JP2014534165A - B7−h6ポリペプチドに対するb7−h6治療活性モノクローナル抗体 - Google Patents
B7−h6ポリペプチドに対するb7−h6治療活性モノクローナル抗体 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明の抗体の好ましい実施形態においては、前記抗体は、配列番号5、7、9、15、17、および19に示される相補性決定領域(CDR)を含む。上記CDRの核酸配列は、IMGT-ONTOLOGYに従ってアノテートされたものである(GiudicelliおよびLefranc 1999, Bioinformatics 15:1047-1054を参照されたい)。
a)サンプルと本発明の抗体とを、B7-H6ポリペプチド上のそのエピトープへの該抗体の結合を可能にする条件下で接触させること;および
b)前記エピトープへの該抗体の結合を決定すること
を含み、それによって癌が診断される、前記方法に関する。
a)サンプルと本発明の抗体とを、B7-H6ポリペプチド上のそのエピトープへの該抗体の結合を可能にする条件下で接触させること;および
b)前記エピトープへの該抗体の結合を決定すること
を含み、それによって炎症疾患が診断される、前記方法にも関する。
a)本発明の抗体を含む分析ユニット;および
b)分析ユニット中の抗体の、B7-H6ポリペプチド上のそのエピトープへの結合を検出する検出器
を含む、前記デバイスも本発明により包含される。
a)サンプルと、本発明の抗体とを、B7-H6ポリペプチド上のそのエピトープへの前記抗体の結合を可能にする条件下で接触させること;および
b)前記エピトープへの該抗体の結合を決定すること
を含み、それによって癌が診断される、前記方法に関する。
a)サンプルと、本発明の抗体とを、B7-H6ポリペプチド上のそのエピトープへの前記抗体の結合を可能にする条件下で接触させること;および
b)前記エピトープへの該抗体の結合を決定すること
を含み、それによって炎症疾患が診断される、前記方法も提供する。
a)本発明の抗体を含む分析ユニット;および
b)分析ユニット中の抗体の、B7-H6ポリペプチド上のそのエピトープへの結合を検出する検出器
を含む、前記デバイスにも関する。
6週齢のBALB/cマウスを、Freundの完全アジュバント中の図1に示されるIgG1-Fcドメインに融合したB7-H6の細胞外ドメインからなるB7-H6-Ig融合タンパク質(B7-H6-Ig-FP)(100μg)を4つの異なる部位に皮下(s.c.)注射して免疫した。3週間後、PBS中のBA/F3(プロB細胞)-B7-H6トランスフェクタント(2 x 107細胞)を、腹腔内(i.p.)注射した。2ヶ月後、PBS中の100μgのB7-H6-Ig-FPを腹腔内適用した。3週間後、PBS中のBA/F3-B7-H6トランスフェクタント(2 x 107細胞)を用いる腹腔内注射を実施し、5日後に脾臓細胞をAg8マウスミエローマ細胞と融合させた。BA/F3-B7-H6細胞への産生された免疫グロブリンの結合について、910個のハイブリドーマをフローサイトメトリーによりスクリーニングした。さらに、B7-H6-Ig-FPへの結合について、480個のクローンをELISAによりスクリーニングした。抗B7-H6クローン1.18は高レベルでBA/F3-B7-H6トランスフェクタントを染色し、対照ベクターで形質導入されたBA/F3細胞を染色せず、それは高レベルでB7-H6を内因的に発現する細胞系に結合したため、それをさらなる試験のために選択した。
ELISAについて:B7-H6-Ig-FP(3μg/ml)をELISAプレート上に固定し、示された濃度の抗B7-H6 mAb 1.18と共にインキュベートし、HRPコンジュゲート化mAbを用いて現像した。
CD8-リーダーペプチドおよびB7-H6の以下の部分をコードするC末端HAタグを含むpcNDA3.1に基づく以下の構築物を調製した:
B7-H6_1(アミノ酸24〜454)
B7-H6_2(アミノ酸83〜454)
B7-H6_3(アミノ酸141〜454)
B7-H6_4(アミノ酸190〜454)
B7-H6_5(アミノ酸239〜454)。
異なる起源の細胞系を、抗B7-H6 mAb 1.18で染色し、実施例2に記載のようにフローサイトメトリーにより分析した。データは、異なる起源の細胞系への抗B7-H6 mAb 1.18の結合を示す。
RNAを、RNeasy Miniキット(Qiagen)を用いて腫瘍細胞系から単離し、TURBO DNase(Ambion)を用いて汚染DNAを除去し、ProtoScript M-MuLV First Strand cDNA合成キット(NEB)を用いてRNAを逆転写した。SYBR Green I MasterおよびLightCycler480(Roche)を用いて定量的リアルタイムPCRを実施した。B7-H6(配列番号23に示されるGACCTGGAGCCATTGTGTCTおよび配列番号24に示されるAAGCTGGACTGTTCCCTGTG)ならびにハウスキーピング遺伝子GAPDH (配列番号25に示されるGCAAATTCCATGGCACCGTおよび配列番号26に示されるTCGCCCCACTTGATTTTGG)のための特異的プライマーを用いて、GAPDHと比較したB7-H6 mRNA発現レベルを算出した。データは、抗B7-H6 mAb 1.18で染色された異なる起源の細胞系が、異なる量でB7-H6のmRNAを発現することを示す。
