EA016609B1 - Рекомбинантные моновалентные антитела и способы их получения - Google Patents

Рекомбинантные моновалентные антитела и способы их получения Download PDF

Info

Publication number
EA016609B1
EA016609B1 EA200801460A EA200801460A EA016609B1 EA 016609 B1 EA016609 B1 EA 016609B1 EA 200801460 A EA200801460 A EA 200801460A EA 200801460 A EA200801460 A EA 200801460A EA 016609 B1 EA016609 B1 EA 016609B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
region
amino acid
antibodies
monovalent
antibody
Prior art date
Application number
EA200801460A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801460A1 (ru
Inventor
Пауль Паррен
Янине Схюирман
Том Винк
Виллем Карел Блекер
Ян Г.Й. Ван Де Винкел
Патрик Ван Беркел
Франк Бёрскенс
Original Assignee
Генмаб А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Генмаб А/С filed Critical Генмаб А/С
Publication of EA200801460A1 publication Critical patent/EA200801460A1/ru
Publication of EA016609B1 publication Critical patent/EA016609B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell

Abstract

Настоящее изобретение относится к моновалентным антителам с длительным временем полужизни при введении in vivo, способам получения таких моновалентных антител, фармацевтическим композициям, содержащим такие антитела, и применениям таких моновалентных антител.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к моновалентным антителам, которые можно использовать в терапевтических применениях. Изобретение также относится к способам получения моновалентных антител, фармацевтическим композициям, содержащим такие моновалентные антитела, и их использованию для различных терапевтических применений.
Предшествующий уровень изобретения
Нативные антитела и иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой около 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких (Ь) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как число дисульфидных связей изменяется для тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной части (в данном описании сокращенно Уь) и константной части (в данном описании сокращенно Сь). Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной части (в данном описании сокращенно УН) и константной части (в данном описании сокращенно СН, состоящей из трех доменов СН1, СН2 и СН3). СН1, СН2 тяжелой цепи отделены друг от друга так называемой шарнирной областью. Шарнирная область обычно содержит один или несколько цистеиновых остатков, которые могут образовывать дисульфидные мостики с цистеиновыми остатками шарнирной области другой тяжелой цепи в молекуле антитела.
В последнее время антитела стали областью пристального внимания для терапевтических применений, и многие лекарственные продукты на основе антител одобрены или находятся в процессе принятия для применения в качестве терапевтических лекарственных средств. Желательные свойства лечебных антител могут изменяться в соответствии с конкретным состоянием, от которого необходимо лечить. При некоторых показаниях требуется только связывание антигена, например, когда лечебное действие антител должно блокировать взаимодействие между антигеном и одной или несколькими определенными молекулами, способными в других случаях связываться с антигеном. При таких показаниях может быть предпочтительным использование РаЬ-фрагментов, единственной функцией которых является связывание антигена. При других показаниях также могут потребоваться другие действия, такие как, например, способность индуцировать активацию комплемента и/или способность, например, связывать Ререцепторы, защищать от катаболизма, рекрутировать иммунокомпетентные клетки и т.д. Для такого применения могут потребоваться другие части молекулы антитела, такие как Рс-область. Некоторые полноразмерные антитела могут проявлять антагонистическое действие (которое может рассматриваться как нежелательное) после связывания с антигеном-мишенью, даже если антитело работает как антагонист, когда используется в виде РаЬ-фрагмента. В некоторых случаях действие может быть связано с перекрестным сшиванием двухвалентных антител, которое, в свою очередь, промотирует димеризацию мишени, которая может привести к активации, в особенности когда мишенью является рецептор. В случае растворимых антигенов димеризация может привести к образованию нежелательных иммунных комплексов.
В некоторых случаях моновалентное связывание с антигеном, как в случае РсаШ, может активировать сигналы апоптоза (Капатига е! а1., В1оой риЫкйей оп 1те, 8ер!етЬег 25, 2006).
Таким образом, при некоторых показаниях могут быть предпочтительны моновалентные антитела. Доступные в настоящее время РаЬ-фрагменты показывают слабую фармакокинетику из-за их небольшого размера, приводящего к фильтрации в почках, а также их неспособности взаимодействовать с рецептором ВгатЬе11 РсРп (Лшдйапз К..Р. е! а1., Ргос. №111. Лсай. 8с1. И8А, 93(11), 5512-6 (1996)), причем поэтому не устойчивы ш νίνο и имеют очень быстрый клиренс после введения.
Также описаны димерные моновалентные антитела (РаЬ/с), в которых Рс-область содержит два полипептида Рс (АО 200563816, СепеШесН апй Ратйат Р., 1. 1ттипо1., 131(6), 2895-902 (1983)).
Также существует потребность в стабильных моновалентных антителах для применения в качестве лечебных средств.
Делеция одного или нескольких доменов из полноразмерных антител, перекрывающая, например, области, содержащие аминокислотные остатки, необходимые для формирования дисульфидных мостиков или обеспечения нековалентных контактов внутри тяжелой цепи в антителе, может представлять путь конструирования моновалентных антител.
1дагз1и е! а1. (1дагзЫ Т.М. е! а1., ВюсйетщДу, 29, 5727 (1990)) описывают структуру молекулы мышиного 1§С2а, в которой полностью удален домен СН1, но шарнирная область осталась неизменной. Показано, что антитело с делетированным СН1 существует как протяженная структура с относительно небольшим шарнирным углом. Однако молекула сохраняет упорядоченную тетрамерную конфигурацию, состоящую из двух легких цепей и двух тяжелых цепей, ожидаемых для 1дО, и, таким образом, все еще является двухвалентной, и делеция СН1 не влияет на аффинность мутированного антитела.
Ьатзоп е! а1. (Ьагаоп 8.В. е! а1., 1. Мо1. Βίο1., 348, 1177 (2005)) описывают структуру гуманизированного антитела 1дС1, в котором делетирован домен СН2. Такое антитело существует в двух молекулярных формах, названных формой А и формой В. Форма А содержит две внутрицепные дисульфидные связи в шарнире, в то время как форма В не содержит внутрицепных дисульфидных связей. Форма В существует как молекула в ~122 кД, которая, как оказывается, удерживается нековалентными взаимодействиями в
- 1 016609 пределах домена Сн3. Антитело быстро выводится из сыворотки из-за неспособности связываться с рецепторами ЕсВп и возвращаться через них в цикл.
Половинные молекулы 1д, которые имеют димерную конфигурацию, включающую только одну легкую цепь и только одну тяжелую цепь, описаны как результат редких делеций при плазмацитомах человека и мыши. У некоторых пациентов, страдающих от экстрамедуллярной плазмацитомы мягких тканей, макроглобуленемии Вальденстрёма, плазмоцитарного лейкоза и множественной миеломы, половинные молекулы 1дС выделяют в моче. Также обнаружено присутствие половинных молекул в сыворотке. Исследование биохимической природы таких половинных молекул показало, что они состоят из молекул 1дС1, в которых области тяжелой цепи Сн1, шарнирная и Сн2 являются нормальными, в то время как в области Сн3 обнаружены делеции. При анализе делеций в домене Сн3 константной области в половинной молекуле 1дС1 8ре1еде1Ьегд показал, что она включает 5000-8000 Да и шарнирная пептидная последовательность идентична 1дС 1 дикого типа. Оказалось, что мутации локализованы в Сн3, а шарнирный пептид является нормальным (ПоЬЬк ТВ. е! а1., С1ш. Ехр. 1ттипо1., 5, 199 (1969); ИоЬЬх 1.В., Вг. Меб. 1., 2, 67 (1971); 8ре1еде1Ьегд н.Ь. е! а1., В1ооб, 45, 305 (1975); 8ре1еде1Ьегд н.Ь. е! а1., Вюсйетк!гу, 14, 2157 (1975); 8еНдтапп М.Е. е! а1., Апп. 1ттипо1., (Рагк), 129С, 855-870 (1978); Са11апдо М.Х. е! а1., В1и!, 48, 91 (1983)). Также показано, что такая половинная молекула !дС1 человека быстро диссимилирует (время полужизни у человека составляет 4,3 суток) и в мономерной форме неспособна связываться с рецепторами С.’1с.| или Ее на лимфоцитах, моноцитах или нейтрофилах человека (8ре1еде1Ьегд н.Ь., 1. С1ш. 1пуе§!., 56, 588 (1975)). Из этих исследований сделан вывод, что половинной молекуле 1дС1 недостает нековалентных взаимодействий, характерных для части Ес тяжелой цепи 1дС. что дестабилизирует молекулу и что домен Сн3 может быть особенно важным для сохранения взаимодействий между тяжелыми цепями 1дС.
Также описаны половинные молекулы мышиного 1дС, которые получены в результате соматической мутации (МшЫпкк! 1.Е., 1. 1ттипо1., 106, 41 (1971); МикЫпкк! ТЕ. е! а1., 1. 1ттипо1., 117, 1668 (1976); Ро!!ег М. е! а1., 1. Мо1. Вю1., 93, 537 (1964); ВоЬшзоп Е.А. е! а1., 1. Вю1. Сйет., 249, 6605 (1974); 2аск И.1. е! а1., 1. Ехр. Меб., 154, 1554 (1981)). Показано, что все такие молекулы содержат делеции домена Сн3 или мутации в сочленении Сн2-Сн3. Половинные молекулы 1дС человека также обнаружены у пациентов с множественной миеломой. Обнаружено, что такие молекулы имеют делеции, также локализованные в участках Сн3 (8ре1еде1Ьегд н.Ь., 1. С1ш. 1пуе§!., 58, 1259 (1976); Ка^а1 Т. е! а1., Апп. Асаб. Меб. 8шдароге, 9, 50 (1980); ЗакшаЬауакЫ I. е! а1., В1ооб, 53, 269 (1979); В1е^епда 1. е! а1., С1ш. Ехр. 1ттипо1., 51, 395 (1983)).
Описаны и кристаллизованы мутанты человеческого 1дС1 с шарнирными делениями (8арЫге Е.О. е! а1., 1. Мо1. Вю1., 319, 95 (2002)). ИоЬ и Мсд являются белками миеломы человека подкласса человеческого 1дС1, которые содержат делецию шарнирной области. Такие молекулы 1дС1 с делетированной шарнирной областью образуют стабильные 1д со структурой, состоящей из двух тяжелых и двух легких цепей, которая является типичной гетеротетрамерной структурой антител, которая, однако, образует внутрицепные дисульфидные связи между легкими цепями, что приводит к молекулам, которые конформационно сильно ограничены и которые проявляют слабую эффекторную функцию или не проявляют ее (Вийоп И.В. е! а1., 1. Мо1. Вю1., 319, 9 (2002); 8!ешег А. е! а1., Вюсйеткбу, 18, 4068 (1979); Зйуейоп Е.А. е! а1., Ргос. Иа!1. Асаб. 8с1. И8А, 74, 5140 (1977); Кгуап 8.8. е! а1., Мо1. 1ттипо1., 20, 787 (2983); Сибба! А. е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И8А, 90, 4271 (1993); Загта В. е! а1., 1. АррНеб Сгуй, 15, 476 (1982); К1еш М. е! а1., Ргос. Иаб. Асаб. 8сг И8А, 78, 524 (1981)).
Создана молекула 1дС3, в которой делетированы верхняя и средняя части шарнирных областей или полная шарнирная область (Вгекке О.н. е! а1., Иа!иге, 363, 628 (1993); Вгекке О.н. е! а1., Иа!иге, 383, 103 (1996)). В популяции молекул с полностью делегированным шарниром присутствуют половинные молекулы после анализа с помощью невосстанавливающего 8И8-РАСЕ. Во второй популяции молекул с делетированным шарниром, в которых все верхние и нижние части шарнира 1дС3 заменены одним цистеином и нижняя часть шарнира 1дС3 содержит одну делецию А1а, также содержатся половинные молекулы согласно анализу 8И8-РАСЕ. Однако результаты показывают, что в физиологических условиях две половинные молекулы из тяжелой-легкой цепей удерживаются вместе нековалентными взаимодействиями между доменами Сн3 1дС3 и поэтому образуются интактные молекулы 1дС.
Также получен соответствующий набор химерных антител 1дС1 и 1дС4 (Иогдаи С. е! а1., 1. 1ттипо1., 150, 5400 (1993)). Для того чтобы исследовать роль шарнирной области 1дС в связывании антитела с антигеном, получили мутантов как 1дС1, так и 1дС4, лишенных шарнирной области. Мутантов получили с помощью делеций ДНК экзота шарнирной области из генов тяжелых цепей 1дС1 и 1дС4. Сообщалось, что молекулы как 1дС1, так и 1дС4 с делетированными шарнирными областями являются двухвалентными, поэтому имеют типичную гетеротетрамерную структуру. В поддержку этого функциональная аффинность 1дС4 с делетированной шарнирной областью показала лучшее связывание с антигеном, чем 1дС4 дикого типа, что показывает, что на авидность молекулы с делетированной шарнирной областью не влияет полученная таким образом делеция шарнирной области.
Молекулы человеческого 1дС4 существуют в различных молекулярных формах, которые различаются отсутствием или наличием дисульфидных связей внутри тяжелой цепи, локализованных в шарнир
- 2 016609 ной области. Таким образом, существуют молекулы 1§С4. в которых образовались две или одна дисульфидные связи или они не образовались (Зсйииттап 1. е! а1.. Мо1. 1ттипо1.. 38. 1 (2001)). В физиологических условиях такие молекулярные формы 1§С4 могут находиться в равновесии друг с другом. Человеческий 1§С4 существует в виде тетрамеров в растворе. состоящем из двух тяжелых цепей 1д и двух легких цепей. что обычно для молекул иммуноглобулина 6. безотносительно к отсутствию или наличию таких внутрицепных дисульфидных связей (Зсйииттап. 2001. цит. выше; бгедогу Ь. е! а1.. Мо1. 1ттипо1.. 24. 821 (1987)). Только после денатурации в невосстанавливающих условиях две нековалентно ассоциированные половинные молекулы диссоциируют. как показывает анализ. определяющий размеры. такой как 8Ό8-ΡΆ6Ε (Зсйииттап 1. е! а1.. Мо1. 1ттипо1.. 38. 1 (2001); Эепд Ь. е! а1.. Вю!есйпо1. Арр1. Вюсйет.. 40. 261 (2004)). Показано. что мутация остатков шарнирной области. которые вовлечены в образование внутрицепных дисульфидных связей. или делеция шарнирной области ведут к созданию гомогенного пула молекул 1§С4 в растворе. который состоит из тетрамерных молекул. состоящих из двух легких цепей и двух тяжелых цепей (Зсйииттап 1. е! а1.. Мо1. 1ттипо1. 38. 1 (2001); Ногдап С. е! а1.. 1. 1ттипо1.. 150. 5400 (1993)). 1§С4 с делетированной шарнирной областью и мутированные антитела также обладают улучшенной способностью связывать антиген при сравнении с нативными молекулами 1§С4 (Ногдап С. (1993). цит. выше).
Теперь в ряде исследований показано. что мутация или делеция доменов константной области 1дС СН1 и СН2 не влияет на сборку молекул 1дС в их естественной гетеротетрамерной конфигурации с двумя тяжелыми цепями и двумя легкими цепями. Показано. что молекулы рекомбинантных антител. содержащие различные делеции в своих константных областях тяжелой цепи. испытывают влияние на свою эффекторную функцию. например они не способны к активации комплемента. однако они сохраняют свою способность к связыванию антигена. Более того. показано. что половинные молекулы антител. содержащие только одну тяжелую цепь и одну легкую цепь. нестабильны ш νί\Ό и/или имеют пониженное время полужизни ш у1уо. Делеции в/из участка СН3 дают половинные молекулы с быстрым метаболизмом. что делает их непригодными для большинства терапевтических целей.
Таким образом. существует потребность в простом способе получения стабильных моновалентных антител. которые могут быть использованы для терапевтических применений. в которых требуется блокировка антигенопосредованной активности связыванием моновалентными антителами (при отсутствии сшивания).
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения моновалентного антитела. включающему:
A) ί) обеспечение нуклеотидной конструкции. кодирующей легкую цепь указанного моновалентного антитела. причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность. кодирующую область Уъ выбранного антигенспецифического антитела. и нуклеотидную последовательность. кодирующую константную область Сь 1д. где указанная нуклеотидная последовательность. кодирующая область Уъ выбранного антигенспецифического антитела. и указанная нуклеотидная последовательность. кодирующая область Съ 1д. функционально соединены вместе. и где. в случае подтипа 1д61. нуклеотидная последовательность. кодирующая область Сь. модифицирована таким образом. что область Сь не содержит каких-либо аминокислот. способных образовывать дисульфидные связи или ковалентные связи с другими пептидами. содержащими идентичную аминокислотную последовательность области Сь. в присутствии поликлонального человеческого 1дС или при введении в организм животного или человека;
и) обеспечение нуклеотидной конструкции. кодирующей тяжелую цепь указанного моновалентного антитела. причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность. кодирующую область УН выбранного антигенспецифического антитела. и нуклеотидную последовательность. кодирующую константную область СН человеческого 1д. где указанная нуклеотидная последовательность. кодирующая область СН. модифицирована таким образом. что область. соответствующая шарнирной области. и. как требует подтип 1д. другие участки области СН. такие как участок СН3. не содержат какихлибо аминокислотных остатков. которые принимают участие в образовании дисульфидных связей или ковалентных или стабильных нековалентных межцепных связей тяжелой цепи с другими пептидами. содержащими идентичную аминокислотную последовательность области СН человеческого 1д. в присутствии поликлонального человеческого 1дС или при введении в организм животного или человека. где указанная нуклеотидная последовательность. кодирующая область УН выбранного антигенспецифического антитела. и указанная нуклеотидная последовательность. кодирующая область СН указанного 1д. функционально соединены вместе;
ϊϊΐ) обеспечение клеточной экспрессирующей системы для получения указанного моновалентного антитела;
ίν) получение указанного моновалентного антитела коэкспрессией нуклеотидных конструкций (1) и (ίί) в клетках клеточной экспрессирующей системы (ш).
В одном воплощении способа человеческий 1д представляет собой антитела 1д61. 1дС2. 1д63. 1д64. 1дА или 1дЭ. например антитела 1д61. 1дС2 или 1д64.
B) Кроме того. изобретение относится к способу. где человеческий 1д представляет собой 1д61 с аминокислотной областью СН. представленной в 8ΕΟ Ш N0: 19. где участок СН3 модифицирован таким
- 3 016609 образом, что осуществлены одна или несколько следующих замен аминокислот: Лтд (К) в позиции 238 заменен С1п (О); Акр (И) в позиции 239 заменен С1и (Е); Ьук (К) в позиции 292 заменен Агд (К); С1п (О) в позиции 302 заменен С1и (Е) и Рго (Р) в позиции 328 заменен Ьеи (Ь).
Изобретение относится к способу по В), где Агд (К) в позиции 238 заменен С1п (О).
Изобретение относится к способу по В), где Агд (К) в позиции 238 заменен С1п (О) и Рго (Р) в позиции 328 заменен Ьеи (Ь).
Изобретение относится к способу по В), где осуществлены все пять замен аминокислот.
С) Изобретение относится к способу по А) или В), где человеческий 1д представляет собой 1дС1 и область Сь представляет собой Сь легкой цепи каппа с аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕО Ш N0: 18, где область Сь модифицирована таким образом, что концевой цистеиновый остаток в позиции 106 заменен другим аминокислотным остатком или делетирован.
И) Изобретение относится к способу по А) или В), где человеческий 1д представляет собой 1дС1 и область Сь представляет собой Съ легкой цепи лямбда с аминокислотной последовательностью, представленной в 8Е0 Ш N0: 17, где область Съ модифицирована таким образом, что концевой цистеиновый остаток в позиции 104 заменен другим аминокислотным остатком или делетирован.
Е) Изобретение относится к способу по А) или В), С) или И), где человеческий 1д представляет собой 1дС1 с аминокислотной областью СН, представленной в 8Е0 Ш N0: 19, где участок СН1 модифицирован таким образом, что 8ег (8) в позиции 14 заменен цистеиновым остатком.
С) Изобретение относится к способу по А), где человеческий 1д представляет собой 1дС2 с аминокислотной последовательностью области СН, представленной в 8Е0 Ш N0: 20, где участок СН3 модифицирован таким образом, что осуществлены одна или несколько следующих замен аминокислот: Агд (К) в позиции 234 заменен С1п (О); Ме1 (М) в позиции 276 заменен Уа1 (V); Ьук (К) в позиции 288 заменен Агд (К); С1п (О) в позиции 298 заменен С1и (Е) и Рго (Р) в позиции 324 заменен Ьеи (Ь).
Изобретение относится к способу по С), где Агд (К) в позиции 234 заменен С1п (О).
Изобретение относится к способу по С), где Агд (К) в позиции 234 заменен С1п (О) и Рго (Р) в позиции 324 заменен Ьеи (Ь).
Изобретение относится к способу по С), где осуществлены все пять замен аминокислот.
Н) Изобретение относится к способу по А), где человеческий 1д представляет собой 1дС3 с аминокислотной последовательностью области СН, представленной в 8Е0 Ш N0: 21, где участок Сн3 модифицирован таким образом, что осуществлены одна или несколько следующих замен аминокислот: Агд (К) в позиции 285 заменен С1п (О); 8ег (8) в позиции 314 заменен Акп (И); Акп (И) в позиции 322 заменен Ьук (К); Ме1 (М) в позиции 327 заменен ναΐ (V); Ьук (К) в позиции 339 заменен Агд (К); С1п (О) в позиции 349 заменен С1и (Е); 11е (I) в позиции 352 заменен ναΐ (V); Агд (К) в позиции 365 заменен Н1к (Н); Рйе (Е) в позиции 366 заменен Туг (Υ) и Рго (Р) в позиции 375 заменен Ьеи (Ь).
Изобретение относится к способу по Н), где Агд (К) в позиции 285 заменен С1п (О).
Изобретение относится к способу по Н), где Агд (К) в позиции 285 заменен С1п (О) и Рго (Р) в позиции 375 заменен Ьеи (Ь).
Изобретение относится к способу по Н), где осуществлены все 10 замен.
Настоящее изобретение также относится к способу получения моновалентного антитела, включающему:
ί) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей легкую цепь указанного моновалентного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область V выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область (Сь) 1д, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область V выбранного антигенспецифического антитела, и указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область Сь 1д, функционально соединены вместе;
и) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область νιι выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН человеческого 1дС4, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь, модифицирована так, что область, соответствующая шарнирной области тяжелой цепи, не содержат каких-либо аминокислотных остатков, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей с другими пептидами, содержащими идентичную аминокислотную последовательность константной области (СН) человеческого 1дС4, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая область выбранного антигенспецифического антитела, и указанная нуклеиновая кислота, кодирующая область СН 1дС4, функционально соединены вместе;
ϊϊΐ) обеспечение клеточной экспрессирующей системы для получения указанного антитела;
ίν) получение указанного моновалентного антитела коэкспрессией нуклеотидных конструкций (ί) и (ίί) в клетках клеточной экспрессирующей системы (ш).
Настоящее изобретение также относится к моновалентному антителу, полученному с применением способа по изобретению.
Настоящее изобретение также относится к моновалентному антителу, которое можно получить с
- 4 016609 применением способа по изобретению.
Настоящее изобретение также относится к моновалентному антителу, содержащему легкую цепь и тяжелую цепь, в котором:
a) указанная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (Уь) области выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (Сь) области 1д и
b) указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (Ун) области выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (Сн) области человеческого 1дС4, где аминокислотная последовательность тяжелой цепи модифицирована так, что ни один из аминокислотных остатков, присутствующих в области, соответствующей шарнирной области, не способен принимать участие в образовании дисульфидных связей с другими пептидами, содержащими идентичную аминокислотную последовательность константной области (Сн) человеческого 1дС4.
Настоящее изобретение также относится к способу получения моновалентных антител по изобретению, включающему стадии:
a) культивирования клеток-хозяев, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую указанные моновалентные антитела; и
b) извлечения моновалентных антител из культуры клеток-хозяев.
Настоящее изобретение также относится к нуклеотидной конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую область Сн 1дС4. где нуклеотидная последовательность, кодирующая область Сн, модифицирована так, что область, соответствующая шарнирной области в указанной области Сн, не содержит каких-либо аминокислотных остатков, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей с пептидами, содержащими аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности указанной области Сн, или последовательность, комплементарную ей.
Настоящее изобретение также относится к способу получения моновалентных антител по изобретению, включающему культивирование клеток-хозяев, содержащих нуклеотидную конструкцию по изобретению, и, если указанная нуклеотидная конструкция не кодирует легкую цепь указанных антител, также содержащих нуклеотидную конструкцию, кодирующую легкую цепь указанных антител, так что экспрессируются полипептиды, и извлечение моновалентных антител из клеточной культуры.
Настоящее изобретение также относится к применению нуклеотидной конструкции по изобретению для получения моновалентного тела по изобретению.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту по изобретению.
Настоящее изобретение также относится к способу получения моновалентных антител по изобретению, включающему культивирование клеток-хозяев по изобретению, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь указанных антител, так что экспрессируются полипептиды, и извлечение моновалентных антител из клеточной культуры.
Настоящее изобретение также относится к применению клетки-хозяина по изобретению для получения моновалентных антител по изобретению.
Настоящее изобретение также относится к иммуноконъюгату, содержащему моновалентное антитело по изобретению, конъюгированное с лечебной молекулой.
Настоящее изобретение также относится к моновалентным антителам по изобретению для применения в качестве лечебного средства.
Настоящее изобретение также относится к применению моновалентных антител по изобретению в качестве лечебного средства.
Настоящее изобретение также относится к применению антител по изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения рака, расстройства клеточной пролиферации, (ауто)иммунного расстройства и/или ангиогенного расстройства, где антитела специфически связываются с заданной мишенью или эпитопом мишени, где связывание антител с указанными мишенью или эпитопом мишени эффективно при лечении указанного заболевания.
Настоящее изобретение также относится к применению антител по изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания или расстройства, которые поддаются лечению путем введения антител против определенной мишени, где вовлечение опосредованных иммунной системой активностей не является необходимым или нежелательно для достижения эффекта от введения антител, и где указанные антитела специфически связываются с указанным антигеном.
Настоящее изобретение также относится к применению антител по изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания или расстройства, которые поддаются лечению путем блокировки или ингибирования растворимого антигена, где при мультимеризации указанного антигена могут образовываться нежелательные комплексы и где указанные антитела специфически связываются с указанным антигеном.
Настоящее изобретение также относится к применению антител по изобретению для получения
- 5 016609 фармацевтической композиции для лечения заболевания или расстройства, которые поддаются лечению путем блокировки или ингибирования клеточного мембраносвязанного рецептора, где указанный рецептор может быть активирован путем димеризации указанного рецептора и где указанные антитела специфически связываются с указанным рецептором.
Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования антигена у субъекта, страдающего от заболевания или расстройства, при котором нежелательна активность антигена, включающему введение субъекту моновалентных антител по изобретению, которые специфически связываются с указанным антигеном, фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела, иммуноконъюгата, содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по изобретению, так что активность антигена у субъекта ингибируется.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания или расстройства, включающему введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества моновалентных антител по изобретению, фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела, иммуноконъюгата, содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по изобретению, посредством чего заболевание или расстройство лечится.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей моновалентные антитела по изобретению вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями.
Настоящее изобретение также относится к трансгенному животному, содержащему указанную нуклеотидную конструкцию по изобретению.
Описание чертежей
Фиг. 1 - специфические к СЭ20 антитела 7Ό8-Ι§01, 7Ό8-Ι§04 и 7Ό8-ΗΟ оценивают в невосстанавливающем δΌδ-ΡΛΟΕ.
Полоса 1: маркер, предварительно окрашенный 8еиВ1ие р1и§2 (1пуйтодеп ВУ, Нидерланды), полоса 2: внутренний контроль, полоса 3: 7Ό8-Ι§01, полоса 4: 7Ό8-Ι§04 и полоса 5: 7Ό8-ΗΟ.
Фиг. 2 - хроматограмма экстрагированных ионов для ионов [Μ+3Η]3+ и [Μ+2Η]2+ (т/ζ 676,4 и 1014,1 соответственно) с элюированием при времени Т1С 39,3 мин в восстановленной смеси СНВт/триптический гидролизат 7Ό8-ΗΟ.
Фиг. 3 - исходные данные, полученные в анализе МС с распылением до наночастиц/МС сигналов т/ζ, соответствуют пептиду, перекрывающему аминокислотные остатки 220-238 (220УАРЕРЕООР§УРЕРРРКРК238), из восстановленной смеси СНВт/триптический гидролизат 7Ό8-ΗΟ.
Фиг. 4А и 4В - интерпретация исходных данных, полученных в анализе МС с распылением до наночастиц/МС сигналов т/ζ, соответствующих пептиду, перекрывающему аминокислотные остатки 22023 8 (220УАРЕРЕООР§УРЕРРРКРК238), из восстановленной смеси СНВт/триптический гидролизат 7Ό8ΗΟ.
Фиг. 5 - специфические к СЭ20 антитела 7Ό8-Ι§01, 7Ό8-Ι§04 и 7Ό8-ΗΟ оценивают по их связыванию с клетками, трансфицированными СЭ20.
Фиг. 6 - специфические к СЭ20 антитела 7Ό8-Ι§01, 7Ό8-Ι§04 и 7Ό8-ΗΟ наносят на планшет для ЕЫ8А (интервал концентраций указан на оси х). Оценивают связывание С1с.| (2 мкг/мл).
Фиг. 7, 7А) - клетки Дауди предварительно инкубируют со специфическими к СЭ20 антителами в интервале концентраций в течение 10 мин перед добавлением ΝΗ8. Через сорок пять минут после индукции СЭС клетки ресуспендируют в растворе РЕ Лизис клеток (число РЕположительных клеток) измеряют проточной цитометрией. Данные показывают среднюю интенсивность флуоресценции РЕ положительных (погибших) клеток. Фиг. 7В) - для того чтобы оценить роль комплемента в измеренном лизисе, добавляют инактивированную нагреванием сыворотку (сыворотка ΔΤ) к клеткам, инкубированным с 10 мкг антител против 51оГ. Данные показывают среднюю интенсивность флуоресценции РЕ положительных (погибших) клеток.
Фиг. 8 - бесшарнирные (лишенные шарнирной области) антитела Ι§Ο4, направленные против Ве1у1 (ВеШ-ПО) испытывают в невосстанавливающем δΌδ-РАОЕ.
Полоса 1: маркер, предварительно окрашенный 8еиВ1ие р1и§2 Дпуйгодеп ВУ, Нидерланды), полоса 2: внутренний контроль, полоса 3: ВеШШС, полоса 4: контроль Ι§Ο1.
Фиг. 9 - гель-фильтрация ВеШШС (бесшарнирные антитела Ι§Ο4 против Ве1у1). Кондиционированную среду из клеток ΗΕ^ содержащую бесшарнирные γΙ§Ο4 ВеШШС, фракционируют на колонке с супердексом 200. В колонку вносят всего 1 мкг ВеШШС. Во фракциях определяют специфический к Ве1г1 Ι§Ο (·), инкубируя 10 мкл каждой фракции при испытании на связывание Ве1у1. Результаты выражают в виде процента меченного радиоизотопом Ве(у1 относительно добавленного количества. Пунктирная кривая представляет элюирование очищенного Веΐν1-Iд^4 (10 мкг) при ВЭЖХ по измерению поглощения при 214 нм (А214 нм).
Фиг. 10 - проверяют связывание ВеШЛдОЕ Веΐν1-Iд^4 и ВеШШС в радиоиммунном анализе. Проверяют связывание меченного 125Ι Ве1у1 с серийными разведениями антител, связанных с протеиномО на сефарозе.
- 6 016609
Фиг. 11 - в радиоиммунном анализе проверяют способность Вс1у1-1дС1. Вс1у1-1дС4 и Вс1у1-НС сшивать связанный с сефарозой Вс1у1с меченным изотопом Вс1у1. Проверяют связывание меченного 1251 Вс1у1 с серийными разведениями антител. связанных с Вс1у1 на сефарозе.
Фиг. 12 - полулогарифмический график концентраций в мышиной плазме 7Ό8-ΗΟ в сравнении с нормальным 7Ό8-Ι§64. интактным 7Ό8-Ι§61. 7Ό8-Ι§61. фрагментами Р(аЬ')2 и РаЬ 7Ό8-Ι§61 после внутривенного введения 100 мкг на мышь.
Фиг. 13 - логарифмический график скоростей клиренса из плазмы в виде зависимости доза/площадь под кривой. вычисленной из кривых зависимости концентрации от времени (Ό/ЛиС). Данные приводятся для отдельных мышей и выражены в мл-сутки-1-кг-1.
Фиг. 14 - кривые зависимости реакции от дозы. показывающие ингибирование индуцированного ЕСР фосфорилирования ЕСРг в клетках А431 тАЬ 2Р8-НС против ЕСРг. в сравнении с фрагментами 2Р8-ГдС4 и 2Е8-ЕаЬ. Верхний график показывает кривые ингибирования в бессывороточной среде. средний и нижний графики показывают ингибирование. когда в среду добавляют ГУГС в концентрации 100 и 1000 мкг/мл соответственно. Ось у представляет фосфорилированный ЕСРг. обнаруженный с помощью антифосфотирозиновых тАЬ и выраженный в единицах флуоресценции с разрешением во времени (единицы ТКР). По оси х концентрация тАЬ в мкг/мл. Точки данных представляют среднее и БЕМ из 4 повторов.
Фиг. 15 - полулогарифмический график зависимости концентраций от времени. Начальные концентрации в плазме все порядка 100 мкг/мл. что согласуется с начальным распределением в компраменте плазмы мышей. Клиренс варианта бесшарнирного 1дС4 происходит только несколько быстрее. чем нормального ГдС4. Важно. что клиренс варианта бесшарнирного 1дС4 происходит значительно медленнее. чем клиренс фрагментов Р(аЬ')2. которые имеют сравнимый молекулярный размер.
Данный эксперимент показывает. что Рс-часть оказывает благоприятное действие на время пребывания в плазме у мышей с нормальной иммунной системой и указывает на функциональное взаимодействие с неонатальным рецептором Рс (РсВп) также в присутствии эндогенного ГдС.
Фиг. 16 - связывание 2Р8-НС с покрытием из белка ЕСРг сравнивают в ЕЫБА со связыванием 2Р8ГдС4. 2Р8-ГдС1 и фрагментов РаЬ 2Р8-ГдС1 в присутствии поликлонального человеческого ГдС (ГУГС) в концентрации 100 мкг/мл.
Фиг. 17 - индукции АЭСС 2Р8-НС в сравнении с индукцией 2Р8-ГдС1 и 2Р8-ГдС4. Используют клетки А431 в качестве клеток-мишеней и мононуклеарные клетки периферической крови человека в качестве эффекторных клеток.
Фиг. 18 - последовательность праймеров. используемых в примерах.
Фиг. 19 - последовательности праймеров. используемых в примерах.
Фиг. 20 - клиренс вариантов 7Ό8 с добавлением ГУГС у мышей БОЮ. В верхней части чертежа приводятся полулогарифмические графики зависимости концентрации вариантов тАЬ 7Ό8 от времени и в нижней части концентрации полного человеческого ГдС.
Фиг. 21 - клиренс вариантов 7Ό8 у мышей РсВп -/- в сравнении с мышами дикого типа. Чертеж представляет полулогарифмический график зависимости концентрации от времени. Начальные концентрации в плазме все порядка 100 мкг/мл. что согласуется с начальным распределением в компраменте плазмы мышей. На модели сравнивают бесшарнирный вариант 1дС4 (7О8-НС). нормальный человеческий ГдС4 (7О8-ГдС4) и фрагменты из 7П8-ГдС1(7П8-С1-Р(аЬ')2).
Фиг. 22 - клетки Όϋ-145 культивируют и инкубируют с серийным разведением (А) сМс1-РаЬ. сМс1РаЬ и ГУГС. сМеРРаЬ и НСР. сМеРРаЬ и ГУГС и НСР. (В) сМеРНС. сМеРНС и ГУГС. сМеРНС и НСР. сМеРНС и ГУГС. и НСР. Рассеяние наблюдают двойным слепым методом (оценено 14 человек) под микроскопом через 48 ч. и строят график средней оценки ± БЕМ.
Фиг. 23 - клетки Όυ-145 культивируют и инкубируют с 10 мкг/мл (А) сМеРРаЬ. сМеРРаЬ и ГУГС. сМеРРаЬ и НСР. сМеРРаЬ и ГУГС. и НСР. (В) сМеРНС. сМеРНС и ГУГС. сМеРНС и НСР. сМеРНС и ГУГС. и НСР. Рассеяние наблюдают двойным слепым методом (оценено 14 человек) под микроскопом через 48 ч.
сМеРРаЬ с или без ГУГС и сМеРНС. предварительно инкубированные с ГУГС. существенно ингибируют индуцируемое НСР рассеяние. Для статистического анализа выполняют проверенный ранговый двусторонний критерий Уилкоксона с гипотетической медианой 3 (максимальное рассеяние).
Фиг. 24 - экстракты. полученные из клеток А549. инкубированные с сМеРНС (полоса 1). сМеРНС и ГУГС (полоса 2). сМеРНС (полоса 3). сМеРНС. ГУГС и НСР (полоса 4). сМеРГдС1 (полоса 5). сМеРГдС1 и ГУГС (полоса 6). расщепляют БЭБ-РАСЕ в 4-20% геле Стйетюи РгесаЧ с трис-НС1 и осуществляют вестерн-блоттинг на нитроцеллюлозной мембране. Мембрану инкубируют в течение ночи при 4°С с кроличьим ГдС против фосфо-МеррУрУрУ 1230 1234 1235) (АЬсат. аЬ5662). После промывки ТВБТ вторичные антитела. козьи антикроличьи НРР. Се11 Б1дпа1шд. 7074 в реагенте для блокировки инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре на качалке. Мембрану промывают 6 раз ТВБТ. Наконец. полосы проявляют усиливающим стоп-раствором люминала и анализируют на устройстве для визуализации Ьитбуадег. Вестерн-блоттинг показывает полосу 169 кД. указывающую на фосфо-МеррУрУрУ 1230
- 7 016609
1234 1235).
Фиг. 25 - начальная концентрация при добавлении НиМах-СБ4 или фрагментов ЕаЬ НиМах-СБ4 в анализ ίη νίίτο нейтрализации ВИЧ-1. Величины 1С50 ингибирования НиМах-СИ4 и фрагментами ЕаЬ НиМах-СИ4 вычисляют, подбирая 4-параметрическую логистическую кривую, и указывают для каждой вирусной конструкции.
Фиг. 26 - % человеческих Т-клеток, % мышиных клеток и % клеток СИ4 и % клеток СИ8, и отношение СИ4/СИ8 отдельных восстановленных РВМС мышей, обработанных интраперитонеально НиМахСИ4, контролем 1дС, и необработанных и инфицированных ВИЧ-1.
Фиг. 27 - кривые ингибирования НиМах-СИ4 или фрагментов ЕаЬ НиМах-СИ4 заражения несколькими штаммами ВИЧ-1 СИ4-ССК.5- или СИ4СХСК4-положительных клеток, измеренного по люциферазной активности (среднее из трех измерений).
Фиг. 28 - зависимость от времени концентрации НиМах-СИ4 в плазме отдельных восстановленных РВМС мышей, обработанных интраперитонеально НиМах-СИ4 или необработанных и инфицированных ВИЧ-1.
Фиг. 29 - зависимость от времени количества копий РНК ВИЧ-1 у отдельных восстановленных РВМС мышей, обработанных интраперитонеально НиМах-СИ4 или контролем 1дС или необработанных и инфицированных ВИЧ-1.
Подробное описание перечней последовательностей
8ЕР ΙΌ N0: 1: нуклеотидная последовательность Сь каппа человеческого 1д.
8ЕР ΙΌ N0: 2: аминокислотная последовательность легкой цепи каппа человеческого 1д.
8ЕР ΙΌ N0: 3: нуклеотидная последовательность Сь лямбда человеческого 1д.
8ЕР ΙΌ N0: 4: аминокислотная последовательность легкой цепи лямбда человеческого 1д.
8ЕР ΙΌ N0: 5: нуклеотидная последовательность области УН НиМаЬ-7СИ8.
8ЕР ΙΌ N0: 6: аминокислотная последовательность области УН НиМаЬ-7СИ8.
8ЕР ΙΌ N0: 7: нуклеотидная последовательность области УН мышиного антитела против ΒοΙν-1. 8ЕР ΙΌ N0: 8: аминокислотная последовательность области УН мышиного антитела против ΒοΙν-1. 8ЕР ΙΌ N0: 9: нуклеотидная последовательность области Уъ НиМаЬ-7СИ8.
8ЕР ΙΌ N0: 10: аминокислотная последовательность области Уь НиМаЬ-7СИ8.
8ЕР ΙΌ N0: 11: нуклеотидная последовательность области Уъ мышиного антитела против ΒοΙν-1. 8ЕР ΙΌ N0: 12: аминокислотная последовательность области Уъ мышиного антитела против ΒοΙν-1. 8ЕР ΙΌ N0: 13: нуклеотидная последовательность области СН человеческого Ι§04 дикого типа. 8ЕР ΙΌ N0: 14: аминокислотная последовательность области СН человеческого Ι§04 дикого типа.
8ЕР ΙΌ N0: 15: нуклеотидная последовательность области СН человеческого Ι§04 (8ЕР ΙΌ N0: 13), мутированного в позициях 714 и 722.
8ЕР ΙΌ N0: 16: аминокислотная последовательность области СН человеческого Ι§04, полученного экспрессией нуклеотидной последовательности 8ЕР ΙΌ N0: 15.
8ЕР ΙΌ N0: 17: аминокислотная последовательность константной области лямбда-цепи человека (инвентарный номер 825751).
Ер ΙΌ N0: 18: аминокислотная последовательность константной области каппа-цепи человека (инвентарный номер Р01834).
8ЕР ΙΌ N0: 19: аминокислотная последовательность константной области !цС1 (инвентарный номер Р01857).
8ЕР ΙΌ N0: 20: аминокислотная последовательность константной области Ι§02 (инвентарный номер Р01859).
8ЕР ΙΌ N0: 21: аминокислотная последовательность константной области Ι§03 (инвентарный номер А23511).
Подробное описание изобретения
Для того чтобы настоящее изобретение можно было легче понять, сначала даются определения некоторых терминов. Другие определения приводятся по ходу подробного описания.
Термин антитело, используемый в данном описании, включает полные молекулы антител, антигенсвязывающие фрагменты, моновалентные антитела и их отдельные цепи. Молекулы антител принадлежат к семейству белков плазмы, называемых иммуноглобулинами, чей основной строительный блокиммуноглобулиновая складка или домен используются в различных формах во многих молекулах иммунной системы и других биологических систем узнавания. Нативные антитела и иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины в примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких (Ь) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как число дисульфидных связей изменяется для тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепи также может иметь упорядоченно размещенные внутрицепные дисульфидные мостики. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (в данном описании сокращенно Уъ) и константной области легкой цепи (в данном описании сокращенно Съ). Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (УН) и константной области тяжелой цепи (СН), состоящей из трех доменов СН1,
- 8 016609
Сн2 и Сн3 и шарнирной области. Константная область легкой цепи располагается под углом к первому домену константной области (Сн1) тяжелой цепи, и вариабельная область легкой цепи располагается под углом к вариабельной области тяжелой цепи, образуя то, что известно как РаЬ-фрагмент. Сн1 и Сн2 тяжелой цепи отделены друг от друга так называемой шарнирной областью, которая позволяет плечам РаЬ молекулы антитела до некоторой степени колебаться. Шарнирная область обычно содержит один или несколько цистеиновых остатков, которые способны образовывать дисульфидные мостики с цистеиновыми остатками шарнирной области другой тяжелой цепи в молекуле антитела.
Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (С1с|) классической системы комплемента.
В зависимости от аминокислотных последовательностей константной области их тяжелых цепей иммуноглобулины можно приписать к различным классам. Существует по меньшей мере пять основных классов иммуноглобулинов: 1дА, Ι§Ό, 1дЕ, 1дС и 1дМ, и некоторые их них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4; 1дА1 и 1дА2. Гены для константных областей тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются альфа (α), дельта (δ), ипсилон (ε), гамма (γ) и мю (μ) соответственно. Подклассы иммуноглобулинов кодируются различными генами, такими как γ1, γ2, γ3 и γ4. Гены для легких цепей антител приписываются к одному из двух четко различающихся классов, называемых каппа (к) и лямбда (λ), основанных на аминокислотных последовательностях их константной области. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Существуют различные аллотипы иммуноглобулинов в человеческой популяции, такие как С1т(а), С1т(х), С1т(Г) и С1т(х) для тяжелой цепи 1дС1 и Кт1, Кт1,2 и Кт3 для легкой цепи каппа. Такие аллотипы отличаются по различным аминокислотам в их участке, кодирующем константные области.
Термин антитело также охватывает производные антител, в которых один или несколько аминокислотных остатков дериватизированы, например, ацилированием или гликозилированием, без существенного воздействия или изменения связывающих свойств антитела, содержащего аминокислотные последовательности.
В контексте настоящего изобретения производное моновалентного антитела может представлять собой, например, моновалентное антитело, в котором один или несколько аминокислотных остатков моновалентного антитела модифицированы химически (например, алкилированием, ацилированием, образованием эфира или образованием амида) или ассоциированы с одним или несколькими неаминокислотными органическими и/или неорганическими атомными или молекулярными заместителями (например, группой полиэтиленгликоля (ПЭГ, РЕС), липофильным заместителем (который, необязательно, может быть соединен с аминокислотной последовательностью пептида спейсерным остатком или группой, такой как β-аланин, γ-аминомасляная кислота (САВА), Ь/Э-глутаминовая кислота, янтарная кислота и т.д.), флуорофор, биотин, радионуклеид и т. д.) и также, или альтернативно, может содержать несущественные, невстречающиеся в природе и/или не-Ь аминокислотные остатки, если контекст не опровергает этого или не указывает на иное (однако вновь следует признать, что такие производные могут сами по себе рассматриваться как независимые особенности настоящего изобретения и такие молекулы в описании настоящего изобретения включают в обозначения пептида для удобства, а не для того, чтобы выразить какую-либо равнозначность между простыми пептидами и такими производными). Не являющиеся ограничительными примеры таких аминокислотных остатков включают, например, остатки 2аминоадипиновой кислоты, 3-аминоадипиновой кислоты, β-аланина, β-аминопропионовой кислоты, 2аминомасляной кислоты, 4-аминомасляной кислоты, 6-аминокапроновой кислоты, 2-аминогептановой кислоты, 2-аминоизомасляной кислоты, 3-аминоизомасляной кислоты, 2-аминопимелиновой кислоты, 2,4-диаминомасляной кислоты, десмозина, 2,2'-диаминопимелиновой кислоты, 2,3-диаминопропионовой кислоты, Ν-этилглицина, Ν-этиласпарагина, гидроксилизина, аллогидроксилизина, 3-гидроксипролина, 4-гидроксипролина, изодесмозина, аллоизолейцина, Ν-метилглицина, Ν-метилизолейцина, 6-Νметиллизина, Ν-метилвалина, норвалина, норлейцина, орнитина и статингалогенированных аминокислот.
Время полужизни ίη νίνο антител можно, например, улучшить модификацией спасенного эпитопа рецептора константной области 1д или 1д-подобной константной области так, что молекула не содержит интактного домена Сн2 или интактного Рс-участка 1д, ср. υδ 6121022 и ϋδ 6194551. Время полужизни ίη νίνο антител можно повысить, осуществляя мутации Рс-участка, например заменяя треонином лейцин в позиции, соответствующей позиции 252 интактной молекулы антитела, треонином серин в позиции, соответствующей позиции 254 интактной молекулы антитела, или треонином фенилаланин в позиции, соответствующей позиции 256 интактной молекулы антитела, ср. ϋδ 6277375.
Кроме того, антитела, в частности РаЬ или другие фрагменты, для повышения времени полужизни можно пегилировать. Это можно осуществить реакциями пегилирования, известными в технике, как описано, например, в Росик οη Сго\\111 Рас1ог5. 3, 4-10 (1992); ЕР 154316 и ЕР 401384.
- 9 016609
Также можно ввести произвольно мутации по всей или части кодирующей последовательности антитела, например, насыщающим мутагенезом, и полученные модифицированные антитела можно скринировать на связывающую активность и/или другие свойства.
Термин производные антитела относится к любой модифицированной форме антитела, например конъюгату антитела и другого вещества или антитела.
Термин антигенсвязывающая часть или антигенсвязывающий домен антитела, такого как моновалентное антитело, используемый в данном описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченных термином антигенсвязывающая часть антитела, включают:
(ί) фрагмент ЕаЬ или ЕаЬ'-моновалентный фрагмент, состоящий из областей Уь, νΗ, Съ и Сн;
(ίί) фрагмент Е(аЬ')2 - двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента ЕаЬ', соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области;
(ίίί) фрагмент Еб, состоящий, по существу, из областей νΗ и Сн;
(ίν) фрагмент Εν, состоящий, по существу, из областей и νΗ одного плеча антитела;
(ν) фрагмент бАЬ (\Уагб с1 а1., №1Шгс. 341, 544-546 (1989)), который состоит, по существу, из области νΗ;
(νί) изолированный гипервариабельный участок (СОВ) и (νί) сочетание двух или большего числа изолированных СОВ, которые могут быть, необязательно, соединены синтетическим линкером.
Кроме того, хотя две области фрагмента Εν V и νΗ кодируются отдельными генами, их можно соединить с использованием методов рекомбинантных ДНК синтетическим линкером, который позволит получить их в виде единой белковой цепи, в которой области V и νΗ образуют пару с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечные антитела или одноцепочечный Εν (κεΕν), см., например, В1гб е! а1., 8с1еисе, 242, 423-426 (1988) и Нийои е! а1., ΡΝΑ8 И8А, 85, 5879-5883 (1988)). Такие одноцепочечные антитела охватываются термином антитело, если иное не отмечено или четко не указано в контексте.
Другим примером являются слитые белки иммуноглобулинов с антигенсвязывающим доменом, содержащие полипептид с антигенсвязывающим доменом, который слит с:
(ί) полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, (ίί) константной областью Сн2 тяжелой цепи иммуноглобулина, слитой с шарнирной областью, и (ίίί) константной областью Сн3 тяжелой цепи иммуноглобулина, слитой с константной областью Сн2.
Полипептид с антигенсвязывающим доменом может представлять собой вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи, 5сЕу или любой другой полипептид, способный специфически связываться с антигеном. Такие слитые белки иммуноглобулинов с антигенсвязывающим доменом также раскрываются в И8 2003/0118592 и И8 2003/0133939. Такие фрагменты антител получают с использованием обычных методов, известных специалистам в данной области техники, и фрагменты скринируют для использования таким же образом, как интактные антитела.
Термин половинная молекула антитела используется в данном описании для обозначения молекулы антитела, описанной выше, но содержащей не более одной легкой цепи и не более одной тяжелой цепи, которая существует в водных растворах в виде гетеродимера указанной одной легкой и одной тяжелой цепи. Такое антитело является по характеру моновалентным, так как присутствует только одна антигенсвязывающая часть.
Термин консервативные модификации последовательности в контексте нуклеотидных и аминокислотных последовательностей обозначает модификации нуклеотида(ов) и аминокислоты(аминокислот) соответственно, которые существенно не влияют на или не изменяют связывающие свойства антитела, кодированного нуклеотидной последовательностью или содержащего аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации последовательности включают замены, добавления и делеции нуклеотидов и аминокислот. Модификации можно ввести в последовательности стандартными методами, известными в технике, такими как сайт-направленный мутагенез и С\УН-модифицированный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают замены, при которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком со схожей боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков со схожими боковыми цепями определены в технике. Такие семейства включают аминокислоты с боковыми цепями основного характера (например, лизин, аргинин, гистидин), боковыми цепями кислотного характера (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, заранее установленный несущественный аминокислотный остаток в человеческом антителе, специфиче
- 10 016609 ском для определенного антигена, можно заменить другим аминокислотным остатком из семейства с такими же боковыми цепями.
Как используется в данном описании, человеческое антитело получают из определенной последовательности зародышевой линии, если антитело получают из системы с использованием последовательностей человеческого иммуноглобулина, например иммунизацией трансгенной мыши, несущей гены человеческого иммуноглобулина, или скринингом библиотеки генов человеческого иммуноглобулина, и в котором кодируемая геном вариабельная область (не исключая СЭКЗ тяжелой или легкой цепи) выбранного человеческого антитела по меньшей мере на 90%, предпочтительнее по меньшей мере на 95%, даже предпочтительнее по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентична в нуклеотидной последовательности гену иммуноглобулина зародышевой линии. Типично, человеческое антитело, полученное из определенной последовательности человеческой зародышевой линии, будет показывать не более 10 различий в аминокислотах, предпочтительнее не более 5 или даже предпочтительнее не более 4, 3, 2 или 1 различий в аминокислотах в сравнении с аминокислотной последовательностью, кодированной геном иммуноглобулина зародышевой линии.
Термин эпитоп обозначает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Обычно эпитопы состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и, как правило, имеют специфические свойства трехмерной структуры, а также специфические зарядовые характеристики. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются в том, что связывание с первым, но не с последним, отсутствует в присутствии денатурирующих растворителей.
Термин эпитоп прерывистого типа, используемый в данном описании, обозначает конформационный эпитоп на антигене белка, который образуется по меньшей мере из двух отдельных областей в первичной последовательности белка.
Для нуклеотидных и аминокислотных последовательностей термин гомология указывает на степень идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями, при оптимальном выравнивании и сравнении с соответствующими вставками или делениями. С другой стороны, существует значительная гомология, когда сегменты ДНК будут гибридизировать в выбранных условиях гибридизации с комплементом цепи.
Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных позиций, общих для последовательностей (т.е. % гомологии = # идентичных позиций/общее # позиций х 100), принимая в расчет число брешей и длину каждой бреши, которые следует ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно осуществить с использованием математического алгоритма, например, описанного далее.
Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить с использованием программы ОЛР в пакете программного обеспечения ОСО (доступного на ййр://^тете.дсд.сот) с использованием Ы^8дарбпа. Матрикс СМР, штраф за брешь 40, 50, 60, 70 или 80, и штраф за удлиненную брешь 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями также можно определить с использованием алгоритма Е. Меуегк аиб МШег (Сотри!. Арр1. Вюксг, 4, 11-17 (1988)), включенного в программу ΑΕΟΝ (версия 2.0) с использованием таблицы массы остатков РАМ120, штрафа за удлиненную брешь 12 и штрафа за брешь 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с использованием алгоритма Ыееб1етап апб ^ипксй (1. Мо1. Βίο1., 48, 444-453 (1970)), который включен в программу ОАР в пакете программного обеспечения ОСО (доступного на 1Шр://\\л\лу.дсд.сот). с использованием или матрицы Вюккит 62, или матрицы РАМ250, и штрафа за брешь 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и штрафа за удлиненную брешь 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Термин клетка-хозяин (или рекомбинантная клетка-хозяин), используемый в данном описании, предназначен для обозначения клетки, в которую введен рекомбинантный экспрессирующий вектор. Следует иметь в виду, что такие термины предназначены не только для обозначения определенной клетки субъекта, но также для потомства такой клетки. Поскольку некоторые модификации могут иметь место в последующих образованиях из-за или мутации, или влияния окружающей среды, такое потомство, в действительности, не может быть идентичным родительской клетке, но все еще входит в объем термина клетка-хозяин, используемого в данном описании. Рекомбинантные клетки-хозяева включают, например, трансфектомы, такие как трансфицированные клетки СНО, клетки N8/0 и лимфоцитарные клетки. Термин клетка-хозяин в форме единственного числа также может обозначать культуру определенного вида клетки-хозяина.
Термин человеческое антитело, используемый в данном описании, предназначен для включения антител, имеющих вариабельные и константные области, образованные от последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, некодированные последовательностями человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например, мутации, введенные произвольным или сайт-специфическим мутагенезом ίη νίΙΐΌ или соматической мутацией ίη У1уо). Однако термин человеческое антитело, используемый в дан
- 11 016609 ном описании, не предназначен для включения антител, в которых последовательности СОК! или СОР2, образованные от последовательности зародышевой линии другого вида млекопитающего, такого как мышь, или участок СИК3, образованный от антитела другого вида, такого как мышь, привиты на человеческие каркасные последовательности.
Термин Κι; (М), используемый в данном описании, относится к константе равновесия диссоциации определенного взаимодействия антитело-антиген.
Термины моноклональное антитело или композиция моноклональных антител, используемые в данном описании, относятся к препарату молекул антител одного молекулярного состава. Композиция моноклональных антител проявляет одну специфичность связывания и аффинность в отношении определенного эпитопа. Соответственно термин человеческое моноклональное антитело относится к антителам, проявляющим одну специфичность связывания, которые имеют вариабельные и константные области, образованные от последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии.
Термин моноклональное антитело в контексте настоящего изобретения означает, что молекула антитела способна связывать одну молекулу антигена и, таким образом, не способна сшивать антиген.
Термины нуклеиновая кислота, нуклеотидная конструкция или молекула нуклеиновой кислоты, используемые в данном описании, предназначены для включения молекул ДНК и молекул РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной.
Термины изолированная нуклеиновая кислота, изолированная нуклеотидная конструкция или изолированная молекула нуклеиновой кислоты, используемые в данном описании в отношении нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или их фрагменты, предназначены для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие интактное антитело или их фрагменты, свободны от других нуклеотидных последовательностей. Нуклеиновая кислота может являться изолированной или представленной как по существу чистой, когда очищена от других клеточных компонентов или других загрязнений, например других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, включая обработку щелочью/8И8, бэндинг с С§С1, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие методы, хорошо известные в технике, см. Р. Ли8иЬе1 с1 а1., еб., Сиггеи! РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1о§у, Сгееие РиЫНЫид аиб ^11еу 1п1ег8С1еисе, Ыете Уогк (1987).
Нуклеиновая кислота является функционально связанной, когда размещена в функциональном соотношении с последовательностью другой нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связаны с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности. В случае последовательностей-переключателей функционально связанные означает, что последовательности способны влиять на рекомбинацию переключения.
Когда делается ссылка на физиологическое условие, это обозначает условие, которое существует ίη угуо в организме, или условие ίη у1уо, которое создается полностью или частично имитированием условия, указанного ίη у1уо, например водный раствор с осмотическим показателем, эквивалентным крови.
Термин рекомбинантное человеческое антитело, используемый в данном описании, включает все человеческие антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными способами, такие как, например, (а) антитела, выделенные из организма животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным для генов человеческого иммуноглобулина или полученных из них гибридом, (Ь) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антител, например из трансфектом, (с) антитела, выделенные из рекомбинантных комбинаторных библиотек человеческих антител, и (б) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов человеческого иммуноглобулина с другими ДНК-последовательностями. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные области, образованные от последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. Такие рекомбинантные человеческие антитела могут быть подвержены мутагенезу ίη убго (или, когда используют животное, трасгенное для последовательностей человеческого 1д, соматическому мутагенезу ίη У1уо), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей Ун и Уъ рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, хотя и образованы от и родственны с человеческими Ун- и Уъ-последовательностями зародышевой линии, не могут обычно существовать в репертуаре человеческих антител зародышевой линии ίη у1уо.
Используемый в данном описании термин специфическое связывание относится к связыванию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с предварительно установленным антигеном. Типично антитело связывается с аффинностью, соответствующей Кс примерно 10-7 М или меньшей, например 10-8 М или меньшей, например 10-9 М или меньшей, примерно 10-10 М или меньшей или примерно 10-11 М или даже меньшей, при измерении, например, с использованием сульфонплазмонного резонанса на В1Асоге, или как кажущейся аффинности на основе величин 1С50 в РАС8 или ЕЬ18А, и связывается с предварительно установленным антигеном с аффинностью, соответствующей Кс, которая по меньшей мере в десять раз ниже, например по меньшей мере в 100 раз ниже, например по меньшей мере в 1000 раз ниже, например по меньшей мере в 10000 раз ниже, например по меньшей мере в 100000 раз ниже, чем его аффинность для связывания с неспецифическим антигеном (например, В8А, казеином), иным, чем предварительно установленный антиген или близкородственный антиген. Величина, на которую аф
- 12 016609 финность ниже, зависит от Кс антигенсвязывающего пептида, так что когда Кс антигенсвязывающего пептида очень низкая (т.е. антигенсвязывающий пептид высокоспецифичный), тогда величина, на которую аффинность к антигену ниже, чем аффинность к неспецифичному антигену, может составлять по меньшей мере 10000 раз.
Используемый в данном описании термин субъект включает любого человека или животное, не являющееся человеком. Термин животное, не являющееся человеком включает всех позвоночных, например млекопитающих и не относящихся к млекопитающим, таких как приматы, овцы, козы, собаки, кошки, мыши, крысы, кролики, куры, земноводные, пресмыкающиеся и т. д.
Когда делается ссылка на терапевтически эффективную дозировку или терапевтически эффективное количество, это следует использовать для обозначения дозировки или количества, эффективных для достижения желательного лечебного результата за некоторый период времени. Терапевтически эффективная дозировка моновалентных антител по изобретению, конечно, будет изменяться в связи с мишенью антител и также может изменяться в соответствии с факторами, такими как болезненное состояние, возраст, пол и масса тела индивидуума, и способности моновалентных антител добиваться нужной реакции у индивидуума. Терапевтически эффективная дозировка или количество также могут являться дозировкой или количеством, при которых терапевтически благоприятное действие перевешивает любое токсичное или вредное действие моновалентных антител.
