KR20110085038A - 항 ｃｄ137-항체 및 독소 결합물을 이용한 ｃｄ137 양성세포의 제거방법 - Google Patents

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조홍래
이상철
이선경
김은화
김혜정
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울산대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 항 CD137-항체 및 독소 결합물을 이용한 CD137 양성세포의 제거방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 항 CD137-항체 및 독소의 결합물을 CD137 양성세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 시험관내에서 선택적으로 CD137 양성세포를 제거하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 CD137 양성세포의 제거 방법은 CD137 분자에 특이성을 갖는 항 CD137-항체에 독소물질을 결합시킨 결합물을 CD137이 발현되는 세포내로 전달시켜 CD137 양성세포만을 선택적으로 사멸시키는 효과가 우수하고 세포증식을 억제하는 효과도 우수하므로 CD137 양성세포의 활성으로 매개되는 면역질환을 포함한 각종 질환들을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

항 ＣＤ137-항체 및 독소 결합물을 이용한 ＣＤ137 양성세포의 제거방법 {Method for selective depletion of CD137 positive cells using anti-CD137-antibody and toxin complex}
본 발명은 항 CD137-항체 및 독소 결합물을 이용한 CD137 양성세포의 제거방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 항 CD137-항체에 독소 물질을 결합시킨 결합물을 CD137이 발현되는 CD137 양성세포에 선택적으로 전달하여 세포내로 전달된 독소물질에 의해 CD137 양성세포를 효과적으로 제거하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 면역반응은 여러 과정을 거쳐 유도되는데, 특히 T 세포를 중심으로 체내에서 일어나는 과정을 살펴보면, 먼저 세포 바깥에 존재하는 항원이 항원표출세포(antigen presenting cell)의 내부로 들어가 분해과정을 거쳐 세포 안에서 생성되는 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex : MHC)의 클래스 II 분자와 결합하게 된다. 이렇게 생성된 결합체는 항원표출세포 바깥 표면으로 이동하여 외부에 노출되어지는데, 이 결합체를 헬퍼 T 세포 항원 수용체가 인지함으로써 항원에 특이적인 면역반응을 시작할 수 있게 된다. 한편, 바이러스 항원 등과 같이 세포 안에서 생성되는 항원은 세포 안에서 일부가 분해된 후, MHC 클래스 I 분자와 결합하게 되고, 이때 만들어지는 결합체는 항원표출세포 바깥 표면에서 세포독성 T 세포의 항원 수용체에 의하여 인지됨으로써 항원 특이적인 면역 반응을 시작할 수 있게 된다. 또한, 이와 같은 과정이 일어난 후, T 세포와 항원표출세포는 활성화 초기 단계에 들어가 새로운 분자들을 세포 표면에 발현시키게 되고, 발현된 분자들은 서로 결합하여 T 세포 및 항원표출세포의 활성화를 촉진함으로써 다양한 면역 반응을 증진시키게 된다.
한편, 이러한 면역반응 과정에서 T 세포 및 항원표출세포의 표면에 새롭게 발현되는 분자를 악세서리(accessory) 분자라고 하는데, 대표적인 것으로는 B7-1, B7-2, CD28, CTLA4, CD40, CD40 리간드 및 CD137 등이 알려져 있다(Goodwin et al., Eur. J. I mmunol., 23 : 2631 (1993)).
이러한 악세서리 분자들 중에서 특히 CD137은 활성화된 랫드의 T 세포에서 발현된 단백질로 처음 발견되었고(Kwon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2896-2900 (1987); Kwon and Weissman, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 86, 1963-1967 (19 89)), 총 멤브레인 단백질의 종양괴사인자(TNF) 수용체 군의 한 종류임이 밝혀졌으며(Mallett and Barclay, Immunol. Today 12, 220-222 (1991)), 이러한 수용체 군은 세포외 영역에 시스테인이 풍부하게 존재하는 것을 특징으로 하며 NGFR, CD40, OX-40, CD27, TNFR-I, TNFR-II, Fas 및 CD30 등이 속하는 것으로 보고된 바 있다(Smith, et al., Cell 76, 959-962 (1994); Beutler and VanHuffel, Science 264, 66 7-668 (1994)).
또한, CD137은 55kDa의 호모다이머(homodimer)의 형태를 가지며, ConA, 피토헤마글루티닌(PHA)과 이오노마이신, 또는 항-CD3i 등으로 활성화된 랫드의 T 세포주, 흉선세포 및 성숙 T 세포 등에서 다양하게 발현되는 것으로 알려졌다(Kwon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1963-1967 (1989); Pollok, et al., J. Immunol. 150, 771-781 (1993))으며, CD137의 일부는 세포 안쪽에 존재하면서 프로테인 키나제의 한 종류인 p56lck와 결합되어 있는 것으로 보아 세포밖의 신호를 세포안으로 전달하는 과정에서도 중요한 역할을 할 것으로 추측하고 있다(Kin, et al., J. Immunol., 151, 1255-1262 (1993)). 또한, 최근에는 CD137 분자는 T 세포의 활성화에 의해 유도되는 자극 분자로서 CD137의 발현은 항원 특이적 및 선택적이라는 것이 밝혀졌다(Greenberg , Blood . 2007 Jul., 1, 110 (1), 201-210; Greenberg , Cytometry A. 2008 Nov, 73 (11), 1043-1049)).
한편, 면역계의 가장 중요한 기능 중 하나는 자기 항원(self antigen)과 외부에서 들어오는 항원(foreign antigen)을 감별하고 인지하는 능력이다. 일반적으로 정상적인 조건하에서의 면역계는 자기 항원과 반응하지 않으며 외부 항원에 대해서만 반응한다. 그러나 이러한 정상적인 면역반응의 원칙이 깨지면 신체는 자기 항원을 외부 항원처럼 인식하기 시작하여 자신의 세포, 조직 및 기관을 파괴하는 병적인 상태에 이르게 되는데, 이러한 질병을 총칭하여 자가 면역질환(autoimmune disease)이라고 한다.
자가 면역질환의 발생 기전에 대해서는 아직까지 명확히 밝혀진 바가 없으며, 단지 단편적으로 특정 백혈구 유전형을 갖는 인종에게는 특정 자가 면역질환의 발생율이 높다거나, 특정 종류의 자기 항원이 특정 자가 면역질환에 관여하는지에 대한 내용만이 연구가 진행되어 왔을 뿐, 자기 항원에 대한 면역 내성이 파괴되는 궁극적인 원인 및 이를 억제할 수 있는 방법에 대해서는 아직까지 확실히 밝혀지지 않고 있다. 따라서 현재 자가면역질환에 대한 치료는 자가면역을 근본적으로 치료한다기보다는 자가면역에 의하여 일어나는 염증 반응을 억제하기 위한 항염증제, 또는 활발하게 증식하는 세포에 독성을 나타내는 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 직접 투여하는 방법이 사용되고 있고, 과다한 면역반응을 억제해주는 방사선 조사법, 흉선 배액법(thoracic duct drainage) 또는 항임파구 글로불린(anti-lymphocyte globulin, ALG). 항흉선세포 글로불린(anti-thymocyte globulin, ATG)과 같은 면역억제 효과를 갖는 항임파구 혈청 등이 임상적으로 사용되고 있다.
그러나 이러한 자가 면역질환의 치료방법은 단기적으로는 그 효과를 발휘할 수 있으나 앞서 언급한 바와 같이 면역억제요법은 정상적인 면역세포에도 작용하기 때문에 정상세포가 손상 또는 파괴되는 문제점이 있어 면역반응에 직접 관여하는 활성화된 면역세포에만 선택적으로 작용할 수 없다는 단점이 있다.
이에 최근에는 새로운 자가 면역질환의 치료방법으로서 면역억제제나 면역세포를 제거할 수 있는 항체를 이용하는 방법들이 개발되고 있는데, 이는 항체를 사용할 경우, 비특이적인 세포의 손상 없이 특정 표적 세포만을 타겟팅 할 수 있다는 장점이 있기 때문이다. 자가 면역질환의 치료방법으로 항체를 사용한 종래기술들을 살펴보면, 대한민국공개특허 제2009-0059149호에는 인간화 항 ＣＤ19 항체 및 상기 항체의 종양학, 이식 및 자가면역 질환치료에서의 용도에 대한 내용이 개시되어 있고, 대한민국공개특허 제2007-0019727호에는 CD20 항체를 이용한 자가 면역 질환의 예방 방법이 개시되어 있고, 대한민국공개특허 제2009-0122910호에는 류마티스 관절염의 진단 및 치료에 사용되는 항 ＣＤ6 단일클론성 항체를 포함하는 약학 조성물에 대한 내용이 개시되어 있다.
그러나 종래 자가 면역질환을 위해 사용되는 항체의 경우, 너무 강력한 면역 억제 효과로 인하여 2차 감염, 내성, 정상 세포에 대한 독성 유발과 같은 부작용이 발생하는 문제점이 있다.
그러므로 상기와 같은 부작용을 초래하지 않으면서 특정 항원에 대한 면역반응 또는 직접 면역 반응에 관여하는 활성화된 면역세포만을 효과적으로 제거하여 자가 면역질환을 치료할 수 있는 새로운 치료 방법의 개발이 시급한 실정이다.
