CN112638375A - 通过后细胞信号传导因子的调节来增加免疫活性 - Google Patents

通过后细胞信号传导因子的调节来增加免疫活性 Download PDF

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Abstract

本发明提供了通过诱导铁依赖性细胞拆解来增加免疫应答的方法。免疫应答的增加可用于治疗例如感染或癌症。本发明还提供了筛选测定，用于鉴定诱导铁依赖性细胞拆解并且也是免疫刺激剂的化合物。本发明还提供了鉴定由经历铁依赖性细胞拆解的细胞产生的免疫刺激剂的方法。

Description

通过后细胞信号传导因子的调节来增加免疫活性
相关申请
本申请要求于2018年6月15日提交的美国临时专利申请号62/685,770和于2018年12月19日提交的美国临时专利申请号62/781,819的优先权，其每一个的内容通过引用以其全文并入本文。
背景技术
在多细胞生物中，细胞死亡是一个关键且活跃的过程，所述过程被认为可以维持组织稳态并消除潜在有害的细胞。
发明内容
在某些方面，本披露涉及增加免疫细胞中的免疫活性的方法，所述方法包括：(i)使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触以及(ii)使所述免疫细胞按以下量暴露于已与所述药剂接触的靶细胞或由已与所述药剂接触的靶细胞产生的后细胞信号传导因子，所述量足以增加所述免疫细胞中的免疫活性，所述增加是相对于没有使所述靶细胞与所述药剂接触的情况下的免疫细胞，其中所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂选自下组，该组由以下组成：反向转运体系统Xc-的抑制剂、GPX4的抑制剂和他汀。
在某些方面，本披露涉及增加免疫细胞中NFkB的水平或活性的方法，所述方法包括：(i)使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触以及(ii)使所述免疫细胞按以下量暴露于已与所述药剂接触的靶细胞或由已与所述药剂接触的靶细胞产生的后细胞信号传导因子，所述量足以增加所述免疫细胞中NFkB的水平或活性，所述增加是相对于没有使所述靶细胞与所述药剂接触的情况下的免疫细胞，其中所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂选自下组，该组由以下组成：反向转运体系统Xc-的抑制剂、GPX4的抑制剂和他汀。
在某些方面，本披露涉及增加免疫细胞中干扰素调节因子(IRF)或干扰素基因刺激物(STING)的水平或活性的方法，所述方法包括：(i)使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触以及(ii)使所述免疫细胞按以下量暴露于已与所述药剂接触的靶细胞或由已与所述药剂接触的靶细胞产生的后细胞信号传导因子，所述量足以增加所述免疫细胞中IRF或STING的水平或活性，所述增加是相对于没有使所述靶细胞与所述药剂接触的情况下的免疫细胞，其中所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂选自下组，该组由以下组成：反向转运体系统Xc-的抑制剂、GPX4的抑制剂和他汀。
在某些方面，本披露涉及增加免疫细胞中促免疫细胞因子的水平或活性的方法，所述方法包括：(i)使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触以及(ii)使所述免疫细胞按以下量暴露于已与所述药剂接触的靶细胞或由已与所述药剂接触的靶细胞产生的后细胞信号传导因子，所述量足以增加所述免疫细胞中促免疫细胞因子的水平或活性，所述增加是相对于没有使所述靶细胞与所述药剂接触的情况下的免疫细胞，其中所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂选自下组，该组由以下组成：反向转运体系统Xc-的抑制剂、GPX4的抑制剂和他汀。
在某些实施例中，铁依赖性细胞拆解是铁死亡(ferroptosis)。在某些实施例中，反向转运体系统Xc-的抑制剂是爱拉斯汀(erastin)或其衍生物或类似物。
在某些实施例中，爱拉斯汀或其衍生物或类似物具有下式：
Figure BDA0002941045320000031
或其药学上可接受的盐或酯，其中
R1选自下组，该组由以下组成：H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羟基和卤素；
R2选自下组，该组由以下组成：H、卤代和C1-4烷基；
R3选自下组，该组由以下组成：H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、5-7元杂环烷基和5-6元杂芳基；
R4选自下组，该组由以下组成：H和C1-4烷基；
R5是卤代；
Figure BDA0002941045320000032
任选地被＝O取代；并且
n是0至4的整数。
在某些实施例中，爱拉斯汀的类似物是PE或IKE。
在某些实施例中，GPX4的抑制剂选自下组，该组由以下组成：(1S,3R)-RSL3或其衍生物或类似物、ML162、DPI化合物7、DPI化合物10、DPI化合物12、DPI化合物13、DPI化合物17、DPI化合物18、DPI化合物19、FIN56和FINO2。
在某些实施例中，RSL3衍生物或类似物是由结构式(I)表示的化合物：
Figure BDA0002941045320000033
或其对映异构体、旋光异构体、非对映异构体、N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐，其中
R1、R2、R3和R6独立地选自H、C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8芳烷基、3至8元碳环、3至8元杂环、3至8元芳基或3至8元杂芳基、酰基、烷基磺酰基和芳基磺酰基，其中每个烷基、烷氧基、芳烷基、碳环、杂环、芳基、杂芳基、酰基、烷基磺酰基和芳基磺酰基任选地被至少一个取代基取代；
R4和R5独立地选自H1 C1-8烷基、C1-8烷氧基、3至8元碳环、3至8元杂环、3至8元芳基或3至8元杂芳基、羧酸根、酯、酰胺、碳水化合物、氨基酸、酰基、烷氧基取代的酰基、糖醇、NR7R8、OC(R7)2COOH、SC(R7)2COOH、NHCHR7COOH、COR8、CO2R8、硫酸根、磺酰胺、亚砜、磺酸根、砜、硫代烷基、硫酯和硫醚，其中每个烷基、烷氧基、碳环、杂环、芳基、杂芳基、羧酸根、酯、酰胺、碳水化合物、氨基酸、酰基、烷氧基取代的酰基、糖醇、NR7R8、OC(R7)2COOH、SC(R7)2COOH、NHCHR7COOH、COR8、CO2R8、硫酸根、磺酰胺、亚砜、磺酸根、砜、硫代烷基、硫酯和硫醚任选地被至少一个取代基取代；
R7选自H、C1-8烷基、碳环、芳基、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基和烷基杂环，其中每个烷基、碳环、芳基、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基和烷基杂环可以任选地被至少一个取代基取代；
R8选自H、C1-8烷基、C1-8烯基、C1-8炔基、芳基、碳环、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基、烷基杂环和杂芳香族，其中每个烷基、烯基、炔基、芳基、碳环、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基、烷基杂环和杂芳香族可以任选地被至少一个取代基取代；并且
X是在其附接的环上的0至4个取代基。
在某些实施例中，RSL3衍生物或类似物是由结构式(II)表示的化合物：
Figure BDA0002941045320000041
或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐；其中：
R1选自下组，该组由以下组成：H、OH和-(OCH2CH2)xOH；
X是1至6的整数；并且
R2、R2'、R3、和R3’独立地选自下组，该组由以下组成：H、C3-8环烷基及其组合，或R2和R2’可以结合在一起形成吡啶基或吡喃基，并且R3和R3'可以结合在一起形成吡啶基或吡喃基。
在某些实施例中，RSL3衍生物或类似物是由结构式(III)表示的化合物：
Figure BDA0002941045320000051
或其立体异构体，或其药学上可接受的盐；其中：n是2、3或4；并且R是经取代或未经取代的C1-C6烷基基团，经取代或未经取代的C3-C10环烷基基团，经取代或未经取代的C2-C8杂环烷基基团，经取代或未经取代的C6-C10芳香族环基团或经取代或未经取代的C3-C8杂芳基环基团；其中所述取代是指每个基团中的一个或多个氢原子被以下基团取代，所述基团选自下组，该组由以下组成：卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷氧基、COOH(羧基)、COOC1-C6烷基、OCOC1-C6烷基。
在某些实施例中，他汀选自下组，该组由以下组成：阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、西立伐他汀和辛伐他汀。在某些实施例中，免疫细胞是巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、T细胞、CD4+细胞、CD8+细胞或CD3+细胞。在某些实施例中，免疫细胞是THP-1细胞。
在某些实施例中，所述方法是体外或离体进行。在某些实施例中，所述方法是体内进行。在某些实施例中，步骤(i)在体外进行，并且步骤(ii)在体内进行。
在某些方面，本披露涉及一种增加细胞、组织或受试者中的免疫活性的方法，所述方法包括按以下量向所述细胞、组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者增加免疫活性。
在一个实施例中，受试者需要增加的免疫活性。
在一个实施例中，按以下量施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以使细胞、组织或受试者中的以下一种或多种增加：NFkB的水平或活性，IRF或STING的水平或活性，巨噬细胞的水平或活性，单核细胞的水平或活性，树突状细胞的水平或活性，T细胞的水平或活性，CD4+、CD8+或CD3+细胞的水平或活性，以及促免疫细胞因子的水平或活性。
在某些方面，本披露涉及一种增加细胞、组织或受试者中NFkB的水平或活性的方法，所述方法包括按以下量向所述细胞、组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者增加NFkB的水平或活性。
在一个实施例中，受试者需要增加的NFkB水平或活性。
在一个实施例中，相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者，NFkB的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍、或10倍。
在某些方面，本披露涉及一种增加细胞、组织或受试者中IRF或STING的水平或活性的方法，所述方法包括按以下量向所述细胞、组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者增加IRF或STING的水平或活性。
在一个实施例中，受试者需要增加的IRF或STING的水平或活性。
在一个实施例中，相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者，IRF或STING的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍、或10倍。
在某些方面，本披露涉及一种增加组织或受试者中巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞或T细胞的水平或活性的方法，所述方法包括按以下量向所述组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的组织或受试者增加巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞或T细胞的水平或活性。
在一个实施例中，受试者需要增加的巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞或T细胞水平或活性。
在一个实施例中，相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的组织或受试者，巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞或T细胞的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍、或10倍。
在某些方面，本披露涉及一种增加组织或受试者中CD4+、CD8+或CD3+细胞的水平或活性的方法，所述方法包括按以下量向所述受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的组织或受试者增加CD4+、CD8+或CD3+细胞的水平或活性。
在一个实施例中，受试者需要增加的CD4+、CD8+、或CD3+细胞水平或活性。
在一个实施例中，相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的组织或受试者，CD4+、CD8+、或CD3+细胞的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍、或10倍。
在某些方面，本披露涉及一种增加细胞、组织或受试者中促免疫细胞因子的水平或活性的方法，所述方法包括按以下量向所述细胞、组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者增加促免疫细胞因子的水平或活性。
在一个实施例中，受试者需要增加的促免疫细胞因子水平或活性。
在一个实施例中，相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者，促免疫细胞因子的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍、或10倍。
在一个实施例中，促免疫细胞因子选自IFN-α、IL-1、IL-12、IL-18、IL-2、IL-15、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-17和GMCSF。
在一个实施例中，所述方法还包括在施用之前，对细胞、组织或受试者中的以下中的一种或多种进行评估：NFkB的水平或活性；巨噬细胞的水平或活性；单核细胞的水平或活性；树突状细胞的水平或活性；CD4+细胞、CD8+细胞或CD3+细胞的水平或活性；T细胞的水平或活性；以及促免疫细胞因子的水平或活性。
在一个实施例中，所述方法还包括在施用之后，对细胞、组织或受试者中的以下中的一种或多种进行评估：NFkB的水平或活性；巨噬细胞的水平或活性；单核细胞的水平或活性；树突状细胞的水平或活性；CD4+细胞、CD8+细胞或CD3+细胞的水平或活性；T细胞的水平或活性；以及促免疫细胞因子的水平或活性。
在实施例中，促免疫细胞因子选自IFN-α、IL-1、IL-12、IL-18、IL-2、IL-15、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-17和GMCSF。
在一个实施例中，受试者患有感染。
在一个实施例中，感染是慢性感染。
在实施例中，慢性感染选自HIV感染、HCV感染、HBV感染、HPV感染、乙型肝炎感染、丙型肝炎感染、EBV感染、CMV感染、TB感染和寄生虫感染。
在一个实施例中，细胞或组织是癌细胞或癌组织。
在一个实施例中，受试者已被诊断出患有癌症。
在某些方面，本披露涉及治疗需要增加的免疫活性的受试者的方法，所述方法包括以足以增加所述受试者的免疫活性的量向所述受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。
在一个实施例中，受试者患有慢性感染。
在实施例中，慢性感染选自HIV感染、HCV感染、HBV感染、HPV感染、乙型肝炎感染、丙型肝炎感染、EBV感染、CMV感染、TB感染和寄生虫感染。
在一个实施例中，受试者患有癌症。
在实施例中，所述癌症选自黑素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、非鳞状细胞肺癌、尿路上皮癌、霍奇金淋巴瘤、头颈鳞状细胞癌、肝细胞癌、结直肠癌、胃腺癌、胃食管连接部腺癌和默克尔(Merkel)细胞癌。
在一个实施例中，铁依赖性细胞拆解是铁死亡。
在某些方面，本披露涉及一种治疗被诊断出患有癌症的受试者的方法，所述方法包括将(a)免疫治疗和(b)诱导铁依赖性细胞拆解的药剂组合施用给所述受试者，从而治疗所述受试者的癌症。
在一个实施例中，以有效增加受试者免疫应答的量向受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。
在一个实施例中，免疫治疗选自下组，该组由以下组成：Toll样受体(TLR)激动剂、基于细胞的疗法、细胞因子、癌症疫苗和免疫检查点分子的免疫检查点调节剂。
在一个实施例中，TLR激动剂选自科利毒素(Coley’s toxin)和卡介苗(BacilleCalmette-Guérin)(BCG)。
在一个实施例中，免疫检查点分子选自CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、GITR、ICOS、4-1BB、ADORA2A、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG-3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、和VISTA。
在一个实施例中，免疫检查点分子是刺激性免疫检查点分子，并且免疫检查点调节剂是刺激性免疫检查点分子的激动剂。
在一个实施例中，免疫检查点分子是抑制性免疫检查点分子，并且免疫检查点调节剂是抑制性免疫检查点分子的拮抗剂。
在一个实施例中，免疫检查点调节剂选自小分子、抑制性RNA、反义分子和免疫检查点分子结合蛋白。
在一个实施例中，免疫检查点分子是PD-1，并且免疫检查点调节剂是PD-1抑制剂。
在一个实施例中，PD-1抑制剂选自派姆单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、SHR-1210、MEDI0680R01、BBg-A317、TSR-042、REGN2810和PF-06801591。
在一个实施例中，免疫检查点分子是PD-L1，并且免疫检查点调节剂是PD-L1抑制剂。
在一个实施例中，PD-L1抑制剂选自度伐鲁单抗、阿特利珠单抗、阿维鲁单抗、MDX-1105、AMP-224和LY3300054。
在一个实施例中，免疫检查点分子是CTLA-4，并且免疫检查点调节剂是CTLA-4抑制剂。
在一个实施例中，CTLA-4抑制剂选自艾匹利木单抗、曲美利木单抗、JMW-3B3和AGEN1884。
在实施例中，在免疫检查点调节剂的施用之前、之后或同时施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。
在一个实施例中，相对于单独使用免疫检查点调节剂的治疗，癌症对治疗的应答得到改善。
在实施例中，例如在受试者群体中，相对于单独使用免疫检查点调节剂的治疗，应答改善至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％。
在一个实施例中，应答包括以下中的任一项或多项：肿瘤负荷的减少、肿瘤大小的减小、肿瘤生长的抑制、在治疗前患有进展性癌症的受试者中达到稳定的癌症、癌症进展时间的增加、和存活时间的增加。
在一个实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解的药剂和免疫检查点调节剂协同作用。
在一个实施例中，癌症是对免疫检查点疗法有应答的癌症。
在实施例中，所述癌症选自上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤和白血病。
在各种实施例中，所述癌症选自黑素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、非鳞状细胞肺癌、尿路上皮癌、霍奇金淋巴瘤、头颈鳞状细胞癌、肝细胞癌、结直肠癌、胃腺癌、胃食管连接部腺癌和默克尔细胞癌。
在特定实施例中，所述癌症是肾细胞癌。
在一个实施例中，受试者是人。
在一个实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解的药剂选自下组，该组由以下组成：反向转运体系统Xc-的抑制剂、GPX4的抑制剂和他汀。
在一个实施例中，反向转运体系统Xc-的抑制剂是爱拉斯汀或其衍生物或类似物。
在一个实施例中，爱拉斯汀的类似物是PE或IKE。
在一个实施例中，GPX4的抑制剂选自下组，该组由以下组成：(1S,3R)-RSL3或其衍生物或类似物、ML162、DPI化合物7、DPI化合物10、DPI化合物12、DPI化合物13、DPI化合物17、DPI化合物18、DPI化合物19、FIN56和FINO2。
在一个实施例中，他汀选自下组，该组由以下组成：阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、西立伐他汀和辛伐他汀。
在一个实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解的药剂选自下组，该组由以下组成：索拉非尼或其衍生物或类似物、柳氮磺胺吡啶、谷氨酸盐、BSO、DPI2、顺铂、半胱氨酸酶、二氧化硅基纳米颗粒、CCI4、柠檬酸铁铵、葫芦巴碱和鸦胆子苦醇。
在一个实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解的药剂具有以下特征中的一种或多种：
(a)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及随后共培养细胞中免疫应答的活化；
(b)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及随后共培养的巨噬细胞，例如RAW264.7巨噬细胞的活化；
(c)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及随后共培养的单核细胞，例如THP-1单核细胞的活化；
(d)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及随后共培养的骨髓衍生树突状细胞(BMDC)的活化；
(e)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及随后共培养的细胞中NFkB、IRF和/或STING的水平或活性的增加；
(f)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及随后共培养细胞中促免疫细胞因子的水平或活性的增加；以及
(g)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及随后共培养的CD4+细胞、CD8+细胞和/或CD3+细胞的活化；
在实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解的药剂靶向癌细胞。
在某些方面，本披露涉及筛选免疫刺激剂的方法，所述方法包括：
(a)提供多种测试剂(例如测试剂文库)；
(b)评估所述多种测试剂中的每一种诱导铁依赖性细胞拆解的能力；
(c)选择诱导铁依赖性细胞拆解的测试剂作为候选免疫刺激剂；并且
(d)评估所述候选免疫刺激剂刺激免疫应答的能力。
在一个实施例中，评估步骤(b)包括使细胞或组织与所述多种测试剂中的每一种接触。
在一个实施例中，评估步骤(b)包括将所述多种测试剂中的每一种施用于动物。
在一个实施例中，评估步骤(b)还包括测量与测试剂接触的细胞或组织中的选自下组的标志物的水平或活性，该组由以下组成：脂质过氧化、活性氧(ROS)、异前列腺素(isoprostane)、丙二醛(MDA)、铁、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、前列腺素-内过氧化物合酶2(PTGS2)、环氧合酶2(COX-2)和谷胱甘肽(GSH)。
在一个实施例中，评估步骤(b)还包括将与测试剂接触的细胞或组织中标志物的水平或活性与未与测试剂接触的对照细胞或组织中标志物的水平或活性进行比较。
在一个实施例中，评估步骤(d)包括评估诱导铁依赖性细胞拆解的测试剂的免疫刺激活性。
在一个实施例中，评估步骤(d)包括测量动物中的免疫应答。
在一个实施例中，选自由脂质过氧化、异前列腺素、活性氧(ROS)、铁、PTGS2和COX-2组成的组中的标志物的水平或活性增加或选自由GPX4、MDA和GSH组成的组中的标志物的水平或活性降低表明测试剂是诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。
在一个实施例中，评估候选免疫刺激剂包括将免疫细胞与跟选择的候选免疫刺激剂接触的细胞一起培养或使免疫细胞暴露于由与选择的候选免疫刺激剂接触的细胞产生的后细胞信号传导因子，并测量免疫细胞中NFκB、IRF或STING的水平或活性。
在一个实施例中，免疫细胞是THP-1细胞。
在一个实施例中，评估候选免疫刺激剂包括将T细胞与跟选择的候选免疫刺激剂接触的细胞一起培养或使T细胞暴露于由与选择的候选免疫刺激剂接触的细胞产生的后细胞信号传导因子，并测量T细胞的活化和增殖。
在某些方面，本披露涉及鉴定免疫刺激剂的方法，所述方法包括：
(a)使细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂按以下量接触，所述量足以在所述细胞中诱导铁依赖性细胞拆解；
(b)分离与所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触后的细胞产生的一种或多种后细胞信号传导因子；并且
(c)测定所述一种或多种后细胞信号传导因子刺激免疫应答的能力。
在一个实施例中，所述方法还包括选择刺激免疫应答的测试剂。
在一个实施例中，所述方法还包括检测细胞中铁依赖性细胞拆解的标志物。
在一个实施例中，所述方法还包括：
i)测量与所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触后的细胞产生的一种或多种后细胞信号传导因子的水平；
ii)将与所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触后的细胞产生的一种或多种后细胞信号传导因子的水平与未用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的对照细胞中一种或多种测试剂的水平进行比较；并且
iii)选择相对于对照细胞在与所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触的细胞中显示出升高水平的后细胞信号传导因子，以产生一种或多种后细胞信号传导因子用于步骤(c)中的测定。
在一个实施例中，用诱导细胞死亡(其不是铁依赖性细胞拆解)的药剂处理对照细胞。
在一个实施例中，测定包括向动物施用一种或多种后细胞信号传导因子并测量动物中的免疫应答。
在一个实施例中，测定包括用一种或多种后细胞信号传导因子处理免疫细胞，并测量免疫细胞中NFκB活性的水平或活性。
在一个实施例中，测定包括用一种或多种后细胞信号传导因子处理T细胞并测量T细胞的活化或增殖。
在一个实施例中，测定包括使免疫细胞与一种或多种后细胞信号传导因子接触并测量免疫细胞中NFκB、IRF或STING的水平或活性。
在一个实施例中，免疫细胞是THP-1细胞。
附图说明
图1A显示用各种浓度的爱拉斯汀处理的HT1080纤维肉瘤细胞。图1B显示在与用爱拉斯汀处理的HT1080细胞共培养的THP1单核细胞中的NFkB活性。误差棒表示三个重复之间的标准偏差。
图1C显示用DMSO或各种浓度的爱拉斯汀(ERAS)或爱拉斯汀类似物哌嗪爱拉斯汀(PE)或咪唑酮爱拉斯汀(IKE)处理的HT1080纤维肉瘤细胞。DMSO对照位于最左侧。爱拉斯汀或爱拉斯汀类似物的浓度从左到右增加，并且与图1A中所示的那些相同。
图1D显示在与用爱拉斯汀(ERAS)或爱拉斯汀类似物哌嗪爱拉斯汀(PE)或咪唑酮爱拉斯汀(IKE)处理的HT1080细胞共培养的THP1单核细胞中的NFkB活性。DMSO对照位于最左侧。爱拉斯汀或爱拉斯汀类似物的浓度从左到右增加，并且与图1B中所示相同。误差棒表示三个重复之间的标准偏差。
图2A显示用各种浓度的爱拉斯汀处理的胰腺癌细胞(PANC1)。图2B显示在与用爱拉斯汀处理的PANC1细胞共培养的THP1单核细胞中的NFkB活性。
图3A显示用各种浓度的爱拉斯汀处理的肾细胞癌细胞(Caki-1)。图3B显示在与用爱拉斯汀处理的Caki-1细胞共培养的THP1单核细胞中的NFkB活性。
图4A显示用各种浓度的RSL3处理的肾细胞癌细胞(Caki-1)。图4B显示与用RSL3处理的Caki-1细胞共培养的THP1单核细胞中的NFkB活性。
图5A显示用各种浓度的RSL3处理的Jurkat T细胞白血病细胞。图5B显示与用RSL3处理的Jurkat细胞共培养的THP1单核细胞中的NFkB活性。
图6A显示用各种浓度的RSL3处理的A20 B细胞白血病细胞。图6B显示在与用RSL3处理的A20细胞共培养的THP1单核细胞中的NFkB活性。图6C显示与用RSL3处理的A20细胞共培养的THP1单核细胞中的IRF活性。
图7A显示用各种浓度的爱拉斯汀单独处理或与铁死亡抑制剂(铁基他汀(Ferrostatin)-1，利普司他汀(Liproxstatin)-1或Trolox)组合处理的HT1080纤维肉瘤细胞的活力。
图7B显示用爱拉斯汀单独处理或与铁死亡抑制剂(铁基他汀-1，利普司他汀-1或Trolox)组合处理的HT1080纤维肉瘤细胞共培养的THP1单核细胞中的NFkB活性。
图8A显示用各种浓度的爱拉斯汀单独处理或与铁死亡抑制剂(铁基他汀-1，β-巯基乙醇或去铁胺)组合处理的HT1080纤维肉瘤细胞的活力。
图8B显示用爱拉斯汀单独处理或与铁死亡抑制剂(铁基他汀-1，β-巯基乙醇或去铁胺)组合处理的HT1080纤维肉瘤细胞共培养的THP1单核细胞中的NFkB活性。
图9A显示用各种浓度的爱拉斯汀与siRNA对照(si对照)或针对ACSL4基因的siRNA(siACSL4)组合处理的HT1080纤维肉瘤细胞的活力。
图9B显示用DMSO或爱拉斯汀与siRNA对照(si对照)、针对ACSL4基因的siRNA(siACSL4)或针对CARS基因的siRNA(siCARS)组合处理的H1080纤维肉瘤细胞的活力。
图9C显示用DMSO或爱拉斯汀与siRNA对照(si对照)、针对ACSL4基因的siRNA(siACSL4)或针对CARS基因的siRNA(siCARS)组合处理的HT1080纤维肉瘤细胞共培养的THP1单核细胞中NFkB活性的倍数变化。
图10A显示用DMSO或各种浓度的RSL3单独处理或与铁基他汀-1组合处理的A20淋巴瘤细胞的活力。
图10B显示用DMSO或各种浓度的RSL3单独处理或与铁基他汀-1组合处理的A20淋巴瘤细胞共培养的THP1单核细胞中的NFkB活性。
图11A显示用DMSO或各种浓度的ML162单独处理或与铁基他汀-1组合处理的A20淋巴瘤细胞的活力。
图11B显示用DMSO或各种浓度的ML162单独处理或与铁基他汀-1组合处理的A20淋巴瘤细胞共培养的THP1单核细胞中的NFkB活性。
图12A显示用DMSO或各种浓度的ML210单独处理或与铁基他汀-1组合处理的A20淋巴瘤细胞的活力。
图12B显示用DMSO或各种浓度的ML210单独处理或与铁基他汀-1组合处理的A20淋巴瘤细胞共培养的THP1单核细胞中的NFkB活性。
图13A显示用DMSO或各种浓度的RSL3单独处理或与铁基他汀-1组合处理的Caki-1肾癌细胞的活力。
图13B显示用DMSO或各种浓度的RSL3单独处理或与铁基他汀-1组合处理的Caki-1肾癌细胞共培养的THP1单核细胞中的NFkB活性。
图14A显示用DMSO或各种浓度的ML162单独处理或与铁基他汀-1组合处理的Caki-1肾癌细胞的活力。
图14B显示用DMSO或各种浓度的ML162单独处理或与铁基他汀-1组合处理的Caki-1肾癌细胞共培养的THP1单核细胞中的NFkB活性。
具体实施方式
本披露涉及增加细胞、组织或受试者中的免疫活性的方法，所述方法包括向所述细胞、组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。申请人已出人意料地表明，铁依赖性细胞拆解的诱导(例如铁死亡)增加免疫应答，如免疫细胞中NFKB和IRF活性增加所证明。因此，可以施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂来治疗将从免疫活性增加中受益的疾病，例如癌症或感染。
I.定义
术语“施用(administer，administering或administration)”包括将药物组合物或药剂递送至受试者的系统或递送至受试者内或上的特定区域的任何方法。
如本文所用，“组合施用”、“共同施用”或“组合疗法”应理解为使用分开的配制品或单一药物配制品施用两种或更多种活性剂，或以任何顺序连续施用，使得存在两种(或全部)活性剂在发挥其生物学活性方面重叠的时间段。本文中考虑了一种活性剂(例如，诱导铁依赖性细胞拆解的药剂)可以改善第二药剂的活性，例如可以使靶细胞例如癌细胞对第二药剂的活性敏感。“组合施用”不要求同时、以相同的频率或通过相同的施用途径来施用药剂。如本文所用，“组合施用”，“共同施用”或“组合疗法”包括将诱导铁依赖性细胞拆解的药剂与一种或多种另外的抗癌剂例如免疫检查点调节剂施用。本文提供了免疫检查点调节剂的实例。
如本文中所使用的，“铁死亡”是指经受调节的细胞死亡过程，该过程是铁依赖性的并且涉及活性氧物质的产生。
“细胞拆解(cellular disassembly)”指重新排列和散布细胞内物质并最终导致细胞死亡的动态过程。细胞拆解过程包括细胞产生和释放后细胞信号传导因子。
如本文中所使用的，术语“增加”(或“活化”)和“减少”是指相对于参考，调节分别产生参数的更大或更小的量、功能或活性。例如，在施用本文描述的制剂之后，参数(例如，NFkB的活化、巨噬细胞的活化、肿瘤的大小或生长)相对于施用前参数的量，可以在受试者中增加或减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多。通常，在施用已达到所述作用的时间，例如在开始治疗方案后至少一天、一周、一个月、3个月、6个月时，测量施用后的指标。类似地，临床前参数(通过本文所述的制剂，例如体外细胞的NFkB活化和/或测试哺乳动物的肿瘤负荷的减少)相对于施用前参数的量，可以增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多。
如本文所用，“抗肿瘤剂”是指用于治疗癌症的药物。抗肿瘤剂包括化学治疗剂(例如，烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂皮质类固醇和酶)、生物抗癌剂和免疫检查点调节剂。
“癌症治疗方案”或“抗肿瘤方案”是临床上可接受的用于治疗癌症的给药方案，其包括以特定的时间表以特定的量向受试者施用一种或多种抗肿瘤剂。
如本文所用，“免疫检查点”或“免疫检查点分子”是免疫系统中调节信号的分子。免疫检查点分子可以是刺激性检查点分子，即，增加信号，或者是抑制性检查点分子，即，减少信号。如本文所用，“刺激性检查点分子”是免疫系统中增加信号或具有共刺激性的分子。如本文所用，“抑制性检查点分子”是免疫系统中减少信号或具有共抑制性的分子。
如本文所用，“免疫检查点调节剂”是能够改变受试者中免疫检查点的活性的药剂。在某些实施例中，免疫检查点调节剂改变一种或多种免疫检查点分子(其包括但不限于CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、GITR、ICOS、4-1BB、ADORA2A、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG-3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、和VISTA)的功能。免疫检查点调节剂可以是免疫检查点的激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是免疫检查点结合蛋白(例如，抗体、抗体Fab片段、二价抗体、抗体药物缀合物、scFv、融合蛋白、二价抗体或四价抗体)。在其他实施例中，免疫检查点调节剂是小分子。在特定的实施例中，免疫检查点调节剂是抗PD1、抗PD-L1或抗CTLA-4结合蛋白，例如抗体或抗体片段。
如本文所用，“免疫治疗”是指诱导或增强免疫应答的药学上可接受的化合物、组合物或疗法。免疫治疗包括但不限于免疫检查点调节剂、Toll样受体(TLR)激动剂、基于细胞的疗法、细胞因子和癌症疫苗。
如本文所用，“肿瘤障碍”或“癌症”或“赘生物”是指在人中发现的所有类型的癌症或赘生物，包括但不限于：白血病、淋巴瘤、黑素瘤、上皮癌和肉瘤。如本文所用，术语“肿瘤障碍”、“癌症”和“赘生物”可互换使用，并且以单数或复数形式指已经经历了恶性转化的细胞，所述恶性转化使所述细胞对宿主生物而言是病理性的。通过成熟的技术，特别是组织学检查，可以容易地将原发癌细胞(即从恶性转化位点附近获得的细胞)与非癌性细胞区分开。如本文所用，癌细胞的定义不仅包括原发癌细胞，而且包括癌症干细胞，以及癌症祖细胞或任何源自癌细胞祖先的细胞。这包括转移的癌细胞，以及源自癌细胞的体外培养物和细胞系。
基于肿瘤大小、组织学特征、肿瘤标志物和本领域技术人员已知的其他标准，用于癌症分期的特定标准取决于特定的癌症类型。通常，癌症的期可以描述如下：(i)0期，原位癌；(ii)I期，II期和III期，其中较高的数字表示疾病更加广泛，包括更大的肿瘤大小和/或癌症扩散超出其最初发展的器官到附近淋巴结和/或与原发肿瘤位置相邻的组织或器官；和(iii)IV期，其中癌症已经扩散到远处的组织或器官。
