CN109641012A - 与bcma结合的嵌合抗原受体和car-t细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)，其中该CAR包含胞外抗原结合域，所述胞外抗原结合域包含结合B细胞成熟抗原(BCMA)多肽的抗体或抗体片段。CAR优选与包含人BCMA的N末端第13至32个残基中的一个或多个氨基酸的表位结合。本发明还涉及编码本发明的CAR的核酸分子，表达本发明的CAR的经遗传修饰的免疫细胞(优选T细胞)，以及所述细胞在治疗与致病性B细胞的存在相关的医学病症中的用途，所述医学病症例如浆细胞、记忆B细胞和/或成熟B细胞的疾病，特别是多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤或自身抗体依赖性自身免疫疾病。

Description

与BCMA结合的嵌合抗原受体和CAR-T细胞

技术领域

本发明涉及分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)，其中该CAR包含胞外抗原结合域，所述胞外抗原结合域包含结合B细胞成熟抗原(BCMA)多肽的抗体或抗体片段。CAR优选与包含人BCMA的N末端第13至32个残基中的一个或多个氨基酸的表位结合。本发明还涉及编码本发明的CAR的核酸分子，表达本发明的CAR的经遗传修饰的免疫细胞(优选T细胞)，以及所述细胞在治疗与致病性B细胞的存在相关的医学病症中的用途，所述医学病症例如浆细胞、记忆B细胞和/或成熟B细胞的疾病，特别是多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤或自身抗体依赖性自身免疫疾病。

背景技术

在癌症免疫疗法中，为了根除肿瘤和肿瘤干细胞，过继转移经遗传修饰以识别肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的T细胞(ATT)是一种有前景的方法。因此，与传统的化学疗法、放射疗法和手术疗法相比，可以潜在地避免肿瘤复发。此外，新的途径选择性药物通常允许优异的肿瘤控制，但病程通常转变为慢性阶段而没有明确的肿瘤消除。

表达CARs的经遗传修饰的T细胞的出现已被证明在B细胞淋巴瘤/白血病治疗方面取得了巨大成功，尽管事实上患者经过了大量预治疗并且之前已接受过多种化学疗法、抗体疗法甚至是自体/同种异体骨髓移植。因此，具有CAR-T细胞的ATT用作挽救疗法是成功的。

CAR是合成的、工程化的免疫球蛋白衍生的受体，其可以以MHC非依赖性方式识别表面抗原。与TCR不同，CAR具有更广泛的亲和力，其可以与靶抗原结合而不必表现出交叉反应性。靶抗原必须是位于表面的，并且可以包括肿瘤相关蛋白、碳水化合物或甚至糖脂。CAR-T细胞的另一个优势是它们通过转导自体T细胞而快速产生，所述自体T细胞可以是CD4+或CD8+来源的。CAR可以“现成地”产生，并且它们的靶标通常在确定的肿瘤实体中广泛表达(＞90％)，如CD19+B细胞白血病和淋巴瘤所示。有人提出，CAR T细胞可作为“活药物”，即使在单次T细胞输注后也能维持。

对本文所述的嵌合抗原受体(CAR)-T细胞产物存在强力的医学需求。首先，多发性骨髓瘤是不可治愈的B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)，其来源自恶性转化的浆细胞克隆。作为一种特性，肿瘤细胞主要定位于骨髓。该疾病是骨和骨髓中最常见的肿瘤，在强力治疗的年轻患者中10年生存率为50％，并且每年导致2％的癌症死亡。发病率为5/100000，诊断出时的中位年龄为70岁，这表明在许多患者中存在着不适于进行强力和长期的化学疗法的共病。标准治疗是单独的化学治疗，或化学治疗与自体干细胞移植、免疫调节药物、局部放射、蛋白酶体抑制剂的组合，并且对极少数患者适用的是同种异体干细胞移植。尽管采用上述方式进行了强力治疗，但这种疾病通常会复发，并且在多线治疗方案后发生继发性耐药。

其次，大得多的经典B-NHL群包含衍生自通常位于次级淋巴器官的B淋巴细胞的多种肿瘤实体，例如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)亚群。虽然所有NHL的总发病率约为10至12/100000(B细胞来源的＞85％)，但其中大多数是成人疾病，其在老年人中大量增加。人口发展预测，由于西方社会的老龄化，总人数将增加。临床上，B-NHL是异质性的并且可以通过侵袭性和惰性过程来辨别。过去15年来，在治疗B-NHL方面取得了实质性进展，标准治疗是组合的抗体/化学疗法，或将组合的抗体/化学疗法与自体干细胞移植、免疫调节药物、放射、蛋白酶体抑制剂、信号通路抑制剂相结合，并且对极少数患者应用同种异体干细胞移植。因为在许多B-NHL实体中，诊断时的中位年龄为＞55至60岁，所以也存在不适于进行强力和长期的化学疗法甚至同种异体骨髓移植的共病。

以淋巴瘤B细胞上广泛表达的CD19抗原为靶向的过继性CAR-T细胞疗法的出现使得克服这些限制成为可能，目前在FDA注册了大约20项用于治疗B-NHL和B-ALL的CD19 CAR-T细胞研究。虽然2011年CLL和2013年B-ALL在临床试验中已取得重大突破，但据发明人所知，生物医药公司最近才获得批准在德国使用相同的CD19 CAR产品。在其他欧盟国家(例如奥地利)，使用CD19 CAR T细胞的临床试验也在进行中。更重要的是，在针对B-NHL的抗CD19抗体或CAR-T细胞治疗中，由于抗原丢失而发生抗药性。因为在多线的化学疗法/免疫疗法后观察到治疗抗药性，所以迫切需要替代的靶标结构。

对于指征多发性骨髓瘤，先前已描述了两种抗BCMA-CAR产品并且它们已进入I期临床研究。这些研究未证明抗BCMA CAR对B-NHL的适用性。关于B-NHL，抗BCMA靶向治疗代表可能的替代方案，特别是当抗CD19 CAR失败时。靶向于多发性骨髓瘤并在临床研究中测试的其他免疫治疗策略是抗CD19 CAR、NY-ESO1和MAGE-A1指导的TCR转导的T细胞。与BCMA作为肿瘤靶标形成鲜明对比的是，符合条件的患者的频率要低得多，因为这些靶抗原的表达率低于10％。其他靶向治疗包括抗CD38和抗SLAMF7抗体，从概念上讲，这些疗法是完全不同的，因为抗体不是自我维持的，不会形成记忆，据我们所知，尚未证明它可以介导充分的肿瘤根除。

此外，特异性靶向浆细胞的能力对于治疗自身免疫疾病将是非常有益的。轻度形式的自身免疫疾病通常最初用非甾体抗炎药(NSAID)或改善疾病的抗风湿药(DMARD)治疗。较严重形式的系统性红斑狼疮(SLE)涉及由于活动性疾病引起的器官功能障碍，其通常用类固醇和强免疫抑制剂如环磷酰胺(一种靶向循环细胞的细胞毒性剂)联合治疗。

仅在最近，贝利木单抗是一种针对细胞因子BAFF的抗体，发现其在自身免疫性疾病患者的血清中水平升高，其已获得美国食品和药品管理局(FDA)批准用于SLE。然而，只有新形成的B细胞依赖于BAFF而在人体中存活，而记忆B细胞和浆细胞对选择性BAFF抑制较不敏感(Jacobi等人.(2010)Arthritis Rheum 62：201-210)。对于类风湿性关节炎(RA)，TNF抑制剂是第一种获得许可的生物制剂，随后是阿巴西普，利妥昔单抗和托珠单抗等：它们抑制与关节炎症和损坏中相关的关键炎症途径，然而，代价是由相对免疫抑制引起的感染风险(Chan等人.(2010)Nat Rev Immunol 10：301-316，Keyser(2011)Curr Rheumatol Rev7：77-87)

仅在最近，还讨论了CAR-T细胞作为治疗自身抗体介导的疾病的靶向方法(Ellebrecht等人.(2016)Science 353：179-184)。存在于骨髓中的存活龛(survivalniches)中的长寿且固着的浆细胞通常对常规免疫抑制和细胞毒性药物、以及靶向于B细胞及其活化的疗法具有抗性。特别地，利妥昔单抗似乎不适合这种治疗，因为其靶抗原CD20不在浆细胞上表达。通过使用抗BCMA CAR-T细胞构建体可以满足这种治疗挑战，因为BCMA在长寿浆细胞上表达。

目前，在本领域中已经描述了许多其他抗BCMA CAR构建体。2013年，JamesN.Kochenderfer课题组发表了第一种抗BCMA CAR转导的T细胞方法，这是一项使用体外测定和小鼠试验的临床前研究(Carpenter等人，2013；Clin Cancer Res；19(8)；2048-2060)。2015年6月，Bluebird Bio和Celgene宣布合作开发BCMA CAR-T细胞疗法。2016年1月，开始了对多发性骨髓瘤患者的I期临床试验登记。2016年初，宾夕法尼亚大学艾布拉姆森癌症中心(Abramson Cancer Center)开始参与针对使用抗BCMA CAR转导的T细胞治疗多发性骨髓瘤患者的I期研究的招募(ClinicalTrials.gov识别号：NCT02546167)。针对BCMA的CAR已在WO 2016/014789、WO2016/014565和WO2013/154760中描述。WO 2015/128653还公开了结合BCMA的CAR序列，其中负责表位识别的CAR部分是APRIL配体的变体，APRIL配体的变体显示与野生型APRIL相比改善的与BCMA的结合。替代治疗策略涉及抗CD38 CAR。BCMA结合抗体在WO 2015/166073和WO 2014/068079中公开。

尽管许多潜在的替代疗法正在开发中，但仍然需要提供有效的方法来解决与致病性B细胞的存在相关的医学病症，特别是多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤或自身抗体依赖性自身免疫疾病。

发明内容

鉴于现有技术，本发明的技术问题是提供适用于治疗与致病性B细胞相关的疾病的药剂。

该问题通过独立权利要求的特征得以解决。从属权利要求提供了本发明的优选实施方式。

因此，本发明涉及分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)，其中CAR包括：

i.胞外抗原结合域，其包含结合B细胞成熟抗原(BCMA)多肽的抗体或抗体片段，

ii.跨膜域，和

iii.胞内域，

并且其中所述CAR与包含BCMA的N末端第13至32个残基中的一个或多个氨基酸的表位结合。

因此，本发明涉及表达本发明的CAR的经遗传修饰的免疫细胞(优选T细胞)，以及所述细胞在治疗与致病性B细胞的存在相关的医学病症中的用途。

因此，本发明提供了一种适于移植的包含抗BCMA CAR的优选自体T细胞，以用于治疗不同阶段的成熟B-NHL和多发性骨髓瘤。在本发明的免疫治疗方法的优选实施方式中，转导患者来源的T细胞，优选用逆转录病毒转导，以表达如本文所述的人工免疫受体，该人工免疫受体由与跨膜部分融合的胞外抗体衍生的抗原识别部分以及胞内信号传导域组成。本文描述的构建体为转导的T细胞赋予抗肿瘤细胞溶解能力。

如其他临床CAR-T细胞转移所示，本发明的特征在于基于本文所述CAR的抗BCMACAR-T细胞具有可预测、可耐受和易控制的副作用。本文所述的BCMA CAR-T细胞的临床前测试显示对肿瘤相关抗原BCMA的选择性。配备有抗BCMA CAR的T细胞具有高亲和力和亲合力(avidity)，并且识别并破坏多发性骨髓瘤细胞，同时保留正常的造血细胞。在一种优选实施方式中，自体T细胞的转移防止了移植物抗宿主病的可能性。记忆CAR-T细胞的形成对于防止复发很重要，其可以潜在地发展。

由于本文所述的抗BCMA CAR-T细胞的高亲和力和亲合力，甚至可以识别低BCMA表达的成熟B-NHL，从而允许T细胞活化和肿瘤细胞杀伤。

在优选的实施方式中，这类成熟B-NHL实体包括FL(滤泡性淋巴瘤)、DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)，套细胞淋巴瘤(MCL)和CLL(慢性淋巴细胞白血病)的某些阶段。

本文描述的CAR的抗原识别部分优选基于WO/2015/166073中描述的人源化抗体。其中描述的抗体用于构建保留对BCMA的高亲和力和特异性的许多CAR构建体。高亲和力和特异性使得脱靶反应性降低，从而提供优于其他BCMA CAR构建体的优势。令人惊讶的结果是，如本文所述，可以在CAR中维持原始抗体的高特异性和亲和力，以靶向至表达甚至非常低量的BCMA抗原的B细胞。

本发明的CAR优选与包含BCMA的N末端第13至32个残基中的一个或多个氨基酸的表位结合。在其他实施方式中，也可能结合至BCMA的其他表位，特别是BCMA的N末端。

本发明还包括各种信号传导域。信号传导域的交换满足对强效和快速效应阶段(CD28共刺激域)或由T细胞记忆群保护的长效复发控制(4-1BB信号传导域)的需求。如本文所证明的，各种信号传导域可以以多种构型互相交换，从而为CAR提供关于其设计的灵活性而不丧失有利的结合特性。

本文所述的抗BCMA CAR-T细胞产物的特征在于独特的性质。由于CAR-T细胞构建体的胞外域的低纳摩尔亲和力，如本文所述的抗BCMA CAR具有无与伦比的高亲和力并赋予T细胞极高的特异性和亲合力。这些性质使得CAR-T细胞能够i)识别具有高和令人惊讶地低的BCMA表面表达的肿瘤靶细胞，ii)针对所述肿瘤靶细胞而被活化，和iii)杀伤所述肿瘤靶细胞。

在肿瘤细胞表面上表达的BCMA抗原的数量可以通过使用与连接于Quantibrite珠(来自Becton Dicksinson)的与荧光染料偶联的抗BCMA抗体来定量。用于量化在肿瘤细胞表面上表达的BCMA抗原的优选方法是“荧光激活细胞分选/细胞分析”(FACS)。珠的荧光强度与结合至细胞的荧光抗体的数量完全相关，这是对细胞上BCMA分子数量的测量。与低荧光的B-NHL细胞相比，骨髓瘤细胞相关荧光密度通常比其高至少2-3log₁₀倍，表明BCMA抗原密度也可在至少2-3log₁₀倍的范围内变化。

除了多发性骨髓瘤细胞或在非常罕见的伯基特淋巴瘤的情况下，没有一种竞争性抗BCMA CAR已被证实对B-NHL的反应性。因此，抗BCMA CAR显示出对前所未有的B-NHL多样性的反应性。这些性质代表了CAR-T疗法的意外和惊人的益处。技术人员的典型期望需要表达大量靶抗原，以实现CAR-T靶向。使用本发明的CAR的CAR-T显示出针对具有靶抗原低表达水平的B细胞的前所未有的活性。

在优选的实施方式中，与MP71-载体和γ-逆转录病毒表达系统组合，可以实现对人T细胞的异常高的转导率。

关于由CAR结合的BCMA表位的优选实施方式

本发明的CAR优选针对包含人BCMA的N末端第13至32个残基中的一个或多个氨基酸的表位。CD269的第13至32个残基的氨基酸序列在SEQ ID No.33中示出。CD269的N末端序列在SEQ ID No.32中提供。CD269的胞外域以SEQ ID No.31提供。

使用包含根据SEQ ID No.31的CD269的胞外域的抗原进行疫苗接种，以产生本文和之前所描述的小鼠抗体和嵌合抗体的结合特异性(WO/2014/068079)，所述嵌合抗体已被修饰用于本发明中的CAR形式。在抗体产生期间使用包含膜结合域或胞内域的整个CD269蛋白或其片段作为抗原可以产生与CD269的隐匿域或胞内域结合的抗体，从而使这些试剂不适于或不利于治疗应用。因此，本发明的CAR通过其与CD269的胞外部分的结合来定义。胞外域中的特异性表位还代表了本发明的优选的新且以外的特性。

