BR112012013975B1 - anticorpo monoclonal isolado, kit de diagnóstico, conjugado de anticorpo-fármaco, composição compreendendo o referido anticorpo, métodos in vitro para diminuir a atividade, para enfraquecer ou inibir o desenvolvimento de células e de detecção de expressão celular de b7h6, usos do anticorpo e do conjugado, e célula de produção de anticorpo - Google Patents

Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL ISOLADO, KIT DE DIAGNÓSTICO, CONJUGADO DE ANTICORPO-FÁRMACO, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO O REFERIDO ANTICORPO, MÉTODOS IN VITRO PARA DIMINUIR A ATIVIDADE, PARA ENFRAQUECER OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO DE CÉLULAS E DE DETECÇÃO DE EXPRESSÃO CELULAR DE B7H6, USOS DO ANTICORPO E DO CONJUGADO, E CÉLULA DE PRODUÇÃO DE ANTICORPO. A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais que se ligam especificamente ao membro da família B7 B7H6, incluindo anticorpos capazes de inibir a interação de B7H6 com NKp30. Também descritos são conjugados fármaco-anticorpo anti-B7H6 compreendendo um anticorpo monoclonal anti-B7H6 conjugado com um agente terapêutico. Os anticorpos anti-B7H6 e conjugados anticorpo-fármaco são úteis em métodos para exercer efeitos terapêuticos contra células que expressam B7H6, assim como em métodos de diagnóstico para a detecção de células que expressam B7H6 ou B7H6.

Description

ANTICORPO MONOCLONAL ISOLADO, KIT DE DIAGNÓSTICO, CONJUGADO DE ANTICORPO-FÁRMACO, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO O REFERIDO ANTICORPO, MÉTODOS IN VITRO PARA DIMINUIR A ATIVIDADE, PARA ENFRAQUECER OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO DE CÉLULAS E DE DETECÇÃO DE EXPRESSÃO CELULAR DE B7H6, USOS DO ANTICORPO E DO CONJUGADO, E CÉLULA DE PRODUÇÃO DE ANTICORPO Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. nº 61/285, 018, depositado em 9 de dezembro de 2009, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

[0002] A invenção refere-se a anticorpos, em particular anticorpos monoclonais que se ligam a um ligando de célula tumoral, designado B7H6.

[0003] A invenção também se refere a usos dos anticorpos.

ANTECEDENTES Família B7

[0004] Sinais coestimulatórios positivos e negativos desempenham papéis cruciais na modulação da atividade de linfócitos, e as moléculas que medeiam estes sinais têm provado ser alvos eficazes para agentes imunomoduladores. Por exemplo, após interação com B7-1 ou B7-2 na superfície de células que apresentam antígenos (APC), CD28, o protótipo de molécula coestimuladora de células T, emite sinais que promovem a proliferação de células T e diferenciação em resposta a acoplamento de receptor de células T (TcR), enquanto que o antígeno-4 do linfócito T citotóxico homólogo CD28 (CTLA-4) medeia a inibição da proliferação de células T e as funções efetoras. (Ver Chambers et al., Ann. Rev. Immunol., 19:565-594, 2001; Egen et al., Nature Immunol., 3:611-618, 2002).

[0005] Várias moléculas com homologia com a família B7 foram descobertas (Abbas et al., Nat. Med, 5: 1345-6, 1999; Coyle et al., Nat. Immunol., 2: 203-9, 2001; Carreno et al., Annu. Rev. Immunol., 20: 29- 53, 2002; Liang et al., Curr. Opin. Immunol., 14: 384-90, 2002), e seu papel na ativação de linfócitos está apenas começando a ser elucidado. Estes novos contrarreceptores coestimulatórios incluem B7h2, PD-L1, PD-L2, B7-H3 e B7-H4.

[0006] A expressão de membros da família B7 conhecidos é em grande parte restrita a células apresentadoras de antígenos. Estudos revelaram que os membros da família B7 são contrarreceptores em células linfoides que interagem com receptores cognatos sobre os linfócitos para fornecer sinais coestimulatórios positivos ou negativos que desempenham papéis cruciais na regulação de respostas mediadas por células imunitárias.

As células NK e NKp30

[0007] Células assassinas naturais (NK) são um subconjunto de linfócitos ativos no sistema imune e representam uma média de cerca de 15% de células mononucleares no sangue periférico humano. As células NK foram inicialmente descritas funcionalmente em 1971 pela observação de que camundongos letalmente irradiados foram capazes de rejeitar aloenxertos de células da medula óssea (CMO) de cepas alogênicas ou parentais. (vide Cudowicz e Bennett, J. Exp. Med. 134:83-102, 1971; Cudowicz e Bennett, J. Exp. Med. 135:1513-1528, 1971). Cudowicz e Bennett observaram que camundongos F1 híbridos H-2-heterozigotos irradiados (A x B) foram capazes de rejeitar BMC parental H-2-homozigótica (A ou B). Esta observação entrava em conflito com as leis clássicas de transplante em que antígenos de transplante foram pensados herdar codominantemente e filhos eram obrigatoriamente tolerantes em relação a determinantes do complexo de histocompatabilidade parental maior (MHC). (vide Cudowicz e Bennett, J. Exp. Med. 134:83-102, 1971). As células responsáveis por este fenômeno foram encontradas para ser radiorresistentes e idênticas às células linfoides, as quais foram caracterizadas mais tarde, em 1975 pela sua capacidade de mediar matança espontânea de tumores in vitro de uma maneira MHC sem restrições. (vide Herberman e Ortaldo, Science, 214:24-30, 1981; Ortaldo e Herberman, Annu. Rev. Immunol. 2:359 - 394, 1984; Trinchieri, Adv. Immunol. 47:187-376, 1989; Murphy et al., J. Natl. Câncer Inst. 85:1475 - 1482, 1993). Evidência adicional de que as células NK por si só podem mediar a especificidade da rejeição do enxerto de medula surgiu em 1987 quando foi observado que os camundongos com deficiência imunológica combinada grave (SCID), que não se pode desenvolver células T e B, têm a função normal das células NK. (Ver Murphy et al., J. Exp. Med. 165:1212-1217, 1987).

[0008] As células NK são atualmente entendidas para representar um braço importante da imunidade inata e desempenhar um papel fundamental na vigilância imunológica contra tumores e células infectadas por vírus. A menos que ativadas, no entanto, as células NK são ineficazes em executar a sua função normal, mesmo quando presentes em números suficientes de outra forma. Na verdade, atividade das células NK diminuída está associada ao câncer e doenças infecciosas (ver Yamazaki et al., Oncology Reports 9:359- 363, 2002; Rosenberg et al., Cancer Research 51: 5074-5079 (supl)., 1991; Britteenden et al., Cancer 77:1226-1243, 1996; Patente U.S. N°s 5.082.833 e 4.883.662). Por outro lado, como notado acima, atividade NK celulares medeia rejeição aguda de aloenxertos BMC. Portanto, os níveis de atividade de células NK parecem desempenhar um papel importante nos distúrbios imunes relacionados.

[0009] A atividade das células NK é normalmente regulada pela interação entre moléculas MHC classe I e receptores inibitórios e de ativação. (Ver, por exemplo, Barao e Murphy, BB & MT 9:727-741, 2003). A hipótese "autoausente" é originalmente baseada na observação de que as células tumorais que não possuem moléculas MHC classe I são suscetíveis à morte por células NK. (Ver Ljunggren e Karre, Immunol. Hoje 11:237-244, 1990; Ohlen et al., J. Immunol. 145:52-58, 1990). Investigadores adicionalmente observaram que as células NK humanas lisam linhagens celulares de B-linfoblastoides de vírus transformados Epstein-Barr deficientes da classe I. (Storkus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:2361-2364, 1989). Além disso, verificou-se que a transfecção de genes de classe I em células alvo de classe I deficientes fizeram com que essas células fossem parcial ou completamente resistentes à lise mediada por células NK. (Ver Storkus et al., supra; Shimizu e DeMars, Eur. J. Immunol., 19:447-451, 1989). MHC de classe I, no entanto, nem sempre é necessária para a proteção de citotoxidade mediada por células NK, e reconhecimento por MHC de classe I nem sempre impede citólise por células NK. (Barao e Murphy, supra). Nos últimos anos, vários receptores inibitórios e de ativação específicos de MHC de classe I, assim como receptores de ativação específicos de não MHC de classe I de ativação foram identificados. Estes receptores são relevantes no que diz respeito a abordagens terapêuticas, tais como, por exemplo, BMT alogênico e terapia de câncer. (Ver id).

[00010] Receptores de ativação específicos de não MHC de classeI, que são capazes de mediar a citotoxicidade das células NK contra MHC de classe I deficientes ou alvos negativos, são representados em parte, por uma família heterogênea de moléculas tipo imunoglobulina específicas de células NK que são conhecidas como receptores de citotoxicidade natural (NCRs). (Ver, por exemplo, Moretta et al., Annu. Rev. Immunol. 19:197-223, 2001; Diefenbach e Raulet, Immunol. Rev., 181: 170-184, 2001). Na ausência de expressão de MHC de classe I (tal como, por exemplo, em células tumorais ou células infectadas por vírus), a ligação destes receptores de ativação em células NK aciona célula assassinas alvo. Um receptor de ativação tal é NKp30, que é seletiva e constitutivamente expresso na natural assassina madura (NK) e os sinais por meio, inter alia, o acoplamento com CD3. (Ver Barao e Murphy, supra). O ligando de célula alvo ao qual se liga NKp30 não foi previamente identificado.

[00011] Este sistema de reconhecimento inato por células NK representa uma ferramenta potencialmente poderosa para aplicação clínica em transplante de medula óssea (TMO) alogênico, terapia de câncer, ou tratamento de outros distúrbios associados com células NK. (Ver, por exemplo, Barao e Murphy, supra). Por exemplo, estimular ou inibir ativação de NKp30 seria útil para modular atividade de célula NK e tratar doenças ou distúrbios associados com a atividade de células NK. Em particular, o aumento da atividade das células NK acionando NKp30 seria útil para o tratamento de doenças ou distúrbios caracterizados por atividade de células NK insuficiente, tais como o câncer, doenças infecciosas, enquanto que a inibição da atividade de células NK através do bloqueio de NKp30 seria útil para o tratamento de distúrbios mediados por célula NK, tais como, por exemplo, rejeição de aloenxertos BMC.

[00012] O novo membro da família B7, B7H6, foi recentemente descoberto e caracterizado como um contrarreceptor para NKp30, um receptor seletivamente expresso em células assassinas naturais maduras (NK) e que estão envolvidos na citotoxicidade natural humana como um receptor ativador (Brandt et al., J. Exp. Med, 206 (7): 1495-1503, 2009). B7H6 não foi detectado em tecidos humanos normais, mas foi expresso em células tumorais humanas.

[00013] Por conseguinte, existe uma necessidade na técnica para a identificação de anticorpos capazes de inibir a interação de B7H6 com NKp30. Existe um potencial terapêutico para tais anticorpos com base na sua capacidade para modular os sinais coestimulatórios e as respostas imunes. Além disso, os anticorpos que se ligam a proteínas B7H6 serão úteis quando conjugados com um agente citotóxico e usados para alvejar uma célula que expressa B7H6. Estes e outros usos são altamente desejáveis. A presente invenção provê composições e métodos para estes e outros usos que devem ser evidentes para os versados na técnica a partir dos ensinamentos aqui contidos.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00014] Um aspecto da presente invenção provê anticorpos monoclonais isolados que se ligam especificamente ao domínio extracelular de B7H6 humano (resíduos de aminoácidos 25-266 de SEQ ID NO: 2). Em uma modalidade, o anticorpo compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano (resíduos de aminoácidos 25-266 da SEQ ID NO: 2) com um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1- 4242). Em uma outra modalidade, o anticorpo compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano (resíduos de aminoácidos 25-266 da SEQ ID NO: 2) com um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 9G9.2 (Depósito N° CNCM 1-4243). Em uma outra modalidade, o anticorpo compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano (resíduos de aminoácidos 25-266 da SEQ ID NO: 2) com um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 10E2.9 (Depósito N° CNCM 1-4244). Em uma outra modalidade, o anticorpo compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano (resíduos de aminoácidos 25-266 da SEQ ID NO: 2) com um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM 1-4245).

[00015] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal anti-B7H6 descrito acima é um anticorpo murino, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo humano. Em algumas modalidades, o anticorpo irá competir para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano e inibir a interação de B7H6 humano com NKp30. A inibição pode ser completa ou parcialmente bloqueada, e pode neutralizar ou reduzir a interação. Os anticorpos adequados ainda incluem anticorpos de cadeia simples. Outras variações incorporadas incluem anticorpos que compreendem uma região Fc tendo pelo menos uma de atividade ADCC e atividade CDC. Em algumas variações tais, a região Fc, é uma Fc de cadeia simples (scFc). Cada um dos anticorpos monoclonais incorporados que se liga a B7H6 humano é adequado como uma composição que compreende o anticorpo e veículo farmaceuticamente aceitável. Tais anticorpos são adequados para os kits de diagnóstico que detectam ligação pelo anticorpo.

[00016] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um conjugado anticorpo-fármaco que compreende um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao domínio extracelular de B7H6 humano (resíduos de aminoácidos 25-266 SEQ ID NO: 2), onde o anticorpo é conjugado para um agente citotóxico. Em algumas modalidades, a porção de anticorpo do conjugado anticorpo-fármaco é um anticorpo que compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano (resíduos de aminoácidos 25-266 da SEQ ID NO: 2) com um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1-4242); um anticorpo produzido pelo hibridoma da designação de clone 9G9.2 (Depósito N° CNCM 1-4243); um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 10E2.9 (Depósito N° CNCM 1-4244); ou um anticorpo produzido pelo hibridoma da designação de clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM 1-4245). O anticorpo monoclonal pode ser, por exemplo, um anticorpo murino, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo humano. Os anticorpos adequados adicionalmente incluem anticorpos de cadeia simples. Em certas variações, o anticorpo compreende uma região Fc tendo pelo menos uma de atividade ADCC e atividade CDC. Em algumas variações tais, a região Fc, é uma Fc de cadeia simples (scFc). O agente citotóxico pode ser, por exemplo, um agente antitubulina, um agente de ligação de sulco menor de DNA, um agente de alquilação de sulco menor de DNA, um duocarmicina, ou uma puromicina. Agentes adequados antitubulina incluem, por exemplo, dolastatina, um alcaloide de videira, um podoflatoxina, um taxano, um derivado de bacatina, um criptofisina, um maitansinoide ou um combretastatina. Em certas modalidades, o anticorpo é conjugado com o fármaco através de um ligante e, em alguns casos, o ligante é clivável em condições intracelulares. Ligantes cliváveis adequados incluem ligantes peptídicos, incluindo aqueles cliváveis por uma protease intracelular. Qualquer um dos conjugados anticorpo-fármaco incorporados são adequados como composições compreendendo o conjugado anticorpo-fármaco e o veículo farmaceuticamente aceitável.

[00017] Em um outro aspecto relacionado, a presente invenção provê métodos para diminuir atividade das células assassinas naturais (NK) contra uma célula que expressa B7H6 humano, inibindo a interação de B7H6 humano com NKp30 humano. Tais métodos incluem geralmente colocam em contato uma célula que expressa B7H6 humano, na presença de uma célula NK humana, com uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal que compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano com um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 4E5 0,5 (Depósito N° CNCM 1-4242) ou um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM 1-4245), em que o anticorpo inibe a interação de B7H6 humano com NKp30 humano.

[00018] Em um outro aspecto relacionado, a presente invenção provê métodos para o tratamento de células de medula óssea (CMO) rejeição de aloenxertos em um indivíduo, inibindo a interação de B7H6 humano com NKp30 humano. Tais métodos incluem geralmente a administração ao indivíduo, em uma quantidade eficaz para inibir a atividade de células NK e, assim, tratar a rejeição do enxerto aguda BMC, um anticorpo monoclonal que compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano com um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1- 4242) ou um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM 1-4245), onde o anticorpo inibe a interação de B7H6 humano com NKp30 humano.

[00019] Tanto o método para diminuir a atividade de células NK humanas quanto o método para o tratamento de rejeição de aloenxertos BMC incluem certas modalidades em que os anticorpos são humanos ou anticorpos monoclonais humanizados. Os métodos incluem também modalidades onde o anticorpo é um anticorpo de cadeia única.

[00020] Em outros aspectos relacionados, a presente invenção provê métodos para enfraquecer ou inibir o desenvolvimento de células que expressam B7H6 dentro de uma população de células utilizando um conjugado anticorpo-fármaco. Os métodos geralmente compreendem colocar em contato as células que expressam B7H6com uma quantidade eficaz de um conjugado anticorpo-fármaco compreendendo (a) um anticorpo que compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano compete (resíduos de aminoácidos 25-266 da SEQ ID NO: 2) com um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1- 4242); um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 9G9.2 (Depósito N° CNCM 1-4243); um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 10E2.9 (Depósito N° CNCM 1- 4244), ou um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM 1-4245), e (b) um agente citotóxico conjugado com o anticorpo.

[00021] Outro aspecto relacionado provê métodos para o tratamento de um câncer expressando B7H6 em um indivíduo utilizando um conjugado anticorpo-fármaco. Os métodos geralmente compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um conjugado anticorpo-fármaco compreendendo (a) um anticorpo que compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano compete (resíduos de aminoácidos 25-266 da SEQ ID NO: 2) com um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1-4242); um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 9G9.2 (Depósito N° CNCM 1-4243); um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 10E2.9 (Depósito N° CNCM 1-4244), ou um anticorpo produzido pelo hibridoma da designação de clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM 1- 4245), e (b) um agente citotóxico conjugado com o anticorpo. Incluemse as modalidades em que o câncer é um câncer do cólon, fígado, cérvix, pulmão, pâncreas ou próstata. Outros cânceres expressando B7H6 adequados para o tratamento incluem a leucemia pró-emocítica, linfoma de células B, linfoma monocítico, eritroleucemia, linfoma de Burkitt e leucemia mieloide crônica.

[00022] Em ambos um método para enfraquecer ou inibir o desenvolvimento de células que expressam B7H6 dentro de uma população de células e/ou um método de tratamento de um câncer expressando B7H6 em um indivíduo, humano ou anticorpos monoclonais humanizados são adequados para o anticorpo compreendendo o conjugado anticorpo-fármaco. Também é adequado usar um anticorpo de cadeia única para o anticorpo compreendendo o conjugado anticorpo-fármaco para ambos os métodos.

[00023] Em outros aspectos relacionados, métodos para a indução de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) contra uma célula que expressa B7H6 são providos. Estes métodos incluem geralmente colocar em contato a célula que expressa B7H6 com uma quantidade eficaz de um anticorpo que compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano (resíduos de aminoácidos 25- 266 da SEQ ID NO: 2) com um anticorpo produzido pelo hibridoma da designação de clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1-4242); um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 9G9.2 (Depósito N° CNCM 1-4243); um anticorpo produzido pelo hibridoma da designação de clone 10E2.9 (Depósito N° CNCM 1-4244), ou um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM 1-4245); onde o contato é, na presença de uma célula NK ou uma T CD8+ expressando um receptor Fc tendo atividade ADCC, e o anticorpo compreende uma região Fc capaz de se ligar à região Fc.

[00024] Em outros aspectos relacionados, os métodos para induzir citotoxicidade dependente do complemento (CDC) contra uma célula que expressa B7H6 são providos. Estes métodos incluem geralmente colocar em contato a célula que expressa B7H6 com uma quantidade eficaz de um anticorpo que compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano (resíduos de aminoácidos 25-266 da SEQ ID NO: 2) com um anticorpo produzido pelo hibridoma da designação de clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1-4242); um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 9G9.2 (Depósito N° CNCM 1-4243); um anticorpo produzido pelo hibridoma da designação de clone 10E2.9 (Depósito N° CNCM 1-4244), ou um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM 1-4245); onde o contato é, na presença de complemento, e o anticorpo compreende uma região Fc tendo atividade CDC.

[00025] Em ambos os métodos para a indução de ADCC contra uma célula que expressa B7H6 e/ou indução de CDC contra uma célula que expressa B7H6, modalidades incluem anticorpos humanos ou humanizados. Também estão incluídos os anticorpos de cadeia simples. Outra variação inclui regiões Fc onde a região Fc é uma Fc de cadeia simples (scFc). Para qualquer método, em algumas modalidades, o câncer expressando B7H6 é uma célula cancerígena. A célula cancerígena pode ser, por exemplo, uma célula cancerígena do cólon, uma célula cancerígena do fígado, uma célula cancerígena cervical, uma célula cancerígena do pulmão, célula cancerígena do pâncreas, uma célula cancerígena da próstata, uma célula de leucemia pró-emocítica, uma célula de linfoma de células B, uma célula de linfoma monocítico, uma célula de eritroleucemia, uma célula de linfoma de Burkitt, ou uma célula de leucemia mieloide crônica.

[00026] Outro aspecto relacionado provê métodos para o tratamento de um câncer expressando B7H6. O método geralmente compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal que compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano (resíduos de aminoácidos 25-266 da SEQ ID NO: 2) com um anticorpo produzido pelo hibridoma 4E5 de designação do clone 0,5 (Depósito N° CNCM 1-4242); um anticorpo produzido pelo hibridoma da designação de clone 9G9.2 (Depósito N° CNCM 1-4243); um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 10E2.9 (Depósito N° CNCM 1 -4244); ou um anticorpo produzido pelo hibridoma da designação de clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM 1-4245); onde o anticorpo compreende uma região Fc tendo pelo menos uma de atividade ADCC e atividade CDC. Anticorpos monoclonais adequados incluem anticorpos humanos, anticorpos humanizados, e anticorpos de cadeia simples. Em certas variações, a região Fc é uma Fc de cadeia simples (scFc). Cânceres expressando B7H6 passíveis de serem tratados incluem, por exemplo, os cânceres do cólon, do fígado, cérvix, pulmão, pâncreas ou próstata. Outros cânceres expressando B7H6 adequados incluem, por exemplo, leucemia, pró-emocítica, linfoma de células B, linfoma monocítico, eritroleucemia, linfoma de Burkitt, e leucemia mieloide crônica.

[00027] Outro aspecto relacionado provê métodos para detectar a expressão celular B7H6 onde a ligação do anticorpo indica a presença de B7H6 em uma célula. Geralmente, o método compreende (1) colocar em contato uma amostra biológica compreendendo uma célula humana a ser testada com um anticorpo monoclonal que compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano (resíduos de aminoácidos 25-266 da SEQ ID NO: 2) com um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1- 4242); um anticorpo produzido pelo hibridoma da designação de clone 9G9.2 (Depósito N° CNCM 1-4243); um anticorpo produzido pelo hibridoma de 10E2 designação de clones. 9 (Depósito N° CNCM 1- 4244), ou um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM 1-4245); e (2) detectar a ligação do anticorpo, onde a ligação indica a presença de B7H6 na célula e detecta se a célula expressa B7H6. Em algumas modalidades, as amostras biológicas são intactas de células humanas ou uma fração de membrana da célula a ser testada. Em certas modalidades, o anticorpo é marcado com um marcador detectável. Rótulos adequados incluem radioisótopos, rótulos fluorescentes, rótulos quimioluminescentes, rótulos enzimáticos ou rótulos bioluminescentes.

[00028] Em um aspecto relacionado, a presente invenção provê métodos para o diagnóstico de um indivíduo suspeito de ter um câncer expressando B7H6. O método geralmente inclui (1) a administração ao indivíduo de um anticorpo monoclonal que compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano (resíduos de aminoácidos 25- 266 da SEQ ID NO: 2) com um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clones 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1-4242); um anticorpo produzido pelo hibridoma da designação de clone 9G9.2 (Depósito N° CNCM 1-4243); um anticorpo produzido pelo hibridoma de designação de clone 10E2.9 (Depósito N° CNCM 1 - 4244); ou um anticorpo produzido pelo hibridoma da designação de clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM 1-4245) conjugado com um rótulo detectável, e (2) detecção da distribuição do anticorpo dentro do indivíduo. As aplicações apropriadas incluem o diagnóstico de câncer de cólon, fígado, cérvix, pulmão, pâncreas ou próstata.

[00029] Em um outro aspecto, a presente invenção também provê células produtoras de anticorpos selecionadas entre o grupo consistindo em um hibridoma de designação de clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1-4242); um hibridoma de designação de clone 9G9.2 (Depósito Nº CNCM 1-4243); um hibridoma de designação de clone 10E2.9 (Depósito N° CNCM 1-4244), ou um hibridoma de designação de clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM I-4245).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Visão Geral

[00030] A presente invenção se refere à identificação e caracterização de anticorpos anti-B7H6 que se ligam a um membro da família B7 de proteínas de superfície celular, particularmente anticorpos monoclonais anti-humanos B7H6.

[00031] Polipeptídeo B7H6 foi identificado pela primeira vez como um contra-receptor para NKp30, um receptor seletivamente expresso em células assassinas naturais maduras (NK) e está envolvido em citotoxicidade natural humana como um receptor ativador (ver Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº 2009/0.220.502), aqui incorporado por referência na sua totalidade. Uma sequência de nucleotídeos que codifica B7H6 humano é provida por SEQ ID NO: 1; o polipeptídeo codificado é mostrado em SEQ ID NO: 2. O polipeptídeo B7H6 de SEQ ID NO: 2 compreende um domínio extracelular de cerca de 242 resíduos de aminoácidos (resíduos 25- 266 da SEQ ID NO: 2), um domínio transmembrana de cerca de 18 resíduos de aminoácidos (resíduos 267-284 de SEQ ID NO: 2), e um domínio intracelular de cerca de 158 resíduos de aminoácidos (resíduos 285-454 de SEQ ID NO: 2). B7H6 também tem um domínio IGV de cerca de 117 resíduos de aminoácidos (resíduos 25 - 141 da SEQ ID NO: 2) e um domínio de IgG de aproximadamente 97 resíduos de aminoácidos (resíduos 142-238 de SEQ ID NO: 2). Existem também vários potenciais motivos de sinalização dentro do domínio intracelular de B7H6, incluindo um motivo ITIM (SaYtpL, resíduos de aminoácidos 293-298 da SEQ ID NO: 2); um motivo de ligação SH2 (YqlQ, resíduos de aminoácidos 229-332 da SEQ ID NO: 2); e um motivo SH3 de ligação (PdaPilPvsP, resíduos de aminoácidos 418-427 da SEQ ID NO: 2).

