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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft die Synthese und Verwendung oligomerer Verbindungen,
einschließlich
Oligoribonukleotiden und Oligoribonukleosiden, die zur Strangspaltung
von Ziel-RNA-Strängen
von Nutzen sind. Umfasst von der Erfindung sind Oligoribonukleotide
mit modifizierten Zuckern, Basen oder Phosphat-Hauptketten und Oligoribonukleoside
mit Standardzuckern und -basen oder modifizieren Zuckern und Basen,
die über
Nicht-Phosphat-Hauptketten miteinander vernetzt sind. Weiterhin
von der Erfindung umfasst sind chimäre Oligoribonukleotide und
Oligoribonukleoside mit gemischten Hauptketten, entweder Phosphat
oder Nicht-Phosphat. Die Erfindung betrifft Ribonukleasen eines
Säugers,
d. h. Enzyme, die RNA abbauen. Eine solche Ribonuklease wird hierin
als ein dsRNase bezeichnet, wobei „ds" die Spezifität der RNase zu bestimmten doppelsträngigen RNA-Substraten
anzeigt. Die Oligoribonukleotide, Oligoribonukleoside und Ribonuklease-Substrate
der Erfindung sind für
die Therapeutik, Diagnostik und als Reagenzien für die Forschung von Nutzen.
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ALLGEMEINER
STAND DER TECHNIK
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Von
Oligonukleotiden ist bekannt, dass sie zu einzelsträngigen DNA-
oder RNA-Molekülen hybridisieren.
Bei Hybridisierung handelt es sich um die sequenzspezifische Basenpaar-Wasserstoffbrückenbindung von
Nukleobasen der Oligonukleotide an Nukleobasen von Ziel-RNA oder
-DNA. Von derartigen Nukleobasenpaaren wird gesagt, dass sie zueinander
komplementär
sind.
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Die
Komplementarität
von Oligonukleotiden ist zur Inhibierung einer Reihe zellulärer Ziele
verwendet worden. Solche komplementären Oigonukleotide werden häufig als
Antisense-Oligonukleotide beschrieben. Es sind verschiedene, die
Ergebnisse dieser Studien beschreibende Reviews veröffentlicht
worden, darunter Progress In Antisense Oligonucleotide Therapeutics,
S. T. Crooke und C. F. Bennett, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.,
1996, 36, 107–129.
Diese Oligonukleotide haben sich als sehr leistungsstarke Werkzeuge
in der Forschung und Diagnostika erwiesen. Des Weiteren befinden
sich bestimmte Oligonukleotide, von denen gezeigt worden ist, dass
sie wirksam sind, derzeit in klinischen Versuchen am Menschen.
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Bis
heute sind studierte Oligonukleotide Oligodeoxynukleotide gewesen.
Von Antisense-Oligodeoxynukleotiden wird geglaubt, dass sie hauptsächlich durch
die Wirkung von RNase H eine Verringerung der Ziel-RNA-Niveaus verursachen,
einer Endonuklease, die den RNA-Strang von DNA:RNA-Doppeln (DNA:RNA-Doppelsträngen) spaltet.
Von diesem Enzym, von dem geglaubt wird, dass es bei der DNA-Replikation
eine Rolle spielt, ist gezeigt worden, dass es in der Lage ist,
die RNA-Komponente der DNA:RNA-Doppelstränge in zellfreien Systemen
als auch in Xenopus-Oozyten zu spalten. RNase H ist sehr empfindlich
gegenüber
strukturellen Veränderungen
von Antisense-Oligonukleotiden. Diese Empfindlichkeit ist derart,
dass frühere
Versuche zur Erhöhung
der Wirksamkeit von Oligonukleotiden durch Steigern der Affinität, Stabilität, Lipophilie
und anderer Charakteristika durch chemische Modifikationen des Oligonukleotids
häufig
zu Oligonukleotiden geführt
haben, die nicht mehr Substrate für RNase H sind. Darüber hinaus
ist die RNase-H-Aktivität ziemlich
variabel. Folglich ist ein gegebener Krankheitszustand möglicherweise
kein Kandidat für
Antisense-Therapie, nur weil das Zielgewebe eine unzureichende RNase-H-Aktivität aufweist.
Somit ist klar, dass zusätzlich
zu RNase H effektive Terminationsmechanismen zur Entwicklung von
Therapeutika und anderen Agenzien von großem Wert sind.
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Mehrere
Veröffentlichungen
beschreiben die Wechselwirkung von RNase H und Oligonukleotiden. Eine
kürzliche
Veröffentlichung
ist: Crooke et al., Biochem. J., 1995, 312, 599–608. Andere frühere Dokumente sind:
(1) Dagle et al., Nucleic Acids Research, 1990, 18, 4751; (2) Dagle
et al., Antisense Research And Development, 1991, 1, 11; (3) Eder
et al., J. Biol. Chem., 1991, 266, 6472; und (4) Dagle et al., Nucleic
Acids Research, 1991, 19, 1805. Laut diesen Veröffentlichungen sind DNA-Oligonukleotide mit
sowohl unmodifizierten Phosphodiester-Internukleosidverknüpfungen
als auch modifizierten Phosphorthioat-Internukleosidver knüpfungen
Substrate für
zelluläre
RNase H. Da sie Substrate sind, aktivieren sie die Spaltung von
Ziel-RNA durch RNase H. Diese Verfasser merkten jedoch weiterhin
an, dass sowohl Phosphodiesterverknüpfungen als auch Phosphorthioatverknüpfungen
in Xenopus-Embryos auch Exonukleaseabbau unterliegen. Nukleaseabbau
ist nachteilig, da er das Oligonukleotid schnell abreichen.
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Wie
in den Referenzen (1), (2) und (4) beschrieben ist, wurden zum Stabilisieren
von Oligonukleotiden gegenüber
Nukleaseabbau bei gleichzeitigem fortgesetzten Sorgen für RNase-H-Aktivierung
2'-Deoxyoligonukleotide
mit einem kurzen Abschnitt von mit Phosphodiester verknüpften Nukleosiden,
der zwischen Abschnitten von Phosphoramidat-, Alkylphosphonat- oder
Phosphotriesterverknüpfungen
angeordnet ist, konstruiert. Obwohl die Phosphoramidat enthaltenden
Oligonukleotide gegenüber
Exonukleasen stabilisiert wurden, merkten die Verfasser in Referenz
(4) an, dass jede Phosphoramidatverknüpfung in einem Verlust von
1,6°C beim gemessenen
Tm-Wert
der Phosphoramidat enthaltenden Oligonukleotide resultierte. Eine
solche Verringerung des Tm-Werts deutet
auf eine Verringerung der Hybridisierung zwischen dem Oligonukleotid
und seinem Zielstrang hin.
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Andere
Verfasser haben zum Effekt Stellung genommen, den ein solcher Verlust
an Hybridisierung zwischen einem Oligonukleotid und seinem Zielstrang
haben kann. Saison-Behmoaras et al. (EMBO Journal, 1991, 10, 1111)
beobachteten, dass selbst obwohl ein Oligonukleotid ein Substrat
für RNase
H sein könnte, die
Spaltungseffizienz durch RNase H aufgrund der schwachen Hybridisierung
zur mRNA gering war. Die Verfasser merkten auch an, dass das Einbinden
einer Acridin-Substitution
am 3'-Ende des Oligonukleotids
das Oligonukleotid vor Exonukleasen schützte.
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Die
US-Patentschrift 5,013,830, am 7. Mai 1991 ausgegeben, offenbart
Mischoligomere, die ein RNA-Oligomer oder ein Derivat davon umfassen,
das über
eine Phosphodiesterverknüpfung
an ein DNA-Oligomer konjugiert ist. Die RNA-Oligomere tragen außerdem 2'-O-Alkyl-Substituenten. Da es jedoch
Phosphodiester sind, sind die Oligomere gegenüber Nukleasespaltung anfällig.
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Die
europäische
Patentanmeldung 339,842, am 2. November 1989 veröffentlicht, offenbart 2'-O-substituierte
Phosphorthioatoligonukleotide, einschließlich 2'-O-Methylribooligonukleotidphosphorthioat-Derivaten.
Die oben erwähnte
Anmeldung offenbart auch 2'-O-Methylphosphodiesteroligonukleotide,
denen es an Nukleaseresistenz mangelt.
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Die
US-Patentschrift 5,149,797, am 22. September 1992 ausgegeben, offenbart
Mischoligonukleotide mit Phosphaten an der Hauptkette, die einen
internen Teil aus durch Phosphodiesterverknüpfungen verknüpften Deoxynukleotiden
enthalten, der auf jeder Seite von einem Teil aus modifizierten
DNA- oder RNA-Sequenzen flankiert wird. Die Flankensequenzen beinhalten
Methylphosphonat-, Phosphormorpholidat-, Phosphorpiperazidat- oder
Phosphoramidatverknüpfungen.
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Die
US-Patentschrift 5,256,775, am 26. Oktober 1993 ausgegeben, beschreibt
Mischoligonukleotide, die Phosphoramidatverknüpfungen und Phosphorthioat-
oder Phosphordithioatverknüpfungen
einschließen.
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Die
US-Patentschrift 5,403,711, am 4. April 1995 ausgegeben, beschreibt
gegen DNA gerichtete RNA:DNA-Sonden. Die Sonden werden markiert
und in einem System verwendet, das RNase H enthält. Das RNase-H-Enzym spaltet
jene Sonden, die sich an DNA-Ziele binden. Die Sonden können modifizierte
Phosphatgruppen enthalten. Erwähnt
werden Phosphotriester, Hydrogenphosphonate, Alkyl- oder Arylphosphonate,
Alkyl- oder Arylphosphoramidate, Phosphorthioate oder Phosphorselenate.
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Im
Gegensatz zur pharmakologischen Inhibierung von Genexpression über das
RNase-H-Enzym ist es offenbar geworden, dass Organismen von Bakterien
bis zu Menschen endogene Antisense-RNA-Transkripte zum Ändern der
Stabilität
mancher Ziel-mRNAs und zum Regulieren der Genexpression verwenden,
siehe W. Nellen und C. Lichtenstein, Curr. Opin. Cell. Biol., 1993,
18, 419–424,
und W. Nellen et al., Biochem. Soc. Trans., 1992, 20, 750–754. Vielleicht
eines der besten Beispiele kommt von bestimmten Bakterien, bei denen eine
Antisense-RNA die Expression von mok-mRNA reguliert, das für die Translation
des zytotoxischen hok-Proteins erforderlich ist. Wenn das Antisense-Niveau
fällt,
steigen folglich die mok-mRNA-Niveaus
und infolgedessen die hok-Protein-Niveaus und die Zellen sterben
ab, siehe K. Gerdes et al., J. Mol. Biol., 1992, 226, 637–649. Andere
von solchen Mechanismen in Bakterien regulierte Systeme beinhalten
das RNA-I/RNA-II-Hybrid des ColE1-Plasmids, siehe M. T. Häuptle, R.
Frank und B. Dobberstein, Nucleic Acids Res., 1986, 14, 1427, D.
Knecht, Cell Motil. Cytoskel., 1989, 14, 92–102; und M. Maniak und W.
Nellen, Nucleic Acids Res., 1990, 18, 5375–5380; OOP-cII-RIVA-Regulation im Bakteriophage
Lambda, siehe L. Krinke und D. L. Wulff (1990), Genes Dev., 1990,
4, 2223–2233;
und die copA/copT-Hybride in E. coli. Siehe P. Blomberg, E. G. Wagner
und K. Nordstrom, EMBO J., 1990, 9, 2331–2340. In E. coli ist von den
gebildeten RNA:RNA-Doppelsträngen
gezeigt worden, dass sie Substrate für regulierten Abbau durch die
Endoribonuklease RNase III sind. Von Doppelsträngen abhängiger Abbau ist auch im Archaebakterium
Halobacterium salinarium beobachtet worden, in dem das Antisense-Transkript
die Expression des frühen
(T1) Transkripts des Phagengens phiH reduziert, siehe P. Stolt und
W. Zillig, Mol. Microbiol., 1993, 7, 875–882. In mehreren eukaryotischen
Organismen sind ebenfalls endogene Antisense-Transkripte beobachtet
worden. Diese beinhalten p53, siehe Khochbin und Lawrence, EMBO,
1989, 8, 4107–4114;
basischen Fibroblastenwachstumsfaktor, siehe Volk et al., EMBO, 1989,
8, 69, 2983–2988;
N-myc, siehe G.
W. Krystal, B. C. Armstrong und J. F. Battey, Mol. Cell. Biol.,
1990, 10, 4180–4191;
elF-2α,
siehe Noguchi et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 29161–29167.
Die Konservierung endogen exprimierter Antisense-Transkripte über Evolutionslinien
weist darauf hin, dass ihre biologischen Rollen und molekularen
Wirkungsmechanismen ähnlich
sein könnten.
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In
Bakterien ist RNase III die Aktivität doppelsträngiger Endoribonuklease (dsRNase),
die sich für
den Abbau einiger Antisense:Sense-RNA-Doppelstränge verantwortlich zeichnet.
RNase III führt
ortsspezifische Spaltung von dsRNA enthaltenden Strukturen durch,
siehe H. Saito und C. C. Richardson, Cell, 1981, 27, 533–540. Die
RNase III spielt außerdem
eine wichtige Rolle bei der mRNA-Verarbeitung
und der Verarbeitung von rRNA-Vorläufern zu 16S-, 23S- und 5S-Ribosom-RNAs, siehe
J. J. Dunn und F. W. J. Studier, Mol. Biol., 1975, 99, 487. In Eukaryoten
ist kürzlich
ein Hefegen (RNT1) kloniert worden, das für ein Protein kodiert, das Homologie
zu RNase III von E. coli aufweist und dsRNase-Aktivität bei der
Ribosom-RNA-Verarbeitung aufzeigt, siehe S. A. Elela, H. IgeI und
M. Ares, CelI, 1996, 85, 115–124.
Mit Interferon behandelte Vogelzellen produzieren und sezernieren
eine lösliche
Nuklease, die dsRNA abbauen kann, siehe J. Meegan und P. I. Marcus,
Science, 1989, 244, 1089–1091.
Eine solche sezernierte dsRNA-Aktivität ist jedoch
kein wahrscheinlicher Kandidat dafür, am zytoplasmatischen Abbau
von Antisense:Sense-RNA-Doppelsträngen beteiligt zu sein. Trotz
dieser Feststellungen ist fast nichts über die dsRNase-Aktivität von Menschen
oder Säugern
bekannt. Obwohl anerkannt ist, dass die Regulation (mittels eines
beliebigen Mechanismus) eines Ziel-RNA-Strangs von Nutzen wäre, sind
bis heute nur zwei Mechanismen zum Auslösen eines solchen Effekts bekannt.
Diese sind das Anhalten der Hybridisierung und die Verwendung eines
Oligodeoxynukleotids, um die RNase-H-Spaltung des RNA-Ziels zu bewirken.
WO 92/07065 offenbart RNA-Moleküle, die
Segmente aus unmodifizierter RNA zusammen mit Segmenten aus modifizierten
Ribopyranosylnukleotiden umfassen. Ohtsuki et al. (J. Biol. Chem.,
1977, 252: 483–491)
beschreibt die Isolierung einer dsRNase eines Säugers. Nucleic Acids Res. 17, 239
(1989), schlägt
aus 2'-Methyl-substituierten
Nukleotideinheiten aufgebaute Oligoribonukleotidphosphorthioat-Gapmere
vor. Ann. NY. Acad. Sci., S. 2–10
(1992), offenbart Oligoribonukleotidphosphorthioate als mögliche Therapeutika
für die
Behandlung von HIV.
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Dementsprechend
bleibt ein fortgesetzter, lange bestehender Bedarf an Verfahren
und Verbindungen zur Regulation von Ziel-RNA. Eine solche Regulation
von Ziel-RNA wäre für therapeutische
Zwecke sowohl in vivo als auch ex vivo sowie auch für Diagnosereagenzien
und als Reagenzien für
die Forschung, einschließlich Reagenzien
für die
Untersuchung sowohl von zellulären
als auch In-vitro-Ereignissen,
von Nutzen.
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KURZDARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß dieser
Erfindung wird eine oligomere Verbindung bereitgestellt, welche
spezifisch hybridisierbar mit einem vorgewählten RNA-Ziel ist und umfasst:
- (a) ein erstes Segment, das wenigstens eine
Ribofuranosylnukleosiduntereinheit hat, welche modifiziert ist, um
wenigstens eines zu verbessern aus: pharmakokinetischer Bindung,
Absorption, Verteilungs- oder Freisetzungseigenschaften der Verbindung;
Affinität
oder Spezifität
der Verbindung zu der Ziel-RNA; oder Modifizieren der Ladung der
Verbindung, verglichen mit unmodifizierter Verbindung; und
- (b) ein zweites Segment, das wenigstens vier aufeinander folgende
Ribofuranosylnukleosiduntereinheiten hat, welche daran 2'-Hydroxyeinheiten
haben; dadurch gekennzeichnet, dass
- (i) die Nukleosiduntereinheiten der oligomeren Verbindung durch
Internukleosidvernetzungen verknüpft sind,
die gegenüber
Abbau verglichen zu Phosphodiestervernetzungen stabil sind; und
- (ii) diese wenigstens eine modifizierte Ribofuranosylnukleosiduntereinheit
an einem oder beiden der 3'- oder
der 5'-Enden der
oligomeren Verbindung angeordnet ist.
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In
bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung werden die Verbindungen ein drittes Segment mit Eigenschaften
enthalten, die den Eigenschaften des ersten Segments entsprechen.
Es ist bevorzugt, das zweite Segment zwischen dem ersten und dem
dritten Segment zu positionieren, so dass sie eine kontinuierliche,
lineare Sequenz von verknüpften
Nukleosiduntereinheiten bilden. In bevorzugten Verbindungen wird
die Anzahl solcher verknüpften
Nukleosiduntereinheiten von etwa acht bis etwa fünfzig reichen, wobei ein mehr
bevorzugter Bereich von etwa zwölf
bis etwa dreißig
verknüpften
Nukleosiduntereinheiten reicht.
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Die
Modifizierung der pharmakokinetischen Eigenschaften beinhaltet eine
beliebige oder mehrere der Folgenden: Modifizierung der Bindungs-,
Absorptions-, Verteilungs- oder Freisetzungseigenschaften der Verbindung.
Die Modifizierung der Bindungscharakteristika beinhaltet die Modifizierung
der Affinität
oder Spezifität der
Verbindung zu seiner Ziel-RNA. Die Modifizierung der Ladung der
Verbindung beinhaltet das Modifizieren der Nettoladung der Verbindung
im Vergleich zu einer unmodifizierten Verbindung. Für gewöhnlich wird
die Modifizierung der Ladung die negative Gesamtnettoladung einer
mit Phosphor verknüpften
oligomeren Verbindung verringern, um die Verbindung mit weniger
negativer Ladung, einer neutralen Ladung oder einer positiven Nettoladung
auszustatten.
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Weiterhin
gemäß dieser
Erfindung werden oligomere Verbindungen bereitgestellt, die aus
linearen Sequenzen verknüpfter
Ribonukleosiduntereinheiten gebildet sind, die spezifisch an ein
vorgewähltes
RNA-Ziel hybridisierbar sind. Die oligomeren Verbindungen weisen
wenigstens ein erstes Segment und ein zweites Segment auf. Das erste
Segment schließt
wenigstens eine Ribonukleosiduntereinheit ein, die funktionalisiert
wird, um höhere
Affinität
zur Ziel-RNA bereitzustellen. Das zweite Segment enthält wenigstens
vier Ribofuranosylnukleosiduntereinheiten. Die Untereinheiten der
oligomeren Verbindungen sind miteinander in einer linearen Sequenz
durch Internukleosidverknüpfungen
verbunden, die modifiziert sind, um die Verknüpfungen gegenüber Abbau
im Vergleich zu Phosphodiesterverknüpfungen zu stabilisieren.
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In
bestimmten bevorzugten oligomeren Verbindungen der Erfindung werden
das erste oder das erste und das dritte Segment der oligomeren Verbindungen
aus Nukleosiduntereinheiten gebildet, die daran 2'-Substituentengruppen
enthalten. In bevorzugten Ausführungsformen
beinhaltet die 2'-Substituentengruppe
Fluor, C1-C20-Alkoxy, C-C1-Aminoalkoxy, Allyloxy, Imidazolylalkoxy
und Polyethylenglykol. Bevorzugte Alkoxysubstituenten beinhalten
Methoxy, Ethoxy und Propoxy. Ein bevorzugter Aminoalkoxysubstituent
ist Aminopropoxy. Ein bevorzugter Imidazolylalkoxysubstituent ist
Imidazolylpropoxy. Ein bevorzugter Polyethylenglykolsubstituent
ist -O-Ethyl-O-methyl, d. h. Methoxyethoxy oder -O-CH2-CH2-O-CH3.
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In
weiter bevorzugten oligomeren Verbindungen der Erfindung werden
die oligomeren Verbindungen aus Nukleosiduntereinheiten gebildet,
die durch Einbinden bestimmter ausgewählter Nukleobasen daran modifiziert
sind. In bevorzugten Ausführungsformen
beinhalten die ausgewählten
Nukleobasen 2,6-Diaminopurin, N2-Alkylpurine, N2-Aminoalkylpurine, 7-Deaza-7-substituierte
Purine, 5-substituierte Pyrimidine und 2-substituierte Pyrimidine.
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Andere
bevorzugte oligomere Verbindungen der Erfindung beinhalten Oligoribonukleotide
mit Nukleosiduntereinheiten, die durch Phosphorverknüpfungen
verbunden sind, einschließlich
Phosphorthioat, 3'-(oder 5'-)Deoxy-3'-(oder -5'-)thiophosphorthioat,
Phosphordithioat, Phosphorselenate, 3'-(oder 5'-)Deoxyphosphinate,
Boranphosphate, 3'-(oder
5'-)Deoxy-3'-(oder -5'-)aminophosphoramidate, Hydrogenphosphanate,
Boranphosphatester, Phosphoramidate, Alkyl- oder Arylphosphonate
und Phosphotriesterverknüpfungen.
Eine ausgewählte
Gruppe von Oligoribonukleotidverknüpfungen zur Verwendung beim
Verknüpfen
der Nukleoside des zweiten Segments beinhalten Phosphorthioat, Phosphinate
und Phosphoramidate, die alle geladene Spezies sind.
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Weiter
bevorzugte oligomere Verbindungen der Erfindung können außerdem Oligoribonukleoside
mit Nukleosiduntereinheiten beinhalten, die durch Carbonat-, Carbamat-,
Silyl-, Schwefel-, Sulfonat-, Sulfonamid-, Formacetal-, Thioformacetal-,
Oxim-, Methylenimino-, Methylenmethylimino-, Methylenhydrazo-, Methylendimethylhydrazo-
und Methylenoxymethyliminoverknüpfungen
verbunden sind.
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Weiter
bevorzugte oligomere Verbindungen der Erfindung beinhalten welche
mit Nukleosiduntereinheiten, die durch alternierende Phosphor- und
Nicht-Phosphorverknüpfungen
verbunden sind. Solche Nicht-Phosphorverknüpfungen beinhalten Carbonat-,
Carbamat-, Silyl-, Schwefel-, Sulfonat-, Sulfonamid-, Formacetal-,
Thioformacetal-, Oxim-, Methylenimino-, Methylenmethylimino-, Methylenhydrazo-,
Methylendimethylhydrazo- und Methylenoxymethyliminoverknüpfungen,
wohingegen die Phosphorverknüpfungen
Phosphodiester, Phosphorthioat, 3'-(oder 5'-)Deoxy-3'-(oder -5'-)thiophosphorthioat, Phosphordithioat,
Phosphorselenate, 3'-(oder
5'-)Deoxyphosphinate,
Boranphosphate, 3'-(oder
5'-)Deoxy-3'-(oder -5'-)aminophosphoramidate,
Hydrogenphosphanate, Boranphosphatester, Phosphoramidate, Alkyl-
oder Arylphosphonate und Phosphotriesterverknüpfungen beinhalten.
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Weiter
bevorzugte oligomere Verbindungen der Erfindung beinhalten Oligoribonukleotide,
Oligoribonukleoside oder Mischungen von Oligoribonukleotiden und
Oligoribonukleosiden mit mehreren verknüpften Nukleosiduntereinheiten,
die in einer Sequenz verknüpft
sind, die ein komplementärer
Strang der Ziel-RNA ist, und wobei die Sequenz der Verbindung in
eine erste Teilsequenz bzw. ein erstes Segment und eine zweite Teilsequenz
bzw. ein zweites Segment unterteilt ist. Die erste Teilsequenz umfasst
verknüpfte
Nukleosiduntereinheiten, die 2'-O-substitutierte
Pentofuranosylzuckereinheiten tragen, und die zweite Teilsequenz
umfasst verknüpfte
Nukleosiduntereinheiten, die 2'-Hydroxylpentofuranosylzuckereinheiten
tragen. Vorzugsweise hat die zweite Teilsequenz von vier bis zwölf oder
mehr Nukleosiduntereinheiten und mehr bevorzugt fünf bis etwa neun
Nukleosiduntereinheiten. In weiter bevorzugten Ausführungsformen
liegt eine dritte Teilsequenz vor, deren Nukleosiduntereinheiten
aus jenen ausgewählt
sind, die für
die erste Teilsequenz wählbar
sind. Es ist bevorzugt, dass die zweite Teilsequenz zwischen der
ersten und der dritten Teilsequenz positioniert ist. Solche oligomeren
Verbindungen der Erfindungen werden auch als „Chimären", „chimäre" oder „unvollständige" Oligoribonukleotide
oder Oligoribonukleoside bezeichnet.
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In
den oligomeren Verbindungen der Erfindung sind Substituenten tragende
Nukleosiduntereinheiten, welche modifiziert sind, um die pharmakokinetische
Bindung, die Absorption, die Verteilungs- oder Freisetzungseigenschaften
der Verbindung; die Affinität
oder Spezifität
der Verbindung zu der Ziel-RNA und/oder die Modifizierung der Ladung
der Verbindung im Vergleich zu einer unmodifizierten Verbindung
zu verbessern; an einem oder beiden der 3'- oder 5'-Termini (Enden) der oligomeren Verbindungen
angeordnet. In bestimmten bevorzugten Verbindungen gibt es von einer
bis etwa acht Nukleosiduntereinheiten, die mit solchen Substituentengruppen
substituiert sind.
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Die
Nukleosiduntereinheiten sind in einer linearen Sequenz miteinander
verbunden, um die oligomeren Verbindungen der Erfindung zu bilden.
Jede Nukleosiduntereinheit enthält
ein Basenfragment und ein Zuckerfragment. Das Basenfragment umfasst
eine heterozyklische Base, abwechselnd hierin im Folgenden als eine
Nukleobase bezeichnet. Die Basen oder Nukleobasen sind kovalent
an das Zuckerfragment gebunden. Die Zuckerfragmente können eine
2'- substituierte Zuckereinheit,
eine 2'-Hydroxylzuckereinheit
oder eine Zuckersurrogateinheit beinhalten.
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Bevorzugte
Nukleobasen der Erfindung beinhalten Purine und Pyrimidine, wie
beispielsweise Adenin, Guanin, Cytosin, Uridin und Thymin, als auch
andere synthetische und natürliche
Nukleobasen, wie beispielsweise Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin,
6-Methyl- und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Propyl- und andere
Alkylderivate von Adenin und Guanin, 5-Halogenuracil und -cytosin,
5-Propinyluracil und -cytosin, 6-Azouracil, -cytosin und -thymin,
5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Halogen-, -Amino-, -Thiol-, -Thioalkyl-,
-Hydroxyl- und andere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Trifluormethyl-
und andere 5-substituierte
Uracile und Cytosine und 7-Methylguanin. Weitere Purine und Pyrimidine
beinhalten jene, die in den US-Patentschriften 3,687,808, 5,484,908,
5,459,255, 5,457,191 und 5,614,617 (entspricht der US-Patentanmeldung
mit der Seriennummer 07/971,978) offenbart sind, und jene, die in
der Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Seiten
858–859,
J. I. Kroschwitz, Hrsg. John Wiley & Sons, 1990, offenbart sind, und
jene, die von Englisch et al., Angewandte Chemie, International
Edition, 1991, 30, 613, offenbart werden.
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Bevorzugte
Zuckerfragmente sind Pentoribofuranosylzuckereinheiten, d. h. die „natürliche" Zuckereinheit von
Messenger-Ribonukleinsäuren.
Andere zuckerartige oder Zuckersurrogatverbindungen, die zur Verwendung
in den Oligoribonukleotiden oder Oligoribonukleosiden der Erfindung
geeignet sind, beinhalten wie in der US-Patentschrift 5,359,044 beschriebene
Cyclobutylnukleosidsurrogate, wie in der US-Patentschrift 5,519,134 beschriebene
Pyrrolidinnukleosidsurrogate, wie in den US-Patentschriften 5,142,047 und 5,235,033 und
verwandten Patentoffenbarungen beschriebene Morpholinonukleosidsurrogate
und PNA-Nukleosidsurrogate (PNA = Peptidnukleinsäure).
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In
weiter bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung werden synthetische oligomere Verbindungen bereitgestellt,
die spezifisch mit einem vorgewählten
RNA-Ziel hybridisierbar
sind, und wobei die Verbindungen ein erstes Segment, das wenigstens
eine Surrogat-Nukleosiduntereinheit enthält, und ein zweites Segment
enthalten, das wenigstens vier Ribofuranosylnukleosiduntereinheiten
umfasst, die in einer aufeinander folgenden Sequenz angeordnet sind
und daran 2'-Hydroxyleinheiten
aufweisen. Des Weiteren sind die Nukleosiduntereinheiten der oligomeren
Verbindung durch Internukleosidverknüpfungen verbunden, die im Vergleich
zu Phosphodiesterbindungen gegenüber
Abbau stabil sind.
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In
anderen bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung werden synthetische oligomere Verbindungen bereitgestellt,
die spezifisch mit einem vorgewählten
RNA-Ziel hybridisierbar
sind und die ein erstes Segment, das wenigstens eine Ribofuranosylnukleosiduntereinheit
aufweist, die nicht ein DNA- oder RNA-„Hauptbestandteil"-Nukleosid ist, und
ein zweites Segment enthalten, das wenigstens vier aufeinander folgende Ribofuranosylnukleosiduntereinheiten
enthält,
die daran 2'-Hydroxyleinheiten
aufweisen. Die Nukleosiduntereinheiten der Verbindungen sind durch
Internukleosidverknüpfungen
verbunden, die modifiziert sind, um die Verknüpfungen im Vergleich zu Phosphodiesterverknüpfungen
gegenüber
Abbau zu stabilisieren. Nukleosiduntereinheiten, die nicht DNA-
oder RNA-Hauptbestandteilnukleoside
sind, so wie der Ausdruck in Verbindung mit dieser Erfindung verwendet
wird, sind Teile der Gruppe, die aus Adenosin, 2'-Deoxyadenosin,
Guanosin, 2'-Deoxyguanosin,
Cytidin, 2'-Deoxycytidin,
Uridin und 2'-Deoxythymidin besteht.
Als solche schließt
diese Gruppe „unbedeutende" Nukleoside aus,
die in tRNA oder anderen Nukleinsäuren gefunden werden können.
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Die
Erfindung stellt außerdem
Verfahren zum spezifischen Spalten von vorgewählter RNA bereit. Diese Verfahren
beinhalten das Kontaktieren der RNA mit einer Verbindung, die wenigstens
zwölf Ribofuranosylnukleosiduntereinheiten
enthält,
die in einer Sequenz zusammengefügt
sind, die spezifisch mit der vorgewählten RNA hybridisierbar ist.
Die Nukleosiduntereinheiten sind durch Internukleosidbindungen zusammengefügt, die
im Vergleich zu Phosphodiesterbindungen gegenüber Abbau stabil sind. Die
Verbindung weist wenigstens ein Segment auf, das wenigstens eine
modifizierte Nukleosiduntereinheit enthält, wobei die modifizierte
Nukleosiduntereinheit modifiziert ist, um die pharmakokinetische
Bindung, die Absorption, die Verteilungs- oder Freisetzungseigenschaften
der Verbindung; die Affinität
oder Spezifität
der Verbindung zu der Ziel-RNA und/oder die Modifizierung der Ladung
der Verbindung im Vergleich zu einer unmodifizierten Verbindung
zu verbessern. Die Verbindung enthält zusätzlich ein weiteres Segment,
das wenigstens vier Ribonukleosiduntereinheiten aufweist.
