CN110382535A - 抗-gpr20抗体以及抗-gpr20抗体-药物缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明解决了提供以下的问题：特异性结合GPR20阳性肿瘤细胞(如GIST)的抗体，其中使用所述抗体的药物，具有针对肿瘤的治疗作用的药物；和其中使用所述药物产品治疗肿瘤的方法。提供了具有内化活性的抗‑GPR20抗体，和含有所述抗体的抗体‑药物缀合物。

Description

抗-GPR20抗体以及抗-GPR20抗体-药物缀合物
技术领域
本发明涉及结合GPR20并具有内化效果的抗-GPR20抗体，产生所述抗-GPR20抗体的方法、包含所述抗体的抗体-药物缀合物、包含所述抗体-药物缀合物的抗肿瘤剂等。
背景技术
癌症在死亡原因中排名很高。尽管预计癌症患者的数量随着人口老龄化而增加，但治疗需求尚未获得充分满足。常规化疗剂的问题在于：由于它们的低选择性，这些化疗剂不仅对肿瘤细胞是毒性的，而且对正常细胞也是毒性的，并从而产生不良反应；并且化疗剂不能以足够的量施用，并且因此不能充分产生其效果。因此，近年来，已经开发了更高选择性的分子靶向药物或抗体药物，其靶向展示出癌细胞的突变或高表达特征的分子，或靶向参与细胞恶性转化的特定分子。
胃肠道间质瘤(GIST)是在从食道到直肠和肠系膜的胃肠道中发展的间充质肿瘤，并且据报道其发病率为每年每100,000人中1至2人(非专利文献1)。在大约86％的GIST患者中发现受体酪氨酸激酶KIT或PDGFRA中的活化突变，并且这些突变有助于肿瘤细胞的增殖。GIST治疗是基于手术切除。同时，对于不可切除和进行性或转移性GIST，开具酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，如伊马替尼、舒尼替尼或瑞格非尼(非专利文献2)。这些TKI通常对具有上述突变的GIST表现出显著的功效，但需要连续施用。此外，在许多情况下，GIST不能通过TKI完全根除，并且其由于靶KIT或PDGFRA中的二次突变、RAS，BRAF等中的活化突变，以及其他信号传导途径的活化而最终变成对药物无应答，从而导致疾病进展。此外，这些TKI很少对发现在KIT或PDGFRA中没有突变的野生型GIST表现出治疗效果(非专利文献3)，尽管此类野生型GIST仅在少数病例中出现。因此，需要开发对TKI-抗性GIST有效的治疗方法。
GPR20 (G蛋白偶联受体20)是由358个氨基酸构成的七跨膜蛋白，其属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族的A类，并且该蛋白具有N末端细胞外结构域和C末端细胞内结构域。人GPR20基因于1997年首次克隆(非专利文献4)。随后发现其推定的氨基酸序列与2008年由另一研究人员克隆的人GPR20基因编码的氨基酸序列部分不同(非专利文献5)。目前，后一序列(其与人完整基因组序列分析的NCBI数据库中登记的序列相同)作为编码人GPR20的DNA序列，连同其氨基酸序列公开在公共数据库中。DNA序列和氨基酸序列可以参考例如登录号NM_005293和NP_005284 (NCBI)。
GPR20具有与GPCR家族类似的氨基酸序列，GPCR家族的成员识别核苷酸或脂质。然而，尚未鉴定GPR20的生理功能和体内配体。根据其中GPR20在HEK293细胞中外源表达的实验，已经报道GPR20在没有配体刺激的条件下组成型活化Gi三聚体G蛋白(非专利文献5)。
已经证实GPR20在心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、直肠和白细胞中表达信使RNA(mRNA)，并且特别地，已经报道了其在小肠中的高表达(非专利文献5)。在脑中，已经报道了在丘脑、壳核和尾状核中的表达(非专利文献4)。GPR20缺陷小鼠表现出多动症的表型，其特征在于开放场地测试中行进的总距离的增加，这表明GPR20与中枢神经系统中的自发活动相关(专利文献1)。还报道了GPR20在GIST中高度表达(非专利文献6)。据报道，GPR20的表达受ETS变体1 (ETV1)控制，其是GIST的主要转录因子(非专利文献7)。
抗体在血液中高度稳定，并且特异性结合其靶抗原。由于这些原因，预期不良反应的水平下降，并且已经开发了大量靶向在癌细胞表面上高表达的分子的抗体药物。直接靶向肿瘤细胞的抗体药物的作用机制的实例包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、阻断参与肿瘤生长的受体信号和凋亡诱导。
使用抗体的抗原结合能力的产品之一是抗体-药物缀合物(ADC)。用于癌症的ADC是与细胞毒性药物缀合的抗体，其中所述抗体具有结合在癌细胞表面上表达的抗原，和通过与抗原的所述结合内化到细胞中的能力。用于癌症的ADC可以有效地将药物递送至癌细胞，并且因此可以预期通过在癌细胞中积累药物来杀死癌细胞(非专利文献8)。关于ADC，例如，包含与单甲基澳瑞他汀E缀合的抗-CD30单克隆抗体的Adcetris (本妥昔单抗vedotin)已被批准作为霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤的治疗药物。此外，包含与美坦新缀合的抗HER2单克隆抗体的Kadcyla (曲妥珠单抗美坦新)用于治疗HER2阳性进行性或复发性乳腺癌。
适合作为抗肿瘤药物的ADC的靶抗原的特征是：所述抗原在癌细胞表面上特异性高表达，但在正常细胞中具有低表达或不表达；所述抗原可以内化到细胞中；所述抗原不是从细胞表面分泌的等。适用于ADC的抗体的重要特征是所述抗体特异性结合靶抗原并且其具有高内化能力。抗体的内化能力取决于靶抗原和抗体的性质。难以从靶标的分子结构预测适于内化的抗原结合位点，或者容易地从抗体的结合强度、物理性质等预测具有高内化能力的抗体。因此，具有高效力的ADC的开发中重要挑战是获得具有针对靶抗原的高内化能力的抗体(非专利文献9)。
到目前为止，尚不知晓靶向GPR20的抗肿瘤治疗药物。此外，还没有报道与表达在细胞膜表面上并且具有内化活性的GPR20结合的抗-GPR20抗体，以及含有此类抗体的ADC。
引用列表
专利文献
专利文献1：US2003/0018989
[非专利文献]
非专利文献1：Corless CL等人，Nat Rev Cancer(2011)11,865-878
非专利文献2：Demetri GD，等人，NCCN Task Force report，J Natl Compr CancNetw.(2010)8，Suppl2：S1-41
非专利文献3：Bauer S.，Joensuu H.，Drugs.(2015)75,1323-1334
非专利文献4：O'Dowd BF，Gene 187 (1997)75-81
非专利文献5：Hase M.，等人，J Biol Chem.(2008)283,12747-12755
非专利文献6：Allander SV等人，CANCER RESEARCH(2001)61,8624-8628
非专利文献7：Chi P.，等人，Nature.(2010)467 (7317)：849-853
非专利文献8：Heidi L.Perez，等人，Drug Discov.Today(2014)19,869-881
非专利文献9：Peters C.，Brown S.，Bioscience Reports(2015)35，e00225。
发明概述
技术问题
本发明的一个目的是提供特异性结合GPR20-阳性肿瘤细胞(诸如GIST)的抗体，包含所述抗体的抗体-药物缀合物，包含所述抗体-药物缀合物并具有对肿瘤的治疗作用的药物产品，使用上述药物产品治疗肿瘤的方法，产生所述抗体和所述抗体-药物缀合物的方法等等。
解决问题的方案
本发明人进行了针对实现上述目的的深入研究，并假设GPR20是表征GIST的分子之一，并且该分子能够用作GIST特异性的治疗靶标。作为检验抗人GPR20抗体的内化活性和结合模式的结果，本发明人发现了在表现出特异性结合模式的抗体中具有高内化活性的抗-GPR20抗体。本发明人进一步发现，抗GPR20抗体-药物缀合物(其包含经由具有特定结构的接头与在细胞内发挥毒性的药物缀合的上述抗GPR20抗体)，在GPR20阳性的恶性肿瘤(诸如GIST，其表达GPR20)上发挥抗肿瘤作用，从而完成了本发明。具体而言，本发明包括本发明的以下方面。
具体地，本申请的发明提供：
(1)具有以下特性(a)和(b)的抗体或抗体的功能片段：
(a)特异性结合GPR20，和
(b)具有在结合GPR20后允许细胞摄取的内化能力；
(2)根据(1)的抗体或抗体的功能片段，其中所述GPR20是由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成的多肽；
(3)根据(1)或(2)所述的抗体或抗体的功能片段，其特异性结合由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成的多肽，并且不特异性结合氨基酸位置113的氨基酸Y (酪氨酸)被不同的氨基酸取代的多肽；
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其特异性结合由SEQ IDNO: 1所示的氨基酸序列组成的多肽，并且不特异性结合氨基酸位置113的氨基酸Y (酪氨酸)被F (苯丙氨酸)取代的多肽；
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其与由SEQ ID NO: 1中的氨基酸位置1至48的氨基酸序列和氨基酸位置108至125的氨基酸序列组成的构象特异性结合；
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其特异性结合SEQ ID NO:1中选自氨基酸位置1至48的氨基酸序列的至少一个氨基酸残基和选自氨基酸位置108至125的氨基酸序列的至少一个氨基酸残基；
(7)根据(1)至(6)中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其中所述抗体或所述功能片段特异性结合的至少一个氨基酸是SEQ ID NO: 1的氨基酸位置113的氨基酸；
(8)根据(1)至(7)中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其针对选自下列抗体(a)至(c)的任一种抗体，具有对结合GPR20的竞争性抑制活性：
(a)具有重链和轻链的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 2的氨基酸位置20至475的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 7的氨基酸位置21至233的氨基酸序列组成，
(b)具有重链和轻链的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 12的氨基酸位置20至475的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 17的氨基酸位置21至233的氨基酸序列组成，和