[00032] A presente invenção surge a partir da produção de anticorpos monoclonais murinos contra a proteína humana B7H6 e caracterização das propriedades desses anticorpos. Cinco anticorpos monoclonais de camundongo contra B7H6 humano com o isotipo IgGl foram produzidos a partir de hibridomas. Os anticorpos foram designados 4E5.5, 5E1.4, 9G9.2, 10E2.9 e 17B1.3. Ensaios de competição revelaram que os diferentes epítopos foram reconhecidos por anticorpos específicos. Dois dos mAbs anti-B7H6, 17B e 1,3 4E5.5, bloqueiam parcialmente interação NKp30: B7H6, como mostrado pela inibição de ligação NKp30Fc e ativação DOMSP30. Estes estudos correlacionam estrutura para funcionar e são descritos nos Exemplos. Os anticorpos monoclonais diferentes são mostrados para serem reagentes úteis em ensaios bioquímicos e de diagnóstico, bem como terem valor terapêutico.

[00033] Assim, a presente invenção inclui anticorpos monoclonais que se ligam a uma proteína da superfície celular B7H6 humano com a mesma especificidade ou similar e características como mAbs 4E5.5, 5E1.4, 9G9.2, 10E2.9 e/ou 17B 1,3. Como aqui descrito, anticorpos monoclonais anti-humano-B7H6 de camundongo foram produzidos e mostrados para se ligarem a epítopos diferentes em experiências de competição. Portanto, um aspecto da presente invenção provê anticorpos que são capazes de competir com estes anticorpos para a ligação a B7H6 (por exemplo, um anticorpo que é capaz de se ligar ao mesmo epítopo B7H6 como um anticorpo selecionado dentre os mAbs 4E5.5, 9G9.2, 10E2.9, e 17B1.3). Além disso, alguns dos anticorpos foram mostrados para efetuar a interação B7H6-NKp30. Por conseguinte, em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais anti-B7H6 humano da presente invenção inibem a ativação de NKp30 mediada por B7H6.

[00034] A presente invenção provê ainda anticorpos humanizados derivados de anticorpos não humanos anti-B7H6 (por exemplo, anticorpos humanizados derivados de anticorpos murinos), anticorpos neutralizantes, anticorpos monoclonais humanos, e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos. Os fragmentos de anticorpo ilustrativos incluem F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv, e as unidades de reconhecimento mínimas. Os anticorpos neutralizantes ligam B7H6 tal que a sua interação com NKp30 é inibida ou bloqueada. Dentro do escopo da invenção é um anticorpo monoclonal que compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano para uso para inibir respostas mediadas por células NK, tais como, por exemplo, na rejeição aguda de aloenxertos de célula da medula óssea (CMO), onde o anticorpo é administrado em uma quantidade eficaz para bloquear a atividade de células NK e tratar rejeição de aloenxertos BMC.

[00035] Anticorpos anti-B7H6 de acordo com a presente invenção também podem ser usados para alvejar agentes citotóxicos para uma célula que expressa B7H6, particularmente uma célula cancerígena que expressa B7H6. Tais conjugados de fármaco-anticorpo monoclonais anti-humano-B7H6 produzem efeitos clinicamente benéficos sobre células que expressam B7H6 quando administrados a um indivíduo, tal como um indivíduo com um câncer expressando B7H6. O anticorpo é geralmente administrado por si só, mas pode ser administrado em combinação com outros agentes terapêuticos. Em modalidades típicas, um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 é conjugado a um agente citotóxico, tal que o conjugado de anticorpofármaco resultante exerce um efeito citotóxico ou citostático em uma célula que expressa B7H6 (por exemplo, uma célula cancerígena que expressa B7H6) quando levada ou internalizada pela célula.

[00036] Assim, em alguns aspectos, a presente invenção inclui conjugados anticorpo-fármaco monoclonais anti-humano-B7H6. A porção de anticorpo se ligará a uma proteína de superfície celular de B7H6 humano com a mesma especificidade ou similar e características aqui descritas, e a porção do conjugado do fármaco será um agente terapêutico. O conjugado anticorpo-fármaco anti-humano-B7H6 irá exercer um efeito clinicamente benéfico sobre células que expressam B7H6 quando administradas a um indivíduo com um câncer expressando B7H6. Tipicamente, a porção do conjugado de fármaco será um agente citotóxico e irá exercer um efeito citotóxico ou citostático em uma célula que expressa B7H6. Para estes conjugados de anticorpos-fármaco, a porção de anticorpo irá reconhecer epítopos determinados em B7H6. Em certas variações, um conjugado anticorpo-fármaco monoclonal antihumano-B7H6 afeta a interação B7H6-NKp30. Por exemplo, em algumas modalidades, um conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humanoB7H6 de acordo com a presente invenção inibe a ativação de NKp30.

[00037] Em outras modalidades, um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 compreende uma região Fc com função efetora usada para induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra uma célula que expressa B7H6. A presente invenção inclui um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 compreendendo uma região Fc tendo atividade ADCC para uso na indução de ADCC. Para este uso, geralmente uma célula que expressa B7H6 é colocada em contato com uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal anti-humanoB7H6 compreendendo uma região Fc e na presença de uma célula imune citolítica efetora expressando um receptor Fc tendo atividade citolítica. Células efetoras imunes que expressam receptores Fc citolíticos (por exemplo, FcyRIIIα ou CD16) incluem, por exemplo, células NK, bem como certas células T CD8+. Em modalidades em que um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 compreendendo uma região Fc tendo atividade CDC é para uso na indução de CDC, geralmente a célula que expressa B7H6 é colocada em contato com uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 compreendendo uma região Fc tendo atividade CDC, e é, na presença de complemento. Células que expressam B7H6 que podem ser orientadas para matar utilizando os anticorpos e os métodos aqui reivindicados incluem, por exemplo, células cancerígenas, tais como, por exemplo, as células cancerígenas do cólon, células cancerígenas do fígado, células cancerígenas cervicais, células cancerígenas do pulmão, células cancerígenas pancreáticas, células cancerígenas da próstata, células de leucemia pró-emocítica, células de Linfoma de células B, células de linfoma monocítico, células de eritroleucemia, células de linfoma de Burkitt e células de leucemia mielógena crônica, para nomear algumas.

[00038] Estes e outros aspectos da invenção se tornarão evidentes mediante referência à descrição detalhada seguinte. Além disso, diversas referências são identificadas a seguir e são incorporadas por referência em sua totalidade.

II. Definições

[00039] A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que normalmente entendido por um versado na técnica relevante para os métodos e composições descritos. Tal como aqui utilizado, os seguintes termos e frases têm os significados atribuídos a eles, a menos que especificado em contrário.

[00040] Os termos "a/o" e "uma/um" como aqui utilizado incluem referências ao plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[00041] Um "polipeptídeo" é um polímero de resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas, quer produzidos naturalmente ou sinteticamente. Polipeptídeos de menos de cerca de 10 resíduos de aminoácidos são geralmente referidos como "peptídeos".

[00042] Uma "proteína" é uma macromolécula constituída por uma ou mais cadeias polipeptídicas. Uma proteína pode também compreender componentes não peptídicos, tais como grupos carboidratos. Os carboidratos e outros substituintes não peptídicos podem ser adicionados a uma proteína pela célula em que a proteína é produzida, e irá variar com o tipo de célula. As proteínas são aqui definidas em termos das suas estruturas principais de aminoácidos; substituintes tais como grupos carboidratos não são geralmente especificados, mas podem estar presentes, no entanto.

[00043] Um "polipeptídeo isolado" é um polipeptídeo que é essencialmente livre de contaminantes de componentes celulares, tais como carboidratos, lipídios, ou outras impurezas protéicas associadas com o polipeptídeo na natureza. Tipicamente, uma preparação de polipeptídeo isolado contém o polipeptídeo em uma forma altamente purificada, isto é, pelo menos cerca de 80% puro, pelo menos cerca de 90% puro, pelo menos cerca de 95% puro, mais do que 95% puro, tal como 96%, 97%, ou 98% ou mais puro, ou mais do que 99% puro. Uma maneira para mostrar que uma preparação de proteína em particular contém um polipeptídeo isolado é pelo aparecimento de uma única banda seguinte a eletroforese de gel de poliacrilamida (SDS) de sulfato de dodecila da preparação de proteína e coloração com Coomassie Brilliant Blue do gel. No entanto, o termo "isolado" não exclui a presença do mesmo polipeptídeo em formas físicas alternativas, tais como dímeros ou formas glicosiladas ou alternativamente derivatizado.

[00044] Os termos "amino-terminal" e "carboxi-terminal" são usados aqui para denotar posições dentro de polipeptídeos. Sempre que o contexto permite, estes termos são utilizados com referência a uma sequência particular ou porção de um polipeptídeo para denotar proximidade ou posição relativa. Por exemplo, uma determinada sequência posicionada carboxi-terminal a uma sequência de referência dentro de um polipeptídeo está localizado proximal para o terminal carboxila da sequência de referência, mas não é necessariamente no terminal carboxila do polipeptídeo completo.

[00045] O termo "expressão" refere-se à biossíntese de um produto de gene. Por exemplo, no caso de um gene estrutural, a expressão envolve a transcrição do gene estrutural em mRNA e a tradução do mRNA em um ou mais polipeptídeos.

[00046] Tal como aqui utilizado, o termo "imunomodulador" inclui citocinas, fatores de crescimento de células estaminais, linfotoxinas e moléculas coestimulatórias, fatores hematopoiéticos, e similares, e os análogos sintéticos destas moléculas.

[00047] O termo "anticorpo", como é aqui utilizado, refere-se a polipeptídeos de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de polipeptídeos de imunoglobulina, isto é, polipeptídeos da família de imunoglobulinas, ou fragmentos dos mesmos, que contêm um sítio de ligação ao antígeno que imunoespecificamente se liga a um antígeno específico (por exemplo, o domínio extracelular de B7H6).

[00048] Um "anticorpo anti-idiotipo" é um anticorpo que se liga ao domínio da região variável de uma imunoglobulina. No presente contexto, um anticorpo anti-idiotipo liga-se à região variável de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6, e, assim, um anticorpo antiidiotipo imita um epítopo de B7H6.

[00049] Um "fragmento de anticorpo" é uma porção de um anticorpo, tais como F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, e semelhantes. Independentemente da estrutura, um fragmento de anticorpo liga-se ao mesmo antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto. Por exemplo, um fragmento de anticorpo monoclonal anti-B7H6 se liga a um epítopo de B7H6.

[00050] O termo "anticorpo" também engloba anticorpos genéticamente modificados intactos ou fragmentos, tais como, por exemplo, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, fragmentos "Fv", constituídos pelas regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, polipeptídeos que consistem na região variável de cadeia leve, anticorpos de cadeia única recombinantes em que regiões variáveis de cadeias leves e pesadas estão ligadas por um ligante peptídico ("proteínas scFv"), unidades de reconhecimento mínimas que consistem nos resíduos de aminoácidos que imitam a região hipervariável, e semelhantes, bem como peptídeos e polipeptídeos de ligação a antígeno sintéticos.

[00051] Um "anticorpo quimérico" é uma proteína recombinante que contém os domínios variáveis e complementares das regiões determinantes derivadas de um anticorpo de roedor, enquanto o restante da molécula de anticorpo é derivada de um anticorpo humano.

[00052] "Anticorpos humanizados" são proteínas recombinantes em que regiões determinantes de complementaridade (por exemplo, murinos) não humanas de um anticorpo monoclonal foram transferidas de cadeias variáveis pesadas e leves da imunoglobulina não humana para um domínio variável humano. Construção de anticorpos humanizados para uso terapêutico em humanos que são derivados de anticorpos não humanos (por exemplo, murino), tais como aqueles que se ligam a ou neutralizam uma proteína humana, está dentro da perícia de um versado na técnica.

[00053] Os termos "fragmento Fc", "região Fc," ou "domínio Fc", tal como aqui utilizado, são sinônimos e referem-se à porção de um anticorpo que é responsável pela ligação a receptores de anticorpos em células e ao componente de C1Q do complemento. Fc significa "fragmento cristalino", o fragmento de um anticorpo que irá prontamente formar um cristal de proteína. Fragmentos de proteínas distintos, que foram originalmente descritos por digestão proteolítica, podem definir a estrutura geral global de uma proteína de imunoglobulina. Como originalmente definido na literatura, o fragmento Fe consiste nas regiões de dobradiça de cadeia pesada ligada a dissulfureto, domínios CH2 e CH3. No entanto, mais recentemente, o termo tem sido aplicado a uma única cadeia constituída por CH3, CH2, e pelo menos uma porção da dobradiça suficiente para formar um dímero ligado a dissulfureto com uma segunda tal cadeia. Para uma revisão da estrutura e função de imunoglobulina, ver Putnam, The Plasm Proteins, vol. V (Academic Press, Inc., 1987), pp 49-140; e Padlan, Mol. Immunol. 31: 169-217, 1994. Tal como aqui utilizado, o termo Fc inclui variantes de sequências de ocorrência natural.

[00054] Os termos "FC de cadeia única", "domínio Fc de cadeia única", e "scFc", como utilizado aqui, são sinônimos e referem-se a uma fusão de polipeptídeo compreendendo dois monômeros de domínio Fc unidos por um ligante flexível, de modo que os dois monômeros Fc são capazes de dimerização, para formar um domínio Fc dimérico funcional capaz de se ligar a receptores Fc. Polipeptídeos Fc de cadeia simples são ainda descritos na publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Nº WO 08/0131242, intitulado "Single chain Fc, Methods of Making, and Methods of Treatment", cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[00055] O termo "região Fc tendo atividade ADCC," tal como aqui utilizado, refere-se a um domínio Fc capaz de mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) através da ligação de um receptor Fc citolítico (por exemplo, FcyRIIIα) sobre uma célula imune citolítica efetora expressando o receptor Fc (por exemplo, uma célula NK ou célula T CD8+).

[00056] O termo "complemento" refere-se coletivamente aqueles componentes no soro normal que, juntamente com anticorpos ligados a antígeno, exibem a capacidade para lisar as células. Complemento consiste em um grupo de proteínas do soro que agem em conjunto e em uma sequência ordenada para exercer o seu efeito.

[00057] Os termos "via clássica do complemento" e "sistema clássico do complemento", como utilizado aqui, são sinônimos e referem-se a um percurso específico para a ativação do complemento. A via clássica requer complexos antígeno-anticorpo para a iniciação e envolve a ativação, de forma ordenada, de nove componentes de proteína principais designados C1 a C9. Para várias etapas no processo de ativação, o produto é uma enzima que catalisa a etapa subsequente. Esta cascata provê amplificação e ativação de grandes quantidades de complemento através de um sinal relativamente pequeno inicial.

[00058] O termo "região Fc tendo atividade CDC," tal como aqui utilizado, refere-se a um domínio Fc capaz de mediar a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) através da ligação de proteína de complemento C1q e ativação do sistema clássico do complemento.

[00059] O termo "agente", tal como aqui utilizado, significa um elemento, composto ou outra entidade molecular, incluindo, por exemplo, um composto farmacêutico, terapêutico ou farmacológico. Os agentes podem ser naturais ou sintéticos ou uma combinação dos mesmos. Um "agente terapêutico" é um agente que exerce um efeito terapêutico (por exemplo, benéfico) sobre uma célula ou um tecido (por exemplo, em uma célula ou tecido que expressa B7H6, tal como uma célula cancerígena que expressa B7H6), isoladamente ou em combinação com um outro agente (por exemplo, uma enzima de conversão de pró-fármaco em combinação com um pró-fármaco). Em certos aspectos da presente invenção, um "agente terapêutico" é um agente conjugado a um anticorpo para produzir um conjugado que é útil para a terapia. Exemplos de agentes terapêuticos incluem fármacos, toxinas, imunomoduladores, quelantes, compostos de boro, agentes fotoativos ou corantes, e radioisótopos. Em algumas variações, um agente terapêutico para a conjugação a um anticorpo é um agente que exerce um efeito citotóxico ou citostático.

[00060] "Efeito citotóxico", em referência ao efeito de um agente em uma célula, significa matar a célula. "Efeito citostático" significa uma inibição da proliferação celular. Um "agente citotóxico" significa um agente que tem um efeito citotóxico ou citostático sobre uma célula, assim enfraquecendo ou inibindo o crescimento de, respectivamente, células dentro de uma população de células.

[00061] Um "rótulo detectável" é uma molécula ou átomo que pode ser conjugado com uma porção de anticorpo para produzir uma molécula útil para o diagnóstico. Exemplos de rótulos detectáveis incluem agentes quelantes, agentes fotoativos, radioisótopos, agentes fluorescentes, íons paramagnéticos, ou outras porções de rótulo.

[00062] O termo "rótulo de afinidade" é aqui utilizado para denotar um segmento de polipeptídeo que pode ser ligado a um segundo polipeptídeo para prover purificação ou detecção do segundo polipeptídeo ou prover locais para ligação do segundo polipeptídeo a um substrato. Em princípio, qualquer peptídeo ou proteína ao qual um anticorpo ou outro agente específico de ligação está disponível pode ser utilizado como um rótulo de afinidade. Etiquetas de afinidade incluem um trato de poli-histidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol 198:3, 1991)., Glutationa S transferase (Smith e Johnson, Gene 67: 31, 1988), etiqueta de afinidade Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952, 1985), substância P, peptídeo FLAG (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204, 1988), peptídeo de ligação de estreptavidina, ou epítopo antigênico ou outro domínio de ligação. Ver geralmente Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95, 1991. As moléculas de DNA que codificam etiquetas de afinidade estão disponíveis em fornecedores comerciais (por exemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

[00063] Um "anticorpo nu" é um anticorpo inteiro, em oposição a um fragmento de anticorpo, que não é conjugado com um agente terapêutico. Anticorpos nus incluem ambos os anticorpos policlonais e monoclonais, bem como certos anticorpos recombinantes, tais como anticorpos quiméricos e humanizados.

[00064] O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado de um clone de célula única, incluindo qualquer clone de célula eucariótica ou procariótica, ou um clone de fago, e não o método pelo qual é produzido. Assim, o termo "anticorpo monoclonal", tal como aqui utilizado, não se limita a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma.

[00065] Um "imunoconjugado" é um conjugado de um anticorpo com um agente terapêutico ou um rótulo detectável.

[00066] O termo "epítopo" refere-se a qualquer determinante de proteína capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de células T. Os determinantes epitópicos consistem normalmente em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm geralmente características estruturais tridimensionsais específicas, bem como características de carga específicas. Mais especificamente, o termo "epítopo B7H6" tal como aqui utilizado para referir uma porção do polipeptídeo B7H6 tendo atividade antigênica ou imunogênica em um animal, de preferência um mamífero, e mais preferencialmente um camundongo ou humano. Um epítopo tendo atividade imunogênica é uma porção de um polipeptídeo B7H6 que elicia uma resposta de anticorpos em um animal. Um epítopo tendo atividade antigênica é uma porção de um polipeptídeo B7H6 ao qual um anticorpo se liga imunospecificamente como determinado por qualquer método bem conhecido na área, por exemplo, por imunoensaios. Epítopos antigênicos não precisam necessariamente ser imunogênicos. "Epítopos descontínuos" são epítopos conformacionais formados a partir de pelo menos duas regiões separadas na sequência primária da proteína B7H6. Epítopos conformacionais perdem a capacidade de se ligar especificamente, na presença de solventes desnaturantes (por exemplo, análises de Western blot).

[00067] "Atividade de células NK" tal como aqui utilizado refere-se à atividade das células NK citolíticas. Existem numerosos ensaios bem conhecidos pelo versado na técnica para a detecção e/ou controle da atividade deste tipo, incluindo, mas não limitado a ensaios descritos nos exemplos aqui providos.

[00068] Tal como aqui utilizado, a frase "interação de B7H6 e NKp30" refere-se a direcionar a interação física (por exemplo, ligação) e/ou interação indireta outro de um receptor de B7H6 funcional com NKp30 sobre uma célula NK, resultando na estimulação do receptor B7H6 e/ou NKp30 e sinalização intracelular associada.

[00069] Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo bloqueador" refere-se a um anticorpo que interfere com (isto é, inibe) a interação de B7H6 e NKp30, e/ou que interfere com a capacidade do B7H6 de acionar a atividade de células NK, por exemplo, tal como medido por atividade citolítica. A inibição não tem de ser completa e pode ser "parcial", isto é, uma diminuição ou redução da atividade de medição relativa para um controle ou padrão.

[00070] A frase "doença ou distúrbio caracterizada pela presença de células que expressam B7H6", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer doença ou distúrbio que envolve, pelo menos em parte, as células expressando B7H6 patogênicos. Células patogênicas incluem, por exemplo, certas células tumorais. Por conseguinte, doenças ou distúrbios típicos caracterizados pela presença de células que expressam B7H6 são certos cânceres. Tais doenças e distúrbios são particularmente propícios a determinados métodos de tratamento para alvejar as células que expressam B7H6, como descrito mais aqui.

[00071] Os termos "doença ou distúrbio mediado por células que expressam NKp30" e "doença ou distúrbio associado com aumento da atividade de uma célula que expressa NKp30" são usados como sinônimos aqui para se referirem a qualquer doença ou distúrbio tendo uma patologia que é mediada, pelo menos em parte, pela atividade citolítica de uma célula que expressa NKp30. Em algumas variações, a doença ou distúrbio mediado por célula que expressa NKp30 é uma "doença ou distúrbio mediado por células NK", tendo uma patologia que é mediada, pelo menos em parte, pela citolítica das células NK. Um exemplo de tal doença ou distúrbio é a rejeição aguda de aloenxertos de células da medula óssea (CMO). Tais doenças ou distúrbios são particularmente propícios a determinados métodos de tratamento para a inibição da atividade das células NK, como adicionalmente descrito aqui.

[00072] O termo "quantidade eficaz", no contexto de tratamento de uma doença ou distúrbio mediada por células que expressam NKp30 por administração de um anticorpo bloqueador anti-B7H6 a um indivíduo tal como aqui descrito, ou, no contexto de tratamento de um doença ou distúrbio caracterizado pela presença de células que expressam B7H6 por administração de um anticorpo anti-B7H6 ou conjugado fármaco-anticorpo a um indivíduo como descrito aqui, refere-se à quantidade de molécula de tal modo que seja suficiente para inibir a ocorrência ou melhorar um ou mais sintomas clínicos ou de diagnóstico da doença ou distúrbio em um indivíduo. Uma quantidade eficaz de um agente é administrada de acordo com os métodos da presente invenção em um "regime eficaz". O termo "regime eficaz" refere-se a uma combinação de quantidade do agente a ser administrado e a frequência de dosagem adequada para realizar o tratamento ou prevenção da doença ou distúrbio.

[00073] Devido à imprecisão de métodos analíticos padrão, pesos moleculares e comprimentos de polímeros são entendidos como sendo valores aproximados. Quando tal um valor é expresso como "cerca de" X ou "aproximadamente" X, o valor declarado de X será entendido para ser preciso para ±10%.

III. Os anticorpos para Proteínas B7H6

[00074] Em um aspecto, a presente invenção provê anticorpos monoclonais anti-humano-B7H6 que se ligam especificamente a um epítopo de B7H6 humano (por exemplo, a um segmento de polipeptídeo a partir da sequência de aminoácidos apresentada em resíduos 25-266 da SEQ ID NO: 2). Em algumas variações, os anticorpos monoclonais anti-humano-B7H6 providos são capazes de inibir a interação B7H6-NKp30. A inibição não tem de ser bloqueada completamente da interação B7H6-NKp30, e pode haver uma diminuição ou redução na atividade de medição relativa a um controle ou padrão. Em certas modalidades, um anticorpo monoclonal antiB7H6 humano de acordo com a presente invenção é capaz de competir pela ligação ao antígeno B7H6 humano com um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado de entre 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1-4242), 9G9.2 (Depósito nº CNCM 1-4243), 10E2.9 (Depósito n° CNCM 1-4244), ou 17B1.3 (Depósito nº CNCM 1-4245). Estes quatro hibridomas foram depositados na Coleção Nacional de Culturas de Micro-organismos (CNCM, Instituto Pasteur, Paris, França) em 18 de Novembro de 2009, em nome de Institut National de La Santé et De La Recherche Medicale (INSERM).

[00075] Anticorpos monoclonais anti-humano-B7H6 de cinco camundongos foram identificados e caracterizados, e são aqui descritos. Caracterização dos anticorpos demonstrou que alguns destes anticorpos monoclonais reconhecem epítopos diferentes na proteína B7H6, mostrada por ensaios de ligação competitiva e aqui divulgados. Caracterização dos anticorpos adicionalmente demonstrou que os dois anticorpos, pelo menos parcialmente bloqueiam a interação B7H6-NKp30.

[00076] O compartimento de epítopo pode ser usado para identificar anticorpos que caem dentro do âmbito da invenção reivindicada. Compartimento de epítopo refere-se ao uso de ensaios de ligação competitiva para identificar pares de anticorpos que são, ou não são, capazes de se ligar a proteína B7H6 simultaneamente, identificando assim pares de anticorpos que se ligam aos mesmos epítopos ou sobrepostos sobre uma proteína. Experimentos de compartimentos de epítopos fornecem provas de que os epítopos antigenicamente distintos estão presentes. Dados adicionais são necessários para identificar, ou "mapear" o epítopo de uma sequência específica de aminoácidos ou a localização da molécula de proteína B7H6.

