MX2014003065A

MX2014003065A - Anticuerpo monoclonal terapeuticamente activo b7-h6 contra el polipeptido b7-h6.

Info

Publication number: MX2014003065A
Application number: MX2014003065A
Authority: MX
Inventors: Adelheid Cerwenka; Gerhard Moldenhauer
Original assignee: Deutsches Krebsforsch
Priority date: 2011-09-13
Filing date: 2012-09-10
Publication date: 2015-05-11
Also published as: IL231108A0; CN103797032B; US9676855B2; SG2014015051A; JP2014534165A; EP2756000B1; CN103797032A; EP2756000A1; US20140341915A1; ZA201401759B; AU2012307549A1; WO2013037727A1; NZ621727A; RU2014104695A; KR20140069125A; SG10201507970SA; CA2848333A1; BR112014005573A2

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y a medios de diagnóstico. Específicamente, se relaciona con un anticuerpo que une específicamente a una porción del dominio extracelular del polipéptido B7-H6. Por otra parte, se proporciona dicho anticuerpo para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer o de la enfermedad inflamatoria. Además, se proporciona un método para diagnosticar el cáncer en una muestra de un sujeto sospechoso de sufrir cáncer o una enfermedad inflamatoria. Además, la presente invención se refiere a un dispositivo y a un kit para diagnosticar el cáncer o una enfermedad inflamatoria.

Description

ANTICUERPO MONOCLONAL TERAPÉUTICAMENTE ACTIVO B7- H6 CONTRA EL POLIPÉPTIDO B7-H6 Campo de la Invención La presente invención se refiere a metodos y a medios de diagnóstico. Específicamente, se relaciona con un anticuerpo que une específicamente a una porción del dominio extracelular del polipéptido B7-H6. Por otra parte, dicho anticuerpo se proporciona para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer o de la enfermedad inflamatoria. Además, se proporciona un método para diagnosticar el cáncer en una muestra de un sujeto sospechoso de sufrir de cáncer o una enfermedad inflamatoria. Además, la presente invención se refiere a un dispositivo y a un kit para diagnosticar el cáncer o la inflamación. Antecedentes de la Invención Hasta hoy, el cáncer es una de las causas de muerte principales en los Estados Unidos de Norteamérica, aunque el progreso se ha hecho en reducir los índices de incidencia y de mortalidad y la mejora de supervivencia (ver Jemal et al. 2010, CA Cáncer J Clin septiembre-octubre 60(5):277-300). El progreso adicional puede ser acelerado al mejorar los métodos y los medios de diagnóstico debido al hecho de que el desarrollo del cáncer está asociado a menudo con la carencia del reconocimiento específico de células tumorales mediante el sistema inmune.

La terapia dirigida contra el cáncer comprende la medicación que interfiere con moléculas dirigidas específicas (por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales) para bloquear directamente el crecimiento de la célula cancerosa. Así, la terapia dirigida contra el cáncer puede ser más eficaz que los procesos terapéuticos tradicionales (por ejemplo, resección, radiación, quimioterapia) y puede ser menos dañina para las células normales Los anticuerpos monoclonales (mAb, por sus siglas en inglés) se pueden diseñar para unir específicamente a un dominio extracelular o a un objetivo de superficie celular de la célula objetivo para estimular el sistema inmunológico del paciente. Los anticuerpos monoclonales se pueden también crear para numerosas enfermedades serias (por ejemplo, enfermedades inflamatorias o diferentes tipos de cánceres) . Así, los anticuerpos monoclonales pueden proporcionar confiable y eficientes métodos y medios terapéuticos y de diagnóstico para por ejemplo, detectar las etapas de desarrollo tempranas de estas enfermedades u ofrecer procesos terapéuticos.

Las células asesinas naturales (células NK) constituyen un componente importante del sistema inmunológico natural que forma la inmunorespuesta inflamatoria y adaptativa (ver Vivier et al. 2008, Nat. I mmuno. 9:503-510) y desempeñar un papel crucial en el rechazo de células transformadas y viralmente infectadas (ver Smyth et al. 2002, Nat. Rev. Cáncer 2 :850-861 ; Lanier 2005, Annu. Rev. Immunol. 23:225-274) . Las células NK reconocen las células objetivo para la expresión de la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) (ver Parham 2005, Nat. Rev. Immunol. 5:201 -204) la cual protege la célula objetivo contra la activación de la célula N K y contra ataque de la célula N K. Las células objetivo que carecen de la clase I de M HC son aniquiladas directamente por las células NK debido a la inducción de apoptosis (muerte celular programada) . El descubrimiento de los receptores activadores de NK (por ejemplo, la familia del receptor natural de citotoxicidad (NCR, por sus siglas en inglés) como NKp30) reveló que también las señales de activación son necesarias para la activación de células NK y de la lisis de la célula tumoral (ver Pende et al. 1999, Cáncer Res. 62 :6178-6186; Moretta et al. 2001 , Annu . Rev. Immunol. 19: 197-223).

Recientemente, podría demostrarse que el N Kp30 humano interactúa directamente con el miembro B7-H6 de la familia B7 cuya expresión en células tumorales induce la activación y la citotoxicidad de la célula dependiente de N Kp30 (ver Brandt et al. 2009, J . Exp. Med . 206(7): 1495-1503; US 201 1 /0081346). Por esto, el dominio extracelular de NKp30 interactúa directamente con el dominio extracelular de B7-H6 que se expresa exclusivamente en la superficie de varias líneas celulares tumorales (ver Brandt et al. 2009, J . Exp. Med . 206(7): 1495-1503).

Breve Descripción de la Invención La presente invención se relaciona con un anticuerpo que une específicamente a un epítopo formado por una porción del dominio extracelular del polipeptido B7-H6, dicha porción que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC I D NO : 22. Preferiblemente, dicha secuencia representa un dominio similar a IgV.

En una modalidad preferida del anticuerpo de la invención, dicho anticuerpo comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) como se muestra en las SEC I D NO: 5, 7, 9, 15, 17, y 19. Las secuencias del ácido nucleico de las CDR anteriores se anotaron de acuerdo con la I MGT-ONTOLOGY (ver Giudicelli y Lefranc 1999, Biomformatics 15: 1047-1054).

En una modalidad preferida del anticuerpo de la invención , dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Preferiblemente, dicho anticuerpo es el anticuerpo depositado bajo el número de acceso DSM ACC 31 17 en el DSMZ, Brunswick, Alemania bajo el tratado de Budapest el 2 de febrero de 201 1 .

La presente invención contempla un anticuerpo de la invención para el uso en el tratamiento o el diagnóstico contra el cáncer. Preferiblemente, el cáncer es linfoma de célula T, leucemia mieloide, carcinoma de colon, linfoma de célula B, melanoma, o carcinoma cervical .

La presente invención , además, contempla un anticuerpo de la invención para el uso en el tratamiento o el diagnóstico de la enfermedad inflamatoria. Preferiblemente, la enfermedad inflamatoria es una infección viral.

La presente invención se relaciona con un metodo para diagnosticar el cáncer en una muestra de un sujeto sospechoso de sufrir del cáncer que comprende: a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo de la invención bajo cond iciones que permiten la unión de dicho anticuerpo a su epítopo en el polipéptido B7-H6; y b) determinar la unión del anticuerpo a dicho epítopo, por lo cual se diagnostica el cáncer.