(c)具有重链和轻链的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 22的氨基酸位置20至475的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 27的氨基酸位置21至233的氨基酸序列组成；
(9)根据(1)至(8)中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其包含选自以下组合(a)至(c)的任一组合中的CDRH1、CDRH2和CDRH3和选自以下组合(d)至(h)的任一组合中的CDRL1、CDRL2和CDRL3：
(a) 由SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列组成的CDRH3，
(b) 由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列组成的CDRH3，
(c) 由SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列组成的CDRH3，
(d) 由SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列组成的CDRL3，
(e) 由SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 92所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列组成的CDRL3，
(f) 由SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列组成的CDRL3，
(g) 由SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列组成的CDRL3，和
(h) 由SEQ ID NO: 29所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 30所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 31所示的氨基酸序列组成的CDRL3；
(10)根据(1)至(9)中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其包含选自以下组合(a)至(e)的任一组合中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及CDRL1、CDRL2和CDRL3：
(a) 由SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列组成的CDRH2，由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列组成的CDRH3，和由SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列组成的CDRL2，由SEQ IDNO: 11所示的氨基酸序列组成的CDRL3，
(b) 由SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列组成的CDRH2，由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列组成的CDRH3，和由SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 92所示的氨基酸序列组成的CDRL2，由SEQ IDNO: 11所示的氨基酸序列组成的CDRL3，
(c) 由SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列组成的CDRH2，由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列组成的CDRH3，和由SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列组成的CDRL2，由SEQ IDNO: 11所示的氨基酸序列组成的CDRL3，
(d) 由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成的CDRH2，由SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列组成的CDRH3，和由SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列组成的CDRL2，由SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列组成的CDRL3，和
(e) 由SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列组成的CDRH2，由SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列组成的CDRH3，和由SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 30所示的氨基酸序列组成的CDRL2，由SEQ ID NO: 31所示的氨基酸序列组成的CDRL3；
(11)根据(1)至(10)中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其具有选自以下可变区(a)至(c)的任一重链可变区和选自以下可变区(d)至(h)的任一轻链可变区：
选自以下的重链可变区：
(a) 由SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成的重链可变区，
(b) 由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和
(c) 由SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列组成的重链可变区，
(d) 由SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(e) 由SEQ ID NO: 62中氨基酸位置21至129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(f) 由SEQ ID NO: 64中氨基酸位置21至129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(g) 由SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列组成的轻链可变区，和
(h) 由SEQ ID NO: 28所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；
(12)根据(1)至(11)中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其包含选自以下组合(a)至(e)的任一组合中的重链可变区和轻链可变区：
(a) 由SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(b) 由SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 62的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(c) 由SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 64的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(d) 由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列组成的轻链可变区，和
(e) 由SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 28所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；
(13)根据(1)至(12)中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其中所述恒定区是人源恒定区；
(14)根据(13)所述的抗体或抗体的功能片段，其包含由SEQ ID NO: 44所示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 45所示的氨基酸序列组成的轻链；
(15)根据(1)至(14)中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其是人源化的；
(16)根据(15)所述的抗体或抗体的功能片段，其具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由选自以下氨基酸序列(a)至(h)的任一氨基酸序列组成，所述轻链可变区由由选自以下氨基酸序列(i)至(o)的任一氨基酸序列组成：
(a) SEQ ID NO: 48中氨基酸位置20至142的氨基酸序列，
(b) SEQ ID NO: 50中氨基酸位置20至142的氨基酸序列，
(c) SEQ ID NO: 52中氨基酸位置20至142的氨基酸序列，
(d) SEQ ID NO: 54中氨基酸位置20至142的氨基酸序列，
(e) SEQ ID NO: 56中氨基酸位置20至142的氨基酸序列，
(f) SEQ ID NO: 44中氨基酸位置20至142的氨基酸序列，
(g) 与(a)至(f)的序列中除每个CDR序列以外的框架区序列具有至少95％或更高同源性的氨基酸序列，
(h) 包含在(a)至(g)的序列中除每个CDR序列以外的框架区序列中一个或数个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列，
(i) SEQ ID NO: 58中氨基酸位置21至129的氨基酸序列，
(j) SEQ ID NO: 60中氨基酸位置21至129的氨基酸序列，
(k) SEQ ID NO: 62中氨基酸位置21至129的氨基酸序列，
(l) SEQ ID NO: 64中氨基酸位置21至129的氨基酸序列，
(m) SEQ ID NO: 45中氨基酸位置21至128的氨基酸序列，
(n) 与(i)至(m)的序列中除每个CDR序列以外的框架区序列具有至少95％或更高同源性的氨基酸序列，和
(o) 包含在(i)至(n)的序列中除每个CDR序列以外的框架区序列中一个或数个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；
(17)根据(16)所述的抗体或抗体的功能片段，其包含选自以下组合(a)至(t)的任一组合中的重链可变区和轻链可变区：
