CN113784982A - 靶向bcma的car t细胞及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及免疫疗法领域，尤其涉及嵌合抗原受体(CAR)领域。在本申请提出了针对B细胞成熟抗原(BCMA，也称为CD269)的CAR。还提出了编码跨膜多肽链的多核苷酸、载体和表达此类CAR的细胞。这些细胞特别适用于免疫疗法，并且还提供了使用这些细胞治疗癌症等疾病的策略。表达此类CAR的工程化免疫细胞，例如T细胞或自然杀伤(NK)细胞，特别适合于治疗淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。
Description
发明领域
本申请涉及免疫疗法领域，尤其涉及嵌合抗原受体(CAR)领域。本文提出了针对B细胞成熟抗原(BCMA，也称为CD269)的CAR。还提出了编码跨膜多肽链的多核苷酸、载体和表达此类CAR的细胞。这些细胞特别适用于免疫疗法，并且还提供了使用这些细胞治疗癌症等疾病的策略。表达此类CAR的工程化免疫细胞，例如T细胞或自然杀伤(NK)细胞，特别适合于治疗淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。
背景技术
最近FDA批准了头两个均针对B细胞抗原CD19的CAR-T疗法，这导致人们对CAR-T领域的兴趣不断增加。改进CAR设计和寻求新靶点的需求持续存在。最有希望的靶点之一是另一种B细胞抗原，称为B细胞成熟抗原(BCMA，也称为TNFRSF17)。BCMA是一种肿瘤坏死因子受体家族(TNFR)成员，表达在B细胞谱系的细胞中。BCMA的表达在终末分化的B细胞中最高。BCMA参与介导浆细胞的存活，以维持长期体液免疫。最近已将BCMA的表达与许多癌症、自身免疫性疾病和传染病相关联。伴随BCMA表达增加的癌症包括一些血液系统癌症，例如多发性骨髓瘤、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、各种白血病和胶质母细胞瘤。特别是在多发性骨髓瘤中，BCMA被认为是一个有希望的靶点，并且正在开发几种靶向疗法(包括基于抗体的疗法、基于ADC的疗法和基于CAR-T的疗法)。
多发性骨髓瘤(MM)是第二常见的血液系统恶性病(malignancy)，并且占总癌症死亡人数的2％。MM是一种异质性疾病，主要由染色体易位引起，尤其是t(l 1；14),t(4；14),t(8；14),del(13),del(17)(Drach et al.,(1998)Blood 92(3):802-809；Gertz et al.,(2005)Blood 106(8):2837-2840；Facon et al.,(2001)Blood 97(6):1566-1571)。MM受累患者由于骨髓浸润、骨破坏、肾衰竭、免疫缺陷和癌症诊断的社会心理学负担，可能会经历多种疾病相关的症状。目前MM的5年生存率约为50％，这表明MM是一种难以治疗的疾病，目前没有治愈手段。
虽然已经有许多BCMA靶向的嵌合抗原受体(CAR)T细胞正在开发中，但它们中的每一个都表现出不同的功效和安全性，并且每一个都使用不同的构建体。抗体结合功效与CAR的治疗功效之间没有关联。尽管BCMA CAR-T疗法的初步结果和反应率令人振奋，但越来越明显的问题是，迄今为止测试的所有BCMA CAR都存在应答和缓解的持久性问题，而且没有一种BCMA CAR接近批准。目前的CAR-T方案也以频繁的不良事件为代价，包括细胞因子释放综合征和神经毒性。
因此，持续需要能够提高应答持久性的替代的BCMA CAR-T疗法，尤其是高效且副作用较少的CAR-T(例如通过更特异或以毒性更低的更低剂量水平达到相同的功效)。
发明内容
在本申请中，我们开发了大量的BCMA CAR并将它们并排比较。为此，使用了共同的骨架(backbone)，在该骨架中仅改变了BCMA结合部分。在多种测试设置(参见实施例部分)中测试了这些不同的CAR，并且一种特定的CAR明显优于其他CAR。令人惊讶的是，该构建体的结合部分来自之前未在CAR中使用过的抗体，该抗体结合由BCMA的β-发夹(残基Y13-H19)和螺旋-环-螺旋(残基L26、R27和N31-L35)区域中的残基组成的构象表位。结合部分还可以通过空间封闭(steric occlusion)和直接竞争BCMA结合位点来破坏浆细胞中的APRIL和BAFF信号通路。有趣的是，APRIL和BAFF可以使用其他受体(如TACI和BAFF-R)发出信号，并且BCMA敲除的小鼠仍然存活。因此，使用这种CAR构建体通过BCMA封闭来阻断APRIL和BAFF活性对MM患者可能没有严重毒性。
因此，本发明的一个目的是提供靶向BCMA并适用于治疗的CAR构建体和CAR-T细胞。
根据第一方面，本文提供了嵌合抗原受体，其包含抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
根据进一步的实施方案，抗BCMA结合结构域还包含具有GGNNIGSKSVH(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的轻链CDR1、具有DDSDRPS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的轻链CDR2以及具有QVWDSSSDHVV(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的轻链CDR3。
根据特定的实施方案，重链包含QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列。根据特定的实施方案，轻链包含SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列。
抗体序列首次被描述在WO2017031104中，在此将其全文并入。已经表征了抗体的表位(epitope)和互补位(paratope)，并且已经在其中产生了突变抗体序列。在那里，示出了以相似的亲合力结合BCMA的几个突变的CDR序列。例如，在重链CDR1中，在序列SGSYFWG(SEQ ID NO:1)中，第一个G氨基酸(在SEQ ID NO:1的2位)可以突变为S和/或F残基(在5位)可以突变为Y，同时保留或改善结合。因此，本文还提供了在重链CDR1中包含序列SSSYFWG(SEQ ID NO:9)、SGSYYWG(SEQ ID NO:10)和SSSYYWG(SEQ ID NO:11)的CAR。特别涉及具有G到S取代的序列(SEQ ID NO:9和11)。此外，在重链CDR2中，在序列SIYYSGITYYNPSLKS(SEQID NO:2)中，第二个I氨基酸(在SEQ ID NO:2的7位)可以突变为S，同时保留或改善结合。因此，本文还提供了在重链CDR2中包含序列SIYYSGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO:12)的CAR。此外，在重链CDR3中，在序列HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)中，V氨基酸(在SEQ ID NO:3的5位)可以突变为T，同时保留或改善结合。因此，本文还提供了在重链CDR3中包含序列HDGATAGLFDY(SEQ ID NO:13)的CAR。
根据进一步的实施方案，CAR分子的信号传导结构域含有在免疫细胞中起作用的信号传导结构域。根据特定的实施方案，信号传导结构域包含选自CD3ζ结构域、FcεRIγ结构域、CD3ε结构域或最近描述的DAP10/DAP12信号传导结构域(Zheng et al.,2020)的信号传导结构域。
信号传导结构域还可以含有增强或修饰信号的辅助结构域(accessory domain)。根据特定的实施方案，信号传导结构域还包含共刺激结构域。根据进一步的特定实施方案，共刺激结构域选自CD28、4-1BB、OX40、ICOS、DAP10、DAP12、CD27和CD2共刺激结构域。
根据另一方面，CAR不作为蛋白质提供，而是作为编码这些蛋白质的核酸分子(通常是分离的核酸分子)提供。然后可以在合适的细胞中表达此类核酸分子以产生CAR(例如在T细胞中以产生CAR-T细胞)。这些由核酸编码的CAR可具有本文所述的所有特征。
因此，提供了编码CAR的核酸分子，所述CAR包含抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
由这些核酸分子编码的抗BCMA结合结构域还可以包含具有GGNNIGSKSVH(SEQ IDNO:4)的氨基酸序列的轻链CDR1、具有DDSDRPS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的轻链CDR2以及具有QVWDSSSDHVV(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的轻链CDR3。
根据特定的实施方案，核酸分子编码包含QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的重链。根据特定的实施方案，核酸分子编码包含SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的轻链。