En una modalidad preferida del método de la invención , el cáncer es linfoma de célula T, leucemia mieloide, carcinoma de colon , linfoma de la célula B, melanoma, o carcinoma cervical.

La presente invención también se relaciona con un método para diagnosticar una enfermedad inflamatoria en una muestra de un sujeto sospechoso de sufrir de una enfermedad inflamatoria que comprende: a) poner en contacto con la muestra con el anticuerpo de la invención bajo cond iciones que permiten la unión del dicho anticuerpo a su epítopo en el polipéptido B7-H6; y b) determinar la unión del anticuerpo a dicho epítopo, por lo cual se diagnostique la enfermedad inflamatoria.

En una modalidad preferida del método de la invención , dicha muestra es un tejido o una muestra de fluido corporal.

Abarcado por la invención está también un dispositivo para diagnosticar el cáncer o una enfermedad inflamatoria en una muestra que comprende: a) una unidad de análisis que comprende el anticuerpo de la invención; y b) un detector el cual detecta la unión del anticuerpo en la unidad de análisis a su epítopo en el polipeptido B7-H6.

En una modalidad preferida del dispositivo de la invención , dicha muestra es un tejido o una muestra de fluido corporal.

La presente invención finalmente se relaciona con un Kit para diagnosticar el cáncer o una enfermedad inflamatoria que comprende el anticuerpo de la invención y, preferiblemente, un agente para la detección de la unión de dicho anticuerpo a su epítopo en el polipéptido B7-H6.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de la proteína de fusión B7-H6-lg. Las secuencias del ácido nucleico y de aminoácidos en itálicas indican los sitios enzimáticos de restricción. Las secuencias del ácido nucleico y de aminoácidos del dominio extracelular de B7-H6 humano están subrayadas en negritas, por lo cual dichas secuencias de Fcm están subrayaran con líneas discontinuas.

La Figura 2 muestra la secuencia de am inoácido del dominio extracelular del polipéptido B7-H6 humano e indica el dominio similar a IgV y el dominio similar a IgC.

La Figura 3 muestra que el clon 1 .18 anti-B7-H6 reacciona con B7-H6 al usar un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA, por sus siglas en ingles).

La figura 4a representa que el clon 1 .18 anti-B7-H6 u ne a B7-H6 en los transfectantes (BA/F3-B7-H6) al usar la clasificación 5 de células activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés). La figura 4b muestra que el clon 1 .18 anti-B7-H6 une a B7-H6 en líneas celulares (origen hematopoyético y tumor sólido) , pero no a células mononucleares de sangre periférica sana (PBMC, por sus siglas en inglés). ío La Figura 5 muestra que una porción del dominio IgV de B7- H6 está implicada en la unión del clon 1 .18 anti-B7-H6.

Las Figuras 6a-6b representan que la expresión de la superficie celular de B7-H6 determinada por la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en 15 inglés) y la expresión de ARNm en las diferentes líneas celulares.

La figura 6a muestra la expresión de B7-H6 en líneas celu lares tumorales de origen hematopoyético. La figura 6b muestra la expresión de B7-H6 en líneas celulares tumorales de origen de tumor sólido. 20 La Figura 7 muestra que el mAb 1 .18 anti-B7-H6 detecta B7- H6 en las citospinas (secciones congeladas) de los transfectantes BA/F-3-B7-H6.

La Figura 8 muestra que las células asesinas naturales primarias (N K, por sus siglas en inglés) se desgranulan después 25 del co-cultivo con los transfectantes BA/F3-B7-H6.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se relaciona con un anticuerpo que une específicamente a un epítopo formado por una porción del dominio extracelular del polipeptido B7-H6, dicha porción que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC I D NO : 22. Preferiblemente, dicha secuencia representa un dominio similar a IgV.

El término "anticuerpo" se refiere a todos los tipos de anticuerpos que unen específicamente a un epítopo comprendido en una porción del dominio extracelular del polipéptido B7-H6. Los epítopos como se refieren en la presente, son definidos preferiblemente mediante extensiones de 7 a 15, preferiblemente 8 a 1 1 aminoácidos contiguos en longitud. Sin embargo, un epítopo de acuerdo con la presente invención se puede también formar por cierta estructura tridimensional y tales epítopos estructurales también se consideran en la presente. La unión específica en este contexto se entiende que el anticuerpo de la invención esencialmente une al epítopo sin reactividad cruzada significativa (es decir, unión) a otros epítopos en el polipéptido B7-H6 u otros polipéptidos. La unión específica se puede determinar mediante procedimiento bien conocidos en la téenica. Preferiblemente, el anticuerpo une específicamente a dicho epítopo. El epítopo anteriormente mencionado será localizado en una porción del dominio extracelular del polipéptido B7-H6. Preferiblemente, el polipéptido B7-H6 tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC I D NO : 2 y dicho dominio extracelular corresponde a 58 a 300 aminoácidos de dicha secuencia (ver tambien las Figuras 1 y 2). Será entendido que el polipéptido B7-H6 se puede también representar por una secuencia variable de la SEC I D NO: 2 que difiere de la misma mediante sustitución , adición y/o supresión de uno o más aminoácidos. Tales secuencias variables pueden ser secuencias de aminoácido ortólogas a partir de otras especies así como secuencias parálogas u otras homologas del B7-H6 específico anteriormente mencionado. Preferiblemente, tales secuencias variables son por lo menos del 70% , por lo menos del 80% , por lo menos del 90% , por lo menos del 95% o por lo menos del 99% idénticos sobre la longitud entera o por lo menos del 50% de la SEC ID NO: 2 con dicha secuencia. El término "identidad de secuencia" como se usa en la presente se refiere a una relación entre dos o más secuencias de polipéptido, es decir, una secuencia de referencia y una secuencia dada para ser comparada con la secuencia de referencia . La identidad de secuencia puede ser determinada al comparar la secuencia dada a la secuencia de referencia después de que las secuencias se hayan alineado óptimamente para producir el grado más alto de semejanza de secuencia que se puede determinar por la comcidencia entre cadenas de tales secuencias. Dicha alineación se puede realizar por un experto sin más preámbulos. Por consiguiente, la identidad de secuencia proporciona la información en el número total de dichas comcidencias. La identidad de secuencia se puede, preferiblemente, calcular al usar los programas de computadora disponibles públicamente que son conocidos por un experto, por ejemplo, BLAST y FASTA. Otras variantes de secuencias consideradas de acuerdo con la presente invención son las que son codificadas por las moleculas del ácido nucleico capaces de hibridizarse bajo condiciones rigurosas de hibridación a la secuencia del ácido nucleico que codifica B7-H6 mostrada en la SEC ID NO: 1 . Preferiblemente, el polipéptido B7-H6 es codificado por la secuencia del ácido nucleico mostrada en la SEC I D NO : 1 . Las condiciones rigurosas de hibridación referidas de acuerdo con presente invención son equivalentes a la hibridación en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS, por sus siglas en inglés), NaP04 0.5 M , 1 mM de EDTA a 50°C con lavado en 1 X SSC , 0.1 % de SDS a 50°C o 65°C, donde sonda de molécula del ácido nucleico que comprende por lo menos 100, preferiblemente por lo menos 150, aún más preferiblemente por lo menos 200, más preferiblemente por lo menos 250 nucleótldos consecutivos de la SEC I D NO: 1 o su complemento inverso se usa. Será entendido que el primer y el último aminoácido del dominio extracelular en tales variantes puede diferir de las posiciones indicadas para la SEC I D NO: 2, anterior. Sin embargo, el dominio extracelular comenzará y terminará en las posiciones que corresponden a dichas posiciones. Tales posiciones correspondientes se pueden determinar por las herramientas de análisis de secuencia por el experto en la téenica sin más preámbulos.