(a) 由SEQ ID NO: 48的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 58的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(b) 由SEQ ID NO: 48的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 60的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(c) 由SEQ ID NO: 48的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 62的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(d) 由SEQ ID NO: 48的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 64的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(e) 由SEQ ID NO: 50的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 58的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(f) 由SEQ ID NO: 50的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 60的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(g) 由SEQ ID NO: 50的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 62的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(h) 由SEQ ID NO: 50的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 64的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(i) 由SEQ ID NO: 52的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 58的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(j) 由SEQ ID NO: 52的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 60的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(k) 由SEQ ID NO: 52的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 62的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(l) 由SEQ ID NO: 52的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 64的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(m) 由SEQ ID NO: 54的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 58的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(n) 由SEQ ID NO: 54的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 60的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(o) 由SEQ ID NO: 54的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 62的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(p) 由SEQ ID NO: 54的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 64的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(q) 由SEQ ID NO: 56的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 58的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(r) 由SEQ ID NO: 56的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 60的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(s) 由SEQ ID NO: 56的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 62的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(t) 由SEQ ID NO: 56的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQID NO: 64的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区；
(18)根据(16)或(17)的抗体或抗体的功能片段，其包含选自由以下组合(a)至(x)的任一组合中的重链和轻链：
(a) 由SEQ ID NO: 48的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成轻链，
(b) 由SEQ ID NO: 48的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(c) 由SEQ ID NO: 48的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(d) 由SEQ ID NO: 48的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(e) 由SEQ ID NO: 50的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(f) 由SEQ ID NO: 50的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(g) 由SEQ ID NO: 50的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(h) 由SEQ ID NO: 50的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(i) 由SEQ ID NO: 52的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(j) 由SEQ ID NO: 52的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(k) 由SEQ ID NO: 52的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(1) 由SEQ ID NO: 52的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(m) 由SEQ ID NO: 54的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(n) 由SEQ ID NO: 54的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(o) 由SEQ ID NO: 54的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(p) 由SEQ ID NO: 54的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(q) 由SEQ ID NO: 56的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(r) 由SEQ ID NO: 56的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(s) 由SEQ ID NO: 56的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(t) 由SEQ ID NO: 56的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(u) 由SEQ ID NO: 44的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(v) 由SEQ ID NO: 44的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(w) 由SEQ ID NO: 44的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，和
(x) 由SEQ ID NO: 44的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链；
(19)根据(1)-(18)中任一项的抗体的功能片段，其中所述功能片段选自Fab、F(ab)2、Fab'和Fv；
(20)一种多核苷酸，其编码(1)-(19)中任一项的抗体或抗体的功能片段；
(21)根据(20)所述的多核苷酸，其包含选自以下组合(a)至(e)的任一组合中的多核苷酸：
(a) 编码由SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列组成的CDRH3的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列组成的CDRL2和由SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列组成的CDRL的多核苷酸，
(b) 编码由SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列组成的CDRH3的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 92所示的氨基酸序列组成的CDRL2和由SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列组成的CDRL3的多核苷酸，
