DE69838449T2

DE69838449T2 - Aminooxy-modifizierte oligonukleotide

Info

Publication number: DE69838449T2
Application number: DE69838449T
Authority: DE
Inventors: Phillip Dan Carlsbad COOK; Muthiah Carlsbad MANOHARAN; Andrew Mamoru Oceanside KAWASAKI
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-02-14
Filing date: 1998-02-13
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2018-02-14
Also published as: JP4440346B2; US6127533A; EP0977767A1; WO1998035978A1; DE69838449D1; US6194598B1; EP0977767A4; AU6651398A; KR20000071091A; CA2278715A1; AU740799B2; KR100399743B1; CA2278715C; JP2001512457A; ATE373671T1; EP0977767B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung ist auf Aminooxy-modifizierte Oligonucleotide gerichtet. Solche Oligonucleotide sind als Therapeutika, Diagnostika und Forschungsreagenzien geeignet. Die Erfindung ist weiterhin auf Aminooxy-Nucleotide, -Nucleoside und -Nucleosid-Surrogate gerichtet, welche als Vorläufer für die Herstellung von Oligonucleotiden geeignet sind. In bestimmen Ausführungsformen der Erfindung stellt der Einschluss von einer/m oder mehreren erfindungsgemäßen Aminooxy-Einheit/en bzw. Rest/en in ein Oligonucleotid inter alia eine verbesserte Bindung der Oligonucleotide an einen komplementären Strang bereit. In weiteren Ausführungsformen der Erfindung stellt der Einschluss von einem oder mehreren Aminooxy-Rest/en eine oder mehrere Konjugationsstelle/n bereit, welche für die Konjugation verschiedener geeigneter Liganden an die Oligonucleotide geeignet sind. Solche Liganden schließen zum Beispiel Reportergruppen und Gruppen zum Modifizieren der Aufnahme, der Verteilung oder anderer pharmakodynamischer Eigenschaften ein.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist erkannt worden, dass Oligonucleotide verwendet werden können, um die mRNA-Expression durch einen Mechanismus zu modulieren, welcher die komplementäre Hybridisierung von relativ kurzen Oligonucleotiden an die mRNA umfasst, so dass die normalen, grundlegenden Funktionen dieser intrazellulären Nucleinsäuren gestört werden. Eine Hybridisierung ist die sequenzspezifische Wasserstoffbindung der Basenpaare eines Oligonucleotids an eine komplementäre RNA oder DNA.
Für eine Verwendung in Diagnostika und als Forschungsreagenzien, sowie in Therapeutika, stellt die Fähigkeit eines Oligonucleotids, an eine spezifische DNA oder RNA mit Genauigkeit zu binden, einen wichtigen Faktor dar. Die relative Fähigkeit eines Oligonucleotids, an komplementäre Nucleinsäuren zu binden wird durch Bestimmen der Schmelztemperatur eines besonderen Hybridisierungskomplexes verglichen. Die Schmelztemperatur (T_m), eine charakteristische physikalische Eigenschaft von Doppelhelices, ist die Temperatur (in °C), bei welcher 50 % helikale, im Vergleich zu Spiral-(unhybridisierten)-Formen vorliegen. Die T_m wird durch Verwenden einer UV-Spektroskopie gemessen, um die Bildung und das Auseinanderbrechen (Schmelzen) der Hybridisierung zu bestimmen. Die Basenstapelung, welche während der Hybridisierung auftritt, wird von einer Reduktion der UV-Absorption (Hypochromizität) begleitet. Folglich weist eine Reduktion der UV-Absorption auf eine höhere T_m hin. Je höher die T_m, desto größer die Stärke der Bindung der Nucleinsäurestränge. Daher sind Oligonucleotide, die modifiziert sind, um mit geeigneter Stärke und Genauigkeit mit ihrer Ziel-RNA (oder -DNA) zu hybridisieren, für eine Verwendung als Forschungsreagenzien, diagnostische Mittel und als Oligoncleotid-Therapeutika sehr erwünscht.
Verschiedene Substitutionen wurden in die Basen- und Zucker-Reste der Nucleoside der Oligonucleotide eingeführt. Der Einschluss von bestimmten dieser Substitutionen hat zu Verbesserungen der sich ergebenden Oligonucleotide geführt. Eine solche geeignete Verbesserung stellt einen Anstieg der Nucleaseresistenz der Oligonucleotide durch die Einführung von 2'-Substituenten, wie Halogen-, Alkoxy- und Allyloxy-Gruppen, dar.
Ikehara et al. (European J. Biochem., 1984, 139, 447) haben von der Synthese eines gemischten Octamers berichtet, welches einen 2'-Desoxy-2'-fluorguanosinrest oder einen 2'-Desoxy-2'-fluoradeninrest enthält. Guschlbauer und Jankowski (Nucleic Acids Res., 1980, 8, 1421) haben gezeigt, dass der Beitrag des 3'-Endos mit steigender Elektronegativität des 2'-Substituenten ansteigt. Daher enthält 2'-Desoxy-2'-fluoruridin 85 % des C3'-Endo-Konformers.
Weiterhin wurden Belege erbracht, welche darauf hinweisen, dass 2'-substituierte-2'-Desoxyadenosinpolynucleotide eher doppelsträngiger RNA als DNA ähneln. Ikehara et al. (Nucleic Acids Res., 1978, 5, 3315) haben gezeigt, dass ein 2'-Fluor-Substituent in Poly-A, Poly-I oder Poly-C, welcher an sein Komplement gebunden ist, erheblich stabiler ist, als der Ribonucleotid- oder Desoxyribonucleotid-Poly-Doppelstrang, wie durch Standard-Schmelzassays bestimmt wurde. Ikehara et al. (Nucleic Acids Res., 1978, 4, 4249) haben gezeigt, dass ein 2'-Chlor oder -Brom-Substituent in Poly(2'-desoxyadenylsäure) eine Nucleaseresistenz bereitstellt. Eckstein et al. (Biochemistry, 1972, 11, 4336) haben berichtet, dass Poly(2'-chlor-2'-desoxyuridylsäure) und Poly(2'-chlor-2'-desoxycytidylsäure) gegenüber verschiedenen Nucleasen resistent sind. Inoue et al. (Nucleic Acids Res., 1987, 15, 6131) haben die Synthese von gemischten Oligonucleotidsequenzen, welche 2'-OMe-Substituenten an jedem Nucleotid enthalten, beschrieben. Das gemischte 2'-OMe-substituierte Oligonucleotid hybridisierte genauso stark an sein RNA-Komplement, wie der RNA-RNA-Doppelstrang, welcher erheblich stärker als der RNA-DNA-Heterodoppelstrang derselben Sequenz ist (T_ms, 49,0 und 50,1 im Vergleich zu 33,0 Grad für Nonamere). Shibahara et al. (Nucleic Acids Res., 1987, 17, 239) haben von der Synthese von gemischten Oligonucleotiden berichtet, welche 2'-OMe-Substituenten an jedem Nucleotid enthalten. Die gemischten 2'-OMe-substituierten Oligonucleotide wurden entworfen, um die HIV-Replikation zu inhibieren.
Es wird angenommen, dass die Zusammensetzung der sterischen Wirkung der Hydroxylgruppe, ihre Wasserstoff-Bindungsfähigkeiten und ihre Elektronegativität im Vergleich zu den Eigenschaften des Wasserstoffatoms für das Gros des strukturellen Unterschieds zwischen RNA und DNA verantwortlich ist. Thermische Schmelzstudien weisen darauf hin, dass die Reihenfolge der Doppelstrangstabilität (Hybridisierung) von 2'-Methoxy-Oligonucleotiden die Reihenfolge RNA-RNA > RNA-DNA > DNA-DNA aufweist.
Das U.S. Patent 5,013,830 , erteilt am 7. Mai 1991, offenbart gemischte Oligonucleotide, die einen RNA-Teil umfassen, welcher 2'-O-Alkyl-Substituenten trägt, die an einen DNA-Teil über eine Phospodiester-Bindung konjugiert sind. Da sie Phosphodiester sind, sind diese Oligonucleotide jedoch anfällig für eine Nucleasespaltung.
Die europäische Patentanmeldung 339,842 , eingereicht am 13. April 1989, offenbart 2'-O-substituierte Phosphorthioat-Oligonucleotide, einschließlich 2'-O-Methylribooligonucleotid-Phosphorthioat-Derivate. Diese Anmeldung offenbart auch 2'-O-Methylphosphodiester-Oligonucleotide, welchen eine Nucleaseresistenz fehlt.
Die europäische Patentanmeldung 260,032 , eingereicht am 27. August 1987, offenbart Oligonucleotide, welche 2'-O-Methyl-Substituenten am Zuckerrest aufweisen. Diese Anmeldung erwähnt auch andere 2'-O-Alkyl-Substituenten, wie Ethyl-, Propyl- und Butyl-Gruppen.
Die internationale Veröffentlichung Nummer WO 91/06556 , veröffentlicht am 16. Mai 1991, und das U.S. Patent 5,466,786 offenbaren Oligomere, welche an der 2'-Position mit Substituenten, welche gegenüber einer Nucleaseaktivität stabil sind, derivatisiert sind. Besondere 2'-O-Substituenten, die in die Oligonucleotide eingeschlossen wurden, schließen Ethoxycarbonylmethyl (Esterform) und seine Säure-, Amid- und substituierten Amid-Formen ein.
Die europäische Patentanmeldung 399,330 , eingereicht am 15. Mai 1990, offenbart Nucleotide, welche 2'-O-Alkyl-Substituenten aufweisen.
Die internationale Veröffentlichung Nummer WO 91/15499 , veröffentlicht am 17. Oktober 1991, offenbart Oligonucleotide, welche 2'-O-Alkyl-, -Alkenyl- und Alkinyl-Substituenten tragen.
Martin, P., Helvetica Chimica Acta, 78, 1995, 486-504 offenbart bestimmte Nucleoside und Oligonucleotide, welche daraus hergestellt werden, die 2'-Methoxyethoxy-, 2'-Methoxy(tris-ethoxy)- und andere Substituenten einschließen.
Oligonucleotide, die ein Nucleosid enthielten, welches mit beiden, den 2'-Methoxyethoxy- und den 2'-Methoxy(tris-ethoxy)-Substituenten substituiert war, wiesen eine verbesserte Hybridisierung auf, wie durch einen Anstieg der Tm belegt wurde.
Zavgorodny et al., Tetrahedron Letters, Band 32, Nr. 51, 7593-7596, 1991 offenbaren Nucleoside, welche die Grundlage für den Disclaimer in Anspruch 8 bilden.
Es ist erkannt worden, dass Oligonucleotide, welche eine verbesserte Hybridisierungsgenauigkeit aufweisen, von großer Wichtigkeit für die Entwicklung von Oligonucleotiden sind, welche als Forschungsreagenzien, diagnostische Mittel und therapeutische Mitteln geeignet sind.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Aminooxy-enthaltende Zusammensetzungen bereitgestellt, welche die Aktivität von DNA und RNA modulieren. Bevorzugte Zusammensetzungen schließen Verbindungen der Struktur:
ein, worin:
B_x eine heterocyclische Purin- oder Pyrimidinbase ist,
T₁ und T₂ unabhängig voneinander OH, eine Hydroxyl-Schutzgruppe, eine aktivierte Phosphatgruppe, ein Nucleotid, ein Nucleosid oder ein Oligonucleotid sind und
L eine der Strukturen aufweist:
worin
m von 0 bis 10 ist,
y von 1 bis 10 ist,
x 1 ist,
E N(R₁)(R₂) oder N=C(R₁)(R₂) ist und
R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, C₁-C₁₀ Alkyl, eine Stickstoff-Schutzgruppe sind, oder R₁ und R₂ zusammen eine Stickstoff-Schutzgruppe sind, oder wobei R₁ und R₂ in einer Ringstruktur verbunden sind, die mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus N und O, einschließen kann.
Bx ist vorzugsweise Adenin, Guanin, Hypoxanthin, Uracil, Thymin, Cytosin, 2-Aminoadenin oder 5-Methylcytosin. R₁ und R₂ können eine Ringstruktur sein, wie Imidazol, Piperidin, Morpholin oder ein substituiertes Piperazin (z.B. ein mit einem C₁-C₁₂ Alkyl substituiertes Piperazin). Beide von T₁ und T₂ können Oligonucleotide sein, oder eins von ihnen kann ein Oligonucleotid sein und das andere kann eine Hydroxyl-Schutzgruppe sein.
In bestimmten Ausführungsformen schließen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen Verbindungen der Struktur: Q-L ein, wobei
L eine der Strukturen aufweist:
worin
m von 0 bis 10 ist,
y von 1 bis 10 ist,
E N(R₁)(R₂) oder N=C(R₁)(R₂) ist,
R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, C₁-C₁₀ Alkyl, eine Stickstoff-Schutzgruppe sind, oder R₁ und R₂ zusammen eine Stickstoff-Schutzgruppe sind, oder wobei R₁ und R₂ in einer Ringstruktur verbunden sind, die mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus N und O, einschließen kann,
und X und Q derart ausgewählt sind, dass:
wenn X 1 ist, dann ist Q:
ein Nucleosid, substituiert mit der Gruppe L an einer 2'-, 3'- oder 5'-Position, oder
ein 3'-phosphityliertes Nucleosid, substituiert mit der Gruppe L an einer 2'- oder 5'-Position, oder
ein 2'-phosphityliertes Nucleosid, substituiert mit der Gruppe L an einer 3'- oder 5'-Position, oder
ein Oligonucleotid, das ein Nucleotid einschließt, substituiert an einer 2'-, 3'- oder 5'-Position mit der Gruppe L, oder
wenn X 0 ist, dann ist Q eine Verbindung der Struktur:
worin
n und p unabhängig voneinander von 0 bis 10 sind, mit der Summe von n und p größer als 2 und weniger als 11,
Pg eine Hydroxyl-Schutzgruppe (z.B. Dimethoxytrityl) ist, und
Z ein fester Träger oder eine geschützte und aktivierte Phosphoreinheit ist (z.B. eine Cyanoethoxy-N,N-diisopropylphosphoramidit-Gruppe).
Vorzugsweise ist p 1 und n ist 4.
In einer bevorzugten Gruppe der Verbindungen ist y 1 bis 4. In noch weiter bevorzugten Gruppen der Verbindungen ist y 1.
In einer bevorzugten Gruppe der Verbindungen ist m 1 bis 6. In noch weiter bevorzugten Gruppen der Verbindungen ist m 2.
In einer bevorzugten Gruppe der Verbindungen sind R₁ und R₂ H oder Alkyl. In einer weiteren Gruppen der Verbindungen sind R₁ und R₂ eine Stickstoff-Schutzgruppe. Bevorzugte Stickstoff-Schutzgruppen schließen Phthalimido-N-oxy und Formaloximyl ein.
In einer bevorzugten Gruppe der Verbindungen ist Q ein Nucleosid, Nucleotid oder ein Nucleosid, welches in ein Oligonucleotid eingeschlossen ist. In einer weiter bevorzugten Gruppe der Verbindungen ist Q ein 2'- oder 3'-substituiertes Nucleosid, welches in ein Oligonucleotid eingeschlossen ist.
In einer bevorzugten Gruppe von Verbindungen ist Q die Struktur:
worin Pg und Z wie oben definiert sind. In einer weiter bevorzugten Gruppe von Verbindungen ist Z ein fester Träger. In einer weiter bevorzugten Gruppe von Verbindungen ist Z ein geschütztes und aktiviertes Phosphoratom. In einer noch wei ter bevorzugten Gruppe der Verbindungen ist Z ein geschützter Phosphoramiditrest.
Bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzungen schließen Oligonucleotide ein, welche modifiziert sind, um eine oder mehrere der oben erwähnten Q-L-Verbindungen einzuschließen. Daher umfassten diese Zusammensetzungen Oligonucleotide, welche ein oder mehrere erfindungsgemäße/s Aminooxy-modifizierte/s Nucleosid/e aufweisen, oder Oligonucleotide, welche modifiziert wurden, um ein oder mehrere Nucleosid-Surrogat/e der Formel Q-L einzuschließen, worin Q die oben erwähnte Struktur I ist. Diese Oligonucleotide sind insbesondere mit vorausgewählten Nucleotidsequenzen einzelsträngiger oder doppelsträngiger Ziel-DNA oder -RNA hybridisierbar. Die Oligonucleotide erkennen einzelsträngige DNA und RNA und bilden Doppelstränge mit ihr.
Die erfindungsgemäßen modifizierten Oligonucleotide bestehen aus einem Einzelstrang von Nucleinsäurebasen, welche über Verbindungsgruppen miteinander verbunden sind. Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können in der Länge von ungefähr 5 bis ungefähr 50 Nucleinsäurebasen reichen. Gemäß bestimmter bevorzugter Ausführungsformen dieser Erfindung ist jedoch eine Sequenz von ungefähr 12 bis 25 Basen Länge erwünscht.
Die bevorzugten einzelnen Nucleotide der erfindungsgemäßen Oligonucleotide können über Phosphorverbindungen verbunden sein. Bevorzugte Phosphorverbindungen schließen Phosphodiester-, Phosphorthioat- und Phosphordithioat-Verbindungen ein, wobei Phosphodiester- und Phosphorthioat-Verbindungen insbesondere bevorzugt sind.
Bevorzugte erfindungsgemäße Nucleobasen schließen Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl, 2-Propyl und andere Alkyladenine, 5-Halogenuracil, 5-Halogencytosin, 6-Azauracil, 6-Azacytosin und 6-Azathymin, Peusdouracil, 4-Thiouracil, 8-Halogenadenin, 8-Aminoadenin, 8-Thioladenin, 8-Thiolalkyladenine, 8-Hydroxyladenin und andere 8-substituierte Adenine, 8-Halogenguanine, 8-Aminoguanin, 8-Thiolguanin, 8-Thiolalkylguanine, 8-Hydroxylguanin und andere 8-substituierte Guanine, andere Aza- und Desazauracile, andere Aza- und Desazathymidine, andere Aza- und Desazacytosine, andere Aza- und Desazaadenine, andere Aza- und Desazaguanine, 5-Trifluormethyluracil und 5-Trifluorcytosin ein.
Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung ist mindestens eines der Nucleoside eines Oligonucleotids modifiziert. Bevorzugte Stellen für eine Modifikation der Nucleosidbestandteile liegen an den 2'-, 3'- oder 5'-Positionen des Nucleosids. Die Modifikation umfasst eine, die einen Aminooxy-Rest in ein oder mehrere Nucleosid/e einführt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird mindestens ein Nucleosid-Surrogat, welches einen Aminooxy-Rest aufweist, verwendet, um das Oligonucleotid zu modifizieren. Das Aminooxy-modifizierte Nucleosid oder das Aminooxy-enthaltende Nucleosid-Surrogat wird in das Oligonucleotid unter Verwendung von synthetischen Standardverfahren zum Herstellen von Oligonucleotiden eingeschlossen, welche zu einem Einschluss des Aminooxy-Restes in das Oligonucleotid führen.
Eine bevorzugte Modifikation umfasst Oligonucleotide, welche eine oder mehrere Nucleosid-Einheit/en einschließen, welche modifiziert sind, um eine 2', 3'- oder 5'-O-Aminooxyalkyl-, 2'-, 3'- oder 5'-O-Alkylaminooxyalkyl- oder 2'-, 3'- oder 5'-O-Dialkylaminooxyalkyl-Modifikation einzuschließen. Weiter bevorzugte Modifikationen umfassen Nucleosid-Surrogate, welche Alkyleinheiten umfassen, die erste und zweite Hydroxy-Funktionalitäten zum Einschließen in ein Oligonucleotid darauf aufweisen, und welche eine Seitenkette aufweisen, die einen Aminooxy-Rest zur Verwendung beim Verbinden von Konjugatgruppen mit dem Oligonucleotid über eine Konjugation am Aminooxy-Rest daran aufweist. Eine solche Konjugation wird durch eine geeignete Alkylierung oder Acylierung des Stickstoffatoms des Aminooxy-Restes bewirkt. Die Verbindungen der Vitamin A-Familie können an Oligonucleotide über Säure- oder Alkoholfunktionalitäten angeheftet werden, die in den verschiedenen Mitgliedern der Familie gefunden werden. Zum Beispiel führt die Konjugation eines N-Hydroxysuccinimidesters eines Säurerestes der Retinol säure mit einer Aminfunktion einer Verbindungsseitengruppe eines Oligonucleotids zu einer Verbindung der Vitamin A-Verbindung mit dem Oligonucleotid über eine Aminbindung. Auch wurde Retinol in sein Phosphoramidit umgewandelt, welches für eine 5'-Konjugation geeignet ist.
Geeignet für eine Auswahl als Konjugatgruppen oder Liganden sind: ein Steroidmolekül, ein Reportermolekül, ein lipophiles Molekül, ein Reporterenzym, ein Peptid, ein Protein (d.h. ein Substituent, welcher im Wesentlichen aus demselben besteht) oder ein Glykol oder ein Glykol ähnlicher Linker. Für die Zwecke dieser Erfindung schließen die Begriffe "Reportermolekül" und "Reporterenzym" jene Moleküle oder Enzyme ein, welche physikalische oder chemische Eigenschaften aufweisen, die ihnen erlauben, in Gelen, Flüssigkeiten, vollständigen zellulären Systemen, aufgeschlossenen zellulären Systemen und desgleichen, unter Verwendung physikalischer Eigenschaften, wie Spektroskopie, Radioaktivität, kolorimetrische Assays, Fluoreszenz und spezifisches Binden, identifiziert zu werden. Steroide schließen jene chemischen Verbindungen ein, welche ein Perhydro-1,2-cyclopentanophenanthren-Ringsystem enthalten. Proteine und Peptide werden in ihrem gängigen Sinn als Polymere der Aminosäuren verwendet. Normalerweise umfassen Peptide solche Polymere, welche eine kleinere Anzahl Aminosäuren pro Moleküleinheit umfassen, als es Proteine tun. Lipophile Moleküle schließen natürlich vorkommende und synthetische aromatische und nichtaromatische Reste, wie Fettsäuren, Ester, Alkohole und andere Lipid-Moleküle, substituierte aromatische Gruppen, wie Dinitrophenylgruppen, Käfigstrukturen, wie Adamantan und Buckminsterfullerene, und aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Perylen, Phenanthren, Anthracen, Naphthalin, Pyren, Chrysen und Naphthacen ein.
Insbesondere geeignet als Steroid-Moleküle sind die Gallensäuren, einschließlich Cholsäure, Desoxycholsäure und Dehydrocholsäure, Steroide, einschließlich Cortison, Digoxgenin, Testosteron und Cholesterin und sogar kationische Steroide, wie Cortison, welches eine Trimethylaminomethylhydrazidgruppe aufweist, die über eine Doppelbindung an der 3-Position des Cortisonrings angeheftet ist. Insbesondere geeignet als Reportermoleküle sind Biotin-, Dinitrophenyl- und Fluores ceinfarbstoffe. Insbesondere geeignet als lipophile Moleküle sind alicyclische Kohlenwasserstoffe, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, Wachse, Terpene und polyalicyclische Kohlenwasserstoffe, einschließlich Adamantan und Buckminsterfullerene. Insbesondere geeignet als Reporterenzyme sind alkalische Phosphatase und Meerrettichperoxidase. Insbesondere geeignet als Peptide und Proteine sind sequenzspezifische Peptide und Proteine, einschließlich Phosphodiesterase-, Peroxidase-, Phosphatase- und Nuclease-Proteine. Solche Peptide und Proteine schließen SV40-Peptid, RNase A, RNase H und Nuclease aus Staphylococcus ein. Insbesondere geeignet als Terpenoide sind Vitamin A, Retinolsäure, Retinal und Dehydroretinol. Andere Konjugatliganden werden in dem Vereinigten Staaten Patent 5,578,718 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Oligonucleotide ein, welche aus einer Vielzahl von verbundenen Nucleosiden gebildet werden, einschließlich 2'-Desoxyerythro-pentofuranosyl-β-nucleosiden. Diese Nucleoside sind durch geladene Phosphorverbindungen in einer Sequenz verbunden, welche spezifisch mit einer komplementären Ziel-Nucleinsäure hybridisierbar ist. Die Sequenz der verbundenen Nucleoside wird in mindestens zwei Untersequenzen aufgeteilt. Die erste Untersequenz schließt Nucleoside ein, welche 2'-Aminooxyalkyl-Substituenten aufweisen, die über geladene 3'-5'-Phosphorverbindungen verbunden sind. Die zweite Untersequenz besteht aus 2'-Desoxy-erythro-pentofuranosyl-β-nucleosiden, die über 3'-5'-Phosphorverbindungen, welche bei physiologischem pH-Wert eine negative Ladung tragen, verbunden sind. In weiter bevorzugten Ausführungsformen gibt es eine dritte Untersequenz, deren Nucleoside aus jenen ausgewählt sind, die für die erste Untersequenz auswählbar sind. In bevorzugten Ausführungsformen liegt die zweite Untersequenz zwischen der ersten und dritten Untersequenz. Solche erfindungsgemäßen Oligonucleotide werden auch als "chimäre" oder "unterbrochene bzw. gapped" Oligonucleotide bezeichnet oder als "Chimäre".
Die sich ergebenden neuartigen erfindungsgemäßen Oligonucleotide werden eine erhöhte Resistenz gegenüber einem Nucleaseabbau aufweisen und werden Hybridisierungseigenschaften von höherer Qualität im Vergleich zu Wildtyp DNA- DNA- und RNA-DNA-Doppelsträngen und Phosphor-modifizierten Oligonucleotid-Doppelsträngen aufweisen, welche Methylphosphonate, Phosphoramidate und Phosphattriester enthalten, oder sie werden Nucleosid-Surrogat-Einheiten aufweisen, welche darin eingeschlossen sind, die Aminooxy-Stellen an der Surrogat-Einheit zum Verbinden von Konjugat-Gruppen mit dem Oligonucleotid über den Aminooxy-Rest aufweisen.
Die Erfindung ist auch auf Verfahren zum Modulieren der Herstellung eines Proteins durch einen Organismus gerichtet, welche das Inkontaktbringen des Organismus mit einer Zusammensetzung umfassen, die in Übereinstimmung mit den zuvor genannten Betrachtungen formuliert ist. Es ist bevorzugt, dass der RNA- oder DNA-Teil, welcher moduliert werden soll, ausgewählt wird, um den Teil der DNA oder RNA zu umfassen, welcher das Protein kodiert, dessen Bildung moduliert werden soll. Daher wird das Oligonucleotid, welches eingesetzt werden soll, entworfen, um spezifisch mit dem vorausgewählten Teil der Ziel-DNA oder -RNA hybridsierbar zu sein.
Diese Erfindung ist auch auf Verfahren zum Behandeln eines Organismus gerichtet, welcher eine Erkrankung aufweist, die durch die unerwünschte Herstellung eines Proteins gekennzeichnet ist. Dieses Verfahren umfasst das Inkontaktbringen des Organismus mit einer Zusammensetzung in Übereinstimmung mit den zuvor genannten Betrachtungen. Die Zusammensetzung stellt vorzugsweise eine solche dar, die entworfen wird, um spezifisch mRNA zu binden, welche das Protein kodiert, dessen Herstellung inhibiert werden soll.
Die Erfindung ist weiterhin auf diagnostische Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit unnormaler RNA-Moleküle oder unnormaler oder unangemessener Expression von normalen RNA-Molekülen in Organismen oder Zellen gerichtet.
Die Erfindung ist auch auf Verfahren für das selektive Binden von RNA zur Verwendung als Forschungsreagenzien und diagnostische Mittel gerichtet. Ein sol ches selektives und starkes Binden wird durch Interagieren einer solchen RNA oder DNA mit erfindungsgemäßen Oligonucleotiden begleitet, welche eine erhöhte Genauigkeit der Hybridisierung aufweisen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Synthese von bestimmten erfindungsgemäßen Zwischenprodukten.
2 zeigt eine Synthese von 5-Methyluridin-DMT-phosphoramidit mit einer geschützten Aminooxyethyl-Gruppe an der 2'-O-Position.
3 zeigt eine Synthese von bestimmten erfindungsgemäßen Zwischenprodukten.
4 zeigt eine Synthese von Adenosin-DMT-phosphoramidit mit einer geschützten Aminooxyethoxy-Gruppe an der 2'-Position.
5 zeigt eine Synthese von bestimmten erfindungsgemäßen Zwischenprodukten.
6 zeigt eine Synthese von Cytidin-DMT-phosphoramidit mit einer geschützten Aminooxyethoxy-Gruppe an der 2'-Position.
7 zeigt eine Synthese von bestimmten erfindungsgemäßen Zwischenprodukten.
8 zeigt eine Synthese von Guanidin-DMT-phosphoramidit mit einer geschützten Aminooxyethoxy-Gruppe an der 2'-Position.
9 zeigt eine Synthese von einigen erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
10 zeigt eine Verbindung von erfindungsgemäßen Verbindungen mit CPG.
11 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
12 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
13 zeigt eine Kurve der % Oligonucleotid in voller Länge gegenüber der Zeit in Minuten in Bezug auf die Wirkungen einer Nucleasewirkung auf Oligonucleotide.
14 zeigt eine Kurve der % Oligonucleotid in voller Länge gegenüber der Zeit in Minuten in Bezug auf die Wirkungen einer Nucleasewirkung auf Oligonucleotide.
15 zeigt eine Kurve der % Oligonucleotid in voller Länge gegenüber der Zeit in Minuten in Bezug auf die Wirkungen einer Nucleasewirkung auf Oligonucleotide.
16 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
17 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
18 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
19 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
20 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
21 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
22 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
23 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
24 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
25 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
26 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
27 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
28 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
29 zeigt eine Synthese von erfindungsgemäßen Zwischenprodukten und Monomeren.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Geeignete Zusammensetzungen zur Identifizierung oder Quantifizierung einer RNA oder DNA oder zum Modulieren der Aktivität eines RNA- oder DNA-Moleküls umfassen im Allgemein erfindungsgemäß ein Zucker-modifiziertes Oligonucleotid, welches spezifisch mit einer vorausgewählten Nucleotidsequenz eines einzelsträngigen oder doppelsträngigen Ziel-DNA- oder -RNA-Moleküls hybridisierbar ist. Es ist im Allgemeinen wünschenswert, eine Sequenz einer DNA oder RNA auszuwählen, welche an der Herstellung eines Proteins beteiligt ist, dessen Synthese letztendlich in seiner Gesamtheit moduliert oder inhibiert werden soll, oder eine Sequenz einer RNA oder DNA auszuwählen, dessen Anwesenheit, Abwesenheit oder spezifische Menge in einem diagnostischen Test bestimmt werden soll.
Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide werden in geeigneter Weise unter Verwendung einer Festphasensynthese bekannter Methodik synthetisiert und sind entworfen, um komplementär zu oder spezifisch hybridisierbar mit der vorausgewählten Nucleotidsequenz der Ziel-RNA oder -DNA zu sein. Nucleinsäure-Syntheseautomaten sind kommerziell verfügbar, und der Fachmann wird verstehen, dass ihre Verwendung beim Erzeugen irgendeines gewünschten Oligonucleotids von angemessener Länge wirksam ist.
Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide schließen auch jene ein, welche Nucleoside umfassen, die über geladene Verbindungen verbunden sind, und deren Sequenzen in mindestens zwei Untersequenzen geteilt sind. Die erste Untersequenz schließt 2'-Aminooxyalkyl-substituierte Nucleoside ein, die durch einen ersten Verbindungstyp verbunden sind. Die zweite Untersequenz schließt Nucleoside ein, die durch einen zweiten Verbindungstyp verbunden sind. In eine bevorzugten Ausführungsform gibt es eine dritte Untersequenz, deren Nucleoside aus jenen ausgewählt sind, die für die erste Untersequenz auswahlbar sind, und die zweite Untersequenz liegt zwischen der ersten und der dritten Untersequenz. Solche erfin dungsgemäßen Oligonucleotide sind als "Chimäre" oder "chimäre" oder "gapped" Oligonucleotide bekannt.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung betrifft der Begriff "Oligonucleotid" eine Vielzahl von Nucleotiden, welche zusammen in einer spezifischen Sequenz aus natürlich und nicht natürlich vorkommenden Nucleobasen verbunden sind. Bevorzugte erfindungsgemäße Nucleobasen sind durch einen Zuckerrest über Phosphor-Verbindungen verbunden und schließen Adenin, Guanin, Adenin, Cytosin, Uracil, Thymin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl-, 2-Propyl- und andere Alkyladenine, 5-Halogenuracil, 5-Halogencytosin, 6-Azauracil, 6-Azacytosin und 6-Azathymin, Peusdouracil, 4-Thiouracil, 8-Halogenadenin, 8-Aminoadenin, 8-Thioladenin, 8-Thiolalkyladenine, 8-Hydroxyladenin und andere 8-substituierte Adenine, 8-Halogenguanine, 8-Aminoguanin, 8-Thiolguanin, 8-Thiolalkylguanine, 8-Hydroxylguanin und andere 8-substituierte Guanine, andere Aza- und Desazauracile, andere Aza- und Desazathymidine, andere Aza- und Desazacytosine, andere Aza- und Desazaadenine, andere Aza- und Desazaguanine, 5-Trifluormethyluracil und 5-Trifluorcytosin ein. Der Zuckerrest kann Desoxyribose oder Ribose sein. Die erfidungsgemäßen Oligonucleotide können auch modifizierte Nucleobasen oder Nucleobasen umfassen, welche andere Modifikationen aufweisen, die mit dem Sinn dieser Erfindung übereinstimmen, und insbesondere Modifikationen, welche ihre Nucleaseresistenz erhöhen, um ihre Verwendung als therapeutische, diagnostische oder Forschungs-Reagenzien zu erleichtern.
Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide sind ungefähr 5 bis ungefähr 50 Basen lang. Es ist weiter bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Oligonucleotide von 8 bis ungefähr 40 Basen aufweisen, und noch weiter bevorzugt, dass von ungefähr 12 bis ungefähr 25 Basen verwendet werden.
Es ist gewünscht, dass die erfindungsgemäßen Oligonucleotide angepasst werden, um spezifisch mit der Nucleotidsequenz der zur Modulation ausgewählten Ziel-RNA oder -DNA hybridisierbar zu sein. Oligonucleotide, welche insbesondere für die Anwendung in einer oder mehreren Ausführungsform/en der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen 2', 3'- oder 5'-Zucker-modifizierte Oligonucleotide, worin die 2'-, 3'- oder 5'-Position der Pentofuranosylreste des Nucleosids modifiziert ist, um einen Aminooxy-Rest einzuschließen. Zum Beispiel werden die Oligonucleotide modifiziert, um Substitutionen zu enthalten, einschließlich dem Einschluss von einer oder mehreren Nucleosid-Einheit/en, welche als 2', 3'- oder 5'-O-Aminooxyalkyl, als 2'-, 3'- oder 5'-O-Alkylaminooxyalkyl, als 2'-, 3'- oder 5'-O-Dialkylaminooxyethyl modifiziert sind, oder von einer oder mehreren Nucleosid-Surrogat-Gruppe/en, welche eine Alkylgruppe einschließt/en, welche eine oder zwei Hydroxylgruppe/n und eine Aminooxy-Gruppe daran aufweist/en, und von geschützten, blockierten oder Vorläuferformen der oben eingeschlossenen Phthalimido-N-oxyalkyl- und Formaloxymylalkyl-Substitutionen, sind aber nicht darauf beschränkt. Die modifizierten Nucleoside oder Surrogat-Nucleoside können innerhalb des Oligonucleotids über eine Verbindung an das Oligonucleotid-Rückgrat liegen, oder sie können an einem oder beiden der 3'- und 5'-terminalen Enden des Oligonucleotids liegen.
Das Nucleosid-Surrogat kann geeignete aktivierte Phosphoratome in P^III- oder P^V-Valenzstufen zum Einschluss in ein Oligonucleotid einschließen. Solche aktivierten Phosphoratome schließen Phosphoramidit, H-Phosphonate und Triester ein, wie sie im Stand der Technik bekannt sind. Die Nucleosid-Surrogate können auch geeignete Hydroxyl-Blockierungsgruppen einschließen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Dimethoxytrityl-, Trimethoxytrityl-, Monomethoxytrityl- und Trityl-Blockierungsgruppen und andere Blockierungsgruppen, wie sie im Stand der Technik bekannt sind.
Durch Positionieren einer der erfindungsgemäßen Nucleosid-Surrogat-Gruppen in einem Oligonucleotid wird ein angemessen blockiertes und aktiviertes Nucleosid-Surrogat in die Oligonucleotide in der Standardweise zum Einschluss eines normal blockierten und aktivierten Standardnucleotids eingeschlossen. Zum Beispiel wird ein Nucleosid-Surrogat ausgewählt, welches seinen Aminooxy-Rest unter Verwendung einer Phthalimido-Schutzgruppe geschützt hat. Eine der Hydroxylgruppen des Surrogatmoleküls ist durch Verwenden einer Dimethoxytrityl- Schutzgruppe (einer DMT-Schutzgruppe) geschützt, und die andere Hydroxyl-Gruppe, die zweite Hydroxyl-Gruppe, ist als ein Cyanoethoxydiisopropylphosphoramidit-Rest anwesend. Die Surrogat-Einheit wird zu dem wachsenden Oligonucleotid durch Behandeln mit den normalen aktivierenden Mitteln, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, hinzugefügt, um den Phosphoramidit-Rest mit dem wachsenden Oligonucleotid umzusetzen. Dies wird von einem Entfernen der DMT-Gruppe in der Standardweise, wie sie im Stand der Technik bekannt ist, und einem Fortsetzen der Verlängerung des Oligonucleotids mit normalen Nucleotid-Amidit-Einheiten, wie es im Stand der Technik Standard ist, gefolgt. Wenn die Nucleosid-Surrogat-Einheit eine Zwischenprodukt-Einheit darstellt, welche während der Synthese des Oligonucleotids verwendet wird, liegt das Surrogat-Nucleosid im Inneren des Oligonucleotids. Wenn die Nucleosid-Surrogat-Einheit die letzte Einheit darstellt, welche mit dem Oligonucleotid verbunden ist, wird die Nucleosid-Surrogat-Einheit den am weitesten terminal gelegenen 5'-Rest des Oligonucleotids bilden.
Andere Nucleosid-Surrogat-Einheiten können eine Verbindung der zweiten Hydroxyl-Gruppe an einen festen Träger einschließen, in derselben Weise, wie sie zum Verbinden gängiger Nucleoside an feste Träger verwendet wird. Nach der Spaltung des Oligonucleotids vom festen Träger wird die Nucleosid-Surrogat-Einheit den am weitesten terminal gelegenen 3'-Rest des Oligonucleotids bilden.
In jedem solchen Oligonucleotid wird nach einer Spaltung des Oligonucleotids von seinem festen Träger die Phthalimido-Blockierungsgruppe entfernt, um den Aminooxy-Rest am Oligonucleotid zu erzeugen. Die Amino-Funktionalität dieses Aminooxy-Restes kann weiterhin mit angemessenen Liganden über Alkylierungs- oder Acylierungsreaktionen umgesetzt werden, um den Liganden als eine Konjugat-Gruppe mit dem Oligonucleotid zu verbinden. Verschiedene Konjugat-Gruppen, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, können auf diese Weise an das Oligonucleotid konjugiert werden.
In den erfindungsgemäßen substituierten Nucleosiden ist jedes Alkyl eine gerade oder verzweigte Kette von C₁ bis C₁₀. Für eine Verwendung in einem erfindungsgemäßen 2'-, 3'- oder 5'-O-substituierten Nucleosid ist eine weiter bevorzugte Alkyl-Gruppe ein C₁-C₄ Alkyl, wobei ein C₂ Alkyl am meisten bevorzugt ist.
Für erfindungsgemäße Nucleosid-Surrogate wird die Gesamtlänge der Alkyl-Gruppe ausgewählt, weniger als 11 zu betragen, wobei die Aminooxy-Gruppe zwischen den Enden der Alkyl-Gruppe positioniert ist. In bestimmten bevorzugten erfindungsgemäßen Nucleosid-Surrogaten ist es bevorzugt, die Aminooxy-Gruppe mit mindestens zwei Methylen-Gruppen zwischen sich und beiden der Hydroxyl-Gruppen des Nucleosid-Surrogats zu positionieren. Dies kann durch irgendeine Kombination von Methylen-Einheiten in entweder dem Alkyl-Rückgrat oder an der Aminooxy-Seitenkette begleitet werden. So positioniert bilden das Sauerstoffatom des Aminooxy-Restes und die Sauerstoffatome der Hydroxyl-Gruppen keine Strukturen vom Acetaltyp. In anderen Ausführungsformen ist der Aminooxy-Rest mit nur einer Methylen-Gruppe zwischen sich und der einen oder der anderen der Hydroxyl-Gruppen, welche eine Struktur vom Acetaltyp bilden, positioniert.
In erfindungsgemäßen substituierten Nucleosiden schließt eine erste bevorzugte Gruppe von Substituenten 2'-Aminooxyalkyl-Substituenten ein. Eine weiterhin bevorzugte Gruppe von Substituenten schließt alkyliertes Aminooxyalkyl ein, einschließlich Dialkylaminooxyalkyl und Monoalkylaminoalkyl, z.B. Dimethylaminooxyethyl und Ethylaminooxyethyl. Eine zusätzliche -bevorzugte Gruppe von Substituenten schließt Vorläufer- oder blockierte Formen von diesen 2'-O-Aminooxyalkyl-Substituenten ein, einschließlich Phthalimido- und Formaldehyd-Addukte, d.h. Phthalimido-N-oxy- und Formaloximyl-Gruppen.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die einzelnen Nucleoside der erfindungsgemäßen Oligonucleotide über Phosphorverbindungen verbunden. Bevorzugte Phosphorverbindungen schließen Phosphodiester-. Phosphorthioat- und Phosphordithioat-Verbindungen ein. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird den Oligonucleotiden ei ne Nucleaseresistenz durch Verwenden von Internucleosid-Phosphorthioat-Verbindungen verliehen.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können die Nucleoside über Verbindungen zusammengefügt werden, welche die Internucleosid-Phosphat-Verbindung substituieren, z.B. Internucleosid-Substitut-Verbindungen. Makromoleküle von diesem Typ sind als Oligonucleoside identifiziert worden. Der Begriff "Oligonucleosid" bezeichnet daher eine Vielzahl von Nucelosideinheiten, welche durch Nicht-Phosphor-Verbindungen zusammengefügt sind.
Oligonucleotide und Oligonucleoside können zusammengefügt werden, um eine chimäre oligomere Verbindung zu ergeben. Zusätzlich zu der natürlich vorkommenden Phosphodiester-Verbindungsgruppe, sind Phosphor und Nicht-Phosphor enthaltende Verbindungsgruppen, welche verwendet werden können, um erfindungsgemäße Oligonucleotide, Oligonucleoside und oligomere chimäre Verbindungen herzustellen, im Stand der Technik gut dokumentiert und schließen ohne Beschränkung die folgenden ein:
Phosphor-enthaltende Verbindungen

