CN104926942B - 结合b7h6的单克隆抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及结合B7H6的单克隆抗体及其用途。公开了与B7家族成员B7H6特异结合的单克隆抗体，包括能够抑制B7H6和NKp30相互作用的抗体。还公开了抗B7H6抗体‑药物偶联物，其包含偶联了治疗剂的抗人B7H6单克隆抗体。所述抗B7H6抗体和抗体‑药物偶联物可用于有抗B7H6表达细胞的治疗效果的方法中，还可用于检测B7H6或B7H6表达细胞的诊断方法中。

Description

结合B7H6的单克隆抗体及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年12月9日提交的美国临时专利申请61/285,018的权益，该专利申请的公开内容通过引用全部并入本文。

技术领域

本发明涉及抗体，特别是能够结合被称为B7H6的肿瘤细胞配体的单克隆抗体。本发明还涉及所述抗体的用途。

背景技术

B7家族

正和负共刺激信号在淋巴细胞活性的调节中起着关键作用，介导这些信号的分子经证明是免疫调节剂的有效目标。例如，在与抗原呈递细胞(APC)表面上的B7-1或B7-2发生相互作用时，原型T细胞共刺激分子CD28发送的信号能够促进T细胞应答T细胞受体(TcR)结合时发生的增殖和分化，而CD28的同源物细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)介导T细胞增殖和效应子功能的抑制。(参见Chambers et al.,Ann.Rev.Immunol.,19:565-594,2001；Egen et al.,Nature Immunol.,3:611-618,2002)。

已经发现了多个与B7家族有同源性的分子(Abbas et al.,Nat.Med.,5:1345-6,1999；Coyle et al.,Nat.Immunol.,2:203-9,2001；Carreno et al.,Annu.Rev.Immunol.,20:29-53,2002；Liang et al.,Curr.Opin.Immunol.,14:384-90,2002)，它们在淋巴细胞活化中的作用才刚刚开始获得阐述。这些新的共刺激反受体包括B7h2、PD-L1、PD-L2、B7-H3和B7-H4。

已知B7家族成员的表达主要局限于抗原呈递细胞。研究揭示B7家族成员是淋巴样细胞上的反受体，它们与其淋巴细胞上的相应受体相互作用从而提供对调节细胞介导的免疫反应有重要作用的正或负共刺激信号。

NK细胞和NKp30

自然杀伤(NK)细胞是活跃在免疫系统中的一个淋巴细胞亚组，代表了人类外周血中单核细胞的平均大约15％。NK细胞功能的描述最早在1971年观察到被致死辐射的小鼠能够排斥异体移植物或亲本骨髓细胞(BMC)同种异 体移植(allgraft)。(参见Cudowicz andBennett,J.Exp.Med.134:83-102,1971；Cudowicz and Bennett,J.Exp.Med.135:1513-1528,1971)。Cudowicz和Bennett观察到被辐射的F1杂交H-2-杂合小鼠(A x B)能够排斥亲本H-2-纯合BMC(A或B)。在有关移植的经典理论中移植抗原被认为是同等显性遗传，后代对亲代主要组织相容性复合体(MHC)决定簇专性耐受，而以上观察却与该理论冲突(参见Cudowicz and Bennett,J.Exp.Med.134:83-102,1971)。造成该现象的细胞经发现是辐射抗性的，与淋巴样细胞相同，之后在1975年发现它们的特征在于具有以非限制性MHC的方式介导体外自发杀伤肿瘤的能力(参见Herberman and Ortaldo,Science,214:24-30,1981；Ortaldo and Herberman,Annu.Rev.Immunol.2:359-394,1984；Trinchieri,Adv.Immunol.47:187-376,1989；Murphy et al.,J.Natl.Cancer Inst.85:1475-1482,1993)。在1987年观察到有严重联合免疫缺陷(SCID)的小鼠虽然不能发展出T和B细胞，却有正常的NK细胞功能，因此更多证据表明仅有NK细胞即可介导骨髓移植物排斥的特异性(参见Murphy et al.,J.Exp.Med.165:1212-1217,1987)。

目前NK细胞被认为代表了先天免疫的重要部分，在对肿瘤和感染了病毒的细胞的免疫监视中发挥主要作用。但是NK细胞除非被激活，它们即使处于足够的数量也不能有效发挥其正常功能。NK细胞活性下降确实与癌症和传染病存在关联性(参见Yamazaki etal.,Oncology Reports 9:359-363,2002；Rosenberg et al.,Cancer Research 51:5074-5079(suppl.),1991；Britteenden et al.,Cancer 77:1226-1243,1996；美国专利5,082,833和4,883,662)。相反正如以上提到的，NK细胞活性介导BMC同种异体移植的急性排斥。因此NK细胞活性水平似乎在与免疫有关的疾病中起着重要作用。

NK细胞活性一般是由I型MHC分子与抑制性受体和活化性受体的相互作用来调节的(参见，例如Barao and Murphy,BB&MT 9:727-741,2003)。“丢失自我(missing self)”假说最初是基于一个观察结果，即缺乏I型MHC分子的肿瘤细胞对NK细胞的杀伤敏感(参见Ljunggren and Karre,Immunol.Today11:237-244,1990；Ohlen et al.,J.Immunol.145:52-58,1990)。研究人员还观察到人NK细胞能够溶解I型缺陷型EB病毒转化的B淋巴母细胞系(Storkus et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2361-2364,1989)。此外还发现给I型缺陷型靶细胞转染I型基因使得这些细胞能够部分或者完全抗NK细胞介导的溶解(参见，Storkus et al.,同前；Shimizu and DeMars,Eur.J.Immunol.,19:447-451,1989)。 而I型MHC对于免受NK细胞介导的细胞毒性并非总是必需的，被I型MHC识别不都能防止NK细胞造成的细胞溶解(Barao and Murphy,同前)。近年来，鉴定到各种I型MHC特异的抑制性受体和活化性受体以及非I型MHC特异的活化性受体。这些受体与诸如例如异基因BMT和癌症治疗的治疗手段有关(参见出处同上)。

能够介导抗I型MHC缺陷或阴性靶细胞的NK细胞细胞毒作用的非I型MHC特异性活化性受体，其部分代表是被称为自然细胞毒性受体(NCRs)的一组异质的NK细胞特异性免疫球蛋白样分子(参见例如Moretta et al.,Annu.Rev.Immunol.19:197-223,2001；Diefenbach and Raulet,Immunol.Rev.,181:170-184,2001)。在缺乏I型MHC表达的情况下(比如例如，肿瘤细胞或者感染了病毒的细胞上)，NK细胞上这些活化性受体的连接将触发对靶细胞的杀伤。这种活化性受体之一是NKp30，其在成熟的自然杀伤(NK)细胞上选择性和组成性表达，并通过特别是与CD3的偶联发出信号(参见Barao and Murphy,同前)。NKp30所结合的靶物质-细胞配体以前未被发现。

NK细胞的这种天然免疫识别系统代表了潜在的一个有力工具，可能在临床上应用于同种异体骨髓移植(BMI)、癌症疗法或其他NK细胞相关疾病的治疗(参见例如Barao andMurphy，同前)。例如，刺激或抑制NKp30的活化可能用于调节NK细胞的活性，以及治疗与NK细胞活性相关的疾病或紊乱。尤其是，通过触发NKp30增强NK细胞活性可能用于治疗以NK细胞活性不足为特征的疾病或紊乱，比如癌症和传染性疾病，而通过阻断NKp30抑制NK细胞活性能够用于治疗NK细胞介导的紊乱，比如例如BMC同种异体移植排斥。

最近发现的B7家族的最新成员B7H6被鉴定为NKp30的反受体(counter-receptor)，它是在成熟自然杀伤(NK)细胞上选择性表达的受体，以活化性受体参与人天然细胞毒作用(Brandt et al.,J.Exp.Med.,206(7):1495-1503,2009)。B7H6在正常人组织中未检测到，而在人肿瘤细胞上有表达。

因此，本领域需要鉴定能够抑制B7H6和NKp30之间的相互作用的抗体。基于它们调节共刺激信号和免疫反应的能力，这些抗体有潜在的治疗应用。此外，能够结合B7H6蛋白的抗体在偶联了细胞毒药剂时很有用，可以用于寻靶到表达B7H6的细胞。这些和其他用途都是高度需要的。本发明提供了 用于这些和其他用途的组合物和方法，对本领域技术人员来说根据本文的教导是显而易见的。

发明内容

本发明的一个方面提供了分离的单克隆抗体，所述抗体特异结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266)。在一个实施方案中，所述抗体与克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ IDNO:2中的氨基酸残基25-266)。另一个实施方案中，所述抗体与克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM I-4243)产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266)。另一个实施方案中，所述抗体与克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM I-4244)产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266)。另一个实施方案中，所述抗体与克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266)。

某些实施方案中，以上描述的抗-B7H6单克隆抗体是小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。某些实施方案中，抗体将竞争结合人B7H6胞外结构域，抑制人B7H6与NKp30的相互作用。所述抑制可能是完全或部分阻断，可能使相互作用被中和或者减少。合适的抗体还包括单链抗体。其他包含在内的变化形式包括含有Fc区的抗体，其中所述Fc区具有ADCC活性和CDC活性中的至少一种。在某些这类变化形式中，Fc区是单链Fc(scFc)。结合人B7H6的单克隆抗体中每一种都适合制成包含抗体和可药用介质的组合物。这些抗体适合用在诊断试剂盒中，用于检测所述抗体的结合。

另一方面，本发明提供了抗体-药物偶联物，其包含特异结合人B7H6胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266)的单克隆抗体，其中所述抗体偶联了细胞毒性试剂。某些实施方案中，抗体-药物偶联物中的抗体部分是与下述抗体竞争结合人B7H6胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266)的抗体:由克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCMI-4242)产生的抗体；由克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM I-4243)产生的抗体；由克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM I-4244)产生的抗体；由克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)产生的抗体。单克隆抗体可以是例如鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。合适的抗体还包括单链抗体。某些变化形 式中，抗体包含具有ADCC活性和CDC活性中的至少一种的Fc区。在某些这类变化形式中，所述Fc区是单链Fc(scFc)。细胞毒试剂可以是例如抗微管蛋白剂、DNA小沟结合剂、DNA小沟烷基化剂、度卡霉素(duocarmycin)或者嘌呤霉素。合适的抗微管蛋白剂包括，例如海兔毒素(dolastatin)、长春碱类(vinc alkaloid)、鬼臼毒素(podophyllatoxin)、紫杉烷(taxane)、浆果赤霉素baccatin)衍生物、cryptophysin、类美登醇(maytansinoid)或者combretastatin。某些实施方案中，抗体经由连接分子与药物偶联，某些情况中所述连接分子在胞内状况下可以被切割。合适的可切割连接分子包括肽连接分子，包括那些可以通过胞内蛋白酶切割的肽连接分子。任何被包含在内的抗体-药物偶联物都适合制成包含抗体-药物偶联物和可药用介质的组合物。

另一个相关方面中，本发明提供了一些方法，所述方法通过抑制人B7H6与人NKp30的相互作用来降低抗表达人B7H6的细胞的自然杀伤(NK)细胞活性。这些方法通常包括将表达人B7H6的细胞在有人NK细胞的情况下与有效量的单克隆抗体接触，所述单克隆抗体能够与以下(能够抑制人B7H6与人NKp30的相互作用的)抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域:由克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)产生的抗体；由克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)产生的抗体。

另一个相关方面中，本发明提供了一些方法，所述方法通过抑制人B7H6与人NKp30的相互作用来治疗受试对象中的骨髓细胞(BMC)同种异体移植排斥。这些方法通常包括将单克隆抗体以能够有效抑制NK细胞活性的量给予受试对象，从而治疗急性BMC同种异体移植排斥，所述单克隆抗体能够与以下(能够抑制人B7H6与人NKp30的相互作用的)抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域:由克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)产生的抗体；由克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)产生的抗体。

降低人NK细胞活性的方法和治疗BMC同种异体移植排斥的方法都包括这样一些实施方案，所述实施方案中的抗体是人或人源化的单克隆抗体。方法还包括其中的抗体是单链抗体的实施方案。

其他相关方面中，本发明提供了利用抗体-药物偶联物来消除细胞群中的B7H6表达细胞或者抑制其生长的方法。所述方法通常包括将B7H6表达细胞与有效量的抗体-药物偶联物接触，所述偶联物包含(a)抗体，其与以下抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQID NO:2中的氨基酸残基25-266):由 克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)产生的抗体；由克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM I-4243)产生的抗体；由克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM I-4244)产生的抗体；由克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)产生的抗体；以及(b)偶联在抗体上的细胞毒性剂。

另一个相关方面提供了利用抗体-药物偶联物治疗受试对象中B7H6表达癌症的方法。所述方法通常包括将有效量抗体-药物偶联物给予受试对象，所述偶联物包含(a)抗体，其与以下抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266):由克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)产生的抗体；由克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM I-4243)产生的抗体；由克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM I-4244)产生的抗体；由克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)产生的抗体；以及(b)偶联在抗体上的细胞毒性剂。涵盖的实施方案中癌症是结肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌或前列腺癌。其他适合治疗的B7H6表达癌症包括早幼粒细胞白血病(prohemocytic leukemia)、B细胞淋巴瘤、单核细胞淋巴瘤、红白血病(erythroleukemia)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’slymphoma)和慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia)。

在消除细胞群中的B7H6表达细胞或者抑制其生长的方法，和/或治疗受试对象中B7H6表达癌症的方法中，人或人源化单克隆抗体都适合作为抗体-药物偶联物中包含的抗体。也适合使用单链抗体作为所述方法中抗体-药物偶联物中包含的抗体。

其他相关方面中，提供了诱导抗B7H6表达细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法。所述方法通常包括将B7H6表达细胞与有效量的抗体接触，所述抗体与以下抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266):由克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)产生的抗体、由克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM I-4243)产生的抗体、由克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM I-4244)产生的抗体、由克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)产生的抗体；其中所述接触是在有NK或CD8⁺细胞的情况下进行的，所述NK或CD8⁺细胞表达具有ADCC活性的Fc受体，所述抗体包含能够结合该Fc区的Fc区。

其他相关方面，提供了诱导抗B7H6表达细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)的方法。所述方法通常包括将B7H6表达细胞与有效量的抗体接触，所 述抗体与以下抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266):由克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)产生的抗体、由克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM I-4243)产生的抗体、由克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM I-4244)产生的抗体、由克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)产生的抗体；其中所述接触是在有补体的情况下进行的，所述抗体包含具有CDC活性的Fc区。

在诱导抗B7H6表达细胞的ADCC的方法中，和/或诱导抗B7H6表达细胞的CDC的方法中，实施方案包括人或人源化抗体。还包括单链抗体。另一种变化形式包括Fc区，其中所述Fc区是单链Fc(scFc)。对于这两种方法，在某些实施方案中，所述B7H6表达癌症是癌细胞。癌细胞可以是例如直肠癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、早幼粒细胞白血病细胞、B细胞淋巴瘤细胞、单核细胞淋巴瘤细胞、红白血病细胞、伯基特氏淋巴瘤细胞或者慢性粒细胞白血病细胞。

另一个相关方面提供了治疗B7H6表达癌症的方法。所述方法通常包括给予受试对象有效量的单克隆抗体，所述抗体与以下抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266):由克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)产生的抗体、由克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM I-4243)产生的抗体、由克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM I-4244)产生的抗体、由克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)产生的抗体；其中所述抗体包含具有ADCC活性和CDC活性中的至少一种的Fc区。合适的单克隆抗体包括人抗体、人源化抗体和单链抗体。在某些变化形式中，所述Fc区是单链Fc(scFc)。可接受治疗的B7H6表达癌症包括，例如直肠、肝、宫颈、肺、胰腺或前列腺的癌症。其他合适的B7H6表达癌症包括例如早幼粒细胞白血病、B细胞淋巴瘤、单核细胞淋巴瘤、红白血病、伯基特氏淋巴瘤和慢性粒细胞白血病。

另一个相关方面提供了检测B7H6的细胞表达的方法，其中抗体的结合表明细胞上存在B7H6。通常所述方法包括(1)将包含待测试的人细胞的生物样品与单克隆抗体接触，所述单克隆抗体与以下抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266):由克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)产生的抗体、由克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM I-4243)产生的抗体、由克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM I-4244)产生的抗体、或者由克隆编号17B1.3)的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245产生的抗体；以及(2)检测抗体的结合和细胞是否表达B7H6，其中结合表明细胞上存在B7H6。在某些实施方案中。生物样品是完整的人细胞或待测试的细胞的膜部分。某些实施方案中，抗体被标记了可检测的标记。合适的标记包括放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记或生物发光标记。

在相关方面中，本发明提供了给怀疑患有表达B7H6的癌症的受试对象进行诊断的方法。所述方法通常包括(1)给予受试对象单克隆抗体，所述单克隆抗体偶联了可检测的标记，可与以下抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266):由克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)产生的抗体、由克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM I-4243)产生的抗体、由克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM I-4244)产生的抗体、或者由克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)产生的抗体；以及(2)检测所述单克隆抗体在受试对象中的分布。合适的应用包括直肠、肝、宫颈、肺、胰腺或前列腺癌的诊断。

另一方面中，本发明还提供了产生抗体的细胞，所述细胞选自克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)、克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM I-4243)、克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM I-4244)、或者克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)。

具体实施方案

I.概论

本发明涉及抗B7H6抗体的鉴定和表征，所述抗体能够结合B7家族细胞表面蛋白的成员，特别是抗人B7H6单克隆抗体。

B7H6抗体最初被认定是NKp30的反受体，NKp30多肽是在成熟自然杀伤(NK)细胞上选择表达的一种受体，并且作为活化性受体参与人天然细胞毒作用(参见美国专利申请公开2009/0220502，通过引用全部并入本文)。SEQ ID NO:1提供了示意性的编码人B7H6的核苷酸序列，SEQ ID NO:2显示了所编码的多肽。SEQ ID NO:2的B7H6多肽包含大约242个氨基酸残基的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的残基25-266)、大约18个氨基酸残基的跨膜结构域(SEQ ID NO:2中的残基267-284)和大约158个氨基酸残基的胞内结构域(SEQ ID NO:2中的残基285-454)。B7H6还含有大约117个氨基酸残基的IgV结构域(SEQ ID NO:2中的残基25-141)和大约97个氨基酸残基的IgC结构域(SEQ ID NO:2中的残基142-238)。B7H6的胞内结构域中还有几个可能的信号传导基序，包括ITIM基序(SaYtpL,SEQ ID NO:2中的氨基酸残基293-298)；SH2结合基序(YqlQ,SEQ ID NO:2中的氨基酸残基229-332)和SH3结合基序(PdaPilPvsP,SEQ ID NO:2中的氨基酸残基418-427)。

因制得抗人B7H6蛋白的小鼠单克隆抗体并鉴定出这些抗体的特性而得到本发明。由杂交瘤制备了IgG1同种型的五种抗人B7H6的小鼠单克隆抗体。所述抗体被指定为4E5.5、5E1.4、9G9.2、10E2.9和17B1.3。竞争检测法揭示特定抗体识别的是不同表位。NKp30Fc结合被抑制和DOMSP30的活化表明抗B7H6mAbs中的两种，即17B1.3和4E5.5能够部分地阻断NKp30:B7H6相互作用。这些研究将结构和功能关联起来，在实施例中有描述。各种单克隆抗体经证实可以作为生化和诊断检测中的试剂，并且具有治疗价值。

因此，本发明包括那些能够以等同或类似mAbs 4E5.5、5E1.4、9G9.2、10E2.9和/或17B1.3的特异性和特性与人B7H6细胞表面蛋白结合的单克隆抗体。如文中所述，制备了小鼠抗人B7H6单克隆抗体并在竞争试验中证明它们结合不同的表位。因此，本发明的一个方面提供了能够与这些抗体竞争结合B7H6的抗体(例如和选自mAbs 4E5.5、9G9.2、10E2.9和17B1.3的抗体结合相同B7H6表位的抗体)。此外，一些抗体被显示会影响B7H6-NKp30相互作用。相应地，一些实施方案中，本发明的抗人B7H6单克隆抗体能够抑制B7H6介导的NKp30的活化。