由本发明CAR所衍生自的小鼠抗体或嵌合抗体制备的Fab片段与纯化的BCMA胞外域以复合体的方式结晶，并解析该复合体结构。结构分析揭示了本发明的抗体/CAR的结合区表位的详细信息及其生物学相关性。由于本发明的抗体的高结合特异性和胞外位置，通过本发明的抗体与包含胞外域的BCMA的第13至32个残基中的一个或多个氨基酸的表位结合是有利的性质。据发明人所知，先前没有描述过结合该区域的CAR。

在一种实施方式中，本发明的CAR的特征在于CAR与包含CD269(BCMA)的第13、15、16、17、18、19、20、22、23、26、27或32个氨基酸中的一个或多个的表位结合。在另一种实施方式中，本发明的CAR的特征在于抗体与由CD269(BCMA)的第13、15、16、17、18、19、20、22、23、26、27和32个氨基酸组成的表位结合。这些残基代表与本发明的抗体直接相互作用的氨基酸，如本文提供的晶体结构数据所鉴定。已经针对提供了人BCMA的N末端序列的SEQ IDNo.32进行了这些残基的编号。

如先前所公开的，本发明的CAR所衍生自的抗体的亲和力令人惊讶地高并且比现有技术中尝试的类似方法更好。因此，本发明的CAR由在其他抗BCMA CAR分子中未见的高亲和力所限定。在常规实践中，pM范围内的Kd(如下所示)通常被认为是不可预期的出色亲和力。

在另一个方面，本发明的CAR所衍生自的人源化抗体或抗体片段以高亲和力结合BCMA，例如当通过表面等离子体共振(例如Biacore)测量时，该抗体以100nM、90、80、70、60、50、40、30nM或更低、或20nM或更低的亲和力、或15nM或更低的亲和力、或5nM或更低的亲和力、或1000pM或更低的亲和力、或500pM或更低的亲和力、或100pM或更低的亲和力、或80pM或更低、或例如约50pM的亲和力与人BCMA结合。因此，本发明的CAR表现出相应的亲和力。

在另一种实施方式中，本发明的CAR所衍生自的抗体与人CD269结合，当通过表面等离子体共振测量时，具有约1pM至约100nM，或约100pM至约50nM之间，或约200pM至约20nM之间的亲和力。因此，本发明的CAR表现出相应的亲和力。

在一种实施方式中，本发明的CAR和/或CAR-T的特征在于CAR结合表达BCMA的细胞，其中所述BCMA在细胞表面上是可检测的，并且其中，与多发性骨髓瘤细胞相比，优选与本文所述实施例中使用的那些多发性骨髓瘤细胞系相比，BCMA以低1至4log₁₀倍，优选2-3log₁₀倍的量存在于细胞表面。这类细胞的实例是非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)细胞，例如DOHH-2、SU-DHL4、JEKO-1、JVM-3和/或MEC-1细胞系，但不限于此。

关于CAR序列的优选实施方式：

在一种实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)的特征在于抗原结合域包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述VH包含：

-与SEQ ID NO 1(GFTFSRYW)具有至少80％的序列同一性的重链互补决定区1(H-CDR1)，

-与SEQ ID NO 2(INPSSSTI)具有至少80％的序列同一性的重链互补决定区2(H-CDR2)，和

-与SEQ ID NO 3(ASLYYDYGDAYDY)具有至少80％的序列同一性的重链互补决定区3(H-CDR3)；

所述VL包括：

-与SEQ ID NO 4(QSVESN)具有至少80％的序列同一性的轻链互补决定区1(L-CDR1)，

-与SEQ ID NO 5(SAS)具有至少80％的序列同一性的轻链互补决定区2(L-CDR2)，和

-与SEQ ID NO 6(QQYNNYPLT)具有至少80％的序列同一性的轻链互补决定区3(L-CDR3)。

在一种实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)的特征在于抗原结合域包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述VH包含：

-与SEQ ID NO 25(RYWFS)具有至少80％的序列同一性的重链互补决定区1(H-CDR1)，

-与SEQ ID NO 26(EINPSSSTINYAPSLKDK)具有至少80％的序列同一性的重链互补决定区2(H-CDR2)，和

-与SEQ ID NO 27(SLYYDYGDAYDYW)具有至少80％的序列同一性的重链互补决定区3(H-CDR3)，

所述VL包括：

-与SEQ ID NO 28(KASQSVESNVA)具有至少80％的序列同一性的轻链互补决定区1(L-CDR1)，

-与SEQ ID NO 29(SASLRFS)具有至少80％的序列同一性的轻链互补决定区2(L-CDR2)，和

-与SEQ ID NO 30(QQYNNYPLTFG)具有至少80％的序列同一性的轻链互补决定区3(L-CDR3)。

以上以SEQ ID NO 25-30列举的CDR序列表示使用用于定义CDR区的替代参数并且包含例如与SEQ ID NO 1-6相比的另外的侧翼氨基酸来获得的实施方式。

还可以限定SEQ ID NO 1-6和25-30的CDR序列，使得本发明涵盖与列出的特定序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或至少95％的序列同一性的多肽序列。

在一种实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)的特征在于所述CAR包含VH域和VL域，所述VH域包含以下的CDR序列：

-GFTFSRYW(H-CDR1；SEQ ID NO.1)；

-INPX₂X₃STI(H-CDR2；SEQ ID No.7)，其中X₂X₃：SS、NS、TS、GS、KS、RS、SD、SN、DE；和

-ASLYX₄DYGDAX₅DY(H-CDR3；SEQ ID NO 8)，其中X4：Y、L、A、V、F、I、W，和/或X₅：Y、L、F、I、V、A、C；

所述VL域包含以下CDR序列：

-QSVX₁X₂N(L-CDR1；SEQ ID NO 9)，其中X₁X₂：ES、SS、TS、QS、HS、DH；

-SAS(L-CDR2；SEQ ID NO 5)；和

-QQYNNYPLTFG(L-CDR3；SEQ ID NO.10)。

在可供选择的实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)包含VH域和VL域，所述VH域包含以下的CDR序列：

-RYWX₁S(H-CDR1；SEQ ID NO 34)，其中X₁：I、F、L、V、Y.C、G、A、S、T；

-EINPX₂X₃STINYAPSLKDK(H-CDR2；SEQ ID NO 35)，其中X₂X₃：SS、NS、TS、GS、KS、RS、SD、SN、DE；和

-SLYX₄DYGDAX₅DYW(H-CDR3；SEQ ID NO 36)，其中X₄：Y、L、A、V、F、I、W，和/或X₅：Y、L、F、I、V、A、C；

所述VL域包含以下CDR序列：

-KASQSVX₁X₂NVA(L-CDR1；SEQ ID NO 37)，其中X₁X₂：ES、SS、TS、QS、HS、DH；

-SASLRFS(L-CDR2；SEQ ID NO 29)；和

-QQYNNYPLTFG(L-CDR3；SEQ ID NO.30)。

以上以SEQ ID NO 34-37列举的CDR序列表示使用用于定义CDR区的替代参数并且例如包含与SEQ ID NO 1-6相比的另外的侧翼氨基酸来获得的实施方式。

在一种实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)的特征在于所述CAR包含以下序列：

-H-CDR1：GFTFSRYW(SEQ ID NO.1)，

-H-CDR2：INPSSSTI(SEQ ID NO.2)，

-H-CDR3：ASLYYDYGDAYDY(SEQ ID NO.3)，

-L-CDR1：QSVESN(SEQ ID NO.4)，

-L-CDR2：SAS(SEQ ID NO 5)，和

-L-CDR3：QQYNNYPLT(SEQ ID NO 6)。

在一种实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)包含以下的CDR序列：

-H-CDR1：RYWFS(SEQ ID NO.25)，

-H-CDR2：EINPSSSTINYAPSLKDK(SEQ ID NO.26)，

-H-CDR3：SLYYDYGDAYDYW(SEQ ID NO.27)，

-L-CDR1：KASQSVESNVA(SEQ ID NO.28)，

-L-CDR2：SASLRFS(SEQ ID NO.29)，和

-L-CDR3：QQYNNYPLTFG(SEQ ID NO.30)，

在一种实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)的特征在于所述CAR包含与SEQ ID NO 11(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWFSWVRQAPGKGLVWVGEINPSSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSS)具有至少80％的序列同一性的VH域；

和与SEQ ID NO 12(EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVESNVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELK)具有至少80％序列同一性的VL域。

SEQ ID NO 11和12代表优选CAR的“全长”VH域和VL域。与SEQ ID NO11和12具有至少70％、优选80％、85％、90％或至少95％的序列同一性的序列，特别是当这种序列变体显示出所希望的BCMA结合特异性(功能上类似/等同)时，被包括在本发明的范围内。

在一种实施方式中，包含SEQ ID NO 11和12的VH和VL序列、或与SEQ ID NO 11和12具有至少80％同一性的序列的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽中，包含SEQ ID NO 11的至少W36、E50、L99、Y100、Y101和A106，以及SEQ ID NO 12的至少S31、A34、S50、L53、Q89、Y91、Y94和L96。

以上列出的氨基酸残基代表已知与靶BCMA表位直接相互作用的氨基酸残基。因此，本发明涉及CAR，其中在VH和VL中在与SEQ ID NO 11和12具有至少70％、优选80％、85％、90％或至少95％的序列同一性的范围内发生了序列变异，但是VH域和VL域至少包含已知与靶表位相互作用的那些残基。

在一种实施方式中，包含SEQ ID NO 11和12的VH和VL序列、或与SEQ ID NO 11和12具有至少80％同一性的序列的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽中，至少包含SEQ ID NO1、7、8、9、5和10的CDR序列，如本文所述，优选为SEQ NO 1至6的CDR序列。

因此，本发明涉及CAR，其中在VH和VL中在与SEQ ID NO 11和12具有至少70％、优选80％、85％、90％或至少95％的序列同一性的范围内发生了序列变异，但是VH域和VL域至少包含如本文所述的CDR序列。CDR可以代表本文中称为CDR的任何序列，特别是SEQ ID NO1-6或SEQ ID NO 25-30的序列。

在一种优选实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)的特征在于，当所述CAR在经遗传修饰的免疫细胞、优选T淋巴细胞中表达时，所述免疫细胞通过所述CAR在非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)的表面上结合BCMA，并被活化，从而诱导针对所述B-NHL的细胞毒活性。

在一种优选实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)的特征在于B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)细胞，例如DOHH-2、SU-DHL4、JEKO-1、JVM-3和/或MEC-1细胞系。

本发明的CAR的特征在于令人惊讶的特性，即，即使细胞表面上非常低水平的BCMA也可导致CAR结合、T细胞活化和对结合细胞的细胞毒性。与通常描述的CAR相比，这代表了显著的优点。通常，CAR需要大量表面抗原以便能够活化CAR和随后的细胞毒活性。因此，鉴于本领域已知的CAR，本发明的CAR与意想不到的益处相关。

在一些实施方式中，为了产生如本文所述的CAR，先前描述的小鼠抗体、嵌合抗体和/或人抗体的衍生化可以提供该优势。在一些实施方式中，BCMA表位的特征优选地导致该优势。在其他实施方式中，本文所述的VH和VL片段的高亲和力和特异性使得本CAR的灵敏性成为可能。然而，出乎意料的是，该性质将与先前对抗体的描述中的CAR组合而产生。完全出乎意料的是，本文提供的特定序列、优选参与结合的VL和VH区的CDR区，表现出特异且强的结合，足以使CAR-T细胞针对具有最小BCMA表达的细胞活化。

出乎意料的是，本文所述的VH和VL片段可以如本文所述在CAR中以多种构型排列，并且仍然保持对靶表位的高特异性和高亲和力。如下和图3所示，CAR可以构造为VH-VL或VL-VH构型，其中具有在接头、铰链、跨膜域、共刺激域和/或活化域的变异，并且该CAR仍然保持其功效。本发明的这一令人惊讶的特征使得针对BCMA的CAR的设计具有更大的灵活性，从而如果需要或期望进一步的开发，能够基于本文所述的VH域和VL域进一步修饰和/或优化CAR结构。

在优选的实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)的特征在于，所述SAR在遗传修饰的变异细胞、优选T淋巴细胞中表达，所述免疫细胞通过所述CAR在多发性骨髓瘤(MM)的表面上结合BCMA，并被活化，从而诱导针对所述MM细胞毒活性。优选的MM细胞公开于本文中。在优选的实施方式中，本文描述的CAR显示出针对MM和B-NHL的有效结合和毒活性。鉴于现有技术，本领域技术人员不会预料到本文描述的CAR会能够表现出针对这两种细胞类型的活性。

关于人源化VH域和VL域的优选实施方式

如本文和先前(WO/2015/166073)详细公开的，抗体J22.9-xi的序列是人源化的，以提供更适合在人受试者中施用的试剂。已经产生了J22.9-xi的各种人源化序列变体，并测试了它们对人和食蟹猴(cynomolgus)BCMA的结合亲和力和特异性。在优选的实施方式中，本发明的CAR包含这些人源化序列。用相应抗体进行的结合分析的结果表明，人源化序列保持了嵌合试剂J22.9-xi的希望的结合特性。在下面的序列中，下划线区域代表CDR或推定的CDR，这取决于用于CDR测定的方法。

关于人源化VH变体的优选实施方式

以下提供了关于优选地通过本发明的CAR而并入的人源化VH和VL序列的其他信息。

嵌合序列：

HC小鼠(SEQ ID No.38)：

HC小鼠序列代表最初对包含从小鼠抗体获得的VL和VH域的嵌合抗体J22.9-xi而开发的重链(VH)可变区，该重链可变区能够结合CD269(BCMA)的胞外域的表位，VL和VH域分别与人CL和CH结构域融合。在一些实施方式中，CAR可以并入HC小鼠序列或其CDR。

部分人源化的序列：

HC部分人源化(SEQ ID No.39)：

HC部分人源化序列代表与本文公开的嵌合抗体相比修饰的氨基酸序列(通过氨基酸替换)，借此，VL和VH结合区已经针对它们的序列进行了修饰，以使它们更适合于在人类中施用。

人源化VH序列：

hHC01(SEQ ID No.40)

去除翻译后修饰基序的人源化VH序列：

hHC02(SEQ ID No.41)

其中：

X₁：I、F、L、V、Y.C、G、A、S、T，优选I或F；；

X₂X₃：SS、NS、TS、GS、KS、RS、SD、SN、DE，优选SS；

X₄：Y、L、A、V、F、I、W，优选Y；和/或

X₅：Y、L、F、I、V、A、C，优选Y；

“hHC01”和“hHC02”人源化序列代表本发明的CAR的优选氨基酸序列，其包括与本文所述的原始嵌合序列和部分人源化序列相比的序列改变。

PTM突变旨在从所述蛋白中去除潜在有害的翻译后修饰基序，同时保持有利的结合特性。hHC01和hHC02的第1、5、6、19、27、28、34、49、46、48、54、69、84、85、86、88、93、107和/或115位优选与原始嵌合序列相比是突变(替换)的。替换的重要性主要涉及所得氨基酸，而不是原始氨基酸。因此，改变也可以从原始嵌合氨基酸的相应氨基酸或其他变体的相应氨基酸、例如部分人源化序列进行。

在一些实施方式中，以下替换是优选的，并且与嵌合(SEQ ID No 38)序列相比不同：

-HC(VH)序列的氨基酸M34被任何氨基酸替换，所述氨基酸优选为I、L、F、V、Y.C、G、A、S、T；

-HC(VH)序列的氨基酸E46被V替换；

-HC(VH)序列的氨基酸D54和S55被任何氨基酸组合替换，所述氨基酸组合优选为SS、TS、GS、KS、RS、SD、SN、DE；

-HC(VH)序列的氨基酸Y101被任何氨基酸替换，所述氨基酸优选为L、A、V、F、I、W；和/或

-HC(VH)序列的氨基酸M107被任何氨基酸替换，所述氨基酸优选为L、Y、F、I、V、A、C。

可以在与BCMA直接相互作用所需的那些残基处修饰的序列：

hHC03-参与与BCMA相互作用的修饰的氨基酸(SEQ ID No 42)：

其中优选的氨基酸是：

X₁：W、F、Y，优选W；

X₂：S、T、N、Q、D、E，优选S；

X₃：W、F、Y，优选W；

X₄：E、Q，优选E；

X₅：L、I、V、G、A，优选L；

X₆：Y、X，优选Y；

X₇：Y、F、L、I、V、M，优选Y；和/或

X₈：A、G、V，优选A.

“hHC03”人源化序列代表优选的氨基酸序列，其包括与原始嵌合序列和部分人源化序列相比的氨基酸序列改变。这些序列改变旨在反映可被替换的与BCMA靶标结合的氨基酸的潜在变化，同时保持有利的结合特性。替换的重要性主要涉及所得氨基酸，而不是原始氨基酸。因此，改变也可以从原始嵌合氨基酸的相应氨基酸或其他变体的相应氨基酸进行。

例如：

-HC(VH)序列的氨基酸W33是W、F、Y；

-HC(VH)序列的氨基酸S35是S、T、N、Q、D、E；

-HC(VH)序列的氨基酸W47是W、F、Y；

-HC(VH)序列的氨基酸E50为E、Q；

-HC(VH)序列的氨基酸L99是L、I、V、G、A；

-HC(VH)序列的氨基酸Y100为Y、X；

-HC(VH)序列的氨基酸Y101是Y、F、L、I、V、M；和/或

-HC(VH)序列的氨基酸A106是A、G、V。

通常，当独立于作为整体的框架序列考虑时，人源化期间对CDR区进行的任何改变也可以被认为是CDR序列的特征。可以认为这类修饰的CDR序列在本文所述的整个框架区中的上下文内或独立于其上下文而限定本发明的特征。例如，hHC01至hHC03中以下划线标识的CDR序列可以被认为是本发明的限定特征，其独立于周围的可变区序列。

人源化HC(VH)序列的具体实例：

hHC04(SEQ ID NO 43)：

hHC05(SEQ ID NO 44)：

hHC06(SEQ ID NO 45)：

hHC07(SEQ ID NO 46)：

为了去除人源化J22.9中潜在的翻译后修饰位点，将重链CDR2的残基D54突变为天冬酰胺(N)，从而为N-连接糖基化创建新的潜在修饰位点(例如hHC04、05)。含有N54的突变重链可以是糖基化的。然而，相应的IgG，J22.9-FNY在FACS和ELISA中结合BCMA，并且与BCMA以复合体结晶。令人惊讶的是，侧链的这种大的延伸不会破坏与BCMA的结合，并且可以从这些观察结果预期到，在该位置可以容忍多个和各种氨基酸替换，可能还有除糖之外的衍生化。

比对：

图13中，HC序列内各种替换位置的CLUSTAL W(1.83)多序列比对提供了适当的序列比较。“一般序列”代表HC序列，其中每个X代表对任何给定氨基的潜在氨基酸改变。优选的氨基酸替换是上文针对每个潜在突变位置所述的那些。

关于人源化VL变体的优选实施方式

嵌合序列：

LC小鼠(SEQ ID No.47)：

LC小鼠序列代表最初对包含从小鼠抗体获得的VL和VH域的嵌合抗体J22.9-xi而开发的轻链(VL)可变区，该轻链可变区能够结合CD269(BCMA)的胞外域的表位。在一些实施方式中，小鼠VL域或其CDR可以用于本发明的CAR中。

部分人源化的序列：

LC部分人源化(SEQ ID NO 48)：

LC部分人源化序列代表与嵌合抗体相比修饰的序列(通过氨基酸替换)，借此，VL和VH结合区已经针对它们的序列进行了修饰，以使它们更适合于在人类中施用。

人源化VL序列：

hLC01(SEQ ID NO 49)：

去除翻译后修饰基序的人源化VL序列：

hLC02(SEQ ID NO 50)：

其中：

X₁X₂：ES、SS、TS、QS、HS、DH，优选ES。

“hLC01”和“hLC02”人源化序列代表优选的氨基酸序列，其包括与本文所述的原始嵌合序列和部分人源化序列相比的氨基酸序列改变。

PTM突变旨在从所述蛋白中去除潜在有害的翻译后修饰基序，同时保持有利的结合特性。hLC01和hLC02的第1、8、9、10、13、15、17、19、20、21、22、30、41、43、45、49、58、63、70、77、83、85和/或87位与原始嵌合序列相比优选是突变(替换)的。替换的重要性主要涉及所得氨基酸，而不是原始氨基酸。因此，改变也可以从原始嵌合氨基酸的相应氨基酸或其他变体的相应氨基酸进行。

以下替换是优选的，并且与嵌合和部分人源化序列不同：

-LC(VL)序列的氨基酸D1被E替换；

-LC(VL)序列的氨基酸V15被P替换；

-LC(VL)序列的氨基酸D17被E替换；

-LC(VL)序列的氨基酸V19被A替换；

-LC(VL)序列的氨基酸T22被S替换；

-LC(VL)序列的氨基酸D30和S31被任何氨基酸组合替换，所述氨基酸组合优选ES、SS、TS、QS、HS、DH；

-LC(VL)序列的氨基酸V58被I替换；和/或

-LC(VL)序列的氨基酸D70被E替换。

CDR结合区中可以在与BCMA相互作用所需的那些残基修饰的序列：

hLC03-参与与BCMA相互作用的经修饰氨基酸(SEQ ID NO 51)：

其中优选的氨基酸是：

X₁：S、H、T、N、D、Q；

X₂：N、E、Q；

X₃：A、G、V、S、T、L、I；

X₄：Y、F、L、I、V、A、G；

X₅：Y、F、L；

X₆：S、T；

X₇：S、T、D、N、H、E、Q；

X₈：L、V、I、M；

X₉：F、L、I、V、Y、M；

X₁₀：G、X；

X₁₁：S、X；

X₁₂：Q、V、L、I、M；

X₁₃：Y、F、L、I、Q；

X₁₄：Y、F、R、Q、K；和/或

X₁₅：L、I、V、F

“hLC03人源化序列”代表优选的氨基酸序列，其包括与原始嵌合序列和部分人源化序列相比的氨基酸序列改变。这些序列改变旨在反映可被替换的与BCMA靶标结合的氨基酸的潜在变化，同时保持有利的结合特性。替换的重要性主要涉及所得氨基酸，而不是原始氨基酸。因此，改变也可以从原始嵌合氨基酸的相应氨基酸或其他变体的相应氨基酸进行。

例如：

-LC(VL)序列的氨基酸S31是S、H、T、N、D、Q；

-LC(VL)序列的氨基酸N32是N、E、Q；

-LC(VL)序列的氨基酸A34是A、G、V、S、T、L、I；

-LC(VL)序列的氨基酸Y36是Y、F、L、I、V、A、G；

-LC(VL)序列的氨基酸Y49是Y、F、L；

-LC(VL)序列的氨基酸S50是S、T；

-LC(VL)序列的氨基酸S52是S、T、D、N、H、E、Q；

-LC(VL)序列的氨基酸L53是L、V、I、M；

-LC(VL)序列的氨基酸F55是F、L、I、V、Y、M；

-LC(VL)序列的氨基酸G66是G、X；

-LC(VL)序列的氨基酸S67是S、X；

-LC(VL)序列的氨基酸Q89是Q、V、L、I、M；

-LC(VL)序列的氨基酸Y91是Y、F、L、I、Q；

-LC(VL)序列的氨基酸Y94是Y、F、R、Q、K；和/或

-LC(VL)序列的氨基酸L96是L、I、V、F。

通常，当独立于作为整体的框架序列考虑时，对CDR区进行的任何改变也可以被认为是CDR序列的特征。可以认为这类修饰的CDR序列在本文所述的整个框架区中的上下文内或独立于其上下文而限定本文使用的序列的特征。例如，hLC01至hLC03中以下划线标识的CDR序列可以以未修饰或未替换的形式被认为是本发明的限定特征，其独立于周围的可变区序列。

人源化LC序列的实例：

hLC04(SEQ ID NO 52)：

比对：

图14中，LC序列内各种潜在修改的位点的CLUSTAL W(1.83)多序列比对提供了适当的序列比较。“一般序列”代表LC序列，其中每个X代表潜在氨基酸变化。优选的氨基酸替换是上文针对每个潜在突变位置所述的那些。

因此，本发明涉及根据hHC01、hHC02、hHCO03、hHCO04、hHC05、hHC06、hHC07、hLC01、hLC02、hLC03和/或hLC04或其任何给定组合的人源化序列。

对本文提出的任何给定的潜在变体残基的潜在修饰的所有可能组合(如“一般”序列中的X所标识)包括在本发明中。通过组合这些各种替换中的一种或多种，可以产生人源化变体，该人源化变体表现出本文最初开发和证明的嵌合抗体的所需结合特性。本文所述的抗体或其部分还包括与明确公开或通过序列式公开的那些人源化序列具有至少80％、优选90％的序列同一性的序列。

本发明进一步涉及如本文所述的包含VH域的CAR，其中所述VH域包含根据X₁VQLX₂X₃SGGGLVQPGGSLX₄LSCAASGX₅X₆FX₇X₈YWZ₁SWVRX₉APGKGLEWX₁₀GEINPZ₂SSTINYAPSLKX₁₁X₁₂FX₁₃ISRDNAKNTLYLQMX₁₄X₁₅X₁₆RX₁₇EDTAX₁₈YYCASLYYDYGDAZ₃DYWGQGTX₁₉VTVSS的序列(SEQ IDNo.53)，其中X1：Q、E；X2：Q、V；X3：Q、E；X4：K、R；X5：I、F；X6：D、T；X7：S、D；X8：R、D；X9：R、Q；X10：I、V；X11：D、G；X12：K、R；X13：I、T；X14：S、N；X15：K、S；X16：V、L；X17：S、A；X18：L、V；X19：S、L；并且其中Z₁、Z₂的和/或Z₃中至少一个为：Z₁：I、F、L、V、Y.C、G、A、S、T，优选I或F；Z₂：S、N、T、G、K、R、D，优选S；Z₃：Y、L、F、I、V、A、C，优选Y；并且其中所述抗体或其片段特异性结合CD269(BCMA)胞外域的表位。

该实施方式包括用于本发明的CAR的各种人源化序列，特别是其VH序列，所有变体由在本文所述的CDR中进行的有利人源化定义。

本发明进一步涉及如本文所述的包含VL域的抗体或抗体片段，其中所述VL域包含根据DIVMTQSX₁X₂X₃X₄X₅X₆SVGDX₇VX₈X₉TCKASQSVESNVAWYQQKPX₁₀QX₁₁PKX₁₂LIX₁₃SX₁₄X₁₅LRFSGVPARFX₁₆GSGSGTDFTLTISX₁₇LQSEDX₁₈AX₁₉YX₂₀CQQYNNYPLTFGAGTKLELKR(SEQ ID No.54)的序列，其中X1：Q、P；X2：R、A；X3：F、T；X4：M、L；X5：T、S；X6：T、V；X7：R、E；X8：S、T；X9：V、L；X10：R、G；X11：S、A；X12：A、L；X13：F、Y；X14：A、D；X15：S、D；X16：T、S；X17：N、S；X18：L、F；X19：E、V；X20：F、Y；其中所述抗体或其片段特异性结合CD269(BCMA)胞外域的表位。

该实施方式包括用于本发明的CAR的各种人源化序列，特别是其VL序列，所有变体由在本文所述的CDR中进行的有利人源化定义。

在一种实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)的特征在于胞外抗原结合域包含位于VH域和VL域之间的接头多肽，其中所述接头优选选自惠特洛(Whitlow)(SEQ ID NO 13；GSTSGSGKPGSGEGSTKG)或Gly-Ser(SEQ ID NO 14；SSGGGGSGGGGSGGGGS)接头，或与SEQ ID NO 13或14具有至少80％的序列同一性的接头。

在一种实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)的特征在于所述CAR包含位于胞外抗原结合域和跨膜域之间的间隔区多肽，其中所述间隔区优选选自：

-IgG1-CD28间隔区(SEQ ID NO 15；PAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKK)，

-IgG1Δ-4-1BB间隔区(SEQ ID NO 16；PAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSSLSPGKK)，

-IgG4(Hi-CH2-CH3)间隔区(SEQ ID NO 17；ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK)，

-IgG4(Hi-CH3)间隔区(SEQ ID NO 18；ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK)，

-IgG4(Hi)间隔区(SEQ ID NO 19；ESKYGPPCPPCP)，或

-与SEQ ID NO 15至19中的任一个具有至少80％的序列同一性的间隔区；

在一种实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)的特征在于跨膜域优选选自CD8α域(SEQ ID NO 20；IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC)或CD28域(SEQ ID NO 21；FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV)或与SEQ ID NO 20或21具有至少80％的序列同一性的跨膜域。

在一种实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)的特征在于胞内域包含共刺激域，所述共刺激域优选选自4-1BB共刺激域(SEQ ID NO 22；KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL)或CD28共刺激域(SEQ ID NO 23；RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS)，或与SEQ ID NO 22或23具有至少80％的序列同一性的共刺激域；和/或

在一种实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)的特征在于所述CAR包含信号传导域，其中所述信号传导域优选选自CD3ζ(CD28或4-1BB)信号传导域(SEQ IDNO 24；LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR)，或与SEQ ID NO 24具有至少80％的序列同一性的信号传导域。

在一种实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体(CAR)的特征在于所述CAR包含串联的共刺激域和CD3ζ信号传导/活化域(SEQ ID NO 24)，该串联的共刺激域包含4-1BB共刺激域(SEQ ID NO 22)和CD28共刺激域(SEQ ID NO 23)。

在一种实施方式中，本发明的分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)的特征在于所述CAR包含前导区序列，其中所述前导区序列优选选自IGK前导区(SEQ ID NO 55；MDFQVQIFSFLLISASVIMSR)或GMCSF前导区(SEQ ID NO 56；MLLLVTSLLLCELPHPAFLLI)或与SEQ ID NO 55或56具有至少80％的序列同一性的前导区序列。

本发明的另一方面涉及选自由以下组成的组中的分离的核酸分子：

a)包含核苷酸序列的核酸分子，

-所述核苷酸序列编码如本文所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，和/或

-所述核苷酸序列包含SEQ ID No.66和/或67，或SEQ ID NO 86至94的序列或序列片段，或

b)与根据a)的核苷酸序列互补的核酸分子；

c)核酸分子，其包含与a)或b)的核苷酸序列具有足够的序列同一性的核苷酸序列，使得其功能上类似于/等同于根据a)或b)的核苷酸序列，优选包含与a)或b)的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的序列；

d)核酸分子，其作为遗传密码的结果，简并到根据a)至c)的核苷酸序列中；和

e)根据a)至d)的核苷酸序列的核酸分子，其通过缺失、添加、替换、易位、倒置和/或插入进行修饰，并且功能上类似于/等同于根据a)至d)的核苷酸序列。

本发明的优选的氨基酸序列：

优选的核苷酸序列：

本发明的另一方面涉及载体，其包含如本文所述的核酸分子，所述载体优选为病毒载体，更优选为γ逆转录病毒载体。

本发明的另一方面涉及经遗传修饰的免疫细胞，其包含如本文所述的核酸分子或载体、和/或表达如本文所述的CAR，其中免疫细胞优选选自由T淋巴细胞或NK细胞组成的组，更优选细胞毒性T淋巴细胞。

在优选的实施方式中，经遗传修饰的免疫细胞包含如本文所述的核酸分子或载体、和/或表达如本文所述的CAR，该免疫细胞的特征在于，该免疫细胞是CD4+和/或CD8+T细胞，优选CD4+和CD8+T细胞的混合物。这些T细胞群、优选包含CD4+和CD8+转化细胞的组合物对各种恶性B细胞(例如多发性骨髓瘤和B-NHL)、优选对本文所述的那些细胞和/或相关医学病症，显示出特别有效的细胞溶解活性。

