DE69133405T2 - Oligonukleotidderivate zur detektieren und modulation von rna aktivität und genexpression - Google Patents

Oligonukleotidderivate zur detektieren und modulation von rna aktivität und genexpression Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Materialien und Verfahren zum Nachweis und zur Modulation der RNA-Aktivität. Die Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der „Antisense"-Verbindungen, d. h. Verbindungen, die zur spezifischen Hybridisierung mit einer Nukleotidsequenz einer RNA in der Lage sind. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung das Design, die Synthese und die Anwendung von Oligonukleotiden und Verfahren zum Erzielen einer therapeutischen Krankheitsbehandlung, zum Regulieren der Genexpression in experimentellen Systemen, zum Untersuchen von RNA und RNA-Produkten durch die Verwendung von Antisense-Wechselwirkungen mit einer derartigen RNA, zur Diagnose von Krankheiten, zum Modulieren der Herstellung von Proteinen und zum ortsspezifischen Spalten von RNA.
  • Es ist gut bekannt, dass die meisten der körperlichen Zustände in Säugern, einschließlich der meisten Krankheitszustände, durch Proteine bewirkt werden. Derartige Proteine, die entweder direkt oder durch ihre enzymatischen Funktionen wirken, tragen den Hauptanteil an vielen Krankheiten in Tieren und Menschen. Die klassische Therapeutik hat sich im Allgemeinen auf die Wechselwirkungen mit derartigen Proteinen in dem Bemühen konzentriert, ihre krankheitsverursachende oder krankheitsverstärkende Wirkungen zu mildern. In letzter Zeit wurden jedoch Versuche unternommen, die eigentliche Herstellung derartiger Proteine durch Wechselwirkungen mit Molekülen zu bremsen, die ihre Synthese lenken, nämlich intrazellulärer RNA. Es wurde erhofft, dass durch ein Eingreifen in die Proteinherstellung, therapeutische Ergebnisse mit maximaler Wirkung und minimalen Nebenwirkungen bewirkt werden können. Das allgemeine Ziel derartiger therapeutischer Methoden ist es, die Genexpression, die zu der unerwünschten Proteinbildung führt, zu stören oder diese zu modulieren.
  • Ein Verfahren zum Hemmen einer spezifischen Genexpression ist die Verwendung von Oligonukleotiden und Oligonukleotidanaloga als „Antisense"-Wirkstoffe. Es werden Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloga, die zu einer spezifischen Ziel-Messenger-RNA, mRNA-Sequenz komplementär sind, verwendet. Eine Anzahl von Forschern haben über derartige Versuche berichtet. Relevante Übersichtsartikel um fassen C. A. Stein & J. S. Cohen, Cancer Research, Band 48, Seiten 2659–2668 (1988); J. Walder, Genes & Development, Band 2, Seiten 502–504 (1988); C. J. Marcus-Sekura, Anal. Biochemistry, Band 172, 289–295 (1988); G. Zon, Journal of Protein Chemistry, Band 6, Seiten 131–145 (1987); G. Zon, Pharmaceutical Research, Band 5, Seiten 539–549 (1988); A. R. Van der Krol, J. N. Mol & A. R. Stuitje, BioTechniques, Band 6, Seiten 958–973 (1988) und D. S. Loose-Mitchell, TIPS, Band 9, Seiten 45–47 (1988). Jeder der vorstehenden Verweise stellt einen Hintergrund zur Verfügung, der die allgemeine Antisense-Theorie und Techniken aus dem Stand der Technik betrifft.
  • Daher betraf die Antisense-Methodologie die komplementäre Hybridisierung von relativ kurzen Oligonukleotiden an eine einzelsträngige mRNA oder einzelsträngige DNA so, dass die normalen, wesentlichen Funktionen dieser intrazellulären Nukleinsäuren gespalten werden. Eine Hybridisierung ist die sequenzspezifische Wasserstoffbindung von Oligonukleotiden an Watson-Crick-Basenpaare einer RNA oder einzelsträngigen DNA. Derartige Basenpaaren heißen zueinander komplementär.
  • Frühere Versuche bei der Antisense-Therapie stellten Oligonukleotide oder Oligonukleotdianaloga zur Verfügung, die so entworfen wurden, dass sie auf spezifische Art an eine spezifische mRNA durch Hybridisierung binden, oder mit ihr spezifisch hybridisierbar sind. Derartige Analoga sollen durch jeden aus einer Zahl von Mechanismen die Aktivität der ausgewählten mRNA hemmen und Translationsreaktionen stören, durch die Proteine hergestellt werden, die von der mRNA kodiert werden. Es wurde gehofft, dass die Hemmung der Bildung der spezifischen Proteine, die die gestörten mRNA-Sequenzen kodieren, zu therapeutischen Nutzen führt.
  • Eine Anzahl chemischer Modifikationen wurde in Antisense-Oligonukleotide eingeführt, um ihre therapeutische Aktivität zu erhöhen. Derartige Modifikationen wurden so entworfen, dass das Eindringen der Antisense-Oligonukleotide in die Zelle zunimmt, dass sie gegen Nukleasen und gegen andere Enzyme, die abbauen oder die Struktur oder Aktivität der Oligonukleotidanaloga im Körper stören, stabilisiert werden, dass ihre Bindung an eine Ziel-RNA verstärkt wird, dass ein Abbruchmodus (Abbruchereignis) zur Verfügung gestellt wird, sobald eine Sequenz spezifisch an eine Ziel-RNA gebunden hat, und dass ihre pharmakokinetischen Eigenschaften ver bessert werden. Derzeit wurde jedoch kein verallgemeinertes therapeutisches oder diagnostisches Antisense-Oligonukleotid-Schema gefunden. Der schwerste Mangel bei den früheren Bemühungen war das vollständige Fehlen eines Abbruchereignisses, sobald eine geeignete Hybridisierung stattfindet, oder das Vorhandensein von nur einem Abbruchereignis, das so ineffizient ist, dass aufgrund der Unfähigkeit von Oligonukleotiden, von Zellen in wirksamen Konzentrationen aufgenommen zu werden, keine verwendbare Wirkung erreicht werden kann. Die Aktivität der derzeit verfügbaren Antisense-Oligonukleotide war für eine wirksame Verwendung als Forschungsreagenz, für eine therapeutische oder für eine diagnostische Verwendung im praktischen Sinne nicht ausreichend. Dementsprechend gab und gibt es weiterhin einen lange bemerkten Bedarf an Oligonukleotiden und Oligonukleotidanaloga, die zu einer wirksamen therapeutischen und diagnostischen Antisense-Verwendung in der Lage sind.
  • Dieser lange bemerkte Bedarf wurde durch die frühere Arbeit auf dem Gebiet der Antisense-Oligonukleotidtherapie und -diagnostik nicht befriedigt. Es gelang anderen nicht, Materialien zur Verfügung zu stellen, die bei vernünftigen Anwendungsgeschwindigkeiten gleichzeitig therapeutisch oder diagnostisch wirksam sind.
  • Anfänglich wurde geglaubt, dass nur zwei Mechanismen oder Abbruchereignisse in der Antisense-Methode für eine Therapie wirksam sind. Diese sind der Hybridisierungsabbruchmechanismus und die Spaltung der hybridisierten RNA durch das Zellenzym, Ribonuclease H (RNase H). Es ist jedoch wahrscheinlich, dass zusätzliche „natürliche" Ereignisse mit der Spaltung der Ziel-RNA zu tun haben.
  • Diese natürlich auftretenden Ereignisse werden von Cohen in Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1989) erörtert. Das erste, der Hybridisierungsabbruch bezeichnet das Abbruchereignis, bei dem der Oligonukleotidinhibitor an die Zielnukleinsäure bindet und somit durch einfache sterische Hinderung das Binden wesentlicher Proteine, meistens Ribosomen, an die Nukleinsäure verhindert. Methylphosphonatoligonukleotide; P. S. Miller & P. O. P. Ts'O, Anti-Cancer Drug Design, 2: 117–128 (1987) und α-Anomeroligonukleotide sind die zwei umfassendsten untersuchten Antisense-Mittel, von denen angenommen wird, dass sie die Nukleinsäurefunktion durch Hybridisierungsabbruch hemmen.
  • Das zweite Abbruchereignis „natürlicher" Art ist die Aktivierung von RNase H durch den zwischen dem Oligonukleotid vom DNA-Typ und der Ziel-RNA gebildeten Heteroduplex mit nachfolgender Spaltung der Ziel-RNA durch das Enzym. Das Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon, das vom Desoxyribo-Typ sein muss, hybridisiert mit der Ziel-RNA und dieser Duplex aktiviert das RNase H-Enzym zum Spalten des RNA-Strangs, wodurch die normale Funktion der RNA zunichte gemacht wird. Phosphorthioatoligonukleotide sind die bekanntesten Beispiele für Antisense-Mittel, von denen angenommen wird, dass sie durch diese Art des Antisense-Abbruchereignisses wirksam sind. R. Y. Walder und J. A. Walder, in Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., Band 85, Seiten 5011–5015 (1988) und C. A. Stein, C. Subasinghe, K. Shenozuka und J. Cohen, in Nucleic Acids Research, Band 16, Seiten 3209–3221 (1988) beschreiben die Rolle, die die RNase H bei der Antisense-Methode spielt.
  • Zur Erhöhung der Wirksamkeit über die „natürlichen" Abbruchereignisse ist die Modifikation an den Phosphoratomen die am häufigsten verwendete Oligonukleotidmodifikation. Ein Oligonukleotidanalogon, das in dem Bemühen zur Sicherung der Hybridisierungsabbrüche entwickelt worden ist, ist ein Methylphosphonatoligonukleotid. Über derartige Analoga von Oligonukleotiden, Analoga dem Sinne, dass die übliche Struktur des Oligonukleotids zu einer oder mehreren Methylphosphonat-substituierten Strukturen modifiziert worden ist, wurde umfassend berichtet. Eine Zahl von Autoren, umfassend, K. L. Agarwal & F. Riftina, Nucleic Acids Research, Band 6, Seiten 3009–3024 (1979); P. S. Miller, J. Yano, E. Yano, C. Carroll, C. Jayaraman, K. & P. O. P Ts'O, Biochemistry, Band 18, Seiten 5134–5143 (1979); K. Jayaraman, K. McParland & P. O. P. Ts'O, Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., Band 78, Seiten 1537–1541 (1981); P. S. Miller, K. B. McParland, K. Jayaraman und P. O. P. Ts'O, Biochemistry, Band 20, Seiten 1874–1880 (1981); P. S. Miller, K. N. Fang, S. Kondo und P. O. P Ts'O, Journal of the American Chemical Society, Band 93, Seiten 6657–6665 (1971); C. H. Agris, K. R. Blake, P. S. Miller, M. P. Reddy und P. O. P Ts'O, Biochemistry, Band 25, 6268–6275 (1986); C. C. Smith, L. Aurelian, M. P. Reddy, P. S. Miller & P. O. P. Ts'O, Proceedings of the National Academy of Science of the U.S.A., Band 83, Seiten 2787–2791 (1986), und S. W. Ruby und J. Abelson, Science, Band 242, Seiten 1028–1035 (1988), berichteten über der artige Oligonukleotidmodifikationen. Bei derartigen Modifikationen wird ein nicht bindender Phosphorylsauerstoff der Phosphordiesterkopplungseinheit ersetzt oder die Nukleotidelemente werden zusammen entweder insgesamt oder teilweise gegen Methylgruppen ersetzt. Diese Modifikation verleiht dem Molekül eine größere Beständigkeit gegen Nukleasen. Die Hemmung der Genexpression wurde mit Methylphosphonatoligonukleotiden, die auf mehrere mRNAs gerichtet waren, gezeigt, wie zum Beispiel von D. M. Tidd, T. Hawley, H. M. Warenius & I. Gibson, Anti-Cancer Drug Design, Band 3, Seiten 117–127 (1988) berichtet wurde. Die Methylphosphonat-modifizierten Oligonukleotide aktivieren nicht RNase H bei der Hybridisierung an eine RNA und sind nur in einem strengen Hybridisierungsabbruchmodus wirksam. Oligonukleotide aus dieser Modifikationsklasse besitzen typischerweise eine geringere Bindung an eine Ziel-RNA, wahrscheinlich aufgrund eines R/S-Stereoisomers an jedem Phosphoratom, sowie eine erhöhtes sterisches Volumen um Phosphatbindung herum.
  • Andere Mitarbeiter stellten andere Arten von Modifikationen an dem Phosphoratom des Phosphatgrundgerüsts der Oligonukleotide in dem Versuch her, die Wirksamkeit der Oligonukleotidtherapie zu erhöhen. Das bekannteste Beispiel ist die Verwendung von Phosphorthioatoligonukleotiden. Diese sind von HCPF Roelen, E. DeVroom, G. A. Van der Marel & J. H. VanBoom, Nucleic Acid Research, Band 16, Seiten 7633–7645 (1988) umfasst, die Methylphoshorthionate verwendeten. S. Agarwal, J. Goodchild, M. P. Civeira, A. H. Thornton, P. S. Sarin & P. C. Zamecnik, in Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A, Band 85, Seiten 7079–7083 (1988); M. Matsukara, K. Shinozuka, G. Zon, H. Mitsuya, M. Reitz, J. S. Cohen & S. Broder, in Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., Band 84, Seiten 7706–7710 (1987); und C. J. Marcus-Sekura, A. M. Woerner, K. Shinozuka, G. Zon & G. V. Quinnan, in Nucleic Acid Research, Band 15, Seiten 5749–5763 (1987) verwendeten Phosphorthioate. Siehe ebenfalls Biosis/CA Selects Abstrakt 110: 88603e, das die U.S. Anmeldenummer 30,075, angemeldet am 1. September 1987 wiedergibt und das Phosphorthioat-modifizierte Oligonukleotide betrifft. Es wird angenommen, dass die Phosphorthioat-modifizierten Oligonukleotide die RNA durch Aktivierung von RNAse H bei Hybridisierung an die RNA abbrechen, obwohl der Hybridisierungsabbruch der RNA-Funktion eine gewisse Rolle für ihre Aktivität spielen kann.
  • Phosphordithioate für eine derartige Verwendung sind von W. K. D. Brill, J. Y. Yang, Y. X. Ma & M. H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, Band 111, Seiten 2321–2322 (1989) offenbart worden. Die Phosphorthioat- und Phosphordithioat-Modifikationen besitzen eine Antisense-artige Wirkung darin, dass sie an die Proteinfunktion binden und diese hemmen. Die Proteinwechselwirkungen der Oligonukleotide von diesem Typ untergraben leider das Konzept der Antisense-Methode, die ursprünglich Forscher zu diesem neuen Gebiet zog. Zusätzlich sind Phosphoramidate für derartige Verwendungen von A. Jager, M. J. Levy und S. M. Hecht in Biochemistry, Band 27, Seiten 7237–7246 (1988); und R. L. Letsinger, S. A. Bach & J. S. Eadie in Nucleic Acids Research, Band 14, Seiten 3487–3499 (1986) offenbart worden.
  • In Erwägung der Anwendung von Oligonukleotiden und Oligonukleotidanaloga als Antisense-Mittel für therapeutische Zwecke, erfordern alle Anwendungen von Oligonukleotiden als diagnostische Mittel, Forschungsreagenzien und mögliche therapeutische Mittel, dass die Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloga in großen Mengen synthetisiert werden, durch die Zellmembranen hindurch befördert werden oder von Zellen aufgenommen werden, dass sie geeignet an eine Ziel-RNA oder -DNA hybridisieren und nachfolgend die Nukleinfunktion beenden oder zerstören. Diese kritischen Funktionen hängen von der anfänglichen Stabilität der Oligonukleotide gegenüber Nukleaseabbau ab.
  • Eine ernsthafte Unzulänglichkeit von Oligonukleotiden für diese Zwecke, insbesondere als Antisense-Therapeutika, ist der enzymatische Abbau des verabreichten Oligonukleotids durch eine Vielzahl von allgegenwärtigen nucleolytischen Enzymen, die intrazellulär und extrazellulär lokalisiert sind und nachstehend als „Nukleasen" bezeichnet werden. Es ist unwahrscheinlich, das nicht modifizierte „Wildtyp" Oligonukleotide als therapeutische Mittel wirksam sind, weil sie schnell durch Nukleasen abgebaut werden. Im primären Mittelpunkt der Antisenseforschung liegt daher die Modifikation von Oligonukleotiden, um sie gegen Nukleasen beständig zu machen.
  • Modifikationen von Oligonukleotiden zum Erhöhen der Nukleasebeständigkeit fanden bis jetzt ausschließlich an dem Zuckerphosphatgrundgerüst, insbesondere an dem Phosphoratom statt. Es wurde berichtet, dass Phosphorthioate, Methylphosphonate, Phosphorimidate und Phosphortriester (Phosphat-methylierte DNA) verschiedene Grade der Beständigkeit gegen Nukleasen aufweisen. Obwohl jedoch die Fähigkeit eines Antisense-Oligonukleotids zum genauen Binden an eine spezifische DNA oder RNA für die Antisense-Methodologie fundamental ist, leiden modifizierte Phosphoroligonukleotide an minderen Hybridisierungseigenschaften, obwohl sie verschiedene Grade der Nukleasebeständigkeit zur Verfügung stellen.
  • Phosphoratommodifikationen, wie zum Beispiel Methylphosphonate, Phosphorthioate und Phosphoramidate, wie vorstehend beschrieben, verleihen dem Phosphoratom Chiralität. Aufgrund dieser prochiralen Natur des Phosphoratoms führen Modifikationen an den inneren Phosphoratomen der modifizierten Phosphoroligonukleotide zu Rp- und Sp-Stereoisomeren. Da eine praktische Synthese von stereoregulären Oligonukleotiden (alles Rp- oder Sp-Phosphatbindungen) unbekannt ist, weisen Oligonukleotide mit modifizierten Phosphoratomen n2 Isomere auf, wobei n gleich der Zahl der Phosphoratome in dem so modifizierten Oligonukleotid ist. Weiterhin weisen Modifikationen auf dem Phosphoratom eine unnatürliche Masse um die Phosphordiesterbindung herum auf, die die Konformation des Zucker-Phosphatgrundgerüsts stört und folglich die Stabilität des Duplexes beeinflusst. Die Wirkungen der Phosphoratommodifikationen bewirken eine mindere Hybridisierung an die Zielnukleinsäuren hinsichtlich des an dasselbe Ziel hybridisierende nicht modifizierten Oligonukleotids.
  • Die relative Fähigkeit eines Oligonukleotids zum Binden an komplementäre Nukleinsäuren wird durch Bestimmen der Schmelztemperatur eines speziellen Hybridisierungskomplexes verglichen. Die Schmelztemperatur (Tm), die eine charakteristische physikalische Eigenschaft von Doppelhelices ist, bezeichnet die Temperatur in Grad Celsius, bei der 50% helikale gegenüber Knäuel- (nicht hybridisierte) Formen vorhanden sind. Tm wird unter Verwendung des UV-Spektrums zum Bestimmen der Bildung und des Auflösens (Schmelzen) der Hybridisierung gemessen. Die Basenstapelung, die während der Hybridisierung stattfindet, wird von einer Verringerung in der UV-Absorption (Hypochromie) begleitet. Folglich zeigt eine Verringerung in der UV-Adsorption einen höheren Tm-Wert an. Je größer der Tm-Wert ist, desto größer ist die Bindungsstärke der Stränge. Nicht Watson-Crick-Basenpaarung weist eine starke destabilisierende Wirkung auf den Tm-Wert auf. Folglich ist eine absolute Genauigkeit in der Basenpaarung notwendig, um eine optimale Bindung eines Antisense-Oligonukleotids an dessen Ziel-RNA zu erhalten
  • Eine beträchtliche Verringerung in den Hybridisierungseigenschaften von Methylphosphonaten und Phosphortioaten wurde von Cohen berichtet. Methylphosphonate weisen einen weiteren Nachteil darin auf, dass der mit der RNA gebildete Duplex nicht den Abbau durch RNase N als Abbruchereignis aktiviert, sondern stattdessen durch Hybridisierungsabbruch wirkt, der aufgrund einer auf dem Ribosom lokalisierten Helix-Schmelzaktivität umgekehrt werden kann. Phosphorthioate sind gegen die meisten Nukelasen hoch beständig. Jedoch zeigen Phosphorthioate typischerweise keine Antisense-artige Wirkung; insbesondere die Hemmung verschiedener Enzymfunktionen aufgrund unspezifischen Bindens. Die Enzymhemmung durch sequenzspezifische Oligonukleotide untergräbt genau die Basis der Antisense-Chemotherapie.
  • Obwohl gezeigt wurde, dass bekannte Modifikationen an Oligonukleotiden eine gewisse Wirkung auf die Verbesserung ihrer Translationshemmung aufweisen, und obwohl gezeigt wurde, dass derartige Materialien eine gewisse hemmende Aktivität auf die Herstellung von Proteinen, die die mRNA kodiert, aufweisen, sind keine für die diagnostische oder therapeutische Verwendung ausreichende Aktivitäten gezeigt worden.
  • Oligonukleotide, die modifiziert sind, um eine Beständigkeit gegen Nukleasen aufzuweisen, um das RNase N Abbruchereignis zu aktivieren und um mit geeigneter Stärke und Genauigkeit an ihre Ziel-RNA (oder DNA) zu hybridisieren, sind für Antisense-Oligonukleotidzwecke immer noch hoch erwünscht.
  • M. Ikehara et al., European Journal of Biochemistry 139: 447–450 (1984) berichtet die Synthese eines gemischten Octamers, das einen 2'-Desoxy-2'-fluorguanosinrest oder einen 2'-Desoxy-2'fluoradeninrest enthält. W. Guschlbauer und K. Jankowski, Nucleic Acids Res. Vol. 8, Seite 1421 (1980) zeigte, dass der Beitrag der N-Form (3'-endo, 2'-exo) mit der Elektronegativität des 2'-Substituenten zunimmt. Daher enthält 2'-Desoxy-2'-fluoruridin 85% des C3'-endo-Konformers. M. Ikehra et al., Tetrahedron Letters Band 42, Seite 4073 (1979) zeigte eine lineare Beziehung zwischen der E lektronegativität von 2'-Susbtituenten und der prozentualen N-Konformation (3'-endo-2'-exo) bei einer Reihe von 2'-Desoxyadenosinen. M. Ikehara et al., Nucleic Acids Research, Band 5, Seite 1877 (1978) transformierte chemisch 2'Desoxy-2'-fluoradenosin zu dessen 5'-Diphosphat. Dieses wurde nachfolgend enzymatisch unter Bereitstellung von Poly(2'-desoxy-2'fluoradenylsäure) polymerisiert.
  • Weiterhin wurden ein Beweis vorgebracht, der darauf hinweist, dass 2'-substituierte 2'-Desoxyadenosin-Polynukleotide eher eine doppelsträngigen RNA als einer DNA ähneln. M. Ikehara et al., Nucleic Acids Res., Band 5, Seite 3315 (1978) zeigt, dass Poly A, Poly I und Poly C mit einem 2'-Fluorsubstituent, die unter Duplexbildung an ihr U, C oder I-Komplement gebunden sind, stabiler sind, als die Ribo- oder Desoxy-Poly-Duplexe, entsprechend der Bestimmung durch Standardschmelzassays. M. Ikehara et al., Nucleic Acids Res. 4: 4249 (1978) zeigen, dass 2'-Chlor- oder Bromsubstituenten in Poly(2'-Desoxyandenylsäure) für Nukleasebeständigkeit sorgt. F. Eckstein et al., Biochemistry Band 11, Seite 4336 (1972) zeigen, dass Poly(2'-chlor-2'-desoxyuridylsäure) und Poly(2'-chlor-2'-desoxytidylsäure) gegen verschiedene Nukleasen beständig sind. H. Inous et al., Nucleic Acids Research, Band 15, Seite 6131 (1987) beschreibt die Synthese gemischter Oligonukleotidsequenzen, die 2'-OMe an jeder Nukleotideinheit enthalten. Die gemischten 2'-OMe substituierten Sequenzen hybridisierten an ihr Ribooligonukleotidkomplement (RNA) so stark, wie der Ribo-Ribo-Duplex (RNA-RNA), was signifikant stärker ist, als bei dem Ribo-Desoxyribo-Heteroduplex mit derselben Sequenz (Tms, 49,0 und 50,1 gegen 33,0 Grad für Nonamere). S. Shibahara et al., Nucleic Acids Research Band 17, Seite 239 (1987) beschreibt die Synthese gemischter Oligonukleotidsequenzen, die 2'-OMe an jeder Nukleotideinheit enthalten. Die gemischten 2'-OMe-substituierten Sequenzen wurden so entworfen, dass sie die HIV-Replikation hemmen.
  • Es wird angenommen, dass die Summe der sterischen Effekte der Hydroxylgruppen, deren Wasserstoffbindungsfähigkeiten und deren Elektronegativität, im Vergleich zu den Eigenschaften des Wasserstoffatoms, für den insgesamt strukturellen Unterschied zwischen RNA und DNA verantwortlich ist. Thermische Schmelzuntersuchungen weisen darauf hin, dass die Reihenfolge der Duplexstabilität (Hybridisierung) von 2'-Methoxyoligonukleotiden die Reihenfolge RNA-RNA, RNA-DNA, DNA-DNA aufweist. Die 2'-Desoxy-2'-halogen-, Azido-, Amino-, Methoxy-Homopolymere mehrerer natürlich vorkommender Nukleoside sind durch Polymeraseverfahren hergestellt worden. Die erforderlichen 2'-modifizierten Nukleosidmonomere sind in die Oligonukleotide nicht über Nukleinsäuresynthesevorrichtungen eingebaut worden. Daher sind Oligonukleotide mit gemischten Sequenzen (sequenzspezifische), die 2'-Modifikationen an jedem Zucker enthalten, mit Ausnahme von 2'-Desoxy-2'-methoxyanalgoa nicht bekannt.
  • Andere synthetischen Abbruchereignisse, im Vergleich zu dem Hybridisierungsabbruch und der RNase H-Spaltung, wurde in dem Versuch untersucht, die Wirksamkeit von Oligonukleotiden zur Verwendung in der Antisense-Diagnostik und Therapeutik zu erhöhen. Daher wurde ein Forschungsgebiet entwickelt, in dem eine an den Oligonukleotiden zweite Domäne, die im allgemeinen als eine angehängte Gruppe bezeichnet wird, eingeführt worden ist.
  • Die angehängte Gruppe betrifft nicht die spezifischen Watson-Crick-Hybridisierung des Oligonukleotidanalogons mit der mRNA, sie wird jedoch durch das Oligonukleotidanalogon mitgeführt, um als reaktive Funktionalität zu dienen. Die angehängte Gruppe soll mit der mRNA auf eine gewisse wirksamere Weise wechselwirken, um die Translation der mRNA zu einem Protein zu hemmen. Derartige angehängte Gruppen sind ebenfalls an Moleküle gebunden worden, die entweder auf einzel- oder doppelsträngige DNA zielten.
  • Die Art einer angehängten Gruppe, die als ein interkalierendes Mittel bekannt ist, wurde von Cazenave, N. Loreau, N. T. Thuong, J. J. Toulme und C. Helene in Nucleic Acid Research, Band 15, Seiten 4717–4736 (1987) und von J. F. Constant, P. Laugaa, B. P. Roques & J. Lhomme, in Biochemistry, Band 27, Seiten 3997–4003 (1988) offenbart. Der offenbarte Zweck derartiger interkalierender Mittel ist es, zu dem Hybrid, das zwischen dem Oligonukleotidanalogon und der Zielnukleinsäure gebildet wurde, durch Binden an den zwischen ihnen gebildeten Duplex Bindungsstabilität hinzuzufügen.
  • Es wurde ebenfalls offenbart, Oligonukleotidanaloga eine angehängte Gruppe zur Verfügung zu stellen, die zum Vernetzen in der Lage ist. Eine angehängte Gruppe, wie zum Beispiel Psoralin wurde daher von A-T. Yeung, B. K. Jones und C. T. Chu in Biochemistry, Band 27, Seiten 2304–3210 (1988) offenbart. Es wird angenommen, dass nach der Hybridisierung des Oligonukleotidanalogons an die Ziel-mRNA das Psoralin photoaktiviert wird, um mit der mRNA unter Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Oligonukleotidanalogon und der mRNA zu vernetzen, wobei das mRNA-Molekül dauerhaft inaktiviert wird und die weitere Bildung von Protein, das dieser spezielle RNA-Teil kodiert, ausgeschlossen wird.
  • Es wurde ebenfalls vorgeschlagen, ein Alkylierungsmittel als angehängte Gruppe für Oligonukleotidanaloga zur Verwendung in Antisense-Methoden für die Diagnostik und Therapeutik zu verwenden, wie von R. B. Meyer in dem Journal of the American Chemical Society, Band 111, Seiten 8517–8519 (1989) und D. G. Knorre und V. V. Vlassov, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Band 32, Seiten 291–320 (1985) offenbart ist.
  • Das Ziel der Verwendung von Alkylierungsmitteln und angehängten Gruppen in Oligonukleotidanaloga in Antisense-Methoden soll bewirken, dass das Alkylierungsmittel irreversibel mit der Ziel-mRNA reagiert. Eine derartige irreversible Bindung zwischen dem Antisense-Oligonukleotid und der mRNA ist im Allgemeinen kovalent und führt zu einer dauerhaften Inaktivierung der mRNA zusammen mit einem Anhalten der Proteinherstellung von dem auf diese Weise inaktivierten Teil der mRNA.
  • Eine weitere Strategie, die vorgeschlagen wurde, ist die Verwendung chemischer Reagenzien, die unter ausgewählten Bedingungen eine Radialspezies zur Reaktion mit der Zielnukleinsäure erzeugen, um eine Spaltung zu bewirken oder sie anderweitig zu inaktivieren. Vorgeschlagene angehängte Gruppen dieser Kategorie umfassen Koordinationkomplexe, die ein Metallion mit assoziierten Liganden enthalten. Ein Metallion kann den Oxidationszustand unter Erzeugung reaktiver Sauerstoff-enthaltender Radikalionen oder anderer Radialspezies ändern. P. L. Doan, L. Perroualult, M. Chassignol, N. T. Thuong & C. Helene, in Nucleic Acids Research, Band 15, Seiten 8643–8659 (1987) offenbarten für diesen Zweck Eisen/EDTA- und Eisen/Porphyrinspezies. Kupfer/Phenanthrolinkomplexe wurden von D. S. Sigman, in Accounts of Chemical Research, Band 19, Seiten 180–186 (1986) offenbart. G. B. Dreyer und P. B. Dervan, in Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., Band 82, Seiten 968–972 (1985) untersuchten die EDTA/Fe-Einheit bezüglich der Spaltung von Nukleinsäuren.
  • Frühere Methoden unter Verwendung von Vernetzungsmitteln, Alkylierungsmitteln und Radikal-erzeugenden Spezies als angehängte Gruppen an Oligonukleotiden zur Antisense-Diagnostik und Therapeutik weisen mehrere signifikante Mängel auf. Die Bindungsstellen der angehängten Gruppen an Oligonukleotiden spielen eine wichtige Rolle, die noch unvollständig bekannt ist, zum Teil in der Wirksamkeit von Oligonukleotiden zur Therapie und Diagnostik. Frühere Mitarbeiter berichteten über die meisten angehängten Gruppen, dass sie an ein Phosphoratom gebunden sind, das, wie vorstehend angemerkt wurde, den Oligonukleotiden schlechtere Hybridisierungseigenschaften verleiht. Frühere Versuche waren relativ unempfindlich, das heißt, die reaktive angehängte Gruppe wurde nicht wirksam an Stellen auf den Messenger-RNA-Molekülen zur Alkylierung oder Spaltung in einem wirksamen Anteil transportiert. Überdies wäre selbst wenn die Reaktivität derartiger Materialien vollkommen wäre, das heißt, wenn jede reaktive Funktionalität tatsächlich mit einem Messenger-RNA-Molekül reagieren sollte, die Wirkung nicht besser als stöchiometrisch. Das heißt, nur ein mRNA-Molekül würde für jedes Oligonukleotidmolekül inaktiviert. Es ist ebenfalls wahrscheinlich, dass die unspezifischen Wechselwirkungen der modifizierten Oligonukleotide mit Molekülen, die andere al die Ziel-RNA sind, zum Beispiel mit anderen Molekülen, die alkyliert werden können oder die mit Radikalspezies reagieren können, sowie die Selbstzerstörung, nicht nur die diagnostische und therapeutische Wirkung der Antisense-Behandlung verringern, sondern ebenfalls zu unerwünschten toxischen Reaktionen in der Zelle oder in vitro führen. Dies ist insbesondere bei Radikalspezies akut, von denen angenommen wird, dass sie in der Lage sind, außerhalb des Ortes der spezifischen Hybridisierung zu diffundieren, wobei sie einen unerwünschten Schaden an Nicht-Ziel-Materialien, anderen Zellmolekülen und Zellmetaboliten bewirken. Dieser erkannte Mangel, der Begrenzung der Spezifität- und Stöchiometrie für die Leistungsfähigkeit derartige früherer Alkylierungsmittel und Radikal-erzeugender Typen von Antisense-Oligonukleotiden, ist ein signifikanter Nachteil für ihre Verwendung.
  • Dementsprechend bleibt ein großer Bedarf an Antisense-Oligonukleotidformulierungen vorhanden, die zu einer verbesserten Spezifität und Wirksamkeit sowohl zum Binden als auch zur mRNA-Modulierung oder Inaktivierung in der Lage sind, ohne unerwünschte Nebenwirkungen aufzudrängen.
  • ZIELE DER ERFINDUNG
  • Ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, Oligonukleotide und Oligonukleotidanaloga zur Verwendung in der Antisense-Oligonukleotid-Diagnose und -Therapie zur Verfügung zu stellen.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, nukleasebeständige, Zucker-modifizierte Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloga zur Verwendung in Antisense-Oligonukeotiddiagnostika, Forschungsreagenzien und Therapeutika zur Verfügung zu stellen.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, derartige Oligonukleotide und Oligonukleotidanaloga zur Verfügung zu stellen, die wirksam die Aktivität einer DNA oder einer RNA modulieren.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, derartige Oligonukleotide und Oligonukleotidanaloga zur Verfügung zu stellen, die mit geringerer Wahrscheinlichkeit unerwünschte oder toxische Nebenreaktionen hervorrufen.
  • Ein weiteres Ziel ist es, Forschungs- und Diagnoseverfahren und Materialien zum Untersuchen der körperlichen Zustände in Tieren, insbesondere erkrankte Zustände, zur Verfügung zu stellen.
  • Ein weiteres Ziel ist es, Mittel zum Modifizieren von Nukleinsäuren zum Ausführen von Substitutionen auf selektiven Teilen davon, zur Verfügung zu stellen.
  • Ein weiteres Ziel ist es, Mittel zur selektiven Spaltung einer RNA zur Verfügung zu stellen.
  • Diese und andere Ziele werden dem Durchschnittsfachmann aus einer Besprechung der vorliegenden Beschreibung und der angefügten Ansprüche offenbar werden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen zum Modulieren der Aktivität einer DNA und RNA zur Verfügung gestellt. Diese Verbindungen umfassen einen Zielabschnitt, der mit einer vorher ausgewählten Nukleotidsequenz einer RNA spezifisch hybridisierbar ist. Die Verbindung stellt weiterhin einen reaktiven Teil zur Verfügung, der zum Katalysieren, Alkylieren oder anderweitigen Ausführen der Spaltung einer RNA, insbesondere ihrer Phosphodiesterbindungen, in der Lage ist. Die Verbindungen können ebenfalls ein Halteseil, ein Mittel zum Verbinden der Ziel- und reaktiven Teile miteinander unter Bildung der Verbindung, umfassen. Gemäß mehrerer bevorzugter Ausführungsformen, werden die Verbindungen zum Anbringen des reaktiven Teils in die kleinere Furchenstelle der aus der Hybridisierung der RNA und der Verbindungen gebildeten Hybridstruktur, angepasst.
