JP2021517473A - Cd30+腫瘍の治療のためのcar−cd30t細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.4−1BB.ζ(28.4−1BB.ζ)
SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.OX40.ζ(28.OX40.ζ)
これらは、
これまでにCAR療法に適用されていなかった、AC10ハイブリドーマ由来の一本鎖可変断片(scFv)、
遺伝子修飾T細胞の、FACS(蛍光活性化細胞分取)システムによる迅速な同定及び/又は細胞選別システムによる選択のための、追跡可能なマーカーである16アミノ酸(aa)のみ(追跡可能なマーカーとして)のCD34に由来するエピトープ(ΔCD34)、
同様のCARの大部分に適用される免疫原性CH2−CH3マウス配列を回避するためのCD8領域により代表されるヒンジ(20)、
分子の安定化を向上させるためのCD8の膜貫通ドメイン由来の膜貫通ドメイン、
両方がCD3−ζ鎖にそれぞれ融合している、CAR−CD30ベクターに加えられた2つの共刺激ドメイン:CD28(21、22)及びOX40(23、24)又はCD28及び4−1BB(25)
を含む。したがって、2つのSFGベクターは、単一の共刺激ドメイン(第1のベクターでは4−1BB及び第2のベクターではOX40)により識別することができる。
a)シグナルペプチド、例えば、MEFGLSWLFLVAILKGVQC(配列番号1)(ヌクレオチド識別番号AB776838.1及びタンパク質識別番号BAN63131.1)を含むか、又はこれからなるシグナルペプチドであって、第1のリンカーにより以下に連結されている、シグナルペプチド、
b)AC10 VL配列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK(配列番号2)及びAC10 VH配列:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA(配列番号3)を含むか、又はこれらからなる、AC10ハイブリドーマ由来の抗CD30一本鎖抗体ドメインであって、上記AC10 VL及びVH配列が、第2のリンカーにより連結されている、抗CD30一本鎖抗体ドメイン、
c)ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(配列番号4)(ヌクレオチド識別番号AB238231.1及びタンパク質識別番号BAE46748.1)、ΔCD19:PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWK(配列番号5)(ヌクレオチド識別番号M21097.1及びタンパク質識別番号AAA35533.1)、NGFR:KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN(配列番号6)(ヌクレオチド識別番号AK313654.1及びタンパク質識別番号BAG36408.1)、好ましくは、ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(配列番号4)(ヌクレオチド識別番号AB238231.1及びタンパク質識別番号BAE46748.1)からなる群から選択される、追跡可能なマーカー、
d)ヒンジCD8α:PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(配列番号7)(ヌクレオチド識別番号M12828.1及びタンパク質識別番号AAB04637.1)、ヒンジCD28:IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(配列番号8)(ヌクレオチド識別番号AJ517504.1及びタンパク質識別番号CAD57003.1)、ヒンジCH2−CH3(UNIPROTKB:P01861):ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号9)、ヒンジCH3(UNIPROTKB:P01861):ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号10)、好ましくは、ヒンジCD8α:PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(配列番号7)(ヌクレオチド識別番号M12828.1及びタンパク質識別番号AAB04637.1)からなる群から選択される、ヒンジ、
e)CD28TM:FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(配列番号13)(ヌクレオチド識別番号BC112085.1及びタンパク質識別番号AAI12086.1)、CD8aTM(配列番号14)、好ましくは、CD8aTMCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(配列番号14)(ヌクレオチド識別番号NM_001768.6及びタンパク質識別番号NP_001759.3)からなる群から選択される、膜貫通ドメイン、並びに
f)CD28細胞質配列:RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(配列番号21)(ヌクレオチド識別番号AF222341.1及びタンパク質識別番号AAF33792.1)、CD137(4−1BB)配列:KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(配列番号22)(ヌクレオチド識別番号U03397.1及びタンパク質識別番号AAA53133.1)、及びCD3ゼータ鎖:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(配列番号23)(ヌクレオチド識別番号J04132.1及びタンパク質識別番号AAA60394.1)を連結させることにより得られる配列、又はCD28細胞質配列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(配列番号21)(ヌクレオチド識別番号AF222341.1及びタンパク質識別番号AAF33792.1)、OX40配列RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(配列番号24)(ヌクレオチド識別番号NM_003327.3及びタンパク質番号NP_003318.1)及びCD3ゼータ鎖:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(配列番号23)(ヌクレオチド識別番号J04132.1及びタンパク質識別番号AAA60394.1)を連結させることにより得られる配列からなる群から選択される、共刺激シグナル伝達ドメイン
を含むか、又はこれらからなる、CD30キメラ抗原受容体分子である。
a)MEFGLSWLFLVAILKGVQC(配列番号1)を含むか、又はこれからなるシグナルペプチドであって、第1のリンカーにより以下に連結されている、シグナルペプチド、
b)AC10 VL配列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK(配列番号2)及びAC10 VH配列:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA(配列番号3)を含むか、又はこれらからなる、AC10ハイブリドーマ由来の抗CD30一本鎖抗体ドメインであって、上記AC10 VL及びVH配列が、第2のリンカー(G4S)2リンカー:GGGGSGGGG(配列番号17)により連結されている、抗CD30一本鎖抗体ドメイン、
