CN110669144B - 一种靶向b细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其应用，属于生物制药领域。所述靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向B细胞成熟抗原的单链抗体、加长的CD8α铰链区、加长的CD8α跨膜区、共刺激因子、胞内信号域、P2A连接肽、IL2信号肽和抗PD1单链抗体。该嵌合抗原受体可产生更少的细胞因子，安全性更高。

Description

一种靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别涉及一种靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一。嵌合抗原受体（Chimeric AntigenReceptor，CAR）技术是近些年发展非常迅速的一种恶性肿瘤细胞治疗技术。相比于常规免疫细胞，嵌合抗原受体对效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较高。
嵌合抗原受体的发展经历了不同阶段，第二代和第三代嵌合抗原受体包括一个或者两个共刺激分子，临床上使用的共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D以及B7-H3等等，这些共刺激因子在调节T细胞增殖、存活和抗肿瘤效应方面发挥重要作用。
目前，虽然CAR-T细胞可以有效的杀死肿瘤细胞，但同时也带来了诸如免疫因子风暴、神经毒性、脱靶效应和移植抗宿主反应等不良反应，严重时可导致患者死亡。因此，亟需一种安全的嵌合抗原受体用于治疗恶性肿瘤。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其应用。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向B细胞成熟抗原的单链抗体、加长的CD8α铰链区、加长的CD8α跨膜区、共刺激因子、胞内信号域、P2A连接肽、IL2信号肽和抗人PD1单链抗体，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述靶向B细胞成熟抗原的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述加长的CD8α跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，所述信号肽的第一端与所述靶向B细胞成熟抗原的单链抗体的第二端连接，所述胞内信号域的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，所述P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，所述IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示。
具体地，所述共刺激因子为CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。
进一步地，所述4-1BB的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。
进一步地，所述抗人PD1单链抗体包括：重链可变区、柔性肽和轻链可变区，所述重链可变区的第一端与所述IL2信号肽的第二端连接，所述重链可变区的第二端与所述柔性肽的第一端连接，所述柔性肽的第二端与所述轻链可变区的第一端连接，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，所述柔性肽的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:10所示，所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示。
另一方面，本发明实施例提供了一种上述靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体的应用，所述应用包括：将所述嵌合抗原受体作为抗肿瘤药物。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明提供了一种靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体，本发明实施例提供的加长的CD8α铰链区和加长的CD8α跨膜区可以减少细胞因子风暴，从而使恶性肿瘤的治疗具有更好的安全性，进而为治疗恶性肿瘤展现出良好的应用前景。此外，该嵌合抗原受体中的靶向B细胞成熟抗原的单链抗体、加长的CD8α铰链区和加长的CD8α跨膜区，加长的CD8α铰链区能够准确识别BCMA抗原，这使得该嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞可发挥更强的抗肿瘤效果，并能有效保证T细胞的抗肿瘤效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的嵌合抗原受体结构示意图；
图2是本发明实施例提供的CAR01慢病毒转染效率图；
图3是本发明实施例提供的IL-2分泌量的对比图，其中K562为不含BCMA的细胞，K562-BCMA为含有BCMA的细胞；
图4是本发明实施例提供的IFNγ分泌量的对比图，其中K562为不含BCMA的细胞，K562-BCMA为含有BCMA的细胞；
图5是本发明实施例提供的CART01与CART02的IL-2分泌对比图；
图6是本发明实施例提供的CART01与CART02的IFNγ分泌对比图；
图7是本发明实施例提供的CART01与CART02的TNFα分泌对比图；
图8是本发明实施例提供的CART01与CART02的IL-4分泌对比图；
图9是本发明实施例提供的细胞杀伤效率图，图中A为含BCMA的K562细胞，B为不含BCMA的K562细胞，横坐标为效应细胞与靶细胞的个数比，纵坐标为细胞杀伤效率，单位为%。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例一