따라서 본 발명의 목적은 CD137이 발현되는 세포의 활성으로 인해 유발되는 질환들을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 항 CD137-항체 및 독소의 결합물을 CD137 양성세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 시험관내에서 CD137 양성세포를 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 항 CD137-항체 및 독소의 결합물을 CD137이 발현되는 CD137 양성세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 시험관내에서 CD137 양성세포를 제거하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항 CD137-항체는 CD137 분자에 대한 항진성(agonist) 항체 또는 길항성(antagonist) 항체일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 독소는 시클로포스포마이드(Cyclophosphamide), 멜팔란(Melphalan), 마이토신 C(Mitomycin C), 비젤레신(Bizelesin), 시스플라틴(Cisplatin), 독소루비신(Doxorubicin), 에토포시드(Etoposide), 미토잔트론(Mitoxantrone), SN-38, Et-743, 액티노마이신 D(Actinomycin D), 벨로마이신(Bleomycin), TLK286, SGN-15 및 플루다라빈(fludarabin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 화학치료제; 아그로스틴(Agrostin), b-32, 부가닌(Bouganin), 캄포린(Camphorin), 커신(Curcin), 겔로닌(Gelonin), JIP60, 모모르딘(Momordin), PAP(Pokeweed antiviral protein), 사포린, 트리코산틴(Trichosanthin)으로 이루어진 군 중에서 산택되는 타입 I 리보솜 비활성 단백질; 아브린(Abrin), 리신(Ricin), 미슬토 렉틴 I(Mistletoe lectin I), 모데신(Modeccin), 볼켄신(Volkensin), RIP, 란세올린(Lanceolin),스테노댁틸린(Stenodactylin), 아라린(Aralin) 및 리프록시민(Riproximin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 타입 II 리보솜 비활성 단백질; 디프테리아 독신(diphtheria toxin)및 베놈 독신(venom toxin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항 CD137-항체 및 독소의 결합물은 CD137 양성세포의 세포사멸을 촉진시키거나 CD137 양성세포의 세포증식을 억제할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CD137 양성세포는 자가면역 질환, 이식편 거부증, 이식편대 숙주질환, 암질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 질환과 관련된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CD137 양성세포는 CD137이 발현되어 활성화된 세포로서, T 세포, B 세포, 수지상세포(Dendritic Cell), NK(Natural killer)세포, 대식세포, 암세포 및 호중구, 호염구, 호산구를 포함하는 골수(myeloid) 세포로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항 CD137-항체 및 독소의 결합물은 CD137 양성세포와 접촉시 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 독소는 항 CD137-항체(일차 항체) 또는 항 CD137-항체에 대한 이차 항체에 결합될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 항 CD137-항체 및 독소의 결합물은 0.1~5.0 ug/ml의 농도로 CD137 양성세포에 처리할 수 있다.
본 발명에 따른 CD137 양성 세포의 제거 방법은 CD137 분자에 특이성을 갖는 항 CD137-항체에 독소물질을 결합시킨 결합물을 CD137이 발현되는 세포내로 전달시켜 CD137 양성세포만을 선택적으로 사멸시키는 효과가 우수하고 세포증식을 억제하는 효과도 우수하므로 CD137 양성세포의 활성으로 매개되는 면역질환을 포함한 각종 질환들을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 CD137이 발현되는 세포에 항 CD137-항체를 처리한 후 시간에 따른 항 CD137-항체의 세포내 위치변화를 형광 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 2a는 인간과 원숭이로부터 분리된 단핵구를 항 CD3 항체와 24시간 배양시킨 후, 다시 PE-결합된 항 CD137-항체와 30분 반응 시킨 다음, T 세포에서 CD137의 발현을 확인한 것을 나타낸 것이고, 2b는 인간말초혈액단핵세포에서 항 CD137-항체와 CD137의 결합 및 항 CD137-항체의 세포내 위치를 시간별로 확인한 것을 나타낸 것이며, 2c는 원숭이말초혈액단핵세포에서 항 CD137-항체와 CD137의 결합 및 항 CD137-항체의 세포내 위치를 시간별로 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 일실시예에서 제작한 항 CD137-항체와 독소루비신의 결합물을 FPLC를 이용하여 분리 정제한 그래프를 나타낸 것이고, 도 3b는 CD137을 발현하는 T 세포에 FITC 형광이 표지된 항 CD137-항체와 독소루비신의 결합물을 염색하여 CD137 분자와의 결합 정도를 나타낸 것이다.
도 4a는 본 발명의 일실시예에서 제작한 항 CD137-항체와 독소루비신의 결합물의 시험관 내에서 세포 사멸 효과를 측정하기 위한 모식도를 나타낸 것이고, 4b는 항 CD137-항체와 독소루비신의 결합물에 대한 CD137 양성 세포의 사멸효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 CD137이 발현되는 세포 및 CD137이 유전적으로 결핍된 세포에서 본 발명에 따른 항 CD137-항체와 독소물질의 결합물에 대한 세포 사멸 정도를 아넥신 V 염색을 통해 비교한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 5b는 CD137이 발현되는 T 세포에 항 CD137-항체, 항 CD137-항체와 독소루비신의 결합물 및 독소루비신을 각각 처리한 후 세포의 증식정도를 비교하여 나타낸 그래프이고, 도 5c는 FITC로 표지된 본 발명의 항 CD137-항체와 독소물질이 결합된 결합물을 CD137이 발현되는 면역세포에 처리한 후 아넥신 V로 염색하여 세포사멸 정도를 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 6은 급성 이식편대 숙주질환이 유도된 동물 모델에서 비장 및 림프절 T 세포에서의 CD137의 발현정도를 유속세포측정기를 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 본 발명의 일실시예에서 제작한 항 CD137-항체와 독소루비신의 결합물을 급성 이식편대 숙주질환이 유도된 마우스에 복강 주사한 후 시간에 따른 체중의 변화를 나타낸 그래프이며, 7b는 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 CD137이 형질 이입된 EL-4 세포에 랫드의 IgG, 항 CD137-항체, (랫드의 IgG+항 랫드 IgG-사포린 결합물 및 항 CD137-항체+항 랫드 IgG-사포린 결합물을 각각 처리한 후, 유세포 분석기를 이용하여 세포 사멸 정도를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 마우스 비장에서 분리된 면역세포에 항 CD3 항체를 처리하여 면역세포를 활성화 시키고, 상기 세포에 랫드의 IgG, 항 CD137-항체, 랫드의 IgG+항 랫드의 IgG-사포린 결합물 및 항 CD137-항체+항 랫드의 IgG-사포린 결합물을 각각 처리한 후, 세포를 수확하여 PE-Cys-항 CD4 항체, PE-항 CD8 항체 및 FITC-아넥신 V로 염색하여 세포 사멸 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 인간말초혈액에서 분리된 단핵구에 항 CD3 항체를 처리한 후, 항 CD137항체(항진성 항체 및 길항성 항체) 및 CD137항체(항진성 항체 및 길항성 항체)+ 항 마우스 IgG-사포린 결합물을 처리하여 배양한 다음 유세포 분석기를 통해 세포 사멸 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 BDF1 마우스에서 분리되고 방사선 조사된 APC와 마우스의 T 세포를 혼합하여 세포배양액에서 항 CD3 항체와 함께 배양한 후, 배양된 세포에 항 랫드 IgG-사포린 결합물 또는 항 염소 IgG-사포린 결합물을 처리하여 배양한 다음 유세포 분석기를 통해 세포 사멸 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 12는 서로 다른 기증자로부터 분리된 인간 단핵구로부터 분리되고 방사선 조사된 APC와 T 세포를 혼합하여 세포배양액에서 항 CD3 항체와 함께 배양한 후, 배양된 세포에 항 마우스 IgG-사포린 결합물 또는 항 염소 IgG-사포린 결합물을 처리하여 배양한 다음 유세포 분석기를 통해 세포 사멸 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명자들은 CD137이 발현되는 세포의 활성화로 초래되는 질환들을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 개발하기 위해 CD137 양성세포에서 발현되는 CD137 분자를 이용하였는데, 이는 CD137 분자의 경우, 세포 내에서 CD137 분자의 발현이 항원 특이적이며 선택적이라는 특징이 있기 때문이다.
이에 본 발명자들은 비특이적인 세포의 제거 없이 특정 표적 세포만을 사멸 또는 비활성화시키기 위한 방법으로 항원 특이적으로 CD137 양성세포에서 발현되는 CD137 분자에 대한 항체에 독소 물질을 결합시킨 결합물을 표적 세포(즉, CD137이 발현되는 세포)에 전달시켜 전달된 독소에 의해 표적 세포를 효과적으로 제거(비활성화 또는 세포사멸을 유도)할 수 있는 방법을 개발하였다.
따라서 본 발명은 항 CD137-항체 및 독소의 결합물을 CD137 양성세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 시험관내에서 CD137 양성세포를 제거하는 방법을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서 상기 항 CD137-항체는 선택적으로 CD137 분자를 인식하여 CD137과 결합할 수 있는 폴리펩티드일 수 있으며, CD137 분자에 대한 항진성(agonist) 항체 또는 길항성(antagonist) 항체 일 수 있다.
상기에서 “항진성(agonist) 항체 ”란 세포표면의 특정 분자 또는 세포내 특정분자와 결합하는 것에 의해, 세포내에 신호가 전달되어 상기 세포에서 생기는 생물학적 작용을 유도하는 항체로서, 항원-항체 반응에 의해 유도되는 작용을 촉진 또는 활성시키는 역할을 하는 작용제 항체를 말한다. 예컨대, CD137 분자에 항진성 항체가 결합할 경우, 세포내에서 CD137 분자에 의한 하나 이상의 생물학적 작용들을 향상시킬 수 있다.
또한,“길항성(antagonist) 항체”란 세포표면의 특정 분자 또는 세포내 특정분자와 결합하는 것에 의해, 항진성 항체와 리간드의 결합에 의해 발생되는 세포내의 생물학적 작용 또는 활성을 억제하는 작용을 하는 항체를 말하며, 본 발명에서 상기 길항성 항체는 세포 표면에 존재하는 CD137 분자와 결합하여 세포내에서 CD137 분자에 의한 하나 이상의 생물학적 작용들을 감소 또는 억제시킬 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 CD137 분자에 대한 항체로는, 상기 항체의 특성이 항진성이거나 길항성이라는 것에 상관없이 모두 사용할 수 있는데, 이는 본 발명에 따른 CD137 양성세포의 제거방법은 CD137 분자와 결합하는 항체를 이용하여 독소물질을 상기 항체에 결합시킨 후 결합물을 세포내로 전달시켜 상기 독소물질에 의해 CD137 양성세포를 비활성화 또는 세포사멸을 유도함으로써 상기 세포들을 제거하는데 특징이 있기 때문이다. 따라서 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 항 CD137-항체는 CD137 분자에 대한 항진성(agonist) 항체 또는 길항성(antagonist) 항체를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 세포내에서 CD137 분자에 의한 하나 이상의 생물학적 작용들을 감소 또는 억제시킬 수 있는 길항성(antagonist) 항체를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 CD137은 인간을 포함하는 다양한 포유동물의 CD137을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에서 사용한 상기 CD137에 대한 CD137-항체는 시중에서 판매되고 있는 것이라면 모두 사용가능하며, 인간을 제외한 포유동물로부터 생성 및 분리된 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 에모리대학의 로버트 미틀러 박사로부터 얻은 항 CD137- 단일클론 항체를 사용하였다.
한편, 본 발명에서는 활성화된 CD137 양성세포에 의해 매개되는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 물질로서 항 CD137-항체에 독소를 결합시킨 결합물을 제작하였는데, 상기 독소로는 세포의 활성을 억제 또는 감소시킬 수 있거나 또는 세포사멸을 유도할 수 있는 물질로서, 화학치료제, 효소저해물질, 방사성핵종 및 박테리아 독소류 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게 상기 독소는 시클로포스파마이드(Cyclophosphamide), 멜팔란(Melphalan), 마이토신 C(Mitomycin C), 비젤레신(Bizelesin), 시스플라틴(Cisplatin), 독소루비신(Doxorubicin), 에토포시드(Etoposide), 미토잔트론(Mitoxantrone), SN-38, Et-743, 액티노마이신 D(Actinomycin D), 벨로마이신(Bleomycin), TLK286, SGN-15 및 플루다라빈(fludarabin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 화학치료제; 아그로스틴(Agrostin), b-32, 부가닌(Bouganin), 캄포린(Camphorin), 커신(Curcin), 겔로닌(Gelonin), JIP60, 모모르딘(Momordin), PAP(Pokeweed antiviral protein), 사포린, 트리코산틴(Trichosanthin)으로 이루어진 군 중에서 산택되는 타입 I 리보솜 비활성 단백질; 아브린(Abrin), 리신(Ricin), 미슬토 렉틴 I(Mistletoe lectin I), 모데신(Modeccin), 볼켄신(Volkensin), RIP, 란세올린(Lanceolin),스테노댁틸린(Stenodactylin), 아라린(Aralin) 및 리프록시민(Riproximin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 타입 II 리보솜 비활성 단백질; 디프테리아 독신(diphtheria toxin)및 베놈 독신(venom toxin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 독소루비신 또는 사포린을 사용할 수 있다.
특히, 본 발명의 일실시예에서 사용한 상기 독소루비신(doxorubicin)은 DNA를 손상시켜 세포의 세포사멸을 유도시킬 수 있는 물질로서 폐암, 소아기암 및 방광암 등의 항암제로 사용하는 물질이며, 상기 사포린(saporin)은 리보좀 비활성화 단백질로서 세포질에 도입되면 리보좀을 비활성화시켜 단백질의 생합성을 억제함으로써 세포사멸을 유발하는 물질이다.
본 발명의 일실시예에서는 항 CD137-항체에 독소 물질로서 독소루비신 또는 사포린을 결합시킨 결합물을 제작하였으며, 항 CD137-항체에 독소루비신을 결합시켜 제작한 결합물을 FPLC 방법으로 분리 정제하여 확인한 결과를 도 3a에 나타내었다. 또한, 상기 제작한 결합물이 항원-항체 결합에 의해 세포 내로 도입되기 위해서는 CD137 분자와 결합할 수 있어야 하므로 상기 결합물과 CD137 분자와의 결합력을 분석한 결과, 항 CD137-항체에 독소루비신을 결합시켜도 CD137 분자와 정상적으로 결합함을 확인할 수 있었다(도 3b 참조).
본 발명에서 항 CD137-항체에 독소 물질을 결합시키는 방법은 당업계에 공지된 항체에 화합물을 결합시키는 방법을 이용하여 결합물을 제작할 수 있으며, 상기 독소 물질은 CD137에 대한 일차 항체 또는 상기 일차 항체에 대한 이차 항체에 결합시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 항 CD137-단일클론 항체, 즉 일차 항체에 독소루비신을 결합시킨 결합물을 제작하였고, 항 CD137-단일클론 항체에 대한 이차 항체에 사포린을 결합시킨 결합물을 제작하였다.
또한, 본 발명자들은 상기 방법으로 제작된 본 발명의 CD137-항체에 독소 물질이 결합된 결합물이 CD137 양성세포의 활성을 억제시킬 수 있는지를 확인하기에 앞서 먼저 표적세포로 상기 결합물이 효과적으로 전달될 수 있는지를 조사하였다.
즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 항 CD137- 항체를 CD137 양성 세포의 선택적 제거에 사용하기 위해서는 항 CD137- 항체가 CD137과 특이적으로 결합한 후 세포 내로 도입되어야 하는데, 이를 확인하기 위해 마우스의 CD137 양성 세포주를 대상으로 형광 표지된 항 CD137- 항체를 배양시키고 시간별로 세포내에서의 항 CD137- 항체 위치를 관찰하였다. 그 결과, 배양 0 시간에는 세포 표면에 존재하던 항 CD137- 항체가 시간이 경과할수록 세포 내로 도입되는 것으로 나타났으며, 이러한 세포내 도입은 엔도사이토시스 마커인 EEA-1을 사용하여 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 이루어짐을 확인할 수 있었다(도 1 참조). 또한, 항 CD137- 항체가 CD137과 결합 후 세포 내로의 도입은 CD137의 양성세포 중 하나인 마우스의 T 세포뿐만 아니라 인간 및 원숭이의 T 세포에서도 동일한 결과를 보였다(도 2a 내지 2c 참조).
따라서 본 발명자들은 본 발명에서 사용한 항 CD137-항체의 경우, CD137을 발현하는 세포에서 항 CD137-항체가 CD137과 결합하면 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 세포 내로 도입된다는 사실을 알 수 있었으며, 상기에서 제작된 항 CD137-항체에 독소 물질을 결합시킨 결합물의 경우도 엔도사이토시스에 의해 세포 내로 용이하게 도입될 수 있음을 알 수 있었다.
따라서 본 발명은 항 CD137-항체 및 독소의 결합물을 이용하여 CD137이 발현되는 CD137 양성세포로 상기 독소물질을 전달시키는 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제작한 항 CD137-항체에 독소 물질을 결합시킨 결합물은 CD137이 발현되는 CD137 양성세포의 세포사멸을 촉진시키거나 CD137 양성세포의 세포증식을 억제할 수 있는 특징이 있다.
일반적으로 항 CD137-항체는 활성화된 CD4+ T세포와 CD8+ T세포에서 CD137과 결합하면 세포의 증식 및 분화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명자들은 본 발명의 항 CD137-항체에 독소루비신이 결합된 결합물을 사용하였을 경우, CD137 양성세포의 세포증식을 억제하고 세포사멸을 유도할 수 있는지를 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, CD137 양성세포로서 CD137이 발현되는 마우스 세포주 및 활성화된 비장/림프절의 CD4+ T세포와 CD8+ T세포를 이용하여 상기 세포에 항 CD137-항체와 독소루비신이 결합된 결합물을 처리한 후, 세포 사멸 정도를 측정한 결과, 처리한 결합물의 농도가 높을수록 마우스의 비장 면역세포의 사멸 정도가 점차 증가하는 것으로 나타난 반면, CD137이 유전적으로 결핍된 세포에서는 세포 사멸이 일어나지 않는 것으로 나타났다(도 4 및 도 5a 참조). 또한 이러한 결과는 항 CD137-항체에 독소물질로 사포린이 결합된 결합물의 경우에도 동일한 결과를 보였다(도 8 및 도 9 참조).