(c) 编码由SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列组成的CDRH3的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列组成的CDRL2和由SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列组成的CDRL3的多核苷酸，
(d) 编码由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列组成的CDRH3的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列组成的CDRL2和由SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列组成的CDRL3的多核苷酸，
(e) 编码由SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列组成的CDRH3的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 29所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 30所示的氨基酸序列组成的CDRL2和由SEQ ID NO: 31所示的氨基酸序列组成的CDRL3的多核苷酸；
根据(20)或(21)的多核苷酸，其包含选自以下组合(a)至(e)的任一组合中的多核苷酸：
(a)编码由SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成的重链可变区的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列组成的轻链可变区的多核苷酸，
(b)编码由SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成的重链可变区的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 62中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区的多核苷酸，
(c)编码由SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成的重链可变区的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 64中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区的多核苷酸，
(d)编码由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成的重链可变区的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列组成的轻链可变区的多核苷酸，和
(e)编码由SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列组成的重链可变区的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 28所示的氨基酸序列组成的轻链可变区的多核苷酸；
(23)一种表达载体，其包含根据(20)-(22)中任一项的多核苷酸；
(24)使用根据(23)的表达载体转化的宿主细胞；
(25)根据(23)的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞；
(26)一种生产目标抗体或抗体的功能片段的方法，其包括培养根据(24)或(25)的宿主细胞的步骤，和从通过上述步骤获得的培养物收集目标抗体或抗体的功能片段的步骤；
(27)通过根据(26)所述的生产方法获得的抗体或抗体的功能片段；
(28)根据(27)所述的抗体的功能片段，其中所述功能片段选自Fab、F(ab)2、Fab'和Fv；
(29)根据(1)-(19)、(27)和(28)中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其包含选自以下的一种或两种或更多种修饰：N-连接糖基化、O-连接糖基化、N-末端加工、C-末端加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化、向N-末端添加甲硫氨酸残基、脯氨酸残基的酰胺化和包含在羧基末端一个或两个氨基酸缺失的重链；
(30)根据(29)的抗体，其中在其重链的羧基末端缺失一个或两个氨基酸；
(31)根据(30)的抗体，其中在其两条重链的每个羧基末端缺失一个氨基酸；
(32)根据(29)-(31)中任一项的抗体，其中在其重链羧基末端的脯氨酸残基进一步被酰胺化；
(33)根据(1)-(19)和(26)-(31)中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其中调节糖链修饰以增强抗体依赖性细胞毒性活性；
(34)抗体-药物缀合物，其包含与药物缀合的根据(1)-(19)和(27)-(33)中任一项的抗体或抗体的功能片段；
(35)根据(34)所述的抗体-药物缀合物，其中所述药物是抗肿瘤化合物；
(36)根据(35)所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗肿瘤化合物是由下式代表的抗肿瘤化合物：
[式1]
；
(37)根据(35)或(36)所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体经由接头与所述抗肿瘤化合物缀合，所述接头具有下式(a)至(f)中任一个代表的结构：
(a) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- ，
(b) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- ，
(c) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- ，
(d) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-，
(e) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- ，和
(f) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- ，
其中所述抗体连接至-(琥珀酰亚胺-3-基-N)的末端，所述抗肿瘤化合物连接至-(CH2)n2-C(=O)-部分的羰基，其中在位置1处的氨基基团的氮原子作为连接位置，GGFG代表由通过肽键连接的甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸组成的氨基酸序列，和
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-具有由下式代表的结构：
[式2]
其在其位置3处与抗体连接，并且在位置1处的氮原子上与含有该结构的接头结构中的亚甲基连接；
(38)根据(34)-(37)中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头由选自以下式(a)至(c)的任一式表示：
(a) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- ，
(b) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-，和
(c) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
(39)根据(34)-(38)中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中接头由以下式(a)或(b)表示：
(a) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- ，和
(b) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
(40)根据(34)-(39)中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中接头由以下式(a)表示：
(a) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；
(41)根据(34)-(40)中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体通过硫醚键缀合至由下式[式3]表示的药物接头结构(其中A代表与抗体的连接位置)：
[式3]
；
(42)根据(34)至(40)中任一项所述的抗体-药物缀合物，其具有由下式[式4]表示的结构，其中AB代表抗体或抗体的功能片段，n代表每抗体中与抗体缀合的药物-接头结构的单元的平均数，并且所述抗体经由衍生自所述抗体的巯基与所述接头连接：
[式4]
；
(43)根据(34)-(39)中任一项所述的抗体-药物缀合物，其由下式[式5]表示，其中AB代表抗体或抗体的功能片段，n代表每抗体中与抗体缀合的药物-接头结构的单元的平均数，并且所述抗体经由衍生自所述抗体的巯基与所述接头连接：
[式5]
；
(44)根据(41)-(43)中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体是包含选自以下组合(a)至(x)的任一组合中的重链和轻链的抗体，或所述抗体的功能片段：
(a) 由SEQ ID NO: 48的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成轻链，