Phosphordithioat (-O-P(S)(S)-O-),
Phosphorthioat (-O-P(S)(O)-O-),
Phosphoramidat (-O-P(O)(NJ)-O-),
Phosphonat (-O-P(J)(O)-O-),
Phosphotriester (-O-P(OJ)(O)-O-),
Phophosphoramidat (-O-P(O)(NJ)-S-),
Thionoalkylphosphonat (-O-P(S)(J)-O-),
Thionoalkylphosphotriester (-O-P(O)(OJ)-S-),
Boranophosphat (-R⁵-P(O)(O)-J-),

Nicht-Phosphor-enthaltende Verbindungen

Thiodiester (-O-C(O)-S-),
Thionocarbamat (-O-C(O)(NJ)-S-),
Siloxan (-O-Si(J)₂-O-),
Carbamat (-O-C(O)-NH- und -NH-C(O)-O-),
Sulfamat (-O-S(O)(O)-N- und -N-S(O)(O)-N-),
Morpholinosulfamid (-O-S(O)(N(Morpholino)-),
Sulfonamid (-O-SO₂-NH-),
Sulfid (-CH₂-S-CH₂-),
Sulfonat (-O-SO₂-CH₂-),
N,N'-Dimethylhydrazin (-CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-),
Thioformacetal (-S-CH₂-O-),
Formacetal (-O-CH₂-O-),
Thioketal (-S-C(J)₂-O-), und
Ketal (-O-C(J)₂-O-),
Amin (-NH-CH₂-CH₂-),
Hydroxylamin (-CH₂-N(J)-O-),
Hydroxylimin (-CH=N-O-), und
Hydrazinyl (-CH₂-N(H)-N(H)-).

