CN111138548A - 一种egfr靶向性的嵌合抗原受体、car-nk细胞及其制备方法、应用 - Google Patents

一种egfr靶向性的嵌合抗原受体、car-nk细胞及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种EGFR靶向性的嵌合抗原受体，EGFR靶向性的嵌合抗原受体包括抗EGFR抗体的抗原结合域，抗EGFR抗体的抗原结合域表达为EGFRscFv，EGFRscFv的核酸序列为SEQ ID NO:2。本发明还提供了CAR‑NK细胞及其制备方法，使NK细胞表达EGFR靶向性的嵌合抗原受体的EGFRscFv，得EGFR靶向性的CAR‑NK细胞。本发明还提供一种组合物、抗癌剂、应用。本发明提供的EGFR靶向性的CAR‑NK细胞对三阴性乳腺癌EGFR靶点具有特异识别性，靶向杀伤EGFR阳性三阴性乳腺癌癌细胞并促进细胞因子的释放。CAR‑NK细胞作为效应细胞识别肿瘤时，不需要自身白细胞抗原与肿瘤匹配，不会产生移植物抗宿主反应。CAR‑NK疗法不会引发细胞因子风暴，更安全。CAR‑NK细胞来源广泛，如外周血单个核细胞、诱导多能干细胞、脐带血、人类胚胎干细胞和NK‑92细胞系。

Description

一种EGFR靶向性的嵌合抗原受体、CAR-NK细胞及其制备方法、 应用
技术领域
本发明涉及生物与医药技术领域，尤其涉及一种EGFR靶向性的嵌合抗原受体、CAR-NK 细胞及其制备方法、应用。
背景技术
据2018全球癌症年报统计，乳腺癌依旧是女性中发病率最高的癌症类型，仅在2018 年，全球新增2088849个乳腺癌病例，死于乳腺癌的女性患者达到626679例。据《2019年全国癌症报告》及《2018中国肿瘤登记年报》统计，我国乳腺癌新发病例约为279000 例，死亡病例约为66000例。预计2021年，我国乳腺癌患者将达250万。乳腺癌严重危害患者生命和生活质量，同时治疗费用及相关社会经济问题给个人和国家带来沉重负担。但由于特定历史、经济等原因，我国医药产业基础弱于欧美，创新型药物及治疗手段长期依赖于进口和模仿。随着知识产权的保护及限制，模仿不可能成为我国医药发展的长期目标。因而建立具有自主知识产权的创新型药物、创新型疗法成为我国现阶段医药发展的当务之急。
乳腺癌在不同患者中差异很大，差异体现在临床诊断、形态发生和分子分型中。按照组织分期、肿瘤体积、淋巴结浸润、受体特征和信号通路等，乳腺癌可以被分成多种类型。根据雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)、孕激素受体(Progesterone Receptor,PR)和人表皮生长因子受体2(Erb-B2 Receptor Tyrosine Kinase 2,HER2)的表达情况，可以将乳腺癌分为ER+、HER2+和三阴性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer,TNBC)三种类型。在临床中ER+、HER2+乳腺癌患者术后一般采用内分泌治疗或特异性靶向治疗，效果良好。由于缺乏ER、HER2靶点，三阴性乳腺癌恶性程度高，且在临床中尚无特异性靶向治疗药物，化疗和放疗是手术后主要干预手段。但这些疗法的细胞毒性通常会导致患者产生严重的不良反应，如全血细胞减少、恶心和腹泻等。此外，经过化疗或放疗三阴性乳腺癌患者的复发率也显著高于其它类型的乳腺癌患者。因此，为三阴性乳腺癌患者寻找高效且低副作用的治疗策略成为临床科研重点。
表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)是酪氨酸激酶亚家族的成员，通过与其配体结合可诱导EGFR同二聚化或异二聚化，促使其酪氨酸激酶结构域自磷酸化，进一步激活下游信号通路(如：PI3K/AKT信号通路，Ras/Raf/MEK/ERK信号通路)，行使其生物学功能。随着对三阴性乳腺癌研究的深入，发现EGFR在45％—70％三阴性乳腺癌中异常高表达，且EGFR表达高低与乳腺肿瘤大小和预后直接相关。大量研究显示，EGFR在中国、日本、韩国、欧洲、澳洲、美洲三阴性乳腺癌患者中突变率极低，仅有的基因突变几乎都发生在EGFR酪氨酸激酶结构域的第19和21外显子编码部分，而非胞外结构域编码区。所以野生型EGFR几乎可以作为全球通用EGFR阳性乳腺癌直接治疗靶点，目前临床中针对于EGFR阳性乳腺癌治疗药物主要包括单克隆抗体类和小分子抑制剂类，且60％以上的病人对这两类药物有反应。但由于二次突变、其他激酶改变及反馈调节等原因，在抗EGFR治疗过程中也会出现耐药、不敏感等现象，严重制约治疗效果 [33,34]。因而，为EGFR阳性三阴性乳腺癌患者寻找新的治疗方案和可替代手段，成为科研工作者和医护工作者工作重点。
近些年来，嵌合抗原受体修饰的NK细胞或T细胞(Chimeric Antigen Receptor-Engineered NK cells or T cells，CAR-NK or CAR-T)疗法已成为癌症治疗中最具有前景的策略之一。CAR-NK细胞的嵌合抗原受体一般由胞外抗原结合结构域、跨膜区域、胞内信号激活结构域组成。通过改变CAR-NK细胞胞外抗原结合结构域中单链可变区 (Single-ChainFragment Variable，scFv)序列，可以使其靶向不同抗原杀伤肿瘤细胞。第一代CAR-NK仅有含有CD3ζ链的活化信号，当scFv识别肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原后将信号传入胞内，由CD3ζ引发CAR-NK细胞的激活。由于第一代CAR-NK不含有其它共刺激信号结构域，不能维持长期适应性免疫。为提高CAR-NK细胞的寿命及功能，第三代CAR(如附图所示)在第一代CAR结构基础上加入的协同刺激信号(CD28和4-1BB) 进一步增强了CAR-NK细胞的增殖能力、肿瘤细胞杀伤能力和细胞因子分泌能力。因而，第三代抗原特异性CAR-NK细胞可以更有效地抑制实体肿瘤的生长。并且第三代CAR-NK 疗法已经在乳腺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤的临床或临床前治疗中取得令人欣喜的结果。随着生物医药产业对这一领域的重视程度越来越高，基于CAR-NK细胞针对实体肿瘤疗法的基础和临床试验数量持续增加，未来10年实体肿瘤治疗将迎来免疫疗法新纪元，所以通过改变scFv单克隆抗体的重链及可变轻链使CAR-NK靶向肿瘤特异性抗原治疗乳腺癌，已经具备很强的理论和实践基础。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种EGFR靶向性的嵌合抗原受体，将对EGFR 具有靶向性的EGFRscFv基因片段插入到合成慢病毒表达载体的股价质粒中，得到EGFR靶向性的嵌合抗原受体，对EGFR具有特异性。