同样，本文还提供了编码CAR的核酸，所述CAR在重链CDR1中包含序列SSSYFWG(SEQID NO:9)、SGSYYWG(SEQ ID NO:10)和SSSYYWG(SEQ ID NO:11)。特别涉及具有G到S取代的序列(SEQ ID NO:9和11)。此外，在重链CDR2中，在序列SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)中，第二个I氨基酸(在SEQ ID NO:2的7位)可以突变为S，同时保留或改善结合。因此，本文还提供了编码CAR的多核苷酸，所述CAR在重链CDR2中包含序列SIYYSGSTYYNPSLKS(SEQ IDNO:12)。此外，在重链CDR3中，在序列HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)中，V氨基酸(在SEQ IDNO:3的5位)可以突变为T，同时保留或改善结合。因此，本文还提供了编码CAR的核酸分子，所述CAR在重链CDR3中包含序列HDGATAGLFDY(SEQ ID NO:13)。
根据进一步的实施方案，由核酸分子编码的CAR的信号传导结构域含有在免疫细胞中起作用的信号传导结构域。根据特定的实施方案，信号传导结构域包含选自CD3ζ结构域、FcεRIγ结构域、CD3ε结构域或最近描述的DAP10/DAP12信号传导结构域(Zheng etal.,2020)的信号传导结构域。
由核酸分子编码的信号传导结构域还可以含有增强或修饰信号的辅助结构域。根据特定的实施方案，信号传导结构域还包含共刺激结构域。根据进一步的特定实施方案，共刺激结构域选自CD28、4-1BB、OX40、ICOS、DAP10、DAP12、CD27和CD2共刺激结构域。
通常，核酸分子以载体的形式提供。因此，提供了包含如本文所述的核酸分子的载体。因此，提供了包含编码CAR的核酸分子的载体，所述CAR包含抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。这些CAR(和特定的结构域)的所有条件和限制均如本文所述。
除了CAR之外，核酸分子和载体可以含有增强CAR的治疗功效的其他特征。可以被编码的此类特征的实例包括但不限于检查点抑制剂、细胞因子、趋化因子、自杀基因、shRNA、抗体、其他CAR、抗运载蛋白(anticalin)等。根据特定的实施方案，核酸分子和载体可以含有针对CD3ζ的shRNA。这特别可用于同种异体应用。
根据另一方面，当在细胞例如免疫细胞中表达时，CAR特别有用。因此，提供了包含如本文所述的CAR的细胞，即：包含CAR的细胞，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
此外，提供了包含如本文所述的核酸分子的细胞，即：包含编码CAR的核酸分子的细胞，所述CAR包含抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
此外，提供了包含如本文所述的载体的细胞，即：包含含有编码CAR的核酸分子的载体的细胞，所述CAR包含抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。通常，这些细胞将是免疫细胞，例如T细胞或NK细胞。
因此，也可以在细胞中提供针对这些CAR(和特定的结构域)所描述的所有特征。
根据另一方面，提供了本文所述的细胞(即含有抗BCMA CAR)，用作药物。根据进一步的特定方面，提供了本文所述的细胞，用于治疗癌症。根据特定的实施方案，癌症选自白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤(MM)。最特别地，提供了细胞，用于治疗多发性骨髓瘤。根据可选的实施方案，提供了细胞，用于治疗自身免疫性疾病(因为BCMA已经参与自身免疫性疾病)以及B淋巴细胞恶性病(B-lymphocyte malignancy)。已经证明BCMA抑制有用的自身免疫性疾病的实例包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化症(MS)(Hofmann et al.,Front Immunol.2018；9:835)。
含有BCMA CAR的细胞可以是自体细胞(受试者接受源自他或她身体但经过离体修饰的细胞)或者可以是同种异体细胞(免疫细胞源自供体，并且在施用于非供体的受试者之前已经被离体修饰)。同种异体细胞可以含有其他特征，例如针对CD3ζ的shRNA。
这等同于陈述提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用CAR，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
癌症通常选自白血病、淋巴瘤或MM。最特别地，它是MM。
或者，提供了治疗自身免疫性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用CAR，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
待治疗的自身免疫性疾病通常选自RA、SLE和MS。
在这些治疗方法中，CAR可以进一步含有针对它们或针对特定的结构域所描述的所有特征。细胞通常是免疫细胞。
治疗方法可以是自体方法(受试者接受源自他或她的身体的细胞)或者可以是同种异体方法(细胞源自不是受试者的供体)。
根据另一个方面，提供了本文所述的核酸分子(即编码抗BCMA CAR)，用作药物。通常，这些核酸分子随后将用于转导细胞，使得其表达CAR。尽管细胞通常是向有需要的受试者施用的药剂，但核酸分子通常更易于储存或运输，并且更适合用作药物。此外，虽然不是特别优选，但本文还涉及将核酸分子直接施用于受试者。根据进一步的特定方面，提供了本文所述的核酸，用于治疗癌症。根据特定的实施方案，癌症选自白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤(MM)。最特别地，提供了核酸，用于治疗多发性骨髓瘤。根据可选的实施方案，提供了核酸分子，用于治疗自身免疫性疾病。示例性的自身免疫性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化症。
同样，提供了本文所述的载体(即编码抗BCMA CAR)，用作药物。通常，这些载体随后将用于转导细胞，使得其表达CAR。尽管细胞通常是向有需要的受试者施用的药剂，但载体分子通常更易于储存或运输，并且更适合用作药物。此外，虽然不是特别优选，但本文还涉及将载体直接施用于受试者。根据进一步的特定方面，提供了本文所述的载体，用于治疗癌症。根据特定的实施方案，癌症选自白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤(MM)。最特别地，提供了载体，用于治疗多发性骨髓瘤。根据可选的实施方案，提供了载体，用于治疗自身免疫性疾病。示例性的自身免疫性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化症。
这等同于陈述提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用编码CAR的核酸分子，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
或者，提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用含有编码CAR的核酸分子的载体，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
癌症通常选自白血病、淋巴瘤或MM。最特别地，它是MM。
或者，提供了治疗自身免疫性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用编码CAR的核酸，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
或者，提供了治疗自身免疫性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用含有编码CAR的核酸的载体，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
待治疗的自身免疫性疾病通常选自RA、SLE和MS。
在这些治疗方法中，CAR可以进一步含有针对它们或针对特定的结构域所描述的所有特征。
然而，最典型地，核酸分子和载体不会直接施用于受试者。相反，它们将用于过继细胞转移(ACT)的方法。ACT是指将细胞(最通常为免疫细胞)转移到患者体内。这些细胞可能源自患者(自体疗法)或源自其他个体(同种异体疗法)。疗法的目标是提高免疫功能和特性，以及在癌症免疫疗法中提高对癌症的免疫反应。尽管T细胞最常用于ACT，但他免疫细胞类型也可适用，例如NK细胞、淋巴细胞(例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))、树突细胞和骨髓细胞。也可以使用干细胞，例如诱导性多能性干细胞(iPSC)。
根据该方面，提供细胞(从待治疗的受试者或从供体获得)，然后将这些细胞用本文所述的核酸分子或载体转导、转染或以其他方式工程化。然后可以将所得细胞施用于受试者(在自体疗法的情况下是相同的受试者，或者在同种异体疗法的情况下是不同的受试者)。
因此，提供了一种对细胞进行工程化的方法，其包括：