  • Der Zielabschnitt der Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise ein Oligonukleotidanalogon, umfassend von ungefähr 3 bis ungefähr 50 Baseneinheiten, wobei 8 bis 40 Untereinheiten bevorzugt sind und 12 bis 25 noch bevorzugter sind. Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloga mit ungefähr 15 Baseneinheiten werden zum Ausüben bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Entsprechend anderen bevorzugten Ausführungsformen ist der Zielabschnitt ein Analogon eines Oligonukleotids, wobei mindestens einige der Phosphodiesterbindungen des Oligonukleotids gegen eine Struktur substituiert worden sind, die ein Erhöhen der Fähigkeit der Verbindungen bewirkt, in die intrazelluläre Region von Zellen einzudringen, wo die RNA, deren Aktivität moduliert werden soll, lokalisiert ist. Es wird bevorzugt, dass derartige Substitutionen Phosphorthioatbindungen oder kurzkettige Alkyl- oder Cycloalkylstrukturen umfassen. Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsformen werden die Phosphodiesterbindungen durch Strukturen substituiert, die gleichzeitig im Wesentlichen nicht ionisch und nicht chiral sind.
  • Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst der reaktive Teil der Verbindung eine Funktionalität, die in der Lage ist, die Hydrolyse, Spaltung von Phosphodiesterbindungen in einer RNA zu katalysieren. Derartige Funktionalitäten können entweder basisch, sauer oder amphoter sein. Heteroatomare Spezies können so formuliert werden, dass sie für derartige Zwecke entweder basisch oder sauer oder tatsächlich amphoter sind.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von alkylierenden und freien Radikal-bildenden Funktionalitäten als reaktive Teile der vorliegenden Verbindungen, wobei die alkylierenden oder freie Radikal-bildenden Materialien in die kleinere Furche des zwischen den Verbindungen der Erfindung und der zu modulierenden RNA gebildeten Hybrids abgegeben werden.
  • Gemäß anderen Ausführungsformen der Erfindung werden Verbindungen zum Modulieren der Aktivität einer RNA zur Verfügung gestellt, die bestimmte heterocyclische Strukturen mit mindestens einer RNA-Spaltungseinheit oder eine andere Einheit, die zum Wechselwirken mit einer daran angehängten RNA in der Lage ist, umfassen. Diese Verbindungen werden zum Anbringen der reaktiven RNA-Spaltungseinheit oder einer anderen reaktiven Einheit in die kleinere Furchenstelle der aus der RNA und der Verbindung gebildeten Hybridstruktur durch sorgfältige Auswahl der Stellen zum Binden der RNA-Spaltungseinheiten angepasst. Derartige Verbindungen können Zucker oder zu Zucker analoge Teile und neue Nokleosidbasenteile umfassen. Dementsprechend werden neue Nukleoside und Nukleosidanaloga zur Verfügung gestellt. Derartige Nukleoside oder Nukleosidanaloga können in Oligonukleotide und Oligonukleotidanaloga, die zur Ausübung der Erfindung verwendbar sind, eingebaut werden.
  • Die Verbindungen der Erfindung können in Verfahren zum Modulieren der Aktivität einer RNA verwendet werden, umfassend das in Kontakt bringen eines Organismus, der die RNA aufweist, mit einer gemäß den vorstehenden Erwägungen formulierten Verbindung. Es wird bevorzugt, dass die zu modulierende RNA, vorher so ausgewählt wird, dass sie vorzugsweise eine Messenger-RNA umfasst, die ein Protein, dessen Bildung moduliert werden soll, kodiert. Die Erfindung kann ebenfalls auf eine Vormessenger-RNA, und tatsächlich auf eine generische RNA und auf doppelsträngige DNA angewandt werden. Der Zielabschnitt der zu verwendenden Verbindung wird daher so ausgewählt, dass er zu dem vorher ausgewählten Teil der RNA komplementär ist, das heißt, er ist für diesen Teil ein Antisense-Oligonukleotid.
  • Die Verbindungen der Erfindung können in Verfahren zur Behandlung eines Organismus mit einer Krankheit verwendet werden, die durch die unerwünschte Herstellung eines Proteins charakterisiert ist, umfassend das in Kontakt bringen des Organismus mit einer Verbindung entsprechend den vorstehenden Erwägungen, vorzugsweise mit einer, die so entworfen ist, dass sie an die Messenger-RNA spezifisch bindet, die das Protein, dessen Herstellung gehemmt werden soll, kodiert.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Gruppen, die an Oligonukleotide angehängt sind, die keine reaktive Funktion umfassen. Derartige angehängte Gruppen können zu einer erhöhten Oligonukleotidaufnahme, einer erhöhten Beständigkeit des Oligonukleotids gegen Abbau durch Nukleasen und zu einer stärkeren Bindung der Oligonukleotide an die Ziel-RNA führen. Derartige Oligonukleotide können die RNA durch Hybridisierungsabbruch und/oder durch Aktivierung von RNase H, sowie durch Spaltung der RNA-Phosphodiesterbindungen oder sie durch eine andere Zerstörung durch andere reaktive Funktionalitäten spalten.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls Funktionalitäten, die zum Binden von Reportergruppen, wie zum Beispiel Biotin und verschiedene Fluorophore an sequenzspezifische Oligonukleotide für diagnostische Zwecke dienen. Es kann mehr als eine nicht reaktive Funktionalität an jedes Oligonukleotid gebunden werden, zwei oder mehrere nicht reaktive Funktionalitäten können an eine einzelne Nukleosideinheit gebunden werden, und eine Kombination aus nicht reaktiven Funktionalitäten und reaktiven Funktionalitäten kann an eine einzelne Nukleosideinheit oder an ein einzelnes Oligonukleotid gebunden werden. Nicht reaktive Funktionalitäten und reaktive Funktionalitäten, die an sequenzspezifische Oligonukleotide gebunden sind, werden vorzugsweise so entworfen, dass sie in der kleineren Furche oder auf der Seite der kleineren Furche des Heteroduplexes liegen.
  • Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen, die gegen Nukleaseabbau beständig sind und die die Aktivität einer DNA und RNA modulieren, zur Verfügung gestellt. Diese Verbindungen umfassen Zucker-modifizierten Oligonukeotiden oder Oligonukleotidanaloga, deren Zielabschnitte mit vorher ausgewählten Nukleotidsequenzen einer einzelsträngigen oder doppelsträngigen DNA oder RNA spezifisch hybridisierbar sind. Die Zucker-modifizierten Oligonukleotide erkennen und bilden Doppelstränge mit einzelsträngiger DNA und RNA oder Dreifachstränge mit doppelsträngiger DNA und RNA.
  • Die nukleasebeständigen Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung bestehen aus einem einzelnen Strang von Nukleinsäurebasen, die durch Kopplungsgruppen mit einander verknüpft sind. Die Länge des Zielabschnitts des nukleasebeständigen Oligonukleotids kann im Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 50 Nukleinsäurebasen liegen. Jedoch ist gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Zielsequenz mit einer Länge von ungefähr 15 Basen optimal.
  • Die Nukleinsäurebasen können Pyrimidine, wie zum Beispiel Thymin, Uracil oder Cytosin, oder Purine, wie zum Beispiel Guanin oder Adenin, oder beides, in einer spezifischen Sequenz angeordnet sein. Zusätzlich können sie jede der neuen Basen der Erfindung sein. Die Zuckereinheit derartiger Basen kann vom Desoxyribose- oder Ribosetyp sein. Die Gruppen, die die Basen miteinander verbinden, kann das übliche Zuckerphosphatnukleinsäuregrundgerüst sein, jedoch können sie ebenfalls als Phosphorthioat, Methylphosphonat oder als Phosphat-alkylierte Einheit modifiziert sein, um zusammen mit der Entfernung einer 5'-Methylengruppe und/oder carbocyclischem Zucker die Eigenschaften eines Zucker-modifizierten Oligonukleotids weiter zu steigern.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Zielanschnitt ein Analogon eines Oligonukleotids, wobei mindestens eine der 2'-Desoxyribofuranosyleinheiten der Nukleosideinheit mit H, OH, Niederalkyl, substituiertem Niederalkyl, CN, CF3, OCF3, OCN, O-Alkyl, S-Alkyl, SOME, SO2Me, ONO2, NO2, N3, NH2, NH-Alkyl, OCH2CH=CH2, OCH=CH2, OCH2CCH, OCCH, Aralkyl, Heteroalkyl, Heterocycloalkyl, Polyalkylamino oder substituiertem Silyl modifiziert ist, wobei als Alkyl eine gerade oder verzweigte Kette von C1 bis C12, mit einer Ungesättigtheit innerhalb der Kohlenstoffkette, wie zum Beispiel Allyloxy, das besonders bevorzugt wird, verwendet werden kann.
  • Die resultierenden neuen Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloga sind gegen Nukleaseabbau beständig und zeigen Hybridisierungseigenschaften von höherer Qualität als im Vergleich zu Wildtyp- (DNA-DNA und RNA-DNA) Duplexen und den Phosphor-modifizierten Oligonukleotid-Antisense-Duplexen, die Phosphorthioate, Methylphosphonate, Phosphoramidate und Phosphortriester enthalten.
  • Die Verbindungen der Erfindung können bei Diagnoseverfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines abnormalen RNA-Moleküls oder einer abnormalen oder ungeeigneten Expression normaler RNA-Moleküle in Organismen oder Zellen verwendet werden. Sie können ebenfalls in Verfahren zum selektiven Spalten einer RNA, wie zum Beispiel für die Forschung und Diagnose und für die somit gebildete RNA verwendet werden. Eine derartige selektive Spaltung wird durch Wechselwirken einer RNA mit Verbindungen der Erfindung erreicht, die reaktive Teile aufweisen, die zum Ausführen einer derartigen Spaltung in der Lage sind, und Zielabschnitte aufweisen, die zum Erhöhen der Selektivität entworfen sind.
  • Die zum Modulieren der Aktivität einer RNA oder zum erfindungsgemäßen Nachweisen ihres Vorhandenseins verwendbaren Verbindungen umfassen im Allgemeinen drei Teile. Der erste Teil, der Zielabschnitt, ist ein Teil, der mit einer vorher ausgewählten Nukleotidsequenz der zu modulierenden RNA spezifisch hybridisierbar ist. Es ist im Allgemeinen erwünscht, eine RNA-Sequenz auszuwählen, die Proteine kodiert, oder die die Herstellung der Proteine betrifft, deren Synthese schließlich moduliert oder vollständig gehemmt werden soll. Der Zielabschnitt der Verbindung ist ein Oligonukleotidanalogon. Es wird durch Festkörpersynthese mit bekannter Methodologie bequem so entworfen und hergestellt, dass es zu der vorher ausgewählten Nukleotidsequenz der RNA komplementär ist oder mit dieser zumindest spezifisch hybridisierbar ist. Nukleinsäuresynthesevorrichtungen sind handelsüblich und ihre Verwendung wird im Allgemeinen von dem Durchschnittsfachmann verstanden, der zum Erzeugen von nahezu jedem Oligonukleotid mit vernünftiger Länge, das erwünscht sein könnte, in der Lage ist.
  • Die Verbindungen der Erfindung können bei Verfahren zum Modulieren der Herstellung eines Proteins durch einen Organismus verwendet werden, die das in Kontakt bringen des Organismus mit einer Verbindung, die gemäß den vorstehenden Erwägungen formuliert worden ist, umfassen. Es wird bevorzugt, dass der zu modulierende RNA- oder DNA-Teil so ausgewählt wird, dass er den Teil der DNA oder RNA umfasst, der das Protein, dessen Bildung moduliert werden soll, kodiert. Der Zielan schnitt der zu verwendenden Verbindung wird daher so ausgewählt, dass er zu dem vorher ausgewählten Teil der DNA oder RNA komplementär ist, das heißt, dass er für diesen Teil ein Antisense-Oligonukleotid ist.
  • Die Verbindungen der Erfindung können bei Verfahren zum Behandeln eines Organismus verwendet werden, der eine Krankheit aufweist, die durch die unerwünschte Herstellung eines Proteins charakterisiert ist. Dieses Verfahren umfasst das in Kontakt bringen des Organismus mit einer Verbindung gemäß den vorstehenden Erwägungen. Die Verbindung ist vorzugsweise eine, die so entworfen ist, dass sie spezifisch an eine Messenger-RNA bindet, die das Protein kodiert, dessen Herstellung gehemmt werden soll.
  • Die Verbindungen der Erfindung können in Diagnoseverfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit abnormaler RNA-Moleküle oder einer ungeeigneten Expression normaler RNA-Moleküle in Organismen oder Zellen verwendet werden.
  • Die Verbindungen der Erfindung können in Verfahren zum selektiven Binden der RNA für Forschungs- und diagnostische Zwecke verwendet werden. Eine derartige selektive starke Bindung wird durch Wechselwirken einer solchen RNA oder DNA mit Verbindungen der Erfindung erreicht, die gegen abbauende Nukleasen beständig sind und stärker und mit größerer Genauigkeit hybridisieren, als jedes andere bekannte Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden neue Verfahren für die Synthese neuer Nukleosidanaloga, die an der 2'-Position substituiert sind und die zum Einbau in Oligonukleotide und Analoga der Erfindung verwendbar sind, zur Verfügung gestellt. Ein derartiges Verfahren sorgt für die Einführung eines 2'-Substituenten in Abwesenheit einer Blockierung von entweder den 3'- oder 5'-Hydroxylgruppen eines Ribofuranosylnukleosids. Derartige Verfahren verwenden eine Behandlung mit Natriumhydrid, gefolgt von der Verwendung eines Alkylhalogenids, oder eine Behandlung mit Uracilzinnchlorid. An den Nukleosidbasen sind keine Schutzgruppen notwendig, außer für die exocyclische Aminogruppe von Guanosin. Die Reaktionen werden bei oder nahe bei der Raumtemperatur durchgeführt. Diese Bedingungen sind gegensätzlich zu dem früheren bekannten Verfahren, das starke Alkylierungsmittel, wie zum Beispiel Diazomethan, erforderte. Derartige starke Alkylierungsmittel machen den vollständigen Schutz aller reaktiven Stellen auf den Nukleosidbasen und den 3'- und 5'-Zuckerhydroxylgruppen erforderlich.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein neues Verfahren zur Synthese neuer 3-Deazanukleoside und Oligonukleotide, zur Verfügung gestellt, das diese Nukleoside einbaut. In diesem Verfahren werden Verbindungen, wie zum Beispiel 5-Cyanomethyl-1-(2'-desoxy-3',5'-di-O-p-toluoyl-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxylat oder 5-Cyano-[reaktiver Substituent]methyl-1-(2'-desoxy-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxylat hergestellt. Die 5-Cyano-[reaktiver Substituent]methyl-Verbindungen werden aus der entsprechenden 5-Cyanomethylverbindung unter Verwendung von Natriumhydrid und einem geeigneten Alkylhalogenid hergestellt. Die Carboxylate werden deblockiert und zu den entsprechenden Carboxamiden umgewandelt. Dann wird die 5'-Position der Verbindungen geschützt und die Verbindungen werden an der 3'-Position mit einem geeigneten Phosphoramidit oder einer anderen zur Verwendung auf einer DNA-Synthesevorrichtung geeigneten aktivierten Phosphatgruppe derivatisiert. Ein Oligonukleotid wird mit der Synthesevorrichtung aufgebaut. Ein derartiges Oligonukleotid schließt in seiner Sequenz eine oder mehrere 5-Cyano-[reaktiver Substituent]methylimidazolverbindungen ein. Die Imidazolverbindung cyclisiert zu dem entsprechenden 3-Deazapurin oder 3-substituiertem 3-Deazapurin gleichzeitig mit der Spaltung des Oligonukleotids von dem Träger, der Synthesevorrichtung verwendet wird, nach Behandlung mit überschüssigem konzentrierten Ammoniumhydroxid.
  • Die modifizierten Nukleotide (modifizierte Monomere, die die erforderliche Funktionalität in dem Zuckerteil und/oder dem heterocyclischen Teil besitzen, können zur Herstellung der erwünschten neuen Oligonukleotide und Analoga der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Struktur und Synthese der modifizierten Nukleotide waren früher nicht bekannt und werden hiermit zum ersten Mal beschrieben. Die Funktionalitätsstellen in den Zuckern und Heterocyclen sind neu und sind vorzugsweise so entworfen worden, dass die Funktionalitäten in oder an der kleineren Furche liegen, die durch den Heteroduplex zwischen dem modifizierten Oligonukleotid und der Ziel-RNA gebildet wurde. Es wurde festgestellt, dass die kleinere Seite oder kleinere Furche der zwischen derartigen modifizierten Oligonukleotiden und der Ziel-RNA gebildeten Duplexe die besonders bevorzugte Stelle für eine Aktivität einer funktionellen Gruppe ist.
  • Eine Gruppe von Verbindungen, die zum Modulieren der Aktivität eines RNA- oder DNA-Moleküls erfindungsgemäß verwendbar ist, umfasst im Allgemeinen ein Zucker-modifiziertes Oligonukleotid, das eine Zielsequenz enthält, die mit einer vorher ausgewählten Nukleotidsequenz eines einzelsträngigen oder doppelsträngigen DNA oder RNA-Moleküls spezifisch hybridisierbar ist, und das nukleasebeständg ist.
  • Es ist im Allgemeinen erwünscht, eine Sequenz einer DNA oder RNA auszuwählen, die die Herstellung der Proteine betrifft oder diese kodiert, deren Synthese schließlich moduliert oder vollständig gehemmt werden soll. Der Zielabschnitt der Verbindung ist im Allgemeinen ein Oligonukleotidanalogon. Es wird praktischerweise durch Festkörpersynthese mit bekannter Methodologie so synthetisiert, dass es zu einer vorher ausgewählten Nukleotidsequenz der RNA oder DNA komplementär ist oder mindestens mit dieser spezifisch hybridisierbar ist. Nukleinsäuresynthesevorrichtungen sind handelsüblich und ihre Verwendung wird im Allgemeinen von dem Durchschnittsfachmann verstanden, wobei sie die Herstellung von nahezu jedem Oligonukleotid mit vernünftiger Länge, das erwünscht sein könnte, bewirkt.
  • Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Oligonukleotid" auf einer Vielzahl verknüpfter Nukleotideinheiten, gebildet in einer spezifische Sequenz aus natürlich vorkommenden Basen und Pentofuranosylgruppen, die durch Zuckergruppen über native Phosphodiesterbindungen verknüpft sind. Diese Nukleosideinheiten können Nukleinsäurebasen, wie zum Beispiel Guanin, Adenin, Cytosin, Thymin oder Uracil sein. Die Zuckergruppe kann Desoxyribose oder Ribose sein. Dieser Ausdruck bezieht sich sowohl auf natürlich vorkommende als auch synthetische Spezies, die aus natürlich vorkommenden Untereinheiten gebildet sind.
  • Die Ausdrücke „Oligonukleotidanalogon" oder „modifizierte Oligonukleotide", so wie sie im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beziehen sich auf Einheiten, die ähnlich wie die natürlichen Oligonukleotide funktionieren, die jedoch keine natürlich vorkommenden Teile aufweisen. Oligonukleotidanaloga oder modifizierte Oligonukleotide können geänderte Zuckereinheiten, geänderte Basen, sowohl geänderte Zucker als auch geänderte Basen oder geänderte Brücken zwischen Zuckereinheiten, zum Beispiel Phosphorthioate und andere Schwefel-enthaltende Spezies aufweisen, deren Verwendung in dem Fachgebiet bekannt ist. Die Oligonukleotidanaloga der Erfindung können die Nukleasebeständigkeit der Oligonukleotidverbindung erhöhen und damit die Antisense-therapeutische, diagnostische Verwendung oder Verwendung als Forschungsreagenz der Verbindungen der vorliegenden Erfindung erleichtern.
  • In der vorliegenden Erfindung wird besonders bevorzugt, eher Oligonukleotidanaloga oder modifizierte Oligonukleotide zu verwenden als die Oligonukleotide selbst. In diesem Zusammenhang bezieht sich Oligonukleotidanalogon auf eine Struktur, die im Allgemeinen zu der von nativen Oligonukleotiden ähnlich ist, die aber auf eine oder mehrere signifikante Arten modifiziert worden ist.
  • Für die Verwendung in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird im Allgemeinen bevorzugt, dass einige Positionen der Nukleotidbasis substituiert werden, um die Nukleasebeständigkeit der Verbindung zu erhöhen, während die Bindungsfähigkeiten des Oligonukleotids unversehrt bleiben wird.
  • In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt, weitere modifizierten Oligonukleotide zu verwenden. In diesem Zusammenhang bezieht sich Oligonukleotidanalogon auf eine Struktur, die im Allgemeinen zu der nativer Oligonukleotide ähnlich ist, die jedoch auf eine oder mehrere signifikante Arten modifiziert worden sind.
  • Damit das Eindringen in die intrazellulären Räume der Zelle verbessert wird, in denen die Messenger RNA oder DNA liegt, die die Ziele der gesamten Verbindung sind, stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung Modifikationen der Oligonukleotide zur Verfügung. Derartige Modifikationen können Oligonukleotide zur Verfügung stellen, die im Wesentlichen weniger ionisch als native Formen sind. Derartige Modifikationen erleichtern das Eindringen der Oligonukleotide in die intrazellulären Räume. Jedes der bestehenden oder noch zu entdeckenden Verfahren zum Erreichen dieses Ziels kann gemäß der Ausübung der vorliegenden Erfindung verwen det werden. Derzeit wurde festgestellt, vorzugsweise Substitutionen für die Phosphordiesterbindung zu verwenden, wobei die Substitutionen nicht nur relativ weniger ionisch als die natürlich vorkommenden Bindungen sind, sondern auch im Wesentlichen nicht chiral sind.
  • Wie klar ersichtlich ist, ist das Phoshoratom in der Phosphordiesterbindung „prochiral". Modifikationen am Phosphor, wie sie zum Beispiel in Methylphosphonaten und Oligonukleotiden von Phosphorthioattyp durchgeführt worden sind, führen zu im Wesentlichen chiralen Struktuenr. Die Chiralität führt zur Existenz von zwei Isomeren an jedem chiralen Zentrum, die mit den Zellmolekülen unterschiedlich wechselwirken können. Eine derartige nicht getrennte Mischung von Isomeren kann den Transport der resultierenden Verbindungen in die intrazellulären Räume hemmen oder die Affinität und Spezifität der Hybridisierung an die spezifische Ziel-RNA oder -DNA verringern. Daher wird in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, im Wesentlichen nicht ionische, im Wesentlichen nicht chirale Einheiten anstelle einer oder aller Phoshordiesterbindungen zu verwenden. Für diesen Zweck werden vorzugsweise kurzkettige Alkyl- oder Cycloalkylstrukturen, insbesondere C2-C4-Strukturen bevorzugt. Wie in einer Anmeldung mit U.S. Anmeldenummer 558,663, die einem gemeinsam Anmelder davon übertragen wurde, ausgeführt ist, wobei die Anmeldung mit dem Titel „Polyamid Oligonucleotides to Enhance Cellular Uptake" am 27. Juli 1990 angemeldet wurde, kann die Modifikation der Zuckerstruktur, einschließlich der Eliminierung einer der Sauerstofftunktionalitäten, die Einführung derartiger im Wesentlichen nicht chiralen, nicht ionischen Substituenten an dieser Position erlauben. Auf den Offenbarungsgehalt dieser Anmeldung wird hier vollumfänglich Bezug genommen, um derartige Modifikationen vollständiger zu offenbaren.
  • Die Standardgrundgerüstmodifikationen liegen innerhalb der zu verfolgenden Ziele der Erfindung, wie zum Beispiel das Substituieren von S, Me-P, MeO-P, H2N-P, usw. gegen P. Es wird angenommen, dass diese Substitutionen in manchen Fällen die Eigenschaften Zucker-modifizierter-Oligonukieotide verbessern.
  • Die Zielabschnitte der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise Oligonukleotidanaloga mit von ungefähr 3 bis ungefähr 50 Baseneinheiten. Es wird bevorzugt, dass derartige Analoga von ungefähr 8 bis ungefähr 40 Baseneinheiten und aufweisen, und besonders bevorzugt, dass sie von ungefähr 12 bis ungefähr 25 verwendet werden. Derzeit wird angenommen, dass Oligonukleotide oder Analoga mit von ungefähr 15 Baseneinheiten für die Ausübung bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wahrscheinlich am besten sein werden. Es ist erwünscht, dass der Zielabschnitt so angepasst wird, dass er mit der vorher ausgewählten Nukleotidsequenz der zur Modulierung ausgewählten RNA spezifisch hybridisierbar ist.
  • Derzeit umfassen die Oligonukleotidanaloga, von denen angenommen wird, dass sie zur Ausübung einer oder mehrerer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung besonders geeignet sind, eine oder mehrere Untereinheiten mit schematischen Strukturen, wie sie im Ganzen in Formel 1 gezeigt sind.
    Figure 00240001
    wobei B jede der Purin- oder Pyrimidinbasen, modifizierten Basen oder Basenanaloga, einschließlich denjenigen, die in natürlich vorkommenden Oligonukleotiden oder zur Verwendung in modifizierten Oligonukleotiden bekannt sind, oder die ähnliche Funktionen aufweisen, ist; E eine RNA-Spaltungseinheit, eine Gruppe zum Verbessern der pharmakokinetischen Eigenschaften des Oligonukleotids, eine Gruppe zum Verbessern der Pharmakodynamik des Oligonukleotids, N oder OH und eine andere kleine Basensubstituentengruppe ist; S ein Zucker oder ein Zuckeranalogon ist; und L eine Zuckerkopplungsgruppe ist. Die Zuckerkopplungsgruppe L kann jede dieser entweder natürlich vorkommenden oder anderweitig bekannten Strukturen sein, die in der Lage sind, Zuckereinheiten von Oligonukleotiden oder Zuckeranaloga unter Bildung des Zielabschnitts der Verbindungen der vorliegenden Erfindung miteinander zu verbinden. Es wird bevorzugt, dass diese Zuckerbindungsfunktionen entweder eine Phosphodiesterstruktur oder eine im Wesentlichen nicht ionische, im Wesentlichen nicht chirale Struktur, wie sie hier vorstehend beschrieben ist, wie zum Beispiel Niederalkyl und Cycloalkyl, insbesondere C2-C4 Alkyl umfassen. Es ist zu beachten, dass bei Verwendung von Niederalkylstrukturen die 5'-Methylengruppen von einem oder mehreren Zuckern eliminiert werden können. Vorzugsweise sind mindestens einige der Phosphodiesterbindungen des Oligonukleotids mit Phosphorthioat, Methylphosphonat oder Alkylphosphat substituiert.
  • Wie dem Durchschnittsfachmann klar sein wird, können Variationen in den Strukturen der Zuckereinheiten, die zur Herstellung der vorliegenden Verbindungen verwendbar sind, hergestellt werden, ohne vom Geist der Erfindung abzuweichen. Nochmals gesagt, ist es nicht notwendig, dass jede Zuckerbindungsfunktion in modifizierter Form vorliegt. Eine Wesentliche Zahl und sogar ein Vorherrschen derartiger Kopplungsgruppen kann in der nativen Phosphodiesterform vorkommen, sofern der gesamte Zielabschnitt der molekularen Verbindungen eine wirksame Fähigkeit aufweist, in die intrazellulären Räume der Zellen des fraglichen Organismus einzudringen oder anderweitig in Kontakt mit der Ziel-RNA zu kommen und unter Bildung eines Hybrids spezifisch an sie zu hybridisieren, wobei er in der Lage ist, die RNA-Aktivität nachzuweisen und zu modulieren. Natürlich können völlig nicht modifizierte, native Phosphodiesterstrukturen ebenfalls verwendet werden.
  • Es ist nicht notwendig mehr als eine oder vielleicht zwei RNA-Spaltungsfunktionalitäten, Gruppen zum Verbessern der Pharmakodynamik der Oligonukleotide oder Gruppen zum Verbessern der Pharmakokinetik der Oligonukleotide, an Oligonukleotide mit einem Tether erfindungsgemäß zu binden, um für die Vorteile der Erfindung zu sorgen. Daher wird eine RNA-Spaltungseinheit oder eine die Pharmakodynamik verbessernde Gruppe oder eine die Pharmakokinetik verbessernde Gruppe vorzugsweise an einen relativ kleinen Anteil der Untereinheiten, im Allgemeinen nur eine oder zwei, die das Oligonukleotidanalogon umfasst und die der Zielabschnitt der Verbindungen der Erfindung sind, mit einem Tether gebunden. In anderen Ausführungsformen der Erfindung können jedoch alle Nukleotide in einem Oligonukleotid modifiziert werden, um eine oder mehrere RNA-Spaltungseinheitsgruppen, die Pharmakodynamik verbessernde Gruppen oder die Pharmakokinetik verbessernde Gruppen enthalten.
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung umfasst das Oligonukleotid einen Zielabschnitt, der mit einer vorher ausgewählten Nukleotidsequenz einer RNA oder DNA spezifisch hybridisierbar ist, wobei der Zielabschnitt mindestens ein modifiziertes Nukleotid umfasst, dargestellt durch Formel 2:
    Figure 00260001
    wobei:
    J N oder CR3 ist;
    R1 OH oder NH2 ist;
    R2 und R3 H, NH2, Alkyl, substituiertes Alkyl, Alkenyl, Araryl, Alkylamino, Aralkylamino, substituiertes Alkylamino, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkylamino, Aminoalkylamino oder Polyalkylamino ist;
    X eine Zucker oder eine Zuckerderivateinheit ist, wobei die Zuckerderivateinheit ein substituierter Zucker ist, dargestellt durch die Formel:
    Figure 00260002
    wobei:
    Q O oder CHR11 ist;
    R8 und R9 H, Alkyl oder substituiertes Alkyl sind
    R10 H, OH, Niederalkyl, substituiertes Niederalkyl, CN, CF3, OCF3, OCN, O-C3-C12-Alkyl, S-Alkyl, SOMe, SO2Me, ONO2, NO2, NH-Alkyl, OCH=CH2, OCH2CCH, OCCH, Aralkyl, Heteroalkyl, Heterocycloalkyl, Polyalkylamino oder substituiertes Silyl ist; und
    R11 H, OH, Alkyl oder substituiertes Alkyl ist;
    mit der Maßgabe, dass, wenn J CR3 und R3 H ist, dann X die Zuckerderivateinheit ist;
    und ebenso mit der Maßgabe, dass, wenn J N ist, dann X die Zuckerderivateinheit ist.
  • Es wird angenommen, dass das Binden der RNA-Spaltungsfunktionalität an die 2'-Position des Furanosylteils eines Nukleosid-bildenden Teils der Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung in bestimmten Ausführungsformen bevorzugt wird, damit dem Tetherteil gestattet wird, die reaktive Funktionalität der Verbindungen der Erfindung in die durch die Hybridisierung der Verbindung mit der Messenger-RNA gebildete kleinere Furche abzugeben.
  • Die Alkylgruppen der Erfindung umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf C1-C12 gerad- und verzweigtkettige Alkyle, wie zum Beispiel, Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Isopropyl, 2-Butyl, Isobutyl, 2-Methylbutyl, Isopentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 2-Ethylhexyl, 2-Propylpentyl. Alkenylgruppen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf ungesättigte Einheiten, die von den vorstehenden Alkylgruppen abgeleitet sind, umfassend, aber nicht eingeschränkt auf Vinyl, Allyl, Crotyl, Propargyl. Arylgruppen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Phenyl, Tolyl, Benzyl, Naphthyl, Anthracyl, Phenanthryl und Xylyl. Halogene umfassen Fluor, Chlor und Brom. Geeignete heterocyclische Gruppen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Imidazol, Tetrazol, Triazol, Pyrrolidin, Piperidin, Piperazin und Morpholin. Amine umfassen alle Amine der vorstehenden Alkyl-, Alkenyl- und Arylgruppen, umfassend primäre und sekundäre Amine und „maskierte Amine", wie zum Beispiel Phthalimid. Amine sollen ebenfalls Polyalkylaminoverbindungen und Aminoalkylamine, wie zum Beispiel Aminopropylamin und weitere heterocyclischen Alkylamine, wie zum Beispiel Imidazol-1, 2 oder 4-yl-Propylamin umfassen. Substituentengruppen für die vorstehenden Verbindungen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf andere Alkyl-, Halogenalkyl-, Alkenyl, Alkoxy-, Thioalkoxy-, Halogenalkoxy und Arylgruppen, sowie Halogen, Hydroxyl, Amino, Azido, Carboxy, Cyano, Nitro, Mercapto, Sulfide, Sulfone und Sulfoxide. Andere geeigneten Substituentengruppen umfassen ebenfalls Rhodamine, Cumarine, Acridone, Pyrene, Stilbene, Oxazolpyridocarbazole, Anthrachinone, Phenanthridine, Phenazine, Azidobenzole, Psoralene, Porphyrine und Cholesterine.
  • Die Stellen, an die die Funktionalität in den nukleosidischen Einheiten gebunden werden kann, die wiederum zu dem modifizierten Oligonukleotid umgewandelt werden können, ist für das Design der Verbindungen zur sequenzspezifischen Spaltung oder Modulierung der Ziel-RNA entscheidend. Die Funktionalität darf nicht in die Regeln der Watson-Crick-Wasserstoffbindung zwischen Basenpaaren eingreifen, da dies bedeutet, dass der sequenzsspezifische Erkennungs-/Bindungsfaktor, der zur Auswahl der gewünschten RNA wesentlich ist, gespalten wird.
  • Weiterhin werden Methoden zur fehlerlosen Komplementbildung zwischen den modifizierten Oligonukleotiden und der Ziel-RNA zu den stabilsten Heteroduplexen führen. Dies ist erwünscht, weil der Heteroduplex eine ausreichende Halbwertszeit aufweisen muss, um den reaktiven oder nicht reaktiven Funktionalitäten der vorliegenden Erfindung zu gestatten, die Spaltung oder einen anderweitigen Bruch der RNA-Funktion zu initiieren.
  • Die Halbwertszeit des perfekt gebildeten Duplexes wird stark durch die Positionierung der mittels Tether gebundenen funktionellen Gruppe beeinflusst. Eine ungeeignete Positionierung der funktionellen Gruppen, wie zum Beispiel das Anbringen an Stellen der Watson-Crick-Basenpaare würde eine Duplexbildung ausschließen. Andere Bindungsstellen können die sequenzspezifische Bindung erlauben, jedoch können sie von derart geringer Stabilität sein, dass die reaktive Funktionalität nicht ausreichend Zeit hat, um den RNA-Bruch zu initiieren.
  • Ein weiterer wichtiger Faktor zur RNA-Inaktivierung, der das Anbringen der mittels Tether verbundenen Funktionalität betrifft, besteht darin, dass sie, in geeigneter Nähe zum Empfängersubstrat in der Ziel-RNA, insbesondere zu dem empfindlichsten „Triggerpunkt", der 2'-Hydroxylgruppe, lokalisiert sein muss. Eine Vielzahl von Strukturuntersuchungen, wie zum Beispiel Röntgenbeugung, chemische Reaktion und Molekülmodellierungsuntersuchungen lassen vermuten, dass die 2'-Hydroxylgruppe einer RNA in einem Duplex oder Heteroduplex in der kleineren Furche liegt. Daher sollte eine auf den sequenzspezifischen Oligonukleotiden angebrachte Funktionalität (über modifizierte Nukleoside) vorzugsweise in der zwischen dem Oligonukleotid und der Ziel-RNA gebildeten kleineren Furche liegen, nicht die Duplexbildung und die Stabilität stören und eine Spaltung oder einen Bruch der RNA initiieren.
  • Es wurde nun festgestellt, dass bestimmte Positionen auf den Nukleosiden der doppelsträngigen Nukleinsäuren in der kleineren Furche bloßgelegt sind und, ohne die Watson-Crick-Basenpaarung oder die Duplexstabilität zu beeinflussen, substituiert werden können. An diesen Positionen erfindungsgemäß angebrachte reaktive oder nicht reaktive Funktionalitäten können am besten eine Spaltung und einen Bruch einer Ziel-RNA initiieren oder deren Aktivität stören.