“后细胞信号传导因子(postcellular signaling factors)”是由经历细胞拆解(例如，铁依赖性细胞拆解)的细胞产生的分子和细胞片段，其最终从细胞中释放并影响其他细胞的生物学活性。后细胞信号传导因子可包括蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、核酸、小分子和细胞片段(例如囊泡和细胞膜片段)。
“实体瘤”是根据肿瘤团块例如通过诸如CAT扫描、MR成像、X射线、超声或触诊的程序可检测到的肿瘤，和/或由于可从患者获得的样品中一种或多种癌症特异性抗原的表达可检测到的肿瘤。肿瘤不需要具有可测量的尺寸。
通过本发明的方法治疗的“受试者”可以指人或非人动物，优选哺乳动物，更优选人。在某些实施例中，在使用本发明的方法开始治疗之前，受试者具有可检测的或经诊断的癌症。在某些实施例中，在使用本发明的方法开始治疗之前，受试者具有可检测的或经诊断的感染，例如慢性感染。
“治疗有效量”是指当施用于患者以治疗疾病时足以对所述疾病实现这种治疗的化合物的量。当施用用于预防疾病时，所述量足以避免或延迟疾病的发作。“治疗有效量”将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗患者的年龄、体重等而变化。治疗有效量不需要是治愈性的。治疗有效量不需要预防疾病或病症永不发生。相反，治疗有效量是将至少延迟或减少疾病或病症的发作、严重性或进展的量。
如本文所用，“治疗(treatment)”，“治疗(treating)”及其同源词是指旨在改善、改进、稳定、预防或治愈疾病、病理状况或障碍的受试者的医学管理。该术语包括活性治疗(旨在改善疾病、病理状况或障碍的治疗)、病因治疗(针对相关疾病、病理状况或障碍的原因的治疗)、姑息治疗(旨在缓解症状的治疗)、预防性治疗(旨在最大程度减少或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或障碍发展的治疗)；以及支持治疗(用于补充另一治疗的治疗)。
II.铁依赖性细胞拆解
细胞拆解是一个动态过程，其重新排列和散布细胞内的物质，并导致产生和释放后细胞信号传导因子或“效应子”，这可能对其他细胞的生物学活性产生深远影响。细胞拆解发生在受调节的细胞死亡的过程中，并受多种分子机制控制。不同类型的细胞拆解导致产生不同的后细胞信号传导因子，从而介导不同的生物学效应。例如，申请人出人意料地表明，铁依赖性细胞拆解的诱导可以增加免疫应答，如免疫细胞中NFKB和IRF活性的增加所证明的。
在一些实施例中，铁依赖性细胞拆解是铁死亡。铁死亡是受调节的细胞死亡过程，其涉及铁依赖性活性氧(ROS)的产生。在一些实施例中，铁死亡涉及脂质氢过氧化物的铁依赖性积聚至致死水平。对铁死亡的敏感性与许多生物过程紧密相关，包括氨基酸、铁和多不饱和脂肪酸代谢，以及谷胱甘肽、磷脂、NADPH和辅酶Q10的生物合成。铁死亡涉及代谢功能异常，其导致独立于线粒体，但在某些细胞环境中依赖NADPH氧化酶(Dixon等人,2012,Cell[细胞]149(5):1060-72)的细胞溶质ROS和脂质ROS两者的产生。
诱导铁依赖性细胞拆解的药剂
本文提供诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。当以足够的量且足够的时间存在时，这样的药剂能够诱导铁依赖性细胞拆解的过程。在某些实施例中，诱导铁依赖性的细胞拆解的药剂诱导细胞中铁依赖的细胞拆解的过程，使得细胞产生后细胞信号传导因子，例如免疫刺激性后细胞信号传导因子，但不会导致细胞死亡。在其他实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解的药剂在细胞群体的一部分中，例如群体的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多细胞中诱导铁依赖性细胞拆解的过程，使得细胞群体中的所述部分细胞产生后细胞信号传导因子，例如免疫刺激性后细胞信号传导因子。细胞死亡可能发生在细胞群体的所述部分细胞的全部或仅部分中。
范围广泛的诱导铁依赖性细胞拆解(例如铁死亡)的药剂是本领域已知的，并且可用于本发明提供的各种方法中。例如，最初将两个致癌的RAS选择性致死(RSL)小分子(命名为Ras和ST的根除剂(爱拉斯汀)和Ras选择性致死3(RSL3))鉴定为对表达致癌突变型RAS蛋白(通常在癌症中突变的小GTP酶家族)的细胞具有选择性致死作用的小分子。(参见Cao等人,2016,Cell Mol Life Sci[细胞与分子生命科学]73:2195-2209，其整体并入本文。)具体而言，在经工程化的人成纤维细胞细胞系中，发现小分子爱拉斯汀在过度表达致癌性HRAS的细胞中诱导优先致命性(参见Dolma等人,2003,癌细胞[Cancer Cell.]3:285-296，其整体并入本文)。爱拉斯汀在功能上抑制胱氨酸-谷氨酸反向转运体系统Xc-。系统Xc-是异二聚体细胞表面氨基酸反向转运体，由以下构成：通过二硫键连接至单次跨膜调节蛋白SLC3A2(4F2hc，CD98hc)的十二次跨膜转运蛋白SLC7A11(xCT)。反向转运体系统Xc-导入细胞外胱氨酸(半胱氨酸的氧化形式)，交换细胞内谷氨酸。(参见Cao等人,2016,Cell MolLife Sci[细胞与分子生命科学]73:2195-2209，其整体并入本文。)经爱拉斯汀处理的细胞被剥夺了半胱氨酸，并且无法合成抗氧化剂谷胱甘肽。谷胱甘肽的耗竭最终导致过度的脂质过氧化和ROS升高，这触发铁依赖性细胞拆解。基于形态学、生化和遗传学标准，爱拉斯汀诱导的铁死亡细胞死亡不同于凋亡、坏死和自噬。(参见Yang等人,2014,Cell[细胞]156:317-331，其整体并入本文。)
在一些实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解，例如铁死亡，并在本文提供的方法中有用的药剂是反向转运体系统Xc-的抑制剂。反向转运体系统Xc-的抑制剂包括反向转运体系统Xc-结合蛋白(例如抗体或抗体片段)，核酸抑制剂(例如反义寡核苷酸或siRNA)和特异性抑制反向转运体系统Xc-的小分子。例如，在一些实施例中，反向转运体系统Xc-的抑制剂是特异性抑制SLC7A11或SLC3A2的结合蛋白(例如抗体或抗体片段)。在一些实施例中，反向转运体系统Xc-的抑制剂是特异性抑制SLC7A11或SLC3A2的核酸抑制剂。在一些实施例中，反向转运体系统Xc-的抑制剂是特异性抑制SLC7A11或SLC3A2的小分子。抗体和核酸抑制剂是本领域众所周知的，并在本文中进行了详细描述。反向转运体系统Xc-的小分子抑制剂包括但不限于，爱拉斯汀、柳氮磺胺吡啶、索拉非尼及其类似物或衍生物。(参见Cao等人,2016,Cell Mol Life Sci[细胞与分子生命科学]73:2195-2209，例如，图2，其整体并入本文)。
在特定的实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解，例如铁死亡的药剂是爱拉斯汀或其类似物或衍生物。爱拉斯汀的类似物包括但不限于下表1中列出的化合物。表1中列出的每个参考文献通过引用整体并入本文。
表1.爱拉斯汀类似物
Figure BDA0002941045320000231
Figure BDA0002941045320000241
如本文所用，除非另有说明，否则术语“爱拉斯汀”包括爱拉斯汀的任何药学上可接受的形式，包括但不限于其N-氧化物、结晶形式、水合物、盐、酯和前药。如本文所用，术语“爱拉斯汀衍生物或爱拉斯汀类似物”是指与爱拉斯汀具有相似结构和功能的化合物。在一些实施例中，爱拉斯汀衍生物/爱拉斯汀类似物包括具有下式的那些：
Figure BDA0002941045320000242
或其药学上可接受的盐或酯，其中
R1选自下组，该组由以下组成：H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羟基和卤素；
R2选自下组，该组由以下组成：H、卤代和C1-4烷基；
R3选自下组，该组由以下组成：H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、5-7元杂环烷基和5-6元杂芳基；
R4选自下组，该组由以下组成：H和C1-4烷基；
R5是卤代；
Figure BDA0002941045320000251
任选地被＝O取代；并且
n是0至4的整数。
在一个实施例中，爱拉斯汀衍生物或类似物是结构式(I)表示的化合物：
Figure BDA0002941045320000252
或其药学上可接受的盐，其中：
Ra是卤素、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、经取代或未经取代的芳基-O-、经取代或未经取代的烷基-O-、经取代或未经取代的烯基-O-或经取代或未经取代的炔基-O-，其中烷基、烯基和炔基任选地被NR、O或S(O)n中断；
每个R2独立地选自下组，该组由以下组成：卤素、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的非芳香族杂环、-CN、-COOR'、-CON(R)2、-NRC(O)R、-SO2N(R)2、-N(R)2、-NO2、-OH和-OR'；
每个R3独立地选自下组，该组由以下组成：卤素、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的非芳香族杂环、-(CO)R、-CN、-COOR'、-CON(R)2、-NRC(O)R、-SO2N(R)2、-N(R)2、-NO2、-OH和-OR’；
R4和R5独立地选自下组，该组由以下组成：-H、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、经取代或未经取代的非芳香族杂环以及经取代或未经取代的芳基，其中烷基、烯基和炔基任选地被NR、O或S(O)n中断；或R4和R5一起形成碳环或杂环基团；
V是-NH-L-A-Q或
Figure BDA0002941045320000261
其中环C是经取代或未经取代的杂环芳香族环或非芳香族环；
A是NR或O；或A是共价键；
L是任选地被一个或多个选自N、O和S的杂原子中断的经取代或未经取代的烃基基团；
Q选自下组，该组由以下组成：-R、---C(O)R'、-C(O)N(R)2、-C(O)OR'、和-S(O)2R’；
每个R独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基或非芳香族杂环，其中所述烷基、烯基、炔基、芳基或非芳香族杂环基团经取代或未经取代；
每个R′独立地是烷基、烯基、炔基基团、非芳香族杂环基团或芳基基团，其中所述烷基、烯基、炔基、非芳香族杂环基团或芳基经取代或未经取代；
j是0至4的整数；
k是0至4的整数，条件是j和k中的至少一个是1至4的整数；
并且每个n独立地是0、1或2。
在另一个实施例中，爱拉斯汀衍生物是由以上实施例中披露的结构式(I)表示的化合物；其中V是
Figure BDA0002941045320000271
上述结构包含的V的合适实例包括：
Figure BDA0002941045320000272
并且其中所有其他变量如上述实施例中所披露。
在一个实施例中，爱拉斯汀衍生物或类似物是结构式(II)表示的化合物：
Figure BDA0002941045320000273
其中R1选自下组，该组由以下组成：H、C1-6烷基和CF3，其中每个C1-6烷基可以任选地经选自下组的原子或基团取代，该组由以下组成：卤素原子、饱和的或不饱和的C3-6-杂环和胺，每个杂环任选地经选自由C1-4脂肪族组成的组的原子或基团取代，所述C1-4脂肪族可以任选地经C1-4烷基-芳基-O-C1-4烷基取代；
R2选自下组，该组由以下组成：H、卤代和C1-6脂肪族；并且
R3是卤代原子；
或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐。
在另一个实施例中，爱拉斯汀衍生物或类似物是结构式(III)表示的化合物：
Figure BDA0002941045320000281
其中
R1选自下组，该组由以下组成：H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羟基和卤素；
R2选自下组，该组由以下组成：H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、芳基、杂芳基和C1-4芳烷基；
R3不存在，或选自下组，该组由以下组成：C1-4烷基、C1-4烷氧基、羰基、C3-8环烷基和C3-8杂环烷基；
X选自下组，该组由以下组成：C、N和O；并且
n是0至6的整数，
条件是当X是C时，n＝0且R3不存在，当R2是CH3时，R1不能是H；
或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐。
在特定的实施例中，爱拉斯汀衍生物是结构式(IV)表示的化合物：
Figure BDA0002941045320000291
或其N氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐，
其中所有变量的定义是如披露具有式(III)的化合物的上述实施例中所定义。
在另一个实施例中，爱拉斯汀衍生物或类似物是结构式(V)表示的化合物：
Figure BDA0002941045320000292
或其药学上可接受的盐，
其中R1选自H、-Z-Q-Z、-C1-8烷基-N(R2)(R4)、-C1-8烷基-OR3、3至8元碳环或杂环、芳基、杂芳基、和C1-4芳烷基；
对于每次出现，R2和R4各自独立地选自H、C1-4烷基、C1-4芳烷基、芳基、杂芳基、酰基、烷基磺酰基和芳基磺酰基，条件是当R2和R4两者在相同的N原子上且不都是H时，它们是不同的，并且当R2和R4两者在相同的N上且R2或R4是酰基、烷基磺酰基或芳基磺酰基时，则另一个选自H、C1-8烷基、C1-4芳烷基、芳基和杂芳基；
R3选自H、C1-4烷基、C1-4芳烷基、芳基和杂芳基；
W选自
Figure BDA0002941045320000301
Q选自O和NR2；并且
对于每次出现，Z独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基。当Z是烯基或炔基基团时，一个或多个双键或三键优选地不在所述基团的末端(因此排除例如烯醇醚、炔醇醚、烯胺和/或炔胺)。
在特定的实施例中，所述化合物由以上披露的实施例的结构式(V)表示；其中
对于每次出现，R2和R4各自独立地选自H、C1-4烷基、C1-4芳烷基、芳基、杂芳基、酰基、烷基磺酰基和芳基磺酰基，条件是当R2和R4两者在相同的N原子上且不都是H时，它们是不同的；
R3选自H、C1-4烷基、芳基和杂芳基；
对于每次出现，Z独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基；
其中每个杂环基团是3至10元非芳香族环，其包括一至四个选自氮、氧和硫的杂原子；
其中每个芳基是苯基；
其中每个杂芳基是5至7元芳香族环，其包括一至四个选自氮、氧和硫的杂原子；并且
其中每个杂环、芳基和杂芳基基团任选地被一个或多个选自下组的部分取代，该组由以下组成：卤素、羟基、羧基、烷氧基羰基、甲酰基、酰基、硫酯、硫代乙酸根、硫代甲酸根、烷氧基、磷酰基、磷酸根、膦酸根、次膦酸根、氨基、酰胺基、脒基、亚氨基、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸根、磺酸根、氨磺酰基和磺酰胺基。
术语“经取代的”是指在骨架的一个或多个碳原子上具有取代氢的取代基的部分。取代基可包括例如卤素、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸根或硫代甲酸根)、烷氧基、磷酰基、磷酸根、膦酸根、次膦酸根、氨基、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸根、磺酸根、氨磺酰基、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳香族或杂芳香族部分。本领域技术人员将理解，如果合适，在烃链上取代的部分本身可以经取代。
在特定的实施例中，反向转运体系统Xc-的抑制剂是
Figure BDA0002941045320000311
或其药学上可接受的盐。
在特定的实施例中，反向转运体系统Xc-的抑制剂是
Figure BDA0002941045320000312
或其药学上可接受的盐。
在特定的实施例中，反向转运体系统Xc-的抑制剂是
Figure BDA0002941045320000321
或其药学上可接受的盐。
另外的爱拉斯汀衍生物或类似物描述于例如WO 2015/109009、US 9695133、US8535897、WO 2015/051149、US 2008/0299076、US2007/0161644、WO 2008/013987、US8575143、US 8518959、WO2007/076085、Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters[生物有机化学和医药化学快报](2015),25(21),4787-4792、eLife[电子生活](2014),3、Letters in Organic Chemistry[有机化学快报](2015),12(6),385-393、PharmaciaLettre[药学快报](2012),4(5),1344-1351、PLoS Pathogens[美国科学公共图书馆病原体](2014),10(6)、Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters[生物有机化学和医药化学快报](2011),21(18),5239-5243、印度化学杂志B部分:有机化学，包括药物化学[IndianJournal of Chemistry,Section B:Organic Chemistry Including MedicinalChemistry](2010),49B(7),923-928、Synthetic Communications[合成通讯](2009),39(18),3217-3231、印度化学杂志B部分：有机化学，包括药物化学[Indian Journal ofChemistry,Section B:Organic Chemistry Including Medicinal Chemistry](1994),33B(3),260-5、Journal of Heterocyclic Chemistry[杂环化学杂志](1983),20(5),1339-49、Chemical&Pharmaceutical Bulletin[化学与制药公告](1979),27(11),2675-87、Journal of Medicinal Chemistry[药物化学杂志](1977),20(3),379-86、IndianJournal of Chemistry[印度化学杂志](1971),9(3),201-6、和Journal of MedicinalChemistry[药物化学杂志](1968),11(2),392-5，其每一个均通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解(例如，铁死亡)并在本文提供的方法中有用的试剂是谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的抑制剂。GPX4是磷脂氢过氧化物酶，其催化过氧化氢和有机过氧化物的还原，从而保护细胞免受膜脂质过氧化或氧化应激。因此，GPX4有助于细胞在氧化环境中存活的能力。抑制GPX4可以诱导由铁死亡引起的细胞死亡(参见,Yang,W.S.,等人Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4[GPX4细胞对铁死亡癌细胞死亡的调节].Cell[细胞]156,317-331(2014))。GPX4的抑制剂包括GPX4结合蛋白(例如抗体或抗体片段)、核酸抑制剂(例如反义寡核苷酸或siRNA)和特异性抑制GPX4的小分子。GPX4的小分子抑制剂包括但不限于下表2中列出的化合物。表2中列出的每个参考文献通过引用整体并入本文。
表2.GPX4抑制剂
Figure BDA0002941045320000331
在特定的实施例中，GPX4抑制剂是
Figure BDA0002941045320000341
或其药学上可接受的盐。
RSL3是GPX4的已知抑制剂。在敲低研究中，RSL3选择性介导表达RAS的细胞的死亡，并被鉴定为脂质ROS积聚增加。参见美国专利号8,546,421。
在一些实施例中，GPX4的抑制剂是RSL3的非对映异构体。
在特定的实施例中，RSL3的非对映异构体是
Figure BDA0002941045320000342
或其药学上可接受的盐。
在特定的实施例中，RSL3的非对映异构体是
Figure BDA0002941045320000343
或其药学上可接受的盐。
在特定的实施例中，RSL3的非对映异构体是
Figure BDA0002941045320000351
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，GPX4的抑制剂是RSL3的药学上可接受的形式，包括但不限于其N-氧化物、结晶形式、水合物、盐、酯和前药。
在一些实施例中，GPX4的抑制剂是RSL3或其衍生物或类似物。RSL3的衍生物和类似物在本领域中是已知的，并且例如在WO2008/103470、WO 2017/120445、WO 2018118711、US 8546421、和CN108409737中进行了描述，其每一个均通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，RSL3衍生物或类似物是由结构式(I)表示的化合物：
Figure BDA0002941045320000352
或其对映异构体、旋光异构体、非对映异构体、N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐，其中
R1、R2、R3和R6独立地选自H、C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8芳烷基、3至8元碳环、3至8元杂环、3至8元芳基或3至8元杂芳基、酰基、烷基磺酰基和芳基磺酰基，其中每个烷基、烷氧基、芳烷基、碳环、杂环、芳基、杂芳基、酰基、烷基磺酰基和芳基磺酰基任选地被至少一个取代基取代；
R4和R5独立地选自H1 C1-8烷基、C1-8烷氧基、3至8元碳环、3至8元杂环、3至8元芳基或3至8元杂芳基、羧酸根、酯、酰胺、碳水化合物、氨基酸、酰基、烷氧基取代的酰基、糖醇、NR7R8、OC(R7)2COOH、SC(R7)2COOH、NHCHR7COOH、COR8、CO2R8、硫酸根、磺酰胺、亚砜、磺酸根、砜、硫代烷基、硫酯和硫醚，其中每个烷基、烷氧基、碳环、杂环、芳基、杂芳基、羧酸根、酯、酰胺、碳水化合物、氨基酸、酰基、烷氧基取代的酰基、糖醇、NR7R8、OC(R7)2COOH、SC(R7)2COOH、NHCHR7COOH、COR8、CO2R8、硫酸根、磺酰胺、亚砜、磺酸根、砜、硫代烷基、硫酯和硫醚任选地被至少一个取代基取代；
R7选自H、C1-8烷基、碳环、芳基、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基和烷基杂环，其中每个烷基、碳环、芳基、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基和烷基杂环可以任选地被至少一个取代基取代；
R8选自H、C1-8烷基、C1-8烯基、C1-8炔基、芳基、碳环、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基、烷基杂环和杂芳香族，其中每个烷基、烯基、炔基、芳基、碳环、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基、烷基杂环和杂芳香族可以任选地被至少一个取代基取代；并且
X是在其附接的环上的0至4个取代基。
在一个实施例中，RSL3衍生物或类似物是由结构式(II)表示的化合物：
Figure BDA0002941045320000361
或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐；其中：
R1选自下组，该组由以下组成：H、OH和-(OCH2CH2)xOH；
X是1至6的整数；并且
R2、R2'、R3、和R3’独立地选自下组，该组由以下组成：H、C3-8环烷基及其组合，或R2和R2’可以结合在一起形成吡啶基或吡喃基，并且R3和R3'可以结合在一起形成吡啶基或吡喃基。
在一个实施例中，RSL3衍生物或类似物是由结构式(III)表示的化合物：
Figure BDA0002941045320000371
或其立体异构体，或其药学上可接受的盐；其中：n是2、3或4；并且R是经取代或未经取代的C1-C6烷基基团，经取代或未经取代的C3-C10环烷基基团，经取代或未经取代的C2-C8杂环烷基基团，经取代或未经取代的C6-C10芳香族环基团或经取代或未经取代的C3-C8杂芳基环基团；其中所述取代是指每个基团中的一个或多个氢原子被以下基团取代，所述基团选自下组，该组由以下组成：卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷氧基、COOH(羧基)、COOC1-C6烷基、OCOC1-C6烷基。
在一些实施例中，GPX4抑制剂是
Figure BDA0002941045320000372
或其药学上可接受的盐。
ML162已被鉴定为GPX4的直接抑制剂，其可诱导铁死亡(参见，Dixon等人,2015,ACS Chem.Bio.[ACS化学生物学]10,1604-1609)。
在一些实施例中，GPX4抑制剂是ML162的药学上可接受的形式，包括但不限于其N-氧化物、结晶形式、水合物、盐、酯和前药。
在一些实施例中，GPX4的抑制剂是ML162或其衍生物或类似物。
在一些实施例中，GPX4抑制剂是
Figure BDA0002941045320000381
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，GPX4抑制剂是ML210的药学上可接受的形式，包括但不限于其N-氧化物、结晶形式、水合物、盐、酯和前药。
在一些实施例中，GPX4的抑制剂是ML210或其衍生物或类似物。
在一些实施例中，GPX4的抑制剂是FIN56或其衍生物或类似物。
在一个实施例中，FIN56或其衍生物或类似物由下式表示：
Figure BDA0002941045320000382
或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、立体异构体、几何异构体、溶剂化物或前药，其中
n＝0-2，并且其中当n＝1时，X选自CH2、O、NRA、CO并且C＝NORA，并且其中当n＝2时，X＝CH2，
Y是O、S、NORA或NRA，
其中RA选自H、烷基、杂烷基、烯基、炔基、环烷基、-C(＝O)RB、-C(＝O)ORB、-C(＝O)NRBRC、-C(＝NRB)RC、-NRBRc、杂环烷基、芳基或多芳香族、杂芳基、芳基烷基和烷基芳基，
其中所述RB和Rc中的每个独立地是H、烷基或杂烷基，
U和V各自独立地选自C＝O和O＝S＝O，并且其中当U是C＝O时，V不是C＝O，
R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、烷基、杂烷基、环烷基、芳基环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基并且所述NR1R2和NR3R4中的每个可以独立组合形成杂环烷基，
R5和R6各自独立地选自H、OH、SH、烷氧基、硫代烷氧基、烷基、卤素、CN、CF3、NO2、COORD、CONRDRE、NRDRE、NRDCORE、NRDSO2RE、和NRFCONRDRE；
其中RD、RE和RF独立地是H、烷基、杂烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、环烷基或杂环烷基；
条件是如果X是O，Y是O，并且U和V均是O＝S＝O，则NR1R2和NR3R4不相同，则R1和R3各自独立地选自H和低级烷基，并且其中R2和R4各自独立地选自低级烷氧基(低级烷基)、二(低级)烷基氨基(低级)烷基、卤代苄基、吗啉代(低级)烷基，或NR1R2和NR3R4独立地是哌啶代、吗啉代、哌嗪代、N-苯基哌嗪代、乙基氨基或经取代的甘氨酸，
并且其中如果X是(CH2)2，Y是O或NOH，并且U和V各自是O＝S＝O，则R1、R2、R3和R4均不是甲基，
并且其中，如果n＝O，Y是O或NOH，并且U和V各自是O＝S＝O，则NR1R2和NR3R4不相同并且R1、R2、R3和R4各自独立地选自C1-C5烷基、C1O烷基、Ciβ烷基、C17烷基、苯基、苄基、萘基、哌嗪代、吡啶基、吡唑基、苯并咪唑基、三唑基；或NR1R2和NR3R4独立地是哌啶代、吗啉代或哌嗪代，
并且其中如果X是CO，Y是O，并且U和V各自是O＝S＝O，则NR1R2和NR3R4不相同，并且其中R1、R2、R3、和R4各自独立地选自甲基、乙基、羟基-d-Cr烷基、SH、RO、COOH、SO、NH2和苯基，或其中不相同的NR1R2和NR3R4中的一者或两者是未经取代的哌啶代、N-甲基哌嗪代或N-甲基高哌嗪代，
并且其中当X是C＝O或C＝NOH，Y是O或NOH，并且U和V各自是O＝S＝O，且R1或R2之一和R3或R4之一是苯基时，则R1或R2和R3或R4中的另一个不是H或烷基。
在一个实施例中，FIN56衍生物或其类似物由下式表示：
Figure BDA0002941045320000401
其中n＝1-2，并且当n＝1时，X选自CH2、O、CO、和C＝NORA；并且其中当n＝2时，X＝CH2，
Y是O、S、NORA或NRA，
其中U和V各自是O＝S＝O，
其中RA选自H、烷基、杂烷基、烯基、炔基、环烷基、
—C(＝O)RB、—C(＝O)ORB、—C(＝O)NRBRC、—C(＝NRB)RC、—NRBRC、杂环烷基、芳基或多芳香族、杂芳基、芳基烷基和烷基芳基，
其中所述RB和RC中的每个独立地是H、烷基或杂烷基，
R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、烷基、杂烷基、环烷基、芳基环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基并且所述NR1R2和NR3R4中的每个可以独立组合形成杂环烷基，
R5和R6各自独立地选自H、OH、SH、烷氧基、硫代烷氧基、烷基、卤素、CN、CF3、NO2、COORD、CONRDRE、NRDRE、NRDCORE、NRDSO2RE、和NRFCONRDRE；
其中RD、RE和RF独立地是H、烷基、杂烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、环烷基或杂环烷基；条件是X是O，Y是O，且U和V均是O＝S＝O，则NR1R2和NR3R4不相同，则R1和R3各自独立地选自H和低级烷基，并且其中R2和R4各自独立地选自低级烷氧基(低级烷基)、二(低级)烷基氨基(低级)烷基、卤代苄基、吗啉代(低级)烷基，或NR1R2和NR3R4独立地是哌啶代、吗啉代、哌嗪代、N-苯基哌嗪代、乙基氨基或经取代的甘氨酸，
并且其中如果X是(CH2)2，并且Y是O或NOH，则R1、R2、R3、和R4都不是甲基，
并且其中如果X是CO且Y是O，则NR1R2和NR3R4不相同，并且其中R1、R2、R3和R4各自独立地选自甲基、乙基、羟基-C1-C3-烷基、SH、RO、COOH、SO、NH2和苯基，或其中不相同的NR1R2和NR3R4中的一者或两者是未经取代的哌啶代、N-甲基哌嗪代或N-甲基高哌嗪代，其中所述未经取代的哌啶、N-甲基哌嗪代或N-甲基高哌嗪代NR1R2和NR3R4部分不相同，
并且其中当X是C＝O或C＝NOH，Y是O或NOH，并且R1或R2之一和R3或R4之一是苯基时，则R1或R2和R3或R4中的另一个不是H或烷基，
或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、立体异构体或几何异构体。
在一个实施例中，FIN56衍生物或其类似物由下式表示：
Figure BDA0002941045320000411
其中RA是氢，R7和R8独立地选自H和SO2NR3R4，其中R7和R8之一是氢，并且其中NR1R2和NR3R4独立地是在环中含有一个氮的6至15元杂环烷基，或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、立体异构体或几何异构体。
另外的FIN56衍生物或类似物描述于例如WO 2008/140792、WO2010/082912、WO2017/058716、US 6693136、Nature Chemical Biology[自然化学生物学](2016),12(7),497-503doi:10.1038/nchembio.2079、ACS Chemical Biology[ACS化学生物学](2015),10(7),1604-1609doi:10.1021/acschembio.5b00245、Dissertation AbstractsInternational[国际论文摘要],(2015)第76卷,第8B(E)期.订购号:AAI3688566.ProQuestDissertations&Theses.[ProQuest学位论文和论文]120页，其每一个均通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解(例如，铁死亡)并在本文提供的方法中有用的药剂是他汀。在一个实施例中，他汀选自下组，该组由以下组成：阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、西立伐他汀和辛伐他汀。
在一个实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解(例如，铁死亡)并在本文提供的方法中有用的药剂选自下组，该组由以下组成：谷氨酸盐、BSO、DPI2(参见Yang等人,2014,Cell[细胞]156:317-331；图5和S5,其整体并入本文)、顺铂、半胱氨酸酶、基于二氧化硅的纳米颗粒、CCI4、柠檬酸铁铵、葫芦巴碱和鸦胆子苦醇。
诱导铁依赖性细胞拆解的另外的药剂在本领域中是已知的，并且描述于例如US8518959、US 8535897、US 8546421、US 9580398、US 9695133、US 2010/0081654、US 2015/0079035、US 2015/0175558、US 2016/0229836、US 2016/0297748、US 2016/0332974、Cell[细胞].2012年5月25日；149(5):1060-72.doi:10.1016/j.cell.2012.03.042；
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其每一个均通过引用整体并入本文。
在一个实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解(例如，铁死亡)并在本文提供的组合物和方法中有用的药剂在共培养的细胞例如免疫细胞中诱导一种或多种期望的免疫作用。例如，在实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解的药剂具有以下特征中的一种或多种：
(a)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及共培养细胞中的免疫应答的活化；
(b)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及共培养的巨噬细胞，例如RAW264.7巨噬细胞的活化；
(c)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及共培养的单核细胞，例如THP-1单核细胞的活化；
(d)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及共培养的骨髓衍生树突状细胞(BMDC)的活化；
(e)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及共培养的细胞中NFkB、IRF和/或STING的水平或活性的增加；
(f)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及共培养细胞中促免疫细胞因子的水平或活性的增加；
(g)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及共培养的CD4+细胞、CD8+细胞和/或CD3+细胞的活化；以及
(h)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及T细胞的水平或活性的增加。
用于确定除了诱导靶细胞的铁依赖性细胞拆解还在共培养细胞中诱导所述免疫作用的药剂的多种方法是本领域已知的并且在本文中提供并且详细描述。