为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现。
本发明的一个目的是提供一种EGFR靶向性的嵌合抗原受体，所述EGFR靶向性的嵌合抗原受体主要由如下顺序连接的部分组成：EF1a启动子、抗EGFR抗体的抗原结合域、 CDαHinge铰链区、CD28 TM跨膜区域、41-BB共刺激信号传导区域、CD3ζ信号传导结构域；
其中，所述抗EGFR抗体的抗原结合域表达为EGFRscFv，EGFRscFv的核酸序列为SEQID NO:2；所述SEQ ID NO:2具体为：
GTCTCCTCAGATATTGTATTGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTG CAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTTCCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCT ATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCGTCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACC ATCACCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTGGCGACTGGCCGCTCACTTTCGGCGG AGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCGggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggat ctggtggcggcggatctCAGGTGCAGCTACAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCGTGTCCCTC ACCTGCAGTGTCTCTGGTGACTCCCTCAGTCATAACTACTGGAGTTGGATCCGGCAGCCACCAGGGAAGGGACTGGA GTGGATTGGGTATATCTATCCTAGTGGGACTAGTGGGACCACCAAGTACAATCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCA TATCAAGCGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAGGTTGACCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCATATATTAT TGTGCGAAAGAGGCAATCACCGCCAATGCCTGGCCGGTGTCGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC。
优选地，所述EGFR靶向性的嵌合抗原受体的核酸序列为SEQ ID NO:1；所述SEQ IDNO:1 具体为：
gccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggca ccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcggg agagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacgg agtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggagggg ttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctc cttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttc catttcaggtgtcgtgattcgaagccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctc cacgccgccaggccgGTCTCCTCAGATATTGTATTGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAG AGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTTCCAACAGAAACCTGGCCAGGCTC CCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCGTCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACA GACTTCACTCTCACCATCACCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTGGCGACTGGCC GCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCGggtggcggtggctcgggcggtggtgggt cgggtggcggcggatctggtggcggcggatctCAGGTGCAGCTACAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCG GAGACCGTGTCCCTCACCTGCAGTGTCTCTGGTGACTCCCTCAGTCATAACTACTGGAGTTGGATCCGGCAGCCACC AGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATCCTAGTGGGACTAGTGGGACCACCAAGTACAATCCCTCCCTCA AGAGTCGAGTCACCATATCAAGCGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAGGTTGACCTCTGTGACCGCTGCGGAC ACGGCCATATATTATTGTGCGAAAGAGGCAATCACCGCCAATGCCTGGCCGGTGTCGGACTACTGGGGCCAGGGAAC CCTGGTCACCaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgc gcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatttctgggtg ctggtcgttgtgggcggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtgaggag caagcggagcagactgctgcacagcgactacatgaacatgaccccccggaggcctggccccacccggaagcactacc agccctacgcccctcccagggatttcgccgcctaccggagcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaa caaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaagg aggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctata acgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatgggggga aagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtga gattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaagg acacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcTAAtctagaccgcgtctggaacaatcaacctctgga ttacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaa tgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctt tatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttg gggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcg ccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctg acgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggaattaattctgcagtcgagacctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagaggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattagcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaagaactgctgatatcgagcttgctacaagggactttccgctggggactttccagggaggcgtggcctgggcgggactggggagtggcgagccctcagatcctgcatataagcagctgctttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggccttgacattgctagcgttttaccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggt。
优选地，所述EF1a启动子的核酸序列为SEQ ID NO:3；所述SEQ ID NO:3具体为：
gagtaattcatacaaaaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaa cccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgagg ctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaa ccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggt gggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggt aagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgc ccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgctta aggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcttgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcacc ttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttc tggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacgg ggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagt ctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcc cggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcg gcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtg actccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttgg ggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgat gtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtt tttttcttccatttcaggtgtcgtga；
所述CDαHinge铰链区的核酸序列为SEQ ID NO:4；所述的SEQ ID NO:4具体为：
accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggc gtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat；