在优选的实施方式中，经遗传修饰的免疫细胞包含如本文所述的核酸分子或载体、和/或表达如本文所述的CAR，该免疫细胞是CD4+和CD8+T细胞，优选为1∶10至10∶1的比例，更优选5∶1至1∶5的比例、2∶1至1∶2或1∶1的比例。BCMA指导的修饰CAR-T细胞以上述比例、优选1∶1的CD4/CD8+的比例表达CAR，施用该CAR-T细胞在治疗上述疾病期间会带来有益的特征，例如这些比例带来改善的治疗响应和降低的毒性。

在优选的实施方式中，要在上述疾病中施用的免疫细胞是用上述核酸进行了遗传修饰的免疫细胞，使用“睡美人”转座子系统、特别是睡美人转座酶，其编码和表达本文所述的抗BCMA CAR。睡美人转座子系统是设计成引导前面定义的DNA序列进入脊椎动物的染色体的合成DNA转座子，在本发明的上下文中用于修饰免疫细胞以表达本文所述CAR的目的。睡美人转座子将病毒与裸DNA的优点结合。病毒已经基于其在新宿主细胞中感染和复制的能力经过了进化选择。同时，细胞发展出主要的分子防御机制以保护它们自己免受病毒感染。由于社会和管理上的原因，避免使用病毒也是非常重要。因此，使用非病毒载体(例如睡美人系统)避免了细胞面对病毒的许多但不是所有的防御。为此，睡美人病毒系统使得能够为了施用于患者而进行免疫细胞的特别有效和安全的遗传修饰。

本发明的进一步的方面涉及如本文所述的免疫细胞，该免疫细胞包含如本文所述的核酸分子或载体、和/或表达如本文所述的CAR，其用作治疗与致病性B细胞的存在相关的医学病症(例如浆细胞、记忆B细胞和/或成熟B细胞的疾病，特别是多发性骨髓瘤或非霍奇金淋巴瘤)的药物。

在一种实施方式中，免疫细胞的医学用途的特征在于待治疗的医学病症是多发性骨髓瘤。

在一种实施方式中，免疫细胞的医学用途的特征在于待治疗的医学病症是非霍奇金淋巴瘤。

在一种实施方式中，免疫细胞的医学用途的特征在于待治疗的医学病症与致病性成熟B细胞相关。据本发明人所知，本领域中先前没有公开内容如本文所述地明确教导BCMACAR-T可有效靶向这种成熟B细胞。在以下实施方式中说明的一些被测试的肿瘤细胞系涉及成熟B细胞，并且不一定是记忆类型。相比之下，未成熟的B细胞会是那些引起急性淋巴性白血病的细胞。因此，本发明还包括治疗本文公开的医学病症的方法，包括将治疗有效量的CAR或包含本发明CAR的治疗剂施用于需要这种治疗的受试者。

本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含CAR或含CAR的治疗剂，以及药学上可接受的载体的治疗剂。

具体实施方式

多发性骨髓瘤，也称为浆细胞瘤，是目前无法治愈的B细胞淋巴瘤，其来源自恶性转化的浆细胞克隆。该疾病是骨和骨髓中最常见的肿瘤，其预期寿命中位数为7年，每年死于癌症的比例为2％。认为恶性转化发生在发育阶段的次级淋巴器官的生发中心，在该生发中心中B细胞已完成VDJ重排和同种型转换。诊断出时的中位年龄为70岁，这表明在许多患者中存在共病，这会不适于进行强力和长期的化学疗法或放射疗法。此外，该患病人群通常不适于进行同种异体骨髓移植。该疾病的临床特征是溶骨性病变、高钙血症、造血功能不全、淀粉样沉积、肾衰竭、过量抗体重链和/或轻链产生、高粘血症、感染、出血性疾病。护理标准是单独化学疗法，或化学疗法与自体干细胞移植、免疫调节剂如免疫调节药物(IMIDs)、局部放射、蛋白酶体抑制剂的组合，并且对少数患者，适用同种异体干细胞移植。尽管采用前述方式进行强力治疗，但该疾病通常会复发，并且在多线治疗方案后发生一级和二级耐药。

本文所述的过继性嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法靶向B细胞成熟抗原(BMCA)，该疗法可以克服多发性骨髓瘤中的这些限制，因为BCMA在多发性骨髓瘤肿瘤细胞中高度表达，但不在正常B细胞或前体B细胞中高表达。其次，在直接针对B细胞的抗CD19抗体或抗CD19 CAR-T细胞疗法中，由于抗原丢失，发生非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)耐药性。因为在这些B-NHL中多线化学疗法/免疫疗法后发生了治疗耐药性，所以需要替代的靶结构。对于成熟B-NHL，BCMA是合适的靶标，因此，具有高亲和力的抗BCMA CAR-T细胞甚至可以在治疗上用于B-NHL，如下所述。

BCMA CAR-T细胞转移对肿瘤相关抗原BCMA具有选择性，即使对于老年人和出现多药耐药性后也适用且有效。它们具有可预测、可耐受和易处理的副作用。配备抗BCMA CAR的自体T细胞具有高亲和力和亲合力，识别并破坏多发性骨髓瘤细胞，同时保留正常的造血细胞(例如T细胞，B细胞及其骨髓前体细胞)；所有骨髓细胞和NK细胞同样幸免。由于T细胞的自体转移，不会发生移植物抗宿主病。对于防止复发很重要的记忆T细胞的形成可以发展。由于抗BCMA CAR-T细胞的高亲和力和亲合力，甚至可以识别低表达BCMA的成熟B细胞NHL，从而允许T细胞活化和肿瘤细胞杀伤。这类成熟的B-NHL实体包括滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的某些阶段。

在一些实施方式中，本文所述的抗BCMA CAR-T细胞适用于不符合其他疗法的多发性骨髓瘤和B-NHL患者。更具体地说：i)具有多药耐药性的患者，ii)不具有进行同种异体干细胞移植的条件的患者，iii)具有不适于进行进一步化学疗法的共病的患者，iv)不耐受化学疗法的老年患者，v)CAR适用于甚至在进行性疾病和多种其他标准治疗方法失败后的挽救疗法，vi)它甚至以非常低的抗原密度适用于靶肿瘤细胞，其中抗体会失败，vii)与BCMA复合的源抗体的结构在近原子分辨率下验证其精确的特异性，以及其他抗BCMA CAR-T细胞未显示的生物安全特征，和/或vii)它适用于单一疗法，而这与抗体的情况不同。

对于本领域中描述的其他抗BCMA CAR--T细胞，仅对于多发性骨髓瘤细胞和患者表明了它们的反应性；相比之下，即使对于低BCMA表达的B-NHL细胞系，我们的抗BCMA CAR也具有出乎意料的高灵敏度。我们的抗BCMA CAR赋予T细胞极高的亲合力，这是抗肿瘤功效所必需的。没有其他抗BCMA CAR被报道过对成熟B-NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、确定阶段的滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病起反应。本发明证明我们的抗BCMA CAR不赋予T细胞对生理B细胞、T细胞、NK细胞、内皮细胞、所有骨髓细胞谱系及其前体细胞的反应性。因此，本发明对其他造血组织具有前所未有的低脱靶反应性。与抗CD38CAR-T细胞相反，我们的抗BCMA CAR对骨髓细胞前体没有不希望的反应性。

先前在WO/2015/166073和WO/2014/068079中描述的scFV片段的氨基酸序列已进行了修饰，i)以便使得在跨膜受体结构的情况下折叠和表达；ii)轻链和重链片段的顺序已经倒置，iii)重链和轻链之间的接头序列已经延长。修饰使得在T细胞上进行充分的表面表达并且仍然保持适当的抗原结合。

原始FSY IgG作为CAR-T细胞构建体的scFv部分的抗体模板，其纳摩尔亲和力低，因此本发明的优选实施方式的特征在于抗BCMA CAR具有出乎意料的高亲和力并赋予T细胞极高的特异性和亲合力。高亲和力和高亲合力使得CAR-T细胞能够i)识别具有高、中和低BCMA表面表达的肿瘤靶细胞，ii)针对所述肿瘤靶细胞而被活化，和iii)杀伤所述肿瘤靶细胞。除了多发性骨髓瘤细胞之外，现有技术的上述抗BCMA CAR均未证实对B-NHL的反应性。因此，本发明的抗BCMA CAR是具有特异性和高活性的试剂，其低水平/数量BCMA分子对抗前所未有的B-NHL多样性。

与逆转录病毒载体、优选MP71-载体和γ-逆转录病毒表达系统组合，可以实现对人T细胞的异常高的转导率。

本发明的另一个明显优势是对由CAR的scFv片段识别的BCMA表位的详细认识。到目前为止，没有其他基于抗体的发明或出版物已经鉴定出BCMA表位。因此，如本文所述的抗BCMA CAR表现出显著更高的生物安全性，并且在体内和体外没有已知的脱靶反应性。

另外，本发明人已经在简单的三步克隆中交换了我们的CAR构建体的信号传导组件，该三步克隆使得获得临床上可应用的抗BCMA CAR的模块组合物。

在体外共培养系统中，本发明的抗BCMA CAR-T细胞在暴露于表达BCMA的人B-NHL和多发性骨髓瘤肿瘤细胞系后被活化。然后这些T细胞产生具有高水平IFN-γ分泌的效应表型，该表型是预测细胞毒活性的表型。

临床前评估包括i)针对来自患者的合适的B-NHL细胞系和原发性骨髓瘤细胞的体外细胞毒性测试，ii)针对异种移植的B-NHL和多发性骨髓瘤细胞系的抗BCMA CAR活性的体内测试。

在体内人体环境中，通过临床I期研究评估具有以下特征的骨髓瘤患者：i)具有多药耐药性的患者，ii)不具有进行同种异体干细胞移植的条件的患者，iii)具有不适于进行进一步化学疗法的共病的患者，iv)不耐受化学疗法的老年患者，v)进行性疾病出现后进行挽救疗法的患者，vi)多种其他标准护理疗法失败的患者，vii)自体干细胞移植后出现进行性疾病的患者，viii)同种异体干细胞移植后出现进行性疾病的患者，ix)作为同种异体干细胞移植前的桥接疗法(bridging therapy)。

此外，在人类环境中，在临床I期研究中评估具有以下特征的患有弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和套细胞淋巴瘤的B-NHL患者：i)具有多药耐药性的患者，ii)不具有进行同种异体干细胞移植的条件的患者，iii)具有不适于进行进一步化学疗法的共病的患者，iv)不耐受化学疗法的老年患者，v)进行性疾病出现和多线的其他标准护理疗法失败后进行挽救疗法的患者，vi)自体干细胞移植后出现进行性疾病的患者，vii)同种异体干细胞移植后出现进行性疾病的患者，viii)作为同种异体干细胞移植前的桥接疗法，ix)在肿瘤细胞上表现出逃逸变体或CD19和/或CD20突变体的患者，使得目前的抗体疗法(抗CD20、利妥昔单抗、抗CD19、欧来吐单抗(Oletuzumab)、BITE CD19/CD3、博纳吐单抗(Blimatumomab))或抗CD19 CAR疗法已经丢失/下调它们的靶结构而变得无效。

本发明的另一个令人惊讶的方面是本文公开的CAR的稳定性改善。CAR多肽可以在适当的条件下容易地长时间储存而不损失任何结合亲和力。

嵌合抗原受体：

CAR由衍生自抗体的细胞外胞外域和包含衍生自T细胞信号传导蛋白的信号传导模块的胞内域组成。在一种优选实施方式中，胞外域优选包含来自免疫球蛋白的重链和轻链的可变区，其被构建为单链可变片段(scFv)。scFv优选连接到铰链区，该铰链区提供灵活性并通过锚定跨膜部分将信号转导至胞内信号传导域。跨膜域优选源自CD8α或CD28。在第一代CAR中，信号传导域由TCR复合物的ζ链组成。术语“代”是指胞内信号传导域的结构。第二代CAR配备有源自CD28或4-1BB的单一共刺激域。第三代CAR已经包括两个共刺激域，例如CD28、4-1BB、ICOS或OX40、CD3ζ。本发明优选涉及第二代或第三代CAR。

在各种实施方式中，提供了将免疫效应细胞的细胞毒性重定向至B细胞的基因工程受体。这些基因工程受体在本文中称为嵌合抗原受体(CAR)。CAR是将针对期望抗原(例如BCMA)的基于抗体的特异性与活化T细胞受体的胞内域组合以产生表现出特异性抗BCMA细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。如本文所用，术语“嵌合”描述由来自不同来源的不同蛋白质或DNA的部分组成。

本文考虑的CAR包括结合BCMA的胞外域(也称为结合域或抗原结合域)、跨膜域、和胞内域或胞内信号传导域。CAR的抗BCMA抗原结合域与靶细胞表面上的BCMA的结合导致CAR的聚集并向含有CAR的细胞递送活化刺激。CAR的主要特征是它们能够重定向免疫效应细胞特异性，从而触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用或产生能够以主要组织相容性(MHC)的独立方式介导靶抗原表达细胞的细胞死亡的分子，以及开发单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性共受体的细胞特异性靶向能力。

在各种实施方式中，CAR包含含有人源化BCMA特异性结合域的胞外结合域；跨膜域；一个或多个胞内信号传导域。在特别的实施方式中，CAR包含含有人源化抗-BCMA抗原结合片段的胞外结合域；一个或多个间隔区域；跨膜域；一个或多个胞内信号传导域。

“胞外抗原结合域”或“胞外结合域”可互换使用，并为CAR提供特异性结合感兴趣的靶抗原BCMA的能力。结合域可以衍生自天然、合成、半合成或重组来源。优选的是scFV结构域。

“特异性结合”应如本领域技术人员所理解，由此技术人员清楚地知道可用于测试结合和结合特异性的各种实验方法。确定平衡缔合或平衡解离常数的方法是本领域已知的。在许多蛋白质-蛋白质相互作用中，一些交叉反应或背景结合可能是不可避免的；这并不减损CAR和表位之间结合的“特异性”。“特异性结合”描述了抗-BCMA抗体或其抗原结合片段(或包含它们的CAR)与BCMA的结合，其结合亲和力高于背景结合。当理解抗体和表位之间的相互作用而考虑术语“特异性”时，术语“针对(directed against)”也是适用的。

“抗原(Ag)”是指可以在动物中刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质。在特别的实施方式中，靶抗原是BCMA多肽的表位。“表位”是指与结合剂结合的抗原区域。表位可以由连续氨基酸形成，或者由蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH域和VL域，其中这些结构域以单一多肽链且以任一方向存在(例如，VL-VH或VH-VL)。通常，scFv多肽还包含VH域和VL域之间的多肽接头，该多肽接头使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。在优选的实施方式中，本文考虑的CAR包含抗原特异性结合域，该抗原特异性结合域是scFv并且可以是鼠、人或人源化scFv。可以从对希望的靶标有特异性的杂交瘤的V区基因克隆单链抗体。在特别的实施方式中，抗原特异性结合域是结合人BCMA多肽的人源化scFv。适用于构建本文考虑的抗BCMACAR的可变重链的示例性实例包括但不限于SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列。适用于构建本文考虑的抗BCMA CAR的可变轻链的示例性实例包括但不限于SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列。

抗体和抗体片段：

CAR包含胞外抗原结合域，其包含结合B细胞成熟抗原(BCMA)多肽的抗体或抗体片段。因此，本发明的抗体或抗体片段包括但不限于多克隆、单克隆、双特异性、人、人源化或嵌合的抗体、单链片段(scFv)、单可变片段(ssFv)、单结构域抗体(例如来自纳米抗体的VHH片段)、Fab片段、F(ab′)2片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型抗体和表位结合片段或任何上述的组合，条件是它们保留本文所述CAR的相似结合特性，优选包含如本文所述的相应的CDR、或VH和VL区。微小抗体和多价抗体如双价抗体、三价抗体、四价抗体和五价抗体也可用于本发明的方法中。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类别(即IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类。因此，如本文所用，术语抗体还包括由本发明的CAR包含的抗体和抗体片段，其通过修饰完整抗体产生或使用重组DNA方法重新合成。

如本文所用，“抗体”通常是指由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。当使用术语“抗体”时，也可以认为是指“抗体片段”。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。已知基本免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体或二聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”(L)(约25kD)链和一条“重”(H)链(约50-70kD)。每条链的N末端限定了约100-110或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语“可变轻链”和“可变重链”分别指轻链和重链的这些可变区。任选地，抗体或抗体的免疫部分可以与带有其他蛋白的融合蛋白化学缀合成或表达为带有其他蛋白的融合蛋白。

本发明的CAR旨在结合哺乳动物，特别是人的蛋白质靶标。蛋白质名称的使用可以对应于蛋白质的小鼠或人类形式。

根据本公开的结合域多肽和CAR蛋白的亲和力可以使用常规技术容易地确定，例如通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定)、或通过结合关联、或通过使用标记配体的置换测定、或使用表面等离子共振装置(如Biacore)。

可以使用本领域已知的任何方法制备人源化抗体，该人源化抗体包含本发明抗体的一个或多个CDR或衍生自所述抗体的一个或多个CDR。例如，可以使用四个一般步骤来使单克隆抗体人源化。这些是：(1)确定起始抗体轻链和重链可变域的核苷酸和预测的氨基酸序列；(2)设计人源化抗体，即决定在人源化过程中使用哪个抗体框架区；(3)实际人源化方法/技术；和(4)人源化抗体的转染和表达。参见，例如，美国专利第4,816,567号；第5,807,715号；第5,866,692号；第6,331,415号；第5,530,101号；第5,693,761号；第5,693,762号；第5,585,089号；第6,180,370号；第5,225,539号；第6,548,640号。

术语人源化抗体意指免疫球蛋白的至少一部分框架区和任选的CDR区的一部分或其他参与结合的区域来源于或调整为人免疫球蛋白序列。小鼠单克隆抗体的人源化、嵌合或部分人源化形式可以例如通过重组DNA技术制备，从而偏离编码H和L链的小鼠和/或人基因组DNA序列或编码H和L链的cDNA克隆。通过重组DNA技术将非人抗体的CDR区与人恒定区连接，可以产生人源化形式的小鼠抗体(Queen等人，1989；WO 90/07861)。可供选择地，用于本发明方法的单克隆抗体可以是人单克隆抗体。人抗体可以例如使用噬菌体展示法来获得(WO 91/17271；WO 92/01047)。

如本文所用，人源化抗体还指非人(例如鼠、骆驼、美洲驼、鲨)抗体的形式，其是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)₂或抗体的其他抗原结合亚序列)。

如本文所用，人或人源化抗体或抗体片段是指具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体，和/或已经使用本领域已知的或本文公开的制备人抗体的任何技术制备。可以通过竞争性结合实验或其他方式选择人抗体或其片段，以具有与特定小鼠抗体相同的表位特异性。本发明的人源化抗体在很大程度上令人惊讶地共享小鼠抗体的有用的功能特性。人多克隆抗体也可以以用免疫原性剂免疫的人的血清的形式提供。任选地，这类多克隆抗体可以通过使用淀粉样纤维状多肽和/或非纤维状多肽或其片段作为亲和试剂的亲和纯化来浓缩。可以根据WO 99/60846中描述的技术从血清中获得单克隆抗体。

可变区和CDR

抗体的可变区是指单独的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区或其组合。重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)连接的四个框架区(FR)组成，所述三个互补决定区也称为高变区。每条链中的CDR由FR紧密靠近地保持在一起，并且与来自其他链的CDR一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成。

有许多可用于确定CDR的技术，例如基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat等人，免疫学蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，(第5版，1991，国立卫生研究院，Bethesda Md))；以及基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等人.(1997)J.Molec.Biol.273：927-948)。可供选择的方法包括IMGT国际ImMunoGeneTics信息系统(Marie-Paule Lefranc)。Kabat定义基于序列可变性，并且是最常用的方法。Chothia定义基于结构环区域的位置，其中AbM定义是对牛津分子的AbM抗体建模软件所使用的两者之间的折衷(参见www.bioinf.org.uk：Dc Andrew CR Martin组)。如本文所用，CDR可以指通过一种或多种方法，或通过这些方法的组合定义的CDR。

在一些实施方式中，本发明提供并入CAR的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含与本发明的抗体的至少一个CDR、至少两个、至少三个或更多个CDR基本上相同的至少一个CDR、至少两个、至少三个或更多个CDR。其他实施方式包括具有至少两个、三个、四个、五个或六个CDR的抗体，该至少两个、三个、四个、五个或六个CDR与本发明的抗体的至少两个、三个、四个、五个或六个CDR基本上相同或衍生自本发明的抗体的抗体。在一些实施方式中，所述至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR与本发明的抗体的至少一个、两个或三个CDR至少约70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。应当理解，出于本发明的目的，通常保留结合特异性和/或总体活性，尽管活性程度与所述抗体相比可以变化(可以更大或更小)。

CAR的其他组件

在某些实施方式中，本文考虑的CAR可以包含为了分子的适当间隔和构象而添加的在各个域之间的接头残基，例如包含氨基酸序列的接头，其连接VH域和VL域并提供与两个亚结合域的相互作用相容的间隔区功能，使得所得多肽保持对与包含相同轻链和重链可变区的抗体相同的靶分子的特异性结合亲和力。本文考虑的CAR可包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个接头。在特别的实施方式中，接头的长度为约1至约25个氨基酸、约5至约20个氨基酸、或约10至约20个氨基酸、或任何介入长度的氨基酸。

接头的示例性实例包括甘氨酸聚合物；甘氨酸-丝氨酸聚合物；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；本领域已知的其他柔性接头，例如惠特洛接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以作为融合蛋白的域(例如本文所述的CAR)之间的中性系链。

在特别的实施方式中，CAR的结合域之后是一个或多个“间隔区”或“间隔区多肽”，其是指使抗原结合区远离效应细胞表面以使细胞/细胞能够适当接触、抗原结合和活化的区域。在某些实施方式中，间隔区域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区，例如CH2和CH3。间隔区域可包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。在一种实施方式中，间隔区域包括IgG1或IgG4的CH2和CH3结构域。

在一些实施方式中，CAR的结合域之后可以是一个或多个“铰链域”，其在将抗原结合域定位到远离效应细胞表面中起作用，以使得细胞/细胞能够适当接触、抗原结合和活化。CAR可以在结合域和跨膜域(TM)之间包含一个或多个铰链域。铰链域可以衍生自天然、合成、半合成或重组来源。铰链域可包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。适用于本文所述CAR的示例性铰链域包括衍生自1型膜蛋白(例如CD8α、CD4、CD28、PD1、CD152和CD7)的胞外区的铰链区，它们可以是来自这些分子的野生型铰链区，或可以是改变的。在另一种实施方式中，铰链域包含PD1、CD152或CD8α铰链区。

“跨膜域”是CAR的一部分，其融合胞外结合部分和胞内信号传导域并将CAR锚定在免疫效应细胞的质膜上。TM域可以衍生自天然、合成、半合成或重组来源。TM域可以衍生自T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和PD1。在一种实施方式中，本文考虑的CAR包含衍生自CD8α或CD28的TM结构域。

在特别的实施方式中，本文考虑的CAR包含胞内信号传导域。“胞内信号传导域”是指参与将有效的抗BCMA CAR与人BCMA多肽结合的信息转导到免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能(例如活化、产生细胞因子、增殖和细胞毒活性，所述细胞毒活性包括向CAR所结合的靶细胞释放细胞毒性因子)或由抗原结合胞外CAR域引发的其他细胞反应。术语“效应功能”是指免疫效应细胞的特化功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或包括细胞因子分泌在内的帮助或活性。术语“胞内信号传导域”是指蛋白质中转导效应功能信号并指导细胞执行特化功能的部分。

本文考虑的CAR包含一个或多个共刺激信号传导域，以增强表达CAR受体的T细胞的功效、扩增和/或记忆形成。如本文所用，术语“共刺激信号传导域”是指共刺激分子的胞内信号传导域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体之外的细胞表面分子，其提供在与抗原结合后T淋巴细胞的有效活化和功能所需的第二信号。

多肽

“肽”、“多肽”、“多肽片段”和“蛋白质”可互换使用，除非有相反的说明，并且根据常规含义，即作为氨基酸序列使用。多肽不限于特定长度，例如，它们可以包含全长蛋白质序列或全长蛋白质的片段，并且可以包括多肽的翻译后修饰(例如糖基化、乙酰化、磷酸化等)以及包括天然存在的和非天然存在的本领域已知的其他修饰。

在各种实施方式中，本文考虑的CAR多肽包含在蛋白质N末端的在共翻译或翻译后指导蛋白质转移的信号(或前导区)序列。可以使用各种熟知的重组和/或合成技术制备多肽。本文考虑的多肽具体包括本公开的CAR，或具有对本文公开的CAR的一个或多个氨基酸缺失、添加和/或替换的序列。

如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指从细胞环境或从与细胞的其他组件的结合(即它与体内物质没有显著关联)将肽或多肽分子体外分离和/或纯化。类似地，“分离的细胞”是指从体内组织或器官获得并且基本上不含胞外基质的细胞。

核酸

如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)或重组DNA。多核苷酸包括单链和双链多核苷酸。优选地，本发明的多核苷酸包括与本文所述的任何参考序列具有至少约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性的多核苷酸或变体，通常其中变体保持参考序列的至少一种生物学活性。在各种示例性实施方式中，本发明部分地考虑了包含表达载体、病毒载体和转移质粒的多核苷酸，以及包含其的组合物和细胞。

可以使用本领域已知和可获得的各种成熟技术中的任何一种来制备、操作和/或表达多核苷酸。为了表达所希望的多肽，可以将编码多肽的核苷酸序列插入合适的载体中。载体的实例是质粒、自主复制序列和转座元件。另外的示例性载体包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体(例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC))、噬菌体(例如λ噬菌体或M13噬菌体)和动物病毒。作为载体有用的动物病毒类别的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如SV40)。表达载体的实例是用于在哺乳动物细胞中表达的pClneo载体(Promega)；用于在哺乳动物细胞中进行慢病毒介导的基因转移和表达的pLenti4/V5-DEST^TM、pLenti6/V5-DEST^TM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)。在特别的实施方式中，本文公开的嵌合蛋白的编码序列可以连接到用于在哺乳动物细胞中表达嵌合蛋白的这类表达载体中。存在于表达载体中的“控制元件”或“调节序列”是载体的非翻译区(即复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(ShineDalgarno序列或Kozak序列)内含子、多腺苷酸化序列、5′和3′非翻译区)，其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。这类元件的强度和特异性可以不同。取决于所用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括泛在启动子和诱导型启动子。

载体

在特别的实施方式中，用编码CAR的逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)转导细胞(例如，免疫效应细胞，例如T细胞)。例如，用编码CAR的载体转导免疫效应细胞，所述载体包含结合BCMA多肽的人源化抗BCMA抗体或抗原结合片段，所述人源化抗BCMA抗体或抗原结合片段具有跨膜域和胞内信号传导域，使得这些经转导的细胞可以引发CAR介导的细胞毒性反应。

逆转录病毒是基因传递的常用工具。在特别的实施方式中，逆转录病毒用于将编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸递送至细胞。如本文所用，术语“逆转录病毒”是指一种RNA病毒，其逆转录其基因组RNA为线性双链DNA拷贝，随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。一旦病毒被整合到宿主基因组中，它就被称为“原病毒”。原病毒作为RNA聚合酶II的模板，并指导RNA分子的表达，所述RNA分子编码产生新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶。

适用于特别的实施方式的示例性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗里德鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯氏肉瘤病毒(RSV))和慢病毒。

如本文所用，术语“慢病毒”是指复杂逆转录病毒的组(或属)。示例性慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)；维斯那-梅迪病毒(visna-maedivirus，VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一种实施方式中，基于HIV的载体骨架(即HIV顺式作用序列元件)是优选的。在特别的实施方式中，慢病毒用于将包含CAR的多核苷酸递送至细胞。

术语“载体”在本文中用于指能够转移或转运另一种核酸分子的核酸分子。转移的核酸通常与载体核酸分子连接，例如插入载体核酸分子中。载体可以包括指导细胞中自主复制的序列，或者可以包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包括，例如，质粒(例如DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。

对于本领域技术人员显而易见的是，术语“病毒载体”广泛用于指核酸分子(例如转移质粒)或介导核酸转移的病毒颗粒，核酸分子包括病毒衍生的通常促进核酸分子转移或整合到细胞基因组中的核酸元件。病毒颗粒通常包括各种病毒组件，有时还包括除核酸外的宿主细胞组件。

术语病毒载体可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或被转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要衍生自病毒的结构和/或功能遗传元件。术语“逆转录病毒载体”是指主要来源于逆转录病毒的含有结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。

因此，在优选实施方式中，本发明涉及用编码CAR的表达载体转染细胞的方法。例如，在一些实施方式中，载体包含额外的序列，例如促进CAR表达的序列，例如启动子、增强子、poly-A信号和/或一个或多个内含子。在优选的实施方式中，CAR编码序列的侧翼是转座子序列，使得存在转座酶以允许编码序列整合到转染细胞的基因组中。

在一些实施方式中，用转座酶进一步转染遗传转化的细胞，所述转座酶促进CAR编码序列整合到转染细胞的基因组中。在一些实施方式中，转座酶作为DNA表达载体提供。然而，在优选的实施方式中，转座酶作为可表达的RNA或蛋白质提供，使得转座酶不在转基因细胞中发生长期表达。例如，在一些实施方式中，转座酶作为mRNA提供(例如，包含帽和poly-A尾的mRNA)。可以根据本发明的实施方式使用任何转座酶系统。然而，在一些实施方式中，转座酶是鲑鱼型Tel样转座酶(SB)。例如，转座酶可以是所谓的“睡美人”转座酶，参见例如美国专利6,489,458，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，转座酶是具有增加的酶活性的工程化酶。转座酶的一些具体实例包括但不限于SB 10、SB 11或SB 100X转座酶(参见，例如，Mates等人，2009，Nat Genet.41(6)：753-61或US9228180，其通过引用并入本文)。例如，方法可以包括对具有编码SB 10、SB 11或SB 100X转座酶的mRNA的细胞进行电穿孔。

序列变体：

所要求保护的核酸、蛋白质、抗体、抗体片段和/或CAR的序列变体(例如由百分比序列同一性限定的那些)也包括在本发明的范围内，其维持本发明的类似结合特性。这些变体显示了替代序列，但保持基本相同的结合特性例如靶特异性，因为所提供的特定序列已知是功能类似物或功能上的类似物。序列同一性涉及进行序列比对时相同核苷酸或氨基酸的百分比。

本文所用的叙述“序列同一性”是指在比较窗口上基于核苷酸-核苷酸或基于氨基酸-氨基酸的序列相同的程度。因此，可以通过以下来计算“序列同一性的百分比”：在比较窗口上比较两个最佳比对序列，确定两个序列上存在相同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、He、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数量来产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数量(即窗口大小)，以及将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。包括了具有与本文所述的任何参考序列至少约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性的核苷酸或多肽，通常其中多肽变体保持参考多肽的至少一种生物学活性。

本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码如本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性或序列同一性。尽管如此，本发明特别考虑了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸。落入所述序列同一性的序列中的缺失、替换和其他变化也包括在本发明中。

可通过替换发生的蛋白质序列修饰也包括在本发明的范围内。如本文所定义的替换是对蛋白质的氨基酸序列进行的修饰，借此，一个或多个氨基酸被相同数量的(不同的)氨基酸替换，从而产生含有与初级蛋白质不同的氨基酸序列的蛋白质。可以进行替换，其优选不显著改变蛋白质的功能。与添加一样，替换可以是天然的或人为的。本领域熟知的是，可以在不显著改变蛋白质功能的情况下进行氨基酸替换。当修饰涉及用一种氨基酸替换另一种具有相似性质的氨基酸的“保守性”氨基酸替换时，尤其如此。这类“保守性的”氨基酸可以是天然或合成的氨基酸，其由于大小、电荷、极性和构象而可被替换但不会显著影响蛋白质的结构和功能。通常，许多氨基酸可被保守性氨基酸替换而不会有害地影响蛋白质的功能。