본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 항 CD137-항체에 독소루비신이 결합된 결합물의 CD137 양성세포에 대한 세포증식에 미치는 효과를 조사하였는데, 즉, 마우스의 비장으로부터 분리된 활성화된 면역 세포에 항 CD137-항체, 항 CD137-항체에 독소루비신이 결합된 결합물 및 독소루비신을 각각 처리한 후, 세포증식 관찰 결과, 항 CD137-항체만을 처리한 경우 세포 증식이 유도되는 것으로 나타난 반면, 결합물을 처리한 경우에는 세포 증식이 유의적인 수준으로 억제되는 것으로 나타났다(도 5b 및 도 5c 참조). 또한 이러한 결과는 항 CD137-항체에 독소물질로 사포린이 결합된 결합물의 경우에도 동일한 결과를 나타내었다(도 11 참조).
그러므로 본 발명은 CD137 양성세포의 활성을 억제시킬 수 있는 항 CD137-항체에 독소물질이 결합된 결합물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 항 CD137-항체에 독소 물질을 결합시킨 결합물은 항원의 종류와 무관하게 CD137이 발현되는 세포, 즉 CD137 양성세포를 선택적으로 제거하고 증식을 억제할 수 있는 특징이 있다.
일반적으로“항원”이란 면역반응을 유발할 수 있는 물질을 뜻하며, 면역반응은 항체생성이나 면역학적으로 활성화된 세포의 자극을 포함하는데, 항원은 항체 또는 활성화된 세포의 수용체와 반응할 수 있는데, 본 발명에서 상기 CD137이 발현되는 세포는 동종항원, 이종항원 또는 외래항원에 의해 활성화될 수 있다.
상기에서 “동종항원”이란 유전인자가 다른 동종의 다른 개체에서 유래된 항원성 물질을 말하며, “이종항원”이란 다른 종, 즉, 유전인자가 다른 종으로부터 유래된 항원성 물질을 말한다.
또한, 본 발명에서 상기 CD137 양성세포 활성으로 매개되는 질환으로는 CD137 양성세포로 인한 면역반응으로 유발될 수 있는 질환을 포함할 수 있으며, 이러한 질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역 질환, 이식편 거부증, 이식편대 숙주질환, 암 질환 및 염증성 질환을 포함할 수 있다.
일반적으로 자가면역 질환은 숙주조직에 반응하는 항체가 내인성의 자기 펩티드에 스스로 반응하여 면역효과 T 세포를 생성하는 것을 특징으로 하며, 이러한 T 세포의 면역반응은 세포 또는 조직의 손상을 초래하여 자가면역 질환을 유발시킨다. 상기 자가면역 질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 크론씨병(Crohn disease), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 반응성 관절염(reactive arthritis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 고초열(hay fever), 아토피(atopy), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 유육종증(sarcoidosis), 인슐린 의존형 당뇨병(insulin dependent diabetes mellitus), 자가면역성 갑상선염(autoimmune thyroiditis), 강직성 척수염(ankylosing spondylitis) 및 경피증(scleroderma)을 포함할 수 있다.
이식편대 숙주질환(graft versus host disease:GVHD)은 통상적으로 동종(allogenic) 줄기 세포 이식의 수여자에게 일어나는 질환으로서 환자들 간에 그 질환 양상이 다양하나 종종 섬유증(fibrosis) 및 경피증(scleroderma)-유사 질환들을 임상적 합병증으로 수반하기도 한다(Gilliam AC, J. Invest . Dermatol ., 123, 251-257, 2003). 또한, 이식편대 숙주질환은 숙주의 부조직복합성 항원(minor histocompatibility (mH) antigen) 또는 자가항원(autoantigen)에 대한 동종반응(alloreactivity) 후 생성된 병원성 공여 T 세포에 의해 매개되는 것으로 알려져 있으며, 이러한 T 세포는 직접적인 세포용해성 공격 외에 전염증성 및 섬유성 사이토카인의 분비 또는 자가항체 생산의 촉진 등을 통해 표적 조직을 위협하는 것으로 알려져 있다.
또한, 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 하는 문제점이 있다. 이식을 수행할 경우, 면역 거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다. 최근 외과적 시술 및 HLA 유형(type) 판독기법의 발달과 면역억제제의 개발에 의해 이식 성공률은 높아졌지만 여전히 면역거부반응과 면역억제제의 부작용에 의한 사망률이 높아 효과적이고 안전한 새로운 면역억제제의 개발이 요구되고 있다.
또한, CD137 양성세포의 활성으로 매개되는 질환 중 상기 암질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 혈액암, 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 골암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나판관암종, 자궁내막암종, 질암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 전립선암, 방광암 및 신장암을 포함할 수 있다.
또한, CD137 양성세포의 활성으로 매개되는 질환 중 상기 염증성 질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 천식, 건초염, 음식 알레르기, 전신홍반루푸스, 혈관염, 피부염, 첩촉 피부염 및 패혈증을 포함할 수 있다.
그러므로 CD137 양성세포의 활성을 억제할 수 있는 물질 또는 방법의 경우, CD137 양성세포의 활성으로 유발되는 상기 질환들을 예방 또는 치료할 수 있으며, 본 발명에 따른 항 CD137-항체에 독소물질이 결합된 결합물은 CD137 양성세포의 세포사멸을 촉진하거나 세포증식을 억제하여 CD137 양성세포를 제거하는 효과가 우수하므로 CD137 양성세포의 활성으로 매개되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 특징이 있다.
따라서 본 발명은 항 CD137-항체에 독소물질이 결합된 결합물을 유효성분으로 함유하는 CD137 양성세포의 활성으로 매개되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양의 항 CD137-항체에 독소물질이 결합된 결합물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 CD137 양성세포 활성으로 매개되는 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 항 CD137-항체에 독소물질이 결합된 결합물의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg일 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환의 증상 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 CD137 양성세포 활성으로 매개되는 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 항 CD137-항체 및 독소의 결합물을 CD137 양성세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 시험관내에서 CD137 양성세포의 활성을 억제시키는 방법을 제공할 수 있으며, 나아가 CD137 양성세포를 선택적으로 제거하는 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 CD137 양성세포는 세포 독성 세포, 즉, CD137이 발현되어 활성화된 세포로서, 상기 CD137 양성세포로는 이에 제한되지는 않으나, T 세포; B 세포; 수지상세포(Dendritic Cell); NK(Natural killer)세포; 대식세포; 암세포; 및 호중구, 호염구, 호산구를 포함하는 골수(myeloid) 세포로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 CD137 양성세포로서 T 세포에 속하는 CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 T 헬퍼 세포를 사용하였다.
또한, 상기 항 CD137-항체 및 독소의 결합물을 CD137 양성세포와 접촉시킬 경우, 항 CD137-항체 및 독소의 결합물은 0.1~5.0 ug/ml의 농도로 상기 세포에 처리할 수 있다.
나아가 본 발명은 항 CD137-항체에 독소물질이 결합된 결합물 또는 상기 결합물을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 CD137 양성세포의 활성으로 매개되는 질환의 예방 또는 치료방법을 제공할 수 있으며, 상기 개체는 인간을 제외한 모든 동물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 실험동물 모델로 급성 이식편대 숙주질환(acute GVHD)모델을 사용하였는데, 급성 GVHD는 이식된 공여 면역세포, 즉 활성화된 T 세포에 의해 매개되는 질환으로 잘 알려져 있다. 따라서 본 발명에 따른 결합물에 의해 활성화된 T 세포 활성이 억제되거나 세포 사멸이 유발되는지를 조사한 결과, 급성 GVHD 유도에 의해 CD137이 발현되는 마우스 모델에 항 CD137-항체에 독소루비신이 결합된 결합물을 복강 주사하였을 경우, 투여 시점 이후부터 체중의 회복세와 생존율이 증가되는 것으로 나타났다(도 7a 및 7b 참조).
따라서 본 발명자들은 본 발명에 따른 항 CD137-항체에 독소물질이 결합된 결합물을 CD137 양성세포 활성으로 매개되는 질환의 치료에 매우 효과적이라는 사실을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명의 항 CD137-항체에 독소물질이 결합된 결합물 또는 상기 결합물을 포함하는 조성물은 인간을 제외한 포유동물을 대상으로 앞서 기술한 조성물의 투여 방식과 동일한 방식으로 투여될 수 있으며, 예컨대, 경구, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
CD137 및 항 CD137 항체 결합체의 세포내 이입 확인
먼저, 본 발명자들은 항 CD137 항체가 독소, 즉 세포 독성을 유발하는 약물을 표적 세포로 전달하기에 효과적인 물질인지를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
<1-1> 세포주에서 CD137 항체의 세포내 이입 확인
먼저 본 발명에서 사용한 실험 동물은 찰스리버사의 오리엔트 지사를 통하여 구입한 8~10 주령의 수컷 마우스(C57BL/6, BDF1)를 실험에 사용하였고, 울산대학교 생의과학연구소 부속시설인 실험동물 사육 시설(SPF ; specific pathogens free facility)에서 사육하였다. 또한, 하기 실험들에 사용한 항 마우스 CD137 단클론 항체(clone : 3E1, 3H3)는 에모리(emory) 대학의 로버트 미틀러 박사로부터 기부 받은 교잡세포(hybridoma cell clone: 3E1, 3H3)를 누드 마우스에 투여하여 생긴 복수를 수확하여 단백질 G 컬럼(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 이용하여 분리 및 정제한 것을 사용하였고, 항 인간 CD137 단클론 항체(4B4, 4785)는 Balb/c로부터 수확된 복수로부터 마우스와 동일하게 분리 및 정제한 것을 사용하였다. 대조군으로 사용된 랫트 IgG는 시그마알드리치 한국 지사로부터 구입하여 사용하였다.
세포주에서 CD137의 세포내 이입 확인 실험은, 먼저 배양된 CD137 발현 세포주인 CTLL-R8과 CD137이 형질이입(transfection)된 EL-4 세포를 수확한 후, PBS로 2회 세척하고 각각의 세포를 채취하여 PE 형광이 표지된 항 CD137 항체로 30 분간 4 ℃에서 염색하였다. 염색 후 PBS로 3회 세척하여 CD137과 결합하지 않은 PE-항 CD37 항체를 제거하고 세포배양액(RPMI1640-10% FBS+항생제)에 현탁하여 4시간 배양하였다. 배양 후 세포를 수확하였고 폴리 L 라이신이 코팅 된 슬라이드에 세포를 부착하여 마운팅 솔루션(Fluoromount G; Southern biotech)으로 고정하고 형광 현미경(올림푸스 FV500)으로 PE-항 CD137 항체의 세포내 위치를 확인하였다.
<1-2> 마우스 세포주 및 T 세포에서 CD137-항 CD137 항체 결합체의 세포내 이입 확인
항 CD137 항체와 결합한 CD137-항 CD137 항체 결합체의 세포내 이입을 확인하기 위하여 비장과 림프절로부터 면역세포를 분리하였다. 분리된 면역세포를 5ⅹ106/ml 로 계수하여 세포 배양액(RPMI1640 + 10% FBS + 항생제) 10ml에 현탁하고 항 마우스 CD3 mAb를 0.2 μg/ml의 농도로 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 배양 후, 세포를 수확하고 PBS로 2회 세척한 다음, 일부 세포(1ⅹ106)를 채취하여 PE 형광이 표지된 항 CD137 mAb-PE와 FITC 형광이 표지된 항 CD4 mAb-FITC 또는 항 CD8 mAb-FITC와 동시 염색하여 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포에서 CD137의 발현 수준을 확인하였다. CD137의 발현이 확인 되면 배양된 면역 세포는 MACS 방법을 통하여 CD4+ T 세포와 CD8+T 세포를 순수 분리 하였다. 분리된 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포에 PE 형광이 표지된 항 CD137 항체를 0.4 μg/ml로 30 분간 4 ℃에서 결합시키고 PBS로 3회 세척하여 CD137과 결합하지 않은 PE-항 CD37 항체를 제거한 다음, 세포배양액(RPMI1640(10% FBS가 포함되지 않음) + 항생제)에 현탁하여 4시간 배양하였다. 4 시간 세포 배양 후, 다시 세포를 수확하고 FITC 형광이 표지된 항 CD8 mAb(clone:)로 30분간 4℃에서 염색하고 PBS로 3회 세척하였다. 세척 후 4% 파라포름알데히드로 15 분간 세포를 고정시키고 PBS로 3회 세척하였고, 0.25 % Triton X100을 처리함으로써 침윤(permablization) 시켰다. 이후 FITC 형광으로 표지된 항 EEA-1 항체를 처리하여 1시간 염색하였으며, 염색이 끝난 후 PBS로 3회 세척하여 폴리 L 라이신이 코팅된 슬라이드에 세포를 부착시켰고, 마운팅 솔루션(Fluoromount G; Southern biotech)으로 고정한 다음, 형광현미경(올림푸스 FV500)으로 PE-항 CD137 항체의 세포 내 위치를 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 배양 0 시간에는 세포 표면에 위치하는 PE-항 CD137 항체가 배양 4 시간일 경우, 세포주와 T 세포(CD4+ T 세포, CD8+ T 세포)에서 세포 내로 이입되어 있는 것으로 나타났다. 또한 이러한 세포 내 이입이 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 유도되는지 확인하기 위해 엔도사이토시스 마커인 EEA-1로 동시 염색하여 확인한 결과, 본 발명에 따른 CD137 및 CD137-항 CD137 항체 결합체는 엔도사이토시스에 의해 세포내로 이입된다는 사실을 알 수 있었다.
<1-3> 인간과 원숭이 T 세포에서 CD137-항 CD137 항체 결합체의 세포내 이입 확인
인간 말초 혈액과 원숭이 말초혈액(서울대 병원 특수생명자원센터)으로부터 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 Ficoll-paqueTM plus(GE healthcare, Sweden)을 사용하여 말초 혈액으로부터 분리하였다. 분리된 단핵구는 계수하여 5x106/ml로 세포수를 맞추고 10 ml의 세포 배양액(RPMI1640 + 10 % FBS + 항생제)에 현탁하여 0.2 μg/ml 의 농도로 항 CD3 mAb(human clone : OKT-3, monkey clone:FN-18;U-cytech bioscience, Netherlands)와 함께 24 시간 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 배양 후, CD137 발현 수준을 확인한 다음, CD137이 발현되면 배양된 세포를 2회 세척하여 PE 형광이 표지된 항 인간 CD137 항체를 30 분간 4 ℃ 반응시켜 결합시킨 뒤, PBS로 3회 세척하여 CD137과 결합하지 않은 PE-항 인간 CD37 항체를 제거하였고, 세포배양액(RPMI1640-10% FBS+항생제)에 현탁하여 4시간 배양하였다. 4 시간 세포 배양 후 세포를 수확하고 FITC 형광이 표지된 항 CD8 mAb(clone:)로 30분간 4℃에서 염색한 다음, 다시 PBS로 3회 세척하였다. 세척 후 4% 파라포름알데히드로 15 분간 세포를 고정시키고 PBS로 3회 세척한 다음, 0.25 % Triton X100을 처리하여 permablization 시켰다. 이후 FITC 형광으로 표지된 항 EEA-1 항체를 처리하여 1 시간 염색하였다. 염색이 끝난 후 PBS로 3 회 세척하여 폴리 L 라이신이 코팅 된 슬라이드에 세포를 부착시켰고, 마운팅 솔루션(Fluoromount G; Southern biotech)으로 고정시키고 형광현미경(올림푸스 FV500)으로 PE-항 CD137 항체의 세포 내 위치를 확인하였다.
그 결과, 도 2a 내지 2c에 나타낸 바와 같이, 인간과 원숭이로부터 분리된 단핵구를 항CD3 항체와 함께 배양할 경우, T 세포(CD4+ T세포, CD8+ T 세포)에서 CD137이 발현되는 것을 확인할 수 있었으며(도 2a 참조). 항 CD137 항체를 활성화된 T 세포의 CD137과 결합시켜 배양하였을 경우에도 마우스 경우와 동일하게 CD137-항 CD137 항체 결합체가 세포내로 이입되었음을 확인할 수 있었다(도 2b 및 2c 참조).
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 사용한 항 CD137 항체가 CD137 양성 세포의 내부로 독소를 전달하여 세포를 제거하기 위한 운반 물질로 매우 적합하다는 사실을 알 수 있었고, 또한, 항 CD137 항체가 독소의 전달을 위해 마우스 뿐 만 아니라 원숭이 및 인간세포 까지도 활용이 가능하다는 사실을 알 수 있었다.
<실시예 2>
항 CD137 항체-독소루비신 결합물의 합성
상기 실시예 1의 실험을 통해 항 CD137 항체가 CD137과의 결합에 의해 세포내로 이입된다는 사실을 확인함으로써 CD137 양성 세포로 전달할 독소를 선별하고 항 CD137 항체와의 결합물을 합성하였다. 상기 독소 물질로는 항암제의 일종인 독소루비신을 선택하였고, 항 CD137 항체(clone : 3H3, 3E1)에 독소루비신이 결합된 결합물은 펩트론(peptron, 대전)사에 의뢰하여 제작하였는데, 먼저 MPBH:독소루비신을 1:10의 비율로 황산나트륨이 함유된 DMSO에 첨가한 후, 50℃에서 30분간 반응시키고 원심분리하여 황산나트륨을 제거하였다. 이후 에테르를 이용하여 침전물을 생성시킨 다음, 동결건조시켜 활성화된 독소루비신을 수득하였다. 그런 뒤, 상기 활성화된 독소루비신을 항 CD137 항체에 결합시키기 위해 항 CD137 항체를 환원시켰는데, 즉, 40mM DTT 1ml 중에 있는 16mg의 항 CD137 항체를 5mM EDTA가 함유된 0.1M 인산나트륨 용액(pH 7.5)로 37℃에 40분간 부분적 환원반응을 시켰다. 이후 2mM EDTA가 함유된 50mM ABS(acetate buffered saline) 용액(pH 5.3)으로 탈염시킨 후, 엘르만 테스트를 이용하여 자유 티올기를 정량하였다. 그런 다음, 1.5ml의 아세테이트 버퍼에 15mg의 항 CD137 항체를 용해시키고, 500ul DMSO에 2mg의 독소루비신을 각각 용해시킨 다음, 상기 두 용해시킨 용액을 혼합하여 얼음 상태에서 pH를 7.2가 되도록 보정시켰다. 이후 얼음 상태에서 2시간 동안 반응시킨 후, PBS 용액으로 탈염시켜 상기 부분 환원된 항 CD137 항체의 시스테인에 독소루비신이 결합된 결합물을 제조하였다. 상기 결합물은 FPLC 수행을 통해 순수 분리하였으며, 제작된 결합물이 CD137 분자와 정상적으로 결합하는지 여부를 확인하였는데, 이를 위해 제작된 상기 결합물에 FITC 형광을 표지하였고(CD137-독소루비신-FITC), 항 CD137 항체(CD137-FITC)와 CD137에 대한 결합력을 비교하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 항 CD137 항체에 독소루비신이 결합된 결합물은 FPLC 수행을 통해 순수 분리되었음을 확인할 수 있었고, 상기 결합물에 대한 CD137에 대한 결합력 측정 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이 항 CD137 항체에 독소루비신을 결합시켜도 CD137과 정상적으로 결합됨을 확인 할 수 있었다.