Preferiblemente, un anticuerpo como se refiere de acuerdo con la presente invención comprende un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo quimérico o cualquier frag mento o derivado de tales anticuerpos que tienen las propiedades de unión antes mencionadas. Tales fragmentos y derivados comprendidos por el término anticuerpo como se usa en la presente comprenden un anticuerpo sintético, un fragmento Fab, F(ab)2Fv o scFv, o un derivado químicamente modificado de cualquiera de estos anticuerpos. Las modificaciones químicas consideradas preferiblemente por la presente invención incluyen las que apuntan para combinar el anticuerpo a un marcador detectable como se especifica en otra parte en esta especificación . Los anticuerpos o los fragmentos de los mismos, pueden ser obtenidos generalmente al usar los métodos que se describen , por ejemplo, en Harlow y Lañe "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Coid Spring Harbor, 1988.

Ventajosamente, el anticuerpo de la presente invención une específicamente a B7-H6 con una alta afinidad. En los estudios subyacentes de la presente invención se ha encontrado que comparado a otros anticuerpos anti-B7-H6 descritos o sugeridos en el estado de la técnica (Brandt 2009, J. Exp. Med. 206(7): 1495-1 503 y US 201 1 /0081346), el anticuerpo es particularmente útil en aplicaciones in vivo como separación de FACS y cultivo celular así como usos in vitro incluyendo inmunohistoquímica en , por ejemplo, secciones congeladas de tejido. Gracias a la presente invención , el diagnóstico contra cáncer basado en la determinación de B7-H6 mejorará. Por otra parte, los procesos terapeuticos que apuntan a fármacos antitumorales objetivo a células positivas B7-H6 son factibles.

En una modalidad preferida del anticuerpo de la presente invención , dicho anticuerpo comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) como se muestra en la SEC I D NO: 5, 7, 9, 15, 17, y 19. Las secuencias del ácido nucleico de las CDR mencionadas anteriormente se anotaron de acuerdo con la I MGT-ONTOLOGY (ver Giudicelli y Lefranc 1999, Biomformatics 15: 1047-1054).

El término "región determinante de complementariedad” o "CDR" como se usa en la presente se refiere a los dominios variables de un anticuerpo que son responsables de la especificidad en la unión al antígeno. Un antígeno, generalmente, comprende tres CDR (CDR1 , CDR2 y CDR3). Estas CDR se arreglan de una manera no consecutiva. Puesto que el antígeno que reconoce las porciones del anticuerpo se compone comúnmente de dos dominios variables en una cadena pesada y ligera , seis CDR entran en contacto con el antígeno durante la unión . Las CDR se pueden transferir desde una especie de anticuerpo a otra mediante téenicas de biología molecular convencionales como injerto de CDR (ver Ewert 2004, Methods 34(2) : 184-199; Benny K.C . Lo in Antibody Engineering -Methods in Molecular Biology 2004, Volumen 248, I I , 135-159, DO I 10.1385/1 -59259-666-5: 1 35) .

Se entenderá de lo anterior que en otra modalidad preferida, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo monoclonal.

Preferiblemente, tal anticuerpo monoclonal puede ser preparado al aplicar un polipeptido inmunogenético que tiene la porción del dominio extracelular como se caracteriza antes a un mamífero, preferiblemente un ratón. Más preferiblemente, el polipéptido inmunogenético se conjuga a una proteína portadora, como albúmina de suero bovino, tiroglobulina, y hemocianina de Lapa de ojo de la cerradura (KLH , por sus siglas en inglés) . Dependiendo de la especie hospedadora, varios adyuvantes se pueden usar para aumentar la respuesta inmunológica. Tales adyuvantes comprenden , preferiblemente, adyuvante de Freund , geles minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio, y sustancias tensioactivas, por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemocianina de Lapa de ojo de la cerradura, y dinitrofenol. Los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención se pueden preparar posteriormente al usar la téenica bien conocida del hibridoma, la técnica del hibridoma de célula B humana, y la técnica de hibridoma EBV. Detalles adicionales en la preparación de un anticuerpo de la invención se describen en los ejemplos adjuntos a continuación.

En una modalidad más preferida del anticuerpo de la presente invención, el anticuerpo es el anticuerpo o el anticuerpo producido por el clon de celula de hibridoma correspondiente como se deposita bajo el número de acceso DSM ACC 31 17 en el "DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", 38124 Braunschweig , ALEMANIA el 2 de febrero de 201 1 de acuerdo con el tratado de Budapest por “Deutsches Krebsforschungszentrum”, Heidelberg , ALEMAN IA El mAb anti-B7-H6 anteriormente mencionado comprenderá por lo menos una cadena pesada y por lo menos una cadena ligera. Preferiblemente, mAb anti-B7-H6 tiene una secuencia de aminoácido de la cadena pesada (IGHV/IGH D/IGHJ) como se muestra en la SEC I D NO: 3, por lo cual la forma secretada (IGHV/IG HD/IGHJ/IGHG1 ) se muestra en la SEC ID NO: 1 1 y la forma unida a la membrana (I GHV/IGH D/IGH J/IGHG 1 ) se muestra en la SEC ID NO: 12. Las secuencias del ácido nucleico de 1 -4 fragmentos de la cadena pesada se muestran en la SEC I D NO: 4, 6, 8, y 10 y las secuencias del ácido nucleico de 1 -3 CDR de la cadena pesada se muestran en la SEC ID NO: 5, 7, y 9. Además, dicho anticuerpo tiene una secuencia de aminoácido de la cadena ligera (IGLV/IGLJ) como se muestra en la SEC I D NO: 13, por lo cual la secuencia de IG LV/IGLJ/IGLC se muestra en la SEC I D NO: 21 . Las secuencias del ácido nucleico de 1 -4 fragmentos de la cadena ligera se muestran en la SEC I D NO : 14, 16, 18, y 20 y las secuencias del ácido nucleico de 1 -3 CDR de la cadena ligera se muestran en la SEC I D NO: 1 5, 17, y 19. Será entendido que el mAb anti-B7-H6 se puede tambien representar por secuencias variables de las SEC I D NO: 3-21 anteriormente mencionadas que 5 difieren del mismo mediante sustitución, adición y/o supresión de uno o más aminoácidos. Tales secuencias variables pueden ser secuencias de aminoácido de ortólogos de otras especies así como secuencias parálogas u otras homologas del mAb anti-B7- H6 específico anteriormente mencionado. Preferiblemente, tales ío secuencias variables son por lo menos del 70%, por lo menos del 80% , por lo menos del 90% , por lo menos del 95% o por lo menos del 99% idénticas sobre la longitud entera o por lo menos del 50% de las SEC I D NO: 3-21 con dichas secuencias. El término identidad de secuencia se ha definido a otra parte en esta 15 descripción y se aplica mutatis mutandis.

La presente invención además se relaciona con un anticuerpo de la invención para el uso en el tratamiento o el diagnóstico contra el cáncer.