  • Reaktive Funktionalitäten oder angehängte Gruppen der früher in der Literatur beschriebenen Oligonukleotide wurden beinahe ausschließlich auf einem Phosphoratom, an die 5-Position von Thymin und die 7-Position von Purinen angebracht. Eine Phosphoratombindungsstelle kann einer reaktiven Gruppe gestatten, sowohl auf die Haupt- als auch auf die kleineren Furchen zuzugreifen. Jedoch führt die innere Phosphormodifikation zu einer stark verringerten Heteroduplexstabilität. Bindungen an den 3'- und/oder 5'-Enden sind dadurch eigneschränkt, dass nur eine oder zwei funktionelle Gruppen in dem Oligonukleotid untergebracht werden können. Eine an der 5-Position oder 7-Position des heterocyclischen Pyrimidins beziehungsweise Purins (Basen) angebrachte Funktionalität wird in der Hauptfurche des Duplexes liegen und wird nicht in der Nähe des 2'-Hydroxyl-RNA-Substrats liegen. Weiterhin kann eine derartige Anbringung die Watson-Crick-Bindung stören.
  • Angehängte Gruppen, die keine reaktive Funktionalität besitzen, aber zur Verbesserung der pharmakodynamischen und pharmakokinetischen Eigenschaften der Oligonukleotide dienen, werden gemäß bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ebenfalls zur Verwendung bevorzugt. Eine Verbesserung der pharmakodynamischen Eigenschaft bedeutet in diesem Zusammenhang eine verbesserte Oligonukleotidaufnahme, eine erhöhte Oligonukleotidbeständigkeit gegen Abbau und/oder eine verstärkte sequenzspezifische Hybridisierung mit einer RNA. Eine Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaft bedeutet in diesem Zusammenhang eine verbesserte Oligonukleotidaufnahme, Verteilung, Metabolismus oder Ausscheidung. Derartige angehängte Gruppen initiieren keine chemischen Reaktionen. Sie umfassen vorzugsweise Alkylketten, Polyamine, Ethylenglycole, Polyamide, Aminoalkylketten, amphipatische Einheiten, Punkte für eine Reportergruppenbindung und Intercalationsverbindungen, die an jede beliebige der bevorzugten Bindungsstellen gebunden sind.
  • Es wird angenommen, dass das Binden der RNA-Spaltungseinheiten gemäß den vorstehenden Erwägungen es diesen Einheiten gestatten wird, in der kleineren Furche des aus der Verbindung der vorliegenden Erfindung und der Messenger-RNA, für die eine Modulation erwünscht wird, gebildeten Hybrids zu liegen. Es ist möglich, dass andere Bindungspositionen der RNA-Spaltungseinheiten mit einer ähnlichen Wirkung gefunden werden können, insbesondere, wenn weitere Modifikationen an der Purin- oder Pyrimidinstruktur vorgenommen worden sind, wie sie durch den Durchschnittsfachmann, ohne vom Geist der vorliegenden Erfindung abzuweichen, durchgeführt werden können. Nochmals gesagt, es versteht sich von selbst, dass vorzugsweise eine oder höchstens ein paar RNA-Spaltungseinheiten im Allgemeinen zu verwenden sind. Daher wird der Fachmann einen großen Spielraum beim Auswählen der Mittel zum Binden der erfindungsgemäßen RNA-Spaltungseinheiten, der die Pharmakodynamik verbessernden Gruppe oder der die Pharmakokinetik verbessernden Gruppe haben.
  • Die RNA-Spaltungseinheiten der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind so entworfen, dass sie wirksam ihre nahe liegende Aufgabe ausführen, was zu der erwünschten Modulation der RNA-Aktivität führt. Es wird angenommen, dass es brauchbar ist, heteroatomare Substitutionen in den RNA-Spaltungseinheiten dieser Moleküle, insbesondere in den Amiden und Polyamiden, zu verwenden, und tatsächlich können manche bevorzugt werden, um für sogar eine engere Bindung zwischen der Ziel-mRNA und den Verbindungen der Erfindung zu sorgen.
  • Oligonukleotidanaloga, die besonders für die Ausübung einer oder mehrerer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen 2'-Zucker-modifizierte Oligonukleotide, wobei eine oder mehrere der 2'-Desoxyribofuranosyleinheiten der Nukleosideinheiten mit N, OH, Niederalkyl, substituiertem Niederalkyl, CN, CF3, OCF3, OCN, O-Alkyl, S-Alkyl, SOME, SO2Me. ONO2, NO2, N3, NH2, NH-Alkyl, OCH2CH=CH2, OCH=CH2, OCH2CCH, OCCH, Aralkyl, Heteroaralkyl, Heterocycloalkyl, Polyalkylamino oder substituiertem Silyl modifiziert sind, wobei Alkyl eine gerade oder verzweigte Kette von C1 bis C12 mit einer Ungesättigtheit innerhalb der Kohlenstoffkette, wie zum Beispiel Allyloxy, ist.
  • Diese modifizierten Basen sind miteinander verknüpft und an das restliche Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon durch eine Zucker-Kopplungsgruppe verknüpft. Die Kopplungsgruppe kann jede der hier beschrieben Strukturen sein, die zum miteinander Verbinden von Zuckereinheiten von Oligonukleotiden unter Bildung des Zielabschnitts der Verbindungen der vorliegenden Erfindung in der Lage sind. Es wird bevorzugt, dass diese Zuckerkopplungseinheiten die Phosphodiesterstruktur oder ein Derivat davon umfassen. Derivate der Phosphodiesterstruktur können eine Substitution eines Sauerstoffatoms gegen Schwefel, Methyl, Methyloxid oder gegen eine Amingruppe umfassen. Das Zuckerphosphatnukleinsäuregrundgerüst kann als Phosphorthioat, Methylphosphonat oder als phosphatalkylierte Einheit modifiziert werden. Die Phosphodiesterbindung kann ebenfalls gegen eine Kohlenstoff- oder Etherbindung, wie vorstehend erörtert ist, ersetzt werden.
  • Zum Binden getetherten Funktionalität an die exocyclische 2-Position von 2'-Desoxyadenosinen, 2'-Desoxyguanosinen und anderen Purinen und Purinanaloga kann das folgende beispielhafte verfahren verwendet werden. 2,6-Dichlorpurin (Aldrich Chemical Co.) wird mit 2,5-Di-O-(4-methylbenzoyl)-α-D-erythropentofuranosylchlorid, gemäß dem in Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, Band 1, Seite 521 (1968) ausgeführten Verfahren, desoxyribosyliert und nachfolgend mit methanolischem Ammoniak aminiert, gemäß dem Verfahren in Journal of the American Chemical Society, Band 106. Seite 6379 (1984). Das resultierende 2-Chlor-2-desoxyadenosin wird in eine Reihe von 2-substituierten 2-Desoxyadenosine durch nukleophile Verdrängung der 2-Chlorgruppe mit ausgewählten nukleophilen reaktiven Funktionalitäten umgewandelt. Auf diese Weise kann eine Vielzahl substituierter Spezies, wie zum Beispiel Amine, Sauerstoffe, Schwefel und Selene direkt an das Kohlenstoffatom in der 2-Position des bicyclischen Ringes gebunden werden. Reaktive Funktionalitäten, die an die 2-Position von 2'-Desoxyadenosin über ein Kohlenstoffatom gebunden sind, können aus 5-Amino-1-(2-desoxy-β-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxyamidin und substituierten Alkdehyden, gemäß dem in dem Journal of the American Chemical Society, Band 90, Seite 4962 (1974) veröffentlichten Verfahren, oder aus Palladium-katalysierten Kreuzkopplungsreaktionen, wie sie in Nucleosides and Nucleotides, Band 8, Seite 699, (1989) mit 2-Iod-2'-desoxyadenosin ausgeführt sind, erhalten werden. Siehe das U.S. Patent 4,719,295. Die 2-reaktive Funktionalität der 2'-Desoxyadenosine kann mit Adenosindeaminase oder Salpetersäure deaminiert werden, um die Desoxyguanosingegenstücke zu ergeben. Wie in den nachstehenden ausgewählten Beispielen können 2-substituierte 2-Desoxyguanosine und 2-Adenosine in die 5'-Dimethoxytrityl-3'-cyanoethylphosphoramidite (N6-Benzoyl für Adenintypen und N2-Isobutyryl für Guanintypen) umgewandelt werden. Diese werden routinemäßig in Oligonukleotide über automatisierte Festphasen-DNA-Synthesevorrichtungen, gemäß gut bekannter Verfahren, eingeschoben.
  • Reaktive Funktionalitäten, die von der 3-Position von 2'-Desoxyguanosin ausgehen, können durch eine mehrstufige Synthese erhalten werden, die mit der Alkylierung der Methyleneinheit von Methyl-5-(cyanomethyl)-1-(2-desoxy-3,5-di-o-p-toluoyl-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxylat mit halogenierten reaktiven Funktionalitäten beginnt. Das Ausgangsimidazolmaterial kann gemäß einem bekannten Verfahren synthetisiert werden. Journal of Medicinal Chemistry, Band 27, Seite 1389 (1984). Die alkylierten Imidazole werden mit methanolischem Ammoniak zum Entfernen der Tolylgruppen und zum Bereitstellen der Imidazolcarboxamide behandelt. Diese werden in Oligonukleotide als 5'-DMT-3'-cyanoethylphosphoramidite durch Routine-Festkörpersynthesetechniken eingeschoben.
  • Nach der Synthese werden die hergestellten Oligonukleotide, die in blockierter Form vorliegen, von dem festen Träger entfernt, worauf sie beispielsweise durch Ammoniumhydroxidbehandlung bearbeitet werden. Eine weitere Grundbehandlung deblockiert und cyclisiert das Imidazolcarboxamid in einen 3-Deaza-3-(reaktive Funktionalität)guaninrest innerhalb der gewünschten Oligonukleotidsequenz. Alternativ dazu, cyclisiert die Spaltung von dem Träger mit konzentriertem Ammoniumhydroxid direkt das Imidazolcarboxamid zu dem 3-Deazaguanin.
  • Die Alkylierung des Imidazol-aktiven Methylens mit α-Halogen-α-[reaktive Funktionalität]acetaldehyddimethylketal oder α-Halogen-methyl-[reaktive Funktionalität]keton mit nachfolgender Aminierung liefert Imidazolcarboxamide. Diese können zu 5'-DMT-3'-cyanoethylphosphoramiditen umgewandelt und in sequenzspezifische Oligonukle otide eingeschoben werden. Ein Grundbehandlung, wie vorstehend, cyclisiert die Imidazoleinheit zu einem 3-Desaza-3-[reaktive Funktionalität]guanin. Weiterer Ringschluß zwischen der resultierenden N-2-exocyclischen Amingruppe und dem Aldehyd- oder Ketoncarbonyl liefert einen tricyclischen Heterocyclus mit einer reaktiven Funktionalität, (Pyrrolo[2,3-β]imidazo[2,3-δ]pyridin-2-on-(5H)-7-(oder 8)-[reaktive Funktionalität]).
  • Tetherfunktionalitäten, die an die 3-Position der 3-Deazaadenin-modifizierten Oligonukleotide gebunden sind, können zum Beispiel durch eine mehrstufige Synthese, die das Binden der reaktiven Funktionalitäten an die Methyleneinheit des Tetrahydropyranylderivats von Dimethyl-5-carboxymethylimidazol-4-carboxylaten betrifft, erhalten werden. Siehe The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A. Weissberger, Herausg., Imidazol and Derivatives, Teil 1, Interscience, N. Y. (1953). Es werden reaktive Funktionalitäten mit geeigneten Abgangsgruppen, wie zum Beispiel Halogene, Sulfonate, Trichloracemidate oder konjugierte. Doppelbindungssysteme verwendet. Die modifizierten Imidazole können mit Ammonium/Wärme unter Bildung der 3-Deaza-3-(reaktive Funktionalität)-1(oder 3)-tetrahydropyranylxanthanine aminiert werden. Diese können mit Phosphorylchlorid chloriert werden, woraus sich 2,6-Dichlor-3-deazapurine ergeben, die an der 3-Position substituiert sind. Diese Verbindungen können mit Ammoniak selektiv aminiert werden, einer katalytischen Hydrogenolyse zum Entfernen des Chloratoms unterzogen werden und dann mit einer herkömmlichen Diphenylcarbymoylgruppe geschützt werden. Desoxyribosylierung dieser Verbindungen untergrundlegenden Bedingungen mit 3'5-Di-O-Tolyl-α-D-erythropentofuranosylchlorid, gefolgt von selektivem Deblockieren der Zucker-Blockierungsgruppen liefert 4-(Di-phenylcarbamoyl)-1-(2-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)-7-[reaktive Funktionalität]imidazo[4,5-d]pyridine. Diese können auf herkömmliche Art in ihre 5'-DMT-3'-cyanoethylphosphoramidite umgewandelt werden und in Oligonukleotide eingebaut werden.
  • Zum Binden der getetherten Funktionalität an die 2'-Position von Ribooligonukleotiden wurden mehrere beispielhafte Syntheseverfahren ersonnen.
  • Synthese 1: Nucleophile Verdrängung der 2'-Abgangsgruppe in Arabinopurinnukleosiden
  • Die nukleophile Verdrängung einer Abgangsgruppe an der 2'-Position nach oben (2'-Desoxy-2'-(Abgangsgruppe)arabinozucker) von Adenin oder Guanin oder deren analogen Nukleosiden kann so verwendet werden. Allgemeine synthetische Verfahren dieser Art sind von M. Ikehara et al., Tetrahedron Band 34, Seiten 1133–1138 (1978); ebd. Band 31, Seiten 1369–1372 (1975); Chemistry and Pharmaceutical Bulletin, Band 26, Seiten 2449–2453 (1978); ebd., Band 26, Seiten 240–244 (1978); M. Ikehara Accounts of Chemical Research, Band 2, Seiten 47–53; und R. Ranganathan Tetrahedron Letters, Band 15, Seiten 1291–1294 (1977) beschrieben worden. Somit können β-D-Arabinofuranosylderivate von Guanin, Adenin, Cytosin und Thymin (Aldrich Chemcial Co.) als N2-Isobutyryl, N6-Benzoyl beziehungsweise N4-Benzoyl durch bekannte Verfahren geschützt werden. Der gleichzeitige Schutz der 3',5'-Hydroxylgruppen der Arabinofuranosylnukleoside kann mit 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan gemäß dem in Nucleic Acid Chemistry, Improved and New Synthetic Procedures, Methods and Techniques, Teil 3, Seite 229 (1986) ausgeführtem bekannten Verfahren ausgeführt werden. Die 2'-Hydroxygruppe wird für eine nukleophile Verdrängung durch Behandlung mit Trichloracetonitril und Natriumhydrid, Tetrahedron Letters, Band 23, Seiten 409–412 (1982) oder Trifluormethylsulfonsäureanhydrid und Natriumhydrid aktiviert. Diese Abgangsgruppen können mittels Inversion durch substituierte Heteroatome, wie zum Beispiel Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff oder Selen verdrängt werden, um die getetherte Funktionalität an der 2'-Position der 3',5'-Silyl-blockierten Nukleoside zu liefern. Dieses Nukleoside können dann, zum Beispiel durch Fluoridionen, deblockiert und in ihre 5'-DMT-3'-cyanoethylphosphoramidiete zum Einschub in Oligonukleotide umgewandelt werden.
  • Synthese 2. Nukleophile Verdrängung von 2,2'-Anhydropyrimidinen
  • Die Nukleoside Thymin, Uracil, Cytosin oder deren Analoga werden in 2'-substituierte Nukleoside über 2,2'-Cycloanhydronukleosid als Zwischenprodukt umgewandelt, wie von J. J. Fox, et al., Journal of Organic Chemistry, Band 29, Seiten 558–564 (1964) beschrieben ist.
  • Synthese 3. 2'-Kopplungsreaktionen
  • Geeignete 3',5'-Zucker und Basen-geschützte Purin- und Pyrimidinnukleoside mit einer ungeschützten Hydroxylgruppe werden mit elektrophilen Reagenzien, wie zum Beispiel Methyliodid und Diazomethan gekoppelt, um die gemischte Sequenz zu liefern, die eine 2'-OMe-Gruppe N enthält, entsprechend dem Verfahren von Inoue, et al., Nucleic Acids Research Band 15, Seiten 6131.6148 (1987).
  • Synthese 4. 2-Desoxy-2-substituierte Ribosylierungen
  • 2-Substituierte 2-Desoxyribosylierung geeigneter geschützter Nukleinsäurebasen und Nukleinsäurebasenanaloga wurde von E. T. Jarvi, et al., Nucleosides & Nucleotides Band 8, Seiten 1111–1114 (1989) und L. W. Hertel, et al., Journal of Organic Chemistry Band 53, Seiten 2406–2409 (1988) berichtet.
  • Synthese 5. Enzymatische Synthese von 2'-Desoxy-2'-substituierten Nukleosiden
  • Die 2-Desoxy-2-substituiertes-Gylcosyl-Übertragung von einem Nukleosid zu einem anderen mit Hilfe von Pyrimidin und Purinribo- oder Desoxyribophosphorlysen wurde von J. R. Rideout und T. A. Krenitsky, U.S. Patent Nr. 4,381,344 (1983) beschrieben.
  • Synthese 6. Umwandlung der 2'-Substituenten in neue Substituenten
  • 2'-substituierte 2-Desoxynukleoside wurden über chemische Standardmanipulationen zu neuen Substituenten umgewandelt. Zum Beispiel beschreibt S. Chladek et al., Journal of Carbohydrates, Nucleosides & Nucleotides Band 7, Seiten 63–75 (1980) die Umwandlung von 2'-Desoxy-2'-azidoadenosin, hergestellt aus Arabinofuranosyladenin, in 2'-Desoxy-2'-aminoadenosin.
  • Synthese 7. Freie Radikalreaktionen
  • Umwandlungen von Halogen substituierten Nukleosiden in 2'-Desoxy-2'-substituierte Nukleoside über freie Radikalreaktionen wurden von K. E. B. Parkes und K. Taylor, Tetrahedron Letters Band 29, Seiten 2995–2996 (1988) beschrieben.
  • Synthese 8. Umwandlung von Ribonukleosiden in 2'-Desoxy-2'-subsituuierte Nukleoside
  • Geeignete 3',5'-Zucker- und Basen-geschützte Purin- und Pyrimidinnukleoside mit einer ungeschützten 2'-Hydroxylgruppe werden in 2'-Desoxy-2'-substituierte Nukleoside durch das Oxidationsverfahren zu der 2'-Ketogruppe, Reaktion mit nukleophilen Reagenzien und schließlich Desoxydierung umgewandelt. Verfahren dieser Art sind von F. De las Heras, et al., Tetrahedron Letters Band 29, Seiten 941–944 (1988) beschrieben worden.
  • Eine Funktionalität in der 1'-Position einer 2'-Desoxyribofuranosyleinheit kann aus dem Nukleosidantibiotikum, Psicofuranin, erhalten werden, das sich von Adenosin dadurch unterscheidet, dass es eine Hydroxylmethylgruppe in der 1'-Position aufweist. Die 3',5'-Hydroxylgruppen können durch 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan geschützt werden, gefolgt von Schützen des 1'-Hydroxymethyls mit einer Triphenylmethylgruppe. Die 2'-Hydroxygruppe kann durch Bildung des Thiocarbonats und nachfolgende Behandlung mit Tri-n-butylhydrid, gemäß bekannter Verfahren, desoxidiert werden. Siehe J. Amer. Chem. Soc., Band 105, Seiten 4059–4065 (1983). Die N6-Aminogruppe kann benzoyliert werden, die Tritylgruppe mit Säure entfernt werden und die resultierende primäre Hydroxygruppe kann zu Trichloracetamidat mit Natriumhydrid und Trichloracetonitril umgewandelt werden. Verdrängungsreaktionen mit verschiedenen Tether/reaktiven Funktionalitäten können leicht im nächsten Schritt ausgeführt werden. Die Disilylblockierungsgruppe kann mit Fluoridionen entfernt werden und das resultierende 2'-Desoxynukleosid kann zu dem 5'-DMT-3'-phosphoramidit zum Einschub in Oligonukleotide über bekannte Verfahren umgesetzt werden.
  • Eine reaktive Funktionalität an der 4'-Position kann aus 2'-Desoxynukleotiden (Sigma Chemical Company) durch selektives Entschützen der 5'-Hydroxylgruppe mit der t-Butyldimethylsilylgruppe und der 3'-Hydroxylgruppe mit der Tetrahydropyranylgruppe erhalten werden. Die Silylgruppe wird mit Fluoridionen entfernt. Das Pfitzner-Moffatt-Oxidationsverfahren, Journal of the American Chemical Society, Band 85, Seite 3027 (1963) kann zum Bereitstellen der 5'-Aldehyde verwendet werden, die dann mit Formaldehyd behandelt werden, woraus sich die 4'-Hydroxymethylderivate ergeben.
  • Tetrahedron Letters, 435 (1977). Diese Desoxynukleoside, so wie ihre 5'-Trityle, können zu 4'-Trichloracetamide mit Trichloracetonitril und Natriumhydrid umgesetzt werden. Die reaktive Funktionalität wird dann an der 4'-Position über nukleophile Verdrängungen der Acetamidate angebracht. Eine Säurebehandlung entfernt die Blockierungsgruppen an den 5'- und 3'-Positionen. Diese können nachfolgend zu einem 5'-DMT-3'-cyanoethylphosphoramidit umgesetzt werden und in die modifizierten Oligonukleotide über automatisierte Festphasen-DNA-Synthesevorrichtungen eingeschoben werden.
  • Die Synthese von gekürzten Guanosinnukleosiden (Monocyclen), die mit einer reaktiven Funktionalität, wie zum Beispiel 2'-Desoxy-2-imidazolon-4-carboxamid-5-reaktive Funktionalität, substituiert sind, kann durch die Reaktion von Ethyl-2-Brommethyl-2-imidazolon(1H,3H)-4-carboxylat mit Nukleophilen mit reaktiver Funktionalität, wie zum Beispiel Histamin, Hydroxyethylimidazolyl und Mercaptoethylimidazolyl ausgeführt werden. Andere heteroatomare neutrale oder anionische Nukleophile, die mit einer reaktiven Funktionalität verknüpft sind, können ebenfalls verwendet werden. Diese Verbindungen werden als 2-o-Diphenylcarbamoylderivate mit Diphenylcarbamoylchlorid und Base geschützt und mit 3,5-Di-o-(4-methylbenzoyl)-α-D-erythropentofuranosylchlorid 2'-desoxyribosyliert. Die 3',5'-Dihydroxygruppen des Zuckers werden mit Base selektiv deblockiert und wieder mit 5'-DMT-3'-cyanoethylphosphoramidit geschützt. Diese Imidazolnukleoside können in Oligonukleotide gemäß bekannter Verfahren eingeschoben werden. Die stark basischen Bedingungen, die zum Entfernen der Acylblockierungsgruppen auf Cytosin, Adenin, Guanin und Imidazolbasen erforderlich sind, wandeln das 4-Imidazolcarboxylat in die 4-Carboxyamideinheit um.
  • Eine reaktive Funktionalität an der 5-Position von 4-Aminoimidazol-2-on-modifizierten Oligonukleotiden kann durch die Desoxyribosylierung von 2,5-Dibrom-4-nitroimidazol, Journal of the Chemical Society Band 121, Seite 947 (1922), mit 3,5-o-(p-Methylbenzoyl)-α-D-erythropentofuranosylchiorid unter basischen Bedingungen hergestellt werden. Die selektive Verdrängung der 5-Bromgruppe mit der nukleophilen reaktiven Funktionalität ergibt eine Vielzahl von Bromnitrodesoxynukleotiden. Die Verdrängung der 2-Bromgruppe und nachfolgende Reduktion der 4-Nitrogruppe liefert 4-Amino-1-(2-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-2-on(3H), das über deren 5'-DMT-3'-cyanoethylphosphoramidite in Oligonukleotide eingeschoben werden kann.
  • Zum Binden der reaktiven Funktionalität an die 2'-Position von α-Arabinofuranosyloligonukleotiden, können silylierte Heterocyclen mit 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-o-benzoyl-D-arabinofuranose (Pfanstiehl Laboratories, Inc.) unter Lewissäure-Katalyse glycosyliert werden. Die Benzoylgruppen des Zuckers des resultierenden α-Nukleosids werden mit methanolischem Ammoniak selektiv entfernt; dann werden die 3',5'-Hydroxylgruppen mit 1,1,3,3-Tetraisopropyldisiloxan entschützt. Die reaktive Funktionalität wird an die 2'-Hydroxylgruppe über die Mitsunobureaktion gebunden. Synthese 1 (1981). Entschützen mit Fluoridionen ergibt dann 2'-[getetherte reaktive Funktionalität]-1-(α-D-Arabinofuranosyl)nukleoside, die über ihre 5'-DMT-3'-cyanoethylphosphoramidite in Oligonukleotide eingeschoben werden können.
  • Die Funktionalität kann an die 6'-Position von natürlich vorkommenden Nukleosiden oder Basenanaloga davon durch direkten nukleophilen Angriff geschützter Heterocyclen auf carbocyclische 3,5-Di-Ο-benzyl-2-desoxy-α-1,6-epoxy-D-erythropentofuranose gebunden werden, wie von K. Biggadike, et al., J. Chem. Soc. Comm., 1083 (1987) ausgeführt wurde. Reaktionen dieser Art werden carbocyclische 2'-Desoxynukleoside mit einer an der 6'-Position auf der α-Fläche des Cyclopentanrings lokalisierten Hydroxylgruppe ergeben. Nun kann die Funktionalität an die ungeschützte Hydroxylgruppe durch direktes Koppeln (das heißt, Mitsunobu Bedingungen, Triphenylphosphin/DEAD) oder doppelte Verdrängungsreaktionen gebunden werden. Die Debenzylierung der Verbindung dieses Typs, gefolgt von Bildung des 5'-DMT und des 3'-β-Cyanoethoxydiisopropylphosphoramidits durch Standardverfahren liefert Monomere, die durch automatisierte Festphasen-DNA-Synthesevorrichtungen in Oligonukleotide eingeschoben werden können.
  • Ohne den Wunsch, an eine beliebige spezielle Theorie über die Funktionsweise gebunden zu sein, wird angenommen, dass die reaktiven RNA-Spaltungsfunktionalitäten, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, über Mechanismen ablaufen, die entweder:
    • 1. Phosphodiesterbindungsspaltung über Säure/Base-Katalyse;
    • 2. Grundgerüstzuckerspaltung;
    • 3. Spaltung über Basenalkylierung; oder
    • 4. Zuckeralkylierung, das heißt 2'-Hydroxyl, Vernetzung, betreffen.
  • Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Position und Orientierung einer geeigneten reaktiven Funktionalität an der kleineren Furche oder Seite, die zwischen dem Zielabschnitt der vorliegenden Erfindung und der Ziel-RNA gebildet wird. Eine Zusammenfassung davon wird in Tabelle 1 zur Verfügung gestellt, und jede reaktive Funktionalität wird entsprechend dem vorgeschlagenen Wirkungsmechanismus beschrieben.
  • Figure 00400001
  • Die Spaltung der Phosphodiesterbindung kann durch strategisches Positionieren von entweder funktionellen Protonenakzeptor-, Protonendonor- oder Elektronenakzeptorgruppen erreicht werden, die durch X, Y beziehungsweise Z in Schema 1 dargestellt sind und zu derartigen Phosphodiesterbindungen benachbart sind.
    Figure 00410001
    SCHEMA 1 wobei B1 und B2 Baseneinheiten sind. Bei manchen Anwendungen ist eine der chemischen Gruppen zum Katalysieren der RNA-Spaltung ausreichend. Jedoch kann in anderen Anwendungen der Erfindung die Kombination von zwei oder sogar drei Gruppen bevorzugt sein. Der Fachmann wird einen großen Spielraum zum Auswählen der spezifischen reaktiven Funktionalitäten X, Y, und/oder Z haben. Es gibt ebenfalls einen großen Spielraum in der Wahl eine oder mehrere reaktive Funktionalitäten in demselben Molekül zu verwenden.
  • Beispiele von Protonenakzeptorfunktionalitäten, die die erfindungsgemäße Phosphodiesterbindung-spaltende reaktive Einheit bildet, umfassen heteroatomare Basen, die zur Basenkatalyse der Phosphodiesterbindung in der Lage sind. Im Allgemeinen werden ammoniakalische Spezies, wie zum Beispiel Alkyl- und Arylamine und Alkyl- und Arylhydrazine bevorzugt. Heterocyclische stickstoffhaltige Verbindungen, insbesondere Imidazole, Pyridine, Azine, Oxazole, Thiazole und dergleichen werden mehr bevorzugt. Von diesen Spezies werden die 1-, 2-, und 5-Imidazole besonders bevor zugt. Jede dieser Verbindungen kann weitreichend substituiert werden, um die Elektronegativität der verschiedenen Stickstoffatome, die für eine Basenkatalyse verfügbar sind, zu variieren. Alkyl- und Arylamidiniumspezies werden ebenfalls besonders bevorzugt.
  • Eine weitere Art von Spezies, die als Protonenakzeptorfunktion in den Verbindungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sein können, sind Koordinationskomplexe. Sie sind als Beispiel 2 von Tabelle 1 dargestellt. Koordinationskomplexe sind dahingehend verwendbar, dass sie ein Metallion mit Liganden aufweisen, die so entworfen sind, dass nicht alle der Koordinationsstellen auf dem Metall durch die Liganden besetzt sind, wodurch eine oder mehrere freie Stellen verbleiben. In Lösung werden die freien Stellen durch Wassermoleküle besetzt, was zu -OH-Einheiten führt, die an das Metall koordiniert sind. Die -OH-Gruppe kann als eine Base zum Abstrahieren des 2'-Protons und zum Ausüben der Phosphodiesterbindungsspaltung wirken. Die Auswahl von Liganden zur Koordination mit den Metallionen sollte sich nach drei wichtigen Erwägungen richten. Zuerst sollten sie in der Lage sein, das Metall nahe an der Ziel-RNA zu halten und die Hydroxylgruppe auf dem Koordinationskomplex (die als HO-ML dargestellt werden kann) in die Nähe des 2'-Protons, das abstrahiert werden soll, zu „steuern". Die Liganden werden so entworfen, dass sie mit dem zwischen den Verbindungen der Erfindung und der Ziel-RNA gebildeten Duplex vorteilhaft wechselwirken.
  • Eine zweite wichtige Funktion der Liganden besteht darin, den pKa-Wert des hydrolysierten Metalls zu regulieren. Der Koordinationskomplex, HO-ML, kann die Katalyse der Spaltung der Ziel-RNA bewirken, indem er nicht nur eine Hydroxylgruppe in der zur Protonenabstraktion richtigen Orientierung, sondern auch den geeigneten pKa-Wert zur Verfügung stellt. Der geeignete pKa-Wert hängt von dem pH-Wert ab, der während der Ausübung der Verfahren der Erfindung vorhanden ist. Der einzuhaltende geeignete pKa-Wert ist vorzugsweise derart, dass die Hydroxylgruppe ausreichend ionisiert ist, um eine Protonenabstraktion zu gestatten, jedoch nicht so niedrig ist, dass die Hydroxylgruppe keine Tendenz zur Abstraktion des Protons aufweist. Die Liganden werden vorzugsweise erfindungsgemäß ausgewählt, um den pKa-Wert des hydrolysierten Metallkomplexes so einzustellen, dass diese Ziele erreicht werden.
  • Die dritte wichtige Funktion der Liganden besteht in der Regulierung von Redoxreaktionen. Im Falle von Metallionen, die zwei oder mehrere zugängliche Oxidationszustände aufweisen, stabilisieren die Liganden einen Oxidationszustand bevorzugt gegenüber anderen und verhindern oder verzögern die Erzeugung diffundierbarer toxischer üblicherweise Sauerstoff enthaltender Radikale.
  • Andere Koordinationskomplexe, umfassend einige, die diffundierbare Sauerstoff-enthaltende Radikale erzeugen sollen, können gemäß anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, jedoch wird von diesen angenommen, dass sie die Ziel-RNA über einen davon verschiedenen Mechanismus, wie er nachstehend beschrieben ist, spalten.
  • Die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugten Metallionen umfassen Ca+2, Sc+3, Cr+3, Mn+2, Fe+3/+2, Co+2,+1, Zn+2, Al+3, Ga+3, Rh+3, Mg+2. Liganden umfassen mehrzähnige Carboxylate, Aminogruppen und Peptide. Liganden dieser Typen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf EDTA, NTA, Bipyridyl, Phenanthrolin, Desferrioxamin, Enterobactin (und deren Analoga), gly gly his und gly gly gly.
  • Diese reaktiven Funktionalitäten werden an den Rest des Moleküls, umfassend die Verbindungen der Erfindung, auf jede praktische Art, üblicherweise über eine Amidfunktion gebunden. Der Durchschnittsfachmann wird keine Schwierigkeit haben, die geeigneten Mittel zum Binden der reaktiven Funktionalitäten an die Zielabschnitte der Verbindungen der vorliegenden Erfindung über herkömmliche Tethermittel auszuwählen.
  • Gemäß anderen Ausführungsformen der Erfindung können Protonen-abgebende, saure Medien als reaktive Funktionalitäten verwendet werden, um eine saure Katalyse der Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen zu bewirken. Derartige Funktionalitäten sind als Gruppe Y in Schema 1 dargestellt und spezielle Ausführungsformen sind in Beispiel 3 in Tabelle 1 dargestellt. Es wird angenommen, dass jede aus einer großen Zahl von Säuren in der Lage ist, Protonen für die Säure-katalysierte Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen erfindungsgemäß abzugeben. Derartige Säurefunktionen umfassen Carbonsäuren und heterocyclische Säuren.
  • Unter der Klasse von heterocyclischen sauren Funktionalitäten werden Tetrazole und Triazole bevorzugt. Es ist bekannt, dass mehrere der Stickstoffatome in den Triazolen und Tetrazolen eine beträchtliche Acidität aufweisen. Es wird angenommen, dass sie zur Katalyse derartiger Hydrolysereaktionen verwendet werden können. Die sauren Funktionalitäten werden an den Zielabschnitt der Verbindungen gebunden, da sie alle erfindungsgemäße reaktive Spezies sind.
  • Es wird angenommen, dass die Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen in Nukleotiden über eine pentakoordinierte Struktur an dem Phosphoratom mit trigonal bipyramidaler Geometrie und einer Ladung von –2 verläuft. Es wird angenommen, dass das Vorhandensein einer elektropositiven Spezies, die diesen Übergangszustand stabilisieren kann, die Spaltungsreaktion katalytisch unterstützt. Es wird angenommen, dass derartige Spezies eine elektropositive Einheit sind und sie wird in Schema 1 als Gruppe Z bezeichnet. Beispiele derartiger Funktionalitäten sind in Beispiel 4 in Tabelle 1 dargestellt. Diese reaktiven Funktionalitäten können einen Koordinationskomplex mit zwei freien Stellen umfassen. Es wird angenommen, dass die zwei freien Stellen an den Phosphorübergangszustand koordinieren und diesen stabilisieren. Unter den reaktiven Funktionalitäten, die für diesen Zweck verwendbar sein können, sind diejenigen, die Metallionen, wie zum Beispiel Ca+2, Sc+3, Cr+3, Mn+2, Fe+3/+2, Co+2/+1, Zn+2, Al+3, Ga+3, Rh+3, Mg+2 enthalten. Liganden, die zur Bildung derartiger Koordinationskomplexe geeignet sind umfassen mehrzähnige Carboxylate, Aminogruppen, Hydroxaminsäuren, Catecholate, heterocyclische Amine und Peptide.
