EA024629B1 - Моноклональные антитела, связывающие b7h6, и их применение - Google Patents

Abstract

Предложены моноклональные антитела, специфически связывающие молекулу В7Н6 семейства В7, включая антитела, способные подавлять взаимодействие В7Н6 с NKp30. Также предложены конъюгаты антитела против В7Н6 с лекарственными средствами, содержащие моноклональное антитело против В7Н6, конъюгированное с терапевтическим веществом. Данные антитела против В7Н6 и конъюгаты антител с лекарственными средствами применимы для оказания терапевтических эффектов против В7Н6-экспрессирующих клеток, а также в диагностических приложениях для детекции В7Н6 или экспрессирующих В7Н6 клеток.

Description

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США №°61/285018 поданной 9 декабря 2009 г., описание которой включено в данную заявку во всей полноте посредством отсылки.

Область техники

Данное изобретение относится к антителам, в частности моноклональным антителам, связывающим лиганд опухолевых клеток, обозначаемый как В7Н6. Также изобретение относится к способам применения данных антител.

Уровень техники

Семейство В7.

Положительные и отрицательные ко-стимуляторные сигналы играют решающую роль при регуляции активности лимфоцита. Показано, что опосредующие такие сигналы молекулы являются эффективными мишенями для иммунорегуляторных агентов. Например, связывание лигандов В7-1 или В7-2 на поверхности антиген-презентирующих клеток (АРС) с СО28, ко-стимуляторным рецептором наивных Тлимфоцитов, обеспечивает сигнал к пролиферации и дифференцировке Т-лимфоцита в ответ на связывание Т-клеточного рецептора (ТсК). В то же время, связывание рецептора СТЬА4, гомологичного СО28, приводит к ингибированию пролиферации и эффекторных функций Т-клеток. (См. СйатЪеге е! а1., Апп. Кеу. 1ттипо1, 19:565-594, 2001; Едеп е! а1, Иа!иге 1ттипо1, 3:611-618, 2002.)

В последнее время активно изучается роль ряда молекул, гомологичных семейству В7, в процессе активации лимфоцитов (АЪЪак е! а1., ΝηΙ. МеБ, 5:1345-6, 1999; Соу1е е! а1, ΝηΙ. 1ттипо1, 2: 203-9, 2001; Саггепо е! а1., Аппи. Кеу. 1ттипо1, 20: 29-53, 2002; Ыапд е! а1., Сигг. Орш. 1ттипо1, 14: 384-90, 2002). Такими новыми ко-стимуляторными контррецепторами являются молекулы В7Ь2, ΡΌ-Ы, ΡΌ-Ε2, В7-Н3 и В7-Н4.

Экспрессия известных на настоящий момент молекул семейства В7 в основном ограничена антиген-презентирующими клетками. По современным данным на лимфоидных клетках эти молекулы выступают в роли контррецепторов, взаимодействующих с соответствующими им рецепторами на лимфоцитах и обеспечивающих, таким образом, позитивные или негативные ко-стимуляторные сигналы, играющие решающую роль в регуляции клеточного иммунного ответа. НК-клетки и рецептор ΝΚρ30

Натуральные киллеры (НК-клетки) являются важной субпопуляцией лимфоцитов и составляют в среднем около 15% от мононуклеарной фракции клеток периферической крови у человека. Впервые, НКклетки были функционально описаны в 1971 г. на основе экспериментов по изучению отторжения клеток костного мозга (ВМС) трансплантируемых от мышей других линий или от мышей родительской линии летально облученным мышам (см. С’иБо\\тс/ апБ Веппе!!, 1. Ехр. МеБ. 134:83-102, 1971; С’иБо\У1с/ апБ Веппе!!, 1. Ехр. МеБ. 135:1513-1528, 1971). СиБо\\тс/ и Веппе!! в своих экспериментах наблюдали отторжение ВМС от родительской гомозиготной линии Н2 (А или В), трансплантированных гетерозиготным гибридам первого поколения линии Н2 (А х В). Это наблюдение шло в разрез с классическими законами трансплантологии того времени, согласно которым считалось, что тканевые антигены наследуются кодоминантно и потомки, полученные в результате скрещивания, будут, таким образом, толерантны к родительским антигенам главного комплекса гистосовместимости (МНС) (см. С'иБозую/ апБ Веппе!!, 1. Ехр. МеБ. 134:83-102, 1971). Ответственные за описанный процесс клетки были радиологически устойчивы и идентичны лимфоидным клеткам, для которых позднее, в 1975 г., была показана цитотоксическая активность против клеток опухоли ш уйго. осуществляемая по МНС-независимому пути (см. НегЪегтап апБ Ойа1Бо, 8с1епсе, 214:24-30, 1981; Ойа1Бо апБ НегЪегтап, Аппи. Кеу. 1ттипо1. 2:359-394, 1984; ТгшсЫеп, АБу. 1ттипо1. 47:187-376, 1989; Мигрйу е! а1., I. №ιΐ1. Сапсег 1п§!. 85:1475-1482, 1993). Дальнейшие доказательства того, что НК-клетки сами по себе могут опосредовать отторжение костномозгового трансплантата были получены в 1987 году, когда было показано, что у мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (линия 8СГО), у которых нет Т- и В-лимфоцитов, функция НК-клеток в норме (см. Митрйу е! а1., I. Ехр. МеБ. 165:1212-1217, 1987).

В настоящее время считается, что НК-клетки являются важной составляющей системы врожденного иммунитета и играют основную роль при борьбе иммунной системы с опухолевыми и вирусинфицированными клетками. Однако, до активации НК-клетки не способны выполнять свои функции, даже если присутствуют в достаточном количестве. Сниженная активность НК-клеток ассоциирована с развитием онкологических и инфекционных заболеваний (См. Уата/аО е! а1., Опсо1оду Керотй 9:359363, 2002; КокепЪетд е! а1., Сапсег Кекеатсй 51:5074-5079 (8ирр1.), 1991; ВгШеепБеп е! а1., Сапсег 77:12261243, 1996; и.8. Ра!еп! Иов. 5082833 и 4883662). В то же время, как сказано выше, НК-клетки опосредуют острое отторжение аллогенных трансплантатов ВМС. Таким образом, различные уровни активности НКклеток, по-видимому, играют важную роль в развитии заболеваний, обусловленных нарушениями функций иммунной системы.

В норме активность НК-клеток регулируется посредством взаимодействия между молекулами МНС 1-типа с ингибиторными и активационными рецепторами НК-клеток (см., например, Вагао апБ МитрЬу, ВВ&МТ 9:727-741, 2003). Гипотеза неправильный свой (тймпд §е1£) изначально основана на наблюдении, что опухолевые клетки, не несущие на своей поверхности молекул МНС-Ι, убиваются НК- 1 024629 клетками (см. Цииддгеи апб Кагге, 1ттипо1. Тобау 11:237-244, 1990; ОЫеи е! а1., 1. 1ттипо1. 145:52-58, 1990). Кроме того, было показано, что человеческие НК-клетки способны лизировать трансфецированные вирусом Эпштейна-Барр клетки В-лимфобластоидных линий не экспрессирующие МНС (З!огки8 е! а1., Ргос. Νηΐ1. Асаб. 8е1. ИЗА 86:2361-2364, 1989). Также было показано, что трансфекция генами МНС-1 клеток, дефектных по МНС-Ι, приводит к частичной или полной устойчивости данных клеток к лизису, опосредуемому НК-клетками (см. З1огки8 е! а1., 8ирга; 81ιίιηίζιι апб ИеМагк, Еиг. 1. 1ттипо1, 19:447-451, 1989). Однако присутствия молекул МНС-Ι на поверхности целевых клеток не всегда достаточно для устойчивости к лизису НК-клетками, равно как распознавание молекул МНС-Ι на поверхности целевых клеток не всегда предотвращает их лизис НК-клетками (Вагао апб Мигрйу, ранее). В последние годы были открыты разнообразные МНСЛ-специфичные ингибиторные и активирующие рецепторы, а также активационные рецепторы, специфичные к другим молекулам. Такие рецепторы задействуются в различных терапевтических подходах, например при аллогенной трансплантации ВМС и противораковой терапии (См. 1б.)

Активирующие рецепторы, специфичные к не-МНС-Ι молекулам, опосредующие цитотоксичность НК-клеток против МНС-1-дефектных или МНС-1-негативных целевых клеток, представляют собой специфичное для НК-клеток гетерогенное семейство иммуноглобулин-подобных молекул, называемых рецепторами цитотоксичности НК-клеток (см., например, Могейа е! а1., Аппи. Реу. 1ттипо1. 19:197-223, 2001; Н1е£епЬасй апб Раи1е!, 1ттипо1. Реу., 181:170-184, 2001). При отсутствии экспрессии на клеточной поверхности молекул МНС-Ι (например, на опухолевых или вирус-инфицированных клетках) связывание таких активирующих рецепторов НК-клеток с лигандами запускает механизм лизиса целевой клетки. Одним из таких рецепторов является рецептор ΝΚρ30, селективно и конститутивно экспрессирующийся на зрелых НК-клетках. Сигналинг такого рецептора, ш!ег айа, включает в себя взаимодействие с субъединицей ΤΌ3ζ (См. Вагао апб Мигрйу, ранее) Лиганд для рецептора ΝΚρ30, экспрессирующийся на поверхности целевой клетки, до настоящего времени не был определен.

Данная система врожденного распознавания НК-клетками является потенциально мощным инструментом для клинических приложений при аллогенной трансплантации ВМС, противоопухолевой терапии или терапии других заболеваний, связанных с нарушением функционирования НК-клеток. (См., например, Вагао апб Мигрйу, ранее) Например, стимулиряция или ингибирование активации ΝΚρ30 может применяться для изменения активности НК-клеток и терапии заболеваний или расстройств, связанных с НК-клеточной активностью. В частности, повышение активности НК-клеток за счет связывания ΝΚρ30 было бы применимо при терапии заболеваний или расстройств, характеризующихся недостаточной активностью НК-клеток, таких как рак или инфекционные заболевания. Ингибирование НК-клеточной активности за счет блокировки ΝΚρ30 было бы применимо при терапии расстройств, опосредуемых НКклетками, например отторжения трансплантата при аллогенной трансплантации ВМС.

Недавно открытый и охарактеризованный член семейства В7 - В7Н6, является контр-партнером рецептора ΝΚρ30, который селективно экспрессируется на зрелых НК-клетках и функционирует в качестве активирующего рецептора при осуществлении НК-клетками своих функций (Вгапб! е! а1., 1. Εχρ. Меб., 206(7): 1495-1503, 2009). Молекула В7Н6 экспрессируется на опухолевых клетках человека и не экспрессируется нормальными клетками тканей.

Таким образом, существует необходимость в поиске антител, способных ингибировать взаимодействие В7Н6 с ΝΚρ30. Терапевтический потенциал применения таких антител основывается на их способности регулировать ко-стимуляторные сигналы и, таким образом, иммунный ответ. Кроме того, распознающие В7Н6 антитела, конъюгированные с цитотоксическими веществами, могут применяться против целевых клеток, экспрессирующих В7Н6. Такое применение, а также другие способы применения данных антител, являются весьма актуальными. Данное изобретение охватывает композиции и способы их применения, а также другие способы применения, очевидные для экспертов в данной области на основе сведений, приводимых в данной заявке.

Сущность изобретения

Объектом данного изобретения являются выделенные моноклональные антитела, специфически связывающиеся с внеклеточным доменом В7Н6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности ЗЕС ΙΌ ΝΟ:2). В одном варианте исполнения антитела содержат определяющие комплементарность участки (СИР) тяжелой и легкой цепей или последовательности тяжелой и легкой цепей антитела, продуцируемого гибридомным клоном 4Е5.5 (депозитный номер СЫСМ Ι-4242). В другом исполнении антитела содержат определяющие комплементарность участки (СИР) тяжелой и легкой цепей или последовательности тяжелой и легкой цепей антитела, продуцируемого гибридомным клоном 17В1.3 (депозитный номер СЫСМ Ι-4245).

В определенных вариантах исполнения описанные выше моноклональные антитела против В7Н6 являются мышиными антителами, гибридными антителами, гуманизированными антителами или человеческими антителами. В некоторых вариантах исполнения антитела способны конкурировать за связывание с внеклеточным доменом В7Н6 человека и ингибировать взаимодействие В7Н6 человека с ΝΚρ30. Ингибирование может быть полным или частично блокирующим, и может нейтрализовать или понизить

- 2 024629 силу взаимодействия. Подходящими антителами также являются одноцепочечные антитела. Другие варианты исполнения включают антитела, содержащие Рс фрагмент, обладающий, по крайней мере, одной из АПСС- или СЭС-активностей. В некоторых из таких вариантов, Рс-фрагмент является одноцепочечным (всРс). Каждое из используемых моноклональных антител, которые связывают В7Н6 человека, может входить в состав композиции, содержащей антитело и фармацевтически приемлемое средство доставки. Такие антитела применимы для диагностических наборов, где определяется связывание данного антитела.

Другим объектом настоящего изобретения является коньюгат антитела с лекарственным средством, в котором моноклональное антитело, специфически связывающееся с внеклеточным доменом В7Н6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности 8ЕЦ ГО N0:2), связано с цитотоксическим агентом. В некоторых вариантах исполнения антитело, являющееся частью коньюгата с лекарственным средством, представляет собой антитело, способное конкурировать за связывание с внеклеточным доменом В7Н6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности 8ЕЦ ГО N0:2), с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 4Е5.5 (депозитный номер СNСΜ 1-4242); с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 17В1.3 (депозитный номер СNСΜ 1-4245). Данное моноклональное антитело может быть, например, мышиным антителом, гибридным антителом, гуманизированным антителом или человеческим антителом. Подходящими антителами, так же, являются простые одноцепочечные антитела. В некоторых вариантах исполнения антитело содержит Рс-фрагмент, обладающий, по крайней мере, одной из ЛЭСС- или СЭС-активностей. В некоторых вариантах таких исполнений Рс-фрагмент представляет собой одноцепочечный Рс-домен (всРс). Цитотоксический агент может быть, к примеру, антитубулиновым агентом, веществом, связывающимся с малой бороздкой в спирали ДНК, веществом, алкилирующим малую бороздку ДНК, дуокармицином или пуромицином. Подходящим антитубулиновым агентом может быть, к примеру, доластатин, винкаалкалоид, подофиллотоксин, таксан, производное баккатина, криптофизин, майантозиноид или комбретастатин. В некоторых вариантах исполнения антитело связано с лекарственным средством через линкер, и в некоторых случаях линкер расщепляется под действием внутриклеточных условий. Применимые расщепляемые линкеры включают пептидные линкеры, включающие те, которые расщепляются внутриклеточной протеазой. Любые варианты исполнения конъюгатов антитела с лекарственным средством подходят для использования в составе композиций, включающих коньюгат антитела с лекарственным средством и фармацевтически приемлемый носитель.

К объектам данного изобретения также относятся способы снижения активности натуральных киллеров (НК-клеток) против клеток, экспрессирующих В7Н6 человека, путем подавления взаимодействия В7Н6 человека с человеческим ΝΚρ30. Такие способы обычно включают взаимодействие экспрессирующей В7Н6 человека клетки, в присутствии НК-клетки человека, с эффективным количеством моноклональных антител, конкурирующих за связывание с внеклеточным доменом В7Н6 человека с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 4Е5.5 (депозитный номер СNСΜ 1-4242) или с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 17В1.3 (депозитный номер. СNСΜ 1-4245), где антитело ингибирует взаимодействие В7Н6 человека с человеческим ΝΚρ30.

Также объектом данного изобретения являются способы применения антитела или его антигенсвязывающей части для лечения отторжения аллотрансплантата клеток костного мозга (ВМС) с помощью ингибирования взаимодействия В7Н6 человека с человеческим ΝΚρ30. Такие способы обычно включают прием в эффективном для ингибирования активности НК-клеток количестве и, таким образом, лечения острого отторжения аллотрансплантанта клеток костного мозга, моноклонального антитела, конкурирующего за связывание с внеклеточным доменом В7Н6 человека с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 4Е5.5 (депозитный номер СNСΜ 1-4242) или продуцируемым гибридомным клоном 17В1.3 (депозитный номер СNСΜ 1-4245), когда антитело ингибирует взаимодействие В7Н6 человека с человеческим ΝΚρ30.

Также объектом данного изобретения является композиция для лечения отторжения аллотрансплантата клеток костного мозга (ВМС) у пациента, содержащая антитело или его антигенсвязывающую и фармацевтически приемлемый носитель.

Способ снижения активности человеческих НК-клеток и способ применения для лечения отторжения аллотрансплантанта клеток костного мозга включают определенные варианты исполнений, в которых антитела являются человеческими или гуманизированными моноклональными антителами. Эти способы также включают варианты исполнения, где антитело является одноцепочечным.

Также к объектам данного изобретения относятся способы уничтожения или подавления роста В7Н6-экспрессирующих клеток внутри клеточной популяции, с помощью конъюгатов антител с лекарственным средством. Эти способы обычно включают взаимодействие В7Н6-экспрессирующих клеток с эффективным количеством коньюгата антитела с лекарственным средством, включающего (а) антитело, конкурирующее за связывание с внеклеточным доменом В7Н6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности 8ЕЦ ГО N0:2) с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 4Е5.5 (депозитный номер СЛСМ 1-4242); антителом, продуцируемым гибридомным клоном 17В1.3 (депозитный номер СЛСМ 1-4245); и (Ь) цитотоксическим агентом, конъюгированным с антителом.

Также к объектам данного изобретения относятся способы применения коньюгата антитела с лекар- 3 024629 ственным средством для лечения В7Н6-экспрессирующей опухоли. Эти способы обычно включают введение эффективного количества коньюгата антитела с лекарственным средством, содержащего (а) антитело, конкурирующее за связывание с внеклеточным доменом В7Н6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности 8ЕО ГО N0:2) с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 4Е5.5 (депозитный номер 0Ν0Μ 1-4242); или с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 17В1.3 (депозитный номер 0Ν0Μ 1-4245); и (Ь) цитотоксический агент, конъюгированный с антителом. Включены исполнения, в которых опухоль представляет собой рак толстой кишки, печени, шейки матки, легких, поджелудочной железы или простаты. Другими подходящими для терапии В7Н6-экспрессирующими опухолями являются, к примеру, прогемоцитарная лейкемия, В-клеточная лимфома, моноцитарная лимфома, эритролейкоз, лимфома Беркитта и хронический миелолейкоз.

Для способа уничтожения или подавления роста В7Н6-экспрессирующих клеток и/или для способа терапии В7Н6-экспрессирующей опухоли применимы человеческие или гуманизированные моноклональные антитела в качестве антител, входящих в состав коньюгата антитела с лекарственным средством. Для обоих способов также применимы одноцепочечные антитела, в качестве антител, входящих в состав коньюгата антитела с лекарственным средством.

Также к объектам данного изобретения относятся способы применения моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части для лечения В7Н6-экспрессирующей опухоли. Данный способ обычно включает введение эффективного количества моноклонального антитела, конкурирующего за связывание с внеклеточным доменом В7Н6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности 8Е0 ГО N0:2) с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 4Е5.5 (депозитный номер 0Ν0Μ I4242); или с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 17В1.3 (депозитный номер 0Ν0Μ I4245); когда антитело содержит Ре-фрагмент, обладающий ЛЭСС- и/или СЭС-активностью. Применимыми моноклональными антителами являются также человеческие антитела, гуманизированные антитела и одноцепочечные антитела. В некоторых вариантах исполнения Рс-фрагмент является одноцепочечным (ксРс). В7Н6-экспрессирующие опухоли, поддающиеся лечению, включают, к примеру, рак толстой кишки, печени, шейки матки, легких, поджелудочной железы или простаты, поддаются лечению. Другие подходящие опухоли, экспрессирующие В7Н6, включают, к примеру, прогемоцитарную лейкемию, Вклеточную лимфому, моноцитарную лимфому, эритролейкоз, лимфому Беркитта и хронический миелолейкоз.

Также объектом данного изобретения является композиция для лечения В7Н6-экспрессирующией опухоли у пациента, содержащая антитело или его антигенсвязывающую часть или конъюгата антитела с лекарственным средством и фармацевтически приемлемый носитель.

Также к объектам настоящего изобретения относятся способы определения клеточной экспрессии В7Н6, где связывание антитела указывает на присутствие В7Н6 на поверхности клетки. В общем, этот способ включает (1) взаимодействие биологического образца, содержащего человеческие клетки с моноклональными антителами, конкурирующими за связывание с внеклеточным доменом В7Н6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности 8Е0 ГО N0:2) с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 4Е5.5 (депозитный номер СNСΜ 1-4242); или с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 17В1.3 (депозитный номер СNСΜ 1-4245); и (2) определение связывания антитела, при этом связывание указывает на присутствие В7Н6 на поверхности клетки и показывает экспрессирует ли клетка В7Н6. В некоторых вариантах исполнения биологические образцы для исследования представляют собой интактные человеческие клетки или мембранную фракцию клеток. В некоторых вариантах исполнения используются антитела с детектируемыми метками. Подходящие метки включают радиоизотопы, флуоресцентные метки, хемилюминисцентные метки, ферментные метки или биолюминисцентные метки.

К объектам настоящего изобретения также относятся также способы диагностики больных с подозрением на опухоль, клетки которой экспрессируют В7Н6. Этот способ обычно включает (1) введение больному моноклональных антител, конкурирующих за связывание с внеклеточным доменом В7Н6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности 8Е0 ГО N0:2) с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 4Е5.5 (депозитный номер СNСΜ 1-4242); с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 909.2 (депозитный номер СNСΜ 1-4243); с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 10Е2.9 (депозитный номер СNСΜ 1-4244); или с антителом, продуцируемым гибридомным клоном 17В1.3 (депозитный номер СNСΜ 1-4245), конъюгированных с детектируемой меткой; и (2) определение распределения антител в организме пациента. Подходящие применения включают диагностику рака толстой кишки, печени, шейки матки, легких, поджелудочной железы или простаты.

Другим объектом настоящего изобретения являются следующие клетки продуцирующие антитела: гибридомный клон 4Е5.5 (депозитный номер. СNСΜ 1-4242); гибридомный клон 909.2 (депозитный номер СNСΜ 1-4243); гибридомный клон 10Е2.9 (депозитный номер СNСΜ 1-4244); гибридомный клон 17В1.3 (депозитный номер СNСΜ 1-4245).

Подробное описание изобретения

I. Обзор

Настоящее изобретение относится к области идентификации и характеристики антител против

- 4 024629

В7Н6, которые связываются с клеточным поверхностным белком семейства В7, в частности моноклональных антител против В7Н6 человека.

Полипептид В7Н6 был впервые описан как контррецептор для рецептора ΝΚρ30 человека - селективно экспрессирующегося на зрелых НК-клетках активирующего рецептора, связанного с цитотоксическими функциями НК-клеток (см. И8 Ра1сп1 Аррйсабои РиЪНсайои Νο/2009|0220502), приводимый здесь во всей полноте посредством отсылки. Нуклеотидная последовательность, кодирующая В7Н6 человека, показана здесь как 8ЕО ГО N0:1, а кодируемый ею полипептид показан как 8Е0 ГО N0:2. Полипептид В7Н6 последовательности 8Е0 ГО N0:2 включает в себя внеклеточный домен размером около 242 аминокислотных остатков (остатки 25-266 последовательности 8Е0 ГО N0:2), трансмембранный домен размером около 18 аминокислотных остатков (остатки 267-284 последовательности 8Е0 ГО N0:2) и внутриклеточный домен размером около 158 аминокислотных остатков (остатки 285-454 последовательности 8Е0 ГО N0:2). Структура В7Н6 включает домен 1§У размером около 117 аминокислотных остатков (остатки 25-141 последовательности 8Е0 ГО N0:2) и домен 1§С размером около 97 аминокислотных остатка (остатки 142-238 последовательности 8Е0 ГО N0:2). Кроме того, в последовательности В7Н6 выделяют несколько потенциальных сигнальных мотивов, расположенных во внутриклеточной части молекулы, такие как мотив ΙΤΙΜ (§аУ1рЬ, аминокислотные остатки 293-298 последовательности 8Е0 ГО N0:2), мотив связывания §Н2 (ΥςΙΟ. аминокислотные остатки 229-332 последовательности 8Е0 ГО N0:2) и мотив связывания §Н3 (РбаРПРукР, аминокислотные остатки 418-427 последовательности 8Е0 ГО N0:2).

Настоящее изобретение касается получения моноклональных антител мыши против В7Н6 человека и характеристики свойств этих антител. С помощью гибридомной технологии были получены пять мышиных моноклональных антител с изотипом Ι§01 против В7Н6 человека. Полученные антитела обозначены как 4Е5.5, 5Е1.4, 909.2, 10Е2.9 и 17В1.3. С помощью конкурентных анализов было показано, что данные антитела связываются с разными эпитопами молекулы В7Н6. Антитела 17В1.3 и 4Е5.5 частично блокируют взаимодействие между М<р30 и В7Н6, о чем свидетельствует ингибирование связывания NΚρ30Ρс и активации Э0М§Р30.

Результаты этих экспериментов приводят в соответствие структуру и функцию и описаны в Примерах. Эти разные моноклональные антитела, как было показано, могут быть использованы для биохимических и диагностических анализов, а также имеют терапевтическое значение.

Таким образом, настоящее изобретение охватывает моноклональные антитела, связывающие мембранный белок В7Н6 человека с такой же или схожей специфичностью и другими характеристиками как МКА 4Е5.5, 5Е1.4, 909.2, 10Е2.9 и/или 17В1.3. Как описано в данной заявке, были получены мышиные моноклональные антитела и показана их способность связываться с различными эпитопами. Таким образом, одним объектом данного изобретения являются антитела, способные конкурировать за связывание с В7Н6 с описанными антителами (например, антитела, способные связывать те же самые эпитопы, что и антитела 4Е5.5, 909.2, 10Е2.9 и 17В1.3). Кроме того, для некоторых из этих антител показана способность воздействия на взаимодействие Β7Н6-NΚρ30. В соответствии с этим в некоторых вариантах исполнения моноклональные антитела против В7Н6 человека, описанные в настоящем изобретении, ингибируют активацию М<р30 опосредованную В7Н6.

Настоящее изобретение охватывает также гуманизированные антитела, полученные из анти-В7Н6 антител других организмов (напр. гуманизированные антитела мыши), нейтрализующие антитела, моноклональные антитела человека, а также антиген-связывающие фрагменты перечисленных антител. Типичными фрагментами антител являются Е(аЪ')2, Р(аЪ)2, РаЪ', РаЪ, Εν, зсЕу и минимальные единицы узнавания. Нейтрализующие антитела связываются с В7Н6 таким образом, что снижается сила или вовсе блокируется связывание В7Н6 с М<р30. Также к области данного изобретения относится моноклональное антитело, конкурирующее за место связывания с внеклеточным доменом В7Н6, которое может быть использовано для ингибирования иммунного ответа, обусловленного НК-клетками, например, при остром отторжении трансплантата ВМС, когда данное антитело вводится в терапевтически эффективных количествах для блокирования активности НК-клеток.

В соответствии с данным изобретением, анти-В7Н6 антитела также могут быть использованы для воздействия против В7Н6-экспрессирующих клеток, в частности против В7Н6-экспрессирующих клеток опухоли. Конъюгаты моноклональных антител против В7Н6 человека с лекарственным средством оказывают положительный клинический эффект против В7Н6-экспрессирующих клеток при введении субъекту, имеющему В7Н6-положительную опухоль. Такое антитело в основном вводится отдельно, однако может применяться и в комбинации с другими терапевтическими агентами. В наиболее распространенном варианте применения моноклональные антитела против В7Н6 человека конъюгированы с цитотоксическим агентом, в результате чего такой конъюгат при связывании или интернализации экспрессирующей В7Н6 клеткой (например, В7Н6-экспрессирующей клеткой опухоли) оказывает цитотоксический или цитостатический эффект.

Таким образом, некоторые объекты данного изобретения включают конъюгаты моноклональных антител против В7Н6 человека с лекарственными средствами. Часть такого конъюгата, представляющая собой антитело, будет связывать клеточный поверхностный белок человека В7Н6 с такой же или сходной специфичностью и другими характеристиками, как и описанные здесь. Часть конъюгата, представ- 5 024629 ляющая собой лекарственное средство будет оказывать терапевтическое воздействие (является терапевтическим агентом). Такой конъюгат анти-В7Н6 антитела с лекарственным средством будет оказывать положительный клинический эффект на В7Н6-экспрессирующие клетки при введении субъекту с опухолью, клетки которой экспрессируют В7Н6. Обычно часть такого конъюгата, которая является лекарственным средством, является цитотоксическим агентом и будет оказывать цитотоксический или цитостатический эффект на клетки, экспрессирующие В7Н6. В таких конъюгатах часть, являющаяся антителом, будет распознавать конкретные эпитопы молекулы В7Н6. Отдельные варианты таких конъюгатов влияют на взаимодействие В7Н6 с ΝΚρ30. Например, в некоторых вариантах исполнения, конъюгат моноклонального антитела против В7Н6 человека с лекарственным средством, в соответствии с настоящим изобретением, подавляет активацию НК-клеток за счет ΝΚρ30.

В других вариантах исполнения моноклональное антитело против В7Н6 человека содержит Рсфрагмент с эффекторной функцией, применяемый для активизации антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС) или комплемент-зависимой цитотоксичности (СЭС) против клеток, экспрессирующих В7Н6. Настоящее изобретение включает моноклональные антитела против В7Н6 человека, содержащие Рс-фрагмент, обладающий АЭСС-активностью, для применения в качестве индукторов АЭСС. В таком применении обычно В7Н6-экспрессирующие клетки взаимодействуют с эффективным количеством содержащих Рс-фрагмент моноклональных антител против В7Н6 человека в присутствии экспрессирующих Рс-рецептор эффекторных иммунных клеток, обладающих цитолитической активностью.