所述CD28 TM跨膜区域的核酸序列为SEQ ID NO:5；所述SEQ ID NO:5具体为：
ttctgggtgctggtcgttgtgggcggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttg ggtgaggagcaagcggagcagactgctgcacagcgactacatgaacatgaccccccggaggcctggccccacccgga agcactaccagccctacgcccctcccagggatttcgccgcctaccggagc；
所述41-BB共刺激信号传导区域的核酸序列为SEQ ID NO:6；所述SEQ ID NO:6具体为：
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaaga tggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg；
所述CD3ζ信号传导结构域的核酸序列酸序列为SEQ ID NO:7；所述SEQ ID NO:7具体为：
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatct aggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaagga agaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaa ggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgc ccttcacatgcaggccctgccccctcgc。
本发明的第二个目的是提供一种组合物，包括载体以及如上所述EGFR靶向性的嵌合抗原受体。
本发明的第三个目的是提供一种EGFR靶向性的CAR-NK细胞的制备方法，包括步骤利用慢病毒的包装质粒将如上所述的EGFR靶向性的嵌合抗原受体在293T/17细胞中包装，构建含有EGFR靶向性的嵌合抗原受体的慢病毒载体，感染NK细胞,使NK细胞表达EGFR 靶向性的嵌合抗原受体的EGFRscFv。
优选地，采用三质粒包装系统进行慢病毒包装，三质粒分别为慢病毒包装质粒Pmd2.G、载体质粒PSPAX2、权利要求1所述的EGFR靶向性的嵌合抗原受体。
优选地，还包括步骤扩增NK细胞：将单个核细胞置入含有10％自体血清的无饲养细胞培养基中，37℃、5％CO2的培养箱中培养1周；再于含有5％自体血清的无饲养细胞培养基中，37℃、5％CO2的培养箱中继续培养1周。
本发明的第四个目的是提供一种EGFR靶向性的CAR-NK细胞，采用如上所述的制备方法得到。
本发明的第五个目的是提供一种抗癌剂，包括如上所述的EGFR靶向性的CAR-NK细胞和药学上允许的添加剂。
本发明的第六个目的提供一种如上所述的EGFR特异性嵌合抗原受体或如上所述的 EGFR靶向性的CAR-NK细胞在制备杀伤EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞的产品中的应用。
在本发明中，“EF1a”是一种构建核苷酸序列的启动子，属于广泛表达的类型。启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子是基因转录水平表达调控的重要和关键元件，在基因的调控方面起着决定性作用。EF1a长度约1200bp，它驱动能力较强，是目前分子平台上用的较多的广泛表达启动子。
“scFv”，是识别肿瘤相关特异性抗原的单链抗体片段，全称single-chainantibody fragment。scFv是指这样的抗体片段：其是包含通过接头(linker)连接的重链可变区 (variable region of heavy chain，VH)和轻链可变区(variable region of lightchain， VL)的重组蛋白,接头使得这两个结构域相关联，以最终形成抗原结合位点。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。“EGFRscFv”是向第三代CAR质粒的scFv片段中构建入具有EGFR靶向性的基因片段所制得。
“CDαHinge”为嵌合受体铰链，起定位及连接作用。
术语“跨膜区域”和“跨膜部分”为等同概念，具有本领域技术人员通常已知的含义，指扩膜蛋白中连接蛋白的胞外区和胞内区的部分，其跨越细胞膜，通常为α-螺旋结构。构成蛋白质跨膜部分的氨基酸大部分是疏水性氨基酸。构成本发明的EGFR特异性的嵌合抗原受体的跨膜区域选自CD分子的跨膜部分。本发明优选的跨膜区域为CD28 TM， CD28 TM是CD28细胞内跨膜结构域，连接胞外结构域及胞内结构域，CD28是粘附分子免疫球蛋白超家族的一员，转导增殖信号并诱导细胞因子的产生，抑制肿瘤生长。
“41-BB”分子是肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)超家族的成员，是除CD28/B7之外的另一重要的介导T细胞活化的共刺激分子。主要分布在活化的CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞和NK细胞表面，产生共刺激信号能够促进CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞和NK细胞增殖、分化及细胞因子的产生。41-BB分子的胞浆功能区含有5个氨基酸的保守序列，可介导T细胞活化的第二信号。本发明所述的41-BB分子的胞浆功能区是指能够介导T细胞活化的41-BB分子的胞浆区的全部或一部分。优选地，所述的41-BB分子的胞浆功能区包含或由SEQ ID NO:6所示核酸序列编码的氨基酸组成。
“CD3ζ”为信号转导域，当胞外区和目标抗原结合时，就会向胞内传导TCR样信号，激活T细胞，发挥靶向性杀伤肿瘤细胞的作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过改变第三代CAR质粒的scFv单链抗体的重链及可变轻链，获得本发明的嵌合抗原受体对EGFR具有特异性，其在NK细胞上表达之后所得到的CAR-NK细胞针对EGFR靶点具有特异识别性，该CAR-NK细胞可以靶向EGFR抗原从而治疗EGFR阳性三阴性乳腺癌。该EGFR特异性的CAR-NK细胞对EGFR阳性三阴性乳腺癌杀伤细胞因子释放量大，对 EGFR高表达的三阴性乳腺癌细胞系的毒性大。在本发明的一些优选方案中，EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞系的EGFR表达量高于非三阴性乳腺癌细胞系，本发明的EGFR特异性的 CAR-NK细胞对EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞系细胞得毒性更大，可以高效的杀伤EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞。