Термин трансгенное животное, не являющееся человеком относится к животному, не являющемуся человеком, с геномом, содержащим один или несколько трансгенов или трансхромосом тяжелой и/или легкой цепи человека (или интегрированных, или неинтегрированных в природную геномную ДНК животного), и которое способно экспрессировать человеческие антитела. Например, трансгенная мышь может иметь трансген легкой цепи человека и/или трансген тяжелой цепи человека или трансхромосому тяжелой цепи человека, так что мышь продуцирует человеческие антитела, когда иммунизирована антигеном и/или клетками, экспрессирующими антиген. Трансген тяжелой цепи человека может быть интегрирован в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенных мышей, например НиМАЬ, таких как мыши НСо7 или НСо12, или трансген тяжелой цепи человека может поддерживаться экстрахромосомно, как в случае трансхромосомных мышей КМ, как описано в АО 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши способны продуцировать многие классы и изотипы моновалентных антител к данному антигену (например, 1дМ, 1§С. 1дА и/или 1дЕ) за счет претерпевания рекомбинации У-Ό-Ι и переключения изотипов.
Термин трансфектома, используемый в данном описании, включает рекомбинантные эукариотические клетки-хозяева, экспрессирующие антитела, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки N8/0, клетки НЕК293, клетки растений или грибов, в том числе дрожжевые клетки.
Термины лечение, лечащий или лечить обозначают облегчение, ослабление или устранение (вылечивание) симптомов болезненных состояний.
Термин валентность антитела обозначает максимальное число антигенных детерминант, с которыми антитело может взаимодействовать. Например, антитела 1дС содержат два участка РаЬ и могут связывать две молекулы антигена или два идентичных сайта на одной и той же частице и, таким образом, имеют валентность два.
Термин вектор, используемый в данном описании, предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, способной переносить и вызывать репликацию другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Одним типом вектора является плазмида, которая относится к кольцевой петле двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы сегменты другой ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК или РНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они внедрены (например, бактериальные векторы с бактериальным происхождением репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина и посредством этого реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы в данном описании относят к рекомбинантным экспрессирующим векторам (или проще экспрессирующим векторам). Вообще, экспрессирующие векторы для применения в методах рекомбинантных ДНК часто находятся в форме плазмид. В настоящем описании термины плазмида и вектор могут использоваться как взаимозаменяемые, так как плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако предполагается, что изобретение включает также другие формы экспрессирующих векторов, например вирусные векторы (например, репликативно дефектные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.
Ряд ссылок в данном описании сделан на водный раствор или физиологическое условие. Когда упоминается водный раствор, это обозначает водный раствор любого химического вещества в воде, например раствор соли, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор (РВ8). Водный раствор может быть получен для определенной цели и содержать ряд различных химических веществ или он может представлять собой природную жидкость организма, например кровь.
- 13 016609
Существует пять различных классов иммуноглобулинов, т.е. 1дМ, 1дЭ. 1дС, 1дА и 1дЕ, и указанные классы можно различить по их С-областям.
В пределах класса антител 1дС существует несколько подклассов, т.е. в человеческом 1дС подклассы 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4 (ЛеГГег1к К., 1990, Мо1еси1аг к1гис1иге ок йитап 1дС кийс1аккек. 1п Тйе йитап 1дС кийс1аккек. Е. 8йак1Ь, еб., Регдатоп Ргекк, 0хкогб, р. 15). Каждая тяжелая цепь 1дС состоит из структурно родственных пептидных последовательностей (т.е. доменов вариабельной и константной областей), которые кодированы различными сегментами гена или экзонами. Шарнирная область, соединяющая домены СН1 и СН2, кодируется отдельным экзоном. Тяжелые цепи каждого из четырех подклассов 1дС можно экспрессировать в сочетании с или каппа, или лямбда легкими цепями и получить, по существу, симметричные молекулы, состоящие из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей каппа или лямбда. Сравнение в пределах тяжелой цепи определяет участки гомологии СН1, СН2 и СН3. Сравнение между схожими по гомологии участками каждого из четырех подклассов показывает идентичность последовательностей >95% (беГГепк К., 1990, Е. 8йак1Ь, еб., Регдатоп Ргекк, 0хкогб, р. 15). Последовательность между доменами СН1 и СН2 называют шарнирной областью, поскольку она допускает гибкость молекулы. Домены СН3 являются парными, и для молекул 1дС достаточно нековалентных взаимодействий для поддержания структурной идентичности после восстановления дисульфидных мостиков вне тяжелой цепи в умеренных условиях. Объединение доменов СН3 является компактным и схожим с объединением в ЕаЬ с почти точной диадой между двумя доменами (8арййе е1 а1., 2002, Т Мо1. Вю1., 319: 9). Это противоположно доменам СН2, которые тесно не ассоциируют, и их контакт опосредуется, главным образом, двумя углеводными цепями, присоединенными к остаткам Акп297 (8арййе е1 а1., 2002, I Мо1. Вю1., 319:9).
Таким образом, характеристическая структура 1дС, в которой соединены два гетеродимера из тяжелой и легкой цепей, сохраняется за счет дисульфидных мостиков между тяжелыми цепями в шарнирной области и нековалентных взаимодействий доменов СН3.
Показано, что взаимодействие участка СН3 в 1дС1 является важным. Половинные молекулы 1д, которые имеют димерную конфигурацию, состоящую только из одной легкой цепи и только одной тяжелой цепи, описаны как результат редких делеций при человеческой и мышиной плазмацитоме. Некоторые пациенты, страдающие от экстрамедуллярной плазмацитомы мягкой ткани, макроглобулинемии Вальденстрёма, плазмацитарного лейкоза и множественной миеломы, выделяют половинные молекулы 1дС в свою урину. Также обнаружено, что половинные молекулы присутствуют в их сыворотке. Исследования биохимической природы таких половинных молекул показало, что они состоят из молекул 1дС1, в которых участки СН1 тяжелой цепи, шарнира и СН2 оказываются нормальными, в то время как в участке СН3 обнаружены делеции (уже описано в заявке на патент, с. 3).
Авторы в данной заявке показывают, что удаление шарнирной области в 1дС4 приводит к образованию моновалентных антител, в которых связь между двумя гетеродимерами тяжелой и легкой цепей утрачена или ослаблена. Следовательно, изменения в дисульфидных мостиках шарнирной области других подклассов 1дС, одни или в сочетании с мутациями во взаимодействиях домена СН3, также могут привести к образованию моновалентных антител в случае таких других подклассов. Специалисты в данной области техники могут применить свои знания структуры подклассов 1д, как это сделано в данной заявке, для отбора и модификации выбранных аминокислот для предотвращения взаимодействий легкой цепи.
Соответственно в одном воплощении настоящее изобретение относится к моновалентному антителу, содержащему легкую цепь и тяжелую цепь, в котором:
a) указанная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (νθ области выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (Сь) области 1д;
b) указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (V! области выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (СН) области человеческого 1д, где аминокислотная последовательность тяжелой цепи модифицирована таким образом, что ни один из аминокислотных остатков, присутствующих в области, соответствующей шарнирной области, не способен принимать участие в образовании дисульфидных связей с другими пептидами, содержащими идентичную аминокислотную последовательность константной области (СН) человеческого 1д;
c) указанная тяжелая или легкая цепь в зависимости от изотипа 1д модифицирована точечной мутацией или делецией для того, чтобы удалить или заменить любые аминокислоты, т.е. цистеины, способные вызывать соединение антитела, или модифицирована в форме точечной мутации или делеции для того, чтобы сделать константную область тяжелой цепи схожей с такой же областью 1дС4 в отношении способности образовывать дисульфидные связи или ковалентно соединять молекулу с ее эквивалентом с образованием димера.
Аминокислотная последовательность легкой цепи моновалентного антитела по изобретению содержит вариабельную (УД область выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (Съ) области иммуноглобулина.
Согласно изобретению аминокислотная последовательность области V моновалентного антитела
- 14 016609 не вносит вклад в молекулярные свойства указанной молекулы антитела. представляющей интерес по изобретению. в частности неспособность моновалентного антитела образовывать гетеротетрамеры (нормальные антитела). и поэтому изобретение не ограничивается какими-либо определенными аминокислотными последовательностями области Уь. Аминокислотная последовательность области Уъ может быть образована от аминокислотной последовательности любого антигенспецифического антитела. полученного любым из многочисленных способов. известных специалистам в данной области техники.
Согласно изобретению аминокислотная последовательность области УН моновалентного антитела не вносит вклад в молекулярные свойства указанной молекулы антитела. представляющей интерес по изобретению. в частности неспособность моновалентного антитела образовывать гетеротетрамеры (нормальные антитела). и поэтому изобретение не ограничивается какими-либо определенными аминокислотными последовательностями области УН. Аминокислотная последовательность области УН может быть образована от аминокислотной последовательности любого антигенспецифического антитела. полученного любым из многочисленных способов. известных специалистам в данной области техники.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению не связывается с синтетическим антигеном (Туг. 61и). А1а. Ьу§ (Ршсик е! а1.. 1985. Мо1еси1аг 1ттипо1.. νо1. 22. 4; р. 455-461).
В другом воплощении антитело по изобретению является человеческим антителом.
В другом воплощении антитело по изобретению является антителом на основе человеческого антитела.
В одном воплощении настоящее изобретение относится к моновалентному антителу. содержащему легкую цепь и тяжелую цепь. в котором:
a) указанная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (Уь) области выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (Сь) области 1д;
b) указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (УН) области указанного выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (СН) области человеческого 1д64. где аминокислотная последовательность тяжелой цепи модифицирована таким образом. что ни один из аминокислотных остатков. присутствующих в области. соответствующей шарнирной области. не способен принимать участие в образовании дисульфидных связей с другими пептидами. содержащими идентичную аминокислотную последовательность константной области (СН) человеческого 1д64.
Аминокислотная последовательность легкой цепи моновалентного антитела по изобретению содержит вариабельную (Уь) область выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (Сь) области иммуноглобулина.
Согласно изобретению аминокислотная последовательность области Уъ моновалентного антитела не вносит вклад в молекулярные свойства указанной молекулы антитела. представляющей интерес по изобретению. в частности неспособность моновалентного антитела образовывать гетеротетрамеры (нормальные антитела). и поэтому изобретение не ограничивается какими-либо определенными аминокислотными последовательностями области Уъ. Аминокислотная последовательность области Уъ может быть образована от аминокислотной последовательности любого антигенспецифического антитела. полученного любым из многочисленных способов. известных специалистам в данной области техники.
Согласно изобретению аминокислотная последовательность области УН моновалентного антитела не вносит вклад в молекулярные свойства указанной молекулы антитела. представляющей интерес по изобретению. в частности неспособность моновалентного антитела образовывать гетеротетрамеры (нормальные антитела). и поэтому изобретение не ограничивается какими-либо определенными аминокислотными последовательностями области УН. Аминокислотная последовательность области УН может быть образована от аминокислотной последовательности любого антигенспецифического антитела. полученного любым из многочисленных способов. известных специалистам в данной области техники.
Изобретение относится к примеру 1) моновалентного антитела. содержащего область УН. содержащую аминокислотную последовательность области УН НиМаЬ-7Э8. идентифицированную как 8ΕΟ ΙΌ N0: 6. и аминокислотную последовательность. кодирующую бесшарнирную СН 1д64. идентифицированную как 8Ε0 ΙΌ N0: 16. где указанные последовательности функционально связаны вместе. и 2) моновалентного антитела. содержащего область УН. содержащую аминокислотную последовательность области УН мышиного антитела против Ве1у-1. идентифицированную как 8Ε0 ΙΌ N0: 8. и аминокислотную последовательность. кодирующую бесшарнирную СН 1д64. идентифицированную как 8Ε0 ΙΌ N0: 16. где указанные последовательности функционально связаны вместе.
В одном воплощении области УН и Уъ молекулы антитела по изобретению образованы от одного и того же антигенспецифического антитела.
Согласно изобретению последовательность области Сь легкой цепи молекулы антитела может быть образована от последовательности области Съ иммуноглобулина. В одном воплощении область Съ является константной областью легкой цепи каппа человеческого 1§С. В одном воплощении область Съ содержит аминокислотную последовательность 8Ε0 ΙΌ N0: 2. В одном воплощении область Съ является константной областью легкой цепи лямбда человеческого !§С. В одном воплощении область Сь содержит
- 15 016609 аминокислотную последовательность 8Е0 Ш ΝΟ: 4.
В одном воплощении легкая цепь и тяжелая цепь моновалентного антитела соединены друг с другом через одну или несколько дисульфидных связей. Очевидно, что в случае таких дисульфидных связей ни один из партнеров по связыванию в дисульфидной связи не присутствует в области, соответствующей шарнирной области.
В одном воплощении легкая цепь и тяжелая цепь моновалентного антитела соединены друг с другом через амидную связь, например, как видно в случае одноцепочечных Ρν.
Шарнирная область представляет собой участок антитела, расположенный между участками Сн1 и Сн2 константной области тяжелой цепи. Протяженность шарнирной области определяется отдельным экзоном, который кодирует шарнирную область. Шарнирная область обычно вовлекается в участие в обеспечении правильной сборки цепей четырех пептидов антитела в традиционную тетрамерную форму через образование дисульфидных связей или мостиков между одним или несколькими цистеиновыми остатками в шарнирной области одной тяжелой цепи и одним или несколькими цистеиновыми остатками в шарнирной области другой тяжелой цепи. Модификация шарнирной области таким образом, что ни один из аминокислотных остатков в шарнирной области не способен принимать участие в образовании дисульфидных связей, может включать, например, делецию и/или замену цистеиновых остатков, присутствующих в шарнирной области. Участок, соответствующий шарнирной области, для целей данного описания должен быть сконструирован как обозначающий область между участками Сн1 и Сн2 тяжелой цепи антитела. В контексте настоящего изобретения такая область также может вовсе не содержать аминокислотные остатки, что соответствует делеции шарнирной области, и приводит к тому, что участки Сн1 и Сн2 соединяются друг с другом без каких-либо аминокислотных остатков-посредников. Такая область также может содержать только один или несколько аминокислотных остатков, которые не нуждаются в том, чтобы представлять собой аминокислотные остатки, присутствующие в Ν- или С-конце исходной шарнирной области.
Дисульфидные связи являются хорошо известной особенностью некоторых белков, например антител, когда один цистеиновый остаток образует дисульфидную связь с другим цистеиновым остатком в той же цепи (внутрицепные дисульфидные связи) или других цепях (межцепные дисульфидные связи) белка. В данном белке может иметься несколько таких дисульфидных связей. В случае антител образование дисульфидных связей как внутрицепных, так и межцепных является неотъемлемой частью правильной сборки полного зрелого антитела дикого типа, и дисульфидные связи обычно, по меньшей мере, частично ответственны за высокоупорядоченный и регулярный вид антител, а также за стабильность антитела. В моновалентных антителах по изобретению ни один из аминокислотных остатков в шарнирной области не способен принимать участие в образовании таких дисульфидных связей.
Модификацию аминокислотной последовательности шарнирной области можно осуществить на уровне ДНК с использованием рекомбинантных методов, дающих возможность делеции и/или замены нуклеиновых кислот, что хорошо известно в технике, и как описано также в данном описании и приведены примеры в примерах.
Модификацию также можно осуществить с антителом, экспрессированным из немодифицированной нуклеиновой кислоты, например, дериватизацией в шарнирной области аминокислотных остатков, которые способны к образованию дисульфидных связей. Такую дериватизацию цистеиновых остатков путем блокировки их от образования дисульфидных связей с другими цистеиновыми остатками можно осуществить так, как известно в технике.
Модификацию также можно осуществить, получая цепи антител синтетически с использованием аминокислотных остатков иных, чем цистеин, например встречающихся в природе аминокислот или аминокислот, невстречающихся в природе, таких как, например, дериватизированные цистеины вместо цистеиновых остатков.
Моновалентное антитело 1дС4 по настоящему изобретению также может представлять собой вариант 1дС4. Такое вариантное антитело представляет собой антитело, которое отличается от антитела 1дС4 одним или несколькими изменениями подходящих аминокислотных остатков, т.е. заменами, делециями, вставками или добавлениями концевых последовательностей, например, в константной области и/или вариабельных областях (или в любом одном или нескольких ее СОЯ), в одном вариантном антителе. Типично желательно, чтобы изменения аминокислотных последовательностей, такие как вариации консервативных замен, существенно не изменяли структурные характеристики исходной последовательности (например, замена аминокислоты не должна приводить к нарушению вторичной структуры, которая характеризует функцию исходной последовательности), но которые могут ассоциироваться с выгодными свойствами, такими как изменение функциональных или фармакокинетических свойств антител, например увеличение времени полужизни, изменение иммуногенности, обеспечение сайта для ковалентного или нековалентного связывания с другой молекулой, уменьшение подверженности протеолизу, уменьшение подверженности окислению или изменение картины гликозилирования. Такие варианты аминокислотной последовательности антитела можно получить так, как описано выше для модификаций в участке, соответствующем шарнирной области.
В одном воплощении аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким об
- 16 016609 разом, что участок, соответствующий шарнирной области, не включает никаких цистеиновых остатков.
В одном воплощении аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков участка, соответствующего шарнирной области, включая любые цистеиновые остатки, делетирован и/или заменен на другой аминокислотный остаток. Таким образом, шарнирная область антител по изобретению может быть модифицирована в иных позициях, чем позиции, в которых обычно присутствуют любые цистеиновые остатки, что также описано выше для антител вариантов 1дС4 по изобретению. Такие модификации можно осуществить так, как описано выше, или любыми другими способами, известными в технике.
В контексте настоящего изобретения цистеиновые остатки участка, соответствующего шарнирной области, модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область Сн, в которой аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 106 и 109 последовательности 8ЕЭ ΙΌ N0: 14, делетированы. 8ЕЭ ΙΌ N0: 14 показывает аминокислотную последовательность области Сн дикого типа человеческого 1дС4, а позиции 106 и 109 являются позициями двух цистеиновых остатков.
В одном воплощении аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область Сн, в которой делетированы, по меньшей мере, аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 106-109 последовательности 8ЕЭ ΙΌ N0: 14.
В одном воплощении аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область Сн, в которой делетированы, по меньшей мере, аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 99-110 последовательности 8ЕЭ ΙΌ N0: 14.
В одном воплощении тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность 8ЕЭ ΙΌ N0: 16. 8ЕЭ ΙΌ N0: 16 представляет собой аминокислотную последовательность области Сн человеческого Ι§04, полученного экспрессией нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность 8ЕЭ ΙΌ N0: 15, которая представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую область Сн человеческого Ιβ64 (8Е6 ΙΌ N0: 13), с мутациями замены в позициях 714 и 722. Такие замены в донорном сайте сплайсинга нуклеотидной последовательности имеют такое действие, что сплайсинг с участием экзона, кодирующего шарнирную область, не будет осуществляться правильно, причем результатом станет тяжелая цепь без аминокислотных остатков, кодируемых экзоном.
В одном воплощении делетируют всю шарнирную область области Сн. Это случай, когда в тяжелой цепи не присутствуют аминокислоты, кодированные экзоном, кодирующим область Сн. Для Ι§04, представленного в 8ЕЭ ΙΌ N0: 14, это будет соответствовать области Сн с аминокислотной последовательностью 8ЕС) ΙΌ N0: 16.
В одном воплощении аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область Сн, в которой аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 106 и 109 последовательности 8ЕЭ ΙΌ N0: 14, заменены на аминокислотные остатки, отличные от цистеина.
В одном воплощении аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область Сн, в которой один из аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотам 106 и 109 последовательности 8ЕЭ ΙΌ N0: 14, заменен на аминокислотный остаток, отличный от цистеина, а другой из аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотам 106 и 109 последовательности 8ЕЭ ΙΌ N0: 14, делетирован. В другом воплощении аминокислотный остаток, который заменен аминокислотным остатком, отличным от цистеина, соответствует аминокислотным остаткам 106, а аминокислотный остаток, который делетирован, соответствует аминокислотным остаткам 109. В еще одном воплощении аминокислотный остаток, который делетирован, соответствует аминокислотным остаткам 106, а аминокислотный остаток, который заменен аминокислотным остатком, отличным от цистеина, соответствует аминокислотным остаткам 109.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению можно получить способом, включающим рекомбинантную экспрессию антитела в клеточной экспрессирующей системе ίη νίίτο, как описано в данном описании.
В одном воплощении такой способ включает:
ί) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей легкую цепь указанного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область ν выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область Сь ΙβΟ;
ίί) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей тяжелую цепь указанного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область νΗ выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую область Сн человеческого Ι§04, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область Сн, модифицирована таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области, не содержат каких-либо аминокислотных остатков, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей;
ίίί) обеспечение клеточной экспрессирующей системы для получения указанного моновалентного антитела;
ίν) получение указанного моновалентного антитела, содержащего легкую цепь, кодируемую нук
- 17 016609 леотидной конструкцией (ί), и тяжелую цепь, кодируемую нуклеотидной конструкцией (ίί), коэкспрессией нуклеотидных конструкций (1) и (ίί) в клетках клеточной экспрессирующей системы (ш).
В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению имеют концентрацию в плазме свыше 10 мкг/мл в течение более 7 дней, когда введены ίη νίνο в дозе 4 мг на 1 кг, при измерении в фармакокинетическом исследовании на мышах 8СШ (например, как показано в примере 32). Скорость клиренса моновалентных антител по изобретению можно измерить с применением фармакокинетических методов, как известно в технике. Антитела можно инъецировать человеку или животному, например, внутривенно (также можно использовать другие способы, такие как ί.ρ. или 1.т.), после чего берут образцы крови венопункцией в определенные моменты времени, например через 1, 4, 24 ч, 3, 7, 14, 21 и 28 дней после инъекции. Концентрацию антител в сыворотке определяют соответствующим анализом, таким как ЕЫ8А. Фармакокинетический анализ осуществляют так, как известно в технике и описано в примере 32. Моновалентные антитела по изобретению могут иметь время пребывания в плазме, которое в 100 раз протяженнее, чем время пребывания в плазме, например фрагментов ЕаЬ, которые часто используют в качестве моновалентных антител.
В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению имеют клиренс из плазмы, который в более чем в 10 раз медленнее, чем клиренс из плазмы фрагментов Е(аЬ')2, которые имеют сравнимый молекулярный размер. Это может указывать на способность антител по изобретению связываться с ЕсЕп. ЕсЕп является рецептором класса Ι главного комплекса гистосовместимости и играет некую роль в пассивной доставке иммуноглобулинов (Ι§)0 от матери к зародышу и в регуляции сывороточных уровней ΙβΟ. защищая Ι§0 от внутриклеточного разрушения (Сйебе У. с1 а1., Аппи. Есу. Iттиηο1., 18, 739-66 (2000)). В одном воплощении фрагмент Е(аЬ')2 направляют на тот же антиген, что и моновалентное антитело по изобретению. В одном воплощении фрагмент Е(аЬ')2 направляют на тот же эпитоп, что и моновалентное антитело по изобретению. В одном воплощении область УН и область Уъ фрагмента Е(аЬ')2 идентичны области УН и области Уъ моновалентного антитела по изобретению.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению имеет время полужизни по меньшей мере 5 дней, когда введено ίη νίνο. Время полужизни моновалентного антитела по изобретению можно измерить любым способом, известным в технике, например, так как описано выше.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению имеет время полужизни по меньшей мере 5 дней и до 14 дней, когда введено ίη νίνο.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению имеет время полужизни по меньшей мере 5 дней и до 21 дня, когда введено ίη νίνο.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению способно связываться с ЕсЕп. Такое связывание можно определить с применением способов определения связывания, известных в технике, например с использованием анализов ЕЫ8А. Связывание моновалентного антитела по изобретению с ЕсЕп можно сравнить, например, со связыванием с ЕсЕп фрагмента Е(аЬ')2, который имеет область УН и область Уъ, идентичные области УН и области Уъ моновалентного антитела по изобретению, в том же анализе. В одном воплощении связывание моновалентного антитела по изобретению с ЕсЕп более чем в 10 раз прочнее, чем связывание фрагмента Е(аЬ')2 с ЕсЕп.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению специфически связывает опухолевый антиген. Не ограничиваясь определенными опухолевыми антигенами, примерами таких опухолевых антигенов могут быть сМс1 и УЕСЕ-Е.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению специфически связывается с рецептором клеточной поверхности, который активирован после димеризации рецепторов. Моновалентные антитела, такие как моновалентные антитела по изобретению, часто можно применять для лечения заболеваний или расстройств, при которых активация рецептора нежелательна, так как молекулы антител по изобретению из-за их моновалентного характера неспособны индуцировать такую димеризацию и посредством этого активацию. Не ограничиваясь определенными рецепторами, примерами таких рецепторов могут быть егЬ-В1, егЬ-В2, егЬ-В3, егЬ-В4 и представители эфринов и эфриновых рецепторов, такие как эфрин-А1-эфрин-А6, ерйА1-А8, эфрин-В1-В3 и ер11В1-В6.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению, когда связывается с молекулоймишенью, ингибирует мультимеризацию молекулы-мишени (такую как димеризация). Вновь моновалентные антитела, такие как моновалентные антитела по изобретению, часто можно применять для лечения заболеваний или расстройств, при которых нежелательна мультимеризация мишени-антигена, так как молекулы антител по изобретению из-за их моновалентного характера неспособны индуцировать такую мультимеризацию. В случае растворимых антигенов мультимеризация может давать нежелательные иммунные комплексы. Не ограничиваясь определенными мишенями, примерами таких мишеней могут быть Τοΐΐ-подобные рецепторы, такие как ТЕЕ3 и ТЕЕ9, или ангиопоэтин-1 или ангиопоэтин-2 или члены семейства рецепторов ТИЕ, такие как СЭ30, СЭ40 и СЭ95.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению является ингибитором Т№-альфа. В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению являются моновалентной формой адалимумаба, этанерцепта или инфликсимаба.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению неспособно связываться с эффекто
- 18 016609 ром. Выражение не способно связываться с эффектором или неспособность к связыванию с эффектором в данном контексте означает, что моновалентное антитело 1дО4 по изобретению не способно связываться с компонентом С.'1с.| первого компонента комплемента (С1) и поэтому не способно активировать классический путь комплементопосредованной цитотоксичности. Кроме того, моновалентные антитела по изобретению не способны взаимодействовать с Рс-рецепторами и поэтому не способны запускать эффекторные функции, опосредуемые Рс-рецепторами, такие как фагоцитоз, активация клеток, индукция высвобождения цитокинов.
В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению получают с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Антитела можно получить с использованием рекомбинантных эукариотических клеток-хозяев, таких как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки N8/0, клетки НЕК293, клетки насекомых, клетки растений или грибов, включая дрожжевые клетки. Как устойчивые, так и транзиентные системы можно использовать для такой цели. Трансфекцию можно осуществить с использованием плазмидных экспрессирующих векторов рядом установленных способов, таких как электропорация, липофекция или нуклеофекция. С другой стороны, можно использовать заражение для экспрессии белков, кодированных рекомбинантными вирусами, такими как аденовирусы, вакцины или бакуловирусы. Другим способом может являться использование трансгенных животных для продуцирования антител.
Последовательность ДНК, кодирующую антитело, можно получить синтетически известными стандартными способами, например фосфоамидиновым способом, описанным в Веасаиде е! а1., Те!гайебгоп Ье!!., 22, 1859-1869 (1981), или способом, описанным в Маййек е! а1., ЕМВО I., 3, 801-805 (1984). Согласно фосфоамидиновому способу олигонуклеотиды синтезируют, например, в автоматическом синтезаторе ДНК, очищают, отжигают, лигируют и клонируют в подходящих векторах.
Кодирующая ДНК-последовательность также может быть по происхождению геномной или от кДНК, например, полученной через получение геномной библиотеки или библиотеки кДНК и скрининг последовательностей кДНК, кодирующих все антитело или его часть, путем гибридизации с использованием синтетических олигонуклеотидных зондов согласно стандартным методам (ср. 8атЬгоок е! а1. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2иб еб., Со1б 8ргшд НагЬог, 1089). Последовательность ДНК также можно получить полимеразной цепной реакцией с использованием специфических праймеров, например, так, как описано в И8 4683202 или в 8а1к1 е! а1., 8с1епсе, 239, 487-491 (1988).
Затем ДНК-последовательность можно встроить в рекомбинантный экспрессирующий вектор, который можно традиционно подвергнуть процедурам метода рекомбинантных ДНК. Выбор вектора часто будет зависеть от клетки-хозяина, в которую его вводят. Так, вектор может представлять собой автономно реплицирующий вектор, т. е. вектор, который существует как внехромосомный элемент, репликация которого не зависит от репликации хромосомы, например плазмиду. С другой стороны, вектор может представлять собой вектор, который, когда внедрен в клетку-хозяина, интегрирует в геном клеткихозяина и реплицирует вместе с хромосомой(ами), в которую(ые) он интегрирован.
В векторе последовательность ДНК, кодирующая антитело, должна быть функционально соединена с подходящей промоторной последовательностью. Промотор может представлять собой последовательность любой ДНК, которая показывает транскрипционную активность в выбранной клетке-хозяине, и может происходить от генов, кодирующих белки или гомологичные или гетерологичные клетке-хозяину. Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией кодирующей последовательности ДНК в клетках млекопитающих являются промотор СМУ, промотор 8У40, промотор МТ-1 (ген металлотионеина) или главный поздний промотор аденовирус 2. В технике известны другие подходящие промоторы. Подходящим промотором для применения в клетках насекомых является, например, полиэдриновый промотор. Подходящие промоторы для применения в дрожжевых клетках включают промоторы из гликолитических генов дрожжей или генов алкогольдегидрогеназы или промоторы ТР11 или АОН2-4с. Подходящими промоторами для применения в клетках-хозяевах мицелиальных грибов являются, например, промотор АЭН3 или промотор !р1А.
Кодирующая ДНК-последовательность также может быть соединена с подходящим терминатором, таким как терминатор гормона роста человека или (в случае хозяев грибов) терминаторы ТР11 или АЭН3. В технике известны другие подходящие терминаторы. Вектор также может содержать элементы, такие как сигналы полиаденелирования (например, из 8У40 или области 5Е1Ь аденовируса), транскрипционные энхансерные последовательности (например, энхансер 8У40) и трансляционные энхансерные последовательности (например, последовательности, кодирующие РНК аденовируса УА). В технике известны другие такие сигналы и энхансеры.
Рекомбинантный экспрессирующий вектор также может содержать последовательность ДНК, позволяющую вектору реплицировать в данной клетке-хозяине. Примером такой последовательности (когда клеткой-хозяином является клетка млекопитающего) является ориджин 8У40 репликации. В технике известны другие ориджины репликации. Вектор также может содержать селектируемый маркер, например ген, продукт которого дополняет дефект в клетке-хозяине, такой как ген, кодирующий дигидрофолат-редуктазу (ОНРЕ), глутамин-синтетазу (О8), или ген, который придает устойчивость к лекарственному средству, например неомицину, гидромицину или метотрексату. В технике известны другие селек
- 19 016609 тируемые маркеры.
Процедуры, используемые для лигирования последовательностей ДНК, кодирующих пептиды или полноразмерные белки, промотор и терминатор соответственно, и встраивания их в подходящие векторы, содержащие информацию, необходимую для репликации, хорошо известны специалистам в данной области техники (ср., например, 8атЬгоок е1 а1., цит. выше).
Для того чтобы получить рекомбинантные моновалентные антитела по изобретению, последовательности ДНК, кодирующие различные части полипептидной(ых) цепи(ей) антитела, можно экспрессировать по отдельности в клетке-хозяине или можно слить, получая конструкцию ДНК, кодирующую слитый полипептид, такой как полипептид, содержащий как легкие, так и тяжелые цепи, встроенные в рекомбинантный экспрессирующий вектор, и экспрессировать в клетках-хозяевах.
Клетка-хозяин, в которую можно ввести экспрессирующий вектор, может представлять собой любую клетку, способную к экспрессии полноразмерных белков, и может представлять собой, например, эукариотическую клетку, такую как клетки беспозвоночных (насекомых) или клетки позвоночных, например ооциты Хепорик 1аеу1к или клетки млекопитающих, такие как клетки насекомых или клетки млекопитающих. Примерами подходящих клеточных линий млекопитающих являются клеточные линии ΗΕ^93 (АТСС СКТ-1573), СО8 (АТСС СКЬ-1650), ВЖ. (АТСС СКЬ-1632, АТСС ССЬ-10), N8/0 (ЕСАСС 85110503) или СШО (АТСС ССЬ-61). В технике известны другие подходящие клеточные линии. В одном воплощении экспрессирующая система представляет собой экспрессирующую систему млекопитающего, такую как экспрессирующая система клеток млекопитающего, содержащая различные клональные вариации клеток ΗΕ^93.
Способы трансфекции клеток млекопитающего и экспрессии последовательностей ДНК, введенных в клетки, описаны, например, в КаиГтап е! а1., 1. Мо1. Вю1., 159, 601-621 (1982); 8ои111егп е! а1., 1. Мо1. Арр1. Сепе!., 1, 327-341 (1982); Ьоу!ег е! а1., Ргос. Асаб. 8с1. И8А, 79, 422-426 (1982); \\щег е! а1., Се11., 14, 725 (1978); Согкаго е! а1., 8отабс Се11 Сепебск, 7, 603 (1981); Сгабат е! а1., У1го1., 52, 456 (1973); и №итапп е! а1., ΕΜВО 1., 1, 841-845 (1982). Для того чтобы получить моновалентные антитела по изобретению, клетки-хозяева экспрессирующей системы можно в одном воплощении котрансфицировать двумя экспрессирующими векторами одновременно, где первый вектор из двух указанных экспрессирующих векторов содержит последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь антитела, и второй вектор из двух указанных экспрессирующих векторов содержит последовательность ДНК, кодирующую легкую цепь антитела. Также две последовательности могут присутствовать в одном и том же экспрессирующем векторе или они могут быть слиты с образованием конструкции ДНК, кодирующей слитый полипептид, такой как полипептид, содержащий как легкую, так и тяжелую цепи.
В одном воплощении в качестве клеток-хозяев можно использовать клетки грибов (включая клетки дрожжей). Примеры подходящих клеток дрожжей включают клетки вида 8ассбаготусек или вида 8с1^о8асс11аготусе8. в частности штаммов 8ассНаготусек сегеу1К1ае. Примерами других клеток грибов являются клетки мицеллиальных грибов, например, вида АкрегдШик или вида ^прокрою, в частности штаммов АкрегдШик огу^ае или АкрегдШик шдег. Применение вида АкрегдШик для экспрессии белков описано, например, в ΕΡ 238023.
Среда, используемая для культивирования клеток, может представлять собой любую обычную среду, подходящую для выращивания клеток млекопитающих, такую как содержащая сыворотку или бессывороточная среда, содержащая подходящие добавки, или подходящая среда для выращивания клеток насекомых, дрожжей или грибов. Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков или их можно получить согласно опубликованным рецептам (например, в каталоге Американской коллекции типовых культур).
Затем полученные рекомбинантно моновалентные антитела можно извлечь из среды для выращивания обычными процедурами, включающими отделение клеток-хозяев от среды центрифугированием или фильтрацией, осаждение белковых компонентов супернатанта или фильтрата с помощью соли, например сульфата аммония, и очистку различными хроматографическими процедурами, например ВЭЖХ, ионообменной хроматографии, хроматографии на протеине А, хроматографии на протеине С или подобными способами.
Настоящее изобретение также относится к способу получения моновалентных антител по изобретению, включающему стадии:
(a) культивирования клеток-хозяев, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую указанные моновалентные антитела; и (b) извлечения моновалентных антител из культуры клеток-хозяев.
В одном воплощении указанные клетки-хозяева являются прокариотическими клетками-хозяевами. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой клетку Ε. соб. В одном воплощении клетки Ε. соб являются клетками штамма с недостаточной эндогенной протеазной активностью.
В одном воплощении указанные клетки-хозяева являются эукариотическими клетками-хозяевами. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой клетку ΗΕ^93. В другом воплощении клеткахозяин представляет собой клетку СΗО.
В одном воплощении моновалентные антитела выделяют из среды для культивирования. В другом
- 20 016609 воплощении моновалентные антитела выделяют из клеточного лизата.
Антитела по настоящему изобретению имеют преимущество длительного времени полужизни, что ведет к более протяженному терапевтическому окну по сравнению с, например, фрагментами ЕАВ тех же антител, которые имеют сравнительно более короткое время полужизни ίη νΐνο.
Кроме того, в силу длительного времени полужизни и небольшого размера моновалентные антитела по изобретению будут иметь возможность лучшего распределения ίη νΐνο, например, за счет способности проникать в солидные опухоли. Это ведет к большей возможности применения моновалентных антител по изобретению, например, при лечении рака, так как антитела по изобретению можно применять или для ингибирования молекул-мишеней, или в качестве механизма мишенеспецифической доставки для других лекарственных средств, которые могут лечить болезнь.
Из-за отсутствия активации иммунной системы моновалентными антителами по изобретению такие антитела являются ингибиторами клетки-мишени, но не киллерами клетки-мишени. Это может являться преимуществом при рассмотрении лечения различных заболеваний, когда механизм ингибирования нужен без желания уничтожения клетки.
В одном воплощении моновалентные антитела против УЕСЕ используют для лечения АМЭ (острой дегенерации желтого пятна) и других заболеваний.
В одном воплощении используемые моновалентные антитела против УЕСЕ являются моновалентной формой бевацизумаба (авастина).
Антитела по настоящему изобретению являются моновалентными, стабильными в физиологических условиях, неспособны к активации комплемента и, таким образом, подходят для применения при лечении расстройств и заболеваний, при которых не является необходимым или выгодным применение поливалентных антител, или когда не является необходимой или выгодной активация комплемента. Моновалентное антитело по изобретению можно представить в водных растворах гетеродимером, состоящим из одной легкой цепи и одной тяжелой цепи.
Выражение устойчивы в физиологических условиях или устойчивость в физиологических условиях в данном контексте означает, что моновалентные антитела сохраняют свои основные структурные и функциональные характеристики неизменными и присутствуют в терапевтически существенной концентрации в течение более одной недели после того, как указанные молекулы введены субъекту ίη νΐνο в дозе 1-10 мг на 1 кг. Концентрация в плазме 5 мкг/мл считается существенной для большинства лечебных антител, поскольку антитела могут показывать насыщение связывания с мишенью на таком уровне. Промежуток времени в 7 дней в данном контексте рассматривается как относительно длительный.
Как у иммунодефицитных, так и у иммунокомпетентных мышей клиренс бесшарнирного варианта происходит значительно медленнее, чем фрагментов Е(аЬ')2, которые имеют сравнимый молекулярный размер. Это показывает, что Ес-часть оказывает благоприятное действие на время пребывания в плазме и указывает на функциональное взаимодействие с неонатальным Ес-рецептором (ЕсВп), который защищает захваченный клеткой 1дС от внутриклеточного разложения. Скорость клиренса бесшарнирного варианта примерно в 300 раз меньше, чем скорость клиренса фрагментов Е(аЬ')2, что указывает на то, что можно давать дозу в 300 раз меньшую для получения равнозначных во времени концентраций в плазме.
Изобретение также относится к иммуноконъюгату моновалентного антитела по изобретению. Настоящее изобретение относится, в частности, к моновалентному антителу по изобретению, конъюгированному с лечебной молекулой, такой как цитотксин, химиотерапевтическое лечебное средство, иммунодепрессант или радиоизотоп. Такие конъюгаты называют иммуноконъюгатами. Цитотоксин или цитотоксическое средство включают любое средство, которое вредно для клеток (например, убивает клетки). Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ό, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропанолол и пирумицин, их аналоги и гомологи.
Подходящие химиотерапевтические средства для образования иммуноконъюгатов по изобретению включают, но не ограничиваются перечисленным, антиметаболиты (например, метотрексат, 6меркаптопутин, 6-тиогуанин, цитарабин, флударабин, 5-флуороурацил, декарбазин, гидроксимочевину, азатиприн, гемцитабин и кладрибин), алкилирующие агенты (например, мехлоретамин, тиоэпу, хрорамбуцил, мелфалан, кармустин (ΒδΝυ) и ломустин (ССЫИ), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цисплатин цис-дихлордиаминплатину(П) (ΌΌΡ)), антрациклины (например, даунорубицин (прежде дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (прежде актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)) и антимитотические средства (например, винкристин, винбластин, доцетксел, паклитаксел и винорелбин).
Подходящими радиоизотопами являются, например, иод-131, иттрий-90 или индий-111.
Другими примерами лечебных элементов могут являться белок или полипептид, обладающие нужной биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно активный токсин или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин А, эндотоксин Рзеийошопаз или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухоли или интерферон-γ, или модификаторы биологических реакций, такие как, например, лимфокины, интерлейкин-1 (Ш-1), интерлейкин-2 (!Ь-2), интерлейкин-6
- 21 016609 (1Ь-6), колониестимулирующий фактор макрофагов (СМ-С8Р), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (С-С8Р) или другие факторы роста.
В одном воплощении лечебной молекулой является доксорубицин, цисплатин, блеомицин, кармустин, хлорамбуцил, циклофосфамид или рицин А.
Методы конъюгации такой лечебной молекулы с антителами хорошо известны, см., например, Моηос1оηа1 Ап11Ьо6|Ск Рог 1ттиио!агдебид ОГ Игадк Ιη Саисег ТНегару, МопоЛошН Ап11Ьо6|Ск Аи6 Саисег ТНегару, Ке1кГе1б с! а1. (ебк.), р. 243-56 (А1аи К. Ыкк, 1ис. 1985); не11к!гот с! а1., АибЬоб1ек Рог Эгид Иебуегу, Сои!го11сб Игад Иебуегу (2иб Еб.), КоЫикои с! а1. (ебк.), р. 623-53 (Магсс1 Иеккег, 1ис. 1987); ТНогре, АибЬобу Сагпегк ОГ Су!о!ох1с Адеи!к Ιη Саисег ТНегару: А Кеу1еА', Моиос1оиа1 АибЬоФек 1984: В1о1од1са1 Аиб С11шса1 Аррбсабоик, РшсНега е! а1. (ебк.), р. 475-506 (1985); Аиа1ук1к, Кеки1!к, Аиб Ри!иге Ргокресбуе ОГ ТНе ТНегареибс Ике ОГ Каб1о1аЬе1еб АибЬобу Ιη Саисег ТНегару, Моиос1оиа1 АибЬоб1ек Рог Саисег Пе!есбои Аиб ТНегару, Ва1б\\б'1 е! а1. (ебк.), р. 303-16 (Асабетк Ргекк 1985), аиб ТНогре е! а1., ТНе Ргерагабои Аиб Су!о!ох1с Ргорегбек ОГ АибЬобу-Тохт Сои)ида!ек, 1ттиио1. Кеу., 62:119-58 (1982).
В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению присоединены к линкерукомплексообразователю, например тиуксетану, что дает возможность конъюгировать антитела с радиоизотопом.
В одном воплощении настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей моновалентные антитела по настоящему изобретению. Фармацевтическую композицию можно получить с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, а также любыми другими известными адъювантами и эксципиентами согласно обычным методам, таким как раскрыты в Кетшд!ои: ТНе Заеисе аиб Ргасбсе оГ РНагтасу, 19'1' Еб1бои, Сспп-го, Еб., Маск РиЫкЫид Со., Еак!ои, РА, 1995.
Фармацевтическую композицию можно вводить любым подходящим путем и способом. Как будет понятно специалистам, путь и/или способ введения будет изменяться в зависимости от желаемых результатов.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает композиции, подходящие для перорального, назального, местного (включая трансбуккальный и сублингвальный), ректального, вагинального и/или парентерального введения.
Композиции по настоящему изобретению, подходящие для вагинального введения, включают пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пенки или спреи, содержащие такие носители, которые известны в технике для соответствующего случая. Лекарственные формы для местного или трансдермального введения композиций по изобретению включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пэтчи и лекарственные формы для ингаляции.
В одном воплощении фармацевтическая композиция подходит для парентерального введения.
Выражения парентеральное введение и введенный парентерально, используемые в данном описании, обозначают способ введения иной, чем энтеральное и местное введение, как правило, инъекцию, и включает, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, интраартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, интракардиальную, интрадермальную, интраперитонеальную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, интраартикулярную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию.
В одном воплощении фармацевтическую композицию вводят внутривенной или подкожной инъекцией или инфузией.
В одном воплощении моноклональные антитела по изобретению вводят в кристаллической форме подкожной инъекцией, ср. Уаид е! а1., РЫА8, 100 (12), 6943-6939 (2003).
Независимо от выбранного способа введения, моноклональные антитела по настоящему изобретению, которые можно использовать в форме фармацевтически приемлемой соли или в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции по настоящему изобретению, составляют в фармацевтически приемлемых лекарственных формах обычными способами, известными специалистам в данной области техники.
Используемое в данном описании определение фармацевтически приемлемый носитель включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, средства для регулирования изотоничности, антиоксиданты и средства для отсрочки поглощения и подобные средства, которые являются физиологически совместимыми.
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекции. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных веществ известно в технике. За исключением тех случаев, когда обычные среды или средства несовместимы с моновалентными антителами, предполагается их применение в фармацевтических композициях по изобретению.
В одном воплощении носитель является подходящим для парентерального введения, например, внутривенной или подкожной инъекции или инфузии.
Типично фармацевтические композиции должны быть стерильными и устойчивыми в условиях изготовления и хранения. Композиция может быть получена в виде раствора, микроэмульсии, липосом или
- 22 016609 другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно использовать в фармацевтических композициях по изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и подходящие для инъекции органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, применяя обволакивающие материалы, такие как лецитин, путем сохранения требуемого размера частиц в случае дисперсии и применения поверхностно-активных веществ.
Фармацевтические композиции также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие вещества, эмульгаторы и диспергирующие вещества. Предотвращение присутствия микроорганизмов можно обеспечить как процедурами стерилизации, так и включением различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и подобных средств. Также может быть желательно включение в композиции средств для регулирования изотоничности, таких как сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, глицерин, или хлорид натрия. Также можно включать фармацевтически приемлемые антиоксиданты, например (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п.; и (3) вещества, образующие хелатные соединения с металлами, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.
Пролонгированное всасывание композиций для инъекции можно получить, включая средства, задерживающие всасывание, например соли моностеараты и желатин.
Стерильные растворы для инъекций можно получить, включая моновалентные антитела в требуемом количестве в соответствующий растворитель с одним ингредиентом или сочетанием ингредиентов, например, из числа перечисленных выше, как требуется, с последующей стерилизацией микрофильтрацией. Как правило, дисперсии получают, включая моновалентные антитела в стерильную среду, которая содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты, например, из числа перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций примерами способов получения являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием (лиофилизация), которые дают порошок активного ингредиента с добавлением любого желательного дополнительного ингредиента из их раствора, предварительно стерилизованного фильтрацией.
В соответствующем случае моновалентные антитела можно использовать в подходящей гидратированной форме или в форме фармацевтически приемлемых солей. Термин фармацевтически приемлемая соль относится к соли, которая сохраняет желательную биологическую активность исходного соединения и не оказывает какого-либо нежелательного токсикологического действия (см., например, Вегде 8.М. е! а1. (1977), 1. РНагт. 8с1., 66: 1-19). Примеры таких солей включают соли присоединения кислот и оснований. Соли присоединения кислот включают соли, образованные с нетоксичными неорганическими кислотами, такими как хлороводородная, азотная, фосфорная, серная, бромоводородная, фосфористая и т.п., а также нетоксичными органическими кислотами, такими как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т. п. Соли присоединения оснований включают соли, образованные со щелочными и щелочно-земельными металлами, такими как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также с нетоксичными органическими аминами, такими как Ν,Ν'дибензилэтилендиамин, Ν-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т. п.
В зависимости от способа введения моновалентные антитела можно заключить в материал для защиты соединения от действия кислот и других естественных факторов, которые могут инактивировать соединение. Например, соединение можно вводить субъекту в соответствующем носителе, например липосомах. Липосомы включают эмульсии ССЕ вода-в-масле, масло-в-воде, а также обычные липосомы (81ге)ап е! а1., 1. №иго1ттипо1., 7, 27 (1984)).
Моновалентные антитела можно ввести в препарат с носителями, которые будут защищать моновалентные антитела от быстрого высвобождения, такой как композиция с регулируемым высвобождением, включая такие системы доставки, как имплантаты, трансдермальные пэтчи и микроинкапсулированные препараты. Можно использовать биоразлагаемые биосовместимые полимеры, такие как сополимер этилена с винилацетатом, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полиакриловая кислота. Способы получения таких композиций вообще известны специалистам в данной области техники, см., например, 8и8!атеб апб Соп!го11еб Ве1еа§е Эгид ОеНуегу 8у5!ет5, ТВ. ΚоЬ^и5Οи. еб., Магсе1 Оеккег, 1пс., №\ν Уогк, 1978.
Фармацевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, известных в технике. В одном воплощении лечебную композицию по изобретению можно вводить безыгольным устройством для подкожных инъекций, таким как устройства, описанные в И8 5399163; И8 5383851; И8 5312335; И8 5064413; И8 4941880; И8 4790824 или И8 4596556. Примеры хорошо известных импланта
- 23 016609 тов и модулей. применимых в настоящем изобретении. включают устройства. описанные в иБ 4487603. где раскрывается имплантируемый насос для микроинфузий для подачи лекарственного средства с регулируемой скоростью; в иБ 4486194. где раскрывается лечебное устройство для введения лекарственных средств через кожу; в иБ 4447233. где раскрывается насос для инфузии лекарственных средств для доставки лекарственного средства с точной скоростью инфузии; в иБ 4447224. где раскрывается имплантируемый прибор для инфузии с переменным потоком для непрерывной доставки лекарственного средства; в иБ 4439196. где раскрывается осмотическая система доставки лекарственного средства с многокамерными компартментами; и в иБ 4475196. где раскрывается осмотическая система доставки лекарственного средства. Специалистам известно много других таких имплантатов. систем доставки и модулей.
В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению можно ввести в композицию. обеспечивающую надлежащее распределение ίη νίνο. например. с использованием липосом. В отношении способов получения липосом см.. например. иБ 4522811; иБ 5374548 и иБ 5399331. Липосомы могут содержать одну или несколько частиц. которые селективно переносятся в определенные клетки или органы. таким образом усиливая направленную доставку лекарственного средства (см.. например. У. У. Капабе. ί. С11п. Рбагтасо1.. 29. 685 (1989)). Примеры нацеливающих частиц включают фолат или биотин (см.. например. иБ 5416016); маннозиды (итеха\\'а е1 а1.. Вюсбет. Вюрбук. Кек. Соттип.. 153. 1038 (1988)); другие антитела (В1оетап е1 а1.. РЕВБ беИ.. 357. 140 (1995); О\\шк е1 а1.. АпбтюгоЬ. Адеп!к СбетоШег.. 39. 180 (1995)); поверхностно-активный рецептор протеина А (Впксое е1 а1.. Ат. ί. Рбукю1.. 1233. 134 (1995)); различные добавки. которые могут содержать композиции по изобретению. а также компоненты молекул по изобретению; р.120 (Бсбге1ег е1 а1.. 1. Вю1. Сбет.. 269. 9090 (1994)); см. также Кетапеп е1 а1.. РЕВБ беИ.. 346. 123 (1994); КШюп е1 а1.. Гттипоте1бобк. 4. 273 (1994). Композиция должна быть жидкой до такой степени. чтобы существовала возможность легкого введения через шприц. Она должна быть устойчива в условиях изготовления и хранения. и ее необходимо защитить от загрязняющего действия микроорганизмов. таких как бактерии и грибы.
В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению можно ввести в композицию с предотвращением или уменьшением их переноса через плаценту. Это можно осуществить способами. известными в технике. например ПЭГилированием моновалентных антител. Также можно сослаться на Сипшпдбат-Кипб1ек е1 а1.. ί. Гттипо1. Ме1бобк. 152. 177-190 (1992) и Ьапбог е1 а1.. Апп. А11егду Акбта Гттипо1.. 74. 279-283 (1995).
Подбирают схемы введения лекарственных средств. обеспечивающие оптимальную желательную реакцию (например. лечебную реакцию). Например. можно ввести однократную болюсную дозу. можно ввести несколько разделенных во времени доз или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать. как показывают потребности лечебной ситуации. Особенно выгодно получать парентеральные композиции в стандартной лекарственной форме для простоты введения и равномерности дозировки. Стандартной лекарственной формой в данном описании называются физически дискретные единицы. подходящие как единичные дозировки для субъектов. которых лечат; каждая единица содержит предварительно установленное количество моновалентных антител. рассчитанное на получение нужного лечебного действия. в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Технические требования для стандартных лекарственных форм по изобретению диктуются и непосредственно зависят от (а) уникальных характеристик моновалентных антител и определенного лечебного действия. которого нужно достичь. и (Ь) собственных ограничений в технике получения композиций таких моновалентных антител для лечения из-за чувствительности у индивидуумов.
Фактические уровни дозировки моновалентных антител в фармацевтических композициях по настоящему изобретению могут изменяться с тем. чтобы получить количество активного ингредиента. которое эффективно для достижения желательной лечебной реакции у определенного пациента. в зависимости от композиции и способа введения. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от многих фармакокинетических факторов. включая активность используемых определенных моновалентных антител по настоящему изобретению. способ введения. время введения. скорость экскреции определенных используемых моновалентных антител. длительность лечения. другие лекарственные средства. соединения и/или материалы. используемые в сочетании с определенной используемой композицией. возраст. пол. массу тела. состояние. общее состояние здоровья и предшествующую историю болезни пациента. которого лечат. и подобных факторов. хорошо известных в медицине.
Рядовой врач или ветеринар может легко определить и прописать эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Например. врач или ветеринар может назначить начальные дозы соединений по изобретению. используемых в фармацевтической композиции. на уровнях меньших. чем требуется для того. чтобы достичь желательного лечебного действия. и постепенно увеличивать дозировку до тех пор. пока желаемое действие не будет достигнуто. Вообще. подходящая доза фармацевтической композиции по изобретению будет представлять собой количество моновалентных антител. которое является наименьшей дозой. эффективной для получения лечебного действия. Такая эффективная доза. как правило. будет зависеть от факторов. описанных выше. Как другой пример. врач или ветеринар могут начать с высокой ударной дозы с последующим повторным введением меньших доз для быстрого накопления терапевтически эффективной дозы и поддержания ее в течение длительных периодов време
- 24 016609 ни.
Фармацевтическая композиция по изобретению может содержать одни моноклональные антитела или комбинацию различных моноклональных антител по изобретению. Таким образом, в другом воплощении фармацевтическая композиция включает сочетание нескольких (например, двух или большего числа) моновалентных антител по изобретению, которые действуют по различным механизмам. Моновалентные антитела также можно комбинировать с двухвалентными антителами.
Настоящее изобретение также относится к нуклеотидной конструкции, кодирующей аминокислотную последовательность области СН тяжелой цепи моновалентного антитела по изобретению.
В одном воплощении изобретение относится к нуклеотидной конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность области СН 1дС4, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область СН, модифицирована таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области в указанной области СН, не содержит каких-либо аминокислотных остатков, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей с пептидами, содержащими аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности указанной области СН, или комплементарной ей последовательности.
Нуклеотидную конструкцию, кодирующую область СН моновалентного антитела по изобретению, можно получить из нуклеиновых кислот, кодирующих область СН 1дС4. Нуклеотидную конструкцию, кодирующую полноразмерную аминокислотную последовательность области СН 1дС4, можно получить любым из способов, обсуждаемых в данном описании, например в примерах, или другими способами, известными в технике. Способы манипуляции с последовательностями рекомбинантных ДНК хорошо известны в технике, и могут, например, осуществляться с использованием сайт-направленного мутагенеза, как описано в настоящем описании. Однако сайт-направленный мутагенез является только одним из неограничительных примеров технологий, которые можно применять.
Модификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей область СН, можно осуществить так, как описано выше для конструкции моновалентных антител по изобретению.
В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН, модифицируют таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области, не содержит цистеиновых остатков.