在本发明的某些方面，可能期望将诱导铁依赖性细胞拆解的药剂靶向或引导递送至特定的靶细胞，例如癌细胞。因此，在一些实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解的药剂靶向癌细胞。将治疗剂靶向癌细胞的方法是本领域已知的，并且描述于例如US 2017/0151345中，其通过引用整体并入本文。例如，诱导铁依赖性细胞拆解的药剂可以通过例如以复合物或缀合物的形式与特异性结合癌细胞标志物的分子结合而靶向癌细胞。如本文所用，术语“癌细胞标志物”是指存在于癌细胞表面上的多肽。例如，癌细胞标志物可以是癌细胞受体，例如，与细胞外环境中的分子特异性结合的多肽。癌细胞标志物(例如受体)可以是仅在癌细胞上展示的多肽、在癌细胞上比在相同或不同组织类型的正常细胞上以更高水平展示的多肽、或者在癌细胞和正常细胞类型上展示的多肽。在一些实施例中，癌细胞标志物(例如，受体)可以是在癌细胞中具有改变(例如高于或低于正常)的表达和/或活性的多肽。在一些实施例中，癌细胞标志物(例如，受体)可以是与癌症的疾病过程有关的多肽。在一些实施例中，癌细胞标志物(例如，受体)可以是涉及控制细胞死亡和/或细胞凋亡的多肽。癌细胞标志物的非限制性实例包括但不限于EGFR、ER、PR、HER2、PDGFR、VEGFR、MET、c-MET、ALK、CD117、RET、DR4、DR5、和FasR。在一些实施例中，与癌细胞标志物(例如，受体)特异性结合的分子是抗体或其癌细胞标志物结合片段。在一些实施例中，癌细胞标志物是受体，并且与癌细胞受体特异性结合的分子是所述受体的配体或配体模拟物。
因此，在一些实施例中，设想本发明的组合物包含复合物或缀合物，所述复合物或缀合物包含诱导铁依赖性细胞拆解的药剂和与癌细胞标志物(例如，受体)特异性结合的分子。在某些实施例中，复合物或缀合物包含药学上可接受的树枝状聚合物，例如PAMAM树枝状聚合物。在某些实施例中，复合物包含脂质体。在某些实施例中，复合物包含微颗粒或纳米颗粒。
III.增加免疫活性的方法
本文所述的诱导铁依赖性细胞拆解(例如，铁死亡)的药剂可用于增加细胞、组织或受试者(例如，受益于提高的免疫活性的受试者)中的免疫活性。例如，在一些方面，本披露涉及一种增加细胞、组织或受试者中的免疫活性的方法，所述方法包括按以下量向所述细胞、组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者增加免疫活性。在一些方面，本披露涉及一种增加组织或受试者中的免疫活性的方法，所述方法包括按以下量向所述组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的组织或受试者增加免疫活性。
在一个实施例中，受试者需要增加的免疫活性。
诱导铁依赖性细胞拆解的药剂的施用导致调节免疫活性的后细胞信号传导因子的产生。免疫活性可以通过后细胞信号传导因子与范围广泛的免疫细胞的相互作用来调节，所述免疫细胞包括肥大细胞、自然杀伤(NK)细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞(例如B-淋巴细胞(B细胞))和T淋巴细胞(T细胞))。
肥大细胞是包含富含组胺和抗凝剂肝素的颗粒的粒细胞。活化时，肥大细胞将炎性化合物从颗粒释放到局部微环境中。肥大细胞在变态反应、过敏反应、伤口愈合、血管生成、免疫耐受、病原体防御和血脑屏障功能中发挥作用。
天然杀伤(NK)细胞是细胞毒性淋巴细胞，在无需任何事先刺激或免疫情况下裂解某些肿瘤细胞和病毒感染的细胞。NK细胞也是各种细胞因子的有效生产者，例如IFN-γ(IFNγ)、TNF-α(TNFα)、GM-CSF和IL-3。因此，也认为NK细胞在免疫系统中起调节性细胞的作用，影响其他细胞和应答。在人中，NK细胞被广泛定义为CD56+CD3-淋巴细胞。NK细胞的细胞毒性活性受到细胞表面受体活化信号和抑制信号之间平衡的严格控制。抑制NK细胞活化的主要受体组是抑制性杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)。在识别靶细胞上的自身MHC I类分子后，这些受体会递送停止活化信号传导级联的抑制信号，从而使具有正常MHC I类表达的细胞免受NK细胞裂解。活化受体包括天然细胞毒性受体(NCR)和NKG2D，它们通过与靶细胞表面上的不同配体接合而将平衡推向细胞溶解作用。因此，靶细胞的NK细胞识别受到涉及多个活化受体和抑制受体递送的信号整合的过程的严格控制。
单核细胞是骨髓衍生的单核吞噬细胞，其在被募集到组织中之前在血液中循环数小时/天。参见Wacleche等人,2018,Viruses[病毒](10)2:65。各种趋化因子受体和细胞粘附分子在其表面上的表达使它们能够从骨髓中进入血液，并随后从血液募集到组织中。单核细胞属于免疫系统的先天武器，提供对病毒、细菌、真菌或寄生虫感染的应答。它们的功能包括通过吞噬作用、产生活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、髓过氧化物酶和炎性细胞因子杀死病原体。在特定条件下，单核细胞可在癌症以及感染性疾病和自身免疫性疾病中刺激或抑制T细胞应答。它们也参与组织修复和新血管形成。
巨噬细胞在称为吞噬作用的过程中吞噬并消化诸如细胞碎片、外来物质、微生物和癌细胞的物质。除吞噬作用外，巨噬细胞在非特异性防御(先天免疫)中起关键作用，并且还通过募集其他免疫细胞(例如淋巴细胞)来帮助启动特异性防御机制(适应性免疫)。例如，巨噬细胞作为针对T细胞的抗原呈递者是重要的。除了增加炎症和刺激免疫系统外，巨噬细胞还起重要的抗炎作用，并且可以通过释放细胞因子来降低免疫应答。促进炎症的巨噬细胞称为M1巨噬细胞，而减轻炎症并促进组织修复的巨噬细胞称为M2巨噬细胞。
树突状细胞(DC)在刺激针对病原体的免疫应答以及维持针对无害抗原的免疫稳态方面起关键作用。DC表示专化的抗原感测和抗原呈递细胞(APC)的异质组，它们对于诱导和调节免疫应答是必不可少的。在外周血中，人DC的特征是缺少T细胞标志物(CD3、CD4、CD8)、B细胞标志物(CD19、CD20)和单核细胞标志物(CD14、CD16)，但高表达HLA-DR和其他DC谱系标志物(例如CD1a、CD1c)。参见Murphy等人，Janeway’s Immunobiology.[詹恩威免疫生物学]第8版花环科学公司(Garland Science)；纽约,纽约州,美国:2012.868p。
术语“淋巴细胞”是指在全身淋巴组织中和正常成年人中形成的小白细胞，约占循环血液中白细胞总数的22％-28％，在保护机体抵抗疾病中起着重要作用。个体淋巴细胞是专化的，因为它们致力于通过其遗传物质的重组(例如产生T细胞受体和B细胞受体)对结构相关抗原的有限组作出应答。这种行为在免疫系统与给定抗原首次接触之前就存在，通过淋巴细胞表面膜上抗原上决定簇(表位)的特异性受体的存在来表达。每个淋巴细胞都具有独特的受体群，受体群的所有受体都具有相同的结合位点。淋巴细胞的一个组或克隆在其受体的结合区结构方面与另一克隆不同，并且因此在其可识别的表位方面也不同。淋巴细胞不仅在受体的特异性方面彼此不同，而且在其功能方面也彼此不同。(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999),第102页)。
淋巴细胞包括作为抗体分泌细胞的前体的B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)。
B淋巴细胞(B细胞)
B淋巴细胞源自骨髓的造血细胞。成熟的B细胞可以用表达被其细胞表面识别的表位的抗原活化。活化过程可以是直接的(这依赖于抗原对膜Ig分子的交联(交联依赖性B细胞活化))，也可以是间接的(通过在称为同源辅助的过程中与辅助T细胞的相互作用)。在许多生理情况下，受体交联刺激和同源辅助协同产生更强烈的B细胞应答(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
交联依赖性B细胞活化需要抗原表达与细胞表面受体的结合位点互补的表位的多个拷贝，因为每个B细胞表达具有相同可变区的Ig分子。具有重复表位的其他抗原，例如微生物的荚膜多糖或病毒包膜蛋白，可以满足这种要求。交联依赖性B细胞活化是针对这些微生物的主要保护性免疫应答(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:anintroduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
同源辅助使B细胞针对无法交联受体的抗原进行应答，同时当B细胞受到弱交联事件刺激时，提供共刺激信号，拯救B细胞免于失活。同源辅助依赖于B细胞膜免疫球蛋白(Ig)对抗原的结合、抗原的胞吞作用及其在细胞的内体/溶酶体区室中片段化成肽。产生的肽中的一些被加载到一组专化的细胞表面蛋白(称为II类主要组织相容性复合物(MHC)分子)的凹槽中。所得的II类/肽复合物在细胞表面表达，并充当一组T细胞(称为CD4+ T细胞)的抗原特异性受体的配体。CD4+ T细胞在其表面上具有针对B细胞的II类/肽复合物特异性的受体。B细胞活化不仅依赖于T细胞通过其T细胞受体(TCR)的结合，而且这种相互作用还允许T细胞上的活化配体(CD40配体)与其在B细胞上的受体(CD40)结合，从而信号转导B细胞活化。此外，T辅助细胞分泌几种细胞因子，所述细胞因子通过与B细胞上的细胞因子受体结合来调节经刺激的B细胞的生长和分化(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:anintroduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
在针对抗体产生的同源辅助过程中，CD40配体在活化的CD4+ T辅助细胞上瞬时表达，并它与抗原特异性B细胞上的CD40结合，从而转导第二共刺激信号。第二共刺激信号对于B细胞的生长和分化以及对于记忆B细胞的生成(通过防止已遇到抗原的生发中心B细胞的凋亡)是必要的。B和T细胞两者中CD40配体的超表达与人SLE患者的致病性自身抗体产生有关(Desai-Mehta,A.等人,“Hyperexpression of CD40 ligand by B and T cells inhuman lupus and its role in pathogenic autoantibody production[在人狼疮中B和T细胞中CD40配体的超表达及其在致病性自身抗体产生中的作用],”J.Clin.Invest.[临床研究杂志]卷97(9),2063-2073,(1996))。
T淋巴细胞(T细胞)
源自造血组织前体的T淋巴细胞在胸腺中分化，然后接种到外周淋巴组织和淋巴细胞再循环池中。T淋巴细胞或T细胞介导范围广泛的免疫学功能。这些包括辅助B细胞发展为产生抗体的细胞的能力、增强单核细胞/巨噬细胞杀微生物作用的能力、抑制某些类型的免疫应答、直接杀伤靶细胞以及动员炎性应答。这些作用依赖于T细胞表达特定细胞表面分子和分泌细胞因子(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
T细胞与B细胞的抗原识别机制不同。免疫球蛋白(B细胞的受体)与可溶性分子或颗粒表面的独特表位结合。B细胞受体针对在天然分子表面表达的表位。当抗体和B细胞受体进化为结合细胞外液中的微生物并针对细胞外液中的微生物保护时，T细胞识别其他细胞表面的抗原并介导它们的功能，这是通过与这些抗原呈递细胞(APC)相互作用和改变其行为。外周淋巴器官中有三种可以活化T细胞的主要APC类型：树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。其中最有效的是树突状细胞，其唯一功能是将外来抗原呈递给T细胞。未成熟的树突状细胞位于全身的组织中，包括皮肤、肠道和呼吸道。当它们在这些部位遇到入侵的微生物时，会吞噬病原体及其产物，并通过淋巴将其携带到局部淋巴结或肠道相关的淋巴器官。与病原体的遭遇会诱导树突状细胞从抗原捕获细胞成熟为可以活化T细胞的APC。APC在其表面显示三种类型的蛋白质分子，这些分子在活化T细胞成为效应细胞方面具有作用：(1)MHC蛋白，其向T细胞受体呈递外来抗原；(2)共刺激蛋白，其与T细胞表面互补受体结合；和(3)细胞-细胞粘附分子，其可使T细胞与APC结合足够长的时间以被活化(“Chapter 24:Theadaptive immune system[第24章：适应性免疫系统],”Molecular Biology of the Cell[细胞分子生物学],Alberts,B.等人,花环科学公司(Garland Science),纽约州,(2002))。
T细胞根据其表达的细胞表面受体被分为两个不同的类别。大多数T细胞表达由α和β链组成的T细胞受体(TCR)。一小组T细胞表达由γ和δ链组成的受体。α/β T细胞中有两个亚谱系：那些表达共受体分子CD4的细胞(CD4+ T细胞)；和那些表达CD8的细胞(CD8+T细胞)。这些细胞在它们识别抗原的方式以及其效应子功能和调节功能方面有所不同。
CD4+ T细胞是免疫系统的主要调节性细胞。它们的调节功能依赖于它们的细胞表面分子的表达(例如CD40配体，当T细胞被活化时其表达被诱导)，以及它们在活化时分泌的多种细胞因子。
T细胞还介导重要的效应子功能，其中的某些由它们分泌的细胞因子的模式决定。细胞因子对靶细胞可以直接是毒性的并且可以动员有效的炎性机制。
此外，T细胞，特别是CD8+ T细胞，可以发展为能够有效裂解靶细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，所述靶细胞表达由CTL识别的抗原(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immunesystem:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
T细胞受体(TCR)识别由以下组成的组的复合物：与II类或I类MHC蛋白的专化凹槽结合的抗原的蛋白水解衍生的肽。CD4+ T细胞仅识别肽/II类复合物，而CD8+ T细胞识别肽/I类复合物(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
在APC内产生TCR的配体(即肽/MHC蛋白复合物)。通常，II类MHC分子结合由APC通过内吞过程摄取的蛋白质衍生的肽。这些载有肽的II类分子随后在细胞表面表达，在那里它们可被CD4+ T细胞(其具有能够识别表达的细胞表面复合物的TCR)结合。因此，CD4+ T细胞专门与细胞外来源衍生的抗原反应(Paul,W.E.,“Chapter1:The immune system:anintroduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
相比之下，I类MHC分子主要加载衍生自内部合成蛋白(例如病毒蛋白)的肽。这些肽是通过蛋白酶体的蛋白水解作用从细胞溶质蛋白产生，并被转运到粗糙内质网中。通常由长度为九个氨基酸构成的此类肽结合到I类MHC分子中，并被带到细胞表面，在这里它们可以被表达适当受体的CD8+ T细胞识别。这使T细胞系统(尤其是CD8+ T细胞)能够检测表达以下蛋白的细胞，所述蛋白与生物体其余部分的细胞的那些(例如，病毒抗原)或突变抗原(例如活性癌基因产物)不同或比其以大得多的量产生，即使这些蛋白以其完整形式既不在细胞表面表达也不被分泌(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
T细胞也可以根据其作为辅助T细胞的功能进行分类；参与诱导细胞免疫的T细胞；阻抑性T细胞；和细胞毒性T细胞。
辅助T细胞
辅助T细胞是刺激B细胞对蛋白质和其他T细胞依赖性抗原产生抗体应答的T细胞。T细胞依赖性抗原是免疫原，其中独特表位仅出现一次或出现有限次数，因此它们无法交联B细胞的膜免疫球蛋白(Ig)或效率低下。B细胞通过其膜Ig结合抗原，并且复合物经历胞吞作用。在内体区室和溶酶体区室中，抗原通过蛋白水解酶被片段化为肽，并且产生的肽中的一种或多种被加载到II类MHC分子中，所述MHC分子运输通过该囊泡室。然后将所得的肽/II类MHC复合物输出至B细胞表面膜。具有肽/II类分子复合物特异性受体的T细胞可在B细胞表面识别该复合物。(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
B细胞活化依赖于以下两者：T细胞通过其TCR的结合以及T细胞CD40配体(CD40L)与B细胞上CD40的相互作用。T细胞不组成型表达CD40L。而是，与APC相互作用的结果是诱导CD40L表达，所述APC表达被T细胞的TCR识别的同源抗原和CD80或CD86。CD80/CD86通常由活化的而不是由静息的B细胞表达，因此涉及活化的B细胞和T细胞的辅助相互作用可以导致有效的抗体产生。但是，在许多情况下，CD40L在T细胞上的初始诱导依赖于它们对组成型表达CD80/86的APC(例如树突状细胞)的表面抗原的识别。然后，这种活化的辅助T细胞可以有效地与B细胞相互作用并辅助B细胞。即使效率低下，B细胞上膜Ig的交联也可与CD40L/CD40相互作用协同以产生强烈的B细胞活化。B细胞应答中的后续事件(包括增殖，Ig分泌和所表达的Ig类别的类别转换)依赖于T细胞衍生的细胞因子的作用或被其增强(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
CD4+ T细胞倾向于分化为主要分泌细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、和IL-10的细胞(TH2细胞)或分化为主要产生IL-2、IFN-γ和淋巴毒素(TH1细胞)的细胞。TH2细胞在辅助B细胞发展为产生抗体的细胞方面非常有效，而TH1细胞则是细胞免疫应答的有效诱导剂，涉及单核细胞和巨噬细胞的杀微生物活性的增强，并且因此增加了细胞内囊泡隔室中裂解微生物的效率。尽管具有TH2细胞表型(即IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)的CD4+ T细胞是有效的辅助细胞，但TH1细胞也有成为辅助细胞的能力(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:anintroduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
T细胞参与细胞免疫诱导
T细胞还可以起到增强单核细胞和巨噬细胞破坏细胞内微生物的能力的作用。特别是，辅助T细胞产生的干扰素-γ(IFN-γ)增强单核吞噬细胞破坏细胞内细菌和寄生虫的几种机制，包括一氧化氮的产生和肿瘤坏死因子(TNF)产生的诱导。TH1细胞有效增强杀微生物作用，因为它们产生IFN-γ。相比之下，TH2细胞产生的主要细胞因子中的两种，IL-4和IL-10，阻断这些活性(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
调节性T(Treg)细胞
免疫稳态是通过免疫应答的启动和下调之间的受控平衡来维持。凋亡和T细胞无反应性的机制(一种耐受机制，其中T细胞在遇到抗原后固有地功能失活(Schwartz,R.H.,“T cell anergy[T细胞无反应性]”,Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度回顾],卷21:305-334(2003))有助于免疫应答的下调。第三种机制是通过阻抑性或调节性CD4+ T(Treg)细胞主动阻抑活化的T细胞而提供(在Kronenberg,M.等人,“Regulation of immunity by self-reactive T cells[自身反应性T细胞对免疫力的调节]”,Nature[自然],卷435:598-604(2005)中综述)。组成型表达IL-2受体α(IL-2Rα)链的CD4+ Treg(CD4+CD25+)是天然存在的T细胞亚群，其是无反应性的和阻抑性的(Taams,L.S.等人,“Human anergic/suppressiveCD4+CD25+ T cells:a highly differentiated and apoptosis-prone population[人无反应性/阻抑性CD4+CD25+ T细胞：高度分化且易发生凋亡的群体]”,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]卷31:1122-1131(2001))。人CD4+CD25+Treg，类似于它们的鼠对应物，在胸腺中产生，并且特征在于能够通过细胞-细胞接触依赖性机制阻抑应答性T细胞的增殖、不能产生IL-2、以及体外的无反应性表型。根据CD25的表达水平，人CD4+CD25+ T细胞可分为阻抑性(CD25高)和非阻抑性(CD25低)细胞。叉形转录因子家族的成员FOXP3已显示在鼠和人CD4+CD25+Treg中表达，并且似乎是控制CD4+CD25+ Treg发育的主要基因(Battaglia,M.等人,“Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+Foxp3+regulator T cellsof both healthy subjects and type 1diabetic patients[雷帕霉素促进健康受试者和1型糖尿病患者的功能性CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的扩增]”,J.Immunol.[免疫学杂志],卷177:8338-8347,(2006))。因此，在一些实施例中，免疫应答的增加可能与缺乏调节性T细胞的活化或增殖有关。
细胞毒性T淋巴细胞
识别来自靶细胞内产生的蛋白质的肽的CD8+ T细胞具有细胞毒性，因为它们导致靶细胞裂解。CTL诱导的裂解机制涉及CTL产生穿孔素，穿孔素是可以插入靶细胞的膜中并促进该细胞裂解的分子。穿孔素介导的裂解被颗粒酶增强，颗粒酶是活化的CTL产生的一系列酶。许多活性CTL还在其表面表达大量fas配体。CTL表面上的fas配体与靶细胞表面上的fas的相互作用启动靶细胞的凋亡，导致这些细胞死亡。CTL介导的裂解似乎是破坏病毒感染的细胞的主要机制。
淋巴细胞活化
术语“活化”或“淋巴细胞活化”是指特异性抗原、非特异性有丝分裂原或同种异体细胞刺激淋巴细胞，从而导致RNA、蛋白质和DNA的合成以及淋巴因子的产生；随后是各种效应细胞和记忆细胞的增殖和分化。T细胞活化依赖于TCR/CD3复合物与其同源配体的相互作用，所述同源配体是结合在I类或II类MHC分子的凹槽中的肽。通过受体接合而调动的分子事件是复杂的。最早的步骤之一似乎是酪氨酸激酶的活化，从而导致控制几个信号传导通路的一组底物的酪氨酸磷酸化。这些包括一组将TCR连接至ras通路的衔接蛋白，磷脂酶Cγ1，其酪氨酸磷酸化增加其催化活性并参与肌醇磷脂代谢通路，从而导致细胞内游离钙浓度升高和蛋白激酶C活化，以及控制细胞生长和分化的一系列其他酶活化。T细胞的完全应答性，除了受体接合外，还需要辅助细胞递送的共刺激活性，例如，T细胞上的CD28与APC上的和/或CD80和/或CD86接合。
T记忆细胞
在通过适应性免疫应答识别和根除病原体后，绝大多数(90％-95％)T细胞发生凋亡，其余细胞形成记忆T细胞池，称为中央记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM)和常驻记忆T细胞(TRM)(Clark,R.A.,“Resident memory T cells in human health and disease[人健康和疾病中的常驻记忆T细胞]”,Sci.Transl.Med.[科学转化医学],7,269rv1,(2015))。
与标准T细胞相比，这些记忆T细胞寿命长，具有不同的表型，例如特定的表面标志物的表达、不同细胞因子谱的快速产生、直接效应细胞功能的能力以及独特的归巢分布模式。记忆T细胞在重新暴露于其各自的抗原后表现出快速反应，从而消除冒犯者的再感染，并且从而迅速恢复免疫系统的平衡。越来越多的证据证实，自身免疫记忆T细胞阻碍了大多数治疗或治愈自身免疫疾病的尝试(Clark,R.A.,“Resident memory T cells in humanhealth and disease[人健康和疾病中的常驻记忆T细胞]”,Sci.Transl.Med.[科学转化医学],卷7,269rv1,(2015))。
诱导铁依赖性细胞拆解的药剂可通过诱导产生后细胞信号传导因子来增加组织或受试者中的免疫活性，所述后细胞信号传导因子增加本文所述的免疫细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和CD4+、CD8+或CD3+细胞(例如CD4+、CD8+或CD3+ T细胞)的水平或活性。例如，在一个实施例中，按以下量施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以使组织或受试者中的以下一种或多种增加：巨噬细胞的水平或活性、单核细胞的水平或活性、树突状细胞的水平或活性、T细胞的水平或活性以及CD4+、CD8+或CD3+细胞(例如CD4+、CD8+或CD3+ T细胞)的水平或活性。
诱导铁依赖性细胞拆解的药剂还可以通过诱导后细胞信号传导因子的产生来增加细胞、组织或受试者中的免疫活性，所述后细胞信号传导因子增加促免疫细胞因子的水平或活性。例如，在一些实施例中，以足以增加细胞、组织或受试者中促免疫细胞因子的水平或活性的量施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。在一个实施例中，促免疫细胞因子选自IFN-α、IL-1、IL-12、IL-18、IL-2、IL-15、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-17和GMCSF。
诱导铁依赖性细胞拆解的药剂还可以通过诱导后细胞信号传导因子的产生来增加细胞、组织或受试者中的免疫活性，所述后细胞信号传导因子增加免疫应答的正调节子(例如活化的B细胞的核因子κ轻链-增强物(NFkB)、干扰素调节因子(IRF)和干扰素基因刺激物(STING))的水平或活性。例如，在一些实施例中，以足以增加细胞、组织或受试者中NFkB、IRF和/或STING的水平或活性的量施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。
在一些实施例中，本披露涉及增加免疫细胞的免疫活性的方法，所述方法包括：(i)使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触以及(ii)使免疫细胞按以下量暴露于已与所述药剂接触的靶细胞或由已与所述药剂接触的靶细胞产生的后细胞信号传导因子，所述量足以增加免疫细胞中的免疫活性，所述增加是相对于没有使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触的情况下的免疫细胞。
在一些实施例中，本披露涉及增加免疫细胞中NFkB的水平或活性的方法，所述方法包括：(i)使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触以及(ii)使免疫细胞按以下量暴露于已与所述药剂接触的靶细胞或由已与所述药剂接触的靶细胞产生的后细胞信号传导因子，所述量足以增加免疫细胞中NFkB的水平或活性，所述增加是相对于没有使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触的情况下的免疫细胞。
在一些实施例中，本披露涉及增加免疫细胞中干扰素调节因子(IRF)或干扰素基因刺激物(STING)的水平或活性的方法，所述方法包括：(i)使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触以及(ii)使免疫细胞按以下量暴露于已与所述药剂接触的靶细胞或由已与所述药剂接触的靶细胞产生的后细胞信号传导因子，所述量足以增加免疫细胞中IRF或STING的水平或活性，所述增加是相对于没有使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触的情况下的免疫细胞。
在一些实施例中，本披露涉及增加免疫细胞中促免疫细胞因子的水平或活性的方法，所述方法包括：(i)使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触以及(ii)使免疫细胞按以下量暴露于已与所述药剂接触的靶细胞或由已与所述药剂接触的靶细胞产生的后细胞信号传导因子，所述量足以增加免疫细胞中促免疫细胞因子的水平或活性，所述增加是相对于没有使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触的情况下的免疫细胞。
在一些实施例中，所述方法是体外进行。在一些实施例中，所述方法是离体进行。在一些实施例中，所述方法是体内进行。在一些实施例中，步骤(i)在体外进行，并且步骤(ii)在体内进行。
在一些实施例中，免疫细胞是巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、T细胞、CD4+细胞、CD8+细胞或CD3+细胞。在一些实施例中，免疫细胞是THP-1细胞。
在一些实施例中，本披露涉及增加免疫细胞的免疫活性的方法，所述方法包括使免疫细胞与靶细胞或由靶细胞产生的后细胞信号传导因子接触，其中靶细胞先前已按以下量与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触，所述量足以增加免疫细胞中的免疫活性，所述增加是相对于没有使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触的情况下的免疫细胞。
在一些实施例中，本披露涉及增加免疫细胞中NFkB的水平或活性的方法，所述方法包括使免疫细胞与靶细胞或由靶细胞产生的后细胞信号传导因子接触，其中靶细胞先前已按以下量与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触，所述量足以增加免疫细胞中NFkB的水平或活性，所述增加是相对于没有使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触的情况下的免疫细胞。
在一些实施例中，本披露涉及增加免疫细胞中干扰素调节因子(IRF)或干扰素基因刺激物(STING)的水平或活性的方法，所述方法包括使免疫细胞与靶细胞或由靶细胞产生的后细胞信号传导因子接触，其中靶细胞先前已按以下量与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触，所述量足以增加免疫细胞中干扰素调节因子(IRF)或干扰素基因刺激物(STING)的水平或活性，所述增加是相对于没有使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触的情况下的免疫细胞。
在一些实施例中，本披露涉及增加免疫细胞中促免疫细胞因子的水平或活性的方法，所述方法包括使免疫细胞与靶细胞或由靶细胞产生的后细胞信号传导因子接触，其中靶细胞先前已按以下量与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触，所述量足以增加免疫细胞中促免疫细胞因子的水平或活性，所述增加是相对于没有使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触的情况下的免疫细胞。
在一些实施例中，使免疫细胞与靶细胞接触的步骤是体外进行。在一些实施例中，使免疫细胞与靶细胞接触的步骤是离体进行。在一些实施例中，使免疫细胞与靶细胞接触的步骤是体内进行。
在一些实施例中，靶细胞事先与药剂体外接触。在一些实施例中，靶细胞事先与药剂离体接触。在一些实施例中，靶细胞事先与药剂体内接触。
在一些实施例中，本披露涉及一种增加组织或受试者中免疫细胞的免疫活性的方法，所述方法包括使组织或受试者中的靶细胞与以下量的诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触，所述量足以增加免疫细胞的免疫活性，所述增加是相对于其中靶细胞未与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触的组织或受试者中的免疫细胞。
在一些实施例中，本披露涉及一种增加组织或受试者中免疫细胞中NFkB的水平或活性的方法，所述方法包括使组织或受试者中的靶细胞与以下量的诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触，所述量足以增加免疫细胞中NFkB的水平或活性，所述增加是相对于其中靶细胞未与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触的组织或受试者中的免疫细胞。
在一些实施例中，本披露涉及一种增加组织或受试者中免疫细胞中IRF或STING的水平或活性的方法，所述方法包括使组织或受试者中的靶细胞与以下量的诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触，所述量足以增加免疫细胞中IRF或STING的水平或活性，所述增加是相对于其中靶细胞未与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触的组织或受试者中的免疫细胞。
在一些实施例中，本披露涉及一种增加组织或受试者中免疫细胞中促免疫细胞因子的水平或活性的方法，所述方法包括使组织或受试者中的靶细胞与以下量的诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触，所述量足以增加免疫细胞中促免疫细胞因子的水平或活性，所述增加是相对于其中靶细胞未与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触的组织或受试者中的免疫细胞。在一些实施例中，靶细胞和免疫细胞在组织或受试者中非常接近或物理接触。在一些实施例中，靶细胞和免疫细胞存在于受试者的相同组织或器官中。
在一些方面，本披露涉及一种增加细胞、组织或受试者中NFkB的水平或活性的方法，所述方法包括按以下量向所述细胞、组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者增加NFkB的水平或活性。
在一个实施例中，受试者需要增加的NFkB水平或活性。
在一个实施例中，相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者，NFkB的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍、或10倍。
在一些方面，本披露涉及一种增加细胞、组织或受试者中IRF或STING的水平或活性的方法，所述方法包括按以下量向所述细胞、组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者增加IRF或STING的水平或活性。
在一个实施例中，受试者需要增加的IRF或STING的水平或活性。
在一个实施例中，相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者，IRF或STING的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍、或10倍。
在一些方面，本披露涉及一种增加组织或受试者中巨噬细胞、单核细胞、T细胞或树突状细胞的水平或活性的方法，所述方法包括按以下量向所述组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的组织或受试者增加巨噬细胞、单核细胞、T细胞或树突状细胞的水平或活性。
在一个实施例中，受试者需要巨噬细胞、单核细胞或树突状细胞水平或活性的增加。
在一个实施例中，相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的组织或受试者，巨噬细胞、单核细胞、T细胞或树突状细胞的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍、或10倍。
在一些方面，本披露涉及一种增加组织或受试者中CD4+、CD8+或CD3+细胞的水平或活性的方法，所述方法包括按以下量向所述受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的组织或受试者增加CD4+、CD8+或CD3+细胞的水平或活性。
在一个实施例中，受试者需要增加的CD4+、CD8+、或CD3+细胞水平或活性。
在一个实施例中，相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的组织或受试者，CD4+、CD8+、或CD3+细胞的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍、或10倍。
在一些方面，本披露涉及一种增加细胞、组织或受试者中促免疫细胞因子的水平或活性的方法，所述方法包括按以下量向所述细胞、组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者增加促免疫细胞因子的水平或活性。
在一个实施例中，受试者需要增加的促免疫细胞因子水平或活性。
在一个实施例中，相对于未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者，促免疫细胞因子的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍、或10倍。
在一个实施例中，促免疫细胞因子选自IFN-α、IL-1、IL-12、IL-18、IL-2、IL-15、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-17和GMCSF。
在一些实施例中，本发明的方法还包括在施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂之前，针对以下中的一种或多种评估细胞、组织或受试者：NFkB的水平或活性；巨噬细胞的水平或活性；单核细胞的水平或活性；树突状细胞的水平或活性；CD4+细胞、CD8+细胞或CD3+细胞的水平或活性；T细胞的水平或活性；以及促免疫细胞因子的水平或活性。
在一个实施例中，本发明的方法还包括在施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂之后，针对以下中的一种或多种评估细胞、组织或受试者：NFkB、IRF或STING的水平或活性；巨噬细胞的水平或活性；单核细胞的水平或活性；树突状细胞的水平或活性；CD4+细胞、CD8+细胞或CD3+细胞的水平或活性；T细胞的水平或活性；以及促免疫细胞因子的水平或活性。
测量NFkB、IRF或STING的水平或活性；巨噬细胞的水平或活性；单核细胞的水平或活性；树突状细胞的水平或活性；CD4+细胞、CD8+细胞或CD3+细胞的水平或活性；T细胞的水平或活性；以及促免疫细胞因子的水平或活性的方法是本领域已知的。