(b) 由SEQ ID NO: 48的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(c) 由SEQ ID NO: 48的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(d) 由SEQ ID NO: 48的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(e) 由SEQ ID NO: 50的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(f) 由SEQ ID NO: 50的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(g) 由SEQ ID NO: 50的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(h) 由SEQ ID NO: 50的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(i) 由SEQ ID NO: 52的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(j) 由SEQ ID NO: 52的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(k) 由SEQ ID NO: 52的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(1) 由SEQ ID NO: 52的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(m) 由SEQ ID NO: 54的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(n) 由SEQ ID NO: 54的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(o) 由SEQ ID NO: 54的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(p) 由SEQ ID NO: 54的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(q) 由SEQ ID NO: 56的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(r) 由SEQ ID NO: 56的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(s) 由SEQ ID NO: 56的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(t) 由SEQ ID NO: 56的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(u) 由SEQ ID NO: 44的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(v) 由SEQ ID NO: 44的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(w) 由SEQ ID NO: 44的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，和
(x) 由SEQ ID NO: 44的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链；
(45)根据(44)的抗体-药物缀合物，其中所述抗体的重链包含选自以下的一种或两种或更多种修饰：N-连接糖基化、O-连接糖基化、N-末端加工、C-末端加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化、向N-末端添加甲硫氨酸残基、脯氨酸残基的酰胺化和包含在羧基末端一个或两个氨基酸缺失的重链；
(46)根据(34)-(45)中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中每抗体所缀合的所选药物-接头结构的平均数在1至10的范围内；
(47)根据(34)-(46)中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中每抗体所缀合的所选药物-接头结构的平均数在2至8的范围内；
(48)根据(34)-(47)中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中每抗体所缀合的所选药物-接头结构元的平均数在3至8的范围内；
(49)根据(34)-(48)中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中每抗体所缀合的所选药物-接头结构的平均数在7至8的范围内；
(50)根据(32)-(49)中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中每抗体所缀合的所选药物-接头结构的平均数为8；
(51)一种药物组合物，其包含选自根据(1)-(19)和(27)-(33)的抗体或抗体的功能片段和根据(34)-(50)的抗体-药物缀合物的任何组分，所述组分的盐或所述组分或所述盐的水合物；
(52)根据(51)所述的药物组合物，其是抗肿瘤药；
(53)根据(52)所述的抗肿瘤药，其中所述肿瘤是表达GPR20的肿瘤；
(54)根据(52)或(53)所述的抗肿瘤药，其中所述肿瘤是胃肠道间质瘤；
(55)根据(51)-(54)中任一项所述的药物组合物或抗肿瘤药，其还包含另外的抗肿瘤药；
(56)一种治疗肿瘤的方法，其包括向个体施用选自根据(1)-(19)和(27)-(33)的抗体或抗体的功能片段、根据(34)-(50)的抗体-药物缀合物的任何组分，这些组分的盐，以及这些成分或所述盐的水合物；
(57)根据(56)所述的治疗方法，其中所述肿瘤是胃肠道间质瘤；
(58)根据(56)或(57)所述的治疗方法，其中所述肿瘤是对酪氨酸激酶抑制剂展示出抗性的肿瘤；
(59)一种治疗肿瘤的方法，其包括同时、分隔或连续地向个体施用包含选自根据(1)-(19)和(27)-(33)的抗体或抗体的功能片段、根据(34)-(50)的抗体-药物缀合物的至少一种组分、这些组分的盐，以及这些成分或所述盐的水合物，和至少一种抗肿瘤药的药物组合物；
(60)根据(59)所述的治疗肿瘤的方法，其中所述抗肿瘤药是酪氨酸激酶抑制剂；
(61)根据(60)所述的治疗肿瘤的方法，其中酪氨酸激酶抑制剂是选自舒尼替尼、伊马替尼和瑞格非尼中的至少一种；
(62)根据(56)-(61)中任一项的治疗肿瘤的方法，其中所述肿瘤是对酪氨酸激酶抑制剂展示出抗性的胃肠道间质瘤；和
(63)生产抗体-药物缀合物的方法，其包括培养根据(24)或(25)的宿主细胞的步骤，从通过上述步骤获得的培养物中收集目标抗体或抗体的功能片段的步骤，以及使通过上述步骤获得的抗体或抗体的功能片段与药物-接头中间体化合物反应的步骤。
本发明的有利效果
本发明的抗-GPR20抗体的特征是识别由两个胞外区域组成的构象并且具有内化活性，所述两个胞外区域分别具有从GPR20的N-末端起位置1至48的氨基酸序列和位置108至125的氨基酸序列。可以预期，在向具有表达GPR20的癌细胞的患者施用时，抗-GPR20抗体-药物缀合物可以实现优异的抗肿瘤效果并且是安全的，所述抗-GPR20抗体-药物缀合物包含经由具有特定结构的接头与在细胞中发挥毒性的药物缀合的本发明的抗-GPR20抗体。具体地，本发明的抗-GPR20抗体-药物缀合物可用作抗肿瘤药物。
附图简述
[图1] 图1显示了大鼠抗-GPR20抗体04-046的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)和编码所述重链的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO: 32)。
[图2] 图2显示了大鼠抗-GPR20抗体04-046的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 7)和编码所述轻链的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO: 34)。
[图3] 图3显示了大鼠抗-GPR20抗体04-079的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)和编码所述重链的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO: 36)。
[图4] 图4显示了大鼠抗-GPR20抗体04-079的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)和编码所述轻链的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO: 38)。
[图5] 图5显示了大鼠抗-GPR20抗体04-126的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)和编码所述重链的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO: 40)。
[图6] 图6显示了大鼠抗-GPR20抗体04-126的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)和编码所述轻链的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO: 42)。
[图7] 图7显示人嵌合抗-GPR20抗体04-046Ch的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:44)和编码所述重链的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO: 46)。
[图8] 图8显示人嵌合抗-GPR20抗体04-046Ch的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:45)和编码所述轻链的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO: 47)。
[图9] 图9显示人源化h046-H4b型重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 48)。
[图10] 图10显示人源化h046-H4e型重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 50)。
[图11] 图11显示人源化h046-H5b型重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 52)。
[图12] 图12显示人源化h046-H8型重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 54)。
[图13] 图13显示人源化h046-H10型重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 56)。
[图14] 图14显示人源化h046-L1型轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 58)。
[图15] 图15显示人源化h046-L2型轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 60)。
[图16] 图16显示人源化h046-L6型轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 62)。
[图17] 图17显示人源化h046-L7型轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 64)。
[图18] 图18显示当产生抗-人GPR20抗体的杂交瘤的培养物上清液与瞬时表达人GPR20的细胞系反应时的流式细胞术分析结果。
[图19-1] 图19-1显示了在流式细胞术分析中大鼠抗-人GPR20抗体与表达人GPR20的细胞系的浓度依赖性结合。