  • Radikal-bildende Einheiten, insbesondere diejenigen, die Sauerstoffradikale bilden, können ebenfalls als reaktive Funktionalitäten der Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Werden Radikal-erzeugende Spezies als reaktive Teile der Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet, wird angenommen, dass es notwendig ist, dass sie in die kleinere Furche des zwischen den Verbindungen und der Ziel-RNA gebildeten Komplexes abgegeben werden. Es wird angenommen, dass die Abgabe in die kleinere Furche für ihre wirksame Funktion mit hoher Ausbeute ohne nachteilige und möglicherweise toxische Nebenwirkungen wesentlich ist. Es ist bekannt, dass die frühere Verwendung von Radikal-erzeugenden Spezies der Wanderung toxischer Verbindungen entsprach, die entweder die gebildeten Radikale umfassten oder von diesen abgeleitet waren, wobei Toxizität und Schädigung anderer intrazellulärer Spezies resultierte. Es wird angenommen, dass die Abgabe dieser Spezies in die kleinere Furche diese negativen Wirkungen vermeidet oder sie zumindest wesentlich verringert. Eine große Zahl organischer Radikal-erzeugender Spezies, wie zum Beispiel Chinone, Cumarine und andere Mittel, die zur Herstellung von aktivem Sauerstoff in der Lage sind, können verwendet werden.
  • Koordinationskomplexe können ebenfalls als Radikal-erzeugende Mittel in der kleineren Furche verwendet werden. Es ist bekannt, dass bestimmte Metalle, die mehr als einen zugänglichen Oxidationszustand aufweisen, wenn sie mit geeigneten Liganden und in Gegenwart von Reduktionsmitteln und Sauerstoff komplexiert werden, Sauerstoffradikalspezies erzeugen, die in der Lage sind, Oligonukleinsäureziele zu spalten. Wie bei den organischen Radikal-erzeugenden Spezies ist es notwendig, den Koordinationskomplex in die kleinere Furche des zwischen den Verbindungen und der Ziel-RNA gebildeten Hybrids zu transportieren.
  • Koordinationskomplexe, die zum Erzeugen von Radikalspezies in der Lage sind, umfassen Eisen-, Kupfer- und Molybdänkomplexe mit Liganden, wie zum Beispiel Carbonsäuren, Amine, heterocyclische Stickstoff-enthaltende Spezies, wie zum Beispiel Phenanthroline, Dipyridyl, Imidazol oder Peptidylliganden, wie zum Beispiel gly gly his, gly gly his lys und gly gly gly gly und Hyodroxaminsäuren. Diese Liganden können zum Erzeugen von wirksameren Kombinationen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung gemischt werden.
  • Eine weitere Gruppe von Einheiten, die als reaktive Teile der Verbindungen der vorliegenden Erfindung dienen können, sind Alkylierungsmittel. Dem Fachmann sind mehrere Klassen von Alkylierungsmitteln bekannt, umfassend die N-Senftypen, die im Allgemeinen β,β-Halogenethylamine sind. Andere Alkylierungsmittel, wie zum Beispiel alpha-Halogenketone, Sulfonylhalogenide, Aziridine, allylische Halogenide, Epoxide, AlkylArylhalogenide und leicht aktivierbare Alkylierungsmittel, wie zum Beispiel Psoraline können ebenfalls verwendet werden. Für die Michael-Reaktion brauchbare Verbindungen können ebenfalls bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung Verwendung finden.
  • Eine 2'-Hydroxylgruppe der Ziel-RNA, die in der kleineren Furch oder auf der Seite bloßgelegt ist, dient als nukleophiles Zentrum zur Bindungsbildung mit einer getetherten elektrophilen Funktionalität, die sich ebenfalls in der kleineren Furche des Heteroduplexes befindet. Klassen von Elektrophilen für die geeignete Bindung an Nukleotide sind vorstehend aufgelistet. Die Ziel-RNA wird durch Bildung von kovalenten Bindungen zwischen einem modifizierten Oligonukleotid und der 2'-Hydroxylgruppe der RNA inaktiviert.
  • Aus Untersuchungen zu Struktur-Aktivitäts-Beziehungen wurde nun entdeckt, dass eine signifikante Zunahme in dem TM-Wert bei der Bindung bestimmter 2'-Zucker-modifizierter Oligonukleotide an deren RNA-Ziel (Komplement) mit einer Zunahme einer „A"-Typ Konformation des Heteroduplexes korreliert ist. Weiterhin wird eine absolute Genauigkeit der modifizierten Oligonukleotide beibehalten. Die erhöhte Bindung unserer 2'-Zucker-modifizierten sequenzspezifischen Oligonukleotide sorgt für eine überlegene Wirksamkeit und Spezifität im Vergleich zu Phosphor-modifizierten Antisense-Oligonukleotiden, wie zum Beispiel Methylphosphonate, Phosphorthioate, Phosphattriester und Phosphoramidite, wie sie in der Literatur bekannt sind.
  • Der einzige strukturelle Unterschied zwischen DNA und RNA-Duplexen ist ein Wasserstoffatom an der 2'-Position der DNA-Ribofuranosyleinheiten gegenüber einer Hydroxylgruppe an der 2'-Position der RNA-Ribofuranosyleinheiten (unter der Maßgabe, dass das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer Methylgruppe in dem Uracilringsystem keine Wirkung aufweist). Jedoch bestehen grobe Unterschiede in der Konformation zwischen DNA- und RNA-Duplexen.
  • Aus der Röntgenbeugungsanalyse von Nukleinsäurefasern, Arnott und Hukins, Biochemical and Biophysical Research Communication, Band 47, Seiten 1504–1510 (1979), und aus der Analyse von Kristallen doppelsträngiger Nukleinsäuren ist bekannt, dass die DNA die Struktur der „B"-Form annimmt und, dass die RNA nur die weitaus starrerere Struktur der „A"-Form annimmt. Der Unterschied zwischen der Zuckerfaltung (C2'-endo für die „B"-Form-DNA und C3'-endo für die „A"-Form-RNA) der monomeren Nukleosideinheiten von DNA und RNA ist der Hauptunterschied in der Konformation zwischen den doppelsträngigen Nukleinsäuren.
  • Den Hauptbeitrag zu der Konformation der Pentofuranosyleinheit leistet die Art des Substituenten an der 2'-Position. Daher nimmt die Population der C3'-endo-Form in Bezug auf die C2'-endo-Form zu, wenn die Elektronegativität des 2'-Substituenten zunimmt. Zum Beispiel zeigt unter den 2'-Desoxy-2'-halogenandeninnukleosiden das 2'-Fluoroderivat die größte Population (65%) an C3'-endo, und das 2'-Iodderivat zeigt die geringste (7%). Diejenigen von Adenosin (2'-OH) und Desoxyadenosin (2'-H) betragen 36% beziehungsweise 19%. Weiterhin ist die Wirkung der 2'-Fluorgruppe von Adenindinukleotiden (2'-Desoxy-2'-fluoradenosin-2'-desoxy-2'-fluoradenosin oder -uridin) mehr mit der Stabilisierung der gestapelten Konformationen als Ribo- oder Desoxyribo-modifizierte Dimere korreliert. Die Forschung weist darauf hin, dass die Dinukleosidphosphate eine gestapelte Konformation mit einer Geometrie aufweisen, die ähnlich zu derjenigen von A-A ist, jedoch mit einer Basen-Basen-Überlappung in einem größeren Ausmaß als A-A. Es wurde angenommen, dass die hoch polare Natur der C2'-F-Bindung und der extreme Vorzug für die C3'-endo-Faltung die gestapelte Konformation in einer „A"-Struktur stabilisiert.
  • Daten aus UV-Hypochromie, Zirkulardichroismus und 1H NMR weisen ebenfalls darauf hin, dass der Grad der Stapelung mit abnehmender Elektronegativität des Halogens abnimmt. Weiterhin gibt es mehr Platz für eine sterische Massigkeit an der 2'-Position in einem Duplex mit „A"-Form als mit „B"-Form.
  • Es wird daher angenommen, dass ein 2'-Substituent auf der 3'-Nukleotidyleinheit eines Dinukleosidmonophosphats eine Reihe von Wirkungen auf die gestapelte Konformation ausübt: sterische Abstoßung, Bevorzugung der Furanosefaltung, elektrostatische Abstoßung, hydrophobe Anziehung und Fähigkeiten zur Wasserstoffbindung. Es wird angenommen, dass diese Substituentenwirkungen durch die molekulare Größe, Elektronegativität und Hydrophobie des Substituenten bestimmt werden.
  • Die 2'-Iod-substituierten Nukleoside besitzen die geringste C3'-endo Population (7%) der Halogenreihen. Nur unter Berücksichtigung von sterischen Wirkungen würde man daher vorhersagen, dass 2'-Iod- oder ähnliche Gruppen zu den die Stapelung destabilisierenden Eigenschaften betragen würden und somit die Bindungs-(Tm)s für Antisense-Oligonukleotide verringern. Jedoch machen die niedrigere Elektronegativität und hohe hydrophobe Anziehungskräfte des Iodatoms und ähnlicher Gruppen die Fähigkeit zum Vorhersagen der Stapelungsstabilitäten und Bindungsstärken komplizierter.
  • Untersuchungen mit der 2'-OMe-Modifikation von 2'-Desoxyguanosin-, Cytidin- und Uridindinuleosidphosphaten zeigen erhöhte Stapelungswirkungen bezogen auf die entsprechenden nicht methylierten Spezies (2'-OH). In diesem Fall neigen die hydrophoben Anziehungskräfte der Methylgruppe dazu, die destabilisierenden Wirkungen durch ihre sterische Masse (Hinderung) zu überwinden.
  • Es wurde festgestellt, dass 2'-Fluor-2'-desoxyadenosin eine ungewöhnlich hohe Population an 3'-endo-Faltung unter Nukleosiden aufweist. Adenosin, 2'-Desoxyadenosin und andere Derivate weisen typischerweise eine Population unterhalb von 40% an 3'-endo-Konformer auf. Es ist bekannt, dass ein Nukleosidrest in gut gestapelten Oligonukleotiden die 3'-endo-Ribofuranosefaltung begünstigt.
  • Die Schmelztemperaturen (komplementäre Bindung) nehmen mit den 2'-susbtituierten Adenosindiphosphaten zu. Es ist nicht klar, ob die Bevorzugung der 3'-endo-Konformation oder ob das Vorhandensein des Substituenten für die erhöhte Bindung verantwortlich ist. Jedoch, wie bemerkt wurde, kann eine größere Überlappung von benachbarten Basen (Stapelung) mit den 3'-endo-Konformationen erreicht werden.
  • Die vorliegende neue Methode zum Erhalten einer stärkeren Bindung besteht darin, Antisense-RNA-Nachahmungen zur Bindung an die Ziel-RNA herzustellen. Daher wurde eine Methode einer zufälligen Struktur-Aktivitäts-Beziehung durchgeführt, um nukleasebeständige Antisense-Oligonukleotide zu entdecken, die geeignete Hybridiserungseigenschaften behielten.
  • Eine Reihe von 2'-Desoxy-2'-modifizierten Nukleosiden von Adenin, Guanin, Cytosin, Thymidin und bestimmten Analoga dieser Basen wurden hergestellt und wurden als modifizierte Nukleoside in sequenzspezifische Oligonukleotide über Festphasen- Nukleinsäuresynthese eingeschoben. Diese neuen Antisense-Oligonukleotide wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, einem Abbau durch Nukleasen zu widerstehend und auf den Besitz von Hybridisierungseigenschaften untersucht, die mit denen des nicht modifizierten Ausgangsoligonukleotid vergleichbar sind. Anfangs wurden kleine elektronegative Atome oder Gruppen ausgewählt, weil für diesen Typ eine Störung der erforderliche Wasserstoffbindung für die Watson-Crick-Basenpaarung (Hybridisierung) unwahrscheinlich ist. Jedoch können elektronische Änderungen aufgrund der Elektronegativität des Atoms oder der Gruppen an der 2'-Position die Zuckerkonformation stark beeinflussen. Während unserer Untersuchungen zur Struktur-Aktivitäts-Beziehung entdeckten wir, dass die Zucker-modifizierten Oligonukleotide an die Ziel-RNA stärker hybridisierten als die nicht modifizierten (2'-Desoxyribosyltyp).
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde eine Kopplungseinheit ersonnen, um die direkte Bindung einer modifizierten Einheit an die endständige Position des 3'-Endes der modifizierten Oligonukleotide zu gestatten. Daher wird ein Ester oder bevorzugter eine Brommethylketogruppe an die 3'-Hydroxylgruppe eines modifizierten 2'-modifizierten Nukleosids gebunden, dessen 5'-Hydroxylgruppe mit einer Dimethoxytriphenylmethylgruppe und dem heterocyclischen Bezoylat des Cytosinreihe geschützt ist. Falls die erforderliche Zielsequenz eine endständige 3'-Thymin- oder Cytosinbase aufweist, wird die erwünschte modifizierte Thymin- oder Cytosinbase, die den Brommethylketolinker enthält, als erstes Monomer zum Binden and das Kontrollporenglas als festen Träger verwendet, das ein über seine 3'-Hydroxylgruppe gebundenes normales Nukleosid enthält. Die basenempfindliche Esterbrücke, die das 2'-modifizierte Nukleosid and das Nukleosid bindet, das an das CPG gebunden ist, wird unter den üblichen Bedingungen mit konzentriertem Ammoniumhydroxid gespalten, die zum Entfernen des Oligonukleotids von dem CPG-Träger verwendet werden. Dies wird gestatten, dass das modifizierte Oligonukleotid eine 2'-modifizierte Einheit an dessen Ende, dem 3'-Ende aufweist.
  • Die Spaltung von Oligonukleotiden durch nukleolytische Enzyme erfordert die Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes oder insbesondere eines Nuklease-Oligonukleotidkomplexes. Die Nukleaseenzyme werden im Allgemeinen spezifische Bindungsstellen, die sich auf den Oligonukleotiden befinden, für eine geeignete Bin dung erfordern. Falls die Oligonukleotid-Bindungsstellen entfernt oder so gehindert sind, dass die Nukleasen nicht an die Oligonukleotide binden, werden nukleasebeständige Oligonukleotide resultieren. Im Falle von Restriktionsendonukleasen, die sequenzspezifische Palindom-Doppelstrang-DNA spalten, wurden bestimmte Bindungsstellen, wie zum Beispiel der Ringstickstoff an den 3- und 7-Positionen, als erforderliche Bindungsstellen identifiziert. Das Entfernen von einer oder mehrerer dieser Stellen oder das Behindern der Annäherung der Nuklease an diese speziellen Positionen innerhalb der Erkennungssequenz sorgte für verschiedene Grade der Beständigkeit gegen spezifische Nukleasen.
  • Die Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloga der vorliegenden Erfindung können in der Diagnose, Therapeutik und als Forschungsreagenzien und Kits verwendet werden. Für die therapeutische Verwendung wird das Oligonukleotid einem Tier verabreicht, das an einer durch ein gewisses Protein beeinflussten Krankheit leidet. Es wird bevorzugt, Patienten, von denen angenommen wird, dass sie an einer derartigen Krankheit leiden, Oligonukleotidmengen zu verabreichen, die wirksam die Symptomatik dieser Krankheit verringern. Es liegt innerhalb des Bereichs eines Fachmanns die optimalen Dosierungen und Behandlungspläne für derartige Behandlungstherapien zu bestimmen.
  • Es wird im Allgemeinen bevorzugt, die erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel innerlich, wie zum Beispiel oral, intravenöse oder intramuskulär zu verabreichen. Andere Verabreichungsformen, wie zum Beispiel transdermal, topisch oder intralesional können ebenfalls verwendbar sein. Der Einschluß in Zäpfchen kann ebenfalls verwendbar sein. Die Verwendung pharmakologisch verträglicher Träger wird für einige Ausführungsformen ebenfalls bevorzugt.
  • Die folgenden Verfahren und Beispiel erläutern die Ausübung der vorliegenden Erfindung. Diese Verfahren und Beispiel sind nicht als die Erfindung einschränkend aufzufassen.
  • Sobald die Nukleotide der Erfindung hergestellt sind, können sie dann nachfolgend in die Oligonukleotide der Erfindung eingebaut werden.
  • Die Oligonukleotide der Erfindung werden durch automatisierte Standardfestphase-Nukleinsäuresynthesevorrichtungen, wie zum Beispiel Applied Biosystems, Incorporates 380B oder MilliGen/Biosearch 7500 oder 8800 synthetisiert. Triester, Phosphoramidit oder Wasserstoffphosphonatkopplungschemie, M. Caruthers, Oligonucleotides. Antisense-Inhibitors of Gene Expression, Seiten 7–24, J. S. Cohen, Herausg. (CRC Press, Inc, Boca Raton, Florida, 1989) werden in diesen Synthesevorrichtungen verwendet, um die gewünschten Oligonukleotide zur Verfügung zu stellen. Das Beaucage-Reagenz, Journal of the American Chemical Society, Band 112, Seiten 1253–1255 (1990) oder elementarer Schwefel, S. Beaucage et al., Tetrahedron Letters, Band 22, Seiten 1859–1862 (1981) wird mit Phosphoramidit oder Wasserstoffphosphonatchemie verwendet, um substituierte Phosphorthioatoligonukleotide zur Verfügung zu stellen.
  • Zur Herstellung bestimmter Verbindungen der Erfindung wurden flüchtige Maskierungsgruppen verwendet. Derartige Maskierungsgruppen gestatten eine einfache Synthese der Verbindungen. Die Maskierungsgruppen werden nachfolgend in die gewünschte Funktionalität umgewandelt. Eine derartige Umwandlung findet vorzugsweise während einem Standarddeblockierungsschritt für eine spätere Reaktion statt. Ein Beispiel für die Verwendung dieses Verfahrens ist die Verwendung einer Phthalimidgruppe zur Einführung einer Aminofunktionalität. Alkylphthalimide werden an die richtige Position in einer interessierenden Verbindung gebunden, wie zum Beispiel ein Nukleosid, über eine geeignete Zwischenverbindung, wie zum Beispiel ein N-(halogenalkyl)phthalimid. Nach Abschluß der Synthese der interessierenden Verbindung wird sie dann als ein strukturelles Nukleotid für die Oligonukleotidsynthese unter Verwendung von Standard-Oligonukleotidsynthesetechniken auf einer Nukleotidsynthesevorrichtung verwendet. Nachdem das gewünschte Oligonukleotid vervollständigt ist, wird es von dem Träger der Synthesevorrichtung abgespalten und dabei wandelt das Spaltungsmittel ebenfalls das Alkylphthalimid zu dem gewünschten Alkylamin um. Das vorstehende Verfahren kann ausgedehnt werden, um längerkettige Polyamino-Funktionalitäten an die Oligonukleotide der Erfindung zu binden. Nukleotide oder Oligonukleotide mit einer ersten Alkylaminofunktionalität werden mit einem weiteren N-(Halogenalkyl)phthalimid behandelt. Die verlängerte Funktionalität wird dann behandelt, woraus sich die endständige Amingruppe ergibt. Dies kann wiederholt werden, um auf Wunsch die Polyamino-Funktionalität weiter zu verlän gern. Alternativ dazu wird die verlängerte Polyamino-Funktionalität zuerst synthetisiert und dann mit der ersten Alkylamino-Funktionalität unter Bildung der Polyamino-Funktionalitätumgesetzt.
  • VERFAHREN 1 – Hybridisierungsanalyse
  • A. Bewertung der Thermodynamik der Hybridisierung modifizierter Oligonukleotide
  • Die Fähigkeit modifizierter Oligonukleotide der Erfindung, an ihre komplementären RNA- oder DNA-Sequenzen zu binden, wurde durch thermische Schmelzanalyse bestimmt. Das RNA-Komplement wurde aus T7-RNA-Polymerase und einem Templatpromotor einer DNA, die mit einer Applied Biosystems, Inc. 380B Nukleinsäuresynthesevorrichtung synthetisiert wurde, synthetisiert. Die RNA-Spezies wurde durch Ionenaustausch unter Verwendung von FPLC (LKB Pharmacia, Inc.) gereinigt. Zu entweder dem RNA- oder DNA-Komplement wurden natürliche Antisense-Oligonukleotide oder diejenigen, die die Modifikationen an spezifischen Orten enthalten, in stöchiometrischen Konzentrationen gegeben und die Extinktions-Hyperchromie (260 nm) nach einem Übergang von Duplex zu Zufallsknäuel wurde unter Verwendung eines Gilford Response II Spektrophotometers überwacht. Diese Messungen wurden in einem Puffer mit 10 mM Na-Phosphat, pH-Wert 7,4, 0,1 mM EDTA und NaCl durchgeführt, um eine Ionenstärke von 10 entweder 0,1 M oder 1,0 M zu ergeben. Die Daten wurden durch eine graphische Darstellung von 1/Tm gegen In[ct] analysiert, wobei [ct] die gesamte Oligonukleotidkonzentration war. Aus dieser Analyse wurden die thermodynamischen Parameter bestimmt. Basierend auf der die Stabilität des Duplexes des gebildeten Heteroduplexes betreffenden gewonnenen Information wurde das Anbringen des modifizierten Pyrimidins in die Oligonukleotide bezüglich ihrer Wirkungen auf die Helixstabilität bewertet. Modifikationen, die die Stabilität des Hybrids drastisch verändern zeigen Verringerungen der freien Energie (delta G) und über ihrer Verwendbarkeit als Antisense-Oligonukleotide wurde befunden.
  • B. Genauigkeit der Hybridisierung modifizierter Oligonukleotide
  • Die Fähigkeit modifizierter Antisense-Oligonukleotide der Erfindung, mit absoluter Spezifität an die Ziel-mRNA zu hybridisieren, wurde durch Northern-Blot-Analyse von gereinigter Ziel-mRNA in Gegenwart der gesamten Zell-RNA gezeigt. Ziel-mRNA wurde aus einem Vektor, der die cDNA für die Ziel-mRNA stromabwärts von einem T7-RNA-Polymerasepromotor enthielt, synthetisiert. Die synthetisierte mRNA wurde in einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und auf eine geeignete Trägermembran (das heißt Nitrocellulose) überführt. Die Trägermembran wurde blockiert und unter Verwendung von [32P]-markierten Antisense-Oligonukleotiden sondiert. Die Strenge wurde durch Wiederholungs-Blots und Waschen bei entweder erhöhten Temperaturen oder verringerter Ionenstärke des Waschpuffers bestimmt. Eine Autoradiographie wurde zum Bewerten des Vorhandenseins von Heteroduplexbildung durchgeführt und das Autoradiogramm wurde durch Laserdensitometrie (LKB Pharmacia, Inc.) quantitativ bestimmt. Die Spezifität der Hybridbildung wurde durch Isolierung der gesamten Zell-RNA durch Standarttechniken und deren Analyse durch Agarose-Elektrophorese, Membrantransfer und Sondierung mit markierten modifizierten Oligonukleotiden bestimmt. Die Strenge wurde für die nicht modifizierten Antisense-Oligonukleotide vorher bestimmt und es wurden solche Bedingungen angewandt, dass nur die mRNA, auf die spezifisch gezielt wurde, zur Bildung eines Heteroduplexes mit dem 2'-modifizierten Oligonukleotid in der Lage war.
  • VERFAHREN 2 – Nukleasebeständigkeit
  • A. Bewertung der Beständigkeit modifizierter Oligonukleotide gegen Serum- und zytoplasmatischen Nukleasen
  • Natürliches Phosphorthioat und modifizierte Oligonukleotide der Erfindung wurden bezüglich ihrer Beständigkeit gegen Serumnukleasen durch Inkubation der Oligonukleotide in Medium bewertet, die verschiedene Konzentrationen an fetalem Kälberserum oder dem Serum erwachsener Menschen enthielten. Markierte Oligonukleotide wurden während verschiedener Zeiten inkubiert, mit Protease K behandelt und dann durch Gelelektrophorese auf 20% Polyacrylaminharnstoft-denaturierenden Gelen und nachfolgender Autoradiographie analysiert. Die Autoradiogramme wurden durch Laserdensitometrie quantitativ bestimmt. Basierend auf dem Ort der Modifikationen und der bekannten Länge des Oligonukleotids war es möglich, die Wirkung der speziellen Modifikation auf den Nukleaseabbau zu bestimmten. Für die zy toplasmatischen Nukleasen wurde eine HL60-Zelllinie verwendet. Ein post-mitochondrialer Überstand wurde durch differentielle Zentrifugation hergestellt und die markierten Oligonukleotide wurden in diesem Überstand für verschiedene Zeitdauern inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Oligonukleotide bezüglich eines wie vorstehend ausgeführten Abbaus auf einen Serum-nukleolytischen Abbau bewertet. Autoradiographieergebisse wurden zum Vergleich mit den nicht modifizierten Phosphorthioaten und den modifizierten Oligonukleotiden quantitativ bestimmt.
  • B. Bewertung der Beständigkeit modifizierter Oligonukleotide gegen spezifische Endo- und Exonukleasen
  • Eine Bewertung der Beständigkeit natürlicher und 2'-modifizierter Oligonukleotide gegen spezifische Nukleasen (das heißt, Endonukleasen, 3',5'-Exo-, und 5',3'-Exonukleasen) wurde zum Bestimmen der genauen Wirkung der Modifikationen auf den Abbau durchgeführt. Modifizierte Oligonukleotide wurden in definierten Reaktionspuffern, die spezifisch für verschiedene ausgewählte Nukleasen sind, inkubiert. Auf die Behandlung der Produkte mit Proteinase K folgend, wurde Harnstoff zugegeben und eine Analyse auf 20% Polyacrylamidgelen, die Harnstoff enthielten, wurde durchgeführt. Die Gelprodukte wurden durch Färben unter Verwendung von Stains All (Sigma Chemical Co.) sichtbar gemacht. Laserdensitometrie wurde zur quantitativen Bestimmung des Ausmaßes des Abbaus verwendet. die Wirkungen der Modifikationen wurden für spezifische Nukleasen bestimmt und mit den aus dem Serum und zytoplasmatischen Systemen erhaltenen Ergebnissen verglichen.
  • VERFAHREN 3 – 5-Lipoxygenaseanalyse, Therapie und Assays
  • A. Therapeutik
  • Zur therapeutischen Verwendung wird ein Tier, das unter dem Verdacht steht eine Krankheit zu haben, die durch übermäßige oder abnormale Versorgung mit 5-Lipoxygenase charakterisiert ist, durch Verabreichen eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids behandelt. Der Durchschnittsfachmann kann leicht die optimalen Dosierungen, Dosierungsmethodologien und Wiederholungsraten bestimmen. Eine derartige Behandlung wird im Allgemeinen fortgesetzt, bis eine Heilung bewirkt wird oder eine Verminderung des Krankheitszustandes erreicht wird. Für manche Krankheiten ist die Behandlung wahrscheinlich langfristig.
  • B. Forschungsreagenzien
  • Die Oligonukleotidverbindungen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls als Forschungsreagenzien verwendbar, wenn sie zum Spalten oder anderweitigen Modulieren von 5-Lipoxygenase-mRNA unverarbeiteten Zelllysaten oder insbesondere in gereinigten oder vollständig gereinigten RNA-Präparaten verwendet werden. Die vorliegende Anmeldung der Erfindung wird zum Beispiel durch Lysieren von Zellen mittels Standardverfahren ausgeführt, wobei die RNA optimal extrahiert und dann, wie in den folgenden Beispielen beschrieben ist, mit einer Verbindung bei Konzentrationen behandelt wird, die im Bereich von zum Beispiel ungefähr 100 bis ungefähr 500 ng pro 10 kg gesamte RNA in einem Puffer, bestehend aus zum Beispiel 50 mm Phosphat mit einem pH-Wert im Bereich von ungefähr 4–10 bei einer Temperatur von ungefähr 30 bis ungefähr 50°C, liegen. Die gespaltene 5-Lipoxygenase-RNA kann durch Agarosegel-Elektrophorese und Hybridisierung mit radioaktiv markierten DNA-Sonden oder durch andere Standardverfahren analysiert werden.
  • C. Diagnose
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden ebenfalls in diagnostischen Anwendungen, insbesondere für die Bestimmung der Expression einer spezifischen mRNA-Spezies in verschiedenen Geweben oder der Expression von abnormalen oder mutierten RNA-Spezies verwendbar sein. In diesem Beispiel zielt die Oligonukleotidverbindung auf eine hypothetische abnormale mRNA, indem sie zu der abnormalen Sequenz komplementär konstruiert wurde, jedoch würde sie nicht mit der normalen mRNA hybridisieren oder diese spalten.
  • Gewebeproben können homogenisiert werden und die RNA kann gegebenenfalls durch Standardverfahren extrahiert werden. Das Rohhomogenat oder Extrakt kann zum Beispiel zum Bewirken der Spaltung der Ziel-RNA behandelt werden. Dann kann das Produkt an einen festen Träger hybridisiert werden, der ein gebundenes Oligonukleotid enthält, das zu einer Region auf der 5'-Seite der Spaltungsseite kom plementär ist. Sowohl die normale als auch die abnormale 5'-Region der mRNA würden an den festen Träger binden. Die 3'-Region der abnormalen RNA, die durch die Verbindung der Erfindung gespalten wurde, würde nicht an den Träger gebunden werden und würde daher von der normalen mRNA getrennt werden.
  • Mehrere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind beispielhaft gemäß den folgenden Beispielen erläutert. Die zu modulierende Ziel-RNA-Spezies bezieht sich auf 5-Lipogenase. Dem Durchschnittsfachmann ist klar, dass die vorliegende Erfindung jedoch nicht derart eingeschränkt ist und dass sie Allgemein anwendbar ist. Es wird erwartet, dass die Hemmung oder Modulierung der Produktion des Enzyms 5-Lipogenase signifikante therapeutische Vorteile bei der Krankheitsbehandlung aufweist. Zum Bewerten der Wirksamkeit der Verbindungen ist ein Assay oder eine Reihe von Assays erforderlich.
  • D. In Vitro Assays
  • Die zellulären Assays für 5-Lipogenase verwenden vorzugsweise die menschliche promyleocytische Leukämiezelllinie HL-60. Diese Zellen können durch verschiedene bekannte Mittel veranlasst werden, sich in entweder eine Monozyt-artige Zelle oder eine Neutrophil-artige Zelle zu differenzieren. Es ist bekannt, dass die Behandlung der Zellen mit 1,3% Dimethylsulfoxid, DMSO, die Differenzierung der Zellen in Neutrophile fördert. Es wurde nun festgestellt, dass HL-60 Basiszellen keine nachweisbaren Gehalte des 5-Lipoxygenaseproteins synthetisieren oder Leukotriene (ein Produkt stromabwärts von 5-Lipoxygenase) ausscheiden). Die Differenzierung der Zellen mit DMSO bewirkt ein Erscheinen des 5.Lipoxygenaseproteins und die Leukotrien-Biosynthese 48 Stunden nach Zugabe von DMSO. Daher kann die Einleitung der 5-Lipogenaseproteinsynthese als Testsystem für eine Analyse von Antisense-Oligonukleotiden, die die 5-Lipoxygenasesynthese in diesen Zellen stört, verwendet werden.
  • Ein zweites Testsystem für Antisense-Oligonukleotide macht von der Tatsache Gebrauch, dass 5-Lipoxygenase ein „Suizid"-Enzym darin ist, dass es nach Reaktion mit dem Substrat sich selbst inaktiviert. Eine Behandlung differenzierter HL-60- oder anderer Zellen, die 5-Lipogenase exprimieren, mit 10 μM A23187, ein Calcium- Ionophor, fördert die Translokation von 5-Lipogenase aus dem Cytosol zu der Membran mit nachfolgender Aktivierung des Enzyms. Nach der Aktivierung und mehreren Katalyserunden wird das Enzym katalytisch inaktiv. Daher inaktiviert die Behandlung der Zellen mit Calcium-Ionophor die endogene 5-Lipogenase. Die Zellen brauchen ungefähr 24 Stunden, um sich von der A23187-Behandlung zu erholen, entsprechend der Messung durch ihre Fähigkeit zur Synthese von Leukotrien B4. Antisense-Oligonukleotide, die gegen 5-Lipogenase gerichtet sind, können auf die Aktivität in zwei HL-60-Modellsystemen unter Verwendung der folgenden quantitativen Assays getestet werden. Die Assays werden ausgehend von den direktesten Messungen zur Hemmung der 5-Lipogenaseproteinsynthese in intakten Zellen zu mehr stromabwärts liegenden Ereignissen beschrieben, wie zum Beispiel die Messung der 5-Lipogenaseaktivität in intakten Zellen.
  • Die direkteste Wirkung, die Antisense-Oligonukleotide auf intakte Zellen ausüben, die leicht quantitativ bestimmt werden kann, ist die spezifische Hemmung der 5-Lipogenaseproteinsynthese. Zum Durchführen dieser Technik können Zellen mit 35S-Methionin (50 μCi/ml) während 2 Stunden bei 37°C zum Markieren von neu synthetisiertem Protein markiert werden. Die Zellen werden extrahiert, um die gesamten Zellproteine zu löslich zu machen und 5-Lipogenase wird mit 5-Lipogenaseantikörper immungefällt, gefolgt von Elution aus Protein A Sepharosekügelchen. Die immungefällten Proteine werden durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgelöst und zur Autoradiographie belichtet. Die Menge an immungefällter 5-Lipogenase wird durch Rasterdensitometrie quantitativ bestimmt.
  • Ein aus diesen Experimenten vorhergesagtes Ergebnis wäre folgendes. Die Menge an 5-Lipoxygenaseprotein, das aus Kontrollzellen immungefällt ist, würde auf 100% skaliert werden. Eine Behandlung der Zellen mit 1 μM, 10 μM und 30 μM an wirksamem Antisense-Oligonukleotid während 48 Stunden würde die immungefällte 5-Lipoxygenase auf 5%, 25% beziehungsweise 75%, bezogen auf die Kontrolle, verringern.
  • Die Messung der 5-Lipoxygenaseenzymaktivität in Zellhomogenaten könnte ebenfalls zum quantitativen Bestimmen der Menge an vorhandenem Enzym verwendet werden, das zur Synthese von Leukotrienen in der Lage ist. Es wurde nun ein radio metrischer Assay zum quantitativen Bestimmen der 5-Lipoxygenaseenzymaktivität in Zellhomogenaten unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC entwickelt. Die Zellen werden durch Beschallen in einem Puffer, der Proteaseinhibitoren und EDTA enthält, aufgebrochen. Das Zellhomogenat wird mit 10.000 × g während 30 min zentrifugiert und die Überstände werden auf 5-Lipogenaseaktivität analysiert. Cytosolproteine werden mit 10 μM 14C-Arachidonsäure, 2 mM ATP, 50 μM freiem Calcium, 100 μg/ml Phosphatidylcholin und 50 mM Bis-Tris-Puffer, bei einem pH-Wert von 7,0 während 5 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen werden durch Zugabe eines gleichen Volumens Aceton gequencht und die Fettsäuren werden mit Ethylacetat extrahiert. Das Substrat und die Reaktionsprodukte werden durch Umkehrphasen-HPLC auf einer Novapak C18 Säule (Waters Inc., Millford, MA) getrennt. Radioaktive Peaks werden durch ein Beckman Modell 171 Radiochromatographiedetektor nachgewiesen. Die Menge an Arachidonsäure, die in Di-HETE und Mono-HETE umgewandelt wurde, wird als Maß für die 5-Lipoxygenaseaktivität verwendet.
  • Ein vorhergesagtes Ergebnis für eine Behandlung von mit DMSO differenzierten HL-60-Zellen während 72 Stunden mit wirksamem Antisense-Oligonukleotid mit 1 μM, 10 μM und 30 μM wäre folgendes. Kontrollzellen oxidieren 200 pmol Arachidonsäure/5 min/106 Zellen. Zellen, die mit 1 μM, 10 μM und 30 μM eines wirksamen Oligonukleotids behandelt werden, würden 195 pmol, 140 pmol beziehungsweise 60 pmol Arachidonsäure/5 min/106 Zellen oxidieren.