本发明还提供了由非人抗B7H6抗体衍生的人源化抗体(例如由小鼠抗体衍生的人源化抗体)、中和抗体、人单克隆抗体以及它们的抗原结合片段。示范性的抗体片段包括F(ab')₂、F(ab)₂、Fab'、Fab、Fv、scFv和最小识别单位。中和抗体结合B7H6从而使得它与NKp30的相互作用被抑制或阻断。包含在发明范围内的是竞争结合人B7H6胞外结构域的单克隆抗体，所述单克隆抗体可用于在例如急性骨髓细胞(BMC)同种异体移植排斥中抑制NK细胞介导的反应，其中抗体被以有效量给予从而阻断NK细胞活性和治疗BMC同种异体移植排斥。

本发明的抗B7H6抗体还可用于将细胞毒性剂寻靶到B7H6表达细胞，特别是B7H6表达癌症细胞。这种抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物在给予受试对象(比如带有B7H6表达癌症的受试对象)时，对B7H6表达细胞产生临床上的有益效果。抗体通常是单独给予的，但也可以与其他治疗剂联用。在典型 实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体与细胞毒性剂偶联，这样得到的抗体-药物偶联物在被细胞摄取或内在化时对B7H6表达细胞(例如B7H6表达癌症细胞)发挥细胞毒性效应或抑制细胞效应。

因此，本发明某些方面包括抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物。其中抗体部分以本文描述的相同或类似特异性和特性结合人B7H6细胞表面蛋白，药物偶联物部分作为治疗剂。抗人B7H6抗体-药物偶联物在给予带有B7H6表达癌症的受试对象时，对B7H6表达细胞发挥临床上的有益效果。一般来说，药物偶联物部分是细胞毒性剂，能够对B7H6表达细胞发挥细胞毒性效应或抑制细胞效应。对于这些抗体-药物偶联物，抗体部分识别B7H6上的一定表位。某些变化形式中，抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物影响B7H6-NKp30相互作用。例如，一些实施方案中，根据本发明的抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物抑制NKp30的活化。

其他实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体包含具有效应子功能的Fc区用于诱导抗B7H6表达细胞的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或补体依赖性细胞毒作用(CDC)。本发明包括抗人B7H6单克隆抗体，其包含具有ADCC活性的Fc区可用于诱导ADCC。对于该用途，通常在有表达Fc受体(具有溶细胞活性)的溶细胞性免疫效应细胞的情况下，将B7H6表达细胞与有效量含有Fc区的抗人B7H6单克隆抗体接触。表达溶细胞性Fc受体(例如FcγRIIIα或CD16)的免疫效应细胞包括例如NK细胞以及某些CD8⁺T细胞。对于抗人B7H6单克隆抗体被用于诱导CDC的实施方案，其中所述单克隆抗体包含具有CDC活性的Fc区，通常在有补体的情况下，将B7H6表达细胞与有效量含有Fc区的抗人B7H6单克隆抗体接触。可以利用本文要求的抗体和方法进行靶向杀伤的B7H6表达细胞包括例如癌症细胞，仅举数例，比如例如直肠癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、早幼粒细胞白血病细胞、B细胞淋巴瘤细胞、单核细胞淋巴瘤细胞、红白血病细胞、伯基特氏淋巴瘤细胞和慢性粒细胞白血病细胞。

本发明的这些和其他方面在参考以下详细描述的情况下是显而易见的。此外，下文确认了各种参考文献，通过引用全文并入。

II.定义

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有与所述方法和组合物相关领域的技术人员通常理解的相同的意义。本文中，以下术语和短语具有认定给它们的含义除非另有明确说明。

术语“一个/种(“a”“an”和“the”)”本文中包括复数指代物，除非上下文另有明确说明。

“多肽”是通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，无论是天然还是合成生产的。少于大约10个氨基酸残基的多肽通常被称为“肽”。

“蛋白质”是包含一或多个多肽链的大分子。蛋白质还可能包含非肽成分，比如碳水化合物基团。产生蛋白质的细胞可以给蛋白添加碳水化合物和其他非肽取代成分，并且根据细胞类型而不同。本文中按照蛋白质的氨基酸骨架结构对蛋白进行定义；诸如碳水化合物的取代成分一般不作限定，但可能仍然存在。

“分离的多肽”是基本不含污染细胞成分的多肽，比如与自然界中多肽关联的碳水化合物、脂类或其他蛋白质性质的杂质。一般来说，分离的多肽制品含有高度纯化形式的多肽，即纯度至少大约80％、纯度至少大约90％、纯度至少大约95％、纯度大于95％，比如纯度96％、97％或98％或以上，或者纯度大于99％。显示特定蛋白制品含有分离的多肽的一个途径是通过蛋白制品在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶的考马斯亮蓝染色后出现单一条带。但是术语“分离的”不排除相同多肽存在的替代物理形式，比如二聚体或备选地糖基化形式或衍生形式。

术语“氨基端”和“羧基端”本文中指示多肽内的位置。上下文允许的情况下，这些术语是参照多肽中的特定序列或部分来指示接近性或相对位置的。例如，多肽内位于参照序列羧基端的特定序列是位于靠近参照序列的羧基端，但不一定是整个多肽的羧基端。

术语“表达”是指基因产物的生物合成。例如，就结构基因而言，表达涉及结构基因转录为mRNA和mRNA翻译为一或多个多肽。

本文中，术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、共刺激分子(co-stimulatory molecules)、造血因子等，以及这些分子的合成类似物。

术语“抗体”本文中是指免疫球蛋白多肽和免疫球蛋白多肽的免疫活性部分，即含有抗原结合位点的免疫球蛋白家族的多肽或其片段，所述抗原结合位点与特异抗原(例如B7H6的胞外结构域)免疫特异性结合。

“抗独特型抗体”是与免疫球蛋白可变区结合的抗体。在本文语境中，抗独特型抗体与抗人B7H6单克隆抗体的可变区结合，因此抗独特型抗体模拟B7H6的表位。

“抗体片段”是抗体中诸如F(ab')₂、F(ab)₂、Fab'、Fab等的部分。无论结构如何，抗体片段结合的抗原与完整抗体识别的抗原相同。例如，抗B7H6单克隆抗体片段与B7H6的表位结合。

术语“抗体”还涵盖基因改造的完整抗体或片段，比如例如嵌合抗体、人源化抗体、由重链和轻链的可变区构成的“Fv”片段、由轻链可变区构成的多肽、其中轻链和重链可变区通过连接肽相连的重组单链抗体(“scFv蛋白”)、由模拟高变区的氨基酸残基构成的最小识别单位等，以及合成的抗原结合肽和多肽。

“嵌合抗体”是含有来源于啮齿动物抗体的可变结构域和补体决定区，而抗体分子的其他部分来源于人抗体的重组蛋白。

“人源化抗体”是这样的重组蛋白，所述重组蛋白中非人(例如小鼠)单克隆抗体的补体决定区是从非人免疫球蛋白的重和轻可变链被转移到人可变区内的。由非人(例如小鼠)抗体构建用于人类治疗用途的人源化抗体，比如能够结合或中和人蛋白的那些人源化抗体，是本领域技术人员能力范围内的。

术语“Fc片段”、“Fc区”或“Fc结构域”本文中是同义词，是指抗体中负责结合细胞上的抗体受体和补体的C1q成分的部分。Fc表示“结晶片段”，是抗体中很容易形成蛋白晶体的片段。最初通过蛋白水解消化描述的不同蛋白片段可以限定免疫球蛋白的整体的大概结构。文献中原来定义Fc片段是由二硫键连接的重链铰链区、C_H2和C_H3结构域构成。但是近来该术语被应用于由C_H3、C_H2和至少部分铰链构成的单链，其中所述部分铰链足够与第二个这样的链形成二硫键连接的二聚体。有关免疫球蛋白结构和功能的综述，参见Putnam,ThePlasma Proteins,Vol.V(Academic Press,Inc.,1987),pp.49-140；和Padlan,Mol.Immunol.31:169-217,1994。本文中，术语Fc包括天然存在序列的变体。

术语“单链Fc”、“单链Fc结构域”和“scFc”本文中是同义词，是指包含两个通过柔性连接分子连接起来的Fc结构域单体的多肽融合，其中两个Fc单体能够 二聚化形成可以结合Fc受体的功能性二聚体Fc结构域。单链Fc多肽在名为“Single Chain Fc,Methods ofMaking,and Methods of Treatment”的国际PCT专利申请公开号WO 08/0131242中有更详细的描述，其公开内容通过引用全部并入本文。

术语“具有ADCC活性的Fc区”本文中是指Fc结构域，所述Fc结构域能够通过结合表达Fc受体的溶细胞性免疫效应细胞(例如NK细胞或CD8⁺T细胞)上的溶细胞性Fc受体(例如FcγRIIIα)而介导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。

术语“补体”是指正常血清中这样一些成分的总称，所述成分与结合在抗原上的抗体一起展现出溶解细胞的能力。补体由一组协调作用并按顺序发挥效应的血清蛋白构成。

术语“经典补体途径”和“经典补体系统”本文中是同义词，是指特定的补体活化途径。经典途径的开始需要抗原-抗体复合体，途径包括被命名为C1到C9的9个主要蛋白成分的顺序活化。活化过程的几个步骤中，产物是催化后续步骤的酶。这种级联方式使得通过较小的初始信号即可放大和活化大量补体。

术语“具有CDC活性的Fc区”本文中是指能够通过结合C1q补体成分蛋白和经典补体系统的活化来介导补体依赖性细胞毒作用(CDC)的Fc结构域。

术语“试剂”本文中意味着元素、化合物或其他分子实体，包括例如药学、治疗或药理化合物。试剂可以是天然或合成的或者它们的组合。“治疗剂”是单独或者与另一种试剂(例如前药转换酶与前药组合)联用时对细胞或组织(例如对表达B7H6的细胞或组织，比如B7H6表达癌细胞)发挥(例如有益的)治疗效果的试剂。本发明的某些方面中，“治疗剂”是与抗体偶联形成有治疗用途的偶联物的试剂。治疗剂的例子包括药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光敏的试剂或染料，以及放射性同位素。一些变化形式中，与抗体偶联的治疗剂是发挥细胞毒性或细胞抑制性效应的试剂。

在谈及试剂对细胞的影响时，“细胞毒效应”表示对细胞的杀伤。“抑制细胞效应”意味着对细胞增殖的抑制。“细胞毒性剂”意味着试剂对细胞有细胞毒效应或抑制细胞效应，从而将细胞群中的细胞分别消除或抑制其生长。

“可检测标记”是可以与抗体部分偶联形成诊断使用的分子的分子或原子。可检测标记的例子包括螯合剂、光敏剂、放射性同位素、荧光剂、顺磁离子或其他标记物部分。

术语“亲和标签”本文中是指多肽区段，所述多肽区段可以附着到第二多肽上协助第二多肽的纯化或检测，或者给第二多肽提供附着到底物上的位点。理论上，有抗体或其他特异结合剂可供使用的任何肽或蛋白都可以作为亲和标签。亲和标签包括多组氨酸串、蛋白A(Nilsson et al.,EMBO J.4:1075,1985；Nilsson et al.,Methods Enzymol.198:3,1991)、谷胱甘肽S转移酶(Smith and Johnson,Gene 67:31,1988)、Glu-Glu亲和标签(Grussenmeyer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:7952,1985)、P物质(substance P)、FLAG肽(Hopp et al.,Biotechnology 6:1204,1988)、链霉亲和素结合肽或其他抗原表位或结合结构域。一般可参见Ford et al.,Protein Expression and Purification2:95,1991。编码亲和标签的DNA分子可以从商家购买(例如Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)。

“裸抗体”与抗体片段不同，是完整的未偶联治疗剂的抗体。裸抗体包括多克隆和单克隆抗体，以及某些重组抗体，比如嵌合和人源化抗体。

术语“单克隆抗体”是指来源于单一细胞克隆(包括真核或原核细胞克隆或者噬菌体克隆)的抗体，而不是说它的制备方法。因此，术语“单克隆抗体”本文中不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。

“免疫偶联物”是抗体与治疗剂或可检测标记的偶联物。

术语“表位”是指能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异结合的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由具有化学活性的表面分子群，比如氨基酸或糖侧链构成，并且一般有特异的三维结构特征以及特异的电荷特性。更具体地说，术语“B7H6表位”本文中是指B7H6多肽中在动物里具有抗原或免疫原活性的部分，所述动物优选是哺乳动物，最优选是小鼠或人。具有免疫原活性的表位是B7H6多肽中在动物里引发抗体反应的部分。具有抗原活性的表位是B7H6多肽中抗体可以特异免疫反应性地结合的部分，所述结合可以通过任何本领域已知方法，例如免疫检测来确定。抗原表位不需要一定是免疫原性的。“非连续表位”是由B7H6蛋白一级序列中至少两个分开的区域形成的构象表位。构象表位在有变性溶剂的情况下，失去特异结合的能力(例如在Western印迹分析中)。

“NK细胞活性”本文中是指NK细胞溶细胞活性。有许多本领域技术人员熟知的检验方法可以检测和/或监测这种活性，包括但不限于本文提供的实施例中描述的检验方法。

本文中，短语“B7H6和NKp30的相互作用”是指功能性B7H6受体与NK细胞上的NKp30之间直接的物理相互作用(例如结合)和/或间接的相互作用，造成B7H6受体和/或NKp30得到刺激以及相关联的胞内信号传导。

本文中，术语“封闭抗体”是指干扰(即抑制)B7H6和NKp30的相互作用的抗体，和/或通过例如溶细胞活性可以测量到的干扰B7H6激发NK细胞活性的能力的抗体。抑制不必是完全彻底的，可以是“部分”的，即活性相对对照或标准发生下降或减少。

短语“以存在B7H6表达细胞为特征的疾病或紊乱”本文中，是指(至少部分)涉及表达B7H6的病理细胞的任何疾病或紊乱。这类病理细胞包括，例如某些肿瘤细胞。相应地，典型的以存在B7H6表达细胞为特征的疾病或紊乱是某些癌症。正如本文将进一步描述的，这类疾病或紊乱特别适合靶向B7H6表达细胞的某些治疗方法。

术语“NKp30表达细胞介导的疾病或紊乱”和“与NKp30表达细胞活性提高相关的疾病或紊乱”在本文中作为同义词使用，是指其病理至少部分地由NKp30表达细胞的溶细胞活性介导的任何疾病或紊乱。某些变化形式中，NKp30表达细胞介导的疾病或紊乱是“NK细胞介导的疾病或紊乱”，其病理至少部分地由NK细胞溶细胞活性介导。这类疾病或紊乱的一个例子是骨髓细胞(BMC)同种异体移植物急性排斥。正如本文将进一步描述的，这类疾病或紊乱特别适合抑制NK细胞活性的某些治疗方法。

术语“有效量”在如本文所述通过给予受试对象封闭抗B7H6抗体从而对NKp30表达细胞介导的疾病或紊乱进行治疗的语境中，或者在如本文所述通过给予受试对象抗B7H6抗体或抗体-药物偶联物从而对以存在B7H6表达细胞为特征的疾病或紊乱进行治疗的语境中，是指所述分子的量足够抑制疾病或紊乱在受试对象中的发生或者足够缓解一或多个临床或诊断症状。按照本发明的方法在“有效治疗方案”中用有效量的抗原进行给药。术语“有效治疗方案”是指用于给药的试剂的量和剂量频率的组合，所述组合足以实现对疾病或紊乱的治疗或预防。

由于常规分析方法的不精确，可以理解聚合物的分子量和长度都是大概值。当这类值被表达为“大约”X或“大概”X，所述X值应理解为精确至±10％。

III.B7H6蛋白的抗体

本发明一个方面提供了特异结合人B7H6表位(例如，结合SEQ ID NO:2中氨基酸残基25-266给出的氨基酸序列中的某个多肽区段)的抗人B7H6单克隆抗体。某些变化形式中，提供的抗人B7H6单克隆抗体能够抑制B7H6-NKp30相互作用。抑制不必是对B7H6-NKp30相互作用的完全阻断，而可以是活性相对对照或标准下降或减少。某些实施方案中，根据本发明的单克隆抗人B7H6抗体能够与选自4E5.5(保藏号CNCM I-4242)、9G9.2(保藏号CNCM I-4243)、10E2.9(保藏号CNCM I-4244)或17B1.3(保藏号CNCM I-4245)的杂交瘤产生的抗体竞争结合人B7H6。这四种杂交瘤于2009年11月18日以Institut National De La SantéetDe La Recherche Médicale(INSERM)的名义保藏在法国微生物保藏中心(CNCM,InstitutPasteur；法国巴黎)。

鉴定到五种小鼠抗人B7H6单克隆抗体并进行了表征，本文中有描述。通过本文公开的竞争结合分析法显示，对这些抗体的表征表明这些单克隆抗体中的某些识别的是B7H6蛋白上的不同表位。对抗体的表征还显示其中的两种抗体至少部分地阻断B7H6-NKp30相互作用。

表位归类(Epitope binning)可用于鉴定落在本发明范围内的抗体。表位归类是指利用竞争结合试验鉴定能够或者不能同时结合B7H6蛋白的抗体对，从而鉴定出与蛋白上相同或重叠的表位相结合的抗体对。表位归类试验提供了证据表明，存在着抗原性有差异的表位。还需要进一步的数据来将所述表位鉴定为或“作图”至B7H6蛋白分子中的特定氨基酸序列或位置。

可以评估任何成对抗体或片段竞争结合的情况。例如，使用合适的检测剂可以将来自任何来源的抗体或结合片段的结合特异性与本文公开的单克隆抗体的结合特异性进行比较。可以用“分离的抗体”或细胞培养物上清进行表位归类。通常，对第一轮克隆上清进行归类来指导对有待进一步开发的克隆的选择。被比较的抗体应当是基本同质的抗原结合结构域。对于“双特异性”或“双功能”抗体的情况，两个不同结合位点的结合特异性需要独立地评价或归类。

本发明的抗体可以通过本领域任何已知方法检验其特异结合。许多不同的竞争结合分析形式可以用于表位归类。可以使用的免疫分析法包括，但不限于利用诸如Western印迹、放射免疫分析、ELISA、“夹心”免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀试验、凝胶扩散沉淀试验、免疫放射分析、荧光免疫分析、 蛋白A免疫分析和补体结合分析的技术的竞争检验系统。这类检验方法是本领域常规的公知方法(参见例如Ausubel et al.,eds,1994CurrentProtocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley&sons,Inc.,New York)。此外，可以进行诸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,EdHarlow and David Lane,1988中描述的那些常规交叉阻断分析方法。

(GE Healthcare,Piscaataway,NJ)只是常规用于单克隆抗体表位归类分组的表面等离子共振分析形式中的一种。其他参考文献，例如The Epitope MappingProtocols,Methods in Molecular Biology,Vol.66,Glenn Morris ed.Humana Press,1996描述了可以用于结合抗体的替代方法，所述方法预期可以提供关于抗体与B7H6配体结合特异性的可比信息。在使用 系统时，用可溶性、天然或重组抗原进行表位归类试验。表位归类研究可以在系统(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上进行。 v.1.2软件可用于设计操作方法。例如，为了bin培育的抗B7H6的小鼠单克隆抗体，可以将多克隆山羊抗小鼠IgG Fc抗体(Jackson ImmunoResearchLaboratories,West Grove,PA)共价固定到 CM5传感芯片上，用于将测试系列中的第一单克隆抗体结合(捕获)到芯片上。然后使用多克隆IgG Fc片段(JacksonImmunoResearch Laboratories)封闭芯片上未被占据的Fc结合位点。随后，注射B7H6蛋白并允许其与捕获的第一单克隆抗体特异结合。仪器测量结合到传感芯片上的蛋白质量，可以验证每轮中第一抗体和B7H6抗原都结合了。第一抗体和抗原都结合到芯片后，注射可溶性的第二抗体，允许其结合到预先结合好的抗原上。如果第二单克隆抗体能够与第一单克隆抗体同时结合B7H6抗原，可以检测到它的结合。而如果第二单克隆抗体不能与第一单克隆抗体一起结合B7H6抗原，则不会检测到另外的结合。测试每个单克隆抗体抗自身的情况作为阴性对照，从而确立背景(无结合)信号。

还可以利用无标记竞争性ELISA形式(LFC-ELISA)对抗体归类。这种方法是Nagataet al.,J.Immunol.Methods 292:141-155,2004中描述的，使用的是生物素化B7H6。在对培育的抗B7H6的小鼠单克隆抗体进行归类的例子中，用稀释在ELISA B(PBS,0.1％Tween 20,1％BSA)中的1μg/mL的山羊抗小鼠IgG Fc-γ特异抗体(Jackson ImmunoResearch)以100μL/孔包被微量滴定板。该包被抗体在室温下结合3小时后，将每种含有mAb的条件培养基在ELISA B中稀释得到大概0.5μg/mL的mAb浓度，并允许其与包被了山羊抗小鼠IgG的培养板于4℃过夜结合(mAb#1)。与此平行，第二组条件培养基(mAb#2)在聚苯乙烯试管中在ELISAB里稀释至大概0.5μg/mL mAb，与50ng/mL生物素化的B7H6抗原混合，4℃过夜温育。mAb#1与包被抗体温育后，培养板用无关抗体进行封闭直至培养板上未被占据的结合位点饱和。向培养板中加入mAb#2-生物素-B7H6混合物，允许进行结合。作为分析中的(非竞争)对照，向含有固定化mAb#1的孔中直接(未经与mAb#2的预温育)加入50ng/mL生物素化的B7H6。在与生物素化B7H6-mAb#2复合体温育后，以0.5μg/mL向培养板中加入链霉亲和素-HRP(Pierce,Rockford,Ill.)。培养板用TMB底物(BioFX Laboratories,Owings Mills,Md.)显影，各个孔在450nm处的吸光度用培养板阅读仪(Molecular Devices SPECTRAMAX 340,Sunnyvale,Calif.)测量。如果mAb#1和mAb#2结合的表位不同，生物素-B7H6-mAb#2复合体会结合到培养板上，导致高的吸光度读数。如果mAb#1和mAb#2结合的表位相同，生物素-B7H6-MAb#2复合体不会与培养板结合，因此得到低的吸光度读数。

在一些实施方案中，本发明的抗人B7H6单克隆抗体能够抑制B7H6与人NKp30的相互作用；所述抗体可用于例如抑制与B7H6和NKp30的相互作用有关的细胞或其他生理事件(包括例如B7H6-和/或NKp30介导的胞内信号传导)和相关的效应子功能(例如NKp30介导的溶细胞活性)。

针对B7H6的抗体可以利用例如B7H6表达载体的产物或者分离自天然来源的B7H6作为抗原来获得。特别有用的抗人B7H6单克隆抗体与B7H6特异结合。抗体如果表现出以下两个特性中的至少一个，即可认为是特异结合:(1)抗体以阈值水平的结合活性与B7H6结合，和(2)抗体和B7H6的相关多肽不发生显著交叉反应。

对于第一个特点，抗体如果与B7H6多肽、肽或表位以10⁶M^-1或以上的结合亲和力(K_a)，优选10⁷M^-1或以上，更优选10⁸M^-1或以上，最优选10⁹M^-1或以上的结合亲和力结合，它们是特异结合的。抗体的结合亲和力可以由本领域普通技术人员通过例如Scatchardanalysis(Scatchard,Ann.NY Acad.Sci.51:660,1949)很容易地确定。对于第二个特点，如果例如利用标准的Western印迹分析，抗体可以检测到B7H6，但不能检测到目前已知的多肽，就可以说抗体与相关多肽分子不发生显著交叉反应。已知的相关多肽的例子包括已知的B7家族成员。

抗人B7H6单克隆抗体可以利用带有B7H6抗原表位的肽和多肽来生产。带有抗原表位的肽和多肽通常含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列中包含的至少9个，或者15到大约30个氨基酸的序列。但是，包含更大一部分发明所述氨基酸序列的肽或多肽也可以用于诱导能与B7H6结合的抗体，所述肽或多肽含有30到50个氨基酸，或者是最多并且包括B7H6多肽的整个氨基酸序列的任何长度。希望选择的所述带有表位的肽的氨基酸序列能够实现在水溶剂中的较大溶解度(即序列包括相对亲水的残基，而一般避免疏水残基)。此外，含有脯氨酸残基的氨基酸序列也是有利抗体制备的。

B7H6中的潜在抗原位点可以利用比如LASERGENE(DNASTAR；Madison,WI)中PROTEAN程序(3.14版本)执行的Jameson-Wolf方法(Jameson and Wolf(CABIOS 4:181,1988)进行鉴定。该分析中可以使用缺省参数。

Jameson-Wolf方法通过联合6个主要的蛋白结构预测子程序来预测潜在的抗原决定簇。例如，首先可以利用Hopp-Woods方法(参见Hopp et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA78:3824,1981)鉴定代表局部亲水性最高的区域的氨基酸序列(参数:7个残基的平均值)。第二步，可以利用Emini的方法(参见Emini et al.,J.Virology 55:836,1985)计算表面概率(参数:表面决策阈值(0.6)＝1)。第三，可以利用Karplus-Schultz方法(Karplus andSchultz,Naturwissenschaften 72:212,1985)预测主链柔性(参数:柔性阈值(0.2)＝1)。在分析的第四和第五步，利用Chou-Fasman(参见Chou,“Prediction of ProteinStructural Classes from Amino Acid Composition,”in Prediction of ProteinStructure and the Principles of Protein Conformation 549-586(Fasman,ed.,Plenum Press 1990))和Garnier-Robson(参见Garnier et al.,J.Mol.Biol.120:97,1978)的方法对数据实行二级结构预测(Chou-Fasman参数:构象表格＝64个蛋白质；α区阈值＝103；β区阈值＝105；Garnier-Robson参数:α和β决策常数＝0)。在第6个子程序中，结合柔性参数和亲水性/溶剂可及性因子来确定表面外形数值，指定为“抗原性指数”。最后，对抗原性指数运用峰加宽函数，所述函数通过增加对应峰值的20、40、60或80％使主要表面峰加宽从而计算表面区域相对内部区域的移动所产生的附加自由能。但这种计算通常不会应用在任何位于螺旋区内的主要峰，因为螺旋区倾向于有较低的柔性。

产生单克隆抗体的方法是公知的。例如针对特定抗原的啮齿单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的方法获得(参见例如Kohler et al.,Nature 256:495,1975；Coligan et al.(eds.),Current Protocols in Immunology,Vol.12.5.1-2.6.7(JohnWiley&Sons 1991)[“Coligan”]；Picksley et al.,“Production of monoclonalantibodies against proteins expressed in E.coli,”in DNA Cloning2:ExpressionSystems,2nd Edition 93(Glover et al.,eds.,Oxford University Press 1995)。某些变化形式中，获取单克隆抗体是通过用包含B7H6基因产物(例如包含SEQ ID NO:2中残基25-266或者由其组成的多肽)的组合物注射小鼠、取血清样品验证有抗体产生、移取脾获得B淋巴细胞、将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤、克隆杂交瘤、挑选能够产生针对抗原的抗体的阳性克隆、培养产生针对抗原的抗体的克隆并从杂交瘤培养物中分离抗体。

抗人B7H6单克隆抗体也可以是人单克隆抗体，或者来源于人单克隆抗体的抗体。可以从转基因小鼠获得人单克隆抗体，所述小鼠经过基因改造能够在应答抗原攻击时产生特异人抗体。在该项技术中，人重链和轻链基因座中的元件被导入由胚胎干细胞系衍生的小鼠株中，后者含有被定向破坏了的内源重链和轻链基因座。转基因小鼠可以合成针对人抗原的特异性人抗体，并且小鼠可以用于产生分泌人抗体的杂交瘤。例如Green et al.,Nature Genet.7:13,1994；Lonberg et al.,Nature 368:856,1994；和Taylor et al.,Int.Immun.6:579,1994中描述了由转基因小鼠获得人抗体的方法。

产生或者挑选单克隆抗体的替代技术包括，例如体外将淋巴细胞与B7H6蛋白或肽进行接触和从噬菌体或类似载体中的抗体展示文库中挑选抗体(例如，通过利用固定化或标记的B7H6蛋白或肽)。制备和筛选这类抗体展示文库的技术是本领域已知的(参见例如美国专利5,580,717、5,885,793、5,969,108和6,040,136)。

单克隆抗体可以通过多种成熟技术从细胞培养物中得以分离和纯化。这类分离技术包括例如，用蛋白A Sepharose进行的亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析(参见例如Coligan at pages 2.7.1-2.7.12和pages 2.9.1-2.9.3；Baines et al.,“Purification of Immunoglobulin G(IgG),”in Methods in Molecular Biology(Vol.10)79-104(The Humana Press,Inc.1992))。

单克隆抗体的氨基酸序列通过采用重组DNA技术可以有所不同。因此，可以重新设计抗体以得到所需的特点。经过改造的抗体相对其未改造形式可以带来例如改善的稳定性和/或治疗效力。可能的变化有很多，从只改变一个或少量几个氨基酸到例如可变区或恒定区的完全重新设计。通常为了提高 或改变诸如补体结合、与膜的相互作用以及其他效应子功能的特性，要对恒定区进行改变。一般来说，要在可变区内进行改变以便提高抗原结合特性、提高可变区稳定性或减少免疫原性的危险。也可以采用噬菌体展示技术。参见例如Huseet al.,Science 246:1275-1281,1989；Ladner et al.,美国专利5,571,698。

在一些实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体是包含完整(整个)抗体的抗原结合结构域的抗体片段。这类抗体片段可以通过例如对抗体进行蛋白水解获得。可以通过常规方法用胰蛋白酶或木瓜酶对完整抗体消化来获得抗体片段。作为一个实例，抗体片段的产生可以用胰蛋白酶对抗体进行酶法切割从而得到表示为F(ab')₂的5S片段。该片段可以进一步用巯基还原剂切割产生3.5S Fab'单价片段。任选地，进行切割反应时可以使用硫氢基(切割二硫键产生的)的封闭基团。作为替代方法，利用胰蛋白酶进行的酶法切割可以直接产生两个单价F_ab片段和F_c片段。这些方法在例如授予Goldenberg的美国专利4,331,647；Nisonoff et al.,Arch Biochem.Biophys.89:230,1960；Porter,Biochem.J.73:119,1959；Edelman et al.,in Methods in Enzymology(Vol.1)422(Academic Press 1967)；以及Coligan(2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4页)中有描述。

还可以使用其他抗体切割方法，比如将重链分开形成单价轻链-重链片段；片段的进一步切割；或者其他酶学、化学或者基因技术，只要片段能够与完整抗体所识别的抗原结合。

例如，Fv片段包含V_H和V_L链的关联。这种关联可以是非共价的，正如Inbar et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 69:2659,1972描述的。或者，可变链可以通过分子内二硫键或者化学物质(比如戊二醛)的交联连接在一起(参见例如Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437,1992)。

Fv片段可能包含通过连接肽连接的V_H和V_L链。这些单链抗原结合蛋白(scFv)的制备是通过构建结构基因，所述结构基因包含通过寡核苷酸连接在一起的编码V_H和V_L结构域的DNA序列。将结构基因插入表达载体，后者随后被导入宿主细胞，比如大肠杆菌。重组宿主细胞合成单个多肽链，其带有衔接两个V结构域的连接肽。例如Whitlow et al.,Methods:ACompanion to Methods in Enzymology 2:97,1991描述过制备scFvs的方法(还可以参见Bird et al.,Science 242:423,1988；授予Ladner等的美国专利4,946,778；Pack et al.,Bio/Technology 11:1271,1993和Sandhu,同前)。作为一个实例，scFv可以通 过筛选scFvs文库(例如scFvs展示文库)中与B7H6(例如，固定化的或者带标记的B7H6蛋白或肽)的特异结合来获得。

另一种形式的抗体片段是代表单个互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码目的抗体CDR的基因来获得。这类基因是通过例如利用聚合酶链式反应制备的，从而可以由抗体生成细胞的RNA来合成可变区(参见例如Larrick et al.,Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:106,1991；Courtenay-Luck,“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,”in Monoclonal Antibodies:Production,Engineering and Clinical Application 166(Ritter et al.,eds.,Cambridge University Press1995)；以及Ward et al.,“Genetic Manipulation andExpression of Antibodies,”in Monoclonal Antibodies:Principles andApplications 137(Birch et al.,eds.,Wiley-Liss,Inc.1995))。

备选地，抗人B7H6单克隆抗体可以是来源于非人抗B7H6抗体的“人源化”单克隆抗体。人源化单克隆抗体是通过将非人(例如，小鼠)免疫球蛋白重和轻可变链的非人互补决定区转移到人可变结构域中产生的。然后将非人抗体框架区内的人抗体典型残基取代。使用人源化单克隆抗体避免了小鼠恒定区相关的潜在问题。克隆小鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术在例如Orlandi et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:3833,1989中有描述。制备人源化单克隆抗体的技术由例如Jones et al.,Nature 321:522,1986；Carter etal.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 89:4285,1992；Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437,1992；Singer et al.,J.Immun.150:2844,1993；Sudhir(ed.),Antibody EngineeringProtocols(Humana Press,Inc.1995)；Kelley,“Engineering Therapeutic Antibodies,”in Protein Engineering:Principles and Practice 399-434(Cleland et al.,eds.,John Wiley&Sons,Inc.1996)；以及授予Queen等的美国专利5,693,762描述过。

某些变化形式中，抗人B7H6单克隆抗体包含Fc区，所述Fc区包含免疫球蛋白(Ig)重链的C_H2和C_H3结构域，并且一般还含有部分Ig铰链区。IgG的非常有利的属性中的两个是Fc引起的:召集效应子功能和较长的血清半寿期。对抗体附着其上的靶细胞的杀伤能力来源于经由Fc分别与Fc受体和补体蛋白C1q的结合引起的免疫效应途径(ADCC)和补体途径(CDC)的活化。结合是由主要位于铰链区下半部和C_H2结构域上半部的残基介导的(参见例如 Wines et al.,J.Immunol.164:5313,2000；Woof and Burton,Nature Reviews 4:1,2004)。IgG表现出来的较长血清半寿期是由C_H2和C_H3结构域内的氨基酸与新生儿Fc受体—FcRn之间的pH依赖性相互作用介导的(参见例如Getie and Ward,Immunology Today 18:592,1997；Petkova et al.,Int.Immunol.18:1759,2006)。

相应地，在包含Fc区的抗人B7H6单克隆抗体的某些实施方案中，所述Fc区具有ADCC和/或CDC活性。这类抗体对于介导杀伤表达B7H6的靶细胞，例如癌细胞或病毒感染细胞尤其有用。其他实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体包含的Fc区缺少一或多种效应子功能(例如，缺乏ADCC和/或CDC活性)。获得缺少效应子功能或者效应子功能极大地降低的Fc区可以通过例如给天然Fc区序列引入一或多个氨基酸取代，从而使得Fc区与溶胞性Fc受体和/或C1q补体蛋白不能结合或者结合极大地降低。有多种经过改造的缺少效应子功能或者效应子功能极大降低的Fc区是本领域已知的。特别合适的缺少效应子功能或者效应子功能极大降低的Fc区包括例如美国专利申请公开2009/0220502中描述的Fc区变体。

某些包含Fc区的实施方案中，所述Fc区是单链Fc(scFc)，其包含两个通过柔性连接分子相连的Fc结构域单体，这样两个Fc单体能够二聚化形成有功能的二聚Fc结构域。例如，在包含scFc的抗人B7H6单克隆抗体的一些变化形式中，抗体包含与scFc部分融合的单链Fv(scFv)，其中所述scFv部分特异结合B7H6。单链Fc多肽，包括含有scFc和另一个抗原结合结构域(例如scFv)的融合多肽在名为“Single Chain Fc,Methods of Making,andMethods of Treatment”的国际PCT专利申请WO 08/0131242中有进一步描述，该专利申请的公开内容通过引用全部并入本文。

此外，本发明的抗人B7H6单克隆抗体或抗体片段可以利用本领域和本文描述的方法进行PEG化。

抗人B7H6单克隆抗体可以偶联上可检测标记从而形成抗B7H6免疫偶联物。合适的可检测标记包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记、生物发光标记或胶态金。制成和检测这类带有可检测标记的免疫偶联物的方法是本领域技术人员熟知的，下文有更详细描述。

可检测标记可以是能够通过放射自显影检测的放射性同位素。对于本发明的目的尤其有用的同位素是³H、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S和¹⁴C。

抗B7H6免疫偶联物还可以用荧光化合物标记。通过将免疫偶联物暴露于合适波长的光并检测产生的荧光可以证实荧光标记抗体的存在。荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。

备选地，抗B7H6免疫偶联物可以通过给抗体偶联上化学发光化合物而带上可检测标记。通过检测化学反应过程中出现发光现象可以证实带化学发光物标签的免疫偶联物的存在。化学发光标记化合物的例子包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

类似地，可以利用生物发光化合物来标记本发明的抗B7H6免疫偶联物。生物发光是可见于生物系统的一类化学发光现象，其中催化蛋白提高了化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在可以通过检测发光现象来确认。可用于标记的生物发光化合物包括虫萤光素、虫萤光素酶和水母发光蛋白。

备选地，抗B7H6免疫偶联物可以通过将抗人B7H6单克隆抗体连接到酶上而带上可检测的标记。当抗B7H6-酶偶联物在有合适底物的情况下温育时，酶部分与底物反应产生可以通过例如分光光度法、荧光测定或目测手段来检测的化学部分。可以用来可检测地标记多特异性免疫偶联物的酶的例子包括β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。

本领域技术人员知道其他可用于本发明的合适标记。标记物部分与抗人B7H6单克隆抗体的结合可以利用本领域的已知标准技术来实现。这方面的典型方法学在Kennedy etal.,Clin.Chim.Acta 70:1,1976；Schurs et al.,Clin.Chim.Acta 81:1,1977；Shih etal.,Int'l J.Cancer 46:1101,1990；Stein et al.,Cancer Res.50:1330,1990；和Coligan(同前)中有描述。

此外，使用偶联有抗生物素蛋白、链霉亲和素和生物素的抗人B7H6单克隆抗体可以进一步提高免疫化学检测的便利性和多能性(参见例如Wilchek et al.(eds.),“Avidin-Biotin Technology,”Methods In Enzymology(Vol.184)(Academic Press1990)；Bayer et al.,“Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,”in Methods In Molecular Biology(Vol.10)149-162(Manson,ed.,The Humana Press,Inc.1992))。

实施免疫分析的方法已经成熟(参见例如Cook and Self,“MonoclonalAntibodies in Diagnostic Immunoassays,”in Monoclonal Antibodies:Production,Engineering,and Clinical Application 180-208(Ritter and Ladyman,eds.,Cambridge University Press 1995)；Perry,“The Role of Monoclonal Antibodies inthe Advancement of Immunoassay Technology,”in Monoclonal Antibodies:Principles and Applications 107-120(Birch and Lennox,eds.,Wiley-Liss,Inc.1995)；Diamandis,Immunoassay(Academic Press,Inc.1996))。

IV.抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物

本发明另一方面提供了抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物。“抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物”本文中是指偶联有治疗剂的抗人B7H6单克隆抗体(如Section III中的描述,同前)。这类抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物在被给予受试对象时，一般是单独给予但也可以与其他治疗剂联用，对B7H6表达细胞能够产生临床上的有益效果，所述受试对象是例如患有B7H6表达性癌症的个体。

在典型实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体被偶联了细胞毒性剂，从而使得所得到的抗体-药物偶联物在被B7H6表达细胞(例如，B7H6表达癌细胞)摄取或内化时，对所述细胞能够发挥细胞毒或抑制细胞效应。尤其适合与抗体偶联的部分是化学治疗剂、前药转换酶、放射性同位素或化合物，或者毒素。例如，可以给抗人B7H6单克隆抗体偶联上细胞毒性剂，比如化学治疗剂(参见下文)或毒素(例如，抑制细胞性的或者杀细胞性的试剂，比如例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)。下文提供了适合与抗人B7H6单克隆抗体偶联的其他试剂的例子。

其他实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体被偶联了前药转换酶。所述前药转换酶可以利用已知方法通过重组融合到抗体上或者以化学方法偶联到抗体。示范性的前药转换酶是羧肽酶G2、β-葡糖苷酸酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶、硝基还原酶和羧肽酶A。

将治疗剂与蛋白(特别是抗体)偶联的方法是已知的(参见例如Arnon et al.,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,”inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Reisfeld et al.eds.,Alan R.Liss,Inc.,1985)；Hellstrom et al.,“Antibodies For Drug Delivery,”in Controlled DrugDelivery(Robinson et al.eds.,Marcel Deiker,Inc.,2nd ed.1987)；Thorpe,“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,”in MonoclonalAntibodies'84:Biological And Clinical Applications(Pinchera et al.eds.,1985)；“Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use ofRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy,”in Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy(Baldwin et al.eds.,Academic Press,1985)；和Thorpe etal.,1982,Immunol.Rev.62:119-58。还可参见例如PCT公开WO89/12624)。

某些变化形式中，按照本文描述的方法，抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物被B7H6表达细胞内化并累积，所述抗体-药物偶联物即在这些细胞中发挥治疗效果(例如，细胞毒性或者抑制细胞效应)。确定累积和累积速率的方法可以在例如名为“Drug Conjugatesand Their Use for Treating Cancer,an Autoimmune Disease or an InfectiousDisease”的WO 2004/010957中找到。

在典型实施方案中，当使用偶联有治疗剂(例如，药物或前药转换酶)的抗人B7H6单克隆抗体时，优选试剂在被待治疗的B7H6表达细胞(例如，B7H6表达性癌症的细胞)内化时有活性。其他实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物不被内化，而药物能够通过结合到细胞膜上发挥治疗效果(例如，消除B7H6表达细胞或者抑制其生长)。

为了使治疗剂在B7H6-表达细胞(例如，B7H6表达癌细胞)以外的活性最小化，治疗剂的偶联方式通常使得它活性下降，除非被从抗体上切割下来(例如，通过水解或切割试剂)。这类实施方案中，治疗剂通过可切割的连接分子附着到抗体上，所述连接分子对B7H6表达细胞的胞内环境中的切割敏感，但对胞外环境基本不敏感，这样在被B7H6表达细胞内化时，偶联物即被(例如，在内体，或者例如借助pH敏感性或蛋白酶敏感性，在溶酶体环境或者质膜微囊中)从抗体上切割下来)(参见下文IV(A)部分)。

此外，某些实施方案中，抗体-药物偶联物包含的治疗剂相对质膜带有电荷，从而进一步降低试剂在被细胞内化后穿过质膜的能力。本文中，“带电荷的试剂”意味着试剂(a)是极化的，所述试剂的一个区域相对质膜带有电荷，或者(b)相对质膜带有净电荷。

A.连接分子

一般来说，B7H6抗体-药物偶联物包含位于治疗剂和抗人B7H6单克隆抗体之间的连接分子区。正如上文指出的，在某些实施方案中，连接分子在胞内条件下可以被切割，连接分子在胞内环境中的切割使治疗剂被从抗体上释放。

例如，在一些实施方案中，所述连接分子可以被存在于胞内环境(例如处于溶酶体或内体或质膜微囊内)的切割剂切割。连接分子可以是例如肽连接分子，可以被胞内肽酶或蛋白酶，包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶切割。一般来说，肽连接分子是至少两个氨基酸长，或者至少三个氨基酸长。切割剂可以包括cathepsins B和D以及胞质素(plasmin)，这三者已知可以水解二肽药物衍生物，导致有活性的药物在靶细胞内被释放(参见例如Dubowchik and Walker,Pharm.Therapeutics 83:67-123,1999)。最典型的是可以被B7H6表达细胞中存在的酶切割的肽连接分子。例如，可以使用能够被在癌变组织中高度表达的巯基依赖性蛋白酶cathepsin-B切割的肽连接分子(例如Phe-Leu或者Gly-Phe-Leu-Gly连接分子)。其他这类连接分子在例如美国专利6,214,345中有描述。特定实施方案中，可以被胞内蛋白酶切割的肽连接分子是Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)连接分子或者Phe-Lys(苯丙氨酸-赖氨酸)连接分子(参见例如美国专利6,214,345，该专利描述了带有Val-Cit连接分子的多柔比星(doxorubicin)的合成)。利用胞内蛋白水解来释放治疗剂的一个优点是试剂在偶联状态时通常是弱化的，偶联物的血清稳定性一般较高。

在其他实施方案中，可切割的连接分子是pH敏感的，即对在某个pH值的水解敏感。一般来说，对pH敏感的连接分子在酸性条件下可被水解。例如，可以使用在溶酶体中可被水解的酸不稳定连接分子(例如，腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺乌头酰胺、原酸酯、乙缩醛、缩酮等等)(参见例如美国专利5,122,368、5,824,805、5,622,929；Dubowchik and Walker,Pharm.Therapeutics 83:67-123,1999；Neville et al.,Biol.Chem.264:14653-14661,1989)。这类连接分子在中性pH条件(比如血液中的条件)下相对稳定，但在pH 5.5或5.0(溶酶体的大概pH)以下时不稳定。在某些实施方案中，可水解的连接分子是硫醚连接分子(比如，例如通过酰腙键附着到治疗剂上的硫醚(参见例如美国专利5,622,929))。

还有一些实施方案中，连接分子在还原条件下是可切割的(例如，二硫化物连接分子)。多种二硫化物连接分子是本领域已知的，包括例如可以利用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-硫代吡啶)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-硫代吡啶)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-羰氧基-α-甲基-α-(2-硫代吡啶)甲苯)、SPDB、以及SMPT形成的那些二硫化物连接分子(参见例如Thorpe et al.,Cancer Res.47:5924-5931,1987；Wawrzynczak et al.,In Immunoconjugates:Antibody Conjugatesin Radioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel ed.,Oxford U.Press,1987。还可见美国专利4,880,935)。

再有一些变化形式中，连接分子是丙二酸连接分子(Johnson et al.,AnticancerRes.15:1387-93,1995)、马来酰亚胺苯甲酰连接分子(Lau et al.,Bioorg-Med-Chem.3:1299-1304,1995)、或者3'-N-酰胺类似物(Lau et al.,Bioorg-Med-Chem.3:1305-12,1995)。

一般来说，连接分子对胞外环境基本不敏感。本文中，就连接分子而言的“对胞外环境基本不敏感”意味着抗体-药物偶联物样品中不超过大约20％，普遍来说不超过等于15％，更普遍来说不超过大约10％，甚至更普遍来说不超过大约5％，不超过大约3％，或者不超过大约1％的连接分子，在所述抗体-药物偶联物处于胞外环境(例如，在血浆中)时被切割。要确定连接分子对胞外环境是否基本不敏感可以通过例如将血浆分别与(a)抗体-药物偶联物(“抗体-药物偶联物样品”)和(b)等摩尔量的未偶联抗体或治疗剂(“对照样品”)温育预先确定的一段时间(例如2、4、8、16或24小时)，然后将通过例如高效液相层析测量到的抗体-药物偶联物样品中存在的未偶联抗体或治疗剂与对照样品存在的进行比较。

一些变化形式中，连接分子能够促进细胞内化。某些实施方案中，当连接分子与治疗剂偶联(即，位于抗体-药物偶联物的连接分子-治疗剂部分之中)时，细胞内化得以增强。而其他实施方案中，当连接分子与治疗剂和抗B7H6抗体均偶联(即，位于抗体-药物偶联物之中)时，细胞内化得以增强。

可以用于本发明的组合物和方法的多种连接分子在例如名为“Drug Conjugatesand Their Use for Treating Cancer,an Autoimmune Disease or an InfectiousDisease”的WO 2004/010957中有描述。

B.治疗剂

按照本发明，能够对B7H6表达细胞发挥治疗效果的任何试剂可以作为与抗人B7H6单克隆抗体进行偶联的治疗剂。某些实施方案中，比如治疗B7H6表达性癌症，治疗剂是细胞毒性剂。

有用的细胞毒性剂种类包括，例如抗微管蛋白剂、auristatins、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂(例如，铂络合物，比如顺铂、单(铂)、双(铂)以及三核铂络合物和卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、 化疗增敏剂、duocarmycins、依托泊甙(etoposides)、氟化嘌嘧啶剂、离子载体、lexitropsins、nitrosoureas、普拉汀诺(platinols)、预形成化合物(pre-forming compounds)、嘌呤拮抗剂、嘌呤霉素、放疗增敏剂、类固醇、紫杉醇、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。

具体细胞毒性剂包括例如,雄激素\安曲霉素(AMC)、天冬酰胺酶、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博莱霉素、白消安(busulfan)、丁胱亚磺酰亚胺(buthionine sulfoximine)、喜树碱(camptothecin)、卡铂、卡莫司汀(carmustine(BSNU))、CC-1065(Li et al.,CancerRes.42:999-1004,1982)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂、秋水仙碱(colchicine)、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、细胞松弛素B、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(以前称为放线菌素)、道诺霉素(daunorubicin)、decarbazine、多烯紫杉醇(docetaxel)、多柔比星、雌激素、5-氟脱氧尿苷、依托泊甙磷酸酯(VP-16)、5-氟尿嘧啶、短杆菌肽D、羟基脲、伊达比星(idarubicin)、异磷酰胺、伊立替康(irinotecan)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、6-巯基嘌呤、氨甲蝶呤、光辉霉素(mithramycin)、丝裂霉素C、米托蒽醌(mitoxantrone)、硝基咪唑、太平洋紫杉醇、普卡霉素(plicamycin)、普鲁苄肼(procarbizine)、链脲霉素(streptozotocin)、替尼泊苷(tenoposide，VM-26)、6-硫鸟嘌呤、硫TEPA、拓扑特肯(topotecan)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)和长春瑞滨(vinorelbine)。

特别合适的细胞毒性剂包括例如，海兔毒素(例如auristatin E、AFP、MMAF、MMAE)、DNA小沟结合剂(例如烯二炔类和lexitropsins)、倍癌霉素(duocarmycins)、紫杉醇(例如太平洋紫杉醇和多烯紫杉醇)、嘌呤霉素、长春花生物碱、CC-1065、SN-38(7-乙基-10-羟基-喜树碱),拓扑特肯、吗啉-多柔比星、根霉菌素(rhizoxin)、cyanomorpholino-多柔比星、棘霉素(echinomycin)、combretastatin、纺锤菌素(netropsin)、埃博霉素A和B、雌莫司汀(estramustine)、cryptophysins、西马多丁(cemadotin)、美登类化合物(maytansinoids)、discodermolide、eleutherobin以及米托蒽醌。

某些实施方案中，细胞毒性剂是常规的化疗剂，比如例如多柔比星、太平洋紫杉醇、美法仑、长春花生物碱、氨甲蝶呤、丝裂霉素C或依托泊甙。此外，诸如CC-1065类似物、卡奇霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)、 海兔毒素10的类似物、根霉菌素和沙海葵毒素(palytoxin)的强力试剂可以与抗B7H6表达抗体连接。

在特定变化形式中，细胞毒性剂或细胞抑制剂是auristatin E(现有技术中又称为海兔毒素10)或其衍生物。一般来说，auristatin E衍生物是例如auristatin E和酮酸之间形成的酯。例如，auristatin E可以分别与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰戊酸反应产生AEB和AEVB。其他典型的auristatin衍生物包括AFP(二甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸(dolaisoleuine)-海兔脯氨酸(dolaproine)-苯丙氨酸-p-苯二胺)、MMAF(dovaline-缬氨酸-海兔异亮氨酸-dolaproine-苯丙氨酸)和MAE(一甲基auristatin E)。Auristatin E及其衍生物的合成和结构在美国专利申请公开20030083263；国际专利公开WO 2002/088172和WO2004/010957；以及美国专利6,884,869、6,323,315、6,239,104、6,034,065、5,780,588、5,665,860、5,663,149、5,635,483、5,599,902、5,554,725、5,530,097、5,521,284、5,504,191、5,410,024、5,138,036、5,076,973、4,986,988、4,978,744、4,879,278、4,816,444和4,486,414中有描述。

其他变化形式中，细胞毒性剂是DNA小沟结合剂(参见例如美国专利6,130,237)。例如，在某些实施方案中，所述小沟结合剂是CBI化合物。其他实施方案中，小沟结合剂是烯二炔(例如，卡奇霉素)。

某些实施方案中，抗体-药物偶联物包含抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的例子包括，例如紫杉醇(例如(太平洋紫杉醇)、(多烯紫杉醇))、T67(Tularik)、长春花生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春地辛(vindesine)和长春瑞滨)和海兔毒素(例如，auristatin E、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)。其他抗微管蛋白剂包括，例如浆果赤霉素(baccatin)衍生物、紫杉烷类似物(例如，埃博霉素A和B)、诺考达唑(nocodazole)、秋水仙碱和秋水仙胺、雌氮芥、cryptophysins、西马多丁、美登类化合物、combretastatins、discodermolide和eleutherobin。在一些实施方案中，细胞毒性剂是另一组抗微管蛋白剂—美登类化合物。例如，在特定实施方案中，美登类化合物是美登素或DM-1(ImmunoGen,Inc.；还可参见Chari et al.,Cancer Res.52:127-131,1992)。

其他实施方案中，细胞毒性剂是抗代谢物。所述抗代谢物可以是例如嘌呤拮抗剂(例如硫唑嘌呤(azathioprine)或霉酚酸酯(mycophenolate mofetil))、二氢叶酸还原酶抑制剂(例如，氨甲蝶呤)、无环鸟苷、丙氧鸟苷(gangcyclovir)、 叠氮胸苷(zidovudine)、阿糖腺苷(vidarabine)、利巴韦林(ribavirin)、叠氮胸苷(azidothymidine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、金刚烷胺(amantadine)、二脱氧尿苷、碘脱氧尿苷、膦甲酸(poscarnet)或三氟胸苷。

C.抗B7H6抗体-药物偶联物的形成

抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物的制备可以通过本领域技术人员已知的任何技术来完成。简单来说，抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物包含抗人B7H6单克隆抗体、药物以及任选的将药物和抗体连接在一起的连接分子。有多种不同反应可用于将药物共价连接到抗体上。这经常是通过抗体分子的氨基酸残基(包括赖氨酸的胺基)、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧基、半胱氨酸的巯基以及芳香族氨基酸的各种部分的反应实现的。最常用的非特异性共价连接方法之一是将化合物的羧基(或氨基)与抗体的氨基(或羧基)连接的碳化二亚胺反应。此外，双功能试剂，比如二醛或亚氨酸酯也曾被用于连接化合物的氨基和抗体分子的氨基。还可用于药物与抗体连接的是席夫碱反应(Schiff base reaction)。该方法包括将含有乙二醇或羟基的药物进行过碘酸氧化，然后将这样形成的醛与抗体分子反应。通过与抗体分子的氨基形成席夫碱而发生连接。异硫氰酸酯也可以作为将药物与抗体共价连接的偶联剂。其他技术是本领域技术人员已知，也在本发明的范围内。这类技术的非限制性实施例在例如，美国专利5,665,358、5,643,573和5,556,623中有描述。

在一些实施方案中，作为连接分子的前体的中间体在合适的条件下与药物进行反应。某些实施方案中，活性基团被用于药物和/或中间体。药物和中间体之间的反应产物，或者药物衍生物随后与抗人B7H6单克隆抗体在合适的条件下反应。

D.细胞毒或者抑制细胞活性的检验方法

某些实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物包含偶联了细胞毒性剂的抗人B7H6单克隆抗体，从而所述抗体-药物偶联物对B7H6表达细胞(例如，B7H6表达癌细胞)能够发挥细胞毒或细胞抑制效应。可以用于检测抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物的细胞毒效应或细胞抑制效应的B7H6表达细胞可以是培养细胞系，比如例如下文表5中列举的那些。抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物一经证实能够对B7H6表达细胞发挥细胞毒或细胞抑制作用，即可在合适的动物模型中验证其治疗价值。在优选实施方案中，包含细胞毒性剂的抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物被用于治疗B7H6表达性癌症。 下文V(B)部分和实施例X中描述了可以用于评估发明所述抗体-药物偶联物的治疗效果的多种癌症的示范性动物模型。

确定试剂对细胞是否有细胞毒或细胞抑制效应的方法一般是本领域已知的。这类方法的说明性例子在下文有描述。证实对B7H6表达细胞有任何这类效果即表明抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物能够用于治疗或防止那些其病理至少部分是由B7H6表达细胞的异常生长或活化介导的疾病或紊乱，比如例如B7H6表达性癌症。

为了确定抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物是否对B7H6表达细胞有细胞抑制效应，可以利用胸腺嘧啶核苷掺入法。例如，可以将96孔板上密度为5000细胞/孔的B7H6表达细胞培养72小时，在72小时时间段的最后8小时与0.5μCi的³H-胸腺嘧啶核苷接触，并在有和没有抗体-药物偶联物的情况下测量³H-胸腺嘧啶核苷掺入细胞的情况。

为了确定细胞毒性，可以测量坏死或细胞凋亡(程序化细胞死亡)。坏死通常伴有细胞质膜通透性提高、细胞肿胀和细胞质膜的破裂。细胞凋亡的特征通常在于膜起泡、细胞质凝聚和内源核酸内切酶的活化。

细胞活性的测量可以通过确定细胞摄取染料，比如中性红、台盼蓝或者(Trek Diagnostic Systems,Cleveland,OH)的情况。还可参见例如Page etal.,Intl.J.of Oncology 3:473-476,1993。在这类分析法中，细胞温育在含有染料的培养基中，将细胞洗涤，经分光光度术测量存留的染料，反映细胞所摄取的染料。蛋白结合染料磺酰罗丹明B(SRB)也可以用于测量细胞毒性(Skehan et al.,J.Nat'l Cancer Inst.82:1107-12,1990)。

备选地，诸如MTT等四氮唑盐(tetrazolium salt)被用于通过仅检测活细胞进行的定量比色试验来分析哺乳动物细胞的存活和增殖(参见例如Mosmann,J.Immunol.Methods 65:55-63,1983)。

细胞凋亡可以通过测量例如DNA片段化来进行定量。DNA片段化的体外定量确定有商业光度测定方法可供使用。这类分析法的例子，包括TUNEL(检测被片段化的DNA中掺入带标记核苷酸的情况)和基于ELISA的分析法，在Biochemica,1999,no.2,pp.34-37(RocheMolecular Biochemicals)中有描述。

细胞凋亡还可以通过测量细胞中的形态变化来确定。例如，和对于坏死一样，通过测量某些染料的摄取可以确定细胞质膜完整性的丧失(例如，荧 光染料，比如例如吖啶橙或溴化乙锭)。测量凋亡细胞数量的方法已由Duke and Cohen,Current Protocols InImmunology(Coligan et al.eds.,1992,pp.3.17.1-3.17.16)描述过。还可以用DNA染料(例如，吖啶橙、溴化乙锭或碘化丙锭)将细胞标记，观察细胞中染色质凝聚和沿内核膜着边的情况。其他可以测量用于确定凋亡的形态变化包括例如细胞质浓缩、膜起泡增加和细胞皱缩。

附着的和“浮动”的培养物区域内都可以测量是否存在凋亡细胞。例如，两种区域的采集可以通过移去上清、对附着细胞进行胰蛋白酶解、离心洗涤步骤(例如，10分钟，2000rpm)后将制品合并以及检测凋亡(例如，通过测量DNA片段化)(参见例如Piazza etal.,Cancer Research 55:3110-16,1995)。

V.使用方法

A.总论

本发明另一方面提供了调控NKp30表达细胞，包括例如自然杀伤(NK)细胞和T细胞(例如CD8⁺T细胞)的活性(例如溶细胞活性)的方法。这类方法包括例如与NKp30表达细胞活性提高相关的疾病或紊乱的治疗方法。合适的抗体包括能够与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合B7H6的抗体，所述杂交瘤是(i)克隆4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)；(ii)克隆9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM I-4243)；(iii)克隆10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM I-4244)；和(iv)克隆17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)。特定变化形式中，抗体是嵌合或人源化抗体，其来源于由选自以上(i)-(iv)的杂交瘤产生的抗体。

在一些实施方案中，本发明的抗体用于干扰B7H6和NKp30的相互作用。用于这类实施方案，方法包括在有NKp30表达细胞的情况下，将表达功能性B7H6的细胞与有效量的抗人B7H6单克隆抗体或者其他能够干扰B7H6和NKp30的相互作用的试剂进行接触。合适的抗体包括能够与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合B7H6的抗体，所述杂交瘤是(i)克隆4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)或者(ii)克隆17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)。在特定变化形式中，抗体是嵌合或人源化抗体，其来源于由选自以上(i)和(ii)的杂交瘤产生的抗体。这类方法可以在体外、离体或体内实施。某些优选变化形式中，NKp30表达细胞是NK细胞，调节NK细胞活性的用途或方法是为了例如治疗与NK细胞活性提高相关的疾病或紊乱。其他变化形式中，NKp30表达细胞是NKp30表达T细胞(例如CD8⁺T细胞)，调节NKp30表达T细胞活性 的用途或方法是为了例如治疗与NKp30表达T细胞活性提高相关的疾病或紊乱。某些T细胞(包括CD8⁺T细胞)已被证实能够表达NKp30(参见例如Srivastava andSrivastava,Leuk.Res.30:37-46,2006)。