此外，与CAR-T技术相比，CAR-NK疗法在肿瘤免疫治疗中具有更多优势。由于CAR-NK 细胞作为效应细胞识别肿瘤时，不需要自身白细胞抗原与肿瘤匹配，所以不会产生移植物抗宿主反应。并且，CAR-NK疗法不会引发细胞因子风暴，这使得CAR-NK技术比CAR-T技术更安全。而且，CAR-NK细胞来源广泛，如外周血单个核细胞、诱导多能干细胞、脐带血、人类胚胎干细胞和NK-92细胞系。即本发明所制得CAR-NK细胞，即能使EGFR阳性三阴性乳腺癌杀伤细胞因子释放量大，对EGFR高表达的三阴性乳腺癌细胞系的毒性大，又不会产生移植物抗宿主反应，使用更安全。
而且本发明中NK细胞在培养过程中采用无饲养细胞培养基加自体血清扩增技术，回避了常用的胎牛血清或异源血清作为添加物，避免了引入异种蛋白及动物源性病原微生物的可能。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以一些实施例来详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本实发明的不当限定。在附图中：
图1为第三代CAR质粒模式图；
图2为EGFR-CAR质粒结构图图一；
图3为EGFR在乳腺癌细胞中的表达结果图；其中，图3A为蛋白质免疫印迹印迹；图3B-3E分别为流式细胞法检测EGFR在MCF7、HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231中的表达量结果图；
图4为流式细胞法检测NK细胞表型和亚群组成结果图；图4A-4E表示用流式细胞仪检测NK细胞表型和亚群组成，分别用抗PE-Cy7，抗PE，抗APC-Cy7，抗CD3-PE-Cy7，抗 CD56-PE和抗CD69-APC-Cy7流式抗体标记；
图5为Con-CAR质粒结构图；
图6为EGFR-CAR质粒结构图图二；
图7为Con-CAR质粒和限制性酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；
图8为EGFR-CAR质粒和限制性酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；
图9为蛋白质免疫印迹法检测外源CD3ζ在未转染NK细胞、Con-CAR-NK、EGFR-CAR-NK 中的表达结果图；
图10为流式细胞法检测未转染NK细胞(Non-transduced NK)、Con-CAR-NK、EGFR-CAR-NK与EFGR的结合情况；
图11为三种阳性乳腺癌细胞系(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231)的EGFR被抑制后的三阴性乳腺癌中的EGFR的表达结果图；其中，图11A、图11B、图11C分别对应表示HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231三种阳性乳腺癌细胞系；
图12为未转染NK细胞(Non-transduced NK cell)、Con-CAR-NK细胞和EGFR-CAR-NK 细胞对EGFR阳性或阴性乳腺癌细胞杀伤细胞因子释放的实验结果图；其中，图12A、图12B、图12C分别对应表示HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF-7四种乳腺癌细胞；
图13为未转染NK细胞(Non-transduced NK cell)、Con-CAR-NK细胞和EGFR-CAR-NK 细胞对EGFR阳性或阴性乳腺癌细胞的细胞杀伤效果图。
具体实施方式
为了可以更充分地理解本文描述的发明，阐述以下实施例。应当理解这些实施例仅用于说明性目的并且不应被理解为以任何方式限制本发明。
以下实施例所用的材料来源说明如下：
1.慢病毒表达质粒Lenti-EF1a-scFv-3rd-CAR，慢病毒包装质粒pMD2G，载体质粒PSPAX2购自爱康得生物医学技术有限公司。
2.感受态细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
3.293T/17细胞、MCF7细胞、HS578T细胞、MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞购自ATCC。
4.CD3-PE-Cy7、CD56-PE、CD69-APC-Cy7、PE-Cy7、PE、APC-Cy7购自Biogems。
应当解释的，本发明实施例所涉及的材料均是可以通过常规商业途径购买获得。
对本文中的以下的英文名称进行解释：
Figure BDA0002285494970000111
本发明提供了一种EGFR靶向性的CAR-NK细胞的构建方法，包括以下步骤：
1)从健康人血液中分离出单个核细胞；
2)将步骤1)所得的单个核细胞进行活化扩增，将单个核细胞置入含有10％自体血清的无饲养细胞培养基中，37℃、5％CO2的培养箱中培养1周；再于含有5％自体血清的无饲养细胞培养基中，37℃、5％CO2的培养箱中继续培养1周，通过流式细胞法检测CD3、CD56、CD69阳性比例在NK细胞合理范围内(即CD3-、CD56+、CD69+)，以确定得到高纯度NK淋巴细胞；其中，CD3-表示阴性，CD56+、CD69+表示阳性；
3)将特异性强的EGFR胞外结构域结合抗体的核酸序列构建入第三代CAR质粒编码基因的scFv片段中，得到包括EF1a启动子、抗EGFR抗体的抗原结合域、CDαHinge铰链区、CD28 TM-跨膜区域、41-BB共刺激信号传导区域、CD3ζ信号传导结构域核酸序列的EGFR靶向性的嵌合抗原受体，即EGFR靶向性的CAR质粒，结构为EF1a-EGFRscFv-CDα Hinge-CD28 TM-41-BB-CD3ζ，该CAR质粒命名为EGFR-CAR；其中，第三代CAR质粒结构为EF1a-scFv-CDαHinge-CD28 TM-41-BB-CD3ζ，第三代CAR质粒模式图如图1所示；
EGFRscFv的核酸序列为SEQ ID NO:2；EGFR-CAR质粒结构图如图2所示；
4)利用慢病毒的包装质粒将步骤3)所得到的所述的EGFR靶向性的嵌合抗原受体在 293T/17细胞中包装，构建含有EGFR靶向性的嵌合抗原受体的慢病毒载体，感染NK细胞,使NK细胞表达EGFR靶向性的嵌合抗原受体的EGFRscFv，制得的EGFR靶向性的CAR-NK 细胞命名为EGFR-CAR-NK。