c)ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(配列番号4)を含むか、又はこれからなる追跡可能なマーカー、
d)ヒンジCD8αPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(配列番号7)、
e)リンカーCD8a細胞質(cyto):LYCNHRN(配列番号25)を含むか、又はこれからなる1つ又は複数のリンカーにより、以下に連結されている膜貫通ドメインCD8aTMCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(配列番号14)、
f)CD28細胞質配列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(配列番号21)、OX40配列RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(配列番号24)及びCD3ゼータ鎖:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(配列番号23)を連結させることにより得られる配列からなる共刺激シグナル伝達ドメイン
を含むか、又はこれらからなる。
或いは、本発明によるCD30キメラ抗原受容体分子は、
a)MEFGLSWLFLVAILKGVQC(配列番号1)を含むか、又はこれからなるシグナルペプチドであって、第1のリンカーにより以下に連結されている、シグナルペプチド、
b)AC10 VL配列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK(配列番号2)及びAC10 VH配列:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA(配列番号3)を含むか、又はこれらからなる、AC10ハイブリドーマ由来の抗CD30一本鎖抗体ドメインであって、上記AC10 VL及びVH配列が、第2のリンカー(G4S)2リンカー:GGGGSGGGG(配列番号17)により連結されている、抗CD30一本鎖抗体ドメイン、
c)ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(配列番号4)を含むか、又はこれからなる追跡可能なマーカー、
d)ヒンジCD8αPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(配列番号7)、
e)CD8a細胞質(cyto):LYCNHRN(配列番号25)を含むか、又はこれからなる1つ又は複数のリンカーにより、以下に連結されている膜貫通ドメインCD8aTMCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(配列番号14)、
f)CD28細胞質配列:RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(配列番号21)、CD137(4−1BB)配列:KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(配列番号22)、及びCD3ゼータ鎖:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(配列番号23)を連結させることにより得られる配列からなる、共刺激シグナル伝達ドメイン
を含むか、又はこれらからなる。
シグナルペプチド
MEFGLSWLFLVAILKGVQC(配列番号1)(ヌクレオチド識別番号AB776838.1及びタンパク質識別番号BAN63131.1)
連結
SR(接続配列)
VL(AC10)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK(配列番号2)
フレックス
GGGSGGGG(G3SG4リンカー)(配列番号20)
VH(AC10)
QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA(配列番号3)
連結
GS(接続配列)
ΔCD34
ELPTQGTFSNVSTNVS(配列番号4)(ヌクレオチド識別番号AB238231.1及びタンパク質識別番号BAE46748.1)
ヒンジ(スペーサー)細胞外
PAPRPPTPAPT(スペーサー)(配列番号11)
ヒンジ(CD8a)細胞外
IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(配列番号12)(ヌクレオチド識別番号NM_001768.6及びタンパク質識別番号NP_001759.3)
CD8a(TM)膜貫通
CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(配列番号14)(ヌクレオチド識別番号NM_001768.6及びタンパク質識別番号NP_001759.3)
接続のCD8a細胞質(cyto)連結
LYCNHRN(配列番号25)(ヌクレオチド識別番号NM_001768.6及びタンパク質識別番号NP_001759.3)
接続の連結
EF(接続配列)
CD28 cyto
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(配列番号21)(ヌクレオチド識別番号AF222341.1及びタンパク質識別番号AAF33792.1)
4.1BB
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(配列番号22)(ヌクレオチド識別番号U03397.1及びタンパク質識別番号AAA53133.1)
CD3ゼータ鎖
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(配列番号23)(ヌクレオチド識別番号J04132.1及びタンパク質識別番号AAA60394.1)
を含む。
シグナルペプチド
MEFGLSWLFLVAILKGVQC(配列番号1)(ヌクレオチド識別番号AB776838.1及びタンパク質識別番号BAN63131.1)
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SR(接続配列)
VL(AC10)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK(配列番号2)
フレックス
GGGSGGGG(G3SG4リンカー)(配列番号20)
VH(AC10)
QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA(配列番号3)
連結
GS(接続配列)
ΔCD34
ELPTQGTFSNVSTNVS(配列番号4)(ヌクレオチド識別番号AB238231.1及びタンパク質識別番号BAE46748.1)
ヒンジ(スペーサー)細胞外
PAPRPPTPAPT(スペーサー)(配列番号11)
ヒンジ(CD8a)細胞外
IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(配列番号12)(ヌクレオチド識別番号NM_001768.6及びタンパク質識別番号NP_001759.3)
CD8a(TM)膜貫通
CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(配列番号14)(ヌクレオチド識別番号NM_001768.6及びタンパク質識別番号NP_001759.3)
接続のCD8a細胞質(cyto)連結
LYCNHRN(配列番号25)(ヌクレオチド識別番号NM_001768.6及びタンパク質識別番号NP_001759.3)
接続の連結
EF(接続配列)
CD28 cyto
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(配列番号21)(ヌクレオチド識別番号AF222341.1及びタンパク質識別番号AAF33792.1)
OX40
RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(配列番号24)(ヌクレオチド識別番号NM_003327.3及びタンパク質識別番号NP_003318.1)
CD3ゼータ鎖
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(配列番号23)(ヌクレオチド識別番号J04132.1及びタンパク質識別番号AAA60394.1)
を含む。
シグナルペプチド
ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGTGTTCACGA(配列番号29)(ヌクレオチド識別番号AB776838.1)
VL(AC10)
GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAG(配列番号30)
フレックス
GGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGG(G3SG4リンカー)(配列番号31)
VH(AC10)
GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAG(配列番号32)
連結(BamH1制限部位)
GGATCC(BamH1制限部位及び接続配列)(配列番号33)
ΔCD34
GAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGT(配列番号34)(ヌクレオチド識別番号AB238231.1)
ヒンジ(CD8a)細胞外
CCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCT(配列番号35)(NM_001768.6)
CD8a(TM)膜貫通
TGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATCACC(配列番号36)(NM_001768.6)
接続のCD8a細胞質(cyto)連結
CTTTATTGCAACCATCGAAAC(配列番号37)(NM_001768.6)
連結(EcoR1制限部位及び接続配列)
GAATTC(配列番号38)
CD28 cyto
AGAAGTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACCTGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCATACCGCTCT(配列番号39)(AF22234.1)
4.1BB
AAGAGAGGGAGAAAAAAATTGCTCTATATTTTTAAACAACCATTTATGAGGCCCGTACAGACAACTCAGGAAGAGGATGGCTGTAGTTGCCGCTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGAGGCTGCGAGTTG(配列番号40)(U03397.1)
CD3ゼータ鎖
AGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA(配列番号41)(J04132.1)
を含む。
シグナルペプチド
ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGTGTTCACGA(配列番号29)(AB776838.1)
VL(AC10)
GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAG(配列番号30)
フレックス
GGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGG(G3SG4リンカー)(配列番号31)
VH(AC10)
GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAG(配列番号32)
連結(BamH1制限部位及び接続配列)
GGATCC(配列番号33)
ΔCD34
GAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGT(配列番号34)(AB238231.1)
ヒンジ(CD8a)細胞外
CCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCT(配列番号35)(NM_001768.6)
CD8a(TM)膜貫通
TGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATCACC(配列番号36)(NM_001768.6)
接続のCD8a細胞質(cyto)連結
CTTTATTGCAACCATCGAAAC(配列番号37)(NM_001768.6)
連結(EcoR1制限部位及び接続配列)
GAATTC(配列番号38)
CD28 cyto
AGAAGTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACCTGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCATACCGCTCT(配列番号39)(AF222341.1)
OX40
CGCGATCAAAGACTCCCGCCCGATGCCCACAAACCCCCTGGCGGGGGCAGCTTTAGGACACCCATTCAAGAAGAGCAGGCAGACGCCCACAGCACCTTGGCCAAAATT(配列番号43)(NM_003327.3)
CD3ゼータ鎖
AGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA(配列番号41)(J04132.1)
を含む。
材料及び方法
CAR−CD30プラスミド(構築物)のデザイン
臨床グレードの2つの「第三」世代レトロウイルスベクターSFGをデザインした。これは、IgG(AC10)クラスのマウス抗体に由来し、コドン最適化ヒトCD8ヒンジ膜貫通ドメインを介して、2つの共刺激ドメインCD28、4−1BB(CD137)又はOX40及びCD3−ζのコドン最適化シグナル伝達ドメインに連結した、抗CD30一本鎖可変断片(scFv)のカセットを有する(図1A)。CD30に特異性の一本鎖可変断片(scFv)は、8アミノ酸のフレックス(27)(短いリンカーペプチド)により、免疫グロブリン重鎖の117aa(VH)に接続された、免疫グロブリン軽鎖の可変領域(VL)の111アミノ酸(aa)の融合タンパク質である。特定には、scFv AC10は、16aa(追跡可能なマーカーとして)のコドン最適化CD34由来のエピトープを用いてインフレームでクローニングし、40aaのヒンジ(スペーサーとしての11aaに加えてコドン最適化CD8細胞外ドメインの29aa)により連結して、30aaのコドン最適化ヒトCD8膜貫通ドメイン(CD8aTM)に結合させる。シグナルは、CD30scFvAC10の細胞外部分からCD3−ζ鎖(113aa)の細胞内部分まで、2つの共刺激分子:
SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.4.1BB.ζレトロウイルスベクター(28.4−1BB.ζ)
のCD28エンドドメイン(41aa)及び4−1BBエンドドメイン(42aa)により実行する。
SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.OX40.ζレトロウイルスベクター(28.OX40.ζ)
を得ることが可能となる。
eGFPホタルルシフェラーゼ細胞株の生成
eGFPホタルルシフェラーゼをコードするレトロウイルスベクター(eGFP−FFLuc)を選択された実験に使用して、CD30+腫瘍細胞:
非ホジキンリンパ腫(NHL)カルパス299、
ホジキンリンパ腫(HL)HDML−2及びL428、
横紋筋肉腫RD、
線維形成性小脳髄芽腫DAOY
を標識した。
eGFPホタルルシフェラーゼをコードするレトロウイルスベクター(eGFP−FFLuc)を選択された実験に使用してCD30陰性対照:
前駆B細胞白血病BV173、
慢性骨髄性白血病K562、
を標識した。
非ホジキンリンパ腫(NHL)カルパス299をSigma−Aldrichから得た。ホジキンリンパ腫(HL)HDML−2及びL428並びに前駆B細胞白血病Ph+BV173をDSMZから得た。横紋筋肉腫RD、線維形成性小脳髄芽腫DAOY、慢性骨髄性白血病K562、髄芽腫D283及び胚性腎293T細胞株をLGC Standards−ATCCから得た。
一過性レトロウイルス上清を、それぞれ2:3:3の比率のMoMLVgag/pol発現プラスミドPeqPam3(−env)、RD114env発現プラスミドRDF、及びSFGベクター、総DNA10μgとの293Tの共トランスフェクションにより生成した。トランスフェクションは、ジーンジュース(GeneJuice)試薬(Calbiochem)により促進した。トランスフェクション後2及び3日に上清を採取し、濾過(0.45mmのフィルターを使用)、スナップフリーズし、5mlのアリコートに−80℃で保存した(28)。
エフェクター細胞の単離、生成及び形質導入
OPBGの施設内審査委員会(IRB)により設定された規則に従って(倫理委員会認可No969/2015 prot.No669LB)サインされたインフォームドコンセントを得た後、末梢血単核細胞(PBMC)を、リンパ球分離培地(Eurobio、仏国)を使用して、健常ドナー(OPBG病院、ローマ、伊国)から得た末梢血(PB)又は軟膜から単離した。Tリンパ球は、固定化したOKT3(1μg/ml、e−Bioscience Inc.、サンディエゴ、CA、米国)及び抗CD28(1μg/ml、BD Biosciences、欧州)抗体を用いて、組換えヒトインターロイキン2(IL−2、100U/ml、R&D、米国)(28)の存在下で、又は組換えヒトインターロイキン7(IL7、10ng/ml、R&D、米国)(29)及び組換えヒトインターロイキン15(IL15、5ng/ml、R&D)(18、30)の組合せにより活性化した。3日目に、組換えヒトレトロネクチン(RetroNectin)(Takara−Bio.Inc、日本)をプレコーティングした24ウェルプレートにおいて、特異性レトロウイルス上清及び上記の特異性サイトカインを使用して、活性化T細胞に形質導入した。形質導入から5日目に、T細胞は、45%のRPMI 1640を含む「CTL完全培地」及び10%のFBS及び2mMのグルタマックスを添加した45%のクリック(Click’s)培地(Sigma−Aldrich,Co.、米国)で増殖させ、上記の特異性サイトカインを週に2回与えた。
細胞表面分子の発現を、フローサイトメトリーにより標準的方法を使用して判定した。次のモノクローナル抗体(mAb):CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD56、CD57、CD62L、CD62E、CD62P、CD95、CD106、CD127、CD137、CD197、CD223(Lag3)、CD274(PDL1)、CD279(PD1)及びTIM3を使用した。T細胞におけるCAR−CD30の発現は、scFvに効率的に結合することが可能な、特異性抗CD34+(QBENd10Vクローン)又はピアース組換えビオチン化タンパク質L(Pierce Recombinant Biotinylated Protein L)を使用して検出した。+15日目及び+30日目に、CD3特異性mAb(BD Biosciences)及びアイソタイプ対照mAb(BD Biosciences)に付随して使用される24種の異なるTCR Vβ特異性mAbのパネル(IO TEST Beta Mark TCR−Vβレパトワキット、BC)を使用して、NT T細胞及びCAR−T細胞におけるT細胞受容体(TCR)−Vβレパトワを評価した(31)。試料をBD LSRフォルテッサ(Fortessa)X−20により解析した。フローサイトメトリープロファイルは、FACSディーバ(Diva)ソフトウェア(BD Biosciences)を使用して解析した。各試料について、最低限20,000イベントを解析した。
+15日目のNT及びCAR修飾T細胞の間の相対TCR Vβレパトワの分布を評価するために、IOTest(登録商標)Beta Mark Kit(Beckman Coulter)を使用した。この方法では、フローサイトメトリーによるヒトTリンパ球のTCR Vβレパトワの定量的判定のためにデザインされたマルチパラメータ解析ツールを使用する。
CAR−CD30T細胞が、特異性抗原又はサイトカインの使用の存在下のみで増殖するかどうかを評価するために、フローサイトメトリー用セルトレース(CellTrace)(商標)CFSE細胞増殖キット(Cell Proliferation Kit)(Invitrogen)を使用して、T細胞を蛍光細胞染色色素カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識した。
形質導入したエフェクター細胞の細胞毒性活性を、これまでに記載されているように(9)、6時間のクロム放出アッセイを使用して評価した。標的細胞(カルパス299、HDML−2、L428及びBV−173)を放射性クロム(51Cr、PerkinElmer、カタログ番号NEZ030S)で標識し、引き続いて洗浄した後、異なる比率で4時間CAR T細胞と共培養した。共培養物上清をマイクロベータ22450マイクロプレートカウンター(Microbeta2 Microplate Counter)(Pekin Elmer)で解析した。三つ組のウェルの特異的溶解の割合の平均を次のように算出した:[(実験放出−自然放出)/(最大放出−自然放出)]×100。
共培養実験では、非形質導入対照(NT)及びCAR−CD30Tリンパ球を1×106細胞/ウェルで、指示するエフェクター:標的(E:T)比により、24ウェルプレートに播種した。37℃で7日のインキュベーション後、腫瘍細胞及びT細胞を採取し、残留腫瘍細胞及びT細胞を、CD3発現(エフェクターT細胞)及びGFP又はCD30+(腫瘍細胞株)に基づいて、蛍光活性化細胞選別(FACS)解析により評価した。
酵素結合免疫吸着アッセイ及びサイトメトリー用ビーズアレイ
IFNガンマの生成を、特異的ELISAにより市販のキット(R&D Systems、Pepro−Tech、ロッキーヒル、NJ)を使用して定量した。ELISAにより試験した上清を共培養アッセイから採取した。
in vivoでの実験のすべては、国際的、EU及び国の倫理的要件に従い、伊国保健大臣により認可された(No88/2016−PR)。