J bezeichnet darin eine Substituentengruppe, welche gängigerweise Wasserstoff oder eine Alkyl-Gruppe oder eine kompliziertere Gruppe darstellt, die von einem Typ der Verbindung zur anderen variiert.
Zusätzlich zu den wie oben beschriebenen Verbindungsgruppen, welche die Modifikation oder Substitution der -O-P-O-Atome einer natürlich vorkommenden Verbindung umfassen, sind innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung Verbindungsgruppen eingeschlossen, welche eine Modifikation der 5'-Methylen-Gruppe, sowie eines oder mehrerer der -O-P-O-Atome einschließen. Verbindungen von diesem Typ sind im Stand der Technik gut dokumentiert und schließen ohne Beschränkung die Folgenden ein:
Amide (-CH₂-CH₂-N(H)-C(O)) und -CH₂-O-N=CH-, und
Alkylphosphor (-C(J)₂-P(=O)(OJ)-C(J)₂-C(J)₂-),
wobei J wie oben beschrieben ist.
Synthetische Schemata für die Synthese der oben beschriebenen Internucleosid-Substitut-Verbindungen sind offenbart in:
WO 91/08213 , WO 90/15065 , WO 91/15500 , WO 92/20822 , WO 92/20823 , WO 91/15500 , WO 89/12060 , EP 216860 , US 92/04294 , US 90/03138 , US 91/06855 , US 92/03385 , US 91/03680 , US Patent Nrn. 07/990,848 , 07/892,902 , 07/806,710 , 07/763,130 , 07/690,786 , 5,466,677 , 5,034,506 , 5,124,047 , 5,278,302 , 5,321,131 , 5,519,126 , 4,469,863 , 5,455,233 , 5,214,134 , 5,470,967 , 5,434,257 ; Stirchak, E.P., et al., Nucleic Acid Res., 1989, 17, 6129-6141; Hewitt, J.M., et al., 1992, 11, 1661-1666; Sood, A., et al., J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 9000-9001; Vaseur, J.J., et al., J. Amer. Chem. Soc., 1992, 114, 4006-4007; Musichi, B., et al., J. Org. Chem., 1990, 55, 4231-4233; Reynolds, R.C., et al., J. Org. Chem., 1992, 57, 2983-2985; Mertes, M.P., et al., J. Med. Chem., 1969, 12, 154-157; Mungall, W.S., et al., J. Org. Chem., 1977, 42, 703-706; Stirchak, E.P., et al., J. Org. Chem., 1987, 52, 4202-4206; Coull, J.M., et al., Tet. Lett., 1987, 28, 745; und Wang, H., et al., Tet. Lett., 1991, 32, 7385-7388.
Andere Modifikationen können am Zucker, an der Base oder an der Phosphat-Gruppe des Nucleotids vorgenommen werden. Repräsentative Modifikationen sind in den internationalen Veröffentlichungen Nrn. WO 91/10671 , veröffentlicht am 25. Juli 1991, WO 92/02258 , veröffentlicht am 20. Februar 1992, WO 92/03568 , veröffentlicht am 5. März 1992 und den Vereinigte Staaten Patenten 5,138,045 , 5,218,105 , 5,223,618 , 5,359,044 , 5,378,825 , 5,386,023 , 5,457,191 , 5,459,255 , 5,489,677 , 5,506,351 , 5,541,307 , 5,543,507 , 5,571,902 , 5,578,718 , 5,587,361 , 5,587,469 offenbart.
Das Anheften von Konjugat-Gruppen an Oligonucleotide und Analoge davon ist im Stand der Technik gut dokumentiert. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können Konjugat-Gruppen einschließen, welche kovalent an funktionelle Gruppen gebunden sind, wie primäre oder sekundäre Hydroxyl-Gruppen. Erfindungsgemäße Konjugat-Gruppen schließen Interkalatoren, Reportermoleküle, Polyamine, Po lyamide, Polyethylenglykole, Polyether, Gruppen, welche die pharmakodynamischen Eigenschaften von Oligomeren verstärken und Gruppen, welche die pharmakokinetischen Eigenschaften von Oligomeren verstärken, ein. Typische Konjugat-Gruppen schließen Cholesterine, Phospholipide, Biotin, Phenazin, Phenanthridin, Anthrachinon, Acridin, Fluoresceine, Rhodamine, Cumarine und Farbstoffe ein. Gruppen, welche die pharmakodynamischen Eigenschaften im Zusammenhang mit dieser Erfindung verstärken, schließen Gruppen ein, welche die Oligomer-Aufnahme verbessern, die Oligomer-Resistenz gegenüber Abbau verstärken und/oder eine sequenzspezifische Hybridisierung mit RNA festigen. Gruppen, welche die pharmakokinetischen Eigenschaften im Zusammenhang mit dieser Erfindung verstärken, schließen Gruppen ein, welche die/den Oligomer-Aufnahme, -Verteilung, -Metabolismus oder -Exkretion verbessern. Repräsentative Konjugat-Gruppen werden in der internationalen Patentanmeldung PCT/US92/09196, eingereicht am 23. Oktober 1992, dem Vereinigten Staaten Patent Nr. 5,578,718 , erteilt am 1. Juli 1997 und dem Vereinigten Staaten Patent Nr. 5,218,105 offenbart.
Die Eigenschaften vieler Vitamine machen sie zu guten Konjugat-Gruppen zum Einschluss in erfindungsgemäße Oligonucleotide, Oligonucleoside oder chimäre, oligomere Verbindungen. α-Tocopherol (Vitamin E) und die anderen Tocopherole (Beta bis Zeta) können an Oligonucleotide konjugiert werden, um die Aufnahme aufgrund ihrer lipophilen Eigenschaft zu verstärken. Auch das lipophile Vitamin, Vitamin D, und seine Ergosterolvorläufer können an Oligonucleotide über ihre Hydroxyl-Gruppen konjugiert werden, indem zuerst die Hydroxyl-Gruppen zu, zum Beispiel, Hemisuccinatestern aktiviert werden. Anschließend wird eine Konjugation an eine Aminolinker-Seitengruppe des Oligonucleotids bewirkt. Andere Vitamine, welche an Oligonucleotid-Aminolinker über Hydroxyl-Gruppen an den Vitaminen konjugiert werden können, schließen Thiamin, Riboflavin, Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxal, Desoxypyridoxin ein. Fettlösliche Vitamine K und verwandte Chinon-enthaltende Verbindungen können über Carbonyl-Gruppen am Chinonring konjugiert werden. Der Phytol-Rest des Vitamins K kann auch dazu dienen, die Bindung der Oligonucleotide an Zellen zu verstärken.
Pyridoxal (Vitamin B₆) weist spezifische B₆-Bindungsproteine auf. Die Rolle dieser Proteine beim Pyridoxaltransport wurde von Zhang und McCormick, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 10407, untersucht. Zhang und McCormick haben auch gezeigt, dass eine Reihe von N-(4'-Pyridoxyl)aminen, in welchen mehrere synthetische Amine an die 4'-Position des Pyridoxals konjugiert waren, in der Lage sind, über einen Prozess in Zellen einzudringen, welcher durch den B6-Transporter vereinfacht wird. Sie zeigten auch die Freisetzung von diesen synthetischen Aminen innerhalb der Zelle. Andere Mitglieder der Pyridoxal-Familie schließen Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxalphosphat und Pyridoxinsäure ein. Pyridoxinsäure, Niacin, Pantothensäure, Biotin, Folsäure und Ascorbinsäure können unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimidestern, die mit Aminolinkern reagieren, die auf dem Oligonucleotid liegen, an Oligonucleotide konjugiert werden, wie oben für Retinolsäure beschrieben wurde.
Andere Gruppen zum Modifizieren von Antisense-Eigenschaften schließen RNA-Spaltungskomplexe, Pyrene, Metallchelatoren, Prophyrine, Alkylatoren, hybride Interkalator/Liganden und Photovernetzungsmittel ein. RNA-Spalter schließen o-Phenanthrolin/Cu-Komplexe und Ru(bipyridin)₃ ²⁺-Komplexe ein. Die Ru(bpy)₃ ²⁺-Komplexe interagieren mit Nucleinsäuren und Spalten und Nucleinsäuren photochemisch. Metallchelatoren schließen EDTA, DTPA und o-Phenanthrolin ein. Alkylatoren schließen Verbindungen wie Iodacetamid ein. Porphyrine schließen Porphin, seine substituierten Formen und Metallkomplexe ein. Pyrene schließen Pyren und andere Pyren basierte Carbonsäuren ein, welche unter Verwendung ähnlicher Protokolle konjugiert werden könnten.
Hybride Interkalator/Liganden schließen den Photonuclease/Interkalator-Liganden 6-[[[9-[[6-(4-Nitrobenzamido)hexyl]amino]acridin-4-yl]carbonyl]amino]hexanoylpentafluorphenylester ein. Diese Verbindung zwei erwähnenswerte Eigenschaften: einen Acridin-Rest, der einen Interkalator darstellt, und eine p-Nitrobenzamido-Gruppe, die eine Photonuclease darstellt.
Photovernetzungsmittel schließen Arylazide wie zum Beispiel N-Hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoat (HSAB) und N-Succinimidyl-6(-4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoat (SANPAH) ein. An Oligonucleotide konjugierte Arylazide bewirken eine Vernetzung mit Nucleinsäuren und Proteinen bei Bestrahlung. Sie vernetzen sich auch mit Trägerproteinen (wie KLH oder BSA), was Antikörper gegen die Oligonucleotide erzeugt.
Erfindungsgemäße Vitamine können im Allgemeinen als wasserlöslich oder fettlöslich klassifiziert werden. Wasserlösliche Vitamine schließen Thiamin, Riboflavin, Nicotinsäure oder Niacin, die Vitamin B₆-Pyridoxal-Gruppe, Pantothensäure, Biotin, Folsäure, die B₁₂-Cobamid-Koenzyme, Inositol, Cholin und Ascorbinsäure ein. Fettlösliche Vitamine schließen die Vitamin A-Familie, Vitamin D, die Vitamin E-Tocopherol-Familie und Vitamin K (und Phytole) ein. Die Vitamin A-Familie, einschließlich Retinolsäure und Retinol, wird über ihre Interaktion mit spezifischen Proteinen, wie dem cytosolischen Retinol-Bindungsprotein Typ II (CRBP-II), dem Retinol-Bindungsprotein (RBP) und dem zellulären Retinol-Bindungsprotein (CRBP) absorbiert und zu den Zielgeweben transportiert. Diese Proteine, die in verschiedenen Teilen des menschlichen Körpers gefunden wurden, weisen Molekulargewichte von ungefähr 15 kD auf. Sie weisen spezifische Interaktionen mit Verbindungen der Vitamin A-Familie, insbesondere Retinolsäure und Retinol auf.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung soll "Hybridisierung" eine Wasserstoffbrückenbindung, welche eine Watson-Crick-, Hoogsteen- oder umgekehrte Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindung darstellen kann, zwischen komplementären Nucleotiden bedeuten. Zum Beispiel sind Adenin und Thymin komplementäre Nucleobasen, welche sich über die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen paaren. "Komplementär", so wie hier verwendet, betrifft auch die Sequenz-komplementarität zwischen zwei Nucleotiden. Wenn zum Beispiel ein Nucleotid an einer bestimmten Position eines Oligonucleotids in der Lage zu einer Wasserstoffbrückenbindung mit einem Nucleotid an derselben Position eines DNA- oder RNA-Moleküls ist, dann werden das Oligonucleotid und die DNA oder RNA als komplementär zueinander an dieser Position angesehen. Das Oligonucleotid und die DNA oder RNA sind komplementär zueinander, wenn eine ausreichende Anzahl entsprechender Positionen in jedem Molekül durch Nucleotide besetzt ist, welche miteinander Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden können. Daher stellen "spezifisch hybridisierbar" und "komplementär" Begriffe dar, welche verwendet werden, um auf einen ausreichenden Grad der Komplementarität hinzuweisen, so dass eine stabile und spezifische Bindung zwischen dem Oligonucleotid und dem DNA- oder RNA-Ziel auftritt. Es wird verstanden, dass ein Oligonucleotid nicht 100 % komplementär zu seiner Ziel-DNA-Sequenz sein muss, um spezifisch hybridisierbar zu sein. Ein Oligonucleotid ist spezifisch hybridisierbar, wenn das Binden des Oligonucleotids an das Ziel-DNA- oder -RNA-Molekül die normale Funktion der Ziel-DNA oder -RNA beeinträchtigt, und ein, ausreichender Grad an Komplementarität vorliegt, um ein nicht spezifisches Binden des Oligonucleotids an Nicht-Ziel-Sequenzen unter Bedingungen zu verhindern, bei welchen spezifisches Binden erwünscht ist, d.h. unter physiologischen Bedingungen im Fall von in vivo Assays oder therapeutischer Behandlung oder, im Fall von in vitro Assays, unter Bedingungen, bei welchen die Assays durchgeführt werden.
Eine Spaltung von Oligonucleotiden durch nucleolytische Enzyme erfordert die Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes oder im Besonderen eines Nuclease-Oligonucleotid-Komplexes. Die Nucleaseenzyme werden im Allgemeinen spezifische Bindungsstellen für eine geeignete Anheftung benötigen, welche auf den Oligonucleotiden liegen. Wenn die Oligonucleotid-Bindungsstellen entfernt oder blockiert werden, so dass die Nucleasen nicht in der Lage sind, sich an die Oligonucleotide anzuheften, werden die Oligonucleotide Nuclease-resistent. Im Fall von Restriktionsendonucleasen, welche palindrome doppelsträngige DNA sequenzspezifisch spalten, wurden bestimmte Bindungsstellen, wie der Ringstickstoff in den Positionen 3 und 7 als nötige Bindungsstellen identifiziert. Eine Entfernung von einer oder mehreren dieser Stellen oder ein sterischer Blockierungsansatz der Nuclease für diese besonderen Positionen innerhalb des Oligonucleotids hat verschiedene Grade der Resistenz gegenüber spezifischen Nucleasen bereitgestellt.
Diese Erfindung stellt Oligonucleotide bereit, welche bessere Hybridisierungseigenschaften besitzen. Untersuchungen zum Struktur-Aktivitätsverhältnis haben gezeigt, dass ein Anstieg des Bindens (T_m) bestimmter 2'-Zucker-modifizierter Oligonucleotide an ein RNA-Ziel (Komplement) mit einer verstärkten "A"-Typ-Konformation des Heterodoppelstrangs korreliert. Darüber hinaus wird die absolute Genauigkeit der modifizierten Oligonucleotide beibehalten. Ein verstärktes Binden von erfindungsgemäßen 2'-Zucker-modifizierten sequenzspezifischen Oligonucleotiden stellt eine bessere Wirksamkeit und Spezifität verglichen mit Phosphor-modifizierten Oligonucleotiden, wie Methylphosphonaten, Phosphattriestern und Phosphoramidaten, wie sie aus der Literatur bekannt sind, bereit.
Der einzige strukturelle Unterschied zwischen DNA- und RNA-Doppelsträngen stellt ein Wasserstoffatom an der 2'-Position des Zucker-Restes eines DNA-Moleküls dar, im Vergleich zu einer Hydroxyl-Gruppe an der 2'-Postion des Zucker-Restes eines RNA-Moleküls (angenommen, dass die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Methyl-Gruppe im Uracil-Ringsysteme keine Wirkung zeigt). Es gibt jedoch allgemeine Konformationsunterschiede zwischen DNA- und RNA-Doppelsträngen.
Es ist aus der Röntgenbeugungsanalyse von Nucleinsäurefasern (Arnott und Hukins, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1970, 47, 1504) und der Analyse von Kristallen von doppelsträngigen Nucleinsäuren bekannt, dass DNA eine Struktur einer "B"-Form annimmt und RNA eine starrere Struktur einer "A"-Form annimmt. Der Unterschied zwischen der Zucker-Faltung bzw. des Puckering (C2'-Endo für "B"-Form DNA und C3'-Endo für "A"-Form RNA) der Nucleoside von DNA und RNA ist der Hauptkonformationsunterschied zwischen doppelsträngigen Nucleinsäuren.
Der Hauptbeitragende zur Konformation des Pentofuranosyl-Restes ist die Natur des Substituenten an der 2'-Position. Daher steigt die Population der C3'-Endo-Form im Vergleich zu der C2'-Endo-Form an, wenn die Elektronegativität des 21 Substituenten ansteigt. Zum Beispiel weist unter den 2'-Desoxy-2'-halogenadenosinen das 2'-Fluor-Derivat die größte Population (65 %) der C3'- Endo-Form auf, und das 2'-Iod weist die niedrigste Population (7 %) auf. Jene von Adenosin (2'-OH) und Desoxyadenosin (2'-H) betragen jeweils 36 % und 19 %. Weiterhin ist die Wirkung der 2'-Fluor-Gruppe der Adenosin-Dimere (2'-Desoxy-2'-fluoradenosin-2'-desoxy-2'-fluoradenosin) weiter mit der Stabilisierung der gestapelten Konformation korreliert. Die Forschung weist darauf hin, dass Dinucleosidphosphate eine gestapelte Konformation mit einer Geometrie aufweisen, welche ähnlich zu der von A-A ist, aber mit einem größeren Ausmaß der Base-Base-Überlappung als bei A-A. Es wird angenommen, dass die hochpolare Natur der C2'-F-Bindung und die außergewöhnliche Bevorzugung für eine C3'-Endo-Faltung die gestapelte Konformation in einer "A"-Struktur stabilisieren kann.
Daten aus UV-Hypochromizität, zirkulärem Dichroismus und ¹H NMR weisen auch darauf hin, dass der Grad der Stapelung abnimmt, wenn die Elektronegativität des Halogensubstituenten abnimmt. Weiterhin wird sterisches Volumen an der 21 Position des Zucker-Restes in einem "A"-Form-Doppelstrang besser angepasst als in einem "B"-Form-Doppelstrang.
Daher wird für einen 2'-Substituenten an der 3'-Nucleotidyl-Einheit eines Dinucleosidmonophosphats angenommen, dass es eine Anzahl von Wirkungen auf die Stapelkonformation ausübt: sterische Abstoßung, Bevorzugung der Furanosefaltung, elektrostatische Abstoßung, hydrophobe Anziehung und Wasserstoffbrückenbindungsfähigkeiten. Von diesen Substituentenwirkungen wird angenommen, dass sie durch die Molekulargröße, Elektronegativität und Hydrophobizität des Substituenten bestimmt werden.
Untersuchungen mit einer 2'-OMe-Modifikation von 2'-Desoxyguanosin, -cytidin und -uridindinucleosidphosphaten zeigen verstärkte Stapelwirkungen im Vergleich zu den entsprechenden unmethylierten Arten (2'-OH). In diesem Fall scheinen die hydrophoben Anziehungskräfte der Methylgruppe die destabilisierenden Wirkungen ihres sterischen Volumens zu überwinden.
Die Schmelztemperaturen (komplementäre Bindung) sind bei den 2'-substituierten Adenosindiphosphaten erhöht. Es ist nicht klar, ob die 3'-Endo-Bevorzugung der Konformation oder die Anwesenheit des Substituenten für die verstärkte Bindung verantwortlich ist. Eine größere Überlappung benachbarter Basen (Stapelung) kann jedoch mit der 3'-Endo-Konformation erreicht werden.
Obwohl wir nicht wünschen, durch eine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass die erfindungsgemäßen Aminooxyalkyl-Substituenten auch dazu führen, dass die Zuckerfaltung des Nucleosids eine C3'-Endo-Faltung darstellt.
Erfindungsgemäße Verbindungen können als Diagnostika, Therapeutika und als Forschungsreagenzien und Kits verwendet werden. Sie können in pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Hinzufügen einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Oligonucleotids zu einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Träger verwendet werden. Sie können weiterhin zum Behandeln von Organismen verwendet werden, welche eine Erkrankung aufweisen, die durch die unerwünschte Herstellung eines Proteins gekennzeichnet ist. Der Organismus kann mit einem erfindungsgemäßen Oligonucleotid in Kontakt gebracht werden, welches eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch mit einem Strang einer Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, welche das unerwünschte Protein kodiert.
Für die Formulierung von therapeutischen Zusammensetzungen und ihrer nachfolgenden Verabreichung wird angenommen, dass sie innerhalb der Fähigkeit des Fachmanns liegen. Für Therapeutika wird einem Patienten, welcher eine solche Therapie benötigt, in Allgemeinen ein erfindungsgemäßes Oligomer verabreicht, gängigerweise in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, in Dosen, welche von 0,01 μg bis 100 g pro kg Körpergewicht reichen, abhängig vom Alter des Patienten und der Schwere des zu behandelnden Krankheitszustandes. Weiterhin kann die Behandlung eine Einzeldosis darstellen oder kann einen Plan darstellen, welcher für einen Zeitraum andauert, welcher abhängig von der Natur der besonderen Erkrankung, seiner Schwere und dem Gesamtzustand des Patienten variie ren wird, und kann von einmal täglich bis einmal alle 20 Jahre reichen. Der Behandlung folgend wird der Patient auf Änderungen in seinem/ihrem Zustand und auf eine Linderung der Symptome des Krankheitszustandes überwacht. Die Dosierung des Oligomers kann entweder erhöht werden, im Fall, dass der Patient nicht wesentlich auf die aktuellen Dosierungsmengen anspricht, oder die Dosis kann vermindert werden, wenn eine Linderung der Symptome des Krankheitszustandes beobachtet wird, oder wenn der Krankheitszustand abgenommen hat.
In einigen Fällen kann es wirksamer sein, einen Patienten mit einem erfindungsgemäßen Oligomer in Verbindung mit anderen traditionellen therapeutischen Modalitäten zu behandeln. Zum Beispiel kann einem Patienten, welcher gegen AIDS behandelt wird, ein Oligomer zusammen mit AZT verabreicht werden, oder ein Patient mit Arteriosklerose kann mit einem erfindungsgemäßen Oligomer nach einer Angioplastie behandelt werden, um einen Wiederverschluss der behandelten Arterien zu verhindern.
Die Dosierung ist abhängig von der Schwere und Empfindlichkeit des zu behandelnden Krankheitszustandes, wobei der Verlauf der Behandlung von mehreren Tagen bis zu mehreren Monaten reichen kann, oder bis eine Heilung bewirkt wird oder eine Verminderung des Krankheitszustandes erreicht wird. Optimale Dosierungspläne können aus Messungen der Arzneimittelakkumulation im Körper des Patienten berechnet werden. Der Fachmann kann einfach optimale Dosierungen, Dosierungsmethodiken und Wiederholungsraten bestimmen. Optimale Dosierungen können abhängig von der relativen Wirksamkeit einzelner Oligomere variieren, und können im Allgemeinen basierend auf EC₅₀ abgeschätzt werden, für welche gefunden wurde, dass sie in Tiermodellen in vitro und in vivo wirksam sind. Im Allgemeinen beträgt die Dosierung von 0,01 μg bis 100 g pro kg Körpergewicht und kann einmal oder mehrmals täglich, wöchentlich, monatlich oder jährlich oder sogar einmal alle 2 bis mehrere Jahre gegeben werden.
Einer erfolgreichen Behandlung folgend kann es wünschenswert sein, dass der Patient eine Nachsorgetherapie durchläuft, um das Wiederauftreten des Krank heitszustandes zu verhindern, wobei das Oligomer in Nachsorgedosen verabreicht wird, welche von 0,01 μg bis 100 g pro kg Körpergewicht reichen, einmal oder mehrmals täglich bis einmal in mehreren Jahren.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einer Anzahl von Wegen verabreicht werden, abhängig davon, ob eine lokale oder systemische Behandlung gewünscht wird und von dem zu behandelnden Gebiet. Eine Verabreichung kann topisch (einschließlich ophthalmisch, vaginal, rektal, intranasal, transdermal), oral oder parenteral sein. Eine parenterale Verabreichung schließt einen intravenösen Tropf, subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion oder intrathekale oder intraventrikuläre Verabreichung ein.
Formulierungen zur topischen Verabreichung können transdermale Pflaster, Salben, Lotionen, Cremes, Gele, Tropfen, Zäpfchen, Sprays, Flüssigkeiten und Pulver einschließen. Gängige pharmazeutische Träger, wässrige, Pulver- oder ölige Grundlagen, Verdickungsmittel und desgleichen können nötig oder wünschenswert sein. Beschichtete Kondome, Handschuhe und desgleichen können auch geeignet sein.
Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung schließen Pulver oder Granula, Suspensionen oder Lösungen in Wasser oder nichtwässrigen Medien, Kapseln, Portionspackungen oder Tabletten ein. Verdickungsmittel, Aromastoffe, Verdünnungsmittel, Emulgatoren, Dispersionsmittel oder Bindemittel können wünschenswert sein.
Zusammensetzungen zur intrathekalen oder intraventrikulären Verabreichung können sterile wässrige Lösungen einschließen, welche auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Zusatzstoffe enthalten können.
Formulierungen zur parenteralen Verabreichung können sterile wässrige Lösungen einschließen, welche auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Zusatzstoffe enthalten können.
Die vorliegende Erfindung kann in einer Vielzahl von Organismen angewendet werden, von einzelligen prokaryotischen und eukaryotischen Organismen bis zu vielzelligen eukaryotischen Organismen reichend. Jeder Organismus, welcher DNA-RNA-Transkription oder RNA-Protein-Translation als grundlegenden Teil seines Vererbungs-, metabolischen oder zellulären Mechanismus verwendet, ist für eine solche therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung empfänglich. Scheinbar unterschiedliche Organismen, wie Bakterien, Hefe, Protozoen, Algen, Pflanzen und höhere Tierformen, einschließlich warmblütigen Tieren, können in dieser Weise behandelt werden. Da weiterhin jede der Zellen von vielzelligen Eukaryoten auch sowohl DNA-RNA-Transkription, als auch RNA-Protein-Translation als einen integralen Teil ihrer zellulären Aktivität einschließt, können solche Therapeutika und/oder Diagnostika auch für solche zellulären Populationen angewendet werden. Weiterhin schließen auch viele der Organellen, z.B. Mitochondrien und Chloroplasten, der eukaryotischen Zellen Transkriptions- und Translationsmechanismen ein. Als solche können Einzelzellen, zelluläre Populationen oder Organellen auch in die Definition von Organismen eingeschlossen werden, welche in der Lage sind, mit den therapeutischen oder diagnostischen erfindungsgemäßen Oligonucleotiden behandelt zu werden. So wie hier verwendet, bedeutet Therapeutika, dass sowohl die Ausrottung eines Krankheitszustands, das Töten eines Organismus, z.B. einer bakteriellen, Protozoen- oder einer anderen Infektion, oder die Kontrolle von abweichendem/r oder unerwünschtem/r zellulären Wachstum oder Expression eingeschlossen sind.
2'-substituierte Oligonucleotide wurden durch eine Standard-Festphasen-Nucleinsäuresynthese unter Verwendung eines automatisierten Syntheseautomaten, wie Modell 380B (Perkin-Elmer/Applied Biosystems) oder MilliGen/Biosearch 7500 oder 8800 synthetisiert. Triester, Phosphoramidit oder Wasserstoffphosphonat-Kopplungschemien (Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression. M. Caruthers, S. 7, J.S. Cohen (Hrsg.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1989) werden bei diesen Syntheseautomaten verwendet, um die gewünschten Oligonucleotide bereitzustellen. Das Beaucage-Reagens (J. Amer. Chem. Soc., 1990, 112, 1253) oder elementarer Schwefel (Beaucage et al., Tet. Lett., 1981, 22, 1859) werden bei Phosphoramidit- oder Wasserstoffphosphonat-Chemien verwendet, um 2'-substituierte Phosphorthioat-Oligonucleotide bereitzustellen.
Die benötigten 2'-substituierten Nucleoside (A, G, C, T(U) und andere modifizierte Nucleobasen) werden hergestellt, wobei wie unten beschriebene Verfahren verwendet werden.
Neben einer anderen Verwendung sind die erfindungsgemäßen Oligonucleotide für ein ras-Luciferase Fusionssystem geeignet, welches eine ras-Luciferase Transaktivierung verwendet. Wie in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 92/22651 , veröffentlicht am 23. Dezember 1992 und in den Vereinigte Staaten Patenten 5,582,972 und 5,582,986 beschrieben, stellen die ras-Oncogene Mitglieder einer Genfamilie dar, welche verwandte Proteine kodieren, die auf der Innenseite der Plasmamembran lokalisiert sind. Für ras-Proteine wurde gezeigt, dass sie auf der Aminosäureebene hochkonserviert sind, dass sie GTP mit hoher Affinität und Spezifität binden und dass sie GTPase-Aktivität besitzen. Obwohl die zelluläre Funktion der ras-Genprodukte unbekannt ist, legen ihre biochemischen Eigenschaften, zusammen mit ihrer erheblichen Sequenzhomologie mit einer Klasse von Signal-transduzierenden Proteinen, welche als GTP-bindende Proteine oder G-Proteine bekannt sind, nahe, dass die ras-Genprodukte eine grundlegende Rolle bei grundlegenden zellulären regulatorischen Funktionen spielen, welche in Beziehung zur Transduktion extrazellulärer Signale durch die Plasmamembranen stehen.
Drei ras-Gene, als H-ras, K-ras und N-ras bezeichnet, wurden im Säugetiergenom identifiziert. Säugetier-ras-Gene erhalten transformationsinduzierende Eigenschaften durch einzelne Punktmutationen in ihren kodierenden Sequenzen. Mutationen in natürlich vorkommenden ras-Oncogenen wurden auf den Codons 12, 13 und 61 lokalisiert. Die am häufigsten nachgewiesene aktivierende ras-Mutation, welche in menschlichen Tumoren gefunden wird, liegt in Codon 12 des H-ras-Gens, in welchem ein Basenaustausch von GGC in GTC zu einer Glycin-zu-Valin-Substitution in der regulatorischen Domäne der GTPase des ras-Proteinprodukts führt. Für diesen einzelnen Aminosäureaustausch wird angenommen, dass er die normale Kontrolle der ras-Proteinfunktion aufhebt, wodurch ein normal reguliertes Zellprotein in eines umgewandelt wird, das kontinuierlich aktiv ist. Es wird angenommen, dass eine solche Deregulation der normalen ras-Proteinfunktion für die Transformation von normalem zu bösartigem Wachstum verantwortlich ist.
Zusätzlich zur Modulation des ras-Gens, können die erfindungsgemäßen Oligonucleotide, welche spezifisch mit anderen Nucleinsäuren hybridisierbar sind, verwendet werden, um die Expression von solchen anderen Nucleinsäuren zu modulieren. Beispiele schließen das raf-Gen ein, ein natürlicherweise anwesendes zelluläres Gen, welches sich gelegentlich in eine aktivierte Form umwandelt, die mit unnormaler Zellproliferation und Tumorbildung in Verbindung gebracht wurde. Andere Beispiele schließen jene ein, welche mit Proteinkinase C (PKC) in Verbindung stehen, für welche gefunden wurde, dass sie die Expression von PKC modulieren, jene, welche mit Zelladhäsionsmolekülen, wie ICAM in Beziehung stehen, jene, welche mit dem Multi-Drug-Resistenz verbundenen Protein in Beziehung stehen und virale genomische Nucleinsäuren, einschließlich HIV, Herpesviren, Epstein-Barr-Virus, Cytomegalovirus, Papillomavirus, Hepatitis C-Virus und Influenzavirus (siehe die Vereinigten Staaten Patente 5,166,195 , 5,242,906 , 5,248,670 , 5,442,049 , 5,457,189 , 5,510,476 , 5,510,239 , 5,514,577 , 5,514,786 , 5,514,788 , 5,523,389 , 5,530,389 , 5,563,255 , 5,576,302 , 5,576,902 , 5,576,208 , 5,580,767 , 5,582,972 , 5,582,986 , 5,591,720 , 5,591,600 und 5,591,623 ).
BEISPIELE
Allgemeines
Alle Reagenzien und Lösungsmittel wurden von Aldrich Chemicals bezogen, wenn es nicht anders angegeben ist. NMR-Spektren wurden mit den folgenden Geräten erhalten: ¹H-NMR: Varian Gemini-200 (199,975 MHz) oder Varian Unity 400 (399,952 MHz). ¹³C-NMR: Varian Gemini-200 (50,289 MHz). ³¹P-NMR: Varian Gemini-200 (79,990 MHz) oder Varian Unity 400 (159,981 MHz). NMR-Spektren wurden unter Verwendung von entweder Deuteriochloroform oder Dimethylsulfoxid-d₆ als Lösungsmittel aufgenommen (Tetramethylsilan oder Phosphorsäure interner Standard). Die folgenden Abkürzungen wurden verwendet, um die Multiplizität der einzelnen Signale zu bezeichnen: s = Singlet, d = Doublet, t = Triplet, q = Quartet, m = Multiplet, d = Doublet aus Doublets, br s = breites Singlet. Massenspektren wurden mit einem VG 70-SEQ-Gerät (VG Analytical (Fisons)) erhalten, wobei eine Schnell-Atom-Beschussionisierung verwendet wurde (7 kV Xe-Atome). Lösungsmittelverhältnisse für die Säulenchromatographie sind als Volumen/Volumen angegeben. Verdampfungen der Lösungsmittel wurden in vacuo (60 Torr) bei 35°C durchgeführt, wenn es nicht anders angegeben ist.
BEISPIEL 1
Methyl-2-O-(2-ethylacetyl)-3,5-bis-O-(2,4-dichlorbenzyl)-α-D-ribofuranosid (3, 1)
Die Verbindung 2 (1) (Multigrammmengen von 2 wurden aus 1 über das Verfahren aus der Literatur hergestellt, Martin, P. Helv. Chem. Acta, 1995, 78, 486-504) wurde in DMF (86 ml) unter Abkühlen auf 5°C gelöst, und NaH (60 % Dispersion, 1,38 g, 34,38 mmol) wurde hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 5°C für 5 Minuten gerührt, anschließend auf Umgebungstemperatur erwärmt und für 20 Minuten gerührt, wonach das Reaktionsgemisch auf 5°C abgekühlt wurde, und Ethylbromacetat (3,81 ml, 34,4 mmol) wurde tropfenweise hinzugefügt, was zu einer Gasentwicklung führte. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur erwärmt und für 3 Stunden gerührt, wonach das Gemisch auf 5°C abgekühlt wurde, und der pH-Wert wurde auf 3 mit gesättigtem, wässrigem NH₄Cl eingestellt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft, um einen Sirup zu ergeben, welcher in EtOAc (200 ml) gelöst wurde, mit Wasser und anschließend mit Salzlösung gewaschen wurde. Die organische Schicht wurde getrennt, mit MgSO₄ getrocknet, und das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft, um ein Öl zu ergeben. Das Öl wurde durch eine Flash-Chromatographie unter Verwendung von He xanen-EtOAc, 60:40, gereinigt, um die Titelverbindung (3) als ein Öl (15,52 g, 95 %) zu ergeben. ¹H NMR (CDCl₃): δ 7,58-7,18 (m, 6H), 5,05 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 4,79 (q, J_AB = 13,7 Hz, 2H), 4,57 (d, J = 2,8 Hz, 2H), 4,31-4,16 (m, 5H), 4,03 (m, 2H), 3,62 (d, 2H), 3,50 (s, 3H), 1,28 (t, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃): δ 170,0, 134,2, 133,6, 133,5, 130,3, 129,8, 129,1, 128,8, 127,1, 102,1, 81,4, 78,9, 76,6, 70,6, 70,0, 69,3, 67,6, 61,0, 55,6, 14,2. Anal. berechnet für C₂₄H₂₆Cl₄O₇·H₂O: C, 49,17; H, 4,81. Gefunden: C, 49,33; H, 4,31.
Beispiel 2
1-[2'-O-(2-ethylacetyl)-3',5'-bis-O-(2,4-dichlorbenzyl)-β-D-ribofuranosyl]thymin (4, 1)
Thymin (6,90 g, 54,6 mmol) wurde in wasserfreiem Dichlorethan (136 ml) suspendiert, und bis-Trimethylsilylacetamid (40,5 ml, 164 mmol) wurde hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 10 Minuten auf Rückflusstemperatur erhitzt, um eine Auflösung zu ergeben. Nach einem Abkühlen auf Umgebungstemperatur wurde die Lösung unter Rühren zu Verbindung 3 hinzugefügt. Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (6,86 ml, 35,5 mmol) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde für 6 Stunden auf Rückflusstemperatur erhitzt. Das Gemisch wurde auf 5°C abgekühlt, und der pH-Wert wurde auf 7 durch das langsame Hinzufügen von gesättigtem NaHCO₃ eingestellt. Das Gemisch wurde mit CH₂Cl₂ (3 × 150 ml) extrahiert, und die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, und das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft, um ein Öl zu ergeben. Das Öl wurde in CH₂Cl₂ gelöst und durch eine Flash-Chromatographie unter Verwendung von Hexanen-EtOAc, 45:55, gereinigt, um die Titelverbindung (4) als ein Öl (7,92 g, 44 %) bereitzustellen. (Das α-Anomer war in einer späteren Fraktion enthalten). ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8,25 (s, 1H), 7,67 (s, 1H), 7,46-7,21 (m, 6H), 5,94 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 4,80 (q, J_AB = 12,4 Hz, 2H), 4,70-4,18 (m, 9H), 4,02 (d, 1H), 3,75 (d, 1H), 1,58 (s, 3H), 1,26 (t, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃): δ 170,1, 164,3, 150,3, 135,5, 134,5, 134,2, 134,1, 133,8, 133,5, 130,7, 130,2, 129,4, 129,0, 127,1, 110,3, 88,4, 80,8, 80,5, 74,7, 70,1, 68,9, 68,0, 66,2, 60,9, 14,1, 12,1. Anal. be rechnet für C₂₈H₂₈Cl₄N₂O₈·H₂O: C, 49,43; H, 4,44; N, 4,12. Gefunden: C, 49,25; H, 4,10; N, 3,94.
BEISPIEL 3
1-[2'-O-(2-Hydroxyethyl-3',5'-bis-O-(2,4-dichlorbenzyl)-β-D-ribofuranosyl]thymin (5, 1)
Die Verbindung 4 (9,92 g, 15,0 mmol) wurde in heißem EtOH (150 ml) gelöst, und die Lösung wurde auf Umgebungstemperatur in einem Wasserbad abgekühlt. Zu der Lösung wurde über 10 Minuten vorsichtig NaBH₄ (1,13 g, 30,0 mmol) hinzugefügt. Nach 3 Stunden wurde zusätzliches NaBH₄ (282 mg, 7,45 mmol) hinzugefügt, das Gemisch wurde für 1 Stunde gerührt und für 8 Stunden stehen gelassen. Der pH-Wert wurde durch das Hinzufügen von gesättigtem NH₄Cl (25 ml) auf 4 eingestellt, um ein Gummi zu ergeben. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und in vacuo verdampft, um einen weißen Feststoff zu liefern, welcher in CH₂Cl₂ (250 ml) gelöst wurde. Das Gummi wurde mit gesättigtem wässrigen NaHCO₃ gelöst, und diese Lösung wurde behutsam mit dem CH₃Cl₂, welches das Produkt enthielt, extrahiert. Die organische Schicht wurde getrennt, und die wässrige Schicht wurde wieder mit CH₂Cl₂ (2 × 50 ml) extrahiert. Nach dem Vereinigen der organischen Schichten wurde das Lösungsmittel über MgSO₄ getrocknet und in vacuo verdampft, um einen weißen Schaum zu liefern. Der Schaum wurde in CH₂Cl₂ gelöst und durch eine Flash-Chromatographie unter Verwendung von Hexanen-EtOAc, 20:80, gereinigt, um die Titelverbindung (5) als einen weißen Schaum (8,39 g, 90 %) zu ergeben. ¹H NMR (CDCl₃): δ 10,18 (s, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,39-7,20 (m, 6H), 5,96 (s, 1H), 4,76-3,62 (m, 14H), 1,58 (s, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃): δ 164,0, 150,8, 135,2, 134,6, 134,2, 134,1, 133,5, 133,4, 130,2, 129,4, 129,0, 127,1, 110,6, 88,6, 81,0, 80,7, 75,2, 72,0, 70,1, 68,9, 68,1, 61,9, 12,1.
BEISPIEL 4
1-[2'-O-(2-Phthalimido-N-hydroxyethyl)-3',5'-bis-O-(2,4-dichlorbenzyl)-β-D-ribofuranosyl]thymin (6, 1)
Die Verbindung 5 wurde durch Verdampfen zusammen mit wasserfreiem Acetonitril, gefolgt von weiterem Trocknen in vacuo (0,1 Torr) bei Umgebungstemperatur für 12 h getrocknet. Das getrocknete Material (8,39 g, 13,53 mmol) wurde in frisch destilliertem THF (97 ml), PPh₃ (3,90 g, 14,9 mmol) gelöst, und N-Hydroxyphthalimid (2,43 g, 14,9 mmol) wurde hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde auf –78°C abgekühlt, und Diethylazodicarboxylat (2,34 ml, 14,9 mmol) wurde hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur erwärmt, und das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft, um einen Schaum zu ergeben. Der Schaum wurde in EtOAc (100 ml) gelöst und mit gesättigtem wässrigen NaHCO₃ (3 × 30 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrennt, mit Salzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, und das Lösungsmittel wurde verdampft, um einen Schaum zu ergeben. Der Schaum wurde durch eine Flash-Chromatographie unter Verwendung von CH₂Cl₂-Aceton, 85:15, gereinigt, um die Titelverbindung (6) als einen weißen Schaum (3,22 g, 31 %) zu ergeben. Eine zweite chromatographische Reinigung stellte zusätzlich 6 als einen weißen Schaum (5,18 g, 50 %) bereit. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9,0 (s, 1H), 7,8 (m, 11H), 5,95 (s, 1H), 4,84-3,70 (m, 13H), 1,60 (s, 3H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 163,7, 163,5, 150,2, 138,0, 135,6, 134,5, 134,1, 134,0, 133,9, 133,7, 133,6, 130,6, 130,4, 130,1, 129,8, 129,4, 129,1, 129,0, 128,8, 127,2, 123,5, 110,4, 88,2, 81,0, 80,9, 77,6, 75,4, 70,2, 68,9, 68,4, 68,1, 12,1. LRMS (FAB+) m/z: 766 (M + H). LRMS (FAB–) m/z: 764 (M – H).
BEISPIEL 5
1-[2'-O-(2-Phthalimido-N-oxyethyl)-3',5'-bis-O-(2,4-dichlorbenzyl)-β-D-ribofuranosyl]thymin (7, 2)
Die Verbindung 6 (1,79 g, 2,34 mmol) wurde in CH₂Cl₂ (12 ml) gelöst, die Lösung wurde auf –78°C abgekühlt, und 1,0 M Bortrichlorid (5,15 ml, 5,15 mmol) in CH₂Cl₂ wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei 5°C für 1,5 Stunden gehalten. Zusätzliches 1,0 M Bortrichlorid (5,15 ml, 5,15 mmol) in CH₂Cl₂ wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde bei 5° für weitere 1,5 Stunden gerührt. Der pH-Wert wurde mit gesättigtem wässrigen NaHCO₃ (30 ml) auf 7 eingestellt. Nach einer Verdünnung mit CH₂Cl₂ (100 ml) wurde die organische Schicht getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit CHCl₃ (5 × 25 ml) und anschließend EtOAc (3 × 25 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, über Na₂SO₄ getrocknet und in vacuo verdampft, um ein Öl zu ergeben. Das Öl wurde durch eine Flash-Chromatographie unter Verwendung von CH₂Cl₂-Aceton, 45:55, gereinigt, um die Titelverbindung (7) als einen weißen Schaum (619 mg, 59 %) bereitzustellen. ¹H NMR (CDCl₃): δ 8,8 (br, 1H), 7,88-7,75 (m, 4H), 7,50 (s, 1H), 5,70 (d, J = 4 Hz, 1H), 4,45-3,75 (m, 11H), 2,95 (br, 1H), 1,90 (s, 3H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 164,3, 163,7, 150,6, 137,4, 134,7, 128,5, 123,6, 110,5, 89,7, 84,7, 81,9, 77,6, 68,5, 68,4, 61,0, 12,3. LRMS (FAB+) m/z: 448 (M + H). LRMS (FAB–) m/z: 446 (M – H).
BEISPIEL 6
1-[2'-O-(2-Phthalimido-N-oxyethyl)-5'-O-(4,4'dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl]thymin (8, 2)
Die Verbindung 7 wurde durch Verdampfen zusammen mit wasserfreiem Acetonitril getrocknet, gefolgt von weiterem Trocknen in vacuo (0,1 Torr) bei Umgebungstemperatur für 12 Stunden. Das getrocknete Material (619 mg, 1,38 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (7 ml) gelöst, und 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (514 mg, 1,52 mmol) wurde hinzugefügt. Nach 2 Stunden wurde zusätzliches 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (257 mg, 0,76 mmol) hinzugefügt. Die Lösung wurde für 2 Stunden gerührt, und ein abschließendes Hinzufügen von 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (257 mg, 0,76 mmol) wurde vorgenommen. Nach 12 h wurde MeOH (10 ml) zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, es wurde für 10 min gerührt, und das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft, um ein Öl zu ergeben, welches zusammen mit Toluol verdampft wurde. Das Öl wurde durch eine Flash- Chromatographie durch Vorbehandeln der Kieselsäure mit CH₂Cl₂-Aceton-Pyridin, 80:20:1, anschließend durch Verwenden von CH₂Cl₂-Aceton, 80:20, gereinigt, um die Titelverbindung (8) als einen gelben Feststoff (704 mg, 68 %) zu liefern. ¹H NMR (CDCl₃): δ 7,8-6,8 (m, 18H), 5,94 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 4,57-4,12 (m, 7H), 3,78 (s, 6H), 3,53 (m, 2H), 1,34 (s, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃): δ 164,3, 163,8, 158,6, 150,6, 144,4, 135,5, 135,4, 134,7, 130,1, 128,7, 128,2, 128,0, 127,1, 123,7, 113,3, 110,9, 87,9, 86,7, 83,2, 68,7, 68,5, 61,7, 55,2, 11,9. LRMS (FAB+) m/z: 750 (M + H). LRMS (FAB–) m/z: 748 (M – H). Anal. berechnet für C₄₁H₃₉N₃O₁₁·H₂O: C, 65,14; H, 5,38; N, 5,47. Gefunden: C, 63,85; H, 5,16; N, 5,14. Anal. berechnet für C₄₁H₃₉N₃O₁₁: C, 65,68; H, 5,24; N, 5,60. Gefunden: C, 65,23; H, 5,27; N 5,45.
BEISPIEL 7
1-[2'-O-(2-Phthalimido-N-oxyethyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl]thymin-3'-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] (9, 2)
Die Verbindung 8 wurde durch Verdampfen zusammen mit wasserfreiem Pyridin (2 × 20 ml) getrocknet, anschließend weiterhin in vacuo (0,1 Torr) bei Umgebungstemperatur für 12 Stunden getrocknet. Das getrocknete Material (704 mg, 0,939 mmol) wurde in CH₂Cl₂ (9 ml), Diisopropylamintetrazolid (80,4 mg, 0,47 mmol) und 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (0,33 ml, 1,03 mmol) unter Rühren gelöst. Nach 2 Stunden bei Umgebungstemperatur wurde zusätzliches 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (0,33 ml, 1,03 mmol) hinzugefügt, und die Lösung wurde für 20 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft, um ein Öl zu ergeben, welches durch eine Flash-Chromatographie durch Vorbehandeln der Kieselsäure mit CH₂Cl₂-Aceton-Pyridin, 85:15:1, anschließend durch Verwenden von CH₂Cl₂-Aceton, 85:15, gereinigt, um die Titelverbindung (9) als ein Öl (704 mg, 68 %) zu liefern. Das Produkt wurde zusammen mit wasserfreiem Acetonitril (2 × 30 ml) und CH₂Cl₂ (2 × 30 ml) verdampft, um einen gelben Schaum zu liefern. ¹H NMR (CDCl₃): δ 8,6 (br, 1H), 7,78-6,82 (m, 18H), 6,06 (m, 1H), 4,6-3,3 (m, 14H), 3,75 (s, 6H), 2,66 (m, 1H), 2,37 (m, 1H), 1,36 (s, 3H), 1,16 (m, 12H). ³¹P NMR (CDCl₃): δ 150,5, 151,2. LRMS (FAB+) m/z: 950 (M + H). LRMS (FAB–) m/z: 948 (M – H). Anal. berechnet für C₅₀H₅₆N₅O₁₂P·H₂O: C, 62,04; H, 6,04; N, 7,24. Gefunden: C, 62,20; H, 5,94; N, 7,34.
BEISPIEL 8
2'-O-(2-Ethylacetyl)-3',5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)adenosin (11, 3)
Adenosin (30,00 g, 112 mmol) wurde in heißem wasserfreien DMF (600 ml) gelöst, und die Lösung wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt. NaH (60 % Dispersionsöl, 4,94 g, 124 mmol) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde mit einem mechanischen Rührgerät für 1 Stunde gerührt. Die sich ergebende Suspension wurde auf 5°C abgekühlt, und Ethylbromacetat (13,7 ml, 124 mmol) wurde hinzugefügt. Die sich ergebende Lösung wurde für 12 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, und das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft, um einen Rest zu ergeben, welcher 2'-O-(2-Ethylacetyl)adenosin (10) und das vermeintliche 3'-O-Isomer enthielt. Dieses Material wurde zusammen mit Pyridin verdampft, um einen Schaum zu ergeben, welcher in wasserfreiem Pyridin (400 ml) gelöst wurde. 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan (39,52 ml, 124 mmol) wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde für 24 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft, um ein Öl zu ergeben, welches in EtOAc (500 ml) gelöst und dreimal mit Salzlösung gewaschen wurde. Die organische Schicht wurde getrennt, über MgSO₄ getrocknet, und das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft, um ein Öl zu liefern. Das Öl wurde durch eine Flash-Chromatographie unter Verwendung von Hexanen-EtOAc, 80:20, gereinigt, um die Titelverbindung (11) als ein Öl (14,63 g, 22 %) zu ergeben. ¹H NMR (CDCl₃): δ 8,26 (s, 1H), 8,07 (s, 1H), 6,20 (br s, 2H), 4,91 (dd, J_1',2' = 4,7 Hz, J_2',3' = 9,3 Hz, 1H), 4,64-3,97 (m, 8H), 1,22 (t, 3H), 1,05 (m, 28H). ¹³C NMR (CDCl₃): δ 170,0, 155,5, 152,8, 149,0, 139,3, 120,2, 88,6, 82,2, 81,1, 69,9, 68,3, 60,8, 60,0, 17,2, 14,0, 12,7. Anal. berechnet für C₂₆H₄₅N₅O₇Si₂: C, 52,41; H, 7,61; N, 11,75, Si, 9,43. Gefunden: C, 52,23; H, 7,34; N, 11,69.
BEISPIEL 9
2'-O-(2-Hydroxyethyl)-3',5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)adenosin (12, 3)
Die Verbindung 11 (4,175 g, 7,01 mmol) wurde in Ethanol (95 %, 40 ml) gelöst und die sich ergebende Lösung wurde auf 5°C abgekühlt. NaBH₄ (60 % Öldispersion, 0,64 g, 16,8 mmol) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde auf Umgebungstemperatur erwärmt. Nach einem Rühren für 12 Stunden wurde CH₂Cl₂ (200 ml) hinzugefügt, und die Lösung wurde zweimal mit Salzlösung gewaschen, und die organische Schicht wurde getrennt. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet, und das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft, um ein Öl zu ergeben. Das Öl wurde durch eine Flash-Chromatographie unter Verwendung von EtOAc-MeOH, 95:5, gereinigt, um die Titelverbindung (12) als ein Öl (0,368 g, 9,5 %) zu liefern. ¹H NMR (CDCl₃): δ 8,31 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 6,18 (br s, 2H), 6,07 (s, 1H), 4,62 (dd, J_1',2' = 4,6 Hz, J_2',3' = 9,4 Hz, 1H), 4,3-3,5 (m, 8H), 1,03 (m, 28H). ¹³C NMR (CDCl₃): δ 155,5, 153,0, 148,7, 138,3, 120,3, 89,2, 82,7, 81,4, 73,5, 69,3, 61,8, 59,7, 17,2, 17,0, 16,8, 13,4, 12,9, 12,8, 12,6. LRMS (FAB+) m/z: 544 (M + H), 686 (M + Cs+).
BEISPIEL 10
2'-O-(2-Phthalimido-N-hydroxyethyl)-3',5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)adenosin (13, 4)
Zu einer Lösung aus Verbindung 12 (0,330 g, 0,596 mmol) in wasserfreiem THF (10 ml) wurden Triphenylphosphin (0,180 g, 0,685 mmol) und N-Hydroxyphthalimid (0,112 g, 0,685 mmol) hinzugefügt. Zu diesem Gemisch wurde Diethylazodicarboxylat (0,11 ml, 685 mmol) tropfenweise bei 5°C hinzugefügt.
Nach Rühren für 3 Stunden bei Umgebungstemperatur wurde das Lösungsmittel verdampft, um ein Öl zu ergeben. Das Öl wurde in EtOAc gelöst und mit gesättigtem wässrigen NaHCO₃ (×3) und Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde getrennt, über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft, um ein Öl zu ergeben. Das Öl wurde durch eine Flash-Chromatographie unter Verwendung von EtOAc-MeOH, 95:5, gereingt, um die Titelverbindung (13) als ein Öl (0,285 g, 68 %) zu ergeben. ¹H NMR (CDCl₃): δ 8,21 (s, 1H), 8,05 (s, 1H), 7,8-7,45 (m, 4H), 6,00 (s, 1H), 5,88 (br s, 2H), 4,92 (dd, J_1',2' = 4,6 Hz, J_2',3' = 9,0 Hz), 4,5-3,9 (m, 8H), 1,0 (m, 28H). ¹³C NMR (CDCl₃): δ 163, 155,3, 152,8, 149, 139,6, 134,3, 123,4, 120, 88,7, 82,7, 81,1, 77,4, 70,2, 69,5, 60,1, 17,4, 17,2, 17,0, 16,9, 13,3, 12,9, 12,7, 12,6. LRMS (FAB+) m/z: 699 (M + H).
BEISPIEL 11
N6-Benzoyl-2'-O-(2-phthalimido-N-hydroxyethyl)-3',5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)adenosin (14, 4)
Zu einer Lösung aus Verbindung 13 (1,09 g, 1,97 mmol) in wasserfreiem Pyridin (19 ml), welche auf 5°C abgekühlt war, wurde Benzoylchlorid (1,14 ml, 9,8 mmol) hinzugefügt, und das sich ergebende Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur für 12 Stunden gerührt. Nach Abkühlen des Gemisches auf 5°C wurde kaltes Wasser (3,8 ml) hinzugefügt, das Gemisch wurde für 15 Minuten gerührt und konz. NH₄OH (3,8 ml) wurde hinzugefügt. Nach Rühren für 30 Minuten bei 5°C wurde das Lösungsmittel verdampft, um einen Rest zu ergeben, welcher in Wasser gelöst und dreimal mit CH₂Cl₂ extrahiert wurde. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, über MgSO₄ getrocknet und in vacuo verdampft, um ein Öl zu liefern. Das Öl wurde durch eine Flash-Chromatographie unter Verwendung von Hexanen-EtOAc, 50:50, anschließend 20:80, gereinigt, um die Titelverbindung (14) als ein Öl (0,618 g, 48 %) zu ergeben. ¹H NMR (CDCl₃): δ 9,2 (br s, 1H), 8,69 (s, 1H), 8,27 (s, 1H), 8,0-7,4 (m, 9H), 6,12 (s, 1H), 4,95 (dd, J_1',2' = 4,7 Hz, J_2',3' = 9,1 Hz, 1H), 4,5-4,0 (m, 8H), 1,06 (m, 28H). ¹³C NMR (CDCl₃): δ 164,4, 163,3, 152,5, 150,8, 149,3, 142,1, 134,4, 133,7, 132,6, 132,1, 128,7, 128,2, 127,7, 123,4, 88,9, 82,7, 81,3, 77,5, 70,1, 69,6, 60,0, 17,2, 17,0, 16,8, 13,3, 12,8, 12,7, 12,6. LRMS (FAB+) m/z: 803 (M + H).
BEISPIEL 12
N⁶-Benzoyl-2'-O-(2-phthalimido-N-hydroxyethyl)adenosin (15, 4)
Zu einer Lösung aus Verbindung 14 (0,680 g, 0,847 mmol) in THF (20 ml) in einem Polyethylen-Reaktionsgefäß bei 5°C wurde HF-Pyridin (70 %, 0,48 ml, 16,9 mmol) hinzugefügt, und das sich ergebende Gemisch wurde auf Umgebungstemperatur erwärmt. Nach Rühren für 12 Stunden wurde das Lösungsmittel in vacuo verdampft, EtOAc wurde hinzugefügt, die Lösung wurde mit Wasser gewaschen, und die wässrige Schicht wurde getrennt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, über MgSO₄ getrocknet, und das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft, um die Titelverbindung (15) als einen Feststoff (408 mg, 86 %) zu ergeben. ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 11,2 (br s, 1H), 8,71 (s, 1H), 8,67 (s, 1H), 8,0-7,5 (m, 9H), 6,11 (d, J_1',2' = 5,7 Hz), 5,23 (d, 1H), 5,14 (t, 1H), 4,66 (t, 1H), 4,35 (m, 3H), 3,90 (m, 3H), 3,6 (m, 2H). ¹³C NMR (DMSO-d₆): δ 163,5, 152,0, 143,2, 135,0, 132,6, 131,9, 131,7, 129,3, 128,7, 128,5, 123,4, 86,3, 85,8, 81,3, 76,8, 69,0, 68,7, 61,3. LRMS (FAB+) m/z: 561 (M + H), 583 (M + Na+).
BEISPIEL 13
N⁶-Benzoyl-2'-O-(2-phthalimido-N-oxyethyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)adenosin (16, 4)
Zu einer Lösung aus Verbindung 15 (0,258 g, 0,46 mmol) in wasserfreiem Pyridin (5 ml) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (0,179 g, 0,53 mmol) hinzugefügt, und die Lösung wurde für 12 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Wasser wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde mit EtOAc dreimal extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, in vacuo verdampft und über MgSO₄ getrocknet. Das sich ergebende Öl wurde durch eine Flash-Chromatographie unter Verwen dung von Hexanen-EtOAc, 90:10, gereinigt, um die Titelverbindung (16) als ein Öl (0,249 g, 63 %) zu ergeben. ¹H NMR (CDCl₃): δ 9,16 (br s, 1H), 8,68 (s, 1H), 8,28 (s, 1H), 8,1-6,8 (m, 22H), 6,26 (d, J_1',2' = 4,0 Hz, 1H), 4,76 (m, 1H), 4,60 (m, 1H), 4,4-4,3 (m, 3H), 4,13-4,0 (m, 3H), 3,77 (s, 6H), 3,48 (m, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃): δ 164,5, 163,6, 158,5, 152,6, 151,4, 149,5, 144,5, 141,9, 135,7, 134,7, 132,7, 130,1, 128,8, 128,2, 127,8, 126,9, 123,7, 113,2, 87,2, 84,1, 82,6, 69,9, 69,0, 63,0, 60,3, 55,2. HRMS (FAB+) m/z (M + Cs+) berechnet für C₄₈N₄₂N₆O₁₀ 995,2017, gefunden 995,2053 (M + Cs+).
BEISPIEL 14
N⁶-Benzoyl-2'-O-(2-phthalimido-N-oxyethyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)adenosin-3'-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] (17, 4)
Zu einer Lösung aus Verbindung 16 (0,300 g, 0,348 mmol) in CH₂Cl₂ (10 ml) wurden Diisopropylamintetrazolid (0,030 g, 0,174 mmol) und 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (0,13 ml, 0,418 mmol) hinzugefügt. Nach Rühren für 12 Stunden bei Umgebungstemperatur wurden zusätzliches Diisopropylamintetrazolid (0,060 g, 0,348 mmol) und 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (0,26 ml, 0,832 mmol) in zwei Teilen über 24 Stunden hinzugefügt. Nach 24 Stunden wurde CH₂Cl₂-NEt₃, 100:1, hinzugefügt, und das Gemisch wurde mit gesättigtem wässrigen NaHCO₃ und Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde getrennt, über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft. Das sich ergebende Öl wurde durch eine Flash-Chromatographie durch Vorbehandeln der Kieselsäure mit Hexanen-EtOAc-NEt₃ (40:60:1), anschließend durch Verwenden desselben Lösungsmittelsystems gereinigt, um die Titelverbindung (17) als ein Öl (203 g, 55 %) zu ergeben. ¹H NMR (CDCl₃): δ 6,27 (m, 1H). ³¹P NMR (CDCl₃): δ 151,0, 150,5. HRMS (FAB+) m/z (M + Cs+) berechnet für C₅₇H₅₉N₈O₁₁P 1195,3095, gefunden 1195,3046 (M + Cs+).
BEISPIEL 15
2'-O-(2-Aminooxyethyl)-3',5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)adenosin (18, 5)
Zu einer Lösung aus Verbindung 13 (0,228 g, 0,326 mmol) in CH₂Cl₂ (5 ml) bei 5°C wurde Methylhydrazin (0,017 ml, 0,326 mmol) unter Rühren für 2 Stunden hinzugefügt. Das Gemisch wurde filtriert, um ein Präzipitat zu entfernen, und das Filtrat wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde getrennt, über MgSO₄ getrocknet und in vacuo verdampft, um die Titelverbindung (18) als ein Öl (186 mg) zu ergeben. Das Öl wies eine ausreichende Reinheit für nachfolgende Reaktionen auf. ¹H NMR (CDCl₃): δ 8,31 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 6,07 (s, 1H), 5,78 (br s, 2H), 4,70 (dd, J_1',2' = 4,4 Hz, J_2',3' = 9,0 Hz, 1H), 4,3-3,9 (m, 8H), 1,9 (br, 2H), 1,0 (m, 28H). LRMS (FAB+) m/z: 569 (M + H), 702 (M + Cs⁺).
BEISPIEL 16
2'-O-(2-O-Formaldoximylethyl)-3',5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)adenosin (19, 5)
Zu einer Lösung aus Verbindung 18 (0,186 g, 0,326 mmol) in EtOAc (2 ml) und MeOH (2 ml) wurde Formaldehyd (wässrig 37 %, 0,028 ml, 0,342 mmol) unter Rühren bei Umgebungstemperatur für 3 Stunden hinzugefügt. Das Lösungsmitttel wurde in vacuo verdampft, um die Titelverbindung (19) als ein Öl (189 mg) zu ergeben. Das Öl wies eine ausreichende Reinheit für nachfolgende Reaktionen auf. ¹H NMR (CDCl₃): δ 8,31 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 6,97 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,38 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,01 (s, 1H), 5,66 (br s, 2H), 4,77 (dd, J_1',2' = 4,7 Hz, J_2',3' = 9,3 Hz), 4,3-4,0 (m, 8H), 1,0 (m, 28H). LRMS (FAB+) m/z: 581 (M + H), 713 (M + Cs⁺).
BEISPIEL 17
N⁶-Benzoyl-2'-O-(2-O-formaldoximylethyl)-3',5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)adenosin (20, 5)
Zu einer Lösung aus Verbindung 19 (0,189 g, 0,326 mmol) in Pyridin (5 ml) bei 5°C wurde Benzoylchlorid (0,19 ml, 1,63 mmol) hinzugefügt, und die sich ergebende Lösung wurde bei Umgebungstemperatur für 3 Stunden gerührt. Die Lösung wurde auf 5°C abgekühlt und konzentriertes NH₄OH (1,5 ml) wurde unter Rühren für 1 Stunde hinzugefügt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft, um ein Öl zu ergeben, welches in CH₂Cl₂ gelöst wurde. Die Lösung wurde mit Wasser gewaschen, und die organische Schicht wurde getrennt, mit MgSO₄ getrocknet, und das Lösungsmittel wurde verdampft, um die Titelverbindung (20) (223 mg) als ein Öl zu ergeben, welches eine ausreichende Reinheit für nachfolgende Reaktionen aufwies. ¹H NMR (CDCl₃): δ 9,30 (br, 1H), 8,79 (s, 1H), 8,31 (s, 1H), 8,1-7,2 (m, 5H), 7,00 (d, 1H), 6,39 (d, 1H), 6,09 (s, 1H), 4,77 (dd, 1H), 4,4-3,9 (m, 8H), 1,1 (m, 28H).