El térmi no "tratamiento" como se usa en la presente 20 comprende el mejoramiento de una enfermedad referida en la presente o sus síntomas así como la curación de la enfermedad, es decir, el restablecimiento de la condición de salud en un sujeto con respecto a la enfermedad o a sus síntomas. El mejoramiento como se refiere en la presente se refiere a una mejora 25 significativa de la condición de salud con respecto a la enfermedad o a un síntoma de la enfermedad. Tal mejora significativa es, preferiblemente, clínicamente evidente en, por ejemplo, sistemas de clasificación o graduación aplicados para investigar un sujeto. Como será entendido por los expertos en la téenica, el tratamiento como se usa en la presente no se propone generalmente para ser correcto para todos (es decir 100%) de los sujetos bajo un tratamiento dado. El término, sin embargo, requiere que una porción estad ísticamente significante de los sujetos puede tratarse (por ejemplo, una cohorte de un estudio de cohortes). Si una porción es estadístico significativa puede determinarse sin más preámbulos por la persona experta en la técnica usar varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, intervalos de determinación de confianza, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitncy etc.. Se encontraron los detalles en Dowdy and Wearden, Statistics for Research, Joh n Wiley & Sons, New York 1983.

Preferiblemente, el anticuerpo de la invención para el uso en tratar el cáncer se acopla con un agente citotóxico o con un agente antitumoral o es capaz de reclutar tales agentes adecuados para tratar el cáncer. El término "agente" como se usa en la presente se refiere al elemento, al compuesto, o a la otra entidad molecular (por ejemplo, un compuesto farmacéutico, un compuesto terapéutico, o un compuesto farmacológico). Tal agente puede ser natural, sintético o una combinación de los mismos. El término "agente terapéutico" como se usa en la presente se refiere con un agente que, o bien solo o en combinación con otro agente exhibe un efecto terapeutico o beneficioso sobre una célula o un tejido. Preferiblemente, un agente terapéutico de acuerdo con la presente invención comprenderá fármacos, toxinas, inmunomoduladores, quelantes, compuestos de boro, agentes fotoactivos o tintes, y radioisótopos. Las téenicas para acoplar agentes terapéuticos a polipéptidos como a anticuerpos son bien conocidas por el experto en la técnica (por ejemplo, Amon et al. 1985, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy (Reisfeld et a! eds. , Alan R. Liss, Inc., 1985)). El término "agente citotóxico" como se usa en la presente se refiere con un agente el cual tiene un efecto citotóxico o citoestático en una célula, de tal modo agotando o inhibiendo el crecimiento de, respectivamente, células dentro de una población de células. Preferiblemente, los agentes citotóxicos de acuerdo con la presente invención comprenderán agentes anti-tubulina (por ejemplo, dolastatinas, alcaloides de vinca, podofilatoxinas, taxanos, derivados de baccatina, criptofisinas, maitansinoides, y combretastatinas) , agentes de unión de canal menor de ADN , inhibidores de réplica de ADN , agentes alquilizantes (por ejemplo, complejos de platino) , antracielinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, activadores de quimioterapia, duocarmicinas, etopósidos, pirimidinas fluoradas, ionoforos, lexitropsinas, nitro soureas, platinóles, compuestos pre-formadores, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizadores de radiación , esteroides, taxanos, inhibidores de topoisomerasa, alcaloides de vinca, o similares. El termino "agente antitumoral" como se usa en la presente se refiere con un agente que tiene un efecto citotóxico o maligno en las células cancerosas, de tal modo arrestando el crecimiento de, respectivamente, las células cancerosas dentro de un tumor dando lugar, preferiblemente, a la muerte celular. Preferiblemente, el anticuerpo de la invención une a una célula objetivo (por ejemplo, célula cancerosa) y a las células efectoras específicas que expresan receptores para dicho anticuerpo (por ejemplo, células asesinas naturales, monocitos, granulocitos) que da lugar en la muerte celular objetivo. En otra modalidad preferida de la invención el anticuerpo de la invención se combina con un agente citotóxico o un agente antitumoral a través de un enlazador. Preferiblemente, un enlazador de acuerdo con la presente invención comprenderá enlazador que es divisible bajo condiciones intracelulares (por ejemplo, un enlazador de péptido divisible por u na proteasa intracelular, el enlazador de dipéptido, el enlazador de disulfuro, y el enlazador hidrolizable que están , por ejemplo, hidrolizable en un pH de menos de 5.5). Sin embargo, el anticuerpo de la invención se puede también usar para tratar el cáncer debido a sus propiedades de bloqueo y de unión en B7-H6 como un modulador de cascadas de señalización implicadas en el cáncer.

El término "diagnóstico" como se usa en la presente se entiende la evaluación si un sujeto sufre de una enfermedad referida en la presente, o no. Como se entenderá por los expertos en la téenica, tal evaluación no se propone generalmente para ser correcta para todo (es decir 100%) de los sujetos a ser identificados. El término, sin embargo, requiere que una porción estadísticamente significativa de sujetos pueda ser identificada (por ejemplo, una cohorte en un estudio de cohorte) . Si una porción es estad ísticamente significativa puede ser determinada sin más preámbulos por el experto en la técnica al usar varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas referidas a otra parte en la presente. El diagnóstico de acuerdo con la presente invención incluye aplicaciones del método en la supervisión , la confirmación, y la sub-graduación de la enfermedad relevante. Por otra parte, el establecimiento de un diagnóstico como se usa en la presente también incluye establecer un pronóstico para un sujeto. Tal pronóstico es un indicador predictivo para el desarrollo adicional de la enfermedad en una ventana de tiempo futuro, es decir la ventana predictiva. Así, una diag nóstico como se usa en la presente, comprende preferiblemente una predicción de si un sujeto mejorará con respecto a la enfermedad o a los síntomas de las enfermedades en el futuro o si la enfermedad o los síntomas llegará a ser peores. Por consiguiente, el anticuerpo de la invención se puede también aplicar para los procesos de estratificación de riesgo y, así, determinar la cantidad de cuidados intensivos y de hospitalización que será requerida para un sujeto individual que sufre de una enfermedad referida en la presente.

Preferiblemente, el anticuerpo de la invención para el uso en diagnóstico es bien combinado con un agente de detección o es capaz de reclutar tal agente. Un agente de detección como se usa en la presente comprende un isótopo radiactivo (por ejemplo, isótopos radiactivos de Youduro-Teenetio), agentes fluorescentes o quimioluminiscentes (por ejemplo, FITC, rodamina) , una enzima que es capaz de generar una señal detectable al convertir un sustrato (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, luciferasa de luciernaga, o beta galactosidasa), una proteína fluorescente de la (por ejemplo, proteína fl uorescente verde, azul o roja) . Los agentes de detección adecuados son bien conocidos en la técnica. También preferiblemente, el anticuerpo que se aplicará en el método de la presente invención se puede combinar con un agente que sea capaz de atraer un agente de detección. Tal agente puede ser biotina . En tal caso, un agente de detección combinado de estreptavidina de avidina puede ser usado que tras la unión de la biotina del anticuerpo unido servirá como un marcador detectable. Los marcadores detectables adecuados en tal caso son los referidos antes, más preferiblemente, una enzima será usada como un marcador detectable en tal caso. Además, un anticuerpo secundario se puede usar para la detección del primer anticuerpo, es decir, el anticuerpo que se aplicará en el método de la presente invención que está unido al polipéptido B7- H6 de la muestra. Un anticuerpo tan secundario será combinado a un marcador detectable como describe antes. Así, en el último caso, el anticuerpo secundario tras la unión al primer anticuerpo para generar una señal detectable y de tal modo permite la detección del primer anticuerpo unido. El principio de detección de anticuerpos unidos con un anticuerpo secundario es bien conocido en la téenica y se aplica rutinariamente, por ejemplo, para determinar la unión al anticuerpo en las secciones de tejido. Dependiendo del tipo de marcador detectable, diferentes métodos de detección pueden ser aplicados al usar un sistema lector para la señal generada por el marcador detectable. Tales sistemas incluyen el dispositivo de lectura de señal automática, como un lector de ELISA o de RIA, pero también el dispositivo microscópico para la detección manual o automática de la señal detectable. Por otra parte, el sistema lector puede determinar la información adicional de la muestra, por ejemplo, un sistema microscópico puede exhibir ópticamente las células de un lector de señal o un automatizado de sección de tejido puede determinar los biomarcadores adicionales comprendidos por la muestra además.