Эффекторными клетками иммунной системы, экспрессирующими Рс-рецепторы, вызывающие цитолитическую активность, являются, например, НК-клетки, а также отдельные субпопуляции СЭ8+ Тклеток. В вариантах исполнения, когда моноклональные антитела против В7Н6 человека, содержащие Рс-фрагмент с СЭС-активностью, используются для индукции СЭС, обычно, В7Н6-экспрессирующие клетки взаимодействуют, в присутствии белков системы комплемента, с эффективным количеством содержащих СЭС-активный Рс-фрагмент моноклональных антител против В7Н6 человека. В7Н6экспрессирующие клетки, которые могут являться мишенями для цитолиза с помощью антител и способов, заявляемых в данной заявке на изобретение, включают, например опухолевые клетки, такие как, например, клетки рака толстой кишки, клетки рака печени, клетки рака мочеиспускательного канала, клетки рака легкого, клетки рака поджелудочной железы, клетки рака простаты, клетки прогемоцитарной лейкемии, клетки В-клеточной лимфомы, клетки моноцитарной лимфомы, клетки эритролейкемии, клетки лимфомы Беркитта, клетки хронического миелолейкоза и многие другие.

Эти и другие объекты изобретения станут очевидны при последующем детальном описании. Кроме того, различные ссылки указываются ниже и включаются в данное описание во всей их полноте посредством отсылки.

II. Определения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же общепринятое значение, которое применяется специалистами в данной области по отношению к описываемым способам и композициям. При использовании в данной заявке следующие термины и выражения имеют принятое для них значение, если не указано иное.

Термин полипептид подразумевает собой полимер из аминокислот, соединенных пептидной связью, независимо натурального или синтетического происхождения. Полипептиды, состоящие менее чем из 10 аминокислотных остатков, традиционно обозначаются термином пептиды.

Термин белок означает макромолекулу, состоящую из одной или более полипептидных цепей. Белок также может содержать непептидные компоненты, например углеводные группы. Углеводные группы и другие заместители непептидной природы могут вноситься в белковую молекулу системами клетки, в которой синтезируется белок, и, таким образом, будут различаться в зависимости от типа клеток. В данном документе белки называются по структуре их аминокислотного скелета; такие заместители, как углеводные группы, в основном не указываются, хотя могут присутствовать.

Выражение очищенный полипептид обозначает полипептид, практически полностью очищенный от загрязняющих клеточных компонентов, таких как углеводы, липиды или другие белковые примеси, ассоциированные с данным полипептидом в естественных условиях. Обычно препарат очищенного полипептида содержит наиболее очищенную фракцию данного полипептида, т.е. с чистотой не менее 80%, не менее 90%, не менее 95%, более 95%, с чистотой 96, 97 или 98% или с большей степенью чистоты или с чистотой более 99%. Единственный способ демонстрации, что конкретный препарат полипептида содержит выделенный полипептид, - электрофореграмма данного препарата, полученная с помощью электрофореза в полиакриамидном геле в денатрурирующих условиях (ДСН-ПААГ -электрофорез) с окрашиванием красителем Кумасси бриллиантовый синий (Сооша881е ВпШаи! В1ие), на которой присутствует только одна полоса белковой природы. Однако термин очищенный не исключает присутствия того же полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры или альтернативно гликозилированные формы или производные.

Термины Ν-концевой и С-концевой применяются в данной заявке для обозначения положения внутри полипептидов. Там где позволяет контекст, эти термины используются с указанием конкретной последовательности или фрагмента полипептида для обозначения близости или относительности распо- 6 024629 ложения. Например, определенная последовательность, расположенная с С-конца относительно референсной последовательности внутри полипептида, может быть расположена проксимально от С-конца референсной последовательности, но не обязательно на С-конце последовательности всего полипептида.

Термин экспрессия обозначает биосинтез продукта гена. Например, в случае структурного гена экспрессия подразумевает транскрипцию последовательности структурного гена в последовательность мРНК и трансляцию этой мРНК в одну или более полипептидных цепей.

Используемый в данной заявке термин иммуномодулятор включает цитокины, ростовые факторы стволовых клеток, ко-стимуляторные молекулы, факторы гемопоэза и подобные им, а также синтетические аналоги данных молекул.

Используемый в данном документе термин антитело означает иммуноглобулиновые полипептиды и иммунологически активные части иммуноглобулиновых полипептидов, т.е. полипептиды иммуноглобулинового семейства или их фрагменты, содержащие сайт связывания антигена, который иммуноспецифически связывается со специфическим антигеном (например, внеклеточным доменом В7Н6).

Термин антиидиотипическое антитело означает антитело, связывающее вариабельный домен иммуноглобулина. В данном контексте, антиидиотипическое антитело связывается с вариабельным участком моноклонального антитела против В7Н6 человека. Таким образом, антиидиотипическое антитело является миметиком эпитопа молекулы В7Н6.

Термин фрагмент антитела означает часть антитела, такую как Р(аЬ')2, Р(аЬ)2, РаЬ', РаЬ и подобную им. Независимо от структуры фрагмент антитела связывает тот же антиген, который распознается интактным антителом. Например, фрагмент моноклонального антитела против В7Н6 человека связывает эпитоп на молекуле В7Н6.

Термин антитело также охватывает интактные антитела, полученные генно-инженерным путем, или их фрагменты. Например, химерные антитела, гуманизированные антитела, Ρν-фрагменты, состоящие из вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, полипептиды состоящие из вариабельного домена легкой цепи, рекомбинантные одноцепочечные антитела, у которых вариабельные домены легкой и тяжелой цепей соединены пептидным линкером (5сРν-белки), минимальные единицы узнавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые являются миметиками гипервариабельной области, а также схожие молекулы, также как синтетические антиген-связывающие пептиды и полипептиды.

Термин химерное антитело означает рекомбинантный белок, содержащий вариабельные домены и определяющие комплементарность участки (СЭР) из антитела грызуна, в то время как остальная часть молекулы антитела получена от антитела человека.

Термин гуманизированые антитела означает рекомбинантные белки, у которых участки, определяющие комплементарность и происходящие от моноклонального антитела другого, чем человек, организма (например, мыши), перенесены с вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей исходного антитела на вариабельный домен антитела человека. Создание гуманизированных антител, являющихся производными антител других, кроме человека организмов (например, мыши), и связывающих или нейтрализующих белки человека, для терапевтического применения у человека является сферой деятельности экспертов в соответствующей области.

Термины Рс-фрагмент, Рс-область или Рс-домен, используемые в данной заявке, являются синонимами и означают часть антитела, которая ответственна за связывание с рецепторами для антител на клетках и с компонентом С1с| системы комплемента. Рс означает кристаллиновый фрагмент - фрагмент антитела, который легко кристаллизуется, при получении кристалла белка. Отдельные белковые фрагменты, которые изначально были описаны с помощью протеолитического анализа, определяют общую структуру иммуноглобулинов. Согласно принятым в литературе определениям, Рс-фрагмент состоит из связанных дисульфидной связью шарнирных областей тяжелых цепей, а также С_н2 и С_н3 доменов. Однако в последнее время данный термин употребляется для обозначения одной цепи, состоящей из С_н3, С_н2 и по меньшей мере части шарнирной области, достаточной для формирования димера за счет дисульфидной связи со второй цепью такой же структуры. Литературный обзор по структуре и функциям иммуноглобулинов доступен по данной ссылке: Рйпат, ТЬе Р1авта Ρτοΐβίηβ, Уо1. V (Асайетю Ргевв, 1пс., 1987), рр. 49-140; и Рай1ап, Мо1. 1ттипо1. 31:169-217, 1994. При использовании в данном документе термин Рс включает варианты природных последовательностей.

Термины одноцепочечный Рс, одноцепочечный Рс-домен и всРс при использовании в данном документе синонимичны и означают фьюжн-полипептиды, содержащие мономеры Рс-доменов, соединенные посредством гибкого линкера таким образом, что два мономера Рс способны димеризоваться и формировать функциональный димерный Рс-домен, способный связываться с Рс-рецепторами. Одноцепочечные Рс-полипептиды более подробно описаны в международной патентной заявке Νο. νθ 08/0131242, озаглавленной §ш§1е СЬаш Рс, МеШойв о£ Мактд, апй МеШойв о£ Тгеа1теп1, и описание которых включается в данную заявку во всей полноте посредством отсылки.

Термин Рс-область обладающая АЭСС-активностью используемый в данной заявке, означает Рсфрагмент, способный обуславливать реакции антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС) посредством связывания с цитолитическим Рс-рецептором (например, РсуКШа) на цитолитической эффекторной иммунной клетке экспрессирующей данный Рс-рецептор (например, НК-клетке или СЭ8' Т- 7 024629 клетке).

Обобщающий термин система комплемента означает компоненты нормальной сыворотки, которые при взаимодействии с комплексами антиген-антитело на поверхности клетки способны осуществлять лизис клеток. Система комплемента состоит из группы сывороточных белков, которые последовательно функционируют в единой системе для осуществления лизирующего эффекта.

Термины классический путь активации системы комплемента и классическая система комплемента, используемые в данной заявке, являются синонимами и означают определенный каскад реакций для активации системы комплемента. Для осуществления данного пути активации необходимо присутствие комплексов антиген-антитело для инициации последовательного каскада взаимодействий девяти основных компонентов, называемых С1-С9. В результате некоторых стадий процесса активации образуемым продуктом является фермент, катализирующий реакцию последующей стадии. Данный каскад обеспечивает умножение сигнала и активацию большого количества компонентов системы комплемента при относительно слабом инициирующем сигнале.

Термин Ре-фрагмент обладающий СЭС-активностью, используемый в данной заявке, означает Рефрагмент, способный обуславливать реакции комплемент-зависимой цитотоксичности (СЭС) посредством связывания белка С'1с| системы комплемента и инициации классического пути активации системы комплемента.

Термин агент, используемый в данной заявке, означает элемент, вещество или другое молекулярное формирование, включающее, например, фармацевтическое, терапевтическое или фармакологическое вещество. Агенты могут быть естественными или синтетическими или являться их комбинацией. Терапевтическим агентом является агент, который оказывает терапевтический (например, положительный) эффект на клетку или ткань (например, на клетку или ткань экспрессирующую В7Н6, такую как В7Н6экспрессирующую клетку опухоли), либо отдельно, либо в комбинации с другим агентом (например, комбинация неактивного лекарственного средства с активирующим его ферментом). В отдельных областях данного изобретения терапевтический агент представляет собой агент, конъюгированный с антителом с получением конъюгата, применимого для терапии. Примерами терапевтических агентов являются лекарственные средства, токсины, иммуномодуляторы, соединения бора, фотоактивные агенты или красители, радиоизотопы. В некоторых вариантах исполнения терапевтическим агентом для конъюгации с антителом является агент, обладающий цитотоксическим или цитостатическим эффектом.

Термин цитотоксический эффект по отношению к эффекту, оказываемому агентом на клетку, означает уничтожение клетки. Термин цитостатический эффект означает ингибирование пролиферации клетки. Термин цитотоксический агент означает вещество, которое оказывает цитотоксический или цитостатический эффект на клетку, таким образом, соответственно, снижая численность или ингибируя рост клеток в клеточной популяции.

Детектируемой меткой является молекула или атом, которые могут быть конъюгированы с носителем в форме антитела, с образованием молекулы, применимой для диагностики. Примерами детектируемых меток являются хелаторы, фотоактивные вещества, радиоизотопы, флуоресцентные вещества, парамагнитные ионы и другие маркеры подвижных носителей.

Термин аффинная метка, применяемый в данной заявке, означает полипептидный фрагмент, который может быть присоединен ко второму полипептиду для детекции или очистки второго полипептида, или для образования сайтов связывания второго полипептида с субстратом. Принципиально любой пептид или белок, для которого доступно антитело или другой специфический связывающий агент, могут быть использованы в качестве аффинной метки. Аффинными метками могут являться полигистидиновый тракт, белок Α (Νί1δδοη е! а1., ЕМВО 1. 4:1075, 1985; Νίΐδδοη е! а1., МеЛобв Еи7ушо1. 198:3, 1991), глутатион-З-трнсфераза (Зтйй аиб Ιοίιηδοη. Оеие 67:31, 1988), аффинная метка О1и-О1и Сп^еитеуег е! а1., Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. Зет ИЗА 82:7952, 1985), вещество Р, пептид РЬАО (Ηορρ е! а1., Βΐοΐ£θΗηο1ο^ 6:1204, 1988), стрептавидин-связывающий пептид и другие антигенные эпитопы или связывающие домены. См. общий обзор Ροτ6 е! а1., Рго!ет Εχρκδδίοη аиб РипЛса1юп 2:95, 1991. Молекулы ДНК, кодирующие аффинные метки доступны у коммерческих поставщиков (например, Рйагташа Вго!есЬ, Р^δсаιа\γау. Νί).

Термин свободное антитело означает полноразмерное, по сравнению с фрагментом, антитело, не конъюгированное с каким-либо терапевтическим агентом. Свободные антитела могут быть поли- и моноклональными, а также являться некоторыми видами рекомбинантных антител: химерными или гуманизированными.

Термин моноклональное антитело означает антитело, имеющее происхождение от одного клона клеток, включая любые, прокариотические или эукариотические, клетки, а также фаговые клоны, и не обозначает способ их получения. Таким образом, термин моноклональное антитело при применении в данной заявке не ограничен только антителами, полученными с помощью гибридомной технологии.

Термин иммуноконъюгат означает конъюгат антитела с терапевтическим агентом или детектируемой меткой.

Термин эпитоп относится к любой белковой последовательности, способной специфично связываться с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, аминокислот или углеводных боковых цепей,

- 8 024629 и чаще всего обладают специфической пространственной структурой, а также специфическим распределением зарядов. Более определенно, термин В7Н6 эпитоп, используемый в данной заявке, относится к части полипептида В7Н6, обладающего антигенной или иммуногенной активностью у животных, предпочтительно у млекопитающих, а наиболее предпочтительно - у мыши или человека. Эпитоп, обладающий иммуногенной активностью, представляет собой часть полипептида В7Н6, которая вызывает иммунный ответ у животных. Эпитопом, обладающим антигенной активностью является часть В7Н6 полипептида, с которой иммуноспецифически связываются антитела, что определяется любым методом, принятым и известным в соответствующей области деятельности, например: с помощью различных иммуноанализов. Антигенные эпитопы могут не являться иммуногенными. Прерывистые эпитопы представляют собой конформационные эпитопы сформированные по меньшей мере из двух удаленных в первичной последовательности белка друг от друга фрагментов последовательности В7Н6. В присутствии денатурирующих растворителей (например, при Вестерн-блот анализе) конформационные эпитопы теряют способность специфически связываться с распознающей их молекулой.

Термин НК-клеточная активность, используемый в данной заявке, означает цитолитическую активность НК-клеток. Разработано большое количество тестов, которые хорошо известны специалистам в данной области, для детекции и/или мониторинга активности такого рода, включая, но не ограничиваясь, тестами, описанными в примерах в данной заявке.

Используемая в данной заявке фраза взаимодействие В7Н6 и ΝΚρ30 относится к прямому физическому взаимодействию (например, связыванию) и/или другому непрямому взаимодействию функционального рецептора В7Н6 и ΝΚρ30 на поверхности НК-клетки, которое приводит к стимуляции рецептора В7Н6 и/или ΝΚρ30 и передаче сигнала внутрь клетки.

Используемый в данной заявке термин блокирующее антитело относится к антителам, препятствующим (т.е. ингибирующим) взаимодействию В7Н6 и ΝΚρ30 и/или препятствующим активации НКклеток с помощью В7Н6, например, по результатам определения цитотоксической активности. Ингибирование может не являться полным и быть частичным, т.е. выражаться в снижении или ограничении активности по отношению к стандартной величине или величине контрольного эксперимента.

Выражение заболевание или расстройство характеризуемое присутствием В7Н6-экспрессирующих клеток, используемое в данной заявке, относится к любому заболеванию или расстройству, в развитии которых принимают участие, по меньшей мере частично, клетки экспрессирующие В7Н6. Такими патогенными клетками, например, могут являться клетки определенных видов опухолей. В соответствии с этим, типичными заболеваниями или расстройствами, характеризуемыми присутствием В7Н6экспрессирующих клеток, являются определенные виды рака. Такие заболевания и расстройства особенно поддаются определенным способам лечения, направленным против В7Н6-экспрессирующих клеток, что описано далее в данной заявке.

Выражения заболевание или расстройство, опосредованное МКр30-экспрессирующими клетками и заболевание или расстройство, характеризующееся повышенной активностью ΝΚρ30экспрессирующих клеток используются в данной заявке в качестве синонимичных выражений по отношению к заболеваниям или расстройствам, патология которых опосредована, по крайней мере отчасти, цитолитической активностью МКр30-экспрессирующих клеток. В некоторых случаях заболевания или расстройства, обусловленные МКр30-экспрессирующими клетками и патогенез которых опосредован, по крайней мере частично, цитолитической активностью НК-клеток, являются заболеваниями или расстройствами, обусловленными НК-клетками. Примером таких заболеваний или расстройств является острое отторжение аллотрансплантатов клеток костного мозга (ВМС). Такие заболевания и расстройства особенно поддаются определенным способам лечения, направленным против В7Н6-экспрессирующих клеток, что описано далее в данной заявке.

Термин эффективное количество в контексте описания в данной заявке лечения заболевания или расстройства опосредуемого МКр30-экспрессирующими клетками посредством введения субъекту блокирующих анти-В7Н6 антител, или в контексте описания лечения заболевания или расстройства, характеризующегося присутствием В7Н6-экспрессирующих клеток, посредством введения анти-В7Н6 антител или конъюгатов антитела с лекарственным средством субъектом, относится к такому количеству молекул, которого достаточно для подавления патогенеза или облегчения состояния по одному или более клиническим или диагностическим симптомам данного заболевания или расстройства у субъекта. Эффективное количество терапевтического агента вводится в соответствии со способами, описанными в настоящем изобретении, в режиме эффективного дозирования. Термин эффективное дозирование относится к сочетанию вводимого количества терапевтического агента и частоты введения, подходящих для осуществления лечения или профилактики данного заболевания или расстройства.

Вследствие недостаточной точности стандартных аналитических методов молекулярные веса и линейные размеры полимеров следует понимать как аппроксимированные значения. Когда такое значение указывается как около X или примерно X, величину данного значения следует понимать как указанную с точностью ±10%.

- 9 024629

III. Антитела к белкам В7Н6

Одним из объектов данного изобретения являются моноклональные антитела против В7Н6 человека, специфически связывающиеся с эпитопом В7Н6 человека (к примеру, с полипептидным фрагментом аминокислотной последовательности, содержащейся в остатках 25-266 последовательности 8ЕО ГО N0:2). В некоторых вариантах исполнения данные моноклональные антитела против В7Н6 человека способны ингибировать взаимодействие В7Н6 с ΝΚρ30. Ингибирование не обязательно является полным блокированием взаимодействия В7Н6 с ΝΚρ30, возможно снижение активности по сравнению с показаниями контроля или стандарта. В определенных вариантах исполнения моноклональные антитела против В7Н6 человека в соответствии с данным изобретением способны конкурировать за связывание с В7Н6 человека с антителом, продуцируемым одним из гибридомных клонов: 4Е5.5 (депозитный номер 0Ν0Μ 1-4242), 909.2 (депозитный номер 0Ν0Μ 1-4243), 10Е2.9 (депозитный номер 0Ν0Μ 1-4244), или 17В1.3 (депозитный номер 0Ν0Μ 1-4245). Данные четыре гибридомы депонированы в Национальную коллекцию культур микроорганизмов ( 0Ν0Μ, Институт Пастера, Париж, Франция) 18 ноября 2009 г. от имени Национального института здравоохранения и медицинских исследований (ΙΝ8ΕΚΜ).

Были идентифицированы, охарактеризованы и описаны пять мышиных моноклональных антител против В7Н6 человека. При характеристике антител показано, что определенные моноклональные антитела распознают различные эпитопы белка В7Н6, что показано с помощью анализов конкурентного связывания и описано в данной заявке. В дальнейшем, при характеристике антител показано, что два из них, по крайней мере частично, блокируют взаимодействие В7Н6 с ΝΚρ30.

Группирование антител по эпитопам может быть использовано для идентификации антител, которые попадают в область заявленного изобретения. Под группировкой антител по эпитопам понимается использование анализов конкурентного связывания для идентификации пар антител, которые способны или неспособны одновременно связывать белок В7Н6, таким образом, идентифицируя пары антител, связывающихся с теми же или перекрывающимися эпитопами белка. Эксперименты по группированию антител по эпитопам демонстрируют существование эпитопов с различной иммуногенностью. Для идентификации или картирования эпитопов на специфической аминокислотной последовательности белка В7Н6 требуются дополнительные данные.

Конкуренцию за связывание можно оценить для любых пар антител или фрагментов. К примеру, при использовании соответствующих реактивов для детекции, специфичность связывания антител или связывающих фрагментов из любого источника можно сравнить со специфичностью связывания описанных в данной заявке моноклональных антител. Группировка антител по эпитопам на основе конкуренции за связывание может быть выполнена с выделенными антителами или с супернатантами клеточных культур. Часто группировка по эпитопам выполняется для супернатантов клонов первого раунда, с целью выбора клонов для дальнейшего культивирования. Сравниваемые антитела должны обладать в значительной мере однородными доменами, связывающими антиген. В случае биспецифических или бифункциональных антител оценка специфичности связывания двух различных центров связывания или сортировка должны проводится независимо.

Специфичность связывания антител, описываемых в данном изобретении, может быть исследована любым известным в соответствующей области деятельности способом. Многие различные форматы анализов конкурентного связывания могут быть использованы для группировки по эпитопам. Набор иммунноанализов, которые могут быть использованы, включает, но не ограничивается следующими видами: системы конкурентных анализов, использующие такие методики, как вестерн блоттинг, радиоимунноанализы, ИФА, сендвич-иммунноанализы, иммуннопреципитационные анализы, преципитиновые анализы, гель-диффузионные преципитиновые анализы, иммуннорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы, иммуноанализы с белком А и реакции связывания комплемента. Такие способы являются потоковыми и хорошо известны в соответствующей области (см., к примеру, АизиЬе1 е! а1., ебз, 1994 Сиггеи! Рго1осо1з ίη ΜοΕοιιΕιγ Вю1оду, νοί. 1, ίοΐιη АПеу & зоиз, 1пс., Νον Уогк). Кроме того могут быть использованы такие обычные перекрестные конкурентные анализы, как описаны в АиЬЬоб1ез, А ЬаЬогаФгу Μαηυαΐ, Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬогаФгу, Еб Наг1оте аиб Эа\гб Еаие, 1988.

В1АС0КЕ® (0Е НеаЬЬсаге, Р1зсаа1атау, Νί) - один из множества вариантов форматов анализа поверхностного плазмонного резонанса, используемый для построения сгруппированных панелей моноклональных антител по эпитопам. По другим ссылкам, к примеру, ТЬе ЕрЬоре Μηρρίηβ Рго1осо1з, ΜеΐЬобз ίη ΜοΚαιΕίΓ Вю1оду, νο1. 66, 01еии Μογ^ еб. Нитаиа Ргезз, 1996, описаны альтернативные способы, которые могут быть использованы для связывания антител и, как ожидается, могут дать сопоставимую информацию о специфичности связывания антител с лигандом В7Н6. При использовании системы В1АС0РЕ® эксперименты по группировке по эпитопам проводятся с растворимыми, нативными или рекомбинатными антигенами. Такие исследования могут быть выполнены на системе В1АС0КЕ1000® (0Е НеаЬЬсаге, Р1зса1атау, Νί). Для управления анализом может быть использовано программное обеспечение В1А1одие® ν. 1.2. К примеру, для группирования мышиных моноклональных антител полученных против В7Н6 человека по аффинности связывания, козьи поликлональные антитела против 1§0-Рс мыши Иаскзои 1ттииоКезеагсЬ ЬаЬогаФпез, Аез1 Огоуе, РА) могут быть ковалентно иммобилизированы

- 10 024629 на сенсорном чипе В1АСОКЕ® СМ5 и использованы для связывания (захвата) первичных моноклональных антител в тесте. Незанятые сайты связывания Рс-фрагментов на чипе затем блокируются с использованием поликлональных 1дС-Рс-фрагментов Наскюп 1ттипоКе8еагсЬ каЬогаЮпсЦ Затем в систему вводится белок В7Н6, который специфически связывается с иммобилизованными первичными моноклональными антителами. Прибор В1АСОКЕ® измеряет массу белка, связавшегося с сенсорным чипом; связывание как первичного антитела, так и антигена В7Н6 может быть измерено для каждого цикла. После связывания первичных антител и антигена с чипом, в систему вводятся растворимые вторичные антитела, которые связываются с предварительно связанным антигеном. Если вторичные моноклональные антитела способны связывать антиген В7Н6 одновременно с первичными моноклональными антителами, такое связывание определяется В1АСОКЕ®. Если, однако, вторичные моноклональные тела не способны связывать антиген В7Н6 одновременно с первичными моноклональными антителами, дополнительное связывание не детектируется. Для каждого моноклонального антитела проводится отрицательный контроль относительно себя самого, с целью установления уровня фонового сигнала (отсутствие связывания).

Формат конкурентного ИФА без метки (ЬРС-ЕиЗА) также может использоваться для группировки антител по эпитопам. В этом способе, описанном Ыада!а и соавторами, 1 1ттипо1. МеФойз 292:141-155, 2004, используются биотинилированные молекулы В7Н6. Например, для группирования мышиных моноклональных антител, полученных против В7Н6, лунки планшета для микротитрования заполняют 100 мкл раствора с концентрацией 1 мкг/мл козьих специфических антител против ЦС-Рс-у мыши Даскюп 1ттипоКе8еагсЬ), разведенными в буфере В для ИФА (фосфатно-солевой буфер, 0.1% Т\\сеп 20, 1% бычий сывороточный альбумин). После связывания этих антител с подложкой в течении 3 часов при комнатной температуре, каждую кондиционированную среду содержащую моноклональные антитела разводят в буфере В для ИФА до концентрации моноклональных антител приблизительно 0,5 мкг/мл, и инкубируют в течение на ночи при 4°С с подготовленным планшетом для связывания с козьими антимышиными 1дС (тАЬ#1). Параллельно второй набор кондиционированных сред (тАЬ#2) разводят в пробирках из полистирола до концентрации приблизительно 0,5 мкг/мл моноклональных антител в буфере В для ИФА, смешивают с 50 нг/мл биотилированного В7Н6 и инкубируют в течение ночи при 4°С. После инкубации тАЬ#1 с антителами, сорбированными на подложке, планшет блокируется какими-либо не относящимися к эксперименту антителами, чтобы заполнить свободные центры связывания на планшете. Смеси тАЬ#2 с биотинилированным В7Н6 добавляют в планшет и инкубируют. В качестве контроля (отсутствие конкуренции) 50 нг/мл биотинилированного В7Н6 добавляют непосредственно (без предварительной инкубации с тАЬ#2) в лунки, содержащие иммобилизированный тАЬ#1. После инкубации с комплексом биотинилированного В7Н6 с тАЬ#2 в планшет добавляют 0,5 мкг/мл конъюгата стрептавидин-НКР (Р1егсе, КоскГогй, 111.). Количество связанного конъюгата в лунке визуализируется с помощью реакции с ТМВ-субстратом (ВюРХ ЕаЬога1ог1е8, ОМп§8 МИН, Мй.) и измерения поглощения при длине волны 450 нм с помощью спектрофотометра для микропланшетов (Мо1еси1аг ОеНсех 8РЕСТКАМАХ 340, §иппууа1е, СаПГ.). Если тАЬ#1 связывается с отличным от тАЬ#2 эпитопом, комплекс биотинилированного В7Н6 с тАЬ#2 будет связываться с планшетом, приводя к высокому уровню сигнала поглощения. Если тАЬ#1 связывается с тем же эпитопом, что и тАЬ#2, комплекс биотинилированного В7Н6 с тАЬ#2 не будет связываться с планшетом, приводя к низком уровню сигнала поглощения.

В некоторых вариантах исполнения моноклональные антитела против В7Н6 человека, описанные в настоящей заявке, способны ингибировать взаимодействие В7Н6 с человеческим ΝΚρ30; такие антитела применимы, к примеру, для ингибирования клеточных или других физиологических событий, связанных с взаимодействием В7Н6 с ΝΚρ30, включая, к примеру, В7Н6- и/или NΚρ30-опосредованный внутриклеточный сигналинг и ассоциированная с ним эффекторная функция (например, №<р30-опосредованная цитолитическая активность).

Антитела к В7Н6 могут быть получены, например, с использованием в качестве антигена продукта экспрессионного вектора для наработки В7Н6 или В7Н6, выделенного из природного источника.. В частности применимые моноклональные антитела против В7Н6 человека «специфически связывают» В7Н6. Антитела считаются специфически связывающими, если обладают хотя бы одним из следующих двух свойств: (1) антитела связывают В7Н6 с пороговым значением активности связывания, и (2) антитела не обладают значительной кросс-реактивностью по отношению к полипептидам, относящимися к В7Н6.

В отношении первой характеристики антитела специфически связываются, если они связываются с полипептидом В7Н6, пептидом или эпитопом с аффинностью связывания (КД 10⁶ М^-1 или более, а наиболее предпочтительно - 10⁹М^-1 или более. Аффинность связывания антитела может быть легко определена с помощью одного из обычных способов, применяемых в соответствующей сфере, например, с помощью анализа Скэтчарда (8са1сПагй, Апп. ΝΥ Асай. 8е1. 51:660, 1949). В отношении второй характеристики антитела не обладают значительной кросс-реактивностью по отношению к иным полипептидам, например, если при вестерн-блоттинге данные антитела детектируют В7Н6 и не реагируют с известными в настоящее время полипептидами. Примеры известных полипептидов, относящихся к анализу, включа- 11 024629 ют известные белки семейства В7.

Моноклональные антитела против В7Н6 человека могут быть получены с помощью антигенных эпитоп-содержащих пептидов и полипептидов. Пептиды и полипептиды, несущие антигенные эпитопы обычно содержат последовательность, содержащую не менее девяти или 15-30 аминокислот из аминокислотной последовательности δΕΟ ГО N0:2. Однако для индукции выработки антител, которые связывают В7Н6, также применимы пептиды и полипептиды включающие большую часть аминокислотной последовательности, описываемой в данной заявке, 30 до 50 аминокислотных остатков, или любой длины вплоть до полноразмерной последовательности полипептида В7Н6. Желательно, чтобы аминокислотная последовательность пептида, несущего эпитоп выбиралась так, чтобы обеспечить достаточную растворимость в водном растворе (к примеру, последовательность включает относительно гидрофильные остатки, в то время как гидрофобные остатки обычно избегают). Кроме того, аминокислотные последовательности, содержащие остатки пролина также желательны для получения антител.