-提供源自受试者的细胞
-在所述细胞中引入编码CAR的核酸分子，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
或者，提供了一种对细胞进行工程化的方法，其包括：
-提供源自受试者的细胞
-在所述细胞中引入含有编码CAR的核酸分子的核酸载体，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
根据特定的实施方案，这些方法是离体或体外方法。
在这些方法中，CAR可以进一步含有针对它们或针对特定的结构域所描述的所有特征。细胞通常是免疫细胞。最特别地，细胞选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、淋巴细胞、树突细胞、骨髓细胞、干细胞、祖细胞或iPSC。
当细胞被工程化用于同种异体方法时，核酸分子或载体可额外含有预防或减少移植物抗宿主病的特征，例如编码TCR功能抑制剂(例如shRNA或TCR抑制分子，如WO2013166051中所述)的核酸。
该方法可以进一步包括将工程化的细胞施用于有需要的受试者，使它们成为治疗方法的步骤。治疗方法可以是自体方法(受试者接受源自他或她身体的细胞)或同种异体方法(细胞源自不是受试者的供体)。
附图的简要描述
图1.A：BCMA CAR表达载体的设计。LTR：长末端重复；pack.Ψ：Ψ包装信号；tCD34：截短的CD34，一种标记蛋白；CD247：针对CD247的shRNA。上部设计用于自体使用，下部设计用于同种异体使用，其中针对CD247的shRNA抑制TCR信号传导。B：BCMA CAR蛋白布局。抗BCMA scFv：BCMA结合部分；CD8 H+TM：源自CD8的分子的铰链+跨膜部分；CD28/4-1BB：使用的共刺激结构域；CD3ζ：CD3ζ信号传导结构域。
图2.在图1的BCMA CAR设计中测试了11种不同的抗BCMA scFv。将来自三个不同健康供体的PBMC用所示BCMA CAR构建体或Mock(tCD34)对照载体转导。比较了第4天到第10天之间的细胞倍数扩增(A)。所有构建体都显示出类似的倍数扩增。在用不同的BCMA CAR构建体转导的细胞之间，收获时的存活率相当(B)。
图3.A.对于用不同的BCMA-CAR构建体转导并扩增10天的细胞，用BCMA-Fc融合蛋白进行染色。在第二步中，用结合有PE的抗Fc和结合有APC的抗CD34抗体对细胞进行染色。A.显示了转基因在细胞表面上的表达，使用tCD34的平均荧光强度作为替代标记物。B.在总的T细胞群中评价的BCMA-CAR阳性细胞百分数(％)的总结。C.对于BCMA CAR+T细胞，显示了BCMA-Fc染色的中值荧光强度。
图4.通过将不同BCMA-CAR T细胞与不同的BCMA阳性癌细胞系(RPMI-8226(A)、U266(B)、OPM-2(C))共培养，来评估不同BCMA-CAR T细胞的细胞毒性。释放到培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)被用作细胞毒性和胞溶作用的生物标记物。
图5.将不同的表达BCMA的癌细胞系与Mock(tCD34)或表达BCMA-CAR的T细胞共培养。与不同的BCMA阳性癌细胞系(RPMI-8226(A)、U266(B)、OPM-2(C))共培养24小时后，测量上清液中的IFN-γ水平。
图6.NSG小鼠植入KMS11-luc多发性骨髓瘤细胞。在第5天进行生物发光测量后，将小鼠随机分为三个不同的组。在第6天，用媒介物(vehicle)对照、tCD34转导的T细胞或用选定的BCMA-CAR转导的T细胞处理动物。显示了正在离开一平方厘米的组织并辐射到一个球面度的立体角中的光子每秒的生物发光值。
图7.在(A)KMS-11MM模型和(B)RPMI-8226MM模型中用单次注射T细胞处理的小鼠的存活曲线。在静脉注射5×106个KMS-11癌细胞(A)或RPMI-8226癌细胞(B)后6天，静脉注射媒介物或107个CYAD-211细胞或107个对照T细胞的NSG小鼠(每组n＝5)的存活曲线。对照T细胞是用与CYAD-211细胞相同的载体骨架转导的细胞，没有BCMA CAR或shRNA-CD3ζ。CYAD-211：基于scFv#11的抗BCMA CAR，包括针对CD3ζ的shRNA。
图8.小鼠外周血中的BCMA CAR T细胞植入。在注射了表达RPMI-8226BCMA的MM细胞后14天，用单次注射媒介物或CYAD-211细胞处理小鼠(每组n＝3)。在注射后4小时(第14天)、24小时(第15天)、48小时(第16天)、1w(第21天)、2w(第28天)和1月(第42天)，在外周血中通过流式细胞术测量人T细胞的频率(总群体(mCD45+/GFP-活细胞和hCD45+/GFP-活细胞)中mCD45-/GFP-/hCD45+/hCD4+活细胞和mCD45-/GFP-/hCD45+/hCD8+活细胞的总和。CYAD-211：基于scFv#11的抗BCMA CAR，包括针对CD3ζ的shRNA。
图9.注射了CYAD-211细胞、对照T细胞或媒介物的NGS小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。在接受1.44Gy全身照射后1天，对小鼠(每组n＝5)注射20×106个CYAD-211细胞、对照T细胞或媒介物。显示了三个独立供体的结果。CYAD-211：基于scFv#11的抗BCMA CAR，包括针对CD3ζ的shRNA。
详细说明
定义
将结合特定实施方案并参考某些附图来描述本发明，但本发明不限于此，而仅受权利要求的限制。权利要求中的任何附图标记不应被解释为限制范围。所描述的附图只是示意性的并且是非限制性的。在附图中，为了说明的目的，一些元件的尺寸可能被夸大并且未比例绘制。当在本说明书和权利要求中使用术语“包含”时，它不排除其他元件或步骤。当指代单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“a”或“an”、“the”，除非另有说明，否则这包括多个该名词。
此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等用于区分相似的元件，并不一定用于描述顺序或时间顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且这里描述的本发明的实施方案能够以不同于这里描述或说明的其他顺序进行操作。
提供以下术语或定义仅用于帮助理解本发明。
除非在此特别定义，否则在此使用的所有术语都具有与本发明领域的技术人员所理解的相同的含义。关于本领域的定义和术语，从业人员被特别指引到Green andSambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,,New York(2012)；和Ausubel et al.,Current Protocols inMolecular Biology(up to Supplement 114),John Wiley&Sons,New York(2016)。不应将本文提供的定义解释为具有低于本领域普通技术人员理解的范围。
如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指嵌合受体(即由来自不同来源的部分组成)，其至少具有对抗原具有特异性的结合部分(其可以例如源自抗体、受体或其同源配体)以及可以在免疫细胞中传递信号的信号部分(例如CD3ζ链)。
如本文所用，“跨膜结构域”或“TM结构域”是任何跨膜蛋白结构域。最常见的是，它来源于跨膜蛋白。然而，它也可以是人工设计的。本文使用的跨膜结构域通常通过带电和不带电相互作用与其他跨膜结构域结合。
如本文所用，术语“信号传导结构域”是指可以在细胞中(特别是在免疫细胞中)传递信号的部分。信号传导结构域通常包含源自在免疫细胞中通过自身发出信号的受体(例如T细胞受体(TCR)复合物或Fc受体)的结构域。此外，它可以含有共刺激结构域(即，衍生自获得T细胞的完全激活或在抑制性共刺激结构域的情况下获得信号的全谱所需的除了TCR之外的受体的结构域)。共刺激结构域可以来自激活性共刺激受体或来自抑制性共刺激受体。
如本文所用，术语“B细胞成熟抗原”、BCMA、CD269或TNFRSF17(UniProt Q02223；基因ID：608，在人类中)是指在分化的浆细胞中优先表达的肿瘤坏死因子受体超家族的成员(Laabi et al.(1992)EMBO J 11(11):3897-3904；Madry et al.(1998)Int Immunol 10(11):1693-1702)。BCMA是一种非糖基化的I型跨膜蛋白，其参与B细胞的成熟、生长和存活。BCMA是TNF超家族的以下两种配体的受体：APRIL(增殖诱导性配体，CD256，TNFSF13)，其是BCMA的高亲合力配体；和B细胞激活因子BAFF(THANK，BlyS，B淋巴细胞刺激剂，TALL-1和zTNF4)，其是BCMA的低亲合力配体。APRIL和BAFF显示结构相似性和重叠但具有不同的受体结合特异性。负调节因子TACI也与BAFF和APRIL两者结合。抗BCMA结合结构域是与BCMA蛋白结合的结构域。
如本文所用，术语“免疫细胞”是指作为免疫系统(其可以是适应性或先天性免疫系统)的一部分的细胞。本文使用的免疫细胞通常是为过继细胞转移(自体转移或同种异体转移)而制造的免疫细胞。许多不同类型的免疫细胞用于过继疗法，因此涉及免疫细胞，用于本文所述的方法中。免疫细胞的实例包括但不限于T细胞、NK细胞、NKT细胞、淋巴细胞、树突细胞、骨髓细胞、干细胞、祖细胞或iPSC。后三种本身不是免疫细胞，但可以用在过继细胞转移中用于免疫疗法(参见例如Jiang et al.,Cell Mol Immunol2014；Themeli et al.,Cell Stem Cell 2015)。通常，虽然制造从干细胞或iPSC开始(甚至可以从自免疫细胞至iPSC的去分化步骤开始)，但制造在给药前需要分化为免疫细胞的步骤。用于制造过继转移用免疫细胞的干细胞、祖细胞和iPSC(即，用本文所述的CAR转导的干细胞、祖细胞和iPSC或其分化后代)被认为是本文的免疫细胞。根据特定的实施方案，所述方法中涉及的干细胞不涉及破坏人类胚胎的步骤。
特别涉及的免疫细胞包括白血细胞(白细胞)，包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞。特别涉及的淋巴细胞包括T细胞、NK细胞和B细胞，最特别涉及的是T细胞。在过继转移的背景下，注意免疫细胞通常将是原代细胞(即直接从人类或动物组织中分离出来的，不培养或仅短暂培养的细胞)，而不是细胞系(即已经长时间连续传代并获得了同质的基因型和表型特征的细胞)。根据具体的实施方式，免疫细胞是原代细胞。根据可选的具体实施方案，免疫细胞不是来自细胞系的细胞。
“抗体”是指免疫球蛋白的所有同种型(IgG、IgA、IgE、IgM、IgD和IgY)，包括各种单体、聚合和嵌合形式，除非另有说明。
术语“抗体”具体涵盖多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)和抗体样多肽，例如嵌合抗体和人源化抗体。“抗原结合片段”是可以表现出对特定抗原的结合亲合力的任何蛋白质结构。抗原结合片段包括通过任何已知技术(例如酶切、肽合成和重组技术)提供的那些。一些抗原结合片段由完整抗体的保留了亲本抗体分子的抗原结合特异性的部分组成。例如，抗原结合片段可以包含已知与特定抗原结合的抗体的至少一个可变区(重链或轻链可变区)或者一个或多个CDR。合适的抗原结合片段的实例包括但不限于双抗体(diabody)和单链分子以及Fab、F(ab’)2、Fc、Fabc和Fv分子、单链(Sc)抗体、单个抗体轻链、单个抗体重链、抗体链或CDR与其他蛋白质之间的嵌合融合体、蛋白质支架、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体、由一条重链和一条轻链组成的二聚体、由VL、VH、CL和CHI结构域组成的单价片段、或如WO2007059782中所述的单价抗体、包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段、基本上由V.sub.H和C.sub.Hl结构域组成的Fd片段；基本上由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，dAb片段(Ward et al.,Nature 341,544-546(1989))(其基本上由VH结构域组成，也称为结构域抗体(Holt et al；Trends Biotechnol.2003Nov.；21(11):484-90))；骆驼科动物(camelid)或纳米抗体(nanobody)(Revets et al；Expert Opin BiolTher.2005Jan.；5(1):111-24)；分离的互补决定区(CDR)等。所有抗体同种型均可用于产生抗原结合片段。此外，抗原结合片段可以包括非抗体蛋白质框架，其可以以赋予对给定的感兴趣抗原的亲合性的方向成功地引入多肽片段，例如蛋白质支架。抗原结合片段可以重组产生或通过完整抗体的酶促或化学裂解产生。短语“抗体或其抗原结合片段可以用于表示给定的抗原结合片段引入了该短语中提及的抗体的一个或多个氨基酸片段。
术语“表位”是指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子的表面聚集组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于与前者的结合在变性溶剂的存在下会丧失，而后者不会。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其他氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效阻断或覆盖的氨基酸残基(换言之，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹内)。
当在抗体或抗体片段的上下文中使用时，“特异性结合”或“免疫特异性结合”或其衍生物表示通过免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的结构域与感兴趣的蛋白质的一个或多个表位的结合，而不优先与含有混合分子群的样品中的其他分子结合。通常，如通过表面等离子共振测定或细胞结合测定所测量的，抗体以小于约1×108M的KD与同源抗原结合。诸如“[抗原]-特异性”抗体(例如，BCMA-特异性抗体)的短语意在表示所述抗体与所述抗原特异性地结合。
如本文所用，“分离的”是指生物组分(例如核酸、肽或蛋白质)已从该组分天然存在于其中的生物体的其他生物组分(即，其他染色体的和染色体外的DNA和RNA以及蛋白质)基本上分离、从其中产生或从其中纯化。已“分离”的核酸、肽和蛋白质因此包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。“分离”的核酸、肽和蛋白质可以是组合物的一部分，并且如果这样的组合物不是核酸、肽或蛋白质的天然环境的一部分，则可以被继续分离。该术语还包括通过在宿主细胞中的重组表达而制备的核酸、肽和蛋白质，以及化学合成的核酸。如本文所用，“分离”的抗体或抗原结合片段旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体或抗原结合片段的抗体或抗原结合片段(例如，与BCMA特异性结合的分离的抗体基本上不含与BCMA以外的抗原特异性结合的抗体)。然而，与BCMA的表位、同种型或变体特异性结合的分离的抗体可能与其他相关抗原(例如来自其他物种(例如BCMA物种同系物)的抗原)具有交叉反应性。
短语“核酸分子”(其被同义地称为“核苷酸”或“核酸”或“多核苷酸”)是指任何聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。核酸分子包括但不限于单链和双链DNA、作为单链和双链区域混合物的DNA、单链和双链RNA以及作为单链和双链区域的混合物的RNA、包含DNA和RNA(其可以是单链的，或更典型地是双链的或是单链和双链区域的混合物)的杂种分子。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域。术语多核苷酸还包括含有一个或多个经修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其他原因而修饰的骨架的DNA或RNA。“经修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化的碱基和不常见的碱基，例如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常在自然界中发现的多核苷酸的化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”还包括相对较短的核酸链，通常称为寡核苷酸。
“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体、粘粒或病毒，其中可以可操作地插入另一个核酸段以引起该段的复制或表达。“克隆”是通过有丝分裂从单个细胞或共同祖先衍生的细胞群。“细胞系”是能够在体外稳定生长多代的原代细胞的克隆。在本文提供的一些实例中，通过用DNA转染细胞来转化细胞。
术语“表达”和“产生”在本文中同义使用，并且指基因产物的生物合成。这些术语涵盖将基因转录为RNA。这些术语还涵盖将RNA翻译成一种或多种多肽，并进一步涵盖所有天然发生的转录后和翻译后修饰。
术语“受试者”是指人类和非人类动物，包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、小鼠、兔、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在所述方法的大多数特定实施方案中，受试者是人。
术语“治疗(treating或treatment)”是指减轻或改善损伤、病理或状况的任何成功或成功标志，包括任何客观或主观参数，例如减轻、缓解、减少症状或使患者对病情更耐受，减慢退化或衰退的速度，使退化的最终点不那么虚弱，改善受试者的身体或精神健康，或延长存活的时间。治疗可以通过客观或主观参数进行评估；包括身体检查、神经系统检查或精神评估的结果。
“有效量”或“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望的治疗结果的量。治疗剂(例如本文所述的转化的免疫细胞)的治疗有效量可以根据个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及治疗剂(例如细胞)在个体中引起期望反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是治疗剂的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。
