ES2556641T3 - Conjugados de fármacos y su uso para tratar cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa - Google Patents

Conjugados de fármacos y su uso para tratar cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa Download PDF

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antibody
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Peter D. Senter
Svetlana Doronina
Brian E. Toki
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Abstract

Una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos, que comprende un compuesto de la fórmula Ia:**Fórmula** o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos en los que, L- es un anticuerpo monoclonal que se une inmunoespecíficamente al antígeno CD30; -A- es una unidad de extensor; a es 1; cada -W- es independientemente una unidad de aminoácido; w es un número entero que varía de 2 a 12; - Y- es una unidad de espaciador que se autoinmola; y es 1 ó 2; p varía de 1 a alrededor de 20, y es el número promedio de unidades -Aa-Ww-Yy-D por anticuerpo en la composición; y - D es una unidad de fármaco, en el que los compuestos de fórmula Ia tienen la estructura**Fórmula** o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

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DESCRIPCION
Conjugados de farmacos y su uso para tratar cancer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa
1. Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a conjugados de farmaco-enlazador-ligando y a compuestos de farmaco-enlazador, para composiciones que comprenden un conjugado de farmaco-enlace-ligando o un compuesto de farmaco- enlazador, y al uso de los mismos para tratar cancer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa.
2. Antecedentes de la invencion
Se han aislado varios compuestos peptidicos cortos de fuentes naturales y se ha descubierto que estos poseen actividad biologica. Tambien se han preparado analogos de estos compuestos y se descubrio que algunos teman actividad biologica. Por ejemplo, la auristatina E (patente US 5.635.483 de Pettit et al.) es un analogo sintetico del producto marino natural dolastatina 10, un agente que inhibe la polimerizacion de la tubulina uniendose al mismo sitio en la tubulina que el farmaco contra el cancer vincristina ((G. R. Pettit, Prog. Chem. Org. Nat. Prod., 70: 1-79 (1997)). La dolastatina 10, la auristatina PE y la auristatina E son peptidos lineales que tienen cuatro aminoacidos, de los cuales tres son exclusivos de la clase dolastatina de los compuestos. Tanto la dolastatina 10 como la auristatina PE estan siendo utilizadas en ensayos clmicos en humanos para tratar el cancer. Las diferencias estructurales entre la dolastatina 10 y la auristatina E residen en el residuo terminal C, en el que el grupo tiazolfeniletilamino de la dolastatina 10 se sustituye por una unidad de norefedrina en la auristatina E.
Las siguientes referencias describen compuestos de dolastatina y auristatina y sus analogos, y su uso para tratar el cancer:
Publicacion Internacional n° WO 96/33212 A1 a nombre de Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd.;
Publicacion Internacional n° WO 96/14856 A1 a nombre de Arizona Board of Regents;
Publicacion de patente europea n° EP 695757 A2 a nombre de Arizona Board of Regents;
Publicacion de patente europea n° EP 695758 A2 a nombre de Arizona Board of Regents;
Publicacion de patente europea n° EP 695759 A2 a nombre de Arizona Board of Regents;
Publicacion Internacional n° WO 95/09864 A1 a nombre de Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd.;
Publicacion Internacional n° WO 93/03054 A1 a nombre de Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd.;
Patente US 6.323.315 B1 a nombre de Pettit et al.;
G.R. Pettit et al., Anti-Cancer Drug Des. 13(4): 243-277 (1998);
G.R. Pettit et al., Anti-Cancer Drug Des. 10(7): 529-544 (1995); y K. Miyazaki et al., Chem. Pharm. Bull. 43(10),' 1706-18 (1995).
A pesar de los datos in vitro de los compuestos de la clase de la dolastatina y su analogo, los importantes efectos toxicos generales en las dosis necesarias para lograr un efecto terapeutico comprometen su eficacia en estudios clmicos. En consecuencia, existe una clara demanda en la tecnica de derivados de dolastatina que tengan una toxicidad significativamente menor pero una eficacia terapeutica util, en comparacion con las terapias con farmacos de dolastatina actuales.
El enunciado de cualquier referencia en la Seccion 2 de esta solicitud no quiere decir que se admita que la referencia constituya la tecnica anterior a esta solicitud.
3. Sumario de la invencion
En un aspecto, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica adaptada para administracion intravenosa a seres humanos, que comprende compuestos de la formula Ia:
t-f-A—W—Yy-^j) p la
o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos en los que,
L- es un anticuerpo monoclonal que se une inmunoespedficamente al antfgeno CD30;
-A- es una unidad de extensor; a es 1;
5 cada -W- es independientemente una unidad de aminoacido;
w es un numero entero que vana de 2 a 12;
- Y- es una unidad de espaciador que se autoinmola; y es 1 o 2;
p vana de 1 a alrededor de 20, y es el numero promedio de unidades -Aa-Ww-Yy-D por anticuerpo en la 10 composicion; y
- D es una unidad de farmaco,
en el que los compuestos de formula la tienen la estructura
imagen1
15 Un compuesto de formula la, o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo (un conjugado de "farmaco-enlazador-ligando") es util para tratar o prevenir el cancer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa en un animal.
Tambien se describen compuestos de farmaco-ligando de la formula lla:
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y sales
imagen2
donde, de forma independiente en cada lugar:
R1 se selecciona de -H, -C1-C8 alquilo y -C3-C8 carbociclo; y R2 se selecciona de -H y -C1-C8 alquilo; o R1 y R2 juntos, tienen la formula -(CRaRb)n-, donde Ra y Rb se seleccionan independientemente de -H, -C1-C8 alquilo y - C3-C8 carbociclo y n se selecciona de 2, 3, 4, 5 y 6, y forman un anillo con el atomo de nitrogeno al que estan 25 unidos;
R3 se selecciona de -H, -C1-C8 alquilo, -C3-C8 carbociclo, -O-(C1-C8 alquilo), -arilo, -C1-C8 alquil-arilo, -C1-C8
alquil-(C3-C8 carbociclo), -C3-C8 heterociclo y -C1-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo);
R4 se selecciona de -H, -C1-C8 alquilo, -C3-C8 carbociclo, -O-(C1-C8 alquilo), -arilo, -C1-C8 alquil-arilo, -C1-C8
alquil-(C3-C8 carbociclo), -C3-C8 heterociclo y -C1-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo) donde R5 se selecciona de -H y - 30 metilo;
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o R4 y R5 juntos, tienen la formula -(CRaRb)n- donde Ra y Rb se seleccionan independientemente de -H, -C1-C8 alquilo y -C3-C8 carbociclo y n se selecciona de 2, 3, 4, 5 y 6, y forman un anillo con el atomo de carbono al que estan unidos;
R6 se selecciona de -H y -C1-C8 alquilo;
R7 se selecciona de -H, -C1-C8 alquilo, -C3-C8 carbociclo, -O-(Ci-C8 alquilo), -arilo, -C1-C8 alquil-arilo, -C1-C8 alquil-(C3-C8 carbociclo), -C3-C8 heterociclo y -C1-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo);
cada R8 se selecciona independientemente de -H, -OH, -C1-C8 alquilo, -C3-C8 carbociclo y -O-(Ci-C8 alquilo);
R9 se selecciona de -H y -C1-C8 alquilo;
X es -O-, -S-, -NH-o -N(R14)-;
R11 se selecciona de -H, -OH, -NH2, -NHR14, -N(R14)2, -C1-C8 alquilo, -C3-C8 carbociclo, -O-(Ci-C8 alquilo), -arilo, -C1-C8 alquil-arilo, C1-C8 alquil-(C3-C8 carbociclo), -C3-C8 heterociclo y -C1-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo);o R11 es un atomo de ox^geno que forma una unidad de carbonilo (C=O) con el atomo de carbono al cual esta unido y un atomo de hidrogeno en este atomo de carbono se sustituye por uno de los enlaces en el enlace doble (C=O);
cada R12 se selecciona independientemente de -arilo y -C3-C8 heterociclo;
cada R14 es independientemente -H o -C1-C8 alquilo; y
R16 es -Yy-Ww-A'
donde
cada -W- es independientemente una unidad de aminoacido;
-Y- es una unidad de espaciador;
w es un numero entero que varia de 0 a 12;
y es 0, 1 o 2; y
-A' se selecciona de
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y
H2N—o---R17-C(0)—| .
donde
G se selecciona de -Cl, -Br, -I, -O-mesilo y -O-tosilo;
J se selecciona de -Cl, -Br, -I, -F, -OH, -O-N-succinimida, -O-(4-nitrofenilo), -O-pentafluorofenilo, -O- tetrafluorofenilo y -O-C(O)-OR18;
R17 se selecciona de -C1-C10 alquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -O-(Ci-C8 alquil)-, -arileno-, -C1-C10 alquileno-arileno-, -arileno-Ci-Cio alquileno-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)-Ci-Cio alquileno-, -C3-C8 heterociclo-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-, -(C3-C8 heterociclo)-C1-C1o alquileno-, -(CH2CH2O)r- y - (CH2CH2OX-CH2-;
r es un numero entero que vana de 1-10; y R18 es -C1-C8 alquilo o -arilo.
Un compuesto de la formula IIa o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo (un compuesto de "farmaco-enlazador") es util para tratar el cancer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa en un animal o sirve como intermediario para la smtesis de un conjugado de farmaco-enlazador-ligando.
Tambien se describen composiciones que comprenden una cantidad efectiva de un conjugado de farmaco- enlazador-ligando y un soporte o vetnculo farmaceuticamente aceptable.
Tambien se describen composiciones que comprenden una cantidad efectiva de un compuesto de farmaco- enlazador y un soporte o vetnculo farmaceuticamente aceptable.
Tambien se describen metodos para eliminar o inhibir la multiplicacion de una celula tumoral o celula cancerosa, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un conjugado de farmaco-enlazador- ligando.
Tambien se describen metodos para tratar cancer, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un compuesto de farmaco-enlazador.
Tambien se describen metodos para tratar cancer, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un conjugado de farmaco-enlazador-ligando.
Tambien se describen metodos para eliminar o inhibir la replicacion de una celula que exprese un anticuerpo autoinmune, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un compuesto de farmaco-enlazador.
Tambien se describen metodos para eliminar o inhibir la replicacion de una celula que exprese un anticuerpo autoinmune, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un conjugado de farmaco-enlazador-ligando.
Tambien se describen metodos para tratar una enfermedad autoinmune, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un compuesto de farmaco-enlazador.
Tambien se describen metodos para tratar una enfermedad autoinmune, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un conjugado de farmaco-enlazador-ligando.
Tambien se describen metodos para tratar una enfermedad infecciosa, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un compuesto de farmaco-enlazador.
Tambien se describen metodos para tratar una enfermedad infecciosa, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un conjugado de farmaco-enlazador-ligando.
Tambien se describen metodos para prevenir la multiplicacion de una celula tumoral o celula cancerosa, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un compuesto de farmaco-enlazador.
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Tambien se describen metodos para prevenir la multiplicacion de una celula tumoral o celula cancerosa, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un conjugado de farmaco-enlazador- ligando.
Tambien se describen metodos para prevenir el cancer, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un compuesto de farmaco-enlazador.
Tambien se describen metodos para prevenir el cancer, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un conjugado de farmaco-enlazador-ligando.
Tambien se describen metodos para prevenir la multiplicacion de una celula que exprese un anticuerpo autoinmune, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un compuesto de farmaco- enlazador.
Tambien se describen metodos para prevenir la multiplicacion de una celula que exprese un anticuerpo autoinmune, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un conjugado de farmaco- enlazador-ligando.
Tambien se describen metodos para prevenir una enfermedad autoinmune, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un compuesto de farmaco-enlazador.
Tambien se describen metodos para prevenir una enfermedad autoinmune, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un conjugado de farmaco-enlazador-ligando.
Tambien se describen metodos para prevenir una enfermedad infecciosa, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un compuesto de farmaco-enlazador.
Tambien se describen metodos para prevenir una enfermedad infecciosa, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un conjugado de farmaco-enlazador-ligando.
Tambien se describe un compuesto de farmaco-enlazador que puede ser utilizado como producto intermedio para la smtesis de un conjugado de farmaco-enlazador-ligando.
La presente invencion se puede entender con mas detalle con referencia a la siguiente descripcion detallada, las figuras y los ejemplos ilustrativos, que estan destinados a ilustrar las realizaciones de la invencion.
4. Descripcion breve de los dibujos
FIG. 1 muestra la citotoxicidad del compuesto 49 y del compuesto 53 contra la lmea celular H3396. La lmea -D- representa el compuesto 49 y la lmea -o- representa el compuesto 53.
FIG. 2 muestra la citotoxicidad de los compuestos 64, 65, 68 y 69 contra la lmea celular H3396. La lmea -♦- representa el compuesto 64, la lmea -■- representa el compuesto 65, la lmea -▲- representa el compuesto 68, y la lmea -X- representa el compuesto 69.
FIG. 3 muestra la citotoxicidad de los compuestos 64, 65, 68 y 69 contra la lmea celular HCT-116. La lmea -♦- representa el compuesto 64, la lmea -■- representa el compuesto 65, la lmea -▲- representa el compuesto 68, y la lmea -X- representa el compuesto 69.
FIG. 4 muestra la citotoxicidad de los compuestos 66 y 68 contra la lmea celular H3396. La lmea -□- representa el compuesto 66 y la lmea -*- representa el compuesto 68.
FIG. 5 muestra la citotoxicidad de los compuestos 66, 68 y 69 contra la lmea celular colorrectal humana Karpas. La lmea -♦- representa el compuesto 66, la lmea -▲- representa el compuesto 68 y la lmea -X- representa el compuesto 69.
FIG. 6 muestra la citotoxicidad de los compuestos 66 y 67 contra la lmea celular H3396 en funcion de la duracion de exposicion. Las celulas se expusieron a los conjugados durante todo el tiempo que duro el ensayo, sin lavar (96 horas), o fueron expuestas a los conjugados durante 2 horas, lavadas y luego incubadas durante otras 94 horas. Al final del penodo de 96 horas, las celulas fueron pulsadas con azul Alamar para determinar la viabilidad celular. La lmea -□- representa el compuesto 66 con una exposicion de 2 h, la lmea -- representa el compuesto 67 con una exposicion de 2 h, la lmea -•- representa el compuesto 66 con una exposicion de 96 h, y la lmea - - representa el compuesto 67 con una exposicion de 96 h.
FIG. 7 muestra el efecto de los compuestos 66-69 en el crecimiento de tumores en un aloinjerto de adenocarcinoma pulmonar humano L2987, que se implantaron en ratones calvos. La lmea -X- representa el tumor sin tratar, la lmea -
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▼ - representa el compuesto 66, la lmea -♦- representa el compuesto 68, la lmea -V- representa el compuesto 67 y la lmea -0- representa el compuesto 69.
FIG. 8 muestra los efectos de los compuestos 66-69 en el crecimiento de tumores en un aloinjerto de linfoma de celulas grandes anaplasico humano que se implantaron en ratones calvos. La lmea -X- representa el tumor sin tratar, la lmea -A- representa el compuesto 67, la lmea -•- representa el compuesto 69, la lmea -A- representa el compuesto 66 y la lmea -o- representa el compuesto 68.
5. Descripcion detallada de la invencion
5.1 definiciones
Los ejemplos de un "animal" incluye, aunque no exclusivamente, humano, rata, raton, cobaya, mono, cerdo, cabra, vaca, caballo, perro, gato, pajaro y aves de corral. "Arilo" se refiere a un grupo aromatico carbodclico. Ejemplos de grupos arilo incluyen, aunque no exclusivamente, fenilo, naftilo y antracenilo. Un grupo aromatico carbodclico o un grupo aromatico heterodclico puede ser sustituido o no sustituido con uno o mas grupos, incluyendo, aunque no exclusivamente, -C-i-Ca alquilo,-O-(Ci-Cs alquilo), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)oR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', - C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN, donde cada R' se selecciona independientemente de-Ci-Ca alquilo y arilo.
El termino "Ci-Ca alquilo", como se usa aqu se refiere a un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada, saturado o insaturado que tiene de 1 a 8 atomos de carbono. Los grupos "Ci-Ca alquilo" representativos incluyen, aunque no exclusivamente, -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo, -n-pentilo, -n-hexilo, -n-heptilo, -n-octilo, -n-nonilo y -n-decilo; mientras que los C1-C8 alquilos incluyen, aunque no exclusivamente, -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -ferc-butilo, - isopentilo, 2-metilbutilo, los C1-C8 alquilos incluyen, aunque no exclusivamente, -vinilo, -alilo, -i-butenilo, -2-butenilo, -isobutilenilo, -i-pentenilo, -2-pentenilo, -3-metil-i-butenilo,-2-metil-2-butenilo, -2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2- hexilo, 3-hexilo,-acetilenilo, -propinilo, -i-butinilo, -2-butinilo, -i-pentinilo, -2-pentinilo, -3-metil-i-butinilo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, ferc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, isohexilo, 2- metilpentilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilpentilo, 2,3-dimetilpentilo, 3,3-dimetilpentilo, 2,3,4-trimetilpentilo, 3-metilhexilo, 2,2-dimetilhexilo, 2,4-dimetilhexilo, 2,5-dimetilhexilo, 3,5-dimetilhexilo, 2,4- dimetilpentilo, 2-metilheptilo, 3-metilheptilo, n-heptilo, isoheptilo, n-octilo, e isooctilo. Un grupo Ci-C8 alquilo puede ser sustituido o no sustituido con uno o mas grupos, incluyendo, aunque no exclusivamente, -Ci-C8 alquilo,-O-(Ci-C8 alquilo), -arilo,-C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN, donde cada R' se selecciona independientemente de-Ci-C8 alquilo y arilo.
Un "C3-C8 carbociclo" es un anillo de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 miembros carbodclicos no aromatico saturado o insaturado. Los C3-C8 carbociclos representativos incluyen, aunque no exclusivamente, -ciclopropilo, -ciclobutilo, -ciclopentilo, - ciclopentadienilo, -ciclohexilo, -ciclohexenilo, -i,3-ciclohexadienilo, -i,4-ciclohexadienilo, -cicloheptilo, -i,3- cicloheptadienilo, -i,3,5-cicloheptatrienilo, -ciclooctilo y -cilooctadienilo. Un grupo C3-C8 carbociclo puede ser sustituido o no sustituido con uno o mas grupos, incluyendo, aunque no exclusivamente, -Ci-C8 alquilo,-O-(Ci-C8 alquilo),-arilo,-C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN, donde cada R' se selecciona independientemente de -Ci-C8 alquilo y arilo.
Un "C3-C8 carbociclo" se refiere a un grupo C3-C8 carbociclo definido arriba donde uno de los atomos de hidrogeno de los grupos carbociclo es sustituido con un enlace.
Un "Ci-Cio alquileno" es un grupo hidrocarburo saturado de cadena lineal de la formula -(CH2)i-io-. Ejemplos de un grupo Ci-Cio alquileno incluyen metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, ocitileno, nonileno y decaleno.
Un "arileno" es un grupo arilo que tiene dos enlaces covalentes y pueden estar en las configuraciones orto, meta, o para como se muestra en las siguientes estructuras:
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en el que el grupo fenilo puede ser sustituido o no sustituido con hasta cuatro grupos, incluyendo, aunque no exclusivamente, -Ci-C8 alquilo,-O-(Ci-C8 alquilo),-arilo,-C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -
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C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN, donde cada R' se selecciona independientemente de-C1-C8 alquilo y arilo.
Un "C3-C8 heterociclo" se refiere a un anillo aromatico o no aromatico C3-C8 carbociclo en el que de uno a cuatro de los atomos de carbono son independientemente sustituidos con un heteroatomo del grupo formado por O, S y N. Los ejemplos representativos de un C3-C8 heterociclo incluyen, benzofuranilo, benzotiofeno, indolilo, benzopirazolilo, cumarinilo, isoquinolinilo, pirrolilo, tiofenilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo , isoxazolilo y tetrazolilo. Un grupo C3-C8 heterociclo puede ser sustituido o no sustituido con hasta siete grupos, incluyendo, -C1-C8 alquilo, -O-(Ci-C8 alquilo), -arilo, -C(O)R', - OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogeno, -N3, -NH2, - NH(R'), -N(R')2 y -CN, donde cada R' se selecciona independientemente de -C1-C8 alquilo y arilo.
Un "C3-C8 heterociclo" se refiere a un grupo C3-C8 heterociclo definido arriba donde uno de los atomos de hidrogeno de los grupos heterociclo es sustituido con un enlace. Un grupo C3-C8 heterociclo puede ser sustituido o no sustituido con hasta seis grupos, incluyendo, -C1-C8 alquilo, -O-(Ci-C8 alquilo), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', - C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN, donde cada R' se selecciona independientemente de-Ci-c8 alquilo y arilo.
Un "compuesto de la invencion" es un compuesto de farmaco-enlazador o un conjugado de farmaco-enlazador- ligando.
En una forma de realizacion, los compuestos de la invencion estan en forma aislada o purificada. Como se usa aqrn, "aislado", significa separado de los demas componentes de (a) una fuente natural, tal como una celula vegetal o animal o cultivo celular, o (b) una mezcla de reaccion qmmica organica sintetica. Como se usa aqrn, "purificado" significa que, cuando se afsla, el aislamiento contiene al menos el 95%, preferentemente al menos 98%, de un compuesto de la invencion en peso del producto aislado.
Los ejemplos de un "grupo protector hidroxilo" incluyen eter metoximetflico, eter 2-metoxietoximetflico, eter tetrahidropiramlico, eter bendlico, eter p-metoxibendlico, eter trimetilsilflico, eter triisopropilsiKlico, eter t- butildimetilsdlico, eter trifenilmetilsidico, ester de acetato, esteres de acetato sustituidos, pivaloato, benzoato, metanosulfonato y p-toluenosulfonato.
"Grupo saliente" se refiere a un grupo funcional que puede ser sustituido por otro grupo funcional. Tales grupos salientes son muy conocidos en la tecnica, y los ejemplos incluyen un haluro (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro), metanosulfonilo (mesilo), p-toluenosulfonilo (tosilo), trifluorometilsulfonilo (triflato), y trifluorometilsulfonato.
El termino "anticuerpo", como se usa aqrn, se refiere a una molecula de inmunoglobulina de longitud completa o una parte inmunologicamente activa de una molecula de inmunoglobulina de longitud completa, es decir, una molecula que contiene un sitio de union del antfgeno que se une inmunoespedficamente a un antfgeno de un objetivo de interes o parte del mismo, estos objetivos, incluyendo celulas cancerosas o celulas que producen autoanticuerpos autoinmunes asociados con una enfermedad autoinmune. La inmunoglobulina descrita en la presente memoria puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molecula de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden provenir de cualquier especie. Preferiblemente, sin embargo, la inmunoglobulina es de origen humano, murino o de conejo. Los anticuerpos utiles en la invencion son monoclonales, e incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, biespedficos, humanos, humanizados o quimericos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fv, Fab, fragmentos "F(ab'), fragmentos F(ab')2, fragmentos producidos por una biblioteca de expresion Fab, anticuerpos antiidiotipo (anti-Id), CDR, y fragmentos de union de epttopos de alguno de los anteriores que se una inmunoespedficamente al antfgeno CD30.
La frase "sal farmaceuticamente aceptable", como se usa aqrn, se refiere a sales organicas o inorganicas farmaceuticamente aceptables de un compuesto de la invencion. Los compuestos de la invencion contienen al menos un grupo amino, y en consecuencia, se pueden formar sales de adicion acidas con este grupo amino. Las sales preferidas incluyen sales de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato acido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato acido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato (es decir, 1,1'- metileno-bis-(2-hidroxi-3-naftoato )). Una sal farmaceuticamente aceptable puede implicar la inclusion de otra molecula como un ion de acetato, un ion de succinato u otros contraiones. El contraion puede ser cualquier porcion organica o inorganica que estabilice la carga en el compuesto original. Ademas, una sal farmaceuticamente aceptable puede tener mas de un atomo cargado en su estructura. Los casos en que varios atomos cargados son parte de la sal farmaceuticamente aceptable pueden tener varios contraiones. Asf pues, una sal farmaceuticamente aceptable puede tener uno o mas atomos cargados y o uno o mas contraiones.
"Solvato farmaceuticamente aceptable" se refiere a una asociacion de una o mas moleculas solventes y un compuesto de la invencion. Los ejemplos de solventes que forman solvatos farmaceuticamente aceptables incluyen agua, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, acido acetico y etanolamina.
En el contexto del cancer, el termino "tratamiento" incluye cualquiera o todo de lo siguiente: prevenir el crecimiento 5 de celulas tumorales o celulas cancerosas, prevenir la replicacion de las celulas tumorales o celulas cancerosas, disminuir el volumen total del tumor y mejorar uno o mas smtomas asociados con la enfermedad.
En el contexto de una enfermedad autoinmune, el termino "tratamiento" incluye cualquiera o todo de lo siguiente: prevenir la replicacion de las celulas asociadas con un estado de enfermedad autoinmune, incluyendo, aunque no exclusivamente, las celulas capaces de producir un anticuerpo autoinmune, disminuir la cantidad de anticuerpos 10 autoinmunes y mejorar uno o mas smtomas de una enfermedad autoinmune.
En el contexto de una enfermedad infecciosa, el termino "tratamiento" incluye cualquiera o todo de lo siguiente: prevenir el crecimiento, multiplicacion o replicacion del patogeno que causa la enfermedad infecciosa y mejorar uno o mas smtomas de una enfermedad infecciosa.
Las siguientes abreviaturas se utilizan en la presente memoria y tienen las definiciones que se indican: AE es 15 auristatina E, Boc es W-(t-butoxicarbonilo), cit es citrulina, DAP es dolaproina, DCC es 1,3-diciclohexilcarbodiimida, DCM es diclorometano, DEA es dietilamina, DEAD es dietilo, DEPC es dietilfosforilcianidato, DIAD es diisopropilazodicarboxilato, DIEA es W,A/-diisopropiletilamina, dil es dolaisoleuina, DMAP es 4-dimetilaminopiridina, DME es eter dimefflico de etilenoglicol (o 1,2-dimetoxietano), DMF es W,W-dimetilformamida, DMSO es dimetilsulfoxido, doe es dolafenina, dov es W,W-dimetilvalina, DTNB es 5,5'-ditiobis(acido 2-nitrobenzoico), DTPA es 20 acido dietilentriaminopentaacetico, DTT es ditiotreitol, EDCI es hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3- etilcarbodiimida, EEDQ es 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina, ES-MS es espectrometffa de masas con electrospray, EtOAc es acetato de etilo, Fmoc es W-(9-fluorenilmetoxicarbonilo), gly es glicina, HATU es hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-W,W,W,W-tetrametiluronio, HOBt es 1-hidroxibenzotriazol, HPLC es cromatograffa lfquida de alta presion, ile es isoleucina, lys es lisina, MeCN es acetonitrilo, MeOH es metanol, Mtr es 25 4-anisildifenilmetilo (o 4-metoxitritilo), nor es (1S,2R )-(+)-norefedrina, PAB es p-aminobencilo, PBS es solucion salina tamponada con fosfato (pH 7,4), PEG es polietilenoglicol, Ph es fenilo, Pnp es p-nitrofenilo, MC es 6- maleimidocaproilo, Ph es fenilo, phe es L-fenilalanina, PyBrop es hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfonio, SEC es tamano con exclusion por tamano, Su es succinimida, TFA es acido trifluoroacetico, TLC es cromatograffa de capa fina, UV es ultravioleta, val es valina.
30 5.2 conjugados de farmaco-enlazador-ligando
Como se ha indicado arriba, la invencion proporciona de la formula la: una composicion farmaceutica adaptada para administracion intravenosa a seres humanos, que comprende compuestos de la formula la:
fc-(-A—W—Yy-^j) p la
o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos en los que,
35 L- es un anticuerpo monoclonal que se une inmunoespedficamente al anffgeno CD30;
-A- es una unidad de extensor; a es 1;
cada -W- es independientemente una unidad de aminoacido; w es un numero entero que vaffa de 2 a 12;
40 - Y- es una unidad de espaciador que se autoinmola;
y es 1 o 2;
p vaffa de 1 a alrededor de 20, y es el numero promedio de unidades -Aa-Ww-Yy-D por anticuerpo en la composicion; y
- D es una unidad de farmaco,
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en el que los compuestos de formula la tienen la estructura
imagen6
o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos.

En una forma de realizacion, p vana de 1 a alrededor de 8.

En otra forma de realizacion, p vana de 1 a alrededor de 3.

En otra forma de realizacion, p vana de alrededor de 3 a alrededor de 5.
En otra forma de realizacion mas, p vana de alrededor de 7 a alrededor de 9.
En otra forma de realizacion, p es alrededor de 8.
En otra forma de realizacion, p es alrededor de 4.
En otra forma de realizacion, p es alrededor de 2.
Un compuesto ilustrativo de la formula la tiene la estructura:
imagen7
y sales y solvatos farmaceuticamente aceptables del mismo, donde p vana de alrededor de 7 a alrededor de 9.
En una forma de realizacion, p vana de 1 a alrededor de 3.
En otra forma de realizacion, p vana de alrededor de 3 a alrededor de 5.
En otra forma de realizacion, p es alrededor de 8.
En otra forma de realizacion mas, p es alrededor de 4.
En otra forma de realizacion, p es alrededor de 2.
Se entiende que p es el numero promedio de unidades de Aa-Ww-Yy-D por ligando en un conjugado de farmaco- enlazador-ligando de la formula la.

En una forma de realizacion, p vana de 1 a 15.

En otra forma de realizacion, p vana de 1 a 10.

En otra forma de realizacion, p vana de 1 a alrededor de 8.

En otra forma de realizacion, p vana de 1 a alrededor de 5.

En otra forma de realizacion, p vana de 1 a alrededor de 3.
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En una forma de realizacion, p vana de alrededor de 3 a alrededor de 5.
En una forma de realizacion, p vana de alrededor de 7 a alrededor de 9.
En otra forma de realizacion, p es alrededor de 8.
En otra forma de realizacion mas, p es alrededor de 4.
En otra forma de realizacion mas, p es alrededor de 2.
Los conjugados de farmaco-enlazador-ligando de la formula la pueden existir en forma de mezclas, donde cada componente de una mezcla tiene un valor de p diferente. Por ejemplo, un conjugado de farmaco-enlazador-ligando puede existir como una mezcla de dos conjugados separados, con un componente del conjugado en el que p es 7 y el otro componente del conjugado en el que p es 8.
En una forma de realizacion, un conjugado de farmaco-enlazador-ligando existe como una mezcla de tres conjugados separados en el que p para los tres conjugados separados es 1,2 y 3, respectivamente.
En otra forma de realizacion, un conjugado de farmaco-enlazador-ligando existe como una mezcla de tres conjugados separados en el que p para los tres conjugados separados es 3, 4 y 5, respectivamente.
En otra forma de realizacion, un conjugado de farmaco-enlazador-ligando existe como una mezcla de tres conjugados separados en el que p para los tres conjugados separados es 5, 6 y 7, respectivamente.
En otra forma de realizacion mas, un conjugado de farmaco-enlazador-ligando existe como una mezcla de tres conjugados separados en el que p para los tres conjugados separados es 7, 8 y 9, respectivamente.
En otra forma de realizacion mas, un conjugado de farmaco-enlazador-ligando existe como una mezcla de tres conjugados separados en el que p para los tres conjugados separados es 9, 10 y 11, respectivamente.
En otra forma de realizacion mas, un conjugado de farmaco-enlazador-ligando existe como una mezcla de tres conjugados separados en el que p para los tres conjugados separados es 11, 12 y 13, respectivamente.
En otra forma de realizacion, un conjugado de farmaco-enlazador-ligando existe como una mezcla de tres conjugados separados en el que p para los tres conjugados separados es 13, 14 y 15, respectivamente.
