CN107759699A

CN107759699A - 靶向cd30抗原的转基因t细胞及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN107759699A
Application number: CN201710969264.1A
Authority: CN
Inventors: 黄昕华; 生德伟; 于丽丽; 张晋伟; 庞勇; 李德柱
Original assignee: Yinfeng Biological Group Ltd
Current assignee: Yinfeng Biological Group Ltd
Priority date: 2017-10-18
Filing date: 2017-10-18
Publication date: 2018-03-06

Abstract

本发明公开了一种靶向CD30抗原的转基因T细胞，为染色体中整合有SEQ ID NO:2所示的编码靶向CD30抗原的基因、且敲除了PD1基因或/和CTLA4基因的原始细胞，或：包含有重组慢病毒表达载体(包含有SEQ ID NO:2所示的编码靶向CD30抗原的基因，以及靶向PD1基因的shRNA或/和靶向CTLA4基因的shRNA)的原始细胞；所述原始细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。制备方法为：(1)慢病毒感染CD4+T细胞或CD8+T细胞；(2gRNA、CRISPR‑cas9mRNA、HDR混合，电转重组T细胞，即得。本发明在carT构建中，引入了EGFR的识别序列，必要时可用EGFR单抗Cetuximab消除carT细胞，并且敲除或沉默了PD1、CTLA4基因，解除了其对carT细胞的抑制，增强了carT细胞克服肿瘤微环境抑制免疫细胞功能。

Description

靶向CD30抗原的转基因T细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及靶向CD30抗原的转基因T细胞及其制备方法与应用。

背景技术

恶性淋巴瘤是淋巴结和结外部位淋巴组织的免疫细胞肿瘤，来源于淋巴细胞或组织细胞的恶变。是青年人中最常见的恶性肿瘤之一。病变主要发生在淋巴结，以颈部淋巴结和锁骨上淋巴结最为常见，其次是纵隔、腹膜后、主动脉旁淋巴结。病变从一个或一组淋巴结开始，通常表现由原发灶沿淋巴道向邻近淋巴结有规律的逐站播散。晚期可发生血行播散，侵犯血管，累及脾、肝、骨髓和消化道等部位。

在我国，恶性淋巴瘤近年来新发病例逐年上升，每年至少超过25000例，而在欧洲、美洲和澳大利亚等西方国家的发病率可高达11/10万～18/10万，略高于各类白血病的总和。在美国每年至少发现新病例3万以上。我国恶性淋巴瘤的死亡率为1.5/10万，占所有恶性肿瘤死亡位数的第11～13位，与白血病相仿。

霍奇金淋巴瘤(HL)占全部肿瘤的0.1％～0.2％。年发病率1/10万～4/10万人口，在亚洲较少见。我国上海市1989年统计标准化年发病率1.1/10万人口，在淋巴瘤中占16.5％～22.5％(西方国家为34.6％～51.6％)。男性多于女性(1.3～1.4∶1)。发病年龄发达国家呈双峰分布，第1年龄高峰在15～35岁，第2年龄高峰在55岁以后。我国和日本发病无年龄的双峰分布，发病者多为40岁左右。

非霍奇金淋巴瘤(NHL)占中国全部淋巴瘤病例的90％左右，并且近十几年来发病率逐年升高，分为B细胞型和T/NK细胞型两大类。B细胞型淋巴瘤占70％左右，又进一步分为高度侵袭性、侵袭性和惰性淋巴瘤三大类；T/NK细胞型淋巴瘤约占30％，主要分为高度侵袭性和侵袭性两大类。

石远凯主编的《淋巴瘤》一书中指出，PTCL在我国和其他亚洲国家发病率约占所有NHL的29.6～39.1％，中位生存期大约2年。

2015年12月，美国Baylor医学院临床试验在美国血液病年会初步报道，anti-CD30-CD28-CD3zeta构建临床试验9患者，2CR，4PR，3PD。抗CD30的单抗药物Brentuximabvedotin给药1次，初始剂量为0.1mg/kg，最高剂量为3.6mg/kg，17例(38％)患者发生客观反应，其中包括11例完全缓解(25％)。当给药剂量达到最大耐受剂量(1.8mg/kg)时，接受治疗的12例患者中客观反应率为50％(6例)，副作用主要是疲劳、发热、腹泻、恶心、嗜中性白血球减少和外周神经病变等。在另一项I期临床试验中，患者每周给药一次(4周一个疗程，前3周给药)，初始剂量为0.4mg/kg，最高剂量为1.4mg/kg，85％的患者肿瘤有消退，59％的患者发生客观反应，其中34％的患者完全缓解。

car T技术的基本原理嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。患者的T细胞被“重编码”后，生成大量肿瘤特异性的CAR-T细胞。

第一代CAR由识别肿瘤表面抗原的单链抗体(single chain fragment variable，scFv)和免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activationmotifs，ITAM，通常为CD3-ζ和FcεRIγ)组成。早期的实验证明了CAR-T的可行性，然而第一代CAR只能引起短暂的T细胞增值和较低的细胞因子分泌，不能提供长时间的T细胞扩增信号和持续的体内抗肿瘤效应。

依照T细胞活化的双信号学说，T细胞的激活和增殖需要共刺激信号；第二代、第三代CAR引入了共刺激分子信号序列(costimulatory molecule，CM)，旨在提高T细胞的细胞毒活性、增殖性与存活时间，促进细胞因子的释放。现有的国内外第2代carT细胞培养技术，大致遵循类似的技术路线，即在分离患者外周血单个核细胞后，起始培养1～2天后，转染逆转录病毒(retroviral)，或慢病毒(lentiviral)，或转座子(transponson)为载体的基因表达嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，car)分子，加共刺激因素(IL2等生长因子，辅助以CD3CD28抗体，或者抗原表达的细胞株等)培养7～30天后，回输患者。

欧美少量临床试验的数据表明，现有的CD30 chimeric antigen receptor T(carT)技术，治疗顽固性霍奇金淋巴瘤(HL)响应率66％，高于单抗药物Brentuximab-vedotin38％。存在的临床不足如下：

1、患者在治疗过程中需要密切监护，有中度的CRS，主导原因之一是数十倍于正常水平的血清IL6。欧美临床对此有比较好的处理方案，主要是IL6R单抗或大剂量类固醇激素。

2、治疗有效率低于典型的CD19 carT 70～90％完全治愈率(CR)，有效率有待提高，有待于克服肿瘤微环境的抑制。

3、长期存在的CD30 carT可能对患者有持久毒性。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种靶向CD30抗原的转基因T细胞，及其制备方法。本发明在carT构建中，引入了EGFR的识别序列，必要时可用EGFR单抗Cetuximab消除carT细胞，并且敲除或沉默了PD1、CTLA4基因，解除了其对carT细胞的抑制，增强了carT细胞克服肿瘤微环境抑制免疫细胞功能。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种靶向CD30抗原的受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其结构为：anti-CD30 AC10 scFv-CD27 Hinge-TM-CD28-41BB-CD3zeta。

一种编码上述靶向CD30抗原受体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；其结构为：anti-CD30 AC10 scFv-CD27 Hinge-TM-CD28-41BB-CD3zeta。

一种重组慢病毒表达载体，其包含有上述编码靶向CD30抗原的基因。或：一种重组慢病毒表达载体，其包含有上述编码靶向CD30抗原的基因，以及靶向PD1基因的shRNA或/和靶向CTLA4基因的shRNA。

本发明的重组表达载体的病毒包被系统，为常规方法(第2代或第3代慢病毒包被系统)；本发明所使用的慢病毒表达载体(lentiviral expression vector)SIN-3LTR的载体，母本来自1998年发表的载体序列(Dull T et al(1998)A third-generationlentivirus vector with a conditional packaging system.JVirol.1998Nov；72(11):8463-71.)。

所述靶向PD1基因的shRNA，包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.3所示，反义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.4所示。

所述靶向CTLA4基因的shRNA，包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.5所示，反义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.6所示。

一种靶向CD30抗原的转基因T细胞，为包含有上述重组慢病毒表达载体的原始细胞，所述原始细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。或：为包含有上述重组慢病毒表达载体的、且敲除了PD1基因或/和CTLA4基因的原始细胞，或染色体中整合有上述编码靶向CD30抗原的基因、且敲除了PD1基因或/和CTLA4基因的原始细胞，所述原始细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。

一种靶向CD30抗原的转基因T细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)慢病毒感染CD4+T细胞或CD8+T细胞：利用上述重组慢病毒表达载体感染CD4+T细胞或CD8+T细胞，得重组T细胞；感染方法为常规方法；若重组慢病毒表达载体中不包含靶向PD1基因的shRNA和靶向CTLA4基因的shRNA，则进行步骤(2)；

(2)gRNA、CRISPR-cas9mRNA、HDR混合，电转重组T细胞(400V，0.5ms)，即得靶向CD30抗原的转基因T细胞，其PD1基因、CTLA4基因被敲除，染色体中整合有编码靶向CD30抗原受体的基因。所述gRNA为靶向PD1基因的gRNA或靶向CTLA4基因的gRNA，所述HDR为PD1基因的HDR或CTLA4基因的HDR。

所述CRISPR-cas9mRNA，是通过体外转录spCas9-2.0得到。SpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0(简称spCas9-2.0)为现有技术中已有的序列，为张峰(ZhangFeng)所发布，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示(序列所示为相对应的DNA序列)；克隆出spCas9-2.0的cas9蛋白的mRNA，克隆到pUC19质粒中，经过in vitro转录和5’加帽反应，形成成熟的mRNA，供细胞转染，适合E.coli表达。

所述靶向PD1基因的gRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示(序列所示为相对应的DNA序列)。

所述靶向CTLA4基因的gRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示(序列所示为相对应的DNA序列)。

所述PD1基因的HDR，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

所述CTLA4基因的HDR，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

所述靶向CD30抗原的转基因T细胞在制备治疗霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤的药物中的应用。

本发明的技术方案，针对问题3，本发明提出必要时用anti-EGFR单抗Cetuximab和anti-CD20单抗Rituximab消除carT细胞。在carT构建中，引入EGFR和CD20的识别位点。本发明提出用人源化单抗制作的scFv降低免疫原性。改进细胞培养方案增强car T细胞的中央记忆细胞(central memory T)的比例。针对问题2，本发明提出用基因编辑的方法，敲除PD1CTLA4基因的，解除对carT细胞的抑制，增强carT细胞克服肿瘤微环境抑制免疫细胞功能。

附图说明

图1：：anti-CD30 carT细胞的增殖示意图。

图2：各种构建的CD30 carT在不同的培养刺激后的增殖曲线。

图3：病毒滴度稀释法在K562细胞株的测试示意图。

图4：CD30 carT培养后，以goat anti-mouse Fab抗体测量anti-CD30 car分子的表达示意图。

图5：CD30 carT杀K562-CD30示意图。

图6：CD30 carT杀伤K562-CD30细胞因子释放图。

图7：CD30几种构建的carT杀伤K562-CD30的不同E∶T比例的24小时杀伤曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1 构建慢病毒表达载体

(1)构建anti-CD30 AC10 scFv-CD27 Hinge-TM-CD28-41BB-CD3zeta：构建方法为常规方法。

(2)构建慢病毒表达载体：

用RPMI1640+10％ FBS培养293T细胞。待细胞90％密度后，用lipo2000 293T细胞，转染方法按照Invitrogen厂商的标准操作，质粒有：表达质粒，pMDLg/pRRE,pRSV-Rev，pMD2.G，混合质粒按照2∶1∶1∶0.5的比例，转染293T细胞。24-48小时后收获慢病毒上清2次。超离心100,000g 120min，去除上清，获取慢病毒沉淀，加无血清T细胞培养基，重悬后用稀释法感染K562测量病毒感染滴度(IU/ml)。

获得某个实验批次的慢病毒数据(如表1所示)，实验步骤如下：

1.感染前6h在24孔细胞培养板中以2.5×105个细胞/孔均匀接种HEK293细胞。

2.将慢病毒进行梯度稀释，共做3个梯度，即每孔(500μl无双抗、无血清的DMEM培养基)中含10μl、1μl、0.1μl病毒，震荡混匀后加至接种好细胞的24孔板中，加病毒之前将培养板中的培养基吸净。

3.感染18-20h后，将培养板中的培养基更换为新鲜的DMEM完全培养基。

4.感染64-68h后收集细胞并进行基因组DNA的提取。

5.提取基因组DNA(按照AxyGEN的基因组DNA提取试剂盒说明书)。

6.以被测慢病毒载体梯度稀释为标准品，慢病毒载体上的通用引物进行qPCR以获得病毒整合拷贝数。

7.以Actin质粒梯度稀释为标准品，Actin引物进行qPCR检测样品的基因组拷贝数以得到基因组拷贝数。

表1 慢病毒滴度数据(qPCR法检测)

慢病毒滴度数据，qPCR法检测

实施例2 转染T细胞

健康人或肿瘤患者的外周血抽取50-100ml，或者用Cobra Spectra血细胞分离机获取单个核细胞，经过Ficoll分离后，用CD4+或CD8+磁珠分选(磁珠购自Stem CellTechnologies公司)。

慢病毒感染人CD4+T或CD8+T细胞：制备和浓缩后的慢病毒感染参考TakaraRetronectin说明书，简单描述如下：

制备Retronectin浓度20-100μg/ml，铺板使用密度是4-20μg/cm²，室温2小时后，吸去上清备用；用慢病毒加到上述板125-250μl/cm²，37C温浴4-6小时；待感染T细胞以密度0.5-2.5×10⁴cells/cm²铺板。T细胞感染24小时后换液。

T细胞培养1天后(培养基配方：Lonza X vivo15，成人血清10％，IL2300-500IU/ml，

penicillin(100units/ml)and streptomycin(100μg/ml)，用抗CD3CD28的磁珠(与car T细胞3∶1混合)，刺激CD19 carT细胞生长。

实施例3 敲除PD1基因、CTLA4基因

分别进行敲除PD1基因、CTLA4基因的实验，具体方式如下：

gRNA、CRISPR-cas9 mRNA、HDR混合，电转重组T细胞(400V，0.5ms)。

电转后，培养细胞24小时后换培养基(所用培养基为：Lonza X vivo15，成人血清10％，IL2500IU/ml，gentamycin 100ug/ml，IL155ng/ml，IL215ng/ml OKT3antibody 50ng/ml)，，在预先用OKT单抗包被(10ug/ml，25C 4hr)后的T75flask中继续培养，每2天计数一次，观察细胞形态和添加培养液，维持细胞浓度在1.0-3.0×10⁶/ml之间。培养第10天后离心收获T细胞，洗涤去除培养液。

所述CRISPR-cas9 mRNA核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；

敲除PD1基因时，靶向PD1基因的gRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；PD1基因的HDR核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；

敲除CTLA4基因时，靶向CTLA4基因的gRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；CTLA4基因的HDR核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

扩增基因敲除位置附近所用引物为：

靶向PD1的exon2附近区域的引物：

Forward：TTCCTCACCTCTCTCCATCTC；

Reverse：CTCTCTTTGATCTGCGCCTT；如SEQ ID NO：12、13所示。

靶向CTLA4的exon2附近区域的引物：

Forward：TGAGTTCACTGAGTTCCCTTTG；

Reverse：GAAATGGCTTTGCTCACCAATTA；如SEQ ID NO：14、15所示。

实施例4：carT细胞的性能鉴定，实验数据系列

脐带血T细胞经过Ficoll-plus分离和CD30car慢病毒转染后，添加CD3/CD28抗体磁珠(磁珠：T细胞＝3)，T细胞培养基中添加IL-2(100-200IU/mL)，调整细胞浓度为1x10⁶/mL。6-well板预先以OKT3单抗包被(5ug/ml)中，室温4hr，anti-CD30carT细胞于37℃，5％CO2培养箱中进行培养，每2-3天计数一次。细胞经过14天培养，增值240倍，如图1所示。

图2：各种构建的CD30carT在不同的培养刺激后的增殖曲线。细胞数量归一化(normalization)后以载体GFP阴性对照为100％(数值计算为1)作图，完全培养基为LonzaX vivo15，成人血清10％，IL2 300-500IU/ml。各个组别为：载体GFP阴性对照；CD30 car T(car分子构建不含CD28-41BB共刺激序列)；CD30 car T(car分子构建不含CD28共刺激序列)；CD30 car T(car分子构建不含41BB共刺激序列)；CD30 car T(car分子构建含CD28-41BB共刺激序列)，以Invitrogen的CD3CD28磁珠共培养；CD30 car T(car分子构建含CD28-41BB共刺激序列)，以转染了CD30的异体外周血单核细胞(PBMNC)共培养获取。

图3：病毒滴度稀释法在K562细胞株的测试，慢病毒滴度范围5×10⁶-2×10⁷)。具体实验过程如下：

一、1.取包被后的病毒悬液，感染前6h在24孔细胞培养板中以2.5×105个细胞/孔均匀接种K562细胞。

2.将慢病毒进行梯度稀释，共做8个梯度，即每孔(500μl无双抗、无血清的DMEM培养基)中含100ul、10μl、1μl、0.1μl等稀释梯度，震荡混匀后加至接种好细胞的24孔板中，加病毒之前将培养板中的培养基吸净。

4.感染64-68h后收集细胞并进行基因组DNA的提取。

5.每次检测我们都会设置一组带荧光的已知滴度的慢病毒作为对照，以核对检测出的数值。

二、提取基因组DNA(按照AxyGEN的基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作)。

三、qPCR检测

1.以被测慢病毒载体梯度稀释为标准品，慢病毒载体上的通用引物进行qPCR以获得病毒整合拷贝数。

2.以Actin质粒梯度稀释为标准品，Actin引物进行qPCR检测样品的基因组拷贝数以得到基因组拷贝数。

3.Syber green法相对定量PCR反应体系及参数。

计算慢病毒IU(Integration Unit)/ml；

IU/ml＝(C×N×D×1000)/V；

C＝平均每基因组慢病毒整合拷贝数；

N＝感染时细胞的数目(约为2.5×105)；

D＝病毒的稀释倍数；

V＝加入稀释病毒的体积数；

最后获取该批次的病毒(超离心浓缩前或超离心浓缩后)的病毒滴度。通常浓缩前滴度是2x10e6以下浓度，浓缩后大约是1x10e8-9IU/ml。

图4：CD30 carT培养后，以goat anti-mouse Fab抗体测量anti-CD30 car分子的表达。MOI＝5，感染后48hr测量。具体实验过程如下：

(1)取1×106个细胞/100μl，1％～4％的多聚甲醛固定，4℃15min，然后700g10min离心，1xPBS洗涤2次。加入goat anti-mouse Fab多克隆一抗混匀，置室温下避光反应30min。

(2)用PBS洗涤细胞2次，离心沉淀弃掉上清液(离心转数一般为500-800g，5min)。

(3)用100μl PBS重悬细胞，再加入FITC标记荧光anti goat二抗(用量均按说明书要求加入)混匀，室温下避光反应30min。

(4)用PBS再洗涤细胞2次，加入500μl PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。

纯化后的anti-CD30 car慢病毒以MOI 5-10感染T细胞后，一般感染效率是30-60％。

图5：CD30 carT杀K562-CD30示意图。

图6：CD30 carT杀伤K562-CD30细胞因子释放图：CD30 carT：K562-CD30＝1∶1混合前和混合24hr后细胞因子IL2和IFNgamma在上清中的释放ELISA检测。具体实验过程如下：

制备后的CD30 carT细胞和K562-CD30靶肿瘤细胞以1∶1的数量混合混合，细胞数各自为5x10e5 cells，24小时后，600g 10min离心2次后取上清，用RnD system公司的试剂盒，ELISA法测量上清中IL2和IFNgamma的含量。两种细胞混合前释放很少的细胞因子，混合后释放的细胞因子在1000pg/ml以上，证明CD30 carT细胞激活。

图7：CD30几种构建的carT杀伤K562-CD30的不同E∶T比例的24小时杀伤曲线图。K562-CD30残留细胞anti-CD30单抗作流式测量获取。具体实验过程如下：

制备后的CD30 carT细胞(CD30-4-1BB-CD3zeta构建和CD30-CD3zeta构建，以及表达GFP的阴性对照car构建)和K562-CD30靶肿瘤细胞以1∶1，5∶1,10∶1,20∶1,30∶1,50∶1的数量混合混合，K562-CD30细胞数均为5x10e5 cells，24小时后，600g 10min离心2次后取细胞沉淀分析。

以anti-CD30抗体(Abcam公司)，流式细胞计量术测量CD30细胞含量，靶肿瘤细胞的减少就间接证明了CD30 carT的细胞杀伤能力。

实验室结果证明，CD30 carT细胞能专一识别CD30抗原，在5∶1的混合比例时候，就能大量杀伤K562-CD30靶细胞。

序列表

<110> 银丰生物工程集团有限公司

<120> 靶向CD30抗原的转基因T细胞及其制备方法与应用

<141> 2017-10-18

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 949

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ala Ala Ala Met Asn Phe Gly Leu Arg

20 25 30

Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly Val Gln Cys Gln Ile Gln

35 40 45

Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys

50 55 60

Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Thr

65 70 75 80

Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile

85 90 95

Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys

100 105 110

Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe Met Gln Leu

115 120 125

Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Asn Tyr

130 135 140

Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Ala Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

165 170 175

Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val

180 185 190

Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val

195 200 205

Asp Phe Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

210 215 220

Gln Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly

225 230 235 240

Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

245 250 255

Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

260 265 270

Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

275 280 285

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Pro Thr His Leu Pro Tyr Val Ser Glu

290 295 300

Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met Gln Thr Leu Ala Asp Phe

305 310 315 320

Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr His Trp Pro Pro Gln Arg

325 330 335

Ser Leu Gly Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile Leu Val Ile Phe Ser Gly

340 345 350

Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala Leu Phe Leu His Gln Arg

355 360 365

Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

370 375 380

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

385 390 395 400

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys

405 410 415

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

420 425 430

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

435 440 445

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

450 455 460

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

465 470 475 480

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

485 490 495

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

500 505 510

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

515 520 525

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

530 535 540

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

545 550 555 560

Ala Leu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

565 570 575

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu

580 585 590

Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys

595 600 605

Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu

610 615 620

Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile

625 630 635 640

Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe

645 650 655

Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr

660 665 670

Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn

675 680 685

Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg

690 695 700

Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile

705 710 715 720

Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val

725 730 735

Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp

740 745 750

Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn

755 760 765

Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu

770 775 780

Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser

785 790 795 800

Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu

805 810 815

Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln

820 825 830

Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly

835 840 845

Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro

850 855 860

His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr

865 870 875 880

Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His

885 890 895

Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro

900 905 910

Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala

915 920 925

Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg

930 935 940

Arg Arg His Ile Val

945

<210> 2

<211> 2853

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgctgctgc tggtaacttc actcctcctc tgcgaactcc ctcaccctgc atttttgctt 60

atccccgagg ccgcggccat gaactttggt ttgcgattga tcttcctggt gctgacactc 120

aaaggcgtcc aatgtcagat tcagttgcaa cagagtggcc cggaagttgt aaaacctggt 180

gcatccgtca agatttcttg taaggcctcc ggctacacat tcaccgatta ttacattact 240

tgggtaaaac agaaaccggg gcaaggcttg gagtggattg gatggattta tcccggatcc 300

ggcaacacca agtataatga aaaatttaaa ggtaaagcaa cgctcacggt tgacacaagt 360

tcaagcaccg cttttatgca actttcatca ctgactagtg aagacacagc ggtttatttc 420

tgcgcgaatt acggtaatta ttggttcgcg tattgggggc aagggaccca ggttacagtt 480

tcagcggcta gcggtggagg tgggtctggc ggcggtggta gcgggggtgg aggttcagac 540

attgtgctta ctcaaagtcc ggcttccctc gccgtgtccc tggggcagcg ggcgactatt 600

agttgtaagg ccagtcaatc tgtcgatttt gatggagata gttacatgaa ttggtaccaa 660

cagaagcctg gccaaccgcc aaaagttctc atttacgctg cctccaactt ggaatcaggt 720

atccctgctc gctttagtgg atccggtagt ggaacggact ttaccctcaa tatccacccc 780

gtggaagaag aagacgctgc cacttattat tgtcagcaat ccaatgaaga cccatggacg 840

ttcggaggtg ggacgaaact tgaaatcaaa ggtggaggag ggagtcctac tcatctcccc 900

tatgtttcag agatgctgga ggcccgaacc gctggtcata tgcaaacgct tgctgatttt 960

aggcagttgc cagcgcggac gctgtctaca cactggcccc ctcagcgctc acttgggagt 1020

tctgatttta tacggatcct tgtgatattc tctggcatgt ttcttgtctt caccctggct 1080

ggagcgttgt tccttcacca aagatccaag agaagccggg ggggacattc tgattacatg 1140

aatatgacac ctcgaagacc gggaccaact cggaaacatt accaaccata cgctccccct 1200

agggattttg cggcgtaccg ctcatctgtc gtgaaaagag gacgcaagaa actcttgtat 1260

attttcaaac aaccatttat gagacccgtt caaaccactc aagaagagga cgggtgttcc 1320

tgcagatttc ctgaagaaga ggaggggggc tgcgaattga gggtaaaatt cagtagatcc 1380

gccgatgcac cggcgtacca acagggtcaa aaccaattgt acaacgagtt gaacctgggg 1440

agaagggaag aatatgatgt cctcgataaa agaagaggaa gggacccgga aatgggggga 1500

aaacccagga gaaaaaaccc ccaggaaggg ctctataatg agctgcaaaa agataagatg 1560

gcggaagcat actctgagat tggaatgaag ggggaacgac gccgaggcaa aggacacgat 1620

gggctttatc agggactctc cacggctaca aaagacacgt acgatgcttt gcacatgcag 1680

gctcttcctc ctagagaggg cagaggcagc ctgctgacct gcggcgacgt ggaggagaac 1740

cccggcccca tggcctgtgg ggccgacagc tatgagatgg aggaagacgg cgtccgcaag 1800

tgtaagaagt gcgaagggcc ttgccgcaaa gtgtgtaacg gaataggtat tggtgaattt 1860

aaagactcac tctccataaa tgctacgaat attaaacact tcaaaaactg cacctccatc 1920

agtggcgatc tccacatcct gccggtggca tttaggggtg actccttcac acatactcct 1980

cctctggatc cacaggaact ggatattctg aaaaccgtaa aggaaatcac agggtttttg 2040

ctgattcagg cttggcctga aaacaggacg gacctccatg cctttgagaa cctagaaatc 2100

atacgcggca ggaccaagca acatggtcag ttttctcttg cagtcgtcag cctgaacata 2160

acatccttgg gattacgctc cctcaaggag ataagtgatg gagatgtgat aatttcagga 2220

aacaaaaatt tgtgctatgc aaatacaata aactggaaaa aactgtttgg gacctccggt 2280

cagaaaacca aaattataag caacagaggt gaaaacagct gcaaggccac aggccaggtc 2340

tgccatgcct tgtgctcccc cgagggctgc tggggcccgg agcccaggga ctgcgtctct 2400

tgccggaatg tcagccgagg cagggaatgc gtggacaagt gcaaccttct ggagggtgag 2460

ccaagggagt ttgtggagaa ctctgagtgc atacagtgcc acccagagtg cctgcctcag 2520

gccatgaaca tcacctgcac aggacgggga ccagacaact gtatccagtg tgcccactac 2580

attgacggcc cccactgcgt caagacctgc ccggcaggag tcatgggaga aaacaacacc 2640

ctggtctgga agtacgcaga cgccggccat gtgtgccacc tgtgccatcc aaactgcacc 2700

tacggatgca ctgggccagg tcttgaaggc tgtccaacga atgggcctaa gatcccgtcc 2760

atcgccactg ggatggtggg ggccctcctc ttgctgctgg tggtggccct ggggatcggc 2820

ctcttcatgc gaaggcgcca catcgtttga taa 2853

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

caccggagag cttcgtgcta aactgcgaac agtttagcac gaagctctcc 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aaaaggagag cttcgtgcta aactgttcgc agtttagcac gaagctctcc 50

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

caccgccagc tttgtgtgtg agtatcgaaa tactcacaca caaagctggc 50

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aaaagccagc tttgtgtgtg agtatttcga tactcacaca caaagctggc 50

<210> 7

<211> 4869

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

atggcaccca agaaaaagcg taaggtgggg atccacggcg ttccagcggc tgataaaaaa 60

tattctatcg gtctggacat tggaacaaat tctgtcggtt gggcagtaat tacggatgaa 120

tataaagttc ctagcaaaaa gtttaaggta ttaggcaaca ccgatcgtca ctcaatcaag 180

aaaaacctga ttggcgcgtt actgttcgac agtggtgaaa ctgcagaggc cacccgcctt 240

aagcgtactg ctcgccgccg ctatactcgt cgtaagaatc gcatttgcta tcttcaggag 300

atcttctcta acgaaatggc gaaggttgac gattcttttt tccaccgctt agaagaatct 360

ttcctggtcg aggaggacaa gaagcatgaa cgccatccga tcttcggcaa cattgtcgat 420

gaagtcgcat atcacgaaaa gtatccaacc atctaccact tgcgtaagaa actggtcgac 480

tcaactgata aagccgactt gcgccttatc taccttgctc ttgcccatat gattaaattt 540

cgtggtcact ttttaattga aggagacctt aacccggaca attctgacgt tgacaagttg 600

ttcatccagc ttgtgcagac ctataaccaa ttattcgagg aaaacccgat caacgcttcc 660

ggagtggacg cgaaggctat tctttccgct cgtcttagta aatctcgccg cctggagaac 720

ctgattgcac aattgcctgg tgagaagaag aatggccttt tcggcaactt gattgcgtta 780

agcttaggcc tgacaccaaa ttttaagtcc aatttcgatt tggcagaaga cgctaagctg 840

caattaagca aagatactta tgacgatgat ttagataatt tgctggctca gattggcgac 900

cagtacgcgg accttttcct tgcggcgaag aatcttagtg acgctatcct gctttctgat 960

atcctgcgcg ttaatactga gatcacgaag gcgccgctta gtgcaagtat gattaagcgc 1020

tacgacgagc atcatcagga ccttacatta cttaaagcat tggttcgcca acaattaccg 1080

gaaaaataca aagagatctt tttcgatcag tcgaagaacg gttacgcagg atacatcgat 1140

ggcggggcat cccaagagga gttttataaa ttcatcaagc ctattttaga gaaaatggac 1200

ggtactgagg agctgctggt aaaactgaat cgtgaagact tacttcgcaa gcaacgcaca 1260

tttgacaatg gatcgatccc ccaccagatt cacttgggcg aattgcacgc gatccttcgt 1320

cgtcaggagg acttctaccc cttcttaaaa gacaaccgtg agaagattga gaaaattttg 1380

accttccgca ttccctacta tgtcggacct ctggcacgcg gaaactctcg ctttgcttgg 1440

atgacccgca aatcagagga gacgattacc ccatggaact ttgaggaggt tgtcgacaag 1500

ggagcctccg cgcaaagctt tattgagcgt atgactaact tcgataaaaa tcttcccaac 1560

gaaaaggtgt tgcccaagca ttcccttctg tatgaatact tcaccgttta taacgaatta 1620

acgaaggtaa agtacgtaac agaggggatg cgcaaacccg ccttccttag cggtgaacag 1680

aagaaagcca ttgttgacct gttattcaag actaaccgta aagtaacggt aaagcaactt 1740

aaagaggact atttcaagaa aattgagtgc tttgacagcg tggagatttc gggtgtggag 1800

gaccgcttca acgcttcgct tggtacgtat cacgatttgt tgaagattat taaagacaaa 1860

gatttcttag ataatgagga aaatgaggac attttagagg acatcgtctt gacactgacg 1920

ctgttcgagg accgcgagat gatcgaagaa cgtcttaaga cttatgctca cttgtttgat 1980

gataaagtca tgaaacagtt gaagcgtcgc cgctatacgg gctggggtcg cctttcccgt 2040

aaattaatta acgggattcg tgataaacag tctggcaaga caattctgga ttttttgaag 2100

tcggacgggt tcgcgaatcg taattttatg caactgatcc acgacgactc tctgactttc 2160

aaggaagata ttcagaaagc tcaggtgtcg ggccaaggtg acagtttgca cgaacatatt 2220

gctaaccttg ccggttctcc tgctatcaaa aaaggtatcc ttcagacagt caaggtcgtc 2280

gacgaattag taaaggtaat ggggcgccat aaacctgaga acatcgtcat cgagatggca 2340

cgtgagaatc aaaccacaca gaaggggcaa aagaactccc gtgaacgtat gaagcgtatt 2400

gaagagggga ttaaagagtt gggctcccag attcttaaag agcacccggt cgagaatacc 2460

caactgcaaa acgaaaaatt atacctttat tatttgcaga atggacgcga tatgtatgtg 2520

gatcaagagt tagatattaa tcgtctgtca gactacgacg tcgaccacat cgttccgcaa 2580

tcattcttaa aggatgactc tatcgataac aaggtcttga ctcgttctga taagaatcgc 2640

ggaaagtccg acaacgttcc atcagaggag gtcgtcaaga aaatgaagaa ttattggcgt 2700

cagcttttga atgccaaact gattacacaa cgcaaatttg acaaccttac aaaggcggaa 2760

cgtggtggac tttccgaatt ggataaggcg ggctttatta agcgccaact ggttgaaacc 2820

cgccagatca ccaaacatgt ggcccaaatt ttggactccc gtatgaatac caagtacgat 2880

gagaatgata agcttattcg tgaggttaag gtcattactc ttaaatcaaa gttggtcagt 2940

gattttcgca aggactttca gttctacaaa gtccgcgaga tcaataacta ccatcatgcg 3000

cacgacgctt atttaaacgc cgtagtagga acggccctga ttaaaaaata cccaaaactt 3060

gagagcgagt ttgtgtatgg ggactataag gtttacgacg ttcgtaaaat gatcgccaaa 3120

tctgagcaag aaatcggcaa agcaactgcc aaatatttct tttacagtaa catcatgaat 3180

tttttcaaga cagaaatcac attggccaat ggggagattc gtaaacgtcc tttaattgag 3240

accaacggcg agactggcga gattgtatgg gataagggac gtgactttgc gacagtgcgc 3300

aaagtcttat ccatgccaca ggtgaacatc gtgaagaaaa ccgaggtgca aactggtggc 3360

ttctctaagg aatcaatcct gccaaagcgt aatagtgata aacttattgc tcgcaaaaag 3420

gactgggacc cgaaaaagta cggtggattc gactcaccta cagtcgcata ctcggttctt 3480

gtcgtcgcaa aagtcgagaa agggaaatca aaaaagttaa agtcggttaa ggagcttctt 3540

gggatcacaa tcatggagcg ctcaagtttt gagaagaatc ctattgattt tttggaagca 3600

aaagggtata aagaggtaaa aaaggactta atcattaaat tgcccaaata cagtcttttt 3660

gaacttgaaa acgggcgtaa gcgtatgctt gcgagcgcgg gcgagctgca aaagggtaat 3720

gaattagcac tgccatcgaa atacgtcaac ttcttatacc tggcctcaca ttacgagaaa 3780

cttaaaggat ccccggagga taacgaacaa aagcaactgt ttgtagagca gcataagcac 3840

tatctggatg aaattatcga acaaatcagc gagttcagca aacgtgtgat cttggcggac 3900

gctaaccttg acaaggtact gagtgcctat aacaaacatc gtgacaagcc cattcgtgaa 3960

caggccgaaa acattatcca ccttttcact ctgacgaact tgggagcgcc ggccgcattt 4020

aagtactttg acactacgat cgatcgcaag cgctatacat ccactaagga ggtattggac 4080

gcgaccctta tccatcaaag cattacggga ctttacgaga cacgtatcga cctttcacaa 4140

ttaggaggag ataaacgtcc agccgcgacc aaaaaagcag gccaggccaa gaagaaaaag 4200

gaatttgggt ctggagaggg acgtggctcc ttgcttacgt gcggtgatgt cgaggaaaac 4260

ccgggaccta tgaccgaata caagcccacc gtacgcttag ccacccgcga cgacgttcca 4320

cgcgcagtgc gcacgttagc tgcagcattc gcagactatc ccgcaactcg tcacactgtt 4380

gaccccgatc gccatattga gcgtgtaacc gaacttcagg agttattttt gacgcgtgta 4440

ggtttagata ttggaaaggt gtgggtagca gatgatggcg cggcggtggc agtgtggacc 4500

acaccggagt cagtggaggc aggtgccgtg tttgcagaga tcgggcctcg tatggccgaa 4560

ttatccggct cgcgtttagc tgcccaacag caaatggaag gacttttagc cccacaccgt 4620

cctaaggaac cagcctggtt tttagcgact gtgggtgtct cccccgatca ccaaggaaag 4680

gggctgggaa gcgccgttgt tttacccggt gtagaagcgg cagagcgtgc aggagtacct 4740

gcgtttctgg aaacgtcagc tcctcgtaat ttacccttct atgagcgcct tggctttaca 4800

gttacagcag acgtcgaggt tcccgaaggc cctcgcacat ggtgtatgac ccgtaagccc 4860

ggagcttga 4869

<210> 8

<211> 98

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gcggagagct tcgtgctaaa cgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 60

ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgct 98

<210> 9

<211> 98

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ggtgcggcaa cctacatgat ggttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 60

ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgct 98

<210> 10

<211> 100

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

aacgccacct tcacctgcag cttctccaac acatcggaga gcttcgtgtg ataatggtac 60

cgcatgagcc ccagcaacca gacggacaag ctggccgctt 100

<210> 11

<211> 99

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

caggctgaca gccaggtgac tgaagtctgt gcggcaacct acatgtgata aaatgagttg 60

accttcctag atgattccat ctgcacgggc acctccagt 99

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

ttcctcacct ctctccatct c 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ctctctttga tctgcgcctt 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

tgagttcact gagttccctt tg 22

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gaaatggctt tgctcaccaa tta 23

Claims

1.一种靶向CD30抗原的受体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种编码权利要求1所述的靶向CD30抗原受体的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种重组慢病毒表达载体，其特征在于：其包含有权利要求2的编码靶向CD30抗原的基因。

4.一种重组慢病毒表达载体，其特征在于：其包含有权利要求2的编码靶向CD30抗原的基因，以及靶向PD1基因的shRNA或/和靶向CTLA4基因的shRNA。

5.根据权利要求4所述的重组慢病毒表达载体，其特征在于：所述靶向PD1基因的shRNA，包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.3所示，反义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.4所示；所述靶向CTLA4基因的shRNA，包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.5所示，反义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.6所示。

6.一种靶向CD30抗原的转基因T细胞，其特征在于：为包含有权利要求3所述的重组慢病毒表达载体的、且敲除了PD1基因或/和CTLA4基因的原始细胞，或染色体中整合有权利要求2所述的编码靶向CD30抗原的基因、且敲除了PD1基因或/和CTLA4基因的原始细胞，所述原始细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。

7.一种靶向CD30抗原的转基因T细胞，其特征在于：为包含有权利要求4或5重组慢病毒表达载体的原始细胞；所述原始细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。

8.权利要求6或7所述的靶向CD30抗原的转基因T细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)慢病毒感染CD4+T细胞或CD8+T细胞：利用权利要求3所述的重组慢病毒表达载体感染CD4+T细胞或CD8+T细胞，得重组T细胞；

(2)gRNA、CRISPR-cas9mRNA、HDR混合，电转重组T细胞，即得靶向CD30抗原的转基因T细胞；所述gRNA为靶向PD1基因的gRNA或靶向CTLA4基因的gRNA，所述HDR为PD1基因的HDR或CTLA4基因的HDR；

或：利用权利要求4或5所述的重组慢病毒表达载体感染CD4+T细胞或CD8+T细胞，即得。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述CRISPR-cas9mRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；

所述靶向PD1基因的gRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

所述靶向CTLA4基因的gRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

所述PD1基因的HDR，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；

所述CTLA4基因的HDR，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

10.权利要求6或7所述的靶向CD30抗原的转基因T细胞在制备治疗霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤的药物中的应用。