BEISPIEL 18
N⁶-Benzoyl-2'-O-(2-O-formaldoximylethyl)adenosin (21, 5)
Zu einer Lösung aus Verbindung 20 (223 mg, 0,326 mmol) in THF (10 ml) in einem Polyethylen-Reaktionsgefäß bei 5°C wurde HF-Pyridin (70 %, 0,19 ml, 6,5 mmol) hinzugefügt, und das Gemisch wurde auf Umgebungstemperatur erwärmt. Nach Rühren für 48 Stunden wurden die Lösungsmittel in vacuo verdampft, um einen Rest zu ergeben, welcher in EtOAc gelöst und mit Wasser gewaschen wurde. Die organische Schicht wurde getrennt, die wässrige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert, und die organischen Schichten wurden vereinigt, über MgSO₄ getrocknet und in vacuo verdampft. Der sich ergebende Rest wurde durch eine Flash-Chromatographie unter Verwendung von EtOAc-MeOH, 95:5, gereinigt, um die Titelverbindung (21) als einen Feststoff (24 mg, 17 % von 13) zu ergeben. ¹H NMR (CDCl₃): δ 9,05 (br s, 1H), 8,77 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 7,9-7,2 (m), 6,26 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 6,03 (d, J_1',2' = 7,8 Hz), 4,88 (dd, J = 4,6 Hz, J = 7,9 Hz, 1H), 4,6-3,7 (m, 10H). LRMS (FAB+) m/z: 443 (M + H). LRMS (FAB–) m/z: 441 (M – H).
BEISPIEL 19
N⁶-Benzoyl-2'-O-(2-O-formaldoximylethyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)adenosin (21A, 5)
Zu einer Lösung aus Verbindung 21 (0,34 g, 0,768 mmol) in Pyridin (7 ml) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (0,312 g, 0,922 mmol) hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur für 5 Stunden gerührt. Zusätzliche Mengen von 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (520 mg, 1,54 mmol und 340 mg, 0,768 mmol) wurden über 24 Stunden hinzugefügt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, das Rohprodukt wurde in EtOAc gelöst und mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde getrennt, über MgSO₄ getrocknet, und das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft. Das Rohmaterial wurde durch eine Säulen-Chromatographie unter Verwendung von EtOAc-Hexanen-NEt₃, 80:20:0,5, v/v/v, gefolgt von EtOAc-NEt₃, 100:0,5, v/v, als Lösungsmittel gereinigt, um die Titelverbindung (21 A) als ein Öl (0,269 g, 47 %) zu ergeben. ¹H NMR (CDCl₃): δ 8,99 (br s, 1H), 8,74 (s, 1H), 8,1-6,8 (m, 18H), 7,00 (d, 1H), 6,43 (d, 1H), 6,19 (d, 1H), 4,72 (m, 1H), 4,48 (m, 1H), 4,23 (m, 3H), 4,1 (m, 1H), 3,9 (m, 1H), 3,78 (s, 6H), 3,45 (m, 2H), 3,15 (d, 1H). HRMS (FAB+) m/z (M + Cs+) berechnet für C₄₁H₄₀N₆O₈ 877,1962, gefunden 877,1988 (M + Cs+).
BEISPIEL 20
2'-O-Allyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin
In einem 100 ml Edelstahldruckreaktor wurde Allylalkohol (20 ml) langsam zu einer Lösung aus Boran in Tetrahydrofuran (1 M, 10 ml, 10 mmol) unter Rühren hinzugefügt. Wasserstoffgas entwickelte sich schnell. Sobald die Geschwindigkeit der Blasenbildung abnahm, wurden 2,2'-Anhydro-5-methyluridin (1,0 g, 0,4,2 mmol) und Natriumbicarbonat (6 mg) hinzugefügt, und der Reaktor wurde verschlossen. Der Reaktor wurde in ein Ölbad gebracht und auf 170°C Innentemperatur für 18 Stunden erhitzt. Der Reaktor wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und geöffnet. Eine TLC zeigte, dass das gesamte Ausgangsmaterial verbraucht war (Aus gangsmaterial und Produkt jeweils Rf 0,25 und 0,60 in 4:1 Ethylacetat/Methanol auf einem Kieselsäuregel).
Die Rohlösung wurde konzentriert, zusammen mit Methanol (50 ml), kochendem Wasser (15 ml), absolutem Ethanol (2 × 25 ml) verdampft, und anschließend wurde der Rest zu 1,4 g bräunlichem Schaum (1 mm Hg, 25°C, 2 Stunden) getrocknet. Ein Teil des Rohnucleosids (1,2 g) wurde ohne weitere Aufreinigung für den nächsten Reaktionsschritt verwendet. Der Rest wurde zusammen mit Pyridin (30 ml) verdampft und wiederum in Pyridin (30 ml) gelöst. Dimethoxytritylchlorid (1,7 g, 5,0 mmol) wurde in einem Teil bei Raumtemperatur hinzugefügt. Nach 2 Stunden wurde die Reaktion mit Methanol (5 ml) abgestoppt, in vacuo konzentriert und zwischen einer Lösung aus gesättigtem Natriumbicarbonat und Ethylacetat (jeweils 150 ml) aufgeteilt. Die organische Phase wurde getrennt, konzentriert, und der Rest wurde einer Säulen-Chromatographie (45 g Kieselsäuregel) unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten aus Hexanen-Ethylacetat-Triethylamin (50:49:1) bis (60:39:1) unterzogen. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert, zusammen mit Acetonitril (30 ml) verdampft und auf 840 mg (34 % Ausbeute in zwei Schritten) eines weißen Schaumfeststoffs getrocknet (1 mm Hg, 25°C, 24 Stunden). Die NMR stimmte mit dem unmethylierten Uridin-Analog überein, von welchem in der Literatur berichtet wurde.
BEISPIEL 21
2'-O-(2-Hydroxyethyl)-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin
2'-O-Allyl-5'-O-Dimethoxytrityl-5-methyluridin (1,0 g, 1,6 mmol), wässriges Osmiumtetroxid (0,15 M, 0,36 ml, 0,0056 mmol, 0,035 Äq.) und 4-Methylmorpholin-N-oxid (0,41 g, 3,5 mmol, 2,15 Äq.) wurden in Dioxan (20 ml) gelöst und bei 25°C für 4 Stunden gerührt. Eine TLC wies auf eine vollständige und saubere Reaktion in das Diol hin (Rf vom Ausgangspunkt zum Diol 0,40 bis 0,15 in Dichlormethan/Methanol 97:3 auf Kieselsäure). Kaliumperiodat (0,81 g, 3,56 mmol, 2,2 Äq.) wurde in Wasser (10 ml) gelöst und zu der Reaktion hinzugefügt. Nach 17 Stunden wies die TLC auf eine zu 90 % vollständige Reaktion hin (Aldehyd Rf 0,35 im oben erwähnten System). Die Reaktionslösung wurde filtriert, mit 5 % wässrigem Natriumbisulfit (200 ml) abgestoppt, und das Aldehyd des Produkts wurde mit Ethylacetat (2 × 200 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, mit Salzlösung (2 × 100 ml) gewaschen und zu einem Öl konzentriert. Das Öl wurde in absolutem Ethanol (15 ml) gelöst, und Natriumborhydrid (1 g) wurde hinzugefügt. Nach 2 Stunden bei 25°C wies die TLC auf eine vollständige Reaktion hin. Wasser (5 ml) wurde hinzugefügt, um das Borhydrid zu zerstören. Nach 2 Stunden wurde die Reaktion desorbiert bzw. gestrippt, und der Rest wurde zwischen Ethylacetat und gesättigter Natriumbicarbonatlösung aufgeteilt (jeweils 50 ml). Die organische Schicht wurde in vacuo konzentriert, und der Rest wurde einer Säulenchromatographie unterzogen (Kieselsäuregel 30 g, Dichlormethan-Methanol 97:3). Die Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und desorbiert und auf 0,50 g (50 %) weißen Schaum getrocknet. Die NMR stimmte mit der des Materials überein, welches über den Glykosylierungsweg hergestellt wurde.
BEISPIEL 22
2'-O-(2-Hydroxyethyl)-5-methyluridin
In einem 100 ml Edelstrahldruckreaktor wurde Ethylenglykol (20 ml) langsam zu einer Lösung aus Boran in Tetrahydrofuran (1 M, 10 ml, 10 mmol) unter Rühren hinzugefügt. Wasserstoffgas entwickelte sich schnell. Sobald die Geschwindigkeit der Blasenbildung abnahm, wurden 2,2'-Anhydro-5-methyluridin (1,0 g, 0,4,2 mmol) und Natriumbicarbonat (3 mg) hinzugefügt, und der Reaktor wurde verschlossen. Der Reaktor wurde in ein Ölbad gebracht und auf 150°C Innentemperatur für 72 Stunden erhitzt. Die Bombe wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und geöffnet. Eine TLC zeigte, dass 65 % des Ausgangsmaterials verbraucht war (Ausgangsmaterial und Produkt jeweils Rf 0,25 und 0,40 in 4:1 Ethylacetat/Methanol auf Kieselsäuregel). Die Reaktion wurde unvollständig aufgearbeitet. Die Rohlösung wurde konzentriert (1 mm Hg bei 100°C), zusammen mit Methanol (50 ml), kochendem Wasser (15 ml) und absolutem Ethanol (2 × 25 ml) verdampft, und der Rest wurde zu 1,3 g cremefarbenem Schaum getrocknet (1 mm Hg, 25°C, 2 Stunden). Die NMR des Rohprodukts stimmte mit 65 % gewünschtem Produkt und 35 % Ausgangsmaterial überein. Der TLC-Rf stimmte (als Kospot) mit demselben Produkt überein, welches durch Behandeln des oben erwähnten DMT-Derivats mit verdünnter Salzsäure in Methanol erzeugt wurde, sowie der Rf einer der Spots, welche durch Behandeln einer Probe dieses Produkts mit Dimethoxytritylchlorid erzeugt wurden, stimmte mit dem bekannten DMT-Derivat überein (andere Spots waren DMT an der Seitenkette und bis-substituiertes Produkt).
BEISPIEL 23
N4-Benzoyl-2'-O-(2-phthalimido-N-oxyethyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin-3'-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] (25, 6)
Die 2'-O-Aminooxyethylcytidin- und -guanosin-Analoge können über eine ähnliche Chemie in Verbindung mit in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Ein Schlüssel für die Synthesewege stellt die selektive 2'-O-Alkylierung von ungeschützten Nucleosiden dar. (Guinosso, C. J., Hoke, G. D., Frier, S., Martin, J. F., Ecker, D. J., Mirabelli, C. K., Crooke, S. T., Cook, P. D., Nucleosides Nucleotides, 1991, 10, 259; Manoharan, M., Guinosso, C. J., Cook, P. D., Tetrahedron Lett., 1991, 32, 7171; Izatt, R. M., Hansen, L. D., Rytting, J. H., Christensen, J. J., J. Am. Chem. Soc., 1965, 87, 2760, Christensen, L. F., Broom, A. D., J. Org. Chem., 1972, 37, 3398. Yano, J., Kan, L. S., Ts'o, P.O.P., Biochim. Biophys. Acta, 1980, 629, 178; Takaku, H., Kamaike, K., Chemistry Lett., 1982, 189). Daher kann Cytidin selektiv alkyliert werden, um das Zwischenprodukt 2'-O-(2-Ethylacetyl)cytidin 22 zu liefern. Das 3'-Isomer von 22 ist typischerweise in einer geringeren Menge anwesend und kann durch eine Chromatographie oder Kristallisation getrennt werden. Die Verbindung 22 kann geschützt werden, um 2'-O-(2-Ethylacetyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin (23) zu ergeben. Die Reduktion des Esters 23 sollte 2'-O-(2-Hydroxyethyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin (24) ergeben, welches N-4-benzoyliert werden kann, die primäre Hydroxylgruppe kann durch N-Hydroxyphthalimid über eine Mitsunobu-Reaktion ersetzt werden, und das geschützte Nucleosid kann wie gewöhnlich phosphityliert werden, um N4-Benzyol-2'-O-(2-phthalimido-N-oxyethyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin-3'-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] (25) zu ergeben.
BEISPIEL 24
N2-Isobutyryl-6-O-diphenylcarbamoyl-2'-O-(2-ethylacetyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin-3'-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] (31)
In einer ähnlichen Weise kann das 2'-O-Aminooxyethylguanosin-Analog durch selektive 2'-O-Alkylierung des Diaminopurinribosids erhalten werden (Multigrammmengen des Diaminopurinribosids können von Schering AG (Berlin) bezogen werden), um 2'-O-(2-Ethylacetyl)diaminopurinribosid 26 zusammen mit einer geringeren Menge des 3'-O-Isomers bereitzustellen. Verbindung 26 kann getrennt werden und in 2'-O-(2-Ethylacetyl)guanosin 27 durch eine Behandelung mit Adenosindesaminase umgewandelt werden. (McGee, D. P. C., Cook, P. D., Guinosso, C. J., PCT Int. Appl., 85 S.; PIXXD2; WO 94/02501 A1 940203). Standardschutzverfahren sollten 2'-O-(2-Ethylacetyl)-5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)guanosin 28 und 2N-Isobutyryl-6-O-diphenylcarbamoyl-2'-O-(2-ethylacetyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin 29 liefern, welches reduziert werden kann, um 2-N-Isobutyryl-6-O-diphenylcarbamoyl-2'-O-(2-ethylacetyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin (30) bereitzustellen. Wie zuvor kann die Hydroxylgruppe durch N-Hydroxyphthalimid über eine Mitsunobu-Reaktion ersetzt werden, und das geschützte Nucleosid kann wie gewöhnlich phosphityliert werden, um 2-N-Isobutyryl-6-O-diphenylcarbamol-2'-O-(2-ethylacetyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytriyl)guanosin-3'-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] (31) zu ergeben.
BEISPIEL 25
N-(1-Hydroxyphthalimido)-5-hexen (32, 9)
Zu einer gerührten Lösung aus 5-Hexan-1-ol (20 g, 0,2 mol) in THF (500 ml) wurden Triphenylphosphin (80 g, 0,3 mol) und N-Hydroxyphthalimid (49 g, 0,3 mol) hinzugefügt. Das Gemisch wurde auf 0°C abgekühlt, und Diethylazidocarboxylat (48 ml, 0,3 mol) wurde langsam über einen Zeitraum von 1 Stunde hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt, und die gelbe Lösung wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde anschließend verdampft, um ein gelbes Öl zu ergeben. Das Öl wurde in CH₂Cl₂ gelöst und mit Wasser, gesättigter NaHCO₃-Lösung, gefolgt von einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Schicht wurde in vacuo konzentriert, und das sich ergebende Öl wurde in einer Lösung aus CH₂Cl₂/Ether gelöst, um so viel Ph₂P=O wie möglich auszukristallisieren. Nach drei Reinigungsschritten wurde die Titelverbindung als ein gelber wachsartiger Feststoff (Ausbeute 93 %) isoliert. ¹³C NMR: δ 21,94, 24,83, 27,58, 33,26, 78,26, 114,91, 123,41, 128,40, 128,54, 128,63, 134,45 und 163,8 ppm.
BEISPIEL 26
N-(1-Hydroxyphthalimido-5,6-hexandiol) (33, 9)
Die Verbindung 32 (2,59 g, 10 mmol), wässriges Osmiumtetroxid (0,15 M, 3,6 ml, 0,056 mmol) und N-Methylmorpholin-N-oxid (2,46 g, 21 mmol) wurden in THF (100 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde mit Aluminiumfolie bedeckt und bei 25°C für 4 Stunden gerührt. Eine TLC wies darauf hin, dass das Diol gebildet wurde. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rest wurde zwischen Wasser und CH₂Cl₂ aufgeteilt. Die organische Schicht wurde mit einer gesättigten Lösung aus NaCl gewaschen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Die Konzentration der organischen Schicht führte zu einem bräunlichen Öl, welches durch eine ¹³C NMR charakterisiert wurde und im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde. ¹³C NMR: δ 21,92, 28,08, 32,62, 66,76, 71,96, 78,33, 123,43, 128, 47, 128,71, 131,93, 132,13, 134,49, 163,89.
BEISPIEL 27
N-1-Hydroxyphthalimido-6-O-dimethoxytrityl-5,6-hexandiol (34, 9)
Das Produkt aus dem vorigen Schritt (3,0 g) wurde zusammen mit Pyridin (2 × 20 ml) verdampft und in Pyridin (100 ml) gelöst. Dimethoxytritylchlorid (3,5 g, 10 mmol) wurde in Pyridin (30 ml) gelöst und tropfenweise zu dem Diol über einen Zeitraum von 30 Minuten hinzugefügt. Nach 4 Stunden wurde die Reaktion mit Methanol (10 ml) abgestoppt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und das restliche Produkt zwischen gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung und CH₂Cl₂ (jeweils 100 ml) aufgeteilt. Die organische Phase wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, konzentriert, und der Rest wurde einer Kieselsäuregel-Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von Hexanen-Ethylacetat-Triethylamin (60:39:1) unterzogen. Die Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, in vacuo konzentriert und getrocknet, um einen gelben, schaumigen Feststoff zu ergeben. Die NMR-Analyse zeigte die Titelverbindung als einen reinen, homogenen dimethoxytritylierten Feststoff (5,05 g, 83 % Ausbeute).
BEISPIEL 28
(35, 9)
Die Verbindung 34 wurde in CH₂Cl₂-Lösungsmittel (20 ml) durch das Hinzufügen von Diisopropylamintetrazolid (214 mg, 1,25 mmol) und 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (1,3 ml, 4,0 mmol) phosphityliert (1,5 g, 2,5 mmol). Nach Rühren der Lösung über Nacht wurde das Lösungsmittel verdampft, und der Rest wurde auf eine Kieselsäure-Säule gebracht und mit Hexanen-Ethylacetat-Triethylamin (50:49:1) eluiert. Die Konzentration der geeigneten Fraktionen ergab 1,61 g der phosphitylierten Verbindung als einen gelben Schaum (81 %).
BEISPIEL 29
Anheftung eines O-N-Linkers an CPG (36, 10)
Succinyliertes und überkapptes CPG wurde gemäß dem von P. D. Cook et al. ( US Patent 5,541,307 ) beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Verbindung 34 (0,8 mmol), Dimethylaminopyridin (0,2 mmol), 2,0 g succinyliertes und überkapptes CPG-Triethylamin (160 μl) und DEC (4,0 mmol) wurden für 24 Stunden zusammen geschüttelt. Pentachlorphenyl (1,0 mmol) wurde anschließend hinzugefügt, und das sich ergebende Gemisch wurde für 24 Stunden geschüttelt. Die CPG-Kügelchen wurden abfiltriert und gründlich mit Pyridin (30 ml), Dichlormethan (2 × 30 ml), CH₃OH (30 ml) in Ether gewaschen. Der feste CPG-Träger wurde über P₂O₅ getrocknet, und seine Beladung wurde bestimmt, 28 μmol/g zu betragen.
BEISPIEL 30
Synthese von Oligonucleotiden unter Verwendung eines ON-Linkers
Die folgenden Oligonucleotide wurden unter Verwendung von Verbindung 35 synthetisiert:
SEQ ID NR: 1 5'XTTTTTTTTTT3'
SEQ ID NR: 2 5'XTGCATCCCCCAGGCCACCATTTTTT3'
Diese Oligonucleotide wurden als Phosphorthioate synthetisiert. Die Verbindung 35 wurde als eine 0,1 M Lösung in CH₃CN verwendet. Die Kopplungswirksamkeit des ON-Linkers betrug > 95 %, wie durch Tritylfarben gezeigt wurde. Die Oligonucleotide wurden in dem festen Träger für eine Festphasenkonjugation zurückbehalten.
BEISPIEL 31
Konjugation von Pyren an Oligonucleotide unter Verwendung eines ON-Linkers
Das Oligonucleotid SEQ ID NR: 1 in CPG (1 μmol) wurde in einen Glastrichter-Reaktor gebracht, und 5 % Methylhydrazin (5 ml) in 9:1 CH₂Cl₂/CH₃OH wurde hinzugefügt. Der Reaktor wurde für 30 Minuten geschüttelt. Das Methylhydrazin wurde abgelassen, mit CH₂Cl₂ gewaschen, und die Methylhydrazin-Reaktion wurde wiederholt. Die Kügelchen wurden mit CH₂Cl₂, gefolgt von Ether, gewaschen und getrocknet. Pyren-buttersäure-N-hydroxysuccinimid (110 mg) in DMF (5 ml) wurde hinzugefügt. Nach Schütteln für 2 Stunden wurde die Pyrenbutyrat-Lösung abgelassen, das Oligonucleotid wurde in NH₄OH für 30 Minuten bei Raumtemperatur entschützt. Die wässrige Lösung wurde anschließend filtriert, und eine HPLC-Analyse wurde durchgeführt. Der Produkt-Peak wies eine Retentionszeit von 34,85 Minuten auf, und das Dioden-Array-Spektralphotometer zeigte eine Pyrenabsorption.
BEISPIEL 32
Konjugation von Pyrenbutyraldehyd an das Oligonucleotid (SEQ ID NR: 2)
Pyrenbutyraldehyd wird zu SEQ ID NR: 2 nach einer MeNHNH₂-Behandlung hinzugefügt. NaCNBH₃ in MeOH wurde anschließend hinzugefügt. Eine Entschützung von CPG, gefolgt von einer NH₄OH-Spaltung des CPG zeigte eine Pyrenkonjugation an das Oligonucleotid.
BEISPIEL 33
Zu einer gerührten Lösung aus 1,6-Hexandiol-N-hydroxyphthalimid (6,525 g, 0,039 mol) und Triphenylphosphin (10,2 g, 0,039 mol) in wasserfreiem THF (100 ml) wurde Diethylazidocarboxylat (DEAD, 7,83 g, 0,045 mol) über einen Zeitraum von 1 Stunde bei 5°C unter einer Argonatmosphäre hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die hellgelbe Lösung wurde unter Vakuum konzentriert, um das THF zu entfernen, und zwischen CH₂Cl₂ und Wasser aufgeteilt. Die organische Schicht wurde anschließend mit gesättigtem NaHCO₃, gefolgt von gesättigtem NaCl gewaschen. Sie wurde anschließend über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und auf eine Kieselsäure-Säule gebracht und mit EtOAc/Hexan 1:1 eluiert, um 9,8 g zu ergeben. Das Material wurde mit Ph₃P=O kontaminiert und wurde mit CH₂Cl₂/Ether rekristallisiert.
BEISPIEL 34
(11 und 12)
5-Hexen-1-ol wird unter Verwendung von Imidazol/TBDPS-Cl in CH₂Cl₂ silyliert, um Verbindung 37 zu ergeben. Die Verbindung 37 wird anschließend mit OSO₄/NMMO dihydroxyliert, wie in Beispiel 25 für Verbindung 33, um Verbindung 38 zu ergeben. Verbindung 38 wird an der primären Alkoholfunktion dimethoxytrityliert, um Verbindung 39 zu ergeben. Sie wird anschließend einer Mitsunobu-Reaktion mit N-Hydroxyphthalimid unterzogen, um Verbindung 40 zu ergeben. Verbindung 40 wird anschließend mit TRAF (Tetrabutylammoniumfluorid, 1 M in THF) disilyliert, um Verbindung 41 zu ergeben. Verbindung 41 wird anschließend in ein Phosphoramidit 42 derivatisiert. Verbindung 41 wurde auch separat mit kontrollierten Porenglaskügelchen verbunden (Verbindung 43).
BEISPIEL 35
2,6,9-(β-D-Ribofuranosyl)purin (5,64 g, 20 mmol) wurde zu einer Suspension aus 800 mg 60 % Natriumhydrid in Öl, welches vorher mit Hexanen in 100 ml DMF unter Argon gewaschen wurde, hinzugefügt. Nach 1 Stunde des Rührens bei Raumtemperatur wurde Allylbromid (2 ml, 1,1 Äquivalente) zu der Lösung hinzugefügt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde verdampft und auf eine Kieselsäure-Säule gebracht und mit CH₂Cl₂/CH₃OH (20:1), welches 1 % Triethylamin enthielt, eluiert. Die Gesamtausbeute von 2'- und 3'-O-Allyl-Verbindungen betrug 5,02 g (77 %). Das Gemisch der 2'- und 3'-Isomere wurde anschließend durch eine Behandlung mit DMF DMA in MeOH in quantitativer Ausbeute exocyclisch Amin-geschützt. Dieses Material wurde anschließend 5'- O-dimethoxytrityliert, um ein Gemisch aus 5'-O-Dimethoxytrityl-N-2-formamidin-2'-O-(2-hydroxyethyl)guanosin und 5'-O-Dimethoxytrityl-N2-formamidin-3'-O-(2-hydroxyethyl)guanosin im Verhältnis 2:1 zu ergeben. Die endgültigen Verbindungen wurden durch eine Kieselsäuregel-Flash-Säulenchromatographie gereinigt.
BEISPIEL 36
2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin (282 mg, 1 mmol) wurde zu einer Suspension aus 40 mg 60 % Natriumhydrid in Öl, welches vorher mit Hexanen in wasserfreiem DMF (5 ml) gewaschen wurde, hinzugefügt. Zu dieser Lösung aus 2-(Bromethoxy)-t-butyldimethyl wurde Silan (220 ml) hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde verdampft, und das sich ergebende Öl wurde zwischen Wasser und Ethylacetat aufgeteilt. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet. Das Reaktionsgemisch wurde über das Kieselsäuregel gereinigt, um die 2'- und 3'-Isomere zu ergeben. Das 2'-Material wurde anschließend mit DMF DMA Amin-geschützt und 5'-dimethoxytrityliert, um 5'-O-Dimethoxytrityl-N2-formamidin-2'-O-(2-TBDMS-hydroxyethyl)guanin zu ergeben.
BEISPIEL 37
Oligonucleotidsynthese
Unsubstituierte und substituierte Oligonucleotide werden auf einem automatischen DNA-Syntheseautomaten (Applied Biosystems Modell 380B) unter Verwendung einer Standard-Phosphoramidit-Chemie mit Oxidation durch Iod synthetisiert. Für Phosphorthioat-Oligonucleotide wird die Standardoxidationsflasche durch eine 0,2 M Lösung aus 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid in Acetonitril für die schrittweise Thionierung der Phosphit-Verbindungen ersetzt. Der Thionierungs-Warte-Schritt wird auf 68 sek erhöht und wird von dem Überkappungs-Schritt gefolgt. Nach der Spaltung von der CPG-Säule und dem Entblockieren in konzentriertem Ammoniumhydroxid bei 55°C (18 Stunden) werden die Oligonucleotide durch zweimaliges Präzipitieren mit 2,5 Volumina Ethanol aus einer 0,5 M NaCl-Lösung gereinigt. Eine analytische Gelelektrophorese wird in 20 % Acrylamid, 8 M Harnstoff, 454 mM Trisborat-Puffer, pH-Wert = 7,0, durchgeführt. Für Oligonucleotide und Phosphorthioate wird basierend auf einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese festgestellt, dass mehr als 80 % Material in voller Länge vorliegt
Beispiel 38
Allgemeines Verfahren zum Anheften von 2'-Desoxy-2'-substituierten 5'-Dimethoxytriphenylmethyl-Ribonucleosiden an das 5'-Hydroxyl von Nucleosiden, welche an einen CPG-Träger gebunden sind.
Das 2'-Desoxy-2'-substituierte Nucleosid, welches an der terminalen 3'-Position des Oligonucleotids zurückbleibt, wird als eine 5'-DMT-Gruppe geschützt (die exocyclischen Cytosin- und Adenin-Aminogruppen werden benzoyliert und das Guanin-Amino wird isobutryliert) und mit mit Trifluoressigsäure/Bromessigsäure gemischtem Anhydrid in Pyridin und Dimethylaminopyridin bei 50°C für 5 Stunden behandelt. Die Lösung wird anschließend unter reduziertem Druck zu einem dünnen Sirup verdampft, welcher in Ethylacetat gelöst wird und durch eine Säule aus Kieselsäuregel gebracht wird. Die homogenen Fraktionen werden gesammelt und bis zur Trockenheit verdampft. Eine Lösung aus 10 ml Acetonitril, 10 μM des 3'-O-Brommethylester-modifizierten Nucleosids und 1 ml Pyridin/Dimethylaminopyridin (1:1) wird langsam (60 bis 90 sek) mit einer Spritze durch eine 1 μM Säule aus CPG-Thymidin (Applied Biosystems, Inc.) gedrückt, welche vorher gemäß Standardbedingungen mit Säure behandelt wurde, um die freie 5'-Hydroxyl-Gruppe zu liefern. Andere Nucleosid-gebundene CPG-Säulen können verwendet werden. Das Eluat wird gesammelt und wiederum mit einer Spritze durch die Säule gedrückt. Dieses Verfahren wird dreimal wiederholt. Die CPG-Säule wird langsam mit 10 ml Acetonitril gewaschen und anschließend an einen ABI 380B Nucleinsäure-Syntheseautomaten angeschlossen. Nun wird die Oligonucleotidsynthese initiiert. Die Standardbedingungen der konzentrierten Ammoniumhydroxid-Entschützung, welche die Thymidinester-Verbindung von dem CPG-Träger spal tet, spaltet auch die 3'-, 5'-Esterverbindung, welche das Pyrimidin-modifizierte Nucleosid mit dem Thymidin verbindet, welches anfänglich an das CPG-Nucleosid gebunden war. Auf diese Weise kann irgendein 2'-substituiertes Nucleosid oder im Allgemeinen irgendein Nucleosid mit Modifikationen am Heterocyclus und/oder Zucker an das 3'-Ende eines Oligonucleotids angeheftet werden.
BEISPIEL 39
Modifizierte Oligonucleotidsynthese zum Einschluss von 2'-substituierten Nucleotiden
A. ABI-Syntheseautomat
Oligonucleotidsequenzen, welche 1-[2'-O-(2-Phthalimido-N-oxyethyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl]thymin einschließen, wurden auf einem ABI 3808 unter Verwendung einer Phosphoramidit-Chemie mit doppelter Kopplung und erhöhten Kopplungszeiten (5 und 10 min) synthetisiert. Das 2'-O-Aminooxyethoxyphosphoramidit wurde bei einer Ausgangskonzentration von 0,08 M verwendet, und 10 % tert-Butylperoxid in Acetonitril wurde als Oxidationsmittel verwendet. Die Desoxyphosphoramidite wurden bei 0,2 M verwendet. Die Endkonzentrationen von 2'-O-Aminooxyethoxy- und Desoxyamiditen betrugen jeweils 0,04 M und 0,1 M. Die Oligonucleotide wurden von dem CPG-Träger gespalten, und die Schutzgruppen der Basen wurden unter Verwendung von konzentriertem Ammoniak bei 55°C für 6 Stunden entfernt. Die Oligonucleotide wurden durch eine Größenausschluss-Chromatographie über Sephadex G25 gereinigt und durch eine Elektrospray-Massenspektrometrie und eine Kapillargel-Elektrophorese analysiert. Die Desoxyphosphoramidite wurden von Perseptive Biosystems GmbH bezogen.
(SEQ ID NR: 6) CTC GTA CCt TTC CGG TCC. LRMS (ES–) m/z: berechnet: 5453,2; gefunden: 5453,5.
(SEQ ID NR: 8) CTC GTA Ctt ttC CGG TCC. LRMS (ES–) m/z: berechnet: 5693,2; gefunden: 5692,9.
(SEQ ID NR: 12) GCG ttt ttt ttt tGC G. LRMS (ES–) m/z: berechnet: 5625,7; gefunden: 5625,9.
B. Expedite-Syntheseautomat
Oligonucleotide, welche 1-[2'-O-(2-Phthalimido-N-oxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-β-D-ribofuranosyl)-6-N-benzoylthymin einschließen, wurden in einem Expedite 8690 Syntheseautomaten synthetisiert. 130 mg von dem Amidit wurde in trockenem CH₃CN (1,3 ml, ungefähr 0,08 M) gelöst. 10 % t-BuOOH in CH₃CN v/v wurde als Oxidationsmittel verwendet. Verlängerte Kopplungs- und Wartezeiten wurden verwendet, und eine 10 min Oxidation wurde angewendet. Die Oligonucleotidsynthese ergab hervorragende Kopplungsausbeuten (> 98 %). Die Oligonucleotide wurden gereinigt, und ihre Massenspektren und -profile wurden bestimmt.