[图19-2] 图19-2显示了在流式细胞术分析中大鼠抗-人GPR20抗体与表达人GPR20的细胞系的浓度依赖性结合。
[图19-3] 图19-3显示了在流式细胞术分析中大鼠抗-人GPR20抗体与表达人GPR20的细胞系的浓度依赖性结合。
[图20] 图20显示大鼠抗-GPR20抗体的内化能力。纵坐标描绘了当将大鼠抗-GPR20抗体和皂草素标记的抗-大鼠IgG抗体添加到表达人GPR20的细胞系中时的存活率(与定义为100％的没有添加抗体的细胞存活率的相对比率)。
[图21] 图21显示人GPR20和小鼠GPR20的氨基酸序列之间的比较的图。EC1、EC2、EC3和EC4表示的氨基酸序列代表胞外区域，并且括号内的数字代表基于人GPR20氨基酸位置的区域位点。阴影字符代表人和小鼠之间相同的氨基酸。
[图22-a] 图22-a显示各种抗-GPR20抗体的结合特性。该图显示了每种抗-GPR20抗体对人GPR20、小鼠GPR20和人/小鼠嵌合GPR20 (其中人GPR20的胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4之一被小鼠GPR20的相应序列取代)蛋白的结合活性，。
[图22-b] 图22-b显示各种抗-GPR20抗体的结合特性。该图显示了每种抗-GPR20抗体对人GPR20、小鼠GPR20和人/小鼠嵌合GPR20 (其中人GPR20的胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4之一被小鼠GPR20的相应序列取代)蛋白的结合活性。
[图23-a] 图23-a显示人嵌合抗-GPR20抗体04-046Ch的人GPR20特异性结合。
[图23-b] 图23-b显示人嵌合抗-GPR20抗体04-046Ch的人GPR20特异性结合。
[图24] 图24显示人源化抗-GPR20抗体的GPR20结合活性。
[图25] 图25显示人源化抗-GPR20抗体和抗体-药物缀合物的GPR20结合活性。
[图26] 图26显示抗体-药物缀合物(1)对表达GPR20的细胞的体外细胞增殖抑制活性。
[图27] 图27显示抗体-药物缀合物(7)、(8)和(9)对表达GPR20的细胞的体外细胞增殖抑制活性。
[图28] 图28显示抗体-药物缀合物(1)和(2)在皮下移植GIST-T1/GPR20细胞的裸鼠模型中的抗肿瘤效果。
[图29] 图29显示抗体-药物缀合物(1)和(2)在皮下移植GIST430细胞的裸鼠模型中的抗肿瘤效果。
[图30] 图30显示抗体-药物缀合物(6)和(9)在皮下移植GIST-T1/GPR20细胞的裸鼠模型中的抗肿瘤效果。
[图31] 图31显示抗体-药物缀合物(3)、(5)、(6)、(10)、(11)和(12)在皮下移植GIST-T1/GPR20细胞的裸鼠模型中的抗肿瘤效果。
[图32] 图32显示抗体-药物缀合物(13)在皮下移植GIST-T1/GPR20细胞的裸鼠模型中的抗肿瘤效果。
[图33] 图33显示抗体-药物缀合物(4)和(13)在皮下移植GIST020的裸鼠模型中的抗肿瘤效果。
[图34] 图34显示抗体-药物缀合物(13)在皮下移植GIST1的裸鼠模型中的抗肿瘤效果。
[图35] 图35显示抗体-药物缀合物(14)和靶向HER2的抗体-药物缀合物在皮下移植胃癌细胞系NCI-N87细胞的裸鼠模型中的抗肿瘤效果。
[图36] 图36显示抗体-药物缀合物(14)在通过将肿瘤GIST074皮下移植到裸鼠中制备的模型中的抗肿瘤效果，所述肿瘤GIST074衍生自在胃中具有胃肠道间质瘤的患者，其对瑞格非尼治疗变得无应答。
[图37] 图37显示抗体-药物缀合物(3)和舒尼替尼联合使用在通过将人胃肠道间质瘤细胞系GIST430/654皮下移植到裸鼠中制备的模型中的效果，所述细胞系具有伊马替尼抗性突变。
[实施方案描述]
在下文中，将参考附图描述用于实施本发明的优选实施方案。应注意，下面描述的实施方案仅说明了本发明的代表性实施方案，并且不应由于这些实例而将本发明的范围限制狭义解释。
在本说明书中，所使用的术语“癌症”具有与术语“肿瘤”的含义相同的含义。
在本说明书中，所使用的术语“基因”不仅包括DNA，而且包括其mRNA和cDNA以及其cRNA。
在本说明书中，所使用的术语“多核苷酸”具有与核酸的含义相同的含义，并且包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。
在本说明书中，使用术语“多肽”和“蛋白质”而没有彼此区分。
在本说明书中，术语“细胞”包括个体动物中的细胞和培养的细胞。
在本说明书中，所使用的术语“GPR20”具有与GPR20蛋白的含义相同的含义。
在本说明书中，术语“细胞毒性活性”用于意指通过任何给定的方式造成的细胞病理变化。所述术语不仅意指直接外伤，而且意指造成细胞的所有类型的结构或功能损伤，诸如DNA切割、碱基二聚体的形成、染色体切割、对细胞有丝分裂装置的损伤以及各种类型的酶的活性降低。
在本说明书中，短语“在细胞中发挥毒性”用于表示以任何给定方式在细胞中表现出毒性。所述术语不仅意指直接的外伤，而且意指造成细胞的所有类型的结构、功能或代谢影响，诸如DNA切割、碱基二聚体的形成、染色体切割、对细胞有丝分裂装置的损伤、各种类型的酶的活性降低和细胞生长因子的效果的抑制。
在本说明书中，术语“表位”用于表示特定抗-GPR20抗体结合的GPR20的部分肽或部分三维结构。这种表位，即上述GPR20的部分肽，可以通过本领域技术人员熟知的方法测定，例如免疫测定。首先，产生抗原的各种部分结构。关于产生此类部分结构，可以应用已知的寡肽合成技术。例如，通过本领域技术人员熟知的遗传重组技术产生一系列多肽，其中GPR20已经从其C-末端或N-末端连续截短。此后，研究抗体对这些多肽的反应性，并粗略确定识别位点。此后，进一步合成更短的肽，并且随后研究对这些肽的反应性，从而确定表位。当与具有多个胞外结构域的膜蛋白结合的抗体靶向作为表位的由多个结构域构成的三维结构时，可以通过修饰特定胞外结构域的氨基酸序列，并且从而改变所述三维结构，来确定抗体结合的结构域。还可以通过经由X-射线结构分析指出与上述抗体相邻的抗原的氨基酸残基，来确定作为与特定抗体结合的抗原的部分三维结构的表位。
在本说明书中，短语“结合相同表位的抗体”用于意指结合共同表位的抗体。如果第二抗体结合第一抗体结合的部分肽或部分三维结构，则可以确定第一抗体和第二抗体结合相同的表位。另外，即使表位的特定序列或结构尚未确定，可以通过证实第二抗体与第一抗体竞争第一抗体与抗原的结合(即，第二抗体干扰第一抗体与抗原的结合)，确定第一抗体和第二抗体结合相同的表位。另外，当第一抗体和第二抗体结合相同的表位且进一步地，第一抗体具有特殊效果诸如抗肿瘤活性或内化活性时，可预期第二抗体具有与第一抗体的活性相同的活性。因此，通过确认第二抗-GPR20抗体与第一抗-GPR20抗体竞争第一抗-GPR20抗体与GPR20的部分肽的结合，可以确定第一抗体和第二抗体是结合GPR20的相同表位的抗体。
在本说明书中，术语“CDR”用于意指互补决定区。已知抗体分子的重链和轻链各自具有三个CDR。这样的CDR也称为高变区，并且位于抗体的重链和轻链的可变区中。这些区域具有特别高度可变的一级结构，并且在重链和轻链的每一个的多肽链的一级结构上分为三个位点。在本说明书中，关于抗体的CDR，重链的CDR从重链的氨基酸序列的氨基-末端侧起分别被称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，而轻链的CDR从轻链的氨基酸序列的氨基-末端侧起分别被称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。这些位点在三维结构上彼此接近定位，并且决定抗体对抗原(所述抗体与其结合)的特异性。
在本发明中，短语“在严格条件下杂交”用于表示杂交在商购可得的杂交溶液ExpressHyb杂交溶液(由Clontech Laboratories, Inc.制造)中在68℃下实施，或者杂交如下条件(或与其等同的条件)下实施，其中使用DNA固定化过滤器，在0.7-1.0M NaCl存在下，在68℃下实施杂交，并且随后将所得物在68℃下使用0.1-2倍浓度的SSC溶液(其中1倍浓度的SSC由150mM NaCl和15mM柠檬酸钠组成)洗涤，用于鉴定。
1. GPR20
GPR20是由358个氨基酸构成的七次跨膜蛋白，其属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族A类，并且该蛋白具有N末端胞外结构域和C末端胞内结构域。
用于本发明的GPR20蛋白可以直接从人或非人哺乳动物(例如大鼠或小鼠)的表达GPR20的细胞中纯化，并且随后可以使用，或者可以制备上述细胞的细胞膜级分并且可以作为GPR20蛋白使用。可选地，GPR20也可以通过在体外合成或通过遗传操作而允许宿主细胞产生GPR20而获得。根据这种遗传操作，可以获得GPR20蛋白，具体地，将GPR20 cDNA并入到能够表达GPR20 cDNA的载体中，并且随后在含有酶、底物和转录和翻译所需的能量材料的溶液中合成GPR20，或者通过转化其他原核生物或真核生物的宿主细胞，从而允许其表达GPR20。基于上述遗传操作的表达GPR20的细胞或表达GPR20的细胞系也可以作为GPR20蛋白使用。可选地，可以直接向待免疫的动物施用已并入GPR20 cDNA的表达载体，并且GPR20可以在如此免疫的动物体内表达。
人GPR20的DNA序列和氨基酸序列公开在公共数据库中，并且可以参考例如登录号NM_005293和NP_005284 (NCBI)。
此外，GPR20中还包括如下的蛋白质，其由包含在上述GPR20的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加的氨基酸序列组成，并且具有与GPR20蛋白等同的生物活性。
人GPR20蛋白的氨基酸序列显示在序列表中的SEQ ID NO: 1中。胞外区域由以下构成：由序列表中SEQ ID NO: 1的氨基酸位置1至48组成的胞外结构域(EC1)，由序列表中SEQ ID NO: 1的氨基酸位置108至125组成的胞外结构域(EC2)，由序列表中SEQ ID NO: 1的氨基酸位置190至196组成的胞外结构域(EC3)，和由序列表中SEQ ID NO: 1中的氨基酸位置260至275组成的胞外结构域(EC4)。
2. 抗-GPR20抗体的产生
本发明的抗-GPR20抗体的一个实例可包括抗-GPR20抗体，其识别由两个胞外区域组成的构象并且具有内化活性，所述两个胞外区域分别具有序列表中SEQ ID NO: 1所示的GPR20的N末端起，位置1至48的氨基酸序列和位置108至125的氨基酸序列。
本发明的抗-GPR20抗体的另一个实例可包括抗-GPR20抗体，其识别由两个胞外区域组成的构象，至少结合在位置113处的酪氨酸并且具有内化活性，所述两个胞外区域分别具有序列表中SEQ ID NO: 1所示的GPR20的N末端起，位置1至48的氨基酸序列和位置108至125的氨基酸序列。
本发明的抗-GPR20抗体的另一个实例可以包括抗-GPR20抗体，其特异性结合由序列表中SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成的多肽，其不结合具有在序列表中SEQ ID NO:1的氨基酸位置113的氨基酸酪氨酸被不同氨基酸(例如苯丙氨酸)取代的多肽，并且具有内化活性。
本发明的抗-GPR20抗体可以衍生自任何物种。所述物种的优选实例可包括人、大鼠、小鼠和兔。当本发明的抗-GPR20抗体衍生自除人以外的物种时，优选通过众所周知的技术使抗-GPR20抗体嵌合或人源化。本发明的抗体可以是多克隆抗体，或者可以是单克隆抗体，且优选单克隆抗体。
本发明的抗-GPR20抗体是可以靶向肿瘤细胞的抗体。具体地，本发明的抗-GPR20抗体具有能够识别肿瘤细胞的特性，能够与肿瘤细胞结合的特性，通过细胞摄取而内化到肿瘤细胞中的特性等。因此，本发明的抗-GPR20抗体可以通过经由接头与具有抗肿瘤活性的化合物缀合，以制备抗体-药物缀合物。
可以通过流式细胞术确认抗体对肿瘤细胞的结合活性。可以通过以下证实抗体至肿瘤细胞中的摄取：(1)使用结合治疗抗体的二级抗体(荧光标记的)，在荧光显微镜下观察细胞摄取的抗体的测定(Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761)，(2)使用结合治疗抗体的二级抗体(荧光标记的)，测量细胞摄取荧光量的测定(MolecularBiology of the Cell Vol. 15, 5268-5282, 2004年12月)，或(3)使用结合治疗抗体的免疫毒素的Mab-ZAP测定，其中所述毒素在细胞摄取时释放，从而抑制细胞增殖(BioTechniques 28: 162-165, 2000年1月)。白喉毒素的催化区域和蛋白G的重组复合蛋白可用作免疫毒素。
在本说明书中，术语“高内化能力”用于表示已经施用上述抗体和皂草素标记的抗大鼠IgG抗体的表达GPR20的细胞的存活率(其为相对于定义为100％的没有添加抗体的细胞存活率的比率)，优选为70％或更少，且更优选为60％或更少。
本发明的抗肿瘤抗体-药物缀合物包含发挥抗肿瘤作用的缀合的化合物。因此，优选抗体本身应具有抗肿瘤效果，但非必需的。为了特异性和选择性地在肿瘤细胞中发挥抗肿瘤化合物的细胞毒性的目的，重要且优选的是所述抗体应具有内化并转移到肿瘤细胞中的特性。
抗-GPR20抗体可以通过如下获得：按本领域通常实施的方法，使用充当抗原的多肽免疫动物，并且随后收集和纯化在其活体中产生的抗体。由于GPR20是七次跨膜蛋白，因此优选使用保留三维结构的GPCR作为抗原。这种方法的实例可包括DNA免疫方法。
抗原的来源不限于人，并且因此也可以使用来源于非人动物如小鼠或大鼠的抗原免疫动物。在此方面，可以通过检验所获得的结合异源抗原的抗体与人抗原的交叉反应性来选择适用于人类疾病的抗体。
此外，可以根据已知方法，将产生针对抗原的抗体的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合(例如，Kohler和Milstein, Nature(1975)256, p. 495-497；和Kennet, R.编辑,Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N. Y.(1980))以建立杂交瘤，从而获得单克隆抗体。
在下文中，将具体描述获得针对GPR20的抗体的方法。
(1)抗原的制备
可以根据遗传操作，通过允许宿主细胞产生编码抗原蛋白的基因而获得抗原。具体地，产生能够表达抗原基因的载体，并且随后将载体导入宿主细胞，从而在其中表达基因，并且随后，可以纯化表达的抗原。抗体还可以通过使用基于上述遗传操作的抗原表达细胞或表达所述抗原的细胞系免疫动物的方法来获得。
可选地，也可以不使用抗原蛋白，通过将抗原蛋白的cDNA并入表达载体中，然后将所述表达载体施用至待免疫的动物，并在所述动物体内表达抗原蛋白而使之免疫，从而在其中产生针对所述抗原蛋白的抗体。
(2)抗-GPR20单克隆抗体的产生
用于本发明的抗-GPR20抗体没有特别限制。例如，可以适当地使用由本申请的序列表中所示的氨基酸序列指定的抗体。用于本发明的抗-GPR20抗体理想地是具有以下特性的抗体：
(1)具有以下特性的抗体：
(a)特异性结合GPR20，和
(b)具有通过与GPR20结合而内化到表达GPR20的细胞中的活性；
(2)根据上述(1)所述的抗体或上述抗体，其中，所述GPR20是人GPR20；和
(3)识别由两个胞外区域组成的构象，并具有内化活性，所述两个胞外区域分别具有人GPR20的N末端起，位置1至48的氨基酸序列和位置108至125的氨基酸序列。
获得本发明的针对GPR20的抗体的方法没有特别限制，只要可以获得抗-GPR20抗体即可。由于GPR20是跨膜蛋白，因此优选使用保留构象的GPR20作为抗原。
获得所述抗体的方法的一个优选实例可包括DNA免疫方法。DNA免疫方法是涉及以下的方法：施用抗原表达质粒转染动物(例如小鼠或大鼠)个体，并随后在所述个体中表达抗原以诱导针所述抗原的免疫。转染方法包括将质粒直接注射到肌肉的方法，将诸如脂质体或聚乙烯亚胺的转染试剂注射到静脉的方法，使用病毒载体的方法，使用基因枪注射附着质粒的金颗粒的方法，将大量质粒溶液快速注入静脉的流体动力学方法等。关于将表达质粒注射到肌肉的转染方法，作为提高表达水平的方法，已知称为体内电穿孔的技术，其涉及将电穿孔应用于质粒的肌内注射部位(Aihara H, Miyazaki J. Nat Biotechnol. 1998年9月; 16 (9): 867-70 或Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D,Caillaud JM, Delaere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. Proc Natl AcadSci U S A. 1999年4月13日; 96 (8): 4262-7)。该方法通过使用透明质酸酶处理肌肉，随后肌内注射质粒来进一步提高表达水平(McMahon JM, Signori E, Wells KE, Fazio VM,Wells DJ., Gene Ther. 2001年8月; 8 (16): 1264-70)。此外，杂交瘤的产生可以通过已知方法进行，并且也可以使用例如Hybrimune杂交瘤生产系统(Cyto Pulse Sciences,Inc.)进行。
获得单克隆抗体的具体实例还可包括以下程序：
(a)通过将GPR20 cDNA并入表达载体(例如，pcDNA3.1；Thermo Fisher ScientificInc.)中，并通过例如电穿孔或使用基因枪的方法，将载体直接施用至待免疫的动物(例如，大鼠或小鼠)，从而在所述动物体内表达GPR20，可以诱导免疫应答。如果需要增加抗体滴度，通过电穿孔等的载体施用可以进行一次或多次，优选多次；
(b)从已诱导免疫应答的上述动物收集含有产生抗体的细胞的组织(例如，淋巴结)；
(c)制备骨髓瘤细胞(下文称为“骨髓瘤”)(例如，小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14细胞)；
(d)产生抗体的细胞和骨髓瘤之间的细胞融合；
(e)选择产生目标抗体的杂交瘤组；
(f)分成单细胞克隆(克隆)；
(g)任选地，培养杂交瘤用于单克隆抗体的大量生产，或培育移植杂交瘤的动物；和
(h)研究由此产生的单克隆抗体的生理活性(内化活性)和结合特异性，或检测抗体作为标记试剂的特性。
用于测量本文中使用的抗体滴度的方法的实例可包括但不限于流式细胞术和细胞ELISA。
如此建立的杂交瘤株的实例可包括产生抗-GPR20抗体的杂交瘤04-046、04-079和04-126。应注意，在本说明书中，由产生抗-GPR20抗体的杂交瘤04-046产生的抗体被称为“04-046抗体”或简称为“04-046”，由杂交瘤04-079产生的抗体被称为“04-079抗体”或简称为“04-079”，并且杂交瘤04-126产生的抗体被称为“04-126抗体”或简称为“04-0126”。
04-046抗体的重链具有序列表中SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。在序列表中SEQ ID NO: 2所示的重链氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置20至142的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置143至475的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。前述可变区具有CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述CDRH1由以序列表中SEQ ID NO: 2中的位置45至54的氨基酸残基组成的氨基酸序列组成，所述CDRH2由以序列表中SEQ ID NO: 2中的位置69至78处氨基酸残基组成的氨基酸序列组成，所述CDRH3由以序列表中SEQ ID NO: 2中的位置118至131的氨基酸残基组成的氨基酸序列组成。04-046抗体的重链可变区具有序列表中SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。04-046抗体的CDRH1具有序列表中SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，CDRH2的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列，且CDRH3的氨基酸序列具有序列表中SEQ IDNO: 6所示的氨基酸序列。此外，04-046抗体的重链序列示于图1中。
04-046抗体的轻链具有序列表中SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。在序列表中SEQ ID NO: 7所示的轻链氨基酸序列中，由位置1至20的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置21至128的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置129至233的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。前述可变区具有CDRL1、CDRL2和CDRL3，所述CDRL1由以序列表中SEQ ID NO: 7中的位置43至53的氨基酸残基组成的氨基酸序列组成，所述CDRL2由以序列表中SEQ ID NO: 7中的位置69至75处氨基酸残基组成的氨基酸序列组成，所述CDRL3由以序列表中SEQ ID NO: 7中的位置108至116的氨基酸残基组成的氨基酸序列组成。04-046抗体的轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。04-046抗体的CDRL1具有序列表中SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列，CDRL2的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，且CDRL3的氨基酸序列具有序列表中SEQ IDNO: 11所示的氨基酸序列。此外，04-046抗体的轻链序列示于图2中。