例如，可以通过本领域已知的合适技术(包括ELISA、蛋白质印迹或原位杂交)来测量NFkB、IRF或STING的蛋白水平或活性。可以使用本领域已知的合适技术来测量编码NFkB、IRF或STING的核酸(例如mRNA)的水平，所述技术包括聚合酶链反应(PCR)扩增反应、逆转录酶PCR分析、定量实时PCR、单链构象多态性分析(SSCP)、错配切割检测、异双链体分析、RNA印迹分析、原位杂交、阵列分析、脱氧核糖核酸测序、限制性片段长度多态性分析及其组合或子组合。
测量巨噬细胞水平和活性的方法描述于例如Chitu等人,2011,Curr ProtocImmunol[免疫学当前方案]14:1-33中。可以通过流式细胞术来测量单核细胞的水平和活性，如例如在Henning等人,2015,Journal of Immunological Methods[免疫学方法杂志]423:78-84中所述。树突状细胞的水平和活性可以通过流式细胞术来测量，如例如在Dixon等人,2001,Infect Immun.[感染与免疫]69(7):4351-4357中所述。这些参考文献中的每一个均通过引用整体并入本文。
可以使用基于人CD4+ T细胞的增殖测定法评估T细胞的水平或活性。例如，用荧光染料5,6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞。那些增殖的细胞显示CFSE荧光强度降低，这可通过流式细胞术直接测量。可替代地，放射性胸腺嘧啶核苷掺入可用于评估T细胞的生长速率。
在一些实施例中，免疫应答的增加可能与调节性T细胞(Treg)的活化减少有关。可以使用体外Treg阻抑测定法评估功能活性Treg。此类测定法在Collinson和Vignali中进行了描述(Methods Mol Biol.[分子生物学方法]2011；707：21-37，通过引用整体并入本文)。
促免疫细胞因子的水平或活性可以例如在CD8+ T细胞中定量。在实施例中，促免疫细胞因子选自干扰素α(IFN-α)、白介素-1(IL-1)、IL-12、IL-18、IL-2、IL-15、IL-4、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-17、和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。可以使用ELISPOT(酶联免疫斑点)技术进行定量，该技术可检测应答抗原性刺激而分泌给定细胞因子(例如IFN-α)的T细胞。在已用例如抗-IFN-α抗体包被的孔中将T细胞与抗原呈递细胞培养。分泌的IFN-α被包被的抗体捕获，并且然后用偶联到生色底物上的第二抗体显示。因此，局部分泌的细胞因子分子形成斑点，每个斑点对应于一个分泌IFN-α的细胞。斑点的数量允许确定分析样品中对给定抗原具有特异性的分泌IFN-α的细胞的频率。还描述了ELISPOT测定法用于检测TNF-α、白介素4(IL-4)、IL-6、IL-12和GMCSF。
IV.治疗障碍的方法
申请人已经表明，用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理细胞导致产生和释放增加免疫活性的后细胞信号传导因子。因此，诱导铁依赖性细胞拆解并增加免疫活性的药剂可用于治疗可得益于增加的免疫活性的障碍，例如癌症和感染。
A.感染性疾病
如本文所提供的，诱导铁依赖性细胞拆解(例如，铁死亡)的药剂可以活化免疫细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞等)，并且因此可以增强免疫细胞功能，例如抑制细菌和/或病毒感染，和/或恢复免疫监视和免疫记忆功能以治疗感染。因此，在一些实施例中，本发明的组合物，例如包含诱导铁依赖性细胞拆解(例如，铁死亡)的药剂，被用于治疗受试者的感染或感染性疾病，例如慢性感染。
如本文所用，术语“感染”是指生物体(即，受试者)的细胞或组织被感染原感染的任何状态(例如，受试者具有细胞内病原体感染，例如慢性细胞内病原体感染)。如本文所用，术语“感染原”是指在被感染的生物的至少一个细胞中的外来生物实体(即病原体)。例如，感染原包括但不限于细菌、病毒、原生动物和真菌。细胞内病原体是特别关注的。感染性疾病是由感染原引起的障碍。在某些条件下，一些感染原不引起可识别的症状或疾病，但是在变化的条件下有可能引起症状或疾病。所述主体方法可以用于治疗慢性病原体感染，包括但不限于病毒感染、例如逆转录病毒、慢病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、痘病毒或人乳头瘤病毒；细胞内细菌感染，例如分支杆菌属(Mycobacterium)、嗜衣原体属(Chlamydophila)、埃立克体属(Ehrlichia)、立克次体属(Rickettsia)、布鲁氏菌属(Brucella)、军团菌属(Legionella)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、李斯特菌属(Listeria)、柯克斯体属(Coxiella)、奈瑟菌属(Neisseria)、沙门氏菌属(Salmonella)、耶尔森菌属物种(Yersiniasp)或幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)；和细胞内原生动物病原体，例如疟原虫属物种(Plasmodium sp)、锥虫属物种(Trypanosoma sp.)、贾第虫属物种(Giardia sp.)、弓形虫属物种(Toxoplasma sp.)或利什曼原虫属物种(Leishmania sp.)。
可以使用本文所述的组合物治疗的感染性疾病包括但不限于：HIV，流感，疱疹，贾第鞭毛虫，疟疾，利什曼原虫，病毒性肝炎(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II和CMV、爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒脑炎病毒导致的病原体感染，细菌衣原体、立克次体细菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、脑膜炎球菌和淋球菌(conococci)、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、沙雷氏菌属，假单胞菌属、大肠杆菌、军团菌属、白喉、沙门氏菌属、杆菌纲、霍乱、破伤风、肉毒杆菌中毒、炭疽、鼠疫、钧端螺旋体病和莱姆氏病细菌导致的病原体感染，真菌假丝酵母属(白色假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母等)、新型隐球菌、曲霉属(烟曲霉、黑曲霉等)、毛霉目(毛霉属、犁头霉属、根霉属)、申克氏孢子丝菌、皮炎芽生霉菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和组织胞浆菌导致的病原体感染，以及寄生虫痢疾变形虫、结肠小袋绦虫、福氏纳格里阿米巴原虫、棘阿米巴属物种、蓝氏贾第虫、隐孢子虫属物种、卡氏肺孢子虫、间日疟原虫、田鼠巴贝虫、布氏锥虫、克氏锥虫、杜氏利什曼虫、弓形虫、和/或巴西日圆线虫导致的病原体感染。
术语“慢性感染”是指持续约一个月或更长时间，例如至少一个月、两个月、三个月、四个月、五个月或六个月的感染。在一些实施例中，慢性感染与一个或多个感染区域中和/或周围的抗炎趋化因子的产生增加有关。慢性感染包括但不限于被HIV、HPV、乙型肝炎、丙型肝炎、EBV、CMV、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)以及细胞内细菌和寄生虫感染。在一些实施例中，慢性感染是细菌感染。在一些实施例中，慢性感染是病毒感染。
B.癌症
如本文所提供的，诱导铁依赖性细胞拆解(例如，铁死亡)的药剂可以活化免疫细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞等)，并且因此可以增强免疫细胞功能，像例如，免疫疗法中涉及的免疫细胞功能。因此，在某些方面，本披露涉及一种治疗被诊断出患有癌症的受试者的方法，所述方法包括将(a)免疫治疗性抗肿瘤剂和(b)诱导铁依赖性细胞拆解的药剂组合施用给所述受试者，从而治疗所述受试者的癌症。
癌细胞利用一系列复杂、重叠的机制阻止免疫系统将自身与非自身区分开的能力代表了癌症逃避免疫监视的基本机制。一种或多种机制包括破坏抗原呈递、破坏控制T细胞活化或抑制的调节通路(免疫检查点调节)、募集有助于免疫阻抑的细胞(Treg、MDSC)或释放影响免疫活性的因子(IDO、PGE2)。(参见Harris等人,2013,J Immunotherapy Cancer[癌症免疫疗法杂志]1:12；Chen等人,2013,Immunity[免疫]39:1；Pardoll,等人,2012,NatureReviews:Cancer[自然评论:癌症]12:252；和Sharma等人,2015,Cell[细胞]161:205，其每一个均通过引用整体并入本文。)
免疫检查点调节剂
在一些实施例中，免疫治疗是免疫检查点分子的免疫检查点调节剂。实例包括LAG-3(Triebel等人,1990,J.Exp.Med.[实验医学杂志]171:1393-1405)、TIM-3(Sakuishi等人,2010,J.Exp.Med.[实验医学杂志]207:2187-2194)和VISTA(Wang等人,2011,J.Exp.Med.[实验医学杂志]208:577-592)。改善免疫应答的共刺激性分子的实例包括ICOS(Fan等人,2014,J.Exp.Med.[实验医学杂志]211:715-725)、OX40(Curti等人,2013,CancerRes.[癌症研究]73:7189-7198)和4-1BB(Melero等人,1997,Nat.Med.[自然·医学]3:682-685)。
免疫检查点可以是刺激性免疫检查点(即刺激免疫应答的分子)或抑制性免疫检查点(即抑制免疫应答的分子)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是抑制性免疫检查点的拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是刺激性免疫检查点的激动剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是免疫检查点结合蛋白(例如，抗体、抗体Fab片段、二价抗体、抗体药物缀合物、scFv、融合蛋白、二价抗体或四价抗体)。在某些实施例中，免疫检查点调节剂能够结合或调节一个以上免疫检查点的活性。下面提供了可以在本发明的方法中使用的刺激性和抑制性免疫检查点的实例以及调节这些免疫检查点的分子。
i.刺激性免疫检查点分子
CD27支持原初T细胞的抗原特异性扩增，并且对于T细胞记忆的产生至关重要(参见,例如,Hendriks等人(2000)Nat.Immunol.[自然免疫学]171(5):433-40)。CD27也是B细胞的记忆标志物(参见，例如，Agematsu等人(2000)Histol.Histopathol.[组织学和病理组织学]15(2):573-6。CD27活性受其配体CD70在淋巴细胞和树突状细胞上的瞬时可利用性的支配(参见，例如，Borst等人(2005)Curr.Opin.Immunol.[免疫学最新观点]17(3):275-81)。已经开发了对CD27具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节CD27的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与CD27结合的药剂(例如，抗CD27抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是CD27激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是CD27拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是CD27结合蛋白(例如，抗体)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是伐立鲁单抗(希尔德克施治疗学公司(Celldex Therapeutics)。另外的CD27结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并且在例如美国专利号9,248,183、9,102,737、9,169,325、9,023,999、8,481,029；美国专利申请公开号：2016/0185870、2015/0337047、2015/0299330、2014/0112942、2013/0336976、2013/0243795、2013/0183316、2012/0213771、2012/0093805、2011/0274685、2010/0173324；和PCT公开号WO 2015/016718、WO2014/140374、WO 2013/138586、WO 2012/004367、WO 2011/130434、WO 2010/001908、和WO 2008/051424中披露，其每一个均通过引用并入本文。
CD28.分化簇28(CD28)是在提供T细胞活化和存活所需要的共刺激信号的T细胞上表达的蛋白之一。除T细胞受体(TCR)外，还通过CD28刺激T细胞提供有效的信号产生各种白介素(特别是IL-6)。与在树突状细胞上表达的它的两个配体CD80和CD86的结合促使T细胞扩增(参见，例如，Prasad等人(1994)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91(7):2834-8)。已经开发了对CD28具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节CD28的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与CD28结合的药剂(例如，抗CD28抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是CD28激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是CD28拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是CD28结合蛋白(例如，抗体)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂选自下组，该组由以下组成：TAB08(TheraMab LLC)、鲁利珠单抗(也称为BMS-931699，百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))和FR104(OSE免疫治疗公司(OSEImmunotherapeutics))。另外的CD28结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利号9,119,840、8,709,414、9,085,629、8,034,585、7,939,638、8,389,016、7,585,960、8,454,959、8,168,759、8,785,604、7,723,482；美国专利申请公开号2016/0017039、2015/0299321、2015/0150968、2015/0071916、2015/0376278、2013/0078257、2013/0230540、2013/0078236、2013/0109846、2013/0266577、2012/0201814、2012/0082683、2012/0219553、2011/0189735、2011/0097339、2010/0266605、2010/0168400、2009/0246204、2008/0038273；和PCT公开号WO 2015198147、WO2016/05421、WO 2014/1209168、WO2011/101791、WO 2010/007376、WO 2010/009391、WO 2004/004768、WO 2002/030459、WO2002/051871、和WO 2002/047721中披露，其每一个通过引用并入本文。
CD40.在多种免疫系统细胞(包括抗原呈递细胞)上发现了分化簇40(CD40，也称为TNFRSF5)。CD40L，也称为CD154，是CD40的配体，并且在活化的CD4+ T细胞表面瞬时表达。已知CD40信号传导‘许可’树突状细胞成熟并由此触发T细胞活化和分化(参见，例如，O'Sullivan等人(2003)Crit.Rev.Immunol.[免疫学重要评论]23(1):83-107。已经开发了对CD40具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节CD40的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与CD40结合的药剂(例如，抗CD40抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是CD40激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是CD40拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是选自下组的CD40结合蛋白，该组由以下组成：达西珠单抗(基因技术/西雅图遗传学公司(Genentech/Seattle Genetics))、CP-870,893(辉瑞公司(Pfizer))、布来鲁单抗(安斯泰来制药公司(Astellas Pharma))，鲁卡妥木单抗(诺华公司(Novartis))、CFZ533(诺华公司；参见，例如，Cordoba等人(2015)Am.J.Transplant.[美国移植杂志]15(11):2825-36)、RG7876(基因技术公司(Genentech Inc.))、FFP104(泛遗传学公司(PanGenetics,B.V.)、APX005(Apexigen公司),BI 655064(勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim))、ChiLob 7/4(英国癌症研究中心(Cancer Research UK)；参见，例如，Johnson等人(2015)Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]21(6):1321-8)、ADC-1013(国际生物发明公司(BioInvent International))、SEA-CD40(西雅图遗传学公司(Seattle Genetics))、XmAb5485(Xencor公司)、PG120(泛遗传学公司)、替奈昔单抗(百时美施贵宝公司；参见，例如，Thompson等人(2011)Am.J.Transplant.[美国移植杂志]11(5):947-57)、和AKH3(Biogen；参考，例如，国际公开号WO 2016/028810)。另外的CD40结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且披露于例如美国专利号9,234,044、9,266,956、9,109,011、9,090,696、9,023,360、9,023,361、9,221,913、8,945,564、8,926,979、8,828,396、8,637,032、8,277,810、8,088,383、7,820,170、7,790,166、7,445,780、7,361,345、8,961,991、8,669,352、8,957,193、8,778,345、8,591,900、8,551,485、8,492,531、8,362,210、8,388,971；美国专利申请公开号2016/0045597、2016/0152713、2016/0075792、2015/0299329、2015/00574372015/0315282、2015/0307616、2014/0099317、2014/0179907、2014/0349395、2014/0234344、2014/0348836、2014/0193405、2014/0120103、2014/0105907、2014/0248266、2014/0093497、2014/0010812、2013/0024956、2013/0023047、2013/0315900、2012/0087927、2012/0263732、2012/0301488、2011/0027276、2011/0104182、2010/0234578、2009/0304687、2009/0181015、2009/0130715、2009/0311254、2008/0199471、2008/0085531、2016/0152721、2015/0110783、2015/0086991、2015/0086559、2014/0341898、2014/0205602、2014/0004131、2013/0011405、2012/0121585、2011/0033456、2011/0002934、2010/0172912、2009/0081242、2009/0130095、2008/0254026、2008/0075727、2009/0304706、2009/0202531、2009/0117111、2009/0041773、2008/0274118、2008/0057070、2007/0098717、2007/0218060、2007/0098718、2007/0110754；和PCT公开号WO 2016/069919、WO2016/023960、WO 2016/023875、WO 2016/028810、WO 2015/134988、WO 2015/091853、WO2015/091655、WO 2014/065403、WO2014/070934、WO 2014/065402、WO 2014/207064、WO2013/034904、WO 2012/125569、WO 2012/149356、WO 2012/111762、WO2012/145673、WO2011/123489、WO 2010/123012、WO 2010/104761、WO 2009/094391、WO 2008/091954、WO2007/129895、WO2006/128103、WO 2005/063289、WO 2005/063981、WO 2003/040170、WO2002/011763、WO 2000/075348、WO 2013/164789、WO2012/075111、WO 2012/065950、WO2009/062054、WO 2007/124299、WO 2007/053661、WO 2007/053767、WO 2005/044294、WO2005/044304、WO 2005/044306、WO 2005/044855、WO 2005/044854、WO 2005/044305、WO2003/045978、WO 2003/029296、WO2002/028481、WO 2002/028480、WO 2002/028904、WO2002/028905、WO 2002/088186、和WO 2001/024823中，其每一个都通过引用并入本文。
CD122.CD122是白介素-2受体β亚基，并且已知会增加CD8+效应T细胞的增殖。参见，例如，Boyman等人(2012)Nat.Rev.Immunol.[自然综述免疫学]12(3):180-190。已经开发了对CD122具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节CD122的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与CD122结合的药剂(例如，抗CD122抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是CD122激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是CD22激动剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是人源化的MiK-β-1(Roche；参见，例如，Morris等人(2006)Proc Nat’l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]103(2):401-6，其通过引用并入)。另外的CD122结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利号9,028,830中披露，其通过引用并入本文。
OX40.OX40受体(也称为CD134)促进效应T细胞和记忆T细胞的扩增。OX40还阻抑T调节细胞的分化和活性，并调节细胞因子的产生(参见，例如，Croft等人(2009)Immunol.Rev.[[免疫学评论]]229(1):173-91)。已经开发了对OX40具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节OX40的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与OX40结合的药剂(例如，抗OX40抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是OX40激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是OX40拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是OX40结合蛋白(例如，抗体)，其选自下组，该组由以下组成：MEDI6469(AgonOx公司/医学免疫公司(AgonOx/Medimmune))、泊加珠单抗(pogalizumab)(也称为MOXR0916和RG7888；基因技术公司(Genentech Inc.))、他佛利珠单抗(tavolixizumab)(也称为MEDI0562；医学免疫公司)、和GSK3174998(葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline))。另外的OX-40结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利号9,163,085、9,040,048、9,006,396、8,748,585、8,614,295、8,551,477、8,283,450、7,550,140；美国专利申请公开号2016/0068604、2016/0031974、2015/0315281、2015/0132288、2014/0308276、2014/0377284、2014/0044703、2014/0294824、2013/0330344、2013/0280275、2013/0243772、2013/0183315、2012/0269825、2012/0244076、2011/0008368、2011/0123552、2010/0254978、2010/0196359、2006/0281072；和PCT公开号WO 2014/148895、WO 2013/068563、WO 2013/038191、WO2013/028231、WO 2010/096418、WO 2007/062245、和WO 2003/106498中披露，其每一个均通过引用并入本文。
GITR.糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族(其在Treg、CD4和CD8 T细胞上组成型或条件型表达)的成员。在TCR连接和活化后，GITR在效应T细胞上迅速上调。人GITR配体(GITRL)在次级淋巴器官和一些非淋巴组织中的APC上组成型表达。GITR的下游影响：GITRL相互作用诱导Treg活性减弱并增强CD4+ T细胞活性，从而导致Treg介导的免疫阻抑作用逆转并增强免疫刺激。已经开发了对GITR具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节GITR的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与GITR结合的药剂(例如，抗GITR抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是GITR激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是GITR拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是GITR结合蛋白(例如，抗体)，其选自下组，该组由以下组成：TRX518(飞跃疗法公司(LeapTherapeutics))、MK-4166(默克公司(Merck&Co.))、MEDI-1873(医学免疫公司(MedImmune))、INCAGN1876(安帝君斯公司/英赛德公司(Agenus/Incyte))、和FPA154(五主疗法公司(Five Prime Therapeutics))。另外的GITR结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利号9,309,321、9,255,152、9,255,151、9,228,016、9,028,823、8,709,424、8,388,967；美国专利申请公开号2016/0145342、2015/0353637、2015/0064204、2014/0348841、2014/0065152、2014/0072566、2014/0072565、2013/0183321、2013/0108641、2012/0189639；和PCT公开号WO 2016/054638、WO2016/057841、WO 2016/057846、WO 2015/187835、WO 2015/184099、WO 2015/031667、WO 2011/028683、和WO 2004/107618中披露，其每一个均通过引用并入本文。
ICOS.诱导型T细胞共刺激物(ICOS，也称为CD278)在活化的T细胞上表达。它的配体是主要在B细胞和树突状细胞上表达的ICOSL。ICOS在T细胞效应子功能中很重要。T细胞活化后，ICOS表达上调(参见，例如,Fan等人(2014)J.Exp.Med.[实验医学杂志]211(4):715-25)。已经开发了对ICOS具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节ICOS的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与ICOS结合的药剂(例如，抗ICOS抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是ICOS激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是ICOS拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是ICOS结合蛋白(例如，抗体)，其选自下组，该组由以下组成：MEDI-570(也称为JMab-136，医学免疫公司)、GSK3359609(葛兰素史克公司/INSERM)和JTX-2011(弹跳疗法公司(Jounce Therapeutics))。另外的ICOS结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并且在例如美国专利号9,376,493、7,998,478、7,465,445、7,465,444；美国专利申请公开号2015/0239978、2012/0039874、2008/0199466、2008/0279851；和PCT公开号WO2001/087981中披露，其每一个均通过引用并入本文。
4-1BB.4-1BB(也称为CD137)是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员。4-1BB(CD137)是II型跨膜糖蛋白，可在引发的CD4+和CD8+ T细胞、活化的NK细胞、DC和嗜中性粒细胞上诱导表达，并与在与活化的巨噬细胞、B细胞和DC上发现的4-1BB配体(4-1BBL)结合时起T细胞共刺激分子的作用。4-1BB受体的连接导致NF-B、c-Jun和p38信号传导通路的活化，并且已被证明可通过上调抗凋亡基因BcL-x(L)和Bfl-1的表达来促进CD8+ T细胞的存活。以这种方式，4-1BB起到增强甚至挽救次优免疫应答的作用。已经开发了对4-1BB具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节4-1BB的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与4-1BB结合的药剂(例如，抗4-1BB抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是4-1BB激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是4-1BB拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是4-1BB结合蛋白，其是乌瑞鲁单抗(也称为BMS-663513；百时美施贵宝公司)或乌托鲁单抗(辉瑞公司)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是4-1BB结合蛋白(例如，抗体)。4-1BB结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利号9,382,328、8,716,452、8,475,790、8,137,667、7,829,088、7,659,384；美国专利申请公开号2016/0083474、2016/0152722、2014/0193422、2014/0178368、2013/0149301、2012/0237498、2012/0141494、2012/0076722、2011/0177104、2011/0189189、2010/0183621、2009/0068192、2009/0041763、2008/0305113、2008/0008716；和PCT公开号WO 2016/029073、WO2015/188047、WO 2015/179236、WO 2015/119923、WO 2012/032433、WO 2012/145183、WO 2011/031063、WO 2010/132389、WO2010/042433、WO 2006/126835、WO 2005/035584、WO 2004/010947；和Martinez-Forero等人(2013)J.Immunol.[免疫学杂志]190(12):6694-706，和Dubrot等人(2010)Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫学与免疫疗法]59(8):1223-33中披露，其每一个均通过引用并入本文。
ii.抑制性免疫检查点分子
ADORA2A.腺苷A2A受体(A2A4)是G蛋白偶联受体(GPCR)家族的成员，所述家族拥有七个跨膜α螺旋并且被认为是癌症疗法中的重要检查点。A2A受体可以负调节过度反应的免疫细胞(参见，例如，Ohta等人(2001)Nature[自然]414(6866):916-20)。已经开发了对ADORA2A具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节ADORA2A的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与ADORA2A结合的药剂(例如，抗ADORA2A抗体)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是ADORA2A结合蛋白(例如，抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是ADORA2A激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是ADORA2A拮抗剂。ADORA2A结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利申请公开号2014/0322236中披露，其通过引用并入本文。