5.3 COMPUESTOS DE FARMACO-ENLAZADOR
Tambien se describen los compuestos de la formula lli:
y sales y
imagen8
donde, de forma independiente en cada lugar:
R2 se selecciona de -H y -C-i-Ca alquilo;
R3 se selecciona de -H, -C-i-Ca alquilo, -C3-C8 carbociclo, -O-(C-i-Ca alquilo), -arilo, -C-i-Ca alquil-arilo, -C-i-Ca alquil-(C3-Ca carbociclo), -C3-C8 heterociclo y -C1-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo);
R4 se selecciona de -H, -C-i-Ca alquilo, -C3-C8 carbociclo, -O-(C-i-Ca alquilo), -arilo, -C-i-Ca alquil-arilo, -C-i-Ca alquil-(C3-Ca carbociclo), -C3-C8 heterociclo y -C-i-Ca alquil-(C3-Ca heterociclo) donde R5 se selecciona de -H y - metilo; o R4 y R5 juntos, tienen la formula - (CRaRb)n- donde Ra y Rb se seleccionan independientemente de-H, C-i-Ca alquilo y -C3-C8 carbociclo y n se selecciona de 2, 3, 4, 5 y 6, y forman un anillo con el atomo de carbono al que estan unidos;
R6 se selecciona de -H y -C-i-Ca alquilo;
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R7 se selecciona de -H, -C1-C8 alquilo, -C3-C8 carbociclo, -O-(Ci-C8 alquilo), -arilo, -C1-C8 alquil-arilo, -C1-C8 alquil-(C3-C8 carbociclo), -C3-C8 heterociclo y -C1-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo);
cada R8 se selecciona independientemente de -H, -OH, -C1-C8 alquilo, -C3-C8 carbociclo y -O-(Ci-C8 alquilo);
R9 se selecciona de -H y -C1-C8 alquilo;
R11 se selecciona de -H, -OH, -NH2, -NHR14, -N(R14)2, -C1-C8 alquilo, -C3-C8 carbociclo, -O-(C1-C8 alquilo), -arilo, - C1-C8 alquil-arilo, -C1-C8 alquil-(C3-C8 carbociclo), -C3-C8 heterociclo y -C1-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo); o R11 es un atomo de ox^geno que forma una unidad de carbonilo (C=O) con el atomo de carbono al cual esta unido y un atomo de hidrogeno en este atomo de carbono se sustituye por uno de los enlaces en el enlace doble (C=O);
cada R12 se selecciona independientemente de -arilo y -C3-C8 heterociclo;
R13 se selecciona de hidrogeno, -OH, -NH2, -NHR14, -N(R14)2, C1-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, -O-(C1-C8 alquilo), - arilo, -C1-C8 alquil-arilo, alquil-(C3-C8 carbociclo), -C3-C8 heterociclo y alquil-(C3-C8 heterociclo);
cada R14 es independientemente -H o -C1-C8 alquilo;
R16 es -Yy-Ww-A'
donde
cada -W- es independientemente una unidad de aminoacido;
-Y- es una unidad de espaciador;
w es un numero entero que vana de 0 a 12;
y es 0, 1 o 2; y
-A' se selecciona de
imagen9
H2N-n—R17-C(0)-|
I
17-C(0) |
S=ON—R
0=C=N----R^-CP)
17 s
U
G-CH-C;N-R17-C(0)—|
H 5 ;
imagen10
y
H2N-O-R17-C(O)-;
donde
G se selecciona de -Cl, -Br, -I, -O-mesilo y -O-tosilo;
J se selecciona de -Cl, -Br, -I, -F, -OH, -O-N-succinimida, -O-(4-nitrofenilo), -O-pentafluorofenilo, -O- tetrafluorofenilo y -O-C(O)-OR18;
R17 se selecciona de -C1-C10 alquileno-, -C3-C8 carbociclo, -O-(C1-C8 alquilo)-, -arileno-, -C1-C10 alquileno-arileno- , -arileno-C1-C10 alquileno-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-, -C3-C8
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heterociclo-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-, -(C3-C8 heterociclo)-Ci-Cio alquileno-, -(CH2CH2O)r-, y - (CH2CH2O)r-CH2-; r es un numero entero que vana entre 1-10; y
R18 es -C1-C8 alquilo o -arilo.
El compuesto de la formula IIi que tiene la estructura:
imagen11
es un compuesto que se puede usar para formar conjugados de farmaco-espaciador-ligando para uso en la presente invencion.
Los compuestos de la formula IIi son utiles para tratar o prevenir el cancer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa en un animal.
5.4 LA UNIDAD DE ENLAZADOR
La unidad de enlazador del conjugado de farmaco-enlazador-ligando enlaza la unidad de farmaco y la unidad de ligando y tiene la formula:
—At-w^y—
donde:
-A- es una unidad de extensor; a es 1;
cada -W- es independientemente una unidad de aminoacido; w es independientemente un numero entero de 2 a 12;
-Y- es una unidad de espaciador que se autoinmola; e y es 1 o 2;
5.4.1 la unidad de extensor
La unidad de extensor (-A-) enlaza una unidad de ligando a una unidad de aminoacido (-W-). A este respecto, un ligando (L) tiene un grupo funcional que puede formar una union con un grupo funcional de un extensor. Los grupos funcionales utiles que pueden estar presentes en un ligando, ya sea naturalmente o por medio de manipulation qufmica incluyen sulfhidrilo (-SH), amino, hidroxilo, carboxi, el grupo hidroxilo anomerico de un carbohidrato, y carboxilo. Los grupos funcionales del ligando preferidos son sulfhidrilo y amino. Los grupos sulfhidrilo pueden ser generados por la reduction de un enlace disulfuro intramolecular de un ligando. Alternativamente, los grupos sulfhidrilo pueden ser generados por la reaction de un grupo amino de una portion de lisina de un ligando utilizando 2-iminotiolano (reactivo de Traut) u otro reactivo que genere sulfhidrilo.
En una forma de realization, la unidad de extensor forma una union con un atomo de azufre de la unidad de ligando. El atomo de azufre se pueden derivar de un grupo sulfhidrilo de un ligando. La unidad de extensor es la de la formula
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5.4.2 la unidad de aminoacido
La unidad de aminoacido (-W-) enlaza la unidad de extensor a la unidad de espaciador. Ww tiene la formula:
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5 donde R20 es isopropilo y R21 es (CH2)3NHCONH2
5.4.3 la unidad de espaciador
La unidad de espaciador (-Y-) enlaza una unidad de aminoacido a la unidad de farmaco. La unidad de espaciador es autoinmoladora.
-Yy- es una unidad de alcohol p-aminobendlico (PAB) (vease Esquema 2), donde Qm no esta presente, es decir, 10 m es 0.
Un compuesto de la invencion que contenga una unidad de espaciador autoinmoladora puede liberar -D sin necesidad de una etapa de hidrolisis separada. -Y- es un grupo PAB que se enlaza a -Ww- a traves del atomo de nitrogeno del grupo amino PAB, y se conecta directamente a -D a traves de un grupo carbonato. Sin pretender imponer ninguna teoria, el Esquema 2 muestra un posible mecanismo de liberacion de farmaco de un grupo PAB 15 que se une directamente a -D a traves de un grupo carbamato.
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donde Q no esta presente, es decir, m es 0; y p varia de 1 a alrededor de 20.
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La unidad de espaciador (-Yy-) esta representada por la formula (X):
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donde Qm no esta presente, es decir, m es 0;
5.5 la unidad de farmaco
-D es una unidad de farmaco que tiene un atomo de nitrogeno que puede formar una union con la unidad de espaciador cuando y = 1 o 2.
5.6 la unidad de ligando
La unidad de ligando (L-) es un anticuerpo monoclonal que se une inmunoespedficamente al antngeno CD30. El ligando se une a complejos con o reaccionar con resto de una poblacion de celulas que se pretende que sea modificada terapeutica o biologicamente de otra forma. La unidad de ligando actua para suministrar la unidad de farmaco a la poblacion particular de celulas diana con la que la unidad de ligando reacciona. Estos ligandos incluyen anticuerpos de longitud completa y fragmentos de anticuerpos.
Una unidad de ligando forma una union a una unidad de extensor de un enlazador. Una unidad de ligando puede formar una union a una unidad de enlazador a traves de un heteroatomo del ligando. Los heteroatomos que pueden estar presentes en una unidad de ligando incluyen azufre (en una forma de realizacion, de un grupo sulfhidrilo de un ligando), oxfgeno (en una forma de realizacion, de un grupo carbonilo, carboxilo o hidroxilo de un ligando) y nitrogeno (en una forma de realizacion, de un grupo amino primario o secundario de un ligando). Estos heteroatomos pueden estar presentes en el ligando en el estado natural del ligando, por ejemplo un anticuerpo de origen natural, o pueden ser introducidos en el ligando a traves de una modificacion qmmica.
En una forma de realizacion preferida, un ligando tiene un grupo sulfhidrilo y el ligando se une a la unidad de enlazador a traves del atomo de azufre del grupo sulfhidrilo.
En otra forma de realizacion, el ligando puede tener uno o mas grupos carbohidratos que pueden ser modificados qmmicamente para tener uno o mas grupos sulfhidrilo. La unidad de ligando se une a la unidad de extensor a traves del atomo de azufre del grupo sulfhidrilo.
En otra forma de realizacion mas, el ligando puede tener uno o mas grupos carbohidratos que pueden ser oxidados para proporcionar un grupo aldehfdo (-CHO) (vease Laguzza, et al., J. Med. Chem. 1989, 32(3), 548-55). El aldehfdo correspondiente puede formar una union con un sitio reactivo en un extensor. Los sitios reactivos en un extensor que pueden reaccionar con un grupo carbonilo en un ligando incluyen, aunque no exclusivamente, hidracina e hidroxilamina.
Tambien se describen ligandos de protemas, polipeptidos, o peptidos no inmunorreactivos que incluyen la transferrina, los factores de crecimiento epidermico (“EGF”), la bombesina, la gastrina, el peptido liberador de la gastrina, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas, el IL-2, el IL6, los factores de crecimiento transformante (“TGF”), tales como el TGF-a y el TGF-U, el factor de crecimiento del vaccinia (“VGF”), la insulina, y los factores de crecimiento similares a la insulina I y II, las lectinas, y la apoprotema a partir de la lipoprotema de baja densidad.
Los ligandos de anticuerpos monoclonales utiles son poblaciones homogeneas de anticuerpos frente al antfgeno CD30. Se puede preparar un anticuerpo monoclonal (mAb) frente al antfgeno de interes empleando cualquier tecnica conocida en la tecnica que prevea la produccion de moleculas de anticuerpos mediante lmeas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, aunque no exclusivamente, la tecnica del hibridoma, descrita originalmente por Kohler y Milstein (1.975 Nature 256, 495-497), la tecnica del hibridoma celular humano B (Kozbor et al., 1.983, Immunology Today 4: 72), y la tecnica del hibridoma EBV (Cole et al., 1.985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pag. 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluidas IgG, IgM, IgE, IgA, e IgD, y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el mAbs empleado en esta invencion puede ser cultivado in vitro o in vivo.
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Los ligandos de anticuerpos monoclonales utiles incluyen, aunque no exclusivamente, los anticuerpos monoclonales humanos o los anticuerpos monoclonales quimericos humano-raton (u otras especies). Los anticuerpos monoclonales humanos pueden producirse mediante cualquiera de las numerosas tecnicas conocidas en la tecnica (por ejemplo, Teng et al., 1.983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7.308-7.312; Kozbor et al., 1.983, Immunology Today 4, 72-79; y Olsson et al., 1.982, Meth. Enzymol. 92, 3-16).
El ligando tambien puede ser un anticuerpo biespedfico. Los metodos para la produccion de anticuerpos biespedficos son conocidos en la tecnica. La produccion tradicional de anticuerpos biespedficos de longitud completa se basa en la expresion conjunta de dos pares de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienes diferentes especificidades. (Milstein et al., 1.983, Nature 305:53.7-539). Debido a la seleccion aleatoria de las cadenas ligeras y pesadas de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moleculas de anticuerpos diferentes, de las que solo una tiene la estructura biespedfica correcta. La purificacion de la molecula correcta, la cual se lleva a cabo habitualmente utilizandose pasos de cromatograffa por afinidad, es mas bien compleja, y los rendimientos del producto son bajos. En la publicacion internacional n° WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3.655-3.659 (1.991) se divulgan procedimientos similares.
Segun un enfoque diferente, y mas preferido, los dominios variables de los anticuerpos con las especificidades de union deseadas (sitios de combinacion anticuerpo-antfgeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de la inmunoglobulina. La fusion se da preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, comprendiendo, al menos, parte de la bisagra, regiones CH2 y CH3. Se prefiere que la primera region constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la union de cadena ligera, presente en, al menos, una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se introducen en vectores de expresion separados, y se lleva a cabo su transfeccion conjunta a un organismo huesped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipeptidos en formas de realizacion en las que las relaciones desiguales de las tres cadenas de polipeptidos empleadas en la construccion proporcionen los resultados optimos. Sin embargo, es posible introducir las secuencias de codificacion para dos o las tres cadenas de polipeptidos en un vector de expresion cuando la expresion de, al menos, dos cadenas de polipeptidos en relaciones iguales proporcione rendimientos elevados, o cuando las relaciones no sean de especial importancia.
En una forma de realizacion preferida de este procedimiento, los anticuerpos biespedficos tienen una cadena pesada de inmunoglobulina tubrida con una primera especificidad de union en un brazo, y un par de cadena ligera- cadena pesada de inmunoglobulina tubrida (que provee una segunda especificidad de union) en el otro brazo. Esta estructura asimetrica facilita la separacion del compuesto biespedfico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, al proporcionar la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molecula biespedfica un modo sencillo de separacion (publicacion internacional n° WO 94/04690).
Para obtener informacion mas detallada acerca de la generacion de anticuerpos biespedficos, vease, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 1.986, 121:210. Mediante la utilizacion de tales tecnicas, los ligandos de anticuerpos biespedficos pueden ser preparados para su uso en el tratamiento o la prevencion de enfermedades tal y como se define en la presente memoria.
Los anticuerpos bifuncionales aparecen tambien descritos en la publicacion de patente europea n° EP A 0 105 360. Tal y como se divulga en esta referencia, los anticuerpos tubridos o bifuncionales pueden derivarse bien biologicamente, esto es, mediante tecnicas de fusion celular, bien qmmicamente, en particular con agentes de entrecruzamiento o reactivos de formacion de puentes de disulfuro, y pueden comprender anticuerpos enteros o fragmentos de los mismos. Los metodos para la obtencion de tales anticuerpos tubridos se divulgan, por ejemplo, en la publicacion internacional WO 83/03679, y la publicacion de patente europea n° EP A 0 217 577.
El ligando puede ser un fragmento, derivado o analogo activo funcionalmente de un anticuerpo que se una de manera inmunoespedfica al antfgeno CD30. A este respecto, “activo funcionalmente” significa que el fragmento, derivado o analogo puede provocar anticuerpos anti-anti-idiotipos que reconozcan el mismo antfgeno que reconocio el anticuerpo del cual este derivado el fragmento, derivado, o analogo. De manera espedfica, en una forma de realizacion preferida, la antigenicidad del idiotipo de la molecula de inmunoglobulina puede aumentarse eliminando la estructura y secuencias de la CDR (region determinante de la complementariedad) que sean terminales C para la secuencia de CDR que reconozca de manera espedfica el antfgeno. Con el fin de determinar que secuencias de CDR se unen al antfgeno, se pueden utilizar peptidos sinteticos que contengan las secuencias de CDR en los ensayos de union con el antfgeno por medio de cualquier metodo de ensayo de union conocido en la tecnica (por ejemplo, el ensayo del nucleo BIA).
Se pueden producir otros ligandos utiles que incluyan fragmentos de anticuerpos tales como, aunque no exclusivamente, fragmentos F(ab')2, que contengan la region variable, la region constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada, mediante la digestion de la pepsina de la molecula del anticuerpo, y fragmentos Fab, que pueden ser generados reduciendo los puentes de disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Otros ligandos utiles
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son d^eros de cadena pesada y de cadena ligera de anticuerpos, o cualquier fragmento mmimo de los mismos, tales como Fvs o anticuerpos de cadena sencilla (SCA), (por ejemplo, tal y como se describe en la patente US 4.946.778; Bird, 1.988, Science 242:423-42; Huston et al., 1.988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5.879-5.883; y Ward et al., 1.989, Nature 334: 544-54), o cualquier otra molecula con la misma especificidad que el anticuerpo.
De manera adicional, los anticuerpos recombinantes, tales como los anticuerpos monoclonales quimericos y humanizados, que comprendan tanto partes humanas como no humanas, los cuales pueden ser producidos utilizando tecnicas de aDn recombinante estandares, son ligandos utiles. Un anticuerpo quimerico es una molecula en la que diferentes partes provienen de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una region variable derivada de una region constante monoclonal murina y una de inmunoglobulina humana. (Vease, por ejemplo, Cabilly et al., patente US 4.816.567; y Boss et al., patente US 4.816.397). Los anticuerpos humanizados son moleculas de anticuerpos de especies no humanas que tienen una o mas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las especies no humanas, asf como una region estructural de una molecula de inmunoglobulina humana. (Vease, por ejemplo, Queen, patente US 5.585.089). Tales anticuerpos monoclonales quimericos y humanizados pueden ser producidos mediante tecnicas de ADN recombinante conocidas en la tecnica, por ejemplo, utilizandose metodos descritos en la publicacion internacional n° WO 87/02671; la publicacion de patente europea n° 184.187; la publicacion de patente europea n° 171.496; la publicacion de patente europea n° 173.494; la publicacion de patente internacional n° WO 86/01533; la patente estadounidense n° 4.816.567; la publicacion de patente europea n° 125.023; Berter et al., 1.988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1.987, Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:3.439-3.443; Liu et al., 1.987, J. Immunol. 139:3.521-3.526; Sun et al., 1.987, Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1.987, Canc. Res. 47:999-1.005; Wood et al., 1.985, Nature 314:446-449; y Shaw et al., 1.988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1.553-1.559; Morrison, 1.985, Science 229:1.202-1.207; Oi et al., 1.986, BioTechniques 4:214; patente US 5.225.539; Jones et al., 1.986, Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. (1.988) Science 239:1.534; y Beidler et al., 1.988, J. Immunol. 141:4.053-4.060.
Los anticuerpos completamente humanos son especialmente preferidos para los ligandos. Tales anticuerpos pueden ser producidos empleandose ratones transgenicos que no puedan expresar genes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina endogena, pero que sf puedan expresar genes humanos de cadena pesada y ligera. Los ratones transgenicos son inmunizados del modo normal con un antfgeno seleccionado, por ejemplo, todo o parte de un polipeptido de la invencion. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antfgeno pueden obtenerse utilizando tecnologfa convencional del hibridoma. Los transgenes de inmunoglobulina humana alojados por el raton transgenico se redisponen durante la diferenciacion de celulas B y, a continuacion, son sometidos a un cambio de clase y a una mutacion somatica. Asf, utilizandose tal tecnica, es posible producir terapeuticamente anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE utiles. Si se desea realizar una revision de esta tecnologfa para la produccion de anticuerpos humanos, vease Lonberg y Huszar (1.995, Int. Rev. Immunol., 13:65-93). Si lo que se desea es realizar un analisis detallado de esta tecnologfa para la produccion de anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos, asf como de los protocolos para la produccion de tales anticuerpos, vease, por ejemplo, la patente US 5.625.126; la patente US 5.633.425; la patente US 5.569.825; la patente US 5.661.016; y la patente US 5.545.806. Otros anticuerpos humanos se pueden obtener comercialmente de, por ejemplo, Abgenix, Inc. (Freemont, California) y Genpharm (San Jose, California).
Los anticuerpos completamente humanos que reconozcan un epftopo seleccionado pueden ser generados utilizando una tecnica conocida como “seleccion guiada”. En este procedimiento, se utiliza un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de un raton, para guiar la seleccion de un anticuerpo completamente humano que reconozca el mismo epftopo [Jespers et al. (1.994) Biotechnology 12:899-903].
En otras formas de realizacion, el ligando es una protema de fusion de un anticuerpo, o un fragmento activo funcionalmente del mismo, por ejemplo, en el cual el anticuerpo es fusionado a traves de un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptfdico), bien en el terminal N, bien, en el terminal C, a una secuencia de aminoacidos de otra protema (o una parte de la misma, preferiblemente, una parte de, al menos 10, 20 o 50 aminoacidos de la protema) que no sea el anticuerpo. Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento del mismo esta unido de manera covalente a la otra protema en el terminal N del dominio constante.
Los anticuerpos del ligando incluyen analogos y derivados cualquiera de los cuales este modificado, esto es, mediante el enlace covalente de cualquier tipo de molecula, siempre y cuando tal enlace covalente permita que el anticuerpo retenga su inmunoespecificidad de union al antfgeno. Por ejemplo, sin que deba entenderse como una limitacion, los derivados y analogos de los anticuerpos incluyen aquellos que hayan sido modificados en mayor medida, por ejemplo, mediante glicosilacion, acetilacion, pegilacion, fosfilacion, amidacion, derivatizacion a traves de grupos protectores/bloqueadores conocidos, fragmentacion proteolftica, union a una unidad ligando celular o a otra protema, etc. Cualquiera de numerosas modificaciones qmmicas puede ser llevada a cabo mediante tecnicas conocidas, entre las que se incluye, aunque no exclusivamente, la fragmentacion qmmica espedfica, la acetilacion, la formilacion, la smtesis metabolica de la tunicamicina, etc. De modo adicional, el analogo o derivado puede contener uno o mas aminoacidos no naturales.
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Los anticuerpos del ligando incluyen anticuerpos que tengan modificaciones (por ejemplo, sustituciones, eliminaciones o adiciones) en residuos de aminoacidos que interactuen con receptores Fc. En particular, los anticuerpos del ligando incluyen anticuerpos que tengan modificaciones en residuos de aminoacidos identificados como participates en la interaccion entre el dominio Fc y el receptor FcRn (vease, por ejemplo, la publicacion internacional n° WO 97/34631). Los anticuerpos inmunoespedficos para un antigeno de celula cancerosa pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo, de Genentech (San Francisco, California), o producirse mediante cualquier metodo conocido para un experto en la materia tales como, por ejemplo, las tecnicas de expresion recombinante o de smtesis qrnmica. La secuencia de nucleotidos que codifica anticuerpos inmunoespedficos para un antigeno de celula cancengena puede ser obtenida, por ejemplo, de la base de datos de GenBank, o una base de datos similar, de las publicaciones de la literatura, o por clonacion y secuenciacion rutinarias.
En una forma de realizacion espedfica, se utilizan anticuerpos anti-CD30 para el tratamiento o prevencion del cancer de conformidad con las composiciones y metodos de la invencion. Los anticuerpos inmunoespedficos el antigeno CD30 pueden obtenerse comercialmente, o producirse mediante cualquier metodo conocido para un experto en la materia tales como, por ejemplo, las tecnicas de smtesis qrnmica o de expresion recombinante. La secuencia de nucleotidos que codifica anticuerpos inmunoespedficos para el antigeno cD30 puede obtenerse, por ejemplo, de la base de datos de GenBank, o una base de datos similar, de las publicaciones de la literatura, o por clonacion y secuenciacion rutinarias.
mAbs contra el antigeno CD30, por ejemplo, el AC10 (Bowen, M. A., Olsen, K. J., Cheng, L., Avila, D., y Podack, E. R. "Functional effects of CD30 on a large granular lymphoma cell line YT" J. Immunol., 151, 5.896-5.906, 1.993) encuentran uso en la invencion. Se conocen otros muchos anticuerpos internalizadores que se unan a antfgenos asociados a tumores, y han sido resenados (Franke, A. E., Sievers, E., L., y Scheinberg, D. A., "Cell surface receptor-targeted therapy of acute myeloid leukemia: a review" Cancer Biother Radiopharm. 2.000,15, 459-76; Murray, J. L., "Monoclonal antibody treatment of solid tumors: a coming of age" Semin Oncol. 2.000, 27, 64-70; Breitling, F., y Dubel, S., Recombinant Antibodies, John Wiley, and Sons, New York, 1.998).
Los anticuerpos adecuados para su uso en la invencion pueden ser producidos mediante cualquier metodo conocido en la tecnica para la smtesis de anticuerpos, en especial, por smtesis qrnmica o por expresion recombinante, y son producidos preferiblemente mediante tecnicas de expresion recombinante.
5.6.1 produccion de anticuerpos recombinantes
Los anticuerpos de ligando de la invencion pueden ser producidos utilizando cualquier metodo que sea conocido en la tecnica por su utilidad para la smtesis de anticuerpos, en especial, mediante smtesis qrnmica o expresion recombinante, y son producidos preferiblemente mediante tecnicas de expresion recombinante.
La expresion recombinante de los anticuerpos de ligando, o un fragmento, derivado o analogo de los mismos, requiere la construccion de un acido nucleico que codifique el anticuerpo. Si se conoce la secuencia de nucleotidos del anticuerpo, un acido nucleico que codifique el anticuerpo puede ser compuesto a partir de oligonucleotidos sintetizados qmmicamente (por ejemplo, tal y como se describe en Kutmeier et al., 1.994, Bio Techniques 17:242), lo cual comprende la smtesis de oligonucleotidos superpuestos que contengan partes de la secuencia que codifica el anticuerpo, la hibridacion y el ligamiento de tales oligonucleotidos y, entonces, la amplificacion de los oligonucleotidos ligados por PCR (reaccion en cadena de la polimerasa).
De modo alternativo, una molecula de acido nucleico que codifique un anticuerpo puede ser generada a partir de una fuente adecuada. Si un clon que contenga el acido nucleico que codifica el anticuerpo particular no esta disponible, pero se conoce la secuencia del anticuerpo, un acido nucleico que codifique el anticuerpo puede ser obtenido a partir de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de cADN de anticuerpos, o biblioteca de cADN generada a partir de cualquier tejido o celulas que expresen la inmunoglobulina) mediante amplificacion por PCR usandose cebadores sinteticos hibridizables a los extremos 3' y 5' de la secuencia, o mediante clonacion usandose una sonda de oligonucleotido espedfica para la secuencia de genes concreta.
Anticuerpos espedficos para el antfgeno CD30 se pueden generar por medio de cualquier metodo conocido en la tecnica, por ejemplo generando anticuerpos monoclonales, por ejemplo, tal y como describen Kohler y Milstein (1.975, Nature 256:495-497), o tal y como describen Kozbor et al. (1.983 Immunology Today 4:72), o Cole et al. (1.985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pag. 77-96). De manera alternativa, un clon que codifique, al menos, el fragmento Fab del anticuerpo puede ser obtenido examinando las bibliotecas de expresion Fab (por ejemplo, tal y como se describe en Huse et al., 1.989, Science 256:1.275-1.281) para clones de fragmentos Fab que se unan al antfgeno espedfico, o examinado bibliotecas de anticuerpos (vease, por ejemplo, Clackson et al., 1.991, Nature 352: 624; Hane et al., 1.997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:4.937).
Una vez que se haya obtenido una secuencia de acido nucleico que codifique, al menos, el dominio variable del anticuerpo, esta puede ser introducida en un vector que contenga la secuencia de nucleotidos que codifique las regiones constantes del anticuerpo (vease, por ejemplo, la publicacion internacional n° WO 86/05807; la publicacion
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internacional n° WO 89/01036; y la patente US 5.122.464). Los vectores que contienen la cadena ligera o pesada completa que permiten la expresion de una molecula de anticuerpo completa estan disponibles. Entonces, el acido nucleico que codifique el anticuerpo puede ser utilizado para introducir las sustituciones o eliminacion de nucleotidos necesarias con el fin de sustituir (o eliminar) el o los residuos de cistema de la region variable que participen en un puente de disulfuro dentro de la cadena con un residuo de aminoacidos que no contenga un grupo sulfhidilo. Tales modificaciones pueden ser llevadas a cabo mediante cualquier metodo conocido en la tecnica para la introduccion de mutaciones o eliminaciones espedficas en una secuencia de nucleotidos, por ejemplo, aunque no exclusivamente, la mutagenesis qmmica y la mutagenesis dirigida al sitio in vitro (Hutchison et al., 1.978, J. Biol. Chem., 253:6.651).
Asimismo, se pueden emplear las tecnicas desarrolladas para la produccion de “anticuerpos quimericos” (Morrison et al., 1.984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-85.5; Neuberger et al., 1.984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1.985, Nature 314:452-454) mediante el corte y empalme de genes de una molecula de anticuerpo de un raton de especificidad del antfgeno apropiada con genes de una molecula de anticuerpo humano de actividad biologica apropiada. Un anticuerpo quimerico es una molecula en la que distintas partes provienen de diferentes especies animales, tales como aquellos que tienen una region variable derivada de una region constante de anticuerpo monoclonal murino y una de inmunoglobulina humana, por ejemplo, anticuerpos humanizados.
De modo alternativo, las tecnicas descritas para la produccion de anticuerpos de cadena sencilla (patente US 4.694.778; Bird, 1.988, Science 242:423-42; Huston et al., 1.988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5.879-5.883; y Ward et al., 1.989, Nature 334:544-54) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de cadena sencilla. Los anticuerpos de cadena sencilla se forman por la union de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la region Fv a traves de un puente de aminoacidos, dando como resultado un polipeptido de cadena sencilla. Tambien se pueden utilizar las tecnicas para la composicion de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skeria et al., 1.988, Science 242:1.038-1.041).
Los fragmentos del anticuerpo que reconocen los epttopos espedficos pueden ser generados por medio de tecnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, aunque no exclusivamente, los fragmentos F(ab')2 que puedan ser producidos mediante la digestion de la pepsina de la molecula del anticuerpo, asf como los fragmentos Fab que puedan ser generados mediante la reduccion de los puentes de disulfuro de los fragmentos F(ab')2.
Una vez que se haya obtenido una secuencia de acido nucleico que codifique un anticuerpo de ligando, el vector para la produccion del anticuerpo puede ser producido mediante tecnologfa de ADN recombinante utilizandose tecnicas muy conocidas en la tecnica. Se pueden utilizar metodos muy conocidos para los expertos en la materia para construir vectores de expresion que contengan las secuencias de codificacion del anticuerpo y senales de control de la transcripcion y de la traduccion apropiadas. Estos metodos incluyen, por ejemplo, las tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas sinteticas, y la recombinacion genetica in vivo. Vease, por ejemplo, las tecnicas descritas en Sambrook et al. (1.990, Molecular Cloning, Manual de laboratorio, 2a edicion, Laboratorio Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, Nueva York) y Ausubel et al. (eds., 1.998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York).
Se puede transferir un vector de expresion que comprenda la secuencia de nucleotidos de un anticuerpo, o la secuencia de nucleotidos de un anticuerpo a una celula huesped mediante tecnicas convencionales (por ejemplo, electroporacion, transfeccion liposomal, y precipitacion de fosfato calcico), y las celulas transfectadas son entonces cultivadas por medio de tecnicas convencionales para producir el anticuerpo. En formas de realizacion espedficas, la expresion del anticuerpo es regulada por un promotor constitutivo, inducible, o tisular espedfico.
Las celulas huesped usadas para expresar el anticuerpo de ligando recombinante pueden ser celulas bacterianas, tales como la Escherichia coli, o, de manera preferida, celulas eucarioticas, en especial para la expresion de la molecula de inmunoglobulina recombinante entera. En especial, las celulas mairnferas tales como las celulas ovaricas del hamster chino (CHO), junto con un vector tal como el mayor elemento promotor de genes temprano- intermedio del citomegalovirus humano es un sistema de expresion efectivo para las inmunoglobulinas (Foecking et al., 198, Gene 45:101; Cockett et al., 1.990, Bio Technology 8:2).
Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresion-huesped para expresar los ligandos de la inmunoglobulina. Tales sistemas de expresion-huesped representan vehfculos por medio de los cuales las secuencias de codificacion del anticuerpo pueden ser producidas y, a continuacion, purificadas, pero tambien representan a celulas que puedan, cuando sean transformadas o transfectadas con las secuencias de codificacion de nucleotidos adecuadas, expresar una molecula de inmunoglobulina de ligando in situ. Estos incluyen, aunque no exclusivamente, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con ADN bacteriofago recombinante, ADN plasmido, o vectores de expresion de ADN cosmido que contengan secuencias de codificacion de la inmunoglobulina; levadura (por ejemplo, la Saccharomyces Pichia) transformada con vectores de expresion de levadura recombinantes que contengan secuencias de codificacion de la inmunoglobulina; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresion de virus recombinantes (por ejemplo, el baculovirus) que contengan las secuencias de codificacion de la inmunoglobulina; sistemas celulares vegetales infectados con
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vectores de expresion de virus recombinantes [por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el virus del mosaico del tabaco (TMV)], o transformados con vectores de expresion de plasmidos recombinantes (por ejemplo, plasmido Ti) que contengan secuencias de codificacion de la inmunoglobulina; o sistemas de celulas mai^eras (por ejemplo, las celulas COS, CHO, BH, 293, 293T, 3T3) que alojen constructos de expresion recombinantes que contengan promotores derivados del genoma de las celulas mairnferas (por ejemplo, el promotor de la metalotionema) o de virus mamfferos (por ejemplo, el promotor tardfo del adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia).
En los sistemas bacterianos, un numero de vectores de expresion puede ser seleccionado ventajosamente dependiendo del uso pretendido para el anticuerpo que se este expresando. Por ejemplo, cuando haya que producir una gran cantidad de tal protema, pueden ser deseables los vectores que dirigen la expresion de niveles elevados de productos de protema de fusion que ya esten purificados. Tales vectores incluyen, aunque no exclusivamente, el vector de expresion de E.coli pUR278 (Ruther et al., 1.983, EMBO J. 2:1.791), en el que la secuencia de codificacion del anticuerpo puede ser ligada individualmente al vector en marco con la region de codificacion de lac Z, de modo que se produce una protema de fusion; los vectores pIN (Inouye & Inouye, 1.985, Nucleic Acids Res. 13:3.101-3.109; Van Heeke & Schuster, 1.989, J. Biol. Chem. 24:550 5.509); y similares. Los vectores pGEX tambien pueden emplearse para expresar polipeptidos extranos como protemas de fusion con glutationa S-transferasa (GST). En general, tales protemas de fusion son solubles y pueden ser purificadas facilmente a partir de celulas lisadas por adsorcion y union a una matriz de perlas de glutationa-agarosa seguida de elucion en presencia de glutationa libre. Los vectores pGEX son disenados para incluir sitios de fragmentacion de la proteasa trombina o factor Xa, de modo que el producto del gen objetivo clonado pueda ser liberado de la fraccion de GST.
En un sistema de insecto se utiliza el virus de polihedrosis nuclear de la Autographa californica (AcNPV) o el virus analogo del Drosophila Melanogaster como vector para expresar genes extranos. El virus crece en celulas de Spodoptera frugiperda. La secuencia de codificacion del anticuerpo puede ser clonada individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y puesta bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo, el promotor de la polihedrina).
En las celulas huesped mai^eras, se puede utilizar un numero de sistemas de expresion de base viral. En casos en los que se utilice un adenovirus como vector de expresion, la secuencia de codificacion del anticuerpo de interes puede ser ligada a un complejo de control de la transcripcion/traduccion del adenovirus, por ejemplo, el promotor tardm y la secuencia lfder tripartita. Este gen quimerico puede entonces ser introducido en el genoma del adenovirus por recombinacion in vitro o in vivo. La insercion en una region no esencial del genoma viral (por ejemplo, la region E1 o E3) produce un virus recombinante que es viable y que puede expresar la moleculas de la inmunoglobulina en huespedes infectados (por ejemplo, vease Logan & Shenk, 1.984, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 81:355-359). Las senales de iniciacion espedficas tambien pueden requerirse para la traduccion eficiente de secuencias de codificacion del anticuerpo insertado. Estas senales incluyen el codon de iniciacion ATG y secuencias adyacentes. Asimismo, el codon de iniciacion debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificacion deseada con el fin de asegurar la traduccion del inserto completo. Estas senales de control de traduccion exogena y los codones de iniciacion pueden ser de una diversidad de ongenes, tanto naturales como sinteticos. La eficiencia de la expresion puede ser mejorada por la inclusion de elementos favorecedores de la transcripcion adecuados, terminadores de la transcripcion, etc. (vease Bittner et al., 1.987, Methods in Enzymol. 153:51-544).
Asimismo, se puede escoger una cepa de celulas huesped para modular la expresion de las secuencias introducidas, o modifica y procesa el producto genetico de la manera deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilacion) y procesamiento (por ejemplo, fragmentacion) de producto protemicos puede ser de importancia para la funcion de la protema. Diferentes celulas huesped tienen mecanismos caractensticos y espedficos para el procesamiento posterior a la traduccion y la modificacion de protemas y productos geneticos. Se pueden escoger lmeas celulares o sistemas huesped adecuado para asegurar la modificacion y el procesamiento correctos de la protema extrana expresada. Para tal fin, se pueden usar celulas huesped eucarioticas que posean la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcripto primario, la glicosilacion y la fosforilacion del producto genetico. Tales celulas huesped mamfferas incluyen, aunque no exclusivamente, CHO, VERY, BH, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7030 y Hs578Bst.
Para la produccion a largo plazo de alto rendimiento de protemas recombinantes, se prefiere la expresion estable. Por ejemplo, las lmeas celulares que expresen de manera estable un anticuerpo pueden ser producidas por ingeniena. Mas que usar vectores de expresion que contengan ongenes virales de replicacion, las celulas huesped pueden ser transformadas con ADN controlado por elementos de control de la expresion apropiados (por ejemplo, promotor, intensificador, secuencias, terminadores de transcripcion, sitios de poliadenilacion, etc.), y un marcador seleccionable. A continuacion de la introduccion del ADN extrano, se puede permitir que las celulas producidas por ingeniena crezcan durante 1-2 dfas en un medio enriquecido y, despues, son trasladadas a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plasmido recombinante confiere resistencia a la seleccion, y permite que las celulas integren establemente el plasmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que, a su vez, pueden ser clonados y expandidos al interior de lmeas celulares. Este metodo puede ser utilizado de manera ventajosa para
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producir por ingeniena lrneas celulares que expresen el anticuerpo. Tales lrneas celulares producidas por ingeniena pueden ser especialmente utiles en el examen y evaluacion de antfgenos tumorales que interaction directa o indirectamente con el ligando del anticuerpo.
Se puede utilizar un numero de sistemas de seleccion entre los que se incluye, aunque no exclusivamente, aquellos en los que los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., 1.977, Cell 11:223), la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 192, Proc. Natl. Acad Sci. USA 48:202), y la adenina-fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1.980, Cell 22:817) pueden utilizarse en celulas tk, hgprt, o aprt. Ademas, la resistencia a los antimetabolitos puede ser utilizada como base para la seleccion de los siguientes genes: el dhfr, el cual confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1.981, Proc. Natl. Acad Sci. USA 78:1.527); el gpt, el cual confiere resistencia al acido micofenolico (Mulligan & Berg, 1.981, Proc. Natl. Acad Sci. USA 78:2.072); el neo, el cual confiere resistencia a la aminoglucosido G418 (Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, 1.991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1.993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1.993, Science 260:926-932; y Morgan y Anderson, 1.993, Ann. Rev. Biochem 62: 191-217; May, 1993, TIB TECH 11 (5):155-215), e hygro, el cual confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1.984, Genes 30:147). Los metodos conocidos comunmente en la tecnica de la tecnologfa de ADN recombinante que pueden utilizarse estan descritos en in Ausubel et al. (eds., 1.993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York; Kriegler, 1.990, Gene Transfer and Expression, manual de laboratorio, Stockton Press, Nueva York; y, en los capftulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), 1.994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, Nueva York.; Colberre-Garapin et al., 1.981, J. Mol. Biol. 150:1).
Los niveles de expresion de un anticuerpo pueden aumentarse mediante amplificacion vectorial (si se desea consultar una resena, vease Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, Nueva York, 1.987)). Cuando un marcador del sistema vectorial que expresa un anticuerpo es amplificable, un aumento del nivel de inhibidor presente en el cultivo de la celula huesped aumentara el numero de copias del gen marcador. Puesto que la region amplificada esta asociada a la secuencia de nucleotidos del anticuerpo, tambien aumentara la produccion del anticuerpo (Crouse et al., 1.983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
La celula huesped puede ser transfectada junto con dos vectores de expresion de la invencion, el primer vector codificando un polipeptido derivado de cadena pesada y, el segundo vector, codificando un polipeptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables identicos que permitan la misma expresion de polipeptidos de cadenas ligeras y pesadas. De modo alternativo, un vector sencillo puede ser utilizado para codificar tanto polipeptidos de cadena ligera como pesada. En tales situaciones, la cadena ligera debena estar situada antes de la cadena pesada con el fin de evitar un exceso de cadena pesada libre toxica (Proudfoot, 1.986, Nature 322:52; Kohler, 1.980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2.197). Las secuencias de codificacion para las cadenas ligeras y pesadas pueden comprender ADN para ADN genomico.
Una vez que el anticuerpo haya sido expresado de manera recombinante, puede ser purificado utilizando cualquier metodo conocido en la tecnica para la purificacion de un anticuerpo, por ejemplo, por cromatograffa (por ejemplo, cromatograffa por intercambio de iones, afinidad, en especial, por afinidad para el antfgeno espedfico tras la proterna A, y por columnas de exclusion molecular), centrifugado, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra tecnica estandar para la purificacion de proternas.
5.7 srntesis de los compuestos de la invencion
Esta seccion contiene informacion general sobre la srntesis de los conjugados de ligando-farmaco e intermedios para ellos. Su descripcion es mas amplia que el alcance de la presente invencion como se define en las reivindicaciones, e incluye informacion sobre compuestos analogos a compuestos utiles en la presente invencion.
Tal y como se describe mas detalladamente a continuacion, los compuestos de la invencion son preparados de manera conveniente mediante el uso de un enlazador que tenga dos o mas sitios reactivos para la union al farmaco y al ligando. En un aspecto de la invencion, un enlazador tiene un sitio reactivo, el cual tiene un grupo electrofflico que es reactivo a un grupo nucleofflico presente sobre un ligando. Los grupos nucleofflicos utiles sobre un ligando incluyen, aunque no exclusivamente, los grupos sulfhidrilo, hidroxilo y amino. El heteroatomo del grupo nucleofflico de un ligando es reactivo a un grupo electrofflico sobre un enlazador, y forma un enlace covalente con una unidad de enlazador. El grupo electrofflico es un grupo maleimida. El grupo electrofflico proporciona un sitio conveniente para la union al ligando.
Tambien es util como sitio reactivo un grupo funcional carbonato sobre un enlazador que pueda reaccionar con un grupo amino de un farmaco para formar un enlace de carbamato.
Habitualmente, los farmacos basados en peptidos pueden ser preparados mediante la formacion de un enlace peptfdico entre dos o mas fragmentos de aminoacidos y/o peptidos. Tales enlaces peptfdicos pueden prepararse, por ejemplo, de conformidad con el metodo de la srntesis en fase lfquida (vease E. Schroder y K. Lubke, "The
Peptides", volumen 1, pag. 76-136, 1.965, Academic Press), que es muy conocido en el campo de la qmmica de los peptidos.
En una forma de realization, se prepara un farmaco mediante la combination de aproximadamente un equivalente estequiometrico de un dipeptido y un tripeptido, preferiblemente, en una reaction en un unico recipiente bajo 5 condiciones de condensation apropiadas. Este procedimiento aparece ilustrado en los siguientes esquemas 5-7. Asi, el tripeptido 6 puede ser preparado tal y como se muestra en el esquema 5, y el dipeptido 9 puede ser preparado tal y como se muestra en el esquema 6. Los dos fragmentos 6 y 9 pueden ser condensados para proveer un farmaco 10 como aparece mostrado en la figura 7.
La smtesis de un extensor ilustrativo con un grupo maleimido electrofflico aparece ilustrada en los esquemas 8-9. 10 Los metodos sinteticos generales utiles para la smtesis de un enlazador se describen en el esquema 10. El esquema 11 muestra la construction de una unidad de enlazador con un grupo val-cit, un grupo maleimido electrofflico, y un grupo separador autoinmolador PAB. El esquema 12 representa la smtesis de un enlazador con un grupo phe-lys, un grupo maleimido electrofflico, con y sin el grupo espaciador autoinmolador PAB. El esquema 13 presenta una vista general para la smtesis de un compuesto de farmaco-enlazador, mientras que el esquema 14 presenta una via 15 alternativa para la preparation de un compuesto de farmaco-enlazador. El esquema 15 representa la smtesis de un enlazador ramificado que contiene un grupo BHMS. El esquema 16 ilustra la union de un ligando a un compuesto de farmaco-enlazador para formar un conjugado de farmaco-enlazador-ligando, y el esquema 17 ilustra la smtesis de los conjugados de farmaco-enlazador-ligando con 2 o 4 farmacos por ligando.
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Como se ilustra en el Esquema 5, un aminoacido protegido 1 (donde PG representa un grupo amino protector, R4 se selecciona de hidrogeno, Ci-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, -O-(Ci-C8 alquilo), -arilo, alquil-arilo, alquilo-(C3-C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo, alquil-(c3-C8 heterociclo), donde R5 se selecciona de H y metilo; o R4 y R5 juntos
tienen la formula -(CRaRb)n- donde Ra y Rb se seleccionan independientemente de hidrogeno, C1-C8 alquilo y C3-C8 25 carbociclo y n se selecciona de 2, 3, 4, 5 y 6, y forman un anillo con el atomo de carbono al que estan unidos) es acoplado al ester t-butflico 2 (donde R6 se selecciona de -H y -C1-C8 alquilo; y R7 se selecciona de hidrogeno, C1-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, -O-(C1-C8 alquilo), -arilo, alquil-arilo, alquil-(C3-C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo y alquil-(C3- C8 heterociclo)) bajo condiciones adecuadas de acoplamiento, por ejemplo, en presencia de PyBrop, y diisopropiletilamina, o utilizando DCC (vease, por ejemplo, Miyazaki, K. et. al. Chem. Harm. Bull. 1995, 43(10), 170630 1718).
Los grupos protectores PG adecuados y los metodos de smtesis adecuados para proteger a un grupo amino con un grupo protector son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Greene, TW y Wuts, P.G.M., Protective
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Groups in Organic Synthesis, 2 a edicion, 1991, John Wiley & Sons. Los aminoacidos protegidos preferidos 1 son PG-Ile y, en particular, PG-Val, mientras que otros aminoacidos protegidos apropiados incluyen, sin limitacion: PG- ciclohexilglicina, PG-ciclohexilalanina, acido PG-aminociclopropano-1-carbox^lico, acido PG-aminoisobuffrico, PG- fenilalanina, PG-fenilglicina y PG-terc-butilglicina. Z es un grupo protector preferido. Fmoc es otro grupo protector preferido. Un ester t-bufflico preferido 2 es el ester t-bufflico de dolaisoleuina.
El dipeptido 3 puede ser purificado, por ejemplo, usando cromatograffa, y, posteriormente, se desprotege, por ejemplo, utilizando H2 y Pd-C al 10% en etanol cuando el PG es benciloxicarbonilo, o utilizando dietilamina para la eliminacion de un grupo protector Fmoc. La amina resultante 4 facilmente forma un enlace pepffdico con un aminoacido 5 (donde R1 se selecciona de -H, -alquilo C1-C-8 y C3-C8 carbociclo, y R2 se selecciona de -H y C1-C8 alquilo, o R1 y R2 juntos, tienen la formula - (CRaRb)n, donde Ra y Rb se seleccionan independientemente de -H, C1- C-8 alquilo y -C3-C8 carbociclo y n se selecciona de 2, 3, 4, 5 y 6, y forman un anillo con el atomo de nitrogeno al que estan unidos, y R3 se selecciona de hidrogeno, C1-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo,-O-(C1-C8 alquilo),-arilo, alquil-arilo, alquilo (C3-C8 carbociclo), C3-C8 y heterociclo-alquilo (C3-C8 heterociclo)). Los aminoacidos preferidos 5 son los aminoacidos de N,N-dialquilo, como N,N-dimetil-valina disponible en el mercado. Otros aminoacidos de N,N-dialquilo pueden ser preparados por bis-alquilacion reductora utilizando procedimientos conocidos (vease, por ejemplo, Bowman, rE, Stroud, HH J. Chem. Soc., 1950, 1342-1340). Fmoc-Me-L-Val y Fmoc-Me-L-glicina son dos aminoacidos preferidos 5 utiles para la smtesis de derivados N-monoalqmlicos. La amina 4 y el aminoacido 5 reaccionan para proporcionar el tripeptido 6 utilizando el reactivo de acoplamiento DEPC con trietilamina como base.
La metodologfa ilustrativa de acoplamiento con DEPC y la metodologfa de acoplamiento con PyBrop mostradas en el Esquema 5 se describen a continuacion en el Procedimiento General A y Procedimiento General B, respectivamente. La metodologfa ilustrativa para la desproteccion de una amina protegida en Z a traves de hidrogenacion catalffica se describe a continuacion en el Procedimiento General C.
Procedimiento General A: Smtesis de peptidos utilizando DEPC. Se disuelven el aminoacido o peptido 4 N-protegido o N,N-disustituido (1,0 eq.) y una amina 5 (1,1 eq.) con un solvente organico aprotico, tal como el diclorometano (0,1 a 0,5 M). Entonces se anade una base organica tal como trietilamina o diisopropiletilamina (1,5 eq.) seguido de DEPC (1,1 eq.). La solucion resultante se agita, preferiblemente en atmosfera de argon, durante 12 horas mientras se controla por HPLC o TLC. El solvente se elimina al vacro a temperatura ambiente, y el producto crudo se purifica mediante, por ejemplo, HPLC o cromatograffa de columna flash (columna de gel de sflice). Las fracciones relevantes se combinan y se concentran al vacm para producir el tripeptido 6, que se seca al vacm durante la noche.
Procedimiento general B: Smtesis de peptidos utilizando PyBrop. El aminoacido 2 (1,0 eq.), que tiene opcionalmente un grupo protector carboxilo, se diluye con un solvente organico aprotico tal como diclorometano o DME para proporcionar una solucion con una concentracion de entre 0,5 y 1,0 mM, luego se anade diisopropiletilamina (1,5 eq.). Se anade el aminoacido 1 protegido en Fmoc o Z (1,1 eq.) como un solido en una porcion, entonces se anade PyBrop (1,2 eq.) a la mezcla resultante. La reaccion se controla por TLC o HPLC, seguido de un procedimiento de diagnostico diferencial similar al descrito en el Procedimiento General A.
Procedimiento general C: Eliminacion de Z por hidrogenacion catalftica. Se diluye el aminoacido protegido en Z o peptido 3 con etanol para proporcionar una solucion con una concentracion de entre 0,5 y 1,0 mM en un recipiente adecuado, como un frasco de fondo redondo y pared gruesa. Se anade paladio al 10% sobre carbono (5-10 % peso/peso) y la mezcla de reaccion se coloca bajo una atmosfera de hidrogeno. El progreso de la reaccion se controla mediante HPLC y se completa generalmente en 1-2 h. La mezcla de reaccion se filtra a traves de una almohadilla de celita prelavada y la celita se lava de nuevo con un solvente organico polar, tal como metanol, despues de la filtracion. La solucion eluyente se concentra al vacm para dar un residuo que se diluye con un solvente organico, preferiblemente tolueno. El solvente organico se elimina al vacm para dar la amina desprotegida 4.
La Tabla 1 enumera los ejemplos representativos de los productos intermedios de tripeptido (compuestos 39-43) que se prepararon segun el Esquema 5.
Tabla 1
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Compuesto
X1 X2
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Fmoc-N-Me-L-val L-val
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Fmoc-N-Me-L-val L-ile
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Fmoc-N-Me-Gly L-ile
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dov L-val
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dov L-ile
adov=N,N-dimetil-L-valina
El dipeptido 9 se pueden preparar facilmente por condensacion del aminoacido modificado Boc-Dolaproina 7 (vease, por ejemplo, Pettit, GR, et al. Synthesis, 1996, 719-725), con (1S, 2R)-norefedrina, L- o D-fenilalaninol, o con p- acetilfenetilamina 8 sintetica (Patente US 3.445.518 a nombre de Shavel et al.) usando agentes de condensacion muy conocidos en la qmmica de peptidos, como, por ejemplo, DEPC en presencia de trietilamina, como se muestra en el Esquema 6. El compuesto 7 tambien se puede condensar con los compuestos disponibles en el mercado de esta manera para formar dipeptidos de la formula 9. Ejemplos de compuestos disponibles comercialmente que sirven para este proposito incluyen, aunque no exclusivamente, norefedrina, efedrina, y estereoisomeros de las mismas (Sigma-Sigma-Aldrich), L- o D-fenilalaninol (Sigma-Aldrich), 2-feniletilamina (Sigma-Aldrich), 2-(4- aminofenil)etilamina (Sigma-Aldrich), 1,2-etanodiamina-1,2-difenilo (Sigma-Aldrich), o 4- (2-aminoetil)fenol (Sigma- Aldrich), o preparadas sinteticamente con p-acetilfenetilamina, arilo- y heterociclo-amidas de L-fenilalanina, 1- azidometil-2-feniletilamina (preparado a partir de fenilalaninol segun un procedimiento general descrito en J. Chem. Research (S), 1992, 391), y 1-(4-hidroxifenil)-2-feniletilamina (publication de patente europea n° 0356035 A2), entre otros.
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donde R8 se selecciona independientemente de -H, -OH, -Ci-C8 alquilo, -C3-C8 carbociclo y -O-(Ci-C8 alquilo); R9 se selecciona de -H y -C1-C8 alquilo; y R10 se selecciona de:
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donde Z es -O-, -S-, -NH- o -N(R14)-; R11 se selecciona de -H, -OH, -NH2, -NHR14, -N(R14)2, -C1-C8 alquilo, -C3-C8 carbociclo, -O-(C1-C8 alquilo), -arilo, -C1-C8 alquil-arilo, -C1-C8 alquil-(C3-C8 carbociclo), -C3-C8 heterociclo y -C1-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo); o R11 es un atomo de ox^geno que forma una unidad de carbonilo (C=O) con el atomo de carbono al cual esta unido y un atomo de hidrogeno en este atomo de carbono se sustituye por uno de los enlaces en el enlace doble (C=O); cada R12 se selecciona independientemente de -arilo y -C3-C8 heterociclo; R13 se selecciona de -H, -OH, -NH2, -NHR14,-N(R14)2, -Ci-C8 alquilo, -C3-C8 carbociclo, -O-(Ci-C8 alquilo), -arilo, -Ci-C8 alquil-arilo, -C1-C8 alquil-(C3-C8 carbociclo), -C3-C8 heterociclo y -C1-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo); y cada R14 es independientemente -H o -C1-C8 alquilo.
La Tabla 2 enumera ejemplos representativos de dipeptidos (compuestos 44-48) que fueron preparados segun el Esquema 6.
Compuesto
Tabla 2
Y
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Compuesto
Y
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HCX^Ph H
'N* '*CH3
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Ph
o
TX.
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El Esquema 7 ilustra un procedimiento util para el acoplamiento del tripeptido 6 y dipeptido 9 para formar un farmaco 10. El acoplamiento de 6 y 9 se puede lograr utilizando un acido fuerte, por ejemplo, TFA, para facilitar la escision de 5 Boc y el ester t-butflico, del dipeptido 9 y del tripeptido 6, respectivamente, seguido por las condiciones de condensation, por ejemplo, la utilization de DEPC, o reactivo de acoplamiento similar, en presencia de exceso de base (trietilamina o equivalente) para proporcionar el farmaco 10.
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Un procedimiento ilustrativo para la smtesis del farmaco 10 como se representa en el Esquema 7 se detalla a continuacion en el Procedimiento General D.
El grupo R10 de un farmaco de la formula general 10 se puede modificar, si as^ se desea, para incluir a un grupo 5 funcional que permite que el farmaco se una a un enlazador. Ejemplos de modificaciones utiles del grupo R10 de un farmaco 10, incluyen, aunque no exclusivamente, las transformaciones quimicas que se describen a continuacion.
Cuando R10 es
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el grupo hidroxilo de R10 puede hacerse reaccionar con acidos carboxflicos comerciales o derivados sinteticamente o 10 derivados de acidos carboxflicos, incluyendo, aunque no exclusivamente, esteres carboxflicos, cloruros acidos, anhidridos y carbonatos, para proporcionar los esteres correspondientes de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica. Los reactivos de acoplamiento, incluyendo, aunque no exclusivamente, DCC/DMAP y EDCI/HOBt, pueden servir en este tipo de reacciones de acoplamiento entre alcoholes y acidos carboxflicos o derivados de acidos carboxflicos. En una forma de realization preferida, los acidos carboxflicos son acidos aril-carboxflicos 15 sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, acido 4-aminobenzoico. Por lo tanto, la condensation de un grupo hidroxilo del grupo R10 mostrada arriba con acidos carboxflicos proporciona farmacos de la estructura general 10, donde R10 es
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y donde R , R , R y R son como se describieron anteriormente en la presente memoria y X se selecciona de - 20 OH, -NH2 y NHR14
Cuando R10 es
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el grupo azido del farmaco puede reducirse (por ejemplo, vease J. Chem. Research (S), 1992, 391) para proporcionar el derivado amino correspondiente donde R10 es
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cuyo grupo amino se puede hacer reaccionar con el grupo carboxilo de un acido carbox^lico bajo condiciones de acoplamiento generales del peptido para proporcionar farmacos de la estructura general 10, donde R10 es
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O
o
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11 12 14 15
y donde R , R , R y R son como se describieron anteriormente en la presente memoria y X se selecciona de - OH,-NH2 y NHR14
Los acidos carbox^licos utiles en el sentido anterior incluyen, aunque no exclusivamente, acido 4-aminobenzoico, acido p-acetilbenzoico y 2-amino-4-tiazolcarboxflico (Tyger Scientific, Inc., Ewing, NJ).
Un grupo amino protegido en Fmoc puede estar presente en un grupo R10 que contenga una amina del farmaco 10 (por ejemplo, como se muestra en la Tabla 2). El grupo Fmoc se puede quitar de la amina protegida con dietilamina (ver Procedimiento General E como un ejemplo ilustrativo que se describe a continuacion).
Procedimiento general D: Smtesis del farmaco. Se diluye una mezcla de dipeptido 9 (1,0 eq.) y tripeptido 6 (1 eq.) con un solvente organico aprotico, tal como diclorometano, para formar una solucion 0,1 M, a continuacion se anade un acido fuerte, como el acido trifluoroacetico (1/2 v/v) y la mezcla resultante se agita bajo atmosfera de nitrogeno durante dos horas a 0 °C. La reaccion se puede controlar con TLC o HPLC, preferentemente. El solvente se elimina al vado y el residuo resultante se seca azeotropicamente dos veces, preferiblemente con tolueno. El residuo resultante se seca a alto vado durante 12 horas y luego se diluye con un solvente organico aprotico, tal como el diclorometano. Entonces se anade una base organica tal como trietilamina o diisopropiletilamina (1,5 eq.) seguido de PyBrop (1,2 eq.) o DEPC (1,2 eq.) dependiendo de la funcionalidad qrnmica de los residuos. La mezcla de reaccion se controla por TLC o HPLC, y una vez terminada, la reaccion se somete a un procedimiento de tratamiento final similar o identico al descrito en el Procedimiento General A.
Procedimiento general E: Eliminacion de Fmoc utilizando dietilamina. Se diluye un farmaco protegido en Fmoc 10 con un solvente organico aprotico tal como diclorometano y a la solucion resultante se anade dietilamina (^ v/v). El progreso de la reaccion se controla por TLC o HPLC y se suele completar en 2 horas. La mezcla de reaccion se concentra al vado y el residuo resultante se seca azeotropicamente, preferiblemente utilizando tolueno, luego se seca a alto vado para proporcionar el farmaco 10 que tiene un grupo amino desprotegido.
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Por lo tanto, los metodos anteriores son utiles para hacer farmacos que pueden ser utilizados en la presente invencion.
Para preparar un compuesto de farmaco-enlazador de la presente invencion, el farmaco se hace reaccionar con un sitio reactivo en el enlazador. En general, el enlazador puede tener la estructura:
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cuando tanto una unidad de espaciador (-Y) como una unidad de extensor (-A-) estan presentes.
En general, un enlazador adecuado tiene una unidad de aminoacido unida a una unidad de extensor y una unidad de separador. El sitio reactivo 1 esta presente en el extremo del sitio del espaciador y el sitio reactivo 2 esta presente en el extremo del extensor.
En una forma de realizacion de la invencion, el sitio reactivo n° 1 reacciona con un atomo de nitrogeno del farmaco, y el sitio reactivo n° 2 reacciona con un grupo sulfhidrilo en el ligando. Los sitios reactivos 1 y 2 pueden reaccionar con los diferentes grupos funcionales.
En un aspecto de la invencion, el sitio reactivo n° 1 es
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En otro aspecto de la invencion, el sitio reactivo n° 1 es
C(0)R
donde R es-Br, -Cl, -O-Su o -O-(4-nitrofenilo).
Los enlazadores que tienen
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en el sitio reactivo n° 1, donde R es -Br o -Cl, pueden ser preparados a partir de enlazadores que tienen
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en el sitio reactivo n° 1 mediante la reaccion del grupo -COOH con PX3 o PX5, donde X es -Br o -Cl. Alternativamente, los enlazadores que tienen
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en el sitio reactivo n° 1 pueden ser preparados a partir de enlazadores que tienen
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en el sitio reactivo n° 1 mediante la reaccion del grupo -COOH con cloruro de tionilo. Para una explicacion general de la conversion de los acidos carboxflicos en haluros de acilo, vease March, Advanced Organic Chemistry-Reactions, Mechanisms and Structure, 4a Ed., 1992, John Wiley and Sons, New York, p. 437-438.
En otro aspecto de la invencion, el sitio reactivo n° 1 es
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En otro aspecto mas de la invencion, el sitio reactivo n° 1 es
0C(0)R
»
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donde R es -Cl, -O-CH(Cl)CCl3 o -O-(4-nitrofenilo). Los enlazadores que tienen
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en el sitio reactivo n° 1 pueden ser preparados a partir de enlazadores que tienen
imagen40
-OH en el sitio reactivo n° 1 mediante la reaccion del grupo -OH con fosgeno o trifosgeno para formar el cloroformato correspondiente. Los enlazadores que tienen
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en el sitio reactivo n° 1, donde R es -O-CH(Cl)CCl3 o -O-(4-nitrofenilo) pueden ser preparados a partir de enlazadores que tienen
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en el sitio reactivo n° 1 mediante la reaccion del grupo -OC(O)Cl con HO-CH(Cl)CCh u HO-(4-nitrofenilo), respectivamente. Para una explicacion general de esta qmmica vease March, Advanced Organic Chemistry - Reaction, Mechanisms and Structure, 4a Ed., 1992, John Wiley and Sons, New York, p. 392.
En otro aspecto de la invencion, el sitio reactivo n° 1 es
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donde X es-F, -Cl, -Br, -I, o un grupo saliente, como -O-mesilo, -O-tosilo u -O-triflato. Los enlazadores que tienen
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en el sitio reactivo n° 1, donde X es -O-mesilo, -O-tosilo y O-triflato pueden ser preparados a partir de enlazadores que tienen
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en el sitio reactivo n° 1 mediante la reaccion del grupo -OH con reactivos diferentes, incluyendo HCl, SOCI2, PCI5, PCI3 y POCl3 (donde X es Cl); HBr, PBr3, PBr5 y SOBr2 (donde X es Br), HI (donde X es I), y CH3CH2NSF3 (DAST), SF4, SeF4 y fluoruro de p-toluensulfonilo (donde X es F). Para una explicacion general de la conversion de los alcoholes en haluros de alquilo, vease March, Advanced Organic Chemistry -Reaction, Mechanisms and Structure, 5 4a Ed., 1992, John Wiley and Sons, New York, p. 431-433.
Los enlazadores que tienen
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en el sitio reactivo n° 1, donde X es -O-mesilo, -O-tosilo y O-triflato pueden ser preparados a partir de enlazadores que tienen
10
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en el sitio reactivo n° 1 mediante la reaccion del grupo -OH con varios reactivos de mesilacion, tosilacion y triflacion, respectivamente. Estos reactivos y metodos para su uso son muy conocidos para un experto en la tecnica de la smtesis organica. Para una explicacion general sobre el mesilo, tosilo y triflatos como grupos salientes, vease March, Advanced Organic Chemistry -Reaction, Mechanisms and Structure, 4a Ed., 1992, John Wiley and Sons, New 15 York, p. 353-354.
En una forma de realizacion, cuando una unidad de separador (-Y) esta presente, el sitio reactivo n° 1 es
0C(0)R o > — X
donde R es -Cl, -O-CH(Cl)CCl3 o -O-(4-nitrofenilo) y X es -F, -Cl, -Br, -I, o un grupo saliente, como -O-mesilo, -O- tosilo u O-triflato.
20 En otro aspecto de la invencion, el sitio reactivo n° 1 es
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En otro aspecto mas de la invencion, el sitio reactivo n° 1 es un carbonato de p-nitrofenilo que tiene la formula
En un aspecto de la invencion, el sitio tiene la formula
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Los enlazadores utiles se pueden obtener a traves de fuentes comerciales, tales como de Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), o sintetizados de acuerdo con los procedimientos descritos en la Patente US 6.214.345 a nombre de Firestone et al., resumidos en los Esquemas 8-10 que siguen.
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donde X es -CH2- o -CH2OCH2-, y n es un numero entero de 0-10 cuando X es -CH2-, o 1-10 cuando X es - CH2OCH2.
El metodo que se muestra en el Esquema 9 combina la maleimida con un glicol bajo condiciones de Mitsunobu para 5 hacer un extensor de maleimida y polietilenoglicol (vease, por ejemplo, Walker, M.A. J Org. Chem. 1995, 60, 53525), seguido de la instalacion de un grupo con sitio reactivo de carbonato de p-nitrofenilo.
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Alternativamente, los extensores de PEG-maleimida y PEG-haloacetamida se pueden preparar como han descrito 10 Frisch, et al. Bioconjugate Chem. 1996, 7, 180-186.
El Esquema 10 ilustra una smtesis general de una unidad de enlazador ilustrativa que contiene un grupo extensor de maleimida y, un separador autoinmolador de eter p-aminobencflico.
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donde Q es -C1-C8 alquilo, -O-(C1-C8 alquilo), -halogeno, -nitro o -ciano; m es un numero entero que varia de 0-4; y n es un numero entero que varia de 0-10.
Los extensores utiles pueden ser incorporados en un enlazador utilizando productos intermedios disponibles en el 5 mercado de Molecular Biosciences (Boulder, CO) que se describen a continuation utilizando tecnicas conocidas de smtesis organica.
Los extensores de la formula (IIIa) se pueden introducir en un enlazador haciendo reaccionar los siguientes productos intermedios con el N-terminal de una unidad de aminoacido como se representa en los Esquemas 11 y 12:
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donde n es un numero entero que varia de 1-10 y T es -H o -SO3Na;
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donde n es un numero entero que varia de 0-3;
y
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Las unidades de extensor de la formula (IIIb) pueden ser introducidas en un enlazador haciendo reaccionar los siguientes productos intermedios con el N-terminal de una unidad de aminoacido:
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donde X es -Br o I; y
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5 Las unidades de extensor de la formula (IV) pueden ser introducidas en un enlazador haciendo reaccionar los siguientes productos intermedios con el N-terminal de una unidad de aminoacido:
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y
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10 Las unidades de extensor de la formula (Va) pueden ser introducidas en un enlazador haciendo reaccionar los siguientes productos intermedios con el N-terminal de una unidad de aminoacido:
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y
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Se pueden sintetizar otros extensores utiles en la invention segun procedimientos conocidos. Los extensores aminooxi de la formula que se muestra a continuation se pueden preparar mediante el tratamiento de haluros de alquilo con N-Boc-hidroxilamina de acuerdo con los procedimientos descritos por Jones, DS et al, Tetrahedron Letters, 2000, 41 (10), 1531-1533; y Gilon, C. et al., Tetrahedron, 1967, 23 (11), 4441-4447.
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donde -R17- se selecciona de -C1-C10 alquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -O-(C1-C8 alquilo)-, -arileno-, -C1-C10 alquilenoarileno-, -arileno-C1-C10 alquileno-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-, -C3-C8 heterociclo-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-, -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-, - (CH2CH2O)r-, -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es un numero entero que varia de 1-10;
Los extensores de isotiocianato de la formula que se muestra a continuacion pueden ser preparados a partir de cloruros de acido isotiocoanatocarboxflico como se describe en Angew. Chem, 1975, 87 (14), 517.
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donde -R17-es como se describe en esta memoria.
El Esquema 11 muestra un metodo para la obtencion de un enlazador dipeptido val-cit que tiene un extensor de maleimida y, opcionalmente, un separador autoinmolador p-aminobencilo.
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El Esquema 12 ilustra la smtesis de una unidad enlazadora dipeptido phe-lys(Mtr) que tiene una unidad de extensor de maleimida y una unidad de separador autoinmolador p-aminobencilo. El material de partida 23 (Lys(Mtr)) esta 5 disponible comercialmente (Bachem, Torrance, CA) o puede prepararse segun Dubowchik, et al. Tetrahedrom Letters 1997, 38, 5257-60.
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Como se muestra en el Esquema 13, se puede hacer reaccionar un enlazador con un grupo amino de un farmaco 10 para formar un compuesto de farmaco-enlazador que contiene un grupo amida o carbamato, que enlaza la unidad 5 de farmaco a la unidad del enlazador. Cuando el sitio reactivo n° 1 es un grupo de acido carboxflico, como en el enlazador 29, la reaccion de acoplamiento se puede realizar utilizando HATU o PyBrop y una base de amina apropiada, lo que produce un compuesto de farmaco-enlazador 30, que contiene una union amida entre la unidad de farmaco y la unidad enlazadora. Cuando el sitio reactivo n° 1 es un carbonato, como en el enlazador 31, el enlazador puede acoplarse al farmaco utilizando HOBt en una mezcla de DMF/piridina para proporcionar un compuesto de 10 farmaco-enlazador 32, que contiene una union carbamato entre la unidad de farmaco y la unidad de enlazador.
Cuando el sitio reactivo n° 1 es un grupo hidroxilo, como en el enlazador 33, el enlazador puede acoplarse a un grupo fenol de un farmaco utilizando la qmmica Mitsunobu para proporcionar un compuesto de farmaco-enlazador 34 que tiene un enlace eter entre la unidad de farmaco y la unidad de enlazador.
Alternativamente, cuando el sitio reactivo n° 1 es un buen grupo saliente, como en el enlazador 70, el enlazador 15 puede acoplarse a un grupo hidroxilo de un farmaco a traves de un proceso de sustitucion nucleofflica para proporcionar un compuesto de farmaco-enlazador que tiene un enlace eter (34) o un enlace amino (71) entre la unidad de farmaco y la unidad de enlazador.
Los metodos ilustrativos que sirven para enlazar un farmaco a un ligando para formar un compuesto de farmaco- enlazador se representan en el Esquema 13 y se describen en los procedimientos generales G-J.
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Procedimiento general G: Formation de amida utilizando HATU. Se diluyen un farmaco 10 (1,0 eq.) y un enlazador protegido en N conteniendo un sitio reactivo de acido carboxflico (1,0 eq.) con un solvente organico adecuado, tal como el diclorometano, y la solution resultante se trata con HATU (1,5 eq.) y una base organica, preferiblemente piridina (1,5 eq.). Se deja agitar la mezcla de reaction bajo atmosfera inerte, preferiblemente argon, durante 6 horas, tiempo durante el cual la mezcla de reaccion se controla por HPLC. La mezcla de reaccion se concentra y el residuo resultante se purifica utilizando HPLC para obtener la amida 30.
Procedimiento general H: Formacion de carbamato utilizando HOBt. Se diluye una mezcla de un enlazador 31 que tiene un sitio reactivo de carbonato de p-nitrofenilo (1,1 eq.) y el farmaco 10 (1,0 eq.) con un solvente organico aprotico, tal como DMF, para proporcionar una solucion con una concentration de 50-100 mM, y la solucion resultante se trata con HOBt (2,0 eq.) y se coloca bajo una atmosfera inerte, preferiblemente argon. Se deja agitar la mezcla de reaccion durante 15 min, luego se anade una base organica, tal como piridina (1/4 v/v) y el progreso de la reaccion se controla por HPLC. El enlazador se consume normalmente a las 16 h. La mezcla de reaccion se concentra al vatio y el residuo resultante se purifica utilizando, por ejemplo, HPLC para obtener el carbamato 32.
Procedimiento general I: Formacion de eter utilizando qmmica Mitsunobu. Se diluye un farmaco de la formula general 10, que contiene un grupo hidroxilo libre, con THF para hacer una solucion de 1,0 M y a esta solucion se anade un enlazador (1,0 eq), que contiene un grupo hidroxilo en el sitio reactivo n° 1 (33), seguido de trifenilfosfina (1,5 eq.). La mezcla de reaccion se pone bajo una atmosfera de argon y se enfria a 0 °C. Entonces se anade DEAD (1,5 eq.) gota a gota con una jeringa y la reaccion se deja en agitation a temperatura ambiente mientras se controla utilizando HPLC. La reaccion se completa normalmente a las 0,5-12 h, dependiendo de los sustratos. La mezcla de reaccion se diluye con agua (en un volumen igual al del THF) y la mezcla de reaccion se extrae en EtOAc. La capa de EtOAc se lava sucesivamente con agua y salmuera, despues se seca sobre MgSO4 y se concentra. El residuo resultante se purifica por cromatografia en columna flash utilizando un eluyente adecuado para proporcionar eter 34.
Procedimiento general J: Formacion de eter/amina por sustitucion nucleofflica. Un farmaco de la formula general 10, que contiene un grupo hidroxilo libre o un grupo amino libre, se diluye con un solvente aprotico polar, tal como THF, DMF o DMSO, para hacer una solucion de 1,0 M y a esta solucion se anade una base no nucleofflica (alrededor de
1,5 eq), tal como piridina, diisopropiletilamina o trietilamina. La mezcla de reaccion se deja en agitacion durante 1 hora aproximadamente, y a la solucion resultante se le anade una solucion de aproximadamente 1,0 M de enlazador 70 en un solvente polar aprotico, tal como THF, DMF o DMSO. La reaccion resultante se agita en atmosfera inerte, mientras se controla utilizando TLC o HPLC. La reaccion se completa normalmente a las 0,5-12 h, dependiendo de los sustratos. La mezcla de reaccion se diluye con agua (en un volumen igual al del volumen de reaccion) y se
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extrae en EtOAc. La capa de EtOAc se lava sucesivamente con agua, 1N de HCl, agua y salmuera, despues se seca sobre MgSO4 y se concentra. El residuo resultante se purifica por cromatograffa en columna flash utilizando un eluyente adecuado para proporcionar un eter de la formula 34 o una amina de la formula 71, dependiendo de si el farmaco 10 contiene un grupo hidroxilo libre o un grupo amino libre.
5 Un metodo alternativo para la preparacion de compuestos de farmaco-enlazador de la invencion se describe en el Esquema 14. Utilizando el metodo del Esquema 14, el farmaco se une a una unidad parcial de enlazador (19a, por ejemplo), que no tiene una unidad de extensor unida. Esto proporciona el producto intermedio 35, que tiene una unidad de aminoacido que tiene un N-terminal protegido en Fmoc. El grupo Fmoc se elimina y la amina intermediaria resultante 36 se fija a una unidad de extensor a traves de una reaccion de acoplamiento catalizada con PyBrop o 10 DEPC. La construction de los compuestos de farmaco-enlazador que contienen o un extensor de bromoacetamida 39 o un extensor de maleimida PEG 38 se ilustra en el Esquema 14.
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La metodologia util para la preparacion de una unidad de enlazador conteniendo un separador ramificado se 15 muestra en el Esquema 15.
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El Esquema 15 ilustra la smtesis de un enlazador dipeptido val-cit que tiene una unidad de extensor de maleimida y una unidad de bis(4-hidroximetil)estireno (BHMS). La smtesis del producto intermedio BHMS (75) se ha mejorado a partir de los procedimientos de la literatura anterior (vease la Publication Internacional n° WO 98 13059 de Firestone 5 et al., y Crozet, MP.; Archaimbault, G.; Vanelle, P.; Nouguier, R. Tetrahedron Lett. 1985, 26, 5133-5134) y utiliza como materiales de partida, disponibles en el mercado, dietil (4-nitrobencil)fosfonato (72) y 2,2-dimetil-1 ,3-dioxan-5- ona (73). Los enlazadores 77 y 79 se pueden preparar a partir del producto intermedio 75 mediante la metodologia descrita en el Esquema 11.
El esquema 16 ilustra la metodologia util para la hacer conjugados de farmaco-enlazador-ligando de la invention 10 teniendo aproximadamente de 2 a 4 farmacos por anticuerpo.
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Procedimiento general K: Preparation de conjugados con aproximadamente 2 a 4 farmacos por anticuerpo. Reduccion parcial del anticuerpo
En general, para preparar conjugados que tienen dos farmacos por anticuerpo, el anticuerpo relevante se reduce 15 con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP) (alrededor de 1,8 equivalentes) en
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PBS con 1 mM DTPA, ajustado a pH 8 con 50 mM de borato. La solucion se incuba a 37 °C durante 1 hora, se purifica utilizando una columna de 50 ml G25 con desalacion equilibrada en PBS/1mM DTPA a 4° C. La concentracion de tiol se puede determinar segun el Procedimiento General M, la concentracion de protemas puede determinarse dividiendo el valor de A280 por el coeficiente de extincion de 1,58 (mg/ml), y la relacion de tiol a 5 anticuerpo puede determinarse segun el Procedimiento General N.
Los conjugados que tienen 4 farmacos por anticuerpo se pueden hacer utilizando la misma metodologfa, con alrededor de 4,2 equivalentes de un agente reductor adecuado para reducir parcialmente el anticuerpo.
Conjugacion del farmaco-enlazador al anticuerpo parcialmente reducido
Las muestras de anticuerpo parcialmente reducido pueden conjugarse con el correspondiente compuesto de 10 farmaco-enlazador con alrededor de 2,4 y alrededor de 4,6 equivalentes molares de compuesto de farmaco- enlazador por anticuerpo para preparar los conjugados de 2 y 4 farmacos por anticuerpo, respectivamente. Las reacciones de conjugacion se incuban en hielo durante 1 hora, se extinguen con cerca de 20 veces el exceso de cistema para el farmaco, y se purifica por elucion en una columna de desalacion G25 a aproximadamente 4 °C. Los conjugados de farmaco-enlazador-ligando resultantes se concentran a cerca de 3 mg/ml, se pasan por un filtro 15 esteril, se dividen en partes almuotas y se almacenan congelados.
El esquema 17 muestra la construccion de un conjugado de farmaco-enlazador-ligando mediante la reaccion del grupo sulfhidrilo de un ligando con un grupo aceptante tiol en el grupo enlazador de un compuesto de farmaco- enlazador.
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20 Los metodos ilustrativos para unir un anticuerpo ligando a un compuesto de farmaco-enlazador se describen en los procedimientos generales L-R.
Procedimiento general L: Union de un ligando de anticuerpo a un compuesto de farmaco-enlazador. Todas las etapas de la reaccion se llevan a cabo tipicamente a 4 °C. Cuando el ligando es un anticuerpo monoclonal que tiene uno o mas puentes disulfuro, las soluciones del anticuerpo monoclonal (5-20 mg/ml) en solucion salina tamponada 25 con fosfato pH, 7,2, se reducen con ditiotreitol (10 mM final) a 37 °C durante 30 minutos (vease el Procedimiento General M) y la separacion de los agentes de bajo peso molecular se logra mediante cromatograffa de exclusion molecular en columnas Sephadex G25 en PBS conteniendo 1 mM de acido dietilentriaminopentaacetico.
El contenido de sulfhidrilo en el ligando se puede determinar utilizando acido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB) como se describe en el Procedimiento General M (vease Riddles, P.W., Blakeley, RL, y Zemer, B. (1979) Anal. 30 Biochem. 94, 75-81). A una solucion de PBS de ligando reducido segun el Procedimiento General L se anade un
compuesto de farmaco-enlazador en MeCN de manera que la solucion sea de 20% de MeCN/PBS (vol/vol). La cantidad de compuesto de farmaco-enlazador es aproximadamente un 10% mas que el numero total de grupos sulfhidrilo en un ligando. Despues de 60 min a 4 °C, la cistema se anade (20 veces el exceso en la concentracion del compuesto de farmaco-enlazador), la solucion se concentra por ultrafiltracion, y todos los agentes de bajo peso 35 molecular se eliminan por filtracion en gel. El numero de compuestos de farmaco-enlazador por anticuerpo se determina por espectroscopia uv/vis utilizando formulas derivadas de los coeficientes de extincion relativa de los ligandos y compuestos de farmaco-enlazador como se describe en el Procedimiento General O. La cantidad de compuesto de farmaco-enlazador extinguido se determina entonces como se describe en el Procedimiento General P utilizando HPLC de fase inversa. El estado de agregacion de los anticuerpos del ligando de los conjugados de
40 farmaco-enlazador-ligando se puede determinar utilizando HPLC de exclusion por tamano como se describe en el
Procedimiento General R. Los conjugados de farmaco-enlazador-ligando pueden utilizarse sin purificacion adicional.
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Procedimiento general M: Reduccion de los puentes disulfuro entre cadenas de un anticuerpo. A una solucion de 24 mg de un anticuerpo (2,4 ml de 10 mg/ml de solucion) en el tampon adecuado se anade 300 ml de solucion tampon de borato (500 mM de borato de sodio/500 mM de cloruro de sodio, pH 8,0), seguido de 300 jl de ditiotreitol (DTT, una solucion de 100 mM en H2O). La mezcla de reaccion se agita con un instrumento vortex y se incuba a 37 °C durante 30 min. Se equilibran tres columnas PD10 con PBS conteniendo 1 mM de DTPA (en PBS) y el anticuerpo reducido se eluye a traves de las tres columnas PD10 y se recoge en 4,2 ml de solucion PBS/DTPA (1,4 ml por columna). El anticuerpo reducido se almacena luego en hielo. El numero de tioles por anticuerpo y la concentracion de anticuerpos se determinan segun el Procedimiento General N.
Procedimiento general N: Determinacion del numero de tioles por ligando.
Una muestra de referencia de un ligando o una muestra de un anticuerpo reducido segun el Procedimiento General L se diluye a aproximadamente 1:40 (peso/peso) en PBS, y la absorbancia UV de la solucion se mide a 280 nm utilizando metodos espectroscopicos de UV. Preferentemente, la relacion de ligando : PBS en la solucion es tal que la absorbancia UV oscila entre aproximadamente 0,13-0,2 UA (unidades de absorbancia).
Una muestra de ensayo de un ligando o una muestra de ensayo de un anticuerpo reducido segun el Procedimiento General L se diluye a 1:20 con una solucion de PBS conteniendo unos 15 jl de solucion madre de DTNB/ml de PBS. Entonces se prepara una muestra en blanco conteniendo DTNB en la misma concentracion que la solucion de ensayo (es decir, 15 jl de solucion madre de DTNB/ml de PBS). El espectrofotometro se pone como referencia a cero nm con la muestra en blanco, entonces la absorbancia de la muestra se mide a 412 nm.
La concentracion molar del anticuerpo se determina mediante la formula: [Ligando] = (OD280/2,24e5) x factor de dilucion.
La concentracion molar de tiol se determina mediante la formula: [-SH] = (OD412/1,415e4) x factor de dilucion.
Entonces se calcula la relacion [SH]/[ligando]. Un ligando de anticuerpo monoclonal reducido puede tener de 1 a 20 grupos sulfhidrilo, pero por lo general tiene entre 6 a 9 grupos sulfhidrilo. En una forma de realizacion preferida, el rango de la relacion de [SH]/[ligando] es de aproximadamente 7 a 9.
Se entiende que la relacion de [SH]/[ligando] es el numero promedio de unidades de -Aa-Ww-Yy-D por unidad de ligando.
Procedimiento general O: Determinacion del numero de moleculas de farmaco por anticuerpo en un conjugado de farmaco-enlazador-anticuerpo. La relacion de farmaco : anticuerpo para un conjugado de farmaco-enlazador- anticuerpo se determina midiendo el numero de tioles reducibles con ditiotreitol (dTt) que quedan despues de la conjugacion, utilizando el siguiente metodo: Se trata una muestra de 200 ml de un conjugado de farmaco-enlazador- anticuerpo con DTT (solucion de 100 mM en agua) para llevar la concentracion a 10 mM de TDT. La solucion resultante se incuba a 37 °C durante 30 minutos, luego se eluye a traves de una columna PD10 con PBS/DTPA como eluyente. Entonces se mide el OD280 del conjugado reducido y se mide la concentracion molar segun el Procedimiento General P.
La concentracion molar de tiol se determina usando DTNB como se describe en el procedimiento general M. Se calcula la relacion de la concentracion de tiol a la concentracion de anticuerpo y la relacion de farmaco : ligando es la diferencia entre la relacion tiol : anticuerpo (determinado utilizando el procedimiento general N) y la relacion farmaco : anticuerpo como se determina en el parrafo anterior.
Procedimiento General P: Determinacion de la cantidad de compuesto de farmaco-enlazador extinguido en un conjugado de farmaco-enlazador-anticuerpo. Este ensayo proporciona una determinacion cuantitativa del farmaco- enlazador en el conjugado de farmaco-enlazador-anticuerpo que no se une covalentemente al anticuerpo. Asumiendo que todos los grupos maleimida del farmaco-enlazador en la mezcla de reaccion se han extinguido con cistema, el farmaco no unido es el aducto extinguido de cistema del compuesto de farmaco-enlazador, es decir, farmaco-enlazador-cys. El conjugado protemico de farmaco-enlazador-anticuerpo se desnaturaliza, se precipita, y se afsla por centrifugacion en las condiciones en las que el farmaco-enlazador-cys es soluble. El farmaco-enlazador-cys no unido se detecta cuantitativamente por HPLC, y el cromatograma resultante se compara con una curva estandar para determinar la concentracion farmaco-enlazador-cys no unido en la muestra. Esta concentracion se divide por la concentracion total del farmaco en el conjugado como se determina utilizando el Procedimiento General 0 y el Procedimiento General Q.
Espedficamente, se preparan 100 ml de "solucion de trabajo" de un aducto de 100 jM de farmaco-enlazador-cys anadiendo 1 jl de 100 mM de cistema en PBS/DTPA y un volumen adecuado de solucion madre de un compuesto de farmaco-enlazador a 98 jl de metanol/PBS al 50%. El "volumen apropiado" en litros se calcula utilizando la formula: V = 1e-8/[farmaco-enlazador]. Se etiquetan seis tubos como sigue: "0", "0,5", "1", "2", "3", y "5", y se coloca
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la cantidad apropiada de solucion de trabajo en cada tubo y se diluye con metanol/PBS al 50% para obtener un volumen total de 100 ml en cada tubo. Las etiquetas indican la concentracion en pM de los estandares.
Se recogen una solucion de 50 pl de un conjugado de farmaco-enlazador-anticuerpo y una solucion de 50 pl de la mezcla de reaccion de cistema extinguida ("qriri") en tubos de ensayo por separado y cada uno se diluye con 50 pl de metanol que ha sido enfriado a -20 °C. Las muestras se enfnan a -20 °C durante l0 min.
Las muestras se centrifugan a 13.000 rpm en una centnfuga de sobremesa durante 10 minutos. Los sobrenadantes se transfirieren a viales de HPLC, y se analizan alfcuotas de 90 pl de cada muestra por separado por HPLC (columna C12 RP (Phenomenex) y se monitorizan con la maxima absorbancia del compuesto de farmaco-enlazador utilizando un caudal de 1,0 ml / min. El eluyente utilizado es un gradiente lineal de MeCN que vana de 10 a 90% en solucion acuosa de fosfato de amonio 5 mM, pH 7,4, durante 10 minutos, luego 90% de MeCN durante 5 min.; luego se vuelve a las condiciones iniciales). El aducto de farmaco-enlazador-cys eluye generalmente entre 7 y 10 minutos.
Se prepara una curva estandar trazando el area pico de los estandares frente a su concentracion (en pM). Se realiza el analisis de regresion lineal para determinar la ecuacion y el coeficiente de correlacion de la curva estandar. Los valores de R2 son tipicamente > 0,99. A partir de la ecuacion de regresion se determina la concentracion del aducto de farmaco-enlazador-cys en la muestra de HPLC y en el conjugado, utilizando las formulas:
[Farmaco-Enlazador-Cys](muestra hplc) = (area Pico - intercepcion)/inclinacion
[Farmaco-Enlazador-Cys](conjugado) = 2 x [Farmaco-Enlazador-Cys](muestra hplc) El porcentaje del aducto de farmaco-enlazador-cys se puede determinar mediante la formula:
% Farmaco-Enlazador-Cys = 100 x [Farmaco-Enlazador-Cys](conjugado)/[farmaco]
donde [farmaco] = [conjugado] x farmaco/Anticuerpo, [conjugado] se determina utilizando el ensayo de concentracion de conjugado, y la relacion farmaco : anticuerpo se determina usando el ensayo de relacion de farmaco : anticuerpo.
Procedimiento General Q: Determinacion de la concentracion de conjugado de farmaco-enlazador-anticuerpo para enlazadores de farmacos con absorbancia de uv minima a 280 nm. La concentracion de conjugado farmaco- enlazador-anticuerpo se puede determinar de la misma manera que la concentracion del anticuerpo de origen, mediante la medicion de la absorbancia a 280 nm de una dilucion adecuada, utilizando la siguiente formula:
[Conjugado] (mg/ml) = OD280 x factor de dilucion/1,4) x 0,9
Determinacion de la concentracion de conjugado de farmaco-enlazador-anticuerpo para enlazadores de farmacos con absorbancia de uv substancial a 280 nm (por. ej. compuestos 68 y 69). Debido a que las absorbancias de los compuestos 68 y 69 se solapan con las absorbancias de un anticuerpo, la determinacion espectrofotometrica de la concentracion del conjugado es mas util cuando la medicion se realiza utilizando las absorbancias tanto a 270 nm como a 280 nm. Utilizando estos datos, la concentracion molar del conjugado de farmaco-enlazador-ligando viene dada por la siguiente formula:
[Conjugado] = (OD280 x 1,23 e-5 - OD270 x 9,35 e-6) x factor de dilucion
donde los valores 1,23e-5 y 9,35e-6 se calculan a partir de los coeficientes de extincion molar del farmaco y el anticuerpo, que se estima como:
e270 Farmaco= 2,06e4 e270 Anticuerpo= 1,87e5
e280 Farmaco= 1,57e4 e280 Anticuerpo= 2,24e5
Procedimiento general R: Determinacion del estado de agregacion del anticuerpo en un conjugado de farmaco- enlazador-anticuerpo. Una cantidad adecuada (~ 10 pg) de un conjugado de farmaco-enlazador-anticuerpo se eluye a traves de una cromatograffa de exclusion por tamano (SEC), columna (Tosoh Biosep SW3000 4,6 mm x 30 cm elrnda a 0,35 ml/min. con PBS) en condiciones normales. Los cromatogramas se obtienen a 220 nm y 280 nm y se calcula la relacion OD280/OD220. El agregado correspondiente por lo general tiene un tiempo de retencion de entre unos 5,5 y 7 minutos, y tiene aproximadamente la misma relacion de OD280/OD220 que el conjugado monomerico de farmaco-enlazador-anticuerpo.
5.8 composiciones
En otros aspectos, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica adaptada para la administracion intravenosa, que comprende preferiblemente una cantidad efectiva de un compuesto de formula la y un soporte o vetuculo farmaceuticamente aceptable. Por comodidad, los compuestos de formula la utiles en la invencion se
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pueden llamar simplemente compuestos de la invencion. Las composiciones son adecuadas para la administracion humana.
Las composiciones de la presente invencion pueden tener cualquier forma que permita que la composicion se administre de forma intreavenosa a seres humanos. Por ejemplo, la composicion puede ser en forma de un solido o lfquido. Las otras v^as de administracion descritas aqu incluyen, la oral, topica, parenteral, sublingual, rectal, vaginal, ocular e intranasal. La administracion parenteral incluye inyecciones subcutaneas, intramusculares, intraesternales o tecnicas de infusion. Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden formularse con el fin de permitir que un compuesto de la invencion sea biodisponible tras la administracion de la composicion a un animal. Las composiciones pueden tomar la forma de una o mas unidades de dosificacion.
Los materiales utilizados en la preparacion de las composiciones farmaceuticas pueden ser no toxicos en las cantidades utilizadas. Sera evidente para los expertos en la materia que la dosis optima del o de los ingredientes activos en la composicion farmaceutica dependera de una variedad de factores. Los factores relevantes incluyen, sin limitacion, el tipo de animal (por ejemplo, humano), la forma particular del compuesto de la invencion, la forma de administracion, y la composicion empleada.
El soporte o vehuculo farmaceuticamente aceptable puede estar en partfculas, de modo que las composiciones esten, por ejemplo, en forma de polvo. El o los soportes pueden ser lfquidos, con las composiciones siendo, por ejemplo, un lfquido inyectable.
La composicion puede estar en forma de lfquido, por ejemplo, una solucion, emulsion o suspension. El lfquido puede ser util para suministrarlo por inyeccion. En una composicion para administracion por inyeccion, tambien se pueden incluir uno o mas de un surfactante, conservante, agente humectante, dispersante, agente de suspension, tampon, estabilizador y agente isotonico.
Las composiciones lfquidas de la invencion, ya se trate de soluciones, suspensiones u otra forma similar, tambien puede incluir uno o mas de los siguientes: diluyentes esteriles tales como agua para inyeccion, solucion salina, preferiblemente solucion salina fisiologica, solucion de Ringer, cloruro de sodio isotonico, aceites fijos, tales como mono o digliceridos sinteticos que pueden servir como medio disolvente o de suspension, polietilenoglicol, glicerina, ciclodextrina, propilenoglicol u otros solventes, agentes antibacterianos tales como alcohol bendlico o metilparabeno, antioxidantes como acido ascorbico o bisulfito de sodio, agentes quelantes tales como acido etilenodiaminotetraacetico, tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Una composicion parenteral puede estar encerrada en una ampolla, una jeringa desechable o un frasco de dosis multiples de vidrio, plastico u otro material. La solucion salina fisiologica es un adyuvante preferido. Una composicion inyectable es preferiblemente esteril.
La cantidad del compuesto de la invencion que es eficaz en el tratamiento de una enfermedad o condicion en particular dependera de la naturaleza de la enfermedad o condicion, y puede ser determinado por tecnicas clmicas estandares. Ademas, se pueden emplear opcionalmente ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar los rangos optimos de dosificacion. La dosis precisa que hay que emplear en las composiciones dependera tambien de la via de administracion y la gravedad de la enfermedad o trastorno, y debena decidirse segun el juicio del profesional habilitado y las circunstancias de cada paciente.
Las composiciones comprenden una cantidad efectiva de un compuesto de la invencion de tal manera que se obtenga una dosificacion adecuada. Tfpicamente, esta cantidad es de al menos 0,01% de un compuesto de la invencion en peso de la composicion. Las composiciones preferidas de la presente invencion se preparan de tal manera que una unidad de dosificacion parenteral contenga aproximadamente 0,01% a 2% en peso del compuesto de la invencion.
Para la administracion intravenosa, la composicion puede comprender desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 250 mg de un compuesto de la invencion por kg de peso corporal del animal. Preferiblemente, la cantidad administrada estara en el rango de 4 a 25 mg/kg de peso corporal del compuesto de la invencion.
En general, la dosificacion del compuesto de la invencion administrada a un animal es de alrededor de 0,1 mg/kg a 250 mg/kg de peso corporal del animal. Preferiblemente, la dosis administrada a un animal es entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg de peso corporal del animal, mas preferiblemente de 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal del animal.
Los compuestos o composiciones de la invencion se pueden administrar intravenosamente por cualquier via conveniente, por ejemplo, por infusion o inyeccion. Se conocen varios sistemas de suministro, por ejemplo, la encapsulacion en liposomas, micropartfculas, microcapsulas, capsulas, etc, y se pueden utilizar para administrar un compuesto o composicion de la invencion. En algunas formas de realizacion, se administra mas de un compuesto o composicion de la invencion a un animal. El modo preferido de administracion se deja a la discrecion del profesional habilitado, y dependera en parte del sitio de la condicion medica (por ejemplo, el sitio del cancer o enfermedad autoinmune).
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El termino "soporte" se refiere a un diluyente, adyuvante o excipiente, con el que se administra un compuesto de la invencion. Tales vetuculos farmaceuticos pueden ser Kquidos, como agua y aceites, incluyendo los de origen del petroleo, animal, vegetal o sintetico, tales como el aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. Los soportes pueden ser solucion salina, goma arabiga, gelatina, pasta de almidon, talco, queratina, s^lice coloidal, urea, y similares. Ademas, se pueden utilizar auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y agentes colorantes. En una forma de realizacion, cuando se administra a un animal, los compuestos o composiciones de la invencion y los soportes farmaceuticamente aceptables son esteriles. El agua es un soporte preferido cuando los compuestos de la invencion se administran por via intravenosa. Tambien se puede emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como soportes lfquidos para soluciones inyectables. Si se desea, las presentes composiciones tambien pueden contener pequenas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes o agentes reguladores del pH.
Las presentes composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, capsulas, capsulas que contengan lfquidos, polvos, o cualquier otra forma adaptada para su uso intravenoso. Soportes farmaceuticamente aceptables adecuados han sido descritos en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin.
Los compuestos de la invencion se formulan de acuerdo con los procedimientos rutinarios como una composicion farmaceutica adaptada para la administracion intravenosa a los seres humanos. Por lo general, los soportes o vetuculos para la administracion intravenosa son soluciones tampon acuosas isotonicas esteriles. Cuando sea necesario, las composiciones pueden incluir tambien un agente solubilizante. Las composiciones para la administracion por via intravenosa, opcionalmente pueden incluir un anestesico local como la lidocarna para aliviar el dolor en el sitio de la inyeccion. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o mezclados en forma de dosis unitarias, por ejemplo, como un polvo seco liofilizado o concentrado sin agua en un recipiente hermeticamente cerrado, como una ampolla o sobrecito indicando la cantidad de ingrediente activo. Cuando un compuesto de la invencion se administra por infusion, se puede dispensar, por ejemplo, con una botella de infusion que contenga agua o solucion salina esteril de grado farmaceutico. Cuando el compuesto de la invencion se administra por inyeccion, se pueden proporcionar una ampolla de agua esteril para inyeccion o solucion salina para que los ingredientes puedan ser mezclados antes de su administracion.
Las composiciones farmaceuticas se pueden preparar usando metodologfa bien conocida en la tecnica farmaceutica. Por ejemplo, una composicion destinada a ser administrada por inyeccion puede ser preparada combinando un compuesto de la invencion con agua para formar una solucion. Se puede anadir un surfactante para facilitar la formacion de una solucion o suspension homogenea. Los surfactantes son compuestos que interaction de forma no covalente con un compuesto de la invencion con el fin de facilitar la disolucion o suspension homogenea del compuesto activo en el sistema acuoso de suministro.
5.9 usos terapeuticos de los compuestos de la invencion
Los compuestos de la invencion son utiles para tratar el cancer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa en un animal.
5.10 tratamiento del cancer
Los compuestos de la invencion son utiles para inhibir la multiplicacion de celulas tumorales o celulas cancerosas o para tratar el cancer en un animal. Los compuestos de la invencion pueden utilizarse, por lo tanto, en una variedad de opciones para el tratamiento de canceres en animales. Los conjugados de farmaco-enlazador-ligando pueden utilizarse para administrar un farmaco o unidad de farmaco a una celula tumoral o celula cancerosa. Sin pretender imponer ninguna teona, en una realizacion, la unidad de ligando de un compuesto de la invencion se une o se asocia al antfgeno asociado a la celula cancerosa o celula tumoral, y el compuesto de la invencion puede absorberse en el interior de una celula cancerosa o celula tumoral a traves de endocitosis mediada por un receptor. El antfgeno se puede unir a una celula cancerosa o celula tumoral o puede ser una proterna de matriz extracelular asociada a la celula cancerosa o celula tumoral. Una vez dentro de la celula, una o mas secuencias de peptidos espedficas dentro de la unidad de enlazador son escindidas hidroltticamente por una o mas proteasas asociadas a las celulas tumorales o celulas cancerosas, generando la liberacion de un farmaco o un compuesto de farmaco- enlazador. El farmaco o compuesto de farmaco-enlazador liberado es entonces libre de emigrar en el citosol e inducir las actividades citotoxicas. En una forma de realizacion alternativa, el farmaco o unidad de farmaco se escinde del compuesto de la invencion fuera de la celula tumoral o celula cancerosa, y el farmaco o compuesto de farmaco-enlazador penetra despues en la celula.
En una forma de realizacion, la unidad de ligando se une a la celula tumoral o celula cancerosa.
En otra forma de realizacion, la unidad de ligando se une a un antfgeno de la celula tumoral o celula cancerosa que se encuentra en la superficie de la celula tumoral o celula cancerosa.
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En otra forma de realizacion, la unidad de ligando se une a un antfgeno de la celula tumoral o celula cancerosa que es una protema de matriz extracelular asociada a la celula tumoral o celula cancerosa.
En una forma de realizacion, la celula tumoral o la celula cancerosa es del tipo de tumor o cancer del cual el animal necesita tratamiento o prevencion.
La especificidad de la unidad de ligando de una celula tumoral o celula cancerosa puede ser importante para la determinacion de aquellos tumores o canceres que se tratan con mayor eficacia. Por ejemplo, los compuestos de la invencion que tienen una unidad de ligando BR96 pueden ser utiles para el tratamiento de carcinomas de antfgeno positivo, incluyendo los de pulmon, mama, colon, ovarios y pancreas. Los compuestos de la invencion que tienen una unidad de ligando anti-CD30 o anti-CD40 pueden ser utiles para el tratamiento de neoplasias hematologicas.
Otros tipos particulares de canceres que pueden tratarse con los compuestos de la invencion incluyen, aunque no exclusivamente, los descritos en la Tabla 3.
TABLA 3
Tumores solidos, incluyendo, aunque no exclusivamente: fibrosarcoma mixosarcoma liposarcoma condrosarcoma sarcoma osteogenico cordoma angiosarcoma endoteliosarcoma linfangiosarcoma linfangioendoteliosarcoma sinovioma mesotelioma tumor de Ewing leiomiosarcoma rabdomiosarcoma cancer de colon (continuacion) cancer colorrectal cancer de rinon cancer de pancreas cancer de hueso cancer de mama cancer de ovario cancer de prostata cancer de esofago
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cancer de estomago
cancer oral
cancer nasal
cancer de garganta
carcinoma de celulas escamosas
carcinoma de celulas basales
adenocarcinoma
carcinoma de glandula sudonpara carcinoma de glandula sebacea carcinoma papilar adenocarcinomas papilares cistoadenocarcinoma carcinoma medular carcinoma broncogenico carcinoma de celulas renales hepatoma
carcinoma del conducto biliar
coriocarcinoma
seminoma
carcinoma embrionario tumor de Wilms cancer de cuello uterino cancer de utero cancer testicular
carcinoma pulmonar de celulas pequenas
carcinoma de vejiga
cancer de pulmon
carcinoma epitelial
(continuacion)
glioma
glioblastoma multiforme
astrocitoma
meduloblastoma
craneofaringioma
ependimoma
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pinealoma
hemangioblastoma
neuroma acustico
oligodendroglioma
meningioma
cancer de piel
melanoma
neuroblastoma
retinoblastoma
canceres de origen sangumeo incluyendo, aunque no exclusivamente: leucemia linfoblastica aguda "LLA" leucemia linfoblastica aguda de celulas B leucemia linfoblastica aguda de celulas T leucemia mieloblastica aguda "LMA" leucemia promielocftica aguda "APL" leucemia monoblastica aguda leucemia eritroleucemica aguda leucemia megacarioblastica aguda leucemia mielomonocftica aguda leucemia no linfodtica aguda leucemia indiferenciada aguda leucemia mielodtica cronica "LMC" leucemia linfoctica cronica "LLC" leucemia de celulas peludas mieloma multiple
leucemias agudas y cronicas:
linfoblastica
mielogena
linfocftica
leucemias mielocfticas
Linfomas:
Enfermedad de Hodgkin Linfoma no Hodgkin Mieloma multiple
Macroglobulinemia de Waldenstrom
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Enfermedad de cadena pesada Policitemia vera
Los compuestos de la invencion tambien pueden ser utilizados como quimioterapeuticos en forma no selectiva. Por ejemplo, los propios farmacos o compuestos de farmaco-enlazador son utiles para canceres y tumores de ovario, sistema nervioso central, rinon, pulmon, colon, melanoma, o hematologicos.
Los compuestos de la invencion proporcionan una conjugacion espedfica selectiva del tumor o cancer, reduciendo asf la toxicidad general de estos compuestos. Las unidades de enlazador estabilizan los compuestos de la invencion en la sangre, sin embargo, son escindibles por las proteasas espedficas del tumor dentro de la celula, liberando un farmaco.
5.10.1 terapia multimodal para el cancer
El cancer, incluyendo, aunque no exclusivamente, un tumor, metastasis, o cualquier otra enfermedad o trastorno caracterizado por el crecimiento incontrolado de celulas, puede tratarse o prevenirse con la administracion de un compuesto de la invencion.
En otras formas de realizacion, la invencion proporciona los usos de los compuestos de la invencion para el tratamiento o la prevencion del cancer, comprendiendo administrar a un animal que lo necesite una cantidad efectiva de un compuesto de la invencion y un agente quimioterapeutico. En una forma de realizacion, el agente quimioterapeutico es aquel con el cual no se ha constatado que el tratamiento del cancer sea refractario. En otra forma de realizacion, el agente quimioterapeutico es aquel con el cual se ha constatado que el tratamiento de cancer es refractario. Los compuestos de la invencion pueden ser administrados a un animal que tambien haya sido sometido a cirugfa como tratamiento para el cancer.
En una forma de realizacion, el metodo adicional de tratamiento es la radioterapia.
En una forma de realizacion espedfica, el compuesto de la invencion se administra simultaneamente con el agente quimioterapeutico o con radioterapia. En otra forma de realizacion espedfica, el agente quimioterapeutico o la radioterapia se administra antes o despues de la administracion de un compuesto de la invencion, preferiblemente al menos una hora, cinco horas, 12 horas, un dfa, una semana, un mes, mas preferiblemente varios meses (por ejemplo, hasta tres meses), antes o despues de la administracion de un compuesto de la invencion.
Un agente quimioterapeutico puede ser administrado en una serie de sesiones, pudiendose administrar cualquiera o una combinacion de los agentes quimioterapeuticos que se relacionan en la Tabla 4. Con respecto a la radiacion, se puede utilizar cualquier protocolo de radioterapia en funcion del tipo de cancer a tratar. Por ejemplo, aunque no exclusivamente, se puede administrar radiacion de rayos X, en particular se puede utilizar con megavoltaje de alta energfa (radiacion de mayor energfa que 1 MeV) para tumores profundos, y se puede utilizar radiacion de haz de electrones y de rayos X con ortovoltaje para el cancer de piel. Tambien se pueden administrar radioisotopos que emitan rayos gamma, tales como isotopos radiactivos o radio, cobalto y otros elementos.
Ademas, la invencion proporciona los usos para el tratamiento de cancer con un compuesto de la invencion como una alternativa a la quimioterapia o radioterapia cuando la quimioterapia o la radioterapia hayan demostrado o pudieran demostrar resultados demasiado toxicos, por ejemplo, den como resultado efectos secundarios inaceptables o intolerables para el sujeto que esta siendo tratado. El animal tratado puede, opcionalmente, ser tratado con otro tratamiento para el cancer, como cirugfa, radioterapia o quimioterapia, dependiendo de que el tratamiento se encuentre aceptable o tolerable.
Los compuestos de la invencion tambien pueden ser utilizados in vitro o ex vivo, como para el tratamiento de ciertos tipos de cancer, incluyendo, aunque no exclusivamente, las leucemias y los linfomas, tales tratamientos implicando trasplantes autologos de celulas madre. Esto puede implicar un proceso de multiples pasos en el que las celulas madre autologas hematopoyeticas del animal se cosechan y purgan de todas las celulas cancerosas, luego se erradica la poblacion restante de celulas de la medula osea del paciente a traves de la administracion de una dosis elevada de un compuesto de la invencion con o sin el acompanamiento de una terapia de alta dosis de radiacion, y el injerto de celulas madre se vuelve a inyectar en el animal. Entonces se proporciona cuidado de apoyo mientras se restablece la funcion de la medula osea y el animal se recupera.
5.10.2 terapia polifarmacologica para el cancer
La presente invencion incluye los usos para el tratamiento del cancer, mediante la administracion a un animal que lo necesite de una cantidad efectiva de un compuesto de la invencion y otro agente terapeutico que es un agente contra el cancer. Los agentes contra el cancer incluyen, aunque no exclusivamente, metotrexato, taxol, L- asparaginasa, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiurea, citarabina, ciclofosfamida, nitrosoureas, cisplatino, carboplatino, mitomicina, dacarbazina, procarbizina, topotecan, mostazas de nitrogeno, citoxan, etoposido, 549
fluorouracilo, BCNU, irinotecan, camptotecinas, bleomicina, doxorrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, asparaginasa, vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel y docetaxel. En una forma de realizacion preferida, el agente contra el cancer incluye, aunque no exclusivamente, un farmaco relacionado en la Tabla 4.
Agentes alquilantes Mostazas de nitrogeno:
Nitrosoureas:
Alquilsulfonatos
Triacenos:
Compuestos que contienen platino:
Alcaloides vegetales Alcaloides de vinca:
Taxoides:
TABLA 4
ciclofosfamida
Ifosfamida
trofosfamida
Clorambucilo
carmustina (BCNU)
Lomustina (CCNU)
busulfan
Treosulfan
Dacarbazina
Cisplatino
carboplatino
vincristina
Vinblastina
Vindesina
Vinorelbina
paclitaxel
Docetaxol
Inhibidores de la topoisomerasa del ADN
Epipodofilinas: etoposido
Teniposido
Topotecan
9-aminocamptotecina
camptotecina
crisnatol
mitomicinas: Mitomicina C
Antimetabolitos
Antifolatos:
Inhibidores de la DHFR:
Inhibidores de la IMP deshidrogenasa:
Inhibidores de la ribonucleotido reductasa:
Analogos de la pirimidina: Analogos de uracilo
analogos de la citosina:
Analogos de la purina:
Terapias hormonales: Antagonistas de receptores: Antiestrogeno
Agonistas de la LHRH:
Antiandrogenos:
Retinoides/Deltoides Analogos de la vitamina D3
Terapias fotodinamicas:
metotrexato
Trimetrexato
acido micofenolico Tiazofurina Ribavirina EICAR
hidroxiurea
deferoxamina
5-Fluorouracilo
Floxuridina
Doxifluridina
Ratitrexed
citarabina (ara-C)
Arabinosido de citosina
fludarabina
mercaptopurina
Tioguanina
Tamoxifeno
Raloxifeno
megestrol
goserelina
Acetato de leuprolida
flutamida
bicalutamida
EB 1089 CB 1093 KH 1060
vertoporfina (BPD-MA) Ftalocianina fotosensibilizador Pc4
Citocinas:
Otros:
Inhibidores de isoprenilacion: Neurotoxinas dopaminergicas: Inhibidores del ciclo celular: Actinomicinas:
Bleomicinas:
Antraciclinas:
Agentes alquilantes
Dimetoxi-hipocrelina A (2BA-2-DMHA)
Interferon a Interferon-Y
Factor de necrosis tumoral Lovastatina
ion 1 -metil-4-fenilpiridinio estaurosporina Actinomicina D Dactinomicina Bleomicina A2 Bleomicina B2 Peplomicina daunorrubicina
Doxorrubicina (adriamicina) Idarrubicina
Epirrubicina
Pirarrubicina
Zorrubicina
Mitoxantrona
Inhibidores de la MDR: verapamilo
Inhibidores de la ATPasa Ca2+: tapsigargina
5.11 tratamiento de enfermedades autoinmunes
Los compuestos de la invencion son utiles para eliminar o inhibir la replicacion de una celula que produce una enfermedad autoinmune o para tratar una enfermedad autoinmune. Los compuestos de la invencion pueden utilizarse, por lo tanto, en una variedad de opciones para el tratamiento de una enfermedad autoinmune en un 5 animal. Los conjugados de farmaco-enlazador-ligando pueden utilizarse para administrar un farmaco a una celula diana. Sin pretender imponer ninguna teona, en una forma de realizacion, el conjugado de farmaco-enlazador- ligando se asocia a un antfgeno en la superficie de una celula diana, y el compuesto de la invencion es llevado hasta el interior de la celula diana mediante endocitosis mediada por un receptor. Una vez dentro de la celula, una o mas secuencias de peptidos espedficas dentro de la unidad de enlazador son escindidas enzimatica o hidroltticamente, 10 generando la liberacion de un farmaco. El farmaco liberado es entonces libre de emigrar en el citosol e inducir las actividades citotoxicas. En una forma de realizacion alternativa, el farmaco se escinde del compuesto de la invencion fuera de la celula diana, y el farmaco penetra despues en la celula.
En otra forma de realizacion, la unidad de ligando se une al antfgeno autoinmune.
En otra forma de realizacion, la unidad de ligando se une a un antfgeno autoinmune que se encuentra en la 15 superficie de una celula.
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35
40
En otra forma de realizacion, la celula diana es el tipo de celula que produce el antigeno autoinmune que causa la enfermedad en el animal que necesita de su tratamiento o prevencion.
En una forma de realizacion preferida, el ligando se une a linfocitos activos que se asocian con el estado de la enfermedad autoinmune.
En otra forma de realizacion, los compuestos de la invencion eliminan o inhiben la multiplicacion de las celulas que producen un anticuerpo autoinmune asociado a una enfermedad autoinmune en particular.
Los tipos particulares de enfermedades autoinmunes que pueden ser tratadas con los compuestos de la invencion incluyen, aunque no exclusivamente, los trastornos relacionados con los linfocitos Th2, (por ejemplo, dermatitis atopica, asma atopica, rinitis rinoconjuntivitis alergica, smdrome de Omenn, esclerosis sistemica y enfermedad injerto contra huesped); los trastornos relacionados con los linfocitos Th1 (por ejemplo, artritis reumatoide, esclerosis multiple, psoriasis, smdrome de Sjorgren, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener, y tuberculosis); los trastornos relacionados con los linfocitos B activados (por ejemplo, lupus eritematoso sistemico, smdrome de Goodpasture, artritis reumatoide y diabetes tipo I), y los que se describen en la Tabla 5.
TABLA 5
Hepatitis cronica activa Enfermedad de Hodgkin Alveolitis alergica Reaccion alergica Rinitis alergica Smdrome de Alport Anafilaxia
Espondilitis anquilosante
Smdrome antifosfolipfdico
Artritis
Ascariasis
Aspergilosis
Alergia atopica
Dermatitis atropica
Rinitis atropica
Enfermedad de Behcet
Neumopatfa del avicultor
Asma bronquial
Smdrome de Caplan
Cardiomiopatfa
Enfermedades celfacas
Enfermedad de Chagas
Glomerulonefritis cronica
Smdrome de Cogan
Enfermedad de aglutininas fnas 53
5
10
15
20
25
30
35
Infeccion de rubeola congenita
Smdrome de CREST
Enfermedad de Crohn
Crioglobulinemia
Smdrome de Cushing
Dermatomiositis
Lupus discoide
Smdrome de Dressier
Smdrome de Eaton-Lambert
Infeccion por echovirus
Encefalomielitis
Oftalmopatfa endocrina
Infeccion por el virus de Epstein-Barr
Obstruccion de las v^as aereas en equinos
Eritematosis
Smdrome de Evan
Smdrome de Felty
Fibromialgia.
Ciclitis de Fuch
Atrofia gastrica
Alergia gastrointestinal
Arteritis de celulas gigantes
Glomerulonefritis
Smdrome de Goodpasture
Enfermedad de injerto contra huesped
Enfermedad de Graves
Enfermedad de Guillain-Barre
Tiroiditis de Hashimoto
Anemia hemolttica
Purpura de Schonlein-Henoch
Atrofia suprarrenal idiopatica
Fibritis pulmonar idiopatica
Nefropatia por IgA
Enfermedades inflamatorias del intestino Diabetes mellitus insulinodependiente
5
10
15
20
25
30
35
Artritis juvenil
Diabetes mellitus juvenil (Tipo I)
Smdrome de Lambert-Eaton
Laminitis
Liquen plano
Hepatitis lupoide
Lupus
Linfopenia
Enfermedad de Meniere
Enfermedad mixta del tejido conectivo
Esclerosis Multiple
Miastenia Gravis
Anemia perniciosa
Smdromes poliglandulares
Demencia presenil
Agammaglobulinemia primaria
Cirrosis biliar primaria
Psoriasis
Artritis psoriasica
Fenomeno de Raynaud
Aborto recurrente
Smdrome de Reiter
Fiebre reumatica
Artritis reumatoide
Smdrome de Sampter
Esquistosomiasis
Smdrome de Schmidt
Esclerodermia
Smdrome de Shulman
Smdrome de Sjorgen
Smdrome de Stiff-Man
Oftalirna simpatica
Lupus eritematoso sistemico
Arteritis de Takayasu
Arteritis de la temporal
5
10
15
20
25
30
35
Trombocitopenia
Tirotoxicosis
Necrolisis epidermica toxica
Resistencia a la Insulina Tipo B
Diabetes mellitus tipo I
Colitis ulcerosa
Uveftis
Vitiligo
Macroglobulemia de Waldenstrom Granulomatosis de Wegener
5.11.1 terapia polifarmacologica de enfermedades autoinmunes
La presente invencion tambien incluye el uso para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, mediante la administracion a un animal que lo necesite de una cantidad efectiva de un compuesto de la invencion y otro agente terapeutico conocido para el tratamiento de una enfermedad autoinmune. En una forma de realizacion, el agente contra la enfermedad autoinmune incluye, aunque no exclusivamente, los agentes que enumeran en la Tabla 6.
Tabla 6
ciclosporina ciclosporina A micofenolato mofetilo sirolimus tacrolimus enanercept prednisona azatioprina
metotrexato ciclofosfamida
prednisona
acido aminocaproico
cloroquina
hidroxicloroquina
hidrocortisona
dexametasona
clorambucil
DHEA
danazol
bromocriptina
5
10
15
20
25
30
35
40
meloxicam
infliximab
5.12 tratamiento de enfermedades infecciosas
Los compuestos de la invencion son utiles para eliminar o inhibir la multiplicacion de una celula que produce una enfermedad infecciosa o para tratar una enfermedad infecciosa. Los compuestos de la invencion pueden utilizarse, por lo tanto, en una variedad de opciones para el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un animal. Los conjugados de farmaco-enlazador-ligando pueden utilizarse para administrar un farmaco a una celula diana. Sin pretender imponer ninguna teona, en una forma de realizacion, el conjugado de farmaco-enlazador-ligando se asocia a un antfgeno en la superficie de una celula diana, y el compuesto de la invencion es llevado hasta el interior de la celula diana mediante endocitosis mediada por un receptor. Una vez dentro de la celula, una o mas secuencias de peptidos espedficas dentro de la unidad de enlazador son escindidas enzimatica o hidrolfticamente, generando la liberacion de un farmaco. El farmaco liberado es entonces libre de emigrar en el citosol e inducir las actividades citotoxicas. En una forma de realizacion alternativa, el farmaco se escinde del compuesto de la invencion fuera de la celula diana, y el farmaco penetra despues en la celula.
En una forma de realizacion, la unidad de ligando se une a la celula de la enfermedad infecciosa.
En una forma de realizacion, la enfermedad infecciosa es del tipo de enfermedad infecciosa de la que el animal necesita tratamiento o prevencion.
En otra forma de realizacion, los compuestos de la invencion eliminan o inhiben las multiplicaciones de las celulas que producen una enfermedad infecciosa en particular.
Los tipos particulares de enfermedades infecciosas que pueden tratarse con los compuestos de la invencion incluyen, aunque no exclusivamente, los descritos en la Tabla 7.
TABLA 7
Enfermedades bacterianas:
Difteria
Tos ferina
Bacteriemia oculta
Infeccion del tracto urinario
Gastroenteritis
Celulitis
Epiglotitis
Traquettis
Hipertrofia de adenoides
Absceso retrofarmgeo
Impetigo
Ectima
Neumoma
Endocarditis
Artritis septica
Enfermedad neumococica
Peritonitis
Bactermia
5
10
15
20
25
30
35
Meningitis purulenta aguda
Uretritis
Cervicitis
Proctitis
Faringitis
Salpingitis
Epididimitis
Gonorrea
S^filis
Listeriosis
Antrax
Nocardiosis
Salmonela
Fiebre Tifoidea
Disentena
Conjuntivitis
Sinusitis
Brucelosis
Tularemia
Colera
Peste bubonica Tetanos
Enteritis necrotizante Actinomicosis
Infecciones por anaerobios mixtos S^filis
Fiebre recurrente
Leptospirosis
Enfermedad de Lyme
Fiebre por mordedura de rata
Tuberculosis
Linfadenitis
Lepra
Clamidia
5
10
15
20
25
30
35
Neumoma por clamidia Tracoma
Conjuntivitis de inclusion Enfermedades sistemicas por hongos:
Histoplamosis
Coccicidiodomicosis
Blastomicosis
Esporotricosis
Criptococcsis
Candidiasis sistemica
Aspergilosis
Mucormicosis
Micetoma
Cromomicosis
Enfermedades por rickettsias:
Tifus
Fiebre de las Montanas Rocosas Erliquiosis
Rickettsiosis transmitidas por garrapatas Rickettsiosis pustulosa Fiebre Q Bartonelosis
Enfermedades parasitarias:
Malaria
Babesiosis
Enfermedad africana del sueno
Enfermedad de Chagas
Leishmaniasis
Fiebre dum-dum
Toxoplasmosis
Meningoencefalitis
Queratitis
Entamebiasis
Giardiasis
Criptosporidiasis
5
10
15
20
25
30
35
Isosporiasis
Ciclosporiasis
Microsporidiosis
Ascariasis
Infeccion por tricocefalos Infeccion por uncinarias Infeccion por oxiuros Infeccion por larva migrans ocular Triquinosis
Enfermedad del gusano de Guinea
Filariasis linfatica
Loiasis
Ceguera de los nos
Infeccion del gusano del corazon canino
Esquistosomiasis
Prurito del nadador
Duela pulmonar oriental
Duela hepatica Oriental
Fascioliasis
Fasciolopsiasis
Opistorquiasis
Infecciones por tenia
Enfermedad hidatfdica
Enfermedad hidatfdica alveolar
Enfermedades virales:
Sarampion
Panencefalitis esclerosante subaguda
Resfriado Comun
Paperas
Rubeola
Roseola
Eritema infeccioso Varicela
Infeccion por virus respiratorio sincicial Crup
5
10
15
20
25
30
35
Mononucleosis infecciosa
Poliomyelitis
Herpangina
Fiebre aftosa
Enfermedad de Bornholm
Herpes genital
Verrugas genitales
Meningitis aseptica
Miocarditis
Pericarditis
Gastroenteritis
Smdrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA)
Smdrome de Reye
Smdrome de Kawasaki
Gripe
Bronquitis
Neumoma "errante" vmica Enfermedad respiratoria febril aguda Fiebre faringoconjuntival aguda Queratoconjuntivitis epidemica Virus del herpes simple 1 (HSV-1)
Virus del herpes simple 2 (HSV-2)
Herpes zoster
Enfermedad de inclusion citomegalica Rabia
Leucoencefalopatfa multifocal progresiva Kuru
Insomnio familiar fatal
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
Enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker
Paraparesia espastica tropical
Encefalitis equina occidental
Encefalitis de California
Encefalitis de San Luis
5
10
15
20
25
30
35
Fiebre Amarilla
Dengue
Coriomeningitis linfodtica
Fiebre de Lassa
Fiebre hemorragica
Smdrome pulmonar por hantavirus
Infecciones por virus de Marburg
Infecciones por virus del Ebola
Viruela
5.12.1 terapia polifarmacologica de enfermedades infecciosas
La presente invencion tambien incluye los usos para el tratamiento de una enfermedad infecciosa, por administracion a un animal que lo necesite de un compuesto de la invencion y otro agente terapeutico, que es un agente contra la enfermedad infecciosa. En una forma de realizacion, el agente contra la enfermedad infecciosa es, aunque no exclusivamente, un agente de los relacionados en la Tabla 8.
TABLA 8 Agentes antibacterianos:
Antibioticos 13-lactamicos:
Penicilina G
Penicilina V
Cloxacilina
Dicloxacilina
Meticilina
Nafcilina
Oxacilina
Ampicilina
Amoxicilina
Bacampicilina
Azlocilina
Carbenicilina
Mezlocilina
Piperacilina
Ticarcilina
Aminoglucosidos:
Amicacina
Gentamicina
Kanamicina
Neomicina
5
10
15
20
25
30
35
Estreptomicina
Tobramicina
Macrolidos:
Azitromicina
Claritromicina
Eritromicina
Lincomicina
Clindamicina
Tetraciclinas:
Demeclociclina
Doxiciclina
Minociclina
Oxitetraciclina
Tetraciclina
Quinolonas:
Cinoxacina Acido nalid^xico
Fluoroquinolonas:
Ciprofloxacina
Enoxacina
Grepafloxacina
Levofloxacina
Lomefloxacina
Norfloxacina
Ofloxacina
Esparfloxacina
Trovafloxicina
Polipeptidos:
Bacitracina
Colistina
Polimixina B
Sulfonamidas:
Sulfisoxazol
Sulfametoxazol
5
10
15
20
25
30
35
Sulfametizol
Sulfacetamida
Varios agentes antibacterianos:
Trimetoprim
Sulfametazol
Cloranfenicol
Vancomicina
Metronidazol
Quinupristina
Dalfopristina
Rifampicina
Espectinomicina
Nitrofurantoma
Agentes antivirales:
Agentes antivirales generales:
Idoxuradina
Vidarabina
Trifluridina
Aciclovir
Famciciclovir
Penciciclovir
Valaciclovir
Ganciciclovir
Foscarnet
Ribavirina
Amantadina
Rimantadina
Cidofovir
Oligonucleotidos antisentido
Inmunoglobulinas
Interferones
Farmacos para la infeccion por el VIH:
Zidovudina
Didanosina
5
10
15
20
25
30
35
Estavudina
Lamivudina
Nevirapina
Delavirdina
Saquinavir
Ritonavir
Indinavir
Nelfinavir
5.13 otros agentes terapeuticos
Los presentes usos pueden comprender ademas un compuesto de la invention y otro agente terapeutico o sales o solvatos farmaceuticamente aceptables de los mismos. El compuesto de la invencion y el agente terapeutico pueden actuar de forma acumulativa o, mas preferiblemente, en sinergia. En una forma de realization preferida, una composition que comprende un compuesto de la invencion se administra simultaneamente con la administration de uno o mas agentes terapeuticos adicionales, que pueden ser parte de la misma composicion o en una composicion diferente de la que comprende el compuesto de la invencion. En otra forma de realizacion, un compuesto de la invencion se administra antes o despues de la administracion de otro u otros agentes terapeuticos.
Para el tratamiento del cancer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa, el agente terapeutico puede ser un agente antiemetico. Los agentes antiemeticos apropiados incluyen, aunque no exclusivamente, metoclopramida, domperidona, proclorperazina, prometazina, clorpromazina, trimetobenzamida, ondansetron, granisetron, hidroxizina, acetil-leucina, monoetanolamina, alizaprida, azasetron, benzquinamida, bietanautina, bromoprida, buclizina, cleboprida, ciclicina, dimenhidrinato, difenidol, dolasetron, meclizina, metalatal, metopimazina, nabilona, oxiperndil, pipamazina, escopolamina, sulpirida, tetrahidrocanabinoles, tietilperacina, tioproperacina y tropisetron.
En otra forma de realizacion, el agente terapeutico puede ser un factor estimulante de colonias hematopoyeticas. Los factores estimulantes de colonias hematopoyeticas adecuados incluyen, aunque no exclusivamente, filgrastim, sargramostim, molgamostim y eritropoyetina alfa.
En otra forma de realizacion, el agente terapeutico puede ser un agente analgesico opioide o no opioide. Los agentes analgesicos opioides incluyen, aunque no exclusivamente, morfina, heroma, hidromorfona, hidrocodona, oximorfona, oxicodona, metopon, apomorfina, normorfina, etorfina, buprenorfina, meperidina, lopermida, anileridina. Los siguientes Ejemplos ilustran conjugados de ligando-farmaco. Su description es mas amplia que el alcance de la presente invencion como se define en las reivindicaciones, e incluyen information sobnre compuestos analogos a compuestos utiles en la presente invencion.
EJEMPLO 1: Preparation del compuesto 21
imagen75
Se diluyo Fmoc-(L)-val-(L)-cit-PAB-OH (19) (14,61 g, 24,3 mmol, 1,0 eq., Pat. US 6.214.345 a nombre de Firestone et al.) con DMF (120 ml, 0,2 M) y a esta solucion se le anadio una dietilamina (60 ml). La reaccion se controlo por HPLC y se constato que se completo en 2 h. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se precipito con acetato de etilo (aproximadamente 100 ml) bajo sonicacion durante 10 minutos. Se anadio eter (200 ml) y el 5 precipitado se sometio de nuevo a sonicacion durante 5 min. La solucion se dejo reposar durante 30 min. sin agitacion y se filtro y se seco a alto vacfo para proporcionar Val-cit-PAB-OH, que se utilizo en el paso siguiente sin purification adicional. Rendimiento: 8,84 g (96 %). Se diluyo Val-cit-PAB-OH (8,0 g, 21 mmol) con DMF (110 ml) y la solucion resultante se trato con MC-OSu (Willner et al. Bioconjugate Chem. 4, 521,1993, 6,5 g, 21 mmol, 1,0 eq.). La reaccion se completo segun la HPLC despues de 2 h. La mezcla de reaccion se concentro y el aceite resultante se 10 precipito con acetato de etilo (50 ml). Despues de la sonicacion durante 15 min., se anadio eter (400 ml) y la mezcla se sometio de nuevo a sonicacion hasta que todas las partfculas grandes se rompieron. La solucion se filtro y el solido se seco para proporcionar el compuesto 20 como un solido blancuzco. Rendimiento: 11,63 g (96 %), ES-MS m/z 757,9 [MH].
El compuesto 20 (8,0 g, 14,0 mmol) se diluyo con DMF (120 ml, 0,12 M) y a la solucion resultante se le anadio bis(4- 15 nitrofenil)carbonato (8,5 g, 28,0 mmol, 2,0 eq.) y diisopropiletilamina (3,66 ml, 21,0 mmol, 1,5 eq.). La reaccion se completo en 1 h segun la HPLC. La mezcla de reaccion se concentro para proporcionar un aceite que se precipito con acetato de etilo, y luego se trituro utilizando ETOAc (aproximadamente 25 ml). El soluto se precipito aun mas con eter (aproximadamente 200 ml) y se trituro durante 15 min. El solido se filtro y se seco a alto vacfo para proporcionar el compuesto 21, que tuvo una pureza del 93% segun la HPLC y se utilizo en el paso siguiente sin 20 purificacion adicional. Rendimiento: 9,7 g (94 %).
EJEMPLO 2
PREPARACION DEL COMPUESTO 27
imagen76
El compuesto 26 (2,0 g, 2,31 mmol, 1,0 eq.) se diluyo con diclorometano (30 ml), y a la solucion resultante se le 25 anadio bis(4-nitrofenil)carbonato (2,72 g, 8,94 mmol, 3,8 eq.) seguido de diisopropiletilamina (1,04 ml, 5,97 mmol, 2.6 eq.). La reaccion se completo en 3 d, segun la HPLC. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se trituro con eter, luego se filtro y seco a alto vacfo para proporcionar el compuesto 27 como un solido amarillo (2,37 g, 97%).
EJEMPLO 3
30 PREPARACION DEL COMPUESTO 28
imagen77
Se diluyo Fmoc-Phe-Lys (Mtr)-OH (24) (0,5 g, 0,63 mmol, Pat. US 6.214.345 a nombre de Firestone et al.) con diclorometano a una concentracion de 0,5 M y a esta solucion se le anadio dietilamina en una cantidad que fue de aproximadamente un tercio del volumen del compuesto 24/solucion de diclorometano. La reaccion se dejo en agitacion y se controlo utilizando HPLC. Se demostro que se completo por HPLC en 3 h. La mezcla de reaccion se 5 concentro al vado y el residuo resultante se diluyo con acetato de metilo y luego se reconcentro. El residuo resultante se trituro con eter y se filtro. El solido residual se diluyo con diclorometano a una concentracion de 0,2 M, y a la solucion resultante se le anadio MC-OSu (0,20 g, 0,63 mmol, 1,0 eq.) y diisopropiletilamina (0,12 ml, 0,70 mmol, 1,1 eq.). La mezcla de reaccion se dejo en agitacion bajo atmosfera de nitrogeno durante 16 horas, tras lo cual la HPLC mostro muy poco material de partida. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se 10 trituro con eter para proporcionar el compuesto 28 como un solido coloreado. Rendimiento: 100 mg (21%), ES-MS m/z 757,9 [MH]-.
EJEMPLO 4
PREPARACION DEL COMPUESTO 19A
imagen78
15 El compuesto 19 (1,0 g, 1,66 mmol) se diluyo con DMF (10 ml) y a la solucion resultante se le anadio bis (4- nitrofenil)carbonato (1,0 g, 3,3 mmol, 2,0 eq.).
La mezcla de reaccion se trato inmediatamente con diisopropiletilamina (0,43 ml, 2,5 mmol, 1,5 eq.) y la reaccion se dejo en agitacion bajo atmosfera de argon. La reaccion se completo en 2,5 h segun la HPLC. La mezcla de reaccion se concentro para proporcionar un aceite de color marron claro que se precipito con acetato de etilo (5 ml), y luego 20 se precipito de nuevo con eter (100 ml). El precipitado resultante se dejo reposar durante 30 minutos y se filtro y se seco a alto vado para proporcionar el compuesto 19a como un polvo blancuzco. Rendimiento: 1,05 g (83 %), ES-MS m/z 767,2 [M+H]+; UVAmax 215, 256 nm.
EJEMPLO 5
PREPARACION DEL COMPUESTO 49
imagen79
El compuesto 49 se hizo segun el Procedimiento General D utilizando Fmoc-Me-va-va-dil-O-t-Bu 39 (0,40 g, 0,57 mmol) como el tripeptido y Boc-dap-nor 44 (0,26 g, 0,62 mmol, 1,1 eq.) como el dipeptido. La mezcla de reaccion se
purifico mediante cromatografia en columna flash (columnas de gel de sflice, eluyente EtOAc al 100%). Dos productos conteman Fmoc elmdo: el derivado de Fmoc del compuesto 49 (Rf 0,17 en ETOAc al 100%) y lo que se creyo que era el derivado de Fmoc del acetato de TFA del compuesto 49 (Rf 0,37). Los productos se combinaron para proporcionar una espuma blanca que fue sometida al procedimiento general E. La reaccion se completo 5 despues de 2 h. Los solventes se eliminaron para proporcionar un aceite que se purifico mediante cromatografia en columna flash (eluyente - 09:01 diclorometano-metanol) para proporcionar el compuesto 49.
EJEMPLO 6
PREPARACION DEL COMPUESTO 50
imagen80
10 El compuesto 50 se preparo haciendo reaccionar el tripeptido 42 y el dipeptido 48 segun el Procedimiento General D usando trietilamina (5,0 eq.) como base. Despues de la concentration de la mezcla de reaccion, el residuo resultante se inyecto directamente en una fase inversa preparativa en una columna HPLC (columna Varian Dynamax 21,4 mm x 25 cm, 5 ^, 100 A, utilizando un gradiente de ejecucion de MeCN y 0,1 M de TEA/CO2 a 20 ml/min de 10% a 100% durante 40 minutos seguido de MeCN al 100% durante 20 min). Las fracciones relevantes se agruparon y 15 concentraron y el residuo resultante se diluyo con 10 ml de diclorometano-eter (1:1). La solution se enfrio a 0 °C y se anadio 1,0 M de HCl etereo, gota a gota (aprox. 10 eq.). El precipitado, compuesto 50, se filtro y seco demostrando ser sustancialmente puro por HPLC. Rendimiento: 71 mg (43 %); ES-MS m/z 731,6 [M+H]+; UVAmax 215, 238, 290 nm. Anal. Calc. C40H70N6O6.4H2O 2HCl: C, 54,84; H, 9,20; N, 9,59.
Hallado: C, 55,12; H, 9,41; N, 9,82.
20 EJEMPLO 7
PREPARACION DEL COMPUESTO 51
imagen81
El compuesto 51 se preparo haciendo reaccionar el tripeptido Fmoc 41 y el dipeptido 46 segun el Procedimiento General D usando trietilamina como base. Despues de la concentracion de la mezcla de reaccion, el residuo se
25 inyecto directamente en una columna de HPLC de fase inversa preparativa (columna Varian Dynamax 21,4 mm x 25 cm, 5 ^, 100 A, utilizando un gradiente de ejecucion de MeCN y 0,1 M de TEA/CO2 a 20 ml/min de 10% a 100% durante 40 minutos seguido de MeCN al 100% durante 20 min). Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar un producto intermedio solido blanco que se utilizo en el paso siguiente sin purification adicional. ES-MS m/z 882,9 [M+NH4]+, 899,9 [M+Na]+; UVAmax215, 256 nm.
30 La desproteccion del producto intermedio solido blanco se realizo segun el Procedimiento General E. El producto crudo se purifico mediante HPLC preparativa (columna Varian Dynamax 21,4 mm x 25 cm, 5 ^, 100 A, utilizando un gradiente de ejecucion de MeCN y 0,1 M de TEA/CO2 a 20 ml/min de 10% a 100% durante 40 minutos seguido de MeCN al 100% durante 20 min). Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar el compuesto 51 como un solido pegajoso. ES-MS m/z 660,1 [M+H]+, 682,5 [M+Na]+; UVAmax 215 nm.
5
10
15
20
25
30
35
EJEMPLO 8
PREPARACION DEL COMPUESTO 52
imagen82
Se diluyo Boc-dolaproma (0,33 g, 1,14 mmol) y (1S, 2S)-(-)-1,2-difeniletilenodiamina (0,5 g, 2,28 mmol, 2,0 eq.) con diclorometano (10 ml) y a la solucion resultante se le anadio trietilamina (0,32 ml, 2,28 mmol, 2,0 eq.) y luego DEPC (0,39 ml, 2,28 mmol, 2,0 eq.). Despues de 4 horas, se anadio mas DEPC (0,39 ml) y la reaccion se dejo agitando durante la noche. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se purifico mediante HPLC preparativa (columna Varian Dynamax Ci8 21,4 mm x 25 cm, 5 ^, 100 A, con un gradiente de ejecucion de MeCN y agua a 20 ml/min de un 10% a 100% durante 40 minutos seguido de MeCN al 100% durante 20 min). Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar un peptido solido gomoso amarillo que se utilizo sin purificacion adicional. Rf 0,15 (EtOAc al 100 %), ES-MS m/z 482,4 [M+H]+; UVAmax 215, 256 nm.
El peptido intermedio gomoso amarillo (0,24 g, 0,50 mmol) se diluyo con diclorometano, y a la solucion resultante se le anadio diisopropiletilamina (0,18 ml, 1,0 mmol, 2,0 eq.) y Fmoc-Cl (0,15 g, 0,55 mmol, 1,1 eq.). La reaccion se dejo en agitacion durante 3 horas, tras lo cual la HPLC mostro una reaccion completa. La mezcla de reaccion se concentro en un aceite y el aceite se diluyo con EtOAc y se extrajo posteriormente con una solucion acuosa de acido dtrico al 10%, agua, bicarbonato sodico acuoso saturado y salmuera. La capa de EtOAc se seco, se filtro y se concentro y el residuo resultante se purifico mediante cromatograffa en columna flash (gel de sflice con malla de 230-400; gradiente eluyente 4:1 hexanos-EtOAc a 1:1 hexanos-EtOAc) para proporcionar el compuesto 45 como un solido blanco. Rendimiento: 0,37 g (46% total); Rf 0,47 (1:1 hexano-EtOAc), ES-MS m/z 704,5 [M+H]+, 721,4 [M+NH4]+; UVAmax 215, 256 nm.
El compuesto 52 se preparo haciendo reaccionar el compuesto tripeptido 42 (94 mg, 0,13 mmol) y el dipeptido 45 (65 mg, 0,13 mmol) segun el Procedimiento General D (con 3,6 eq. de diisopropiletilamina como base). Despues de la concentracion de la mezcla de reaccion, el residuo resultante se diluyo con EtOAc y se lavo posteriormente con acido dtrico acuoso al 10%, agua, bicarbonato sodico acuoso saturado y salmuera. La fase organica se seco, se filtro y se concentro para proporcionar un residuo solido blanco que se diluyo con diclorometano y se desprotegio segun el Procedimiento General E. Segun la HPLC, la reaccion se completo despues de 2 h. La mezcla de reaccion se concentro en un aceite. El aceite se diluyo con DMSO y la solucion resultante se purifico utilizando una columna de HPLC de fase inversa preparativa (columna Varian Dynamax 21,4 mm x 25 cm, 5 ^, 100 A, utilizando un gradiente de ejecucion de MeCN y TFA al 0,1 % a 20 ml/min de 10% a 100% durante 40 minutos seguido de MeCN al 100% durante 20 min). Se aislaron dos productos que teman espectros UV similares. El producto principal, compuesto 52, se proporciono como un solido blancuzco. Rendimiento total: 24 mg (23 %); ES-MS m/z 793,5 [M+H]+;UVAmax 215 nm.
EJEMPLO 9
PREPARACION DEL COMPUESTO 53
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Se anadio Boc-fenilalanina (1,0 g, 3,8 mmol) a una suspension de 1,4-diaminobenceno-HCl (3,5 g, 19,0 mmol, 5,0 eq.) en trietilamina (10,7 ml, 76,0 mmol, 20 eq.) y diclorometano (50 ml). A la solucion resultante se anadio DEPC (3,2 ml, 19,0 mmol, 5,0 eq.) mediante una jeringa. La HPLC no mostro ningun resto de Boc-Phe pasadas 24 h. La mezcla de reaccion se filtro y el filtrado se concentro para proporcionar un solido oscuro. El residuo solido oscuro se dividio entre 1:1 EtOAc-agua y la capa de EtOAc se lavo sucesivamente con agua y salmuera. La capa de EtOAc se seco y se concentro para proporcionar un residuo oscuro marron/rojo que se purifico mediante HPLC (columna Varian Dynamax 41,4mm x 25 cm, 5 ^ 100 A, utilizando un gradiente de ejecucion de MeCN y agua a 45 ml/min de 10 % a 100% durante 40 minutos seguido de MeCN 100% durante 20 min). Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar un producto intermedio solido de color rojizo. Rendimiento: 1,4 g (100%); ES- MS m/z 355,9 [M+H]+; UVAmax 215, 265 nm; 1H RMN (CDCls) 5 7,4s (1 H, br s), 7,22-7,37 (5 H, m), 7,12 (2 H, d, J=8,7 Hz), 7,61 (2 H, d, J=8,7 Hz), 5,19 (1 H, br s), 4,39-4,48 (1 H, m), 3,49 (2 H, s), 3,13 (2 H, d, J=5,7 Hz), 1,43 (9 H, s).
El producto intermedio solido de color rojizo (0,5 g, 1,41 mmol) y diisopropiletilamina (0,37 ml, 2,11 mmol, 1,5 eq.) se diluyeron con diclorometano (10 ml), y a la solucion resultante se le anadio Fmoc-Cl (0,38 g, 1,41 mmol). La reaccion se dejo en agitacion y se formo un precipitado solido blanco despues de unos minutos. La reaccion se completo segun la HPLC despues de 1 h. La mezcla de reaccion se filtro y el filtrado se concentro para proporcionar un aceite. El aceite se precipito con EtOAc, proporcionando un producto intermedio blanco rojizo, que fue recogido por filtracion y se seco al vado. Rendimiento: 0,75 g (93 %); ES-MS m/z 578,1 [M+H]+, 595,6 [M+NH4]+.
El producto intermedio blanco rojizo (0,49 g, 0,85 mmol) se diluyo con 10 ml de diclorometano, y despues se trato con 5 ml de acido trifluoroacetico. La reaccion se completo en 30 minutos segun la HPLC de fase inversa. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se precipito con eter para proporcionar un solido blancuzco. El solido blancuzco se filtro y seco para proporcionar un polvo amorfo, que se anadio a una solucion de Boc-DAP (0,24 g, 0,85 mmol) en diclorometano (10 ml). A esta solucion se le anadio trietilamina (0,36 ml, 2,5 mmol, 3,0 eq.) y PyBrop (0,59 g, 1,3 mmol, 1,5 eq.). La mezcla de reaccion se controlo utilizando HPLC de fase inversa. Una vez completada, la mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se diluyo con EtOAc, y se lavo posteriormente con acido dtrico acuoso al 10%, agua, bicarbonato sodico acuoso saturado, agua y salmuera. La capa de EtOAc se seco (MgSO4), se filtro y se concentro. El residuo resultante se purifico mediante cromatografia de columna flash (gel de sflice) para proporcionar el compuesto 47 como un polvo blanco. Rendimiento: 0,57 g (88 %); ES-MS m/z 764,7 [M+NH4]+; UVAmax 215, 265 nm; 1H RMN (DMSO-d6) 5 10,0-10,15 (1 H, m), 9,63 (1 H, br s), 8,42 (1/2 H, d, J=8,4 Hz), 8,22 (1/2 H, d, J=8,4 Hz), 7,89 (2 H, d, J=7,2 Hz), 7,73 (2H, d, J=7,6 Hz), 7,11-7,55 (13 H, m), 4,69-4,75 (1H, m), 4,46 (2 H, d, J=6,8 Hz), 4,29 (1H, t, J=6,4 Hz), 3,29 (3 H, s), 2,77-3,47 (7 H, m), 2,48-2,50 (3 H, m), 2,25 (2/3 H, dd, J=9,6, 7,2 Hz), 1,41-1,96 (4 H, m), 1,36 (9 H, s), 1,07 (1 H, d, J=6,4 Hz, isomero rotatorio), 1,00 (1 H, d, J=6,4 Hz, isomero rotatorio).
El compuesto tripeptido 42 (55 mg, 0,11 mmol) y el compuesto dipeptido 47 (85 mg, 0,11 mmol) se hicieron reaccionar segun el Procedimiento General D (utilizando 3,0 eq. de diisopropiletilamina). Despues de la concentracion de la mezcla de reaccion, el residuo resultante se diluyo con EtOAc y se lavo posteriormente con acido dtrico acuoso al 10%, agua, bicarbonato sodico acuoso saturado y salmuera. La capa de EtOAc se seco, se filtro y se concentro para proporcionar un aceite de color amarillo.
El aceite de color amarillo se diluyo con diclorometano (10 ml) y se desprotegio segun el Procedimiento General E. Segun la HPLC, la reaccion se completo despues de 2 h. La mezcla de reaccion se concentro para proporcionar un aceite. El aceite se diluyo con DMSO y el DMSO se purifico utilizando una columna de HPLC de fase inversa preparativa (columna Varian Dynamax 21,4 mm x 25 cm, 5 y, 100 A, utilizando un gradiente de ejecucion de MeCN y TFA al 0,1 % a 20 ml/min de 10% a 100% durante 40 minutos seguido de MeCN al 100% durante 20 min). Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar el compuesto 53 como un solido blancuzco. Rendimiento total: 42 mg (44% total); ES-MS m/z 837,8 [M+H]+, 858,5 [M+Na]+; UVAmax 215, 248 nm.
EJEMPLO 10
PREPARACION DEL COMPUESTO 54
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El compuesto 54 se prepare segun Miyazaki K., et al. Chem. Pham. Bull. 1995, 43(10), 1706-18. EJEMPLO 11
PREPARACION DEL COMPUESTO 55
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El compuesto 55 se sintetizo de la misma manera que el compuesto 54, pero sustituyendo FmocMeVal-IIe-Dil-tBu (40) por FmocMeVal-Val-Dil-tBu (39) como material de partida.
EJEMPLO 12
PREPARACION DEL COMPUESTO 56
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Se diluyo ester [(1S)-1-(azidometil)-2-fenil]-1,1-dimetiletflico del acido carbamico (0,56 g, 2 mmol, preparado como se describe en J. Chem. Research (S), 1992, 391), se diluyo con una solucion de 4 M de HCl en dioxano (10 ml) y la solucion resultante se agito durante 2 ha temperatura ambiente. Entonces se anadio tolueno (10 ml) a la reaccion, la mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se seco al vado azeotropicamente utilizando tolueno (3 x 15 ml), para proporcionar un producto intermedo solido blanco. ES-MS m/z 177,1 [M+H]+.
El producto intermedio solido blanco se diluyo con diclorometano (5 ml) y a la solucion resultante se le anadio posteriormente N-Boc-Dolaproma (0,58 g, 1 eq.), trietilamina (780 pl, 3 eq.) y DEPC (406 pl, 1,2 eq.), y la mezcla de reaccion se dejo en agitacion durante 2 horas a temperatura ambiente. La reaccion se controlo utilizando HPLC de fase inversa. Al termino de la reaccion segun lo determinado por HPLC, la mezcla de reaccion se diluyo con diclorometano (30 ml), la capa de diclorometano se lavo posteriormente con acido dtrico acuoso al 10% (20 ml), NaHCO3 acuoso saturado (20 ml) y agua (20 ml). La capa de diclorometano se concentro y el residuo resultante se purifico mediante cromatografia en columna flash utilizando un gradiente de metanol de 0-5% en diclorometano. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar un producto intermedio solido 0,78 g (88 %). ES-MS m/z 446,1 [M+H]+, 468,3 [M+Na]+.
El producto intermedio solido (450 mg, 1 mmol) y el tripeptido 42 (534 mg, 1,1 eq.) se diluyeron con una solucion al 50% de TFA en diclorometano. (10 ml), y la reaccion resultante se dejo en agitacion durante 2 horas a temperatura ambiente. Se anadio tolueno (10 ml) a la reaccion y la mezcla de reaccion se concentro. La amina intermedia resultante se seco azeotropicamente utilizando tolueno (3 x 20 ml) y se seco al vado durante la noche.
La amina intermedia resultante se diluyo con diclorometano (2 ml) y a la solucion resultante se le anadio trietilamina (557 pl, 4 eq.), Seguido de DEPC (203 pl, 1,4 eq.). La mezcla de reaccion se dejo en agitacion durante 4 ha temperatura ambiente y el progreso de la reaccion se controlo por HPLC. Al termino de la reaccion, la mezcla de reaccion se diluyo con diclorometano (30 ml) y la capa de diclorometano se lavo posteriormente utilizando NaHCO3 acuoso saturado (20 ml) y NaCl acuoso saturado (20 ml). La capa de diclorometano se concentro y el residuo resultante se purifico utilizando cromatografia en columna flash en un gradiente de metanol de 0-5% en diclorometano. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron y el residuo resultante se seco utilizando
un diclorometano:hexano (1:1) para proporcionar un producto intermedio solido blanco, 0,64 g (84 %). ES-MS m/z
757,5 [M+H]+.
El producto intermedio solido blanco (536 mg, 0,73 mmol) se diluyo con metanol y a la solucion resultante se le anadio Pd/C al 10% (100 mg). La reaccion se coloco en una atmosfera de hidrogeno y se dejo en agitacion a presion 5 atmosferica y a temperatura ambiente durante 2 h. El progreso de la reaccion se siguio por HPLC y se completo en 2
h. El frasco de reaccion se purgo con argon y la mezcla de reaccion se filtro a traves de una capa de celita. La
almohadilla de celita se lavo posteriormente con metanol (30 ml) y los filtrados combinados se concentraron para producir un producto intermedio solido gris que se utilizo sin purificacion adicional. Rendimiento = 490 mg (91 %). ES-MS m/z 731,6 [M+H]+, 366,6 [M+2H]2+/2.
10 Se diluyo el producto intermedio solido gris (100 mg, 1,136 mmol), acido N-Boc-aminobenzoico (39 mg, 1,2 eq.) y trietilamina (90 |jl, 4 eq.) con diclorometano (10 ml), y a la solucion resultante se le anadio DEPC (28 |jg, 1,2 eq.). La mezcla de reaccion se dejo agitando a temperatura ambiente durante 2 h, a continuacion, la mezcla de reaccion se diluyo con diclorometano (30 ml). La capa de diclorometano se lavo posteriormente con NaHCO3 acuoso saturado (20 ml) y NaCl acuoso saturado (20 ml). La capa de diclorometano se concentro y el residuo resultante se purifico 15 mediante cromatograffa en columna flash utilizando un gradiente de 0-5% en diclorometano. Las fracciones
relevantes se combinaron y se concentraron y el residuo resultante se seco utilizando diclorometano:hexano (1:1) para proporcionar un producto intermedio solido blanco. ES-MS m/z 950,7 [M+H]+.
El producto intermedio solido blanco se diluyo con una solucion al 50% de TFA en diclorometano y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. Se anadio tolueno (10 ml) a la reaccion y la mezcla de reaccion se concentro. El 20 residuo resultante se seco azeotropicamente utilizando tolueno (3 x 15 ml), para proporcionar un aceite amarillo que se purifico mediante HPLC preparativa (columna Varian Dynamax C18-RP, 5 j, 100 A, gradiente lineal de MeCN 10 a 95% en 0,05 M de tampon carbonato de trietilamonio, pH 7,0, en 30 minutos a un caudal de 10 ml/min). Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron y el residuo resultante se seco utilizando MeCN (3 x 20 ml) para proporcionar el compuesto 56 como un solido blanco: 101 mg (87 % en 2 pasos). ES-MS m/z 850,6 [M+H]+, 25 872,6 [M+Na]+.
EJEMPLO 13
PREPARACION DEL COMPUESTO 57
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El compuesto 49 (100 mg, 0,14 mmol), el compuesto 27 (160 mg, 0,15 mmol, 1,1 eq.) y HOBt (19 mg, 0,14 mmol, 30 1,0 eq.) se diluyeron con DMF (2 ml). Despues de 2 minutos se anadio piridina (0,5 ml) y la mezcla de reaccion se
controlo utilizando HPLC de fase inversa. Ni el compuesto 49 ni el compuesto 27 se detecto despues de 24 h. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se purifico utilizando HPLC de fase inversa preparativa (columna Varian Dynamax de 21,4 mm x 25 cm, 5 j, 100 A, utilizando un gradiente de ejecucion de MeCN y Et3N- CO2 (pH 7) a 20 ml/min de 10% a 100% mas de 40 minutos seguido de MeCN al 100% durante 20 min.). Las 35 fracciones relevantes se agruparon y se concentraron para proporcionar un producto intermedio solido blancuzco.
ES-MS m/z 1608,7 [M+H]+.
El producto intermedio solido blancuzco se diluyo con MeCN/agua/TFA en una relacion de 85:5:10, respectivamente. La mezcla de reaccion fue controlada por HPLC y se completo en 3 h. La mezcla de reaccion se concentro directamente y el residuo resultante se purifico utilizando una columna de HPLC de fase inversa preparativa 40 (columna Varian Dynamax 21,4 mm x 25 cm, 5 j, 100 A, utilizando un gradiente de ejecucion de MeCN y TFA al 0,1
% a 20 ml/min de 10% a 100% durante 40 minutos seguido de MeCN al 100% durante 20 min). Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar el compuesto 57 como un polvo blancuzco. Rendimiento: 46 mg (32 % total), ES-MS m/z 1334,8 [M+H]+; UVAmax215, 256 nm.
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PREPARACION DEL COMPUESTO 58
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El compuesto 49 (1,69 mg, 2,35 mmol), el compuesto 21 (2,6 g, 3,52 mmol, 1,5 eq.) y HOBt (64 mg, 0,45 mmol, 0,2 eq.) se diluyeron con DMF (25 ml). Despues de 2 minutos se anadio piridina (5 ml) y la reaccion se controlo utilizando HPLC de fase inversa. La reaccion demostro completarse en 24 h. La mezcla de reaccion se concentro para proporcionar un aceite oscuro, que se diluyo con 3 ml de DMF. La solucion de DMF se purifico mediante cromatograffa en columna flash (gel de sflice, gradiente eluyente: 100% de diclorometano para 4:1 de diclorometano-metanol). Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar un aceite que se solidifico a alto vado para proporcionar una mezcla del compuesto 58, y que no reacciono con el compuesto 49, como un solido de color amarillo sucio (Rf 0,40 en 9:1 de diclorometano-metanol). El solido amarillo sucio se diluyo con DMF y se purifico utilizando HPLC de fase inversa preparativa (columna Varian Dynamax C-is de 41,4 mm x 25 cm, 8 m, 100 A, utilizando un gradiente de ejecucion de MeCN y TFA acuoso al 0,1 % a 45 ml/min del 10% al 100% durante 40 minutos seguido de MeCN al 100 % durante 20 minutos) para proporcionar el compuesto 58 como un polvo blanco amorfo (Rf 0,40 en 9:1 de diclorometano-metanol), que tuvo una pureza > 95 % por HPLC y que contema menos del 1% del compuesto 49. Rendimiento: 1,78 g (57 %); ES-MS m/z 1316,7 [M+H]+; UVAmax 215, 248 nm.
EJEMPLO 15
PREPARACION DEL COMPUESTO 59
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La sal clorhidrato del compuesto 51 (11 mg, 15,2 mmol) y el compuesto 21 (11 mg, 15,2 mmol) se diluyeron con 1- metil-2-pirolidinona (1 ml) y a la solucion resultante se le anadio diisopropiletilamina (5,3 ml, 30,3 mmol, 2.0 eq.). La mezcla se dejo en agitacion bajo atmosfera de argon durante 3 dfas mientras se controlaba utilizando HPLC. Despues de este tiempo, aun quedaba mucho material de partida sin reaccionar, se anadio HOBt (1,0 eq.) y la mezcla de reaccion se dejo en agitacion durante 24 h, despues de lo cual no quedo ningun material de partida segun la HPLC. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se purifico mediante HPLC preparativa (columna Varian Dynamax C18 de 21,4 mm x 25 cm, 5 p, 100 A, con un gradiente de ejecucion de MeCN y agua a 20 ml/min de un 10% a 100% durante 30 minutos seguido de MeCN al 100% durante 20 min). Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar el compuesto 59 como un solido blanco. Rendimiento: 13 mg (67 %); ES-MS m/z 1287,2 [M+H]+, 1304,3 [M+NH4]+; UVAmax 215, 248 nm.
EJEMPLO 16
PREPARACION DEL COMPUESTO 60
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El compuesto 53 (9 mg, 10,8 ^mol) y el compuesto 28 (5,2 mg, 10,8 ^mol) se diluyo con diclorometano (1 ml) y a la solucion resultante se le anadio HATU (6,3 mg, 16,1 ^mol, 1,5 eq.), seguido de piridina (1,3 ^l, 16,1 ^mol, 1,5 eq.). La mezcla de reaccion se dejo en agitacion bajo atmosfera de argon, mientras se controlaba utilizando HPLC. La reaccion se completo despues de 6 h. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se diluyo con DMSO. La solucion de DMSO se purifico utilizando HPLC de fase inversa preparativa (columna Varian Dynamax de 21,4 mm x25 cm, 5 ^, 100 A, utilizando un gradiente de ejecucion de MeCN y TFA al 0,1% a 20 ml/min de 10% a 100% durante 40 min seguido de MeCN al 100% durante 20 min) y las fracciones relevantes se combinaron y concentraron para proporcionar un producto intermedio solido blancuzco que tuvo una pureza > 95% segun la HPLC.
El producto intermedio solido blancuzco se diluyo con diclorometano (2 ml) y la solucion resultante se trato con TFA (0,5 ml). La reaccion se controlo por HPLC, y se completo en 2 h. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se diluyo con DMSO y se purifico en las mismas condiciones que las descritas en el Ejemplo 13. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar el compuesto 60 como un polvo blancuzco.
Rendimiento: 14,9 mg (90 %); ES-MS m/z 1304,6 [M+H]+; UVAmax 215, 275 nm.
EJEMPLO 17
PREPARACION DEL COMPUESTO 61
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La sal trifluoroacetato del compuesto 53 (0,37 g, 0,39 mmol, 1,0 eq.) y el compuesto 18 (0,30 g, 0,58 mmol, 1,5 eq.) se diluyeron con DMF (5 ml, 0,1 M), y a la solucion resultante se le anadio piridina (95 ^l, 1,2 mmol, 3,0 eq.). HATU (0,23 g, 0,58 mmol, 1,5 eq.) se anadio entonces como un solido y la mezcla de reaccion se dejo en agitacion bajo atmosfera de argon, mientras que se controlaba utilizando HPLC. La reaccion progreso lentamente y 4 horas mas tarde se anadio 1,0 eq. de diisopropiletilamina. La reaccion se completo en 1 h. La mezcla de reaccion se concentro al vado y el residuo resultante se purifico mediante HPLC preparativa (columna Varian Dynamax Ci8 de 41,4 mm x 25 cm, 5 ^, 100 A, utilizando un gradiente de ejecucion de MeCN y TFA acuoso al 0,1 % a 45 ml/min de 10% a 100% durante 20 minutos seguido de MeCN al 100% durante 20 min) para proporcionar un producto intermedio solido rosa claro.
El producto intermedio solido rosa se diluyo con DMF (30 ml) y a la solucion resultante se le anadio dietilamina (15 ml). La reaccion se completo por HPLC en 2 h. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se lavo dos veces con eter. El producto intermedio solido se seco a alto vado y luego se uso directamente en el siguiente paso.
El producto intermedio solido se diluyo con DMF (20 ml) y a la solucion resultante se le anadio MC-OSu (0,12 g, 0,39 mmol, 1,0 eq.). Despues de 4 d., la mezcla de reaccion se concentro para proporcionar un aceite que se purifico mediante HPLC preparativa (columna Varian Dynamax C18 de 41,4 mm x 25 cm, 5 ^, 100 A, con un gradiente de ejecucion de MeCN y TFA acuoso al 0,1 % a 45 ml/min de 10% a 100% durante 40 minutos seguido de MeCN al
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100% durante 20 min). El compuesto 61 se aislo como un solido escamoso blanco. Rendimiento: 0,21 g (38 % total); ES-MS m/z 1285,9 [M+H]+, 13.07.8 [M+Na]+; UVAmax 215, 266 nm.
EJEMPLO 18
PREPARACION DEL COMPUESTO 62
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Se diluyo Fmoc-Val-cit-PAB-OCO-Pnp (19a) (0,65 g, 0,85 mmol, 1,1 eq.), el compuesto 49 (0,55 g, 0,77 mmol, 1,0 eq.) y HOBt (21 mg, 0,15 mmol, 2,0 eq.) con DMF (2,0 ml) y se disolvieron utilizando sonicacion. A la solucion resultante se anadio piridina (0,5 ml) y la reaccion se controlo utilizando HPLC. Despues de 24 h, se anadio diisopropiletilamina (1,0 eq.) y la reaccion se dejo en reposo, sin agitacion durante 24 h. La mezcla de reaccion se concentro para proporcionar un residuo de aceite. El residuo de aceite se purifico utilizando HPLC de fase inversa preparativa (columna Varian Dynamax 41,4 mm x 25 cm, 5 ^, 100 A, utilizando un gradiente de ejecucion de MeCN y TFA al 0,1 % a 45 ml/min de 10% a 100% durante 40 min seguido de MeCN al 100% durante 20 min.) Las fracciones deseadas se agruparon y se concentraron para dar un aceite que se precipito con eter para proporcionar un producto intermedio solido blancuzco. Rendimiento: 0,77 g (74 %), ES-MS m/z 1345,7 [M+H]+; UVAmax 215, 254 nm.
El producto intermedio solido blancuzco (aproximadamente 85 mg) se desprotegio con dietilamina (1 ml) en DMF (3 ml). Despues de 1 h, la reaccion se completo. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se precipito en 1 ml de EtOAc seguido por la adicion de eter abundante (aproximadamente 20 ml). La amina intermedia se filtro y se seco a alto vado y se utilizo en el paso siguiente sin purificacion adicional.
La amina intermedia (70 mg, 61 ^mol, 1,0 eq.) se recogio en DMF (10 ml), y a la solucion resultante se le anadio posteriormente acido bromoacetamidocaproico (17 mg, 67 ^mol, 1,1. eq.), PyBrop (32 mg, 67 ^mol, 1,1 eq.) y diisopropiletilamina (16 ^l, 92 ^mol, 1,5 eq.). Despues de 24 h, se anadio 1,0 eq. adicional de acido bromoacetamidocaproico. La reaccion se paro despues de 30 h. La mezcla de reaccion se concentro en un aceite que se purifico utilizando HPLC preparativa de fase inversa (columna Synergi MaxRP C12 de 21,4 mm x 25 cm, 5 ^, 80 A, utilizando un gradiente de ejecucion de MeCN y TFA acuoso al 0,1 % a 20 ml/min de 10% a 100% durante 40 minutos seguido de MeCN al 100% durante 20 min). Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar el compuesto 62 como un solido blanco. Rendimiento: 23 mg (27 %), ES-MS m/z 1356,7 [M+H]+; UVA max 215, 247 nm.
EJEMPLO 19
PREPARACION DEL COMPUESTO 63
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Se sometio Fmoc-Val-cit-PAB-OC(O)-Me-val-val-dil-dap-nor (aproximadamente 48 mg, obtenido segun el Ejemplo 18) a elimination de Fmoc mediante el tratamiento con dietilamina (1 ml) en DMF (3 ml). Despues de 1 h, la reaction se completo. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se precipito utilizando 1 ml de EtOAc 5 seguido por la adicion de eter abundante (aproximadamente 20 ml). La amina intermedia se filtro y se seco a alto vatio y se utilizo en el paso siguiente sin purification adicional.
La amina intermedia (35 ^mol, 1,1 eq.) se diluyo con DMF (2 ml), y a la solution resultante se le anadio posteriormente maleimido-acido PEG (Frisch, B.; Boeckler, C.; Schuber, F. Bioconjugate Chem. 1996, 7, 180-6; 7,8 mg, 32 ^mol, 1,0 eq), DEPC (10,7 ^l, 64 ^mol, 2,0 eq), y diisopropiletilamina (11,3 ^l, 64 ^mol, 2,0 eq.). La reaccion 10 se completo en 15 min segun la HPLC. La mezcla de reaccion se concentro para proporcionar un aceite. El aceite se diluyo con 1 ml de DMSO y se purifico utilizando HPLC de fase inversa preparativa (columna Synergi MaxRP Ci2 de 21,4 mm x 25 cm, 5 |j, 80 A, utilizando un gradiente de ejecucion de MeCN y TFA al 0,1% a 20 ml/min de 10% a 100% durante 40 minutos seguido de MeCN al 100% durante 20 min). Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar el compuesto 63 como un solido blanco.
15 Rendimiento: 16,2 mg (34 %), ES-MS m/z 1348,6 [M+H]+; UVA max 215, 247 nm.
Los ejemplos 20-25 describen la conjugation de los anticuerpos monoclonales cBR96 y cAC10 para un compuesto de farmaco-enlazador. Estos anticuerpos se obtuvieron como se describe en Bowen, et al., J. Immunol. 1993, 151, 5896, y Trail, et al, Science 1993, 261,212, respectivamente.
El numero de fracciones de farmaco-enlazador por ligando en un conjugado de farmaco-enlazador-ligando varia de 20 reaccion de conjugacion a reaccion de conjugacion, pero por lo general oscila aproximadamente de 7 a 9, en particular cuando el ligando es cBR96 o cAC10.
EJEMPLO 20
PREPARACION DEL COMPUESTO 64
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El anticuerpo cBR96 (24 mg) se redujo utilizando DTT como se describe en el Procedimiento General L, entonces se determinaron el numero de tioles por anticuerpo y la concentration de anticuerpo como se describe en el Procedimiento General M y en el Procedimiento General N, respectivamente.
Resultados: [Ab] = 4,7 mg/ml = 29,4 ^M; [tiol] = 265 |jM, SH/Ab = 9,0 (el rango tfpico de SH/Ab es de aproximadamente 7,8 a 9,5.).
Conjugation:
Se anadio una solution de PBS/DTPA (2,2 ml), como se definio anteriormente en esta memoria, a 4,2 ml de anticuerpo reducido y la solucion resultante se enfrio a 0 °C utilizando un bano de hielo. En un frasco separado se diluyo una solucion madre de 130,5 ml del compuesto 57 (8,4 mM en DMSO, 8,5 mol de compuesto 57 por mol de anticuerpo reducido) con MeCN (1,48 ml, previamente enfriado a 0 °C en un bano de hielo). La solucion de MeCN del compuesto 57 se anadio rapidamente a la solucion de anticuerpo y la mezcla de reaction se agito con un aparato de vortice durante 5-10 seg., se devolvio al bano de hielo y se agito a 0 °C durante 1 h., tras lo cual se anadio 218 ^l de una solucion de cistema (100 mM en PBS/ DTPA), para detener la reaccion. Se reservaron 60 ^l de la mezcla de reaccion extinguida como una muestra "qrm".
Mientras la reaccion procedia, se colocaron tres columnas PD10 (Sephadex G25, ofrecida por Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en un espacio frio y se equilibro con PBS (que habia sido previamente enfriado a 0 °C utilizando un bano de hielo).
La mezcla de reaccion extinguida, que contema el compuesto 64, se concentro a <= 3 ml por ultracentrifugacion utilizando dos dispositivos de filtration con centrifuga Ultrafree 4 (membrana de separation de 30K de peso molecular, Millipore Corp., Bedford, MA; utilizada segun las instrucciones del fabricante), que se enfriaron previamente a 4 °C en un refrigerador y la mezcla de reaccion concentrada se eluyo a traves de las tres columnas PD10 previamente enfriadas utilizando PBS como eluyente (1 ml por cada columna). El conjugado eluido se recogio en un volumen de 1,4 ml por columna, para un volumen total de 4,2 ml de eluido. La solucion del conjugado eluido se filtro utilizando un filtro final con jeringa de 0,2 micras, se apartaron 250 ^l de solucion de conjugado para su analisis, y el resto de la solucion del conjugado fue congelada en viales esteriles.
Se determinaron la concentracion del compuesto 64, el numero de moleculas de farmaco por anticuerpo, la cantidad de farmaco-enlazador extinguida y el porcentaje de agregados utilizando los Procedimientos Generales P, N, O y Q, respectivamente.
Resultados del ensayo:
[Compuesto 64] = 3,8 mg/mlg
% Agregado= traza
Titulacion de tiol residual: Tioles residuales = 1,7/Ab Farmaco/Ab ~ 9,0 -1,7 = 7,3 Farmaco-enlazador extinguido: indetectable Rendimiento: 4,2 ml, 16 mg, 66 %.
EJEMPLO 21
PREPARACION DEL COMPUESTO 65
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El anticuerpo cAC10 (24 mg) se redujo utilizando DTT como se describe en el Procedimiento General L, entonces se determinaron el numero de tioles por anticuerpo y la concentration de anticuerpo como se describe en el Procedimiento General M y en el Procedimiento General N, respectivamente.
Resultados: [Ab] = 4,9 mg/ml = 30,7 mM;
[Tiol] = 283 |jM, 9,2 SH/Ab
Conjugation:
Una solution de PBS/DTPA (2,2 ml) como se definio anteriormente en esta memoria, se anadio a 4,2 ml de anticuerpo reducido y la solucion resultante se enfrio a 0 °C utilizando un bano de hielo. En un frasco separado se diluyo una solucion madre de 125 jl del compuesto 57 (8,4mM en DMSO, 8,5 mol de compuesto 57 por mol de anticuerpo reducido) con MeCN (1,48 ml, previamente enfriado a 0 °C en un bano de hielo). La solucion de MeCN del compuesto 57 se anadio rapidamente a la solucion de anticuerpo y la mezcla de reaction se agito con un aparato de vortice durante 5-10 seg., luego se devolvio al bano de hielo y se agito a 0 °C durante 1 hora, tras lo cual se anadio 218 jl de una solucion de cistema (100 mM en PBS/ DTPA), para detener la reaccion. Se reservaron 60 jl de la mezcla de reaccion extinguida como una muestra "qrm".
Mientras la reaccion procedia, se colocaron cuatro columnas PD10 (Sephadex G25, ofrecida por Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en un espacio frio y se equilibraron con PBS (que habia sido previamente enfriado a 0 °C utilizando un bano de hielo).
La mezcla de reaccion extinguida, que contema el compuesto 65, se concentro a <= 3 ml por ultracentrifugacion utilizando dos dispositivos de filtration con centrifuga Ultrafree 4 (membrana de separation de 30K de peso molecular, Millipore Corp., Bedford, MA; utilizada segun las instrucciones del fabricante), que se enfriaron previamente a 4 °C en un refrigerador y la mezcla de reaccion concentrada se eluyo a traves de las tres columnas PD10 previamente enfriadas utilizando PBS como eluyente (1 ml por cada columna). El conjugado eluido se recogio en un volumen de 1,4 ml por columna, para un volumen total de 5,6 ml de eluido. La solucion del conjugado eluido se filtro utilizando un filtro final con jeringa de 0,2 micras, se apartaron 250 jl de solucion de conjugado para su analisis, y el resto de la solucion del conjugado fue congelada en viales esteriles.
Se determinaron la concentracion del compuesto 65, el numero de moleculas de farmaco por anticuerpo, la cantidad de farmaco-enlazador extinguida y el porcentaje de agregados utilizando los Procedimientos Generales P, N, O y Q, respectivamente.
Resultados del ensayo:
[Compuesto 65] = 2,8 mg/ml
% Agregado= traza
Titulacion de tioles residuales: Tioles residuales = 1,6/Ab. Farmaco/Ab ~ 9,2 -1,6 = 7,6 Farmaco-enlazador no unido covalentemente: Rendimiento indetectable: 5,6 ml, 15,7 mg, 65 %.
EJEMPLO 22
PREPARACION DEL COMPUESTO 66
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Se redujo el anticuerpo cBR96 (24 mg) utilizando DTT como se describe en el Procedimiento General L, entonces se determinaron el numero de tioles por anticuerpo y la concentracion de anticuerpo como se describe en el Procedimiento General M y en el Procedimiento General N, respectivamente.
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Resultados: [Ab] = 3,7 mg/ml = 23,1 |jM; [tiol] = 218 |jM; 9,4 SH/Ab.
Conjugation:
Una solution de PBS/DTPA (2,2 ml) como se definio anteriormente en esta memoria, se anadio a 4,2 ml de anticuerpo reducido y la solucion resultante se enfrio a 0 °C utilizando un bano de hielo. En un frasco separado se diluyo una solucion madre de 145,5 jl del compuesto 58 (8,3 mM en DMSO, 9,0 mol de compuesto 58 por mol de anticuerpo reducido) con MeCN (1,48 ml, previamente enfriado a 0 °C en un bano de hielo). La solucion de MeCN del compuesto 58 se anadio rapidamente a la solucion de anticuerpo y la mezcla de reaction se agito con un aparato de vortice durante 5-10 seg., entonces se devolvio al bano de hielo y se agito a 0 °C durante 1 hora, tras lo cual se anadio 249 jl de una solucion de cistema (100 mM en PBS/DTPA), para detener la reaccion. Se reservaron 60 jl de la mezcla de reaccion extinguida como una muestra "qrm".
Mientras la reaccion procedia, se colocaron tres columnas PD10 (Sephadex G25, ofrecida por Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en un espacio frio y se equilibraron con PBS (que habia sido previamente enfriado a 0 °C utilizando un bano de hielo).
La mezcla de reaccion extinguida, que contema el compuesto 66, se concentro a <= 3 ml por ultracentrifugacion utilizando dos dispositivos de filtration con centrifuga Ultrafree 4 (membrana de separation de 30K de peso molecular, Millipore Corp., Bedford, MA; utilizada segun las instrucciones del fabricante), que se enfriaron previamente a 4 °C en un refrigerador y la mezcla de reaccion concentrada se eluyo a traves de las tres columnas PD10 previamente enfriadas utilizando PBS como eluyente (1 ml por cada columna). El conjugado eluido se recogio en un volumen de 1,4 ml por columna, para un volumen total de 4,2 ml de eluido. La solucion del conjugado eluido se filtro utilizando un filtro final con jeringa de 0,2 micras, se apartaron 250 jl de solucion de conjugado para su analisis, y el resto de la solucion del conjugado fue congelada en viales esteriles.
Se determinaron la concentration del compuesto 66, el numero de moleculas de farmaco por anticuerpo, la cantidad de farmaco-enlazador extinguida y el porcentaje de agregados utilizando los Procedimientos Generales P, N, O y Q, respectivamente.
Resultados del ensayo:
[Compuesto 66] = 3,0 mg/ml
% Agregado= traza
Titulacion de tioles residuales: Tioles residuales = 0,4/Ab. Farmaco/Ab ~ 9,5 - 0,4 = 9,1 Farmaco-enlazador no unido covalentemente: 0,3% de aducto de 57-cys Rendimiento: 5,3 ml, 15,9 mg, 66 %.
EJEMPLO 23
PREPARACION DEL COMPUESTO 67
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El anticuerpo cAC10 (24 mg) se redujo utilizando DTT como se describe en el Procedimiento General L, entonces se determinaron el numero de tioles por anticuerpo y la concentracion de anticuerpo como se describe en el Procedimiento General M y en el Procedimiento General N, respectivamente.
Resultados: [Ab] = 3,9 mg/ml = 24,5 jM; [tiol] = 227 jM; 9,3 SH/Ab
Conjugation:
Una solution de PBS/DTPA (2,2 ml) como se definio anteriormente en esta memoria, se anadio a 4,2 ml de anticuerpo reducido y la solucion resultante se enfrio a 0 °C utilizando un bano de hielo. En un frasco separado se diluyo una solucion madre de 154,4 jl del compuesto 58 (8,3 mM en DMSO, 9,0 mol de compuesto 58 por mol de 5 anticuerpo reducido) con MeCN (1,46 ml, previamente enfriado a 0 °C en un bano de hielo). La solucion de MeCN del compuesto 58 se anadio rapidamente a la solucion de anticuerpo y la mezcla de reaction se agito con un aparato de vortice durante 5-10 seg., entonces se devolvio al bano de hielo y se agito a 0 °C durante 1 hora, tras lo cual se anadio 249 jl de una solucion de cistema (100 mM en PBS/ DTPA), para detener la reaccion. Se reservaron 60 jl de la mezcla de reaccion extinguida como una muestra "qrm".
10 Mientras la reaccion procedia, se colocaron cuatro columnas PD10 (Sephadex G25, ofrecida por Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en un espacio frio y se equilibraron con PBS (que habia sido previamente enfriado a 0 °C utilizando un bano de hielo).
La mezcla de reaccion extinguida, que contema el compuesto 67, se concentro a <= 3 ml por ultracentrifugacion utilizando dos dispositivos de filtration con centrifuga Ultrafree 4 (membrana de separation de 30K de peso 15 molecular, Millipore Corp.; Bedford, MA; utilizada segun las instrucciones del fabricante), que se enfriaron previamente a 4 °C en un refrigerador y la mezcla de reaccion concentrada se eluyo a traves de las tres columnas PD10 previamente enfriadas utilizando PBS como eluyente (1 ml por cada columna). El conjugado eluido se recogio en un volumen de 1,4 ml por columna, para un volumen total de 5,6 ml de eluido. La solucion del conjugado eluido se filtro utilizando un filtro final con jeringa de 0,2 micras, se apartaron 250 jl de solucion de conjugado para su
20 analisis, y el resto de la solucion del conjugado fue congelada en viales esteriles.
Se determinaron la concentration del compuesto 67, el numero de moleculas de farmaco por anticuerpo, la cantidad de farmaco-enlazador extinguida y el porcentaje de agregados utilizando los Procedimientos Generales P, N, O y Q, respectivamente.
Resultados del ensayo:
25 [Compuesto 67] = 3,0 mg/ml
% Agregado= traza
Titulacion de tioles residuales: Tioles residuales = 0,5/Ab. Farmaco/Ab ~ 9,5 - 0,5 = 9,0 Farmaco-enlazador extinguido: 1,1% de aducto de 58-Cys Rendimiento: 5,3 ml, 15,9 mg, 66 %.
30 EJEMPLO 24
PREPARACION DEL COMPUESTO 68
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[510] El anticuerpo cBR96 (24 mg) se redujo utilizando DTT como se describe en el Procedimiento General L, entonces se determinaron el numero de tioles por anticuerpo y la concentracion de anticuerpo como se describe en 35 el Procedimiento General M y en el Procedimiento General N, respectivamente.
Resultados: [Ab] = 4,4 mg / ml = 27,2 |jM; [tiol] = 277 |jM; 10,2 SH/Ab
Conjugation:
El anticuerpo reducido se diluyo con DMSO (1,47 ml, previamente enfriado a 0 °C en un bano de hielo) para que la solucion resultante fuera de DMSO al 20 %. La solucion se dejo en agitation durante 10 min. a 0 °C, y luego se
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anadieron rapidamente 127,8 ^l de una solucion madre del compuesto 60 (7,6 mM de solucion en DMSO, 9 mol de Compuesto 60 por mol de anticuerpo). La mezcla de reaccion se agito inmediatamente utilizando un aparato de vortice y se devolvio al bano de hielo y se agito a 0 °C durante 1 hora, tras lo cual se anadieron 213 ^l de una solucion de cistema (100 mM en PBS/DTPA), para extinguir la reaccion. Se reservaron 60 ^l de la mezcla de reaccion extinguida como una muestra "qrm".
Mientras la reaccion procedia, se colocaron cuatro columnas PD10 (Sephadex G25, ofrecida por Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en un espacio frio y se equilibraron con PBS (que habia sido previamente enfriado a 0 °C utilizando un bano de hielo).
La mezcla de reaccion extinguida, que contema el compuesto 68, se concentro a <= 3 ml por ultracentrifugacion utilizando dos dispositivos de filtracion con centrifuga Ultrafree 4 (membrana de separation de 30K de peso molecular, Millipore Corp., Bedford, MA; utilizada segun las instrucciones del fabricante), que se enfriaron previamente a 4 °C en un refrigerador y la mezcla de reaccion concentrada se eluyo a traves de las cuatro columnas PD10 previamente enfriadas utilizando PBS como eluyente (1 ml por cada columna). El conjugado eluido se recogio en un volumen de 1,4 ml por columna, para un volumen total de 5,6 ml de eluido. La solucion del conjugado eluido se filtro utilizando un filtro final con jeringa de 0,2 micras, se apartaron 250 ^l de solucion de conjugado para su analisis, y el resto de la solucion del conjugado fue congelada en viales esteriles.
[515] Se determinaron la concentration del compuesto 68, el numero de moleculas de farmaco por anticuerpo, la cantidad de farmaco-enlazador extinguida y el porcentaje de agregados utilizando los Procedimientos Generales P, N, O y Q, respectivamente.
Debido a que las absorbancias del compuesto 60 y del anticuerpo se superponen en gran medida, la determinacion espectrofotometrica de la concentracion de conjugado requiere la medicion de la absorbancia a 270 y 280 nm. La concentracion molar de conjugado viene dada por la siguiente formula:
[Conjugado] = (OD280 x 1,08e-5 - OD270 x 8,20e-6) x factor de dilution
donde los valores 1,08e-5 y 8,20e-6 se calculan a partir de los coeficientes de extincion molar del farmaco y el anticuerpo, que se estiman como:
e270 Compuesto 60 = 2,06e4 e270 cBR96 = 1,87e5
£280 Compuesto 60 = 1,57e4 £280 cBR96 =2,24e5
Resultados del ensayo:
[Compuesto 68] = 3,2 mg/ml
% Agregado= traza
Titulacion de tioles residuales: Tioles residuales = 1,0/Ab. Farmaco/Ab ~ 10,2 -1,0 = 9,2 Farmaco-enlazador extinguido: traza Rendimiento: 5,6 ml, 17,9 mg, 75%.
EJEMPLO 25
PREPARACION DEL COMPUESTO 69
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El anticuerpo cAC10 (24 mg) se redujo utilizando DTT como se describe en el Procedimiento General L, entonces se determinaron el numero de tioles por anticuerpo y la concentracion de anticuerpo como se describe en el Procedimiento General M y en el Procedimiento General N, respectivamente.
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Resultados: [Ab] = 4,8 mg/ml = 29,8 mM; [tiol] = 281 mM; 9,4 SH/Ab Conjugation:
El anticuerpo reducido se diluyo con DMSO (1,47 ml, previamente enfriado a 0 °C en un bano de hielo) para que la solution resultante fuera de DMSO al 20 %. La solution se dejo en agitation durante 10 min. a 0 °C, y luego se anadieron rapidamente 140 mI de una solucion madre del compuesto 60 (7,6 mM de solucion en DMSO, 8,5 mol de Compuesto 60 por mol de anticuerpo). La mezcla de reaction se agito inmediatamente utilizando un aparato de vortice y se devolvio al bano de hielo y se dejo agitar durante 1 h a 0 °C, tras lo cual se anadieron 213 mI de una solucion de cistema (100 mM en PBS/ DTPA), para extinguir la reaccion. Se reservaron 60 mI de la mezcla de reaccion extinguida como una muestra "qrm".
Mientras la reaccion procedia, se colocaron cuatro columnas PD10 (Sephadex G25, ofrecida por Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en un espacio frio y se equilibraron con PBS (que habia sido previamente enfriado a 0 °C utilizando un bano de hielo).
La mezcla de reaccion extinguida, que contema el compuesto 69, se concentro a <= 3 ml por ultracentrifugacion utilizando dos dispositivos de filtration con centrifuga Ultrafree 4 (membrana de separation de 30K de peso molecular, Millipore Corp., Bedford, MA; utilizada segun las instrucciones del fabricante), que se enfriaron previamente a 4 °C en un refrigerador y la mezcla de reaccion concentrada se eluyo a traves de las cuatro columnas PD10 previamente enfriadas utilizando PBS como eluyente (1 ml por cada columna). El conjugado eluido se recogio en un volumen de 1,4 ml por columna, para un volumen total de 5,6 ml de eluido. La solucion del conjugado eluido se filtro utilizando un filtro final con jeringa de 0,2 micras, se apartaron 250 mI de solucion de conjugado para su analisis, y el resto de la solucion del conjugado fue congelada en viales esteriles.
Se determinaron la concentration del compuesto 69, el numero de moleculas de farmaco por anticuerpo, la cantidad de farmaco-enlazador extinguida y el porcentaje de agregados utilizando los Procedimientos Generales P, N, O y Q, respectivamente.
Debido a que las absorbancias del compuesto 60 y del anticuerpo se superponen en gran medida, la determination espectrofotometrica de la concentracion de conjugado requiere la medicion de la absorbancia a 270 y 280 nm. La concentracion molar de conjugado viene dada por la siguiente formula:
[Conjugado] = (OD280 x 1,08e-5 - OD270 x 8,20e-6) x factor de dilution,
donde los valores 1,08e-5 y 8,20e-6 se calculan a partir de los coeficientes de extincion molar del farmaco y el anticuerpo, que se estiman como:
£270 Compuesto 60 = 2,06e4
£280 Compuesto 60 = 1,57e4
Resultados del ensayo:
[Compuesto 69] = 3,0 mg/ml
% Agregado= traza
Titulacion de tioles residuales: Tioles residuales = 0,7/Ab. Farmaco/Ab ~ 9,4 - 0,7 = 8,7 Farmaco-enlazador extinguido: traza Rendimiento: 5,6 ml, 16,8 mg, 70 %.
EJEMPLO 26
PREPARACION DEL COMPUESTO 75
£270 cAC10 = 2,10e5 £280 cAC10 = 2,53e5
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Se diluyo dietil-(4-nitrobencilo)fosfonato (1,1 g, 4,02 mmol) en THF anhidro (4 ml) y la mezcla resultante se enfrio a 0 °C. Se anadio hidruro de sodio (0,17 g, 4,22 mmol, 1,05 eq., dispersion al 60% en aceite mineral) y la reaccion resultante se dejo en agitacion durante 5 min. En este momento la evolucion de gas de la mezcla de reaccion habia cesado. Entonces se anadio 2,2-dimetil-1,3-dioxan-5-ona (0,52 g, 4,02 mmol) en 1 ml de THF anhidro a la mezcla de reaccion a traves de una jeringa y la reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente con agitacion. Se anadio mas THF (1 ml) despues de 30 minutos para ayudar a diluir el precipitado resultante y la mezcla resultante se agito durante otros 30 min. y se transfirio a un embudo de separation que contenia EtOAc (10 ml) y agua (10 ml). La fase organica se recogio, se lavo con salmuera, y los extractos acuosos combinados se lavaron con acetato de etilo (2x). Los extractos organicos combinados se secaron sobre MgSO4, se filtraron y concentraron para proporcionar un aceite crudo rojo oscuro que se purifico mediante cromatografia flash en columna de gel de sflice (300 x 25 mm) y eluyendo con hexanos-EtOAc 9:1 para proporcionar un producto intermedio solido amarillo palido.
Rendimiento: 0,57 g (57 %); Rf 0,24 (9:1 hexanos-EtOAc); UVAmax 225, 320 nm. 1H RMN (CDCh) 5 8,19 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,24 (2H, d, J = 8,4 Hz), 6,33 (1H, s), 4,62 (2 H , s), 4,42 (2H, s), 1,45 (6 H, s). 13C RMN (CDCh) 5 146,6, 142,7, 141,3, 129,4, 123,9, 121,1, 99,9, 64,4, 60,8, 24,1.
El producto intermedio solido amarillo palido (0,25 g, 1,0 mmol) se diluyo con THF (20 ml), la mezcla resultante se trato con 1 N de HCl (10 ml) y se dejo agitar durante 5 min. A la mezcla de reaccion se le anadio eter dietilico (150 ml) y agua y la mezcla resultante se transfirio a un embudo de separacion. La capa organica se seco (MgSO4), se filtro y se concentro para dar un aceite. El diol resultante se recogio en THF-metanol (1:1, 4 ml cada uno, 0,3 M), seguido de la adicion de niquel Raney (100 pl, 100 pl/mmol grupo nitro, suspension en agua al 50%) e hidracina (74 pl, 1,5 eq.) La evolucion de gas se produjo mientras la mezcla de reaccion se calentaba a 50-60 °C. Despues de 30 minutos y 1 hora se agrego 1,5 eq. de hidracina cada vez. La mezcla amarilla se filtro a traves de celita y se lavo con metanol. El filtrado se concentro para proporcionar el compuesto 75 como un aceite que cristalizo despues en un solido amarillo. Rendimiento: 0,14 g (78 %); UVAmax.215, 260 nm. 1H RMN (DMSO) 5 7.00 (2H, d, J = 8,4 Hz), 6,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 6,33 (1H, s), 5,20 (2H, bs), 4,64 (2H, bd), 4,04 (2H, s). 13C RMN (DMSO) 5 147,2, 38,1, 129,6, 126,1, 124,6, 113,7, 63,6, 57,5.