具体步骤为：采用三质粒包装系统进行慢病毒包装，三质粒分别为慢病毒包装质粒 Pmd2.G、载体质粒PSPAX2、步骤3)中所得的EGFR靶向性的EGFR-CAR质粒，用293T/17 细胞作为慢病毒的包装细胞，培养，收集病毒液，将此病毒液浓缩后，感染NK细胞，即可获得EGFR-CAR-NK细胞。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。应当理解这些实施例仅用于说明性目的并且不应被理解为以任何方式限制本发明。
实施例1
分离并得到健康成人外周血的单个核细胞，具体步骤如下：
经静脉采集健康成人的外周血，250g离心力离心10min，弃上清，向离心得到的下层沉淀物中加入体积PBS混匀，用移液管将混匀后的溶液加到淋巴细胞分离液的上层。在800g下离心30min，最上方为血浆和缓冲液层，第二层为白色雾状层，第三层为较为清澈的淋巴细胞分离液层，最下层为红细胞及粒细胞层，单个核细胞富集于第二层。将所得的第二层液体转移至另一离心管中，加入三倍体积的PBS溶液混匀，400g条件下离心10min，用去除上清，得到外周血单个核细胞。
应当解释的，上述实验中的健康成人外周血免疫细胞的分离和冻存需在5小时内完成。
实施例2
进行NK细胞扩增培养及鉴定，具体步骤如下：
将实施例1得到的单个核细胞群体进行活化扩增，在含10％自体血清的10ml NK细胞无饲养培养基中，37℃含5％CO2的培养箱中培养1周，然后在在含5％自体血清的10ml NK细胞无饲养培养基中，37℃含5％CO2的培养箱中培养1周，共两周。然后在4℃，400g 条件下离心10min，收集细胞，用1ml含0.5％BSA的PBS重悬细胞，短暂离心两遍，离心时间大约2秒，弃上清。将离心后所得细胞重悬在95ul含0.5％BSA的PBS，并加入5ul Fc blocker，冰域30min。向用Fc blocker处理后所得细胞溶液中加入300ul 0.5％BSA 的PBS，100ul一管，分装两管；一管中加入5ul CD3-PE-Cy7、5ul CD56-PE、5ul CD69-APC-Cy7，另一管中加入5ulcontrol PE-Cy7、5ul control PE、5ul APC-Cy7，4℃震荡一小时。向每一管中分别加入1ml含0.5％BSA的PBS，4℃，400g条件下离心10min，洗两次。
用200ul 0.5％BSA的PBS将上述步骤得到的细胞重悬，流式细胞法测CD3、CD56、CD69 表达量，鉴定NK细胞的培养。
如图4所示，通过流式细胞法检测NK细胞表型和亚群组成，分别用抗PE-Cy7，抗PE，抗APC-Cy7，抗CD3-PE-Cy7，抗CD56-PE和抗CD69-APC-Cy7流式抗体标记，检测CD3、CD56、CD69阳性比例分别为0％、96.1％、55.2％，各项指标在NK细胞合理范围内(CD3-、CD56+、CD69+)，所以确定得到高纯度NK淋巴细胞。
实施例3
进行EGFR-CAR-NK细胞构建，具体步骤如下：
将EGFR胞外结构域结合抗体的核酸序列构建入第三代CAR质粒scFv，命名为EGFR-CAR。其中，第三代CAR质粒模式图如图1所示，特异性强的EGFR胞外结构域结合抗体的核酸序列为SEQ ID NO:2，构建完成后的EGFR-CAR质粒结构图如图2所示，编码 EGFR-CAR质粒的基因的核酸序列为SEQ ID NO:1。EGFR-CAR质粒采用常规生物合成方法进行合成，由爱康得生物医学技术有限公司合成；
取指数生长期的293T/17细胞，将其传至大皿中，细胞密度在70％-80％。将CAR、pMD2.G、psPAX2慢病毒质粒与50ul Lipo2000共同加入200ul Opti-MEM(减血清培养基) 中混匀后放入37℃培养箱孵育15min后，加入293T/17细胞中。在6小时后更换新鲜完全培养基。48小时后收集病毒液，通过0.45um过滤器过滤，收集病毒上清液。将Con-CAR、 EGFR-CAR病毒直接感染人源NK细胞，获得Con-CAR-NK、EGFR-CAR-NK细胞。
对本实施例中的Con-CAR质粒和EGFR-CAR质粒进行鉴定，结果如下：
如图5所示，图5为实施例3中的Con-CAR质粒结构图，Con-CAR质粒表示未作任何处理的第三代CAR质粒。
如图6所示，图6为实施例3中的EGFR-CAR质粒结构图。
如图7所示，图7表示为实施例3中的Con-CAR质粒和限制性酶切产物琼脂糖凝胶电泳图，其中，图7中1表示Con-CAR质粒(8533bp)，2表示Con-CAR质粒由Ncol酶切产物，7201bp和1332bp。
如图8所示，图8表示为实施例3中的EGFR-CAR质粒和限制性酶切产物琼脂糖凝胶电泳图，其中，图8中3表示EGFR-CAR质粒(9262bp)，4表示EGFR-CAR质粒由KpnI酶切产物，7201bp和2061bp。
对本实施例中的Con-CAR-NK和EGFR-CAR-NK细胞采用蛋白质免疫印迹法进行鉴定，结果如下：
如图9所示，蛋白质免疫印迹检测CD3ζ，确定外源CAR在NK细胞中有效表达，图中β-actin为参照。
采用流式细胞法检测本实施例中的未转染NK细胞(Non-transduced NK)、 Con-CAR-NK、EGFR-CAR-NK与EGFR的结合情况，如图10所示，与未转染NK细胞 (Non-transducedNK)、Con-CAR-NK细胞相比，EGFR-CAR-NK细胞与EGFR抗原有很高结合效率，从而确定针对EGFR靶点的CAR-NK细胞构建成功。其中，图10中，“GFP”表示绿色荧光蛋白GFP标记的对照组，“EGFP-GFP”表示绿色荧光蛋白GFP标记的含有EGFR抗原的实验组。纵坐标“Count”表示CAR-NK细胞数，横坐标表示加入的GFP流式抗体、 EGFP-GFP流式抗体数。
实施例4
用ELISA法检测细胞因子(IFN-γ/Granzyme B/perforin)释放，具体步骤如下：