B7-H3.B7-H3(也称为CD276)属于B7超家族，这是一组共刺激或下调T细胞应答的分子。B7-H3有效且持续地下调人T细胞应答(参见例如，Leitner等人(2009)Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]39(7):1754-64)。已经开发了对B7-H3具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节B7-H3的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与B7-H3结合的药剂(例如，抗B7-H3抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是B7-H3激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是B7-H3拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是抗B7-H3结合蛋白，其选自下组，该组由以下组成：DS-5573(第一三共株式会社(Daiichi Sankyo,Inc.))、依诺妥珠单抗(宏基因公司(MacroGenics,Inc.)和8H9(斯隆凯特琳癌症研究所(Sloan Kettering Institute for Cancer Research)；参见，例如，Ahmed等人(2015)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]290(50):30018-29)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是B7-H3结合蛋白(例如，抗体)。B7-H3-结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利号9,371,395、9,150,656、9,062,110、8,802,091、8,501,471、8,414,892；美国专利申请公开号2015/0352224、2015/0297748、2015/0259434、2015/0274838、2014/032875、2014/0161814、2013/0287798、2013/0078234、2013/0149236、2012/02947960、2010/0143245、2002/0102264；PCT公开号WO 2016/106004、WO 2016/033225、WO 2015/181267、WO2014/057687、WO 2012/147713、WO 2011/109400、WO 2008/116219、WO 2003/075846、WO2002/032375；和Shi等人(2016)Mol.Med.Rep.[分子医学报告]14(1):943-8中披露，其每一个通过引用并入本文。
B7-H4.B7-H4(也称为O8E、OV064和含V-set结构域的T细胞活化抑制剂(VTCN1))属于B7超家族。通过阻止细胞周期，T细胞的B7-H4连接对细胞生长、细胞因子分泌和细胞毒性的发展具有深远的抑制作用。向小鼠中施用B7-H4Ig会损害抗原特异性T细胞应答，而特异性单克隆抗体对内源性B7-H4的阻断则会促进T细胞应答(参见，例如，Sica等人(2003)Immunity[免疫]18(6):849-61)。已经开发了对B7-H4具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节B7-H4的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与B7-H4结合的药剂(例如，抗B7-H4抗体)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是B7-H4结合蛋白(例如，抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是B7-H4激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是B7-H4拮抗剂。B7-H4结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并且在例如美国专利号9,296,822、8,609,816、8,759,490、8,323,645；美国专利申请公开号2016/0159910、2016/0017040、2016/0168249、2015/0315275、2014/0134180、2014/0322129、2014/0356364、2014/0328751、2014/0294861、2014/0308259、2013/0058864、2011/0085970、2009/0074660、2009/0208489；和PCT公开号WO2016/040724、WO 2016/070001、WO 2014/159835、WO 2014/100483、WO 2014/100439、WO 2013/067492、WO 2013/025779、WO2009/073533、WO 2007/067991、和WO 2006/104677中披露，其每一个通过引用并入本文。
BTLA.B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，也称为CD272，以HVEM(疱疹病毒侵入介导物)作为其配体。在人CD8+ T细胞从原初到效应细胞表型分化过程中，BTLA的表面表达逐渐下调，但是肿瘤特异性的人CD8+ T细胞表达高水平的BTLA(参见，例如，Derre等人(2010)J.Clin.Invest.[临床研究杂志]120(1):157-67)。已经开发了对BTLA具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节BTLA的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与BTLA结合的药剂(例如，抗BTLA抗体)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是BTLA结合蛋白(例如，抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是BTLA激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是BTLA拮抗剂。BTLA结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并且在例如美国专利号9,346,882、8,580,259、8,563,694、8,247,537；美国专利申请公开号2014/0017255、2012/0288500、2012/0183565、2010/0172900；和PCT公开号WO 2011/014438和WO 2008/076560中披露，其每一个均通过引用并入本文。
CTLA-4.细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)是免疫调节性CD28-B7免疫球蛋白超家族的成员，并且作用于原初和静息的T淋巴细胞，以通过B7依赖性和非B7依赖性途径促进免疫阻抑(参见，例如，Kim等人(2016)J.Immunol.Res.[免疫学研究杂志],文章ID4683607,第14页)。CTLA-4也被称为CD152。CTLA-4调节T细胞活化的阈值。参见，例如，Gajewski等人(2001)J.Immunol.[免疫学杂志]166(6):3900-7。已经开发了对CTLA-4具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节CTLA-4的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与CTLA-4结合的药剂(例如，抗CTLA-4抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是CTLA-4激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是CTLA-4拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是CTLA-4结合蛋白(例如，抗体)，其选自下组，该组由以下组成：艾匹利木单抗(Yervoy；美达瑞公司/百时美施贵宝公司(Medarex/Bristol-Myers Squibb))、曲美利木单抗(以前的ticilimumab；辉瑞公司/阿斯利康公司(Pfizer/AstraZeneca))、JMW-3B3(阿伯丁大学(University ofAberdeen))和AGEN1884(安帝君斯公司(Agenus))。另外的CTLA-4结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并在例如美国专利号8,697,845；美国专利申请公开号2014/0105914、2013/0267688、2012/0107320、2009/0123477；和PCT公开号WO 2014/207064、WO 2012/120125、WO 2016/015675、WO2010/097597、WO 2006/066568、和WO 2001/054732中披露，其每一个均通过引用并入本文。
IDO.吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)是一种具有免疫抑制特性的色氨酸分解代谢酶。另一个重要的分子是TDO，色氨酸2,3-双加氧酶。已知IDO阻抑T和NK细胞，产生并活化Treg和衍生自髓系的阻抑细胞，并促进肿瘤血管生成。Prendergast等人,2014,Cancer ImmunolImmunother.[癌症免疫学与免疫疗法]63(7):721-35，其通过引用并入本文。
已经开发了对IDO具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节IDO的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与IDO(例如，IDO结合蛋白，例如抗IDO抗体)结合的药剂。在一些实施例中，检查点调节剂是IDO激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是IDO拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂选自下组，该组由以下组成：去甲哈尔满、迷迭香酸、COX-2抑制剂、α-甲基色氨酸和依多司他。在一个实施例中，调节剂是依多司他。
KIR.杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)包含MHCI结合分子的多样性库，其负调节自然杀伤(NK)细胞功能，以保护细胞免受NK介导的细胞裂解。KIR通常在NK细胞上表达，但也已在肿瘤特异性CTL上检测到。已经开发了对KIR具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节KIR的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与KIR结合的药剂(例如，抗KIR抗体)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是KIR结合蛋白(例如，抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是KIR激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是KIR拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是利瑞鲁单抗(也称为BMS-986015；百时美施贵宝公司)。另外的KIR结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并且在例如美国专利号8,981,065、9,018,366、9,067,997、8,709,411、8,637,258、8,614,307、8,551,483、8,388,970、8,119,775；美国专利申请公开号2015/0344576、2015/0376275、2016/0046712、2015/0191547、2015/0290316、2015/0283234、2015/0197569、2014/0193430、2013/0143269、2013/0287770、2012/0208237、2011/0293627、2009/0081240、2010/0189723；和PCT公开号WO 2016/069589、WO2015/069785、WO 2014/066532、WO 2014/055648、WO 2012/160448、WO2012/071411、WO2010/065939、WO 2008/084106、WO 2006/072625、WO 2006/072626、和WO 2006/003179中披露，其每一个均通过引用并入本文。
LAG-3，淋巴细胞活化基因3(LAG-3，也称为CD223)是与CD4相关的跨膜蛋白，其竞争性结合MHC II，并作为T细胞活化的共抑制性检查点(参见，例如，Goldberg和Drake(2011)Curr.Top.Microbiol.Immunol.[微生物学和免疫学最新话题]344:269-78)。已经开发了对LAG-3具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节LAG-3的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与LAG-3结合的药剂(例如，抗PD-1抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是LAG-3激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是LAG-3拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是LAG-3-结合蛋白(例如，抗体)，其选自下组，该组由以下组成：派姆单抗(Keytruda；以前是兰博单抗(lambrolizumab)；默克公司(Merck&Co.,Inc.))、纳武单抗(Opdivo；百时美施贵宝公司)、匹地利珠单抗(CT-011，治愈科技公司(CureTech))、SHR-1210(因赛特/江苏恒瑞药业有限公司(Incyte/Jiangsu Hengrui Medicine Co.,Ltd.))、MEDI0680(也称为AMP-514；应用免疫公司/医学免疫公司(Amplimmune Inc./Medimmune))、PDR001(诺华公司)、BGB-A317(百济神州有限公司(BeiGene Ltd.))、TSR-042(也称为ANB011；安珀特生物公司-特沙若公司(AnaptysBio/Tesaro,Inc.))，REGN2810(再生元制药公司/赛诺菲-安万特公司(Regeneron Pharmaceuticals,Inc./Sanofi-Aventis))和PF-06801591(辉瑞公司)。另外的PD-1-结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利号9,181,342、8,927,697、7,488,802、7,029,674；美国专利申请公开号2015/0152180、2011/0171215、2011/0171220；和PCT公开号WO2004/056875、WO 2015/036394、WO2010/029435、WO 2010/029434、WO 2014/194302中披露，其每一个均通过引用并入本文。
PD-1.程序性细胞死亡蛋白1(PD-1，也称为CD279和PDCD1)是抑制性受体，其负调节免疫系统。与主要影响原初T细胞的CTLA-4相反，PD-1在免疫细胞上更广泛地表达，并调节周围组织和肿瘤微环境中成熟T细胞活性。PD-1通过干扰T细胞受体信号传导来抑制T细胞应答。PD-1具有两个配体，PD-L1和PD-L2。已经开发了对PD-1具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节PD-1的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与PD-1结合的药剂(例如，抗PD-1抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是PD-1激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是PD-1拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是PD-1-结合蛋白(例如，抗体)，其选自下组，该组由以下组成：派姆单抗(Keytruda；以前是兰博单抗；默克公司)、纳武单抗(Opdivo；百时美施贵宝公司)、匹地利珠单抗(CT-011，治愈科技公司)、SHR-1210(因赛特/江苏恒瑞药业有限公司)、MEDI0680(也称为AMP-514；应用免疫公司/医学免疫公司)、PDR001(诺华公司)、BGB-A317(百济神州有限公司)、TSR-042(也称为ANB011；安珀特生物公司-特沙若公司)，REGN2810(再生元制药公司/赛诺菲-安万特公司)和PF-06801591(辉瑞公司)。另外的PD-1-结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利号9,181,342、8,927,697、7,488,802、7,029,674；美国专利申请公开号2015/0152180、2011/0171215、2011/0171220；和PCT公开号WO 2004/056875、WO 2015/036394、WO 2010/029435、WO2010/029434、WO 2014/194302中披露，其每一个均通过引用并入本文。
PD-L1/PD-L2.PD配体1(PD-L1，也称为B7-H1)和PD配体2(PD-L2，也称为PDCD1LG2、CD273和B7-DC)与PD-1受体结合。这两个配体都属于与CD28和CTLA-4相互作用的B7-1和B7-2蛋白相同的B7家族。PD-L1可以在许多细胞类型上表达，包括例如上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞。PDL-1的连接减少IFN、TNF、和IL-2的产生，并刺激IL10的产生，IL10是一种与T细胞反应性和增殖降低以及抗原特异性T细胞无反应性相关的抗炎细胞因子。PDL-2主要在抗原呈递细胞(APC)上表达。PDL2连接也导致T细胞阻抑，但在PDL-1-PD-1相互作用通过在G1/G2期的细胞周期阻滞来抑制增殖的情况下，PDL2-PD-1接合已经显示出通过在低抗原浓度下阻断B7:CD28信号并在高抗原浓度下降低细胞因子产生来抑制TCR介导的信号传导。已经开发了对PD-L1和PD-L2具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。
在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节PD-L1的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与PD-L1结合的药剂(例如，抗PD-L1抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是PD-L1激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是PD-L1拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是PD-L1-结合蛋白(例如，抗体或Fc融合蛋白)，其选自下组，该组由以下组成：度伐鲁单抗(也称为MEDI-4736；阿斯利康公司/新基生物制药公司(AstraZeneca/Celgene Corp.))、阿特利珠单抗(Tecentriq；也称为MPDL3280A和RG7446；基因技术公司(Genetech Inc.))、阿维鲁单抗(也称为MSB0010718C；默克雪兰诺公司/阿斯利康公司(Merck Serono/AstraZeneca))；MDX-1105(美达瑞公司/百时美施贵宝公司)、AMP-224(应用免疫公司，葛兰素史克公司)、LY3300054(礼来公司(Eli Lilly and Co.))。另外的PD-L1结合蛋白是本领域已知的，并且在例如美国专利申请公开号2016/0084839、2015/0355184、2016/0175397、和PCT公开号WO 2014/100079、WO 2016/030350、WO2013181634中披露，其每一个均通过引用并入本文。
在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节PD-L2的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与PD-L2结合的药剂(例如，抗PD-L2抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是PD-L2激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是PD-L2拮抗剂。PD-L2结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并且在例如美国专利号9,255,147、8,188,238；美国专利申请公开号2016/0122431、2013/0243752、2010/0278816、2016/0137731、2015/0197571、2013/0291136、2011/0271358；和PCT公开号WO 2014/022758和WO2010/036959中披露；其每一个均通过引用并入本文。
TIM-3.T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3，也称为甲型肝炎病毒细胞受体(HAVCR2))是A型I糖蛋白受体，其与S型凝集素半乳凝素9(Gal-9)结合。TIM-3是在淋巴细胞、肝脏、小肠、胸腺、肾脏、脾脏、肺、肌肉、网状细胞和脑组织上广泛表达的配体。Tim-3最初被鉴定为在分泌IFN-γ的Th1和Tc1细胞上选择性表达(Monney等人(2002)Nature[自然]415:536-41)。TIM-3受体与Gal-9结合触发下游信号传导，从而负调节T细胞存活和功能。已经开发了对TIM-3具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节TIM-3的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与TIM-3结合的药剂(例如，抗TIM-3抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是TIM-3激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是TIM-3拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是抗TIM-3抗体，其选自下组，该组由以下组成：TSR-022(安珀特生物公司-特沙若公司)和MGB453(诺华公司)。另外的TIM-3结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并在例如美国专利号9,103,832、8,552,156、8,647,623、8,841,418；美国专利申请公开号2016/0200815、2015/0284468、2014/0134639、2014/0044728、2012/0189617、2015/0086574、2013/0022623；和PCT公开号WO 2016/068802、WO 2016/068803、WO 2016/071448、WO 2011/155607和WO 2013/006490中披露，其每一个均通过引用并入本文。
VISTA.T细胞活化的V结构域Ig阻抑物(VISTA，也称为血小板受体Gi24)是负调控T细胞应答的Ig超家族配体。参见，例如，Wang等人,2011,J.Exp.Med.[实验医学杂志]208:577-92。在APC上表达的VISTA直接阻抑CD4+和CD8+ T细胞增殖和细胞因子产生(Wang等人(2010)J Exp Med.[实验医学杂志]208(3):577-92)。已经开发了对VISTA具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节VISTA的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与VISTA结合的药剂(例如，抗VISTA抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是VISTA激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是VISTA拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是VISTA结合蛋白(例如，抗体)，其选自下组，该组由以下组成：TSR-022(安珀特生物公司-特沙若公司)和MGB453(诺华公司)。VISTA结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利申请公开号2016/0096891、2016/0096891；和PCT公开号WO 2014/190356、WO 2014/197849、WO2014/190356和WO 2016/094837中披露，其每一个均通过引用并入本文。
可用于本文披露的方法中的另外免疫治疗包括但不限于Toll样受体(TLR)激动剂、基于细胞的疗法、细胞因子和癌症疫苗。
TLR激动剂
TLR是单跨膜的非催化受体，其识别衍生自微生物的结构保守分子。TLR与白介素-1受体共同形成受体超家族，称为“白介素-1受体/Toll样受体超家族”。该家族的成员在结构上的特征是胞外富亮氨酸重复(LRR)结构域、近膜半胱氨酸残基的保守模式和胞质内信号传导结构域，所述胞质内信号传导结构域通过募集含TIR结构域的衔接子(包括MyD88)、含TIR结构域的接合子(TRAP)和含TIR结构域的接合子(诱导IFNβ)(TRIF)形成用于下游信号传导的平台(O'Neill等人,2007,Nat Rev Immunol[自然评论免疫学]7,353)。
TLR包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、和TLR10。TLR2介导细胞对多种微生物产物的应答，所述微生物产物包括肽聚糖、细菌脂肽、脂磷壁酸、分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖和酵母细胞壁成分。TLR4是跨膜蛋白，其属于模式识别受体(PRR)家族。它的活化导致细胞内信号传导通路NF-κB和炎性细胞因子产生，这负责活化先天免疫系统。已知TLR5从入侵的移动细菌识别细菌鞭毛蛋白，并且已显示在许多疾病(包括炎性肠病)的发作中涉及。
TLR激动剂是本领域已知的，并且描述于例如US2014/0030294中，其通过引用整体并入本文。示例性的TLR2激动剂包括分枝杆菌细胞壁糖脂、脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)和甘露糖基化磷脂酰肌醇(PIIM)、MALP-2和Pam3Cys及其合成变体。示例性TLR4激动剂包括脂多糖或其合成的变体(例如，MPL和RC529)和脂质A或其合成的变体(例如，氨基烷基氨基葡萄糖苷4-磷酸酯)。参见，例如，Cluff等人,2005,Infection and Immunity[感染与免疫],p.3044-3052:73；Lembo等人,2008,The Journal of Immunology[免疫学杂志]180,7574-7581；和Evans等人,2003,Expert Rev Vaccines[疫苗专家评论]2:219-29。示例性的TLR5激动剂包括鞭毛蛋白或其合成的变体(例如，通过缺失对于TLR5活化不是必需的鞭毛蛋白部分而制成的具有降低的免疫原性的药理学优化的TLR5激动剂(例如CBLB502))。
其他TLR激动剂包括科利毒素和卡介苗(BCG)。科利毒素是由物种化脓性链球菌和粘质沙雷氏菌的被杀死的细菌组成的混合物。参见Taniguchi等人,2006,Anticancer Res.[抗癌研究]26(6A)：3997-4002。BCG由减毒的活牛结核杆菌，牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)制备。参见Venkataswamy等人,2012,Vaccine.[疫苗]30(6):1038-1049。
基于细胞的疗法
用于治疗癌症的基于细胞的疗法包括对受试者施用免疫细胞(例如T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、天然杀伤细胞和树突状细胞)。在基于自体细胞的疗法中，免疫细胞衍生自对其施用的相同受试者。在基于异体细胞的疗法中，免疫细胞衍生自一个受试者，并施用于不同的受试者。在施用于受试者之前，可以例如通过用细胞因子处理来活化免疫细胞。在一些实施例中，例如在嵌合抗原受体(CAR)T细胞免疫疗法中，免疫细胞在施用于受试者之前经基因修饰。
在一些实施例中，基于细胞的疗法包括过继细胞转移(ACT)。ACT通常由三个部分组成：淋巴细胞耗竭、细胞施用和高剂量的IL-2疗法。可以在ACT中施用的细胞类型包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞受体(TCR)转导的T细胞和嵌合抗原受体(CAR)T细胞。
肿瘤浸润淋巴细胞是在包括乳腺癌在内的许多实体瘤中观察到的免疫细胞。它们是包含细胞毒性T细胞和辅助T细胞以及B细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞和树突状细胞的混合物的细胞群体。自体TIL疗法的一般程序如下：(1)将切除的肿瘤消化成片段；(2)每个片段在IL-2中生长，并且淋巴细胞增殖破坏肿瘤；(3)在存在纯淋巴细胞群体之后，扩增这些淋巴细胞；和(4)扩增至1011个细胞后，将淋巴细胞注入患者体内。参见Rosenberg等人，2015,Science[科学]348(6230):62-68，其通过引用整体并入本文。
TCR转导的T细胞是通过肿瘤特异性TCR的遗传诱导产生。这通常是通过将特定的抗原特异性TCR克隆到逆转录病毒骨架中来完成。从患者抽血，并提取外周血单核细胞(PBMC)。在IL-2存在下，用CD3刺激PBMC，然后用编码抗原特异性TCR的逆转录病毒进行转导。这些转导的PBMC在体外进一步扩增并输注回患者体内。参见Robbins等人,2015,Clinical Cancer Research[临床癌症研究]21(5):1019-1027，其通过引用整体并入本文。
嵌合抗原受体(CAR)是包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(例如CD3ζ、CD28和4-1BB)的重组受体。CAR同时具有抗原结合和T细胞活化功能。因此，表达CAR的T细胞可以识别多种细胞表面抗原，包括糖脂、碳水化合物和蛋白质，并且可以通过活化细胞质共刺激来攻击表达这些抗原的恶性细胞。参见Pang等人,2018,MolCancer[分子癌症]17:91，其通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，基于细胞的疗法是基于自然杀伤(NK)细胞的疗法。NK细胞是大的粒状淋巴细胞，其具有杀伤肿瘤细胞的能力，而无需主要组织相容性复合物(MHC)分子的任何事先敏化或限制。参见Uppendahl等人,2017,Frontiers in Immunology[免疫学前言]8:1825。在人临床试验中已评估了大剂量IL-2疗法情况下的自体淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞的过继转移。与LAK免疫疗法相似，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞在抗CD3 mAb、IFN-γ和IL-2的刺激作用情况下产生自外周血单核细胞培养物。CIK细胞的特征在于混合的T-NK表型(CD3+CD56+)，并且与LAK细胞相比，其显示增强的针对卵巢癌和宫颈癌的细胞毒活性。还进行了人临床试验，研究初次瘤体减灭术和佐剂卡铂/紫杉醇化疗后自体CIK细胞的过继转移。参见Liu等人,2014,J Immunother[免疫疗法杂志]37(2):116-122。
在一些实施例中，基于细胞的疗法是基于树突状细胞的免疫疗法。已经显示用肿瘤裂解物处理的树突状细胞(DC)的疫苗接种在体外和体内增加治疗性抗肿瘤免疫应答。参见Jung等人，2018,Translational Oncology[转化肿瘤学]11(3):686-690。DC捕获并处理抗原、迁移到淋巴器官中、表达淋巴细胞共刺激分子、并分泌引发免疫应答的细胞因子。它们还刺激表达肿瘤相关抗原特异性受体的免疫效应细胞(T细胞)，并减少免疫抑制因子(例如CD4+CD25+Foxp3+调节性T(Treg)细胞)的数量。例如，基于肿瘤细胞裂解物-DC混杂物的肾细胞癌(RCC)DC疫苗接种策略在临床前和临床试验中显示出治疗潜力。参见Lim等人,2007,Cancer Immunol Immunother[癌症免疫学与免疫疗法]56:1817-1829。
细胞因子
包括IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21在内的几种细胞因子已用于治疗癌症，以活化免疫细胞，例如NK细胞和T细胞。IL-2是临床上首先使用的细胞因子之一，希望能够诱导抗肿瘤免疫力。作为高剂量的单一药剂，IL-2在某些肾细胞癌(RCC)和转移的黑素瘤患者中诱导缓解。还研究了低剂量的IL-2，并且目的是选择性地连接IL-2αβγ受体(IL-2Rαβγ)，以降低毒性，同时保持生物学活性。参见Romee等人，2014,Scientifica[科学],卷2014,文章ID 205796,第18页，其通过引用整体并入本文。
白介素15(IL-15)是与白介素2(IL-2)结构相似的细胞因子。如同IL-2，IL-15结合并通过由IL-2/IL-15受体β链(CD122)和共同的γ链(γ-C，CD132)组成的复合物来发出信号。已对重组IL-15用于在癌症患者中过继转移后治疗实体瘤(例如黑素瘤、肾细胞癌)并支持NK细胞进行了评估。参见上面引用的Romee等人。
IL-12是由p35和p40亚基(IL-12α和β链)构成的异二聚体细胞因子，基于其增强NK细胞毒性的能力，最初被鉴定为“NK细胞刺激因子(NKSF)”。遇到病原体后，IL-12被活化的树突状细胞和巨噬细胞释放，并与其主要在活化的T和NK细胞上表达的同源受体结合。许多临床前研究表明，IL-12具有抗肿瘤潜力。参见上面引用的Romee等人。
IL-18是促炎性IL-1家族的成员，并且如同IL-12，由活化的吞噬细胞分泌。IL-18在临床前动物模型中已显示出显著的抗肿瘤活性，并已在人临床试验中进行了评估。参见Robertson等人,2006,Clinical Cancer Research[临床癌症研究]12:4265-4273。
IL-21由于其刺激NK细胞和CD8+ T细胞的能力，已被用于抗肿瘤免疫疗法。对于离体NK细胞扩增，已在K562刺激细胞中表达了膜结合的IL-21，具有有效的结果。参见Denman等人,2012,PLoS One[公共科学图书馆·综合]7(1)e30264。重组人IL-21也显示增加可溶性CD25并诱导穿孔素和颗粒酶B在CD8+细胞上的表达。IL-21已在几项治疗实体瘤的临床试验中进行了评估。参见上面引用的Romee等人。
癌症疫苗
治疗性癌症疫苗通过在适当佐剂的辅助下增强患者自身对癌症的免疫应答，特别是CD8+ T细胞介导的应答，来消除癌细胞。癌症疫苗的治疗功效依赖于肿瘤细胞相对于正常细胞的肿瘤相关抗原(TAA)差异表达。TAA衍生自细胞蛋白，并且应主要或选择性地在癌细胞上表达，以避免免疫耐受或自身免疫作用。参见Circelli等人,2015,Vaccines[疫苗]3(3):544-555。癌症疫苗包括例如基于树突状细胞(DC)的疫苗、肽/蛋白质疫苗、基因疫苗和肿瘤细胞疫苗。参见Ye等人,2018,J Cancer[癌症杂志]9(2):263-268。
包含诱导铁依赖性细胞拆解的药剂和免疫治疗的组合疗法
提供了通过向受试者组合施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂与至少一种免疫检查点调节剂来治疗肿瘤障碍的方法。在某些实施例中，免疫检查点调节剂刺激受试者的免疫应答。例如，在一些实施例中，免疫检查点调节剂刺激或增加刺激性免疫检查点(例如CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、GITR、ICOS、或4-1BB)的表达或活性。在一些实施例中，免疫检查点调节剂抑制或降低抑制性免疫检查点(例如A2A4、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3或VISTA)的表达或活性。
在某些实施例中，免疫检查点调节剂靶向选自下组的免疫检查点分子，该组由以下组成：CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、GITR、ICOS、4-1BB、A2A4、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3和VISTA。在某些实施例中，免疫检查点调节剂靶向选自下组的免疫检查点分子，该组由以下组成：CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、GITR、ICOS、4-1BB、A2A4、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3和VISTA。在特定的实施例中，免疫检查点调节剂靶向选自下组的免疫检查点分子，该组由以下组成：CTLA-4、PD-L1和PD-1。在另一个特定的实施例中，免疫检查点调节剂靶向选自下组的免疫检查点分子，该组由以下组成：PD-L1和PD-1。
在一些实施例中，向受试者施用一种以上(例如2、3、4、5种或更多)免疫检查点调节剂。当施用一种以上的免疫检查点调节剂时，调节剂可各自靶向刺激性免疫检查点分子，或各自靶向抑制性免疫检查点分子。在其他实施例中，免疫检查点调节剂包括至少一种靶向刺激性免疫检查点的调节剂和至少一种靶向抑制性免疫检查点分子的免疫检查点调节剂。在某些实施例中，免疫检查点调节剂是结合蛋白，例如抗体。如本文所用，术语“结合蛋白”是指可以特异性结合靶分子(例如免疫检查点分子)的蛋白或多肽。在一些实施例中，结合蛋白是抗体或其抗原结合部分，并且靶分子是免疫检查点分子。在一些实施例中，结合蛋白是与靶分子(例如免疫检查点分子)特异性结合的蛋白或多肽。在一些实施例中，结合蛋白是配体。在一些实施例中，结合蛋白是融合蛋白。在一些实施例中，结合蛋白是受体。可用于本发明方法的结合蛋白的实例包括但不限于人源化抗体、抗体Fab片段、二价抗体、抗体药物缀合物、scFv、融合蛋白、二价抗体、以及四价抗体。