В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН, модифицируют таким образом, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков участка, соответствующего шарнирной области, включая цистеиновые остатки, делетирован и/или заменен другими аминокислотными остатками.
В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН, модифицируют таким образом, что аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 106 и 109 последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 14, делетированы.
В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН, модифицируют таким образом, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотам 106 и 109 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 14, делетирован.
В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН, модифицируют таким образом, что делетированы, по меньшей мере, аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 99-110 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 14.
В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН, модифицируют таким образом, что делетирована вся шарнирная область.
В одном воплощении мутация (замена) нуклеотидов, соответствующих донорному сайту сплайсинга шарнирной области в последовательности, кодирующей область СН 1дС4, идентифицированную в данном описании как 8Е0 ΙΌ N0: 13, приводит к экспрессии полипептида, содержащего бесшарнирную область СН 1дС4.
Соответственно в одном воплощении нуклеотидную конструкцию по изобретению модифицируют таким образом, что по меньшей мере один нуклеотид донорного сайта сплайсинга нуклеотидной последовательности, кодирующей шарнирную область, заменен нуклеотидом иным, чем нуклеотид, первоначально присутствующий в указанной позиции.
В одном воплощении нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам в позиции 714 и 722 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 13, заменяют нуклеотидом иным, чем нуклеотид, присутствующий в указанной позиции в 8Е0 ΙΌ N0: 13.
В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая область СН нуклеотидной конструкции по изобретению, содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 13, в которой нуклеотиды 714 и 722 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 13 заменены нуклеотидом иным, чем нуклеотид, присутствующий в указанной позиции в 8Е0 ΙΌ N0: 13.
В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая область СН, нуклеотидной конструкции по изобретению, содержит нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:15.
В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая область СН нуклеотидной конструкции по изобретению, модифицируют таким образом, что аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 106 и 109 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 14, заменены аминокислотными ос
- 25 016609 татками, отличными от цистеина.
В одном воплощении заменяемые нуклеотиды нуклеотидной последовательности, кодирующей область Сн нуклеотидной конструкции по изобретению, заменяют с использованием сайт-направленного мутагенеза.
В одном воплощении нуклеотидную конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую область Сн 1§С4, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область Сн, модифицирована таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области в указанной области Сн, не содержит каких-либо аминокислотных остатков, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей, сливают с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую область Уъ моновалентного антитела по изобретению.
Таким образом, в одном воплощении нуклеотидная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область У|, антигенспецифического антитела, или последовательность, комплементарную ей.
В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая область Уъ нуклеотидной конструкции, функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей область Сн, или последовательностью, комплементарную ей.
В одном воплощении нуклеотидная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь моновалентного антитела по изобретению.
Этого можно достичь с использованием хорошо известных технологий получения нуклеотидной конструкции, в которой две различные кодирующие последовательности функционально связаны вместе. Нуклеотидную последовательность, кодирующую область Ун моновалентного антитела по изобретению, можно получить из нуклеиновых кислот, кодирующих область Ун любого антигенспецифического антитела. В одном воплощении область Ун получают из того же антитела, из которого получают область У|, моновалентного антитела. В изобретении приводятся примеры того, как получить конструкции нуклеиновых кислот, содержащие:
1) нуклеотидную последовательность, кодирующую область Ун НиМаЬ-7Э8. идентифицированную как 8ЕЭ ГО N0: 5, и нуклеотидную последовательность, кодирующую бесшарнирную область Сн 1дС4, идентифицированную как 8Еф ГО N0: 15, где указанные последовательности функционально связаны вместе;
2) нуклеотидную последовательность, кодирующую область Ун мышиного антитела против Ββΐν-1, идентифицированную как 8Еф ГО N0: 7, и нуклеотидную последовательность, кодирующую бесшарнирную область Сн 1дС4, идентифицированную как 8Еф ГО N0: 15, где указанные последовательности функционально связаны вместе.
Ряд различных нуклеотидных конструкций, кодирующих моновалентные антитела, способные связываться с различными специфическими антигенами, можно получить с использованием способа по изобретению, описанного выше, и поэтому примеры специфических моновалентных антител не ограничиваются примерами антител, описанных в данном описании.
В одном воплощении нуклеотидная конструкция по изобретению также содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь моновалентного антитела по изобретению.
В одном воплощении нуклеотидная конструкция по изобретению также содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область У|, моновалентного антитела по изобретению.
В одном воплощении нуклеотидная конструкция по изобретению также содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область Сь моновалентного антитела по изобретению. В одном воплощении область Сь представляет собой область Сь легкой цепи каппа. В одном воплощении область Сь имеет последовательность 8Еф ГО N0: 1. В другом воплощении область Сь представляет собой область Сь легкой цепи лямбда. В одном воплощении область Сь имеет последовательность 8Еф ГО N0: 3.
Такую нуклеотидную конструкцию можно получить любой рекомбинантной технологией, обсуждаемой в данном описании, или получить согласно процедурам, описанным в настоящей заявке в приведенных примерах.
Нуклеотидную последовательность, кодирующую область Уъ моновалентного антитела по изобретению, можно получить из нуклеиновых кислот, кодирующих область Ун любого антигенспецифического антитела. В одном воплощении область У|, получают из того же антитела, из которого получают область Ун моновалентного антитела. В изобретении приводятся примеры того, как получить:
1) нуклеотидную конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую область Уь НиМаЬ-7П8, идентифицированную как 8Еф ГО N0: 9, и нуклеотидную последовательность, кодирующую Сь каппа 1д, идентифицированную как 8Еф ГО N0: 1, где указанные последовательности функционально связаны вместе;
2) нуклеотидную конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую область Уъ мышиного антитела против Ββΐν-1, идентифицированную как 8Еф ГО N0: 11, и нуклеотидную последовательность, кодирующую Съ каппа 1д, идентифицированную как 8Еф ГО N0: 1, где указанные последовательности функционально связаны вместе.
Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточных лизатах или в частично
- 26 016609 очищенной или в, по существу, очищенной форме.
Нуклеотидные конструкции по настоящему изобретению часто не только в нативной последовательности (за исключением модифицированных сайтов рестрикции и т.п.), но и из кДНК, геномной последовательности или их смесей можно мутировать согласно стандартным методам получения последовательностей генов. В случае кодирующих последовательностей такие мутации могут влиять на аминокислотную последовательность, как желательно. В частности, рассматриваются последовательности ДНК, по существу, гомологичные или происходящие от нативной, V, Ό, 1, константной, вариантовпереключателей и других таких последовательностей, описанных в данном описании (где происходящие от указывает, что последовательность идентична другой последовательности или модифицирована).
В одном воплощении нуклеотидная конструкция представляет собой конструкцию ДНК. В одном воплощении нуклеотидная конструкция представляет собой конструкцию двухцепочечной ДНК.
В одном воплощении нуклеотидная конструкция представляет собой конструкцию РНК.
В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению получают, создавая возможность экспрессии в клетке нуклеотидной конструкции, описанной выше.
Таким образом, изобретение относится к нуклеотидной конструкции, описанной выше, которая является экспрессирующим вектором. В одном воплощении экспрессирующий вектор является прокариотическим экспрессирующим вектором. В одном воплощении экспрессирующий вектор является эукариотическим экспрессирующим вектором. В одном воплощении экспрессирующий вектор представляет собой экспрессирующий вектор на основе ДНК млекопитающего. Примеры различных экспрессирующих векторов, которые можно использовать для целей изобретения, обсуждаются в тексте описания, и конкретные примеры описаны в разделе Примеры.
Изобретение относится к способу получения моновалентных антител по изобретению, включающему культивирование клеток-хозяев, содержащих нуклеотидную конструкцию по изобретению и, если указанная нуклеотидная конструкция не кодирует легкую цепь указанных антител, также нуклеотидную конструкцию, кодирующую легкую цепь указанных антител, так что экспрессируются полипептиды, и извлечение моновалентных антител из культуры клеток. В одном воплощении моновалентные антитела выделяют из клеточного лизата. В другом воплощении моновалентные антитела выделяют из культуральной среды.
Изобретение также относится к применению нуклеотидной конструкции по изобретению для получения моновалентных антител по изобретению. В одном воплощении указанное получение включает применение способа, подробно описанного ниже.
Таким образом, моновалентные антитела по изобретению можно получить, например, экспрессией в клетках-хозяевах экспрессирующего вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела по изобретению, и экспрессией экспрессирующего вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела по изобретению, или экспрессирующего вектора, содержащего обе последовательности. Клетки-хозяева можно выбрать из числа любых клеток, подходящих для экспрессии чужеродных белков, например клетки млекопитающего, как описано в данном описании. Изобретение относится к экспрессии как ίη νίνο, так и ίη νίίτο.
Для транзиентной экспрессии ίη νίΐτο можно использовать клетки млекопитающего нЕК293. В таком случае клетки в культуре трансфицируют описанными выше экспрессирующими векторами любым из способов, подходящих для трансфекции клеток, которые хорошо известны в технике, например можно закупить подходящий набор для трансфекции клеток у коммерческого производителя, например у 81гаЮдснс или ΙηνίΙΐΌβοηο. Для экспрессии ίη νίνο экспрессирующий вектор вводят ίη νίνο любым подходящим способом введения, разработанным для такой цели. Способы введения экспрессирующих векторов ίη νίνο хорошо известны в технике.
Соответственно изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеотидную конструкцию, описанную выше. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой клетку Е. той. В другом воплощении клеткахозяин представляет собой эукариотическую клетку. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой клетку СнО. В другом воплощении клетка-хозяин представляет собой клетку нЕК-293Р.
Изобретение относится к способу получения моновалентных антител по изобретению, включающему культивирование клеток-хозяев по изобретению, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь указанных антител, и нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь указанных антител, так что экспрессируются полипептиды, и извлечение моновалентных антител из культуры клеток. Изобретение также относится к применению клеток-хозяев по изобретению для получения моновалентных антител по изобретению. В одном воплощении указанное получение включает применение способа, подробно описанного ниже. Нуклеотидная последовательность может присутствовать в одной и той же нуклеотидной конструкции как нуклеотидной последовательности, кодирующей тяжелую цепь, или присутствовать в отдельной нуклеотидной конструкции. В одном воплощении моновалентные антитела выделяют из клеточного лизата. В другом воплощении моновалентные антитела вы
- 27 016609 деляют из культуральной среды.
Изобретение также относится к трансгенному животному, содержащему нуклеотидную конструкцию, описанную выше.
Изобретение относится к способу рекомбинантного получения моновалентного антитела, включающему:
ί) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей легкую цепь указанного моновалентного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область Уъ выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область (Сь) 1д, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область Уъ выбранного антигенспецифического антитела, и указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область С|. 1д, функционально соединены вместе;
ίί) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область Ун выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую область Сн человеческого 1дС4. где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь, модифицирована таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области тяжелой цепи, не содержит каких-либо аминокислотных остатков, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей с другими пептидами, содержащими идентичную аминокислотную последовательность константной области (Сн) человеческого 1дС4, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область Ун выбранного антигенспецифического антитела, и указанная нуклеиновая кислота, кодирующая область Сн 1дС4, функционально соединены вместе;
ίίί) обеспечение клеточной экспрессирующей системы для получения указанного антитела;
ίν) получение указанного моновалентного антитела коэкспрессией нуклеотидных конструкций (ί) и (ίί) в клетках клеточной экспрессирующей системы (ίίί).
После стадии (ίν) моновалентные антитела можно очистить и ввести в нужные композиции.
В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области тяжелой цепи, не содержит каких-либо цистеиновых остатков, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков участка, соответствующего шарнирной области, включая цистеиновые остатки, делетирован и/или заменен на другие аминокислотные остатки, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область Сн, в которой аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 106 и 109 последовательности 8ЕО Ш N0: 14, делетированы, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область Сн, в которой делетированы, по меньшей мере, аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотным остаткам 99-110 последовательности 8ЕО Ш N0: 14, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что делетирована вся шарнирная область, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидная конструкция, кодирующая тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область Сн человеческого 1дС4, где по меньшей мере один нуклеотид донорного сайта сплайсинга нуклеотидной последовательности, кодирующей шарнирную область, заменен другим нуклеотидом, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидная конструкция, кодирующая тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область Сн человеческого 1дС4, где нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам в позиции 714 и 722 последовательности 8Е0 Ш N0: 13, заменены нуклеотидом иным, чем нуклеотид, присутствующий в указанной позиции в 8Е0 Ш N0: 13, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидная конструкция, кодирующая тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область Сн человеческого 1дС4, содержащую последовательность 8Е0 Ш N0: 13, в которой нуклеотиды 714 и 722 последовательности 8Е0 Ш N0: 13 заменены нуклеотидом иным, чем нуклеотид, присутствующий в указанной позиции в 8Е0 Ш N0: 13, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидная конструкция, кодирующая тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, содержит нуклеотидную последовательность 8Е0 Ш N0: 15, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидную конструкцию, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область Сн, в которой аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотным остаткам 106 и 109 последовательности 8Е0 Ш N0: 14, заменены аминокислотными остатками, отличными от цистеина, как описано выше.
- 28 016609
В одном воплощении заменяемые нуклеотиды нуклеотидной последовательности, кодирующей шарнирную область области СН, заменяют с использованием сайт-направленного мутагенеза, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидная конструкция, кодирующая легкую цепь указанного моновалентного антитела, содержит последовательность, кодирующую область Сь цепи каппа человеческого 1дС4, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидная конструкция содержит последовательность 8Е0 Ш N0: 1, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидная конструкция, кодирующая легкую цепь указанного моновалентного антитела, содержит последовательность, кодирующую область Сь цепи лямбда человеческого 1дС4, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидная конструкция содержит последовательность 8Е0 Ш N0: 3, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидные конструкции представляют собой конструкции ДНК, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидная конструкция (ί)-(ίίί) и/или (ίν) представляет собой прокариотический экспрессирующий вектор, описанный выше. В другом воплощении клеточная экспрессирующая система представляет собой прокариотическую клеточную экспрессирующую систему, как описано выше. В другом воплощении прокариотическая клеточная экспрессирующая система содержит клетки Е. со11, как описано выше. В другом воплощении клетки Е. сой представляют собой штамм с недостаточной эндогенной протеазной активностью, как описано выше.
В одном воплощении нуклеотидная конструкция (ί)-(ίίί) и/или (ίν) представляет собой эукариотический экспрессирующий вектор, описанный выше. В другом воплощении клеточная экспрессирующая система представляет собой эукариотическую клеточную экспрессирующую систему, как описано выше. В другом воплощении эукариотическая клеточная экспрессирующая система представляет собой экспрессирующую систему на основе клеток млекопитающего, как описано выше. В другом воплощении клеточная экспрессирующая система на основе клеток млекопитающего содержит клетки СН0, как описано выше. В еще одном другом воплощении клеточная экспрессирующая система на основе клеток млекопитающего содержит клетки НЕК-293Е, как описано выше.
Настоящее изобретение также относится к моновалентному антителу, которое можно получить с применением способа по изобретению.
Настоящее изобретение также относится к моновалентному антителу, которое получают с применением способа по изобретению.
Согласно изобретению любое антигенспецифическое моновалентное антитело по изобретению можно получить с использованием способа, описанного выше.
Моновалентные антитела по настоящему изобретению имеют многочисленные диагностические и терапевтические применения ίπ νίΙΐΌ и ίπ у|уо, включая диагностику и лечение расстройств с участием клеток, экспрессирующих антиген, который антитела могут узнавать и связываться с ним. Изобретение не относится к моновалентным антителам, направленным на любой специфический антиген, так как согласно изобретению моновалентные антитела, описанные в настоящем описании, можно получить против любого специфического антигена. Изобретение раскрывает два различных моновалентных антитела 7Э8-НС (НиМаЬ 7Ό8 или просто 7Ό8 представляет собой антитело против СЭ20, описанное в XV0 04/035607, и НиМаЬ 7Э8-НС или просто 7Э8-НС представляет собой то же самое антитело, содержащее тяжелую цепь 1дС4, содержащую область СН, состоящую из аминокислотной последовательности 8Е0 Ш N0: 16) и антитело против ВеА-1 (антитело против Ве1у-1 представляет собой мышиное антитело, экспрессируемое клоном 2Н8, см. ссылку (Аккегбаак ЕН. е1 а1., А11егду, 50(3), 215-20 (1995)), и антитело против ВеА-1-НС представляет собой то же самое антитело, содержащее тяжелую цепь 1дС4, содержащую область СН, состоящую из аминокислотной последовательности 8Е0 Ш N0: 16), полученные способом, описанным в настоящей заявке, однако изобретение не ограничивается указанными двумя моновалентными антителами. В одном воплощении моновалентные антитела к СЭ20 по изобретению представляют собой моновалентные антитела из антител, описанных в А0 2005/103081.
При некоторых патологических состояниях необходимо и/или желательно использовать моновалентные антитела. Также в некоторых случаях предпочтительно, чтобы лечебные антитела проявляли свое лечебное действие без вовлечения активностей, опосредуемых иммунной системой, таких как эффекторные функции, АОСС, фагоцитоз и СЭС. В таких ситуациях желательно получать формы антител, в которых такая активность существенно ослаблена или устранена. Также выгодно, если антитела имеют форму, которую можно получить эффективно и с хорошим выходом. Настоящее изобретение относится к таким антителам, которые можно использовать для различных целей, например в качестве лечебных средств, профилактических средств и диагностических средств.
Конкретное применение моновалентных антител по изобретению, естественно, зависит от специфической мишени антител. Выбор мишеней, для которых моновалентные антитела по изобретению являются антителами, применимыми для лечения, профилактики и диагностики, может основываться на
- 29 016609 лечебной эффективности введения антител. специфических для мишени или специфических для данного эпитопа мишени (такой информации. касающейся хозяина различных мишеней. в технике предостаточно). и преимуществе применения стабильных моновалентных антител для специфической мишени. Такие соображения входят в компетенцию специалистов в данной области техники.
Моновалентные антитела по изобретению можно использовать в качестве антагонистов для частичной или полной блокировки специфической антигенной активности ш νίΙΐΌ. ех νί\Ό и/или ш νί\Ό. Более того. моновалентные антитела по изобретению могут нейтрализовать антигенную активность других видов из-за перекрестного связывания. вызываемого совместным пользованием различных антигенов одними и теми же эпитопами. Соответственно моновалентные антитела по изобретению можно использовать для ингибирования специфической антигенной активности. например. в клеточной культуре. содержащей антиген. для людей или других млекопитающих. имеющих антиген. с которым перекрестно взаимодействуют антитела по изобретению (например. для шимпанзе. бабуина. мартышки. собаковидных и макаки-резус. свиньи или мыши). В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению можно использовать для ингибирования антигенной активности путем контактирования антител с антигеном таким образом. что антигенная активность ингибируется. В одном воплощении антигеном является молекула человеческого белка.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению является специфическим для антигена лиганда и ингибирует антигенную активность. блокируя или препятствуя взаимодействию лигандрецептор с вовлечением антигена лиганда. причем посредством этого ингибируется соответствующий путь передачи сигнала и другие молекулярные или клеточные события.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению является специфическим для антигена рецептора. который может быть активирован контактом с лигандом. и ингибирует антигенную активность. блокируя или препятствуя взаимодействию лиганд-рецептор. причем посредством этого ингибируется соответствующий путь передачи сигнала и другие молекулярные или клеточные события.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению направлено на СЭ74 и ингибирует передачу сигнала. индуцируемую М1Р. но утрачивает Рс-опосредованные эффекторные функции.
Изобретение также относится к рецепторспецифическим моновалентным антителам. которые необязательно предотвращают связывание лиганда. но препятствуют активации рецептора. причем посредством этого ингибируются любые реакции. которые обычно могли бы инициироваться связыванием лиганда. Изобретение также охватывает моновалентные антитела. которые или предпочтительно. или исключительно связываются с комплексами лиганд-рецептор.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению может действовать как агонист определенного рецептора антигена. причем посредством этого потенцируется. усиливается или активируется или вся. или часть активностей лигандопосредованной активации рецептора.
В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению может предотвращать связывание вируса или другого патогена с его рецептором. например ингибирует связывание ВИЧ с СЭ4 или корецептором. таким как ССК5 или СХСК4.
В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению можно использовать для лечения. ингибирования. замедления развития или предотвращения/замедления рецидива. облегчения или предупреждения заболеваний. расстройств или состояний. связанных с аномальной экспрессией и/или активностью молекул одного или нескольких антигенов. включая. но не ограничиваясь перечисленным. такие заболевания. расстройства или состояния. как злокачественные и доброкачественные опухоли; нелейкозные и лимфоидные злокачественности; нейронные. глиальные. астроглиальные. гипоталамусные и другие гранулярные. макрофагиальные. эпителиальные. стромальные и бластоцельные расстройства и воспалительные. антиогенные и иммунологические расстройства.
В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению можно использовать для лечения. например ингибирования. замедления развития или предотвращения/замедления рецидива. или облегчения или предупреждения заболеваний. расстройств или состояний. таких как рак. расстройство клеточной пролиферации. (ауто)иммунное расстройство. воспалительное расстройство и/или ангиогенное расстройство. Это будет зависеть от способности моновалентных антител через их антигенную специфичность влиять на клеточную пролиферацию. рост клеток. жизнеспособность клеток. апоптоз. некроз. взаимодействие клетка-клетка. взаимодействие клетка-матрикс. передачу сигнала клеткой. экспрессию молекул клеточной поверхности. взаимодействия молекул клеточной поверхности. взаимодействия лиганд-рецептор.
Настоящее изобретение относится к моновалентным антителам по изобретению для применения в качестве лекарственного средства.
Настоящее изобретение относится к моновалентным антителам по изобретению для применения в качестве лекарственного средства для лечения рака. расстройства клеточной пролиферации. (ауто)иммунного расстройства. воспалительного расстройства и/или ангиогенного расстройства. когда антитела специфически связываются с данной мишенью или эпитопом мишени. где связывание антитела с указанной мишенью или эпитопом мишени эффективно для лечения указанного заболевания.
Настоящее изобретение относится к моновалентным антителам по изобретению для применения в
- 30 016609 качестве лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем блокировки или ингибирования растворимого антигена, когда при мультимеризации (такой как димеризация) указанного антигена могут образовываться нежелательные иммунные комплексы и где указанное антитело специфически связывается с антигеном.
Настоящее изобретение относится к моновалентным антителам по изобретению для применения в качестве лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем введения антител против определенной мишени, где вовлечение активностей, опосредуемых иммунной системой, не является необходимым или нежелательно для достижения эффекта от внедрения антител, и где указанное антитело специфически связывается с антигеном.
Настоящее изобретение относится к моновалентным антителам по изобретению для применения в качестве лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем блокировки или ингибирования клеточного мембраносвязанного рецептора, где указанный рецептор может быть активирован димеризацией указанного рецептора и где указанное антитело специфически связывается с указанным рецептором.
Настоящее изобретение относится к применению моновалентных антител по изобретению в качестве лекарственного средства.
Настоящее изобретение относится к применению моновалентных антител по изобретению в качестве лекарственного средства для лечения рака, расстройства клеточной пролиферации, (ауто)иммунного расстройства, воспалительного расстройства и/или ангиогенного расстройства, когда антитела специфически связываются с данной мишенью или эпитопом мишени, где связывание антитела с указанной мишенью или эпитопом мишени эффективно для лечения указанного заболевания.
Настоящее изобретение относится к применению моновалентных антител по изобретению в качестве лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем блокировки или ингибирования растворимого антигена, когда при мультимеризации (такой как димеризация) указанного антигена могут образовываться нежелательные иммунные комплексы.
Настоящее изобретение относится к применению моновалентных антител по изобретению в качестве лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем введения антител против определенной мишени, где вовлечение активностей, опосредуемых иммунной системой, не является необходимым или нежелательно для достижения эффекта от внедрения антител, и где указанное антитело специфически связывается с указанным антигеном.
Настоящее изобретение относится к применению моновалентных антител по изобретению в качестве лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем блокировки или ингибирования клеточного мембраносвязанного рецептора, где указанный рецептор может быть активирован димеризацией указанного рецептора и где указанное антитело специфически связывается с указанным рецептором.
Настоящее изобретение относится к применению моновалентных антител по изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения рака, расстройства клеточной пролиферации, (ауто)иммунного расстройства, воспалительного расстройства и/или ангиогенного расстройства, когда антитела специфически связываются с данной мишенью или эпитопом мишени, где связывание антитела с указанной мишенью или эпитопом мишени эффективно для лечения указанного заболевания.
Настоящее изобретение относится к применению моновалентных антител по изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем блокировки или ингибирования растворимого антигена, когда при мультимеризации (такой как димеризация) указанного антигена могут образовываться нежелательные иммунные комплексы.
Настоящее изобретение относится к применению моновалентных антител по изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем введения антител против определенной мишени, где вовлечение активностей, опосредуемых иммунной системой, не является необходимым или нежелательно для достижения эффекта от внедрения антител, и где указанное антитело специфически связывается с указанным антигеном.
Настоящее изобретение относится к применению моновалентных антител по изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем блокировки или ингибирования клеточного мембраносвязанного рецептора, где указанный рецептор может быть активирован димеризацией указанного рецептора и где указанное антитело специфически связывается с указанным рецептором.
Изобретение относится к способу лечения заболевания или расстройства, включающему введение субъекту, нуждающемуся в лечении, моновалентных антител по изобретению, фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела, иммуноконъюгата, содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по изобретению, посредством чего лечится заболевание или расстройство.
Изобретение относится к способу ингибирования антигена у субъекта, страдающего от заболевания или расстройства, при котором активность антигена нежелательна, включающему введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества моновалентных антител по изобретению, которые специфически связываются с указанным антигеном, фармацевтической композиции, со
- 31 016609 держащей указанные антитела, иммуноконъюгата, содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по изобретению, так что антигенная активность у субъекта ингибируется.
Настоящее изобретение относится к способу лечения рака, расстройства клеточной пролиферации, (ауто)иммунного расстройства, воспалительного расстройства и/или ангиогенного расстройства, включающему введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества моновалентных антител по изобретению, которые специфически связываются с указанным антигеном, фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела, иммуноконъюгата, содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по изобретению, и где указанные антитела специфически связываются с данной мишенью или эпитопом мишени, где связывание антитела с указанной мишенью или эпитопом мишени эффективно для лечения указанного заболевания.
В одном воплощении такое заболевание или расстройство представляет собой заболевание или расстройство, поддающееся лечению путем блокировки или ингибирования растворимого антигена, когда при мультимеризации (такой как димеризация) указанного антигена могут образовываться нежелательные иммунные комплексы, включающему введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества моновалентных антител по изобретению, направленных против указанного антигена, фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела, иммуноконъюгата, содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по изобретению.
В одном воплощении такое заболевание или расстройство представляет собой заболевание или расстройство, поддающееся лечению путем введения антител против определенной мишени, где вовлечение активностей, опосредуемых иммунной системой, не является необходимым или нежелательно для достижения эффекта от внедрения антител, включающему введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества моновалентных антител по изобретению, которые специфически связываются с указанным антигеном, фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела, иммуноконъюгата, содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по изобретению.
В одном воплощении такое заболевание или расстройство представляет собой заболевание или расстройство, поддающееся лечению путем блокировки или ингибирования клеточного мембраносвязанного рецептора, где указанный рецептор может быть активирован димеризацией указанного рецептора, включающему введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества моновалентных антител по изобретению, которые специфически связываются с указанным рецептором, фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела, иммуноконъюгата, содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по изобретению.
В научной литературе описывается множество примеров мишеней, где показано, что связывание антител против указанных мишеней или специфических эпитопов указанных мишеней имеет лечебный эффект. С учетом указаний в данном описании и самого описания специалист в данной области техники определит, можно ли ожидать, что применение моновалентных антител, таких как моновалентные антитела по настоящему изобретению, против таких мишеней окажет лечебное действие. Далее приводятся некоторые примеры таких мишеней; однако указанные примеры не следует рассматривать как ограничение объема изобретения.
Моновалентное антитело по изобретению, которое специфически связывается с растворимым антигеном, когда при мультимеризации (такой как димеризация) указанного антигена могут образовываться нежелательные иммунные комплексы, например, в результате агрегации, например, когда растворимые антигены состоят из нескольких идентичных субъединиц.
Моновалентное антитело по изобретению, которое специфически связывается с рецептором, который может быть активирован димеризацией указанного рецептора, например направленное на рецептор сшеЕ ЕсеВф ацетилхолиновый рецептор, £а§ или £а§Ь, ТВАШ или УЕСЕ.
В одном воплощении изобретения заболевание или расстройство, которое лечат, поддается лечению путем препятствования активации клеток через ЕсоВ1, путем препятствования функции ЕсаВЕ путем ингибирования последующих реакций, опосредованных Ι§Ε, активированным ЕсоВ1, или путем связывания растворимого ЕсаВЕ В одном воплощении изобретения моновалентные антитела направлены против ΕсαВI и индуцируют апоптоз клеток, экспрессирующих ЕсаВЕ В одном воплощении изобретения такое заболевание или расстройство может представлять собой, например, аллергическую астму или другие аллергические болезни, такие как аллергический ринит, сезонные/постоянные аллергии, сенная лихорадка, аллергические риниты, атопический дерматит, экзема, сыпь, крапивница, контактные аллергии, аллергический конъюнктивит, глазные аллергии, пищевые и лекарственные аллергии, латексаллергии или аллергии на насекомых, или ^А-нефропатию, такую как ^А-пузырчатка. В одном воплощении изобретения моновалентные антитела направлены против ЕсаВЕ Такие моновалентные антитела также можно использовать для скрининга ίη νίίΓο или ίη νίνο на ΕсαВI в образце или у пациента или в подходе с иммунотоксином или радиоизотопами для лечения указанных заболеваний и расстройств.
В одном воплощении изобретения заболевание или расстройство, которое лечат, поддается лечению путем даун-регуляции передачи сигнала, опосредуемого γ-цепью Ес-рецептора, через рецепторы
- 32 016609
ЕсеШ и Есу. Известно, что мономерное связывание антитела с ЕсоК осуществляет такое ингибирование. Таким образом, моновалентные антитела можно использовать для ингибирования иммунной активации через ряд Ес-рецепторов, включая рецепторы Есу, Есо и Есе.
В одном воплощении изобретения заболевание или расстройство, которое лечат, поддается лечению путем ингибирования, уничтожения и/или модуляции активности и/или роста (например, пролиферации) клеток, экспрессирующих 0025, через прямую или косвенную блокировку активированных Тклеток или клеток, экспрессирующих СО25. В одном воплощении такое заболевание или расстройство может представлять собой, например, отторжение трансплантата, в том числе отторжение аллотрансплантата и ксенотрансплантата, у пациентов, претерпевающих или которые претерпели пересадку органа или ткани, таких как сердце, легкое, комбинированную пересадку сердца и легкого, трахеи, почки, печени, поджелудочной железы, пищевода, кишечника, кожи, конечности, пупочного канатика, стволовых клеток, островковых клеток и т.п., когда моновалентные антитела по изобретению можно использовать в качестве профилактических средств при отторжении аллотрансплантата и ксенотрансплантата, или использовать для реверсии, лечения или иного облегчения острых эпизодов отторжении аллотрансплантата или ксенотрансплантата, болезнь трансплантат против хозяина, например болезнь трансплантат против хозяина при переливании крови и болезнь трансплантат против хозяина при пересадке костного мозга, воспалительные иммунные или аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, псориатический артрит, диабет типа Ι, инсулинзависимый диабет типа ΙΙ, рассеянный склероз, системная красная волчанка, тяжелая псевдопаралитическая миастения, воспалительная болезнь кишечника, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, дерматополимиозит, синдром Шегрена, артерииты, в том числе гигантоклеточный артериит, апластическая анемия, склеродермия и увеит, воспалительные или гиперпролиферативные кожные расстройства, например псориаз, в том числе бляшковый псориаз, ладонный пустулёз (ρπ8ΐο1ο8ΐ8 ρа1тορ1аηίа^^8) (РРР), эрозивный плоский лишай, пузырчатка буллезная, контактный дерматит и атопический дерматит, лимфоидные неоплазмы, например Т-клеточный лейкоз, болезнь Ходжкина, лейкемический ретикулез или кожная Т-клеточная лемфома, в том числе грибовидный микоз, и синдром Сезари, злокачественности, например рак желудка, онкозаболевания пищевода, злокачественная меланома, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, рак шейки матки, рак яичников и почечно-клеточная карицинома, гематологические расстройства, такие как Т-клеточный лейкоз/лимфома взрослых, анапластическая крупноклеточная лимфома, хронический лимфоцитарный лейкоз (СЬЬ)/небольшая лимфоцитарная лимфома (8ЬЬ), лимфома периферических Т-клеток и вторичный амилоидоз, кожные расстройства, такие как гангренозная пиодеомия, кольцевидная гранулема, аллергический контактный дерматит, рубцовый пемфигоид и герпес беременных, гепато-желудочно-кишечные расстройства, такие как коллагеновый колит, склерозирующий холангит, хронический активный гепатит, волчаночный гепатит, аутоиммунный гепатит, алкогольный гепатит, хронический панкреатит и острый панкреатит, сердечные расстройства, такие как миокардит и перикардит, сосудистые расстройства, такие как артериосклероз, гигантоклеточный артериит/ревматоидная полимиалгия, артериит Такаясу, нодозный полиартериит, синдром Кавасаки, гранулематоз Вегенера, микроскопическая ангиопатия, синдром Чурга-Штрауса, лейкоцитокластический ангиит и вторичный лейкоцитокластический васкулит, почечные расстройства, такие как гломерулонефрит, хронический гломерулонефрит, нефрит с минимальными изменениями и синдром Гудпасчера, легочные расстройства, такие как альвеолит, облитерирующий бронхоилит, силикоз и бериллиоз, неврологические расстройства, такие как рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, тяжелая псевдопаралитическая миастения, хроническая демиелинизирующая полиневропатия и полирадикулоневрит, в том числе синдром Гийена-Барре, расстройства соединительной ткани, такие как рецидивирующее воспаление нескольких хрящей, саркоидоз, системная красная волчанка, волчанка ЦНС, дискоидная волчанка, люпус-нефрит, синдром хронической усталости и фибромиалгия, эндокринные расстройства, такие как болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото и подострый тиреоидит, или вирусные инфекции, такие как ВИЧ-1/СПИД и тропический спастический парапарез.
В одном таком воплощении моновалентные антитела по изобретению направлены на СО25. Такие моновалентные антитела также можно использовать для скрининга ίη νίίτο или ίη νίνο на СО25 в образце или у пациента или в подходе с иммунотоксинами или радиоизотопами для лечения указанных заболеваний и расстройств.
В одном воплощении изобретения заболевание или расстройство, которое лечат, поддается лече
- 33 016609 нию путем антагонизирования и/или ингибирования функций рецепторов ГБ-15 или рецепторов ГБ-15. В одном воплощении такое заболевание или расстройство может представлять собой, например, артерииты, подагру, расстройства соединительной ткани, неврологические, желудочно-кишечные расстройства, гепатит, аллергические, гематологические, кожные, легочные расстройства, злокачественности, эндокринные, сосудистые расстройства, инфекции, почечные, сердечные расстройства, расстройства кровообращения и мышечные расстройства. В одном таком воплощении моновалентные антитела по изобретению направлены на ГБ-15. Такие моновалентные антитела также можно использовать для скрининга ίη νίΐτο или ίη νΐνο на ГБ-15 в образце или у пациента или в подходе с иммунотоксинами или радиоизотопами для лечения указанных заболеваний и расстройств.
В одном воплощении изобретения заболевание или расстройство, которое лечат, поддается лечению путем предотвращения связывания ГБ-8 со своим рецептором или путем блокировки функции ГБ-8. В одном таком воплощении такое заболевание или расстройство может представлять собой, например, ладонный пустулёз (РРР), псориаз или другие кожные заболевания, воспалительные, аутоиммунные и иммунные расстройства, такие как псориатический артрит, системная склеродермия и склероз, воспалительное заболевание кишечника (ΣΒΌ), болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, острое повреждение легких, такое как острый респираторный дистресссиндром или респираторный дистресс-синдром взрослых, менингит, энцефалит, увеит, множественная миелома, гломерулонефрит, нефрит, астма, атеросклероз, недостаточность адгезии лейкоцитов, рассеянный склероз, синдром Рейно, синдром Шегрена, ювенильный диабет, болезнь Рейтера, болезнь Бехчета, иммунный комплексный нефрит, нефропатия ГдА, полиневропатии ГдМ, иммуноопосредованные тромбоцитопении, такие как острая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и хроническая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, гемолитическая анемия, тяжелая псевдопаралитическая миастения, люпус-нефрит, красная волчанка, ревматоидный артрит (НА), анкилозирующий спондилит, пузырчатка, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, васкулиты мелких сосудов, такие как гранулематоз Вегенера, синдром Омена, хроническая почечная недостаточность, аутоиммунная болезнь щитовидной железы, острый инфекционный мононуклеоз, ВИЧ, болезни, ассоциированные с вирусом герпеса, вирусные инфекции человека, такие как насморк, как инфекции, вызываемые риновирусном, коронавирусом, другим энтеровисом, вирусом герпеса, вирусом гриппа, вирусом парагриппа, респираторно-синцитиальным вирусом или аденовирусом, бактериальная пневмония, раны, сепсис, мозговой удар/отек мозга, ишемическое-реперфузионное повреждение и гепатит С, алкогольный гепатит и острый панкреатит, болезни с участием опосредованного ГБ-8 ангиогенеза, такие как опухоли и онкозаболевания, например меланома, карцинома щитовидной железы, переходно-клеточная карцинома, трихолеммома, плоскоклеточная карцинома и рак молочной железы.
В одном таком воплощении моновалентные антитела по изобретению направлены на ГБ-8. Такие моновалентные антитела также можно использовать для скрининга ίη νίίτο или ίη νΐνο на ГБ-8 в образце или у пациента либо в подходе с иммунотоксинами или радиоизотопами для лечения указанных заболеваний и расстройств.
В одном воплощении изобретения заболевание или расстройство, которое лечат, поддается лечению путем препятствования активности ί.Ό20. исчерпывания В-клеток, препятствования росту и/или пролиферации В-клеток через, например, подход с иммунотоксинами или радиоизотопами. В одном воплощении такое заболевание или расстройство может представлять собой, например, ревматоидный артрит, (ауто)иммунные и воспалительные расстройства (какие описаны выше для заболеваний и расстройств, связанных с ГБ-8), не-ходжкинскую лимфому, В-СББ, лимфоидные неоплазмы, злокачественности и гематологические расстройства, инфекционные заболевания и расстройства соединительной ткани, неврологические, желудочно-кишечные расстройства, гепатит, аллергические, гематологические, кожные, легочные расстройства, злокачественности, эндокринные, сосудистые расстройства, инфекции, почечные, сердечные расстройства, расстройства кровообращения, костные и мышечные расстройства и иммуноопосредованную цитопению.
В одном таком воплощении моновалентные антитела по изобретению направлены на Γ.Ό20. Такие моновалентные антитела также можно использовать для скрининга ίη νίίτο или ίη νΐνο на Γ.Ό20 в образце или у пациента.
В одном воплощении изобретения заболевание или расстройство, которое лечат, поддается лечению путем препятствования активности СБ38, исчерпывания клеток, экспрессирующих СБ38, препятствования росту и/или пролиферации клеток Γ.Ό38' через, например, подход с иммунотоксинами или радиоизотопами. В одном воплощении такое заболевание или расстройство могут представлять собой, например, туморогенные расстройства, такие как В-клеточная лимфома, злокачественности клеток плазмы, Τ/ΝΚ-клеточная лимфома и миелоидные злокачественности, иммунные расстройства, в которые вовлечены В-клетки, экспрессирующие СБ38, клетки плазмы, моноциты и Τ-клетки, такие как аутоиммунные расстройства, такие как псориаз, псориатический артрит, дерматит, системная склеродермия и склероз, воспалительное заболевание кишечника (!ВО), болезнь
- 34 016609
Крона, неспецифический язвенный колит, респираторный дистресс-синдром, менингит, энцефалит, увеит, гломерулонефрит, экзема, астма, атеросклероз, недостаточность адгезии лейкоцитов, рассеянный склероз, синдром Рейно, синдром Шегрена, ювенильный диабет, болезнь Рейтера, болезнь Бехчета, иммунный комплексный нефрит, нефропатия ΙβΛ, полиневропатии ЕМ, иммуноопосредованные тромбоцитопении, такие как острая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и хроническая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, гемолитическая анемия, тяжелая псевдопаралитическая миастения, люпус-нефрит, системная красная волчанка, ревматоидный артрит (НА), атопический дерматит, пузырчатка, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, гранулематоз Вегенера, синдром Омена, хроническая почечная недостаточность, острый инфекционный мононуклеоз, ВИЧ и болезни, ассоциированные с вирусом герпеса, острый респираторный дистресс-синдром и хориоретинит, заболевания и расстройства, такие как заболевания и расстройства, вызванные или опосредованные инфицированием В-клеток вирусом, таким как вирус Эпстайна-Барр (ЕВУ), ревматоидный артрит, воспалительные, аутоиммунные и/или иммунные расстройства, при которых заметны аутоантитела и/или избыточная активность В- и Т-лимфоцитов, такие как васкулиты и другие сосудистые расстройства, такие как микроскопическая ангиопатия, синдром Чурга-Штрауса и другие АNСАассоциированные васкулиты, нодозный полиартериит, эссенциальный криоглобулинный васкулит, кожный лейкоцитокластический ангиит, болезнь Кавасаки, артериит Такаясу, гигантоклеточный артериит, пурпура Генеха-Шенлейна, первичный или изолированный церебральный ангиит, нодозная эритема, облитерирующий тромбангиит, тромбоцитопеническая тромбогемолитическая пурпура (в том числе гемолитико-уремический синдром) и вторичные васкулиты, в том числе, кожный лейкоцитокластический васкулит (например, вторичный к гепатиту В, гепатиту С, макроглобулинемии Вальденстрема, Вклеточной неоплазии, ревматоидному артриту, синдрому Шегрена или системной красной волчанке); другими примерами являются нодозная эритема, аллергический васкулит, панникулит, болезнь ВебераКрисчина, гиперглобулинемическая пурпура и болезнь Бюргера, кожные расстройства, такие как контактный дерматит, линейный ^А-дерматоз, витилиго, гангренозная пиодермия, восприимчивость к врожденному буллезному эпидермолизу, пузырчатка вульгарная (в том числе рубцовый пемфигоид и буллезный пемфигоид), гнездная алопеция (в том числе тотальная алопеция и универсальная алопеция), герпетиформный дерматит, многоформная эритема и хроническая аутоиммунная крапивница, иммуноопосредованные цитопении, такие как аутоиммунная нейтропения и истинная эритроцитарная аплазия, расстройства соединительной ткани, такие как волчанка ЦНС, дискоидная красная волчанка, синдром СНЕ8Т, смешанное заболевание соединительной ткани, полимиозит/дерматомиозит, миозит вирусных включений, вторичный амилоидоз, криоглобулинемия типа Ι и типа ΙΙ, фибромиалгия, синдром антител к фосфолипидам, вторичная гемофилия, рецидивирующее воспаление нескольких хрящей, саркоидоз, синдром негнущегося человека и ревматическая лихорадка; другим примером является эозинофильный фасцит, артриты, такие как анкилозирующий спондилит, ювенильный хронический артрит, болезнь Стилла взрослых и синдром 8АРН0; другими примерами являются сакроилеит, реактивный артрит, болезнь Стилла и подагра, гематологические расстройства, такие как апластическая анемия, первичная гемолитическая анемия (в том числе синдром холодового агглютинина), гемолитическая анемия, вторичная к СЬЬ или системной красной волчанке; синдром Р0ЕМ8, пернициозная анемия и гиперглобулинемическая пурпура Вальдемстрема; другими примерами являются агранулоцитоз, аутоиммунная нейтропения, болезнь Франклина, болезнь Селигманна, болезнь -цепи, паранеопластический синдром, вторичный к тимоме и лимфомам, и образование ингибитора фактора УП, эндокринопатии, такие как полиэндокринопатия и болезнь Аддисона; другими примерами являются аутоиммунная гипогликемия, аутоиммунный гипотиреоидизм, аутоиммунный инсулиновый синдром, тиреоидит Кервена и инсулинорезистентность, опосредуемая антителами к инсулиновым рецепторам;
гепато-желудочно-кишечные расстройства, такие как чревная болезнь, болезнь Уиппла, первичный биллиардный цирроз, хронический активный гепатит и первичный склерозирующий холангилит; другим примером является гастрит, нефропатии, такие как быстро прогрессирующий гломерулонефрит, постстрептококковый нефрит, синдром Гудпасчера, мембранозный гломерулонефрит и криоглобулинемический нефрит; другим примером является болезнь с минимальными изменениями, неврологические расстройства, такие как аутоиммунные невропатии, множественный мононеврит, миастенический синдром Ламберта-Итона, хорея Сидингама, сухотка спинного мозга и синдром ГийенаБарре; другими примерами являются миелопатия/тропический спастический парапарез, тяжелая псевдопаралитическая миастения, острая воспалительная демиелинизирующая полинефропатия и хроническая воспалительная демиелинизирующая полинефропатия; рассеянный склероз, вызванная ВИЧ деменция,
- 35 016609 сердечные и легочные расстройства, такие как СОРЭ, фиброзный альвеолит, облитерирующий бронхиолит, аллергический асперогиллоз, кистозный фиброз, синдром Леффлера, миокардит и перикардит; другими примерами являются аллергический пневмонит и паранеопластический синдром, вторичный к раку легких, аллергические расстройства, такие как бронхиальная астма и синдром гипер-1дЕ; другим примером является преходящая слепота, офтальмологические расстройства, такие как заражение парвовирусом В (в том числе синдром подбитого глаза), гинекологические и акушерские расстройства, такие как привычный аборт, привычный выкидыш и задержка внутриутробного развития; другим примером является паранеопластический синдром, вторичный к гинекологическим неоплазмам, расстройства репродуктивной функции у мужчин, такие как паранеопластический синдром, вторичный к тестикулярным неоплазмам; и расстройства вследствие пересадки, такие как отторжение аллотранспланата и ксенотрансплантата, и болезнь трансплантат против хозяина.
В одном таком воплощении моновалентные антитела по изобретению направлены против СО38. Такие моновалентные антитела также можно использовать для скрининга ш У1!го или ш у1уо на СЭ38 в образце или у пациента.
В одном воплощении изобретения заболевание или расстройство, которое лечат, поддается лечению путем блокировки взаимодействия лиганд-ЕСЕг, блокировки функции ЕСЕг, исчерпывания экспрессирующих ЕСЕг клеток/препятствование росту и/или пролиферации ЕСЕг+ клеток, например, подходом с иммунотоксинами или радиоизотопами. В одном воплощении такое заболевание или расстройство может представлять собой, например, онкозаболевания, при которых (сверх)экспрессируется ЕСЕг, такие как рак мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, почек, яичников, предстательной железы, почечно-клеточный рак, плоскоклеточный рак, рак легких (немелкоклеточный) и головы и шеи, и глиомы, другие связанные с ЕСЕг расстройства, такие как аутоиммунные болезни, псориаз, воспалительный артрит.
В одном таком воплощении моновалентные антитела по изобретению направлены против ЕСЕг. Такие моновалентные антитела также можно использовать для скрининга ш У1!го или ш у1уо на ЕСЕг в образце или у пациента.
В одном воплощении изобретения заболевание или расстройство, которое лечат, поддается лечению путем блокировки функции СЭ4, исчерпывания экспрессирующих СЭ4 клеток/препятствование росту и/или пролиферации СЭ4+ клеток, например, подходом с иммунотоксинами или радиоизотопами. В одном воплощении такое заболевание или расстройство может представлять собой, например, ревматоидный артрит, (ауто)иммунные и воспалительные расстройства (описанные выше для заболеваний или расстройств, связанных с 1Ь-8), кожные Т-клеточные лимфомы, некожные Т-клеточные лимфомы, лимфоидные неоплазмы, злокачественности и гематологические расстройства, инфекционные заболевания и расстройства соединительной ткани, неврологические, желудочно-кишечные расстройства, расстройства печени, аллергические, гематологические, кожные, легочные, злокачественные, эндокринные, сосудистые, инфекционные расстройства, расстройства почек, сердца, кровообращения, метаболизма, костные и мышечные расстройства и иммуноопосредованная цитопения.
В одном таком воплощении моновалентные антитела по изобретению направлены против СО4. Такие моновалентные антитела также можно использовать для скрининга ш νίΙΐΌ или ш у1уо на СЭ4 в образце или у пациента.
В одном таком воплощении моновалентные антитела, направленные против СЭ4, используют для лечения ВИЧ-инфекции или для лечения СПИДа.
В одном воплощении изобретения моновалентные антитела по изобретению представляют собой моновалентные антитела из антител к СЭ4, раскрытых в АО 97/13852.
В одном воплощении изобретения заболевание или расстройство, которое лечат, поддается лечению путем антагонизирования и/или ингибирования функций СЭ8, например путем предотвращения костимулирующих сигналов, необходимых для активации Т-клеток. В одном воплощении такое заболевание или расстройство может представлять собой, например, аутоиммунное и иммунное расстройство из числа указанных выше. В одном таком воплощении моновалентные антитела по изобретению направлены против СО28.
В одном воплощении изобретения заболевание или расстройство, которое лечат, поддается лечению путем изменения функций фактора ткани, например путем изменения коагуляции или ингибирования передачи сигнала тканевым фактором. В одном воплощении такое заболевание или расстройство может представлять собой, например, сосудистые заболевания, такие как болезнь сосудов сердца, болезнь сосудов мозга, ретинопатия и дегенерация желтого пятна, и воспалительные расстройства, такие как описаны выше.
В одном воплощении изобретения моновалентные антитела направлены против фактора ткани или
- 36 016609 против комплекса фактора УН и фактора ткани.
В одном воплощении изобретения заболевание или расстройство, которое лечат, поддается лечению путем препятствования заражению вирусом гепатита С ШСУ). В одном таком воплощении изобретения моновалентные антитела по изобретению направлены против ΗСУ или рецептора ΗСУ, такого как СО81.
В одном воплощении изобретения моновалентные антитела по изобретению представляют собой моновалентные антитела из антител к СЭ4, раскрытых в \УО 2000/05266.
В одном воплощении изобретения заболевание или расстройство, которое лечат, поддается лечению путем предотвращения связывания аллергена с IдΕ-сенсибилизированной или тучной клеткой. В одном воплощении такое заболевание или расстройство может представлять собой, например, поддающиеся лечению противоаллергенной иммунотерапией аллергические заболевания, такие как астма, аллергический ринит, сезонные/постоянные аллергии, сенная лихорадка, назальные аллергии, атопический дерматит, экзема, сыпь, крапивница, контактные аллергии, аллергический конъюнктивит, глазные аллергии, пищевые и лекарственные аллергии, латекс-аллергии и аллергии на насекомых.
В одном таком воплощении моновалентное(ые) антитело(а) по изобретению представляет(ют) собой бесшарнирные антитела Ι§04, направленные против аллергена(ов).
В некоторых воплощениях пациенту вводят иммуноконъюгат, содержащий моновалентные антитела, конъюгированные с цитотоксическим средством. В некоторых воплощениях иммуноконъюгат и/или антиген, с которым он связывается, интернализовано/интернализованы клеткой, что приводит к повышенной терапевтической эффективности иммуноконъюгата при уничтожении клетки-мишени, с которой он связывается. В одном воплощении цитотоксическое средство избирает мишенью или воздействует на нуклеиновую кислоту в клетке-мишени.
Примеры таких цитотоксических средств включают любые химиотерапевтические средства, указанные в данном описании (такие как мейтансиноид или калихемицин), радиоактивные изотопы или рибонуклеазу или ДНК-эндонуклеазу.
В одном воплощении антиген представляет собой молекулу белка человека, и субъектом является человек. В одном воплощении субъектом может быть млекопитающее, не являющееся человеком, в организме которого экспрессируется антиген, с которым связываются антитела по изобретению. В одном воплощении субъектом может быть млекопитающее, в организм которого введен антиген (например, путем введения антигена или экспрессией трансгена антигена). Более того, моновалентные антитела по изобретению можно вводить млекопитающему, не являющемуся человеком, в организме которого экспрессируется антиген, с которым иммуноглобулин перекрестно взаимодействует (например, примату, свинье или мыши), в целях ветеринарии или как животной модели заболевания человека. Что касается последнего, то такие животные модели можно использовать для оценки терапевтической эффективности антител по изобретению (например, для испытания дозировок и времени курсов введения).
Моновалентные антитела по изобретению можно использовать при лечении или одни, или в сочетании с другими композициями. Например, моновалентные антитела по изобретению можно вводить совместно с одним или несколькими другими антителами, такими как моновалентные антитела по настоящему изобретению, одним или несколькими химиотерапевтическими средствами (включая смеси химиотерапевтических средств), одним или несколькими цитотоксическими средствами, одним или несколькими антиангиогенными средствами, одним или несколькими цитокинами, одним или несколькими ингибиторами роста, одним или несколькими противовоспалительными средствами, одним или несколькими антиревматическими лекарственными средствами, модифицирующими заболевание (ОМАКЭ), или одним или несколькими иммунодепрессантами, в зависимости от заболевания или состояния, которое лечат. Когда моновалентные антитела по изобретению ингибируют рост опухоли, может быть особенно желательным их сочетание с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, которые также ингибируют рост опухоли. Например, антитела против УБОР, блокирующие активность УБОР, можно объединять с антителами против РгЬВ (например, трастузумабом (герцептином) - антителами против ΗΕΚ2) при лечении метастазирующего рака молочной железы. С другой стороны или кроме того, пациент может получать комбинированную лучевую терапию (например, лучевую терапию с наружным источником излучения или терапию средством, меченным радиоактивным изотопом, таким как антитела). Такие комбинированные терапии, указанные выше, включают комбинированное введение (когда два или большее число средств включают в одну и ту же или раздельные композиции) и раздельное введение, в таком случае введение антител по изобретению может происходить до и/или после введения (осуществления) вспомогательной терапии или терапий.
В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению представляют собой моновалентную форму трастузумаба для лечения Ηе^2-положительного онкозаболевания.
Композицию моновалентных антител по изобретению можно составить, дозировать и вводить способом, согласующимся с обычной медицинской практикой. Факторы, которые учитывают в данном контексте, включают конкретное расстройство, которое лечат, конкретное млекопитающее, которое лечат, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, место доставки средства, способ введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам. В одном воплощении