一般来说，非极性氨基酸Gly、Ala、Val、Ile和Leu；非极性芳香族氨基酸Phe、Trp和Tyr；中性极性氨基酸Ser、Thr、Cys、Gln、Asn和Met；带正电荷的氨基酸Lys、Arg和His；带负电荷的氨基酸Asp和Glu代表保守性氨基酸组。这份清单并非穷举。例如，熟知的是，Ala、Gly、Ser和有时Cys可以相互替代，即使它们属于不同的组。

替代变体在抗体分子中除去至少一个氨基酸残基，并在其位置上插入不同的残基。对于替代诱变的发生，最感兴趣的位置包括高变区，但也考虑了FR改变。如果这样的替代导致生物活性的变化，则可以引入更大量的改变(在下表中称为“示例性替换”，或如下文关于氨基酸类别所进一步描述)，并筛选产物。

潜在的氨基酸替换：

对抗体的生物学性质的实质性修饰通过选择在维持如下几方面的作用显著不同的替换来实现：(a)替换的区域中多肽骨架的结构(例如，片状或螺旋构象)、(b)靶位点处分子的电荷或疏水性、或(c)侧链的主体。

保守性氨基酸替换不限于天然存在的氨基酸，还包括合成氨基酸。常用的合成氨基酸是作为中性非极性类似物的各种链长的ω氨基酸和环己基丙氨酸；作为中性非极性类似物的瓜氨酸和甲硫氨酸亚砜，作为芳香族中性类似物的苯基甘氨酸；作为带负电荷的类似物的半胱磺酸和作为带正电荷的氨基酸类似物的鸟氨酸。与天然存在的氨基酸一样，该列表并非穷举，而仅仅是本领域熟知的替换的示例。

基因修饰基因细胞和免疫细胞

在特别的实施方式中，本发明考虑遗传修饰以表达本文考虑的CAR的细胞，以用于治疗B细胞相关病症。如本文所用，术语“经遗传改造的”或“经遗传修饰的”是指将DNA或RNA形式的另外的遗传物质添加到细胞中的总遗传物质中。术语“经遗传修饰的细胞”、“经修饰的细胞”和“重定向的细胞”可互换使用。如本文所用，术语“基因疗法”是指将DNA或RNA形式的另外的遗传物质引入细胞中的总遗传物质中，其恢复、修正或修饰基因的表达，或用于表达治疗性多肽(例如CAR)。在特别的实施方式中，本文考虑的CAR被引入免疫效应细胞并在免疫效应细胞中表达，以便重定向它们对感兴趣的靶抗原、例如BCMA多肽的特异性。

“免疫细胞”或“免疫效应细胞”是免疫系统的任何细胞，其具有一种或多种效应功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子分泌、ADCC和/或CDC的诱导)。

本发明的免疫效应细胞可以是自体/自身的(autologous/autogeneic)(“自己的”)或非自体的(“非自己的”，例如同种异体的、同基因的或异基因的)。如本文所用，“自体的”是指来自相同受试者的细胞，代表本发明的优选实施方式。如本文所用，“同种异体的”是指与相比较的为相同物种但在遗传上不同的细胞。如本文所用，“同基因的”是指在遗传上与相比较的细胞相同的不同受试者的细胞。如本文所用，“异基因的”是指物种与相比较的细胞不同的细胞。在优选的实施方式中，本发明的细胞是自体的或同种异体的。

与本文考虑的CAR一起使用的示例性免疫效应细胞包括T淋巴细胞。术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的并且旨在包括胸腺细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)或活化的T淋巴细胞。细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞通常是CD3-和CD56-阳性的非主要组织相容性复合物(MHC)，其是限制性的自然杀伤(NK)样T淋巴细胞。T细胞可以是T帮手细胞(Th)，例如T帮手细胞1(Th1)或T帮手细胞2(Th2)。T细胞可以是帮手T细胞(HTL；CD4+T细胞)CD4+T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4 CD8 T细胞或任何其他T细胞亚群。适用于特别的实施方式的其他示例性T细胞群包括初始T细胞和记忆T细胞。

例如，当在自体细胞移植后重新引入回患者时，用本文所述的本发明的CAR修饰的T细胞可识别并杀死肿瘤细胞。与其他T细胞相比，CIK细胞可具有增强的细胞毒活性，因此其代表本发明免疫细胞的优选实施方式。

如技术人员所理解的，其他细胞也可以用作具有本文所述的CAR的免疫效应细胞。特别地，免疫效应细胞还包括NK细胞、NKT细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。免疫效应细胞还包括效应细胞的祖细胞，其中可以在体内或体外诱导这类祖细胞分化成免疫效应细胞。

本发明提供了制备表达本文考虑的CAR的免疫效应细胞的方法。在一种实施方式中，该方法包括转染或转导从个体分离的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达如本文所述的一种或多种CAR。在某些实施方式中，免疫效应细胞从个体分离并经遗传修饰而无需在体外进一步操作。然后可以将这些细胞直接再次施用于个体。在进一步的实施方式中，首先活化免疫效应细胞并刺激其在体外增殖，然后将其进行遗传修饰以表达CAR。在这方面，免疫效应细胞可以在遗传修饰(即转导或转染以表达本文考虑的CAR)之前和/或之后培养。

在特别的实施方式中，在本文所述的免疫效应细胞的体外操作或遗传修饰之前，从受试者获得细胞来源。在特别的实施方式中，CAR修饰的免疫效应细胞包含T细胞。T细胞可以从许多来源获得，包括但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在某些实施方式中，T细胞可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术、例如沉降(例如FICOLL^TM分离)、基于抗体缀合珠的方法(例如MACS^TM分离(Miltenyi))，从受试者采集的血液单位获得。在一种实施方式中，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采血液成分产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一种实施方式中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于后续处理。可以用PBS或另一种合适的溶液洗涤细胞，所述溶液缺乏钙、镁和大多数(如果不是全部的话)二价阳离子。如本领域普通技术人员所理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，例如通过使用半自动流通式离心机(例如Cobe2991细胞处理器、Baxter CytoMate等)进行。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液或具有或不具有缓冲液的其他盐水溶液中。在某些实施方式中，可以在直接重悬于培养基的细胞中除去单采血液成分样品的不希望的组分。

在某些实施方式中，通过裂解红细胞和耗尽单核细胞(例如通过PERCOLL^TM梯度离心)，从外周血单核细胞(PBMC)分离T细胞。可以通过正或负选择技术进一步分离特定的T细胞亚群。本文使用的一种方法是通过使用单克隆抗体混合物的负磁免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述单克隆抗体混合物针对于负选择的细胞上存在的细胞表面标志物。

可以使用本文考虑的方法直接遗传修饰PBMC以表达CAR。在某些实施方式中，在分离PBMC后，进一步分离T淋巴细胞，并且在某些实施方式中，细胞毒性和帮手T淋巴细胞可以在遗传修饰和/或扩增之前或之后分选为初始、记忆和效应T细胞亚群。CD8+细胞可以通过使用标准方法获得。在一些实施方式中，通过鉴定与这些类型的CD8+细胞中的每一种相关的细胞表面抗原，将CD8+细胞进一步分选为初始、中枢记忆和效应细胞。

免疫效应细胞(例如T细胞)可以在使用已知方法分离后进行遗传修饰，或者免疫效应细胞可以在进行遗传修饰之前在体外活化和扩增(或在祖细胞的情况下分化)。在特别的实施方式中，免疫效应细胞(例如T细胞)用本文考虑的嵌合抗原受体进行遗传修饰(例如，用包含编码CAR的核酸的病毒载体转导)，然后在体外活化和扩增。在各种实施方式中，可以使用例如美国专利第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；和美国专利申请公开第20060121005号中所述的方法，在经遗传修饰以表达CAR之前或之后激活和扩增T细胞。

在另一种实施方式中，例如，一种，两种，三种，四种，五种或更多种不同表达载体的混合物可以用于遗传修饰免疫效应细胞的供体群，其中每种载体编码如本文考虑的不同的嵌合抗原受体蛋白质。得到的修饰的免疫效应细胞形成修饰细胞的混合群，其中一部分修饰细胞表达多于一种的不同CAR蛋白。

在一种实施方式中，本发明提供了一种储存靶向BCMA蛋白的表达经遗传修饰的鼠、人或人源化CAR蛋白的免疫效应细胞的方法，包括冷冻保存免疫效应细胞，使得细胞在解冻时保持存活。一部分表达CAR蛋白的免疫效应细胞可以通过本领域已知的方法冷冻保存，以提供这种细胞的永久来源，用于将来治疗患有B细胞相关病症的患者。需要时，可以使冷冻保存的转化免疫效应细胞解冻、生长和扩增以获得更多这样的细胞。

组合物和制剂

本文考虑的组合物可包含如本文所考虑的一种或多种多肽、多核苷酸、包含该多核苷酸的载体、经遗传修饰的免疫效应细胞等。组合物包括但不限于药物组合物。“药物组合物”是指在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中配制的组合物，其单独或与一种或多种其他治疗方式组合施用于细胞或动物。还应理解，如果需要，本发明的组合物也可以与其他药剂组合施用，例如细胞因子、生长因子、激素、小分子、化学治疗剂、前药、药物、抗体或其他各种药物活性剂。对组合物中还可包含的其它组分实际上没有限制，条件是额外的组分不会不利地影响组合物递送预期疗法的能力。

术语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症并且与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文所用，“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于已经由美国食品和药品管理局批准可用于人或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。示例性的药学上可接受的载体包括但不限于糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂，蜡，动植物油脂，石蜡，有机硅，膨润土，硅酸，氧化锌；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；以及药物制剂中使用的任何其他相容性物质。

在特别的实施方式中，本发明的组合物包含一定量的本文考虑的表达CAR的免疫效应细胞。如本文所用，术语“量”是指实现有益或所希望的预防或治疗结果(包括临床结果)的经遗传修饰的治疗细胞(例如T细胞)的“有效量(an amount effective/aneffective amount)”。

“预防有效量”是指有效实现所希望的预防结果的经遗传修饰的治疗细胞的量。通常但不是必须的，因为预防剂量在受试者中用于疾病之前或疾病的早期阶段，所以预防有效量小于治疗有效量。术语预防不一定是指完全禁止或防止特定的医学病症。术语预防还指降低某种医学病症发生或症状恶化的风险。

经遗传修饰的治疗细胞的“治疗有效量”可以根据各种因素而变化，所述因素例如疾病状态、年龄、性别和个体体重，以及干细胞和祖细胞在个体中引发所希望的反应的能力。治疗有效量也是这样的量，即，治疗有益效果超过病毒或转导的治疗细胞的任何毒性或有害作用。术语“治疗有效量”包括有效“治疗”受试者(例如患者)的量。当指示治疗量时，可以由医生在考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度和患者(受试者)状况的个体差异的情况下确定待施用的本发明组合物的精确量。可以通常规定的是，包含本文所述T细胞的药物组合物可以以10²至10¹⁰个细胞/kg体重，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括在这些范围内的所有整数值)来施用。细胞的数量将取决于组合物的最终用途以及其中包含的细胞类型。对于本文提供的用途，细胞通常为1L或更少的体积，可以为500mL或更少，甚至250mL或100mL或更少。因此，所希望细胞的密度通常大于10⁶个细胞/ml，通常大于10⁷个细胞/ml，通常为10⁸个细胞/ml或更高。免疫细胞的临床相关数量可以分配成多次输注，该多次输注累积等于或超过10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²个细胞。在本发明的一些方面，特别是因为所有输注的细胞将被重定向至特定的靶抗原，可以施用较低数量的细胞。表达CAR的细胞组合物可以在这些范围内的剂量下多次施用。对于接受治疗的患者，细胞可以是同种异体的、同基因的、异基因的或自体的。

通常，包含如本文所述活化和扩增的细胞的组合物可用于治疗和防止免疫受损个体中出现的疾病。特别地，包含本文考虑的经CAR修饰的T细胞的组合物用于治疗B细胞恶性肿瘤。本发明的经CAR修饰的T细胞可以单独施用，或作为药物组合物与载体、稀释剂、赋形剂和/或与其他组分(例如IL-2)或其他细胞因子或细胞群组合施用。在特别的实施方式中，本文考虑的药物组合物包含一定量的经遗传修饰的T细胞，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

包含表达CAR的免疫效应细胞群(例如T细胞)的本发明药物组合物可包含：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸(例如甘氨酸)；抗氧化剂；螯合剂(例如EDTA)或谷胱甘肽；佐剂，例如氢氧化铝；和防腐剂。优选配制本发明的组合物用于肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌肉内施用。

液体药物组合物无论是溶液、悬浮液或其他类似形式，可包括以下中的一种或多种：无菌稀释剂(例如注射用水)、盐水溶液(优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠)、固定油(例如可用作溶剂或悬浮介质的合成单甘油酯或甘油二酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和调节紧张性(tonicity)的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选是无菌的。

在特别的实施方式中，本文考虑的组合物包含单独的有效量的表达CAR的免疫效应细胞，或其与一种或多种治疗剂的组合。因此，表达CAR的免疫效应细胞组合物可以单独施用或与其他已知的癌症治疗组合施用，所述其他已知的癌症治疗例如放射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等。组合物也可以与抗生素组合施用。本领域可接受这类治疗剂作为如本文所述的特定疾病状态(例如特定癌症)的标准治疗。考虑的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎剂、化学治疗剂、放射治疗剂、治疗性抗体或其他活性和辅助性药剂。

治疗方法

本文考虑的经遗传修饰的免疫效应细胞提供用于治疗B细胞相关病症的过继免疫疗法的改进方法，所述B细胞相关病症包括但不限于免疫调节病症和血液学恶性肿瘤。

在特别的实施方式中，包含含有本文考虑的CAR的免疫效应细胞的组合物用于治疗与异常B细胞活性相关的病症，也称为“与致病性B细胞的存在相关的医学病症”。

如本文所用，“与致病性B细胞的存在相关的医学病症”或“B细胞恶性肿瘤”是指在B细胞中形成的医学病症，例如癌症。在特别的实施方式中，本文考虑的包含经CAR修饰的T细胞的组合物用于治疗恶性血液病，包括但不限于B细胞恶性肿瘤，例如多发性骨髓瘤(MM)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。

在本发明的另一个方面，提供了如本文所述的根据本发明的CAR和CAR-T，其用于治疗选自以下的由B细胞介导的或浆细胞介导的疾病或抗体介导的疾病或病症：多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非分泌性多发性骨髓瘤、郁积型多发性骨髓瘤、意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、孤立性浆细胞瘤(骨、髓外)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s Macroglobulinemia)、浆细胞白血病、原发性淀粉样变性(AL)、重链疾病、系统性红斑狼疮(SLE)、POEMS综合征/骨硬化性骨髓瘤、I型和II型冷球蛋白血症、轻链沉积病、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture′ssyndrome)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、急性肾小球肾炎、天疱疮和类天疱疮病症、以及大疱性表皮松解症；或任何具有BCMA表达的非霍奇金淋巴瘤B细胞白血病或霍奇金淋巴瘤(HL)或患者产生针对重组蛋白替代疗法的中和抗体的任何疾病，其中所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的如本文所述的CAR或CAR-T。

多发性骨髓瘤是成熟浆细胞形态的B细胞恶性肿瘤，其特征在于这些类型细胞的单个克隆的肿瘤转化。这些浆细胞在BM中增殖并且可能侵入邻近的骨骼，有时侵入血液。多发性骨髓瘤的变异形式包括显性多发性骨髓瘤(overt multiple myeloma)、郁积型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤。