El término "cáncer" como se usa en la presente se refiere a cualquier neoplasma maligno. El neoplasma maligno se refiere a enfermedades que resulta del crecimiento indeseado, la invasión, y bajo cierta condiciones de metástasis de células deterioradas en un organismo. Las celulas que dan lugar al cáncer son genéticamente deterioradas y han perdido generalmente su capacidad de controlar la división celular, el comportamiento de migración de la célula, el estado de diferenciación y/o la maqumaria de muerte celular. La mayoría de los cánceres forman un tumor pero algunos cánceres hematopoyéticos, como leucemia, no lo hacen . El cáncer de acuerdo con la presente invención comprenderá células cancerosas que expresan un polipéptido B7-H6 como se especifica en otra parte en la presente. Los tipos preferidos de cáncer se seleccionan del grupo que consiste de: Linfoma de célula T, leucemia mieloide, carcinoma de colon, linfoma de célula B, melanoma, o carcinoma cervical. Los síntomas y los sistemas de clasificación para los diferentes cánceres son bien conocidos en la téenica y se describen en libros de texto estándar de la patología. El cáncer como se usa en la presente comprende cualquier etapa, grado, característica morfológica, invasividad , agresividad o malignidad del cáncer o el tejido o el órgano afectado de tal modo.

La presente invención además se relaciona con un anticuerpo de la invención para el uso en el tratamiento o el diagnóstico de una enfermedad inflamatoria.

Preferiblemente, el anticuerpo de la invención para el uso en tratar una enfermedad inflamatoria se combina con un agente antiinflamatorio o es capaz de reclutar un agente como el especificado en otra parte en la presente . Sin embargo, el anticuerpo de la invención se puede tambien usar para una enfermedad inflamatoria debido a sus propiedades de bloqueo y de unión en B7-H6 como un modulador de las cascadas de señalización implicadas en la inflamación.

Preferiblemente, el anticuerpo de la invención para el uso en diagnóstico se combina con un agente de detección o es capaz de reclutar un agente como especifica en otra parte en la presente.

El término "enfermedad inflamatoria" como se usa en la presente se refiere a una respuesta de tejido que implica citocinas inflamatorias y la célula inflamatoria infiltrada en respuesta a una lesión o destrucción de tejido. La enfermedad inflamatoria de acuerdo con la presente invención comprenderá una infección viral , y la infección bacteriana. Además, son incluidas las enfermedades autommunes como diabetes, esclerosis múltiple y enfermedad inflamatoria intestinal.

Haciendo referencia a lo anterior, la presente invención también se relaciona con un método para diagnosticar el cáncer en una muestra de un sujeto sospechoso de sufrir cáncer que comprende: a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo de la invención bajo cond iciones que permiten la unión de dicho anticuerpo a su epítopo en el polipéptido B7-H6; y b) determinar la unión del anticuerpo a dicho epítopo, por lo cual se diagnostica el cáncer.

El termino " diagnostico" como se usa en la presente se entiende la evaluación si un sujeto sufre de una enfermedad referida en la presente, o no. Como será entendido por los expertos en la téenica, tal evaluación no se propone generalmente para ser correcta para todos los (es decir 100%) de los sujetos a ser identificados . El término, sin embargo, requiere que las porciones estad ísticamente significativas de los sujetos pueden ser identificadas (por ejemplo, una cohorte en un estudio de cohorte). Si una porción es estadísticamente significativa puede ser determinada sin más preámbulos por el experto en la técnica al usar varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas referidas en otra parte en la presente. El diagnóstico de acuerdo con la presente invención incluye las aplicaciones del método en la supervisión, la confirmación, y la sub-graduación de la enfermedad relevante. Por otra parte, el establecimiento de un diagnóstico como se usa en la presente también incluye estabilizar un pronóstico para un sujeto. Tal pronóstico es un indicador predictivo para el desarrollo adicional de la enfermedad en una ventana de tiempo futuro, es decir, la ventana predictiva. Así, una diag nóstico como se usa en la presente, comprende preferiblemente una predicción de si un sujeto mejorará con respecto a la enfermedad o a los síntomas de las enfermedades en el futuro o si la enfermedad o los síntomas llegará a ser peores. Por consiguiente, el anticuerpo de la invención se puede también aplicar para los procesos de estratificación de riesgo y, así, determinar la cantidad de cuidados intensivos y de hospitalización que serán requeridos para un sujeto individual que sufre de una enfermedad referida en la presente.

El metodo anteriormente mencionado para diagnosticar el cáncer en una muestra del sujeto también , comprende preferiblemente la etapa de recomendar una terapia anticáncer para un sujeto basado sobre el resultado de diagnóstico obtenido mediante el método. El término "que recomienda" como se usa en la presente se refiere a hacer una recomendación para una terapia anticáncer o excluir (es decir, no recomendando) cierta terapia anticáncer para un sujeto. Tal recomendación servirá opcionalmente junto con otra información , por ejemplo, información aplicación de las investigaciones histopatológ icas, como una base para un médico para aplicar cierta terapia anticáncer para un sujeto individual, o no. Basado en el diagnóstico de la presente invención , es decir el diagnóstico de cáncer o sin cáncer, será hecha una recomendación para una terapia anticáncer. Será entendido que solamente en caso donde el diagnóstico de cáncer se ha establecido mediante el método de la presente invención, será hecha la recomendación para la terapia anticáncer. En caso donde ningún cáncer se establece como diagnóstico basado en el método de la presente invención , la recomendación sería la de abstenerse de una terapia contra el cáncer. Como se indica antes, la información adicional a partir del sujeto del cual la muestra precede puede usarse también para mejorar la recomendación. En un aspecto, una terapia anticáncer combinada, por ejemplo, con diferentes fármacos antitumorales, puede ser recomendada si el metodo de la presente invención identifica células cancerosas pero si las células cancerosas adicionales que no son identificadas por el método de la presente invención son detectadas en el cáncer investigado, por ejemplo mediante análisis histopatológicos.