Oligonucleotid Sequenz SEQ ID NR:

V CTC GTA CCa TTC CGG TCC 13

VI GGa CCG Gaa GGT aCG aG 14

VII aCC GaG GaT CaT GTC GTa CGC 15

wobei a 1-[2'-O-(2-Aminooxyethyl)-β-D-ribofuranosyl]adenosin darstellt.
BEISPIEL 40
Oligonucleotid mit 2'-substituierten Oligonucleotid-Regionen, welche eine zentrale 2'-Desoxyphosphorthioat-Oligonucleotid-Region flankieren
Eine 15mere RNA-Zielsequenz mit der Sequenz 5'-GCGTTTTTTTTTTGCG 3' (SEQ ID NR: 3) wird in normaler Weise mit dem DNA-Sequenzierautomaten unter Verwendung von RNA-Protokollen hergestellt. Eine Reihe von komplementären Phosphorthioat-Oligonucleotiden mit 2'-O-substituierten Nucleotiden in Regionen, welche eine 2'-Desoxy-Region flankieren, werden unter Verwendung von 2'-O-substituierten Nucleotidvorläufern hergestellt, welche wie durch aus der Literatur bekannte Präparationen hergestellt werden, d.h. 2'-O-Methyl, oder wie durch das Verfahren der internationalen Veröffentlichung Nummer WO 92/03568 , veröffentlicht am 5. März 1992. Die 2'-O-substituierten Nucleotide werden als ihre 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-phosphoramidite in der normalen Weise mit dem DNA-Syntheseautomaten hinzugefügt. Die komplementären Oligonucleotide weisen die Sequenz 5' CGCAAAAAAAAAAAAACGC 3' (SEQ ID NR: 4) auf. Der 2'-O-Substituent ist in CGC- und CG-Regionen von diesen Oligonucleotiden lokalisiert. Die verwendeten 2'-O-Substituenten sind 2'-Aminooxyethyl, 2'-O-Ethylaminooxyethyl und 2'-O-Dimethylaminooxyethyl.
BEISPIEL 41
Hybridisierungsanalyse
A. Überprüfung der Thermodynamik der Hybridisierung von 2'-modifizierten Oligonucleotiden.
Die Fähigkeit der 2'-modifizierten Oligonucleotide, mit ihren komplementären RNA- oder DNA-Sequenzen zu hybridisieren, wird durch eine thermische Schmelzanalyse bestimmt. Das RNA-Komplement wird von T7-RNA-Polymerase und einem Matrizen-Promotor aus DNA synthetisiert, welche mit einem Applied Biosystems, Inc. 3808 synthetisiert wurde, die RNA-Probe wird durch Ionenaustausch unter Verwendung einer FPLC (LKB Pharmacia, Inc.) gereinigt. Natürliche Antisense-Oligonucleotide oder jene, welche 2'-Modifikationen an spezifischen Stellen enthalten, werden entweder zu dem RNA- oder dem DNA-Komplement in stöchiometrischen Konzentrationen hinzugefügt, und die Absorptions-(260 nm)-Hyperchromizität beim Übergang einer doppelsträngigen zu einer zufälligen Spirale wird unter Verwendung eines Gilford Response II Spektralphotometers überwacht. Diese Messungen werden in einem Puffer aus 10 mM Na-Phosphat, pH-Wert 7,4, 0,1 mM EDTA und NaCl durchgeführt, um eine Ionenstärke von 10 ent weder 0,1 M oder 1,0 M zu erhalten. Die Daten werden durch eine graphische Darstellung von 1/T_m gegenüber In(Ct) analysiert, wobei (Ct) die Gesamt-Oligonucleotidkonzentration darstellte. Aus dieser Analyse werden die thermodynamischen Parameter bestimmt. Basierend auf der Information, welche bezüglich der Stabilität des Doppelstranges des gebildeten Heterodoppelstranges erhalten wurde, wird das Einbringen von modifiziertem Pyrimidin in Oligonucleotide auf seine Wirkungen auf die Helixstabilität bewertet. Modifikationen, welche die Stabilität des Hybrids drastisch verändern, weisen Reduktionen in der freien Energie (delta G) auf, und es werden Entscheidungen bezüglich ihrer Verwendbarkeit als Antisense-Oligonucleotide getroffen.
Wie in der folgenden Tabelle (Tabelle 1) gezeigt ist, kann der Einschluss von erfindungsgemäßen 2'-substituierten Nucleosiden in Oligonucleotide zu erheblichen Anstiegen der Doppelstrangstabilität des modifizierten Oligonucleotidstrangs (des Antisense-Strangs) und seines komplementären RNA-Strangs (des Sense-Strangs) führen. Die Stabilität des Doppelstrangs stieg an, wenn die Anzahl der 2'-substituierten Nucleoside im Antisense-Strang anstieg. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, führte das Hinzufügen eines 2'-substituierten Nucleosids, unabhängig vom einzelnen Nucleosid oder der Position dieses Nucleosids in der Oligonucleotidsequenz, zu einem Anstieg der Doppelstrang-Stabilität.
In Tabelle 1 stellen die Nucleoside in Kleinbuchstaben die Nucleoside dar, welche erfindungsgemäße Substituenten einschließen. Wirkungen von 2'-O-Aminooxyethoxy-Modifikationen auf die DNA (Antisense)-RNA (Sense)-Doppelstrangstabilität. Tabelle 1

t = 1-[2'-O-(2-Aminooxyethyl)-β-D-ribofuranosyl]thymin. a = 1-[2'-O-(2-Aminooxyethyl)-β-D-ribofuranosyl]adenosin. * = wurde gegen DNA als Sense-Strang hybridisiert.