Ba/F3およびBa/F3-B7-H6細胞の1:1混合物のアセトン固定されたサイトスピンを、Dual Envision+ System-HRP(Dako)を用いて染色した。内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断した後、サイトスピンを10%ヤギ血清および0.1mg/mlヒトIgGを用いて遮断した。サイトスピンを、Dako抗体希釈液中の5μg/mlの抗B7-H6 mAb 1.18またはマウスIgG1アイソタイプ対照(クローン11711、R&D)と共にインキュベートし、洗浄し、ヤギ抗マウスおよびヤギ抗ウサギ免疫グロブリンにコンジュゲートさせたDako Peroxidase標識ポリマーと共にインキュベートした。3,3'-ジアミノベンズイジン(DAB)基質溶液と共にインキュベートした後、細胞核をヘマトキシリンで対抗染色し、マウントされたサイトスピンを光学顕微鏡により分析した。データは、抗B7-H6 mAb 1.18がサイトスピン上のB7-H6 Ba/F3-B7-H6トランスフェクタントを染色することを示す。
IL-2を用いて14日間増殖させた一次NK細胞を、BA/F3、BA/F3-B7-H6(NKp30のリガンド)またはBA/F3-MICA(活性化受容体NKG2Dのリガンド)細胞と共に、PE-コンジュゲート化抗CD107 mAbの存在下で5h、培地中で培養した。NK細胞の脱顆粒化を、フローサイトメトリーにより、同時培養後のCD107陽性NK細胞の割合として決定した。エラーバーは、3回の培養の平均±SDを示す。データは、BA/F3-B7-H6細胞が一次NK細胞の脱顆粒化を誘導することを示す。
Claims (15)
- B7-H6ポリペプチドの細胞外ドメインの一部により形成されるエピトープに特異的に結合する抗体であって、前記一部が配列番号22に示されるアミノ酸配列を有する、前記抗体。
- 前記抗体が配列番号5、7、9、15、17および19に示される相補性決定領域(CDR)を含む、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1または2に記載の抗体。
- 前記抗体が、2011年2月2日にブダペスト条約の下でDSMZ、Braunschweig、Germanyに受託番号DSM ACC 3117の下で寄託された抗体である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
- 癌の治療または診断における使用のための請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体。
- 癌がT細胞リンパ腫、骨髄性白血病、結腸癌、B細胞リンパ腫、メラノーマ、または子宮頸癌である、請求項4に記載の抗体。
- 炎症疾患の治療または診断における使用のための請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体。
- 炎症疾患がウイルス感染である、請求項7に記載の抗体。
- 癌に罹患することが疑われる被験体のサンプルにおいて癌を診断するための方法であって、
a)前記サンプルと、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体とを、B7-H6ポリペプチド上のそのエピトープへの前記抗体の結合を可能にする条件下で接触させること;および
b)前記エピトープへの該抗体の結合を決定すること、
を含み、それによって癌が診断される、前記方法。 - 癌がT細胞リンパ腫、骨髄性白血病、結腸癌、B細胞リンパ腫、メラノーマ、または子宮頸癌である、請求項9に記載の方法。
- 炎症疾患に罹患することが疑われる被験体のサンプルにおいて炎症疾患を診断するための方法であって、
a)前記サンプルと、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体とを、B7-H6ポリペプチド上のそのエピトープへの前記抗体の結合を可能にする条件下で接触させること;および
b)前記エピトープへの該抗体の結合を決定すること、
を含み、それによって炎症疾患が診断される、前記方法。 - 前記サンプルが組織または体液サンプルである、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
- サンプルにおいて癌または炎症疾患を診断するためのデバイスであって、
a)請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体を含む分析ユニット;および
b)分析ユニット中の抗体の、B7-H6ポリペプチド上のそのエピトープへの結合を検出する検出器、
を含む、前記デバイス。 - 前記サンプルが組織または体液サンプルである、請求項13に記載のデバイス。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体および好ましくは、B7-H6ポリペプチド上のそのエピトープへの前記抗体の結合の検出剤を含む、癌または炎症疾患を診断するためのキット。
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