- 37 016609 моновалентные антитела можно ввести в композицию с одним или несколькими средствами, обычно используемыми для предупреждения или лечения расстройства, о котором идет речь. Эффективное количество таких других средств зависит от количества моновалентных антител по изобретению, присутствующих в композиции, типа расстройства или лечения и других факторов, которые обсуждались выше.
Моновалентные антитела по изобретению (и вспомогательное лечебное средство) можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, подкожное, интраперитонеальное, внутрилегочное и интраназальное введение и, если желательно для местного лечения, местное введение внутрь. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, интраартерильное, интраперитонеальное или подкожное введение. Кроме того, моновалентные антитела можно вводить импульсной инфузией, в частности, уменьшающимися дозами моновалентных антител. Введение доз можно осуществить любым подходящим путем, например инъекциями, такими как внутривенные или подкожные инъекции, в зависимости частично от того, кратковременное ли введение или длительное.
Для предупреждения или лечения заболевания соответствующая дозировка моновалентных антител по изобретению (когда их используют одни или в сочетании с другими средствами, такими как химиотерапевтические средства) будет зависеть от типа заболевания, которое лечат, типа антител, тяжести и хода заболевания, от того, вводят ли моновалентные антитела в целях предупреждения, лечения или диагностики, предыдущего лечения, истории болезни пациента и реакции на антитела и предписания лечащего врача. Моновалентные антитела можно соответствующим образом вводить пациенту однократно или несколько раз.
Такие дозировки можно вводить периодически, например каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, чтобы пациент получал от примерно двух до примерно двадцати, например примерно шесть доз моновалентных антител). Можно вводить начальную ударную дозу, а затем одну или несколько меньших доз. Примерная схема введения доз лекарственного средства включает введение начальной ударной дозы в примерно 4 мг/кг с последующим сохранением еженедельной дозы моновалентных антител в примерно 2 мг/кг. Однако можно использовать другие схемы введения. В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению вводят в еженедельной дозе от 50 до 4000 мг, например от 250 до 2000 мг, например 300, 500, 700, 1000, 15000 или 2000 мг, до 8 раз, например от 4 до 6 раз. Еженедельную дозировку можно разделить на две или три субдозировки и вводить не в один день. Например, дозировку в 300 мг можно вводить в течение 2 дней - 100 мг в день первый (1) и 200 мг в день второй (2). Дозировку в 500 мг можно вводить в течение 3 дней - 100 мг в день первый (1), 200 мг в день второй (2) и 200 мг в день третий (3), и дозировку в 700 мг можно вводить в течение 3 дней - 100 мг в день первый (1), 300 мг в день второй (2) и 300 мг в день третий (3). Схему можно повторять один или несколько раз, по необходимости, например, через 6 или 12 месяцев.
Дозировку можно определить или подобрать, измеряя количество циркулирующих моновалентных антител по изобретению после введения в биологическом образце, например, с использованием антиидиотипических антител, для которых указанные моновалентные антитела являются мишенью.
В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению можно вводить как поддерживающую терапию, например, один раз в неделю в течение 6 месяцев или долее.
В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению можно вводить по схеме, включающей одну инфузию моновалентных антител по изобретению с последующей инфузией тех же антител, конъюгированных с радиоизотопом. Схема введения может повторяться, например, через 7-9 дней.
Развитие такого лечения можно контролировать обычными методами и анализами.
Изобретение относится к изделию, содержащему материалы, применимые для лечения, предупреждения и/или диагностики расстройств, описанных выше. Изделие по настоящему изобретению содержит контейнер и ярлык или вкладыш в упаковку на или в сочетании с контейнером. Подходящие емкости включают, например, пузырьки, флаконы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая само по себе или в сочетании с другими композициями эффективна для лечения, предупреждения и/или диагностики состояния и может иметь стерильный ввод (например, контейнер может представлять собой мешок для раствора для внутривенного введения или флакон с пробкой, которую можно проткнуть иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере одно активное средство в композиции представляет собой моновалентные антитела по изобретению. Ярлык или вкладыш в упаковку показывает, что композицию используют для лечения выбранного состояния, например рака. Более того, изделие может содержать: (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, которая содержит моновалентные антитела по изобретению; и (Ь) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, которая содержит другое цитотоксическое средство. Изделие в таком воплощении изобретения также может содержать вкладыш в упаковку, в котором указывается, что первую и вторую композицию можно использовать для лечения определенного состояния, например рака. С другой стороны или кроме того, изделие также может содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (В^Р1), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он также может содержать другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения и точки зрения потребителя, в том числе другие буферные растворы, разбавите
- 38 016609 ли. фильтры. иглы и шприцы.
В объем изобретения также входят наборы. содержащие фармацевтические композиции по изобретению. содержащие одно или несколько моновалентных антител по изобретению и инструкции по применению. Набор также может содержать одно или несколько других средств. таких как иммунодепрессант. цитотоксическое средство или радиоактивное токсическое вещество. в зависимости от заболевания или расстройства. которое лечат. или одно или несколько других антител по изобретению (например. моновалентные антитела с комплементарной активностью).
В одном воплощении изобретение относится к способам детекции присутствия в образце специфического антигена. с которым связываются моновалентные антитела. или измерения количества указанного специфического антигена. включающим контактирование образца и контрольного образца с моновалентными антителами. которые специфически связываются с указанным антигеном. в условиях. которые допускают образование комплекса между антителом или его частью с указанным антигеном. Затем детектируют образование комплекса. когда различие в образовании комплекса с образцом в сравнении с контрольным образцом является показателем присутствия указанного антигена в образце.
В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению можно использовать для детекции уровней циркулирующего специфического антигена. с которым связываются моновалентные антитела. или уровней клеток. которые содержат указанный специфический антиген на поверхности своих мембран. которые затем можно связать с некоторыми симптомами заболевания. С другой стороны. антитела можно использовать для исчерпывания или взаимодействия с функцией клеток. экспрессирующих указанный антиген. причем это обозначает указанные клетки как важные медиаторы заболевания. Этого можно достичь путем введения образца и контрольного образца в контакт с моновалентными антителами в условиях. которые допускают образование комплекса между антителом и указанным специфическим антигеном. Любые комплексы. образованные между антителом и указанным специфическим антигеном в образце и контрольном образце. детектируют и сравнивают.
В одном воплощении изобретение относится к способу детекции присутствия или количественного определения в образце ш νί\Ό или ш νίΙΐΌ количества клеток. экспрессирующих специфический антиген. с которым связываются моновалентные антитела. Способ включает: (1) введение субъекту моновалентных антител по изобретению. конъюгированных с детектируемым маркером; (ίί) воздействие на субъекта средствами детекции указанного детектируемого маркера для идентификации участков. содержащих клетки. экспрессирующие указанный антиген.
В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению можно использовать для нацеливания соединений (например. лечебных средств. меток. цитотоксинов. радиотоксинов. иммунодепрессантов и т.д.) на клетки. которые имеют специфический антиген. с которым связываются моновалентные антитела. экспрессированный на их поверхности. путем связывания таких соединений с моновалентными антителами. Таким образом. настоящее изобретение также относится к способам локализации ех νί\Ό или 1п νί!ΐΌ клеток. экспрессирующих указанный антиген. таких как клетки Рид-Штернберга (например. с детектируемой меткой. такой как радиоизотоп. флуоресцентное соединение. фермент или кофактор фермента).
Далее приводится перечень воплощений настоящего изобретения.
Воплощение 1. Способ получения моновалентного антитела. включающий:
ί) обеспечение нуклеотидной конструкции. кодирующей легкую цепь указанного моновалентного антитела. причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность. кодирующую область Уъ выбранного антигенспецифического антитела. и нуклеотидную последовательность. кодирующую константную область Сь 1д. где указанная нуклеотидная последовательность. кодирующая область Уь выбранного антигенспецифического антитела. и указанная нуклеотидная последовательность. кодирующая область Сь 1д. функционально соединены вместе. и где. в случае подтипа !дС1. нуклеотидная последовательность. кодирующая область Сь. модифицирована таким образом. что область Сь не содержит каких-либо аминокислот. способных образовывать дисульфидные связи или ковалентные связи с другими пептидами. содержащими идентичную аминокислотную последовательность области Съ;
ίί) обеспечение нуклеотидной конструкции. кодирующей тяжелую цепь указанного моновалентного антитела. причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность. кодирующую область УН выбранного антигенспецифического антитела. и нуклеотидную последовательность. кодирующую константную область СН человеческого 1д. где нуклеотидная последовательность. кодирующая область СН. модифицирована таким образом. что область. соответствующая шарнирной области. и. как требует подтип 1д. другие участки области СН. такие как участок СН3. не содержат каких-либо аминокислотных остатков. которые принимают участие в образовании дисульфидных связей или ковалентных или нековалентных межцепных связей тяжелой цепи с другими пептидами. содержащими идентичную аминокислотную последовательность области СН человеческого 1д. где указанная нуклеотидная последовательность. кодирующая область УН выбранного антигенспецифического антитела. и указанная нуклеотидная последовательность. кодирующая область СН указанного 1д. функционально соединены вместе;
ϊϊΐ) обеспечение клеточной экспрессирующей системы для получения указанного моновалентного антитела;
- 39 016609 ίν) получение указанного моновалентного антитела коэкспрессией нуклеотидных конструкций (ί) и (ίί) в клетках клеточной экспрессирующей системы (ш).
Воплощение 2. Способ согласно воплощению 1. где человеческий Гд представляет собой антитело ГдС1. ГдС2. ГдС3. ГдС4 или ГдА или Гдр. такое как антитело ГдС1. ГдС2 или ГдС4.
Воплощение 3. Способ согласно воплощению 1. где человеческий Гд представляет собой ГдС1 с аминокислотной областью СН. представленной в БЕЦ ГО N0: 19. где участок СН3 модифицирован таким образом. что осуществлены одна или несколько следующих замен аминокислот: Агд (К) в позиции 238 заменен С1п (Ц); Акр (Ό) в позиции 239 заменен С1и (Е); Ьук (К) в позиции 292 заменен Агд (К); С1п (Ц) в позиции 302 заменен С1и (Е) и Рго (Р) в позиции 328 заменен Ьеи (Ь).
Воплощение 4. Способ согласно воплощению 3. где Агд (К) в позиции 238 заменен С1п (Ц).
Воплощение 5. Способ согласно воплощению 3. где Агд (К) в позиции 238 заменен С1п (Ц) и Рго (Р) в позиции 328 заменен Ьеи (Ь).
Воплощение 6. Способ согласно воплощению 3. где осуществлены все пять замен аминокислот.
Воплощение 7. Способ согласно воплощению 1 или 3. где человеческий Гд представляет собой ГдС1 и область С'.'|, представляет собой Съ легкой цепи каппа с аминокислотной последовательностью. представленной в БЕЦ ГО N0: 18. где область Сь модифицирована таким образом. что концевой цистеиновый остаток в позиции 106 заменен другим аминокислотным остатком или делетирован. В одном воплощении он делетирован.
Воплощение 8. Способ согласно воплощению 1 или 3. где человеческий Гд представляет собой ГдС1 и область Сь представляет собой Сь легкой цепи лямбда с аминокислотной последовательностью. представленной в БЕЦ ГО N0: 17. где область Сь модифицирована таким образом. что концевой цистеиновый остаток в позиции 104 заменен другим аминокислотным остатком или делетирован. В одном воплощении он делетирован.
Воплощение 9. Способ согласно воплощению 1. 3. 7 или 8. где человеческий Гд представляет собой ГдС1 с аминокислотной областью СН. представленной в БЕЦ ГО N0: 19. где участок СН1 модифицирован таким образом. что Бег (Б) в позиции 14 заменен цистеиновым остатком.
Воплощение 10. Способ согласно воплощению 1. где человеческий Гд представляет собой ГдС2 с аминокислотной областью СН. представленной в БЕЦ ГО N0: 20. где участок СН3 модифицирован таким образом. что осуществлены одна или несколько следующих замен аминокислот: Агд (К) в позиции 234 заменен С1п (Ц); Ме! (М) в позиции 276 заменен Уа1 (У); Ьук (К) в позиции 288 заменен Агд (К); С1п (Ц) в позиции 298 заменен С1и (Е) и Рго (Р) в позиции 324 заменен Ьеи (Ь).
Воплощение 11. Способ согласно воплощению 10. где Агд (К) в позиции 234 заменен С1п (Ц).
Воплощение 12. Способ согласно воплощению 10. где Агд (К) в позиции 234 заменен С1п (Ц) и Рго (Р) в позиции 324 заменен Ьеи (Ь).
Воплощение 13. Способ согласно воплощению 10. где осуществлены все пять замен аминокислот.
Воплощение 14. Способ согласно воплощению 1. где человеческий Гд представляет собой ГдС3 с аминокислотной областью СН. представленной в БЕЦ ГО N0: 21. где участок СН3 модифицирован таким образом. что осуществлены одна или несколько следующих замен аминокислот: Агд (К) в позиции 285 заменен С1п (Ц); Бег (Б) в позиции 314 заменен Акп (И); Акп (И) в позиции 322 заменен Ьук (К); Ме! (М) в позиции 327 заменен Уа1 (У); Ьук (К) в позиции 339 заменен Агд (К); С1п (Ц) в позиции 349 заменен С1и (Е); Г1е (Г) в позиции 352 заменен Уа1 (У); Агд (К) в позиции 365 заменен Н1к (Н); Рбе (Р) в позиции 366 заменен Туг (Υ) и Рго (Р) в позиции 375 заменен Ьеи (Ь).
Воплощение 15. Способ согласно воплощению 14. где Агд (К) в позиции 285 заменен С1п (Ц).
Воплощение 16. Способ согласно воплощению 14. где Агд (К) в позиции 285 заменен С1п (Ц) и Рго (Р) в позиции 375 заменен Ьеи (Ь).
Воплощение 17. Способ согласно воплощению 14. где осуществлены все 10 замен.
Воплощение 18. Способ получения моновалентного антитела. включающий:
ί) обеспечение нуклеотидной конструкции. кодирующей легкую цепь указанного моновалентного антитела. причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность. кодирующую область Уъ выбранного антигенспецифического антитела. и нуклеотидную последовательность. кодирующую константную область (Сь) Гд. где указанная нуклеотидная последовательность. кодирующая область Уь выбранного антигенспецифического антитела. и указанная нуклеотидная последовательность. кодирующая область Сь Гд. функционально соединены вместе;
ίί) обеспечение нуклеотидной конструкции. кодирующей тяжелую цепь указанного моновалентного антитела. причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность. кодирующую область УН выбранного антигенспецифического антитела. и нуклеотидную последовательность. кодирующую область СН человеческого ГдС4. где нуклеотидная последовательность. кодирующая тяжелую цепь. модифицирована таким образом. что участок. соответствующий шарнирной области тяжелой цепи. не содержат каких-либо аминокислотных остатков. способных принимать участие в образовании дисульфидных связей с другими пептидами. содержащими идентичную аминокислотную последовательность константной области (СН) человеческого ГдС4. где указанная нуклеотидная последовательность. кодирующая область УН выбранного антигенспецифического антитела. и указанная нуклеиновая кисло
- 40 016609 та, кодирующая область СН 1дС4, функционально соединены вместе;
ϊϊΐ) обеспечение клеточной экспрессирующей системы для получения указанного антитела;
ίν) получение указанного моновалентного антитела коэкспрессией нуклеотидных конструкций (ί) и (ίί) в клетках клеточной экспрессирующей системы (ш).
Воплощение 19. Способ согласно любому из воплощений 1-18, где нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь, модифицирована таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области тяжелой цепи, не содержит никаких цистеиновых остатков.
Воплощение 20. Способ согласно любому из воплощений 1-19, где полученное моновалентное антитело является человеческим антителом.
Воплощение 21. Способ согласно любому из воплощений 1-20, где полученное моновалентное антитело не связывается с синтетическим антигеном (Туг, С1и), А1а, Ьук.
Воплощение 22. Способ согласно любому из воплощений 1-21, где нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков участка, соответствующего шарнирной области, включая любые цистеиновые остатки, делетирован и/или заменен на другие аминокислотные остатки.
Воплощение 23. Способ согласно воплощению 22, где нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что цистеиновые остатки шарнирной области заменяют аминокислотными остатками, имеющими незаряженную полярную боковую цепь или неполярную боковую цепь.
Воплощение 24. Способ согласно воплощению 22 или 23, где аминокислоты с незаряженными полярными боковыми цепями выбирают, независимо, из числа глицина, аспарагина, глутамина, серина, треонина, тирозина, триптофана и аминокислоту с неполярными боковыми цепями выбирают из числа аланина, валина, лейцина, изолейцина, пролина, фенилаланина, метионина.
Воплощение 25. Способ согласно воплощению 22, где нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область СН 1дС4, где аминокислоты, соответствующие аминокислотам 106 и 109 последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 14, делетированы.
Воплощение 26. Способ согласно воплощению 22 или воплощению 25, где нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область СН 1дС4, в которой делетированы, по меньшей мере, аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 106-109 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 14.
Воплощение 27. Способ согласно любому из воплощений 22-26, где нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область СН, в которой делетированы, по меньшей мере, аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотным остаткам 99-110 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 14.
Воплощение 28. Способ согласно любому из воплощений 22-27, где нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что делетирована вся шарнирная область.
Воплощение 29. Способ согласно любому из воплощений 1-28, где нуклеотидная конструкция, кодирующая тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН человеческого 1дС4, где по меньшей мере один нуклеотид донорного сайта сплайсинга нуклеотидной последовательности, кодирующей шарнирную область, заменен другим нуклеотидом.
Воплощение 30. Способ согласно воплощению 29, где нуклеотидная конструкция, кодирующая тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН человеческого 1дС4, где нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам в позиции 714 и 722 8Е0 ΙΌ N0: 13, заменены нуклеотидами иными, чем нуклеотид, присутствующий в такой позиции в 8ЕО ΙΌ N0: 13.
Воплощение 31. Способ согласно воплощению 30, где нуклеотидная конструкция, кодирующая тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН человеческого 1дС4, содержащую 8Е0 ΙΌ N0: 13, где нуклеотиды 714 и 722 8Е0 ΙΌ N0: 13 заменены нуклеотидами иными, чем нуклеотид, присутствующий в такой позиции в 8Е0 ΙΌ N0: 13.
Воплощение 32. Способ согласно воплощению 31, где нуклеотидная конструкция, кодирующая тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, содержит нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 15.
Воплощение 33. Способ согласно воплощению 22, где нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область СН, в которой аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотным остаткам 106 и 109 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 14, заменены на аминокислотные остатки, отличные от цистеина.
Воплощение 34. Способ согласно любому из воплощений 29-33, где замененные нуклеотиды нуклеотидной последовательности, кодирующей шарнирную область области СН, заменены с использовани
- 41 016609 ем сайт-направленного мутагенеза.
Воплощение 35. Способ согласно любому из воплощений 1-34, где нуклеотидная конструкция, кодирующая легкую цепь указанного моновалентного антитела, содержит последовательность, кодирующую область Съ цепи каппа человеческого 1дС.
Воплощение 36. Способ согласно воплощению 35, где нуклеотидная конструкция содержит нуклеотидную последовательность 8ЕС Ш N0: 1.
Воплощение 37. Способ согласно любому из воплощений 1-34, где нуклеотидная конструкция, кодирующая легкую цепь указанного моновалентного антитела, содержит последовательность, кодирующую область Сь цепи лямбда человеческого 1дС.
Воплощение 38. Способ согласно воплощению 37, где нуклеотидная конструкция содержит нуклеотидную последовательность 8ЕС Ш N0: 3.
Воплощение 39. Способ согласно любому из воплощений 1-38, где нуклеотидные конструкции представляют собой конструкции ДНК.
Воплощение 40. Способ согласно любому из воплощений 1-39, где нуклеотидная конструкция (ί)(ш) и/или (ίν) представляет собой прокариотический экспрессирующий вектор.
Воплощение 41. Способ согласно любому из воплощений 1-40, где клеточная экспрессирующая система является прокариотической клеточной экспрессирующей системой.
Воплощение 42. Способ согласно воплощению 41, где прокариотическая клеточная экспрессирующая система содержит клетки Е. со11.
Воплощение 43. Способ согласно воплощению 42, где клетки Е. со11 являются штаммом с недостаточной эндогенной протеазной активностью.
Воплощение 44. Способ согласно любому из воплощений 1-39, где нуклеотидная конструкция (ί)(ίίί) и/или (ίν) представляет собой эукариотический экспрессирующий вектор.
Воплощение 45. Способ согласно любому из воплощений 44, где клеточная экспрессирующая система является эуокариотической клеточной экспрессирующей системой.
Воплощение 46. Способ согласно воплощению 45, где эукариотическая клеточная экспрессирующая система является клеточной экспрессирующей системой клеток млекопитающего.
Воплощение 47. Способ согласно воплощению 46, где клеточная экспрессирующая система клеток млекопитающего содержит клетки Сн0.
Воплощение 48. Способ согласно воплощению 46, где клеточная экспрессирующая система клеток млекопитающего содержит клетки нЕК-293Е.
Воплощение 49. Способ согласно любому из воплощений 1-39, где I и II экспрессирующие системы содержат конструкции ДНК, подходящие для генной терапии.
Воплощение 50. Способ согласно любому из воплощений 1-39, где I и II экспрессирующие системы являются вирусными конструкциями, подходящими для генной терапии.
Воплощение 51. Способ согласно любому из воплощений 1-39, где III экспрессирующая система клеток млекопитающего представляет собой человеческие клетки, содержащие I и II, которые подходят для имплантации пациенту, нуждающемуся в лечении полученными моновалентными антителами.
Воплощение 52. Способ согласно воплощению 51, где человеческие клетки получены от пациента.
Воплощение 53. Способ согласно любому из воплощений 1-51, где полученные моновалентные антитела предназначены для фармацевтического применения.
Воплощение 53а. Способ согласно любому из воплощений 1-53, где нуклеотидные конструкции ί) и ίί) находятся в одной и той же плазмиде.
Воплощение 53Ь. Способ согласно любому из воплощений 1-53, где антитела получают в двух различных клеточных линиях и собирают антитела после экспрессии ίη νίίτο.
Воплощение 54. Моновалентное антитело, полученное с применением способа по любому из воплощений 1-50 и 53.
Воплощение 55. Моновалентное антитело, которое можно получить с применением способа по любому из воплощений 1-50 и 53.
Воплощение 56. Моновалентное антитело, содержащее легкую цепь и тяжелую цепь, в котором:
a) указанная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (Уь) области выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (Сь) области ^, и где, в случае подтипа (дС!, аминокислотная последовательность константной области (Сь) модифицирована таким образом, что она не содержит каких-либо аминокислот, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей или ковалентных связей с другими пептидами, содержащими идентичную аминокислотную последовательность константной области (Сь) Щ и
b) указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (Ун) области выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (Сн) области человеческого Щ где аминокислотная последовательность константной (Сн) области модифицирована таким образом, что шарнирная область и, как требует подтип Щ другие участки области Сн, такие как Сн3, не содержат каких-либо аминокислотных остатков, которые принимают участие в образовании дисульфидных связей или ковалентных связей или нековалентных межцепных связей тяжелой
- 42 016609 цепи с другими пептидами, содержащими идентичную аминокислотную последовательность константной области (Сн) человеческого 1д.
Воплощение 57. Моновалентное антитело согласно воплощению 56, где человеческий 1д представляет собой антитело 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4 или 1дЛ, такое как антитело 1дС1, 1дС2 или 1дС4.
Воплощение 58. Моновалентное антитело, содержащее легкую цепь и тяжелую цепь, в котором:
a) указанная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (Уъ) области выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (Сь) области 1д; и
b) указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (Ун) области выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (Сн) области человеческого 1дС4, где аминокислотная последовательность тяжелой цепи модифицирована таким образом, что ни один из аминокислотных остатков, присутствующих в участке, соответствующем шарнирной области, не способен принимать участие в образовании дисульфидных связей с другими пептидами, содержащими идентичную аминокислотную последовательность константной области (Сн) человеческого 1дС4.
Воплощение 59. Моновалентное антитело согласно воплощениям 54-58, где область Сь представляет собой константную область легкой цепи каппа человеческого 1дС.
Воплощение 60. Моновалентное антитело согласно воплощению 59, где область Сь содержит аминокислотную последовательность 8Еф ΙΌ N0: 2.
Воплощение 61. Моновалентное антитело согласно воплощениям 54-58, где область Сь представляет собой константную область легкой цепи лямбда человеческого 1дС.
Воплощение 62. Моновалентное антитело согласно воплощению 61, где область Сь содержит аминокислотную последовательность 8Еф ΙΌ N0: 4.
Воплощение 63. Моновалентное антитело согласно любому из воплощений 54-62, где легкая цепь и тяжелая цепь соединены друг с другом через одну или несколько дисульфидных связей.
Воплощение 64. Моновалентное антитело согласно любому из воплощений 54-63, где легкая цепь и тяжелая цепь соединены друг с другом через амидную связь.
Воплощение 65. Моновалентное антитело согласно любому из воплощений 54-64, где аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области, не содержит никаких цистеиновых остатков.
Воплощение 66. Моновалентное антитело согласно любому из воплощений 54-65, где аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков участка, соответствующего шарнирной области, включая любые цистеиновые остатки, делетирован и/или заменен на другие аминокислотные остатки.
Воплощение 67. Моновалентное антитело согласно любому из воплощений 54-66, где цистеиновые остатки шарнирной области заменяют аминокислотными остатками, имеющими незаряженную полярную боковую цепь или неполярную боковую цепь.
Воплощение 68. Моновалентное антитело согласно воплощению 67, где аминокислоты с незаряженными полярными боковыми цепями выбирают, независимо, из числа глицина, аспарагина, глутамина, серина, треонина, тирозина, триптофана и аминокислоты с неполярными боковыми цепями выбирают, независимо, из числа аланина, валина, лейцина, изолейцина, пролина, фенилаланина, метионина.
Воплощение 69. Моновалентное антитело согласно воплощению 68, где аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область Сн, где аминокислоты, соответствующие аминокислотам 106 и 109 последовательности 8Еф ΙΌ N0: 14, делетированы.
Воплощение 70. Моновалентное антитело согласно воплощению 66 или воплощению 69, где аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область Сн 1дС4, в которой делетированы, по меньшей мере, аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 106-109 последовательности 8Еф ΙΌ N0: 14.
Воплощение 71. Моновалентное антитело согласно любому из воплощений 66-70, где аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область Сн 1дС4, в которой делетированы, по меньшей мере, аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотным остаткам 99-110 последовательности 8Еф ΙΌ N0: 14.
Воплощение 72. Моновалентное антитело согласно любому из воплощений 66-71, где делетирована вся шарнирная область.
Воплощение 73. Моновалентное антитело согласно любому из воплощений 66-72, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность 8Еф ΙΌ N0: 16.
Воплощение 74. Моновалентное антитело согласно воплощению 66, где аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область Сн Ι§04, в которой аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотным остаткам 106 и 109 последовательности 8Еф ΙΌ N0: 14, заменены на аминокислотные остатки, отличные от цистеина.
Воплощение 75. Моновалентное антитело согласно воплощению 66, где аминокислотную последо
- 43 016609 вательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область СН, в которой один из аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотным остаткам 106 и 109 последовательности 8ЕО Ш N0: 14, заменен на аминокислотный остаток, отличный от цистеина, такой как аминокислотный остаток, раскрытый в воплощении 67 или 68, и другой аминокислотный остаток, соответствующий аминокислотным остаткам 106 и 109 последовательности 8Е0 Ш N0: 14, делетирован.
Воплощение 76. Моновалентное антитело согласно воплощению 75, где аминокислотный остаток, соответствующий аминокислотным остаткам 106, заменен аминокислотным остатком, отличным от цистеина, таким как аминокислотный остаток, раскрытый в воплощении 67 или 68, и где аминокислотный остаток, соответствующий аминокислотным остаткам 109, делетирован.
Воплощение 77. Моновалентное антитело согласно воплощению 75, где аминокислотный остаток, соответствующий аминокислотным остаткам 106, делетирован, и где аминокислотный остаток, соответствующий аминокислотным остаткам 109, заменен аминокислотным остатком, отличным от цистеина, таким как аминокислотный остаток, раскрытый в воплощении 67 или 68.
Воплощение 78. Моновалентное антитело согласно любому из воплощений 54-77, где указанное антитело можно получить способом, включающим рекомбинантную экспрессию антитела в клеточной экспрессирующей системе ш νίΙΐΌ.
Воплощение 79. Моновалентное антитело согласно воплощению 78, где указанный способ включает:
ί) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей легкую цепь указанного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область Уъ выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую область Сь 1д;
и) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей тяжелую цепь указанного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область УН выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН человеческого 1дО4, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область СН, модифицирована таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области тяжелой цепи, не содержат какихлибо аминокислотных остатков, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей;
ϊϊΐ) обеспечение клеточной экспрессирующей системы для получения указанного моновалентного антитела;
ίν) получение указанного моновалентного антитела, содержащего легкую цепь, кодированную нуклеотидной конструкцией (ί), и тяжелую цепь, кодированную нуклеотидной конструкцией (и), коэкспрессией указанных нуклеотидных конструкций в клетках клеточной экспрессирующей системы (ίίί).
Воплощение 80. Моновалентное антитело согласно воплощению 79, где человеческий 1д представляет собой антитело 1дО1, 1дО2, 1дО3, 1дО4 или 1дА, такое как антитело 1дО1, 1дО2 или 1дО4.
Воплощение 81. Моновалентное антитело согласно воплощению 78, где указанный способ включает:
ί) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей легкую цепь указанного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область Уъ выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую область Сь 1дО;
и) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей тяжелую цепь указанного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область УН выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН человеческого 1дО4, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область СН, модифицирована таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области тяжелой цепи, не содержат какихлибо аминокислотных остатков, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей;
ίίί) обеспечение клеточной экспрессирующей системы для получения указанного моновалентного антитела;
ίν) получение указанного моновалентного антитела, содержащего легкую цепь, кодированную нуклеотидной конструкцией (ί), и тяжелую цепь, кодированную нуклеотидной конструкцией (ίί), коэкспрессией указанных нуклеотидных конструкций в клетках клеточной экспрессирующей системы (ίίί).
Воплощение 82. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-81, где моновалентные антитела имеют концентрацию в плазме свыше 10 мкг/мл более 7 дней, когда введены ш νί\Ό в дозе 4 мг на 1 кг.
Воплощение 83. Моновалентные антитела согласно воплощению 82, где моновалентные антитела имеют концентрацию в плазме свыше 10 мкг/мл более 7 дней, когда введены ш νί\Ό мышам 8СШ в дозе 4 мг на 1 кг.
Воплощение 84. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-83, где моновалентные антитела имеют клиренс из плазмы, который более чем в 10 раз медленнее, чем клиренс из плазмы фрагментов Р(аЬ')2.
Воплощение 85. Моновалентное антитело согласно воплощению 84, где последовательность фрагмента Р(аЬ')2 идентична последовательности соответствующей области моновалентного антитела.
- 44 016609
Воплощение 86. Моновалентные антитела согласно воплощению 84, где клиренс из плазмы измеряют с использованием мышей 8СГО.
Воплощение 87. Моновалентные антитела согласно воплощению 86, где область Ун и область Уъ фрагмента Р(аЬ')2 идентичны области Ун и области Уъ моновалентного антитела.
Воплощение 88. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-87, где указанные моновалентные антитела имеют время полужизни по меньшей мере 5 дней, когда введены ίη у1уо.
Воплощение 89. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-87, где указанные моновалентные антитела имеют время полужизни по меньшей мере 5 и до 21 дня, когда введены ίη у1уо.
Воплощение 90. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-87, где указанные моновалентные антитела имеют время полужизни по меньшей мере 5 и до 14 дней, когда введены ίη у1уо.
Воплощение 91. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-87, где указанные моновалентные антитела имеют время полужизни по меньшей мере 14 дней.
Воплощение 92. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-87, где указанные моновалентные антитела имеют время полужизни по меньшей мере 21 день.
Воплощение 93. Моновалентные антитела согласно воплощению 88, где указанные моновалентные антитела имеют время полужизни по меньшей мере 5 дней, когда введены ίη у1уо мышам 8СГО.
Воплощение 94. Моновалентное антитело согласно любому из воплощений 54-93, где указанное моновалентное антитело способно связываться с РсКи.
Воплощение 95. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-94, которые специфически связываются с опухолевым антигеном.
Воплощение 96. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-95, которые специфически связываются с рецепторами клеточной поверхности, активированными после димеризации рецепторов.
Воплощение 97. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-96, где моновалентные антитела, когда связываются с молекулой-мишенью, ингибируют мультимеризацию и/или агрегацию молекулы-мишени.
Воплощение 98. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-97, где моновалентные антитела связываются с мишенью, выбранной из числа УЕСР, сМе!, СЭ20, СЭ38, 1Ь-8, СЭ25, Рса1рНаК1, РсеркПоиК!, ацетилхолинового рецептора, Гак, ГакЬ, ТКА1Ь, вируса гепатита, вируса гепатита С, фактора ткани, комплекса фактора ткани и фактора У11, ЕСРг, СЭ4 и СЭ28.
Воплощение 99. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-97, где моновалентные антитела специфически связываются с мишенью, выбранной из числа УЕСР, сМе!, СЭ20, СЭ38, 1Ь8, СЭ25, Рса1рНаК1, РсеркПоиК!, ацетилхолинового рецептора, Гак, ГакЬ, ТКА1Ь, вируса гепатита, вируса гепатита С, фактора ткани, комплекса фактора ткани и фактора У11, ЕСРг, СЭ4 и СЭ28.
Воплощение 100. Моновалентные антитела 1дС4 против сМе! согласно любому из воплощений 5697.
Воплощение 101. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-100, которые являются моновалентной формой в присутствии поликлонального человеческого 1дС.
Воплощение 102. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-100, которые являются моновалентной формой, когда вводятся в организм человека.
Воплощение 103. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-100, которые диссоциируют до моновалентной формы в присутствии поликлонального человеческого 1дС.
Воплощение 104. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-100, которые диссоциируют до моновалентной формы, когда вводятся в организм человека.
Воплощение 105. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-104, где указанные антитела неспособны связываться с эффектором.
Воплощение 106. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-104, где антитела получают для фармацевтического применения.
Воплощение 107. Способ получения моновалентных антител согласно любому из воплощений 54104, включающему стадии:
a) культивирования клеток-хозяев, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую указанное моновалентное антитело; и
b) извлечения моновалентных антител из культуры клеток-хозяев.
Воплощение 108. Способ согласно воплощению 107, где указанные клетки-хозяева является прокариотическими.
Воплощение 109. Способ согласно воплощению 108, где клетки-хозяева представляют собой клетки Е. со11.
Воплощение 110. Способ согласно воплощению 109, где клетки Е. соб представляют собой штамм с недостаточной эндогенной протеазной активностью.
Воплощение 111. Способ согласно воплощению 107, где указанные клетки-хозяева является эукариотическими.
Воплощение 112. Способ согласно воплощению 111, где клетки-хозяева представляют собой клетки
- 45 016609
НЕК-293Е.
Воплощение 113. Способ согласно воплощению 111, где клетки-хозяева представляют собой клетки СН0.
Воплощение 114. Способ согласно воплощению 111, где клетки-хозяева представляют собой человеческие клетки.
Воплощение 115. Способ согласно любому из воплощений 107-114, где моновалентные антитела выделяют из культуральной среды.
Воплощение 116. Способ согласно любому из воплощений 107-114, где моновалентные антитела выделяют из клеточного лизата.
Воплощение 117. Нуклеотидная конструкция, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН ЦС4, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область СН, модифицирована таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области в указанной области СН, не содержит каких-либо аминокислотных остатков, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей с пептидами, содержащими аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности указанной области СН, или последовательность, комплементарную ей.
Воплощение 118. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 117, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область СН, модифицирована таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области, не содержит никаких цистеиновых остатков.
Воплощение 119. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 117 или воплощению 118, где нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН, модифицируют таким образом, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков участка, соответствующего шарнирной области, включая любые цистеиновые остатки, делетирован и/или заменен на другие аминокислотные остатки.
Воплощение 120. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 119, где нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН, модифицируют таким образом, что аминокислоты, соответствующие аминокислотам 106 и 109 последовательности 8ЕР ΙΌ N0: 14, делетированы.
Воплощение 121. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 119 или воплощению 120, где нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН, модифицируют таким образом, что делетированы, по меньшей мере, аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 106-109 последовательности 8ЕР ΙΌ N0: 14.
Воплощение 122. Нуклеотидная конструкция согласно любому из воплощений 119-121, где нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН, модифицируют таким образом, что делетированы, по меньшей мере, аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотным остаткам 99-110 последовательности 8ЕР ΙΌ N0: 14.
Воплощение 123. Нуклеотидная конструкция согласно любому из воплощений 119-122, где нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН, модифицируют таким образом, что делетирована вся шарнирная область.
Воплощение 124. Нуклеотидная конструкция согласно любому из воплощений 117-123, где нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН, модифицируют таким образом, что по меньшей мере один нуклеотид донорного сайта сплайсинга нуклеотидной последовательности, кодирующей шарнирную область, заменен другим нуклеотидом.
Воплощение 125. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 124, где нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам в позиции 714 и 722 8ЕР ΙΌ N0: 13, заменены нуклеотидами иными, чем нуклеотид, присутствующий в такой позиции в 8ЕР ΙΌ N0: 13.
Воплощение 126. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 125, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область СН, содержит последовательность 8ЕР ΙΌ N0: 13, где нуклеотиды 714 и 722 последовательности 8ЕР ΙΌ N0: 13 заменены нуклеотидами иными, чем нуклеотид, присутствующий в такой позиции в 8ЕР ΙΌ N0: 13.
Воплощение 127. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 126, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область СН, содержит нуклеотидную последовательность 8ЕР ΙΌ N0: 15.
Воплощение 128. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 119, где нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН, модифицируют таким образом, что аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотным остаткам 106 и 109 последовательности 8ЕР ΙΌ N0: 14, заменены на аминокислотные остатки, отличные от цистеина.
Воплощение 129. Нуклеотидная конструкция согласно любому из воплощений 124-128, где замененные нуклеотиды нуклеотидной последовательности, кодирующей область СН, заменены с использованием сайт-направленного мутагенеза.
Воплощение 130. Нуклеотидная конструкция согласно любому из воплощений 117-129, где указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область УН антигенспецифического антитела, или последовательность, комплементарную ей.
Воплощение 131. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 130, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область УН, функционально соединена с нуклеотидной последовательностью, кодирующей область СН, или последовательностью, комплементарную ей.
- 46 016609
Воплощение 132. Нуклеотидная конструкция согласно любому из воплощений 117-131, где указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь моновалентного антитела согласно любому из воплощений 54-106.
Воплощение 133. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 132, где указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область νΗ моновалентного антитела согласно любому из воплощений 54-106.
Воплощение 134. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 133, где нуклеотидная конструкция, кодирующая легкую цепь указанного моновалентного антитела, содержит последовательность, кодирующую область С|. цепи каппа человеческого ΙβΟ.
Воплощение 135. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 134, где нуклеотидная конструкция содержит нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 1.
Воплощение 136. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 133, где нуклеотидная конструкция, кодирующая легкую цепь указанного моновалентного антитела, содержит последовательность, кодирующую область Сь цепи лямбда человеческого ΙβΟ.
Воплощение 137. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 136, где нуклеотидная конструкция содержит нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3.
Воплощение 138. Нуклеотидная конструкция согласно любому из воплощений 117-137, где нуклеотидная конструкция представляют собой конструкцию ДНК.
Воплощение 139. Нуклеотидная конструкция согласно любому из воплощений 117-138, где указанная нуклеотидная конструкции представляет собой экспрессирующий вектор.
Воплощение 140. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 139, где указанный экспрессирующий вектор представляет собой прокариотический экспрессирующий вектор.
Воплощение 141. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 139, где указанный экспрессирующий вектор представляет собой эукариотический экспрессирующий вектор.
Воплощение 142. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 141, где указанный экспрессирующий вектор представляет собой экспрессирующий вектор на основе ДНК млекопитающего.
Воплощение 143. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 142, где указанный экспрессирующий вектор подходит для генной терапии для людей.
Воплощение 144. Нуклеотидная конструкция согласно воплощению 139, где указанный экспрессирующий вектор является вирусным вектором, подходящим для генной терапии для людей.
Воплощение 145. Способ получения моновалентных антител согласно любому из воплощений 54106, включающий культивирование клеток-хозяев, содержащих нуклеотидную конструкцию согласно любому из воплощений 117-144, и, если указанная нуклеотидная конструкция не кодирует легкую цепь указанных антител, также содержащих нуклеотидную конструкцию, кодирующую легкую цепь указанных антител, так что экспрессируются полипептиды, и извлечение моновалентных антител из клеточной культуры.
Воплощение 146. Способ согласно воплощению 145, где моновалентные антитела выделяют из клеточного лизата.
Воплощение 147. Способ согласно воплощению 145, где моновалентные антитела выделяют из культуральной среды.
Воплощение 148. Применение нуклеотидной конструкции согласно любому из воплощений 117-144 для получения моновалентного тела согласно любому из воплощений 54-106.
Воплощение 149. Применение согласно воплощению 148 или 170, где получение моновалентных антител включает применение способа согласно любому из воплощений 1-53.
Воплощение 150. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту согласно любому из воплощений 117-144.
Воплощение 151. Клетка-хозяин согласно воплощению 150, представляющая собой прокариотическую клетку.
Воплощение 152. Клетка-хозяин согласно воплощению 151, представляющая собой клетку Е. со11.
Воплощение 153. Клетка-хозяин согласно воплощению 150, представляющая собой эукариотическую клетку.
Воплощение 154. Клетка-хозяин согласно воплощению 153, представляющая собой клетку млекопитающего.
Воплощение 155. Клетка-хозяин согласно воплощению 154, представляющая собой клетку СН0.
Воплощение 156. Клетка-хозяин согласно воплощению 154, представляющая собой клетку НЕК293Е.
Воплощение 157. Клетка-хозяин согласно воплощению 154, представляющая собой человеческую клетку.
Воплощение 158. Клетка-хозяин согласно воплощению 154, представляющая собой человеческую клетку, полученную от пациента.
Воплощение 159. Клетка-хозяин согласно воплощению 154, представляющая собой человеческую клетку у пациента.
- 47 016609
Воплощение 160. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту согласно любому из воплощений 132-144.
Воплощение 161. Клетка-хозяин согласно воплощению 160, представляющая собой прокариотическую клетку.
Воплощение 162. Клетка-хозяин согласно воплощению 161, представляющая собой клетку Е. той.
Воплощение 163. Клетка-хозяин согласно воплощению 160, представляющая собой эукариотическую клетку.
Воплощение 164. Клетка-хозяин согласно воплощению 163, представляющая собой клетку млекопитающего.
Воплощение 165. Клетка-хозяин согласно воплощению 164, представляющая собой клетку СнО.
Воплощение 166. Клетка-хозяин согласно воплощению 164, представляющая собой клетку нЕК293Р.
Воплощение 167. Способ получения моновалентных антител согласно любому из воплощений 54106, включающему культивирование клеток-хозяев согласно любому из воплощений 160-166, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь указанных антител, так что экспрессируются полипептиды, и извлечение моновалентных антител из клеточной культуры.
Воплощение 168. Способ согласно воплощению 167, где моновалентные антитела выделяют из клеточного лизата.
Воплощение 169. Способ согласно воплощению 167, где моновалентные антитела выделяют из культуральной среды.
Воплощение 170. Применение клетки-хозяина согласно любому из воплощений 150-159 для получения моновалентных антител согласно любому из воплощений 54-106.
Воплощение 171. Применение согласно воплощению 170, где получение моновалентных антител включает применение способа согласно любому из воплощений 1-53.
Воплощение 172. Иммуноконъюгат, содержащий моновалентное антитело согласно любому из воплощений 54-106, конъюгированное с лечебной молекулой.
Воплощение 173. Иммуноконъюгат согласно воплощению 172, где лечебной молекулой является цитотоксин, химиотерапевтическое лекарственное средство, иммунодепрессант или радиоизотоп.
Воплощение 174. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 54-106 для применения в качестве лечебного средства.
Воплощение 175. Моновалентные антитела согласно воплощению 174 для применения в качестве лечебного средства для лечения рака, расстройства клеточной пролиферации, (ауто)иммунного расстройства, воспалительного расстройства и/или ангиогенного расстройства, где антитела специфически связываются с заданной мишенью или эпитопом мишени, где связывание антител с указанными мишенью или эпитопом мишени эффективно при лечении указанного заболевания.
Воплощение 176. Моновалентные антитела согласно воплощению 174 или воплощению 175 для применения в качестве лечебного средства для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем введения антител против определенной мишени, где вовлечение опосредованных иммунной системой активностей не является необходимым или нежелательно для достижения действия введения антител, и где указанные антитела специфически связываются с указанным антигеном.
Воплощение 177. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 174-176 для применения в качестве лечебного средства для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем блокировки или ингибирования растворимого антигена, где при мультимеризации указанного антигена могут образовываться нежелательные иммунные комплексы и где указанные антитела специфически связываются с указанным антигеном.
Воплощение 178. Моновалентные антитела согласно любому из воплощений 174-176 для применения в качестве лечебного средства для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем блокировки или ингибирования мембраносвязанного рецептора, где указанный рецептор может быть активирован путем димеризации указанного рецептора и где указанные антитела специфически связываются с указанным рецептором.
Воплощение 179. Применение моновалентных антител согласно любому из воплощений 54-106 в качестве лечебного средства.
Воплощение 180. Применение согласно воплощению 179, где лечебное средство применимо для лечения рака, расстройства клеточной пролиферации, (ауто)иммунного расстройства, воспалительного расстройства и/или ангиогенного расстройства, где антитела специфически связываются с заданной мишенью или эпитопом мишени, где связывание антител с указанными мишенью или эпитопом мишени эффективно при лечении указанного заболевания.
Воплощение 181. Применение согласно воплощению 179 или воплощению 180, где лечебное средство применимо для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем введения антител против определенной мишени, где вовлечение опосредованных иммунной системой активностей не является необходимым или нежелательно для достижения действия введения антител и где указанные антитела специфически связываются с указанным антигеном.
- 48 016609
Воплощение 182. Применение согласно любому из воплощений 179-181, где лечебное средство применимо для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем блокировки или ингибирования растворимого антигена, где при мультимеризации указанного антигена могут образовываться нежелательные иммунные комплексы и где указанные антитела специфически связываются с указанным антигеном.
Воплощение 183. Применение согласно любому из воплощений 179-181, где лечебное средство применимо для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем блокировки или ингибирования мембраносвязанного рецептора, где указанный рецептор может быть активирован путем димеризации указанного рецептора и где указанные антитела специфически связываются с указанным рецептором.
Воплощение 184. Применение антител согласно любому из воплощений 54-106 для получения фармацевтической композиции для лечения рака, расстройства клеточной пролиферации, (ауто)иммунного расстройства, воспалительного расстройства и/или ангиогенного расстройства, где антитела специфически связываются с заданной мишенью или эпитопом мишени, где связывание антител с указанными мишенью или эпитопом мишени эффективно при лечении указанного заболевания.
Воплощение 185. Применение антител согласно любому из воплощений 54-106 или воплощению 184 для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем введения антител против определенной мишени, где вовлечение опосредованных иммунной системой активностей не является необходимым или нежелательно для достижения действия введения антител, и где указанные антитела специфически связываются с указанным антигеном.
Воплощение 186. Применение антител согласно любому из воплощений 54-106 или воплощению 184 или воплощению 185 для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем блокировки или ингибирования растворимого антигена, где при мультимеризации указанного антигена могут образовываться нежелательные иммунные комплексы и где указанные антитела специфически связываются с указанным антигеном.
Воплощение 187. Применение антител согласно любому из воплощений 54-106 или воплощению 184 или воплощению 185 для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению путем блокировки или ингибирования клеточного мембраносвязанного рецептора, где указанный рецептор может быть активирован путем димеризации указанного рецептора и где указанные антитела специфически связываются с указанным рецептором.
Воплощение 188. Способ ингибирования антигена у субъекта, страдающего от заболевания или расстройства, при котором активность антигена нежелательна, включающий введение субъекту моновалентных антител согласно любому из воплощений 54-106, которые специфически связываются с указанным антигеном, фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела, иммуноконъюгата, содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по любому из воплощений 117-144, так что активность антигена у субъекта ингибируется.
Воплощение 189. Способ лечения заболевания или расстройства, включающий введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества моновалентных антител согласно любому из воплощений 54-106, фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела, иммуноконъюгата, содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по любому из воплощений 117-144, посредством чего заболевание или расстройство излечивается.
Воплощение 190. Способ согласно воплощению 189, где указанное заболевание или расстройство представляет собой рак, расстройство клеточной пролиферации, (ауто)иммунное расстройство, воспалительное расстройство и/или ангиогенное расстройство и где указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества моновалентных антител согласно любому из воплощений 54-106, которые специфически связываются с указанным антигеном, фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела, иммуноконъюгата, содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по любому из воплощений 117-144, и где антитела специфически связываются с заданной мишенью или эпитопом мишени, где связывание антител с указанными мишенью или эпитопом мишени эффективно при лечении указанного заболевания.
Воплощение 191. Способ согласно воплощению 189 или воплощению 190, где указанное заболевание или расстройство поддается лечению путем введения антител против определенной мишени, где вовлечение опосредованных иммунной системой активностей не является необходимым или нежелательно для достижения действия введения антител и где указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества моновалентных антител согласно любому из воплощений 54-106, где указанные антитела специфически связываются с указанным рецептором, фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела, иммуноконъюгата, содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по любому из воплощений 117-144.
Воплощение 192. Способ согласно любому из воплощений 189-191, где указанное заболевание или расстройство поддается лечению путем блокировки или ингибирования растворимого антигена, где при мультимеризации указанного антигена могут образовываться нежелательные иммунные комплексы и где указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного
- 49 016609 количества моновалентных антител согласно любому из воплощений 54-106, которые специфически связываются с указанным антигеном, фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела, иммуноконъюгата, содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по любому из воплощений 117-144.
Воплощение 193. Способ согласно любому из воплощений 189-191, где указанное заболевание или расстройство поддается лечению путем блокировки или ингибирования мембраносвязанного рецептора, где указанный рецептор может быть активирован путем димеризации указанного рецептора и где указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества моновалентных антител согласно любому из воплощений 54-106, где указанные антитела специфически связываются с указанным рецептором, фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела, иммуноконъюгата, содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по любому из воплощений 117-144.
Воплощение 194. Способ по любому из воплощений 189-193, включающий введение субъекту одного или нескольких других лечебных средств.
Воплощение 195. Фармацевтическая композиция, содержащая моновалентные антитела по любому из воплощений 54-106 вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями.
Воплощение 196. Трансгенное животное, содержащее нуклеотидную конструкцию по любому из воплощений 117-144.
Воплощение 197. Применение моновалентных антител согласно любому из воплощений 54-106 в качестве диагностического средства.
Воплощение 198. Способ идентификации моновалентных антител или фрагментов моновалентных антител с длительным временем полужизни, где моновалентные антитела или фрагменты антител испытывают на защиту против клиренса РсКп.
Воплощение 199. Моновалентные антитела или фрагменты моновалентных антител, защищенные от клиренса РсКп.
Воплощение 200. Моновалентные антитела или фрагменты моновалентных антител согласно воплощению 199, где указанные моновалентные антитела или фрагменты моновалентных антител имеют время полужизни по меньшей мере 5 дней, когда введены ίπ у1уо.
Воплощение 201. Моновалентные антитела или фрагменты моновалентных антител согласно воплощению 199, где указанные моновалентные антитела или фрагменты моновалентных антител имеют время полужизни по меньшей мере 5 дней и до 21 дня, когда введены ш у1уо.
Воплощение 202. Моновалентные антитела или фрагменты моновалентных антител согласно воплощению 199, где указанные моновалентные антитела или фрагменты моновалентных антител имеют время полужизни по меньшей мере 5 дней и до 14 дней, когда введены ш у1уо.
Воплощение 203. Моновалентные антитела или фрагменты моновалентных антител согласно воплощению 199, где указанные моновалентные антитела или фрагменты моновалентных антител имеют время полужизни по меньшей мере 14 дней.
Воплощение 204. Моновалентные антитела или фрагменты моновалентных антител согласно воплощению 199, где указанные моновалентные антитела или фрагменты моновалентных антител имеют время полужизни по меньшей мере 21 день.
Воплощение 205. Моновалентные антитела или фрагменты моновалентных антител согласно воплощению 199, где указанные моновалентные антитела или фрагменты моновалентных антител имеют время полужизни по меньшей мере 5 дней, когда введены ш у1уо мышам 8СШ.
Воплощение 206. Моновалентные антитела или фрагменты моновалентных антител согласно воплощению 199, где указанные моновалентные антитела или фрагменты моновалентных антител способны связываться с РсКп.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется приведенными примерами, которые не следует рассматривать как дополнительное ограничение.
Примеры
Пример 1.
Олигонуклеотидные праймеры и ПЦР-амплификация.
Олигонуклеотидные праймеры синтезируют и определяют количественно по Нодеп Вюкаепсе (Маагккеп, Нидерланды). Праймеры растворяют в Η2Ο до концентрации 100 пмоль/мкл и хранят при -20°С. Итог - все ПЦР и праймеры секвенирования сводят в одну картину (фиг. 1). Для ПЦР используют ДНК-полимеразу РГиТигЬо® ^£1311 (81га!адепе, Атк!егбат, Нидерланды) согласно инструкциям производителя. Каждая реакционная смесь содержит 200 мкМ смеси дНТФ (6№ТР) (Косйе П1адпокйск, А1теге, Нидерланды), 6,7 пмоль как прямого, так и обратного праймера, 100 нг геномной ДНК или 1 нг ДНК и 1 единицу ДНК-полимеразы РГиТигЬо® в буфере для реакции ПЦР (с добавлением полимеразы) в общем объеме 20 мкл. Реакции ПЦР осуществляют с помощью термоциклера ТОгаЛеп! ТНегтосус1ег 96 (\У11а1тап Вюте!га, Ооебтдеп, Германия) с использованием программы из 32 циклов: денатурация при
- 50 016609