  • Es wurde ein quantitativer kompetitiver Enzym-gebundener Immunosorbens-Assay (ELISA) zur Messung des gesamten 5-Lipoxygenaseproteins in Zellen entwickelt. Menschliche 5-Lipoxygenase, exprimiert in E. coli und gereinigt durch Extraktion, Q-Sepharose, Hydroxyapatit und Umkehrphasen-HPLC wird als ein Standard und als das primäre Antigen zum Beschichten von Mikrotiterplatten verwendet. 25 ng gereinigte 5-Lipoxygenase werden an die Mikrotiterplatten über Nacht bei 4°C gebunden. Die Vertiefungen werden während 90 min mit 5% Ziegenserum, verdünnt in 20 mM Tris·HCL-Puffer, pH-Wert 7,4 in Gegenwart von 150 mM NaCl (TBS) blockiert. Die Zellextrakte (0,2% Triton X-100, 12.000 × g während 30 min) oder gereinigte 5-Lipoxygenase wurden mit einer 1 : 4000 Verdünnung von 5-Lipoxygenasepolyklonalem Antikörper in einem Gesamtvolumen von 100 μl in den Mikrotitervertiefungen während 90 min inkubiert. Die Antikörper wurden durch Immunisieren von Kaninchen mit gereinigter menschlicher rekombinanter 5-Lipoxygenase hergestellt. Die Vertiefungen wurden mit TBS gewaschen, das 0,05% Tween 20 (TBST) enthielt, dann mit 100 μl einer 1 : 1000 Verdünnung von Peroxidase konjugiertem Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Cappel Laboratories, Malvern, PA) während 60 min bei 25°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit TBST gewaschen und die Menge an Peroxidase-markiertem zweiten Antikörper wurde durch Entwickeln mit Tetramethylbenzidin bestimmt.
  • Die vorhergesagten Ergebnisse eines derartigen Assays unter Verwendung eines 30-mer-Antisense-Oligonukelotids mit 1 μM, 10 μM und 30 μM wären 30 ng, 18 ng beziehungsweise 5 ng 5-Lipoxygenase auf 106 Zellen, wobei die unbehandelten Zellen ungefähr 34 ng 5-Lipoxygenase enthalten.
  • Eine Nettowirkung der Hemmung der 5-Lipoxygenase-Biosynthese ist eine Verminderung der Leukotrienmengen, die aus stimulierten Zellen freigesetzt werden. DMSO-differenzierte HL-60-Zellen setzen Leukotrien B4 bei Stimulierung mit dem Calcium-Ionophor A23187 frei. Das in das Zellmedium freigesetzte Leukotrien B4 kann durch einen Radioimmunoassay unter Verwendung handelsüblicher Diagnosekits (New England Nuclear, Boston, MA) quantitativ bestimmt werden. Die Leukotrien B4-Herstellung kann in HL-60-Zellen 48 Stunden nach Zugabe von DMSO zum Differenzieren der Zellen in Neutrophil-artige Zellen nachgewiesen werden. Die Zellen (2 × 105 Zellen/ml) werden mit zunehmenden Konzentrationen an Antisense-Oligonukleotiden während 48–72 Stunden in Gegenwart von 1,3% DMSO behandelt. Die Zellen werden gewaschen und mit einer Konzentration von 2 × 106 Zellen/ml in Dulbeccos phosphatgepufferte Salzlösung, die 1% delipidierets Rinderserumalbumin enthält, resuspendiert. Die Zellen werden mit 10 μM Caclium-Ionophor A23187 während 15 min stimuliert und die aus 5 × 105 Zellen hergestellte Menge an LTB4 wird durch einen Radioimmunoassay entsprechend der Beschreibung des Herstellers bestimmt.
  • Unter Verwendung dieses Assays würden wahrscheinlich die folgenden Ergebnisse mit einem 15-mer-Antisense-Oligonukelotid (GCAAGGTCACTGAAG), das gegen die 5-LO-mRNA gerichtet ist, erhalten werden. Die Zellen werden während 72 Stunden mit entweder 1 μM, 10 μM oder 30 μM Oligonukleotid in Gegenwart von 1,3% DMSO behandelt werden. Man würde erwarten, dass die von 5 × 105 Zellen hergestellte Menge an LTB4 ungefähr 75 pg, 50 pg beziehungsweise 35 pg betragen würde, wobei die unbehandelten differenzierten Zellen 75 pg LTB4 herstellen.
  • E. In Vivo Assay
  • Die Hemmung der Herstellung von 5-Lipoxygenase in der Ratte kann gemäß dem folgenden Protokoll gezeigt werden. Die topische Anwendung von Arachidonsäure führt zur schnellen Produktion von Leukotrien B4, Leukotrien C4 und Prostaglandin E2 in der Haut, gefolgt von einem Ödem und Eindringen in Zellen. Es ist bekannt, dass bestimmte Inhibitoren der 5-Lipoxygenase in diesem Assay eine Aktivität zeigen. Für den Assay werden 2 mg Arachidonsäure auf ein Rattenohr aufgebracht, wobei das auf der anderen Seite liegende Ohr als Kontrolle dient. Das polymorph-nukleare Zellinfiltrat wird durch die Myeloperoxidaseaktivität in Homogenaten untersucht, die aus einer Biopsie, 1 Stunde nach Verabreichung der Arachidonsäure, entnommen wurden. Die ödematöse Reaktion wird durch Messung der Ohrdicke und des Feuchtgewichts einer Stempelbiopsie quantitativ bestimmt. Die Messung des in Biopsieproben hergestellten Leukotrien B4 wird als direkte Messung der 5-Lipoxygenaseaktivität in dem Gewebe durchgeführt. Antisense-Oligonukleotide werden topisch auf beide Ohren 12 bis 24 Stunden vor Verabreichung der Arachidonsäure aufgebracht, um eine optimale Aktivität der Verbindungen zu gestatten.
  • Ein unter Verwendung eines 15-mer-Antisense-Oligonukleotids, das gegen Ratten-5-Lipoxygenase gerichtet ist und den Nukleotiden 80–97 entspricht, erwartetes Ergebnis ist nachstehend angegeben. Beide Ohren werden während 24 Stunden mit entweder 0,1 μmol, 0,3 μmol oder 1,0 μmol Antisense-Oligonukleotid vor der Herausforderung mit Arachidonsäure vorbehandelt. Die Werte werden als Mittelwerte für drei Tiere pro Konzentration ausgedrückt. Es wird erwartet, dass die Hemmung der polymorph-nuklearen Zellinfiltration für 0,1 μmol, 0,3 μmol und 1 μmol ungefähr 10%, 75% beziehungsweise 92% der Kontrollaktivität beträgt. Es wird erwartet, dass die Hemmung des Ödems ungefähr 3%, 58% beziehungsweise 90% beträgt, während erwartet würde, dass die Hemmung der Leukotrien B4-Produktion ungefähr 15%, 79% beziehungsweise 99% beträgt.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • 2'-O-(Nonyl)adenosin (1)
  • Zu einer Lösung aus 10 g Adenosin in 400 ml Dimethylformamid wird 2,25 g 60% Natriumhydrid (Öl) gegeben. Nach einer Stunde wird 8,5 ml 1-Bromnonan zugegeben. Die Reaktionsmischung wird während 16 Stunden gerührt. Eis wird zugegeben und die Lösung wird im Vakuum eingedampft. Wasser und Ethylacetat werden zugegeben. Die organische Phase wird abgetrennt, getrocknet und im Vakuum eingedampft, woraus sich ein weißer Feststoff ergibt, der aus Ethanol umkristallisiert wird, woraus sich 4,8 g der Titelverbindung ergeben, Smp. 143–144°C. Analyse für: C19H31N5O4. Berechnet: C, 57,99; H, 7,94; N, 17,79. Gefunden: C, 58,13; H, 7,93; N, 17,83.
  • BEISPIEL 2
  • 2'-O-(Nonyl)-N6-benzoyladenosin (2)
  • 2'-O-(Nonyl)adenosin (1) wird mit Benzoylchlorid auf eine Weise behandelt, die ähnlich zu dem Verfahren von B. L. Caffney und R. A. Jones, Tetrahedron Lett., Band 32, Seite 2257 (1982) ist. Nach Chromatographie auf Silikagel (Ethylacetat-Methanol) wurde die Titelverbindung erhalten. Analyse für: C26H35N5O5. Berechnet: C, 62,75; H, 7,09; N, 17,07. Gefunden: C, 62,73; H, 14,07; N, 13,87.
  • BEISPIEL 3
  • 2'-O-(Nonyl)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (3)
  • Zu einer Lösung aus 4,0 g 2'-O-(Nonyl)-N6-benzoyladenosin (2) in 250 ml Pyridin wird 3,3 g 4,4'-Dimethoxytritylchlorid gegeben. Die Reaktionsmischung wird während 16 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird zu Eis/Wasser/Ethylacetat gegeben, die organische Phase abgetrennt, getrocknet und im Vakuum zu einer gummiartigen Masse eingeengt. 5,8 g der Titelverbindung wurden nach Chromatographie auf Silikagel (Ethylacetat-Methanol-Triethylamin) erhalten. Analyse für: C47N53N5O7. Berechnet: C, 70,56; H, 6,68; N, 8,75. Gefunden: C, 70,26; H, 6,70; N, 8,71.
  • BEISPIEL 4
  • N6-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-(nonyl)adenosin-3'-O,N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit (4)
  • 2'-O-(Nonyl)-5'-O-dimethoxytrityl-N-benzoyladenosin (3) wird mit (β-Cyanoethoxy)chlor(N,N-diisopropyl)aminphosphan auf eine Weise, ähnlich zu dem Verfahren von F. Seela und A. Kehne, Biochemistry, Band 26, Seite 2233 (1987) behandelt. Nach Chromatographie auf Silikagel (E = OAc/Hexan) wurde die Titelverbindung als weißer Schaum erhalten.
  • BEISPIEL 5
  • 2'-O-(Pentyl)adenosin (5)
  • Die Titelverbindung wird wie in Beispiel 1 unter Verwendung von 1-Brompentan anstelle von 1-Bromnonan hergestellt, Smp. 108–109°C. Analyse für: C15H24N5O4. Berechnet: C, 53,24; H, 7,15; N, 20,69. Gefunden: C, 53,37; H, 6,86; N, 20,51.
  • BEISPIEL 6
  • 2'-O-(Pentyl)-N6-benzoyladenosin (6)
  • Die Benzoylierung von 2'-O-(Pentyl)adenosin, wie in Beispiel 2, ergibt die Titelverbindung. Analyse für: C22H29N5O5. Berechnet: C, 59,58; H, 6,59; N, 15,79. Gefunden: C, 59,34; N, 6,27; N, 15,53.
  • BEISPIEL 7
  • 2'-O-(Pentyl)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (7)
  • Die Titelverbindung wird aus 2'-O-(Pentyl)-N6-benzoyladenosin (6) wie in Beispiel 3 hergestellt. Analyse für: C43H46N5O7. Berechnet: C, 69,34; H, 6,22; N, 9,40. Gefunden: C, 68,97; H, 6,07; N, 9,12.
  • BEISPIEL 8
  • N6-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-(pentyl)adenosin-3'-O,N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit (8)
  • Die Titelverbindung wird aus 2'-O-(Pentyl)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (7) wie in Beispiel 4 hergestellt.
  • BEISPIEL 9
  • 2'-O-(Benzyl)adenosin (9)
  • Die Titelverbindung wird wie in Beispiel 1 unter Verwendung von Benzylbromid anstelle von 1-Bromnonan hergestellt. Chromatographie auf Silikagel (E = OAc-MeOH) ergibt einen weißen Feststoff. Smp. 87–88°C. Analyse für: C17H19N5O4·25 m H2O. Berechnet: C, 56,42; H, 5,43; N, 19,35. Gefunden: C, 56,46; H, 5,23; N, 19,50.
  • BEISPIEL 10
  • 2'-O-(Benzyl)-N6-benzoyladenosin (10)
  • Die Benzoylierung von 2'-O-(Benzyl)adenosin (9), wie in Beispiel 2, ergibt die Titelverbindung. Analyse für: C24H23N5O5·25 m H2O. Berechnet: C, 61,86; H, 5,08; N, 15,03. Gefunden: C, 61,89; H, 5,01; N, 14,88.
  • BEISPIEL 11
  • 2'-O-(Benzyl)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (11)
  • Die Titelverbindung wird aus 2'-O-(Benzyl)-N6-benzoyladenosin (10) wie in Beispiel 3 hergestellt. Analyse für: C45H41N5O7. Berechnet: C, 70,76; H, 5,41; N, 9,17. Gefunden: C, 70,84; H, 5,35; N, 8,90.
  • BEISPIEL 12
  • N6-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-(benzyl)adenosin-3'-O,N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit (12)
  • Die Titelverbindung wird aus 2'-O-(Benzyl)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (11) wie in Beispiel 4 hergestellt. Die Verbindung ist ein weißer Schaum.
    31P-NMR (CDCN) S 151,08, 151,25
  • BEISPIEL 13
  • 2'-O-(Butyl)adenosin (13)
  • Die Titelverbindung wird wie in Beispiel 1 unter Verwendung von 1-Brombutan anstelle von 1-Bromnonan hergestellt. Nach Chromatographie auf Silikagel (E = Oc-MeOH) wurde ein weißer Feststoff erhalten.
    1H-NMR (DMSO-d6): 5,97 (d, 1H, C, H).
  • BEISPIEL 14
  • 2'-O-(Butyl)-N6-benzoyladenosin (14)
  • Die Benzoylierung von 2'-O-(Butyl)adenosin (13), wie in Beispiel 2, ergibt die Titelverbindung als weißen Schaum.
    1H-NMR (DMSO-d6): 6,11 (d, 1H, C, H).
  • BEISPIEL 15
  • 2'-O-(Butyl)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (15)
  • Die Titelverbindung wird aus 2'-O-(Butyl)-N6-benzoyladenosin (14) wie in Beispiel 3 hergestellt. Nach Chromatographie auf Silikagel (E = OAc-Hexan-TRA) wurde ein gelber Schaum erhalten. Analyse für C42H43N5O7. Berechnet: C, 69,12; H, 5,94; N, 9,59. Gefunden: C, 69,21; H, 5,99; N, 9,43.
  • BEISPIEL 16
  • N6-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-(butyl)adenosin-3'-O,N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit (16)
  • Die Titelverbindung wird aus 2'-O-(Butyl)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (15) wie in Beispiel 4 hergestellt. Die Verbindung ist ein weißer Schaum.
  • BEISPIEL 17
  • 2'-O-(Propyl)adenosin (17)
  • Die Titelverbindung wird wie in Beispiel 1 unter Verwendung von 1-Brompropan anstelle von 1-Bromnonan hergestellt. Smp. 127–128°C. Analyse für C13H19N5O4. Berechnet: C, 50,48; H, 6,19; N, 22,64. Gefunden: C, 50,58; H, 6,21; N, 22,56.
  • BEISPIEL 18
  • 2'-O-(Propyl)-N6-benzoyladenosin (18)
  • Die Benzoylierung von 2'-O-(Propyl)adenosin (17), wie in Beispiel 2, ergab die Titelverbindung. Analyse für C20H23N5O5. Berechnet: C, 58,10; H, 5,61; N, 16,94. Gefunden: C, 58,12; H, 5,58; N, 16,79
  • BEISPIEL 19
  • 2'-O-(Propyl)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (19)
  • Die Titelverbindung wird aus 2'-O-(Propyl)-N6-benzoyladenosin (18) wie in Beispiel 3 hergestellt.
    1H-NMR (DMSO-d6): 6,13 (d, 1H, C, H).
  • BEISPIEL 20
  • N6-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-(propyl)adenosin-3'-O,N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit (20)
  • Die Titelverbindung wird aus 2'-O-(Propyl)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (19) wie in Beispiel 4 hergestellt. Die Verbindung ist ein weißer Schaum.
  • BEISPIEL 21
  • 2'-O-(Allyl)adenosin (21)
  • Die Titelverbindung wird wie in Beispiel 1 unter Verwendung von Allylbromid anstelle von 1-Bromnonan hergestellt. Die Verbindung ist nach Chromatographie auf Silikagel (E = OAc-Methanol) ein weißer Feststoff.
    1H-NMR (DMSO-d6): S 6,03 (d, 1H, C, H).
  • BEISPIEL 22
  • 2'-O-(Allyl)-N6-benzoyladenosin (22)
  • Die Benzoylierung von 2'-O-(Allyl)adenosin (21), wie in Beispiel 2, ergab die Titelverbindung als weißen Schaum.
    1H-NMR (DMSO-d6): S 6,17 (d, 1H, C, H).
  • BEISPIEL 23
  • 2'-O-(Allyl)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (23)
  • Die Titelverbindung wird aus 2'-O-(Allyl)-N6-benzoyladenosin (22) wie in Beispiel 3 hergestellt. Analyse für C41H39N5O7. Berechnet: C, 68,99; H, 5,51; N, 9,81. Gefunden: C, 68,68; H, 5,43; N, 9,70.
  • BEISPIEL 24
  • N6-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-(allyl)adenosin-3'-O,N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit (24)
  • Die Titelverbindung wird aus 2'-O-(Allyl)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (23) wie in Beispiel 4 hergestellt. Die Verbindung ist ein weißer Schaum.
    32P-NMR (CD3CN): S 151,11, 151,32.
  • BEISPIEL 25
  • 2'-O-(Propylphthalimid)adenosin (25)
  • sDie Titelverbindung wird wie in Beispiel 1 unter Verwendung von N-(3-Brompropyl)phthalimid hergestellt. Die Chromatographie auf Silikagel ergab einen weißen Feststoff. Smp. 123–124°C. Analyse für C21H22N6O6. Berechnet: C, 55,03; H, 4,88; N, 18,49. Gefunden: C, 55,38; H, 4,85; N, 18,46.
  • BEISPIEL 26
  • 2'-O-(Propylphthalimid)-N6-benzoyladenosin (26)
  • Die Benzoylierung von 2'-O-(Propylphthalimid)adenosin (25), wie in Beispiel 2, ergab die Titelverbindung. Analyse für C28H26N6O7. Berechnet: C, 60,21; H, 4,69; N, 15,05. Gefunden: C, 59,94; H, 4,66; N, 14,76.
  • BEISPIEL 27
  • 2'-O-(Propylphthalimid)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (27)
  • Die Titelverbindung wird aus 2'-O-(Propylphthalimid)-N6-benzoyladenosin (26) wie in Beispiel 3 hergestellt. Analyse für C49H44N6O9. Berechnet: C, 68,36; H, 5,15; N, 9,76. Gefunden: C, 68,16; H, 5,03; N, 9,43.
  • BEISPIEL 28
  • N6-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-(propylphthalimid)adenosin-3'-O,N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit (28)
  • Die Titelverbindung wird aus 2'-O-(Propylphthalimid)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (27) wie in Beispiel 4 hergestellt. Ein weißer Schaum wurde erhalten.
  • BEISPIEL 29
  • 2'-O-(Butylphthalimid)adenosin (29)
  • Die Titelverbindung wird wie in Beispiel 1 unter Verwendung von N-(4-Brombutyl)phthalimid anstelle von 1-Bromnonan hergestellt. Die Chromatographie auf Silikagel (E = OAc-MeOH) ergibt einen weißen Feststoff. Smp. 199–200°C. Analyse für C22H24N6O6. Berechnet: C, 56,42; H, 5,16; N, 17,94. Gefunden: C, 56,31; H, 5,04; N, 17,95.
  • BEISPIEL 30
  • 2'-O-(Butylphthalimid)-N6-benzoyladenosin (30)
  • Die Benzoylierung von 2'-O-(Butylphthalimid)adenosin (29), wie in Beispiel 2, ergibt die Titelverbindung. Analyse für C29H28N6O7. Berechnet: C, 60,83; H, 4,93; N, 14,68. Gefunden: C, 60,48; N, 14,41.
  • BEISPIEL 31
  • 2'-O-(Butylphthalimid)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (31)
  • Die Titelverbindung wird aus 2'-O-(Butylphthalimid)-N6-benzoyladenosin (30) wie in Beispiel 3 hergestellt. Analyse für C50H46N6O9. Berechnet: C, 68,64; H, 5,29; N, 9,60. Gefunden: C, 68,47; H, 5,12; N, 9,37.
  • BEISPIEL 32
  • N6-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-(butylphthalimid)adenosin-3'-O,N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit (32)
  • Die Titelverbindung wurde aus Verbindung (31) wie in Beispiel 4 hergestellt.
    31P-NMR (CD3CN): S 150,88, 151,22.
  • BEISPIEL 33
  • 2'-O-(Pentylphthalimid)adenosin (33)
  • Die Titelverbindung wird wie in Beispiel 1 unter Verwendung von N-(5-Brompentyl)phthalimid anstelle von 1-Bromnonan hergestellt. Smp. 159–160°C. Analyse für C, 57,26; H, 5,43; N, 17,42. Gefunden: C, 57,03; H, 5,46; N, 17,33.
  • BEISPIEL 34
  • 2'-O-(Pentylphthalimid)-N6-benzoyladenosin (34)
  • Die Benzoylierung von 2'-O-(Pentylphthalimid)adenosin (33), wie in Beispiel 2, ergibt die Titelverbindung. 1H-NMR (DMSO-d6): 6,10 (d, 1H, C1, H). Analyse für C30H30N6O7. Berechnet: C, 61,43; H, 5,16; N, 14,33. Gefunden: C, 61,51; H, 4,97; N, 14,10.
  • BEISPIEL 35
  • 2'-O-(Pentylphthalimid)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (35)
  • Die Titelverbindung wird aus 2'-O-(Pentylphthalimid)-N6-benzoyladenosin (34) wie in Beispiel 3 hergestellt. Nach Chromatographie auf Silikagel (Ethylacetat, Hexan, Triethylamin) wurde die Titelverbindung erhalten. Analyse für C51H48N6O9. Berechnet: C, 68,91; H, 5,44; N, 9,45. Gefunden: C, 68,65; H, 5,45; N, 9,61.
  • BEISPIEL 36
  • N6-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-(pentylphthalimid)adenosin-3'-O,N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit (36)
  • Die Titelverbindung wurde aus 2'-O-(Pentylphthalimid)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (35) wie in Beispiel 4 hergestellt. Die Verbindung ist ein weißer Schaum.
  • BEISPIEL 37
  • 2'-O-[Imidazo-1-yl-(propyl)]adenosin (41)
  • Die Titelverbindung kann wie in Beispiel 1 unter Verwendung von 1-(3-Brompropyl)imidazol anstelle von 1-Bromnonan hergestellt werden.
  • BEISPIEL 38
  • 2'-O-[Imidazo-1-yl-(propyl)]-N6-benzoyladenosin (42)
  • Die Benzoylierung von 2'-O-[Imidazo-1-yl-(propyl)]adenosin (41), wie in Beispiel 2, wird die Titelverbindung ergeben.
  • BEISPIEL 39
  • 2'-O-[Imidazo-1-yl(propyl)]-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (43)
  • Die Titelverbindung kann aus 2'-O-[Imidazo-1-yl-(propyl)]adenosin (42) wie in Beispiel 3 hergestellt werden.
  • BEISPIEL 40
  • N6-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-[Imidazo-1-yl-(propyl)]adenosin-3'-O,N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit (44)
  • Die Titelverbindung kann aus 2'-O-[Imidazo-1-yl-(propyl)]-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (43) wie in Beispiel 4 hergestellt werden.
  • BEISPIEL 41
  • 2'-O-(Phenylpropyl)adenosin (45)
  • Die Titelverbindung kann wie in Beispiel 1 unter Verwendung von 3-Brompropylbenzol anstelle von 1-Bromnonan hergestellt werden.
  • BEISPIEL 42
  • 2'-O-(Phenylpropyl)-N6-benzoyladenosin (46)
  • Die Benzoylierung von 2'-O-(Phenylpropyl)adenosin (45), wie in Beispiel 2, wird die Titelverbindung ergeben.
  • BEISPIEL 43
  • 2'-O-(Phenylpropyl)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (47)
  • Die Titelverbindung kann aus 2'-O-(Phenylpropyl)adenosin (46) wie in Beispiel 3 hergestellt werden.
  • BEISPIEL 44
  • N6-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-(phenylpropyl)adenosin-3'-O,N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit (48)
  • Die Titelverbindung kann aus 2'-O-(Phenylpropyl)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (47) wie in Beispiel 4 hergestellt werden.
  • BEISPIEL 45
  • 2'-O-[Naphth-1-yl-(propyl)]adenosin (49)
  • Die Titelverbindung kann wie in Beispiel 1 unter Verwendung von 1-(3-Brompropyl)naphthalin anstelle von 1-Bromnonan hergestellt werden.
  • BEISPIEL 46
  • 2'-O-[Naphth-1-yl-(propyl)]-N6-benzoyladenosin (50)
  • Die Benzoylierung von 2'-O-[Naphth-1-yl-(propyl)]adenosin (49), wie in Beispiel 2, wird die Titelverbindung ergeben.
  • BEISPIEL 47
  • 2'-O-[Naphth-1-yl(propyl)]-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (51)
  • Die Titelverbindung kann aus 2'-O-[Naphth-1-yl-(propyl)]-N6-benzoyladenosin (50) wie in Beispiel 3 hergestellt werden.
  • BEISPIEL 48
  • N6-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-[Naphth-1-yl-(propyl)]adenosin-3'-O,N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit (52)
  • Die Titelverbindung kann aus 2'-O-[Naphth-1-yl-(propyl)-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (51) wie in Beispiel 4 hergestellt werden.
  • BEISPIEL 49
  • 2'-O-[Anthracen-2-yl-(propyl)]adenosin (53)
  • Die Titelverbindung kann wie in Beispiel 1 unter Verwendung von 2-(3-Brompropyl)anthracen anstelle von 1-Bromnonan hergestellt werden.
  • BEISPIEL 50
  • 2'-O-[Anthracen-2-yl-(propyl)]-N6-benzoyladenosin (54)
  • Die Benzoylierung von 2'-O-[Anthracen-2-yl-(propyl)]adenosin (53), wie in Beispiel 2, wird die Titelverbindung ergeben.
  • BEISPIEL 51
  • 2'-O-[Anthracen-2-yl(propyl)]-5'-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (55)
  • Die Titelverbindung kann aus 2'-O-[Anthracen-2-yl-(propyl)]-N6-benzoyladenosin (54) wie in Beispiel 3 hergestellt werden.
  • BEISPIEL 52
  • N6-Benzoyl-5'-Ο-dimethoxytrityl-2'-O-[anthracen-2-yl-(propyl)]adenosin-3'-O,N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit (56)
  • Die Titelverbindung kann aus 2'-O-[Anthracen-2-yl-(propyl)]-5'-Ο-dimethoxytrityl-N6-benzoyladenosin (55) wie in Beispiel 4 hergestellt werden.
  • BEISPIEL 53
  • 2'-O-[Bis(phthalimidbutyl)-(aminobutyl)]-N6-benzoyladenosin (57)
  • Verbindung 30 wird mit TIPS-Reagenz (Tetraisopropyldisilyldichlorid) zum Blockieren der 3',5'-Hydroxylgruppen mit der TIPS-Blockierungsgruppe behandelt. Die Behandlung mit Ammoniumhydroxid spaltet die Phthalimidgruppe, woraus sich ein 2'-O-Aminobutyl-blockiertes Adenosin ergibt. Diese Verbindung kann mit n-(4-Brombutyl)phthalimid weiter wie in Beispiel 29 behandelt werden, woraus sich das 2'-O-Polyalkylamino-blockierte Adenosin ergibt. Deblockieren der TIPS-Blockierungsgruppe mit Tetrabutylammoniumfluorid wird die Titelverbindung ergeben. Die Titelverbindung kann wie in den Beispielen 31 und 32 zum Bilden geeigneter blockierter Nukleotide, die zum Einbau in Oligonukleotide geeignet sind, verwendet werden.
  • BEISPIEL 54
  • 2'-O-[Bis(aminobutyl)-(aminobutyl)]N6-benzoyladenosin (58)
  • Die Behandlung von Verbindung 57 mit Ammoniumhydroxid spaltet die Phthalimidgruppe, um die Titelverbindung zu ergeben. Diese Verbindung kann weiterhin entsprechend der Behandlungsweise von Beispiel 53 behandelt werden, um die Polyalkylaminokette weiter zu verlängern.
  • Referenzbeispiel 1
  • N6-Benzoyl-9-(2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl]adenin (65)
  • N6-Benzoyl-9-(2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)adenin (64) (1,08 g, 2,89 mmol), das geringe Verunreinigungen enthielt, wurde in wasserfreiem Pyridin (20 ml) unter Argonatmosphäre gelöst und trockenes Triethylamin (0,52 ml, 3,76 mmol) wurde, gefolgt von der Zugabe von 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (1,13 g, 3,32 mmol), zugegeben. Nach 4 Stunden Rühren bei 20°C wurde die Reaktionsmischung in einen Scheidetrichter überführt und Diethylether (40 ml) wurde unter Bildung einer weißen Suspension zugegeben. Diese Mischung wurde dreimal mit Wasser (3 × 10 ml) gewaschen, die organische Phase wurde abgetrennt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Zu der Lösung wurde Triethylamin (1 ml) gegeben und das Lösungsmittel wurde im Vakuum (60 Torr Hg) bei 20°C verdampft, woraus sich ein Öl ergab, das mit Triethylamin (1 ml)-enthaltendem Toluol (20 ml) eingedampft wurde. Diese Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Silika und Ethylacetat-Triethylamin (99 : 1, v/v), gefolgt von Ethylacetat-Methanol-Triethylamin (80 : 19 : 1) gereinigt, woraus sich das Produkt in zwei Fraktionen ergab. Die Fraktionen wurden im Vakuum (60 Torr, dann 1 Torr Hg) bei 20°C eingedampft, woraus sich ein Schaum ergab, der weiterhin im Vakuum (1 Torr Hg) bei 20°C in Gegenwart von Natriumhydroxid getrocknet wurde, woraus sich N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl]adenin (65) als Schaum ergab (1,02 g, 52%).
  • Referenzbeispiel 2
  • N6-Benzoyl-[2'-desoxy-2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O,N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit (66)
  • N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl]adenin (65) (1,26 g, 1,89 mmol) wurde in wasserfreiem Dichlormethan (13 ml) unter Argonatmosphäre gelöst, Diisopropylethylamin (0,82 ml, 4,66 mmol) wurde zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde auf Eistemperatur abgekühlt. Chlor(diisopropylamino)-β-cyanoethoxyphosphin (0,88 ml, 4,03 mmol) wurde zu der Reaktionsmischung gegeben, die man auf 20°C erwärmen ließ und die während 3 Stunden gerührt wurde. Ethylacetat (80 ml) und Triethylamin (1 ml) wurden zugegeben und diese Lösung wurde mit Kochsalzlösung dreimal (3 × 25 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration von dem Feststoff wurde das Lösungsmittel im Vakuum bei 20°C eingedampft, woraus sich ein Öl ergab, das durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Silika und Hexan-Ethylacetat-Triethylamin (50 : 49 : 1) als Elutionsmittel gereinigt wurde. Eindampfen der Fraktionen im Vakuum bei 20°C ergab einen Schaum, der mit wasserfreiem Pyridin (20 ml) im Vakuum (1 Torr) bei 26°C eingedampft wurde und im Vakuum (1 Torr Hg) bei 20°C in Gegenwart von Natriumhydroxid während 24 h weiter getrocknet wurde, um N6-Benzoyl-[2'-desoxy-2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O,N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit (66) als Schaum (1,05 g, 63%) zu ergeben.
  • Beispiel 55
  • N6-Benzoyl-[2'-desoxy-2'-cyano-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit) (70)
  • 2'-Desoxy-2'-cyanoadenosin wird durch Ersetzen mittels freiem Radikal der 2'-Iodgruppe von 2'-Desoxy-2'-iod-3',5'-O-(disiloxytetraisopropyl)-N6-benzoyladenosin entsprechend einem von K. E. B. Parkes und K. Taylor, Tetrahedron Letters, Band 29, Seiten 2995–2996 (1988) beschriebenem ähnlichen Verfahren hergestellt. 2'-Desoxy-2'-iodadenosin wurde von R. Ranganathan hergestellt, wie in Tetrahedron Letters, Band 15, Seiten 1291–1294 (1977) beschrieben ist, und entsprechend der Beschreibung von W-T. Markiewicz und M. Wiewiorowski in Nucleic Acid Chemistry, Teil 3, Seiten 222–231, Townsend, L. B.; Topsin, R. S. Herausg. (J. Wiley & Sons, New York, 1986) disilyliert. Dieses Material wird mit Hexamethylditin, AIBN, und t-Butylisocyanat in Toluol behandelt, um das geschützte 2'-Desoxy-2'-cyanoadenosin zur Verfügung zu stellen. Nach selektivem Entschützen wird dieses Material zu seinem 5'-DMT-3'-phosphoramidit, entsprechend der Beschreibung in den Referenzbeispielen 1 und 2, umgesetzt.
  • BEISPIEL 56
  • 2'-Desoxy-2'-cyano-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit) (71)
  • 2'-Desoxy-2'-ioduridin (oder 5-Methyluridin), das wie vorstehend beschrieben 3',5'-disilyliert ist, wird durch Behandlung mit Triphenylphosphoniummethyliodid zu dem 2'-Iodderivat umgewandelt, wie von K. E. B. Parkes und K. Taylor, Tetrahedron Letters Band 29, Seiten 2995–2996 (1988) beschrieben ist. Anwendung von Reaktionsbedingungen für freie Radikale, entsprechend der Beschreibung von K. E. B. Parkes und K. Taylor, Tetrahedron Letters, Band 29; Seiten 2995–2996 (1988) liefert die 2'-Cyanogruppe des geschützten Nukleosids. Entschützen dieses Materials und nachfolgende Umsetzung zu dem geschützten Monomer, entsprechend der Beschreibung in den vorstehenden Referenzbeispielen 1 und 2, stellt das erforderliche Nukleinsäure Material für die Synthesevorrichtung zur Verfügung.
  • BEISPIEL 57
  • 2'-Desoxy-2'-cyano-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit) (72)
  • 2'-Desoxy-2'-iodcytidin wird über eine herkömmliche Umsetzung von Keto zu Amino erhalten.
  • BEISPIEL 58
  • 2'-Desoxy-2'-cyano-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit) (73)
  • 2'-Desoxy-2'-cyanoguanosin wird durch Verdrängung der Triflatgruppe an der 2'-Position nach oben (Arabinozucker) von 3',5'-disilyliertem N2-Isobutyrylguanosin erhalten. Entschützen entsprechend einem Standardverfahren und nachfolgendes Wiederschützen, wie zum Beispiel entsprechend der Methodologien von den Referenzbeispielen 1 und 2, stellt das Titelmonomer zur Verfügung.
  • BEISPIEL 59
  • Herstellung von 2'-Desoxy-2'-(trifluormethyl)-modifizierten Oligonukleotiden
  • Die erforderlichen 2'-Desoxy-2'-trifluormethylriboside der Nukleinsäurebasen A, G, U(T) und C werden durch Modifikationen eines Literaturverfahrens, das von Q. Y. Chen und S. W. Wu in dem Journal of the Chemical Society Perkin Transactions, Seiten 2385–2387 (1989) beschrieben ist, hergestellt. Standardverfahren, wie sie in den Referenzbeispielen 1 und 2 beschrieben sind, werden zum Herstellen der 5'-DMT- und 3'-Phosphoramidite, wie sie nachstehend aufgelistet sind, verwendet.
    • A. N6-Benzoyl-[2'-desoxy-2'-trifluormethyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
    • B. 2'-Desoxy-2'-trifluormethyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
    • C. 2'-Desoxy-2'-trifluormethyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
    • D. 2'-Desoxy-2'-trifluormethyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • BEISPIEL 60
  • Herstellung von 2'-Desoxy-2'-(trifluormethoxy)-modifizierten Oligonukleotiden
  • Die erforderlichen 2'-Desoxy-2'-O-trifluormethylriboside der Nukleinsäurebasen A, G, U(T) und C werden durch Modifikationen des von B. S. Sproat, et al., Nucleic Acids Research, Band 18, Seiten 41–49 (1990) und N. Inoue, et al., Nucleic Acids Research, Band 15, Seiten 6131–6148 (1987) beschriebenem Literaturverfahrens modifiziert. Standardverfahren, wie sie in Beispiel 1A beschrieben sind, werden zur Herstellung der 5'-DMT- und 3'-Phosphoramidite, wie sie nachstehend aufgelistet sind, verwendet.
    • A. N6-Benzoyl-[2'-desoxy-2'-(trifluormethoxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
    • B. 2'-Desoxy-2'-(trifluormethoxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
    • C. 2'-Desoxy-2'-(trifluormethoxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
    • D. 2'-Desoxy-2'-(trifluormethoxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • Beispiel 61
  • Herstellung von 2'-Desoxy-2'-(1-propoxy)-modifizierten G, U (T) und C Oligonukleotiden
  • Die erforderlichen 2'-Desoxy-2'-O-propylriboside der Nukleinsäurebasen G, U (T) und C werden durch Routinemodifikation der Beispiele 17 und 18 hergestellt. Siehe ebenfalls B. S. Sprout, et al., Nucleic Acids Research, Band 18, Seiten 41–49 (1990) und N. Inoue, et al., Nucleic Acids Research, Band 15, Seiten 6131–6148 (1987). Die Verfahren, entsprechend der Beschreibung in den Referenzbeispielen 1 und 2 oder in den Beispielen 19 und 20, werden zum Herstellen der 5'-DMT- und 3'-Phosphoramidite, wie sie nachstehend aufgelistet sind, verwendet.
    • A. 2'-Desoxy-2'-(1-propoxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
    • B. 2'-Desoxy-2'-(1-propoxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
    • C. 2'-Desoxy-2'-(1-propoxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • BEISPIEL 62
  • Herstellung von 2'-Desoxy-2'-(vinyloxy)-modifizierten Oligonukleotiden
  • Die erforderlichen 2'-Desoxy-2'-O-vinylriboside der Nukleinsäurebasen A, G, U(T) und C werden durch Modifikationen der Verfahren von Beispiel 1 hergestellt. In diesem Falle wird 1,2-Dibrommethan an die 2'-Hydroxylgruppe gekoppelt und die nachfolgende Dehydrobromierung ergibt das gewünschte blockierte 2'-Vinylnukleosid. Standardverfahren, entsprechend der Beschreibung in den Referenzbeispielen 1 und 2, werden zum Herstellen der 5'-DMT- und 3'-Phosphoramidite, wie sie nachstehend aufgelistet sind, verwendet.
    • A. N6-Benzoyl-[2'-desoxy-2'-(vinyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
    • B. 2'-Desoxy-2'-(vinyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
    • C. 2'-Desoxy-2'-(vinyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
    • B. 2'-Desoxy-2'-(vinyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • BEISPIEL 63
  • Herstellung von 2'-Desoxy-2'(allyloxy)-modifizierten G, U(T) und C Oligonukleotiden
  • Die erforderlichen 2'-Desoxy-2'-O-allylriboside der Nukleinsäurebasen G, U(T) und C werden durch Modifikationen der Verfahren von Beispiel 21 hergestellt. Siehe ebenfalls B. S. Sprout, et al., Nucleic Acids Research, Band 15, Seiten 6131–6148 (1987). Die in den Referenzbeispielen 1 und 2 oder in den Beispielen 23 und 24 beschriebenen Verfahren werden zum Herstellen der 5'-DMT- und 3'-Phosphoramidite, wie sie nachstehend aufgelistet sind, verwendet.
    • A. N6-Benzoyl-[2'-desoxy-2'-(allyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
    • B. 2'-Desoxy-2'-(allyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
    • C. 2'-Desoxy-2'-(allyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
    • D. 2'-Desoxy-2'-(allyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • BEISPIEL 64
  • Chemische Umwandlung eines Thymins oder Cytosins (pyrimidinartige Base) zu dessen β-D-2'-Desoxy-2'-sustituiertem Erythropentofuranosylnukleosid; (2'-substituierte Ribosylierung)
  • Die Thymin- oder Cytosin-artigen Analoga werden unter Standardbedingungen, wie zum Beispiel Hexamethylsilazan (HMDS) und Säurekatalysator (das heißt Ammoniumchlorid) trimethylsilyliert und dann mit 3,5-O-Ditolyl-2-desoxy-2-substituiertes-α-D-erythropentofuranosylchlorid in Gegenwart von Lewissäure-Katalysatoren (das heißt Zinnchlorid, Iod, Bortetrafluorborat, usw.) behandelt. Kürzlich wurde ein spezifisches Verfahren von J. N. Freskos, Nucleosides & Nucleotides Band 8, Seiten 1075–1076 (1989) beschrieben, bei dem Kupfer(I)iodid als Katalysator verwendet wurde.
  • BEISPIEL 65
  • Chemische Umwandlung eines Adenins oder Guanins (purinartige Base) zu dessen β-D-2'-Desoxy-2'-sustituiertem Erythropentofuranosylnukleosid; (2'-substituierte Ribosylierung)
  • Die geschützten purinartigen Analoga werden zu ihren Natriumsalzen über Natriumhydrid in Acetonitril umgewandelt und dann mit 3,5-O-Ditolyl-2-desoxy-2-substituiertes-α-D-erythropentofuranosylchlorid bei Umgebungstemperatur behandelt. Kürzlich wurde ein spezifisches Verfahren von R. K. Robins et al., Journal of the American Chemical Society Band 106, Seite 6379 (1984) beschrieben.
  • BEISPIEL 66
  • Umsetzung von 2'-Desoxy-2-substituierten Thymidinen zu den entsprechenden 2'-Desoxy-2'-substituierten Cytidinen (chemische Umsetzung einer pyrimidinartigen Ketogruppe zu einer 4-Aminogruppe)
  • Die 3',5'-Zuckerhydroxylgruppen der 2'-modifizierten Nukleosidtypen werden durch Acylgruppen, wie zum Beispiel Tolyl, Benzoyl, p-Nitrobenzoyl, Acetyl, Isobutyryl, Trifluoracetyl, usw. unter Verwendung von Standardbedingungen der Säurechloride oder -anhydride und Pyridin/Dimethylaminopyridin als Lösungsmittel und Katalysator geschützt. Das geschützte Nukleosid wird nun mit Thionylchlorid oder Phosphorylchlorid in Pyridin oder anderen geeigneten Grundlösungsmitteln chloriert. Die pyrimidinartigen 4-Chlorgruppen werden nun mit Ammoniak in Methanol verdrängt. Ebenfalls findet das Entschützen der Zuckerhydroxylgruppen statt. Die Aminogruppe wird durch das zweistufige Standartverfahren mit vollständiger Benzylierung (Zuckerhydroxylgruppen und Aminogruppe) benzoyliert und die Acylgruppen werden durch wässrige Natriumhydroxidlösung selektiv entfernt. Alternativ dazu kann das in situ Verfahren, wobei zuerst das Nukleosid mit Chlortrimethylsilan und Base zum Schützen der Zuckerhydroxylgruppen behandelt wird und anschließend acyliert wird, verwendet werden. K. K. Ogilvie, Can. J. Chem. Band 67, Seiten 831–830 (1989). Eine weitere Umwandlungsmethode besteht darin, die pyrimidinartige 4-Chlorgruppe gegen eine 1,2,4-Triazolgruppe zu ersetzen, die während der gesamten Oligonukleotidsynthese auf der DNA-Synthesevorrichtung intakt bleibt, und durch Ammoniak während des Ammoniumhydroxidschritts, der das Oligonukleotid von dem CPG- Träger entfernt, verdrängt wird, und die Heterocyclen zu entschützen. Weiterhin kann in vielen Fällen die pyrimidinartige 4-Chlorgruppen wie soeben beschrieben verwendet werden und am Ende der Oligonukleotidsynthese ersetzt werden.
  • BEISPIEL 67
  • Methyl-5-(cyanomethyl)-1-(2'-desoxy-3,5-di-O-p-Tolyl-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxylat (82-A) und 5-Cyanomethyl-1-(2'-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (82-B)
  • Die Synthese des Methyl-5-(cyanomethyl)-1-(2'-desoxy-3,5-di-O-p-Toluoyl-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxylats (82-A) wurde in großem Umfang, entsprechend des Natriumsalz-Glycosylierungsverfahrens, das von G. R. Revankar, et al., in J. Med. Chem. Band 27, Seiten 1389–1396 (1984) veröffentlicht wurde, ausgeführt. In den nachstehenden Beispielen 68 bis 70 sind die Alkylierungsprodukte dieses Ausgangsmaterials diastereomere Mischungen, die sich in der Konfiguration am alkylierten Kohlenstoff unterscheiden. Als solche zeigen diese Mischungen im 1H-NMR doppelte Resonanzen für jedes Proton. 5-Cyanomethyl-1-(2'-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (82-B), das Produkt der Reaktion von 82A mit flüssigem Ammoniak bei 100°C wurde entsprechend demselben Literaturverweis hergestellt.
  • BEISPIEL 68
  • Methyl-5-(cyano[nonyl]methyl)-1-(2'-desoxy-3,5-di-O-p-toluoyl-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxylat (83)
  • Eine Lösung aus 82-A (5,7 g, 11 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (75 ml) wurde mit Natriumhydrid (0,88 g, 60% in Öl, gewaschen mit Hexan) bei Raumtemperatur und unter Argonatmosphäre behandelt. Diese Suspension wurde während 15 Minuten gerührt und dann mit Iodnonan (7,5 ml, 37,4 mmol) unter Verwendung einer Spritze behandelt. Die Reaktionsmischung wurde unter diesen Bedingungen während 6 Stunden gerührt; Dünnschichtchromatographieplatten (Ethylacetat/Hexane, 3 : 2, v/v) zeigten das Verschwinden des Ausgangsnukleosids und das Erscheinen von zwei schneller wandernden Produkten. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Eisessig auf einen pH-Wert von 5 gequencht und dann zur Trockene im Vakuum eingedampft, woraus sich ein gelber Sirup ergab. Der Sirup wurde in Dichlormethan (150 ml) gelöst und die Lösung wurde mit kalter 0,1 N HCl, Wasser gewaschen und dann über Magnesiumchlorid getrocknet. Filtration des Trockenmittels und Verdampfen des Lösungsmittels ergaben eine gelbe gummiartige Masse, die auf Silikagel (120 g) unter Verwendung von Ethylacetat-Hexanen (1 : 4, dann 1 : 1) Flash-chromatographiert wurde. Die den alkylierten Produkten entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft, woraus sich 83 als gelblicher Schaum, 2,98 g (47%) ergab. 1H-NMR (Me2SO-d6): δ 8,18 und 8,15 (s,s; C-2H, 1H); 6,48 und 6,37 (t,t; H-1', 1H); 1,18 und 0,90 (2m, Nonyl, 19H).
  • BEISPIEL 69
  • Methyl-5-(allyl[cyano]methyl-1-(2'-desoxy-3,5-di-O-p-tolyl-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxylat (84)
  • Eine Lösung aus 82-A (5,0 g, 9,7 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (75 ml) wurde mit Natriumhydrid (0,46 g, 11,6 mmol) und dann mit Allylbromid (2,5 ml, 29 mmol) auf dieselbe Weise, wie für 83 beschrieben ist, behandelt. Die Reaktionsmischung wurde aufgearbeitet und auf Silikagel (75 g) unter Verwendung des vorstehend erwähnten Lösungsmittelsystems chromatographiert, woraus sich 84 als gelblicher Schaum, 3,66 g (68%) ergab. 1H-NMR (Me2SO-d6): δ 8,15 und 8,13 (s,s; C-2H, 1H); 6,38 (m, H-1', 1H); 5,75 und 5,08 (2m, Vinyl, 3H).
  • BEISPIEL 70
  • Methyl-5-(benzyl[cyano]methyl)-1-(2'-desoxy-3,5-di-O-p-tolyl-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxylat (85)
  • Eine Lösung aus 82-A (5,0 g, 9,6 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (75 ml) wurde mit Natriumhydrid (0,46 g, 11 mmol) unter Argon behandelt und während 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde auf 4°C in einem) Eisbad abgekühlt und eine Lösung aus Benzylbromid (1,26 ml, 10,6 mmol) in Acetonitril (15 ml) wurde über 70 min tropfweise zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 2,5 Stunden weiter gerührt. Aufarbeiten der Reaktionsmischung und Reinigung der Produkte auf Silikagel (100 g) ergab 85 als einen weißen Schaum, 3,4 g (58%). 1H-NMR (Me2SO-d6): δ 8,10 und 8,05 (s,s; C-2H, 1Η); 7,30–7,10 (m, Phenyl, 5H); 5,33 und 6,01 (t,t; H-1', 1Η).
  • BEISPIEL 71
  • 5-(Cyano[nonyl]methyl)-1-(2'-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (86)
  • Das Nonylimidazol-Nukleosid 83 (2,98 g, 4,6 mmol) wurde in wasserfreiem Methanol (5 ml) gelöst und in eine Edelstahlbombe überführt. Die Lösung wurde in einem Trockeneis/Isopropanolbad gekühlt und dann mit wasserfreiem flüssigen Ammoniak (45 ml) behandelt. Die Bombe wurde dicht verschlossen und dann auf 100°C in einem Ölbad während 21 Stunden erhitzt. TLC (Ethylacetat/Methanol, 4 : 1, v/v) zeigte eine vollständige Entfernung der Tolylschutzgruppen an. Überschüssiger Ammoniak wurde bei Raumtemperatur verdampft und die resultierende bernsteinfarbene gummiartige Masse wurde auf Silikagel (80 g) unter Verwendung von Ethylacetat/Methanol (95 : 5, dann 9 : 1) Flash-chromatographiert. Die den entschützten Produkten entsprechenden Fraktionen wurde vereinigt und im Vakuum eingedampft, woraus sich 86 als weißer Schaum, 1,14 g (63%) ergab. 1H-NMR (Me2SO-d6): δ 8,09 und 8,05 (s,s; C-2H, 1H); 6,14 (t, H-1', 1H); 1,40–1,05 und 0,95 (2m, Nonyl, 19H).
  • BEISPIEL 72
  • 5-(Allyl[cyano]methyl)-1-(2'-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (87)
  • Das Allylimidazol-Nukleosid 84 (3,95 g, 7,08 mmol) wurde mit flüssigem Ammoniak in einer Edelstahlbombe behandelt und auf 100°C während 8 Stunden erhitzt. Die Produkte dieser Reaktion wurden aufgearbeitet und auf Silikagel (80 g) auf eine zu Verbindung 86 analoge Weise gereinigt. Die deblockierte Verbindung 87 wurde als weißer Schaum isoliert, 1,29 g (58%). 1H-NMR (Me2SO-d6): δ 8,09 und 8,07 (s,s; C-2H, 1H); 6,15 (t, H-1'-1H); 5,75 und 5,10 (2m, Vinyl, 3H).
  • BEISPIEL 73
  • 5-(Benzyl[cyano]methyl)-1-(2'-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (88)
  • Das Benzylimidazol-Nukleosid 85 (3,0 g, 4,93 mmol) wurde mit flüssigem Ammoniak in einer Edelstahlbombe behandelt und auf 100°C während 6 Stunden erhitzt. Die Produkte dieser Reaktion wurden aufgearbeitet und auf Silikagel (80 g) auf eine zu Verbindung 86 analoge Weise gereinigt. Die deblockierte Verbindung 88 wurde als weißer Schaum isoliert, 1,03 g (59%). 1H-NMR (Me2SO-d6): δ 8,03 und 8,04 (s,s; C-2H, 1H); 7,25 (m, Phenyl, 5H); 6,17 und 6,07 (t,t; H-1', 1H).
  • BEISPIEL 74
  • 5-(Cyanomethyl)-1-(2'-desoxy-5'-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (89)
  • Das Nukleosid 82-B (1,95 g, 7,3 mmol) wurde durch Coverdampfung mit Pyridin (30 ml) getrocknet. Die resultierende gummiartige Masse, wurde in wasserfreiem Pyridin unter Argon gelöst und dann mit Dimethoxytritylchlorid (2,90 g, 12,4 mmol) behandelt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt, worauf TLC (Ethylacetat : Methanol, 19 : 1), v/v) eine vollständige Umsetzung des Ausgangsmaterials anzeigte. Tritylierte Produkte wurde als orangefarbene Flecken unter Verwendung von H2SO4-Dämpfen sichtbar gemacht. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Methanol (2 ml) gequencht und wurde nachfolgend während 15 min gerührt. Die Mischung wurde im Vakuum eingedampft, um einen dicken orangefarbenen Sirup zu ergeben, der mit Toluol (3 × 25 ml) coverdampft wurde. Der Sirup wurde auf Silikagel (100 g) unter Verwendung eines schrittweisen Methanolgradienten in 1% Et3N/CH2Cl2 (0 bis 5% Methanol) Flash-chromatographiert. Die passenden Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft, woraus sich 89 als weißer Schaum ergab, 3,64 g (87%). 1H-NMR (Me2SO-d6): δ 7,96 (s; C-2H, 1H); 6,85–7,35 (m, DMT, 13H); 6,13 (t, H-1', 1H).
  • BEISPIEL 75
  • 5-(Cyano[nonyl]methyl)-1-(2'-desoxy-5'-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (90)
  • Das Nukleosid 86 (1,20 g, 3,1 mmol) wurde vollständig durch Coverdampfung mit wasserfreiem Pyridin (30 ml) getrocknet. Der resultierende Sirup wurde in wasser freiem Pyridin unter Argon wieder gelöst und mit Dimethoxytritylchlorid (1,0 g, 3,1 mmol) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 3,5 Stunden gerührt, wobei nach diesem Zeitraum TLC (Ethylacetat) die vollständige Umsetzung des Ausgangsmaterials anzeigte. Die Reaktionsmischung wurde mit 2 ml wasserfreiem Methanol behandelt, während 15 Minuten gerührt und dann im Vakuum eingedampft, wobei sich ein hellorangefarbener Sirup ergab. Dieser Sirup wurde mit Toluol (2 × 50 ml) coverdampft und dann auf Silika (80 g) unter Verwendung eines schrittweisen Methanolgradienten in Dichlormethan/1% Triethylamin (0 bis 3% Methanol) Flash-chromatographiert. Die passenden Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft, woraus sich die dimethoxytritylierte Verbindung 90 als weißer Schaum ergab, 1,46 g (69%). 1H-NMR (Me2SO-d6): δ 7,98 und 7,93 (s,s; C-2H, 1H); 7,30 und 6,92 (2m, DMT, 13H); 6,21 (t, H-1', 1H); 1,20 und 0,92 (2m, Nonyl, 19H).
  • BEISPIEL 76
  • 5-(Allyl[nonyl]methyl)-1-(2'-desoxy-5'-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (91)
  • Das Nukleosid 87 (1,25 g, 4,08 mmol) wurde durch Coverdampfen mit Pyridin getrocknet und dann in wasserfreiem Pyridim (50 ml) wieder gelöst und mit Dimethoxytritylchlorid (1,38 g, 4,08 mmol) unter Argonatmosphäre behandelt. Die Reaktionsmischung wurde während 2,5 Stunden gerührt und dann aufgearbeitet und die Produkte wurden durch Flash-Chromatographie auf Silikagel (90 g) auf eine zu Verbindung 89 analoge Weise isoliert. Die passenden Fraktionen wurde vereinigt und im Vakuum eingedampft, um die dimethoxytritylierte Verbindung 91 als weißen Schaum zu ergeben, 1,86 g (75%). 1H-NMR (Me2SO-d6): δ 7,98 und 7,95 (s,s; C-2H, 1H); 7,25 und 6,93 (2m, DMT, 13H); 6,21 (m, H-1', 1H); 5,78 und 5,10 (2m, Vinyl, 3H).
  • BEISPIEL 77
  • 5-(Benzyl[nonyl]methyl)-1-(2'-desoxy-5'-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (92)
  • Das Nukleosid 88, 930 mg (2,6 mmol) wurde durch Coverdampfen mit Pyridin getrocknet und dann in wasserfreiem Pyridin (50 ml) wieder gelöst und mit Dimetho xytritylchlorid (884 mg, 2,6 mmol) unter Argonatmosphäre behandelt. Die Reaktionsmischung wurde während 4 Stunden gerührt und dann aufgearbeitet und die Produkte wurden durch Flash-Chromatographie auf Silikagel (80 g) auf eine zu Verbindung 89 analoge Weise isoliert. Die passenden Fraktionen wurde vereinigt und im Vakuum eingedampft, um 1,5 g von 92 als rosafarbenen Schaum zu ergeben, (87%). 1H-NMR (Me2SO-d6): δ 7,70 (s; C-2H, 1H); 7,40 und 6,70 (2m, DMT, Phenyl, 18H); 6,10 (t, H-1', 1H).
  • BEISPIEL 78
  • 5-(Cyanomethyl)-1-(5'-O-dimethoxytrityl-3'-O-[2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl]phosphoramidit-2'-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (93)
  • Das tritylierte Nukleosid 89 (1,82 g, 3,2 mmol) wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran (50 ml) unter Argon gelöst und dann mit Diisopropylethylamin (1 ml) behandelt. Die Lösung wurde auf 4°C in einem Eisbad abgekühlt und dann mit 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphorchloridat (1,2 g, 5,12 mmol), das auf einmal zugegeben wurde, abgekühlt. Das Eisbad wurde entfernt und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 3 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit zeigte TLC (CH2Cl2/1% MeOH/1% Et3N) die vollständige Umsetzung des Ausgangsmaterials an. Reaktionsprodukte wurden unter Verwendung von H2SO4-Dämpfen sichtbar gemacht. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingedampft, um einen dicken Sirup zu ergeben, der sofort in Dichlormethan (100 ml) wieder gelöst wurde und mit kalter gesättigter Natriumbicarbonat- (2 × 50 ml) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen wurde. Die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, woraus sich ein gelblicher Schaum (2,8 g) ergab. Dieser Schaum wurde auf Silikagel (75 g) unter Verwendung eines schrittweisen Gradienten von Ethylacetat/Hexanen (1 : 4 bis 1 : 1), 1% Et3N enthaltend, Flashchromatographiert. Die passenden Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft, wobei sich 93 als weißer Schaum ergab, 1,65 g (59%). Ein Aliquot dieses Materials wurde durch Lösen des Schaums in einem kleinen Volumen Dichlormethan und dessen Zugeben zu einem großen Teil (1 : 50) Hexanen gefällt. 1H-NMR (CD3CN): δ, 7,78 und 7,72 (s,s; C-2H, 1H); 7,25 und 6,95 (m, DMT, 13H); 6,12 (t, H-1', 1H). 31P-NMR (CD3CN): δ, 150,02, 149,98.
  • BEISPIEL 79
  • 5-(Cyano[nonyl]methyl)-1-(5'-O-dimethoxytrityl-3'-O-[2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl]phosphoramidit-2'-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (94)
  • Das tritylierte Nukleosid 90, 1,46 g (2,1 mmol) wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran (50 ml) unter Argon gelöst und dann mit Diisopropylethylamin (1,5 ml) behandelt. Diese Mischung wurde in einem Eisbad auf 4°C abgekühlt und dann mit 2-Cyanoethyl-N-N-diisopropylaminophosphorchloridit (488 mg; 2,1 mmol), das auf einmal zugegeben wurde, abgekühlt. Das Eisbad wurde entfernt und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während insgesamt weiteren 3 Stunden gerührt. Am Ende der ersten und zweiten Stunde der Reaktion wurde zusätzliches Phosphorchloridit (48 mg) zugegeben. Am Ende dieser Zeit zeigte TLC (CH2Cl2/3% MeOH/1% Et3N) die vollständige Umsetzung des Ausgangsmaterials an. Die Reaktionsmischung wurde, wie für 93 beschrieben ist, aufgearbeitet und die Produkte wurden auf Silikagel (80 g) unter Verwendung eines schrittweisen Gradienten von Ethylacetat/Hexanen (2 : 3 bis 3 : 2), 1% Et3N enthaltend, gereinigt. Die passenden Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft, wobei sich 94 als farbloser Schaum ergab, 1,37 g (73%). Ein Aliquot dieses Materials wurde unter Verwendung des für die Verbindung 93 beschriebenen Verfahrens gefällt. 1H-NMR (CD3CN): δ, 7,75 (s; C-2H); 7,25 und 6,85 (2m, DMT, 13H); 6,25 und 6,20 (2m, H-1', 1H). 31P-NMR (CD3CN): δ, 150,1 und 149,9.
  • BEISPIEL 80
  • 5-(Allyl[cyano]methyl)-1-(5'-O-dimethoxytrityl-3'-O-[2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl]phosphoramidit-2'-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (95)
  • Das tritylierte Nukleosid 91, 1,86 g (3,1 mmol) wurde in wasserfreiem THF (50 ml) gelöst und dann mit Diisopropylethylamin (1,5 ml) und 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylaminophosphorchloridt (705 mg, 3,1 mmol) auf eine zu Verbindung 94 analoge Weise behandelt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während insgesamt 3 Stunden gerührt. Am Ende der Reaktionszeit von 2 Stunden wurde zusätzli ches Phosphorchloridit (140 mg) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde aufgearbeitet und die Produkte wurden unter Verwendung eines schrittweisen Gradienten von Ethylacetat/Hexanen (2 : 3 bis 4 : 1, v/v) durch Flash-Chromatographie auf Silikagel isoliert. Die passenden Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft, wobei sich 2,18 g (88%) von 95 als weißer fester Schaum ergaben. Ein Aliquot dieses Materials wurde unter Verwendung eines für die Verbindung 93 beschriebenen Verfahrens gefällt. 1H-NMR (CD3CN): δ, 7,77 und 7,75 (s,s; C-2H, 1H); 7,45 und 6,85 (2m, DMT, 13H); 6,25 und 6,20 (t,t, H-1', 1H). 31P-NMR (CD3CN): δ, 150,05, 149,98 und 149,85.
  • BEISPIEL 81
  • 5-(Benzyl[cyano]methyl)-1-(5'-O-dimethoxytrityl-3'-O-[2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl]phosphoramidit-2'-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (96)
  • Das tritylierte Nukleosid 92, 1,50 g (2,3 mmol) wurde in wasserfreiem THF (50 ml) gelöst und dann mit Diisopropylethylamin (1,5 ml) und 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylaminophosphorchloridt (539 mg, 2,3 mmol) auf eine zu Verbindung 93 analoge Weise behandelt. Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur während insgesamt 3 Stunden gerührt. Am Ende der Reaktionszeit von 2 Stunden wurde zusätzliches Phosphorchloridit (110 mg) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde aufgearbeitet und die Produkte wurden unter Verwendung eines schrittweisen Gradienten von Ethylacetat/Hexanen (1 : 4 bis 3 : 2, v/v) durch Flash-Chromatographie auf Silikagel isoliert. Die passenden Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft, wobei sich 96 1,03 g (55%) als farbloser Schaum ergab. Ein Aliquot dieses Materials wurde unter Verwendung eines für die Verbindung 93 beschriebenen Verfahrens gefällt. 1H-NMR (CD3CN): δ, 7,72 (s,s; C-2H, 1H); 7,30 und 6,80 (2m, DMT, Benzyl, 18H); 6,10 (m, H-1', 1H). 31P-NMR (CD3CN): δ, 150,00, 149,90 und 149,85.
  • BEISPIEL 82
  • Synthese von Oligomeren
  • Oligomere, die die Nukleotide der Beispiele 78, 79, 80 und 81 einschließen, wurden unter Verwendung von Standardphosphoramiditchemievarianten auf der Applied Biosystems 380B Synthesevorrichtung hergestellt. Die durchschnittlichen Kopplungsleistungsfähigkeiten betrugen 94%, wobei ein Verfahren verwendet wurde, das auf jedem Oligonukleotid die 5'-Dimethoxytritylgruppe beließ. Nach Spaltung von dem festen Träger wurden die Oligomere mit konzentriertem Ammoniumhydroxid im Überschuß behandelt und dann in einem abgedichteten Gefäß bei 55°C während mindestens 15 Stunden erwärmt. Dieses Verfahren entfernte alle Schutzgruppen der A-, G- und C-Basen und bewirkte den Ringschluss des 5-Cyano[alkyl]methylimidazols an die 3-Deaza-3-alkyl(oder aryl)heterocyclen. Für jedes Nukleotid wurde das Nachprüfen dieses Ringschlusses durch die Analyse eines 1H-NMR-Spekltrums eines TG3C-Trimers durchgeführt, das eine einzelne 3-Deaza-3-substituierte 2'-Desoxyguanosinbase enthielt. Die Reinigung dieser Oligomere mit darauf vorhandenem Trityl wurde unter Verwendung einer C-4 Waters Prepak Cassette (10 cm) unter Verwendung eines Elutionsgradienten von Acetonitril in 50 mM Triethylammoniumacetat (pH-Wert 7,0) (4 bis 48% während 60 min) durchgeführt. Die Tritylgruppe wurde durch Behandlung mit 15% Essigsäure entfernt und die Oligomere wurden dann aus 70% Ethanol gefällt.
  • BEISPIEL 83
  • 5-(Cyano[propylphthalimid]methyl)-1-(5'-O-dimethoxytrityl-3'-O'-[2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl]phosphoramidit-2'-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (98)
  • Verbindung 82-A kann auf eine Weise wie im Beispiel 68 mit N-(3-Brompropyl)phthalimid anstelle von Iodnonan behandelt werden. Nach Aufarbeiten wie in Beispiel 68 kann das Produkt wie in den Beispielen 74 und 78 behandelt werden, um die Titelverbindung zu ergeben. Zusätzlich zu dem Ringschluss nach Spaltung von dem festen Träger der Oligonukleosidsynthesevorrichtung wird ebenfalls wie in den vorstehenden Beispielen das Phthalimid als Amino abgespalten. Weiterhin kann das Alkylaminoprodukt mittels Kettenverlängerung zu einem Polyalkylamin, wie in den Beispielen 53 und 54, umgesetzt werden.
  • BEISPIEL 84
  • 5-(Cyano[imidazo-1-yl(propyl)]methyl-1-(5'-O-dimethoxytrityl-3'-O'-[2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl]phosphoramidit-2'-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (99)
  • Verbindung 82-A kann auf eine Weise wie im Beispiel 68 mit 1-(3-Brompropyl)imidazol anstelle von Iodnonan behandelt werden. Nach Aufarbeiten wie in Beispiel 68 kann das Produkt wie in den Beispielen 74 und 78 behandelt werden, um die Titelverbindung zu ergeben.
  • BEISPIEL 85
  • 5-(Cyano[anthracen-2-yl(propyl)]methyl-1-(5'-O-dimethoxytrityl-3'-O'-[2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl]phosphoramidit-2'-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid (100)
  • Verbindung 82-A kann auf eine Weise wie im Beispiel 68 mit 2-(3-Brompropyl)anthracen anstelle von Iodnonan behandelt werden. Nach Aufarbeiten wie in Beispiel 68 kann das Produkt wie in den Beispielen 74 und 78 behandelt werden, um die Titelverbindung zu ergeben.
  • BEISPIEL 86
  • 2-Chlor-6-allyloxy-9-2'-desoxypurin (101)
  • Zu einer gerührten Suspension von 2,6-Dichlor-9-(2'-desoxy-3',5'-di-o-tolyl)purin (10,3 g, 19,04 mmol) in Allylalkohol (150 ml) wurde Natriumhydrid (0,8 g, 20 mmol) in kleinen Mengen über einen Zeitraum von 10 Minuten bei Raumtemperatur gegeben. Nach Zugabe des Natriumhydrids wurde die Reaktionsmischung in ein vorgeheiztes Ölbad bei 55°C während 20 Minuten unter Ausschluss von Feuchtigkeit gesetzt. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt, filtriert und mit Allylalkohol (100 ml) gewaschen. Zu dem Filtrat wurde IRC-50 (schwach sauer) H⨁-Harz gegeben, bis der pH-Wert der Lösung 4–5 betrug. Das Harz wurde abfiltriert, mit Methanol (100 ml) gewaschen und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde auf Silikagel (10 g, 60–100 Mesh) adsorbiert und zur Trockene eingedampft. Das getrocknete Silkagel wurde auf die Silikasäule (5 × 25 cm, 100–250 Mesh), die in Dichlormethan gepackt worden war, gegeben. Die Säule wurde mit CH2Cl2→Aceton elu iert. Die Fraktionen mit dem Produkt wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, um 6 g (96%) der Titelverbindung als Schaum zu ergeben.
  • BEISPIEL 87
  • 2-Chlor-2'-desoxyinosin (102)
  • Eine Mischung aus (101) (6 g, 18,4 mmol), pd/c (10%, 1 g) und Triethylamin (1,92 g, 19 mmol) in Ethylalkohol (200 ml) wurde bei Atmosphärendruck während Zeitintervallen von 30 Minuten bei Raumtemperatur hydriert. Die Reaktionsmischung wurde filtriert, mit MeOH (50 ml) gewaschen und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Es wurde festgestellt, dass das Produkt (5,26 g, 100%) feuchtigkeitsempfindlich war und als Öl zurückblieb. Das Öl wurde als solches ohne Reinigung zur weiteren Reaktion verwendet.
  • BEISPIEL 88
  • N2-[Imidazol-1-yl-(propyl)]-2'-desoxyguanosin (103)
  • Eine Lösung des Nukleosids 102 (10,31 g, 36 mmol) und 1-(3-Aminopropyl)imidazol (9 g, 72 mmol) in 2-Methoxyethanol (60 ml) wurde in einer Edelstahlbombe bei 120°C (Ölbad) während 24 Stunden erwärmt. Die Bombe wurde auf 0°C abgekühlt, vorsichtig geöffnet und der ausgefällte feste Niederschlag wurde filtriert. Der Feststoff wurde mit Methanol (50 ml) und Aceton (50 ml) gewaschen und über Natriumhydroxid getrocknet, woraus sich 9 g (67%) reines 103 ergaben. Eine kleine Menge wurde für analytische Zwecke aus DMF umkristallisiert. Smp 245–47°C.
  • BEISPIEL 89
  • N2,3',5'-Tn-O-isobutyryl-N2-[imidazol-1-yl(propyl)]-2'-desoxyguanosin (104)
  • Zu einer gut getrockneten Lösung des Substrats 103 (1,5 g, 4 mmol) und Triethylamin (1,62 g, 16 mmol) in trockenem Pyridin (30 ml) und trockenem DMF (30 ml) wurde Isobutyrylchlorid (1,69 g, 16 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Man ließ die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur während 12 Stunden Rühren und dampfte zur Trockene ein. Der Rückstand wurde auf Dichlormethan und Wasser (100 ml) aufgeteilt und mit CH2Cl2 (2 × 200 ml) extrahiert. Das organische Extrakt wurde mit Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das getrocknete organische Extrakt wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde unter Verwendung von CH2Cl2→MeOH als Elutionsmittel mittels Flash-Chromatographie gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, woraus sich aus CH2Cl2/MeOH 1,8 g (77%) der Titelverbindung als farblose Kristalle ergaben. Smp. 210–12°C.
  • BEISPIEL 90
  • 6-O-[2-Nitrophenylethyl]-N2,3',5'-Tn-O-isobutyryl-N2-[imidazol-1-yl(propyl)]-2'-desoxyguanosin (105)
  • Zu einer gerührten Lösung aus 104 (2,0 g, 3,42 mmol), Triphenylphosphin (2,58 g, 10,26 mmol) und p-Nitrophenylethanol (1,72 g, 10,26 mmol) in trockenem Dioxan wurde Diethylazodicarboxylat (1,78 g, 10, 26 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 12 Stunden gerührt und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie über Silikagel unter Verwendung von CH2Cl2→Aceton als Elutionsmittel gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, woraus sich 2,4 g (96%) von 6 als amorpher Feststoff ergaben.