正如以上提及的，在某些变化形式中，本发明的抗体是用于治疗与NK细胞活性相关的疾病或紊乱。例如，在一些实施方案中，使用所述抗体的方法包括将能够干扰B7H6和NKp30的相互作用的有效量抗人B7H6单克隆抗体给予患有或者有风险发展出NK细胞介导的疾病或紊乱(例如，NK细胞介导的同种异体移植排斥，比如,例如NK细胞介导的骨髓细胞(BMC)同种异体移植排斥)的患者。包含在本发明中的是用于抑制NK细胞介导的骨髓同种异体移植排斥的方法，所述方法包括使用抗人B7H6单克隆抗体。骨髓移植(BMT)已成为治疗各种血液科恶性疾病的一种被认可的疗法。但是同种异体BMT的效力受到某些障碍的限制，比如例如移植物被排斥。充分的证据表明NK细胞是进行骨髓同种异体移植物植入的障碍，NK细胞单独即可介导小鼠中BMC排斥的特异性(参见例如Murphy et al.,J.Exp.Med.165:1212-1217,1987；Murphy et al.,J.Exp.Med.166:1499-1509,1987；Murphy et al.,J.Immunol.144:3305-3311,1990；Murphy et al.,Eur.J.Immunol.20:1729-1734,1990；Murphy et al.,Immunol.Rev.181:279-289,2001)。临床上，在接受了HLA配型不合BMTs(T细胞被去除，但未经细胞减灭调节)的SCID患者中观察到的同种异体移植阻力是供体NK细胞的高活性造成的(参见O’Reilly et al.,Vox.Sang.51:81-86,1986)。相应地，在BMT过程中可以使用本文描述的抗体来抑制NK细胞抗同种异体移植物的溶细胞活性，从而治疗或防止BMC同种异体移植排斥，所述抗体抗B7H6胞外结构域并且能够抑制B7H6和NKp30的相互作用。

还有一些实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体被用于诱发抗B7H6表达细胞的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或者补体依赖性细胞毒作用(CDC)，用于比如例如治疗以存在B7H6表达细胞为特征的疾病或紊乱。例如，在一些实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体被用于诱发抗B7H6表达癌细胞的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或补体依赖性细胞毒作用(CDC)。抗体疗法在癌症的治疗中特别成功，因为某些肿瘤会展示独特的抗原、种系特异性抗体或者相对正常细胞抗原的量过多。试验证据显示相对正常组织，许多来源于肿瘤的细胞系高度表达B7H6，所述来源于肿瘤的细胞系包括来源于直肠癌、肝 癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌的细胞系，以及那些来源于各种血癌，比如早幼粒细胞白血病、B细胞淋巴瘤、单核细胞淋巴瘤、红白血病、伯基特氏淋巴瘤和慢性粒细胞白血病的细胞系。这一证据表明B7H6是新的肿瘤特异性或者肿瘤相关性抗原，并且抗人B7H6单克隆抗体可以作为抗肿瘤治疗剂。与单克隆抗体疗法相关的一个机制是抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。在ADCC中，单克隆抗体与靶细胞(例如，癌细胞)结合，表达单克隆抗体受体的特异效应细胞(例如，NK细胞、CD8⁺T细胞、单核细胞、粒细胞)与单克隆抗体/靶细胞复合体结合，造成靶细胞死亡。

相应地，在一些实施方案中，包含具有效应子功能的Fc区的抗人B7H6单克隆抗体被用于诱发抗B7H6表达细胞的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或者补体依赖性细胞毒作用(CDC)。诱发ADCC的方法通常包括将B7H6表达细胞与有效量的抗人B7H6单克隆抗体接触，其中所述单克隆抗体包含具备ADCC活性的Fc区。该接触步骤是在有溶细胞免疫效应细胞的情况下进行的，所述免疫效应细胞表达具备溶细胞活性的Fc受体。表达溶细胞性Fc受体(例如，FcγRIIIα或CD16)的免疫效应细胞包括例如NK细胞和某些CD8⁺T细胞。诱发CDC的方法通常包括将B7H6表达细胞与有效量的抗人B7H6单克隆抗体接触，其中所述单克隆抗体包含具备CDC活性的Fc区。该接触步骤是在有补体的情况下进行的。可以利用所述方法进行靶向杀伤的B7H6表达细胞包括例如癌细胞，比如象结肠癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、早幼粒细胞白血病细胞、B细胞淋巴瘤细胞、单核细胞淋巴瘤细胞、红白血病细胞、伯基特氏淋巴瘤细胞和慢性粒细胞白血病细胞等等。合适的抗体包括能够与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合B7H6的抗体，所述杂交瘤是(i)克隆4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)；(ii)克隆9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM I-4243)；(iii)克隆10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM I-4244)；和(iv)克隆17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)。在一些实施方案中，抗体能够与由选自以上(ii)-(iii)的杂交瘤产生的抗体竞争结合B7H6。特定变化形式中，抗体是嵌合或人源化抗体，其来源于由选自以上(i)-(iv)或者(ii)-(iii)的杂交瘤产生的抗体。

相关实施方案中，如本文所述的包含具有效应子功能的Fc区的抗人B7H6单克隆抗体被用于治疗受试对象的B7H6表达性癌症。这类方法通常包括将有效量的抗人B7H6单克隆抗体给予受试对象，所述单克隆抗体包含具 有ADCC活性和/或CDC活性的Fc区。特别适合利用这类方法进行治疗的B7H6表达性癌症包括，例如直肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌或者前列腺癌，以及血癌，比如例如早幼粒细胞白血病、B细胞淋巴瘤、单核细胞淋巴瘤、红白血病、伯基特氏淋巴瘤或慢性粒细胞白血病。

还有一些实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物(参见上文IV部分)被用于将治疗剂递送到B7H6表达细胞，药剂在此发挥治疗效果。这类方法对于以存在B7H6表达细胞为特征的疾病或紊乱的治疗尤其有用。在某些使用抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物的优选变化形式中，所述治疗剂是对B7H6表达细胞，比如B7H6表达癌细胞发挥细胞毒或者抑制细胞效应的细胞毒性剂。正如上文指出的，试验证据显示相对正常组织，许多来源于肿瘤的细胞系高度表达B7H6，所述来源于肿瘤的细胞系包括来源于直肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌的细胞系，以及那些来源于各种血癌，比如早幼粒细胞白血病、B细胞淋巴瘤、单核细胞淋巴瘤、红白血病、伯基特氏淋巴瘤和慢性粒细胞白血病的细胞系。这一证据表明B7H6是新的肿瘤特异性或者肿瘤相关性抗原，可以用于给在癌症治疗中有治疗效果的试剂，特别是可以消除肿瘤细胞或者抑制其生长的细胞毒性剂导靶。相应地，在一些实施方案中，包含偶联了细胞毒性剂的抗人B7H6单克隆抗体的抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物被用于治疗B7H6表达性癌症。合适的抗体-药物偶联物包括那些含有能够与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合B7H6的抗体，所述杂交瘤是(i)克隆4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)；(ii)克隆9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM I-4243)；(iii)克隆10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM I-4244)；和(iv)克隆17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)。在一些实施方案中，抗体-药物偶联物包含能够与由选自以上(ii)-(iii)的杂交瘤产生的抗体竞争结合B7H6的抗体。特定变化形式中，抗体-药物偶联物包含嵌合或人源化抗体，其来源于由选自以上(i)-(iv)或者(ii)-(iii)的杂交瘤产生的抗体。

在本文描述的治疗方法的每个实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体或者抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物的递送方式与要治疗的疾病或紊乱的处置相关的传统方法一致。按照本文的公开内容，将有效量的抗体或抗体-药物偶联物给予需要这类治疗的受试对象，并且给药时间和条件足以防止或治疗所述疾病或紊乱。

被给予本文描述的抗人B7H6单克隆抗体或者抗体-药物偶联物的受试对象包括有高于正常的发展出疾病或紊乱的风险的患者，以及已经表现出疾病或紊乱的患者，其中所述疾病或紊乱是NKp30表达细胞介导的或者以存在B7H6表达细胞为特征。某些实施方案中，受试对象还未受到疾病或紊乱的困扰，用途是进行筛选或诊断。其他一些实施方案中，受试对象已被诊断患有需要所述治疗的疾病或紊乱。此外，在治疗过程中可以监测受试对象是否有疾病或紊乱的任何变化(例如疾病或紊乱的临床症状是否增加或减少)。

在预防性应用中，将药物组合物(药物)以足够消除疾病或减少疾病风险或者延迟发病的量给予患者，所述患者是对特定疾病易感或者通过其他方式有患病风险。在治疗应用中，将所述组合物以足够治愈或至少部分地遏制疾病及其并发症症状的量给予患者，所述患者是被怀疑或者已经受到这类疾病的困扰。足够实现以上目的的量是指对于治疗来说或者预防来说有效的剂量或用量。在预防和治疗方案中，通常是将抗体或抗体-药物偶联物以多个剂量给药直至已经达到足够的反应(例如激发合适的NK细胞活性或抑制不当的NK细胞活性)。一般来说，要对反应进行监测，如果期望的反应开始消退可以给予多次剂量。

对于本发明的这样的变化形式，所述变化形式中受试对象还未受到那些NKp30表达细胞介导的或者以存在B7H6表达细胞为特征的疾病或紊乱的困扰，用途是诊断或者筛选风险提高的受试对象，可以从受试对象中取生物样品，与来自正常或健康个体的生物样品或者预先确定的基础水平进行比较。在受试对象样品中检测到高于来自正常和健康个体的相当生物样品或者基础水平可以确定患癌症的风险。检测本发明所述抗体组合物的方法在V.C部分进行了描述。

本发明的组合物和方法可以用于在骨髓移植后的不同时间或者被给予抗癌症药物或治疗后的不同时间，在来自受试对象的生物样品中监测治疗进展。在来自受试对象的生物样品中检测到的B7H6水平作为治疗前水平(T1)，并与来自相同个体的第二次取的生物样品的治疗后水平(T2)进行比较。B7H6水平升高通常表明疾病的进展，B7H6降低表明疾病的消退。

为了鉴定按照本发明的方法进行筛选或治疗的受试患者，可以采用获得认可的筛选方法来确定与特定疾病或紊乱相关的风险因素，所述疾病或紊乱是由NKp30表达细胞介导的或者以存在B7H6表达细胞为特征；或者确定受 试对象中鉴定到的已有紊乱的状态。这类方法可以包括，例如确定个体是否有亲戚已被诊断患有特定疾病。筛选方法还可以包括，例如常规工作来确定已知有遗传性组成的特定疾病的家族状况(例如，就BMT而言，临床研究显示某些HLA-C等位基因的存在与BM同种异体移植排斥风险增加有相关性(参见Scottet al.,Blood 92:4864-4871,1998)，而且已知多种癌症有一定的遗传性组成)。癌症的遗传性组成包括，例如多个基因中的转化性突变(例如Ras、Raf、EGFR、cMet和其他)；某些HLA和杀伤细胞抑制性受体(KIR)分子，或者这样一些机制的存在与否，所述机制是癌症细胞能够通过它直接或者间接地调节对诸如NK细胞和T细胞的细胞的免疫抑制(参见例如Ljunggren and Malmberg,Nature Rev.Immunol.7:329-339,2007；Boyton and Altmann,Clin.Exp.Immunol.149:1-8,2007)。为了这个目的，可以常规地使用核苷酸探针来鉴定携带与特定目标疾病相关的遗传标记物的个体。此外，有大量已知的免疫学方法可用于鉴定具体疾病的标记物。例如，有各种本领域公知的采用单克隆抗体探针来检测与特定种类相关的抗原的ELISA免疫检测法可供使用。通过已知的患者症状学、年龄因素、相关风险因素等可以实现筛选。这些方法使得临床医师可以常规地选择需要利用本文描述的方法进行治疗的患者。与这些方法相对应，调节NK细胞活性可以作为独立的治疗流程，或者作为其他治疗的复查、附加或协同治疗方案。

B.癌症治疗

1.癌症的类型

正如本文描述并经研究证实的，B7H6抗体可以被用于通过活化ADCC或CDC途径直接杀伤B7H6表达细胞，所述途径的活化经由Fc与Fc受体和补体蛋白C1q的结合。还有一些变化形式中，包含偶联在抗人B7H6单克隆抗体上的细胞毒性剂的抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物可以被用于给B7H6表达癌细胞递送细胞毒性剂，细胞毒性剂在此通过消除癌细胞或者抑制其生长而发挥治疗效果。

下表4列举了本发明所述治疗方法适用的一些癌症，主要按照目标部位排列。

表4:示范性癌症类型列表

下文更详细地讨论了以上列举的癌症中的一些，包括用于评价发明所述抗B7H6抗体或抗体-药物偶联物的效果的一些相关动物模型。

a.慢性骨髓性白血病

慢性骨髓性白血病(CML)是一种主要影响成人的罕见癌症类型。它是粒细胞(主要的白细胞类型)的癌症。在CML中，产生许多粒细胞并在它们未成熟还不能发挥正常功能时即被释放到血液中。不成熟的白细胞被称为原始细胞。其他类型血细胞的产生也被打断。正常情况下，白细胞以有序和受控的方式对自身进行修复和再生，而在慢性骨髓性白血病中，这个过程不受控制，细胞继续分裂和异常成熟。该病通常进展非常缓慢，被认为是慢性骨髓性白血病。

因为CML进展缓慢，很难在早期检测到。有时，只有因为另外的原因进行血检时才被发现。CML的症状经常不明显，没有特异性，是由骨髓中异常白细胞数量增加和正常血细胞数量减少引起的，造成腹部左侧饱胀感或者疼痛肿块。在CML中，脾脏会变大。脾的肿胀还可能引起对胃的压力，造成消化不良和食欲不振，因此导致贫血。由于血液中的血小板数量较低，一些人可能会注意到他们更容易流血或瘀伤。与CML相关联的“出血点”是一种特殊类型的瘀伤，通常在腿上或口腔内可见到小的象血一样的斑点。妇女可能发现她们的经期血量增加很多。但这些症状和体征不常见。慢性骨髓性白血病可以发生在任何年龄，但常见的是影响中年和老年人，在儿童中少见(National Cancer Institute,“NIH PublicationNo.08-3775”Rockville,MD,Sept.2008)。抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对肿瘤反应的效果可以利用植入免疫缺陷型小鼠的人CML细胞在例如人移植瘤模型中进行评估(参见 例如Ren,Leukemia and Lymphoma 8:1549-1561,2002；Van Etten,Blood CellsMol.Dis.27:201-205,2001；Wong and Witte,Oncogene 20:5644-5659,2001)。

b.多发性骨髓瘤

多发性骨髓瘤是影响某种被称为浆细胞的白细胞的一类癌症。在涉及浆细胞的癌症中，细胞均是异常和相同的，被称为骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞倾向于聚集在骨髓以及骨的坚硬外部。有时它们仅聚集在一个骨中，形成单一肿块，或者肿瘤，被称为浆细胞瘤。但多数情况中，骨髓瘤细胞聚集在许多骨中，经常形成多个肿瘤并引起其他问题。这种情况下，疾病被称为多发性骨髓瘤。

患有多发性骨髓瘤的人因为有数量反常多的相同浆细胞，它们也有过多的同一类型的抗体。这些骨髓瘤细胞和抗体会导致多种严重的医学问题，包括:(1)随着骨髓瘤细胞数量增加，它们破坏并弱化骨骼，造成疼痛，有时还会骨折。(2)骨遭到破坏时，钙被释放到血液中。这可能导致高钙血症。高钙血症会导致失去食欲、恶心、口渴、疲劳、肌无力、坐立不安和意识混乱。(3)骨髓瘤细胞阻止骨髓形成正常的浆细胞和其他对免疫细胞很重要的白细胞。患者可能对感染和疾病更易感。(4)癌细胞还可能阻止新的红细胞的生长，导致贫血。(5)多发性骨髓瘤患者的肾脏可能有严重问题。过多的抗体蛋白和钙使得肾脏不能正常地过滤和净化血液。症状取决于疾病的严重程度。在疾病的最早期阶段，可能没有症状。当症状真的出现时，患者通常有发生在背部或肋骨的骨痛。患者还可能发生骨折、乏力、疲劳、减重或反复感染。疾病到了晚期时，症状可能包括恶心、呕吐、便秘、排尿困难以及腿部无力或麻木(National Cancer Institute,“NIH Publication No.08-1575”Rockville,MD,Sept.2008)。抗B7H6抗体或抗体-药物偶联物对肿瘤反应的效果可以在免疫缺陷型小鼠中的人移植瘤模型，比如Miyakawa等描述的(Biochem.Biophys.Res.Commun.313:258-62,2004)模型中进行评估。

c.非霍奇金淋巴瘤

淋巴瘤有两大主要类型。霍奇金氏病和非霍奇金淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤有大约20个不同类型。多数霍奇金氏病的病例中，在活检中可以发现一种被称为李特-斯顿伯格細胞(Reed-Sternberg cell)的特别的细胞。其他淋巴瘤中通常没有这种细胞，因此霍奇金和非霍奇金淋巴瘤的疗法不同。

非霍奇金淋巴瘤的第一个体征经常是颈部、腋窝或腹股沟的淋巴结的无痛肿大。其他症状可能包括任何以下症状:盗汗或原因不明的发烧；失去食欲、原因不明的减重和过度的疲劳感；儿童可能发生咳嗽或呼吸困难。患者可能抱怨腹部疼痛，或者在儿童的腹部有肿块或者全身皮肤持续性瘙痒(National Cancer Institute,“NIH Publication No.07-1567”Rockville,MD,Sept.2007)。抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对肿瘤反应的效果可以在类似于Ansell等(Leukemia 18:616-23,2004)描述的非霍奇金淋巴瘤移植瘤模型中进行评估。

最常用的非霍奇金淋巴瘤分类方法是REAL分类系统(Ottensmeier,Chemico-Biological Interactions 135-136:653-664,2001)。已鉴定到用于淋巴瘤分类的特异性免疫标记物。例如，滤泡性淋巴瘤标记物包括CD20+、CD3-、CD10+、CD5-；小淋巴细胞淋巴瘤标记物包括CD20+、CD3-、CD10-、CD5+、CD23+；边缘区B细胞淋巴瘤标记物包括CD20+、CD3-、CD10-、CD23-；弥漫大B细胞淋巴瘤标记物包括CD20+、CD3-；套细胞淋巴瘤标记物包括CD20+、CD3-、CD10-、CD5+、CD23+；外周T细胞淋巴瘤标记物包括CD20-、CD3+；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤标记物包括CD20+、CD3-；淋巴母细胞淋巴瘤标记物包括CD20-、CD3+、Tdt+，以及伯基特氏淋巴瘤标记物包括CD20+、CD3-、CD10+、CD5-(Decision Resourses,Non-HodgkinsLymphoma,Waltham,MA.,Feb.2002)。