SEQ ID NR:	Substituenten	T_m °C	ΔT_m °C	ΔT_m °C/Sub.
5	0	65,2 ± 0,0
6	1	64,8 ± 0,1	–0,5 ± 0,1	–0,5 ± 0,1
7	0	61,5 ± 0,0
8	4	65,6 ± 0,4	4,1 ± 0,4	1,0 ± 0,1
9	0	48,2 ± 0,6
10	10	60,0 ± 0,0	11,9 ± 0,7	1,19 ± 0,07
11	0	53,5 ± 0,1✝
12	10	44,0 ± 0,02✝	–9,4 ± 0,3✝	–0,94 ± 0,03✝

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, wiesen die Doppelstränge, welche zwischen RNA und Oligonucleotiden, welche erfindungsgemäße 2'-Substituenten enthielten, gebildet wurden, eine erhöhte Bindungsstabilität auf, wie durch die thermodynamische Hybridisierungsstabilität gemessen wurde. Obwohl wir nicht an eine Theorie gebunden werden wollen, wird zur Zeit angenommen, dass die Anwesenheit eines erfindungsgemäßen 2'-Substituenten zu dem Zucker-Rest des 2'-substituierten Nucleosids führt, welcher im Wesentlichen eine 3'-Endo-Konformation annimmt, und dieses führt zu dem Oligonucleotid-RNA-Komplex, welcher eine helikale A-Typ-Konformation annimmt.
BEISPIEL 42
5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-O²-2'-anhydro-5-methyluridin (101)
O²-2'-Anhydro-5-methyluridin (Pro. Bio. Sint., Varese, Italien, 100,0 g, 0,416 mmol), Dimethylaminopyridin (0,66 g, 0,013 Äq. 0,0054 mmol) wurden in trockenem Pyridin (500 ml) bei Umgebungstemperatur unter einer Argonatmosphäre und unter mechanischem Rühren gelöst. tert-Butyldiphenylchlorsilan (125,8 g, 119,0 ml, 1,1 Äq., 0,458 mmol) wurde in einem Teil hinzugefügt. Die Reaktion wurde für 16 h bei Umgebungstemperatur gerührt. Eine TLC (Rf 0,22, Ethylacetat) wies auf eine vollständige Reaktion hin. Die Lösung wurde unter reduziertem Druck zu einem dicken Öl konzentriert. Dieses wurde zwischen Dichlormethan (1 l) und gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 1 l) und Salzlösung (1 l) aufgeteilt. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck zu einem dicken Öl konzentriert. Das Öl wurde in einem 1:1 Gemisch aus Ethylacetat und Ethylether (600 ml) gelöst, und die Lösung wurde auf –10°C abgekühlt. Das sich ergebende kristalline Produkt wurde durch Filtration gesammelt, mit Ethylether gewaschen (3 × 200 ml) und auf 149 g (74,8 %) eines weißen Feststoffes getrocknet (40°C, 1 mm Hg, 24 h). TLC und NMR stimmten mit dem reinen Produkt überein.
BEISPIEL 43
5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-2'-O-(2-hydroxyethyl)-5-methyluridin (102)
In einen ungerührten 2 l Edelstahl-Druckreaktor wurde Boran in Tetrahydrofuran (1,0 M, 2,0 Äq., 622 ml) hinzugefügt. Im Dunstabzug und unter manuellem Rühren wurde Ethylenglykol (350 ml, Überschuss) zunächst vorsichtig, bis die Entwicklung von Wasserstoffgas abnahm, hinzugefügt. 5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-O²-2'- anhydro-5-methyluridin (149 g, 0,311 mol) und Natriumbicarbonat (0,074 g, 0,003 Äq.) wurden unter manuellem Rühren hinzugefügt. Der Reaktor wurde verschlossen und in einem Ölbad erhitzt, bis eine Innentemperatur von 160°C erreicht war, und anschließend wurde diese für 16 h beibehalten (Druck < 100 psig). Das Reaktionsgefäß wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt und geöffnet. Eine TLC (Rf 0,67 für das gewünschte Produkt und Rf 0,82 für ein ara-T Nebenprodukt, Ethylacetat) zeigte ungefähr 70 % Umwandlung in das Produkt. Um zusätzliche Nebenproduktbildung zu verhindern, wurde die Reaktion abgestoppt, unter reduziertem Druck (10 bis 1 mm Hg) in einem Warmwasserbad (40-100°C) konzentriert, wobei die extremeren Bedingungen verwendet wurden, um das Ethylenglykol zu entfernen. [Alternativ kann, sobald das niedrig siedende Lösungsmittel entfernt ist, die zurückbleibende Lösung zwischen Ethylacetat und Wasser aufgeteilt werden. Das Produkt wird in der organischen Phase sein.] Der Rest wurde durch eine Säulenchromatographie (2 kg Kieselsäuregel, Ethylacetat-Hexane-Gradient 1:1 bis 4:1) gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, desorbiert, und zu einem Produkt als ein weißer, harter Schaum (84 g, 50 %), kontaminiertem Ausgangsmaterial (17,4 g) und reinem wiederverwendtbaren Ausgangsmaterial (20 g) getrocknet. Die Ausbeute basierte auf Ausgangsmaterial, weniger reines, gewonnenes Ausgangsmaterial betrug 58 %. TLC und NMR standen stimmten mit 99 % reinem Produkt überein. NMR (DMSO-d6) d 1,05 (s, 9H, t-Butyl), 1,45 (s, 3H, CH3), 3,5-4,1 (m, 8H, CH2CH2, 3'-H, 4'-H, 5'-H, 5''-H), 4,25 (m, 1H, 2'-H), 4,80 (t, 1H, CH2O-H), 5,18 (d, 2H, 3'-OH), 5,95 (d, 1H, 1'-H), 7,35-7,75 (m, 11H, Ph und C6-H), 11,42 (s, 1H, N-H).
BEISPIEL 44
2'-O-([2-Phthalimidoxy)ethyl]-5'-t-butyldiphenylsilyl-5-methyluridin (103)
Das Nucleosid 102 (20 g, 36,98 mmol) wurde mit Triphenylphosphin (11,63 g, 44,36 mmol) und N-Hydroxyphthalimid (7,24 g, 44,36 mmol) gemischt. Es wurde anschließend über P₂O₅ unter einem Hochvakuum für zwei Tage bei 40°C getrocknet. Das Reaktionsgemisch wurde mit Argon gespült und trockenes THF (369,8 ml, Aldrich, Sicherheitsverschlussflasche) wurde hinzugefügt, um eine klare Lösung zu erhalten. Diethylazodicarboxylat (6,98 ml, 44,36 mmol) wurde tropfenweise zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt. Die Geschwindigkeit des Hinzufügens wird so beibehalten, dass die sich ergebende tiefrote Färbung gerade verschwindet, bevor der nächste Tropfen hinzugefügt wird. Nachdem das Hinzufügen vollständig war, wurde die Reaktion für 4 Std. gerührt. Zu diesem Zeitpunkt zeigte eine TLC die Vollständigkeit der Reaktion (Ethylacetat:Hexan, 60:40). Das Lösungsmittel wurde in Vakuum verdampft. Der erhaltene Rest wurde auf eine Flash-Säule gebracht und mit Ethylacetat:Hexan (60:40) eluiert, um 103 als einen weißen Schaum (21,819, 86 %) zu ergeben. Rf 0,56 (Ethylacetat:Hexan, 60:40). MS (FAB^–) m/e 684 (M – H⁺)
BEISPIEL 45
5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-2'-O-[(2-formadoximinooxy)ethyl]-5-methyluridin (104)
Die Verbindung 103 (3,1 g, 4,5 mmol) wurde in trockenem CH₂Cl₂ (4,5 ml) gelöst, und Methylhydrazin (300 ml, 4,64 mmol) wurde tropfenweise bei –10°C bis 0°C hinzugefügt. Nach 1 h wurde das Gemisch filtriert, das Filtrat wurde mit eiskaltem CH₂Cl₂ gewaschen, und die vereinigte organische Phase wurde mit Wasser, Salzlösung gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Die Lösung wurde konzentriert, um 2'-O-(Aminooxyethyl)thymidin zu erhalten, welches anschließend in MeOH (67,5 ml) gelöst wurde. Zu diesem wurde Formaldehyd (20 % wässrige Lösung, w/w, 1,1 Äq.) hinzugefügt, und das Gemisch für 1 h. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, der Rest wurde chromatographiert, um Verbindung 104 als einen weißen Schaum (1,95, 78 %) zu erhalten. Rf 0,32 (5 % MeOH in CH₂Cl₂). MS (Elektrospray^–) m/e 566 (M – H^•)
BEISPIEL 46
5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-2'-O-[N,N-dimethylaminooxyethyl]-5-methyluridin (105)
Die Verbindung 104 (1,77 g, 3,12 mmol) wurde in einer Lösung aus 1M Pyridinium-p-toluolsulfonat (PPTS) in trockenem MeOH (30,6 ml) gelöst. Natriumcyanoborhydrid (0,39 g, 6,13 mmol) wurde zu dieser Lösung bei 10°C unter einer inerten Atmosphäre hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 10 Minuten bei 10°C gerührt. Danach wurde das Reaktionsgefäß aus dem Eisbad entfernt und bei Raumtemperatur für 2 h gerührt, die Reaktion wurde durch eine TLC (5 % MeOH in CH₂Cl₂) überwacht. Wässrige NaHCO₃-Lösung (5 %, 10 ml) wurde hinzugefügt und mit Ethylacetat (2 × 20 ml) extrahiert. Die Ethylacetat-Phase wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, bis zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde in einer Lösung aus 1 M PPTS in MeOH (30,6 ml) gelöst. Formaldehyd (20 %, w/w, 30 ml, 3,37 mmol) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 10°C in einem Eisbad abgekühlt, Natriumcyanoborhydrid (0,39 g, 6,13 mmol) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei 10°C für 10 Minuten gerührt. Nach 10 Minuten wurde das Reaktionsgemisch aus dem Eisbad entfernt und bei Raumtemperatur für 2 Std. gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde 5 % NaCO₃-Lösung (25 ml) hinzugefügt und mit Ethylacetat (2 × 25 ml) extrahiert. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit verdampft. Der erhaltene Rest wurde durch eine Flash-Säulenchromatographie gereinigt und mit 5 % MeOH in CH₂Cl₂ eluiert, um 105 als einen weißen Schaum (14,6 g, 80 %) zu erhalten. Rf 0,35 (5 % MeOH in CH₂Cl₂). MS (FAB^•) m/e 584 (M + H^•)
BEISPIEL 47
2'-O-(Dimethylaminooxyethyl)-5-methyluridin (106)
Triethylamintrihydrofluorid (3,91 ml, 24,0 mmol) wurde in trockenem THF und Triethylamin (1,67 ml, 12 mmol, trocken, über KOH gelagert) gelöst. Dieses Gemisch aus Triethylamin-2HF wurde anschließend zu der Verbindung 105 (1,40 g, 2,4 mmol) hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 24 Std. gerührt. Die Reaktion wurde durch eine TLC (5 % MeOH in CH₂Cl₂) überwacht. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rest wurde auf eine Flash-Säule gebracht und mit 10 % MeOH in CH₂Cl₂ eluiert, um 106 (766 mg, 92,5 %) zu ergeben. Rf 0,27 (5 % MeOH in CH₂Cl₂). MS (FAB^⊕) m/e 346 (M + H^•)
BEISPIEL 48
5'-O-DMT-2'-O-(Dimethylaminooxyethyl)-5-methyluridin (107)
Die Verbindung 106 (750 mg, 2,17 mmol) wurde über P₂O₅ unter einem Hochvakuum über Nacht bei 40°C getrocknet. Sie wurde anschließend zusammen mit wasserfreiem Pyridin (20 ml) verdampft. Der erhaltene Rest wurde in Pyridin (11 ml) unter einer Argonatmosphäre gelöst. 4-Dimethylaminopyridin (26,5 mg, 2,60 mmol), 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (880 mg, 2,60 mmol) wurden zu dem Gemisch hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt, bis das gesamte Ausgangsmaterial verschwunden war. Pyridin wurde unter Vakuum entfernt, und der Rest wurde chromatographiert und mit 10 % MeOH in CH₂Cl₂ (welches ein paar Tropfen Pyridin enthielt) eluiert, um 107 (1,13 g, 80 %) zu erhalten. Rf 0,44 (10 % MeOH in CH₂Cl₂). MS (FAB^•) m/e 648 (M + H^σ)
BEISPIEL 49
5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-Dimethylaminooxyethyl)-5-methyluridin-3'-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] (108)
Die Verbindung 107 (1,08 g, 1,67 mmol) wurde zusammen mit Toluol (20 ml) verdampft. Zu dem Rest wurde N,N-Diisopropylamintetrazonid (0,29 g, 1,67 mmol) hinzugefügt und über P₂O₅ unter einem Hochvakuum über Nacht bei 40°C ge trocknet. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch in wasserfreiem Acetonitril (8,4 ml) gelöst, und 2-Cyanoethyl-N,N,N¹,N¹-tetraisopropylphosphoramidit (2,12 ml, 6,08 mmol) wurde hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur für 4 Std. unter einer inerten Atmosphäre gerührt. Der Fortschritt der Reaktion wurde durch eine TLC (Hexan:Ethylacetat 1:1) überwacht. Das Lösungsmittel wurde verdampft, anschließend wurde der Rest in Ethylacetat (70 ml) gelöst und mit 5 % wässrigem NaHCO₃ (40 ml) gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Der erhaltene Rest wurde chromatographiert (Ethylacetat als Elutionsmittel), um 108 als einen Schaum (1,04 g, 74,9 %) zu erhalten. Rf 0,25 (Ethylacetat:Hexan, 1:1). ³¹P NMR (CDCl₃) δ 150,8 ppm; MS (FAB^⊕) m/e 848 (M + H^⊕)
BEISPIEL 50
2'/3'-O-Allyladenosin (109)
Adenosin (20 g, 74,84 mmol) wurde über P₂O₅ unter einem Hochvakuum bei 40°C für zwei Tage getrocknet. Es wurde anschließend in DMF unter einer inerten Atmosphäre suspendiert. Natriumhydrid (2,5 g, 74,84 mmol, 60 % Dispersion in Mineralöl), gerührt bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Anschließend wurde Allylbromid (7,14 ml, 82,45 mmol) tropfenweise hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. DMF wurde unter Vakuum entfernt, und der Rest wurde mit Ethylacetat (100 ml) gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde dekantiert. Das erhaltene Filtrat enthielt das Produkt. Es wurde anschließend auf eine Flash-Säule gebracht und mit 10 % MeOH in CH₂Cl₂ eluiert, um 109 (15,19 g, 66 %) zu erhalten. Rf 0,4, 0,4a (10 % MeOH in CH₂Cl₂)
BEISPIEL 51
2'/3'-O-Allyl-N⁶-benzoyladenosin (110)
Die Verbindung 109 (15,19 g, 51,1 mmol) wurde über P₂O₅ unter einem Hochvakuum über Nacht bei 40°C getrocknet. Es wurde anschließend in wasserfreiem Pyridin (504,6 ml) unter einer inerten Atmosphäre suspendiert. Trimethylchlorsilan (32,02 ml, 252,3 mmol) wurde bei 0°C hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde für 1 h unter einer inerten Atmosphäre gerührt. Anschließend wurde Benzoylchlorid (29,4 ml, 252,3 mmol) tropfenweise hinzugefügt. Sobald das Hinzufügen von Benzoylchlorid vorüber war, wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur gebracht und für 4 Std. gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch in einem Eisbad auf 0°C gebracht. Wasser (100,9 ml) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde für 30 Minuten gerührt. Anschließend wurde NH₄OH (100,0 ml, 30 % wässrige Lösung w/w) hinzugefügt, wobei das Reaktionsgemisch bei 0°C gehalten wurde und für 1 weitere Stunde gerührt wurde. Das Lösungsmittel wurde verdampft, der Rest wurde zwischen Wasser und Ether aufgeteilt. Das Produkt präzipitiert als ein Öl, welches anschließend chromatographiert wurde (5 % MeOH in CH₂Cl₂), um 13 als einen weißen Schaum (12,67 g, 62 %) zu erhalten.
BEISPIEL 52
3'-O-Allyl-5'-O-tert-butyldiphenylsilyl-N⁶-benzoyladenosin (111)
Die Verbindung 110 (11,17 g, 27,84) wurde über P₂O₅ unter einem Vakuum bei 40°C getrocknet, anschließend in trockenem CH₂Cl₂ (56 ml, Sicherheitsverschluss von Aldrich) gelöst. 4-Dimethylaminopyridin (0,34 g, 2,8 mmol), Triethylamin (23,82 ml, 167 mmol) und t-Butyldiphenylsilylchlorid wurden hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde kräftig für 12 h gerührt. Die Reaktion wurde durch eine TLC (Ethylacetat:Hexan 1:1) überwacht. Sie wurde anschließend mit CH₂Cl₂ (50 ml) verdünnt und mit Wasser (3 × 30 ml) gewaschen. Die Dichlormethan-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde durch eine Flash-Chromatographie (Ethylacetat:Hexan 1:1 als Elutionsmittel) gereinigt, um 111 als einen weißen Schaum (8,85 g, 49 %) zu erhalten. Rf 0,35 (Ethylacetat:Hexan, 1:1)
BEISPIEL 53
5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-N⁶-benzoyl-2'-O-(2,3-dihydroxypropyl)adenosin (112)
Die Verbindung 111 (5,5 g, 8,46 mmol), 4-Methylmorpholin-N-oxid (1,43 g, 12,18 mmol) wurden in Dioxan (45,42 ml) gelöst. Eine 4 % wässrige Lösung aus OSO₄ (1,99 ml, 0,31 mmol) wurde hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde vor Licht geschützt und für 3 Std. gerührt. Die Reaktion wurde durch ein TLC (5 % MeOH in CH₂Cl₂) überwacht. Ethylacetat (100 ml) wurde hinzugefügt, und das sich ergebende Reaktionsgemisch wurde mit Wasser (1 × 50 ml) gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und verdampft, um 112 (5,9 g) zu erhalten, und für den nächsten Schritt ohne Reinigung verwendet. Rf 0,17 (5 % MeOH in CH₂Cl₂).
BEISPIEL 54
5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-N⁶-benzoyl-2'-O-(formylmethyl)adenosin (113)
Die Verbindung 112 (5,59 g, 8,17 mmol) wurde in trockenem CH₂Cl₂ (40,42 ml) gelöst. Zu diesem wurde NaIO₄, welches an ein Kieselsäuregel absorbiert war (Ref. J. Org. Chem. 1997, 62, 2622-2624) (16,34 g, 2 g/mmol) hinzugefügt und bei Umgebungstemperatur für 30 Minuten gerührt. Die Reaktion wurde durch eine TLC (5 % MeOH in CH₂Cl₂) überwacht. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und die Filtrate wurden gründlich mit CH₂Cl₂ gewaschen. Die Dichlormethan-Schicht wurde verdampft, um das Aldehyd 113 (5,60 g) zu erhalten, welches im nächsten Schritt ohne Reinigung verwendet wurde. Rf 0,3 (5 % MeOH in CH₂Cl₂)
BEISPIEL 55
5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-N⁶-2'-O-(2-hydroxyethyl)adenosin (114)
Die Verbindung 113 (5,55 g, 8,50 mmol) wurde in einer Lösung aus 1 M Pyridinium-p-toluolsulfonat in wasserfreiem MeOH (85 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde vor Feuchtigkeit geschützt. Natriumcyanoborhydrid (1,08 g, 17,27 mmol) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur für 5 Std. gerührt. Der Fortschritt der Reaktion wurde durch eine TLC (5 % MeOH in CH₂Cl₂) überwacht. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat (150 ml) verdünnt, anschließend mit 5 % NaHCO₃ (75 ml) und Salzlösung (75 ml) gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde durch eine Flash-Chromatographie (5 % MeOH in CH₂Cl₂) gereinigt, um 114 (4,31 g, 77,8 %) zu erhalten. Rf 0,21 (5 % MeOH in CH₂Cl₂). MS (FAB^•) m/e 655 (M + H^•), 677 (M + Na^•)
BEISPIEL 56
5'-tert-Butyldiphenylsilyl-N⁶-benzoyl-2'-O-(2-phthalimidooxyethyl)adenosin (115)
Die Verbindung 114 (3,22 g, 4,92 mmol) wurde mit Triphenylphosphin (1,55 g, 5,90 mmol) und N-Hydroxyphthalimid (0,96 g, 5,90 mmol) gemischt. Sie wurde anschließend über P₂O₅ unter einem Vakuum bei 40°C für zwei Tage getrocknet. Gelöstes, getrocknetes Gemisch in wasserfreiem THF (49,2 ml) unter einer inerten Atmosphäre. Diethylazodicarboxylat (0,93 ml, 5,90 mmol) wurde tropfenweise hinzugefügt. Die Geschwindigkeit des Hinzufügens wurde beibehalten, so dass die sich ergebende tiefrote Färbung gerade verschwand, bevor der nächste Tropfen hinzugefügt wurde. Nachdem das Hinzufügen abgeschlossen war, wurde die Reaktion für 4 Std. gerührt, durch eine TLC (Ethylacetat:Hexan 70:30) überwacht. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rest in Ethylacetat (75 ml) gelöst. Die Ethylacetat-Schicht wurde mit Wasser (75 ml) gewaschen, anschließend über Na₂SO₄ getrocknet, konzentriert und chromatographiert (Ethylacetat:Hexan 70:30), um 115 (3,60 g, 91,5 %) zu erhalten. Rf 0,27 (Ethylacetat:Hexan, 7:3) MS (FAB^•) m/e 799 (M + H^•), 821 (M + Na^•)
BEISPIEL 57
5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-N⁶-benzoyl-2'-O-(2-formaldoximinooxyethyl)adenosin (116)
Die Verbindung 115 (3,5 g, 4,28 mmol) wurde in CH₂Cl₂ (43,8 ml) gelöst. N-Methylhydrazin (0,28 ml, 5,27 mmol) wurde bei –10°C hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei –10 bis 0°C gerührt. Die Reaktion wurde durch eine TLC (5 % MeOH in CH₂Cl₂) überwacht. Ein weißes Präzipitat, welches sich bildete, wurde filtriert, und das Filtrat wurde gründlich mit eiskaltem CH₂Cl₂ gewaschen. Die Dichlormethan-Schicht wurde mit einem Rotavapor-Rotationsverdampfer verdampft, wobei die Temperatur des Wasserbads des Rotavapors bei weniger als 25°C gehalten wurde. Der erhaltene Rest wurde anschließend in MeOH (65,7 ml) gelöst. Formaldehyd (710 ml, 4,8 mmol, 20 % Lösung in Wasser) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur für 1 h gerührt. Die Reaktion wurde durch eine ¹H NMR überwacht. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert und chromatographiert (5 % MeOH in CH₂Cl₂), um 116 als einen weißen Schaum (2,47 g, 83 %) zu erhalten. Rf 0,37 (5 % MeOH in CH₂Cl₂). MS (FAB^•) m/e 681 (M + H^σ)
BEISPIEL 58
5'-tert-Butyldiphenylsilyl-N⁶-benzoyl-2'-O-(2-N,N-dimethylaminooxyethyl)adenosin (117)
Die Verbindung 116 (2,2 g, 3,23 mmol) wurde in einer Lösung aus 1 M Pyridinium-p-toluolsulfonat (PPTS) in MeOH (32 ml) gelöst. Die Reaktion wurde vor Feuchtigkeit geschützt. Natriumcyanoborhydrid (0,31 g) wurde bei 10°C hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde für 10 Minuten bei 10°C gerührt. Es wurde anschließend auf Umgebungstemperatur gebracht und für 2 Std. gerührt, durch eine TLC (5 % MeOH in CH₂Cl₂) überwacht. 5 % wässriges Natriumbicarbonat (100 ml), und es wurde mit Ethylacetat (3 × 50 ml) extrahiert. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde in einer Lösung aus 1 M PPTS in MeOH (32 ml) gelöst. Formaldehyd (0,54 ml, 3,55 mmol, 20 % wässrige Lösung) wurde hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt. Natriumcyanoborhydrid (0,31 g) wurde bei 10°C hinzugefügt und für 10 Minuten bei 10°C gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch aus dem Eisbad entfernt und bei Raumtemperatur für weitere 2 Std. gerührt, durch eine TLC (5 % MeOH in CH₂Cl₂) überwacht. Das Reaktionsgemisch wurde mit 5 % wässrigem NaHCO₃ (100 ml) verdünnt und mit Ethylacetat (3 × 50 ml) extrahiert. Die Ethylacetat-Schicht wurde getrocknet, verdampft und chromatographiert (5 % MeOH in CH₂Cl₂), um 117 (1,9 g, 81,8 %) zu erhalten. Rf 0,29 (5 % MeOH in CH₂Cl₂). MS (FAB^•) m/e 697 (M + H^•), 719 (M + Na^•)
BEISPIEL 59
N⁶-Benzoyl-2'-O-(N,N-dimethylaminooxyethyl)adenosin (118)
Zu einer Lösung aus Et₃N-3HF (1,6 g, 10 mmol) in wasserfreiem THF (10 ml) wurde Triethylamin (0,71 ml, 5,12 mmol) hinzugefügt. Anschließend wurde dieses Gemisch zu Verbindung 117 (0,72 g, 1 mmol) hinzugefügt und bei Raumtemperatur unter einer inerten Atmosphäre für 24 Std. gerührt. Die Reaktion wurde durch eine TLC (10 % MeOH in CH₂Cl₂) überwacht. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rest wurde chromatographiert (10 % MeOH in CH₂Cl₂), um 118 (0,409 g, 89 %) zu erhalten. Rf 0,40 (10 % MeOH in CH₂Cl₂). MS (FAB^⊕) m/e 459 (M + H^•)
BEISPIEL 60
5'-O-Dimethoxytrityl-N⁶-benzoyl-2'-O-(2-N,N-dimethylaminooxyethyl)adenosin (119)
Die Verbindung 118 (0,4 g, 0,87 mmol) wurde über P₂O₅ unter Vakuum über Nacht bei 40°C getrocknet. 4-Dimethylaminopyridin (0,022 g, 0,17 mmol) wurde hinzugefügt. Anschließend wurde es zusammen mit wasserfreiem Pyridin (9 ml) verdampft. Der Rest wurde in wasserfreiem Pyridin (2 ml) unter einer inerten Atmosphäre gelöst, und 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (0,58 g, 1,72 mmol) wurde hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 4 Std. gerührt. Eine TLC (5 % MeOH in CH₂Cl₂) zeigte die Vollständigkeit der Reaktion. Pyridin wurde unter Vakuum entfernt, der Rest in CH₂Cl₂ (50 ml) gelöst und mit wässriger 5 % NaHCO₃-Lösung (30 ml), gefolgt von Salzlösung (30 ml) gewaschen. Die CH₂Cl₂-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und verdampft. Der Rest wurde chromatographiert (5 % MeOH in CH₂Cl₂, welches wenige Tropfen Pyridin enthielt), um 119 (0,5 g, 75 %) zu erhalten. Rf 0,20 (5 % MeOH in CH₂Cl₂). MS (Elektrospray^–) m/e 759 (M + H^⊕)
BEISPIEL 61
N⁶-Benzoyl-5'-O-DMT-2'-O-(N,N-dimethylaminooxyethyl)adenosin-3'-O-phosphoramidit (120)
Die Verbindung 119 (0,47 g, 0,62 mmol) wurde zusammen mit Toluol (5 ml) verdampft. Der Rest wurde mit N,N-Diisopropylamintetrazolid (0,106 g, 0,62 mmol) gemischt und über P₂O₅ unter einem Hochvakuum über Nacht getrocknet. Anschließend wurde er in wasserfreiem CH₃CN (3,2 ml) unter einer inerten Atmosphäre gelöst. 2-Cyanoethyltetraisopropylphosphordiamidit (0,79 ml, 2,48 mmol) wurde tropfenweise hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur unter einer inerten Atmosphäre für 6 Std. gerührt. Die Reaktion wurde durch eine TLC (Ethylacetat, welches einige Tropfen Pyridin enthielt) überwacht. Das Lösungsmittel wurde entfernt, anschließend wurde der Rest in Ethylacetat (50 ml) gelöst und mit 5 % wässrigem NaHCO₃ (2 × 25 ml) gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, verdampft, und der Rest wurde chromatographiert (Ethylacetat, welches einige Tropfen Pyridin enthielt), um 120 (0,45 g, 76 %) zu erhalten. MS (Elektrospray^–) m/e 959 (M + H^σ). ³¹P NMR (CDCl₃) δ 151,36, 150,77 ppm
BEISPIEL 62
2'/3'-O-Allyl-2,6-diaminopurinribosid (121 und 122)
2,6-Diaminopurinribosid (30 g, 106,4 mmol) wurde in wasserfreiem DMF (540 ml) suspendiert. Das Reaktionsgefäß wurde mit Argon durchspült. Natriumhydrid (3,6 g, 106,4 mmol, 60 % Dispersion in Mineralöl) wurde hinzugefügt und die Reaktion für 10 min gerührt. Allylbromid (14,14 ml, 117,22 mmol) wurde tropfenweise über 20 min hinzugefügt. Das sich ergebende Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 20 h gerührt. Eine TLC (10 % MeOH in CH₂Cl₂) zeigte ein vollständiges Verschwinden des Ausgangsmaterials. DMF wurde unter Vakuum entfernt, und der Rest, welcher auf Kieselsäure absorbiert war, wurde auf eine Flash-Säule gebracht und mit 10 % MeOH in CH₂Cl₂ eluiert. Die Fraktionen, welche ein Gemisch aus 2'- und 3'-allyliertem Produkt enthielten, wurden zusammengefasst und bis zur Trockenheit konzentriert, um ein Gemisch aus 121 und 122 (26,38 g, 77 %) zu ergeben. Rf 0,26, 0,4 (10 % MeOH in CH₂Cl₂)
BEISPIEL 63
2'-O-Allylguanosin (123)
Ein Gemisch aus 121 und 122 (20 g, 62,12 mmol) wurde in 100 mm Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,5) suspendiert, und Adenosindesaminase (1 g) wurde hinzugefügt. Die sich ergebende Lösung wurde sehr langsam für 60 h gerührt, wobei das Reaktionsgefäß zur Atmosphäre offen gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend in einem Eisbad für eine Std. abgekühlt, und das erhaltene Präzipitat wurde filtriert, über P₂O₅ unter einem Hochvakuum getrocknet, um 123 als weißes Pulver (13,92 g, 69,6 % Ausbeute) zu ergeben. Rf 0,19 (20 % MeOH in CH₂Cl₂)
BEISPIEL 64
2'-O-Allyl-3',5'-bis(tert-butyldiphenylsilyl)guanosin (124)
2'-O-Allylguanosin (6 g, 18,69 mmol) wurde mit Imidazol (10,18 g, 14,952 mmol) gemischt und wurde über P₂O₅ unter einem Hochvakuum über Nacht getrocknet. Es wurde anschließend mit Argon durchgespült. Wasserfreies DMF (50 ml) wurde hinzugefügt und mit dem Reaktionsgemisch für 10 Minuten gerührt. Zu diesem wurde tert-Butyldiphenylsilylchlorid (19,44 ml, 74,76 mmol) hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter einer Argonatmosphäre gerührt. Das DMF wurde unter Vakuum entfernt, und der Rest wurde in Ethylacetat (100 ml) gelöst und mit Wasser (2 × 75 ml) gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde auf eine Flash-Säule gebracht und mit 5 % MeOH in CH₂Cl₂ eluiert. Fraktionen, welche das Produkt enthielten, wurden zusammengefasst und verdampft, um 124 (10,84 g, 72 % Ausbeute) als einen weißen Schaum zu ergeben. Rf = ? MS (FAB^•) m/e 800 (M + H^σ), 822 (M + Na^⊕)
BEISPIEL 65
2'-O-(2-Hydroxyethyl)-3',5'-bis(tert-butyldiphenylsilyl)guanosin (125)
Die Verbindung 124 (9 g, 11,23 mmol) wurde in CH₂Cl₂ (80 ml) gelöst. Zu der klaren Lösung wurden Aceton (50 ml), 4-Methylmorpholin-N-oxid (1,89 g, 16,17 mmol) hinzugefügt. Der Reaktionskolben wurde vor Licht geschützt. So wurden 4 % wässrige Lösung aus Osmiumtetroxid hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 6 h gerührt. Das Reaktionsvolumen wurde auf die Hälfte konzentriert, und Ethylacetat (50 ml) wurde hinzugefügt. Es wurde anschließend mit Wasser (30 ml) und Salzlösung (30 ml) gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde anschließend in CH₂Cl₂ gelöst, und NaIO₄, welches an Kieselsäure (21,17 g, 2 g/mmol) absorbiert war, wurde hinzugefügt und mit dem Reaktionsgemisch für 30 min gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und die Kieselsäure wurde gründlich mit CH₂Cl₂ gewaschen. Die vereinigte CH₂Cl₂- Schicht wurde bis zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde anschließend in 1 M Pyridinium-p-toluolsulfonat (PPTS) in trockenem MeOH (99,5 ml) unter einer inerten Atmosphäre gelöst. Zu der klaren Lösung wurde Natriumcyanoborhydrid (1,14 g, 18,2 mmol) hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 4 h gerührt. 5 % wässriges Natriumbicarbonat (50 ml) wurde langsam zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt und mit Ethylacetat (2 × 50 ml) extrahiert. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde auf eine Flash-Säule gebracht und mit 10 MeOH in CH₂Cl₂ eluiert, um 125 (6,46 g, 72 % Ausbeute) zu ergeben. MS (Elektrospray^–) m/e 802 (M – H^•)
BEISPIEL 66
2'-O-[(2-Phthalimidoxy)ethyl]-3'-5'-bis(tert-butyldiphenylsilyl)guanosin (126)
Die Verbindung 125 (3,7 g, 4,61 mmol) wurde mit Ph₃P (1,40 g, 5,35 mmol) und Hydroxyphthalimid (0,87 g, 5,35 mmol) gemischt. Anschließend wurde sie über P₂O₅ unter einem Hochvakuum für zwei Tage bei 40°C getrocknet. Dazu wurde wasserfreies THF (46,1 mmol) hinzugefügt, um eine klare Lösung unter einer inerten Atmosphäre zu erhalten. Diethylazidocarboxylat (0,73 ml, 4,61 mmol) wurde tropfenweise in einer solchen Weise hinzugefügt, dass die rote Farbe vor dem Hinzufügen des nächsten Tropfens verschwindet. Die sich ergebende Lösung wurde anschließend bei Raumtemperatur für 4 Std. gerührt. Das THF wurde unter Vakuum entfernt, und der Rest wurde in Ethylacetat (75 ml) gelöst und mit Wasser (2 × 50 ml) gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit konzentriert. Der Rest wurde durch eine Säulenchromatographie gereinigt und mit 7 % MeOH in Ethylacetat eluiert, um 126 (2,62 g, 60 % Ausbeute) zu ergeben. Rf 0,48 (10 % MeOH in CH₂Cl₂). MS (FAB^–) m/e 947 (M – H^⊕)
BEISPIEL 67
2'-O-(2-Phthalimido-N-oxyethyl)-3',5'-O-bis-tert-butyldiphenylsilyl-N2-isobutyrylguanosin (127)
2'-O-(2-Phthalimido-N-oxyethyl)-3',5'-O-bis-tert-butyldiphenylsilylguanosin (3,66 g, 3,86 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (40 ml) gelöst, die Lösung wurde auf 5°C abgekühlt, und Isobutyrylchlorid (0,808 ml, 7,72 mmol) wurde tropfenweise hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 25°C erwärmt und nach 2 h wurde zusätzliches Isobutyrylchlorid (0,40 ml, 3,35 mmol) bei 25°C hinzugefügt. Nach 1 h wurde das Lösungsmittel in vacuo (0,1 Torr) bei 30°C verdampft, um einen Schaum zu ergeben, der in Ethylacetat (150 ml) gelöst wurde, um eine feine Suspension zu ergeben. Die Suspension wurde mit Wasser (2 × 15 ml) und Salzlösung (4 ml) gewaschen, und die organische Schicht wurde getrennt und über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft, um einen Schaum zu ergeben, welcher durch eine Säulenchromatographie unter Verwendung von CH₂Cl₂-MeOH, 94:6, v/v, gereinigt wurde, um die Titelverbindung als einen weißen Schaum (2,57 g, 65 %) zu liefern. ¹H NMR (CDCl₃): d 11,97 (br s, 1H), 8,73 (s, 1H), 7,8-7,2 (m, 25H), 5,93 (d, 1H, J_1',2' = 3,3 Hz), 4,46 (m, 1H), 4,24 (m, 2H), 3,83 (m, 2H), 3,60 (m, 2H), 3,32 (m, 1H), 2,67 (m, 1H), 1,30 (d, 3H, J = 3,2 Hz), 1,26 (d, 3H, J = 3,1 Hz), 1,05 (s, 9H), 1,02 (s, 9H).
Diese Verbindung wurde weiterhin in das entsprechende Phosphoramidit unter Verwendung der oben für die A- und T-Analoge beschriebenen Chemien derivatisiert, um Verbindung 128 zu ergeben.
BEISPIEL 68
3'-O-Acetyl-2'-O-(2-N,N-dimethylaminooxyethyl)-5'-O-tert-butyldiphenylsilylthymidin (129)
Die Verbindung 105 (3,04 g, 5,21 mmol) wurde in Chloroform (11,4 ml) gelöst. Dazu wurde Dimethylaminopyridin (0,99 g, 8,10 mmol) hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde für 10 Minuten gerührt. Essigsäureanhydrid (0,701 g, 6,87 mmol) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit CH₂Cl₂ (40 ml) verdünnt und mit gesättigtem NaHCO₃ (30 ml) und Salzlösung (30 ml) gewaschen. Die CH₂Cl₂-Schicht wurde bis zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde auf eine Flash-Säule gebracht und mit Ethylacetat:Hexan (80:20) eluiert, um 129 zu ergeben. Rf 0,43 (Ethylacetat:Hexan, 80:20). MS (Elektrospray^–) m/e 624 (M – H^•)
BEISPIEL 69
2'-O-(2-N,N-Dimethylaminooxyethyl)-5'-O-tert-butyldiphenylsilyl-5-methylcytidin (130)
Eine Suspension aus 1,2,4-Triazol (5,86 g, 84,83 mmol) in wasserfreiem CH₃CN (49 ml) wurde in einem Eisbad für 5 bis 10 min unter einer Argonatmosphäre abgekühlt. Zu dieser kalten Suspension wurde langsam POCl₃ (1,87 ml, 20 mmol) über 10 min hinzugefügt, und das Rühren wurde für weitere 5 min fortgesetzt. Triethylamin (13,9 ml, 99,8 mmol) wurde langsam über 30 min hinzugefügt, wobei die Badtemperatur um 0-2°C gehalten wurde. Nachdem das Hinzufügen vollständig war, wurde das Reaktionsgemisch bei dieser Temperatur für weitere 30 Minuten gerührt, als Verbindung 35 (3,12 g, 4,99 mol) in wasserfreiem Acetonitril (3 ml) in einem Teil hinzugefügt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0-2°C für 10 min gerührt. Anschließend wurde das Eisbad entfernt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 1,5 Std. gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf °C abgekühlt, und dieses wurde auf ein kleineres Volumen konzentriert und in Ethylacetat (100 ml) gelöst, mit Wasser (2 × 30 ml) und Salzlösung (30 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit konzentriert. Der erhaltene Rest wurde anschließend in einer gesättigten Lösung aus NH₃ in Dioxan (25 ml) gelöst und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rest wurde durch eine Säulenchromatographie gereinigt und mit 10 % MeOH in CH₂Cl₂ eluiert, um 130 zu erhalten.
BEISPIEL 70
2'-O-(2-N,N-Dimethylaminooxyethyl)-N⁴-benzoyl-5'-O-tert-butyldiphenylsilylcytidin (131)
Die Verbindung 130 (2,8 g, 4,81 mmol) wurde in wasserfreiem DMF (12,33 ml) gelöst. Benzoesäureanhydrid (1,4 g, 6,17 mmol) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Methanol wurde hinzugefügt (1 ml) und das Lösungsmittel bis zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde in Dichlormethan (50 ml) gelöst und mit einer gesättigten Lösung aus NaHCO₃ (2 × 30 ml), gefolgt von Salzlösung (30 ml) gewaschen. Die Dichlormethan-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Der erhaltene Rest wurde durch eine Säulenchromatographie gereinigt und mit 5 % MeOH in CH₂Cl₂ eluiert, um 131 als einen Schaum zu ergeben.
BEISPIEL 71
N⁴-Benzoyl-2'-O-(2-N,N-dimethylaminooxyethyl)-5-methylcytidin (132)
Die Verbindung 131 (2,5 g, 3,9 mmol) wurde über P₂O₅ unter einem Hochvakuum getrocknet. In einem 100 ml Rundkolben wird Triethylamintrihydrofluorid (6,36 ml, 39 mmol) in wasserfreiem THF (39 ml) gelöst. Dazu wurde Triethylamin (2,72 ml, 19,5 mmol) hinzugefügt, und das Gemisch wurde schnell in Verbindung 131 gegossen und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum entfernt und der Rest in einer Flash-Säule gehalten und mit 10 % MeOH in CH₂Cl₂ eluiert, um 132 zu ergeben.
BEISPIEL 72
N⁴-Benzoyl-2'-O-(2-N,N-dimethylaminooxyethyl)-5-O'-dimethoxytrityl-5-methylcytidin (133)
Die Verbindung 132 (1,3 g, 2,98 mmol) wurde über P₂O₅ unter einem Hochvakuum über Nacht getrocknet. Sie wurde anschließend zusammen mit wasserfreiem Pyridin (10 ml) verdampft. Der Rest wurde in wasserfreiem Pyridin (15 ml) gelöst, 4-Dimethylaminopyridin (10,9 mg, 0,3 mmol) wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre für 4 Std. gerührt. Das Pyridin wurde unter Vakuum entfernt und der Rest in Ethylacetat gelöst und mit 5 % NaHCO₃ (20 ml) und Salzlösung (20 ml) gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit konzentriert. Der Rest wurde auf eine Flash-Säule gebracht und mit 10 % MeOH in CH₂Cl₂, welches wenige Tropfen Pyridin enthielt, eluiert, um die Verbindung 133 zu ergeben.
BEISPIEL 73
N⁴-Benzoyl-2'-O-(2-N,N-dimethylaminooxyethyl)-5-dimethoxytrityl-5-methylcytidin-3'-O-phosphoramidit (134)
Die Verbindung 133 (1,54 g, 2,09 mmol) wurde zusammen mit Toluol (10 ml) verdampft. Sie wurde anschließend mit Diisopropylamintetrazolid (0,36 g, 2,09 mmol) gemischt und über P₂O₅ unter einem Hochvakuum bei 40°C über Nacht getrocknet. Anschließend wurde sie in wasserfreiem Acetonitril (11 ml) gelöst, und 2-Cyanoethyltetraisopropylphosphoramidit (2,66 ml, 8,36 mmol) wurde hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur unter einer inerten Atmosphäre für 4 Std. gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Ethylacetat (50 ml) wurde zu dem Rest hinzugefügt und mit 5 % NaHCO₃ (30 ml) und Salzlösung (30 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit konzentriert. Der Rest wurde auf eine Flash-Säule gebracht und mit Ethylacetat:Hexan (60:40), welches wenige Tropfen Pyridin enthielt, eluiert, um 134 zu erhalten.
BEISPIEL 74
2'-O-Dimethylaminooxyethyl-2,6-diaminopurinribosidphosphoramidit (135)
Für den Einschluss von 2'-O-Dimethylaminooxyethyl-2,6-diaminopurinribosid in Oligonucleotide wählten wir das Phosphoramidit des geschützten 6-Amino-2-fluorpurinribosids 135 aus, um es zu verwenden. Nach einer Oligonucleotidsynthese wird, zusammen mit der Entschützung der Oligonucleotid-Schutzgruppen, die 2-Fluor-Gruppe mit Ammoniak ersetzt, um das 2,6-Diaminopurinribosid-Analog zu ergeben. Dann wird 2,6-Diaminopurinribosid mit Diemethylaminooxyethylbromid 136 alkyliert, um ein Gemisch aus 2'-O-Dimethylaminooxyethyl-2,6-diaminopurinribosid 137 und dem 3'-Isomer 138 zu liefern. Typischerweise kann nach dem Funktionalisieren des 5'-Hydroxyls mit DMT, um die 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-O-dimethylaminooxyethyl-2,6-diaminopurinribosid 139 bereitzustellen, das 2'-Isomer chromatographisch getrennt werden. Eine Fluorierung von 139 über die Schiemann-Reaktion (Krolikiewicz, K.; Vorbruggen, H. Nucleosides Nucleotides, 1994, 13, 673-678) stellt 2'-O-Dimethylaminooxyethyl-6-amino-2-fluorpurinribosid 140 bereit, und Standardschutz-Protokolle liefern 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-O-dimethylaminooxyethyl-6-dimethylformamidin-2-fluorpurinribosid 140. Eine Phosphitylierung von 140 ergibt 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-O-dimethylaminooxyethyl-6-dimethylformamidin-2-fluorpurinribosid-3'-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] 138.
In dem Fall, dass die Verbindung 139 chromatographisch nicht von dem 3'-Isomer getrennt werden kann, kann das Gemisch aus den Verbindungen 137 und 138 mit Adenosindesaminase behandelt werden, für welche bekannt ist, dass sie selektiv 2'-O-substituierte Adenosinanaloge bevorzugt gegenüber dem 3'-O-Isomer desaminiert, um 2'-O-Dimethylaminooxyethylguanosin 142 zu liefern.
5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-O-dimethylaminooxyethylguanosin 140 kann in das 2,6-Diaminopurinribosid-Analogon 139 durch eine Aminierung der 6-Oxo-Gruppe umgewandelt werden (Gryaznov, S.; Schultz, R. G. Tetrahedron Lett. 1994, 2489-2492). Dies wurde anschließend durch Standard-Schutzverfahren und -Protokolle zur Phosphitylierung in das entsprechende Amidit 144 umgewandelt.
BEISPIEL 75
2'/3-O-[2-(tert-Butyldimethylsilylhydroxy)ethyl]-2,6-diaminopurinribosid (145 und 146)
2,6-Diaminopurinribosid (10 g, 35,46 mmol) wurde über P₂O₅ unter einem Hochvakuum über Nacht getrocknet. Es wurde in wasserfreiem DMF (180 ml) suspendiert, und NaH (1,2 g, 35,46 mmol, 60 % Dispersion in Mineralöl) wurde hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur in einer inerten Atmosphäre für 30 Minuten gerührt. Dazu wurde (2-Bromethoxy)-tert-butyldimethylsilan (12,73 g, 53,2 mmol) tropfenweise hinzugefügt, und die sich ergebende Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das DMF wurde unter Vakuum entfernt, der Rest wurde in Ethylacetat (100 ml) gelöst und mit Wasser (2 × 70 ml) gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit konzentriert. Der Rest wurde auf eine Flash-Säule gebracht und mit 5 % MeOH in CH₂Cl₂ eluiert, um ein Gemisch aus Produkten (6,0711 g, 31 % Ausbeute) zu erhalten. Rf 0,49, 0,59, 0,68 (5 % MeOH in CH₂Cl₂).
BEISPIEL 76
2'-O-Aminooxyethyl-Analoge
Verschiedene andere 2'-O-Aminooxyethyl-Analoge des Nucleosids (für z.B. 2,6-Diaminopurinribosid) können als Verbindungen 154 hergestellt werden. Dann ergibt eine Alkylierung von 2,6-Diaminopurin mit (2-Bromethoxy)-tert-butyldimethylsilan 2'-O-tert-Butyldimethylsilyloxyethyl-2,6-diaminopurinribosid 145 und das 3'-Isomer 146. Das gewünschte 2'-O-Isomer kann durch eine Präparation von 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-O-tert-butyldimethylsilyloxyethyl-2,6-diaminopurinribosid 147 und durch Unterziehen des Gemisches einer Säulenchromatographie getrennt werden. Die Entschützung der Silyl-Gruppe stellt 5'-O-(4,4'- Dimethoxytrityl)-2'-O-hydroxyethyl-2,6-diaminopurinribosid 148 bereit, welches eine Mitsunobu-Reaktion durchläuft, um 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-O-(2-phthalimido-N-oxyethyl)-2,6-diaminopurinribosid 149 zu ergeben. Eine Behandlung von 149 unter Schiemann-Bedingungen bewirkt eine Fluorierung und Entschützung der DMT-Gruppe, um 2'-O-(2-Phthalimido-N-oxyethyl)-6-amino-2-fluorpurinribosid 150 zu ergeben. Standard-Schutzbedingungen stellen 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-O-(2-phthalimido-N-oxyethyl)-6-dimethylformamidin-2-fluorpurinribosid 151 bereit, und eine Entschützung der Phthalimido-Funktion liefert 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-O-aminooxyethyl-6-dimethylformamidin-2-fluorpurinribosid 152.
Eine reduktive Aminierung von 152 mit Aldehyden oder Dialdehyden führt zu cyclischen oder acyclischen, disubstituierten 2'-O-Aminooxyethyl-Analogen 153. Eine Phosphitylierung von 153 stellt cyclische oder acyclische, disubstituierte 2'-O-Aminooxyethyl-Analoge 154 als Phosphoramidite bereit.
BEISPIEL 77
2'/3'-O-(2-tert-Butyldimethylsilylhydroxyethyl)adenosin (155 und 156)
Adenosin (10 g, 37,42 mmol) wurde über P₂O₅ unter einem Hochvakuum getrocknet. Anschließend wurde es in wasserfreiem DMF (150 ml) suspendiert, und NaH (1,35 g, 56,13 mmol) wurde hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur unter einer inerten Atmosphäre für 30 min gerührt. Anschließend wurde (2-Bromethyl)-tert-butyldimethylsilan (9,68 ml, 4,4,90 mmol) tropfenweise hinzugefügt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das DMF wurde unter Vakuum entfernt, und zu dem Rest wurde Dichlormethan (100 ml) hinzugefügt und mit Wasser (2 × 80 ml) gewaschen. Die Dichlormethan-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde durch eine Säule gereinigt, um ein Gemisch aus Produkten (4,30 g) zu erhalten. Rf 0,49, 0,57 (10 % MeOH in CH₂Cl₂)
BEISPIEL 78
2'-O-(2-Methyleniminooxyethyl)thymidin (157)
Die Verbindung 104 (3,10 g, 5,48 mmol) wurde über P₂O₅ unter einem Hochvakuum getrocknet. In einem 100 ml Rundkolben wurde Triethylamintrihydrofluorid (8,93 ml, 54,8 mmol) in wasserfreiem THF gelöst, und Triethylamin (3,82 ml, 27,4 mmol) wurde hinzugefügt. Die sich ergebende Lösung wurde sofort zu der Verbindung 104 hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Der erhaltene Rest wurde auf eine Flash-Säule gebracht und mit 10 % MeOH in CH₂Cl₂ eluiert, um 157 als einen weißen Schaum (1,35 g, 75 % Ausbeute) zu ergeben. Rf 0,45 (5 % MeOH in CH₂Cl₂). MS (FAB^⊕) m/e 330 (M + H^⊕), 352 (M + Na^•)
BEISPIEL 79
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-(2-methyleniminooxyethyl)thymidin (158)
Die Verbindung 157 (0,64 g, 1,95 mmol) wurde über P₂O₅ unter einem Hochvakuum über Nacht getrocknet. Anschließend wurde sie zusammen mit wasserfreiem Pyridin (5 ml) verdampft. Der Rest wurde in wasserfreiem Pyridin (4,43 ml) und Dimethoxytritylchlorid (0,79 g, 2,34 mmol) gelöst, und 4-Dimethylaminopyridin (23,8 mg, 0,2 mmol) wurde hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde unter einer inerten Atmosphäre bei Umgebungstemperatur für 4 Std. gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, der Rest durch eine Säule gereinigt und mit 5 % MeOH in CH₂Cl₂, welches wenige Tropfen Pyridin enthielt, eluiert, um 158 als einen Schaum (1,09 g, 88 % Ausbeute) zu ergeben. Rf 0,4 (5 % MeOH in CH₂Cl₂). MS (Elektrospray^–) m/e 630 (M – H^⊕)
BEISPIEL 80
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-(2-methyleniminooxyethyl)thymidin-3'-O-phosphoramidit (159)
Die Verbindung 158 (0,87 g, 1,34 mmol) wurde zusammen mit Toluol (10 ml) verdampft. Der Rest wurde anschließend mit Diisopropylamintetrazolid (0,23 g, 1,34 mmol) gemischt und über P₂O₅ unter einem Hochvakuum über Nacht getrocknet. Anschließend wurde er mit Argon durchgespült. Wasserfreies Acetonitril (6,7 ml) wurde hinzufügt, um eine klare Lösung zu erhalten. Zu dieser Lösung wurde 2-Cyanoethyltetraisopropylphosphordiamidit (1,7 ml, 5,36 mmol) hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 6 Std. unter einer inerten Atmosphäre gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, der Rest wurde mit Ethylacetat (40 ml) verdünnt und mit 5 % NaHCO₃ (20 ml) und Salzlösung (20 ml) gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit konzentriert. Der Rest wurde auf eine Flash-Säule gebracht und mit Ethylacetat:Hexan (60:40) eluiert, um 159 (1,92 g, 80 % Ausbeute) zu ergeben. Rf 0,34 (Ethylacetat:Hexan, 60:40). ³¹P NMR (CDCl₃) 150,76 ppm, MS (Elektrospray^–) m/e 830 (M – H^⊕)
BEISPIEL 81
Allgemeines Verfahren der Anheftung eines Nucleosids an einen festen Träger
Die Verbindung 107 (200 mg, 0,31 mmol) wurde mit DMAP (19 mg, 16 mmol), Succinsäureanhydrid (47 mg, 0,47 mmol), Triethylamin (86 ml, 0,62 mmol) und Dichlormethan (0,8 ml) gemischt und für 4 Std. gerührt. Das Gemisch wurde mit CH₂Cl₂ (50 ml) verdünnt, und die CH₂Cl₂-Schicht wurde zuerst mit eiskalter 10 % wässriger Zitronensäure und anschließend mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde bis zur Trockenheit konzentriert, um 161 zu ergeben. Der Rest (161) wurde in wasserfreiem Acetonitril (23 ml) gelöst. Dazu wurden DMAP (37 mg, 0,3 mmol) und 2',2'-Dithiobis(5-nitropyridin) (103 mg, 0,33 mmol) hinzugefügt. Die Lösung wurde für 5 min gerührt. Dazu wurde Triphenylphosphin (78,69 mg, 0,3 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (3 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde für 10 min gerührt, und anschließend wurde CPG zu ihr hinzugefügt. Die Aufschlämmung wurde anschließend für 2 Std. geschüttelt. Anschließend wurde sie filtriert, mit Acetonitril und CH₂Cl₂ gewaschen. Das funktionalisierte CPG wurde getrocknet und mit Überkappungslösung überkappt, um 161 zu ergeben. Die Beladungskapazität wurde bestimmt (58,3 μmol/g).
BEISPIEL 82
Synthese von Aminooxy-Derivaten: Alternatives Verfahren
Das Diol 162 wird in sein Tosylat-Derivat 163 durch eine Behandlung mit 1 Äquivalent p-Toluolsulfonylchloridpyridin umgewandelt, gefolgt durch eine Standardaufarbeitung. Das Tosylat wird nachfolgend mit mehreren Aminohydroxy-Verbindungen behandelt, um als Nucleophile beim Ersetzen des Tosylats zu wirken, um eine Reihe von Oxyamino-Verbindungen zu erhalten. Die Reaktion wird durch Vorbilden des Anions aus dem Aminoalkohol oder dem Hydroxylamin-Derivat durch die Verwendung von Natriumhydrid unter wasserfreien Bedingungen erleichtert.
VERFAHREN 1
Nucleaseresistenz
A. Überprüfung der Resistenz von modifizierten Oligonucleotiden gegenüber Serum- und cytoplasmatischen Nucleasen.
Oligonucleotide, einschließlich der erfindungsgemäßen modifizierten Oligonucleotide, können auf ihre Resistenz gegenüber Serumnucleasen durch Inkubation der Oligonucleotide in Medien untersucht werden, welche verschiedene Konzentrationen fötales Kälberserum oder adultes Humanserum enthalten. Markierte Oligonucleotide werden für verschiedene Zeiten inkubiert, mit Protease K behandelt und anschließend durch eine Gelelektrophorese auf denaturierenden 20 % Polyacry lamid-Harnstoffgelen und einer nachfolgenden Autoradiographie analysiert werden. Die Autoradiogramme werden durch eine Laserdensitometrie quantifiziert. Basierend auf der Lage der Modifikationen und der bekannten Länge des Oligonucleotids ist es möglich, die Wirkung auf den Nucleaseabbau durch die besondere Modifikation zu bestimmen. Für die cytoplasmatischen Nucleasen wird eine HL60 Zelllinie verwendet. Ein post-mitochondrialer Überstand wird durch Differenzialzentrifugation hergestellt, und die markierten Oligonucleotide werden in diesem Überstand für verschiedene Zeiten inkubiert. Der Inkubation folgend, werden die Oligonucleotide auf einen Abbau untersucht, wie oben für den nucleolytischen Serum-Abbau dargestellt wurde. Die Autoradiographieergebnisse werden zum Vergleich der unmodifizierten und modifizierten Oligonucleotide quantifiziert. Als Kontrolle wurde für ein unsubstituiertes Phosphodiester-Oligonucleotid gefunden, dass es innerhalb von 1 Stunde zu 50 % abgebaut und innerhalb von 20 Stunden zu 100 % abgebaut war.
B. Überprüfung der Resistenz von modifizierten Oligonucleotiden gegenüber spezifischen Endo- und Exonucleasen.
Eine Überprüfung der Resistenz natürlicher und modifizierter Oligonucleotide gegenüber spezifischen Nucleasen (d.h. Endonucleasen, 3',5'-Exo- und 5',3'-Exonucleasen) wird durchgeführt, um die genaue Wirkung der Modifikationen auf eine Abbau zu bestimmen. Modifizierte Oligonucleotide werden in definierten Reaktionspuffern inkubiert, welche spezifische für verschiedene ausgewählte Nucleasen sind. Einer Behandlung der Produkte mit Protease K folgend, wird Harnstoff hinzugefügt, und eine Analyse auf 20 % Polyacrylamid-Gelen, welche Harnstoff enthalten, wird durchgeführt. Die Gelprodukte wurden durch Färben unter Verwendung von Stains All (Sigma Chemical Co.) sichtbar gemacht. Eine Laserdensitometrie wird verwendet, um das Ausmaß des Abbaus zu quantifizieren. Die Wirkungen der Modifikationen werden für spezifische Nucleasen bestimmt und mit den Ergebnissen verglichen, welche aus den Serum- und cytoplasmatischen Systemen erhalten wurden. Nucleaseresistenz von Oligonucleotiden, welche neuartige 2'-Modifikationen enthalten

Serie I

5' TTT TTT TTT TTT TTT*T*T*T* T 3'

SEQ ID NR: 20 wobei T* = 5-Methyl, 2'-Aminooxyethoxy 2' AOE

SEQ ID NR: 21 wobei T* = 5-Methyl, 2'-Dimethylaminooxyethoxy 2' DMAOE
Zusammen mit T19-Diester und Thioat-Kontrollen wurden die Gel gereinigten Oligonucleotide am 5'-Ende mit ³²P markiert und einem Standard-Nucleaseassy-Protokoll unterzogen.
Ein PAGE/Phosphorimaging erzeugte Bilder, welche für % intakt und % (intakt + (N-1)) quantifiziert wurden. Die prozentualen Anteile wurden aufgetragen, um Halbwertszeiten zu erzeugen, welche in einer Tabelle unten aufgeführt sind. Eingeschlossen ist die Halbwertszeit des 2'-O-Methoxyethyl-(MOE)-Analogons (SEQ ID NR: 22) in der Tabelle. Dieses Ergebnis zeigte, dass 2'-Dimethylaminooxyethyl (DMAOE) eine hoch Nuclease resistente Modifikation darstellt (14 und 15).