<실시예 3>
항 CD137 항체-독소루비신 결합물의 in vitro에서 세포사멸 활성 및 세포증식 억제 활성 측정
<3-1> 항 CD137 항체-독소루비신 결합물의 세포사멸 활성 측정
정상 마우스와 CD137 결핍 마우스의 비장과 림프절로부터 분리된 면역세포를 0.2 μg/ml 농도로 항 CD3 항체를 처리하여 세포배양액에서 24시간 배양하였다. 이후 배양된 세포를 수확하여 PBS로 2회 세척하고 세포를 소량(1x105 cells) 채취하여 PE-항 CD137 mAb 와 FITC-항 CD8 mAb 또는 FITC-항 CD4 mAb와 30 분간 4 ℃에서 형광 염색 하였다. 염색 후 PBS로 2회 세척하고 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포에서 CD137의 발현 수준을 유세포 분석기(FACS caliber, BD)로 확인하였으며, CD137의 발현을 확인 후 배양된 세포(1x106 cells)에 상기 실시예 3에서 제조한 본 발명의 항 CD137 항체-독소루비신과 대조군으로 독소루비신만을 농도별로 처리하여 30 분간 4℃에서 반응시키고, 반응 후 결합하지 않은 항 CD137 항체-독소루비신 결합물의 제거를 위하여 PBS로 3회 세척하였다. 세척 후 세포 배양액 0.5 ml에 현탁하여 48웰 세포 배양용기에서 48 시간 추가 배양하였다. 배양 후 세포를 수확하여 Annexin V로 20 분간 염색하였고 유세포분석기로 Annexin V 양성 세포의 비율을 분석하였다. 또한, 본 발명에 따른 항 CD137 항체-독소루비신 결합물이 세포 사멸과의 직접적인 연관성을 확인하기 위하여 위와 동일한 방법으로 마우스 T 세포에 CD137을 발현시키고, FITC 형광이 표지된 항 CD137 항체-독소루비신을 처리하여 24 시간 배양 한 후, PE-Annexin V로 염색하여 항 CD137 항체-독소루비신 결합물과 Annexin V의 형광 위치의 상호 관계를 유세포 분석기로 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항CD137 항체-독소루비신 결합물에 의한 세포 사멸 효능을 마우스 세포주와 비장 면역세포에서 확인한 결과, CD137을 발현하는 CTLL-R8에서 항CD137 항체-독소루비신 결합물에 의한 세포 사멸 정도는 농도 의존적으로 세포 사멸이 증가되는 것으로 나타났다(도 4b 참조). 또한, CD137이 발현되는 조건의 마우스 면역세포에 항CD137 항체-독소루비신 결합물을 처리하여 세포사멸 효과를 측정한 결과, 본 발명의 결합물의 농도에 의존적으로 T 세포(CD4+ T 세포, CD8+ T 세포)가 사멸되는 것으로 나타났다(도 5a 참조). 반면, 이러한 세포 사멸 효능은 CD137이 유전적으로 결핍된 마우스의 비장 면역세포에서는 관찰되지 않는 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 항-CD137 항체를 이용한 독소루비신의 세포 내 전달은 CD137에 대해 특이적으로 발생된다는 것을 알 수 있었고, 나아가 독소루비신이 결합된 항CD137 항체가 CD137 양성 세포의 선택적 제거에 효과적인 물질임을 알 수 있었다.
<3-2> 항 CD137 항체-독소루비신 결합물의 세포증식 억제 활성 측정
CD137 발현되는 조건의 면역세포(항 CD3 mAb 자극)를 2 x 105/well로 계수하어 96웰 세포배양 용기에 분주하고, 항 CD137 항체, 항 CD137 항체-독소루비신 결합물 및 독소루비신을 5 μg/ml의 농도로 각각 처리한 다음 48시간 배양하였다. 배양 40 시간째에는 방사선 동위원소로 표지된 1μCi의 티미딘(thymidine:3H)을 각 웰이 처리하였다. 그런 뒤 48 시간째 배양된 세포를 동위 원소 측정 장치(micro beta counter)를 이용하여 동위원소의 세포내 양을 각 실험 그룹을 대상으로 비교하였다.
그 결과, 일반적으로 항 CD137 항체는 활성화된 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포의 CD137과 결합하여 세포의 증식과 분화를 유도한다고 알려져 있는데, 이러한 보고 내용과 같이 상기 항CD137 항체만을 처리한 경우에는 면역 세포의 증식이 유도되는 것으로 나타났다. 반면, 본 발명의 항CD137 항체- 독소루비신 결합물은 항 CD137 항체에 의한 면역세포의 증식을 유의적인 수준으로 억제하는 것으로 나타났다(도 5b 참조). 또한, 독소루비신이 결합된 항 CD137 항체가 실제로 CD137 양성 세포와 결합하여 세포사멸을 유도하는지 확인하였는데, 도 5c에 나타낸 바와 같이, CD8+T 세포 중 Annexin V 양성인 세포에서 항CD137 항체-독소루비신 결합물이 양성으로 존재하는 것으로 나타났다.
따라서 상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 항CD137 항체-독소루비신 결합물은 세포의 증식을 유도하지 않는 반면, 세포사멸을 유도하는 활성이 있다는 것을 알 수 있었고, 독소루비신이 결합된 항CD137 항체는 CD137 양성 세포에 대해 선택적으로 세포 사멸을 유도한다는 사실을 알 수 있었다.
<실시예 4>
항 CD137 항체-독소루비신 결합물의 in vivo 에서의 효능 확인
상기 실시예 3을 통해 본 발명에 따른 항 CD137 항체-독소루비신 결합물이 in vitro에서 CD137 양성 세포에 대해 선택적으로 세포사멸을 유도하고 세포증식을 억제하는 활성이 있음을 확인함에 따라 본 발명자들은 상기와 같은 활성이 in vivo에서도 이루어지는지를 확인하였는데, 이를 위한 실험 모델로 이식편대 숙주질환 (Graft-versus-Host disease, GVHD) 마우스를 사용하였다. 일반적으로 급성 GVHD 모델은 이식된 공여면역세포 특히, 활성화된 T 세포에 의해 매개되는 질환으로 잘 알려져 있다. 구체적으로 상기 in vivo 실험을 위해 먼저, 급성 GVHD를 유도하기 위하여 수혜 마우스(recipient mouse)로는 BDF1 마우스를 사용하였고, 공여 마우스(donor mouse)는 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 이후 준비된 상기 BDF1 마우스를 750 rad로 방사선 조사하고 조사된 마우스에 공여 마우스의 골수 세포(5 x 106 cell/mouse)와 비장에서 분리된 면역세포(2.5 x 107/mouse)를 꼬리 정맥 주사 하였다. 세포 주사 후, 하루 간격으로 마우스를 희생시켜 비장과 림프절, 혈액을 채취하고 채취된 각각의 시료에서 면역세포를 분리하여 FITC-항 CD4 mAb + PE-항 CD137 mAb 또는 FITC-항 CD8 mAb+ PE-항 CD137 mAb를 동시 염색하여 CD4+T 세포와 CD8+ T 세포에서의 CD137 발현 수준을 유세포 분석기를 이용하여 확인하였다. 또한, 본 발명에서 제작한 항 CD137 항체-독소루비신 결합물의 투여는 급성 GVHD 유도 후 7 일째 100 μg/mouse로 복강 주사 하였으며 대조군으로 항 CD137 항체만을 투여한 군과 아무것도 처리하지 않은 군을 사용하였다. 급성 GVHD 유도 후 질병의 정도를 가늠하기 위하여 매일 체중 변화를 측정하였으며 마우스의 생존률을 확인하였다.
그 결과, 급성 GVHD를 유도 후 T 세포내 CD137 분자의 발현이 어떠한지를 조사한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 급성 GVHD 유도에 의해 CD137은 발현되는 것을 확인 할 수 있었고, 림프절 CD4+T 세포와 CD8+ T 세포의 경우, 질병이 유도된 지 7~8일째 발현 수준이 정점에 도달하는 것으로 나타났다. 반면, 비장 T 세포의 경우에는 7~8일째 정점에 도달하여 지속되는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 본 발명자들은 in vivo에서 항 CD137 항체에 의해 CD137 양성 세포의 제거가 가능함을 예상할 수 있었다.