将1×104个乳腺癌细胞HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF7分别铺入4个96 孔板中。并将三种效应细胞未转染NK细胞(Non-transduced NK cell)、Con-CAR-NK cell、EGFR-CAR-NK cell分别与四种靶细胞HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF7按5:1、 10:1、20:1的比例混合，在37℃含5％CO2培养箱培养24小时。在酶标板中加入 100ulCytokinestandard为标准品孔、100ul Dilution buffer R(1×)为空白对照孔、 100ul步骤1所得细胞培养上清液为样本孔，盖上封板膜，室温孵育2h。去除孔内液体，加入300ul 1×Washingbuffer后，弃去孔内液体，重复3次。加入100ul Biotinylated antibody，盖上封板膜，室温孵育1小时。去除孔内液体，加入300ul 1×Washing buffer 后，弃去孔内液体，重复3次。每孔加入100ul Streptavidin-HRP，盖上封板膜,室温孵育30min。去除孔内液体，加入300ul1×Washing buffer后，弃去孔内液体，重复 3次。每孔加入100ul TMB，室温避光孵育，根据孔内颜色呈深蓝色的时候，立即加入100 ul Stop solution终止反应。终止后10min之内，上酶标仪用检测波长450nm/610nm/630nm 进行读取OD值。
实施例5
用LDH法检测EGFR-CAR-NK细胞对三阴性乳腺癌细胞的杀伤效果，具体步骤如下：
将1×104个乳腺癌细胞HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF7分别铺入96孔板中。将三种效应细胞未转染NK细胞(Non-transduced NK cell)、Con-CAR-NK cell、 EGFR-CAR-NK cell与分别于四种乳腺癌靶细胞HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF7 按5:1、10:1、20:1的比例混合，在37℃含5％CO2培养箱培养24小时。将培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔(背景空白对照孔)，未加入CAR-NK细胞的对照细胞孔(样品对照孔)，未加入CAR-NK细胞的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔)，以及CAR-NK细胞处理的细胞孔(处理样品孔)。到预定的检测时间点前1小时，细胞培养板，在步骤1)的样品最大酶活性对照孔中加入LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10％。加入LDH释放试剂后，吹打混匀，然后继续培养。到达预定时间后。分别取各孔的上清液 120ul，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。使用酶标仪读取OD值(吸光度值)。
靶细胞裂解百分数计算公式：Lysis％＝(ODeach well-ODmini lysis)/ODmaxi lysis×100％；
其中，Lysis％表示靶细胞裂解百分数，ODeach well表示每个孔的吸光度值，ODmini lysis表示只有乳腺癌细胞没加CAR-NK的孔的吸光度值，ODmaxi lysis表示样品最大酶活性对照孔的吸光度值。
实施例6
筛选EGFR高表达的乳腺癌细胞系，具体步骤如下：
如图3所示，通过蛋白质免疫印迹(图3A)、流式细胞法检测EGFR在MCF7、HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231中的表达量(图3B-3E)可知，与非三阴性乳腺癌MCF7相比，三阴性乳腺癌细胞系HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231的EGFR表达量较高。其中，图 3B-3E中横坐标数值越大表示EGFR表达量越高。图中，“IgG”表示对照流式抗体，“EGFR-FITC”表示与EGFR结合的流式抗体实验组。
实施例7
EGFR-CAR-NK细胞对EGFR阳性或阴性乳腺癌细胞杀伤细胞因子释放实验
将未转染NK细胞(Non-transduced NK cell)、Con-CAR-NK cell和EGFR-CAR-NKcell 分别与四种乳腺癌细胞系(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF7)及被抑制EGFR表达的该四种乳腺癌细胞(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF7)按效应细胞与靶细胞 10:1的比例混合培养24小时，用ELISA法(IFN-γ/Granzyme B/perforin)检测细胞因子产物。
如图11所示，图11表示三种阳性乳腺癌细胞系(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231)的EGFR被抑制后的三阴性乳腺癌中的EGFR的表达。实时定量PCR法、蛋白质免疫印迹法显示si-EGFR可以有效地抑制HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231三种阳性乳腺癌细胞系在转录水平、蛋白表达水平的EGFR表达。流式细胞法检测三阴性乳腺癌转染si-Control、 si-EGFR，48小时后的三种阳性乳腺癌细胞系(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231)的EGFR 表达量；其中，si-Control表示对照小干扰RNA，si-EGFR表示抑制EGFR表达的小干扰 RNA。EGFR被抑制后，三种阳性乳腺癌细胞系(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231)的EGFR 表达量均相应减少。
如图12所示，图12为本实施例中未转染NK细胞(Non-transduced NK cell)、 Con-CAR-NK cell和EGFR-CAR-NK cell对EGFR阳性或阴性乳腺癌细胞杀伤细胞因子释放的实验结果线性图。结果显示，与EGFR低表达乳腺癌细胞系MCF7相比，EGFR高表达乳腺癌细胞系与EGFR-CAR-NK细胞混合培养后，细胞因子产物(IFN-γ/Granzyme B/perforin)的释放量更大。对于同一个乳腺癌细胞系，EGFR-CAR-NK细胞得EGFR被抑制后的细胞因子(IFN-γ/Granzyme B/perforin)释放量显著低于EGFR未被抑制组。
以上结果说明，本发明的EGFR-CAR-NK细胞对EGFR靶点具有特异识别性，并能促进细胞因子大量释放。
实施例8
CAR-NK细胞对EGFR阳性或阴性乳腺癌细胞的杀伤作用