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Die
Erfindung betrifft außerdem
Verfahren zum Behandeln eines Organismus, der eine Krankheit hat, die
durch die unerwünschte
Erzeugung eines Proteins gekennzeichnet ist. Diese Verfahren beinhalten
das Kontaktieren des Organismus mit einer oligomeren Verbindung
der Erfindung, die eine Sequenz von Nukleosiduntereinheiten aufweist,
die spezifisch mit einem komplementären Strang von Ribonukleinsäure hybridisieren
kann, wobei wenigstens eine der Nukleosiduntereinheiten funktionalisiert
ist, um eine oder mehrere Eigenschaften der oligomeren Verbindungen
im Vergleich zu nativer RNA zu modifizieren. Die Verbindung enthält weiterhin
eine Vielzahl der Nukleosiduntereinheiten, die 2'-Hydroxylpentofuranosylzuckereinheiten
aufweisen.
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Weiterhin
gemäß der vorliegenden
Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die eine pharmazeutisch
wirksame Menge einer oligomeren Verbindung enthalten, die eine Sequenz
von Nukleosiduntereinheiten aufweist, die spezifisch mit einem komplementären Strang
von RNA hybridisieren kann, und wobei wenigstens eine der Nukleosiduntereinheiten
modifiziert ist, um die pharmakokinetische Bindung, die Absorption,
die Verteilungs- oder Freisetzungseigenschaften der Verbindung;
die Affinität
oder Spezifität
der Verbindung zu der Ziel-RNA und/oder die Modifizierung der Ladung
der Verbindung im Vergleich zu einer unmodifizierten Verbindung
zu verbessern. In solchen Verbindungen hat eine Vielzahl der Nukleosiduntereinheiten 2'-Hydroxylpentofuranosylzuckereinheiten.
Die Zusammensetzungen enthalten weiterhin ein pharmazeutisch unbedenkliches
Verdünnungsmittel
oder einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Ribonukleasen eines Säugers, die
aus menschlichen T24-Zellen, anderen Zelllinien und Rattengewebe
isolierbar sind und die RNA in einem Oligoribonukleotid:RNA-Doppelstrang abbauen.
Eine solche Ribonuklease wird hierin als ein dsRNase bezeichnet,
wobei „ds" die Spezifität der RNase
zu bestimmten doppelsträngigen
RNA-Substraten anzeigt. Geeignete Substrate für solche dsRNasen werden hierin
ebenfalls bereitgestellt sowie Affinitätsmatrizen, die solche Substrate
umfassen.
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Es
werden ebenfalls Verfahren zur In-vitro-Modifizierung einer sequenzspezifischen
Ziel-RNA bereitgestellt, einschließlich des Kontaktierens einer
Testlösung,
die ein dsRNase-Enzym enthält,
d. h. ein doppelsträngiges
RNase-Enzym, und der Ziel-RNA
mit einer oligomeren Verbindung. Die oligomere Verbindung weist eine
Sequenz von Nukleosiduntereinheiten auf, die spezifisch an einen
komplementären
Strang der Nukleinsäure
hybridisieren kann, wobei wenigstens eine der Nukleosiduntereinheiten
funktionalisiert ist, um die Bindungsaffinität oder Bindungsspezifität des Oligoribonukleotids
zum komplementären
Strang der Nukleinsäure zu
erhöhen,
und wobei eine Vielzahl der Nukleosiduntereinheiten 2'-Hydroxylpentafurosanylzuckereinheiten aufweisen.
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Die
Erfindung betrifft außerdem
Verfahren zum gleichzeitigen Verstärken der Hybridisierung und/oder dsRNase-Enzymaktivierung
in einem Organismus, das das Kontaktieren des Organismus mit einer
oligomeren Verbindung beinhaltet, die eine Sequenz von Nukleosiduntereinheiten
aufweist, die spezifisch an einen komplementären Strang der Ziel-RNA hybridisieren
kann. Wenigstens eine der Nukleosiduntereinheiten ist modifiziert,
um die pharmakokinetische Bindung, die Absorption, die Verteilungs-
oder Freisetzungseigenschaften der Verbindung; die Affinität oder Spezifität der Verbindung
zu der Ziel-RNA und/oder die Modifizierung der Ladung der Verbindung
im Vergleich zu einer unmodifizierten Verbindung zu verbessern.
Wiederum weist eine Vielzahl der Nukleosiduntereinheiten 2'-Hydroxylpentafurosanylzuckereinheiten
auf.
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Die
Erfindung stellt weiterhin Diagnostikverfahren zum Erkennen des
Vorliegens oder Fehlens abnormer RNA-Moleküle oder abnormer oder ungeeigneter
Expression von normalen RNA-Molekülen in Organismen oder Zellen.
Die Erfindung stellt weiterhin Reagenzien für die Forschung zum Modulieren
der Enzymaktivität
bereit, einschließlich
der dsRNase-Aktivität
in In-vitro-Lösungen.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 stellt
schematisch bestimmte veranschaulichende chimäre oligomere Verbindungen der
Erfindung dar, wobei leere Kästchen
2'-Methoxy-modifizierte
Ribonukleotide darstellen, gefüllte
Kreise 2'-Hydroxylribonukleotide
darstellen und in allen in der Figur gezeigten Verbindungen Phosphorthioatverknüpfungen
eingesetzt werden.
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Die 2 stellen Ha-ras-mRNA-Niveaus in mit vollständigem 2'-Methoxy- oder chimärem RNA-Gapmer-Oligonukleotid
behandelten Zellen dar. Es sind Northern-Blot-Analysen für Ha-ras-mRNA-Niveaus in mit den
angezeigten Dosen von vollständigem
2'-Methoxyoligonukleotid
(Feld 2A) oder 3-Gap-Oligonukleotid (Feld 2C) zu 24 Std. gezeigt.
Die obere Bande ist das Signal für
Ha-ras; dieses Signal wurde auf das für G3PDH erhaltene (untere Bande)
normiert, es wurden die relativen Ha-ras-Niveaus bestimmt und graphisch dargestellt
(Felder 2C–2D).
Keine der Behandlungen mit Oligonukleotid reduzierte die Ha-ras-mRNA-Niveaus.
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3 zeigt Northern-Blot-Analysen von T24-Zellen,
die wie in 2 behandelt wurden, mit
der Ausnahme, dass chimäre
RNA-Gapmer-Oligonukleotide entweder ein 5-, 7- oder 9-Ribonukleotidgap
oder ein vollständiges
Ribonukleotidmolekül
enthielten (linke Felder 3A, 3B, 3C bzw. 3D); die Zellen wurden
außerdem
mit einem Kontrolloligoribonukleotid behandelt, das vier mit der
Ha-ras-mRNA-Sequenz nicht zusammenpassende Basenpaare enthält (linkes
Feld 3E). Die Ha-ras-Signale wurden auf das von G3PDN normiert und
die relativen Ha-ras-Niveaus wurden graphisch dargestellt (rechte
Felder).
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In 4 ist
die Auswirkung von T24-Zytosolextrakten und RNase H auf Doppelstränge in vitro
gezeigt. Ein Doppelstrang mit 17 Basenpaaren, der aus dem gegen
Ha-ras gerichtete 9-RNA-Gapmer-Oligonukleotid besteht, das mit einem
mit 32P markierten RNA-Komplement verschmolzen
wurde, wurde die angegebenen Zeiten lang bei 37°C mit 3 μg T24-Zytosolproteinfraktion
inkubiert, die Reaktion wurde angehalten und die Produkte wurden
auf einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel getrennt. Die Verdauprodukte
(Pfeile) weisen darauf hin, dass die Spaltung des Doppelstrangs
auf die RNA:RNA-Region beschränkt
ist (siehe schematische Darstellung des Doppelstrangs, ganz rechts).
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5 zeigt
den gleichen 9-RNA-Gapmer-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrang wie in 4,
der mit oder ohne RNase H von E. coli inkubiert ist (– bzw. +).
Das Fehlen von Verdauprodukten weist darauf hin, dass dieser Doppelstrang
kein Substrat für RNase
H ist. Doppelstränge,
die aus mit 32P markierter RNA bestehen,
die entweder mit einem vollständigen
Oligodeoxynukleotid (mittleres Feld) oder einem 9-DNA-Gapmer-Oligonukleotid
(linkes Feld) verschmolzen wurde, sind Substrate zum Spalten durch
RNase H und erzeugen folglich wie erwartet Verdauprodukte (Pfeile).
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6 stellt
eine elektrophoretische Analyse mit SDS-Polyacrylamid-Gel der aktiven
Fraktion konzentrierter Rattenleber nach Größenausschlusschromatographie.
mw: Molekulargewichtmarkierungen in Kilodalton (kD). Fraktion 3
(Spur 4) mit einem scheinbaren Molekulargewicht im Bereich von etwa
35 bis etwa 100 kD, wobei eine Menge des Materials ein scheinbares
Molekulargewicht im Bereich von 50 bis etwa 80 kD aufweist, hatte
das höchste
Ausmaß an
dsRNase-Aktivität.
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7 zeigt
eine Analyse von Verdauprodukten von dsRNase-Substraten mittels
Elektrophorese mit nativem Polyacrylamid-Gel. Antisense- und Sense-Oligonukleotide wurden
vorverschmolzen und mit Zellextrakten inkubiert und wie hierin beschrieben
mit dsRNasen gereinigt. Spur 1: unbehandelte „Sense"-Strang-RNA; Spur 2: mit 0,02 Einheiten RNase
V1 behandelte „Sense"-Strang-RNA; übrige Spuren:
dsRNase-Substrate, behandelt mit 0,02 (Spur 3) und 0,002 (Spur 4)
Einheiten RNase V1, mit ungereinigtem Zellkernextrakt für 0 Minuten
(Spur 5) oder 240 Minuten (Spur 6), mit ungereinigtem Zellkernextrakt
für 240
Minuten ohne Mg++ (Spur 7), mit ungereinigtem
Zytosolextrakt für
240 Minuten (Spur 8), mit durch Ionenaustausch gereinigtem Zytosolextrakt
für 240
Minuten in Gegenwart (Spur 9) oder Abwesenheit (Spur 10) von Mg++ und mit durch Ionenaustausch/Gelfiltration
gereinigtem Zytosolextrakt für
240 Minuten in Gegenwart (Spur 11) oder Abwesenheit (Spur 12) von
Mg++.
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8 zeigt
eine Analyse von Produkten des Verdaus von dsRNase-Substraten mittels
Elektrophorese mit denaturierendem Polyacrylamid-Gel. Spur 1: mit
5 × 10–3 Einheiten
RNase A behandelte „Sense"-Strang-RNA; Spur
2: mit 0,02 Einheiten RNase V1 behandelte „Sense"-Strang-RNA; Spuren 3–9: dsRNase-Produkte,
behandelt mit 0,02 (Spur 3) und 0,002 (Spur 4) Einheiten RNase V1,
mit ungereinigtem Zellkernextrakt für 0 Minuten (Spur 5) oder 240
Minuten (Spur 6), mit ungereinigtem Zytosolextrakt für 240 Minuten (Spur
7), mit durch Ionenaustausch gereinigtem Zytosolextrakt für 240 Minuten
(Spur 8) und mit durch Ionenaus tausch/Gelfiltration gereinigtem
Zytosolextrakt für
240 Minuten (Spur 9). Spur 10: Basenhydrolyseleiter.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Ohne
sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, wird heute geglaubt,
dass man durch die Verwendung bestimmter chemisch modifizierter
oligomerer Verbindungen bestimmte Enzymaktivitäten in eukaryotischen Zellen,
einschließlich
menschlichen Zellen, ausnutzen kann, was aus der unerwarteten Wechselwirkung
dieser Verbindungen mit einem Ziel-RNA-Strang zur Bildung doppelsträngiger RNA-artiger
Strukturen, die durch bestimmte Enzyme gespalten werden, resultiert.
Vordem ist eine solche Aktivität
in eukaryotischen System weder erkannt noch ausgenutzt worden. Es
wurde nun festgestellt, dass die oligomeren Verbindungen der Erfindung gewisse
RNA-artige Merkmale haben, die ihnen ermöglichen, eine doppelsträngige Struktur
mit einer als Ziel gesetzten RNA-Region zu bilden, und diese doppelsträngige Struktur
wird anschließend
von eukaryotischen dsRNasen, d. h. doppelsträngigen RNase-Enzymen, in einer
Zell- oder Testlösung
abgebaut. Durch Verwendung von T24-Krebszellen der menschlichen
Blase als einem veranschaulichenden eukaryotischen Zellsystem wurde
gezeigt, dass diese Aktivität
in vergleichbaren Niveaus sowohl in Zell- als auch zytoplasmatischen
Fraktionen vorliegt.
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Bei
bestimmten veranschaulichenden Methoden, die hierin zur Veranschaulichung
dieser Erfindung bereitgestellt sind, wurde festgestellt, dass diese
Aktivität
nach der Spaltung des RNA-Substrats 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxylgruppen hinterlässt. Diese
Erzeugung von 5'-Phosphat-
und 3'-Hydroxyltermini
ist ein Merkmal, das es mit mehreren anderen Nukleasen gemein hat,
die doppelsträngige
Nukleinsäuremoleküle erkennen, einschließlich RNase
HI und II, die die RNA-Komponente eines DNA:RNA-Doppelstrangs in
E. coli spalten, RNase III, die die Hydrolyse von doppelsträngiger RNA
mit hohem Molekulargewicht katalysiert und den Abbau von Sense/Antisense-Doppelsträngen vermittelt,
und RNase V1.
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Viele
Komponenten von mRNA-Abbausystemen sind zwischen Prokaryoten und
Eukaryoten konserviert worden. Es wurde nun festgestellt, dass wie
prokaryotische Organismen, in denen RNase III den Abbau von Sense/Antisense-Hybriden
zum Regulieren der Expression mancher Gene durchführt, auch
menschliche Zellen eine Aktivität
konserviert haben, die eine ähnliche
Rolle ausführen
kann. Zusätzlich
zu anderen Verwendungszwecken, einschließlich therapeutischen und diagnostischen
Verwendungszwecken, können
die Verbindungen dieser Erfindung dank dieser Aktivität als Reagenzien
für die
Forschung verwendet werden, um dabei zu helfen zu verstehen, wie
menschliche Zellen endogen exprimierte Antisense-Transkripte zum
Modulieren der Genexpression verwenden.
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Die überwiegende
Mehrheit von experimentell verwendeten oder derzeit im klinischen
Gebrauch getesteten Antisense-Oligonukleotiden im Menschen sind
modifizierte Oligodeoxynukleotide. Es wurde gezeigt, dass die zwischen
solchen Oligodeoxynukleotid-Antisense-Verbindungen und ihrer Ziel-RNA
gebildete Heteroduplex von einer intrazellulären Nuklease, RNase H, erkannt
wird, die nur den RNA-Strang
dieses Doppelstrangs spaltet. Obwohl durch RNase H vermittelter
Abbau von Ziel-RNA sich als ein nützlicher Mechanismus erwiesen
hat, hat er gewisse Einschränkungen.
RNase H ist gegenüber
an den Antisense-Oligonukleotiden vorgenommenen strukturellen Modifikationen
hoch empfindlich und folglich haben die meisten der Modifikationen,
die zum Verbessern der therapeutischen Eigenschaften, wie beispielsweise
erhöhte
Affinität,
erhöhte Nukleaseresistenz
und höhere
Zelldurchlässigkeit,
entworfen wurden, zu Oligonukleotiden geführt, die die Spaltung durch
RNase H nicht unterstützen.
Eine weitere Einschränkung
von RNase H als einem Terminationsmechanismus für Antisense-Wirkung ist die
Tatsache, dass die Oligonukleotide DNA-„artig" sein müssen, und dadurch dass sie
DNA-„artig" sind, haben solche
Oligonukleotide eine von Natur aus geringe Affinität zu ihrer
Ziel-RNA. Zum Umgehen dieser geringen Affinität konzipierte Strategien beinhalten
den Entwurf von „Gapmer"-Oligonukleotiden,
die sich aus einer Länge
chemisch modifizierter Oligonukleotide mit hoher Affinität an den
5'- und 3'-Enden (den Schenkeln)
mit einer Länge
unmodifizierter Deoxyoligonukleotide in der Mitte (dem Zwischenteil
oder Gap) zusammensetzen. DNA-Gapmere, d. h. Oligodeoxynukleotid-Gapmere,
haben erheblich höhere
Affinitäten
zu ihrem Ziel als Oligodeoxynukleotide; von der RNase-H-Aktivität ist jedoch
gezeigt worden, dass sie je nach der Größe des DNA-Gaps beeinträchtigt ist.
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Bei
Verwendung von RNase H als einem Terminationsmechanismus mittels
RNA-Abbau muss auch die
zelluläre
Lokalisation und Gewebeverteilung von RNase H berücksichtigt
werden. RNase-H-Aktivität
ist hauptsächlich
zum Zellkern lokalisiert, obwohl sie im Zytoplasma in geringerem
Ausmaß entdeckt
worden ist. Der größte Teil
einer gegebenen mRNA wird im Zytoplasma von Zellen gefunden; folglich
wäre die
ideale, als Terminationsmechanismus auszunutzende Aktivität eine mit
hohem Ausmaß sowohl
im Zellkern als auch im Zytoplasma. RNase-H-Aktivität ist auch
von Zelllinie zu Zelllinie oder zwischen Geweben sehr variabel,
wodurch ein gegebener Krankheitszustand möglicherweise nicht ein guter
Kandidat nur für
den RNA-Abbau ist, da das Zielgewebe unzureichende RNase-H-Aktivität aufweist.
Es ist klar, dass alternative Terminationsmechanismen zum Abbauen
von Ziel-RNA sehr wünschenswert
sind.
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Neben
anderen Verwendungszwecken kann die Aktivität, die nun erkannt wurde, jetzt
als ein alternativer Terminationsmechanismus zu RNase H für Antisense-Therapien ausgenutzt
werden. Es wurde festgestellt, dass die Aktivität durch Verwendung von RNA-artigen
Oligonukleotiden, die eine hohe Affinität zu ihrem Ziel und folglich
eine höhere
Wirksamkeit als DNA-artige Oligonukleotide haben, in menschlichen
Zellen exprimiert werden kann. Das Vorliegen der Aktivität in sowohl
dem Zytoplasma als auch dem Zellkern ermöglicht es, dass die Verbindungen
der Erfindung zum Inhibieren vieler RNA-Verarbeitungsereignisse
vom Prä-mRNA-Kernspleißen und
-Transport bis zum Abbau von reifem Transkript im Zytoplasma verwendet
werden können.
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Um
diese Erfindung zu veranschaulichen und sie mit anderen bekannten
Antisense-Mechanismen,
z. B. RNase H, zu vergleichen, ist die von den Verbindungen der
Erfindung induzierte dsRNase-Aktivität durch Richten dieser auf
das Codon 12 von Ha-ras untersucht worden. Wie in der US-Patentschrift
5,297,248, die der Seriennummer 08/297,248 entspricht, und ihrer
verwandten Anmeldung mit der internationalen Patentanmeldung mit
der Nummer WO 92/22651, am 23. Dezember 1992 veröffentlicht, die beide häufig dieser
Anmeldung zugeordnet werden, beschrieben ist, sind die ras-Onkogene
Mitglieder einer Genfamilie, die verwandte Proteine kodieren, die
zur Innenseite der Plasmamembran lokalisiert sind und von denen
gezeigt wurde, dass sie beim Aminosäuren-Niveau stark konserviert
sind, um GTP mit hoher Affinität
und Spezifität
zu binden und über
GTPase-Aktivität
zu verfügen.
Obwohl die zelluläre
Funktion von ras-Genprodukten unbekannt ist, deuten ihre biochemischen
Eigenschaften, zusammen mit ihrer signifikanten Sequenzhomologie
mit einer Klasse von signalübertragenden
Proteinen, die als GTP-Bindeproteine oder G-Proteine bekannt sind,
an, dass ras-Genprodukte eine wesentliche Rolle bei grundlegenden
Zellregulationsfunktionen spielen, die mit der Transduktion von
extrazellulären
Signalen über
Plasmamembranen hinweg zusammenhängen.
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Drei
ras-Gene, mit H-ras, K-ras und N-ras bezeichnet, sind im Genom eines
Säugers
identifiziert worden. ras-Gene eines Säugers erlangen eine Umformung
induzierende Eigenschaften durch Einzelpunktmutationen mit ihren
kodierenden Sequenzen. Mutationen in natürlich vorkommenden ras-Onkogenen
sind in den Codonen 12, 13 und 61 lokalisiert worden. Die am häufigsten
entdeckte, in Tumoren von Menschen gefundene aktivierende ras-Mutation
ist im Codon 12 des H-ras-Gens, in dem ein Basenwechsel von GGC
zu GTC in einer Substitution von Glycin durch Valin in der GTPase-Regulationsdomäne des ras-Proteinprodukts
resultiert. Von diesem Wechsel einer einzigen Aminosäure wird
vermutet, dass er die normale Steuerung der ras-Proteinfunktion
aufhebt, wodurch ein normal reguliertes Zellprotein zu einem kontinuierlich
aktiven umgewandelt wird. Es wird geglaubt, dass sich eine solche
Deregulation der normalen ras-Proteinfunktion für die Umformung von normalem
zu malignem Wachstum verantwortlich zeichnet.
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Obwohl
die Verbindungen der Erfindung aus Veranschaulichungszwecken gegen
ras-RNA gerichtet sind, ist natürlich
anerkannt, dass eine Menge anderer RNAs ebenfalls als die Ziel-RNA
geeignet sind. Folglich können
die Verbindungen der Erfindung zum Modulieren der Expression einer
beliebigen geeigneten Ziel-RNA, die in Zellen natürlich vorhanden
ist, oder einer beliebigen Ziel-RNA in vitro verwendet werden.
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Der
aus Veranschaulichungszwecken verwendete ras-Zielort ist einer der
am meisten gegenüber RNase
H empfindlichen Oligonukleotidorte, der in der Literatur identifiziert
worden ist. Die selektive Inhibition von mutierten Genen, wie beispielsweise
dem ras-Onkogen, macht die Hybridisierung einer Regulationsverbindung
in der Kodierregion der mRNA erforderlich. Dies bedingt entweder
eine Wechselwirkung mit hoher Affinität zwischen einer solchen Verbindung
und ras-mRNA, um die Verdrängung
der Verbindung durch das Polysom zu verhindern, oder den schnellen
Abbau der Ziel-mRNA durch einen gegebenen Terminationsmechanismus.
Wiederum ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, haben die
RNA-artigen Verbindungen der Erfindung von sich aus eine hohe Affinität und sind
zudem in der Lage, die Aktivität
zellulärer
dsRNase auszunutzen.
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Gemäß der Aufgaben
dieser Erfindung werden neuartige oligomere Verbindungen bereitgestellt,
die sich an einen Ziel-RNA-Strang binden und die Substrate für dsRNase-Enzyme
sind. Die oligomeren Verbindungen der Erfindung beinhalten Oligoribonukleotide,
Oligoribonukleoside und andere oligomere Verbindungen mit einer
darin eingebundenen linearen Sequenz verknüpfter Ribonukleosiduntereinheiten.
Solche anderen oligomeren Verbindungen beinhalten chimäre Strukturen,
die zwischen PNA-Segmenten (PNA = Peptidnukleinsäure) und verknüpften Ribonukleosiden
gebildet werden. Folglich ist der Ausdruck „oligomere Verbindung" für die Zwecke
dieser Patentschrift so zu verstehen, dass er die Ausdrücke „Oligoribonukleotide" und „Oligoribonukleoside", entweder einzeln
oder in Kombination verwendet, als auch andere oligomere Verbindungen
beinhaltet, einschließlich
chimären
Verbindungen, die zwischen PNA-Segmenten (und anderen Surrogat-Nukleosidkomponenten)
und verknüpften
Ribonukleosidsegmenten gebildet werden. Wie in dieser Patentschrift
und den hieran angehängten
Ansprüchen
verwendet, wird der Ausdruck „oligomere
Verbindung" in einer
Hinsicht dazu verwendet, Oligoribonukleotide zu repräsentieren,
in einer anderen Hinsicht, Oligoribonukleoside zu repräsentieren,
in einer noch weiteren Hinsicht, Mischungen aus Oligoribonukleotiden
und Oligoribonukleosiden zu repräsentieren,
und in anderen Fällen,
weitere chimäre
Verbindungen zu bezeichnen, wie beispielsweise die oben identifizierten
chimären
PNA-Verbindungen.
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Die
Oligoribonukleotide und Oligoribonukleoside der Erfindung sind aus
einer Vielzahl von Nukleosiduntereinheiten aufgebaut. In bestimmten
bevorzugten Oligoribonukleotiden oder Oligoribonukleosiden der Erfindung
trägt wenigstens
eine der Nukleosiduntereinheiten eine Substituentengruppe, die die
Bindungsaffinität des
Oligoribonukleotids oder Oligoribonukleosids zu einem komplementären Strang
von Nukleinsäure
erhöht. Darüber hinaus
umfassen wenigstens einige der Nukleosiduntereinheiten 2'-Hydroxylpentofuranosylzuckereinheiten.
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Damit
ein Oligonukleotid für
die zelluläre
Verwendung besonders nützlich
ist, muss das Oligoribonukleotid gegenüber Nukleasen einigermaßen stabil
sein, um in Zellen einen ausreichenden Zeitraum lang zu überleben,
um mit Zielnukleinsäuren
der Zellen wechselwirken zu können.
Daher werden in bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung spezifische Nukleosiduntereinheiten oder Internukleosidverknüpfungen
funktionalisiert oder ausgewählt,
um die Nukleaseresistenz des Oligoribonukleotids oder Oligoribonukleosids
zu erhöhen.
Bei nicht-zellulären
Verwendungszwecken, wie beispielsweise der Verwendung von oligomeren
Verbindungen der Erfindung als Reagenzien für die Forschung und als Diagnostika,
ist eine solche Nukleasestabilität
jedoch möglicherweise
nicht erforderlich.
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Beim
Bestimmen des Ausmaßes
an Bindungsaffinität
einer ersten Nukleinsäure
zu einer komplementären
Nukleinsäure
kann die relative Fähigkeit
der ersten Nukleinsäure,
sich an die komplementäre
Nukleinsäure
zu binden, durch Bestimmen der Schmelztemperatur eines bestimmten
Hybridisierungskomplexes verglichen werden. Die Schmelztemperatur
(Tm), eine charakteristische physikalische
Eigenschaft doppelsträngiger
Nukleotide, zeigt die Temperatur an (in Grad Celsius), bei der 50%
helikale Formen (hybridisiert) gegenüber Spiralformen (nicht hybridisiert)
vorliegen. Tm wird durch Verwendung des
UV-Spektrums gemessen, um die Bildung und das Zerfallen (Schmelzen)
des Hybridisierungskomplexes zu bestimmen. Basenstapelung, die während der
Hybridisierung auftritt, wird von einer Verminderung der UV-Absorption
(Hypochromie) begleitet. Infolgedessen deutet eine Verminderung
der UV-Absorption auf eine höhere
Tm hin. Je höher die Tm ist,
desto größer ist
die Festigkeit der Bindungen zwischen den Strängen.
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Es
wurde in der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass die Bindungsaffinität von Oligoribonukleotiden
und Oligoribonukleosiden der vorliegenden Erfindung durch Einbinden
von Substituentengruppen in die Nukleosiduntereinheiten dieser Verbindungen
erhöht
werden kann. Bevorzugte Substituentengruppen sind 2'-Substituentengruppen, d. h. Substituentengruppen,
die an der 2'-Stellung
der Pentofuranosylzuckereinheiten der Nukleosiduntereinheiten der
Verbindungen der vorliegenden Erfindung angeordnet sind. Derzeit
bevorzugte Substituentengruppen beinhalten Fluor, Alkoxy, Aminoalkoxy,
Allyloxy, Imidazolylalkoxy und Polyethylenglykol. Alkoxy- und Aminoalkoxygruppen
beinhalten im Allgemeinen Niederalkylgruppen, insbesondere C1-C9-Alkyl. Polyethylenglykole
sind von der Struktur (O-CH2-CH2)n-O-Alkyl. Eine besonders bevorzugte Substituentengruppe
ist ein Polyethylenglykolsubstituent der Formel (-O-CH2-CH2)-O-Alkyl, worin n = 1 und Alkyl = CH3. Von dieser Modifizierung wurde gezeigt,
dass sie sowohl die Affinität
eines Oligonukleotids für
sein Ziel als auch die Nukleaseresistenz eines Oligonukleotids erhöht.
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Eine
weiter besonders nützliche
2'-Substituentengruppe
zum Erhöhen
der Bindungsaffinität
ist die 2'-Fluorgruppe.
In einer veröffentlichten
Studie (Synthesis and Biophysical Studies of 2'-dR180-F Modified Oligonucleotides,
Conference on Nucleic Acid Therapeutics, Clearwater, FL, USA, 13.
Januar 1991) wurde von einem Anstieg der Bindungsaffinität von 1,6°C pro substituierter
Nukleosiduntereinheit bei einem 15-mer-Phosphodiesteroligonukleotid
mit 2'-Fluorsubstituentengruppen
an fünf
der Nukleosiduntereinheiten des Oligonukleotids berichtet. Wenn
11 der Nukleosiduntereinheiten des Oligonukleotids 2'-Fluorsubstituentengruppen
trugen, stieg die Bindungsaffinität auf 1,8°C pro substituierter Nukleosiduntereinheit
an. In dieser Studie wurde das 15-mer-Phosphodiesteroligonukleotid
zum entsprechenden Phosphortioatanalogon derivatisiert. Wenn das
15-mer-Phosphodiesteroligonukleotid mit seinem Phosphorthioatanalogon
verglichen wurde, hatte das Phosphorthioatanalogon eine Bindungsaffinität von nur
etwa 66% der des 15-mer-Phosphodiesteroligonukleotids.
In anderen Worten, beim Derivatisieren des Oligonukleotids zu seinem
Phosphorthioatanalogon ging Bindungsaffinität verloren. Wenn sich jedoch
2'-Fluorsubstituenten
an 11 der Nukleosiduntereinheiten des 15-mer-Phosphodiesteranalogums befanden,
wurde die verzeichnete Abnahme durch Derivatisieren des 15-mer-Oligonukleotids
zu seinem Phosphorthioatanalogon durch die Bindungsaffinität der 2'-Substituentengruppen
mehr als überwunden.
In dieser Verbindung, d. h. dem 15-mer-Phosphodiesteroligonukleotid
mit 11 mit 2'-Fluorsubstituentengruppen
substituierten Nukleosiduntereinheiten, wurde die Bindungsaffinität auf 2,5°C pro Substituentengruppe
erhöht.
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Zur
Verwendung bei der Herstellung der Nukleosidstrukturuntereinheiten
der Verbindungen der Erfindung geeignete Nukleobasen zur Einbindung
in diesen Nukleosiduntereinheiten beinhalten Purine und Pyrimidine,
wie beispielsweise Adenin, Guanin, Cytosin, Uridin und Thymin, als
auch andere synthetische und natürliche
Nukleobasen, wie beispielsweise Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin,
6-Methyl- und andere
Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Propyl- und andere Alkylderivate
von Adenin und Guanin, 5-Halogenuracil und -cytosin, 5-Propinyluracil
und -cytosin, 6-Azouracil, -cytosin und -thymin, 5-Uracil (Pseudouracil),
4-Thiouracil, 8-Halogen-, -Amino-, -Thiol-, -Thioalkyl-, -Hydroxyl-
und andere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Trifluormethyl-
und andere 5-substituierte Uracile und Cytosine, 7-Methylguanin.
Weitere Purine und Pyrimidine beinhalten jene, die in der US-Patentschrift
3,687,808 offenbart sind, jene, die in der Concise Encyclopedia
Of Polymer Science And Engineering, Seiten 858–859, J. I. Kroschwitz, Hrsg.
John Wiley & Sons,
1990, offenbart sind, und jene, die von Englisch et al., Angewandte
Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, offenbart werden.
Bestimmte dieser Nukleobasen sind besonders zum Erhöhen der
Bindungsaffinität
der oligomeren Verbindungen der Erfindung von Nutzen. Diese beinhalten
5-substituierte Pyrimidine, 6-Azapyrimidine und N-2-, N-6- und O-6-substituierte
Purine, einschließlich
2-Aminopropyladenin,
5-Propinyluracil und 5-Propinylcytosin. Von anderen modifizierten
Pyrimidin- und Purinbasen wird ebenfalls erwartet, dass sie die
Bindungsaffinität von
oligomeren Verbindungen zu einem komplementären Strang von Nukleinsäure erhöhen.
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Gemäß dieser
Erfindung bevorzugte Oligoribonukleotide und Oligoribonukleoside
umfassen vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 50 Nukleosiduntereinheiten.
Im Rahmen dieser Erfindung versteht sich, dass dies nicht-natürlich vorkommende
Oligomere wie hierin zuvor beschrieben umfasst, die 5 bis 50 Nukleosiduntereinheiten
aufweisen. Es ist mehr bevorzugt, dass die Oligoribonukleotide und
Oligoribonukleoside der vorliegenden Erfindung etwa 15 bis etwa
25 Nukleosiduntereinheiten umfassen. Wie man zu schätzen wissen
wird, ist eine Nukleosiduntereinheit eine Kombination aus Nukleobase
und Zucker oder Zuckersurrogat, die auf geeignete Weise durch Phosphorverknüpfungen
bei Oligoribonukleotiden und durch Nicht-Phosphorverknüpfungen bei
Oligoribonukleosiden an benachbarte Untereinheiten gebunden ist.