短语“移植物抗宿主病”或“GvHD”是指同种异体移植后可能发生的状况。在GvHD中，捐赠的骨髓、外周血(干)细胞或其他免疫细胞将接受者的身体视为异物，并且捐赠的细胞会攻击身体。由于供体免疫活性免疫细胞(如T细胞)是GvHD的主要驱动力，所以预防GvHD的一种策略是减少这些免疫活性细胞中的(基于TCR的)信号传导，例如通过直接或间接抑制TCR复合物的功能。
本申请是第一个在常见CAR背景下显示系统地并排比较BCMA scFv的申请。这能够识别以前未在CAR中使用过，并且在几个实验设置中优于其他scFv的scFv。
因此，本发明的一个目的是提供包含抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
根据进一步的实施方案，抗BCMA结合结构域还包含具有GGNNIGSKSVH(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的轻链CDR1、具有DDSDRPS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的轻链CDR2以及具有QVWDSSSDHVV(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的轻链CDR3。由于轻链CDR1不主动参与配体结合，因此根据可选的实施方案，抗BCMA结合结构域还包含具有DDSDRPS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的轻链CDR2以及具有QVWDSSSDHVV(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的轻链CDR3。
根据特定的实施方案，重链包含QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列。根据特定的实施方案，轻链包含SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列。
抗体序列首先描述在WO2017031104中，将其全文并入本文。如其中的实施例2所述，人免疫球蛋白转基因大鼠品系(OmniRat
OMT,Inc.)用于开发表达人BCMA单克隆抗体的杂交瘤细胞。当用重组人BCMA(rhBCMA)进行免疫时，这种转基因大鼠产生对人BCMA具有特异性的人IgG抗体。如此产生的抗体被纯化和表征，并且源自M2杂交瘤的抗体-命名为BCMB69-被选为最佳命中物。该抗体分别包含SEQ ID NO:7和8作为其重链和轻链。结晶后，测定表位、互补位和相互作用(WO2017031104中的实施例6)。该抗体识别由BCMA的β发夹(残基Y13-H19)和螺旋-环-螺旋(残基L26、R27和N31-L35)区域中的残基组成的构象表位。其表位包含BCMA上约830A2的面积，并含有配体结合性DXL基序(β发夹的I型转角中的D15-L18残基)，该基序伸入由抗体互补决定区(CDR)排列的浅空腔中。在DXL转角尖端的亮氨酸17完全埋在抗体腔中，并与抗体有广泛的相互作用。另一个普遍的表位残基是Arg27，它与重链CDR形成几个氢键接触。
抗体互补位由来自除CDR-L1之外的所有CDR的残基组成。因此，根据一些实施方案，轻链中CDR1的序列可以改变而不影响抗体的性质。与轻链相比，重链与BCMA具有两倍的接触数，总接触的40％是由CDR-H3完成的。
因此，已经表征了抗体的表位和互补位两者，并且已经在其中产生了突变抗体序列。在那里，表明几个突变的CDR序列以相似的亲合力与BCMA结合。例如，在重链CDR1中，在序列SGSYFWG(SEQ ID NO:1)中，第一个G氨基酸(在SEQ ID NO:1的2位)可以突变为S和/或F残基(在5位)可以突变为Y，同时保留或改善结合。因此，本文还提供了在重链CDR1中包含序列SSSYFWG(SEQ ID NO:9)、SGSYYWG(SEQ ID NO:10)和SSSYYWG(SEQ ID NO:11)的CAR。特别涉及具有G到S取代的序列(SEQ ID NO:9和11)。此外，在重链CDR2中，在序列SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)中，第二个I氨基酸(在SEQ ID NO:2的7位)可以突变为S，同时保留或改善结合。因此，本文还提供了在重链CDR2中包含序列SIYYSGSTYYNPSLKS(SEQID NO:12)的CAR。此外，在重链CDR3中，在序列HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)中，V氨基酸(在SEQ ID NO:3的5位)可以突变为T，同时保留或改善结合。因此，本文还提供了在重链CDR3中包含序列HDGATAGLFDY(SEQ ID NO:13)的CAR。
根据进一步的实施方案，CAR分子的信号传导结构域含有在免疫细胞中起作用的信号传导结构域。根据特定的实施方案，信号传导结构域包含选自CD3ζ结构域、FcεRIγ结构域、CD3ε结构域和DAP10/DAP12结构域的信号传导结构域。
信号传导结构域还可以含有增强或修饰信号的辅助结构域。根据特定的实施方案，信号传导结构域还包含共刺激结构域。根据进一步的具体实施方案，共刺激结构域选自CD28、4-1BB、OX40、ICOS、DAP10、DAP12、CD27和CD2共刺激结构域。
根据另一方面，CAR不作为蛋白质提供，而是作为编码这些蛋白质的核酸分子(通常是分离的核酸分子)提供。然后可以在合适的细胞中表达此类核酸分子以产生CAR(例如在T细胞中以产生CAR-T细胞)。这些由核酸编码的CAR可能具有本文所述的所有特征。
因此，提供了编码CAR的核酸分子，所述CAR包含抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
由这些核酸分子编码的抗BCMA结合结构域可以进一步包含具有GGNNIGSKSVH(SEQID NO:4)的氨基酸序列的轻链CDR1、具有DDSDRPS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的轻链CDR2以及具有QVWDSSSDHVV(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的轻链CDR3。
根据特定的实施方案，核酸分子编码包含QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的重链。根据特定的实施方案，核酸分子编码包含SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的轻链。
同样，本文还提供了编码在重链CDR1中包含序列SSSYFWG(SEQ ID NO:9)、SGSYYWG(SEQ ID NO:10)和SSSYYWG(SEQ ID NO:11)的CAR的核酸。特别涉及具有G到S取代的序列(SEQ ID NO:9和11)。此外，在重链CDR2中，在序列SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)中，第二个I氨基酸(在SEQ ID NO:2的7位)可以突变为S，同时保留或改善结合。因此，本文还提供了编码在重链CDR2中包含序列SIYYSGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO:12)的CAR的多核苷酸。此外，在重链CDR3中，在序列HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)中，V氨基酸(在SEQ ID NO:3的5位)可以突变为T，同时保留或改善结合。因此，本文还提供了编码在重链CDR3中包含序列HDGATAGLFDY(SEQ ID NO:13)的CAR的核酸分子。
根据进一步的实施方案，由核酸分子编码的CAR的信号传导结构域含有在免疫细胞中起作用的信号传导结构域。根据特定的实施方案，信号传导结构域包含选自CD3ζ结构域、FcεRIγ结构域、CD3ε结构域和DAP10/DAP12结构域的信号传导结构域。
由核酸分子编码的信号传导结构域还可以含有增强或修饰信号的辅助结构域。根据特定的实施方案，信号传导结构域还包含共刺激结构域。根据进一步的具体实施方案，共刺激结构域选自CD28、4-1BB、OX40、ICOS、DAP10、DAP12、CD27和CD2共刺激结构域。
通常，核酸分子将以载体的形式提供。因此，提供了包含如本文所述的核酸分子的载体。因此，提供了包含编码CAR的核酸分子的载体，所述CAR包含抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。这些CAR(和特定的结构域)的所有条件和限制均如本文所述。
除了CAR之外，核酸分子和载体还可以含有增强CAR的治疗功效的其他特征。可以被编码的此类特征的实例包括但不限于检查点抑制剂、细胞因子、趋化因子、自杀基因、shRNA、抗体、其他CAR、抗运载蛋白等。根据特定的实施方案，核酸分子和载体可以含有针对CD3ζ的shRNA。这尤其可用于同种异体应用。
根据另一方面，当在细胞例如免疫细胞中表达时，CAR特别有用。因此，提供了包含如本文所述的CAR的细胞，即：包含CAR的细胞，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
此外，提供了包含如本文所述的核酸分子的细胞，即：包含编码CAR的核酸分子的细胞，所述CAR包含抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
此外，提供了包含如本文所述的载体的细胞，即：包含含有编码CAR的核酸分子的载体的细胞，所述CAR包含抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
因此，也可以在细胞中提供针对这些CAR(和特定的结构域)所描述的所有特征。
根据另一方面，提供了本文所述的细胞(即含有抗BCMA CAR)，用作药物。根据进一步的特定方面，提供了本文所述的细胞，用于治疗癌症。根据特定的实施方案，癌症选自白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤(MM)。最特别地，提供了细胞，用于治疗多发性骨髓瘤。根据可选的实施方案，提供了细胞，用于治疗自身免疫性疾病(因为BCMA已经参与自身免疫性疾病)以及B淋巴细胞恶性病。已经证明BCMA抑制有用的自身免疫性疾病的实例包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化症(MS)(Hofmann et al.,FrontImmunol.2018；9:835)。
含有BCMA CAR的细胞可以是自体细胞(受试者接受源自他或她身体但经过离体修饰的细胞)或者可以是同种异体细胞(免疫细胞来自供体，并且在向非供体的受试者施用之前已经被离体修饰)。
这等同于陈述提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用CAR，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
癌症通常选自白血病、淋巴瘤或MM。最特别地，它是MM。原则上，任何表达BCMA的癌症都适合治疗；已知BCMA是MM中的主要抗原。
或者，提供了治疗自身免疫性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用CAR，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
待治疗的自身免疫性疾病通常选自RA、SLE和MS。
CAR通常以有效量(即，导致接受治疗的受试者的至少一种症状或参数改善的量)施用。方法可以包括由此改善疾病的至少一种症状或参数的进一步步骤。
在这些治疗方法中，CAR可以进一步含有针对它们或针对特定的结构域所描述的所有特征。
治疗方法可以是自体方法(受试者接受源自他或她的身体的细胞)或者可以是同种异体方法(细胞源自不是受试者的供体)。
根据另一个方面，提供了本文所述的核酸分子(即编码抗BCMA CAR)，用作药物。通常，这些核酸分子随后将用于转导细胞，使得其表达CAR。尽管细胞通常是向有需要的受试者施用的药剂，但核酸分子通常更易于储存或运输，并且更适合用作药物。此外，虽然不是特别优选，但本文也涉及将核酸分子直接施用于受试者。根据进一步的特定方面，提供了本文所述的核酸，用于治疗癌症。根据特定的实施方案，癌症选自白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤(MM)。最特别地，提供了核酸，用于治疗多发性骨髓瘤。根据可选的实施方案，提供了核酸分子，用于治疗自身免疫性疾病。示例性的自身免疫性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化症。
同样，提供了本文所述的载体(即编码抗BCMA CAR)，用作药物。通常，这些载体随后将用于转导细胞，使得其表达CAR。尽管细胞通常是向有需要的受试者施用的药剂，但载体分子通常更易于储存或运输，并且更适合用作药物。此外，虽然不是特别优选，但本文也涉及将载体直接施用于受试者。根据进一步的特定方面，提供了本文所述的载体，用于治疗癌症。根据的特定实施方案，癌症选自白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤(MM)。最特别地，提供了载体，用于治疗多发性骨髓瘤。根据可选的实施方案，提供了载体，用于治疗自身免疫性疾病。示例性的自身免疫性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化症。
这等同于陈述提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用编码CAR的核酸分子，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
或者，提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用含有编码CAR的核酸分子的载体，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
癌症通常选自白血病、淋巴瘤或MM。最特别地，它是MM。
或者，提供了治疗自身免疫性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用编码CAR的核酸，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
或者，提供了治疗自身免疫性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用含有编码CAR的核酸的载体，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
待治疗的自身免疫性疾病通常选自RA、SLE和MS。
核酸或载体通常以有效量(即，导致接受治疗的受试者的至少一种症状或参数改善的量)施用。方法可以包括由此改善疾病的至少一种症状或参数的进一步步骤。
在这些治疗方法中，CAR可以进一步含有针对它们或针对特定的结构域所描述的所有特征。编码本文所述的CAR的核酸或载体可以含有进一步的特征以提高治疗功效。例如，当提供用于同种异体方法时，核酸/载体通常将进一步包含T细胞受体复合物的抑制剂，以防止GvHD。通常包含在核酸或载体构建体中的其他元素包括但不限于检查点抑制剂、细胞因子、趋化因子等。
然而，最典型地，核酸分子和载体不会直接施用于受试者。相反，它们将用于过继细胞转移(ACT)的方法。ACT是指将细胞(最常见为免疫细胞)转移到患者体内。这些细胞可能源自患者(自体疗法)或源自其他个体(同种异体疗法)。疗法的目标是提高免疫功能和特性，和在癌症免疫疗法中提高对癌症的免疫反应。尽管T细胞最常用于ACT，但它的实施也可通过使用其他免疫细胞类型，例如NK细胞、淋巴细胞(例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))、树突细胞和骨髓细胞。也可以使用干细胞，例如诱导性多能性干细胞(iPSC)。
根据该方面，提供细胞(从待治疗的受试者或从供体获得)，然后将这些细胞用本文所述的核酸分子或载体转导、转染或以其他方式工程化。然后可以将所得细胞施用于受试者(在自体疗法的情况下是相同的受试者，或者在同种异体疗法的情况下是不同的受试者)。
因此，提供了一种对细胞进行工程化的方法，其包括：
-提供源自受试者的细胞
-在所述细胞中引入编码CAR的核酸分子，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
或者，提供了一种对细胞进行工程化的方法，其包括：
-提供源自受试者的细胞
-在所述细胞中引入含有编码CAR的核酸分子的载体，所述CAR含有抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SGSYFWG(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ IDNO:2)的氨基酸序列的重链CDR2以及具有HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3。
根据特定的实施方案，这些方法是离体或体外方法。
在这些方法中，CAR可以进一步包含针对它们或针对特定的结构域所描述的所有特征。细胞通常是免疫细胞。最特别地，细胞选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、淋巴细胞、树突细胞、骨髓细胞、干细胞、祖细胞或iPSC。
当细胞被工程化用于同种异体方法时，核酸分子或载体可额外含有预防或减少移植物抗宿主病的特征，例如编码TCR功能抑制剂的核酸(例如shRNA或TCR抑制分子，如WO2013166051中所述)。
该方法可以进一步包括将工程化的细胞施用于有需要的受试者，使它们成为治疗方法的步骤。治疗方法可以是自体方法(受试者接受源自他或她身体的细胞)或同种异体方法(细胞源自不是受试者的供体)。
细胞通常以有效量(即，导致接受治疗的受试者的至少一种症状或参数改善的量)施用。方法可以含有由此改善疾病的至少一种症状或参数的进一步步骤。
应当理解，尽管本文已经针对本发明的细胞和方法讨论了特定的实施方案、具体的配置以及材料和/或分子，但是在不脱离本发明的范围和精神的情况下可以在形式和细节上进行各种改变或修改。提供以下实施例以更好地说明特定的实施方案，并且不应将它们视为限制本申请。本申请仅受权利要求的限制。
实施例
实施例1.几种BCMA CAR的设计
为了能够并排比较针对改进的BCMA CAR的不同结合部分，使用了相同的骨架构建体，其中在待测试的不同构建体之间仅改变了BCMA-CAR的结合部分。该骨架构建体如图1A所示，基于逆转录病毒载体，并进一步含有标记物。此外，为了在同种异体环境中使用，制备了相同的构建体，其进一步含有针对CD247的shRNA(图1A，底部)。当在细胞中表达时，该shRNA干扰T细胞受体复合物的功能，并因此能够防止同种异体ACT中的移植物抗宿主病(GvHD)的发展。
BCMA CAR的设计更详细地显示在图1B中。测试了十一种不同的结合部分，但铰链、跨膜和CD3ζ信号传导结构域保持相同。每种构建体都以具有CD28或4-1BB共刺激结构域的版本进行了测试。对于BCMA结合部分(所有抗BCMA scFv)，一些序列取自目前正在开发的BCMA CAR(作为基准)，而其他序列则来自之前未在CAR中使用过的BCMA抗体。CAR序列的实例是来自WO2013154760、WO2015158671和WO2016014789的那些。
实施例2.不同CAR的体外性质
为了测试是否所有CAR都可以成功表达，将来自三个不同健康供体的PBMC用所示BCMA CAR构建体或Mock(tCD34)对照载体转导。比较了第4天到第10天之间的细胞扩增倍数(图2A)。所有构建体都显示出相似的倍数扩增。在用不同BCMA CAR构建体转导的细胞之间，收获时的存活率也相当(图2B)。从这里开始的结果是使用基于4-1BB的CAR完成的。
接下来，为了评估不同scFv与BCMA结合的亲合力，将用不同的BCMA-CAR构建体转导的细胞用BCMA-Fc融合蛋白染色。在第二步中，将细胞用结合有PE的抗Fc和结合有APC的抗CD34抗体染色。使用tCD34的平均荧光强度作为替代标记物，转基因在细胞表面的表达如图3A所示。
图3B显示了在T细胞的全部群中评价的BCMA-CAR阳性细胞百分比(％)的总结。对于BCAM CAR+T细胞，BCMA-Fc染色的中值荧光强度(MFI)也显示在图3B中。在这里可以看出，一些scFv对BCMA的亲合力比其他scFv更好。差异不是由于表达水平的变化，因为来自同一载体的tCD34水平没有变化。因此，亲合力差异大部分是由于BCMA识别而不能单独归因于表达。
实施例3.抗肿瘤细胞活性
为了进一步评估不同抗BCMA CAR的活性，评估了不同BCMA-CAR T细胞的细胞毒性和抗癌细胞活性。通过将CAR T细胞以1:1的比例与不同的表达BCMA的MM癌细胞系(RPMI-8226、OPM-2和U266)孵育24小时，探索了不同的scFv引发功能性应答的能力。释放到培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)被用作细胞毒性和胞溶作用的生物标记物。结果如图4所示。构建体#4、#6和#11显示出独立于癌细胞系的最高水平的细胞毒活性，而构建体#3显示出针对RPMI-8226和OPM-2肿瘤细胞的非常高的细胞毒活性。
同样，使用干扰素γ分泌来测量抗癌细胞活性。为此，将不同的表达BCMA的癌细胞系与Mock(tCD34)或表达BCMA-CAR的T细胞共培养。共培养24小时后，测量上清液中的IFN-γ水平。结果如图5所示。最高水平的IFN-γ由用构建体#4、#6和#11转导的T细胞分泌，这与参与测定的癌细胞系无关。
基于转基因的表达水平和T细胞针对表达BCMA的MM细胞系的功能，与被评估的其他构建体相比，带有scFv#4和#11的构建体系统地表现出更高的性能，并被选择用于验证阶段的进一步研究。
使用来自7名与初级筛选中不同的健康供体的PBMC，利用构建体#4和#11以及对照T细胞(使用相同的载体骨架但没有CAR)来生成CAR T细胞。分别使用ELISA和LDH测定，在CAR T细胞和由7个健康供体产生的对照T细胞与MM癌细胞系(RPMI-8226、OPM-2和KMS-11)的24小时共培养物的上清液中，测量IFN-γ分泌和细胞毒活性(数据未显示)。
虽然两种构建体都引发了针对MM癌细胞系的有效细胞毒性反应，但构建体#11在与表达BCMA的癌细胞系共培养时显示出更高的IFN-γ分泌的趋势。由于scFv#11是人源化的，而scFv#4是鼠类来源的(源自WO2018028647的表5中的BCAR003)，因此选择构建体#11用于进一步表征和体内评估，其逻辑是避免潜在诱导宿主免疫反应和因此的受限的持久性(Stoiber et al.,2019)。
简而言之，BCMA scFv#11优于其他被测试的scFv：它不仅具有高表达水平和亲合力，而且还是以可重复的方式对被测试的三种不同癌细胞系具有最高活性的CAR。
scFv#4是源自二价CAR的单价序列，所用的scFv对应于WO2018028647中序列308的前295个氨基酸。值得注意的是，scFv#11源自一种以前未在CAR中使用的抗体，因此在这些分析中，其优于目前临床开发中的几种scFv。scFv#11是源自WO2017031104(“抗bcma抗体，与bcma和cd3结合的双特异性抗原结合分子，及其用途”，其全文并入本文)的序列。简而言之，其中描述的抗体的结合序列已用于通过散布有接头肽融合重链和轻链的可变区来产生scFv。scFv#11的CDR对应于：
重链:
CDR1：SGSYFWG(SEQ ID NO:1)，
CDR2：SIYYSGITYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)，
CDR3：HDGAVAGLFDY(SEQ ID NO:3)
轻链:
CDR1：GGNNIGSKSVH(SEQ ID NO:4)，
CDR2：DDSDRPS(SEQ ID NO:5)，
CDR3：QVWDSSSDHVV(SEQ ID NO:6)。
更详细地，重链含有氨基酸序列QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)，轻链含有序列SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:8)。
本文中所使用的scFv#11的完整序列对应于MALPVTALLLPLALLLHAARPQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLSS(SEQ ID NO:14)。本文中所使用的scFv#4的序列对应于MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAVQLVESGGGLVQAGDSLRLTCTASGRAFSTYFMAWFRQAPGKEREFVAGIAWSGGSTAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCASRGIEVEEFGAWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPP(SEQ ID NO:15)。
为了制造各自的CAR，两个序列都与CD8结构域和CD3ζ结构域融合。用于这些的相应序列是：
AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE(SEQ ID NO:16)和LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:17)。
实施例4.体内抗肿瘤活性
为了检查scFv#11在体外测定中的优越性能是否也转化为体内抗肿瘤功效，在小鼠中进行了一项实验。NSG小鼠植入有KMS11-luc多发性骨髓瘤细胞。在第5天进行生物发光测量后，将小鼠随机分为三个不同的组。在第6天，用媒介物对照、tCD34转导的T细胞或用选定的BCMA-CAR转导的T细胞处理动物。结果如图6所示。
虽然在媒介物和mock处理的动物中，肿瘤继续生长，但在用选定的BCMA CAR处理的小鼠中，肿瘤缩小。在三只动物中的一只中，肿瘤开始重新生长，而在另外两只动物中，生物发光似乎保持在平台水平。这种剩余的生物发光很可能是由于背景发光，因为这两只动物似乎都没有肿瘤。
除了肿瘤生长之外，还在两种不同的MM异种移植模型中评估了长期存活率，以评估基于scFv#11的抗BCMA CAR的体内抗肿瘤活性。在第一个模型中，将5×106个KMS-11细胞静脉注射到Nod-Scid IL-2Rg-/-(NSG)小鼠中，然后在6天后输注107个T细胞或媒介物。来自2个不同健康供体的取出材料(apheretic material)用于生成具有针对CD3ζ的shRNA的基于scFv#11抗BCMA CAR细胞(参见图1A；此特定构建体在本文中也称为CYAD-211)，以及对照T细胞，其用没有BCMA CAR和shRNA-CD3ζ的相同载体转导。虽然接受媒介物注射或对照T细胞的小鼠死于肿瘤，其中位生存期分别为35天和43天，但注射了基于scFv#11的抗BCMA CART细胞的小鼠在实验结束前仍然存活，显示出与各供体的对照细胞的统计学显著差异(图7A)。