95°С в течение 2 мин; 30 циклов 95°С в течение 30 с, градиент 60-70°С (или другая специфическая температура отжига) в течение 30 с и 72°С в течение 3 мин; конечное удлинение при 72°С в течение 10 мин. В соответствующем случае смеси для ПЦР хранят при 4°С до осуществления дополнительного анализа.
Пример 2.
Электрофорез в агарозном геле.
Электрофорез в агарозном геле осуществляют согласно 8ашЬ^οοк (8αηΛΐΌο1< к ипй Киззе1 Б.У., Μο1еси1аг Ο1οηίη§: А ^аЬο^аΐο^у Маше1, 3пй Ей., ^1Й 8ргшд ΗηΛογ, 2000) с использованием гелей 50 мл в трис-ацетат-ЭДТК буфере 1х. ДНК визуализируют включением бромида этидия в гель и наблюдением в УФ-свете. Изображения в геле регистрируют камерой ССБ и системой анализа изображений (СеηСηοте; δνη^ικ, с помощью УезЬигд В.У., ^еи5йеη, Нидерланды).
Пример 3.
Анализ и очистка продуктов ПЦР и продуктов ферментативного расщепления.
Очистку нужных фрагментов ПЦР осуществляют с использованием набора МшЕййе РСН РигШсаΐίοη Κίΐ (Р1адещ с помощью УезЬигд, Беизйей Нидерланды; продукт #28006) согласно инструкциям производителя. Выделенную ДНК определяют количественно УФ-спектроскопией, и качество оценивают электрофорезом в агарозном геле.
Альтернативно, продукты ПЦР или расщепления разделяют электрофорезом в агарозном геле (например, когда присутствует несколько фрагментов) с использованием 1% агарозного геля в трис-ацетатЭДТК. Нужный фрагмент вырезают из геля и выделяют с использованием набора О!АЕХ П Се1 ЕхГтасΐίοη Κίΐ (Р1адещ продукт #20051) согласно инструкциям производителя.
Пример 4.
Количественное определение ДНК УФ-спектроскопией.
Оптическую плотность нуклеиновых кислот определяют с использованием спектрофотометра ΝηηοΩΐΌρ ΝΏ-1000 (I5οдеη БаГе 8^1^, Маагззещ Нидерланды) согласно инструкциям производителя. Концентрацию ДНК определяют анализом оптической плотности (ΟΌ) при 260 нм (одна единица ΟΌ260 нм = 50 мкг/мл). Для всех образцов в качестве эталона используют буфер, в котором растворяют нуклеиновые кислоты.
Пример 5.
Гидролитическое расщепление рестриктазами.
Рестриктазы и другие реагенты получают от №\ν Еп§1ипй Вю1аЬз (Веуег1у, МА, и8А) или ЕегшеШаз (Уйшиз, Литва) и используют согласно инструкциям производителя.
ДНК (100 нг) гидролизуют 5 единицами фермента(ов) в соответствующем буфере в конечном объеме 10 мкл (объемы реакционных смесей устанавливают соответственно). Гидролизуемые смеси инкубируют при рекомендованной температуре в течение минимум 60 мин. В случае фрагментов, требующих двойного гидролитического расщепления с помощью рестриктаз с участием несовместимых буферов или требований к температуре, гидролитическое расщепление осуществляют последовательно. При необходимости продукты гидролиза очищают электрофорезом в агарозном геле и экстракцией из геля.
Пример 6.
Лигирование фрагментов ДНК.
Лигирование фрагментов ДНК осуществляют с помощью набора Ошск Елда1юг1 Κίΐ (Νο\ν Е^Ипй Вю1аЬз) согласно инструкциям производителя. Для каждого лигирования векторную ДНК смешивают с приблизительно трехкратным молярным избытком ДНК-вставки.
Пример 7.
Трансформация Е. той.
Плазмидной ДНК (1-5 мкл раствора ДНК, как правило, 2 мкл смеси для лигирования ДНК) трансформируют компетентные клетки Е. той Оме 81ιοΙ ΌΗ5αΤ1κ или МАСН-1 Т1Н (Г^йто^е^ Вгейа, Нидерланды; продукт #12297-016) с использованием метода теплового шока согласно инструкциям производителя. Затем клетки высевают на агаровые чашки Бшга-Вейаш (БВ), содержащие 50 мкг/мл амипициллина. Чашки инкубируют в течение 16-18 ч при 37°С до тех пор, пока бактериальные колонии не станут явными.
Пример 8.
Скрининг бактериальных колоний ПЦР.
Бактериальные колонии скринируют на присутствие векторов, содержащих нужные последовательности, с помощью ПЦР колоний с использованием набора Ηοΐ8ΐπΠ^ Маз1ег М1х Κίΐ (01аце1г; продукт # 203445) и соответствующих прямых и обратных праймеров. К выбранным колониям слегка прикасаются кончиком 20-мкл пипетки и быстро касаются им 2 мл БВ для мелкомасштабной культуры, затем ресуспендируют в смеси для ПЦР. ПЦР осуществляют с помощью термоциклера ТСгаЙ1егИ Τйе^тοсус1е^ 96 (\У11а1таг1 Вюшейа, ^ей^е^ Германия) с использованием программы из 35 циклов: денатурация при 95°С в течение 15 мин; 35 циклов 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 2 мин; с последующей стадией конечного удлинения в течение 10 мин при 72°С. При необходимости смеси ПЦР хранят при 4°С до осуществления анализа методом электрофореза в агарозном геле.
- 51 016609
Пример 9.
Выделение плазмидной ДНК из культуры Е. сой.
Плазмидную ДНК выделяют из культур Е. сой с использованием перечисленных далее наборов от О1адеп (с помощью АекЬигд, Ьеикбеп, Нидерланды) согласно инструкциям производителя. При выделении плазмиды из больших объемов культуры (50-150 мл) используют или набор н18рееб Р1а8Ш1б Мах1 Кй (продукт #12663) или набор н18рееб Р1а§т1б Мах1 Кй (продукт #12643). При выделении плазмиды из малых объемов культуры (±2 мл) используют набор 01аргер 8рш Мйиргер Кй (продукт #27106) и ДНК элюируют в 50 мкл буфера для элюирования (прилагаемого к набору).
Пример 10.
Сайт-направленный мутагенез.
Сайт-направленный мутагенез осуществляют с использованием набора ОшскС'йапде II ХЬ 8йеЭйес1еб Ми!адепе818 Кй (8!га!адепе, Ашйегбаш, Нидерланды) согласно инструкциям производителя. Данный способ включает введение молчащего дополнительного сайта Хта1 для скрининга на успешный мутагенез. Коротко, 5 мкл 10х буфера для реакции, 1 мкл олигонуклеотида 1дС48228РГ (Р16) (100 пмоль/мкл), 1 мкл олигонуклеотида 1дС48228Рг (Р17) (100 пмоль/мкл), 1 мкл смеси дНТФ, 3 мкл раствора Ошск, 1 мкл плазмиды рТотС4Тот7Э8 (см. пример 16) (50 нг/мкл) и 1 мкл ДНК-полимеразы РГШИга смешивают в общем объеме 50 мкл и амплифицируют с помощью термоциклера ТСгаб1еп! Тйегшосус1ег 96 (Айа!тап Вютейа, Соейшдеп, Германия; продукт #050-081) с использованием программы из 18 циклов: денатурация при 95°С в течение 1 мин; 18 циклов 95°С в течение 50 с, 55°С в течение 30 с и 68°С в течение 10 мин. Смеси ПЦР хранят при 4°С до дальнейшей обработки. Затем смеси ПЦР инкубируют с 1 мкл Эрп1 в течение 60 мин при 37°С для расщепления вектора рТошС47Э8 и хранят при 4°С до дальнейшей обработки. Реакционные смеси осаждают 5 мкл сМ (&М) №1Ас и 125 мкл этанола, инкубируют в течение 20 мин при -20°С и центрифугируют в течение 20 мин при 4°С при 14000хд. Осадок ДНК промывают 70% этанолом, сушат и растворяют в 4 мкл воды. 4-мкл реакционным объемом трансформируют компетентные клетки Е. сой Опе 8йо! Тор 10 (1пуйгодеп, Вгеба, Нидерланды) согласно инструкциям производителя. Затем клетки высевают на агаровые чашки Ьипа-Вейаш (ЬВ), содержащие 50 мкг/мл амипициллина. Чашки инкубируют в течение 16-18 ч при 37°С до тех пор, пока бактериальные колонии не станут явными.
Пример 11.
Секвенирование ДНК.
Образцы плазмидной ДНК передают в АСОАА (Берлин, Германия) для анализа последовательностей. Последовательности анализируют с использованием передового программного обеспечения Уес!ог ΝΉ (Могтах, ОхГогб, ИК).
Пример 12.
Транзиентная экспрессия в клетках нЕК-293Е.
Клетки Егеейу1е™ 293-Е (субклон нЕК-293, адаптированный для выращивания в суспензии и химически определенной среде Егеейу1е, например, нЕК-293Е) получают от 1пуйгодеп и трансфицируют согласно протоколу производителя с использованием фектина 293 (1пуйгодеп).
Пример 13.
Конструирование рСопС1ГА77-вектора для получения тяжелой цепи А77-1дС1.
С помощью фагового вектора ксЕу амплифицируют кодирующую область Ун мышиного антиЕсаВ1 антитела А77, содержащую кодирующие области Ун и У|, указанного антитела, ПЦР удлинения двойного перекрывания. В полученную последовательность встраивают сигнальный пептид млекопитающего, последовательность Козак и подходящие сайты рестрикции для клонирования в рСопС1Г. Первую ПЦР осуществляют с использованием праймеров А77нГог1 и А77нгеу с использованием фагового вектора ксЕу в качестве матрицы. Часть продукта первой ПЦР используют во второй ПЦР с использованием праймеров А77нГог2 и А77нгеу. Фрагмент Ун очищают в геле и клонируют в рСопС1Г0. Для этого вектор рСопС1Г0.4 и фрагмент Ун расщепляют ЫшбШ и Ара1 и очищают. Фрагмент Ун и расщепленный вектор рСопС1Г0.4ншбШ-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки Эн5а-Т1В. Отбирают клон, содержащий вставку нужного размера, подтверждают последовательность и называют рСопС1ГА77.
Пример 14.
Конструирование рСопКА77-вектора для получения легкой цепи антител А77.
С помощью фагового вектора ксЕу амплифицируют кодирующую область У|, мышиного антиЕсаВ1 антитела А77, содержащую Ун и Уъ указанного антитела, ПЦР удлинения двойного перекрывания. В полученную последовательность встраивают сигнальный пептид млекопитающего, последовательность Козак и подходящие сайты рестрикции для клонирования в рСопКарра0.4. Первую ПЦР осуществляют с использованием праймеров А77УЪГог1 и А77УЪгеу с использованием фагового вектора ксЕу в качестве матрицы. Часть продукта первой ПЦР используют во второй ПЦР с использованием праймеров А77УЪГог2 и А77УЪгеу. Продукт ПЦР и вектор рСопКарра0.4 расщепляют ЫшбШ и РГ12311 и очищают. Фрагмент Уь и расщепленный вектор рСоиКарра0.4Η^ηбIII-РГ123II лигируют и трансформируют компе- 52 016609 тентные Ε. сой ЭН5а-Т1К.
Отбирают клон. содержащий вставку нужного размера. и подтверждают последовательность. Полученную плазмиду называют рСопКА77.
Пример 15.
Конструирование рТотС4А77-вектора для получения тяжелой цепи А77-1дС4.
Для того чтобы сконструировать вектор для экспрессии А77-1дС4. область УН А77 клонируют в рТот64.
Для этого рТот64 и рСоп61ГА77 расщепляют НшбШ и Ара1 и выделяют соответствующие фрагменты. Фрагмент УН А77 и расщепленный вектор рТот64НшбШ-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки ЭН5а-Т1К.
Отбирают клон. содержащий вставку нужного размера. Полученную плазмиду называют рТот64А77.
Пример 16.
Конструирование рТотС4А77НС-вектора для получения тяжелой цепи А77-НС.
Для того чтобы получить конструкцию для экспрессии А77-НС. область УН А77 клонируют в рТотС47Э8НС. заменяя область УН 7Ό8.
Для этого рТотС47Э8НС и рСоп61ГА77 расщепляют НшбШ и Ара1 и выделяют соответствующие фрагменты. Фрагмент УН А77 и расщепленный вектор рТош647П8Н6НшбШ-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки ЭН5а-Т1К.
Отбирают клон. содержащий вставку нужного размера. Полученную плазмиду называют рТот64А77Н6.
Пример 17.
Конструирование рЕЕ6.4А77РаЬ-вектора для получения тяжелой цепи А77-РаЬ.
Для того чтобы получить конструкцию для экспрессии А77-РаЬ. область УН А77 клонируют в рЕЕ6.42Р8РаЬ. заменяя область УН 2Р8.
Для этого рЕЕ6.42Р8РаЬ и рСоп61ГА77 расщепляют НшбШ и Ара1 и выделяют соответствующие фрагменты.
Фрагмент УН А77 и фрагмент расщепленного вектора рЕЕ6.42Р8РаЬ НшбШ-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки ЭН5а-Т1К.
Отбирают клон. содержащий вставку нужного размера. Полученную плазмиду называют рЕЕ6.4А77РаЬ.
Пример 18.
Клонирование вариабельных областей человеческого антитела против сМе!.
Тотальную РНК из 1 х 106 мышиных гибридомных клеток осуществляют с помощью набора Кпеаку (О1адеп. Аек!Ьигд. Ьеикбеп. Нидерланды) согласно инструкциям производителя.
5'-КАСЕ-Комплементарную ДНК (кДНК) получают из 60 нг тотальной РНК с использованием набора 8МАКТ КАСЕ сЭНА Ашрййсайоп (ВО Вюкшепсек С1оп!ес1. Моип!аш У|е\у. СА. И8А). следуя протоколу производителя. Области У|, и УН антитела сМе! амплифицируют ПЦР. Для этого используют ДНК-полимеразу РГиТигЬо® Но(8(аг( (81га1адепе) согласно инструкциям производителя. Каждая реакционная смесь содержит 5 мкл 10х буфера ВО АФшИаде 2 РСК (С1оп!ес1). 200 мкМ смеси дНТФ (Косйе О|адпо5йс5). 12 пмоль обратного праймера (КАСЕ61А1 для области УН и КАСЕКА1 для области Уъ). 7.2 пмоль ИРМ-М1Х (ИРМ-М1х: 2 мкМ олигонуклеотида 81юпиРМН3 и 0.4 мкМ олигонуклеотида ЬопдиРМН3). 1 мкл матрицы кДНК 5'-КАСЕ. описанной выше. и 1 мкл смеси 50Х ВО А^ап!аде 2 ро1утегаке т1х (С1оп!ес1) в общем объеме 50 мкл.
Реакции ПЦР осуществляют с помощью термоциклера ТСгаФеп! Тйегтосус1ег 96 (АНа1тап Вюте!га) с использованием программы из 35 циклов: денатурация при 95°С в течение 1 мин; 35 циклов 95°С в течение 30 с. 68°С в течение 60 с.
Продукты реакции разделяют электрофорезом в 1% агарозном геле ТАЕ и окрашивают этидиум бромида. Полосы нужного размера вырезают из гелей. и выделяют ДНК из агарозы с использованием набора Ц1адеп Мше1и!е Кеасйоп С1еапир (01адеп).
Выделенные из геля фрагменты ПЦР клонируют в вектор рСК4В1ип!-Т0Р0 (1пуЦгодеп) с использованием набора для секвенирования 2его В1ип!® Т0Р0® РСКС1ошпд (1пуЦгодеп). следуя протоколу производителя. Компетентные клетки Е. сой 0пе 81ю1 ЭН5а-Т1К (1пуЦгодеп) трансформируют 5 мкл смеси для лигирования и высевают на чашки ЬВ/ампициллин.
Из шести содержащих вставки клонов определяют последовательности Уъ и из пяти содержащих вставки клонов определяют последовательности УН.
Пример 19.
Конструирование рСоп61ГсМе!-вектора для получения тяжелой цепи сМе!-1д61.
Кодирующую область УН человеческого антитела против сМе! вырезают из плазмиды. содержащей данную область. с использованием НшбШ и Ара1. Фрагмент УН очищают в геле и клонируют в рСопС1Г0.4. Для этого вектор расщепляют НшбШ и Ара1 и очищают. Фрагмент УН и расщепленный век
- 53 016609 тор рСопС1к0.4НтбШ-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки ЭН5а-Т1К.
Отбирают клон, содержащий вставку нужного размера, выделяют и называют рСопС1ГсМе!. Пример 20.
Конструирование рСопКсМе!-вектора для получения легкой цепи антител к сМе!.
Кодирующую область V человеческого антитела против сМе! амплифицируют из плазмиды, содержащей данную область, с использованием праймеров кйогЮТМ-3 и КАСЕ^В^А^ вводя подходящие сайты рестрикции для клонирования в рСопК0.4.
Продукт ПЦР и вектор рСопКарра0.4 гидролизуют НшбШ и РГ123П и очищают. Фрагмент V и расщепленный вектор рСопКарра0.4НшбШ-РГ123П лигируют и трансформируют компетентные клетки ОН5а-Т1К Е. со11.
Отбирают клон, содержащий вставку нужного размера, и подтверждают последовательность. Полученную плазмиду называют рСопКсМе!.
Пример 21.
Конструирование рТотС4сМе!-вектора для получения тяжелой цепи сМеЫдС4.
Для того чтобы сконструировать вектор для экспрессии сМеЫдС4, область VII сМе! клонируют в рТотС4.
Для этого рТотС42Е8 и рСопС1ксМе! расщепляют НшбШ и Ара1 и выделяют соответствующие фрагменты.
Фрагмент сМе! и расщепленный вектор рТотС42Е8НшбШ-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки ЭН5а-Т1К.
Отбирают клон, содержащий вставку нужного размера. Полученную плазмиду называют рТотС4сМе!.
Пример 22.
Конструирование рТотС4сМе!НС-вектора для получения тяжелой цепи сМе!-НС.
Для того чтобы сконструировать вектор для экспрессии сМе!-НС, область VII сМе! клонируют в рТотС42Е8НС, заменяя область 2Е8.
Для этого рТотС42Е8НС и рСопС1ксМе! расщепляют НшбШ и Ара1 и выделяют соответствующие фрагменты.
Фрагмент сМе! и фрагмент расщепленного вектора рТотС42Е8НСНшбШ-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки ЭН5а-Т1К.
Отбирают клон, содержащий вставку нужного размера. Полученную плазмиду называют рТотС4сМе!НС.
Пример 23.
Конструирование рЕЕ6.4сМе!ЕаЬ-вектора для получения тяжелой цепи сМе!-ЕаЬ.
Для того чтобы получить конструкцию для экспрессии сМе!-ЕаЬ, область VII сМе! клонируют в рЕЕ6.42Е8ЕаЬ, заменяя область 2Е8.
Для этого рЕЕ6.42Е8ЕаЬ и рСопС1ксМе! расщепляют НшбШ и Ара1 и выделяют соответствующие фрагменты.
Фрагмент сМе! и фрагмент расщепленного вектора рЕЕ6.42Е8ЕаЬ НшбШ-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки ЭН5а-Т1К.
Отбирают клон, содержащий вставку нужного размера. Полученную плазмиду называют рЕЕ6.4сМе!ЕаЬ.
Пример 24.
Конструирование рСопС1Г2Е8 - вектора для получения тяжелой цепи 2Е84дС1.
Кодирующую область V 2Е8 (А0 2002/100348) амплифицируют ПЦР из рШ8Ка2Е8 (Мебагех) с использованием праймеров 2к8Нсехког и 2Г8Нсехгеу и субклонируют в РСКкспр!Сат (8!га!адепе). Затем фрагмент клонируют в рС0Nд1к0.4.
Для этого векторы рСопС1 Г0.4 и РСКкспр!Сат расщепляют НшбШ и Ара1 и очищают соответствующие фрагменты.
Фрагмент V и расщепленный вектор рСопС1к0.4Н1пбШ-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки ЭН5а-Т1К. Отбирают клон, содержащий вставку нужного размера, подтверждают последовательность, и вектор называют рСопС1Г 2Е8.
Пример 25.
Конструирование рСопК2Е8-вектора для получения легкой цепи антител к 2Е8.
рШ8Ка2Е8 гидролизуют НшбШ и ВбАк и кодирующую область VI. 2Е8 (анти-ЕСЕг) выделяют из геля. Вектор рСопКарра0.4 расщепляют НшбШ и β^ΑΙ и очищают. Фрагмент V,. и расщепленный вектор рСоηКарра0.4Н^пбШ-Вк^ΑI лигируют и трансформируют компетентные Е. сой ЭН5а-Т1К.
Отбирают клон, содержащий вставку нужного размера, и подтверждают последовательность. Полученную плазмиду называют рСопК2Е8.
- 54 016609
Пример 26.
Конструирование рТотС42Е8-вектора для получения тяжелой цепи 2Е8-1д64.
Для того чтобы сконструировать вектор для экспрессии 2Ρ8-Ι§64, область νΗ 2Е8 клонируют в рТотС4.
Для этого рТотС4 и рСопС1Г2Е8 расщепляют Η ίιτάΙΙ Ι и Ара1 и выделяют соответствующие фрагменты.
Фрагмент νΗ 2Е8 и расщепленный вектор рТотС4Нтб111-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки ОН5а-Т1к.
Отбирают клон, содержащий вставку нужного размера. Полученную плазмиду называют рТотС42Е8.
Пример 27.
Конструирование рТот642Е8Н6-вектора для получения тяжелой цепи 2Ρ8Η6-Ι§64.
Для того чтобы получить конструкцию для экспрессии 2Ρ8-Η6, область νΗ 2Е8 клонируют в рТотС47О8Н6, заменяя область νΗ 7Ό8.
Для этого рТотС47О8ИО и рСопС1Г2Е8 расщепляют ΗίηάΙΙΙ и Ара1 и выделяют соответствующие фрагменты.
Фрагмент νΗ 2Е8 и фрагмент расщепленного вектора рТот647О8Н6Н1пбШ-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки ОН5а-Т1к.
Отбирают клон, содержащий вставку нужного размера. Полученную плазмиду называют рТот642Е8Н6.
Пример 28.
Конструирование рЕЕ6.42Е8ЕаЬ-вектора для получения тяжелой цепи 2Е8-ЕаЬ.
Область, кодирующую ЕаЬ, амплифицируют из вектора рСопС1Г2Е8 ПЦР с праймерами рСопО15СС|1 и 2Е8ГаЬгеу2, вводя подходящий сайт рестрикции клонирования и С-концевую кодирующую последовательность Ь18 1;щ. Фрагмент ПЦР очищают и клонируют в РЕЕ6.4.
Для этого РЕЕ6.4 и фрагмент ПЦР расщепляют ΗίηάΙΙΙ и ЕсоК! и выделяют соответствующие фрагменты.
Фрагмент 2Е8 ЕаЬ и фрагмент расщепленного вектора РЕЕ6.4Η^ηάIII-ЕсоΚI лигируют и трансформируют компетентные клетки ОИ5а-Т1к.
Отбирают клон, содержащий вставку нужного размера, и подтверждают последовательность секвенированием ДНК. Полученную плазмиду называют РЕЕ6.42Е8ЕаЬ.
Пример 29.
Конструирование рСоп61Г7О8-вектора для получения тяжелой цепи 7Ό8-Ι§61.
Кодирующую область νΗ СЭ20-специфического ИпМаЬ-708 (УО 04/035607) амплифицируют ПЦР из вектора рСетТ (Рготеда, МабБоп. И8А), содержащего данную область, с использованием праймеров 7О8ИехГог (Р8) и 2Е8ИСехгеу (Р13) (фиг. 14), вводя подходящие сайты рестрикции для клонирования в рСопС1Г0.4 (Бопха Вю1още5, 81оидй, ИК) - экспрессирующий вектор млекопитающего, содержащий геномную константную область (аллотип Г) человеческого Ι§61, и идеальную последовательность Козак (ССССССАСС (Кохак М. е! а1., Сепе, 234(2), 187-208 (1999)). Фрагмент ПЦР клонируют в РСВ-Зспр1 САМ (81га1адепе, Амстердам, Нидерланды) с использованием набора для клонирования РСВ-Зепр1 Сат С1ошпд Кй (31га1адепе) согласно инструкциям производителя. Несколько клонов секвенируют и для дальнейшего применения выбирают клон, содержащий предсказанную последовательность.
Фрагмент νΗ очищают в геле и клонируют в рСОЫд1Г0.4. Для этого фрагмент νΗ выделяют из вектора рРСВ-Зепр1 САМ после расщепления ΗίπάΙΙΙ и Ара1 и очистки в геле.
Вектор рСОЫд1Г0.4 расщепляют ΗίπάΙΙΙ и Ара1, и фрагмент вектора выделяют из геля с последующим дефосфорилированием щелочной фосфатазой креветки (8йптр) (Ыете Епд1апб Вю1аЬв). Фрагмент νΗ и дефосфорилированный фрагмент рСоη^1Γ0.4Η^ηάIII-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки ОИ5а-Т1к Дпуйгодеп). Контролируют восемь колоний ПЦР колоний (с использованием праймеров рСопСНесД (Р10) и Исвеср (Р11) (фиг. 14)) и находят, что все колонии содержат вставку нужного размера.
Отбирают клон для дальнейшего исследования и называют рСопС1Г 7Ό8.
Пример 30.
Конструирование рСопК7Э8-вектора для получения легкой цепи антител к 7Ό8-Ι§61.
Кодирующую У,, область СЭ20-специфического ИиМаЬ-7Э8 (УО 04/035607) амплифицируют из плазмиды, содержащей указанную область, с использованием праймеров 7^8У^еxГо^ (Р7) и 7Ω8νΕΌχΐΌν (Р6) (фиг. 14), вводя подходящие сайты рестрикции для клонирования в рСопКарра0.4 (Бопха Вю1ощев) экспрессирующий вектор млекопитающего, содержащий константную область легкой цепи каппа (аллотип кт3) человеческого ΙβΟ и идеальную последовательность Козак.
Продукт ПЦР и вектор рСопКарра0.4 расщепляют ΗίιτάΙΙΙ и Ββί\νΙ. Вектор и фрагмент Υ|. очищают, и вектор дефосфорилируют щелочной фосфатазой креветки. Фрагмент νι. и расщепленный вектор рСопКарра0.4Η^ηάIII-Β8^УI лигируют и трансформируют компетентные клетки Е. со11 ОИ5а-Т1к. Контроли
- 55 016609 руют десять колоний ПЦР колоний (с использованием праймеров рСопК5ес.|1 (Ρ9) и Ьс5е43 (Ρ5) (фиг. 14)) и находят, что 9 колоний содержат вставку нужного размера.
Из 4 клонов выделяют плазмидную ДНК и секвенируют область Уъ. Предсказанную последовательность содержат 3 клона, и один клон отбирают для дальнейшего исследования и называют рСопК7П8.
Пример 31.
Конструирование рТотС4-вектора для экспрессии вариабельных областей тяжелой цепи человеческого ΙβΟ с константной областью человеческого Ι§04.
Геномную ДНК выделяют из образца крови добровольца и используют в качестве матрицы в ПЦР с праймерами Тд64депе2Г (Ρ15) и Ι§Ο4^^2γ (Ρ14) (фиг. 14), амплифицируя полную геномную константную область тяжелой цепи Ι§04 и вводя подходящие сайты рестрикции для клонирования в экспрессионный вектор на основе ДНК млекопитающего рЕЕ6.4 (Ъопха Вю1още5). Фрагмент ПЦР очищают и клонируют в рЕЕ6.4. Для этого продукт ПЦР расщепляют Ηίη6ΙΙΙ и ЕсοВI с последующей инактивацией рестриктаз нагреванием. Вектор рЕЕ6.4 расщепляют Ηίη6ΙΙΙ и ЕсοВI с последующими инактивацией рестриктаз нагреванием и дефосфорилированием фрагмента вектора щелочной фосфатазой из креветки с последующей тепловой инактивацией фосфатазы. Фрагмент Ι§04 и дефосфорилированный вектор рЕЕ6.4Η^ηбIII/ЕсοВI лигируют и трансформируют компетентные клетки МАСН1-Т1В (ΙηνίΙΐΌ^η). Выращивают три клона в ЬВ, и из мелкомасштабной культуры выделяют плазмидную ДНК (1,5 мл). Рестрикционное расщепление дает картину, согласующуюся с клонированием фрагмента Ι§04 в векторе рЕЕ6.4. Плазмидную ДНК из двух клонов трансформируют Е. сой ЭН5а-Т1В и плазмидную ДНК выделяют, конструкции контролируют анализом последовательности вставки и находят, что один клон идентичен клону геномного Ι§04 из базы данных СеЛаик, кроме небольших различий в интронах. 8Е6 ΙΌ N0: 13 показывает последовательность участка Ι§04 в рТотС4. Такие различия являются, вероятно, или полиморфизмами, или ошибками последовательности в последовательности от Сеик-тк. Плазмиду называют рТотС4.
Пример 32.
Конструирование рТотС47Э8-вектора для получения тяжелой цепи 7Ό8-Ι§04.
Плазмидную ДНК из рСоиО1Г7П8 расщепляют Ηίη6ΙΙΙ и Ара1 и очищают фрагмент νΗ в геле. Вектор рТотС4 расщепляют Ηίη6ΙΙΙ и Ара1 и фрагмент вектора выделяют из геля. Фрагмент νΗ и фрагмент рТотО4НтбШ-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки ЭН5а-Т1к. Четыре колонии проверяют ПЦР колоний (с использованием праймеров рСоиКхесО (Ρ9) и Нскес|11 (Ρ12)) и находят, что две колонии содержат вставку нужного размера, и подтверждают присутствие основной цепи рТотС4 расщеплением Мзр1 на фрагменте ПЦР колонии. Один из клонов отбирают для дальнейшего использования. Полученную плазмиду называют рТотС47Э8.
Пример 33.
Конструирование рТотС47О8НС-вектора для экспрессии тяжелой цепи 7Ό8-ΗΟ.
Используют сайт-направленный мутагенез для разрушения донорного сайта сплайсинга экзона шарнира ΙβΟ4 в плазмиде рТотС47Э8. Реакцию сайт-направленного мутагенеза осуществляют согласно методу сайт-направленного мутагенеза ^и^скСйаиде ХЬ с использованием праймеров Ι§Ο48228ΡΓ (Ρ16) и Ι§Ο48228Ργ (Ρ17). Скринируют 24 колонии ПЦР колоний и расщеплением Хта1 (дополнительный сайт Хта1 вводят во время мутагенеза), и оказывается, что все колонии содержат нуклеотидные замены. Две положительные колонии выращивают в течение ночи, плазмидную ДНК выделяют и секвенируют для того, чтобы подтвердить, что введена правильная мутация. Обе колонии содержат правильную последовательность, и одну выбирают для дальнейшего воспроизводства и называют рТотС47Э8НС. Для того чтобы исключить введение других мутаций во время процесса мутагенеза, всю кодирующую область ΙβΟ4 рТотС47Э8НС секвенируют повторно, и другие мутации не находят. Конечный вектор называют рТотО47П8НО.
Пример 34.
Клонирование вариабельных областей мышиного анти-Ве!у1 антитела.
Получают тотальную РНК из 0,3 х105 мышиных гибридомных клеток (клон 2Н8 из ссылки Аккегбааз кН. е! а1., А11егду. 50(3), 215-20 (1995)) с помощью набора Впеаху (^^адеη, ХУеЧЬигд, ΕΌνι^η, Нидерланды) согласно протоколу производителя.
5'-ВАСЕ-Комплементарную ДНК (кДНК) получают из 112 нг тотальной РНК с использованием набора 8МАВТ ВАСЕ с^NΑ Αтр1^Γ^саΐ^οη (ΒΌ Вю5с1ег1се5 ОогИеск МошИат ^ете, СА, И8А), следуя протоколу производителя.
Области Уь и νΗ антитела Ве1х1 амплифицируют ПЦР. Для этого используют ДНК-полимеразу ВГиТигЬо® Но1Чаг1 (81га1а8ег1е) согласно инструкциям производителя. Каждая реакционная смесь содержит 200 мкМ смеси дНТФ (Воске ^^адηο8ΐ^С8), 12 пмоль обратного праймера (ВАСЕС1тт1 (Ρ19) для области Ун и ВАСЕКтт1 (Ρ18) для области Уъ), 7,2 пмоль иВМ-М|х (иВМ-М|х: 2 мкМ олигонуклеотида 811ойЕТ\111.3 (Ρ20) и 0,4 мкМ олигонуклеотида ^οηдυΡМΗ3 (Ρ21) (фиг. 14)), 0,6 мкл матрицы кДНК 5'ВАСЕ, описанной выше, и 1,5 единицы ДНК-полимеразы ВГиТигЬо® Но1Чаг1 в буфере для ПЦР (с до
- 56 016609 бавлением полимеразы) в общем объеме 30 мкл.
Реакции ПЦР осуществляют с помощью термоциклера ТСгаФеп! ТНсгтосус1сг 96 (\У11а1тап Βίοтс1га) с использованием программы из 35 циклов: денатурация при 95°С в течение 2 мин; 35 циклов 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1,5 мин; заключительное удлинение при 72°С в течение 10 мин.
Продукты реакции разделяют электрофорезом в 1% агарозном геле ТАЕ и окрашивают бромидом этидия. Полосы нужного размера вырезают из гелей и выделяют ДНК из агарозы с использованием набора для экстракции из геля О1асх11 (01адсп).
Выделенным из геля фрагментам ПЦР достраивают последовательность поли(А) путем инкубации в течение 10 мин при 72°С с 200 мкМ 4АТР и 2,5 единиц Атр1йац (Рсгкш Е1тсг) и очищают с использованием колонок для миниэлюирования (01адсп). Фрагменты ПЦР с достроенной последовательностью поли(А) клонируют в вектор рСЕМТсаку (Рготсда) с использованием набора рСЕМТсаку уссЮг куЦст II (Рготсда), следуя протоколу производителя. Компетентные клетки Е. сой 0пс 81ю1 Он5а-Т1к ([псЦгодсп) трансформируют 2 мкл смеси для лигирования и высевают на чашки ЬВ/Атр/ГРТО/Хдак
Четыре белые колонии, содержащие вставки, каждую для последовательностей Ун и Уъ, выделяют и вставки секвенируют. Выделенные аминокислотные последовательности Ун и Уъ Вс1у1 показаны как 8ЕО ГО N0: 8 и 8Е0 ГО N0: 12 соответственно.
Пример 35.
Конструирование рСопОНВс1у1-вектора для получения тяжелой цепи ВсРуЫдОЕ
Кодирующую область Ун мышиного антитела против Вс1у1 амплифицируют ПЦР из плазмиды, содержащей указанную область (пример 18), с использованием праймеров УнсхЬсМЕог (Р3) и УЫсхЬсМгсу (Р4), вводя подходящие сайты рестрикции для клонирования в рСопС1£0.4 и идеальную последовательность Козак.
Фрагмент Ун очищают в геле и клонируют в рСопС1£0.4. Для этого продукт ПЦР и вектор рСопКарра0.4 расщепляют ШпйШ и Ара1 и очищают.
Фрагмент Ун и расщепленный вектор рСоп61Ю.4ншйШ-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки ПЫ5а-Т1к.
Отбирают клон, содержащий вставку нужного размера, и подтверждают правильную последовательность. Полученную плазмиду называют рСопО1£ Вс£у1.
Пример 36.
Конструирование рСопКВс£у1-вектора для получения легкой цепи ВсЮЫдОЕ
Кодирующую область Уъ мышиного антитела против Вс1у1 амплифицируют ПЦР из плазмиды, содержащей указанную область (пример 18), с использованием праймеров УЕсхЬсЕ'Иог (Р2) и УЬсхЬс£у1гсу (Р1), вводя подходящие сайты рестрикции для клонирования в рСопК0.4 и идеальную последовательность Козак.
Продукт ПЦР и вектор рСопКарра0.4 расщепляют ЫтбШ и ВД^ и очищают. Фрагмент Уь и расщепленный вектор рСοηI<арра0.4Η^ηά[[[-Β5^\V[ лигируют и трансформируют компетентные клетки Е. со11 ПЫ5а-Т1к.
Отбирают клон, содержащий вставку нужного размера, и подтверждают последовательность. Полученную плазмиду называют рСопКВс£у1.
Пример 37.
Конструирование рТотО4Вс£у1-вектора для получения тяжелой цепи Βсΐν1-Iд^4.
Для того чтобы сконструировать вектор для экспрессии Βсΐν1-Iд^4, область Ун Вс£у1 клонируют в рТотС4.
Для этого рТотС4 и рСопОНВс1у1 расщепляют ЫшбШ и Ара1 и выделяют соответствующие фрагменты.
Фрагмент Ун Вс(у 1 и расщепленный вектор рТот64ншйШ-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки ПЫ5а-Т1к.
Отбирают клон, содержащий вставку нужного размера, и подтверждают последовательность. Полученную плазмиду называют рТотС4Вс1уЕ
Пример 38.
Конструирование рТотО4Вс£у1нО-вектора для получения тяжелой цепи Вс£у1-нО.
Для того чтобы сконструировать вектор для экспрессии Вс£у1-нО, область Ун Вс£у1 клонируют в рТотО47П8нО, заменяя область Ун 7Ό8.
Для этого рТотС47О8нС и рСопОНВс1у1 расщепляют нтбШ и Ара1 и выделяют соответствующие фрагменты.
Фрагмент Ун Вс(у1 и фрагмент расщепленного вектора рТот647П8нтйШ-Ара1 лигируют и трансформируют компетентные клетки Он5а-Т1к.
Отбирают клон, содержащий вставку нужного размера, и подтверждают последовательность. Полученную плазмиду называют рТотО4Вс£у1нО.
Пример 39.
- 57 016609
Получение 7Э8-1дО1, 7Э8-1д41, 7Э8-НО, ВеК1-1дО1, ВеК1-1дО4, ВеМ-НО, 2Р8-1дО1, 2Р8-1дО4, 2Р8-НО, 2Р8-РаЬ, А77-1дО1, А77-1дО4, А77-НО, А77-РаЬ, сМе!-1дО1, сМе!-1дО4, сМе!-НО и сМе!-РаЬ транзиентной экспрессией в клетках Нек-293Р.
Антитела получают для всех конструкций с помощью котрансфекции соответствующих векторов для тяжелой и легкой цепей клеток НЕК-293Р с помощью фектина 293 согласно инструкциям производителя. Для 7Э8-1дО1 коэкспрессируют рСопС1Г7Э8 и рСопК7Э8. Для 7Э8-1дО4 коэкспрессируют рТотС47Э8 и рСопК7Э8. Для 7Э8-НС коэкспрессируют рТотС47Э8НС и рСопК7Э8. Для Ве^1-1дО1 коэкспрессируют рСопО1Ве^1 и рСопКВеК1. Для Ве^1-1дО4 коэкспрессируют рТотС4Ве1\'1 и рС’опКВеКГ Для ВеК1-НС коэкспрессируют рТотО4Ве^1НО и рСопК ВеК1.
Для 2Р8-1дО1 коэкспрессируют рСопО1Г2Р8 и рСопК2Р8. Для 2Р8-1дО4 коэкспрессируют рТотО4Г2Р8 и рСопК2Р8. Для 2Р8-НО коэкспрессируют рТотО42Р8НО и рСопК2Р8. Для 2Р8-РаЬ коэкспрессируют рЕЕ6.42Р8РаЬ и рСопК2Р8.
Для сМе!-1дО1 коэкспрессируют рСопО1ГсМе! и рСопКсМе!. Для сМе!-1дО4 коэкспрессируют рТотО4сМе! и рСопКсМе!. Для сМе!-НО коэкспрессируют рТотО4сМе!НО и рСопКсМе!. Для сМе!-РаЬ коэкспрессируют рЕЕ6.4сМе!РаЬ и рСопКсМе!.
Для А77-1дО1 коэкспрессируют рСопО1ГА77 и рСопКА77. Для А77-1дО4 коэкспрессируют рТотО4А77 и рСопКА77. Для А77-НО коэкспрессируют рТотО4А77НО и рСопКА77. Для А77-РаЬ коэкспрессируют рЕЕ6.4А77РаЬ и рСопКА77.
Пример 40.
Очистка антител 1дО1, 1дО4 и бесшарнирных 1дО4.
Все 1дО1, 1дО4 и бесшарнирные антитела очищают. Сначала фильтруют супернатанты через 0,20 мкМ беаб-епб фильтр. Затем супернатант наносят на 5-мл колонку с протеином А (гРго!ет А РР, Атегкйат Вюкаепсе) и элюируют 0,1 М лимонной кислотой-№ОН, рН 3. Элюат сразу же нейтрализуют 2 М трис-НС1, рН 9 и диализуют в течение ночи против 12,6 мМ фосфата натрия, 140 мМ №С1, рН 7,4 (В. Вгаип, Окк, Нидерланды). После диализа образцы стерильно фильтруют через 0,20 мкМ беаб-епб фильтр.
Антитела дегликозилируют инкубацией в течение ночи при 37°С с 1 единицей Р^аке Р (Кос1е)/мкг антител с последующей очисткой на колонке с протеином А.
Образцы анализируют на концентрацию 1дО нефелометрией и по поглощению при 280 нм.
Пример 41.
Очистка рекомбинантных РаЬ антител аффинной хроматографией на иммобилизованном металле. Гранулы Та1оп (С1оп!ес1) используют для очистки антител А77-РаЬ, 2Р8-РаЬ и сМе!.
Перед применением гранулы уравновешивают 1х буфером для уравновешивания/промывки, рН 7,0 (50 мМ фосфата натрия и 300 мМ №С1), с последующей инкубацией с культуральным супернатантом, содержащим антитела РаЬ. Гранулы промывают 1х буфером для уравновешивания/промывки для удаления неспецифических связанных белков и элюируют меченный Н1к белок 1х буфером для элюирования (50 мМ фосфата натрия, 300 мМ №1С1 и 150 мМ имидазола) при рН 5,0. Инкубацию осуществляют периодически, в то время как промывку и элюирование проводят в набитых колонках с использованием центрифугирования (2 мин при 700 д). Элюированный белок обессоливают на колонке РЭ-10 с использованием в качестве буфера РВ8. Выход очищенного белка определяют путем измерения поглощения при 280 нм с использованием теоретического коэффициента поглощения, вычисленного из аминокислотной последовательности. Очищенные белки анализируют 808-РАСЕ, белок мигрирует в виде одной полосы в ожидаемом размере.
Пример 42.
Анализ антител 7Э8-1дО4 и 7Э8-НС методом невосстанавливающего 8Э8-РАОЕ.
После очистки специфические к СЭ20 антитела 7Э8-1дО1 (1дО1 против СЭ20), 7Э8-1дО4 (1дО4 против СО20) и 7Э8-НС (бесшарнирный 1дО4 против СО20) анализируют методом невосстанавливающего 808-РАСЕ.
Метод бис-трис электрофореза является модификацией метода ЬаеттИ (Ьаеттй и.К., №!иге, 227, 6801 (1970)), в котором образцы разделяют при нейтральном рН. Гели 808-РАСЕ окрашивают кумассии и получают цифровое изображение с использованием ОепеОешик (8упорйск, СатЬпбде, ИК).
Как можно видеть на фиг. 1, 7Э8-1дО1 показывает 1 главную полосу, представляющую полноразмерную тетрамерную (2 тяжелые и две легкие цепи) молекулу 7Э8-1дО1. 7Э8-1дО4 показывает наличие, кроме основной полосы, представляющей тетрамерную молекулу 1дО4, существенное количество половинных молекул (т.е. с одной тяжелой и одной легкой цепью), как описано в литературе (8сйиигтап I. е! а1., Мо1. 1ттипо1., 38, 1 (2001); Апда1 8. е! а1., Мо1. 1ттипо1., 30, 105 (1993); Со1с1ег Ό. е! а1., Сапсег Кек., 49, 1738 (1989); Кшд Ό.Ι. е! а1., Вюсйет. I., 281 (Р!. 2), 317 (1992); Ре!егкеп 1.О. е! а1., I. Вю1. С1ет., 249, 5633 (1974)). Видно, что молекулы бесшарнирного 1дО4 7Э8-НС являются только половинными молекулами.
Пример 43.
Масс-спектрометрия 7Э8-НС.
Для масс-спектрометрии методом распыления до наночастиц образцы концентрируют и буфер за
- 58 016609 меняют на 20 мМ фосфат натрия, рн 7,2, с использованием концентраторов ΜίΙΙίροΓΟ Μίαοωιι ΥΜ-30. Затем приблизительно 100 мкг 1дС расщепляют в течение 16 ч при 37°С 1Е Ν-гликозидазы Р (ΡοΟιο. кат. № 1365177) для высвобождения Ν-связанных гликанов.
Образцы обессоливают с использованием картриджа-микроловушки С4 и элюируют смесью 30% пропанол/5% уксусная кислота. Анализ молекулярной массы осуществляют с использованием МС с ионизацией распылением электронов до наночастиц с использованием 0-ТОР (ХУаЮгк, А1теге, Нидерланды). Прибор калибруют с использованием глуфибринопептида. Используют программное обеспечение МаккЕих 4.0 для обратной свертки полученных многозарядных данных.
Другую аликвоту образца восстанавливают с использованием дитиотреитола. Продукты восстановления обессоливают с использованием картриджа-микроловушки С4 и анализируют так, как описано выше. МС-Анализ 7Э8-ИС в условиях восстановления показывает массу легкой цепи 23440 Да, что согласуется с предсказанной массой легкой цепи 23440 Да. Массу тяжелой цепи определить не удалось, вероятно, из-за осаждения тяжелой цепи.
МС-Анализ в невосстанавливающих условиях показывает преобладающую массу 71520 Да, которая хорошо коррелирует с предсказанной массой (71522 Да) половинной молекулы (объединяющей одну тяжелую и одну легкую цепь) с обнаружением отсутствия шарнира. Определяют очень маленькое количество продукта с массой 143041 Да, вероятно, представляющей тетрамерную молекулу с бесшарнирной тяжелой цепью.
Пример 44.
Пептидное картирование 7Э8-ИС масс-спектрометрией.
Аликвоту (25 мкг) 7Э8-ИС расщепляют СИВг в течение 5 ч при комнатной температуре. Образцы, расщепленные СИВг, сушат вымораживанием и затем снова растворяют в 50 мМ аммонийбикарбонатном буфере, рн 8,4, доведенным 10% водн. аммиаком, и расщепляют обработанным ТРСК трипсином в течение 5 ч при 37°С. Продукты расщепления лиофилизуют и восстанавливают расщепленный лиофилизованный образец с использованием 20-кратного молярного избытка дитиотреитола (ΌΤΤ) в трисацетатном буфере при рн 8,5. Продукты реакции анализируют ЖХ/Е8-МС с использованием колонки с С-18. Элюирование осуществляют с использованием водного раствора муравьиной кислоты и градиента ацетонитрила. Молекулярные массы определяют с помощью масс-спектрометра ЬСТ Ргет1ег Е1ес1го8ргау, калиброванного в интервале т/ζ 250-3000.
Детектируют типичный пептид с массой 2026,2 Да, соответствующей теоретической массе бесшарнирного специфического пептида 220 VАΡЕЕ^ССΡδVΡ^ΡΡΡКΡК 238 (фиг. 2). Идентичность данного пептида подтверждают МС с помощью распыления до наночастиц и МС/МС (фиг. 3 и 4).
Такой результат подтверждает, что антитело 7Э8-ИС не содержит шарнирную область.
Пример 45.
Эксперименты по молекулярномассовому распределению 7Э8-ИС по скорости седиментации в аналитической центрифуге (АИС).
Образец 7Э8-нС в 1 мг/мл в РВ8 отправляют в Nанο1уί^с8 (Όπΐ^ν, Германия) на анализ АИС. Идентифицируют основную часть 7О8-ИС, осаждающуюся со скоростью 6,7 δ (95%). Отдельные агрегаты обнаруживают при 11,5 δ (2%). Остальное вещество обнаруживают в более крупных агрегатах.
Коэффициент осаждения основной фракции показывает, что 7Э8-ИС в ΡΒδ находится преимущественно в виде димера с фрикционным отношением 1,4.
Очевидно 7Э8-ИС образует димер за счет низкоаффинных нековалентных взаимодействий, вероятно, в участке Сн3 ^арЫге, δΙηηΜ6 е1 а1., 2002). Такой процесс димеризации можно ингибировать, используя молекулы нС в присутствии избытка нерелевантных антител (см. пример 54), δηι^Ι)^ Е.О., Я.Ь. δΙηηΠ^Ιά е1 а1. (2002), Τ’οηΙπικΙίημ 1дС кЦпсЮгек гехеа1 ех1гете акуттебу аиб Пех1ЬП11у, Т Μο1. Βίο1., 319(1): 9-18.
Пример 46.
Функциональный анализ антител 7Э8-1дСЕ 7Э8-1§С4 и 7Э8-ИС.
Связывание с антигеном ί.Ό20 указанных СЭ20-специфических антител проверяют проточной цитометрией. Трансфицированные клетки ΝδΟ/ί.Ό20 (50000 клеток/50 мкл) промывают буфером ΡАСδ (РВ: ΡΒδ, 0,05% В δ А, 0,02% NаNз) и инкубируют в 96-луночном планшете с лунками с ν-образным дном с испытываемыми антителами (50 мкл при 4°С в течение 30 мин). После промывки к клеткам добавляют козьи Р(аЬ)2 против человеческого 1дС-каппа, меченные РЕ (δοιιΙΙκΓη Β^οίесЬнο1ο§у, кат. № 2062-09, \ν\ν\ν.8οιι11κΓηΝο^1ι^οιη). Клетки промывают РВ и клетки собирают в пробирки ΡАСδ в общем объеме 150 мкл. Образцы измеряют и анализируют с использованием РАСЪсаНЬиг™ (ВесЮа ΌκΗηκοη, δаи Эхе^, СА, υδΛ).
Как можно видеть на фиг. 5, все три антитела являются антигенспецифическими и показывают хорошее связывание с ί.Ό20.
Связывание С1с.| (первый компонент классического пути активации комплемента) с 7О1-1дС1, 7Ό81дС4 и 7Э8-ИС определяют с помощью ЕЬКА. Титрационные микропланшеты для ЕЬКА (Стешет, Германия) сенсибилизируют в течение ночи при ЯТ испытываемыми антителами, серийно разведенными в
- 59 016609
РВ8 от 10 до 0,06 мкг/мл. Раствор удаляют и лунки блокируют 200 мкл на лунку буфера для ЕЫ8А (0,1 М ЫаРО4, 0,1 М ЫаС1, 0,1% желатина и 0,05% твина-20) при КТ в течение 30 мин. Затем раствор удаляют и проводят инкубацию, добавив в лунки 2 мкг/мл человеческого С1с.| (ОшбеН лот # 900848) в буфере для СЦ (РВ8 с добавлением 0,1% мас./об. желатина и 0,05% мас./об. твина-20, 100 мкл/лунку, 37°С, 1 ч). Планшеты промывают три раза РВ8Т и проводят инкубацию, добавив в лунки кроличьи антитела против человеческого СЦ (ПАКО, А 0136), разведенные в буфере для СЦ (100 мкл/лунку, КТ, 1 ч). После промывки планшетов (3х) РВ8Т проводят инкубацию, добавив в лунки конъюгированные с нРК свиные антикроличьи 1дС-Рс (ПАКО, Р0300, лот # 069), разведенные в буфере для ЕЫ8А (1:2500, 100 мкл/лунку, КТ, 1 ч). После этого планшеты трижды промывают и проводят анализы со свежеприготовленным раствором АВТ8, 1 мг/мл (АВТ8: 2,2'-азино-бис-[3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота]); 2 таблетки по 5 мг в 10 мл АВТ8-буфера, ВоеНгтдег МаииНет, 1иде1Не1т, Германия) при КТ в темноте в течение 30 мин. Измеряют поглощение при 405 нм с помощью мультиканального спектрофотометра для ЕЫ8А (Вю!ек 1ик!гитеи!к 1ис., \Утоок1г И8А).
Как можно видеть на фиг. 6, С1с.| не связывается ни с 7О8-1дС4, ни с 7Э8-нС. В качестве контроля оценивают связывание С1с.| с 7О8-1дС1, которые показывают зависимость связывания с С1д от концентрации.
Для того чтобы дополнительно исследовать комплементарные свойства СП20-специфических антител, оценивают комплементзависимую клеточную токсичность. После сбора клетки Дауди (АТСС, те^^.АТСС.огд) трижды промывают РВ8 и ресуспендируют в количестве 2х 106 клеток/мл в КРМ1 1640 с добавлением 1% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (В8А; КосНе, Ваке1, Швейцария). Затем клетки помещают в 96-луночный планшет с круглодонными лунками в количестве 1,0х105 клеток/лунку в объеме 50 мкл. В лунки добавляют такой же объем антител (наивысшая концентрация 10 мкг/мл, разводят в КРМ1 1640 и 1% В8А) и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре (КТ). Затем добавляют 25 мкл сыворотки здорового человека (ΝΉ8) и клетки инкубируют при 37°С в течение 45 мин. Инактивированная нагреванием сыворотка (сыворотка АТ) представляет собой ΝΉ8, инкубированную в течение 10 мин при 56°С. После инкубации в течение 45 мин клетки ресуспендируют и переносят в пробирки РАС8 (Стешет). Затем к полученной суспензии добавляют 10 мкл раствора иодида пропидия (Р1; 81дта-А1бгюН СНспис В.У.) (раствор 10 мкг/мл). Лизис детектируют проточной цитометрией (РАС8са11ЬигТМ, Вес!ои Пюкткои, 8аи П1едо, СА, И8А), измеряя число погибших клеток (Р1-положительные клетки).
Как можно видеть на фиг. 7А, 7Э8-1дС1 показывают хороший лизис клеток Дауди, в то время как и 7Э8-1дС4 и 7Ό8-ΒΟ показывают пониженный лизис клеток Дауди.
Для того чтобы оценить роль сыворотки, инактивированную нагреванием сыворотку (сыворотку ДТ) добавляют к клеткам, инкубированным с 10 мкг антител против к!оГ. Фиг. 7В показывает, что индукция лизиса зависит от комплементактивной сыворотки, добавление инактивированной нагреванием сыворотки не приводит к лизису.
Пример 47.
Анализ антител Ве!у1-нС невосстанавливающим δΌδ-РАСЕ.
После очистки Ве!у1-нС (бесшарнирный 1дС4 против Ве!у1) анализируют невосстанавливающим δΌδ-РАСЕ. Метод бис-трис электрофореза является модификацией метода ЬаетшП, где образцы разделяют при нейтральном рн. Гели δΌδ-РАСЕ окрашивают кумассии и получают цифровое изображение с использованием СеиеСешик ^уиорбск, СатЬпбде, ИК).
Как можно видеть на фиг. 8, Ве!у1-нС показывает 1 основную полосу, представляющую половинную молекулу (т. е. одну тяжелую цепь и одну легкую цепь).
Пример 48.
Гель-фильтрация антител Ве1у1-нС.
Ве!у1-нС подвергают гель-фильтрации для того, чтобы исследовать будет ли такой мутант элюироваться в виде половинной молекулы интактного димера. Образцы (100 мкл) наносят на колонку 10/30 с супердексом 200 (АтегкНат Вюкс1еисек, Иррка1а, Швеция), которая соединена с системой ВЭЖХ (АКТА ехр1огег) от АтегкНат Вюкс1еисек, Иррка1а, Швеция. Колонку сначала уравновешивают РВδ. Собирают фракции по 250 мкл, в которых определяют Ве!у1-специфический 1дС с использованием реакции связывания антигена. Затем также измеряют поглощение в образцах при 214 нм.
Для того чтобы проверить связывание антигена Век 1-специфическими антителами, образец антител инкубируют в течение ночи при комнатной температуре с 0,75 мг протеин С-сефарозы (АтегкНат Вюкс1еисек, Иррка1а, Швеция) в 750 мкл РВδ/АТ (РВδ с добавлением 0,3% ВδА, 0,1% твина-20, 0,05% №1Ν3) вместе с 50 мкл разведенного меченного 125Ι Ве!у1 или меченного 125Ι Ре1б1. Вс1у1 иодируют методом с хлорамином-Т с носителем свободного 125Ι (АтегкНат Вюкаеисек, Иррка1а, Швеция), как описано в Аа1Ьегке е! а1. ^его1одюа1 акрес!к оГ [дС4 аиНЬобхек, 1983, 130: 722-726). После промывки суспензии сефарозы РВδ-Т (РВδ с добавлением 0,1% твина-20) измеряют связанную радиоактивность. Результаты выражают в виде количества радиоактивности относительно добавленного количества.
Активность связывания Ве!у1 бесшарнирного Ве!у1-нС элюируется в одном пике, который удер
- 60 016609 живается долее, чем пик элюирования очищенного Ββΐν1-Ι§04 (Ι§04 против Ββΐν1), содержащего интактный шарнир (фиг. 9). Калибрование такой колонки с использованием глобулярных белков показывает, что Β^Τ^Ο элюируется во фракциях, соответствующих белкам с размером молекул ~70 кД (данные не приводятся). Такие данные подтверждают наблюдения, что бесшарнирный Ι§Ο4 существует в виде половинных молекул в отличие от описанных молекул Ι§Ο1 и Ι§Ο4 (8буег1оп Е.^. е! а1., Ргос. ИаИ. Асаб. 8οί. И8А, 74, 5140 (1977); Ка)ап 8.8. е! а1., Мо1. Iттиηο1., 20т 787 (1983); ногдап С е! а1., 1. Iттиηο1., 150, 5400 (1993)), и не ассоциируется посредством нековалентных взаимодействий в тетрамерные молекулы.
Пример 49.
Функциональная характеризация антител Βеΐν1-IдС4 и Бе1у1-нС.
Ранее показано, что, в отличие от полученного из сыворотки антигенспецифического ΙβΟ4 полученные ίη νίΐτο моноклональные антитела ΙβΟ4 способны сшивать антиген подобно антителам ΙβΟ1 и поэтому являются двухвалентными антителами (8сЬииттап 1. е! а1., Iттиηο1οду, 97, 693 (1999); АаЬегае К.С. е! а1., Iттиηο1οду, 105, 9 (2002)). Способность сшивать антиген Βеΐν1-IдС1, Βеΐν1-IдС4 и Βеΐν1-ΗС определяют радиоиммунным анализом с использованием связанного с сефарозой Βеΐν1 и антигена, меченного 125Ι. Прежде всего (ИегеГоге) получают сефарозу с пыльцой березы. Для этого экстракт пыльцы березы (А11егдоп, Апде1Ьо1т, Швеция) смешивают с активированной СПБт сефарозой 4Β (АтегаРат Βίο8С1епсе8, ирр§а1а, Швеция) согласно инструкциям производителя. Затем сефарозу ресуспендируют в ΡΒ8 с добавлением 0,3% Β8А, 0,1% твина-20 и 0,05% №N3.
Для того чтобы проверить способность антител сшивать антиген, связанный с сефарозой, с антигеном, меченным 125Ι, 50 мкл разбавленных антител инкубируют в течение ночи при комнатной температуре с 750 мкл сефарозы в ΡΒ8/АΤ. Затем суспензию сефарозы промывают ΡΒ8-Τ, после чего суспензию инкубируют в течение ночи при комнатной температуре с 50 мкл разведенных меченных 125Ι Βеΐν1 в общем объеме 750 мкл ΡΒ8Μ.Τ. Затем сефарозу промывают ΡΒ8-Τ и измеряют связанную радиоактивность. Результаты выражают в виде количества связанной радиоактивности относительно количества добавленной радиоактивной метки.
Как можно видеть на фиг. 10, все три антитела являются антигенспецифическими и показывают хорошее связывание с меченным радиоактивным изотопом Βеΐν1.
Из фиг. 11 видно, что Βеΐν1-IдС1 и Βеΐν1-IдС4 способны сшивать Βеΐν1, связанный с сефарозой, с Βеΐν1, меченным радиоактивным изотопом. Антитела !дС1 и !дС4 ведут себя как двухвалентные антитела. Антитела Βеΐν1-ΗС не способны сшивать антиген Βеΐν1 и поэтому показывают моновалентное связывание.
Пример 50.
Фармакокинетическая оценка бесшарнирных мутантных антител !дС4 в сравнении с нормальными Тд61, !дС4 и фрагментами Тд61.
Для эксперимента используют двадцать пять мышей 8СГО (ΠΒ-17/ΚΛτί-δα6-ΒΚ, СРапек-КГСег) с массой тела от 24 до 27 г. Мышей содержат в секции за барьером Сеп!га1 ЬаЬотаФгу Ашта1 Расббу (ШтесР!, Нидерланды) и держат в клетках с фильтрами в потолке с обеспечением водой и кормом аб 11Ь11шп. Все эксперименты санкционированы Комитетом по биоэтике Утрехтского университета.
Моноклональные антитела вводят внутривенно через хвостовую вену. Образцы крови по 50 мкл берут из подкожной вены лапы через 1, 4, 24 ч, 3, 7, 14, 21 и 28 дней после введения. Кровь собирают в содержащие гепарин флаконы и центрифугируют в течение 5 мин при 10000 д. Плазму хранят при -20°С до определения концентрации тАЬ.
В данном эксперименте клиренс бесшарнирного варианта ^С4 (7И8-нС, лот 570-003-ЕР) сравнивают с клиренсом нормального человеческого !дС4 (708-^04, лот 570-002-ЕР), варианта !дС1 (7Ό8ТдС1, лот 793-001-ЕР), Р(аЬ')2 (7И8-О1-Р(аЬ')2, лот 815-004-ХХ) и фрагментов РаЬ (7И8-С1-РаЬ, 815-003Х) последних тАЬ. Каждые антитела вводят 5 мышам в дозе 0,1 мг в 200 мкл на мышь.
Концентрации человеческого !дС определяют с помощью сэндвич-ЕЫ8А. Мышиные тАЬ против клона человеческого [дС-каппа Мн19-1 (#М1272, ίΕΒ 8апдшп, Нидерланды), нанесенные на 96луночные планшеты для ЕЫ8А М1сго1оп (Стешет, Германия) в концентрации 100 нг/лунку, используют в качестве иммобилизованных антител. После блокировки планшетов ΡΒ8 с 2% куриной сыворотки добавляют образцы, серийно разведенные в буфере для ЕМ8А (ΡΒ8, содержащий 0,05% твина-20 и 2% куриной сыворотки), и инкубируют в планшетном шейкере в течение 1 ч при комнатной температуре (КГ). Затем планшеты инкубируют с меченными пероксидазой фрагментами Р(аЬ')2 козьего иммуноглобулина против человеческого ^С (#109-035-097, 1аск§оп, ХУеЧ Сгасе, ΡА) и проявляют 2,2'-азино-бис-(3этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислотой) (АБΤ8; КосРе. МаппРеш, Германия). Измеряют поглощение с помощью многоканального спектрофотометра ^ю^ек, ХУшоохкк УТ) при 405 нм.
Мышей 8СГО выбирают потому, что они имеют низкие концентрации ^С в плазме и поэтому относительно медленный клиренс ^С. Это обеспечивает модель ΡΚ, которая очень чувствительна для детекции ускоренного клиренса из-за уменьшенного связывания Рса-части неонатального рецептора Рс (РсКп).
Фармакокинетический анализ осуществляют, определяя площадь под кривой (АИС) концентрация
- 61 016609 время с коррекцией хвоста. Скорость клиренса из плазмы вычисляют в виде доза/АИС (мл/день). Статистическую проверку осуществляют с использованием СгарйРаб РШ8М νδ. 4 (программное обеспечение Отарйраб).
Фиг. 12 показывает полулогарифмический график зависимости концентрации от времени. Начальные концентрации в плазме для всех интактных тАЬ одного и того же порядка - 85-105 мкг/мл, включая бесшарнирный вариант. Такие начальные концентрации соответствуют объему центрального распределения примерно 1 мл, что согласуется с распределением в компартменте плазмы мышей. Для фрагментов Е(аЬ')2 и ЕаЬ наблюдают более низкие начальные концентрации - 75 и 4 мкг/мл соответственно. Для фрагментов ЕаЬ это, вероятно, происходит из-за быстрого внесосудистого распределения в пределах первого часа после введения.
Фиг. 13 показывает скорости клиренса, вычисленные для отдельных мышей. Скорость клиренса бесшарнирного варианта в 3-4 раза выше, чем скорость нормальных ЦС1 и ЦС4. Однако это более чем в 10 раз медленнее, чем для фрагментов Е(аЬ')2, и более чем в 200 раз медленнее, чем клиренс фрагментов ЕаЬ.
Пример 51.
Фармакокинетическая оценка бесшарнирных мутантных антител ЦС4 в сравнении с нормальными ЦС4 и фрагментами ЦС1 Е(аЬ')2 на иммунокомпетентных мышах.
Для эксперимента используют двенадцать 8-недельных мышей Ва1Ь/с (Ва1Ь/САпЯСг1, Сйаг1е8Етуег). Мышей содержат в секции за барьером Сеп1га1 Επόοπ-ιΙοιγ Ашта1 Еасййу (И1тесЫ, Нидерланды) и держат в стерильных условиях в клетках с фильтрами в потолке с обеспечением водой и кормом аб 11Ь1Ццп. Все эксперименты санкционированы Комитетом по биоэтике Утрехтского университета.
Моноклональные антитела вводят внутривенно через хвостовую вену. Образцы крови по 50 мкл берут из подкожной вены лапы через 1, 4, 24 ч, 3, 7 и 10 дней после введения. Кровь собирают в содержащие гепарин флаконы и центрифугируют в течение 5 мин при 10000 д. Плазму хранят при -20°С до определения концентрации тАЬ.
В данном эксперименте скорость клиренса бесшарнирного варианта ЦС4 (7О8-НС, лот 570-003-ЕР) сравнивают с клиренсом нормального человеческого ЦС4 (7П84дС4, лот 570-002-ЕР) и фрагментов Е(аЬ')2 из 7Б8-ЦС1 (7О8-С1-Е(аЬ')2, лот 815-004-ХХ). Каждые антитела вводят 4 мышам в дозе 0,1 мг в 200 мкл на мышь, что соответствует дозе 4 мг на 1 кг массы тела.
Концентрации человеческого ЦС определяют с помощью сэндвич-ЕЫ8А. Мышиные тАЬ против клона человеческого ЦС-каппа МН19-1 (#М1272, СБВ 8аидшп, Нидерланды), нанесенные на 96луночные планшеты для ЕЫ8А МюгоШп (Отешет, Германия) в концентрации 100 нг/лунку, используют в качестве иммобилизованных антител. После блокировки планшетов РВ8, содержащим 2% куриной сыворотки, добавляют образцы, серийно разведенные в буфере для ЕЫ8А (РВ8, содержащий 0,05% твина20 и 2% куриной сыворотки), и инкубируют в планшетном шейкере в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ). Затем после промывки планшеты инкубируют с меченными пероксидазой фрагментами Е(аЬ')2 козьего иммуноглобулина против человеческого ЦС (#109-035-097, .Иск^п, АеЛ Сгасе, РА) и проявляют 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислотой) (АВТ8; Κο^. Мапп1е1т, Германия). Измеряют поглощение с помощью многоканального спектрофотометра (Вю1ек, Αίηοο^Κί, УТ) при 405 нм.
Мышей Ва1Ь/с выбирают потому, что они имеют нормальное продуцирование ЦС и поэтому относительно более быстрый клиренс ЦС, чем мыши 8СШ. Это обеспечивает мышиную модель, в которой введенные антитела компетентны с эндогенным мышиным ЦС в отношении связывания с неонатальным рецептором Ес (ЕсКп).
Фиг. 15 показывает полулогарифмический график зависимости концентрации от времени. Начальные концентрации в плазме во всех случаях порядка 100 мкг/мл, что согласуется с распределением в компартменте плазмы мышей. Клиренс бесшарнирного варианта ЦС4 только чуть быстрее, чем нормального ЦС4. Важно, что клиренс бесшарнирного варианта значительно медленнее, чем клиренс фрагментов Е(аЬ')2, которые имеют сравнимый размер.
Эксперимент показывает, что Ес-часть оказывает благоприятное действие на время пребывания в плазме у мышей с нормальной иммунной системой и дает указание на функциональное взаимодействие с неонатальным рецептором Ес (ЕсКп) также в присутствии эндогенного ЦС.
Пример 52.
Фармакокинетическая оценка бесшарнирных мутантных антител ЦС4 на мышах 8СШ, получивших человеческий ЦС.
Для эксперимента используют шестнадцать мышей 8СШ (С.В-КДстСп-кщб-ВК, Сйат1е8-Етуег) с массой тела от 18 до 22 г. Мышей содержат в секции за барьером Сеп1га1 Ба^таФту Ашта1 Еасббу (ШгесЫ, Нидерланды) и держат в стерильных условиях в клетках с фильтрами в потолке с обеспечением водой и кормом аб НЬбит. Все эксперименты санкционированы Комитетом по биоэтике Утрехтского университета.
Для исследования фармакокинетики бесшарнирного варианта ЦС4 выбирают иммунодефицитных мышей 8СШ, поскольку у таких мышей не развиваются реакции на человеческие белки, которые могут
- 62 016609 повлиять на исследования клиренса продолжительностью более недели. Таким ^С-дефицитным мышам дают внутривенно высокую дозу иммуноглобулина (человеческого поликлонального Ι§Ο от нескольких доноров) для исследования клиренса бесшарнирного мутанта ΙβΟ4 в присутствии человеческого Ι§Ο в физиологически релевантных концентрациях. Это обеспечивает мышиную модель, которая лучше представляет условия в организме человека, поскольку: 1) ассоциация бесшарнирного ΙβΟ4 в двухвалентную форму предотвращается присутствием ГУ!С и 2) бесшарнирный ΙβΟ4 должен конкурировать с другим Ι§Ο за связывание с неонатальным рецептором Рс (РсНп). Связывание с РсНп защищает Ι§Ο от внутриклеточного разложения после эндоцитоза и ответственно за его длительное время полужизни в плазме.
На данной модели исследуют клиренс из плазмы вариантов из СЭ20-специфического клона человеческих тАЬ 7Ό8. Скорость клиренса бесшарнирного варианта ΙβΟ4 (708-НС, лот 992-001-ЕР) сравнивают с клиренсом нормального человеческого ΙβΟ4 (7Ό8-Ι§64, лот 992-002-ЕР) и фрагментов Р(аЬ')2 7Ό8Ι§Ο1 (7О8-Р(аЬ')2, лот 892-020-ХХ). Кроме того, испытывают препарат бесшарнирного варианта, который ферментативно дегликозилирован (ТН3001-7Э8-НС деглик., лот 991-004-ЕР). Каждые антитела вводят 4 мышам через хвостовую вену в дозе 0,1 мг в 200 мкл на мышь, что соответствует дозе в примерно 5 мг на 1 кг массы тела. Моноклональные антитела вводят в смеси 1:1 с внутривенным иммуноглобулином (60 мг/мл, Запсции, Нидерланды, 1ЕК1088Т, загрузка 3 04Н04Н443А). Общий объем инъекции составляет 400 мкл/мышь, причем доза ΙνΙΟ 12,5 мг на мышь.
Образцы крови по 50 мкл берут из подкожной вены лапы через 15 мин, 5, 24 ч, 2, 3, 7 и 10 дней после введения. Кровь собирают в содержащие гепарин флаконы и центрифугируют в течение 10 мин при 14000 д. Плазму хранят при -20°С до определения концентрации тАЬ. Концентрации вариантов 7Ό8 определяют с помощью сэндвич-ЕЬИЗА. Мышиные тАЬ против 708-идиотипических антител (клон 2Р2 8АВ 1.1 (ЬО2), лот 0347-028-ЕР) используют в качестве иммобилизованных антител. После блокировки планшетов РВ8, содержащим 0,05% твина и 2% куриной сыворотки, добавляют образцы, серийно разведенные в буфере для ЕЫ8А (РВ8, содержащий 0,05% твина-20 и 2% куриной сыворотки), и инкубируют в планшетном шейкере в течение 2 ч при комнатной температуре (НТ). В качестве эталона используют антитела, введенные инфузией. Затем после промывки планшеты инкубируют с меченными пероксидазой козьими антителами, специфическими против человеческих Р(аЬ')2 (109-035-097, 1аскзоп Рптипогезеагск Аез! Сгасе, РА), и проявляют 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислотой) (АВТ8; Носке. Маппкет, Германия). Измеряют поглощение с помощью многоканального спектрофотометра (Вю!ек, Атаоозкк УТ) при 405 нм. Общие концентрации человеческого Ι§Ο в плазме определяют с помощью аналогичного ЕЫ8А. Мышиные тАЬ против клона человеческого ^С-каппа МН16 (#М1268, СЬВ ^апцит, Нидерланды) используют в качестве иммобилизованных антител. Для детекции используют меченный пероксидазой козий иммуноглобулин против человеческого Ι§Ο (# 109-035-098, 1аскзоп, Аез! Стасе, РА).
Фармакокинетический анализ осуществляют, определяя площадь под кривой (АИС) концентрация время с коррекцией хвоста. Скорость клиренса из плазмы вычисляют в виде доза/АИС (мл/день). Статистическую проверку осуществляют с использованием СгаркРай РШ8М ν8. 4 (программное обеспечение Сгаркрай).
Фиг. 20 в верхней части показывает полулогарифмические графики зависимости концентрации вариантов тАЬ 7Ό8 от времени, и в нижней части общие концентрации человеческого Ι§Ο в плазме. Начальные общие концентрации человеческого Ι§Ο в плазме в среднем составляют 2,3 мкг/мл и снижаются до 0,47 мг/мл через 10 дней. Начальные концентрации вариантов 7Ό8 ΙβΟ4 и ΙβΟ4 НС находятся в интервале 94-180 мкг/мл, что согласуется с начальным распределением в компартменте плазмы мышей. Для фрагментов Р(аЬ')2 начальные концентрации несколько ниже - в среднем 62 мкг/мл. Из графиков в верхней части ясно, что клиренс бесшарнирного варианта, включая дегликолизированный препарат, несколько быстрее, чем скорость интактного Ι§Ο4, но значительно медленнее, чем клиренс фрагментов Р(аЬ')2. Таблица, приведенная ниже, показывает скорости клиренса, вычисленные из кривых зависимости концентрации от времени. Скорость клиренса бесшарнирного варианта в 2-3 раза выше, чем нормального ΙβΟ4. Однако это почти в 10 раз медленнее, чем для фрагментов Р(аЬ')2. Важно, что дегликолизирование не влияет существенно на скорость клиренса бесшарнирного варианта Ι§Ο4.
Скорость клиренса из плазмы (д/АиС) в мл/день на кг Г(аЬ’)21§О1 1804 Ι&Ο4 НО Деглик. 1§О4 НО
Среднее 380 14 39 29
Ниже 95% С1 ср. 346 12 25 19
Выше 95% С1 ср. 415 17 53 38
Число значений 4 4 4 4
Таким образом, также в присутствии человеческого Ι§Ο в физиологически релевантных концентрациях клиренс бесшарнирного варианта значительно медленнее, чем фрагментов Р(аЬ')2, которые имеют сравнимый молекулярный размер. Данный эксперимент показывает, что также в присутствии конкурирующего человеческого Ι§Ο в физиологически релевантных концентрациях бесшарнирный вариант ΙβΟ4 способен к функциональному взаимодействию с неонатальным рецептором Рс (РсНп). Более того, данный эксперимент показывает, что гликолизирование бесшарнирного варианта ΙβΟ4 не влияет на скорость клиренса из плазмы и что негликолизированный бесшарнирный вариант ΙβΟ4 имеет время полужизни ш
- 63 016609 νί\Ό. схожее с полностью гликолизированной формой.
Пример 53.
Фармакокинетическая оценка бесшарнирных мутантных антител ГдС4 в сравнении с нормальными ГдС4 и фрагментами ГдС1 Р(аЬ')2 на мышах РсКп -/-.
Данный эксперимент осуществляют для того. чтобы исследовать. способен ли бесшарнирный мутант ГдС4 взаимодействовать с неонатальным рецептором Рс (РсКп). который ответственен за длительное время полужизни ГдС в плазме за счет защиты ГдС от внутриклеточного разложения после эндоцитоза. В данном эксперименте используют нокаутированных мышей В2М. поскольку они не экспрессируют РсКп.
Для эксперимента используют двенадцать самок нокаутированных мышей С57ВГ/6 В2М (Тасошс. модель В2МЮ2-М. называемая мышами РсКп -/-) и двенадцать самок контрольных мышей С57ВГ/6 дикого типа (Тасошс. модель № В6. называемая мышами ^Т). Мышей содержат в секции за барьером Сеп!га1 ЬаЬога!огу Ашта1 Расййу (и!гесб!. Нидерланды) и держат в клетках с фильтрами в потолке с обеспечением водой и кормом аб 11Ь1!ит. Все эксперименты санкционированы Комитетом по биоэтике Утрехтского университета.
Исследуют клиренс из плазмы вариантов СП20-специфических человеческих тАЬ клона 7Ό8. Скорость клиренса бесшарнирного варианта ГдС4 (7И8-НС. лот 992-001-ЕР) сравнивают с клиренсом нормального человеческого ГдС4 (7И8-ГдС4. лот 992-002-ЕР) и фрагментов Р(аЬ')2 7И8-ГдС1 (7И8-С1-Р(аЬ')2. лот 892-020-ХХ).
Моноклональные антитела вводят внутривенно через хвостовую вену. Каждые антитела вводят 4 мышам в дозе 0.1 мг в 200 мкл на мышь. что соответствует дозе 5 мг на 1 кг массы тела. Образцы крови по 50 мкл берут из подкожной вены лапы через 10 мин. 5. 24 ч. 2. 3. 7 и 10 дней после введения. Кровь собирают в содержащие гепарин флаконы и центрифугируют в течение 10 мин при 14000 д. Плазму хранят при -20°С до определения концентрации тАЬ. Концентрации человеческого ГдС определяют с использованием сэндвич-ЕЬГБА. в котором мышиные тАЬ против клона человеческого ГдС-каппа МН19-1 (#М1272. СЬВ Бапс|шп. Нидерланды). нанесенные на 96-луночные планшеты для ЕЬГБА Мюго1оп (Сгетег. Германия) в количестве 100 нг/лунку. используют в качестве иммобилизованных антител. После блокировки планшетов буфером для ЕЬГБА (РВБ. с 0.05% твина и 2% куриной сыворотки) добавляют образцы. серийно разведенные в буфере для ЕЬГБА. В качестве эталона используют серийные разведения соответствующих антител. введенные инфузией. После инкубации и промывки планшеты инкубируют с меченными пероксидазой козьими антителами АйшРиге. фрагментспецифическими против Р(аЬ')2 человеческого ГдС (#109-035-097. 1асккоп Гттипогекеагсб. ^ек! Сгасе. РА) и проявляют 2.2'-азино-бис-(3этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислотой) (АВТБ; Косбе. Маппбе1т. Германия). Измеряют поглощение с помощью многоканального спектрофотометра (Вю!ек. ХУпюоккг УТ) при 405 нм. Фармакокинетический анализ осуществляют. определяя площади под кривыми (АиС) концентрация-время. Скорость клиренса из плазмы вычисляют в виде доза/АиС (мл/день). Статистический анализ осуществляют с использованием СгарбРаб РКГБМ ν§. 4 (программное обеспечение Сгарбраб).
Фиг. 21 показывает полулогарифмический график зависимости концентрации от времени. Начальные концентрации в плазме во всех случаях порядка 100 мкг/мл. что согласуется с начальным распределением в компартменте плазмы мышей. Таблица. приведенная ниже. показывает скорости клиренса из плазмы. вычисленные из кривых зависимости концентрации от времени для отдельных мышей.
Скорость клиренса из плазмы, мл/день на кг 5Д 1 ЁГ | Р(аЬ’)2 РсКп-/- 1804 ТУТ 1§О4 РсКп-/- 1864 НО λντ 1§С4 НС ГсКа-/-
Среднее 183 159 12 45 15 83
Ст.отклонение 19 19 10 3 4 29
Число величин 4 4 4 4 4 4
Значимое различие: 0,1265, 0,0009 0,0033
величина Р (ΐ-критерий) П5 **