本发明实施例提供了一种靶向B细胞成熟抗原（BCMA，B-Cell MaturationAntigen）的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽（CD8 α leader）、靶向B细胞成熟抗原的单链抗体（hBCMA）、加长的CD8α铰链区（CD8αhinge）、加长的CD8α跨膜区（CD8 α transmembrane）、共刺激因子、CD3ζ胞内信号域（CD3ζsignal）、P2A连接肽、IL2信号肽（IL2 signal）和单链抗体（αPD1 scFv），信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，靶向B细胞成熟抗原的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，加长的CD8α跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，信号肽的第一端与靶向B细胞成熟抗原的单链抗体的第二端连接，CD3ζ胞内信号域的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示。在本实施例中，信号肽为人CD8α信号肽（CD8α leader），靶向B细胞成熟抗原的单链抗体可以为J22.9抗BCMA人源化单链抗体（aBCMA），胞内信号域可以为人CD3ζ胞内信号域。
具体地，共刺激因子为CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种，在实现时，共刺激因子可以为上述两种或多种的组合，此时，两种或多种共刺激因子依次首尾连接后其两端再分别与加长的CD8α跨膜区和胞内信号域连接。
本发明实施例提供的共刺激因子为4-1BB，该4-1BB的核苷酸序列如序列表中SEQID NO:8所示。
具体地，抗人PD1单链抗体包括：重链可变区VH、连接肽（G4S）3和轻链可变区VL，VH的第一端与IL2信号肽的第二端连接，VH的第二端与（G4S）3的第一端连接，（G4S）3的第二端与VL的第一端连接，VH的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，（G4S）3的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示，VL的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示。在实现时，单链抗体为抗人PD1单链抗体，抗人PD1单链抗体可以阻断PD1与PD-L1的结合，从而阻断负向调控信号，使T细胞恢复活性，从而增强免疫应答。
具体地，本发明实施例还提供了一种嵌合抗原受体的应用，该应用包括：将嵌合抗原受体作为抗肿瘤药物。
进一步地，肿瘤可以包括：多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性B-淋巴细胞白血病和非霍奇金氏淋巴瘤。
优选地，肿瘤可以为多发性骨髓瘤。
在实现时，在NCBI网站数据库中分别搜索：人的加长的CD8α铰链区、人的加长的CD8α跨膜区、人的CD8α信号区、4-1BB的胞内区、人的CD3ζ胞内信号域、抗PD1单克隆抗体的重链和轻链可变区的基因序列信息，这些基因序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码核苷酸序列不变的情况下更适合人类细胞的表达。基因全合成嵌合抗原受体的基因序列，其结构为：CD8α信号肽-靶向B细胞成熟抗原的单链抗体- 加长的CD8α铰链区-加长的CD8α跨膜区-共刺激因子-胞内信号域-P2A连接肽-IL2信号肽-单链抗体，具体为：CD8 α leader-hBCMA-CD8αhinge-CD8 α transmembrane-（4-1BBsignal）-CD3ζsignal -P2A-IL2 signal -αPD1 scFv，标记为CAR01，该嵌合抗原受体的结构如图1所示，结构如图1所示的嵌合抗原受体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示。相应地，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:13所示。
该嵌合抗原受体各部分在连接时，可以直接连接在一起，也可以通过接头序列进行连接。接头序列可以是本领域公知的适用于抗体轻链可变区和重链可变区的柔性序列，例如含G和S的（G4S）3接头序列。
制备该嵌合抗原受体的基因质粒载体，具体方法如下：
通过PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）扩增并获得CAR01基因序列，在CAR01基因序列的两端分别添加酶切位点Xba I和酶切位点EcoR I，得到待酶切物，将其与慢病毒载体质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP分别进行Xba I和EcoR I的双酶切反应，得到含有CAR01的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段。酶切反应条件为：酶切温度为37℃，酶切时间为30min。酶切体系（总体积50μL）包括：5μL的10×buffer；5μg的待酶切物的DNA；2μL的XbaI酶；2μL的EcoRI酶；用去离子水将酶切体系的体积补至50μL。
将含有CAR01的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段分别利用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后分别将含有CAR01的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段的条带切下，并分别放在两个洁净的EP管中，然后将琼脂糖凝胶中的DNA纯化回收，得到CAR01酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物。
将得到的CAR01酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物在16℃下过夜连接，得到连接产物pCDH-EF1-CAR01-T2A-copGFP。其中，总体积为10μL的连接体系包括：1μL的pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物、7μL的CAR01酶切产物、1μL的T4 DNA连接酶和1μL的10×T4 DNA连接酶Buffer。