将未转染NK细胞(Non-transduced NK cell)、Con-CAR-NK cell和EGFR-CAR-NKcell 分别与四种乳腺癌细胞系(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF7)及被抑制EGFR表达的该四种乳腺癌细胞(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF7)按效应细胞与靶细胞 5：1、10:1、20:1的比例混合培养24小时，用LDH法检测细胞毒性。
如图13所示，与EGFR低表达乳腺癌细胞系MCF7相比，EGFR-CAR-NK细胞对EGFR 高表达乳腺癌细胞系(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231)细胞毒性更大。图13中， EGFR-CAR-NK实验组对应的纵坐标数值越大，对相应的乳腺癌细胞的细胞毒性越大。而当EGFR高表达乳腺癌系EGFR被siRNA抑制后，EGFR-CAR-NK细胞对EGFR抑制表达组的细胞毒性显著低于EGFR未被抑制组。因而可知，本发明的EGFR-CAR-NK细胞对EGFR靶点具有特异识别性，可以靶向EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞，
本发明，通过改变第三代CAR质粒的scFv单链抗体的重量级可变轻链，获得本发明的嵌合抗原受体对EGFR具有靶向性，其在NK细胞上表达之后所得到的CAR-NK细胞针对EGFR靶点具有特异识别性，可以靶向EGFR阳性癌细胞，可以促进EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞杀伤细胞因子的释放，并且杀伤EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞。
三阴性乳腺癌细胞系的EGFR表达量高于非三阴性乳腺癌细胞系，本发明的EGFR特异性的CAR-NK细胞对EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞系细胞的毒性更大，可以高效的杀伤EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞，并促进EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞杀伤细胞因子的释放。
将本发明所提供的EGFR-CAR在NK细胞上表达，不需要自身白细胞抗原与肿瘤匹配，所以不会产生移植物抗宿主反应，避免移植后并发症的发生，降低受移植患者治疗过程中不必要出现的危险，安全性更高。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。
发明名称：一种EGFR靶向性的嵌合抗原受体、CAR-NK细胞及其制备方法、应用
申请人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
SEQ ID NO:1:
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SEQ ID NO:2:
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SEQ ID NO:3:
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SEQ ID NO:4:
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SEQ ID NO:5:
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SEQ ID NO:6:
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SEQ ID NO:7:
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Claims (9)

1.一种EGFR靶向性的嵌合抗原受体，其特征在于，所述EGFR靶向性的嵌合抗原受体主要由如下顺序连接的部分组成：EF1a启动子、抗EGFR抗体的抗原结合域、CDαHinge铰链区、CD28 TM跨膜区域、41-BB共刺激信号传导区域、CD3ζ信号传导结构域；
其中，所述抗EGFR抗体的抗原结合域表达为EGFRscFv，编码所述EGFRscFv的基因的核酸序列为SEQ ID NO:2。
2.根据权利要求1所述的一种EGFR靶向性的嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述EGFR靶向性的嵌合抗原受体的基因的核酸序列为SEQ ID NO:1。
3.一种组合物，其特征在于，包括载体以及如权利要求1或2所述的EGFR靶向性的嵌合抗原受体。
4.一种EGFR靶向性的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤利用慢病毒的包装质粒将如权利要求1所述的EGFR靶向性的嵌合抗原受体在293T/17细胞中包装，构建含有EGFR靶向性的嵌合抗原受体的慢病毒载体，感染NK细胞,使NK细胞表达EGFR靶向性的嵌合抗原受体的EGFRscFv。
5.根据权利要求4所述的EGFR靶向性的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，采用三质粒包装系统进行慢病毒包装，三质粒分别为慢病毒包装质粒Pmd2.G、载体质粒PSPAX2、权利要求1所述的EGFR靶向性的嵌合抗原受体。
6.根据权利要求4所述的EGFR靶向性的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，还包括步骤扩增NK细胞：将单个核细胞置入含有10％自体血清的无饲养细胞培养基中，37℃、5％CO2的培养箱中培养1周；再于含有5％自体血清的无饲养细胞培养基中，37℃、5％CO2的培养箱中继续培养1周。
7.一种EGFR靶向性的CAR-NK细胞，其特征在于，采用如权利要求4-6任意一项所述的制备方法得到。
8.一种抗癌剂，其特征在于，包括如权利要求7所述的EGFR靶向性的CAR-NK细胞和药学上允许的添加剂。
9.根据权利要求1所述的EGFR特异性嵌合抗原受体或权利要求7所述的EGFR靶向性的CAR-NK细胞在制备杀伤EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞的产品中的应用。
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