Для фрагментов Р(аЬ')2 значимых различий между мышами дикого типа (^Т) и нокаутированными мышами (РсКп-/-) не наблюдают. Напротив. для ГдС4 и бесшарнирного варианта ГдС4 скорости клиренса в 3-5 раз ниже у мышей \УТ по сравнению с мышами РсКп-/-. Данный эксперимент показывает. что присутствие РсКп оказывает благоприятное действие на время пребывания в плазме бесшарнирного варианта ГдС4. Поэтому это является свидетельством того. что бесшарнирный ГдС4 способен к функциональному взаимодействию с РсКп ш νί\Ό. что объясняет его благоприятное время полужизни в плазме.
Пример 54.
Функциональный анализ тАЬ анти-ЕСР 2Р8-НС.
МАЬ 2Р8 представляет собой человеческий ГдС1 - моноклональные антитела (тАЬ) против человеческого рецептора эпидермального фактора роста (ЕСРг). которые способны ингибировать передачу сигналов ЕСРг путем блокировки связывания лигандов. Из таких тАЬ получают вариант ГдС4 2Р8-Г дС4. а также бесшарнирный вариант 2Р8-НС.
В данном примере сравнивают возможности 2Р8-НС с возможностями 2Р8-Г дС4 и фрагментов 2Р8РаЬ ингибировать лигандиндуцированное фосфорилирование ЕСРг в клетках ш урго. Анализ проводят как с добавлением внутривенного иммуноглобулина (ГУГС) - препарата поликлонального человеческого
- 64 016609 ^О, содержащего все подклассы ^О, так и без добавления.
Ингибирование фосфорилирования бОРг измеряют в двухстадийном анализе с использованием эпидермоидной клеточной линии А431 (АТСС, Американская коллекция типовых культур, Мапаккак, И8А). Клетки культивируют в течение ночи в 96-луночных планшетах в бессывороточной среде, содержащей 0,5% человеческого альбумина (20% человеческий альбумин, 8апдшп, Нидерланды). Затем добавляют тАЬ в серийном разведении с IУIО или без него (Iттиπод1оЬи1^πе ГУ., 8апс.|шп) в фиксированной конечной концентрации или 100, или 1000 мкг/мл. После 60-минутной инкубации при 37°С добавляют рекомбинантный человеческий ΕОР (Вюкоигсе), 50 нг/мл, для индуцирования активации неблокированных бОРг. После дополнительной 30-минутной инкубации клетки солюбилизируют буфером для лизиса (Се11 81дпа1шд Тес1по1оду, Веуег1у, МА) и лизаты переносят в планшеты для Ε^I8А, сенсибилизированные 1 мкг/мл мышиных антител против ΕОР-Κ (тАЬ ΕОРΚ1, ВО Рбагтшдеп, 8ап П1едо, СА). После 2-часовой инкубации при КТ планшеты промывают и детектируют связывание фосфорилированных РОР-К с использованием мышиных тАЬ, специфических для фосфорилированных тирозинов, меченных европием (тАЬ Ευ-Ν1 Р-Туг-100, Регкт б1тег). Затем добавляют стимулирующий раствор ΌΕΕИА и измеряют флуоресценцию при возбуждении при 315 нм, измеряя испускание при 615 нм на планшет-ридере ГпУекеоп (Регкш б1тег). Сигмоидальные кривые зависимости реакции от дозы рассчитывают с использованием нелинейной регрессии (ОгарбРаб Рпкт 4).
Как можно видеть в верхней части фиг. 14, 2Р8-ΗО равно эффективен с 2Р8-IдО1 при ингибировании фосфорилирования, когда используют культуральную среду без добавления МО. Оба тАЬ более сильные, чем фрагменты 2Р8-РаЬ, которые связываются с бОРг моновалентно. Средняя и нижняя части фиг. 14 показывают, что добавление IVIО оказывает незначительное влияние на 2Р8-IдО4 и 2Р8-РаЬ. Однако он заметно сдвигает вправо кривую зависимости реакции от дозы для 2Р8-ΗО, что указывает на изменение характеристик связывания, что согласуется с мыслью, что в определенных условиях 2Р8-ΗО может вести себя как двухвалентное антитело, но диссоциирует до моновалентной формы в присутствии поликлонального человеческого ^О.
Пример 55.
Подтверждение принципа бесшарнирный ^О4 против СЭ89 (С^89-ΗО) ингибирует ^Εопосредованную астму у мышей.
Ракдшег е! а1. (Ракдшег В. е! а1., Iттишίу, 22, 31 (2005)) показали, что РсаШ (СЭ89 (Моп!епо К.С. е! а1., Аппи. Кеу. Iттиπо1., 21, 177 (2003)) играет как анти-, так и провоспалительную роль. Агрегация РсаШ приводит к активации клеток путем рекруитмента 8ук и блокировки связывания 8^-1. Мономерное взаимодействие с РсаШ ингибирует реакцию активации: 8ΗΡ-1 восстанавливается и происходит ухудшение фосфорилирования 8ук, БАТ и ΕΡΕ.
Фрагменты РаЬ антител против СЭ89 (клон А77) могут ингибировать опосредуемый ^О фагоцитоз с использованием человеческих моноцитов. Более того, IдΕ-опосредуемые реакции ш У1бо с использованием трансфицированных РсаКГ клеток ΚΕΕ-2Η3 и 1п у1уо на модели IдΕ-опосредованной астмы ингибируются фрагментами РаЬ таких антител против СО89. На данной модели РсаК1-трансгенных мышей (Баипау Р. е! а1., 1. Εxр. Меб., 191, 1999 (2000)) сенсибилизируют Т№-ОУА. Мыши, которым вводили интраназально иммунные комплексы IдΕ-ΤNΡ-ΟУА в присутствии РаЬ-фрагментов А77, показывают пониженную бронхиальную реактивность на метахолин, тогда как и иррелевантные РаЬ-фрагменты могут снижать бронхиальную повышенную реактивность.
Подтверждение 1п У1бо в соответствии со спецификой действия антигенспецифических несшивающих моновалентных неактивирующих антител получают в следующем эксперименте. Прилипающие РВМС инкубируют с 10 мкг/мл А77ШО (бесшарнирный IдО4), предварительно инкубированными 24 ч с иррелевантным ^О4 (ОептаЬ ВУ) или без него, или инкубируют с иррелевантными антителами ΗО в течение 30 мин при 37°С, промывают и инкубируют при 37°С в течение 30 мин с Е. соб, конъюгированными с Техак-геб (50 бактерий/клетку) (Мо1еси1аг РгоЬек, ОК), опсонизированными или нет поликлональными кроличьими антителами против ^О Е. соб, согласно инструкциям производителя. Слайды контролируют и проверяют с помощью конфокального лазерного микроскопа. РВМС, получающие опсонизированные Ε. соб и А77ШО (предварительно инкубированные с иррелевантным IдО4), показывают уменьшенный фагоцитоз Ε. соб при сравнении с РВМС, получающими опсонизированные Ε. соб и контрольные ΗО антитела.
РсаШ-трансгенных мышей сенсибилизируют Т№-ОУА так, как описано в Ракс.|шег В. е! а1., Iттипбу, 22, 31 (2005), или, с другой стороны, с ОУА, как описано Эеиг1оо е! а1. (Эеиг1оо Э.Т. е! а1., С1т. Εxр. А11егду, 33, 1297 (2003)). Трансгенных мышей с человеческим РсаКГ и контрольных детенышей итраперитонеально иммунизируют дважды в день 0 и день 7 Т№-ОУА или (81дта) в гидроксиде алюминия. Мышам вводят интраназально в течение нескольких дней подряд или комплекс Т№-ОУА с 20 мкг антител против Ό^-^Ε (Ζι.ι№π ΚΙ. е! а1., 1. Iттиπо1., 164, 2667 (2000)) или аэрозоль ОУА (Эеибоо Э.Т. е! а1., Сбп. Εxр. А11егду, 33, 1297 (2003)) в присутствии А77ШО (бесшарнирный ^О4) или иррелевантных бесшарнирных антител (контроль ΗО).
Мыши дважды получают 50 мкг А77ШО или контроля ΗО интраперитонеально, один раз в период
- 65 016609 введения для заражения и один раз с последним интраназальным введением. Через двенадцать часов после последнего интраназального введения мышей помещают в камеру плетизмографа для всего тела (ВИХС0 Е1есктошск, 8йагоп, СТ, И8А) и доставляют 300 мкл метахолина. После воздействия метахолина измеряют резистентность дыхательных путей. После эвтаназии мышей осуществляют иммуногистохимическую оценку на срезах легких.
Мыши, получающие А77-НС, показывают ослабленную повышенную реактивность при сравнении с мышами, получающими контрольные антитела НС.
Это показывает, что молекулы бесшарнирного Ιβ64 являются несшивающими, моновалентными и неактивирующими и, следовательно, применимыми для лечебных целей, когда такие инертные антитела могут быть выгодны, например, при ингибировании воспалительных реакций через ЕсоКЕ
Пример 56.
Проверочное исследование концепции сМе! с бесшарнирным Ιβ64 (сМе!-НС).
Известно, что рецепторная тирозинкиназа сМе! экспрессируется в самых разных эпителиальных клетках. Во время эмбриогенеза сМе! и фактор роста гепатоцитов/фактор рассеяния (НСЕ/8Е) вовлекаются в тканеспецифическую дифференцировку, ведущую к должной организации эпителиальных клеток, мышечного эндотелия и нервной и кроветворной систем. Анормальная передача сигналов сМе! вовлечена в онкогенез, в частности в развитие инвазивных и метастатических опухолей. Как следствие усиленной активности сМе!, опухолевые клетки могут увеличить скорость своего роста и стать резистентными к апоптозу, что приводит к преимуществу роста и/или выживания. Кроме того, активация сМе! может привести к реорганизации цитоскелета и активации интегрина, а также к активации протеолитических систем, вовлеченных в разрушение внеклеточного матрикса, что приводит к повышенной инвазивной и метастатической способности. Поэтому ингибирование передачи сигналов НСЕ/8Е представляет существенный терапевтический путь для лечения злокачественных опухолей.
Копд-ВеИтап е! а1. в Сапсег Се11. (2004, том 6, с. 75-84) описывают антитело (5Ό5) к внеклеточному домену сМе! и ингибирование связывания НСЕ. Показано, что ЕаЬ-фрагмент 5Ό5 против сМе! ингибирует управляемое НСЕ фосфорилирование сМе!, подвижность и миграцию клетки и рост опухоли. Авторы утверждают, что ЕаЬ 5Ό5 против сМе! блокируют димеризацию рецептора за счет стерического затруднения.
МАЬ С6 представляют собой человеческие моноклональные антитела (тАЬ) Ιβ61 против человеческой сМе!, которые способны связываться с высокой аффинностью с клетками Н441, активировать фосфорилирование сМе!, вызывать рассеяние Όυ-145 и блокировать связывание НСЕ с сМе! в ЕЫ8А. Из таких тАЬ получены фрагмент ЕаЬ (сМе!-ЕаЬ), вариант Ιβ64 (сМе!ЧдС4), а также бесшарнирный вариант (сМе!-НС).
В проверочном исследовании концепции с бесшарнирным Ιβ64 против сМе! (сМе!-НС) указанные моновалентные антитела ингибируют связывание НСЕ, димеризацию/активацию рецептора, рассеяние клеток и супрессию передачи сигналов. Такой эксперимент осуществляют как с добавлением внутривенного иммуноглобулина (Γ^Ο) - препарата поликлонального человеческого ΙβΟ, содержащего все подклассы ΙβΟ, так и без добавления, и с гНСЕ или без него.
Анализ рассеяния Όυ-145.
Клетки Όυ-145 (клеточная линия клеток карциномы предстательной железы человека, АТСС НТВ81) культивируют в ОМЕМ+ (содержащей 500 мл МЕМ Дульбекко (среда ОМЕМ, 4,5 г/мл глюкозы с NаНС0з, без глутамина, 81дта, Ό-6546), 50 мл телячьей сыворотки Соктю (Нус1опе 8Н30087.03), 5 мл 200 мМ/л Ь-глутамина (Вю АЫ!!аккет, ВЕ 17-605Е), 5 мл пирувата натрия (Вю АЫ!!аккет, ВЕ 13-115Е), 5 мл пенициллина/стрептомицина (Вю АЫ!!аккет, ОЕ 17-603Е)) и выращивают адгезивные кластеробразующие клетки. После добавления гйНСЕ (81дта, Н-1404) индуцируют миграцию клеток, что приводит к обособленным клеткам. Такой процесс называют рассеянием. Индукцию ингибирования рассеяния наблюдают средствами микроскопии.
День 1. Инкубируют сМе!, сМе!-НС, сМе!-ЕаЬ, сМе!ЧдС4 (30/3,0/0,3/0,03 мкг/мл) в течение ночи с добавлением IVIС, 6 мг/мл, или без добавления. Клетки Όυ-245 рассеивают (адгезивные клетки из колбы для культивирования Т75), супернатант клеточной культуры удаляют и клетки промывают 1 раз 10 мл РВ8, добавляют 2 мл смеси трипсин/ЭДТК (37°С) и клетки инкубируют при 37°С в течение 1-2 мин. Клетки удаляют с поверхности колбы для культивирования постукиванием и взаимодействие с трипсином/ЭДТК останавливают сохранившимся культуральным супернатантом. Клетки подсчитывают, получают суспензию 1х104 клеток/мл в свежей среде для выращивания и 50 мкл/лунку высевают в 96луночные планшеты (8!етбе Г1а! Ьо!!от Сок!аг, 3596) (конечная плотность 1000 клеток/лунку). Клетки культивируют в течение 15-24 ч при 37°С и 5% С02 в инкубаторе.
День 2. Среду заменяют свежей средой, 40 мкл/лунку. К клеткам добавляют 40 мкл предварительно инкубированных антител, и клетки инкубируют при 37°С в инкубаторе в течение 60 мин, после чего добавляют 40 мкл/лунку среды или 60 нг/лунку гй-НСЕ (конечные концентрации составляют 10/1,0/0,01 мкг/мл АЬ, 2 мг/мл IVIС, 20 нг/мл НСЕ). Клетки инкубируют в течение по меньшей мере 24 ч.
День 3 и 4. Наблюдают рассеяние двойным слепым методом с помощью микроскопа через 24 ч или
- 66 016609 через 48 ч. Морфологические характеристики рассеяния: клетки отделены от поверхности, показывают веретенообразные формы (мигрируют), и большинство клеток являются одиночными клетками, а не кластерами.
Обозначение степени ингибирования антителами рассеяния, вызванного гй-НСЕ:
- клетки максимально рассеиваются;
- слабое ингибирование рассеяния;
- ингибирование рассеяния;
- отсутствие рассеяния.
В данном эксперименте С6-НС, предварительно инкубированные с ГУГС, существенно блокируют рассеяние, вызванное НСЕ.
Фосфорилирование рецептора сМеЕ
Клетки А549 культивируют в среде Хэма (Наш) Е12, и сΜеΐ не фосфорилируется в нормальных условиях выращивания. После активации НСЕ рецептор сΜеΐ становится фосфорилированным. Фосфорилирование рецептора, опосредуемое НСЕ, ингибируют, применяя блокирующие сΜеΐ сМейЕаЬ или сМей НС с предварительной инкубацией с ГУГС.
День 1. сМеШдСЕ сМейНС (12,5 мкг/мл) инкубируют в течение ночи с добавлением или без добавления ГУГС, 2,5 мг/мл. Культивируют клетки А459 (1 х 106 /лунку) в 6-луночном планшете.
День 2. Культуральную среду (содержащую 500 мл среды Хэма Е12 (Вю ^ЫЦаСкег, ВЕ 12-615Е, 50 мл телячьей сыворотки Οοδ^ο (Нус^ие 8Н30087.03), 5 мл 200 мМ/л Ь-глутамина (Вю ^Ыйа1кег, ВЕ 17605Е), 5 мл пенициллина/стрептомицина (Вю ^Ыйа1кег, ОЕ 17-603Е)) удаляют и к клеткам добавляют 800 мкл предварительно инкубированных антител, клетки инкубируют при 37°С в инкубаторе в течение 15 мин, после чего добавляют 200 мкл/лунку среды или 80 нг/мл гй-НСЕ (конечные концентрации составляют 10 мкг/мл АЬ, 2 мг/мл ГУГС, 16 нг/мл НСЕ.) После инкубации еще в течение 15 мин среду для инкубации удаляют, клетки дважды промывают охлажденным на льду РВ8, добавляют 250 мкл буфера для лизиса НГРА (содержащего 50 мМ трис, рН 7,5, 0,5% дезоксихолата натрия и 0,1% нонидета 340, 150 мМ №С1, 0,1% 8Ό8, 2 мМ ванадата и ингибитор СЪшр1ек (ингибитор протеаз, Кцсйе 1836170)) и планшет аккуратно вращают в течение 10 мин при 4°С. Лизаты переносят в предварительно охлажденные пробирки (Эппендорф) и центрифугируют при самой высокой скорости в течение 30 мин при 4°С. Удаляют ДНК и лизат быстро охлаждают в Ν2, после чего фракцию используют для анализа на содержание белка ВСА (Р1егсе). Лизаты хранят при -80°С до анализа вестерн-блоттингом. Восстановленные образцы по 10 мкг подвергают электрофорезу в 4-20% геле Οί^ιϊοη Ргесаз! (Вюгай 345-0033) в трис-НС1 и вестерн-блоттингу на нитроцеллюлозной мембране (Вюгай 162-0114) согласно стандартным процедурам. Мембрану блокируют раствором для блокировки (содержащим 5% В8А (Кцсйе, 10735086) в ТВ8Т (20 мМ трис-НС1, рН 7,5, 150 мМ №С1, 0,1% твина 20) в течение 1,5 ч при комнатной температуре на качалке. Мембрану инкубируют в течение ночи при 4°С с разведением 1:1000 кроличьего ГдС против фосфоМеЙрУрУрУ 1230 1234 1235) (АЬсаш, аЬ5662). После 6-кратной промывки ТВ8Т вторичные козьи антикроличьи антитела НРН, Се11 8^дηайηд, 7074 (1:2000), в реагенте для блокировки инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре на качалке. Мембрану 6 раз промывают ТВ8Т. Затем полосы проявляют усиливающим стоп-раствором люминала (Р1егсе 1856145) и анализируют на устройстве для визуализации Ьитпшадег.
сМейНС, предварительно инкубированные с ГУГС, ингибируют опосредуемое НСЕ фосфорилирование рецептора.
Фиг. 22.
Клетки Όυ-145 культивируют и инкубируют с серийным разведением (А) сМейЕаЬ, сМейЕаЬ и ГУГС, сМейЕаЬ и НСЕ, сМейЕаЬ и ГУГС и НСЕ, (В) сМейНС, сМейНС и ГУГС, сМейНС и НСЕ, сМейНС и ГУГС и НСЕ. Рассеяние наблюдают двойным слепым методом (оценено 14 человек) под микроскопом через 48 ч и строят график средней оценки ± 8ЕМ.
сМейЕаЬ с или без ГУГС (А) и сМейНС, предварительно инкубированные с ГУГС (В), существенно блокируют вызванное НСЕ рассеяние в зависимости от дозы.
Фиг. 23.
Клетки Όυ-145 культивируют и инкубируют с 10 мкг/мл (А) сМейЕаЬ, сМейЕаЬ и ГУГС, сМейЕаЬ и НСЕ, сМейЕаЬ и ГУГС и НСЕ, (В) сМейНС, сМейНС и ГУГС, сМейНС и НСЕ, сМейНС и ГУГС, и НСЕ. Рассеяние наблюдают двойным слепым методом (оценено 14 человек) под микроскопом через 48 ч.
сМейЕаЬ с или без ГУГС и сМейНС, предварительно инкубированные с ГУГС, существенно ингибируют индуцируемое НСЕ рассеяние. Для статистического анализа выполняют проверенный ранговый двусторонний критерий Уилкоксона с гипотетической медианой 3 (максимальное рассеяние).
Фиг. 24.
Экстракты, полученные из клеток А549, инкубированных с сМейНС (полоса 1), сМейНС и ГУГС (полоса 2), сМейНС (полоса 3), сМейНС, ГУГС и нСе (полоса 4), сМейГдС1 (полоса 5), сМейГдС1 и ГУГС (полоса 6), расщепляют 808-РАСЕ в 4-20% геле Οί^ιϊοη Ргесаз! в трис-НС1 и осуществляют вестерн-блоттинг на нитроцеллюлозной мембране. Мембрану инкубируют в течение ночи при 4°С с кро
- 67 016609 личьим 1дС против фосфо-Ме1(рУрУрУ 1230 1234 1235) (АЬсат, аЬ5662). После промывки ТВ8Т вторичные козьи антикроличьи антитела нРВ, Се11 81дпа1тд, 7074, в реагенте для блокировки инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре на качалке. Мембрану промывают 6 раз ТВ8Т. Затем полосы проявляют усиливающим стоп-раствором люминала и анализируют на устройстве для визуализации изображений Ьититадег. Вестерн-блоттинг показывает полосу 169 кД, указывающую на фосфоМе!(рУрУрУ 1230 1234 1235).
Пример 57. Оценка ш уйго антител бесшарнирных мутантов 1дС4 к мишени рецептору эпидермального фактора роста (ЕСЕг); авидность связывания и индукция антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЭСС).
В данном эксперименте антитела бесшарнирные мутанты 1дС4 к мишени рецептору эпидермального фактора роста (ЕСЕг) тАЬ 2Е8-нС сравнивают с вариантом 1дС4, вариантом 1дС1 и фрагментами ЕаЬ, называемыми 2Е8-1дС4, 2Е8-1дС1 и 2Е8-ЕаЬ соответственно. Оценка ш уйго включает авидность связывания с ЕСЕг в ЕЫ8А и индукции АЭСС.
ЕЫ8А.
Аффинность связывания определяют с помощью ЕБ18А, в котором очищенный ЕСЕ-В (81дта, 8! Ьоик, МО) наносят на 96-луночные планшеты Мюго1оп для ЕЫ8А (Сгешег, Германия) в количестве 50 нг/лунку. Планшеты блокируют РВ8 с добавлением 0,05% твина 20 и 2% куриной сыворотки. Затем добавляют образцы, серийно разведенные в буфере, содержащем 100 мкг/мл поликлонального человеческого 1дС (внутривенный иммуноглобулин 1У1С, 8аи^и^п, Нидерланды), и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре (ВТ). Затем планшеты инкубируют с конъюгированными с пероксидазой кроличьими антителами против легкой цепи каппа человека (ЭАКО, С1о8!гир, Дания) как детектирующими антителами и проявляют 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолин-сульфоновой кислотой) (АВТ8; Восйе. Маиηйе^т, Германия). Измеряют поглощение с помощью многоканального спектрофотометра (Вю!ек, Атооккц УТ) при 405 нм.
Фиг. 16 показывает, что кривые связывания 2Е8-нС и 2Е8-ЕаЬ накладываются друг на друга и явно смещены вправо относительно кривых связывания 1дС1 и 1дС4. Такое различие в авидности в отношении нанесенного ЕСЕг согласуется с мыслью, что в присутствии 1У1С 2Е8-ЯС связываются моновалентно почти как фрагменты ЕаЬ.
Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АЭСС).
Способность вызывать эффекторный клеточнозависимый лизис опухолевых клеток оценивают в анализе с высвобождением хрома-51 (51 Сг). Клетки-мишени А431 (2,5х106 клеток) метят 100 мкКи №251СгО4 (Атегайат Вюкаепсек, Ирр8а1а, Швеция) в условиях встряхивания при 37°С в течение 1 ч. Клетки трижды промывают РВ8 и ресуспендируют в среде для выращивания, 1х 10 клеток/мл. Меченые клетки распределяют в 96-луночные планшеты (5х103, 50 мкл/лунку) и предварительно инкубируют (ВТ, 30 мин) с 50 мкл 10-кратных серийных разведений тАЬ в среде для выращивания в интервале от 20 мкг/мл до 0,02 нг/мл (конечные концентрации). Среду для выращивания добавляют вместо антител для определения спонтанного высвобождения Сг, добавляют тритон Х100 (конечная концентрация 1%) для определения максимального высвобождения 51Сг. Затем в лунки добавляют РВМС (5х105/лунку) и клетки инкубируют при 37°С в течение ночи. На следующий день супернатанты собирают для измерения высвобождения 51Сг путем определения числа импульсов в 1 мин (чим) в счетчике гамма-частиц. Процент клеточной цитотоксичности вычисляют с использованием следующей формулы:
% специфического лизиса = (экспериментальное высвобождение (чим) - спонтанное высвобождение (чим))/(максимальное высвобождение (чим) - спонтанное высвобождение (чим))х100, где максимальное высвобождение 51Сг определяют, добавляя тритон Х-100 к клеткам-мишеням, и спонтанное высвобождение измеряют в отсутствие сенсибилизирующих антител и эффекторных клеток.
Фиг. 17 показывает, что 2Е8-нС не индуцирует АЭСС, подобно 2Е8-1дС4, в то время как 2Е8-1дС1 является очень сильным в этом отношении.
Пример 58.
Платформу А1до№т1с§' ЕрФаке® используют для изучения моновалентных антитела 1дС4 с бесшарнирной константной областью. Коротко, платформа анализирует специфичность связывания ГКС (нЬА) всеми возможными 10-мерными пептидами, полученными из последовательности-мишени (Эекте! е! а1., 1992, 1997, 2002, 2005). Анализ профиля делают на уровне аллотипа для 20 ОВВ1, 7 ОВВ3/4/5,14 ЭО и 7 ЭР, т.е. в целом 48 рецепторов класса II ГКС.
Ер1Ьаке® вычисляет количественную оценку свободной энергии связывания ДСЬшб пептида для каждого из 48 рецепторов класса II ГКС. Затем полученные данные обрабатывают далее следующим образом. Пептиды классифицируют по связыванию на сильные (8), средние (М), слабые и несвязывающие (Ν).
В константной области бесшарнирных моновалентных антител ^С4 не встречают сильно- и только 1 среднесвязывющий эпитоп. Такой единственный неоэпитоп создает среднесвязывающий ПВВ1-0407. ЭВВ1 -0407 представляет собой минорный аллотип, присутствующий у менее чем 2% населения Кавказа. Кроме того, единственный эпитоп средней силы несущественен в общем числе эпитопов даже наименее
- 68 016609 иммуногенных антител.
В итоге прогнозируется. что весьма маловероятно. что бесшарнирные моновалентные антитела 1дС4 являются иммуногенными.
Пример 59. Предпосылки исследований и материалы. используемые в примерах 59 и 60. представленные для ИпЬобу-СП4.
Осуществляют эксперименты ш νίΙΐΌ и ш хйо для того. чтобы направить способность человеческих моноклональных антител против СЭ4 (НиМах-СЭ4) на ингибирование инфекции ВИЧ-1. Антитела направляются против домена 1 СЭ4 и перекрывают сайт связывания ВИЧ-1 др 120 на СЭ4.
Данный пример (59) показывает. что фрагменты РаЬ антител против СЭ4 ингибируют заражение клеток СЭ4-ССК5 или клеток СЭ4-СХСК4 различными первичными изолятами и вирусами ВИЧ. адаптированными к линии Т-клеток. Величины 1С50 ингибирования находятся в интервале величин ЕС50 связывания НиМах-СЭ4 с кСЭ4 и связанного с клеткой СЭ4 (данные не приводятся). что подразумевает ингибирование связывания оболочки ВИЧ-1 с СЭ4 как механизм ингибирования. Вообще. фрагменты РаЬ НиМах-СЭ4 ингибируют с эффективностью в 10 раз меньшей. чем полные антитела. что и ожидалось из различия в авидности между РаЬ и полными антителами.
Пример 60 показывает. что у мышей. обработанных НиМах-СЭ4. наблюдают меньшее падение отношения ί.Ό4/ί.Ό8 в сравнении с группами. обработанными контрольным 1дС. что показывает. что НиМах-СЭ4 защищает от истощения СО4-положнтельных клеток ВИЧ-1. Более того. обработка НиМахСЭ4 ведет к снижению количества копий РНК ВИЧ-1 в крови со временем. в то время как обработка контрольным 1дС не вызывает такого снижения. Данные ш ν 11го показывают. что антитела против СЭ4 могут защищать от вызываемого ВИЧ-1 истощения СЭ4 и снижают интенсивность заражения ВИЧ и вирусную нагрузку.
Еогпк е! а1. опубликовали данные о лечении зараженных ВИЧ-1 индивидуумов полными антителами против СЭ4 (домен 2) подкласса 1дС4.
Результаты по эффективности показали значительную антивирусную активность в первый момент (неделя 24).
Реакция может длиться предположительно до недели 48 у пациентов. получающих ТNX-355.
ТNX-355. 10 мг/кг + 0ВК. показал 0.96. 1од 10. снижение РНК ВИЧ-1 от базовой линии в неделю 48 против 0.14. 1од 10. снижения для плацебо + 0ВК (р < 0.001).
ТNX-355. 15 мг/кг + 0ВК. показал 0.71. 1од 10. снижение РНК ВИЧ-1 от базовой линии в неделю 48 против 0.14. 1од 10. снижения для плацебо + 0ВК (р = 0.009).
Обработка 'ТЫХ-355 + 0ВК ассоциируется со статистнческн значимым и клинически значимым возрастанием числа СЭ4+ клеток в неделю 48 как при лечении 10 мг/кг (+48 клеток. р = 0.031). так и при лечении 15 мг/кг (+51 клетка. р = 0.016). против возрастания в случае плацебо (+1 клетка).
Литература.
Ζ\νχ1< М.В.. Аапд М.. Ро1дпагб Р.. 8йед1ег 6.. Кайпдег Н.. Виг1оп Р.К.. апб Раггеп Р.А.Н.1. №ιιΙη1ίхайоп купегду оГ Нитап 1ттипобеДс1епсу νίπικ !уре 1 рптагу йокИек Ьу сосктбк оГ Ьгоаб1у пеи1га1|/1пд ап!1Ьоб1ек. I. Уй.. 2001. 75:12198.
Ро1дпагб Р.. 8аЬЬе К.. РюсЫо С.К.. Аапд М.. 6ιι1ίζίη Кб.. Кайпдег Н.. Раггеп Р.А.Н.1.. Мок1ег О.Е.. апб Вийоп Э.К. йеШгаК/тд ап!1Ьоб1ек Нахе йтйеб еГГес!к оп Не соп!го1 оГ ек!аЬ11кйеб Н1У-1 тГесйоп ш νί\Ό. 1ттипйу. 1999. 10:431.
йоггй Ό.. Могайк 1.. Сайе 1.. СобаГкку Е.. Сагс1ак Р.. Нагб\\зск К.. апб Ье^й 8. РНаке 2 еГПсасу апб каГе1у оГ 1Не похе1 хйа1-еп1гу шЫЬйог. 'ТЫХ-355. ш сотЫпайоп νίΐΗ орИни/еб Ьаскдгоипб гед1теп (0ВК). ХУ1 1п!ета!юпа1 ΆΙΌ8 СопГегепсе. Тогоп!о. Сапаба. 2006.
Нейтрализация ВИЧ-1 т νίΙΐΌ полными антителами НиМах-СЭ4 и фрагментами РаЬ антител НиМах-СЭ4.
Способ подробно описан Ζ\νχ1< е! а1.. 2001. Коротко. степень нейтрализации вируса антителами измеряют по люциферазной активности. Вирусы. компетентные для одного цикла репликации. получают котрансфекцией соответствующими вирусными конструкциями в модифицированном векторе р8У11епх (например. первичными изолятами ДК-С8Р. ДК-РЬ. 8Р162. АОА. Υυ2. 89.6. И8 143 и адаптированным к линии Т-клеток вирусом ШВ) и рйЪ4-3.1ес.К-Е-. Вирусы предварительно инкубируют с различными количествами антител (перед добавлением. определенным для получения примерно 100000 импульсов) к клеткам и87.СО4.ССК5 (первичные изоляты) или клеткам СЭ4-СХСК4 (в случае ШВ) и культивируют в течение 3 дней. Лунки промывают. инкубируют с люциферазным реагентом для лизиса культуры клеток и лизаты переносят в непрозрачный аналитический планшет для измерения люциферазной активности в люменометре с использованием люциферазного реагента для анализа. Испытывают НиМах-СЭ4 и фрагменты РаЬ НиМах-СЭ4 на нейтрализацию.
Согласно описанному способу вирусные конструкции Υυ2. 111В. АОА. 89.6. и8 143. ДК-РЬ. ДК-С8Р и 8Р 162 используют в анализе 1п νίΙΐΌ на нейтрализацию с использованием экспрессирующей системы анализа с люциферазой. ВИЧ-1 ШВ представляет собой вирус. адаптированный к линии Т-клеток. все другие вирусы представляют собой первичные изоляты ВИЧ-1. Антитела НиМах-СЭ4 и фрагменты РаЬ НиМах-СЭ4 добавляют в разведении 1:2. начиная с концентраций. показанных на фиг. 25. На фиг. 27
- 69 016609 приводятся кривые, подобранные 4-параметрическим логистическим анализом, для НиМах-СО4 и фрагментов РаЬ НиМах-СП4, и на фиг. 25 указаны 1С50, вычисленные из таких подборок. Данные показывают, что антитела НиМах-СО4 ингибируют заражение всеми испытанными вирусами, и, как правило, это происходит с эффективностью, в 10 раз лучшей, чем для фрагментов РаЬ (исключениями являются УИ2 и Ж-С8Р). Определяют, что ЕС50 для связывания НиМах-СО4 с кСЭ4 составляет примерно 0,3-1 нМ. Величины 1С50 ингибирования находятся в интервале этих указанных величин ЕС50, что указывает, что занятость рецепторов НиМах-СО4 соотносится со степенью ингибирования инфекции.
Описанные эксперименты подтверждают эффективное ингибирование заражения ВИЧ-1 клеток как СХСК4, так и ССК5, экспрессирующих корецептор ВИЧ-1, моновалентным связыванием антителами против СЭ4 (т.е. фрагментами РаЬ). Это свидетельствует, что подобное ингибирование можно осуществить антителами НО против СЭ4.
Пример 60.
Защита от истощения вирусом СЭ4+ Т-клеток ш νί\Ό на мышиной Ьи-РВМС-8СШ модели заражения ВИЧ.
Экспериментальная процедура подробно описана в Ро1дпагб е! а1., 1999. Коротко, воссоздают мышей СВ-17 8СШ примерно 15х106 РВМС здорового человека (мононуклеарные клетки периферической крови). Примерно двумя неделями позже животных заражают ВИЧ-1 (ВИЧ-1Ж-С8Р). Через три дня животных обрабатывают 1 мг/мл НиМах-СО4 или контрольными антителами изотипом человеческого 1дО или не обрабатывают, при интраперитонеальной доставке. Образцы крови берут через 1, 6 ч, в дни 1, 2, 3, 6, 9, 13 и 15 после инъекции, и через две недели животных подвергают эвтаназии и осуществляют анализ РАС8 для определения % человеческих клеток (с использованием Н2Кб-РЕ и человеческих СЭ3-АРС) и отношения СО4/СЭ8 (с использованием двойного окрашивания СЭ4-РЕ и СЭ8-АРС). Кроме того, определяют вирусную нагрузку в плазме, измеряя уровни РНК ВИЧ-1 количественным анализом методом КосБе КТ РСК. Кроме того, определяют концентрации НиМах-СЭ4 в плазме с помощью прямого связывания кСЭ4 в ЕЬ18А (нанесение кСЭ4 на планшет и детекция поликлональными антителами против Рс).
На фиг. 28 приводятся уровни в плазме животных. Из них следует, что инъекция НиМах-СО4 приводит к высоким концентрациям НиМах-СО4 в плазме, которые в день 15 все еще выше 100 мкг/мл. У необработанных мышей нет поддающихся измерению величин выше уровня фона.
На фиг. 26 приводится число клеток, собранных у мышей по окончании эксперимента. Данные показывают, что заражение ВИЧ-1 приводит к большому снижению количества СЭ4-положительных Тклеток, как показывает падение соотношения СЭ4/СЭ8. Это показывает, что СЭ4-положительные Тклетки быстро истощаются из крови ВИЧ-1 в отличие от постоянных уровней у неинфицированных мышей. Мыши, обработанные 1р НиМах-СО4, имеют значительно меньшее падение соотношения СО4/СЭ8, которое показывает, что НиМах-СО4 обеспечивают защиту СЭ4-положительных Т-клеток от истощения ВИЧ-1. На фиг. 29 приводится число копий РНК ВИЧ-1 на 1 мл крови со временем, и приведенные данные показывают, что обработка НиМах-СО4 ведет к снижению количества копий РНК ВИЧ-1 в крови со временем, в то время как изотопические контрольные антитела не приводят к снижению.
Данный эксперимент подтверждает защиту от истощения СЭ4-клеток при заражении ВИЧ-1 ш νί\Ό. Защиту от истощения наблюдают даже тогда, когда полные антитела против СЭ4 сами обладают свойством истощения СЭ4. Это показывает, что более сильную защиту от вызываемого ВИЧ-1 истощения Тклеток можно получить обработкой моновалентными не вызывающими истощения антителами против СЭ4, такими как НО антитела против СЭ4. Решающее подтверждение нейтрализации ВИЧ-1 НО против СЭ4 и защиты от истощения СЭ4 можно получить при постановке подобного эксперимента. Это является свидетельством того, что НиМах-СО4 НО, показывающие длительное время полужизни ш νίνΌ, могут ингибировать заражение ВИЧ-1 и вирусную нагрузку ВИЧ-1 и защищать от истощения СЭ4положительных клеток.
Вывод.
Данные, представленные в примерах, показывают, что экспрессия бесшарнирных антител 1дО4 путем разрушения донорного сайта сплайсинга в экзоне шарнира приводит к бесшарнирным половинным молекулам 1дО4 (объединены одна тяжелая и одна легкая цепь). Присутствие бесшарнирных половинных молекул 1дО4 подтверждается 8Э8-РАОЕ в условиях невосстановления, масс-спектрометрией, гельхроматографией и радиоиммуноанализом по отсутствию способностей к сшиванию. Бесшарнирные антитела сохраняют ту же специфичность связывания, что и естественный формат молекул антител 1дО1 и 1дО4. Это показано для двух бесшарнирных антител с различной специфичностью - 7Э8-НО (специфичность в отношении В-клеточного антигена СЭ20) и Ве1х1-НО (специфичность в отношении антигена пыльцы березы Ве1х1). Связывание С1с.| 7Э8-НО отсутствует, и наблюдают только незначительную комплементзависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) (сравнимую с естественным форматом антител 7О8-1дО4). Моновалентность бесшарнирной половинной молекулы показана в эксперименте по сшиванию с использованием Ве1х1-НО. В то время как и 1дО1 и 1дО4 показывают сшивание связанного с сефарозой Ве1х1 с меченным радиоизотопом Ве1хЕ бесшарнирная молекула Ве1х1-НО не способна к сшиванию.
Время полужизни 7Э8-НО оценивается ш νί\Ό в эксперименте по фармакокинетике (РК) на мышах
- 70 016609 и сравнивается с 7Э84дС4. Хотя 7Э8-НС имеет в 2-3 раза более быстрый клиренс, чем нормальный ЦС4 на данной модели, время полужизни в 6 дней считается благоприятным относительно времени полужизни в один день, сообщенным для фрагментов Е(аЬ')2 ЦС. Вывод таков, что благоприятный РК-профиль будет придавать бесшарнирным антителам ЦС4 ценность для терапевтических применений, когда требуются несшивающие моновалентные и комплементнеактивирующие антитела.
Перечень последовательностей
8Ер Ιϋ ΝΟ: 1: нуклеотидная последовательность Сь каппа человеческого
С6ТАС66ТОО СТОСАССАТС ТСТСТТСАТС ТТССССССАТ СТ6АТОАССА аТТСАААТСТ ССААСТСССТ СТОТТОТСТ6 ССТССТСААТ ААСТТСТАТС
101 ССАОАОАССС САААОТАСАО ТССААОСТСО АТААСССССТ ССААТСОООТ
151 ААСТСССАОО АОАОТОТСАС АОАОСАССАС А6САА6ОАСА ССАССТАСА6
201 ССТСАОСАОС АСССТОАСОС ТСАОСАААОС АОАСТАСОАО АААСАСАААС.
251 ТСТАССССТО С6АА6ТСАСС САТСАОООСС ТСАОСТСОСС СОТСАСАААО
301 АОСТТСААСА ООООЛОАОТО Т
8Е<2 Ш N0: 2: аминокислотная последовательность Сь каппа человеческого Тд
КТУААР8УР1 ΡΡΡ5ί)ΕΤ)Ι,Κ8 ΟΤΑΚννΟΧΝΝΡΥΡΚΕΑΚν(2 \νκνθΝΑίΟ8Γ,
Ν89Ε8νΤΕΟ1) 8ΚΌ8ΤΥ8Ε88 ΤίΤίδΚΑϋΥΕ КНКУУАСЕУТ Н96С85РУТК
101 ЗГЫКОЕС
8Ε0 ГО ΝΟ: 3: нуклеотидная последовательность Сь лямбда человеческого 1д
АССОТССТАО ОТСАССССАА ООСТОССССС ТСООТСАСТС ТОТТСССОСС
СТССТСТОАО ОАССТТСААО ССААСААОСС САСАСТОСТО ТСТСТСАТАА
101 СтТОАСТТСТА ССС6ССА0СС ОТОАСАОТОС ССТООААССС АОАТАОСАОС
151 СССОТСААСС ССЗСОАСТССА САССАССАСА СССТССАААС АААОСААСАА
201 СААОТАСОС6 ОССАССЛССТ АССТОАОССТ САСОССТСЛО САСТССААСТ
251 СССАСАСААС СТАСАОСТОС САССТСАССС АТСААСОСАС САСССТССАО
301 ААСАСАСТССССССТАСА6А АТОТТСА
КЕр ГО ΝΟ: 4: аминокислотная последовательность Сь лямбда человеческого !д
ТУЬбОРКААР 8¥ТТ,ЕРР88Р. ЕТ.ОЛККЛТЕУ СЕКПЕУРОА УТУА1¥КАО88
РУКАСУЕТТТ Ρ8Κ08ΝΝΚΥΑ Λ88ΥΕ81.ΤΡΕ ОЗУК8НК8У8С ОУГНЕСКТУЕ
101 КТУАРТЕС8
8ЕО ГО ΝΟ: 5: нуклеотидная последовательность НиМаЬ-7СО8
СААСТССАСС Т6СТОСАОТС ТОС66ОАС6С ТТООТЛСЛС.С СТСАСАСОТС
ССТСАОАСТС ТССТОТССАО ССТСТ06АТТ САССТТТСАТ 6АТТАТ6ССА
101 ТССЛСТССОТ СССОСААССТ ССАОООААОО 6ССТССА6ТС ОСТСТСААСТ
151 АТТАОТТСОА АТАОТ60ТАС САТАООСТАТ ССССАСТСТО ТОААОСОССС
201 АТТСАССАТС ТССАСАОАСА АССССААСАА СТСССТСТАТ СТССАААТСА
251 АСАСТСТОАС АбСТОАОСАС АСС6ССТТОТ АТТАСТОТОС ААААОАТАТА
301 САС,ТАССОСА АСТАСТАСТА С6ОТАТ6ОАС ОТСТО6ООСС ААССЮАССАС
351 ООТСАССОТС ТССТСА
- 71 016609
8Е<} Ю ΝΟ: 6: аминокислотная последовательность Ун НиМаЬ-7С1)8.
ЕУОЬУЕЗСОС ΕΛΌΡΕ1Κ.8ΕΚΕ 8САА8ОЕТРН ЕУЛМИ\УУК.ОА РОКОЕЕ\УУ8Т
5118\νΝ8ΟΤΙΟΥ АО8УКСКГТ1 8ΚΟΝΑΚΝ8ΕΥ ЕрМКХЕК АЕП ТАЬУУСАКЫ
101 ςΥΟΝΥΥΥΟΜΟ νινσροττντν 88
8Ер ГО ΝΟ: 7: нуклеотидная последовательность Ун мышиного антитела против
ΒεΙν-1
ОАСОТТСАСС ТССА6САОТС ТОСООСАОАО СТТОТСЛЛЛС СЛСЮО6ССТС
АОТСААОТТС ТССТ0САСА6 СТТСТСОСТТ С А АС АТТА АА ОАСАССТАТА
101 ТССАСТСаОТСААОСАСАСО ССТОААСАСО СССТССАСТС ССТТС6ААОО
151 АТТ6АТССТО СОАСТСССАА ТАСТАСАТАТ САСССОААСТ ТССАСОССАА
201 ООССАСТАТА АСАССТСАСА САТССТССАА САСАОССТАС СТССААСТСА
251 ОСАОССТОАС АТСТОАС6АС АСТаСССТСТ АТТАСТОТСС ТАОТТТГАСС
301 ССаСКЗОТАТО СТСТ60АСТА СТСКЭОСТСАА ССААССТСАО ТСАСС6ТСТС
351 СТСА
Ер Ш ΝΟ: 8: аминокислотная последовательность Ун мышиного антитела против
Ββ(ν-1
ЕУРЕРОЗСАЕ ЕУКРСА8УКЕ 8СТА86ЕЫК ШУШУ/АКрН РЕрСЬЕЧУСК
ΙΟΡΑΤΟΝΤΚΥ ЕРКЕОСКЛТ1ΤΑΟΤ88ΝΤΑΥ ЬрЬЗЗЬТЗЕО ТАУУУСА8РК
10! ΡΟΥΑΕΟΥλναρ СТ8УТУ88
ЗЕр ГО ΝΟ: 9: нуклеотидная последовательность Уг НиУ1аЬ-7С1)8
ОАААТТОТОТ ТСАСАСАСТС ТССАОССАСС СТОТСТТТОТ СТССЛСЮСЮЛ
ААОАСССАСС СТСТССТССА С66ССАСТСА ОАОТСТТАСС АОСТАСТГАО
101 ССТ6СТАССА АСАСАААССТ СОССАСССТС ССАСОСТССТ САТСТАТОАТ
151 ССАТССААСА ОбОССАСТОВ САТСССАССС АСЮТТСАСТа ОСАСТООСТС
201 ТООСАСАСАС ТТСАСТСТСА ССАТСАОСАО ССТАОАСССТ СААОАТТТТО
251 САОТТТАТТА СТСТСАССАО ССТАОСААСТ СССС6АТСАС СТТС60ССАА
301 ОООАСАСОАС ТО6АОАТТАА А
8Ер ГО ΝΟ: 10: аминокислотная последовательность Уь НиМ;1Ь-7СВХ
Е1УЕК)8РЛТ Е8Е8РСЕКАТ Е8СКА8р8У8 8УЕА\УУррК1-> ΟΟΛΡΚΙ.Ι ΙΥΌ
Α8ΝΚΑΤΟ1ΡΑ ΚΡ8Ο8Ο8ΟΤΏ ΡΤΕΤΙ88ΕΕΡ ЕОГАУУ УСрр Т<8\\УРПТ6р
101 ОТКЕЕПС
- 72 016609
8Е0 ΙΟ N0: 11: нуклеотидная последовательность У[. мышиного антитела против Ββίν-1
САСАТТСТСА ТСАСССАСТС ТСАСАААТТС АТ6ТССАСАТ САОТТССАСА
САОООТСАОС ТТСАССТОСА АООССАОТСА ОСАТСТОТТТ АСТОСТОТАС
101 ССТСОТАТСА АСАААААССА ССССААТСТС СТАААСТАСТ САТТТАСТСС
151 ССАТССАССС СССОСАСТСО АСТСССТСАТ СССТТСАСАС ССАСТССАТС
201 ТОООАСАОАТ ТАТАСТСТСА ССАТСАССАО ТОТОСАООСТ ОААОАССТОО
251 САСТТТАТГА СТОТСА6САА САТТТТАОСА СТССТСССАС СТТСССТССА
301 СОСАССААОС ТСОАААТСАА А
8Εζ> ΙΠ ΝΟ: 12: аминокислотная последовательность У[. мышиного антитела против Ве(¥-1
Г>1УМГС«1ТК1 М8Т8УСИКУ8 ГТСКАЭДОУН ΙΑ V А\¥ ¥(,)()КР СССРКШУУУ
Αδτκβ,τανρϋ κρταεοκατϋ утьтвкуоа еиеаьууссо нрктрртрсс
101 ΟΤΚΙ.ΕΙΚ
8Ер Ю ΝΟ: 13: нуклеотидная последовательность области Сн человеческого 1дС4 дикого типа
ОСТ АССАССА ЛССОСССЛТС ССТСТТСССС СТСССССССТ ССТССАССАС
САССТСССАС АССАСАОССС СССТССОСТО ССТСОТСААС 6АСТАСТТСС
101 СССААССОСТ САСОСТСТСС ТСОААСТСАО ССССССТСАС САОССОСОТО
151 САСАССТТСС ССССТСТССТ АСАСТССТСА СС АСТСТ АСТ СССТС АССАС
201 ССТСОТСАСС ОТССССТССА ССАССТТСЮС САССААСАСС ТАСАССТССА
251 АСОТА ОАТСА СААОСССАОС ААСАССААОО ТОСАСААСАО АОТТОСТОАО
301 АООССАОСАС АОООАСООАС ООТОТСТССТ ООААСССАОО СТСАССССТС
351 СТОССТООАС ССАСССССЮС ТСТССАСССС САОСССАСОО САССААСССА
401 ТСССССАТСТ ОТСТССТСАС СС60А60ССТ СТСАССАССС САСТСАТОСТ
451 САОаОАОАОО ОТСТТСТССА ТПТТССАСС А6ССТССССС САСССАСАСС
501 СТСОАТОССС СТАССССАОО СССГССССАТ АСАСССССАО СТ6СТ0СССТ
551 САСАССТОСС АА0А6ССАТА ТССОССАООА СССТОССССТ САССТААССС
601 САССССАААС СССАААСТСТ ССАСТСССТС АССТСАСАСА ССТТСТСТСС
651 ТСССАСАТСТ 6А0ТААСТСС СААТСТТСТС ТСТССАОЛОТ ССАААТАТСС
701 ТСССССАТСС ССАТСАТССС САССТААССС ААСССАСССС ТСОСССТССА
751 0СТСАА6ССС, сслслсотас ССТАСАОТАС ССТССЛТССА СССАСАСЮСС
801 ССАССССССТССТСАСОСАТ ССАССТССАТ СТСТТССТСА ССАССТСАСТ
851 ТССТССОССС АССАТСАСТС ТТССТОТТСС ССССААААСС СААССАСАСТ
- 73 016609
901 СТСАТСАТСТ СССОСАСССС ТСА06ТСАСС Т6ССТС0Т06 ТС6АС0Т0А0
951 ССАООААОАС СССОАСОТСС АОТТСААСТ6 СТАСОТООАТ ООСОТССАОО
1001 Т6САТААТОС СААОАСАААО ССОСОЗОАОО АОСАОТТСАА САОСАСОТАС
1051 С0Т0Т60ТСА ОСОТССТСАС СОТССТОСАС САООАСТООС ТСААССОСАА
1101 ООАаТАСААО ТССААаОТСТ ССААСАААОС сстсссатсс ТССАТССАОА
1151 АААССАТСТС САААСССААА ОСТОООАССС АСООООТОСО АОООССАСАТ
1201 С5САСАОАОСТ САССТСООСС САСССТСТОС ССТСаОАСТО АССССТСТОС
1251 СААССТСТОТ СССТАСАООО САОССССОА6 АОССАСАООТ ОТАСАСССТС
1301 СССССАТССС АСОАООАОАТ ОАССААСААС САООТСАОСС ТСАССТСССТ
1351 ОСТСАААСОС ТТСТАССССА ОСОАСАТСОС С0Т6С.АСТ6С. САОАОСААТС
1401 ОбСАСССаОА ОААСААСТАС ААОАССАСОС СТСССОТОСТ ООАСТСССАС
1451 ОССТССТТСТ ТССТСТАСАО САООСТААСС СТССАСААСА ОСАСОТООСА
1501 ООАООООААТ ОТСТТСТСАТ ОСТССОТОАТ ОСАТСАООСТ СТОСАСААСС
1551 АСТАСАСАСА СААСАОССТС ТСССТ’ОТСТС ТОООТААА
ЙЕ() ГО ΝΟ: 14: аминокислотная последовательность области Си человеческого 1^04 дикого типа
А8ТКОР8УРР ЬАРС8К8Т8Е ЗТААЕССЬУК ΟΥΓΡΕΡνΤνδ ΙΕΝΜ,ΑΙ.ΤΚΟν
НТГРА УЬС>88 ОЬУ8Ь85УУТ УРЗЗЗЬОТКТ ΥΤΟΝνΟΗΚΡδ КГКУГЖКУЕК
101 КУОРРСРКСР АРЕЕЬаОРКУ ЕЬЕРРКРКОТ ЕМ18КТРЕУТ Ε.νννυνΚΟΕΙ)
151 ρρ.νοΕΝ\νγνο оуеушактк ρκεεογνκτυ к ννκνι,τνιι-ι Οον/ΕΝΟΚΕΥΚ
201 Ε ΚνΚΝΚΟΙ.Ι’Ε 8ΙΕΚΤΊ8ΚΑΚ СОРЕЕРрУУТ Ι,ΡΓ’ΚΟΕΕΜΤΚ ΝΟνΚΙ.ΤΕΙ.νΚ
251 ΟΕΥΡδϋΙΑνΕ ΧνΕϊΝΟΟΡΕ.ΜΝ ΥΚΤΤΡΡνΕΟδ ΠΟδΕΓΕΥΚΚΕ ΤνΟΚΚΚΛνρΡΟ
301 ΝνΕδΟβνΜΗΕ ΑΙ.ΗΝΗΥΤ0Κ8 Е8Е8ЕСК
8ΕΟ ГО ΝΟ: 15: нуклеотидная последовательность, кодирующая область Сн человеческого 1§С4 (8ЕО ГО ΝΟ: 13), мутированного в позициях 714 и 722
ОСТАОСАССА АСООСССАТС СОТСТТСССС СТСОСОСССТ ОСТССАООАО
САССТСССАО АССАСАСССО СССТОСССТС ССТСОТСААО САСТАСТГСС
101 СССААССССТ ОАССОТСТСО ТООААСТСАО ССОСССТСАС САСССОСОТО
151 САСАССТТСС СООСТОТССТ АСАОТССТСА СЮАСТСТАСТ СССТСАОСАО
201 СОТООТСАСС СТССССТССА ОСАССТТССО САСОААСАСС ТАСАССТОСА
251 АСОТАОАТСА СЛАОСССЛОС ААСАССААСО ТСОАСААСАО ΛΟ ΠΟΟΤΟΛΟ
301 аосссаосас АоаоАосоАС остстстост ооааоссасо стслассстс
351 стасстсоАс осассссоос татсслассс саосссаосс сассааооса
401 ТОССССАТСТ СТСТССТСАС ССССАОСССТ СТОАССАССС САСТСАТ6СТ
451 САСОСАОАОЗ ОТСТТСТООА ТТТТТССАСС АСЮСТССООО САОССАСАОС
501 СТООАТОССС СТАССССАОО ссстссссат асасооосао отостоссст
- 74 016609
551 САСАССТССС ААСАСССАТА ТССООСАССА СССТСССССТ ОАССТААОСС
601 САССССАААО СССАААСТСТ ССАСТСССТС АССТСАОАСА ССТТСТСТСС
651 ТСССАСАТСТ САОТААСТСС СААТСТТСТС ТСТ6САСА0Т ССАААТАТСС
701 ТСССССАТОС ССАССАТССС С6ССТААССС ААСССАСОСС ТСССССТССА
751 ССТСААООСО 6САСАООТОС ССТА0А6ТА0 ССТССАТССА ОООАСАООСС
801 ССАСССОССТ сстоасосат ссасстссат стсттсстса осасстоаот
851 тсстсассоо АССАТСАСТС ттсстоттсс ССССААААСС САА60АСАСТ
901 СТСАТСАТСТ СССССАСССС ТОАССТСАСС ТОССТСОТОС ТССАССТОАО
951 ССАСЮААОАС СССОАООТСС АОТТСААСТО 6ТАС0Т6САТ С6С0Т06АСС
1001 ТОСАТААТОС СААОАСАААО СС6СС6ОАСС АССАОТТСАА САОСАСОТАС
1051 СОТОТООТСА ОССТССТСАС СОТССТОСАС САССАСТСЮС ТОААСООСАА
1101 ООАОТАС ААС ТОСААСОТСТ ССААСАААОС ССТССССТСС ТССАТС6АОА
1151 АААССАТСТС САААСССААА 6СТСС6АССС АССССОТОСО АООСССАСАТ
1201 СЮАСАСАС6Т СА6СТС6ОСС САСССТСТСС ССТС66А6Т6 АССОСТСТСС
1251 СААССТСТСТ СССТАСАООС САССССССАС АСССАСАСОТ СТАСАСССТС
1301 СССССАТССС АООАбОАОАТ ОАССААОААС САО6ТСАССС ТОАССТСССТ
1351 ОСТСАААООС ТТСТАССССА СССАСАТСОС СОТССАОТСб ОАбАОСААТО
1401 СгССАОССООА ОААСААСТАС ААОАССАСОС СТСССОТОСТ ООАСТССОАС
1451 ООСТССТТСТ ТССТСТАСАО САСОСТААСС ОТОСАСААСА ССАСОТСССА
1501 СОАООСОААТ ОТСТТСТСАТ 6СТСС6ТСАТ ССАТОАСССТ СТОСАСААСС 1551 АСТАСАСАСА 0АА0А6ССТС ТСССТСТСТС Т66СТААА §Εζ) ГО ΝΟ: 16: аминокислотная последовательность шарнирной области Сн человеческого 1§О4
А8ТКОР8УГР ЕАРС8КЗТ8Е ЗТААЬССЬУК ОУЕРЕРУТУЗ ТОЗОАЬТЗСУ
НТРРАУЬрЗЗ ОЬУЗЬЗЗУУТ УРЗЗЗЬСТКТ ΥΤ€ΝνϋΗΚΡ3 КГКУОКНУАР ιοί ерьсорзурь ρρρκρκώτεμ кктреутсу уупузрЕОРЕ νρρΝν/γνϋαν
151 ΕνΗΝΑΚΤΚΡΚ ЕЕрР№ТУКУ УЗУЫУЬНрР Υ/ΕΝθΚΕΥΚϋΚ Υ3ΝΚΟΕΡ88Ι
201 ЕКТ18КАКСР РКЕРрУУТЬР РЗрЕЕМТКЫр УЗЬТСЬУКОР ΥΡδϋΓΑνΕΨΕ
251 8ΝΟ(2ΡΕΝΝΥΚ ТТРРУБЭЗОО бРГЬУЗКЬТУ ΟΚ3Κ\¥9Ε6Νν РЗСЗУМНЕАБ
301 НЫНУТОКЗЬЗ ьзьск
8Е(2 ГО ΝΟ: 17: аминокислотная последовательность константной области лямбдацепи человека (инвентарный номер 825751) рРКААРЗУТБ РРР88ЕЕЬрАЕЖАТЕУСиЗ ОРУРСАУТУА ^КАОЗЗРУКА
ОУЕТТТР8К9 8ΝΝΚΥΑΑ88Υ Ь8ЬТРЕ(2\УК8 НКЗУЗСрУТН ЕО8ТУЕКТУА
101 РТЕС8
- 75 016609
ЗЕр Ш N0: 18: аминокислотная последовательность константной области каппацепи человека (инвентарный номер Р01834)
ТУААРЗУЕТГ РРЗБЕрЕКЗа ТЛЗУУСЬЬКЯ ЕУРКЕАКУр'Л' КУГЖАГ.рЗОУ
ЗрЕЗ УТЕОБЗ КБЗТ УЗЬЗЗТ ЬТЬЗКАВУЕК НКУУАСЕУТН рРЬЗЗРУТК8
101 ΕΝΚΟΕΡ
ЗГ.р Ш ΝΟ: 19: аминокислотная последовательность константной области Ц61 (инвентарный номер РО1857)
А8ТКОР8УГР ЬАР85КЗТ5С СТААЕССЬУК БУЕРЕРУТУЗ «ЛЗОАЬТЗаУ
ПТЕРЛУ1.р38 СЕУЗЕЗЗУУТ УРЗЗЗЕРТрТ Υ [СУУЦНКРЗ ΝΤΚνϋΚΚνΕΡ
101 К8СВКТНТСР РСРАРЕШЗО РЗУГЬГРРКР КБТБМ18КТР еутсууубуз
151 ΗΕϋΡΕνΚΡΝΨ УУБОУЕУНБЛ ΚΤΚΡΚΕΕρΥΝ ЗТУКУУЗУЪТ УЬНОБΨίΝΟΚ
201 ΕΥΚΟΚνδΝΚΑ ЬРАР1ЕКТ18 КАКОО1ЖЕРР V ΥΤΙ_ΡΡ3Κ1>Ε МТКПрУЗЕТС
251 I УКОРУ РЗБТ ЛУЕЛУЕЗЖтрР ΕΝΝΥΚΤΤΡΡν ШЗБСтЗЕЕЕУ ЗКЫУЕЖЗКЛУ
301 ОрОМУЕЗСЗУ МНЕАЬНЫНУТ рКЗЕЗЕЗРСЖ
ЗЕр Ш ΝΟ: 20: аминокислотная последовательность константной области ЦО2 (инвентарный номер Р01859)
А8ТКОР8УРР ЬАРС8К8Т8Е ЗТААЬССЬУК ВУЕРЕРУТУЗ и'У.ЗСЛЕТЗОУ
ЕП ЕРАУЕОЗЗ ОЕУЗЕЗЗУУТ νΡ33ΝΕΟΤΟΤ УТСКУ ОНКРЗ ΝΤΚνΟΚΊΛΈΚ
101 КССУЕСРРСР ЛРРУАОРЗУТ ЕЕРРКЕКОТЪ МТЗКТТ’ЕУТС УУУБУЗНЕБР
151 ЕУОЕЖУУУОС УЕУТОАКТКР КЕЕрЕИЗТЕК. УУЗУЬТУУНр Ον,ΈΜΕΚΕΥΚΡ
201 КУЯЖОЬРАР ΙΕΚΤΤ8ΚΤΚΟ рРКЕРр УУТЬ ΡΡ8ΚΕΕΜΤΚΝ рУЗЬТСЬУКО
251 ЕУР8П1ЛУГЛУ Ε8ΝΟΡΡΕΝΝΥ КЕГРРМЕВЗ В О8ЕЕЬУ8КЬТ УЕЖЗК %'ρρθΝ
301 УГ8С8УМНЕА ЕНЕТГУТОКЗЕ ЗЕЗРРК
ЗЕр Ю ΝΟ: 21: аминокислотная последовательность константной области 1§<33 (инвентарный номер А23511)
А8ТКСР8УГР 1.АРСЗК818О СТААЬОСЬУК ВУЕРЕРУТУЗ \УОЗОАЫ'ЗОУ
ПТЕРЛУТрЗЗ ОЬУ8Ь88УУТ УРЗЗЗЕОТрТ ΥΤΡΝνΝΗΚΡΚ УТКУГЖКУЕЕ
101 КТРЬОБТТНТ СРКСРЕРК8С БТРРРСРКСР ЕРК8СБТРРР СРКСРЕРК8С
151 БТРРРСРКСР ЛРЕРЕОСтРЗ V ЕЬЕРРКРКБТ ЬМККТРЕУТ СУУУБУЗНЕБ
201 РЕУрЕКЗУУУТ) ОУЕУЕМАКТК ΡΚΙίΕΡΥΝΑΤΙ· |<УУ8У1.ТУЕЕ( рЖТЖЖЕУК
251 СКУЗЖАЬРА ΡΙΕΚ.ΤΙ8Κ.ΤΚ СОРКЕРОУУТ ЕРР8КЕЕМТК ЫрУЗЬТСЕУК
301 ОГУРЗПГАУЕ ΨΕ886<2ΡΕΝΝ УКТТРРМЬВЗ БОЗЕЕЕУЗКЕ ТУБКЗКЗУррС
351 МЕЗСЗУМНЕ ΛΓ ΗΝΚΕΤ0Κ3 Т ЗЕЗРСЖ
- 76 016609
<110> бептаЬ А/5
<120> кесотЫпапт топоуаЗепх атиЬосНез апс! тегИобг Гог рго<1исХ1оп СйегеоГ
<130> Р23-ШО
<160> 21
<170> Ρβΐβηΐΐη νβΓ5Ί0Π 3.2
<210> 1
<211> 321
<212> □ΝΑ
<213> ното зартепз
<400> 1
сдгасддъдд сТдсассагс 1дгсггса-сс 11сссдсса£ сгдагдадса д-Ндааагсг 60
ддаасгдссг сгдх^дгдгд ссгдсгдааг аасхгсгагс ссадададдс сааадгасад 120
1ддаадд1:дд агаасдсссс ссаа1сддд1 аасхсссадд ададхдхсас ададсаддас 180
адсааддаса дсассеасад ссгсадсадс ассссдасдс гдадсааадс адасхасдад 240
ааасасааад (ссасдсстд сдаад^сасс сагсадддсс гдадсЪсдсс сдхсасааад 300
адсггсааса ддддададгд ΐ 321
<210> 2 <211> 107 <212> РЯТ <213? ното зарт епз <400> 2
Агд 1 тЬг Уа1 АЗа АЗа 5 Рго Зег УаЗ РЬе 11е 10 рЬе РГО РГО Зег Азр 15 01 и
01 η йеи 1у5 зег 20 б1у ТНг АЗа $ег Уа1 25 Уа1 суз Беи Беи АЗП 30 А5П рЬе
Туг Рго Агд 35 61и АЗа 1_У5 УаЗ 63η 40 Тгр 1уз УаЗ А5р А5П 45 АЗа Ьей 01 η
5ег бЗу 50 АЗ П Зег С1п 6*1 и Зег 55 УаЗ ТНг 01 и 61п Азр 60 Зег Ьуз Азр 5ег
ТНг 65 туг вег 1еи Зег 5ег 70 тЬг ьей ТНг ьей зег 75 1У5 АЗа А$р Туг 01 и 80
ЬУ5 Н1£ 1_уз уаЗ Туг 85 АЗа Суз С1и Уа1 ТНг 90 Н15 63 η 63 у 1еи Зег 95 5ег
рго УаЗ ТНг 1_У5 100 Зег рКе А5П Агд 01 у 105 01и Су5
<210? ; 1
- 77 016609 <211> 327 <212> ΟΝΑ <213> ното зартепз
<400> 3 ассдХссХад дХсадсссаа ддсхдссссс ХсддХсасХс хдххсссдсс сХссХсХдад 60
дадсххсаад ссаасааддс сасасхддхд хдхсхсахаа дхдасххсха сссдддадсс 120
дХдасадХдд ссХддааддс адахадсадс сссдХсаадд сдддадХдда дассассаса 180
сссхссааас ааадсаасаа саадхасдсд дссадсадсх ассхдадссх дасдссхдад 240
садхддаадх сссасадаад схасадсхдс саддхсасдс ахдаадддад сассдхддад 300
аадасадХдд ссссХасада аХдХХса 327
<210> <211> <212> <213> 4 109 РКТ ногтю 5ар1еп5
<400> 4
тНг Уа1 1 Хеи 61у 61п 5 Рго Хуз А1а А1а рго зег УаТ тНг ьеи Рпе Рго
10 15
рго зег Зег СТ и 61 и хеи сТп А1а АЗП ьуз А1а тКг хеи Уа1 Суз хеи
20 25 30
11е 5ег Азр рИе Туг Рго С1у А1а УаТ ТЬг УаТ А1а Тгр ьуз А1а Азр
35 40 45
5ег 5ег Рго УаТ ьуз А1а СТ у УаТ С1и ТНг ТНг тНг Рго 5ег Ьуз 61 π
50 55 60
Зег Азп Азп ьуз туг А1а А1а Зег Зег Туг Хеи Зег Хеи ТНг Рго 61 и
65 70 75 80
<31 η Тгр Ьуз Зег ΗΊ5 Агд 5ег Туг Зег Суз 61 п УаТ ТНг Н15 61 и 61 у
85 90 95
зег тНг Уа1 сТи хуз ТЬг уаТ А1а РГО ТЬг 61 и Суз Зег
100 105
<210> 5
<211> 366
<212> ϋΝΑ
<213> Ното зар!епз
<400> 5
даадтдсадс хддхддадхс Хдддддаддс ххддхасадс схдасаддХс ссХдадасХс60 хссхдхдсад ссхсхддахх сассхххсах даххахдсса хдсасхдддх ссддсаадсх120 ссадддаадд дссХддадхд ддхсхсаасх аххадххдда ахадхддхас саХаддсХаХ180 дсддасхсхд хдаадддссд аххсассахс хссададаса асдссаадаа схсссхдхах240 сХдсаааХда асадХсХдад адсХдаддас асддссххдх аХХасХдХдс аааадаХаХа300
- 78 016609 садХасддса асХасХасХа сддХаХддас дХсХддддсс аадддассас ддхсассдхс 360 хссхса 366 <210> 6 <211> 122 <212> РКТ
<213> 1 Ното зар; 1епз
<400> ( 5
01 и 1 уа1 61 η ьеи Уа1 5 61 и 5ег 61у б!у 61 у 10 ьеи Уа1 61 п РГО Азр 15 Агд
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61 у РЬе ТЬг РЬе ΗΊ3 Азр туг
20 25 30
А1а мег Н15 35 тгр Уа1 Агд <31 п А1а 40 РГО 61 у ьу$ 61 у ьеи 45 61 и Тгр Уа1
Зег тЬг 50 11е зег тгр Азп 5ег 55 С1у тЬг 11 е 61 у туг 60 А1а А5р Зег уа1
ίγε 61 у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи 61 η мех АЗП Зег Ьеи Агд А1а <31 и Азр ТЬг А1а Ьеи Туг Туг Суз
85 90 95
А1а 1-уз Азр 11е 100 61 η туг 01 у Азп туг 105 Туг туг 61 у мех АЗр 110 Уа1 тгр
б!у 61 η б! у тЬг тЬг Уа1 тЬг ναΐ Зег Зег
115 120
<210>7 <211>354 <212> ΟΝΑ <213> Миз <400>7 даддххсадс хдсадсадьс хддддсадад сххдхдааас саддддссхс адхсаадгХд60 хссхдсасад сххсхддсхх саасатхааа дасассхаха хссасхдддх даадсададд120 ссхдаасадд дссхддадхд ддххддаадд аххдахссхд сдасхддсаа хасхадахах180 дасссдаадх Хссадддсаа ддссасХаХа асадсХдаса саХссХссаа сасадссХас240 схдсаасхса дсадссхдас ахсхдаддас асхдссдхсх аххасхдхдс хадххххадд300 ссддддХаХд схсхддасха сХддддХсаа ддаассхсад хсассдхсхс схса354 <210> 8 <211> 118 <212> РКТ <213> шиз
- 79 016609 <400> 8
б1и Уа1 1 61 и ьеи 61 η 5 61 п зег б!у А1а б1и 10 !_еи Уа1 1_У5 РГО 61у 15 А1а
зег Уа1 ьуз 1_еи 20 зег Суз ТНг А1а зег 25 61 у рНе АЗП 11е ьуз 30 АЗр ТНг
туг 11 е НТ 5 тгр νπΊ 1-У5 61 η Агд рго 61 и οΊ η 61 у ьеи 61 и тгр Уа1
35 40 45
61 у Агд 11е АЗР РГО А1а тЬг 61у А5П Т1гг Агд туг А5Р РГО суз РНе
50 55 60
с!п 61 у ьуз А1а тНг 11 е ТЬг А1а А5р ТНг Зег Зег А5П тЬг А1а туг
65 70 75 80
1_еи 61 η 1_еи Зег Зег 85 1_еи ТНг Зег 61и Аэр 90 ТНг А1а Уа1 Туг Туг 95 Суз
А1а Зег РНе Агд 100 Рго 61 у Туг А1а ьеи АЗР Туг Тгр б!у 61 η 61 у ТНг
105 110
Зег Уа1 ТНг Уа1 5ег 5ег
115
<210> 9
<211> 321
<212> ϋΝΑ
<213> Ното 5ар1еп5
<400> 9 даааМдТдТ ТдасасадТс тссадссасс схдьсгггдг сТссадддда аададссасс 60 сТХТсссдса дддссадбса дадТдТгадс адсТасТТад ссТддТасса асадааасст 120 ддссаддсгс ссаддстсст сатстатдаб дсагссааса дддссасТдд саГсссадсс 180 аддТТсадтд дсадТдддТс Тдддасадас ТГсасТсТса ссагсадсад сстададсст 240 даадаттттд садхттатта сТдТсадсад сдТадсаасТ ддссдабсас сТТсддссаа 300 дддасасдас тддадаттаа а 321 <210> 10 <211>107 <212> РВТ <213> Ното зар1епз <400>10
С1и 11е Уа1 1_еи ТНг 61η Зег Рго А1а тКг 1_еи Зег 1_еи Зег Рго С1у 15 1015
61и Агд А1а тЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег 61п 5ег Уа1 5ег Зег Туг
2530
ьеи А1а тгр 35 туг 61 η 61 п Ьуз рго ст у сТп А1а 40 РГО Агд 45 ьеи ьеи 1Те
туг Азр 50 А1а 5ег Азп Агд А1а 55 ТЬг СТ у Не Рго А1а 60 Агд РКе 5ег с! у
5ег СТу 5ег СТ у тЬг АЗр РНе ТЬг ьеи ТЙГ Не 5ег 5ег ьеи 61 и РГО
65 70 75 80
61 и Азр рЬе АТа Уа1 туг туг суз 61 п 61 п Агд 5ег А5П тгр РГО 11е
85 90 95
тЬг рЬе 61 у 61 η б1у ТЬг Агд Реи бТи 11 е иуа
100 105
<210> 11 <211> 321 <212> ΡΝΑ <213> шиз <400> 11
дасаТХдТда 1дасссадтс хсасааатхс аьдьссаса!; садххддада саддд^садс 60
гссассгдса аддссадгса ддагдгдтьт астдсгдгад ссхдд^агса асааааасса 120
дддсаатстс ссааассаст даттхасхдд дса'Ессассс ддсдсастдд адхссстдах 180
сдсхгсасад дсадгддагс тдддасадат татасгсгса ссахсадсад сдтдсаддсс 240
даадассгдд сасТЬТа«а с!д!садсаа сагтадса сТссТссдас дьтсддгдда 300
ддсассаадс 1ддаааРсаа а 321
<210> 12 <211> 107 <212> РКТ <213> шиз <400> 12
А5р 11е УаТ Μ«ΐ ТЬг 61 п Зег Н15 ЬУ5 РЬе Мег 5ег ТЬг Зег УаТ СТу
1 5 10 15
Азр Агд УаТ 5ег 20 РЬе тНг Суз ьуз АТа 25 Зег 61 п Азр УаТ РЬе 30 ТЬг АТа
Уа1 А1а тгр туг 61 п 61 п ьуз РГО сТу бТп 5ег РГО ьуз ьеи Ьеи 11 е
35 40 45
Туг тгр АТа 5ег тЬг Агд Агд ТЬг СТу УаТ РГО Азр Агд рЬе ТЬг СТу
50 55 60
Зег 61у 5ег 61 у ТЬг Азр Туг тЬг Ьеи ТЬг 11 е 5ег 5ег УаТ 61 п А1а
65 70 75 80
С1и Азр Ьеи А1а Ьеи Туг Туг Суз 61 п 61 п Н15 Рпе зег ТЬг РГО РГО
- 81 016609
тЬг РЬе <31у С1у С1у тЬг Ьуз Ьеи С1и 11е 1_уз
100105 <210>13 <211>1588 <212> ΟΝΑ <213> Ното 5артеп5 <400> 13
дсхадсасса адддсссаХс сдхсххсссс сХддсдсссХ дсхссаддад сассхссдад 60
адсасадссд сссхдддсхд ссхддхсаад дасхасххсс ссдаассддх дасддхдхсд 120
ХддаасХсад дсдсссхдас садсддсдхд сасассХХсс сддсхдхссх асадХссХса 180
ддасхсхасх сссХсадсад сдХддХдасс дХдсссХсса дсадсххддд сасдаадасс 240
хасассхдса асдхадахса саадсссадс аасассаадд хддасаадад адххддхдад 300
аддссадсас адддадддад ддХдХсгдсХ ддаадссадд схсадсссхс схдссхддас 360
дсассссддс ХдХдсадссс садсссаддд садсааддса ХдссссаХсХ дХсХссХсас 420
ссддаддссх схдассассс сасхсахдсх садддададд дхсххсхдда хххххссасс 480
аддсхссддд садссасадд сХддаХдссс сХассссадд сссхдсдсах асаддддсад 540
дХдсХдсдсХ садассХдсс аададссаХа хссдддадда сссхдссссх дассхаадсс 600
сассссааад дссааасхсх ссасхсссхс адсхсадаса ссххсхсхсс хсссадахсх 660
дадХаасХсс саахсххсхс ХсХдсададХ ссааахахдд ХсссссаХдс ссахсахдсс 720
саддхаадсс аасссаддсс хсдсссхсса дсхсааддсд ддасаддхдс ссхададхад 780
ссхдсахсса дддасаддсс ссадссдддх дсхдасдсах ссассхссах схсххссхса 840
дсассХдадХ ХссХдддддд ассаХсадхс ххссхдххсс ссссаааасс сааддасасХ 900
схсахдахсх сссддасссс ХдаддХсасд хдсдхддхдд ХддасдХдад ссаддаадас 960
сссдаддхсс адххсаасхд дхасдхддах ддсдхддадд хдсахаахдс саадасааад 1020
ссдсдддадд адсадХХсаа садсасдхас сдХдХддХса дсдХссхсас сдхссХдсас 1080
саддасхддс хдаасддсаа ддадхасаад хдсааддхсх ссаасааадд ссхсссдхсс 1140
ХссаХсдада ааассахсхс сааадссааа ддхдддассс асддддхдсд адддссасах 1200
ддасададдХ садсХсддсс сасссхсхдс ссХдддадХд ассдсхдхдс саассхсхдх 1260
сссхасаддд садссссдад адссасаддх дхасасссхд сссссахссс аддаддадаХ 1320
дассаадаас саддхсадсс хдассхдссх ддхсаааддс ххсхасссса дсдасахсдс 1380
сдхддадХдд дададсаахд ддсадссдда даасаасХас аадассасдс схсссдхдсх 1440
ддасхссдас ддсхссххсх хссхсхасад саддсхаасс дхддасаада дсаддХддса 1500
ддаддддаах дхсххсХсах дсхссдхдах дсахдаддсх схдсасаасс асхасасаса 1560
даададссхс хсссхдхсхс ХдддХааа 1588
- 82 016609 <210>14 <211>327 <212> РИТ <213> нолю зартепз <400>14
А1а Бег ТКг 1_уз 61 у Рго Бег Уа1 РНе Рго Ьеи 10 А1а Рго Суз Бег 15 лгд
1 5
Зег ТНг Бег 61 и Бег тНг А1а А1а геи 61 у суз геи Уа1 гуз Азр Туг
20 25 30
РНе Рго 61 и Рго Уа1 ТНг Уа1 Бег Тгр Азп Бег 61 у А1а геи ТКг Бег
35 40 45
61у Уа1 НТЗ ТНг РНе Рго А1а уа! геи 61 п Бег Бег 61 у геи Туг Бег
50 55 60
1_еи Зег Бег Уа1 Уа1 тНг Уа1 Рго Бег Бег Бег геи С1у тНг гуз тНг
65 70 75 80
туг ТНг Суз АЗП Уа1 85 АЗр НТ5 гуз РГО Бег 90 АЗП тКг гуз уа1 Азр 95 гуз
Агд Уа1 61 и Бег ьуэ туг 61у РГО Рго Суз Рго Бег Суз РГО А1а РГО
100 105 110
61 и РНе Ьеи 61у 61 у Рго Бег Уа1 РНе геи РНе Рго Рго гуз Рго гуз
115 120 125
А5Р ТНг 130 1_еи Мег 11е Бег Агд 135 тНг РГО 61 и Уа1 ТКг 140 Суз Уа1 Уа1 Уа1
Азр Уа1 Зег 61 п 61 и Азр Рго 61 и Уа1 61 п рНе А$П тгр туг Уа! Азр
145 150 155 160
61 у уа! 61 и уа! нтз АЗП А1а гуз тНг гуз РГО Агд 61 и 61 и 61 п РНе
165 170 175
АЗП Бег тНг Туг 180 Агд Уа1 Уа1 Бег Уа1 185 геи ТНг Уа1 геи Нт 5 190 61 п Азр
Тгр геи Азп 61 у гуз 61 и Туг гуз Суз гуз Уа1 Бег Азп гуз 61 у геи
195 200 205
Рго Зег Бег 11е 61 и гуз тЬг 11е Бег гуз А1а гуз 61 у 61 п Рго Агд
210 215 220
61 и Рго 61 п Уа1 Туг ТНг Ьеи Рго Рго Бег 61 п 61 и 61 и мег ТНг гуз
225 230 235 240
АЗП 61 п Уа1 Зег геи ТНг Суз геи Уа1 гуз 61 у РНе Туг Рго Бег Аар
- 83 016609
245 250 255
11е А1а Уа1 61 и тгр 61 и 5ег А5П 61 у 61 η Рго 61 и АЗП А5П Туг Ьуз
260 265 270
тКг тЬг РГО РГО Уа1 ьеи А$р 5ег А$р 61 у зег рпе рпе ьеи туг Зег
275 280 285
Агд Ьеи тНг Уа1 Азр ьуз 5ег Агд Тгр 61 η 61 и 61 у Азп Уа1 Рпе Зег
290 295 300
Суз Бег Уа1 мег Илз 61 и А1а |_еи ΗΊ5 АЗП ΗΊ5 туг тНг 61 п ьуз 5ег
305 310 815 320
ьеи Бег ьеи Бег ьеи 61 у Ьуз
325 <210> 15 <211> 1588 <212> ϋΝΑ <213> Ното зартепз
<400> 15 дсхадсасса адддсссахс сдхсххсссс схддсдсссх дсхссаддад сассхссдад 60
адсасадссд сссхдддсхд ссХддьсаад дасхасххсс ссдаассддх дасддХдХсд 120
гддаастсад дсдсссХдас садсддсдХд сасассХХсс сддсхдхссх асадХссХса 180
ддасхсхасх сссхсадсад сдхддхдасс дхдсссхсса дсадсххддд сасдаадасс 240
хасассхдса асдхадахса саадсссадс аасассаадд Хддасаадад адххддхдад 300
аддссадсас адддадддад ддхдхсхдсх ддаадссадд сХсадсссХс сХдссХддас 360
дсассссддс хдхдсадссс садсссаддд садсааддса хдссссахсх дхсхссхсас 420
ссддаддссх схдассассс сасхсахдсх садддададд дхсххсхдда хххххссасс 480
аддсхссддд садссасадд схддахдссс схассссадд сссхдсдсах асаддддсад 540
дхдсхдсдсх садассхдсс аададссаха Хссдддадда сссХдссссХ дассХаадсс 600
сассссааад дссааасхсх ссасхсссхс адсхсадаса ссххсхсхсс хсссадахсх 660
дадхаасхсс саахсххсхс хсхдсададх ссааахахдд хсссссахдс ссассахдсс 720
сдддхаадсс аасссаддсс ХсдсссХсса дсХсааддсд ддасаддХдс ссхададхад 780
сстдсахсса дддасаддсс ссадссдддх дсхдасдсах ссассхссах схсххссхса 840
дсассхдадх хссхдддддд ассахсадхс ххссхдххсс ссссаааасс сааддасасх 900
схсахдахсх сссддасссс хдаддхсасд хдсдхддхдд хддасдхдад ссаддаадас 960
сссдаддхсс адххсаасхд дхасдхддах ддсдхддадд Ьдсахаахдс саадасааад 1020
ссдсдддадд адсадххсаа садсасдхас сдхдхддхса дсдхссХсас сдХссхдсас 1080
саддасхддс хдаасддсаа ддадхасаад хдсааддхсх ссаасааадд ссхсссдхсс 1140
хссахсдада ааассахсхс сааадссааа ддхдддассс асддддхдсд адддссасах 1200
- 84 016609
ддасададдт садсссддсс сасссгсгдс ссгдддадгд ассдсгдгдс саассгсгдг 1260
сссгасаддд садссссдад адссасаддг дгасасссгд сссссагссс аддаддадаг 1320
дассаадаас саддгсадсс гдассхдсс! ддгсаааддс «сгасссса дсдасахсдс 1380
сдгддадтдд дададсаасд ддсадссдда даасаассас аадассасдс сгсссдтдст 1440
ддасхссдас ддсгсссхсх хссхсхасад саддс^аасс дхддасаада дсаддгддса 1500
ддаддддааг дтсггсссаг дсгссдгдаг дсагдаддсг стдсасаасс асгасасаса 1560
даададссгс гсссгдтсгс гдддгааа 1588
<210> 16 <211> 315 <212> РКТ <213> Ното эартепз <400> 16
лТа зег 1 тНг 1_уз С1у РГО бег Уа1 РНе Рго 1_еи 10 АТ а Рго Суз Зег 15 Агд
бег ТНг бег 61 и бег ТЬг А1а А1а Ьеи 61у Суз кеи Уа1 1_уз Азр Туг
20 25 30
РНе РГО 61 и РГО Уа1 ТНг Уа1 бег тгр АЗП бег СТ у А1а кеи тНг бег
35 40 45
б1у Уа1 НТ 5 тНг РНе РГО А1а Уа1 |_еи 61 η бег Зег 61у 1_еи Туг бег
50 55 60
1_еи бег бег Уа1 Уа1 ТНг Уа1 Рго бег бег бег кеи 61у ТЬг куз ТЬг
65 70 75 80
туг тНг суз АЗП Уа1 АЗр ΗΊ8 |_уз РГО бег АЗП тНг ЬУ5 Уа1 А5р кУ5
85 90 95
Агд Уа1 А1а РГО 61 и РНе 1_еи 61 у 61 у Рго бег УаТ РНе 1_еи РНе Рго
100 105 110
РГО ЬУ5 Рго 1-У5 АЗр ТЬг |_еи Μβΐ Не бег Агд ТНг Рго 61 и УаТ ТЬг
115 120 125
Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 бег 61 η 61 и Азр Рго СТи Уа1 61 η рНе АЗП
130 135 140
тгр 145 туг Уа1 АЗр 61 у Уа1 150 61 и Уа1 нтз АЗП А1а 155 ку5 тНг ьуз рго Агд 160
61 и 61 и 61 п РНе А5П бег ТЬг туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 кеи тНг Уа1
165 170 175
1.еи НТ 5 С1п Азр Тгр 1_еи А5П 61 у |_уз 61 и Туг куз Суз ьуз УаТ бег
- 85 016609
180 185 190
АЗП ьуз 61 у ьеи рго зег зег Не 61 и ьуз тНг 11 е зег ьуз А1а ьуз
195 200 205
01 у 61 η 210 Рго Агд 61 и Рго 61 π 215 Уа1 Туг тНг ьеи РГО 220 Рго Зег 61 η 61 и
61 и МеЬ ТЬг ьуз АЗП 61 η Уа1 5ег Ьеи тНг суз Ьеи Уа1 ьуз 61 у РНе
225 230 235 240
Туг Рго Зег АЗр Не А1а Уа1 61 и тгр 61 и зег АЗП 61 у 61 η Рго 61 и
245 250 255
АЗП АЗП Туг Ьуз тНг тНг РГО Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр 61 у Зег Рпе
260 265 270
рНе ьеи Туг зег Агд ьеи тНг Уа1 Азр ьуз 5ег Агд тгр 61 η 61 и 61 у
275 280 285
АЗП Уа1 РЬе Зег Суз Зег уа1 МеТ нтз 61 и А1а Ьеи Н15 АЗП НТ 5 Туг
290 295 300
тНг 61 η Ьуз Зег Ьеи Зег ьеи Зег ьеи 61 у ьуз
305 310 315
<2ΐο> : 17
<211> : 105
<212> 1 РКТ
<213> 1 ното зарт 1епз
<400> : 17
61 η Рго Ьуз А1а А1а Рго 5ег Уа1 тНг ьеи РЬе Рго РГО зег Зег 61 и
1 5 10 15
61 и ьеи 61 п А1а А5П Ьуз А1а тНг ьеи Уа1 суз Ьеи Не зег Азр РНе
20 25 30
Туг Рго 61 у А1а Уа1 тНг уа1 А1а тгр Ьуз А1а А5р Зег Зег Рго Уа1
35 40 45
ьуз А1а 61 у Уа1 61 и ТЬг тКг тНг Рго Зег ьуз 61 η 5ег А5П АЗП ьуз
50 55 60
туг А1а А1а Зег Зег туг Ьеи Зег ьеи ТЬг Рго 61 и 61 η Тгр ьуз Зег
65 70 75 80
Илз Агд 5ег туг Зег Суз 61 η УаТ тНг Нт 5 61 и 61 у Зег тКг Уа1 61 и
85 90 95
ьуз тНг Уа1 А1а рго ТНг б1и Суз 5ег
100 105
- 86 016609 <210> 18 <211> 106 <212> ΡΚΤ <213> ното зартепз <400> 18
тНг уаЗ 1 АЗа АЗа рго Зег уаЗ 5 РЬе 13е РЬе рго Рго Зег азр СЗи СЗп
10 15
Ьеи Туз Зег СЗу ТНг АЗа зег УаЗ УаЗ Суз Теи Теи Азп Азп РЬе Туг
20 25 30
Рго Агд СЗи АЗа Туз УаЗ С1 п Тгр Туз УаЗ Азр Азп АЗа Теи СЗп Зег
35 40 45
сЗу АЗП зег сЗп <31 и зег УаЗ ТЬг СЗи сЗп Азр зег туз Азр 5ег тЬг
50 55 60
Туг 5ег теи Зег зег ТЬг теи тЬг Теи зег ТУ5 АЗа АЗр Туг СЗи Туз
65 70 75 80
НТ 3 ьуз УаЗ Туг АЗа Суз бЗи УаЗ ТЬг нт 5 СЗп СЗу Теи Зег Зег Рго
85 90 95
УаЗ тЬг туз зег РЬе АЗП Агд сЗу СЗи суз
100 105
<2ΐο> : 19
<211> 330
<212> РКТ
<213> 1 Ното Бартелз
<400> : 19
АЗа зег тЬг туз СЗу РГО зег УаЗ РЬе РГО теи АЗа РГО Зег зег туе
1 5 10 15
Зег тЬг Зег сЗу СЗу ТЬг АЗа АЗа Теи СЗу суз Теи УаЗ Туз А5р Туг
20 25 30
РЬе РГО С1и РГО УаЗ тЬг УаЗ зег тгр АЗП Зег СЗу АЗа теи ТЬг Зег
35 40 45
СЗу УаЗ НТЗ ТЬг РЬе РГО АЗа УаЗ Теи СЗп зег Зег СЗу теи Туг зег
50 55 60
Теи Зег Зег УаЗ УаЗ Ткг УаЗ Рго Зег 5ег зег Теи СЗу тЬг СЗп тЬг
65 70 75 80
туг Не суз АЗП УаЗ АЗП НТЗ туз РГО зег АЗП тЬг туз УаЗ Азр туг
85 90 95
- 87 016609
гуз Уа! 61 и Рго 100 гуз Бег Суз Азр гуз 105 тКг НТЗ ТКг Суз РГО 110 Рго Су5
Рго А1а РГО 61 и геи геи б1у 61 у РГО Бег Уа! РКе геи РКе Рго Рго
115 120 125
гуз РГО гуз Азр тКг геи мег Не Бег Агд ТКг Рго 61 и уа1 ТНг СУ5
130 135 140
Уа1 уа1 Уа1 Азр уа1 Бег НТ 5 61 и АЗр РГО 61 и Уа! гуз РНе АЗП тгр
145 150 155 160
Туг νβΐ АЗр 61 у уа1 165 61 и уа! НТ 5 Азп л!а 170 гуз ТКг гуз рго Агд 175 61 и
61 и 61 η туг АЗП Бег ТКг туг дгд уа! Уа1 Бег Уа1 геи тНг Уа1 геи
180 185 190
Ηί 5 61 π Азр 195 Тгр геи АЗП 61 у гуз 200 61 и туг гуз Суз гуз 205 Уа1 Бег Азп
гуз А1а геи РГО А1а РГО 11 е 61 и гуз тКг Не Бег гу5 А1а гуз 61 у
210 215 220
61 η РГО Агд 61 и РГО б1п Уа1 туг тКг геи Рго РГО Бег Агд Авр 61 и
225 230 235 240
мег ТНг гуз Азп 61 η Уа1 Бег геи тКг суз геи Уа1 гуз 61 у РНе Туг
245 250 255
РГО Бег АЗр 11е А1а Уа1 61 и Тгр 61 и Бег АЗП 61 у 61 п РГО 61 и АЗП
260 265 270
А5П туг гуэ ТКг тНг РГО Рго Уа1 геи Азр Бег АЗр 61 у Бег РНе РНе
275 280 285
геи Туг Бег гуз геи тКг Уа1 Авр гуз Бег Агд тгр 61 п 61 η 61у Азп
290 295 300
Уа1 РНе Бег суз Бег Уа1 Мег НТ 5 61 и А1а геи НТЗ АЗП Н15 туг тНг
305 310 315 320
61 η гуз Бег геи Бег 325 геи Бег РГО 61 у гуз 330
<210> 20
<211> 326
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 20
А1а Бег ТНг гуз 61у Рго Бег Уа! РКе Рго геи А1а РГО Суз Бег Агд
- 88 016609
1 5 10 15
Зег ТЬг Зег СТи 5ег ТЬг АТа АТа кеи 61 у Суз ьеи УаТ ьуз АЗР туг
20 25 30
РЬе РГО СТ и РГО УаТ ТЬг УаТ Зег Тгр Азп Зег СТу АТа кеи ТНг бег
35 40 45
СТу Уа1 Н1 5 ТЬг РЬе РГО АТа УаТ кеи СТп Зег Зег 61 у кеи Туг бег
50 55 60
Ьеи Зег Зег УаТ УаТ ТЬг УаТ Рго Зег Зег Азп РЬе СТу ТЬг С1п тЬг
65 70 75 80
Туг ТЬг Суз АЗП Уа1 85 Азр НТВ 1_уз Рго Зег 90 Азп ТЬг ьуз УаТ Азр 95 Ьуз
тНг УаТ СТи Агд Ьуз Суз Суз УаТ СТи Суз Рго РГО Суз Рго АТа РГО
100 105 110
Рго УаТ АТа СТу Рго Зег УаТ РЬе 1_еи рИе рго РГО ьуз Рго ьуз А5Р
115 120 125
тЬг ьеи мет 1Те зег Агд тЬг РГО 61 и УаТ тЬг суз УаТ УаТ УаТ АЗР
130 135 140
УаТ Зег Нт 5 СТи А5Р Рго 61 и Уа1 61 п рЬе АЗП Тгр Туг Уа1 Азр 61 у
145 150 155 160
УаТ сТи УаТ Н1 5 А$П АТа 1_уз тЬг ьуз РГО Агд сТи сТи сТп рЬе АЗП
165 170 175
вег тЬг рЬе Агд УаТ УаТ зег УаТ ьеи тЬг УаТ УаТ Н15 61 п АЗр тгр
180 185 190
кеи АЗП сТу Ьуз СТи Туг ьуз Суз суз УаТ Зег АЗП ьуз сТу кеи Рго
195 200 205
А1а РГО 11 е 61 и |_уз тЬг 11 е зег куЗ тЬг ЬУЗ 61 у 61 п РГО Агд СТи
210 215 220
Рго сТп УаТ Туг ТЬг кеи Рго Рго зег Агд СТи СТи Ме! тЬг куз Азп
225 230 235 240
С1п УаТ Зег 1_еи ТЬг 245 Суз 1_еи УаТ ьуз СТу 250 РЬе Туг Рго Зег Азр 255 11е
АТа Уа1 СТи Тгр 260 СТи 5ег Азп СТ у СТп 265 Рго СТи Азп Азп Туг 270 1_уз ТЬг
тЬг РГО рго Мет Ьеи Азр Зег Азр СТ у Зег рЬе рЬе 1_еи Туг Зег ьуз
- 89 016609
275 280 285
Ьей ТНг УаЗ Азр 1-уз Бег Агд Тгр 61 п 61 η С1у А5П Уа1 РНе Зег суз
290 295 300
зег Уа1 мех ΗΊ 5 61 и А1а ьей ΗΊ5 АЗП ΗΊ5 туг тНг 61 η 1У5 зег ьей
305 310 315 320
зег ьей зег РГО 61 у |_у5
325 <210> 21 <211> 377 <212> РКТ
<213> Ното зарт 1еп5
<400? 21
А1а Бег тНг Ьуз 61 у РГО Бег Уа1 рНе РГО ьей А1а РГО суз Бег Агд
1 5 10 15
Бег ТНг Бег 61 у б1у ТНг А1а А1а Ьей 61у Суз Ьей Уа1 ЬУ5 Азр Туг
20 25 30
РНе Рго 61 и Рго Уа1 ТНг Уа1 Бег Тгр А5П Зег 61 у А1а Ьей ТНг Бег
35 40 45
61 у Уа1 Ηί 5 ТНг РНе РГО А1а Уа1 ьей 61 П зег Бег 61 у ьей туг Бег
50 55 60
ьей Бег зег νβΐ νβΐ тНг Уа1 РГО Бег Бег зег ьей 61 у тНг 61 η ТНг
65 70 75 80
туг тИг суз АЗП Уа1 85 АЗП НТ 5 Ьуз РГО Бег 90 А5П ТНг Ьуз Уа1 Азр 95 Ьуз
Агд Уа1 61 и Ьей Ьуз тНг РГО Ьей 61 у АЗР ТНг ТНг Нтз ТНг Суз Рго
100 105 110
Агд Суз Рго 115 61 и РГО ьуз Бег СУ5 120 АЗр ТНг РГО Рго Рго 125 Суз Рго Агд
Суз Рго 61 и Рго Ьуз Бег Суз Азр ТНг РГО РГО РГО суз РГО Агд суз
130 135 140
РГО б1и РГО ьуз Бег Су 5 АЗр тНг РГО РГО РГО СУ5 РГО Агд суз РГО
145 150 155 160
А1а РГО 61 и ьей ьей 61 у 61 у РГО Бег Уа1 РНе Ьей РНе Рго Рго Ьуз
165 170 175
РГО ьуз Азр ТНг ьей мет 11е Бег Агд ТНг Рго 61 и Уа1 ТНг Суз Уа1
180 185 190
- 90 016609
уа! Уа1 Авр Уа1 195 Бег ΗΪ 5 61 и АБр Рго 61 и Уа1 200 61 П РНе 205 Буз Тгр Туг
Уа1 АБр 210 61 у Уа1 61 и Уа1 Нт 5 215 АБП А1а БУЗ ТЬг Буз 220 Рго Агд 61 и 61 и
61 η Туг АБП 5ег ТНг РНе Агд νβΐ Уа1 Бег Уа1 Беи тНг Уа1 Беи НТ 5
225 230 235 240
61 п АБР тгр Беи АБП 245 61 у БУЗ 61 и Туг Буз 250 СуБ БУ5 Уа1 Бег АБП 255 Буз
А1а Беи РГО А1а РГО 11е 61 и Буз тНг 11 е Бег Буз ТНг Буз 61 у 61 η
260 265 270
РГО дгд 61 и РГО 61 η Уа1 Туг ТНг Беи Рго РГО Бег Агд 61 и 61 и МеБ
275 280 285
тНг Буз АБП 61 η Уа1 Бег Беи ТЬг суз Беи Уа1 Буз 61 у РНе туг Рго
290 295 300
Бег А5р 11е А1а Уа1 61 и Тгр 61 и Бег Бег 61 у 61 η Рго 61 и АБП АБП
305 310 315 320
туг А5П тНг ТНг РГО РГО МеБ Беи АБР Бег АБр 61 у Бег РНе РНе Беи
325 330 335
Туг Бег Буз ьеи ТНг Уа1 АБР БУЗ Бег Агд тгр 61 η 61 η 61 у АБП Не
340 345 350
РНе 5ег СуБ Бег Уа1 МеБ Нт 5 61 и А1а Беи НТ 5 АБП Агд РНе тНг 61 η
355 360 365
Ьу5 5ег Беи Бег Беи Бег Рго 61 у БуБ
370 375
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (29)