如本文所用，术语“抗体”是指由四个多肽链—两个重(H)链和两个轻(L)链或其任何功能片段、突变体、变体或衍生物构成的任何免疫球蛋白(Ig)分子。这样的突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。在全长抗体中，每个重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每个轻链由轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间插着更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类别。在一些实施例中，抗体是全长抗体。在一些实施例中，抗体是鼠抗体。在一些实施例中，抗体是人抗体。在一些实施例中，抗体是人源化抗体。在其他实施例中，抗体是嵌合抗体。嵌合抗体和人源化抗体可以通过本领域技术人员熟知的方法制备，包括CDR移植方法(参见，例如，美国专利号5,843,708、6,180,370、5,693,762、5,585,089、和5,530,101)、链改组策略(参见，例如，美国专利号5,565,332；Rader等人(1998)PROC.NAT’L.ACAD.SCI.USA[美国国家科学院院刊]95:8910-8915)、分子建模策略(美国专利号5,639,641)等等。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指抗体的保留特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。这样的抗体实施例也可以是双特异性，二重特异性或多特异性形式；例如，多特异性形式；与两种或更多种不同抗原特异性结合。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含由二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单一臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人(1989)NATURE[自然]341:544-546；和WO 90/05144 A1，其内容通过引用并入本文)，其包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过使它们能够形成为单一蛋白链的合成接头来相连，其中VL区和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)SCIENCE[科学]242:423-426；和Huston等人(1988)PROC.NAT’L.ACAD.SCI.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。这样的单链抗体也旨在涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内。也涵盖其他形式的单链抗体，例如双抗体。抗原结合部分也可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv中(参见，例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。
如本文所用，术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。重链和轻链的每个可变区中有三个CDR，分别称为CDR1、CDR2和CDR3。如本文所用，术语“CDR组”是指能够结合抗原的单可变区中存在的三个CDR的组。这些CDR的确切边界已根据不同的系统进行了不同的定义。由Kabat(Kabat等人，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST[免疫学意义的蛋白质序列](National Institutes of Health(美国国立卫生研究院)，贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州(1987)和(1991))所描述的系统不仅提供了适用于抗体任何可变区的明确的残基编号系统，而且提供了定义三个CDR的精确残基边界。这些CDR可以被称为Kabat CDR。Chothia及其同事发现，Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大的多样性(Chothia等人(1987)J.MOL.BIOL.[分子生物学杂志]196:901-917，和Chothia等人(1989)NATURE[自然]342:877-883)。这些子部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链和重链区域。这些区域可以称为Chothia CDR，其边界与Kabat CDR重叠。定义与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界描述于Padlan等人(1995)FASEB J.[美国实验生物学会联合会杂志]9:133-139，和MacCallum等人(1996)J.MOL.BIOL.[分子生物学杂志]262(5):732-45。还有其他CDR边界定义可能并不严格遵循上述系统之一，但仍会与Kabat CDR重叠，尽管根据以下预测或实验发现，它们可以被缩短或延长：特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合。尽管优选的实施例使用Kabat或Chothia定义的CDR，但是本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何一个定义的CDR。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指非人(例如鼠)抗体，其是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(接受体抗体或抗体片段)，其中来自接受体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有所希望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体/抗体片段可包含既不在接受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含至少一个(典型地两个)可变结构域中的基本上全部，其中CDR区的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的那些，并且FR区的全部或很大部分是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。有关更多详细信息，参见Jones等人(1986)NATURE[自然]321:522-525；Reichmann等人(1988)NATURE[自然]332:323-329；和Presta(1992)CURR.OP.STRUCT.BIOL.[结构生物学当前观点]2:593-596，其每一个均通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“免疫缀合物”或“抗体药物缀合物”是指抗体或其抗原结合片段与另一种药剂例如化学治疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针等的连接。连接可以是共价键，也可以是非共价相互作用，例如通过静电力。为了形成免疫缀合物，可以使用本领域已知的各种接头。另外，可以以融合蛋白的形式提供免疫缀合物，所述融合蛋白可从编码免疫缀合物的多核苷酸表达的。如本文所用，“融合蛋白”是指通过两个或更多个基因或基因片段的连接而产生的蛋白，所述两个或更多个基因或基因片段本来编码单独的蛋白(包括肽和多肽)。融合基因的翻译产生具有衍生自每个本来蛋白的功能特性的单蛋白。
“二价抗体”是指包含两个抗原结合位点的抗体或其抗原结合片段。两个抗原结合位点可以结合相同的抗原，或者它们可以各自结合不同的抗原，在这种情况下，抗体或抗原结合片段被表征为“双特异性”。“四价抗体”是指包含四个抗原结合位点的抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，四价抗体是双特异性的。在某些实施例中，四价抗体是多特异性的，即与两种以上不同抗原结合。
Fab(片段抗原结合)抗体片段是包含抗体的单价抗原结合结构域的免疫反应性多肽，其包括由重链可变区(VH)和重链恒定区1(CH1)部分组成的多肽以及由轻链可变(VL)和轻链恒定(CL)部分组成的多肽，其中CL和CH1部分优选地通过Cys残基之间的二硫键结合在一起。
免疫检查点调节剂抗体包括但不限于至少4个主要类别：i)直接阻断对T细胞或自然杀伤(NK)细胞的抑制性通路的抗体(例如，PD-1靶向抗体(如纳武单抗和派姆单抗)、靶向TIM-3的抗体以及靶向LAG-3、2B4、CD160、A2aR、BTLA、CGEN-15049、和KIR的抗体)，ii)直接活化对T细胞或NK细胞的刺激性通路的抗体(例如，靶向OX40、GITR和4-1BB的抗体)，iii)阻断对免疫细胞的阻抑性通路或依靠抗体依赖性细胞的细胞毒性来耗竭免疫细胞的阻抑性群体的抗体(例如，CTLA-4靶向抗体(例如艾匹利木单抗，靶向VISTA的抗体以及靶向PD-L2、Gr1和Ly6G的抗体)，以及iv)直接阻断对癌细胞的阻抑性通路或依靠抗体依赖性细胞毒性增强对癌细胞的细胞毒性的抗体(例如，利妥昔单抗，靶向PD-L1的抗体和靶向B7-H3、B7-H4、Gal-9和MUC1的抗体)。检查点抑制剂的实例包括例如CTLA-4的抑制剂，例如艾匹利木单抗或曲美利木单抗；PD-1通路的抑制剂，例如抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2抗体。示例性的抗PD-1抗体描述于WO 2006/121168、WO 2008/156712、WO2012/145493、WO 2009/014708和WO2009/114335中。示例性的抗PD-L1抗体描述于WO 2007/005874、WO 2010/077634和WO2011/066389中，并且示例性的抗PD-L2抗体描述于WO 2004/007679中。
在特定的实施例中，免疫检查点调节剂是融合蛋白，例如，调节免疫检查点调节剂的活性的融合蛋白。
在一个实施例中，免疫检查点调节剂是治疗性核酸分子，例如调节免疫检查点蛋白或mRNA的表达的核酸。核酸治疗剂是本领域众所周知的。核酸治疗剂包括与细胞中靶序列互补的单链和双链(即，具有长度至少为15个核苷酸的互补区的核酸治疗剂)核酸。在某些实施例中，核酸治疗剂靶向编码免疫检查点蛋白的核酸序列。
反义核酸治疗剂是单链核酸治疗剂，通常长约16至30个核苷酸，并且与培养物或生物体中靶细胞中的靶核酸序列互补。
在另一方面，药剂是单链反义RNA分子。反义RNA分子与靶mRNA内的序列互补。反义RNA可以通过与mRNA碱基配对并物理性地阻碍翻译机制以化学计量的方式抑制翻译，参见Dias,N.等人,(2002)Mol Cancer Ther[分子癌症疗法]1:347-355。反义RNA分子可具有与靶mRNA互补的约15-30个核苷酸。涉及反义核酸、化学修饰和治疗用途的专利包括，例如：美国专利号5,898,031涉及经化学修饰的含RNA的治疗化合物；美国专利号6,107,094涉及使用这些化合物作为治疗剂的方法；美国专利号7,432,250涉及通过施用单链化学修饰的RNA样化合物来治疗患者的方法；并且美国专利号7,432,249涉及含有单链化学修饰的RNA样化合物的药物组合物。美国专利号7,629,321涉及使用具有多个RNA核苷和至少一个化学修饰的单链寡核苷酸切割靶mRNA的方法。本段中列出的每个专利的全部内容都通过引用并入本文。
用于本发明方法的核酸治疗剂还包括双链核酸治疗剂。在本文中可互换使用的“RNAi药剂”，“双链RNAi药剂”，双链RNA(dsRNA)分子，也称为“dsRNA药剂”，“dsRNA”，“siRNA”，“iRNA药剂”指具有双链结构的核糖核酸分子的复合物，所述双链结构包含两个反平行且基本互补(如下文所定义)的核酸链。如本文所用，RNAi药剂还可以包括dsiRNA(参见，例如，美国专利公开20070104688，其通过引用并入本文)。通常，每个链的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但是如本文所述，每个链或两个链也可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的核苷酸。此外，如本说明书中所使用的，“RNAi药剂”可包括具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi药剂可包括在多个核苷酸处的实质性修饰。这样的修饰可以包括本文披露的或本领域已知的所有类型的修饰。出于本说明书及权利要求书的目的，任何此类修饰，如在siRNA类型分子中所使用的，是由“RNAi药剂”涵盖。在本发明的方法中使用的RNAi药剂包括具有化学修饰的药剂，如例如在WO/2012/037254和WO2009/073809中披露的，其每一个的整体内容通过引用并入本文。
可以以适当剂量施用免疫检查点调节剂以治疗肿瘤障碍，例如通过使用标准剂量。本领域技术人员将能够通过常规实验确定用于治疗肿瘤障碍的目的的免疫检查点调节剂的有效无毒量。免疫检查点调节剂的标准剂量是本领域技术人员已知的，并且可以例如从免疫检查点调节剂的制造商提供的产品说明书中获得。下表3中提供了免疫检查点调节剂的标准剂量的实例。在其他实施例中，免疫检查点调节剂以与用于在针对特定肿瘤障碍的标准护理下治疗肿瘤障碍的免疫检查点调节剂的标准剂量不同(例如更低)的剂量施用。
表3.免疫检查点调节剂的示例性标准剂量
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在某些实施例中，免疫检查点调节剂的施用剂量比针对特定肿瘤障碍的免疫检查点调节剂的标准剂量低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。在某些实施例中，免疫检查点调节剂的施用剂量是针对特定肿瘤障碍的免疫检查点调节剂的标准剂量的95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一个实施例中，在施用免疫检查点调节剂的组合的情况下，免疫检查点调节剂中的至少一种以低于针对特定肿瘤障碍的免疫检查点调节剂的标准剂量的剂量施用。在一个实施例中，在施用免疫检查点调节剂的组合的情况下，免疫检查点调节剂中的至少两种以低于针对特定肿瘤障碍的免疫检查点调节剂的标准剂量的剂量施用。在一个实施例中，在施用免疫检查点调节剂的组合的情况下，免疫检查点调节剂中的至少三种以低于针对特定肿瘤障碍的免疫检查点调节剂的标准剂量的剂量施用。在一个实施例中，在施用免疫检查点调节剂的组合的情况下，免疫检查点调节剂中的所有以低于针对特定肿瘤障碍的免疫检查点调节剂的标准剂量的剂量施用。
共同施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂和免疫检查点调节剂
如本文所用，术语“组合施用”、“共同施用”或“协同施用”是指在施用免疫检查点调节剂之前、同时或基本上同时、其后或间歇地施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。在某些实施例中，在施用免疫检查点调节剂之前施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。在某些实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解的药剂与免疫检查点调节剂同时施用。在某些实施例中，在免疫检查点调节剂的施用之后施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。
诱导铁依赖性细胞拆解的药剂和免疫检查点调节剂可以累加或协同作用。在一个实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解的药剂和免疫检查点调节剂协同作用。在一些实施例中，协同作用是在肿瘤障碍的治疗中。例如，在一个实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解的药剂与免疫检查点调节剂的组合改善了针对免疫检查点调节剂靶向的癌症的免疫应答的耐久性，即延长了持续时间。在一些实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解的药剂和免疫检查点调节剂累加作用。
本发明的组合疗法可以用于治疗肿瘤障碍。在一些实施例中，诱导铁依赖性细胞拆解的药剂与免疫检查点调节剂的组合疗法抑制肿瘤细胞生长。因此，本发明进一步提供了抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂和至少一种免疫检查点调节剂，从而抑制肿瘤细胞生长。在某些实施例中，与对照相比，治疗癌症包括延长存活或延长肿瘤进展时间。在一些实施例中，对照是用免疫检查点调节剂治疗但未用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂治疗的受试者。在一些实施例中，对照是用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂治疗但未用免疫检查点调节剂治疗的受试者。在一些实施例中，对照是未用免疫检查点调节剂或诱导铁依赖性细胞拆解的药剂治疗的受试者。在某些实施例中，所述受试者是人受试者。在优选的实施例中，在施用第一剂量的诱导铁依赖性细胞拆解的药剂或第一剂量的免疫检查点调节剂之前，受试者被鉴定为具有肿瘤。在某些实施例中，受试者在第一次施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂时或在第一次施用免疫检查点调节剂时具有肿瘤。
在某些实施例中，向受试者施用组合疗法的至少1、2、3、4或5个周期。在每个周期结束时针对应答标准评估受试者。还在每个周期的整个过程中监测受试者的不良事件(例如凝血、贫血、肝和肾功能等)，以确保治疗方案被充分耐受。
应当注意，可以与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂组合施用一种以上的免疫检查点调节剂例如2、3、4、5或更多种免疫检查点调节剂。
在一个实施例中，施用本文所述的诱导铁依赖性细胞拆解的药剂和免疫检查点调节剂导致以下中的一种或多种：减小肿瘤大小、重量或体积，增加进展时间，抑制肿瘤生长和/或延长患有肿瘤障碍的受试者的存活时间。在某些实施例中，相对于单独施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂或单独施用免疫检查点调节剂的相应对照受试者，施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂和免疫检查点调节剂可将肿瘤大小、重量或体积减小、将进展时间增加、将肿瘤生长抑制和/或将受试者的存活时间延长至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在某些实施例中，相对于单独施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂或单独施用免疫检查点调节剂的相应的罹患肿瘤障碍的对照受试者群体，施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂和免疫检查点调节剂可将肿瘤大小、重量或体积减小、将进展时间增加、将肿瘤生长抑制和/或将罹患肿瘤障碍的受试者群体的存活时间延长至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在其他实施例中，向在治疗之前患有进展性肿瘤障碍的受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂和免疫检查点调节剂稳定肿瘤障碍。
在某些实施例中，用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂和至少一种免疫检查点调节剂的治疗与另外的抗肿瘤剂(例如用于治疗待治疗的特定癌症的标准护理，例如通过施用标准剂量的一种或多种抗肿瘤剂(例如化疗剂))组合。特定癌症类型的标准护理可以由本领域技术人员根据例如癌症的类型和严重性，受试者的年龄、体重、性别和/或病史，和先前治疗的成功或失败确定。在本发明的某些实施例中，标准护理包括手术、放射、激素疗法、抗体疗法、生长因子疗法、细胞因子和化学疗法中的任何一种或组合。在一个实施例中，所述另外的抗肿瘤剂不是诱导铁依赖性细胞拆解试剂和/或免疫检查点调节剂。
适用于本文披露的方法的其他抗肿瘤剂包括但不限于化学治疗试剂(例如，烷基化剂(例如阿勒密胺，白消安，卡铂，卡莫司汀，氯丁酸，顺铂，环磷酰胺，达卡巴嗪，洛美司汀，美法仑；奥沙利铂，替莫唑胺，噻替帕)；抗代谢物(例如5-氟尿嘧啶(5-FU)，6-巯基嘌呤(6-MP),卡培他滨
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阿糖胞苷
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氟尿苷，氟达拉滨，吉西他滨
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羟基脲，甲氨蝶呤，培美曲塞
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抗肿瘤抗生素，例如蒽环类(例如柔红霉素、多柔比星
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表柔比星、依达比星)、放线菌素-D、博来霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌(还用作拓扑异构酶II抑制剂)；拓扑异构酶抑制剂，例如托泊替康、伊立替康(CPT-11)、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷、米托蒽醌(还用作抗肿瘤抗生素)；有丝分裂抑制剂，例如多西他赛、雌莫司汀、伊沙匹隆、紫杉醇、长春碱、长春新碱、长春瑞滨；皮质类固醇，例强的松、甲基强的松龙
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地塞米松
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酶，例如L-天冬酰胺酶和硼替佐米
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抗肿瘤剂还包括生物抗癌剂，例如抗TNF抗体，例如阿达木单抗或英夫利昔单抗；抗CD20抗体，例如利妥昔单抗，抗VEGF抗体(例如贝伐单抗)；抗HER2抗体，例如曲妥珠单抗；抗RSV，例如帕利珠单抗。使用本发明的方法进行治疗的癌症包括，例如，哺乳动物中发现的所有类型的癌症或赘生物或恶性肿瘤，包括但不限于：肉瘤、黑素瘤、上皮癌、白血病和淋巴瘤。
术语“肉瘤”通常是指由诸如胚胎结缔组织的物质构成的肿瘤，并且通常由嵌入纤维状或均质物质中的紧密堆积的细胞构成。可以用本发明的方法治疗的肉瘤的实例包括，例如，软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏肉瘤、骨肉瘤、阿贝西米肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、威尔姆斯瘤肉瘤(Wilms'tumor sarcoma)、子宫内膜肉瘤、基质肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤、纤维母细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素性出血肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、詹恩逊氏肉瘤(Jensen's sarcoma)、卡波济氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、枯否细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病肉瘤、恶性间质瘤肉瘤、骨旁骨肉瘤、网状细胞肉瘤、鲁斯氏肉瘤(Rous sarcoma)、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤、子宫肉瘤、粘液样脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、梭形细胞肉瘤、促结缔组织增生肉瘤和毛细血管扩张肉瘤(telangiectalticsarcoma)。
术语“黑素瘤”是指源自皮肤和其他器官的黑素细胞系统的肿瘤。可以用本发明的方法治疗的黑素瘤包括，例如，肢端雀斑样痣黑素瘤(acral-lentiginous melanoma)、无黑素性黑素瘤、良性青少年黑素瘤、Cloudman黑素瘤、S91黑素瘤、Harding-Passey黑素瘤、青少年黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤、舌下黑素瘤和浅表扩散性黑素瘤。
术语“上皮癌”是指由上皮细胞构成的恶性新生长，趋于浸润周围组织并引起转移。如本文所述，可以用本发明的方法治疗的上皮癌包括，例如，腺泡癌、腺癌、腺囊癌、腺样囊性癌、腺瘤癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底上皮细胞癌、基底样癌、基底鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、支气管癌、支气管源性癌、脑样癌、胆管细胞癌、绒膜上皮癌、胶样癌、结肠的结肠腺癌、粉刺性癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬脑膜癌、胚胎性癌、髓样癌、上皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性胃癌(carcinoma ex ulcere)、纤维瘤、胶样癌、胶状癌、巨细胞癌(giant cellcarcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、粒层细胞癌、发母质癌、血癌、肝细胞癌、许特耳氏细胞癌(Hurthle cell carcinoma)、透明癌(hyaline carcinoma)，肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩切氏癌(Krompecher's carcinoma)，Kulchitzky细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪瘤癌、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素鳞癌、软癌(carcinoma molle)、默克尔细胞癌(merkelcell carcinoma)、粘液性癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌(carcinomamyxomatode)、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化癌(carcinoma ossifican)、骨样癌、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、脑样癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌、阴囊癌(carcinoma scroti)，印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、茄状癌(solanoid carcinoma)，球状细胞癌、梭形细胞癌、髓样癌(carcinomaspongiosum)、鳞状细胞癌(squamous carcinoma)、鳞状细胞癌(squamous cellcarcinoma)、绳捆癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinomatuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌(verrucous carcinoma)、宫颈鳞状细胞癌、扁桃体鳞状细胞癌和绒毛状癌。在特定实施例中，所述癌症是肾细胞癌。
术语“白血病”是指以未成熟白细胞(称为“母细胞”)异常增加为特征的血液或骨髓的癌症类型。白血病是涵盖广泛疾病的广义术语。反过来，它是影响血液、骨髓和淋巴系统的更广泛疾病组的一部分，这些疾病都被称为血液赘生物。白血病可分为四个主要类别：急性淋巴细胞(淋巴母细胞)白血病(ALL)、急性骨髓性(或髓系或非淋巴细胞)白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性骨髓性白血病(CML)。白血病的其他类型包括毛细胞白血病(HCL)、T细胞淋巴细胞白血病(T-PLL)、大颗粒淋巴细胞白血病和成人T细胞白血病。在某些实施例中，白血病包括急性白血病。在某些实施例中，白血病包括慢性白血病。
术语“淋巴瘤”是指从淋巴细胞发展而来的一组血细胞肿瘤。淋巴瘤的两个主要类别是霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。淋巴瘤包括淋巴组织的任何赘生物。主要类别是淋巴细胞的癌症，淋巴细胞是一种既属于淋巴液又属于血液并遍及在两者中的白细胞。
在一些实施例中，所述组合物用于治疗各种类型的实体瘤，例如乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、膀胱癌、泌尿生殖道癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、肾(肾细胞)癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌(例如甲状腺乳头状癌)、皮肤癌、骨癌、脑癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、口癌和口腔癌、食道癌、腺样囊性癌、神经母细胞瘤、睾丸癌、子宫癌、甲状腺癌、头颈癌、肾癌、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌、子宫颈癌、髓母细胞瘤和外阴癌。在某些实施例中，皮肤癌包括黑素瘤、鳞状细胞癌和皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。
可以用本发明的组合物治疗的另外的癌症包括，例如，多发性骨髓瘤，原发性血小板增多、原发性巨球蛋白血症、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和恶性纤维组织细胞瘤。
在一些实施例中，本文所述的组合疗法可以施用于先前已经用另一种抗肿瘤(例如化疗)方案治疗癌症失败的受试者。“抗肿瘤方案失败的受试者”是患有癌症的受试者，其根据RECIST 1.1标准对抗肿瘤方案的治疗无应答或停止应答，即未达到完全应答，部分应答或靶病变中的疾病稳定；或在抗肿瘤治疗方案(单独或与手术和/或放射疗法(可能的话通常在临床上指示与抗肿瘤疗法联合)联合使用)期间或完成后未实现非靶病变的完全应答或非CR/非PD。RECIST 1.1标准在例如Eisenhauer等人,2009,Eur.J.Cancer[欧洲癌症杂志]45:228-24(通过引用整体并入本文)中进行描述，并在下面进行更详细的讨论。抗肿瘤疗法的失败导致例如，肿瘤生长、增加的肿瘤负荷和/或肿瘤转移。如本文所用的失败的抗肿瘤方案包括由于剂量限制性毒性(例如不能解决以允许继续或恢复引起毒性的抗肿瘤剂或方案的治疗的III级或IV级毒性)而终止的治疗方案。在一个实施例中，受试者用抗肿瘤方案治疗失败，所述抗肿瘤方案包括施用一种或多种抗血管生成剂。
失败的抗肿瘤方案包括如下治疗方案，所述治疗方案针对所有靶病变和非靶病变不导致至少稳定的疾病持续延长的时间段，例如至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少12个月、至少18个月或少于临床定义的治愈的任何时间段。失败的抗肿瘤方案包括如下治疗方案，所述方案在用抗肿瘤剂治疗期间导致至少一个靶病变的进展性疾病，或在结束治疗方案后少于2周、少于1个月、少于2个月、少于3个月、少于4个月、少于5个月、少于6个月、少于12个月或少于18个月、或少于任何少于临床定义的治愈的时间段导致进展性疾病。
失败的抗肿瘤方案不包括如下治疗方案，其中治疗癌症的受试者在治疗方案结束后达到临床定义的治愈(例如，5年完全应答)，并且其中随后在治疗方案结束后，例如，超过5年、超过6年、超过7年、超过8年、超过9年、超过10年、超过11年、超过12年、超过13年、超过14年、或超过15年诊断出所述受试者具有不同癌症。
RECIST标准是临床上接受的评估标准，用于提供实体瘤测量的标准方法，并提供用于临床试验中客观评估肿瘤大小变化的定义。这样的标准也可以用于监测进行实体瘤治疗的个体的应答。RECIST 1.1标准在Eisenhauer等人,2009,Eur.J.Cancer[欧洲癌症杂志]45:228-24中详细讨论，其通过引用并入本文。靶病变的应答标准包括：
完全应答(CR)：所有靶病变消失。任何病理性淋巴结(无论是靶还是非靶)都必须将短轴减小至<10mm。
部分应答(PR)：以基线直径总和为参考，靶病变直径总和至少减少30％。
进展性疾病(PD)：靶病变的直径总和增加至少20％，以研究中的最小总和作为参考(如果研究中基线总和最小，则包括基线总和)。除了相对增加20％，总和还必须显示至少5mm的绝对增加。(注意：一个或多个新病变的出现也被视为进展。)
稳定性疾病(SD)：以研究时最小的直径总和作为参考，既没有足够的收缩率来满足PR，也没有足够的增加来满足PD。
RECIST 1.1标准还考虑了非靶病变，其定义为可测量但无需测量的病变，仅应在期望时间点进行定性评估。非靶病变的应答标准包括：
完全应答(CR)：所有非靶病变消失和肿瘤标志物水平正常化。所有淋巴结的大小均必须是非病理性的(短轴<10mm)。
非CR/非PD：一个或多个非靶病变的持续存在和/或肿瘤标志物水平维持在正常限度以上。
进展性疾病(PD)：现有非靶病变的明确进展。一个或多个新病变的出现也被视为进展。为了在非靶疾病的基础上实现“明确的进展”，非靶疾病的整体水平必须严重恶化，以使即使在靶疾病中存在SD或PR的情况下，总体肿瘤负荷也已增加足以值得中止疗法。一个或多个非靶病变的大小适度地“增加”通常不足以证明明确的进展状态。因此，仅基于面对靶疾病中的SD或PR的非靶疾病的变化来指定总体进展极为罕见。
在一些实施例中，本文所述的组合疗法可以施用于患有难治性癌症的受试者。“难治性癌症”是手术无效的恶性肿瘤，其最初对化学疗法或放射疗法无应答，或者随着时间的推移对化学疗法或放射疗法无应答。
V.药物组合物和施用方式
本文所述的药物组合物可以任何合适的配制品形式施用于受试者。这些包括例如液体、半固体和固体剂型。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。
在某些实施例中，组合物适合于口服施用。在某些实施例中，配制品适合于肠胃外施用，包括局部施用和静脉内、腹膜内、肌内和皮下注射。在特定的实施例中，组合物适合于静脉内施用。
肠胃外施用的药物组合物包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。对于静脉内施用，配制品可以是水溶液。水溶液可以包括汉克氏溶液(Hank’s solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水缓冲液或其他合适的盐或组合，以实现用于肠胃外递送递送配制品的合适的pH和渗透压。水溶液可用于稀释配制品至期望浓度用以施用。水溶液可以包含增加溶液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。在一些实施例中，配制品包括磷酸盐缓冲盐溶液，其包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠和注射用水。
适用于局部施用的配制品包括适合于穿透皮肤的液体或半液体制剂，例如擦剂、洗剂、乳膏、软膏或糊剂，以及适合于眼、耳或鼻施用的滴剂。适用于口服施用的配制品包括含有惰性稀释剂或可吸收的可食用载体的制剂。用于口服施用的配制品可以被封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者可以被压制成片剂，或者可以与饮食中的食物直接合并。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的材料之外，它可以包含液体载体。各种其他材料可以作为包衣存在或以其他方式修饰剂量单位的物理形式。适用于本发明的药物组合物包括其中包含有效量的活性成分以实现其预期目的的组合物。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细披露内容。除了活性成分之外，这些药物组合物还可包含合适的药学上可接受的载体，包括赋形剂和助剂，其有助于将活性化合物加工成可药用的制剂。
对于本领域技术人员而言显而易见的是，待施用的有用的体内剂量和特定的施用方式将根据年龄、体重、患病的严重程度和所治疗的哺乳动物物种、所使用的具体化合物、以及使用这些化合物的具体用途而变化。本领域技术人员可以使用常规方法，例如人临床试验、动物模型和体外研究来确定有效剂量水平，即达到期望结果所需的剂量水平。