  • BEISPIEL 91
  • 6-O-[2-(4-Nitrophenyl)ethyl]-N2-isobutyryl-N2-[imidazol-1-yl(propyl)-2'-desoxyguanosin (106)
  • Eine gerührte Lösung von 105 (9 g, 12,26 mmol) in Methanol (250 ml) wurde mit Ammoniumhydroxid (30%, 150 ml) bei Raumtemperatur behandelt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 12 h gerührt und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie über Silikagel unter Verwendung von CH2Cl2-Aceton als Elutionsmittel gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, woraus sich 2,4 g (96%) von 105 als amorpher Feststoff ergaben.
  • BEISPIEL 92
  • 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-6-O-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]-N2-isobutyryl-N2-[imidazol-1-yl(propyl-2'-desoxyguanosin (107)
  • Das Substrat 106 (5,94 g, 10 mmol) wurde in trockenem Pyridin (75 ml) gelöst und zur Trockene eingedampft. Dies wurde zum Entfernen von Feuchtigkeitsspuren dreimal wiederholt. Zu dieser gut getrockneten Lösung des Substrats in trockenem Pyridin (100 ml) wurde trockenes Triethylamin (4,04 g, 40 mmol), N,N-Dimethylaminopyridin (10,14 g, 30 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 12 h unter Argonatmosphäre gerührt. Methanol (50 ml) wurde zugegeben und das Rühren wurde während 15 Minuten fortgesetzt. Die Mischung wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie über Silikagel gereinigt, wobei als Elutionsmittel CH2Cl2→Aceton, 1% Triethylamin enthaltend, verwendet wurde. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, woraus sich 7,2 g (80%) von 107 als farbloser Schaum ergaben.
  • BEISPIEL 93
  • 3'-O-[(N,N-Diisopropylamino)(β-cyanoethoxy)phosphanyl]-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-6-O-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]-N2-isobutyryl-N2-[imidazol-1-yl(propyl)-2'-desoxyguanosin (108)
  • Das Substrat 107 (2,5 g, 2,7 mmol) wurde in trockenem Pyridin (30 ml) gelöst und zur Trockene eingedampft. Dies wurde zum Entfernen von Wasserspuren dreimal wiederholt und es wurde über festem Natriumhydroxid über Nacht getrocknet. Dieses getrocknete 107 wurde in trockenem Dichlormethan (30 ml) gelöst und unter Argonatmosphäre auf 0°C abgekühlt. Zu dieser kalten gerührten Lösung wurde N,N-diisopropylethylamin (0,72 g, 5,6 mmol), gefolgt von (β-Cyanoethyoxy)chlor(N,N-diisopropylamin)phosphan (1,32 g, 5 mmol) über einen Zeitraum von 15 Minuten tropfweise gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 0°C während 1 h gerührt und bei Raumtemperatur während 2 h. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan (100 ml) verdünnt und mit Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen. Das organische Extrakt wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie über Silikagel, gereinigt, wobei als Elutionsmittel Hexan-Aceton, 1% Triethylamin enthaltend, ver wendet wurde. Die Hauptfraktionen wurden gesammelt und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in trockenem Dichlormethan (10 ml) gelöst und zu einer gerührten Hexanlösung (15 ml) über einen Zeitraum von 30 Minuten tropfweise zugegeben. Nach der Zugabe wurde das Rühren während einer weiteren Stunde (1 h) bei Raumtemperatur unter Argon fortgesetzt. Der ausgefallene Feststoff wurde abfiltiert und über festem NaOH unter Vakuum über Nacht getrocknet, woraus sich 2 g (65%) der Titelverbindung als farbloses Pulver ergaben.
  • BEISPIEL 94
  • N2-[Imidazol-1-yl(propyl)]-2'-desoxyadenosin (109)
  • Eine Suspension von 2-Chlor-2'-desoxyadenosin (10,68 g, 37,4 mmol) und 1-(3-Aminopropyl)imidazol (12,5 g, 100 mmol) in 2-Methoxyethanol (80 ml) wurde bei 125°C während 45 h in einer Stahlbombe erhitzt. Die Bombe wurde auf 0°C abgekühlt, vorsichtig geöffnet und es wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mehrere Male mit Ethanol und Toluol zusammen eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethanol gelöst, worauf sich beim Abkühlen ein Niederschlag ergab. Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet. Das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde ohne Charakterisierung zur nächsten Reaktion überführt.
  • BEISPIEL 95
  • 3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1-3-diyl)-N2-[imidazol-1-yl(propyl)]-2'-desoxyadenosin (110)
  • Das Rohprodukt (14,03 g) von Beispiel 94 wurde in trockenem DMF (100 ml) und trockenem Pyridin (50 ml) gelöst und zur Trockene eingedampft. Dies wurde zum Entfernen des gesamten Wassers dreimal wiederholt. Das getrocknete Substrat wurde in trockenem DMF (75 ml) und trockenem Pyridin (75 ml) gelöst und man ließ es bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre rühren. Zu dieser gerührten Lösung wurde trockenes Triethylamin (10,1 g, 100 mmol) und Dichlor-1,1,3,3-tetraisotpropyldisiloxan (Tipsicol) (15,7 g, 50 mmol) über einen Zeitraum von 15 Minuten zugegeben. Nach Zugabe von Tipsicol wurde die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit Toluol (100 ml) gemischt und wieder einge dampft. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie über Silikagel unter Verwendung von Methylenchlorid→Methanol als Elutionsmittel gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, woraus sich 12,5 g (54%) von 110 als amorphes Pulver ergaben.
  • BEISPIEL 96
  • 3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1-3-diyl)-N2,N6-diisobutyloyl-N2-[imidazol-1-yl(propyl)]-2'-desoxyadenosin (111)
  • Man ließ eine Lösung von Verbindung 110 (12,0 g, 19,42 mmol) bei Raumtemperatur mit Triethylamin (10,1 g, 100 mmol) unter Argonatmosphäre rühren. Zu dieser in Pyridin (100 ml) gerührten Lösung wurde Isobutyrylchlorid (6,36 g, 60 mmol) über einen Zeitraum von 15 Minuten tropfweise zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter Argon während 10 h gerührt und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde auf Dichlormethan/Wasser aufgeteilt und mit Dichlormethan (2 × 150 ml) extrahiert. Das organische Extrakt wurde mit Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das organische Extrakt wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie über Silikagel unter Verwendung von Methylenchlorid→Aceton als Elutionsmittel gereinigt, woraus sich reines 111 als Schaum ergab.
  • BEISPIEL 97
  • N2,N6-Di-isobutyryl-N2-[imidazol-1-yl(propyl)]-2'-desoxyadenosin (112)
  • Die Titelverbindung wird hergestellt werden, indem man auf Verbindung 111 Tetrabutylammoniumfluorid (5 Äquivalente) in trockenem Tetrahydrofuran bei Raumtemperatur einwirken lässt. Eindampfen und Reinigen der Reaktionsmischung durch Silika-Säulenchromatographie wird 112 ergeben.
  • BEISPIEL 98
  • 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-N2,N6-di-isobutyryl-N2-[imidazol-1-yl(propyl)]-2'-desoxyadenosin (113)
  • Verbindung 113 wird aus Verbindung 112 wie im vorstehenden Beispiel 92 hergestellt.
  • BEISPIEL 99
  • 3'-O-[(N,N-Diisopropylamino)(β-cyanoethoxy)phosphanyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-N2,N6-di-isobutyryl-N2-[imidazol-1-yl(propyl)]-2'-desoxyadenosin (113)
  • Das Phosphoramiditmonomer 113 wird aus Verbindung 112 entsprechend dem Verfahren von Beispiel 94 hergestellt. Das Rohprodukt wird durch Silikagel-Chromatographie gereinigt.
  • BEISPIEL 100
  • N2-Nonyl-2'-desoxyguanosin (115)
  • Verbindung 115 wird aus Verbindung 112 (9,5 g, 22 mmol) und Nonylamin (9,58 g, 67 mmol) wie in Beispiel 88 hergestellt. Das Rohprodukt wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde mit einer Mischung aus Ethanol und Toluol (dreimal) zusammen eingedampft. Der resultierende Rückstand wurde in Ethanol gelöst und abgekühlt, um eine kleine Menge des Produkts zu ergeben. Es wurde filtriert und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde ohne Charakterisierung verwendet.
  • BEISPIEL 101
  • 3',5'-N2-Triisobutyoyl-N2-nonyl-2'-desoxyguanosin (116)
  • Die Titelverbindung 116 wurde entsprechend dem Verfahren von Beispiel 96 unter Verwendung von Verbindung 115 (18 g, 32,9 mmol), TEA (30,3 g, 300 mmol), Isobutyrylchlorid (21,2 g, 200 mmol) und trockenem Pyridin (150 ml) hergestellt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie über Silikagel unter Verwendung von Methylenchlorid→Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt. Das Rohprodukt wurde als Schaum in einer Ausbeute von 40% erhalten.
  • BEISPIEL 102
  • N2-Isobutyryl-N2-nonyl-2'-desoxyguanosin (117)
  • Eine gerührte Lösung aus Verbindung 116 (5 g, 6,61 mmol) in Methanol (100 ml) wurde mit konzentriertem Ammoniumhydroxid (30%, 100 ml) bei Raumtemperatur behandelt. Nach 8 Stunden wurde die Reaktionsmischung zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von Methylenchlorid-Methanol als Elutionsmittel gereinigt. Die Rohfraktionen wurden vereinigt und bis auf einen Rückstand eingedampft. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid/Aceton auskristallisiert, woraus sich 1,5 g (49%) von 117 ergaben.
  • BEISPIEL 103
  • 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-N2-isobutyryl-N2-nonyl-2'-desoxyguanosin (118)
  • Verbindung 118 wurde aus Verbindung 117 durch Befolgen des Verfahren aus Beispiel 92 unter Verwendung von Verbindung 117 (2,2 g, 4,75 mmol), DMTCI (1,69 g, 5 mmol), trockenem TEA (1,01 g, 10 mmol) und trockenem Pyridin (70 ml) hergestellt. Die Rohverbindung wurde unter Verwendung von Flash-Chromatographie und Methylenchlorid/Methanol/TTEA als Elutionsmittel gereinigt. 2 g (55%) Rohprodukt wurde als Schaum erhalten.
  • BEISPIEL 104
  • 3'-O-[N,N-Diisopropylamino)(β-cyanoethoxy)phosphanyl]-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-N2,N6-diisobutyryl-N2-nonyl-2'-desoxyadenosin (119)
  • Das Phosphoramiditmonomer, Verbindung 119 wird aus 118 entsprechend dem Verfahren von Beispiel 94 hergestellt. Das Rohprodukt wird durch Silikagel-Chromatographie gereinigt.
  • BEISPIEL 105
  • 3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-2-chlor-2'-desoxyadenosin (120)
  • Verbindung 120 wurde aus 2-Chlor-2'-desoxyadenosin entsprechend dem Verfahren von Beispiel 95 unter Verwendung von 2-Chlor-2'-desoxyadenosin (4,3 g, 15,09 mmol), 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan (4,74 g, 15,1 mmol), trockenem TEA (3,05 g, 30,2 mmol) und trockenem Pyridin (100 ml) hergestellt. Das reine Produkt wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Methylenchlorid→Aceton als Elutionsmittel gereinigt, woraus sich 7,3 g (92%) reines 120 als amorpher Feststoff ergaben.
  • BEISPIEL 106
  • 3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-2-chlor-N6-benzoyl-2'-desoxyadenosin (121)
  • Eine gut getrocknete Lösung aus Verbindung 120 (8 g, 15 mmol) in trockenem Pyridin ließ man mit Triethylamin (4,55 g, 45 mmol) und Benzoylchlorid (6,3 g, 45 mmol) bei Raumtemperatur während 12 h unter Argonatmosphäre reagieren. Die Reaktionsmischung wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde auf Methylenchlorid/Wasser aufgeteilt und in Methylenchlorid (2 × 150 ml) extrahiert. Das organische Extrakt wurde mit Kochsalzlösung (60 ml) gewaschen, getrocknet und zur Trockene eingedampft. Reinigung durch eine Silikasäule ergab 8,2 g (86%) von 121 als Schaum.
  • BEISPIEL 107
  • N6-Benzoyl-2-chlor-2'desoxyadenosin (122)
  • Zu einer gerührten Lösung aus Verbindung 121 (7,9 g, 12,5 mmol) in trockenem THF (100 ml) wurde eine 1 M Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in THF (50 ml, 5 mmol) über einen Zeitraum von 15 Minuten bei Raumtemperatur langsam zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde während weiteren 6 Stunden gerührt und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand ergab nach Reinigung durch Silikagel-Chromatographie unter Verwendung von Methylenchlorid→Aceton als Elutionsmittel 3,88 g (80%) reines 122.
  • BEISPIEL 108
  • 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-N6-benzoyl-2-chlor-2'-desoxyadenosin (123)
  • Verbindung 123 wurde aus Verbindung 122 entsprechend dem Verfahren von Beispiel 92 unter Verwendung von Verbindung 122 (2,5 g, 6,43 mmol), DMTCI (2,37 g, 7 mmol), trockenem TEA (0,71 g, 7 mmol) und trockenem Pyridin (100 ml) hergestellt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von Methylenchlorid→Ethylacetat als Elutionsmittel, das 1% TEA enthielt, gereinigt, woraus sich 3 g (68%) reines 123 als Schaum ergaben.
  • BEISPIEL 109
  • 3'-O-[(N,N-Diisopropylamino)(β-cyanoethoxy)phosphanyl]-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-N6-benzoyl-2-chlor-2'-desoxyadenosin (124)
  • Das Phosphoramiditmonomer 124 wird aus Verbindung 123 entsprechend dem Verfahren von Beispiel 94 unter Verwendung von Verbindung 123 (2,4 g, 3,47 mmol), N,N-Diisopropylethylamin (1,22 ml, 7 mmol), 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramid (1,65 g, 7 mmol) und trockenem Methylenchlorid (30 ml) hergestellt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von Hexan→Ethylacetat als Elutionsmittel, das TEA (1%) enthielt, gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 ml trockenem Methylenchlorid gelöst und in gut gerührtes Hexan (1500 ml) unter Argon tropfweise zugegeben. Nach der Zugabe wurde das Rühren während einer weiteren Stunde (1 h) fortgesetzt und der ausgefallene Feststoff wurde filtriert, mit Hexan gewaschen und über festem Natriumhydroxid während 3 Stunden getrocknet. Das getrocknete Pulver zeigte auf dem 31P-Spektrum keine Spuren einer Verunreinigung.
  • BEISPIEL 110
  • N2-[Imidazol-4-yl(ethyl)]-2'-desoxyguanosin (125)
  • Eine Mischung aus 2-Chlor-2-desoxyinosin (6,0 g, 20,97 mmol) und Histamin (4,4 g, 40 mmol) in 2-Methoxyethanol (60 ml) wurde in einer Stahlbombe bei 110°C während 12 Stunden erhitzt. Die Bombe wurde auf 0°C abgekühlt, vorsichtig geöffnet und der ausgefällte Feststoff wurde abfiltriert. Der Feststoff wurde mit Methanol und Aceton gewaschen und in DMF/Wasser auskristallisiert, woraus sich 6 g (79%) reines 125 ergaben. Smp. 220–222°C.
  • BEISPIEL 111
  • 3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-N2-[imidazol-4-yl-(ethyl)]-2'-desoxyguanosin (126)
  • Zu einer gerührten Lösung von Verbindung 125 (2,4 g, 6,65 mmol) in trockenem DMF (50 ml) und trockenem Pyridin (20 ml) wurde Triethylamin (4,04 g, 40 mmol), gefolgt von 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan (4,18 g, 13,3 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand ergab nach Reinigung mit Silikagel-Chromatographie unter Verwendung von Methylenchlorid→Methanol als Elutionsmittel 3,2 g (80%) von 126 als amorphen Feststoff.
  • BEISPIEL 112
  • 3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-6-O-diphenylcarbamoyl-N2-[1-diphenylcarbamoylimidazol-4-yl-(ethyl)]-2'-desoxyguanosin (127)
  • Zu einer Lösung aus Verbindung 126 (12,34 g, 20 mmol) in trockenem Pyridin (50 ml) und trockenem DMF (200 ml) wurde N,N-Diisopropylethylamin (7,74 g, 60 mmol) und Diphenylcarbamoylchlorid (11,55 g, 50 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während 12 Stunden unter Argonatmosphäre gerührt. Sie wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde in Methylenchlorid (400 ml) gelöst. Das organische Extrakt wurde mit Wasser (100 ml) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen, getrocknet und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie über Silikagel unter Verwendung von Methylenchlorid→Aceton als Elutionsmittel gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, woraus sich 15 g (75%) von 127 als Schaum ergaben.
  • BEISPIEL 113
  • 6-O-Diphenylcarbamoyl-N2-[1-diphenylcarbamoylimidazol-4-yl(ethyl)]-2'-desoxyguanosin (128)
  • Verbindung 128 kann aus Verbindung 127 durch selektives Deblockieren der „TIP"-Gruppe mit Tetrabutylammoniumfluorid/Pyridin/THF bei Raumtemperatur hergestellt werden.
  • BEISPIEL 114
  • 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-6-O-diphenylcarbamoyl-N2-[1-diphenylcarbamoylimidazol-1-yl(ethyl)]-2'-desoxyguanosin (129)
  • Verbindung 129 kann aus Verbindung 128 entsprechend dem Verfahren von Beispiel 92 hergestellt werden.
  • BEISPIEL 115
  • 3'-O-[(N,N-diisopropylamino)(β-cyanoethoxy)phosphanyl]-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-6-O-diphenylcarbamoyl-N2-[1-diphenylcarbamoylimidazol-4-yl-(ethyl)]-2'-desoxyguanosin (130)
  • Verbindung 130 kann aus Verbindung 129 entsprechend dem Verfahren von Beispiel 93 hergestellt werden.
  • BEISPIEL 116
  • Verfahren zum Binden modifizierter 5'-Dimethoxytriphenylmethylribonukleoside der Erfindung an die 5'-Hydroxylgruppe der an den CPG-Träger gebundenen Nukleoside
  • Die modifizierten Nukleoside, die sich an der endständigen 3'-Position bestimmter Antisense-Oligonukleotide befinden werden, sind als ihre 5'-DMT-Gruppen (die Cytosin- und Adenin-exocyclischen Aminogruppen sind benzoyliert und die Guaninaminogruppe ist isobutyryliert) geschützt und werden mit Trifluoressigsäure/Bromessigsäure, gemischt mit Anhydrid, in Pyridin und Dimethylaminopyridin bei 50°C während fünf Stunden behandelt. Die Lösung wird unter verringertem Druck zu einem dünnen Sirup eingedampft, der in Ethylacetat gelöst wird, eine Silikagelsäule durchläuft. Die homogenen Fraktionen wurden gesammelt und zur Trockene eingedampft. Eine Lösung aus 10 ml Acetonitril, 10 Mikromol 3'-O-Brommethylester-modifiziertes Pyrimidinnukleosid und ein ml Pyridin/Dimethylaminopyridin (1 : 1) wird langsam (60 bis 90 sek) durch eine ein mikromolare Säule aus CPG-Thymidin (Applied Biosystems, INC) mittels Spritze gegeben, die vorher mit Säure, entsprechend Standardbedingungen, behandelt worden war, um die freie 5'-Hydroxylgruppe zu ergeben. Andere Nukleosid-gebundene CPG-Säulen könnten verwendet werden. Das Eluant wird gesammelt und wieder durch die Säule gespritzt. Dieses Verfahren wird dreimal wiederholt. Die CPG-Säule wird langsam mit 10 ml Acetonitril gewaschen und dann an eine ABI 380B Nukleinsäuresynthesevorrichtung angefügt. Die Standardbedingungen für die konzentrierte Ammoniumhydroxidentschützung, die die Thyminesterverknüpfung mit dem CPG-Träger spaltet, spaltet ebenfalls die 3',5'-Esterverknüpfung, die das Pyrimidin-modifizierte Nukleosid mit dem Thymidin verbindet, das anfänglich an das CPG-Nukleosid gebunden war. Auf diese Weise kann jedes modifizierte Nukleosid oder allgemein jedes Nukleosid mit Modifikationen in dem Heterocyclus und/oder Zucker genau an das 3'-Ende einer Oligonukleotidsequenz gebunden werden.
  • BEISPIEL 117
  • Verfahren zur Umsetzung der modifizierten Nukleosid-5'-DMT-3'-phosphoramidite zu Oligonukleotiden
  • Zur Herstellung der modifizierten Oligonukleotide wird das Polyribonukleotid-Festphasensyntheseverfahren von B. S. Sproat, et al., Nucleic Acids Research Band 17, Seiten 3373–3386 (1989) verwendet.
  • BEISPIEL 118
  • Herstellung modifizierter Phosphorthioatoligonukleotide
  • Substituierte 5'-DMT-Nukleosid-3'-phosphoramidite, die entsprechend den vorstehend beschriebenen Beispielen hergestellt worden sind, werden in sequenzspezifische Oligonukleotidphosphorthioate, entsprechend der Beschreibung von S. Beaucage et al., Journal of the American Chemical Society Band 112, Seiten 1253–1255 (1990) und B. S. Sproat et al., Nucleic Acids Research Band 17, Seiten 3373–3386 (1989) eingeschoben.
  • BEISPIEL 119
  • Herstellung modifizierter Phosphat-methylierter Oligonukleotide
  • Das Schützen, die Tosylchlorid-vermittelte Methanolyse und die milde Entschützung, die von L. H. Koole et al., in the Journal of Organic Chemistry Band 54, Seiten 1657–1664 (1989) beschrieben ist, wird auf substituierte Oligonukleotide angewandt, um Phosphat-methylierte substituierte Oligonukleotide zu ergeben.
  • BEISPIEL 120
  • Die Fähigkeit der modifizierten Oligonukleotide der Erfindung an ihre komplementäre RNA- oder DNA-Sequenzen zu hybridisieren wird durch thermische Schmelzanalyse bestimmt. Natürliche Antisense-Oligonukleotide oder diejenigen, die Modifikationen an spezifischen Orten enthalten, wurden zu entweder dem DNA- oder RNA-Komplement in stöchiometrischen Konzentrationen gegeben. Der Übergang von Helix zu Knäuel wurde durch Messen der Extinktion bei 260 nm gegen die Temperatur überwacht. Messungen wurden in 100 mM Na+, 10 mM Phosphat, pH-Wert 7 und 0,1 mM EDTA durchgeführt, die Oligonukleotidkonzentrationen betrugen 4 μM. Die Schmelztemperatur oder Tm ist die Temperatur bei der sich eine Hälfte der Moleküle in dem Duplexzustand befindet und eine Hälfte einzelsträngig ist. Die berichteten Tm-Werte sind die Temperaturwerte, bei der dExtinktion/dTemperatur maximal ist. Thermodynamische Parameter der Duplexbildung wurden aus einer nichtlinearen Anpassung nach der Methode der kleinsten Quadrate der Extinktion gegen Temperatur-Kurven an ein Zwei-Zustandsmodell mit linear gekrümmten Grundlinien erhalten.
  • Jede Modifikation wurde in mehrere Oligonukleotidsequenzen eingebaut, die in der Länge von 15 bis 21 Resten variierten. Die untersuchten Sequenzen waren verschiedene 15 bis 21-mere eines Zielorganismus, einschließlich des Papiloma Virus, Herpes Virus, 5-LO, HIV und anderer Zielsequenzen.
  • Oligonukleotide, die von einer bis fünf Modifikationen enthielten, wurden zusätzlich zu vollständig modifizierten Sequenzen getestet. Für jedes modifizierte Oligonukleotid wurde die Tm mit derjenigen des nicht modifizierten DNA-Analogons verglichen. Zusätzlich wurden Vergleiche zwischen Oligonukleotiden, die über Phosphorthioatsubstitution modifizierte Phosphodiesterbrücken aufwiesen, durchgeführt.
  • In dem vorliegenden Beispiel wurde die thermodynamische Stabilität bestimmter neuer modifizierter Oligonukleotide der Erfindung durch Schmelzuntersuchungen bestimmt. Bestimmte Untersuchungen, wie sie in nachstehender Tabelle 2 gezeigt sind, offenbaren, dass bis zu fünf angehängte Gruppen, die spezifisch innerhalb der Oligonukleotidesequenzen mit einer Länge von 15 bis 21 Basen angebracht wurden, im Vergleich zu den nicht modifizierten Ausgangsoligonukleotiden im Allgemeinen nur zu einer bescheidenen Wirkung bezüglich der Tm-Werte führten. Die Wirkungen auf die Tm-Werte waren vom Ort in der Sequenz abhängig, wobei eine nahe an dem 3'-Ende angebrachte Modifikation weniger destabilisierende Wirkungen aufwies, als am 5'-Ende angebrachte Modifikationen.
  • Tabelle 2
  • THERMODYNAMISCHE STABILITÄT
    • Untersuchte Sequenz A'CC GA'C G'AT C'AT GTC GTA' CGC
    • (21-mer, Positionen 1, 5, 8, 11 & 18 sind modifiziert)
  • Figure 01040001
    • Untersuchte Sequenz CGA CTA TGC AAG TA'C
    • (15-mer, Position 14 ist modifiziert)
  • Figure 01040002
    • Untersuchte Sequenz CGA CTA TGC AAA' A'A'C
    • (15-mer, Positionen 12, 13, 14 sind modifiziert)
  • Figure 01040003
  • BEISPIEL 121
  • In diesem Test wurde die Spezifität der Hybridisierung durch Vergleichen der Stabilität eines Duplexes, der ein an einem einzelnen Rest modifiziertes Oligonukleotid und dessen Komplement enthielt, mit der Stabilität eines Duplexes bestimmt, der dasselbe einfach modifizierte Oligonukleotid und eine komplementäre Sequenz enthielt, die eine der Modifikation gegenüberliegende nicht komplementäre Base enthielt. Zum Beispiel wurde die Spezifität eines nicht modifizierten Adenosins durch Messen der Tm der Sequenz CTC GTA CCA TCC CCG TCC (X-Strang), die an die Sequenz GGA CCG GAA YGG TAC GAG (Y-Strang) hybridisiert war, gemessen, wobei Y = A, C, G, T oder keines war. Der Unterschied in dem Tm-Wert für den zusammenpassenden Duplex (Y = T) im Vergleich zu dem Duplex, der eine einzelne Nichtentsprechung oder Bauchung enthält (Y = A, C, G oder keines), ist ein Maß für die Spezifität des nicht modifizierten A-T-Paars. Ähnliche Experimente wurden mit einem modifizierten Adenosin durchgeführt, das das A an Position 9 des X-Strangs ersetzte. Der Vergleich für die Delta Tm-Werte (fehlende Entsprechung gegen Entsprechung) für die modifizierte Sequenz mit denjenigen für das nicht modifizierte Analogon ergibt ein Maß für die Spezifität dieser Modifikation.
  • In diesem Test wurde die Spezifität der modifizierten Adenosine für das Watson-Crick-Basenpaar mit Thymidin bestimmt, indem als Y-Strang ein 18-mer mit T (Watson-Crick-Komplement), A, G, C (fehlende Entsprechung), oder mit der Deletion des Nukleotids an der 9-Position (ausgebauchte Schleife) hergestellt wurde. Der Y-Komplementstrang enthält ein 2'-modifiziertes Adenosin an der 9ten Position. Die Daten sind in Tabelle 3 gezeigt. Wie in Tabelle 3 ersichtlich ist, blieb die Spezifität der modifizierten Adenosine erhalten, das heißt, ihre Tm-Werte waren eher größer bei Paarung mit T als bei Situationen mit fehlender Entsprechung bei A, G, C oder ausgebauchten Schleifen.
  • Tabelle 3
  • Spezifität der Modifikation
    • X-Strang 5'-CTC GTA CCA' TTC CGG TCC
    • Y-Strang 3'-GAG CAU GGY' AAG GCC AGG (18-mer, 9-Position ist modifiziert)
    • Y = T (Watson-Crick-Komplement)
    • Y = A, C oder G (fehlende Entsprechung)
    • Y = keines (ausgebauchte Schleife, „BU")
  • Figure 01060001
  • In diesem Beispiel wird die Beständigkeit gegen Nukleaseabbau gemessen. Aliquoten mit 10% fetalem Kälberserum in DMEM-Medien, die 50 μM Oligonukleotid enthielten, wurden bei 37°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeiten wurden Aliquoten mit 15 μl entfernt und mit 15 μl 9 M Harnstoff in 1 × TBE gemischt. Die Zeitpunkte wurden bis zur Analyse mit Elektrophorese mittels 20% Polyacrylamid/7 M Harnstoff eingefroren. Die Gele wurde mit „Stains All" (Sigma Chem Co., St. Louis, MO) gefärbtund und nach dem Entfärben unter Verwendung eines LKB-Laserdesnsitometers gescannt. Die Scans wurden durch Integration der Peakreihe und Berechnung der prozentual abgebauten Oligonukleotide aus den Oligonukleotiden mit vollständiger Länge (n) bezogen auf den Verlust von zwei Basenresten (n – 2) analysiert. Die Daten wurden als % Abbau gegen die Zeit aufgetragen und mit Kurven verglichen, die für Phosphodiester-(PO) und Phosphorthioat-(PS) Oligonukleotide erzeugt worden waren.
  • Für dieses Beispiel sind die Daten in Tabelle 4 gezeigt. Anhand dieser Daten sind die modifizierten Oligonukleotide der Erfindung mindestens so beständig wie die nicht modifizierten Sequenzen und in bestimmten Fällen beständiger als Phosphorthioat-modifizierte Sequenzen.
  • Tabelle 4
  • NUKLEASEBESTÄNDIGKEIT
    • Untersuchte Sequenz CGA CTA TGC AAG TA'C
    • (15-mer, Position 14 ist modifiziert)
  • Figure 01070001
    • Untersuchte Sequenz CGA CTA TGC AAA' A'A'C
    • (15-mer, Positionen 12, 13,14 sind modifiziert)
  • Figure 01080001
    • Untersuchte Sequenz CGA CAA TGC AAG' G'G'T
    • (15-mer, Positionen 12, 13, 14 sind modifiziert)
  • Figure 01080002
  • BEISPIEL 123
  • Im Allgemeinen ist der Delta Tm-Wert zwischen dem modifizierten Oligonukleotid und dessen nicht modifiziertem Analogon zu der Zahl der modifizierten Reste proportional. In einem weiteren Test wurden die Delta Tm-Werte pro Modifikation aufgeschrieben. Die Delta Tm-Werte pro Modifikation wurde über alle modifizierten Sequenzen gemittelt und sind in Tabelle 5 aufgelistet. Die Daten sind als durchschnittliche Delta Tm-Werte pro Modifikation im Vergleich zur Wildtyp-DNA für sowohl die DNA-Ziele als auch die RNA-Ziele gezeigt. Weiterhin ist die Spezifität gegen DNA-Ziele mit ei ner willkürlichen Punktebewertung aufgeschrieben, wobei 1 spezifisch und 4 nicht spezifisch ist.
  • Tabelle 5 BIOPHYSIKALISCHE BEWERTUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN
    Figure 01090001
  • BEISPIEL 124
  • In weiteren Tests wurde die Beständigkeit gegen Nukleasen in Bezug auf diejenige von Phosphorthioat und Phosphodiester verglichen. Unter Verwendung der Protokolle von Beispiel 122 wurde die Abbaukurve für Phosphodiesteroligonukleotide bestimmt und wie in 5 bewertet. Für die Phosphodiesteroligonukleotide betrug der Abbau nach ungefähr 1 Stunde ungefähr 50% und war nach ungefähr 4 Stunden vollständig. Die Phosphorthioatoligonukleotide wurden mit 1 bewertet. Für die Phosphorthioatoligonukleotide betrug der Abbau nach ungefähr vier Stunden ungefähr 20% und nach ungefähr 20 Stunden ungefähr 50%. Den Oligonukleotiden, die Modifikationen enthielten, wurden Werte, basierend auf dem visuellen Vergleich mit den Phosphodiester- und Phosphorthioatkurven, zugeordnet. Diese Werte werden in Tabelle 6 berichtet.
  • Tabelle 6 RELATIVE BESTÄNDIGKEIT GEGEN FETALE KÄLBERSERUMNUKLEASEN
    Figure 01100001
  • BEISPIEL 125
  • Unter Verwendung der Protokolle der Beispiele 120 und 123 wurden Oligonukleotide der Erfindung mit neuen Nukleotiden, entsprechend der Herstellung nach bestimmten vorstehenden Beispielen, auf ihre DNA-DNA-Duplexstabilität oder DNA-RNA-Duplexstabilität gegen DNA- oder RNA-Sequenzen getestet. Die Hybridisierungsanalysen basierend auf Tm, Delta Tm und Delta Tm pro Modifikation wurden bestimmt. Die Ergebnisse dieser Tests sind in nachstehender Tabelle 6 gezeigt.
  • Die Testsequenzen repräsentieren verschiedene Sequenzen, die so gewählt sind, dass sie die spezifische Aktivität in bekannten Pathogenen oder Testsequenzen zeigen. JM-12 ist eine synthetische Sequenz, die selbstkomplementär ist. Da sie selbstkomplementär ist, wird jede Modifikation zweimal exprimiert, für jedes Auftreten in den komplementären Sequenzen einmal. HSV-21 ist eine 21-mer-Sequenz aus dem Herpes Virus. G-gekapptes PAP ist eine Sequenz aus dem Papiloma Virus mit einem C-Nukleotid an dem 3'-Ende, das das Kopplungsnukleotid während der Synthese ist. Darauf folgen drei verkappende G-Nukleotide. Dieses Verkappen wird spezifisch zum Erhöhen der Nukleasebeständigkeit der Sequenz hinzugefügt. Die XY-Sequenz ist besonders zur Bestimmung der sterischen Hinderung der Watson-Crick-Blndung zwischen komplementären Strängen verwendbar. 5LO ist ein 16-mer aus der mRNA der menschlichen 5-Lipoxygenase.
  • Für diese Tests wurde das „2-Chlor-dA"-Nukleotid entsprechend dem synthetischen chemischen Sequenzabbruch in vorstehendem Beispiel 109 hergestellt und das „2-Propylimidazoyl-dG"-Nukleotid wurde entsprechend dem synthetischen chemischen Sequenzabbruch in vorstehendem Beispiel 92 hergestellt.
  • Tabelle 7
  • DUPLEXSTABILITÄT
    • DNA-RNA-DUPLEXSTABILITÄT
    • Komplementärer Strang – YX: GGA CCG GAA GGT ACG AG
    • Testnukleotid – 2-Chlor-dA
  • Figure 01110001
    • Komplementärer Strang – HSV 21: ACC GAG GAT CAT GTC GTA CGC
    • Testnukleotid – 2-Chlor-dA
  • Figure 01110002
    • DNA-RNA-DUPLEXSTABILITÄT
    • Komplementärer Strang – HSV 21 GCC GAG GTC CAT GTC GTA CGC
    • Testnukleotid – 2-Propylimidazoyl-dG
  • Figure 01120001
    • DNA-DNA-DUPLEXSTABILITÄT
    • Komplementärer Strang – HSV 21 GCC GAG GTC CAT GTC GTA CGC
    • Testnukleotid – 2-Propylimidazoyl-dG
  • Figure 01120002
    • Komplementärer Strang – JM-12: GCC TGA TCA GGC
    • Testnukleotid – 2-Propylimidazoyl-dG
  • Figure 01120003
    • Komplementärer Strang – G-verkapptes PAP: CGA CTA TGC AAG GGC
    • Testnukleotid – 2-Propylimidazoyl-dG
  • Figure 01120004
  • BEISPIEL 126
  • Verbindungen zum Modulieren der Aktivität von Messenger-RNA, die die Produktion des Proteins 5-Lipoxygenase kodiert, werden entsprechend diesem Beispiel und anderen nachfolgenden konstruiert. Die Sequenz CGUUCCAGUGACUUC erscheint in der 5-Lipoxygenase-mRNA am Nukleotid 1065 beginnend, definiert durch Zählen der Initiierung der Translation „A" bei 0. Es können ebenfalls andere Regionen ausgewählt werden, die wahrscheinlich zu wirksamen Antisense-Mitteln führen. Für die vorstehend beschriebene Region kann ein Ziel-Antisense-Oligonukleotid (GCAAGGTCACTGAAG), das auf die 5-Lipoxygenase-RNA gerichtet ist, durch Standardfestkörpertechniken konstruiert werden, die zu einer wirksamen erfindungsgemäßen Verbindung führen. Die 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die spezifische Adenine enthält, die gegen 2-Imidazolylethylamino-2-desoxyadenin ersetzt wurden, kann entsprechend den Beispielen 94 und 99 aus 2-Chlor-2'-desoxyadenosin (5,72 g, 20 mmol), Journal of the American Chemical Society Band 106, Seite 6379 (1984) hergestellt werden. Geeignete Mengen dieses Materials werden in trockenem THF gelöst und bei der automatisierten Festphasensynthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3' verwendet.