1. Моновалентное антитело. содержащее легкую цепь и тяжелую цепь. в котором:
a) указанная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (Уъ) области выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (Сь) области 1д и
b) указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (УН) области указанного выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (СН) области человеческого 1дС4. где аминокислотная последовательность тяжелой цепи была модифицирована таким образом. чтобы область. соответствующая шарнирной области. не содержала каких-либо остатков цистеина. способных участвовать в образовании стабильных дисульфидных связей с другими пептидами. содержащими аминокислотную последовательность. идентичную константной области (СН) человеческого 1дС4. в присутствии поликлонального человеческого 1дС или при введении в организм человека.
2. Моновалентное антитело по п.1. где область Сь представляет собой константную область легкой цепи каппа человеческого 1дС.
3. Моновалентное антитело по п.1. где область Сь представляет собой константную область легкой цепи лямбда человеческого 1дС.
4. Моновалентное антитело по любому из пп.1-3. где легкая цепь и тяжелая цепь соединены друг с другом через одну или несколько дисульфидных связей или через амидную связь.
5. Моновалентное антитело по любому из пп.1-4. где аминокислотная последовательность тяжелой цепи модифицирована таким образом. чтобы по меньшей мере один из аминокислотных остатков участка. соответствующего шарнирной области. включая любые цистеиновые остатки. был удален и/или заменен на другие аминокислотные остатки.
6. Моновалентное антитело по п.5. где тяжелая цепь представляет собой тяжелую цепь человеческого 1дС4. где аминокислотная последовательность тяжелой цепи модифицирована таким образом. чтобы тяжелая цепь содержала область СН. в которой аминокислотные остатки. соответствующие. по меньшей мере. аминокислотным остаткам 106 и 109 последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 14. были удалены.
7. Моновалентное антитело по любому из пп.5 или 6. где тяжелая цепь представляет собой тяжелую цепь человеческого 1дС4. где аминокислотная последовательность тяжелой цепи модифицирована таким образом. чтобы тяжелая цепь содержала область СН. в которой аминокислотные остатки. соответствую- 91 016609 щие, по меньшей мере, аминокислотным остаткам 99 и 110 последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 14, были удалены.
8. Моновалентное антитело по любому из пп.5-7, где удалена вся шарнирная область.
9. Моновалентное антитело по п.5, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 16.
10. Моновалентное антитело по п.5, где тяжелая цепь представляет собой тяжелую цепь человеческого ^С4, где аминокислотная последовательность тяжелой цепи модифицирована таким образом, чтобы тяжелая цепь содержала область СН, в которой аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотным остаткам 106 и 109 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 14, были заменены на аминокислотные остатки, отличные от цистеина.
11. Моновалентное антитело по любому из пп.1-10, которые связываются с мишенью, выбранной из числа VЕСЕ, сМе!, СЭ20, СЭ38, ΙΌ-8, СЭ25, СЭ74, Еса1рйаВ1, ЕсеркбоиК!, ацетилхолинового рецептора, Гак, ГакЬ, ТКА1Е, вируса гепатита, вируса гепатита С, содержащего оболочку вируса гепатита С Е2, фактора ткани, комплекса фактора ткани и фактора ^Ι, ЕСЕг, СЭ4 и СЭ28.
12. Моновалентное антитело по любому из пп.1-11, которое является моновалентной формой в присутствии поликлонального человеческого Ιβ6.
13. Моновалентное антитело по любому из пп.1-11, которое является моновалентной формой при введении человеческому существу.
14. Моновалентное антитело по любому из пп.1-13, где антитело не связывается специфически с синтетическим антигеном пептида (Туг, С1и)-А1а-Ьук.
15. Моновалентное антитело по любому из пп.1-14, где полученное моновалентное антитело является человеческим антителом.
16. Способ получения моновалентного антитела по любому из пп.1-15, включающий:
ί) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей легкую цепь указанного моновалентного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область V выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область (Съ) Ιβ, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область V выбранного антигенспецифического антитела, и указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область С|. Ι§, функционально связаны друг с другом;
и) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область VII выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область СН человеческого ^С4, где нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь, модифицирована таким образом, что область, соответствующая шарнирной области тяжелой цепи, не содержит каких-либо остатков цистеина, которые принимают участие в образовании дисульфидных связей или ковалентных или устойчивых нековалентных межцепных связей тяжелой цепи с другими пептидами, содержащими идентичную аминокислотную последовательность константной области СН человеческого ^С4, в присутствии поликлонального человеческого Ι§6 или при введении человеческому существу, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область V выбранного антигенспецифического антитела, и указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область СН указанного Ιβ64, функционально связаны друг с другом;
ϊϊΐ) обеспечение клеточной экспрессирующей системы для получения указанного моновалентного антитела;
ίν) получение указанного моновалентного антитела коэкспрессией нуклеотидных конструкций (ί) и (ίί) в клетках клеточной экспрессирующей системы (ш).
17. Способ по п.16, в котором нуклеотидные конструкции, кодирующие легкую и тяжелую цепь, присутствуют в одном и том же экспрессирующем векторе.
18. Нуклеотидная конструкция для экспрессии моновалентного антитела по любому из пп.1-15, содержащая:
ί) нуклеотидную последовательность, кодирующую область СН Ιβ64, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область СН, модифицирована таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области в указанной области СН, не содержит каких-либо остатков цистеина, способных принимать участие в образовании устойчивых дисульфидных связей с пептидами, содержащими аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности указанной области СН, в присутствии поликлонального человеческого Ι§6 или при введении человеческому существу, или ίί) нуклеотидную последовательность, комплементарную ей.
19. Нуклеотидная конструкция по п.18, где указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область антигенспецифического антитела, или последовательность, комплементарную ей.
20. Нуклеотидная конструкция по п.19, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область ^, функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей область СН, или с последовательностью, комплементарной ей.
- 92 016609
21. Клетка-хозяин, содержащая нуклеотидную конструкцию по любому из пп.18-20.
22. Способ получения моновалентного антитела по любому из пп.1-15, включающий культивирование клетки-хозяина по п.21 и извлечение и очистку моновалентных антител из клеточной культуры.
23. Иммуноконъюгат, содержащий моновалентное антитело по любому из пп.1-15, конъюгированное с лечебной молекулой.
24. Применение моновалентного антитела по любому из пп.1-15 в качестве лечебного средства.
25. Применение моновалентного антитела по любому из пп.1-15 для лечения злокачественного новообразования, расстройства клеточной пролиферации, аутоиммунного расстройства, воспалительного расстройства и/или ангиогенного расстройства, где антитела специфически связываются с заданной мишенью или эпитопом мишени, где связывание антител с указанными мишенью или эпитопом мишени эффективно при лечении указанного заболевания.
26. Применение моновалентного антитела по любому из пп.1-15 для получения фармацевтической композиции.
27. Применение по п.26, где фармацевтическую композицию используют для лечения злокачественного новообразования или воспалительного состояния.
28. Фармацевтическая композиция, содержащая моновалентное антитело по любому из пп.1-15 и один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей, разбавителей или носителей.
29. Фармацевтическая композиция по п.28, также содержащая одно или несколько других лечебных средств.
EA200801460A 2005-11-28 2006-11-28 Рекомбинантные моновалентные антитела и способы их получения EA016609B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US74040305P 2005-11-28 2005-11-28
US85247906P 2006-10-17 2006-10-17
US85261106P 2006-10-18 2006-10-18
PCT/DK2006/000669 WO2007059782A1 (en) 2005-11-28 2006-11-28 Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801460A1 EA200801460A1 (ru) 2009-02-27
EA016609B1 true EA016609B1 (ru) 2012-06-29