6週齢のNSG(NOD.Cg−Prkdcscid II2rgtm1Wil/SzJ株、Charles Riverより)マウスに、CD30+カルパス299−F−Luc.GFP 0.2×106を静脈内(i.v.)注射により移植した。3日後、腫瘍の光の放射が一貫して測定可能となると、マウスは、10×106の対照(非形質導入、NT)リンパ球、又はIL2若しくはIL7/IL15のカクテルにより12〜15日間増殖させた、CAR.CD30.ΔCD34.28.4.1BB.ζ(28.4.1BB.ζ)若しくはCAR.CD30.ΔCD34.CD28.OX40.ζ(28.OX40.ζ)のいずれかを用いて遺伝子修飾したT細胞をi.v.注射により受けた。腫瘍の増殖は、IVISイメージングシステム(Xenogen)を使用して評価した。腫瘍のシグナルの強度は、総光子/sec/cm2/sr(p/s/cm2/sr)として測定した。5×105p/sec/cm2/sr未満の生物発光のシグナル(腫瘍を有しないマウスを測定)は、陰性と考えた。in vivoでの実験は、140日間経過観察した。マウス末梢血において循環するT細胞を定期的に評価した。
NHL CD30+カルパス299−F−Luc.GFP腫瘍細胞株を移植し、ある単一用量のCAR.CD30T細胞で処置したマウスを140日間監視し、腫瘍の完全な根絶が(5×105p/sec/cm2/sr未満の生物発光シグナルにより)少なくとも70日間観察された場合、治癒したと考えた。長期免疫記憶の確立を評価するために、+140日目に、治癒したマウスをCD30+カルパス299−F−Luc.GFP腫瘍細胞株0.2×106にi.v.によって再曝露した。マウスを少なくともさらに110日間、経過観察した。対照マウス(CTRマウス)の新たなコホートを腫瘍移植の陽性対照として実験に加えた。CD30+腫瘍の再曝露前後にマウス末梢血において循環するT細胞を評価した。250日目にマウスを安楽死させた。
6週齢のNSGマウスにCD30+L428−FF−Luc.GFP 2×106を静脈内(i.v.)注射により移植した。6日後、腫瘍の光の放射が一貫して測定可能となると、マウスは、10×106の対照(非形質導入、NT)リンパ球、又はIL2若しくはIL7/IL15のカクテルにより12〜15日間増殖させた、CAR.CD30.ΔCD34.28.4.1BB.ζ(28.4.1BB.ζ)若しくはCAR.CD30.ΔCD34.CD28.OX40.ζ(28.OX40.ζ)のいずれかを用いて遺伝子修飾したT細胞を静脈内(iv)注射により受けた。腫瘍の増殖は、IVISイメージングシステム(Xenogen)を使用して評価した。
グラフパッドプリズム(GraphPad Prism)(GraphPad Software)を使用して統計学的評価を実施し、P値<0.05を生成する群間の差異は、有意であると考えた。
CAR−CD30T細胞の生成、特性評価
IgG(AC10)のマウス抗体に由来する一本鎖可変断片(scFv)をCD28とともにインフレームに、及び4−1BB又はOX40のいずれかにより代表される第2の共刺激ドメイン、並びにシグナル伝達ドメインCD3ゼータ鎖(ζ)を含む、2つの強力な第3世代のCAR−CD30(CAR−CD30)T細胞を生成した。選択可能なマーカーとして、図1Aのリン糖タンパク質CD34に由来する低分子(ΔCD34)を加えた。IL2、又はIL7/IL15のカクテルを有するCTL完全培地において増殖させた活性化T細胞(ATC)を、6名の健常ドナーから確立し、CAR.CD30.ΔCD34.28.4.1BB.ζ(28.4.1BB.ζ)又はCAR.CD30.ΔCD34.CD28.OX40.ζ(28.OX40.ζ)SFGベクターをそれぞれコードするレトロウイルス上清を形質導入した。陰性対照として、非形質導入(NT)ATCを並行して培養した。形質導入したT細胞は、フローサイトメトリーにより、代表的な図1Bに示すCD34抗体(クローンQBEnd10)、又は代替的な図1Cのタンパク質L試薬(32)を効率的に使用して検出した。図1Dに示すように、28.OX40.ζ又は28.4.1BB.ζ構築物のいずれかにより形質導入したT細胞は、高レベルのCAR−CD30を発現した。しかし、+5日目に、形質導入のレベルは、28.OX40.ζ(IL2)をコードするベクターを用いてIL2において形質導入したT細胞において、28.4.1BB.ζ(IL2)に対して有意に高くなった(それぞれ87.3%±5.1%対76.1%±9.8%、p<0.05、(平均±標準偏差(SD)は、他に明示しない限り、本明細書及び論文を通して表す))。同様の結果が、IL7/IL15において形質導入したT細胞についても得られた。+5日目に、形質導入のレベルは、28.OX40.ζ(IL7/IL15)T細胞において(84.1%±2.2%)、28.4.1BB.ζ(IL7/IL15)T細胞(78.6%±3.9%)よりも同様に高くなった。p<0.05。注目すべきは、IL2により増殖させた両CD3+CAR.CD30T細胞において、形質導入のレベルが、+15日目に有意に低下し(それぞれ28.OX40.ζ(IL2)では65.1%±10.9%及び28.4.1BB.ζ(IL2)では49.2%±13.3%、p<0.05、青色のアスタリスク)、翌2週間も、少なくとも+30日目まで、さらに安定なままであった(28.OX40.ζ(IL2)及び28.4.1BB.ζ(IL2)はそれぞれ73.0%±6.4%対55.9%±18.1%)。使用する構築物の独立的なIL7/IL15の切替えにより、CD4+及び/又はCD8+T細胞における安定性及び形質導入のレベルが有意に向上する。
特異性共刺激ドメイン及びサイトカインのCAR.CD30T細胞区画に対する影響を評価するために、CD3+CAR−T細胞を、記憶マーカーの発現について特性評価した。培養の+15日目に、CD3/CD28により刺激しIL2で培養した後に生成した増殖T細胞の大部分は、エフェクターメモリー(EfM)表現型を有し、NT及び2種類のCAR.CD30T細胞の間の実質的な差異はなかった。しかし、IL7/IL15の切替えにより、CAR.CD30T細胞のEfM及びターミナルエフェクター(EfT)では、セントラルメモリー(CM)区画が有意に減少した。in vitroでの培養の30日後、ナイーブCAR.CD30T細胞の有意な(IL2により培養したT細胞についてのみ)減少のみが認められた。
修飾T細胞の安全性プロファイルに対するレトロウイルス修飾又は培養条件の影響を、NT又はCAR−CD30T細胞について評価するために、基底増殖又はサイトカイン若しくは/及び抗原特異的増殖を評価した。ゼロ日目に、T細胞を蛍光細胞染色CFSEにより標識し、サイトカイン有/無で5日間播種するか、又は腫瘍細胞株CD30陽性(カルパス299)若しくは腫瘍細胞株CD30陰性(BV173)の存在下で共培養した。CD3+細胞だけでなく、CD8+細胞及びCD4+細胞の基底増殖を評価した。
次いで、CD30+ヒト腫瘍細胞株を殺傷するCAR−CD30T細胞の能力を評価した。
CAR−CD30T細胞のin vivoでの有効性及び持続性を、NHLカルパス299−FF−Luc.GFP腫瘍細胞株(図10A)に対して、異種移植モデルにおいて、免疫不全NSGマウスを使用して比較した。