Потенциальные антигенные сайты связывания В7Н6 могут быть идентифицированы с помощью метода Джеймсона-Вульфа, 1атезои аиб Ао1Г (СЛБ108 4:181, 1988), как это реализовано в программе ΡΚ0ΤΕΛΝ (версия 3.14) ΕΑδΕΚΟΕΝΕ (ΌΝΑδΤΑΚ; Μαάίδοη. ΑΙ). Для данного анализа могут использоваться параметры по умолчанию.

Метод Джеймсона-Вульфа предсказывает потенциальные антигенные детерминанты с помощью комбинирования шести основных подпрограмм для предсказывания структуры белков. К примеру, метод Хоппа-Вудса (см. Норр е! а1., Ргос. ΝαΙ'Ι Асаб. δει. υδΑ 78:3824, 1981) может быть использован для идентификации областей аминокислотной последовательности с наибольшей локальной гидрофобностью (параметр: усреднение по 7 остаткам). На второй стадии может применяться метод Эмини (см. Ειηίηί е! а1., 1. Уйо1оду 55:836, 1985) для подсчета поверхностных вероятностей (параметры: порог принятия решения по поверхности (0.6) = 1). На третьей стадии может быть использован метод Карплюса-Шульца, Кагр1и8 и 8с1ш11/ (№1иго188еп8сЬаГ1еи 72:212, 1985) для предсказания гибкости цепи скелета (параметры: порог гибкости (0.2) = 1). На четвертой и пятой стадиях анализа к полученным данным могут применяться предсказания вторичной структуры с помощью метода Чоу-Фасмана (см. СЬои, РгебюНои оГ Рго!еш 81гис1ига1 С1а88е8 Ггот Атто Лаб СотрозПюи, в РгебюНои оГ Рго!еш 81гис1иге апб Не Рйис1р1е8 оГ Рго!ет СоиГогтаНои 549-586 (Разтаи, еб, Р1еиит Ргезз 1 990) и метода Гарниера-Робсона (см. Оат1ег е! а1., 1. Мо1. Бю1. 120:97, 1978) (параметры метода Чоу-Фасмана: таблица конформаций = 64 белка; порог для α области = 103; порог для β области = 105; параметры метода Гарниера-Робсона: α и β константы решения = 0). На шестом шаге анализа могут быть комбинированы параметры гибкости и факторы гидрофобности и доступности остатков растворителю для определения значения профиля поверхности, называемого антигенный индекс. Наконец, функция расширения пиков может быть применена к антигенному индексу, которая увеличивает основные пики поверхности путем добавления, например, 20, 40, 60 или 80% от соответственного значения пика, чтобы учесть дополнительную свободную энергию, возникающую из подвижности поверхностных участков по сравнению с внутренними участками. Эти вычисления, однако, обычно не применяют к любым основным пикам, которые располагаются в спиральных участках, поскольку спиральные участки имеют тенденцию к снижению гибкости.

Способы получения моноклональных антител обычно известны. К примеру, моноклональные антитела грызунов к специфическим антигенам могут быть получены способами, известными специалистам в данной области, (см., например, КоЫег е!. а1., №Ииге 256:495, 1975; Сойдаи е!. а1. (ебз.), Сиггеи! Рго!осо1з ш 1ттиио1оду, Уо1. 1 2.5.1-2.6.7 (1оЬи Абеу & 8оиз 1991) [Сойдаи]; РюкПеу е! а1., Ргобисбои оГ тоиос1оиа1 аиНЬоб1е8 адатз! ргоЮиъ ехргеззеб ш Ε. сой, ш ΌΝΑ С1отид 2: Εxр^е88^οи 8у§!ет8, 2иб ВбИю!·! 93 (С1оуег е! а1., ебз., ОхГогб иЫуегзПу Ргезз 1995). В определенных вариантах исполнения моноклональные антитела получают вводя мышам композицию, содержащую продукт гена В7Н6 (например, полипептид, содержащий или состоящий из остатков 25-266 последовательности δΕρ ГО N0:2), после чего проверяют наличие антител, отбирая образец плазмы, выделяют селезенку для получения В-лимфоцитов, после чего проводят слияние В-лимфоцитов с миеломными клетками для получения гибридом, затем клонируют гибридомы, отбирают положительные клоны, продуцирующие антитела к антигенам, культивируют клоны для наработки антител к целевому антигену и выделяют антитела из культур гибридом.

Моноклональные антитела против В7Н6 человека также могут быть человеческими антителами или производными этих антител. Человеческие моноклональные антитела могут быть получены, к примеру, из трансгенных мышей, продуцирующих человеческие антитела в ответ на иммунизацию антигеном. В данной методике элементы локуса тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина человека введены в геном линий мышей, полученных из линий эмбриональных стволовых клеток, содержащих целевые делеции локусов эндогенных тяжелой и легкой цепи. Трансгенные мыши могут синтезировать человеческие антитела специфические для человеческих антигенов, такие мыши могут использоваться для получения гибридом, секретирующих человеческие антитела. Способы получения человеческих антител из трансгенных мышей описаны, к примеру, Огееи е! а1., ШШге Оеие!. 7:13, 1994; ЬоиЬегд е! а1., №Циге 368:856, 1994; аиб Тау1ог е! а1., 1и!. 1ттии. 6:579, 1994.

Альтернативные способы получения или селекции моноклональных антител включают, к примеру,

- 12 024629 презентацию белка В7Н6 или пептида лимфоцитам ίη νίΐτο и последующий выбор антител из фаговых или сходных библиотек, кодирующих антитела (к примеру, с помощью иммобилизированного или меченого белка В7Н6 или пептида). Методики создания и скрининга таких библиотек, кодирующих антитела, известны в соответствующей области (см, к примеру, и.8. Ра!еп! Νοδ. 5580717; 5885793; 5969108 апД 6040136).

Моноклональные антитела могут быть выделены из клеточных культур и очищены с помощью широкого набора хорошо разработанных методик. Такие методики выделения включают, к примеру, аффинную хроматографию на белок-А-сефарозе, гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию (см., например, СоНдап а! радез 2.7.1-2.7.12 апД радез 2.9.1-2.9.3; Вашез е! а1., Рипйса!юп οί 1ттипод1оЪи1ш С (1дС), ш Ме!НоДз т Мо1еси1аг Вю1оду (Уо1. 10) 79-104 (ТНе Нитапа Ргезз, 1пс. 1992)).

Аминокислотная последовательность моноклонального антитела может быть изменена с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Таким образом, структура антител может быть изменена для получения необходимых характеристик. Модифицированные антитела могут обладать, например, лучшей стабильностью и/или терапевтической эффективностью относительно их немодифицированных форм. Возможных вариантов много и они варьируют от замены одной или нескольких аминокислот до почти полной перестройки, например, вариабельной или константной области. Изменения в константной области будут в основном осуществляться для того, чтобы улучшить или изменить такие характеристики, как связывание компонентов системы комплемента, взаимодействие с мембранами и другие эффекторные функции. Обычно изменения в вариабельной области могут осуществляться для того чтобы улучшить характеристики связывания антигена, повысить стабильность вариабельной области или снизить риск иммуногенности. Также могут быть использованы методики фагового дисплея (см., например, Низе е! а1., 8с1епсе 246:1275-1281, 1989; ЬаДпет е! а1., и.8. Ра!еп! №. 5571698).

В некоторых вариантах исполнения моноклональные антитела против В7Н6 человека являются фрагментами антител, содержащими антиген-связывающие домены интактного (полноразмерного) антитела. Такие фрагменты антител могут быть получены, например, с помощью протеолитического расщепления антител. Фрагменты антител могут быть получены с помощью расщепления пепсином или папаином интактных антител стандартными способами. В качестве примера, фрагменты антител могут быть получены с помощью ферментативного расщепления антител пепсином с получением 58 фрагмента, обозначаемого Р(аЪ')2. Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с помощью тиолвосстанавливающего агента с получением одновалентных 3.58 РаЪ'-фрагментов. Опционально реакция расщепления может быть проведена с использованием блокирующей группы для сульфгидрильных групп, образующихся при расщеплении дисульфидных связей. Как альтернативный вариант, ферментативное расщепление с использованием пепсина напрямую приводит к образованию двух одновалентных РаЪфрагметов и Рс-фрагмента. Эти способы описаны, например, в и.8. ра!еп! №. 4331647 !о Со1ДепЪегд; №зопо£Т е! а1., АгсН ВюсНет. ВюрНуз. 89:230, 1960; Ройет, ВюсНет. ί. 73:119, 1959; ЕДе1тап е! а1., ш Ме!НоДз ш Еп/уто1оду Цо1. 1) 422 (АсаДетю Ргезз 1967); апД СоНдап а! радез 2.8.1-2.8.10 апД 2.10.2.10.4.

Другие способы расщепления антител, такие как разделение тяжелых цепей для получения одновалентных фрагментов легких-тяжелых цепей, дальнейшее расщепление фрагментов или использование других ферментных, химических или генетических методик, также могут быть использованы, до тех пор, пока фрагменты связывают антиген, распознаваемый интактным антителом.

К примеру, Ρν фрагменты содержат комплекс У_Н и У_ъ цепей. Такой комплекс может быть нековалентным, как описано у 1пЪаг е! а1., Ргос. Νηί1 АсаД. 8ск И8А 69:2659, 1972. В другом случае, вариабельные цепи могут быть связаны межмолекулярной дисульфидной связью или сшиты посредством таких химических соединений как глутаральдегид (см., например, 8апДНи, Сп!. Рее. Вю!есН. 12:437, 1992).

Ρν-фрагменты могут содержать У_Н и У_ъ цепи, связанные посредством пептидного линкера. Эти одноцепочечные белки, связывающие антигены (зсРу), получают при помощи сборки структурных генов, содержащих последовательности ДНК, кодирующие У_Н и У_ъ домены, связанных между собой олигонуклеотидом. Структурный ген встраивается в экспрессионный вектор, который затем вводится в клеткухозяина, например Е. со1к Полученные рекомбинантные клетки синтезируют единую полипептидную цепь с пептидным линкером, связывающим два У домена. Способы получения зсРе описаны, к примеру, в \У1и11о\у е! а1., Ме!НоДз: А Сотрашоп !о Ме!НоДз ш Еп/уто1оду 2:97, 1991 (см., также ВйД е! а1., 8с1епсе 242:423, 1988; и.8. Ра!еп! №. 4,946,778 !о ЬаДпет е! а1.; Раск е! а1., Вю/ТесНпо1оду 11:1271, 1993, апД 8апДНи, выше.) Например, зсРе может быть получен скринингом библиотеки зсРе (к примеру фаговых библиотек зсРе) на специфическое связывание с В7Н6 (к примеру, иммобилизированного или меченного белка В7Н6 или пептида).

Другой формой фрагмента антитела является пептид, образующий участок определяющий комплементарность (СИР). СИР-пептиды (минимальные единицы узнавания) могут быть получены путем конструирования генов, кодирующих СИР антител, представляющих интерес. Такие гены получают, к примеру, используя полимеразную цепную реакцию для наработки ДНК вариабельных областей антител, используя РНК клеток, продуцирующих антитела, (см., например, Ьатск е! а1.,, МеДюДз: А Сотрашоп !о МеДюДз ш Еп/уто1оду 2:106, 1991; Соипепау-Ьиск, СепеНс Матри1а!юп оР Мопос1опа1 Ап!1ЪоД1ез, ш

- 13 024629

Мопос1опа1 АпЬЬобкв: РтобисЬоп, Епдшеегшд апб СПп1са1 Άρρίκαίίοη 166 (РтЬет с! а1., сбв., СатЬпбде ЕппсгвЩ Ргевв 1995); апб \Уагб с! а1., Оепейс Маη^ρи1аЬοη апб Εχρι^δ^ оГ АпЬЬобкв, в Мопос1опа1 АпЬЬобкв: РЕпИцкв апб ΑρρЬсаЬοηβ 137 (ВисЬ с! а1., ебв., ^беу-Ывв, 1пс. 1995)).

Также моноклональные антитела против В7Н6 человека могут быть гуманизированными моноклональными антителами против В7Н6, полученными из антител других организмов. Гуманизированные моноклональные антитела получают переносом участков, определяющих комплементарность тяжелых или легких вариабельных цепей антител других организмов (к примеру, мышиных), в вариабельные домены человеческих антител. Типичные аминокислотные остатки в каркасных участках человеческих антител являются, таким образом, замещенными на соответствующие остатки антител других организмов. Использование гуманизированных моноклональных антител устраняет проблему иммуногенности константных доменов мыши. Основные методики для клонирования вариабельных доменов иммуноглобулинов мыши описаны, например 0г1апб1 с! а1., Ргос. №П Асаб. 8сЕ υδΑ 86:3833, 1989. Методики получения гуманизированных моноклональных антител описаны, например, 1опсв с! а1., №1иге 321:522, 1986; Сайег с! а1., Ргос. №П Асаб. 8сЕ υδΑ 89:4285, 1992; 8апбЬи, СпЕ Реу. ВюксЬ. 12:437, 1992; 8шдег с! а1., ί. 1ттип. 150:2844, 1993; 8ибйг (еб.), АпЬЬобу Епдшеегшд Рго!осо1в (Нитапа Ргевв, 1пс. 1995); Ке11еу, Епдшеегшд ТЬе^аρеиЬс АпЬЬобкв, в Ртокш Епдтеегшд: Рт-кацкв апб РгасЬсе 399-434 (С1е1апб с! а1., с! а1., ебв., 1оЬп \Убсу & 8опв, 1пс. 1996) и в υ.δ. Ра1еп1 №. 5,693,762 !о Циееп с! а1.

В отдельных вариантах исполнения моноклональные антитела против В7Н6 человека содержат Рсфрагмент, содержащий домены С_Н2 и С_Н3 тяжелой цепи иммуноглобулина (1д) и обычно часть шарнирной области иммуноглобулина. Рс-фрагмент отвечает за два очень желательных свойства 1дО: активацию эффекторных функций и длительный период полужизни в плазме. Способность уничтожать целевые клетки, к которым прикрепляются антитела, связана с активацией эффекторных клеток иммунной системы (АЭСС) и путей активации комплемента (СЭС) за счет связывания Рс-фрагмента с Рс-рецептором и комплементарным белком С1с.| соответственно. Связывание опосредовано остатками, содержащимися преимущественно в участках, расположенных ниже шарнирной области и выше домена С_Н2. (см., например, \νίικ5 с! а1., ί. 1ттипо1. 164:5313, 2000; \УооГ апб Вийоп, №1иге Рсук\ув 4:1, 2004.) Длительный период полужизни в плазме для 1дО связан с рН зависимым взаимодействием между аминокислотами в доменах С_Н2 и С_Н3 и неонатальным Рс рецептором - РсКп. (см., например, ОеЬе апб Vа^б. 1ттипо1оду Тобау 18:592, 1997; Ре1коуа νίικβ с! а1., 1пЕ 1ттипо1. 18:1759, 2006.)

Таким образом, в некоторых вариантах исполнения моноклональные антитела против В7Н6 человека содержат Рс-фрагмент, обладающий АЭЭС и/или СЭС активностями. Такие антитела весьма применимы для уничтожения целевых клеток, экспрессирующих В7Н6, таких как, к примеру, раковые или вирус-инфицированные клетки. В других вариантах исполнения моноклональные антитела против В7Н6 человека содержат Рс-фрагмент, у которого отсутствуют одна или более эффекторные функции (например, отсутствуют АЭСС и/или СЭС-активности). Рс-фрагменты с отсутствующей или значительно пониженной эффекторной функцией, могут быть получены, к примеру, включением одной или более аминокислотных замен в нативную последовательность Рс-фрагмента, так что Рс-фрагмент не связывается или гораздо слабее связывается с цитолитическими Рс-рецепторами и/или с белком С1с.| системы комплемента. В соответствующей области знаний описаны различные модификации Рс-фрагментов с отсутствующей или сильно ограниченной эффекторной функцией. В частности применимые Рс-фрагменты, не обладающие или обладающие сильно сниженной эффекторной функцией включают, к примеру, варианты Рс-фрагментов как описано в υδ Ра1еШ ΑρρЬсаЬοη РиЬЬсаЬоп № 2009/0220502.

В некоторых вариантах исполнения, включающих Рс-фрагмент, данный Рс-фрагмент представляет собой одноцепочечный Рс (всРс), состоящий из двух мономеров Рс-фрагмента, связанных гибким линкером, так что два Рс мономера способны к димеризации с образованием функционального димерного Рсфрагмента. Например, в нескольких вариантах моноклональных антител против В7Н6 человека, содержащих всРс, антитела содержат одноцепочечные Рν (βсРν), слитые с всРс-фрагментом, при этом βсРνфрагмент специфически связывается с В7Н6. Одноцепочечные Рс-полипептиды, включающие фъюжнполипетиды, содержащие всРс и один или более антиген-связывающих доменов (например, βсРν), описаны подробнее в 1пктпаЬопа1 РСТ Ракп! ΑρρЬсаЬοη РиЬЬсаЬоп № ν0 08/0131242 'Ътд1е СЬаш Рс, Ме1Ьобв оГ Макшд, апб Мебюбв оГ Тгеа1тсШ, и описание которых включено в настоящую заявку во всей полноте посредством отсылки.

Также моноклональные антитела против В7Н6 человека или фрагменты антител, описанные в данной заявке, могут быть пегилированы с помощью способов, используемых в данной сфере и описанных в данной заявке.

Моноклональные антитела против В7Н6 человека могут быть конъюгированы с детектируемыми метками с образованием иммуноконьюгатов против В7Н6. Подходящие детектируемые метки включают, например, радиоизотопы, флуоресцентные метки, хемилюминесцентные метки, ферментные метки, биолюминесцентные метки или коллоидное золото. Способы создания и детекции таких меченых иммуноконьюгатов, широко известны специалистам в данной области, и ниже описаны более подробно.

Детектируемая метка может быть радиоизотопной, детектируемой с помощью авторадиографических методов. Изотопами, которые в основном применимы для целей, описываемых в настоящем изобре- 14 024629 тении, являются ³Н, ¹²⁵Ι, ¹³¹Ι, ³⁵δ апб ¹⁴С.

Иммуноконьюгаты против В7Н6 могут быть мечены флуоресцентными соединениями. Присутствие антител с флуоресцентной меткой детектируется облучением иммуноконьюгатов светом с нужной длиной волны и регистрацией результирующей флуоресценции. Соединения, используемые в качестве флуоресцентных меток, содержат флуоресцентный изоцианат, родамин, фикоцианин, аллофикоцианин, флалальдегид и флуорескамин.

Кроме того, иммуноконьюгаты против В7Н6 могут быть мечены хемилюминесцентными соединениями. Присутствие иммуноконьюгатов, меченых хемилюминесцентными метками, определяют по возникновению люминесценции, нарастающей в течение химической реакции. Примеры соединений, применяемых в качестве хемилюминесцентных меток, включают люминол, изолюминол, ароматический эфир акридина, имидазол, акридиновую соль и эфир щавелевой кислоты

Также биолюминисцентные соединения, могут быть использованы в качестве меток для иммунокольюгатов против В7Н6, описанных в данном изобретении. Биолюминесценция - это вид хемилюминесценции найденный в биологических системах, при котором каталитические белки увеличивают эффективность хемилюминисцентных реакций. Присутствие биолюминесцентых белков определяют по появлению люминесценции. Биолюминисцентные соединения, применимые в качестве меток, включают люциферин, люциферазу и акворин.

Кроме того, иммуноконьюгаты против В7Н6 могут быть помечены ферментом, связанным с моноклональным антителом против В7Н6 человека. Когда такой коньюгат фермента с антителом против В7Н6 инкубируется в присутствии подходящего субстрата, ферментативная часть конъюгата реагирует с субстратом с образованием вещества, которое может быть детектировано, например, спектрофотометрически, флуорометрически или визуально. Примерами ферментов, используемых в качестве ферментной метки для полиспецифических иммуноконьюгатов, являются Р-галоктосидаза, глюкозооксидаза, пероксидаза и щелочная фосфатаза.

Специалистам в данной области будут известны другие применимые метки, которые могут использоваться в соответствии с данной заявкой. Связывание маркеров с моноклональными антителами против В7Н6 человека может быть выполнено с помощью стандартных способов, известных в данной области. Типичная методология в этой области описана в Кеппебу с1. а1., СЬп. СЫт. Лс1а 70:1, 1976; 8сЬигк с1. а1., СЬп. СЫт. Лс!а 81:1, 1977; 8ЫЬ ек а1., 1пШ. Сапсег 46:1101, 1990; 8!ет ек а1., Сапсег Кек. 50:1330, 1990; апб СоЬдап, выше.

Кроме того, воспроизводимость и гибкость иммунохимической детекции может быть увеличена за счет использования конъюгатов моноклональных антител против В7Н6 человека с авидином, стрептавидином и биотином (см., например, ХУПсЬек ек а1., (ебк.), Лу1бт-ВюЬп ТесЬпο1οду,ΜеίЬοб5 1п Еп/уто1оду (νοί. 184) (Асабетю Ргекк 1990); Вауе ек а1., 1ттипосЬетюа1 АррЬсаЬопк ок ЛЦбт-ВюЬп ТесЬпо1оду, т ΜеΐЬοб5 1п Μο1еси1а^ Вю1оду Цо1. 10) 149-162 (^топ, еб., ТЬе Нитапа Ргекк, 1пс. 1992))

Способы проведения иммуноанализов хорошо разработаны (см., например, Соок апб 8е1к, Μοпοс1опа1 АпЬЬоб1ек т Э1адпокЬс 1ттипоаккау5, ш Μοпοс1οпа1 АпЬЬоб1ек: РгобисЬоп, Епдтеегшд, апб СЬтса1 АррЬсаЬоп 180-208 (КЫег апб Ьабутап, ебк., СатЬпбде ипТОегкЬу Ргекк 1995); Репу, ТЬе Ко1е ок Μοпοс1οпа1 АпЬЬоб1ек ш 1Ье Абνапсетепΐ ок 1ттипоаккау ТесЬпо1оду, ш Μοпοс1οпа1 АпЬЬоб1ек: РгшсЬ р1ек апб АррЬсаЬопк 107-120 (ВпсЬ апб Ьеппох, ебк., УЬеу-Ыкк, 1пс. 1995); Э1атапб15, 1ттипоаккау (Асабетю Ргекк, 1пс. 1996).

IV. Конъюгаты анти-В7Н6 моноклональных антител с лекарственными средствами

Другим объектом изобретения данной заявки является конъюгат моноклонального антитела против В7Н6 человека с лекарственным средством. Выражение конъюгат моноклонального антитела против В7Н6 человека с лекарственным средством в данной заявке означает моноклональное антитело против В7Н6 человека (как описано в разделе III, выше) конъюгированное с каким-либо терапевтическим агентом. Такие конъюгаты оказывают положительные терапевтические эффекты на экспрессирующие В7Н6 клетки при введении субъекту, например, с В7Н6-экспрессирующей опухолью. Обычно положительный клинический эффект достигается при приеме конъюгата отдельно, но также может использоваться комбинация конъюгата с другими терапевтическими агентами.

В обычных вариантах исполнения конъюгат состоит из моноклонального антитела против В7Н6 человека и цитотоксического агента, таким образом, такой конъюгат обладает цитотоксическим или цитостатическим эффектом по отношению к В7Н6-экспрессирующим клеткам (например, В7Н6экспрессирующим клеткам опухоли) при контакте с клеткой или интернализации. В частности, применимыми веществами для конъюгации с антителами являются хемотерапевтические агенты, ферменты, активирующие неактивные лекарственные средства, радиоактивные изотопы или соединения, токсины. Например, моноклональное антитело против В7Н6 человека может быть конъюгировано с хемотерапевтическим агентом (см. ниже) или токсином (например, цитостатическое или цитотоксическое вещество, к примеру, абрин, рицин А, экзотоксин из бактерий рода Ркеиботопак, дифтерийным токсином). Дополнительные примеры веществ, которые могут быть использованы для конъюгирования с моноклональным антителом против В7Н6 человека, приводятся ниже.

В других исполнениях моноклональное антитело против В7Н6 человека конъюгируется с фермен- 15 024629 том, конвертирующим пролекарство. Такой фермент может быть соединен с антителом посредством технологии рекомбинвантных ДНК или химически конъюгирован с антителом с помощью известных способов. Типовыми ферментами, конвертирующими пролекарство, являются карбокиспептидаза 02, βглюкуронидаза, пенициллин-У-амидаза, пенициллин-0-амидаза, β-лактамаза, β-глюкозидаза, азотредуктаза и карбоксипептидаза А.

Методики, применяемые для конъюгирования терапевтических веществ с белками, в частности, с антителами, хорошо известны (См., например, Агпоп е! а1., Мопос1опа1 АпйЪой1е8 Рог 1ттипо!агдейпд Θί Эгид8 1п Сапсег ТНегару, т Мопос1опа1 АпйЪой1е8 Апй Сапсег ТНегару (Ке18Не1й е! а1. ей8., А1ап К. Ы88, 1пс., 1985); Не118йот е! а1., АпйЪой1е8 Рог Эгид ЭеНуегу, ш Сойго11ей Эгид ЭеНуегу (РоЬиъоп е! а1. еЙ8., Магсе1 Эе1кег, 1пс., 2пй ей. 1987); ТНогре, АпйЪойу Сатег8 Οί Су1о1о\1с Адеп!8 1п Сапсег ТНегару: А КеУ1е^, т Мопос1опа1 АпйЪой1е8 '84: Вю1од1са1 Апй СНтса1 Аррйсайоп8 (РтсНега е! а1. ей8., 1985); Апа1у818, Ке8и118, апй Ри!иге Рго8ресйуе оί !Не ТНегареийс И8е оί Кайю1аЪе1ей АпйЪойу 1п Сапсег ТНегару, ш Мопос1опа1 АпйЪой1е8 Рог Сапсег Эе!есйоп Апй ТНегару (Ва1й\ут е! а1. ей8., Асайепис Рге88, 1985); апй ТНогре е! а1., 1982, 1ттипо1. Кеу. 62:119-58. Также, см., например, РСТ риЪНсайоп АО 89/12624.)

В определенных вариантах исполнения в соответствии со способами, описанными в данной заявке, конъюгат моноклонального антитела против В7Н6 человека и лекарственного средства интернализуется и накапливается внутри В7Н6-экспрессирующих клеток, против которых оказывает терапевтический эффект (цитотоксический или цитостатический). Способы детекции накопления и определения скорости накопления описаны, например, в АО 2004/010957, озаглавленном Эгид Сон)ида!е8 апй ТНей И8е Ног Тгеайпд Сапсег, ап Аи!о1ттипе Э|8еа8е ог ап 1пГесНои8 Э|8еа8е.

В типичных вариантах исполнения, при использовании моноклонального антитела против В7Н6 человека конъюгированного с терапевтическим веществом (например, лекарственным средством или ферментом, конвертирующим пролекарство), данное вещество преимущественно проявляет активность при интернализации целевыми В7Н6-экспрессирующими клетками (например, клетками В7Н6экспрессирующей опухоли). В других вариантах исполнения, моноклональное антитело против В7Н6 человека конъюгированное с лекарственным средством не интернализуется клеткой, а лекарственное средство оказывает терапевтический эффект (например, уничтожение или подавление роста В7Н6экспрессирующих клеток) при связывании с клеточной мембраной.

Для минимизации активности терапевтического вещества вне В7Н6-экспрессирующих клеток (например, В7Н6-экспрессирующих клеток опухоли), конъюгирование терапевтического вещества с антителом, чаще всего, производится таким образом, чтобы активность терапевтического вещества в составе конъюгата была ограничена до тех пор, пока терапевтическое вещество не будет отщеплено от антитела (например, вследствие гидролиза или под действием отщепляющего агента). В таких исполнениях терапевтическое вещество соединяется с антителом с помощью расщепляемого в условиях внутриклеточной среды В7Н6-экспрессирующих клеток линкера, достаточно устойчивого к действию внешней среды, так что конъюгат антитела с терапевтическим веществом расщепляется при интернализации В7Н6экспресирующей клеткой (например, в эндосомах клетки или, например, за счет рН-чувствительности или чувствительности к действию протеаз в лизосомах или в мембранных ямках клетки). (См. Раздел 1У(А), ниже).

Далее в определенных вариантах исполнения конъюгат антитела с лекарственным средством содержит заряженное относительно плазматической мембраны терапевтическое вещество, что тем самым еще более снижает способность терапевтического вещества проникать через плазматическую мембрану будучи интернализованным клеткой. Используемое в данной заявке выражение заряженный агент означает, что агент (а) поляризован, т.е. одна часть молекулы агента заряжена относительно плазматической мембраны, или (б) молекула агента имеет суммарный заряд относительно плазматической мембраны.

А. Линкеры

Чаще всего конъюгат антитела против В7Н6 и лекарственного средства содержит соединительную область (линкер) между терапевтическим веществом и моноклональным антителом против В7Н6 человека. Как указано выше, в определенных исполнениях линкер может быть расщепляемым под действием внутриклеточных условий. Таким образом, такое расщепление линкера высвобождает терапевтическое вещество из конъюгата с антителом во внутриклеточной среде.