또한, 급성 GVHD에 따른 CD137의 발현 양상을 토대로, CD137 발현이 최고점에 이르는 7일째 항CD137 항체-독소루비신 결합물을 복강 주사하여 치료 효과를 확인하였는데, 치료 효과에 대한 지표로 체중의 변화와 생존율을 조사하였다. 그 결과, 도 7에서 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 군과 항 CD137 항체만을 투여한 대조군에서는 급격한 체중 감소와 생존율의 저하가 확인된 반면, 항 CD137 항체-독소루비신 결합물이 투여된 군에서는 투여 시점 후 체중의 회복세와 생존율이 증가하는 것으로 나타났다(도 7a 및 7b 참조). 따라서 이러한 결과로 본 발명자달은 본 발명에 따른 항 CD137 항체-독소루비신 결합물이 급성 GVHD를 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있었고, 나아가 본 발명의 결합물은 in vitro 뿐만 아니라 in vivo에서도 CD137 양성 T 세포의 제거가 가능하기 때문에 특정 질환을 치료하기에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 5>
항 CD137 항체- 사포린 결합물의 합성
항 CD137 항체에 결합하는 독소로서 독소루비신 이외에 사포린을 사용하여 항 CD137 항체에 사포린이 결합된 결합물을 합성하였다. 상기 사포린이 결합된 결합물의 합성은 다양한 타입의 이차 항체에 결합된 사포린을 일차 항CD137 항체와 결합시켜 제조하였는데, 상기 이차 항체에 결합된 사포린은 Advanced Targeted System사로부터 구입한 것을 사용하였다. 또한, 하기 실험에서 마우스 실험의 경우에는 항-rat IgG-사포린을 사용하였고, 인간 실험의 경우에는 항 mouse IgG-사포린을 사용하였다. 또한, 마우스에 사용한 항 CD137 항체의 경우에는 IgG 타입이 rat IgG이므로 항-rat IgG-사포린은 항체의 rat IgG와 결합이 가능하다. 반면, 인간에 사용한 항 CD137 항체는 IgG 타입이 mouse IgG 이므로 항-mouse IgG-사포린이 항CD137 항체의 mouse IgG와 결합 가능하다. 본 실시예에서는 사포린을 이차 항체에 결합된 형태로 일차 항 CD137 항체와 결합시켜 항 CD137 항체-사포린 결합물을 제작하였으며 상기 결합물을 하기 실시예들에서 사용하였다. 항체-사포린 결합물은 제작은 사포린을 7 mg/ml의 농도로 pH가 9.0인 50 mM sodium borate buffer에 녹이고 최종 농도가 1mM이 되도록 2-iminothiolane을 가하여 60분 동안 반응시켰다. 반응 후 Sulfyhyryl group이 도입 된 사포린을 Sephadex G25 column으로 gel filtration 을 하여 분리해 내고 분리된 사포린을 20 mM의 2-메르켑토에탄올로 환원 시켜 Sephadex G25 column으로 filter하여 환원형의 사포린을 분리 하였다. 분리된 사포린과 항체를 10:1 molar 비율로 혼합하여 실온에서 16시간 반응 시킨 후 Sephacryl S200 high-resolution column으로 gel filtration 하고 pH 7.4의 phosphate-buffer saline(PBS)로 pH를 보정하며 항체-사포린 결합물을 용출하였다(Bolognesi A 등, Br J Haematol . 2000 Aug;110(2):351-61:“In vitro anti-tumour activity of anti-CD80 and anti-CD86 immunotoxins containing type 1 ribosome-inactivating proteins”참조).
<실시예 6>
항 CD137 항체- 사포린 결합물의 세포사멸 활성 측정
<6-1> 세포주에 대한 세포사멸 측정
CD137이 형질이입(transfection)된 EL-4 세포주(5x105 cells)에 rat IgG, 항 CD137 항체, rat IgG + 항 rat IgG-사포린, 항 CD137 항체 + 항 rat IgG-사포린을 각각 1μg/ml의 농도로 처리하고 24시간 및 48시간 동안 각각 배양한 후, 세포들을 수확하여 FITC 형광 효지된 Annexin V로 염색하여 각 실험군에 대한 세포사멸을 유세포 분석기를 통해 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 세포 사멸이 관찰되지 않았지만, 항 CD137 항체와 항 rat IgG-사포린을 처리한 군에서는 유의적인 수준으로 세포사멸이 증가되는 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과를 통해 본 발명에서 사용한 사포린의 경우 세포의 선택적인 제거와 세포독성을 증가시키기 위한 물질로 사용하기에 적합하다는 것을 알 수 있었다.
<6-2> 마우스 세포에서의 항 CD137 항체- 사포린 결합물의 세포사멸 활성
마우스의 비장과 림프절로 부터 분리된 면역세포를 0.2μg/ml 농도로 항 CD3 항체를 처리하여 세포배양액에서 24시간 배양하였다. 배양된 세포를 수확하여 PBS로 2회 세척하고 세포를 소량(1x105 cells) 채취하여 PE-항 CD137 mAb 와 FITC-항 CD8 mAb 또는 FITC-항 CD4 mAb와 30 분간 4 ℃에서 형광 염색 하였다. 염색 후 PBS로 2회 세척하고 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포에서 CD137의 발현 수준을 유세포 분석기(FACS caliber, BD)로 확인하였다. CD137의 발현을 확인 후 배양된 세포(5x105 cells)에 rat IgG, 항 CD137 항체, rat IgG + 항 rat IgG-사포린, 항 CD137 항체 + 항 rat IgG-사포린을 각각 1μg/ml의 농도로 처리하여 48웰 세포배양 플레이트에서 48 시간 세포 배양 하였다. 배양 후, 세포를 수확하여 PBS로 2 회 세척하고 PE-Cy5-항 CD4 mAb, PE-항 CD8 항체, FITC-Annexin V로 염색하여 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포에서 Annexin V의 양성 비율을 유세포 분석기로 분석하였다.
그 결과, 비장에서 분리된 면역세포를 항 CD3 항체로 자극하여 활성화 시키면 T 세포에서 CD137 분자가 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 활성화된 T 세포에 대하여 각각의 항체를 처리한 경우, 항 CD137 항체와 항 rat IgG-사포린을 처리한 군에서는 대조군 비해 유의적의 수준으로 세포사멸이 증가하는 것으로 나타났다(도 9 참조). 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 항 CD137 항체를 통한 사포린의 세포 내 전달 방법이 CD137 양성 세포를 선택적으로 제거하는데 효과적이라는 사실을 알 수 있었다.
<6-3> 인간 세포에서의 항 CD137 항체- 사포린 결합물의 세포사멸 활성
인간 말초 혈액으로부터 분리된 단핵구를 0.2 μg/ml 농도로 항 CD3 항체를 처리하여 세포배양액에서 24시간 배양하였다. 배양된 세포를 수확하여 PBS로 2회 세척하고 세포를 소량(1x105 cells) 채취하여 PE-항 CD137 mAb 와 FITC-항 CD8 mAb 또는 FITC-항 CD4 mAb와 30분간 4℃에서 형광 염색 하였다. 염색 후 PBS로 2회 세척하고 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포에서 CD137의 발현 수준을 유세포 분석기(FACS caliber, BD) 확인하였다. CD137의 발현을 확인 후, 배양된 세포(5x105 cells)에 대하여 4B4(항진성 항체), 4785(길항성 항체), 4B4 + 항 mouse IgG-사포린, 4785 + 항 mouse IgG-사포린을 각각 1μg/ml의 농도로 처리하여 48웰 세포배양 플레이트에서 48 시간 세포 배양 하였다. 세포 배양 후 배양 된 세포를 수확하여 PBS로 2 회 세척하고 FITC-Annexin V로 염색하여 Annexin V의 양성 비율을 유세포 분석기로 분석하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 항진성 항체(agonistic antibody-clone: 4B4)와 길항성 항체(antagonistic antibody-clone :4785) 모두에서 유의적의 수준으로 세포사멸이 일어나는 것을 확인하였으며, 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 마우스 뿐 만 아니라 인간 면역세포에서도 항 CD137 항체-사포린이 CD137 양성 세포의 제거에 효과적이라는 사실을 알 수 있었다.
<실시예 7>
항 CD137 항체-사포린 결합물에 의한 동종 항원 특이적인 T 세포의 세포분열억제 활성 측정
본 발명에 따른 항 CD137 항체-독소 결합체는 CD137 양성 T 세포에 선택적으로 결합하고 독소를 전달하여 세포사멸을 유도한다는 사실을 상기 실시예들을 통해 확인하였다. 따라서 본 발명자들은 항원의 종류와 무관하게 CD137이 발현되는 조건의 활성화 상황에서 본 발명에 따른 항 CD137-독소 결합물이 CD137 양성 세포를 제거 할 수 있을 것으로 예상함에 따라 동종 항원 특이적인 T 세포에서 항 CD137 항체-사포린 결합물에 의한 세포분열 억제 활성을 측정하였다. 상기 측정을 위해 준비한 시료 및 세포들의 처리는 다음과 같다.