EJEMPLO 27
PREPARACION DEL COMPUESTO 79
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A una mezcla del compuesto 75 (BHMS, 0,12 g, 0,67 mmol) en metanol-diclorometano (1:2, 4,5 ml en total) se anadio Fmoc-Val-Cit (0,33 g, 0,67 mmol), seguido de EEDQ (0,25 g, 1,0 mmol, 1,5 eq.) y la reaccion resultante se dejo en agitacion durante 15 horas bajo atmosfera inerte. Entonces se anadio mas EEdQ (1,5 eq.) y Fmoc-Val-Cit (1,0 eq.) debido a la presencia de BHMS sin reaccionar y la reaccion resultante se dejo en agitacion durante 2 dias y se concentro. El residuo resultante se trituro utilizando eter para proporcionar un producto intermedio solido marron. ES-MS m/z 659 [M+H]+, 681 [M+Na]+; UVAmax 215, 270 nm. 1H RMN (DMSO) 5 10,04 (1 H, s), 8,10 (1 H, d, J= 7,2 Hz), 7 87 (2 H, d, J= 7,6 Hz), 7,72 (2 H, t, J= 7,6 Hz), 7,55 (2 H, d, J= 8,4 Hz), 7,37-7,43 (3 H, m), 7,30 (2 H, t, J= 7,2 Hz), 7,24 (2 H, d, J = 8,4 Hz), 6,47 (1 H, s), 5,96 (1 H, t, J = 5,2 Hz), 5,39 (1 H, s), 4,83 (1 H, t, J= 5,2 Hz), 4,78 (1 H, t, J= 5,2 Hz), 4,40 (1 H, dd, J= 5,2, 8,0 Hz), 4,20-4,30 (3 H, m), 4,11 (2 H, d, J= 4,4 Hz), 4,04 (2 H, d, J= 5,2 Hz), 3,91 (1 H, t, J = 7,2 Hz), 2,84-3,06 (2 H, m), 1,91-2,03 (1 H, m), 1,29-1,74 (4 H, m), 0,86 (3 H, d, J= 6,8 Hz), 0,84 (3 H, d, J= 6,8 Hz).
El producto intermedio solido marron se diluyo con DMF (10 ml) y la mezcla resultante se trato con dietilamina (5 ml), se dejo agitar durante 1 hora y se concentro para proporcionar un solido marron que se seco a alto vado durante 3 dias . El solido marron se trituro utilizando EtOAc (10 ml) y se precipito adicionalmente con eter (80 ml) para
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proporcionar un residuo crudo que se filtro a traves de un embudo de cristal sinterizado y se seco al vado para dar un producto intermedio marron claro. ES-MS m/z 436 [M+H]+, 458 [M+Na]+; UVAmax215, 270 nm.
El producto intermedio marron claro se diluyo con DMF (10 ml) y se trato con ester hidroxisuccinimidico del acido 6- maleimidocaproico (0,16 g, 0,53 mmol, 1 eq.). La reaccion se dejo en agitacion durante 18 h, se anadio mas diisopropiletilamina (1,0 eq) seguido de mas ester hidroxisuccinimidico del acido 6-maleimidocaproico (0,5 eq.). La reaccion resultante se dejo en agitacion durante 4 horas, despues de lo cual la HPLC indico que el material de partida se habia consumido. La mezcla de reaccion se concentro para proporcionar un residuo crudo que se trituro utilizando EtOAc (10 ml) y luego se precipito adicionalmente con eter (75 ml). El precipitado se seco durante la noche para proporcionar un producto intermedio marron/naranja en polvo. Rendimiento total: 0,42 g (cuant.). ES-MS m/z 629 [M+H]+, 651 [M+Na]+; UVAmax 215, 270 nm.
El producto intermedio en polvo marron/naranja (0,40 g, 0,64 mmol) se disolvio parcialmente en DMF (20 ml) y a la mezcla resultante se le anadio bis(4-nitrofenil)carbonato (0,98 g, 3,2 mmol, 5,0 eq. ) y diisopropiletilamina (0,45 ml,
2,5 mmol, 4,0 eq.). La reaccion resultante se dejo en agitacion durante unas 4 horas, tras lo cual, el control por HPLC indico que no quedo material de partida y que la mezcla de reaccion contema 2 productos en una relacion de 3:2 (el bis-carbonato deseado y la 1,3-dioxan-2-ona, respectivamente). La mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se trituro utilizando EtOAc (10 ml), y luego se precipito adicionalmente con eter (80 ml) en un solo proceso. La mezcla de EtOAc-eter se filtro y el solido se seco para proporcionar el compuesto 79 como un polvo marron que se utilizo sin purification adicional.
EJEMPLO 28
PREPARACION DEL COMPUESTO 80
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El compuesto 49 (202 mg, 0,22 pmol, 2,0 eq., 80% de pureza) y el compuesto 79 (180 mg, 0,11 mmol, 1,0 eq., 60% de pureza) se suspendieron en DMF seco (2 ml, 0,1 M) y a la mezcla resultante se le anadio HOBt (3 mg, 22 pmol, 0,2 eq.) seguido de piridina (400 pl, % v/v DMF). La reaccion resultante se dejo en agitacion durante 16 h, se diluyo con DMSO (2 ml) y la mezcla resultante se purifico mediante HPLC preparativa (columna C-is-RP, 5 ^, 100 A, gradiente lineal de MeCN en agua de 10 a 100 % en 40 min seguido de 20 minutos a 100%, con un caudal de 50 ml/min) para proporcionar el compuesto 80 como un solido blanco. Rendimiento: 70 mg (18 %). MALDI-TOF MS m/z 2138,9 [M+Na]+, 2154,9 [M+K]+.
EJEMPLO 29
PREPARACION DEL COMPUESTO 81
imagen103
El compuesto 81 se realizo utilizando el metodo descrito en el Ejemplo 1 y sustituyendo Fmoc-(D)-val-(L)-cit-PABOH por el Compuesto 19.
EJEMPLO 30
5 PREPARACION DEL COMPUESTO 82
imagen104
El compuesto 82 se realizo utilizando el metodo descrito en el Ejemplo 1 y sustituyendo Fmoc-(L)-val-(D)-cit-PABOH por el Compuesto 19.
EJEMPLO 31
10 PREPARACION DEL COMPUESTO 83
imagen105
El compuesto 83 se realizo utilizando el metodo descrito en el Ejemplo 1 y sustituyendo Fmoc-(D)-val-(D)-cit-PABOH por el Compuesto 19.
EJEMPLO 32
PREPARACION DEL COMPUESTO 84
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El compuesto 84 se realizo utilizando el metodo descrito en el Ejemplo 14 y sustituyendo el compuesto 81 por el compuesto 21.
EJEMPLO 33
PREPARACION DEL COMPUESTO 85
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El compuesto 85 se realizo utilizando el metodo descrito en el Ejemplo 14 y sustituyendo el compuesto 82 por el compuesto 21.
EJEMPLO 34
PREPARACION DEL COMPUESTO 86
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El compuesto 86 se realizo utilizando el metodo descrito en el Ejemplo 14 y sustituyendo el compuesto 83 por el compuesto 21.
EJEMPLO 35
PREPARACION DEL COMPUESTO 87
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Se diluyo una mezcla de acido 6-maleimidocaproixo (1,00 g, 4,52 mmol, 1,0 eq.), alcohol p-aminobenflico (1,11 g, 9,04 mmol, 2,0 eq.) y EEDQ (2,24 g, 9,04 mmol, 2,0 eq.) en diclorometano (13 ml). La reaccion resultante se agito durante aproximadamente 16 h., luego se concentro y se purifico utilizando cromatografia en columna flash de un gradiente de EtOAc de 25-100% en hexano para proporcionar un producto intermedio solido. Rendimiento: 1,38 g (96 %); ES-MS m/z 317,22 [M+H]+, 339,13 [M+Na]+; UVAmax 215, 246 nm.
Se diluyo el producto intermedio solido (0,85 g, 2,69 mmol, 1,0 eq.) y bis(4-nitrofenil)carbonato (2,45 g, 8,06 mmol, 3,0 eq.) en DMF (10 ml), y a la mezcla resultante se le anadio diisopropiletilamina (0,94 ml, 5,37 mmol, 2,0 eq.). La reaccion resultante se agito durante aproximadamente 1 h., tras lo cual la RP-HPLC indico que la reaccion se hada completado. La mezcla de reaccion se concentro al vado y el residuo crudo resultante se trituro con eter dietflico (unos 250 ml) para proporcionar un producto intermedio solido blanco tras la filtracion. Rendimiento: 1,25 g (96 %); UVAmax 215, 252 nm.
Se diluyo el producto intermedio solido blanco (259 mg, 0,0538 mmol, 1,0 eq.), MMAE (464 mg, 0,646 mmol, 1,2 eq.) y HOBt (14,5 mg, 0,108 mmol, 0,2 eq.) en piridina/DMF (1:5, 6 ml), y la reaccion resultante se agito durante 10 h, tras lo cual la RP-HPLC indico una reaccion incompleta. La mezcla de reaccion se concentro, el residuo crudo resultante se diluyo utilizando DMF (3 ml), y a la mezcla resultante se le anadio diisopropiletilamina (0,469 ml, 0,538 mmol, 1,0 eq.) y la reaccion resultante se dejo en agitacion durante unas 16 h. La mezcla de reaccion se purifico directamente utilizando Chromatotron® (cromatografia radial en capa fina) con un gradiente (0-5% de metanol en diclorometano), para proporcionar el compuesto 87 como un solido blanco. Rendimiento: 217 mg (38 %); ES-MS m/z 1082,64 [M+Na]+; UVAmax 215, 248 nm.
EJEMPLO 36
PREPARACION DEL COMPUESTO 88
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Se suspendio Fmoc-Val-cit (Patente US 6.214.345 a nombre de Firestone et al.) en diclorometano (50 ml) y la mezcla resultante se trato con HBr al 33% en HOAc (20 ml), que se anadio a traves de una pipeta durante unos 5 minutos. Despues de agitar durante unos 10 minutos, se demostro que la mezcla de reaccion se hada completado utilizando HPLC. La mezcla de reaccion se diluyo con hielo (unos 500 ml) y se anadio bicarbonato sodico acuoso saturado lentamente mientras se agitaba hasta que la evolucion de gas ceso. La masa gelatinosa resultante se filtro y lavo con agua destilada para proporcionar un solido que se seco a alto vado, en presencia de P2O5 durante 24 h. El producto intermedio en polvo marron (Fmoc-val-cit-PAB-Br) tuvo una pureza de aproximadamente 70 % por HPLC y se utilizo sin purificacion adicional.
El producto intermedio en polvo marron (30 mg, 40,6 ^mol) y el compuesto 53 (34 mg, 40,6 ^mol) se disolvieron en DMF (1 ml), y a la mezcla resultante se le anadio diisopropiletilamina (21 ^l, 0,12 mmol, 3,0 eq.). La reaccion resultante se dejo en agitacion durante 6 h., se diluyo en DMSO (1 ml) y se purifico inmediatamente usando HPLC preparativa (columna C12-RP, 5 ^, 100 A, gradiente lineal de MeCN en agua (conteniendo acido formico al 0,1%) de
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10 a 100% en 40 min seguido de 20 minutos a 100%, con un caudal de 25 ml/min) para proporcionar un producto intermedio en polvo marron claro. Rendimiento: 5 mg (8 %); ES-MS m/z 14207,2 [M+H]+, 1443 [M+Na]+; UVAmax 205, 258 nm.
El producto intermedio en polvo marron claro (4 mg, 9,5 ^mol) se diluyo con DMF (1 ml) y la mezcla resultante se trato con dietilamina (0,5 ml). La reaccion resultante se completo en 1 h segun la HPLC. La mezcla de reaccion se concentro para proporcionar un residuo solido oleoso que se trituro con eter (3x) para proporcionar un residuo crudo. El residuo bruto se diluyo con DMF (1 ml) y a la mezcla resultante se le anadio ester hidroxisuccinimidico del acido 6-maleimidocaproico (3 mg, 9,5 ^mol). La reaccion resultante se dejo agitar la reaccion a temperatura ambiente durante unas 16 h. La mezcla de reaccion se purifico directamente utilizando HPLC preparativa (columna C12-RP, 5 ^, 100 A, gradiente lineal de MeCN en agua (conteniendo acido formico al 0,1 %) de 10 a 100% en 40 min seguido de 20 minutos a 100%, con un caudal de 25 ml/min) para proporcionar el compuesto 88 como un solido ligeramente marron. Rendimiento: 3,9 mg (cuant); ES-MS m/z 1391 [M+H]+; UVAmax 205, 250 nm.
EJEMPLO 37
PREPARACION DEL COMPUESTO 89
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El compuesto 89A se preparo utilizando el metodo descrito en el Ejemplo 9 y sustituyendo el tripeptido del compuesto 43 por el producto intermedio tripeptido del compuesto 42.
Preparacion del Compuesto 89
El compuesto 89a (0,13 g, 0,15 ^mol, 1,0 mmol), el compuesto 21 (0,12 g, 0,17 mmol, 1,1 eq.) y HOBt (4 mg, 31 ^mol, 0,2 eq.) se suspendieron en DMF/piridina (2 ml/0,5 ml, respectivamente). La reaccion resultante se dejo en agitacion durante unas 4 h., luego se le anadio diisopropiletilamina (27 ^l, 0,15 mmol, 1,0 eq.) y la reaccion resultante se dejo en agitacion durante unas 54 h, y se concentro a vado. El crudo resultante se diluyo con DMSO y se purifico utilizando HPLC preparativa (columna Ci2-RP, 5 ^, 100 A, gradiente lineal de MeCN en agua (conteniendo TFA al 0,1%) de 10 a 100% en 40 min seguido de 20 minutos a 100%, con un caudal de 25 ml/min) para proporcionar un aceite de color amarillo que se recogio en una cantidad minima de diclorometano y se precipito con abundante eter para producir el compuesto 89 como un polvo marron.
Rendimiento: 0,15 mg (68 %). ES-MS m/z 1449,14 [M+H]+; UVA max 215, 258 nm.
EJEMPLO 38
PREPARACION DEL COMPUESTO 90
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Se diluyo dihidrocloruro de 1,4-fenilendiamina (3,06 g, 17 mmoles) y dicarbonato di-t-butflico (3,69 g, 17 mmoles) 5 con 30 ml de diclorometano. A la mezcla resultante se le anadio diisopropiletilamina (8,83 ml, 50,7 mmol, 3,0 eq.) y la reaccion resultante se dejo en agitacion durante 1 h. La mezcla de reaccion se transfirio a un embudo de separation y la fase organica se lavo con agua (3 x 10 ml). La capa organica se conservo a 4 °C durante 15 h y se produjo la cristalizacion del producto. Los cristales se recogieron por filtration y se lavaron con diclorometano frio para proporcionar el compuesto 90 como un solido cristalino. (1,2 g, 34 %). UVAmax 215, 250 nm. 1H RMN (DMSO) 5 10 8,78 (1 H, bs), 7,04 (2 H, bd, J = 7,2 Hz), 6,43 (2H, d, J = 7,2 Hz), 4,72 (2H, s) , 1,41 (9 H, s).
EJEMPLO 39
PREPARACION DEL COMPUESTO 91
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Una solution de cAC10 (10 mg/ml en 25 mM de citrato sodico, 250 mM de cloruro de sodio, Tween 80 al 0,02 %, pH 15 6,5) se ajusto a pH 7,5 por adicion de 0,3 M de fosfato de sodio dibasico. A esta solucion de cAC10 con el pH
ajustado se le anadio EDTA para una concentration final de 5 mM. Entonces la solucion de cAC10 se calento previamente a 37 °C por incubation en un horno de temperatura controlada. Despues de equilibrar la temperatura de la solucion de cAC10 a 37 °C, se anadio DTT (de una solucion madre de 10 mM) para alcanzar una relation molar de DTT a cAC10 de alrededor de 3,0 en la reaccion de reduction (se utilizo un peso molecular de 148.500 Da para 20 cAC10). La reaccion de reduccion se dejo proceder durante 2 horas a 37 °C.
Al final de la incubacion, la reaccion de reduccion se enfrio a una temperatura interna de 2 a 8 °C en un bano de hielo-agua. La temperatura de la solucion se mantuvo entre 2 y 8 °C en todo el resto de los pasos de conjugation. La reaccion de reduccion fria se sometio a una diafiltracion de volumen constante para eliminar el exceso de DTT utilizando una membrana de 30 kDa y el tampon se cambio por una solucion salina tamponada con fosfato pH 7,4 25 (PBS). Despues de la diafiltracion, se determino la concentracion exenta de tioles en el cAC10 reducido y diafiltrado utilizando el Procedimiento General M. La conjugacion se realizo entonces mediante la adicion de un exceso molar del 15% del compuesto 58 (de una solucion madre de 13 mg/ml en DMSO) en relacion con los tioles totales determinados mediante el Procedimiento General M. Se anadio mas DMSO a la reaccion de conjugacion para lograr una concentracion final de DMSO del 15% (v/v). La reaccion de conjugacion se dejo proceder durante un total de 30 30 min.
Al final de la reaccion de conjugacion, se extinguio cualquier excedente del compuesto de farmaco-enlazador sin reaccionar por la adicion de abundante cistema (exceso molar de 2X con respecto a los tioles totales determinados utilizando el Procedimiento General M, realizado en el cAC10 reducido y diafiltrado para producir la mezcla de reaccion extinguida. La mezcla de reaccion extinguida se purifico eliminando los contaminantes de pequenas 35 moleculas a traves de una diafiltracion de volumen constante utilizando una membrana de 30 kDa y el tampon se
cambio por PBS, pH 7,4. Despues de la diafiltracion, el conjugado se paso por un filtro esteril utilizando un filtro de 0,22 micras para proporcionar el compuesto 91 en una solution clara e incolora.
EJEMPLO 40
PREPARACION DEL COMPUESTO 92
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El compuesto 92 se preparo utilizando el metodo descrito en el Ejemplo 39 utilizando una cantidad de DTT (de una solucion madre de 10 mM), que proporciono una relation molar final de DTT-cAC10 de aproximadamente 1,5 en la reaction de reduction.
6.2 EXPERIMENTOS DE CITOTOXICIDAD IN VITRO
10 Las lmeas celulares utilizadas fueron carcinoma de mama humano H3396 (antigeno positivo cBR96, antigeno negativo cAC10), carcinoma colorrectal humano HCT-116 (antigeno negativo cBR96 y cAClO) y linfoma anaplasico de celulas grandes humano Karpas (LACG) (antigeno negativo cBR96, antigeno positivo cAC10). Estas lmeas celulares son suministradas por el ATCC. La lmea celular L540 de la enfermedad de Hodgkin (HD) de CD30 positiva y la lmea celular Karpas 299 se obtuvieron de la Deutsche Sammlung von und Mikroorganism Zellkulturen GmbH 15 (Braunschweig, Alemania). L540cy, un derivado de la L540 HD adaptado al crecimiento de aloinjertos, fue proporcionado por el Dr. Phil Thorpe (Universidad de Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX). Las lmeas celulares se cultivaron en medio rPmI-1640 (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD), complementadas con suero fetal bovino al 10%. Se sembraron las celulas H3396 en RPMI con suero fetal bovino al 10% (al que se llamara medio) en placas de 96 pocillos en aproximadamente 3.000-10.000 celulas/pocillo y se dejo que se adhirieran 20 durante toda la noche. La lmea celular Karpas no adherente se sembro en aproximadamente 10.000 celulas/pocillo al inicio del ensayo. Se anadieron varias concentraciones de los compuestos ilustrativos de la invention en el medio por triplicado, y despues de los tiempos indicados en las figuras 1-7, se retiro el medio y las celulas se lavaron con medio fresco tres veces. Despues de un periodo de 96 horas de incubation a 37 °C, se anadio azul Alamar y se determino la viabilidad celular 4 horas mas tarde segun lo descrito por Ahmed SA, Gogal RM Jr, Walsh JE., J. 25 Immunol. Methods, 170, 211-224, 1994.
Se utilizaron ratones C.B.-17 SCID (Harlan, Indianapolis, IN) para los experimentos in vivo.
EJEMPLO 41
DATOS DE CITOTOXICIDAD IN VITRO
Los efectos citotoxicos del compuesto 49 y el compuesto 53 en las celulas de carcinoma de mama humano H3396 30 se muestran en la figura 1. Los datos muestran que despues de la exposition durante 1 hora, el compuesto 53 es mas citotoxico que el compuesto 49 en concentraciones de hasta 0,01 mM. Los compuestos muestran sustancialmente la misma citotoxicidad a concentraciones entre 0,01 mM y 1,0 mM.
EJEMPLO 42
DATOS DE CITOTOXICIDAD IN VITRO
35 La figura 2 muestra los efectos citotoxicos de los compuestos 64, 65, 68 y 69 en celulas de carcinoma de mama humano H3396 (antigeno positivo cBR96, antigeno negativo cAC10). Los datos muestran que los compuestos 64 y 68 demuestran una citotoxicidad similar y significativa, mientras que los compuestos 65 y 69 son menos eficaces, pero citotoxicos contra las celulas H3396 en este ensayo en particular.
EJEMPLO 43
40 DATOS DE CITOTOXICIDAD IN VITRO
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La figura 3 muestra los efectos citotoxicos de los compuestos 64, 65, 68 y 69 en celulas de carcinoma colorrectal humano HCT-116 (antigeno negativo cBR96, antigeno negativo cAC10). Los datos ilustran que ninguno de los compuestos 64, 65, 68 y 69 es citotoxico hacia las celulas HCT-116 con el antfgeno negativo en este ensayo.
EJEMPLO 44
DATOS DE CITOTOXICIDAD IN VITRO
La figura 4 ilustra los efectos citotoxicos de los compuestos 66 y 68 en celulas de carcinoma de mama humano H3396 (antigeno positivo cBR96). Los datos muestran que ambos compuestos son altamente citotoxicos a concentraciones superiores a 0,1 mM y que el Compuesto 68 muestra una mayor citotoxicidad que el compuesto 66 en concentraciones entre 0,01 mg/ml y 0,4 mg/ml.
EJEMPLO 45
DATOS DE CITOTOXICIDAD IN VITRO
La figura 5 ilustra la citotoxicidad de los compuestos 66, 68 y 69 en el linfoma anaplasico de celulas grandes humano Karpas (antfgeno negativo cBR96, antfgeno positivo cAC10). Los datos muestran que el compuesto 69 era mas citotoxico hacia las celulas Karpas en comparacion con los compuestos 68 y 66 en este ensayo. El compuesto 69 demostro una citotoxicidad significativa con concentraciones superiores a 0.001 mM, mientras que el compuesto 66 y el compuesto 68 no fueron citotoxicos a concentraciones inferiores a 1,0 mg/ml.
EJEMPLO 46
DATOS DE CITOTOXICIDAD IN VITRO
La figura 6 ilustra la citotoxicidad de los compuestos 66 y 67 a las 2 h. y 96 h. en celulas de carcinoma de mama humano H3396 (antfgeno positivo cBR96, antfgeno negativo cAC10). Los datos muestran que el compuesto 66 es altamente citotoxico a concentraciones superiores a 100 mg/ml en una exposicion a corto plazo (2 h) mg/ml, y en concentraciones superiores a 100 mg/ml durante la exposicion a largo plazo (96 h). El compuesto 67 no demostro citotoxicidad contra las celulas H3396 en este ensayo en concentraciones de hasta 1000 mg/ml.
Procedimiento general S: Prueba in vivo de una seleccion de conjugados de farmaco-enlazador-anticuerpo. Para la lrnea celular de adenocarcinoma humano L2987, a unos ratones calvos atfmicos (de 8-10 semanas de edad) se les implantaron tumores o celulas tumorales de aloinjerto. Para el modelo de linfoma anaplasico de celulas grandes humano Karpas, se implantaron a ratones CB-17 SCID subcutaneamente con 5 x 106 celulas. En los dos modelos tumorales, la terapia se inicio una vez que los tumores alcanzaron un volumen medio de 100 mm3. Los grupos de ratones fueron inyectados con uno de los compuestos 66-69 en solucion salina tamponada con fosfato por via intravenosa cada cuatro dfas para un total de 6 inyecciones para los animales con L2987 y dos inyecciones para los animales con Karpas. El volumen tumoral se calculo utilizando la formula: 0,5 (dimension mayor x dimension2 perpendicular). Los ratones se retiraron del estudio cuando los tumores fueron de aproximadamente 1.000 mm3, momento en el que el tamano medio del tumor en el grupo en particular dejo de representarse en el grafico.
EJEMPLO 47
EFICACIA TERAPEUTICA IN VIVO EN TUMORES L2987
La figura 7 muestra los efectos terapeuticos de los compuestos 66-69 en tumores de aloinjertos de adenocarcinoma pulmonar humano L2987 (antfgeno positivo cBR96, antfgeno negativo cAC10) implantados en ratones calvos atfmicos. Se siguio el Procedimiento general S utilizando tumores pulmonares humanos L2987 subcutaneos (para su transferencia in vivo). A los ratones se les administro por inyeccion uno de los compuestos 66, 67, 68 o 69 a intervalos de cuatro dfas para un total de 6 inyecciones. La primera inyeccion fue a los 15 dfas posteriores al implante del tumor. Los datos ilustran que la administracion del compuesto 66 y el compuesto 68 reduce notablemente el volumen del tumor sin que se observara ningun crecimiento adicional en los ratones tratados durante aproximadamente 25 dfas despues de la ultima inyeccion. El compuesto 67 y el compuesto 69 fueron menos eficaces, pero inhibieron la multiplicacion de las celulas tumorales en los ratones tratados. La prueba se detuvo en los animales que recibieron los compuestos 67 y 69 cuando el volumen del tumor supero 1.000 mm3.
EJEMPLO 48
EFICACIA TERAPEUTICA IN VIVO EN TUMORES KARPAS
La figura 8 muestra los efectos terapeuticos de los compuestos 66-69 en tumores de aloinjertos de linfoma anaplasico de celulas grandes humano Karpas (antfgeno positivo cAC10, antfgeno negativo cBR96) implantados en ratones calvos. Se siguio el Procedimiento General S utilizando el modelo de linfoma anaplasico de celulas grandes
5
10
15
20
25
30
35
40
humano Karpas, implantando a ratones CB-17 SCID subcutaneamente con 5 x 106 celulas. A los ratones se les administro por via intravenosa uno de los compuestos 66, 67, 68 o 69 a intervalos de cuatro d^as para un total de 2 inyecciones empezando en el d^a 8. Los datos ilustran que los compuestos 67 y 69 indujeron regresiones completas y que los tumores progresaron en los animales que recibieron cantidades sustancialmente equivalentes de los compuestos 66 y 68.
EJEMPLO 49
DETERMlNACION DE LA CITOTOXICIDAD DE UNA SELECCION DE COMPUESTOS EN CELULAS CD30- Y CD30+
Despues de su caracterizacion ffsica, se evaluo la citotoxicidad in vitro de los compuestos 67, 91 y 92 en celulas CD30+ Karpas 299 y CD30" Raji utilizando el ensayo con azul Alamar como se describio anteriormente. El porcentaje de celulas viables se represento en un grafico frente a la concentracion de cada molecula para determinar la IC50 (definida como la concentracion de mAb que dio una eliminacion del 50% de las celulas).
El compuesto 67 demostro actividad contra de las celulas Karpas 299 con un IC50 de 4 ng/ml. El IC50 fue inversamente proporcional a la carga del farmaco, ya que aumento de 4 ng/ml para el compuesto 67 a 7 ng/ml para el Compuesto 91 y a 40 ng/ml para el compuesto 92. La selectividad de los compuestos probados se evaluo utilizando la lrnea celular Raji con el antfgeno negativo, que fue imperceptible para todos los compuestos que conternan cAC10 con valores de IC50 > 1000 ng/ml para los compuestos 67, 9l y 92.
EJEMPLO 50
CITOTOXICIDAD EN UNA SELECCION DE COMPUESTOS EN MODELOS DE ALOINJERTOS DE HD Y ALCL
Se evaluo la citotoxicidad de los compuestos 67, 91 y 92 en modelos de aloinjertos de enfermedad de Hodgkin L540c2 y de linfoma de celulas grandes anaplasico humano Karpas 99 en ratones C.B.-17 SCID. Las evaluaciones se iniciaron cuando el volumen de los tumores alcanzo un promedio de 50 a 100 mm3. Las cohortes de ratones portadores de Karpas-299 se inyectaron 4 veces durante 4 dfas con el compuesto 92, el compuesto 91 o el compuesto 67 con 0,25 mg/kg o 0,5 mg/kg. Ninguno de los animales tratados con 0,25 mg/kg tuvo una regresion, aunque se produjo un retraso en el crecimiento tumoral, en comparacion con los controles no tratados, de los animales tratados con el compuesto 91 y el compuesto 67. El tratamiento de los tumores Karpas con el compuesto 91 y el compuesto 67 con 0,5 mg/kg 4 veces al dfa durante 4 dfa consiguio 5/5 regresiones completas y 4/5 regresiones completas, respectivamente. Se observo un retraso en el crecimiento del tumor, en comparacion con los animales no tratados para el Compuesto 92 con 0,5 mg/kg 4 veces al dfa durante 4 dfas, pero no se obtuvieron regresiones completas.
Tambien se probo la eficacia en un modelo de Karpas subcutaneo con una seleccion de compuestos administrados como una dosis unica. El compuesto 91 y el compuesto 67 fueron inyectados con dosis unica de 0,25, 0,5 y 2,0 mg/kg. En la dosis de 0,25 mg/kg no hubo actividad antitumoral en ninguno de los grupos y el volumen del tumor no se desvio de los controles no tratados. Se demostro un retraso en el crecimiento del tumor por las dos moleculas de 0,5 mg/kg, pero no se obtuvieron regresiones completas. El tratamiento de los ratones con el compuesto 91 y el compuesto 67 con 2 mg/kg alcanzo el 100% de las regresiones completas en ambos grupos.
El compuesto 91 y el compuesto 67 se compararon tambien en ratones portadores de tumores HD humanos L540cy subcutaneos tratados con el compuesto 4 veces al dfa durante 4 dfas con el compuesto 91 y el compuesto 67 con 1 y 3 mg/kg. En los ratones tratados con el compuesto 91 y el compuesto 67 con 1 mg/kg se produjeron retrasos significativos en el crecimiento del tumor en comparacion con los animales no tratados. Se observaron regresiones completas en los ratones administrados con ambos, el compuestos 91 y el compuesto 67 con 3 mg/kg.

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion farmaceutica adaptada para administracion intravenosa a seres humanos, que comprende un compuesto de la formula Ia:
    L-(-Ar-W—Yy-^p la
    o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos en los que,
    L- es un anticuerpo monoclonal que se une inmunoespedficamente al antfgeno CD30;
    -A- es una unidad de extensor; a es 1;
    cada -W- es independientemente una unidad de aminoacido; w es un numero entero que vana de 2 a 12;
    - Y- es una unidad de espaciador que se autoinmola; y es 1 o 2;
    p vana de 1 a alrededor de 20, y es el numero promedio de unidades -Aa-Ww-Yy-D por anticuerpo en la composicion; y
    - D es una unidad de farmaco,
    en el que los compuestos de formula la tienen la estructura
    imagen1
    o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo.
  2. 2. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 1, en la que el anticuerpo es un anticuerpo quimerico AC 10.
  3. 3. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 2, en la que p vana de 1 a alrededor de 5.
  4. 4. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 2, en la que p vana de alrededor de 3 a alrededor de 5.
  5. 5. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composicion farmaceutica es un polvo liofilizado seco.
  6. 6. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composicion farmaceutica esta en forma de un lfquido.
  7. 7. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento de cancer.
  8. 8. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 7, que es para uso en el tratamiento de un cancer hematologico.
  9. 9. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 8, en la que el cancer hematologico es linfoma de Hodgkin.
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