[00077] A competição para ligação pode ser avaliada para qualquer par de anticorpos ou fragmentos. Por exemplo, usando os reagentes de detecção adequados, a especificidade de ligação de anticorpos ou fragmentos de ligação a partir de qualquer fonte pode ser comparada com a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais aqui revelados. Compartimento de epítopo pode ser usado para identificar anticorpos que caem dentro do âmbito da invenção reivindicada. Compartimento de epítopo refere-se ao uso de ensaios de ligação competitiva a pares de identidade de anticorpos que são, ou não são, capazes de se ligar a proteína B7H6 simultaneamente, identificando assim pares de anticorpos que se ligam aos mesmos epítopos ou sobrepostos sobre uma proteína. Experimentos de compartimento de epítopos fornecem provas de que os epítopos antigenicamente distintos estão presentes. Dados adicionais são necessários para identificar, ou "mapear" o epítopo de uma sequência específica de aminoácidos ou a localização da molécula de proteína B7H6.

[00078] A competição para ligação pode ser avaliada para qualquer par de anticorpos ou fragmentos. Por exemplo, usando os reagentes de detecção adequados, a especificidade de ligação de anticorpos ou fragmentos de ligação a partir de qualquer fonte pode ser comparada com a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais aqui revelados. Compartimento de epítopo pode ser realizado com anticorpos "isolados" ou com sobrenadantes de cultura de células. Frequentemente, compartimento é realizado com primeira rodada de sobrenadantes clonais para orientar a escolha dos clones a ser desenvolvidos. Os anticorpos a ser comparados deverão ser domínios de ligação de antígenos substancialmente homogêneos. No caso de anticorpos "biespecíficos" ou "bifuncionais" a especificidade de ligação dos dois locais de ligação diferentes necessitam de ser avaliados ou binned independentemente.

[00079] Os anticorpos da presente invenção podem ser ensaiados quanto à ligação específica por qualquer método conhecido na área. Muitos formatos de ensaio de ligação competitiva diferentes podem ser usados para compartimento de epítopo. Os imunoensaios que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a sistemas de ensaio competitivos, utilizando técnicas tais como western blots, radioimunoensaio, ELISA, imunoensaios "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, ensaios de precipitina, ensaios de precipitina de difusão de gel, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, proteínas A imunoensaios, e fixação do complemento ensaios. Tais ensaios são de rotina e bem conhecidos na área (ver, por exemplo, Ausubel et al., Eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York). Além disso, a ensaios de bloqueio cruzado de rotina, tais como os descritos em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane, 1988, podem ser executados.

[00080] A BIACORE® (GE Healthcare, Piscaataway, NJ) é apenas um de uma variedade de formatos de ensaio de ressonância de plasmon de superfície que são rotineiramente utilizados para painéis de bin de epítopos de anticorpos monoclonais. Outras referências, por exemplo, dos protocolos de mapeamento de epítopos, Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn Morris ed. Humana Press, 1996, descrevem métodos alternativos que podem ser utilizados para ligar anticorpos e seria de esperar fornecerem informações comparáveis sobre a especificidade de ligação dos anticorpos a ligando de B7H6. Quando se utiliza o sistema de BIACORE®, as experiências de compartimento de epítopo são realizadas com o antígeno solúvel, nativo ou recombinante. Estudos de compartimento de epítopo podem ser realizados em um sistema de BIACORE1000® (GE Healthcare, Piscataway, NJ). BIAlogue (R) v 1.2 software pode ser usado para os métodos de execução de programação. Por exemplo, para os anticorpos monoclonais de camundongo bin criados contra B7H6, anticorpo Fc IgG policlonal de cabra anti-camundongo (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) pode ser covalentemente imobilizado a um chip de sensor BIACORE® CM5 e usado para ligar (captura) o anticorpo primário monoclonal de séries de ensaios ao chip. Sítios de ligação Fc desocupados no chip são então bloqueados usando um fragmento Fc IgG policlonal (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Subsequentemente, proteína B7H6 é injetada e deixada se ligar especificamente ao anticorpo primário monoclonal capturado. O instrumento BIACORE® mede a massa de proteína ligada ao sensor de chip, e a ligação de ambos o anticorpo primário e antígeno B7H6 pode ser verificada para cada ciclo. Após a ligação do anticorpo primário e antígeno ao chip, o anticorpo secundário solúvel é injetado e deixado se ligar ao antígeno pré-ligado. Se o anticorpo monoclonal secundário é capaz de se ligar ao antígeno B7H6 simultaneamente com o anticorpo monoclonal primário, a sua ligação é detectada pelo BIAcore®. Se, no entanto, o anticorpo monoclonal secundário não é capaz de se ligar ao antígeno B7H6 simultaneamente com o anticorpo monoclonal primário, nenhuma ligação adicional é detectada. Cada anticorpo monoclonal é testado contra si próprio como um controle negativo para estabelecer o nível de sinal de fundo (sem ligação).

[00081] Um formato de ELISA competitivo livre de etiqueta (LFCELISA) também pode ser usado para ligar anticorpos. Este método é descrito por Nagata et al., J. Immunol. Methods 292:141-155, 2004, e utiliza B7H6 biotinilado. Para o exemplo de anticorpos monoclonais de camundongo compartimento criados contra B7H6, placas de microtitulação são revestidas com 100 µL/poço com 1 µg/mL de um anticorpo específico de Fc-γ IgG anticamundongo de cabra (Jackson ImmunoResearch) diluída em ELISA B (PBS, 0,1% de Tween 20, 1% de BSA). Após a ligação deste anticorpo de revestimento durante 3 horas à temperatura ambiente, cada um dos meios condicionados contendo mAb é diluído em ELISA B para se obter uma concentração de mAb aproximada de 0,5 µg/mL e deixado se ligar a placas revestidas com IgG anticamundongo de cabra durante a noite a 4°C. (mAb # 1). Em paralelo, um segundo conjunto de meios condicionados (mAb # 2) são diluídos em tubos de ensaio de poliestireno em aproximadamente 0,5 µg/mL de mAb em ELISA B, misturados com 50 ng/mL de antígeno B7H6 biotinilado, e incubados durante a noite a 4°C. Após a incubação do mAb # 1 com o anticorpo de revestimento, as placas são bloqueadas com um anticorpo não relacionado para saturar os locais de ligação não ocupados na placa. As misturas mAb # 2-biotina-B7H6 são adicionadas à placa e deixadas se ligar. Como um controle para (não concorrência) no ensaio, 50 ng/mL de B7H6 biotinilado é adicionado diretamente (sem pré-incubação com mAb # 2) aos poços contendo mAb # 1 imobilizado. Após a incubação com o complexo B7H6-mAb # 2 biotinilado, estreptavidina-HRP (Pierce, Rockford, 111). É adicionada à placa a 0,5 µg/mL. As placas são desenvolvidas com substrato TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, Maryland), e a absorbância dos poços individuais a 450 nm é medida com um leitor de placas (Molecular Devices Spectramax 340, Sunnyvale, Califórnia). Se o mAb # 1 liga-se a um epítopo diferente do mAb # 2, o complexo biotina-B7H6-mAb # 2 irá se ligar à placa resultando em uma leitura de absorvência elevada. Se o mAb # 1 se liga ao mesmo epítopo como mAb # 2, o complexo biotina-B7H6-mAb # 2 não se ligará à placa, resultando em uma leitura de absorbância baixa.

[00082] Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 da presente invenção é capaz de inibir a interação de B7H6 com NKp30 humano; tais anticorpos são úteis, por exemplo, para inibir eventos celulares ou outros eventos fisiológicos associados com a interação de B7H6 com NKp30, incluindo, por exemplo, sinalização intracelular mediada por B7H6 e/ou NKp30 e função efetora associada (por exemplo, atividade citolítica mediada por NKp30).

[00083] Anticorpos para B7H6 podem ser obtidos, por exemplo, utilizando o produto de um vetor de expressão B7H6 ou B7H6 isolado a partir de uma fonte natural como um antígeno. Anticorpos monoclonais anti-humano-B7H6 particularmente úteis "ligam-se especificamente" a B7H6. Os anticorpos são considerados como se ligando especificamente, se os anticorpos apresentarem pelo menos uma das duas seguintes propriedades: (1) anticorpos ligam-se a B7H6 com um nível limite de atividade de ligação, e (2) anticorpos não reagem de forma cruzada significativamente com polipeptídeos relacionados para B7H6.

[00084] No que diz respeito à primeira característica, os anticorpos especificamente se ligam se eles se ligam a um peptídeo B7H6, polipeptídeo, ou epítopo com uma afinidade de ligação (Ka) de 106 M-1 ou superior, de preferência 10 <7 »M <"1> ou superior, mais preferivelmente 107 M-1 ou maior, e ainda mais preferivelmente 109 M-1 ou maior. A afinidade de ligação de um anticorpo pode ser prontamente determinada por um versado na técnica, por exemplo, por análise de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660, 1949). No que diz respeito à segunda característica, os anticorpos não reagem de forma cruzada significativamente com moléculas polipeptídicas relacionadas, por exemplo, se eles detectarem B7H6, sem polipeptídeos presentemente conhecidos usando uma análise de western blot padrão. Exemplos de polipeptídeos conhecidos relacionados incluem membros da família B7 conhecidos.

[00085] Anticorpos monoclonais anti-humano-B7H6 podem ser produzidos utilizando peptídeos e polipeptídeos que carregam epítopo B7H6 antigênico. Peptídeos e polipeptídeos que carregam epítopo antigênico contêm tipicamente uma sequência de pelo menos nove, ou entre 15 a cerca de 30 aminoácidos contidos dentro da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. No entanto, os peptídeos ou polipeptídeos que compreendem uma porção maior de uma sequência de aminoácidos da presente invenção, contendo de 30 a 50 aminoácidos, ou qualquer comprimento até e incluindo a sequência completa de aminoácido de um polipeptídeo B7H6, também são úteis para induzir anticorpos que se ligam a B7H6. É desejável que a sequência de aminoácidos do peptídeo que carrega o epítopo seja selecionada para proporcionar a solubilidade substancial em solventes aquosos (isto é, a sequência inclui os resíduos relativamente hidrofílicos, enquanto os resíduos hidrofóbicos são tipicamente evitados). Além disso, as sequências de aminoácidos contendo resíduos de prolina podem ser também desejáveis, para a produção de anticorpos.

[00086] Sítios antigênicos potenciais em B7H6 podem ser identificados utilizando o método de Jameson-Wolf, Jameson e Wolf (CABIOS 4: 181, 1988), como implementado pelo programa PROTEAN (versão 3.14) de Lasergene (DNASTAR, Madison, WI). Os parâmetros padrão podem ser utilizados para esta análise.

[00087] O método Jameson-Wolf prevê determinantes antigênicos potenciais através da combinação de seis sub-rotinas principais para a predição de proteína estrutural. Por exemplo, o método de HoppWoods (ver Hopp et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 78:3824, 1981) pode primeiro ser usado para identificar sequências de aminoácidos representando áreas de maior hidrofilicidade local (parâmetro: sete resíduos em média). Na segunda etapa, o método Emini (ver Emini et al., J. Virology 55:836, 1985) pode ser utilizado para calcular as probabilidades de superfície (parâmetro: limite de decisão de superfície (0,6) = 1). Em terceiro lugar, o método Karplus-Schultz, Karplus e Schultz (Naturwissenschaften 72:212, 1985) pode ser utilizado para prever a flexibilidade da cadeia principal (parâmetro: limite de flexibilidade (0,2) = 1). Nas quarta e quinta etapas de análise, as previsões da estrutura secundária podem ser aplicadas aos dados usando os métodos de Chou-Fasman (ver Chou, "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition", em Prediction of protein Structure and the Principals of protein Conformation 549-586 (Fasman, ed., Plenum Press 1990) e Garnier-Robson (ver Garnier et al., J. Mol. Biol. 120:97, 1978) (parâmetros Chou-Fasman: tabela conformação = 64 proteínas; limite de região α = 103; limite de região β = 105; parâmetros Garnier-Robson: constantes de decisão α e β = 0). Em uma sexta sub-rotina, os parâmetros de flexibilidade e fatores de acessibilidade de hidropatia/solvente podem ser combinados para determinar um valor de contorno de superfície, designado como "índice antigênico." Finalmente, uma função de ampliação de pico pode ser aplicada ao índice antigênico, que amplia picos principais de superfície por adição de, por exemplo, 20, 40, 60, ou 80% do respectivo valor de pico para considerar a energia livre adicional derivada da mobilidade das regiões de superfície relativas às regiões internas. Este cálculo, no entanto, não é normalmente aplicado a qualquer pico principal que reside em uma região helicoidal, uma vez que as regiões helicoidais tendem a ser menos flexíveis.

[00088] Métodos para a geração de anticorpos monoclonais são geralmente conhecidos. Por exemplo, anticorpos de roedores monoclonais para antígenos específicos podem ser obtidos por métodos conhecidos dos versados na técnica (ver, por exemplo, Kohler et al., Nature 256:495, 1975; Coligan et al. (Eds)., Current Protocols in Immunology, vol. 12.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"]; Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expresses in E. coli", na Clonagem de DNA 2: Expression Systems, 2ª Edição 93 (Glover et al., eds., Oxford University Press 1995). Em certas variações, os anticorpos monoclonais são obtidos injetando em camundongos uma composição compreendendo um produto de gene B7H6 (por exemplo, um polipeptídeo ou compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 2 resíduos 25-266), verificando-se a presença de produção de anticorpos através da remoção de uma amostra de soro, a remoção do baço para obter B-linfócitos, fundindo os linfócitos B com células de mieloma para produzir hibridomas, clonagem dos hibridomas, seleção de clones positivos que produzem anticorpos para o antígeno, cultura dos clones que produzem anticorpos para o antígeno, e isolar os anticorpos a partir das culturas de hibridoma.

[00089] Um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 pode também ser um anticorpo monoclonal humano, ou um anticorpo derivado do mesmo. Os anticorpos monoclonais humanos podem ser obtidos, por exemplo, a partir de camundongos transgênicos que foram modificados para produzir anticorpos específicos humanos em resposta a estimulação antigênica. Nesta técnica, os elementos do locus de cadeia pesada e leve humana são introduzidos em cepas de camundongos derivadas de linhagens celulares estaminais embrionárias que contêm perturbações específicas do loci endógeno de cadeia pesada e cadeia leve. Os camundongos transgênicos podem sintetizar anticorpos humanos específicos para os antígenos humanos, e os camundongos podem ser usados para produzir hibridomas secretores de anticorpo humano. Métodos para a obtenção de anticorpos humanos a partir de camundongos transgênicos são descritos, por exemplo, por Green et al., Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; e Taylor et al., Int.. Immun. 6:579, 1994.

[00090] Técnicas alternativas para a geração ou seleção de anticorpos monoclonais incluem, por exemplo, exposição in vitro de linfócitos a proteína ou peptídeo B7H6, e seleção de anticorpos a partir de bibliotecas de exibição de anticorpos em vetores fágicos ou semelhantes (por exemplo, através do uso de proteína ou peptídeo B7H6 imobilizada ou rotulada). Técnicas para a criação e pesquisa de bibliotecas de exibição de anticorpos são conhecidas na área (ver, por exemplo, Patentes US N°s 5.580.717; 5.885.793; 5.969.108; e 6.040.136).

[00091] Os anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados a partir de culturas de células por uma variedade de técnicas bem estabelecidas. Tais técnicas de isolamento incluem, por exemplo, cromatografia de afinidade com Proteína A-Sepharose, cromatografia de exclusão de tamanho, e cromatografia de troca iônica (ver, por exemplo, Coligan nas páginas 2.7.1-2.7.12 e páginas 2.9.1- 2.9.3; Baines et al., "Purificação de Imunoglobulina G (IgG)," em Métodos em Biologia Molecular (Vol. 10) 79-104 (O Humana Press, Inc. 1992)).

[00092] A sequência de aminoácidos de um anticorpo monoclonal pode ser variada através da aplicação de técnicas de DNA recombinante. Assim, os anticorpos podem ser reprojetados para obter as características desejadas. Anticorpos modificados podem proporcionar, por exemplo, estabilidade melhorada e/ou eficácia terapêutica em relação à sua forma não modificada. As variações possíveis são muitas e vão desde a mudança de apenas um ou alguns aminoácidos ao reprojeto completo de, por exemplo, região variável ou constante. As alterações na região constante serão, em geral, feitas de modo a melhorar ou alterar as características, tais como fixação do complemento, interação com as membranas, e outras funções efetoras. Tipicamente, as alterações na região variável irão ser feitas a fim de melhorar as características de ligação ao antígeno, melhorar a estabilidade da região variável, ou reduzir o risco de imunogenicidade. Técnicas de exibição em fagos podem também ser empregadas. Ver, por exemplo, Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989; Ladner et al., Patente US N° 5.571.698.

[00093] Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 é um fragmento de anticorpo compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo intacto (inteiro). Tais fragmentos de anticorpo podem ser obtidos, por exemplo, por hidrólise proteolítica de um anticorpo. Os fragmentos de anticorpos podem ser obtidos por digestão de pepsina ou papaína de anticorpos inteiros por métodos convencionais. Como uma ilustração, fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para proporcionar um fragmento 5S denotado F(ab')2. Este fragmento pode ser adicionalmente clivado utilizando um agente de redução de tiol para produzir fragmentos monovalentes 3.5s Fab'. Opcionalmente, a reação de clivagem pode ser realizada utilizando um grupo de bloqueio para os grupos sulfidrila que resultam da clivagem de ligações de dissulfureto. Como uma alternativa, uma clivagem enzimática utilizando pepsina produz dois fragmentos Fab monovalentes e um fragmento Fc diretamente. Estes métodos são descritos, por exemplo, na patente US Nº 4.331.647 para Goldenberg, et al Nisonoff, Arch Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., em Methods in Enzymology (Vol. 1) 422 (Academic Press 1967); e Coligan nas páginas 2.8.1-2.8.10 e 2.10.-2.10.4.

[00094] Outros métodos de clivagem de anticorpos, tais como a separação de cadeias pesadas para formar fragmentos de cadeia leve - pesada monovalente, a clivagem adicional de fragmentos, ou outras técnicas químicas, enzimáticas, ou genéticas podem também ser utilizados, desde que os fragmentos se liguem ao antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.

[00095] Por exemplo, fragmentos Fv compreendem uma associação das cadeias VH e VL. Esta associação pode ser não covalente, tal como descrito por Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 69:2659, 1972. Alternativamente, as cadeias variáveis podem ser ligadas por uma ligação de dissulfureto intermolecular ou reticulada por produtos químicos tais como glutaraldeído (ver, por exemplo, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992).

[00096] Os fragmentos Fv podem compreender cadeias VH e VL que são ligados por um ligante peptídico. Estas proteínas de ligação ao antígeno de cadeia simples (scFv) são preparadas através da construção de um gene estrutural que compreende sequências de DNA que codificam os domínios VH e VL que são ligados por um oligonucleotídeo. O gene estrutural é inserido em um vetor de expressão que é subsequentemente introduzido em uma célula hospedeira, tal como E. coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma única cadeia polipeptídica com um peptídeo de ligação fazendo ponte com os dois domínios V. Métodos para a produção de scFv são descritos, por exemplo, por Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97, 1991. (Ver também Bird et al., Science 242:423, 1988; Patente US N° 4.946.778 de Ladner et al.; Pack et al., Bio/Technology 11: 1271, 1993, e Sandhu, supra). Como uma ilustração, um scFv pode ser obtido selecionando uma biblioteca de scFv (por exemplo, fago exibido por scFvs) para ligação específica a B7H6 (por exemplo, proteína ou peptídeo B7H6 imobilizado ou marcado).

[00097] Outra forma de um fragmento de anticorpo é um peptídeo que codifica uma região de determinação de complementaridade única (CDR). Peptídeos CDR ("unidades de reconhecimento mínimas") podem ser obtidos através da construção de genes que codificam o CDR de um anticorpo de interesse. Tais genes são preparados, por exemplo, usando a reação em cadeia da polimerase para sintetizar a região variável a partir de RNA de células produtoras de anticorpos (ver, por exemplo, Larrick et al., Methods: A Companion para Methods in Enzymology 2: 106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic manipulation of monoclonal antibodies" em Monoclonal Antibodies: Engineering and Clinical Application 166 (Ritter et al., eds, Cambridge University Press 1995) e Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 137 (Birch et al., eds, Wiley-Liss, Inc. 1995)).

[00098] Alternativamente, um anticorpo monoclonal anti-humanoB7H6 pode ser um anticorpo monoclonal "humanizado" derivado de um anticorpo não humano anti-B7H6. Anticorpos monoclonais humanizados são produzidos por transferência de regiões de determinação de complemento não humanas (por exemplo, camundongo) de cadeias pesadas e leves variáveis da imunoglobulina não humana em um domínio variável humano. Resíduos típicos de anticorpos humanos são então substituídos nas regiões de estrutura dos homólogos não humanos. O uso de anticorpos monoclonais humanizados obvia os problemas potenciais associados com a imunogenicidade de regiões constantes murinos. As técnicas gerais de clonagem de domínios variáveis de imunoglobulina murino são descritas, por exemplo, por Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833, 1989. Técnicas para a produção de anticorpos monoclonais humanizados são descritas, por exemplo, por Jones et al., Nature 321: 522, 1986; Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 89:4285, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; Singer et al., J. Immun. 150:2844, 1993; Sudhir (ed), Antibodie Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995); Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies", em Protein Engineering: Principles and Practice 399-434 (Cleland et al., eds, John Wiley & Sons, Inc. 1996), e Patente US nº 5.693.762 para Queen et al.

[00099] Em certas variações, um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 inclui uma região Fc, que compreende os domínios CH2 e CH3 de uma de cadeia pesada de imunoglobulina (Ig) e tipicamente uma parte de uma região de dobradiça Ig. Fc é responsável por duas das propriedades altamente desejáveis de uma IgG: recrutamento de função efetora e uma longa semi-vida sérica. A capacidade de matar células alvo a qual um anticorpo está ligado a hastes a partir da ativação da via de efetor imune (ADCC) e da via do complemento (CDC) através da ligação de Fc a receptores Fc e a proteína do complemento, C1q, respectivamente. A ligação é mediada por resíduos localizados principalmente na região inferior da dobradiça e domínio CB2 superior. (Ver, por exemplo, Wines et al., J. Immunol. 164:5313, 2000; Woof e Burton, Nature Reviews 4: 1, 2004). O tempo de vida útil no soro demonstrado por IgG é mediado através de uma interação dependente do pH entre os aminoácidos no domínio CH2 e CH3 e o receptor Fc neonatal, FcRn. (Ver, por exemplo, Getie e Ward, Immunology Today 18:592, 1997; Petkova et al., Int. Immunol. 18: 1759, 2006).

[000100] Assim, em certas modalidades de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 compreendendo uma região Fc, a região Fc tem atividade ADCC e/ou CDC. Tais anticorpos são particularmente úteis para mediar morte de células alvo que expressam B7H6, tais como, por exemplo, células cancerígenas ou células infectadas por vírus. Em outras modalidades, um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 compreende uma região Fc que carece de uma ou mais funções efetoras (por exemplo, falta de ADCC e/ou atividade CDC). Regiões Fc que faltam ou têm função efetora substancialmente reduzida podem ser obtidas, por exemplo, através da introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos em uma sequência de região Fc nativa, tal que a região Fc não se liga, ou tem ligação substancialmente reduzida, a receptores de Fc citolíticos e/ou a proteína de complemento C1q. Uma variedade de regiões Fc modificadas que faltam ou têm funções efetoras substancialmente reduzidas são conhecidas na área. Particularmente regiões Fc adequadas que faltam ou têm função efetora substancialmente reduzida incluem, por exemplo, as regiões Fc variantes, tal como descrito na Publicação do Pedido de Patente US Nº 2009/0.220.502

[000101] Em certas modalidades compreendendo uma região Fc, a região Fc, é uma Fc de cadeia simples (scFc), que compreende dois monômeros de domínio Fc unidos por um ligante flexível, de modo que os dois monômeros Fc são capazes de dimerização, para formar um domínio Fc dimérico funcional, Por exemplo, em algumas variações de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 compreendendo um scFc, o anticorpo compreende uma cadeia única Fv (scFv) fundido com a porção scFc, em que a porção scFv se liga especificamente a B7H6. Polipeptídeos Fc de cadeia simples, incluindo polipeptídeos de fusão compreendendo scFc e um ou mais domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv), são ainda descritos em Publicação de Pedido de Patente Internacional PCT Nº WO 08/0131242, intitulado "Single chains Fc, Methods of Making, and Methods of Treatment", cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[000102] Além disso, anticorpos monoclonais anti-humano-B7H6 ou fragmentos de anticorpo da presente invenção podem ser PEGilados utilizando métodos na técnica e aqui descritos.

[000103] Um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 pode ser conjugado com um rótulo detectável para formar um imunoconjugado anti-B7H6. Rótulos detectáveis adequados incluem, por exemplo, um radioisótopo, um rótulo fluorescente, um rótulo quimioluminescente, um rótulo enzimático, um rótulo bioluminescente ou ouro coloidal. Métodos de produção e detecção de tais imunoconjugados detectávelmente marcados são bem conhecidos dos versados na técnica comum, e são descritos em mais detalhe abaixo.

[000104] O rótulo detectável pode ser um radioisótopo que é detectado por autorradiografia. Isótopos que são particularmente úteis para o propósito da presente invenção são 3H, 125 I, 131I, 35S e 14C.

[000105] Imunoconjugados anti-B7H6 também podem ser marcados com um composto fluorescente. A presença de um anticorpo fluorescentemente marcado é determinada pela exposição do imunoconjugado à luz do comprimento de onda apropriado e detecção da fluorescência resultante. Os compostos de rotulagem fluorescentes incluem o isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeriterina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehídeo e fluorescamina.

[000106] Alternativamente, imunoconjugados anti-B7H6 podem ser marcados de forma detectável por acoplamento de um anticorpo a um composto quimioluminescente. A presença do imunoconjugado de etiqueta quimioluminescente é determinada pela detecção da presença de luminescência que surge durante o decurso de uma reação química. Exemplos de compostos de rotulagem quimioluminescentes incluem luminol, isoluminol, um éster de acridinio aromático, um imidazol, um sal de acridinio e um éster de oxalato.