将连接产物转入Stbl3感受态细胞（购置于TRANSGEN BIOTECH）中，具体方法如下：
取出保存在-80℃冰箱中的Stbl3感受态细胞，并置于冰上解冻。将连接产物加入Stbl3感受态细胞中，冰浴30min后，于42℃下热击45s，然后再冰浴2min，得到转化产物。
将转化产物加入900μL未添加抗生素的液体LB培养基中，于37℃下摇床的转速为200rpm，发酵培养45min，得到发酵液。未添加抗生素的液体LB培养基的制备方法包括：取5g进口酵母提取物、10g进口蛋白胨、10g无水氯化钠和1L无菌水混匀后，经121℃灭菌20min后使用。
将发酵液经过4000rpm离心5min，弃去上清液，保留沉淀物，将沉淀物采用100μL的液体LB培养基进行重悬，得到重悬液。
将重悬液涂抹至Amp抗性的固体LB平板培养基（购自上海科玛嘉微生物技术有限公司）上，将固体LB平板培养基置于37℃的细菌培养箱中，过夜培养。
在固体LB平板培养基上挑取阳性克隆。
鉴定得到的阳性克隆，具体方法如下：
将得到的阳性克隆经Xba I和EcoR I双酶切反应，具体操作参见上述待酶切物的双酶切反应，将由阳性克隆获得的酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定目标片段，获得了大小约为2000bp的目标片段。经测序鉴定可知该目标序列为CAR01基因。
提取质粒：将测序正确的阳性克隆制备成原始菌液接种至100mL的Amp抗性的液体LB培养基中，于37℃下，摇床转速为200rpm，进行过夜培养，得到原始菌发酵液。
将原始菌发酵液经过4000rpm离心10min，弃去上清液，保留沉淀物（菌体）。
采用无内毒素质粒大提试剂盒（购自天根公司）提取菌体的质粒，具体方法按照该试剂盒的说明书进行。
CAR01慢病毒载体包装：在转染前6h，以每皿约8.5×106个细胞将293T细胞接种至直径为10cm的培养皿中。确保转染时细胞的汇合度在80%左右，且均匀分布于培养皿中。
制备溶液A和溶液B，其中，溶液A包括：4mL的2×HEPES buffer缓冲液（8个培养皿一起包装的量），溶液B包括：72ug质粒（target plasmid）、37.04ug包装质粒PLP1、34.8ug包装质粒PLP2、24.08ug包装质粒PLP-VSVG和400μL 2.5M钙离子溶液，溶液B的总体积为4mL。充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，向溶液A中逐滴加入溶液B，静置3~5min，得到混合液。轻轻涡旋混合液，将混合液逐滴加入含293T细胞的培养皿上，每个培养皿中加入1mL该混合液，轻轻前后晃动培养皿使混合液均匀分布在培养皿的表面（注意晃动时不要旋转培养皿），将培养皿放置于37℃培养箱中培养。培养12h后，更换新鲜的培养基，继续培养。培养48h后，将培养基经过1500rpm/min离心5min后保留上清液，收集含CAR01慢病毒的上清液，将上清液用规格为0.45μm的滤膜过滤，得到含CAR01慢病毒的滤液。
将含CAR01慢病毒的滤液转移至超速离心管中，在超速离心管的底部小心地铺上一层浓度为20%的蔗糖（每8mL含慢病毒的滤液加1mL蔗糖）。以PBS（phosphate buffersaline，磷酸缓冲盐溶液）平衡超速离心管，在4℃下于27600rpm/min离心2h，小心取出超速离心管，倒掉上清液，倒置该超速离心管去掉残余上清液，保留沉淀物。向超速离心管中加入150μLPBS，使用微量移液枪在超速离心管的底部轻轻吹打几次，使沉淀物溶解在PBS中，得到浓缩的CAR01慢病毒（嵌合抗原受体的基因质粒载体），在实现时可将浓缩的CAR01慢病毒分装于离心管，置于-80℃保存。
CAR01慢病毒滴度检测：取浓缩的CAR01慢病毒0.5μL、5μL和50μL分别感染293T细胞（1×105个/孔）24h，24h后换液，72h后提取细胞基因组DNA, 并将基因组DNA浓度稀释至5~100ng/μL。采用TransLv TM Lentivirus qPCR Titration Kit（购自TransGen），具体方法按照其说明书进行。经检测可知该CAR01慢病毒滴度为4.5×108 TU/mL。
制备嵌合抗原受体的T细胞，具体方法如下：
PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血单个核细胞）的制备：采集志愿者20mL外周血，将外周血加入至含有肝素的50mL离心管中，经过2000rpm离心10min，将上层血浆转移至新的离心管内冻存。向离心管中加入与沉淀等体积的37℃预热的生理盐水，充分混匀，进行血细胞沉淀重悬，得到重悬细胞液。另取一只50mL离心管，加入20mL预温的淋巴细胞分离液。将20mL重悬细胞液缓慢的加至淋巴细胞分离液的上层。于800rpm离心20min。匀速吸去上层血浆，当血浆距白膜层2～3cm时停止吸去血浆，然后快速吸去白膜层细胞，并转移至另一新的50mL离心管中，用生理盐水将其体积补充至45mL，于1200rpm离心5min，重复2次，用于清洗细胞。使用RPMI1640+浓度为10%的FBS培养基重悬细胞沉淀，并计算T细胞数量。在本实施例中，T细胞数量为1.2×107个 。
CAR01慢病毒转染人的T细胞：在本实施例中，将T细胞密度调整到1×106/mL，将T细胞按照1mL/孔接种到抗人50ng/mL CD3抗体和50ng/mL CD28抗体中，再加入200IU/mL的白细胞介素2，刺激培养48h。T细胞活化培养两天后，将CAR01慢病毒以MOI=5的感染系数进行转染，并添加8μg/mL的polybrene，于37℃培养培养箱中培养。转染24h后，更换培养基，并持续观察细胞生长状况，培养时间为8~13天。得到转染的CAR-T细胞。
CAR01慢病毒转染效率检测：转染完成后，定时使用倒置荧光显微镜下观察转染细胞。吸取转染的CAR-T细胞，于1000rpm离心5min收集沉淀物，将沉淀物用PBS溶液洗涤。使用流式细胞仪FITC通道检测转染的CAR-T细胞的表达GFP荧光的细胞比例。其转染效率如图2所示。
靶向BCMA CAR-T细胞的细胞因子分泌检测，具体如下：