引き続いて、IL2又はIL7/IL15により15日間増殖させたCAR−CD30T細胞のin vivoでの有効性におけるサイトカインの使用の影響を、さらに侵襲性のHL L428に対して評価した。マウスは、−6日目に、L428−FF−Luc.GFP細胞株2×106をi.v.により受け、腫瘍の光の放射が一貫して測定可能となると、マウスをNT又は遺伝子修飾T細胞でi.v.により処置した。循環するヒトT細胞の持続性を評価するために、+15、+30、+56、+80、+100、+130、+160日目に、処置したマウスの血液を採取した(図12A)。NT T細胞で処置したHL腫瘍担持マウスにおけるL428細胞株の生物発光が、50日未満で最大5logまで急速に増加し(図12B及び図12C)、マウスは病的状態により、死亡したか又は犠死させた。犠死させたマウスの臓器の肉眼による解析により、肝臓に優先的に存在する大量の腫瘍量が示された。28.4−1BB.ζ(IL2)で処置したHL腫瘍担持マウスは、NT(IL2)、NT(IL7/IL15)で処置したHL腫瘍担持マウス(それぞれ52±9及び58±1日)と比べて、中央値に対してわずかに有意に長く生存した(79±10日)(図12B〜E)。IL7/IL15による切替えによって、28.4−1BB.ζ(IL7/IL15)の活性における細胞毒性は向上しなかった(図12B〜D)。28.OX40.ζ(IL2)で処置したHL腫瘍担持マウスの生存の中央値は、NT(IL2)又は28.4−1BB.ζ(IL2)で処置したマウスに対して、最大133±4日まで有意に上昇する。HL腫瘍担持マウスを28.OX40.ζ(IL7/IL15)で処置した場合、生存の中央値は定義されず、2つの28.OX40.ζCAR T細胞で処置したマウス間の全生存のいかなる有意差も有しなかった(p=0.0876及び図12E)。注入したT細胞の持続性を評価するために、L428腫瘍を担持するNSGマウスにおける血液を循環するT細胞を定期的に監視し、実験の全期間においてNT又は遺伝子修飾T細胞で処置した(図12F)。また、NT T細胞で処置したマウスが、循環するヒトCD45+CD3+細胞の有意な増加を、+56日目に評価されたピークにより示したが(NT(IL2)及びNT(IL7/IL15)について、それぞれ26.69%±7.02%及び5.97%±9.63%)、腫瘍制御は、観察されなかった。
材料及び方法
ストレス共培養実験では、非形質導入(NT)対照及びCAR.CD30Tリンパ球(28.OX40.ζT細胞及び28.4−1BB.ζT細胞)を1×106細胞/ウェルで、指示するエフェクター:標的(E:T)比1:1により、24ウェルプレートに播種した。腫瘍を2回以上加えた場合、CAR.T細胞が腫瘍を除去することが可能な時間を評価するために、ゼロ、5、10及び15日目に腫瘍細胞をウェルに加えた。次いで、最大20日共培養した場合のCD3発現(エフェクターT細胞)及びGFP又はCD30+(腫瘍細胞株)に基づくFACS解析により、残留腫瘍細胞及びT細胞の持続性を評価した。
E:T共培養した上清を24時間で採取して、インターフェロンγ(IFNγ)、インターロイキン2(IL−2)、インターロイキン10(IL−10)及び腫瘍壊死因子α(TNF−α)のレベルを、ELLAプロトコール(R and D System)を使用して評価した。
さらに複雑な異議におけるCAR.CD30T細胞の溶解効率を評価するために、5日毎(共培養の0、+5、+10及び+15日目)に腫瘍(カルパス299)を再曝露することにより、共培養条件に「ストレスを与えた」(図13A)。各時点において、一本鎖発現及び相対平均蛍光強度(MFI)、記憶及び枯渇プロファイル並びに相対特異性サイトカイン産生、例えば、IFNγ、TNFα、IL−2及びIL−10(共培養の1、+6、+11及び+16日目)を評価することにより、残留腫瘍の割合及びCAR.CD30T細胞の挙動を評価した。両CAR.CD30T細胞は、カルパス299への複数回の曝露後でさえも高い腫瘍制御を示した。+5日目及び+10日目のそれらの間の溶解活性における有意差は観察されなかったが、28.OX40.ζT細胞は、+20日目に主な腫瘍制御を示した(28.OX40.ζでは8.6%±5.3%及び28.4−1BBζT細胞では27.9%±29.5%)(図13B)。興味深いことには、両CAR.CD30分子の割合は、第1の共培養後に、28.4−1BB.ζT細胞では66.9%±15.23%(+5日目)から93.8%±11.3%(10日目)まで(p=0.022)及び28.OX40.ζT細胞では74.9%±11.3%(+5日目)から93.2%±11.3%(+10日目)まで(p=0.007)有意に上昇した。実際、次の腫瘍再曝露により、28.4−1BB.ζT細胞についてのみ、93.8%±3.06%(+10日目)から67.9%±32.33%(+20日目)まで形質導入のレベルが負に影響され、一方、28.OX40.ζT細胞においては、割合は、93.22%±2.75%(+10日目)から92.53%±3.45%(+20日目)までと安定なままであった(図13C)。
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Claims (17)
- N末端からC末端までに、
a)シグナルペプチド、例えば、MEFGLSWLFLVAILKGVQC(配列番号1)を含むか、又はこれからなるシグナルペプチドであって、第1のリンカーにより以下に連結されている、シグナルペプチド、
b)AC10 VL配列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK(配列番号2)及びAC10 VH配列:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA(配列番号3)を含むか、又はこれらからなる、AC10ハイブリドーマ由来の抗CD30一本鎖抗体ドメインであって、前記AC10 VL及びVH配列が、第2のリンカーにより連結されている、抗CD30一本鎖抗体ドメイン、
c)ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(配列番号4)、
ΔCD19:PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWK(配列番号5)、
NGFR:KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN(配列番号6)、
好ましくは、ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(配列番号4)
からなる群から選択される、追跡可能なマーカー、
d)ヒンジCD8α:PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(配列番号7)、ヒンジCD28:IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(配列番号8)、ヒンジCH2−CH3:ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号9)、ヒンジCH3:ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号10)、好ましくは、ヒンジCD8α:PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(配列番号7)からなる群から選択される、ヒンジ、
e)CD28TM:FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(配列番号13)、CD8aTMCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(配列番号14)、好ましくは、CD8aTMCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(配列番号14)からなる群から選択される、膜貫通ドメイン、並びに
f)CD28細胞質配列:RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(配列番号21)、CD137(4−1BB)配列:KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(配列番号22)、及びCD3ゼータ鎖:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(配列番号23)を連結させることにより得られる配列、又はCD28細胞質配列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(配列番号21)、OX40配列RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(配列番号24)及びCD3ゼータ鎖:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(配列番号23)を連結させることにより得られる配列からなる群から選択される、共刺激シグナル伝達ドメイン
を含むか、又はこれからなるCD30キメラ抗原受容体。 - AC10 VL及びVH配列を連結させる第2のリンカーが、プロリンリッチな強固なリンカー、例えば、マウスigG3上部ヒンジ(mlgG3UH):PKPSTPPGSS(配列番号15)、(mlgG3UH)2:PKPSTPPGSSPKPSTPPGSS(配列番号16)、又はグリシンリッチな可動性リンカー、例えば、(G4S)2リンカー:GGGGSGGGG(配列番号17)、(G4S)4リンカーGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号18)、G4SG2リンカーGGGGSGG(配列番号19)若しくはG3SG4リンカー:GGGSGGGG(配列番号20)、好ましくは、GGGSGGGG(配列番号20)からなる群から選択される、請求項1に記載のCD30キメラ抗原受容体。
- AC10 VH配列及び追跡可能なマーカー配列が、第3のリンカーの配列GSにより連結されている、請求項1又は2に記載のCD30キメラ抗原受容体。
- 膜貫通ドメイン配列及び共刺激シグナル伝達ドメイン配列が、CD8a細胞質(cyto):LYCNHRN(配列番号25)又はEFを含むか、又はこれからなる1つ又は複数のリンカーにより連結されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載のCD30キメラ抗原受容体。
- a)MEFGLSWLFLVAILKGVQC(配列番号1)を含むか、又はこれからなるシグナルペプチドであって、第1のリンカーにより以下に連結されている、シグナルペプチド、
b)AC10 VL配列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK(配列番号2)及びAC10 VH配列:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA(配列番号3)を含むか、又はこれらからなる、AC10ハイブリドーマ由来の抗CD30一本鎖抗体ドメインであって、前記AC10 VL及びVH配列が、第2のリンカー(G4S)2リンカー:GGGGSGGGG(配列番号17)により連結されている、抗CD30一本鎖抗体ドメイン、
c)ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(配列番号4)を含むか、又はこれからなる追跡可能なマーカー、
d)ヒンジCD8αPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(配列番号7)、
e)リンカーCD8a細胞質(cyto):LYCNHRN(配列番号25)を含むか、又はこれからなる1つ又は複数のリンカーにより、以下に連結されている膜貫通ドメインCD8aTMCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(配列番号14)、
f)CD28細胞質配列:RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(配列番号21)、OX40配列:RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(配列番号24)、及びCD3ゼータ鎖:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(配列番号23)を連結させることにより得られる配列からなる、共刺激シグナル伝達ドメインである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のCD30キメラ抗原受容体。 - a)MEFGLSWLFLVAILKGVQC(配列番号1)を含むか、又はこれからなるシグナルペプチドであって、第1のリンカーにより以下に連結されている、シグナルペプチド、
b)AC10 VL配列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK(配列番号2)及びAC10 VH配列:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA(配列番号3)を含むか、又はこれらからなる、AC10ハイブリドーマ由来の抗CD30一本鎖抗体ドメインであって、前記AC10 VL及びVH配列が、第2のリンカー(G4S)2リンカー:GGGGSGGGG(配列番号17)により連結されている、抗CD30一本鎖抗体ドメイン、
c)ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(配列番号4)を含むか、又はこれからなる追跡可能なマーカー、
d)ヒンジCD8αPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(配列番号7)、
e)CD8a細胞質(cyto):LYCNHRN(配列番号25)を含むか、又はこれからなる1つ又は複数のリンカーにより、以下に連結されている膜貫通ドメインCD8aTMCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(配列番号14)、
f)CD28細胞質配列:RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(配列番号21)、CD137(4−1BB)配列:KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(配列番号22)、及びCD3ゼータ鎖:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(配列番号23)を連結させることにより得られる配列からなる、共刺激シグナル伝達ドメインである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のCD30キメラ抗原受容体。 - MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGQIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAGSELPTQGTFSNVSTNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNEFRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(配列番号26)である、請求項1〜4、6のいずれか一項に記載のCD30キメラ抗原受容体。
- MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGQIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAGSELPTQGTFSNVSTNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNEFRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(配列番号27)である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のCD30キメラ抗原受容体。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載のCD30キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列。
- ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGTGTTCACGAGATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAGGGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGGCAGATTCAACTGCAGCAATCAGGACCCGAGGTGGTCAAACCAGGTGCCAGTGTCAAGATATCTTGCAAGGCATCCGGATATACATTTACCGACTATTACATTACCTGGGTCAAGCAGAAACCCGGGCAAGGACTTGAATGGATTGGATGGATCTACCCTGGTAGCGGCAACACCAAATACAACGAAAAGTTTAAAGGGAAGGCAACCCTGACTGTAGACACCTCCAGCTCCACAGCATTCATGCAGCTCTCCTCACTGACCTCCGAGGACACAGCAGTGTATTTCTGTGCTAATTACGGTAATTACTGGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCAAGTGACCGTTTCAGCTGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATCACCCTTTATTGCAACCATCGAAACGAATTCAGAAGTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACCTGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCATACCGCTCTAAGAGAGGGAGAAAAAAATTGCTCTATATTTTTAAACAACCATTTATGAGGCCCGTACAGACAACTCAGGAAGAGGATGGCTGTAGTTGCCGCTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGAGGCTGCGAGTTGAGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA(配列番号28)である、請求項9に記載のヌクレオチド配列。
- ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGTGTTCACGAGATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAGGGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGGCAGATTCAACTGCAGCAATCAGGACCCGAGGTGGTCAAACCAGGTGCCAGTGTCAAGATATCTTGCAAGGCATCCGGATATACATTTACCGACTATTACATTACCTGGGTCAAGCAGAAACCCGGGCAAGGACTTGAATGGATTGGATGGATCTACCCTGGTAGCGGCAACACCAAATACAACGAAAAGTTTAAAGGGAAGGCAACCCTGACTGTAGACACCTCCAGCTCCACAGCATTCATGCAGCTCTCCTCACTGACCTCCGAGGACACAGCAGTGTATTTCTGTGCTAATTACGGTAATTACTGGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCAAGTGACCGTTTCAGCTGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATCACCCTTTATTGCAACCATCGAAACGAATTCAGAAGTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACCTGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCATACCGCTCTCGCGATCAAAGACTCCCGCCCGATGCCCACAAACCCCCTGGCGGGGGCAGCTTTAGGACACCCATTCAAGAAGAGCAGGCAGACGCCCACAGCACCTTGGCCAAAATTAGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA(配列番号42)である、請求項9に記載のヌクレオチド配列。
- DNAベクター、RNAベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、請求項9〜11のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
- 請求項12に記載のベクター又はプラスミドを含む、細胞、例えば、T細胞、例えば、アルファ/ベータ及びガンマ/デルタT細胞、NK細胞、NK−T細胞。
- IL−7及びIL−15の両方が存在する培養条件下、例えば、細胞の調製のためのプロセスの活性化ステップ、形質導入ステップ及び/又は増殖ステップの条件下で得られる、請求項13に記載の細胞。
- 請求項9〜11のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、又は請求項12に記載のベクター、又は請求項13又は14に記載の細胞を、1つ又は複数の賦形剤及び/又はアジュバントとともに含む医薬組成物。
- 医学的使用のための、請求項1〜8のいずれか一項に記載のCD30キメラ抗原受容体、請求項9〜11のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、請求項12に記載のベクター、請求項13又は14に記載の細胞、請求項15に記載の医薬組成物。
- CD30+がん、例えば、CD30+PDL1+がん、特定には、L428−PDl1+がん、例えば、リンパ腫、例えば、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、固形腫瘍、例えば、筋線維芽細胞性肉腫、ラブドイド腫瘍、組織球性肉腫、胚性癌腫、腺癌、中皮腫、混合胚細胞腫瘍(GCT)、非精上皮腫GCT、頭頸部癌、卵黄嚢腫瘍、血管肉腫、下垂体腺腫、未分化胚細胞腫、奇形腫若しくは精上皮腫の治療における使用のための、請求項1〜8のいずれか一項に記載のCD30キメラ抗原受容体、請求項9〜11のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、請求項12に記載のベクター、請求項13又は14に記載の細胞、請求項15に記載の医薬組成物。
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