El término "muestra" se refiere a una muestra de células separadas o a una muestra a partir de un tejido o de un órgano. Las muestras de tejido o de órgano se pueden obtener a partir de cualquier tejido u órgano mediante, por ejemplo, biopsia. Las células separadas se pueden obtener a partir de los fluidos corporales, como linfa, sangre, plasma, suero, licor y otro, o a partir de los tejidos o de los órganos mediante téenicas de separación como centrifugación o síntesis celular. Preferiblemente, la muestra es un una muestra de tejido o de fluido corporal que expresa o produce los polipéptidos referidos en la presente. La muestra se puede obtener a partir del sujeto mediante técnicas rutinarias que son bien conocidas por el experto en la técnica, por ejemplo, biopsia abierta incluyendo aspiración del tejido o material celular a partir de un sujeto. Para estas áreas que no pueden alcanzarse fácilmente a través de una biopsia abierta, puede realizarse una cirug ía y, preferiblemente, una cirugía invasiva mínima.

El término "sujeto" como se usa en la presente se relaciona con animales, preferiblemente mamíferos, y, más preferiblemente, humanos. El metodo de la presente invención será aplicado para sujetos sospechosos de sufrir de cáncer. Un sujeto sospechoso de sufrir de cáncer es un sujeto que exhibe síntomas clínicamente aparentes del cáncer o es un sujeto que tiene una pred isposición creciente para el cáncer. En el contexto de los ensayos de evaluación de diagnóstico a gran escala, un sujeto sospechoso de sufrir de cáncer puede ser incluso un sujeto sano, es decir, sujeto que no muestre síntomas de la enfermedad ni de un sujeto que tiene una predisposición por consig uiente.

Los términos "contacto" y "contacto de la muestra" como se usa en la presente se refieren a llevar el anticuerpo y la muestra en contacto físico de tal modo que permite la unión específica del anticuerpo al epítopo en el polipéptido B7-H6 si se comprenden por la muestra. Será entendido que poner en contacto como se entiende en la presente es realizado por un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que el anticuerpo se una específicamente al polipéptido B7-H6. Dependiendo de la naturaleza de la muestra, las etapas de pretratamiento pueden ser necesarias para liberar el polipéptido B7-H6 o des-mascarar el epítopo en el polipéptido B7-H6 de modo que el anticuerpo tenga acceso y pueda unirse específicamente al mismo. Por otra parte, dependiente de la clase de muestra, el manejo puede ser diferente. Por ejemplo, una muestra de tejido que será analizada para la presencia o la ausencia de un polipéptido B7-H6, se homogeneiza preferiblemente y las proteínas comprendidas por el tejido son aisladas y separadas, por ejemplo, mediante SDS PAGE u otros metodos de separación de proteína conocidos por un experto. Las proteínas separadas son analizadas para la presencia o la ausencia del polipéptido B7-H6 mediante métodos inmunológicos como Transferencia de Tipo Western al usar el anticuerpo definido en la presente antes. Estos métodos también incluyen las etapas de incubación que permiten la unión específica del anticuerpo al polipéptido B7-H6. Para aumentar especificidad deben realizarse las etapas de lavado. Cómo se realizan tales medidas es bien conocido por el experto en la téenica. Si una sección de tejido se usa como una muestra (es decir una muestra de sección de tejido) , será entendido que está considerada para analizar no sólo la presencia o la ausencia del polipéptido B7-H6 sino también la localización celular o sub celular de la misma. Por consiguiente, el tejido será mantenido intacto y se puede también teñir mediante técnicas de teñido histoquímicas antes o después de la unión del anticuerpo. Las técnicas adecuadas que permiten la inmunotinción de las secciones de tejido son bien conocidas por el experto en la técnica. Dependiendo si la muestra de sección de tejido se ha incrustado en un medio de inclusión, como parafina, puedes ser necesario retirarse de dicho medio de inclusión. Las técnicas relevantes son también bien conocidas en la técnica.

El término "que determina" como se usa en la presente se refiere a la detección del anticuerpo que está unido específicamente al polipeptido B7-H6 comprendido por la muestra , si la hay. Los métodos de detección para los anticuerpos que están unidos específicamente a un antígeno son también bien conocidos en la téenica. Preferiblemente, el anticuerpo que se aplicará en el método de la presente invención por sí mismo se puede combinar con un marcador detectable como un isótopo radiactivo (por ejemplo, isótopos radiactivos de Youduro-Ttecnetio) , agentes fluorescentes o quimioluminiscentes (por ejemplo, FITC , rodamina), una enzima que sea capaz de generar una señal detectable al convertir un sustrato (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, luciferasa de luciérnaga , o beta galactosidasa), una proteína fluorescente (por ejemplo, proteína fluorescente verde, azul o roja) . Los marcadores detectables adecuados son bien conocidos en la técnica. También preferiblemente, el anticuerpo que se aplicará en el método de la presente invención se puede combinar con un agente que sea capaz de atraer un agente de detección . Tal agente puede ser biotina. En tal caso un agente de detección combinado de avidina- o estreptavidina puede ser usado que tras la unión de la biotina del anticuerpo unido servirá como un marcador detectable. Los marcadores detectables adecuados en tal caso son aquellos referidos antes, más preferiblemente, una enzima será usada como un marcador detectable en tal caso. Además, un anticuerpo secundario se puede usar para la detección del primer anticuerpo, es decir el anticuerpo que se aplicará en el metodo de la presente invención que está unido al polipéptido B7-H6 de la muestra. Tal anticuerpo secundario será combinado con un marcador detectable como se describe antes. Así, en el último caso, el anticuerpo secundario tras la unión al primer anticuerpo genera una señal detectable y de tal modo permite la detección del primer anticuerpo unido. El principio de la detección de anticuerpos u nidos con un anticuerpo secundario es bien conocido en la téenica y se aplica rutinariamente, por ejemplo, por determinar la unión al anticuerpo en las secciones de tejido. Dependiendo del tipo de marcador detectable, diferentes métodos de detección pueden ser aplicados al usar un sistema de lectura para la señal generada por el marcador detectable. Tales sistemas incluyen el dispositivo automático de lectura de señal, como un lector de ELISA o de RIA, pero también el dispositivo microscópico para la detección manual o automática de la señal detectable. Por otra parte, el sistema de lectura puede determinar la información adicional de la muestra, por ejemplo, un sistema microscópico puede exhibir las células de una sección de tejido ópticamente o un lector automatizado de señal puede determinar biomarcadores adicionales comprendidos por la muestra además.

En una modalidad preferida del método de la presente invención , el cáncer es linfoma de célula T, leucemia mieloide, carcinoma de colon , linfoma de célula B, melanoma , o carcinoma cervical.

La presente invención tambien proporciona un método para diagnosticar una enfermedad inflamatoria en una muestra de un sujeto sospechoso de sufrir de una enfermedad inflamatoria que comprende: a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo de la invención bajo condiciones que permiten la unión de dicho anticuerpo a su epítopo en el polipéptido B7-H6; y b) determinar la unión del anticuerpo a dicho epítopo, por lo cual se diagnostica la enfermedad inflamatoria.

Las explicaciones de los términos hechos en relación con el método para diagnosticar el cáncer u otras modalidades en otra parte en la presente aplican mutatis mutandis para los términos en relación con el método anteriormente mencionado excepto como se especifica de otra manera en la presente a continuación .

El término "sujeto" como se usa en la presente se relaciona con animales, preferiblemente mamíferos, y, más preferiblemente, humanos. El método de la presente invención será aplicado para los sujetos sospechosos de sufrir de una enfermedad inflamatoria. Un sujeto sospechoso de sufrir de una enfermedad inflamatoria es un sujeto que exhibe síntomas clínicamente aparentes de una enfermedad inflamatoria o es un sujeto que tiene una predisposición aumentada para una enfermedad inflamatoria. En el contexto de los ensayos de evaluación de diagnóstico a gran escala, un sujeto sospechoso de sufrir de una enfermedad 32 inflamatoria puede ser incluso un sujeto sano, es decir, un sujeto que no muestre síntomas de la enfermedad ni de un sujeto que tiene una predisposición de la misma.

Como se discute en otra parte en la presente, la enfermedad inflamatoria referida antes es, preferiblemente, una infección viral.

La invención también se relaciona con un dispositivo para diagnosticar el cáncer o una enfermedad inflamatoria en una muestra que comprende: a) una unidad de análisis que comprende el anticuerpo de la invención : y b) un detector que detecta la unión del anticuerpo en la unidad de análisis a su epítopo en el polipéptido B7-H6.

El término "dispositivo" como se usa en la presente se relaciona con un sistema que comprende por lo menos la unidad de análisis anteriormente mencionada y la u nidad de evaluación ligadas operativamente entre sí. Cómo ligar las unidades del dispositivo de una manera operativa dependerá del tipo de unidades incluidas en el dispositivo. Por ejemplo, donde se aplican las unidades para el análisis automático de una muestra, los datos obtenidos por dicha unidad de análisis automáticamente operada pueden procesarse mediante, por ejemplo, un prog rama de computadora para obtener los resultados deseados med iante la unidad de evaluación . Preferiblemente, las unidades están comprendidas por un solo dispositivo en tal caso. La unidad de análisis puede comprender el anticuerpo en forma inmovilizada en un soporte sólido. Tal unidad de análisis es útil en particular para las muestras líquidas. La muestra que se investigará con el dispositivo de la presente invención es preferiblemente una muestra de tejido y, más preferiblemente, una muestra de sección de tejido. Así, en otro aspecto, el anticuerpo se puede comprender en una solución de detección que será aplicada a las muestras de tejido como la sección de tejido por la unidad de análisis. La solución de detección se puede almacenar en la unidad de análisis o un frasco separado, incluso fuera del dispositivo. La unidad de evaluación, preferiblemente una computadora o un dispositivo de procesamiento de datos, comprende las reglas implementadas, es decir, un algoritmo, para evaluar la unión determinada por la unidad de análisis por lo cual la unión se evalúa en la unión significativa o no significativa basada en el tipo de señal , la fuerza y, en el caso de muestras de tejido, la posición de la señal con respecto al tejido. Para las muestras que se evalúan para mostrar unión no significativa se establecerá el diagnóstico "sin cáncer". Si la unión significativa se obtiene como resultado de la evaluación, será establecido el diagnóstico de cáncer.

Preferiblemente, el dispositivo en su unidad de evaluación tambien comprende un sistema experto implementado con un algoritmo que se adapta para hacer las recomendaciones basadas en el diagnóstico establecido para una terapia o un tratamiento adecuado como se indica en otra parte en la presente más detalladamente.

En una modalidad preferida del dispositivo de la presente invención, dicha muestra es un tejido o una muestra de fluido corporal.

Finalmente, la presente invención se relaciona con u n kit para diagnosticar el cáncer o una enfermedad inflamatoria que comprende el anticuerpo de la invención y, preferiblemente, un agente para la detección de unión de dicho anticuerpo a su epítopo en el polipeptido B7-H6.

El término "kit" como se usa en la presente se refiere a una colección del anticuerpo y las instrucciones anteriormente mencionadas proporcionadas de una manera lista para su uso para diagnosticar el cáncer en una muestra . El anticuerpo y las instrucciones están , preferiblemente, proporcionados en un solo recipiente. Preferiblemente, el kit también comprende componentes adicionales que son necesarios para realizar el diagnóstico. Tales componentes pueden ser agentes auxiliares que se requieren para la detección de la unión al anticuerpo, agentes para pretratar la muestra que se analizarán o estándares de calibración .

Todas las referencias citadas en esta especificación están incorporadas en la presente por referencia con respecto a su contenido descrito completo y el contenido descrito se menciona expresamente en esta especificación.

Ejem plos Los siguientes Ejemplos ilustrarán simplemente la invención . No se entenderán, en absoluto, para limitar el alcance de la invención . 5 Ejemplo 1 : Método para la inmunización para obtener el anticuerpo monoclonal (mAb) anti-B7-H6 1.18: Se inmunizaron ratones de seis semanas de edad BALB/c con 100 mg de una B7- H6-lg-proteína de fusión que consiste del dominio extracelular de B7-H6 fusionado a un dominio de IgGI-Fc (B7-H6-lg-FP) mostrado ío en la Fig . 1 en adyuvante de Freud completo inyectado s.c. en cuatro diferentes sitios. Tres semanas después, se inyectaron 100 pg de B7-H6-lg-FP i.p. en PBS. Después de tres semanas, se inyectaron i. p. transfectantes BA/F3 (células pro-B)-B7-H6 (2 x 107 células) en PBS. Después de dos meses, se aplicaron i.p. 15 100 pg de B7-H6-lg-FP en PBS. Después de tres semanas, se realizó la inyección con transfectantes BA/F3-B7-H6 (2 x 107 células) en PBS i.p. y cinco d ías después las células del bazo se fusionaron con células de mieloma de ratón Ag8. Se evaluó el hibridoma 910 mediante citometría de flujo para la unión de las 0 inmunoglobulinas producidas a células BA/F3-B7-H6.

Adicionalmente, se evaluaron 480 clones mediante ELI SA para unir al B7-H6-lg-FP. Se seleccionó el clon 1 .18 anti-B7-H6 para estudios adicionales, debido a que los transfectantes BA/F3-B7- H6 teñidos y no las células BA/F3 transducidas del vector de 5 control a altos niveles y se unen a líneas celulares que expresan B7-H6 endógenamente a altos niveles.

Ejem plo 2: Unión de mAb 1.18 anti-B7-H6 a B7-H6-lg-FP mediante ELISA y a células BA/F3-B7-H6 transfectadas mediante citometría de flujo: Para ELISA: Se inmovilizó B7-H6-lg-FP (3 m/ml) en placas de ELISA e incubó con las concentraciones indicadas de mAb 1 .18 anti-B7-H6 y se desarrolló con mAb conjugados con HRP.

Para citometría de flujo: Se tiñeron los transfectantes BA/F3 o BA/F3-B7-H6 con mAb 1 .18 anti-B7-FI6 (2 mg/ml), los controles del isotipo, NKp30-FP y un FP de control y mAb secundarios conjugados con PE.

Los datos representan la unión de mAb 1 .18 anti-B7-H6 a B7-H6-lg-FP mediante ELISA y a células BA/F3-B7-H6 transfectadas mediante citometría de flujo.