为了检测经过CAR01慢病毒转染后的CAR-T细胞是否被有效激活，本实施例采用CAR-T细胞分别与表达BCMA的K562细胞（靶细胞）和不表达BCMA的K562细胞共培养后检测IFNγ和IL-2的分泌情况。分别通过使用ELISA试剂盒检测IFNγ和IL-2的分泌量。具体地，分别将每孔1×106个CAR-T细胞和每孔1×105个靶细胞接种至6孔板中，于37℃、浓度为5%的CO2中培养24h。吸取培养的上清液，于1000rpm离心5min去除细胞沉淀，收获培养上清液。按照ELISA剂盒说明书检测培养上清液中的IFNγ和IL-2。如图3和图4所示，图3为IL-2分泌量的对比图，图4为IFNγ分泌量的对比图。结合图3和图4可知，该经过CAR01慢病毒转染后的CAR-T细胞已经被有效激活。
检测不同长度CD8α铰链区和CD8α跨膜区的细胞因子分泌情况，具体操作如下：
将本发明实施例提供的加长的CD8α铰链区和加长的CD8α跨膜区构建的CAR-T细胞记作CART01，将现有技术中常用的未加长的CD8α铰链区和未加长的CD8α跨膜区构建的CAR-T细胞记作CART02，其中，未加长的CD8α铰链区的序列如序列表中SEQ ID NO:14所示，未加长的CD8α跨膜区的序列如序列表中SEQ ID NO:15所示，将未转染的T细胞、CART01和CART02分别与表达BCMA的K562细胞共培养后，并检测IL-2、IFNγ、TNFα和IL-4的分泌情况。具体地，按照每孔1×106个CAR-T细胞和每孔1×105个靶细胞接种至6孔板中，于37℃浓度为5%的CO2培养箱中培养24h。吸取每个孔内的上清液，于1000rpm离心5min，去除细胞沉淀，得到培养上清液。按照ELISA剂盒说明书的操作方法检测该培养上清液中的IL-2、IFNγ、TNFα和IL-4的分泌量，结果如图5~图8所示。由图5~图8可知，本发明实施例提供的CART01的细胞因子分泌量明显少于CART02的细胞因子分泌量，可见，本发明实施例提供的加长的CD8α铰链区和加长的CD8α跨膜区构建的CAR-T细胞能够有效减少细胞因子分泌。
体外抗肿瘤效果：①组：在96孔板中取其中40个孔并分成八个小组，每个小组设置五个复孔，第一组中均只加入200μL培养基（记作Ab），第二组中均加入100μL培养基和100μL1×104个靶细胞（记作Ack），第三组中均加入100μL培养基和100μL 1×104个效应细胞（记作Acn），其中效应细胞为转染CAR结构的CAR-T细胞或未感染过的T细胞，第四组中均加入100μL 1×104个靶细胞和100μL 1×104个效应细胞（记作As，效应细胞个数：靶细胞个数=1:1），第五组中均加入100μL培养基和100μL 5×104个效应细胞（记作Acn），第六组中均加入100μL 1×104个靶细胞和100μL 5×104个效应细胞（记作As，效应细胞个数：靶细胞个数=5:1），第七组中均加入100μL培养基和100μL 1×105个效应细胞（记作Acn），第八组中均加入100μL 1×104个靶细胞和100μL 1×105个效应细胞（记作As，效应细胞个数：靶细胞个数=10:1）。①组靶细胞为K562细胞。
②组：将96孔板另外的40个孔分成八个小组，每个小组设置五个复孔，分组方法与①组相同，且②组的靶细胞为表达BCMA的K562细胞。
将96孔板孵育4h后每孔加入20uL的CCK-8溶液，将96孔板在培养箱内再孵育2h。用酶标仪在450nm处测定吸光度。根据吸光度分别计算①组和②组的细胞杀伤效率＝[1-(As-Acn)/(Ack-Ab)]×100%，式中，As为试验孔（含有靶细胞的培养基、效应细胞和CCK-8），Ack为靶细胞对照孔（含有靶细胞的培养基和CCK-8溶液），Acn为效应细胞对照孔（含有效应细胞的培养基、CCK-8溶液），Ab为空白对照（不含细胞的培养基和CCK-8溶液）。图9为本发明实施例提供的细胞杀伤效率图，如图9所示，CAR-T细胞对含BCMA的K562细胞杀伤效率明显优于不含BCMA的K562细胞。由此可见，本发明实施例提供的靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体具有良好的抗肿瘤效果。
本发明提供了一种靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体，本发明实施例提供的加长的CD8α铰链区和加长的CD8α跨膜区可以减少细胞因子风暴，从而使恶性肿瘤的治疗具有更好的安全性，进而为治疗恶性肿瘤展现出良好的应用前景，该嵌合抗原受体中的靶向B细胞成熟抗原的单链抗体能够准确识别BCMA抗原，这使得该嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞可发挥更强的抗肿瘤效果，并能有效保证T细胞的抗肿瘤效果。此外，分泌的抗人PD1单链抗体可以封闭PD1-PDL1抑制信号，增加CAR-T细胞的活性。
序列表
<110> 华夏源(上海)细胞基因工程股份有限公司
<120> 一种靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 2
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaggtgcagc tggtggaatc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc tctgagactg 60
tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc cggtactggt ttagctgggt gcgccaggcc 120
cctggcaagg gactcgtgtg ggtgggagag atcaacccca gcagcagcac catcaactac 180
gcccccagcc tgaaggacaa gttcaccatc agcagagaca acgccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actattgtgc cagcctgtac 300
tacgactacg gcgacgccta cgattactgg ggccagggca cactggtgac tgttagctcc 360
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatctgagat cgtgatgaca 420
cagagccctg ccaccctgag cgtgtcccca ggcgaaagag ctaccctgag ctgcaaggcc 480