[000107] Similarmente, um composto bioluminescente pode ser usado para rotular imunoconjugados anti-B7H6 da presente invenção. A bioluminescência é um tipo de quimioluminescência encontrada em sistemas biológicos em que uma proteína catalítica aumenta a eficiência da reação de quimioluminescente. A presença de uma proteína bioluminescente é determinada detectando a presença de luminescência. Compostos bioluminescentes que são úteis para rotulagem incluem luciferina, luciferase e aequorina.

[000108] Alternativamente, imunoconjugados anti-B7H6 podem ser marcados de forma detectável, ligando um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 a uma enzima. Quando o conjugado anti-B7H6-enzima é incubado na presença do substrato adequado, a porção de enzima reage com o substrato para produzir uma porção química que pode ser detectada, por exemplo, por meios espectrofotométricos, fluorométricos ou visuais. Exemplos de enzimas que podem ser utilizadas para detectavelmente rotular imunoconjugados poliespecífico incluem β-galactosidase, glucose oxidase, peroxidase e fosfatase alcalina.

[000109] Aqueles versados na técnica saberão de outros rótulos adequados que podem ser empregues de acordo com a presente invenção. A ligação de porções de marcadores a anticorpos monoclonais anti-humano-B7H6 pode ser realizada utilizando técnicas padrão conhecidas na área. Metodologia típico, a este respeito é descrita por Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81: 1, 1977; Shih et al., Int'U. Cancer 46: 1101, 1990; Stein et al., Cancer Res. 50.T330, 1990; e Coligan, supra.

[000110] Além disso, a conveniência e a versatilidade de detecção imunoquímica podem ser melhoradas usando anticorpos monoclonais anti-humano-B7H6 que têm sido conjugados com avidina, estreptavidina e biotina. (Ver, por exemplo, Wilchek et al. (eds), "Avidin-Biotin Technology, "Methods in Enzymology (Vol. 184) (Academic Press 1990); Bayer et al., "Immunochemical Applications of Avidin-biotin Technology", em Methods in Molecular Biology (Vol. 10) 149-162 (Manson, ed., A Humana Press, Inc. 1992)).

[000111] Métodos para a realização de imunoensaios estão bem estabelecidos. (Ver, por exemplo, Cook and Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays", em Monoclonal Antibodies: Productions, Enginnering, and Clinical Application 180-208 (Ritter e Ladyman, Eds., Cambridge University Press 1995); Perry, "The role of monoclonal in the advancement of immunoassay Technology", em Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 107-120 (Birch e Lennox, eds, Wiley-Liss, Inc. 1995); Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996)).

IV. Conjugados de Fármaco-Anticorpo Monoclonal anti-B7H6

[000112] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humano-B7H6. Um "conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humano-B7H6" tal como aqui utilizado refere-se a um anticorpo monoclonal anti-humanoB7H6 (como descrito na Secção III, supra) conjugado com um agente terapêutico. Tais conjugados anticorpo-fármaco monoclonais antihumano-B7H6 produzem efeitos clinicamente benéficos sobre células que expressam B7H6 quando administrados a um indivíduo, tal como, por exemplo, um indivíduo com um câncer expressando B7H6, tipicamente, quando administrados sozinhos, mas também em combinação com outros agentes terapêuticos.

[000113] Em modalidades típicas, um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 é conjugado a um agente citotóxico, tal que o conjugado de anticorpo - fármaco resultante exerce um efeito citotóxico ou citostático em uma célula que expressa B7H6 (por exemplo, uma célula cancerígena que expressa B7H6), quando tomado ou internalizado pela célula. Porções especialmente adequadas para conjugação com anticorpos são agentes quimioterapêuticos, enzimas de conversão de pró-fármaco, isótopos radioativos ou compostos, ou toxinas. Por exemplo, um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 pode ser conjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico (ver infra) ou uma toxina (por exemplo, um agente citostático ou citocida tal como, por exemplo, abrina, ricina A, pseudomonas exotoxina, ou toxina da difteria). Exemplos de agentes adicionais que são úteis para conjugar um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 são providos infra.

[000114] Em outras modalidades, um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 é conjugado com uma enzima de conversão de prófármaco. A enzima de conversão de pró-fármaco pode ser recombinantemente fundida com o anticorpo ou quimicamente conjugada ao mesmo usando métodos conhecidos. Exemplos de enzimas de conversão de pró-fármacos são carboxipeptidase G2, β-glucuronidase, penicilina-V-amidase, penicilina-G-amidase, β-lactamase, β-glucosidase, nitrorredutase, e carboxipeptidase A.

[000115] Técnicas para conjugar agentes terapêuticos para as proteínas, e em particular para os anticorpos, são bem conhecidos. (Ver, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Reisfeld et al., eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies for drug delivery", em Controlled Drug Delivery (Robinson et al., eds., Marcel Deiker, Inc., 2 ª ed. 1987); Thorpe, "Antibodiy Carries of Citotoxic Agents in Cancer Therapy: A review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications (Pinchera et al eds, 1985); "Analyses, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabed Antibody in Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies for cancer detection and therapy (Baldwin et al., eds., Academic Press, 1985).; e Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58. Ver também, por exemplo, publicação PCT WO 89/12624).

[000116] Em certas variações, de acordo com os métodos aqui descritos, um conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humanoB7H6 é internalizado e se acumula dentro de uma célula expressando B7H6, onde o conjugado fármaco-anticorpo exerce um efeito terapêutico (por exemplo, um efeito citotóxico ou citostático). Métodos para determinar o acúmulo e as taxas de acúmulo são encontrados em, por exemplo, WO 2004/010957, intitulado "conjugados de fármacos e seu uso para tratar o câncer, uma doença autoimune ou uma doença infecciosa".

[000117] Em modalidades típicas, quando se utiliza um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 conjugado com um agente terapêutico (por exemplo, um fármaco ou uma enzima de conversão de prófármaco), o agente é preferencialmente ativo quando internalizado por células que expressam B7H6 (por exemplo, células de um câncer expressando B7H6) a ser tratado. Em outras modalidades, o conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humano-B7H6 não é internalizado, e o fármaco é eficaz para exercer um efeito terapêutico (por exemplo, enfraquecimento ou inibição do crescimento de células que expressam B7H6) através da ligação à membrana celular.

[000118] Para minimizar a atividade de um agente terapêutico fora de uma célula que expressa B7H6 (por exemplo, uma célula cancerígena que expressa B7H6), um agente terapêutico é tipicamente conjugado de uma maneira que reduz a sua atividade a menos que seja clivado do anticorpo (por exemplo, por hidrólise ou por um agente de clivagem). Em tais modalidades, o agente terapêutico está ligado ao anticorpo com um ligante clivável que é sensível a clivagem no ambiente intracelular da célula que expressa B7H6, mas que não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular, de tal modo que o conjugado é clivado a partir do anticorpo quando ele é internalizado pela célula que expressa B7H6 (por exemplo, no endossoma ou, por exemplo, em virtude da sensibilidade ao pH ou a sensibilidade da protease, no ambiente lisossomal ou em uma cavéola). (Ver Secção IV (A), infra).

[000119] Além disso, em certas modalidades, um conjugado anticorpo-fármaco compreende um agente terapêutico que é carregado em relação à membrana plasmática, assim adicionalmente minimizando a capacidade do agente de atravessar a membrana plasmática, uma vez internalizado por uma célula. Como aqui utilizado, um "agente carregado" significa um agente que (a) é polarizado, de tal modo que uma região do agente tem uma carga relativa à membrana plasmática, ou (b) tem uma carga líquida em relação à membrana plasmática.

A. Ligantes

[000120] Tipicamente, um conjugado de anticorpo – fármaco B7H6 compreende uma região ligante entre o agente terapêutico e o anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6. Como notado acima, em certas modalidades, o ligante é clivável em condições intracelulares, tal clivagem do ligante libera o agente terapêutico do anticorpo para o ambiente intracelular.

[000121] Por exemplo, em algumas modalidades, o ligante é clivável por um agente de clivagem que está presente no ambiente intracelular (por exemplo, dentro de um lisossoma ou endossoma ou cavéola). O ligante pode ser, por exemplo, um ligante de peptidila que é clivado por uma peptidase intracelular ou enzima protease, incluindo, mas não limitado a uma protease lisossomal ou endossomal. Tipicamente, o ligante de peptidila é pelo menos dois aminoácidos de comprimento ou pelo menos três aminoácidos de comprimento. Agentes de clivagem podem incluir as catepsinas B e D e plasmina, todas as quais são conhecidas para hidrolisar derivados de fármaco dipeptídico, resultando na liberação de fármaco ativo dentro das células alvo (ver, por exemplo, Dubowchik e Walker, Pharm. Therapeutics 83:67-123, 1999). Mais típicos são ligantes de peptidila que são cliváveis por enzimas que estão presentes em células que expressam B7H6. Por exemplo, um ligante de peptidila que é clivável pela protease dependente de tiol catepsina-B, que é altamente expresso no tecido canceroso, pode ser usado (por exemplo, um ligante Phe-Leu ou GlyPhe-Leu-Gly). Outros tais ligantes são descritos, por exemplo, na Patente US N° 6.214.345. Em modalidades específicas, o ligante de peptidila clivável por uma protease intracelular é um ligante Val-Cit (valina-citralina) ou um ligante Phe-Lys (fenilalanina-lisina) (ver, por exemplo, Patente US N° 6.214.345, que descreve a síntese de doxorrubicina com o ligante Val-Cit). Uma vantagem de usar liberação proteolítica intracelular do agente terapêutico é que o agente é tipicamente atenuado quando conjugado e as estabilidades de soro dos conjugados são tipicamente elevadas.

[000122] Em outras modalidades, o ligante clivável é sensível ao pH, isto é, sensível à hidrólise a valores de pH determinados. Tipicamente, um ligante sensível a pH é hidrolisável em condições ácidas. Por exemplo, um ligante de ácido-lábil que é hidrolisável no lisossoma (por exemplo, uma hidrazona, semicarbazona, tiossemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal, ou semelhante) pode ser usado. (Ver, por exemplo, Patentes US N°s 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik e Walker, Pharm. Therapeutics 83:67-123, 1999; Neville et al., Biol. Chem. 264:14653-14661, 1989). Tais ligantes são relativamente estáveis sob condições de pH neutros, tais como aqueles no sangue, mas são instáveis a pH abaixo de 5,5 ou 5,0, o pH aproximado do lisossoma. Em certas modalidades, o ligante é hidrolizável de um ligante tioéter (tal como, por exemplo, um tioéter ligado ao agente terapêutico através de uma ligação de acilhidrazona (ver, por exemplo, Patente US N° 5.622.929)).

[000123] Em ainda outras modalidades, o ligante é clivável em condições de redução (por exemplo, um ligante de dissulfureto). Uma variedade de ligantes de dissulfureto é conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, aqueles que podem ser formados usando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-butirato) e SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno), e SPDB e SMPT. (Ver, por exemplo, Thorpe et al., Cancer Res. 47:5924-5931, 1987; Wawrzynczak et al., em Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Ver também Patente US N° 4.880.935).

[000124] Em ainda outras variações, o ligante é um ligante de malonato (Johnson et al., Anticancer Res. 15:1387-93, 1995), um ligante de maleimidobenzoila (Lau et al., Bioorg-Med-Chem. 3:1299- 1304, 1995), ou um análogo de 3'-N-amida (Lau et al., Bioorg-Med - Chem. 3:1305-12, 1995).

[000125] Tipicamente, o ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular. Tal como aqui utilizado, "substancialmente não sensível ao ambiente extracelular", no contexto de um ligante, significa que não mais do que cerca de 20%, tipicamente não mais do que cerca de 15%, mais tipicamente não mais do que cerca de 10%, e ainda mais tipicamente não mais do que cerca de 5%, não mais do que cerca de 3%, ou não mais do que cerca de 1% dos ligantes, em uma amostra de um conjugado anticorpo-fármaco, são clivados quando o conjugado anticorpo-fármaco está presente em uma extracelular ambiente (por exemplo, no plasma). Se um ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular pode ser determinado, por exemplo, por incubação independentemente com plasma ambos (a) o conjugado anticorpo-fármaco (a "amostra de conjugado anticorpo-fármaco") e (b) uma quantidade molar igual de anticorpo não conjugado ou agente terapêutico (a "amostra de controla") durante um período de tempo predeterminado (por exemplo, 2, 4, 8, 16 ou 24 horas) e, em seguida, comparando a quantidade de anticorpo não conjugado ou agente terapêutico presente na amostra de conjugado anticorpo-fármaco com a presente na amostra de controle, tal como medido, por exemplo, por cromatografia líquida de alta performance.

[000126] Em algumas variações, o ligante promove interiorização celular. Em certas modalidades, o ligante promove a internalização celular quando conjugado com o agente terapêutico (isto é, no meio da porção do agente ligante-terapêutico do conjugado fármaco-anticorpo). Em ainda outras modalidades, o ligante promove a internalização celular quando conjugado com ambos o agente terapêutico e o anticorpo anti-B7H6 (isto é, no meio do conjugado de anticorpofármaco).

[000127] Uma variedade de ligantes que podem ser utilizados com as presentes composições e métodos são descritos em, por exemplo, WO 2004/010957, intitulado " Drug Conjugates and Their Use for Treating Cancer, an Autoimmune Disease or an Infectious Disease".

B. Agentes Terapêuticos

[000128] De acordo com a presente invenção, qualquer agente que exerça um efeito terapêutico sobre uma célula que expressa B7H6 pode ser usado como o agente terapêutico para a conjugação de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6. Em certas modalidades, tais como para o tratamento de um câncer expressando B7H6, o agente terapêutico é um agente citotóxico.

[000129] Classes úteis de agentes citotóxicos incluem, por exemplo, os agentes antitubulina e auristatinas, aglutinantes de sulco menor de DNA, inibidores de replicação de DNA, agentes alquilantes (por exemplo, complexos de platina, tais como cis-platina, mono (platina), bis (platina) e complexos de platina tri-nucleares e carboplatina), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabólitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas e etoposidas, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas e nitrosuréias e platinols, compostos de préformação, antimetabólitos de purinas, puromicinas e sensibilizadores de radiação, esteroides, taxanos, inibidores da topoisomerase, alcaloides da vinca, ou semelhantes.

[000130] Agentes citotóxicos individuais incluem, por exemplo, um androgênio, antramicina (AMC), asparaginase, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfan, sulfoximina butionina, camptotecina, carboplatina, carmustina (BSNU), CC-1065 (Li et al., Cancer Res. 42:999-1004, 1982) clorambucil, colchicina, cisplatina, ciclofosfamida, citarabina, arabinósido citidina, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (actinomicina anteriormente), daunorubicina, decarbazine, docetaxel, doxorrubicina, um estrogênio, 5-fluordeoxiuridina, fosfato de etopsida (VP-16), 5-fluorouracil, gramicidina D, hidroxiureia, idarubicina, ifosfamida, irinotecano, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalano, 6-mercaptopurina, metotrexato de mitoxantrona, mitramicina, mitomicina C, nitroimidazol, paclitaxel, plicamicina, procarbizina, estreptozotocina, tenoposida (VM-26), 6-tioguanina, tiotepa, topotecano, vinblastina, vincristina, e vinorelbina.

[000131] Agentes citotóxicos particularmente adequados incluem, por exemplo, dolastatinas (por exemplo, auristatin E, AFP, MMAF, MMAE), aglutinantes de sulco menores de DNA (por exemplo, enediinos e lexitropsinas) e duocarmicinas e taxanos (por exemplo, paclitaxel, e docetaxel), puromicinas, alcaloides da vinca, CC-1065, SN-38 (7-etil-10- hidróxi-camptoteína), topotecano, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, equinomicina, combretastatin, netropsin e epotilona A e B, estramustina, criptofisins, cemadotin, maitansinoidas e discodermolídeo, eleutherobin, e mitoxantrona.

[000132] Em certas modalidades, um agente citotóxico é um quimioterapêutico convencional, tal como, por exemplo, doxorubicina, paclitaxel, melfalano, alcaloides da vinca, metotrexato, mitomicina C ou etoposido. Além disso, os agentes potentes tais como análogos de CC-1065, calicheamicina, Maitansina, análogos de dolastatina 10, rizoxina, e palitoxina podem ser ligados a um anticorpo expressando anti-B7H6.

[000133] Em variações específicas, o agente citotóxico ou citostático é auristatina E (também conhecido na técnica como dolastatina-10) ou um seu derivado. Tipicamente, o derivado de auristatina E é, por exemplo, um éster formado entre auristatina E e um ceto ácido. Por exemplo, auristatin E pode ser feito para reagir com ácido paraacetil benzóico ou ácido benzoilvalérico para produzir AEB e AEVB, respectivamente. Outros derivados de auristatina típicos incluem AFP (dimetilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproina-fenilalanina-pfenilenodiamina), MMAF (dovalina-valina-dolaisoleunina-dolaproinafenilalanina), e MAE (auristatina E de monometila). A síntese e a estrutura de auristatina E e seus derivados são descritas em Publicações de Pedido de Patente US N° 20030083263; Publicação de Patente Internacional N°s WO 2002/088172 e WO 2004/010957, e Patentes US N°s 6.884.869; 6.323.315; 6.239.104; 6.034.065; 5.780.588; 5.665.860; 5.663.149; 5.635.483; 5.599.902; 5.554.725; 5.530.097; 5.521.284; 5.504.191; 5.410.024; 5.138.036; 5.076.973; 4.986.988; 4.978.744; 4.879.278; 4.816.444; e 4.486.414.

[000134] Em outras variações, o agente citotóxico é um agente de ligação de sulco menor de DNA. (Ver, por exemplo, Patente US N° 6.130.237). Por exemplo, em certas modalidades, o agente de sulco menor de ligação é um composto CBI. Em outras modalidades, o agente de sulco menor de ligação é uma enediina (por exemplo, calicheamicina).

[000135] Em certas modalidades, um conjugado anticorpo-fármaco compreende um agente antitubulina. Exemplos de agentes antitubulina incluem, por exemplo, taxanos (por exemplo, Taxol (R) (paclitaxel), Taxotere (R) (docetaxel)), T67 (Tularik), alquiloides de vinca (por exemplo, vincristina, vinblastina, vindesina, e vinorelbina), e dolastatinas (por exemplo, auristatin E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB). Outros agentes antitubulina incluem, por exemplo, derivados de bacatina, análogos de taxano (por exemplo, epotilona A e B), Nocodazol, colchicina e colcimid e estramustina e criptofisinas e cemadotin e maitansinoides e combretastatinas e discodermolídeo, e eleuterobina. Em algumas modalidades, o agente citotóxico é um maitansinoide, um outro grupo de agentes antitubulina. Por exemplo, em modalidades específicas, o maitansinoide é Maitansina ou DM-1 (imunógeno, Inc., ver também Chari et al., Res., Cancer. 52:127-131, 1992).

[000136] Em outras modalidades, o agente citotóxico é um antimetabólito. O anti-metabólito pode ser, por exemplo, um antagonista da purina (por exemplo, azotioprina, ou mofetil micofenolato), um inibidor da di-hidrofolato redutase (por exemplo, metotrexato), zidovudina aciclovir, gangciclovir, vidarabina, ribavarina, azidotimidina, arabinósido citidina, amantadina, didesoxiuridina, iododeoxiuridina, poscarnet, ou trifluridina.

C. Formação de Conjugados Anticorpos-Fármacos Anti-B7H6

[000137] A geração de conjugados anticorpo-fármaco monoclonais anti-humano-B7H6 pode ser conseguida por qualquer técnica conhecida do versado na técnica. Resumidamente, um conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humano-B7H6 compreende um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6, um fármaco e, opcionalmente, um ligante que se junta ao fármaco e ao anticorpo. Um certo número de diferentes reações estão disponíveis para ligação covalente de fármacos a anticorpos. Isto é frequentemente realizado por reação dos resíduos de aminoácidos da molécula de anticorpo, incluindo os grupos amina da lisina, os grupos de ácido carboxílico livres de ácido glutâmico e aspártico, os grupos sulfidrila de cisteína, e as porções de vários dos aminoácidos aromáticos. Um dos métodos mais utilizados não específicos de ligação covalente é a reação de carbodiimida para ligar um grupo carbóxi (ou amino) de um composto a grupos amino (ou carbóxi) do anticorpo. Adicionalmente, agentes bifuncionais, tais como dialdeídos ou imidoésteres têm sido usados para ligar o grupo amino de um composto aos grupos amino da molécula de anticorpo. Também disponível para a ligação de fármacos a anticorpos é a reação de base de Schiff. Este método envolve a oxidação de periodato de um fármaco que contém grupos de glicol ou hidróxi, formando assim um aldeído que é então reagido com a molécula de anticorpo. Fixação ocorre via formação de uma base de Schiff com grupos amino da molécula de anticorpo. Isotiocianatos também podem ser usados como agentes de acoplamento para ligar covalentemente os fármacos a anticorpos. Outras técnicas são conhecidas do versado na técnica e dentro do âmbito da presente invenção. Exemplos não limitativos de tais técnicas são descritos em, por exemplo, Patentes US N°s 5.665.358; 5.643.573; e 5.556.623.

[000138] Em algumas modalidades, um intermediário, que é o precursor do ligante, é reagido com o fármaco em condições adequadas. Em certas modalidades, os grupos reativos são utilizados no fármaco e/ou o intermediário. O produto da reação entre o fármaco e o intermediário, ou o derivatizado, é subsequentemente reagido com o anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 sob condições apropriadas.

D. Ensaios para Atividades Citotóxica ou Citostática

[000139] Em certas modalidades, um conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humano-B7H6 compreende um conjugado anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 a um agente citotóxico, tal que o conjugado anticorpo-fármaco exerce um efeito citotóxico ou citostático sobre uma célula que expressa B7H6 (por exemplo, uma célula cancerígena que expressa B7H6). Células que expressam B7H6 que podem ser ensaiadas para um efeito citotóxico ou citostático de um conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humano-B7H6 podem ser linhagens de cultura de células, tais como, por exemplo, as listadas na Tabela 5, infra. Uma vez que um conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humano-B7H6 é confirmado como exercendo um efeito citotóxico ou citostático em células que expressam B7H6, o seu valor terapêutico pode ser validado em um modelo animal adequado. Em modalidades preferidas, um conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humano-B7H6 compreendendo um agente citotóxico é usado para tratar um câncer expressando B7H6. Exemplos de modelos animais de vários cânceres, que podem ser usados para avaliar a eficácia terapêutica de um conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção, são descritos na Seção V (B) e nos Exemplos X, infra.

[000140] Métodos de determinar se um agente exerce um efeito citostático ou citotóxico sobre uma célula são geralmente conhecidos na técnica. Exemplos ilustrativos de tais métodos são descritos abaixo. Determinação de qualquer um destes efeitos sobre células que expressam B7H6 indica que um conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humano-B7H6 é útil no tratamento ou prevenção de doenças ou distúrbios que têm uma patologia mediada, pelo menos em parte, pelo crescimento aberrante ou ativação de células que expressam B7H6, tais como, por exemplo, um câncer expressando B7H6.

[000141] Para determinar se um conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humano-B7H6 exerce um efeito citostático em células que expressam B7H6, um ensaio de incorporação de timidina pode ser usado. Por exemplo, células que expressam B7H6, com uma densidade de 5.000 células/poço de uma placa de 96 poços, podem ser cultivadas durante um período de 72 horas e expostas a 0,5 µCi 3H-timidina durante as últimas 8 horas do período de 72 horas, e a incorporação de 3H-timidina em células da cultura é medida na presença e ausência do conjugado anticorpo-fármaco.

[000142] Para determinar citotoxicidade, necrose ou apoptose (morte celular programada) podem ser medidas. Necrose é tipicamente acompanhada por aumento da permeabilidade da membrana plasmática, inchaço da célula, e ruptura da membrana plasmática. A apoptose é caracterizada tipicamente por blebbing (protuberância irregular) da membrana, condensação do citoplasma, e a ativação de endonucleases endógenas.

[000143] A viabilidade celular pode ser medida através da determinação de uma célula a absorção de um corante, tais como vermelho neutro, azul de tripano, ou AlamarBlue ® (Diagnostic Trek Systems, Cleveland, OH). Ver, também, por exemplo, Page et al., Intl. J. of Oncology 3:473-476, 1993. Em tal um ensaio, as células são incubadas em meio contendo o corante, as células são lavadas, e o corante remanescente, refletindo a absorção celular do corante, é medido espectrofotometricamente. O corante sulforrodamina B da proteína de ligação (SRB) também pode ser usado para medir a citotoxicidade (Skehan et al., J. Nat'l Cancer Inst. 82:1107-12, 1990).

[000144] Alternativamente, um sal de tetrazólio, tal como MTT, é usado em um ensaio quantitativo calorimétrico para a sobrevivência de células de mamíferos e proliferação através da detecção de células vivas, e não mortas, (ver, por exemplo, Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983).

[000145] A apoptose pode ser quantificada através da medição, por exemplo, da fragmentação do DNA. Métodos fotométricos comerciais para a determinação in vitro quantitativa da fragmentação de DNA estão disponíveis. Exemplos de tais ensaios, incluindo TUNEL (que detecta a incorporação de nucleotídeos marcados no DNA fragmentado) e ELISA com base em ensaios, são descritos em Biochemics, 1999, n. 2, PP 34-37 (Roche Molecular Biochemicals).

[000146] A apoptose pode também ser determinada medindo as alterações morfológicas em uma célula. Por exemplo, como com necrose, perda de integridade da membrana plasmática pode ser determinada medindo a absorção de certos corantes (por exemplo, um corante fluorescente, tal como, por exemplo, acridina laranja ou brometo de etídio). Um método para medir o número de células apoptóticas foi anteriormente descrito por Duke e Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan et al. Eds., 1992, pp 3.17.1-3.17.16). As células podem ser também rotuladas com um corante de DNA (por exemplo, laranja de acridina, brometo de etídio, ou iodeto de propídio) e as células observadas para a condensação da cromatina e marginação ao longo da membrana nuclear interna. Outras alterações morfológicas que podem ser medidas para determinar a apoptose incluem, condensação, por exemplo, citoplasmática, blebbing aumentada da membrana, e enrugamento celular.

[000147] A presença de células apoptóticas pode ser medida em ambos os compartimentos anexo e "flutuante" das culturas. Por exemplo, ambos os compartimentos podem ser coletados por remoção do sobrenadante, colocando tripsina nas células ligadas, combinando as preparações seguintes a uma etapa de lavagem por centrifugação (por exemplo, 10 minutos, 2000 rpm), e detecção de apoptose (por exemplo, medindo a fragmentação do DNA). (ver, por exemplo, Piazza et al., Cancer Research 55:3110-16, 1995).

V. Métodos de Uso A. Geral

[000148] Em um outro aspecto, a presente invenção provê métodos de atividade de modulação (por exemplo, a atividade citolítica) de uma célula que expressa NKp30, incluindo, por exemplo, células assassinas naturais (NK) e células T (por exemplo, células T CD8+).
Tais métodos incluem, por exemplo, métodos para o tratamento de doenças ou distúrbios associados com atividade aumentada de uma célula que expressa NKp30. Os anticorpos adequados incluem anticorpos capazes de competir para a ligação a B7H6 com um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado de entre o grupo consistindo em (i) o hibridoma do clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1- 4242), (ii) o hibridoma de clone 9G9.2 (Depósito N° CNCM 1-4243), (iii) o hibridoma do clone 10E2.9 (Depósito N° CNCM I-4244), e (iv) o hibridoma do clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM 1-4245). Em variações específicas, o anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado derivado de um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado de entre (i) - (iv) acima.

[000149] Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção são para uso para interferir na interação de B7H6 com NKp30. Para uso em tais modalidades, os métodos compreendem colocar uma célula que expressa B7H6 funcional, na presença de uma célula que expressa NKp30, em contato com uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou outro agente capaz de interferir na interação de B7H6 com NKp30. Os anticorpos adequados incluem anticorpos capazes de competir para a ligação a B7H6 com um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado de entre (i) o hibridoma do clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1-4242) ou (ii) o hibridoma do clone 17B1.3 (Depósito nº CNCM 1-4245). Em variações específicas, o anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado derivado de um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado de entre (i) e (ii) acima. Tais métodos podem ser realizados in vitro, ex vivo, ou in vivo. Em certas variações preferidas, a célula que expressa NKp30 é uma célula NK e o uso ou método de modular atividade de célula NK seria, por exemplo, no tratamento de uma doença ou distúrbio associado com a atividade aumentada de células NK. Em outras variações, a célula que expressa NKp30 é uma célula T que expressa NKp30 (por exemplo, uma célula T CD8+) e o uso ou método de modulação da atividade das células T expressando NKp30 seria, por exemplo, para o tratamento de uma doença ou distúrbio associado com atividade aumentada de Células T que expressam NKp30. Certas células T, incluindo células T CD8+, têm sido mostradas para expressar NKp30. (Ver, por exemplo, Srivastava e Srivastava, Leuk. Res. 30:37-46, 2006).

[000150] Como notado acima, em variações particulares, os anticorpos da presente invenção são para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio associado com a atividade de células NK. Por exemplo, em algumas modalidades, o método de usar os anticorpos inclui a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 capaz de interferir com a interação de B7H6 com NKp30 a um indivíduo que sofre de, ou tem um risco elevado de desenvolver uma doença ou distúrbio mediada por células NK (por exemplo, rejeição de aloenxertos mediada por células NK, tais como, por exemplo, rejeição de aloenxertos, de células da medula óssea meidada por células NK (CMO)). Incorporado na presente invenção é um método que compreende um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 utilizado para suprimir a Células da medula óssea meidada por células NK. Transplante de medula óssea (TMO) tornouse um método aceitável de terapia para o tratamento de várias doenças hematológicas malignas. A eficácia da BMT alogênica é limitada, no entanto, por certos obstáculos, tais como, por exemplo, rejeição ao enxerto. Há evidências de que as células NK são uma barreira para o enxerto de aloenxertos de medula óssea e que elas só podem mediar a especificidade da rejeição BMC em camundongos. (Ver, por exemplo, Murphy et al., J. Exp. Med. 165:1212-1217, 1987; Murphy et al., J. Exp. Med. 166:1499-1509, 1987; Murphy et al., J. Immunol. 144:3305-3311, 1990; Murphy et al., Eur. J. Immunol. 20:1729-1734, 1990; Murphy et al., Immunol. Rev. 181 :279-289, 2001). Clinicamente, a resistência do aloenxerto observada em pacientes com SCID que receberam BMTs descombinados de HLA depletados de células T, sem condicionamento citorredutor, é atribuída à elevada atividade de células NK do doador. (ver O'Reilly et al., Vox. Sang. 51 :81-86, 1986). Assim, anticorpos contra o domínio extracelular de B7H6 e capaz de inibir a interação de B7H6 com NKp30, como aqui descrito, podem ser utilizados durante o TMO para inibir a atividade de células NK citolíticas contra aloenxertos e, assim, tratar ou prevenir rejeição de aloenxertos BMC.

[000151] Em ainda outras modalidades, um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 é utilizado para induzir a citotoxidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra células que expressam B7H6, tais como, por exemplo, para o tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizada pela presença de células que expressam B7H6. Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 é utilizado para induzir a citotoxidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra células cancerígenas que expressam B7H6. Terapia de anticorpos tem sido particularmente bem sucedida no tratamento do câncer porque certos tumores, ou exibem antígenos únicos, antígenos específicos de linhagem ou antígenos presentes em quantidades excessivas em relação às células normais. A evidência experimental demonstra que B7H6 é, em relação aos tecidos normais, altamente expressa por muitas linhagens celulares derivadas de tumor, incluindo linhagens celulares derivadas de cânceres do cólon, fígado, cérvix, pulmão, pâncreas, e próstata, bem como aqueles derivados a partir de vários cânceres do sangue, tais como a leucemia pró-emocítica, linfoma de células B, linfoma monocítico, eritroleucemia, linfoma de Burkitt, ou leucemia mieloide crônica. Esta evidência indica que B7H6 é um novo antígeno associado a tumor ou específico de tumor, e que um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 pode ser utilizado como uma terapêutica anti-tumoral. Um dos mecanismos associados com a atividade anti-tumoral da terapia de anticorpo monoclonal é citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Em ADCC, os anticorpos monoclonais se ligam a uma célula alvo (por exemplo, célula cancerígena) e células efetoras específicas que expressam receptores para o anticorpo monoclonal (por exemplo, células NK, células Células T CD8+, monócitos, granulócitos) ligam-se ao complexo celular anticorpo monoclonal/alvo resultando na morte da célula alvo.

[000152] Assim sendo, em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 compreendendo uma região Fc com a função efetora é utilizado para induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra uma célula que expressa B7H6. Métodos para induzir ADCC geralmente incluem colocar em contato a célula que expressa B7H6 com uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 compreendendo uma região Fc tendo atividade ADCC, em que a etapa de contato está na presença de uma célula efetora imune citolítica expressando um receptor Fc tendo atividade citolítica. Células efetoras imunitárias que expressam receptores de Fc citolítico (por exemplo, FcyRIIIα ou CD16) incluem, por exemplo, células NK, bem certas células T CD8+. Métodos para induzir CDC geralmente incluem colocar em contato a célula que expressa B7H6 com uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 compreendendo uma região Fc tendo atividade CDC, em que a etapa de contato é na presença de complemento. Células que expressam B7H6 que podem ser orientadas para matar utilizando tais métodos incluem, por exemplo, células cancerígenas, tais como, por exemplo, as células cancerígenas do cólon, células cancerígenas do fígado, células cancerígenas cervicais, células cancerígenas do pulmão, células cancerígenas pancreáticas, células cancerígenas da próstata, células de leucemia pró-emocítica, células Células do linfoma da célula B, células de linfoma monocítico, células de eritroleucemia, células de linfoma de Burkitt e células de leucemia mielógena crônica, para citar alguns. Os anticorpos adequados incluem anticorpos capazes de competir para a ligação a B7H6 com um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado de entre o grupo consistindo em (i) o hibridoma do clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1-4242), (ii) o hibridoma de clone 9G9.2 (Depósito N° CNCM 1-4243), (iii) o hibridoma do clone 10E2.9 (Depósito N° CNCM 1-4244), e (iv) o hibridoma do clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM 1-4245). Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de competir para a ligação a B7H6 com um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado de entre (ii) - (iii) acima. Em variações particulares, o anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado derivado de um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado de entre (i) - (iv) acima ou selecionado a partir de (ii) - (iii) acima.

[000153] Em modalidades relacionadas, um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 compreendendo uma região Fc com a função efetora, como aqui descrito, é utilizado para tratar um câncer expressando B7H6 em um indivíduo. Tais métodos geralmente incluem a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 compreendendo uma região Fc tendo atividade ADCC e/ou atividade CDC. Cânceres que expressam B7H6 são particularmente passíveis de tratamento utilizando tais métodos e incluem, por exemplo, os cânceres do cólon, do fígado, cérvix, pulmão, pâncreas, ou próstata, bem como o câncer do sangue, tais como, leucemia, por exemplo, pró-emocítica, linfoma de células B, linfoma monocítico, eritroleucemia, linfoma de Burkitt, ou leucemia mieloide crônica.

[000154] Em ainda outras modalidades, um conjugado anticorpofármaco monoclonal anti-humano-B7H6 (ver seção IV, supra) é usado para prover um agente terapêutico para uma célula que expressa B7H6, onde o agente exerce um efeito terapêutico. Tais métodos são particularmente úteis para o tratamento de doenças ou distúrbios caracterizados pela presença de células que expressam B7H6. Em certas variações preferidas utilizando um conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humano-B7H6, o agente terapêutico é um agente citotóxico que exerce um efeito citotóxico ou citostático em uma célula que expressa B7H6, tal como uma célula cancerígena que expressa B7H6. Como indicado acima, a evidência experimental demonstra que B7H6 é, em relação aos tecidos normais, altamente expresso por muitas linhagens celulares derivadas de tumor, incluindo linhagens celulares derivadas de cânceres do cólon, do fígado, cérvix, pulmão, pâncreas, e próstata, assim como os derivados de vários cânceres do sangue tais como a leucemia pró-emocítica, linfoma de células B, linfoma monocítica, eritroleucemia, linfoma de Burkitt, ou leucemia mieloide crônica. Esta evidência indica que B7H6 é um antígeno de novo antígeno específico de tumor ou associado ao tumor útil para alvejar agentes que tenham eficácia terapêutica no tratamento do câncer, agentes citotóxicos que podem particularmente enfraquecer ou inibir o crescimento de células tumorais. Assim sendo, em algumas modalidades, um conjugado anticorpo-fármaco monoclonal antihumano-B7H6, que compreende um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 conjugado a um agente citotóxico, é utilizado para tratar câncer que expressa B7H6. Conjugados de anticorpo-fármaco adequados incluem aqueles compreendendo um anticorpo capaz de competir para a ligação a B7H6 com um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado de entre o grupo consistindo em (i) o hibridoma do clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1-4242); (ii) o hibridoma do clone 9G9.2 (Depósito N° CNCM 1-4243), (iii) o hibridoma do clone 10E2.9 (Depósito N° CNCM 1-4244), e (iv) o hibridoma do clone 17B 1,3 (Depósito nº CNCM 1-4245). Em algumas modalidades, o conjugado anticorpo-fármaco compreendendo um anticorpo é capaz de competir para a ligação a B7H6 com um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado de entre (ii) - (iii) acima. Em variações específicas, o conjugado anticorpo-fármaco compreende um anticorpo quimérico ou humanizado derivado de um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado de entre (i) - (iv) acima ou selecionado a partir de (ii) - (iii) acima.

[000155] Em cada uma das modalidades dos métodos de tratamento aqui descritos, o anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humano-B7H6 é entregue de uma maneira consistente com metodologias convencionais associadas com o gerenciamento da doença ou distúrbio cujo tratamento é procurado. De acordo com a divulgação aqui, uma quantidade eficaz do anticorpo ou conjugado anticorpo-fármaco é administrada a um indivíduo em necessidade de tal tratamento durante um tempo e sob condições suficientes para prevenir ou tratar a doença ou distúrbio.

[000156] Indivíduos para a administração de anticorpos monoclonais anti-B7H6 humano ou conjugados de anticorpo-fármaco tal como aqui descrito incluem pacientes em risco maior do que o normal para o desenvolvimento de uma doença ou distúrbio mediada por células que expressam NKp30 ou caracterizada pela presença de células que expressam B7H6, bem como pacientes apresentando-se com uma doença ou distúrbio existente. Em certas modalidades em que o indivíduo não está ainda sofrendo de uma doença ou distúrbio, o uso é para o rastreio ou diagnóstico. Em outras certas modalidades, o indivíduo tem sido diagnosticado como tendo a doença ou distúrbio em que o tratamento é procurado. Além disso, os indivíduos podem ser monitorizados durante o decurso do tratamento para qualquer alteração na doença ou distúrbio (por exemplo, por um aumento ou diminuição dos sintomas clínicos da doença ou distúrbio).

[000157] Em aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas (medicamentos) são administradas a um paciente suscetível a, ou de outra forma em risco de uma doença em particular, em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco ou atrasar o início da doença. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um paciente suspeito de, ou que já sofrem de uma doença em uma quantidade suficiente para curar ou, pelo menos parcialmente reduzir, os sintomas da doença e as suas complicações. Uma quantidade adequada para conseguir isto é referida como uma dose terapeuticamente ou farmaceuticamente eficaz ou quantidade. Em ambos os regimes profiláticos e terapêuticos um conjugado de anticorpo ou anticorpofármaco é geralmente administrado em várias dosagens até que uma resposta suficiente (por exemplo, acionando atividade de células NK apropriada ou inibindo atividade de células NK inapropriada) seja alcançada. Tipicamente, a resposta é monitorada e dosagens repetidas são dadas se a resposta desejada começa a desaparecer.

[000158] Para variações da presente invenção em que o uso é de diagnóstico ou de triagem para um risco elevado em um indivíduo que ainda não sofreu de doença ou distúrbio mediado por células que expressam NKp30 ou caracterizada pela presença de células que expressam B7H6, uma amostra biológica é tomada do indivíduo e comparada com uma amostra biológica de indivíduos normais ou saudáveis ou um nível de base predeterminado. O risco de desenvolver câncer é determinado pela detecção de um nível mais elevado na amostra de indivíduos do que o encontrado na amostra biológica comparável de indivíduos normais ou saudáveis ou nível de base. Métodos de detecção das composições de anticorpos da presente invenção são descritas na seção VC

[000159] As composições e métodos da presente invenção podem ser usados para monitorar o progresso da terapia em uma amostra biológica a partir de um indivíduo em vários momentos após o transplante de medula óssea ou em vários momentos após ter sido dado um fármaco anticâncer ou uma terapia. Nível de B7H6 detectado em uma amostra biológica a partir de um indivíduo é detectado como antes do tratamento (Tl) e comparado com uma amostra biológica a partir do mesmo indivíduo tirado em uma segunda vez (T2); após o tratamento. Um nível mais elevado de B7H6 geralmente indica a progressão da doença e menor B7H6 indica regressão.

[000160] Para identificar pacientes indivíduos para a seleção ou tratamento de acordo com os métodos da invenção, os métodos de rastreio aceitos podem ser empregues para determinar os fatores de risco associados a doenças específicas ou distúrbios mediados por células que expressam NKp30 ou caracterizados pela presença de células que expressam B7H6, ou para determinar o status de um distúrbio existente identificado em um indivíduo. Tais métodos podem incluir, por exemplo, determinar se um indivíduo tem parentes que tenham sido diagnosticados com uma doença em particular. Métodos de rastreio podem também incluir, por exemplo, trabalho convencionais para determinar o status familiar para uma determinada doença conhecida por ter um componente hereditário (por exemplo, no caso de BMT, estudos clínicos têm demonstrado que a presença de certos alelos HLA-C correlaciona com um risco aumentado de rejeição do enxerto BM (ver Scott et al., Blood 92:4864-4871, 1998) e vários tipos de câncer também são conhecidos por ter certos componentes herdáveis). Componentes herdáveis de cânceres incluem, por exemplo, mutações em múltiplos genes que estão se transformando (por exemplo, Ras, Raf, EGFR, CMET e outros), a presença ou ausência de HLA determinado e moléculas de receptor inibitório assassino (KIR), ou mecanismos pelos quais as células cancerígenas são capazes de modular a supressão imune de células como as células NK e células T, quer diretamente ou indiretamente (ver, por exemplo, Ljunggren e Malmberg, Nature Rev. Immunol. 7:329-339, 2007; Boyton e Altmann, Clin. Exp. Immunol. 149: 1-8, 2007). Para esse fim, as sondas de nucleotídeos podem ser empregadas rotineiramente para identificar indivíduos portadores de rótulos genéticos associados com a doença de interesse. Além disso, uma grande variedade de métodos imunológicos é conhecida na técnica as quais são úteis para identificar rótulos para doenças específicas. Por exemplo, vários métodos de imunoensaio ELISA estão disponíveis e são bem conhecidos na técnica os quais empregam sondas de anticorpos monoclonais para detectar antígenos associados a tumores específicos. Rastreio pode ser implementado como indicado por sintomatologia de paciente conhecido, os fatores de idade, os fatores de risco associados, etc. Estes métodos permitem ao médico selecionar rotineiramente pacientes com necessidade dos métodos aqui descritos para o tratamento. De acordo com estes métodos, a modulação da atividade das células NK pode ser implementada como um programa de tratamento independente ou como um regime de tratamento de seguimento, adjuvante, ou coordenado a outros tratamentos.

B. Tratamento do Câncer 1. Tipos de Câncer

[000161] Tal como descrito e mostrado por estudos aqui, um anticorpo B7H6 pode ser utilizado para direcionar morte de uma célula que expressa B7H6 através da ativação da via de ADCC ou CDC através da ligação de Fc a receptores Fc e a proteína de complemento, C1q. Em ainda outras variações, um conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humano-B7H6, compreendendo um agente citotóxico conjugado a um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6, pode ser utilizado para entregar um agente citotóxico para células cancerígenas que expressam B7H6, em que o agente citotóxico exerce um efeito terapêutico enfraquecendo ou inibindo o crescimento das células cancerígenas.

[000162] A Tabela 4 abaixo lista alguns cânceres passíveis de serem tratados de acordo com a presente invenção, organizados predominantemente por alvo.

[000163] Alguns dos cânceres listados acima, incluindo alguns dos modelos animais relevantes para a avaliação dos efeitos de um anticorpo anti-B7H6 ou conjugado fármaco-anticorpo de acordo com a presente invenção sobre as respostas tumorais, são discutidos em detalhe mais abaixo.

a. Leucemia mieloide crônica

[000164] A leucemia mieloide crônica (LMC) é um tipo raro de câncer que afeta principalmente os adultos. É um câncer de granulócitos (um tipo predominante de células brancas do sangue). Na CML muitos granulócitos são produzidos e liberados no sangue quando eles são imaturos e incapazes de funcionar adequadamente. Os glóbulos brancos imaturos são conhecidos como blastos. A produção de outros tipos de células do sangue é também interrompida. Normalmente, as células brancas do sangue se reparam e se reproduzem de forma ordenada e controlada, mas na leucemia mieloide crônica o processo é controlado e as células continuam a se dividir e amadurecer de forma anormal. A doença geralmente se desenvolve muito lentamente, e é considerada leucemia mieloide crônica.

[000165] Devido ao fato de CML progredir lentamente, é difícil de se detectar em seus estágios iniciais. Às vezes só é descoberta quando um exame de sangue é feito por outra razão. Os sintomas de LMC são frequentemente vagos, não específicos e causados pelo aumento do número de glóbulos brancos anormais na medula óssea e no número reduzido de células de sangue normais, resultando em uma sensação de saciedade ou um leve inchaço no lado esquerdo do abdômen. Na CML, o baço pode ser alargado. O inchaço do baço pode também causar a pressão sobre o estômago, levando a indigestão e falta de apetite, resultando em anemia. Devido a um menor número de plaquetas no sangue, algumas pessoas podem perceber que elas sangram ou contundem-se mais facilmente. "Petéquias" associado a CML, é um tipo especial de contusão, onde pequenas manchas de sangue, como vistas geralmente nas pernas ou na boca. As mulheres podem achar que os seus períodos menstruais tornar-se muito mais pesados. No entanto, estes sinais e sintomas são raros. Leucemia mieloide crônica pode ocorrer em qualquer idade, mas afeta mais comumente pessoas de meia-idade e idosos e é rara em crianças (National Cancer Institute, "NTH Publication N° 08-3775" Rockville, MD, setembro 2008). Os efeitos de um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco na resposta tumoral podem ser avaliados, por exemplo, em um modelo de xenoenxerto de tumor humano, utilizando células humanas CML enxertadas em camundongos imunodeficientes (ver, por exemplo, Ren, Leukemia and Lymphoma 8:1549-1561, 2002; Van Etten, Mol Blood Cells. Dis. 27:201-205, 2001; Wong e Witte, Oncogene 20:5644-5659, 2001).

b. Mieloma Múltiplo

[000166] O mieloma múltiplo é um tipo de câncer que afeta determinados glóbulos brancos, chamados de células plasmáticas. No câncer envolvendo células do plasma, as células são todas anormais e idênticas e chamadas de células de mieloma. Células de mieloma tendem a acumular-se na medula óssea e na parte mais externa dura dos ossos. Às vezes, eles coletam em apenas um osso e formam uma única massa, ou tumor, chamado de plasmocitoma. Na maioria dos casos, no entanto, as células de mieloma coletam em muitos ossos, frequentemente formando muitos tumores e causando outros problemas. Quando isto acontece, a doença é denominada mieloma múltiplo.

[000167] Devido ao fato de as pessoas com mieloma múltiplo terem um número anormalmente grande de células plasmáticas idênticas, elas também têm muito de um tipo de anticorpo. Estas células de mieloma e anticorpos podem causar um certo número de problemas médicos graves, que podem incluir: (1) Conforme as células de mieloma aumentam em número, elas danificam e enfraquecem os ossos, causando dor e algumas vezes fraturas. (2) Quando os ossos são danificados, o cálcio é liberado no sangue. Isto pode conduzir a hipercalcemia. Hipercalcemia pode causar perda de apetite, sede, náuseas, fadiga, fraqueza muscular, inquietação e confusão. (3) As células de mieloma impedem a medula óssea da formação de células normais do plasma e outros glóbulos brancos importantes para o sistema imunitário. Os pacientes podem ser mais suscetíveis à infecção e doença. (4) As células cancerígenas também podem prevenir o crescimento de novas células vermelhas do sangue, causando anemia. (5) Pacientes com mieloma múltiplo podem ter sérios problemas de rins. Proteínas de anticorpos em excesso e cálcio podem evitar que os rins filtrem e limpem o sangue de forma adequada. Os sintomas dependem de quão avançada a doença é. No estágio inicial da doença, pode não haver sintomas. Quando ocorrem sintomas, os pacientes geralmente têm dor óssea, muitas vezes nas costas ou nas costelas. Os pacientes também podem ter os ossos quebrados, fadiga, fraqueza, perda de peso, ou infecções repetidas. Quando a doença está avançada, os sintomas podem incluir náuseas, vômitos, constipação, problemas com a micção, e fraqueza ou dormência nas pernas (Instituto Nacional do Câncer, "NIH Publication Nº 08-1575" Rockville, MD, setembro 2008). Os efeitos de um anticorpo anti-B7H6 ou conjugado fármaco-anticorpo sobre a resposta tumoral podem ser avaliados em um modelo de xenoenxerto de tumor humano em camundongos imunodeficientes, tal como descrito em Miyakawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 313:258-62, 2004.

c. Não Hodgkin

[000168] Existem dois tipos principais de linfoma. Doença de Hodgkin e o linfoma não Hodgkin. Há cerca de 20 diferentes tipos de linfoma não Hodgkin. Na maioria dos casos de doença de Hodgkin, uma célula em particular conhecida como a célula de Reed-Sternberg é encontrada nas biópsias. Esta célula não é normalmente encontrada em outros linfomas, e resulta em um tratamento diferente para linfomas Hodgkin e não Hodgkin.

[000169] Muitas vezes, o primeiro sinal de um linfoma não Hodgkin é um inchaço indolor de um gânglio linfático no pescoço, axila ou virilha. Outros sintomas podem incluir qualquer um dos seguintes: suores noturnos e febre inexplicável, perda de apetite, perda de peso inexplicável e cansaço excessivo, as crianças podem desenvolver uma tosse ou falta de ar. Os pacientes podem se queixar de dor abdominal, ou uma protuberância no abdômen de uma criança ou prurido persistente da pele por todo o corpo (Instituto Nacional do Câncer, "NIH Publication Nº 07-1567" Rockville, MD, setembro 2007). Os efeitos de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco na resposta tumoral podem ser avaliados em um modelo de xenoenxerto de linfoma não Hodgkin semelhante ao descrito no Ansell et al., Leukemia 18:616-23, 2004.

[000170] A classificação dos linfomas não Hodgkin mais comumente usada é o Sistema de classificação REAL (Ottensmeier, Interactions Chemico-Biological 135-136:653-664, 2001). Rótulos imunológicos específicos foram definidos para a classificação de linfomas. Por exemplo, os rótulos de linfoma folicular incluem CD20+, CD3-, CD10+, CD5-; rótulos de linfoma linfocítico pequenas incluem CD20+, CD3-, CD10-, CD5+, CD23+; rótulos de linfoma de células B de zona marginal incluem CD20+, CD3-, CD10-, CD23-; rótulos de linfoma de células B difusas grandes incluem CD20+, CD3-; rótulos de linfoma de células manto incluem CD20+, CD3-, CD10-, CD5+, CD23+; rótulos de linfoma de células T periféricos incluem CD20-, CD3+; rótulos de linfoma de célula B grande mediastinal primário incluem CD20+, CD3-, rótulos de linfoma linfoblástico incluem CD20, CD3+, TdT+ e rótulos de linfoma de Burkitt incluem CD20+, CD3-, CD10+, CD5- (Recursos de decisão, linfoma não Hodgkin, Waltham, MA., Fevereiro . 2002).

[000171] A classificação clínica de linfoma de Hodgkins (LNH) pelas Regras de trabalho Internacionais divide a doença em subtipos: (1) doença de grau baixo (indolente) que inclui linfocítica pequena, de acordo com leucemia linfocítica crônica (SC); folicular, predominantemente de pequenas células clivadas (FSC); folicular, células pequenas e grandes clivadas mista (FM), (2) doença de grau intermédio que inclui célula folicular, célula predominantemente grande (FL); difusa, de pequenas células clivadas (DSC); difusa misturada, célula pequena e grande (DM); células difusa, grandes não clivada ou clivada (DL); e (3) doença de alto grau, que inclui célula imunoblástica grande (IBL); célula linfoblástica, enrolada ou cão convolucional (LL), e células não clivadas pequenas, de Burkitt ou não Burkitts (SNC; The Non-Hodgkin's Lymphoma Pathologic Classification Project, Cancer 49:2112-35, 1982). O sistema Ann Arbor de teste é comumente usado para encenar pacientes com NHL. Estágio I significa o envolvimento de uma única região de linfonodo ou envolvimento localizado de um único órgão extralinfático ou sítio. Fase II significa envolvimento de duas ou mais regiões dos nódulos linfáticos do mesmo lado do diafragma ou envolvimento localizado de um sítio extranodal ou de órgãos e uma ou mais regiões dos nódulos linfáticos do mesmo lado do diafragma. Fase III significa envolvimento das regiões dos nódulos linfáticos de ambos os lados do diafragma, eventualmente acompanhados por envolvimento localizado de um órgão extranodal ou sítio. Estágio IV significa envolvimento difuso ou disseminado de um ou mais órgãos extranodais distantes com ou sem envolvimento associado de linfonodo ("Lymphoid neoplasms," In American Joint Committee on Cancer.: AJCC Cancer Staging Manual 6th ed. New York, NY: Springer, 2002, pp. 393-406). Rituximab tem se mostrado eficaz no tratamento de linfomas indolentes e foliculares (Boye et al., Annals of Oncol. 14:520-535, 2003).

d. Câncer Cervical

[000172] O cérvix é o pescoço do útero que se abre dentro da vagina. Câncer cervical, também denominado carcinoma cervical, desenvolve-se a partir de células anormais na superfície do cérvix e é um dos cânceres mais comuns que afetam as mulheres. O câncer cervical é geralmente precedido por displasia, alterações précancerígenas nas células na superfície do cérvix. Estas células anormais podem progredir para câncer invasivo. Uma vez que o câncer aparece, ele pode progredir através de quatro etapas. As fases são definidas a medida que o câncer se dissemina. Quanto mais o câncer se espalha, mais extenso o tratamento é provável de ser. Existem 2 tipos principais de câncer de cérvix: (1) do tipo espinocelular (carcinoma epidermoide): Este é o tipo mais comum, representando cerca de 80% a 85% dos cânceres cervicais. Este câncer pode ser causado por doenças sexualmente transmissíveis. Uma dessas doenças sexual é o vírus do papiloma humano, que causa verrugas venéreas. O tumor canceroso cresce no e dentro do cérvix. O câncer é geralmente iniciado na superfície do cérvix e pode ser diagnosticado em uma fase precoce por um exame. (2) Adenocarcinoma: Este tipo de câncer do cérvix se desenvolve a partir do tecido nas glândulas cervicais no canal do cérvix. Doença precoce geralmente não causa sintomas. O câncer geralmente pode ser detectado por um exame de Papanicolaou e exame pélvico. Estágios mais avançados da doença causam sangramento vaginal anormal ou um corrimento manchado de sangue em momentos inesperados, como entre os períodos menstruais, após a relação sexual, ou após a menopausa. Corrimento vaginal anormal pode ser turvo ou com sangue ou pode conter muco com um odor ruim. Estágios avançados do câncer podem causar dor (National Cancer Institute, "NTH Publication Nº 08-2407" Rockville, MD, setembro 2008). Os efeitos de um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco na resposta tumoral podem ser avaliados em um modelo de xenoenxerto de tumor humano semelhante ao descrito em Downs et al., Gynecol. Oncol. 98:203-10, 2005; e Li et al., Int. J. Gynecol. Cancer 15:301-7, 2005.

e. Tumores de Cabeça e Pescoço

[000173] A maioria dos cânceres de cabeça e pescoço são de um tipo chamado carcinoma (carcinoma de células escamosas em particular). Carcinomas da cabeça e do pescoço se iniciam nas células que formam o revestimento da boca, nariz, garganta ou ouvidos, ou a camada de superfície que cobre a língua. No entanto, os cânceres da cabeça e do pescoço podem se desenvolver a partir de outros tipos de células. Linfoma se desenvolve a partir das células do sistema linfático. Sarcoma se desenvolve a partir das células de suporte que formam os músculos, cartilagem, ou vasos sanguíneos. Melanoma começa a partir de células chamadas melanócitos, que dão cor aos olhos e pele. Os sintomas de um câncer de cabeça e pescoço irão depender de onde ele é - por exemplo, câncer da língua pode causar algum discurso imperceptível. Os sintomas mais comuns são uma úlcera ou área dolorida na cabeça ou no pescoço que não cicatriza dentro de algumas semanas, dificuldade em engolir ou dor ao mastigar ou engolir; problemas com a respiração ou a fala, tal como respiração ruidosa persistente, discurso imperceptível ou uma voz rouca, uma sensação de dormência na boca, nariz entupido persistente ou um sangramento no nariz; dor de ouvido persistente, zumbido no ouvido, ou dificuldade em ouvir, um inchaço ou caroço na boca ou no pescoço, dor na face ou mandíbula superior; em pessoas que fumam ou mastigam tabaco, alterações pré-cancerígenas podem ocorrer no revestimento da boca, ou sobre a língua. Estes podem aparecer como manchas brancas persistentes (leucoplasia) ou manchas vermelhas (eritroplasia). Eles são geralmente indolores, mas podem às vezes ser doloridos e podem sangrar (National Cancer Institute, "NTH Publication Nº 09-1574" Rockville, MD, setembro 2009). Os efeitos de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpofármaco na resposta tumoral podem ser avaliados em um modelo de xenoenxerto tumoral de cabeça e cabeça humano semelhante ao descrito em Kuriakose et al., Head Neck 22:57-63, 2000; Cao et al., Clin. Cancer Res. 5:1925-34, 1999; Braakhuis et al., Cancer Res. 51 :211-4, 1991; e Baker, Laryngoscope 95:43-56, 1985.

f. Câncer Cerebral

[000174] Tumores que começam no tecido cerebral são conhecidos como tumores primários do cérebro e são denominados de acordo com o tipo de células ou a parte do cérebro em que eles começam. Os tumores cerebrais primários mais comuns começam em células gliais, chamadas de gliomas. Existem muitos tipos de gliomas: (1) Astrocitoma – O tumor que surge a partir de células gliais em forma de estrela chamadas astrócitos. Em adultos, os astrocitomas mais frequentemente surgem no cérebro. Em crianças, elas ocorrem no tronco cerebral, o cérebro e o cerebelo. O astrocitoma de grau III é chamado às vezes de um astrocitoma anaplásico. O astrocitoma de grau IV é geralmente chamado de glioblastoma multiforme. (2) glioma de tronco cerebral - O tumor ocorre na parte mais baixa do cérebro. Gliomas do tronco cerebral na maioria das vezes são diagnosticados em crianças jovens e adultos de meia idade. (3) Ependimoma - O tumor tem origem nas células que revestem os ventrículos ou o canal central da medula espinhal, e eles são mais comumente encontrados em crianças e adultos jovens. (4) Oligodendroglioma - Este tumor raro surge a partir de células que produzem a substância gordurosa que cobre e protege os nervos. Estes tumores geralmente ocorrem no cérebro. Eles crescem lentamente e geralmente não se espalham em torno do tecido cerebral. Eles são mais comuns em adultos de meia idade. Os sintomas de tumores cerebrais dependem do tamanho do tumor, tipo e localização. Os sintomas podem ser causados quando um tumor pressiona um nervo ou danifica uma determinada área do cérebro. Eles também podem ser causados quando o cérebro incha ou fluido acumula-se dentro do crânio. Os sintomas mais comuns de tumores cerebrais incluem dores de cabeça (geralmente pior durante a manhã), náuseas ou vômitos, alterações na fala, visão, audição ou problemas de equilíbrio, ou ao caminhar, mudanças de humor, personalidade ou capacidade de concentração, problemas com memória; abalos musculares ou espasmos (desmaios ou convulsões) e dormência ou formigamento nos braços ou pernas (Instituto Nacional do Câncer, "NTH Publication Nº 09-1558" Rockville, MD, Maio de 2009). Os efeitos de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco na resposta tumoral podem ser avaliados em um modelo de xenoenxerto glioma humano semelhante ao descrito no Bello et al., Clin. Cancer Res. 8:3539-48, 2002.

g. Câncer de Tireoide

[000175] Cânceres da tireoide papilares e foliculares são considerados 80 a 90 por cento de todos os cânceres da tireoide. Ambos os tipos começam nas células foliculares da tireoide. A maioria dos cânceres da tiroide papilares e foliculares tendem a crescer lentamente. Se forem detectados precocemente, a maioria pode ser tratada com sucesso. Câncer de tiroide medular são considerados 5 a 10 por cento dos casos de câncer de tireoide, e surgem em células C, células não foliculares. Câncer da tireoide anaplásico é o tipo menos comum de câncer da tiroide (apenas 1 a 2 por cento dos casos), e ele surge nas células foliculares. As células cancerígenas são altamente anormais e difíceis de reconhecer. Este tipo de câncer é geralmente muito difícil de controlar porque as células cancerígenas tendem a crescer e se espalhar muito rapidamente. Câncer de tireoide precoce geralmente não causa sintomas. Mas, conforme o câncer se desenvolve, os sintomas podem incluir: um caroço, ou nódulo, na parte da frente do pescoço perto do pomo de Adão, rouquidão ou dificuldade em falar com uma voz normal; gânglios linfáticos inchados, especialmente no pescoço, dificuldade em engolir ou respirar; ou dor na garganta ou no pescoço (National Cancer Institute, "NTH Publication Nº 07-4994" Rockville, MD, setembro 2007). Os efeitos de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpofármaco na resposta tumoral podem ser avaliados em um modelo de xenoenxerto de tumor humano semelhante ao descrito no Quidville et al., Endocrinology 145:2561-71, 2004.

h. Câncer do Fígado

[000176] Existem dois tipos diferentes de câncer de fígado primário. O tipo mais comum é chamado de hepatoma ou carcinoma hepatocelular (HCC), e surge a partir das principais células do fígado (hepatócitos). Este tipo é normalmente limitado ao fígado, embora ocasionalmente se espalhe para outros órgãos. Há também um raro e não relacionado sub-tipo de hepatoma chamado hepatoma fibrolamelar, que pode ocorrer em pessoas mais jovens. O outro tipo de câncer primário do fígado tem início nas células dos dutos biliares é chamado colangiocarcinoma ou câncer do duto da bile. A maioria das pessoas que desenvolve hepatoma geralmente também tem uma condição chamada cirrose hepática. Esta é uma fina cicatriz em todo o fígado, que é devido a uma variedade de causas, incluindo infecções e consumo de álcool durante um longo período de tempo. No entanto, apenas uma pequena proporção de pessoas que têm cirrose do fígado desenvolve câncer primário de fígado. A infecção com o vírus da hepatite B ou vírus da hepatite C pode levar ao câncer do fígado, e pode causar cirrose, o que aumenta o risco de desenvolvimento de hepatoma. As pessoas que têm uma condição rara chamada hemocromatose, que provoca excesso de depósitos de ferro no organismo, têm uma maior chance de desenvolver hepatoma. Um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpofármaco pode ser usado para tratar, prevenir, inibir a progressão, retardar o aparecimento, e/ou reduzir a gravidade ou inibir, pelo menos, uma das condições ou sintomas associados com o carcinoma hepatocelular. O carcinoma hepatocelular pode ou não estar associado a uma infecção de hepatite (por exemplo, hepatite A, hepatite B, hepatite C e hepatite D). Os efeitos de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco na resposta tumoral podem ser avaliados em um modelo de xenoenxerto de tumor humano semelhante ao descrito no Zhou et al., Clin. Cancer Res. 9:6030-7, 2003; e Huynh et al., J. Cell Mol. Med. 2008 (EPublicação 10,1111/j.1582-4934.2008.00364, 2008, Blackwell Synergy).

i. Câncer de Pulmão

[000177] Os efeitos de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco na resposta tumoral podem ser avaliados em um modelo de xenoenxerto de carcinoma de pulmão de células pequenas/não pequenas humano. Resumidamente, os tumores humanos são enxertados em camundongos immunodeficiente e esses camundongos são tratados com um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco, sozinho ou em combinação com outros agentes. A eficácia do tratamento pode ser demonstrada através da avaliação do crescimento do tumor (Nemati et al., Clin Cancer Res. 6:2075-86, 2000;. E Hu et al., Clin. Cancer Res. 10:7662-70, 2004).

2. Atividade Antitumoral e Parâmetros em Tumores Sólidos

[000178] Embora cada protocolo possa definir as avaliações de resposta tumoral de forma diferente, o RECIST (Critérios de avaliação de resposta em tumores sólidos) é atualmente considerado como critério a ser a diretriz recomendada para avaliação da resposta tumoral pelo National Cancer Institute (ver Therasse et al., J. Natl. Cancer Inst. 92:205-216, 2000). De acordo com os critérios RECIST, a resposta tumoral significa uma redução ou eliminação de todas as lesões mensuráveis ou metástases. A doença é geralmente considerada mensurável se compreende lesões que podem ser medidas em pelo menos uma dimensão como ≥ 20mm com as técnicas convencionais ou ≥ 10mm com tomografia computadorizada espiral, com margens claramente definidas, através da fotografia médica ou raios-X, tomografia axial computadorizada (TC), ressonância magnética (MRI), ou exame clínico (se as lesões são superficiais). Doença não mensurável significa que a doença é composta por lesões < 20mm com as técnicas convencionais ou < 10mm tomografia computadorizada espiral, e lesões verdadeiramente não mensuráveis (muito pequenas para medir com precisão). Doença não mensurável inclui derrame pleural, ascite e doença documentada por evidências indiretas.

[000179] Os critérios para o status objetivo são necessários para protocolos para avaliar a resposta de tumor sólido. Critérios representativos incluem o seguinte: (1) Resposta Completa (CR), definida como o desaparecimento completo de toda a doença mensurável; novas lesões; sem sintomas de doenças relacionadas; nenhuma evidência de doença não mensurável, (2) resposta parcial (PR), definida como a diminuição de 30% na soma do maior diâmetro das lesões alvo, (3) doença progressiva (PD), definida como um aumento de 20% na soma do maior diâmetro das lesões alvo ou aparência de qualquer nova lesão; (4) Estável ou Sem resposta, definida como não qualificação para CR, PR, ou PD. (vide Therasse et al., supra).

[000180] Outros parâmetros que são aceitos dentro da área da oncologia incluem a sobrevida global (OS), sobrevida livre de doença (DFS), taxa de resposta objetiva (ORR), tempo para progressão (TTP), e sobrevida livre de progressão (PFS) (ver Guidance for Industry: Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologies, April 2005, Center for Drug Evaluation and Research, FDA, Rockville, MD).

3. Terapia de Câncer de Combinação

[000181] Como discutido anteriormente, em certas modalidades, um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpofármaco é usado em combinação com um segundo agente para o tratamento de uma doença ou distúrbio. Quando utilizado para tratar o câncer, um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção pode ser utilizado em combinação com terapias do câncer convencionais, tais como, por exemplo, cirurgia, radioterapia, quimioterapia ou combinações dos mesmos. Em alguns aspectos, outros agentes terapêuticos úteis para a terapia de combinação do câncer com um anticorpo anti-B7H6 ou conjugado fármaco-anticorpo de acordo com a presente invenção incluem agentes antiangiogênicos. Em alguns outros aspectos, outros agentes terapêuticos úteis para a terapia de combinação incluem um antagonista de alguns fatores que estão envolvidos no crescimento do tumor, tal como, por exemplo, EGFR, ErbB2 (Her2), ErbB3, ErbB4, ou TNF. Em alguns aspectos, um conjugado de anticorpo ou anticorpofármaco de acordo com a presente invenção é coadministrado com uma citocina (por exemplo, uma citocina que estimula uma resposta imune contra um tumor). Exemplos de terapias de combinação particularmente favoráveis para o tratamento de câncer são descritas em detalhe mais abaixo.

a. Anticorpos Direcionados a Antígenos Associados a Tumor

[000182] Como observado anteriormente, a terapia de anticorpos tem sido particularmente bem sucedida no tratamento do câncer porque certos tumores, exibindo antígenos exclusivos, antígenos específicos de linhagem ou antígenos presentes em quantidades excessivas em relação às células normais. Um dos mecanismos associados com a atividade antitumoral da terapia de anticorpo monoclonal é citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Em ADCC, os anticorpos monoclonais se ligam a uma célula alvo (por exemplo, célula cancerígena) e células efetoras específicas que expressam receptores para o anticorpo monoclonal (por exemplo, células NK, monócitos, granulócitos) se ligam ao complexo anticorpo monoclonal/células alvo, resultando em morte de células alvo. Assim, em certas variações da presente invenção, um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco tendo eficácia contra um câncer é coadministrado com um anticorpo monoclonal contra um segundo antígeno associado ao tumor (isto é, um antígeno associado ao tumor que não seja B7H6). A dose e o programa dos mAbs baseiam-se em propriedades farmacocinéticas e toxicocinéticas atribuídas ao anticorpo específico coadministrado, e deve otimizar estes efeitos, minimizando qualquer toxicidade que pode ser associada com a administração de um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco.

[000183] Terapia de combinação com um anticorpo monoclonal antiB7H6 ou conjugado fármaco-anticorpo, tal como aqui descrito e um anticorpo monoclonal contra um segundo antígeno associado ao tumor pode ser indicada quando uma primeira linha de tratamento falhou e pode ser considerado como um tratamento de segunda linha. A presente invenção também provê usar a combinação como um tratamento de primeira linha em populações de doentes que foram recentemente diagnosticadas e que não tenham sido previamente tratadas com agentes anticancerígenos ("pacientes de novo") e pacientes que não receberam previamente qualquer terapia de anticorpo monoclonal ("pacientes naive").

[000184] Um anticorpo anti-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco, tal como aqui descrito é também útil em terapia de combinação com anticorpos monoclonais contra antígenos associados a tumores, na ausência de qualquer ADCC mediada por anticorpo direta ou CDC de células tumorais. Por exemplo, os anticorpos que bloqueiam um sinal de inibição no sistema imunológico podem levar a um aumento nas respostas imunes. Exemplos incluem (1) anticorpos contra moléculas da família B7R que têm a função inibitória, tal como, antígeno 4 associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4), morte programada-1 (PD-1), atenuador de linfócitos B e T (BTLA), (2) anticorpos contra citocinas inibitórias como a IL-10, TGFβ; e (3) anticorpos que enfraquecem ou inibem funções das células supressoras, como antiCD25 ou CTLA-4. Por exemplo, mAbs anti-CTLA4 em ambos os camundongos e seres humanos são pensados para suprimir a função de ambas as células T reguladoras imunossupressores (Tregs) ou inibir o sinal inibitório transmitido através da ligação do CTLA-4 em células T a moléculas B7-1 ou B7- 2 em APCs ou células tumorais.

[000185] Tabela 6 é uma lista não exclusiva de anticorpos monoclonais aprovados ou a serem testados para os quais a terapia combinada de acordo com a presente invenção é possível.

b. Inibidores da Tirosina Cinase

[000186] Em algumas modalidades, um anti-humano conjugado anticorpo-B7H6 ou anticorpo monoclonal de fármaco, tal como aqui descrito é usado em combinação com um inibidor da tirosina cinase. Tirosina-cinases são enzimas que catalisam a transferência do grupo fosfato γ a partir do trifosfato de adenosina para proteínas alvo. Tirosina-cinases podem ser classificadas como receptores e tirosina cinases de proteína não receptor. Desempenham um papel essencial em diversos processos celulares normais, incluindo a ativação através de receptores de crescimento e afetam a sobrevivência, proliferação e crescimento de vários tipos de células. Além disso, elas são pensadas para promover a proliferação de células de tumor, induzir efeitos antiapoptóticos e promover a angiogênese e metástase. Além disso a ativação através de fatores de crescimento, a ativação da proteína cinase através de mutação somática é um mecanismo comum de tumorigênese. Algumas das mutações identificadas são em B-Raf cinase, flt3 cinase, BCR-ABL cinase, c-kit cinase, fator de crescimento epidérmico (EGFR) e vias PDGFR. O Her2, VEGFR e c-Met são outras vias de tirosina-cinase de receptor significativo (RTK) implicado na progressão do câncer e tumorigênese. Como um grande número de processos celulares são iniciados por tirosina-cinases, elas têm sido identificadas como alvos principais para os inibidores.

[000187] Inibidores da cinase de tirosina cinase (TKIs) são pequenas moléculas que atuam no interior da célula, competindo com o trifosfato de adenosina (ATP) para a ligação ao domínio tirosina cinase catalítico de ambas as tirosinas cinases receptores e não receptor. Esta iniciação competitiva bloqueia a ligação de sinalização a jusante que conduzem a funções efetoras associadas a estes eventos de sinalização como o crescimento, angiogênese e sobrevivência. Usar uma estrutura e abordagem computacional, um número de compostos a partir de numerosas bibliotecas combinatórias químicas medicinais foi identificado os quais inibem tirosina-cinases.

[000188] A maioria dos TKIs são pensados para inibir o crescimento de tumores através da inibição direta da célula tumoral, ou através da inibição da angiogênese. Além disso, certos inibidores da tirosina cinase afetam a sinalização através dos receptores da família VEGF, incluindo sorafenib e sunitinib. Em alguns casos TKIs têm sido mostrados para ativar as funções de células dendríticas e outras células imunes inatas, tais como as células NK. Isto foi relatado recentemente em modelos animais para imatinib. Imatinib é um TKI que tem demonstrado aumentar a atividade assassina por células dendríticas e células NK (para revisão, ver Smyth et al., NEJM 354:2282, 2006).

[000189] BAY 43-9006 (sorafenib, Nexavar®) e SU11248 (sunitinib, Sutent ®) são dois tais TKIs que foram recentemente aprovados para uso em carcinoma de células renais (CCR). Um certo número de outros TKIs estão em desenvolvimento de fase tardia e precoce para o tratamento de vários tipos de câncer. Outros TKIs incluem, mas não estão limitados a: Mesilato de Imatinib (Gleevec®, Novartis); Gefitinib (Iressa®, AstraZeneca); Cloridrato de Erlotinib (Tarceva®, Genentech); Vandetanib (Zactima®, AstraZeneca), Tipifarnib (Zarnestra®, JanssenCilag); Dasatinib (Sprycel®, Bristol Myers Squibb); Lonafarnib (Sarasar®, Schering Plough); Succinato de Vatalanib (Novartis, Schering AG); Lapatinib (Tykerb®, Glaxo SmithKline); Nilotinib (Novartis); Lestaurtinib (Cephalon); Cloridrato de Pazopanib (Glaxo SmithKline); Axitinib (Pfizer); Dicloridrato de Canertinib (Pfizer); Pelitinib (National Cancer Institute, Wyeth); Tandutinib (Millennium); Bosutinib (Wyeth); Semaxanib (Sugen, Taiho); AZD-2171 (AstraZeneca); VX-680 (Merck, Vertex); EXEL-0999 (Exelixis); ARRY142886 (Array BioPharma, AstraZeneca); PD-0325901 (Pfizer); AMG-706 (Amgen); BIBF-1120 (Boehringer Ingelheim); SU-6668 (Taiho); CP547632 (OSI); (AEE-788 (Novartis); BMS-582664 (Bristol-Myers Squibb); JNK-401 (Celgene); R-788 (Rigel); AZD-1152 HQPA (AstraZeneca); NM-3 (Genzyme Oncology); CP-868596 (Pfizer); BMS-599626 (Bristol-Myers Squibb); PTC-299 (PTC Therapeutics); ABT-869 (Abbott); EXEL-2880 (Exelixis); AG-024322 (Pfizer); XL-820 (Exelixis); OSI-930 (OSI); XL-184 (Exelixis); KRN-951 (Kirin Brewery); CP724714 (OSI); E-7080 (Eisai); HKI-272 (Wyeth); CHIR-258 (Chiron); ZK-304709 (Schering AG); EXEL-7647 (Exelixis); BAY-57-9352 (Bayer); BIBW-2992 (Boehringer Ingelheim); AV-412 (AVEO); YN-968D1 (Advenchen Laboratories); Midostaurin (Novartis); Perifosine (AEterna Zentaris, Keryx, National Cancer Institute); AG-024322 (Pfizer); AZD-1152 (AstraZeneca); ON-01910Na (Onconova); e AZD-0530 (AstraZeneca).

c. Combinações de Quimioterapia

[000190] Em certas modalidades, um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco é administrado em combinação com um ou mais agentes quimioterapêuticos. Os agentes quimioterapêuticos têm diferentes modos de ação, por exemplo, influenciando o DNA ou RNA e interferindo com a replicação do ciclo celular. Exemplos de agentes quimioterapêuticos que atuam ao nível do DNA ou no nível de RNA são anti-metabolitos (tais como azatioprina, citarabina, fosfato de fludarabina, fludarabina, gemcitabina, citarabina, cladribina, capecitabina 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, metotrexato, 5-fluoroouracil e hiroxiureia; agentes alquilantes (tal como o melfalano, busulfan, cis-platina carboplatina, ciclofosfamida, ifosfamida, dacarabazina, procarbazina, clorambucil, tiotepa, lomustina, temozolamida); agentes antimitóticos (tais como vinorelbina, vincristina, vinblastina, docetaxel, paclitaxel); inibidores de topoisomerases (por exemplo, doxorubincin, amsacrina, irinotecan, daunorrubicina, epirrubicina, mitomicina, mitoxantrona, idarrubicina, teniposido, etoposida, topotecano), antibióticos (tais como actinomicina e bleomicina); asparaginase; antraciclinas ou taxanos

d. Combinações de Radioterapia

[000191] Em algumas variações, um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco é administrado em combinação com a radioterapia. Certos tumores podem ser tratados com radiação ou radiofármacos. A radioterapia é geralmente usada para tratar tumores irressecáveis ou inoperáveis e/ou metástases tumorais. A radioterapia é normalmente entregue de três maneiras. Irradiação por feixe externo é administrada a uma distância do corpo e inclui os raios gama (60Co) e raios-X. Braquiterapia usa fontes, por exemplo, 60Co, 137Cs, 192IR, ou 125I, com ou em contato com um tecidoalvo.

e. Combinações de Agente Hormonal

[000192] Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco é administrado em combinação com um hormônio ou antihormônio. Certos cânceres estão associados com a dependência hormonal e incluem, por exemplo, câncer do ovário, câncer da mama, e câncer da próstata. Tratamento de câncer dependente de hormônio pode compreender a uso de compostos antiandrogênio ou antiestrogênio. Hormônios e anti-hormônios utilizados na terapia do câncer incluem fosfato de estramustina, fosfato de poliestradiol, estradiol, anastrozol, exemestano, letrozol, tamoxifeno, acetato de megestrol, acetato de medroxiprogesterona, octreotida, acetato de ciproterona, bicaltumida, flutamida, tritorelina, leuprorrelina, buserelina e goserelina.

[000193] Para administração, o anticorpo monoclonal anti-humanoB7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco é formulado como uma composição farmacêutica. Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpofármaco pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, em que a molécula terapêutica é combinada em mistura com um veículo farmacêuticamente aceitável. Uma composição diz-se ser um "veículo farmaceuticamente aceitável" se a sua administração pode ser tolerada por um doente receptor. Solução salina tamponada com fosfato estéril é um exemplo de um veículo farmaceuticamente aceitável. Outros veículos adequados são bem conhecidos para aqueles na área. (ver, por exemplo, Gennaro (ed)., Remington 's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, ed 19. 1995)). Formulações podem adicionalmente incluir um ou mais excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tamponantes, albumina para evitar a perda de proteína nas superfícies dos frascos, etc.

[000194] Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco é administrada a um indivíduo em uma quantidade eficaz. De acordo com os métodos da presente invenção, o conjugado anticorpo ou anticorpo fármaco pode ser administrado a indivíduos por uma variedade de modos de administração, incluindo, por exemplo, as vias de administração intramuscular, subcutânea, intravenosa, intra-auricular, intra-articular, parentérica, intranasal, intrapulmonar, transdérmica, intrapleural, intratecal e oral. Para fins de prevenção e tratamento, o conjugado anticorpo ou anticorpo fármaco pode ser administrado a um indivíduo em bolus único de entrega, através da entrega contínua (por exemplo, a administração transdérmica contínua) ao longo de um período de tempo prolongado, ou em um protocolo de administração repetido (por exemplo, em uma base horária, diária ou semanalmente).

[000195] A determinação das dosagens eficazes neste contexto é tipicamente baseada em estudos em animais modelo seguido por ensaios clínicos humanos e é guiada através da determinação de dosagens eficazes e protocolos de administração que reduzem significativamente a ocorrência ou a gravidade da doença ou distúrbio do indivíduo em indivíduos modelo. As doses eficazes das composições da presente invenção variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou um animal, outros medicamentos administrados, se o tratamento é profilático ou terapêutico, bem como a atividade específica da própria composição e a sua capacidade para eliciar a resposta desejada no indivíduo. Normalmente, o paciente é um ser humano, mas em algumas doenças, o paciente pode ser um mamífero não humano. Tipicamente, regimes de dosagens são ajustados para proporcionar uma resposta terapêutica ideal, isto é, para optimizar a segurança e eficácia. Por conseguinte, uma quantidade terapêutica ou profilacticamente eficaz é também uma em que quaisquer efeitos colaterais indesejáveis são compensados pelos efeitos benéficos de modular a atividade de células NK mediada por NKp30. Para a administração de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco, uma dosagem varia tipicamente de cerca de 0,1 µg até 100 mg/kg ou 1 µg/kg a cerca de 50 mg/kg, e mais geralmente 10 µg de 5 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em modalidades mais específicas, uma quantidade eficaz do agente está entre cerca de 1 µg/kg e cerca de 20 mg/kg, entre cerca de 10 µg/kg e cerca de 10 mg/kg, ou entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 5 mg/kg. Dosagens dentro desta faixa podem ser alcançadas pelas administrações únicas ou múltiplas, incluindo, por exemplo, as administrações múltiplas por administrações por dia ou diária, semanal, bi-semanal ou mensalmente. Por exemplo, em certas variações, um regime consiste em uma administração inicial seguida por múltiplas administrações subsequentes, em intervalos semanais ou bi-semanais. Outro regime consiste em uma administração inicial, seguida de múltiplas administrações subsequentes em intervalos mensais ou bimestrais. Alternativamente, as administrações podem ser de forma irregular, como indicado por monitorização da atividade das células NK e/ou sintomas clínicos da doença ou distúrbio.

[000196] Dosagem da composição farmacêutica pode ser variada pelo médico assistente para manter uma concentração desejada em um local de destino. Por exemplo, se um modo de entrega intravenosa é selecionado, a concentração local de agente na corrente sanguínea no tecido-alvo pode ser entre cerca de 1-50 nanomoles da composição por litro, algumas vezes entre cerca de 1,0 nanomol por litro e 10, 15, ou 25 nanomoles por litro dependendo do status do indivíduo e resposta medida projetada. Concentrações mais elevadas ou mais baixas podem ser selecionadas com base no modo de entrega, por exemplo, a entrega transepidérmica contra a entrega a uma superfície de mucosa. A dosagem deve também ser ajustada com base na taxa de liberação da formulação administrada, por exemplo, spray nasal contra pó, libração sustentada oral ou partículas injetadas, formulações transdérmicas, etc. Para atingir o mesmo nível de concentração sérico, por exemplo, partículas de liberação lenta com uma taxa de liberação de 5 nanomolares (sob condições normais), seriam administradas cerca de duas vezes a dose de partículas com uma taxa de liberação de 10 nanomolares.

[000197] Uma composição farmacêutica compreendendo uma composição de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco pode ser provida na forma líquida, em um aerossol, ou na forma sólida. As formas líquidas são ilustradas por soluções injetáveis, aerossóis, gotas, soluções e suspensões orais topológicas. Exemplos de formas sólidas incluem cápsulas, comprimidos e formas de liberação controlada. A última forma é ilustrada por meio de bombas miniosmótica e implantes. (ver, por exemplo, Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239, 1997; Ranade, "Implants in Drug Delivery", in Drug Delivery Systems 95-123 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps," in Protein Delivery: Physical Systems 239-254 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997); Yewey et al, "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant," in Protein Delivery: Physical Systems 93-117 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997).) Outras formas sólidas incluem cremes, pastas, outras aplicações topológicas, e semelhantes.

[000198] Lipossomas proveem um meio para entregar composições terapêuticas a um indivíduo, por exemplo, por via intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutânea, ou através de administração oral, inalação, ou administração intranasal. Os lipossomas são vesículas microscópicas que consistem em uma ou mais bicamadas lipídicas que circundam compartimentos aquosos. (ver, em geral, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 7>: S61, 1993; Kim, Drugs 46:618, 1993; Ranade, "SiteSpecific Drug Delivery Using lipossomes as Carriers", in in Drug Delivery Systems 3-24 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995)). Os lipossomas são semelhantes na composição a membranas celulares e, como resultado, os lipossomas podem ser administrados de forma segura e são biodegradáveis. Dependendo do método de preparação, os lipossomas podem ser unilamelares ou multilamelares, e lipossomas podem variar em tamanho, com diâmetros variando de 0,02 µm a mais de 10 µm. Uma variedade de agentes pode ser encapsulada em lipossomas: partição de agentes hidrofóbicos nas bicamadas e partição de agentes hidrofílicos dentro do espaço aquoso interno. (ver, por exemplo, Machy et al., lipossomas em Cell Biology and Pharmacology (John Libbey 1987); Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46: 1576, 1989). Além disso, é possível controlar a disponibilidade do agente terapêutico encapsulado variando o tamanho dos lipossomas, o número de bicamadas de lípidos, a composição, bem como as características de carga e de superfície dos lipossomas.

[000199] Os lipossomas podem adsorver praticamente qualquer tipo de célula e, em seguida, lentamente liberam o agente encapsulado. Alternativamente, um lipossoma absorvido pode ser sujeito a endocitose por células que são fagocíticas. Endocitose é seguido por degradação intralisossomal de lípidos lipossômicas e liberação dos agentes encapsulados (ver Scherphof et al., Ann. NY Acad. Sci. 446:368, 1985). Após administração intravenosa, os lipossomas pequenos (0,1 a 1,0 µm) são tipicamente absorvidos pelas células do sistema reticuloendotelial, localizadas principalmente no fígado e baço, enquanto que os lipossomas maiores do que 3,0 µm são depositados no pulmão. Esta absorção preferencial de lipossomas menores por parte das células do sistema reticuloendotelial tem sido utilizada para entregar agentes quimioterapêuticos para macrófagos e para os tumores do fígado.

[000200] O sistema reticuloendotelial pode ser contornado por vários métodos, incluindo a saturação com doses grandes de partículas de lipossomas, ou inativação seletiva de macrófagos por meios fármacológicos (ver Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428, 1984). Além disso, a incorporação de fosfolípidos derivatizados de glicolipídeos ou polietileno glicol em membranas de lipossomas tem sido mostrada para resultar em uma absorção significativamente reduzida pelo sistema reticuloendotelial (ver Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068: 133, 1991; Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9, 1993).

[000201] Os lipossomas podem também ser preparados para células-alvo específicas ou órgãos, variando a composição de fosfolípido ou através da inserção de receptores ou contrarreceptores nos lipossomas. Por exemplo, lipossomas, preparados com um teor elevado de um surfactante não iônico, têm sido utilizados para alcançar o fígado. (Ver, por exemplo, Patente Japonesa, 04-244,018 para Hayakawa et al.; Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960, 1993). Estas formulações foram preparadas por mistura de fospatidilcolina de soja, α-tocoferol, e óleo de rícino etoxilado hidrogenado (HCO-60) em metanol, concentrando-se a mistura sob vácuo, e, em seguida, reconstituindo-se a mistura com água. Uma formulação lipossomal de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) com uma mistura de esterilglucosídeo derivado de soja (SG) e colesterol (Ch) também tem sido demonstrada para alvejar o fígado. (ver Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881, 1997).

[000202] Alternativamente, vários contrarreceptores alvo podem ser ligados à superfície do lipossoma, tais como anticorpos, fragmentos de anticorpos, carboidratos, vitaminas e proteínas de transporte. Por exemplo, para direcionamento para o fígado, os lipossomas podem ser modificados com derivados de galactosillípidio do tipo ramificado para atingir receptores de asialoglicoproteína (galactose), que são exclusivamente expressos na superfície das células do fígado. (ver Kato e Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrirer Syst. 14:287, 1997; Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20: 259, 1997). Em uma abordagem mais geral para a segmentação do tecido, as células alvo são pré-rotuladas com anticorpos biotinilados específicos para um contra-receptor expresso pela célula alvo. (Ver Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99, 1998). Depois de eliminação plasmática de anticorpo livre, conjugados estreptavidina-lipossomas são administrados. Em uma outra abordagem, os anticorpos de segmentação estão diretamente ligados a lipossomas. (Ver Harasym et al., Supra).

[000203] Conjugados anticorpos ou anticorpo-fármaco podem ser encapsulados dentro de lipossomas utilizando técnicas padrão de microencapsulação de proteína. (Ver, por exemplo, Anderson et al., Infect. Immun. 31: 1099, 1981; Anderson et al., Cancer Res. 50:1853, 1990; Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95, 1991; Alving et al., "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies," in Liposome Technology (Vol. Ill) 317 (Gregoriadis, ed., CRC Press, 2nd ed. 1993); Wassef et al, Meth. Enzymol. 149:124, 1987). Como notado acima, lipossomas terapeuticamente úteis podem conter uma variedade de componentes. Por exemplo, os lipossomas podem compreender derivados lipídicos de poli (etileno glicol). (Ver Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9, 1993).

[000204] Microesferas de polímero degradáveis foram projetadas para manter altos níveis sistêmicos de proteínas terapêuticas. Microesferas são preparadas a partir de polímeros degradáveis, tais como poli (lactido-co-glicólido) (PLG), polianidridas, poli (orto ésteres), polímeros de acetato de etilvinil não biodegradáveis, no qual as proteínas são aprisionadas no polímero. (Ver, por exemplo, Gombotz e Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332, 1995; Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery," in Drug Delivery Systems 51-93 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery," in Protein Delivery: Physical Systems 45-92 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997); Bartus et al, Science 281 : 1161, 1998; Putney and Burke, Nature Biotechnology 16: 153, 1998; Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548, 1998). Nanoesferas revestidas de polietileno glicol (PEG) podem também proporcionar veículos para administração intravenosa de proteínas terapêuticas. (Ver, por exemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167, 1997).

[000205] Outras formas de dosagem podem ser concebidas por aqueles versados na técnica, como mostrado por, por exemplo, Ansel e Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lea & Febiger, 5th ed. 1990); Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995), and Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).

[000206] Composições farmacêuticas, como aqui descritas podem também ser utilizadas no contexto da terapia de combinação. O temo "terapia de combinação" é aqui utilizado para denotar que um indivíduo é administrado pelo menos com uma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco, em combinação com um segundo agente para o tratamento de uma doença ou distúrbio. O anticorpo anti-B7H6 ou conjugado de anticorpo-fármaco e o segundo agente pode ser, por exemplo, coadministrado em conjunto (por exemplo, como uma única composição compreendendo ambos os agentes, ou simultaneamente como composições separadas no mesmo ou substancialmente o mesmo sítio) ou, alternativamente, administrados separadamente (por exemplo, em tempos diferentes e/ou nos locais de administração diferentes).

[000207] As composições farmacêuticas podem ser providas como um kit compreendendo um recipiente que compreende um aqui polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo, tal como descrito. Uma molécula terapêutica pode ser provida, por exemplo, sob a forma de uma solução injetável para administração de doses únicas ou múltiplas, ou como um pó estéril que irá ser reconstituído antes da injeção. Alternativamente, tal kit pode incluir um dispersor de pó seco, gerador de aerossol líquido, ou nebulizador para administração de um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo. Tal kit pode adicionalmente compreender uma informação gravada sobre as indicações e uso da composição farmacêutica. Por exemplo, essas informações podem incluir uma declaração de que uma composição anti-B7H6 é contra-indicada em pacientes com hipersensibilidade conhecida ao B7H6.

C. Métodos de detecção de B7H6 Expression

[000208] Os anticorpos aqui descritos têm também uso em métodos de detecção de expressão de B7H6, incluindo as utilizações de diagnóstico. Detecção de expressão de B7H6 pode ser importante por várias razões. Por exemplo, expressão de B7H6 em células ou tecidos pode ser utilizada na detecção do câncer. A detecção pode ser utilizada como parte de triagem, o diagnóstico, ou prognóstico de câncer. O método de detecção pode ser utilizado para comparar o nível de expressão de B7H6 em uma amostra biológica a partir de um indivíduo a um padrão ou referência, como parte de determinar a severidade ou estágio do câncer ou monitorização do tratamento. O método de detecção pode ocorrer uma vez ou ser usado várias vezes para os mesmos usos como o monitoramento, por exemplo, para monitorar o progresso de um indivíduo durante o tratamento para indicar se o câncer é recorrente.

[000209] Em certas modalidades, um método de detecção de expressão celular de B7H6 inclui colocar em contato uma amostra biológica a ser testada com um anticorpo monoclonal anti-B7H6 e depois detecção da ligação do anticorpo. A ligação do anticorpo indica a presença de B7H6 sobre a célula. O anticorpo e B7H6 formam um complexo anticorpo-antígeno e as condições sob as quais as formas complexas serão dependentes da amostra biológica e o método utilizado, e são prontamente determinações feitas por aqueles versados na técnica. Os anticorpos adequados incluem anticorpos que competem para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano com um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado de entre o grupo consistindo em (i) o hibridoma do clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1-4242), (ii ) hibridoma a do clone 9G9.2 (Depósito N° CNCM 1-4243), (iii) o hibridoma do clone 10E2.9 (Depósito N° CNCM 1-4244), e (iv) o hibridoma do clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM 1-4245).

[000210] A amostra biológica pode compreender células humanas intactas ou uma fração de membrana da célula a ser testada. Por exemplo, as células testadas com os métodos reivindicados irão incluir células suspeitas de expressar B7H6 e associadas com o câncer em um indivíduo, tal como, por exemplo, as células cancerígenas do cólon, células cancerígenas do fígado, células cancerígenas cervicais, células cancerígenas do pulmão, células cancerígenas do pâncreas, células cancerígenas da próstata, células de leucemia pró-emocítica, células do linfoma de célula B, células de linfoma monocítico, células de eritroleucemia, células de linfoma de Burkitt e células de leucemia mielógena crônica, para nomear algumas.

[000211] Detecção de ligação pelo anticorpo para indicar a presença de uma célula que expressa B7H6 incluem ensaios para a ligação específica por qualquer método conhecido na área. Existem diversos formatos de ensaio de ligação que são bem conhecidos. Por exemplo, sistemas de ensaio de ligação podem ser diretos ou indiretos, utilizando tais técnicas de western blot, radioimunoensaio, ELISA, imunoensaios em "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, ensaios de precipitina, ensaios de precipitina em gel de difusão, ensaios imunorradiométricos, imunotestes fluorescentes, imunoensaios de proteína A, ensaios de fixação de complemento, para citar apenas alguns. Tais ensaios são de rotina e bem conhecido na área. Para melhorar a detecção, o anticorpo é marcado com um rótulo detectável tal como um radioisótopo, um rótulo fluorescente, um rótulo quimioluminescente, um rótulo de enzima, ou uma etiqueta bioluminescente. Métodos de conjugação de rótulos para os anticorpos são conhecidos na área e qualquer método adequado pode ser usado.

[000212] A presente invenção adicionalmnente provê um método para diagnosticar um indivíduo suspeito de ter um tipo de câncer expressando B7H6. O método compreende a administração ao indivíduo, geralmente um humano (mas pode ser outro mamífero tal como um primata não humano, cão, gato, porco, etc.), de um anticorpo monoclonal anti-B7H6 conjugado com um rótulo detectável, tal como os descrito acima. Os anticorpos adequados incluem anticorpos aqueles que competem para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 humano (resíduos de aminoácidos 25-266 da SEQ ID NO: 2) com um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado de entre (i) o hibridoma de número de designação de clone 4E5.5 , (ii) o hibridoma de número de designação de clone 9G9.2, (iii) o hibridoma de número de designação de clone 10E2.9, e (iv) o hibridoma de número de designação de clone 17B1.3. Em algumas modalidades, o anticorpo compete para a ligação ao domínio extracelular de B7H6 com um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado de entre (ii) - (iii) acima. Em variações específicas, o anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado derivado de um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado de entre (i) - (iv) acima ou a partir de (ii) - (iii) acima. Após a administração do anticorpo, a distribuição do anticorpo dentro do indivíduo é detectada. Métodos para detectar a distribuição de qualquer rótulo específico são conhecidos dos versados na técnica e qualquer método adequado pode ser usado. Alguns exemplos não limitantes incluem, tomografia computadorizada (TC), tomografia por emissão de posição (PET), ressonância magnética (MRI), fluorescência, quimioluminescência e ultra-sonografia.

[000213] A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Produção e seleção de anticorpos monoclonais antihumanos B7H6 de camundongo
A. Imunização
um camundongo Balb/c foi imunizado de acordo com o protocolo seguinte:
D0: injeção i.v. de 100 µg de B7H6 solúvel (o domínio extracelular de B7H6 humano com uma fusão Fc C-terminal murino (hB7H6/mFc2; forma madura, como mostrado nos resíduos 25-500 da SEQ ID NO: 3)).
D15: injeção i.v. de 100 µg de B7H6 solúvel
D25: Reforço i.p., com 100 µg de B7H6 solúvel

[000214] Três dias após a terceira imunização, o baço foi colhido. Os esplenócitos foram isolados e fundidos com células de mieloma e semeados em 40 placas de 96 poços. Após 3 semanas em cultura, sobrenadantes de 3840 hibridomas foram pesquisados quanto à presença de anticorpos monoclonais anti-humano-B7H6.

B. Primeira triagem de hibridomas

[000215] Para selecionar os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais anti-humano-B7H6, células P815 que expressam B7H1 e células P815 que expressam B7H6 foram coradas com o sobrenadante dos hibridomas 3840. A coloração dos hibridomas foi revelada por análise FACS utilizando Ig anticamundongo conjugado com Cy5. Para diferenciar, os dois transfectantes P815, células P815 B7-H1 foram coradas com CFSE primeiro. Os resultados mostraram 114 de 3840 sobrenadantes de hibridoma positivos para a coloração de células que expressam B7H6 P815 em relação a células P815 que expressam B7H1, indicando assim a produção de mAbs anti-B7H6 pelos hibridomas correspondentes.

C. Segunda Triagem de hibridomas

[000216] A segunda triagem foi feita para selecionar anticorpos bloqueadores. A fim de identificar esses hibridomas, a capacidade de cada um dos 114 sobrenadantes para bloquear NKp30Fc que se liga células P815.B7H6 foram avaliados. Os hibridomas selecionados foram verificados em paralelo para confirmar se eles ainda estavam produzindo mAbs anti-B7H6 pela coloração P815.B7H6. Além disso, um anticorpo policlonal anti-B7H6 (pAb), previamente mostrado para inibir a ligação de NKp30 a células que expressam B7H6 P815 foi utilizado como um controle positivo.

[000217] Os resultados mostraram que células P815.B7-H6 foram coradas por NKp30Fc e o pAb anti-B7H6 inibiu a coloração quando incubado a 10 µg/ml. Os 114 sobrenadantes foram divididos em 4 grupos de acordo com os resultados: (1) hibridomas que produzem mAbs anti-B7H6 que bloquearam ligação de NKp30Fc (1/114), (2) hibridomas que produzem mAbs anti-B7H6 que não bloquearam ligação de NKp30Fc (27/114), (3) hibridomas que produzem mAbs anti-B7H6 que bloquearam parcialmente ligação de NKp30Fc (1/114), (4) hibridomas que não produzem mais mAbs anti-B7H6 (85/114). Conclusão, 29 hibridomas eficientemente produziram mAbs anti-B7H6 e apenas 2 deles podem estar bloqueando mAbs. Os 29 hibridomas que produzem mAbs anti-B7H6 foram clonados.

D. Clonagem de hibridomas

[000218] Depois de clonagem de 29 hibridomas selecionados, 11 hibridomas não crescem, 5 hibridomas apenas aumentaram clones negativos e 13 geraram clones positivos. Amplificação em frascos resultou em apenas 9 clones derivados de 5 hibridomas diferentes ainda produzindo mAb anti-B7H6. Os clones que se seguem foram caracterizados e todos foram identificados como IgGl de camundongo: 4E5.5, 5E1.4, 9G9.2, 10E2.9, e 17B1.3.

[000219] Os hibridomas que expressam anticorpos monoclonais para B7H6 foram depositados com a Coleção Nacional de Culturas de Micro-organismos (CNCM, Instituto Pasteur, Paris, França), patente depositada como depósito original sob o Tratado de Budapeste e receberam os seguintes números de acesso de depósito CNCM: clone 4E5.5 (Depósito n° CNCM I-4242, depositado em 18 de novembro de 2009); clone 9G9.2 (Depósito n° CNCM I-4243, depositado em 18 de novembro de 2009); clone 10E2.9 (Depósito n° CNCM I-4244, depositado em 18 de novembro de 2009); e clone 17B1.3 (Depósito n° CNCM I-4245, depositado em 18 de novembro de 2009).

Exemplo 2: Caracterização de anticorpos monoclonais anti-humanoB7H6 de camundongo A. Reatividade de anticorpo monoclonal anti-B7H6 humano de camundongo para linhagens de células tumorais.

[000220] Cada mAb de anti-humano-B6H7 (4E5.5, 5E1.4, 9G9.2, 10E2.9, e 17B1.3) foi comparado com o anticorpo policlonal anti-B7 H6 para a coloração das seguintes linhagens da célula tumoral: HEK-293, HeLa EV2, K562, e Raji. Células P815.B7H6 e células P815.B7-H1 foram utilizadas como um controle positivo e um controle negativo, respectivamente. Cada um dos cinco mAbs foi positivo para a coloração em cada uma das linhagens de células tumorais, com algumas variações no perfil de intensidade da coloração para cada mAb. Por exemplo, 17B1.3 manchou P815.B7-H6 com a mesma intensidade do que o pAb, no entanto, não manchou as células Raji com a mesma eficácia. Além disso, a coloração de células HEK-293 e células HeLa EV2 foi ligeiramente menos intensa com 17B1.3 do que com o pAb, enquanto a coloração de K562 foi ligeiramente menos com 4E5.5 do que com o pAb.