Ejemplo 3: Unión de mAb 1.18 anti-B7-H6 implica el dominio de IgV de B7-H6: Se prepararon los siguientes constructos basados en el pcADN3.1 con el péptido de CD8-leader y una etiqueta HA de terminal C codificada para las siguientes porciones de B7-H6: B7-H6_1 (aminoácidos 24-454) B7-H6_2 (aminoácidos 83-454) B7-H6_3 (aminoácidos 141 -454) B7-H6_4 (aminoácidos 190-454) B7-H6_5 (aminoácidos 239-454) Los plásmidos resultantes se transfectaron transitoriamente en celulas H EK y se tiñeron posteriormente con el mAb 1 .18 anti- B7-H6 como se describe en el Ejemplo 2. Como puede verse en la Figura 5, el mAb 1 .18 anti-B7-H6 unido a B7-H6_01 (aminoácidos 24-454) y a B7-H6_2 (aminoácidos 83-454), pero no 5 a B7-H6_3 (aminoácidos 141 -454) indican que los aminoácidos 83-141 de B7-H6 (GDHQEAFRPGAIVSPWRLKSGDASLRLPGIQLEEAGEYRCEVWTP LKAQGTVQLEW, como se muestra en la SEC I D NO: 22 y las Figuras 1 y 2) están implicados en la unión de mAb 1 .18 anti-B7-ío H6. Todas las proteínas de B7-H6 truncado se expresaron y se detectaron mediante transferencia de tipo Western al usar el mAb anti-etiqueta HA.

Ejemplo 4: Unión de mAb 1.18 anti-B7-H6 a líneas celulares de diferente origen: Se tiñeron las líneas celulares de 15 diferente origen con mAb 1 .18 anti-B7-H6 y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe en el Ejemplo 2. Los datos revelan la unión de mAb 1 .18 anti-B7-H6 a líneas celulares de d iferente origen.

Ejemplo 5: PCR en tiempo real cuantitativo para 20 determinar la expresión del ARNm B7-H6: Se aisló el ARN a partir de líneas celulares tumorales al usar el kit miniatura RNeasy (Qiagen), se eliminó el ADN contaminante al usar el TU RBO DNase (Ambion) y se transcribió al revés el ARN al usar el kit de síntesis ProtoScript M-MuLV First Strand cDNA (NEB). 25 Se realizó el PCR cuantitativo en tiempo real al usar el SYBR Green I Master and UghtCycler480 (Roche). Los cebadores específicos para B7-H6 (GACCTGGAGCCATTGTGTCT como se muestra en la SEC I D NO: 23 y AAGCTGGACTGTTCCCTGTG como se muestra en la SEC I D NO: 24) y el gen de mantenimiento 5 GAPDH (GCAAATTCCATGGCACCGT como se muestra en la SEC ID NO: 25 y TCGCCCCACTTGATTTTGG como se muestra en la SEC I D NO: 26) se usaron para calcular el nivel de expresión del ARNm B7-H6 en relación a GAPDH . Los datos representan que las líneas celulares de diferente origen que se tiñeron con mAb ío 1 .18 anti-B7-H6 expresan el ARNm de B7-H6 en diferentes cantidades.

Ejemplo 6: Tinción inmunohistoquímica de B7-H6 en citospinas de transfectantes Ba/F3-B7-H6. Se tiñeron citospinas fijas a acetona de una mezcla 1 : 1 de celulas Ba/F3 y 15 Ba/F3-B7-H6 al usar el Sistema-HRP de Dual Envision+ (Dako).

Después de bloquear la actividad de la peroxidasa endógena , se bloquearon las citospinas con 10% de suero de cabra y 0.1 mg/ml de IgG humana. Se incubaron las citospinas con 5 mg/ml de mAb 1 .18 anti-B7-H6 o un control de isotipo de I g G I de ratón (clon 0 1 171 1 , R&D) en diluyente del anticuerpo Dako, se lavó e se incubó con conjugado del polímero etiquetado de peroxidasa Dako a ¡nmunoglobulinas anti-ratón de cabra y anti-conejo de cabra. Después de la incubación con soluciones del sustrato de 3,3'- diaminobencidina (DAB, por sus siglas en inglés), se analizaron 25 los núcleos celulares se sometieron a tinción de contraste con Hematoxilina y citospinas montadas mediante microscopía de luz. Los datos revelan que mAb 1 .18 anti-B7-H6 tiñe los transfectantes B7-H6 Ba/F3-B7-H6 en citospinas.

Ejem plo 7: Desgranulación de celulas NK primarias después del co-cultivo con células BA/F3 transducidas con B7-H6. Se enltivaron las células NK primarias expandidas con I L-2 durante 14 d ías en medios, con células BA F3, BA F3-B7-H6 (ligando para N Kp30) o BA F3-M ICA (ligando para el receptor de activación N KG2D) en presencia de un mAb anti-CD 107 conjugado con PE durante 5 h . Se determinó la desgranulación de las células N K como los porcentajes de las células N K CD107-positiva después del co-cultivo mediante citometría de flujo. Las barras de error representan medio+/- SD de cultivos por triplicado. Los datos revelan que las células BA/F3-B7-H6 inducen la desgranulación de las células NK primarias.

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Un anticuerpo que une específicamente a un epítopo formado por u na porción del dominio extracelular del polipeptido B7-H6, dicha porción que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 22.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1 , donde dicho anticuerpo comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) como se muestra en las SEC I D NO: 5, 7, 9, 15, 17, y 19.

3. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho anticuerpo es el anticuerpo depositado bajo el número de acceso DSM ACC 31 17 en el DSMZ, Brunswick, Alemania bajo el tratado de Budapest el 2 de febrero de 201 1 .

5. Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer.

6. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el cáncer es linfoma de célula T, leucemia mieloide, carcinoma de colon , linfoma de cél ula B, melanoma, o carcinoma cervical .

7. Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para el uso en el tratamiento o el diagnóstico de la enfermedad inflamatoria.

8. El anticuerpo de la reivindicación 7, donde la enfermedad inflamatoria es una infección viral.

9. Un metodo para diagnosticar el cáncer en una muestra de un sujeto sospechoso de sufrir cáncer que comprende: a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo de 5 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 bajo las condiciones que permiten la unión de dicho anticuerpo a su epítopo en el polipéptido B7-H6; y b) determinar la unión del anticuerpo a dicho epítopo, por lo cual se diagnostica el cáncer. ío

10. El método de la reivindicación 9, donde el cáncer es linfoma de célula T, leucemia mieloide, carcinoma de colon , linfoma de célula B, melanoma, o carcinoma cervical .

1 1 . U n método para diagnosticar una enfermedad inflamatoria en una muestra de un sujeto sospechoso de sufrir 15 una enfermedad inflamatoria, que comprende: a) poner en contacto con la muestra con el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 bajo las condiciones que permiten la unión de dicho anticuerpo a su epítopo en el polipéptido B7-H6; y 20 b) determinar la unión del anticuerpo a dicho epítopo, por lo cual se diagnostica la enfermedad inflamatoria.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 1 1 , donde dicha muestra es un tejido o una muestra de fluido corporal. 25

13. U n dispositivo para diagnosticar el cáncer o una enfermedad inflamatoria en una muestra que comprende: a) una unidad de análisis que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y b) un detector que detecta la unión del anticuerpo en la 5 unidad de análisis a su epítopo en el polipeptido B7-H6.

14. El dispositivo de la reivindicación 13, donde dicha muestra es un tejido o una muestra de fluido corporal. 1 5. Un kit para diagnosticar el cáncer o una enfermedad inflamatoria que comprende el anticuerpo de cualquiera de las ío reivindicaciones 1 a 4 y, preferiblemente, un agente para la detección de la unión de dicho anticuerpo a su epítopo en el polipéptido B7-H6.