Например, в некоторых исполнениях линкер является расщепляемым под действием расщепляющих агентов, присутствующих во внутриклеточной среде (например, внутри лизосом, эндосом или кавеол). Такой линкер может иметь пептидную природу и расщепляться под действием внутриклеточных пептидаз или протеаз, включая, но не ограничиваясь ими, лизосомные или эндосомные протеазы. Обычно, пептидный линкер состоит по меньшей мере из двух или трех аминокислотных остатков. Расщепляющими агентами могут являться катепсины В и Ό и плазмин, для которых описана способность гидролизовать дипептидные производные лекарственных средств, что приводит к высвобождению активного лекарственного средства внутри клетки (см., например, ЭиЬо\ус1йк апй Аа1кег, РНагт. ТНегареийс8 83:67123, 1999). Наиболее типичными являются пептидные линкеры, расщепляемые ферментами, присутст- 16 024629 вующими внутри В7Н6-экспрессирующих клеток. Например, может использоваться пептидный линкер, расщепляемый катепсином В - тиолзависимой протеазой, экспрессирующейся на высоком уровне в опухолевой ткани (например, линкеры РЬе-Ьеи или О1у-РЬе-Ьеи-О1у). Другие линкеры такого типа описаны в И.8. Ра1еп1 Νο. 6214345. В специфических вариантах исполнения пептидным линкером, расщепляемым внутриклеточной протеазой, может быть линкер Уа1-Са1 (валин-цитруллин) или РЬе-Ьук (фенилаланинлизин) (см., например, и.8. Ра1еп1 Νο. 6,214,345, в которой описан синтез доксорубицина с линкером Уа1Сй). Одно из преимуществ внутриклеточного высвобождения терапевтического вещества под действием проетолитических ферментов заключается, как правило, во временной инактивации терапевтического вещества в составе конъюгата с антителом и, как правило, в высокой стабильности таких конъюгатов в сыворотке.

В других вариантах исполнения расщепляемый линкер является рН-чувствительным, т.е. чувствительным к гидролизу при определенных значениях рН. Обычно рН-чувствительный линкер гидролизуется в кислых условиях. Часто может использоваться кислотно-лабильный линкер, расщепляемый в кислых условиях внутри лизосомы (таким линкером может быть, например, гидразон, полукарбазон, тиополукарбазон, цис-аконитовый амид, ортоэфир, ацетальный, кетальный или подобный им), (см., например, и.8. Ра!еп! Νοδ. 5122368; 5824805; 5622929; ОиЪотоЫк апй \Уа1кег, РЬагт. ТЬе^аρеийсκ 83:67-123, 1999; №уШе е! а1., ΒίοΙ. СЬет. 264:14653-14661, 1989). Такие линкеры относительно стабильны при нейтральном рН крови и нестабильны при рН ниже 5,5 или 5.0, приблизительно соответствующем рН внутри лизосомы. В определенных исполнениях гидролизуемым линкером является тиоэфирный линкер (такой как, например, тиоэфир, соединенный с терапевтическим веществом посредством ацилгидразоновой связи (см., например, и.8. Ра!еп! Νο. 5622929)).

В других вариантах исполнения линкер является расщепляемым в восстанавливающих условиях (например, дисульфидный линкер). Существует большое количество дисульфидных линкеров, известных в соответствующей области, которое включает, например, линкеры, которые могут быть получены при использовании 8АТА ^-сукцинимидил-8-ацетилтиоацетат), 8РЭР ^-сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионат), 8РИВ ^-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)бутират) и 8МРТ (Νсукцинимидил-оксикарбоинил-альфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)толуол), 8РЭВ и 8МРТ. (см., например, Тюрте е! а1., Сапсег Ке8. 47:5924-5931, 1987; \Уа\\т/упс/ак е! а1., 1п Iттиηοсοη^ида!еκ: ΑηίΦοά.ν Сοη^ида!еκ ш Кайюипадегу апй ТЬе^аρу ο£ Сапсег (С. νο^1 ей., О\1огй и. Ргекк, 1987. См., также, и.8. Ра!еп! Νο. 4880935).

В других вариантах исполнения линкер представляет собой малонатный линкер е! а1., Апйсапсег Кек. 15:1387-93, 1995), малеимидобензоильный линкер (Ьаи е! а1., В^г^-Мей-СЫт. 3:1299-1304, 1995) или 3'-Ы-амидный аналог (Ьаи е! а1., Βίοοι^-Ι^Φί’ΐΒ;ιη. 3:1305-12, 1995).

Как правило, линкер не обладает значительной чувствительностью к внеклеточным условиям. Используемое в данной заявке выражение не обладает значительной чувствительностью к внеклеточным условиям в контексте свойств линкера означает, что не более 20%, обычно не более 15%, часто не более 10%, еще более часто не более 5%, не более 3% или не более 1% линкера в образце конъюгата антитела с лекарственным средством, расщепляется под действием внеклеточной среды (например, в плазме крови). Определение, не обладает ли линкер значительной чувствительностью к внеклеточным условиям, может проводиться, например, с помощью инкубирования с плазмой независимо двух образцов: (а) тестируемого конъюгата антитела с лекарственным средством (образец конъюгат антитела с лекарственным средством) и (б) эквимолярного количества неконъюгированного антитела или терапевтического средства (контрольный образец) в течение заранее определенного времени (например, 2, 4, 8, 16, или 24 ч) и последующего сравнения количества неконъюгированного антитела или терапевтического вещества, присутствующего в образце конъюгата антитела с лекарственным средством с количеством такого вещества в контрольном образце. Измерения количеств могут быть осуществлены, например, с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения.

В некоторых вариантах исполнения линкер способствует интернализации конъюгата клеткой. В определенных исполнениях такой линкер способствует (обеспечивает) интернализации клеткой при конъюгировании его с терапевтическим веществом (т.е. в составе линкер-терапевтическое вещество части конъюгата антитела с лекарственным средством). В других исполнениях такой линкер способствует (обеспечивает) интернализации при конъюгировании как с терапевтическим веществом, так и с антителом против В7Н6 (т.е. в составе конъюгата антитело-лекарственное средство).

Множество линкеров, которые могут быть использованы в представленных композициях и способы применения описаны, например, в \УО 2004/010957, озаглавленной Эгид Сοη^ида!еκ апй ТЬей Ике £οτ Тгеайпд Сапсег, ап ЛиЮйптипе Эйеаке οτ ап ΙπίοΠίοιικ Э|кеаке.

В. Терапевтические агенты

В соответствии с настоящим изобретением любое вещество, обладающее терапевтическим эффектом в отношении В7Н6-экспрессирующих клеток, может быть использовано как терапевтический агент для конъюгирования с моноклональным антителом против В7Н6 человека. В определенных вариантах исполнения, таких как применение для терапии В7Н6-экспрессирующих опухолей, терапевтическое вещество является цитотоксическим агентом.

- 17 024629

Применяемые цитотоксические агенты включают, например, антитубулиновые агенты, ауристатины, вещества, связывающиеся с малой бороздкой ДНК-дуплекса, ингибиторы репликации ДНК, алкилирующие агенты (например, комплексы платины, такие как цис-платин, комплексы моно(платины), бис(платины) и триядерные комплексы платины и карбоплатин), антрациклины, антибиотики, антифолаты, антиметаболиты, вещества, повышающие чувствительность к хемотерапевтическому воздействию, дуокармицины, этопозиды, фторированные пиримидины, ионофоры, лекситропсины, нитрозомочевины, платинолы, предварительные соединения, пуриновые антиметаболиты, пуромицины, вещества, повышающие чувствительность к радиоизлучению, стероиды, таксаны, ингибиторы топоизомераз, винкаалкалоиды или подобные.

Характерными цитотоксическими агентами являются, например, андроген, антрамицин (АМС), аспарагиназа, 5-азацитидин, азатиоприн, блеомицин, бусульфан, бутионин, сульфоксимин, камптотецин, карбоплатин, кармустин (ВЗЫИ), СС-1065 (Ы е! а1., Сапсег Рек. 42:999-1004, 1982), хлорамбуцил, цисплатин, колхицин, циклофосфамид, цитарабин, цитидина арабинозид, цитохалазин В, дакарбазин, дактиномицин (ранее актиномицин), даунорубицин, декарбазин, доцетаксел, доксорубицин, эстроген, 5фтордезоксиуридин, этопсид фосфат (УР-16), 5-фосфоурацил, грамицидин Ό, гидроксимочевина, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин (ССХН), мехлорэтамин, мелфалан, 6-меркаптопурин, метотрексат, митрамицин, митомицин С, митоксантрон, нитроимидазол, паклитаксел, пликамицин, прокарбизин, стрептозотоцин, тенопозид (УМ-26), 6-тоигуанин, тиоТЕРА, топотекан, винбластин, винкристин и винорелбин.

Наиболее применимыми цитотоксическими агентами являются, например, долостатины (например, ауристатин Е, АРР, ММАР, ММАЕ), вещества, связывающиеся с малой бороздкой ДНК (например, энедины и лекситропсины), дуокармицины, таксаны (например, паклитаксел и доцетаксел), пуромицины, винка алкалоиды, СС-1065, 8Ы-38-(7-этил-10-гидроксикамптотеин), топотекан, морфолинодоксорубицин, ризоксин, цианоморфолинодоксорубицин, эхиномицин, комбрестатин, нетропсин, эпотилон А и В, эстрамустин, криптофизины, цемадотин, майтанзиноиды, дискодермолид, элеутеробин и митоксантрон.

В отдельных вариантах исполнения цитотоксический агент представляет собой традиционное вещество для химиотерапии, например, доксорубицин, паклитаксел, мелфалан, винка алкалоиды, метотрексат, митомицин С или этопозид. Кроме того, потенциальные цитотоксические агенты, такие как аналоги СС-1065, каликеамицин, майтанзин, аналоги доластатина 10, ризоксин и палитоксин, могут быть соединены с антителом против В7Н6 человека.

В определенных вариантах исполнения цитотоксическим или цитостатическим агентом является ауристатин Е (также известный в соответствующей сфере как доластатин-10) или его производные. Обычными дериватами ауристатина Е является, например, эфир ауристатина Е и кето-кислоты. Например, может быть проведена реакция между ауристатином Е и параацетил бензойной кислотой или бензоилвалериановой кислотой с получением АЕВ и АЕВУ, соответственно. Другими типичными производными ауристатина включают АРР (диметилвалин-валин-долаизолейнин-долапролин-фенилаланин-рфенилендиамин), ММАР (довалин-валин-долаизолейнин-долапролин-фенилаланин) и МАЕ (монометил ауристатин Е). Синтез и структура ауристатина Е и его производных описаны в и.З. Ра!еп! Аρρ1^са!^оп РиЬНсайоп № 20030083263; Iп!е^па!^опа1 Ра!еп! РиЬНсайоп Ыок. \УО 2002/088172 апб \УО 2004/010957; апб и.З. Ра!еп! \ок. 6884869; 6323315; 6239104; 6034065; 5780588; 5665860; 5663149; 5635483; 5599902; 5554725; 5530097; 5521284; 5504191; 5410024; 5138036; 5076973; 4986988; 4978744; 4879278; 4816444; 4486414.

В других вариантах исполнения цитотоксическим агентом является вещество, связывающееся с малой бороздкой ДНК. (См., например, и.З. Ра!еп! № 6130237). Например, в некоторых исполнениях, веществом, связывающимся с малой бороздкой ДНК, является соединение СВР В других исполнениях, веществом, связывающимся с малой бороздкой ДНК, является вещество из группы энедиинов (например, калихеамицин).

В определенных вариантах исполнения, конъюгат антитела с лекарственным веществом содержит анти-тубулиновый агент. Примерами антитубулиновых агентов являются, например, таксаны (например, Таксол® (паклитаксел), Таксотере® (доцетаксел), Т67 (Туларик), винка-алкалоиды (например, винкристин, винбластин, виндезин и винорелбин) и доластатины (например, ауристатин Е, АРР, ММАР, ММАЕ, АЕВ, АЕУВ). Другими антитубулиновыми агентами являются, например, производные баккатина, аналоги таксана (например, эпотилоны А и В), нокодазол, колхицин и кольцимид, экстрамустин, криптофизины, цематодин, майтанзиноиды, комбрестатины, дискодермолид и элеутеробин. В некоторых исполнениях цитотоксическим агентом является вещество из группы других антитубулиновых агентов майтанзиноидов. Например, в определенных исполнениях веществами из группы майтанзиноидов являются майтанзин или ОМ-1 (ЧттипоСеп. Шс.; см. также Сйап е! а1., Сапсег Рек. 52:127-131, 1992).

В других вариантах исполнения цитотоксическим агентом является вещество-антиметаболит. Антиметаболитом может являться, например, пуриновый антагонист (например, азотиоприн или микофенолата мофетил), ингибитор дигидрофолатредуктазы (например, метотрексат), ацикловир, ганцикловир, зидовудин, видарабин, рибавирин, азидотимидин, цитидина арабинозид, амантадин, дидезоксиуридин,

- 18 024629 йоддезоксиуридин, поскарнет или трифлуридин.

С. Получение конъюгатов моноклинального антитела против В7Н6 человека с лекарственным веществом

Получение конъюгатов моноклонального антитела против В7Н6 человека с лекарственным средством может быть выполнено любым способом, известным специалистам в данной области. Схематично, конъюгат моноклонального антитела против В7Н6 человека с лекарственным средством состоит из моноклонального антитела против В7Н6 человека, лекарственного средства и, необязательно, линкера, соединяющего лекарственное средство с антителом. Существует ряд реакций для ковалентного соединения лекарственных средств с антителами. Часто для таких реакций используют боковые группы аминокислотных остатков молекулы антитела, включая аминогруппы лизина, свободные карбоксигруппы остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот, сульфгидрильные группы цистеина и различные группы ароматических аминокислотных остатков. Одним из наиболее применяемых неспецифических способов ковалентного присоединения является карбодиимидная реакция для соединения карбокси (или амино) группы соединения с амино (карбокси) группами антитела. Также используются бифункциональные реагенты, такие как диальдегиды или имидоэфиры для соединения аминогруппы соединения с аминогруппами молекулы антитела. Также для соединения лекарственных средств с антителами может быть использована реакция образования оснований Шиффа. Данный способ подразумевает преийодатное окисление лекарственного средства, содержащего спиртовые или гидроксильные группы, с получением альдегида, который затем взаимодействует с молекулой антитела. Присоединение происходит за счет формирования основания Шиффа с аминогруппами молекулы антитела. Также для ковалентного присоединения лекарственного средства к антителам могут использоваться изотиоцианаты. Также существуют другие способы, известные специалистам в данной области и относящиеся к области данного изобретения. Не ограничивающий список таких способов описан, например, в патентах США № 665358; 5643573 и 5556623.

В некоторых вариантах исполнения интермедиат, который является предшественником линкера, взаимодействует с лекарственным средством при соответствующих условиях. В определенных вариантах исполнения используются реакционные группы лекарственного средства и/или интермедиата. Продукт такой реакции, производное лекарственного средства, затем, в соответствующих условиях, взаимодействует с моноклональным антителом против В7Н6 человека.

Ό. Способы анализа цитотоксическоп и цитостатическоп активностей

В определенных вариантах исполнения конъюгат моноклонального антитела против В7Н6 человека содержит моноклональное антитело против В7Н6 человека конъюгированное с цитотоксическим агентом; таким образом, данный конъюгат обладает цитотоксическим или цитостатическим эффектом по отношению к клеткам, экспрессирующим В7Н6 {например, к экспрессирующим В7Н6 клеткам опухоли). В качестве В7Н6-экспрессирующих клеток для определения цитотоксического или цитостатического эффекта конъюгата моноклонального антитела против В7Н6 человека с лекарственным средством могут быть использованы клетки различных линий, например, перечисленные в табл. 5, ниже. После подтверждения цитостатического или цитотоксического эффекта по отношению к В7Н6-экспрессирующим клеткам конъюгата моноклонального антитела против В7Н6 человека с лекарственным средством, терапевтическое значение такого конъюгата может быть валидировано на соответствующей животной модели. В предпочтительных вариантах исполнения, конъюгат моноклонального антитела против В7Н6 человека с лекарственным средством содержащий цитотоксический агент применяется для терапии В7Н6экспрессирующих опухолей. Типичные животные модели различных опухолей, которые могут быть использованы для оценки терапевтической эффективности конъюгата моноклонального антитела против В7Н6 человека с лекарственным средством, описаны в разделе У(В) и в примере X, ниже.

Способы определения наличия цитостатической или цитотоксической активности определенного агента по отношению к клетке, в общем, известны в соответствующей области. Показательные примеры таких способов описаны ниже. Обнаружение любых из данных эффектов по отношению к В7Н6экспрессирующим клеткам показывает, что конъюгат моноклонального антитела против В7Н6 человека применим для лечения или предотвращения развития заболеваний или расстройств, патология которых опосредуется, по крайней мере отчасти, нарушением роста или активации В7Н6-экспрессирующих клеток, например, В7Н6-экспрессирующих опухолей.

Для определения наличия цитостатической активности по отношению к В7Н6-экспрессирующим клеткам конъюгата моноклонального антитела против В7Н6 человека с лекарственным средством может быть использован анализ на основе включения тимидина. Например, культуру В7Н6-экспресирующих клеток, при плотности 5000 клеток/лунку, культивируют в течение 72 ч с последующим добавлением к среде 0,5 мкКи Н-тимидина в последние 8 ч инкубации. После этого измеряют внутриклеточное содержание ³Н-тимидина в присутствии и в отсутствие исследуемого конъюгата моноклонального антитела с лекарственным средством.

Для определения цитотоксической активности может быть измерена степень некроза или апоптоза (программируемой клеточной смерти) соответствующих клеток-мишеней. При некрозе обычно происходит повышение проницаемости мембраны клетки, разбухание клеток и разрывы мембраны. Апоптоз, как

- 19 024629 правило, характеризуется образованием пузырьков на мембране, конденсацией цитоплазмы и активацией эндогенных эндонуклеаз.

Жизнеспособность клеток может определяться по уровню поглощения клетками какого-либо красителя, например, нейтрального красного, трипанового синего или А1атагВ1ие® (Тгек Ихадпокбс ЕуЧепъ, С^е1аиб, ОН). Также, см., например, Раде е! а1., Ιηίΐ. 1. о£ 0псо1оду 3:473-476, 1993. При таком анализе исследуемые клетки инкубируются в среде, содержащей краситель, после чего суспензия клеток отмывается от красителя и спектрофотометрически измеряется количество оставшегося внутри клеток красителя, содержание которого отражает степень клеточного поглощения данного красителя. Также для определения степени цитотоксической активности может быть использован белок-связывающий краситель сульфодиамин В (§РВ) (§кеЬап е! а1., 1. №й'1 Сапсег Ιηδΐ. 82:1107-12, 1990).

В качестве альтернативы, для измерения жизнеспособности и пролиферативной активности клеток млекопитающих используется тетразолиновая соль, например МТТ, для количественного калориметрического анализа, который позволяет отличать живые клетки от мертвых, {см., например, 1. 1ттипо1. МеШобк 65:55-63, 1983).

Степень апоптоза может быть количественно определена на основе измерения, например, степени фрагментации ДНК. Существуют коммерческие фотометрические методы для количественного определения степени фрагментации ДНК Примеры такого анализа, включая ТН^Ь (на основе определения уровня включения меченых нуклеотидов в молекулы фрагментированной ДНК) и анализы на основе ИФА, описаны в ВюсЬетюа, 1999, по. 2, рр. 34-37 (РосЬе Мо1еси1аг ВюсЬетюай).

Также степень апопотоза может быть определена по морфологическим изменениям клетки. Например, при некрозе может определяться степень нарушения целостности мембраны за счет измерения поглощения определенных красителей (например, флуоресцентные красители, такие как акридиновый оранжевый и бромистый этидий). Метод определения числа апоптотических клеток ранее описан Иике и СоЬеп, Ситтей РтоФсой 1п 1ттипо1оду (СоЬдап е! а1. ебк., 1992, рр. 3.17.1-3.17.16). Исследуемые клетки окрашиваются ДНК-связывающим красителем (например, акридиновым оранжевым, бромистым этидием или пропидиум иодидом) и наблюдают за конденсацией и скоплением хроматина вокруг внутренней ядерной мембраны. Другими морфологическими изменениями, которые могут быть измерены для определения апоптоза, являются, например, конденсация цитоплазмы, повышенное образование мембранных пузырьков и сжимание клеток.

Наличие апоптотических клеток может быть определено как для прикрепленных, так и для неприкрепленных частей культур. Например, обе части могут быть выделены путем удаления супернатанта, обработкой трипсином прикрепленных клеток с последующим объединением с клетками неприкрепленной фракции с помощью центрифугирования при удалении остатков среды (например, при 2000об/мин в течение 10 мин), и последующего измерения количества апоптотических клеток (например, при измерении степени фрагментации ДНК). (См., например, Р1а//а е! а1., Сапсег РезеагсЬ 55:3110-16, 1995).

V. Способы применения

А. Общее

Другим аспектом настоящего изобретения являются способы изменения активности (например, цитолитической активности) NΚρ-30-экспрессирующих клеток, включая, например, натуральные киллеры (НК-клетки) и Т-клетки (например, СИ8+ Т-клетки). Такие способы включают, например, способы терапии заболеваний и расстройств, связанных с повышенной активностью NΚρ30-экспессирующих клеток. Применимыми антителами являются антитела, способные конкурировать за связывание с В7Н6 с антителами, продуцируемыми гибридомными клонами из списка:

(ί) гибридомный клон 4Е5.5 (депозитный № СNСΜ-I-4242), (ί) клоны гибридомы 909/2 (депозитный № СNСΜ Ι-4243), (ίίί) гибридомный клон 10Е2.9 (депозитный номер СNСΜ Ι-4244) и (ίν) гибридомный клон 17В1.3 (депозитный № СNСΜ Ι-4245).

В отдельных вариантах антитела являются химерными или гуманизированными антителами, являющимися производными от антител, продуцируемых клонами гибридом (ί)-(ίν) из списка выше.

В некоторых вариантах исполнения антитела, описываемые в данной заявке, используются для конкуренции за связывание при взаимодействии В7Н6 с М<р30. В таком исполнении способ применения заключается во взаимодействии экспрессирующих функциональный В7Н6 клеток, в присутствии М<р30экспрессирующих клеток, с эффективным количеством моноклонального антитела против В7Н6 человека или другим агентом, способным конкурировать за связывание с В7Н6 с М<р30. Применимыми антителами являются антитела способные конкурировать за связывание с В7Н6 с антителами, продуцируемыми одним из гибридомных клонов: (ί) либо гибридомным клоном 4Е5.5 (депозитный № СNСΜ Ι4242), либо (ίί) гибридомным клоном 17В1.3 (депозитный № СNСΜ Ι-4245). В отдельных вариантах исполнения антитело представляет собой химерное или гуманизированное антитело, которое является производным от антител, продуцируемых гибридомными клонами (ί) и (ίί), выше. Такие способы могут осуществляться ш уйго, ех νί\Ό или ш νί\Ό. В отдельных предпочтительных вариантах исполнения NΚρ30-экспрессирующие клетки представляют собой НК-клетки. Такой способ изменения активности НК-клеток может быть применен, например, для лечения заболеваний или расстройств, связанных с по- 20 024629 вышенной активностью НК-клеток. В других вариантах исполнения NΚр30-экспрессирующими клетками являются Т-клетки (например, СЭ8+ Т-клетки). Такое применение или способ изменения активности NΚр30-экспрессирующих Т-клеток может быть применено для лечения заболеваний или расстройств, связанных с повышенной активностью NΚр30-экспрессирующих Т-клеток. Было показано, что определенные Т-клетки, включая субпопуляцию СЭ8+ Т-клеток, экспрессируют ΝΚρ30 (см., например, δτίνа5ΐаνа апй ЗпуаЧауа, Ьеик. Кее. 30:37-46, 2006.)

Как упомянуто выше, в отдельных вариантах исполнения антитела, описываемые в данной заявке, применимы для лечения заболеваний или расстройств, связанных с повышенной активностью НКклеток. Например, в некоторых вариантах исполнения, данный способ применения антител включает введение эффективного количества моноклонального антитела против В7Н6 человека, которое способно конкурировать за взаимодействие В7Н6 с ΝΚρ30, пациенту, страдающему или имеющему высокий риск развития заболевания или расстройства опосредуемого НК-клетками (например, опосредованное НКклетками отторжение аллотрансплантата, такое как, например, опосредуемое НК-клетками отторжение аллотрансплантата ВМС). В данном изобретении осуществлен подход к супрессии опосредуемого НКклетками отторжения аллотрансплантата костного мозга с помощью моноклональных антител против В7Н6 человека. Пересадка костного мозга (ВМТ) - принятый метод терапии при лечении различных гематологических опухолей. Однако эффективность аллогенной трансплантации костного мозга ограничена в связи с рядом трудностей, например, с отторжением трансплантата. Существует достаточное количество данных о том, что НК-клетки являются помехой для приживления аллотрансплантатов клеток костного мозга и способны сами по себе опосредовать специфичность отторжения трансплантатов костного мозга у мышей (см., например, МигрЬу е! а1., 1. Ехр. Мей. 165:1212-1217, 1987; МигрЬу е! а1., 1. Ехр. Мей. 166:1499-1509, 1987; МигрЬу е! а1., 1. 1ттипо1. 144:3305-3311, 1990; МигрЬу е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 20:1729-1734, 1990; МигрЬу е! а1., 1ттипо1. Кеу. 181:279-289, 2001). Клинически, резистентность по отношению к аллографту наблюдаемая у пациентов со 8СГО, получивших НЬА-несоответствующий трансплантат ВМС с деплецией Т-клеток, без циторедуктивного кондиционирования, связана с высокой активностью НК-клеток донора. (8ее ОКеШу е! а1., ^х. 8ап§. 51:81-86, 1986.)). Соответственно, антитела против внеклеточного домена В7Н6, способные ингибировать взаимодействие В7Н6 с №<р30, как описано в данной заявке, могут быть использованы при пересадке костного мозга для подавления цитолитической активности НК-клеток против аллотрансплантата, и, таким образом, оказывать терапевтический эффект или предотвращать отторжение аллотрансплантата ВМС.

В остальных вариантах исполнения моноклональное антитело против В7Н6 человека используется для индукции антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС) или комплемент-зависимой цитотоксичности (СЭС) против клеток, экспрессирующих В7Н6, например, при лечении заболеваний или расстройств, характеризующихся наличием В7Н6-экспрессирующих клеток. Например, в некоторых вариантах исполнения, моноклональное антитело против В7Н6 человека используется для индукции антитело-зависимой клеточной цитотоксической активности (АЭСС) или комплемент-зависимой цитотоксической активности (СЭС) против клеток опухоли, экспрессирующей В7Н6. Применение антител особенно успешно при лечении опухолей, так как определенные опухоли либо обладают уникальными опухолеспецифичными антигенами, либо их антигены экспрессируются на значимо большем количественном уровне, чем у нормальных клеток. Экспериментальные данные свидетельствуют, что В7Н6 экспрессируется на высоком, относительно нормальных тканей, уровне клетками многих видов рака, включая клетки рака толстой кишки, печени, шейки матки, легких, поджелудочной железы и простаты, а также клетки многих видов рака крови, таких как прогомоцитарная лейкемия, В-клеточная лимфома, моноцитарная лимфома, эритролейкемия, лимфома Беркита, хронический миелолейкоз. Основываясь на этих данных, В7Н6 является новым опухолеспецифичным или опухолеассоциированным антигеном. Моноклональные антитела против В7Н6 человека могут применяться для противоопухолевой терапии. Одним из механизмов, связанных с противоопухолевой активностью терапии с помощью моноклональных антител, является антитело-зависимая клеточная цитотоксичность (АЭСС). При этом процессе моноклональные антитела связываются с целевой клеткой (например, клеткой опухоли), тогда как определенные эффекторные клетки (например, НК-клетки, СЭ8+ Т-клетки) за счет определенного рецептора связываются с комплексом моноклонального антитела с целевой клеткой, что приводит к гибели целевой клетки.

В соответствии с этим в некоторых вариантах исполнения моноклональное антитело против В7Н6 человека содержит Рс-фрагмент с эффекторными функциями для индукции антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС) или комплемент зависимой цитотоксичности (СЭС) по отношению к В7Н6-экспрессирующим клеткам. Способы индукции АЭСС, в основном, заключаются в контакте В7Н6экспрессриующей клетки с эффективным количеством моноклонального антитела против В7Н6 человека обладающего Рс-областью с АЭСС-активностью. При этом этап взаимодействия происходит в присутствии эффекторных иммунных клеток, экспрессирующих Рс-рецептор и обладающих цитолитическими функциями. Эффекторными клетками иммунной системы, экспрессирующими цитолитические Рсрецепторы (например, Рс ΚΙΙΙ или СЭ16), являются, например, НК-клетки наряду с определенными субпопуляциями СЭ8+ Т-клеток. Способы индукции СЭС в основном заключаются в контакте В7Н6экспрессирующих клеток с эффективным количеством моноклонального антитела против В7Н6 человека

- 21 024629 содержащего Рс-фрагмент с СЭС-активностью в присутствии белков системы комплемента. В7Н6экспрессирующими клетками-мишенями для описанных способов цитолиза могут являться, например, опухолевые клетки, например клетки рака толстой кишки, клетки рака печени, клетки рака шейки матки, клетки рака легкого, клетки рака поджелудочной железы, клетки рака простаты, клетки прогемоцитарной лейкемии, клетки В-клеточной лимфомы, клетки моноцитарной лимфомы, клетки эритролейкемии, клетки лимфомы Беркитта и хронического миелолейкоза и многих других типов рака. Применимыми антителами являются антитела, способные конкурировать за связывание с В7Н6 с антителами, продуцируемыми следующими гибридомными клонами: (ί) гибридомный клон 4У5.5 (депозитный № СИСМ Ι-4242); (ίί) гибридомный клон 909.2 (депозитный № СИСМ Ι-4243); (ίίί) гибридомный клон 10Е2.9 (депозитный № СИСМ Ι-4244); и (ίν) гибридомный клон 17В1.3 (депозитный № СИСМ Ι-4245). В некоторых исполнениях антитело способно конкурировать за связывание с В7Н6 с антителом, продуцируемым клоном гибридомы (ίί)-(ίίί) из списка выше. В отдельных вариантах исполнения антитело является химерным или гуманизированным производным от антитела, продуцируемого клоном гибридомы (ί)-(ίν) из списка выше или (ίί)-(ίίί) из списка выше.

В соответствующих исполнениях содержащее Рс-фрагмент с эффекторной функцией моноклональное антитело против В7Н6 человека, как описано в данной заявке, применяется для лечения В7Н6экспрессирующей опухоли у пациента. Такие способы обычно включают прием пациентом эффективного количества содержащего Рс-фрагмент, обладающий ЛЭСС и/или СЭС активностью, моноклонального антитела против В7Н6 человека. В7Н6-экспрессирующими опухолями, в значительной степени отвечающими на лечение с использованием таких способов, являются, например, рак толстой кишки, печени, шейки матки, легкого, поджелудочной железы или простаты, а также такие типы рака крови, как, например, прогемоцитарная лейкемия, В-клеточная лимфома, моноцитарная лимфома, эритролейкемия, лимфома Беркитта или хронический миелолейкоз.