在某些实施例中，组合物经口服递送。在某些实施例中，组合物经肠胃外施用。在某些实施例中，组合物通过注射或输注来递送。在某些实施例中，组合物局部地(包括经粘膜)递送。在某些实施例中，组合物通过吸入递送。在一个实施例中，本文提供的组合物可通过直接注射至肿瘤来施用。在一些实施例中，组合物可通过静脉内注射或静脉内输注来施用。在某些实施例中，施用是全身性的。在某些实施例中，施用是局部的。
VI.诱导铁依赖性细胞拆解的免疫刺激剂的鉴定方法
除了本领域已知的和本文所述的诱导铁依赖性细胞拆解的药剂外，本披露还涉及鉴定其他诱导铁依赖性细胞拆解并刺激免疫活性的化合物的方法。
例如，在某些方面，本披露涉及筛选免疫刺激剂的方法，所述方法包括：
(a)提供多种测试剂(例如测试剂文库)；
(b)评估所述多种测试剂中的每一种诱导铁依赖性细胞拆解(例如，铁死亡)的能力；
(c)选择增加铁依赖性细胞拆解(例如，铁死亡)的测试剂作为候选免疫刺激剂；并且
(d)评估所述候选免疫刺激剂增加免疫应答的能力。
在一些实施例中，评估测试剂诱导铁依赖性细胞拆解(例如，铁死亡)的能力包括使细胞或组织与多种测试剂中的每一种接触。
几种方法在本领域中是已知的，并且可以用于鉴定经历铁依赖性细胞拆解(例如，铁死亡)的细胞，并通过检测特定标志物与其他类型的细胞拆解和/或细胞死亡区分开。(参见，例如，Stockwell等人,2017,Cell[细胞]171:273-285，通过引用整体并入本文)。例如，由于铁依赖性细胞的拆解可能是由致命的脂质过氧化引起的，因此测量脂质过氧化提供了一种鉴定经历铁依赖性细胞拆解的细胞的方法。C11-BODIPY和Liperfluo是亲脂性ROS传感器，可提供快速、间接的手段来检测脂质ROS(Dixon等人,2012,Cell[细胞]149:1060-1072)。液相色谱(LC)/串联质谱(MS)分析也可用于直接检测特定的氧化脂质(FriedmannAngeli等人,2014,Nat.Cell Biol.[自然细胞生物学]16:1180-1191；Kagan等人,2017,Nat.Chem.Biol.[自然化学生物学]13:81-90)。异前列腺素和丙二醛(MDA)也可用于测量脂质过氧化(Milne等人,2007,Nat.Protoc.[自然实验手册]2:221-226；Wang等人,2017,Hepatology[肝脏病学]66(2):449-465)。用于测量MDA的试剂盒是可商购的(碧云天公司(Beyotime)，海门市(Haimen)，中国)。
用于研究铁依赖性细胞拆解的其他有用测定方法包括测量铁丰度和GPX4活性。可以使用电感耦合等离子体-MS或钙黄绿素AM淬灭法以及其他特定的铁探针来测量铁丰度(Hirayama和Nagasawa,2017,J.Clin.Biochem.Nutr.[临床生物化学与营养学杂志]60:39-48；Spangler等人,2016,Nat.Chem.Biol.[自然化学生物学]12:680-685)，而GPX4活性可以使用LC-MS使用细胞裂解液中的磷脂酰胆碱过氧化氢还原来检测(Yang等人,2014,Cell[细胞]156:317-331)。另外，可以通过测量谷胱甘肽(GSH)含量来评估铁依赖性细胞拆解。GSH可以例如通过使用可商购的GSH-Glo谷胱甘肽测定法(普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)来测量。
铁依赖性细胞拆解也可以通过测量一种或多种标志物蛋白的表达来评估。合适的标志物蛋白包括但不限于谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)和环氧合酶2(COX-2)。可以使用本领域已知的合适技术来确定标志物蛋白或编码标志物蛋白的核酸的表达水平，这些技术包括但不限于聚合酶链反应(PCR)扩增反应、逆转录酶PCR分析、定量实时PCR、单链构象多态性分析(SSCP)、错配切割检测、异双链体分析、RNA印迹分析、蛋白质印迹分析、原位杂交、阵列分析、脱氧核糖核酸测序、限制性片段长度多态性分析及其组合或子组合。
在一些实施例中，评估测试剂诱导铁依赖性细胞拆解的能力包括测量与测试剂接触的细胞或组织中的铁死亡标志物的水平或活性，例如选自下组的标志物，该组由以下组成：脂质过氧化、活性氧(ROS)、异前列腺素、丙二醛(MDA)、铁、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、前列腺素-内过氧化物合酶2(PTGS2)、环氧合酶2(COX-2)和谷胱甘肽(GSH)。
在一些实施例中，评估测试剂诱导铁依赖性细胞拆解的能力包括将与测试剂接触的细胞或组织中标志物的水平或活性与未与测试剂接触的对照细胞或组织中标志物的水平或活性进行比较。
在一个实施例中，选自由脂质过氧化、异前列腺素、活性氧(ROS)、铁、PTGS2和COX-2组成的组中的标志物的水平或活性增加或选自由GPX4、MDA和GSH组成的组中的标志物的水平或活性降低表明测试剂是诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。
在一个实施例中，评估测试剂诱导铁依赖性细胞拆解的能力包括测量与测试剂接触的细胞或组织中的脂质过氧化物。
在一个实施例中，与测试剂接触的细胞或组织中脂质过氧化物水平的增加表明所述测试剂是诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。
在一个实施例中，评估测试剂诱导铁依赖性细胞拆解的能力进一步包括评估测试剂的一种或多种活性(例如，调节铁死亡的标志物(例如脂质过氧化)和/或免疫刺激活性)是否被已知的铁死亡抑制剂(例如铁基他汀、B-巯基乙醇或铁螯合剂)抑制。
在一个实施例中，评估候选免疫刺激剂增加免疫应答的能力包括评估诱导铁依赖性细胞拆解的测试剂的免疫刺激活性。本文描述的用于评估免疫应答的任何方法都可以用于评估候选免疫刺激剂。
在一个实施例中，评估候选免疫刺激剂包括将免疫细胞与跟选择的候选免疫刺激剂接触的细胞一起培养或使免疫细胞暴露于由与选择的候选免疫刺激剂接触的细胞产生的后细胞信号传导因子，并测量免疫细胞中NFκB、IRF或STING的水平或活性。
在一个实施例中，免疫细胞是THP-1细胞。例如，可以在可商购的THP1-Dual细胞(英杰公司(InvivoGen)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州)中测量NFκB和IRF活性。THP1-Dual细胞是人单核细胞，其在NFKB或IRF通路的活化后诱导报告蛋白。可以将THP-1细胞与跟选择的候选免疫刺激剂接触的细胞培养，或暴露于由与选择的候选免疫刺激剂接触的细胞产生的后细胞信号传导因子，并且然后与200μl QuantiBlue(英杰公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)或50μl QuantiLuc混合用于检测NFKB和IRF活性。NFKB和IRF活性可以通过在分子装置(Molecular Device)读版仪上测量吸光度或发光来定量。
在一个实施例中，评估候选免疫刺激剂包括将T细胞与跟选择的候选免疫刺激剂接触的细胞一起培养或使T细胞暴露于由与选择的候选免疫刺激剂接触的细胞产生的后细胞信号传导因子，并测量T细胞的活化和增殖。
在一个实施例中，免疫细胞是巨噬细胞。例如，可以在可商购的Raw-DualTM和J774-DualTM巨噬细胞(英杰公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)中测量NFκB和IRF活性。Raw-DualTM和J774-DualTM细胞是小鼠巨噬细胞系，其在NFKB或IRF通路的活化后诱导报告蛋白。可以将巨噬细胞与跟选择的候选免疫刺激剂接触的细胞培养，或暴露于由与选择的候选免疫刺激剂接触的细胞产生的后细胞信号传导因子，并且然后与200μl QuantiBlue(英杰公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)或50μl QuantiLuc混合用于检测NFKB和IRF活性。NFKB和IRF活性可以通过在分子装置读版仪上测量吸光度或发光来定量。
在一个实施例中，免疫细胞是树突状细胞。例如，可以通过流式细胞术在树突状细胞中测量共刺激性标志物(例如CD80，CD86)或增强的抗原呈递的标志物(例如MHCII)。可以将树突状细胞与跟选择的候选免疫刺激剂接触的细胞一起培养，或者暴露于由与选择的候选免疫刺激剂接触的细胞产生的化合物，然后用对指示活化状态的细胞表面标志物特异性的抗体染色。随后，通过流式细胞术确定这些标志物的表达水平。
候选免疫刺激剂也可以通过测量巨噬细胞和/或树突状细胞中的促免疫细胞因子水平来评估。例如，在一些实施例中，评估候选免疫刺激剂包括将巨噬细胞和/或树突状细胞与跟选择的候选免疫刺激剂接触的细胞一起培养，或使巨噬细胞和/或树突状细胞与由跟选择的候选免疫刺激剂接触的细胞产生的后细胞信号传导因子接触，并测量促免疫细胞因子(例如IFN-α、IL-1、IL-12、IL-18、IL-2、IL-15、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-17和GMCSF)的水平。促免疫细胞因子水平可以通过本领域已知的方法例如ELISA确定。
VII.铁依赖性细胞拆解产生的后细胞免疫刺激剂的鉴定方法
申请人已经表明，用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理细胞导致产生和释放增加免疫活性的后细胞信号传导因子。因此，诱导铁依赖性细胞拆解并增加免疫活性的药剂可用于治疗可得益于增加的免疫活性的障碍，例如癌症和感染。在可替代方法中，由拆解细胞产生的后细胞信号传导因子可以被分离并针对免疫活性进行筛选。以这种方式，可以鉴定增加免疫活性的后细胞信号传导因子或“效应子”以用于治疗障碍。
例如，在某些方面，本披露涉及鉴定免疫刺激剂的方法，所述方法包括：
(a)使细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂按以下量接触，所述量足以在所述细胞中诱导铁依赖性细胞拆解；
(b)分离与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触后的细胞产生的一种或多种后细胞信号传导因子；并且
(c)测定一种或多种后细胞信号传导因子调节，例如增加或诱导免疫应答的能力。
可以分离细胞产生的一种或多种后细胞信号传导因子，例如，通过将细胞从其生长所在的培养基中分离出来(例如通过离心)并对该条件培养基进行进一步分析。例如，在一些实施例中，将条件培养基用有机溶剂萃取，然后进行HPLC分级分离。在其他实施例中，对条件培养基进行尺寸排阻色谱，并收集不同的级分。例如，可以将条件培养基施加到尺寸排阻柱上并在FPLC上分级分离。
可以通过使后细胞信号传导因子与免疫细胞接触并评估免疫活性来测定后细胞信号传导因子调节免疫应答的能力。本文描述的用于测量免疫应答的任何方法，例如测量NFkB、IRF和/或STING的水平或活性，巨噬细胞的水平或活性，单核细胞的水平或活性，树突状细胞的水平或活性，CD4+、CD8+或CD3+细胞的水平或活性，T细胞的水平或活性以及促免疫细胞因子的水平或活性可用于测量后细胞信号传导因子调节免疫应答的能力。例如，在一些实施例中，将含有后细胞信号传导因子的级分收集应用于THP-1Dual细胞，并评估NFKB和/或IRF1报告子活性。阳性命中级分通过其在THP1 Dual细胞中诱导NFKB或IRF活性的能力来确认。可以通过质谱(大分子)或NMR(小分子)进一步表征阳性命中级分，以鉴定具有免疫活性的特定化合物。可以通过以下来测试各个化合物或种类的免疫活性：向THP1 Dual细胞中添加合成形式或重组形式的此类化合物或种类，然后如上所述测量NFKB或IRF活性。
可通过将后细胞信号传导因子应用于巨噬细胞，单核细胞，树突状细胞，CD4+、CD8+或CD3+细胞和/或T细胞并测量细胞的水平或活性来确定后细胞信号传导因子的免疫活性。例如，在一个实施例中，测定包括用一种或多种后细胞信号传导因子处理免疫细胞，并测量免疫细胞中NFκB活性的水平或活性。在一个实施例中，测定包括用一种或多种后细胞信号传导因子处理T细胞并测量T细胞的活化或增殖。在一个实施例中，测定包括使免疫细胞与一种或多种后细胞信号传导因子接触并测量免疫细胞中NFκB、IRF或STING的水平或活性。在一个实施例中，免疫细胞是THP-1细胞。
后细胞信号传导因子的免疫刺激活性也可以在动物模型(例如动物癌症模型)中进行评估。例如，在一些实施例中，向动物施用后细胞信号传导因子并在施用后细胞信号传导因子后，例如通过测量NFkB、IRF和/或STING的水平或活性，巨噬细胞的水平或活性、单核细胞的水平或活性，树突状细胞的水平或活性，CD4+、CD8+或CD3+细胞的水平或活性，T细胞的水平或活性以及促免疫细胞因子的水平或活性的变化，在动物中测量免疫应答。
在一个实施例中，所述方法还包括选择刺激免疫应答的后细胞信号传导因子。
在一个实施例中，所述方法还包括检测细胞中铁依赖性细胞拆解(例如，铁死亡)的标志物。
可以在铁依赖性细胞拆解(例如，铁死亡)中以相对于未经历细胞拆解的细胞更高的水平产生的后细胞信号传导因子可以通过比较处理和未处理细胞中的后细胞信号传导因子的水平来鉴定。例如，在一个实施例中，所述方法还包括：
i)测量与所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触后的细胞产生的一种或多种后细胞信号传导因子的水平；
ii)将与所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触后的细胞产生的一种或多种后细胞信号传导因子的水平与未用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的对照细胞中一种或多种后细胞信号传导因子的水平进行比较；并且
iii)选择相对于对照细胞在与所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触的细胞中显示出升高水平的后细胞信号传导因子，以产生一种或多种后细胞信号传导因子用于步骤(c)中的测定。
铁依赖性细胞拆解(例如铁死亡)特异性的或在铁依赖性细胞拆解(例如铁死亡)中相对于其他细胞死亡过程以更高水平产生的后细胞信号传导因子还可通过比较经历不同的细胞死亡过程的细胞中的后细胞信号转导因子水平来鉴定。
例如，在上述方法的一个实施例中，对照细胞用诱导非铁依赖性细胞拆解的细胞拆解的药剂处理，例如非铁死亡的细胞死亡过程，例如细胞凋亡、坏死性凋亡或细胞焦亡。
实例
实例1：爱拉斯汀处理的HT1080纤维肉瘤细胞对人单核细胞的活化/刺激
药剂/治疗设计：
将HT1080纤维肉瘤细胞用对照(DMSO)或不同剂量的爱拉斯汀、哌嗪爱拉斯汀(PE)或咪唑酮爱拉斯汀(IKE)处理24小时，然后与THP1-Dual细胞共培养另外24小时。爱拉斯汀购自塞勒克切姆公司(Selleckchem)(休斯顿(Houston)，德克萨斯州)，并溶解于DMSO中。随后，针对活化B细胞的核因子μ轻链增强物(NFKB)或干扰素调节因子(IRF)报告子活性评估THP1上清液。
材料/方法：
HT1080细胞获自ATCC，并且THP1-Dual细胞获自英杰公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)。THP1-Dual细胞是人单核细胞，其在NFKB或IRF通路的活化后诱导报告蛋白。在测定期间，将两种细胞类型在96孔板中培养。在含10％FBS的DMEM中培养HT1080细胞，并在含10％FBS的RPMI中培养THP1-Dual细胞。在爱拉斯汀、PE或IKE给药之前24小时，将7,500个HT1080细胞铺板，其中最终DMSO浓度为0.5％。处理后24小时，将THP1-Dual细胞(25,000个细胞/孔)添加到HT1080细胞中。24小时后，将30μl上清液与200μl QuantiBlue(英杰公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)(针对NFKB报告子活性)或50μl QuantiLuc(针对IRF报告子活性)混合，并在分子装置读版仪上记录吸光度或发光。
结论：
如图1A所示，爱拉斯汀处理对HT1080细胞的活力产生负面影响。图1B显示，用爱拉斯汀(而非媒介物对照DMSO)处理的HT1080细胞在THP1单核细胞中引发了NFKB信号传导。爱拉斯汀类似物PE和IKE还负面影响HT1080细胞的活力(图1C)，并在THP1单核细胞中引发NFKB信号传导(图1D)。
实例2：爱拉斯汀处理的PANC1胰腺癌细胞对人单核细胞的活化/刺激。
药剂/治疗设计：
将PANC1胰腺癌细胞用对照(DMSO)或不同剂量的爱拉斯汀处理24小时，然后与THP1-Dual细胞共培养另外24小时。爱拉斯汀购自塞勒克切姆公司(休斯顿，德克萨斯州)，并溶解于DMSO中。随后，针对NFKB或IRF报告子活性评估THP1上清液。
材料/方法：
PANCl细胞获自ATCC，并且THP1-Dual细胞获自英杰公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)。在测定期间，将两种细胞类型在96孔板中培养。在爱拉斯汀给药之前24小时，将7,500个PANC-1细胞铺板，其中最终DMSO浓度为0.5％。处理后24小时，将THP1-Dual细胞(25,000个细胞/孔)添加到PANC-1细胞中。24小时后，将30μl上清液与200μl QuantiBlue(英杰公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)或50μl QuantiLuc混合，并在分子装置读版仪上记录吸光度或发光。
结论：
如图2A所示，爱拉斯汀处理对PANC1细胞的活力产生负面影响。图1B显示，用爱拉斯汀(而非媒介物对照DMSO)处理的PANC1细胞在THP1单核细胞中引发了NFKB信号传导。
实例3：爱拉斯汀处理的Caki-1肾细胞癌细胞对人单核细胞的活化/刺激
药剂/治疗设计：
将Caki-1肾细胞癌细胞用对照(DMSO)或不同剂量的爱拉斯汀处理24小时，然后与THP1-Dual细胞共培养另外24小时。爱拉斯汀购自塞勒克切姆公司(休斯顿，德克萨斯州)，并溶解于DMSO中。随后，针对NFKB或IRF报告子活性评估THP1上清液。
材料/方法：
Caki-1细胞获自ATCC，并且THP1-Dual细胞获自英杰公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)。在测定期间，将两种细胞类型在96孔板中培养。在爱拉斯汀给药之前24小时，将7,500个Caki-1细胞铺板，其中最终DMSO浓度为0.5％。处理后24小时，将THP1-Dual细胞(25,000个细胞/孔)添加到Caki-1细胞中。24小时后，将30μl上清液与200μl QuantiBlue(英杰公司)或50μl QuantiLuc混合，并在分子装置读版仪上记录吸光度或发光。
结论：
如图3A所示，爱拉斯汀处理对Caki-1细胞的活力产生负面影响。图3B显示，用爱拉斯汀(而非媒介物对照DMSO)处理的Caki-1细胞在THP1单核细胞中引发了NFKB信号传导。
实例4：RSL3处理的Caki-1肾细胞癌细胞对人单核细胞的活化/刺激药剂/治疗设计：
将Caki-1肾细胞癌细胞用对照(DMSO)或不同剂量的RSL3处理24小时，然后与THP1-Dual细胞共培养另外24小时。RSL3购自塞勒克切姆公司，并溶解于DMSO中。随后，针对NFKB或IRF报告子活性评估THP1上清液。
材料/方法：
Caki-1细胞获自ATCC，并且THP1-Dual细胞获自英杰公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)。在测定期间，将两种细胞类型在96孔板中培养。在RSL3给药之前24小时，将7,500个Caki-1细胞铺板，其中最终DMSO浓度为0.5％。处理后24小时，将THP1-Dual细胞(25,000个细胞/孔)添加到Caki-1细胞中。24小时后，将30μl上清液与200μl QuantiBlue(英杰公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)或50μl QuantiLuc混合，并在分子装置读版仪上记录吸光度或发光。结论：
如图4A所示，RSL3处理对Caki-1细胞的活力产生负面影响。图4B显示，用RSL3(而非媒介物对照DMSO)处理的Caki-1细胞在THP1单核细胞中引发了NFKB信号传导。
实例5：RSL3处理的Jurkat T细胞白血病细胞对人单核细胞的活化/刺激
药剂/治疗设计：
将Jurkat T细胞白血病细胞用对照(DMSO)或不同剂量的RSL3处理24小时，然后与THP1-Dual细胞共培养另外24小时。RSL3购自塞勒克切姆公司(休斯顿，德克萨斯州)，并溶解于DMSO中。随后，针对NFKB或IRF报告子活性评估THP1上清液。
材料/方法：
Jurkat细胞获自ATCC，并且THP1-Dual细胞获自英杰公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)。在测定期间，将两种细胞类型在96孔板中培养。在RSL3给药之前24小时，将100,000个Jurkat细胞铺板，其中最终DMSO浓度为0.5％。处理后24小时，将THP1-Dual细胞(25,000个细胞/孔)添加到Jurkat细胞中。24小时后，将30μl上清液与200μl QuantiBlue(英杰公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)或50μl QuantiLuc混合，并在分子装置读版仪上记录吸光度或发光。
结论：
如图5A所示，RSL3处理对Jurkat T细胞白血病细胞的活力产生负面影响。图5B显示，用RSL3(而非媒介物对照DMSO)处理的Jurkat细胞在THP1单核细胞中引发了NFKB信号传导。
实例6：RSL3处理的A20 B细胞白血病细胞对人单核细胞的活化/刺激
药剂/治疗设计：
将A20 B细胞白血病细胞用对照(DMSO)或不同剂量的RSL3处理24小时，然后与THP1-Dual细胞共培养另外24小时。RSL3购自塞勒克切姆公司(休斯顿，德克萨斯州)，并溶解于DMSO中。随后，针对NFKB或IRF报告子活性评估THP1上清液。
材料/方法：
A20细胞获自ATCC，并且THP1-Dual细胞获自英杰公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)。在测定期间，将两种细胞类型在96孔板中培养。在RSL3给药之前24小时，将50,000个A20细胞铺板，其中最终DMSO浓度为0.5％。处理后24小时，将THP1-Dual细胞(25,000个细胞/孔)添加到A20细胞中。24小时后，将30μl上清液与200μl QuantiBlue(英杰公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)或50μl QuantiLuc混合，并在分子装置读版仪上记录吸光度或发光。
结论：
如图6A所示，RSL3处理对A20 B细胞白血病细胞的活力产生负面影响。用RSL3(而非媒介物对照DMSO)处理的A20细胞在THP1单核细胞中引发NFKB(图6B)和IRF(图6C)信号传导。
实例7：用爱拉斯汀处理的HT1080纤维肉瘤细胞引发的促炎信号传导的特异性。
药剂/治疗设计：
在存在或不存在1μM铁基他汀的情况下，用对照(DMSO)或不同剂量的爱拉斯汀(例如0.098、0.195、0.391、0.781、1.563、3.125、6.25、12.5和25μM)处理HT1080纤维肉瘤细胞24小时，然后与THP1-Dual细胞共培养另外24小时。铁基他汀购自塞勒克切姆公司(休斯顿，德克萨斯州)，并溶解于DMSO中。随后，针对NFKB或IRF报告子活性评估THP1上清液。HT1080细胞获自ATCC，并且THP1-Dual细胞获自英杰公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)。在测定期间，将两种细胞类型在96孔板中培养。爱拉斯汀处理的HT1080细胞引发的NFKB信号传导的诱导特异性通过其逆转(所述逆转是通过同时对HT1080细胞的铁基他汀处理)来评估。
实例8：用爱拉斯汀处理的Caki-1细胞引发的促炎信号传导的特异性
药剂/治疗设计：
在存在或不存在1μM铁基他汀(塞勒克切姆公司，休斯顿，德克萨斯州)的情况下，用对照(DMSO)或不同剂量的爱拉斯汀(例如0.098、0.195、0.391、0.781、1.563、3.125、6.25、12.5和25μM)处理Caki-1肾癌细胞24小时，然后与THP1-Dual细胞共培养另外24小时。随后，针对NFKB或IRF报告子活性评估THP1上清液。Caki-1细胞获自ATCC，并且THP1-Dual细胞获自英杰公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)。在测定期间，将两种细胞类型在96孔板中培养。爱拉斯汀处理的Caki-1细胞引发的NFKB信号传导的诱导特异性通过其逆转(所述逆转是通过同时对Caki-1细胞的铁基他汀处理)来评估。
实例9：用RSL3处理的Caki-1肾癌细胞引发的促炎信号传导的特异性
药剂/治疗设计：
在存在或不存在1μM铁基他汀的情况下，用对照(DMSO)或不同剂量的RSL3(例如0.002、0.005、0.014、0.041、0.123、0.370、1.111、3.333和10μM)处理Caki-1肾癌细胞24小时，然后与THP1-Dual细胞共培养另外24小时。随后，针对NFKB或IRF报告子活性评估THP1上清液。Caki-1细胞获自ATCC，并且THP1-Dual细胞获自英杰公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)。在测定期间，将两种细胞类型在96孔板中培养。RSL3处理的Caki-1细胞引发的NFKB信号传导的诱导特异性通过其逆转(所述逆转是通过同时对Caki-1细胞的铁基他汀处理)来评估。
实例10：用RSL3处理的A20细胞引发的促炎信号传导的特异性
药剂/治疗设计：
在存在或不存在1μM铁基他汀的情况下，用对照(DMSO)或不同剂量的RSL3(例如0.002、0.005、0.014、0.041、0.123、0.370、1.111、3.333和10μM)处理A20淋巴瘤细胞24小时，然后与THP1-Dual细胞共培养另外24小时。随后，针对NFKB或IRF报告子活性评估THP1上清液。A20细胞获自ATCC，并且THP1-Dual细胞获自英杰公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)。在测定期间，将两种细胞类型在96孔板中培养。RSL3处理的A20细胞引发的NFKB信号传导的诱导特异性通过其逆转(所述逆转是通过同时对A20细胞的铁基他汀处理)来评估。
实例11：通过RSL3处理A20淋巴瘤肿瘤异种移植物在体内诱导抗肿瘤/促炎应答
药剂/治疗设计：
BALB/C小鼠皮下注射5x106个A20淋巴瘤细胞。当肿瘤的中位大小达到150-200mm3时，通过对小鼠注射媒介物或RSL3进行肿瘤内给药。48小时后，对肿瘤浸润细胞、淋巴细胞和脾细胞进行免疫表型分型，以表征髓样细胞和淋巴样细胞的募集和活化状态。通过对肿瘤切片进行免疫组织化学/免疫荧光染色或通过首先将肿瘤解离为单细胞悬浮液并且然后对细胞进行流式细胞术来进行免疫表型分型(J Vis Exp.[视觉化实验杂志]，2015，(98)：52657；J Natl Cancer Inst.[国家癌症研究所杂志]2015年2月3日；107(3)；CancerDiscov.[癌症发现]2012年7月；2(7)：608-23.)。与媒介物相比，通过单核细胞、巨噬细胞和T细胞向肿瘤微环境中募集的增加来评估RSL3处理诱导的促炎应答。此外，通过确定巨噬细胞(MHCII和CD80)CD11+CD103+树突状细胞(MHCII)以及CD4和CD8 T细胞(Ki67和CD69)中活化标志物的增加，而不会同时活化CD4+ FoxP3+ T调节性细胞来评估抗肿瘤免疫应答。此外，通过测量肿瘤大小经三周时间或直到肿瘤达到最大尺寸2000mm3来评估RSL3对肿瘤生长的抑制。
实例12：通过局部RSL3处理A20淋巴瘤肿瘤异种移植物在体内诱导全身性抗肿瘤/促炎应答
药剂/治疗设计：
BALB/C小鼠在体内两个不同部位皮下注射5x106个A20淋巴瘤细胞。当肿瘤的中位大小达到150-200mm3时，在一个肿瘤部位向小鼠肿瘤内给予媒介物或RSL3。通过测量处理的和未处理(对侧)的肿瘤大小经三周时间或直至肿瘤最大尺寸达到2000mm3来评估RSL3对肿瘤生长的抑制。另外，通过分析对侧肿瘤部位内的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)来评估全身适应性免疫应答的参与。对侧肿瘤中与治疗相关的适应性免疫应答可通过T效应细胞(FoxP3-CD4+ T细胞、CD8+ T细胞)数量的定量增加或通过T细胞(CD69，ki67)、巨噬细胞(MHCII和CD80)或CD11+CD103+树突状细胞(MHCII)的活化状态的增加来评估。
实例13：RSL3在人临床试验中用于治疗肾细胞癌的用途
药剂/治疗设计：
RSL3以引起促炎信号传导的方式诱导肾细胞癌细胞的细胞死亡。使用涉及使用RSL3的本披露的方法，预期本实例将提供RSL3的治疗作用的证据。
进行了一项随机对照试验(RCT)，以评估多次输注单独RSL3或与纳武单抗的组合后与多次输注纳武单抗相比，RSL3在治疗1或2种抗血管生成疗法方案失败的肾癌患者中的安全性和功效。
一百名抗血管生成疗法失败的晚期RCC患者被随机分配接受单独的RSL3(每天10mg)、单独的纳武单抗(每2周3mg/kg)或RSL3与纳武单抗组合。要求患者具有至少为70％的卡诺斯基表现评分(Karnosky Performance Score，KPS)，无脑转移迹象，事先未接受过纳武单抗治疗，并且没有活动性自身免疫病或需要全身免疫阻抑的医学病症。KPS排序从100到0，其中100表示没有疾病迹象，0表示死亡，用于评估患者的化疗存活能力。
肿瘤评估从疗法开始后的第8周开始，此后第一年持续每8周一次，以及每12周一次直到进展或治疗中断。通过评估总存活率评估RSL3功效。
实例14：哌嗪爱拉斯汀和抗CTLA4抗体(9D9)组合处理B16.BL6黑素瘤肿瘤异种移植在体内诱导抗肿瘤免疫应答。
药剂/治疗设计：
C57/BL6小鼠皮下注射1x105个B16.BL6黑素瘤细胞。小鼠肿瘤内给予媒介物、哌嗪爱拉斯汀(40mg/kg，i.p.)、抗CTLA4抗体9D9(10mg/kg，i.p.)或哌嗪爱拉斯汀和9D9的组合。当肿瘤的中位大小达到150-200mm3时，给小鼠给药。48小时后，对肿瘤浸润细胞、淋巴细胞和脾细胞进行免疫表型分型，以表征髓样细胞和淋巴样细胞的募集和活化状态。与媒介物相比，哌嗪爱拉斯汀和9D9组合处理对最大促炎应答的诱导通过以下来评估：与单独的任一处理相比，CD3+ T细胞向肿瘤微环境中的募集增加。此外，通过测量肿瘤大小超过三周时间或直到肿瘤达到最大尺寸2000mm3来评估组合疗法相比于单独的任一处理对肿瘤生长的最大抑制。
实例15：筛选诱导促炎性铁死亡的化合物的方法
药剂/治疗设计：
将384孔格式中的Caki-1肾癌细胞在存在或不存在铁死亡抑制剂(铁基他汀、B-巯基乙醇或铁螯合剂)情况下暴露于来自化学筛选文库中的测试化合物24-48小时。随后，将THP1 dual细胞与经处理的Caki-1细胞共培养。调节THP1-Dual细胞后24小时，针对NFKB或IRF报告子活性评估上清液。选择在不存在铁死亡抑制剂的情况下诱导NFKB或IRF报告子活性，但在存在铁死亡抑制剂的情况下不诱导NFKB或IRF报告子活性的化合物作为促炎化合物。
实例16：测试源自用铁死亡诱导剂处理的细胞的物质的炎性性质的方法
药剂/治疗设计：
将Caki-1肾癌细胞暴露于爱拉斯汀或RSL3(或其他铁死亡诱导剂)，并在24-48小时后收集条件培养基。随后，将条件培养基用有机溶剂萃取，然后进行HPLC分级分离。具体地，将条件培养基使用乙酸乙酯萃取、浓缩，并通过极性分级。可替代地，对条件培养基进行尺寸排阻色谱，并收集级分。具体地，将条件培养基施加到尺寸排阻柱上并在FPLC上分级分离。将收集的级分应用于THP1-Dual细胞24小时，随后评估报告子活性。阳性命中级分通过其在THP1 Dual细胞中诱导NFKB或IRF活性的能力来确认。通过质谱(大分子)或NMR(小分子)进一步表征阳性命中级分，以鉴定具有炎性活性的特定化合物。通过以下来测试各个化合物或种类的炎性性质：向THP1Dual细胞中添加合成形式或重组形式的此类化合物或种类，然后如上所述测量NFKB或IRF活性。
实例17：用爱拉斯汀处理的HT1080纤维肉瘤细胞引发的促炎信号传导的特异性。
药剂/治疗设计：
用不同剂量的单独爱拉斯汀(例如0.8、0.16、0.31、0.63、1.25、2.5、5、10或20μM)或与铁死亡抑制剂(1μM铁基他汀-1、1μM利普司他汀-1、100μM Trolox、25μM β-巯基乙醇或100μM去铁胺)组合处理HT1080纤维肉瘤细胞24小时，然后与THP1-Dual细胞共培养另外24小时。铁基他汀-1和利普司他汀-1购自塞勒克切姆公司(休斯顿，德克萨斯州)，并溶解于DMSO中。Trolox购自开曼化学公司(Cayman Chemical Company Inc)，并重悬浮于DMSO中。甲磺酸去铁胺购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，并且重悬浮于水中。β-巯基乙醇购自美国生命技术公司(Life Technologies)。随后，针对NFKB活性评估THP1上清液。HT1080细胞获自ATCC，并且THP1-Dual细胞获自英杰公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)。在测定期间，将两种细胞类型在96孔板中培养。
结果：
如图7A和8A所示，HT1080纤维肉瘤细胞的爱拉斯汀处理以剂量依赖的方式降低了细胞的活力，并且这种降低的活力被铁死亡抑制剂中的每一种减弱。如图7B和8B所示，HT1080纤维肉瘤细胞的爱拉斯汀处理以剂量依赖的方式增加了THP1细胞中的NFKB活性，并且这种增加的NFKB活性被铁死亡抑制剂中的每一种消除。这些结果证明细胞死亡在爱拉斯汀处理的HT1080细胞引发的NFKB信号传导的诱导中起作用。
实例18：敲低ACSL4和CARS基因抑制HT1080纤维肉瘤细胞中爱拉斯汀介导的细胞死亡
药剂/治疗设计：
使用以下以96孔格式对HT1080细胞(5,000个细胞/孔)进行反转染：DharmaFECT I转染试剂(目录号T-2001)和对照siRNA(Dharmacon目录号D-001810-10-05)或靶向ACSL4的siRNA[37.5nM](图9A，Dharmacon目录号L-009364-00-005)或针对ACSL4(赛默飞世尔科学公司选择目录号：s5001，s5001，s5002)或针对CARS(赛默飞世尔科学公司选择目录号：S2404，s2405，s2406)的siRNA池(图9B/C)。转染后48小时，将细胞培养基换成新鲜培养基，所述新鲜培养基中含有各种浓度的爱拉斯汀(图9A)或固定浓度的爱拉斯汀(10μM，图9B/C)。另外，将50,000个报告THP1-dual细胞添加到一些板中(图9C)。24小时后，测量HT1080细胞活力(图9A/B)或针对NFKB活性评估THP1上清液(图9C)。HT1080细胞获自ATCC，并且THP1-Dual细胞获自英杰公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)。
结果：
ACSL4基因编码长链脂肪酸-CoA连接酶4，其是酰基-CoA合成酶，控制细胞中花生四烯酸的水平，并参与细胞死亡的调节。CARS基因编码半胱氨酰-tRNA合成酶。CARS的敲低已被证明可以通过阻止脂质反应性氧的诱导来抑制爱拉斯汀诱导的铁死亡。参见Hayano等人，2016，Cell Death Differ.[细胞死亡与分化]23(2)：270-278。如图9A和9B所示，HT1080细胞中ACLS4或CARS的基因敲底部分挽救在爱拉斯汀存在下培养的HT1080细胞的活力。此外，HT1080细胞中ACLS4或CARS的基因敲低消除了与爱拉斯汀处理的HT1080细胞共培养的单核细胞中的NFKB活性(图9C)。这些结果证明细胞死亡在爱拉斯汀处理的HT1080细胞引发的NFKB信号传导的诱导中起作用并且缺少特定的细胞内蛋白降低了铁死亡的促炎性质。
实例19：用GPX4抑制剂(RSL3、ML162或ML210)处理的A20细胞引发的促炎信号传导的特异性
药剂/治疗设计：
在存在或不存在1μM铁基他汀-1的情况下，用不同剂量(例如0.002、0.005、0.014、0.041、0.123、0.370、1.111、3.333和10μM)的GPX4抑制剂(RSL3、ML162或ML210)处理A20淋巴瘤细胞24小时。ML162购自开曼化学公司，并重悬浮于DMSO中。ML210购自西格玛奥德里奇公司，并重悬浮于DMSO中。还用DMSO处理A20淋巴瘤细胞作为阴性对照。用DMSO或GPX4抑制剂处理24小时后，将A20淋巴瘤细胞与THP1-Dual细胞共培养另外24小时。随后，针对NFKB报告子活性评估THP1上清液。A20细胞获自ATCC，并且THP1-Dual细胞获自英杰公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)。在测定期间，将两种细胞类型在96孔板中培养。
结果：
如图10A、11A和12A所示，用GPX4抑制剂(RSL3、ML162或ML210)中的每一种处理A20淋巴瘤细胞以剂量依赖性方式降低所述细胞的活力，并且这种降低的活力被铁死亡抑制剂铁基他汀-1减弱。如图10B、11B和12B所示，GPX4抑制剂处理A20淋巴瘤细胞以剂量依赖性方式增加了THP1细胞中的NFKB活性，并且这种增加的NFKB活性被铁死亡抑制剂铁基他汀-1减弱。这些结果表明，细胞死亡在GPX-4抑制剂处理的A20淋巴瘤细胞引发的NFKB信号传导的诱导中起作用。