In diesem Zusammenhang wird der Ausdruck „Nukleosiduntereinheit" austauschbar mit
dem Ausdruck „Nukleosideinheit" oder „Nukleosid" verwendet.
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Die
Oligoribonukleotide der Erfindung weisen ihre Nukleosiduntereinheiten
durch Phosphorverknüpfungen
verbunden auf, einschließlich
Phosphodiester, Phosphorthioat, 3'-(oder 5'-)Deoxy-3'-(oder -5'-)thiophosphorthioat, Phosphordithioat,
Phosphorselenate, 3'-(oder
5'-)Deoxyphosphinate,
Boranphosphate, 3'-(oder
5'-)Deoxy-3'-(oder -5'-)aminophosphoramidate,
Hydrogenphosphanate, Boranphosphatester, Phosphoramidate, Alkyl-
oder Arylphosphonate und Phosphotriesterphosphorverknüpfungen.
Die Oligoribonukleoside der Erfindung dagegen weisen ihre Nukleosiduntereinheiten
durch Carbonat-, Carbamat-, Silyl-, Schwefel-, Sulfonat-, Sulfonamid-,
Formacetal-, Thioformacetal-, Oxim-, Methylenimino-, Methylenmethylimino-,
Methylenhydrazo-, Methylendimethylhydrazo- und Methylenoxymethyliminoverknüpfungen
verbunden auf.
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Um
eine dsRNase-Reaktion in der gesamten Sequenzlänge der oligomeren Verbindungen
der Erfindung auszulösen,
wird ein Segment oder eine Teilsequenz von mehr als drei, aber vorzugsweise
vier, fünf
oder mehr aufeinander folgend verknüpften, 2'-Hydroxylpentofuranosyl enthaltenden
Nukleosiduntereinheiten vorliegen. Es ist derzeit bevorzugt, die
2'-Hydroxylpentofuranosyl
enthaltende Nukleosidteilsequenz in der oligomeren Verbindung derart
einzubinden, dass weitere Teilsequenzen bzw. Segmente der oligomeren
Verbindung zu beiden Seiten der 2'-Hydroxylpentofuranosyl
enthaltenden Nukleosidteilsequenz angeordnet sind. Bei einer solchen
Konstruktion wird die 2'-Hydroxylpentofuranosyl
enthaltende Nukleosidteilsequenz auch als die „mittlere" oder „Gap"-Region bzw. das „mittlere" oder „Gap"-Segment bezeichnet und die anderen
Nukleosidteilsequenzen bzw. -segmente werden als „Flanken"- oder „Schenkel"-Regionen bzw. -Segmente
bezeichnet. Folglich wird die „Gap"-Region zu beiden
Seiten von Schenkeln flankiert. Andere Konstruktionen sind ebenfalls möglich, einschließlich dem
Anordnen der 2'-Hydroxylpentofuranosyl
enthaltenden Nukleosidteilsequenz an entweder dem 3'- oder dem 5-Terminus der oligomeren
Verbindung der Erfindung. Diese anderen Konstruktionen können als „offene", „gapped" Strukturen betrachtet
werden, d. h. die Gap-Region ist am Ende (entweder dem 3'- oder dem 5'-Ende) der oligomeren
Verbindung offen.
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Die
gemäß dieser
Erfindung verwendeten Oligoribonukleotide und Oligoribonukleoside
können
in geeigneter Weise und routinemäßig mittels
der wohl bekannten Technik der Festphasensynthese hergestellt werden,
siehe beispielsweise „Oligonucleotide
synthesis, a practical approach",
Hrsg. M. J. Gait, IRL Press, 1984; „Oligonucleotides and Analogues,
A Practical Approach",
Hrsg. F. Eckstein, IRL Press, 1991 (insbesondere Kapitel 1: Modern
machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis, Kapitel
2: Oligoribonucleotide synthesis, Kapitel 3: 2'-O-Methyloligoribonucleotides: synthesis
and applications, Kapitel 4: Phosphorothioate oligonucleotides,
Kapitel 5: Synthesis of oligonucleotide phosphorodithioates, Kapitel
6: Synthesis of oligo-2'-deoxyribonucleoside
methylphosphonates und Kapitel 7: Oligodeoxynucleotides containing
modified bases). Andere besonders dienliche Synthesemethoden, Reagenzien,
Blockierungsgruppen und Reaktionsbedingungen sind in P. Martin,
Helv. Chim. Acta., 1995, 78, 486–504; S. L. Beaucage und R.
P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223–2311, und S. L. Beaucage und
R.P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123–6194, oder darin genannten
Referenzen beschrieben.
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Einrichtungen
zur Oligonukleotid- und Oligonukleosidsynthese werden von mehreren
Händlern
verkauft, darunter Applied Biosystems. Auch verschiedene Amitid-Reagenzien sind im
Handel erhältlich,
darunter 2'-O-Methylamidite
und 2'-O-Hydroxylamidite.
Es können
auch beliebige andere Mittel für
eine solche Synthese eingesetzt werden. Die eigentliche Synthese
der Oligonukleotide liegt sehr gut innerhalb der Fähigkeiten von
Fachmännern.
Es ist ebenfalls wohl bekannt, ähnliche
Techniken zum Herstellen anderer Oligonukleotide, wie beispielsweise
der Phosphorthioate und alkylierten Derivate, zu verwenden. Es ist
auch wohl bekannt, ähnliche
Techniken und im Handel erhältliche
modifizierte Amidite und CPG-Produkte
(CPG = controlled-pore glass, Glas mit kontrollierter Porengröße), wie
beispielsweise mit Biotin, Fluoreszein, Acridin oder Psolaren modifizierte
Amidite und/oder CPG (von Glen Research, Sterling, VA, USA, erhältlich),
zu verwenden, um fluoreszierend markierte, biotinylierte oder andere
konjugierte Oligonukleotide zu synthetisieren.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Ribonuklease eines Säugers, die
aus menschlichen T24-Zellen und anderen Zelllinien isolierbar ist
und die RNA in einem Antisense-Oligoribonukleotid:RNA-Doppelstrang
abbaut. Die Ribonuklease wird hierin als ein dsRNase bezeichnet,
wobei „ds" die Spezifität der RNase
zu doppelsträngigen
RNA-Substraten anzeigt. Antisense-Oligodeoxynukleotide, die mit
2'-Methoxy modifizierte
Zuckereinheiten enthalten, binden mit hoher Affinität an ihre
zellulären
mRNA-Ziele, die resultierenden [„DNA-artig"]:[RNA]-Doppelstränge sind jedoch keine Substrate
für nukleolytischen
Abbau in T24-Zellen. Wie in den Beispielen ausführlich beschrieben ist, wurden
2'-Methoxyphosphorthioat-Antisense-Oligonukteotide,
die gegen das Codon 12 von Ha-ras-mRNA gerichtet sind, durch Substituieren
von 2'-Methoxynukleotiden
mit einer Länge
von Ribonukleotiden in der Mitte des Oligonukleotids modifiziert,
um chimäre
2'-Methoxy/Ribo/2'-Methoxy- oder „Gapmer"-Nukleotide zu bilden,
wobei die Phosphorthioatverknüpfung
in den gesamten Molekülen aufrechterhalten
wird. Diese „RNA-artigen" Gapmer-Oligonukleotide binden
an ihr zelluläres
mRNA-Ziel mit einer Affinität,
die mit der des vollständigen
2'-Methoxyoligodeoxynukleotid
vergleichbar ist; die resultierenden [„RNA-artig"]:[RNA]-Doppelstränge sind jedoch im Gegensatz
zu den [„DNA-artig"]:[RNA]-Doppelsträngen Substrate
für nukleolytischen
Abbau in T24-Zellen. Der Abbau des [„RNA-artiges" Antisense-Gapmer-Oligonukleotid]:[Ha-ras-mRNA]-Doppelstrangs hängt von
der Anzahl der in das Antisense-Molekül eingebundenen Ribonukleotide
ab. Ein 17-Basenpaar-9-RNA-Gapmer-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrang ist
kein Substrat für RNase-H-Abbau,
ist aber ein Substrat für
die Spaltung durch eine dsRNase der Erfindung in T24-Zelllysaten. Darüber hinaus
werden die bei T24-Zelllysaten erkannten Spaltungsorte zum RNA:RNA-Teil
des Doppelstrangs lokalisiert und werden nicht im 2'-Methoxy:RNA-Teil
des Doppelstrangs erkannt. Die Spaltung des Doppelstrangs durch
die dsRNase der Erfindung produziert 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxyltermini.
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Verbindungen
der Erfindung können
als Diagnostika, Therapeutika und Reagenzien und Kits für die Forschung
verwendet werden. Sie können
in pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden, indem eine
wirksame Menge einer Verbindung der Erfindung zu einem geeigneten
pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmittel oder Trägerstoff
gegeben wird. Sie können
weiterhin zum Behandeln von Organismen verwendet werden, die eine
Krankheit haben, die durch die unerwünschte Erzeugung eines Proteins
gekennzeichnet ist. Der Organismus kann mit einer Verbindung der
Erfindung in Kontakt gebracht werden, die eine Sequenz aufweist,
die spezifisch mit einem Strang von Zielnukleinsäure hybridisieren kann, die
für das
unerwünschte
Protein kodiert.
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Von
der Formulierung von therapeutischen Zusammensetzungen und deren
anschließender
Verabreichung wird geglaubt, dass sie innerhalb der Fähigkeiten
von Fachmännern
liegen. Im Allgemeinen wird bei der Therapeutik einem Patienten,
der einer solchen Therapie bedarf, eine erfindungsgemäße Verbindung
verabreicht, üblicherweise
in einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff, in Dosen im Bereich
von 0,01 μg bis
100 g pro kg Körpergewicht
je nach Alter des Patienten und der Schwere des behandelten Krankheitszustands.
Weiterhin kann das Behandlungsregime einen Zeitraum lang währen, der
je nach der Natur der bestimmten Krankheit, ihrer Schwere und dem
Gesamtzustand des Patienten variieren wird, und kann sich von einmal
täglich
bis zu einmal alle 20 Jahre erstrecken. Nach der Behandlung wird
der Patient auf Änderungen seines
Zustands und auf Linderung der Symptome des Krankheitszustands überwacht.
Die Dosierung der Verbindung kann entweder im Fall, dass der Patient
nicht signifikant auf derzeitige Dosierungsniveaus anspricht, erhöht werden
oder die Dosis kann verringert werden, wenn eine Linderung der Symptome
des Krankheitszustands beobachtet wird oder wenn der Krankheitszustand
nicht mehr besteht.
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In
einigen Fällen
kann es effektiver sein, einen Patienten mit einer Verbindung der
Erfindung zusammen mit anderen herkömmlichen therapeutischen Modalitäten zu behandeln.
Einem Patienten, der aufgrund einer Viruserkrankung behandelt wird,
kann beispielsweise eine Verbindung der Erfindung zusammen mit einem
bekannten Antivirusmittel verabreicht werden oder ein Patient mit
Atherosklerose kann nach Angioplastik mit einer Verbindung der Erfindung
behandelt werden, um eine Reokklusion der behandelten Arterien zu
verhindern.
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Nach
erfolgreicher Behandlung kann es wünschenswert sein, den Patienten
einer Erhaltungstherapie zu unterziehen, um das Wiederauftreten
des Krankheitszustands zu verhindern, wobei die Verbindung der Erfindung
in Erhaltungsdosen verabreicht wird, im Bereich von 0,01 μg bis 100
g pro kg Körpergewicht,
einmal oder mehrmals täglich
bis zu einmal alle 20 Jahre.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf
eine Reihe von Weisen verabreicht werden, in Abhängigkeit davon, ob eine lokale
oder systemische Behandlung erwünscht ist,
und vom zu behandelnden Bereich. Die Verabreichung kann topisch
(einschließlich
ophthalmitisch, vaginal, rektal, intranasal, transdermal), oral
oder parenteral sein. Parenterale Verabreichung beinhaltet Tropfinfusion, subkutane,
intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion oder intrathekale
oder intraventrikuläre
Verabreichung.
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Formulierungen
zur topischen Verabreichung können
Transdermalpflaster, Salben, Lotionen, Cremes, Gele, Tropfen, Suppositorien,
Sprays, Flüssigkeiten
und Pulver beinhalten. Herkömmliche
pharmazeutische Trägerstoffe,
wässrige,
pulvrige oder ölige
Grundstoffe, Verdickungsmittel und dergleichen können erforderlich oder wünschenswert
sein. Beschichtete Kondome, Handschuhe und dergleichen können ebenfalls
von Nutzen sein.
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Zusammensetzungen
zur oralen Verabreichung beinhalten Pulver oder Granulate, Suspensionen
oder Lösungen
in Wasser oder nicht-wässrige
Medien, Kapseln, Briefchen oder Tabletten. Verdickungsmittel, Geschmacksstoffe,
Verdünnungsmittel,
Emulgiermittel, Dispergierhilfsmittel oder Bindemittel können wünschenswert
sein.
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Zusammensetzungen
zur intrathekalen oder intraventrikulären Verabreichung können sterile
wässrige Lösungen beinhalten,
die auch Puffer, Verdünnungsmittel
und andere geeignete Additive beinhalten können.
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Formulierungen
zur parenteralen Verabreichung können
sterile wässrige
Lösungen
beinhalten, die auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete
Additive beinhalten können.
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Die
Dosierung hängt
von der Schwere und dem Ansprechen des zu behandelnden Krankheitszustands
ab, wobei der Behandlungsverlauf von mehreren Tagen bis zu mehreren
Monaten dauert oder bis eine Heilung bewirkt oder eine Verminderung
des Krankheitszustands erzielt worden ist. Optimale Dosierungsschemata
können
aus Messungen der Arzneimittelansammlung im Körper des Patienten berechnet
werden. Durchschnittsfachmänner
können
optimale Dosierungen, Dosierungsmethodologien und Wiederholungsraten
leicht bestimmen. Optimale Dosierungen können je nach der relativen
Wirksamkeit einzelner Verbindungen variieren und können im
Allgemeinen auf Grundlage von EC50-Werten
abgeschätzt
werden, die als in In-vitro- und
In-vivo-Tiermodellen effektiv befunden worden sind. Im Allgemeinen
beträgt
die Dosierung von 0,01 μg
bis 100 g pro kg Körpergewicht
und kann einmal oder mehrmals täglich,
wöchentlich,
monatlich oder jährlich
oder sogar einmal alle 2 bis 20 Jahre verabreicht werden.
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Eine
solche Behandlung kann in einer Vielfalt von Organismen ausgeübt werden,
die von einzelligen prokaryotischen und eukaryotischen Organismen
bis hin zu mehrzelligen eukaryotischen Organismen reichen. Jeder
Organismus, der DNA-RNA-Transkription
oder RNA-Protein-Translation als einen grundlegenden Teil seiner
heriditären,
metabolischen oder zellulären
Maschinerie einsetzt, ist für
eine solche diagnostische, therapeutische und/oder prophylaktische
Behandlung empfänglich.
Scheinbar verschiedene Organismen, wie beispielsweise Bakterien,
Hefe, Protozoen, Algen, Pflanzenformen und Formen höherer Tiere,
einschließlich Warmblütern, können auf
diese Weise behandelt werden. Weiterhin können, da jede der Zellen von
mehrzelligen Eukaryoten ebenfalls sowohl DNA-RNA-Transkription als
auch RNA-Protein-Translation als einen integralen Teil ihrer zellulären Aktivität enthält, solche
Therapeutiken und/oder Diagnostiken an solchen Zellpopulationen
ausgeübt
werden. Des Weiteren enthalten viele der Organellen, z. B. Mitochondrien
und Chloroplasten, von Eukaryotenzellen ebenfalls Transkriptions-
und Translationsmechanismen. Als solche können auch einzelne Zellen,
Zellpopulationen oder Organellen in die Definition von Organismen
einbezogen werden, die mit den therapeutischen oder diagnostischen
Verbindungen der Erfindung behandelt werden können. Wie hierin verwendet,
soll Therapeutik das Auslöschen
eines Krankheitszustands, Abtöten
eines Organismus, z. B. einer bakteriellen, Protozoen- oder anderen Infektion,
oder die Kontrolle von aberrierenden oder unerwünschtem zellulärem Wachstum
oder Expression beinhalten.
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Im
Rahmen dieser Erfindung soll „Ziel-RNA" jede RNA bedeuten,
die mit einer komplementären
nukleinsäureartigen
Verbindung hybridisieren kann. Weiterhin im Rahmen dieser Erfindung
soll „Hybridisierung" Wasserstoffbrückenbindung,
bei der es sich um Watson-Crick-, Hoogsteen- oder umgekehrte Hoogsteen-Wasser stoffbrückenbindung
handeln kann, zwischen komplementären Nukleobasen bedeuten. „Komplementär", wie es hierin verwendet
wird, bezieht sich auf die Fähigkeit
zur präzisen
Paarbildung zwischen zwei Nukleobasen. Adenin und Thymin beispielsweise
sind komplementäre
Nukleobasen, die durch die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen
ein Paar bilden. „Komplementär" und „spezifisch
hydrisierbar", wie
sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf präzise Paarbildung
oder Sequenzkomplementarität
zwischen einem ersten und einem zweiten nukleinsäureartigen, Nukleosiduntereinheiten
enthaltenden Oligomer. Wenn beispielsweise eine Nukleobase an einer
bestimmten Position an der ersten Nukleinsäure zur Wasserstoffbrückenbindung mit
einer Nukleobase an der gleichen Stellung an der zweiten Nukleinsäure in der
Lage ist, werden die erste Nukleinsäure und die zweite Nukleinsäure als
zueinander an dieser Position komplementär betrachtet. Die erste und
die zweite Nukleinsäure
sind zueinander komplementär,
wenn eine ausreichende Anzahl von übereinstimmenden Positionen
in jedem Molekül
von Nukleobasen belegt ist, die sich durch Wasserstoffbrückenbindung
miteinander verbinden können.
Somit sind „spezifisch
hybridisierbar" und „komplementär" Ausdrücke, die zum
Anzeigen eines ausreichenden Grads an Komplementarität, so dass
eine stabile und spezifische Bindung zwischen einer Verbindung der
Erfindung und einem Ziel-RNA-Molekül erfolgt, verwendet werden.
Es versteht sich, dass eine oligomere Verbindung der Erfindung nicht
zu 100% mit ihrer Ziel-RNA-Sequenz komplementär sein muss, um spezifisch
hybridisierbar zu sein. Eine oligomere Verbindung ist spezifisch
hybridisierbar, wenn die Bindung der oligomeren Verbindung an das
Ziel-RNA-Molekül
die normale Funktion der Ziel-RNA so stört, dass ein Verlust des Nutzens
verursacht wird, und ein ausreichender Grad an Komplementarität vorliegt,
um eine nicht-spezifische Bindung der oligomeren Verbindung an Nicht-Zielsequenzen
unter Bedingungen zu verhindern, bei denen eine spezifische Bindung
erwünscht
ist, d. h. unter physiologischen Bedingungen im Fall von in-vivo-Assays
oder therapeutischer Behandlung oder im Fall von In-vitro-Assays, unter Bedingungen,
bei denen die Assays durchgeführt
werden.
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Die
folgenden Beispiele und Methoden veranschaulichen die vorliegende
Erfindung und sollen diese nicht einschränken. Beim Veranschaulichen
der Erfindung identifiziert Beispiel 1 bestimmte handelsübliche Nukleosidamidite
und andere zusätzliche
Nukleosidamidite, die zur Herstellung von bestimmten veran schaulichenden
Oligoribonukleotid- oder Oligoribonukleosid-Verbindungen der Erfindung
von Nutzen sind. Die Beispiele 2 bis 5 veranschaulichen die Herstellung
weiterer Nukleosidamidite zur Verwendung beim Herstellen anderer
veranschaulichender Oligoribonukleotid- oder Oligoribonukleosid-Verbindungen
der Erfindung. Beispiel 6 veranschaulicht die Herstellung von Oligoribonukleotid-Verbindungen der
Erfindung. Beispiel 7 veranschaulicht die Herstellung von Oligoribonukleosid-Verbindungen
der Erfindung. Die Beispiele 8 bis 16 veranschaulichen die Herstellung
von chimären
oligomeren Verbindungen der Erfindung, einschließlich bestimmter „Gapmere", d. h. Verbindungen
mit „Gap"- und „Schenkel"-Konstruktionen.
Die Beispiele 17 bis 18 veranschaulichen bestimmte nützliche
Aspekte der Verbindungen der Erfindung. Die Beispiele 19 bis 28
veranschaulichen die Identifizierung, Charakterisierung und Reinigung
der doppelsträngigen
Ribonukleasen (dsRNasen) der Erfindung. Beispiel 29 veranschaulicht
Affinitätssäulen, die
die dsRNase-Substrate der Erfindung einbinden.
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In
den veranschaulichenden Beispielen werden mehrere verschiedene Typen
von „Gapmeren" ausführlich beschrieben.
Diese beinhalten einen ersten Typ, wobei das „Gap"-Segment verknüpfter Nukleoside zwischen 5'- und 3'-„Schenkel"-Segmenten verknüpfter Nukleoside positioniert
ist, und einen zweiten Typ „mit offenem
Ende", in dem das „Gap"-Segment an entweder
dem 3'- oder dem
5'-Terminus der
oligomeren Verbindung angeordnet ist. In den veranschaulichenden
Beispielen werden bei allen chimären
Oligoribonukleotiden und Oligoribonukleosiden, sofern nicht anders
angegeben, 2'-O-Methylnukleoside
in den „Schenkel"-Segmenten und 2'-OH-Nukleoside in den „Gap"-Segmenten der jeweiligen
Oligoribonukleotide oder Oligoribonukleoside eingesetzt.
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Für die Zwecke
der veranschaulichenden Beispiele werden die folgenden Kurzformelrichtlinien
verwendet. In Klammern, d. h. [ ], dargelegte Strukturen sind Nukleosidabkürzungen,
wohingegen auf einen Schrägstrich,
d. h. /, folgende dargelegte Strukturen Verknüpfer sind, die zum Verbinden
der Nukleoside verwendet werden, d. h. Hauptkettenstrukturen, die
die Nukleoside in entweder Oligoribonukleotid- oder Oligoribonukleosid-Verbindungen
miteinander verknüpfen.
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Unter
Verwendung dieser Nomenklatur werden die folgenden Abkürzungen
für Phosphatverknüpfungen
zwischen Nukleosiden verwendet: Es werden PO für Phosphodiester, PS für Phosphorthioat,
P2S für Phosphordithioat,
PSe für
Phosphorselenate, PMe für
Methylphosphonat, POMe für
Methylphosphotriester, PN für
Phosphoramidat, 3'NPN
für 3'-Deoxy-3'-aminophosphoramidat,
PI für
Phosphinat, McPS für
Alkylphosphonothioat und BP für
Boranphosphat verwendet. Für
Nicht-Phosphatverknüpfungen
zwischen Nukleosiden sind die verwendeten Abkürzungen: MMI für Methylenmethylimino,
MDH für
Methylendimethylhydrazo, FA für Formacetal,
TFA für
Thioformacetal, ETO für
Ethylenoxid und Amid-3 für
Methylcarbonylamino. 2'-OH
wird als eine Abkürzung
für unmodifizierte
Ribozucker, d. h. Pentoribofuranosylzucker, verwendet. Für modifizierte
Nukleoside sind die verwendeten Abkürzungen: 2'-O-Alkyl für allgemeine Alkylgruppen an
der 2'-Stellung einer Pentoribofuranosyleinheit,
wobei spezifisches Alkyl als 2'-O-Me,
2'-O-Et, 2'-O-Pr und 2'-O-EtOMe für Methyl, Ethyl,
Propyl bzw. Methoxyethyl bezeichnet wird; 2'-F für
eine Fluoreinheit an der 2'-Stellung
einer Pentoribofuranosyleinheit, Mod-Purin für eine Purin-Nukleobasensubstitution,
wie beispielsweise gemäß der Offenbarung
der US-Patentschrift 5,459,255; und Mod-Pyr für eine Pyrimidin-Nukleobasensubstitution,
wie beispielsweise gemäß der Offenbarung
der US-Patentschrift
5,484,908; und SS für
ein Zuckersurrogat, wie beispielsweise gemäß der Offenbarung der US-Patentschrift
5,359,044.
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BEISPIEL 1
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Amidite für die Oligonukleotid-/Oligonukleosidsynthese
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2'-O-Methylnukleosidamidite
und 2'-OH-Nukleosidamidite
(als 2'-tert.-Butyldimethylsilylderivat
blockiert) sind von Glen Research, Sterling, VA, USA, erhältlich.
Andere 2'-O-Alkyl-substituierte
Nukleosidamidite werden hergestellt, wie in den US-Patentschriften
5,506,351, 5,466,786 oder 5,514,786 beschrieben ist, die hierin
durch Bezugnahme aufgenommen sind. Cyclobutylzuckersurrogatverbindungen
werden hergestellt, wie in der US-Patentschrift 5,359,044 beschrieben
ist, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. Pyrrolidinzuckersurrogate
werden hergestellt, wie in der US-Patentschrift 5,519,134 beschrieben
ist, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. Morpholinozuckersurrogate
werden hergestellt, wie in den US-Patentschriften 5,142,047 und
5,235,033, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind, und anderen verwandten
Patentoffenbarungen beschrieben ist. N-2-substituierte Purinnukleosidamidite
werden hergestellt, wie in der US-Patentschrift 5,459,255 beschrieben
ist, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. 3-Deazapurinnukleosidamidite
werden hergestellt, wie in der US-Patentschrift 5,457,191 beschrieben
ist, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. 5,6-substituierte
Pyrimidinnukleosidamidite werden hergestellt, wie in der US-Patentschrift
5,614,617 beschrieben ist, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen
ist. 5-Propinylpyrimidinnukleosidamidite werden hergestellt, wie
in der US-Patentschrift 5,484,908 beschrieben ist, die hierin durch
Bezugnahme aufgenommen ist.
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BEISPIEL 2
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2'-O-(Methoxyethyl)nukleosidamidite
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2'-O-Ethyl-O-methyl-substituierte
Nukleosidamidite werden wie in den Beispielen 2-a bis 2-h folgt
hergestellt oder alternativ gemäß der Verfahren
von P. Martin, Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486–504.
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BEISPIEL 2-a
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2,2'-Anhydro-[1-(β-D-arabinofuranosyl)-5-methyluridin]
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5-Methyluridin
(Ribosylthymin, im Handel erhältlich
von Yamasa, Choshi, Japan) (72,0 g, 0,279 M), Diphenylcarbonat (90,0
g, 0,420 M) und Natriumhydrogencarbonat (2,0 g, 0,024 M) wurden
zu DMF (300 ml) gegeben. Das Gemisch wurde unter Rühren zum
Rückfluss
erhitzt, was ermöglichte,
dass das entstehende Kohlenstoffdioxidgas kontrolliert freigesetzt
werden konnte. Nach 1 Stunde wurde die leicht verdunkelte Lösung unter
vermindertem Druck eingeengt. Der resultierende Sirup wurde unter
Rühren
in Diethylether (2,5 l) gegossen. Das Produkt bildete ein Gummi.
Der Ether wurde dekantiert und der Rückstand wurde in einer minimalen Menge
an Methanol (ca. 400 ml) gelöst.
Die Lösung
wurde in frischen Ether (2,5 l) gegossen, um ein starres Gummi zu
erzielen. Der Ether wurde dekantiert und das Gummi wurde in einem
Vakuumofen getrocknet (60°C bei
1 mm Hg für
24 h), um einen Feststoff zu erhalten, der zu einem hellbraunen
Pulver zerstoßen
wurde (57 g, Rohausbeute: 85%). Das NMR-Spektrum war mit der Struktur
konsistent, mit Phenol als seinem Natriumsalz verunreinigt (ca.
5%). Das Material wurde als solches für weitere Reaktionen verwendet
(oder es kann weiter durch Säulenchromatographie
unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Essigsäureethylester (10–25%) gereinigt
werden, um einen weißen
Feststoff zu erhalten, Fp. 222–224°C).
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BEISPIEL 2-b
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2'-O-Methoxyethyl-5-methyluridin
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2,2'-Anhydro-5-methyluridin
(195 g, 0,81 M), Tris-(2-methoxyethyl)borat (231 g, 0,98 M) und
2-Methoxyethanol (1,2 l) wurden in einen 2-l-Edelstahldruckgefäß gegeben
und dieser in ein zuvor erhitztes Ölbad bei 160°C gestellt.
Nach Erhitzen für
48 Stunden bei 155–160°C wurde das
Gefäß geöffnet und
die Lösung
zur Trockne eingedampft und es wurde mit MeOH (200 ml) verrieben.
Der Rückstand
wurde in heißem
Aceton (1 l) suspendiert. Die unlöslichen Salze wurden filtriert,
mit Aceton (150 ml) gewaschen und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand
(280 g) wurde in CH3CN (600 ml) gelöst und eingedampft.
Eine Kieselgelsäule
(3 kg) wurde in CH2Cl2/Aceton/MeOH
(20:5:3), das 0,5% Et3NH enthielt, gepackt.
Der Rückstand
wurde in CH2Cl2 (250
ml) gelöst
und auf Kieselgel (150 g) adsorbiert, bevor es auf die Säule geladen
wurde. Das Produkt wurde mit dem Packungslösungsmittel eluiert, um 160
g (63%) des Produkts zu erhalten. Zusätzliches Material wurde mittels
erneuten Aufarbeitens unreiner Fraktionen erhalten.
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BEISPIEL 2-c
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2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin
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2'-O-Methoxyethyl-5-methyluridin
(160 g, 0,506 M) wurde mit Pyridin (250 ml) koevaporiert und der
getrocknete Rückstand
in Pyridin (1,3 l) gelöst.
Ein erstes Aliquot von Dimethoxytritylchlorid (94,3 g, 0,278 M) wurde
zugegeben und das Gemisch eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Es
wurde ein zweites Aliquot von Dimethoxytritylchlorid (94,3 g, 0,278
M) zugegeben und das Reaktionsgemisch eine weitere Stunde lang gerührt. Dann
wurde Methanol (170 ml) zugegeben, um die Reaktion anzuhalten. HPLC
zeigte das Vorhandensein von ungefähr 70% Produkt. Das Lösungsmittel
wurde verdampft und es wurde mit CH3CN (200 ml)
verrieben. Der Rückstand
wurde in CHCl3 (1,5 l) gelöst und mit
2 × 500
ml gesättigter
NaHCO3-Lösung
und 2 × 500
ml gesättigter
NaCl-Lösung extrahiert.
Die organische Phase wurde über
Na2SO4 getrocknet,
filtriert und eingedampft. Es wurden 275 g Rückstand erhalten. Der Rückstand
wurde auf einer 3,5-kg-Kieselgelsäule gereinigt, diese gepackt
und mit EtOAc/Hexan/Aceton (5:5:1), das 0,5% Et3NH
enthielt, eluiert. Die reinen Fraktionen wurden eingedampft, um
164 g Produkt zu erhalten. Ungefähr
20 g zusätzlich
wurden aus den unreinen Fraktionen erhalten, um eine Gesamtausbeute
von 183 g (57%) zu erzielen.
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BEISPIEL 2-d
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3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin
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2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin
(106 g, 0,167 M), DMF/Pyridin (750 ml eines 3:1-Gemischs, hergestellt
aus 562 ml DMF und 188 ml Pyridin) und Essigsäureanhydrid (24,38 ml, 0,258
M) wurden vereinigt und 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die
Reaktion wurde mittels DC überwacht, indem
die DC-Probe zunächst unter
Zugabe von MeOH abgekühlt
wurde. Nach Abschluss der Reaktion, wie durch DC beurteilt, wurde
MeOH (50 ml) zugegeben und das Gemisch bei 35°C eingedampft. Der Rückstand wurde
in CHCl3 (800 ml) gelöst und mit 2 × 200 ml
gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung
und 2 × 200
ml gesättigter
NaCl-Lösung extrahiert.
Die Wasserschichten wurden mit 200 ml CHCl3 zurückextrahiert.
Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Natriumsulfat getrocknet
und eingedampft, um 122 g Rückstand
(ungefähr
90% Produkt) zu erhalten. Der Rückstand
wurde auf einer 3,5-kg-Kieselgelsäule gereinigt und mit EtOAc/Hexan
(4:1) eluiert. Die reinen Produktfraktionen wurden eingedampft,
um 96 g (84%) zu erzielen. Weitere 1,5 g wurden aus späteren Fraktionen
gewonnen.