非霍奇金淋巴瘤包括一大群的淋巴细胞癌(白血细胞)。非霍奇金淋巴瘤可以在任何年龄发生，并且通常以比正常时更大的淋巴结、发热和体重减轻为标记。非霍奇金淋巴瘤也可存在于结外部位，例如中枢神经系统、粘膜组织，包括肺、肠、结肠和内脏。有许多不同类型的非霍奇金淋巴瘤。例如，非霍奇金淋巴瘤可分为侵袭性(快速生长)和惰性(慢性生长)类型。尽管非霍奇金淋巴瘤可以源自B细胞和T细胞，如本文所用，术语“非霍奇金淋巴瘤”和“B细胞非霍奇金淋巴瘤”可互换使用。B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞型大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。骨髓或干细胞移植后发生的淋巴瘤通常是B细胞非霍奇金淋巴瘤。

慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种惰性(缓慢生长)癌症，其导致被称为B淋巴细胞或B细胞的未成熟白血细胞缓慢增加。癌细胞通过血液和骨髓扩散，并且也可以影响淋巴结或其他器官，如肝脏和脾脏。CLL最终导致骨髓衰竭。该疾病的不同呈现被称为小淋巴细胞淋巴瘤，并且主要定位于次级淋巴器官，例如淋巴结和脾。

在本发明的一种实施方式中，CAR或表达所述CAR的免疫细胞旨在用于治疗自身免疫疾病，优选自身抗体依赖性自身免疫疾病，优选具有炎性组分的自身免疫疾病，其中自身免疫疾病是优选选自以下的疾病：高安氏动脉炎、巨细胞动脉炎、家族性地中海热、川崎病、结节性多动脉炎、皮肤结节性多动脉炎、肝炎相关动脉炎、贝切特综合征(Behcet’ssyndrome)、韦格氏肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)、ANCA血管炎、丘-施二氏综合征(Churg-Strauss syndrome)、显微镜下多血管炎、结缔组织病血管炎、Hennoch-紫癜、冷球蛋白血管炎、皮肤白细胞破碎性脉管炎、热带性主动脉炎、结节病、柯根综合征(Cogan’s syndrome)、威斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich Syndrome)、麻风结节动脉炎、CNS原发性脉管炎、闭塞性血栓性血管炎、副肿瘤性动脉炎(Paraneoplasticateritis)、荨麻疹、德高病(Dego’s disease)、骨髓增生异常综合征、持久性隆起性红斑、高免疫球蛋白D、过敏性鼻炎、支气管哮喘、慢性阻塞性肺病、牙周炎、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、淀粉样变性、科隆病(Morbus Chron)、溃疡性结肠炎、自身免疫性肌炎、糖尿病、格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome)、组织细胞增生症、骨关节炎、特应性皮炎、牙周炎、慢性鼻窦炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、显微镜结肠炎、肺纤维化、肾小球肾炎、惠普耳氏病(Whipple′s disease)、斯提耳氏病(Still′s disease)、结节性红斑、耳炎、冷球蛋白血症、干燥综合征(Sjogren′s syndrome)、红斑狼疮(优选系统性红斑狼疮(SLE))、再生障碍性贫血、骨髓纤维化、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、木村氏病、系统性硬化症、慢性织脉周炎、慢性前列腺炎、特发性肺纤维化、慢性肉芽肿性疾病、特发性失弛缓症、博来霉素诱导的肺部炎症、阿糖胞苷诱导的肺部炎症、自身免疫性血小板减少、自身免疫性嗜中性粒细胞减少、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性淋巴细胞减少症、恰加斯氏病、慢性自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性肝炎、桥本氏甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎、格雷夫斯病(Gravesdisease)、自身免疫性多腺体综合征、自身免疫性阿狄森综合征、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、疱疹样皮炎、自身免疫性秃头症、白癜风、抗磷脂综合征、重症肌无力、僵硬综合征(Stiff-man syndrome)、古德帕斯彻氏综合征、交感性眼炎、毛囊炎、夏普综合征(Sharpsyndrome)和/或伊文综合征(Evans syndrome)，特别是枯草热、牙周炎、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎，最优选SLE。

系统性红斑狼疮(SLE)也称为狼疮，是一种身体的免疫系统攻击身体各部位的健康组织的自身免疫性疾病。症状因人而异，可能从轻微到严重。常见症状包括关节疼痛和肿大、发热、胸痛、脱发、口腔溃疡、淋巴结肿大、感觉疲劳，以及最常见于脸上的红色皮疹。

如本文所用，术语“个体”和“受试者”通常可互换使用，并且是指可以用本文别处公开的基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和方法治疗的表现出疾病、病症或病况的症状的任何动物。在优选的实施方式中，受试者包括可以用本文别处公开的基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和方法治疗的表现出造血系统的疾病、病症或病况(例如B细胞恶性肿瘤)的症状的任何动物。典型的受试者包括实验动物(例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物(例如猫或狗)。包括非人灵长类动物，优选包括人类患者。典型的受试者包括具有B细胞恶性肿瘤，已被诊断患有B细胞恶性肿瘤或处在具有B细胞恶性肿瘤的风险中的人类患者。

如本文所用，“治疗(treatment/treating)”包括对疾病或病理状况的症状或病理学的任何有益或期望的作用，并且可包括所治疗的疾病或病症的一种或多种可测量标记物的甚至最小的减少。治疗可任选地涉及疾病或病症的症状的减轻或改善，或疾病或病症的进展的延迟。“治疗”不一定表示完全根除或治愈疾病或病症或其相关症状。

如本文所用，“防止(prevent)”和类似的词语，例如“防止(prevented/preventing)”或“预防(prophylactic)”等，表示防止、抑制或降低疾病或病症发生或复发的可能性的方法。它还指延迟疾病或病症的发作或复发，或延迟疾病或病症的症状的发生或复发。如本文所用，“防止”和类似词语还包括在疾病或病症发作或复发之前降低疾病或病症的强度、影响、症状和/或负担。

在一种实施方式中，在有此需要的受试者中治疗B细胞相关病症的方法包括施用有效量、例如治疗有效量的包含本文考虑的经遗传修饰的免疫效应细胞的组合物。施用的数量和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重性等因素确定，尽管适当的剂量可以通过临床试验确定。

本文考虑的组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输血、植入或移植进行。在优选的实施方式中，肠胃外施用组合物。本文所用的短语“肠胃外施用(parenteral administration/administered parenterally)”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，包括但不限于血管内、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、瘤内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下腔、脊柱内和胸骨内注射和输注。在一种实施方式中，通过直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位而将本文考虑的组合物施用于受试者。

附图说明

通过本文公开的实施例和附图的示例说明本发明。本文提供的附图代表本发明的特别的实施方式，并不意图限制本发明的范围。这些附图应当被认为是对可能的和潜在优选的实施方式的进一步描述，这些实施方式增强了一个或多个非限制性实施方式的技术支持。

图1：优选的CAR结构的示意图。

图2：优选的CAR构建体IX、X；XI、XV、XVI、XVII的示意图。

图3：如本文所述的CAR的各种结构元件的优选构建体和潜在组合的列表。

图4：mAb结合区与本发明的CAR中使用的优选人源化序列之间的序列比较。

图5：具有BCMA-CAR序列的GeneArt^TM质粒。

图6：限制切割后构建体和载体的凝胶电泳。

图7：逆转录病毒转导后人T细胞上BCMA CAR表达的确认：CAR表达、构建体IX-XII、CD19、SP6。

图8：CAR转导的人T细胞与不同靶细胞系的共培养显示通过不同的BCMA⁺多发性骨髓瘤(MM)和B-NHL细胞系进行的特异性T细胞活化。功能性体外共培养和IFN-γELISA。

图9：共培养的CAR-T细胞与多发性骨髓瘤细胞的CD107a(LAMP1)染色：通过流式细胞术检测抗原特异性(BCMA)刺激后活化的脱粒CD8+T细胞。功能性体外共培养和LAMP1检测，通过FACS确定。

图10：细胞毒性分析揭示选择性杀伤BCMA阳性细胞系；在BCMA阴性细胞系中基本上未见杀伤。功能性体外共培养和51Cr释放测定。

图11：在功能性分析中评估的细胞类型上的BCMA和CD19表达。还显示了从PBMC分离基于MACS的B细胞的结果，以及抗BCMA和抗CD19染色。

图12：CAR的scFV与BCMA表位之间的结合相互作用的示意图。

图13：与J22.9-xi相比，HC的优选人源化序列的序列比对。

图14：与J22.9-xi相比，LC的优选人源化序列的序列比对。

图15：BCMA重定向的CAR-T细胞在异种移植的NSG小鼠模型中对MM肿瘤有效。(A)在异种移植的NSG小鼠模型中植入MM肿瘤。通过静脉内移植MM.1S细胞攻击小鼠。在肿瘤接种后第8天，通过IVIS成像可视化肿瘤细胞生长。为了测量肿瘤负荷，将成像延长至300秒(第-1天)。(B)遵循治疗效果并按比例减少生物发光强度以更好地呈现，如(A)中的小鼠在第-1天再次成像30秒。在30秒内完成CAR-T细胞转移后、对照SP6 CAR-T细胞(n＝4)和BCMA CAR-T细胞(n＝6)的后续IVIS曝光，以便对在第-1天和第17天之间哪天强度最高进行更好的比较。基于先进的疾病和动物保护法，动物通过催泪剂(White cross)处死。(C)在每个时间点针对每组绘制从覆盖每只小鼠的整个身体的感兴趣区域获得的生物发光信号强度的平均值。

图16：BCMA重定向的CAR-T细胞在异种移植的NSG小鼠模型中对B-NHL肿瘤有效。(A)在异种移植的NSG小鼠模型中植入套细胞淋巴瘤。通过静脉内移植6×10⁵个JeKo-1细胞来攻击小鼠。在肿瘤接种后第7天，通过IVIS成像可视化肿瘤细胞生长。IVIS曝光，120秒。(B)遵循治疗效果并按比例减少生物发光强度以更好地呈现，如(A)中的小鼠在第0天再次成像30秒。在30秒内完成CAR-T细胞转移后、对照SP6 CAR-T细胞(n＝7)和BCMA CAR-T细胞(n＝7)的后续IVIS曝光，以便对在第0天和第16天之间哪天强度最高进行更好的比较。(C)在每个时间点针对每组绘制从覆盖每只小鼠的整个身体的感兴趣区域获得的生物发光信号强度的平均值。

实施例

通过本文公开的实施例说明本发明。这些实施例为本发明的潜在优选的非限制性实施方式提供技术支持和更详细的描述。为了证明本文所述CAR的功能，本发明人进行了以下实验：

-CAR转导的人T细胞与不同靶细胞系的共培养显示通过不同的BCMA+MM和NHL细胞系的特异性T细胞活化；读数是作为效应细胞因子的IFN-γ从T细胞中释放；

-细胞毒性分析揭示选择性杀伤BCMA+细胞系；在BCMA阴性细胞系或原代细胞(例如HUVEC(内皮起源)、HEK293(肾)、外周血B细胞、外周血总白细胞、T-和B-ALL、结肠癌)中基本上未见杀伤。

-共培养的CAR-T细胞与多发性骨髓瘤细胞的CD107a染色，通过流式细胞术检测抗原特异性(BCMA)刺激后脱粒的CD8+T细胞。

-体内实验涉及使用异种移植NSG小鼠模型来生成以下的数据：过继转移的CAR-T细胞针对B-NHL和骨髓瘤细胞系的i)功能性、ii)脱靶反应性、iii)T细胞记忆，和iv)生物安全性。对于B-NHL，将抗BCMA CAR-T细胞的细胞溶解能力与已建立的抗CD19 CAR-T细胞产物进行比较。

实施例1：克隆和质粒制备：

使用GeneArt^TM(基因合成服务)合成CAR序列。使用NotI和EcoRI进行CAR构建体的限制性消化(图5)。逆转录病毒载体MP71也用NotI和EcoRI消化，随后去磷酸化。

使用凝胶电泳分离CAR和载体(图6)并纯化片段。随后将CAR构建体以3∶1的比例连接到载体(50ng)中。将连接混合物转化到MACH-1中(图3)。进行对照消化，并对小量制备物(Mini-Preparation)进行测序。随后将构建体重新转化到MACH-1中。进行大量制备MP71-BCMA-CAR质粒。

MP71是单(+)链RNA病毒。逆转录酶将逆转录病毒RNA-基因组转化为DNA拷贝。DNA作为原病毒在随机位置整合到靶基因组中。通过细胞分裂，病毒作为原病毒稳定再生。

实施例2：转染和转导：

第0天：在6孔板中接种用于产生病毒的HekT(293T)或GalV细胞

第1天：瞬时3-质粒转染(磷酸钙转染)以产生逆转录病毒。根据标准方案，每孔使用在250mM CaCl₂、150μl H₂O中的18μg DNA。将细胞在37℃下培养6小时，更换培养基，在37℃下进一步培养48小时。

用抗huCD3和抗huCD28抗体包被24孔非组织培养板：

制备抗CD3/抗CD28-抗体的PBS溶液(5μg/ml抗CD3、1μg/ml抗CD28)，每孔0.5ml。将每个孔用0.5ml抗体溶液在37℃下温育2小时，用无菌2％BSA溶液(水溶液)替换，温育：30分钟(37℃)。去除BSA溶液并用2ml PBS洗涤孔。

从40ml血液(～2.5×10⁷个PBMC)中纯化PBMC：

在2×50ml Falcon管中制备12.5ml聚蔗糖梯度培养基，用RPMI(+100IU/ml青霉素、链霉素)稀释血液至45ml，混合并涂上22.5ml血液-培养基混合物，离心(20分钟，20℃，1800rpm，RZB*648，G17.9)。弃去15ml上层相。将剩余上层相与白乳状含有PBMC的中间相的转移到新的50ml Falcon管中，用RPMI(+100IU/ml青霉素、链霉素)填充至45ml并离心。将小球重悬于45ml RPMI(+100IU/ml青霉素、链霉素)中，离心，将小球装入10-20ml T细胞培养基中，用台盼蓝对一个样品染色，对细胞计数并以浓度1-1.5×10⁶个细胞/ml将细胞(T细胞培养基(+100IU/ml IL-2)对应于400U/ml临床-IL2)添加到抗CD3、抗CD28包被的孔中。将剩余的PBMC离心，悬浮在冷冻培养基中，并在-80℃下储存在冷冻管中。

第3天：PBL的转导

从Hekt或GalV细胞中取出并过滤(0.45μm过滤器)病毒上清。用1.5ml病毒上清处理经刺激的PBMC。

第4天：PBL的转导

过滤剩余的病毒上清(4℃)和来自Hekt-或GalV-细胞(0.45μm)的第二上清。从PBL中收集1ml至1.5ml上清。用1ml至1.5ml病毒上清处理经刺激的PBMC，并在CD3/CD28包被的孔中离心(90分钟，32℃，2000rpm)。最终浓度为100IU/ml IL2(1μl von 400U/μl)或10ng/μl IL7和10ng/μl IL15，以及另外4μg/ml(8μl)鱼精蛋白硫酸盐。在2000rpm，32℃下离心90分钟。

第7天至第13天：培养PBL，用新鲜IL2或IL7/IL15处理T细胞培养基。

第13天：结束T细胞刺激。

冲洗来自细胞培养瓶中的PBL培养物，离心，将小球重新悬浮在T细胞培养基(+10IU/ml IL2)中。

从第15天：功能分析

实施例3：抗BCMA CAR T细胞的功能性体外测试

I.逆转录病毒转导后在人T细胞上确认BCMA CAR表达

在人T细胞的背景下获得CAR受体的折叠和转运的证据；评估了逆转录病毒转导方案的功能性。

通过聚蔗糖梯度纯化人外周血白细胞。如上所述培养、刺激和用逆转录病毒转导细胞。转导后，在分析BCMA-CAR表达之前，将细胞在含有IL-2或IL-7/IL-15的培养基中进一步培养。

通过流式细胞术(FACS)分析来评估转导率和活力。为了检测BCMA-CAR表达，用抗人Ig抗体将细胞染色，所述抗人Ig抗体选择性识别CAR构建体的间隔区中的人IgG1或IgG4区段。进行CD3/CD8/CD4T细胞的共染色。结果参见图7。