按照国际工作分类(International Working Formulation)进行的非霍奇金淋巴瘤(NHL)临床分类将疾病再分成亚型:(1)低度(惰性)疾病，包括小淋巴细胞性，与慢性淋巴细胞白血病(SC)一致；滤泡性，绝大多数是小裂细胞(FSC)；滤泡性，混合的小裂细胞和大细胞(FM)；(2)中度疾病，包括滤泡性，绝大多数是大细胞(FL)；弥漫性，小裂细胞(DSC)；弥漫混合性，小和大细胞(DM)；弥漫性，大裂细胞或者无裂细胞(DL)；和(3)高度疾病，包括免疫母细胞、大细胞性(IBL)；淋巴母细胞性，卷曲核或非卷曲核细胞(LL)；以及小无裂细胞，伯基特氏或非伯基特氏(SNC；The Non-Hodgkin's Lymphoma Pathologic ClassificationProject,Cancer 49:2112-35,1982)。通常利用Ann Arbor Staging system给NHL患者分期。I期意味着涉及单一淋巴结区或者局部涉及单一淋巴外器官或部位。II期意味着涉及横隔膜同侧两个或以上淋巴结区或者局部涉及淋巴外部位或器官和横隔膜同侧的一或多个淋巴结区。III 期意味着涉及横隔膜两侧的淋巴结区，可能伴有局部涉及淋巴结外器官或部位。IV期意味着涉及弥漫性或扩散性一或多个远端淋巴结外器官，有或没有相关的淋巴结参与(“Lymphoid neoplasms,”In American Joint Committee on Cancer.:AJCCCancer Staging Manual 6th ed.New York,NY:Springer,2002,pp.393-406)。利妥昔单抗已显示能有效治疗惰性和滤泡性淋巴瘤(Boye et al.,Annals of Oncol.14:520-535,2003)。

d.宫颈癌

宫颈是子宫通向阴道的颈部。宫颈癌(Cervical cancer，又称为cervicalcarcinoma)发生在宫颈表面上的异常细胞，是影响妇女的最常见癌症之一。宫颈癌之前通常宫颈表面上的细胞发生发育不良的癌前病变。这些异常细胞可以进展成侵入性癌症。癌症一旦表现出来，有四个发展阶段。各阶段是按照癌症的扩散程度限定的。癌症扩散越严重，治疗可能就越广泛。宫颈癌有两种主要类型:(1)鳞状类型(上皮癌):这是最常见的类型，占宫颈癌的大约80％到85％。这种癌症可能由性传播疾病引起。这类性病的一种是导致性病疣的人乳头瘤病毒。恶性肿瘤在宫颈上生长并进入宫颈。癌症通常在宫颈表面开始，通过宫颈抹片可以在早期诊断。(2)腺癌:这类宫颈癌从宫颈管内宫颈腺中的组织开始发病。疾病早期一般不引起症状。这种癌症通常可以通过宫颈抹片和盆腔检查检测到。疾病较晚期引起异常的阴道出血或在异常时期有带血的分泌物，比如月经周期之间、性交后或者绝经后。异常的阴道分泌物可能浑浊或带血或者含有粘液，并伴有异味。癌症晚期可能引起疼痛(National Cancer Institute,“NIH Publication No.08-2407”Rockville,MD,Sept.2008)。抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对肿瘤反应的效果可以在类似于Downs等(Gynecol.Oncol.98:203-10,2005)和Li等(Int.J.Gynecol.Cancer15:301-7,2005)描述的人移植瘤模型中进行评估。

e.头颈癌

头部和颈部的多数癌症属于恶性瘤(特别是鳞状细胞癌)。头颈部恶瘤从构成口腔、鼻、喉或耳的粘膜或者覆盖在舌上的表面层的细胞开始。但是，头颈部的癌症可以从任何类型的细胞发病。淋巴瘤从淋巴系统的细胞开始。肉瘤从构成肌肉、软骨或血管的支持细胞开始。黑素瘤从被称为黑色素细胞(赋予眼睛和皮肤的颜色)的细胞开始。头颈癌的症状取决于其部位–例如，舌癌可能导致说话含糊不清。最常见的症状是头或颈部有几周内不能痊愈的 溃疡或伤疤；吞咽困难，或者咀嚼或吞咽时疼痛；呼吸或说话困难，比如持续的呼吸带有噪音、口齿不清或嗓音嘶哑；口腔麻木；持续的鼻塞或流鼻血；持续耳痛、耳鸣或视觉困难；口或颈的肿胀或肿块；面部或上腭疼痛；在抽烟或嚼烟叶的人中，癌前期病变可能发生在口腔或舌头上的粘膜。这些可以表现为持续的白斑(粘膜白斑症)或红斑(粘膜红斑症)。它们通常不痛，但有时可能酸痛，并可能出血(National Cancer Institute,“NIHPublication No.09-1574”Rockville,MD,Sept.2009)。抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对肿瘤反应的效果可以在类似于Kuriakose等(Head Neck 22:57-63,2000)、Cao等(Clin.Cancer Res.5:1925-34,1999)、Braakhuis等(Cancer Res.51:211-4,1991)和Baker(Laryngoscope 95:43-56,1985)描述的人头颈移植瘤模型中进行评估。

f.脑癌

始于脑组织的肿瘤被称为脑的原发性肿瘤，并根据它们开始的细胞类型或脑部位命名。最常见的原发性脑瘤始于胶质细胞，称为胶质瘤。胶质瘤有许多类型:(1)星状细胞瘤–肿瘤发生在被称为星状细胞的星形胶质细胞。在成人中，星状细胞瘤最常发生在大脑。在儿童中，它们发生在脑干、大脑和小脑。III级星状细胞瘤有时被称为分化不良星状细胞瘤。IV级星状细胞瘤通常被称为多形性胶质母细胞瘤。(2)脑干胶质瘤–肿瘤发生在脑的最下部。脑干胶质瘤最经常在幼童和中年人中被诊断。(3)室管膜瘤–肿瘤发生在沿脑室或脊髓中央管排列的细胞，最常见于儿童和青年人。(4)寡轴突胶质细胞瘤–这种罕见的肿瘤所发生的细胞是构成覆盖和保护神经的脂肪物质的细胞。这些肿瘤通常发生在大脑中。它们生长缓慢，一般不会扩散到周围的脑组织中。在中年人中最常见。脑瘤的症状取决于肿瘤大小、类型和位置。症状可能是由肿瘤压迫到神经或破坏了脑的某个区域引起的。也可能是脑肿胀或者颅骨内液体累积造成的。脑瘤最常见的症状包括头痛(通常在早晨更严重)；恶心或呕吐；说话、视力或听力的改变；平衡或行走困难；情绪、个性或集中精力的能力的改变；记忆出现问题；肌肉猝动或颤搐(抽搐或痉挛)；以及胳膊或腿的麻木感或刺痛感(NationalCancer Institute,“NIH Publication No.09-1558”Rockville,MD,May 2009)。抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对肿瘤反应的效果可以在类似于Bello等(Clin.CancerRes.8:3539-48,200)描述的人移植胶质瘤模型中进行评估。

g.甲状腺癌

乳头状和滤泡状甲状腺癌占全部甲状腺癌的百分之80到90。两种类型都始于甲状腺的滤泡细胞。多数乳头状和滤泡状甲状腺癌生长缓慢。如果早期检测到，多数能够成功治愈。甲状腺髓样癌占甲状腺癌的百分之5到10，发生在C细胞，而不是滤泡细胞。未分化甲状腺癌是甲状腺癌中最少见的类型(只占病例的百分之1到2)，发生在滤泡细胞中。癌细胞高度异常，很难识别。这种癌症通常非常难控制，因为癌细胞倾向于生长和扩散很快。早期甲状腺癌一般不引起症状。但随着癌的生长，症状可能包括:颈部前方靠近喉结处的肿块、结节；声音嘶哑或者难以正常声音说话；肿大的淋巴结，特别是颈部；吞咽或呼吸困难；或者喉部或颈部疼痛(National Cancer Institute,“NIH Publication No.07-4994”Rockville,MD,Sept.2007)。抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对肿瘤反应的效果可以在类似于Quidville等(Endocrinology145:2561-71,2004)描述的人移植瘤模型中进行评估。

h.肝癌

原发性肝癌有两种不同类型。最常见的种类称为肝细胞瘤(hepatoma)或肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，始于肝脏的主要细胞(肝细胞)。这种类型通常局限在肝脏中，虽然偶尔会扩散到其他器官。还有一种较少见的肝细胞瘤的无关亚型，被称为纤维板层肝细胞瘤，发生在年轻人中。原发性肝癌的另一种类型始于胆管细胞，被称为胆管癌(cholangiocarcinoma或bile duct cancer)。多数发生肝细胞瘤的人一般还有一种被称为肝硬化的状况。这是整个肝脏遍布小块伤疤的一种状态，其原因多样，包括感染和长期酗酒。但患有肝硬化的人只有一小部分发展成原发性肝癌。感染乙肝或丙肝病毒会导致肝癌，引起肝硬化，增加发生肝细胞瘤的风险。有被称为遗传性血色病(造成铁在体内过多沉积)的罕见状况的人更有可能发生肝细胞瘤。抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物可以用于肝细胞癌的治疗、预防、遏制其进展、延迟发病，和/或减轻严重程度或者抑制至少一种与肝细胞癌相关的状况或症状。肝细胞癌可能与肝炎(例如甲肝、乙肝、丙肝和丁肝)感染有关或者无关。抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对肿瘤反应的效果可以在类似于Zhou等(Clin.Cancer Res.9:6030-7,2003)和Huynh等(J.Cell Mol.Med.2008(E-Publication10.1111/j.1582-4934.2008.00364.,2008,Blackwell Synergy))描述的人移植瘤模型中进行评估。

i.肺癌

抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对肿瘤反应的效果可以在人小/非小细胞肺癌移植瘤模型中进行评估。简单来说，将人肿瘤移植到免疫缺陷型小鼠中，小鼠用抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物单独或者与其他药剂组合处理。通过评估肿瘤生长情况可以展现处理效力(Nemati et al.,Clin Cancer Res.6:2075-86,2000；和Hu et al.,Clin.Cancer Res.10:7662-70,2004)。

2.对实体瘤而言的终点和抗肿瘤活性

虽然每种方案可能对肿瘤反应评价有不同的定义，RECIST(实体瘤反应评价标准Response evaluation Criteria in solid tumors)标准目前被认为是National CancerInstitute推荐的评价肿瘤反应的指南(参见Therasse et al.,J.Natl.Cancer Inst.92:205-216,2000)。根据RECIST标准，肿瘤反应意味着所有可测量的病灶或转移灶有减少或者被消除。如果疾病包含的病灶用传统技术可以准确测量到至少在一个维度上>20mm，或者通过螺旋CT扫描测量到>10mm并且通过医学摄影或X-射线、计算机化轴向层面X射线摄影法(CT)、磁共振成像(MRI)或临床检验(如果病灶是浅表的)确定有清楚限定的边缘，疾病通常被认为是可测量的。不可测量的疾病意味着疾病包含的病灶以传统技术测量<20mm，或者以螺旋CT扫描测到<10mm，以及真的无法测量(太小以至于不能准确测量)。不可测量的疾病包括胸腔积液、腹水和通过间接证据备案的疾病。

评价实体瘤反应的方案需要确定客观状态的标准。代表性的标准包括以下:(1)完全反应(CR)，定义为所有可测量的疾病完全消失；没有新病灶；没有疾病相关症状；没有证据表明存在无法测量的疾病；(2)部分反应(PR)，定义为目标病灶最大直径总和下降30％；(3)进展性疾病(PD)，定义为目标病灶最大直径总和下降20％，或者出现任何新病灶；(4)稳定或无反应，定义为未达到CR、PR或PD的标准(参见Therasse et al.,同前)。

肿瘤学领域认可的其他终点包括总存活率(OS)、无病生存期(DFS)、客观反应率(ORR)、疾病进展时间(TTP)和无进展生存期(PFS)(参见Guidance for Industry:ClinicalTrial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics,April 2005,Center for Drug Evaluation and Research,FDA,Rockville,MD)。

3.组合癌症疗法

正如前面讨论过的，某些实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物与第二试剂组合用于治疗疾病或紊乱。当用于治疗癌症时，本发明的抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物可以与常规癌症疗法组合，所述常规疗法是比如例如手术、放疗、化疗或者它们的组合。在某些方面中，可以与本发明的抗B7H6抗体或抗体-药物偶联物用于组合癌症疗法的其他治疗剂包括抗血管生成剂。在一些其他方面中，可用于组合疗法的其他治疗剂包括参与肿瘤生长的某些因子(比如例如EGFR、ErbB2(Her2)、ErbB3、ErbB4或TNF)的拮抗剂。某些方面中，将根据本发明的抗体或抗体-药物偶联物和细胞因子(例如刺激抗肿瘤免疫反应的细胞因子)共同给予。下文详细描述了特别适用于癌症治疗的示范性的组合疗法。

a.靶向肿瘤相关抗原的抗体

正如前面指出的，因为某些肿瘤或者展示独特的抗原、谱系特异性抗原，或者抗原存在的量大大超过正常细胞，抗体疗法在癌症的治疗中一直特别成功。与单克隆抗体疗法的抗肿瘤活性相关的机制之一是抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。在ADCC中，单克隆抗体与靶细胞(例如癌细胞)结合，表达所述单克隆抗体之受体的特异性效应子细胞(例如NK细胞、单核细胞、粒细胞)与单克隆抗体/靶细胞复合体结合，导致靶细胞的死亡。相应地，在本发明的某些变化形式中，具有抗癌疗效的抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物和抗第二种肿瘤相关抗原(即除B7H6以外的肿瘤相关抗原)的单克隆抗体被共同给药。MAbs的剂量和给药时间安排取决于被共同给予的具体抗体的药代动力学和毒代动力学特性，应当在尽量减少与给予抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物相关的任何毒性的同时，优化这些效果。

当第一线疗法失败时，可能表明需要用本文描述的抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物和抗肿瘤相关抗原的第二单克隆抗体进行的组合疗法作为第二线治疗。本发明还提供了使用组合疗法作为那些刚刚诊断的以前从未用抗癌剂治疗过的患者(“首次接受治疗的患者(de novo patients)”)和从未接受过任何单克隆抗体疗法的患者(“未接受过该类治疗的患者( patients)”)的第一线疗法。

本文描述的抗B7H6抗体或抗体-药物偶联物还可以和抗肿瘤相关抗原的单克隆抗体在没有肿瘤细胞的任何直接抗体介导的ADCC或CDC的情况下， 用于组合疗法。例如，阻断免疫系统中的抑制信号的抗体可以造成强化的免疫反应。实例包括(1)抗B7R家族分子的抗体，所述家族分子具有抑制功能，比如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、程序化死亡-1(PD-1)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)；(2)抗抑制性细胞因子(IL-10、TGFβ)的抗体；和(3)消除抑制性细胞(比如抗CD-25或CTLA-4)或抑制其功能的抗体。例如，抗CTLA4MAbs在小鼠和人中均被认为或者能够抑制免疫抑制性的调节性T细胞(Tregs)的功能；或者能够抑制抑制性信号，所述抑制性信号是通过T细胞上的BTLA-4与APCs或肿瘤细胞上的B7-1或B7-2结合而传送的。

表6是已被批准或测试可能用于本发明组合疗法的单克隆抗体的非排他性列表。

表6:用于与抗B7H6抗体或抗体-药物偶联物组合的单克隆抗体疗法

b.酪氨酸激酶抑制剂

在一些实施方案中，本文描述的抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物与酪氨酸激酶抑制剂组合使用。酪氨酸激酶是催化γ磷酸基团从三磷酸腺苷转移到靶蛋白上的酶。酪氨酸激酶可分为受体和非受体蛋白酪氨酸激酶。它们在繁多的正常细胞过程中有重要作用，包括通过生长受体进行活化和影响各种类型细胞的增殖、存活和生长。此外，它们被认为能够促进肿瘤细胞 的增殖、诱导抗凋亡效应以及促进血管生成和转移。除了通过生长因子进行的活化，经由体细胞突变的蛋白激酶活化是一种常见的肿瘤发生机制。鉴定到的一些突变位于B-Raf激酶、FLt3激酶、BCR-ABL激酶、c-KIT激酶、表皮生长因子(EGFR)和PDGFR途径。Her2、VEGFR和c-Met是另一些被显示参与癌症进展和肿瘤发生的重要受体酪氨酸激酶(RTK)途径。因为有大量细胞过程是由酪氨酸激酶启动的，这些激酶被认为是抑制剂的关键靶点。

络氨酸激酶抑制剂(TKIs)是在细胞内发挥作用的小分子，它们与三磷酸腺苷(ATP)竞争结合受体和非受体酪氨酸激酶的催化性酪氨酸激酶结构域。这种竞争结合能够阻断下游信号转导的启动，所述下游信号转导会导致与这些信号转导事件相关的效应子功能，比如生长、存活和血管生成。利用结构和计算方法，在多种药物化学组合文库中鉴定到许多能够抑制酪氨酸激酶的化合物。

多数TKIs被认为能够通过直接抑制肿瘤细胞或通过抑制血管生成而抑制肿瘤的生长。并且，某些TKIs能够通过VEGF家族受体(包括索拉非尼(sorafenib)和舒尼替尼(sunitinib))影响信号转导。在一些情况中，TKIs经证实能够活化树突状细胞和其他先天免疫细胞(比如NK细胞)的功能。近来报道了伊马替尼(imatinib)在动物模型中的这种情况。伊马替尼是被证实能够通过树突状细胞和NK细胞增强杀伤活性的TKI(综述参见Smythet al.,NEJM354:2282,2006)。

BAY 43-9006(索拉非尼,多吉美和SU11248(舒尼替尼,索坦)是来自最近被批准用于转移性肾细胞癌(RCC)的TKIs。许多其他TKIs处于各种类型癌症治疗的晚期和早期开发阶段。所述其他TKIs包括，但不限于:伊马替尼甲磺酸盐(格列卫Novartis)；吉非替尼(Gefitinib)(易瑞沙AstraZeneca)；盐酸埃罗替尼(Erlotinib hydrochloride)(特罗凯Genentech)；凡德他尼(Vandetanib)(AstraZeneca),替吡法尼(Tipifarnib)(Janssen-Cilag)；达沙替尼(Dasatinib)(扑瑞赛Bristol Myers Squibb)；洛那法尼(Lonafarnib)(Schering Plough)；琥珀酸瓦他拉尼(Vatalanib succinate)(Novartis,Schering AG)；拉帕替尼(Lapatinib)(GlaxoSmithKline)；尼罗替尼(Nilotinib)(Novartis)；来他替尼(Lestaurtinib)(Cephalon)；盐酸帕唑帕尼(Pazopanibhydrochloride)(GlaxoSmithKline)；阿西 替尼(Axitinib)(Pfizer)；卡纽替尼二盐酸盐(Canertinib dihydrochloride)(Pfizer)；Pelitinib(National Cancer Institute,Wyeth)；坦度替尼(Tandutinib)(Millennium)；博舒替尼(Bosutinib)(Wyeth)；Semaxanib(Sugen,Taiho)；AZD-2171(AstraZeneca)；VX-680(Merck,Vertex)；EXEL-0999(Exelixis)；ARRY-142886(Array BioPharma,AstraZeneca)；PD-0325901(Pfizer)；AMG-706(Amgen)；BIBF-1120(Boehringer Ingelheim)；SU-6668(Taiho)；CP-547632(OSI)；(AEE-788(Novartis)；BMS-582664(Bristol-Myers Squibb)；JNK-401(Celgene)；R-788(Rigel)；AZD-1152HQPA(AstraZeneca)；NM-3(Genzyme Oncology)；CP-868596(Pfizer)；BMS-599626(Bristol-Myers Squibb)；PTC-299(PTC Therapeutics)；ABT-869(Abbott)；EXEL-2880(Exelixis)；AG-024322(Pfizer)；XL-820(Exelixis)；OSI-930(OSI)；XL-184(Exelixis)；KRN-951(Kirin Brewery)；CP-724714(OSI)；E-7080(Eisai)；HKI-272(Wyeth)；CHIR-258(Chiron)；ZK-304709(Schering AG)；EXEL-7647(Exelixis)；BAY-57-9352(Bayer)；BIBW-2992(Boehringer Ingelheim)；AV-412(AVEO)；YN-968D1(Advenchen Laboratories)；Midostaurin(Novartis)；哌立福新(Perifosine)(AEterna Zentaris,Keryx,NationalCancer Institute)；AG-024322(Pfizer)；AZD-1152(AstraZeneca)；ON-01910Na(Onconova)；和AZD-0530(AstraZeneca)。

c.化疗组合

某些实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物与一或多种化疗剂组合给药。化疗剂有不同的作用模式，例如通过影响DNA或RNA，以及干预细胞周期复制。作用于DNA水平或RNA水平的化疗剂的例子是抗代谢物(比如硫唑嘌呤、阿糖胞苷、磷酸氟达拉滨(Fludarabine phosphate)、氟达拉滨、吉西他滨(Gemcitabine)、阿糖胞苷、克拉屈滨(Cladribine)、卡培他滨(capecitabine)6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和羟脲)；烷基化剂(比如美法仑、白消安、顺铂、卡铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡巴嗪(Dacarabazine)、丙卡巴肼(Procarbazine)、苯丁酸氮芥、噻替派(Thiotepa)、洛莫司汀、替莫唑胺(Temozolamide))；抗有丝分裂剂(比如长春瑞滨、长春新碱、长春碱、多烯紫杉醇、太平洋紫杉醇)；拓扑异构酶抑制剂(比如Doxorubincin、安吖啶(Amsacrine)、伊立替康、道诺霉素、表柔比星(Epirubicin)、丝裂霉素、米托蒽醌、伊达比星、替尼泊甙(Teniposide)、依托 泊甙、拓扑特肯)；抗生素(比如放线菌素和博莱霉素)；天门冬酰胺酶；蒽环类或紫杉醇。

d.放疗组合

在一些变化形式中，抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物与放疗组合给予。某些肿瘤可以用放射或放射性药品治疗。放疗通常用于不能切除或不能手术的肿瘤和/或肿瘤转移的治疗。放疗一般有三种途径进行。体外照射在距离身体一段距离进行，包括γ射线(⁶⁰Co)和X-射线。近距放射疗法在靶组织内部或者接触靶组织使用例如⁶⁰Co、¹³⁷Cs、¹⁹²Ir或¹²⁵I的放射源。

e.荷尔蒙剂组合

在一些实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物与荷尔蒙或者抗荷尔蒙组合给药。某些癌症与荷尔蒙依赖性有关，包括例如卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌。荷尔蒙依赖性癌症疗法可能包括使用抗雄激素或抗雌激素化合物。用于癌症疗法的荷尔蒙和抗荷尔蒙包括磷酸雌莫司汀、聚磷酸雌二醇、雌二醇、瑞宁德(Anastrozole)、依西美坦(Exemestane)、来曲唑(Letrozole)、它莫西芬(Tamoxifen)、醋酸甲地孕酮(Megestrolacetate)、醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesterone acetate)、奥曲肽(Octreotide)、醋酸环丙氯地孕酮(Cyproterone acetate)、比卡鲁胺(Bicaltumide)、氟他胺(Flutamide)、曲普瑞林(Tritorelin)、亮丙瑞林(Leuprorelin)、布舍瑞林(Buserelin)和戈舍瑞林(Goserelin)。