В других вариантах исполнения конъюгат моноклонального антитела против В7Н6 человека с лекарственным средством (см. раздел ГУ, выше) применяется для доставки терапевтического вещества к В7Н6-экспрессирующей клетке, по отношению к которой терапевтическое вещество оказывает терапевтический эффект. Такие способы особенно применимы для лечения заболеваний или расстройств, характеризуемых присутствием В7Н6-экспрессирующих клеток. В отдельных предпочтительных вариантах исполнения, использующих конъюгат моноклонального антитела с лекарственным средством, терапевтическое вещество является цитотоксином, оказывающим цитотоксический или цитостатический эффект по отношению к В7Н6-экспрессирующей клетке, например В7Н6-экспрессирующей клетке опухоли. Как описано выше, на основе экспериментальных данных показано, что В7Н6 экспрессируется на высоком, по сравнению с нормальной тканью, уровне многими опухолевыми линиями клеток, включая линии клеток рака толстой кишки, печени, шейки матки, легкого, поджелудочной железы или простаты, а также линиями клеток различных типов рака крови, таких как, прогемоцитарная лейкемия, В-клеточная лимфома, моноцитарная лимфома, эритролейкемия, лимфома Беркитта или хронический миелолейкоз. Эти данные показывают, что В7Н6 является новым опухолеспецифичным или опухолеассоциированным антигеном, применимым для целевой доставки веществ, обладающих терапевтической активностью в отношении опухоли, в частности для доставки цитотоксических веществ, которые способны элиминировать или остановить рост клеток опухоли. Таким образом, в некоторых вариантах исполнения конъюгат моноклонального антитела против В7Н6 человека с лекарственным средством, содержащий моноклональное антитело против В7Н6 человека, конъюгированное с цитотоксическим веществом, применяется для лечения В7Н6-экспрессирующих опухолей. Применимые конъюгаты антитела с лекарственным средством включают те, которые состоят из антитела, способного конкурировать за связывание с В7Н6 с антителами, продуцируемыми клонами гибридом из следующего списка: (ί) гибридомный клон 4Е5.5 (депозитный №. СИСМ Ι-4242); (ίί) гибридомный клон 909.2 (депозитный № СИСМ Ι-4243); (ίίί) гибридомный клон 10Е2.9 (депозитный № СИСМ Ι-4244) и (ίν) гибридомный клон 17В1.3 (депозитный № СИСМ Ι-4245). В некоторых исполнениях конъюгат антитела с лекарственным средством содержит антитело, способное конкурировать за связывание с В7Н6 с антителом, продуцируемым клонами гибридом (ίί)-(ίίί) из списка выше. В отдельных вариантах исполнения конъюгат антитела с лекарственным средством содержит химерное или гуманизированное антитело, являющееся производным от антитела, продуцируемого гибридомным клоном (ί)-(ίν) из списка выше или (ίί)-(ίίί) из списка выше.

В каждом варианте исполнения способов лечения, описанных в данной заявке, прием моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата моноклонального антитела против В7Н6 человека с лекарственным средством, осуществляется в соответствии с общепринятыми способами, существующими для терапии того заболевания или расстройства, о лечении которого идет речь. В соответствии с описанием, приведенным в данной заявке, эффективное количество антитела или конъюгата антитела с лекарственным средством вводится пациенту в течение того времени и в таких условиях, которые являются достаточными для профилактики или лечения данного заболевания или расстройства.

Субъектами для введения описанных в данной заявке моноклональных антител или конъюгатов моноклональных антител с лекарственным средством являются пациенты с высоким, по сравнению с нормальным, риском развития заболевания или расстройства, опосредуемого ИКр30-экспрессирующими

- 22 024629 клетками или характеризующиеся присутствием В7Н6-экспрессирующих клеток, а также пациенты с развившимся заболеванием или расстройством. Определенные варианты исполнения используются для скрининга или диагностики у субъектов, у которых еще нет развитого заболевания или расстройства. Другие определенные варианты исполнения используются для лечения заболевания или расстройства у субъектов, у которых диагностировано данное заболевание или расстройство. Также возможно применение для мониторинга изменений в ходе лечения заболевания или расстройства (например, возрастания или снижения выраженности клинических симптомов данного заболевания или расстройства).

При профилактических применениях фармацевтические композиции (медикаменты) вводятся пациенту с высоким риском развития или склонным к развитию данного заболевания, в количестве, достаточном для элиминации или снижения риска, или задержки развития данного заболевания. В терапевтических применениях композиции вводятся пациентам с диагностированным или с подозрением на данное заболевание, в количестве, достаточном для излечения или, по меньшей мере, остановки развития симптомов данного заболевания и сопутствующих ему осложнений. Количество, достаточное для достижения данных целей называется терапевтически или фармацевтически эффективной дозой или количеством. Как в профилактическом, так и в терапевтическом режиме приема, антитело или конъюгат антитела с лекарственным средством, обычно принимается в нескольких дозировках до достижения достаточного эффекта (например, переключения соответствующей активности НК-клеток или ингибирования нежелательной активности НК-клеток). Обычно, дозу повторяют при снижении достигнутого желаемого эффекта.

Для вариантов применения настоящего изобретения в целях диагностики или скрининга для оценки риска у пациента, не страдающего от заболевания или расстройства, опосредуемого ΝΚρ30экспрессирующими клетками или характеризующегося присутствием В7Н6-экспрессирующих клеток, результаты, полученные на биологическом образце, полученном от пациента сравниваются с результатами, полученными на образце здорового субъекта или с предварительно определенным базальным уровнем. Риск развития опухоли определяется на основе детекции более высокого уровня, полученного на образце пациента, по сравнению с таковым на сопоставимом образце здорового субъекта или базальным уровнем. Способы обнаружения композиций антител, описываемых настоящим изобретением, описаны в разделе МС.

Композиции и способы, описываемые в настоящем изобретении, могут быть использованы для мониторинга прогресса терапии с использованием образцов, полученных от пациента через определенные временные интервалы после трансплантации ВМС или после начала противоопухолевой терапии. Уровень экспрессии В7Н6 в биологическом образце пациента определяется перед началом терапии (Т1) и сравнивается с биологическим образцом того же пациента, полученным после курса терапии (Т2). Более высокий уровень экспрессии В7Н6, как правило, характеризует прогресс развития заболевания, а более низкий - регресс.

Для определения необходимости проведения для пациента скрининговых или терапевтических процедур в соответствии со способами, описанными в данном изобретении, могут быть применены подходящие способы скрининга для определения рисковых факторов, ассоциированных с определенными заболеваниями или расстройствами, опосредуемыми ИКр30-экспрессирующими клетками или характеризующимися присутствием В7Н6-экспрессирующих клеток. Также данные процедуры могут быть проведены для определения статуса уже диагностированного у пациента заболевания. Такие способы могут включать, например, выявление семейного анамнеза, т.е. наличия у пациента родственников, у которых диагностировано определенное заболевание. Также скрининговые методы могут включать, например, традиционные клинические обследования для определения семейного статуса определенного заболевания с известным наследуемым рисковым фактором (например, в случае трансплантации ВМС, по данным клинических исследований показано, что присутствие определенных аллелей НЬА-С корреллирует с повышенным риском отторжения аллотрансплантата костного мозга (см., 8со11 е! а1., В1ооб 92:48644871, 1998), а также известно, что различные типы рака имеют определенные наследуемые рисковые факторы). Наследуемыми рисковыми факторами опухолей могут быть, например, мутации в различных генах, которые приводят к трансформации клетки (например, Каз, Ка£, Е0РК, сΜеΐ и другие), присутствие или отсутствие определенных молекул НЬА и иммуноглобулин-подобных рецепторов натуральных киллеров (ΚΙΚ), или механизмы, с помощью которых прямо или опосредованно опухолевые клетки способны регулировать иммунную супрессию клетками, подобными НК или Т-клеткам (см., например, Ь]и觧геи аиб Μа1тЬе^§, №Циге Кеу. 1ттиио1. 7:329-339, 2007; ВоуЮи аиб АЬтаии, СЬи. Εxρ. 1ттиио1. 149:1-8, 2007). С этой целью могут стандартно применяться олигонуклеотидные пробы для идентификации индивидуумов, несущих в геноме генетические маркеры, ассоциированные с определенным изучаемым заболеванием. Кроме того, в соответствующей области хорошо известен широкий набор иммунологических методов, применимых для идентификации маркеров для определенных заболеваний. Например, доступны и широко известны в соответствующей области, различные иммуноанализы на основе ИФА, в которых применяются моноклональные антитела для детектирования антигенов, ассоциированных со специфическими опухолями. Скрининг может быть осуществлен в соответствии с симптоматологией, возрастными и рисковыми факторами и др. Данные методики позволяют на практике консультирующим

- 23 024629 врачам определять пациентов, которым необходимы описанные в данной заявке способы лечения. В соответствии с данными способами, регуляция активности НК-клеток может применяться в качестве независимой программы лечения или в качестве последующего, дополнительного или координированного с другими способа лечения.

В. Противораковое лечение

1. Типы опухолей

Как описано и показано по результатам исследований в данной заявке, антитела против В7Н6 могут применяться для прямого уничтожения В7Н6-экспрессирующих клеток путем активации каскадов АЭСС или СОС за счет связывания Рс-фрагмента с Рс-рецептором и белком С.'1с| системы комплемента. В других вариантах исполнения конъюгат моноклонального антитела против В7Н6 человека с лекарственным средством, содержащий цитотоксическое вещество конъюгированное с моноклональным антителом против В7Н6 человека, может использоваться для доставки цитотоксического вещества к В7Н6экспрессирующим клеткам опухоли, по отношению к которым цитотоксическое вещество оказывает терапевтический эффект путем уничтожения или торможения роста этих клеток.

В табл. 4 ниже приведен список некоторых видов рака, поддающихся лечению в соответствии с настоящей заявкой. Список организован преимущественно по месту локализации.

Таблица 4. Иллюстративный список типов рака

1. Опухоли головы и шеи
а.	Мозг
ь	Ротовая полость
с.	Ротоглотка
1	Носоглотка

- 24 024629

	е. Г. δ- Η.	Готраноглотка Носовые ходы и параназальные синусы Гортань Губа
2.	Рак легкого
	а	Немелкоклеточная карцинома
	Ь.	Мелкоклеточная карцинома
3	Опухоли желудочно-кишечною тракта
	а	Колоректальный рак
	Ь	Рак желудка
	с.	Рак пищевода
	ό	Анальный рак
	е.	Рак внепеченочных желчных протоков
	Г.	Рак Фатерова сосочка
	§·	Стромальный рак желудочно-кишечного
тракта (ΟΙδΤ)
4.	Рак печени
		а. Аденома клеток печени
		Ь. Гепатоклеточная карцинома
5.	Рак груди
6.	Г инекологические опухоли
	а	Рак шейки матки
	Ь	Рак яичника
	с.	Рак влагалища
	<1	Рак вульвы
	е.	Гестационная трофобластическая неоплазия
	Г,	Рак матки

- 25 024629

7.	Опухоли мочевыводящих путей
a. b. c. а. е.	Почечная карцинома Рак простаты Рак мочевого пузыря Рак полового члена Рак уретры
8.	Рак мочевого пузыря
9.	Нейрональные опухоли
	а.	Астроцитома и глиобластома
	Ь.	Первичная лимфома ЦНС
	с.	Медуллобластома
	а.	Герминогенные опухоли
	е.	Ретинобластома
10.	Неоплазии эндокринной системы
	а.	Рак щитовидной железы
	Ь.	Рак поджелудочной железы
		1) Опухоли островков Лангерганса
		a) Инсулиномы b) Глюкагономы
	с.	Феохром о цито м а
	а	Карцинома надпочечников
	е.	Карциноидные опухоли
	Г.	Карцинома паращитовидной железы
	8-	Неоплазии шишковидного тела
11.	Рак кожи
	а.	Злокачественная меланома
	Ь.	Чешуйчато-клеточная карцинома
	с.	Базально-клеточная кариинома
	а.	Саркома Капоши

- 26 024629

12.	Рак кости
а Ь с.	Остеобластома Остеохондрома Остеосаркома
13.	Неоплазии соединительной ткани
	а	Хон др обл астом а
	Ь	Хондрома
14.	Опухоли системы гемопоэза
	а	Неходжкинская лимфома
		1)	В-клегочная лимфома
		2)	Т-клеточная лимфома
		3)	Недифференцированная лимфома
	Ь.	Лейкемии
		1)	Хронический миелолейкоз
		2)	Волосаклеточная лейкемия
		3)	Хроническая лимфоцитарная
лейкемия
		4)	Хроническая миеломоноцитарная
лейкемия
		5)	Острая миелоцитарная лейкемия
		6)	Острая лимфобластная лейкемия
	с.	Миелопролиферативные расстройства
		1)	Множественная миелома
		2)	Эссенциальная тромбоцитемия
		3)	Миелофиброз с миелоидной
метаплазией
		4)	Гмперэозинофильный синдром
		5)	Хроническая эозинофильная
лейкемия
		6)	Полицитемия Вера

- 27 024629

	б	Ходжкинская лимфома
15.	Детские опухоли
	а	Лейкемии и лимфомы
	Ь	Опухоли мозга
	с	Нейробластома
	б	Опухоль Вильмса (нефробластома)
	е.	Рабдомиосаркома
	Г.	Ретинобластома
16.	Иммунотерапевтически-чувствительные опухоли
	а.	меланома
	ь.	рак почек
	с.	лейкемии, лимфомы и миеломы
	б.	рак груди
	е.	рак простаты
	Г.	колоректальный рак
	&	рак шейки матки
	ь.	рак яичника
	Е	рак легкого

Ниже более детально обсуждаются некоторые типы рака, из перечисленных выше, включая соответствующие животные модели для оценки эффективности антител против В7Н6 или конъюгатов антител с лекарственным средством при терапии опухолей в соответствии с настоящим изобретением.

а) Хронический миелейкоз

Хронический миелейкоз (СМЬ) - редкий вид рака, встречающийся наиболее часто у взрослых индивидуумов. Данный тип рака обусловлен гранулоцитами (предоминантный вид белых клеток крови). В ходе развития СМЬ происходит образование и выход в кровоток большого количества незрелых и неспособных к нормальной функции гранулоцитов. Незрелые белые клетки крови известны как бласты. В ходе развития СМЬ также нарушается продукция других видов клеток крови. В норме процессы восстановления и воспроизведения белых клеток крови упорядочены и строго контролируются, тогда как при хроническом миелейкозе этот процесс не контролируется и клетки продолжают делиться и пролиферировать аномально. Данное заболевание обычно развивается очень медленно, и рассматривается как хронический миелолейкоз.

Вследствие медленного прогресса заболевания, СМЬ сложно определять на ранних стадиях. Иногда его обнаруживают, только при анализе крови, выполняемом по другим причинам. Симптомы СМЬ часто неопределенны, неспецифичны и вызваны увеличением числа аномальных белых клеток крови в костном мозге и снижением числа нормальных клеток крови, приводя к ощущению полноты и появлению болезненной шишки с левой стороны живота. При СМЬ может увеличиваться селезенка. Опухоль селезенки может также давить на желудок, приводя к нарушению пищеварения, плохому аппетиту и анемии. Из-за низкого числа тромбоцитов в крови некоторые пациенты могут замечать, что кровотечения стали длительнее и легче образуются синяки. Ассоциированные с СМЬ петехии являются особым видом синяков, когда мелкая кровяная сыпь обычно появляется на ногах или во рту. У женщин при СМЬ могут более тяжело проходить менструации. Однако эти симптомы и признаки встречаются редко. Хронический миелейкоз может встречаться в любом возрасте, но более типичен у пациентов среднего возраста и у пожилых людей и редко встречается у детей (Ναΐίοηαΐ Сапсег 1п8ЙГиГе, ΝΙΗ РиЪйсайоп Νο. 08-3775 КоскуШе, МИ, §ерк 2008). Терапевтический эффект моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгатов антител с лекарственным средством по отношению к опухоли можно оценить, например, на модели ксенотрансплантанта опухоли человека, заключающейся в пересадке клеток СМЬ человека к иммунодифецитным мышам (см., например, Кеп, Ьеикет1а апб Ьутрйота 8:1549-1561, 2002; Уап ЕНеп. В1ооб Се115 Мо1. ϋΐδ. 27:201-205, 2001; \\ опд апб М«е, Опсодепе 20:5644-5659, 2001).

- 28 024629

b) Множественная миелома

Множественная миелома - вид рака, затрагивающий определенные белые клетки крови, называемые плазматическими клетками. При опухоли, затрагивающей плазматические клетки, данные клетки являются аномальными и идентичными и называются миеломными клетками. Миеломные клетки, как правило, накапливаются в костном мозге и плотном, наружном веществе костей. Иногда эти клетки накапливаются в только одной кости и образуют единую массу, или опухоль, называемую плазмоцитомой. В большинстве случаев, однако, миеломные клетки накапливаются в разных костях, часто формируя множественные опухоли и являясь причиной других проблем. При наступлении такой стадии данное заболевание называют множественной миеломой.

Вследствие аномально большого количества идентичных плазматических клеток при множественной миеломе, у пациентов также вырабатывается избыток антител одного вида. Эти миеломные клетки и антитела могут вызывать ряд серьезных медицинских проблем, которые могут включать:

(1) Увеличение количества миеломных клеток приводит к повреждению и ослаблению кости, вызывая боль и иногда переломы.

(2) При повреждении костей происходит вымывание кальция, что может приводить к гиперкальцемии. Гиперкальцемия может вызывать потерю аппетита, тошноту, жажду, утомляемость, мышечную слабость, беспокойность и спутанность сознания.

(3) Миеломные клетки препятствуют образованию в костном мозге нормальных плазматических клеток и белых клеток крови других типов, важных для иммунной системы.

(4) Раковые клетки также препятствуют росту новых красных клеток крови, вызывая анемию.

(5) У больных с множественной миеломой могут развиваться серьезные проблемы с почками. Избыток антител и кальция могут мешать должной очистке крови в почках. Симптомы заболевания зависят от степени прогресса. На ранних стадиях болезни симптомов может и не быть. При появлении симптомов заболевания у больного обычно присутствуют боли в костях, часто в костях спины и ребрах. Также у пациента могут присутствовать переломы костей, чувство слабости, утомляемости, потеря веса или частые инфекционные заболевания. На более поздних стадиях симптомами могут быть также тошнота, рвота, запоры, проблемы с мочеиспусканием, слабость или онемение ног (№Бопа1 Сапсег ФкФФе, ΝΙΗ РиЬНсайоп №. 08-1575 КоскуШе, МО, §ерк 2008). Терапевтический эффект моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгатов антител с лекарственным средством по отношению к опухоли можно оценить, например, на модели ксенотрансплантата опухоли человека, иммунодефицитным мышам, как описано М1уака\уа и соавторами, ВюсПет. Вюркук. Кек. Соттип. 313:258-62, 2004.

c) Неходжкинская лимфома

Существует два основных типа лимфомы. Болезнь Ходжкина и неходжкинская лимфома. Описано около 20 видов неходжкинской лимфомы. В большинстве случаев болезни Ходжкина, в биоптатах обнаруживаются определенные клетки, называемые клетками Рида-Стенберга. Эти клетки, обычно не находят при других лимфомах, что приводит к различным терапевтическим подходам против Ходжкинских и неходжкинских лимфом.

Часто первым признаком неходжкинской лимфомы является безболезненное опухание лимфатических узлов на шее, в подмышках или паху. Другими симптомами могут быть следующие: потение ночью или необъяснимый жар, потеря аппетита, необъяснимая потеря веса, сильная утомляемость; у детей может появиться кашель или одышка. Больные могут жаловаться на боль в животе или на сильный зуд кожи по всему телу, у детей может появиться шишка на животе, (№йопа1 Сапсег 1пк111и1е, ΝΙΗ РиЬНсайоп №. 07-1567 КоскуШе, МО, §ерк 2007). Терапевтический эффект по отношению к опухоли моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгатов антител с лекарственным средством можно оценить, на модели ксенотрансплантата неходжкинской лимфомы, схожей с описанной Апке11 е1.а1., Ьеикешй 18:616-23, 2004.

Наиболее часто используемая классификация неходжкинских лимфом - классификация КЕАЬ (Οΐ(епкпШег, СЬетюо-Вю1одюа1 1п1егас1юпк 135-136:653-664, 2001). Для классификации лимфом определены специфические иммунологические маркеры. Например, маркеры фолликулярной лимфомы включают СЭ20+, СЭ3-, СЭ10+, С.О5-; маркеры лимфомы из малых лимфоцитов включают СЭ20+, СЭ3-, СОК)-, СО5+, С.О23+; маркеры В-клеточной лимфомы краевой зоны включают СЭ20+, СЭ3-, СЭ10-, С.О23-; маркеры диффузной В-крупноклеточной лимфомы включают СЭ20+, С.О3-; маркеры лимфомы из клеток майтийной зоны включают СЭ20+, СЭ3-, СОК)-, СО5+, С.О23+; маркеры периферийной Т-клеточной лимфомы включают СЭ20-, С.О3+; маркеры первичной медиастинальной В-клеточной лимфомы включают СЭ20+, СЭ3-, маркеры лимфобластной лимфомы включают СЭ20-, СЭ3+, Тй!+, и маркеры лимфомы Беркитта включают СЭ20+, СЭ3-, СЭ10+, С'О5- (Оесыоп Кекоигкек, №п-Нойдкш5 ЬутрПота, ^а1Фат, МА., РеЬ. 2002).

Клиническая классификация неходжкинских лимфом (ΝΗΕ), предложенная в 1\УР (1п1егпа1юпа1 ХУогктд РогтФайоп) подразделяет заболевания на подтипы:

(1) лимфома с низкой степенью злокачественности (неактивная), включающая лимфому из малых лимфоцитов, соответствующую хронической лимфоцитарной лейкемии (8С); фолликулярную, преимущественно из малых клеток с расщепленным ядром (Р8С); фолликулярную смешанную, из малых клеток

- 29 024629 с расщепленным ядром и крупных клеток (РМ);

(2) лимфома со средней степенью злокачественности, включающая фолликулярную, преимущественно с крупными клетками (РЬ); диффузную, с малыми клетками с расщепленным ядром (Э8С); диффузную смешанную, с малыми клетками и крупными клетками (ЭМ); диффузную, с крупными клетками с расщепленным и нерасщепленным ядром (ЭЬ) и (3) лимфома с высокой степенью злокачественности, включающая иммунобластную, с крупными клетками (ГВЬ); лимфобластную, из клеток со складчатым и нескладчатым ядром (ЬЬ); и малых клеток с нерасщепленным ядром, лимфома Беркитта или неберкиттовская лимфома (8ЫС; ТЬе Νοη-Ηού§1<ίη'5 ЬутрЬота ΡαΐΗοΙοβίο С1а881ЙсаЬоп Рго|ес1, Сапсег 49:2112-35, 1982). Для больных с неходжкинской лимфомой обычно применяется система классификации стадий болезни Энн Арбор. I стадия означает поражение отдельного лимфатического узла или локализированное поражение одного нелимфоидного органа или участка. II стадия означает поражение двух или более областей лимфатических узлов по одну сторону диафрагмы или локализированное поражение экстранодального участка или органа и одной или более областей лимфатических узлов по одну сторону диафрагмы. III стадия означает поражение областей лимфатических узлов по обе стороны диафрагмы, возможно сопровождаемое локализированным поражением экстранодального органа или участка. IV стадия означает диффузное или диссеминированное поражение одного или более отдаленно расположенных экстранодальных органов, сопровождающееся или не сопровождающееся поражением ассоциированных лимфатических узлов (Бутр^Н ηеοр1аδтδ, в Атепсап Ιοίηΐ ί’οιηιηίΐ^ οη Сапсег.: Л1СС Сапсег 81адт§ Мапиа1 6Й1 ей. Νον ΥοιΓ. ΝΥ: 8ргшдег, 2002, рр. 393-406). Эффективность ритуксимаба была показана для терапии неактивной и фолликулярной лимфом (Воуе еЬ а1, Аппак ο£ Οικοΐ. 14:520-535, 2003).

й) Рак шейки матки

Шейка матки - часть соединяющего влагалище и матку прохода, которая открывается во влагалище. Рак шейки матки, также называемый карциномой шейки матки, развивается из аномальных клеток на поверхности шейки матки и является одним из самых распространенных видов рака у женщин. Раку шейки матки обычно предшествует дисплазия - предраковые изменения в клетках на поверхности шейки матки. Эти аномальные клетки могут развиваться в инвазивную опухоль. Развитие рака также проходит четыре стадии, которые выделяют по степени распространения опухоли. Чем больше распространилась опухоль, тем, вероятно, более обширное лечение потребуется. Существует два основных типа рака шейки матки:

(1) Плоскоклеточный тип (эпидермоидная опухоль): наиболее распространенный тип, на который приходится от 80 до 85% случаев рака шейки матки. Этот тип рака может быть вызван венерическими заболеваниями. Одно из таких венерических заболеваний - вирус папилломы человека, который вызывает образование венерических бородавок. Канцерогенная опухоль растет на поверхности и внутри шейки матки. Опухоль обычно начинается на поверхности шейки матки и может быть определена на ранней стадии с помощью мазка Папаниколау.

(2) Аденокарцинома: данный тип рака шейки матки развивается из ткани желез шейки матки в канале шейки матки. Ранняя стадия заболевания обычно не сопровождается симптомами. Данный тип рака обычно можно определить с помощью мазка Папаниколау и гинекологического обследования. Поздние стадии болезни вызывают аномальное вагинальное кровотечение или неожиданные выделения крови, между периодами менструации, после полового акта, после менопаузы. Аномальные влагалищные выделения могут быть мутными или кровянистыми, или содержать слизь с неприятным запахом. Более поздние стадии развития заболевания могут вызывать боль (№1юпа1 Сапсег ШзЙШе, №Н РиЪЬса1юп Νο. 082407 РискуШе, ΜΌ, 8ер1. 2008). Терапевтический эффект моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгатов антител с лекарственным средством по отношению к опухоли можно оценить, например, на модели ксенотрансплантата опухоли человека, аналогичной описанной в Όον^ е1. а1., Оупеοο1. ОптоЬ 98:203-10, 2005 апй Ы и соавторами, ШЬ ί. Оупе^Ь Сапсег 15:301-7, 2005.

е) Опухоли головы и шеи

Большинство опухолей головы и шеи относятся к типу опухолей, называемому карциномой (в частности плоскоклеточной карциномой). Карциномы головы и шеи начинаются в клетках, формирующих слизистые рта, носа, глотки или уха или поверхностном слое эпителия языка. Однако, опухоли головы и шеи могут развиваться и из других типов клеток. Лимфома развивается из клеток лимфатической системы. Саркома развивается из клеток соединительной ткани, составляющих мышцы, хрящи и кровеносные сосуды. Меланома развивается из клеток, называемых меланоцитами, определяющих цвет глаз и кожи. Симптомы рака головы и шеи будут зависеть от того, где локализуется развивающаяся опухоль - например, опухоль языка может вызывать невнятную речь. Наиболее распространенными симптомами являются язва или нарыв в области головы или шеи, которые не заживают в течение нескольких недель; трудности при глотании или боль при жевании или глотании, такие проблемы с дыханием или речью, как постоянное шумное дыхание, невнятная речь или хриплый голос; чувство онемения во рту; постоянная заложенность носа или носовое кровотечение; постоянная боль в ушах, звон в ушах или проблемы со слухом; отек или опухоль в области рта или шеи, боли лица или верхней челюсти; у людей, курящих или жующих табак, предраковые изменения могут происходить в слизистой оболочке полости рта или на

- 30 024629 языке. Эти симптомы могут проявляться как постоянные белые пятна (лейкоплакия) или красные пятна (эритроплакия). Обычно такие пятна безболезненны, но иногда могут нарывать и кровоточить (№!юиа1 Саисег 1из!1!и!е, ΝΙΗ РиЬЬсайои №. 09-1574 КоскуШе, ΜΌ, δер!. 2009). Терапевтический эффект моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгатов антител с лекарственным средством по отношению к опухоли можно оценить, например, на модели ксенотрансплантата опухоли головы и шеи человека, схожей с описанной Кшгакозе е! а1., Неаб №ск 22:57-63, 2000; Сао е! а1., С1ш. Саисег Кез. 5:1925-34, 1999; ВгаакЬшз е! а1., Саисег Кез. 51:211-4, 1991 аиб Вакег, Ьагуидозсоре 95:43-56, 1985.

Г) Опухоль головного мозга

Опухоли, развивающиеся в ткани головного мозга, известны как первичные опухоли мозга и называются в соответствии с типами клеток или областями мозга, в которой они начали развиваться. Наиболее распространенными первичными опухолями головного мозга, развивающимися в глиальных клетках, являются глиомы. Существует большое количество типов глиом:

(1) Астроцитома - данная опухоль происходит из звездновидных глиальных клеток, называемых астроцитами. У взрослых астроцитомы наиболее часто образуются в головном мозге. У детей они образуются в стволе головного мозга, головном мозге и мозжечке. Астроцитому ΙΙΙ степени иногда называют анапластичной астроцитомой. Астроцитому IV степени обычно называют мультиформной глиобластомой.

(2) Глиома ствола головного мозга - данный тип опухоли развивается в нижнем отделе мозга. Глиомы ствола головного мозга наиболее часто встречается у детей и людей среднего возраста.