II.CAR转导的人T细胞与不同靶细胞系的共培养显示通过不同的BCMA⁺多发性骨 髓瘤(MM)和B-NHL细胞系的特异性T细胞活化

读数是作为效应细胞因子的IFN-γ从T细胞中释放。

如之前详述的，产生逆转录病毒转导的人T细胞；使用所有BCMA CAR受体变体(IX-XVII)、SP6阴性对照CAR、CD19 CAR，UT＝未转导的T细胞。在共培养中使用以下人类细胞系作为靶细胞：

在所列出的细胞系或原代细胞存在下以1∶1的比例共培养逆转录病毒转导的T细胞18至20小时。在此之后，取无细胞培养上清液；通过PMA/离子霉素刺激效应T细胞来诱导最大释放；最小释放仅用T细胞刺激。通过ELISA确定上清液中的IFN-γ释放。有关结果，请参见图8。

III.共培养的CAR-T细胞与多发性骨髓瘤细胞的CD107a(LAMP1)染色：通过流式细 胞术检测抗原特异性(BCMA)刺激后活化的脱粒CD8+T细胞。

如之前详述的，产生逆转录病毒转导的人T细胞；使用BCMA CAR受体变体(IX-XI)、SP6阴性对照CAR。

在所列细胞系存在下以1∶1的比例共培养逆转录病毒转导的T细胞18小时。

向细胞培养基中添加抗CD107a(LAMP1)抗体以过夜培养；当分泌性溶酶体与质膜融合并释放其囊泡的酶内容物时，抗体连续结合在T细胞上。这些囊泡含有溶细胞介质，如颗粒酶和穿孔素。第二天，将T细胞用抗CD8和/或CD3共染色。

通过流式细胞术分析：以平均荧光强度(MFI)表示的较高CD107a反应性表明T细胞的活化更强。可以确认T细胞的抗原依赖性活化。有关结果，请参见图9。

IV.细胞毒性分析揭示了选择性杀伤BCMA阳性细胞系；在BCMA阴性细胞系中基本 上未见杀伤。

使用⁵¹Cr-释放分析来定量细胞毒性T淋巴细胞活性。测量靶细胞的细胞溶解。

如之前详述的，产生逆转录病毒转导的人T细胞；使用BCMA CAR受体变体(IX-XI)、SP6阴性对照CAR；CD19 CAR作为对照。

用⁵¹Cr标记靶细胞。然后共培养CAR-T细胞和标记的靶细胞4小时。滴定法测量效靶比。

效∶靶

80∶1

40∶1

20∶1

10∶1

5∶1

2.5∶1

收获无细胞的细胞培养上清液。将上清液转移至LUMA-闪烁板，在γ-闪烁计数器中测量释放的⁵¹Cr。最大释放：通过Triton X-100透化作用裂解的靶细胞。最小释放：仅靶细胞。有关结果，请参见图10。

此外，图11提供的结果显示了在评估细胞毒性的每种细胞类型的表面上表达的BCMA和CD19的量。图12提供了CAR的scFV结合区与BCMA表位之间相互作用的示意图。

实施例4：使用异种移植NSG小鼠模型的体内实验，用以评估针对B-NHL和骨髓瘤细胞系的过继转移的CAR-T细胞

使用异种移植到NSG小鼠内的体内实验：

1)为了证明配备有不同的抗BCMA-变体的CAR T细胞在原位条件下也具有效应活性，具有不同BCMA抗原密度的多发性骨髓瘤细胞经由静脉内途径移植到NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^{tm1 Wjl}/SzJ)。可以使用的多发性骨髓瘤细胞系是：RPMI-8226，低BCMA；MM1S，居中BCMA密度；NCI-H229，高BCMA密度。

2)为了确认抗BCMA CAR T细胞在原位对B-NHL细胞系的反应性，向NSG小鼠静脉内注射荧光素酶转导的细胞系，如SU-DHL4(DLBCL)、JEKO-1(套细胞淋巴瘤)、JVM3(CLL)、MEC1(CLL)、DOHH-2(FL)。

BCMA CAR-T细胞介导多发性骨髓瘤(MM)和B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)小鼠模型的体内抗肿瘤活性：

为了提供对于用BCMA CAR修饰的T细胞的强体外活性转化成体内有效的抗肿瘤活性提供概念验证，我们用荧光素酶基因与GFP串联转导的人MM.1S细胞系(图15)或B-NHL细胞系JeKo-1(套细胞淋巴瘤)(图16)静脉内接种一组NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^{tm1 Wjl}/SzJ(NSG)小鼠。NSG小鼠不发育T、B和NK细胞，因此适合于异种移植的人细胞的耐受性和生长。在此处呈现的实验时间范围内，未观察到“移植物抗宿主”(GvHD)反应(异种反应性)(数据未显示)。在此后7-8天通过IVIS成像和荧光素注射监测肿瘤生长。在确认肿瘤生长后，在一天后(＝第0天)静脉内注射CAR-T细胞。对于功能性体内实验，使用CAR构建体IX(B IX)。总数从未超过6-7×10⁶个CAR-T细胞/动物，该群体中T细胞的平均转导率为40-60％。每个供者、SP6和BCMA转导率在+/- 10％的范围内匹配。对于所示的两个实验，使用3×10⁶个转导的CAR-T细胞的有效率。对照小鼠接受SP6 CAR-T细胞。

在MM1.S实验(图15)中，移植3×10⁶个转导的CAR-T细胞(如上所述，总计：6-7×10⁶个)并且观察间隔延长至17天。尽管基本上所有SP6 CAR治疗的动物都具有以脊柱、骨盆和后腿有强力的发光信号为特征的进行性MM疾病，或者由于疾病进展而根据(柏林州)动物保护法被处死，但是BCMA CAR治疗组的病例显然不是这种情况。我们得出结论，在相对较低的CAR-T细胞数下，BCMA CAR-T细胞已经具有抗骨髓瘤活性(图15A-C)。

由于抗BCMA CAR-T细胞的高亲和力和亲合力，BCMA低表达的成熟B细胞NHL甚至也可以被识别，从而使得T细胞活化和肿瘤细胞杀伤。这种成熟的B-NHL实体包括滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的某些阶段(参见图11、10、9、8)。为了证明BCMA作为B-NHL实体中的靶结构的适合性，将转导的CAR-T细胞(总计：6-7×10⁶个)移植到已经用套细胞淋巴瘤细胞系JeKo-1攻击的NSG小鼠中。尽管基本上所有SP6 CAR治疗的动物都具有以肝脏、胸部器官、后肢骨髓和脾脏有强发光信号为特征的进行性淋巴瘤疾病，但是BCMA CAR治疗组显然不是这种情况。由此，我们提供了第一个临床前体内证据，证明BCMA CAR-T细胞具有的抗肿瘤活性不仅对于多发性骨髓瘤还延伸到B-NHL淋巴瘤实体(图16A-C)。

实施例5：确定BCMA分子的表面密度

抗BCMA CAR-T细胞的高亲和力和亲合力使得能够识别甚至BCMA低表达的成熟B细胞NHL实体，从而导致T细胞活化和肿瘤细胞杀伤。这种成熟的B-NHL实体包括滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的某些阶段。

为了量化BCMA分子的表面密度，我们应用了PE藻红蛋白荧光检测试剂盒，也称为BD Quantibrite试验(BD Bioscience)。每个细胞的PE分子数可以转换成每个细胞的抗体，这是对每个细胞抗原数量的定量估计。应用流式细胞术检测方法。

使用该方法，我们发现多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929的相对表面BCMA抗原密度为12555，多发性骨髓瘤细胞系OPM-2具有3443个BCMA分子，而多发性骨髓瘤细胞系MM.1S的相对值为3181。

相对于NCI-H929，所提及的B-NHL细胞系的BCMA抗原密度为：

DOHH-2：1/20，JeKo-1：1/250，MEC-1：1/34。

Claims (27)

1.一种分离的嵌合抗原受体多肽(CAR)，其中，所述CAR包括：

i.胞外抗原结合域，其包含结合B细胞成熟抗原(BCMA)多肽的抗体或抗体片段，

ii.跨膜域，和

iii.胞内域，

并且其中，所述CAR与包含人BCMA的N末端第13至32个残基中的一个或多个氨基酸的表位结合。

2.根据前述权利要求所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，其中，所述抗原结合域包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述VH包含：

-与SEQ ID NO 1(GFTFSRYW)具有至少80％的序列同一性的重链互补决定区1(H-CDR1)，

-与SEQ ID NO 2(INPSSSTI)具有至少80％的序列同一性的重链互补决定区2(H-CDR2)，和

-与SEQ ID NO 3(ASLYYDYGDAYDY)具有至少80％的序列同一性的重链互补决定区3(H-CDR3)；

所述VL包含：

-与SEQ ID NO 4(QSVESN)具有至少80％的序列同一性的轻链互补决定区1(L-CDR1)，

-与SEQ ID NO 5(SAS)具有至少80％的序列同一性的轻链互补决定区2(L-CDR2)，和

-与SEQ ID NO 6(QQYNNYPLT)具有至少80％的序列同一性的轻链互补决定区3(L-CDR3)。

3.根据前述权利要求中任一项所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包含VH域和VL域，所述VH域包含以下的CDR序列：

-GFTFSRYW(H-CDR1；SEQ ID NO.1)；

-INPX₂X₃STI(H-CDR2；SEQ ID No.7)，其中X₂X₃：SS、NS、TS、GS、KS、RS、SD、SN、DE；和

-ASLYX₄DYGDAX₅DY(H-CDR3；SEQ ID NO 8)，其中X₄：Y、L、A、V、F、I、W，和/或X₅：Y、L、F、I、V、A、C；

所述VL域包含以下CDR序列：

-QSVX₁X₂N(L-CDR1；SEQ ID NO 9)，其中X₁X₂：ES、SS、TS、QS、HS、DH；

-SAS(L-CDR2；SEQ ID NO 5)；和

-QQYNNYPLTFG(L-CDR3；SEQ ID NO.10)。

4.根据前述权利要求中任一项所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包含以下序列：

i.H-CDR1：GFTFSRYW(SEQ ID NO.1)，

ii.H-CDR2：INPSSSTI(SEQ ID NO.2)，

iii.H-CDR3：ASLYYDYGDAYDY(SEQ ID NO.3)，

iv.L-CDR1：QSVESN(SEQ ID NO.4)，

v.L-CDR2：SAS(SEQ ID NO 5)，和

vi.L-CDR3：QQYNNYPLT(SEQ ID NO 6)。

5.根据前述权利要求中任一项所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包含与SEQ IDNO 11(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWFSWVRQAPGKGLVWVGEINPSSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSS)具有至少80％的序列同一性的VH域；

和与SEQ ID NO 12(EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVESNVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELK)具有至少80％的序列同一性的VL域。

6.根据权利要求5所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包含SEQ ID NO 11的至少W36、E50、L99、Y100、Y101和A106，以及SEQ ID NO 12的至少S31、A34、S50、L53、Q89、Y91、Y94和L96。

7.根据权利要求5或6所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，至少包含SEQ NO 1至6的CDR序列。

8.根据权利要求5至7中任一项或多项所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，分别包含根据SEQ ID NO 11的VH域和根据SEQ ID NO 12的VL域。

9.根据前述权利要求中任一项所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，其中，当所述CAR在经遗传修饰的免疫细胞、优选T淋巴细胞中表达时，所述免疫细胞通过所述CAR而在非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)的表面上结合BCMA，并被活化，从而诱导针对所述B-NHL的细胞毒活性。

10.根据前述权利要求所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，其中，所述B-NHL是JeKo-1、DOHH-2、SU-DHL4、JVM-3和/或MEC-1细胞系。

11.根据前述权利要求中任一项所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，其中，所述胞外抗原结合域包含位于VH域和VL域之间的接头多肽。

12.根据前述权利要求所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，其中，所述接头选自惠特洛(SEQ ID NO 13；GSTSGSGKPGSGEGSTKG)或Gly-Ser(SEQ ID NO 14；SSGGGGSGGGGSGGGGS)接头，或与SEQ ID NO 13或14具有至少80％的序列同一性的接头。

13.根据前述权利要求中任一项所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包含位于胞外抗原结合域和跨膜域之间的间隔区多肽，其中，所述间隔区选自：

a.IgG1-CD28间隔区(SEQ ID NO 15；

b.IgG1Δ-4-1BB间隔区(SEQ ID NO 16；

c.IgG4(Hi-CH2-CH3)间隔区(SEQ ID NO 17；

d.IgG4(Hi-CH3)间隔区(SEQ ID NO 18；

e.IgG4(Hi)间隔区(SEQ ID NO 19；ESKYGPPCPPCP)，或

f.与SEQ ID NO 15至19中的任一个具有至少80％的序列同一性的间隔区。

14.根据前述权利要求中任一项所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，其中，所述跨膜域选自CD8α域(SEQ ID NO 20；IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC)或CD28域(SEQ ID NO 21；FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV)或与SEQ ID NO 20或21具有至少80％的序列同一性的跨膜域。

15.根据前述权利要求中任一项所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，其中，所述胞内域包含共刺激域，所述共刺激域选自4-1BB共刺激域(SEQ ID NO 22；KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL)或CD28共刺激域(SEQ ID NO 23；RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS)，或与SEQ ID NO 22或23具有至少80％的序列同一性的共刺激域。

16.根据前述权利要求中任一项所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包含信号传导域，其中所述信号传导域选自CD3ζ(CD28或4-1BB)信号传导域(SEQ ID NO 24；LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR)，或与SEQ ID NO 24具有至少80％的序列同一性的信号传导域。

17.根据前述权利要求中任一项所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包含串联的共刺激域和CD3ζ信号传导/活化域(SEQ ID NO 24)，所述串联的共刺激域包含4-1BB共刺激域(SEQ ID NO 22)和CD28共刺激域(SEQ ID NO 23)。

18.一种分离的核酸分子，优选为载体形式，例如病毒载体，选自由以下组成的组：

a)包含核苷酸序列的核酸分子，

-所述核苷酸序列编码根据前述权利要求中任一项所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，和/或

-所述核苷酸序列包含SEQ ID No.66和/或67，或SEQ ID NO 86至94的序列；

b)与根据a)所述的核苷酸序列互补的核酸分子；

c)核酸分子，其包含与根据a)或b)所述的核苷酸序列具有足够的序列同一性的核苷酸序列，使得其功能上类似于/等同于根据a)或b)所述的核苷酸序列，优选包含与a)或b)所述的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的序列；

d)核酸分子，其作为遗传密码的结果，简并到根据a)至c)所述的核苷酸序列中；和

e)根据a)至d)所述的核苷酸序列的核酸分子，其通过缺失、添加、替换、易位、倒置和/或插入进行修饰，并且功能上类似于/等同于根据a)至d)所述的核苷酸序列。

19.一种经遗传修饰的免疫细胞，包含权利要求18的所述核酸分子或载体，和/或表达权利要求1至17中任一项中所述的CAR。

20.根据前述权利要求所述的经遗传修饰的免疫细胞，其中，所述免疫细胞选自由T淋巴细胞或NK细胞组成的组。

21.根据前述权利要求所述的经遗传修饰的免疫细胞，其中，所述T淋巴细胞是细胞毒性T淋巴细胞。

22.根据权利要求19至21中任一项所述的免疫细胞，其用于治疗与致病性B细胞的存在相关的医学病症。

23.根据权利要求22所述的免疫细胞，其用作药物，其中，所述与致病性B细胞的存在相关的医学病症是浆细胞、成熟B细胞和/或记忆B细胞的疾病。

24.根据权利要求22所述的免疫细胞，其用作药物，其中，所述医学病症是多发性骨髓瘤。

25.根据权利要求22所述的免疫细胞，其用作药物，其中，所述医学病症是非霍奇金淋巴瘤。

26.根据权利要求22所述的免疫细胞，其用作药物，其中，所述医学病症是自身抗体依赖性自身免疫疾病。

27.根据权利要求26所述的免疫细胞，其用作药物，其中，所述医学病症是系统性红斑狼疮(SLE)或类风湿性关节炎。