CN106589139A - 一种靶向表达cd30表面抗原的细胞的嵌合抗原受体 - Google Patents

一种靶向表达cd30表面抗原的细胞的嵌合抗原受体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种靶向表达CD30表面抗原的细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，包含CD30结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域，所述CD30结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还涉及编码所述嵌合抗原受体的核酸，还涉及表达所述嵌合抗原受体的重组表达载体。通过将本发明的嵌合抗原受体表达于T细胞中可使得到CAR T细胞能够有效并且特异性地靶向表达CD30表面抗原的恶性细胞，从而为治疗一些表达CD30表面抗原的肿瘤，例如霍奇金淋巴瘤等，提供更高效并且副作用和不良反应更少的方法。

Description

一种靶向表达CD30表面抗原的细胞的嵌合抗原受体
技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗领域，更特别地，涉及一种靶向表达CD30表面抗原的细胞的嵌合抗原受体及其编码序列和表达载体。
背景技术
CD30是霍奇金淋巴瘤和一些非霍奇金淋巴瘤的恶性细胞常常表达的细胞表面抗原，因此，在治疗这类疾病时，最好能够使用可靶向CD30的药物或疫苗。
细胞免疫治疗是一种正在兴起的肿瘤治疗方法，其通过分子生物学技术构建嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的表达载体，并将该表达载体导入到从人体分离的免疫细胞中，使其细胞表面表达CAR后，将其回输至人体。表达CAR的免疫细胞能够特异性识别靶细胞，并对其进行杀伤。
在这种治疗方法中，CAR的作用至关重要。嵌合抗原受体包括单链抗体结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域。其中，单链抗体结构域将免疫细胞靶向目标细胞，胞内信号结构域释放胞内信号，启动免疫细胞的杀伤活性。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种靶向表达CD30表面抗原的细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，包含CD30结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域，所述CD30结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述跨膜结构域为CD8，其氨基酸序列序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述细胞内信号结构域由CD28、4-1BB和CD3组成，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
本发明还提供了一种编码上述嵌合抗原受体的核酸，其序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供了一种表达上述嵌合抗原受体的重组表达载体，其包括嵌合抗原受体表达框和复制系统，所述嵌合抗原受体表达框由可在T细胞中表达的启动子和位于所述启动子下游的编码所述嵌合抗原受体的核酸组成。
优选地，所述启动子为巨细胞病毒启动子、SV40启动子、EF1alpha启动子或RSV启动子。
优选地，所述重组表达载体通过将所述编码嵌合抗原受体的核酸插入慢病毒表达载体中的CMV启动子得到。
通过将本发明的嵌合抗原受体表达于T细胞中可使得到CAR T细胞能够有效并且特异性地靶向表达CD30表面抗原的恶性细胞，从而为治疗一些表达CD30表面抗原的肿瘤，例如霍奇金淋巴瘤等，提供更高效并且副作用和不良反应更少的方法。
附图说明
图1为实施例中编码CD30嵌合抗原受体的DNA片段的示意图；
图2为CAR T细胞、GAR T细胞和T细胞对高表达CD30的霍奇金淋巴瘤细胞的杀伤活性统计图；
图3为CAR T细胞、GAR T细胞和T细胞对不表达CD30的人成纤维细胞BJ的杀伤活性统计图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.CD30 SCFV嵌合抗原受体表达质粒的构建
通过人工合成SEQ ID NO:4所示的长度为1623bp的DNA片段，其中，第1-819位的核苷酸编码CD30 SCFV，第820-954位的核苷酸编码CD8铰链区，第955-1158位的核苷酸编码CD28，第1159-1284位的核苷酸编码41BB，第1285-1623位的核苷酸编码CD3。后面三个区域构成胞内信号区。
将上述DNA片段插入慢病毒表达载体pLVX-IRES-puro的CMV启动子下游，得到CD30SCFV嵌合抗原受体表达质粒。
2.CD30 SCFV嵌合抗原受体表达质粒转染T细胞
1)慢病毒的包装制备
将CD30 SCFV嵌合抗原受体表达质粒和辅助质粒psPAX2、pMD2.G以4:3:1的比例用lipo2000转染试剂(Invitrogen)转染，具体方法见lipo2000转染试剂说明书。转染48小时后，将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中，4℃2000g离心10min，转移上清至新EP管中，0.45μm滤器过滤后-80℃保存.
2)T细胞的制备
取10ml健康人的新鲜血液，用淋巴细胞分离液(Mediatech)分离外周血单核细胞，具体方法见说明书。用含有300IU/ml的IL-2、50ng/ml的OKT-3和5％人AB血清(Invitrogen)的AIM-V培养基(Invitrogen)诱导培养48h，得到T细胞。
3)慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的扩增培养
从-80℃取出2ml病毒液，加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺(购自Sigma公司)，用该病毒液重悬1×106个上述诱导培养的T细胞。将细胞悬液加入24孔板的1个孔中，1000g，32℃，离心1h。37℃，5％CO2培养箱内培养8h后，1000g，32℃，再次离心1h。吸弃1.4ml培养上清，加入1.4ml新鲜的含有300IU/ml的IL-2、50ng/ml的OKT-3和5％人AB血清的AIM-V培养基，继续培养。每2-3天检测一次细胞密度，当细胞密度达到2×106个/ml时，吸取1ml细胞悬液，加入另一个孔中，分别向两个孔中加入1ml新鲜的含有300IU/ml的IL-2和5％人AB血清的AIM-V培养基，继续扩大培养。如此反复，直至细胞扩增至足够的用量。
检验CD30 SCFV嵌合抗原受体在T细胞中有效表达后，即获得针对CD30的CART细胞。
3.CAR T细胞的对CD30阳性的恶性细胞的特异性杀伤活性
分别取5×104个霍奇金淋巴瘤细胞(高表达CD30)和人成纤维细胞BJ接种于96孔板，过夜培养后，分别向两种细胞培养孔中按效应细胞(E)：靶细胞(T)＝10:1和3:1的比例加入CAR-T细胞、对照病毒修饰的T细胞(GFP-T)和未加修饰的T细胞(T)。孵育5h后，按照LDH细胞毒性分析试剂盒(Cayman Chemical)说明书进行操作，检测CAR T细胞对霍奇金淋巴瘤细胞的特异杀伤活性。结果显示CAR T细胞组与GFP-T组和T细胞组相比，在效靶比为10:1和3:1的情况下，对高表达CD30的霍奇金淋巴瘤细胞都具有更强的杀伤作用，且这种差异具有显著性(p<0.05)(图1)；对不表达CD30的人成纤维细胞BJ的杀伤作用无显著性差异(p>0.05)(图2)。因此CAR T细胞对高表达CD30的肿瘤细胞具有特异杀伤活性。
上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉波睿达生物科技有限公司
<120> 一种靶向表达CD30表面抗原的细胞的嵌合抗原受体
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val
1 5 10 15
Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Thr Ile
20 25 30
His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile Gly Tyr
35 40 45
Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly
50 55 60
Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln
65 70 75 80
Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Asn Val Thr Tyr Lys
145 150 155 160
Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
180 185 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys
210 215 220
Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Pro Ala
245
<210> 2
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val
1 5 10 15
Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Thr Ile
20 25 30
His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp
35 40 45
<210> 3
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn
1 5 10 15
Phe Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala
20 25 30
Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
35 40 45
Cys Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala
50 55 60
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr
85 90 95
Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Asn Val
100 105 110
Thr Tyr Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln
115 120 125
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr
130 135 140
Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr
145 150 155 160
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu
165 170 175
Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Pro Ala
195 200
<210> 4
<211> 1623
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtct 60
agaatggccc aggtgcaact gcagcagtca ggggctgagc tggctagacc tggggcttca 120
gtgaagatgt cctgcaaggc ttctggctac acctttacta cctacacaat acactgggta 180
agacagaggc ctggacacga tctggaatgg attggataca ttaatcctag cagtggatat 240
tctgactaca atcagaactt caagggcaag accacattga ctgcagacaa gtcctccaac 300
acagcctaca tgcaactgaa cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcta ttactgtgca 360
agaagagcgg actatggtaa ctacgaatat acctggtttg cttactgggg ccaagggacc 420
acggtcaccg tctcctcagg tggaggcggt tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga 480
tcggacatcg agctcactca gtctccaaaa ttcatgtcca catcagtagg agacagggtc 540
aacgtcacct acaaggccag tcagaatgtg ggtactaatg tagcctggtt tcaacaaaaa 600
ccagggcaat ctcctaaagt tctgatttac tcggcatctt accgatacag tggagtccct 660
gatcgcttca caggcagtgg atctggaaca gatttcactc tcaccatcag caatgtgcag 720
tctgaagact tggcagagta tttctgtcag caatatcaca cctatcctct cacgttcgga 780
gggggcacca agctggaaat caaacgggcg gatcccgcca ccacgacgcc agcgccgcga 840
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatttttgg 960
gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct tgctatagct tgctagtaac agtggccttt 1020
attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc acagtgacta catgaacatg 1080
actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc cctatgcccc accacgcgac 1140
ttcgcagcct atcgctccaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 1200
tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 1260
gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 1320
taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1380
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 1440
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1500
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1560
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1620
taa 1623

Claims (7)

1.一种靶向表达CD30表面抗原的细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，包含CD30结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域，所述CD30结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为CD8，其氨基酸序列序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述细胞内信号结构域由CD28、4-1BB和CD3组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.一种编码权利要1-3中任一项所述的嵌合抗原受体的核酸，其特征在于，序列如SEQID NO:4所示。
5.一种表达权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体的重组表达载体，其特征在于，包括嵌合抗原受体表达框，所述嵌合抗原受体表达框由可在T细胞中表达的启动子和位于所述启动子下游的编码所述嵌合抗原受体的核酸组成。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述启动子为巨细胞病毒启动子、SV40启动子、EF1alpha启动子或RSV启动子。
7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体通过将所述编码嵌合抗原受体的核酸插入慢病毒表达载体中的CMV启动子的3’下游得到。
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Pledgee: Wuhan area branch of Hubei pilot free trade zone of Bank of China Ltd.

Pledgor: WUHAN BIO-RAID BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

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