(3) Эпендимома - данный тип опухоли возникает из клеток, выстилающих желудочки и центральный канал спинного мозга и наиболее часто встречается у детей и пациентов молодого возраста. (4) Олигодендроглиома - данный редкий тип опухоли возникает из клеток, формирующих жировую ткань, покрывающую и защищающую нервные пучки. Данные опухоли обычно возникают в головном мозге. Они растут медленно и обычно не распространяются в окружающие ткани мозга. Наиболее часто такой тип опухоли встречаются у людей среднего возраста. Симптомы опухоли мозга зависят от размера, типа и расположения опухоли. Симптомы могут проявляться, когда опухоль давит на нерв или повреждает определенную области мозга. Они также могут проявляться, при опухании головного мозга или накоплении жидкости в полости черепа. Наиболее распространенные симптомы опухоли головного мозга включают головную боль (обычно самую сильную утром), тошноту или рвоту; нарушения речи, зрения или слуха; проблемы с равновесием и ходьбой, изменения в настроении, особенностях характера или способности к концентрации, проблемы с памятью, подергивания или сокращение мышц (судороги или конвульсии), а также онемение или покалывание в руках или ногах (№!юиа1 Саисег [изОННе, ΝΙΗ РиЬЬса!юи №. 09-1558 КоскуШе, ΜΌ, Мау 2009). Терапевтический эффект моноклональных антител против В7Н6 человека и конъюгатов антитела с лекарственным средством по отношению к опухоли может быть оценен с помощью модели ксенотрансплантанта глиомы человека сходной с описанной в Ве11о е!. а1., С1ш. Саисег Кез. 8:3539-48, 2002. д. Опухоль щитовидной железы

Папиллярная и фолликулярная опухоли щитовидной железы составляют от 80 до 90% от всех типов опухолей щитовидной железы. Оба типа возникают в фолликулярных клетках щитовидной железы. Большинство папиллярных и фолликулярных опухолей щитовидной железы, как правило, растут медленно. При выявлении на ранней стадии лечение может быть успешно. Медуллярный рак щитовидной железы составляет от 5 до 10% случаев рака щитовидной железы и имеет происхождение из нефолликулярных клеток - С клеток,. Анапластичный рак щитовидной железы является наименее распространенным типом рака щитовидной железы (только 1-2% случаев), и происходит из фолликулярных клеток. Раковые клетки такого типа являются сильно измененными и труднораспознаваемыми. Такой тип опухоли сложно контролируется вследствие очень быстрого роста и распространения раковых клеток. На ранних стадиях рак щитовидной железы не имеет симптомов. Но по мере роста опухоли симптомы могут включать шишку или узел в передней части шеи рядом с адамовым яблоком; охриплость или трудности с произношением нормальным голосом, увеличение лимфатических узлов, особенно на шее, затрудненное глотание или дыхание или боль в глотке или шее (№!юиа1 Саисег [изОННе, ΝΙΗ РиЬБсайои №. 07-4994 КоскуШе, ΜΌ, δер!. 2007). Терапевтический эффект моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгатов антитела с лекарственным средством по отношению к опухоли может быть оценен с помощью модели ксенотрансплантанта опухоли человека сходной с описанной РшбуШе е!. а1., Εибοс^^иο1ο§у 145:2561-71, 2004.

1) Рак печени

Существует два типа первичного рака печени. Наиболее распространенным типом является рак, называется гепатомой или гепатоклеточной карциномой (НСС), который возникает из основных клеток печени (гепатоцитов). Такой тип опухоли обычно развивается в печени, хотя иногда может распространяться и на другие органы. Кроме того, существуют более редкие и несвязанные подтипы гепатомы, называемые фиброламелярной гепатомой, которая может развиваться у пациентов юношеского возраста. Другой тип первичного рака печени, называемый холангиокарцинома или рак желчных протоков, развивается из клеток желчных протоков. Большинство людей, у которых развивается гепатома, обычно страдают циррозом печени. При циррозе печени происходит образование мелких рубцов по всей печени, что

- 31 024629 является следствием различных причин, включая инфекции и употребление большого количества алкоголя в течение длительного периода времени. Однако только у небольшой части пациентов с циррозом печени развивается первичный рак печени. Такие инфекции как вирус гепатита В или гепатита С могут приводить к развитию рака печени, и могут вызывать цирроз, который увеличивает риск развития гепатомы. Наличие редкого заболевания, называемого гемахромотозом, которое вызывает избыточное содержание железа в организме, увеличивает шансы развития гепатомы. Моноклональные антитела против В7Н6 человека или конъюгаты антитела с лекарственным средством могут быть использованы для лечения, профилактики, замедления прогрессии, задержки начала, и/или снижения тяжести болезни или препятствования хотя бы одному из условий или симптомов, связанных с гепатоклеточной карциномой. Гепатоклеточная карцинома в некоторых случаях ассоциирована с инфекцией гепатитом (например, гепатит В, гепатит С и гепатит И). Терапевтический эффект моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгатов антитела с лекарственным средством по отношению к опухоли может быть оценен с помощью модели ксенотрансплантанта опухоли человека сходной с описанной в 2Ьои е! а1., СПп. Сапсег Рез. 9:6030-7, 2003; апД НиупЬ е! а1., 1. Се11 Мо1. МеД. 2008 (Е-РиЪИса!юп 10.1111/). 15824934.2008.00364., 2008, В1аск\уе11 8упегду), ί. Рак легких

Терапевтический эффект моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгатов антитела с лекарственным средством по отношению к опухоли может быть оценен с помощью модели ксенотрансплантанта мелкоклеточного/немелкоклеточного рака легких. Кратко, опухоль человека пересаживают иммунодефицитным мышам, и затем проводят лечение с помощью моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгатов антитела с лекарственным средством отдельно или в комбинации с другими агентами. Эффективность такого лечения может быть оценена при мониторинге роста опухоли (№таП е!. а1.,, С1ш Сапсег Рез. 6:2075-86, 2000; апД Ни е! а1., СПп. Сапсег Рез. 10:7662-70, 2004).

2. Ожидаемые результаты и противоопухолевая активность по отношению к солидным опухолям

Хотя каждый протокол может определять различные оценки реакции опухоли на терапию, критерии РЕС18Т (критерии оценки ответа солидных опухолей на терапию) в настоящее время считаются основным руководством для оценки ответа опухоли, рекомендуемыми Национальным Институтом Рака (№!юпа1 Сапсег 1пз!Ьи!е) {см. ТЬегаззе е!. а1., 1. №!1. Сапсег 1пз!. 92:205-216, 2000). В соответствии с критериями РЕС18Т, ответ опухоли означает снижение или устранение всех измеримых очагов или метастаз. Обычно заболевание считается измеряемым, если имеются очаги > 20 мм, которые могут быть точно измерены по крайней мере в одном измерении с помощью обычных способов или > 10мм, при измерении с помощью спиральной компьютерной томографии, с четко определенными границами с помощью рентгена, компьютерной осевой томографии (СТ), магнитно-резонансной томографии (МР1) или клиническими исследованиями (если повреждения поверхностные). Неизмеряемой считается заболевание, при котором очаги составляют < 20 мм при измерении с помощью обычной техники или < 10 мм, при измерении с помощью спиральной компьютерной томографии, или в случае, если очаги являются действительно неизмеряемыми (слишком малый размер для точного измерения). Неизмеряемые заболевания включают плевральный выпот, асциты и болезни, документированные по косвенным признакам.

Критерии объективного статуса требуются для протоколов оценки ответа солидных опухолей. Типичные критерии включают: (1) Полный ответ (СР), определяемый как полное исчезновение измеряемого заболевания; отсутствие новых очагов, отсутствие симптомов болезни; отсутствие признаков неизмеряемого заболевания; (2) Частичный ответ (РР), определяемый как 30%-ное уменьшение суммы наибольшего диаметра целевых очагов; (3) Прогресс заболевания (РИ), определяемый как 20%-ное увеличение суммы наибольшего диаметра целевого очага или появление новых очагов; (4) Стабильный или отсутствующий ответ, определяемый как не соответствующий СР, РР или РИ. (см. ТЬегаззе е!. а1. выше)

Дополнительными ожижаемыми результатами, принятыми в онкологии, являются общая выживаемость (08), выживаемость без признаков заболевания (ИР8), объективная степень ответа (ОРР), время до прогрессирования (ТТР), и выживаемость без прогрессирования (РР8) (см. СшДапсе Рог 1пДиз!гу: СЬшса1 Тпа1 ЕпДрош!з Рог !Ье Арргоеа1 оР Сапсег Игидз апД Вю1од1ез, АргП 2005, Сеп!ег Рог Эгид Еуа1иаПоп апД РезеагсЬ, РИА, РоскеШе, МИ.)

3. Комбинированное противоопухолевое лечение

Как обсуждалось ранее, в некоторых вариантах исполнения, моноклональные антитела против В7Н6 человека или конъюгаты антитела с лекарственным средством используются в сочетании со вторым агентом для лечения заболевания или расстройства. При использовании для лечения опухоли моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгатов антитела с лекарственным средством, они могут использоваться в сочетании с такими общепринятыми способами противоопухолевой терапии, как, например, хирургия, лучевая терапия, химиотерапия или их комбинации. В отдельных вариантах исполнения другие терапевтические агенты применимые для комбинированной противоопухолевой терапии с помощью антител к В7Н6 или конъюгатов антитела с лекарственным средством в соответствии с данным изобретением, включают антиангиогенные агенты. В некоторых других вариантах исполнения другие терапевтические агенты, пригодные для комбинационной терапии, включают антагонисты таких факторов, участвующих в росте опухоли, как, например, ЕСРР, ЕгЪВ2 (Нег2), ЕгЪВ3, ЕгЪВ4 или ЮТ. В неко- 32 024629 торых вариантах исполнения антитела и конъюгаты антитела с лекарственным средством в соответствии с данным изобретением вводятся в организм совместно с цитокинами (например, цитокин, стимулирующий иммунный ответ против опухоли). Иллюстративные примеры комбинированных вариантов терапии, применимые для лечения опухоли, описаны более детально ниже.

а) Антитела против опухолеассоциированных антигенов

Как было упомянуто ранее, антительная терапия особенно успешна при лечении опухоли, т.к. некоторые виды опухолей либо обладают уникальными антигенами, либо линия-специфическими антигенами, либо антигенами, присутствующими в избыточном количестве по сравнению с нормальными клетками. Одним из механизмов, связанных с противоопухолевой активностью моноклональных антител, является антителозависимая клеточная цитотоксичность (АИСС). При АИСС моноклональные антитела связываются с клетками-мишенями (например, опухолевой клеткой), после чего специфические эффекторные клетки, экспрессирующие рецепторы для моноклональных антител (например, НК-клетки, моноциты, гранулоциты) связывают комплекс моноклональное антитело/клетка-мишень, что приводит к уничтожению клетки-мишени. Соответственно в некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения моноклональные антитела против В7Н6 человека или конъюгаты антитела с лекарственным средством, обладающие противоопухолевой активностью, вводят в организм вместе с моноклональными антителами против вторичных опухолеассоциированных антигенов (т.е. других опухолеассоциированных антигенов, кроме В7Н6). Доза и график введения моноклональных антител (МΑЬδ) основаны на описанных фармакокинетических и токсикокинетических свойствах совместного приема специфических антител и должны быть оптимизированы в сторону минимизации любой токсичности, которая может быть связана с приемом моноклональных антител против В7Н6 человека или коньюгата антитела с лекарственным средством.

Комбинированная терапия с использованием моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгатов антитела с лекарственным средством, как описано в данной заявке, и вторичных моноклональных антител против опухолеассоциированных антигенов может применяться в случаях, когда лечение первой линии было неудачным, и, таким образом, может рассматриваться как способ лечения второй линии. Данное изобретение также включает использование такой комбинации как способа лечения первой линии для пациентов с впервые поставленным диагнозом или проходивших ранее курсов противораковой терапии (бе ηονο пациенты) и пациентов, не проходивших ранее никакой терапии моноклональными антителами ('Лайе пациенты).

Описанные в данной заявке моноклональные антитела против В7Н6 человека или конъюгаты антитела с лекарственным средством также применимы для комбинированной терапии с моноклональными антителами против опухолеассоциированных антигенов при отсутствии любой прямой антителоопосредованной АИСС- или СИС-активности по отношению к опухолевым клеткам. Например, антитела, блокирующие ингибирующий сигнал в иммунной системе могут приводить к обширному иммунному ответу. Примеры включают (1) антитела против молекул семейства В7К, которые обладают такой же функцией ингибирования, как цитотоксический-Т-лимфоцит-ассоциированный антиген 4 (СТЬА-4), белок запрограммированной смерти 1 (РИ-1), аттенюатор В- и Т-лимфоцитов (ВТЬА); (2) антитела против ингибирующих цитокинов, таких как 1Ь-10, ΤΟΡβ; и (3) антитела, уничтожающие или ингибирующие функции супрессорных клеток, например анти-СИ25 или СТЬА-4. Например, моноклональные антитела против СТЬА4, как мышиные, так и человеческие, либо подавляют функцию иммуно-супрессивных регуляторных Т клеток (Тге^), либо ингибируют сигнал, передающийся посредством связывания СТЬА-4 на Т клетках с молекулами В7-1 или В7-2 на АРС или опухолевых клетках.

В табл. 6 представлен не исключающий список моноклональных антител, одобренных или проходящих испытания, для которых возможно применение для комбинированной терапии в соответствии с данным изобретением.

- 33 024629

Таблица 6. Препараты моноклональных антител для использования в сочетании с антителами против В7Н6 или конъюгатами антитела с лекарственным средством

Мишень	Название лекаиственного соедства	Клинические показания	Ппоизвоонтель
ТКА1Ь-К1	НО5-ЕТК1	Опухоли	НОЗ
ΤΡΛΙΙ.-Ρ2	НО5-ЕТК2	Солидные опухоли	ΗΟδ
СЦ40	8ΟΝ40	мм	8еа(11е ОепеПсЕ
НЕК2	Герцептин	Рак груди	ОепетйесЬ
ЕОР-К	АВХ-ЕОР	СКС, Ц8СЬС, КСС	АЬуешх
ЕОР-К	ЕМЦ72000	Солидные опухоли	Мегск
ЕОР-К	МЦХ-214	ЕОР-К-положительные опухоли	Мебагех
ЕОР-К	Эрбитукс	СКС	1тс1опе
α5β3 интегрин	Витаксин	Псориаз, рак предстательной железы	АМЕ/ЬШу
СШ 52	СТЬА-4	Опухоли	Мебагех
СО49е	Интегрин а5	Опухоли	Рго1ет Ос51сш ЬаЬз
МиС18 (ΤΙΜ-подос	АВХ-МА1	Меланома
ТАО-72 муцин	Анатумомаб	Опухоли
СЦЗ	Экромекимаб	Меланома	Куоук'а Накко

Мишень	Название лекаиственного средства	Клинические показания	Ппонзводитель
СЦ64 (РсОК1)	Анти-СЦ64	Опухоли	Медагех
СЕА	СЕА-СМе	Опухоли	1тп1ипотесНс5
ЕрСАМ	Напорекс	Рак толстой кишки	Сеп1осог
Εβννίί-Υ-Αϊ	3ΟΝ15	Опухоли	8еай1е Оепейсз

Ь) Ингибиторы тирозинкиназы

В некоторых вариантах исполнения моноклональные антитела против В7Н6 человека или конъюгаты антитела с лекарственным средством, как описано в данной заявке, используются в сочетании с ингибиторами тирозинкиназы. Тирозинкиназы - это ферменты, катализирующие перенос γ-фосфатной группы с аденозинтрифосфата на белки-мишени. Тирозинкиназы можно разделить на тирозинкиназы рецепторных белков и тирозинкиназы нерецепторных белков. Они играют важную роль в различных нормальных клеточных процессах, включая активацию через рецепторы ростовых факторов и влияя на пролиферацию, длительность жизни и рост различных типов клеток. Кроме того, как предполагается, они способствуют пролиферации опухолевых клеток, индуцируют антиапоптотические пути и способствуют ангиогенезу и метастазированию. В дополнение к активации за счет факторов роста, активация протеинкиназы за счет соматических мутаций является общим механизмом образования опухолей. Некоторые из таких мутаций идентифицированы в киназах В-РаГ. РЬ!3, ВСР-АВЬ, с-ΚΙΤ, киназах каскадов эпидермального фактора роста (ЕСРР) и РЭСРР. Нег2, УЕСРР и с-Ме! - это другие важные каскады рецепторной тирозинкиназы (РТК), вовлеченные в образование и прогрессирование опухолей. Вследствие большого числа клеточных процессов, инициируемых тирозинкиназами, они были определены как ключевые мишени для ингибиторов.

Ингибиторы тирозинкиназы (ΤΚΙ) являются небольшими молекулами, действующими внутри клетки, конкурируя с аденозинтрифосфатом (АТР) за связывание с каталитическим доменом рецепторных и нерецепторных тирозинкиназ. Это конкурентное связывание блокирует инициацию нисходящего сигнала, приводящего к осуществлению эффекторных функций, связанных с такими событиями сигналинга, как рост, выживание и ангиогенез. Используя структурные и вычислительные подходы, из обширной химической комбинаторной библиотеки был идентифицирован ряд веществ-ингибиторов тирозинкиназ.

Предполагается, что большинство ΤΚΙ ингибируют рост опухолей за счет прямого ингибирования опухолевых клеток или за счет ингибирования ангиогенеза. Кроме того, определенные ΤΚΙ, включающие сорафениб и сунитиб, влияют на сигнальные каскады через рецепторы семейства УЕОР. В некоторых случаях ΤΚΙ, как было показано, активируют функции дендритных клеток и других клеток системы врожденного иммунитета, таких как НК-клетки. Для иматиниба это было недавно показано на животных моделях. Иматиниб является ΤΚΙ, который, как было показано, повышает цитотоксическую активность

- 34 024629 дендритных клеток и НК-клеток (обзор см., ЗтуШ е1 а1., NЕ^Μ 354: 2282, 2006).

ВАУ 43-9006 (сорафениб, Nеxаνа^®) апб ЗИ11248 (сунитиниб, Зи1еп1®) являются двумя ТЫ, недавно одобренными для использования при метастазирующей почечной карциноме (КСС). Ряд других ТЫ находятся в той или иной стадии разработки для терапии различных видов рака. Другие ТЫ включают следующие, но не ограничиваются ими: Иматиниб мезилат (01ееνес®, №\'агПк); Гефинитиб Цгекка®, Акй^епеса); Эрлотиниб гидрохлорид (Та^сеνа®, ОепеЫесЬ); Вандетаниб ^асПта®, Ак!га2епеса), Типифарниб ^агпекйа®, Ыпккеп-СПад); Дазатиниб (Зргусе1®, Вг1к1о1 Μуе^к ЗцшЬЬ); Лонафарниб (Загакаг®, ЗсЬегшд Р1оидЬ); Витаналиб сукцинат (№\'агПк. ЗсЬегшд АО); Лапатиниб (ТукегЬ®, О1ахоЗшйЬЫше); Нилотиниб (ШтагПк); Лестауртиниб (СерЬа1оп); Пазопаниб гидрохлорид (О1ахоЗтйЬЫше); Акситиниб (РП/ег); Канертиниб гидрохлорид (РП/ег); Пелитиниб (№-1Попа1 Сапсег ШкЫШе, УуеГО); Тандутиниб (ΜΗΚιπιπιπι); Бозутиниб (\Ууе1Н); Семаксаниб (Зидеп, ТаТОо); А2Э-2171 (Ак1га2епеса); νΧ-680 (Μе^ск, Vе^ιеx); ЕХЕЬ-0999 (ЕхеЬхй); АККУ-142886 (Аггау ВюРЬагта, Ак!га2епеса); РЭ-0325901 (РП/ег); ΛΜО-706 (Атдеп); ВГОР-1120 (ВоеЬгшдег ШдеГОеш); ЗИ-6668 (ТаГОо); СР547632 (0ЗЦ; (АЕЕ-788 (\о\агпк); ВΜЗ-582664 (В^^кΐο1-Μуе^к ЗцшЬЬ); .ΙΧΚ-401 (Се1депе); К-788 (ГОде1); А2Э-1152 НОРА (Ак1га2епеса); N^3 (Оеп/уте 0псо1оду); СР-868596 (РП/ег); ВΜЗ-599626 (Вйк1о1\1\егк ЗсцнЬЬ); РТС-299 (РТС ТЬегареиЬск); АВТ-869 (АЬЬой); ЕХЕЬ-2880 (ЕхеЬхЦ); АО-024322 (РП/ег); ХЬ-820 (ЕхеЬхЦ); 0ЗИ930 (0ЗЦ; ХЬ-184 (ЕхеЬхЦ); КК№951 (Киш Вге^егу); СР-724714 (0ЗЦ; Е-7080 (Е1ка1); НЫ-272 (УуеШ); СШК-258 (СЫгоп); ΖΚ-304709 (ЗсЬеппд АО); ЕХЕЬ-7647 (ЕхеЬхЫ); ВАУ-579352 (Вауег); ВШУ-2992 (ВоеЬгшдег ЫдеШеш); АV-412 (А'У^гЕ0); УА968Э1 (АбνепсЬеп ЬаЬогаЫпек); Мидостаурин (№\'агПк); Перифосин (АЕ1егпа Ζепιа^^к. Кегух, №йюпа1 Сапсег Н1кПйНе); АО-024322 (РП/ег); ЛΖ^-1152 (Акй^епеса); 0Ш)1910№1 (Οпсοпονа) и ЛΖ^-0530 (Акй^епеса).

с) Химиотерапевтические комбинации

В некоторых вариантах исполнения моноклональные антитела против В7Н6 человека или конъюгаты антитела с лекарственным средством вводят в организм в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими препаратами. Химиотерапевтические препараты обладают различными способами действия, например, воздействуя на ДНК, или РНК и нарушая цикл репликации. Примерами химиотерапевтических препаратов, действующих на уровне ДНК или РНК, являются антиметаболиты (такие как Азатиоприн, Цитарабин, Флударабин фосфат, Флударабин, гемцитабин, цитарабин, кладрибин, 6меркаптопурин капецитабина, 6-тиогуанин, метотрексат, 5-фторурацил и гироксимочевина; аликилирующие агенты (такие как Мелфалан, Бусулфан, Цисплатин, Карбоплатин, Циклофосфамид, Ифосфамид, Дакарабазин, Прокарбазин, Хлорамбуцил, Тиотепа, Томустин, Темозоламид); антимитотические препараты (такие как Винорелбин, Винкристин, Винбластин, Доцетаксел, Паклитаксел); ингибиторы топоизомераз (такие как Доксорубицин, Амсакрин, Иронотекан, Даунорубицин, Эпирубицин, Митомицин, Митоксантрон, Идарубицин, Тенипозид, Этопосид, Топотекан); антибиотики (такие как актиномицин и блеомицин); аспарагиназа; антрациклины, таксаны.

б) Радиотерапевтические комбинации

В некоторых вариантах исполнения моноклональные антитела против В7Н6 человека или конъюгаты антитела с лекарственным средством вводят в организм в сочетании с радиотерапией. Лечение некоторых видов опухолей может осуществляться при использовании облучения или радиофармацевтических препаратов. Радиотерапия обычно используется для терапии нерезектабельных или неоперабельных опухолей и/или опухолевых метастаз. Радиотерапия обычно проводится тремя способами. Внешнее облучение проводится на расстоянии от тела и включает гамма-лучи (⁶⁰Со) и рентгеновские лучи. Брахитерапия использует такие источники как, например, ⁶⁰Со, ¹³⁷Ск, ¹⁹²й или ^Ι2'Ί, воздействуя непосредственно на целевую ткань или в контакте с ней.

е) Комбинации с гормональными препаратами

В некоторых вариантах исполнения моноклональные антитела против В7Н6 человека или конъюгаты антитела с лекарственным средством принимают в сочетании с гормонами или антигормонами. Определенные виды опухолей связаны с гормональной зависимостью и включают, например, рак яичников, рак груди и рак предстательной железы. Лечение гормонально-зависимой опухоли может включать использование антиандрогеных или антиэстрогенных веществ. Гормоны и антигормоны, используемые при лечении опухоли, включают Эстрамустин фосфат, Полиэстрадиол фосфат, Эстрадиол, Анастрозол, Эксеместан, Летрозол, Тамоксифен, Мегестрола ацетат, Медроксипрогестерона ацетат, Октреотид, Ципротерона ацетат, Бикалтумид, Флутамид, Триторелин, Лепротеин, Бусерелин и Госерелин.

При введении в организм моноклональные антитела против В7Н6 человека или конъюгаты антитела с лекарственным средством представляют собой фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональные антитела против В7Н6 человека или конъюгаты антитела с лекарственным средством, может быть составлена в соответствии с известными способами приготовления применимых фармацевтических композиций, согласно которым терапевтическая молекула смешивается с фармацевтически приемлемым носителем. Композиция называется фармацевтически приемлемым носителем, если ее введение может хорошо переносится пациентом. Стерильный фосфатнобуферный солевой раствор является одним из примеров фармацевтически приемлемого носителя. Другие

- 35 024629 приемлемые носители известны специалистам в данной области (см., например, Оеппаго (ей.), Кештд!оп'8 РЬагтасеийса1 8аепсе8 (Маск РиЪГОНтд Сотрапу, 191Н ей. 1995).) Составление композиции может также включать одно или несколько вспомогательных веществ, консерванты, солюбилизаторы, буферные вещества, альбумин для предотвращения денатурации белков на поверхности флакона и так далее.

Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональные антитела против В7Н6 человека или конъюгаты антитела с лекарственным средством, вводится пациенту в эффективном количестве. В соответствии со способами, описанными в данной заявке, антитела или конъюгаты антитела с лекарственным средством могут вводиться в организм пациента различными способами, включая, например внутримышечное, подкожное, внутривенное, внутрипредсердное, внутрисуставное, парентеральное, интраназальное, внтурилегочное, трансдермальное, внутриплевральное, интратекальное введение или введение оральным путем. Для профилактики и терапии антитела или конъюгаты антитела с лекарственным средством могут вводиться пациенту в форме одной таблетки, при постоянной подаче лекарства (например, постоянное трансдермальное введение) свыше продленного периода времени или при повторяющемся протоколе приема (например, каждый час, раз в день, раз в неделю).

В связи с этим определение эффективной дозировки обычно основывается на данных, полученных при изучении животных моделей, и в последующих клинических испытаниях на человеке. Кроме того, учитываются данные об эффективных дозировках и схемах введения, которые в значительной степени снижают частоту возникновения и тяжесть болезни или расстройства на модельных объектах. Эффективные дозы композиций настоящего изобретения зависят от многих различных факторов, включающих способ введения, целевой орган, физиологическое состояние пациента, является ли пациент человеком или животным, принимаются ли другие лекарственные средства, является ли лечение профилактическим или терапевтическим, а также специфическая активность композиции и ее способность вызывать желаемый отклик у пациента. Обычно пациентом является человек, но при некоторых болезнях пациентом может быть нечеловекоподобное млекопитающее. Обычно схемы дозировки должны обеспечивать оптимальный терапевтический эффект, т.е. оптимальную эффективность и безопасность. Соответственно терапевтически или профилактически эффективное количество также является таким количеством, при котором любые заложенные отрицательные эффекты перевешиваются положительными эффектами изменения эффективности NΚρ30-опосредованных НК-клеток. Вводимая доза моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгатов антитела с лекарственным средством обычно варьируется от 0,1 мг до 100 мг/кг или от 1 мкг/кг до около 50 мг/кг и чаще от 10 мкг до 5 мг на килограмм массы тела пациента. Дозировки в таком диапазоне могут достигаться с помощью одноразового или многоразового введения, включающего, например, несколько раз в день или раз в день, в неделю, в две недели или в месяц. Например, в некоторых вариантах схема состоит из первого введения, а затем нескольких последующих введений с интервалом в неделю или в две недели. Другие схемы состоят из первого введения, а затем нескольких последующих введений с интервалом в месяц или два месяца. Кроме того, введение может быть нерегулярным, что связано с активностью НК-клеток и/или клиническими симптомами болезни или расстройства.

Лечащий врач может менять дозировку фармацевтической композиции для поддержания желаемой концентрации в целевом сайте. Например, при выборе внутривенного способа доставки лекарства, локальная концентрация препарата в кровеносных сосудах целевой ткани может быть около 1-50 нмоль/л, иногда от 1 нмоль/л до 10, 15 или 25 нмоль/л в зависимости от состояния пациента и прогнозируемого измеряемого ответа. Более высокая или более низкая концентрация может быть выбрана в зависимости от способа доставки лекарства, например, трансэпидермальное введение по сравнению с введением с поверхности слизистой оболочки. Дозировка также должна быть подобрана в зависимости от скорости высвобождения вводимого препарата, например, назальный спрей по сравнению с порошком, лекарственная форма, вводимая перорально с замедленным высвобождением или впрыскиваемые частицы, лекарственная форма для трансдермального введения и т.д. Например, для достижения такого же уровня концентрации в плазме, медленно высвобождающиеся частицы со скоростью высвобождения 5 нмоль (при стандартных условиях) нужно вводить в два раза чаще, чем частицы со скоростью высвобождения 10 нмоль.

Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональные антитела против В7Н6 человека или конъюгаты антитела с лекарственным средством, может доставляться в жидкой форме, в виде аэрозоля или в твердой форме. Жидкие формы представлены инъекционными растворами, аэрозолями, каплями, растворами для местного применения или оральными суспензиями. Типичные твердые формы включают капсулы, таблетки и формы с контролируемым высвобождением лекарственного вещества. Последняя форма представлена осмотическими минипомпами и имплантами. (См., например, Вгетег е!. а1., РНагт. Вю1есНпо1. 10:239, 1997; Капайе, 1тр1ап!8 ш Эгид ЭеНуегу, ш Эгид ЭеНуегу 8у8!ет8 95-123 (Капайе апй НоШпдег, ей8., СКС Рге88 1995); Вгетег е! а1., Рго!еш ЭеНуегу \\йН 1пГи8юп Ритр8, ш Рго!еш ЭеНуегу: РНу81са1 8у8!ет8 239-254 (8апйег8 апй Непйгеп, ей8., Р1епит Рге88 1 997); Уе\уеу е! а1., ЭеНуегу оГ Рго!еш8 Ггот а Соп1го11ей Ке1еа8е 1н)ес!аЪ1е 1тр1ап!, ш Рго!еш ЭеНуегу: РНу81са1 8у8!ет8 93-117 (8апйег8 апй Непйгеп, ей8., Р1епит Рге88 1 997).) Другие твердые формы включают крема, пасты, местные аппликации и тому подобные.