为了给药，将抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物配制成药物组合物。包含抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物的药物组合物可以根据制备药学有用的组合物的已知方法来配制，其中治疗性分子与药学可接受载体合并在一起。如果接受给药的患者可以耐受，则组合物被称为是“药学可接受载体”。无菌磷酸缓冲液是药学可接受载体的一个例子。其他的合适载体是本领域技术人员熟知的(参见例如Gennaro(ed.),Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,19th ed.1995))。制剂还可以包含一或多种赋形剂、防腐剂、助溶剂、缓冲剂、防止蛋白丢失到药瓶表面的清蛋白等。

将有效量的包含抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物的药物组合物给予受试对象。根据本发明的方法，抗体或抗体-药物偶联物可以通过多种给药模式给予受试对象，包括例如经肌内、皮下、静脉内、动脉内、关节内、 肠胃外、鼻内、肺内、透皮、胸膜内、鞘内和经口给药途径。对于预防和治疗目的，可以将抗体或抗体-药物偶联物以单次大剂量递送、在持续的时间段内连续递送(例如连续透皮递送)，或者按照反复给药的方案(例如每小时、每天或每周地)给药。

本文中有效剂量的确定一般是在动物模型研究和之后的人体临床试验的基础上，根据模型受试对象中明显减少疾病或紊乱复发率或严重程度的有效剂量和给药方案指导下进行。本发明所述组合物的有效剂量因多种不同因素而变动，包括给药手段、目标部位、患者生理状态、患者是人还是动物、给予的其他药物、治疗是预防性还是治疗性的，以及组合物自身的具体活性和它在个体中引发所需反应的能力。通常患者是人，但在一些疾病中，患者可以是非人的哺乳动物。一般来说，需要调节剂量方案以提供最佳的治疗反应，即优化安全性和疗效。相应地，治疗或预防有效量还是其中调节NKp30介导的NK细胞活性带来的有益效果超过任何不希望的附带效果的量。对于抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物的给药，剂量一般在大约0.1μg-100mg/kg、或者大约1μg/kg–大约50mg/kg、更通常在10μg-5mg/kg患者体重的范围内。在一些特定实施方案中，药剂的有效量在大约1μg/kg和大约20mg/kg之间、大约10μg/kg和大约10mg/kg之间或者大约0.1mg/kg和大约5mg/kg之间。可以通过单次或多次给药达到位于该范围的剂量，包括例如每天(per day或daily)、每周、两周或每月给药的多次给药。例如，在某些变化形式中，给药方案可能包括开始的给药，然后以每周或每两周间隔进行的多次后续给药。另一种方案包括开始的给药，然后以每月或每两个月间隔进行的多次后续给药。备选地，通过监测NK细胞活性和/或疾病或紊乱的临床症状可能指示要不规律地给药。

临床医师可以改变药物组合物的剂量来维持目标部位的所需浓度。例如，如果选择静脉内递送模式，根据受试对象的状态和预期的测量到的反应，药剂在目标组织血流中的局部浓度可以在每升大约1-50纳摩组合物，有时在大约每升1.0纳摩和每升10、15或25纳摩之间。根据递送模式，例如透皮递送相比于递送至粘膜表面，可以选择更高或更低的浓度。还应当根据所给予的剂型，例如喷鼻剂相比于粉末、缓释口服或注射颗粒、透皮制剂等来调节剂量。为了达到相同的血清浓度水平，例如释药速度为5纳摩(在标准状况下)的缓释颗粒的给药剂量应当是释药速度为10纳摩的颗粒的大约两倍。

包含抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物的药物组合物可以被配制成液体形式、气溶胶或固体形式。液体形式可以通过注射液、气溶胶、小滴、局部溶液和口服悬液说明。示范性的固体形式包括胶囊、片剂和控释形式。微量渗透泵和植入物可以说明后一种形式(参见例如Bremer et al.,Pharm.Biotechnol.10:239,1997；Ranade,“Implants inDrug Delivery,”in Drug Delivery Systems 95-123(Ranade and Hollinger,eds.,CRCPress 1995)；Bremer et al.,“Protein Delivery with Infusion Pumps,”in ProteinDelivery:Physical Systems 239-254(Sanders and Hendren,eds.,Plenum Press1997)；Yewey et al.,“Delivery of Proteins from a Controlled Release InjectableImplant,”in Protein Delivery:Physical Systems 93-117(Sanders and Hendren,eds.,Plenum Press1997))。其他固体形式包括霜剂、糊剂、其他局部施药形式等。

脂质体提供了通过静脉内、腹腔内、鞘内、肌内、皮下或经口给药、吸入或鼻内给药给受试对象递送治疗性组合物的一种工具(means)。脂质体是由包围着水性小腔的一或多个脂质双层构成的微小囊(参见generally,Bakker-Woudenberg et al.,Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1):S61,1993；Kim,Drugs 46:618,1993；Ranade,“Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers,”in DrugDelivery Systems 3-24(Ranade and Hollinger,eds.,CRC Press 1995))。脂质体与细胞膜成分类似，因此使用脂质体是安全的，并且它们可以被生物降解。根据制备方法，脂质体可能是单层或多层的，并且脂质体大小不同，直径在0.02μm到10μm以上。许多药剂可以包裹在脂质体内:疏水性药剂隔离在双层中，亲水性药剂隔离在内部水性空间(参见例如Machyet al.,Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey1987)；Ostro etal.,American J.Hosp.Pharm.46:1576,1989)。此外，通过改变脂质体大小、双层的数量、脂质成分以及脂质体的电荷和表面性质，有可能控制被包裹的药剂的治疗利用率。

脂质体可以吸收到几乎任何类型的细胞内，任何缓慢释放包裹的药剂。备选地，被吸收的脂质体可以被能够吞噬细胞的细胞吞噬。胞吞后，脂质体的脂质在溶酶体内被降解，释放出包裹的药剂(参见Scherphof et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.446:368,1985)。静脉给药后，小的脂质体(0.1到1.0μm)一般被网状内皮系统的细胞(主要位于肝脏和脾内)摄取，而大于3.0μm的脂质体 沉积在肺里。网状内皮系统的细胞对较小脂质体的优先摄取已被用于给巨噬细胞和肝脏肿瘤递送化疗剂。

有几种方法可以避开网状内皮系统，包括用大剂量的脂质体颗粒使之饱和或者通过药理学工具选择性地使巨噬细胞失活(参见Claassen et al.,Biochim.Biophys.Acta802:428,1984)。此外，在脂质体膜内引入糖脂-或聚乙二醇-衍生的磷脂经证实可以显著减少网状内皮系统的摄取(参见Allen et al.,Biochim.Biophys.Acta 1068:133,1991；Allen et al.,Biochim.Biophys.Acta1150:9,1993)。

还可以通过改变磷脂组成或者通过向脂质体内插入受体或反受体来制备靶向特定细胞或器官的脂质体。例如，用高含量非离子型表面活性剂制备的脂质体被用于靶向到肝脏(参见例如Japanese Patent 04-244,018 to Hayakawa et al.；Kato et al.,Biol.Pharm.Bull.16:960,1993)。这些制剂的制备是通过将大豆磷脂酰胆碱、α-生育酚和聚氧乙烯氢化蓖麻油(HCO-60)在甲醇中混合，混合物在真空下浓缩，然后用水将混合物复原。二棕榈酰磷脂胆碱(DPPC)与来源于大豆的固醇糖甙混合物(SG)和胆固醇(Ch)的脂质体制剂经证实可以寻靶到肝脏(参见Shimizu et al.,Biol.Pharm.Bull.20:881,1997)。

备选地，可以在脂质体表面结合上各种靶向反受体，比如抗体、抗体片段、碳水化合物、维生素和转运蛋白。例如，为了导靶到肝脏，可以用支链型的半乳糖苷脂衍生物对脂质体进行修饰，从而靶向到脱唾液酸糖蛋白(半乳糖)受体，这种受体专一地表达在肝细胞表面(参见Kato and Sugiyama,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.14:287,1997；Murahashi et al.,Biol.Pharm.Bull.20:259,1997)。在更一般性的组织靶向方法中，靶细胞预先标记了生物素化的抗体，所述抗体对靶细胞表达的反受体是特异的(参见Harasymet al.,Adv.Drug Deliv.Rev.32:99,1998)。清除血浆的游离抗体后，给予偶联了链霉亲和素的脂质体。另一种方法中，靶向抗体直接附着于脂质体(参见Harasym et al.,同前)。

利用常规蛋白微囊化技术可以将抗体或抗体-药物偶联物包裹到脂质体内(参见例如Anderson et al.,Infect.Immun.31:1099,1981；Anderson et al.,Cancer Res.50:1853,1990；Cohen et al.,Biochim.Biophys.Acta 1063:95,1991；Alving et al.“Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies,”in LiposomeTechnology(Vol.III)317(Gregoriadis,ed.,CRC Press,2nd ed.1993)； Wassef et al.,Meth.Enzymol.149:124,1987)。正如以上提到的，治疗有用的脂质体可能含有各种各样的成分。例如，脂质体可能包含聚(乙二醇)的脂质衍生物(参见Allen et al.,Biochim.Biophys.Acta 1150:9,1993)。

已设计了可降解的聚合物微球来维持治疗性蛋白的高系统水平。微球可以由降解性聚合物，比如聚乳酸/聚甘醇酸共聚物(poly(lactide-co-glycolide)，PLG)、聚酸酐、聚原酸酯，或者非生物降解性乙烯-醋酸乙烯共聚物来制备，其中蛋白被包裹在聚合物中(参见例如Gombotz and Pettit,Bioconjugate Chem.6:332,1995；Ranade,“Role ofPolymers in Drug Delivery,”in Drug Delivery Systems 51-93(Ranade andHollinger,eds.,CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz,“Degradable ControlledRelease Systems Useful for Protein Delivery,”in Protein Delivery:PhysicalSystems 45-92(Sanders and Hendren,eds.,Plenum Press 1997)；Bartus et al.,Science 281:1161,1998；Putney and Burke,Nature Biotechnology 16:153,1998；Putney,Curr.Opin.Chem.Biol.2:548,1998)。包被了聚乙二醇(PEG)的纳米球也可以作为治疗性蛋白静脉内给药的载体(参见例如Gref et al.,Pharm.Biotechnol.10:167,1997)。

正如例如Ansel and Popovich,Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems(Lea&Febiger,5th ed.1990)；Gennaro(ed.),Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,19th ed.1995)，和Ranade andHollinger,Drug Delivery Systems(CRC Press 1996)中显示的，本领域技术人员可以设计出其他的剂量形式。

本文描述的药物组合物还可以用于组合疗法。术语“组合疗法”本文中表示受试对象被给予至少一个治疗有效剂量的抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物，和第二药剂组合用于疾病或紊乱的治疗。抗B7H6抗体或抗体-药物偶联物和第二药剂可以是例如一起共同给药的(例如作为包含两种药剂的单一组合物，或者作为同时在相同部位的分开的组合物，或者顺序在相同部位的分开的组合物)，或者备选地，是分别给药的(例如在不同时间和/或不同给药部位)。

药物组合物可以提供为试剂盒，所述试剂盒包含一个含有本文描述的治疗性多肽或多核苷酸的容器。治疗分子可以提供为注射液形式的单个或多个剂量，或者作为在注射前进行复原的无菌粉末。备选地，这类试剂盒可以包含用于治疗性多肽或多核苷酸给药的干粉末分散器、液体烟雾剂发生器、或 者雾化器。这类试剂盒还可以包含关于药物组合物的适应症和用途的书面信息。例如，所述信息可能包括抗B7H6组合物在已知对B7H6超敏的患者中禁用的说明。

C.检测B7H6表达的方法

本文描述的抗体还可以用于检测B7H6表达的方法，包括用于诊断。可能有多个原因检测B7H6表达很重要。例如，B7H6在细胞或组织中的表达情况可以用于癌症的检测。这种检测可以作为癌症的筛选、诊断或预后的一部分。检测方法可以用于将来自受试对象的生物药品中B7H6的表达水平与标准或参照进行比较，作为判断癌症严重程度或阶段或者监测治疗的一部分。检测方法可以进行一次，或者使用多次来用于监测例如治疗过程中受试对象的进展，从而表明癌症是否复发。

在某些实施方案中，检测B7H6的细胞表达情况的方法包括将待测试的生物样品与抗人B7H6单克隆抗体接触，然后检测是否有抗体结合。抗体的结合表明细胞上存在B7H6。抗体和B7H6形成抗体-抗原复合体，形成复合体的条件取决于生物样品和所用的方法，本领域技术人员可以很容易地确定。合适的抗体包括能够与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合人B7H6(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266)的抗体，所述杂交瘤是(i)克隆4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)；(ii)克隆9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM I-4243)；(iii)克隆10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM I-4244)；和(iv)克隆17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)。

生物样品可能包含完整的人细胞或者待检测细胞的膜部分。例如，利用本发明要求保护的方法进行测试的细胞可以包括那些怀疑表达B7H6并且与受试对象的癌症相关的细胞，比如例如结肠癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、早幼粒细胞白血病细胞、B细胞淋巴瘤细胞、单核细胞淋巴瘤细胞、红白血病细胞、伯基特氏淋巴瘤细胞和慢性粒细胞白血病细胞等等。

通过检测抗体的结合来说明存在B7H6表达细胞包括利用针对特异结合的本领域任何已知的方法。已知有许多不同的结合分析法形式。例如，结合分析法系统可以是直接或间接的，仅举几例，包括利用诸如Western印迹、放射免疫分析、ELISA、“夹心”免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀分析、凝胶扩散沉淀试验、免疫放射分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析、补体结合 试验技术。为了强化检测，给抗体标记上可检测标记，比如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记或者生物发光标记。给抗体偶联标记的方法是本领域已知的，可以使用任何合适的方法。

本发明还提供了对被怀疑患有B7H6表达型癌症的受试对象进行诊断的方法。方法包括将偶联了如上所述的可检测标记的抗人B7H6单克隆抗体给予受试对象，通常是人(但也可以是另一种哺乳动物，比如非人灵长类、犬、猫、猪等。合适的抗体包括能够与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合人B7H6(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266)的抗体，所述杂交瘤是(i)克隆4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM I-4242)；(ii)克隆9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM I-4243)；(iii)克隆10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM I-4244)；和(iv)克隆17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM I-4245)。在一些实施方案中，抗体与选自以上(ii)-(iii)的杂交瘤产生的抗体竞争结合B7H6的胞外结构域。在特定变化形式中，抗体是嵌合或人源化抗体，其来源于由选自以上(i)-(iv)或以上(ii)-(iii)的杂交瘤产生的抗体。给予抗体后，检测抗体在受试对象体内的分布。检测任何特定标记的分布的方法是本领域技术人员已知的，可以使用任何合适的方法。一些非限制性的例子包括计算机断层成像(CT)、正电子发射计算机断层显像(PET)、磁共振成像(MRI)、荧光、化学发光和超声波检查法。

通过以下非限制性实施例对发明进行进一步阐述。

实施例

实施例1:小鼠抗人B7H6单克隆抗体的制备和挑选

A.免疫

按照以下方案对Balb/c小鼠进行免疫:

D0:i.v.注射100μg可溶性B7H6(人B7H6的胞外结构域，带有C末端小鼠Fc融合(hB7H6/mFc2；成熟形式如SEQ ID NO:3中残基25-500所示))

D15:i.v.注射100μg可溶性B7H6

D25:i.p.给予100μg可溶性B7H6作为加强剂

第三次免疫后三天，采集脾脏。分离脾细胞，与骨髓瘤细胞融合，接种到40个96孔板中。培养三周后，筛选3840个杂交瘤的上清液中是否存在抗人B7H6单克隆抗体。

B.杂交瘤的第一次筛选

为了挑选产生抗人B7H6单克隆抗体的杂交瘤,用3840个杂交瘤的上清液给表达B7H1的P815细胞和表达B7H6的P815细胞染色。利用偶联Cy5的抗小鼠Ig经FACS分析显示杂交瘤上的染色。为了区分两种P815转染子，P815B7-H1细胞首先用CFSE染色。结果显示在3840个杂交瘤上清中，有114个对表达B7H6的P815细胞的染色相对表达B7H1的P815细胞来说是阳性的，从而表明相应杂交瘤产生了抗B7H6mAbs。

C.杂交瘤的第二次筛选

进行第二次筛选来挑选封闭抗体。为了鉴定到这些杂交瘤，对114份上清中每份上清液阻断NKp30Fc结合P815.B7H6细胞的能力进行了评估。挑选到的杂交瘤同时做检测，通过P815.B7H6染色证实它们仍然产生抗B7H6mAbs。此外，先前经证实能够抑制NKp30结合P815.B7H6的抗B7H6多克隆抗体(pAb)作为阳性对照。

结果显示P815.B7-H6细胞被NKp30Fc染色，而当抗B7H6pAb以10μg/ml温育时，能够抑制该染色。根据结果将114份上清分为四组:(1)产生抗B7H6mAbs的杂交瘤，所述mAbs能够阻断NKp30Fc结合(1/114)；(2)产生抗B7H6mAbs的杂交瘤，所述mAbs不能阻断NKp30Fc结合(27/114)；(3)产生抗B7H6mAbs的杂交瘤，所述mAbs只能部分阻断NKp30Fc结合(1/114)；(4)不再产生抗B7H6mAbs的杂交瘤(85/114)。总之，29个杂交瘤能够有效产生抗B7H6mAbs，其中只有2个可以作为封闭mAbs。克隆了产生抗B7H6mAbs的29个杂交瘤。

D.杂交瘤的克隆

对挑选到的29个杂交瘤进行克隆后，11个杂交瘤未能生长，5个杂交瘤只长出了阴性克隆，13个形成了阳性克隆。在摇瓶中进行的扩增只得到了9个克隆，这9个克隆来自仍然产生抗B7H6mAb的5个不同杂交瘤。对以下克隆进行了表征，经鉴定全部为小鼠IgG1:4E5.5、5E1.4、9G9.2、10E2.9和17B1.3。

表达抗B7H6的单克隆抗体的杂交瘤按照布达佩斯条约保藏在CollectionNationale de Cultures de Microorganismes(CNCM,Institut Pasteur；Paris,France)专利保藏处作为原始保藏物，所给的CNCM保藏号如下:克隆4E5.5(保藏号CNCM I-4242，保藏于2009年11月18日)；克隆9G9.2(保藏号CNCM I-4243，保藏于2009年11月18日)；克隆10E2.9(保藏号CNCM I-4244，保藏于 2009年11月18日)；和17B1.3(保藏号CNCM I-4245，保藏于2009年11月18日)。

实施例2:小鼠抗人B7H6单克隆抗体的表征

A.小鼠抗人B7H6单克隆抗体对肿瘤细胞系的反应性

比较了每个抗人B6H7mAb(4E5.5、5E1.4、9G9.2、10E2.9和17B1.3)和抗B7H6多克隆抗体对以下肿瘤细胞系的染色能力:HEK-293、HeLa EV2、K562和Raji。P815.B7H6细胞和P815.B7-H1细胞分别作为阳性对照和阴性对照。5种mAbs的每一种对每种肿瘤细胞系染色都是阳性的，但每种mAb的染色强度分布有所区别。例如，17B1.3与pAb对P815.B7-H6的染色强度相同，但它不能等效地染色Raji细胞。并且，17B1.3略低于pAb对HEK-293和HeLa EV2细胞的染色，而4E5.5略低于pAb对K562的染色。

C.通过竞争实验对表位进行区分

为了明确4E5.5、5E1.4、9G9.2、10E2.9和17B1.3mAbs是否靶向不同的表位，在这些mAbs之间进行了竞争实验。唯一直接偶联荧光染料(Alexa 647,Molecular Probes)的克隆是9G9.2。因此，该抗体被用于评估在和其他纯化的抗B7H6mAbs一起温育后，9G9.2-Alexa647与HEK 293细胞的结合。HEK-293细胞首先与纯化的mAbs(30μg/ml)温育，然后与9G9.2Alexa 647(10μg/ml)温育。然后通过(BD Sciences,Inc.,Franklin Lakes,NJ)评估9G9.2-Alexa 647对HEK-293的染色。这项分析的结果显示HEK-293细胞与mAbs10E2.9、4E5.5或9G9.2的预温育显著降低了9G9.2-Alexa 647对细胞的染色强度。与10E2.9、4E5.5或9G9.2的预温育显著降低了9G9.2-Alexa 647的染色强度，而与5E1.4的预温育仅略微降低了染色强度。与17B1.3进行的预温育对9G9.2-Alexa 647染色没有明显的影响。这些结果显示10E2.9、4E5.5和9G9.2靶向的表位有重叠(如果不是基本相同或类似)。相反，17B1.3和9G9.2(以及有可能5E1.4和9G9.2)识别的是没有重叠的表位。

D.小鼠抗人B7H6单克隆抗体部分地阻断NKp30Fc结合

为了鉴定对NKp30Fc结合有某些阻断作用的mAbs，进行了竞争试验。NKp30Fc是可溶形式的人NKp30，它由人NKp30的胞外结构域和C-末端Fc融合构成。在与B7H6多克隆抗体、mIgG1、对照以及纯化的4E5.5、5E1.4、9G9.2、10E2.9和17B1.3抗B7-H6mAbs温育后，评估了NKp30Fc结合HEK 293细胞的情况。HEK-293细胞首先与纯化的mAbs(30μg/ml)温育，清洗，然后与预形 成的复合体—偶联了NKp30Fc(5μg/ml)/PE的抗huIg(5μg/ml,JacksonImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)温育。在BD FACSCalibur^TM(BD SciencesInc.)上使用FlowJo软件(Tree Star,Inc.Ashland,OR)分析了荧光染色。结果显示4E5.5和17B1.3部分地阻断了NKp30Fc结合。

E.小鼠抗人B7H6单克隆抗体部分地阻断DOMSP30活化

为了证实17B1.3和4E5.5是封闭mAbs，用报告细胞DOMSP30进行了功能试验。DOMSP30细胞被用作报告细胞系统来评价B7H6是否能够直接通过NKp30诱导信号转导(关于DOMSP30细胞，参见Schleinitz et al.Arthritis Rheum.58:32156-3223,2008)。通过刺激24小时后IL-2的产生或者通过刺激4小时后CD69的上调可以检测到DOMSP30的活化。在有或没有抗NKp30、抗NKp46、抗B7H6多克隆抗体、小鼠IgG1或者抗人B7H6单克隆抗体4E5.5、5E1.4、9G9.2、10E2.9和17B1.3(浓度10μg/ml)之一的情况下，将DOMSP30细胞与HeLa EV2或HeLa PF细胞系共培养。共培养4小时后，测量CD69+DOMSP30细胞的数量(百分比)。

结果显示抗NKp30完全阻断了DOMSP30活化，4E5.5和17B1.3部分地抑制了DOMSP30活化。简单来说，在没有抗体的情况下，大约75％的DOMSP30细胞是CD69+，相较与抗体共培养后的CD69+百分比如下:与抗NKP30共培养，低于10％；与抗B7H6pAb共培养，大约20％；与mAbs 4E5.5和17B1.3中的一种共培养，大约45％。相比之下，抗NKp46以及mAbs 9G9.2、10E2.9和5E1.4中的任何一种未显示对DOMSP30活化有影响。

F.小鼠抗人B7H6单克隆抗体17B1.3是印迹抗体

通过使用来自以下三种不同细胞系的蛋白提取物通过进行免疫印迹试验测试了抗B7H6mAbs作为印迹抗体的能力:不表达B7H6的KHYG-1，以及分别表达B7H6的P815.B7-H6和HEK293。抗B7H6pAb作为阳性对照。收集细胞，在冷的PBS 1X中清洗，以20.10⁶细胞.mL-1的浓度悬浮于Lysis Buffer(10mM Tris-HCl pH 7.6；150mM NaCl；1％Triton X；1XProtease Inhibitor(Roche Applied Science,Indianapolis,IN))，置于冰上30分钟。然后将裂解物于4℃、13200rpm离心10分钟。收集上清液，用购自Pierce的BCA试剂盒测量蛋白浓度，并调节至1.5mg/ml。细胞裂解物各取30μL与10μL 4X Loading Buffer混合，于95℃加热10分钟。然后将它们上样到预制凝胶(2-20％Precise Protein Gel from Thermoscientific)上，于110V跑胶。电泳后，用iBlot Gel Transfer Stack Nitrocellulose,Regular kit(Invitrogen,San Diego,CA)将样品转移到膜上。室温下的1小时期间，膜在1XTBST(100mM Tris HCl pH＝7.5+0,9％HCl+0,05％Tween)+5％牛奶中饱和，然后与各种抗B7H6mAbs(2μg.mL-1)在1X TBST+5％牛奶中于4℃温育过夜。膜在1X TBST中洗2次10分钟，与在1X TBST+5％牛奶中稀释的偶联了辣根过氧化物酶的绵羊抗小鼠IgG抗体在RT下温育1小时。然后在TBST中将膜清洗4次20分钟，用ECL试剂盒kit(GE Healthcare,Piscataway,NJ)显影。

5种mAbs中，只有mAb 10E2.9(10μg/ml)能够在所测试的条件下作为免疫印迹mAb。这些结果提示mAbs 4E5.5、5E1.4、9G9.2和17B1.3对应的B7H6表位可能不是线性的，而是包含B7H6多肽中的不连续区域。

G.五种抗人B7H6单克隆抗体中的三种能够用于免疫沉淀

为了评估4E5.5、5E1.4、9G9.2、10E2.9和17B1.3是否能有效用于免疫沉淀，制备了P815.B7-H6蛋白提取物，用不同的mAbs进行免疫沉淀。免疫沉淀物在SDS上跑胶，用抗B7H6多克隆抗体和偶联了HRP的抗小鼠Ig观察到存在B7H6。结果显示4E5.5、9G9.2和10E2.9从P815.B7-H6蛋白提取物中免疫沉淀了B7H6，而5E1.4和17B1.3不能。

实施例3:用于评估抗B7H6抗体或抗体-药物偶联物抗肿瘤生长的效力的BxPC3胰 腺癌模型

为了检验抗人B7H6单克隆抗体或抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物对小鼠中肿瘤生长是否有活性，第0天给小鼠组经s.c注射BxPC3胰脏肿瘤。待肿瘤长到150-200mm³，即给小鼠(n＝10/组)组注射1mg/Kg-30mg/Kg的对照试剂、抗B7H6抗体或者抗B7H6抗体-药物偶联物，每周注射1-3次，共3周。每周3次监测肿瘤体积，共5周。与注射对照试剂的小鼠相比，注射了抗B7H6抗体或抗体-药物偶联物的小鼠中的肿瘤小得多，这表明了拮抗剂对抑制肿瘤生长的效力。

试验设计:8-10周龄雌性C.B-17SCID小鼠(Charles River Laboratories)第0天在右侧腹部s.c.(皮下)注射2x 10⁶BxPC-3细胞。从肿瘤大小达到150-200mm³开始，小鼠组(n＝10/组)i.p.(静脉)注射1mg/Kg-30mg/Kg对照试剂、抗B7H6抗体或者抗B7H6抗体-药物偶联物，每周1-3次，共3周。用游标卡尺测量每周3次监测肿瘤的生长，共5周。利用公式1/2*(B)²*L(mm³)计算肿瘤体积。

实施例4:利用抗人B7H6单克隆抗体或抗体药物偶联物抑制人肝细胞癌细胞的体 内生长

为了评估抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对体内人肝细胞癌细胞的抗肿瘤活性，给BALB/c裸鼠组在第0天注射HuH7或C3A肝细胞癌细胞。从第5-33天，荷瘤小鼠组(n＝10/组)经i.p.或肿瘤周边注射隔天(EOD)接受5-75μg抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物。每周3次监测肿瘤体积，共6周。抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对肿瘤生长的抑制表明相应蛋白对体内人肝细胞癌有抑制效果。

试验设计:8周龄雌性BALB/c裸鼠(Charles River Laboratories)第0天在右侧腹部s.c.注射6x 10⁶HuH7或C3A细胞。从第5-33天，小鼠组(n＝10/组)经i.p.或肿瘤周边注射5μg-75μg抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物。注射总体积为200μl。用游标卡尺测量每周3次监测肿瘤的生长，共6周。利用公式1/2*(B)²*L(mm³)计算肿瘤体积。

实施例5:利用抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物抑制人前列腺癌细胞的体 内生长

为了评估抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对体内人前列腺癌细胞的抗肿瘤活性，给BALB/c裸鼠组在第0天注射PC-3或者DU-145前列腺癌细胞。从第5-33天，荷瘤小鼠组(n＝10/组)经i.p.或肿瘤周边注射隔天(EOD)接受5-75μg抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物。每周3次监测肿瘤体积，共6周。抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对肿瘤生长(体积或重量)的抑制表明相应蛋白对体内人前列腺癌有抑制效果。

试验设计:8周龄雌性BALB/c裸鼠(Charles River Laboratories)第0天在右侧腹部或者前列腺叶原位s.c.注射10x 10⁶PC-3或6x 10⁶DU-145细胞。从第5-33天，小鼠组(n＝10/组)经i.p.或肿瘤周边(仅对s.c.模型)注射5-75μg抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物。注射总体积为200μl。对于s.c.肿瘤，用游标卡尺测量每周3次监测肿瘤的生长，共5周。利用公式1/2*(B)²*L(mm³)计算肿瘤体积。对于原位肿瘤，试验结束时将小鼠处死，肿瘤称重以便进行肿瘤负荷评估。

实施例6:利用抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物抑制体内人结肠癌细胞

为了评估抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对体内人结肠癌细胞的抗肿瘤活性，给BALB/c裸鼠组在第0天注射DLD-1或者HCT-116结肠癌细胞。从第5-33天，荷瘤小鼠组(n＝10/组)经i.p.或肿瘤周边注射隔天(EOD)接受5-75μg抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物。每周3次监测肿瘤体积，共6周。抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对肿瘤生长(体积或重量)的抑制提示相应蛋白对体内人结肠癌有抑制效果。

试验设计:8周龄雌性BALB/c裸鼠(Charles River Laboratories)第0天在右侧腹部或者结肠壁原位s.c.注射6x 10⁶DLD-1或HCT-116细胞。从第5-33天，小鼠组(n＝10/组)经i.p.或肿瘤周边(仅对s.c.模型)注射5-75μg抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物。注射总体积为200μl。对于s.c.肿瘤，用游标卡尺测量每周3次监测肿瘤的生长，共6周。利用公式1/2*(B)²*L(mm³)计算肿瘤体积。对于原位肿瘤，试验结束时将小鼠处死，肿瘤称重以便进行肿瘤负荷评估。

实施例7:利用抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物抑制体内人胰腺癌细胞

为了评估抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对体内人胰腺癌细胞的抗肿瘤活性，给BALB/c裸鼠组在第0天注射BxPC-3或者HPAF-II胰腺癌细胞。从第5-33天，荷瘤小鼠组(n＝10/组)经i.p.或肿瘤周边注射隔天(EOD)接受5-75μg抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物。每周3次监测肿瘤体积，共6周。抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对肿瘤生长(体积或重量)的抑制表明相应蛋白对体内人胰腺癌有抑制效果。

实验设计:8周龄雌性BALB/c裸鼠(Charles River Laboratories)第0天在右侧腹部或者胰腺叶原位s.c.注射6x 10⁶BxPC-3或HPAF-II细胞。从第5-33天，小鼠组(n＝10/组)经i.p.或肿瘤周边(仅对s.c.模型)注射5-75μg抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物。注射总体积为200μl。对于s.c.肿瘤，用游标卡尺测量每周3次监测肿瘤的生长，共6周。利用公式1/2*(B)²*L(mm³)计算肿瘤体积。对于原位肿瘤，试验结束时将小鼠处死，肿瘤称重以便进行肿瘤负荷评估。

实施例8:利用抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物抑制体内B细胞淋巴瘤

通过在生长培养基中传代体外维持人B淋巴细胞瘤细胞系。细胞在PBS中彻底清洗以除去培养物成分。

SCID小鼠经尾静脉注射悬浮在100微升体积中的(通常是)1x 10⁶人淋巴瘤细胞。在先期研究中利用经验确定最佳的注射细胞数量以便得到的成瘤率与所希望的动力学一致。第二天通过皮下植入微量渗透泵(ALZET,Cupertino,CA)或者每天i.p.注射抗人B7H6单克隆抗体或者抗体-药物偶联物或介质开始抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物处理。监测小鼠的存活率和明显发病率。失去20％以上初始体重的小鼠以及表现出明显病状(比如后肢瘫痪)的小鼠被处死。根据采用的淋巴瘤细胞系，未处理的小鼠通常3-6周后死亡。对分泌IgG或IgM的B细胞淋巴瘤，还可以通过每周采血和通过ELISA测量血清人免疫球蛋白水平来监测疾病的进展情况。

抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物剂量反应/IM-9模型

给小鼠注射1x 10⁶IM-9细胞，第二天植入28日微量渗透泵。泵中装有以下浓度的抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物用于递送:每天0、0.12、1.2或12微克，每个剂量组有8只小鼠。随抗体或抗体-药物偶联物剂量的增加，小鼠受到的免于肿瘤细胞系侵害的保护加强，这表明抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物的效果是剂量依赖性的。试验结束时存活的小鼠没有疾病迹象，它们的血清中检测不到人IgG。

这些数据展示了抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物在SCID小鼠淋巴瘤模型中的效力与它们抑制淋巴细胞瘤体内生长的能力有相关性。

实施例9:利用抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物抑制体内源于B细胞的肿 瘤

经由微量渗透泵通过恒量输注给予抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物导致与泵中含有的抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物浓度成比例的稳定态血清浓度。将包含在磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中的浓度为2mg/ml或0.2mg/ml的0.22ml抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物在无菌状态下装入Alzet微量渗透泵(model 2004；Alzacorporation Palo Alto,CA)。通过背部皮肤上的1cm切口将泵经皮下植入，将皮肤无菌缝合。这些泵设计为在28天内以每小时0.25μl的速率递送其内容物。该给药方法导致被注射肿瘤细胞的小鼠存活率显著提高(见下文)。

抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物对源于B细胞的肿瘤的体内效果

利用本文描述的小鼠异种移植肿瘤模型体内检验了抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物的效果。待测试的异种移植模型是人淋巴母细胞细胞系IM-9。C.B-17SCID小鼠(雌性C.B-17/IcrHsd-scid；Harlan,Indianapolis,Indiana)被分成4组。第0天，从培养物中收获IM-9细胞，经尾静脉给所有小鼠进行静脉内注射(每只小鼠大约1,000,000细胞)。第1天，给小鼠皮下植入含有测试物或对照物的微量渗透泵。给第1-3组的小鼠(n＝9/组)递送抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物:第1组含有2.0mg/mL抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物，每天递送12μg；第2组含有0.20mg/mL，每天递送1.2μg；第3组含有0.02mg/mL，每天递送0.12μg。第4组的小鼠(n＝9)作为对照，用介质(PBS pH 6.0)处理。

与介质处理的小鼠相比，处理组(例如12μg/天或者1.2μg/天)中存活率的增加显示抗人B7H6单克隆抗体或抗体-药物偶联物在体内降低了B细胞肿瘤细胞的影响。

由上文应当理解，为了说明的目的文中用实施例描述了具体的发明实施方案。相应地，发明只受到所附权利要求的限制。为了所有目的，文中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用全部引入本文。

Claims (30)

1.分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人B7H6，其包含保藏号为CNCM I-4245 的杂交瘤所产生的抗体的重链CDR 序列和轻链CDR 序列，或重链和轻链可变区序列，所述抗原结合片段选自下组：F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv。

2.权利要求1 的抗体或其抗原结合片段，其由保藏号为CNCM I-4245 的杂交瘤产生。

3.权利要求1 的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体抑制人B7H6 与人NKp30 的相互作用，并抑制对表达B7H6 的靶细胞的细胞识别。

4.权利要求1 所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。

5.权利要求1 所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是小鼠抗体。

6.权利要求1 的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化抗体。

7.权利要求1 或6 的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单链抗体。

8.权利要求1 的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含的Fc 区具有ADCC 活性和CDC 活性中的至少一种。

9.权利要求4 的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含的Fc 区具有ADCC 活性和CDC 活性中的至少一种。

10.权利要求6 的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含的Fc区具有ADCC 活性和CDC 活性中的至少一种。

11.权利要求8-10 之一所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc 区是单链Fc。

12.权利要求1 的抗体或其抗原结合片段，其结合人B7H6，其包含保藏号CNCM I-4245的杂交瘤所产生的抗体的重链和轻链可变区序列。

13.权利要求1 的抗体或其抗原结合片段，其结合人B7H6，其包含保藏号为CNCM I-4245

的杂交瘤所产生的抗体的重链CDR 序列和轻链CDR 序列。

14.诊断试剂盒，其包含:权利要求 1-13 中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；和检测所述抗体的结合的装置。

15.组合物，其包含:权利要求 1-13 中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；和可药用载体。

16.抗体-药物偶联物，其包含权利要求1-13 中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段偶联细胞毒性剂。

17.权利要求16 所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体选自小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。

18.权利要求16 所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体是人源化抗体。

19.权利要求16 或18 的抗体-药物偶联物，其中所述抗体是单链抗体。

20.权利要求16 或18 所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体包含的Fc 区具有ADCC活性和CDC 活性中的至少一种。

21.权利要求20 所述的抗体-药物偶联物，其中所述Fc 区是单链Fc。

22.权利要求16 所述的抗体-药物偶联物，其中所述细胞毒性剂选自抗微管蛋白剂、DNA 小沟结合剂、DNA 小沟烷基化剂、度卡霉素和嘌呤霉素。

23.权利要求22 所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗微管蛋白剂选自海兔毒素、长春碱类、

鬼臼毒素、紫杉烷、浆果赤霉素衍生物、念珠藻环肽、类美登醇和康普立停。

24.权利要求16 所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体或其抗原结合片段经由连接分子偶联细胞毒性剂。

25.权利要求24 所述的抗体-药物偶联物，其中所述连接分子在胞内条件下是可切割的。

26.权利要求25 所述的抗体-药物偶联物，其中可切割性连接分子是能被胞内蛋白酶切割的连接肽。

27.组合物，其包含:权利要求 16-26 中任一项所述的抗体-药物偶联物；和可药用载体。

28.权利要求1-13 之一所述抗体或其抗原结合片段在制备降低人自然杀伤细胞作用于表达人B7H6 的细胞的活性的药物中的用途。

29.权利要求16 所述抗体-药物偶联物在制备消除包含B7H6 表达细胞的细胞群中的B7H6表达细胞或者抑制所述B7H6 表达细胞生长的药物中的用途。

30.保藏号CNCM I-4245 的杂交瘤。