DE69732911T2 - Oligoribonukleotide und ribonukleasen zur spaltung von rns - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft die Synthese und Verwendung oligomerer Verbindungen, einschließlich Oligoribonukleotiden und Oligoribonukleosiden, die zur Strangspaltung von Ziel-RNA-Strängen von Nutzen sind. Umfasst von der Erfindung sind Oligoribonukleotide mit modifizierten Zuckern, Basen oder Phosphat-Hauptketten und Oligoribonukleoside mit Standardzuckern und -basen oder modifizieren Zuckern und Basen, die über Nicht-Phosphat-Hauptketten miteinander vernetzt sind. Weiterhin von der Erfindung umfasst sind chimäre Oligoribonukleotide und Oligoribonukleoside mit gemischten Hauptketten, entweder Phosphat oder Nicht-Phosphat. Die Erfindung betrifft Ribonukleasen eines Säugers, d. h. Enzyme, die RNA abbauen. Eine solche Ribonuklease wird hierin als ein dsRNase bezeichnet, wobei „ds" die Spezifität der RNase zu bestimmten doppelsträngigen RNA-Substraten anzeigt. Die Oligoribonukleotide, Oligoribonukleoside und Ribonuklease-Substrate der Erfindung sind für die Therapeutik, Diagnostik und als Reagenzien für die Forschung von Nutzen.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Von Oligonukleotiden ist bekannt, dass sie zu einzelsträngigen DNA- oder RNA-Molekülen hybridisieren. Bei Hybridisierung handelt es sich um die sequenzspezifische Basenpaar-Wasserstoffbrückenbindung von Nukleobasen der Oligonukleotide an Nukleobasen von Ziel-RNA oder -DNA. Von derartigen Nukleobasenpaaren wird gesagt, dass sie zueinander komplementär sind.
  • Die Komplementarität von Oligonukleotiden ist zur Inhibierung einer Reihe zellulärer Ziele verwendet worden. Solche komplementären Oigonukleotide werden häufig als Antisense-Oligonukleotide beschrieben. Es sind verschiedene, die Ergebnisse dieser Studien beschreibende Reviews veröffentlicht worden, darunter Progress In Antisense Oligonucleotide Therapeutics, S. T. Crooke und C. F. Bennett, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1996, 36, 107–129. Diese Oligonukleotide haben sich als sehr leistungsstarke Werkzeuge in der Forschung und Diagnostika erwiesen. Des Weiteren befinden sich bestimmte Oligonukleotide, von denen gezeigt worden ist, dass sie wirksam sind, derzeit in klinischen Versuchen am Menschen.
  • Bis heute sind studierte Oligonukleotide Oligodeoxynukleotide gewesen. Von Antisense-Oligodeoxynukleotiden wird geglaubt, dass sie hauptsächlich durch die Wirkung von RNase H eine Verringerung der Ziel-RNA-Niveaus verursachen, einer Endonuklease, die den RNA-Strang von DNA:RNA-Doppeln (DNA:RNA-Doppelsträngen) spaltet. Von diesem Enzym, von dem geglaubt wird, dass es bei der DNA-Replikation eine Rolle spielt, ist gezeigt worden, dass es in der Lage ist, die RNA-Komponente der DNA:RNA-Doppelstränge in zellfreien Systemen als auch in Xenopus-Oozyten zu spalten. RNase H ist sehr empfindlich gegenüber strukturellen Veränderungen von Antisense-Oligonukleotiden. Diese Empfindlichkeit ist derart, dass frühere Versuche zur Erhöhung der Wirksamkeit von Oligonukleotiden durch Steigern der Affinität, Stabilität, Lipophilie und anderer Charakteristika durch chemische Modifikationen des Oligonukleotids häufig zu Oligonukleotiden geführt haben, die nicht mehr Substrate für RNase H sind. Darüber hinaus ist die RNase-H-Aktivität ziemlich variabel. Folglich ist ein gegebener Krankheitszustand möglicherweise kein Kandidat für Antisense-Therapie, nur weil das Zielgewebe eine unzureichende RNase-H-Aktivität aufweist. Somit ist klar, dass zusätzlich zu RNase H effektive Terminationsmechanismen zur Entwicklung von Therapeutika und anderen Agenzien von großem Wert sind.
  • Mehrere Veröffentlichungen beschreiben die Wechselwirkung von RNase H und Oligonukleotiden. Eine kürzliche Veröffentlichung ist: Crooke et al., Biochem. J., 1995, 312, 599–608. Andere frühere Dokumente sind: (1) Dagle et al., Nucleic Acids Research, 1990, 18, 4751; (2) Dagle et al., Antisense Research And Development, 1991, 1, 11; (3) Eder et al., J. Biol. Chem., 1991, 266, 6472; und (4) Dagle et al., Nucleic Acids Research, 1991, 19, 1805. Laut diesen Veröffentlichungen sind DNA-Oligonukleotide mit sowohl unmodifizierten Phosphodiester-Internukleosidverknüpfungen als auch modifizierten Phosphorthioat-Internukleosidver knüpfungen Substrate für zelluläre RNase H. Da sie Substrate sind, aktivieren sie die Spaltung von Ziel-RNA durch RNase H. Diese Verfasser merkten jedoch weiterhin an, dass sowohl Phosphodiesterverknüpfungen als auch Phosphorthioatverknüpfungen in Xenopus-Embryos auch Exonukleaseabbau unterliegen. Nukleaseabbau ist nachteilig, da er das Oligonukleotid schnell abreichen.
  • Wie in den Referenzen (1), (2) und (4) beschrieben ist, wurden zum Stabilisieren von Oligonukleotiden gegenüber Nukleaseabbau bei gleichzeitigem fortgesetzten Sorgen für RNase-H-Aktivierung 2'-Deoxyoligonukleotide mit einem kurzen Abschnitt von mit Phosphodiester verknüpften Nukleosiden, der zwischen Abschnitten von Phosphoramidat-, Alkylphosphonat- oder Phosphotriesterverknüpfungen angeordnet ist, konstruiert. Obwohl die Phosphoramidat enthaltenden Oligonukleotide gegenüber Exonukleasen stabilisiert wurden, merkten die Verfasser in Referenz (4) an, dass jede Phosphoramidatverknüpfung in einem Verlust von 1,6°C beim gemessenen Tm-Wert der Phosphoramidat enthaltenden Oligonukleotide resultierte. Eine solche Verringerung des Tm-Werts deutet auf eine Verringerung der Hybridisierung zwischen dem Oligonukleotid und seinem Zielstrang hin.
  • Andere Verfasser haben zum Effekt Stellung genommen, den ein solcher Verlust an Hybridisierung zwischen einem Oligonukleotid und seinem Zielstrang haben kann. Saison-Behmoaras et al. (EMBO Journal, 1991, 10, 1111) beobachteten, dass selbst obwohl ein Oligonukleotid ein Substrat für RNase H sein könnte, die Spaltungseffizienz durch RNase H aufgrund der schwachen Hybridisierung zur mRNA gering war. Die Verfasser merkten auch an, dass das Einbinden einer Acridin-Substitution am 3'-Ende des Oligonukleotids das Oligonukleotid vor Exonukleasen schützte.
  • Die US-Patentschrift 5,013,830, am 7. Mai 1991 ausgegeben, offenbart Mischoligomere, die ein RNA-Oligomer oder ein Derivat davon umfassen, das über eine Phosphodiesterverknüpfung an ein DNA-Oligomer konjugiert ist. Die RNA-Oligomere tragen außerdem 2'-O-Alkyl-Substituenten. Da es jedoch Phosphodiester sind, sind die Oligomere gegenüber Nukleasespaltung anfällig.
  • Die europäische Patentanmeldung 339,842, am 2. November 1989 veröffentlicht, offenbart 2'-O-substituierte Phosphorthioatoligonukleotide, einschließlich 2'-O-Methylribooligonukleotidphosphorthioat-Derivaten. Die oben erwähnte Anmeldung offenbart auch 2'-O-Methylphosphodiesteroligonukleotide, denen es an Nukleaseresistenz mangelt.
  • Die US-Patentschrift 5,149,797, am 22. September 1992 ausgegeben, offenbart Mischoligonukleotide mit Phosphaten an der Hauptkette, die einen internen Teil aus durch Phosphodiesterverknüpfungen verknüpften Deoxynukleotiden enthalten, der auf jeder Seite von einem Teil aus modifizierten DNA- oder RNA-Sequenzen flankiert wird. Die Flankensequenzen beinhalten Methylphosphonat-, Phosphormorpholidat-, Phosphorpiperazidat- oder Phosphoramidatverknüpfungen.
  • Die US-Patentschrift 5,256,775, am 26. Oktober 1993 ausgegeben, beschreibt Mischoligonukleotide, die Phosphoramidatverknüpfungen und Phosphorthioat- oder Phosphordithioatverknüpfungen einschließen.
  • Die US-Patentschrift 5,403,711, am 4. April 1995 ausgegeben, beschreibt gegen DNA gerichtete RNA:DNA-Sonden. Die Sonden werden markiert und in einem System verwendet, das RNase H enthält. Das RNase-H-Enzym spaltet jene Sonden, die sich an DNA-Ziele binden. Die Sonden können modifizierte Phosphatgruppen enthalten. Erwähnt werden Phosphotriester, Hydrogenphosphonate, Alkyl- oder Arylphosphonate, Alkyl- oder Arylphosphoramidate, Phosphorthioate oder Phosphorselenate.
  • Im Gegensatz zur pharmakologischen Inhibierung von Genexpression über das RNase-H-Enzym ist es offenbar geworden, dass Organismen von Bakterien bis zu Menschen endogene Antisense-RNA-Transkripte zum Ändern der Stabilität mancher Ziel-mRNAs und zum Regulieren der Genexpression verwenden, siehe W. Nellen und C. Lichtenstein, Curr. Opin. Cell. Biol., 1993, 18, 419–424, und W. Nellen et al., Biochem. Soc. Trans., 1992, 20, 750–754. Vielleicht eines der besten Beispiele kommt von bestimmten Bakterien, bei denen eine Antisense-RNA die Expression von mok-mRNA reguliert, das für die Translation des zytotoxischen hok-Proteins erforderlich ist. Wenn das Antisense-Niveau fällt, steigen folglich die mok-mRNA-Niveaus und infolgedessen die hok-Protein-Niveaus und die Zellen sterben ab, siehe K. Gerdes et al., J. Mol. Biol., 1992, 226, 637–649. Andere von solchen Mechanismen in Bakterien regulierte Systeme beinhalten das RNA-I/RNA-II-Hybrid des ColE1-Plasmids, siehe M. T. Häuptle, R. Frank und B. Dobberstein, Nucleic Acids Res., 1986, 14, 1427, D. Knecht, Cell Motil. Cytoskel., 1989, 14, 92–102; und M. Maniak und W. Nellen, Nucleic Acids Res., 1990, 18, 5375–5380; OOP-cII-RIVA-Regulation im Bakteriophage Lambda, siehe L. Krinke und D. L. Wulff (1990), Genes Dev., 1990, 4, 2223–2233; und die copA/copT-Hybride in E. coli. Siehe P. Blomberg, E. G. Wagner und K. Nordstrom, EMBO J., 1990, 9, 2331–2340. In E. coli ist von den gebildeten RNA:RNA-Doppelsträngen gezeigt worden, dass sie Substrate für regulierten Abbau durch die Endoribonuklease RNase III sind. Von Doppelsträngen abhängiger Abbau ist auch im Archaebakterium Halobacterium salinarium beobachtet worden, in dem das Antisense-Transkript die Expression des frühen (T1) Transkripts des Phagengens phiH reduziert, siehe P. Stolt und W. Zillig, Mol. Microbiol., 1993, 7, 875–882. In mehreren eukaryotischen Organismen sind ebenfalls endogene Antisense-Transkripte beobachtet worden. Diese beinhalten p53, siehe Khochbin und Lawrence, EMBO, 1989, 8, 4107–4114; basischen Fibroblastenwachstumsfaktor, siehe Volk et al., EMBO, 1989, 8, 69, 2983–2988; N-myc, siehe G. W. Krystal, B. C. Armstrong und J. F. Battey, Mol. Cell. Biol., 1990, 10, 4180–4191; elF-2α, siehe Noguchi et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 29161–29167. Die Konservierung endogen exprimierter Antisense-Transkripte über Evolutionslinien weist darauf hin, dass ihre biologischen Rollen und molekularen Wirkungsmechanismen ähnlich sein könnten.
  • In Bakterien ist RNase III die Aktivität doppelsträngiger Endoribonuklease (dsRNase), die sich für den Abbau einiger Antisense:Sense-RNA-Doppelstränge verantwortlich zeichnet. RNase III führt ortsspezifische Spaltung von dsRNA enthaltenden Strukturen durch, siehe H. Saito und C. C. Richardson, Cell, 1981, 27, 533–540. Die RNase III spielt außerdem eine wichtige Rolle bei der mRNA-Verarbeitung und der Verarbeitung von rRNA-Vorläufern zu 16S-, 23S- und 5S-Ribosom-RNAs, siehe J. J. Dunn und F. W. J. Studier, Mol. Biol., 1975, 99, 487. In Eukaryoten ist kürzlich ein Hefegen (RNT1) kloniert worden, das für ein Protein kodiert, das Homologie zu RNase III von E. coli aufweist und dsRNase-Aktivität bei der Ribosom-RNA-Verarbeitung aufzeigt, siehe S. A. Elela, H. IgeI und M. Ares, CelI, 1996, 85, 115–124. Mit Interferon behandelte Vogelzellen produzieren und sezernieren eine lösliche Nuklease, die dsRNA abbauen kann, siehe J. Meegan und P. I. Marcus, Science, 1989, 244, 1089–1091. Eine solche sezernierte dsRNA-Aktivität ist jedoch kein wahrscheinlicher Kandidat dafür, am zytoplasmatischen Abbau von Antisense:Sense-RNA-Doppelsträngen beteiligt zu sein. Trotz dieser Feststellungen ist fast nichts über die dsRNase-Aktivität von Menschen oder Säugern bekannt. Obwohl anerkannt ist, dass die Regulation (mittels eines beliebigen Mechanismus) eines Ziel-RNA-Strangs von Nutzen wäre, sind bis heute nur zwei Mechanismen zum Auslösen eines solchen Effekts bekannt. Diese sind das Anhalten der Hybridisierung und die Verwendung eines Oligodeoxynukleotids, um die RNase-H-Spaltung des RNA-Ziels zu bewirken. WO 92/07065 offenbart RNA-Moleküle, die Segmente aus unmodifizierter RNA zusammen mit Segmenten aus modifizierten Ribopyranosylnukleotiden umfassen. Ohtsuki et al. (J. Biol. Chem., 1977, 252: 483–491) beschreibt die Isolierung einer dsRNase eines Säugers. Nucleic Acids Res. 17, 239 (1989), schlägt aus 2'-Methyl-substituierten Nukleotideinheiten aufgebaute Oligoribonukleotidphosphorthioat-Gapmere vor. Ann. NY. Acad. Sci., S. 2–10 (1992), offenbart Oligoribonukleotidphosphorthioate als mögliche Therapeutika für die Behandlung von HIV.
  • Dementsprechend bleibt ein fortgesetzter, lange bestehender Bedarf an Verfahren und Verbindungen zur Regulation von Ziel-RNA. Eine solche Regulation von Ziel-RNA wäre für therapeutische Zwecke sowohl in vivo als auch ex vivo sowie auch für Diagnosereagenzien und als Reagenzien für die Forschung, einschließlich Reagenzien für die Untersuchung sowohl von zellulären als auch In-vitro-Ereignissen, von Nutzen.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß dieser Erfindung wird eine oligomere Verbindung bereitgestellt, welche spezifisch hybridisierbar mit einem vorgewählten RNA-Ziel ist und umfasst:
    • (a) ein erstes Segment, das wenigstens eine Ribofuranosylnukleosiduntereinheit hat, welche modifiziert ist, um wenigstens eines zu verbessern aus: pharmakokinetischer Bindung, Absorption, Verteilungs- oder Freisetzungseigenschaften der Verbindung; Affinität oder Spezifität der Verbindung zu der Ziel-RNA; oder Modifizieren der Ladung der Verbindung, verglichen mit unmodifizierter Verbindung; und
    • (b) ein zweites Segment, das wenigstens vier aufeinander folgende Ribofuranosylnukleosiduntereinheiten hat, welche daran 2'-Hydroxyeinheiten haben; dadurch gekennzeichnet, dass
    • (i) die Nukleosiduntereinheiten der oligomeren Verbindung durch Internukleosidvernetzungen verknüpft sind, die gegenüber Abbau verglichen zu Phosphodiestervernetzungen stabil sind; und
    • (ii) diese wenigstens eine modifizierte Ribofuranosylnukleosiduntereinheit an einem oder beiden der 3'- oder der 5'-Enden der oligomeren Verbindung angeordnet ist.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden die Verbindungen ein drittes Segment mit Eigenschaften enthalten, die den Eigenschaften des ersten Segments entsprechen. Es ist bevorzugt, das zweite Segment zwischen dem ersten und dem dritten Segment zu positionieren, so dass sie eine kontinuierliche, lineare Sequenz von verknüpften Nukleosiduntereinheiten bilden. In bevorzugten Verbindungen wird die Anzahl solcher verknüpften Nukleosiduntereinheiten von etwa acht bis etwa fünfzig reichen, wobei ein mehr bevorzugter Bereich von etwa zwölf bis etwa dreißig verknüpften Nukleosiduntereinheiten reicht.
  • Die Modifizierung der pharmakokinetischen Eigenschaften beinhaltet eine beliebige oder mehrere der Folgenden: Modifizierung der Bindungs-, Absorptions-, Verteilungs- oder Freisetzungseigenschaften der Verbindung. Die Modifizierung der Bindungscharakteristika beinhaltet die Modifizierung der Affinität oder Spezifität der Verbindung zu seiner Ziel-RNA. Die Modifizierung der Ladung der Verbindung beinhaltet das Modifizieren der Nettoladung der Verbindung im Vergleich zu einer unmodifizierten Verbindung. Für gewöhnlich wird die Modifizierung der Ladung die negative Gesamtnettoladung einer mit Phosphor verknüpften oligomeren Verbindung verringern, um die Verbindung mit weniger negativer Ladung, einer neutralen Ladung oder einer positiven Nettoladung auszustatten.
  • Weiterhin gemäß dieser Erfindung werden oligomere Verbindungen bereitgestellt, die aus linearen Sequenzen verknüpfter Ribonukleosiduntereinheiten gebildet sind, die spezifisch an ein vorgewähltes RNA-Ziel hybridisierbar sind. Die oligomeren Verbindungen weisen wenigstens ein erstes Segment und ein zweites Segment auf. Das erste Segment schließt wenigstens eine Ribonukleosiduntereinheit ein, die funktionalisiert wird, um höhere Affinität zur Ziel-RNA bereitzustellen. Das zweite Segment enthält wenigstens vier Ribofuranosylnukleosiduntereinheiten. Die Untereinheiten der oligomeren Verbindungen sind miteinander in einer linearen Sequenz durch Internukleosidverknüpfungen verbunden, die modifiziert sind, um die Verknüpfungen gegenüber Abbau im Vergleich zu Phosphodiesterverknüpfungen zu stabilisieren.
  • In bestimmten bevorzugten oligomeren Verbindungen der Erfindung werden das erste oder das erste und das dritte Segment der oligomeren Verbindungen aus Nukleosiduntereinheiten gebildet, die daran 2'-Substituentengruppen enthalten. In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die 2'-Substituentengruppe Fluor, C1-C20-Alkoxy, C-C1-Aminoalkoxy, Allyloxy, Imidazolylalkoxy und Polyethylenglykol. Bevorzugte Alkoxysubstituenten beinhalten Methoxy, Ethoxy und Propoxy. Ein bevorzugter Aminoalkoxysubstituent ist Aminopropoxy. Ein bevorzugter Imidazolylalkoxysubstituent ist Imidazolylpropoxy. Ein bevorzugter Polyethylenglykolsubstituent ist -O-Ethyl-O-methyl, d. h. Methoxyethoxy oder -O-CH2-CH2-O-CH3.
  • In weiter bevorzugten oligomeren Verbindungen der Erfindung werden die oligomeren Verbindungen aus Nukleosiduntereinheiten gebildet, die durch Einbinden bestimmter ausgewählter Nukleobasen daran modifiziert sind. In bevorzugten Ausführungsformen beinhalten die ausgewählten Nukleobasen 2,6-Diaminopurin, N2-Alkylpurine, N2-Aminoalkylpurine, 7-Deaza-7-substituierte Purine, 5-substituierte Pyrimidine und 2-substituierte Pyrimidine.
  • Andere bevorzugte oligomere Verbindungen der Erfindung beinhalten Oligoribonukleotide mit Nukleosiduntereinheiten, die durch Phosphorverknüpfungen verbunden sind, einschließlich Phosphorthioat, 3'-(oder 5'-)Deoxy-3'-(oder -5'-)thiophosphorthioat, Phosphordithioat, Phosphorselenate, 3'-(oder 5'-)Deoxyphosphinate, Boranphosphate, 3'-(oder 5'-)Deoxy-3'-(oder -5'-)aminophosphoramidate, Hydrogenphosphanate, Boranphosphatester, Phosphoramidate, Alkyl- oder Arylphosphonate und Phosphotriesterverknüpfungen. Eine ausgewählte Gruppe von Oligoribonukleotidverknüpfungen zur Verwendung beim Verknüpfen der Nukleoside des zweiten Segments beinhalten Phosphorthioat, Phosphinate und Phosphoramidate, die alle geladene Spezies sind.
  • Weiter bevorzugte oligomere Verbindungen der Erfindung können außerdem Oligoribonukleoside mit Nukleosiduntereinheiten beinhalten, die durch Carbonat-, Carbamat-, Silyl-, Schwefel-, Sulfonat-, Sulfonamid-, Formacetal-, Thioformacetal-, Oxim-, Methylenimino-, Methylenmethylimino-, Methylenhydrazo-, Methylendimethylhydrazo- und Methylenoxymethyliminoverknüpfungen verbunden sind.
  • Weiter bevorzugte oligomere Verbindungen der Erfindung beinhalten welche mit Nukleosiduntereinheiten, die durch alternierende Phosphor- und Nicht-Phosphorverknüpfungen verbunden sind. Solche Nicht-Phosphorverknüpfungen beinhalten Carbonat-, Carbamat-, Silyl-, Schwefel-, Sulfonat-, Sulfonamid-, Formacetal-, Thioformacetal-, Oxim-, Methylenimino-, Methylenmethylimino-, Methylenhydrazo-, Methylendimethylhydrazo- und Methylenoxymethyliminoverknüpfungen, wohingegen die Phosphorverknüpfungen Phosphodiester, Phosphorthioat, 3'-(oder 5'-)Deoxy-3'-(oder -5'-)thiophosphorthioat, Phosphordithioat, Phosphorselenate, 3'-(oder 5'-)Deoxyphosphinate, Boranphosphate, 3'-(oder 5'-)Deoxy-3'-(oder -5'-)aminophosphoramidate, Hydrogenphosphanate, Boranphosphatester, Phosphoramidate, Alkyl- oder Arylphosphonate und Phosphotriesterverknüpfungen beinhalten.
  • Weiter bevorzugte oligomere Verbindungen der Erfindung beinhalten Oligoribonukleotide, Oligoribonukleoside oder Mischungen von Oligoribonukleotiden und Oligoribonukleosiden mit mehreren verknüpften Nukleosiduntereinheiten, die in einer Sequenz verknüpft sind, die ein komplementärer Strang der Ziel-RNA ist, und wobei die Sequenz der Verbindung in eine erste Teilsequenz bzw. ein erstes Segment und eine zweite Teilsequenz bzw. ein zweites Segment unterteilt ist. Die erste Teilsequenz umfasst verknüpfte Nukleosiduntereinheiten, die 2'-O-substitutierte Pentofuranosylzuckereinheiten tragen, und die zweite Teilsequenz umfasst verknüpfte Nukleosiduntereinheiten, die 2'-Hydroxylpentofuranosylzuckereinheiten tragen. Vorzugsweise hat die zweite Teilsequenz von vier bis zwölf oder mehr Nukleosiduntereinheiten und mehr bevorzugt fünf bis etwa neun Nukleosiduntereinheiten. In weiter bevorzugten Ausführungsformen liegt eine dritte Teilsequenz vor, deren Nukleosiduntereinheiten aus jenen ausgewählt sind, die für die erste Teilsequenz wählbar sind. Es ist bevorzugt, dass die zweite Teilsequenz zwischen der ersten und der dritten Teilsequenz positioniert ist. Solche oligomeren Verbindungen der Erfindungen werden auch als „Chimären", „chimäre" oder „unvollständige" Oligoribonukleotide oder Oligoribonukleoside bezeichnet.
  • In den oligomeren Verbindungen der Erfindung sind Substituenten tragende Nukleosiduntereinheiten, welche modifiziert sind, um die pharmakokinetische Bindung, die Absorption, die Verteilungs- oder Freisetzungseigenschaften der Verbindung; die Affinität oder Spezifität der Verbindung zu der Ziel-RNA und/oder die Modifizierung der Ladung der Verbindung im Vergleich zu einer unmodifizierten Verbindung zu verbessern; an einem oder beiden der 3'- oder 5'-Termini (Enden) der oligomeren Verbindungen angeordnet. In bestimmten bevorzugten Verbindungen gibt es von einer bis etwa acht Nukleosiduntereinheiten, die mit solchen Substituentengruppen substituiert sind.
  • Die Nukleosiduntereinheiten sind in einer linearen Sequenz miteinander verbunden, um die oligomeren Verbindungen der Erfindung zu bilden. Jede Nukleosiduntereinheit enthält ein Basenfragment und ein Zuckerfragment. Das Basenfragment umfasst eine heterozyklische Base, abwechselnd hierin im Folgenden als eine Nukleobase bezeichnet. Die Basen oder Nukleobasen sind kovalent an das Zuckerfragment gebunden. Die Zuckerfragmente können eine 2'- substituierte Zuckereinheit, eine 2'-Hydroxylzuckereinheit oder eine Zuckersurrogateinheit beinhalten.
  • Bevorzugte Nukleobasen der Erfindung beinhalten Purine und Pyrimidine, wie beispielsweise Adenin, Guanin, Cytosin, Uridin und Thymin, als auch andere synthetische und natürliche Nukleobasen, wie beispielsweise Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl- und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Propyl- und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 5-Halogenuracil und -cytosin, 5-Propinyluracil und -cytosin, 6-Azouracil, -cytosin und -thymin, 5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Halogen-, -Amino-, -Thiol-, -Thioalkyl-, -Hydroxyl- und andere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Trifluormethyl- und andere 5-substituierte Uracile und Cytosine und 7-Methylguanin. Weitere Purine und Pyrimidine beinhalten jene, die in den US-Patentschriften 3,687,808, 5,484,908, 5,459,255, 5,457,191 und 5,614,617 (entspricht der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/971,978) offenbart sind, und jene, die in der Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Seiten 858–859, J. I. Kroschwitz, Hrsg. John Wiley & Sons, 1990, offenbart sind, und jene, die von Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, offenbart werden.
  • Bevorzugte Zuckerfragmente sind Pentoribofuranosylzuckereinheiten, d. h. die „natürliche" Zuckereinheit von Messenger-Ribonukleinsäuren. Andere zuckerartige oder Zuckersurrogatverbindungen, die zur Verwendung in den Oligoribonukleotiden oder Oligoribonukleosiden der Erfindung geeignet sind, beinhalten wie in der US-Patentschrift 5,359,044 beschriebene Cyclobutylnukleosidsurrogate, wie in der US-Patentschrift 5,519,134 beschriebene Pyrrolidinnukleosidsurrogate, wie in den US-Patentschriften 5,142,047 und 5,235,033 und verwandten Patentoffenbarungen beschriebene Morpholinonukleosidsurrogate und PNA-Nukleosidsurrogate (PNA = Peptidnukleinsäure).
  • In weiter bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden synthetische oligomere Verbindungen bereitgestellt, die spezifisch mit einem vorgewählten RNA-Ziel hybridisierbar sind, und wobei die Verbindungen ein erstes Segment, das wenigstens eine Surrogat-Nukleosiduntereinheit enthält, und ein zweites Segment enthalten, das wenigstens vier Ribofuranosylnukleosiduntereinheiten umfasst, die in einer aufeinander folgenden Sequenz angeordnet sind und daran 2'-Hydroxyleinheiten aufweisen. Des Weiteren sind die Nukleosiduntereinheiten der oligomeren Verbindung durch Internukleosidverknüpfungen verbunden, die im Vergleich zu Phosphodiesterbindungen gegenüber Abbau stabil sind.
  • In anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden synthetische oligomere Verbindungen bereitgestellt, die spezifisch mit einem vorgewählten RNA-Ziel hybridisierbar sind und die ein erstes Segment, das wenigstens eine Ribofuranosylnukleosiduntereinheit aufweist, die nicht ein DNA- oder RNA-„Hauptbestandteil"-Nukleosid ist, und ein zweites Segment enthalten, das wenigstens vier aufeinander folgende Ribofuranosylnukleosiduntereinheiten enthält, die daran 2'-Hydroxyleinheiten aufweisen. Die Nukleosiduntereinheiten der Verbindungen sind durch Internukleosidverknüpfungen verbunden, die modifiziert sind, um die Verknüpfungen im Vergleich zu Phosphodiesterverknüpfungen gegenüber Abbau zu stabilisieren. Nukleosiduntereinheiten, die nicht DNA- oder RNA-Hauptbestandteilnukleoside sind, so wie der Ausdruck in Verbindung mit dieser Erfindung verwendet wird, sind Teile der Gruppe, die aus Adenosin, 2'-Deoxyadenosin, Guanosin, 2'-Deoxyguanosin, Cytidin, 2'-Deoxycytidin, Uridin und 2'-Deoxythymidin besteht. Als solche schließt diese Gruppe „unbedeutende" Nukleoside aus, die in tRNA oder anderen Nukleinsäuren gefunden werden können.
  • Die Erfindung stellt außerdem Verfahren zum spezifischen Spalten von vorgewählter RNA bereit. Diese Verfahren beinhalten das Kontaktieren der RNA mit einer Verbindung, die wenigstens zwölf Ribofuranosylnukleosiduntereinheiten enthält, die in einer Sequenz zusammengefügt sind, die spezifisch mit der vorgewählten RNA hybridisierbar ist. Die Nukleosiduntereinheiten sind durch Internukleosidbindungen zusammengefügt, die im Vergleich zu Phosphodiesterbindungen gegenüber Abbau stabil sind. Die Verbindung weist wenigstens ein Segment auf, das wenigstens eine modifizierte Nukleosiduntereinheit enthält, wobei die modifizierte Nukleosiduntereinheit modifiziert ist, um die pharmakokinetische Bindung, die Absorption, die Verteilungs- oder Freisetzungseigenschaften der Verbindung; die Affinität oder Spezifität der Verbindung zu der Ziel-RNA und/oder die Modifizierung der Ladung der Verbindung im Vergleich zu einer unmodifizierten Verbindung zu verbessern. Die Verbindung enthält zusätzlich ein weiteres Segment, das wenigstens vier Ribonukleosiduntereinheiten aufweist.
  • Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zum Behandeln eines Organismus, der eine Krankheit hat, die durch die unerwünschte Erzeugung eines Proteins gekennzeichnet ist. Diese Verfahren beinhalten das Kontaktieren des Organismus mit einer oligomeren Verbindung der Erfindung, die eine Sequenz von Nukleosiduntereinheiten aufweist, die spezifisch mit einem komplementären Strang von Ribonukleinsäure hybridisieren kann, wobei wenigstens eine der Nukleosiduntereinheiten funktionalisiert ist, um eine oder mehrere Eigenschaften der oligomeren Verbindungen im Vergleich zu nativer RNA zu modifizieren. Die Verbindung enthält weiterhin eine Vielzahl der Nukleosiduntereinheiten, die 2'-Hydroxylpentofuranosylzuckereinheiten aufweisen.
  • Weiterhin gemäß der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die eine pharmazeutisch wirksame Menge einer oligomeren Verbindung enthalten, die eine Sequenz von Nukleosiduntereinheiten aufweist, die spezifisch mit einem komplementären Strang von RNA hybridisieren kann, und wobei wenigstens eine der Nukleosiduntereinheiten modifiziert ist, um die pharmakokinetische Bindung, die Absorption, die Verteilungs- oder Freisetzungseigenschaften der Verbindung; die Affinität oder Spezifität der Verbindung zu der Ziel-RNA und/oder die Modifizierung der Ladung der Verbindung im Vergleich zu einer unmodifizierten Verbindung zu verbessern. In solchen Verbindungen hat eine Vielzahl der Nukleosiduntereinheiten 2'-Hydroxylpentofuranosylzuckereinheiten. Die Zusammensetzungen enthalten weiterhin ein pharmazeutisch unbedenkliches Verdünnungsmittel oder einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Ribonukleasen eines Säugers, die aus menschlichen T24-Zellen, anderen Zelllinien und Rattengewebe isolierbar sind und die RNA in einem Oligoribonukleotid:RNA-Doppelstrang abbauen. Eine solche Ribonuklease wird hierin als ein dsRNase bezeichnet, wobei „ds" die Spezifität der RNase zu bestimmten doppelsträngigen RNA-Substraten anzeigt. Geeignete Substrate für solche dsRNasen werden hierin ebenfalls bereitgestellt sowie Affinitätsmatrizen, die solche Substrate umfassen.
  • Es werden ebenfalls Verfahren zur In-vitro-Modifizierung einer sequenzspezifischen Ziel-RNA bereitgestellt, einschließlich des Kontaktierens einer Testlösung, die ein dsRNase-Enzym enthält, d. h. ein doppelsträngiges RNase-Enzym, und der Ziel-RNA mit einer oligomeren Verbindung. Die oligomere Verbindung weist eine Sequenz von Nukleosiduntereinheiten auf, die spezifisch an einen komplementären Strang der Nukleinsäure hybridisieren kann, wobei wenigstens eine der Nukleosiduntereinheiten funktionalisiert ist, um die Bindungsaffinität oder Bindungsspezifität des Oligoribonukleotids zum komplementären Strang der Nukleinsäure zu erhöhen, und wobei eine Vielzahl der Nukleosiduntereinheiten 2'-Hydroxylpentafurosanylzuckereinheiten aufweisen.
  • Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zum gleichzeitigen Verstärken der Hybridisierung und/oder dsRNase-Enzymaktivierung in einem Organismus, das das Kontaktieren des Organismus mit einer oligomeren Verbindung beinhaltet, die eine Sequenz von Nukleosiduntereinheiten aufweist, die spezifisch an einen komplementären Strang der Ziel-RNA hybridisieren kann. Wenigstens eine der Nukleosiduntereinheiten ist modifiziert, um die pharmakokinetische Bindung, die Absorption, die Verteilungs- oder Freisetzungseigenschaften der Verbindung; die Affinität oder Spezifität der Verbindung zu der Ziel-RNA und/oder die Modifizierung der Ladung der Verbindung im Vergleich zu einer unmodifizierten Verbindung zu verbessern. Wiederum weist eine Vielzahl der Nukleosiduntereinheiten 2'-Hydroxylpentafurosanylzuckereinheiten auf.
  • Die Erfindung stellt weiterhin Diagnostikverfahren zum Erkennen des Vorliegens oder Fehlens abnormer RNA-Moleküle oder abnormer oder ungeeigneter Expression von normalen RNA-Molekülen in Organismen oder Zellen. Die Erfindung stellt weiterhin Reagenzien für die Forschung zum Modulieren der Enzymaktivität bereit, einschließlich der dsRNase-Aktivität in In-vitro-Lösungen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 stellt schematisch bestimmte veranschaulichende chimäre oligomere Verbindungen der Erfindung dar, wobei leere Kästchen 2'-Methoxy-modifizierte Ribonukleotide darstellen, gefüllte Kreise 2'-Hydroxylribonukleotide darstellen und in allen in der Figur gezeigten Verbindungen Phosphorthioatverknüpfungen eingesetzt werden.
  • Die 2 stellen Ha-ras-mRNA-Niveaus in mit vollständigem 2'-Methoxy- oder chimärem RNA-Gapmer-Oligonukleotid behandelten Zellen dar. Es sind Northern-Blot-Analysen für Ha-ras-mRNA-Niveaus in mit den angezeigten Dosen von vollständigem 2'-Methoxyoligonukleotid (Feld 2A) oder 3-Gap-Oligonukleotid (Feld 2C) zu 24 Std. gezeigt. Die obere Bande ist das Signal für Ha-ras; dieses Signal wurde auf das für G3PDH erhaltene (untere Bande) normiert, es wurden die relativen Ha-ras-Niveaus bestimmt und graphisch dargestellt (Felder 2C–2D). Keine der Behandlungen mit Oligonukleotid reduzierte die Ha-ras-mRNA-Niveaus.
  • 3 zeigt Northern-Blot-Analysen von T24-Zellen, die wie in 2 behandelt wurden, mit der Ausnahme, dass chimäre RNA-Gapmer-Oligonukleotide entweder ein 5-, 7- oder 9-Ribonukleotidgap oder ein vollständiges Ribonukleotidmolekül enthielten (linke Felder 3A, 3B, 3C bzw. 3D); die Zellen wurden außerdem mit einem Kontrolloligoribonukleotid behandelt, das vier mit der Ha-ras-mRNA-Sequenz nicht zusammenpassende Basenpaare enthält (linkes Feld 3E). Die Ha-ras-Signale wurden auf das von G3PDN normiert und die relativen Ha-ras-Niveaus wurden graphisch dargestellt (rechte Felder).
  • In 4 ist die Auswirkung von T24-Zytosolextrakten und RNase H auf Doppelstränge in vitro gezeigt. Ein Doppelstrang mit 17 Basenpaaren, der aus dem gegen Ha-ras gerichtete 9-RNA-Gapmer-Oligonukleotid besteht, das mit einem mit 32P markierten RNA-Komplement verschmolzen wurde, wurde die angegebenen Zeiten lang bei 37°C mit 3 μg T24-Zytosolproteinfraktion inkubiert, die Reaktion wurde angehalten und die Produkte wurden auf einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel getrennt. Die Verdauprodukte (Pfeile) weisen darauf hin, dass die Spaltung des Doppelstrangs auf die RNA:RNA-Region beschränkt ist (siehe schematische Darstellung des Doppelstrangs, ganz rechts).
  • 5 zeigt den gleichen 9-RNA-Gapmer-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrang wie in 4, der mit oder ohne RNase H von E. coli inkubiert ist (– bzw. +). Das Fehlen von Verdauprodukten weist darauf hin, dass dieser Doppelstrang kein Substrat für RNase H ist. Doppelstränge, die aus mit 32P markierter RNA bestehen, die entweder mit einem vollständigen Oligodeoxynukleotid (mittleres Feld) oder einem 9-DNA-Gapmer-Oligonukleotid (linkes Feld) verschmolzen wurde, sind Substrate zum Spalten durch RNase H und erzeugen folglich wie erwartet Verdauprodukte (Pfeile).
  • 6 stellt eine elektrophoretische Analyse mit SDS-Polyacrylamid-Gel der aktiven Fraktion konzentrierter Rattenleber nach Größenausschlusschromatographie. mw: Molekulargewichtmarkierungen in Kilodalton (kD). Fraktion 3 (Spur 4) mit einem scheinbaren Molekulargewicht im Bereich von etwa 35 bis etwa 100 kD, wobei eine Menge des Materials ein scheinbares Molekulargewicht im Bereich von 50 bis etwa 80 kD aufweist, hatte das höchste Ausmaß an dsRNase-Aktivität.
  • 7 zeigt eine Analyse von Verdauprodukten von dsRNase-Substraten mittels Elektrophorese mit nativem Polyacrylamid-Gel. Antisense- und Sense-Oligonukleotide wurden vorverschmolzen und mit Zellextrakten inkubiert und wie hierin beschrieben mit dsRNasen gereinigt. Spur 1: unbehandelte „Sense"-Strang-RNA; Spur 2: mit 0,02 Einheiten RNase V1 behandelte „Sense"-Strang-RNA; übrige Spuren: dsRNase-Substrate, behandelt mit 0,02 (Spur 3) und 0,002 (Spur 4) Einheiten RNase V1, mit ungereinigtem Zellkernextrakt für 0 Minuten (Spur 5) oder 240 Minuten (Spur 6), mit ungereinigtem Zellkernextrakt für 240 Minuten ohne Mg++ (Spur 7), mit ungereinigtem Zytosolextrakt für 240 Minuten (Spur 8), mit durch Ionenaustausch gereinigtem Zytosolextrakt für 240 Minuten in Gegenwart (Spur 9) oder Abwesenheit (Spur 10) von Mg++ und mit durch Ionenaustausch/Gelfiltration gereinigtem Zytosolextrakt für 240 Minuten in Gegenwart (Spur 11) oder Abwesenheit (Spur 12) von Mg++.
  • 8 zeigt eine Analyse von Produkten des Verdaus von dsRNase-Substraten mittels Elektrophorese mit denaturierendem Polyacrylamid-Gel. Spur 1: mit 5 × 10–3 Einheiten RNase A behandelte „Sense"-Strang-RNA; Spur 2: mit 0,02 Einheiten RNase V1 behandelte „Sense"-Strang-RNA; Spuren 3–9: dsRNase-Produkte, behandelt mit 0,02 (Spur 3) und 0,002 (Spur 4) Einheiten RNase V1, mit ungereinigtem Zellkernextrakt für 0 Minuten (Spur 5) oder 240 Minuten (Spur 6), mit ungereinigtem Zytosolextrakt für 240 Minuten (Spur 7), mit durch Ionenaustausch gereinigtem Zytosolextrakt für 240 Minuten (Spur 8) und mit durch Ionenaus tausch/Gelfiltration gereinigtem Zytosolextrakt für 240 Minuten (Spur 9). Spur 10: Basenhydrolyseleiter.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, wird heute geglaubt, dass man durch die Verwendung bestimmter chemisch modifizierter oligomerer Verbindungen bestimmte Enzymaktivitäten in eukaryotischen Zellen, einschließlich menschlichen Zellen, ausnutzen kann, was aus der unerwarteten Wechselwirkung dieser Verbindungen mit einem Ziel-RNA-Strang zur Bildung doppelsträngiger RNA-artiger Strukturen, die durch bestimmte Enzyme gespalten werden, resultiert. Vordem ist eine solche Aktivität in eukaryotischen System weder erkannt noch ausgenutzt worden. Es wurde nun festgestellt, dass die oligomeren Verbindungen der Erfindung gewisse RNA-artige Merkmale haben, die ihnen ermöglichen, eine doppelsträngige Struktur mit einer als Ziel gesetzten RNA-Region zu bilden, und diese doppelsträngige Struktur wird anschließend von eukaryotischen dsRNasen, d. h. doppelsträngigen RNase-Enzymen, in einer Zell- oder Testlösung abgebaut. Durch Verwendung von T24-Krebszellen der menschlichen Blase als einem veranschaulichenden eukaryotischen Zellsystem wurde gezeigt, dass diese Aktivität in vergleichbaren Niveaus sowohl in Zell- als auch zytoplasmatischen Fraktionen vorliegt.
  • Bei bestimmten veranschaulichenden Methoden, die hierin zur Veranschaulichung dieser Erfindung bereitgestellt sind, wurde festgestellt, dass diese Aktivität nach der Spaltung des RNA-Substrats 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxylgruppen hinterlässt. Diese Erzeugung von 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxyltermini ist ein Merkmal, das es mit mehreren anderen Nukleasen gemein hat, die doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle erkennen, einschließlich RNase HI und II, die die RNA-Komponente eines DNA:RNA-Doppelstrangs in E. coli spalten, RNase III, die die Hydrolyse von doppelsträngiger RNA mit hohem Molekulargewicht katalysiert und den Abbau von Sense/Antisense-Doppelsträngen vermittelt, und RNase V1.
  • Viele Komponenten von mRNA-Abbausystemen sind zwischen Prokaryoten und Eukaryoten konserviert worden. Es wurde nun festgestellt, dass wie prokaryotische Organismen, in denen RNase III den Abbau von Sense/Antisense-Hybriden zum Regulieren der Expression mancher Gene durchführt, auch menschliche Zellen eine Aktivität konserviert haben, die eine ähnliche Rolle ausführen kann. Zusätzlich zu anderen Verwendungszwecken, einschließlich therapeutischen und diagnostischen Verwendungszwecken, können die Verbindungen dieser Erfindung dank dieser Aktivität als Reagenzien für die Forschung verwendet werden, um dabei zu helfen zu verstehen, wie menschliche Zellen endogen exprimierte Antisense-Transkripte zum Modulieren der Genexpression verwenden.
  • Die überwiegende Mehrheit von experimentell verwendeten oder derzeit im klinischen Gebrauch getesteten Antisense-Oligonukleotiden im Menschen sind modifizierte Oligodeoxynukleotide. Es wurde gezeigt, dass die zwischen solchen Oligodeoxynukleotid-Antisense-Verbindungen und ihrer Ziel-RNA gebildete Heteroduplex von einer intrazellulären Nuklease, RNase H, erkannt wird, die nur den RNA-Strang dieses Doppelstrangs spaltet. Obwohl durch RNase H vermittelter Abbau von Ziel-RNA sich als ein nützlicher Mechanismus erwiesen hat, hat er gewisse Einschränkungen. RNase H ist gegenüber an den Antisense-Oligonukleotiden vorgenommenen strukturellen Modifikationen hoch empfindlich und folglich haben die meisten der Modifikationen, die zum Verbessern der therapeutischen Eigenschaften, wie beispielsweise erhöhte Affinität, erhöhte Nukleaseresistenz und höhere Zelldurchlässigkeit, entworfen wurden, zu Oligonukleotiden geführt, die die Spaltung durch RNase H nicht unterstützen. Eine weitere Einschränkung von RNase H als einem Terminationsmechanismus für Antisense-Wirkung ist die Tatsache, dass die Oligonukleotide DNA-„artig" sein müssen, und dadurch dass sie DNA-„artig" sind, haben solche Oligonukleotide eine von Natur aus geringe Affinität zu ihrer Ziel-RNA. Zum Umgehen dieser geringen Affinität konzipierte Strategien beinhalten den Entwurf von „Gapmer"-Oligonukleotiden, die sich aus einer Länge chemisch modifizierter Oligonukleotide mit hoher Affinität an den 5'- und 3'-Enden (den Schenkeln) mit einer Länge unmodifizierter Deoxyoligonukleotide in der Mitte (dem Zwischenteil oder Gap) zusammensetzen. DNA-Gapmere, d. h. Oligodeoxynukleotid-Gapmere, haben erheblich höhere Affinitäten zu ihrem Ziel als Oligodeoxynukleotide; von der RNase-H-Aktivität ist jedoch gezeigt worden, dass sie je nach der Größe des DNA-Gaps beeinträchtigt ist.
  • Bei Verwendung von RNase H als einem Terminationsmechanismus mittels RNA-Abbau muss auch die zelluläre Lokalisation und Gewebeverteilung von RNase H berücksichtigt werden. RNase-H-Aktivität ist hauptsächlich zum Zellkern lokalisiert, obwohl sie im Zytoplasma in geringerem Ausmaß entdeckt worden ist. Der größte Teil einer gegebenen mRNA wird im Zytoplasma von Zellen gefunden; folglich wäre die ideale, als Terminationsmechanismus auszunutzende Aktivität eine mit hohem Ausmaß sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma. RNase-H-Aktivität ist auch von Zelllinie zu Zelllinie oder zwischen Geweben sehr variabel, wodurch ein gegebener Krankheitszustand möglicherweise nicht ein guter Kandidat nur für den RNA-Abbau ist, da das Zielgewebe unzureichende RNase-H-Aktivität aufweist. Es ist klar, dass alternative Terminationsmechanismen zum Abbauen von Ziel-RNA sehr wünschenswert sind.
  • Neben anderen Verwendungszwecken kann die Aktivität, die nun erkannt wurde, jetzt als ein alternativer Terminationsmechanismus zu RNase H für Antisense-Therapien ausgenutzt werden. Es wurde festgestellt, dass die Aktivität durch Verwendung von RNA-artigen Oligonukleotiden, die eine hohe Affinität zu ihrem Ziel und folglich eine höhere Wirksamkeit als DNA-artige Oligonukleotide haben, in menschlichen Zellen exprimiert werden kann. Das Vorliegen der Aktivität in sowohl dem Zytoplasma als auch dem Zellkern ermöglicht es, dass die Verbindungen der Erfindung zum Inhibieren vieler RNA-Verarbeitungsereignisse vom Prä-mRNA-Kernspleißen und -Transport bis zum Abbau von reifem Transkript im Zytoplasma verwendet werden können.
  • Um diese Erfindung zu veranschaulichen und sie mit anderen bekannten Antisense-Mechanismen, z. B. RNase H, zu vergleichen, ist die von den Verbindungen der Erfindung induzierte dsRNase-Aktivität durch Richten dieser auf das Codon 12 von Ha-ras untersucht worden. Wie in der US-Patentschrift 5,297,248, die der Seriennummer 08/297,248 entspricht, und ihrer verwandten Anmeldung mit der internationalen Patentanmeldung mit der Nummer WO 92/22651, am 23. Dezember 1992 veröffentlicht, die beide häufig dieser Anmeldung zugeordnet werden, beschrieben ist, sind die ras-Onkogene Mitglieder einer Genfamilie, die verwandte Proteine kodieren, die zur Innenseite der Plasmamembran lokalisiert sind und von denen gezeigt wurde, dass sie beim Aminosäuren-Niveau stark konserviert sind, um GTP mit hoher Affinität und Spezifität zu binden und über GTPase-Aktivität zu verfügen. Obwohl die zelluläre Funktion von ras-Genprodukten unbekannt ist, deuten ihre biochemischen Eigenschaften, zusammen mit ihrer signifikanten Sequenzhomologie mit einer Klasse von signalübertragenden Proteinen, die als GTP-Bindeproteine oder G-Proteine bekannt sind, an, dass ras-Genprodukte eine wesentliche Rolle bei grundlegenden Zellregulationsfunktionen spielen, die mit der Transduktion von extrazellulären Signalen über Plasmamembranen hinweg zusammenhängen.
  • Drei ras-Gene, mit H-ras, K-ras und N-ras bezeichnet, sind im Genom eines Säugers identifiziert worden. ras-Gene eines Säugers erlangen eine Umformung induzierende Eigenschaften durch Einzelpunktmutationen mit ihren kodierenden Sequenzen. Mutationen in natürlich vorkommenden ras-Onkogenen sind in den Codonen 12, 13 und 61 lokalisiert worden. Die am häufigsten entdeckte, in Tumoren von Menschen gefundene aktivierende ras-Mutation ist im Codon 12 des H-ras-Gens, in dem ein Basenwechsel von GGC zu GTC in einer Substitution von Glycin durch Valin in der GTPase-Regulationsdomäne des ras-Proteinprodukts resultiert. Von diesem Wechsel einer einzigen Aminosäure wird vermutet, dass er die normale Steuerung der ras-Proteinfunktion aufhebt, wodurch ein normal reguliertes Zellprotein zu einem kontinuierlich aktiven umgewandelt wird. Es wird geglaubt, dass sich eine solche Deregulation der normalen ras-Proteinfunktion für die Umformung von normalem zu malignem Wachstum verantwortlich zeichnet.
  • Obwohl die Verbindungen der Erfindung aus Veranschaulichungszwecken gegen ras-RNA gerichtet sind, ist natürlich anerkannt, dass eine Menge anderer RNAs ebenfalls als die Ziel-RNA geeignet sind. Folglich können die Verbindungen der Erfindung zum Modulieren der Expression einer beliebigen geeigneten Ziel-RNA, die in Zellen natürlich vorhanden ist, oder einer beliebigen Ziel-RNA in vitro verwendet werden.
  • Der aus Veranschaulichungszwecken verwendete ras-Zielort ist einer der am meisten gegenüber RNase H empfindlichen Oligonukleotidorte, der in der Literatur identifiziert worden ist. Die selektive Inhibition von mutierten Genen, wie beispielsweise dem ras-Onkogen, macht die Hybridisierung einer Regulationsverbindung in der Kodierregion der mRNA erforderlich. Dies bedingt entweder eine Wechselwirkung mit hoher Affinität zwischen einer solchen Verbindung und ras-mRNA, um die Verdrängung der Verbindung durch das Polysom zu verhindern, oder den schnellen Abbau der Ziel-mRNA durch einen gegebenen Terminationsmechanismus. Wiederum ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, haben die RNA-artigen Verbindungen der Erfindung von sich aus eine hohe Affinität und sind zudem in der Lage, die Aktivität zellulärer dsRNase auszunutzen.
  • Gemäß der Aufgaben dieser Erfindung werden neuartige oligomere Verbindungen bereitgestellt, die sich an einen Ziel-RNA-Strang binden und die Substrate für dsRNase-Enzyme sind. Die oligomeren Verbindungen der Erfindung beinhalten Oligoribonukleotide, Oligoribonukleoside und andere oligomere Verbindungen mit einer darin eingebundenen linearen Sequenz verknüpfter Ribonukleosiduntereinheiten. Solche anderen oligomeren Verbindungen beinhalten chimäre Strukturen, die zwischen PNA-Segmenten (PNA = Peptidnukleinsäure) und verknüpften Ribonukleosiden gebildet werden. Folglich ist der Ausdruck „oligomere Verbindung" für die Zwecke dieser Patentschrift so zu verstehen, dass er die Ausdrücke „Oligoribonukleotide" und „Oligoribonukleoside", entweder einzeln oder in Kombination verwendet, als auch andere oligomere Verbindungen beinhaltet, einschließlich chimären Verbindungen, die zwischen PNA-Segmenten (und anderen Surrogat-Nukleosidkomponenten) und verknüpften Ribonukleosidsegmenten gebildet werden. Wie in dieser Patentschrift und den hieran angehängten Ansprüchen verwendet, wird der Ausdruck „oligomere Verbindung" in einer Hinsicht dazu verwendet, Oligoribonukleotide zu repräsentieren, in einer anderen Hinsicht, Oligoribonukleoside zu repräsentieren, in einer noch weiteren Hinsicht, Mischungen aus Oligoribonukleotiden und Oligoribonukleosiden zu repräsentieren, und in anderen Fällen, weitere chimäre Verbindungen zu bezeichnen, wie beispielsweise die oben identifizierten chimären PNA-Verbindungen.
  • Die Oligoribonukleotide und Oligoribonukleoside der Erfindung sind aus einer Vielzahl von Nukleosiduntereinheiten aufgebaut. In bestimmten bevorzugten Oligoribonukleotiden oder Oligoribonukleosiden der Erfindung trägt wenigstens eine der Nukleosiduntereinheiten eine Substituentengruppe, die die Bindungsaffinität des Oligoribonukleotids oder Oligoribonukleosids zu einem komplementären Strang von Nukleinsäure erhöht. Darüber hinaus umfassen wenigstens einige der Nukleosiduntereinheiten 2'-Hydroxylpentofuranosylzuckereinheiten.
  • Damit ein Oligonukleotid für die zelluläre Verwendung besonders nützlich ist, muss das Oligoribonukleotid gegenüber Nukleasen einigermaßen stabil sein, um in Zellen einen ausreichenden Zeitraum lang zu überleben, um mit Zielnukleinsäuren der Zellen wechselwirken zu können. Daher werden in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung spezifische Nukleosiduntereinheiten oder Internukleosidverknüpfungen funktionalisiert oder ausgewählt, um die Nukleaseresistenz des Oligoribonukleotids oder Oligoribonukleosids zu erhöhen. Bei nicht-zellulären Verwendungszwecken, wie beispielsweise der Verwendung von oligomeren Verbindungen der Erfindung als Reagenzien für die Forschung und als Diagnostika, ist eine solche Nukleasestabilität jedoch möglicherweise nicht erforderlich.
  • Beim Bestimmen des Ausmaßes an Bindungsaffinität einer ersten Nukleinsäure zu einer komplementären Nukleinsäure kann die relative Fähigkeit der ersten Nukleinsäure, sich an die komplementäre Nukleinsäure zu binden, durch Bestimmen der Schmelztemperatur eines bestimmten Hybridisierungskomplexes verglichen werden. Die Schmelztemperatur (Tm), eine charakteristische physikalische Eigenschaft doppelsträngiger Nukleotide, zeigt die Temperatur an (in Grad Celsius), bei der 50% helikale Formen (hybridisiert) gegenüber Spiralformen (nicht hybridisiert) vorliegen. Tm wird durch Verwendung des UV-Spektrums gemessen, um die Bildung und das Zerfallen (Schmelzen) des Hybridisierungskomplexes zu bestimmen. Basenstapelung, die während der Hybridisierung auftritt, wird von einer Verminderung der UV-Absorption (Hypochromie) begleitet. Infolgedessen deutet eine Verminderung der UV-Absorption auf eine höhere Tm hin. Je höher die Tm ist, desto größer ist die Festigkeit der Bindungen zwischen den Strängen.
  • Es wurde in der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass die Bindungsaffinität von Oligoribonukleotiden und Oligoribonukleosiden der vorliegenden Erfindung durch Einbinden von Substituentengruppen in die Nukleosiduntereinheiten dieser Verbindungen erhöht werden kann. Bevorzugte Substituentengruppen sind 2'-Substituentengruppen, d. h. Substituentengruppen, die an der 2'-Stellung der Pentofuranosylzuckereinheiten der Nukleosiduntereinheiten der Verbindungen der vorliegenden Erfindung angeordnet sind. Derzeit bevorzugte Substituentengruppen beinhalten Fluor, Alkoxy, Aminoalkoxy, Allyloxy, Imidazolylalkoxy und Polyethylenglykol. Alkoxy- und Aminoalkoxygruppen beinhalten im Allgemeinen Niederalkylgruppen, insbesondere C1-C9-Alkyl. Polyethylenglykole sind von der Struktur (O-CH2-CH2)n-O-Alkyl. Eine besonders bevorzugte Substituentengruppe ist ein Polyethylenglykolsubstituent der Formel (-O-CH2-CH2)-O-Alkyl, worin n = 1 und Alkyl = CH3. Von dieser Modifizierung wurde gezeigt, dass sie sowohl die Affinität eines Oligonukleotids für sein Ziel als auch die Nukleaseresistenz eines Oligonukleotids erhöht.
  • Eine weiter besonders nützliche 2'-Substituentengruppe zum Erhöhen der Bindungsaffinität ist die 2'-Fluorgruppe. In einer veröffentlichten Studie (Synthesis and Biophysical Studies of 2'-dR180-F Modified Oligonucleotides, Conference on Nucleic Acid Therapeutics, Clearwater, FL, USA, 13. Januar 1991) wurde von einem Anstieg der Bindungsaffinität von 1,6°C pro substituierter Nukleosiduntereinheit bei einem 15-mer-Phosphodiesteroligonukleotid mit 2'-Fluorsubstituentengruppen an fünf der Nukleosiduntereinheiten des Oligonukleotids berichtet. Wenn 11 der Nukleosiduntereinheiten des Oligonukleotids 2'-Fluorsubstituentengruppen trugen, stieg die Bindungsaffinität auf 1,8°C pro substituierter Nukleosiduntereinheit an. In dieser Studie wurde das 15-mer-Phosphodiesteroligonukleotid zum entsprechenden Phosphortioatanalogon derivatisiert. Wenn das 15-mer-Phosphodiesteroligonukleotid mit seinem Phosphorthioatanalogon verglichen wurde, hatte das Phosphorthioatanalogon eine Bindungsaffinität von nur etwa 66% der des 15-mer-Phosphodiesteroligonukleotids. In anderen Worten, beim Derivatisieren des Oligonukleotids zu seinem Phosphorthioatanalogon ging Bindungsaffinität verloren. Wenn sich jedoch 2'-Fluorsubstituenten an 11 der Nukleosiduntereinheiten des 15-mer-Phosphodiesteranalogums befanden, wurde die verzeichnete Abnahme durch Derivatisieren des 15-mer-Oligonukleotids zu seinem Phosphorthioatanalogon durch die Bindungsaffinität der 2'-Substituentengruppen mehr als überwunden. In dieser Verbindung, d. h. dem 15-mer-Phosphodiesteroligonukleotid mit 11 mit 2'-Fluorsubstituentengruppen substituierten Nukleosiduntereinheiten, wurde die Bindungsaffinität auf 2,5°C pro Substituentengruppe erhöht.
  • Zur Verwendung bei der Herstellung der Nukleosidstrukturuntereinheiten der Verbindungen der Erfindung geeignete Nukleobasen zur Einbindung in diesen Nukleosiduntereinheiten beinhalten Purine und Pyrimidine, wie beispielsweise Adenin, Guanin, Cytosin, Uridin und Thymin, als auch andere synthetische und natürliche Nukleobasen, wie beispielsweise Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl- und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Propyl- und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 5-Halogenuracil und -cytosin, 5-Propinyluracil und -cytosin, 6-Azouracil, -cytosin und -thymin, 5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Halogen-, -Amino-, -Thiol-, -Thioalkyl-, -Hydroxyl- und andere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Trifluormethyl- und andere 5-substituierte Uracile und Cytosine, 7-Methylguanin. Weitere Purine und Pyrimidine beinhalten jene, die in der US-Patentschrift 3,687,808 offenbart sind, jene, die in der Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Seiten 858–859, J. I. Kroschwitz, Hrsg. John Wiley & Sons, 1990, offenbart sind, und jene, die von Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, offenbart werden. Bestimmte dieser Nukleobasen sind besonders zum Erhöhen der Bindungsaffinität der oligomeren Verbindungen der Erfindung von Nutzen. Diese beinhalten 5-substituierte Pyrimidine, 6-Azapyrimidine und N-2-, N-6- und O-6-substituierte Purine, einschließlich 2-Aminopropyladenin, 5-Propinyluracil und 5-Propinylcytosin. Von anderen modifizierten Pyrimidin- und Purinbasen wird ebenfalls erwartet, dass sie die Bindungsaffinität von oligomeren Verbindungen zu einem komplementären Strang von Nukleinsäure erhöhen.
  • Gemäß dieser Erfindung bevorzugte Oligoribonukleotide und Oligoribonukleoside umfassen vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 50 Nukleosiduntereinheiten. Im Rahmen dieser Erfindung versteht sich, dass dies nicht-natürlich vorkommende Oligomere wie hierin zuvor beschrieben umfasst, die 5 bis 50 Nukleosiduntereinheiten aufweisen. Es ist mehr bevorzugt, dass die Oligoribonukleotide und Oligoribonukleoside der vorliegenden Erfindung etwa 15 bis etwa 25 Nukleosiduntereinheiten umfassen. Wie man zu schätzen wissen wird, ist eine Nukleosiduntereinheit eine Kombination aus Nukleobase und Zucker oder Zuckersurrogat, die auf geeignete Weise durch Phosphorverknüpfungen bei Oligoribonukleotiden und durch Nicht-Phosphorverknüpfungen bei Oligoribonukleosiden an benachbarte Untereinheiten gebunden ist. In diesem Zusammenhang wird der Ausdruck „Nukleosiduntereinheit" austauschbar mit dem Ausdruck „Nukleosideinheit" oder „Nukleosid" verwendet.
  • Die Oligoribonukleotide der Erfindung weisen ihre Nukleosiduntereinheiten durch Phosphorverknüpfungen verbunden auf, einschließlich Phosphodiester, Phosphorthioat, 3'-(oder 5'-)Deoxy-3'-(oder -5'-)thiophosphorthioat, Phosphordithioat, Phosphorselenate, 3'-(oder 5'-)Deoxyphosphinate, Boranphosphate, 3'-(oder 5'-)Deoxy-3'-(oder -5'-)aminophosphoramidate, Hydrogenphosphanate, Boranphosphatester, Phosphoramidate, Alkyl- oder Arylphosphonate und Phosphotriesterphosphorverknüpfungen. Die Oligoribonukleoside der Erfindung dagegen weisen ihre Nukleosiduntereinheiten durch Carbonat-, Carbamat-, Silyl-, Schwefel-, Sulfonat-, Sulfonamid-, Formacetal-, Thioformacetal-, Oxim-, Methylenimino-, Methylenmethylimino-, Methylenhydrazo-, Methylendimethylhydrazo- und Methylenoxymethyliminoverknüpfungen verbunden auf.
  • Um eine dsRNase-Reaktion in der gesamten Sequenzlänge der oligomeren Verbindungen der Erfindung auszulösen, wird ein Segment oder eine Teilsequenz von mehr als drei, aber vorzugsweise vier, fünf oder mehr aufeinander folgend verknüpften, 2'-Hydroxylpentofuranosyl enthaltenden Nukleosiduntereinheiten vorliegen. Es ist derzeit bevorzugt, die 2'-Hydroxylpentofuranosyl enthaltende Nukleosidteilsequenz in der oligomeren Verbindung derart einzubinden, dass weitere Teilsequenzen bzw. Segmente der oligomeren Verbindung zu beiden Seiten der 2'-Hydroxylpentofuranosyl enthaltenden Nukleosidteilsequenz angeordnet sind. Bei einer solchen Konstruktion wird die 2'-Hydroxylpentofuranosyl enthaltende Nukleosidteilsequenz auch als die „mittlere" oder „Gap"-Region bzw. das „mittlere" oder „Gap"-Segment bezeichnet und die anderen Nukleosidteilsequenzen bzw. -segmente werden als „Flanken"- oder „Schenkel"-Regionen bzw. -Segmente bezeichnet. Folglich wird die „Gap"-Region zu beiden Seiten von Schenkeln flankiert. Andere Konstruktionen sind ebenfalls möglich, einschließlich dem Anordnen der 2'-Hydroxylpentofuranosyl enthaltenden Nukleosidteilsequenz an entweder dem 3'- oder dem 5-Terminus der oligomeren Verbindung der Erfindung. Diese anderen Konstruktionen können als „offene", „gapped" Strukturen betrachtet werden, d. h. die Gap-Region ist am Ende (entweder dem 3'- oder dem 5'-Ende) der oligomeren Verbindung offen.
  • Die gemäß dieser Erfindung verwendeten Oligoribonukleotide und Oligoribonukleoside können in geeigneter Weise und routinemäßig mittels der wohl bekannten Technik der Festphasensynthese hergestellt werden, siehe beispielsweise „Oligonucleotide synthesis, a practical approach", Hrsg. M. J. Gait, IRL Press, 1984; „Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", Hrsg. F. Eckstein, IRL Press, 1991 (insbesondere Kapitel 1: Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis, Kapitel 2: Oligoribonucleotide synthesis, Kapitel 3: 2'-O-Methyloligoribonucleotides: synthesis and applications, Kapitel 4: Phosphorothioate oligonucleotides, Kapitel 5: Synthesis of oligonucleotide phosphorodithioates, Kapitel 6: Synthesis of oligo-2'-deoxyribonucleoside methylphosphonates und Kapitel 7: Oligodeoxynucleotides containing modified bases). Andere besonders dienliche Synthesemethoden, Reagenzien, Blockierungsgruppen und Reaktionsbedingungen sind in P. Martin, Helv. Chim. Acta., 1995, 78, 486–504; S. L. Beaucage und R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223–2311, und S. L. Beaucage und R.P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123–6194, oder darin genannten Referenzen beschrieben.
  • Einrichtungen zur Oligonukleotid- und Oligonukleosidsynthese werden von mehreren Händlern verkauft, darunter Applied Biosystems. Auch verschiedene Amitid-Reagenzien sind im Handel erhältlich, darunter 2'-O-Methylamidite und 2'-O-Hydroxylamidite. Es können auch beliebige andere Mittel für eine solche Synthese eingesetzt werden. Die eigentliche Synthese der Oligonukleotide liegt sehr gut innerhalb der Fähigkeiten von Fachmännern. Es ist ebenfalls wohl bekannt, ähnliche Techniken zum Herstellen anderer Oligonukleotide, wie beispielsweise der Phosphorthioate und alkylierten Derivate, zu verwenden. Es ist auch wohl bekannt, ähnliche Techniken und im Handel erhältliche modifizierte Amidite und CPG-Produkte (CPG = controlled-pore glass, Glas mit kontrollierter Porengröße), wie beispielsweise mit Biotin, Fluoreszein, Acridin oder Psolaren modifizierte Amidite und/oder CPG (von Glen Research, Sterling, VA, USA, erhältlich), zu verwenden, um fluoreszierend markierte, biotinylierte oder andere konjugierte Oligonukleotide zu synthetisieren.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Ribonuklease eines Säugers, die aus menschlichen T24-Zellen und anderen Zelllinien isolierbar ist und die RNA in einem Antisense-Oligoribonukleotid:RNA-Doppelstrang abbaut. Die Ribonuklease wird hierin als ein dsRNase bezeichnet, wobei „ds" die Spezifität der RNase zu doppelsträngigen RNA-Substraten anzeigt. Antisense-Oligodeoxynukleotide, die mit 2'-Methoxy modifizierte Zuckereinheiten enthalten, binden mit hoher Affinität an ihre zellulären mRNA-Ziele, die resultierenden [„DNA-artig"]:[RNA]-Doppelstränge sind jedoch keine Substrate für nukleolytischen Abbau in T24-Zellen. Wie in den Beispielen ausführlich beschrieben ist, wurden 2'-Methoxyphosphorthioat-Antisense-Oligonukteotide, die gegen das Codon 12 von Ha-ras-mRNA gerichtet sind, durch Substituieren von 2'-Methoxynukleotiden mit einer Länge von Ribonukleotiden in der Mitte des Oligonukleotids modifiziert, um chimäre 2'-Methoxy/Ribo/2'-Methoxy- oder „Gapmer"-Nukleotide zu bilden, wobei die Phosphorthioatverknüpfung in den gesamten Molekülen aufrechterhalten wird. Diese „RNA-artigen" Gapmer-Oligonukleotide binden an ihr zelluläres mRNA-Ziel mit einer Affinität, die mit der des vollständigen 2'-Methoxyoligodeoxynukleotid vergleichbar ist; die resultierenden [„RNA-artig"]:[RNA]-Doppelstränge sind jedoch im Gegensatz zu den [„DNA-artig"]:[RNA]-Doppelsträngen Substrate für nukleolytischen Abbau in T24-Zellen. Der Abbau des [„RNA-artiges" Antisense-Gapmer-Oligonukleotid]:[Ha-ras-mRNA]-Doppelstrangs hängt von der Anzahl der in das Antisense-Molekül eingebundenen Ribonukleotide ab. Ein 17-Basenpaar-9-RNA-Gapmer-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrang ist kein Substrat für RNase-H-Abbau, ist aber ein Substrat für die Spaltung durch eine dsRNase der Erfindung in T24-Zelllysaten. Darüber hinaus werden die bei T24-Zelllysaten erkannten Spaltungsorte zum RNA:RNA-Teil des Doppelstrangs lokalisiert und werden nicht im 2'-Methoxy:RNA-Teil des Doppelstrangs erkannt. Die Spaltung des Doppelstrangs durch die dsRNase der Erfindung produziert 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxyltermini.
  • Verbindungen der Erfindung können als Diagnostika, Therapeutika und Reagenzien und Kits für die Forschung verwendet werden. Sie können in pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden, indem eine wirksame Menge einer Verbindung der Erfindung zu einem geeigneten pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmittel oder Trägerstoff gegeben wird. Sie können weiterhin zum Behandeln von Organismen verwendet werden, die eine Krankheit haben, die durch die unerwünschte Erzeugung eines Proteins gekennzeichnet ist. Der Organismus kann mit einer Verbindung der Erfindung in Kontakt gebracht werden, die eine Sequenz aufweist, die spezifisch mit einem Strang von Zielnukleinsäure hybridisieren kann, die für das unerwünschte Protein kodiert.
  • Von der Formulierung von therapeutischen Zusammensetzungen und deren anschließender Verabreichung wird geglaubt, dass sie innerhalb der Fähigkeiten von Fachmännern liegen. Im Allgemeinen wird bei der Therapeutik einem Patienten, der einer solchen Therapie bedarf, eine erfindungsgemäße Verbindung verabreicht, üblicherweise in einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff, in Dosen im Bereich von 0,01 μg bis 100 g pro kg Körpergewicht je nach Alter des Patienten und der Schwere des behandelten Krankheitszustands. Weiterhin kann das Behandlungsregime einen Zeitraum lang währen, der je nach der Natur der bestimmten Krankheit, ihrer Schwere und dem Gesamtzustand des Patienten variieren wird, und kann sich von einmal täglich bis zu einmal alle 20 Jahre erstrecken. Nach der Behandlung wird der Patient auf Änderungen seines Zustands und auf Linderung der Symptome des Krankheitszustands überwacht. Die Dosierung der Verbindung kann entweder im Fall, dass der Patient nicht signifikant auf derzeitige Dosierungsniveaus anspricht, erhöht werden oder die Dosis kann verringert werden, wenn eine Linderung der Symptome des Krankheitszustands beobachtet wird oder wenn der Krankheitszustand nicht mehr besteht.
  • In einigen Fällen kann es effektiver sein, einen Patienten mit einer Verbindung der Erfindung zusammen mit anderen herkömmlichen therapeutischen Modalitäten zu behandeln. Einem Patienten, der aufgrund einer Viruserkrankung behandelt wird, kann beispielsweise eine Verbindung der Erfindung zusammen mit einem bekannten Antivirusmittel verabreicht werden oder ein Patient mit Atherosklerose kann nach Angioplastik mit einer Verbindung der Erfindung behandelt werden, um eine Reokklusion der behandelten Arterien zu verhindern.
  • Nach erfolgreicher Behandlung kann es wünschenswert sein, den Patienten einer Erhaltungstherapie zu unterziehen, um das Wiederauftreten des Krankheitszustands zu verhindern, wobei die Verbindung der Erfindung in Erhaltungsdosen verabreicht wird, im Bereich von 0,01 μg bis 100 g pro kg Körpergewicht, einmal oder mehrmals täglich bis zu einmal alle 20 Jahre.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf eine Reihe von Weisen verabreicht werden, in Abhängigkeit davon, ob eine lokale oder systemische Behandlung erwünscht ist, und vom zu behandelnden Bereich. Die Verabreichung kann topisch (einschließlich ophthalmitisch, vaginal, rektal, intranasal, transdermal), oral oder parenteral sein. Parenterale Verabreichung beinhaltet Tropfinfusion, subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion oder intrathekale oder intraventrikuläre Verabreichung.
  • Formulierungen zur topischen Verabreichung können Transdermalpflaster, Salben, Lotionen, Cremes, Gele, Tropfen, Suppositorien, Sprays, Flüssigkeiten und Pulver beinhalten. Herkömmliche pharmazeutische Trägerstoffe, wässrige, pulvrige oder ölige Grundstoffe, Verdickungsmittel und dergleichen können erforderlich oder wünschenswert sein. Beschichtete Kondome, Handschuhe und dergleichen können ebenfalls von Nutzen sein.
  • Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung beinhalten Pulver oder Granulate, Suspensionen oder Lösungen in Wasser oder nicht-wässrige Medien, Kapseln, Briefchen oder Tabletten. Verdickungsmittel, Geschmacksstoffe, Verdünnungsmittel, Emulgiermittel, Dispergierhilfsmittel oder Bindemittel können wünschenswert sein.
  • Zusammensetzungen zur intrathekalen oder intraventrikulären Verabreichung können sterile wässrige Lösungen beinhalten, die auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Additive beinhalten können.
  • Formulierungen zur parenteralen Verabreichung können sterile wässrige Lösungen beinhalten, die auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Additive beinhalten können.
  • Die Dosierung hängt von der Schwere und dem Ansprechen des zu behandelnden Krankheitszustands ab, wobei der Behandlungsverlauf von mehreren Tagen bis zu mehreren Monaten dauert oder bis eine Heilung bewirkt oder eine Verminderung des Krankheitszustands erzielt worden ist. Optimale Dosierungsschemata können aus Messungen der Arzneimittelansammlung im Körper des Patienten berechnet werden. Durchschnittsfachmänner können optimale Dosierungen, Dosierungsmethodologien und Wiederholungsraten leicht bestimmen. Optimale Dosierungen können je nach der relativen Wirksamkeit einzelner Verbindungen variieren und können im Allgemeinen auf Grundlage von EC50-Werten abgeschätzt werden, die als in In-vitro- und In-vivo-Tiermodellen effektiv befunden worden sind. Im Allgemeinen beträgt die Dosierung von 0,01 μg bis 100 g pro kg Körpergewicht und kann einmal oder mehrmals täglich, wöchentlich, monatlich oder jährlich oder sogar einmal alle 2 bis 20 Jahre verabreicht werden.
  • Eine solche Behandlung kann in einer Vielfalt von Organismen ausgeübt werden, die von einzelligen prokaryotischen und eukaryotischen Organismen bis hin zu mehrzelligen eukaryotischen Organismen reichen. Jeder Organismus, der DNA-RNA-Transkription oder RNA-Protein-Translation als einen grundlegenden Teil seiner heriditären, metabolischen oder zellulären Maschinerie einsetzt, ist für eine solche diagnostische, therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung empfänglich. Scheinbar verschiedene Organismen, wie beispielsweise Bakterien, Hefe, Protozoen, Algen, Pflanzenformen und Formen höherer Tiere, einschließlich Warmblütern, können auf diese Weise behandelt werden. Weiterhin können, da jede der Zellen von mehrzelligen Eukaryoten ebenfalls sowohl DNA-RNA-Transkription als auch RNA-Protein-Translation als einen integralen Teil ihrer zellulären Aktivität enthält, solche Therapeutiken und/oder Diagnostiken an solchen Zellpopulationen ausgeübt werden. Des Weiteren enthalten viele der Organellen, z. B. Mitochondrien und Chloroplasten, von Eukaryotenzellen ebenfalls Transkriptions- und Translationsmechanismen. Als solche können auch einzelne Zellen, Zellpopulationen oder Organellen in die Definition von Organismen einbezogen werden, die mit den therapeutischen oder diagnostischen Verbindungen der Erfindung behandelt werden können. Wie hierin verwendet, soll Therapeutik das Auslöschen eines Krankheitszustands, Abtöten eines Organismus, z. B. einer bakteriellen, Protozoen- oder anderen Infektion, oder die Kontrolle von aberrierenden oder unerwünschtem zellulärem Wachstum oder Expression beinhalten.
  • Im Rahmen dieser Erfindung soll „Ziel-RNA" jede RNA bedeuten, die mit einer komplementären nukleinsäureartigen Verbindung hybridisieren kann. Weiterhin im Rahmen dieser Erfindung soll „Hybridisierung" Wasserstoffbrückenbindung, bei der es sich um Watson-Crick-, Hoogsteen- oder umgekehrte Hoogsteen-Wasser stoffbrückenbindung handeln kann, zwischen komplementären Nukleobasen bedeuten. „Komplementär", wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit zur präzisen Paarbildung zwischen zwei Nukleobasen. Adenin und Thymin beispielsweise sind komplementäre Nukleobasen, die durch die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen ein Paar bilden. „Komplementär" und „spezifisch hydrisierbar", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf präzise Paarbildung oder Sequenzkomplementarität zwischen einem ersten und einem zweiten nukleinsäureartigen, Nukleosiduntereinheiten enthaltenden Oligomer. Wenn beispielsweise eine Nukleobase an einer bestimmten Position an der ersten Nukleinsäure zur Wasserstoffbrückenbindung mit einer Nukleobase an der gleichen Stellung an der zweiten Nukleinsäure in der Lage ist, werden die erste Nukleinsäure und die zweite Nukleinsäure als zueinander an dieser Position komplementär betrachtet. Die erste und die zweite Nukleinsäure sind zueinander komplementär, wenn eine ausreichende Anzahl von übereinstimmenden Positionen in jedem Molekül von Nukleobasen belegt ist, die sich durch Wasserstoffbrückenbindung miteinander verbinden können. Somit sind „spezifisch hybridisierbar" und „komplementär" Ausdrücke, die zum Anzeigen eines ausreichenden Grads an Komplementarität, so dass eine stabile und spezifische Bindung zwischen einer Verbindung der Erfindung und einem Ziel-RNA-Molekül erfolgt, verwendet werden. Es versteht sich, dass eine oligomere Verbindung der Erfindung nicht zu 100% mit ihrer Ziel-RNA-Sequenz komplementär sein muss, um spezifisch hybridisierbar zu sein. Eine oligomere Verbindung ist spezifisch hybridisierbar, wenn die Bindung der oligomeren Verbindung an das Ziel-RNA-Molekül die normale Funktion der Ziel-RNA so stört, dass ein Verlust des Nutzens verursacht wird, und ein ausreichender Grad an Komplementarität vorliegt, um eine nicht-spezifische Bindung der oligomeren Verbindung an Nicht-Zielsequenzen unter Bedingungen zu verhindern, bei denen eine spezifische Bindung erwünscht ist, d. h. unter physiologischen Bedingungen im Fall von in-vivo-Assays oder therapeutischer Behandlung oder im Fall von In-vitro-Assays, unter Bedingungen, bei denen die Assays durchgeführt werden.
  • Die folgenden Beispiele und Methoden veranschaulichen die vorliegende Erfindung und sollen diese nicht einschränken. Beim Veranschaulichen der Erfindung identifiziert Beispiel 1 bestimmte handelsübliche Nukleosidamidite und andere zusätzliche Nukleosidamidite, die zur Herstellung von bestimmten veran schaulichenden Oligoribonukleotid- oder Oligoribonukleosid-Verbindungen der Erfindung von Nutzen sind. Die Beispiele 2 bis 5 veranschaulichen die Herstellung weiterer Nukleosidamidite zur Verwendung beim Herstellen anderer veranschaulichender Oligoribonukleotid- oder Oligoribonukleosid-Verbindungen der Erfindung. Beispiel 6 veranschaulicht die Herstellung von Oligoribonukleotid-Verbindungen der Erfindung. Beispiel 7 veranschaulicht die Herstellung von Oligoribonukleosid-Verbindungen der Erfindung. Die Beispiele 8 bis 16 veranschaulichen die Herstellung von chimären oligomeren Verbindungen der Erfindung, einschließlich bestimmter „Gapmere", d. h. Verbindungen mit „Gap"- und „Schenkel"-Konstruktionen. Die Beispiele 17 bis 18 veranschaulichen bestimmte nützliche Aspekte der Verbindungen der Erfindung. Die Beispiele 19 bis 28 veranschaulichen die Identifizierung, Charakterisierung und Reinigung der doppelsträngigen Ribonukleasen (dsRNasen) der Erfindung. Beispiel 29 veranschaulicht Affinitätssäulen, die die dsRNase-Substrate der Erfindung einbinden.
  • In den veranschaulichenden Beispielen werden mehrere verschiedene Typen von „Gapmeren" ausführlich beschrieben. Diese beinhalten einen ersten Typ, wobei das „Gap"-Segment verknüpfter Nukleoside zwischen 5'- und 3'-„Schenkel"-Segmenten verknüpfter Nukleoside positioniert ist, und einen zweiten Typ „mit offenem Ende", in dem das „Gap"-Segment an entweder dem 3'- oder dem 5'-Terminus der oligomeren Verbindung angeordnet ist. In den veranschaulichenden Beispielen werden bei allen chimären Oligoribonukleotiden und Oligoribonukleosiden, sofern nicht anders angegeben, 2'-O-Methylnukleoside in den „Schenkel"-Segmenten und 2'-OH-Nukleoside in den „Gap"-Segmenten der jeweiligen Oligoribonukleotide oder Oligoribonukleoside eingesetzt.
  • Für die Zwecke der veranschaulichenden Beispiele werden die folgenden Kurzformelrichtlinien verwendet. In Klammern, d. h. [ ], dargelegte Strukturen sind Nukleosidabkürzungen, wohingegen auf einen Schrägstrich, d. h. /, folgende dargelegte Strukturen Verknüpfer sind, die zum Verbinden der Nukleoside verwendet werden, d. h. Hauptkettenstrukturen, die die Nukleoside in entweder Oligoribonukleotid- oder Oligoribonukleosid-Verbindungen miteinander verknüpfen.
  • Unter Verwendung dieser Nomenklatur werden die folgenden Abkürzungen für Phosphatverknüpfungen zwischen Nukleosiden verwendet: Es werden PO für Phosphodiester, PS für Phosphorthioat, P2S für Phosphordithioat, PSe für Phosphorselenate, PMe für Methylphosphonat, POMe für Methylphosphotriester, PN für Phosphoramidat, 3'NPN für 3'-Deoxy-3'-aminophosphoramidat, PI für Phosphinat, McPS für Alkylphosphonothioat und BP für Boranphosphat verwendet. Für Nicht-Phosphatverknüpfungen zwischen Nukleosiden sind die verwendeten Abkürzungen: MMI für Methylenmethylimino, MDH für Methylendimethylhydrazo, FA für Formacetal, TFA für Thioformacetal, ETO für Ethylenoxid und Amid-3 für Methylcarbonylamino. 2'-OH wird als eine Abkürzung für unmodifizierte Ribozucker, d. h. Pentoribofuranosylzucker, verwendet. Für modifizierte Nukleoside sind die verwendeten Abkürzungen: 2'-O-Alkyl für allgemeine Alkylgruppen an der 2'-Stellung einer Pentoribofuranosyleinheit, wobei spezifisches Alkyl als 2'-O-Me, 2'-O-Et, 2'-O-Pr und 2'-O-EtOMe für Methyl, Ethyl, Propyl bzw. Methoxyethyl bezeichnet wird; 2'-F für eine Fluoreinheit an der 2'-Stellung einer Pentoribofuranosyleinheit, Mod-Purin für eine Purin-Nukleobasensubstitution, wie beispielsweise gemäß der Offenbarung der US-Patentschrift 5,459,255; und Mod-Pyr für eine Pyrimidin-Nukleobasensubstitution, wie beispielsweise gemäß der Offenbarung der US-Patentschrift 5,484,908; und SS für ein Zuckersurrogat, wie beispielsweise gemäß der Offenbarung der US-Patentschrift 5,359,044.
  • BEISPIEL 1
  • Amidite für die Oligonukleotid-/Oligonukleosidsynthese
  • 2'-O-Methylnukleosidamidite und 2'-OH-Nukleosidamidite (als 2'-tert.-Butyldimethylsilylderivat blockiert) sind von Glen Research, Sterling, VA, USA, erhältlich. Andere 2'-O-Alkyl-substituierte Nukleosidamidite werden hergestellt, wie in den US-Patentschriften 5,506,351, 5,466,786 oder 5,514,786 beschrieben ist, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind. Cyclobutylzuckersurrogatverbindungen werden hergestellt, wie in der US-Patentschrift 5,359,044 beschrieben ist, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. Pyrrolidinzuckersurrogate werden hergestellt, wie in der US-Patentschrift 5,519,134 beschrieben ist, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. Morpholinozuckersurrogate werden hergestellt, wie in den US-Patentschriften 5,142,047 und 5,235,033, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind, und anderen verwandten Patentoffenbarungen beschrieben ist. N-2-substituierte Purinnukleosidamidite werden hergestellt, wie in der US-Patentschrift 5,459,255 beschrieben ist, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. 3-Deazapurinnukleosidamidite werden hergestellt, wie in der US-Patentschrift 5,457,191 beschrieben ist, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. 5,6-substituierte Pyrimidinnukleosidamidite werden hergestellt, wie in der US-Patentschrift 5,614,617 beschrieben ist, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. 5-Propinylpyrimidinnukleosidamidite werden hergestellt, wie in der US-Patentschrift 5,484,908 beschrieben ist, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • BEISPIEL 2
  • 2'-O-(Methoxyethyl)nukleosidamidite
  • 2'-O-Ethyl-O-methyl-substituierte Nukleosidamidite werden wie in den Beispielen 2-a bis 2-h folgt hergestellt oder alternativ gemäß der Verfahren von P. Martin, Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486–504.
  • BEISPIEL 2-a
  • 2,2'-Anhydro-[1-(β-D-arabinofuranosyl)-5-methyluridin]
  • 5-Methyluridin (Ribosylthymin, im Handel erhältlich von Yamasa, Choshi, Japan) (72,0 g, 0,279 M), Diphenylcarbonat (90,0 g, 0,420 M) und Natriumhydrogencarbonat (2,0 g, 0,024 M) wurden zu DMF (300 ml) gegeben. Das Gemisch wurde unter Rühren zum Rückfluss erhitzt, was ermöglichte, dass das entstehende Kohlenstoffdioxidgas kontrolliert freigesetzt werden konnte. Nach 1 Stunde wurde die leicht verdunkelte Lösung unter vermindertem Druck eingeengt. Der resultierende Sirup wurde unter Rühren in Diethylether (2,5 l) gegossen. Das Produkt bildete ein Gummi. Der Ether wurde dekantiert und der Rückstand wurde in einer minimalen Menge an Methanol (ca. 400 ml) gelöst. Die Lösung wurde in frischen Ether (2,5 l) gegossen, um ein starres Gummi zu erzielen. Der Ether wurde dekantiert und das Gummi wurde in einem Vakuumofen getrocknet (60°C bei 1 mm Hg für 24 h), um einen Feststoff zu erhalten, der zu einem hellbraunen Pulver zerstoßen wurde (57 g, Rohausbeute: 85%). Das NMR-Spektrum war mit der Struktur konsistent, mit Phenol als seinem Natriumsalz verunreinigt (ca. 5%). Das Material wurde als solches für weitere Reaktionen verwendet (oder es kann weiter durch Säulenchromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Essigsäureethylester (10–25%) gereinigt werden, um einen weißen Feststoff zu erhalten, Fp. 222–224°C).
  • BEISPIEL 2-b
  • 2'-O-Methoxyethyl-5-methyluridin
  • 2,2'-Anhydro-5-methyluridin (195 g, 0,81 M), Tris-(2-methoxyethyl)borat (231 g, 0,98 M) und 2-Methoxyethanol (1,2 l) wurden in einen 2-l-Edelstahldruckgefäß gegeben und dieser in ein zuvor erhitztes Ölbad bei 160°C gestellt. Nach Erhitzen für 48 Stunden bei 155–160°C wurde das Gefäß geöffnet und die Lösung zur Trockne eingedampft und es wurde mit MeOH (200 ml) verrieben. Der Rückstand wurde in heißem Aceton (1 l) suspendiert. Die unlöslichen Salze wurden filtriert, mit Aceton (150 ml) gewaschen und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand (280 g) wurde in CH3CN (600 ml) gelöst und eingedampft. Eine Kieselgelsäule (3 kg) wurde in CH2Cl2/Aceton/MeOH (20:5:3), das 0,5% Et3NH enthielt, gepackt. Der Rückstand wurde in CH2Cl2 (250 ml) gelöst und auf Kieselgel (150 g) adsorbiert, bevor es auf die Säule geladen wurde. Das Produkt wurde mit dem Packungslösungsmittel eluiert, um 160 g (63%) des Produkts zu erhalten. Zusätzliches Material wurde mittels erneuten Aufarbeitens unreiner Fraktionen erhalten.
  • BEISPIEL 2-c
  • 2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin
  • 2'-O-Methoxyethyl-5-methyluridin (160 g, 0,506 M) wurde mit Pyridin (250 ml) koevaporiert und der getrocknete Rückstand in Pyridin (1,3 l) gelöst. Ein erstes Aliquot von Dimethoxytritylchlorid (94,3 g, 0,278 M) wurde zugegeben und das Gemisch eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde ein zweites Aliquot von Dimethoxytritylchlorid (94,3 g, 0,278 M) zugegeben und das Reaktionsgemisch eine weitere Stunde lang gerührt. Dann wurde Methanol (170 ml) zugegeben, um die Reaktion anzuhalten. HPLC zeigte das Vorhandensein von ungefähr 70% Produkt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und es wurde mit CH3CN (200 ml) verrieben. Der Rückstand wurde in CHCl3 (1,5 l) gelöst und mit 2 × 500 ml gesättigter NaHCO3-Lösung und 2 × 500 ml gesättigter NaCl-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet, filtriert und eingedampft. Es wurden 275 g Rückstand erhalten. Der Rückstand wurde auf einer 3,5-kg-Kieselgelsäule gereinigt, diese gepackt und mit EtOAc/Hexan/Aceton (5:5:1), das 0,5% Et3NH enthielt, eluiert. Die reinen Fraktionen wurden eingedampft, um 164 g Produkt zu erhalten. Ungefähr 20 g zusätzlich wurden aus den unreinen Fraktionen erhalten, um eine Gesamtausbeute von 183 g (57%) zu erzielen.
  • BEISPIEL 2-d
  • 3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin
  • 2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin (106 g, 0,167 M), DMF/Pyridin (750 ml eines 3:1-Gemischs, hergestellt aus 562 ml DMF und 188 ml Pyridin) und Essigsäureanhydrid (24,38 ml, 0,258 M) wurden vereinigt und 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mittels DC überwacht, indem die DC-Probe zunächst unter Zugabe von MeOH abgekühlt wurde. Nach Abschluss der Reaktion, wie durch DC beurteilt, wurde MeOH (50 ml) zugegeben und das Gemisch bei 35°C eingedampft. Der Rückstand wurde in CHCl3 (800 ml) gelöst und mit 2 × 200 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und 2 × 200 ml gesättigter NaCl-Lösung extrahiert. Die Wasserschichten wurden mit 200 ml CHCl3 zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um 122 g Rückstand (ungefähr 90% Produkt) zu erhalten. Der Rückstand wurde auf einer 3,5-kg-Kieselgelsäule gereinigt und mit EtOAc/Hexan (4:1) eluiert. Die reinen Produktfraktionen wurden eingedampft, um 96 g (84%) zu erzielen. Weitere 1,5 g wurden aus späteren Fraktionen gewonnen.
  • BEISPIEL 2-e
  • 3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyl-4-triazoluridin
  • Durch Lösen von 3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin (96 g, 0,144 M) in CH3CN (700 ml) wurde eine erste Lösung hergestellt und beiseite gestellt. Triethylamin (189 ml, 1,44 M) wurde zu einer Lösung von Triazol (90 g, 1,3 M) in CH3CN (1 l) gegeben, es wurde auf –5°C abgekühlt und 0,5 h lang mit einem Überkopfrührer gerührt. POCl3 wurde über einen Zeitraum von 30 Minuten tropfenweise zur gerührten Lösung, die bei 0–10°C gehalten wurde, gegeben und das resultierende Gemisch wurde weitere 2 Stunden lang gerührt. Die erste Lösung wurde über einen Zeitraum von 45 Minuten tropfenweise zur letzteren Lösung gegeben. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde über Nacht in einem kalten Raum gelagert. Salze wurden aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert und die Lösung wurde eingedampft. Der Rückstand wurde in EtOAc (1 l) gelöst und die unlöslichen Feststoffe wurden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde mit 1 × 300 ml NaHCO3 und 2 × 300 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit-EtOAc verrieben, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • BEISPIEL 2-f
  • 2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin
  • Eine Lösung von 3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyl-4-triazoluridin (103 g, 0,141 M) in Dioxan (500 ml) und NH4OH (30 ml) wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Dioxanlösung wurde eingedampft und aus dem Rückstand mit MeOH (2 × 200 ml) ein Azeotrop gebildet. Der Rückstand wurde in MeOH (300 ml) gelöst und in ein 2-Liter-Edelstahldruckgefäß überführt. Mit NH3-Gas gesättigtes MeOH (400 ml) wurde zugegeben und das Gefäß 2 Stunden lang auf 100°C erhitzt (DC zeigte vollständige Umsetzung). Der Gefäßinhalt wurde zur Trockne eingedampft und einmal mit gesättigter NaCl-Lösung (200 ml) gewaschen. Die organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel verdampft, um 85 g (95%) der Titelverbindung zu erhalten.
  • BEISPIEL 2-g
  • N4-Benzoyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin
  • 2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin (85 g, 0,134 M) wurde in DMF (800 ml) gelöst und Benzoesäureanhydrid (37,2 g, 0,165 M) unter Rühren zugegeben. Nach Rühren für 3 Stunden zeigte DC, dass die Reaktion zu ungefähr 95% abgeschlossen war. Das Lösungsmittel wurde verdampft und aus dem Rückstand mit MeOH (200 ml) ein Azeotrop gebildet. Der Rückstand wurde in CHCl3 (700 ml) gelöst und mit gesättigter NaHCO3-Lösung (2 × 300 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (2 × 300 ml) extrahiert, über MgSO4 getrocknet und eingedampft, um einen Rückstand (96 g) zu erhalten. Der Rückstand wurde auf einer 1,5-kg-Kieselgelsäule mit EtOAc/Hexan (1:1), das 0,5% Et3NH enthielt, als dem Elutionsmittel chromatographiert. Die reinen Produktfraktionen wurden eingedampft, um 90 g (90%) der Titelverbindung zu erhalten.
  • BEISPIEL 2-h
  • N4-Benzoyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin-3'-amidit
  • N4-Benzoyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin (74 g, 0,10 M) wurde in CH2Cl2 (1 l) gelöst. Tetrazoldiisopropylamin (7,1 g) und 2-Cyanoethoxytetra(isopropyl)phosphit (40,5 ml, 0,123 M) wurden unter Rühren unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt (DC zeigte, dass die Reaktion zu 95% abgeschlossen war). Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigter NaHCO3-Lösung (1 × 300 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (3 × 300 ml) extrahiert. Die wässrigen Waschlösungen wurden mit CH2Cl2 (300 ml) zurückextrahiert und die Extrakte wurden vereinigt, über MgSO4 getrocknet und eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde auf einer 1,5-kg-Kieselgelsäule mit EtOAc/Hexan (3:1) als dem Elutionsmittel chromatographiert. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, um 90,6 g (87%) der Titelverbindung zu erhalten.
  • BEISPIEL 3
  • Herstellung von langkettigen, d. h. (C20)-, substituierten Nukleosidamiditen
  • Die Synthese von Nukleosidamiditen mit langkettigen, z. B. C20-, Substituenten an ihrer 2'-Stellung ist in den Beispielen 3-a bis 3-c gezeigt.
  • BEISPIEL 3-a
  • Synthese von 2,6-Diamino-9-(2-O-octadecyl-β-D-ribofuranosyl)purin
  • 2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin (50 g, 180 mmol) und Natriumhydrid (7 g) in DMF (1 l) wurden 2 Std. lang zum Sieden erhitzt. Iodoctadecan (100 g) wurde bei 150°C zugegeben und das Reaktionsgemisch auf RT abkühlen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde 11 Tage lang bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand mittels Kieselgelchromatographie gereinigt. Das Produkt wurde mit 5% MeOH/CH2Cl2 eluiert. Die entsprechenden Fraktionen wurden eingedampft, um das Produkt (11 g) zu erzielen. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 0,84 (t, 3, CH2); 1,22 (m, 32, O-CH2-CH2(CH2)16); 1,86 (m, 2, O-CH2-CH2); 3,25 (m, 2, O-CH2); 3,93 (d, 1, 4'-H); 4,25 (m, 1, 3'-H); 4,38 (t, 1, 2'-H); 5,08 (d, 1, 3'-OH); 5,48 (t, 1, 5'-OH); 5,75 (s, 2, 6-NH2); 5,84 (d, 1, 1'-H); 6,8 (s, 2, 2-NH2) und 7,95 (s, 1, 8-H).
  • BEISPIEL 3-b
  • Synthese von 2'-O-Octadecylguanosin
  • 2,6-Diamino-9-(2-O-octadecyl-β-D-ribofuranosyl)purin (10 g) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (50 ml, pH 7,4), 0,1 M Tris-Puffer (1000 ml, pH 7,4) und DMSO (1000 ml) wurde bei RT mit Adenosindeaminase (1,5 g) behandelt. An Tag 3, Tag 5 und Tag 7 wurde ein zusätzliches Aliquot (500 mg, 880 mg bzw. 200 mg) von Adenosindeaminase zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde insgesamt 9 Tage gerührt und eine Reinigung mittels Kieselgelchromatographie ergab das Produkt (2 g). Eine Analysenprobe wurde aus MeOH umkristallisiert. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 0,84 (t, 3, CH3); 1,22 (s, 32, O-CH2-CH2(CH2)16); 5,07 (m, 2, 3'-OH und 5'-OH); 5,78 (d, 1, 1'-H); 6,43 (s, 2, NH2); 7,97 (s, 1, 8-H) und 10,64 (s, 1, NH2). Anal. berechn. für C28H49N5O5: C, 62,80; H, 9,16; N, 12,95. Gefunden: C, 62,54; H, 9,18; N, 12,95.
  • BEISPIEL 3-c
  • Synthese von N2-Isobutyryl-2'-O-octadecylguanosin
  • 2'-O-Octadecylguanosin (1,9 g) in Pyridin (150 ml) wurde in einem Eisbad gekühlt und mit Trimethylsilylchlorid (2 g, 5 Äq.) und Isobutylchlorid (2 g, 5 Äq.) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden lang gerührt, wobei es währenddessen auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen wurde. Die Lösung wurde gekühlt, ihr wurde Wasser (10 ml) zugegeben und sie wurde weitere 30 Minuten gerührt. Konzentriertes Ammoniumhydroxid (10 ml) wurde zugegeben und die Lösung im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Kieselgelchromatographie (mit 3 MeOH/EtOAc eluiert) gereinigt, um 1,2 g des Produkts zu erzielen. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 0,85 (t, 3, CH3), 1,15 (m, 38, O-CH2-CH2(CH2)16, CH(CH3)2), 2,77 (m, 1, CH(CH3)2), 4,25 (m, 2, 2'-H und 3'-H); 5,08 (t, 1, 5'-OH), 5,12 (d, 1, 3'-OH), 5,87 (d, 1, 1'-H), 8,27 (s, 1, 8-H), 11,68 (s, 1, NH2) und 12,08 (s, 1, NH2). Anal. berechn. für C32H55N5O6: C, 63,47; H, 9,09; N, 11,57. Gefunden: C, 63,53; H, 9,20; N, 11,52. Vor dem Einbinden dieses Produkts in ein Oligonukleotid wurde es in N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-octadecylguanosin und dann in ein Phosphoramidit umgewandelt, gemäß der in der internationalen Patentanmeldung mit der Nummer WO 94/02501, am 3. Februar 1994 veröffentlicht, beschriebenen Methoden.
  • BEISPIEL 4
  • 2'-Fluornukleosidamidite
  • 2'-Fluor-substituierte Nukleosidamidite werden wie in den Beispielen 4-a bis 4-d folgt hergestellt oder alternativ gemäß dem Verfahren von Kawasaki et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831–841.
  • BEISPIEL 4-a
  • i. N6-Benzoyl-9-β-D-arabinofuranosyladenin.
  • 9-β-D-Arabinofuranosyladenin (1,07 g, 4,00 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (20 ml) und wasserfreiem Dimethylformamid (20 ml) unter einer Argonatmosphäre gelöst. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und Chlortrimethylsilan (3,88 ml, 30,6 mmol) wurde langsam mit einer Spritze zum Reaktionsgemisch gegeben. Nach Rühren des Reaktionsgemischs bei 0°C für 30 Minuten wurde langsam Benzoylchlorid (2,32 ml, 20 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 20°C aufwärmen gelassen und 2 Stunden lang gerührt. Nach Abkühlen des Reaktionsgemischs auf 0°C wurde kaltes Wasser (8 ml) zugegeben und das Gemisch wurde 15 Minuten lang gerührt. Konzentriertes Ammoniumhydroxid (8 ml) wurde langsam zum Reaktionsgemisch gegeben, um eine Ammoniak-Endkonzentration von 2 M zu erhalten. Nach Rühren des kalten Reaktionsgemischs für 30 Minuten wurde das Lösungsmittel im Vakuum (60 Torr) bei 20°C abgedampft, worauf Abdampfung im Vakuum (1 Torr) bei 40°C folgte, um ein Öl zu erhalten. Dieses Öl wurde mit Diethylether (50 ml) verrieben, um einen Feststoff zu erhalten, der filtriert und dreimal mit Diethylether gewaschen wurde. Dieser rohe Feststoff wurde dreimal in Methanol (100 ml) bei Rückflusstemperatur verrieben und das Lösungsmittel wurde abgedampft, um N6-Benzoyl-9-β-D-arabinofuranosyladenin als einen Feststoff (1,50 g, 100%) zu erzielen.
  • ii. N6-Benzoyl-9-[3',5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl]adenin.
  • N6-Benzoyl-9-β-D-arabinofuranosyladenin (2,62 g, 7,06 mmol) wurde in wasserfreiem Dimethylformamid (150 ml) unter Argon gelöst und p-Toluolsulfonsäure-monohydrat (1,32 g, 6,92 mmol) wurde zugegeben. Diese Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und Dihydropyran (1,26 ml, 13,8 mmol) wurde mit einer Spritze zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 20°C aufwärmen gelassen. Über einen Zeitraum von 5 Stunden wurden insgesamt 10 Äquivalente Dihydropyran in 2 gleichen Mengen auf die beschriebene Weise zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 0°C abgekühlt und es wurde langsam gesättigte wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung bis zu einem pH von 8 und dann Wasser zu einem Volumen von 750 ml zugegeben. Das wässrige Gemisch wurde mit Methylenchlorid (4 × 200 ml) extrahiert und die organischen Phasen wurden vereinigt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Feststoffe wurden filtriert und das Lösungsmittel wurde im Vakuum (60 Torr) bei 30°C abgedampft, um ein geringes Volumen an Flüssigkeit zu erhalten, die im Vakuum (1 Torr) bei 40°C abgedampft wurde, um ein Öl zu erhalten. Dieses Öl wurde mit p-Xylol im Vakuum bei 40°C koevaporiert, um ein Öl zu erhalten, das in Methylenchlorid (100 ml) gelöst wurde. Hexan (200 ml) wurde zu der Lösung gegeben und das niedriger siedende Lösungsmittel wurde im Vakuum bei 30°C abgedampft, um einen in Hexan suspendierten weißen Feststoff zurückzulassen. Dieser Feststoff wurde filtriert und mit Hexan (3 × 10 ml) gewaschen und dann mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel und Methylenchlorid/Methanol (93:7) als dem Elutionsmittel gereinigt. Die erste Fraktion ergab die Titelverbindung 3 als einen weißen Schaum (3,19 g, 83%) und eine zweite Fraktion ergab einen weißen Schaum (0,81 g), der als das 5'-Monotetrahydropyranyl-Derivat von N6-Benzoyl-9-β-D-arabinofuranosyladenin charakterisiert wurde.
  • iii. N6-Benzoyl-9-[2'-O-trifluormethylsulfonyl-3',5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl]adenin.
  • N6-Benzoyl-9-[3',5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl]adenin (2,65 g, 4,91 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (20 ml) gelöst und das Lösungsmittel wurde im Vakuum (1 mm Hg) bei 40°C abgedampft. Das resultierende Öl wurde in wasserfreiem Methylenchlorid (130 ml) unter Argon gelöst und es wurden wasserfreies Pyridin (3,34 ml, 41,3 mmol) und N,N-Dimethylaminopyridin (1,95 g, 16,0 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 0°C abgekühlt und Trifluormethansulfonsäureanhydrid (1,36 ml, 8,05 mmol) wurde langsam mit einer Spritze zugegeben. Nach Rühren des Reaktionsgemischs bei 0°C für 1 Stunde wurde es in kaltes gesättigte wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung (140 ml) gegeben. Das Gemisch wurde geschüttelt und die organische Phase wurde abgetrennt und auf 0°C gehalten. Die wässrige Phase wurde mit Methylenchlorid (2 × 140 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte, die unablässig kalt gehalten wurden, wurden vereinigt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum (60 Torr) bei 20°C und dann im Vakuum (1 Torr) bei 20°C abgedampft, um N6-Benzoyl-9-[2'-O-trifluormethylsulfonyl-3', 5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl]adenin als ein rohes Öl zu erhalten, das nicht weiter gereinigt wurde.
  • iv. N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-3',5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl]adenin.
  • N6-Benzoyl-9-[2'-O-trifluormethylsulfonyl-3',5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl]adenin (4,9 mmol) als ein rohes Öl wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran (120 ml) gelöst und diese Lösung wurde unter Argon auf 0°C abgekühlt. Tetrabutylammoniumfluorid als das Hydrat (12,8 g, 49,1 mmol) wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und eine Hälfte dieses Volumens wurde langsam mit einer Spritze zum kalten Reaktionsgemisch gegeben. Nach Rühren bei 0°C für 1 Stunde wurde der Rest des Reagens langsam zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 weitere Stunde bei 0°C gerührt, dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum (60 Torr) bei 20°C abgedampft, um ein Öl zu erhalten. Dieses Öl wurde in Methylenchlorid (250 ml) gelöst und dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Feststoffe wurden filtriert und das Lösungsmittel abgedampft, um ein Öl zu erhalten. Das Rohprodukt wurde mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel in einem Sinterglastrichter gereinigt und Essigsäureethylester wurde als das Elutionsmittel verwendet. N6- Benzoyl-9-[2'-fluor-3',5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl]adenin wurde als ein Öl (2,03 g, 76%) erhalten.
  • v. N6-Benzoyl-9-(2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)adenin.
  • N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-3',5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl)adenin (1,31 g, 2,42 mmol) wurde in Methanol (60 ml) gelöst und Dowex 50W × 2–100 (4 cm3, 2,4 Moläq.) zum Reaktionsgemisch gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde lang bei 20°C gerührt, dann auf 0°C abgekühlt. Anschließend wurde Triethylamin (5 ml) langsam zum kalten Reaktionsgemisch bis zu einem pH von 12 gegeben. Das Harz wurde filtriert und mit 30% Triethylamin in Methanol gewaschen, bis die Waschlösung kein UV-absorbierendes Material mehr enthielt. Toluol (50 ml) wurde zu den Waschlösungen gegeben und das Lösungsmittel wurde bei 24°C im Vakuum (60 Torr, danach 1 Torr) abgedampft, um einen Rückstand zu erhalten. Dieser Rückstand wurde teilweise in Methylenchlorid (30 ml) gelöst und das Lösungsmittel wurde in einen Trenntrichter überführt. Der Rest des Rückstands wurde in heißem (60°C) Wasser gelöst und wurde nach Abkühlen des Lösungsmittels ebenfalls in den Trenntrichter gegeben. Das Zweiphasensystem wurde extrahiert und die organische Phase wurde abgetrennt und mit Wasser (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten wässrigen Extrakte wurden im Vakuum (60 Torr, danach 1 Torr) bei 40°C eingedampft, um ein Öl zu erhalten, das mit wasserfreiem Pyridin (50 ml) eingedampft wurde. Dieses Öl wurde weiter im Vakuum (1 Torr Hg) bei 20°C in Gegenwart von Phosphor(V)-oxid über Nacht getrocknet, um N6-Benzoyl-9-(2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)adenin als einen gelben Schaum (1,08 g, 100%) zu erhalten, der geringfügige Verunreinigungen enthielt.
  • vi. N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl]adenin.
  • N6-Benzoyl-9-(2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)adenin (1,08 g, 2,89 mmol), das geringfügige Verunreinigungen enthielt, wurde in wasserfreiem Pyridin (20 ml) unter Argon gelöst und trockenes Triethylamin (0,52 ml, 3,76 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (1,13 g, 3,32 mmol). Nach 4 Stunden Rühren bei 20°C wurde das Reaktionsgemisch in einen Trenntrichter überführt und Diethylether (40 ml) wurde zugegeben, um eine weiße Suspension zu erhalten. Dieses Gemisch wurde dreimal mit Wasser (3 × 10 ml) gewaschen, die organische Phase wurde abgetrennt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Triethylamin (1 ml) wurde zu der Lösung gegeben und das Lösungsmittel wurde im Vakuum (60 Torr Hg) bei 20°C abgedampft, um ein Öl zu erhalten, das mit Toluol (20 ml), das Triethylamin (1 ml) enthielt, eingedampft wurde. Dieses Rohprodukt wurde mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel und Essigsäureethylester/Triethylamin (99:1), gefolgt von Essigsäureethylester/-Methanol/Triethylamin (80:19:1) gereinigt, um das Produkt in zwei Fraktionen zu erhalten. Die Fraktionen wurden im Vakuum (60 Torr, danach 1 Torr Hg) bei 20°C eingedampft, um einen Schaum zu erhalten, der weiter im Vakuum (1 Torr Hg) bei 20°C in Gegenwart von Natriumhydroxid getrocknet wurde, um N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl]adenin als einen Schaum (1,02 g, 52%) zu erhalten.
  • vii. N6-Benzoyl-[2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit.
  • N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl]adenin (1,26 g, 1,89 mmol) wurde in wasserfreiem Dichlormethan (13 ml) unter Argon gelöst, Diisopropylethylamin (0,82 ml, 4,66 mmol) zugegeben und das Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt. Chlor(diisopropylamino)-β-cyanoethoxyphosphin (0,88 ml, 4,03 mmol) wurde zum Reaktionsgemisch gegeben, das auf 20°C aufwärmen gelassen und 3 Stunden lang gerührt wurde. Essigsäureethylester (80 ml) und Triethylamin (1 ml) wurden zugegeben und diese Lösung wurde mit gesättigter Kochsalzlösung (3 × 25 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration der Feststoffe wurde das Lösungsmittel im Vakuum bei 20°C abgedampft, um ein Öl zu erhalten, das mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel und Hexanen/Essigsäureethylester/Triethylamin (50:49:1) als dem Elutionsmittel gereinigt wurde. Die Eindampfung der Fraktionen im Vakuum bei 20°C ergab einen Schaum, der mit wasserfreiem Pyridin (20 ml) im Vakuum (1 Torr) bei 26°C eingedampft und weiter im Vakuum (1 Torr Hg) bei 20°C in Gegenwart von Natriumhydroxid 24 h lang getrocknet wurde, um N6-Benzoyl-[2'-deoxy-2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit als einen Schaum (1,05 g, 63%) zu erhalten.
  • BEISPIEL 4-b
  • 2'-Deoxy-2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • 2,2'-Cyclouridin wird mit einer Lösung von 70% Fluorwasserstoff/Pyridin in Dioxin bei 120°C für zehn Stunden behandelt, um nach Lösungsmittelentfernung eine Ausbeute von 75% an 2'-Deoxy-2'-fluoruridin zu liefern. Das mit 5'-DMT und 3'-Cyanoethoxydiisopropylphosphoramidit derivatisierte Nukleosid wird mittels Methoden der Standardliteratur (Gait, Hrsg., Oligonucleotide Synthesis. A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, USA (1984)] oder gemäß der Methode von Beispiel 4-a erhalten.
  • BEISPIEL 4-c
  • 2'-Deoxy-2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • 2'-Deoxy-2'-fluoruridin (2,51 g, 10,3 mmol) wurde mittels des Verfahrens von C. B. Reese et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans 1, S. 1171–1176 (1982), durch Acetylierung mit Essigsäureanhydrid (3,1 ml, 32,7 mmol) in wasserfreiem Pyridin (26 ml) bei Raumtemperatur in das entsprechende Cytidinanalogon umgewandelt. Die Reaktion wurde mit Methanol gequencht und das Lösungsmittel im Vakuum (1 Torr) abgedampft, um ein Öl zu erhalten, das mit Ethanol und Toluol koevaporiert wurde. 3',5'-O-Diacetyl-2'-deoxy-2'-fluoruridin wurde aus Ethanol auskristallisiert, um farblose Kristalle (2,38 g, 81%) hervorzubringen.
  • N-4-(1,2,4-Triazol-1-yl)-3',5'-O-diacetyl-2'-deoxy-2'-fluoruridin wurde in einer Ausbeute von 70% (2,37 g) durch Umsetzung von 3',5'-O-Diacetyl-2'-deoxy-2'-fluoruridin (2,75 g, 9,61 mmol) mit 1,2,4-Triazol (5,97 g, 86,5 mmol), Phosphor(V)-oxidchlorid (1,73 ml, 18,4 mmol) und Triethylamin (11,5 ml, 82,7 mmol) in wasserfreiem Acetonitril bei Raumtemperatur erhalten. Nach 90 Min. wurde das Reaktionsgemisch auf Eistemperatur abgekühlt und Triethylamin (7,98 ml, 56,9 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von der Zugabe von Wasser (4,0 ml). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum (1 Torr) abgedampft, um ein Öl zu erhalten, das in Methylenchlorid gelöst und mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen wurde. Die wässrige Phase wurde zweimal mit Methylenchlorid (2 × 100 ml) extrahiert und die organischen Extrakte mit Magnesiumsulfat getrocknet. Die Abdampfung des Lösungsmittels brachte ein Öl hervor, aus dem das Produkt N-4-(1,2,4-Triazol-1-yl)-3',5'-O-diacetyl-2'-deoxy-2'-fluoruridin durch Auskristallisierung aus Ethanol erhalten wurde.
  • 2'-Deoxy-2'-fluorcytidin wurde durch Behandlung von geschütztem Triazol-1-yl-Derivat mit konzentriertem Ammoniumhydroxid (4,26 ml, 81,2 mmol) in Dioxan bei Raumtemperatur für 6 Stunden hervorgebracht. Nach Abdampfung des Lösungsmittels wurde das Öl in zur Hälfte gesättigtem (bei Eistemperatur) Ammoniak in Methanol für 16 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und 2'-Deoxy-2'-fluorcytidin aus Essigsäureethylester/Methanol (v/v, 75:25) auskristallisiert, um farblose Kristalle (1,24 g, 75%) zu erhalten.
  • N-4-Benzoyl-2'-deoxy-2'-fluorcytidin wurde durch selektive Benzoylierung mit Benzoesäureanhydrid in wasserfreiem Dimethylformamid hergestellt, V. Bhat et al., Nucleosides Nucleotides, Bd. 8, S. 179–183 (1989). Das 5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit) wurde gemäß Beispiel 4-a hergestellt.
  • BEISPIEL 4-d
  • i. 9-(3',5'-[1,1,3,3-Tetraisopropyldisilox-1,3-diyl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin.
  • Die 3'- und 5'-Stellungen von Guanosin wurden durch die Zugabe einer TPDS-Schutzgruppe (TDPS = 1,1,3,3-Tetraisopropyldisilox-1,3-diyl) gemäß der Methode von Robins et al. [Can. J. Chem., 61, 1911 (1983)] geschützt. Das TDPS-Guanosin (21 g, 0,040 mol) wurde zu einer gerührten Lösung aus DMSO (160 ml) und Essigsäureanhydrid (20 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 36 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann auf 0°C abgekühlt. Kaltes Ethanol (400 ml, 95%-ig) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch weiter in einem Trockeneis/Aceton-Bad auf –78°C abgekühlt. NaBH4 (2,0 g, 1,32 Moläq.) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf –2°C aufwärmen gelassen, 30 Minuten lang gerührt und wiederum auf –78°C abgekühlt. Dies wurde zweimal wiederholt. Nachdem die Zugabe von NaBH4 abgeschlossen war, wurde das Reaktionsgemisch 30 Minuten lang bei 0°C und dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Essigsäureethylester (1 l) aufgenommen und zweimal mit einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO4 getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde zweimal mit Toluol koevaporiert und mittels Kieselgelchromatographie unter Verwendung von CH2Cl2/MeOH (9:1) als dem Elutionsmittel gereinigt. Das reine Produkt (6,02 g) präzipitierte aus den entsprechenden Säulenfraktionen während des Eindampfens dieser Fraktionen und weitere 11,49 g des Produkts wurden nach Eindampfen der Fraktionen als ein Rückstand erhalten.
  • ii. N2-Isobutyryl-9-(2'-O-isobutyryl-3',5'-[1,1,3,3-tetraisopropyldisilox-1,3-diyl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin.
  • 9-(3',5'-[1,1,3,3-Tetraisopropyldisilox-1,3-diyl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin (6,5 g, 0,01248 mol) wurde in wasserfreiem Pyridin (156 ml) unter Argon gelöst. DMAP (9,15 g) wurde zugegeben. Isobuttersäureanhydrid (6,12 ml) wurde langsam zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in kalte gesättigte NaHCO-Lösung (156 ml) gegossen und 10 Minuten lang gerührt. Die wässrige Lösung wurde dreimal mit Essigsäureethylester (156 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde dreimal mit gesättigter NaHCO-Lösung gewaschen und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Toluol koevaporiert und mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von CH2Cl2/Aceton (85:15) gereinigt, um 5,67 g des Produkts zu erzielen.
  • iii. N2-Isobutyryl-9-(2'-O-isobutyryl-β-D-arabinofuranosyl)guanin.
  • N2-Isobutyryl-9-(2'-isobutyryl-3',5'-[1,1,3,3-tetraisopropyldisilox-1,3-diyl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin (9,83 g, 0,01476 mol) wurde in wasserfreiem THF (87,4 ml) bei Raumtemperatur unter Argon gelöst. 1 M (nBu)4N+F in THF (29,52 ml, 2 Äq.) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch 30 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur eingedampft und der Rückstand mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc/MeOH (85:15) gereinigt, um 4,98 g (80%) des Produkts zu erzielen.
  • iv. N2-Isobutyryl-9-(2'-O-isobutyryl-3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin.
  • N2-Isobutyryl-9-(2'-isobutyryl-β-D-arabinofuranosyl)guanin (4,9 g) wurde in wasserfreiem 1,4-Dioxan (98 ml) bei Raumtemperatur unter Argon gelöst. p-Toluolsulfonsäure-monohydrat (0,97 g) wurde zugegeben, gefolgt von 3,3-Dihydro-2H-pyran (DHP, 9,34 ml, 8,8 Äq.). Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden lang gerührt, dann auf 0°C abgekühlt und gesättigte NaHCO3-Lösung (125 ml) zugegeben, um die Reaktion anzuhalten. Das Reaktionsgemisch wurde dreimal mit 125-ml-Portionen von CH2Cl2 extrahiert und die organische Phase über MgSO4 getrocknet. Die organische Phase wurde eingedampft und der Rückstand in einem minimalen Volumen von CH2Cl2, jedoch in einer Menge, die dazu ausreicht, um eine klare Flüssigkeit, nicht einen Sirup zu erzielen, gelöst und dann in Hexan (das 100-fache des Volumens von CH2Cl2) getropft. Das Präzipitat wurde filtriert, um 5,59 g (81,5%) des Produkts zu erzielen.
  • v. N2-Isobutyryl-9-(3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin.
  • N2-1 sobutyryl-9-(2'-isobutyryl-3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin (5,58 g) wurde in Pyridin/MeOH/H2O (65:30:15, 52 ml) bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und 52 ml 2 N NaOH in EtOH/MeOH (95:5) wurden langsam zugegeben, gefolgt von Rühren für 2 Stunden bei 0°C. Eisessig wurde bis zum pH 6 und gesättigte NaHCO3-Lösung bis zum pH 7 zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck und der Rückstand mit Toluol koevaporiert. Der Rückstand wurde dann in EtOAc (150 ml) gelöst und 3-mal mit gesättigter NaHCO3-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde eingedampft und der Rückstand mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc/MeOH (85:15) als dem Elutionsmittel gereinigt, wodurch 3,85 g (78,3%) des Produkts erzielt wurden.
  • vi. N2-Isobutyryl-9-(3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-2'-O-trifluormethylsulfonyl-β-D-arabinofuranosyl)guanin.
  • N2-Isobutyryl-9-(3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin (3,84 g) wurde in wasserfreiem CH2Cl2 (79 ml), wasserfreiem Pyridin (5 ml) und DMAP (2,93 g) bei Raumtemperatur unter Argon gelöst. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und Trifluormethansulfonsäureanhydrid (1,99 ml) langsam unter Rühren zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt, dann in 100 ml gesättigte NaHCO3-Lösung gegossen. Die wässrige Phase wurde dreimal mit kaltem CH2Cl2 extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet, eingedampft und mit wasserfreiem MeCN koevaporiert, um ein Rohprodukt zu erzielen.
  • vii. N2-Isobutyryl-9-(2'-deoxy-2'-fluor-3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-2'-O-trifluormethylsulfonyl-β-D-ribofuranosyl)guanin.
  • Rohes N2-Isobutyryl-9-(3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-2'-O-trifluormethylsulfonyl-β-D-arabinofuranosyl)guanin wurde in wasserfreiem THF (113 ml) unter Argon bei 0°C gelöst. 1 M (nBu)4N+F (durch Koevaporieren mit Pyridin getrocknet) in THF (36,95 ml) wurde unter Rühren zugegeben. Nach 1 Stunde wurde ein weiteres Aliquot von (nBu)4N+F in THF (36,95 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0°C 5 Stunden lang gerührt und über Nacht bei –30°C gelagert. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand in CH2Cl2 (160 ml) gelöst und fünfmal mit vollentsalztem Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc/MeOH (95:5) gereinigt, um 5,25 g des Produkts zu erzielen.
  • viii. N2-Isobutyryl-9-(2'-deoxy-2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)guanin.
  • N2-Isobutyryl-9-(2'-deoxy-2'-fluor-3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-ribofuranosyl)guanin (3,85 g) wurde in MeOH (80 ml) bei Raumtemperatur gelöst. Zuvor gewaschenes Dowex 50W-Harz (12,32 cm3) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt. Das Harz wurde filtriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Das Harz wurde mit Pyridin/Triethylamin/H2O (1:3:3) gewaschen, bis das Filtrat klar war. Dieses Filtrat wurde eingedampft, um ein Öl zu erhalten. Die Rückstände von beiden Filtraten wurden in H2O (200 ml) vereinigt und mit CH2Cl2 (3 × 100 ml) gewaschen. Die wässrige Phase wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus heißem MeOH auskristallisiert, um 0,299 g des Produkts als ein weißes Pulver zu erzielen. Die restliche MeOH-Lösung wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie gereinigt, um weiter 0,783 g des Produkts durch Eluieren mit EtOH/MeOH (4:1) zu erzielen.
  • ix. N2-Isobutyryl-9-(2'-deoxy-2'-fluor-5'-O-[4,4-dimethoxytrityl]-β-D-ribofuranosyl)guanin.
  • N2-Isobutyryl-9-(2'-deoxy-2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)guanin (1,09 g) wurde in Pyridin (20 ml) und Triethylamin (0,56 ml) bei Raumtemperatur unter Argon gelöst. 4,4-Dimethoxytritylchlorid (1,20 g, 1,15 Moläq.) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde in einen Trenntrichter überführt und mit Diethylether (100 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigter NaHCO3-Lösung (3 × 70 ml) gewaschen und die wässrige Phase dreimal mit Diethylether zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und es wurde Triethylamin (4 ml) zugegeben, um die Lösung auf einem basischen pH zu halten. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc/Triethylamin (100:1) und dann EtOAc/MeOH/Triethylamin (95:5:1) als Elutionsmitteln gereinigt, wodurch 1,03 g des Produkts erzielt wurden.
  • x. N2-Isobutyryl-9-2'-deoxy-2'-fluor-5'-O-[4,4-dimethoxytrityl]guanosin-3'-O-N,N-diisopropyl-β-D-cyanoethylphosphoramidit.
  • N2-Isobutyryl-9-(2'-deoxy-2'-fluor-5'-O-[4,4'-dimethoxytrityl]-β-D-ribofuranosyl)guanin (0,587 g) wurde in wasserfreiem CH2Cl2 (31 ml) und Diisopropylethylamin (0,4 ml) bei Raumtemperatur unter Argon gelöst. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und es wurde langsam Chlor(diisopropylamino)-β-cyanoethoxyphosphin (0,42 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und 3,5 Stunden lang gerührt. CH2Cl2/Triethylamin (100:1, 35 ml) wurde zugegeben und das Gemisch mit gesättigter NaHCO-Lösung (6 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von Hexan/EtOAc/Triethylamin (75:25:1) für 2 Säulenvolumina, dann Hexan/EtOAc/Triethylamin (25:75:1) und schließlich EtOAc/Triethylamin gereinigt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Das resultierende Öl wurde zweimal mit MeCN koevaporiert und unter vermindertem Druck getrocknet. Der resultierende weiße Feststoff wurde in CH2Cl2 (3 ml) gelöst und in gerührtes Hexan (300 ml) getropft. Das resultierende Präzipitat wurde filtriert und unter vermindertem Druck getrocknet, um 0,673 g (88%) des Produkts zu erzielen.
  • BEISPIEL 5
  • Nukleosidamidite mit Substitution an ihren Zucker- und ihren Basenfragmenten sind in den Beispielen 5-a bis 5-k gezeigt.
  • BEISPIEL 5-a
  • Andere Nukleosidamidite
  • i. 1-(2-Fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
  • 2,2'-Anhydro-[1-(β-D-arabinofuranosyl)-5-methyluridin] (71 g, 0,32 mmol) (aus Beispiel 2-a) und Dioxan (700 ml) wurden in eine 2-Liter-Edelstahlbombe gegeben und es wurde HF/Pyridin (100 g, 70%) zugegeben. Das Gemisch wurde 16 Stunden lang auf 120–125°C erhitzt und dann in einem Eisbad abgekühlt. Die Bombe wurde geöffnet und das Gemisch wurde auf 3 Liter Eis gegossen. Zu diesem Gemisch wurde behutsam Natriumhydrogencarbonat (300 g) und gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung (400 ml) gegeben. Das Gemisch wurde filtriert und der Filterkuchen wurde mit Wasser (2 × 100 ml) und Methanol (2 × 500 ml) gewaschen. Die Wasser- und Methanolwaschlösungen wurden im Vakuum zur Trockne eingeengt. Methanol (200 ml) und grobes Kieselgel (80 g) wurden zum Rückstand gegeben und das Gemisch wurde im Vakuum zur Trockne eingeengt.
  • Das resultierende Material wurde auf dem Kieselgel eingeengt und mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung eines Gradienten aus Essigsäureethylester und Methanol (100:0 bis 85:15) gereinigt. Poolen und Einengen der Produktfraktionen ergab 36,9 g (51%, Ausbeute aus 2 Schritten) der Titelverbindung.
  • Außerdem aus dieser Reaktion isoliert wurde 1-(2-Phenyl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin (10,3 g). Dieses Material wird aus dem Phenol und seinem Natriumsalz aus der obigen Anhydro-Reaktion gebildet, wenn die Bombenreaktion an unreinem Material durchgeführt wird. Wenn das Anhydro-Material gereinigt ist, wird dieses Produkt nicht gebildet. Das gebildete 1-(2-Phenyl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin wurde unter Verwendung derselben Reaktionsbedingungen wie für das 2'-Fluor-Material in sein DMT/Phosphoramidit umgewandelt.
  • ii. 1-(5-O-Dimethoxytrityl-2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
  • 1-(2-Fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin (31,15 g), 0,12 mol) wurde in Pyridin (150 ml) suspendiert und Dimethoxytritylchlorid (44,62 g, 0,12 mol) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde in einem geschlossenen Kolben 2 Stunden lang gerührt und dann wurde Methanol (30 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde im Vakuum eingeengt und der resultierende Rückstand wurde zwischen gesättigter Hydrogencarbonatlösung (500 ml) und Essigsäureethylester (3 × 500 ml) aufgeteilt. Die Essigsäureethylesterfraktionen wurden gepoolt und über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zu einem dicken Öl eingeengt. Das Öl wurde in Dichlormethan (100 ml) gelöst, auf eine Kieselgelsäule aufgetragen und mit Essigsäureethylester:Hexan:Triethylamin, 60/39/1, ansteigend auf 75/24/1, eluiert. Die Produktfraktionen wurden gepoolt und im Vakuum eingeengt, um 59,9 g (89%) der Titelverbindung als einen Schaum zu erhalten.
  • iii. 1-(5-O-Dimethoxytrityl-2-fuor-3-O-N,N-diisopropylamino-2-cyanoethylphosphit-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
  • 1-(5-O-Dimethoxytrityl-2-fuor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin (59,8 g, 0,106 mol) wurde in Dichlormethan gelöst und 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (46,9 ml, 0,148 mol) und Diisopropylamintetrazolid (5,46 g, 0,3 Äq.) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde 16 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (1 l) gewaschen und die Hydrogencarbonatlösung wurde mit Dichlormethan (500 ml) zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit gesättigter Kochsalzlösung (1 l) gewaschen und die gesättigte Kochsalzlösung wurde mit Dichlormethan (100 ml) zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und auf ein Volumen von etwa 200 ml eingeengt. Das resultierende Material wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von Hexan/Essigsäureethylester/Triethylamin, 60/40/1, gereinigt. Die Produktfraktionen wurden im Vakuum eingeengt, in Acetonitril (500 ml) gelöst, filtriert, im Vakuum eingeengt und zu einem Schaum getrocknet. Der Schaum wurde zerkleinert und 24 Stunden lang auf ein konstantes Gewicht getrocknet, um 68,2 g (84%) der Titelverbindung zu ergeben. 1H-NMR: (CDCl3) δ 0,9–1,4 (m, 14H, 4 × CH3, 2 × CH), 2,3–2,4 (t, 1H, CH2CN), 2,6–2,7 (t, 1H, CH2CN), 3,3–3,8 (m, 13H, 2 × CH3Oar, 5'-CH2, CH2OP, C-5-CH3), 4,2–4,3 (m, 1H, 4'), 4,35–5,0 (m, 1H, 3'), 4,9–5,2 (m, 1H, 2'), 6,0–6,1 (dd, 1H, 1'), 6,8–7,4 (m, 13H, DMT), 7,5–7,6 (d, 1H, C-6), 8,8 (bs, 1H, NH). 31P-NMR (CDCl3): 151,468, 151,609, 151,790, 151,904.
  • iv. 1-(3',5'-Di-O-acetyl-2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
  • Aus 1-(2-Fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin (22,4 g, 92 mmol, Reinheit von 85%), wie gemäß der Methode von Beispiel 5-a-i. hergestellt, wurde mit Pyridin (2 × 150 ml) ein Azeotrop gebildet und es wurde in Pyridin (250 ml) gelöst. Essigsäureanhydrid (55 ml, 0,58 mol) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 16 Stunden lang gerührt. Methanol (50 ml) wurde zugegeben und das Rühren wurde 30 Minuten lang fortgesetzt. Das Gemisch wurde zu einem Sirup eingedampft. Der Sirup wurde in einer minimalen Menge an Methanol gelöst und auf eine Kieselgelsäule geladen. Hexan/Essigsäureethylester, 1:1, wurde zum Eluieren der Produktfraktionen verwendet. Eine Reinigung ergab 19,0 g (74%) der Titelverbindung.
  • BEISPIEL 5-b
  • i. 4-Triazin-1-(3',5'-di-O-acetyl-2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
  • 1,2,4-Triazol (106 g, 1,53 mol) wurde in Acetonitril (150 ml) gelöst, gefolgt von Triethylamin (257 ml, 1,84 mol). Das Gemisch wurde auf zwischen 0 und 10°C unter Verwendung eines Eisbads abgekühlt. POCl3 (34,5 ml, 0,375 mol) wurde langsam mittels eines Zugabetrichters zugegeben und das Gemisch wurde weitere 45 Minuten lang gerührt. In einem separaten Kolben wurde 1-(3',5'-Di-O-acetyl-2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin (56,9 g), 0,144 mol) in Acetonitril (150 ml) gelöst. Die das 1-(3',5'-Di-O-acetyl-2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin enthaltende Lösung wurde mittels einer Kanüle langsam zur Triazollösung gegeben. Das Eisbad wurde entfernt und das Reaktionsgemisch 1 Stunde lang auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Acetonitril wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde zwischen gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (400 ml) und Dichlormethan (4 × 400 ml) aufgeteilt. Die organischen Schichten wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde in Essigsäureethylester (200 ml) gelöst und begann, zu einem Feststoff zu präzipitieren. Hexane (300 ml) wurden zugegeben und weiterer Feststoff präzipitierte. Der Feststoff wurde mittels Filtration gesammelt und mit Hexanen (2 × 200 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um 63,5 g zu ergeben, die als solche ohne weitere Reinigung verwendet wurden.
  • ii. 5-Methyl-1-(2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)cytosin
  • 4-Triazin-1-(3',5'-di-O-acetyl-2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)thymin (75,5 g, 0,198 mol) wurde in Ammoniak (400 ml) in einer Edelstahlbombe gelöst und über Nacht versiegelt. Die Bombe wurde abgekühlt und geöffnet und der Ammoniak wurde abgedampft. Methanol wurde zugegeben, um das Material in einen Kolben zu überführen, und etwa 10 Volumina Ethylether wurden zugegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann filtriert. Der Feststoff wurde mit Ethylether gewaschen und getrocknet, um 51,7 g (86%) der Titelverbindung zu ergeben.
  • iii. 4-N-Benzoyl-5-methyl-1-(2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)cytosin
  • 5-Methyl-1-(2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)cytosin (54,6 g, 0,21 mol) wurde in Pyridin (700 ml) suspendiert und Benzoesäureanhydrid (70 g, 0,309 mol) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 48 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Pyridin wurde durch Abdampfen entfernt und Methanol (800 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde gerührt. Es bildete sich ein Präzipitat, das filtriert, mit Methanol (4 × 50 ml) gewaschen, mit Ether (3 × 100 ml) gewaschen und in einem Vakuumofen bei 45°C getrocknet wurde, um 40,5 g der Titelverbindung zu ergeben. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und in einer Bombe mit gesättigtem methanolischem Ammoniak über Nacht bei Raumtemperatur behandelt. Das Gemisch wurde im Vakuum eingeengt und das resultierende Öl wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie gereinigt. Das rückgeführte Ausgangsmaterial wurde erneut wie oben behandelt, um weitere 4,9 g der Titelverbindung zu ergeben, um kombinierte 45,4 g (61%) der Titelverbindung zu erhalten.
  • iv. 4-N-Benzoyl-5-methyl-1-(2-fluor-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)cytosin
  • 4-N-Benzoyl-5-methyl-1-(2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)cytosin (45,3 g, 0,124 mol) wurde in 250 ml trockenem Pyridin gelöst und Dimethoxytritylchlorid (46,4 g, 0,137 mol) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 90 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und Methanol (20 ml) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde im Vakuum eingeengt und zwischen Essigsäureethylester (2 × 1 l) und gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (1 l) aufgeteilt. Die Essigsäureethylesterschichten wurden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Das resultierende Öl wurde in Dichlormethan (200 ml) gelöst und mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan/Triethylamin, 50:50:1, gereinigt. Die Produktfraktionen wurden gepoolt, im Vakuum eingeengt und getrocknet, um 63,6 g (76,6%) der Titelverbindung zu ergeben.
  • v. 4-N-Benzoyl-5-methyl-1-(2-fluor-3-O-N,N-diisopropylamino-2-cyanoethylphosphit-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)cytosin
  • 4-N-Benzoyl-5-methyl-1-(2-fluor-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)cytosin (61,8 g, 92,8 mmol) wurde mit Dichlormethan (300 ml) 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (40,9 ml, 0,130 mol) und Diisopropylamintetrazolid (4,76 g, 0,3 Äq.) bei Raumtemperatur 17 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (1 l) gewaschen und die Hydrogencarbonatlösung wurde mit Dichlormethan (500 ml) zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit gesättigter Kochsalzlösung (1 l) gewaschen und die gesättigte Kochsalzlösung wurde mit Dichlormethan (100 ml) zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und auf ein Volumen von etwa 200 ml eingeengt. Das resultierende Material wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von Hexan/Essigsäureethylester/Triethylamin, 60:40:1, gereinigt. Die Produktfraktionen wurden im Vakuum eingeengt, in Acetonitril (500 ml) gelöst, filtriert, im Vakuum eingeengt und zu einem Schaum getrocknet. Der Schaum wurde zerkleinert und 24 Stunden lang zu einem konstanten Gewicht getrocknet, um 72,4 g (90%) der Titelverbindung zu erhalten. 1H-NMR: (CDCl3) δ 1,17–1,3 (m, 12H, 4 × CH3), 1,5–1,6 (m, 2H, 2 × CH), 2,3–2,4 (t, 1H, CH2CN), 2,6–2,7 (t, 1H, CH2CN), 3,3–3,9 (m, 13H, 2 × CH3Oar, 5'-CH2, CH2OP, C-5-CH3), 4,2–4,3 (m, 1H, 4'), 4,3–4,7 (m, 1H, 3'), 5,0–5,2 (m, 1H, 2'), 6,0–6,2 (dd, 1H, 1'), 6,8–6,9 (m, 4H, DMT), 7,2–7,6 (m, 13H, DMT, Bz), 7,82–7,86 (d, 1H, C-6), 8,2–8,3 (d, 2H, Bz). 31P-NMR (CDCl3): bs, 151,706; bs, 151,941.
  • BEISPIEL 5-c
  • i. 1-(2,3-Di-O-butylzinn-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
  • 5-Methyluridin (7,8 g, 30,2 mmol) und Dibutylzinnoxid (7,7 g, 30,9 mmol) wurden in Methanol (150 ml) suspendiert und 16 Stunden lang zum Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, filtriert und der Feststoff mit Methanol (2 × 150 ml) gewaschen. Der resultierende Feststoff wurde getrocknet, um 12,2 g (80,3%) der Titelverbindung zu ergeben. Dieses Material wurde in anschließenden Reaktionen ohne weitere Reinigung verwendet. Die NMR war mit der Struktur konsistent.
  • ii. 1-(2-O-Propyl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
  • 1-(2,3-Di-O-butylzinn-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin (5,0 g, 10,2 mmol) und Iodpropan (14,7 g, 72,3 mmol) wurden in DMF 2 Tage lang bei 100°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert und eingeengt. Das restliche DMF wurde mit Acetonitril koevaporiert. Nach dem Trocknen des Rückstands wurden 2,40 g (78%) der Titelverbindung und des 3'-O-Propyl-Isomers als ein Rohgemisch erhalten. Dieses Material wurde in anschließenden Reaktionen ohne weitere Reinigung verwendet.
  • iii. 1-(2-O-Propyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
  • 1-(2-O-Propyl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin und das 3'-O-Propyl-Isomer als ein Rohgemisch (2,4 g, 8,4 mmol) wurde mit Pyridin (2 × 40 ml) koevaporiert und in Pyridin (60 ml) gelöst. Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Argon gerührt und Dimethoxytritylchlorid (4,27 g, 12,6 mmol) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde periodisch mittels DC überprüft und war nach 3 Stunden abgeschlossen. Methanol (10 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und der resultierende Rückstand mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von 60:40-Hexan/Essigsäureethylester mit 1% Triethylamin, das die ganze Zeit über verwendet wurde, gereinigt. Das Poolen und Einengen von entsprechenden Fraktionen ergab 1,32 g (26%) der Titelverbindung.
  • iv. 1-(2-O-Propyl-3-O-N,N-diisopropylamino-2-cyanoethylphosphit-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
  • 1-(2-O-Propyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin (50,0 g, 86 mmol), 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (38 ml, 120 mmol) und Diisopropylamintetrazolid (4,45 g, 25,8 mmol) wurden in Dichlormethan (500 ml) gelöst und 40 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (2 × 400 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (1 × 400 ml) gewaschen. Die wässrigen Schichten wurden mit Dichlormethan zurückextrahiert. Die Dichlormethan-Schichten wurden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan, 40:60, und 1% Triethylamin gereinigt. Die ent sprechenden Fraktionen wurden gepoolt, eingeengt und unter Hochvakuum getrocknet, um 43 g (67%) zu ergeben.
  • v. 1-(2-O-Propyl-3-O-acetyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
  • 1-(2-O-Propyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin (10,0 g, 16,6 mmol) wurde in Pyridin (50 ml) gelöst und Essigsäureanhydrid (4,7 ml, 52,7 mmol) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 18 Stunden lang gerührt und überschüssiges Essigsäureanhydrid wurde mit Methanol (10 ml) neutralisiert. Das Gemisch wurde im Vakuum eingeengt und der resultierende Rückstand in Essigsäureethylester (150 ml) gelöst. Der Essigsäureethylester wurde mit gesättigter NaHCO3-Lösung (150 ml) gewaschen und die gesättigte NaHCO3-Waschlösung wurde mit Essigsäureethylester (50 ml) zurückextrahiert. Die Essigsäureethylester-Schichten wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt, um einen weißen Schaum, 11,3 g, zu erhalten. Die Rohausbeute betrug mehr als 100% und die NMR war mit der erwarteten Struktur der Titelverbindung konsistent. Dieses Material wurde in anschließenden Reaktionen ohne weitere Reinigung verwendet.
  • BEISPIEL 5-d
  • i. 1-(2-O-Propyl-3-O-acetyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-4-triazolo-5-methylpyrimidin
  • Triazol (10,5 g, 152 mmol) wurde in Acetonitril (120 ml) und Triethylamin (23 ml) unter Rühren unter wasserfreien Bedingungen gelöst. Die resultierende Lösung wurde in einem Trockeneis/Aceton-Bad gekühlt und Phosphor(V)-oxidchlorid (3,9 ml, 41 mmol) wurde über einen Zeitraum von 5 Minuten langsam zugegeben. Das Gemisch wurde weitere 10 Minuten gerührt, wobei es zu einer dünnen Aufschlämmung wurde, was auf die Bildung des Produkts hinweist. 1-(2-O-Propyl-3-O-acetyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin (11,2 g, 165 mmol) wurde in Acetonitril (150 ml) gelöst und zur obigen Aufschlämmung gegeben, wobei die Temperaturen des Trockeneis/Aceton-Bads aufrechterhalten wurden. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang gerührt und dann auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und weitere 2 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde 18 Stunden lang in einen Gefrierschrank bei 0°C gestellt und dann herausgenommen und auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen. DC in Essigsäureethylester/Hexan, 1:1, des Gemischs zeigte eine vollständige Umwandlung des Ausgangsmaterials. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und wieder in Essigsäureethylester (300 ml) gelöst und mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (2 × 400 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (400 ml) extrahiert. Die wässrigen Schichten wurden mit Essigsäureethylester (200 ml) zurückextrahiert. Die Essigsäureethylester-Schichten wurden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Die Rohausbeute war 11,3 g (95%). Die NMR war mit der erwarteten Struktur der Titelverbindung konsistent. Dieses Material wurde in anschließenden Reaktionen ohne weitere Reinigung verwendet.
  • ii. 1-(2-O-Propyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methylcytidin
  • 1-(2-O-Propyl-3-O-acetyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-4-triazolo-5-methylpyrimidin (11,2 g, 16,1 mmol) wurde in flüssigem Ammoniak (50 ml) in einer 100-ml-Bombe bei Trockeneis/Aceton-Temperaturen gelöst. Die Bombe wurde 18 Stunden lang auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und dann wieder auf Trockeneis/Aceton-Temperaturen gekühlt. Der Inhalt der Bombe wurde in ein Becherglas überführt und Methanol (50 ml) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde bis zur Fast-Trockne abdampfen gelassen. Essigsäureethylester (300 ml) wurde zugegeben und etwas Feststoff wurde vor dem Waschen mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (2 × 250 ml) abfiltriert. Die Essigsäureethylester-Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, mit dem zuvor abfiltrierten Feststoff vereinigt und im Vakuum eingeengt, um 10,1 g Material zu ergeben. Die Rohausbeute betrug mehr als 100% und die NMR war mit der erwarteten Struktur der Titelverbindung konsistent. Dieses Material wurde in anschließenden Reaktionen ohne weitere Reinigung verwendet.
  • iii. 1-(2-O-Propyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-4-N-benzoyl-5-methylcytidin
  • 1-(2-O-Propyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methylcytidin (7,28 g, 10,1 mmol) und Benzoesäureanhydrid (4,5 g, 20 mmol) wurden in DMF (60 ml) gelöst und 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und wieder in Essigsäureethylester (300 ml) gelöst. Die Essigsäureethylester-Lösung wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (2 × 400 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan, 1:2, und 1% Triethylamin gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden gepoolt, eingeengt und unter Hochvakuum getrocknet, um 5,1 g (59% für 4 Schritte, ausgehend von 1-(2-O-Propyldimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin) zu ergeben.
  • iv. 1-(2-O-Propyl-3-O-N,N-diisopropylamino-2-cyanoethylphosphit-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-4-N-benzoyl-5-methylcytidin
  • 1-(2-O-Propyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-4-N-benzoyl-5-methylcytidin (5,0 g, 7 mmol), 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (3,6 ml, 11,3 mmol) und Diisopropylaminotetrazolid (0,42 g, 2,4 mmol) wurden in Dichlormethan (80 ml) gelöst und 40 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (2 × 40 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (1 × 40 ml) gewaschen. Die wässrigen Schichten wurden mit Dichlormethan zurückextrahiert. Die Dichlormethan-Schichten wurden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan, 40:60, und 1% Triethylamin gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden gepoolt, eingeengt und unter Hochvakuum getrocknet, um 7,3 g (98%) zu ergeben.
  • BEISPIEL 5-e
  • i. 2'-O-Methyl-5-methyluridin
  • Vorgehensweise 1:
  • Rohes 2,2'-Anhydro-5-methyluridin (10,0 g, 0,0416 mol) (Beispiel 2-a) wurde in Methanol (80 ml) in einer Edelstahlbombe (Fassungsvermögen von 100 ml) gelöst. Trimethylborat (5,6 ml, 0,049 mol) wurde zugegeben (Anmerkung 1). Die Bombe wurde versiegelt und in ein Ölbad bei 150°C gestellt, das einen Druck von etwa 5 atm erzeugte. Nach 40 h wurde die Bombe in Eis abgekühlt, geöffnet und der Inhalt unter vermindertem Druck zu einem braunen Schaum, 12 g, eingeengt. Die NMR des Rohmaterials war mit dem Produkt konsistent, das mit Verunreinigungen im Ausgangsmaterial und einer Spur Thymin und Ausgangsmaterial kontaminiert war (Hinweis 2). Das Rohprodukt wurde als solches für den nächsten Schritt verwendet.
  • Die Trialkylborate können in geeigneter Weise erstellt werden, indem Lösungen (z. B. 1 M in THF) von Boran zum gewünschten Alkohol gegeben werden und das resultierende Wasserstoffgas sich entwickeln gelassen wird. Das Nukleosid kann zu diesem Zeitpunkt mittels Säulenchromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Essigsäureethylester (0–10%) und Auskristallisieren des Produkts aus absolutem Ethanol gereinigt werden, um weiße Nadeln zu ergeben, Fp. 192–193' (Fp. 197–198'). Eine Literaturreferenz zum Fließpunkt dieser Verbindung ist in E. Ootsuka, H. Inoue, japanische Patentschrift 89-85456, 4. April 1989, enthalten.
  • Vorgehensweise 2:
  • Reines 2,2'-Anhydro-5-methyluridin (1,0 g, 4,16 mmol) und Trimethylborat (0,56 ml, 4,9 mmol) wurden in Methanol (20 ml) in einer Edelstahlbombe (100 ml) gelöst. Die Bombe wurde in ein Ölbad bei 150°C gestellt. Nach 80 h zeigte DC an, dass die Reaktion größtenteils abgeschlossen war. Das Lösungsmittel wurde entfernt, um einen weißen Schaum zu erhalten. Die NMR zeigte ein Produkt/Ausgangsmaterial-Verhältnis von 93:7 ohne weitere bemerkte Verunreinigungen an. Der Rückstand wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung eines Methanol-Gradienten in Essigsäureethylester (0–10%) gereinigt, um 850 mg (75%) reines Produkt und 250 mg noch immer kontaminiertes Produkt zu erhalten. Eine analysenreine Probe wurde zur NMR vorbereitet. 1H-NMR (DMSO-d6): δ 1,79 (s, 3H, 5-CH3), 3,35 (s, 3H, OCH3), 3,5–3,7 (m, 2H, H-5'), 3,7–3,9 (m, 2H, H-3',4'), 4,15 (m, 1H, H-2'), 5,17 (m, 2H, 3',5'-OH), 5,87 (d, J = 5 Hz, 1H, H-1'), 7,80 (s, 1H, H-6), 11,37 (br s, 1H, N-H). Anal. berechn. für C11H16N2O6 (272,26): C, 48,52; H, 5,92; N, 10,29. Gefunden: C, 48,56; H, 5,88; N, 10,22.
  • Vorgehensweise 3:
  • Genauso wie für Vorgehensweise 2 beschrieben, mit der Ausnahme, dass 30 mg Natriumhydrogencarbonat zum Reaktionsgemisch gegeben wurden (um es dem Natriumgehalt des rohen Anhydro anzugleichen), was ermöglichte, die Reaktion in 24 h abzuschließen. Ammoniumchlorid (50 mg) wurde zugegeben, um die Base zu neutralisieren, und die Lösung wurde zur Trockne gestrippt. Die NMR des Rohmaterials zeigte drei geringfügige Nukleosidverunreinigungen (insgesamt etwa 6%) an. Nach einer ähnlichen Säule und dann Auskristallisieren des Rückstands aus Methanol/Essigsäureethylester blieben 850 mg erstes Ertragsmaterial und 120 mg zweites Ertragsmaterial zurück, beide mit 2–3% unbekannter Nukleosidverunreinigungen, für eine noch immer kontaminierte Ausbeute von 85%.
  • ii. 5'-O-Dimethoxytriphenylmethyl-2'-O-methyl-5-methyluridin
  • Rohes 2'-O-Methyl-5-methyluridin (12 g) wurde mit Pyridin (2 × 50 ml) koevaporiert und in trockenem Pyridin (50 ml) gelöst. Dimethoxytriphenylmethylchlorid (18,1 g, 0,054 mol) wurde zugegeben. Der Kolben wurde mit einem Stopfen verschlossen und 45 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Methanol (10 ml) wurde zugegeben, um die Reaktion zu quenchen, und die Lösung wurde unter vermindertem Druck zu einem Öl eingeengt. Der Rückstand wurde zwischen Essigsäureethylester (2 × 400 ml) und gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (500 ml) aufgeteilt. Die organischen Schichten wurden vereinigt, getrocknet (Natriumsulfat), filtriert und zu einem gelben Schaum eingeengt. Der Schaum wurde in Methylenchlorid (60 ml) gelöst und auf eine Kieselgelsäule (300 g) gegeben und mit Essigsäureethylester/Hexanen/Triethylamin, 60:40:1, eluiert. Die Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, eingeengt und mit trockenem Acetonitril (2 × 50 ml) koevaporiert. Der resultierende Rückstand wurde bei 1 mm Hg 24 h lang zu einem spröden weißen Schaum, 17,0 g (60,4% in drei Schritten von 5-Methyluridin aus), getrocknet.
  • BEISPIEL 5-f
  • i. 2,3,5-Tri-O-benzoyl-2-thio-5-methyluridin
  • 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoylribose (0,500 g, 1 mmol) und 5-Methyl-2-thiouracil (0,156 g, 1,1 mmol) wurden in einem 250-ml-Dreihalsrundkolben unter Vakuum über Nacht getrocknet. Diese Komponenten wurden in 10 ml trockenem Acetonitril gelöst und auf 80°C erhitzt. N-O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (0,509 g, 2,5 mmol) wurde zu dieser warmen Lösung gegeben und das Reaktionsgemisch 1 Std. lang bei 80°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde von der Hitze genommen und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und Trimethylsilyltriflat (0,334 g, 1,5 mmol) wurde tropfenweise zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf 50°C erhitzt und 4 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mittels DC unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan, 1:1, überprüft, die zeigte, dass die Reaktion zum Abschluss gekommen war. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und zwischen 50 ml Dichlormethan und 50 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung aufgeteilt. Die wässrige Phase wurde weitere zwei Male mit Dichlormethan extrahiert und die organischen Schichten vereinigt, mit Magnesiumsulfat getrocknet und zu einem blassgelben Schaum eingeengt. Dieser Schaum wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
  • ii. 2-Thio-5-methyluridin
  • Das rohe 2,3,5-Tri-O-benzoyl-2-thio-5-methyluridin (20 g, 37 mmol) wurde in 500 ml Methanol gelöst. Natriummethylat (2,0 g, 37 mmol) wurde zu dieser Lösung gegeben und das Reaktionsgemisch 2 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mittels DC unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan, 1:1, und Essigsäureethylester/Methanol, 9:1, überprüft, die zeigte, dass die Reaktion zum Abschluss gekommen war. Dowex 50 H+-Harz wurde zugegeben, bis die Lösung laut pH-Papier neutral war, und das Harz wurde abfiltriert. Das Harz wurde dann mit weiteren 100 ml Methanol gewaschen und die vereinigten Filtrate wurden eingeengt, um die Titelverbindung, 8,5 g (84%), als einen blassgelben Schaum zu ergeben.
  • BEISPIEL 5-g
  • 2'-O-Methyl-5-methyl-2-thiouridin
  • Dibutylzinnoxid (0,500 g, 2,0 mmol), Tetrabutylammoniumiodid (0,738 g, 2 mmol) und Methyliodid (1,022 g, 7,2 mmol) werden zu einer gerührten Lösung von 5- Methyl-2-thiouridin (0,500 g, 1,8 mmol) in DMF (10 ml) gegeben. Der Reaktionskolben wird versiegelt und 16 Stunden lang auf 50°C erhitzt. Das Gemisch wird abgekühlt und eine weitere Portion Methyliodid wird zugegeben (1,022 g, 7,2 mmol) und das Reaktionsgemisch wird weitere 16 Stunden erhitzt. Bei Ablauf dieses Zeitraums wird das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Methylenchlorid verdünnt und unter Verwendung eines Methylenchlorid/Methanol-Gradienten chromatographiert. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und eingeengt, um 2'-O-Methyl-5-methyl-2-thiouridin zu ergeben.
  • BEISPIEL 5-h
  • 2'-O-Propyl-5-methyl-2-thiouridin
  • Die Titelverbindung wird gemäß den Vorgehensweisen von Beispiel 5-g mittels Austauschen von Methyliodid durch Propyliodid (1,22 g, 7,2 mmol) hergestellt.
  • BEISPIEL 5-i
  • i. 2'-O-Phthalimidopropyl-5-methyl-2-thiouridin
  • Die Titelverbindung wird gemäß den Vorgehensweisen von Beispiel 5-g mittels Austauschen von Methyliodid durch Brompropylphthalimid (0,67 g, 2,5 mmol) hergestellt, wobei weiteres (0,300 g) am zweiten Tag zugegeben wird.
  • ii. 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-propylamin-5-methyl-2-thiouridin
  • 2'-O-Phthalimidopropyl-5-methyl-2-thiouridin (2,6 g, 3,6 mmol) wurde in trockenem Pyridin gelöst und zweimal koevaporiert. Der resultierende Schaum wurde in 25 ml trockenem Pyridin gelöst und Dimethoxytritylchlorid (1,8 g, 5,5 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von 4,4-Dimethylaminopyridin (0,050 g, 0,4 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur rühren gelassen. 1 ml Methanol wurde zum Reaktionsgemisch gegeben. Die Lösung wurde zwischen 75 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und 50 ml Chloroform aufgeteilt. Die wässrige Schicht wurde mit zwei weiteren Portionen Chloroform extrahiert und die organischen Schichten wurden vereinigt und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Trockenmittels mittels Filtration wurde das Filtrat zu einem orange farbenen Öl eingeengt und mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung eines Methanol/Chloroform-Gradienten mit 0,5% Pyridin, das zum Neutralisieren des Kieselgels zugegeben wurde, gereinigt.
  • iii. 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-propylamin-5-methyl-2-S-toluoyl-2-thiouridin
  • 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-propylamin-5-methyl-2-thiouridin (1 g, 1,6 mmol) wurde in DMF gelöst und auf 0°C abgekühlt. Triethylamin (0,300 g, 3 mmol) wurde zu dieser Lösung gegeben, gefolgt von Toluoylchlorid (0,300 g, 1,92 mmol), tropfenweise über 5 Minuten. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und über Nacht gerührt, bei Abschluss der Reaktion wurde diese mit Methanol gequencht und das Reaktionsgemisch zu einem Öl eingeengt. Das Öl wurde dann zwischen 250 ml einer Lösung aus gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung/Chloroform, 1:1, aufgeteilt. Die wässrige Schicht wurde mit zwei weiteren 75-ml-Portionen Chloroform extrahiert und die organischen Schichten wurden getrocknet und zu einem Öl eingeengt. Das geschützte Nukleosid wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung eines Hexan/Essigsäureethylester-Gradienten gereinigt. Das gewünschte Produkt wurde als ein Gemisch aus N-3-Toluoyl- und S-2-Toluoyl-Verbindungen gesammelt. Dieses Gemisch wurde als solches für den Phosphitylierungsvorgang verwendet.
  • iv. 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-propylamin-3'-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethoxyphosphit]-5-methyl-2-S-toluoyl-2-thiouridin
  • Chlor-/3-cyanoethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin (5,6 ml, 25 mmol) wurde zu einer Lösung von 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-propylamin-5-methyl-2-S-toluoyl-2-thiouridin (16,01 g, 22 mmol) und Diisopropylethylamin (10 ml) in THF (200 ml) bei 0°C gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und der Rückstand mittels Kieselgelsäulenchromatographie gereinigt. Elution mit einem Essigsäureethylester/Hexan-Gradienten bei Aufrechterhaltung von 1% Triethylamin, Poolen der entsprechenden Fraktionen und Eindampfen ergibt die Titelverbindung.
  • BEISPIEL 5-j
  • i. 2'-O-Aminopropyl-5-methyl-2-thiouridin
  • 2'-O-Phthalimidopropyl-5-methyl-2-thiouridin (5,0 g, 15,8 mmol) wird in 100 ml Methanol in einem 500-ml-Kolben gelöst. Hydrazin (2,02 g, 63,2 mmol) wird zugegeben und das Gemisch wird 14 Stunden lang unter Rühren zum Rückfluss (60–65°C) erhitzt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft und der Rückstand wird in Dichlormethan (150 ml) gelöst und zweimal mit einem gleichgroßen Volumen NH4OH extrahiert. Die organische Schicht wird eingedampft, um das Rohprodukt zu erhalten. NMR wird verwendet, um die Produktreinheit zu prüfen. Das Produkt wird in anschließenden Reaktionen ohne weitere Reinigung verwendet.
  • ii. 2'-O-Trifluoracetylaminopropyl-5-methyl-2-thiouridin
  • 2'-O-Aminopropyl-5-methyl-2-thiouridin wird in MeOH gelöst und 5 Äquivalente Triethylamin werden zugegeben, gefolgt von 10 Äquivalenten Trifluoressigsäureethylester. Die Titelverbindung wird nach Reinigung isoliert.
  • iii. 2'-O-Trifluoracetylaminopropyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyl-2-thiouridin
  • 2'-O-Trifluoracetylaminopropyl-5-methyl-2-thiouridin (2,5 g, 3,6 mmol) wird in trockenem Pyridin gelöst und zweimal koevaporiert. Der resultierende gelbe Schaum wird in 25 ml trockenem Pyridin gelöst und Dimethoxytritylchlorid (1,8 g, 5,5 mmol) wird zugegeben, gefolgt von 4,4-Dimethylaminopyridin (0,050 g, 0,4 mmol). Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur rühren gelassen. 1 ml Methanol wird zum Reaktionsgemisch gegeben. Die Lösung wird zwischen 75 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und 50 ml Chloroform aufgeteilt. Die wässrige Schicht wird mit zwei weiteren Portionen Chloroform extrahiert und die organischen Schichten werden vereinigt und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Trockenmittels mittels Filtration wird das Filtrat zu einem Öl eingeengt und mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung eines Methanol/Chloroform-Gradienten mit 0,5% Pyridin, das zum Neutralisieren des Kieselgels zugegeben wurde, gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben.
  • iv. 2'-O-Trifluoracetylaminopropyl-3'-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethoxyphosphit]-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyl-2-thiouridin
  • Die Titelverbindung wird gemäß der Vorgehensweise von Beispiel 5-i-iv. unter Verwendung der Titelverbindung von Beispiel 5-j-iii. hergestellt.
  • BEISPIEL 5-k
  • i. 5'-O-Dimethoxytrityl-2-thio-5-methyluridin
  • 2-Thio-5-methyluridin (1 g, 3,6 mmol) wurde in trockenem Pyridin gelöst und zweimal koevaporiert. Der resultierende gelbe Schaum wurde in 25 ml trockenem Pyridin gelöst und Dimethoxytritylchlorid (1,8 g, 5,5 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von 4,4-Dimethylaminopyridin (0,050 g, 0,4 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur rühren gelassen. 1 ml Methanol wurde zum Reaktionsgemisch gegeben. Die Lösung wurde zwischen 75 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und 50 ml Chloroform aufgeteilt. Die wässrige Schicht wurde mit zwei weiteren Portionen Chloroform extrahiert und die organischen Schichten wurden vereinigt und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Trockenmittels mittels Filtration wurde das Filtrat zu einem orangefarbenen Öl eingeengt und mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung eines Methanol/Chloroform-Gradienten mit 0,5% Pyridin, das zum Neutralisieren des Kieselgels zugegeben wurde, gereinigt.
  • ii. 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-tert.-butyldimethylsilyl-5-methyl-2-thiouridin
  • 5'-O-Dimethoxytrityl-2-thio-5-methyluridin (1 g, 1,73 mmol) wurde zweimal mit trockenem DMF koevaporiert und dann in trockenem DMF gelöst und Imidazol (0,141 g, 2,08 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von (0,313 g, 2,08 mmol) tert.-Butyldimethylsilylchlorid. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mittels DC unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan, 1:1, überprüft, die zeigte, dass die Reaktion zum Abschluss gekommen war. Das Reaktionsgemisch wurde dann in 5%-ige Natriumhydrogencarbonatlösung gegossen und 3-mal mit Chloroform extrahiert. Die vereinigte organische Lösung wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet und zu einem Öl eingeengt. Das resultierende Öl wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung eines Methanol/Chloroform-Gradienten gereinigt, wobei das 2'- und das 3'-Silyl-geschützte Nukleosid separat isoliert wurden.
  • iii. 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-tert.-butyldimethylsilyl-2'-methansulfonyl-5-methyl-2-thiouridin
  • 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-tert.-butyldimethylsilyl-5-methyl-2-thiouridin (1,0 g, 1,45 mmol) wurde in Pyridin gelöst und auf 0°C abgekühlt. Methansulfonylchlorid (0,183 g, 1,6 mmol) wurde tropfenweise zu dieser Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann bis zum Abschluss der Reaktion laut DC rühren gelassen. Das Reaktionsgemisch wird mit Methanol neutralisiert und zu einem Öl eingeengt. Die Titelverbindung wird als solche für weitere Reaktionen verwendet.
  • iv. 5'-Dimethoxytrityl-3'-tert.-butyldimethylsilyl-2,2'-thioanhydro-5-methyl-2-thiouridin
  • Das in Beispiel 5-k-iii. gefundene mesylierte Nukleosid wird bei Raumtemperatur mit 5 Äquivalenten Natriummethylat behandelt und bis zur vollständigen Bildung des Thioanhydro-Produkts rühren gelassen. Die Lösung wird dann mit Dowex 50W (H+-Form) neutralisiert, das Harz abfiltriert und die resultierende Lösung eingeengt, um die Titelverbindung zu ergeben.
  • v. 2'-Fluor-3'-tert.-butyldimethylsilyl-5'-dimethoxytrityl-5-methyl-2-thiouridin
  • Das in Beispiel 5-k-iv. gefundene Thioanhydronukleosid wurde in wasserfreiem Dioxan gelöst. 6 Äquivalente HF/Pyridin-Komplex wurden zu dieser Lösung gegeben und das Reaktionsgemisch bis zum Abschluss der Reaktion laut DC gerührt. Das Reaktionsgemisch wird dann über ein Bleichgroßes Volumen Eis gegossen und Calciumcarbonat wird zugegeben, bis das Reaktionsgemisch neutral ist. Die Feststoffe werden abfiltriert und das Filtrat wird eingeengt. Der Rückstand wird mittels Kieselgelsäulenchromatographie gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben.
  • vi. 2'-Fluor-3'-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethoxyphosphit]-5'-dimethoxytrityl-5-methyl-2-thiouridin
  • 2'-Fluor-3'-tert.-butyldimethylsilyl-5'-dimethoxytrityl-5-methyl-2-thiouridin wird gemäß der Vorgehensweise von Beispiel 5-i-iv. behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
  • BEISPIEL 6
  • Oligoribonukleotidsynthese
  • Unsubstituierte und substituierte Phosphodiesteroligoribonukleotide, hierin auch als PO-verknüpfte Oligoribonukleotide bezeichnet, wurden auf einem automatisierten DNA-Synthesegerät (Applied Biosystems Modell 380B) unter Verwendung von Standard-Phosphoramiditchemie mit Oxidation von Iodin synthetisiert.
  • Phosphorthioatoligonukleotide, hierin auch als PS-verknüpfte Oligoribonukleotide bezeichnet, werden wie die Phosphodiesteroligoribonukleotide synthetisiert, mit der Ausnahme, dass die Standardoxidationsflasche durch eine 0,2 M Lösung von 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid in Acetonitril für die schrittweise Thiierung der Phosphitverknüpfungen ersetzt wird. Der Thiierungswarteschritt wurde auf 68 Sek. verlängert und auf diesen folgte der Verschlussschritt. Nach der Spaltung aus der CPG-Säule und dem Entblocken in konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung bei 55°C (18 Std.) wurden die Oligonukleotide durch zweimaliges Präzipitieren mit 2,5 Volumina Ethanol aus einer 0,5 M NaCl-Lösung gereinigt. Analytische Gelelektrophorese wurde in 20%-igem Acrylamid, 8 M Harnstoff, 454 mM Trisboratpuffer, pH = 7,0, durchgeführt. Die Oligonukleotide und Phosphorthioate wurden auf Grundlage von Polyacrylamid-Gelelektrophorese als zu mehr als 80% vollständiges Material beurteilt.
  • Phosphinatoligoribonukleotide, hierin auch als PI-verknüpfte Oligoribonukleotide bezeichnet, werden wie in der US-Patentschrift 5,508,270 beschrieben hergestellt.
  • Alkylphosphonatoligoribonukleotide, hierin auch als PMe-verknüpfte Oligoribonukleotide bezeichnet, werden wie in der US-Patentschrift 4,469,863 beschrieben hergestellt.
  • Phosphoramiditoligoribonukleotide, hierin auch als PN-verknüpfte Oligoribonukleotide bezeichnet, werden wie in der US-Patentschrift 5,256,775 oder der US-Patentschrift 5,366,878 beschrieben hergestellt.
  • Alkylphosphonothioatoligoribonukleotide, hierin auch als MePS-verknüpfte Oligoribonukleotide bezeichnet, werden wie in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen PCT/US94/00902 und PCT/US93/06976 (veröffentlicht als WO 94/17093 bzw. WO 94/02499) beschrieben hergestellt.
  • 3'-Deoxy-3'-aminophosphoramidatoligoribonukleotide, hierin auch als 3'NPN-verknüpfte Oligoribonukleotide bezeichnet, werden wie in der US-Patentschrift 5,476,925 beschrieben hergestellt.
  • Phosphotriesteroligoribonukleotide, hierin auch als POMe-verknüpfte Oligoribonukleotide bezeichnet, werden wie in der US-Patentschrift 5,023,243 beschrieben hergestellt.
  • Boranphosphatoligoribonukleotide, hierin auch als BP-verknüpfte Oligoribonukleotide bezeichnet, werden wie in den US-Patentschriften 5,130,302 und 5,177,198 beschrieben hergestellt.
  • BEISPIEL 7-a
  • Oligoribonukleosidsynthese
  • Mit Methylenmethylimino verknüpfte Oligoribonukleoside, hierin auch als MMI-verknüpfte Oligoribonukleoside bezeichnet, mit Methylendimethylhydrazo verknüpfte Oligoribonukleoside, hierin auch als MDH-verknüpfte Oligoribonukleoside bezeichnet, und mit Methylencarbonylamino verknüpfte Oligoribonukleoside, hierin auch als Amid-3-verknüpfte Oligoribonukleoside bezeichnet, und mit Methylenaminocarbonyl verknüpfte Oligoribonukleoside, hierin auch als Amid-4-verknüpfte Oligoribonukleoside bezeichnet, sowie gemischten Hauptkettenverbindungen, die beispielsweise alternierende MMI- und PO- oder PS-Verknüpfungen aufweisen, werden wie in den US-Patentschriften 5,378,825, 5,386,023 und 5,489,677 und den veröffentlichten PCT-Anmeldungen PCT/US92/04294 und PCT/US92/04305 (veröffentlicht als WO 92/20822 bzw. WO 92/20823) beschrieben hergestellt.
  • Mit Formacetal und Thioformacetal verknüpfte Oligoribonukleoside, hierin auch als FA- bzw. TFA-verknüpfte Oligoribonukleoside bezeichnet, werden wie in den US-Patentschriften 5,264,562 und 5,264,564 beschrieben hergestellt.
  • Mit Ethylenoxid verknüpfte Oligoribonukleoside, hierin auch als ETO-verknüpfte Oligoribonukleoside bezeichnet, werden wie in der US-Patentschrift 5,223,618 beschrieben hergestellt.
  • BEISPIEL 7-b
  • PNA
  • Peptidnukleinsäuren (PNAs) sind an sich bekannt und werden gemäß einer beliebigen der verschiedenen Methoden, auf die in Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5–23, verwiesen wird, hergestellt. Sie können ebenfalls gemäß der US-Patentschrift 5,539,083, die der Seriennummer 08/200,742 entspricht, am 23. Februar 1994 eingereicht und demselben Bevollmächtigten wie für diese Anmeldung übertragen, hergestellt werden.
  • BEISPIEL 8
  • Chimäre Phosphorthioatoligoribonukleotide, z. B. [2'-O-Me]/PS·[2'-OH]/PS·[-2'-O-Me]/PS-Oligoribonukleotid
  • Chimäre Oligoribonukleotide mit 2'-O-Alkylphosphorthioat- und 2'-OH-Phosphorthioatoligonukleotidsegmenten wurden unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesegeräts, Modell 380B von Applied Biosystems, wie oben synthetisiert. Oligoribonukleotide wurden unter Verwendung des automatisierten Synthesegeräts und 5'-Dimethoxytrityl-2'-tert.-butyldimethylsilyl-3'-O-phosphoramidit für den RNA-Teil und 5'-Dimethoxytrityl-2'-O-methyl-3'-O-phosphoramidit für die 5'- und 3'-Schenkel synthetisiert. Die Schutzgruppen an den exozyklischen Aminen waren Phenoxyacetyl für rA und rG, Benzoyl für rC und 2'-O- Methyl A und 2'-O-Methyl C und Isobutyryl für 2'-O-Methyl G. Der Standardsynthesezyklus wurde modifiziert, indem der Warteschritt nach dem Transfer von Tetrazol und der Base auf 600 s verlängert und viermal für RNA und zweimal für 2'-O-Methyl wiederholt wurde. Das vollständig geschützte Oligoribonukleotid wurde vom Träger gespalten und die Phosphatgruppe wurde in 3:1-Ammoniak/Ethanol bei Raumtemperatur über Nacht entschützt und dann zur Trockne lyophilisiert. Es wurde dann eine Behandlung in methanolischem Ammoniak für 24 Std. bei Raumtemperatur vorgenommen, um alle Basen zu entschützen, und die Probe wurde erneut zur Trockne lyophilisiert. Das Pellet wurde in 1 M TBAF in THF für 24 Std. bei Raumtemperatur resuspendiert, um die 2'-Stellungen zu entschützen. Die Reaktion wurde dann mit 1 M TEAA gequencht und die Probe wird dann mittels Rotovac auf das halbe Volumen eingeengt, bevor sie auf einer G25-Größenausschlusssäule entsalzt wird. Das wiedergewonnene Oligo wurde dann spektralphotometrisch auf Ausbeute und Reinheit mittels Kapillarelektrophorese und Massenspektrometer analysiert.
  • BEISPIEL 9
  • Chimäre „Gapmer"-Oligoribonukleotide
  • i. Chimäres Methylphosphonatoligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Me]/PMe·[2'-OH]1PMe·[-2'-O-Me]/PMe-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden des Beispiels 6 ein chimäres Oligoribonukleotid mit einer Methylphosphonat-Hauptkette hergestellt.
  • ii. Chimäres Phosphoramidatoligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Me]/PN·[2'-OH]/PN·[-2'-O-Me]/PN-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden des Beispiels 6 ein chimäres Oligoribonukleotid mit einer Phosphoramidat-Hauptkette hergestellt.
  • iii. Chimäres Phosphoramidatoligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Me]/3'NPN·[2'-OH]/3'NPN·[-2'-O-Me]/3'NPN-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden des Beispiels 6 ein chimäres Oligoribonukleotid mit einer 3'-Deoxy-3'-aminophosphoramidat-Hauptkette hergestellt.
  • iv. Chimäres Phosphinatoligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Me]/PI·[2'-OH]/PI·[-2'-O-Me]/PI-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden des Beispiels 6 ein chimäres Oligoribonukleotid mit einer Phosphinat-Hauptkette hergestellt.
  • v. Chimäres Alkylphosphonothioatoligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Me]/MePS·[2'-OH]/MePS·[-2'-O-Me]/MePS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden des Beispiels 6 ein chimäres Oligoribonukleotid mit einer Phosphonothioat-Hauptkette hergestellt.
  • vi. Chimäres Phosphordithioatoligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Me]/P2S·[2'-OH]/P2S·[-2'-O-Me]/P2S-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden des Beispiels 6 ein chimäres Oligoribonukleotid mit einer Phosphordithioat-Hauptkette hergestellt.
  • vii. Chimäres Phosphorselenatoligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Me]/PSe·(2'-OH]/PSe·[-2'-O-Me]/PSe-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden des Beispiels 6 ein chimäres Oligoribonukleotid mit einer Phosphorselenat-Hauptkette hergestellt.
  • viii. Chimäres Boranphosphatoligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Me]/BP·[2'-OH]/BP·[-2'-O-Me]/BP-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden des Beispiels 6 ein chimäres Oligoribonukleotid mit einer Boranphosphat-Hauptkette hergestellt.
  • ix. Chimäres Methylphosphotriesteroligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Me]/POMe·[2'-OH]/POMe·[-2'-O-Me]/POMe-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden des Beispiels 6 ein chimäres Oligoribonukleotid mit einer Methylphosphotriester-Hauptkette hergestellt.
  • BEISPIEL 10
  • Chimäre Oligoribonukleoside
  • i. Chimäres Methylenmethyliminooligoribonukleosid, z. B. [2'-O-Me]/MMI·[2'-OH]/MMI·[-2'-O-Me]/MMI-Oligoribonukleosid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie des Beispiels 7 ein chimäres Oligoribonukleosid mit Methylenmethyliminoverknüpfungen über das gesamte Oligoribonukleosid hergestellt.
  • ii. Chimäres Methylendimethylhydrazooligoribonukleosid, z. B. [2'-O-Me]/MDH·[2'-OH]/MDH-[-2'-O-Me]/MDH-Oligoribonukleosid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie des Beispiels 7 ein chimäres Oligoribonukleosid mit Methylendimethylhydrazoverknüpfungen über das gesamte Oligoribonukleosid hergestellt.
  • iii. Chimäres Formacetaloligoribonukleosid, z. B. [2'-O-Me]/FA·[2'-OH]/FA-[-2'-O-Me]/FA-Oligoribonukleosid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie des Beispiels 7 ein chimäres Oligoribonukleosid mit Formacetalverknüpfungen über das gesamte Oligoribonukleosid hergestellt.
  • iv. Chimäres Thioformacetaloligoribonukleosid, z. B. [2'-O-Me]/TFA·[2'-OH]/TFA·[-2'-O-Me]/TFA-Oligoribonukleosid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie des Beispiels 7 ein chimäres Oligoribonukleosid mit Thioformacetalverknüpfungen über das gesamte Oligoribonukleosid hergestellt.
  • v. Chimäres Ethylenoxidoligoribonukleosid, z. B. [2'-O-Me]/ETO·[2'-OH]/ETO·[-2'-O-Me]/ETO-Oligoribonukleosid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie des Beispiels 7 ein chimäres Oligoribonukleosid mit Ethylenoxidverknüpfungen über das gesamte Oligoribonukleosid hergestellt.
  • vi. Chimäres Methylencarbonylaminooligoribonukleosid, z. B. [2'-O-Me]/Amid-3·[2'-OH]/Amid-3·[-2'-O-Me]/Amid-3-Oligoribonukleosid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie des Beispiels 7 ein chimäres Oligoribonukleosid mit Amid-3-Verknüpfungen über das gesamte Oligoribonukleosid hergestellt.
  • BEISPIEL 11
  • Chimäre Oligoribonukleotide/Oligoribonukleoside
  • i. Methylenmethylimino/Phosphorthioat-Chimäre, z. B. [2'-O-Me]/PS·[2'-OH]/PS·[-2'-O-Me]/MMI-Oligoribonukleotid/Oligoribonukleosid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie der Beispiele 6 und 7 eine chimäre Verbindung mit sowohl Oligoribonukleotid- als auch Oligoribonukleosidsegmenten hergestellt. Die chimäre Verbindung weist Methylenmethyliminoverknüpfungen in einem „Schenkel" und Phosphorthioatverknüpfungen in einem mittleren „Gap" und im anderen „Schenkel" auf.
  • ii. Chimäres Methylphosphonat/Methylenmethylimino/Phosphorthioat-OligoribonukleotidlOligoribonukleosid, z. B. [2'-O-Me]/PMe·[2'-OH]/PS·[-2'-O-Me]/MMI-Oligoribonukleotid/Oligoribonukleosid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie der Beispiele 6 und 7 eine chimäre Verbindung mit sowohl Oligoribonukleotid- als auch Oligoribonukleosidteilen hergestellt. Die chimäre Verbindung weist Methylenmethyliminoverknüpfungen in einem „Schenkel", Phosphorthioatverknüpfungen in einem mittleren „Gap" und Methylphosphonatverknüpfungen im anderen „Schenkel" auf.
  • iii. Chimäres Methylencarbonylamino/Phosphorthioat/Methylencarbonylamino-OligoribonukleotidlOligoribonukleosid, z. B. [2'-O-Me]/Amid-3·[2'-OH]/PS·[-2'-O-Me]/Amid-3-Oligoribonukleotid/Oligoribonukleosid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie der Beispiele 6 und 7 eine chimäre Verbindung mit sowohl Oligoribonukleotid- als auch Oligoribonukleosidsegmenten hergestellt. Die chimäre Verbindung weist Methylencarbonylaminoverknüpfungen in beiden „Schenkeln" und Phosphorthioatverknüpfungen in einem mittleren „Gap" auf.
  • iv. Chimäres Methylencarbonylamino/Phosphorthioat/Methylenmethylimino-Oligoribonukleotid/Oligoribonukleosid, z. B. [2'-O-Me]/Amid-3·(2'-OH]/PS·[-2'-O-Me]/MMI-Oligoribonukleotid/Oligoribonukleosid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie der Beispiele 6 und 7 eine chimäre Verbindung mit sowohl Oligoribonukleotid- als auch Oligoribonukleosidsegmenten hergestellt. Die chimäre Verbindung weist Methylencarbonylaminoverknüpfungen in einem „Schenkel"-Segment, Phosphorthioatverknüpfungen in einem mittleren „Gap" und Methylenmethyliminoverknüpfungen im anderen „Schenkel"-Segment auf.
  • v. Methylenmethylimino/Phosphodiester/Phosphorthioat-Chimäre, z. B. [2'-O-Me]/MMI-PO·[2'-OH]/PS·[-2'-O-Me]/MMI-PO-Oligoribonukleotid/Oligoribonukleosid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie der Beispiele 6 und 7 eine chimäre Verbindung mit sowohl Oligoribonukleotid- als auch Oligoribonukleosidsegmenten hergestellt. Die chimäre Verbindung weist alternierende Methylenmethylimino- und Phosphodiesterverknüpfungen in seinen „Schenkel"-Segmenten und Phosphorthioatverknüpfungen in seinem mittleren „Gap"-Segment auf.
  • BEISPIEL 12
  • Chimäre, „am Ende gapped" Phosphorthioatoligoribonukleotide
  • i. „Am 3'-Ende gapped" Phosphorthioat-Chimäre, z. B. [2'-O-Me]/PS·[2'-OH]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit einem „offenen Gap"-Segment an ihrem 3'-Terminus, einem „Schenkel"-Segment an ihrem 5'-Terminus und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • ii. „Am 5'-Ende gapped" Phosphorthioat-Chimäre, z. B. [2'-OH]/PS·[2'-O-Me]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit einem „offenen Gap"-Segment an ihrem 5'-Terminus, einem „Schenkel"-Segment an ihrem 3'-Terminus und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • iii. „Am 3'-Ende gapped" Phosphorthioat-Chimäre, z. B. [2'-F]/PS·[2'-OH]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit einer „offenen Gap" an ihrem 3'-Terminus, 2'-Fluornukleosiden in ihrem 5'-„Schenkel"-Segment, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem offenen „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • BEISPIEL 13
  • Chimäre Oligoribonukleotide mit einheitlichen Hauptkettenverknüpfungen und variablen Nukleosiduntereinheiten
  • i. Chimäres 2'-O-Ethyloligoribonukleotid, z. B. (2'-O-Et]/PS[2'-OH]/PS·[2'-O-Et]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Ethylnukleosiden in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • ii. Chimäres 2'-O-Propyloligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Pr]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-Pr]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Propylnukleosiden in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • iii. [2'-O-F]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-F]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-Fluornukleosiden in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • iv. [2'-O-EtOMe]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-EtOMe]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Methoxyethylnukleosiden in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • v. [2'-O-EtOMe]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-F]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Methoxyethylnukleosiden in ihrem 5'-„Schenkel"-Segment, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment, 2'-Fluornukleosiden in ihrem 3'-„Schenkel"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • vi. [2'-O-EtOMe]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-Me]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Methoxyethylnukleosiden in ihrem 5'-„Schenkel"-Segment, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem Gap, 2'-O-Methylnukleosiden in ihrem 3'-„Schenkel"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • BEISPIEL 14
  • Chimäre Oligoribonukleotide mit variablen Hauptkettenverknüpfungen und variablen Nukleosiden
  • i. [2'-O-Me]/PMe·[2'-OH]/PS·[2'-F]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemien des Beispiels 6 eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Methylnukleosiden in ihrem 5'-„Schenkel"-Segment, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap", 2'-O-Fluornukleosiden in ihrem 3'-„Schenkel"-Segment, Phosphorthioatverknüpfungen im „Gap"-Segment und dem 3'-„Schenkel"-Segment und Methylphosphonatverknüpfungen im 5'-„Schenkel"-Segment hergestellt.
  • ii. [2'-O-Me]/PMe·[2'-OH]/PS·2'-Pr]/PI-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemien des Beispiels 6 eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Methylnukleosiden in ihrem 5'-„Schenkel"-Segment, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap", 2'-O-Propylnukleosiden in ihrem 3'-„Schenkel"-Segment, Phosphorthioatverknüpfungen im „Gap"-Segment, Methylphosphonatverknüpfungen im 5'-„Schenkel"-Segment und Phosphinatverknüpfungen im 3'-„Schenkel"-Segment hergestellt.
  • BEISPIEL 15
  • Chimäre Oligoribonukleotide, die Surrogat-Nukleoside enthalten
  • i. Morpholinonukleosidsurrogat enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [Morpholinonukleosidsurrogat]·[2'-OH]/PS·[Morpholinonukleosidsurrogat]-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise der Beispiele 7 und 8 wird eine chimäre Verbindung mit Morpholinonukleosiden, die gemäß der Lehren der US-Patentschrift 5,506,337 hergestellt wurden, in ihren „Schenkel"-Segmenten und über Phosphorthioatverknüpfungen verknüpften 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment hergestellt.
  • ii. Cyclobutylnukleosidsurrogat enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [Cyclobutylnukleosidsurrogat]/PS·[2'-OH]/PS·[Cyclobutylnukleosidsurrogat]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise der Beispiele 7 und 8 wird eine chimäre Verbindung mit Cyclobutylsurrogat-Nukleosiden, die gemäß der Lehren der US-Patentschrift 5,359,044 hergestellt wurden, in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • iii. Pyrrolidinnukleosidsurrogat enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. (Pyrrolidinnukleosidsurrogat]/PS·[2'-OH]/PS·[Pyrrolidinzucker]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise der Beispiele 7 und 8 wird eine chimäre Verbindung mit Pyrrolidinsurrogat-Nukleosiden, die gemäß der Lehren der US-Patentschrift 5,519,135 hergestellt wurden, in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • iv. „Am 3'-Ende gapped" PNA·Phosphorthioat-Chimäre, z. B. PNA·[2'-OH]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 in Kombination mit der Chemie des Beispiels 7-b wird eine chimäre Verbindung mit einem „offenen Gap" an ihrem 3'-Terminus, das aus 2'-OH-Nukleosiden mit Phosphorthioatverknüpfungen gebildet ist, und PNA-Surrogat-Nukleosiden im 5'-„Schenkel"-Segment hergestellt.
  • BEISPIEL 16
  • Chimäre Oligoribonukleotide, die Nukleoside mit modifizierten Basen enthalten
  • i. N-2-modifiziertes Purin enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [Mod-Purin]/PS·[2'-OH]/PS·[Mod-Purin]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 4,7,10,13-Tetraazahexadec-1-ylguanosinnukleosiden, die gemäß der Lehren der US-Patentschrift 5,459,255 hergestellt wurden, in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap" und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • ii. C-5-modifiziertes Pyrimidin enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [Mod-Pyr]/PS·[2'-OH]/PS·[Mod-Pyr]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 5-Propinylpyrimidinnukleosiden, die gemäß der Lehren der US-Patentschrift 5,484,908 hergestellt wurden, in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • iii. N-2-, C-6-modifiziertes Purin enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [Mod-Purin]/PS·[2'-OH]/PS·[Mod-Purin]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 6-Hydroxy-2-fluorpurinnukleosiden, die gemäß der Lehren der US-Patentschrift 5,459,255 hergestellt wurden, in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap" und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • iv. 2'-O-Alkyl-, C-5-modifiziertes Pyrimidin enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Propyl-Mod-Pyr]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-Propyl-Mod-Pyr]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Propyl-5-methylcytidinnukleosiden in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • v. 2'-O-Alkyl-, N-2-, C-5-modifiziertes Pyrimidin enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Propyl-Mod-Pyr]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-Propyl-Mod-Pyr]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Propyl-2-thio-5-methyluridinnukleosiden in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • vi. 2'-O-Aminoalkyl-, N-2-, C-5-modifiziertes Pyrimidin enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Aminopropyl-Mod-Pyr]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-Aminopropyl-Mod-Pyr]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Aminopropyl-2-thio-5-methyluridinnukleosiden in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • vii. 2'-O-Fluor-, N-2-, C-5-modifiziertes Pyrimidin enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Fluor-Mod-Pyr]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-Fluor-Mod-Pyr]/PS-Oligoribonukleotid
  • Nach Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Fluor-2-thio-5-methyluridinnukleosiden in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
  • BEISPIEL 17
  • Zellkultur und Northern-Blot-Analyse eines ras-Ziels
  • T24-Zellen wurden als Monoschichten in mit 10%-igem fötalem Rinderserum und 100 Einheiten/ml Penicillin supplementiertem McCoy's Medium (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, USA) bewahrt. Nach einer Behandlung mit oligomeren Verbindungen für 24 Std. wurden die Zellen mit Trypsin versetzt, zentrifugiert und die gesamte Zell-RNA wurde gemäß Standardprotokollen (siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1988, Wiley and Sons, New York, NY, USA) isoliert. Um die relativen Abundanz an Ha-ras-mRNA zu quantifizieren, wurde die gesamte RNA (10 μg) mittels Northern-Blotting auf Bio-Rad Zeta-Sondenmembran (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) übertragen und mittels UV vernetzt (StratalinkerTM, Stratagene, LaJolla, CA, USA). Membrangebundene RNA wurde auf eine mit 32P markierte, 0,9 kb lange Ha-ras-cDNA-Sonde (Oncogene Science, Pasadena, CA, USA) hybridisiert und auf XAR-Film (Kodak, Rochester, N.Y., USA) belichtet. Der relative Umfang des Ha-ras-Signals wurde bestimmt, indem das Ha-ras-Signal auf jenes normiert wurde, das erhalten wurde, als dieselbe Membran gestrippt und mit einer Sonde für menschliche Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (G3PDH, Clontech, Palo Alto, CA, USA) hybridisiert wurde. Signale von Northern-Blots wurden unter Anwendung von Phospholmager- und ImageQuant-Software (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA) quantifiziert.
  • BEISPIEL 18
  • Behandlung von Zellen mit einer Verbindung
  • In Monoschichten gezüchtete Zellen wurden einmal mit warmer PBS gewaschen und dann wurde Opti-MEM-Medium (GIBCO-BRL), das Lipofectin (GIBCO-BRL) enthielt, in einer Konzentration von 5 μg/ml pro 200 nM Oligo mit einer Höchstkonzentration von 15 μg/ml zugegeben. Es wurden oligomere Verbindungen zugegeben und bei 37°C für 4 Std. inkubiert, wonach das Medium durch Vollserummedium ausgetauscht wurde. Nach 24 Std. bei Vorhandensein der Verbindung wurden die Zellen geerntet und RNA zur weiteren Analyse angesetzt.
  • BEISPIEL 19
  • RNase-H-Analyse
  • Es wurde unter Verwendung von Oligoribonukleotiden mit 17 Basen, die den Basen (+23 bis +47) aktivierter (Codon-12-Mutation) Ha-ras-mRNA entsprachen, eine RNase-H-Analyse durchgeführt. 5'-endmarkierte RNA (20 nM) wurde mit einem 100-fachen molaren Überschuss der verschiedenen Testoligoribonukleotide in einem Reaktionsgemisch, das 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol und 4 Einheiten RNase-Inhibitor (Pharmacia, Newark, NJ, USA) in einem Endvolumen von 100 μl enthielt, inkubiert. Die Oligoribonukleotide wurden durch Erhitzen auf 95°C für 5 Minuten geschmolzen und dann langsam in einem 2- Liter-Wasserbad von 90°C auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die Bildung von Doppelsträngen wurde durch die Mobilitätsverschiebung zwischen der einzelsträngigen, endmarkierten Sense-RNA und dem verschmolzenen Doppelstrang auf nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gelen bestätigt. Die resultierenden Doppelstränge wurden als Substrate zum Verdau durch E. coli-RNase H (USB, Cleveland, OH, USA) geprüft. 1 μl einer 1 × 10–9-mg/ml-Lösung von RNase H wurde zu 10 μl des Doppelstrangreaktionsgemischs, das 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert worden war, gegeben, die Reaktion wurde durch die Zugabe von denaturierendem Ladepuffer beendet und die Reaktionsprodukte wurden auf einem 12%-igem Polyacrylamid-Gel, das 7 M Harnstoff enthielt, getrennt und auf XAR-Film (Kodak) belichtet.
  • BEISPIEL 20
  • Zellfreier In-vitro-Nukleaseassay
  • In den zellfreien T24-Extrakt-Versuchen verwendete Doppelstränge wurden wie oben beschrieben verschmolzen, mit der Ausnahme, dass das Reaktionsgemisch nach Bildung des Doppelstrangs mit 1 μl einer Mischung aus RNase T und RNase A (Ambion RPAII-Kit, Austin, TX, USA) behandelt und 15 Min. bei 37°C inkubiert und dann aus einem nicht denaturierendem 12%-igem Polyacrylamid-Gel gelgereinigt wurde. T24-Zellkern- und Zytosolfraktionen wurden wie zuvor beschrieben isoliert (M. Szyf, V. Bozovic und G. Tanigawa, J. Biol. Chem., 1991, 266, 10027–10030). Verschmolzene Doppelstränge (10 μl) wurden mit 3 μg des T24-Zytosolextrakts bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde mittels Phenol/Chloroform-Extraktion beendet und mit Ethanol durch die Zugabe von 10 μg tRNA als Träger präzipitiert. Die Pellets wurden in 10 μl denaturierendem Ladefarbstoff resuspendiert und die Produkte wurden wie oben beschrieben auf 12%-igen denaturierenden Acrylamid-Gelen getrennt. Mit 32P markierte RNA mit 17 Basen wurde durch Erhitzen auf 95°C für 10 Minuten bei Vorhandensein von 50 mM NaCO3, pH = 9,0, hydrolysiert, um eine Molekulargewichtsabstufung zu erzeugen.
  • BEISPIEL 21
  • Bestimmen des 5'- und des 3'-Terminus
  • Nicht markierter Doppelstrang wurde wie zuvor durchgeführt mit T24-Extrakten behandelt, eine Hälfte dieses Reaktionsgemischs wurde mit Kälberdarmphosphatase (calf intestinal phosphatase, CIP, Stratagene) behandelt und die andere Hälfte wurde unbehandelt belassen. Die Phosphatase wurde durch Erhitzen auf 95°C inaktiviert und die Reaktionsgemische wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert und dann mit Glykogen als Träger in Ethanol präzipitiert. Die Präzipitate wurden dann mit T4-Polynukleotidkinase (Stratagene) und 32P-γ-ATP (ICN, Irvine, CA, USA) behandelt. Die Proben wurden erneut mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert, die Produkte dieser Reaktion wurden dann auf einem 12%-igen Acrylamid-Gel getrennt und mittels Belichtung auf XAR-Film sichtbar gemacht. Der 3'-Terminus des gespaltenen Doppelstrangs wurde durch die Reaktion von Doppelstrangverdauprodukten mit T4-RNA-Ligase (Stratagene) und 32P-pCp (ICN) festgesetzt.
  • BEISPIEL 22
  • Chimäre 2'-Methoxyoligoribonukleotide vermitteln Verdau von Ziel-RNA in T24-Zellen
  • Über Strukturaktivitätsanalysen von Antisense-Oligonukleotiden, die für das Codon 12 des Ha-ras-Onkogens spezifisch sind und verschiedene 2'-Zuckermodifikationen enthalten, wurde von Monia et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 19954–19962, und Monia et al., J. Biol. Chem., 1993, 268, 14514–14522, berichtet. In diesen Berichten, obwohl die 2'-modifizierten Oligonukleotide mit größerer Affinität für RNA als unmodifizierte 2'-Deoxyoligos hybridisierten, waren diese beim Inhibieren der Ha-ras-Genexpression komplett unwirksam. Das Fehlen von mit diesen 2'-modifizierten Oligos beobachteter Aktivität wurde direkt ihrer Unfähigkeit, Doppelstränge zu erzeugen, die als Substrate für den Abbau durch RNase H dienen könnten, zugeschrieben. Unter Befolgung eines ähnlichen Protokolls wurden Längen von Ribonukleotiden in die Mitte von 2'-Methoxyoligoribonukleotiden mit 17 Basen, die sich gegen Ha-ras-mRNA richteten, eingeführt, um „gapped" chimäre 2'-Methoxy-2'-hydroxy-2'-methoxyphosphorthioatoligoribonukleotid-Verbindungen zu bilden, die im mittleren Gap-Segment verschiedene Ribonukleotidgehalte aufweisen (siehe 1 für eine Darstellung dieser Verbindungen sowie ihrer Basensequenz). Bei Hybridisierung an ihr Zellenziel besteht der resultierende Doppelstrang aus zwei Längen, die keine Ziele für den nukleolytischen Abbau sind (die 2'-Methoxy-„Schenkel"), und einer 2'-Hydroxyoligoribonukleotid-Länge, von der gefunden wurde, dass sie ein Ziel für eine neuartige Ribonuklease-Aktivität ist, die RNA:RNA-Doppelstränge erkennt. Es wurden menschliche T24-Blasenkarzinomzellen verwendet, die im Ha-ras-Gen an der Codon-12-Stellung eine aktivierende G-T-Transversionsmutation enthalten. Die „gapped" chimären Verbindungen, die für diese Mutation spezifisch sind, wurden in in Kultur gezüchtete T24-Zellen transfiziert. Nach der Inkubation mit den Verbindungen für 24 Std. wurden die Zellen geerntet, die gesamte zytosolische RNA isoliert und eine Northern-Blot-Analyse auf Ha-ras-mRNA-Niveaus durchgeführt. Vollständig modifizierte 2'-Methoxyoligonukleotide unterstützten die nukleolytische Spaltung von Ziel-mRNA nicht und führten daher selbst bei der höchsten geprüften Konzentration nicht zu einer Verringerung der Gleichgewichtsniveaus von Ha-ras-mRNA (2A und 2B). Ein RNA-Gapmer-Oligonukleotid mit nur 3 Ribonukleotiden im Gap war ebenfalls nicht dazu in der Lage, die nukleolytische Spaltung der Ziel-RNA zu induzieren (2C und 2D). Mit RNA-Gapmer-Oligonukleotiden, die 5, 7 und 9 Ribonukleotide im Gap sowie ein vollständiges Phosphorthioatoligoribonukleotid-Molekül enthielten, behandelte T24-Zellen jedoch zeigten alle von der Dosis abhängige Reduktionen der Ha-ras-mRNA-Gleichgewichtsniveaus auf (3B3D). Mit einem. Kontroll-9-RNA-Gapmer-Oligonukleotid, das in seiner Sequenz vier nicht zusammenpassende Basen enthielt, behandelte T24-Zellen zeigten keine von der Dosis abhängige Reduktion von Ha-ras-mRNA, was nahe legt, dass die Hybridisierung an die Ziel-RNA für eine Aktivität unerlässlich ist (3E). Die RNA-Gapmer-Verbindungen zeigten eine von der Dosis abhängige Inhibierung der Ha-ras-mRNA-Gleichgewichtsniveaus.
  • Die Fähigkeit der RNA-Gapmer-Verbindungen, die Ha-ras-mRNA zu reduzieren, hing von der Größe der RNA-Gap und folglich der Größe des in vivo gebildeten RNA:RNA-Doppelstrangs ab. Eine Behandlung von Zellen mit den RNA-Gapmer-Verbindungen mit 3 Basen resultierte nicht in der Spaltung des Ziels, wohingegen die RNA-Gapmer-Verbindungen mit 5, 7 und 9 Basen zu einer Reduktion der Ha-ras-mRNA führten (4). Die Tatsache, dass das 3 Ribonukleotide im Gap enthaltende RNA-Gapmer-Oligonukleotid nicht dazu in der Lage war, eine Reduktion der Ziel-mRNA zu induzieren, legt nahe, dass die involvierte Aktivität eine Mindest-RNA:RNA-Doppelstrangregion von mindestens vier Ribonukleotiden zum Binden und Spalten des Ziels bedingt. Interessanterweise zeigen chimäre DNA-Gapmer-Oligonukleotide, die anstelle von Ribonukleotiden Deoxynukleotide im Gap enthalten, dieselben Mindestgapgrößenerfordernisse zum Bilden von Substraten für von RNase H vermitteltem Abbau der Ziel-mRNA (Crooke et al., Annu. Rev. Pharmacol., 1996, 36, 107), was nahe legt, dass RNase H und die hier beschriebene Aktivität doppelsträngiger RNase einige Eigenschaften gemein haben können, obwohl ihre Substrate sich deutlich unterscheiden.
  • Eine Kontroll-9-RNA-Gapmer-Verbindung, die in ihrer Sequenz vier nicht zusammenpassende Basen enthält, resultierte wie erwartet in im Wesentlichen keiner Reduktion der Ha-ras-mRNA, wie in 3E gezeigt ist. Ein vollständiges Phosphorthioatoligoribonukleotid-Molekül weist ungefähr die gleiche Aktivität wie das 5-RNA-Gapmer-Oligo auf (3D). Der Grund dafür könnte die relative Abnahme der Stabilität des vollständigen Oligoribonukleotids in vivo gewesen sein, der aus der Inaktivierung durch einzelsträngige Ribonukleasen resultierte, da 2'-Methoxyphosphorthioatoligodeoxynukleotide erheblich stabiler als Phosphorthioatoligoribonukleotide sind. Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923–937. Eine Behandlung von T24-Zellen mit den verschiedenen Oligonukleotiden und verschiedenen Konzentrationen bis zu 800 nM wurde in dreifacher Ausführung vorgenommen und die Quantifizierung der Ha-ras-mRNA-Niveaus zeigte an, dass bei 600 nM das 5-Gapmer die Ha-ras-mRNA um 51%, das 7-Gapmer sie um 49%, das 9-Gapmer sie um 77% und das vollständige Ribonukleotid sie um 38% reduziert, verglichen mit nicht behandelten Kontrollen. Dies legt nahe, dass durch 2'-Methoxy-Schenkel geschützte RNA-Gapmer-Oligoribonukleotide wirksamere Moleküle sein würden. Wie in diesem Beispiel gezeigt ist, erkennt eine Endoribonuklease-Aktivität in menschlichen T24-Blasenkarzinomzellen den internen RNA:Oligoribonukleotid-Teil eines chimären Doppelstrangs und reduzierte die Ziel-mRNA-Niveaus.
  • BEISPIEL 23
  • Eine in T24-Zellextrakten vorliegende Aktivität induziert in vitro die Spaltung des Gapmer-Oligoribonukleotid:RNA-Doppelstrangs im internen RNA:RNA-Teil
  • Um die Spaltungsaktivität doppelsträngiger RNA in T24-Zellen weiter zu charakterisieren, wurden T24-Zellextrakte hergestellt und auf die Fähigkeit zur Spaltung des 9-Gap-Oligoribonukleotid:RNA-Doppelstrangs in vitro geprüft. Der 9-Gap-Verbindung: 32P-endmarkierte-RNA-Doppelstrang wurde wie in 4 gezeigt mit 3 μg Zytosolextrakt unterschiedliche Zeiträume lang bei 37°C inkubiert, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion, Präzipitation mit Ethanol und Trennung der Produkte auf einem denaturierendem Gel. Dass es sich bei diesem Doppelstrang um ein Substrat für den Verdau durch eine in T24-Extrakten vorliegende Aktivität handelte, wird durch den Verlust von vollständiger endmarkierter RNA und das Auftreten von Verdauprodukten niedrigeren Molekulargewichts gezeigt, wie durch die Pfeile in 4 angezeigt wird. Darüber hinaus weist die für die Spaltung des Doppelstrangs verantwortliche Aktivität Spezifität für den RNA:RNA-Teil des Doppelstrangmoleküls auf, wie durch die Größen der Spaltungsprodukte, die sie erzeugt, angezeigt wird (siehe die physikalische Karte der 32P-endmarkierten RNA, in 4 rechts außen). Die RNase-H-Spaltung eines 9-Deoxynukleotid-Gap-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrangs und die Spaltung des 9-Ribonukleotid-Gap-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrangs durch T24-Zellextrakte scheint in ähnlichen Verdauprodukten zu resultieren. Dies ist beim Vergleichen der Gele in den 4 und 5 zu erkennen. Beide Aktivitäten zeigten in ihren jeweiligen Doppelsträngen bevorzugte Spaltungsorte nahe des 3'-Endes der Ziel-RNA auf, was nahe legt, dass sie Bindungs- als auch mechanistische Eigenschaften gemein haben könnten. Aus Epithelzellen der menschlichen Nabelvene (human umbilical vein epithel cells, HUVECs), menschlichem Lungenkarzinom (A549) und Hela-Zelllinien hergestellte Zellextrakte enthielten alle eine Aktivität, die zum Induzieren der Spaltung des 9-RNA-Gapmer:RNA-Ziel-Doppelstrangs in vitro in der Lage ist.
  • BEISPIEL 24
  • Spaltung von Ziel-RNA in sowohl zytoplasmatischen als auch Zellfraktionen von Zellprodukten
  • Die Zellverteilung der hierin beschriebenen Aktivität doppelsträngiger RNase wurde weiter beurteilt. Aus T24-Zellen wurden Zellkernextrakte hergestellt und auf die Fähigkeit zum Verdauen des 9-RNA-Gapmer-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrangs geprüft. Aus T24-Zellen hergestellte Zellkernextrakte waren dazu in der Lage, den Zieldoppelstrang abzubauen, und es wurde festgestellt, dass die Aktivität in der Zellkernfraktion in zu denen in den zytoplasmatischen Fraktionen vergleichbaren Niveaus vorliegt.
  • Es wurde ein RNA-Gapmer-Oligonukleotid synthetisiert, das über die gesamte Länge des Moleküls Phosphorthioatverknüpfungen enthielt. Da dies in erhöhter Stabilität gegenüber einzelsträngigen Nukleasen resultiert, wurde geschlussfolgert, dass es ebenfalls die Spaltung des Antisense-Strangs durch die dsRNase inhibieren würde. Daher wurde, um zu bestimmen, ob die oben beschriebene Aktivität beide Stränge in einem RNA-Doppelstrangmolekül spalten kann, ein 9-RNA-Gapmer-Antisense-Oligonukleotid, das Phosphorthioatverknüpfungen in den Schenkeln zwischen den 2'-Methoxynukleotiden enthielt, aber Phosphodiesterverknüpfungen zwischen den neun Ribonukleotiden im Gap aufwies, synthetisiert. Ein aus diesem mit 32P markiertem 9-RNA-Gapmer-Phosphodiester-/Phosphorthioatoligonukleotid und seinem komplementären Oligoribonukleotid bestehender Doppelstrang wurde als ein Substrat für Aktivität doppelsträngiger RNase in T24-Extrakten geprüft. Die Aktivität war dazu in der Lage, den Antisense-Strang dieses Doppelstrangs als auch den Sense-Strang zu spalten, und das Muster der Verdauprodukte deutete darauf hin, dass die Spaltung erneut auf den RNA:RNA-Phosphodiester-Teil des Doppelstrangs beschränkt war.
  • BEISPIEL 25
  • Ein RNA-Gapmer-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrang ist kein Substrat für RNase H
  • Um die Möglichkeit auszuschließen, dass der Grund für die in Beispiel 23 gezeigte Spaltung RNase H sein könnte, wurde die Fähigkeit von E. coli-RNase H, einen Doppelstrang des 9-Gapmer-Oligoribonukleotids mit 17 Basenpaaren und seiner komplementären, am 5'-Ende mit 32P markierten RNA in vitro zu spalten, geprüft. 5 zeigt die erwartete Verschiebung der elektrophoretischen Mobilität, wenn Doppelstränge gebildet und auf einem nativen Gel neben der einzelsträngigen, 32P-endmarkierten RNA analysiert wurden. Wie in 5 im äußeren rechten Feld zu sehen ist, war der 9-Gapmer-Oligoribonukleotid:RNA-Doppelstrang kein Substrat für RNase-H-Spaltung, da keine Banden niedrigeren Molekulargewichts erschienen, wenn es mit RNase H behandelt wurde. Wie erwartet wurde jedoch ein vollständiger Deoxyofigonukleotid:RNA-Doppelstrang durch RNase H unter denselben Bedingungen gespalten, wie durch das Auftreten von Spezies niedrigeren Molekulargewichts in der mit Enzym behandelten Bahn ersichtlich ist (5, linkes Feld). Ein aus einem 9-Gapmer-DNA-Oligonukleotid und seiner komplementären RNA bestehender Doppelstrang war ein Substrat für RNase-H-Spaltung. Die Tatsache, dass die RNase-H-Spaltungsorte in diesem bestimmten Doppelstrang bei den DNA:RNA-Teilen des Doppelstrangs lokalisiert wurden, beweist weiter, dass der RNA-Gapmer-Oligoribonukleotid:RNA-Doppelstrang kein Substrat für RNase-H-Verdau ist.
  • Es ist interessant zu beobachten, dass die RNase-H-Spaltung des 9-DNA-Gapmer-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrangs (5, linkes Feld) und die Spaltung des 9-RNA-Gapmer-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrangs durch T24-Zellextrakte in ähnlichen Verdauprodukten resultierte (siehe 4). Sowohl RNase H als auch die Aktivität in T24-Zellen zeigten an ihren jeweiligen Doppelsträngen die gleichen bevorzugten Spaltungsorte auf. Darüber hinaus waren beide Oligonukleotide an diesem Ort von der Wirksamkeit her annäherungsweise vergleichbar. Die Spaltung war auf das 3'-Ende der Ziel-RNA in der entweder dem DNA- oder dem RNA-Gap des jeweiligen Antisense-Moleküls gegenüber liegenden Region beschränkt.
  • Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, legt das unmittelbar vorhergehende Ergebnis nahe, dass RNase H und die dsRNase der Erfindung Bindungs- als auch mechanistische Eigenschaften gemein haben können. Eine Analyse der DNA- und RNA-Gapmer-Oligonukleotide, die sich gegen vier Orte an c-Raf-mRNA richten, offenbarte jedoch, dass RNase H und die hier beschriebene dsRNase-Aktivität eindeutig unterschiedliche Substratspezifitäten aufweisen. „RNA-artige" Gapmer-Oligonukleotide, die gegen die c-Raf-mRNA gerichtet waren, waren nicht dazu in der Lage, eine Reduktion der mRNA zu induzieren, wohingegen RNase-H-aktive Oligodeoxynukleotide, die gegen denselben Ort gerichtet waren, Ziel-mRNA-Niveaus reduzieren konnten. Um zu bestimmen, ob der Grund für das Fehlen von durch die vier c-Raf-„RNA-Gapmere" induzierter Spaltung in T24-Zellen eine mögliche Sequenzspezifität oder Spaltung war, wurden vier „RNA-artige" c-Raf-„Gapmere", das „RNA-artige" ras-„Gapmer" und die entsprechenden „DNA-artigen Gapmere" zu mit 32P markierten Oligoribonukleotiden vorhybridisiert und mit T24- Homogenisaten inkubiert. Das „RNA-artige" ras-„Gapmer" unterstützte die Spaltung der ras-Ziel-RNA fast so effizient wie das „DNA-Gapmer". Nur eines der „RNA-artigen Gapmere", das gegen c-Raf-Segmente (SEQ ID NO: 8) gerichtet war, jedoch unterstützte eine Spaltung und die Spaltungsgeschwindigkeit beim „RNA-artigen Gapmer" war viel langsamer als beim vergleichbaren „DNA-artigen Gapmer". Somit zeigt die dsRNase im Gegensatz zu RNase H eine beachtliche Sequenzspezifität auf.
  • BEISPIEL 26
  • Nukleaseaktivität erzeugt 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxyl-Termini
  • Um die Beschaffenheit der von der Nukleasespaltung des Doppelstrangs in vitro hinterlassenen 5'-Termini zu bestimmen, wurde nicht markierter Doppelstrang wie zuvor beschrieben mit T24-Zellextrakten inkubiert und dann mit T4-Polynukleotidkinase und [32P-γ-ATP], mit oder ohne vorherige Behandlung mit Kälberdarmphosphatase, umgesetzt. Die Phosphatase-Behandlung der Doppelstrangprodukte wurde als für die Einbindung der 32P-Markierung während der Umsetzung mit Polynukleotidkinase erforderlich betrachtet, was auf das Vorhandensein einer Phosphatgruppe an den 5'-Termini hindeutete. Die 3'-Termini wurden durch die Umsetzung von Doppelstrangverdauprodukten mit T4-RNA-Ligase und 32P-pCp beurteilt. T4-RNA-Ligase bedingt einen freien 3'-Hydroxyl-Terminus für die Ligierung von 32P-pCp. Die Fähigkeit der Doppelstrangverdauprodukte, 32P-pCp durch T4-RNA-Ligase einzubinden, deutet auf das Vorhandensein von 3'-Hydroxygruppen hin.
  • BEISPIEL 27
  • Reinigung und Charakterisierung von doppelsträngigen Ribonukleasen aus Geweben eines Säugers
  • Um zu bestimmen, ob Zellen eines Säugers, bei denen es sich nicht um kultivierte Zelllinien handelt, Aktivität doppelsträngiger RNase enthalten, und um eine Quelle bereitzustellen, aus der solche Ribonukleasen gereinigt werden könnten, wurden die folgenden Anstrengungen zum Identifizieren und Reinigen von dsRNasen aus Rattenleberhomogenisaten unternommen.
  • BEISPIEL 27-a
  • Substrate und Assays für dsRNasen
  • In vorausgehenden Versuchen wurde die Aktivität doppelsträngiger RNase in Rattenleberhomogenisaten beobachtet; die Homogenisate zeigten jedoch hohe Niveaus an einzelsträngigen dsRNasen auf, was die Analyse der dsRNase-Aktivitäten erschwerte, da die Spaltung des Oligoribonukleotids nach der Spaltung durch die dsRNasen überragt. Um dieses Problem zu lösen, wurden zwei weitere Substrate und ein nicht denaturierendes Gel-Assay angewendet. Der „Sense"-Strang war ein Oligoribonukleotid mit Phosphodiesterverknüpfungen in einem Acht-Basen-Gap mit Flanken, die entweder (a) Reste mit Phosphorthioatverknüpfungen oder (b) 2'-Methoxynukleoside mit Phosphorthioatverknüpfungen aufweisen. Der „Antisense"-Strang in beiden Substraten enthielt 2'-Methoxyphosphorthioat-Schenkel auf beiden Seiten einer Acht-Basen-Ribonukleotid-Gap mit entweder Phosphodiester- oder Phosphorthioatverknüpfungen (Tabelle 1). Derartige dsRNase-Substrate waren gegenüber Exonukleaseverdau stabiler als ein Oligoribonukleotid und Substrate mit sowohl Phosphorthioatverknüpfungen und 2'-Methoxynukleosiden war äußerst stabil. Diese Merkmale sind aufgrund der Abundanz von einzelsträngigen RNasen in Bezug auf die Aktivität doppelsträngiger RNase in der Rattenleber wichtig und unterstützten die Anwendung von nicht denaturierenden Assays. TABELLE 1 Künstliche Substrate für dsRNasen eines Säugers*
    Figure 00920001
    • * Fettgedruckte Reste zeigen 2'-Methoxynukleotidreste in den „Antisense"-Strängen an.
  • Sowohl Zytosol- als auch Zellkernextrakte von Rattenleber induzierten die Spaltung des Doppelstrangsubstrats. Beide Extrakte resultierten in schneller migrierenden Banden bei elektrophoretischen Analysen mit nativem Gel. Der Zytosolextrakt schien aktiver als der Zellkernextrakt zu sein. Eine doppelsträngige RNase, RNase V1 (Pharmacia, Piscataway, NY, USA), spaltete das Substrat; T24-Extrakte spalteten ebenfalls das Substrat. Weder bakterielle noch einzelsträngige RNase spalteten das Substrat, mit Ausnahme von RNase A, die bei sehr hohen Konzentrationen in etwas Spaltung resultierte. Es ist unklar, ob der Grund für diese Spaltung eine kontaminierende doppelsträngige RNase war oder ob RNase A unter manchen Bedingungen doppelsträngige Substrate spalten kann.
  • BEISPIEL 27-b
  • Reinigung von dsRNasen aus Zytosol- und Zellkernextrakten von Rattenleber
  • Um die hierin identifizierte dsRNase eines Säugers zu reinigen, wurden 0,5 kg Rattenleber in Puffer X [10 mM Hepes (pH 7,5), 25 mM KCl, 0,15 mM Spermin, 0,5 mM Spermidin, 1 mM EDTA, 2 M Saccharose, 10% Glycerin; alle Reagenzien von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA] homogenisiert und in einer Beckman J2-21M-Zentrifuge (Beckman, Fullerton, CA, USA) bei 10.000 U/Min. für 1,5 Stunden zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 40%-iger Ammoniumsulfatlösung (Sigma) präzipitiert. Die gesamte dsRNase-Aktivität wurde im Präzipitat aus 40%-iger Ammoniumsulfatlösung wiedergewonnen. Das Pellet wurde in Puffer A [20 mM Hepes (pH 6,5), 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,25 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,1 M KCl, 5% Glycerin, 0,1% NP40, 0,1% Triton X-100; alle Reagenzien von Sigma] resuspendiert und dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen. Aus 0,5 kg Leber wurden ungefähr 40 g Zytosolextrakt erhalten.
  • Ein rohes Zellkernpellet, wie in den vorherigen Beispielen hergestellt, wurde resuspendiert und in Puffer Y [20 mM Hepes (pH 7,5), 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 25% Glycerin] homogenisiert. Das Homogenisat wurde in einer J2-21 M-Zentrifuge (Beckman) bei 10.000 U/Min. für 1,5 Stunden zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 70%-iger Ammoniumsulfatlösung präzipitiert. Das Pellet wurde in Puffer A resuspendiert und dialysiert. Die gesamte dsRNase-Aktivität wurde im Präzipitat aus 70%-iger Ammoniumsulfatlösung wiedergewonnen. Aus 0,5 kg Leber wurden ungefähr 5 g Zellkernextrakt erhalten.
  • Dann wurde eine Ionenaustauschchromatographie durchgeführt, um die dsRNasen der Erfindung weiter zu reinigen. Die Zellkern- und Zytosolextrakte in Puffer A wurden auf Hi-Trap-Säulen (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) zur FPLC geladen. Die Extrakte wurden mit einem linearen Gradienten von NaCl eluiert und es wurden Proben genommen. Es wurde die UV-Absorption bei 257 nm der Proben bestimmt. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 8000 g zentrifugiert, in Puffer A resuspendiert, in Ultrafree-15-Zentrifugalfiltergeräten (Millipore, Bedford, MA, USA) eingeengt und auf Aktivität analysiert. Die dsRNase-Aktivität eluierte in Fraktionen, die 300–450 mM NaCl entsprachen. Im Gegensatz dazu eluierte die dsRNase-Aktivität im Zellkernextrakt bei 700–800 mM NaCl.
  • Fraktionen aus der Ionenaustauschchromatographie wurden eingeengt und einer Größenausschlusschromatographie unterzogen. Aktive Proben aus der Ionenaustauschchromatographie wurden gesammelt, auf eine TSK G-3000-Säule (TosoHaas, Mongomeryville, PA, USA) aufgetragen und mit Puffer A, der 100 mM NaCl enthielt, laufen gelassen. Proben (200 bis 400 μl) wurden gepoolt und es wurde ihre UV-Absorption bei 257 nm bestimmt. Die Proben wurden unter Anwendung von Ultrafree-15-Zentrifugalfiltergeräten (Millipore) eingeengt und dann auf Aktivität analysiert.
  • 6 zeigt eine elektrophoretische Analyse mit Polyacrylamid-Gel der eingeengten aktiven Fraktionen nach der Ionenaustauschchromatographie und der Fraktionen aus der Größenausschlusschromatographie. Die Fraktion mit der höchsten dsRNase-Aktivität (Spur 4, 6) wies einen Molekulargewichtsbereich von etwa 50 bis etwa 80 Kilodalton auf und ein Band bei ungefähr 50 Kilodalton schien bei Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) mit 12%-igem Gel, die unter Verwendung von Precast-Gelen (Novex, San Diego, CA, USA) durchgeführt wurde, verstärkt zu sein.
  • Tabelle 2 liefert eine Zusammenfassung der Reinigung und Wiedergewinnung von dsRNase-Aktivitäten aus Zytosol- und Zellkernextrakten aus Leber.
  • TABELLE 2 5 Zusammenfassung der Reinigung von dsRNasen aus Rattenleberhomogenisaten
    Figure 00950001
  • Eine Einheit ist als die Menge an Probe definiert, die zum Verdau von 10 fmol dsRNA-Doppelstrang in 15 Minuten bei 37°C unter den hierin beschriebenen Bedingungen erforderlich ist.
  • Die Reinigung der dsRNase-Aktivitäten aus Leberzellkernen und -zytosol legt nahe, dass mindestens zwei dsRNasen mit unterschiedlichen Eigenschaften doppelsträngige RNA spalten können. Die nukleare dsRNase eluierte bei höheren NaCl-Konzentrationen aus der Ionenaustauschsäule als die zytosolische dsRNase. Beide erforderten jedoch Mg++ und spalten an mehreren Orten im Oligoribonukleotid-Gap. Beide bedingen ein Doppelstrangsubstrat und können Oligoribonukleotide in einem Doppelstrang spalten, der aus einem Oligoribonukleotid-„Sense"- und einem chimären 2'-Methoxyphosphorthioat-„Antisense"-Strang besteht, wenn der Doppelstrang Phosphorthioat- oder Phosphorthioat-2'-methoxynukleodid-Schenkel aufweist.
  • Nachdem mittels der oben beschriebenen Verfahren (1) ein reproduzierbares und aktivitätsspezifisches Assay für die dsRNasen der Erfindung etabliert, (2) mehrere Quellen dieser bestimmt und (3) ein angemessener Grad an Reinigung dieser erzielt wurde, werden die dsRNasen durch eine Vielfalt von Mitteln weiter gereinigt. In allen Beispielen wird die Verwendung von organischen Lösungsmitteln vermieden, da die dsRNasen der Erfindung in Acetonitril oder Methanol instabil sind (siehe unten), und die hierin beschriebenen Assays werden zum Beurteilen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der gewünschten dsRNase in einer Probe verwendet. Weitere Reinigungsschritte können unter anderem die folgenden Mittel beinhalten.
  • Mehrere Arten von Heparin-Säulen sind zum Reinigen einer Vielfalt von Ribonukleasen verwendet worden. Sepharose-Säulen sind beispielsweise bei der Reinigung einer sequenzspezifischen Ribonuklease aus Oozyten von Rana catesbeiana (Ochsenfrosch) (Liao, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 1371), einer Ribonuklease aus Xenopus laevis-Oozyten (Nitta et al., Biol. Pharm. Bull. (Jpn.), 1993, 16, 353), von mehreren Ribonukleasen aus dem thermophilen Archaebakterium Sulfobus solfataricus (Fusi et al., Eur: J. Biochem., 1993, 211, 305) und einer Ribonuklease aus menschlicher Milz (Yasuda et al., Eur. J. Biochem., 1990, 191, 523) eingesetzt worden.
  • Bei hydrophober Interaktionschromatographie handelt es sich um ein leistungsstarkes Mittel zur Proteinreinigung, das von starken aussalzenden Salzen zum Verstärken der hydrophoben Interaktionen zwischen dem gewünschten Protein und einem Liganden dafür abhängt (Narhi et al., Anal. Biochem., 1989, 182, 266). Hydrophobe Interaktionssäulen (hydrophobic interaction columns, HICs) sind zum Reinigen von Ribonuklease A von unerwünschten Kontaminanten verwendet worden (Wu et al., Methods in Enzymology, 1996, 270, 27; Wettlaufer et al., J. Chromatography, 1986, 359, 55).
  • Die dsRNasen der Erfindung können auch mittels Hydroxyapatit-Chromatographie weiter gereinigt werden (Kennedy, Methods in Enzymology, 1990, 182, 339). Endoribonuklease und Exoribonuklease sind unter Anwendung von Hydroxyapatit-Chromatographie aus Trypanosoma brucei gereinigt worden (Gbenle, Exp. Parasitol., 1990, 71, 432; Gbenle, Mol. Biochem. Parasitol., 1985, 15, 37).
  • RNA-Affinitätssäulen können ebenfalls zum weiteren Reinigen der dsRNasen der Erfindung verwendet werden. Insbesondere kann eine im Handel erhältliche Affinitätssäule für doppelsträngige RNA (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) verwendet werden. Alternativ dazu wird eine Säule erstellt, bei der deren Matrix eines oder mehrere der dsRNase-Substrate der Erfindung umfasst (siehe das folgende Beispiel für Einzelheiten). Aufgrund der relativen Sequenzspezifität der dsRNase der vorliegenden Erfindung kann die letztere Art von Affinitätssäule bevorzugt sein. Um den Abbau der Matrix bei jeder Art von Affinitätsmatrix für doppelsträngige RNA zu verhindern, werden Proben, die die dsRNasen der Erfindung umfassen, so behandelt, dass die Abbaukapazität der dsRNase eingeschränkt wird, ohne deren Fähigkeit zum Binden des doppelsträngigen RNA-Substrats der Matrix erheblich zu verändern. Die Abbauaktivität der dsRNase der Erfindung wird beispielsweise in Lösungen inhibiert, denen es aufgrund beispielsweise der Zugabe von Chelatbildnern, wie beispielsweise EDTA, an verfügbarem Mg++ fehlt, oder durch Zugabe von NaCl zu einer Probe, die derartige dsRNasen enthält, auf eine Endkonzentration von mindestens 300 mM (siehe den folgenden Unterabschnitt).
  • Fachmänner werden erkennen, dass die obigen Mittel sowie andere, hierin nicht beschriebene für eine optimale Effizienz beim Reinigen der dsRNasen der Erfindung optimiert werden müssen. Die Auswahl eines oder mehrerer der obigen Mittel als einem weiteren Reinigungsschritt und der Reihenfolge, in der solche Mittel angewendet werden, beispielsweise wird den Reinheitsgrad und die spezifische Aktivität der so behandelten dsRNase beeinflussen. Es wird jedoch angenommen, dass eine derartige Optimierung im Fachkönnen der Technik liegt, angesichts dessen, dass die hierin beschriebenen Assays von einem qualifizierten Techniker problemlos eingesetzt werden können, um die Auswirkung weiterer Reinigungsschritte auf die Aktivität der gewünschten dsRNase zu bestimmen. Andere in der Technik bekannte Techniken, wie beispielsweise SDS-PAGE, können zum Bestimmen der Reinheit von Proben, die den obigen Reinigungsmitteln unterzogen wurden, verwendet werden.
  • BEISPIEL 27-c
  • Charakterisierung von gereinigten dsRNasen eines Säugers
  • Die Auswirkungen verschiedener Bedingungen auf die dsRNase-Aktivität wurden unter Verwendung der aktiven Fraktionen nach Ionenaustauschchromatographie beurteilt. Die dsRNase-Aktivität war in Tris- oder Phosphatpuffern von etwa pH 7 bis etwa pH 10 beweisbar. Die dsRNase-Aktivität war in Lösung in Acetonitril oder Methanol nicht stabil. Darüber hinaus wurde die Aktivität von NaCl inhibiert; die dsRNase-Aktivität wurde bei 10 mM NaCl um 30%, bei 100 mM NaCl um > 60 und bei 300 mM NaCl um 100% inhibiert. Erhitzen für fünf Minuten bei 60°C, 80°C oder 100°C inaktivierte die dsRNase. Eine optimale Aktivität wurde im Temperaturbereich von etwa 37°C bis etwa 42°C beobachtet. Bei 25°C betrug die dsRNase-Aktivität 50% der bei 37°C beobachteten. Die dsRNase-Aktivität wurde bei 10, 20 und 50 mM EDTA, jedoch nicht bei 5 mM inhibiert, in Übereinstimmung mit ihrer Erfordernis von Mg++, und war gegenüber mehreren Einfrier-/Auftauvorgängen stabil.
  • BEISPIEL 28
  • Weitere Charakterisierung des dsRNase-Spaltungsorts unter Verwendung von gereinigter Ratten-dsRNase
  • Die gereinigten dsRNasen wurden zum Charakterisieren des Orts der Spaltung in mehr Einzelheiten verwendet. Weil es erforderlich war, ein Auftreten einer einzelsträngigen Spaltung nach der Endonukleasespaltung und während der Verarbeitung, insbesondere nach Denaturieren des Doppelstrangs, zu minimieren. Demzufolge wurde das stabilste Doppelstrangsubstrat, d. h. eines, in dem beide Stränge des Doppelstrangs Flankenregionen enthielten, die sich aus 2'-Methoxynukleosiden und Phosphorthioatverknüpfungen zusammensetzten, verwendet.
  • BEISPIEL 28-a
  • Markieren von Oligonukleotiden mit 32P
  • Das Sense-Oligonukleotid wurde mit 32P unter Verwendung von [g32P]ATP, T4-Polynukleotidkinase und Standardvorgehensweisen (Ausubel et al., 1989) 5'-endmarkiert. Das markierte Oligonukleotid wurde mittels Elektrophorese auf 12%-igem denaturierendem PAGE gereinigt (Sambrook et al., 1989). Die spezifische Aktivität des markierten Oligonukleotids betrug ungefähr 5000 cpm/fmol.
  • BEISPIEL 28-b
  • Assay des Verdaus doppelsträngiger RNA
  • Oligonukleotiddoppelstränge wurden in 30 μl Reaktionspuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0,1 mM DTT] hergestellt, die 10 nM Antisense-Oligonukleotid und 105 cpm mit 32P markiertes Sense-Oligonukleotid enthielten. Die Reaktionsgemische wurden 5 Min. lang bei 90°C erhitzt und 2 h bei 37°C inkubiert. Die Oligonukleotiddoppelstränge wurden in entweder ungereinigten oder zur Hälfte gereinigten Zellextrakten bei einer Gesamtproteinkonzentration von 75 μg ungereinigtem Zytosolextrakt, 60 μg ungereinigtem Zellkernextrakt, 5 μg durch Ionenaustausch gereinigter Zytosolfraktion, 5 μg durch Ionenaustausch gereinigter Zellkernfraktion oder 0,5 μg durch Ionenaustausch und Gelfiltration gereinigter Zellkernfraktion inkubiert. Die Verdaureaktionsgemische wurden für 0–240 Min. bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 10 μl jedes Reaktionsgemischs entfernt und es wurde durch Zugabe von denaturierendem Gel-Ladepuffer [5 μl 8 M Harnstoff, 0,25% Xylolcyanol FF, 0,25% Bromphenolblau] gequencht. Die Reaktionsgemische wurden für 5 Min. bei 95°C erhitzt und in einem 12%-igen denaturierenden Polyacrylamid-Gel getrennt. Das verbleibende Aliquot wurde in 2 μl nativem Gel-Ladepuffer [Glycerin, 0,25% Xylolcyanol FF] gequencht. Die Reaktionsgemische wurden bei 10°C in einem 12%-igen nativen Polyacrylamid-Gel, das 44 mM Tris-Borat und 1 mM MgCl2 enthielt, getrennt. Die Gele wurden unter Verwendung eines Phosphorlmager von Molecular Dynamics analysiert.
  • 7 zeigt die Ergebnisse mit nativem Gel auf. Spur 1 zeigt die Stellung, an der der unbehandelte, mit 32P markierte Sense-Strang in das native Gel migrierte, und Spur 2 zeigt die mit 0,02 Einheiten RNase V1 behandelte „Sense"-Strang-RNA. In den verbleibenden Spuren sind die Ergebnisse der Behandlung von dsRNase-Substraten mit 0,02 (Spur 3) und 0,002 (Spur 4) Einheiten RNase V1, ungereinigtem Zellkernextrakt für 0 Minuten (Spur 5) oder 240 Minuten (Spur 6), ungereinigtem Zellkernextrakt für 240 Minuten ohne Mg++ (Spur 7), ungereinigtem Zytosolextrakt für 240 Minuten (Spur 8), durch Ionenaustausch gereinigtem Zytosolextrakt für 240 Minuten bei Vorhandensein (Spur 9) oder Abwesenheit (Spur 10) von Mg++ und durch Ionenaustausch/Gelfiltration gereinigtem Zytosolextrakt für 240 Minuten bei Vorhandensein (Spur 11) oder Abwesenheit (Spur 12) von Mg++ gezeigt.
  • 8 zeigt die Ergebnisse einer Analyse von Produkten des Verdaus von dsRNase-Substraten mittels Elektrophorese mit denaturierendem Polyacrylamid-Gel. Spur 1 zeigt mit 5 × 10–3 Einheiten RNase A behandelte „Sense"-Strang-RNA und Spur 2 zeigt mit 0,02 Einheiten RNase V1 behandelte „Sense"-Strang-RNA. Die verbleibenden Spuren zeigen dsRNase-Produkte, behandelt mit 0,02 (Spur 3) und 0,002 (Spur 4) Einheiten RNase V1, mit ungereinigtem Zellkernextrakt für 0 Minuten (Spur 5) oder 240 Minuten (Spur 6), mit ungereinigtem Zytosolextrakt für 240 Minuten (Spur 7), mit durch Ionenaustausch gereinigtem Zytosolextrakt für 240 Minuten (Spur 8) und mit durch Ionenaustausch/Gelfiltration gereinigtem Zytosolextrakt für 240 Minuten (Spur 9). Spur 10 ist eine RNA-Basenhydrolyseleiter, die aus Bemessungsgründen eingebunden wurde. Der Verdau des einzelsträngigen Substrats mit RNase V1 resultierte in wenig Abbau (Spur 2). Der Verdau des Doppelstrangs mit RNase V1 resultierte in Abbauprodukten, was die Spaltung an mehreren Orten im Gap reflektiert (Spuren 3 und 4). In den Spuren 4–9 beweist die Bande an der Oberseite des Gels, dass selbst nach Denaturierung ein Teil des Doppelstrangs verschmolzen blieb, was die sehr hohe Affinität von Doppelsträngen, die sich aus 2'-Methoxynukleosiden zusammensetzen, reflektiert. Die Spuren 6–9 zeigen, dass sowohl die nuklearen als auch die zytosolischen Ribonukleasen das Triplexsubstrat an mehreren Orten im Oligoribonukleotid-Gap spalteten und dass die Abbauorte sich von denen von RNase V1 unterschieden. Die Stellung der Abbauprodukte in den Spuren 6–9 ist mit denen, bei denen es sich um die 2'-Methoxyphosphorthioat-Flankenregionen (Schenkel) handelt, konsistent.
  • BEISPIEL 29
  • RNA-Affinitätssäulen und Verfahren zum Reinigen von Ribonukleasen
  • Techniken zur Herstellung von Nukleinsäure-Affinitätssäulen sind in der Technik bekannt (siehe z. B. Kadonaga, Methods in Enzymology, 1991, 208, 10). Derartige Affinitätssäulen umfassen eine Matrix, die ein Nukleinsäuresubstrat für eine gewünschte Verbindung umfasst, die das Substrat entweder unspezifisch oder auf sequenzspezifische Weise bindet. Anfangs bei der Reinigung von DNA-bindenden Proteinen verwendet, sind RNA-Affinitätssäulen auch eingesetzt worden, um RNA- bindende Proteine und Ribonukleasen zu reinigen (siehe z. B. Prokipcak et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 9261; Dake et al., J. Biol. Chem., 1988, 263, 7691). Eine Matrix, die ein oder mehrere dsRNase-Substrate der Erfindung umfasst, hat den Vorteil, dass sie ein dsRNA-Substrat bereitstellt, das gegenüber der Aktion einzelsträngiger Ribonuklease resistent ist, die in vielen Geweben und Zellen vorherrschend ist. Eine solche Matrix umfasst außerdem einen geeigneten festen Träger und einen Verknüpfer, der eine Brücke zwischen dem festen Träger und dem dsRNase-Substrat bzw. den dsRNase-Substraten bereitstellt.
  • Geeignete feste Träger beinhalten unter anderem Pfropfpolymere (US-Patentschrift 4,908,405 an Bayer und Rapp); Polyacrylamid (Fahy et al., Nucl. Acids Res., 1993, 21, 1819); Polyacrylmorpholid, Polystyrol und derivatisierte Polystyrolharze (Syvanen et al., Nucl. Acids Res., 1988, 16, 11327; US-Patentschriften 4,373,071 und 4,401,796 an Itakura), einschließlich Aminomethylstyrolharzen (US-Patentschrift 4,507,433 an Miller und Ts'O); Copolymere von N-Vinylpyrrolidon und Vinylacetat (Selinger et al., Tetrahedron Letts., 1973, 31, 2911; Selinger et al., Die Makromolekulare Chemie, 1975, 176, 609; und Selinger et al., Die Makromolekulare Chemie, 1975, 176, 1611); TEFLONTM (Lohrmann et al., DNA, 1984, 3, 122; Duncan et al., Anal. Biochem., 1988, 169, 104); Glas von kontrollierter Porengröße (controlled pore glass, CPG) (Chow et al., Anal. Biochem., 1988, 175, 63); Polysaccharid-Träger, wie beispielsweise Agarose (Kadonaga, Methods Enzymol., 1991, 208, 10; Arndt-Jovin et al., Eur. J. Biochem., 1975, 54, 411; Wu et al., Science, 1987, 238, 1247; Blank et al., Nucleic Acids Res., 1988, 16, 10283) oder Cellulose (Goldkorn et al., Nucl. Acids Res., 1986, 14, 9171; Alberts et al., Meth. Enzymol., 1971, 21, 198) oder Derivate davon, z. B. DEAE-Cellulose (Schott, J. Chromatogr., 1975, 115, 461) oder Phosphocellulose (Siddell, Eur. J. Biochem., 1978, 92, 621; Bunemann et al., Nucl. Acids Res., 1982, 10, 7163; Noyes et al., Cell, 1975, 5, 301; Bunemann et al., Nucl. Acids Res., 1982, 10, 7181); Dextransulfat (Gingeras et al., Nucl. Acids Res., 1987, 15, 5373); Polypropylen (Matson et al., Anal. Biochem., 1994, 217, 306); Agarosekügelchen (Kadonaga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 5889); Latexteilchen (Kawaguchi et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17, 6229); Nylonkügelchen (Van Ness et al., Nucl. Acids Res., 1991, 19, 3345); paramagnetische Kügelchen (Gabrielson et al., Nucl. Acids Res., 1989, 17, 6253; Lund et al., Nucl. Acids Res., 1988, 16, 10861; Day et al., Biochem. J., 1991, 278, 735); Kieselgele (Yashima et al., J. Chromatogr., 1992, 603, 111); derivatisierte Formen von Kieselgelen, Polytetrafluorethylen, Cellulose oder metallischen Oxiden (US-Patentschrift 4,812,512 an Buendia) und in der Technik anerkannte Äquivalente eines beliebigen der vorhergehenden festen Träger; Mikrotiterplatten (Drmanac et al., Science, 1993, 260, 1649); vernetzte Copolymere von N-Vinylpyrrolidon, anderen N-Vinyllactam-Monomeren und einem ethylenisch ungesättigten Monomer mit mindestens einer Amin- oder aminersetzbaren Funktionalität, wie in der US-Patentschrift 5,391,667 offenbart. In einem Satz von bevorzugten Ausführungsformen werden CPG-Kügelchen (CPG = controlled pore glass, Glas von kontrollierter Porengröße) aus Polystyrol oder langkettigem Alkyl eingesetzt. In einem anderen Satz von bevorzugten Ausführungsformen werden Mikroskop-Glasobjektträger eingesetzt (Fodor et al., Science, 1991, 251, 767; Maskos et al., Nucleic Acids Research, 1992, 20, 1679; Guo et al., 1994, 22, 5456; Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1994, 91, 5022).
  • Im Hinblick auf den Verknüpfer kann eine Vielfalt von chemischen Verknüpfungsgruppen oder -ketten in den Matrizen der Erfindung eingesetzt werden. Eine beliebige chemische Gruppe oder Kette, die eine chemische Verknüpfung zwischen dem festen Träger und dem dsRNase-Substrat bilden kann, kann eingesetzt werden. Ein geeigneter Verknüpfer weist das bevorzugte Charakteristikum der Nichtreaktivität mit während der verschiedenen Schritte der Oligonukleotidsynthese eingeführten Verbindungen auf. Fachmänner werden verstehen, dass die chemische Zusammensetzung des festen Trägers und des dsRNase-Substrats die Auswahl des Verknüpfers beeinflussen wird. Viele geeignete Verknüpfer werden eine primäre Amingruppe an einem oder beiden Termini aufweisen, da in der Technik viele chemische Reaktionen zum Verknüpfen primärer Amingruppe mit einer Vielfalt von anderen chemischen Gruppen bekannt sind; andere am Terminus reaktive Moleküleinheiten sind jedoch bekannt und können in der Erfindung verwendet werden. Geeignete Verknüpfer beinhalten unter anderem Verknüpfer mit einer Thiolgruppe am Terminus zum Einbringen einer Disulfidverknüpfung an den festen Träger (Day et al., Biochem. J., 1991, 278, 735; Zuckermann et al., 1987, Nucl. Acids Res., 15, 5305); Verknüpfer mit einer Bromacetylgruppe am Terminus zum Einbringen einer Thiol-Bromacetylverknüpfung an den festen Träger (Fahy et al., Nucl. Acids Res., 1993, 21, 1819); Verknüpfer mit einer Aminogruppe am Terminus, die mit einem 5'-aktivierten Phosphat eines Oligonukleotids umgesetzt werden kann (Takeda et al., Tetrahedron Letts., 1983, 24, 245; Smith et al., Nucl. Acids Res., 1985, 13, 2399; Zarytova et al., Anal. Biochem., 1990, 188, 214); Poly(ethylenimin) (Van Ness et al., Nucl. Acids Res., 1991, 19, 3345); Acylketten (Akashi et al., Chem. Lett., 1988, 1093; Yashima et al., J. Chromatogr., 1992, 603, 111); Polyvinylalkohol (Schott, J. Chromatogr., 1975, 115, 461); Alkylketten (Goss et al., J. Chromatogr., 1990, 508, 279); Alkylaminketten (Pon et al., BioTechniques, 1988, 6, 768); Biotin-Avidin- oder Biotin-Streptavidin-Verknüpfungen (Kasher et al., Mol. Cell. Biol., 1986, 6, 3117; Chodosh et al., Mol. Cell. Biol., 1986, 6, 4723; Fishell of al., Methods Enzymol., 1990, 184, 328) und in der Technik anerkannte Äquivalente eines beliebigen der vorhergehenden Verknüpfer. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Verknüpfer um eine n-Aminoalkylkette. Verfahren zur Bestimmung einer geeigneten (d. h. den optimalen Grad und die optimale Spezifität der Hybridisierung zwischen der Sensoranordnung und dem Ziel-Oligonukleotid bereitstellenden) Verknüpferlänge sind in der Technik bekannt (siehe z. B. Day et al., Biochem. J., 1991, 278, 735).
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 01040001
  • Figure 01050001
  • Figure 01060001

Claims (48)

  1. Synthetische oligomere Verbindung, welche spezifisch hybridisierbar mit einem vorgewählten RNA-Ziel ist und umfasst: (a) ein erstes Segment, das wenigstens eine Ribofuranosylnucleosiduntereinheit hat, welche modifiziert ist, um wenigstens eines zu verbessern aus: pharmakokinetischer Bindung, Absorption, Verteilungs- oder Freisetzungseigenschaften der Verbindung; Affinität oder Spezifität der Verbindung zu der Ziel-RNA; oder Modifizieren der Ladung der Verbindung, verglichen mit der unmodifizierten Verbindung; und (b) ein zweites Segment, das wenigstens vier aufeinander folgende Ribofuranosylnucleosiduntereinheiten hat, welche daran 2'-Hydroxyeinheiten haben; dadurch gekennzeichnet, dass (i) die Nucleosiduntereinheiten der Oligomerverbindung durch Internucleosidvernetzungen verknüpft sind, die gegenüber Abbau verglichen zu Phosphodiestervernetzungen stabil sind; und (ii) diese wenigstens eine modifizierte Ribofuranosylnucleosiduntereinheiten an einem der beiden 3'- oder 5'-Enden der oligomeren Verbindung angeordnet sind.
  2. Synthetische oligomere Verbindung nach Anspruch 1, worin das erste Segment wenigstens eine Ribofuranosylnucleosiduntereinheit hat, welche modifiziert ist, um die Bindungsaffinität der Verbindung an das vorgewählte RNA-Ziel zu verbessern, verglichen mit der Bindungsaffinität eines unmodifizierten Oligoribonukleotids an das RNA-Ziel.
  3. Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, weiterhin umfassend ein drittes Segment, das wenigstens eine Ribofuranosylnucleosiduntereinheit umfasst, welche modifiziert ist, um die Bindungsaffinität der Verbindung an das vorgewählte RNA-Ziel zu verbessern, verglichen mit der Bindungsaffinität eines unmodifizierten Oligoribonukleotids an das RNA-Ziel.
  4. Oligomere Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das erste und dritte Segment wenigstens eine 2'-O-C1-20-Alkyl-, 2'-O-substituierte C1-20-Alkyl- oder 2'-Fluoromodifizierte Ribofuranosylnucleosiduntereinheit umfasst, wobei die Substitution an dem Alkyl Amino, Hydroxy oder C1-10-Alkylether ist
  5. Oligomere Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche, wenn mit dem RNA-Ziel hybridisiert, in der Lage ist, ein doppelsträngiges RNAse-Enzym zu aktivieren, um die Spaltung des RNA-Ziels zu bewirken.
  6. Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, worin das zweite Segment zwischen dem ersten und dem dritten Segmenten positioniert ist.
  7. Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, worin jedes der ersten und dritten Segmente wenigstens drei Untereinheiten umfasst.
  8. Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, worin das zweite Segment 4 bis 12 Nukleosiduntereinheiten umfasst.
  9. Oligomere Verbindung nach Anspruch 8, worin das zweite Segment 5 bis 9 Nukleosiduntereinheiten umfasst.
  10. Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 9, worin das zweite Segment wenigstens fünf Untereinheiten hat und das erste und dritte Segment jedes wenigstens drei Untereinheiten haben.
  11. Oligomere Verbindung nach Anspruch 10, worin das zweite Segment wenigstens 7 Nukleosiduntereinheiten hat.
  12. Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 11, worin jede der Ribofuranosyl-Nukleosiduntereinheiten von den ersten und den dritten Segmenten modifiziert ist, um zu umfassen 2'-O-C1-20-Alkyl, 2'-O-substituiertes C1-20-Alkyl oder 2'-Fluor, und worin die Substitution des Alkyls Amino, Hydroxy oder C1-10 Alkylether ist.
  13. Oligomere Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin wenigstens zwei der Nukleosiduntereinheiten verbunden sind durch eine Phosphorthioat-, 3'-Deoxy-3'-Thiophosphorthioat-, 5'-Deoxy-5'-Thiophosphorthioat-, Phosphordithioat-, Phosphorselenat-, 3'-Deoxyphosphinat-, 5'-Deoxyphosphinat-, Boranphosphat-, 3'-Deoxy-3'Aminophosphoramidat-, 5'-Deoxy-5'-Aminophosphoramidat-, Hydrogenphosphat-, Boranphosphatester-, Phosphoramidat-, Alkylphosphonat-, Arylphosphonat- oder Phosphortriesterverknüpfung.
  14. Oligomere Verbindung nach Anspruch 13, worin jede der Nukleosiduntereinheiten des ersten Segments verbunden sind durch Phosphorthioat, 3'-Deoxy-3'-Thiophosphorthioat-, 5'-Deoxy-5'-Thiophosphorthioat-, Phosphordithioat-, Phosphorselenat-, 3'-Deoxyphosphinat-, 5'-Deoxyphosphinat-, Boranphosphat-, 3'-Deoxy-3'Aminophosphoramidat-, 5'-Deoxy-5'-Aminophosphoramidat-, Hydrogenphosphat-, Boranphosphatester-, Phosphoramidat-, Alkylphosphonat-, Arylphosphonat- oder Phosphortriesterverknüpfungen.
  15. Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 11, worin jede der Nukleosiduntereinheiten des dritten Segments verbunden sind durch Phosphorthioat-, 3'-Deoxy-3'-Thiophosphorthioat-, 5'-Deoxy-5'- Thiophosphorthioat-, Phosphordithioat-, Phosphorselenat-, 3'-Deoxyphosphinat-, 5'-Deoxyphosphinat-, Boranphosphat-, 3'-Deoxy-3'Aminophosphoramidat-, 5'-Deoxy-5'-Aminophosphoramidat-, Hydrogenphosphat-, Boranphosphatester-, Phosphoramidat-, Alkylphosphonat-, Arylphosphonat- oder Phosphortriesterverknüpfungen.
  16. Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 11, worin jede der Nukleosiduntereinheiten des ersten und dritten Segments verknüpft wird durch Carbonat-, Carbamat-, Silyl-, Schwefel-, Sulfonat-, Sulfonamid-, Formacetal-, Thioformacetal-, Oxim-, Methylenimino-, Methylenmethylimino-, Methylenhydrazo-, Methylendimethylhydrazo- oder Methylenoxymethyliminooder Methylencarbonylaminoverknüpfungen.
  17. Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, worin jede der Nukleosiduntereinheiten des ersten oder des dritten Segments verbunden sind durch Phosphothionatverknüpfungen.
  18. Synthetische oligomere Verbindung nach Anspruch 3, worin die Verbindung wenigstens zwölf Ribofuranosylnucleoside in einer Sequenz umfasst und die Nukleosiduntereinheiten durch Internukleosidbindungen verknüpft sind, welche gegenüber Abbau verglichen mit Phosphodiesterbindungen stabiler sind.
  19. Oligomere Verbindung nach Anspruch 18, worin der Zwischenteil wenigstens fünf aufeinander folgende Ribonucleosiduntereinheiten hat.
  20. Synthetische Oligomere Verbindung nach Anspruch 1, worin: das erste Segment eine Vielzahl von 2'-O-Alkyl-Nukleosiduntereinheiten umfasst; das zweite Segment wenigstens vier aufeinanderfolgende 2'-Hydroxyl-Ruibonukleosid-Unterheinheiten umfasst; worin die Verbindung zusätzlich umfasst, ein drittes Segment mit einer Vielzahl von 2'-O-Alkylnukleosiduntereinheiten, wobei die Nukleosiduntereinheiten des Oligomers durch Phosphorthionat-Internukleosidverknüpfungen verbunden sind.
  21. Oligomere Verbindung nach Anspruch 20, worin das zweite Segment wenigstens fünf aufeinander folgende 2'-Hydroxylribonukleosiduntereinheiten hat.
  22. Synthetische oligomere Verbindung nach Anspruch 1, worin das erste Segment wenigstens eine Surrogat-Nukleosiduntereinheit hat und die Nukleosiduntereinheiten der oligomeren Verbindungen verbunden sind durch Internukleosidverknüpfungen, die stabil gegenüber Abbau verglichen mit Phosphodiesterbindungen sind.
  23. Oligomere Verbindung nach Anspruch 22, worin die Surrogatnukleosiduntereinheit eine Peptidnukleinsäureuntereinheit, eine Morpholinonukleosiduntereinheit, ein Cyclobutylnueklosid oder ein Pyrrolidinnukleosid ist.
  24. Synthetische oligomere Verbindung nach Anspruch 23, worin das erste Segment wenigstens zwei Nukleosiduntereinheiten einschließt; wobei die Nukleosiduntereinheiten des ersten Segments verknüpft sind zu Phosphorinternukleosidverknüpfungen.
  25. Synthetische oligomere Verbindung nach Anspruch 24, worin das erste Segment wenigstens drei Nukleosiduntereinheiten umfasst.
  26. Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 24 oder 25, worin die nicht-Phosphorverknpüfungen Carbonat-, Carbamat-, Silyl-, Schwefel-, Sulfonat-, Sulfonamid-, Formacetal-, Thioformacetal-, Oxim-, Methylenimino-, Methylenmethylimino-, Methylenhydrazo-, Methylendimethylhydrazo- oder Methylenoxymethylimino-, Methylenkarbonylaminointernukleosidverknüpfungen sind.
  27. Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 24 oder 25, worin die Nukleosideinheiten des ersten Segments durch Phosphothioat-Internukleosidverknüpfungen verknüpft sind.
  28. Synthetische oligomere Verbindung nach Anspruch 24, worin die Nukleosiduntereinheiten des ersten Segments durch 3'-Deoxy-3'-Thio-Phosphorthioat-, 5'-Deoxy-5'-Thiophosphorthioat-, Phosphordithioat-, Phosphorselenat-, 3'-Deoxyphosphinat-, 5'-Deoxyphosphinat-, Boranphosphat-, 3'-Deoxy-3'Aminophosphoramidat-, 5'-Deoxy-5'-Aminophosphoramidat-, Hydrogenphosphat-, Boranphosphatester-, Phosphoramidat-, Alkylphosphonat-, Arylphosphonat- oder Phosphortriesterverknüpfungen verbunden sind.
  29. Oligomere Verbindung nach Anspruch 28, einschließend ein drittes Segment von wenigstens zwei Nukleosiduntereinheiten, wobei die Nukleosiduntereinheiten des dritten Segments durch 3'-Deoxy-3'-Thiophosphorthioat-, 5'-Deoxy-5'-Thiophosphorthioat-, Phosphordithioat-, Phosphorselenat-, 3'-Deoxyphosphinat-, 5'-Deoxyphosphinat-, Boranphosphat-, 3'-Deoxy-3'Aminophosphoramidat-, 5'-Deoxy-5'-Aminophosphoramidat-, Hydrogenphosphat-, Boranphosphatester-, Phosphoramidat-, Alkylphosphonat-, Arylphosphonat- oder Phosphortriesterverknüpfungen verbunden sind.
  30. Oligomere Verbindung nach Anspruch 28, worin die Nukleosiduntereinheiten der ersten und dritten Segmente verknüpft sind durch Phosphordithioat-, Phosphorselenat-, 3-Deoxyphosphinat-, 3'-Deoxy-3'-Aminophosphoramidat-, Phosphoramidat-, Alkylphosphonat-, Arylphosphonat- oder Phosphotriesterphosphatverknüpfungen.
  31. Synthetische oligomere Verbindung nach Anspruch 1, worin das erste Segment wenigstens eine Ribofuranosylnucleosiduntereinheit hat, welche kein DNA- oder RNA-Hauptbestandteilnukleosid ist; und wobei die Nukleosiduntereinheiten der oligomeren Verbindung durch Internukleosidverknüpfungen verbunden sind, welche modifiziert sind, um die Verknüpfungen gegenüber Abbau verglichen mit Phosphodiesterverbindungen zu stabilisieren.
  32. Verbindung nach Anspruch 31, worin die erste Segment-Nukleosiduntereinheit gewählt ist aus Nukleosiden mit Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Alkylderviate von Adenin und Guanin, 2-Alkylderivate von Adenin und Guanin, 7-Alkylderviate von Adenin und Guanin, 5-Halgen-Uracil und Cytosin, 5-Propynyluracil und Cytosin, 6-Azouracil, Cytosin und Thymin, 5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 2-Thiouracil und Cytosin, 8-Halgen, Amino, Thiol, Thialkyl, Hydroxyladenin und -guanin und 5-Trifluormethyluracil und Cytosin und deren heterozyklischer Base.
  33. Synthetische oligomere Verbindung nach Anspruch 31, worin das erste Segment wenigstens eine Ribofuranosylnucleosiduntereinheit hat, die die Nukleosid-Gruppe ausschließt, welche besteht aus Adenosin, 2-Deoxyadenosin, Guanosin, 2'-Deoxyguanosin, Cytidin, 2'-Deoxyzytidin, Uridin und 2'-Deoxythymidin.
  34. Synthetische oligomere Verbindung nach Anspruch 1, worin das erste Segment eine Vielzahl von 2'-O-Alkylnucleosiduntereinheiten hat, die durch Phosphothionat-Internukleosidverknüpfungen verbunden sind; und die Untereinheiten des zweiten Segments verbunden sind durch Phosphorthioat-Internukleosidverknüpfungen oder Phosphodiester-Internukleosidverknüpfungen.
  35. Synthetische oligomere Verbindung nach Anspruch 34, zusätzlich umfassend ein drittes Segment mit einer Vielzahl von 2'-O-Alkylnukleosiduntereinheiten, die durch Phosphorthioat-Internukleosidverknüpfungen verbunden sind.
  36. Verbindung nach Anspruch 35, worin das zweite Segment der oligomeren Verbindung zwischen dem ersten und dem dritten Segmenten angeordnet ist.
  37. Oligomere Verbindung nach Anspruch 1, worin das erste Segment eine Vielzahl von Ribofuranosylnucleosiduntereinheiten umfasst, wobei die Untereinheiten durch alternierende Phosphor- und nicht-Phosphorverknüpfungen verbunden sind.
  38. Oligomere Verbindung nach Anspruch 37, worin die alternierenden Phosphor- und nicht-Phosphorverknüpfungen Phosphorthioat- und Methylenmethyliminoverknüpfungen sind.
  39. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 38 zum Gebrauch in zusammen wirkender Verstärkung der Hybridisierung und die dsRNase-Enzymaktivierung in vitro.
  40. Doppelsträngiges Substrat, umfassend ein Doppel von Oligomerverbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 21 oder 23 bis 34 und worin die Teile der ersten und zweiten Oligomere basengepaart miteinander in dem Doppel sind.
  41. Doppelsträngiges RNA-Substrat nach Anspruch 40, worin eines der Oligonukleotide die Nukleotidsequenz der SEQ ID No: 8 hat.
  42. Doppelsträngiges Substrat nach Anspruch 40, worin wenigstens eines der ersten und zweiten Oligonukleotide einen chemisch modifizierten Teil hat, um die Affinität für das andere Oligonukleotid zu modulieren.
  43. Affinitätsmatrix, umfassend das dsRNA-Substrat nach einem der Ansprüche 40 bis 42.
  44. Verfahren zum spezifischen Spalten einer vorgewählten RNA, umfassend das Kontaktieren der RNA mit einer oligomeren Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 38.
  45. Verfahren zur in vitro-Modifizierung der sequenzspezifischen Ziel-RNA, umfassend Kontaktieren einer Testlösung, die ein dsRNase-Enyzm enthält und der Ziel-RNA mit einer oligomeren Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin einer Vielzahl von Nukleosiduntereinheiten 2'-Hydroxyl-Pentofuranosyl Zuckereinheiten haben.
  46. Verfahren zum Reinigen einer Ribonuklease oder eines nicht abbauendem RNA-Bindeproteins, umfassend Kontaktieren einer Probe, die die Ribonuklease oder das nicht abbauende RNA-Bindeprotein enthält, mit der Affinitätsmatrix des Anspruchs 43.
  47. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 38 zur Verwendung bei der Therapie einer Krankheit, die durch unerwünschte Erzeugung eines Proteins gekennzeichnet ist.
  48. Zusammensetzung umfassend eine pharmazeutisch wirksame menge einer oligomeren Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 38 und worin eine Vielzahl der Nukleosiduntereinheiten 2'-Hydroxyl-Pentofuranosylzuckereinheiten haben.
DE69732911T 1996-06-06 1997-06-06 Oligoribonukleotide und ribonukleasen zur spaltung von rns Expired - Lifetime DE69732911T2 (de)

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