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BEISPIEL 2-e
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3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyl-4-triazoluridin
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Durch
Lösen von
3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin
(96 g, 0,144 M) in CH3CN (700 ml) wurde
eine erste Lösung
hergestellt und beiseite gestellt. Triethylamin (189 ml, 1,44 M)
wurde zu einer Lösung
von Triazol (90 g, 1,3 M) in CH3CN (1 l)
gegeben, es wurde auf –5°C abgekühlt und
0,5 h lang mit einem Überkopfrührer gerührt. POCl3 wurde über
einen Zeitraum von 30 Minuten tropfenweise zur gerührten Lösung, die
bei 0–10°C gehalten
wurde, gegeben und das resultierende Gemisch wurde weitere 2 Stunden lang
gerührt.
Die erste Lösung
wurde über
einen Zeitraum von 45 Minuten tropfenweise zur letzteren Lösung gegeben.
Das resultierende Reaktionsgemisch wurde über Nacht in einem kalten Raum
gelagert. Salze wurden aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert und
die Lösung
wurde eingedampft. Der Rückstand
wurde in EtOAc (1 l) gelöst
und die unlöslichen
Feststoffe wurden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde mit
1 × 300
ml NaHCO3 und 2 × 300 ml gesättigter
NaCl-Lösung
gewaschen, über
Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit-EtOAc verrieben,
um die Titelverbindung zu erhalten.
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BEISPIEL 2-f
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2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin
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Eine
Lösung
von 3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyl-4-triazoluridin (103
g, 0,141 M) in Dioxan (500 ml) und NH4OH
(30 ml) wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die
Dioxanlösung
wurde eingedampft und aus dem Rückstand
mit MeOH (2 × 200
ml) ein Azeotrop gebildet. Der Rückstand
wurde in MeOH (300 ml) gelöst
und in ein 2-Liter-Edelstahldruckgefäß überführt. Mit NH3-Gas
gesättigtes
MeOH (400 ml) wurde zugegeben und das Gefäß 2 Stunden lang auf 100°C erhitzt
(DC zeigte vollständige
Umsetzung). Der Gefäßinhalt
wurde zur Trockne eingedampft und einmal mit gesättigter NaCl-Lösung (200
ml) gewaschen. Die organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet
und das Lösungsmittel
verdampft, um 85 g (95%) der Titelverbindung zu erhalten.
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BEISPIEL 2-g
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N4-Benzoyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin
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2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin
(85 g, 0,134 M) wurde in DMF (800 ml) gelöst und Benzoesäureanhydrid
(37,2 g, 0,165 M) unter Rühren
zugegeben. Nach Rühren
für 3 Stunden
zeigte DC, dass die Reaktion zu ungefähr 95% abgeschlossen war. Das
Lösungsmittel
wurde verdampft und aus dem Rückstand
mit MeOH (200 ml) ein Azeotrop gebildet. Der Rückstand wurde in CHCl3 (700 ml) gelöst und mit gesättigter
NaHCO3-Lösung
(2 × 300
ml) und gesättigter
NaCl-Lösung
(2 × 300
ml) extrahiert, über
MgSO4 getrocknet und eingedampft, um einen
Rückstand
(96 g) zu erhalten. Der Rückstand
wurde auf einer 1,5-kg-Kieselgelsäule mit
EtOAc/Hexan (1:1), das 0,5% Et3NH enthielt,
als dem Elutionsmittel chromatographiert. Die reinen Produktfraktionen
wurden eingedampft, um 90 g (90%) der Titelverbindung zu erhalten.
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BEISPIEL 2-h
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N4-Benzoyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin-3'-amidit
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N4-Benzoyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin (74
g, 0,10 M) wurde in CH2Cl2 (1 l)
gelöst.
Tetrazoldiisopropylamin (7,1 g) und 2-Cyanoethoxytetra(isopropyl)phosphit
(40,5 ml, 0,123 M) wurden unter Rühren unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben.
Das resultierende Gemisch wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur
gerührt
(DC zeigte, dass die Reaktion zu 95% abgeschlossen war). Das Reaktionsgemisch
wurde mit gesättigter
NaHCO3-Lösung
(1 × 300
ml) und gesättigter
NaCl-Lösung
(3 × 300
ml) extrahiert. Die wässrigen
Waschlösungen
wurden mit CH2Cl2 (300
ml) zurückextrahiert
und die Extrakte wurden vereinigt, über MgSO4 getrocknet
und eingedampft. Der erhaltene Rückstand
wurde auf einer 1,5-kg-Kieselgelsäule mit
EtOAc/Hexan (3:1) als dem Elutionsmittel chromatographiert. Die
reinen Fraktionen wurden vereinigt, um 90,6 g (87%) der Titelverbindung
zu erhalten.
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BEISPIEL 3
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Herstellung von langkettigen,
d. h. (C20)-, substituierten Nukleosidamiditen
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Die
Synthese von Nukleosidamiditen mit langkettigen, z. B. C20-, Substituenten an ihrer 2'-Stellung ist in
den Beispielen 3-a bis 3-c gezeigt.
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BEISPIEL 3-a
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Synthese von 2,6-Diamino-9-(2-O-octadecyl-β-D-ribofuranosyl)purin
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2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin
(50 g, 180 mmol) und Natriumhydrid (7 g) in DMF (1 l) wurden 2 Std.
lang zum Sieden erhitzt. Iodoctadecan (100 g) wurde bei 150°C zugegeben
und das Reaktionsgemisch auf RT abkühlen gelassen. Das Reaktionsgemisch
wurde 11 Tage lang bei RT gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde verdampft und der Rückstand
mittels Kieselgelchromatographie gereinigt. Das Produkt wurde mit
5% MeOH/CH2Cl2 eluiert.
Die entsprechenden Fraktionen wurden eingedampft, um das Produkt
(11 g) zu erzielen. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 0,84
(t, 3, CH2); 1,22 (m, 32, O-CH2-CH2(CH2)16);
1,86 (m, 2, O-CH2-CH2);
3,25 (m, 2, O-CH2); 3,93 (d, 1, 4'-H); 4,25 (m, 1,
3'-H); 4,38 (t,
1, 2'-H); 5,08 (d,
1, 3'-OH); 5,48
(t, 1, 5'-OH); 5,75 (s, 2, 6-NH2); 5,84 (d, 1, 1'-H); 6,8 (s, 2, 2-NH2)
und 7,95 (s, 1, 8-H).
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BEISPIEL 3-b
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Synthese von 2'-O-Octadecylguanosin
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2,6-Diamino-9-(2-O-octadecyl-β-D-ribofuranosyl)purin
(10 g) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (50 ml, pH 7,4), 0,1 M Tris-Puffer
(1000 ml, pH 7,4) und DMSO (1000 ml) wurde bei RT mit Adenosindeaminase
(1,5 g) behandelt. An Tag 3, Tag 5 und Tag 7 wurde ein zusätzliches
Aliquot (500 mg, 880 mg bzw. 200 mg) von Adenosindeaminase zugegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde insgesamt 9 Tage gerührt und eine Reinigung mittels
Kieselgelchromatographie ergab das Produkt (2 g). Eine Analysenprobe
wurde aus MeOH umkristallisiert. 1H-NMR
(DMSO-d6) δ 0,84 (t, 3, CH3);
1,22 (s, 32, O-CH2-CH2(CH2)16); 5,07 (m, 2,
3'-OH und 5'-OH); 5,78 (d, 1,
1'-H); 6,43 (s,
2, NH2); 7,97 (s, 1, 8-H) und 10,64 (s,
1, NH2). Anal. berechn. für C28H49N5O5: C, 62,80; H, 9,16; N, 12,95. Gefunden:
C, 62,54; H, 9,18; N, 12,95.
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BEISPIEL 3-c
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Synthese von N2-Isobutyryl-2'-O-octadecylguanosin
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2'-O-Octadecylguanosin
(1,9 g) in Pyridin (150 ml) wurde in einem Eisbad gekühlt und
mit Trimethylsilylchlorid (2 g, 5 Äq.) und Isobutylchlorid (2
g, 5 Äq.)
behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden lang gerührt, wobei
es währenddessen
auf Raumtemperatur aufwärmen
gelassen wurde. Die Lösung
wurde gekühlt,
ihr wurde Wasser (10 ml) zugegeben und sie wurde weitere 30 Minuten
gerührt.
Konzentriertes Ammoniumhydroxid (10 ml) wurde zugegeben und die
Lösung
im Vakuum eingeengt. Der Rückstand
wurde mittels Kieselgelchromatographie (mit 3 MeOH/EtOAc eluiert)
gereinigt, um 1,2 g des Produkts zu erzielen. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 0,85 (t,
3, CH3), 1,15 (m, 38, O-CH2-CH2(CH2)16,
CH(CH3)2), 2,77
(m, 1, CH(CH3)2),
4,25 (m, 2, 2'-H
und 3'-H); 5,08
(t, 1, 5'-OH), 5,12
(d, 1, 3'-OH), 5,87
(d, 1, 1'-H), 8,27
(s, 1, 8-H), 11,68 (s, 1, NH2) und 12,08
(s, 1, NH2). Anal. berechn. für C32H55N5O6: C, 63,47; H, 9,09; N, 11,57. Gefunden:
C, 63,53; H, 9,20; N, 11,52. Vor dem Einbinden dieses Produkts in
ein Oligonukleotid wurde es in N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-octadecylguanosin und dann in ein
Phosphoramidit umgewandelt, gemäß der in
der internationalen Patentanmeldung mit der Nummer WO 94/02501,
am 3. Februar 1994 veröffentlicht,
beschriebenen Methoden.
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BEISPIEL 4
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2'-Fluornukleosidamidite
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2'-Fluor-substituierte
Nukleosidamidite werden wie in den Beispielen 4-a bis 4-d folgt
hergestellt oder alternativ gemäß dem Verfahren
von Kawasaki et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831–841.
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BEISPIEL 4-a
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i. N6-Benzoyl-9-β-D-arabinofuranosyladenin.
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9-β-D-Arabinofuranosyladenin
(1,07 g, 4,00 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (20 ml) und wasserfreiem
Dimethylformamid (20 ml) unter einer Argonatmosphäre gelöst. Die
Lösung
wurde auf 0°C
abgekühlt und
Chlortrimethylsilan (3,88 ml, 30,6 mmol) wurde langsam mit einer
Spritze zum Reaktionsgemisch gegeben. Nach Rühren des Reaktionsgemischs
bei 0°C
für 30
Minuten wurde langsam Benzoylchlorid (2,32 ml, 20 mmol) zugegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde auf 20°C
aufwärmen
gelassen und 2 Stunden lang gerührt. Nach
Abkühlen
des Reaktionsgemischs auf 0°C
wurde kaltes Wasser (8 ml) zugegeben und das Gemisch wurde 15 Minuten
lang gerührt.
Konzentriertes Ammoniumhydroxid (8 ml) wurde langsam zum Reaktionsgemisch gegeben,
um eine Ammoniak-Endkonzentration
von 2 M zu erhalten. Nach Rühren
des kalten Reaktionsgemischs für
30 Minuten wurde das Lösungsmittel
im Vakuum (60 Torr) bei 20°C
abgedampft, worauf Abdampfung im Vakuum (1 Torr) bei 40°C folgte,
um ein Öl
zu erhalten. Dieses Öl
wurde mit Diethylether (50 ml) verrieben, um einen Feststoff zu
erhalten, der filtriert und dreimal mit Diethylether gewaschen wurde.
Dieser rohe Feststoff wurde dreimal in Methanol (100 ml) bei Rückflusstemperatur
verrieben und das Lösungsmittel
wurde abgedampft, um N6-Benzoyl-9-β-D-arabinofuranosyladenin
als einen Feststoff (1,50 g, 100%) zu erzielen.
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ii. N6-Benzoyl-9-[3',5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl]adenin.
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N6-Benzoyl-9-β-D-arabinofuranosyladenin (2,62
g, 7,06 mmol) wurde in wasserfreiem Dimethylformamid (150 ml) unter
Argon gelöst
und p-Toluolsulfonsäure-monohydrat
(1,32 g, 6,92 mmol) wurde zugegeben. Diese Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und
Dihydropyran (1,26 ml, 13,8 mmol) wurde mit einer Spritze zugegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde auf 20°C
aufwärmen
gelassen. Über
einen Zeitraum von 5 Stunden wurden insgesamt 10 Äquivalente
Dihydropyran in 2 gleichen Mengen auf die beschriebene Weise zugegeben. Das
Reaktionsgemisch wurde auf 0°C
abgekühlt
und es wurde langsam gesättigte
wässrige
Natriumhydrogencarbonatlösung
bis zu einem pH von 8 und dann Wasser zu einem Volumen von 750 ml
zugegeben. Das wässrige
Gemisch wurde mit Methylenchlorid (4 × 200 ml) extrahiert und die
organischen Phasen wurden vereinigt und über Magnesiumsulfat getrocknet.
Die Feststoffe wurden filtriert und das Lösungsmittel wurde im Vakuum (60
Torr) bei 30°C
abgedampft, um ein geringes Volumen an Flüssigkeit zu erhalten, die im
Vakuum (1 Torr) bei 40°C
abgedampft wurde, um ein Öl
zu erhalten. Dieses Öl
wurde mit p-Xylol im Vakuum bei 40°C koevaporiert, um ein Öl zu erhalten,
das in Methylenchlorid (100 ml) gelöst wurde. Hexan (200 ml) wurde
zu der Lösung
gegeben und das niedriger siedende Lösungsmittel wurde im Vakuum
bei 30°C
abgedampft, um einen in Hexan suspendierten weißen Feststoff zurückzulassen.
Dieser Feststoff wurde filtriert und mit Hexan (3 × 10 ml)
gewaschen und dann mittels Säulenchromatographie
unter Verwendung von Kieselgel und Methylenchlorid/Methanol (93:7)
als dem Elutionsmittel gereinigt. Die erste Fraktion ergab die Titelverbindung
3 als einen weißen
Schaum (3,19 g, 83%) und eine zweite Fraktion ergab einen weißen Schaum
(0,81 g), der als das 5'-Monotetrahydropyranyl-Derivat von N6-Benzoyl-9-β-D-arabinofuranosyladenin charakterisiert
wurde.
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iii. N6-Benzoyl-9-[2'-O-trifluormethylsulfonyl-3',5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl]adenin.
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N6-Benzoyl-9-[3',5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl]adenin
(2,65 g, 4,91 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (20 ml) gelöst und das
Lösungsmittel wurde
im Vakuum (1 mm Hg) bei 40°C
abgedampft. Das resultierende Öl
wurde in wasserfreiem Methylenchlorid (130 ml) unter Argon gelöst und es
wurden wasserfreies Pyridin (3,34 ml, 41,3 mmol) und N,N-Dimethylaminopyridin
(1,95 g, 16,0 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 0°C abgekühlt und
Trifluormethansulfonsäureanhydrid
(1,36 ml, 8,05 mmol) wurde langsam mit einer Spritze zugegeben.
Nach Rühren
des Reaktionsgemischs bei 0°C
für 1 Stunde
wurde es in kaltes gesättigte
wässrige
Natriumhydrogencarbonatlösung
(140 ml) gegeben. Das Gemisch wurde geschüttelt und die organische Phase
wurde abgetrennt und auf 0°C
gehalten. Die wässrige
Phase wurde mit Methylenchlorid (2 × 140 ml) extrahiert. Die organischen
Extrakte, die unablässig
kalt gehalten wurden, wurden vereinigt und über Magnesiumsulfat getrocknet.
Das Lösungsmittel
wurde im Vakuum (60 Torr) bei 20°C
und dann im Vakuum (1 Torr) bei 20°C abgedampft, um N6-Benzoyl-9-[2'-O-trifluormethylsulfonyl-3', 5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl]adenin
als ein rohes Öl
zu erhalten, das nicht weiter gereinigt wurde.
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iv. N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-3',5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl]adenin.
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N6-Benzoyl-9-[2'-O-trifluormethylsulfonyl-3',5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl]adenin (4,9
mmol) als ein rohes Öl
wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran (120 ml) gelöst und diese
Lösung
wurde unter Argon auf 0°C
abgekühlt.
Tetrabutylammoniumfluorid als das Hydrat (12,8 g, 49,1 mmol) wurde
in wasserfreiem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und eine Hälfte dieses
Volumens wurde langsam mit einer Spritze zum kalten Reaktionsgemisch
gegeben. Nach Rühren
bei 0°C
für 1 Stunde
wurde der Rest des Reagens langsam zugegeben. Das Reaktionsgemisch
wurde 1 weitere Stunde bei 0°C
gerührt,
dann wurde das Lösungsmittel
im Vakuum (60 Torr) bei 20°C
abgedampft, um ein Öl
zu erhalten. Dieses Öl
wurde in Methylenchlorid (250 ml) gelöst und dreimal mit gesättigter
Kochsalzlösung
gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt und über Magnesiumsulfat
getrocknet. Die Feststoffe wurden filtriert und das Lösungsmittel
abgedampft, um ein Öl
zu erhalten. Das Rohprodukt wurde mittels Säulenchromatographie unter Verwendung
von Kieselgel in einem Sinterglastrichter gereinigt und Essigsäureethylester
wurde als das Elutionsmittel verwendet. N6- Benzoyl-9-[2'-fluor-3',5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl]adenin
wurde als ein Öl
(2,03 g, 76%) erhalten.
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v. N6-Benzoyl-9-(2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)adenin.
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N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-3',5'-di-O-tetrahydropyran-2-yl-β-D-arabinofuranosyl)adenin
(1,31 g, 2,42 mmol) wurde in Methanol (60 ml) gelöst und Dowex
50W × 2–100 (4
cm3, 2,4 Moläq.) zum Reaktionsgemisch gegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde lang bei 20°C gerührt, dann auf 0°C abgekühlt. Anschließend wurde
Triethylamin (5 ml) langsam zum kalten Reaktionsgemisch bis zu einem
pH von 12 gegeben. Das Harz wurde filtriert und mit 30% Triethylamin
in Methanol gewaschen, bis die Waschlösung kein UV-absorbierendes
Material mehr enthielt. Toluol (50 ml) wurde zu den Waschlösungen gegeben
und das Lösungsmittel wurde
bei 24°C
im Vakuum (60 Torr, danach 1 Torr) abgedampft, um einen Rückstand
zu erhalten. Dieser Rückstand
wurde teilweise in Methylenchlorid (30 ml) gelöst und das Lösungsmittel
wurde in einen Trenntrichter überführt. Der
Rest des Rückstands
wurde in heißem
(60°C) Wasser
gelöst
und wurde nach Abkühlen
des Lösungsmittels
ebenfalls in den Trenntrichter gegeben. Das Zweiphasensystem wurde
extrahiert und die organische Phase wurde abgetrennt und mit Wasser
(3 × 100
ml) extrahiert. Die vereinigten wässrigen Extrakte wurden im
Vakuum (60 Torr, danach 1 Torr) bei 40°C eingedampft, um ein Öl zu erhalten,
das mit wasserfreiem Pyridin (50 ml) eingedampft wurde. Dieses Öl wurde
weiter im Vakuum (1 Torr Hg) bei 20°C in Gegenwart von Phosphor(V)-oxid über Nacht
getrocknet, um N6-Benzoyl-9-(2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)adenin als
einen gelben Schaum (1,08 g, 100%) zu erhalten, der geringfügige Verunreinigungen
enthielt.
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vi. N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl]adenin.
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N6-Benzoyl-9-(2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)adenin (1,08
g, 2,89 mmol), das geringfügige
Verunreinigungen enthielt, wurde in wasserfreiem Pyridin (20 ml)
unter Argon gelöst
und trockenes Triethylamin (0,52 ml, 3,76 mmol) wurde zugegeben,
gefolgt von der Zugabe von 4,4'-Dimethoxytritylchlorid
(1,13 g, 3,32 mmol). Nach 4 Stunden Rühren bei 20°C wurde das Reaktionsgemisch
in einen Trenntrichter überführt und
Diethylether (40 ml) wurde zugegeben, um eine weiße Suspension
zu erhalten. Dieses Gemisch wurde dreimal mit Wasser (3 × 10 ml)
gewaschen, die organische Phase wurde abgetrennt und über Magnesiumsulfat
getrocknet. Triethylamin (1 ml) wurde zu der Lösung gegeben und das Lösungsmittel
wurde im Vakuum (60 Torr Hg) bei 20°C abgedampft, um ein Öl zu erhalten,
das mit Toluol (20 ml), das Triethylamin (1 ml) enthielt, eingedampft
wurde. Dieses Rohprodukt wurde mittels Säulenchromatographie unter Verwendung
von Kieselgel und Essigsäureethylester/Triethylamin
(99:1), gefolgt von Essigsäureethylester/-Methanol/Triethylamin
(80:19:1) gereinigt, um das Produkt in zwei Fraktionen zu erhalten.
Die Fraktionen wurden im Vakuum (60 Torr, danach 1 Torr Hg) bei
20°C eingedampft,
um einen Schaum zu erhalten, der weiter im Vakuum (1 Torr Hg) bei
20°C in Gegenwart
von Natriumhydroxid getrocknet wurde, um N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl]adenin als
einen Schaum (1,02 g, 52%) zu erhalten.
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vii. N6-Benzoyl-[2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit.
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N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl]adenin (1,26
g, 1,89 mmol) wurde in wasserfreiem Dichlormethan (13 ml) unter
Argon gelöst,
Diisopropylethylamin (0,82 ml, 4,66 mmol) zugegeben und das Reaktionsgemisch
auf 0°C
abgekühlt.
Chlor(diisopropylamino)-β-cyanoethoxyphosphin
(0,88 ml, 4,03 mmol) wurde zum Reaktionsgemisch gegeben, das auf
20°C aufwärmen gelassen
und 3 Stunden lang gerührt
wurde. Essigsäureethylester
(80 ml) und Triethylamin (1 ml) wurden zugegeben und diese Lösung wurde
mit gesättigter
Kochsalzlösung
(3 × 25
ml) gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt und über Magnesiumsulfat
getrocknet. Nach Filtration der Feststoffe wurde das Lösungsmittel
im Vakuum bei 20°C
abgedampft, um ein Öl
zu erhalten, das mittels Säulenchromatographie
unter Verwendung von Kieselgel und Hexanen/Essigsäureethylester/Triethylamin
(50:49:1) als dem Elutionsmittel gereinigt wurde. Die Eindampfung der
Fraktionen im Vakuum bei 20°C
ergab einen Schaum, der mit wasserfreiem Pyridin (20 ml) im Vakuum
(1 Torr) bei 26°C
eingedampft und weiter im Vakuum (1 Torr Hg) bei 20°C in Gegenwart
von Natriumhydroxid 24 h lang getrocknet wurde, um N6-Benzoyl-[2'-deoxy-2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit
als einen Schaum (1,05 g, 63%) zu erhalten.
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BEISPIEL 4-b
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2'-Deoxy-2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
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2,2'-Cyclouridin wird
mit einer Lösung
von 70% Fluorwasserstoff/Pyridin in Dioxin bei 120°C für zehn Stunden
behandelt, um nach Lösungsmittelentfernung
eine Ausbeute von 75% an 2'-Deoxy-2'-fluoruridin zu liefern.
Das mit 5'-DMT und
3'-Cyanoethoxydiisopropylphosphoramidit
derivatisierte Nukleosid wird mittels Methoden der Standardliteratur
(Gait, Hrsg., Oligonucleotide Synthesis. A Practical Approach, IRL
Press, Washington, DC, USA (1984)] oder gemäß der Methode von Beispiel
4-a erhalten.
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BEISPIEL 4-c
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2'-Deoxy-2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
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2'-Deoxy-2'-fluoruridin (2,51
g, 10,3 mmol) wurde mittels des Verfahrens von C. B. Reese et al.,
J. Chem. Soc. Perkin Trans 1, S. 1171–1176 (1982), durch Acetylierung
mit Essigsäureanhydrid
(3,1 ml, 32,7 mmol) in wasserfreiem Pyridin (26 ml) bei Raumtemperatur
in das entsprechende Cytidinanalogon umgewandelt. Die Reaktion wurde
mit Methanol gequencht und das Lösungsmittel
im Vakuum (1 Torr) abgedampft, um ein Öl zu erhalten, das mit Ethanol
und Toluol koevaporiert wurde. 3',5'-O-Diacetyl-2'-deoxy-2'-fluoruridin wurde
aus Ethanol auskristallisiert, um farblose Kristalle (2,38 g, 81%)
hervorzubringen.
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N-4-(1,2,4-Triazol-1-yl)-3',5'-O-diacetyl-2'-deoxy-2'-fluoruridin wurde
in einer Ausbeute von 70% (2,37 g) durch Umsetzung von 3',5'-O-Diacetyl-2'-deoxy-2'-fluoruridin (2,75 g, 9,61 mmol) mit
1,2,4-Triazol (5,97 g, 86,5 mmol), Phosphor(V)-oxidchlorid (1,73 ml, 18,4 mmol) und
Triethylamin (11,5 ml, 82,7 mmol) in wasserfreiem Acetonitril bei
Raumtemperatur erhalten. Nach 90 Min. wurde das Reaktionsgemisch
auf Eistemperatur abgekühlt
und Triethylamin (7,98 ml, 56,9 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von
der Zugabe von Wasser (4,0 ml). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum
(1 Torr) abgedampft, um ein Öl
zu erhalten, das in Methylenchlorid gelöst und mit gesättigter
wässriger
Natriumhydrogencarbonatlösung
gewaschen wurde. Die wässrige
Phase wurde zweimal mit Methylenchlorid (2 × 100 ml) extrahiert und die
organischen Extrakte mit Magnesiumsulfat getrocknet. Die Abdampfung
des Lösungsmittels
brachte ein Öl
hervor, aus dem das Produkt N-4-(1,2,4-Triazol-1-yl)-3',5'-O-diacetyl-2'-deoxy-2'-fluoruridin durch Auskristallisierung
aus Ethanol erhalten wurde.
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2'-Deoxy-2'-fluorcytidin wurde
durch Behandlung von geschütztem
Triazol-1-yl-Derivat
mit konzentriertem Ammoniumhydroxid (4,26 ml, 81,2 mmol) in Dioxan
bei Raumtemperatur für
6 Stunden hervorgebracht. Nach Abdampfung des Lösungsmittels wurde das Öl in zur
Hälfte
gesättigtem
(bei Eistemperatur) Ammoniak in Methanol für 16 Stunden gerührt. Das
Lösungsmittel
wurde abgedampft und 2'-Deoxy-2'-fluorcytidin aus
Essigsäureethylester/Methanol
(v/v, 75:25) auskristallisiert, um farblose Kristalle (1,24 g, 75%)
zu erhalten.
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N-4-Benzoyl-2'-deoxy-2'-fluorcytidin wurde
durch selektive Benzoylierung mit Benzoesäureanhydrid in wasserfreiem
Dimethylformamid hergestellt, V. Bhat et al., Nucleosides Nucleotides,
Bd. 8, S. 179–183
(1989). Das 5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit) wurde
gemäß Beispiel
4-a hergestellt.
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BEISPIEL 4-d
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i. 9-(3',5'-[1,1,3,3-Tetraisopropyldisilox-1,3-diyl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin.
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Die
3'- und 5'-Stellungen von Guanosin
wurden durch die Zugabe einer TPDS-Schutzgruppe (TDPS = 1,1,3,3-Tetraisopropyldisilox-1,3-diyl)
gemäß der Methode
von Robins et al. [Can. J. Chem., 61, 1911 (1983)] geschützt. Das
TDPS-Guanosin (21 g, 0,040 mol) wurde zu einer gerührten Lösung aus
DMSO (160 ml) und Essigsäureanhydrid
(20 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 36 Stunden lang bei
Raumtemperatur gerührt
und dann auf 0°C
abgekühlt.
Kaltes Ethanol (400 ml, 95%-ig) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch
weiter in einem Trockeneis/Aceton-Bad auf –78°C abgekühlt. NaBH4 (2,0
g, 1,32 Moläq.)
wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf –2°C aufwärmen gelassen, 30 Minuten lang
gerührt
und wiederum auf –78°C abgekühlt. Dies
wurde zweimal wiederholt. Nachdem die Zugabe von NaBH4 abgeschlossen
war, wurde das Reaktionsgemisch 30 Minuten lang bei 0°C und dann
1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
in Essigsäureethylester
(1 l) aufgenommen und zweimal mit einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen.
Die organische Schicht wurde über
MgSO4 getrocknet und unter vermindertem Druck
eingedampft. Der Rückstand
wurde zweimal mit Toluol koevaporiert und mittels Kieselgelchromatographie
unter Verwendung von CH2Cl2/MeOH
(9:1) als dem Elutionsmittel gereinigt. Das reine Produkt (6,02
g) präzipitierte
aus den entsprechenden Säulenfraktionen
während
des Eindampfens dieser Fraktionen und weitere 11,49 g des Produkts
wurden nach Eindampfen der Fraktionen als ein Rückstand erhalten.
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ii. N2-Isobutyryl-9-(2'-O-isobutyryl-3',5'-[1,1,3,3-tetraisopropyldisilox-1,3-diyl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin.
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9-(3',5'-[1,1,3,3-Tetraisopropyldisilox-1,3-diyl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin
(6,5 g, 0,01248 mol) wurde in wasserfreiem Pyridin (156 ml) unter
Argon gelöst.
DMAP (9,15 g) wurde zugegeben. Isobuttersäureanhydrid (6,12 ml) wurde
langsam zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde in kalte gesättigte NaHCO-Lösung (156
ml) gegossen und 10 Minuten lang gerührt. Die wässrige Lösung wurde dreimal mit Essigsäureethylester
(156 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde dreimal mit gesättigter
NaHCO-Lösung
gewaschen und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Toluol koevaporiert
und mittels Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung von CH2Cl2/Aceton
(85:15) gereinigt, um 5,67 g des Produkts zu erzielen.
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iii. N2-Isobutyryl-9-(2'-O-isobutyryl-β-D-arabinofuranosyl)guanin.
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N2-Isobutyryl-9-(2'-isobutyryl-3',5'-[1,1,3,3-tetraisopropyldisilox-1,3-diyl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin (9,83
g, 0,01476 mol) wurde in wasserfreiem THF (87,4 ml) bei Raumtemperatur
unter Argon gelöst.
1 M (nBu)4N+F– in
THF (29,52 ml, 2 Äq.)
wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch 30 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch
wurde bei Raumtemperatur eingedampft und der Rückstand mittels Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung von EtOAc/MeOH (85:15) gereinigt, um 4,98 g (80%)
des Produkts zu erzielen.
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iv. N2-Isobutyryl-9-(2'-O-isobutyryl-3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin.
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N2-Isobutyryl-9-(2'-isobutyryl-β-D-arabinofuranosyl)guanin (4,9
g) wurde in wasserfreiem 1,4-Dioxan (98 ml) bei Raumtemperatur unter
Argon gelöst.
p-Toluolsulfonsäure-monohydrat
(0,97 g) wurde zugegeben, gefolgt von 3,3-Dihydro-2H-pyran (DHP, 9,34
ml, 8,8 Äq.).
Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden lang gerührt, dann auf 0°C abgekühlt und
gesättigte
NaHCO3-Lösung
(125 ml) zugegeben, um die Reaktion anzuhalten. Das Reaktionsgemisch
wurde dreimal mit 125-ml-Portionen von CH2Cl2 extrahiert und die organische Phase über MgSO4 getrocknet. Die organische Phase wurde
eingedampft und der Rückstand
in einem minimalen Volumen von CH2Cl2, jedoch in einer Menge, die dazu ausreicht,
um eine klare Flüssigkeit,
nicht einen Sirup zu erzielen, gelöst und dann in Hexan (das 100-fache des Volumens
von CH2Cl2) getropft.
Das Präzipitat
wurde filtriert, um 5,59 g (81,5%) des Produkts zu erzielen.
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v. N2-Isobutyryl-9-(3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin.
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N2-1 sobutyryl-9-(2'-isobutyryl-3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin
(5,58 g) wurde in Pyridin/MeOH/H2O (65:30:15,
52 ml) bei Raumtemperatur gelöst.
Die Lösung
wurde auf 0°C
abgekühlt
und 52 ml 2 N NaOH in EtOH/MeOH (95:5) wurden langsam zugegeben,
gefolgt von Rühren
für 2 Stunden
bei 0°C.
Eisessig wurde bis zum pH 6 und gesättigte NaHCO3-Lösung bis
zum pH 7 zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem
Druck und der Rückstand
mit Toluol koevaporiert. Der Rückstand wurde
dann in EtOAc (150 ml) gelöst
und 3-mal mit gesättigter
NaHCO3-Lösung
gewaschen. Die organische Phase wurde eingedampft und der Rückstand
mittels Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung von EtOAc/MeOH (85:15) als dem Elutionsmittel gereinigt,
wodurch 3,85 g (78,3%) des Produkts erzielt wurden.
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vi. N2-Isobutyryl-9-(3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-2'-O-trifluormethylsulfonyl-β-D-arabinofuranosyl)guanin.
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N2-Isobutyryl-9-(3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin
(3,84 g) wurde in wasserfreiem CH2Cl2 (79 ml), wasserfreiem Pyridin (5 ml) und
DMAP (2,93 g) bei Raumtemperatur unter Argon gelöst. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und
Trifluormethansulfonsäureanhydrid
(1,99 ml) langsam unter Rühren
zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde
lang gerührt,
dann in 100 ml gesättigte
NaHCO3-Lösung
gegossen. Die wässrige
Phase wurde dreimal mit kaltem CH2Cl2 extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet, eingedampft und mit wasserfreiem
MeCN koevaporiert, um ein Rohprodukt zu erzielen.
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vii. N2-Isobutyryl-9-(2'-deoxy-2'-fluor-3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-2'-O-trifluormethylsulfonyl-β-D-ribofuranosyl)guanin.
-
Rohes
N2-Isobutyryl-9-(3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-2'-O-trifluormethylsulfonyl-β-D-arabinofuranosyl)guanin
wurde in wasserfreiem THF (113 ml) unter Argon bei 0°C gelöst. 1 M
(nBu)4N+F– (durch
Koevaporieren mit Pyridin getrocknet) in THF (36,95 ml) wurde unter
Rühren
zugegeben. Nach 1 Stunde wurde ein weiteres Aliquot von (nBu)4N+F– in
THF (36,95 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0°C 5 Stunden lang
gerührt
und über
Nacht bei –30°C gelagert.
Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck eingedampft
und der Rückstand
in CH2Cl2 (160 ml)
gelöst
und fünfmal
mit vollentsalztem Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet und eingedampft. Der Rückstand
wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung von EtOAc/MeOH (95:5) gereinigt, um 5,25 g des
Produkts zu erzielen.
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viii. N2-Isobutyryl-9-(2'-deoxy-2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)guanin.
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N2-Isobutyryl-9-(2'-deoxy-2'-fluor-3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-ribofuranosyl)guanin
(3,85 g) wurde in MeOH (80 ml) bei Raumtemperatur gelöst. Zuvor
gewaschenes Dowex 50W-Harz (12,32 cm3) wurde zugegeben
und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt. Das
Harz wurde filtriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Das
Harz wurde mit Pyridin/Triethylamin/H2O
(1:3:3) gewaschen, bis das Filtrat klar war. Dieses Filtrat wurde
eingedampft, um ein Öl
zu erhalten. Die Rückstände von
beiden Filtraten wurden in H2O (200 ml)
vereinigt und mit CH2Cl2 (3 × 100 ml)
gewaschen. Die wässrige
Phase wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus heißem MeOH
auskristallisiert, um 0,299 g des Produkts als ein weißes Pulver
zu erzielen. Die restliche MeOH-Lösung wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie
gereinigt, um weiter 0,783 g des Produkts durch Eluieren mit EtOH/MeOH
(4:1) zu erzielen.
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ix. N2-Isobutyryl-9-(2'-deoxy-2'-fluor-5'-O-[4,4-dimethoxytrityl]-β-D-ribofuranosyl)guanin.
-
N2-Isobutyryl-9-(2'-deoxy-2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)guanin (1,09
g) wurde in Pyridin (20 ml) und Triethylamin (0,56 ml) bei Raumtemperatur
unter Argon gelöst.
4,4-Dimethoxytritylchlorid
(1,20 g, 1,15 Moläq.)
wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 5 Stunden
lang gerührt.
Das Gemisch wurde in einen Trenntrichter überführt und mit Diethylether (100
ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigter
NaHCO3-Lösung
(3 × 70
ml) gewaschen und die wässrige
Phase dreimal mit Diethylether zurückextrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen wurden über
MgSO4 getrocknet und es wurde Triethylamin
(4 ml) zugegeben, um die Lösung
auf einem basischen pH zu halten. Das Lösungsmittel wurde abgedampft
und der Rückstand
mittels Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung von EtOAc/Triethylamin (100:1) und dann EtOAc/MeOH/Triethylamin
(95:5:1) als Elutionsmitteln gereinigt, wodurch 1,03 g des Produkts
erzielt wurden.
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x. N2-Isobutyryl-9-2'-deoxy-2'-fluor-5'-O-[4,4-dimethoxytrityl]guanosin-3'-O-N,N-diisopropyl-β-D-cyanoethylphosphoramidit.
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N2-Isobutyryl-9-(2'-deoxy-2'-fluor-5'-O-[4,4'-dimethoxytrityl]-β-D-ribofuranosyl)guanin (0,587
g) wurde in wasserfreiem CH2Cl2 (31
ml) und Diisopropylethylamin (0,4 ml) bei Raumtemperatur unter Argon
gelöst.
Die Lösung
wurde auf 0°C
abgekühlt
und es wurde langsam Chlor(diisopropylamino)-β-cyanoethoxyphosphin (0,42 ml) zugegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen
und 3,5 Stunden lang gerührt.
CH2Cl2/Triethylamin
(100:1, 35 ml) wurde zugegeben und das Gemisch mit gesättigter
NaHCO-Lösung
(6 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet
und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung von Hexan/EtOAc/Triethylamin (75:25:1) für 2 Säulenvolumina,
dann Hexan/EtOAc/Triethylamin (25:75:1) und schließlich EtOAc/Triethylamin
gereinigt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt
und das Lösungsmittel
unter vermindertem Druck abgedampft. Das resultierende Öl wurde
zweimal mit MeCN koevaporiert und unter vermindertem Druck getrocknet.
Der resultierende weiße
Feststoff wurde in CH2Cl2 (3
ml) gelöst und
in gerührtes
Hexan (300 ml) getropft. Das resultierende Präzipitat wurde filtriert und
unter vermindertem Druck getrocknet, um 0,673 g (88%) des Produkts
zu erzielen.
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BEISPIEL 5
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Nukleosidamidite
mit Substitution an ihren Zucker- und ihren Basenfragmenten sind
in den Beispielen 5-a bis 5-k gezeigt.
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BEISPIEL 5-a
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Andere Nukleosidamidite
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i. 1-(2-Fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
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2,2'-Anhydro-[1-(β-D-arabinofuranosyl)-5-methyluridin]
(71 g, 0,32 mmol) (aus Beispiel 2-a) und Dioxan (700 ml) wurden
in eine 2-Liter-Edelstahlbombe gegeben und es wurde HF/Pyridin (100
g, 70%) zugegeben. Das Gemisch wurde 16 Stunden lang auf 120–125°C erhitzt
und dann in einem Eisbad abgekühlt.
Die Bombe wurde geöffnet
und das Gemisch wurde auf 3 Liter Eis gegossen. Zu diesem Gemisch
wurde behutsam Natriumhydrogencarbonat (300 g) und gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung (400
ml) gegeben. Das Gemisch wurde filtriert und der Filterkuchen wurde
mit Wasser (2 × 100
ml) und Methanol (2 × 500
ml) gewaschen. Die Wasser- und Methanolwaschlösungen wurden im Vakuum zur
Trockne eingeengt. Methanol (200 ml) und grobes Kieselgel (80 g)
wurden zum Rückstand
gegeben und das Gemisch wurde im Vakuum zur Trockne eingeengt.
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Das
resultierende Material wurde auf dem Kieselgel eingeengt und mittels
Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung eines Gradienten aus Essigsäureethylester und Methanol
(100:0 bis 85:15) gereinigt. Poolen und Einengen der Produktfraktionen
ergab 36,9 g (51%, Ausbeute aus 2 Schritten) der Titelverbindung.
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Außerdem aus
dieser Reaktion isoliert wurde 1-(2-Phenyl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin (10,3
g). Dieses Material wird aus dem Phenol und seinem Natriumsalz aus
der obigen Anhydro-Reaktion gebildet, wenn die Bombenreaktion an
unreinem Material durchgeführt
wird. Wenn das Anhydro-Material
gereinigt ist, wird dieses Produkt nicht gebildet. Das gebildete
1-(2-Phenyl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
wurde unter Verwendung derselben Reaktionsbedingungen wie für das 2'-Fluor-Material in
sein DMT/Phosphoramidit umgewandelt.
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ii. 1-(5-O-Dimethoxytrityl-2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
-
1-(2-Fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
(31,15 g), 0,12 mol) wurde in Pyridin (150 ml) suspendiert und Dimethoxytritylchlorid
(44,62 g, 0,12 mol) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde in einem geschlossenen
Kolben 2 Stunden lang gerührt
und dann wurde Methanol (30 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde im
Vakuum eingeengt und der resultierende Rückstand wurde zwischen gesättigter
Hydrogencarbonatlösung
(500 ml) und Essigsäureethylester
(3 × 500
ml) aufgeteilt. Die Essigsäureethylesterfraktionen
wurden gepoolt und über
Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zu einem dicken Öl eingeengt.
Das Öl wurde
in Dichlormethan (100 ml) gelöst,
auf eine Kieselgelsäule
aufgetragen und mit Essigsäureethylester:Hexan:Triethylamin,
60/39/1, ansteigend auf 75/24/1, eluiert. Die Produktfraktionen
wurden gepoolt und im Vakuum eingeengt, um 59,9 g (89%) der Titelverbindung
als einen Schaum zu erhalten.
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iii. 1-(5-O-Dimethoxytrityl-2-fuor-3-O-N,N-diisopropylamino-2-cyanoethylphosphit-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
-
1-(5-O-Dimethoxytrityl-2-fuor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
(59,8 g, 0,106 mol) wurde in Dichlormethan gelöst und 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (46,9
ml, 0,148 mol) und Diisopropylamintetrazolid (5,46 g, 0,3 Äq.) wurden
zugegeben. Das Gemisch wurde 16 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde mit
gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung
(1 l) gewaschen und die Hydrogencarbonatlösung wurde mit Dichlormethan
(500 ml) zurückextrahiert.
Die vereinigten organischen Schichten wurden mit gesättigter
Kochsalzlösung
(1 l) gewaschen und die gesättigte
Kochsalzlösung
wurde mit Dichlormethan (100 ml) zurückextrahiert. Die vereinigten
organischen Schichten wurden über
Natriumsulfat getrocknet, filtriert und auf ein Volumen von etwa
200 ml eingeengt. Das resultierende Material wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung von Hexan/Essigsäureethylester/Triethylamin,
60/40/1, gereinigt. Die Produktfraktionen wurden im Vakuum eingeengt,
in Acetonitril (500 ml) gelöst,
filtriert, im Vakuum eingeengt und zu einem Schaum getrocknet. Der
Schaum wurde zerkleinert und 24 Stunden lang auf ein konstantes
Gewicht getrocknet, um 68,2 g (84%) der Titelverbindung zu ergeben. 1H-NMR: (CDCl3) δ 0,9–1,4 (m,
14H, 4 × CH3, 2 × CH),
2,3–2,4
(t, 1H, CH2CN), 2,6–2,7 (t, 1H, CH2CN),
3,3–3,8
(m, 13H, 2 × CH3Oar, 5'-CH2, CH2OP, C-5-CH3), 4,2–4,3
(m, 1H, 4'), 4,35–5,0 (m,
1H, 3'), 4,9–5,2 (m,
1H, 2'), 6,0–6,1 (dd,
1H, 1'), 6,8–7,4 (m,
13H, DMT), 7,5–7,6
(d, 1H, C-6), 8,8 (bs, 1H, NH). 31P-NMR
(CDCl3): 151,468, 151,609, 151,790, 151,904.
-
iv. 1-(3',5'-Di-O-acetyl-2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
-
Aus
1-(2-Fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
(22,4 g, 92 mmol, Reinheit von 85%), wie gemäß der Methode von Beispiel
5-a-i. hergestellt, wurde mit Pyridin (2 × 150 ml) ein Azeotrop gebildet
und es wurde in Pyridin (250 ml) gelöst. Essigsäureanhydrid (55 ml, 0,58 mol)
wurde zugegeben und das Gemisch wurde 16 Stunden lang gerührt. Methanol
(50 ml) wurde zugegeben und das Rühren wurde 30 Minuten lang fortgesetzt.
Das Gemisch wurde zu einem Sirup eingedampft. Der Sirup wurde in
einer minimalen Menge an Methanol gelöst und auf eine Kieselgelsäule geladen.
Hexan/Essigsäureethylester,
1:1, wurde zum Eluieren der Produktfraktionen verwendet. Eine Reinigung
ergab 19,0 g (74%) der Titelverbindung.
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BEISPIEL 5-b
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i. 4-Triazin-1-(3',5'-di-O-acetyl-2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
-
1,2,4-Triazol
(106 g, 1,53 mol) wurde in Acetonitril (150 ml) gelöst, gefolgt
von Triethylamin (257 ml, 1,84 mol). Das Gemisch wurde auf zwischen
0 und 10°C
unter Verwendung eines Eisbads abgekühlt. POCl3 (34,5
ml, 0,375 mol) wurde langsam mittels eines Zugabetrichters zugegeben
und das Gemisch wurde weitere 45 Minuten lang gerührt. In
einem separaten Kolben wurde 1-(3',5'-Di-O-acetyl-2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
(56,9 g), 0,144 mol) in Acetonitril (150 ml) gelöst. Die das 1-(3',5'-Di-O-acetyl-2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
enthaltende Lösung
wurde mittels einer Kanüle
langsam zur Triazollösung
gegeben. Das Eisbad wurde entfernt und das Reaktionsgemisch 1 Stunde
lang auf Raumtemperatur erwärmen
gelassen. Das Acetonitril wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand
wurde zwischen gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung
(400 ml) und Dichlormethan (4 × 400
ml) aufgeteilt. Die organischen Schichten wurden vereinigt und im
Vakuum eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde in Essigsäureethylester
(200 ml) gelöst
und begann, zu einem Feststoff zu präzipitieren. Hexane (300 ml)
wurden zugegeben und weiterer Feststoff präzipitierte. Der Feststoff wurde
mittels Filtration gesammelt und mit Hexanen (2 × 200 ml) gewaschen und im
Vakuum getrocknet, um 63,5 g zu ergeben, die als solche ohne weitere
Reinigung verwendet wurden.
-
ii. 5-Methyl-1-(2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)cytosin
-
4-Triazin-1-(3',5'-di-O-acetyl-2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)thymin
(75,5 g, 0,198 mol) wurde in Ammoniak (400 ml) in einer Edelstahlbombe
gelöst
und über
Nacht versiegelt. Die Bombe wurde abgekühlt und geöffnet und der Ammoniak wurde
abgedampft. Methanol wurde zugegeben, um das Material in einen Kolben
zu überführen, und
etwa 10 Volumina Ethylether wurden zugegeben. Das Gemisch wurde
10 Minuten lang gerührt
und dann filtriert. Der Feststoff wurde mit Ethylether gewaschen
und getrocknet, um 51,7 g (86%) der Titelverbindung zu ergeben.
-
iii. 4-N-Benzoyl-5-methyl-1-(2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)cytosin
-
5-Methyl-1-(2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)cytosin
(54,6 g, 0,21 mol) wurde in Pyridin (700 ml) suspendiert und Benzoesäureanhydrid
(70 g, 0,309 mol) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 48 Stunden
lang bei Raumtemperatur gerührt.
Das Pyridin wurde durch Abdampfen entfernt und Methanol (800 ml)
wurde zugegeben und das Gemisch wurde gerührt. Es bildete sich ein Präzipitat,
das filtriert, mit Methanol (4 × 50
ml) gewaschen, mit Ether (3 × 100
ml) gewaschen und in einem Vakuumofen bei 45°C getrocknet wurde, um 40,5 g
der Titelverbindung zu ergeben. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt
und in einer Bombe mit gesättigtem methanolischem
Ammoniak über
Nacht bei Raumtemperatur behandelt. Das Gemisch wurde im Vakuum
eingeengt und das resultierende Öl
wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie
gereinigt. Das rückgeführte Ausgangsmaterial
wurde erneut wie oben behandelt, um weitere 4,9 g der Titelverbindung
zu ergeben, um kombinierte 45,4 g (61%) der Titelverbindung zu erhalten.
-
iv. 4-N-Benzoyl-5-methyl-1-(2-fluor-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)cytosin
-
4-N-Benzoyl-5-methyl-1-(2-fluor-β-D-erythropentofuranosyl)cytosin
(45,3 g, 0,124 mol) wurde in 250 ml trockenem Pyridin gelöst und Dimethoxytritylchlorid
(46,4 g, 0,137 mol) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde
90 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und Methanol (20 ml) wurde
zugegeben. Das Gemisch wurde im Vakuum eingeengt und zwischen Essigsäureethylester
(2 × 1
l) und gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung
(1 l) aufgeteilt. Die Essigsäureethylesterschichten
wurden vereinigt, über
Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Das resultierende Öl wurde
in Dichlormethan (200 ml) gelöst
und mittels Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan/Triethylamin,
50:50:1, gereinigt. Die Produktfraktionen wurden gepoolt, im Vakuum
eingeengt und getrocknet, um 63,6 g (76,6%) der Titelverbindung
zu ergeben.
-
v. 4-N-Benzoyl-5-methyl-1-(2-fluor-3-O-N,N-diisopropylamino-2-cyanoethylphosphit-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)cytosin
-
4-N-Benzoyl-5-methyl-1-(2-fluor-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)cytosin
(61,8 g, 92,8 mmol) wurde mit Dichlormethan (300 ml) 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit
(40,9 ml, 0,130 mol) und Diisopropylamintetrazolid (4,76 g, 0,3 Äq.) bei
Raumtemperatur 17 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde mit
gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung
(1 l) gewaschen und die Hydrogencarbonatlösung wurde mit Dichlormethan
(500 ml) zurückextrahiert.
Die vereinigten organischen Schichten wurden mit gesättigter
Kochsalzlösung
(1 l) gewaschen und die gesättigte
Kochsalzlösung
wurde mit Dichlormethan (100 ml) zurückextrahiert. Die vereinigten
organischen Schichten wurden über
Natriumsulfat getrocknet, filtriert und auf ein Volumen von etwa
200 ml eingeengt. Das resultierende Material wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung von Hexan/Essigsäureethylester/Triethylamin,
60:40:1, gereinigt. Die Produktfraktionen wurden im Vakuum eingeengt,
in Acetonitril (500 ml) gelöst,
filtriert, im Vakuum eingeengt und zu einem Schaum getrocknet. Der
Schaum wurde zerkleinert und 24 Stunden lang zu einem konstanten
Gewicht getrocknet, um 72,4 g (90%) der Titelverbindung zu erhalten. 1H-NMR: (CDCl3) δ 1,17–1,3 (m,
12H, 4 × CH3), 1,5–1,6
(m, 2H, 2 × CH),
2,3–2,4
(t, 1H, CH2CN), 2,6–2,7 (t, 1H, CH2CN),
3,3–3,9
(m, 13H, 2 × CH3Oar, 5'-CH2, CH2OP, C-5-CH3), 4,2–4,3
(m, 1H, 4'), 4,3–4,7 (m,
1H, 3'), 5,0–5,2 (m,
1H, 2'), 6,0–6,2 (dd,
1H, 1'), 6,8–6,9 (m, 4H,
DMT), 7,2–7,6
(m, 13H, DMT, Bz), 7,82–7,86
(d, 1H, C-6), 8,2–8,3
(d, 2H, Bz). 31P-NMR (CDCl3):
bs, 151,706; bs, 151,941.
-
BEISPIEL 5-c
-
i. 1-(2,3-Di-O-butylzinn-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
-
5-Methyluridin
(7,8 g, 30,2 mmol) und Dibutylzinnoxid (7,7 g, 30,9 mmol) wurden
in Methanol (150 ml) suspendiert und 16 Stunden lang zum Rückfluss
erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, filtriert
und der Feststoff mit Methanol (2 × 150 ml) gewaschen. Der resultierende
Feststoff wurde getrocknet, um 12,2 g (80,3%) der Titelverbindung
zu ergeben. Dieses Material wurde in anschließenden Reaktionen ohne weitere
Reinigung verwendet. Die NMR war mit der Struktur konsistent.
-
ii. 1-(2-O-Propyl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
-
1-(2,3-Di-O-butylzinn-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
(5,0 g, 10,2 mmol) und Iodpropan (14,7 g, 72,3 mmol) wurden in DMF
2 Tage lang bei 100°C
gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und
filtriert und eingeengt. Das restliche DMF wurde mit Acetonitril
koevaporiert. Nach dem Trocknen des Rückstands wurden 2,40 g (78%)
der Titelverbindung und des 3'-O-Propyl-Isomers als
ein Rohgemisch erhalten. Dieses Material wurde in anschließenden Reaktionen
ohne weitere Reinigung verwendet.
-
iii. 1-(2-O-Propyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
-
1-(2-O-Propyl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
und das 3'-O-Propyl-Isomer
als ein Rohgemisch (2,4 g, 8,4 mmol) wurde mit Pyridin (2 × 40 ml)
koevaporiert und in Pyridin (60 ml) gelöst. Die Lösung wurde 15 Minuten lang
bei Raumtemperatur unter Argon gerührt und Dimethoxytritylchlorid
(4,27 g, 12,6 mmol) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde periodisch
mittels DC überprüft und war
nach 3 Stunden abgeschlossen. Methanol (10 ml) wurde zugegeben und
das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
im Vakuum eingeengt und der resultierende Rückstand mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter
Verwendung von 60:40-Hexan/Essigsäureethylester mit 1% Triethylamin,
das die ganze Zeit über
verwendet wurde, gereinigt. Das Poolen und Einengen von entsprechenden
Fraktionen ergab 1,32 g (26%) der Titelverbindung.
-
iv. 1-(2-O-Propyl-3-O-N,N-diisopropylamino-2-cyanoethylphosphit-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
-
1-(2-O-Propyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
(50,0 g, 86 mmol), 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit
(38 ml, 120 mmol) und Diisopropylamintetrazolid (4,45 g, 25,8 mmol)
wurden in Dichlormethan (500 ml) gelöst und 40 Stunden lang bei
Raumtemperatur gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (2 × 400 ml)
und gesättigter
Kochsalzlösung
(1 × 400
ml) gewaschen. Die wässrigen
Schichten wurden mit Dichlormethan zurückextrahiert. Die Dichlormethan-Schichten
wurden vereinigt, über
Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der
resultierende Rückstand
wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan,
40:60, und 1% Triethylamin gereinigt. Die ent sprechenden Fraktionen
wurden gepoolt, eingeengt und unter Hochvakuum getrocknet, um 43
g (67%) zu ergeben.
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v. 1-(2-O-Propyl-3-O-acetyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
-
1-(2-O-Propyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
(10,0 g, 16,6 mmol) wurde in Pyridin (50 ml) gelöst und Essigsäureanhydrid
(4,7 ml, 52,7 mmol) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde
18 Stunden lang gerührt
und überschüssiges Essigsäureanhydrid
wurde mit Methanol (10 ml) neutralisiert. Das Gemisch wurde im Vakuum
eingeengt und der resultierende Rückstand in Essigsäureethylester
(150 ml) gelöst.
Der Essigsäureethylester
wurde mit gesättigter
NaHCO3-Lösung
(150 ml) gewaschen und die gesättigte
NaHCO3-Waschlösung wurde
mit Essigsäureethylester
(50 ml) zurückextrahiert.
Die Essigsäureethylester-Schichten
wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt, um einen weißen Schaum,
11,3 g, zu erhalten. Die Rohausbeute betrug mehr als 100% und die
NMR war mit der erwarteten Struktur der Titelverbindung konsistent.
Dieses Material wurde in anschließenden Reaktionen ohne weitere
Reinigung verwendet.
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BEISPIEL 5-d
-
i. 1-(2-O-Propyl-3-O-acetyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-4-triazolo-5-methylpyrimidin
-
Triazol
(10,5 g, 152 mmol) wurde in Acetonitril (120 ml) und Triethylamin
(23 ml) unter Rühren
unter wasserfreien Bedingungen gelöst. Die resultierende Lösung wurde
in einem Trockeneis/Aceton-Bad gekühlt und Phosphor(V)-oxidchlorid
(3,9 ml, 41 mmol) wurde über
einen Zeitraum von 5 Minuten langsam zugegeben. Das Gemisch wurde
weitere 10 Minuten gerührt,
wobei es zu einer dünnen
Aufschlämmung
wurde, was auf die Bildung des Produkts hinweist. 1-(2-O-Propyl-3-O-acetyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin
(11,2 g, 165 mmol) wurde in Acetonitril (150 ml) gelöst und zur
obigen Aufschlämmung
gegeben, wobei die Temperaturen des Trockeneis/Aceton-Bads aufrechterhalten
wurden. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang gerührt und
dann auf Raumtemperatur aufwärmen
gelassen und weitere 2 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde 18 Stunden
lang in einen Gefrierschrank bei 0°C gestellt und dann herausgenommen
und auf Raumtemperatur aufwärmen
gelassen. DC in Essigsäureethylester/Hexan,
1:1, des Gemischs zeigte eine vollständige Umwandlung des Ausgangsmaterials.
Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und wieder in Essigsäureethylester
(300 ml) gelöst
und mit gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung
(2 × 400
ml) und gesättigter
Kochsalzlösung
(400 ml) extrahiert. Die wässrigen
Schichten wurden mit Essigsäureethylester
(200 ml) zurückextrahiert.
Die Essigsäureethylester-Schichten
wurden vereinigt, über Natriumsulfat
getrocknet und im Vakuum eingeengt. Die Rohausbeute war 11,3 g (95%).
Die NMR war mit der erwarteten Struktur der Titelverbindung konsistent.
Dieses Material wurde in anschließenden Reaktionen ohne weitere
Reinigung verwendet.
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ii. 1-(2-O-Propyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methylcytidin
-
1-(2-O-Propyl-3-O-acetyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-4-triazolo-5-methylpyrimidin (11,2
g, 16,1 mmol) wurde in flüssigem
Ammoniak (50 ml) in einer 100-ml-Bombe bei Trockeneis/Aceton-Temperaturen
gelöst.
Die Bombe wurde 18 Stunden lang auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen
und dann wieder auf Trockeneis/Aceton-Temperaturen gekühlt. Der
Inhalt der Bombe wurde in ein Becherglas überführt und Methanol (50 ml) wurde
zugegeben. Das Gemisch wurde bis zur Fast-Trockne abdampfen gelassen.
Essigsäureethylester
(300 ml) wurde zugegeben und etwas Feststoff wurde vor dem Waschen
mit gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung
(2 × 250
ml) abfiltriert. Die Essigsäureethylester-Schichten wurden über Natriumsulfat
getrocknet, filtriert, mit dem zuvor abfiltrierten Feststoff vereinigt
und im Vakuum eingeengt, um 10,1 g Material zu ergeben. Die Rohausbeute
betrug mehr als 100% und die NMR war mit der erwarteten Struktur
der Titelverbindung konsistent. Dieses Material wurde in anschließenden Reaktionen
ohne weitere Reinigung verwendet.
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iii. 1-(2-O-Propyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-4-N-benzoyl-5-methylcytidin
-
1-(2-O-Propyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methylcytidin
(7,28 g, 10,1 mmol) und Benzoesäureanhydrid
(4,5 g, 20 mmol) wurden in DMF (60 ml) gelöst und 18 Stunden lang bei
Raumtemperatur gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und wieder in Essigsäureethylester
(300 ml) gelöst.
Die Essigsäureethylester-Lösung wurde
mit gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung
(2 × 400 ml)
gewaschen, über
Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der
Rückstand
wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan,
1:2, und 1% Triethylamin gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen
wurden gepoolt, eingeengt und unter Hochvakuum getrocknet, um 5,1
g (59% für
4 Schritte, ausgehend von 1-(2-O-Propyldimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-5-methyluridin)
zu ergeben.
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iv. 1-(2-O-Propyl-3-O-N,N-diisopropylamino-2-cyanoethylphosphit-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-4-N-benzoyl-5-methylcytidin
-
1-(2-O-Propyl-5-O-dimethoxytrityl-β-D-erythropentofuranosyl)-4-N-benzoyl-5-methylcytidin (5,0
g, 7 mmol), 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit
(3,6 ml, 11,3 mmol) und Diisopropylaminotetrazolid (0,42 g, 2,4
mmol) wurden in Dichlormethan (80 ml) gelöst und 40 Stunden lang bei
Raumtemperatur gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (2 × 40 ml)
und gesättigter
Kochsalzlösung
(1 × 40
ml) gewaschen. Die wässrigen
Schichten wurden mit Dichlormethan zurückextrahiert. Die Dichlormethan-Schichten
wurden vereinigt, über
Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der
resultierende Rückstand
wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan,
40:60, und 1% Triethylamin gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen
wurden gepoolt, eingeengt und unter Hochvakuum getrocknet, um 7,3
g (98%) zu ergeben.
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BEISPIEL 5-e
-
i. 2'-O-Methyl-5-methyluridin
-
Vorgehensweise 1:
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Rohes
2,2'-Anhydro-5-methyluridin
(10,0 g, 0,0416 mol) (Beispiel 2-a) wurde in Methanol (80 ml) in
einer Edelstahlbombe (Fassungsvermögen von 100 ml) gelöst. Trimethylborat
(5,6 ml, 0,049 mol) wurde zugegeben (Anmerkung 1). Die Bombe wurde
versiegelt und in ein Ölbad
bei 150°C
gestellt, das einen Druck von etwa 5 atm erzeugte. Nach 40 h wurde
die Bombe in Eis abgekühlt,
geöffnet
und der Inhalt unter vermindertem Druck zu einem braunen Schaum,
12 g, eingeengt. Die NMR des Rohmaterials war mit dem Produkt konsistent,
das mit Verunreinigungen im Ausgangsmaterial und einer Spur Thymin
und Ausgangsmaterial kontaminiert war (Hinweis 2). Das Rohprodukt
wurde als solches für
den nächsten
Schritt verwendet.
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Die
Trialkylborate können
in geeigneter Weise erstellt werden, indem Lösungen (z. B. 1 M in THF) von Boran
zum gewünschten
Alkohol gegeben werden und das resultierende Wasserstoffgas sich
entwickeln gelassen wird. Das Nukleosid kann zu diesem Zeitpunkt
mittels Säulenchromatographie
unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Essigsäureethylester
(0–10%)
und Auskristallisieren des Produkts aus absolutem Ethanol gereinigt
werden, um weiße
Nadeln zu ergeben, Fp. 192–193' (Fp. 197–198'). Eine Literaturreferenz zum
Fließpunkt
dieser Verbindung ist in E. Ootsuka, H. Inoue, japanische Patentschrift
89-85456, 4. April 1989, enthalten.
-
Vorgehensweise 2:
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Reines
2,2'-Anhydro-5-methyluridin
(1,0 g, 4,16 mmol) und Trimethylborat (0,56 ml, 4,9 mmol) wurden in
Methanol (20 ml) in einer Edelstahlbombe (100 ml) gelöst. Die
Bombe wurde in ein Ölbad
bei 150°C
gestellt. Nach 80 h zeigte DC an, dass die Reaktion größtenteils
abgeschlossen war. Das Lösungsmittel
wurde entfernt, um einen weißen
Schaum zu erhalten. Die NMR zeigte ein Produkt/Ausgangsmaterial-Verhältnis von
93:7 ohne weitere bemerkte Verunreinigungen an. Der Rückstand
wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter
Verwendung eines Methanol-Gradienten
in Essigsäureethylester
(0–10%)
gereinigt, um 850 mg (75%) reines Produkt und 250 mg noch immer
kontaminiertes Produkt zu erhalten. Eine analysenreine Probe wurde zur
NMR vorbereitet. 1H-NMR (DMSO-d6): δ 1,79 (s,
3H, 5-CH3), 3,35 (s, 3H, OCH3),
3,5–3,7
(m, 2H, H-5'), 3,7–3,9 (m,
2H, H-3',4'), 4,15 (m, 1H, H-2'), 5,17 (m, 2H, 3',5'-OH), 5,87 (d, J
= 5 Hz, 1H, H-1'),
7,80 (s, 1H, H-6), 11,37 (br s, 1H, N-H). Anal. berechn. für C11H16N2O6 (272,26): C, 48,52; H, 5,92; N, 10,29.
Gefunden: C, 48,56; H, 5,88; N, 10,22.
-
Vorgehensweise 3:
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Genauso
wie für
Vorgehensweise 2 beschrieben, mit der Ausnahme, dass 30 mg Natriumhydrogencarbonat
zum Reaktionsgemisch gegeben wurden (um es dem Natriumgehalt des
rohen Anhydro anzugleichen), was ermöglichte, die Reaktion in 24
h abzuschließen.
Ammoniumchlorid (50 mg) wurde zugegeben, um die Base zu neutralisieren,
und die Lösung
wurde zur Trockne gestrippt. Die NMR des Rohmaterials zeigte drei geringfügige Nukleosidverunreinigungen
(insgesamt etwa 6%) an. Nach einer ähnlichen Säule und dann Auskristallisieren
des Rückstands
aus Methanol/Essigsäureethylester
blieben 850 mg erstes Ertragsmaterial und 120 mg zweites Ertragsmaterial
zurück,
beide mit 2–3%
unbekannter Nukleosidverunreinigungen, für eine noch immer kontaminierte
Ausbeute von 85%.
-
ii. 5'-O-Dimethoxytriphenylmethyl-2'-O-methyl-5-methyluridin
-
Rohes
2'-O-Methyl-5-methyluridin
(12 g) wurde mit Pyridin (2 × 50
ml) koevaporiert und in trockenem Pyridin (50 ml) gelöst. Dimethoxytriphenylmethylchlorid
(18,1 g, 0,054 mol) wurde zugegeben. Der Kolben wurde mit einem
Stopfen verschlossen und 45 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Methanol (10 ml) wurde zugegeben, um die Reaktion zu quenchen, und
die Lösung
wurde unter vermindertem Druck zu einem Öl eingeengt. Der Rückstand
wurde zwischen Essigsäureethylester
(2 × 400
ml) und gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung
(500 ml) aufgeteilt. Die organischen Schichten wurden vereinigt,
getrocknet (Natriumsulfat), filtriert und zu einem gelben Schaum
eingeengt. Der Schaum wurde in Methylenchlorid (60 ml) gelöst und auf eine
Kieselgelsäule
(300 g) gegeben und mit Essigsäureethylester/Hexanen/Triethylamin,
60:40:1, eluiert. Die Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt,
eingeengt und mit trockenem Acetonitril (2 × 50 ml) koevaporiert. Der
resultierende Rückstand
wurde bei 1 mm Hg 24 h lang zu einem spröden weißen Schaum, 17,0 g (60,4% in
drei Schritten von 5-Methyluridin aus), getrocknet.
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BEISPIEL 5-f
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i. 2,3,5-Tri-O-benzoyl-2-thio-5-methyluridin
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1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoylribose
(0,500 g, 1 mmol) und 5-Methyl-2-thiouracil (0,156 g, 1,1 mmol) wurden
in einem 250-ml-Dreihalsrundkolben unter Vakuum über Nacht getrocknet. Diese
Komponenten wurden in 10 ml trockenem Acetonitril gelöst und auf
80°C erhitzt.
N-O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (0,509 g, 2,5 mmol) wurde zu dieser
warmen Lösung
gegeben und das Reaktionsgemisch 1 Std. lang bei 80°C gerührt. Das Reaktionsgemisch
wurde von der Hitze genommen und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen
und Trimethylsilyltriflat (0,334 g, 1,5 mmol) wurde tropfenweise
zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf 50°C erhitzt
und 4 Stunden lang gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mittels DC unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan,
1:1, überprüft, die
zeigte, dass die Reaktion zum Abschluss gekommen war. Die Lösung wurde
auf Raumtemperatur abgekühlt
und zwischen 50 ml Dichlormethan und 50 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung aufgeteilt.
Die wässrige
Phase wurde weitere zwei Male mit Dichlormethan extrahiert und die
organischen Schichten vereinigt, mit Magnesiumsulfat getrocknet
und zu einem blassgelben Schaum eingeengt. Dieser Schaum wurde ohne
weitere Reinigung verwendet.
-
ii. 2-Thio-5-methyluridin
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Das
rohe 2,3,5-Tri-O-benzoyl-2-thio-5-methyluridin (20 g, 37 mmol) wurde
in 500 ml Methanol gelöst. Natriummethylat
(2,0 g, 37 mmol) wurde zu dieser Lösung gegeben und das Reaktionsgemisch
2 Stunden lang gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mittels DC unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan,
1:1, und Essigsäureethylester/Methanol,
9:1, überprüft, die
zeigte, dass die Reaktion zum Abschluss gekommen war. Dowex 50 H+-Harz wurde zugegeben, bis die Lösung laut
pH-Papier neutral war, und das Harz wurde abfiltriert. Das Harz
wurde dann mit weiteren 100 ml Methanol gewaschen und die vereinigten
Filtrate wurden eingeengt, um die Titelverbindung, 8,5 g (84%),
als einen blassgelben Schaum zu ergeben.
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BEISPIEL 5-g
-
2'-O-Methyl-5-methyl-2-thiouridin
-
Dibutylzinnoxid
(0,500 g, 2,0 mmol), Tetrabutylammoniumiodid (0,738 g, 2 mmol) und
Methyliodid (1,022 g, 7,2 mmol) werden zu einer gerührten Lösung von
5- Methyl-2-thiouridin
(0,500 g, 1,8 mmol) in DMF (10 ml) gegeben. Der Reaktionskolben
wird versiegelt und 16 Stunden lang auf 50°C erhitzt. Das Gemisch wird abgekühlt und
eine weitere Portion Methyliodid wird zugegeben (1,022 g, 7,2 mmol)
und das Reaktionsgemisch wird weitere 16 Stunden erhitzt. Bei Ablauf
dieses Zeitraums wird das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und
mit Methylenchlorid verdünnt
und unter Verwendung eines Methylenchlorid/Methanol-Gradienten chromatographiert.
Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und eingeengt, um 2'-O-Methyl-5-methyl-2-thiouridin
zu ergeben.
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BEISPIEL 5-h
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2'-O-Propyl-5-methyl-2-thiouridin
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Die
Titelverbindung wird gemäß den Vorgehensweisen
von Beispiel 5-g mittels Austauschen von Methyliodid durch Propyliodid
(1,22 g, 7,2 mmol) hergestellt.
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BEISPIEL 5-i
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i. 2'-O-Phthalimidopropyl-5-methyl-2-thiouridin
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Die
Titelverbindung wird gemäß den Vorgehensweisen
von Beispiel 5-g mittels Austauschen von Methyliodid durch Brompropylphthalimid
(0,67 g, 2,5 mmol) hergestellt, wobei weiteres (0,300 g) am zweiten
Tag zugegeben wird.
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ii. 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-propylamin-5-methyl-2-thiouridin
-
2'-O-Phthalimidopropyl-5-methyl-2-thiouridin
(2,6 g, 3,6 mmol) wurde in trockenem Pyridin gelöst und zweimal koevaporiert.
Der resultierende Schaum wurde in 25 ml trockenem Pyridin gelöst und Dimethoxytritylchlorid
(1,8 g, 5,5 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von 4,4-Dimethylaminopyridin
(0,050 g, 0,4 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur
rühren
gelassen. 1 ml Methanol wurde zum Reaktionsgemisch gegeben. Die
Lösung
wurde zwischen 75 ml gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung
und 50 ml Chloroform aufgeteilt. Die wässrige Schicht wurde mit zwei
weiteren Portionen Chloroform extrahiert und die organischen Schichten
wurden vereinigt und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen
des Trockenmittels mittels Filtration wurde das Filtrat zu einem
orange farbenen Öl
eingeengt und mittels Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung eines Methanol/Chloroform-Gradienten mit 0,5% Pyridin,
das zum Neutralisieren des Kieselgels zugegeben wurde, gereinigt.
-
iii. 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-propylamin-5-methyl-2-S-toluoyl-2-thiouridin
-
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-propylamin-5-methyl-2-thiouridin
(1 g, 1,6 mmol) wurde in DMF gelöst
und auf 0°C
abgekühlt.
Triethylamin (0,300 g, 3 mmol) wurde zu dieser Lösung gegeben, gefolgt von Toluoylchlorid (0,300
g, 1,92 mmol), tropfenweise über
5 Minuten. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen
und über
Nacht gerührt,
bei Abschluss der Reaktion wurde diese mit Methanol gequencht und
das Reaktionsgemisch zu einem Öl
eingeengt. Das Öl
wurde dann zwischen 250 ml einer Lösung aus gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung/Chloroform,
1:1, aufgeteilt. Die wässrige
Schicht wurde mit zwei weiteren 75-ml-Portionen Chloroform extrahiert
und die organischen Schichten wurden getrocknet und zu einem Öl eingeengt.
Das geschützte
Nukleosid wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung
eines Hexan/Essigsäureethylester-Gradienten
gereinigt. Das gewünschte
Produkt wurde als ein Gemisch aus N-3-Toluoyl- und S-2-Toluoyl-Verbindungen
gesammelt. Dieses Gemisch wurde als solches für den Phosphitylierungsvorgang
verwendet.
-
iv. 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-propylamin-3'-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethoxyphosphit]-5-methyl-2-S-toluoyl-2-thiouridin
-
Chlor-/3-cyanoethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin
(5,6 ml, 25 mmol) wurde zu einer Lösung von 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-propylamin-5-methyl-2-S-toluoyl-2-thiouridin (16,01
g, 22 mmol) und Diisopropylethylamin (10 ml) in THF (200 ml) bei
0°C gegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde eingeengt und der Rückstand mittels Kieselgelsäulenchromatographie
gereinigt. Elution mit einem Essigsäureethylester/Hexan-Gradienten
bei Aufrechterhaltung von 1% Triethylamin, Poolen der entsprechenden
Fraktionen und Eindampfen ergibt die Titelverbindung.
-
BEISPIEL 5-j
-
i. 2'-O-Aminopropyl-5-methyl-2-thiouridin
-
2'-O-Phthalimidopropyl-5-methyl-2-thiouridin
(5,0 g, 15,8 mmol) wird in 100 ml Methanol in einem 500-ml-Kolben
gelöst.
Hydrazin (2,02 g, 63,2 mmol) wird zugegeben und das Gemisch wird
14 Stunden lang unter Rühren
zum Rückfluss
(60–65°C) erhitzt.
Das Lösungsmittel
wird im Vakuum abgedampft und der Rückstand wird in Dichlormethan
(150 ml) gelöst
und zweimal mit einem gleichgroßen
Volumen NH4OH extrahiert. Die organische
Schicht wird eingedampft, um das Rohprodukt zu erhalten. NMR wird
verwendet, um die Produktreinheit zu prüfen. Das Produkt wird in anschließenden Reaktionen
ohne weitere Reinigung verwendet.
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ii. 2'-O-Trifluoracetylaminopropyl-5-methyl-2-thiouridin
-
2'-O-Aminopropyl-5-methyl-2-thiouridin
wird in MeOH gelöst
und 5 Äquivalente
Triethylamin werden zugegeben, gefolgt von 10 Äquivalenten Trifluoressigsäureethylester.
Die Titelverbindung wird nach Reinigung isoliert.
-
iii. 2'-O-Trifluoracetylaminopropyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyl-2-thiouridin
-
2'-O-Trifluoracetylaminopropyl-5-methyl-2-thiouridin
(2,5 g, 3,6 mmol) wird in trockenem Pyridin gelöst und zweimal koevaporiert.
Der resultierende gelbe Schaum wird in 25 ml trockenem Pyridin gelöst und Dimethoxytritylchlorid
(1,8 g, 5,5 mmol) wird zugegeben, gefolgt von 4,4-Dimethylaminopyridin
(0,050 g, 0,4 mmol). Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur
rühren
gelassen. 1 ml Methanol wird zum Reaktionsgemisch gegeben. Die Lösung wird
zwischen 75 ml gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung
und 50 ml Chloroform aufgeteilt. Die wässrige Schicht wird mit zwei
weiteren Portionen Chloroform extrahiert und die organischen Schichten
werden vereinigt und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen
des Trockenmittels mittels Filtration wird das Filtrat zu einem Öl eingeengt
und mittels Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung eines Methanol/Chloroform-Gradienten mit 0,5% Pyridin,
das zum Neutralisieren des Kieselgels zugegeben wurde, gereinigt,
um die Titelverbindung zu ergeben.
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iv. 2'-O-Trifluoracetylaminopropyl-3'-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethoxyphosphit]-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyl-2-thiouridin
-
Die
Titelverbindung wird gemäß der Vorgehensweise
von Beispiel 5-i-iv. unter Verwendung der Titelverbindung von Beispiel
5-j-iii. hergestellt.
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BEISPIEL 5-k
-
i. 5'-O-Dimethoxytrityl-2-thio-5-methyluridin
-
2-Thio-5-methyluridin
(1 g, 3,6 mmol) wurde in trockenem Pyridin gelöst und zweimal koevaporiert.
Der resultierende gelbe Schaum wurde in 25 ml trockenem Pyridin
gelöst
und Dimethoxytritylchlorid (1,8 g, 5,5 mmol) wurde zugegeben, gefolgt
von 4,4-Dimethylaminopyridin (0,050 g, 0,4 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht
bei Raumtemperatur rühren
gelassen. 1 ml Methanol wurde zum Reaktionsgemisch gegeben. Die
Lösung
wurde zwischen 75 ml gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung
und 50 ml Chloroform aufgeteilt. Die wässrige Schicht wurde mit zwei
weiteren Portionen Chloroform extrahiert und die organischen Schichten
wurden vereinigt und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen
des Trockenmittels mittels Filtration wurde das Filtrat zu einem
orangefarbenen Öl
eingeengt und mittels Kieselgelsäulenchromatographie
unter Verwendung eines Methanol/Chloroform-Gradienten mit 0,5% Pyridin,
das zum Neutralisieren des Kieselgels zugegeben wurde, gereinigt.
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ii. 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-tert.-butyldimethylsilyl-5-methyl-2-thiouridin
-
5'-O-Dimethoxytrityl-2-thio-5-methyluridin
(1 g, 1,73 mmol) wurde zweimal mit trockenem DMF koevaporiert und
dann in trockenem DMF gelöst
und Imidazol (0,141 g, 2,08 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von (0,313
g, 2,08 mmol) tert.-Butyldimethylsilylchlorid.
Das Reaktionsgemisch wurde über
Nacht gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mittels DC unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan,
1:1, überprüft, die
zeigte, dass die Reaktion zum Abschluss gekommen war. Das Reaktionsgemisch
wurde dann in 5%-ige Natriumhydrogencarbonatlösung gegossen und 3-mal mit
Chloroform extrahiert. Die vereinigte organische Lösung wurde
mit Magnesiumsulfat getrocknet und zu einem Öl eingeengt. Das resultierende Öl wurde
mittels Kieselgelsäulenchromatographie unter
Verwendung eines Methanol/Chloroform-Gradienten gereinigt, wobei
das 2'- und das 3'-Silyl-geschützte Nukleosid
separat isoliert wurden.
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iii. 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-tert.-butyldimethylsilyl-2'-methansulfonyl-5-methyl-2-thiouridin
-
5'-O-Dimethoxytrityl-3'-tert.-butyldimethylsilyl-5-methyl-2-thiouridin
(1,0 g, 1,45 mmol) wurde in Pyridin gelöst und auf 0°C abgekühlt. Methansulfonylchlorid
(0,183 g, 1,6 mmol) wurde tropfenweise zu dieser Lösung gegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde dann bis zum Abschluss der Reaktion laut
DC rühren
gelassen. Das Reaktionsgemisch wird mit Methanol neutralisiert und
zu einem Öl
eingeengt. Die Titelverbindung wird als solche für weitere Reaktionen verwendet.
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iv. 5'-Dimethoxytrityl-3'-tert.-butyldimethylsilyl-2,2'-thioanhydro-5-methyl-2-thiouridin
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Das
in Beispiel 5-k-iii. gefundene mesylierte Nukleosid wird bei Raumtemperatur
mit 5 Äquivalenten Natriummethylat
behandelt und bis zur vollständigen
Bildung des Thioanhydro-Produkts rühren gelassen. Die Lösung wird
dann mit Dowex 50W (H+-Form) neutralisiert, das Harz abfiltriert
und die resultierende Lösung
eingeengt, um die Titelverbindung zu ergeben.
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v. 2'-Fluor-3'-tert.-butyldimethylsilyl-5'-dimethoxytrityl-5-methyl-2-thiouridin
-
Das
in Beispiel 5-k-iv. gefundene Thioanhydronukleosid wurde in wasserfreiem
Dioxan gelöst.
6 Äquivalente
HF/Pyridin-Komplex wurden zu dieser Lösung gegeben und das Reaktionsgemisch
bis zum Abschluss der Reaktion laut DC gerührt. Das Reaktionsgemisch wird
dann über
ein Bleichgroßes
Volumen Eis gegossen und Calciumcarbonat wird zugegeben, bis das
Reaktionsgemisch neutral ist. Die Feststoffe werden abfiltriert und
das Filtrat wird eingeengt. Der Rückstand wird mittels Kieselgelsäulenchromatographie
gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben.
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vi. 2'-Fluor-3'-O-[(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethoxyphosphit]-5'-dimethoxytrityl-5-methyl-2-thiouridin
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2'-Fluor-3'-tert.-butyldimethylsilyl-5'-dimethoxytrityl-5-methyl-2-thiouridin
wird gemäß der Vorgehensweise
von Beispiel 5-i-iv. behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
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BEISPIEL 6
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Oligoribonukleotidsynthese
-
Unsubstituierte
und substituierte Phosphodiesteroligoribonukleotide, hierin auch
als PO-verknüpfte Oligoribonukleotide
bezeichnet, wurden auf einem automatisierten DNA-Synthesegerät (Applied
Biosystems Modell 380B) unter Verwendung von Standard-Phosphoramiditchemie
mit Oxidation von Iodin synthetisiert.
-
Phosphorthioatoligonukleotide,
hierin auch als PS-verknüpfte
Oligoribonukleotide bezeichnet, werden wie die Phosphodiesteroligoribonukleotide
synthetisiert, mit der Ausnahme, dass die Standardoxidationsflasche
durch eine 0,2 M Lösung
von 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid
in Acetonitril für
die schrittweise Thiierung der Phosphitverknüpfungen ersetzt wird. Der Thiierungswarteschritt
wurde auf 68 Sek. verlängert
und auf diesen folgte der Verschlussschritt. Nach der Spaltung aus
der CPG-Säule
und dem Entblocken in konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung bei
55°C (18
Std.) wurden die Oligonukleotide durch zweimaliges Präzipitieren
mit 2,5 Volumina Ethanol aus einer 0,5 M NaCl-Lösung gereinigt. Analytische
Gelelektrophorese wurde in 20%-igem Acrylamid, 8 M Harnstoff, 454
mM Trisboratpuffer, pH = 7,0, durchgeführt. Die Oligonukleotide und Phosphorthioate
wurden auf Grundlage von Polyacrylamid-Gelelektrophorese als zu
mehr als 80% vollständiges
Material beurteilt.
-
Phosphinatoligoribonukleotide,
hierin auch als PI-verknüpfte
Oligoribonukleotide bezeichnet, werden wie in der US-Patentschrift
5,508,270 beschrieben hergestellt.
-
Alkylphosphonatoligoribonukleotide,
hierin auch als PMe-verknüpfte
Oligoribonukleotide bezeichnet, werden wie in der US-Patentschrift
4,469,863 beschrieben hergestellt.
-
Phosphoramiditoligoribonukleotide,
hierin auch als PN-verknüpfte
Oligoribonukleotide bezeichnet, werden wie in der US-Patentschrift
5,256,775 oder der US-Patentschrift 5,366,878 beschrieben hergestellt.
-
Alkylphosphonothioatoligoribonukleotide,
hierin auch als MePS-verknüpfte
Oligoribonukleotide bezeichnet, werden wie in den veröffentlichten
PCT-Anmeldungen
PCT/US94/00902 und PCT/US93/06976 (veröffentlicht als WO 94/17093
bzw. WO 94/02499) beschrieben hergestellt.
-
3'-Deoxy-3'-aminophosphoramidatoligoribonukleotide,
hierin auch als 3'NPN-verknüpfte Oligoribonukleotide
bezeichnet, werden wie in der US-Patentschrift 5,476,925 beschrieben
hergestellt.
-
Phosphotriesteroligoribonukleotide,
hierin auch als POMe-verknüpfte
Oligoribonukleotide bezeichnet, werden wie in der US-Patentschrift
5,023,243 beschrieben hergestellt.
-
Boranphosphatoligoribonukleotide,
hierin auch als BP-verknüpfte
Oligoribonukleotide bezeichnet, werden wie in den US-Patentschriften
5,130,302 und 5,177,198 beschrieben hergestellt.
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BEISPIEL 7-a
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Oligoribonukleosidsynthese
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Mit
Methylenmethylimino verknüpfte
Oligoribonukleoside, hierin auch als MMI-verknüpfte Oligoribonukleoside bezeichnet,
mit Methylendimethylhydrazo verknüpfte Oligoribonukleoside, hierin
auch als MDH-verknüpfte
Oligoribonukleoside bezeichnet, und mit Methylencarbonylamino verknüpfte Oligoribonukleoside,
hierin auch als Amid-3-verknüpfte
Oligoribonukleoside bezeichnet, und mit Methylenaminocarbonyl verknüpfte Oligoribonukleoside,
hierin auch als Amid-4-verknüpfte
Oligoribonukleoside bezeichnet, sowie gemischten Hauptkettenverbindungen,
die beispielsweise alternierende MMI- und PO- oder PS-Verknüpfungen
aufweisen, werden wie in den US-Patentschriften 5,378,825, 5,386,023
und 5,489,677 und den veröffentlichten
PCT-Anmeldungen PCT/US92/04294 und PCT/US92/04305 (veröffentlicht
als WO 92/20822 bzw. WO 92/20823) beschrieben hergestellt.
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Mit
Formacetal und Thioformacetal verknüpfte Oligoribonukleoside, hierin
auch als FA- bzw. TFA-verknüpfte
Oligoribonukleoside bezeichnet, werden wie in den US-Patentschriften 5,264,562
und 5,264,564 beschrieben hergestellt.
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Mit
Ethylenoxid verknüpfte
Oligoribonukleoside, hierin auch als ETO-verknüpfte Oligoribonukleoside bezeichnet,
werden wie in der US-Patentschrift 5,223,618 beschrieben hergestellt.
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BEISPIEL 7-b
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PNA
-
Peptidnukleinsäuren (PNAs)
sind an sich bekannt und werden gemäß einer beliebigen der verschiedenen
Methoden, auf die in Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties
and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5–23, verwiesen
wird, hergestellt. Sie können
ebenfalls gemäß der US-Patentschrift 5,539,083,
die der Seriennummer 08/200,742 entspricht, am 23. Februar 1994
eingereicht und demselben Bevollmächtigten wie für diese
Anmeldung übertragen,
hergestellt werden.
-
BEISPIEL 8
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Chimäre Phosphorthioatoligoribonukleotide,
z. B. [2'-O-Me]/PS·[2'-OH]/PS·[-2'-O-Me]/PS-Oligoribonukleotid
-
Chimäre Oligoribonukleotide
mit 2'-O-Alkylphosphorthioat-
und 2'-OH-Phosphorthioatoligonukleotidsegmenten
wurden unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesegeräts, Modell
380B von Applied Biosystems, wie oben synthetisiert. Oligoribonukleotide
wurden unter Verwendung des automatisierten Synthesegeräts und 5'-Dimethoxytrityl-2'-tert.-butyldimethylsilyl-3'-O-phosphoramidit für den RNA-Teil
und 5'-Dimethoxytrityl-2'-O-methyl-3'-O-phosphoramidit für die 5'- und 3'-Schenkel synthetisiert.
Die Schutzgruppen an den exozyklischen Aminen waren Phenoxyacetyl
für rA
und rG, Benzoyl für
rC und 2'-O- Methyl A und 2'-O-Methyl C und Isobutyryl
für 2'-O-Methyl G. Der
Standardsynthesezyklus wurde modifiziert, indem der Warteschritt nach
dem Transfer von Tetrazol und der Base auf 600 s verlängert und
viermal für
RNA und zweimal für 2'-O-Methyl wiederholt
wurde. Das vollständig
geschützte
Oligoribonukleotid wurde vom Träger
gespalten und die Phosphatgruppe wurde in 3:1-Ammoniak/Ethanol bei
Raumtemperatur über
Nacht entschützt
und dann zur Trockne lyophilisiert. Es wurde dann eine Behandlung
in methanolischem Ammoniak für
24 Std. bei Raumtemperatur vorgenommen, um alle Basen zu entschützen, und
die Probe wurde erneut zur Trockne lyophilisiert. Das Pellet wurde
in 1 M TBAF in THF für
24 Std. bei Raumtemperatur resuspendiert, um die 2'-Stellungen zu entschützen. Die
Reaktion wurde dann mit 1 M TEAA gequencht und die Probe wird dann
mittels Rotovac auf das halbe Volumen eingeengt, bevor sie auf einer
G25-Größenausschlusssäule entsalzt
wird. Das wiedergewonnene Oligo wurde dann spektralphotometrisch
auf Ausbeute und Reinheit mittels Kapillarelektrophorese und Massenspektrometer
analysiert.
-
BEISPIEL 9
-
Chimäre „Gapmer"-Oligoribonukleotide
-
i. Chimäres Methylphosphonatoligoribonukleotid,
z. B. [2'-O-Me]/PMe·[2'-OH]1PMe·[-2'-O-Me]/PMe-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden
des Beispiels 6 ein chimäres
Oligoribonukleotid mit einer Methylphosphonat-Hauptkette hergestellt.
-
ii. Chimäres Phosphoramidatoligoribonukleotid,
z. B. [2'-O-Me]/PN·[2'-OH]/PN·[-2'-O-Me]/PN-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden
des Beispiels 6 ein chimäres
Oligoribonukleotid mit einer Phosphoramidat-Hauptkette hergestellt.
-
iii. Chimäres Phosphoramidatoligoribonukleotid,
z. B. [2'-O-Me]/3'NPN·[2'-OH]/3'NPN·[-2'-O-Me]/3'NPN-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden
des Beispiels 6 ein chimäres
Oligoribonukleotid mit einer 3'-Deoxy-3'-aminophosphoramidat-Hauptkette hergestellt.
-
iv. Chimäres Phosphinatoligoribonukleotid,
z. B. [2'-O-Me]/PI·[2'-OH]/PI·[-2'-O-Me]/PI-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden
des Beispiels 6 ein chimäres
Oligoribonukleotid mit einer Phosphinat-Hauptkette hergestellt.
-
v. Chimäres Alkylphosphonothioatoligoribonukleotid,
z. B. [2'-O-Me]/MePS·[2'-OH]/MePS·[-2'-O-Me]/MePS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden
des Beispiels 6 ein chimäres
Oligoribonukleotid mit einer Phosphonothioat-Hauptkette hergestellt.
-
vi. Chimäres Phosphordithioatoligoribonukleotid,
z. B. [2'-O-Me]/P2S·[2'-OH]/P2S·[-2'-O-Me]/P2S-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden
des Beispiels 6 ein chimäres
Oligoribonukleotid mit einer Phosphordithioat-Hauptkette hergestellt.
-
vii. Chimäres Phosphorselenatoligoribonukleotid,
z. B. [2'-O-Me]/PSe·(2'-OH]/PSe·[-2'-O-Me]/PSe-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden
des Beispiels 6 ein chimäres
Oligoribonukleotid mit einer Phosphorselenat-Hauptkette hergestellt.
-
viii. Chimäres Boranphosphatoligoribonukleotid,
z. B. [2'-O-Me]/BP·[2'-OH]/BP·[-2'-O-Me]/BP-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden
des Beispiels 6 ein chimäres
Oligoribonukleotid mit einer Boranphosphat-Hauptkette hergestellt.
-
ix. Chimäres Methylphosphotriesteroligoribonukleotid,
z. B. [2'-O-Me]/POMe·[2'-OH]/POMe·[-2'-O-Me]/POMe-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Verwendung von Oligoribonukleotiden
des Beispiels 6 ein chimäres
Oligoribonukleotid mit einer Methylphosphotriester-Hauptkette hergestellt.
-
BEISPIEL 10
-
Chimäre Oligoribonukleoside
-
i. Chimäres Methylenmethyliminooligoribonukleosid,
z. B. [2'-O-Me]/MMI·[2'-OH]/MMI·[-2'-O-Me]/MMI-Oligoribonukleosid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie des
Beispiels 7 ein chimäres Oligoribonukleosid
mit Methylenmethyliminoverknüpfungen über das
gesamte Oligoribonukleosid hergestellt.
-
ii. Chimäres Methylendimethylhydrazooligoribonukleosid,
z. B. [2'-O-Me]/MDH·[2'-OH]/MDH-[-2'-O-Me]/MDH-Oligoribonukleosid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie des
Beispiels 7 ein chimäres Oligoribonukleosid
mit Methylendimethylhydrazoverknüpfungen über das
gesamte Oligoribonukleosid hergestellt.
-
iii. Chimäres Formacetaloligoribonukleosid,
z. B. [2'-O-Me]/FA·[2'-OH]/FA-[-2'-O-Me]/FA-Oligoribonukleosid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie des
Beispiels 7 ein chimäres Oligoribonukleosid
mit Formacetalverknüpfungen über das
gesamte Oligoribonukleosid hergestellt.
-
iv. Chimäres Thioformacetaloligoribonukleosid,
z. B. [2'-O-Me]/TFA·[2'-OH]/TFA·[-2'-O-Me]/TFA-Oligoribonukleosid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie des
Beispiels 7 ein chimäres Oligoribonukleosid
mit Thioformacetalverknüpfungen über das
gesamte Oligoribonukleosid hergestellt.
-
v. Chimäres Ethylenoxidoligoribonukleosid,
z. B. [2'-O-Me]/ETO·[2'-OH]/ETO·[-2'-O-Me]/ETO-Oligoribonukleosid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie des
Beispiels 7 ein chimäres Oligoribonukleosid
mit Ethylenoxidverknüpfungen über das
gesamte Oligoribonukleosid hergestellt.
-
vi. Chimäres Methylencarbonylaminooligoribonukleosid,
z. B. [2'-O-Me]/Amid-3·[2'-OH]/Amid-3·[-2'-O-Me]/Amid-3-Oligoribonukleosid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie des
Beispiels 7 ein chimäres Oligoribonukleosid
mit Amid-3-Verknüpfungen über das
gesamte Oligoribonukleosid hergestellt.
-
BEISPIEL 11
-
Chimäre Oligoribonukleotide/Oligoribonukleoside
-
i. Methylenmethylimino/Phosphorthioat-Chimäre, z. B.
[2'-O-Me]/PS·[2'-OH]/PS·[-2'-O-Me]/MMI-Oligoribonukleotid/Oligoribonukleosid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie der
Beispiele 6 und 7 eine chimäre
Verbindung mit sowohl Oligoribonukleotid- als auch Oligoribonukleosidsegmenten
hergestellt. Die chimäre
Verbindung weist Methylenmethyliminoverknüpfungen in einem „Schenkel" und Phosphorthioatverknüpfungen
in einem mittleren „Gap" und im anderen „Schenkel" auf.
-
ii. Chimäres Methylphosphonat/Methylenmethylimino/Phosphorthioat-OligoribonukleotidlOligoribonukleosid, z.
B. [2'-O-Me]/PMe·[2'-OH]/PS·[-2'-O-Me]/MMI-Oligoribonukleotid/Oligoribonukleosid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie der
Beispiele 6 und 7 eine chimäre
Verbindung mit sowohl Oligoribonukleotid- als auch Oligoribonukleosidteilen
hergestellt. Die chimäre Verbindung
weist Methylenmethyliminoverknüpfungen
in einem „Schenkel", Phosphorthioatverknüpfungen
in einem mittleren „Gap" und Methylphosphonatverknüpfungen
im anderen „Schenkel" auf.
-
iii. Chimäres Methylencarbonylamino/Phosphorthioat/Methylencarbonylamino-OligoribonukleotidlOligoribonukleosid,
z. B. [2'-O-Me]/Amid-3·[2'-OH]/PS·[-2'-O-Me]/Amid-3-Oligoribonukleotid/Oligoribonukleosid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie der
Beispiele 6 und 7 eine chimäre
Verbindung mit sowohl Oligoribonukleotid- als auch Oligoribonukleosidsegmenten
hergestellt. Die chimäre
Verbindung weist Methylencarbonylaminoverknüpfungen in beiden „Schenkeln" und Phosphorthioatverknüpfungen
in einem mittleren „Gap" auf.
-
iv. Chimäres Methylencarbonylamino/Phosphorthioat/Methylenmethylimino-Oligoribonukleotid/Oligoribonukleosid,
z. B. [2'-O-Me]/Amid-3·(2'-OH]/PS·[-2'-O-Me]/MMI-Oligoribonukleotid/Oligoribonukleosid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie der
Beispiele 6 und 7 eine chimäre
Verbindung mit sowohl Oligoribonukleotid- als auch Oligoribonukleosidsegmenten
hergestellt. Die chimäre
Verbindung weist Methylencarbonylaminoverknüpfungen in einem „Schenkel"-Segment, Phosphorthioatverknüpfungen
in einem mittleren „Gap" und Methylenmethyliminoverknüpfungen
im anderen „Schenkel"-Segment auf.