agccagagcg tggaaagcaa cgtggcctgg tatcagcaga agcccggaca ggctcctcgg 540
gccctgatct acagcgccag cctgagattc agcggcatcc ccgccaggtt tagcggctct 600
ggcagcggca ccgagttcac cctgacaatc agcagcctgc agagcgagga ctttgccgtg 660
tattactgcc agcagtacaa caactacccc ctgaccttcg gagccggcac caagctggag 720
ctgaag 726
<210> 3
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 60
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 120
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 180
atctgggcg 189
<210> 4
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac 60
cacaggaac 69
<210> 5
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
<210> 8
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 9
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caagtccaat tggtggagtc tggcggtggg gtagttcagc ccggccgatc cctgcgcctg 60
gactgcaaag cttctggaat tacgttctca aactccggaa tgcactgggt gcggcaagca 120
cctgggaaag ggctggagtg ggttgcggtg atttggtacg atggctctaa gaggtactac 180
gcagacagcg ttaaaggcag atttactata tcccgagata actctaaaaa tacgctcttc 240
ctccaaatga atagcctgag ggcagaagac acagccgttt actattgtgc taccaatgat 300
gattactggg gacagggcac cctggttacc gtaagttcc 339
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcggtggtg gaagtggagg agggggatcc ggaggcgggg gttct 45
<210> 11
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagatcgtcc tgacccagtc tccagccact ctctccctgt ctccaggcga gcgcgctaca 60
ctgagttgta gagcttccca gtccgtgagc agctatctgg cctggtatca gcagaagcct 120
gggcaggctc cacggttgct gatttatgac gcctccaacc gcgcgactgg gataccagct 180
aggttttccg gatcaggcag cggcactgat tttacactga ccatctcatc tctcgagccg 240
gaagatttcg ccgtttacta ttgtcaacag agttcaaact ggccacggac attcggtcag 300
gggaccaagg ttgaaattaa g 321
<210> 12
<211> 2340
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc agctggtgga atctggcgga ggactggtgc agcctggcgg ctctctgaga 120
ctgtcttgtg ccgccagcgg cttcaccttc agccggtact ggtttagctg ggtgcgccag 180
gcccctggca agggactcgt gtgggtggga gagatcaacc ccagcagcag caccatcaac 240
tacgccccca gcctgaagga caagttcacc atcagcagag acaacgccaa gaacaccctg 300
tacctgcaga tgaacagcct gcgggccgag gacaccgccg tgtactattg tgccagcctg 360
tactacgact acggcgacgc ctacgattac tggggccagg gcacactggt gactgttagc 420
tccggtggcg gtggctcggg cggtggtggg tcgggtggcg gcggatctga gatcgtgatg 480
acacagagcc ctgccaccct gagcgtgtcc ccaggcgaaa gagctaccct gagctgcaag 540
gccagccaga gcgtggaaag caacgtggcc tggtatcagc agaagcccgg acaggctcct 600
cgggccctga tctacagcgc cagcctgaga ttcagcggca tccccgccag gtttagcggc 660
tctggcagcg gcaccgagtt caccctgaca atcagcagcc tgcagagcga ggactttgcc 720
gtgtattact gccagcagta caacaactac cccctgacct tcggagccgg caccaagctg 780
gagctgaagg cggccgcatt cgtgccggtc ttcctgccag cgaagcccac cacgacgcca 840
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 900
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 960
gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 1020