- 36 024629

Липосомы используются как одно из средств доставки терапевтических композиций, например, при внутривенном, внутрибрюшинном, внутримышечном, подкожном или пероральном введении, ингаляции или интраназальном введении. Липосомы - это микроскопические везикулы, содержащие один или более липидных бислоев, окруженных водным компонентом. (См.,в общем, ,Ваккег-^оиБепЪегд е! а1., Еиг. 1. СНп. М\\тоЫо1. Ыес!. Όίδ. 12 (8ирр1. 1):861, 1993; Кгт, Эгидк 46:618, 1993; КапаБе, 81!е-8ресШс Эгид ЭеЬхегу Икшд Ырокотек ак Сатегк, ш Эгид ЭеЫуегу 8ук!етк 3-24 (КапаБе апБ НоШпдег, еБк., СКС Ргекк 1995).) Липосомы по строению похожи на биологические мембраны, в результате чего введение липосом безопасно и они биоразлагаемы. В зависимости от способа приготовления липосомы могут быть однослойными и многослойными, а размер липосом может варьировать от 0,02 мкм до более чем 10 мкм. В липосомы могут быть инкапсулированы различные вещества: гидрофобные вещества располагаются в бислоях, а гидрофильные во внутреннем водном пространстве(вах). (См, например., МасЬу е! а1., Ырокотек Ы Се11 Вю1оду АпБ РЬагтасо1оду ЦоЬп ЫЪЪеу 1987); Ок!го е! а1., Атпсап I. Нокр. РЬагт. 46:1576, 1989.) Кроме того, такой способ доставки позволяет контролировать терапевтическую доступность инкапсулированного вещества путем изменения размера липосом, числа бислоев, липидного состава, а также изменения заряда и характеристик поверхности липосом.

Липосомы могут абсорбироваться практически на любом типе клеток и затем медленно высвобождать инкапсулированное вещество. Кроме того, абсорбированная липосома может подвергнуться эндоцитозу фагоцитарными клетками. За эндоцитозом следует внутрилизосомная деградация липосомных липидов и высвобождение инкапсулированных веществ (см. 8сЬегрЬоГ е! а1., Апп. И.У. АсаБ. 8е!. 446:368, 1985). После внутривенного введения липосомы небольшого размера (0,1-1,0 мкм) обычно захватываются клетками ретикулоэндотелиальной системы, находящимися преимущественно в печени и селезенке, в то время как липосомы более 3,0 мкм накапливаются в легких. Это селективное поглощение более мелких липосом клетками ретикулоэндотелиальной системы используется для доставки химиотерапевтических препаратов к макрофагам и опухолям печени.

Поглощение липосом клетками ретикулоэндотелиальной системы можно избежать несколькими способами, включающими насыщение большими дозами липосомальных частиц или селективное подавление активности макрофагов фармакологическими средствами (см. С1ааккеп е!. а1., ВюсЫт. ВюрЬук. Ас!а 802:428, 1984). Кроме того, введение гликолипид- или полиэтиленгликоль-производных фосфолипидов в липосомные мембраны, как было показано, приводит к значительному уменьшению захвата липосом клетками ретикулоэндотелиальной системой (см. А11еп е! а1., ВюсЫт. ВюрЬук. Ас!а 1068:133, 1991; А11еп е! а1, ВюсЫт. ВюрЬук. Ас!а 1150:9, 1993).

Липосомы могут быть также ориентированы на воздействие на определенные клетки или органы путем изменения фосфолипидного состава или включения рецепторов или контррецепторов в липосомы. Например, липосомы с большим содержанием неионных поверхносто-активных веществ были использованы для воздействия на печень, (см. например, Ырапеке Ра!еп! 04-244,018 !о Науаката е!. а1, Ка!о е!. а1., Вю1. РЬагт. Ви11. 16:960, 1993.) Эти составы были приготовлены путем смешения фосфатидилхолина из соевых бобов, а- токоферола и этоксилированного гидрогенизированного касторового масла (НСО-60) в метаноле, концентрирования смеси под вакуумом, и, затем, растворения смеси в воде. Липосомальный состав дипальмитилфосфатидилхолина (ЭРРС) со стерил-глюкозидной смесью, полученной из соевых бобов (80) и холестеролом (СЬ), как было показано, также локализуется в печени (См. 81ιίιηίζιι е!. а1., Вю1. РЬагт. Ви11. 20:881, 1997.)

Кроме того, различные контррецепторы для обеспечения специфичности контакта липосомы с мишенью могут быть связаны с поверхностью липосомы: антитела, антительные фрагменты, углеводы, витамины и транспортные белки. Например, для обеспечения специфичности липом к клеткам печени, липосомы могут быть модифицированы с помощью производных галактозиллипидов разветвленного типа, связывающихся с асиалогликопротеиновыми рецепторами (распознают остатки галактозы), которые селективно экспрессируются на поверхности клеток печени (см. Ка!о апБ 8ид1уата, Сгй. Кех. ТЬег. Эгид Сатег 8ук!. 14:287, 1997; МигаЬакЫ е! а1., Вю1 РЬагт. Ви11.20:259, 1997.) Более распространенный подход к обеспечению тканеспецифичности заключается в том, что клетки-мишени предварительно метят биотинилированными антителами, специфичными к контррецепторам, экспрессирующимся на клеткахмишенях (См. Нагакут е!. а1, АБх. Эгид Эейх. Кех. 32:99, 1998.) После удаления из плазмы свободных антител в организм вводятся липосомы, конъюгированные со стрептавидином. При другом подходе тканеспецифические антитела непосредственно связаны с липосомами (См. Нагакут е! а1., вверху.)

Антитела или конъюгаты антитела с лекарственным средством могут быть инкапсулированы в липосомы с помощью стандартных методик белкового микроинкапсулирования (см., например, АпБегкоп е! а1., Ыес!. Iттип. 31:1099, 1981; АпБегкоп е! а1., Сапсег Кек. 50:1853, 1990; СоЬеп е!. а1, ВюсЫт. ВюрЬук. Ас!а 1063:95, 1991; АМпд е!. а1., Ргерага!юп апБ Ике оГ Ырокотек ш ИптипоЫдЫй 8!иБ1ек, т Прокоте ТесЬпо1оду (Уо1. ΙΙΙ) 317 (ОгедопаБЫ, еБ., СКС Ргекк, 2пБ еБ. 1993); ХУаккеГ е!. а1, Ме!Ь. Епζуто1 149:124, 1987.) Как отмечено выше, липосомы, пригодные для терапевтического применения, могут содержать различные компоненты. Например, липосомы могут содержать липидные производные полиэтиленгликоля. (См. А11еп е!. а1., ВюсЫт. ВюрЬук. Ас!а 1150:9, 1993.)

Деградирующие полимерные микросферы были разработаны для поддержания высокого системно- 37 024629 го уровня терапевтических белков. Микросферы изготавливаются из таких деградирующих полимеров как сополимер лактида с гликолидом (РЬ0), полиангидриды, полиортоэфиры небиоразлагаемые полимеры этиленвинилацетата, в которых белки заключены в полимер (см.,например, СотЬо1/ апб РсПП, Вюсоп)ида!е СЬет. 6:332, 1995; Рапабе, Ро1е о£ Ро1утег8 ш Эгид ПеЬуегу, ш Эгид ПеЬуегу §у81ет8 51-93 (Рапабе апб НоШпдег, еб8., СРС Рге88 1995); Роккок апб МакЕезую/, ОедгабаЫе Соп!го11еб Рс1еа8е §у81ет8 И8е£и1 £ог Рго!еш ПеЬуегу, ш Рго!еш ЭсПуегу: РЬу81са1 5>у81ет8 45-92 (§апбег8 апб Непбгеп, еб8., Р1епит Рге88 1997); Вапи8 е!. а1., 8с1епсе 281:1161, 1998; Ри!пеу апб Вигке, №Лиге Вю!есЬпо1оду 16:153, 1998; Ри!пеу, Сигг. 0рш. СЬет. Вю1. 2:548, 1998). Наносферы, покрытые полиэтиленгликолем (РЕ0), можно также вводить внутривенно для доставки терапевтических белков (См.,например, 0ге£ е!. а1., РЬагт. Вю!есЬпо1. 10:167, 1997.)

Специалистами в соответствующей области могут быть разработаны другие лекарственные формы, как показано, например, Ап8е1 и РороуасЬ, РЬагтасеибса1 Эо8аде Еогт8 апб Эгид ОеЬуегу §у8!ет8 (Ьеа & ЕеЫдег, 5Ш еб. 1990); Оеппаго (еб.), РетЫд!оп'8 РЬагтасеибса1 8с1епсе8 (Маск РиЪЫЬтд Сотрапу, 19!Ь еб. 1995) апб Рапабе апб НоШпдег, Эгид ОеЬуегу §у8!ет8 (СРС Рге88 1 996).

Фармацевтические композиции, как описано в данной заявке, могут также быть использованы для комбинированной терапии. Термин комбинированная терапия используется в данной заявке для обозначения той ситуации, когда пациенту вводят по крайней мере одну терапевтически эффективную дозу моноклональных антител против В7Н6 человека или коньюгата антитела с лекарственным средством в сочетании со вторым веществом для лечения заболевания или расстройства. Антитела против В7Н6 или коньюгат антитела с лекарственным средством и второе вещество могут, например, вводиться совместно (например, как одна композиция, содержащая оба вещества или одновременно как разные композиции в тот же или почти тот же целевой орган или ткань) или, в другом случае, вводиться раздельно (например, в разное время и/или разные целевые органы или ткани).

Фармацевтические композиции могут поставляться как наборы, содержащие контейнер, который содержит терапевтический полипептид или полинуклеотид, описанные в данной заявке. Терапевтическая молекула может поставляться, например, в форме впрыскиваемого раствора для однократного или многократного применения или как стерильный порошок, который необходимо растворять перед инъекцией, Кроме того, такой набор может включать диспензер для сухих порошков, жидкостной аэрозольный генератор или ингалятор для введения терапевтических пептидов или полинуклеотидов. Такой набор может дополнительно содержать письменную информацию о показаниях и применении фармацевтической композиции. Например, такая информация может включать предписание о наличии противопоказаний к применению композиции против В7Н6 у пациентов с повышенной чувствительностью к В7Н6.

С. Способы определения экспрессии В7Н6

Антитела, описанные в данной заявке также применимы для определения экспрессии В7Н6, включая применение для диагностики. Определение уровня экспрессии может быть необходимо по ряду причин. Например, определение уровня экспрессии В7Н6 на клеточном уровне может применяться при диагностике рака. Определение уровня экспрессии В7Н6 может быть частью процедур скрининга, диагностики или прогнозирования развития рака. Способ определения уровня экспрессии В7Н6 может применяться для сравнения уровней экспрессии В7Н6 в образце пациента со стандартным образцом или референсным количеством, в качестве одного из анализов при определении степени тяжести или стадии развития опухоли или мониторинга результатов лечения. Данный способ детекции экспрессии В7Н6 может использоваться однократно или многократно для таких приложений, как мониторинг, например, для мониторинга прогресса лечения, давая информацию о рецидиве опухоли.

В определенных вариантах исполнения способ определения уровня экспрессии В7Н6 на клеточном уровне включает обработку тестируемого биологического образца моноклональными антителами против В7Н6 и последующее определение уровня связывания антител. Связывание антител показывает присутствие В7Н6 на клетках образца. Антитело и молекула В7Н6 образуют комплекс антиген-антитело, при этом определение условий, в которых формируется данный комплекс в зависимости от свойств биологического образца и способа анализа, не является затруднительным для специалистов в данной области. Применимыми антителами являются антитела, способные конкурировать за связывание с внеклеточным доменом В7Н6 человека с антителами, продуцируемыми клонами гидридом из группы, состоящей из:

(ί) гибридомный клон 4Е5.5 (депозитный № СNСΜ Ι-4242);

(ίί) гибридомный клон 909.2 (депозитный № СNСΜ Ι-4243);

(ίίί) гибридомный клон 10Е2.9 (депозитный № СNСΜ Ι-4244) и (ίν) гибридомный клон 17В1.3 (депозитный № СNСΜ Ι-4245).

Тестируемый биологический образец может содержать интактные человеческие клетки или мембранную фракцию тестируемых клеток. Например, клетками, тестируемыми с помощью заявленных способов являются клетки, предположительно экспрессирующие В7Н6 и ассоциированные с развитием опухоли у пациента, такие как, например, клетки рака толстой кишки, клетки рака печени, клетки рака шейки матки, клетки рака легкого, клетки рака поджелудочной железы, клетки рака простаты, клетки прогемоцитарной лейкемии, клетки В-клеточной лимфомы клетки моноцитарной лимфомы, клетки эритролейкемии, клетки лимфомы Беркитта, клетки хронического миелолейкоза и другие.

- 38 024629

Определение связывания с антителом для обнаружения присутствия В7Н6-экспрессирующих клеток подразумевает анализы на специфическое связывание с помощью любого метода, известного в соответствующей области. Существует большое количество хорошо известных форматов для подобного анализа. Например, системы анализа связывания могут быть прямым и непрямым, с использованием таких методик, как Вестерн блоты, радиоиммуноанализ, ИФА, сэндвич-иммуноанализы, иммунопреципитационные анализы, преципитиновые анализы, гель-диффузионные преципитиновые анализы, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы, иммуноанализы с использованием белка А, анализ фиксации комплемента и другие. Такие анализы являются потоковыми и хорошо известны в соответствующей области. Для повышения чувствительности определения, используемое антитело отмечается детектируемой меткой, например, радиоизотопной, флуоресцентной, хемилюминесцентной, ферментативной или биолюминесцентной меткой. Способы конъюгирования меток и антител описаны в соответствующей области, и любой соответствующий способ может быть использован.

Настоящее изобретение также включает способ диагностики пациента с подозрением на наличие опухоли экспрессирующей В7Н6. Данный метод включает введение субъекту, чаще всего человеку (однако субъектом может являться другой вид млекопитающих, например, не-человекообразный примат, собака, кошка, свинья и др.) моноклонального антитела против В7Н6 конъюгированного с детектируемой меткой, такой, как описано выше. Применимыми антителами являются антитела, конкурирующие за связывание с внеклеточным доменом В7Н6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности §ЕЦ ГО N0:2) с антителом, продуцируемым клонами гибридомы из группы, состоящей из:

(ί) гибридомный клон 4Е5.5;

(ίί) гибридомный клон 909.2;

(ίίί) гибридомный клон 10Е2.9 и (ίν) гибридомный клон 17В1.3.

В некоторых вариантах исполнения, используемые антитела конкурируют за связывание с внеклеточным доменом В7Н6 с антителами, продуцируемыми клоном гидридомы (ίί)-(ίίί) из списка выше. В отдельных вариантах исполнения антитело является химерным или гуманизированным антителом, производным от антител, продуцируемых клонами гибридом (ί)-(ίν) из списка выше или (ίί)-(ίίί) из списка выше. После приема антитела, определяется распределение данного антитела в организме субъекта. Способы детекции распределения любой специфической метки известны специалистам в соответствующей области. Может использоваться любой подходящий способ. Неограничивающий список примеров включает компьютерную томографию (КТ), позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ), магниторезонансную томографию (МРТ), флуоресценцию, хемилюминесценцию и ультразвуковое исследование.

Данная заявка ниже иллюстрируется неограничивающими примерами.

Примеры

Пример 1. Получение и отбор моноклональных антител мыши против В7Н6 человека

A. Иммунизация

Мыши линии Ва1Ь/с были иммунизированы в соответствии со следующим протоколом:

Ό0: внутривенное введение 100 мкг растворимого В7Н6 (внеклеточный домен В7Н6 человека слитый с мышиным Рс-фрагментом со стороны С-конца (ЬВ7Н6/тРс2; зрелая форма, остатки 25-500 последовательности №3))

Ό15: внутривенное введение 100 мкг растворимого В7Н6

Ό25: интраперитонеальное бустирование 100 мкг растворимого В7Н6

Три дня спустя после третьей иммунизации выделяли селезенку. Изолировали спленоциты, сливали с клетками миеломной линии и рассевали в 40 96-луночных планшетов. Через 3 недели культивирования анализировали супернатанты 3840 поликлональных линий гибридом на присутствие моноклональных антител против В7Н6 человека.

B. Первичный скрининг гибридомных клонов

Для отбора поликлональных линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела против В7Н6 человека, клетки линии Р815, экспрессирующие В7Н1 и линии Р815, экспрессирующие В7Н6, инкубировали с супернантанами 3840 поликлональных линий гибридом. Результаты оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии с использованием для окрашивания иммуноглобулинов против иммуноглобулинов мыши, конъюгированных с красителем Су5. В результате показано, что 144 из 3840 поликлональных линий гибридом были позитивны при взаимодействии с В7Н6-экспрессирующими клетками в отличие от В7Н1-экспрессирующих, что означает продукцию этими линиями моноклональных антител против В7Н6.

C. Второй скрининг поликлональных линий гибридом

Второй скрининг проводили для отбора блокирующих антител. Для идентификации таких поликлональных линий гибридом оценивали способность каждого из 114 супернатантов блокировать связывание NΚρ30Рс с клетками линии Р815.В7Н6. Для отобранных поликлональных линий гибридом параллельно проводили подтверждение продукции моноклональных антител против В7Н6 с помощью инкубации с клетками линии Р815.В7Н6. Дополнительно в качестве положительного контроля для анализа использовали поликлональные антитела против В7Н6, для которых предварительно была продемонстрирована

- 39 024629 ингибирующая связывание ΝΚρ30 с В7Н6-экспрессирующими клетками линии Р815 активность.

Полученные результаты продемонстрировали, что клетки линии Р815.В7Н6 окрашивались NΚρ30Ρс и данное окрашивание ингибировалось поликлональными антителами против В7Н6 в концентрации 10 мкг/мл. В соответствии с полученными результатами 114 супернатанта разделили на 4 группы:

(1) поликлональные линии гибридом, продуцирующие моноклональные антитела против В7Н6, блокирующие связывание NΚρ30Ρс (1/114);

(2) поликлональные линии гибридом, продуцирующие моноклональные антитела против В7Н6 не блокирующие связывание NΚρ30Ρс (27/114);

(3) поликлональные линии гибридом, продуцирующие моноклональные антитела против В7Н6, которые лишь частично блокируют связывание NΚρ30Ρс (1/114);

(4) поликлональные линии гибридом, не продуцирующие каких-либо моноклональных антител против В7Н6 (85/114). В итоге, 29 поликлональных линий гибридом эффективно продуцируют моноклональные антитела против В7Н6 и только 2 линии продуцируют блокирующие моноклональные антитела. Данные 29 поликлональных линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела против В7Н6 клонировали.

Ό. Клонирование поликлональных линий гибридом

После клонирования 29 отобранных поликлональных линий гибридом 11 линий не дали клонов, клоны, полученные от 5 поликлональных линий гибридом оказались негативны по требуемым свойствам, 13 поликлональных линий гибридом, дали позитивные и способные к росту гибридомные клоны. Наращивание в культуральных колбах позволило получить только 9 клонов, производных 5 поликлональных линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела против В7Н6. Были охарактеризованы и определены как мышиные антитела изотипа 1д01 антитела следующих клонов гибридом: 4Е5.5, 5Е1.4, 909.2, 10Е2.9 и 17В1.3.

Гибридомные клоны, экспрессирующие моноклональные антитела против В7Н6 депонировали в патентный депозитарий Национальной коллекции культур микроорганизмов (СNСΜ) Института Пастера в Париже, в качестве оригинальных депозитов в соответствии с Будапештским договором. Клонам были присвоены следующие депозитные номера: гибридомный клон 4Е5.5 (депозитный № СNСΜ Ι-4242, депонирован 18 ноября, 2009); гибридомный клон 909.2 (депозитный № СNСΜ Ι-4243, депонирован 18 ноября, 2009); гибридомный клон 10Е2.9 (депозитный № СNСΜ Ι-4244, депонирован 18 ноября, 2009); и гибридомный клон 17В1.3 (депозитный № СNСΜ Ι-4245, депонирован 18 ноября, 2009).

Пример 2. Характеристика моноклональных антител мыши против В7Н6 человека

А. Активность моноклональных антител мыши против В7Н6 человека по отношению к клеткам опухолевых линий

Каждое моноклональное антитело против В7Н6 человека (4Е5.5, 5Е1.4, 909.2, 10Е2.9, и 17В1.3) сравнивали по способности окрашивать клетки опухолевых линий с препаратом поликлональных антител протии В7Н6. Использовали клетки следующих линий: НЕК-293, НеЬа ΕV2, К562, и Кар. Клетки линий Р815.В7Н6 и Р815.В8Н1 использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Каждое из данных пяти моноклональных антител было способно окрашивать клетки всех опухолевых линий, с незначительными вариациями по интенсивности окрашивания между исследуемыми антителами. Например, антитела клона 17В1.3 окрашивали клетки линии Р815.В7Н6 с такой же интенсивностью, что и препарат поликлональных антител, однако эффективность окрашивания ими клеток линии Кар была ниже. Также, окрашивание антителами клона 17В3.1 клеток линий НЕК-293 и НеЬа ΕV2 было менее интенсивным, чем у препарата поликлональных антител, тогда как окрашивание клеток линии К562 было более слабым с антителами клона 4Е5.5, по сравнению с препаратом поликлональных антител.

С. Дифференцировка эпитопов с помощью конкурентного анализа

Для определения перекрывания эпитопов, связываемых моноклональными антителами клонов 4Е5.5, 5Е1.4, 909.2, 10Е2.9 аиб 17В1.3, проводили конкретный анализ. Только антитела гибридомного клона 909.2 были непосредственно конъюгированы с флуорохромом (А1еха 647, ΜοΚαιΕίΓ РгоЬез). Таким образом, данное антитело использовали для оценки уровня связывания данного антитела с клетками линии НЕК-293 после инкубации клеток с другими моноклональными антителами против В7Н6. Клетки линии НЕК-293 сначала инкубировали с препаратами очищенных моноклональных антител при концентрации 30 мкг/мл, после чего инкубировали клетки с конъюгатом 909.2-А1еха647 в концентрации 10 мкг/мл. После этого оценивали интенсивность окрашивания клеток антителами 909.2-А1еха647 с помощью проточной цитофлуорометрии (ВИ §с1еисез, Шс., РгаикПи Ьакез, Νί). По результатам такого анализа показано, что предварительная инкубация клеток линии НЕК-293 с моноклональными антителами клонов 10Е2.9, 4Е5.5, или 909.2 в значительной степени снижает интенсивность окрашивания данных клеток моноклональным антителом 909.2-А1еха 647. Предварительная инкубация клеток линии НЕК-293 с моноклональными антителами клона 5Е1.4 в значительно меньшей степени снижает интенсивность окрашивания этих клеток антителом 909.2-А1еха 647. Предварительная инкубация клеток с антителами клона 17В1.3 не оказывает значимого эффекта на последующее окрашивание этих клеток антителом 909.2-А1еха 647. Полученные результаты показывают, что антитела клонов 10Е2.9, 4Е5.5 и 909.2 связы- 40 024629 ваются с перекрывающимися эпитопами (возможно, с одинаковыми или очень схожими). Антитела клонов 17В1.3 и 909.2 (и, возможно, 5Е1.4 и 909.2) распознают неперекрывающиеся эпитопы.

Ό. Моноклональные антитела мыши против В7Н6 человека блокируют связывание ΝΙ<ρ30^ в значительной степени

Для определения моноклональных антител, которые обладают блокирующей активностью по отношению к связыванию с МКр30Рс использовали конкурентный анализ связывания. NΚρ30Ρс представляет собой растворимую форму ΝΚρ30 человека, состоящую из внеклеточного домена ΝΚρ30 человека слитый с Рс-фрагментом с С-конца. В ходе анализа оценивали связывание МКр30Рс с клетками линии НЕК-293 после инкубации клеток с поликлональными антителами против В7Н6, т1д01, контролем и очищенными моноклональными антителами мыши против В7Н6 человека 4Е5.5, 5Е1.4, 909.2, 10Е2.9 и 17В1.3. Сначала клетки линии НЕК-293 инкубировали с очищенными моноклональными антителами в концентрации 30 мкг/мл, отмывали и, затем, инкубировали с комплексом МКр30Рс (5 мкг/мл)/РЕконъюгированные антитела против иммуноглобулинов человека (5 мкг/мл, Гаскюп IттиηοКеκеа^сЬ ЬаЪο^а!ο^^еκ, \Уек1 Огаме, РА). Интенсивность флуоресцентного сигнала оценивали с помощью прибора ΒΌ РАС8Са11Ъиг™ (ΒΌ 8с1епсек 1пс.) и программного обеспечения Ρ1ο\\3ο (Тгее 8!аг, 1пс. АкЬ1апй, ОК). По результатам анализа моноклональные антитела клонов 4Е5.5 и 17В1.3 в значительной степени блокировали связывание ΝΚρ30Ρ^

Е. Моноклональные антитела мыши против В7Н6 человека в значительной степени блокируют активацию ИОМ8Р30.

Для подтверждения блокирующей активности моноклональных антител 17В1.3 и 4Е5.5 проводили функциональный анализ с использованием клеток линии ИОМ8Р30 в качестве репортеров. Клетки линии ИОМ8Р30 использовали в качестве репортерной клеточной системы для подтверждения способности В7Н6 индуцировать передачу сигнала напрямую через ΝΚρ30. (См. 8сЫетП/ е! а1. АйЬтШк КЬеит. 58:32156-3223, 2008, для описания ИОМ8Р30). Активация ИОМ8Р30 может быть детектирована либо по продукции интерлейкина 2 через 24 ч после стимуляции, либо по повышению уровня экспрессии 0069 через 4 ч после стимуляции. Клетки линии ИОМ8Р30 культивировали совместно с клетками линий НеЬа Εν2 либо НеЬа РР в присутствии и в отсутствии антител против ΝΚρ30, ΝΚρ46, поликлональных антител против В7Н6, 1дО1 мыши или одного из моноклональных антител против В7Н6 человека 4Е5.5, 5Е1.4, 909.2, 10Е2.9 и 17В1.3 (в концентрации 10мкг/мл). После 4 ч совместного культивирования оценивали число (процент) СЭ69+ клеток ИОМ8Р30.

По результатам анализа, антитела против ΝΚρ30 полностью блокировали ИОМ8Р30 активацию, а моноклональные антитела 4Е5.5 и 17В1.3 частично ингибировали активацию ИОМ8Р30. Вкратце, в отсутствие антител около 75% клеток линии ИОМ8Р30 были СЭ69, тогда как процент СЭ69 клеток при культивировании в присутствии антител был следующим: менее 10% при анти-МКР30 антителах, около 20% при поликлональных антителах против В7Н6, около 45% при моноклональных антителах 4Е5.5 или 17В1.3. В то же время, антитела против ΝΚρ46 и моноклональные антитела 909.2, 10Е2.9 и 5Е1.4 не оказывали эффекта на активацию ИОМ8Р30.

Р. Моноклональное антитело мыши против В7Н6 человека приемлемо для иммуноблоттинга

Возможность применения описываемых моноклональных антител против В7Н6 человека для иммуноблоттинга исследовали в экспериментах по иммуноблоттингу белковых экстрактов трех клеточных линий: ΚΗΥ0-1 не экспрессирующей В7Н6, и Р825.В7Н6 и НЕК-293, каждая из которых экспрессируют В7Н6. Поликлональные антитела против В7Н6 использовали в качестве положительного контроля. Клетки собирали, промывали охлажденным 1хРВ8, суспендировали в Лизирующем Буфере (10 тМ Тпк-НС1 рН 7.6; 150 тМ ЫаС1; 1% ТиГОм X; 1Х Ингибитор протеаз (^сЬе Аρρ1^ей 8с1епсе, Iηй^аηаρο1^κ. ΙΝ) в концентрации 20х10⁶ клеток/мл и инкубировали на льду в течение 30 мин. Полученные клеточные лизаты центрифугировали в течение 20 мин при 13200 об/мин и +4°С. Затем отбирали супернатант и измеряли суммарное содержание белка с помощью набора реактивов ВСА (Р1етсе, И8А), после чего доводили концентрацию белка до 1,5 мг/мл; 30 мкл каждого клеточного лизата смешивали с 10 мкл 4х буфера для нанесения и прогревали 10 мин при 95°С. Полученные образцы наносили на предварительно готовый к применению гель (2-20% Ртесйе Рго!еш 0е1 Ггот ТЬе^тο ктепййс) и проводили электрофорез при НОВ. После электрофореза образцы переносили на мембрану с использованием набора ίΒ1ο! 0е1 ТгапкГег 8!аск N^ιгосе11и1οκе. Кеди1аг кН (ЗпуНгодеп, 8ап ^^едο. СА). Мембрану насыщали 1Х буферным раствором ТΒ8Т (100 тМ Тпк НС1 ρΗ=7.5 + 0,9% НС1 + 0,05% Т\уееп) с 5% молока в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего инкубировали с каждым моноклональным антителом против В7Н6 в концентрации 2 мкг/мл в буфере 1хТΒ8Т с 5% молока в течение ночи при +4С. Затем мембрану отмывали дважды по 10 мин в 1хТΒ8Т и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с препаратом овечьих антител против антител мыши конъюгированных с пероксидазой НКР в 1хТΒ8Т с 5% молока. После инкубации мембрану промывали 4 раза по 20 мин в ТΒ8Т и обрабатывали набором реактивов для ЕСЬ (0Ε Неа1!Ьсаге, РйсаРцуау, Ш).

Из 5 протестированных моноклональных антител только антитело 10Е2.9 (10 мкг/мл) являлось пригодным для применения в иммуноблоттинге в описанных условиях. Полученные результаты позволяют

- 41 024629 предполагать, что эпитопы молекулы В7Н6, с которыми связываются моноклональные антитела 4Е5.5, 5Е1.4, 909.2, и 17В1.3, возможно, не являются линейными, а состоят из удаленных участков линейной структуры В7Н6, сближенных в пространстве за счет укладки полипептидной цепи В7Н6.

0. Три из пяти моноклональных антител мыши против В7Н6 человека применимы для иммунопреципитации

Для оценки эффективности использования антител 4Е5.5, 5Е1.4, 909.2, 10Е2.9 и 17В1.3 для иммунопреципитации получали белковые экстракты клеток линии Р815В7Н6 и проводили иммунопреципитацию с использованием тестируемых моноклональных антител. Полученные иммунопреципитаты наносили на гель и, после электрофореза, анализировали присутствие В7Н6 с помощью поликлональных антител против В7Н6 и конъюгированных с НКР антител против антител мыши. В результате показано, что в иммунопреципитатах моноклональных антител 4Е5.5, 909.2 и 10Е2.9 содержится В7Н6, а в иммунопреципитатах моноклональных антител 5Е1.4 и 17В1.3 нет.