-
v. Methylenmethylimino/Phosphodiester/Phosphorthioat-Chimäre, z. B. [2'-O-Me]/MMI-PO·[2'-OH]/PS·[-2'-O-Me]/MMI-PO-Oligoribonukleotid/Oligoribonukleosid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemie der
Beispiele 6 und 7 eine chimäre
Verbindung mit sowohl Oligoribonukleotid- als auch Oligoribonukleosidsegmenten
hergestellt. Die chimäre
Verbindung weist alternierende Methylenmethylimino- und Phosphodiesterverknüpfungen
in seinen „Schenkel"-Segmenten und Phosphorthioatverknüpfungen
in seinem mittleren „Gap"-Segment auf.
-
BEISPIEL 12
-
Chimäre, „am Ende gapped" Phosphorthioatoligoribonukleotide
-
i. „Am 3'-Ende gapped" Phosphorthioat-Chimäre, z. B. [2'-O-Me]/PS·[2'-OH]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit einem „offenen
Gap"-Segment an
ihrem 3'-Terminus,
einem „Schenkel"-Segment an ihrem
5'-Terminus und
Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
ii. „Am 5'-Ende gapped" Phosphorthioat-Chimäre, z. B. [2'-OH]/PS·[2'-O-Me]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit einem „offenen
Gap"-Segment an
ihrem 5'-Terminus,
einem „Schenkel"-Segment an ihrem
3'-Terminus und
Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
iii. „Am 3'-Ende gapped" Phosphorthioat-Chimäre, z. B. [2'-F]/PS·[2'-OH]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit einer „offenen
Gap" an ihrem 3'-Terminus, 2'-Fluornukleosiden
in ihrem 5'-„Schenkel"-Segment, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem offenen „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
BEISPIEL 13
-
Chimäre Oligoribonukleotide
mit einheitlichen Hauptkettenverknüpfungen und variablen Nukleosiduntereinheiten
-
i. Chimäres 2'-O-Ethyloligoribonukleotid,
z. B. (2'-O-Et]/PS[2'-OH]/PS·[2'-O-Et]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Ethylnukleosiden
in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in
ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
ii. Chimäres 2'-O-Propyloligoribonukleotid,
z. B. [2'-O-Pr]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-Pr]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Propylnukleosiden
in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in
ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
iii. [2'-O-F]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-F]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-Fluornukleosiden in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in
ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
iv. [2'-O-EtOMe]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-EtOMe]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Methoxyethylnukleosiden in
ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in
ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
v. [2'-O-EtOMe]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-F]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Methoxyethylnukleosiden in
ihrem 5'-„Schenkel"-Segment, 2'-OH-Nukleosiden in
ihrem „Gap"-Segment, 2'-Fluornukleosiden
in ihrem 3'-„Schenkel"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
vi. [2'-O-EtOMe]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-Me]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Methoxyethylnukleosiden in
ihrem 5'-„Schenkel"-Segment, 2'-OH-Nukleosiden in
ihrem Gap, 2'-O-Methylnukleosiden
in ihrem 3'-„Schenkel"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
BEISPIEL 14
-
Chimäre Oligoribonukleotide mit
variablen Hauptkettenverknüpfungen
und variablen Nukleosiden
-
i. [2'-O-Me]/PMe·[2'-OH]/PS·[2'-F]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemien des
Beispiels 6 eine chimäre Verbindung
mit 2'-O-Methylnukleosiden
in ihrem 5'-„Schenkel"-Segment, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap", 2'-O-Fluornukleosiden
in ihrem 3'-„Schenkel"-Segment, Phosphorthioatverknüpfungen
im „Gap"-Segment und dem
3'-„Schenkel"-Segment und Methylphosphonatverknüpfungen
im 5'-„Schenkel"-Segment hergestellt.
-
ii. [2'-O-Me]/PMe·[2'-OH]/PS·2'-Pr]/PI-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird unter Anwendung der Chemien des
Beispiels 6 eine chimäre Verbindung
mit 2'-O-Methylnukleosiden
in ihrem 5'-„Schenkel"-Segment, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap", 2'-O-Propylnukleosiden
in ihrem 3'-„Schenkel"-Segment, Phosphorthioatverknüpfungen
im „Gap"-Segment, Methylphosphonatverknüpfungen
im 5'-„Schenkel"-Segment und Phosphinatverknüpfungen
im 3'-„Schenkel"-Segment hergestellt.
-
BEISPIEL 15
-
Chimäre Oligoribonukleotide, die
Surrogat-Nukleoside enthalten
-
i. Morpholinonukleosidsurrogat
enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [Morpholinonukleosidsurrogat]·[2'-OH]/PS·[Morpholinonukleosidsurrogat]-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise der Beispiele 7 und 8 wird eine chimäre Verbindung
mit Morpholinonukleosiden, die gemäß der Lehren der US-Patentschrift
5,506,337 hergestellt wurden, in ihren „Schenkel"-Segmenten und über Phosphorthioatverknüpfungen
verknüpften
2'-OH-Nukleosiden
in ihrem „Gap"-Segment hergestellt.
-
ii. Cyclobutylnukleosidsurrogat
enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [Cyclobutylnukleosidsurrogat]/PS·[2'-OH]/PS·[Cyclobutylnukleosidsurrogat]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise der Beispiele 7 und 8 wird eine chimäre Verbindung
mit Cyclobutylsurrogat-Nukleosiden, die gemäß der Lehren der US-Patentschrift
5,359,044 hergestellt wurden, in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
iii. Pyrrolidinnukleosidsurrogat
enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. (Pyrrolidinnukleosidsurrogat]/PS·[2'-OH]/PS·[Pyrrolidinzucker]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise der Beispiele 7 und 8 wird eine chimäre Verbindung
mit Pyrrolidinsurrogat-Nukleosiden, die gemäß der Lehren der US-Patentschrift
5,519,135 hergestellt wurden, in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
iv. „Am 3'-Ende gapped" PNA·Phosphorthioat-Chimäre, z. B.
PNA·[2'-OH]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 in Kombination mit der Chemie des
Beispiels 7-b wird eine chimäre
Verbindung mit einem „offenen
Gap" an ihrem 3'-Terminus, das aus
2'-OH-Nukleosiden
mit Phosphorthioatverknüpfungen
gebildet ist, und PNA-Surrogat-Nukleosiden
im 5'-„Schenkel"-Segment hergestellt.
-
BEISPIEL 16
-
Chimäre Oligoribonukleotide, die
Nukleoside mit modifizierten Basen enthalten
-
i. N-2-modifiziertes Purin
enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [Mod-Purin]/PS·[2'-OH]/PS·[Mod-Purin]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 4,7,10,13-Tetraazahexadec-1-ylguanosinnukleosiden,
die gemäß der Lehren
der US-Patentschrift
5,459,255 hergestellt wurden, in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden
in ihrem „Gap" und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
ii. C-5-modifiziertes
Pyrimidin enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [Mod-Pyr]/PS·[2'-OH]/PS·[Mod-Pyr]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 5-Propinylpyrimidinnukleosiden, die
gemäß der Lehren
der US-Patentschrift 5,484,908 hergestellt wurden, in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in
ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
iii. N-2-, C-6-modifiziertes
Purin enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [Mod-Purin]/PS·[2'-OH]/PS·[Mod-Purin]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 6-Hydroxy-2-fluorpurinnukleosiden,
die gemäß der Lehren
der US-Patentschrift 5,459,255 hergestellt wurden, in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in
ihrem „Gap" und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
iv. 2'-O-Alkyl-, C-5-modifiziertes Pyrimidin
enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Propyl-Mod-Pyr]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-Propyl-Mod-Pyr]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Propyl-5-methylcytidinnukleosiden
in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in
ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
v. 2'-O-Alkyl-, N-2-, C-5-modifiziertes Pyrimidin
enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Propyl-Mod-Pyr]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-Propyl-Mod-Pyr]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Propyl-2-thio-5-methyluridinnukleosiden
in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in
ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
vi. 2'-O-Aminoalkyl-, N-2-, C-5-modifiziertes
Pyrimidin enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Aminopropyl-Mod-Pyr]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-Aminopropyl-Mod-Pyr]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Aminopropyl-2-thio-5-methyluridinnukleosiden
in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
vii. 2'-O-Fluor-, N-2-, C-5-modifiziertes Pyrimidin
enthaltendes Oligoribonukleotid, z. B. [2'-O-Fluor-Mod-Pyr]/PS·[2'-OH]/PS·[2'-O-Fluor-Mod-Pyr]/PS-Oligoribonukleotid
-
Nach
Art und Weise des Beispiels 8 wird eine chimäre Verbindung mit 2'-O-Fluor-2-thio-5-methyluridinnukleosiden
in ihren „Schenkel"-Segmenten, 2'-OH-Nukleosiden in
ihrem „Gap"-Segment und Phosphorthioatverknüpfungen überall hergestellt.
-
BEISPIEL 17
-
Zellkultur
und Northern-Blot-Analyse eines ras-Ziels
-
T24-Zellen
wurden als Monoschichten in mit 10%-igem fötalem Rinderserum und 100 Einheiten/ml
Penicillin supplementiertem McCoy's Medium (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD,
USA) bewahrt. Nach einer Behandlung mit oligomeren Verbindungen
für 24
Std. wurden die Zellen mit Trypsin versetzt, zentrifugiert und die gesamte
Zell-RNA wurde gemäß Standardprotokollen
(siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1988,
Wiley and Sons, New York, NY, USA) isoliert. Um die relativen Abundanz
an Ha-ras-mRNA zu quantifizieren, wurde die gesamte RNA (10 μg) mittels
Northern-Blotting auf Bio-Rad Zeta-Sondenmembran (Bio-Rad, Hercules,
CA, USA) übertragen
und mittels UV vernetzt (StratalinkerTM,
Stratagene, LaJolla, CA, USA). Membrangebundene RNA wurde auf eine
mit 32P markierte, 0,9 kb lange Ha-ras-cDNA-Sonde
(Oncogene Science, Pasadena, CA, USA) hybridisiert und auf XAR-Film
(Kodak, Rochester, N.Y., USA) belichtet. Der relative Umfang des
Ha-ras-Signals wurde bestimmt, indem das Ha-ras-Signal auf jenes
normiert wurde, das erhalten wurde, als dieselbe Membran gestrippt
und mit einer Sonde für
menschliche Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (G3PDH, Clontech,
Palo Alto, CA, USA) hybridisiert wurde. Signale von Northern-Blots
wurden unter Anwendung von Phospholmager- und ImageQuant-Software
(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA) quantifiziert.
-
BEISPIEL 18
-
Behandlung
von Zellen mit einer Verbindung
-
In
Monoschichten gezüchtete
Zellen wurden einmal mit warmer PBS gewaschen und dann wurde Opti-MEM-Medium
(GIBCO-BRL), das Lipofectin (GIBCO-BRL) enthielt, in einer Konzentration
von 5 μg/ml
pro 200 nM Oligo mit einer Höchstkonzentration
von 15 μg/ml
zugegeben. Es wurden oligomere Verbindungen zugegeben und bei 37°C für 4 Std.
inkubiert, wonach das Medium durch Vollserummedium ausgetauscht
wurde. Nach 24 Std. bei Vorhandensein der Verbindung wurden die
Zellen geerntet und RNA zur weiteren Analyse angesetzt.
-
BEISPIEL 19
-
RNase-H-Analyse
-
Es
wurde unter Verwendung von Oligoribonukleotiden mit 17 Basen, die
den Basen (+23 bis +47) aktivierter (Codon-12-Mutation) Ha-ras-mRNA
entsprachen, eine RNase-H-Analyse durchgeführt. 5'-endmarkierte RNA (20 nM) wurde mit
einem 100-fachen
molaren Überschuss
der verschiedenen Testoligoribonukleotide in einem Reaktionsgemisch,
das 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2,
1 mM Dithiothreitol und 4 Einheiten RNase-Inhibitor (Pharmacia,
Newark, NJ, USA) in einem Endvolumen von 100 μl enthielt, inkubiert. Die Oligoribonukleotide
wurden durch Erhitzen auf 95°C
für 5 Minuten
geschmolzen und dann langsam in einem 2- Liter-Wasserbad von 90°C auf Raumtemperatur
abkühlen
gelassen. Die Bildung von Doppelsträngen wurde durch die Mobilitätsverschiebung
zwischen der einzelsträngigen,
endmarkierten Sense-RNA und dem verschmolzenen Doppelstrang auf
nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gelen bestätigt. Die resultierenden Doppelstränge wurden
als Substrate zum Verdau durch E. coli-RNase H (USB, Cleveland,
OH, USA) geprüft.
1 μl einer
1 × 10–9-mg/ml-Lösung von
RNase H wurde zu 10 μl
des Doppelstrangreaktionsgemischs, das 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert
worden war, gegeben, die Reaktion wurde durch die Zugabe von denaturierendem
Ladepuffer beendet und die Reaktionsprodukte wurden auf einem 12%-igem Polyacrylamid-Gel, das
7 M Harnstoff enthielt, getrennt und auf XAR-Film (Kodak) belichtet.
-
BEISPIEL 20
-
Zellfreier
In-vitro-Nukleaseassay
-
In
den zellfreien T24-Extrakt-Versuchen verwendete Doppelstränge wurden
wie oben beschrieben verschmolzen, mit der Ausnahme, dass das Reaktionsgemisch
nach Bildung des Doppelstrangs mit 1 μl einer Mischung aus RNase T
und RNase A (Ambion RPAII-Kit, Austin, TX, USA) behandelt und 15
Min. bei 37°C inkubiert
und dann aus einem nicht denaturierendem 12%-igem Polyacrylamid-Gel
gelgereinigt wurde. T24-Zellkern- und Zytosolfraktionen wurden wie
zuvor beschrieben isoliert (M. Szyf, V. Bozovic und G. Tanigawa,
J. Biol. Chem., 1991, 266, 10027–10030). Verschmolzene Doppelstränge (10 μl) wurden
mit 3 μg
des T24-Zytosolextrakts bei 37°C
inkubiert. Die Reaktion wurde mittels Phenol/Chloroform-Extraktion
beendet und mit Ethanol durch die Zugabe von 10 μg tRNA als Träger präzipitiert.
Die Pellets wurden in 10 μl
denaturierendem Ladefarbstoff resuspendiert und die Produkte wurden
wie oben beschrieben auf 12%-igen denaturierenden Acrylamid-Gelen
getrennt. Mit 32P markierte RNA mit 17 Basen
wurde durch Erhitzen auf 95°C
für 10
Minuten bei Vorhandensein von 50 mM NaCO3,
pH = 9,0, hydrolysiert, um eine Molekulargewichtsabstufung zu erzeugen.
-
BEISPIEL 21
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Bestimmen des 5'- und des 3'-Terminus
-
Nicht
markierter Doppelstrang wurde wie zuvor durchgeführt mit T24-Extrakten behandelt,
eine Hälfte dieses
Reaktionsgemischs wurde mit Kälberdarmphosphatase
(calf intestinal phosphatase, CIP, Stratagene) behandelt und die
andere Hälfte
wurde unbehandelt belassen. Die Phosphatase wurde durch Erhitzen
auf 95°C
inaktiviert und die Reaktionsgemische wurden mit Phenol/Chloroform
extrahiert und dann mit Glykogen als Träger in Ethanol präzipitiert.
Die Präzipitate
wurden dann mit T4-Polynukleotidkinase (Stratagene) und 32P-γ-ATP
(ICN, Irvine, CA, USA) behandelt. Die Proben wurden erneut mit Phenol/Chloroform
extrahiert und mit Ethanol präzipitiert,
die Produkte dieser Reaktion wurden dann auf einem 12%-igen Acrylamid-Gel
getrennt und mittels Belichtung auf XAR-Film sichtbar gemacht. Der
3'-Terminus des
gespaltenen Doppelstrangs wurde durch die Reaktion von Doppelstrangverdauprodukten
mit T4-RNA-Ligase (Stratagene) und 32P-pCp
(ICN) festgesetzt.
-
BEISPIEL 22
-
Chimäre 2'-Methoxyoligoribonukleotide vermitteln
Verdau von Ziel-RNA in T24-Zellen
-
Über Strukturaktivitätsanalysen
von Antisense-Oligonukleotiden, die für das Codon 12 des Ha-ras-Onkogens
spezifisch sind und verschiedene 2'-Zuckermodifikationen enthalten, wurde
von Monia et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 19954–19962,
und Monia et al., J. Biol. Chem., 1993, 268, 14514–14522,
berichtet. In diesen Berichten, obwohl die 2'-modifizierten Oligonukleotide mit größerer Affinität für RNA als
unmodifizierte 2'-Deoxyoligos
hybridisierten, waren diese beim Inhibieren der Ha-ras-Genexpression komplett
unwirksam. Das Fehlen von mit diesen 2'-modifizierten Oligos beobachteter Aktivität wurde
direkt ihrer Unfähigkeit,
Doppelstränge
zu erzeugen, die als Substrate für
den Abbau durch RNase H dienen könnten,
zugeschrieben. Unter Befolgung eines ähnlichen Protokolls wurden
Längen
von Ribonukleotiden in die Mitte von 2'-Methoxyoligoribonukleotiden mit 17
Basen, die sich gegen Ha-ras-mRNA richteten, eingeführt, um „gapped" chimäre 2'-Methoxy-2'-hydroxy-2'-methoxyphosphorthioatoligoribonukleotid-Verbindungen
zu bilden, die im mittleren Gap-Segment verschiedene Ribonukleotidgehalte
aufweisen (siehe 1 für eine Darstellung dieser Verbindungen
sowie ihrer Basensequenz). Bei Hybridisierung an ihr Zellenziel
besteht der resultierende Doppelstrang aus zwei Längen, die
keine Ziele für
den nukleolytischen Abbau sind (die 2'-Methoxy-„Schenkel"), und einer 2'-Hydroxyoligoribonukleotid-Länge, von
der gefunden wurde, dass sie ein Ziel für eine neuartige Ribonuklease-Aktivität ist, die
RNA:RNA-Doppelstränge erkennt.
Es wurden menschliche T24-Blasenkarzinomzellen verwendet, die im
Ha-ras-Gen an der Codon-12-Stellung eine aktivierende G-T-Transversionsmutation
enthalten. Die „gapped" chimären Verbindungen,
die für
diese Mutation spezifisch sind, wurden in in Kultur gezüchtete T24-Zellen
transfiziert. Nach der Inkubation mit den Verbindungen für 24 Std.
wurden die Zellen geerntet, die gesamte zytosolische RNA isoliert
und eine Northern-Blot-Analyse auf Ha-ras-mRNA-Niveaus durchgeführt. Vollständig modifizierte
2'-Methoxyoligonukleotide
unterstützten
die nukleolytische Spaltung von Ziel-mRNA nicht und führten daher
selbst bei der höchsten
geprüften
Konzentration nicht zu einer Verringerung der Gleichgewichtsniveaus
von Ha-ras-mRNA (2A und 2B).
Ein RNA-Gapmer-Oligonukleotid mit
nur 3 Ribonukleotiden im Gap war ebenfalls nicht dazu in der Lage,
die nukleolytische Spaltung der Ziel-RNA zu induzieren (2C und 2D).
Mit RNA-Gapmer-Oligonukleotiden, die 5, 7 und 9 Ribonukleotide im
Gap sowie ein vollständiges
Phosphorthioatoligoribonukleotid-Molekül enthielten, behandelte T24-Zellen jedoch zeigten
alle von der Dosis abhängige
Reduktionen der Ha-ras-mRNA-Gleichgewichtsniveaus
auf (3B–3D).
Mit einem. Kontroll-9-RNA-Gapmer-Oligonukleotid,
das in seiner Sequenz vier nicht zusammenpassende Basen enthielt,
behandelte T24-Zellen zeigten keine von der Dosis abhängige Reduktion
von Ha-ras-mRNA,
was nahe legt, dass die Hybridisierung an die Ziel-RNA für eine Aktivität unerlässlich ist (3E). Die RNA-Gapmer-Verbindungen zeigten eine
von der Dosis abhängige
Inhibierung der Ha-ras-mRNA-Gleichgewichtsniveaus.
-
Die
Fähigkeit
der RNA-Gapmer-Verbindungen, die Ha-ras-mRNA zu reduzieren, hing
von der Größe der RNA-Gap
und folglich der Größe des in
vivo gebildeten RNA:RNA-Doppelstrangs ab. Eine Behandlung von Zellen
mit den RNA-Gapmer-Verbindungen
mit 3 Basen resultierte nicht in der Spaltung des Ziels, wohingegen die
RNA-Gapmer-Verbindungen mit 5, 7 und 9 Basen zu einer Reduktion
der Ha-ras-mRNA
führten
(4). Die Tatsache, dass das 3 Ribonukleotide im
Gap enthaltende RNA-Gapmer-Oligonukleotid nicht dazu in der Lage
war, eine Reduktion der Ziel-mRNA zu induzieren, legt nahe, dass
die involvierte Aktivität
eine Mindest-RNA:RNA-Doppelstrangregion
von mindestens vier Ribonukleotiden zum Binden und Spalten des Ziels bedingt.
Interessanterweise zeigen chimäre
DNA-Gapmer-Oligonukleotide,
die anstelle von Ribonukleotiden Deoxynukleotide im Gap enthalten,
dieselben Mindestgapgrößenerfordernisse
zum Bilden von Substraten für von
RNase H vermitteltem Abbau der Ziel-mRNA (Crooke et al., Annu. Rev.
Pharmacol., 1996, 36, 107), was nahe legt, dass RNase H und die
hier beschriebene Aktivität
doppelsträngiger
RNase einige Eigenschaften gemein haben können, obwohl ihre Substrate
sich deutlich unterscheiden.
-
Eine
Kontroll-9-RNA-Gapmer-Verbindung, die in ihrer Sequenz vier nicht
zusammenpassende Basen enthält,
resultierte wie erwartet in im Wesentlichen keiner Reduktion der
Ha-ras-mRNA, wie in 3E gezeigt ist. Ein vollständiges Phosphorthioatoligoribonukleotid-Molekül weist
ungefähr
die gleiche Aktivität
wie das 5-RNA-Gapmer-Oligo auf (3D).
Der Grund dafür
könnte
die relative Abnahme der Stabilität des vollständigen Oligoribonukleotids
in vivo gewesen sein, der aus der Inaktivierung durch einzelsträngige Ribonukleasen resultierte,
da 2'-Methoxyphosphorthioatoligodeoxynukleotide
erheblich stabiler als Phosphorthioatoligoribonukleotide sind. Crooke
et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923–937. Eine Behandlung von T24-Zellen mit
den verschiedenen Oligonukleotiden und verschiedenen Konzentrationen
bis zu 800 nM wurde in dreifacher Ausführung vorgenommen und die Quantifizierung
der Ha-ras-mRNA-Niveaus
zeigte an, dass bei 600 nM das 5-Gapmer die Ha-ras-mRNA um 51%,
das 7-Gapmer sie um 49%, das 9-Gapmer sie um 77% und das vollständige Ribonukleotid
sie um 38% reduziert, verglichen mit nicht behandelten Kontrollen.
Dies legt nahe, dass durch 2'-Methoxy-Schenkel
geschützte
RNA-Gapmer-Oligoribonukleotide
wirksamere Moleküle
sein würden.
Wie in diesem Beispiel gezeigt ist, erkennt eine Endoribonuklease-Aktivität in menschlichen
T24-Blasenkarzinomzellen
den internen RNA:Oligoribonukleotid-Teil eines chimären Doppelstrangs
und reduzierte die Ziel-mRNA-Niveaus.
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BEISPIEL 23
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Eine in T24-Zellextrakten
vorliegende Aktivität
induziert in vitro die Spaltung des Gapmer-Oligoribonukleotid:RNA-Doppelstrangs
im internen RNA:RNA-Teil
-
Um
die Spaltungsaktivität
doppelsträngiger
RNA in T24-Zellen weiter zu charakterisieren, wurden T24-Zellextrakte
hergestellt und auf die Fähigkeit
zur Spaltung des 9-Gap-Oligoribonukleotid:RNA-Doppelstrangs in vitro
geprüft.
Der 9-Gap-Verbindung: 32P-endmarkierte-RNA-Doppelstrang wurde wie
in 4 gezeigt mit 3 μg Zytosolextrakt unterschiedliche
Zeiträume
lang bei 37°C
inkubiert, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion, Präzipitation
mit Ethanol und Trennung der Produkte auf einem denaturierendem
Gel. Dass es sich bei diesem Doppelstrang um ein Substrat für den Verdau
durch eine in T24-Extrakten vorliegende Aktivität handelte, wird durch den
Verlust von vollständiger
endmarkierter RNA und das Auftreten von Verdauprodukten niedrigeren
Molekulargewichts gezeigt, wie durch die Pfeile in 4 angezeigt
wird. Darüber
hinaus weist die für
die Spaltung des Doppelstrangs verantwortliche Aktivität Spezifität für den RNA:RNA-Teil
des Doppelstrangmoleküls
auf, wie durch die Größen der
Spaltungsprodukte, die sie erzeugt, angezeigt wird (siehe die physikalische
Karte der 32P-endmarkierten RNA, in 4 rechts
außen).
Die RNase-H-Spaltung eines 9-Deoxynukleotid-Gap-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrangs und
die Spaltung des 9-Ribonukleotid-Gap-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrangs durch
T24-Zellextrakte scheint in ähnlichen
Verdauprodukten zu resultieren. Dies ist beim Vergleichen der Gele
in den 4 und 5 zu erkennen.
Beide Aktivitäten
zeigten in ihren jeweiligen Doppelsträngen bevorzugte Spaltungsorte
nahe des 3'-Endes
der Ziel-RNA auf, was nahe legt, dass sie Bindungs- als auch mechanistische
Eigenschaften gemein haben könnten.
Aus Epithelzellen der menschlichen Nabelvene (human umbilical vein
epithel cells, HUVECs), menschlichem Lungenkarzinom (A549) und Hela-Zelllinien
hergestellte Zellextrakte enthielten alle eine Aktivität, die zum
Induzieren der Spaltung des 9-RNA-Gapmer:RNA-Ziel-Doppelstrangs
in vitro in der Lage ist.
-
BEISPIEL 24
-
Spaltung von
Ziel-RNA in sowohl zytoplasmatischen als auch Zellfraktionen von
Zellprodukten
-
Die
Zellverteilung der hierin beschriebenen Aktivität doppelsträngiger RNase wurde weiter beurteilt. Aus
T24-Zellen wurden Zellkernextrakte hergestellt und auf die Fähigkeit
zum Verdauen des 9-RNA-Gapmer-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrangs geprüft. Aus
T24-Zellen hergestellte Zellkernextrakte waren dazu in der Lage,
den Zieldoppelstrang abzubauen, und es wurde festgestellt, dass
die Aktivität
in der Zellkernfraktion in zu denen in den zytoplasmatischen Fraktionen
vergleichbaren Niveaus vorliegt.
-
Es
wurde ein RNA-Gapmer-Oligonukleotid synthetisiert, das über die
gesamte Länge
des Moleküls Phosphorthioatverknüpfungen
enthielt. Da dies in erhöhter
Stabilität
gegenüber
einzelsträngigen
Nukleasen resultiert, wurde geschlussfolgert, dass es ebenfalls
die Spaltung des Antisense-Strangs durch die dsRNase inhibieren
würde.
Daher wurde, um zu bestimmen, ob die oben beschriebene Aktivität beide
Stränge
in einem RNA-Doppelstrangmolekül
spalten kann, ein 9-RNA-Gapmer-Antisense-Oligonukleotid, das Phosphorthioatverknüpfungen
in den Schenkeln zwischen den 2'-Methoxynukleotiden
enthielt, aber Phosphodiesterverknüpfungen zwischen den neun Ribonukleotiden
im Gap aufwies, synthetisiert. Ein aus diesem mit 32P
markiertem 9-RNA-Gapmer-Phosphodiester-/Phosphorthioatoligonukleotid
und seinem komplementären
Oligoribonukleotid bestehender Doppelstrang wurde als ein Substrat
für Aktivität doppelsträngiger RNase
in T24-Extrakten geprüft.
Die Aktivität
war dazu in der Lage, den Antisense-Strang dieses Doppelstrangs
als auch den Sense-Strang zu spalten, und das Muster der Verdauprodukte
deutete darauf hin, dass die Spaltung erneut auf den RNA:RNA-Phosphodiester-Teil
des Doppelstrangs beschränkt
war.
-
BEISPIEL 25
-
Ein RNA-Gapmer-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrang
ist kein Substrat für
RNase H
-
Um
die Möglichkeit
auszuschließen,
dass der Grund für
die in Beispiel 23 gezeigte Spaltung RNase H sein könnte, wurde
die Fähigkeit
von E. coli-RNase H, einen Doppelstrang des 9-Gapmer-Oligoribonukleotids mit
17 Basenpaaren und seiner komplementären, am 5'-Ende mit 32P
markierten RNA in vitro zu spalten, geprüft. 5 zeigt
die erwartete Verschiebung der elektrophoretischen Mobilität, wenn
Doppelstränge
gebildet und auf einem nativen Gel neben der einzelsträngigen, 32P-endmarkierten
RNA analysiert wurden. Wie in 5 im äußeren rechten
Feld zu sehen ist, war der 9-Gapmer-Oligoribonukleotid:RNA-Doppelstrang
kein Substrat für
RNase-H-Spaltung, da keine Banden niedrigeren Molekulargewichts
erschienen, wenn es mit RNase H behandelt wurde. Wie erwartet wurde
jedoch ein vollständiger Deoxyofigonukleotid:RNA-Doppelstrang
durch RNase H unter denselben Bedingungen gespalten, wie durch das
Auftreten von Spezies niedrigeren Molekulargewichts in der mit Enzym
behandelten Bahn ersichtlich ist (5, linkes
Feld). Ein aus einem 9-Gapmer-DNA-Oligonukleotid und seiner komplementären RNA
bestehender Doppelstrang war ein Substrat für RNase-H-Spaltung. Die Tatsache,
dass die RNase-H-Spaltungsorte in diesem bestimmten Doppelstrang bei
den DNA:RNA-Teilen des Doppelstrangs lokalisiert wurden, beweist
weiter, dass der RNA-Gapmer-Oligoribonukleotid:RNA-Doppelstrang
kein Substrat für
RNase-H-Verdau ist.
-
Es
ist interessant zu beobachten, dass die RNase-H-Spaltung des 9-DNA-Gapmer-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrangs
(5, linkes Feld) und die Spaltung des 9-RNA-Gapmer-Oligonukleotid:RNA-Doppelstrangs
durch T24-Zellextrakte in ähnlichen
Verdauprodukten resultierte (siehe 4). Sowohl
RNase H als auch die Aktivität
in T24-Zellen zeigten an ihren jeweiligen Doppelsträngen die
gleichen bevorzugten Spaltungsorte auf. Darüber hinaus waren beide Oligonukleotide
an diesem Ort von der Wirksamkeit her annäherungsweise vergleichbar.
Die Spaltung war auf das 3'-Ende
der Ziel-RNA in der entweder dem DNA- oder dem RNA-Gap des jeweiligen
Antisense-Moleküls
gegenüber
liegenden Region beschränkt.
-
Ohne
sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, legt das unmittelbar
vorhergehende Ergebnis nahe, dass RNase H und die dsRNase der Erfindung
Bindungs- als auch mechanistische Eigenschaften gemein haben können. Eine
Analyse der DNA- und RNA-Gapmer-Oligonukleotide, die sich gegen
vier Orte an c-Raf-mRNA
richten, offenbarte jedoch, dass RNase H und die hier beschriebene
dsRNase-Aktivität
eindeutig unterschiedliche Substratspezifitäten aufweisen. „RNA-artige" Gapmer-Oligonukleotide,
die gegen die c-Raf-mRNA gerichtet waren, waren nicht dazu in der
Lage, eine Reduktion der mRNA zu induzieren, wohingegen RNase-H-aktive
Oligodeoxynukleotide, die gegen denselben Ort gerichtet waren, Ziel-mRNA-Niveaus reduzieren
konnten. Um zu bestimmen, ob der Grund für das Fehlen von durch die
vier c-Raf-„RNA-Gapmere" induzierter Spaltung
in T24-Zellen eine mögliche
Sequenzspezifität
oder Spaltung war, wurden vier „RNA-artige" c-Raf-„Gapmere", das „RNA-artige" ras-„Gapmer" und die entsprechenden „DNA-artigen
Gapmere" zu mit 32P markierten Oligoribonukleotiden vorhybridisiert
und mit T24- Homogenisaten
inkubiert. Das „RNA-artige" ras-„Gapmer" unterstützte die
Spaltung der ras-Ziel-RNA fast so effizient wie das „DNA-Gapmer". Nur eines der „RNA-artigen
Gapmere", das gegen
c-Raf-Segmente (SEQ ID NO: 8) gerichtet war, jedoch unterstützte eine
Spaltung und die Spaltungsgeschwindigkeit beim „RNA-artigen Gapmer" war viel langsamer
als beim vergleichbaren „DNA-artigen
Gapmer". Somit zeigt
die dsRNase im Gegensatz zu RNase H eine beachtliche Sequenzspezifität auf.
-
BEISPIEL 26
-
Nukleaseaktivität erzeugt
5'-Phosphat- und
3'-Hydroxyl-Termini
-
Um
die Beschaffenheit der von der Nukleasespaltung des Doppelstrangs
in vitro hinterlassenen 5'-Termini
zu bestimmen, wurde nicht markierter Doppelstrang wie zuvor beschrieben
mit T24-Zellextrakten inkubiert und dann mit T4-Polynukleotidkinase und [32P-γ-ATP], mit
oder ohne vorherige Behandlung mit Kälberdarmphosphatase, umgesetzt.
Die Phosphatase-Behandlung der Doppelstrangprodukte wurde als für die Einbindung
der 32P-Markierung während der Umsetzung mit Polynukleotidkinase
erforderlich betrachtet, was auf das Vorhandensein einer Phosphatgruppe
an den 5'-Termini
hindeutete. Die 3'-Termini
wurden durch die Umsetzung von Doppelstrangverdauprodukten mit T4-RNA-Ligase
und 32P-pCp beurteilt. T4-RNA-Ligase bedingt
einen freien 3'-Hydroxyl-Terminus
für die
Ligierung von 32P-pCp. Die Fähigkeit
der Doppelstrangverdauprodukte, 32P-pCp
durch T4-RNA-Ligase einzubinden, deutet auf das Vorhandensein von
3'-Hydroxygruppen hin.
-
BEISPIEL 27
-
Reinigung
und Charakterisierung von doppelsträngigen Ribonukleasen aus Geweben
eines Säugers
-
Um
zu bestimmen, ob Zellen eines Säugers,
bei denen es sich nicht um kultivierte Zelllinien handelt, Aktivität doppelsträngiger RNase
enthalten, und um eine Quelle bereitzustellen, aus der solche Ribonukleasen gereinigt
werden könnten,
wurden die folgenden Anstrengungen zum Identifizieren und Reinigen
von dsRNasen aus Rattenleberhomogenisaten unternommen.
-
BEISPIEL 27-a
-
Substrate
und Assays für
dsRNasen
-
In
vorausgehenden Versuchen wurde die Aktivität doppelsträngiger RNase in Rattenleberhomogenisaten
beobachtet; die Homogenisate zeigten jedoch hohe Niveaus an einzelsträngigen dsRNasen
auf, was die Analyse der dsRNase-Aktivitäten erschwerte, da die Spaltung
des Oligoribonukleotids nach der Spaltung durch die dsRNasen überragt.
Um dieses Problem zu lösen,
wurden zwei weitere Substrate und ein nicht denaturierendes Gel-Assay
angewendet. Der „Sense"-Strang war ein Oligoribonukleotid
mit Phosphodiesterverknüpfungen
in einem Acht-Basen-Gap mit Flanken, die entweder (a) Reste mit
Phosphorthioatverknüpfungen oder
(b) 2'-Methoxynukleoside
mit Phosphorthioatverknüpfungen
aufweisen. Der „Antisense"-Strang in beiden Substraten enthielt
2'-Methoxyphosphorthioat-Schenkel
auf beiden Seiten einer Acht-Basen-Ribonukleotid-Gap mit entweder
Phosphodiester- oder Phosphorthioatverknüpfungen (Tabelle 1). Derartige
dsRNase-Substrate waren gegenüber
Exonukleaseverdau stabiler als ein Oligoribonukleotid und Substrate
mit sowohl Phosphorthioatverknüpfungen
und 2'-Methoxynukleosiden
war äußerst stabil.
Diese Merkmale sind aufgrund der Abundanz von einzelsträngigen RNasen
in Bezug auf die Aktivität
doppelsträngiger
RNase in der Rattenleber wichtig und unterstützten die Anwendung von nicht
denaturierenden Assays. TABELLE
1 Künstliche
Substrate für
dsRNasen eines Säugers*
- * Fettgedruckte Reste zeigen 2'-Methoxynukleotidreste
in den „Antisense"-Strängen an.
-
Sowohl
Zytosol- als auch Zellkernextrakte von Rattenleber induzierten die
Spaltung des Doppelstrangsubstrats. Beide Extrakte resultierten
in schneller migrierenden Banden bei elektrophoretischen Analysen
mit nativem Gel. Der Zytosolextrakt schien aktiver als der Zellkernextrakt
zu sein. Eine doppelsträngige
RNase, RNase V1 (Pharmacia, Piscataway, NY, USA), spaltete das Substrat;
T24-Extrakte spalteten ebenfalls das Substrat. Weder bakterielle
noch einzelsträngige
RNase spalteten das Substrat, mit Ausnahme von RNase A, die bei
sehr hohen Konzentrationen in etwas Spaltung resultierte. Es ist
unklar, ob der Grund für
diese Spaltung eine kontaminierende doppelsträngige RNase war oder ob RNase
A unter manchen Bedingungen doppelsträngige Substrate spalten kann.
-
BEISPIEL 27-b
-
Reinigung
von dsRNasen aus Zytosol- und Zellkernextrakten von Rattenleber
-
Um
die hierin identifizierte dsRNase eines Säugers zu reinigen, wurden 0,5
kg Rattenleber in Puffer X [10 mM Hepes (pH 7,5), 25 mM KCl, 0,15
mM Spermin, 0,5 mM Spermidin, 1 mM EDTA, 2 M Saccharose, 10% Glycerin;
alle Reagenzien von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA] homogenisiert
und in einer Beckman J2-21M-Zentrifuge (Beckman, Fullerton, CA,
USA) bei 10.000 U/Min. für
1,5 Stunden zentrifugiert. Der Überstand
wurde mit 40%-iger Ammoniumsulfatlösung (Sigma) präzipitiert.
Die gesamte dsRNase-Aktivität
wurde im Präzipitat
aus 40%-iger Ammoniumsulfatlösung
wiedergewonnen. Das Pellet wurde in Puffer A [20 mM Hepes (pH 6,5),
5 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,25 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF),
0,1 M KCl, 5% Glycerin, 0,1% NP40, 0,1% Triton X-100; alle Reagenzien
von Sigma] resuspendiert und dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu
entfernen. Aus 0,5 kg Leber wurden ungefähr 40 g Zytosolextrakt erhalten.
-
Ein
rohes Zellkernpellet, wie in den vorherigen Beispielen hergestellt,
wurde resuspendiert und in Puffer Y [20 mM Hepes (pH 7,5), 0,42
M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM
DTT, 0,5 mM PMSF, 25% Glycerin] homogenisiert. Das Homogenisat wurde
in einer J2-21 M-Zentrifuge (Beckman) bei 10.000 U/Min. für 1,5 Stunden
zentrifugiert. Der Überstand
wurde mit 70%-iger Ammoniumsulfatlösung präzipitiert. Das Pellet wurde
in Puffer A resuspendiert und dialysiert. Die gesamte dsRNase-Aktivität wurde
im Präzipitat
aus 70%-iger Ammoniumsulfatlösung
wiedergewonnen. Aus 0,5 kg Leber wurden ungefähr 5 g Zellkernextrakt erhalten.
-
Dann
wurde eine Ionenaustauschchromatographie durchgeführt, um
die dsRNasen der Erfindung weiter zu reinigen. Die Zellkern- und
Zytosolextrakte in Puffer A wurden auf Hi-Trap-Säulen (Pharmacia, Piscataway,
NJ, USA) zur FPLC geladen. Die Extrakte wurden mit einem linearen
Gradienten von NaCl eluiert und es wurden Proben genommen. Es wurde
die UV-Absorption bei 257 nm der Proben bestimmt. Die Proben wurden 10
Minuten lang bei 8000 g zentrifugiert, in Puffer A resuspendiert,
in Ultrafree-15-Zentrifugalfiltergeräten (Millipore, Bedford, MA,
USA) eingeengt und auf Aktivität
analysiert. Die dsRNase-Aktivität
eluierte in Fraktionen, die 300–450
mM NaCl entsprachen. Im Gegensatz dazu eluierte die dsRNase-Aktivität im Zellkernextrakt
bei 700–800
mM NaCl.
-
Fraktionen
aus der Ionenaustauschchromatographie wurden eingeengt und einer
Größenausschlusschromatographie
unterzogen. Aktive Proben aus der Ionenaustauschchromatographie
wurden gesammelt, auf eine TSK G-3000-Säule (TosoHaas, Mongomeryville,
PA, USA) aufgetragen und mit Puffer A, der 100 mM NaCl enthielt,
laufen gelassen. Proben (200 bis 400 μl) wurden gepoolt und es wurde
ihre UV-Absorption bei 257 nm bestimmt. Die Proben wurden unter
Anwendung von Ultrafree-15-Zentrifugalfiltergeräten (Millipore) eingeengt und
dann auf Aktivität
analysiert.
-
6 zeigt
eine elektrophoretische Analyse mit Polyacrylamid-Gel der eingeengten
aktiven Fraktionen nach der Ionenaustauschchromatographie und der
Fraktionen aus der Größenausschlusschromatographie.
Die Fraktion mit der höchsten
dsRNase-Aktivität (Spur
4, 6) wies einen Molekulargewichtsbereich von etwa
50 bis etwa 80 Kilodalton auf und ein Band bei ungefähr 50 Kilodalton
schien bei Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(PAGE) mit 12%-igem Gel, die unter Verwendung von Precast-Gelen (Novex, San
Diego, CA, USA) durchgeführt
wurde, verstärkt
zu sein.
-
Tabelle
2 liefert eine Zusammenfassung der Reinigung und Wiedergewinnung
von dsRNase-Aktivitäten
aus Zytosol- und Zellkernextrakten aus Leber.
-
TABELLE
2 5
Zusammenfassung der Reinigung von dsRNasen aus Rattenleberhomogenisaten
-
Eine
Einheit ist als die Menge an Probe definiert, die zum Verdau von
10 fmol dsRNA-Doppelstrang in 15 Minuten bei 37°C unter den hierin beschriebenen
Bedingungen erforderlich ist.
-
Die
Reinigung der dsRNase-Aktivitäten
aus Leberzellkernen und -zytosol legt nahe, dass mindestens zwei
dsRNasen mit unterschiedlichen Eigenschaften doppelsträngige RNA
spalten können.
Die nukleare dsRNase eluierte bei höheren NaCl-Konzentrationen
aus der Ionenaustauschsäule
als die zytosolische dsRNase. Beide erforderten jedoch Mg++ und spalten an mehreren Orten im Oligoribonukleotid-Gap. Beide bedingen ein
Doppelstrangsubstrat und können
Oligoribonukleotide in einem Doppelstrang spalten, der aus einem
Oligoribonukleotid-„Sense"- und einem chimären 2'-Methoxyphosphorthioat-„Antisense"-Strang besteht,
wenn der Doppelstrang Phosphorthioat- oder Phosphorthioat-2'-methoxynukleodid-Schenkel
aufweist.
-
Nachdem
mittels der oben beschriebenen Verfahren (1) ein reproduzierbares
und aktivitätsspezifisches
Assay für
die dsRNasen der Erfindung etabliert, (2) mehrere Quellen dieser
bestimmt und (3) ein angemessener Grad an Reinigung dieser erzielt
wurde, werden die dsRNasen durch eine Vielfalt von Mitteln weiter gereinigt.
In allen Beispielen wird die Verwendung von organischen Lösungsmitteln
vermieden, da die dsRNasen der Erfindung in Acetonitril oder Methanol
instabil sind (siehe unten), und die hierin beschriebenen Assays werden
zum Beurteilen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der gewünschten
dsRNase in einer Probe verwendet. Weitere Reinigungsschritte können unter
anderem die folgenden Mittel beinhalten.
-
Mehrere
Arten von Heparin-Säulen
sind zum Reinigen einer Vielfalt von Ribonukleasen verwendet worden.
Sepharose-Säulen
sind beispielsweise bei der Reinigung einer sequenzspezifischen
Ribonuklease aus Oozyten von Rana catesbeiana (Ochsenfrosch) (Liao,
Nucl. Acids Res., 1992, 20, 1371), einer Ribonuklease aus Xenopus
laevis-Oozyten (Nitta et al., Biol. Pharm. Bull. (Jpn.), 1993, 16,
353), von mehreren Ribonukleasen aus dem thermophilen Archaebakterium
Sulfobus solfataricus (Fusi et al., Eur: J. Biochem., 1993, 211,
305) und einer Ribonuklease aus menschlicher Milz (Yasuda et al.,
Eur. J. Biochem., 1990, 191, 523) eingesetzt worden.
-
Bei
hydrophober Interaktionschromatographie handelt es sich um ein leistungsstarkes
Mittel zur Proteinreinigung, das von starken aussalzenden Salzen
zum Verstärken
der hydrophoben Interaktionen zwischen dem gewünschten Protein und einem Liganden
dafür abhängt (Narhi
et al., Anal. Biochem., 1989, 182, 266). Hydrophobe Interaktionssäulen (hydrophobic
interaction columns, HICs) sind zum Reinigen von Ribonuklease A
von unerwünschten
Kontaminanten verwendet worden (Wu et al., Methods in Enzymology,
1996, 270, 27; Wettlaufer et al., J. Chromatography, 1986, 359,
55).
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Die
dsRNasen der Erfindung können
auch mittels Hydroxyapatit-Chromatographie weiter gereinigt werden
(Kennedy, Methods in Enzymology, 1990, 182, 339). Endoribonuklease
und Exoribonuklease sind unter Anwendung von Hydroxyapatit-Chromatographie aus
Trypanosoma brucei gereinigt worden (Gbenle, Exp. Parasitol., 1990,
71, 432; Gbenle, Mol. Biochem. Parasitol., 1985, 15, 37).
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RNA-Affinitätssäulen können ebenfalls
zum weiteren Reinigen der dsRNasen der Erfindung verwendet werden.
Insbesondere kann eine im Handel erhältliche Affinitätssäule für doppelsträngige RNA
(Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) verwendet werden. Alternativ dazu
wird eine Säule
erstellt, bei der deren Matrix eines oder mehrere der dsRNase-Substrate
der Erfindung umfasst (siehe das folgende Beispiel für Einzelheiten).
Aufgrund der relativen Sequenzspezifität der dsRNase der vorliegenden
Erfindung kann die letztere Art von Affinitätssäule bevorzugt sein. Um den
Abbau der Matrix bei jeder Art von Affinitätsmatrix für doppelsträngige RNA zu verhindern, werden
Proben, die die dsRNasen der Erfindung umfassen, so behandelt, dass
die Abbaukapazität
der dsRNase eingeschränkt
wird, ohne deren Fähigkeit
zum Binden des doppelsträngigen RNA-Substrats
der Matrix erheblich zu verändern.
Die Abbauaktivität
der dsRNase der Erfindung wird beispielsweise in Lösungen inhibiert,
denen es aufgrund beispielsweise der Zugabe von Chelatbildnern,
wie beispielsweise EDTA, an verfügbarem
Mg++ fehlt, oder durch Zugabe von NaCl zu
einer Probe, die derartige dsRNasen enthält, auf eine Endkonzentration
von mindestens 300 mM (siehe den folgenden Unterabschnitt).
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Fachmänner werden
erkennen, dass die obigen Mittel sowie andere, hierin nicht beschriebene
für eine optimale
Effizienz beim Reinigen der dsRNasen der Erfindung optimiert werden
müssen.
Die Auswahl eines oder mehrerer der obigen Mittel als einem weiteren
Reinigungsschritt und der Reihenfolge, in der solche Mittel angewendet
werden, beispielsweise wird den Reinheitsgrad und die spezifische
Aktivität
der so behandelten dsRNase beeinflussen. Es wird jedoch angenommen,
dass eine derartige Optimierung im Fachkönnen der Technik liegt, angesichts
dessen, dass die hierin beschriebenen Assays von einem qualifizierten
Techniker problemlos eingesetzt werden können, um die Auswirkung weiterer
Reinigungsschritte auf die Aktivität der gewünschten dsRNase zu bestimmen.
Andere in der Technik bekannte Techniken, wie beispielsweise SDS-PAGE,
können
zum Bestimmen der Reinheit von Proben, die den obigen Reinigungsmitteln
unterzogen wurden, verwendet werden.
-
BEISPIEL 27-c
-
Charakterisierung
von gereinigten dsRNasen eines Säugers
-
Die
Auswirkungen verschiedener Bedingungen auf die dsRNase-Aktivität wurden unter
Verwendung der aktiven Fraktionen nach Ionenaustauschchromatographie
beurteilt. Die dsRNase-Aktivität
war in Tris- oder Phosphatpuffern von etwa pH 7 bis etwa pH 10 beweisbar.
Die dsRNase-Aktivität
war in Lösung
in Acetonitril oder Methanol nicht stabil. Darüber hinaus wurde die Aktivität von NaCl
inhibiert; die dsRNase-Aktivität
wurde bei 10 mM NaCl um 30%, bei 100 mM NaCl um > 60 und bei 300 mM NaCl um 100% inhibiert.
Erhitzen für
fünf Minuten
bei 60°C,
80°C oder
100°C inaktivierte
die dsRNase. Eine optimale Aktivität wurde im Temperaturbereich
von etwa 37°C
bis etwa 42°C
beobachtet. Bei 25°C
betrug die dsRNase-Aktivität
50% der bei 37°C
beobachteten. Die dsRNase-Aktivität wurde bei 10, 20 und 50 mM
EDTA, jedoch nicht bei 5 mM inhibiert, in Übereinstimmung mit ihrer Erfordernis
von Mg++, und war gegenüber mehreren Einfrier-/Auftauvorgängen stabil.
-
BEISPIEL 28
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Weitere Charakterisierung
des dsRNase-Spaltungsorts unter Verwendung von gereinigter Ratten-dsRNase
-
Die
gereinigten dsRNasen wurden zum Charakterisieren des Orts der Spaltung
in mehr Einzelheiten verwendet. Weil es erforderlich war, ein Auftreten
einer einzelsträngigen
Spaltung nach der Endonukleasespaltung und während der Verarbeitung, insbesondere
nach Denaturieren des Doppelstrangs, zu minimieren. Demzufolge wurde
das stabilste Doppelstrangsubstrat, d. h. eines, in dem beide Stränge des
Doppelstrangs Flankenregionen enthielten, die sich aus 2'-Methoxynukleosiden und Phosphorthioatverknüpfungen
zusammensetzten, verwendet.
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BEISPIEL 28-a
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Markieren von Oligonukleotiden
mit 32P
-
Das
Sense-Oligonukleotid wurde mit 32P unter
Verwendung von [g32P]ATP, T4-Polynukleotidkinase und
Standardvorgehensweisen (Ausubel et al., 1989) 5'-endmarkiert.
Das markierte Oligonukleotid wurde mittels Elektrophorese auf 12%-igem denaturierendem
PAGE gereinigt (Sambrook et al., 1989). Die spezifische Aktivität des markierten
Oligonukleotids betrug ungefähr
5000 cpm/fmol.
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BEISPIEL 28-b
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Assay des
Verdaus doppelsträngiger
RNA
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Oligonukleotiddoppelstränge wurden
in 30 μl
Reaktionspuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0,1 mM DTT] hergestellt, die 10 nM Antisense-Oligonukleotid und
105 cpm mit 32P
markiertes Sense-Oligonukleotid enthielten. Die Reaktionsgemische
wurden 5 Min. lang bei 90°C
erhitzt und 2 h bei 37°C inkubiert.
Die Oligonukleotiddoppelstränge
wurden in entweder ungereinigten oder zur Hälfte gereinigten Zellextrakten
bei einer Gesamtproteinkonzentration von 75 μg ungereinigtem Zytosolextrakt,
60 μg ungereinigtem Zellkernextrakt,
5 μg durch
Ionenaustausch gereinigter Zytosolfraktion, 5 μg durch Ionenaustausch gereinigter Zellkernfraktion
oder 0,5 μg
durch Ionenaustausch und Gelfiltration gereinigter Zellkernfraktion
inkubiert. Die Verdaureaktionsgemische wurden für 0–240 Min. bei 37°C inkubiert.
Nach der Inkubation wurden 10 μl
jedes Reaktionsgemischs entfernt und es wurde durch Zugabe von denaturierendem
Gel-Ladepuffer [5 μl
8 M Harnstoff, 0,25% Xylolcyanol FF, 0,25% Bromphenolblau] gequencht.
Die Reaktionsgemische wurden für
5 Min. bei 95°C
erhitzt und in einem 12%-igen denaturierenden Polyacrylamid-Gel
getrennt. Das verbleibende Aliquot wurde in 2 μl nativem Gel-Ladepuffer [Glycerin,
0,25% Xylolcyanol FF] gequencht. Die Reaktionsgemische wurden bei
10°C in
einem 12%-igen nativen Polyacrylamid-Gel, das 44 mM Tris-Borat und
1 mM MgCl2 enthielt, getrennt. Die Gele
wurden unter Verwendung eines Phosphorlmager von Molecular Dynamics
analysiert.
-
7 zeigt
die Ergebnisse mit nativem Gel auf. Spur 1 zeigt die Stellung, an
der der unbehandelte, mit 32P markierte
Sense-Strang in das native Gel migrierte, und Spur 2 zeigt die mit
0,02 Einheiten RNase V1 behandelte „Sense"-Strang-RNA. In den verbleibenden Spuren
sind die Ergebnisse der Behandlung von dsRNase-Substraten mit 0,02 (Spur 3) und 0,002
(Spur 4) Einheiten RNase V1, ungereinigtem Zellkernextrakt für 0 Minuten
(Spur 5) oder 240 Minuten (Spur 6), ungereinigtem Zellkernextrakt
für 240
Minuten ohne Mg++ (Spur 7), ungereinigtem
Zytosolextrakt für
240 Minuten (Spur 8), durch Ionenaustausch gereinigtem Zytosolextrakt für 240 Minuten
bei Vorhandensein (Spur 9) oder Abwesenheit (Spur 10) von Mg++ und durch Ionenaustausch/Gelfiltration
gereinigtem Zytosolextrakt für
240 Minuten bei Vorhandensein (Spur 11) oder Abwesenheit (Spur 12)
von Mg++ gezeigt.
-
8 zeigt
die Ergebnisse einer Analyse von Produkten des Verdaus von dsRNase-Substraten
mittels Elektrophorese mit denaturierendem Polyacrylamid-Gel. Spur
1 zeigt mit 5 × 10–3 Einheiten
RNase A behandelte „Sense"-Strang-RNA und Spur
2 zeigt mit 0,02 Einheiten RNase V1 behandelte „Sense"-Strang-RNA. Die verbleibenden Spuren
zeigen dsRNase-Produkte, behandelt mit 0,02 (Spur 3) und 0,002 (Spur
4) Einheiten RNase V1, mit ungereinigtem Zellkernextrakt für 0 Minuten
(Spur 5) oder 240 Minuten (Spur 6), mit ungereinigtem Zytosolextrakt
für 240
Minuten (Spur 7), mit durch Ionenaustausch gereinigtem Zytosolextrakt
für 240
Minuten (Spur 8) und mit durch Ionenaustausch/Gelfiltration gereinigtem
Zytosolextrakt für
240 Minuten (Spur 9). Spur 10 ist eine RNA-Basenhydrolyseleiter,
die aus Bemessungsgründen
eingebunden wurde. Der Verdau des einzelsträngigen Substrats mit RNase
V1 resultierte in wenig Abbau (Spur 2). Der Verdau des Doppelstrangs
mit RNase V1 resultierte in Abbauprodukten, was die Spaltung an
mehreren Orten im Gap reflektiert (Spuren 3 und 4). In den Spuren
4–9 beweist
die Bande an der Oberseite des Gels, dass selbst nach Denaturierung
ein Teil des Doppelstrangs verschmolzen blieb, was die sehr hohe
Affinität
von Doppelsträngen,
die sich aus 2'-Methoxynukleosiden
zusammensetzen, reflektiert. Die Spuren 6–9 zeigen, dass sowohl die
nuklearen als auch die zytosolischen Ribonukleasen das Triplexsubstrat
an mehreren Orten im Oligoribonukleotid-Gap spalteten und dass die
Abbauorte sich von denen von RNase V1 unterschieden. Die Stellung
der Abbauprodukte in den Spuren 6–9 ist mit denen, bei denen
es sich um die 2'-Methoxyphosphorthioat-Flankenregionen
(Schenkel) handelt, konsistent.
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BEISPIEL 29
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RNA-Affinitätssäulen und
Verfahren zum Reinigen von Ribonukleasen
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Techniken
zur Herstellung von Nukleinsäure-Affinitätssäulen sind
in der Technik bekannt (siehe z. B. Kadonaga, Methods in Enzymology,
1991, 208, 10). Derartige Affinitätssäulen umfassen eine Matrix,
die ein Nukleinsäuresubstrat
für eine
gewünschte
Verbindung umfasst, die das Substrat entweder unspezifisch oder auf
sequenzspezifische Weise bindet. Anfangs bei der Reinigung von DNA-bindenden
Proteinen verwendet, sind RNA-Affinitätssäulen auch eingesetzt worden,
um RNA- bindende
Proteine und Ribonukleasen zu reinigen (siehe z. B. Prokipcak et
al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 9261; Dake et al., J. Biol. Chem.,
1988, 263, 7691). Eine Matrix, die ein oder mehrere dsRNase-Substrate
der Erfindung umfasst, hat den Vorteil, dass sie ein dsRNA-Substrat
bereitstellt, das gegenüber
der Aktion einzelsträngiger
Ribonuklease resistent ist, die in vielen Geweben und Zellen vorherrschend
ist. Eine solche Matrix umfasst außerdem einen geeigneten festen
Träger und
einen Verknüpfer,
der eine Brücke
zwischen dem festen Träger
und dem dsRNase-Substrat bzw. den dsRNase-Substraten bereitstellt.
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Geeignete
feste Träger
beinhalten unter anderem Pfropfpolymere (US-Patentschrift 4,908,405
an Bayer und Rapp); Polyacrylamid (Fahy et al., Nucl. Acids Res.,
1993, 21, 1819); Polyacrylmorpholid, Polystyrol und derivatisierte
Polystyrolharze (Syvanen et al., Nucl. Acids Res., 1988, 16, 11327;
US-Patentschriften 4,373,071 und 4,401,796 an Itakura), einschließlich Aminomethylstyrolharzen
(US-Patentschrift 4,507,433 an Miller und Ts'O); Copolymere von N-Vinylpyrrolidon
und Vinylacetat (Selinger et al., Tetrahedron Letts., 1973, 31,
2911; Selinger et al., Die Makromolekulare Chemie, 1975, 176, 609;
und Selinger et al., Die Makromolekulare Chemie, 1975, 176, 1611);
TEFLONTM (Lohrmann et al., DNA, 1984, 3,
122; Duncan et al., Anal. Biochem., 1988, 169, 104); Glas von kontrollierter
Porengröße (controlled
pore glass, CPG) (Chow et al., Anal. Biochem., 1988, 175, 63); Polysaccharid-Träger, wie
beispielsweise Agarose (Kadonaga, Methods Enzymol., 1991, 208, 10;
Arndt-Jovin et al., Eur. J. Biochem., 1975, 54, 411; Wu et al.,
Science, 1987, 238, 1247; Blank et al., Nucleic Acids Res., 1988,
16, 10283) oder Cellulose (Goldkorn et al., Nucl. Acids Res., 1986,
14, 9171; Alberts et al., Meth. Enzymol., 1971, 21, 198) oder Derivate
davon, z. B. DEAE-Cellulose (Schott, J. Chromatogr., 1975, 115, 461)
oder Phosphocellulose (Siddell, Eur. J. Biochem., 1978, 92, 621;
Bunemann et al., Nucl. Acids Res., 1982, 10, 7163; Noyes et al.,
Cell, 1975, 5, 301; Bunemann et al., Nucl. Acids Res., 1982, 10,
7181); Dextransulfat (Gingeras et al., Nucl. Acids Res., 1987, 15,
5373); Polypropylen (Matson et al., Anal. Biochem., 1994, 217, 306);
Agarosekügelchen
(Kadonaga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 5889);
Latexteilchen (Kawaguchi et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17, 6229);
Nylonkügelchen
(Van Ness et al., Nucl. Acids Res., 1991, 19, 3345); paramagnetische
Kügelchen
(Gabrielson et al., Nucl. Acids Res., 1989, 17, 6253; Lund et al.,
Nucl. Acids Res., 1988, 16, 10861; Day et al., Biochem. J., 1991,
278, 735); Kieselgele (Yashima et al., J. Chromatogr., 1992, 603,
111); derivatisierte Formen von Kieselgelen, Polytetrafluorethylen,
Cellulose oder metallischen Oxiden (US-Patentschrift 4,812,512 an
Buendia) und in der Technik anerkannte Äquivalente eines beliebigen
der vorhergehenden festen Träger;
Mikrotiterplatten (Drmanac et al., Science, 1993, 260, 1649); vernetzte
Copolymere von N-Vinylpyrrolidon, anderen N-Vinyllactam-Monomeren
und einem ethylenisch ungesättigten
Monomer mit mindestens einer Amin- oder aminersetzbaren Funktionalität, wie in
der US-Patentschrift 5,391,667 offenbart. In einem Satz von bevorzugten
Ausführungsformen
werden CPG-Kügelchen
(CPG = controlled pore glass, Glas von kontrollierter Porengröße) aus
Polystyrol oder langkettigem Alkyl eingesetzt. In einem anderen
Satz von bevorzugten Ausführungsformen
werden Mikroskop-Glasobjektträger
eingesetzt (Fodor et al., Science, 1991, 251, 767; Maskos et al.,
Nucleic Acids Research, 1992, 20, 1679; Guo et al., 1994, 22, 5456;
Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1994, 91, 5022).
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Im
Hinblick auf den Verknüpfer
kann eine Vielfalt von chemischen Verknüpfungsgruppen oder -ketten in
den Matrizen der Erfindung eingesetzt werden. Eine beliebige chemische
Gruppe oder Kette, die eine chemische Verknüpfung zwischen dem festen Träger und
dem dsRNase-Substrat bilden kann, kann eingesetzt werden. Ein geeigneter
Verknüpfer
weist das bevorzugte Charakteristikum der Nichtreaktivität mit während der verschiedenen
Schritte der Oligonukleotidsynthese eingeführten Verbindungen auf. Fachmänner werden
verstehen, dass die chemische Zusammensetzung des festen Trägers und
des dsRNase-Substrats die Auswahl des Verknüpfers beeinflussen wird. Viele
geeignete Verknüpfer
werden eine primäre
Amingruppe an einem oder beiden Termini aufweisen, da in der Technik
viele chemische Reaktionen zum Verknüpfen primärer Amingruppe mit einer Vielfalt
von anderen chemischen Gruppen bekannt sind; andere am Terminus
reaktive Moleküleinheiten
sind jedoch bekannt und können
in der Erfindung verwendet werden. Geeignete Verknüpfer beinhalten
unter anderem Verknüpfer
mit einer Thiolgruppe am Terminus zum Einbringen einer Disulfidverknüpfung an
den festen Träger
(Day et al., Biochem. J., 1991, 278, 735; Zuckermann et al., 1987,
Nucl. Acids Res., 15, 5305); Verknüpfer mit einer Bromacetylgruppe
am Terminus zum Einbringen einer Thiol-Bromacetylverknüpfung an
den festen Träger
(Fahy et al., Nucl. Acids Res., 1993, 21, 1819); Verknüpfer mit
einer Aminogruppe am Terminus, die mit einem 5'-aktivierten Phosphat eines Oligonukleotids
umgesetzt werden kann (Takeda et al., Tetrahedron Letts., 1983,
24, 245; Smith et al., Nucl. Acids Res., 1985, 13, 2399; Zarytova
et al., Anal. Biochem., 1990, 188, 214); Poly(ethylenimin) (Van
Ness et al., Nucl. Acids Res., 1991, 19, 3345); Acylketten (Akashi
et al., Chem. Lett., 1988, 1093; Yashima et al., J. Chromatogr.,
1992, 603, 111); Polyvinylalkohol (Schott, J. Chromatogr., 1975,
115, 461); Alkylketten (Goss et al., J. Chromatogr., 1990, 508,
279); Alkylaminketten (Pon et al., BioTechniques, 1988, 6, 768);
Biotin-Avidin- oder
Biotin-Streptavidin-Verknüpfungen
(Kasher et al., Mol. Cell. Biol., 1986, 6, 3117; Chodosh et al.,
Mol. Cell. Biol., 1986, 6, 4723; Fishell of al., Methods Enzymol.,
1990, 184, 328) und in der Technik anerkannte Äquivalente eines beliebigen
der vorhergehenden Verknüpfer.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung handelt es sich bei dem Verknüpfer um eine n-Aminoalkylkette.
Verfahren zur Bestimmung einer geeigneten (d. h. den optimalen Grad
und die optimale Spezifität
der Hybridisierung zwischen der Sensoranordnung und dem Ziel-Oligonukleotid bereitstellenden) Verknüpferlänge sind
in der Technik bekannt (siehe z. B. Day et al., Biochem. J., 1991,
278, 735).
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