2'-Modifikation

AOE DMAOE MOE

T1/2 von N (min) 18 60 100

T1/2 von N + (N-1) (min) 200 85 % bleiben bei 24 h übrig. 300
Anfängliche Assays der Nucleaseresistenz von Oligonucleotiden, welche mit 2'-DMAOE-Modifikationen überkappt waren, zeigten eine bessere Resistenz, als die Modifikation 2'-O-Methoxyethyl in einem Vergleich zwischen den Assays (13). Diese Studien sind Vergleiche innerhalb des Assays unter mehreren Modifikationen in zwei Motiven. Das erste Motiv ist ein vollständiges Phosphodiester-Rückgrat, mit einer Überkappung von vier modifizierten Nucleotiden, beginnend an dem am weitesten zum 3'-Ende liegenden Nucleotid. Das zweite Motiv ist ähnlich, aber enthält ein einzelnes Phosphorthioat an der am weitesten zum 3'-Ende liegenden Inter-Nucleotid-Verbindung.

Serie II

5' TTT TTT TTT TTT TTT T*T*T* T* 3'

SEQ ID NR: 23 wobei T* = 5-Methyl, 2'-Dimethylaminooxyethyl

SEQ ID NR: 24 wobei T* = 5-Methyl, 2'-O-Methoxyethyl

SEQ ID NR: 25 wobei T* = 5-Methyl, 2'-O-Propyl

Serie III

5' TTT TTT TTT TTT TTT TTT*T 3'

SEQ ID NR: 26 wobei T* = 5-Methyl, 2'-Dimethylaminooxyethyl

SEQ ID NR: 27 wobei T* = 5-Methyl, 2'-O-Methoxyethyl

Zusammen mit einer T19-Phosphorthioat-Kontrolle wurden die Oligonucleotide gelgereinigt und dem Standard-Nucleaseprotokoll unterzogen. Aus diesen Assays erwies sich SEQ ID NR: 23 als das nächst stärkste resistente Oligonucleotid. SEQ ID NR: 24 wird schneller abgebaut und SEQ ID NR: 25 wird sehr schnell abgebaut. Das Gel zeigt einige Reaktionsprodukte am unteren Rand des Gels, aber wenig n-2 und n-3 der resistenten Oligonucleotide. Diese Produkte scheinen das Ergebnis der endonucleolytischen Spaltung durch SVPD zu sein. Dieser Typ der Aktivität ist mit einer Basisgeschwindigkeit immer anwesend, wird aber gewöhnlicherweise aufgrund der sehr starken Prädominanz der 3'-Exonuclease-Aktivität gegenüber den meisten Oligonucleotiden nicht gesehen. Diese Oligonucleotide sind jedoch so außergewöhnlich resistent gegenüber 3'-Exonucleasen, dass die Endonuclease-Aktivität verantwortlich für einen Großteil der Spaltungsereignisse am Oligonucleotid in voller Länge ist. 2'-Desoxyphosphodiester-Produkte der Endonuclease-Reaktionen werden anschließend schnell zu Monomeren gespalten. Zwei Sätze quantitativer Bestimmungen wurden für diese Reaktionen durchge führt. Eine zählt nur die 3'-Exonuclease-Produkte, und die andere zählt Produkte aus allen Reaktionen. In beiden Fällen beträgt die Halbwertszeit von einer SEQ ID NR: 23 länger als 24 Stunden. Für SEQ ID NR: 24 beträgt die Halbwertszeit der Exonuclease-Aktivität über 24 Stunden, während der andere Typ der quantitativen Bestimmung eine Halbwertszeit von ungefähr 100 min ergibt. Die Oligonucleotide mit dem Motiv, welches eine einzelne Phosphorthioat-Verbindung enthält (SEQ ID NR: 26 und SEQ ID NR: 27) stellen Substrate für die oben beschriebene Endonuclease-Aktivität dar, aber es werden keine Produkte der 3'-Exonuclease-Aktivität im Zeitverlauf dieses Assays nachgewiesen. Tabelle 2 Mit 2'-Dimethylaminooxyethylthymidin (T-2'-DMAOE) synthetisierte Oligonucleotide

SEQ ID NR:	Sequenz	Masse
		Erwartet	Beobachtet
28	5'-CTCGTACCT*TTCCGGTCC-3'	5784,20	5784,09
29	5'-TCCAGGTGTCCGCATC-3'	5548,74	5549,05
30	5'-GCGTTTTTTTTTTGCG-3'	6208,74	6210,52
31	5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'	6433,45	6433,79
32	5'-TTTT-3'	1869,96	1869,5
33	5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT_ST-3'	6449,45	6449,15
34	TTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'	6433,51	6433,19
35	5'-TT-3'	648,49	648,4

Tabelle 3 Mit 2'-Dimethylaminooxyethyladenosin (A-2'-DMAOE) synthetisierte Oligonucleotide

	SEQ ID NR:	Sequenz	Masse
			Erwartet	Beobachtet
1	36	5'-CTCGTACCA*TTCCGGTCC-3'	5490,21	5490,86
2	37	5'-GGACCGGAAGGTACGA*G-3'	5824,96	5826,61
3	38	5'-ACCGAGGAGGATCATGTCGTACGC-3'	6947,9	6947,28

Tabelle 4 Mit 2'-O-Methyleniminooxyethyladenosin synthetisierte Oligonucleotide

SEQ ID NR:	Sequenz	Masse
		Erwartet	Beobachtet
39	5'-CTCGTACCA*TTCCGGTCC-3'	5470,20	5472,50
40	5'-ACCGAGGATCATGTCGTA*CGC-3'	6866,42	6865,88
41	5'-GGACCGGAAGGTACGA*G-3'	5743,12	5743,82

Tabelle 5 Mit 2'-O-Methyleniminooxyethylthymidin synthetisierte Oligonucleotide

	SEQ ID NR:	Sequenz	Masse
			Erwartet	Beobachtet
1	42	5'-CTCGTACCT*TTCCGGTCC-3'	5466,21	5462,25
2	43	5'-TCCAGGTGTCCGCATC-3'	5179,44	5178,96
3	44	5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'	6369,45	6367,79

Tabelle 6 Tm-Vorteil der 2'-DMAOE-Modifikation gegenüber 2'-Desoxyphosphodiestern und Phosphorthioaten

SEQ ID NR:	SEQUENZ	Tm	ΔTm/Mod gegenüber RNA verglichen mit unmodifizierter DNA	ΔTm/Mod gegenüber RNA verglichen mit unmodifiziertem Desoxyphosphorthioat
45	5'-CTCGTAC-CT*TTCCGGTCC-3'	65,44	0,24	1,04
46	5'-TCCAGGTGTCCGCATC-3'	67,90	1,12	2,20
47	5'-GCGTTTTTTTTTTGCG-3'	62,90	1,46	2,36

ΔTm basiert auf beschriebenen Literaturwerten für DNA- und Phosphorthioat-Oligonucleotide.

VERFAHREN 2
Ras-Luciferase Reportergen-Zusammenbau
Die ras-Luciferase-Reportergene, welche in dieser Untersuchung beschrieben werden, werden unter Verwendung der PCR-Technologie zusammengesetzt. Die Oligonucleotid-Primer werden zur Verwendung als Primer für eine PCR-Klonierung der 5'-Regionen von Exon 1 von sowohl den mutanten (Codon 12), als auch den nicht-mutanten (Wildtyp) humanen H-ras-Genen synthetisiert. H-ras-Gen-Matrizen werden von der American Type Culture Collection (ATCC Nummern 41000 und 41001) in Bethesda, MD, bezogen. Die Oligonucleotid-PCR-Primer 5'-ACA-TTA-TGC-TAG-CTT-TTT-GAG-TAA-ACT-TGT-GGG-GCA-GGA-GAC-CCT-GT-3' (Sense) (SEQ ID NR: 16) und 5'-GAG-ATC-TGA-AGC-TTC-TGG-ATG-GTC-AGC-GC-3' (Antisense) (SEQ ID NR: 17) werden in Standard-PCR-Reaktionen unter Verwendung von mutanten und nicht-mutanten H-ras-Genen als Matrizen verwendet. Von diesen Primern wird erwartet, dass sie ein DNA-Produkt von 145 Basenpaaren herstellen, welche den Sequenzen –53 bis +65 (relativ zur Translationsinitiationsstelle) von normalem und mutantem H-ras entsprechen, flankiert von NheI und HindIII Restriktions-Endonuclease-Stellen. Das PCR-Produkt wird gelgereinigt, präzipitiert, gewaschen und in Wasser resuspendiert unter Verwendung von Standardverfahren.
PCR-Primer für die Klonierung des P. pyralis (Leuchtkäfer) Lucifcerase-Gens wurden so entworfen, dass das PCR-Produkt das Luciferase-Protein in voller Länge kodieren würde, mit der Ausnahme des Amino-terminalen Methionin-Restes, welcher durch zwei Aminosäuren ersetzt werden würde, einem Amino-terminalen Lysin-Rest, gefolgt durch einen Leucin-Rest. Die Oligonucleotid-PCR-Primer, welche für die Klonierung des Luciferase-Gens verwendet wurden, sind 5'-GAG-ATC-TGA-AGC-TTG-AAG-ACG-CCA-AAA-ACA-TAA-AG-3' (Sense) (SEQ ID NR: 18) und 5'-ACG-CAT-CTG-GCG-CGC-CGA-TAC-CGT-CGA-CCT-CGA-3' (Antisense) (SEQ ID NR: 19), werden in Standard-PCR-Reaktionen verwendet, wobei ein kommerziell verfügbares Plasmid (pT3/T7-Luc) (Clontech), welches das Luciferase-Reportergen enthält, als eine Matrize verwendet wurde. Von diesen Primern wird erwartet, dass sie ein Produkt von ungefähr 1,9 kb ergeben, entsprechend zu dem Luciferase-Gen, flankiert durch HindIII und BssHII Restriktionsendonuclease-Stellen. Dieses Fragment wird gelgereinigt, präzipitiert, gewaschen und in Wasser resuspendiert unter Verwendung von Standardverfahren.
Um den Zusammenbau des ras-Luciferase-Reporter-Fusionsgens zu vervollständigen, werden die ras- und Luciferase-PCR-Produkte mit den geeigneten Restriktionsendonucleasen gespalten und durch eine dreiteilige Ligation in einen Expressionsvektor, welcher den Steroid induzierbaren Maus-Mammatumor-Viruspromotor MMTV enthält, unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen NheI, HindIII und BssHII kloniert. Der sich ergebende Klon führt zur Insertion von H-ras 5'-Sequenzen (–53 bis +65), welche im Leserahmen mit dem Leuchtkäfer-Luciferase-Gen fusioniert sind. Der sich ergebende Expressionsvektor kodiert ein ras-Luciferase-Fusionsprodukt, welches unter der Kontrolle des Steroid induzierbaren MMTV-Promotors exprimiert wird.
VERFAHREN 3
Transfektion von Zellen mit Plasmid-DNA
Die Transfektionen werden wie bei Greenberg in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., John Wiley and Sons, New York, beschrieben, mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: HeLa-Zellen werden auf 60 mm Schalen mit 5 × 10⁵ Zellen/Schale ausplattiert. Insgesamt 10 μg DNA werden zu jeder Schale hinzugefügt, wovon 9 μg ras-Luciferase-Reporter-Plasmid sind und 1 μg ein Vektor ist, welcher den Ratten-Glucocorticoid-Rezeptor unter der Kontrolle des konstitutiven Rous-Sarkoma-Virus (RSV)-Promotors exprimiert. Calciumphosphat-DNA Kopräzipitate werden nach 16-20 Stunden durch Waschen mit Tris-gepufferter Salzlösung (50 Mm Tris-Cl (pH-Wert 7,5), 150 mM NaCl), welche 3 mM EGTA enthält, entfernt. Frisches Medium, welches mit 10 % fötalem bovi nem Serum ergänzt ist, wird anschließend zu den Zellen hinzugefügt. Zu diesem Zeitpunkt werden die Zellen mit Antisense-Oligonucleotiden vorbehandelt, vor der Aktivierung der Reportergen-Expression durch Dexamethason.
VERFAHREN 4
Oligonucleotidbehandlung von Zellen
Der Plasmidtransfektion sofort folgend, werden die Zellen zweimal mit OptiMEM (GIBCO) gewaschen und auf 37°C vorgewärmt. 2 ml OptiMEM, welches 10 μg/ml N-[1-(2,3-Diolethyloxy)propyl]-N,N,N,-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) (Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD) enthielt, werden zu jeder Schale hinzugefügt, und die Oligonucleotide werden direkt hinzugefügt und für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Das OptiMEM wird anschließend entfernt und mit dem geeigneten Zellwachstumsmedium ersetzt, welches das Oligonucleotid enthält. Zu diesem Zeitpunkt wird die Reportergenexpression durch eine Behandlung der Zellen mit Dexamethason mit einer Endkonzentration von 0,2 μM aktiviert. Die Zellen werden 12-16 Stunden nach der Steroidbehandlung geerntet.
VERFAHREN 5
Luciferase-Assays
Die Luciferase wird aus den Zellen durch Lyse mit dem Detergens Triton X-100 extrahiert, wie bei Greenberg in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., John Wiley and Sons, New York, beschrieben wird. Ein Dynatech ML 1000 Luminometer wird verwendet, um die Peak-Lumineszenz beim Hinzufügen von Luciferin (Sigma) mit 625 μM zu messen. Für jeden Extrakt werden die Luciferase-Assays mehrere Male durchgeführt, wobei verschiedene Mengen Extrakt verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Daten im linearen Bereich des Assays gesammelt werden.
VERFAHREN 6
Antisense-Oligonucleotid Inhibition der ras-Luciferase-Genexpression
Eine Reihe von Antisense-Phosphorthioat-Oligonucleotid-Analogen, welche auf die Codon-12 Punktmutation von aktiviertem H-ras ausgerichtet sind, werden unter Verwendung des ras-Luciferase-Reportergensystems, welches in den vorhergehenden Beispielen beschrieben wurde, getestet. Diese Reihe umfasste eine Basis-Sequenz und Analoge von dieser Basis-Sequenz. Die Basis-Sequenz weist eine bekannte Aktivität auf, wie in der internationalen Veröffentlichung Nummer WO 92/22651 , welche oben identifiziert wurde, berichtet wird. Sowohl in der Basis-Sequenz, als auch in ihren Analogen, schloss jede der Nucleotid-Untereinheiten Phosphorthioat-Verbindungen ein, um eine Nucleaseresistenz bereitzustellen. Jedes der Analoge schloss Nucleotid-Untereinheiten ein, welche 2'-O-Substitutionen und 2'-Desoxy-erthro-pentofuranosylzucker enthielten. In den Analogen wird eine Untersequenz der 2'-Desoxy-erythro-pentofuranosylzucker enthaltenden Untereinheiten an beiden Enden durch Untersequenzen der 2'-O-substituierten Untereinheiten flankiert. Die Analoge unterschieden sich voneinander bezüglich der Länge der Untereinheit der 2'-Desoxy-erythro-pentofuranosylzucker enthaltenden Nucleotide. Die Länge dieser Untersequenzen wird um zwei Nucleotide zwischen 1 und 9 Gesamtnucleotiden variiert. Die 2'-Desoxy-erythro-pentofuranosyl-Nucleotid-Untersequenzen sind an der Punktmutation der Codon-12 Punktmutation des aktivierten ras zentriert.
VERFAHREN 7
Diagnostischer Assay für den Nachweis einer mRNA-Überexpression
Oligonucleotide werden nach der Synthese durch ³²P-Markierung am 5'-Ende mit Polynucleotid-Kinase radioaktiv markiert. Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989, Band 2, S. 11.31-11.32). Radioaktiv markiertes Oligonucleotid wird mit Gewebe- oder Zellproben in Kontakt gebracht, für welche eine mRNA-Überexpression angenommen wird, wie eine Probe aus einem Patienten, unter Bedingungen, in welchen eine spezifische Hybridisierung stattfinden kann, und die Probe wird gewaschen, um ungebundenes Oligonucleotid zu entfernen. Eine ähnliche Kontrolle wird erhalten, worin das radioaktiv markierte Oligonucleotid mit einer normalen Zell- oder Gewebeprobe in Kontakt gebracht wird, unter Bedingungen, welche eine spezifische Hybridisierung erlauben, und die Probe wird gewaschen, um ungebundenes Oligonucleotid zu entfernen. Die in der Probe verbleibende Radioaktivität weist auf gebundenes Oligonucleotid hin und wird unter Verwendung eines Szintillationszählers oder eines anderen üblichen Hilfsmittels quantifiziert. Ein Vergleich der in den Proben aus normalen und erkrankten Zellen verbleibenden Radioaktivität weist auf eine Überexpression der mRNA von Interesse hin.
Erfindungsgemäße radioaktiv markierte Oligonucleotide sind auch für eine Autoradiographie geeignet. Gewebeschnitte werden mit radioaktiv markiertem Oligonucleotid behandelt und wie oben beschrieben gewaschen, anschließend gemäß Standard-Autoradiographieverfahren einer lichtempfindlichen Schicht ausgesetzt. Eine Kontrolle mit einer normalen Zell- oder Gewebeprobe wird auch erhalten. Wenn sie entwickelt wird, ergibt die Schicht ein Bild von Silberkörnern über den Regionen, welche die mRNA überexprimieren, welches quantifiziert wird. Das Ausmaß der mRNA-Überexpression wird durch einen Vergleich der Silberkörner, die bei normalen und erkrankten Zellen beobachtet werden, bestimmt.
Analoge Assays zum fluoreszenten Nachweis einer mRNA-Überexpression verwenden erfindungsgemäße Oligonucleotide, welche mit Fluorescein oder anderen fluoreszenten Markierungen bzw. Tags markiert werden. Markierte DNA-Oligonucleotide werden auf einem automatischen DNA-Syntheseautomaten (Applied Biosystems Modell 380B) unter Verwendung einer Standardphosphoramidit-Chemie mit einer Oxidation durch Iod synthetisiert. β-Cyanoethyldiisopropylphosphoramidite werden von Applied Biosystems (Foster City, CA) bezogen. Fluorescein-markierte Amidite werden von Glen Research (Sterling, VA) bezogen. Die Inkubation von Oligonucleotid und biologischer Probe wird wie für die radioaktiv markierten Oligonucleotide beschrieben, durchgeführt, außer, dass anstelle eines Szintillationszählers ein Fluoreszenz-Mikroskop verwendet wird, um die Fluoreszenz nachzuweisen. Ein Vergleich der Fluoreszenz, welche in Proben aus norma len und erkrankten Zellen beobachtet wird, ermöglicht einen Nachweis der mRNA-Überexpression.
VERFAHREN 8
Nachweis einer unnormalen mRNA-Expression
Gewebe- oder Zellproben, für welche angenommen wird, dass sie unnormale mRNA exprimieren, werden mit einem ersten ³²P- oder Fluorescein-markierten Oligonucleotid inkubiert, welches auf die Wildtyp (normale) mRNA gerichtet ist. Eine identische Probe von Zellen oder Geweben wird mit einem zweiten markierten Oligonucleotid inkubiert, welches auf die unnormale mRNA gerichtet ist, unter Bedingungen, bei welchen eine spezifische Hybridisierung stattfinden kann, und die Probe wird gewaschen, um ungebundenes Oligonucleotid zu entfernen. In der Probe verbleibende Markierung weist auf gebundenes Oligonucleotid hin und kann unter Verwendung eines Szintillationszählers, Fluorometers oder eines anderen üblichen Hilfsmittels quantifiziert werden. Die Anwesenheit von unnormaler mRNA wird angezeigt, wenn ein Binden im Fall der zweiten, aber nicht der ersten Probe beobachtet wird.
Eine Doppelmarkierung kann auch mit den erfindungsgemäßen Oligonucleotiden und Verfahren verwendet werden, um eine Expression von unnormaler mRNA spezifisch nachzuweisen. Eine einzelne Gewebeprobe wird mit einem ersten ³²P-markierten Oligonucleotid, welches auf die Wildtyp mRNA gerichtet ist, und mit einem zweiten Fluorescein-markierten Oligonucleotid, welches auf die unnormale mRNA gerichtet ist, inkubiert, unter Bedingungen, bei welchen eine spezifische Hybridsierung stattfinden kann. Die Probe wird gewaschen, um ungebundenes Oligonucleotid zu entfernen, und die Markierungen werden durch Szintillationszählung und Fluorometrie nachgewiesen. Die Anwesenheit von unnormaler mRNA wird angezeigt, wenn die Probe das ³²P-markierte Oligonucleotid nicht bindet (d.h. nicht radioaktiv ist), aber die fluoreszente Markierung zurückhält (d.h. fluoreszent ist).

Claims

Verbindung mit der Struktur:
worin: B_x eine heterocyclische Purin- oder Pyrimidinbase ist; T₁ und T₂ unabhängig voneinander OH, eine Hydroxyl-Schutzgruppe, eine aktivierte Phosphatgruppe, ein Nucleotid, ein Nucleosid oder ein Oligonucleotid sind; L eine der Strukturen aufweist:
worin m von 1 bis 10 ist, y von 1 bis 10 ist, x 1 ist, E N(R₁)(R₂) oder N=C(R₁)(R₂) ist und R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, C₁-C₁₀ Alkyl, eine Stickstoff-Schutzgruppe sind, oder R₁ und R₂ zusammen eine Stickstoff-Schutzgruppe sind oder wobei R₁ und R₂ in einer Ringstruktur verbunden sind, die minde stens ein Heteroatom, ausgewählt aus N und O, einschließen kann.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei Bx Adenin, Guanin, Hypoxanthin, Uracil, Thymin, Cytosin, 2-Aminoadenin oder 5-Methylcytosin ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₁ und R₂ unabhängig voneinander H oder C₁-C₁₀ Alkyl sind.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₁ und R₂ in einer Ringstruktur verbunden sind, die mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus N und O, einschließen kann.
Verbindung gemäß Anspruch 4, wobei die Ringstruktur Imidazol, Piperidin, Morpholin oder ein substituiertes Piperazin ist.
Verbindung gemäß Anspruch 5, wobei das substituierte Piperazin mit einem C₁-C₁₂ Alkyl substituiert ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei beide von T₁ und T₂ Oligonucleotide sind, oder eines von T₁ und T₂ ein Oligonucleotid ist und das andere eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist.
Verbindung der Struktur: Q-L worin L eine der Strukturen aufweist:
worin m von 1 bis 10 ist, y von 1 bis 10 ist, E N(R₁)(R₂) oder N=C(R₁)(R₂) ist, R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, C₁-C₁₀ Alkyl, eine Stickstoff-Schutzgruppe sind, oder R₁ und R₂ zusammen eine Stickstoff-Schutzgruppe sind, oder wobei R₁ und R₂ in einer Ringstruktur verbunden sind, die mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus N und O, einschließen kann, und X und Q derart ausgewählt sind, daß: wenn X 1 ist, dann ist Q: ein Nucleosid, substituiert mit der Gruppe L bei einer 2'-, 3'- oder 5'-Position, oder ein 3'-phosphityliertes Nucleosid, substituiert mit der Gruppe L bei einer 2'- oder 5'-Position, oder ein 2'-phosphityliertes Nucleosid, substituiert mit der Gruppe L an einer 3'- oder 5'-Position, oder ein Oligonucleotid, das ein Nucleotid einschließt, substituiert an einer 2'-, 3'- oder 5'-Position mit der Gruppe L, oder wenn X 0 ist, dann ist Q eine Verbindung der Struktur:
worin n und p unabhängig voneinander von 0 bis 10 sind, mit der Summe von n und p größer als 2 und weniger als 11, Pg eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist, und Z ein fester Träger oder eine geschützte und aktivierte Phosphoreinheit ist, wobei die Verbindungen, welche die folgenden Strukturen aufweisen, ausgenommen sind:
worin: B Thymin, Benzoyl-cytosin, Benzoyl-adenin oder Isobutyl-guanin ist, B' Thymin, Cytosin, Adenin oder Guanin ist, Bz Benzoyl ist, und X' Aminooxy oder Phthaloylaminooxy ist.
Verbindung gemäß Anspruch 8, wobei Q ist: ein Nucleosid, substituiert mit der Gruppe L an einer 2'- 3'- oder 5'-Position, ein 3'-phosphityliertes Nucleosid, substituiert mit der Gruppe L an einer 2'- oder 5'-Position, ein 2'-phosphityliertes Nucleosid, substituiert mit der Gruppe L an einer 3'- oder 5'-Position, oder ein Oligonucleotid, das ein Nucleotid, substituiert an einer 2'-, 3'- oder 5'-Position mit der Gruppe L, einschließt.
Verbindung gemäß Anspruch 8, wobei Q ein Nucleosid, substituiert mit der Gruppe L an einer 2'-, 3'- oder 5'-Position, ist.
Verbindung gemäß Anspruch 10, wobei Q ein Nucleosid, substituiert mit der Gruppe L an dessen 2'-Position, ist.
Verbindung gemäß Anspruch 10, wobei Q 3'-phosphityliertes Nucleosid, substituiert mit der Gruppe L an dessen 2'-Position, ist.
Verbindung gemäß Anspruch 9, wobei Q ein Oligonucleotid ist, das mindestens ein Nucleotid, substituiert an einer 2'-, 3'- oder 5'-Position mit der Grup pe L, ist.
Verbindung gemäß Anspruch 13, wobei Q ein Oligonucleotid ist, das mindestens ein Nucleotid, substituiert an dessen 2'-Position mit der Gruppe L, einschließt.
Verbindung gemäß Anspruch 9, wobei Q ein Oligonucleotid ist, das mindestens ein Nucleotid, substituiert an dessen 2'-Position mit einer Aminooxyethyl-Gruppe, einschließt.
Verbindung gemäß Anspruch 8, wobei Q eine Verbindung der Struktur ist:
Verbindung gemäß Anspruch 10, wobei Z ein fester Träger ist.
Verbindung gemäß Anspruch 17, wobei Z eine geschützte und aktivierte Phosphoreinheit ist.
Verbindung gemäß Anspruch 18, wobei Z eine Cyanoethoxy-N,N-diisopropylphosphoramidit-Gruppe ist.
Verbindung gemäß Anspruch 16, wobei Pg Dimethoxytrityl ist.
Verbindung gemäß Anspruch 16, wobei p 1 ist und n 4 ist.