Пример 3. Модель карциномы поджелудочной железы ВхРС3 для оценки эффективности подавления роста опухоли с помощью антител против В7Н6 или конъюгата антитела с лекарственным средством

При определении способности моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгатов моноклональных антител против В7Н6 человека с лекарственным средством к подавлению роста опухоли у мышей нескольким группам мышей делали подкожную инъекцию опухоли поджелудочной железы ВхРС3 в день 0. После увеличения опухоли до 150-200 мм³ группам мышей (п=10/группу) делали инъекции в дозировках от 1 до 30 мг/Кг контрольного вещества, антитела против В7Н6 или конъюгата антитела против В7Н6 с лекарственным средством, от 1 до 3 раз в неделю в течение 3 недель. Размер опухоли оценивали 3 раза в неделю в течение 5 недель. Значимо меньший размер опухоли был детектирован у мышей, которым инъецировали антитело против В7Н6 или конъюгат антитела против В7Н6 с лекарственным средством, по сравнению с группой мышей, которым инъецировали контрольное вещество. Таким образом, эти результаты свидетельствуют об эффективности данных антагонистов для подавления роста опухоли.

Дизайн исследования: 8-10 недельным самкам мышей линии С.В-17 §СГО (Сйаг1е8 Клуег ЬаЬога!опе5) подкожно с правой стороны инъецировали 2 х 10⁶ клеток ВхРС3 в день 0. После достижения размера опухоли 150-200 мм³, группам мышей (п=10/группу) инъецировали интраперитонеально в дозировке от 1 до 30 мг/Кг контрольное вещество, антитело против В7Н6, конъюгат антитела против В7Н6. Инъекции проводили 1-3 раза в неделю в течение 3 недель. Размер опухоли оценивали 3 раза в неделю в течение 5 недель с помощью штангенциркуля. Размер опухоли рассчитывали по формуле: ^!/₂*(В)²*Ь(мм³).

Пример 4. Подавление роста гепатоклеточной карциномы человека ш У1уо с помощью моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгата антител с лекарственным средством.

Для оценки противоопухолевой активности моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством по отношению к гепатоклеточной карциноме ш У1уо, нескольким группам мышей линии ВЛЬВ/с пибе были проведены инъекции клеток гепатоклеточной карциномы линий НиН7 или С3А в день 0 исследования. Разным группам мышей (п=10/группу) с опухолью, до 33 дня исследования, делали интраперитонеально или внутрь опухоли инъекции моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством через день, начиная с 5 дня исследования в дозировке 5-75 мкг. Размер опухоли определяли 3 раза в неделю в течение 6 недель. Подавление роста опухоли с помощью моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством показывает, что соответствующий белок обладает ингибирующим действием по отношению к гепатоклеточной карциноме ш У1уо.

Дизайн исследования: 8-10 недельным самкам мышей линии ВЛЬВ/с пибе (Сйаг1е8 Клуег ЬаЬогаЮпе5) подкожно с правой стороны инъецировали 6 х 10⁶ клеток линии НиН7 или С3А в день 0 исследования. Группам мышей (п=10/группу) интраперитонеально или внутрь опухоли инъецировали 5-75 мкг моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством, начиная с 5 и по 33 день исследования. Инъекции делались в общем объеме 200 мкл. Рост опухоли контролировали 3 раза в неделю в течение 6 недель с помощью штангенциркуля. Размер опухоли вычисляли по формуле: ^!/₂*(В)²*Ь(мм³).

Пример 5. Подавление роста клеток карциномы простаты человека ш У1уо с помощью моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством.

Для оценки противоопухолевой активности моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством по отношению к клеткам карциномы простаты человека ш У1уо, нескольким группам мышей линии ВЛЬВ/с пибе инъецировали клетки карциномы простаты линий РС3 или Όυ-145 в день 0 исследования. Разным группам мышей (п=10/группу) с опухолью с 5 по 33 день исследования делали интраперитонеально или внутрь опухоли инъекции моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством через день в дозировке 5-75 мкг. Размер опухоли определяли 3 раза в неделю в течение 6 недель. Подавление роста опухоли (объем или вес) с помощью моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством демонстрирует, что соответствующий белок обладает ингибирующим действием по

- 42 024629 отношению к карциноме простаты человека ίη νίνο.

Дизайн исследования: 8-10 недельным самкам мышей линии ВАЬВ/с гшбе (СЬаг^ Ркег ^аЬο^а!οΛδ) подкожно с правой стороны или ортопически в простату инъецировали 10 χ 10⁶ клеток линии РС-3 или 6 χ 10⁶ клеток линии ИИ-145 в день 0 исследования. Группам мышей (п=10/группу) интраперитонеально или внутрь опухоли (только для моделей с подкожным введением клеток опухоли) инъецировали 5-75 мкг моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством, начиная с 5 и по 33 день исследования. Инъекции делались в общем объеме 200 мкл. Для подкожных опухолей рост опухоли контролировали 3 раза в неделю в течение 6 недель с помощью штангенциркуля. Размер опухоли вычисляли по формуле: ^!/₂*(В)²*Ь (мм³). Для ортопических опухолей мышей умерщвляли в конце исследования и взвешивали опухоли для оценки опухолевой нагрузки.

Пример 6. Подавление клеток крациномы толстой кишки человека ίη νίνο с использованием моноклонального антитела противВ7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством

Для оценки противоопухолевой активности моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством по отношению к клеткам карциномы толстой кишки человека ίη νίνο, нескольким группам мышей линии ВАЬВ/с гшбе были проведены инъекции клеток карциномы толстой кишки линий ИЬИ-1 или НСТ-116 в день 0 исследования. Разным группам мышей (п=10/группу) с опухолью с 5 по 33 день исследования делались интраперитонеально или внутрь опухоли инъекции моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством через день в дозировке 5-75 мкг. Размер опухоли определяли 3 раза в неделю в течение 6 недель. Подавление роста опухоли (объем или вес) с помощью моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством позволяет предполагать, что соответствующий белок обладает ингибирующим действием по отношению к карциноме толстой кишки человека ίη νίνο.

Дизайн исследования: 8-10 недельным самкам мышей линии ВАЬВ/с гшбе (ΟιηΛδ Ркег ΡηόοΗΐΙοΛδ) подкожно с правой стороны или ортопически в стенку толстой кишки инъецировали 6 χ 10⁶ клеток линии ИЬИ-1 или НСТ-116 в день 0 исследования. Группам мышей (п=10/группу) интраперитонеально или внутрь опухоли (только для моделей с подкожным введение клеток опухоли) инъецировали 5-75 мкг моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством, начиная с 5 и по 33 день исследования. Инъекции делались в общем объеме 200 мкл. Для подкожных опухолей рост опухоли контролировали 3 раза в неделю в течение 6 недель с помощью штангенциркуля. Размер опухоли вычисляли по формуле: ^!/₂*(В)²*Ь (мм³). Для ортопических опухолей мышей умерщвляли в конце исследования и взвешивали опухоли для оценки опухолевой нагрузки.

Пример 7. Подавление клеток карциномы поджелудочной железы ίη νίνο с использованием моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством

Для оценки противоопухолевой активности моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством по отношению к клеткам карциномы поджелудочной железы человека ίη νίνο, нескольким группам мышей линии ВАЬВ/с гшбе были проведены инъекции клеток карциномы поджелудочной железы линий ВхРС-3 или НРАР-ΙΙ в день 0 исследования. Разным группам мышей (п=10/группу) с опухолью с 5 по 33 день исследования делались интраперитонеально или внутрь опухоли инъекции моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством через день в дозировке 5-75 мкг. Размер опухоли определяли 3 раза в неделю в течение 6 недель.

Подавление роста опухоли (объем или вес) с помощью моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством позволяет предполагать, что соответствующий белок обладает ингибирующим действием по отношению к карциноме поджелудочной железы человека ίη νίνο.

Дизайн исследования: 8-10 недельным самкам мышей линии ВАЬВ/с гшбе (ΟιηΛδ Ркег ΡηόοΗΐΙοΛδ) подкожно с правой стороны или ортопически в поджелудочную железу инъецировали 6 χ 10⁶ клеток линии ВхРС-3 или НРАР-ΙΙ в день 0 исследования. Группам мышей (п=10/группу) интраперитонеально или внутрь опухоли (только для моделей с подкожным введение клеток опухоли) инъецировали 5-75 мкг моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством, начиная с 5 и по 33 день исследования. Инъекции делались в общем объеме 200 мкл. Для подкожных опухолей рост опухоли контролировали 3 раза в неделю в течение 6 недель с помощью штангенциркуля. Размер опухоли вычисляли по формуле: ^!/₂*(В)²*Ь (мм). Для ортопических опухолей мышей умерщвляли в конце исследования и взвешивали опухоли для оценки опухолевой нагрузки.

Пример 8. Подавление В-клеточной лимфомы ίη νίνο с помощью моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством.

Клеточная линия В-клеточной лимфомы человека поддерживается ίη νίίτο с помощью пассажей в ростовой среде. Для удаления компонентов среды клетки тщательно отмывают в РВЗ.

Мышам линии ЗСГО инъектировали (обычно) 1 χ 10⁶ клеток лимфомы человека в хвостовую вену в объеме 100 мкл. Оптимальное число клеток для введения определяется эмпирически в пилотном иссле- 43 024629 довании, определяющем количество клеток для введения необходимое для получения кинетики развития опухоли близкой к желаемой. Лечение моноклональным антителом или конъюгатом моноклонального антитела с лекарственным средством начинают на следующий день после введения клеток опухоли либо с помощью подкожной имплантации осмотической мини-помпы АЬГЕТ® (АЬ2ЕТ, Сиρе^ι^ηο. СА) либо ежедневной интраперитонеальной инъекции моноклональных антител против В7Н6 или конъюгата антитела с лекарственным средством или носителя. Наблюдают выживаемость и значительное развитие заболевания у мышей в эксперименте. Особей, вес которых снизился более чем на 20% после начала эксперимента, забивают, также как и тех особей, у которых происходит значительный прогресс заболевания, например паралич задних конечностей. В зависимости от используемой линии клеток лимфомы, без терапевтического вмешательства мыши умирают в течение 3-6 недель. При В-клеточных лимфомах, секретирующих иммуноглобулины классов М или О, прогресс заболевания может быть отслежен с помощью анализа сывороточного уровня иммуноглобулинов человека с помощью ИФА на еженедельно отбираемых образцах крови.

Эффект дозы моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством/модель ΙΜ9

Мышам проводится инъекция 1 х 10 клеток линии 1М9, после чего на следующий день имплантируются 28-дневные осмотические мини-помпы. Помпы загружаются для доставки следующих вариантов концентраций моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством: 0, 0,12, 1,2, и 12 мкг/день. На каждую дозу берется группа из 8 мышей. Повышение устойчивости к развитию опухолевых клеток по мере увеличения дозы антитела или конъюгата антитела с лекарственным средством демонстрирует, что данные эффекты моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством являются дозозависимыми. У мышей, которые выжили в течение эксперимента, не обнаруживаются признаки развития заболевания и не детектируются человеческие иммуноглобулины класса О сыворотке.

Полученные данные показывают, что эффективность моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством на моделях лимфом мышей линии δΟΊΩ корреллируют со способностью подавлять рост клеток лимфомных линий ш νί\Ό.

Пример 9. Подавление В-клеточных опухолей ш νί\Ό с помощью моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством

Постоянное введение моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством с помощью осмотической минипомпы позволяет создать постоянную сывороточную концентрацию пропорциональную концентрации моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством в мини-помпе. 0,22 мл раствора моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством в фосфатном буферном растворе (рН 6.0) с концентрацией 2 или 0,2 мг/мл загружается в стерильных условиях в осмотическую мини-помпу А/1е1 (модель 2004; А1/а со1рога1юп Ра1о А1Ю, СА). Помпа имплантируется подкожно в мышь через разрез на спине длиной 1 см, после чего кожа сшивается стерильным шовным материалом. Такие помпы разработаны таким образом, что высвобождение содержимого происходит со скоростью 0,25 мкл в час в течение 28 дней. Данный метод введения приводит к значительному росту выживаемости мышей после инъекции опухоли (ниже).

Эффект моноклинального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством по отношению к опухолям В-клеточного происхождения ΐη νίνο Данные эффекты моноклональных антител против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством тестируются ш νί\Ό с использованием мышиной модели ксенотрансплантата, описанной в данной заявке. Тестируемая модель ксенотрансплантата представляет собой клеточную линию лимфобластомы человека 1М-9. Мышей линии С.В17 δίΊΩ (самки С.В17/1стНвб-вс1б; Наг1ап, Iηб^аηаρο1^β, 1пб1апа) разделяют на 4 группы. В день 0 исследования проводится инъекция в хвостовую вену предварительно собранных из культуры клеток линии 1М-9 всем мышам (около 1 000 000 клеток на мышь). В день 1 исследования мышам подкожно имплантируют осмотические мини-помпы, содержащие либо тестируемое вещество, либо контрольное вещество. Мыши групп 1-3 (п=9 особей в группе) получают моноклональное антитело против В7Н6 человека или конъюгат антитела с лекарственным средством: дозировка группы 1 составляет 12 мкг/день в концентрации 2 мг/мл раствора моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством; дозировка группы 2 составляет 1,2 мкг/день в концентрации 0,20 мг/мл раствора моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством; дозировка группы 3 составляет 0,12 мкг/день в концентрации 0,02 мг/мл раствора моноклонального антитела против В7Н6 человека или конъюгата антитела с лекарственным средством. Группа 4 (п=9) является контрольной и получает буферный раствор (ΤΒδ рН6,0).

Повышенная выживаемость в группах мышей (например, получавших 12 мкг/день или 1,2 мкг/день антитела) по сравнена с группой, получавшей буферный раствор, показывает, что моноклональные антитела против В7Н6 человека или конъюгат антитела с лекарственным средством ограничивает патологи- 44 024629 ческий эффект В-клеточных опухолей ш У1уо.

Основываясь на вышеизложенном, следует принять во внимание, что специфические варианты исполнения данного изобретения описаны в иллюстративных целях и различные модификации исполнений могут быть сделаны без отклонения от духа и области настоящего изобретения. Соответственно настоящее изобретение является неограниченным, кроме как прилагаемыми пунктами формулы изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в данной заявке включаются в настоящее изобретение во всей полноте посредством ссылки для любых целей.

Перечень последовательностей <110> Вивье, Эрик

Баратеи, Мириам Пьерр, Мишель <120> МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕ В7Н6, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ <130> ΖΜΟ5-0169 <160> 3 <170> РаТепИп уегэтоп 3.5 <210> 1 <211> 1365 <212> ДНК <213> Ното Зартепз <400> 1

агдасдгдда	дддсгдссдс	стссасдгдс	дсддсдсгсс	Сдаисгдсс	дгдддсдсгд	60
асдассдаад	дгдагсгдаа	адгададатд	атддсадддд	ддастсадаг	сасассссгд	120
ааТдасааТд	1сасса1а11	сТдсааТаТс	11НаНссс	аассссТсаа	са1сасд1с!	180
агдддгатса	сстддгтттд	даададтстд	асдТГТдаса	аадаадтсаа	адтсгттдаа	240
тгггтгддад	агсассаада	ддсаГТссда	ссгддадсса	ггдгдгсгсс	агддаддсгд	300
аададГдддд	асдссТсасТ	дсддсТдссТ	ддааТссадс	Тддаддаадс	аддададТас	360
сдагдгдадд	гддтддгсас	сссгстдаад	дсасадддаа	садгссадсг	гдаадггдгд	420
дстгссссад	ссадсадагт	дтгдстддаг	саадтдддса	тдааададаа	гдаадасааа	480
ТаТаТдТдТд	ад!саад1дд	д!1с1ассса	даддс1а!1а	аТаТаасаТд	ддадаадсад	540
асссадаадт	ттссссатсс	сагададатг	Гстдаддатд	Тсагсасгдд	ГсссассаГс	600
аадаагатдд	аГддсасаГГ	ГааТдТсасГ	адсгдстгда	адсгдаастс	сгсгсаддаа	660
дасссТддда	сТдТсТасса	дТдТдТддТа	сддсаТдсдТ	ссТТдсаТас	ссссТТдадд	720
адсааста	ссстдастдс	ГдсГсддсас	адтстсгд	ааасТдадаа	дасадаСааС	780

- 45 024629

!!!!сса!!с	а!!дд!ддсс	!а!!!са!!с	а!!дд!д!!д	дас!дд!!!!	атгаатгдтг	840
!!да!!сс!!	ддааааада!	а!д!аасааа	!са!с!!сад	сс!а!ас!сс	!с!саад!дс	900
а!!с!дааас	ас!ддаас!с	с!!!дасас!	садасгсгда	адааададса	сс!са!а!!с	960
!!!!дсас!с	дддса!ддсс	д!с!!ассад	с!дсадда!д	дддаддс!!д	дсс!сс!дад	1020
ддаад!д!!а	а!а!!аа!ас	!а!!саасаа	сгадагд!!!	!с!дсадаса	ддадддсааа	1080
!дд!ссдадд	!!сс!!а!д!	дсаадсс!!с	!!!дсс!!дс	дадасаассс	ада!с!!!д!	1140
сад!д!!д!а	даа!!дассс	!дс!с!сс!а	асад!!аса!	саддсаад!с	са!ада!да!	1200
аа!!ссасаа	ад!с!дадаа	асааасссс!	адддаасас!	сдда!дсад!	!ссдда!дсс	1260
ссаа!сс!!с	с!д!с!сссс	!а!с!дддаа	сс!сс!ссад	ссасаасагс	аасаасгсса	1320
д!!с!а!сс!	сссаассссс	аас!!!ас!д	!!асссс!ас	адГаа		1365

<210> 2

<211> 454

<212> БЕЛОК

<213> Ното

Бартепз

<400> 2

ме! тНг тгр

Агд

АТа

АТа

А1а

Бег

ТНг

суз

АТа

АТа

Ьеи

ьеи

Пе

Ьеи

1

5

10

15

Ьеи Тгр АТа

Ьеи

ТНг

ТНг

С1и

СТу

Азр

Ьеи

ьуз

УаТ

СТи

Ме!

Ме!

АТа

20

25

30

С1у СТу ТНг

С1п

Не

ТНг

Рго

Ьеи

Азп

Азр

Азп

УаТ

ТНг

Не

РНе

Суз

35

40

45

Азп 11 е РНе

туг

5ег

С1п

РГО

Ьеи

АЗП

1Те

тНг

Бег

Ме!

СТу

Пе

тНг

50

55

60

тгр РНе тгр

ьуз

5ег

Ьеи

тНг

РНе

Азр

Ьуз

сТи

УаТ

ьуз

УаТ

РНе

сТи

65

70

75

80

- 47 024629

Ьуз тКг Азр А5П РНе Зег 11е Нтз Тгр Тгр Рго 11е 5ег РНе 11е с1у 260 265 270

Уа1 С1у Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи 11е Уа1 Ьеи 11е Рго Тгр Ьуэ Ьуз 11е Суз 275 280 285

Азп Ьуз 5ег Зег Зег А1а Туг тНг Рго Ьеи Ьуз Суз IIе Ьеи Ьу5 Нтз 290 295 300

Тгр Азп 5ег РНе Агр ТНг С1п ТНг Ьеи Ьуэ Ьуэ С1и Нтз Ьеи 11е РНе 305 310 315 320

РНе Суз ТНг Агд А1а Тгр Рго Зег Туг С1п Ьеи <3ΐη Азр С1у С1и А1а 325 330 335 тгр Рго Рго с1и с1у зег Уа! А5п 11е Азп тНг 11е с1п с!п ьеи Азр 340 345 350

Уа1 РКе Суэ Агд С1п С1и С1у Ьуз Тгр Зег С1и Уа1 Рго Туг Уа1 С1п 355 360 365

А! а РКе РНе А1а Ьеи Агд Азр Азп Рго А5р Ьеи Су5 б1п Суз Суз Агд 370 375 380

11е Азр Рго А1а Ьеи Ьеи ТНг Уа1 ТНг 5ег С1у Ьуз Зег 11е Азр Азр 385 390 395 400

Азп Зег тНг Ьуз Зег б1и Ьуз б!п тНг Рго Агд б1и Нтз Зег Азр А1а 405 410 415

Уа1 Рго Азр А1а Рго IIе Ьеи Рго Уа1 Зег Рго II е Тгр с!и Рго Рго 420 425 430

Рго А1а тНг тНг Зег тНг тНг Рго Уа1 Ьеи 5ег Зег б1п Рго Рго тНг 435 440 445

- 48 024629 ьеи ьеи ьеи Рго ьеи с1п 450 <210> 3 <211> 500 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический полипептид <400> 3

Мег тНг тгр Агд А1а А1а А1а 5ег тНг суз А1а А1а ьеи ьеи 11е ьеи 15 10 15 ьеи тгр д!а ьеи тНг тНг б!и с1у Азр ьеи ьуз Уа! о1и мет мет д1а 20 25 30

С1у С1у ТНг С1п 11е ТНг Рго Ьеи Азп Аэр Аэп Уа! ТНг 11е РНе Суз 35 40 45

Азп 11е РНе Туг Зег С1п Рго Ьеи Азп IIе ТНг Зег МеТ С1у IIе ТНг 50 55 60 тгр РНе тгр ьуэ зег ьеи тНг РНе Азр ьуз с!и Уа1 ьуэ Уа1 РНе с!и 65 70 75 80

РНе РНе с!у Азр Ηΐ5 οίη б!и А1а РНе Агд Рго с1у А1а 11е Уа1 зег 85 90 95

Рго тгр Агд ьеи Ьу5 5ег б!у Азр А1а зег ьеи Агд ьеи Рго с1у 11е 100 105 110 с1п ьеи с!и с1и А1а с!у с!и туг Агд суз с!и Уа1 Уа1 Уа1 тНг Рго 115 120 125

- 49 024629

- 50 024629

МеТ 11е Зег Ьеи Зег Рго IIе Уа1 ТНг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 5ег 305 310 315 320 с1и Азр Азр Рго Азр Уа1 с1п 11е 5ег тгр РКе Уа1 Азп Азп Уа1 с1и 325 330 335

Уа1 т'з тНг А1а с1п тпг с1п тпг нтз Агд е1и Азр туг Азп зег тНг 340 345 350

Ьеи Агд Уа1 Уа1 Зег А1а Ьеи Рго 11е С1п Нтз С1п Азр Тгр МеТ 5ег 355 360 365

С1у Ьуз А1а РНе А1а Суз А1а Уа1 Азп Азп Ьуэ Аэр Ьеи Рго А1а Рго 370 375 380

IIе С1и Агд ТНг IIе Зег Ьуз Рго Ьуз С1у Зег Уа1 Агд А1а Рго С1п 385 390 395 400

Уа1 Туг Уа! ьеи Рго Рго Рго с!и с!и с1и мет тНг ьуз ьуз с1п Уа!

405 410 415 тКг Ьеи тКг суз мет Уа! тКг Азр РНе мет Рго с!и Азр IIе туг Уа! 420 425 430 с!и тгр тКг Азп Азп с1у ьуз тпг с!и ьеи Азп туг ьуз Азп тпг с1и 435 440 445

Рго Уа1 Ьеи Аэр Зег Азр С1у Зег Туг РКе МеТ Туг Зег Ьуз Ьеи Агд 450 455 460

Уа1 с!и Ьуз Ьуз Азп Тгр Уа! с!и Агд Азп Зег Туг Зег Суз Зег Уа! 465 470 475 480

Уа1 Нтз С1и б!у Ьеи Нтз Азп Нтз Нтз ТКг ТКг Ьуз Зег РКе Зег Агд 485 490 495

ТНг Рго с!у Ьуз

Claims (28)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, связывающиеся с внеклеточным доменом В7Н6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности §ЕЦ ГО Ν0:2), включающие определяющие комплементарность участки (СИК) тяжелой и легкой цепей или последовательности тяжелой и легкой цепей антитела, продуцируемого:

   а) гибридомным клоном с маркировочным номером 4Е5.5 (депозитный № СNСΜ Ι-4242) или

   - 51 024629

   Ъ) гибридомным клоном с маркировочным номером 17В1.3 (депозитный № СNСМ 1-4245);

   где данное моноклональное антитело ингибирует взаимодействие В7Н6 человека с ΝΙ<ρ30 человека, подавляя клеточное узнавание целевых клеток, экспрессирующих В7Н6.
2. 2. Антитело по п.1, которое является мышиным антителом, химерным антителом, гуманизированным антителом или антителом человека, или его антигенсвязывающая часть.
3. 3. Антитело по п.1, представляющее собой мышиное антитело, продуцируемое:

   a) гибридомным клоном с маркировочным номером 4Е5.5 (депозитный № СNСМ-4242) или антигенсвязывающая часть указанного антитела; или

   b) гибридомным клоном с маркировочным номером 17В1.3 (депозитный № СNСМ-4245) или антигенсвязывающая часть указанного антитела.
4. 4. Антитело по п.2, которое является гуманизированным антителом, или его антигенсвязывающая часть.
5. 5. Антитело по любому из пп.1-4, которое является одноцепочечным антителом, или его антигенсвязывающая часть.
6. 6. Антитело по любому из пп.1-5, которое содержит Рс-домен, обладающий активностью антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС) и/или активностью комплементзависимой цитотоксичности (СЭС).
7. 7. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.6, в котором Рс-домен является одноцепочечным (8сРс).
8. 8. Диагностический набор для диагностики В7Н6-экспрессирующей опухоли, включающий антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-7 и реактивы для детекции связывания указанного антитела или его антигенсвязывающей части с внеклеточным доменом В7Н6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности 8ЕЦ 1Э ΝΟ: 2).
9. 9. Конъюгат антитела по любому из пп.1-7 и цитотоксического агента.
10. 10. Конъюгат по п.9, в котором цитотоксический агент выбран из антитубулинового агента, агента, связывающегося с малой бороздкой ДНК, вещества, алкилирующего малую бороздку ДНК, дуокармицина и пуромицина.
11. 11. Конъюгат по п.10, в котором антитубулиновый агент выбран из доластатина, винка-алкалоида, подофиллоатосина, таксана, производного баккатина, криптофизина, майтанзиноида и комбрестатина.
12. 12. Конъюгат по п.9, в котором антитело конъюгировано с цитотоксическим агентом посредством линкера.
13. 13. Конъюгат по п.12, в котором линкер является расщепляемым под действием внутриклеточных условий.
14. 14. Конъюгат по п.13, в котором расщепляемый линкер представляет собой пептидный линкер, расщепляемый под действием внутриклеточной протеазы.
15. 15. Композиция для лечения отторжения аллотрансплантата клеток костного мозга (ВМС) у пациента, содержащая антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-5 и фармацевтически приемлемый носитель.
16. 16. Композиция для лечения В7Н6-экспрессирующей опухоли у пациента, содержащая антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.6 и 7 или конъюгат по любому из пп.9-14 и фармацевтически приемлемый носитель.
17. 17. Способ ш У1!го снижения активности натуральных киллеров (НК-клеток) человека по отношению к экспрессирующим В7Н6 клеткам человека, включающий контакт клеток, экспрессирующих В7Н6 человека, в присутствии человеческих НК-клеток с эффективным количеством антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп. 1-7.
18. 18. Способ ш νίΙΐΌ уничтожения или подавления роста В7Н6-экспрессирующих клеток внутри клеточной популяции, содержащей такие В7Н6-экспрессирующие клетки, включающий контакт упомянутых В7Н6-экспрессирующих клеток с эффективным количеством конъюгата антитела с лекарственным средством по любому из пп.9-14.
19. 19. Применение конъюгата антитела с лекарственным средством по любому из пп.9-14 при лечении В7Н6-экспрессирующей опухоли у пациента.
20. 20. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.17 при лечении В7Н6-экспрессирующей опухоли у пациента.
21. 21. Применение по п.19 или 20, в котором В7Н6-экспрессирующей опухолью является рак толстой кишки, печени, шейки матки, легкого, поджелудочной железы или простаты, или в котором В7Н6экспрессирующая опухоль представляет собой прогемоцитарную лейкемию, В-клеточную лимфому, Тклеточную лимфому, моноцитарную лимфому, эритролейкемию, лимфому Беркитта, хронический миелолейкоз или острую лимфобластную лейкемию.
22. 22. Способ ш У1!го детекции экспрессии В7Н6 клеткой, включающий:

    (1) обработку биологического образца, содержащего анализируемые клетки человека, антителом или его антигенсвязывающей частью по любому из пп.1-7; и (2) детекцию связывания данного антитела или его антигенсвязывающей части, в котором связыва- 52 024629 ние указанного антитела или его антигенсвязывающей части с внеклеточным доменом В7Н6 человека (аминокислотные остатки 25-266 последовательности 8ЕО ГО N0:2) показывает присутствие В7Н6 на исследуемых клетках, для определения таким способом экспрессии клеткой В7Н6.
23. 23. Способ ш уйго по п.22, в котором исследуемый биологический образец содержит интактные клетки человека или мембранную фракцию тестируемых клеток.
24. 24. Способ ш уйго по п.22 или 23, в котором используемое антитело или его антигенсвязывающая часть помечены детектируемой меткой, выбранной из радиоизотопа, флуоресцентной метки, хемилюминесцентной метки, ферментативной метки или биолюминесцентной метки.
25. 25. Применение антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-7 при диагностике В7Н6-экспрессирующей опухоли у пациента, при этом используемое антитело или его антигенсвязывающая часть конъюгированы с детектируемой меткой.
26. 26. Применение по п.25, в котором опухолью является рак толстой кишки, печени, шейки матки, легкого, поджелудочной железы или простаты.
27. 27. Гибридомный клон с маркировочным номером 4Е5.5 (депозитный № СNСМ Ι-4242), продуцирующий антитело по любому из пп.1-6.
28. 28. Гибридомный клон с маркировочным номером 17В1.3 (депозитный № СNСМ Ι-4245), продуцирующий антитело по любому из пп.1-6.