atcacccttt actgcaacca caggaacaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 1080
aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 1140
tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 1200
gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1260
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1320
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1380
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1440
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1500
ccccctcgcg gaagcggagc tactaacttc agcctgctga agcaggctgg agacgtggag 1560
gagaaccctg gacctatgta caggatgcaa ctcctgtctt gcattgcact aagtcttgca 1620
cttgtcacaa acagtcaagt ccaattggtg gagtctggcg gtggggtagt tcagcccggc 1680
cgatccctgc gcctggactg caaagcttct ggaattacgt tctcaaactc cggaatgcac 1740
tgggtgcggc aagcacctgg gaaagggctg gagtgggttg cggtgatttg gtacgatggc 1800
tctaagaggt actacgcaga cagcgttaaa ggcagattta ctatatcccg agataactct 1860
aaaaatacgc tcttcctcca aatgaatagc ctgagggcag aagacacagc cgtttactat 1920
tgtgctacca atgatgatta ctggggacag ggcaccctgg ttaccgtaag ttccggcggt 1980
ggtggaagtg gaggaggggg atccggaggc gggggttctg agatcgtcct gacccagtct 2040
ccagccactc tctccctgtc tccaggcgag cgcgctacac tgagttgtag agcttcccag 2100
tccgtgagca gctatctggc ctggtatcag cagaagcctg ggcaggctcc acggttgctg 2160
atttatgacg cctccaaccg cgcgactggg ataccagcta ggttttccgg atcaggcagc 2220
ggcactgatt ttacactgac catctcatct ctcgagccgg aagatttcgc cgtttactat 2280
tgtcaacaga gttcaaactg gccacggaca ttcggtcagg ggaccaaggt tgaaattaag 2340
<210> 13
<211> 780
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Ser Arg Tyr Trp Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Val Trp Val Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Ser Thr Ile Asn
65 70 75 80
Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Tyr Tyr Asp Tyr Gly Asp Ala Tyr
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
165 170 175
Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Glu Ser Asn Val Ala Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser
195 200 205
Leu Arg Phe Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu
260 265 270
Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
290 295 300
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
305 310 315 320
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
325 330 335
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly
340 345 350
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
355 360 365
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
370 375 380
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
385 390 395 400
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
405 410 415
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
420 425 430
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
435 440 445