(1) 항원 제시 세포( APC )의 분리 및 준비
마우스의 비장 및 인간 혈액(50 ml)에서 분리된 면역 세포를 세포 배양액에서 24시간 배양한 후, 부유 세포를 제거하고 플레이트를 PBS로 2회 세척하였다. 세척 후 플레이트에 Trypsin-EDTA를 처리하여 부착된 세포를 수확하고 PBS로 다시 2회 세척하여 2ml의 PBS로 재현탁한 후, 15ml의 튜브에 옮겨 넣었다. 이후 준비된 세포를 방사선 조사기에 넣고 3000 rad의 방사선량을 조사 하였다. 방사선 조사 후 세포배양액으로 1회 세척하고 세포수를 계수하여 1x106 cells/ml로 맞추고 실험에 사용하였다.
(2) CFSE 표지( labeling )하기
마우스의 비장 및 인간 혈액에서 분리된 면역 세포를 계수하여 1x107의 세포를 PBS 7 ml에 현탁하고 CFSE(Molecular Probe)를 0.25 μg 처리하여 5 분간 37℃에서 빛을 차단하고 배양하였다. 5 분간 배양 후 FBS를 3ml 가하여 30 초간 배양하고 PBS로 3회 세척하여 실험에 사용하였다.
(3) in vitro MLR
상기 방법으로 준비된 항원제시세포(1x105 cells)와 CFSE 표지된 면역세포(2 x 105 cells)를 1:2 비율로 혼합하여 항 CD3 항체를 0.2 μg/ml로 처리한 후, 24 시간 48웰 배양 플레이트에서 배양 하였다. 배양 된 세포를 수확하여 CD137의 발현을 확인하고, 각각의 항체와 항 rat IgG-사포린, 항 mouse IgG-사포린을 각각 1μg/ml로 처리하여 48 시간 배양하고 48 시간 후 세포를 수확하여 PBS로 2 회 세척하였다. 세척 후 유세포 분석 용액(2% BSA-PBS)에 부유하여 PE-Cy5-항 CD4 항체와 PE-항 CD8 항체로 염색하여 CFSE의 형광정도를 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포에서 유세포분석기(FACS)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, in vitro MLR(Mixed Lymphocyte Reaction)을 이용하여 CD137 양성 T 세포가 항 CD137 항체-사포린 결합체에 의해 제거 가능한지 상기 방법으로 측정한 결과, T 세포에서 30~40%의 CD137 양성 T 세포가 관찰되었고, CD137의 발현을 확인한 후 세포 배양액에 각각의 항체를 처리하여 세포의 분열 횟수에 따른 증식율을 확인한 결과, 대조군의 경우에는 CD4+ T 세포는 2회의 세포분열이 관찰되었고, CD8+ T 세포는 5회의 세포 분열이 관찰된 반면, 항 CD137 항체와 항 rat IgG-사포린이 처리된 실험군은 CD4+ T 세포(2회 -> 0회)와 CD8+ T 세포(5회->3회)에서 유의적으로 세포분열이 억제되는 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 항 CD137 항체를 통한 사포린의 세포 내 전달은 동종 항원에 대한 CD137 양성 T 세포를 선택적으로 제거하고 증식을 억제하는 활성이 우수함을 알 수 있었다(도 11 참조). 또한, 여기서 CFSE의 희석 정도는 세포의 증식 횟수를 의미한다하는 것으로서 세포가 분열할수록 CFSE 형광 정도는 감소한다.
또한, 인간 in vitro MLR법을 이용하여 CD137 양성 T 세포가 항CD137 항체-사포린에 의해 제거 될 수 있는지 확인하기 위하여 기증자의 말초 혈액으로부터 분리된 항원제시세포를 방사선 조사(3000 rad)하고 CFSE로 표지된 다른 기증자의 T 세포를 1:2 비율로 혼합하여 0.2 μg/ml의 항 인간CD3 항체와 함께 MLR 조건을 조성한 후, 24시간째 배양된 세포를 채취하여 CD137의 발현 수준을 확인한 결과, T 세포에서 25~35%의 CD137 양성 T 세포가 관찰되는 것으로 나타났다. 또한, CD137의 발현을 확인 한 다음 세포 배양액에 각각의 항체를 1 μg/ml의 농도로 처리하여 세포의 분열 횟수에 따른 세포 증식율을 확인한 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 항 CD137 항체와 항 mouse IgG-사포린을 처리한 군에서는 세포분열이 유의적으로 억제되는 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 항 CD137 항체를 통한 사포린의 세포 내 전달이 인간 동종 항원에 의한 CD137 양성 T 세포의 선택적 제거와 증식 억제에 효과적이라는 사실을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

  1. 항 CD137-항체 및 독소의 결합물을 CD137이 발현되는 CD137 양성세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 시험관 내에서 CD137 양성세포를 제거하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 CD137 분자에 대한 항진성(agonist) 항체 또는 길항성(antagonist) 항체인 것을 특징으로 하는 CD137 양성세포를 제거하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 독소는 시클로포스포마이드(Cyclophosphamide), 멜팔란(Melphalan), 마이토신 C(Mitomycin C), 비젤레신(Bizelesin), 시스플라틴(Cisplatin), 독소루비신(Doxorubicin), 에토포시드(Etoposide), 미토잔트론(Mitoxantrone), SN-38, Et-743, 액티노마이신 D(Actinomycin D), 벨로마이신(Bleomycin), TLK286, SGN-15 및 플루다라빈(fludarabin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 화학치료제; 아그로스틴(Agrostin), b-32, 부가닌(Bouganin), 캄포린(Camphorin), 커신(Curcin), 겔로닌(Gelonin), JIP60, 모모르딘(Momordin), PAP(Pokeweed antiviral protein), 사포린, 트리코산틴(Trichosanthin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 타입 I 리보솜 비활성 단백질; 아브린(Abrin), 리신(Ricin), 미슬토 렉틴 I(Mistletoe lectin I), 모데신(Modeccin), 볼켄신(Volkensin), RIP, 란세올린(Lanceolin),스테노댁틸린(Stenodactylin), 아라린(Aralin) 및 리프록시민(Riproximin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 타입 II 리보솜 비활성 단백질; 디프테리아 독신(diphtheria toxin)및 베놈 독신(venom toxin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CD137 양성세포를 제거하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항 CD137-항체 및 독소의 결합물은 CD137 양성세포의 세포사멸을 촉진시키거나 CD137 양성세포의 세포증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 CD137 양성세포를 제거하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 CD137 양성세포는 자가면역 질환, 이식편 거부증, 이식편대 숙주질환, 암질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 질환과 관련된 것을 특징으로 하는 CD137 양성세포를 제거하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 CD137 양성세포는 CD137이 발현되어 활성화된 세포로서, T 세포, B 세포, 수지상세포(Dendritic Cell), NK(Natural killer)세포, 대식세포, 암세포 및 호중구, 호염구, 호산구를 포함하는 골수(myeloid) 세포로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CD137 양성세포를 제거하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 항 CD137-항체 및 독소의 결합물은 CD137 양성세포와 접촉시 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 CD137 양성세포를 제거하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 독소는 항 CD137-항체(일차 항체) 또는 항 CD137-항체에 대한 이차 항체에 결합되는 것을 특징으로 하는 CD137 양성세포를 제거하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 항 CD137-항체 및 독소의 결합물은 0.1~5.0ug/ml의 농도로 CD137 양성세포에 처리하는 것을 특징으로 하는 CD137 양성세포를 제거하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016310348B2 (en) * 2015-08-26 2023-01-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhanced depletion of targeted cells with CD47 blockade and an immune costimulatory agonist
US10111966B2 (en) 2016-06-17 2018-10-30 Magenta Therapeutics, Inc. Methods for the depletion of CD117+ cells
IL268058B2 (en) * 2017-01-20 2023-09-01 Magenta Therapeutics Inc Compositions and methods for depleting cd137 plus cells
KR20210035805A (ko) 2018-06-15 2021-04-01 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 세포후 신호전달 인자의 조절을 통한 면역 활성의 증가
AU2019312200A1 (en) * 2018-07-23 2021-02-25 Heidelberg Pharma Research Gmbh Use of anti-CD137 antibody drug conjugate (ADC) in allogeneic cell therapy
AU2020263959A1 (en) 2019-04-24 2021-11-25 Heidelberg Pharma Research Gmbh Amatoxin antibody-drug conjugates and uses thereof
MA55805A (fr) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V Inc Métodes de modulation de l'activité immunitaire
JP2023509359A (ja) 2019-12-17 2023-03-08 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド 鉄依存性細胞分解の誘導物質との併用抗癌療法
CN116096906A (zh) 2020-06-29 2023-05-09 旗舰创业创新五公司 工程化以促进萨诺传递的病毒及其在治疗癌症中的用途
KR20230165276A (ko) 2021-03-31 2023-12-05 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 타노트랜스미션 폴리펩티드 및 암의 치료에서의 이의 용도
EP4363059A1 (en) 2021-06-29 2024-05-08 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080019905A9 (en) * 2005-02-18 2008-01-24 Strome Scott E Method of using an anti-CD137 antibody as an agent for radioimmunotherapy or radioimmunodetection

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