实例20：用GPX4抑制剂(RSL3或ML162)处理的Caki-1肾癌细胞引发的促炎信号传导的特异性
药剂/治疗设计：
在存在或不存在1μM铁基他汀的情况下，用对照(DMSO)或不同剂量(例如0.002、0.005、0.014、0.041、0.123、0.370、1.111、3.333和10μM)的GPX4抑制剂(RSL3或ML162)处理Caki-1肾癌细胞24小时，然后与THP1-Dual细胞共培养另外24小时。随后，针对NFKB报告子活性评估THP1上清液。Caki-1细胞获自ATCC，并且THP1-Dual细胞获自英杰公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)。在测定期间，将两种细胞类型在96孔板中培养。
结果：
如图13A和14A所示，用GPX4抑制剂(RSL3或ML162)处理Caki-1肾癌细胞以剂量依赖的方式降低了所述细胞的活力，并且这种降低的活力被铁死亡抑制剂铁基他汀-1减弱。如图13B和14B所示，用RSL3或ML162处理Caki-1肾癌细胞以剂量依赖的方式增加了THP1细胞中的NFKB活性，并且这种增加的NFKB活性被铁死亡抑制剂铁基他汀-1减弱。这些结果表明，细胞死亡在GPX-4抑制剂处理的Caki-1肾癌细胞引发的NFKB信号传导的诱导中起作用。
等同物
本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规试验确定本文所描述的具体实施例和方法的许多等效内容。此类等效内容意在由以下权利要求的范围涵盖。
通过引用并入
本申请中引用的每个参考文献、专利和专利申请均通过引用整体并入本文，如同每个参考文献被说明单独并入。

Claims (104)

1.一种增加免疫细胞中的免疫活性的方法，所述方法包括：
(i)使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触以及(ii)使所述免疫细胞按以下量暴露于已与所述药剂接触的靶细胞或由已与所述药剂接触的靶细胞产生的后细胞信号传导因子，所述量足以增加所述免疫细胞中的免疫活性，所述增加是相对于没有使所述靶细胞与所述药剂接触的情况下的免疫细胞，其中所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂选自下组，该组由以下组成：反向转运体系统Xc-的抑制剂、GPX4的抑制剂和他汀。
2.一种增加免疫细胞中NFkB的水平或活性的方法，所述方法包括：(i)使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触以及(ii)使所述免疫细胞按以下量暴露于已与所述药剂接触的靶细胞或由已与所述药剂接触的靶细胞产生的后细胞信号传导因子，所述量足以增加所述免疫细胞中NFkB的水平或活性，所述增加是相对于没有使所述靶细胞与所述药剂接触的情况下的免疫细胞，其中所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂选自下组，该组由以下组成：反向转运体系统Xc-的抑制剂、GPX4的抑制剂和他汀。
3.一种增加免疫细胞中干扰素调节因子(IRF)或干扰素基因刺激物(STING)的水平或活性的方法，所述方法包括：(i)使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触以及(ii)使所述免疫细胞按以下量暴露于已与所述药剂接触的靶细胞或由已与所述药剂接触的靶细胞产生的后细胞信号传导因子，所述量足以增加所述免疫细胞中IRF或STING的水平或活性，所述增加是相对于没有使所述靶细胞与所述药剂接触的情况下的免疫细胞，其中所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂选自下组，该组由以下组成：反向转运体系统Xc-的抑制剂、GPX4的抑制剂和他汀。
4.一种增加免疫细胞中促免疫细胞因子的水平或活性的方法，所述方法包括：(i)使靶细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触以及(ii)使所述免疫细胞按以下量暴露于已与所述药剂接触的靶细胞或由已与所述药剂接触的靶细胞产生的后细胞信号传导因子，所述量足以增加所述免疫细胞中促免疫细胞因子的水平或活性，所述增加是相对于没有使所述靶细胞与所述药剂接触的情况下的免疫细胞，其中所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂选自下组，该组由以下组成：反向转运体系统Xc-的抑制剂、GPX4的抑制剂和他汀。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述铁依赖性细胞拆解是铁死亡。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述反向转运体系统Xc-的抑制剂是爱拉斯汀或其衍生物或类似物。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述爱拉斯汀或其衍生物或类似物具有下式：
Figure FDA0002941045310000021
或其药学上可接受的盐或酯，其中
R1选自下组，该组由以下组成：H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羟基和卤素；
R2选自下组，该组由以下组成：H、卤代和C1-4烷基；
R3选自下组，该组由以下组成：H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、5-7元杂环烷基和5-6元杂芳基；
R4选自下组，该组由以下组成：H和C1-4烷基；
R5是卤代；
Figure FDA0002941045310000031
任选地被＝O取代；并且
n是0至4的整数。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述爱拉斯汀的类似物是PE或IKE。
9.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述GPX4的抑制剂选自下组，该组由以下组成：(1S,3R)-RSL3或其衍生物或类似物、ML162、DPI化合物7、DPI化合物10、DPI化合物12、DPI化合物13、DPI化合物17、DPI化合物18、DPI化合物19、FIN56和FINO2。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述RSL3衍生物或类似物是由结构式(I)表示的化合物：
Figure FDA0002941045310000032
或其对映异构体、旋光异构体、非对映异构体、N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐，其中
R1、R2、R3和R6独立地选自H、C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8芳烷基、3至8元碳环、3至8元杂环、3至8元芳基或3至8元杂芳基、酰基、烷基磺酰基和芳基磺酰基，其中每个烷基、烷氧基、芳烷基、碳环、杂环、芳基、杂芳基、酰基、烷基磺酰基和芳基磺酰基任选地被至少一个取代基取代；
R4和R5独立地选自H1 C1-8烷基、C1-8烷氧基、3至8元碳环、3至8元杂环、3至8元芳基或3至8元杂芳基、羧酸根、酯、酰胺、碳水化合物、氨基酸、酰基、烷氧基取代的酰基、糖醇、NR7R8、OC(R7)2COOH、SC(R7)2COOH、NHCHR7COOH、COR8、CO2R8、硫酸根、磺酰胺、亚砜、磺酸根、砜、硫代烷基、硫酯和硫醚，其中每个烷基、烷氧基、碳环、杂环、芳基、杂芳基、羧酸根、酯、酰胺、碳水化合物、氨基酸、酰基、烷氧基取代的酰基、糖醇、NR7R8、OC(R7)2COOH、SC(R7)2COOH、NHCHR7COOH、COR8、CO2R8、硫酸根、磺酰胺、亚砜、磺酸根、砜、硫代烷基、硫酯和硫醚任选地被至少一个取代基取代；
R7选自H、C1-8烷基、碳环、芳基、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基和烷基杂环，其中每个烷基、碳环、芳基、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基和烷基杂环可以任选地被至少一个取代基取代；
R8选自H、C1-8烷基、C1-8烯基、C1-8炔基、芳基、碳环、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基、烷基杂环和杂芳香族，其中每个烷基、烯基、炔基、芳基、碳环、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基、烷基杂环和杂芳香族可以任选地被至少一个取代基取代；并且
X是在其附接的环上的0至4个取代基。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述RSL3衍生物或类似物是由结构式(II)表示的化合物：
Figure FDA0002941045310000041
或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐；其中：
R1选自下组，该组由以下组成：H、OH和-(OCH2CH2)xOH；
X是1至6的整数；并且
R2、R2'、R3、和R3’独立地选自下组，该组由以下组成：H、C3-8环烷基及其组合，或R2和R2’可以结合在一起形成吡啶基或吡喃基，并且R3和R3'可以结合在一起形成吡啶基或吡喃基。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述RSL3衍生物或类似物是由结构式(III)表示的化合物：
Figure FDA0002941045310000051
或其立体异构体，或其药学上可接受的盐；其中：
n是2、3或4；并且R是经取代或未经取代的C1-C6烷基基团，经取代或未经取代的C3-C10环烷基基团，经取代或未经取代的C2-C8杂环烷基基团，经取代或未经取代的C6-C10芳香族环基团或经取代或未经取代的C3-C8杂芳基环基团；其中所述取代是指每个基团中的一个或多个氢原子被以下基团取代，所述基团选自下组，该组由以下组成：卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷氧基、COOH(羧基)、COOC1-C6烷基、OCOC1-C6烷基。
13.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述他汀选自下组，该组由以下组成：阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、西立伐他汀和辛伐他汀。
14.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、T细胞、CD4+细胞、CD8+细胞或CD3+细胞。
15.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是THP-1细胞。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述方法在体外或离体进行。
17.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述方法在体内进行。
18.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中步骤(i)在体外进行，并且步骤(ii)在体内进行。
19.一种增加细胞、组织或受试者中的免疫活性的方法，所述方法包括按以下量向所述细胞、组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者增加免疫活性。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述受试者需要增加的免疫活性。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中按以下量施用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以使所述细胞、组织或受试者中的以下一种或多种增加：NFkB的水平或活性，干扰素调节因子(IRF)或干扰素基因刺激物(STING)的水平或活性，巨噬细胞的水平或活性，单核细胞的水平或活性，树突状细胞的水平或活性，T细胞的水平或活性，CD4+、CD8+或CD3+细胞的水平或活性，以及促免疫细胞因子的水平或活性。
22.一种增加细胞、组织或受试者中NFkB的水平或活性的方法，所述方法包括按以下量向所述细胞、组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者增加NFkB的水平或活性。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述受试者需要增加的NFkB水平或活性。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中相对于未用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者，NFkB的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍、或10倍。
25.一种增加细胞、组织或受试者中干扰素调节因子(IRF)或干扰素基因刺激物(STING)的水平或活性的方法，所述方法包括按以下量向所述细胞、组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者增加IRF或STING的水平或活性。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述受试者需要增加的IRF或STING水平或活性。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中相对于未用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者，IRF或STING的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍、或10倍。
28.一种增加组织或受试者中巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞或T细胞的水平或活性的方法，所述方法包括按以下量向所述组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的组织或受试者增加巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞或T细胞的水平或活性。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述受试者需要增加的巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞或T细胞水平或活性。
30.如权利要求28所述的方法，其中相对于未用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的组织或受试者，巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞或T细胞的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍、或10倍。
31.一种增加组织或受试者中CD4+、CD8+或CD3+细胞的水平或活性的方法，所述方法包括按以下量向所述组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的组织或受试者增加CD4+、CD8+或CD3+细胞的水平或活性。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述受试者需要增加的CD4+、CD8+或CD3+细胞水平或活性。
33.如权利要求31或32所述的方法，其中相对于未用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的组织或受试者，CD4+、CD8+或CD3+细胞的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍、或10倍。
34.一种增加细胞、组织或受试者中促免疫细胞因子的水平或活性的方法，所述方法包括按以下量向所述细胞、组织或受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂，所述量足以相对于未用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者增加促免疫细胞因子的水平或活性。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述受试者需要增加的促免疫细胞因子水平或活性。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中相对于未用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的细胞、组织或受试者，促免疫细胞因子的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍、或10倍。
37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述施用之前，对所述细胞、组织或受试者中的以下中的一种或多种进行评估：NFkB的水平或活性；巨噬细胞的水平或活性；单核细胞的水平或活性；树突状细胞的水平或活性；CD4+细胞、CD8+细胞或CD3+细胞的水平或活性；T细胞的水平或活性；以及促免疫细胞因子的水平或活性。
38.如权利要求1至36中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述施用之后，对所述细胞、组织或受试者中的以下中的一种或多种进行评估：NFkB的水平或活性；巨噬细胞的水平或活性；单核细胞的水平或活性；树突状细胞的水平或活性；CD4+细胞、CD8+细胞或CD3+细胞的水平或活性；T细胞的水平或活性；以及促免疫细胞因子的水平或活性。
39.如权利要求4和34至38中任一项所述的方法，其中所述促免疫细胞因子选自IFN-α、IL-1、IL-12、IL-18、IL-2、IL-15、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-17和GMCSF。
40.一种治疗需要增加的免疫活性的受试者的方法，所述方法包括以足以增加所述受试者的免疫活性的量向所述受试者施用诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。
41.如权利要求19至40中任一项所述的方法，其中所述受试者具有感染。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述感染是慢性感染。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述慢性感染选自HIV感染、HCV感染、HBV感染、HPV感染、乙型肝炎感染、丙型肝炎感染、EBV感染、CMV感染、TB感染和寄生虫感染。
44.如权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述细胞或组织是癌细胞或癌组织。
45.如权利要求19至40中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、非鳞状细胞肺癌、尿路上皮癌、霍奇金淋巴瘤、头颈鳞状细胞癌、肝细胞癌、结直肠癌、胃腺癌、胃食管连接部腺癌和默克尔细胞癌。
47.如权利要求1至46中任一项所述的方法，其中所述铁依赖性细胞拆解是铁死亡。
48.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括将(a)免疫治疗和(b)诱导铁依赖性细胞拆解的药剂组合施用给所述受试者，从而治疗所述受试者的所述癌症。
49.如权利要求48所述的方法，其中以有效增加所述受试者的免疫应答的量向所述受试者施用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述免疫治疗选自下组，该组由以下组成：Toll样受体(TLR)激动剂、基于细胞的疗法、细胞因子、癌症疫苗和免疫检查点分子的免疫检查点调节剂。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述TLR激动剂选自科利毒素和卡介苗(BCG)。
52.如权利要求50所述的方法，其中所述免疫检查点分子选自CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、GITR、ICOS、4-1BB、ADORA2A、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG-3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、和VISTA。
53.如权利要求50所述的方法，其中所述免疫检查点分子是刺激性免疫检查点分子，并且所述免疫检查点调节剂是所述刺激性免疫检查点分子的激动剂。
54.如权利要求50所述的方法，其中所述免疫检查点分子是抑制性免疫检查点分子，并且所述免疫检查点调节剂是所述抑制性免疫检查点分子的拮抗剂。
55.如权利要求50至54中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂选自小分子、抑制性RNA、反义分子和免疫检查点分子结合蛋白。
56.如权利要求50所述的方法，其中所述免疫检查点分子是PD-1，并且所述免疫检查点调节剂是PD-1抑制剂。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述PD-1抑制剂选自派姆单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、SHR-1210、MEDI0680R01、BBg-A317、TSR-042、REGN2810和PF-06801591。
58.如权利要求50所述的方法，其中所述免疫检查点分子是PD-L1，并且所述免疫检查点调节剂是PD-L1抑制剂。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述PD-L1抑制剂选自度伐鲁单抗、阿特利珠单抗、阿维鲁单抗、MDX-1105、AMP-224和LY3300054。
60.如权利要求50所述的方法，其中所述免疫检查点分子是CTLA-4，并且所述免疫检查点调节剂是CTLA-4抑制剂。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述CTLA-4抑制剂选自艾匹利木单抗、曲美利木单抗、JMW-3B3和AGEN1884。
62.如权利要求48至61中任一项所述的方法，其中在所述免疫治疗的施用之前或与所述免疫治疗的施用同时施用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。
63.如权利要求48至61中任一项所述的方法，其中在所述免疫治疗的施用之后施用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。
64.如权利要求48至63中任一项所述的方法，其中相对于单独使用所述免疫治疗的治疗，所述癌症对治疗的应答得到改善。
65.如权利要求64所述的方法，其中相对于单独使用所述免疫治疗的治疗，所述应答改善至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％。
66.如权利要求64或65所述的方法，其中所述应答包括以下中的任一项或多项：肿瘤负荷的减少、肿瘤大小的减小、肿瘤生长的抑制、在治疗前患有进展性癌症的受试者中达到稳定的癌症、癌症进展时间的增加、和存活时间的增加。
67.如权利要求48至66中任一项所述的方法，其中所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂和所述免疫治疗协同作用。
68.如权利要求48至67中任一项所述的方法，其中所述癌症是对免疫检查点疗法有应答的癌症。
69.如权利要求48至68中任一项所述的方法，其中所述癌症选自上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤和白血病。
70.如权利要求48至68中任一项所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、非鳞状细胞肺癌、尿路上皮癌、霍奇金淋巴瘤、头颈鳞状细胞癌、肝细胞癌、结直肠癌、胃腺癌、胃食管连接部腺癌和默克尔细胞癌。
71.如权利要求48至68中任一项所述的方法，其中所述癌症是肾细胞癌。
72.如权利要求19至71中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
73.如权利要求1至72中任一项所述的方法，其中所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂选自下组，该组由以下组成：反向转运体系统Xc-的抑制剂、GPX4的抑制剂和他汀。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述反向转运体系统Xc-的抑制剂是爱拉斯汀或其衍生物或类似物。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述爱拉斯汀或其衍生物或类似物具有下式：
Figure FDA0002941045310000141
或其药学上可接受的盐或酯，其中
R1选自下组，该组由以下组成：H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羟基和卤素；
R2选自下组，该组由以下组成：H、卤代和C1-4烷基；
R3选自下组，该组由以下组成：H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、5-7元杂环烷基和5-6元杂芳基；
R4选自下组，该组由以下组成：H和C1-4烷基；
R5是卤代；
Figure FDA0002941045310000151
任选地被＝O取代；并且
n是0至4的整数。
76.如权利要求74所述的方法，其中所述爱拉斯汀的类似物是PE或IKE。
77.如权利要求73所述的方法，其中所述GPX4的抑制剂选自下组，该组由以下组成：(1S,3R)-RSL3或其衍生物或类似物、ML162、DPI化合物7、DPI化合物10、DPI化合物12、DPI化合物13、DPI化合物17、DPI化合物18、DPI化合物19、FIN56和FINO2。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述RSL3衍生物或类似物是由结构式(I)表示的化合物：
Figure FDA0002941045310000152
或其对映异构体、旋光异构体、非对映异构体、N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐，其中
R1、R2、R3和R6独立地选自H、C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8芳烷基、3至8元碳环、3至8元杂环、3至8元芳基或3至8元杂芳基、酰基、烷基磺酰基和芳基磺酰基，其中每个烷基、烷氧基、芳烷基、碳环、杂环、芳基、杂芳基、酰基、烷基磺酰基和芳基磺酰基任选地被至少一个取代基取代；
R4和R5独立地选自H1 C1-8烷基、C1-8烷氧基、3至8元碳环、3至8元杂环、3至8元芳基或3至8元杂芳基、羧酸根、酯、酰胺、碳水化合物、氨基酸、酰基、烷氧基取代的酰基、糖醇、NR7R8、OC(R7)2COOH、SC(R7)2COOH、NHCHR7COOH、COR8、CO2R8、硫酸根、磺酰胺、亚砜、磺酸根、砜、硫代烷基、硫酯和硫醚，其中每个烷基、烷氧基、碳环、杂环、芳基、杂芳基、羧酸根、酯、酰胺、碳水化合物、氨基酸、酰基、烷氧基取代的酰基、糖醇、NR7R8、OC(R7)2COOH、SC(R7)2COOH、NHCHR7COOH、COR8、CO2R8、硫酸根、磺酰胺、亚砜、磺酸根、砜、硫代烷基、硫酯和硫醚任选地被至少一个取代基取代；
R7选自H、C1-8烷基、碳环、芳基、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基和烷基杂环，其中每个烷基、碳环、芳基、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基和烷基杂环可以任选地被至少一个取代基取代；
R8选自H、C1-8烷基、C1-8烯基、C1-8炔基、芳基、碳环、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基、烷基杂环和杂芳香族，其中每个烷基、烯基、炔基、芳基、碳环、杂芳基、杂环、烷基芳基、烷基杂芳基、烷基杂环和杂芳香族可以任选地被至少一个取代基取代；并且X是在其附接的环上的0至4个取代基。
79.如权利要求77所述的方法，其中所述RSL3衍生物或类似物是由结构式(II)表示的化合物：
Figure FDA0002941045310000161
或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐；其中：
R1选自下组，该组由以下组成：H、OH和-(OCH2CH2)xOH；
X是1至6的整数；并且
R2、R2'、R3、和R3’独立地选自下组，该组由以下组成：H、C3-8环烷基及其组合，或R2和R2’可以结合在一起形成吡啶基或吡喃基，并且R3和R3'可以结合在一起形成吡啶基或吡喃基。
80.如权利要求77所述的方法，其中所述RSL3衍生物或类似物是由结构式(III)表示的化合物：
Figure FDA0002941045310000171
或其立体异构体，或其药学上可接受的盐；其中：
n是2、3或4；并且R是经取代或未经取代的C1-C6烷基基团，经取代或未经取代的C3-C10环烷基基团，经取代或未经取代的C2-C8杂环烷基基团，经取代或未经取代的C6-C10芳香族环基团或经取代或未经取代的C3-C8杂芳基环基团；其中所述取代是指每个基团中的一个或多个氢原子被以下基团取代，所述基团选自下组，该组由以下组成：卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷氧基、COOH(羧基)、COOC1-C6烷基、OCOC1-C6烷基。
81.如权利要求73所述的方法，其中所述他汀选自下组，该组由以下组成：阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、西立伐他汀和辛伐他汀。
82.如权利要求1至72中任一项所述的方法，其中所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂选自下组，该组由以下组成：索拉非尼或其衍生物或类似物、柳氮磺胺吡啶、谷氨酸盐、BSO、DPI2、顺铂、半胱氨酸酶、二氧化硅基纳米颗粒、CCI4、柠檬酸铁铵、葫芦巴碱和鸦胆子苦醇。
83.如权利要求1至72中任一项所述的方法，其中所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂具有以下特征中的一种或多种：
(a)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及随后共培养细胞中免疫应答的活化；
(b)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及随后共培养的巨噬细胞，例如RAW264.7巨噬细胞的活化；
(c)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及随后共培养的单核细胞，例如THP-1单核细胞的活化；
(d)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及随后共培养的骨髓衍生树突状细胞(BMDC)的活化；
(e)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及随后共培养的细胞中NFkB、IRF和/或STING的水平或活性的增加；
(f)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及随后共培养细胞中促免疫细胞因子的水平或活性的增加；以及
(g)诱导靶细胞的体外铁依赖性细胞拆解以及随后共培养的CD4+细胞、CD8+细胞和/或CD3+细胞的活化。
84.如权利要求1至72中任一项所述的方法，其中所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂靶向癌细胞。
85.一种筛选免疫刺激剂的方法，所述方法包括：
(a)提供多种测试剂(例如测试剂文库)；
(b)评估所述多种测试剂中的每一种诱导铁依赖性细胞拆解的能力；
(c)选择诱导铁依赖性细胞拆解的测试剂作为候选免疫刺激剂；并且
(d)评估所述候选免疫刺激剂刺激免疫应答的能力。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述评估步骤(b)包括使细胞或组织与所述多种测试剂中的每一种接触。
87.如权利要求85所述的方法，其中所述评估步骤(b)包括将所述多种测试剂中的每一种施用于动物。
88.如权利要求86所述的方法，其中所述评估步骤(b)还包括测量与所述测试剂接触的细胞或组织中的选自下组的标志物的水平或活性，该组由以下组成：脂质过氧化、活性氧(ROS)、异前列腺素、丙二醛(MDA)、铁、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、前列腺素-内过氧化物合酶2(PTGS2)、环氧合酶2(COX-2)和谷胱甘肽(GSH)。
89.如权利要求85所述的方法，其中所述评估步骤(b)还包括将与所述测试剂接触的细胞或组织中所述标志物的水平或活性与未与所述测试剂接触的对照细胞或组织中所述标志物的水平或活性进行比较。
90.如权利要求85所述的方法，其中所述评估步骤(d)包括评估所述诱导铁依赖性细胞拆解的测试剂的体外免疫刺激活性。
91.如权利要求85所述的方法，其中所述评估步骤(d)包括测量动物中的免疫应答。
92.如权利要求85至91中任一项所述的方法，其中选自由脂质过氧化、异前列腺素、活性氧(ROS)、铁、PTGS2和COX-2组成的组中的标志物的水平或活性增加或选自由GPX4、MDA和GSH组成的组中的标志物的水平或活性降低表明所述测试剂是诱导铁依赖性细胞拆解的药剂。
93.如权利要求85所述的方法，其中评估所述候选免疫刺激剂包括将免疫细胞与跟选择的候选免疫刺激剂接触的细胞一起培养或使免疫细胞暴露于由与选择的候选免疫刺激剂接触的细胞产生的后细胞信号传导因子，并测量所述免疫细胞中NFκB、IRF或STING的水平或活性。
94.如权利要求85所述的方法，其中评估所述候选免疫刺激剂包括将T细胞与跟选择的候选免疫刺激剂接触的细胞一起培养或使T细胞暴露于由与选择的候选免疫刺激剂接触的细胞产生的后细胞信号传导因子，并测量所述T细胞的活化和增殖。
95.一种鉴定免疫刺激剂的方法，所述方法包括：
(a)使细胞与诱导铁依赖性细胞拆解的药剂按以下量接触，所述量足以在所述细胞中诱导铁依赖性细胞拆解；
(b)分离与所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触后的细胞产生的一种或多种后细胞信号传导因子；并且
(c)测定所述一种或多种后细胞信号传导因子刺激免疫应答的能力。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述方法还包括选择刺激免疫应答的测试剂。
97.如权利要求95所述的方法，其中所述方法还包括检测所述细胞中铁依赖性细胞拆解的标志物。
98.如权利要求95所述的方法，其中所述方法还包括：
i)测量与所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触后的细胞产生的一种或多种后细胞信号传导因子的水平；
ii)将与所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触后的细胞产生的一种或多种后细胞信号传导因子的水平与未用所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂处理的对照细胞中一种或多种测试剂的水平进行比较；并且
iii)选择相对于对照细胞在与所述诱导铁依赖性细胞拆解的药剂接触的细胞中显示出升高水平的后细胞信号传导因子，以产生一种或多种后细胞信号传导因子用于步骤(c)中的测定。
99.如权利要求98所述的方法，其中用诱导细胞死亡的药剂处理所述对照细胞，所述细胞死亡不是铁依赖性细胞拆解。
100.如权利要求95所述的方法，其中所述测定包括向动物施用所述一种或多种后细胞信号传导因子并测量所述动物中的免疫应答。
101.如权利要求95所述的方法，其中所述测定包括用所述一种或多种后细胞信号传导因子处理免疫细胞并测量所述免疫细胞中NFκB活性的水平或活性。
102.如权利要求95所述的方法，其中所述测定包括用所述一种或多种后细胞信号传导因子处理T细胞并测量所述T细胞的活化或增殖。
103.如权利要求95所述的方法，其中所述测定包括使免疫细胞与所述一种或多种后细胞信号传导因子接触并测量所述免疫细胞中NFκB、IRF或STING的水平或活性。
104.如权利要求93或103所述的方法，其中所述免疫细胞是THP-1细胞。
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