Family

ID=37781799

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801460A EA016609B1 (ru) 2005-11-28 2006-11-28 Рекомбинантные моновалентные антитела и способы их получения

Country Status (10)

Country Link
US (3) US10155816B2 (ru)
EP (1) EP1973576B1 (ru)
JP (3) JP5525729B2 (ru)
KR (2) KR20080090406A (ru)
AU (1) AU2006317242A1 (ru)
BR (1) BRPI0619056A2 (ru)
CA (1) CA2631184A1 (ru)
EA (1) EA016609B1 (ru)
SG (1) SG10201600950TA (ru)
WO (1) WO2007059782A1 (ru)

Families Citing this family (306)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006506317A (ja) 2002-01-11 2006-02-23 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド 治療用リソソーム酵素の送達のための酵素送達系としてのｐ９７の使用
US20070087005A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Lazar Gregory A Anti-glypican-3 antibody
EP1973576B1 (en) 2005-11-28 2019-05-15 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
WO2007068255A1 (en) 2005-12-15 2007-06-21 Genmab A/S Use of effector-function-deficient antibodies for treatment of auto-immune diseases
EP2046383B1 (en) 2006-07-04 2014-11-19 Genmab A/S Cd20 binding molecules for the treatment of copd
US20110182904A1 (en) 2006-09-05 2011-07-28 Deborah Zimmerman Antibodies to bone morphogenic proteins and receptors therefor and methods for their use
SG178712A1 (en) 2006-10-02 2012-03-29 Medarex Inc Human antibodies that bind cxcr4 and uses thereof
MX2009005776A (es) 2006-12-01 2009-06-10 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se enlazan al cd 22 y sus usos.
CL2007003622A1 (es) 2006-12-13 2009-08-07 Medarex Inc Anticuerpo monoclonal humano anti-cd19; composicion que lo comprende; y metodo de inhibicion del crecimiento de celulas tumorales.
WO2008074004A2 (en) 2006-12-14 2008-06-19 Medarex, Inc. Human antibodies that bind cd70 and uses thereof
US8465741B2 (en) * 2006-12-20 2013-06-18 Mmrglobal, Inc. Antibodies and methods for making and using them
AU2013202392B2 (en) * 2006-12-20 2016-02-25 Mmrglobal, Inc. Antibodies and methods for making and using them
EP2121745A2 (en) 2007-02-26 2009-11-25 Oxford Genome Sciences (UK) Limited Proteins
WO2008104803A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
EP2626372B1 (en) 2007-03-29 2018-03-21 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
TW200902547A (en) * 2007-04-27 2009-01-16 Genentech Inc Potent, stable and non-immunosuppressive anti-CD4 antibodies
WO2008145138A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Recombinant fucose modified monovalent half-antibodies obtained by molecular engineering
EP2167669A2 (en) * 2007-05-31 2010-03-31 Genmab A/S Transgenic animals producing monovalent human antibodies and antibodies obtainable from these animals
JP6071165B2 (ja) 2007-05-31 2017-02-01 ゲンマブ エー／エス 安定なＩｇＧ４抗体
EP2152751A1 (en) * 2007-05-31 2010-02-17 Genmab A/S Fusion or linked proteins with extended half life
WO2008145137A2 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Recombinant non glycosylated monovalent half-antibodies obtained by molecular engineering
WO2008153926A2 (en) 2007-06-05 2008-12-18 Yale University Inhibitors of receptor tyrosine kinases and methods of use thereof
US9693539B2 (en) 2007-08-10 2017-07-04 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. HCO32 and HCO27 and related examples
EP2190987B1 (en) * 2007-08-21 2012-11-14 MorphoSys AG Methods for the formation of disulphide bonds
EP2185188B1 (en) 2007-08-22 2014-08-06 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
CA2699394C (en) 2007-09-17 2020-03-24 The Regents Of The University Of California Internalizing human monoclonal antibodies targeting prostate cancer cells in situ
BRPI0817108B8 (pt) 2007-09-21 2021-05-25 Univ California composição compreendendo uma proteína de fusão, kit compreendendo a referida composição e uso da mesma.
CN106519025B (zh) 2007-09-26 2021-04-23 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
PE20140132A1 (es) 2007-09-26 2014-02-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-receptor de il-6
AU2008305851B2 (en) * 2007-09-28 2014-12-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican-3 antibody having improved kinetics in plasma
WO2009054001A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Biocon Limited A pharmaceutical composition and a process thereof
TW200944231A (en) 2007-11-30 2009-11-01 Glaxo Group Ltd Antigen-binding constructs
CN101918447B (zh) 2007-12-14 2014-06-11 布里斯托尔-米尔斯·斯奎布公司 人ox40受体的结合分子
EP2080770A1 (en) * 2008-01-21 2009-07-22 MorphoSys AG Proteinaceous binding molecules comprising purification tags
KR102469853B1 (ko) 2008-04-11 2022-11-22 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
EP2316030B1 (en) 2008-07-25 2019-08-21 Wagner, Richard W. Protein screeing methods
US9085625B2 (en) * 2008-12-03 2015-07-21 Genmab A/S Antibody variants having modifications in the constant region
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
CA2750581A1 (en) 2009-01-21 2010-07-29 Oxford Biotherapeutics Ltd. Pta089 protein
WO2010085590A1 (en) 2009-01-23 2010-07-29 Biosynexus Incorporated Opsonic and protective antibodies specific for lipoteichoic acid gram positive bacteria
CA2753332A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
CA2753287A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
CA2753263A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Glaxo Group Limited Multivalent and/or multispecific rankl-binding constructs
BRPI1009232B1 (pt) 2009-03-05 2022-05-03 E.R. Squibb & Sons, Llc. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, ou um fragmento de anticorpo, composição que os compreende, molécula de ácido nucleico, hibridoma e métodos para a preparação de um anticorpo anti-cadm1
SG10201401604VA (en) 2009-04-20 2014-08-28 Oxford Biotherapeutics Ltd Antibodies Specific To Cadherin-17
WO2010122090A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Glaxo Group Limited Fgfr1c antibody combinations
EP2470569A1 (en) 2009-10-13 2012-07-04 Oxford Biotherapeutics Ltd. Antibodies against epha10
US20120269822A1 (en) 2009-10-20 2012-10-25 Marks James D Anti-Botulinum Neurotoxin a Single Domain Antibody Antibodies
WO2011054007A1 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Oxford Biotherapeutics Ltd. Ror1 as therapeutic and diagnostic target
EP2496944A2 (en) 2009-11-05 2012-09-12 Novartis AG Biomarkers predictive of progression of fibrosis
PT2954779T (pt) * 2009-12-10 2019-05-29 Regeneron Pharma Ratinhos que produzem anticorpos de cadeia pesada
MX2012009318A (es) 2010-02-10 2012-09-07 Novartis Ag Metodos y compuestos para el crecimiento muscular.
CN103003307B (zh) 2010-03-10 2017-08-11 根马布股份公司 抗c‑MEt的单克隆抗体
WO2011127412A2 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Critical Care Diagnostics, Inc. Soluble human st-2 antibodies and assays
US9150663B2 (en) 2010-04-20 2015-10-06 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
KR20130066631A (ko) 2010-05-06 2013-06-20 노파르티스 아게 치료적 저밀도 지단백질-관련 단백질 ６ （ｌｒｐ６） 다가 항체에 대한 조성물 및 사용 방법
ES2949159T3 (es) 2010-05-06 2023-09-26 Novartis Ag Composiciones y métodos de uso para anticuerpos terapéuticos de proteína 6 relacionada con lipoproteínas de baja densidad (LRP6)
CA2800769C (en) 2010-05-27 2021-11-02 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2 epitope
AU2011257121A1 (en) 2010-05-27 2013-01-10 Genmab A/S Monoclonal antibodies against HER2
DK2580243T3 (da) 2010-06-09 2020-01-13 Genmab As Antibodies against human cd38
JP6055404B2 (ja) 2010-06-15 2016-12-27 ゲンマブ エー／エス 組織因子に対するヒト抗体薬物結合体
EP3578205A1 (en) 2010-08-06 2019-12-11 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
EP2603526A1 (en) 2010-08-13 2013-06-19 Medimmune Limited Monomeric polypeptides comprising variant fc regions and methods of use
CU24094B1 (es) 2010-08-20 2015-04-29 Novartis Ag Anticuerpos para el receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico(her3)
EP2609114B1 (en) 2010-08-24 2018-04-11 Abbott Laboratories Hiv core protein specific antibodies and uses thereof
KR101527300B1 (ko) 2010-09-09 2015-06-09 화이자 인코포레이티드 4-1ｂｂ 결합 분자
EP2614085B1 (en) 2010-09-10 2016-04-20 Apexigen, Inc. Anti-il-1 beta antibodies and methods of use
SG10201508118WA (en) 2010-09-30 2015-11-27 Agency Science Tech & Res Methods and reagents for detection and treatment of esophageal metaplasia
US20120237975A1 (en) 2010-10-01 2012-09-20 Jason Schrum Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2643351A1 (en) 2010-11-24 2013-10-02 Glaxo Group Limited Multispecific antigen binding proteins targeting hgf
JP6097702B2 (ja) 2011-03-03 2017-03-15 アペクシジェン， インコーポレイテッド 抗ｉｌ−６受容体抗体およびその使用方法
CA2827759C (en) 2011-03-10 2018-10-16 Omeros Corporation Generation of anti-fn14 monoclonal antibodies by ex-vivo accelerated antibody evolution
EP2691101A2 (en) 2011-03-31 2014-02-05 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
WO2012136552A1 (en) 2011-04-08 2012-10-11 H. Lundbeck A/S ANTIBODIES SPECIFIC TO PYROGLUTAMATED Αβ
CN103796678B (zh) 2011-04-20 2018-02-27 健玛保 针对her2的双特异性抗体
CN103796677B (zh) 2011-04-20 2019-08-16 健玛保 针对her2和cd3的双特异性抗体
EP3508500A1 (en) 2011-04-29 2019-07-10 Apexigen, Inc. Anti-cd40 antibodies and methods of use
PE20140756A1 (es) 2011-06-28 2014-07-04 Oxford Biotherapeutics Ltd Anticuerpos que se unen a bst1
ME02632B (me) 2011-06-28 2017-06-20 Oxford Biotherapeutics Ltd Terapeutski i dijagnostički cilj
WO2013003680A1 (en) 2011-06-30 2013-01-03 Genentech, Inc. Anti-c-met antibody formulations
AU2012278944B2 (en) 2011-07-05 2015-09-17 Bioasis Technologies Inc. p97-antibody conjugates and methods of use
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
EP3321281B1 (en) 2011-08-05 2019-11-27 biOasis Technologies Inc P97 fragments with transfer activity
JP5944994B2 (ja) 2011-08-12 2016-07-05 オメロス コーポレーション 抗ｆｚｄ１０モノクローナル抗体およびそれらの使用方法
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
WO2013043452A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 Eli Lilly And Company Anti-c-met antibodies
CA2850624A1 (en) 2011-10-03 2013-04-11 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
CN104114579B (zh) 2011-10-27 2020-01-24 健玛保 异二聚体蛋白的生成
TWI571473B (zh) 2011-11-02 2017-02-21 埃派斯進有限公司 抗ｋｄｒ抗體及使用方法
EP2773669B1 (en) 2011-11-04 2018-03-28 Novartis AG Low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) - half life extender constructs
BR112014012005A2 (pt) 2011-11-21 2017-12-19 Genentech Inc composições, métodos, formulação farmacêutica e artigo
WO2013079973A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Di Cara Danielle Marie Antibodies against hgf - receptor and uses
CN104159924B (zh) 2011-12-05 2018-03-16 诺华股份有限公司 表皮生长因子受体3(her3)的抗体
EP2788382A2 (en) 2011-12-05 2014-10-15 Novartis AG Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3) directed to domain ii of her3
KR20140102759A (ko) 2011-12-16 2014-08-22 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물
AU2013232114B2 (en) 2012-03-15 2018-10-18 Omeros Corporation Composition and method for diversification of target sequences
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
CA2868398A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
MX360109B (es) 2012-04-20 2018-10-23 Merus Nv Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig.
US11180572B2 (en) 2012-07-06 2021-11-23 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
JP6433424B2 (ja) 2012-07-31 2018-12-05 バイオアシス テクノロジーズ インコーポレイテッド 脱リン酸化されたリソソーム蓄積症タンパク質およびその使用方法
GB201213652D0 (en) 2012-08-01 2012-09-12 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
WO2014037419A1 (en) * 2012-09-04 2014-03-13 Vib Vzw Immunoglobulin single variable domains directed against cd74 and uses derived thereof
JP6273205B2 (ja) 2012-10-05 2018-01-31 協和発酵キリン株式会社 ヘテロダイマータンパク質組成物
CN104918957B (zh) 2012-10-30 2018-11-16 埃派斯进有限公司 抗-cd40抗体及其使用方法
JP6144355B2 (ja) 2012-11-26 2017-06-07 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 化学修飾ｍＲＮＡ
ES2664095T3 (es) 2012-12-07 2018-04-18 Pfizer Inc. Fragmentos de anticuerpos monoméricos diseñados mediante ingeniería genética
TWI693073B (zh) 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
US9856319B2 (en) 2012-12-28 2018-01-02 Abbvie Inc. Monovalent binding proteins
EP2943506B1 (en) 2013-01-10 2024-03-13 Genmab B.V. Human igg1 fc region variants and uses thereof
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
GB201302447D0 (en) 2013-02-12 2013-03-27 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
CA2902068C (en) 2013-02-28 2023-10-03 Caprion Proteomics Inc. Tuberculosis biomarkers and uses thereof
WO2014160438A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Bioasis Technologies Inc. Fragments of p97 and uses thereof
EP2970479B1 (en) 2013-03-14 2019-04-24 Novartis AG Antibodies against notch 3
WO2014144542A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Omeros Corporation Methods of generating bioactive peptide-bearing antibodies and compositions comprising the same
US20140363433A1 (en) 2013-03-15 2014-12-11 Omeros Corporation Methods of Generating Bioactive Peptide-bearing Antibodies and Compositions Comprising the Same
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
RS57840B1 (sr) 2013-03-18 2018-12-31 Biocerox Prod Bv Humanizovana anti-cd 134 (ox40) antitela i njihove upotrebe
JPWO2014189138A1 (ja) * 2013-05-23 2017-02-23 Ｉｄａｃセラノスティクス株式会社 免疫不全ウイルス感染の治療又は予防剤
US10465006B2 (en) 2013-07-05 2019-11-05 Genmab A/S Humanized or chimeric CD3 antibodies
CN105658664A (zh) * 2013-07-31 2016-06-08 美国安进公司 含有Fc的多肽的稳定化
RU2675516C2 (ru) 2013-08-02 2018-12-19 Пфайзер Инк. Anti-cxcr4 антитела и конъюгаты антитело-лекарство
US20150093399A1 (en) 2013-08-28 2015-04-02 Bioasis Technologies, Inc. Cns-targeted conjugates having modified fc regions and methods of use thereof
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
JP2016538829A (ja) 2013-10-03 2016-12-15 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 低密度リポタンパク質受容体をコードするポリヌクレオチド
SG10201800772TA (en) 2013-10-11 2018-03-28 Regeneron Pharma Metabolically optimized cell culture
CN113521016A (zh) 2013-11-21 2021-10-22 根马布股份公司 抗体-药物缀合物冻干制剂
AU2015210612B2 (en) 2014-02-03 2020-04-09 Bioasis Technologies Inc. P97 fusion proteins
JP6605482B2 (ja) 2014-02-19 2019-11-13 バイオアシス テクノロジーズ インコーポレイテッド Ｐ９７−ｉｄｓ融合タンパク質
SG11201607203XA (en) 2014-03-21 2016-09-29 Regeneron Pharma Non-human animals that make single domain binding proteins
WO2015168521A2 (en) 2014-05-01 2015-11-05 Bioasis Technologies, Inc. P97-polynucleotide conjugates
SG11201609014TA (en) 2014-05-08 2016-12-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Gpc3 -targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
US10132818B2 (en) 2014-07-08 2018-11-20 New York University Tau imaging ligands and their uses in the diagnosis and treatment of tauopathy
AU2015286569B2 (en) 2014-07-11 2021-04-15 Genmab A/S Antibodies binding AXL
EA037647B1 (ru) 2014-09-05 2021-04-27 Янссен Фармацевтика Нв Агенты, связывающиеся с cd123, и виды их применения
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
WO2016097300A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Genmab A/S Rodent bispecific heterodimeric proteins
WO2016102588A1 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Genmab A/S Method for the production of antibodies
WO2016179518A2 (en) 2015-05-06 2016-11-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate specific membrane antigen (psma) bispecific binding agents and uses thereof
WO2017002934A1 (ja) 2015-07-01 2017-01-05 中外製薬株式会社 Ｇｐｃ３標的治療剤が有効である患者に投与されるｇｐｃ３標的治療剤
JP6892431B2 (ja) 2015-07-10 2021-06-23 ゲンマブ エー／エス 癌治療用のａｘｌ特異的抗体−薬物コンジュゲート
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
GB201512215D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
GB201512203D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
WO2017023863A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Peptides and antibodies for the removal of biofilms
PT3334761T (pt) 2015-08-13 2023-08-17 Univ New York Moléculas baseadas em anticorpo seletivo para o epítopo {p}ser404 da tau e os seus usos no diagnóstico e tratamento de tauopatias
WO2017027685A2 (en) 2015-08-13 2017-02-16 New York University Antibody-based molecules specific for the truncated asp421 epitope of tau and their uses in the diagnosis and treatment of tauopathy
PE20180795A1 (es) 2015-08-17 2018-05-09 Janssen Pharmaceutica Nv Anticuerpos anti-bcma, moleculas de union a antigenos biespecificas que se unen a bcma y cd3, y uso de estos
SI3347054T1 (sl) 2015-09-11 2021-08-31 Genmab A/S Režimi doziranja konjugatov zdravil proti TF protitelesu
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
WO2017066719A2 (en) 2015-10-14 2017-04-20 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Hu specific interfering agents
CN108431042A (zh) 2015-11-02 2018-08-21 詹森药业有限公司 抗-il1rap抗体，结合il1rap和cd3的双特异性抗原结合分子及其用途
CA3006759A1 (en) 2015-11-30 2017-06-08 The Regents Of The University Of California Tumor-specific payload delivery and immune activation using a human antibody targeting a highly specific tumor cell surface antigen
JP2019505520A (ja) 2016-01-13 2019-02-28 ゲンマブ エー／エス 抗体およびその薬物コンジュゲートの製剤
TW201734049A (zh) 2016-01-22 2017-10-01 健生生物科技公司 抗－ｒｏｒ１抗體、ｒｏｒ１ ｘ ｃｄ３雙特異性抗體及使用其之方法
MA43814A (fr) 2016-03-08 2018-11-28 Janssen Biotech Inc Anticorps anti-gitr, méthodes et utilisations
EP3481868A1 (en) 2016-07-08 2019-05-15 Genmab A/S New dosage regimens for antibody drug conjugates based on anti-axl antibodies
MY197836A (en) 2016-07-12 2023-07-20 H Lundbeck As Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
CN109641959B (zh) 2016-07-14 2023-08-22 健玛保 针对cd40和cd137的多特异性抗体
TWI781108B (zh) 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
BR112019001693A2 (pt) 2016-07-29 2019-07-02 Ct Hospitalier Universitaire Toulouse anticorpos direcionados a macrófagos associados a tumores e seus usos
WO2018026969A2 (en) 2016-08-03 2018-02-08 Achaogen, Inc. Plazomicin antibodies and methods of use
CN109641965A (zh) 2016-08-15 2019-04-16 诺华股份有限公司 使用奥法木单抗治疗多发性硬化的方案和方法
US11186632B2 (en) 2016-08-16 2021-11-30 University Of Maryland, Baltimore Methods of treating cancer using bifunctional molecules that target growth factors
MA46700A (fr) 2016-11-01 2021-05-19 Genmab Bv Variants polypeptidiques et ses utilisations
KR102593669B1 (ko) 2016-11-15 2023-10-25 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 시누클레인병증의 치료를 위한 제제, 용도 및 방법
JP2020503857A (ja) 2016-12-12 2020-02-06 セファイド 自動反応カートリッジにおける統合化イムノｐｃｒ及び核酸分析
MA47019A (fr) 2016-12-16 2021-04-21 H Lundbeck As Agents, utilisations et procédés
US10364286B2 (en) 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
CA3049105A1 (en) 2017-01-04 2018-07-12 Lauren O. Bakaletz Dnabii vaccines and antibodies with enhanced activity
CN110267985B (zh) 2017-01-04 2023-05-23 H.隆德贝克有限公司 用于治疗眼科疾病的特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体
WO2018146317A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
WO2018158398A1 (en) 2017-03-02 2018-09-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies having specificity to nectin-4 and uses thereof
WO2018162749A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Genmab A/S Antibodies against pd-l1
CA3056088A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Composition and methods for disruption of bacterial biofilms without accompanying inflammation
BR112019020219A2 (pt) 2017-03-31 2020-11-24 Genmab Holding B.V. anticorpo biespecífico, anticorpo anti-cd37, composição farmacêutica, uso do anticorpo biespecífico, do anticorpo anti-cd37 ou da composição farmacêutica, método para induzir a morte celular, ou inibir o crescimento e/ou a proliferação de uma célula tumoral que expressa cd37, método de tratamento, construto de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, anticorpo anti-idiotípico, e, método in vitro para detectar a presença de um antígeno cd37 humano ou uma célula que expressa cd37 humano.
JP2020517638A (ja) 2017-04-20 2020-06-18 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド 肺の炎症を治療するための組成物および方法
AU2018304173A1 (en) 2017-07-17 2020-01-30 Janssen Biotech, Inc. Antigen binding regions against fibronectin type III domains and methods of using the same
US10894833B2 (en) 2017-07-20 2021-01-19 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods for treatment
US11174322B2 (en) 2017-07-24 2021-11-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies and peptides to treat HCMV related diseases
MX2020001198A (es) 2017-08-04 2020-09-07 Genmab As Agentes de union que se unen a ligando 1 de muerte programada (pd-l1) y grupo de diferenciacion 137 (cd137) y uso de los mismos.
CN111511762A (zh) 2017-08-21 2020-08-07 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
JP2021510740A (ja) 2018-01-24 2021-04-30 ゲンマブ ビー．ブイ． ポリペプチド変種およびそれらの用途
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
JP7326345B2 (ja) 2018-02-09 2023-08-15 ジェンマブ アクティーゼルスカブ Ｃｄ３及びｃｄ２０に対する二重特異性抗体を含む医薬組成物及びそれらの使用
MA52152A (fr) 2018-03-12 2021-01-20 Genmab As Anticorps
EP3774904A1 (en) 2018-04-10 2021-02-17 Genmab A/S Axl-specific antibodies for cancer treatment
CA3098486A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
MA52951A (fr) 2018-06-22 2021-04-28 Genmab Holding B V Anticorps anti-cd37 et anticorps anti-cd20, compositions et méthodes d'utilisation de ceux-ci
AU2019297451A1 (en) 2018-07-03 2021-01-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
SG11202012993SA (en) 2018-07-13 2021-02-25 Genmab As Variants of cd38 antibody and uses thereof
JP2021526845A (ja) 2018-07-13 2021-10-11 ゲンマブ エー／エス Ｃｄ３８抗体を使用したトロゴサイトーシスを介した治療
EP3813867A1 (en) 2018-07-22 2021-05-05 Bioasis Technologies Inc. Treatment of lymmphatic metastases
TW202021618A (zh) 2018-08-17 2020-06-16 美商２３與我有限公司 抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法
US20220047701A1 (en) 2018-09-10 2022-02-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combination of her2/neu antibody with heme for treating cancer
KR20210062051A (ko) 2018-09-19 2021-05-28 라바 테라퓨틱스 비.브이. 이중 작용 CD1d 면역글로불린
US20210393793A1 (en) 2018-09-26 2021-12-23 Genmab A/S Axl-specific antibodies for treatment of non-small cell lung cancer
MA53812A (fr) 2018-10-04 2021-08-11 Genmab Holding B V Compositions pharmaceutiques comprenant des anticorps anti-cd37 bispécifiques
JP2022512580A (ja) 2018-10-05 2022-02-07 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 細菌バイオフィルムの酵素的破壊のための組成物および方法
SG11202103124WA (en) 2018-10-23 2021-04-29 Glycardial Diagnostics S L Antibodies specific for glycosylated apoj and uses thereof
US20210388084A1 (en) 2018-10-25 2021-12-16 Polpharma Biologics Utrecht B.V. Anti-human cd89 antibodies and uses thereof
CA3118397A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Shandong Newtime Pharmaceutical Co., Ltd. Bispecific antibody targeting cd3 and bcma, and uses thereof
CN113454111A (zh) 2018-11-06 2021-09-28 健玛保 抗体配制剂
AR117327A1 (es) 2018-12-20 2021-07-28 23Andme Inc Anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
WO2020126600A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Sapreme Technologies B.V. Antibody-drug conjugate with improved therapeutic window
JP2022514950A (ja) 2018-12-21 2022-02-16 ２３アンドミー・インコーポレイテッド 抗ｉｌ－３６抗体およびその使用方法
JP2022519082A (ja) 2019-02-01 2022-03-18 ラヴァ・セラピューティクス・ベー・フェー 新規ｃｄ４０結合抗体
NL2022494B1 (en) 2019-02-01 2020-08-19 Lava Therapeutics B V Novel CD40-binding antibodies
EP3733707A1 (en) 2019-04-30 2020-11-04 Celyad S.A. Car t-cells targeting bcma and uses thereof
EP3966241A1 (en) 2019-05-09 2022-03-16 Genmab B.V. Dosage regimens for a combination of anti-dr5 antibodies for use in treating cancer
AU2020311897A1 (en) 2019-07-08 2022-02-03 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Antibody compositions for disrupting biofilms
US20220275069A1 (en) 2019-07-12 2022-09-01 Janssen Pharmaceutica Nv Binding agents and uses thereof
WO2021013746A1 (en) 2019-07-19 2021-01-28 Genmab A/S Axl antibody-drug conjugates for use in treating cancer
US20220249674A1 (en) 2019-07-25 2022-08-11 Sapreme Technologies B.V. Bioactive saponin linked to a functional moiety
US20220411505A1 (en) 2019-08-15 2022-12-29 Genmab A/S Pharmaceutical compositions comprising bispecific antibodies directed against cd3 and cd20 and their uses
WO2021048423A1 (en) 2019-09-12 2021-03-18 Genmab A/S Bispecific antibodies binding to 5t4 and cd3 for use in treatment of cancer
AU2020344675A1 (en) 2019-09-13 2022-03-31 Elektrofi, Inc. Compositions and methods for the delivery of therapeutic biologics for treatment of disease
EP3792283A1 (en) 2019-09-16 2021-03-17 Lava Therapeutics B.V. Treatment of cancer comprising administration of vgamma9vdelta2 t cell receptor binding antibodies
WO2021058729A1 (en) 2019-09-27 2021-04-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-müllerian inhibiting substance type i receptor antibodies and uses thereof
US20220324962A1 (en) 2019-09-27 2022-10-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-müllerian inhibiting substance antibodies and uses thereof
EP4055046A1 (en) 2019-11-06 2022-09-14 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
WO2021116119A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies having specificity to her4 and uses thereof
US20230052646A1 (en) 2019-12-24 2023-02-16 Jjp Biologics Sp. Z O.O. Anti-Human Hvem (TNFRSF14) Antibodies And Uses Thereof
WO2021144457A1 (en) 2020-01-16 2021-07-22 Genmab A/S Formulations of cd38 antibodies and uses thereof
WO2021155916A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 BioNTech SE Treatment involving antigen vaccination and binding agents binding to pd-l1 and cd137
US20230087164A1 (en) 2020-02-04 2023-03-23 Genmab A/S Antibodies for use in therapy
CR20220521A (es) 2020-03-18 2023-01-23 Genmab As Anticuerpos
JP2023523919A (ja) 2020-04-21 2023-06-08 ジェイジェイピー バイオロジクス エスピー．ゼット オー．オー． ヒト化抗ヒトｃｄ８９抗体及びその使用
MX2022013173A (es) 2020-04-24 2022-11-30 Hoffmann La Roche Modulacion de enzimas y vias con compuestos de sulfhidrilo y sus derivados.
KR20230008775A (ko) 2020-05-08 2023-01-16 젠맵 에이/에스 Cd3 및 cd20에 대한 이중특이적 항체
CA3182697A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma
EP4149558A1 (en) 2020-05-12 2023-03-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New method to treat cutaneous t-cell lymphomas and tfh derived lymphomas
BR112022024339A2 (pt) 2020-05-29 2022-12-27 23Andme Inc Anticorpos anti cd200r1 e métodos de uso dos mesmos
CN116234824A (zh) 2020-06-22 2023-06-06 阿尔米雷尔有限公司 抗il-36抗体及其使用方法
AU2021305396A1 (en) 2020-07-08 2023-02-09 LAVA Therapeutics N.V. Antibodies that bind PSMA and gamma-delta t cell receptors
EP3939999A1 (en) 2020-07-14 2022-01-19 Fundación del Sector Público Estatal Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas Carlos III (F.S.P. CNIO) Interleukin 11 receptor alpha subunit (il11ra) neutralizing antibodies and uses thereof
US20230293680A1 (en) 2020-07-23 2023-09-21 Genmab B.V. A composition of anti-dr5 antibodies and an immunomodulatory imide drug for use in treating multiple myeloma
EP4192859A1 (en) 2020-08-06 2023-06-14 BioNTech SE Binding agents for coronavirus s protein
EP4192511A1 (en) 2020-08-07 2023-06-14 Fortis Therapeutics, Inc. Immunoconjugates targeting cd46 and methods of use thereof
EP4208200A2 (en) 2020-09-02 2023-07-12 Genmab A/S Antibody therapy
CN116437956A (zh) 2020-09-10 2023-07-14 健玛保 用于治疗慢性淋巴细胞白血病的针对cd3和cd20的双特异性抗体
JP2023541860A (ja) 2020-09-10 2023-10-04 ジェンマブ エー／エス びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫を治療するための併用療法におけるｃｄ３及びｃｄ２０に対する二重特異性抗体
US20230357440A1 (en) 2020-09-10 2023-11-09 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
EP4210744A1 (en) 2020-09-10 2023-07-19 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
JP2023542092A (ja) 2020-09-10 2023-10-05 ジェンマブ エー／エス びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫を治療するための併用療法におけるｃｄ３及びｃｄ２０に対する二重特異性抗体
BR112023004351A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar linfoma folicular em um sujeito humano
MX2023002901A (es) 2020-09-14 2023-06-01 Ichnos Sciences SA Anticuerpos que se unen a la proteína auxiliar del receptor de interleucina-1 (il1rap) y usos de estos.
TW202227478A (zh) 2020-09-15 2022-07-16 德商拜恩迪克公司 對細胞靶向遞送的藥劑及方法
EP4221742A1 (en) 2020-10-02 2023-08-09 Genmab A/S Antibodies capable of binding to ror2 and bispecific antibodies binding to ror2 and cd3
JP2023551980A (ja) 2020-12-07 2023-12-13 ジェンマブ エー／エス 抗体およびタキソンの併用療法
EP4259660A1 (en) 2020-12-10 2023-10-18 LAVA Therapeutics N.V. Antibodies that bind gamma-delta t cell receptors
WO2022148414A1 (zh) 2021-01-08 2022-07-14 北京韩美药品有限公司 特异性结合pd-l1的抗体及其抗原结合片段
WO2022148412A1 (zh) 2021-01-08 2022-07-14 北京韩美药品有限公司 特异性结合cd47的抗体及其抗原结合片段
CN116710482A (zh) 2021-01-08 2023-09-05 北京韩美药品有限公司 特异性结合4-1bb的抗体及其抗原结合片段
GB202100754D0 (en) 2021-01-20 2021-03-03 Coding Bio Ltd Methods for high throughput screening of chimeric antigen receptors
EP4281566A1 (en) 2021-01-20 2023-11-29 Coding Bio Limited Methods for high throughput screening of chimeric antigen receptors
US11639396B2 (en) 2021-02-16 2023-05-02 Janssen Biotech, Inc. Antibody binding to a linker peptide
CR20230398A (es) 2021-02-16 2023-11-15 Janssen Pharmaceutica Nv Anticuerpo triespecífico dirigido a bcma, gprc5d, y cd3
EP4298125A1 (en) 2021-02-26 2024-01-03 LAVA Therapeutics N.V. Antibodies that bind cd123 and gamma-delta t cell receptors
AU2022233547A1 (en) 2021-03-09 2023-09-28 BioNTech SE Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in therapy
WO2022189667A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Genmab A/S Non-activating antibody variants
AU2022244114A1 (en) 2021-03-24 2023-11-09 Janssen Biotech, Inc. TRISPECIFIC ANTIBODY TARGETING CD79b, CD20, AND CD3
BR112023020832A2 (pt) 2021-04-08 2023-12-19 Marengo Therapeutics Inc Moléculas multifuncionais ligadas a tcr e seus usos
KR20240004949A (ko) 2021-05-07 2024-01-11 젠맵 에이/에스 B7h4 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체를 포함하는 제약 조성물
WO2022256840A2 (en) 2021-06-04 2022-12-08 Elektrofi, Inc. Methods for screening particle formulations comprising proteins
EP4351633A1 (en) 2021-06-08 2024-04-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Agents and methods for activation and targeting of immune effector cells
BR112023027006A2 (pt) 2021-06-21 2024-03-12 BioNTech SE Método para reduzir ou prevenir a progressão de um tumor ou tratar um câncer em um sujeito, e, agente de ligação
AU2022312698A1 (en) 2021-07-13 2024-01-25 BioNTech SE Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in combination therapy for cancer
IL309495A (en) 2021-07-15 2024-02-01 BioNTech SE Agents encoding CLDN6 and CD3 binding elements for the treatment of CLDN6-positive cancer
WO2023023227A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating sickle cell disease or beta thalassemia using complement alternative pathway inhibitors
WO2023023220A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating sickle cell disease or beta thalassemia using a complement alternative pathway inhibitor
US20230109496A1 (en) 2021-09-06 2023-04-06 Genmab B.V. Antibodies capable of binding to cd27, variants thereof and uses thereof
CA3233512A1 (en) 2021-10-06 2023-04-13 Alexander Muik Multispecific binding agents against pd-l1 and cd137 in combination with anti pd-1 antibodies for treating cancers
WO2023057534A1 (en) 2021-10-06 2023-04-13 Genmab A/S Multispecific binding agents against pd-l1 and cd137 in combination
US11814437B2 (en) 2021-10-08 2023-11-14 Genmab A/S Antibodies binding to CD30 and CD3
WO2023067138A1 (en) 2021-10-21 2023-04-27 LAVA Therapeutics N.V. Uses of gamma delta t cell activating antibodies
WO2023083439A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 BioNTech SE Tlr7 agonist and combinations for cancer treatment
GB202116514D0 (en) 2021-11-16 2021-12-29 Coding Bio Ltd Computational methods for the design and optimisation of chimeric antigen receptors (cars)
US20230303693A1 (en) 2022-01-28 2023-09-28 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
US20230241211A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
WO2023148275A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 BioNTech SE Cyclic epitope tags
WO2023148276A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 BioNTech SE Agents and methods for targeted delivery to cells
WO2023148277A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 BioNTech SE Agents and methods for targeted delivery of nucleic acids to cells
EP4238988A1 (en) 2022-03-01 2023-09-06 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Antibodies against sars-cov-2 and uses thereof
WO2023174521A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Genmab A/S Binding agents binding to epcam and cd137
WO2023175171A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Bk polyomavirus antibodies and uses thereof
WO2023186905A1 (en) 2022-03-29 2023-10-05 LAVA Therapeutics N.V. A method of treating a hematological cancer following screening for cd1d positive tumor cells
WO2023198839A2 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
WO2023212721A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Elektrofi, Inc. Injectable suspensions
WO2023218046A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023218051A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
EP4285926A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 LAVA Therapeutics N.V. Combination treatment for chronic lymphocytic leukemia
EP4292609A1 (en) 2022-06-15 2023-12-20 LAVA Therapeutics N.V. Compositions comprising antibodies that bind gamma-delta t cell receptors
EP4292610A1 (en) 2022-06-15 2023-12-20 LAVA Therapeutics N.V. Variant antibodies that bind gamma-delta t cell receptors
NL2032398B1 (en) 2022-07-06 2024-01-23 Academisch Ziekenhuis Leiden Bispecific antibody and uses thereof
WO2024028325A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 BioNTech SE Nucleic acid compositions comprising amphiphilic oligo ethylene glycol (oeg)-conjugated compounds and methods of using such compounds and compositions
WO2024049951A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of fusion polypeptides for treatment of sickle cell disease
WO2024052503A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies having specificity to ltbp2 and uses thereof
WO2024056668A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale New anti-itgb8 antibodies and its uses thereof
GB202214132D0 (en) 2022-09-27 2022-11-09 Coding Bio Ltd CLL1 binding molecules

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005023872A1 (en) * 2003-09-10 2005-03-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against interleukin-1 receptor and uses thereof
WO2005063816A2 (en) * 2003-12-19 2005-07-14 Genentech, Inc. Monovalent antibody fragments useful as therapeutics

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6046310A (en) * 1996-03-13 2000-04-04 Protein Design Labs., Inc. FAS ligand fusion proteins and their uses
EP0953639A1 (en) * 1998-04-30 1999-11-03 Boehringer Ingelheim International GmbH FAPalpha-specific antibody with improved producibility
IL141061A0 (en) * 1998-08-10 2002-02-10 Urogenesys Inc Bpc-1 a secreted brain specific protein expressed and sectreted by prostate and bladder cancer cells
EP2341060B1 (en) 2000-12-12 2019-02-20 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7754208B2 (en) * 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) * 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
AU2002241922B2 (en) * 2001-01-17 2007-10-25 Aptevo Research And Development Llc Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7300916B2 (en) 2001-02-27 2007-11-27 Yoshiko Yasuda Preventives/remedies for thickened scar, keloid or chronic arthritic diseases
US7595378B2 (en) 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
US20020197694A1 (en) 2001-06-20 2002-12-26 Weiping Shao Conjugates of reduced antibodies and biomolecules
US7053202B2 (en) * 2001-10-19 2006-05-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin DNA cassette molecules, monobody constructs, methods of production, and methods of use therefor
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
CN1856324A (zh) 2002-09-17 2006-11-01 Gtc生物治疗学公司 缺乏重链间二硫键的免疫球蛋白分子的分离
US7608429B2 (en) 2002-10-31 2009-10-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for increasing antibody production
AU2003295471B2 (en) 2002-11-15 2011-08-25 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD25
CA2520254A1 (en) * 2003-03-26 2004-10-07 Apogenix Gmbh Treatment of viral infections
DK1629088T3 (da) * 2003-05-30 2012-05-07 Agensys Inc Varianter af prostatastamcelleantigen (psca) og undersekvenser deraf
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
US20060134105A1 (en) * 2004-10-21 2006-06-22 Xencor, Inc. IgG immunoglobulin variants with optimized effector function
WO2005063815A2 (en) 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
EP1682584B1 (en) * 2003-11-13 2013-04-17 Hanmi Science Co., Ltd. A pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin fc region as a carrier
US20080318212A1 (en) 2004-04-06 2008-12-25 Wilson Cindy A Orphan Receptor Tyrosine Kinase as a Target in Breast Cancer
CN101124248A (zh) 2004-08-11 2008-02-13 特鲁比昂药品公司 结合域融合蛋白
US20060074225A1 (en) 2004-09-14 2006-04-06 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin Fc domains
US8911726B2 (en) 2004-09-22 2014-12-16 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Stabilized human Igg4 antibodies
CN101312748A (zh) 2005-09-26 2008-11-26 梅达莱克斯公司 抗体-药物轭合物和使用方法
TW200732350A (en) 2005-10-21 2007-09-01 Amgen Inc Methods for generating monovalent IgG
EP1973576B1 (en) 2005-11-28 2019-05-15 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
WO2007068255A1 (en) 2005-12-15 2007-06-21 Genmab A/S Use of effector-function-deficient antibodies for treatment of auto-immune diseases
EP2152751A1 (en) 2007-05-31 2010-02-17 Genmab A/S Fusion or linked proteins with extended half life
WO2008145137A2 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Recombinant non glycosylated monovalent half-antibodies obtained by molecular engineering

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005023872A1 (en) * 2003-09-10 2005-03-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against interleukin-1 receptor and uses thereof
WO2005063816A2 (en) * 2003-12-19 2005-07-14 Genentech, Inc. Monovalent antibody fragments useful as therapeutics

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AALBERSE R.S. ET AL.: "IgG4 breaking the rules", IMMUNOLOGY, BLACKWELL PUBLISHING, OXFORD, GB, vol. 105, no. 1, 2002, pages 9-19, XP002987706, ISSN: 0019-2805, the whole document *
BERNIER G.M. ET AL.: "STRUCTURAL AND BIOSYNTHETIC STUDIES OF A HUMAN IGA HALF MOLECULE", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, WILLIAMS & WILKINS CO, US, vol. 119, no. 4, October 1977 (1977-10), pages 1260-1265, XP009080021, ISSN: 0022-1767, the whole document *
BREKKE O.H. ET AL.: "ACTIVATION OF COMPLEMENT BY AN IGG MOLECULE WITHOUT A GENETIC HINGE", NATURE, NATURE PUBLISHING GROUP, LONDON, GB, vol. 363, no. 6424, 17 June 1993 (1993-06-17), pages 628-630, XP000196003, ISSN: 0028-0836, the whole document *
HORGAN CAROL ET AL.: "Studies on antigen binding by intact and hinge-deleted chimeric antibodies", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 150, no. 12, 1993, pages 5400-5407, XP002423580, ISSN: 0022-1767, the whole document *
SPIEGELBERG H.L. ET AL.: "HUMAN MYELOMA IMMUNO GLOBULIN G HALF MOLECULES STRUCTURAL AND ANTIGENIC ANALYSES", BIOCHEMISTRY, vol. 14, no. 10, 1975, pages 2157-2163, XP002423581, ISSN: 0006-2960, the whole document *
SPIEGELBERG H.L. ET AL.: "IMMUNO GLOBULIN HALF MOLECULES CLINICAL AND IMMUNOLOGIC FEATURES IN A PATIENT WITH PLASMA CELL LEUKEMIA", BLOOD, vol. 45, no. 3, 1975, pages 305-313, XP002423582, ISSN: 0006-4971, the whole document *
TAN L.K. ET AL.: "INFLUENCE OF THE HINGE REGION ON COMPLEMENT ACTIVATION, C1Q BINDING, AND SEGMENTAL FLEXIBILITY IN CHIMERIC HUMAN IMMUNOGLOBULINS", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, WASHINGTON, DC, US, vol. 87, no. 1, January 1990 (1990-01), pages 162-166, XP002050454, ISSN: 0027-8424, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
JP6039542B2 (ja) 2016-12-07
US20220396629A1 (en) 2022-12-15
EP1973576B1 (en) 2019-05-15
US20090226421A1 (en) 2009-09-10
JP2009517006A (ja) 2009-04-30
KR20150041197A (ko) 2015-04-15
EA200801460A1 (ru) 2009-02-27
US20190169298A1 (en) 2019-06-06
BRPI0619056A2 (pt) 2011-09-20
AU2006317242A1 (en) 2007-05-31
EP1973576A1 (en) 2008-10-01
WO2007059782A1 (en) 2007-05-31
KR101866623B1 (ko) 2018-07-04
KR20080090406A (ko) 2008-10-08
JP5525729B2 (ja) 2014-06-18
SG10201600950TA (en) 2016-03-30
US10155816B2 (en) 2018-12-18
CA2631184A1 (en) 2007-05-31
JP2014128266A (ja) 2014-07-10
JP2016182138A (ja) 2016-10-20
JP6341954B2 (ja) 2018-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA016609B1 (ru) Рекомбинантные моновалентные антитела и способы их получения
US20210206829A1 (en) Treatment of cd47+ disease cells with sirp alpha-fc fusions
US11485782B2 (en) Anti-claudin 18.2 antibodies
ES2221045T3 (es) Anticuerpos humanizados anti-cd11a.
KR101348472B1 (ko) Ｃｄ20에 대한 인간 모노클로날 항체
EA013677B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение
CN108884160A (zh) 抗ror1抗体
CN110382535A (zh) 抗-gpr20抗体以及抗-gpr20抗体-药物缀合物
EA027071B1 (ru) АНТИТЕЛО К ActRIIB И СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО КОМПОЗИЦИЯ
KR102323960B1 (ko) 항-pd-l1 항체 및 이의 용도
TW201828991A (zh) 用於移除造血幹細胞的抗體藥物結合物
CN110156893A (zh) 抗cd3抗体及使用方法
EA020465B1 (ru) ИЗОЛИРОВАННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ErbB3, НАБОРЫ И КОМПОЗИЦИИ, ИХ СОДЕРЖАЩИЕ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CN106459201A (zh) 结合人和食蟹猴CD3ε的抗体
CN111378043B (zh) 一种具有中和作用的人鼠嵌合抗Siglec-15全分子IgG及其制备方法和应用
EA016245B1 (ru) Антитела против альфа2-интегрина и их применение
CN109311997A (zh) 抗axl拮抗抗体
CN107849135A (zh) 与分拣蛋白结合并抑制颗粒蛋白前体的结合的抗体
CN114981301A (zh) Pd1和vegfr2双结合剂
CN113348182B (zh) Lag-3抗体及其医药用途
CN116113433A (zh) 结合人cd38的抗体、其制备方法和用途
CN111205370A (zh) 抗ptn抗体在抑制白血病干细胞以及治疗慢性粒细胞白血病中的应用
CN114874330B (zh) 靶向单链抗体的中和性单克隆抗体
WO2023138638A1 (zh) 抗tigit和pd-l1的双特异性抗原结合蛋白及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU