DE69433036T2

DE69433036T2 - Aminoderivatisierte nukleoside und oligonukleoside

Info

Publication number: DE69433036T2
Application number: DE69433036T
Authority: DE
Inventors: Dan Phillip COOK; Muthiah Manoharan; J. Charles GUINOSSO
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-09-02
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2014-09-03
Also published as: US6528631B1; CA2170869C; JPH09500388A; EP0728139A1; AU679566B2; DE69433036D1; ATE247128T1; EP0728139B1; EP0728139A4; CA2170869A1; AU7723394A; JP3484197B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Anmeldung ist auf Nukleoside, Oligonukleotide und Oligonukleoside gerichtet die so funktionalisiert sind, dass sie an einer 3'-O-Stellung oder einer 5'-O-Stellung eine Alkylaminofunktionalität enthalten und auf ihre Derivate. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die erfindungsgemäßen Verbindungen weiter Steroide, Reportermoleküle, Reporterenzyme, lipophile Moleküle, Peptide oder Proteine, die über die Alkylaminogruppe an den Nukleosiden befestigt sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Messenger RNA (mRNA) steuert die Proteinsynthese. Die Antisensemethodologie ist die komplementäre Hybridisierung von relativ kurzen Oligonukleotiden an mRNA oder DNA in einer Weise, dass die normalen, wesentlichen Funktionen dieser intrazellulären Nukleinsäuren unterbrochen werden. Hybridisierung ist die Sequenzspezifische Wasserstoffbindung über Watson-Crick-Basenpaare von Oligonukleotiden an RNA oder Einzelstrang-DNA. Derartige Basenpaare werden als zueinander komplementär bezeichnet.
Von den natürlich vorkommenden Abläufen, die die Unterbrechung der Nukleinsäurefunktion zur Verfügung stellen und von Cohen in Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida (1989) diskutiert wurden, wird angenommen, dass sie aus zwei Arten bestehen. Der erste Vorgang, die Hybridisierungsbeendigung, bezeichnet den Schlussvorgang, bei dem der Oligonukleotidinhibitor an die Targetnukleinsäure bindet und dadurch über einfache sterische Hinderung die Bindung von essentiellen Proteinen, meistens Ribosome, an die Nukleinsäure verhindert. Methylphosphonatoligonukleotide (Miller et al., Anti-Cancer Drug Design 1987, 2, 117) und α-Anomer-Oligonukleotide sind die beiden am meisten studierten Antisensewirkstoffe von denen angenommen wird, dass sie die Nukleinsäurefunktion über die Hybridisierungsbeendigung unterbrechen.
Die zweite Art des Ereignisses der Beendigung für Antisenseoligonukleotide beinhaltet die enzymatische Spaltung der Ziel RNA über intrazelluläre RNase H. Ein 2'-Deoxyribofuranosyloligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon hybridisiert mit der Ziel RNA und dieser Doppelstrang aktiviert das RNase H-Enzym um den RNA-Strang zu spalten und daher die normale Funktion der RNA zu zerstören. Phosphorthioatoligonukleotide sind die prominentesten Beispiele eines Antisensewirkstoffs, der über diese Art des Vorgangs der Antisensebeendigung wirkt.
Beträchtliche Forschungsanstrenungen sind auf die Anwendung von Oligonukleotiden und Oligonukleotidanaloga als Antisensewirkstoffe für diagnostische Zwecke, Forschungsreagenzien und potentielle therapeutische Zwecke gerichtet. Wenigstens für therapeutische Zwecke müssen die Antisenseoligonukleotide und Oligonukleotidanaloga durch die Zellmembran transportiert werden oder von Zellen aufgenommen werden, um eine Aktivität zu exprimieren. Ein Verfahren zur Erhöhung des Membran oder zellulären Transports erfolgt über die Bindung einer angehängten lipophilen Gruppe.
Ramirez et al., J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 5483, führte die Phospholipidgruppe 5'-O-(1,2-di-O-myristoyl-sn-glycero-3-phosphoryl) in das Dimer TpT jeweils unabhängig an den 3'- und 5'-Stellungen ein. Nachfolgend offenbarte Shea et al., Nuc. Acids Res. 1990, 18, 3777 Oligonukleotide, die eine 1,2-di-O-Hexyldecyl-rac-Glycerol-Gruppe aufweisen, die an ein 5'-Phosphat am 5'-Ende des Oligonukleotids gebunden ist. Einige der Shea et al. Autoren offenbarten diese und weitere Verbindungen in der Patentanmeldung PCT/US90/01002 (veröffentlich als WO 90/10448). Ein weiteres Glucosylphospholipid wurde von Guerra et al., Tetrahedron Letters 1987, 28, 3581 offenbart.
In anderen Arbeiten, wurde eine Cholesterylgruppe an die Internukleotidverknüpfung zwischen den ersten und zweiten Nukleotiden (ausgehend vom 3'-Ende) eines Oligonukleotids gebunden. Diese Arbeit ist im US-Patent 4,958,013 offenbart und weiter von Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 6553. Das aromatische interkalierende Mittel Anthrachinon wurde an die 2'-Stellung eines Zuckerfragments eines Oligonukleotids gebunden, wie es von Yamana et al., Bioconjugate Chem. 1990, 1, 319 berichtet wurde. Die gleichen Forscher platzierten Pyren-1-Methyl an die 2'-Stellung eines Zuckers (Yamana et al., Tetrahedron Lett. 1991, 32, 6347).
Lemairte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 84, 648; und Leonetti et al., Bioconjugate Chem. 1990, 1, 149. Jedes der 3'-Enden der Oligonukleotide umfasst eine 3'-endständige Ribosezuckereinheit. Das Poly(L-Lysin) wurde an das Oligonukleotid über Perjodatoxidation dieser endständigen Ribose gefolgt von Reduktion und Kopplung über einen N-Morpholinring verknüpft. Oligonukleotid-poly(L-Lysin)-Konjugate sind in der europäischen Patentanmeldung 87109348.0 beschrieben. In diesem Beispiel wurde der Lysinrest an ein 5'- oder 3'-Phosphat des der 5'- oder 3'-endständigen Nukleotids des Oligonukleotids gekoppelt. Eine Disulfidverknüpfung wurde ebenfalls am 3'-Ende eines Oligonukleotids verwendet um ein Peptid mit dem Oligonukleotid zu verknüpfen, wie es von Corey et al., Science 1987, 238, 1401; Zuckermann, et al., J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 1614; und Corey, et al., J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8524 beschrieben wurde.
Nelson, et al., Nuc. Acids Res. 1989, 17, 7187 beschreiben ein Verknüpfungsmittel zur Bindung von Biotin an das 3'-Ende eines Oligonukleotids. Dieses Reagens, N-Fmoc-O-DMT-3-Amino-1,2-propandiol ist nun kommerziell von Clontech Laboratories (Palo Alto, CA) unter dem Namen 3'-Amine on erhältlich. Es ist ebenfalls unter dem Namen 3'-Amino-Modifier-Wirkstoff von Glen Research Corporation (Sterling, VA) erhältlich. Dieses Reagens wurde ebenfalls verwendet, um ein Peptid mit einem Oligonukleotid zu verknüpfen, wie es von Judy et al., Tetrahedron Letters 1991, 32, 879 berichtet wurde. Ein ähnliches kommerzielles Reagens (in Wirklichkeit eine Serie derartiger Linker, die verschiedene Längen an Polymethylenverknüpfungen aufweisen) zur Bindung an das 5'-Ende eines Oligonukleotids ist 5'-Amino-Modifier C6. Diese Reagenzien sind von der Glen Research Corporation (Sterling, VA) erhältlich. Diese Verbindungen oder ähnliche wurden von Krieg et al., Antisense Research and Development 1991, 1, 161 verwendet, um Fluorescein mit dem 5'-Ende eines Oligonukleotids zu verknüpfen. Andere Verbindungen von Interesse wurden ebenfalls über das 3'-Ende eines Oligonukleotids verknüpft. Asseline et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 3297 beschrieben die Verknüpfung von Acridin mit der 3'-endständigen Phosphatgruppe eines Poly(Tp)Oligonukleotids über eine Polymethylenverknüpfung. Haralambidis, et al., Tetrahedron Letters 1987, 28, 5199 berichten über den Aufbau eines Peptids auf einem Festkörperträger und die anschließende Verknüpfung mit einen Oligonukleotid an dieses Peptid über die 3'-Hydroxylgruppe des 3'-endständigen Nukleotids des Oligonukleotids. Chollet, Nucleosides & Nucleo tides 1990, 9, 957 banden ein Aminolink 2 (Applied Biosystems, Foster City, CA) an das 5'-endständige Phosphat eines Oligonukleotids. Sie verwendeten dann die bifunktionelle Verknüpfungsgruppe SMPB (Pierce Chemical Co., Rockford, II) um ein Interleukinprotein mit dem Oligonukleotid zu verknüpfen.
Ein EDTA-Eisenkomplex wurde an die 5-Stellung eines Pyrimidinnukleosids verknüpft, wie es von Dreier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 968 berichtet wurde. Fluorescein wurde mit einem Oligonukleotid in der gleichen Weise verknüpft wie es von Haralambidis et al., Nucleic Acid Research 1987, 15, 4857 berichtet wurde und Biotin in der gleichen Weise wie es in der PCT-Anmeldung PCT/US/02198 beschrieben wurde. Fluorescein, Botin und Pyren wurden ebenfalls in der gleichen Weise wie es von Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6966 berichtet wurde, verknüpft. Ein kommerzielles Reagens, Amino-Modifier-dT, von der Glen Research Corporation (Sterling, VA) kann verwendet werden, um Pyrimidinnukleotide, die ähnliche Verknüpfungsgruppe tragen, in Oligonukleotide einzuführen.
Cholinsäure, die an EDTA zur Verwendung in radioszintigraphischen Imaging-Studien verknüpft war, wurde von Betebenner et al., Bioconjugate Chem. 1991, 2, 117 beschrieben. Manharan et al., beschreiben die Konjugierung von Cholinsäure an Oligonukleotide (Annals of the New York Academie of Sciences, 1992, Seiten 306– 309) und von Cholinsäure, Biotin, Fluorescein und Digoxigenin an die 2'-O-Stellung von Adenosin, das in Oligonukleotiden inkorporiert wurde (Tetrahedron Letters, Band 32, Nr. 49, 1991, Seiten 7171–7174).
ZIELE DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Nukleoside, Oligonukleotide und Oligonukleoside zur Verfügung zu stellen, die eine alkylamino chemische Funktionalität an einer 3'-O-Stellung oder einer 5'-O-Stellung umfassen.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Verbindungen zur Verfügung stellen, die einen verbesserten Transfer durch Zellmembranen aufweisen.
Es ist ein weiteres Ziel, Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die Interkalatoren, Nukleinsäurespaltungswirkstoffe, Zelloberflächenphospholipide und/oder diagnostische Wirkstoffe umfassen.
Es ist noch ein anderes Ziel, Verbesserungen in der Forschung und diagnostischen Methoden und bei Materialien zum Test von körperlichen Zuständen in Tieren, insbesondere Krankheitszuständen zur Verfügung zu stellen.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, therapeutische und Forschungsmaterialien zur Verfügung zu stellen, die einen verbesserten Transfer und Aufnahmeeigenschaften für die Behandlung von Krankheiten über die Modulation der DNA- oder RNA-Aktivität haben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese und weitere Ziele werden durch die vorliegende Erfindung erfüllt, die Verbindungen zur Verfügung stellt, die eine alkylamino chemische Funktionalität enthalten. In einem Aspekt stellt die Erfindung Nukleoside zur Verfügung, die Basenteile und Ribofuranosylzuckerteile aufweisen. Derartige Nukleoside tragen an einer 3'-O-Stellung oder an einer 5'-O-Stellung einen Substituenten mit der Formel: -R_A-N(R_1a)(R_1b) wobei: R_A ein Alkylrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen;
R_1a und R_1b unabhängig voneinander H, R₂, R_A oder eine Aminschutzgruppe ist oder die Formeln C(X)-R₂, C(X)-R_A-R₂, C(X)-Q-R_A-R₂, C(X)-Q-R₂ aufweisen, R₂ ist ein Folat, ein Steroidmolekül, ein Reportermolekül, ein lipophiles Molekül, ein Reporterenzym, ein Peptid, ein Protein oder hat die Formel -Q-(CH₂CH₂-Q-)_x-R₃;
X ist O oder S;
jedes Q unabhängig NH, O oder S ist;
x ist 1 bis 200;
R₃ ist H, R_A, C(O)OH, C(O)OR_A, C(O)R₄, R_A-N₃ oder R_A-NH₂; und
R₄ ist Cl, Br, I, SO₂R₅ oder hat die Struktur
m ist 2 bis 7; und
R₅ ist ein Alkyl das 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, unter der Bedingung, dass wenn eins von R_1a oder R_1b H ist, dann ist das andere von R_1a oder R_1b nicht H.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Oligonukleotide und Oligonukleoside zur Verfügung, die eine Vielzahl von verknüpften Nukleosiden umfassen, wobei jedes Nukleosid einen Ribofuranosylzuckerteil umfasst und ein Basenteil und wenigstens eines (vorzugsweise mehr als eines) der Nukleoside an einer 3'-O-Stellung oder einer 5'-O-Stellung einen Substituenten trägt, der die Formel -R_A-N(R_1a)(R_1b) hat, wobei
R_A ein Alkyl ist, das 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist oder (CH₂-CH₂-Q)_x;
R_1a und R_1b sind so ausgewählt, dass
R_1a H ist, R₂ eine Aminschutzgruppe oder die Formel C(X)-R₂, C(X)-R_A-R₂, C(X)-Q-R_A-R₂ oder C(X)-Q-R₂ ist,
R_1b ist R₂, eine Aminschutzgruppe oder hat die Formel C(X)-R₂, C(X)-R_A-R₂, C(X)-Q-R_A-R₂ oder C(X)-Q-R₂ ist oder
R_1a und R_1b vervollständigen zusammen eine Cycloalkyl- oder Cycloaryleinheit, die zwei bis sechs Kohlenstoffatome und ein bis zwei Stickstoffatome aufweisen;
R₂ ist ein Folat, ein Steroidmolekül, ein Reportermolekül, ein lipophiles Molekül, ein Reporterenzym, ein Peptid, ein Protein oder hat die Formel -Q-(CH₂CH₂-Q-)_x-R₃;
X ist O oder S;
jedes Q ist unabhängig voneinander NH, O oder S;
x ist 1 bis 200;
R₃ ist H, R_A, C(O)OH, C(O)OR_A, C(O)R₄, R_A-N₃ oder R_A-NH₂;
R₄ ist Cl, Br, I, SO₂R₅ oder hat die Struktur:
m ist 2 bis 7; und
R₅ ist ein Alkyl das ein 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist.
Die Oligonukleotide und Oligonukleoside können hergestellt werden, indem erfindungsgemäße Nukleoside über einen Zeitraum und unter Reaktionsbedingungen, die wirksam sind, um zwischen ihnen eine kovalente Bindung zu bilden, in Kontakt gebracht werden. In bevorzugten Ausführungsformen, trägt wenigstens eines der Nukleoside eine Phosphoramidatgruppe an seiner 2'-O-Stellung oder an seiner 3'-O-Stellung.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können hergestellt werden, indem ein Nukleosid, Oligonukleotid oder Oligonukleosid mit Derivatisierungsreagenzien in Kontakt gebracht werden.
Beispielsweise kann ein Nukleosid, ein Oligonukleotid oder Oligonukleosid, das eine 3'-Hydroxygruppe oder eine 5'-Hydroxygruppe trägt unter basischen Bedingungen mit einer Verbindung, die die Formel L₁-R_A-N(R_1a)(R_1b) hat in Kontakt gebracht werden, wobei L₁ eine Abgangsgruppe ist, wie ein Halogen und wenigstens eines von R_1a und R_1b ist eine Aminschutzgruppe.
Die Verbindung kann in eine Zusammensetzung enthalten sein, die weiter einen inerten Träger für die Verbindung umfasst.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Nukleoside, Oligonukleotide und Oligonukleoside die alkylamino chemische Funktionalitäten an einer 3'-O-Stellung oder an einer 5'-O-Stellung aufweisen zur Verfügung. Die Nukleosiduntereinheiten können "natürliche" oder "synthetische" Einheiten sein. Jedes Nukleosid wird von einer natürlich vorkommenden oder synthetischen Base und einem natürlich vorkommenden oder synthetischen Pentofuranosylzuckergruppe gebildet.
Der Begriff "Oligonukleotid" bezieht sich auf ein Polynukleotid, das aus einer Mehrzahl von verknüpften Nukleotideinheiten gebildet ist. Die Nukleotideinheiten umfassen jede eine Nukleosideinheit. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "Oligonukleosid" auf eine Mehrzahl von Nukleosideinheiten die miteinander verknüpft sind. Da jede Nukleotideinheit eines Oligonukleotids ein Nukleosid umfasst, kann generisch gesprochen der Begriff "Oligonukleosid" dahingehend betrachtet werden, dass er Oligonukleotide umfasst (d. h. Nukleoside, die miteinander über Phosphatverknüpfungsgruppen verknüpft sind). In einer weiteren Bedeutung bezieht sich der Begriff "Oligonukleosid" ebenfalls auf eine Vielzahl von Nukleosiden, die miteinander über andere Verknüpfungen als Phosphatverknüpfungen verknüpft sind. Der Betriff "Oligonukleosid" umfasst daher in Wirklichkeit natürlich vorkommende Spezies oder synthetische Spezies, die aus natürlich vorkommenden Untereinheiten gebildet sind. Der kürze halber wird der Begriff "Oligonukleosid" so verwendet werden, dass er sowohl phosphatverknüpfte (Oligonukleotide) und nicht phosphatverknüpfte Polynukleosidspezies umfasst.
Erfindungsgemäße Oligonukleoside können ebenfalls modifizierte Untereinheiten umfassen. Repräsentative Modifikationen umfassen die Modifizierung eines heterocyclischen Basenteils eines Nukleosids oder eines Zuckerteils eines Nukleosids. Beispielhafte Modifikationen sind in den folgenden US-Patentanmeldungen offenbart: Anmeldenummer 463,358, Anmeldetag 11. Januar 1990, mit dem Titel "Zusammensetzung und Verfahren zum Nachweis und zur Modulierung der RNA-Aktivität"; Anmeldenummer 566,977, Anmeldetag 13. August 1990 mit dem Titel "Zuckermodifizierte Oligonukleotide, die Genexpression nachweisen und Modulieren"; Anmeldenummer 558,663, Anmeldetag 27. Juli 1990 mit dem Titel "Polyaminkonjugierte Oligonukleotide" (veröffentlicht als US-Patent 5,138,045); und die Anmeldenummer PCT/US91/00243, Anmeldetag 11. Januar 1991 mit dem Titel "Zusammensetzung und Verfahren zum Nachweis und zur Modulation der RNA-Aktivität (veröffentlicht als WO 91/10671). Jede dieser Patentanmeldungen wurde auf den Inhaber dieser Erfindung übertragen.
Der Begriff "Oligonukleosid" bezieht sich daher auf Strukturen, die modifizierte Teile umfassen, und zwar können diese modifizierte Zuckerteile oder modifizierte Basenteile sein, die ähnlich natürlichen Basen und natürlichen Zuckern funktionieren. Re präsentative modifizierte Basen umfassen Deaza oder Azapurine und Pyrimidine, die anstelle von natürlichen Purin und Pyrimidinbasen verwendet werden; Pyrimidine die Substituentengruppen an der 5- oder 6-Stellung aufweisen; und Purine die geänderte oder ersetzte Substituentengruppen an 2-, 6- oder 8-Stellungen aufweisen. Repräsentative modifizierte Zucker umfassen carbocyclische oder acyclische Zucker, Zucker, die Substituentengruppen an ihrer 2'-Stellung aufweisen und Zucker, die Substituenten anstelle von einem oder mehreren Wasserstoffatomen am Zucker aufweisen. Andere geänderte Basenteile und geänderte Zuckerteile sind im US-Patent 3,687,808 und in der PCT-Anmeldung PCT/US89/02323 (veröffentlicht als WO 89/12060) offenbart.
Geänderte Baseneinheiten oder geänderte Zuckereinheiten umfassen auch andere Modifikationen, die mit dem Gehalt der vorliegenden Erfindung konsistent sind. Derartige Oligonukleoside werden am besten als strukturell verschieden und doch funktionell austauschbar mit natürlich vorkommen und mit synthetischen Wildtypenoligonukleotiden beschrieben. Alle diese Oligonukleoside werden von der vorliegenden Erfindung umfasst, solange ihre Funktion wirklich die Struktur eines gewünschten RNA- oder DNA-Strangs imitiert.
Zur Verwendung in der Antisensemethodologie umfassen die erfindungsgemäßen Oligonukleoside vorzugsweise von ungefähr 10 bis ungefähr 30 Untereinheiten. Es ist bevorzugter, dass derartige Oligonukleoside von ungefähr 15 bis ungefähr 25 Untereinheiten umfassen. Wie vollkommen klar ist, ist eine Untereinheit eine Basen- und Zuckerkombination, die in geeigneter Weise an benachbarte Untereinheiten gebunden ist über beispielsweise eine Phosphor enthaltende (beispielsweise Phosphordiester) Verknüpfung oder über eine andere Verknüpfungseinheit. Die Nukleoside müssen nicht auf irgendeine besondere Weise verknüpft sein, solange sie kovalent gebunden sind. Beispielhafte Verknüpfungen sind diejenigen zwischen den 3'- und 5'-Stellungen oder den 2'- und 5'-Stellungen von benachbarten Nukleosiden. Beispielhafte Verknüpfungseinheiten sind in den nachfolgenden Literaturstellen offenbart: Beaucage et al., Tetrahedron 1992, 48, 2223 und dort zitierte Literatur; US-Patentanmeldung Anmeldenummer 703,619, angemeldet am 21. Mai 1991 (veröffentlicht als US-Patent 5,378,825); Anmeldenummer 903,160, angemeldet am 24.
Juni 1992. Jede der vorstehenden Patentanmeldungen ist an den Anmelder dieser Erfindung übertragen worden.
Es ist bevorzugt, dass der RNA- oder DNA-Teil der unter Verwendung von erfindungsgemäßen Oligonukleosiden moduliert werden soll, vorher so ausgewählt ist, dass er diesen Teil der DNA oder RNA umfasst, der für das Protein codiert dessen Bildung oder Aktivität moduliert werden soll. Der Zielteil der zu verwendenden Zusammensetzung ist daher so ausgewählt, dass er zu dem vorher ausgewählten Teil der DNA oder RNA komplementär ist, d. h. dass er ein Antisenseoligonukleosid für diesen Teil darstellt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hybridisieren die erfindungsgemäßen Verbindungen an HIV mRNA, die das tat-Protein codiert oder an die TAR-Region von HIV mRNA. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform emittieren die Verbindungen die Sekundärstruktur der TAR-Region von HIV mRNA und damit binden Sie das tat-Protein. Andere bevorzugte Verbindungen sind zu Sequenzen für Herpes, Papilloma und anderen Viren komplementär.
Die erfindungsgemäßen Nukleoside und Oligonukleoside können in der Diagnostik, im therapeutischen Verfahren und als Forschungswirkstoffe und Kits verwendet werden. Sie können in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, indem sie geeignete pharmazeutisch akzeptierbare Verdünnungsmittel oder Träger umfassen. Sie können weiter zur Behandlung von Organismen verwendet werden, die eine Krankheit haben, die durch die unerwünschte Produktion eines Proteins charakterisiert ist. Der Organismus sollte mit einem Oligonukleotid in Kontakt gebracht werden, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch mit einem Strang an Nukleinsäure zu hybridisieren, die für das unerwünschte Protein codiert. Behandlungen dieser Art können an einer Vielzahl von Organismen durchgeführt werden und reichen von einzelligen prokaryotischen und eukaryotischen Organismen bis zu multizellulären eukaryotischen Organismen. Jeder Organismus, der DNA-RNA-Transkription oder RNA-Protein-Translation als grundlegender Teil seiner erblichen, metabolistischen oder zellulären Kontrolle verwendet, ist der therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung gemäß der Erfindung zugänglich. Scheinbar verschiedene Organismen wie Bakterien, Hefen, Protozoen, Algen, alle Pflanzen und alle höheren Tierformen einschließlich Warmblüter können behandelt werden. Da jede Zelle von multizellulären Eukaryoten behandelt werden kann, da sie bei sowohl DNA-RNA-Transkription und RNA-Protein-Translation als integrale Teile ihrer zellulären Aktivität umfassen. Viele der Organellen (beispielsweise Mitochondrien und Chloroplasten) von eukaryotischen Zellen umfassen ebenfalls Transkriptions- und Translationsmechanismen. Daher können ebenfalls Einzelzellen, zelluläre Populationen oder Organellen ebenfalls unter die Definition von Organismen fallen, die mit den therapeutischen oder diagnostischen Oligonukleotiden behandelt werden können. Wie vorliegend verwendet, wird der Betriff "Therapeutik" so verstanden, dass er die Entfernung eines Krankheitszustands umfasst, indem er einen Organismus tötet oder er umfasst die Kontrolle von erratischem oder schädlichem zellulärem Wachstum oder Expression.
In einem Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf Nukleoside und Oligonukleotide gerichtet, die wenigstens einen ein Amin enthaltenden Substituenten der Formel -R_A-N(R_1a)(R_1b) tragen, der an den 3'-O- und/oder 5'-O-Stellungen angehängt ist.
Jedes erfindungsgemäße R_A ist eine Alkyleinheit, die unabhängig voneinander ausgewählt ist, so dass sie 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist oder R_A ist ein Polyether, ein Polythioether oder Polyalkylamin. Der Begriff "Alkyl" soll geradkettige und verzweigte Kohlenwasserstoffe umfassen. Die bevorzugte Länge dieser Kohlenwasserstoffe ist 1 bis 7 Kohlenstoffatome, bevorzugter 3 bis 4 Kohlenstoffatome.
R_1a und R_1b gemäß der Erfindung sind H, R₂, R_A, eine Aminschutzgruppe oder haben die Formel C(X)-R₂, C(X)-R_A-R₂, C(X)-Q-R_A-R₂, C(X)-Q-R₂ oder vervollständigen zusammen eine Cycloalky- oder Cycloaryleinheit, die zwei bis sechs Kohlenstoffatome und ein bis sechs Stickstoffatome wie eine Imidazoleinheit aufweist. Schutzgruppen sind an sich als chemische funktionelle Gruppen bekannt, die selektiv an Funktionalitäten angehängt und entfernt werden können, wie beispielsweise Amingruppen. Diese Gruppen sind in einer chemischen Verbindung vorhanden, um eine derartige Funktionalität gegenüber chemischen Reaktionsbedingungen inert zu machen, denen die Verbindung ausgesetzt ist. Siehe beispielsweise Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Edition, John Wiley & Sons, New York, 1991. Zahlreiche Aminschutzgruppen sind aus dem Stand der Technik bekannt, umfassend aber nicht beschränkt auf Phthalimid (PHTH), Trifluoracetat (Triflat), Allyloxycarbonyl (Alloc), Benzyloxycarbonyl (CBz), Chlorobenzyloxycarbonyl, t-Butyloxycarbonyl (Boc), Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) und Isonicotinyloxycarbonyl (i-Noc) Gruppen. (Siehe beispielsweise Veber und Hirschmann et al., J. Org. Chem. 1977, 42, 3286 und Atherton, et al., The Peptides, Gross und Meienhofer, Herausgeber, Academic Press; New York, 1983; Band 9, S. 1–38).
R₂ kann ein Folat ein Steroidmolekül, ein Reportermolekül, ein lipophiles Molekül, ein Reporterenzym, ein Peptid, ein Protein (d. h. ein Substituent der im Wesentlichen daraus besteht) oder ein Molekül umfassen, das die Formel -Q-(CH₂CH₂-Q-)_x-R₃ aufweist. Für die Zwecke dieser Endung sollen die Begriffe "Reportermolekül" und "Reporterenzym" diejenigen Moleküle oder Enzyme umfassen, die physikalische oder chemische Eigenschaften aufweisen, die es ermöglichen, dass sie in Gelen, Fluiden, ganzen Zellsystemen, gebrochenen Zellsystemen und dergleichen identifiziert werden können unter Verwendung von physikalischen Eigenschaften wie Spektroskopie, Radioaktivität, kolorimetrische Assays, Fluoreszenz und spezifische Bindung. Steroide umfassen diejenigen chemischen Verbindungen, die ein Perhydro-1,2-Cyclopentanophenanthren-Ringsystem enthalten. Proteine und Peptide werden in ihrem üblichen Sinn als Polymere von Aminosäuren verwendet. Normale Peptide umfassen derartige Polymere, die eine kleinere Anzahl von Aminosäuren pro Moleküleinheit enthalten als es Proteine tun. Lipophile Moleküle umfassen natürlich vorkommende und synthetische, aromatische und nicht aromatische Einheiten wie Fettsäuren, Ester, Alkohole und andere Lipidmoleküle, substituierte aromatische Gruppen wie Dinitrophenylgruppen, Käfigstrukturen wie Adamantan und Buckminsterfullere und aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Perylen, Phenanthren, Anthracen, Naphthol, Pyren, Chrysen und Naphthacen.
Als Steroidmoleküle sind insbesondere die Gallensäuren nützlich, umfassend Cholinsäure, Deoxycholinsäure und Dehydrocholinsäure; Steroide umfassend Cortison, Digoxigenin, Testosteron und Cholesterol und selbst kationische Steroide wie Cortison, das eine Trimethylaminomethylhydrazid-Gruppe aufweist, die über eine Doppelbindung an die 3-Stellung der Cortisonringe gebunden ist. Als Reportermoleküle sind insbesondere Biotin, wie Nitrophenyl und Fluorescein-Farbstoffe nützlich. Als lipophile Moleküle sind insbesondere alicyclische Kohlenwasserstoffe; gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, Wachse, Terpene und polyalicyclische Kohlenwasserstoffe, umfassend Adamantan und Buckminsterfullerene nützlich. Als Reporterenzyme sind alkalische Phosphatase und Meerrettichperoxidase nützlich. Als Peptide und Proteine sind sequenzspezifische Peptide und Proteine besonders nützlich, umfassend Phosphordiesterase, Peroxidase, Phosphatase und Nukleaseproteine. Derartige Peptide und Proteine umfassen SV40-Peptid, RnaseA, RNase H und staphylococcale Nuklease. Als Terpenoide sind insbesondere Vitamin A, Retinonsäure, Retinal und Dehydroretinol nützlich.
R₂ kann auch die Formel -Q-(CH₂CH₂-Q-)_x-R₃ aufweisen, wobei Q O oder S ist. Das tiefgestellte x kann 1 bis 200 bedeuten, vorzugsweise 20 bis 150, bevorzugter 10 bis 50. Vorzugsweise wird Q so gewählt, dass es O ist, so dass R₂ eine Poly(ethylenglykol) (PEG)-Gruppe darstellt (d. h. R₃ = H) oder eines seiner funktionalisierten Derivate (beispielsweise R₃ = C(O)Cl). R₃ kann H, R_A, C(O)OH, C(O)OR_A, C(O)R₄, R_A-N₃ oder R_A-NH₂ sein, wobei R₄ Cl, Br, I, SO₂R₅ ist oder ein kleiner Schwefel enthaltender Heterozyklus der die folgende Struktur aufweist:
wobei m 2 bis 7 ist. Repräsentative PEG-enthaltende R₂-Gruppen wurden von Ouchi et al., Drug Design and Discovery 1992, 9, 93, Ravasio et al., J. Org. Chem. 1991, 56, 4329 und Delgardo et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992, 9, 249 offenbart.
Erfindungsgemäße Oligonukleoside können in Lösung oder über Festphasenreaktionen zusammengesetzt werden, beispielsweise auf einem geeigneten DNA-Syntheseapparat, der erfindungsgemäße Nukleoside und/oder Standardnukleotid-Vorläufer verwendet. Die Nukleosid- und Nukleotid-Vorläufer können schon Alkylaminogruppen tragen oder können später dahingehend modifiziert werden, dass sie derartige Gruppen tragen.
Im ersten Fall werden erfindungsgemäße Verbindungen beispielsweise dadurch hergestellt, dass Nukleoside, die wenigstens eine freie 3'- oder 5'-Hydroxylgruppe tragen unter basischen Bedingungen mit einer Verbindung der Formel L₁-(CH₂)_n-N(R_1a)(R_1b) aufweisen, wobei L₁ eine Abgangsgruppe ist und wenigstens eines von R_1a und R_1b ist eine Aminschutzgruppe. Entfernung der Schutzgruppe über nukleophilen Angriff eines Sauerstoffanions ergibt das gewünschte Aminderivat. Erfindungsgemäße Schutzgruppen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Halogen, Alkylsulfonyl, substituiertes Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, substituiertes Arylsulfonyl, Heterocyclosulfonyl oder Trichloracetimidat. Eine bevorzugtere Gruppe umfasst Chlor, Fluor, Brom, Jod, p-(2,4-Dinitroanilino)benzolsulfonyl, Benzolsulfonyl, Methylsulfonyl (Mesylat), p-Methylbenzolsulfonyl (Tosylat), p-Bromobenzolsulfonyl, Trifluoromethylsulfonyl (Triflat), Trichloroacetimidat, Acyloxy, 2,2,2-Trifluoroethansulfonyl, Imidazolsulfonyl und 2,4,6-Trichlorophenyl, wobei Brom bevorzugt ist.
Geeignet geschützte Nukleoside können gemäß bekannten Techniken zu Oligonukleosiden zusammengesetzt werden. Siehe beispielsweise Beaucage et al., Tetrahedron 1992, 48, 2223.
Erfindungsgemäße Oligonukleoside können ebenfalls hergestellt werden, indem ein Oligonukleosid und eine daran hängende Alkylaminofunktionalität zusammengesetzt werden. Beispielsweise können Oligonukleoside, die freie Hydroxylgruppen aufweisen, gemäß bekannten Techniken zusammengesetzt werden und anschließend mit einem Reagens, das die Formel L₁-(CH₂)_n-N(R_1a)(R_1b) aufweist, umgesetzt werden. Wie jedoch erkannt werden wird, kann eine größere Selektivität in Bezug auf die Platzierung der Alkylaminofunktionalität innerhalb eines Oligonukleosids dadurch erreicht werden, dass eine wie vorstehend diskutierte Funktionalität in ausgewählte Nukleoside eingeführt wird und anschließend sowohl die ausgewählten Nukleoside und andere Nukleoside verwendet werden, um ein Oligonukleosid zu konstruieren.
Einmal zusammengebaut, wird ein Oligonukleosid, das ein oder mehrere Gruppen die die Formel -R_A-N(R_1a)(R_1b) aufweisen, wobei wenigstens eines von R_1a und R_1b eine Schutzgruppe ist, mit Reagenzien behandelt, die wirksam sind, um die Schutzgruppe entfernen. Einmal entschützt, kann das Oligonukleosid mit elektrophilen Einheiten in Kontakt gebracht werden wie beispielsweise Succinimidylester und andere aktivierte Carbonsäuren, umfassend C(=O)-O-Succinimid und C(=O)-O-Pentafluorophenyl, isothiocyanaten, Sulfonylchloriden, Halacetamiden, Phospholipidestern die gegenüber carbocyclischen Säuren aktiv sind, o-Phenanthrolin-5- Jodacetamid, Fluoresceinisothiocyanaten, 1-Pyrenbuttersäure-N-Hydroxysuccinimidester und Carbonsäurenderivaten von PNA (Carbonsäurederivate von Peptidnukleinsäuren). Bevorzugte elektrophile Einheiten umfassen Cholesteryl-3-Hemisuccinat-N-Hydroxysuccinimidester, Pyren-1-Buttersäure-N-Hydroxysuccinimidester und Polyethylenglykolpropionsäure-N-Hydroxysuccimidester.
Die Erfindung baut daher zuerst die gewünschte verknüpfte Nukleosidsequenz auf ganz normale Art in dem DNA-Syntheseautomatr auf. Eines oder mehr (vorzugsweise zwei oder mehr) der verknüpften Nukleoside werden anschließend mit dem lipophilen Steroid, dem Reportermolekül, dem lipophilen Molekül, dem Reporterenzym, dem Peptid oder Protein funktionalisiert oder derivatisiert.
Weitere Ziele, Vorteile und neue Merkmale der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann bei der Betrachtung der nachstehenden Beispiele offenbart, die nicht als beschränkend verstanden werden sollen. Alle Oligonukleotidsequenzen sind in der Standard-5'- bis 3'-Reihenfolge von links nach rechts aufgelistet. Der Begriff "Sephadex" ist eine eingetragene Marke. In den nachstehenden Beispielen sind die Oligonukleotide die nur 2'-O-Stellungen, die -R_A-N(R₁)(R₂) aufweisen, nicht Teil der vorliegenden Erfindung.
BEISPIEL 1
Oligonukleotide die 2'-geschützte Amin-endständige Verknüpfungsgruppen aufweisen
A. Darstellung von 5'-Dimethoxytrityl-2'-(O-pentyl-N-phthalimido)-2'-deoxyadenosinphosphoramidit.
Um eine Funktionalisierung einer 2'-Stellung von Nukleotiden innerhalb der gewünschten Oligonukleotidsequenzen einzuführen, wurde 5'-Dimethoxytrityl-2'-(O-pentyl-N-phthalimido)-2'-deoxyadenosinphosphoramidit verwendet, um eine Verknüpfungsgruppe zur Verfügung zu stellen, die an die 2'-Stellung von Nukleotidkomponenten eines Oligonukleotids gebunden ist. Diese Verbindung wurde im allgemeinen gemäß dem Verfahren der Patentanmeldungen mit den Anmeldenummern PCT/US91/00243 (veröffentlicht als WO 91/10671) und 463,358, 1990, wie vorste hend angegeben durchgeführt, ausgehend von Adenosin. Kurz gesagt, behandelt dieses Verfahren Adenosin mit NaH in Dimethylformamid (DMF) gefolgt von Behandlung mit N-(5-Bromopentyl)phthalimid. Weitere Behandlung mit (CH₃)₃SiCl, Ph-C(O)-Cl und NH₄OH ergibt N6-Benzyl geschützte 2'-Pentyl-N-Phthalimid funktionalisiertes Adenosin. Behandlung mit DIPA und CH₂Cl₂ fügt eine DMT-Schutzgruppe in der 5'-Stellung ein. Die letztendliche Phosphitylierung ergibt die gewünschte Phosphoramiditverbindung. Diese Verbindung wurde im DNA-Syntheseautomat als 0,09 M Lösung im trockenen CH₃CN verwendet. Die Oligonukleotidsynthese wurde entweder in einem ABI 390B oder in einem ABI 394 Automat durchgeführt unter Verwendung von Standardsynthesezyklen mit einer verlängerten Kupplungszeit von 10 Minuten während der Kupplung von Verbindung 2 in die Oligonukleotidsequenz. Es wurde eine Kupplungseffizienz von mehr als 98% beobachtet.
B. 2'-geschützte Aminverknüpfungsgruppen die Phosphordiesteroligonukleotide enthalten
Die folgenden Oligonukleotide, die Phosphodiesterinternukleotidverknüpfungen aufweisen, wurden synthetisiert:
wobei A^* ein Nukleotid darstellt, das funktionalisiert ist, um eine Pentyl-N-Phthalimido-Funktionalität einzuschließen. Die Oligomere 12 und 13 sind Antisenseverbindungen für die E2-Region des bovinen Papilloma-Virus-1 (BPV-1 ). Die Oligomeren 12 und 13 haben die gleiche Sequenz wie das Oligomer 3 in der Anmeldung mit der Anmeldenummer 782,374 mit Ausnahme der 2'-Modifikation. Die Oligonukleotide wurden entweder in einer 10 μmol oder in einer 3 × 1 μmol Menge im "Trityl-On"-Modus synthetisiert. Standardentschützungsbedingungen (30% NH₄OH, 55°C, 24 Stunden) wurden verwendet. Die Oligonukleotide wurden über Umkehrphasen HPLC (Waters Delta-Pak C₄ 15 μm, 300A, 25 × 100 mm Kolonne ausgestattet mit einer Leitkolonne des gleichen Materials) gereinigt. Sie wurden detrityliert und weiter über Größenauschlussverfahren gereinigt, unter Verwendung einer Sephadex G-25 Säule. Die NMR-Analysen sowohl mit Protonen und Phosphor NMR bestätigten die erläuterte Struktur für die Oligomere 9 und 10.
C. 2'-geschützte Aminverknüpfungsgruppen enthaltend Phosphorthioatoligonukleotide
Die folgenden Oligonukleotide die Phosphorthioatinternukleotid-Verknüpfungen aufweisen, wurden synthetisiert:
wobei A^* ein Nukleotid darstellt, das so funktionalisiert ist, dass es eine Pentyl-N-Phthalimido-Funktionalität umfasst und das tiefgestellte "s" stellt eine Phosphorothioatinternukleotid-Skelettverknüpfung dar. Das Oligomer 14 ist eine Antisenseverbindung, die auf die E2-Region des bovinen Papilloma-Virus-1 (BPV-1) gerichtet ist. Die Oligomere 15 und 16 sind Antisenseverbindungen für ICAM. Das Oligomer 14 hat die gleiche Sequenz wie Oligomer 3 in der Anmeldung mit der Anmeldenummer 782,374 mit Ausnahme der 2'-Modifikation während die Oligomere 15 und 16 die gleiche Sequenz wie Oligomer 4 in der Anmeldung mit der Anmeldenummer 782,374 aufweist mit der Ausnahme für die 2'-Modifikation. Diese Oligonukleotide wurden gemäß der Methode von Beispiel 1 (B) synthetisiert mit der Ausnahme, dass während der Synthese für die Oxidation der Phosphiteinheiten das Beaucage-Reagens (d. h. 3H-1,2-Benzodithioat-3-on-1,1-dioxid verwendet wurde, siehe Radhakrishnan et al., J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 1253) und als eine 0,24 M Lösung in trockenem CH₃CN-Lösungsmittel verwendet wurde. Die Oligonukleotide wurden im "Trityl-On"-Modus synthetisiert und über Umkehrphasen HPLC unter Verwendung des Reinigungsverfahrens von Beispiel 1(B) gereinigt.
D. 2'-O-Methyl-derivatisierte, 2'-geschützte Aminverknüpfungsgruppe enthaltend RNA Oligonukleotide
Die folgenden Oligonukleotide, die 2'-O-Methylgruppen an jedem nicht funktionalisierten Nukleotid mit einer 2'-geschützten Aminfunktionalisierung aufwiesen, wurden synthetisiert:
wobei A^* ein Nukleotid darstellt, das so funktionalisiert ist, dass es eine Pentyl-N-Phthalimido-Funktionalität enthält und wobei die verbleibenden Nukleotide mit Ausnahme des 3'-endständigen Nukleotids jeweils 2'-O-Methyl-derivatisierte Nukleotide sind. Das 3'-endständige Nukleotid sowohl in Oligomer 17 wie auch 18 ist ein 2'-Deoxynukleotid. Beide Oligomere 17 und 18 sind Antisenseverbindungen für die HIV-1-TAR-Region. Die Oligonukleotide wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 6 in der Anmeldung mit der Nummer 782,374 synthetisiert (unter Verwendung von dessen Verbindung 2) für die Einführung von Nukleotiden, die die Pentyl-N-Phthalimido-Funktionalität enthalten und geeignete 2-O-Methylphosphoramiditnukleotide von Chemgenes Inc. (Needham, MA) für die verbleibenden RNA-Nukleotide. Die 3'-endständigen terminalen 2'-Deoxynukleotide waren Standardphosphoramidite zur Verwendung für den DNA-Syntheseautomaten. Die Oligonukleotide wurden entschützt und wie in dem Verfahren von Beispiel 1(B) gereinigt.
BEISPIEL 2
Funktionalisierung von Oligonukleotiden an der 2'-Stellung
A. Funktionalisierung mit Biotin
1. Einzelstellenmodifikation
Ungefähr 10 O.D.-Einheiten (A₂₆₀) von Oligomer 12 (siehe Beispiel 1) (ungefähr 60 nmol basierend auf den berechneten Extinktionskoeffizienten von 1,6756 × 10⁵) wurden in einem Mikrofugenröhrchen getrocknet. Das Oligonukleotid wurde in 200 μl 0,2 M NaHCO₃ Pufferlösung gelöst und D-Biotin-N-Hydroxysuccinimidester (2,5 mg, 7,3 μmol) (Sigma, St. Louis, MO) wurde zugegeben, gefolgt von 40 μl DMF. Die Lösung wurde über Nacht stehengelassen. Die Lösung wurde auf eine Sephadex G-25 Säule (0,7 × 15 cm) gegeben und die Oligonukleotidfraktionen wurden kombiniert. Analytische HPLC zeigte ungefähr 85% Umsetzung zum Produkt. Das Produkt wurde über HPLC gereinigt (Waters 600E mit 991 Detektor, Hamilton PRP-1-Säule 0,7 × 15 cm; Lösungsmittel A: 500 mM TEAA pH 7,0; B: 45 mM TEAA mit 80% Acetonitril: 1,5 ml Flussgeschwindigkeit: Gradient: 5% B für die ersten 5 Minuten, lineare (1%) Zunahme von B anschließend nach jeder Minute) und weiter auf einer Sephadex G-25 getrennt um das Oligonukleotid zu ergeben:
wobei A^* ein Nukleotid darstellt, das so funktionalisiert ist, dass es eine Biotin-Funktionalität umfasst, die über eine 2'-O-Pentyl-Aminoverknüpfungsgruppe an die 2'-Stellung des bezeichneten Nukleotids gebunden ist. Die HPLC-Retentionszeiten sind in der untenstehenden Tabelle 1 gezeigt.
2. Mehrfach Stellen Modifikation
Ungefähr 10 O.D-Einheiten (A₂₆₀) von Oligomer 13 (siehe Beispiel 1, ungefähr 60 nmol) wurde behandelt unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 8(A)(1) in der Anmeldung mit der Nummer 782,374 mit D-Biotin-N-Hydroxysuccinimidester (5 mg) in 300 μl 0,2 M NaHCO₃-Pufferlösung/50 μl DMF. Analytische HPLC zeigte 65% von doppelt markiertem Oligonukleotidprodukt und 30% von einfach markierten Produkten (von den beiden zugänglichen reaktiven Stellen). HPLC und Sephadex G-25-Reinigung ergab das Oligonukleotid:
wobei A^* Nukleotide darstellt, die funktionalisiert sind, um eine Biotin-Funktionalität zu enthalten, die über eine 2'-O-Pentylaminoverknüpfungsgruppe an die 2'-Stellung des bestimmten Nukleotids gebunden ist. Die HPLC-Retentionszeiten für dieses Produkt (und seine es begleitenden einfach markierten Produkte) sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.
B. Funktionalisierung mit Fluorescein
1-Einzelstellen-Modifikation
Eine 1 M Na₂CO₃/1 M NaHCO₃-Pufferlösung (pH 9,0) wurde hergestellt, indem 1 M NaHCO₃ zu 1 M Na₂CO₃ gegeben wurden. Eine 200 μl Portion dieser Pufferlösung wurde zu 10 O.D.-Einheiten von Oligomer 1 (siehe Beispiel 1) in einem Mikrofugenröhrchen zugegeben. Ein 10 mg Teil von Fluoresceinisocyanat in 500 μl DMF wurde zugegeben, um eine 0,05 M Lösung zu ergeben. Ein 100 μl Teil dieser Fluoresceinlösung wurde zu der Oligonukleotidlösung in dem Mikrofugenröhrchen zugegeben. Das Röhrchen mit Aluminiumfolie bedeckt und über Nacht stehen gelassen. Die Reaktionsmischung wurde auf einer Sephadex G-25-Säule aufgegeben (0,7 × 20 cm), die mit 25% (v/v) Ethylalkohol in Wasser äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert. Die Produktwanderung konnte als gelbe Bande, die gut von der dunklen gelben Bande des überschüssigen Fluoresceinreagens getrennt war, gesehen werden. Die Fraktionen zeigten eine Absorption bei 260 nm und 485 nm und wurden kombiniert und über HPLC gemäß dem Reinigungsverfahren in Beispiel 2(A)(1) gereinigt. Analytische HPLC zeigt 81% des gewünschten doppelt funktionalisierten Oligonukleotids. Das Produkt wurde lyophilisiert und auf Sephadex gereinigt, um das Oligonukleotid:
zu ergeben, wobei A^* ein Nukleotid darstellt, das so funktionalisiert wurde, dass es eine Fluorescein-Funktionalität enthält, die über eine 2'-O-Pentylamino-Verknüpfungsgruppe an die 2'-Stellung des bestimmen Nukleotids verknüpft wurde. HPLC-Rententionszeiten sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.
2. Multiple Site-Modifikation
Eine 10 O.D.-Einheit (A₂₆₀) Teil von Oligomer 13 (aus Beispiel 1) wurde in 300 μl der 1 M Na₂HCO₃/1 M Na₂CO₂-Pufferlösung von Beispiel 2(B)(1) und 200 μl der Fluoresceinisothiocyanat-Vorratslösung von Beispiel 2(B)(1) zugegeben. Die entstehende Lösung wurde wie in Beispiel 2(B)(1) behandelt. Analytische HPLC zeigt 61% von doppelt markiertem Produkt und 38% von einfach markierten Produkten. Die Aufarbeitung der Reaktion ergab das Oligonukleotid:
wobei A^* Nukleotide darstellt, die so funktionalisiert sind, dass sie eine Fluorescein-Funktionalität enthalten, die über eine 2'-O-Pentyl-Amino-Verknüpfungsgruppe an die 2'-Stellung des bezeichneten bestimmten Nukleotids verknüpft sind. Die HPLC-Retentionszeiten sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.
C. Funktionalisierung mit Cholinsäure
1. Einzelstellen-Modifikation
Eine 10 O.D.-Einheit (A₂₆₀) Teil von Oligomer 12 (siehe Beispiel 1) wurde mit Cholinsäure-NHS Ester behandelt (Beispiel 1 in der Anmeldung mit der Nummer 782,374, 5 mg, 9,9 μmol) in 200 μl eines 0,2 M NaHCO₃-Puffers/40 μl DMF. Die Reaktionsmischung wurde für 16 Stunden bei 45°C erhitzt. Das Produkt wurde gemäß dem Verfahren in Beispiel 2(B)(1) isoliert. Analytische HPLC zeigte mehr als 85% Produktbildung. Aufarbeitung der Reaktion ergab das Oligonukleotid:
wobei A^* ein Nukleotid darstellt, das so funktionalisiert wurde, dass es eine Cholinsäure-Funktionalität umfasst, die über eine 2'-O-Pentyl-Amino-Verknüpfungsgruppe an die 2'-Stellung des bestimmten Nukleotids verknüpft ist. Die HPLC-Retentionszeiten sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.
2. Mehrfach Stellen-Modifikation
Eine 10 O.D.-Einheit (A₂₆₀) Teil von Oligomer 13 (siehe Beispiel 1) wurde mit Cholinsäure-NHS Ester behandelt (Verbindung 1 in der Anmeldung mit der Nummer 782,374, 10 mg, 19,8 μmol) in 300 μl 0,2 M NaHCO₃-Puffer/50 μl DMF. Die Reaktionsmischung wurde für 16 Stunden bei 45°C erhitzt. Das Produkt wurde gemäß dem Verfahren im Beispiel 2(A)(1) isoliert. Die Analytische HPLC zeigte 58% von doppelt markiertem Produkt, 17% eines ersten einfach markierten Produkts und 24% eines zweiten einfach markierten Produkts. Die Aufarbeitung gemäß Beispiel 2(A)(1) ergab das Oligonukleotid:
wobei A^* Nukleotide darstellt, die so funktionalisiert sind, dass sie eine Cholinsäure-Funktionalität umfassen, die über eine 2'-O-Pentyl-Amino-Verknüpfungsgruppe an die 2'-Stellung des bestimmten Nukleotids verknüpft ist. Die HPLC-Retentionszeiten sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.
D. Funktionalisierung mit Digoxigenin
1. Einzelstellen-Modifikation
Eine 10 O.D.-Einheit (A₂₆₀) Teil von Oligomer 12 (siehe Beispiel 1) wurde mit Digoxigenin-3-O-Methylcarbonyl-ε-Aminocapron-N-Hydroxysuccinimidester (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) in 200 μl von 0,1 M Boratpuffer bei pH 8,3/40 μl DMF behandelt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht stehen gelassen. Das Produkt wurde gemäß dem Verfahren in Beispiel 2(A)(1) isoliert. Die Aufarbeitung der Reaktion ergab das Oligonukleotid:
wobei A^* ein Nukleotid darstellt, das so funktionalisiert wurde, dass es eine Digoxigenin-Funktionalität umfasst, die über eine 2'-O-Pentyl-Amino-Verknüpfungsgruppe an die 2'-Stellung des bestimmten Nukleotids gebunden ist. Die HPLC-Retentionszeiten sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.
2. Multiple Site-Modifikation
Eine 10 O.D.-Einheiten (A₂₆₀) Teil von Oligomer 13 (siehe Beispiel 1) wurde mit Digoxigenin-3-O-Methylcarbonyl-ε-Aminocapron-N-Hydroxysuccinimidester (Boehringer Mannheim Corporation, Lndianapolis, IN) in 300 μl eines 0,1 M Boratpuffers bei pH 8,3/50 μl DMF behandelt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht stehen gelassen. Das Produkt wurde gemäß dem Verfahren in Beispiel 2(A)(1) isoliert. Die Aufarbeitung gemäß Beispiel 2(A)(1) ergab das Oligonukleotid:
wobei A^* Nukleotide darstellt, die so funktionalisiert sind, dass sie eine Cholinsäure-Funktionalität umfassen, die über eine 2'-O-Pentyl-Amino-Verknüpfungsgruppe an die 2'-Stellung des bestimmten Nukleotids gebunden ist. Die HPLC-Retentionszeiten sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1 HPLC-Retentionszeiten von Oligonukleotiden, die an ihrer 2'-Stellung funktionalisiert sind
Die verwendeten Reaktionsbedingungen waren wie folgt: Waters 600E mit 991-Detektor, Hamilton PRP-1-Säule 0,7 × 15 cm; Lösungsmittel A: 50 mM TEAA pH 7,0; B: 45 mM TEAA mit 80% Acetonitril: 1,5 ml Flussgeschwindigkeit: Gradient: 5% B für die ersten 5 Minuten, lineare (1%) Zunahme von B anschließend minütlich.
VERFAHREN A
Bestätigung der Struktur von funktionalisierten Oligonukleotiden, die eine angehängte 2'-Aminoeinheit enthalten
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide wurden mit Schlangenvenomphosphordiesterase und Kalbsdarm-alkalischer Phosphatase in ihre einzelnen Nukleoside verdaut. Nach dem Verdau wurde die Nukleosidzusammensetzung über HPLC ana lysiert. Die HPLC-Analyse wies nach, dass funktionalisierte Nukleotidverbindungen, die die angehängte 2'-Aminoeinheit aufwiesen, richtig in die Oligonukleotide eingebaut wurden.
Die Schlangenvenomphosphodiesterase [Boehringer-Mannheim cat. #108260, 1 mg (1,5 Einheiten)/0,5 ml] und alkalische Phosphatase vom Kalbsdarm (1 Einheit/Mikroliter, Boehringer-Mannheim cat. #713023) in Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,2, 50 mM) wurden zum Verdau der Oligonukleotide in ihre Nukleosidbestandteile verwendet. Zu 0,5 O.D.-Einheiten an Oligonukleotid in 50 μl Puffer (ungefähr 40 μM Endkonzentration für eine 20 mer) wurden 5 μl von Schlangenvenomphosphosdiesterase (fast 0,3 Einheiten/ml, Endkonzentration) und 10 μl alkaline Phosphatase (ungefähr 150 Einheiten/ml, Endkonzentration) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 37°C für 3 Stunden inkubiert. Nach der Inkubierung wurde die Reaktionsmischung über HPLC unter Verwendung einer umkehrphasenanalytischen Säule (ungefähr 30 × 2,5 cm) mittels HPLC analysiert; Lösungsmittel A: 50 mM TEAA pH 7; Lösungsmittel B: Acetonitril; Gradient 100% für 10 Minuten, anschließend 5% B für 15 Minuten, anschließend 10% B und anschließend Waschen. Die Ergebnisse dieses Verdaus sind in Tabelle 2 für repräsentative Oligonukleotide dargestellt.
Tabelle 2 Oligonukleotidanalyse über enzymatischen Verdau
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, wurden die richtigen Nukleosidverhältnisse für die Nukleotidbestandteile der Testoligonukleotide beobachtet.
VERFAHREN B
Bestimmung von Schmelztemperaturen (Tm's) von Cholinsäureoligonukleotid-Konjugaten
Die relative Fähigkeit von Oligonukleotiden an ihren komplementären Strang zu binden wird dadurch verglichen, dass die Schmelztemperatur des Hybridisierungskomplexes des Oligonukleotids und seines komplementären Strangs bestimmt wird. Die Schmelztemperatur (Tm), eine charakteristische physikalische Eigenschaft von Doppelhelices, bezeichnet die Temperatur in Grad Celsius bei dem 50% helikale gegenüber verknäulten (nicht hybridisierte) Formen vorhanden sind. Die Tm wird gemessen, indem das UV-Spektrum verwendet wird, um die Bildung und den Zusammenbruch (Schmelzen) der Hybridisierung zu bestimmen. Das Basenstapeln, das während der Hybridisierung stattfindet, wird von einer Reduktion in der UV-Absorption (Hypochromizität) begleitet. Folglich zeigt eine Reduktion in der UV-Absorption eine höhere Tm an. Je höher die Tm, desto größer ist die Stärke der Bindung der Stränge. Nicht-Watson-Crick-Basenpaarung hat eine starke destabilisierende Auswirkung auf die Tm. Folglich ist eine absolute Genauigkeit der Basenpaarung nötig, um eine optimale Bindung eines Antisenseoligonukleotids an sein Ziel-RNA zu erreichen.
1. Endständige Konjugate
a. Synthese
Eine Serie von Oligonukleotiden wurden unter Verwendung von Standardsyntheseverfahren synthetisiert (für nichtfunktionalisierte Oligonukleotide) oder das Verfahren aus Beispiel 3(A) in der Anmeldung mit der Nummer 782,374, 1991, die ein Oligonukleotid haben, an dessen 5'-Ende ein Aminolinker sich befindet oder das Verfahren von Beispiel 3(B) in der Anmeldung mit der Nummer 782,374 für Oligonukleotide, die am 5'-Ende Cholinsäure tragen. Jedes der Oligonukleotide hatte die folgenden 5-LO-Antisensesequenz: 5' TCC AGG TGT CCG CAT C 3' (SEQ ID NO: 6). Die Nukleoti de wurden in einer 1,0 μmol Menge synthetisiert. Das Oligomer 32 war die Stammverbindung, die normale Phosphordiesterinternukleotid-Verknüpfungen aufweist. Das Oligomer 33 umfasst Phosphorthioatinternukleotid-Verknüpfungen in der Basisoligonukleotidsequenz. Das Oligomer 34 ist ein Zwischenoligonukleotid, das ein 5'-Aminolinker am 5'-Ende der Basisoligonukleotidsequenz aufweist und das Oligomer 35 war eine ähnliche 5'-Amino-verlinkte Verbindung, die Phosphorthioatinternukleotid-Verknüpfungen umfasst. Das Oligomer 36 ist ein 5'-endständiges Cholinsäure-Konjugat der Basisphosphodiesteroligonukleotidsequenz, während das Oligomer 37 eine ähnlichse 5'-Cholinsäure-Konjugat ist, das Phosphorthioatinternukleotid-Verknüpfungen aufweist. Die Oligomere 32 und 33 wurden in einem "Trityl-On"-Modus synthetisiert und über HPLC gereinigt. Die Oligomere 34 und 35 wurden wie im Beispiel 30 (A) in der Anmeldung mit der Nummer 782,374 mit oder ohne Beaucage-Reagensbehandlung synthetisiert, um Phosphodiester oder Phosphorthioatinternukleotid-Verknüpfungen zu ergeben. Die Oligomere 36 und 37 wurden von Proben der Oligomere 34 und 35 hergestellt, unter Verwendung einer Lösung von Cholinsäure N-Hydroxysuccinimidester (Verbindung 1) gelöst in DMF, gemäß dem Beispiel 3(B) in der Anmeldung mit der Nummer 782,374. Die Oligomere 36 und 37 wurden über HPLC gereinigt. Die Produkte wurden einer Sephadex-G-25-Säule konzentriert und entsalzt. Die Gelelektrophoreseanalyse bestätigte, dass ein reines Produkt vorlag, wobei sich das reine Konjugat langsamer als das Stammoligonukleotid oder das 5'-Amino-funktionalisierte Oligonukleotid bewegte.
b. Schmelzanalyse
Die Testoligonukleotide [entweder erfindungsgemäße Phosphordiester, Phosphorthioat, Cholinsäure-konjugierte Phosphordiester, mit Cholinsäure konjugierte Phosphorthioat oder 5'-Amino-verknüpfte intermediäre Phosphordiester oder Phosphorthioat Oligonukleotide oder andere] und entweder die komplementäre DNA- oder RNA-Oligonukleotide wurden bei einer Standardkonzentration von 4 μM für jedes Oligonukleotid in einem Puffer (100 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 0,1 mM EDTA) inkubiert. Die Proben wurden auf 90°C erhitzt und die Anfangsabsorption unter Verwendung eines Guilford Response II Spektrophotometers (Corning) aufgenommen. Die Proben wurden anschließend langsam auf 15°C abgekühlt und anschließend der Wechsel in der Adsorption bei 260 nm während des Hitzede naturierungsverfahrens verfolgt. Die Temperatur wurde immer um 1 Grad je Absorptionsaufnahme erhöht und das Denaturierungsprofil analysiert, indem die erste Ableitung der Schmelzkurve genommen wurde. Die Daten wurden ebenfalls unter Verwendung einer Zweizustands-linearen Regressionsanalyse analysiert, um die Tm's zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle 3 gezeigt, ebenso wie die HPLC-Retentionszeiten von einigen der Testverbindungen.
Tabelle 3 Schmelztemperatur des Hybridisierungskomplexes des Oligonukleotids und seines komplementären Stranges
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, beeinflussen die Konjugate von Cholinsäure am Ende des Oligonukleotids nicht die Tm der Oligonukleotide.
2. Stränge, die einen 2'-O-Pentylaminolinker umfassen
a. Synthese
Ein Oligonukleotid der Sequenz:
Oligomer 38 (SEQ ID NR: 7): GGA^* CCG GA^*A^* GGT A^*GG A^*G, wobei A^* ein Nukleotid darstellt, das so funktionalisiert ist, um eine Pentylamino-Funktionalität an seine 2'-Stelle zu inkorporieren, wurde in einem Mikromol-Maßstab unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1(B) hergestellt. Das Oligonukleotid wurde über Umkehrphasen-HPLC gereinigt, detriytliert und auf einer Sephadex G-25 entsalzt. PAGE-Gelanalyse zeigte eine einzige Bande. Ein weiteres Oligonukleotid, das Oligomer 39, das dieselbe Sequenz hat aber ohne einen 2'-O-Aminolinker wurde auf übliche Weise synthetisiert. Ein komplementäres DNA-Oligonukleotid der Sequenz: Oligomer 40 (SEQ ID NR: 8): CCT GGC CTT CCA TGC TC wurde ebenfalls auf übliche Weise synthetisiert und war ein komplementäres RNA-Oligonukleotid der Sequenz:
b. Schmelzanalyse
Die Schmelzanalyse wurde gemäß dem Verfahren der Prozedur B(1)(b) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4 Schmelztemperatur des Hybridisierungskomplexes des Oligonukleotids und seines komplementären Strangs
Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, beträgt gegenüber dem zu RNA komplementären Strang die Änderung in den Tm's zwischen dem Strang des 2'-Aminolinkers und dem unmodifizierten Strang 1,1 Grad (0,22 Änderung pro Modifikation). Gegen den DNA- Strang beträgt der Wechsel –6,1 Grad (–1,2 Änderung pro Modifikation). Verglichen mit dem unmodifizierten Stammoligonukleotid hat der Strang, der einen 2'-Aminolinker enthält, einen stabilisierenden Effekt auf die Hybridisierung mit RNA und einen destabilisierenden Effekt auf die Hybridisierung mit DNA.
Erfindungsgemäße Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit hin getestet, die zelluläre Aufnahme zu erhöhen. Dies wurde bestimmt, indem entweder ihre Fähigkeit, die Expression des bovinen Papilloma-Virus-1 (BPV-1) zu inhibieren oder ein Assay der die Luciferase-Herstellung beinhaltet (für HIV-1).
VERFAHREN C
Bestimmung der zellulären Aufnahme, beurteilt durch die Inhibierung der Expression des bovinen Papilloma-Virus-1 (BPV-1) gemessen über einen E2-Transaktivierungsassay
Für diesen Test wurde als Basissequenz ein Phosphorthioatoligonukleotidanalogon der Sequenz:
verwendet. Diese Sequenz ist dahingehend ausgestaltet, dass sie zur Translationsinitiierungsregion des E2-Gens des bovinen Papilloma-Virus Typ 1 (BPV 1) komplementär ist. Das Oligomer 42 diente als positive Kontrolle und als Standard für den Assay. Das Oligomer 3 (aus Beispiel 4 in der Anmeldung mit der Anmeldenummer 782,374) diente als zweite Testverbindung. Diese hatte die gleiche Basissequenz mit der Ausnahme, dass es ein Phosphorthioatoligonukleotid ist und weiter eine Cholinsäure-Einheit, die an das 3'-Ende des Oligonukleotids konjugiert ist, aufweist. Das Oligomer 2 (aus dem Beispiel 2 in der Anmeldung mit der Anmeldenummer 782,374) diente als dritte Testverbindung. Wieder weist dieses die gleiche Sequenz auf, es ist ein Phosphorthioatoligonukleotid und es hat eine Cholinsäure-Einheit, die an das 5'-Ende konjugiert ist. Das Oligomer 5 (aus dem Beispiel 5 in der Anmeldung mit der Anmeldenummer 782,374) diente als vierte Testverbindung. Erneut hat diese die gleiche Sequenz, ist ein Phosphorthioatoligonukleotid und es hat eine Cholinsäure- Einheit, die an sowohl das 3'-Ende und an das 5'-Ende konjugiert ist. Eine fünfte Testverbindung war ein Phosporthioatoligonukleotid mit keiner signifikanten Sequenzhomologie mit BPV-1. Eine sechste Testverbindung war weiterhin ein Phosphorthioatoligonukleotid mit keiner signifikanten Sequenzhomologie zu BPV-1. Die letzte Testverbindung, die siebte Testverbindung, war ein Phosphorthioatoligonukleotid mit Cholinsäure die an das 3'-Ende konjugiert ist, aber keine signifikante Sequenzhomologie zu BPV-1 aufweist. Die Verbindungen fünf, sechs und sieben dienten als negative Kontrollen für den Assay.
Für jeden Test wurden I-38 Zellen in 60 mm Petri-Schalen mit einer Konzentration von 5 × 10⁴ Zellen pro cm² ausgelegt. Acht Stunden nach dem Auslegen wurde das Medium abgezogen und durch ein Medium ersetzt, das das Testoligonukleotid enthielt und über Nacht inkubiert. Nach der Inkubation, wurde das Medium abgezogen und mit frischem Medium ohne Oligonukleotid besetzt und für eine Stunde inkubiert. Die Zellen wurden anschließend über die CaPO₄-Methode mit 2 μg pE2RE-1CAT transfiziert. Nach einer vierstündigen Inkubationsperiode wurden die Zellen mit Glycerin abgeschreckt (15% Glycerin) über 1 Minute gefolgt von zweimal Waschen mit PBS. Das Medium wurde durch DMEM ersetzt, das ein Oligonukleotid in der originalen Konzentration enthielt. Die Zellen wurden für 48 Stunden inkubiert und gesammelt. Die Zelllysate wurden auf Chloramphenicolacetyltransferase mittels Standardverfahren analysiert. Acetyliertes und nicht acetyliertes ¹⁴C-Chloramphenicol wurde über Dünnschichtchromatographie getrennt und über Flüssigszintilation quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in Prozent Acetylierung ausgedrückt.
Es wurde gefunden, dass zwei Chargen der positiven Kontrollverbindung bis zu einem Gehalt von 29% und 30% acetylierten. Es wurde gefunden, dass die negativen Kontrollen, die Testverbindungen fünf, sechs und sieben zu 59%, 58% und 47% acetylierten. Es wurde weiter gefunden, dass das 3'-Cholinsäure-Konjugat-Testverbindung, das Oligomer 3, zu 23% acetyliert, es wurde gefunden, dass die 5'-Cholinsäure-Konjugat-Testverbindung, das Oligomer 2, zu 36% acetyliert und die Testverbindung, die sowohl am 3'-Ende und am 5'-Ende konjugiert ist, das Oligomer 5, zu 27% acetyliert.
Die Ergebnisse dieser Tests lassen vermuten, dass das Platzieren einer Cholinsäure-Einheit am 3'-Ende eines Oligonukleotids dessen Aktivität erhöht. Dies wiederum lässt vermuten, dass die erhöhte Aktivität das Ergebnis eines erhöhten zellulären Membrantransports war.
VERFAHREN D
Bestimmung der zellulären Aufnahme, beurteilt über die Inhibierung von pHIVluc mit Cholinsäure-verknüpften 2'-O-Methyl-substituierten Oligonukleotiden
Für diesen Test diente die Abwesenheit eines Oligonukleotids in einer Testvertiefung als Kontrolle. Alle Oligonukleotide wurden als ihre 2'-O-Methylanaloga getestet. Für diesen Test wurde ein Oligonukleotid der Sequenz:
verwendet, wobei jedes der Nukleotide des Oligonukleotids eine 2'-O-Methyl-Substituentengruppe umfasst und als Basistestverbindung diente. Die zweite Testverbindung mit der Sequenz:
wobei CHA Cholinsäure darstellt und wobei jedes der Nukleotide des Oligonukleotids 2'-O-Methyl-Substituentengruppe umfasst, hatte ebenfalls die gleiche Sequenz wie die erste Testverbindung. Diese zweite Testverbindung umfasst Cholinsäure, die an ihr 5'-Ende konjugiert war und wurde gemäß der Methode des Beispiels 3 in der Anmeldung mit der Anmeldenummer 782,374 hergestellt unter Verwendung von 2'-O-Methylphosphoramidit-Zwischenprodukten, wie sie in Beispiel 1(C) identifiziert sind. Die dritte Testverbindung der Sequenz:
wobei CHA Cholinsäure darstellt und wobei jedes der Nukleotide des Oligonukleotids eine 2'-O-Methyl-Substituentengruppe umfasst, hatte ebenfalls die gleiche Sequenz wie die erste Testverbindung. Die dritte Testverbindung umfasste Cholinsäure, die an ihr 3'-Ende konjugiert war und wurde gemäß der Verfahren in Beispiel 4 in der Anmeldung mit der Anmeldenummer 782,374 hergestellt, unter Verwendung von 2'-O-Methylphosphoramidit-Zwischenprodukten, wie sie in Beispiel 1(C) identifiziert wurden. Die vierte Testverbindung war ein 2'-O-Me-Oligonukleotid einer zweiten Sequenz:
wobei jedes der Nukleotide des Oligonukleotids eine 2'-O-Methyl-Substituentengruppe umfasst. Die fünfte Testverbindung hatte die Sequenz:
wobei CHA Cholinsäure darstellt und wobei jedes der Nukleotide des Oligonukleotids eine 2'-O-Methyl-Substituentengruppe umfasst. Dieses hatte die gleiche Sequenz wie die fünfte Testverbindung. Diese Testverbindung umfasste Cholinsäure, die an ihr 5'-Ende konjugiert war und wurde gemäß dem Verfahren in Beispiel 3 in der Anmeldung mit der Anmeldenummer 782,374 hergestellt, unter Verwendung von 2'-O-Methylphosphoramidit-Zwischenprodukten wie sie in Beispiel 1(C) identifiziert wurden.
Eine sechste Testverbindung war ein Zufallsoligonukleotid der Sequenz:
HeLA-Zellen wurden mit einer Konzentration von 4 × 10⁵ Zellen in Kulturschälchen mit 6 Vertiefungen gezüchtet. Die Testoligonukleotide wurden zu den Dreifachvertiefungen mit einer Konzentration von 1 μM zugegeben und bei 37°C für 20 Stunden inkubiert. Das Medium und das Oligonukleotid wurden anschließend entfernt, die Zellen mit PBS gewaschen und die Zellen wurden CaPO₄ transfiziert. Kurz gesagt wurden 5 μg pHIVluc, ein Plasmid das Luciferase cDNA unter der Transkriptionskontrolle des HIV LTR exprimiert, wobei die letztere Ligation der KpnI/HindIII Restriktionsfragmente der Plasmide pT3/T7luc und pHIVpap (NAR 19(12)), die die Luciferase cDNA und HIV LTR enthielten, hergestellt wurden, und 6 μg von pcDEBtat, ein Plasmid das das HIV tat Protein unter der Kontrolle des SV40-Promotors exprimiert, zu 500 μl von 250 mM CaCl₂ zugegeben, anschließend wurden 500 μl von 2 × HBS gefolgt von heftigem Rühren zugegeben. Nach 30 Minuten wurde der CaPO₄-Niederschlag gleichmäßig zwischen den sechs Vertiefungen des Plättchens aufgeteilt, die anschließend für 4 Stunden inkubiert wurden. Die Medien und der Niederschlag wurden anschließend entfernt, die Zellen mit PBS gewaschen und frisches Oligonukleotid und Medien zugegeben. Inkubation wurde über Nacht fortgesetzt. Die Luciferase-Aktivität wurde für jede Vertiefung am nächsten Morgen bestimmt. Die Medien wurden entfernt, anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden auf dem Plättchen mit 200 μl LB (1% Trit X-100, 25 mM Glycylglycin, pH 7,8, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1 mM DTT) lysiert. Ein 75 μl Aliquot von jeder Vertiefung wurde anschließend in eine Vertiefung einer Miktrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zusammen mit 75 μl eines Assaypuffers (25 mM Glycylglycin, pH 7,8, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 15 mM KPO₄, 1 mM DTT, 2,5 mM ATP) gegeben. Das Plättchen wurde anschließend in einem Dynatec Multiwell Luminometer gelesen, das 75 μl von Luciferin-Puffer (25 mM Glycylglycin, pH 7,8, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 4 mM DTT, 1 mM Luciferin) in jede Vertiefung injizierte, unter sofortigen Lesen des emittierten Lichts (Lichteinheiten).
Die Verbindung mit der Zufallssequenz (Oligomer 48) und die anderen nicht Cholinsäure-konjugierten Testverbindungen (Oligomere 43 und 46) hatten eine vergleichbare Aktivität. Das 5'-Konjugat der ersten Sequenz (Oligomer 44) hatte ebenfalls eine Aktivität, die vergleichbar war mit derjenigen von nichtkonjugierten Verbindungen. Das 5'-Konjugat einer zweiten Sequenz (Oligomer 47) zeigte eine dreifache Zunahme der Aktivität vergleichen mit den nichtkonjugierten Verbindungen auf und das 3'-Konjugat der ersten Sequenz (Oligomer 45) zeigte eine weitere dreifache Zunahme an Aktivität verglichen mit dem Oligomer 47 auf.
Alle Testoligonukleotide, die eine Cholinsäure aufweisen, zeigten eine signifikante Inhibierung der Luciferase-Produktion verglichen mit Oligonukleotiden, die keine Cholinsäure trugen. Dies lässt vermuten, dass die erhöhte Aktivität das Resultat eines erhöhten zellulären Membrantransports der Oligonukleotide war, die Cholinsäure trugen.
BEISPIEL 3
Darstellung von 5'-O-[Dimethoxytrityl]-2'-O-[hexyl-(Ω-N-phthalimido)amino]uridin und 5'-O-[Dimethoxytrityl]-3'-O-[hexyl-(Ω-N-phthalimidoamino)uridin
2',3'-O-Dibutylstannylenuridin wurde gemäß dem Verfahren von Wagner et al., J. Org. Chem., 1974, 39, 24 synthetisiert. Diese Verbindung wurde über P₂O₅ unter Vakuum für 12 Stunden getrocknet. Zu einer Lösung dieser Verbindung (29 g, 42,1 mmol) in 200 ml an trockenem DMF wurde 6-Bromohexylphthalimid (16,8 g, 55 mmol) und 4,5 g Natriumjodid zugegeben und die Mischung wurde bei 130°C für 16 Stunden unter Argon erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde eingedampft, ein weiteres mal mit Toluol eingedampft und der gummiartige Teerrest wurde auf eine Silicasäule (500 g) gegeben. Die Kolonne wurde mit 2 l Ethylacetat (EtOAc) gewaschen, gefolgt von Elution mit 10% Methanol (MeOH): 90% EtOAc. Das Produkt, 2'- und 3'-Isomere von O-Hexyl-Ω-N-Phthalimidouridin wurde als untrennbare Mischung (R_f = 0,64 in 10 MeOH in EtOAc) eluiert. Mittels ¹³C NMR wurde das isomere Verhältnis zu ungefähr 55% des 2'-Isomers und zu ungefähr 45% des 3'-Isomers bestimmt. Die vereinte Ausbeute betrug 9,2 g (46,2%). Diese Mischung wurde unter Vakuum getrocknet und zweimal mit Pyridin wieder eingedampft. Sie wurde in 150 ml trockenem Pyridin aufgelöst und mit 7,5 g Dimethyocytritylchlorid (22,13 mmol) und 500 mg Dimethylaminopyridin (DMAP) behandelt. Nach 2 Stunden zeigte Dünnschichtchromatographie (TLC; 6 : 4 EtOAc : Hexan) das vollständige Verschwinden des Ausgangsmaterials und eine gute Trennung zwischen den 2'- und 3'-Isomeren (R_f = 0,29 für das 2'-Isomer und 0,12 für das 3'-Isomer). Die Reaktionsmischung wurde durch Zugabe von 5 ml CH₃OH gequenscht und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 300 ml CH₂Cl₂ aufgelöst, sukzessive mit gesättigter NaHCO₃ gefolgt von gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Er wurde über Mg₂SO₄ getrocknet und eingedampft, um 15 g eines braunen Schaums zu ergeben, der auf einem Silicagel (500 g) gereinigt wurde, um 6,5 g des 2'-Isomers und 3,5 g des 3'-Isomers zu ergeben.
BEISPIEL 4
Darstellung von 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-(Ω-N-phthalimido)amino]uridin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)-phosphoramidit
Das 5'-Dimethoxytrityl-2'-[O-hexyl-(Ω-N-phthalimidoamino]uridin (4 g, 5,2 mmol) wurde in 40 ml trockenem CH₂Cl₂ gelöst. Zu dieser Lösung wurde Diisopropylamintetrazolid (0,5 g, 2,9 mmol) zugegeben und über Nacht gerührt. TLC (1 : 1 EtOAc/Hexan) zeigte das vollständige Verschwinden des Ausgangsmaterials an. Die Reaktionsmischung wurde mit CH₂Cl₂ transferiert und mit gesättigter NaHCO₃ (100 ml) gewaschen, gefolgt von Waschen mit gesättigter NaCl-Lösung. Die organische Phase wurde über trockenem Na₂SO₄ getrocknet und eingedampft, um 6,4 eines Rohprodukts zu ergeben, welches über eine Silicasäule (200 g) unter Verwendung von 1 : 1 Hexan/EtOAc gereinigt wurde, um 4,6 g (4,7 mmol, 90%) des gewünschten Phosphoramidits zu ergeben.
BEISPIEL 5
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-3'-O-(hexyl-(Ω-N-phthalimidoamino]uridin-2'-O-succinyl-aminopropyl kontrollierte poröses Glas
Succinyliertes und gekapptes Aminopropyl-Glas mit kontrollierten Poren (CPG; 500 A Porendurchmesser, Aminopropyl CPG, 1,0 Gramm hergestellt gemäß Damha et al., Nucl. Acids Res. 1990, 18, 3813) wurde zu 12 ml trockenem Pyridin in einem 100 ml Rundkolben gegeben. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimid (DEC; 0,38 Gramm, 2,0 mmol), Triethylamin (TEA; 100 μl, destilliert über CaH₂), Dimethylaminopyridin (DMAP; 0,012 Gramm, 0,1 mmol) und das Nukleosid 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-O-[hexyl-(Ω-N-phthalimidoamino)]uridin (0,6 Gramm, 0,77 mmol) wurden unter Argon zugegeben und die Mischung mechanisch für 2 Stunden geschüttelt. Noch mehr Nukleosid (0,20 Gramm) wurde zugegeben und die Mischung für weitere 24 Stunden geschüttelt. Das CPG wurde abfiltriert und sukzessiv mit Dichlormethan, Triethylamin und Dichlormethan gewaschen. Das CPG wurde anschließend unter Vakuum getrocknet, in 10 ml Piperidin suspendiert und für 15 Minuten geschüttelt. Das CPG wurde abfiltriert, umfassend mit Dichlormethan gewaschen und wieder unter Vakuum getrocknet. Das Ausmaß der Beladung (bestimmt über einen spektrophotometrischen Assay des Dimethoxytritylkations in 0,3 M p-Toluolsulfonsäure bei 498 nm) betrug etwa ungefähr 28 μmol/g. Das 5'-O-(Dimethoxytrityl)-3'-O-[hexyl-(Ω-N-phthalimidoamino]uridin-2'-O-succinyl-aminopropyl Glas mit kontrollierten Poren wurde verwendet, um die Oligomere 5'-GACU'*-3' und 5'-GCC TTT CGC GAC CCA ACA CU*-3' (SEQ ID NR: 13) (wobei * das derivatisierte Nukleotid anzeigte) in einem ABI 380B DNA Syntheseapparat unter Verwendung von Standardbedingungen in der Phosphoramiditchemie. 45 und 200 O.D. des 4-mers und 20-mers wurden von zwei und drei 1 μmol Synthesen nach Reinigung über RP-HPLC und Entsalzen erhalten.
Das Oligomer 5'-GACU*-3' wurde verwendet, um die Struktur des 3'-O-Hexylamintethers über NMR zu bestätigen, der in das Oligonukleotid eingeführt wurde. Wie erwartet, wurde ein Multiplet-Signal zwischen 1,0–1,8 ppm im ¹H NMR beobachtet. Das Oligomer 5'-GCC TTT CGC GAC CCA ACA CU*-3' gehört zu einer HCV-Sequenz und es wurde verwendet, um die Nukleasewiderstandseigenschaften des 3'-O-Aminotethers (siehe Beispiele 39) zu zeigen.
BEISPIEL 6
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-(Ω-N-phthalimido)amino]uridin-3'-O-succinyl-aminopropyl Glas mit kontrollierten Poren
Das Verfahren aus Beispiel 5 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-(Ω-N-phthalimidoamindo)amino]uridin in dem Beladungsverfahren verwendet wurde.
BEISPIEL 7
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-(hexylamino]uridin
5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-(Ω-N-phthalimidoamino)]uridin (4,5 Gramm, 5,8 mmol) wurde in 200 ml Methanol in einem 500 ml Kolben gelöst. Hydrazin (1 ml, 31 mmol) wurde zur gerührten Reaktionsmischung zugegeben. Die Mischung wurde auf 60 bis 65°C in einem Ölbad erhitzt und für 14 Stunden am Rückfluss erhitzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgezogen. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (250 ml) aufgelöst und zweimal mit einem gleichen Volumen NH₄OH extrahiert. Die organische Phase wurde abgezogen, um 4,36 Gramm Rohprodukt zu ergeben und das NMR zeigte, dass das Produkt nicht vollständig rein war. R_f = 0 in 100% Ethylacetat. Das Produkt wurde in nachfolgenden Reaktionen ohne weitere Aufreinigung verwendet.
BEISPIEL 8
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-3'-O-[hexylamino]uridin
Das Verfahren aus Beispiel 7 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass 5'-O(Dimethoxytrityl)-3'-O-[hexyl-(Ω-N-phthalimidoamino)]uridin als Ausgangsmaterial verwendet wurde.
BEISPIEL 9
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-3'-O-[hexyl-N-(1-pyren-propyl-carbonyl)amino]uridin
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-(hexylamino)uridin (0,5 g, 0,78 mmol) wurden in trockenem DMF (15 ml) gelöst. 1-Hydroxybenzotriazol (0,16 Gramm, 1,17 mmol) und 1-Pyrenbuttersäurepentfluorophenylester (0,53 Gramm, 1,17 mmol) wurde zur Reaktionsmischung gegeben. Die Mischung wurde unter Argon bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt, wonach sie im Vakuum einkonzentriert wurde. Verbleibendes DMF wurde mit Toluol coevaporiert. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (50 ml) gelöst und mit einem gleichen Volumen an gesättigter NaHCO₃ gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Dichlormethan gewaschen und die vereinzelten organischen Extrakte mit einem gleichen Volumen gesättigter NaCl gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Dichlormethan gewaschen und die vereinten organischen Phasen über MgSO₄ getrocknet und einkonzentriert. Der Rückstand wurde auf einer Silicagelsäule chromatographiert unter Eluierung mit einem Gradienten von 50% Ethylacetat in Hexanen bis zu 100% Ethylacetat. Das gewünschte Produkt (0,83 Gramm, 58%) wurde mit 100% Ethylacetat eluiert (R_f 0,46 über Dünnschichtchromatographie (TLC)).
BEISPIEL 10
Darstellung von 5'-O-[Dimethoxytrityl]-2'-O-[hexyl-N-1-pyren-propyl-carbonyl)amino]uridin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
5'-O-[Dimethoxytrityl]-2'-O-[hexyl-N-(1-pyren-propyl-carbonyl)amino]uridin (0,80 Gramm, 0,87 mmol) wurden in 20 ml trockenem Dichlormethan gelöst. 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (erworben von Sigma Chemical Co.; 800 μl, 2,4 mmol) und Diisopropylamintetrazolid (0,090 Gramm, 0,52 mmol) wurden zu der Misch gegeben, die unter Argon für 20 Stunden gerührt wurde. Die Reaktionsmischung wurde anschließend im Vakuum einkonzentriert und der Rückstand in Dichlormethan (75 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit einem gleichen Volumen gesättigter NaHCO₃ gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Dichlormethan (20 ml) gewaschen und die vereinten organischen Phasen mit einem gleichen Volumen an gesättigter NaCl gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Dichlormethan (20 ml) gewaschen und die vereinten organischen Phasen über MgSO₄ getrocknet und einkonzentriert. Der Rückstand wurde auf einer Silicagelsäule chromatographiert unter Eluierung mit einem Gradienten von 50% Ethylacetat in Hexan bis zu 100% Ethylacetat. Das gewünschte Produkt (750 mg, 78% Ausbeute, R_f 0,54 über TLC in 100 Ethylacetat) wurde mit 100% Ethylacetat eluiert.
BEISPIEL 11
Darstellung von 2'-O-[Hexyl-N-(1-pyren-propyl-carbonyl)amino]uridin
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(1-pyren-propyl-carbonyl)amino]uridin (1,0 g) wurde in 20 ml CH₂Cl₂ gelöst und in einem Eisbad für 10 Minuten belassen. Zu der kalten Lösung wurden 5 ml 80% Essigsäure in Wasser zugegeben und die Lösung für 30 Minuten stehen gelassen. Diese wurde anschließend eingedampft und auf eine Silicasäule gegeben und mit 10% Methanol in Methylenchlorid eluiert, um 2'-O-[hexyl-N-(1-pyren-propyl-carbonyl)amino]uridin zu erhalten.
BEISPIEL 12
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-1-pyrenpropylcarbonyl)amino]uridin-3'-O-[succinylaminopropyl] Glas mit kontrollierten Poren
Succinyliertes/gekapptes Aminopropyl-Glas mit kontrollierten Poren wurde unter Vakuum für 3 Stunden direkt vor dem Einsatz getrocknet. Ein Teil (0,3 g) wurde in 3 ml trockene Pyridin in einen 50 ml Rundkolben gegeben. DEC (0,12 Gramm, 0,63 mmol), TEA (25 μl, destilliert über CaH₂), DMAP (0,005 Gramm, mmol) und 5'-O-(Dimethoxytrityl)-3'-O-[hexyl-N-(1-pyrenpropylcarbonyl)amino]uridin (0,21 Gramm, 0,22 mmol) wurden unter Argon zugegeben und die Mischung mechanisch für 19 Stunden geschüttelt. Noch mehr Nukleosid (0,025 Gramm) wurde zugegeben und die Mischung für weitere 5,5 Stunden geschüttelt. Pentachlorphenol (0,045 Gramm, mmol) wurde zugegeben und die Mischung 18 Stunden lang geschüttelt. Das CPG wurde abfiltriert und sukzessive mit Dichlormethan, Triethylamin und Dichlormethan gewaschen. Das so erhaltene CPG wurden anschließend unter Vakuum getrocknet, in 15 ml Piperidin suspendiert und für 30 Minuten geschüttelt. CPG wurde abfiltriert, umfassend mit Dichlormethan gewaschen und erneut unter Vakuum getrocknet. Das Ausmaß der Beladung (bestimmt über einen spektrophotometrischen Assay des Dimethoxytritylkations in 0,3 M p-Toluolsulfonsäure bei 498 nm) betrug ungefähr 27 μmol/g. Der feste Träger des Produkts wurde anschließend verwendet, um die Oligomere herzustellen.
BEISPIEL 13
Darstellung von 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-O-[hexyl-N-1-pyrenpropylcarbonyl)amino]-uridin-2'-O-(succinylaminopropyl) Glas mit kontrollierten Poren
Das Verfahren aus Beispiel 12 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-O-[hexyl-N-(1-pyrenpropylcarbonyl)amino]uridin verwendet wurde.
BEISPIEL 14
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(5-thiocarbonyl-3,6-dipivolyl-fluorescein)amino]uridin.
Fluoresceinisothiocyanat (Isomer I, erhältlich von Cal Biochem, La Jolla, CA) wurde mit 12 Äquivalenten von Pivaloylchlorid in Et₃N/THF behandelt, um di-O-Pivaloylfluoresceinisothiocyanat zu ergeben. Diese Verbindung wurde über eine Silicagelsäule gereinigt unter Verwendung von 3 : 1 Hexan : Ethylacetat. Das Nukleosid 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-(hexylamino)uridin wurde anschließend mit Dipivolylfluoresceinisothiocyanat in CH₂Cl₂/Pyrimidin kondensiert. Die entstehende Verbindung 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(5-thiocarbonyl-3,6-Dipivolyl-fluorescein)amino]uridin wird anschließend unter Verwendung von 100% Ethylacetat in einer Silicasäule gereinigt.
BEISPIEL 15
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(5-thiocarbonyl-3,6-dipivaloylfluorescein)amino]uridin-3'-O-(2-cyanoethyl-N-N-diisopropyl)phosphoramidit.
5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(5-thiocarbonyl-3,6-dipivalolylfluorescein)amino]uridin (0,75 Gramm, 0,672 mmol) wurden in trockenem Dichlormethan (20 ml) gelöst. 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidat (700 μl, 2,2 mmol) und Diisopropylamintetrazolid wurden zur Mischung zugegeben, die anschließend unter Argon für 16 Stunden gerührt wurde. Die Reaktionsmischung wurde anschließend im Vakuum einkonzentriert und sein Rückstand in Dichlormethan (75 ml) gelöst, gefolgt vom Waschen mit einem gleichen Volumen gesättigter NaHCO₃. Die wässrige Phase wurde mit Dichlormethan gewaschen (50 ml) und die kombinierten organischen Phasen mit einem gleichen Volumen gesättigter NaCl gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Dichlormethan (50 ml) gewaschen und die vereinigten organischen Phasen über MgSO₄ getrocknet und einkonzentriert. Der Rückstand wurde über eine Silicagelsäule chromatographiert unter Eluieren mit einem Gradienten von 25% Ethylacetat in Hexanen bis zu 100% Ethylacetat. Das gewünschte Produkt (670 mg, 77% Ausbeute, R_f 0,79 über TLC) wurde mit 100 Ethylacetat eluiert.
BEISPIEL 16
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(5-thiocarbonyl-3,6-dipivaloylfluorescein)amino]uridin-3'-O-(succinylaminopropyl) Glas mit kontrollierten Poren.
Succinyliertes und gekapptes Aminopropyl- Glas mit kontrollierten Poren (CPG) wurde unter Vakuum für 3 Stunden direkt vor Gebrauch getrocknet. CPG (0,3 Gramm) wird zu 3 ml trockenem Pyridin in einem 50 ml Rundkolben zugegeben. DEC (0,12 Gramm, 0,63 mmol), TEA (25 μl, destilliert über CaH₂, DMAP (Dimethylaminopyridin) (0,005 Gramm, 0,04 mmol) und 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(5-thiocarbonyl-3,6-di-pivaloylfluorescein)amino]uridin (0,21 Gramm, 0,19 mmol) wurden unter Argon zugegeben und die Mischung mechanisch für 19 Stunden geschüttelt. Noch mehr Nukleosid (0,025 Gramm) wird zugegeben und die Mischung für weitere 5,5 Stunden geschüttelt. Pentachlorphenol (0,045 Gramm, 0,17 mmol) wird zugegeben, und die Mischung für 18 Stunden geschüttelt. CP wird abfiltriert und sukzessiv mit Dichlormethan, Triethylamin und Dichlormethan gewaschen. Das CPG wird anschließend unter Vakuum getrocknet, in 15 ml Piperidin suspendiert und 30 Minuten geschüttelt. Das CPG wird abfiltriert, umfassend mit Dichlormethan gewaschen und weiter unter Vakuum getrocknet. Das Ausmaß der Beladung wird anschließend über einen spektrophotometrischen Assay des Dimethoxytritylkations in 0,3 M p-Toluolsulfonsäure bei 498 nm bestimmt.
BEISPIEL 17
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(3-oxycarbonylcholesteryl)amino]uridin.
Das Nukleosid 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexylamino]uridin (3,85 g, 6,0 mmol) wurde in trockenem Pyridin/Dichlormethan 50/50 (v/v) (20 ml) gelöst. Cholesterylchloroformat (Fluka, 3,0 g, 6,68 mmol) wurden in trockenem Dichlormethan (20 ml) gelöst und langsam unter Argon mit einer Spritze zur gerührten Reaktionsmischung zugegeben. Die Mischung wurde unter Argon bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt und anschließend im Vakuum einkonzentriert. DMF-Rückstände wurden mit Toluol coevaporiert. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (50 ml) gelöst und mit einem gleichen Volumen gesättiger NaHCO₃ gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Dichlormethan gewaschen und die vereinigten organischen Phasen mit einem gleichen Volumen an gesättigter NaCl gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Dichlormethan gewaschen und die vereinten organischen Phasen über MgSO₄ getrocknet und einkonzentriert. Der Rückstand wurde über eine Silicagelsäulre mit einem Gradienten von 25% Ethylacetat in Hexan bis 100% Ethylacetat chromatographiert. Das gewünschte Produkt (3,78 g, 60%) wurde mit 100% Ethylacetat eluiert (R_f 0,41 über TLC).
BEISPIEL 18
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(3-oxycarbonylcholesteryl)amino]uridin-3'-O-[2-cyanoethyl-N-N-diisopropyl]phosphoramidit
Das Nukleosid 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(3-oxycarbonyl-cholesteryl)amino]-uridin (3,44 g, 3,3 mmol) wurde in trockenem Dichlormethan (75 ml) gelöst. 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (Sigma, 2,1 ml, 6,6 mmol) und Diisopropylamintetrazolid (0,29 g, 1,7 mmol) wurden zur Mischung zugegeben, die unter Argon für 16 Stunden gerührt wurde. Dichlormethan (75 ml) wurde zur Lösung gegeben, die mit einem gleichen Volumen gesättigter NaHCO₃ gewaschen wurde.
Die wässrige Phase wurde mit dem gleichen Volumen Dichlormethan gewaschen. Die wässrigen Phasen wurden mit Dichlormethan (30 ml) gewaschen und die vereinten organischen Phasen mit einem gleichen Volumen gesättigter NaCl gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Dichlormethan (30 ml) gewaschen und die vereinten organischen Phasen über Mg₂SO₄ getrocknet und in Vakuum einkonzentriert. Der Rückstand wurde über eine Silicagelsäule mit einem Gradienten von 25% Ethylacetat in Hexan bis 70% Ethylacetat chromatographiert. Das gewünschte Produkt (3,35 g, 82% Ausbeute, R_f = 0,71 über TLC in 50% Ethylacetat in Hexanen) wurde mit 50 Ethylacetat eluiert.
BEISPIEL 19
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(3-oxycarbonylcholesteryl)amino]uridin-3'-O-(succinylaminopropyl)-kontrolliertes poröses Glas.
Succinyliertes und gekapptes Glas mit kontrollierten Poren (0,3 Gramm) wird zu 2,5 ml trockenem Pyridin in einen 15 ml birnenförmigen Kolben gegeben. DEC (0,07 Gramm, 0,36 mmol), TEA (100 ml, destilliert über CaH₂), DMAP (0,002 Gramm, 0,016 mmol) und 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(3-oxycarbonyl-cholesteryl)amino]uridin (0,25 Gramm, 0,23 mmol) werden unter Argon zugegeben und die Mischung mechanisch für 16 Stunden geschüttelt. Noch mehr Nukleosid (0,20 Gramm) wird zugegeben und die Mischung für weitere 18 Stunden geschüttelt. Pentachlorphenol (0,03 Gramm, 0,11 mmol) wird zugegeben und die Mischung 9 Stunden lang geschüttelt. CPG wird abfiltriert und sukzessive mit Dichlormethan, Triethylamin und Dichlormethan gewaschen. CPG wird anschließend unter Vakuum getrocknet, in 10 ml Piperidin suspendiert und 15 Minuten geschüttelt. CPG wird abfiltriert, umfassend mit Dichlormethan gewaschen und wieder unter Vakuum getrocknet. Das Ausmaß der Beladung wird anschließend über einen spektrophotometrischen Assay des Dimethoxytritylkations in 0,3 M p-Toluolsulfonsäure bei 498 nm mit ungefähr 39 μmol/g bestimmt.
BEISPIEL 20
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(2,4-dinitrophenyl)amino]ridin.
5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-(hexylamino)uridin (0,88 Gramm, 1,37 mmol) wurden in Methanol (20 ml) gelöst. 2,4-Dinitrofluorobenzol (DNFB, 0,25 Gramm, 1,37 mmol) wurden zugegeben und die Mischung auf einem mechanischen Rüttler geschüttelt. Die Reaktion wurde über TLC verfolgt. Nach 90 Minuten wurden weitere 0,25 Gramm DNFB zugegeben und die Reaktionsmischung für weitere 30 Minuten geschüttelt, gefolgt von Zugabe von weiteren 0,25 Gramm von DNFB. Nach 2,5 Stunden Schütteln wurde die Mischung im Vakuum einkonzentriert und auf einer Silicagelsäule chromatographiert unter Elution mit einem Gradienten von 25% Ethylacetat in Hexanen bis zu 100% Ethylacetat. Das gewünschte Produkt (0,51 Gramm, 46%) wurde mit 100% Ethylacetat eluiert (R_f 0,85 über TLC).
BEISPIEL 21
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(2,4-dinitrophenyl)amino]uridin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit.
5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(2,4-dinitrophenyl)amino]uridin (0,45 Gramm, 0,55 mmol) wurde in trockenem Dichlormethan (12 ml) gelöst. 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylposphordiamidit (380 μl, 1,2 mmol) und Diisopropylamintetrazolid (0,041 Gramm, 0,024 mmol) wurden zur Mischung zugegeben, die unter Argon für 16 Stunden gerührt wurde. Die Reaktionsmischung wurde anschließend im Vakuum einkonzentriert und der Rückstand in Dichlormethan gelöst (75 ml) gefolgt von Waschen mit einem gleichen Volumen an gesättigter NaHCO₃. Die wässrigen Phasen wurden mit Dichlormethan (25 ml) gewaschen und die vereinten organischen Phasen wurden mit einem gleichen Volumen von gesättigter NaCl gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Dichlormethan (25 ml) gewaschen und die vereinten organischen Phasen über MgSO₄ getrocknet und einkonzentriert. Der Rückstand wurde auf einer Silicagelsäule chromatographiert, unter Eluieren mit einem Gradienten von 20% Ethylacetat in Hexan um 100% Ethylacetat zu ergeben. Das gewünschte Produkt (510 mg Schaum, 93% Ausbeute, R_f 0,70 über TLC) wurde mit 100% Ethylacetat eluiert. ³¹PNMR (CDCl₃): 150,66 und 150,82 ppm.
BEISPIEL 22
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(2,4-dinitrophenyl)amino]ridin-3'-O-(succinylaminopropyl)-Glas mit kontrollierten Poren.
Succinyliertes und gekapptes Glas mit kontrollierten Poren (0,3 Gramm) wird zu 3 ml trockenem Pyridin in einen 50 ml Rundkolben gegeben. DEC (0,12 Gramm, mmol), TEA (25 μl, destilliert über CaH₂), DMAP (0,005 Gramm, 0,041 mmol) und 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(2,4-dinitrophenyl)amino]uridin (0,21 Gramm, 0,26 mmol) werden unter Argon zugegeben und die Mischung mechanisch für 19 Stunden geschüttelt. Noch mehr Nukleosid (0,025 Gramm) wird zugegeben und die Mischung für weitere 5,5 Stunden geschüttelt. Pentachlorphenol (0,045 Gramm, 0,16 mmol) wird zugegeben und die Mischung für 18 Stunden geschüttelt. CPG wird abfiltriert und sukzessive mit Dichlormethan, Triethylamin und Dichlormethan gewaschen. CPG wird anschließend unter Vakuum getrocknet, in 15 ml Piperidin suspendiert und für 15 Minuten geschüttelt. CPG wird abfiltriert, umfassend mit Dichlormethan gewaschen und wieder unter Vakuum getrocknet. Das Ausmaß der Beladung wird über einen spektrophotometrischen Assay des Dimethoxytritylkations in 0,03 M p-Toluolsulfonsäure bei 498 nm gemessen und betrug ungefähr 29 μmol/gm.
BEISPIEL 23
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(Nα-Nimid-Di-FMOC-L-histidyl)amino]uridin.
Das Nukleosid 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-(hexylamino)uridin (0,97 g, 1,51 mmol) wurde in Dichlormethan (25 ml) gelöst und auf 0°C in einem Eisbad gekühlt. Nα,Nimid-Di-FMOC-L-Histinpentafluorophenylester (2,4 g, 3,1 mmol, erworben von Sigma) und 1-Hydroxybenzotriazol (0,32 g, 0,24 mmol, erworben von Fluka) wurden zur gerührten Reaktionsmischung, die unter Argon gerührt wurde, zugegeben. Nach 15 Minuten wurde das Eisbad entfernt und die Mischung unter Argon bei Raumtemperatur für 72 Stunden gerührt. Die Mischung wurde im Vakuum einkonzentriert und über eine Silicagelsäule chromatographiert unter Eluieren mit einem Gradienten von 50% Ethylacetat in Hexan bis zu 70% Ethylacetat in Hexan. Das gewünschte Produkt (0,53 g, 28%) wurde mit 70% Ethylacetat eluiert (R_f 0,53 über TLC in 100% Ethylacetat).
BEISPIEL 24
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(Nα-Nimid-Di-FMOC-L-histidyl)amino]uridin-3'-O-[2-cyanoethyl-N,N-diiospropyl]phosphoramidit.
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(Nα-Nimid-Di-FMOC-L-histidyl)amino]uridin (1,9 g, 1,6 mmol) wird in trockenem Dichlormethan (20 ml) gelöst. 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (800 μl, 2,4 mmol) und Diisopropylamintetrazolid (0,090 Gramm, 0,52 mmol) wurden zur Mischung zugegeben, die unter Argon für 20 Stunden gerührt wurde. Die Reaktionsmischung wird anschließend im Vakuum aufkonzentriert und der Rückstand in Dichlormethan gelöst (75 ml). Die Lösung wird mit einem gleichen Volumen gesättiger NaHCO₃ gewaschen. Die wässrige Phase wird mit Dichlormethan gewaschen (20 ml) und die vereinten organischen Phasen mit einem gleichen Volumen gesättigter NaCl gewaschen. Die wässrige Phase wird mit Dichlormethan (20 ml) gewaschen und die vereinten organischen Phasen über MgSO₄ getrocknet und einkonzentriert. Der Rückstand wird über eine Silicagelsäule chromatographiert, unter Eluieren mit einem Gradienten von 50% Ethylacetat in Hexanen in bis zu 100% Ethylacetat. Das gewünschte Produkt eluiert mit 100% Ethylacetat.
BEISPIEL 25
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(Nα-Nimid-Di-FMOC-L-histidyl)amino]uridin-3'-O-[succinylaminopropyl]-Glas mit kontrollierten Poren.
Succinyliertes und gekapptes Glas mit kontrollieret Poren (getrocknet unter Vakuum für 3 Stunden direkt bevor Verwendung; 0,3 Gramm) wird zu 3 ml trockenem Pyridin in einen 50 ml Rundkolben zugegeben. DEC (0,12 Gramm, 0,63 mmol), TEA (25 μl, destilliert über CaH₂), DMAP (0,005 Gramm, 0,04 mmol) und 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N(Nα-Nimid-Di-FMOC)-L-histidyl)amino]uridin (0,21 Gramm, 0,17 mmol) werden unter Argon zugegeben und die Mischung mechanisch für 19 Stunden geschüttelt. Noch mehr Nukleosid (0,025 Gramm) wird zugegeben und die Mischung für weitere 5,5 Stunden geschüttelt. Pentachlorphenol (0,045 Gramm, 0,17 mmol) wird zugegeben und die Mischung 18 Stunden lang geschüttelt. CPG wird abfiltriert und sukzessive mit Dichlormethan, Triethylamin und Dichlormethan gewaschen.
CPG wird anschließend unter Vakuum getrocknet, in 15 ml Piperidin suspendiert und 15 Minuten geschüttelt. CPG wird abfiltriert, umfassend mit Dichlormethan gewaschen und erneut unter Vakuum getrocknet. Das Ausmaß der Beladung wird über einen spektrophotometrischen Assay des Dimethoxytritylkations in 0,3 M p-Toluolsulfonsäure bei 498 nm bestimmt und betrug ungefähr 27 μmol/g.
BEISPIEL 26
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(Ω-methylpolyethylenglykol-propionoyl)amino]uridin.
Das Nukleosid 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexylamino]uridin (1 g, 1,55 mmol) wird in trockenem DMF (15 ml) gelöst. 1-Hydroxybenzotriazol (0,24 g, 1,75 mmol) und Polyethylengylkolpropionsäure-NHS-ester (1,23 g, 1,75 mmol) werden zu der Reaktionsmischung zugegeben. Die Mischung wird unter Argon bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt, nachdem sie im Vakuum eingekonzentriert wird. Verbleibendes DMF wird mit Toluol coevaporiert. Der Rückstand wird in Dichlormethan (50 ml) gelöst und anschließend mit einem gleichen Volumen gesättiger NaHCO₃ gewaschen. Die wässrige Phase wird mit Dichlormethan gewaschen und die vereinten organischen Extrakte mit einem gleichen Volumen gesättigter NaCl gewaschen. Die wässrige Phase wird mit Dichlormethan gewaschen und die vereinten organischen Phasen über MgSO₄ getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wird über eine Silicagelsäule chromatographiert unter Eluieren mit einem Gradienten von 50% Ethylacetat in Hexanen bis zu 100% Ethylacetat. Das gewünschte Produkt (1,08 g, 58%) wurde mit 100% Ethylacetat eluiert.
BEISPIEL 27
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(Ω-methylpolyethylenglykol-propionoyl)amino]uridin-3'-O-(2-cyanoethoxy-N,N-diisopropyl)phosphoramidit.
5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(Ω-methylpolyethylenglykol-propionyl)amino]uridin (1,04 Gramm, 0,87 mmol) wird in trockenem Dichlormethan (20 ml) gelöst. 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (800 μl, 2,4 mmol) und Diisopropylamintetrazolid (0,090 Gramm, 0,52 mmol) werden zur Mischung zugegeben, die unter Argon für 20 Stunden gerührt wird. Die Reaktionsmischung wird anschließend in Vakuum einkonzentriert und der Rückstand in Dichlormethan (75 ml) gelöst. Die Lösung wird mit einem gleichen Volumen gesättigter NaHCO₃ gewaschen. Die wässrige Phase wird mit Dichlormethan (20 ml) gewaschen und die vereinigten organischen Phasen mit einem gleichen Volumen gesättigter NaCl gewaschen. Die wässrige Phase wird mit Dichlormethan (20 ml) gewaschen und die vereinten organischen Phasen über MgSO₄ getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wird über eine Silicagelsäule chromatographiert unter Eluieren mit einem Gradienten von 50% Ethylacetat in Hexanen bis zu 100% Ethylacetat. Das gewünschte Produkt eluiert mit 100% Ethylacetat.
BEISPIEL 28
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(Ω-methylpolyethylenglykol-propionoyl)amino]uridin-3'-O-(succinylaminopropyl)-Glas mit kontrollieretn Poren.
Succinyliertes und gekapptes Glas mit kontrollierten Poren (CPG) wird unter Vakuum für 3 Stunden direkt vor Einsatz getrocknet. Das Glas mit kontrollierten Poren (0,3 Gramm) wird zu 3 ml an trockenem Pyridin in einen 50 ml Rundkolben zugegeben. DEC (0,13 Gramm, 0,67 mmol), TEA (25 μl, destilliert über CaH₂), DMAP (0,005 Gramm, mmol) und 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(Ω-methylpolyethylenglykolpropionoyl)amino]uridin (0,21 Gramm, 0,175 mmol) werden unter Argon zugegeben und die Mischung mechanisch für 19 Stunden geschüttelt. Weiteres Nukleosid (0,025 Gramm) wird zugegeben und die Mischung für weitere 5,5 Stunden geschüttelt. Pentachlorphenol (0,045 Gramm, 0,17 mmol) wird zugegeben und die Mischung für 18 Stunden geschüttelt. CPG wird abfiltriert und sukzessive mit Dichlormethan, Triethylamin und Dichlormethan gewaschen. CPG wird unter Vakuum getrocknet, in 15 ml Piperidin suspendiert und für 15 Minuten geschüttelt. CPG wird abfiltriert, umfassend mit Dichlormethan gewaschen und erneut unter Vakuum getrocknet. Das Ausmaß der Beladung wird über einen spektrophotometrischen Assay von Dimethoxytritylkation in 0,3 M p-Toluolsulfonsäure bei 498 nm zu ungefähr 18 μmol/g bestimmt.
BEISPIEL 29
Darstellung von mit einem Makrozyklus derivatisiertem Nukleosid
5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-(hexylamin)uridin wird gemäß dem Verfahren im Beispiel 3 mit dem Makrozyklus 4-{1,4,8,11-tetraza-[tri-(Trifluoroacetyl)cyclotetradec-1-yl]}methylbenzoesäure-N-hydroxysuccinimidester (hergestellt gemäß Simon Jones, et al., Bioconjugate Chem. 1991, 2, 416) behandelt, um das Produkt zu ergeben.
BEISPIEL 30
Darstellung eines mit einem Makrozyklus derivatisiertem Uridinphosphoramidit
Das Nukleosidprodukt von Beispiel 29 wird gemäß dem Verfahren in Beispiel 4 behandelt, um das Produkt zu ergeben.
BEISPIEL 31
Darstellung von CPG das mit einem Makrozyklus derivatisiertem Nukleosid derivatisiert wird
Das Nukleosidprodukt in Beispiel 29 wird gemäß dem Verfahren aus Beispiel 5 behandelt, um das Produkt zu ergeben.
BEISPIEL 32
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-(hexyl-N-(folat)amino)uridin
5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-(hexylamin)uridin wird gemäß dem Verfahren in Beispiel 3 mit Folsäurepentafluorphenylester (geschützt mit einer Isobutyryl-Schutzgruppe) behandelt, um das Produkt zu ergeben.
BEISPIEL 33
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(folat)amino]uridin-3'-O-(2-cyanoethoxy-N,N-diisopropyl)phosphoramidit.
Das Nukleosidprodukt von Beispiel 29 wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 behandelt, um das Produkt zu ergeben.
BEISPIEL 34
Darstellung von CPG, das mit 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-(hexyl-N-(folat)amino)uridin-Nukleosid derivatisiert ist
Das Nukleosidprodukt von Beispiel 32 wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 behandelt, um das Produkt zu ergeben.
BEISPIEL 35
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-{hexyl-N-[2-methoxy-6-chloro-9(Ω-amino-capropyl)acridin)amino}uridin.
6,9-Dichloro-2-methoxyacridin (Aldrich, 10 g, 36 mmol) und Phenol (2,5 g) werden zusammen in einen Rundkolben mit einem Rührstäbchen gegeben und dazu 6-Amino-Hexanonsäure (9,3 g, 71 mmol) und der Kolben wurde auf 100°C (Ölbad) für 2 Stunden erhitzt. TLC (10% Methanol in Methylenchlorid) zeigte das vollständige Verschwinden des Ausgangsmaterials. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und in 200 ml Methanol geschüttet. Das Produkt isolierte sich als gelber Feststoff (ungefähr 10 g) aus. Diese Verbindung wurde anschließend in seinen Pentafluorphenylesterumgewandelt.
5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-(hexylamino)uridin (0,5 g, 0,78 mmol) wird in trockenem DMF (15 ml) gelöst. 1-Hydroxybenzotriazol (0,16 Gramm, 1,17 mmol) und 2-Methoxy-6-chloro-9-(Ω-cyproyl-amino)acridinpentafluorphenylester 80,53 Gramm 1,17 mmol) werden zur Reaktionsmischung zugegeben. Die Mischung wird unter Argon bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt, anschließend wird sie in Vakuum einkonzentriert. Verbleibendes DMF wird mit Toluol coevaporisiert. Der Rückstand wird in Dichlormethan gelöst (50 ml) und mit einem gleichen Volumen gesättigter NaHCO₃ gewaschen. Die wässrige Phase wird mit Dichlormethan gewaschen und die vereinten organischen Extrakte mit einem gleichen Volumen gesättigter NaCl gewaschen. Die wässrige Phase wird mit Dichlormethan gewaschen und die vereinten organischen Phasen über MgSO₄ getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wird auf einer Silicalgelsäule chromatographiert und durch Eluieren mit einem Gradienten von 50% Ethylacetat in Hexan bis zu 100% Ethylacetat. Das gewünschte Produkt eluiert mit 100% Ethylacetat.
BEISPIEL 36
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-{hexyl-N-[2-methoxy-6-chloro-9-(Ω-amino-caproyl)acridin]amino}uridin-3'-O-(2-cyanoethoxy-N,N-diisopropyl)phosphoramidit.
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O{hexyl-N-[2-methoxy-6-chloro-9-(Ω-amino-caproyl)acridin]amino}uridin (0,80 Gramm, 0,77 mmol) wird in trockenem Dichlormethan gelöst (20 ml). 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (800 μl, 2,4 mmol) und Diisopropylamintetrazolid (0,090 Gramm, 0,52 mmol) werden zu der Mischung zugegeben, die unter Argon für 20 Stunden gerührt wird. Die Reaktionsmischung wird anschließend in Vakuum einkonzentriert und der Rückstand in Dichlormethan gelöst (75 ml). Die Lösung wird mit einem gleichen Volumen gesättigter NaHCO₃ gewaschen. Die wässrige Phase wird mit Dichlormethan gewaschen (20 ml) und die vereinten organischen Phasen mit einem gleichen Volumen gesättigter NaCl gewaschen. Die wässrige Phase wird in Dichlormethan gewaschen (20 ml) und die vereinten organischen Phasen über MgSO₄ getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wird auf einer Silicagelsäule chromatographiert unter Eluieren mit einem Gradienten von 50% Ethylacetat in Hexanen bis zu 92% Ethylacetat. Das gewünschte Produkt eluiert mit 100% Ethylacetat.
BEISPIEL 37
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-{hexyl-N-[2-methoxy-6-chloro-9-(Ω-amino-caproyl)acridin]amino}uridin-3'-O-(succinylaminopropyl)-Glas mit kontrollierten Poren.
Succinyliertes und gekapptes Glas mit kontrollierten Poren (0,3 Gramm) wird zu 3 ml trockenem Pyridin in einen 50 ml Rundkolben gegeben. DEC (0,12 Gramm, 0,67 mmol), TEA (25 μl, destilliert über CaH₂), DMAP (0,005 Gramm, 0,04 mmol) und 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-{hexyl-N-[2-methoxy-6-chloro-9-(Ω-amino-caproyl)acridin]amino}uridin (0,21 Gramm, 0,17 mmol) werden unter Argon zugegeben und die Mischung mechanisch für 19 Stunden geschüttelt. Weiteres Nukleosid (0,025 Gramm) wird zugegeben und die Mischung für weitere 5,5 Stunden geschüttelt. Pentachlorphenol (0,045 Gramm, 0,17 mmol) wird zugegeben und die Mischung für 18 Stun den geschüttelt. CPG wird abfiltriert und sukzessive mit Dichlormethan, Triethylamin und Dichlormethan gewaschen. CPG wird anschließend in Vakuum getrocknet, in 15 ml Piperidin suspendiert und für 15 Minuten geschüttelt. CPG wird abfiltriert, umfassend mit Dichlormethan gewaschen und erneut unter Vakuum getrocknet. Das Ausmaß der Beladung wird über einen spektrophotometrischen Assay des Dimethoxytritylkations in 0,3 M p-Toluolsulfonsäure bei 498 nm zu ungefähr 27 μmol/g bestimmt.
BEISPIEL 38
Darstellung von 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[(hexyl-N,N-dimethyl)amino]uridin.
5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-(hexylamino)uridin (0,19 Gramm, 0,29 mmol) wird in 4 ml Methanol gelöst. Natriumacetat, pH 4,0 (2 ml), Natriumcyanoborhydrid (0,02 Gramm, 0,3 mmol) und 37% Formaldehyd in Wasser (300 μl) werden zur Reaktionsmischung zugegeben, die 2 Stunden gerührt wird, und anschließend im Vakuum einkonzentriert wird. Der Rückstand wird in Dichlormethan (50 ml) gelöst und mit einem gleichen Volumen gesättigter NaHCO₃ gewaschen. Die wässrige Phase wird mit Dichlormethan gewaschen und die vereinten organischen Extrakte mit einem gleichen Volumen gesättigter NaCl gewaschen. Die wässrige Phase wird mit Dichlormethan gewaschen und die vereinten organischen Phasen über MgSO₄ getrocknet und einkonzentriert. Der Rückstand wird über eine Silicagelsäule chromatographiert unter Elution mit einem Gradienten von 50% Ethylacetat in Hexanen bis 100% Ethylacetat. Das gewünschte Produkt (0,15 Gramm, 80%) eluiert mit 10% Methanol – 90 Ethylacetat.
BEISPIEL 39
Oligonukleotide, die eine 3'-Alkylaminogruppe aufweisen
3'-O-Hexyl-(N-phthalimido)-aminouridin-CPG, d. h. die 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-O-[hexyl-(Ω-N-phthalimidoamino)]uridin-2'-O-(succinylaminopropyl) kontrolliertes poröses Glas aus Beispiel 5 wurde verwendet zur Synthese der folgenden Oligonukleotide:

wobei "*" das 3'-O-Hexylamino-modifizierte Nukleosid bedeutet. Übliche kommerzielle Phosphoramidite wurden im Synthesezyklus gemäß den Spezifikationen des Herstellers in einem 380B ABI Instrument verwendet (Applied Biosystems).
Das Oligomer 49 wird zum strukturellen Nachweis eines Oligonukleotids das eine 3'-O-Alkylamin-Gruppe am 3'-Ende trägt, verwendet. Es zeigte die erwarteten drei ³¹P NMR Signale (–0,5 ppm, –0,25 ppm, –0,2 ppm) und sieben Linien in der Region mit den aromatischen Spuren in seinem ¹H NMR Spektrum.
Das Oligomer 51 wurde verwendet, um zu zeigen, dass die Widerstandsfähigkeit gegenüber Nukleasen durch diese Alkylamino-Gruppe verliehen wird und ebenso gegenüber weiterer Konjugation. Das Oligomer wurde mit Pyrenbuttersäure-N-Hydroxysuccinimidester in 0,2 M NaHCO₃ Puffer/DMF behandelt. Das Produkt, das Konjugat 1, wurde über HPLC und Größenauschlussverfahren gereinigt. Die HPLC-Retentionszeiten (Eluieren mit einem Gradienten von 5% CH₃CN für 10 Minuten, anschließend 5%–40% CH₃CN für 50 Minuten) waren wie folgt:

Retentionszeit (min.)

Oligomer 50 25,99

Oligomer 51 25,91

Konjugat 1 49,35
Die Nukleasestabilität des Oligomers 51 und des Konjugats wurden gegen das Oligomer 50 in HeLa cytoplasmischen/Kernextrakten getestet. Der Zellextrakt wurde 1,4-fach verdünnt. Die Endkonzentration des Oligonukleotids betrug 20 μM. Die Halbwertszeiten der Oligonukleotide waren wie folgt:

t_1/2 (Stunden)

Oligomer 50 1,0

Oligomer 51 3,5

Konjugat 1 3,6
Die Halbwertszeit von Phosphodiester Oligomer 50 nahm 3- bis 4-mal zu durch die einfache Modifikation am 3'-Ende mit der Hexylamino-Gruppe oder durch weitere Konjugation.
BEISPIEL 40
Oligonukleotide, die eine 2'-O-Alkylamino-Gruppe aufweisen
A.
Das Phosphoramidit aus Beispiel 4, 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-(Ω-N-phthalimido)amino]uridin-3'-O-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropyl]phosphoramidit wurde als 0,2 M Lösung im trockenen CH₃CN hergestellt und zur Synthese der folgenden Oligonukleotide in einem ABI DNA Syntheseapparat, Modell 380 B verwendet. Während der modifizierten Amiditkopplung, nahm die Reaktionszeit auf 10 Minuten zu. Eine Kopplungseffizienz von ungefähr 90% wurde beobachtet. Nach Entschützen mit konzentriertem Ammoniumhydroxid (55°C, 16 Stunden) wurden die Oligonukleotide durch Umkehrphasen-HPLC und Entsalzungssäulen (Sephadex G-25) gereinigt.
B. GCGTGTU'CTGCG wobei U' 2'-O-[Hexyl-N-(1-pyrenpropylcarbonyl)amino]uridin, Konjugat 2 ist (Oligomer 52 – Pyrenbutyrat-Konjugat)
Zu 20 O.D. des Oligomers 52 in 200 μl 0,2 M NaHCO₃ Puffer, wurde 5 ml Pyrenbuttersäure-N-Hydroxysuccinimidester in einem Eppendorf-Röhrchen zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 200 μl DMF. Das Röhrchen wurde über Nacht geschüttelt. Die Reaktion wurde durch Größenauschluss und HPLC gereinigt, um 18 O.D. des Produkts zu ergeben.
C. GCGTGTU''CTGCG wobei U'' 2'-O-[6-Bromacetamidohex-1yl]uridin, Konjugat 3 ist (Oligomer 52 – Bromacetat-Konjugat).
Zu 12 O.D. des Oligomers 52 in 100 0,2 M NaHCO₃ Puffer, wurde 2 mg Bromessigsäure-NHS-Ester (N-Hydroxysuccinimidylbromacetat) zugegeben. Nachdem die Reaktion über Nacht stehen gelassen wurde, wurde sie durch Größenauschluss und HPLC gereinigt, um 7,5 O.D. des Produkts zu ergeben.
D. GCGTGTU^ wobei U^ 2'-O-[Hexyl-N-(polyethylenglykol)-propionoyl]aminouridin, Konjugat 4 ist (Oligomer 52 – PEG-Konjugat).
Zu 24 O.D. des Oligomers 52 in 200 μl 0,2 M NaHCO₃ Puffer wurden 20 mg Polythylenglykolpropionsäure-N-Hydroxysuccinimidester zugegeben. Die Reaktion wurde über Nacht mechanisch geschüttelt und über Sephadex G-25 Größenauschluss und Chromatographie gereinigt, um 22 O.D. des Produkts zu ergeben.
Die HPLC-Retentionszeiten (unter Elution mit einem Gradienten von 5% CH₃CN für 10 Minuten, anschließend 5%–40% CH₃CN für 50 Minuten in einer C-18 Delta Pak Umkehrphasensäule) waren wie folgt:

Retentionszeit (min.)

Oligomer 52 24,05

Konjugat 2 40,80

Konjugat 3 26,04

Konjugat 4 55,58
Die Änderungen bei der T_m aufgrund der Pyrenkonjugation wurden sowohl gegenüber DNA und RNA bewertet. T_m wurde in 100 mM Na⁺, 10 nM Phosphat, 0,1 mM EDTA, pH 7 bei einer 4 μM Strangkonzentration gemessen: Die Resultate waren wie folgt:
Die Werte in Klammern sind die Änderungen bei der T_m verglichen mit dem Aminolinker im Oligomer 52 als Kontrolle.
BEISPIEL 41
Oligonukleotidsynthese unter Verwendung von 2'-O-Hexylamino(pyrenbutyrat)uridinphosphoramidit.
Das Amidit 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(1-pyrenpropylcarbonyl)amino]uridin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit (0,2 M in trockenem Acetontril) wurde zur Synthese der folgenden Oligomere verwendet und auch für NMR-Studien:
Diese Oligomere wurden auf Trityl-On Umkehrphasen-HPLC gereinigt, in 80% Essigsäure für eine Stunde detrityliert und anschließend über RP-HPLC wieder gereinigt und entsalzt über Größenauschlusschromatographie. Die NMR-Analyse zeigte die Gegenwart von Pyrenpeaks.
BEISPIEL 42
Oligonukleotidsynthese unter Verwendung von 2'-O-Hexylamino(dinitrophenyl)uridin-phosphoramidit.
Das Amidit 5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[hexyl-N-(2,4-dinitrophenyl)amino]uridin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit (0,18 M in trockenem Acetonitril) wurde verwendet, um Oligonukleotide, nämlich die Oligomere 56 bis 63 zu synthetisieren. Alle Oligonukleotide sind Analoga der ICAM-Antisensesequenz. Diese Oligomere wurden über Trityl-On durch RP-HPLC (Waters Delta-Pak C₁₈-Säule, 300 Å, 7,8 mm × 30 cm, linearer 50-Minuten-Gradient von 5–60% Acetonitril in 0,05 M TEAA, pH 7,3) gereinigt, in 80% Essigsäure für eine Stunde detrityliert und anschließend über RP-HPLC gereinigt und über Größenaschlusschromatographie entsalzt. Die Daten sind nachstehend zusammengefasst:
BEISPIEL 43
Oligonukleotidsynthese unter Verwendung von 2'-O-[Hexylamino(cholesterol)]uridinphosphoramidit
Das Amidit 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(3-oxycarbonyl-cholesteryl)amino]uridin-3'-O-[2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl]phosphoramidit (0,2 M in trocknem Acetonitril/Dichlormethan 2 : 1 v/v) wurde verwendet, um die Oligomere 67–74 zu synthetisieren. Diese Oligomere werden durch Trityl-On durch Umkehrphasen-HPLC (Water Delta-Pak C₁₈, 300 Å, 7,8 mm × 30 cm, linearer 55-Minuten-Gradient von 5–80% Acetonitril in 0,05 M TEAA , pH 7,3) gereinigt, in 80% Essigsäure für eine Stunde detrityliert und anschließend über RP-HPLC wieder gereinigt und entsalzt über Größenauschlusschromatographie. Die Daten sind nachstehend zusammengefasst:
BEISPIEL 44
Synthese von Oligonukleotiden unter Verwendung von 2'-O-[Hexylaminofluorescein)]amidit.
Das Amidit 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(5-thiocarbonyl-3,5-dipivolylluorescein)amino]uridin-3'-O-(cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit) (0,2 M in trockenem Acetonitril) wurde zur Synthese des Oligomers 74 (vorstehend) und die Oligomere 75–82 auf im 1 × 10⁵ (Oligomer 75) oder 1 × 10² (verbleibende Oligomere) μmol Maßstab verwendet. Diese Oligomere werden über Trityl-On durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt (Waters Delta-Pak C₁₈, 300 Å, 7,8 mm × 30 cm, linearer Gradient von Acetonitril in 0,05 M TEAA, pH 7,3) gereinigt, mit 80% Essigsäure eine Stunde detrityliert und anschließend über RP-HPLC wieder gereinigt und entsalzt über Größenauschlusschromatographie.
BEISPIEL 45
1-Adamantanessigsäurepentafluorphenylester
1-Adamantanessigsäure (5 g, 25,77 mmol) wurde in 50 ml CH₂Cl₂ gelöst und zu dieser Suspension Pentafluorophenyl (5 g, 27,16 mmol) zugegeben. Dicyclohexancarbodiimid (DCC) wurde anschließend zugegeben (6 g, 29,12 mmol), wobei zu diesem Zeitpunkt eine hochgrad exotherme Reaktion einsetzte. Der Reaktionskolben wurde mit Argon gesättigt, versiegelt und anschließend in einem Wrist-Action-Schüttler geschüttelt. Nach 5 Stunden wurde die Lösung durch einen gesinterten Glasfilter filtriert, um Cyclohexylharnstoff zu entfernen, der sich während der Reaktion gebildet hatte. Die Methylenchloridlösung wurde eingedampft und das Produkt des hellgelben Feststoffs (9 g, 96% Rohprodukt Ausbeute) erhalten und im nächsten Kondensationsschritt so verwendet.
BEISPIEL 46
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(1-adamantanacetamido)amino]uridin
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-(hexylamino)uridin (2 g, 3,15 mmol) wurden in 20 ml Methylenchlorid gelöst. Adamantanessigsäurepentafluorphenylester (1,8 g des vorhergehenden Schrittes, 5 mmol Rohprodukt) wurde zugegeben, gefolgt von 3 ml Triethylamin. Die Reaktionsmischung wurde für 4 Stunden in einen Wrist-Action-Schüttler geschüttelt. TLC-Analyse (5% CH₃OH in CH₂Cl₂) zeigte die Bildung des Produkts, der gemäß über einen sich bewegenden Trityl-positiven Spot angezeigt wurde. Wenn das Ausgangsamin vollständig verbraucht worden war (5 Stunden), wurde die Reaktionsmischung eingedampft und auf eine Silicasäule, die mit einem Chloroformlösungsmittel beladen war, gegeben (20 cm × 5 cm Durchmesser). Die Säule wurde mit Chloroform (1 Liter) eluiert, gefolgt von 5 CHCl₃ in CH₃OH. Das Material, das Trityl-positive Spots in TLC zeigte, wurde vereint und verdampft, um 2,5 g des Nukleosidadamantan-Konjugats (98% Ausbeute) zu ergeben. ¹³C-Analyse zeigte die Gegenwart von sowohl Uridin wie auch Adamantan-Rückständen. R_f = 0,21 in 5% CH₃OH in CH₂Cl₂.
BEISPIEL 47
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(1-adamantanacetamido)amino]uridin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N'-diisopropyl)phosphoamidit
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(1-adamantanacetamido)amino]uridin (2,4 g, 2,96 mmol) wurde in 20 ml CH₂Cl₂ gelöst. Zu dieser Lösung wurden 200 mg Diisopropylaminotetrazolid (1,16 mmol) zugegeben, gefolgt von 3,1 ml von 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit (9,45 mmol) unter Argonatmosphäre. Die Mischung wurde unter Argon über Nacht gerührt, wobei nach dieser Zeit TLC (5 CH₃OH/CH₂Cl₂) in die fast vollständige Umwandlung des Nukleosids in sein Phosphoramidit anzeigte. Die Reaktionsmischung wurde mit gesättigter NaHCO₃ gewaschen, gefolgt von gesättigter NaCl-Lösung und anschließend über trockener MgSO₄ getrocknet. Die Lösung wurde eingedampft und der schaumige Rückstand in einer Silicasäule unter Verwendung von 5% CH₃OH/CHCl₃ eines Elutionssystems gereinigt, um das gereinigte Phosphoramidit zu ergeben (2 g, 67% Ausbeute). ³¹P NMR: 150,741, 150,49 ppm.
BEISPIEL 48
Oligonukleotidsynthese mit Adamantan-modifizierten Amidit
5'-O-Dimethosytrityl-2'-O-[hexyl-N-(1-adamantanacetamido)amino]uridinphosphoramidit wurde in trockenem CH₃CN (100 mg Amidit für jedes 1 ml Lösungsmittel, um eine 0,1 M Lösung des Amidits zu ergeben). Für das neue Amidit wurde die Kupplungszeit ausgedehnt durch Erhöhung der Amidit und Abgabezeit auf 7,5 Minuten und der Wartezeit auf 6,0, um somit zu einer gesamten Zeit von 13,5 Minuten zu kommen.
Die Oligonukleotide wurden entschützt und gemäß dem Verfahren wie es in Beispiel 2 beschrieben wurde, gereinigt. Tabelle I führt summarisch die verschiedenen Oligonukleotide zusammen mit ihren HPLC-Retentionszeiten auf.
BEISPIEL 49 Tabelle der synthetisierten Oligonukleotide mit ihren HPLC-Retentionszeiten – Inkorporation von 2'-O-(CH₂)₆-NHCO-O-Adamantylmethyluridin verwendeten Amidit:
NPLC-Bedingungen: Waters DeltaPak C-18 Delta Pak Umkehrphasen 15 m 300 Å Säule, 3,9 × 300 mm Größe ausgestattet mit einer C-18 Guard-Säule; Lösungsmittel A: 50 mM TEAA, pH 7,0; Lösungsmittel B: Acetonitril; Gradient: 0–10 Minuten, 5 Acetonitril; 10–60 Minuten, 5% bis 60% lineare Zunahme an Acetonitril.
BEISPIEL 50
cis-11-Eicosensäurepentafluorophenylester
cis-11-Eicosensäure (Aldrich, 2 g, 6,44 mmol) wurde in 50 ml THF gelöst und zu dieser Suspension wurden 1,2 g Pentafluorophenyl (6,5 mmol) zugegeben, gefolgt von 1,33 g DCC. Die Suspension wurde mit Argon gesättigt, mit einem Gummiseptum versiegelt und anschließend in einen Wrist-Action-Shaker geschüttelt. Nach 4 Stunden ergab sich eine klare hellgelbe Lösung mit einem cremig weißen Niederschlag. Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert, mit Methylenchlorid gewaschen und die vereinigte organische Lösung wurde verdampft, um das gewünschte Produkt als einen wachsähnlichen Feststoff (3,25 g, Rohprodukt aus Ausbeute) zu ergeben. Dieser Feststoff wurde im nächsten Kondensationsschritt ohne weitere Reinigung verwendet.
BEISPIEL 51
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(cis-11-eicosenamido)amino]uridin
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-(hexylamino)uridin (2 g, 3,15 mmol) wurden in 20 ml Methylenchlorid gelöst. cis-11-Eicosensäurepentafluorophenylester (2,5 g aus dem vorhergehenden Schritt, 5 mmol Rohprodukt) wurden zugegeben, gefolgt von 3 ml Pyridin. Die Reaktionsmischung wurde für 4 Stunden in einen Wrist-Action-Shaker geschüttelt. TCL-Analyse (5% CH₃OH in CH₂Cl₂) zeigte die Bildung des Produkts wie es durch ein Trityl-positiven Spot überhalb des Ursprungs des Spots gezeigt wurde. Wenn das Amin am Ursprung vollständig verbraucht war (5 Stunden), wurde die Reaktionsmischung verdampft und auf eine Silicasäule gegeben, die mit einem Chloroformlösungsmittel (20 cm × 5 cm Durchmesser) beladen war. Die Säule wurde mit Chloroform (1 Liter) eluiert, gefolgt von 5% CHCl₃ in CH₃OH. Das Material, das Trityl-positive Spots in der TLC zeigte, wurde vereinigt und verdampft, um 2,72 g des Nukleosideicosensäure-Konjugats (93% Ausbeute) zu ergeben. ¹³C-Analyse zeigte die Gegenwart von sowohl Uridin und cis-11-Eicosensäure-Rückständen. R_f = 0,29 in 5% CH₃OH in CH₂Cl₂.
BEISPIEL 52
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(cis-11-eicosenamido)amino]uridin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N'-diisopropyl)phosophoramidit
Das Eicosensäureuridinnukleosid des vorhergehen Schrittes (2,5 g, 2,7 mmol) wurde in 20 ml CH₂Cl₂ gelöst. 200 mg Diisopropylaminotetrazolid (1,16 mmol) wurde zu dieser Lösung zugegeben, gefolgt von 2 ml 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit (6,1 mmol) unter Argonatmosphäre. Die Mischung wurde unter Argon über Nacht gerührt, wonach anschließend eine TLC (5% CH₃OH/CH₂Cl₂) die fast vollständige Umwandlung des Nukleosids in sein Phosphoramidit anzeigte. Die Reaktionsmischung wurde mit gesättigten NaHCO₃ gewaschen, gefolgt von gesättigter NaCl-Lösung und anschließend über trockenem MgSO₄ getrocknet. Die Lösung wurde verdampft und der schaumige Rückstand in einer Silica säule unter Verwendung von 5% CH₃OH/CHCl₃ als Elutionssystem gereinigt, um das gereinigte Phosphoramidit zu ergeben (2 g, 67% Ausbeute). Da das Phosphoramidit mit dem H-Phosphorat des Phosphitylierungsreagens kontaminiert war, wurde es in einer Silicasäule wieder gereinigt, unter Eluieren mit 8 : 1 EtOAc : Hexan um 1,8 g (60% Ausbeute) des Phosphoramidits zu ergeben. ³¹P NMR: 150,74 und 150,56 ppm.
BEISPIEL 53
Oligonukleotidsynthese mit einem cis-11-Eicosensäure-modifiziertem Amidit 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(cis-11-eicosensäureamido)amino]uridinphosphoramidit wurde in trockenem CH₃CN gelöst (100 mg Amidit für jeden 1 ml Lösungsmittel um eine 0,09 M Lösung des Amidits zu ergeben). Für das neue Amidit wurde die Kupplungszeit ausgedehnt, indem die Amidit und Zugabezeit auf 7,5 Minuten erhöht wurde und die Wartezeit auf 6,0, so dass insgesamt 13,5 Minuten benötigt wurden.
Die Oligonukleotide wurden entschützt und gemäß dem Verfahren beschrieben in Beispiel 2 gereinigt. Tabelle II fasst die verschiedenen Oligonukleotide zusammen mit ihren HPLC-Retentionszeiten zusammen.
BEISPIEL 54 Tabelle der Inkorporierung von 2'-O-(CH₂)₆-NHCO-cis-11-Eicosen U unter Verwendung von Amdit
HPLC-Bedingungen: Waters DeltaPak C-18 Delta Pak Umkehrphasen 15 m 300 Å Säule, 3,9 × 300 mm Größe ausgerüstet mit C-18 Guard-Säule; Lösungsmittel A: 50 mM TEAA, pH 7,0; Lösungsmittel B: Acetonitril; Gradient: 0–10 Minuten, 5% Acetonitril; 10–60 Minuten, 5% bis 60% Acetonitril linearer Zuwachs.
BEISPIEL 55
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(N-biotinyl-6-aminocaproyl)amino]uridin
5'-O-Dimehoxytrityl-2'-O-(hexyiamino)uridin (1,05 g, 1,66 mmol) wurde in 20 ml Methylenchlorid gelöst. N-Biotinyl-6-aminocapronsäure (0,75 g, Fluka, 1,65 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von 1 ml Pyridin. Die Reaktionsmischung wurde für 4 Stunden in einem Wrist-Action-Shaker geschüttelt. Die weiße Suspension des Biotinreagenses löste sich vollständig innerhalb dieses Zeitraums, die TLC-Analyse (5% CH₃OH in CH₂Cl₂) zeigte die Bildung des Produkts, wie es von einem oberen Trityl-positiven Spot überhalb des Ursprungsspots angezeigt wurde. Sobald das Amin des Ursprungsspots vollständig verbraucht war (5 Stunden) wurde die Reaktionsmischung verdampft und auf eine Silicasäule gegeben, die mit einem Chloroformlösungsmittel beladen war (20 cm × 5 cm Durchmesser). Die Säule wurde mit Chloroform eluiert (1 Liter), gefolgt von 5% CHCl₃ in CH₃OH (1 Liter), anschließend gefolgt von 10% CH₃OH in CHCl₃. Das Material, das mit 10% CH₃OH auseluiert, zeigte Trityl-positive Spots in der TLC und wurde vereint und verdampft, um 1,53 des Nukleosid-Biotin-Konjugats zu ergeben (98% Ausbeute). ¹³C-Analyse zeigte die Gegenwart von sowohl Uridin wie auch Biotin-Rückständen. R_f = 0,214 in 10% CH₃OH in CH₂Cl₂.
BEISPIEL 56
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(N-biotinyl-6-aminocaproyl)amino]uridin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N'-diisopropyl)phosphoramidit
Die Biotinuridinnukleosid des vorhergehenden Schrittes wurde in 20 ml CH₂Cl₂ gelöst. Zu dieser Lösung wurden 100 mg Diisopropylaminotetrazolid (0,58 mmol) zugegeben, gefolgt von 1,0 ml von 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit (3,05 mmol) unter Argonatmosphäre. Die Mischung wurde unter Argon über Nacht gerührt, wonach eine TLC (5% CH₃OH/CH₂Cl₂) die fast vollständige Umwandlung des Nukleosids in sein Phosphoramidit anzeigte. Die Reaktionsmischung wurde mit gesättigter NaHCO₃ gewaschen, gefolgt von gesättigter NaCl-Lösung und anschließend über trockenem MgSO₄ getrocknet. Die Lösung wurde verdampft und der schaumige Rückstand in einer Silicasäule unter Verwendung eines 100% Ethylacetatelutionssystems gereinigt, um das gereinigte Phosphoramidit zu ergeben.
BEISPIEL 57
5'-O-Dimethoxytrityl-3'-O-[hexyl-N-(N-biotinyl-6-aminocaproyl)amino]uridin
5'-O-Dimethoxytrityl-3'-O-(hexylamino)uridin (0,53 g, 0,83 mmol) wurden in 10 ml Methylenchlorid gelöst. N-Biotinyl-6-aminocapronsäure (0,75 g, Fluka, 1,65 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von 0,5 ml Pyridin. Die Reaktionsmischung wurde für 4 Stunden in einem Wrist-Action-Shaker geschüttelt. Die weiße Suspension des Biotinreagens wurde während dieser vollständig gelöst. TLC-Analyse (10% CH₃OH in CH₂Cl₂) zeigte, dass die Produktbildung wie es durch einen Trityl-positiven Spot überhalb des Ursprungsspots angezeigt wurde, erfolgte. Sobald das Amin am Ursprungsspot vollständig verbraucht war (5 Stunden), wurde die Reaktionsmischung verdampft und auf eine Silicasäule, die mit einem Chloroformlösungsmittel beladen war (20 cm × 5 cm Durchmesser) gegeben. Die Säule wurde mit Chloroform eluiert (1 Liter); gefolgt von 5% CHCl₃ in CH₃OH (1 Liter). Das Material, das mit 10% CH₃OH auseluiert, zeigte Trityl-positive Spots in der TLC und wurde vereint und verdampft, um 0,6 g des Nukleosid-Biotin-Konjugats und der Biotin-Rückstände zu ergeben. R_f = 0,21 in 10% CH₃OH in CH₂Cl₂.
BEISPIEL 58
5'-O-Dimethoxytrityl-3'-O-[hexyl-N-(N-biotinyl-6-aminocaproyl)amino]uridin-2'-O-(succinylaminopropyl)-Glas mit kontrollierten Poren
Succinylierteslgekapptes Aminopropyl- Glas mit kontrollierten Poren wurde unter Vakuum für 3 Stunden direkt vor Gebrauch getrocknet. Ein Teil (0,3 g, 24 μmol) wurde zu 3 ml trockenem Pyridin in einen 50 ml Rundkolben gegeben. DEC (0,12 g, 0,63 mmol), TEA (25 μl, destilliert über CaH₂). DMAP (0,005 g, 40 μmol) und 5'-O-(Dimethoxytrityl)-3'-O-[hexyl-N-(N-biotinyl-6-aminocaproyl)amino]uridin (0,22 g, 0,22 mmol) wurden unter Argon zugegeben und die Mischung mechanisch für 19 Stunden geschüttelt. Weiteres Nukleosid (0,025 g) wurde zugegeben und die Mischung für weitere 5,5 Stunden geschüttelt. Pentachlorphenol (0,045 g, 0,168 mmol) wurde zugegeben und die Mischung für 18 Stunden geschüttelt. CPG wurde abfiltriert und sukzessiv mit Dichlormethan, Triethylamin und Dichlormethan gewaschen. Das resultierende CPG wurde unter Vakuum getrocknet, in 15 ml Piperidin suspendiert und 30 Minuten lang geschüttelt. CPG wurde abfiltriert, ausreichend mit Dichlormethan gewaschen und wieder unter Vakuum getrocknet. Der Beladungsausmaß (bestimmt über einen spektrophotometrischen Assay des Dimethoxytritylkations in 0,3 M p-Toluolsulfonsäure bei 498 nm) betrug ungefähr 36 μmol/g. Der feste Träger des Produkts wurde nachfolgend verwendet, um die Oligomere zu synthetisieren, die Biotin an der 3'-Nukleotideinheit enthalten.
BEISPIEL 59
Oligonukleotidsynthese mit Biotin-modifiziertem Amidit Glas mit kontrollierten Poren
5'-O-Dimethoxytrityl-3'-O-[hexyl-N-(N-biotinyl-6-aminocaproyl)amino]uridinnukleosidphosphoramidit wurde in trockenem CH₃CN gelöst (100 mg Amidit für jedes 1 ml Lösungsmittel, um 0,08–0,09 M Lösung des Amidits zu ergeben). Für das neue Amidit wurde die Kopplungszeit ausgedehnt durch Erhöhung des Amidits und der Zugabezeit auf 7,5 Minuten und der Wartezeit auf 6,0, daher insgesamt eine Gesamtzeit von 13,5 Minuten.
Die Oligonukleotide wurden entschützt und gereinigt unter Verwendung des Verfahrens wie es in Beispiel 2 beschrieben wurde. Das Glas mit kontrollierten Poren, das Biotin enthält, wurde verwendet um 3'-Biotion-enthaltende Oligonukleotide zu synthetisieren.
BEISPIEL 60
1-2-Di-O-hexadecyl-arc-glycerol-succinimidyl-carbonat
1,2-Di-O-hexadecyl-rac-glycerol (2 g, 3,69 mmol) wurde in 3 ml CH₂Cl₂ gelöst und zu dieser Lösung wurde Disuccinimidylcarbonat (DSC) (1,42 g, 5,54 mmol) zugegeben. Anschließend wurde Triethylamin zugegeben (2 ml, 14,3 mmol), gefolgt von 2 ml trockenem Acetonitril. Das Reaktionsgefäß wurde mit Argon gesättigt, versiegelt und anschließend in einem Wrist-Action-Shaker geschüttelt. Nach 8 Stunden wurde die Reaktionmischung verdampft. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ gelöst (100 ml), mit gesättigter NaHCO₃-Lösung gewaschen, gefolgt von einer gesättigten NaCl-Lösung und die organische Phase wurde über trockenem MgSO₄ getrocknet. Der feste Rückstand (3,5 g) wurde im nächsten verwendet, um mit dem Amin zu kondensieren. ¹³C NMR bestätigt die vollständige Umwandlung von 1,2-Di-O-hexadecyl-rac-glycerol in das entsprechende Succinimidylcarbonat.
BEISPIEL 61
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(carbonyl-1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycerol)amino]uridin
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-(hexylamino)uridin (2 g, 3,15 mmol) wurde in 20 ml Methylenchlorid gelöst. 1,2-Di-O-hexadecyl-rac-glycerolsuccinimidylcarbonat (3,0 g des vorhergehenden Schritts, 5 mmol des Rohprodukts) wurde zugegeben, gefolgt von 3 ml Pyridin. Die Reaktionsmischung wurde für 4 Stunden in einem Wrist-Action-Shaker geschüttelt. TLC-Analyse (5% CH₃OH in CH₂Cl₂) zeigte, dass die Bildung des Produkts wie es durch den sich bewegenden Trityl-positiven Spot angezeigt wurde. Wenn das Amin am Ursprung vollständig verbraucht war (5 Stunden) wurde die Reaktionsmischung verdampft und auf eine Silicasäule, die mit einem Chloroformlösungsmittel beladen war (20 cm × 5 cm Durchmesser) aufgetragen. Die Säule wurde mit Chloroform (1 Liter) eluiert, gefolgt von 5% CHCl₃ in CH₃OH. Das Material, das Trityl-positive Spots in der TLC zeigte, wurde vereint und verdampft, um 3,0 g des Nukleosid-Lipid-Konjugats zu ergeben (98% Ausbeute). ¹³C-Analyse zeigte die Gegenwart von sowohl Uridin wie auch einen Lipid-Rückstand.
BEISPIEL 62
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(carbonyl-1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycerolsuccinimidyl-carbonat]-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N'-diisopropyl)phosphoramidit
Das Lipid-Uridin-Nukleosid des vorhergehenden Schritts wurde in 20 ml CH₂Cl₂ gelöst. Zu dieser Lösung wurden 200 mg Diisopropylaminotetrazolid (1,16 mmol) zugegeben, gefolgt von 1,55 ml von 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit (4,75 mmol) unter Argonatmosphäre. Die Mischung wurde unter Argon über Nacht gerührt, wonach TLC (5% CH₃OH/CH₂Cl₂) die fast vollständige Umwandlung des Nukleosids in sein Phosphoramidit anzeigt. Die Reaktionsmischung wurde mit gesättigtem NaHCO₃ gewaschen, gefolgt von gesättigter NaCl-Lösung und anschließend über trockenem MgSO₄ getrocknet. Die Lösung wurde eingedampft und der schaumige Rückstand über eine Silicasäule unter Verwendung von 5% CH₃OH/CHCl₃ Elutionssystem gereinigt, um ein gereinigtes Phosphoramidit zu ergeben.
BEISPIEL 63
Oligionukleotidsynthese mit Lipid-modifiziertem Amidit
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(carbonyl-1,2-di-O-hexadecyl-rac-glyercol)amino]uridinphosphoramidit wurde in trockenem CH₃CN gelöst (100 mg Amidit für 1 ml Lösungsmittel, um 0,08–0,09 M Lösung des Amidits zu ergeben). Für das neue Amidit wurde die Kupplungszeit ausgedehnt durch Erhöhung des Amidits und der Zugabezeit auf 7,5 Minuten und der Wartezeit auf 6,0, so dass eine Gesamtzeit von 13,5 Minuten verwende wurde. Die Oligonukleotide wurden entschützt und gereinigt, entsprechend des Verfahrens wie es in Beispiel 2 beschrieben wurde.
BEISPIEL 64
Oligonukleotidsynthese
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[hexyl-N-(1-pyrenbutyroyl)amino]uridinphosphoramidit wurde in trockenem CH₃CN gelöst (100 mg Amidit für jedes 1 ml Lösungsmittel, um 0,08 –0,09 M Lösung des Amidits zu ergeben). Für das neue Amidit wurde die Kupplungszeit ausgedehnt durch Erhöhung des Amidit und der Zugabezeit von 7,5 Minuten und der Wartezeit auf 6,0 Minuten und damit unter Verwendung einer Gesamtzeit von 13,5 Minuten.
Die Oligonukleotide wurden entschützt und gereinigt, unter Verwendung des Verfahrens wie es in Beispiel 2 beschrieben wurde. Die nachstehende Tabelle fasst die verschiedenen Oligonukleotide (ICAM, ras, raf und PKC-a Oligonukleotide) zusammen.
Tabelle der Inkorporierung von 2'-O-(CH₂)₆-NHCO-butyrylpyren U unter Verwendung von Amdit
HPLC-Bedingungen: Waters DeltaPak C-4 Delta Pak Umkehrphasen 15 m 300 Å Säule, 3,9 × 300 mm Größe ausgerüstet mit C-18 Guard-Säule; Lösungsmittel A: 50 mM TEAA, pH 7,0; Lösungsmittel B: Acetonitril; Gradient: 0–10 Minuten, 5% Acetonitril; 10–60 Minuten, 5% bis 60% Acetonitril linearer Zuwachs.
BEISPIEL 65
Inkorporation von 2'-O-(CH₂)₆-NHCO-chloesteroluridin am 5'-Ende von Oligonukleotiden unter Verwendung von Amiditen
Synthese:
Die Oligonukleotide wurden auf einem Expedite Nucleic Acid Synthesis System (Millipore Corp., Bedford, MA) synthetisiert. Zwei 1 μmol Synthesen oder eine einzige 15 μmol Synthese wurde für jedes Oligonukleotid durchgeführt. Die Standard-DNA-Synthesebedingungen wurden verwendet mit der Ausnahme, dass während der Kupplung des modifizierten Amidits wie folgt vorgegangen wurde: das neue Amidit wurde in CH₂Cl₂/CH₃CN 50/50 (0,08–0,1 M) gelöst. Für eine 10 μmol Synthese, wurde 6 Minuten Warteschritt zum Kupplungszyklus eingeführt, der einmal wiederholt wurde. Für die 1 μmol Phosphodiestersynthesen wurde der Kupplungsschritt ebenfalls auf 6 Minuten erhöht, mit periodischer Zugabe von frischem Amidit. Für die 1 μmol Phosphorthioatsynthesen wurde der Kupplungsschritt auf 13 Minuten ausgedehnt, unter periodischer Zugabe frischen Amidits.
Reinigung:
Nach der Standardabspaltung von CPG und Entschützung (Ammoniumyhdroxid bei 55°C für 16–24 Stunden) wurden die Oligonukleotide Trityl-On gereinigt durch präparative HPLC, um die Falschsequenz zu entfernen. HPLC-Bedingungen: Waters Delta-Pak C₄-Säule, 7,8 mm × 30 cm , 300 Å, 15 u; 2,5 ml/min Flussgeschwindigkeit unter Verwendung eines Gradienten von 5 bis 80% AcCN in 50 mM Triethylammoniumacetat, pH 7,0 während 50 Minuten. Nach Lyophilisierung wurden die Oligonukleotide detrityliert für 45 Minuten in 80% Essigsäure und wieder lyophilisiert. Die Oligonukleotide wurden anschließend weiter durch Größenauschluss auf einer G-25-Säule gereinigt, um Salze und die Trityl-Gruppe zu entfernen.
Analyse:
Mit der Ausnahme für 8002, wurden die Oligonukleotide über HPLC unter Verwendung eines Gradienten der zu einem der vorstehenden analog ist, analysiert und mit einer Waters Delta-Pak C₄-Säule (3,9 mm × 30 cm) mit einer Flussgeschwindigkeit von 1,5 ml/min über 50 Minuten. 8002 wurde unter Verwendung eines Gradienten von 5 bis 60% AcCN analysiert. Die gereinigten Phosphorthioatoligonukleotide erschienen als zwei Peaks in der HPLC, Phosphodiester als ein Peak. Die Oligonukleotide wurden weiter durch Elektrophorese auf 20% Polyacrylamid denaturierenden (7 M Harnstoff) Gelen analysiert. Alle waren vorzugsweise Einzelbanden der entsprechenden Größe, verglichen mit den Standards. Die Gelanalyse von 8012 (beladen ohne jegliche Vorbehandlung) zeigte eine sehr hohe Bande, wahrscheinlich die tetramere Form des Oligonukleotids, zuzüglich eine schwache Bande, wo man ein monomeres 8-mer + Chooesterol erwarten würde. (von der Stammverbindung, 5320 ist bekannt, dass sie eine G-Quartet-Struktur bildet). Einige Oligonukleotide wurden ebenfalls über Kapillarelektrophorese analysiert. Ausgewählte Oligonukleotide wurden über Elektronenspraymassenspektroskopie analysiert.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt, wobei * die Region der gewählten Modifikation anzeigt.
BEISPIEL 66
Inkorporation von 2'-O-(CH₂)₆-NHCO-cholesteroluridin bei nichtendständigen Stellungen von Oligonukleotiden unter Verwendung Amidit
Olignukleotide, die 2'-O-(CH₂)₆-NHCO-cholesterol am nichtendständigen Ende inkorporieren (d. h. weder am 5'- oder am 3'-Ende des Oligonukleotids) wurden auf eine 1 μmol Synthesemenge synthetisiert, analysiert und gemäß den Verfahren des Beispiels 65 gereinigt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt, wobei * die Region der gewählten Modifikation anzeigt.
BEISPIEL 67
Inkorporation von 3'-O-(CH₂)₆-NHCO-cholesteroluridin am 3'-Ende von Oligonukleotiden unter Verwendung von modifizierten CPG
Cholesterol-modifiziertes CPG wurde in eine Schraubenkopf-CPG-Säule (Glen Research) gepackt. Die Oligonukleotide wurden auf einem 1 μmol Syntheseansatz synthetisiert, analysiert und wie in Beispiel 65 gereinigt, mit der Ausnahme, dass Standard-DNA-Synthesebedingungen für alle Kupplungen verwendet wurden.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt, wobei * die Region der ausgewählten Modifikation anzeigt.
BEISPIEL 68
Inkorporation von 2'-O-(CH₂)₆-NHCO-cholsteroluridin am 3-Ende von Oligonukleotiden unter Verwendung von modifizierten CPG
Cholesterol-modifiziertes CPG wurde in eine Schraubenkopf-CPG-Säule (Glen Research) gepackt. Die Oligonukleotide wurden auf einem 1 μmol Syntheseansatz syn thetisiert, analysiert und wie in Beispiel 65 gereinigt, mit der Ausnahme, dass Standard-DNA-Synthesebedingungen für alle Kupplungen verwendet wurden.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt, wobei * die Region der ausgewählten Modifikation anzeigt.
BEISPIEL 69
Doppelte Inkorporation von Cholesterol durch die Platzierung von 2'-O-(CH₂)₆-NHCO-cholesteroluridin am 5'-Ende und 3'-O-(CH₂)₆-NHCO-cholesteroluridin am 3'-Ende
Cholesterol-modifiziertes CPG wurde in eine Schraubenkopf-CPG-Säule (Glen Research) gepackt. Die Oligonukleotide wurden auf einem 1 μmol Syntheseansatz synthetisiert, analysiert und wie in Beispiel 65 gereinigt, mit der Ausnahme, dass der ausgedehnte Kupplungsschritt für das Cholesterolamidit (siehe Beispiel 65) einmal wiederholt wurde.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt, wobei * die Region der ausgewählten Modifikation anzeigt.
BEISPIEL 70
Inkorporation von Cholesterol und Aminohexy-Modifikationen in 2'F-chimere Oligonukleotide
Das Stammoligonukleotid, das zur Messenger-RNA von PKCα komplementär ist, ist ein chimäres Phosphorthioatoligonukleotid, das einen zentralen Deoxyribonukleotidbereich auf, der "flankiert" ist, sowohl am 5'- und an den 3'-Seiten mit Bereichen, die 2'-Deoxy-2'-fluoronukleotide haben. Diese Verbindungen sind alternativ als "beabstandete" Oligonukleotide bezeichnet. Die zentralen "beabstandeten" Bereiche sind in der nachstehenden Tabelle unterstrichen gezeigt zusammen mit den "Flanken" (oder alternativ auch als "Flügel" bezeichnet), die in der nicht modifizierten Schriftart angezeigt sind.
Die Oligonukleotide wurden synthetisiert, analysiert und wie in Beispiel 65 gereinigt, mit der Ausnahme des folgenden:
Die Konzentration aller Amidite betrug 0,1 M. Zwei 1 μmol Synthesen wurden für jede Oligonukleotid durchgeführt. Der Kupplungsschritt wurde auf 6 Minuten ausgedehnt, mit periodischer Zugabe von frischem Amdit; dieser ausgedehnte Kopplungsschritt wurde einmal für die Cholesterolamiditkupplung wiederholt. Die Trityl-On HPLC-Reinigung der Verbindung ID #9532 verfolgt unter Verwendung eines linearen Gradienten von 5–40% AcCN über 50 Minuten. Nach Detritylierung und Reinigung über Größenausschluss wurde es analysiert, unter Verwendung von ähnlichen analytischen HPCL-Verfahrensgel und einer Kapillarelektrophorese. Die gereinigte Verbindung ID #9535 erscheint als zwei Peaks in der HPLC, bei anderen als ein Peak. Die Verbindung mit den IDs #9532 und 9534 enthielten ungeschütztes 3'-Hexylamin, wahrscheinlich ungefähr 20% gemäß vorhergehenden Resultaten (Phthalimid ist die Schutzgruppe).
U₁* = 3'-O-(CH₂)₆-NH₂U
U₂* = 3'-O-(Ch₂)₆-NHCO-Cholesterol U
U₃* = 2'-O-(CH₂)₆-NHCO-Cholesterol U

Die Resultate sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt, wobei * den Bereich der ausgewählten Modifikation anzeigt

Sequenz	HPLC-Retentionszeit (min)
UGUUCUCGCTGGTGAGUUUCAU (SEQ ID NR: 34)	34,5
UGUUCUCGCTGGTGAGUUUCAU₁*	nicht bestimmt
UGUUCUCGCTGGTGAGUUUCAU₂*	48
U₃GUUCUCGCTGGTGAGUUUCAU₂	46,5, 47,5
U₃*GUUCUCGCTGGTGAGUUUCAU	46,5, 47,5

BEISPIEL 71
5'-O-Dimethoxytrityl-3'-O-[hexyl-(omega-N-phthalimido)amino]uridin-2'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit

Das 5'-Dimethoxytrityl-3'-O-[hexyl-(omega-N-phthalimido)amino]uridin (2 g, 2,6 mmol) wurde in 20 ml trockenem CH₂Cl₂ gelöst. Zu dieser Lösung wurde Diisopropylaminotetrazolid (0,2 g, 1,16 mmol) und 2,0 ml 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit (6,3 mmol) zugegeben und über Nacht gerührt. TLC (1 : 1 EtOAc/Hexan) zeigte das vollständige Verschwinden des Ausgangsmaterials. Die Reaktionsmischung wurde mit CH₂Cl₂ transferiert und mit gesättigter NaHCO₃ (100 ml) gewaschen, gefolgt von gesättigter NaCl-Lösung. Die organische Phase wurde über trockenem Na₂SO₄ getrocknet und verdampft, um 3,8 g eines Rohprodukts zu erhalten, welches über eine Silicasäule (200 g) gereinigt wurde, unter Verwendung von 1 : 1 Hexan/EtOAc, um 1,9 g (1,95 mmol, 74% Ausbeute) des gewünschten Phosphoramidits zu ergeben.

Sequenz (3' ⇒ 5')	Charakteristika der Sequenz
GAU₃*CT	P = O, 2'-5'-Verknüpfung
GCG TGU₃* CTG GG (SEQ ID NR: 35)	P = O, 2'-5'-Verknüpfung
GCG UGU₃* CUG CG (SEQ ID NR: 36)	P = O, 2'-5'-Verknüpfung, Chimeren, die 2'-OMe Flanken haben

BEISPIEL 72
NMR- und HPLC-Analyse von 5'-3' gegen 5'-2'-Internukleotidverknüpfungen und 2'-Substituenten gegen 3'-Substituenten
Das 400 MHz ¹H-Spektrum des Oligomers d(GAU₂*CT), wobei U₂ = 2'-O-Aminohexyluridin ist, zeigte 8 Signale zwischen 7,5 und 9,0 ppm entsprechend den 8 aromatischen Protonen. Außerdem zeigte da anomere Proton U*, erschienen als Doublet bei 5,9 ppm, mit J₁', ₂' = 7,6 Hz, was für eine C2'-Endozucker gewählte Struktur spricht. Die entsprechende 2'-5'-verknüpfte Isomer zeigt eine ähnliche Struktur mit einem J₁', ₂' = 3,85 Hz bei 6,75 ppm, aus einem RNA-ähnlichen Zucker bei der neuen Modifikationsbereich, der für die Hybridisierung auf einem mRNA-Target günstig ist, zeigt. Das Protonenspektrum des Oligomers d(GACU₃*), wobei U₃* = 3'-O-Hexylamin ist, zeigte die erwarteten 7 aromatischen Protonensignale zwischen 7,5 und 9,0 ppm und das anomere Protonendoublet bei 5,9 ppm mit J₁', ₂' = 4,4 Hz. Dies lässt noch mehr C3'-endo für die 3'-O-Alkylamino-Verbindungen verglichen mit ihren 2'-Analoga vermuten. ³¹P NMR dieser Oligonukleotide zeigten die erwarteten 4- und 3-Signale der Internukleotidphosphatverknüpfungen für d(GAU*CT) und d(GAUCU*). Die 3'-5'-Verknüpften gegenüber den 2'-5'-Verknüpften haben verschiedene Retentionszeiten in RP-HPLC und daher verschiedene Lipophilizitäten, was einen potentiellen unterschiedlichen Ausmaß der Wechselwirkung mit Zellmembranen impliziert.
BEISPIEL 73
2'-5'-Internukleotid verknüpfte Oligonukleotid-Konjugationschemie
Die Oligonukleotide 9274 und 9518 (20 Ods jeweils) wurden getrocknet und wieder gelöst in 0,2 M NaHCO₃-Puffer (200 μl) in einem Eppendorf-Röhrchen. 5 mg Pyrenbuttersäure-N-Hydroxysuccinimidester wurde in 400 μl trockenem DMF gelöst. 200 μl dieser Lösung wurde zu jeder der Eppendorf-Röhrchen zugegeben und gerührt und über Nacht stehen gelassen. Die Reaktionsmischungen wurden durch eine g-25-Säule gelassen, um Überschussreagens zu entfernen und anschließend über Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die Retentionszeiten der Ausgangsmaterialien und der Konjugate sind nachstehend zusammengefasst:

Sequenz (3' ⇒ 5') Retentionszeit (min)

GAU₃CT 23,85

GCG TGU₃* CTG GG 24,99

Pyren-Konjugat von 9274 39,00

Pyren-Konjugat von 9518 40,05
HPLC-Bedingungen: Waters DeltaPak C-18 Delta Pak Umkehrphasen 15 m 300 Å Säule, 3,9 × 300 mm Größe ausgerüstet mit C-18 Guard-Säule; Lösungsmmitel A: 50 mM TEAA, pH 7,0; Lösungsmittel B: Acetonitril; Gradient: 0–10 Minuten, 5% Acetonitril; 10–60 Minuten; lineare Erhöhung von 5% bis 40% Acetonitril
BEISPIEL 74
Tm-Analyse von 2'-5' gegen 3'-5' verbundenen Oligonukleotiden und ihre Konjguate
Thermisches Schmelzen wurden gemäß des Verfahrens B(1)(b) durchgeführt. Die Oligonukleotididentität ist wie folgt:
Das Oligonukleotid 31-A ist ein normales 3'-5'-verknüpfter Phosphordiesteroligodeoxyribo-nuleotid der Sequenz d (GGC TGU* CTG CG) (SEQ ID NR: 37), wobei * die Befestigungsstelle von entweder einem 2'-Aminolinker oder einem 2'-Aminolinker plus Pyren anzeigt.
Das Oligonukleotid 31-B ist ein normales 3'-5'-verknüpftes Phosphordiesteroligoribonukleotid der Sequenz d (GGC TGU* CTG CG), wobei * die Befestigungsstelle von sowohl des 2'-Aminolinkers oder eines 2'-Aminolinkers plus Pyren anzeigt. Jedes der Ribonukleotide des Oligonulekotids mit Ausnahme desjenigen, das den *-Substituenten trägt, sind 2'-O-Methylribonukleotide.
Das Oligonukleotid 31-C hat eine 2'-5'-Verknüpfung an einer *-Stelle zuzüglich zu entweder einen 3'-Aminolinker oder einem 3'-Aminolinker plus Pyren an dieser Stelle. Der Rest des Oligonukleotids ist ein Phosphodiesteroligodeoxyribonukleotid der Sequenz d (GGC TGU* CTG CG). Das Basenoligonukleotid (kein 2'-Aminolinker) wurde nicht in der Studie verwendet.
Die 2'-5'-Verknüpfungen zeigten eine höhere Schmelztemperatur gegenüber ein RNA-Target verglichen mit einem DNA-Target.
BEISPIEL 78
2'-O-Propylphthalimid)adenosin und 3'-O-(Propylphthalimid)adenosin
Zu einer Lösung von Adenosin (20,0 g, 75 mmol) in trockenem Dimethylformamid (550 ml) bei 5°C wurde Natriumhydrid zugegeben (60% Öl, 4,5 g, 112 mmol). Nach einer Stunde wurde N-(3-Brompropyl)phthalimid (23,6 g, 86 mmol) zugegeben und die Temperatur wurde auf 30°C erhöht und für 16 Stunden beibehalten. Es wurde Eis zugegeben und die Lösung im Vakuum bis auf einen gummiartigen Rückstand evaporiert. Der gummiartige Rückstand wurde zwischen Wasser und Ethylacetat (4 × 300 ml) partioniert. Die organische Phase wurde getrennt, getrocknet und im Vakuum evaporiert und der entstehende gummiartige Rückstand auf Silicagel (95/5 CH₂Cl₂/MeOH) chromatographiert, um einen weißen Feststoff (5,7 g) des 2'-O-(Propylphthalimid)adenosins zu ergeben. Die Fraktion, die 3'-O-(Propylphthalimid)adenosin enthielten, wurden wieder auf Silicagel unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelsystems chromatographiert.
Kristallisierung des 2'-O-(Propylphthalimid)adensoninfraktionen aus Methanol ergaben einen kristallinen Feststoff, Schmp. 123–124°C,¹H NMR (400 MHz: DMSO-d₆) δ 1,70 (m, 2H, CH₂), 3,4–3,7 (m, 6H, C₅, CH₂, OCH₂, Phth CH₂), 3,95 (q, 1H, C₄, H), 4,30 (q, 1H, C₅, H), 4,46 (t, 1H, C₂, H), 5,15 (d, 1H, C₃, OH), 5,41 (t, 1H, C₅, OH), 5,95 (d, 1H, C₁, H), 7,35 (s, 2H, NH₂), 7,8 (brs, 4H, Ar), 8,08 (s, 1H, C₂H) und 8,37 (s, 1H, C₈H). Analyse berechnet C₂₁H₂₂N₆O₆: C, 55,03; H, 4,88; N, 18,49. Gefunden: C, 55,38; H, 4,85; N, 18,46.
Kristallisation der 3'-O-(Propylphthalimid)adenosinfraktionen aus H₂O lieferte eine analytische Probe, Schmp. 178–179°C. ¹N NMR (400 MHz: DMSO-d₆) δ 5,86 (d, 1H, H-1').
BEISPIEL 76
2'-O-(Propylphthalimid)-N⁶-benzoyladenosin
2'-O-(Propylphthalimid)adenosin wurde mit Benzoylchlorid ähnlich dem Verfahren von Gaffney et al., Tetrahedron Lett. 1982, 23, 2257 behandelt. Chromatographie auf Silicagel (Ethylacetat-Methanol) gibt die Titelverbindung. Analyse berechnet C₂₈H₂₆N₆O₇: C, 60,21; H, 4,69; N, 15,05. Gefunden: C, 59,94; H, 4,66; N, 14,76.
BEISPIEL 77
2'-O-(Propylphthalimid)-5'-O-dimethoxytrityl-N-benzoyladenosin
Zu einer Lösung von 2'-O-(Propylphthalimid)-N⁶-benzoyladenosin (4,0 g) in Pyridin (250 ml) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (3,3 g) zugegeben. Die Reaktion wurde für 16 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde auf Eis/Wasser/Ethylacetat gegeben, die organische Phase getrennt, getrocknet und im Vakuum einkonzentriert und den entstehenden gummiartigen Rückstand auf Silicagel (Ethylacetat-Methanoltriethylamin) chromatographiert, um die Titelverbindung zu ergeben. Anal. Berechnet C₄₉H₄₄N₆O₉: C, 68,36; H, 5,15; N, 9,76. Gefunden: C, 68,16; H, 5,03; N, 9,43.
BEISPIEL 78
N₆-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-(propylphthalimid)-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethyl)adenosinphosphoramidit
2'-O-(Propylphthalimid)-5'-O-dimethoxytrityl-N⁶-benzoyladenosin wurde mit (β-Cyanoethoxy)chloro-N,N-diisopropyl)aminophosphan ähnlich in der Weise wie das Verfahren von Seela, et al., Biochemistry 1987, 26, 2233 behandelt. Die Chroma tographie über Silicagel (EtOAc/Hexan) ergab die Titelverbindung als einen weißen Schaum. ³¹P NMR (CD₃CN) 150,88, 151,22.
BEISPIEL 79
2'-O-(Propylamino)adenosin
Eine Lösung von 2'-O-(Propylphthalimid)adenosin (8,8 g, 19 mmol), 95% Ethanol (400 ml) und Hydrazin (10 ml, 32 mmol) wurde für 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Filtrat im Vakuum einkonzentriert. Wasser (150 ml) wurde zugegeben und mit Essigsäure auf einen pH von 5,0 angesäuert. Die wässrige Lösung wurde mit EtOAc extrahiert (2 × 30 ml) und die wässrige Phase im Vakuum einkonzentriert, um 7,1 g (95%) der Titelverbindung als HOAc-Salz zu ergeben. ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 1,70 (m, 2H, CH₂), 2,76 (m, 2H, CH₂NH₂), 3,55–3,67 (m, 4H, C₅, CH₂, OCH₂), 3,00 (q, 1H, C₄, H), 4,30 (q, 1H, C₃, H), 4,47 (t, 1H, C₂, H), 6,0 (d, 1H, C₁, H), 7,39 (s, 2H, NH₂) und 8,16 (s, 1H, C₂H).
BEISPIEL 80
2'-O-[3-(N-Trifluoroacetamido)propyl]adenosin
Ein Lösung von 2'-O-(Propylamino)adenosin in Methanol (50 ml) und Triethylamin (15 ml, 108 mmol) wurden mit Ethyltrifluoroacetat (18 ml, 151 mmol) behandelt. Die Reaktion wurde für 16 Stunden gerührt und anschließend im Vakuum einkonzentriert und der entstehende gummiartige Rückstand auf Silicagel chromatographiert (9/1, EtOAc/MeON), um die Titelverbindung mit einer Menge von 3,3 g zu ergeben (54%). Schmp. 200–201°C (CH₃CN). ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 1,7 (m, 2H, CH₂), 3,2 (m, 2H, CH₂NHCO), 3,37–3,67 (m, 4H, C₅, CH₂, OCH₂), 4,00 (q, 1H, C₄, H), 4,35 (q, 1H, C₃, H), 4,49 (t, 1H, C₂, H), 5,26 (d, 1H, C₃, OH), 5,43 (t, 1H, C₅, OH), 6,02 (d, 1H, C₁, H), 7,38 (s, 2H, NH₂), 8,16 (s, 1H, C₂H), 8,40 (s, 1H, C₈H), 9,34 (s, 1H, NHCO). ¹⁹F NMR (200 MHz, DMSO) δ –108,76. Anal. berechnet für C₁₅H₁₉F₃N₆O₅: C, 42,86; H, 4,56; N, 19,99. Gefunden: C, 43,10; H, 4,52; N, 20,03.
BEISPIEL 81
N⁶-(Dibenzoyl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetamido)propyl]adenosin
2'-O-[3-(N-Trifluoroacetamido)propyl]adenosin wird gemäß Beispiel 76 unter Verwendung einer Jones-Modifikation behandelt, wobei Tetrabutylammoniumfluorid anstelle von Ammoniumhydroxid bei der Aufarbeitung verwendet wird. Das Rohprodukt wurde unter Verwendung von Silicagelchromatographie gereinigt (EtOAc→EtOAc/MeOH/1/1), um die Titelverbindung zu ergeben. ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆), δ 1,7 (m, 2H, CH₂), 3,2 (m, 2H, CH₂NHCO), 3,45–3,68 (m, 4H, C₅, CH₂, OCH₂), 4,03 (q, 1H, C₄, H), 4,37 (q, 1H, C₃, H), 4,53 (t, 1H, C₂, H), 5,18 (d, 1H, C₃, OH), 5,34 (d, 1H, C₃, OH), 6,17 (d, 1H, C₁, H), 7,45–7,83 (m, 1H, Ar), 8,73 (s, 1H, C₂H), 8,90 (s, 1H, C₈H), 9,3 (s, 1H, NHCO). ¹⁹F NMR (200 MHz, DMSO) δ –108,76. Anal. berechnet für C₂₈H₂₇F₃N₆O₇: C, 55,41; H, 4,33; N, 13,37. Gefunden: C, 55,16; H, 4,24; N, 13,09.
BEISPIEL 82
N⁶-(Dibenzoyl)-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetamido)proypl]adenosin
4,4'-Dimethoxytritylchlorid (3,6 g, 10,0 mmol) wurde zu einer Lösung von N⁶-(Dibenzoyl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetoamido)propyl]adenosin in Pyridin (100 ml) bei Raumtemperatur zugegeben und für 16 Stunden gerührt. Die Lösung wurde im Vakuum einkonzentriert und auf Silicagel (EtOAc/TEA 99/1) chromatographiert, um die Titelverbindung zu ergeben. ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 1,74 (m, 2H, CH₂), 3,23 (m, 2H, CH₂NHCO), 3,60–3,73 (m, 10H, ArOCH₃, C₅, CH₂, OCH₂), 4,09 (m, 1H, C₄, H), 4,51 (q, 1H, C₃, H), 4,66 (t, 1H, C₂, H), 5,34 (d, 1H, C₃, OH), 6,17 (d, 1H, C₁, H), 6,80– 7,83 (m, 23H, Ar), 8,64 (s, 1H, C₂H), 8,78 (s, 1H, C₈H), 9,35 (s, 1H, NHCO). ¹⁹F NMR (200 MHz, DMSO) δ –108,76. Anal. berechnet für C₄₉H₄₅F₃N₆O₉: C, 68,36; H, 5,15; N, 9,76. Gefunden: C, 68,16; H, 5,03; N, 9,43.
BEISPIEL 83
N⁶-(Dibenzoyl)-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetoamid)propyl]-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethyl)adenosinphosphatamidit
Eine Lösung von N⁶-(Dibenzoyl)-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetamido)propyl]adenosin in trockenem CH₂Cl₂ wurden mit bis-N,N-Diisopropylaminocyanoethylphosphit (1,1 Äquivalente) und N,N- Diisopropylaminotetrazolid (katalytische Menge) bei Raumtemperatur für 16 Stunden behandelt.
Die Reaktion wurde im Vakuum einkonzentriert und auf Silicagel (EtOAc/Hexan/TEA 6/4/1) chromatographiert, um 0,5 g der Titelverbindung zu ergeben. ³¹P NMR (200 MHz, CD₃CN) 150,87; (200 MHz, CDCL₃) 150,55, 150,83. ¹⁹F NMR (200 MHz, CD₃CN) 107,14, (200 MHz, CDCl₃) 102,67.
BEISPIEL 84
2'-O-(Butylphthalimid)adenosin
Die Titelverbindung wird wie in Beispiel 75 hergestellt, unter Verwendung von N-(4-Bromobutyl)phthalimid anstelle von 1-Bromopropan. Die Chromatographie auf Silicagel (EtOAc-MeOH) ergibt die Titelverbindung als weißen Feststoff. Schmp. 199– 200°C. Anal. berechnet C₂₂H₂₄N₆O₆: C, 56,42; H, 5,16; N, 17,94. Gefunden: C, 5631; H, 5,04; N, 17,95.
Die 3'-Verbindung kann von den Mutterflüssigkeiten wie im Beispiel 75 gezeigt, getrennt werden. ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 5,88 (d, 1H, C₁, H).
BEISPIEL 85
2'-O-(Butylphthalimid-N⁶-benzoyladenosin)
Benzoylierung von 2'-O-(Butylphathalimid)adenosin wie in Beispiel 76 ergab die Titelverbindung. ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 6,18 (d, 1H, C₁, H). Anal. berechnet C₂₉H₂N₆O₇: C, 60,83; H, 4,93; N, 14,68. Gefunden: C, 60,48; N, 14,41.
BEISPIEL 86
2'-O-(Butylphthalimid)-5'-O-dimethoxytrityl-N⁶-benzoyladenosin
Die Titelverbindung wurde aus 2'-O-(Butylphthalimid)-N⁶-benzoyladenosin wie in Beispiel 77 hergestellt. ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 6,20 (d, 1H, C₁, H). Anal. berechnet für C₅₀H₄₆N₆O₉: C, 68,64; H, 5,29; N, 9,60. Gefunden: C, 68,47; H, 5,12; N, 9,37.
BEISPIEL 87
N⁶-Benzoyl-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-(butylphthalimid)-3'-O-(N,N-düsopropyl-β-cyanoethyl)adenosinphosphoramidit
Die Titelverbindung wurde aus 2'-O-(Butylphthalimid)-5'-O-dimethoxytrityl-N⁶-benzoyladenosin wie in Beispiel 78 hergestellt. ³¹P NMR (CD₃CN) S 1580,88, 151,22.
BEISPIEL 88
2'-O-(Pentylphthalimido)adenosin
Die Titelverbindung wurde wie in Beispiel 75 hergestellt, unter Verwendung von N-(5-Bromopentyl)phthalimid. Das Rohmaterial aus der Extraktion wurde auf Silicagel unter Verwendung von CHCl₃/MeOH (95/5) chromatographiert, um eine Mischung der 2'- und 3'-Isomere zu ergeben. Das 2'-Isomer wurde aus EtOH/MeOH 8/2 umkristallisiert. Die Mutterlösung wurde über Silicagel wieder chromatographiert, um das 3'-Isomer zu ergeben.
2'-O-(Pentylphthalimido)adenosin: Schmp. 159–160°C. Anal. berechnet für C₂₃H₂₄N₆O₅: C, 57,26; H, 5,43; N, 17,42. Gefunden: C, 57,03; H, 5,46; N, 17,33.
3'-O-(Pentylphthalimido)adenosin: ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 5,87 (d, 1H, H-1').
BEISPIEL 89
2'-O-(Pentylphthalimido)-N⁶-benzoyladenosin
Benzoylierung von 2'-O-(Pentylphthalimido)adenosin wurde wie in dem Verfahren in Beispiel 76 durchgeführt, um die Titelverbindung zu ergeben. ¹H NMR (DMSO-d₆): 6,10 (d, 1H, C₁, H). Anal. berechnet für C₃₀H₃₀N₆O₇: C, 61,43; H, 5,16; N, 14,33. Gefunden: C, 61,51; H, 4,97; N, 14,10.
BEISPIEL 90
2'-O-(Pentylphthalimido)-5'-O-(dimethoxytrityl)-N⁶-benzoyladenosin
Die Titelverbindung wurde aus 2'-O-(Pentylphthalimid)-N⁶-benzoyladenosin gemäß den Verfahren in Beispiel 77 hergestellt. Chromatographie auf Silicagel (Ethylacetat, Hexan, Triethylamin) ergab die Titelverbindung. Anal. berechnet für C₅₁H₄₈N₆O₉: C, 68,91; H, 5,44; N, 9,45. Gefunden: C, 68,65; H, 5,45; N, 9,61.
BEISPIEL 91
N⁶-Benzoyl-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-(pentylphthalimido)-3'-(N,N-isopropyl-β-cyanoethyl)phosphoramidit
Die Titelverbindung wurde aus 2'-O-(Pentylpththalimid)-5'-O-(dimethoxytrityl)-N⁵-benzoyladensoin gemäß dem Verfahren von Beispiel 78 hergestellt, um die Verbindung als weißen Schaum zu ergeben.
BEISPIEL 92
2-Amino-2'-O-(propylphthalimid)adenosin und 2-Amino-3'-O-(propylphthalimid)adenosin
Die Lösung von 2-Aminoadenosin (75 g, 281 mmol) in trockenem Dimethylformamid (2000 ml) bei Raumtemperatur wurde Natriumhydrid 60% (13 g, 325 mmol) zugegeben. Nach einer Stunde wurde N-(3-Bromopropan)phthalimid (86,6 g, 3,23 mmol) zugegeben und die Temperatur wurde auf 40°C erhöht und für 16 Stunden beibehalten. Ein weiteres Aliquot von Natriumhydrid 60% (6,2 g, 155 mmol) und N-(3-Bromopropyl)phthalimid (40 g, 150 mmol) wurde zugegeben und das Erhitzen wurde für weitere 16 Stunden beibehalten. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt, mit MeOH gequencht und im Vakuum einkonzentriert. Der resultierende gummiartige Rückstand wurde auf Silicagel chromatographiert (CHCl₃/MeOH 9/1) um 53,3 g des 2'-Isomers (42%) zu ergeben. Diese Fraktionen, die das 3'-Isomer enthielten, wurden aus EtOAc/MeOH kristallisiert, um 20 g des 3'-Isomers zu ergeben (16%).
2-Amino-2'-O-(propylphthalimid)adenosin: ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 1,82 (m, 2H, CH₂), 3,35–3,63 (m, 4H, OCH₂, C₅, H₂), 3,91 (m, 1H, C₄, H), 4,26 (m, 1H, C₃, H), 4,39 (m, 1H, C₂, H), 5,10 (d, 1H, C₃, OH), 5,44 (t, 1H, C₅, OH), 5,77 (s, 2H, NH₂), 5,81 (d, 1H, C₁, H), 6,79 (bs, 2H, NH₂), 7,85 (bs, 4H, Ar) und 7,97 (s, 1H, C₈H). Anal. be rechnet für C₂₁H₂₃N₇O₆: C, 53,72; H, 4,94; N, 20,88. Gefunden: C, 53,70; H, 4,48; N, 20,56.
2-Amino-3'-O-(Propylphthalimid)adenosin: Schmp. 222–224°C, ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 5,69 (d, 1H, H-1').
BEISPIEL 93
2'-O-(Propylphthalimid)guanosin
2-Amino-2'-O-(propylphthalimid)adenosin (3.8,6 g, 82 mmol) wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO, 1000 ml) gelöst. Natriumphosphat (0,1 M, 63 ml) und Tris-Puffer (0,5 M, 1200 ml) wurden unter Rühren zugegeben. Die Lösung wurde auf einen pH von 7,0 mit Phosphorsäure eingestellt. Adenosindeaminase (Sigma, 1,7 g) wurde zugegeben und die Temperatur auf 35°C erhöht. Die Lösung wurde für 4 Tage gerührt mit einem zusätzlichen Aliquot von Adenosindeaminase (0,2 g), die alle 24 Stunden zugegeben wurde. Die Lösung wurde bei einem pH von 7,0 gehalten unter Zugabe von Phosphorsäure. Die Reaktion wurde gekühlt, filtriert und im Vakuum einkonzentriert. Der resultierende gummiartige Rückstand wurde aus MeOH kristallisiert, um 31,6 g der Titelverbindung (82%) zu ergeben. ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 1,82 (m, 2H, CH₂), 3,45 (m, 4H, OCH₂, C₅, H₂), 3,85 (m, 1H, C₄, H), 4,26 (m, 2H, C₃, H, C₂, H), 5,09 (M, 2H, C₃, OH, C₅OH), 5,80 (d, 1H, C₁, H), 6,47 (s, 2H, NH₂), 7,84 (s, 4H, Ar), 7,97 (s, 1H, C₈H) und 10,65 (s, 1H, ArNH). Anal. berechnet für C₂₁H₂₁N₆O₇: C, 53,72; H, 4,94; N, 20,88. Gefunden: C, 54,02; H, 4,73; N, 20.53.
BEISPIEL 94
2'-O-(Propylamino)guanosin
2'-O-(Propylphthalimid)guanosin wurde gemäß dem Verfahren in Beispiel 79 in Wasser/Methanol als Lösungsmittel behandelt, um die Titelverbindung in 91% Ausbeute zu ergeben. ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 1,80 (m; 2H, CH₂, 3,35–3,70 (m, 4H, OCH₂, C₅, H₂), 3,85 (m, 1H, C₄, H), 4,27 (m, 2H, C₃, H, C₂, H), 5,10 (m, 2H, C₃, OH, C₅, OH), 5,78 (d, 1H, C₁, H), 6,49 (s, 2H, NH₂) und 7,97 (s, 1H, C₈H).
BEISPIEL 95
2'-O-[3-(N-Trifluoroacetamido)propyl]guanosin
2'-O-(Propylamino)guanosin wurde gemäß dem Verfahren in Beispiel 80 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 96
N²-(Dibenzoyl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetamido)propyl]guanosin
2'-O-[3-(N-trifluoroacetamido)propyl]guanosin wurde gemäß dem Verfahren in Beispiel 81 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 97
N²-(Dibenzoyl)-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetamido)propyl]guanosin
N²-(Dibenzoyl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetamido)propyl]guanosin wurde gemäß dem Verfahren in Beispiel 82 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 98
N²-(Dibenzoyl)-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetamido)propyl]-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethyl)guanosinphosphoramidit
N²-(Dibenzoyl)-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetamido)propyl]guanosin wurde gemäß dem Verfahren in Beispiel 83 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben. ³¹P NMR (CDCl₃) 150,49, 150,91. ¹⁹F NMR (CDCl₃) 102,71, 102,75.
BEISPIEL 99
2'-O-(Propylphthalimid)uridin und 3'-O-(Propylphthalimid)uridin
Eine Lösung von Uridin-Zinn-Komplex (hergestellt wie in Beispiel 3) (48,2 g, 115 mmol) in trockenem DMF (150 ml) und N-(3-Bromopropyl)phthalimid (46 g, 172 mmol) wurden bei 130°C für 6 Stunden erhitzt. Das Rohprodukt wurde direkt auf Silicagel CHCl₃/MeOH 95/5 chromatographiert. Das Isomerverhältnis der gereinigten Mischung betrug 2'/3' 81/19. Das 2'-Isomer wurde durch Kristallisation aus MeOH erhalten. Das Filtrat wurde auf Silicagel wieder chromatographiert unter Verwendung von CHCl₃→CHCl₃/MeOH (95/5) und ergab das 3'-Isomer als einen Schaum.
2'-O-(Propylphthalimid)uridin: Analytische Probe rekristallisiert aus MeOH, Schmp. 165.5–166.5°C, ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 1,87 (m, 2H, CH₂), 3,49–3,65 (m, 4H, C₂, H), 3,80–3,90 (m, 2H, C₃, H₁C₄, H), 4,09 (m, 1H, C₂, H), 5,07 (d, 1H, C₃, OH), 5,16 (m, 1H, C₅, OH), 5,64 (d, 1H, CH=), 7,84 (d, 1H, C₁, H), 7,92 (bs, 4H, Ar), 7,95 (d, 1H, CH=) und 11,33 (s, 1H, ArNH). Anal. berechnet C₂₀H₂₁N₃H₈; C, 55,69; H, 4,91; N, 9,74. Gefunden: C, 55,75; H, 5,12; N, 10,01.
3'-O-(Propylphthalimid)uridin: ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 5,74 (d, 1H, H-1').
BEISPIEL 100
2-O-(Propylamino)uridin
Die Titelverbindung wurde wie im Verfahren von Beispiel 79 (90% Ausbeute) hergestellt. ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 1,80 (m, 2H, CH₂), 3,57–3,66 (m, 4H, OCH₂, C₅, H₂), 3,88 (m, 2H, C₃, H, C₄, H), 4,15 (m, 1H, C₂, H), 5,64 (d, 1H, CH=), 5,82 (d, 1H, C₁, H), 7,02 (bs, 2H, NH₂) und 8,00 (d, 1H, C₈H).
BEISPIEL 101
2'-O-[3-(N-Trifluoroacetamido)propyl]uridin
2'-O-(Propylamino)uridin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 80 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben. ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 1,75 (m, 2H, CH₂), 3,22–3,36 (m, 2H, CH₂NH), 3,38–3,67 (m, 4H, OCH₂, C₅, H₂), 5,16 (m, 2H, C₃, OH, C₅, OH), 5,67 (d, 1 H, CH=), 7,95 (d, 1 H, CH=), 9,34 (bs, 1 H, NHCO) und 11,36 (s, 1H, ArNH). ¹⁹F NMR (200 MH, DMSO) 108,76. Anal. berechnet für C₁₄H₁₈F₃N₃O₇: C, 42,31; H, 4,56; N, 10,60. Gefunden: C, 42,56; H, 4,61; N, 10,25.
BEISPIEL 102
5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetamido)propyl]uridin
2'-O-[3-(N-Trifluoroacetamido)propyl]uridin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 82 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben. ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 1,95 (m, 2H, CH₂), 3,42–3,80 (m, 12H, ArOCH₃, OCH₂, C₅, H₂), 4,03 (m, 2H, C₂, H), 4,45 (m, 1H, C₃, OH), 5,30 (d, 1H, CH=), 5,91 (s, 1H, C₃, H), 6,83–7,43 (m, 13H, ArH), 7,90 (bs, 1H, NHCO), 8,10 (d, 1H, CH=) und 10,3 (s, 1H, ArNH). ¹⁹F NMR (200 MHz, DMSO) 102,75.
BEISPIEL 103
5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetamido)propyl]-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethyl)uridinphosphoramidit
5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetamido)propyl]uridin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 83 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben. ³¹P NMR (200 MHz, CD₃CN) 154,87, 155,62. ¹⁹F NMR (200 MHz, CD₃CN) 107,19.
BEISPPEL 104
2'-O-(Propylphthalimid)cytidin und 3'-O-(Propylphthalimid)cytidin
Die Titelverbindungen wurden gemäß der Verfahren in Beispiel 75 hergestellt.
2'-O-(Propylphthalimid)cytidin: ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 5,82 (d, 1H, C₁, H).
3'-O-(Propylphthalimid)cytidin: ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 5,72 (d, 1H, C₁H).
BEISPIEL 105
2'-O-(Propylamino)cytidin
2'-O-(Propylphthalimid)cytidin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 79 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben. ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 5,82 (d, 1H, C₁, H).
BEISPIEL 106
2'-O-[3-(N-Trifluoroacetamido)propyl]cytidin
2'-O-(Propylamino)cytidin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 80 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben. ¹⁹F NMR (DMSO-d₆) 108,73.
BEISPIEL 107
N⁴-(Benzoyl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetamido)propyl]cytidin
2'-O-[3-(N-Trifluoroacetaomido)propyl]cytidin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 81 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben. ¹⁹F NMR (DMSO-d₆) 108,79.
BEISPIEL 108
N⁴-(Benzoyl)-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-[3-(N-trifiuoroacetamdio)propyl]cytidin
N⁴-(Benzoyl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetamido)propyl]cytidin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 82 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 109
N⁴-(Benzoyl)-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetamdio)propyl]-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethyl)cytidinphosphoramidit
N⁴-(Benzoyl)-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-[3-(N-trifluoroacetamido)propyl]cytidin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 83 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben. ³¹P NMR (CDCl₃) 150,03, 151,36. ¹⁹F NMR (CDCl₃) 102, 76.
BEISPIEL 110
2'-O-[3-(Imidizo-1-yl)propyl]adenosin
Die Titel 2'-O-substutierte Verbindung wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 75 hergestellt, unter Verwendung von 1-(4-Bromopropyl)imidazol. ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 6,02 (d, 1H, C₁, H).
Die entsprechende 3'-O-substituierte Verbindung kann von den Mutterflüssigkeiten wie in Beispiel 75 getrennt werden. ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 5,91 (d, 1H, C₁, H).
BEISPIEL 111
2'-O-[4-(Imidizo-1-yl)butyl)]adenosin und 3'-O-[4-(Imidizo-1-yl)butyl]adenosin
Eine Lösung von Adenosin (6,97 g, 26 mmol) in trockenem DMF (250 ml) wurde mit NaH 60% (3,9 g, 97 mmol) für 15 Minuten behandelt. N-(4-Bromobutyl)imidazolinacetatsalz (9,4 g, 2,1 Äquivalente HOAc, 29 mmol) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 2 Tage gerührt. Die Reaktion wurde gequenscht (MeOH) und irren Vakuum zu einem Halbfeststoff einkonzentriert. Der Feststoff wurde im Wasser gelöst (250 ml) und mit EtOAc extrahiert (2 × 100 ml). Die wässrige Phase wurde im Vakuum einkonzentriert und auf Silicagel unter Verwendung von EtAOc/MeOH (6/4) chromatographiert, um eine Mischung von 2'- und 3'-Isomeren (70/30, 62%) zu ergeben. Die Kristallisation dieses Feststoffs auf EtOAc/MeOH 8/2 ergab das 2'-Isomer. Eine Konzentration der Mutterflüssigkeit und nachfolgende Kristallisation aus MeOH lieferte das 3'-Isomer in 12% Ausbeute.
2'-O-[4-(Imidizo-1-yl)butyl]adenosin: ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 6,01 (d, 1H, C₁H).
3'-O-[4-(Imidizo-1-yl)butyl]adenosin: Schmp. 183–184°C. ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 5,89 (d, 1H, H-1').
BEISPIEL 112
2'-O-[4-(Imidizo-1-yl)butyl]-N⁶-benzoyladenosin
Die Titelverbindung wurde aus 2'-O-[4-(Imidizo-1-yl)butyl]adenosin gemäß Beispiel 76 hergestellt.
BEISPIEL 113
2'-O-[4-(Imidizo-1-yl)butyl]-5'-O-dimethoxytrityl-N⁶-benzoyladenosin
Die Titelverbindung wurde aus N⁶-Benzoyl-2'-O-[4-(imidizo-1-yl)butyl]adenosin gemäß Beispiel 77 hergestellt.
BEISPIEL 114
N⁶-Benzoyl-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-[4-(imidizo-1-yl)butyl]-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethyl)adenosinphosphatamidit
Die Titelverbindung wurde aus 2'-O-[4-(Imidizo-1-yl)butyl]-5'-O-dimethoxytrityl-N⁶-benzoyladenosin gemäß Beispiel 78 hergestellt. ³¹P NMR (CDCl₃) 150,48, 151,06.
BEISPIEL 115
2-Amino-2'-O-[4-(imidizo-1-yl)butyl]adenosin und 2-Amino-3'-O-[4-(imidizo-1-yl)butyl]adenosin
Die Titelverbindungen wurden gemäß Beispiel 111 mit der Substitution von 2-Aminosadenosin für Adenosin hergestellt. Das Isomerverhältnis von 2'/3' betrug 74/26.
2-Amino-2'-O-[4-(imidizo-1-yl)butyl]guanosin: ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 5,84 (d, 1H, C₁, H).
2-Amino-3'-O-[4-(imidizo-1-yl)butyl]guanosin: ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 5,68 (d, 1H, C₁, H).
BEISPIEL 116
2'-O-[4-(Imidazo-1-yl)butyl]guanosin
In der Art wie in Beispiel 93 beschrieben, wurde 2-Amino-2'-O-[4-(imidazo-1-yl)butyl]adenosin in Natriumphosphat (0,1 M) und Tris-Puffer (0,5 M) beim pH von 7,0 mit Adenosindeaminase (Sigma) bei 35°C deaminiert, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 117
N²-(Dibenzoyl)-2'-O-[4-(imidazo-1-yl)butyl]guanosin
2'-O-[4-(Imidazo-1-yl)butyl]guanosin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 81 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 118
N²-(Dibenzoyl)-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-[4-(imidazo-1-yl)butyl]guanosin
N²-(Dibenzoyl)-2'-O-[4-(imidazo-1-yl)butyl]guanosin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 82 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 119
N²-(Dibenzoyl)-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-(4-(imidazo-1-yl)butyl]-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethyl)guanosinphosphoramidit
N²-(Dibenzoyl)-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-[4-(imidazo-1-yl)butyl]guanosin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 83 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben. ³¹P NMR (CDCl₃) 150,67, 150,80.
BEISPIEL 120
2'-O-(4-(Imidizo-1-yl)butyl]cytidin und 3'-O-[4-(Imidizo-1-yl)butyl]cytidin
Die Titelverbindungen wurden gemäß dem Verfahren in Beispiel 111 hergestellt mit der Substitution von Cytidin für Adenosin. Das Rohprodukt wurde auf Silicagel unter Verwendung von EtOAc/MeOH/HOAc hergestellt. Das Isomerverhältnis von 2'/3' betrug 60/40.
2'-O-[4-(Imidizo-1-yl)butyl]cytidin: ¹H NMR (200 MHz, DMO-d₆) δ 5,88 (d, 1H, C₁, H).
3'-O-[4-(Imidizo-1-yl)butyl]cytidin: ¹H NMR (200 MHz, DMO-d₆) δ 5,78 (d, 1H, H'1').
BEISPIEL 121
2'-O-[4-(Imidizo-1-yl)butyl]-N⁴-benzoylcytidin
Die Titelverbindung wurde aus 2'-O-[4-(Imidizo-1-yl)-butyl]cytidin gemäß Beispiel 76 hergestellt.
BEISPIEL 122
2'-O-[4-(Imidizo-1-yl)butyl]-5'-O-dimethoxytrityl-N⁴-benzoylcytidin
Die Titelverbindung wurde aus N⁴-Benzoyl-2'-O-[4-(imidizo-1-yl)butyl]cytidin gemäß Beispiel 77 hergestellt.
BEISPIEL 123
N⁴-Benzoyl-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-[4-(imidizo-1-yl)butyl]-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethyl)cytidinphoshoramidit
Die Titelerbindung wurde aus 2'-O-[4-(Imidizo-1-yl)butyl]-5'-O-dimethoxytrityl-N⁴-benzoylcytidin gemäß Beispiel 78 hergestellt. ³¹P NM (CDCl₃) 150,39, 150,92.
BEISPIEL 124
3-Benzyloxymethyl-5-methyluridin
Eine Lösung von 5-Methyluridin (51,6, 200 mmol) in DMF (100 ml) wurde mit Natriumhydrid behandelt (60% Öl, 9,9 g, 248 mmol). Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde tropfenweise Benzylchloromethylether (34,4 g, 220 mmol) zugegeben und die Reaktionsmischung auf 35°C für 4 Stunden erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt, mit MeOH gequencht (5 ml), filtriert und im Vakuum einkonzentriert. Der resultierende gummiartige Rückstand wurde zwischen EtOAc/gesättigter NaCl partitioniert, getrennt, getrocknet und die organische Phase einkonzentriert, wobei die Titelverbindung auskristallisierte. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 5,83 (d, 1H, C₁, -H).
BEISPIEL 125
3-Benzyloxymethyl-5-methyl-2'-O-(4-chlorobutyl)uridin
Eine Lösung von 3-Benzyloxymethyl-5-methyluridin (25,9 g, 68 mmol) wurde mit NaH behandelt (60% Öl, 7,9 g, 200 mmol) über 1 Stunde bei Raumtemperatur. 1-Bromo-4-chlorbutan (19,7 g, 115 mmol) wurde langsam zugegeben und die Reaktion bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde anschließend quenscht (MeOH), im Vakuum einkonzentriert und der Rückstand auf Silicagel CHCl₃/MeOH 95/5 chromatographiert, um die Titelverbindung in 41% Ausbeute zu ergeben. ¹H NMR (DMS-d₆) δ 5,87 (d, 1H, C₁, H).
BEISPIEL 126
3-Benzyloxymethyl-5-methyl-2'-O-[4-(imidazo-1-yl)butyl]uridin
Zu einer Lösung von Imidazol (6,8 g, 100 mmol) in DMF (150 ml) wurde NaH zugegeben (60% Öl, 4 g, 100 mmol). Nach 4 Stunden wurde zu dieser Suspension eine Suspension von 3-Benzyloxymethyl-5-methyl-2'-O-(4-chlorobutyl)uridin (8,7 g, 18 mmol), Nal (2,6 g) und DMF (200 ml) zugegeben. Die Reaktion wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, mit MeOH gequenscht, im Vakuum einkonzentriert und der Rückstand auf Silicagel CHCl₃/MeOH 85/15→50/50 chromatographiert, um die Titelverbindung in 31% Ausbeute zu ergeben. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 5,87 (d, 1H, C₁, H).
BEISPIEL 127
2'-O-[4-(Imidazo-1-yl)butyl]-5-methyluridin
Eine Lösung von 3-Benzyloxymethyl-5-methyl-2'-O-[4-(imidazo-1-yl)butyl]uridin (5,4 g, 10 mmol) in MeOH (200 ml) wurde mit 20% Palladiumhydroxid (9,0 g) unter 1 Atmosphäre H₂ für 16 Stunden hydriert. Die Reaktion wurde über Celit filtriert und die Mutterlösung einkonzentriert, um das Produkt in 83% Ausbeute zu ergeben. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 5,86 (d, 1H, C₁, H).
BEISPIEL 128
5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[4-(imidazo-1-yl)butyl]-5-methyluridin
5-Methyl-2'-O-[4-(imidazo-1-yl)butyl]uridin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 77 behandelt, um die Titelverbindung in 91% Ausbeute zu ergeben. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 5,86 (d, 1H, C₁, H).
BEISPIEL 129
5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-[4-(imidazo-1-yl)butyl]-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethyl)-5-methyluridinphosphoramidit
5'-O-(Dimethoxytrityl)-5-methyl-2'-O-[4-(imidazo-1-yl)butyl]uridin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 78 behandelt, um die Titelverbindung in 83% Ausbeute zu ergeben. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 5,85 (d, 1H, C₁, H). ³¹P NMR (DMSO-d₆) 153,99, 154,45.
BEISPIEL 130
Auswirkung der Derivatisierung auf die Schmelztemperatur
Es wurden Schmelztemperaturen (Tm) für eine Vielzahl von modifizierten erfindungsgemäßen Oligonukleotiden gemäß der im Verfahren B(1)(b) Methode bestimmt. Die erhaltenen Daten sind in den Tabellen 5 bis 8 gezeigt, wobei alle aufgeführten Oligonukleotide 2'-Deoxyzucker und Phosphodiesterbackbones enthalten, soweit es nicht anders angegeben ist.
Tabelle 5 zeigt die Änderung im Tm, die aufgrund der Modifizierung der 2'-Stellung von Adenosinnukleotiden resultieren und die eine Vielzahl von Substituentengruppen umfassen. Beispielsweise zeigt der erste Eintrag, dass die Einführung eines 2'-O-Aminopropyladenosin-Substituenten an zwei Adenosinnukleotiden in einem Heteroduplex resultierte, der eine Tm hatte, die 1,13°C größer ist als der Heteroduplex, der durch einen unmodifizierten Oligonukleotid mit der gleichen Sequenz gebildet wurde.
Tabelle 6 zeigt die Änderungen in der Tm, die durch die Modifikation von ein oder meheren 2'- und 3'-Stellungen an den angegebenen Stammoligonukleotiden zum Einschluss von Linkern und Pyren-Konjugaten resultieren. Diese Modifizierungen wurden terminal und intern gemacht (d. h. nicht-terminal) Stellungen innerhalb des Oligonukleotids. Die Bezeichnung "PS" bezeichnet die Gegenwart eines Phosphorthioatbackbones und die Bezeichnung "2'-5'-Verknüpfung" bezeichnet 2'-5'-Interzuckerverknüpfungen. Wie aus dem ersten Eintrag ersichtlich ist, resultierte die Einführung eines 2'-Aminopentoxylinkers zu einem einzigen, internen Adenonnukleotid des Stammoligonukleotids und führte zu einer Tm-Abnahme von 3,1°C, wohingegen die Einführung eines 2'-Pyrenyaminopentoxy-Konjugats in einer Tm-Zunahme von 3,3°C resultierte.
Die Tabellen 7a–c zeigen die Änderungen in der Tm, die aufgrund der Modifikation an ein oder mehreren Stellungen der angegebenen Stammoligonukleotide zum Einschluss von Linkern und Cholat oder Cholesterol-Konjugate resultieren. Wie aus dem ersten Eintrag ersichtlich ist, führt die Einführung eines Aminolinkers an der 3'-Stellung eines einzigen terminalen Nukleotids des Stammphosphorthioatoligonukleotids zu einer Tm-Erhöhung von 1,3°C und die Zugabe einer Cholat-Gruppe zum Linker resultiert in einer weiteren Tm-Zunahme von 1,1°C.
Die Tabelle 8 zeigt die Änderungen in der Tm, die aufgrund der Modifikation von ein oder mehreren 3'-Stellungen der angegebenen Stammoligonukleotide zum Einschluss von Linkern und PEG-Konjugaten resultieren. Die Einträge unter dem Begriff "PEG gegen nicht modifiziert" stellen vorläufige Befunde dar. Wie ersichtlich ist, zeigt der erste Eintrag, dass die Einführung eines Aminolinkers an der 3'-Stellung eine einfachen terminalen Nukleotids am Stammphosophodesteroligonukleotid in einer Tm-Zunahme von 0,9°C resultierte und die Zugabe von einer PEG 550-Gruppe zum Linker änderte nicht den Tm des entstehenden Produkts.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verbindung, umfassend eine Vielzahl von verknüpften Nucleosiden, wobei jedes Nucleosid einen Ribofuranosyl-Zuckerteil und einen Basenteil einschließt und mindestens eines der Nucleoside an einer 3'-O-Position oder einer 5'-O-Position einen Substituenten mit der Formel trägt: -R_A-N(R_1a)(R_1b) wobei R_A ein Alkylrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder (CH₂-CH₂-Q)_x ist, R_1a und R_1b so gewählt sind, daß R_1a H ist, R₂ eine Aminschutzgruppe ist oder die Formeln C(X)-R₂, C(X)-R_A-R₂, C(X)-Q-R_A-R₂ oder C(X)-Q-R₂ aufweist, R_1b R₂, eine Aminschutzgruppe ist oder die Formeln C(X)-R₂, C(X)-R_a-R₂, C(X)-Q-R_A-R₂ oder C(X)-Q-R₂ aufweist oder R_1a und R_1b zusammen eine Cycloalkyl- oder Cycloaryleinheit mit 2 bis sechs Kohlenstoffatomen und einem oder zwei Stickstoffatomen vervollständigen, R₂ ein Folat, ein Steroidmolekül, ein Reportermolekül, ein lipophiles Molekül, ein Reporterenzym, ein Peptid, ein Protein ist oder die Formel -Q-(CH₂CH₂-Q-)_x-R₃ aufweist, X O oder S ist, jedes Q unabhängig NH, O oder S ist, x 1 bis 200 ist, R₃ H, R_A, C(O)OH, C(O)OR_A, C(O)R₄, R_A-N₃ oder R_A-NH₂ ist, R₄ Cl, Br, I, SO₂R₅ ist oder die Struktur aufweist:
m 2 bis 7 ist und R₅ ein Alkylrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei mehr als eines der Nucleoside den Substituenten an einer 2'-O-Position, einer 3'-O-Position oder einer 5'-O-Position trägt.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R_A (CH₂)_n ist, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R_1a und R_1b zusammen Phthalimid sind.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R_1a H ist und R_1b R₂ ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R_1a H ist und R_1b C(O)-O-R₂ ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R_1a H ist und R_1b C(O)-(CH₂)_n-R₂ ist, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R_1a H und R_1b C(S)-NH-R₂ ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₂ Pyren, Fluorescein, Dinitrophenyl, Cholesterol, Acridin einschließt.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R_1a H ist und R_1b C(O)-R₂ ist.
Verbindung nach Anspruch 10, wobei R₂ die Formel -O-(CH₂CH₂-O-)_x-R₃ aufweist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei eine 3'-Position von mindestens einem der Nucleoside mit einer 5'-Position eines benachbarten Nucleosids verknüpft ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei eine 2'-Position von mindestens einem der Nucleoside mit einer 5'-Position eines benachbarten Nucleosids verknüpft ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R_A eine Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist und R_1a und R_1b zusammen eine Cycloaryleinheit mit zwei bis sechs Kohlenstoffatomen und einem oder zwei Stickstoffatomen vervollständigen.
Verbindung nach Anspruch 14, wobei R_A Butyl ist und R_1a und R_1b zusammen Imidazol sind.
Nucleosid, umfassend einen Ribofuranosyl-Zuckerteil und einen Basenteil, wobei das Nucleosid an einer 3'-O-Position oder einer 5'-O-Position einen Substituenten mit der Formel: -R_A-N(R_1a)(R_1b) trägt, wobei R_A eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, R_1a und R_1b unabhängig voneinander H, R₂, R_A oder eine Aminschutzgruppe sind oder die Formel C(X)-R₂, C(X)-R_A-R₂, C(X)-Q-R_A-R₂, C(X)-Q-R₂ aufweisen, R₂ ein Folat, ein Steroidmolekül, ein Reportermolekül, ein lipophiles Molekül, ein Reporterenzym, ein Peptid, ein Protein ist oder die Formel -Q-(CH₂CH₂-Q-)_x-R₃ aufweist, X O oder S ist, jedes Q unabhängig voneinander NH, O oder S ist, x 1 bis 200 ist, R₃ H, R_A, C(O)OH, C(O)OR_A, C(O)R₄, R_A-N₃ oder R_A-NH₂ ist und R₄ Cl, Br, I, SO₂R₅ ist oder die Struktur aufweist:
m 2 bis 7 ist und R₅ eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, mit der Maßgabe, daß wenn einer von R_1a oder R_1b H ist, der andere von R_1a oder R_1b nicht H ist.
Nucleosid nach Anspruch 16, wobei R_A (CH₂)_n ist, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
Nucleosid nach Anspruch 16, wobei R_1a und R_1b zusammen Phthalimid sind.
Nucleosid nach Anspruch 16, wobei R_1a H ist und R_1b C(O)-(CH₂)_n-R₂ ist, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
Nucleosid nach Anspruch 16, wobei R_1a H ist und R_1b R₂ ist.
Nucleosid nach Anspruch 16, wobei R_1a H ist und R_1b C(O)-O-R₂ ist.
Nucleosid nach Anspruch 16, wobei R_1a und R_1b beide Alkylgruppen sind.
Nucleosid nach Anspruch 16, wobei R_1a H ist und R_1b C(S)-NH-R₂ ist.
Nucleosid nach Anspruch 16, wobei R₂ Pyren, Fluorescein, Dinitrophenyl, Cholesterol, Acridin einschließt.
Nucleosid nach Anspruch 16, wobei R_1a H ist und R_1b C(O)-R₂ ist.
Nucleosid nach Anspruch 25, wobei R₂ die Formel -O-(CH₂CH₂-O-)_x-R₃ aufweist.
In-vitro-Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit einer RNA in einer biologischen Probe, von der angenommen wird, die RNA zu enthalten, umfassend das Kontaktieren der Probe mit einer Verbindung nach Anspruch 1.
In-vitro-Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit einer RNA in einer biologischen Probe, von der angenommen wird, die RNA zu enthalten, umfassend das Kontaktieren der Probe mit einem Nucleosid nach Anspruch 16.