C. Diferenciação de epítopo por ensaio de competição

[000221] Para definir se os mAbs 4E5.5, 5E1.4, 9G9.2, 10E2.9 e 17B1.3 atingiram epítopos diferentes, um ensaio de competição entre os mAbs foi feito. O único clone diretamente conjugado com um fluorocromo (Alexa 647, Molecular Probes) foi 9G9.2. Portanto, este anticorpo foi utilizado para avaliar a ligação de 9G9.2-Alexa 647 a células HEK 293 após a incubação com os outros mAbs anti-B7H6 purificados. Células HEK-293 foram primeiro incubadas com os mAbs purificados em 30 µg/ml, em seguida, com 9G9.2 Alexa 647 a 10 µg/ml. A coloração do HEK-293 com 9G9.2-Alexa 647 foi então avaliada por FACS (R) (BD Sciences, Inc., Franklin Lakes, NJ). Os resultados desta análise mostraram que a pré-incubação de células HEK-293 com mAbs 10E2.9, 4E5.5, ou 9G9.2 substancialmente diminuiu a intensidade da coloração com 9G9.2-Alexa 647. Préincubação com 10E2.9, 4E5.5, ou 9G9.2 substancialmente diminuiu intensidade de coloração com 9G9.2-Alexa 647, enquanto a préincubação com 5E1.4 apenas ligeiramente reduziu a intensidade de coloração. A pré-incubação com 17B1.3 não teve nenhum efeito significativo sobre coloração 9G9.2-Alexa 647. Estes resultados mostram que 10E2.9, 4E5.5, e 9G9.2 alcançaram sobreposição de (se não substancialmente os mesmos ou semelhantes) epítopos. Em contraste, 17B1.3 e 9G9.2 (e possivelmente 5E1.4 e 9G9.2) reconheceu epítopos não sobrepostas.

D. Anticorpos monoclonais anti-humano-B7H6 de camundongo parcialmente bloqueiam a ligação de NKp30Fc

[000222] Para identificar os mAbs que tiveram algum bloqueio de ligação de NKp30Fc, um ensaio de competição foi realizado. NKp30Fc é uma forma solúvel de NKp30 humano consistindo no domínio extracelular de NKp30 humano com uma fusão Fc C-terminal. A ligação de NKp30Fc a células HEK 293 após a incubação com anticorpo policlonal B7H6, mlgGl, controle, e mAbs 4E5.5, 5E1.4, 9G9.2, 10E2.9 e 17B1.3 anti-B7-H6 purificados foi avaliada. Células HEK-293 foram primeiro incubadas com os mAbs purificados em 30 µg/ml lavadas, em seguida, incubadas com o complexo pré-formado NKp30Fc (5 µg/ml)/PE-conjugado anti-hulg (5 µg/ml, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Colorações fluorescentes foram analisadas em um BD FACSCalibur® (BD Sciences Inc)., utilizando software FlowJo (Tree Star, Inc. Ashland, OR). Os resultados mostraram que 4E5.5 e 17B1.3 parcialmente bloquearam ligação de NKp30Fc.

E. Anticorpos monoclonais anti-humano-B7H6 de camundongo bloqueaiam parcialmente ativação de DOMSP30

[000223] Para confirmar que 17B1.3 e 4E5.5 estavam bloqueando mAbs, um ensaio funcional com as células repórter DOMSP30 foi realizado. Células DOMSP30 foram utilizadas como um sistema de célula repórter para avaliar se B7H6 foi capaz de induzir a sinalização diretamente através de NKp30. (Ver Schleinitz et al. Arthritis Rheum. 58:32156-3223 de 2008, para DOMSP30 células). Ativação de DOMSP30 pôde ser detectada por produção de IL-2, após 24 horas de estimulação ou por regulação ascendente de CD69 após 4 horas de estimulação. Células DOMSP30 foram cocultivadas quer com células HeLa EV2 ou linhagens de células HeLa PF na presença ou ausência de anti-NKp30, anti-NKp46, anticorpo policlonal anti-B7H6, IgGl de camundongo ou um dos anticorpos monoclonais anti-humano-B7H6 5E1 e 4E5.5. 4, 9G9.2, 10E2.9 e 17B1.3 (a 10 µg/ml). Após 4 horas de cocultura, o número (por cento) de CD69 + células DOMSP30 foi medido.

[000224] Os resultados mostraram que anti-NKp30 completamente bloqueou ativação de DOMSP30 e que 4E5.5 e 17B1.3 parcialmente inibiu ativação de DOMSP30. Resumidamente, na ausência de anticorpo, cerca de 75% de células DOMSP30 foram CD69+, em comparação com as seguintes porcentagens de CD69+ com cocultivo de anticorpo: menos de 10% com o anti-NKP30; cerca de 20% com o pAb anti-B7H6; e cerca de 45 % com cada um dos mAbs 4E5.5 e 17B1.3. Em contraste, o anti-NKp46 e cada um dos mAbs 9G9.2, 10E2.9, e 5E1.4 não mostraram, nenhum efeito sobre ativação de DOMSP30.

F. Anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 17B1.3 de camundongo é um anticorpo blotting

[000225] A capacidade dos mAbs anti-B7H6 para agir como anticorpos blotting foi testada através da realização de experiências de immunoblotting com extratos de proteína a partir de três linhagens de células diferentes: KHYG-1, que não expressam B7H6, e P815.B7-H6 e HEK293, que cada um expressa B7H6. pAb anti-B7H6 foi utilizado como um controle positivo. As células foram recolhidas, lavadas em PBS fria 1X, suspensas em tampão de lise (10 mM de Tris-HCl pH 7,6; 150 mM de NaCl, 1% de Triton X; 1X inibidor da protease (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) a uma concentração de 20.106 células .mL-1 e deixadas em gelo durante 30 min. Os lisados foram então centrifugados por 10 min, a 13 200 rpm, a 4°C. O sobrenadante foi recolhido e concentração de proteína BCA medida com kit de Pierce e ajustada para 1.5mg/ml. 30 µL de cada lisado celular foi misturado com 10 µL de Tampão de Carregamento 4X e aquecida durante 10 min a 95°C. C. Eles foram então carregados em um gel pré-moldado (2-20% de gel de proteína precisa da Thermo científico) e executado em 110 V. Após a eletroforese, as amostras foram transferidas em uma membrana usando o kit regular iBlot Gel Tranfer Stack Nitrocelulose, (Invitrogen, San Diego, CA). A membrana foi saturada em TBST 1X (100 mM de Tris HC1 pH = 7,5 + 0,9% HCl + 0,05% de Tween) + 5% de leite durante 1h à temperatura ambiente e depois incubada com cada mAbs anti-B7H6 em 2 µg.mL-1 em 1X TBST + 5% de leite durante a noite a 4°C. A membrana foi lavada 2 vezes por 10 min em 1X TBST e incubada durante 1 h, à TA, com um anticorpo IgG de ovelha anti-camundongo acoplado a peroxidase de rábano silvestre diluída em 1X de leite TBST + 5%. A membrana foi então lavada 4 vezes por 20 min em TBST e revelada com kit ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

[000226] Entre os cinco mAbs, apenas mAb 10E2.9 (10 µg/ml) foi capaz de realizar como um mAb immunoblotting, nas condições testadas. Estes resultados sugerem que os epítopos B7H6 para mAbs 4E5.5, 5E1.4, 9G9.2, e 17B1.3 não podem ser lineares, mas podem em vez disso, compreender as regiões descontínuas do polipeptídeo B7H6.

G. Três dos cinco anticorpos monoclonais anti-humanoB7H6 são eficientes para imunoprecipitação

[000227] Para avaliar se 4E5.5, 5E1.4, 9G9.2, 10E2.9 e 17B1.3 poderia ser eficiente para imunoprecipitações, extratos de proteína P815.B7-H6 foram preparados e imunoprecipitações foram realizadas com os mAbs diferentes. Os imunoprecipitados foram executados em um gel de SDS e presença de B7H6 foi observada utilizando o anticorpo policlonal anti-B7H6 e Ig anticamundongo conjugaod com HRP. Os resultados mostraram que 4E5.5, 9G9.2 e 10E2.9 imunoprecipitaram B7H6 a partir de extratos de proteína P815.B7-H6, enquanto que 5E1.4 e 17B1.3 não.

Exemplo 3: Modelo de carcinoma pancreático BxPC3 para avaliar a eficácia de um anticorpo anti-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco contra o crescimento do tumor

[000228] Para testar se um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco monoclonal anti-humano-B7H6 tem atividade sobre o crescimento do tumor em camundongos, os grupos de camundongos são injetados s.c. com o tumor pancreático BxPC3 no Dia 0. Uma vez que os tumores crescem para 150-200 milímetros3 , grupos de camundongos (n = 10/gp) camundongos são então injetados com 1mg/kg a 30mg/Kg reagente de controle, o antianticorpo B7H6, ou conjugado fármaco-anticorpo anti-B7H6 - 3X/semana por 3 semanas. O volume do tumor é monitorado 3x/semana durante 5 semanas. Tumores significativamente menores em camundongos injetados com um anticorpo anti-B7H6 ou conjugado fármaco-anticorpo, em comparação com camundongos injetados com o reagente de controle, indica a eficácia do antagonista para a inibição do crescimento do tumor.

[000229] Projeto do estudo: Camundongos SCID CB-17 de oito a dez semanas de idade do sexo feminino (Charles River Laboratories) são injetados s.c. no flanco direito com 2 x 106 de células BxPC-3 no dia 0. Começando com um tamanho do tumor de 150-200 mm3 , grupos de camundongos (n = 10/grupo) são injetados i.p. com 1mg/kg a 30mg/Kg de reagente de controle, o anti-anticorpo B7H6, ou conjugado anticorpo-fármaco anti-B7H6 1X-3X/semana por 3 semanas. O crescimento do tumor é monitorado 3x/semana durante 5 semanas, utilizando medições de calibrador. O volume tumoral é calculado usando a fórmula ½ * (B)2 * L (mm3).

Exemplo 4: Inibição de crescimento de células de carcinoma hepatocelular humano in vivo utilizando anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 ou o conjugado fármaco-anticorpo

[000230] Para avaliar a atividade anti-tumor de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado fármaco-anticorpo contra células humanas de carcinoma hepatocelular in vivo, grupos de camundongos BALB/c nus são injetados com ou células de carcinoma hepatocelular HuH7 ou C3a no Dia 0. Grupos (n = 10/grupo) de camundongos portadores de tumor recebem 5-75 µg de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou do conjugado fármaco-anticorpo injeção i.p. ou peritumoral em dias alternados (EOD) a partir dos dias 5-33. O volume do tumor é monitorado 3x/semana durante 6 semanas. A inibição do crescimento do tumor por anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 ou o conjugado fármaco-anticorpo indica que a respectiva proteína tem efeitos inibidores sobre o carcinoma heptocelular humano in vivo.

[000231] Projeto do estudo: Camundongos BALB/c nude de oito semanas de idade do sexo feminino (Charles River Laboratories) são injetados s.c. no flanco direito com 6 x 106 de células HuH7 ou C3a no dia 0. Grupos de camundongos (n = 10/grupo) são injetados i.p. ou peritumoralmente com 5 µg-75 µg de um anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco a partir de 5-33 dias. As injeções são dadas em um volume total de 200 µL. O crescimento do tumor é monitorado 3x/semana durante 6 semanas, utilizando medições de calibrador. O volume tumoral foi calculado usando a fórmula ½ * (B)2 * L (mm3).

Exemplo 5: Inibição de crescimento de células de carcinoma da próstata humana in vivo utilizando anticorpo monoclonal anti-humanoB7H6 ou o conjugado fármaco-anticorpo

[000232] Para avaliar a atividade antitumoral de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado fármaco-anticorpo contra células de carcinoma da próstata humana in vivo, grupos de camundongos BALB/c nus são injetados com Células de carcinoma da próstata PC-3 ou DU-145 no dia 0. Grupos (n = 10/grupo) de camundongos portadores de tumor recebem 5-75 µg de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou do conjugado fármaco-anticorpo por injeção i.p. ou peritumoral em dias alternados (EOD) entre os Dias 5- 33. O volume do tumor é monitorado 3x/semana durante 6 semanas. A inibição do crescimento do tumor (em volume ou peso) por um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpofármaco indica que a respectiva proteína tem efeitos inibidores sobre o carcinoma da próstata humana in vivo.

[000233] Projeto do estudo: Camundongos BALB/c nude de oito semanas de idade do sexo feminino (Charles River Laboratories) são injetados s.c. no flanco direito ou ortotopicamente no lobo da próstata, com 10 x 106 de PC-3 ou células 6 x 106 de células DU-145 no dia 0. Grupos de camundongos (n = 10/grupo) são injetados i.p. ou peritumoralmente (s.c. único modelo) com 5-75 µg de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado fármaco-anticorpo de 5- 33 dias. As injeções são dadas em um volume total de 200 µL. Para tumores s.c., o crescimento do tumor é monitorado 3x/semana durante 6 semanas, utilizando medições de calibrador. O volume tumoral é calculado usando a fórmula ½ * (B)2 * L (mm3). Para tumores ortotópicos, os camundongos são terminados no final do estudo e o tumor pesado para permitir a avaliação da carga tumoral.

Exemplo 6: Inibição de células de carcinoma de cólon humano in vivo utilizando anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou o conjugado fármaco-anticorpo

[000234] Para avaliar a atividade antitumeoral de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado fármaco-anticorpo contra células de carcinoma do cólon humano in vivo, grupos de camundongos BALB/c nus são injetados com células de carcinoma de cólon DLD-1 ou HCT-116 no dia 0. Grupos (n = 10/grupo) de camundongos portadores de tumor recebem 5-75 µg de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou do conjugado fármaco-anticorpo por injeção i.p. ou peritumoral em dias alternados (EOD) entre os Dias 5- 33. O volume do tumor é monitorado 3x/semana durante 6 semanas. A inibição do crescimento do tumor (em volume ou peso) por anticorpo monoclonal anti-B7H6 humano ou do conjugado fármaco-anticorpo sugere que a respectiva proteína tem efeitos inibidores sobre o carcinoma de cólon humano in vivo.

[000235] Projeto do estudo: Camundongos BALB/c nude de oito semanas de idade do sexo feminino (Charles River Laboratories) são injetados s.c. no flanco direito ou ortotopicamente na parede do cólon com 6 x 106 de células DLD-1 ou HCT-116 no dia 0. Grupos de camundongos (n = 10/grupo) são injetados i.p. ou peritumoralmente (por s.c. único modelo) com 5-75 µg de anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 ou conjugado fármaco-anticorpo entre 5 - 33 dias. As injeções são dadas em um volume total de 200 µL. Para tumores s.c., o crescimento do tumor é monitorado 3x/semana durante 6 semanas, utilizando medições de calibrador. O volume tumoral é calculado usando a fórmula ½ * (B)2 * L (mm3). Para tumores ortotópicos, os camundongos são terminados no final do estudo e o tumor pesado para permitir a avaliação da carga tumoral.

Exemplo 7: Inibição de células de carcinoma do pâncreas humano in vivo utilizando anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou o conjugado fármaco-anticorpo

[000236] Para avaliar a atividade anti-tumor de um anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco contra células de carcinoma de pâncreas humano in vivo, os grupos de camundongos BALB/c nus são injetados com células de carcinoma pancreático BxPC-3 ou HPAF-II no dia 0. Grupos (n = 10/grupo) de camundongos portadores de tumor recebem 5-75 µg de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou do conjugado fármaco-anticorpo por injeção i.p. ou peritumoral em dias alternados (EOD) entre os Dias 5- 33. O volume do tumor é monitorado 3x/semana durante 6 semanas. A inibição do crescimento do tumor (em volume ou peso) por anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado fármaco-anticorpo sugere que a respectiva proteína tem efeitos inibidores sobre o carcinoma pancreático humano in vivo.

[000237] Projeto do estudo: Camundongos BALB/c nude de oito semanas de idade do sexo feminino (Charles River Laboratories) são injetados s.c. no flanco direito ou ortotopicamente no lobo pancreático com 6 x 106 de células BxPC-3 ou HPAF-II Dia 0. Grupos de camundongos (n = 10/grupo) são injetados i.p. ou peritumoralmente (para o modelo apenas s.c.) com 5-75 µg de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou o conjugado fármaco-anticorpo a partir de 5-33 dias. As injeções são dadas em um volume total de 200 µL. Para tumores s.c., o crescimento do tumor é monitorado 3x/semana durante 6 semanas, utilizando medições de calibrador. O volume tumoral foi calculado usando a fórmula ½ * (B)2 * L (mm3). Para tumores ortotópicos, os camundongos são terminados no final do estudo e o tumor pesado para permitir a avaliação da carga tumoral.

Exemplo 8: Inibição de linfoma de células B in vivo utilizando anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou o conjugado fármaco-anticorpo

[000238] Linhagens de células B de linfoma humano são mantidas in vitro por passagem em meio de crescimento. As células são lavadas exaustivamente em PBS para remover componentes de cultura.

[000239] Camundongos SCID são injetados com (tipicamente) 1 x 106 células de linfoma humano através da veia da cauda em um volume de 100 microlitros. O número ideal de injeção de células é determinado empiricamente em um estudo piloto para originar tumor tendo forma consistente com a cinética desejada. Anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 ou o tratamento conjugado anticorpo-fármaco é iniciado no dia seguinte por um implante subcutâneo de uma minobomba osmótica ALZET ® (ALZET, Cupertino, CA) ou por injeção i.p. diária de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpofármaco ou veículo. Os camundongos são monitorizados para a sobrevivência e morbidade significativa. Os camundongos que perdem mais do que 20% do seu peso corporal inicial são sacrificados, bem como camundongos que apresentam uma substancial morbidade, tais como paralisia dos membros posteriores. Dependendo da linhagem celular de linfoma empregue, os camundongos não tratados normalmente morrem em 3 a 6 semanas. Para linfomas de células B, que secretam IgG ou IgM, a progressão da doença também pode ser monitorada semanalmente com amostras de sangue e medição dos níveis séricos de imunoglobulina humana por ELISA.

Resposta de dose de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou um conjugado anticorpo - fármaco/modelo IM-9

[000240] Camundongos são injetados com 1 x 106 de células IM-9, e no dia 28 implantados com minibombas osmóticas no dia seguinte. As bombas são carregadas com as seguintes concentrações de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou o conjugado fármaco-anticorpo para entrgar: 0, 0.12, 1.2, ou 12 microgramas por dia, com 8 camundongos por grupo de dose. O reforço da proteção de camundongos a partir da linhagem de células de tumor com dose aumentada de anticorpo ou conjugado anticorpo fármaco indica que os efeitos do anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco são dependentes da dose. Camundongos sobreviventes no final da experiência não apresentam sinais de doença e sem IgG humana detectável no seu soro.

[000241] Estes dados demonstram que a eficácia de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou do conjugado fármaco-anticorpo em modelos de linfoma de camundongo SCID correlaciona-se com a capacidade de inibir o crescimento das linhagens celulares de linfoma in vivo.

Exemplo 9: Inibição de células B derivadas de tumores in vivo utilizando anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou do conjugado fármaco-anticorpo

[000242] A administração de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou do conjugado fármaco-anticorpo por infusão constante através de minibombas osmóticas resulta em concentrações de estado estacionário no soro proporcional à concentração do anticorpo monoclonal antihumano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco contido na bomba. 0,22 ml de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou do conjugado fármaco-anticorpo contido na solução salina tamponada com fosfato (pH 6,0) a uma concentração de 2 mg/ml ou 0,2 mg/ml é carregado sob condições estéreis em bombas miniosmóticas Alzet (modelo 2004; Alza Corporation Palo Alto, CA). As bombas são implantadas subcutâneamente em camundongos através de uma incisão de 1 cm na pele dorsal, e a pele é fechada com fechos de feridas estéreis. Estas bombas são projetadas para entregar o seu conteúdo a uma taxa de 0,25 µL por hora ao longo de um período de 28 dias. Este método de administração resulta em aumento significativo na sobrevivência em camundongos injetados com células tumorais (abaixo).

Efeito de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou o conjugado fármaco-anticorpo em tumores derivados de células B in vivo

[000243] Os efeitos de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou o conjugado fármaco-anticorpo são testados in vivo utilizando um modelo de xenoenxerto de tumor de camundongo aqui descrito. O modelo de xenoenxerto a ser testado é linhagem celular de linfoblastooide humana IM-9. Camundongos CB-17 SCID (CB-17/IcrHsd-scid do sexo feminino; Harlan, Indianapolis, Indiana) são divididos em 4 grupos. No dia 0, células IM-9 são colhidas a partir de cultura e injetadas por via intravenosa, através da veia da cauda, em todos os camundongos (cerca de 1.000.000 células por camundongo). No dia 1, bombas miniosmóticas contendo artigo de teste ou artigo de controle são implantadas subcutaneamente nos camundongos. Aos camundongos em grupos de 1-3 (n = 9 por grupo) são entregues anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou o conjugado fármaco-anticorpo: grupo 1 contém 2,0 mg/mL de anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou o conjugado fármaco-anticorpo e é entregue 12 µg por dia, grupo 2 contém 0,20 mg/mL e é entregue 1,2 µg por dia, grupo 3 contém 0,02 mg/mL e é entregue 0,12 µg por dia. Os camundongos do grupo 4 (n = 9), são um controle e são tratados com veículo (PBS, pH 6,0).

[000244] Sobrevivência aumentada dos grupos de tratamento (por exemplo, quer 12 µg/dia ou 1,2 µg/dia) em comparação com camundongos tratados com veículo mostra que o anticorpo monoclonal anti-humano-B7H6 ou conjugado anticorpo-fármaco reduz os efeitos das células tumorais de células B in vivo.

[000245] A partir do exposto, será apreciado que modalidades específicas da invenção foram descritas aqui pelos exemplos para fins de ilustração. Por conseguinte, a invenção não está limitada exceto pelas reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente aqui citados são pelo presente incorporados por referência na sua totalidade para todos os fins.

Claims (21)

1. Anticorpo monoclonal isolado, caracterizado pelo fato de que se liga ao domínio extracelular de B7H6 humano (resíduos de aminoácidos 25-266 da SEQ ID NO: 2), em que o referido anticorpo é um anticorpo murino selecionado dentre:

   • a) o anticorpo produzido pelo hibridoma de número de designação de clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM I-4242) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; ou
   • b) o anticorpo produzido pelo hibridoma de número de designação de clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM I-4245) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo;
2. Anticorpo monoclonal isolado, caracterizado pelo fato de que se liga ao domínio extracelular de B7H6 humano (resíduos de aminoácidos 25-266 da SEQ ID NO: 2), em que o referido anticorpo é um anticorpo humanizado derivado de:

   • a) o anticorpo produzido pelo hibridoma de número de designação de clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1-4242); e
   • b) o anticorpo produzido pelo hibridoma de número de designação de clone 17B1.3 (Depósito N° CNCM I-4245).
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo de cadeia simples.
4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma região Fc tendo pelo menos uma de atividade ADCC e atividade CDC; de modo que a região Fc é uma Fc de cadeia simples (scFc).
5. Kit de diagnóstico, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e meios para detecção da ligação por esse anticorpo.
6. Conjugado de anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico.
7. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é selecionado do grupo consistindo em um agente antitubulina, um agente de ligação de sulco menor de DNA, um agente de alquilação de sulco menor de DNA, uma duocarmicina, e uma puromicina; de modo que o agente antitubulina é selecionado a partir do grupo consistindo em uma dolastatina, um alcaloide da vinca, uma podofilatoxina, um taxano, um derivado de bacatina, um criptofsina, um maitansinoide, e uma combretastatina.
8. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é conjugado com o agente citotóxico através de um ligante; de modo que o ligante é clivável em condições intracelulares; de modo que o ligante clivável é um ligante peptídico clivável por uma protease intracelular.
9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou o conjugado anticorpo-fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8; e
   um veículo farmaceuticamente aceitável.
10. Método in vitro para diminuir a atividade de células assassinas naturais (NK) humanas contra uma célula que expressa B7H6 humano, o método caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato uma célula que expressa B7H6 humano, na presença de uma célula NK humana, com uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
11. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de rejeição aguda a aloenxertos de células da medula óssea (BMC).
12. Método in vitro para enfraquecer ou inibir o desenvolvimento de células que expressam B7H6 dentro de uma população de células compreendendo as células que expressam B7H6, o método caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato as referidas células que expressam B7H6 com uma quantidade eficaz de um conjugado de anticorpo-fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8.
13. Conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um câncer expressando B7H6 em um indivíduo.
14. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um câncer expressando B7H6 em um indivíduo.
15. Conjugado de anticorpo-fármaco para uso de acordo com a reivindicação 13 ou anticorpo para uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o câncer expressando B7H6 é um câncer do cólon, fígado, cérvix, pulmão, pâncreas, ou de próstata; ou em que o câncer expressando B7H6 é uma leucemia prohemocítica, um linfoma de células B, um linfoma de células T, um linfoma monocítico, uma eritroleucemia, linfoma de Burkitt, uma leucemia mieloide crônica, ou uma leucemia linfoblástica aguda.
16. Método in vitro de detecção de expressão celular de B7H6, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

    • (i) colocar em contato uma amostra biológica compreendendo uma célula humana a ser testada com um anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e
    • (ii) detectar a ligação do referido anticorpo,

    em que a ligação do referido anticorpo indica a presença de B7H6 na célula, para desse modo detectar se a célula expressa B7H6.
17. Método in vitro de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende células humanas intactas, ou em que a amostra biológica compreende uma fração de membrana da célula a ser testada.
18. Método in vitro de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é marcado com um rótulo detectável selecionado de entre o grupo consistindo em um radioisótopo, um rótulo fluorescente, um rótulo quimioluminescente, um rótulo enzimático, e um rótulo bioluminescente.
19. Anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para uso no diagnóstico de um câncer expressando B7H6 em um indivíduo, em que o referido anticorpo monoclonal é conjugado com um rótulo detectável.
20. Anticorpo monoclonal para uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o câncer expressando B7H6 é um câncer do cólon, fígado, cérvix, pulmão, pâncreas, ou próstata.
21. Célula de produção de anticorpo, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo consistindo em:

    • a) o hibridoma de número de designação de clone 4E5.5 (Depósito N° CNCM 1-4242),
    • b) o hibridoma de número de designação de clone 1761.3 (Depósito N° CNCM 1-4245).