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
450 455 460
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
465 470 475 480
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
485 490 495
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
500 505 510
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Tyr Arg
515 520 525
Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu Val Thr Asn
530 535 540
Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
545 550 555 560
Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn
565 570 575
Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
580 585 590
Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser
595 600 605
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
610 615 620
Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
625 630 635 640
Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
645 650 655
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
660 665 670
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
675 680 685
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser
690 695 700
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
705 710 715 720
Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
725 730 735
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
740 745 750
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro
755 760 765
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
770 775 780
<210> 14
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gctagcacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 60
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 120
gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcg 156
<210> 15
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgc 57

Claims (5)

1.一种靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向B细胞成熟抗原的单链抗体、加长的CD8α铰链区、加长的CD8α跨膜区、共刺激因子、胞内信号域、P2A连接肽、IL2信号肽和抗人PD1单链抗体，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述靶向B细胞成熟抗原的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述加长的CD8α跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，所述信号肽的第一端与所述靶向B细胞成熟抗原的单链抗体的第二端连接，所述胞内信号域的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，所述P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，所述IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激因子为CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述4-1BB的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗人PD1单链抗体包括：重链可变区、柔性肽和轻链可变区，所述重链可变区的第一端与所述IL2信号肽的第二端连接，所述重链可变区的第二端与所述柔性肽的第一端连接，所述柔性肽的第二端与所述轻链可变区的第一端连接，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，所述柔性肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示，所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示。
5.一种如权利要求1~4任一项所述的嵌合抗原受体的应用，其特征在于，所述应用为将所述嵌合抗原受体用于制备抗肿瘤药物的应用。
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