基于RPMI-8226癌细胞的注射，使用相同的方法测试CYAD-211细胞对第二个MM模型的功效。简而言之，在静脉注射5×106个RPMI-8226细胞后14天，在NSG小鼠中施用107个CYAD-211细胞、107个对照T细胞或媒介物。如图7B所示，注射媒介物的小鼠表现的中位存活期为49天。在供体1中，注射对照T细胞的小鼠的中位存活期为58天，而注射CYAD-211细胞的所有小鼠在实验结束前均存活。对于供体2，所有注射人T细胞的小鼠在实验结束前均存活。两种模式都证明了该CAR在体内对MM癌细胞的有效抗肿瘤活性。
实施例5.药代动力学和毒理学
在基于RPMI-8226的MM小鼠模型中评估外周血和骨髓中CYAD-211细胞的频率。对NSG小鼠注射5×106个RPMI-8226细胞(表达BCMA的MM肿瘤细胞)。肿瘤形成后14天，小鼠接受了107个CYAD-211细胞的单次静脉注射。如图8所示，注射后4小时，在注射CYAD-211细胞的小鼠的外周血中几乎检测不到人T细胞。在注射媒介物的小鼠中未检测到人细胞，证明了该测定的特异性。注射后48小时，血液中的人T细胞频率增加达到峰值，占总细胞的4.1％。在这点之后，CYAD-211细胞频率逐渐下降，注射后2周几乎检测不到，注射后1个月检测不到。
毒理学
向健康或荷瘤的NGS小鼠静脉注射CYAD-211细胞具有良好的耐受性，并且未产生任何显著的毒性或组织学损伤。
在RPMI-8226MM肿瘤形成后14天，通过单次静脉注射107个CYAD-211细胞后的血清生化分析研究了CYAD-211的潜在肝和肾毒性。在媒介物或CYAD-211细胞注射之前和之后4小时、1天、2天、1周、2周和1个月，分析了小鼠血清中的天门冬氨酸转氨酶(AST)和肌酐浓度。
AST催化天门冬氨酸和谷氨酸之间的α-氨基转移。AST存在于肝脏、心脏、骨骼肌、肾脏、大脑和红细胞中，并且AST的血清水平通常用作肝功能衰竭的生物标记物。注射CYAD-211的小鼠的AST水平与注射媒介物的小鼠中观察到的相似(数据未显示)。在这两组动物中，AST水平在整个研究过程中保持很低，表明没有明显的肝损伤。
肌酐是肌肉中磷酸肌酸的分解产物。血清中肌酐水平升高是肾功能障碍的标志。
注射媒介物或CYAD-211细胞的所有小鼠的肌酐水平在整个实验过程中保持相对稳定并在基线值(平均值±3xSD)内(对于媒介物在12±1μmol/L和22±6μmol/L之间，对于CYAD-211组在18±1μmol/L和15±2μmol/L之间)。在注射后48小时，注射有媒介物的小鼠的肌酐水平显示49±5μmol/L处的峰值，这可能表明媒介物的短暂作用。在同一时间点，注射CYAD-211的小鼠的肌酐水平为29±9μmol/L，更接近基线水平。注射后1个月，注射CYAD-211的小鼠的肌酐水平略高于基线平均值(33±1μmol/L)。
总的来说，血清的生化分析表明，CYAD-211细胞的耐受性良好，没有明显的肾或肝功能障碍的证据。
同种异体毒性：移植物抗宿主病(GvHD)
同种异体T细胞疗法目前的主要挑战是可能诱导GvHD。GvHD的黄金标准体内模型是在亚致死照射后在免疫缺陷小鼠品系中施用人T细胞，这可以改善人细胞植入。异种GvHD最初表现为体重减轻，逐渐导致恶病质和死亡(Ali et al.,2012)。
为了评估GvHD，NGS小鼠在单次静脉注射20×106个人T细胞或媒介物前1天接受了总共1.44Gy的身体照射。媒介物注射是本研究中的一个重要对照，因为NGS小鼠缺乏参与DNA双链断裂修复的DNA依赖性蛋白激酶催化亚基，因此单独照射可能会引起毒性(Fulopand Phillips,1990)。来自3个不同健康供体的取出材料用于生产CYAD-211细胞和对照T细胞，其中对照T细胞用与CYAD-211具有相同骨架但没有BCMA CAR或shRNA-CD3ζ的载体转导。对照T细胞在细胞表面上具有完整的TCR，因此有产生GvHD的潜力，因此在本实验中作为阳性对照。
在被测试的3个供体中，使用源自供体3的细胞观察到NGS小鼠的最高植入。对于所有供体，初始植入是相似的(对于供体1、2和3分别为8.8±2.3％、5.5±2.0％和7.8±3.0％)。对照T细胞的频率在第7天在所有供体中显示出初始峰值。在此点之后，在注射来自供体1和2的细胞的小鼠中，T细胞的频率逐渐降低，对于前者，在第42天达到几乎无法检测到的水平，而对于后者，在实验结束前保持在稳定状态。在注射来自供体3的对照T细胞的小鼠中，在最初的小幅下降后，T细胞频率逐渐增加，在第28天，即该组死亡或安乐死前的最后一天，达到47.4±19.3％。
对于CYAD-211细胞，T细胞植入动力学是不同的。在与对照T细胞相似的初始植入后，(对于供体1、2和3，第1天的平均频率分别为12.3±4.1％、6.5±2.3％和6.8±2.0％)，T细胞频率保持相对稳定直到第14天，此后降低，到第42天达到检测不到的水平(数据未显示)。
对于3个供体，对照T细胞的植入动力学与GvHD的产生相关。事实上，源自供体3的对照T细胞表现出最高的植入，产生GvHD，到第23天显示开始体重减轻，中位生存期为32天(图9和数据未显示)。注射来自供体1的对照T细胞的小鼠，表现出最低的植入，没有显示出任何GvHD的迹象，而施用了来自供体2的对照T细胞的小鼠，具有中等的植入，在接近实验结束时(到第37天)表现出开始体重减轻，一只小鼠在第68天死亡。
在第15、51和65天，在所有组和供体中都可以观察到有限和短暂的体重减轻。由于这也在注射媒介物的小鼠中以相同的程度在相同的时间点观察到，所以这可以归因于媒介物、处理(包括抽血)或辐射效应。
重要的是，注射有来自3个供体中任何一个的CYAD-211细胞的小鼠都没有表现出特定的体重减轻，并且所有小鼠在实验结束前均存活(图9和数据未显示)。这些数据表明，CYAD-211细胞的静脉注射具有良好的耐受性，未产生任何显著的全身毒性，也未产生任何异种GvHD的迹象。
结论
对基于scFv#11的BCMA CAR的体内治疗影响的研究表明，这些细胞在两种不同的鼠类MM模型中都抑制肿瘤生长。靶向CD3ζ的shRNA的表达与BCMA CAR一起，以便CAR可用于同种异体环境，保护小鼠免受异种GvHD，并且没有观察到体重减轻或任何其他全身或组织毒性或组织学损伤。
总体而言，实现基于scFv#11的BCMA CAR设计和功能评估的一组实验证明了高功效以及有利的安全性。
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Claims (18)
1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗BCMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链CDR2以及具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3。
2.如权利要求1所述的CAR，其中所述抗BCMA结合结构域还包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2以及具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3。
3.如权利要求1或2中任一项所述的CAR，其中所述重链包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的CAR，其中所述轻链包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
5.如权利要求1至4中任一项所述的CAR，其中在CDR1中存在G到S和/或F到Y的突变。
6.如权利要求1至5中任一项所述的CAR，其中在CDR2的7位存在I至S的突变。
7.如权利要求1至6中任一项所述的CAR，其中在CDR3中存在V至T的突变。
8.如权利要求1至7中任一项所述的CAR，其中所述信号传导结构域包含选自CD3ζ结构域、FcεRIγ结构域、CD3ε结构域和DAP10/DAP12结构域的信号传导结构域。
9.如权利要求1至8中任一项所述的CAR，其中所述信号传导结构域还包含选自CD28、4-1BB、OX40、ICOS、DAP10、DAP12、CD27和CD2的共刺激结构域。
10.一种核酸分子，其编码如权利要求1至9中任一项所述的CAR。
11.一种载体，其包含如权利要求10所述的核酸分子，任选地还包含针对CD3ζ的shRNA。
12.一种细胞，其包含如权利要求1至9所述的CAR、如权利要求10所述的核酸分子或如权利要求11所述的载体。
13.如权利要求12所述的细胞或如权利要求10所述的核酸分子，用作药物。
14.如权利要求12所述的细胞或如权利要求10所述的核酸分子，用于治疗癌症。
15.如权利要求12所述的细胞或如权利要求10所述的核酸分子，用于同种异体疗法，特别是同种异体癌症疗法。
16.如权利要求14或15所述的细胞或核酸分子，其中所述癌症选自白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤(MM)。
17.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用包含如权利要求1至9所述的CAR、如权利要求10所述的核酸分子或如权利要求11所述的载体的细胞。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述癌症选自白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤(MM)。
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