  • Die modifizierten synthetisierten Sequenzen werden
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa ACG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    Gaa GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa aCG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a = 2-(Imidazol-4-yl-ethylamino)adenin ist.
  • BEISPIEL 127
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die N2-Imidazolylethylguanin (2-Imidazolylaminohypoxanthin) an spezifischen Guaninpositionen enthält, wird entsprechend den Beispielen 86 und 93 durchgeführt, wobei 1-(3- Aminopropyl)imidazol durch 1-(2-Aminoethyl)imidazol ersetzt wurde. Geeignete Mengen dieses Materials werden in trockenem THF gelöst und in der automatisierten Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3' verwendet.
  • Die modifizierten synthetisierten Sequenzen werden
    gAA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA ACg
    GAA gTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT gGA ACG
    GAA GTC ACT GgA ACG
    gAA GTC ACT GGA ACg
    gAA gTC ACT GGA ACg und
    gAA gTC ACT ggA ACg sein,
    wobei g = N2-(imidazolylethyl)guanin((2-imidazol-4-ylethylamino)hypoxanthin) ist.
  • BEISPIEL 128
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-Desoxy-2'-(imidazol-4-yl-propyl)adenin an spezifischen Positionen enthält, wird durchgeführt. Eine Lösung aus 3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-9-β-D-arabinofuranosyladenin (10,2 g, 20 mmol) in 200 ml trockenem Pyridin wird in einem Eisbad gekühlt und mit Trimethylchlorsilan (6 ml) behandelt. Nach 0,5 h wird Benzoylchlorid (6 ml) zugegeben und das Eisbad wird entfernt. Die Reaktion wird nach zwei Stunden bei Umgebungstemperatur abgekühlt und nach 15 Min mit 20 ml kaltem Wasser, gefolgt von 20 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid, behandelt. Die Reaktionsmischung wird unter verringertem Druck zu einem Öl eingedampft, das durch Silikagel-Chromatographie gereinigt wird, um neun g des 3',5',N6-blockierten Nukleosids zu ergeben. Dieses Material wird in trockenem Acetonitril (200 ml) und trockenem DMF (50 ml) gelöst, in einem Eisbad abgekühlt und mit Natriumhydroxid (400 mg), gefolgt von Trifluormethylsulfonsäureanhydrid (5 g) in Acetonitril (50 ml), das 30 Min später tropfweise zugegeben wurde, behandelt. Die Reaktionsmischung wird unter verringertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, mit Wasser gewaschen und mit MgSΟ4 getrocknet. Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck liefert das 2'-Trifluorsulfonat als harten Schaum. Eine Pro be dieses Materials (4 g, 5,5 mmol) wird in trockenem Ethylacetat (100 ml) und Diisopropylethylamin (800 mg) gelöst, in einem Eisbad gekühlt und mit 1-(4-Imidazolyl)-3-hydroxy-n-propan (750 mg) behandelt. Nach zwei h bei Umgebungstemperatur wird die Reaktionsmischung mit 50 ml kaltem Wasser gewaschen und mit MgSO4 getrocknet. Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck liefert das 2'-(Imidazolylpropoxy)adenosin, das an den 3',5'- und N6-Positionen blockiert ist. Dieses Material wird in 50 ml trockenem THF gelöst und mit Tetrabutylammoniumfluorid (10 ml von 1 M in THF) bei Raumtemperatur während zwei Stunden behandelt. Das Lösungsmittel wird unter verringertem Druck entfernt und der Rückstand, absorbiert auf Silikagel, wird über Sllikagel chromatographiert, wobei mit Chloroform/Methanol-Mischungen eluiert wird. Das 5'-DMT- und 3'-Cyanoethoxyphosphoramidit dieses Materials wird entsprechend den vorstehenden Beispielen 92 und 93 hergestellt und geeignete Mengen dieses Materials werden in trockenem Acetonitril gelöst und bei der automatisierten Festphasensynthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG verwendet.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC CGT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa ACG
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a = 2'-O-(Imidazol-4-yl-n-propyl)adenin ist.
  • BEISPIEL 129
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-(Imidazol-4-yl-propyl)thymidin an spezifischen Positionen enthält, wird beschrieben. Eine Lösung aus 3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-9-β-D-arabinofuranosylthymin (9,7 g, 20 mmol) wird in trockenem Acetonitril (200 ml) und trockenem DMF (50 ml) gelöst, in einem Eisbad abgekühlt und mit Natriumhydrid (400 mg), gefolgt von Trifluormethylsulfonsäureanhydrid (5 g) in trockenem Acetonitril (50 ml), das 30 Min später tropfweise zugegeben wurde, behandelt. Die Reaktionsmischung wird unter verringertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, mit Wasser gewaschen und mit MgSΟ4 getrocknet. Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck liefert das 2'-Trifluorsulfonat als harten Schaum. Eine Probe dieses Materials (4 g, 5,5 mmol) wird in trockenem Ethylacetat (100 ml) und Diisopropylethylamin (800 mg) gelöst, in einem Eisbad abgekühlt und mit 1-(Imidazol-4-yl)-3-hydroxy-n-propan (750 mg) behandelt. Nach 2 Stunden bei Umgebungstemperatur wird die Reaktionsmischung mit kaltem Wasser gewaschen und mit MgSΟ4 getrocknet. Das Material wird weiterhin entsprechend den vorstehenden Beispielen 92 und 93 umgesetzt, um das 5'-DMT-3'-cyanoethoxyphosphoramidit zu liefern. Geeignete Mengen dieses Materials werden in trockenem Acetonitril gelöst und bei der automatisierten Festphasensynthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG verwendet.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAA GTC ACt GGA ACG
    GAA GtC ACT GGA ACG und
    GAA GtC ACt GGA ACG sein,
    wobei t = 2'-O-(Imidazol-4-yl-n-propyl)thymin ist.
  • BEISPIEL 130
  • Es wird die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG, die 3-Deaza-3-(imidazol-4-yl-propyl)guanin an spezifischen Positionen enthält, beschrieben. Eine Lösung von 5,2 g, 10 mmol 5-(Cyanomethyl)-1-(2-desoxy-3,5-di-O-p-tolyl-β-D-erythropentofuranosyl)imidazol-4-carboxylat, Journal of Medicinal Chemistry, Band 27, Seite 1389 (1984), wird in trockenem THF (100 ml) gelöst und mit Natriumhydrid (840 mg) bei Raumtemperatur behandelt. Nachdem die Entwicklung von Wasserstoff aufgehört hat, wird 4-(2-Bromethyl)imidazolhydrobromid (2,6 g) zugegeben, Rec. Trav. Chim., Band 89, Seite 1189 (1970), und die Lösung wird bei Umgebungstemperatur während 5 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, mit Wasser gewaschen und mit MgSO4 getrocknet. Der nach Filtration und Entfernung des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird in flüssigem Ammoniak gelöst und in einem Druckbehälter bei Umgebungstemperatur während 24 Stunden aufbewahrt und auf 100°C während 1 Stunde erhitzt. Der Ammoniak wird abgelassen und der Rückstand wird zusammen mit Methanol zweimal eingedampft. Dieses Material wird in Methanol gelöst, auf Silikagel adsorbiert und auf eine Silikagelsäule gegeben. Die Elution mit Chloroform/Methanol liefert 2,0 g 1-(2-Desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)-5-(1-cyano-3-[imidazol-4-yl]prop-1-yl)-4-carboxamid. Dieses Material wird zu dem 5'-DMT-3'-cyanoethoxyisopropylphosphoramidit entsprechend den vorstehenden Beispielen 92 und 93 umgesetzt, woraus sich ein harter Schaum ergibt. Geeignete Mengen dieses Materials werden in trockenem Acetonitril gelöst und bei der automatisierten Festphasensynthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG verwendet.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    gAA GTC ACT GGA ACg
    gAA GTC ACT gGA ACg
    gAA gTC ACT GGA ACg
    GAA GTC ACT GGA ACg
    GAA GTC ACT ggA ACG
    GAA gTC ACT GGA ACG
    gAA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GgA ACG
    GAA gTC ACT GGA ACG und
    gAA gTC ACT gGA ACg sein,
    wobei g = 3-Deaza-3-(4-imidazolylethyl)guanin ist.
  • BEISPIEL 133
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-Desoxy-2'-(imidazol-4-yl)ethoxyadenosin an spezifischen Positionen enthält, wird beschrieben. Eine Lösung von 3',5'-(1,1,3,3-Tetraisopropyldisiloxanyl)-9-(β-D-arabinofuranosyl)adenin in Pyridin wird durch aufeinanderfolgende Behandlung wird Chlortrimethylsilan, Benzoylchlorid und methanolischem Ammoniak zu einem Zwischenprodukt benzoyliert. Die resultierende Lösung wird zur Trockene eingedampft und aus Ethanol umkristallisiert. Das in Acetonitril gelöste reine Produkt wird mit Trifluormethylsulfon säureanhydrid und Natriumhydrid bei 0°C behandelt. Die Lösung wird bei 0°C während einer Stunde gerührt und dann ließ man sie auf Umgebungstemperatur (eine Stunde) erwärmen. Die Lösung wird zur Trockene eingedampft und durch Silikagel-Chromatographie (Methylenchlorid/Methanol) gereinigt. Dieses Material, N6-Benzoyl-3',5'-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanyl)-2'-trifluormethylsulfonyl-9-(β-D-arabinofuranosyl)adenin, dient als Ausgangsmaterial für die Synthese von Adenosinen, die an der 2'-Position mit einer Vielzahl funktioneller Gruppen und getetherter funktioneller Gruppen substituiert sind. Die β-D-Arabinofuranosylderivate von Guanin, Cytosin und Thymin (Aldrich Chemical Co.) (sowie analoge Basen), die zum Beispiel durch herkömmliche Verfahren mit N2-Isobutyryl beziehungsweise N6-Benzoyl geschützt sind, können wie soeben beschrieben wurde, 2'-modifiziert werden. Die 2'-modifizierten Ribonukleotide können in sequenzspezifische Oligonukleotide, entsprechend den vorstehenden Beispielen 92 und 93 eingeschoben werden. Eine Lösung aus N6-Benzoyl-3',5'-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanyl)-2'-trifluormethylsulfonyl-9-(β-D-arabinofuranosyl)adenin und Acetonitril wird auf 0°C abgekühlt und mit dem Dinatriumsalz von 2-(Imidazol-4-yl)ethanol in Acetonitril behandelt. Man lässt die Suspension auf Raumtemperatur erwärmen und rührt während 2 Stunden bei Umgebungstemperatur. Die Suspension wird mit Essigsäure neutralisiert, mit Tetrabutylammoniumfluorid während 5 Stunden bei Raumtemperatur behandelt und zur Trockene unter verringertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Pyridin gelöst und, wie vorstehend beschrieben ist, zu einem Zwischenprodukt benzoyliert. Nach Entfernen der Lösungsmittel wird der Rückstand durch Silikagel-Chromatographie gereinigt. Das resultierende N6-Benzoyl-2'-desoxy-2'-(1-[benzoyl]imidazol-4-ylethoxy)adenosin wird durch vorstehend beschriebene Verfahren zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethylphosphoramidit umgesetzt, das in die 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa ACG
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a 2'-Desoxy-2'-(imidazo-4-yl)ethoxyadenosin ist.
  • BEISPIEL 134
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-Desoxy-2'-(9-[3-chlor-6-methoxyacridinyl]amino-n-pentyloxy)adenosin an spezifischen Positionen enthält, wird beschrieben. Eine Lösung aus N6-Benzoyl-3',5'-(1,1,3,3-Tetraisopropyldisiloxanyl)-2'-trifluormethylsulfonyl-9-(β-D-arabinofuranosyl)adenin, 3-Chlor-6-methoxyacridinyl-9-amino-n-pentanol und Acetcnitril wird auf 0°C abgekühlt und mit Natriumhydrid behandelt. Man lässt die Lösung auf Raumtemperatur erwärmen und rührt bei Umgebungstemperatur während zwei Stunden und behandelt mit Tetrabutylammoniumfluorid während zwei Stunden. Die Lösung wird zur Trockene eingedampft und der Rückstand wird durch Silikagel-Chromatographie gereinigt. Dieses Material wird entsprechend den Verfahren der vorstehenden Beispiele 92 und 93 zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethyldiisopropylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5-LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa ACG
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a 2'-Desoxy-2'-(9-[3-chlor-6-methoxyacridinyl]amino-n-pentyloxy)adenosin ist.
  • BEISPIEL 135
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-Desoxy-2'-(N1,N1,N2,trimethoxycarbonyl-N2-methylcarbamoylethoxy)ethylendiaminadenosin an spezifischen Positionen enthält, wird beschrieben. Eine Lösung aus N6-Benzoyl-3',5'-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanyl)-2'-trifluormethylsulfonyl-9-(β-D-arabinofuranosyl)adenin und Acetonitril wird auf 0°C abgekühlt und mit dem Natriumsalz von (N1,N1,N2.Trimethoxycarbonyl-N2-methylcarbamoylethanol)ethylendiamin in Acetonitril behandelt. Man lässt die Lösung auf Raumtemperatur erwärmen, rührt dann bei Umgebungstemperatur während zwei Stunden und behandelt mit Tetrabutylammoniumfluorid während zwei Stunden. Die Lösung wird zur Trockene eingedampft und der Rückstand wird durch Silikagel-Chromatographie gereinigt. Dieses Material wird entsprechend der Verfahren der vorstehenden Beispiele 92 und 93 zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa ACG
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein, wobei
    A 2'-Desoxy-2'-(N1,N1,N2,trimethoxycarbonyl-N2-methylcarbomyolethoxy)ethylendiaminadenosin ist.
  • BEISPIEL 136
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-Desoxy-2'-nonanoxyadenosin an spezifischen Positionen enthält, wird durchgeführt. Eine Lö sung aus N6-Benzoyl-3',5'-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanyl)-2'-trifluormethylsulfonyl-9-(β-D-arabinofuranosyl)adenin und Acetonitril wird auf 0°C abgekühlt und mit dem Natriumsalz von Nonanol in Acetonitril behandelt. Man lässt die Lösung auf Raumtemperatur erwärmen, rührt dann bei Umgebungstemperatur während zwei Stunden und behandelt mit Tetrabutylammoniumfluorid während zwei Stunden. Die Lösung wird zur Trockene eingedampft und der Rückstand wird durch Silikagel-Chromatographie gereinigt. Dieses Material wird durch Verfahren der vorstehenden Beispiele 92 und 93 zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethyldiisopropylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5LΟ-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa AGC
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a 2'-Desoxy-2'-nonanoxyadenosin ist.
  • BEISPIEL 137
  • Die Synthese der 5LΟ-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-Desoxy-2'-dimethylamino-tris(ethylamino)adenosin an spezifischen Positionen enthält, wird beschrieben. Eine Lösung aus N6-Benzoyl-3',5'-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanyl)-2'-trifluormethylsulfonyl-9-(β-D-arabinofuranosyl)adenin, Dimethylaminotris(ethylamin), Ethylisopropylamin und Acetonitril bei 0°C lässt man auf Raumtemperatur erwärmen, rührt bei Umgebungstemperatur während 3 Stunden und behandelt dann mit Tetrabutylammoniumfluorid während zwei Stunden. Die Lösung wird zur Trockene eingedampft und der Rückstand wird durch Sllikagel-Chromatographie gereinigt. Dieses Material wird durch Verfahren der vorstehenden Beispiele 92 und 93 zu des sen 5'-DMT-3'-β-cyanoethylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5LΟ-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa AGC
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a 2'-Desoxy-2'-dimethylamino-tris(ethylamino)adenosin ist.
  • BEISPIEL 138
  • Die Synthese der 5LΟ-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-Desoxy-2'-(methoxytris-ethoxy)adenosin an spezifischen Positionen enthält, wird beschrieben. Eine Lösung aus N6-Benzoyl-3',5'-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanyl)-2'-trifluormethylsulfonyl-9-(β-D-arabinofuranosyl)adenin, Methoxybisethoxyethanol und Acetonitril bei 0°C wird mit Natriumhydrid behandelt und man lässt sie auf Raumtemperatur erwärmen, rührt bei Umgebungstemperatur während 3 Stunden und behandelt dann mit Tetrabutylammoniumfluorid während zwei Stunden. Die Lösung wird zur Trockene eingedampft und der Rückstand wird durch Sllikagel-Chromatographie gereinigt. Dieses Material wird durch Verfahren der vorstehenden Beispiele 92 und 93 zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethyldiisopropylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5LΟ-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa AGC
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a 2'-Desoxy-2'-(methoxytrisethoxy)adenosin ist.
  • BEISPIEL 139
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-Desoxy-2'-(N1,N1,N2-trimethoxycarbonyl-N2-methylcarbamoylethoxy)ethylendiaminadenosin an spezifischen Positionen enthält, wird beschrieben. Eine Lösung aus 2-Chlor-2'-desoxyadenosin, Journal of the American Chemical Society, Band 106, Seite 6379 (1984), DMF und Kaliumthiomethylat wird bei 100°C während einer Stunde erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Meta-chlorperbenzoat behandelt. Nach Rühren bei Raumtemperatur während drei Stunden wird die Lösung unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird einer Reinigung durch Silikagel-Chromatographie unterzogen. Das resultierende 2-Methylsulfonyl-2'-desoxyadenosin wird über das transiente Verfahren, entsprechend den vorstehenden Beispielen 107 und 108, benzoyliert. Das somit hergestellte N6-Benzoyl-2'-desoxy-2-methylsulfonyladenosin dient als Ausgangsmaterial für die Herstellung einer Vielzahl von 2'-Desoxyadenosinen und 2'-Desoxyguanosinen, die an der 2-Position substituiert sind. Eine Lösung von N6-Benzoyl-2'-desoxy-2-methylsulfonyladenosin in DMF wird mit einer Lösung des Natriumsalzes von (N1,N1,N2-Trimethoxycarbonyl-N2-methylcarbamoylethanol)ethylendiamin in Acetonitril behandelt. Die Lösung wird auf 100°C während 30 Min erhitzt und unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Umkristallisieren des Rückstands ergibt N6-Benzoyl-2'-desoxyadenosin mit dem Ethylendiaminderivat an der 2-Position. Dieses Material wird durch Verfahren der vorstehenden Beispiele 107 und 108 zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa AGC
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a 2'-Desoxy-2'-(N1,N1,N2-trimethoxycarbonyl-N2-methylcarbamoylethoxy)-ethylendiaminadenosin ist.
  • BEISPIEL 140
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-Desoxy-2'-(9-[3-chlor-6-methoxyacridinyl]amino-n-pentylamino)adenosin an spezifischen Positionen enthält, wird durchgeführt. Eine Lösung aus N6-Benzoyl-2'-desoxy-2-methylsulfonyladenosin, Ethyldiisopropylamin, 9-[3-Chlor-6-methoxyacridinyl]amino-n-pentylamin und DMF wird während 30 Min auf 100°C erwärmt und unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Umkristallisieren des Rückstands ergibt N6-Benzoyl-2'-desoxyadenosin mit dem Aminoacridinderivat an der 2-Position. Dieses Material wird durch Verfahren der vorstehenden Beispiele 92 und 93 zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa AGC
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a 2'-Desoxy-2-(9-[3-chlor-6-methoxyacridinyl]amino-n-pentylamino)adenosin ist.
  • BEISPIEL 141
  • Die Synthese der 5LΟ-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2-Dimethylamino-tris(ethylamino)adenosin an spezifischen Positionen enthält, wird beschrieben. Eine Lösung aus N6-Benzoyl-2'-desoxy-2-methylsulfonyladenosin, Ethyldiisopropylamin, 2-Dimethylamino-tris(ethylamin) und DMF wird während 30 Min auf 100°C erwärmt und unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Umkristallisieren des Rückstands ergibt N6-Benzoyl-2'-desoxyadenosin mit dem Polyaminderivat an der 2-Position. Dieses Material wird durch Verfahren der vorstehenden Beispiele 92 und 93 zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethyldiisopropylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5LΟ-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa AGC
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a 2-Dimethylamino-tris(ethylamino)adenin ist.
  • BEISPIEL 142
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2-(Methoxybisethoxyethylamino)adenin an spezifischen Positionen enthält, wird beschrieben. Eine Lösung aus N6-Benzoyl-2'-desoxy-2-methylsulfonyladenosin, Ethyldiisopropylamin, Methoxybisethoxyethylamin und DMF wird während 30 Min auf 100°C erwärmt und unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Umkristallisieren des Rückstands ergibt N6-Benzoyl-2'-desoxyadenosin mit dem Ethylenglycolderivat an der 2-Position. Dieses Material wird durch Verfahren der vorstehenden Beispiele 92 und 93 zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa AGC
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a 2-(Methoxybisethoxyethylamino)adenin ist.
  • BEISPIEL 143
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2-Octanoxyadenin an spezifischen Positionen enthält, wird beschrieben. Eine Lösung aus N6-Benzoyl-2'-desoxy-2-methylsulfonyladenosin, Ethyldiisopropylamin, Octanoylamin und DMF wird während 30 Min auf 100°C erwärmt und unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Umkristallisieren des Rückstands ergibt N6-Benzoyl-2'-desoxyadenosin mit der Kohlenstoffkette an der 2-Position. Dieses Material wird durch Verfahren der vorstehenden Beispiele 92 und 93 zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethyldiisopropylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa AGC
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a 2-Octanoylaminoadenin ist.
  • BEISPIEL 144
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-Desoxy-6'-(imidazol-4-yl-ethoxy)-carbocyclisches Guanosin an spezifischen Positionen enthält, wird beschrieben. Eine Lösung aus 2'-Desoxy-3',5'-di-O-benzyl-6'-α-hydroxy-N6-methoxyethoxy-carbocyclisches Guanosin, Journal of the Chemical Society, Chemical Communication, London, Seiten 1083–1084 (1987), wird durch das transiente Verfahren (Pyridin, Chlortrimethylsilan, dann Isobutyrylchlorid, dann Methanol(Ammoniak) isobutyryliert. Dieses Material wird mit 2-(1-Benzoylimdiazol-4-yl)ethanol, Triphenylphosphin/DEAD und Acetonitril bei Raumtemperatur während drei Stunden umgesetzt. Die Lösung wird unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird unter Bereitstellung des Produkts aus Ethanol umkristallisiert, das mit Palladium/Holzkohle, Wasserstoff und Salzsäure debenzyliert und deblockiert wird, um 2'-Desoxy-6'-α-(imidazol-4-yl-ethoxy)-N2-isobutyrylcarbocyclisches Guanosin zur Verfügung zu stellen. Dieses Material wird durch Verfahren der vorstehenden Beispiele 92 und 93 zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    gAA GTC ACT GGA ACg
    gAA GTC ACT gGA ACg
    gAA gTC ACT GGA ACg
    GAA GTC ACT GGA ACg
    GAA GTC ACT ggA ACG
    GAA gTC ACT GGA ACG
    gAA GTC ACT GGA AGC
    GAA GTC ACT GgA ACG
    GAA gTC ACT GGA ACG und
    gAA GTC ACT ggA ACg sein,
    wobei g 2'-Desoxy-6'-(imidazol-4-yl-ethoxy)-carbocyclisches Guanosin ist.
  • BEISPIEL 145
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-Desoxy-6'-α-(N1,N1,N2-trimethoxycarbonyl-N2-methylcarbamoylethoxy)ethylendiamin)-carbocyclisches Guanosin an spezifischen Positionen enthält, wird beschrieben. Eine Lösung aus 2'-Desoxy-3',5'-di-O-benzyl-6'-α-hydroxy-N6-methoxyethoxycarbocyclisches Guanosin, Journal of the Chemical Society, Chemical Communication, London, Seiten 1083–1084 (1987), wird durch das transiente Verfahren, Pyridin, Chlortrimethylsilan, dann Isobutyrylchlorid, dann Methanol(Ammoniak), isobutyryliert. Das gereinigte Material wird mit N1,N1,N2-Trimethoxycarbonyl-N2-methylcarbamoylethoxyethylendiamindiphenyldiazin und Acetonitril bei Raumtemperatur während drei Stunden umgesetzt. Die Lösung wird unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird unter Bereitstellung des Produkts aus Ethanol umkristallisiert, das mit Palladium/Holzkohle, Wasserstoff und Salzsäure debenzyliert und deblockiert wird, um 2'-Desoxy-6'-α-(N1,N1,N2-trimethoxycarbonyl-N2-methylcarbamoylethoxy)ethylendiamin)-N2-isobutyryl-carbocyclisches Guanosin zur Verfügung zu stellen. Dieses Material wird durch Verfahren der vorstehenden Beispiele 92 und 93 zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5LΟ-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    gAA GTC ACT GGA ACg
    gAA GTC ACT gGA ACg
    gAA gTC ACT GGA ACg
    GAA GTC ACT GGA ACg
    GAA GTC ACT ggA ACG
    GAA gTC ACT GGA ACG
    gAA GTC ACT GGA AGC
    GAA GTC ACT GgA ACG
    GAA gTC ACT GGA ACG und
    gAA GTC ACT ggA ACg sein,
    wobei g 2'-Desoxy-6'-α-(N1,N1,N2-trimethoxycarbonyl-N2-methylcarbamoylethoxy)-ethylendiamin)-carbocyclisches Guanosin ist.
  • BEISPIEL 146
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-Desoxy-2'-(imidazo-4-yl)ethoxy-α-D-adenosin an spezifischen Positionen enthält, wurde durchgeführt. Die 3',5'-Positionen von N6-Benzoyl-α-adenosin werden mit 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan, entsprechend dem bekannten Verfahren, gleichzeitig geschützt. Nucleic Acid Chemistry, Improved and New Synthetic Procedures, Methods and Techniques, Teil 3, Seite 229 (1986). Die 2'-Hydroxygruppe wird an (1-Benzoylimidazo-4-yl)ethanol, entsprechend dem Mitsunobu-Verfahren mit Triphenylphosphin/DEAD gekoppelt. Synthese 1 (1981). Das gereinigte Produkt wird mit Tetrabutylammoniumfluorid von der Silylgruppe entschützt und das resultierende Nukleosid wird durch Verfahren der vorstehenden Beispiele 92 und 93 zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5LΟ-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa AGC
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a 2'-Desoxy-2'-(imidazo-4-yl)ethoxy-α-D-adenosin ist.
  • BEISPIEL 147
  • Die Synthese der 5LΟ-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-Desoxy-2'-(N1,N1,N2-trimethoxycarbonyl-N2-methylcarbamoylethoxyethylendiamin)-α-D-adenosin an spezifischen Positionen enthält, wurde durchgeführt. Eine Lösung von N6-Benzoyl-3',5'-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanyl)-2'-trifluormethylsulfonyl-9-(7-α-arabinofuranosyl)adenin wird mit (N1,N1,N2-Trimethoxycarbonyl-2-methylcarbamoylethanol)ethylendiamin entsprechend dem Mitsunobu-Verfahren gekoppelt. Dieses Material wird mit Fluoridionen, entsprechend den vorstehenden Beispielen 92 und 93 entschützt. Das resultierende Material wird durch vorstehende beschriebenen Verfahren zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethyldiisopropylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa AGC
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a 2'-Desoxy-2'-(N1,N1,N2-trimethoxycarbonyl-N2-methylcarbamoylethoxyethylendiamin)-α-D-adenosin ist.
  • BEISPIEL 148
  • Die Synthese der 5LΟ-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-Desoxy-2'-(9-[3-chlor-6-methoxyacridinyl]amino-n-pentyloxy-α-D-erythropentofuranosyl)adenin an spezifischen Positionen enthält, wird durchgeführt. Eine Lösung von N6-Benzoyl-3',5'-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanyl)-2'-trifluormethylsulfonyl-9-(β-D-arabinofuranosyl)adenin wird mit Chlor-6-methoxyacridinyl-9-amino-n-pentanol entsprechend dem Mitsunobu-Verfahren gekoppelt. Die Disilylschutzgruppe wird mit Fluoridionen entfernt und das resultierende Material wird durch Verfahren der vorstehenden Beispiele 92 und 93 zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethyldiisopropylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa AGC
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a 2'-Desoxy-2'-(9-[3-chlor-6-methoxyacridinyl]amino-n-pentyloxy)adenosin ist.
  • BEISPIEL 149
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 2'-Desoxy-2'-[dimethylamino-bis(ethylamino)ethoxy]-α-adenosin an spezifischen Positionen enthält, wird durchgeführt. Eine Lösung von N6-Benzoyl-3',5'-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanyl)-2'-trifluormethylsulfonyl-9-(β-D-arabinofuranosyl)adenin wird mit Dimethylamino-bis(ethylamino)ethanol entsprechend dem Mitsunobu-Verfahren gekoppelt. Die Disilylschutzgruppe wird mit Fluoridionen entfernt und das resultierende Material wird durch Verfahren der vorstehenden Beispiele 92 und 93 zu dessen 5'-DMT-3'-β-cyanoethyldiisopropylphosphoramiditderivat umgesetzt, das in die 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben wird.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa AGC
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a 2'-Desoxy-2'-[dimethylamino-bis(ethylamino)ethoxy-α-D-adenosin ist.
  • BEISPIEL 150
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 1'-(Imidazo-4-yl)ethoxymethyladenosin an spezifischen Positionen enthält, wurde durchgeführt. Psicofuranin, Carbohydr. Res., Band 44, Seite 112 (1975) wird über das transiente Verfahren, entsprechend der Ausführung von R. A. Jones in Oligonukleotide Syntheses – A Practical Approach, M. J. Gait, Herausg., (IRL Press, Washington, DC, 1985), benzoyliert und nachfolgend werden die 3',5'-Hydroxylgruppen mit 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan, entsprechend einem bekannten Verfahren, gleichzeitig geschützt. Nucleic Acid Chemistry, Improves and New Synthetic Procedures, Methods und Techniques, Teil 3, Seite 229, (1986). Die 1'-Hydroxymethylgruppe wird mit Triphenylmethylchlorid in Pyridin behandelt, woraus sich der geschützte primäre Alkohol ergibt. 2'-Desoxygenierung wird entsprechend der Beschreibung von M. J. Robins, et al., in J. Am. Chem. Soc., Band 105, Seite 4059 (1983), durchgeführt. Das resultierende 2'-Desoxynukleosid wird selektiv mit verdünnter Trifluoressigsäure detrityliert. Die 1'-Hydroxymethylgruppe wird mit 1-(Benzoylimidazo-4-yl)ethanol, entsprechend den Mitsunobu-Bedingungen gekoppelt.
  • Entfernen der Silylschutzgruppe und nachfolgende Umsetzung des resultierenden Nukleosids zu dem 5'-DMT und dem 3'-Cyanoethyldiisoproyplphosphit, entsprechend den Verfahren der Beispiele 92 und 93, wird Monomere ergeben, die zum Einschub in die 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese geeignet sind.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAa GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC aCT GGA aCG
    GAA GTC aCT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGA aCG
    GaA GTC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACT GGa AGC
    GAa GTC ACT GGA ACG und
    Gaa GTC aCT GGa aCG sein,
    wobei a 1'-(Imidazo-4-yl)ethoxymethyladenosin ist.
  • BEISPIEL 151
  • Die Synthese der 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG-3', die 4'-(Imidazo-4-yl)ethoxymethylthymin an spezifischen Positionen enthält, wurde durchgeführt. 4'-Hydroxymethylthymidin, J. Org. Chem., Band 44, Seite 1309 (1979) wird selektiv mit der TIPS-Gruppe 4',5' geschützt und dann zu dessen 3'-THP-Derivat umgesetzt. Dieses Material wird mit Fluoridionen Silyl-entschützt und anschießend selektiv 5'-trityliert. Die 3'-Hydroxygruppe wird an 2-(1-Benzoylimidazo-4-yl)ethanol über die Mitsunobu-Reaktionsbedingungen gekoppelt. Dieses Material wird zum Entfernen der Trityl- und THP-Gruppen mit Säure behandelt und nachfolgend, entsprechend den vorstehenden Beispielen 92 und 93, zu dessen 5'-DMT- und 3'-β-Cyanoethoxydiisopropylphosphoramiditgruppen umgesetzt. Dieses Material wird in die 5LO-Sequenz 5'-GAA GTC ACT GGA ACG über automatisierte Festphasen-DNA-Synthese eingeschoben.
  • Die synthetisierten modifizierten Sequenzen werden
    GAA GtC ACT GGA ACG
    GAA GTC ACt GGA ACG und
    GAA GtC ACt GGA ACG sein,
    wobei t = 4'-(Imidazo-4-yl)ethoxymethylthymin ist.

Claims (4)

  1. Mischoligonukleotidsequenz, umfassend einen Zielabschnitt, spezifisch hybridisierbar mit einer vorausgewählten Nukleotidsequenz von RNA oder DNA, wobei der Zielabschnitt mindestens ein modifiziertes Nukleotid umfaßt, dargestellt durch Formel 2:
    Figure 01350001
    wobei: J N oder CR3 ist; R1 OH oder NH2 ist; R2 und R3 H, NH2, Alkyl, substituiertes Alkyl, Alkenyl, Aralkyl, Alkylamino, Aralkylamino, substituiertes Alkylamino, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkylamino, Aminoalkylamino oder Polyalkylamino sind; X ein Zucker oder eine Zuckerderivateinheit ist, wobei die Zuckerderivateinheit ein substituierter Zucker ist, dargestellt durch die Formel:
    Figure 01350002
    wobei: Q O oder CHR11 ist; R8 und R9 H, Alkyl oder substituiertes Alkyl sind R10 H, OH, Niederalkyl, substituiertes Niederalkyl, CN, CF3, OCF3, OCN, O-C3-C12-Alkyl, S-Alkyl, SOMe, SO2Me, ONO2, NO2, NH-Alkyl, OCH=CH2, OCH2CCH, OCCH, Aralkyl, Heteroaralkyl, Heterocyclo-Alkyl, Polyalkylamino oder substituiertes Silyl ist; und R11 H, OH, Alkyl oder substituiertes Alkyl ist; mit der Maßgabe, daß, wenn J CR3 ist und R3 H ist, dann X die Zuckerderivateinheit ist; und ebenso mit der Maßgabe, daß, wenn J N ist, dann X die Zuckerderivateinheit ist.
  2. Verbindung gemäß Anspruch 1 zum Modulieren der Aktivität einer ausgewählten Sequenz von RNA oder DNA, die eine Sequenz von Nukleotidbasen aufweist, die mit der ausgewählten Sequenz spezifisch hybridisierbar ist, und mindestens eine modifizierte 2'-Deoxyfuranosyl-Einheit aufweist.
  3. Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei R2 eine Alkylamino-, Aralkylamino-, substituierte Alkylamino-, Heterocycloalkyl-, Heterocycloalkylamino-, Aminoalkylamino- oder Polyalkylaminogruppe ist.
  4. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens eine Verbindung gemäß Anspruch 1.
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