04-079抗体的重链具有序列表中SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列。在序列表中SEQ ID NO: 12所示的重链氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置20至142的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置143至475的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。前述可变区具有CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述CDRH1由以序列表中SEQ ID NO: 12中的位置45至54的氨基酸残基组成的氨基酸序列组成，所述CDRH2由以序列表中SEQ ID NO: 12中的位置69至78处氨基酸残基组成的氨基酸序列组成，所述CDRH3由以序列表中SEQ ID NO: 12中的位置118至131的氨基酸残基组成的氨基酸序列组成。04-079抗体的重链可变区具有序列表中SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列。04-079抗体的CDRH1具有序列表中SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，CDRH2的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列，且CDRH3的氨基酸序列具有序列表中SEQID NO: 16所示的氨基酸序列。此外，04-079抗体的重链序列示于图3中。
04-079抗体的轻链具有序列表中SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列。在序列表中SEQ ID NO: 17所示的轻链氨基酸序列中，由位置1至20的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置21至128的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置129至233的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。前述可变区具有CDRL1、CDRL2和CDRL3，所述CDRL1由以序列表中SEQ ID NO: 17中的位置43至53的氨基酸残基组成的氨基酸序列组成，所述CDRL2由以序列表中SEQ ID NO: 17中的位置69至75处氨基酸残基组成的氨基酸序列组成，所述CDRL3由序列表中SEQ ID NO: 17中的位置108至116的氨基酸残基组成的氨基酸序列组成。04-079抗体的轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列。04-079抗体的CDRL1具有序列表中SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列，CDRL2的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列，且CDRL3的氨基酸序列具有序列表中SEQ IDNO: 21所示的氨基酸序列。此外，04-079抗体的轻链序列示于图4中。
04-126抗体的重链具有序列表中SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列。在序列表中SEQ ID NO: 22所示的重链氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置20至142的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置143至475的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。前述可变区具有CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述CDRH1由以序列表中SEQ ID NO: 22中的位置45至54的氨基酸残基组成的氨基酸序列组成，所述CDRH2由以序列表中SEQ ID NO: 22中的位置69至78处氨基酸残基组成的氨基酸序列组成，所述CDRH3由以序列表中SEQ ID NO: 22中的位置118至131的氨基酸残基组成的氨基酸序列组成。04-126抗体的重链可变区具有序列表中SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列。04-126抗体的CDRH1具有序列表中SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列，CDRH2的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列，且CDRH3的氨基酸序列具有序列表中SEQID NO: 26所示的氨基酸序列。此外，04-126抗体的重链序列示于图5中。
04-126抗体的轻链具有序列表中SEQ ID NO: 27所示的氨基酸序列。在序列表中SEQ ID NO: 27所示的轻链氨基酸序列中，由位置1至20的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置21至128的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置129至233的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。前述可变区具有CDRL1、CDRL2和CDRL3，所述CDRL1由以序列表中SEQ ID NO: 27中的位置43至53的氨基酸残基组成的氨基酸序列组成，所述CDRL2由以序列表中SEQ ID NO: 27中的位置69至75处氨基酸残基组成的氨基酸序列组成，所述CDRL3由以序列表中SEQ ID NO: 27中的位置108至116的氨基酸残基组成的氨基酸序列组成。04-126抗体的轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO: 28所示的氨基酸序列。04-126抗体的CDRL1具有序列表中SEQ ID NO: 29所示的氨基酸序列，CDRL2的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO: 30所示的氨基酸序列，且CDRL3的氨基酸序列具有序列表中SEQID NO: 31所示的氨基酸序列。此外，04-126抗体的轻链序列示于图6中。
04-046抗体的重链氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO: 32所示的核苷酸序列编码。在序列表中SEQ ID NO: 32所示的核苷酸序列中，由位置1至57的核苷酸组成的核苷酸序列编码信号序列，由位置58至426的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-046抗体的重链可变区，并且由位置427至1425位的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-046抗体的重链恒定区。在SEQ ID NO: 32中，编码上述可变区的核苷酸序列具有编码CDRH1的由核苷酸位置133-162的核苷酸序列组成的多核苷酸，编码CDRH2的由核苷酸位置205-234的核苷酸序列组成的多核苷酸，和编码CDRH3的由核苷酸位置352-393的核苷酸序列组成的多核苷酸。04-046抗体的重链可变区的核苷酸序列也显示在序列表中的SEQ ID NO: 33中。此外，SEQ ID NO:32的序列显示在图1中。
04-046抗体的轻链核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO: 34所示的核苷酸序列编码。在序列表中SEQ ID NO: 34所示的核苷酸序列中，由位置1至60的核苷酸组成的核苷酸序列编码信号序列，由位置61至384的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-046抗体的轻链可变区，并且由位置385至699位的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-046抗体的轻链恒定区。在SEQ ID NO: 34中，编码上述可变区的核苷酸序列具有编码CDRL1的由核苷酸位置127-159的核苷酸序列组成的多核苷酸，编码CDRL2的由核苷酸位置205-225的核苷酸序列组成的多核苷酸，和编码CDRL3的由核苷酸位置322-348的核苷酸序列组成的多核苷酸。04-046抗体的轻链可变区的核苷酸序列也显示在序列表中的SEQ ID NO: 35中。此外，SEQ ID NO:34的序列显示在图2中。
04-079抗体的重链核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO: 36所示的核苷酸序列编码。在序列表中SEQ ID NO: 36所示的核苷酸序列中，由位置1至57的核苷酸组成的核苷酸序列编码信号序列，由位置58至426的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-079抗体的重链可变区，并且由位置427至1425位的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-079抗体的重链恒定区。在SEQ ID NO: 36中，编码上述可变区的核苷酸序列具有编码CDRH1的由核苷酸位置133-162的核苷酸序列组成的多核苷酸，编码CDRH2的由核苷酸位置205-234的核苷酸序列组成的多核苷酸，和编码CDRH3的由核苷酸位置352-393的核苷酸序列组成的多核苷酸。04-079抗体的重链可变区的核苷酸序列也显示在序列表中的SEQ ID NO: 37中。此外，SEQ ID NO:36的序列显示在图3中。
04-079抗体的轻链核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO: 38所示的核苷酸序列编码。在序列表中SEQ ID NO: 38所示的核苷酸序列中，由位置1至60的核苷酸组成的核苷酸序列编码信号序列，由位置61至384的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-079抗体的轻链可变区，并且由位置385至699位的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-079抗体的轻链恒定区。在SEQ ID NO: 38中，编码上述可变区的核苷酸序列具有编码CDRL1的由核苷酸位置127-159的核苷酸序列组成的多核苷酸，编码CDRL2的由核苷酸位置205-225的核苷酸序列组成的多核苷酸，和编码CDRL3的由核苷酸位置322-348的核苷酸序列组成的多核苷酸。04-079抗体的轻链可变区的核苷酸序列也显示在序列表中的SEQ ID NO: 39中。此外，SEQ ID NO:38的序列显示在图4中。
04-126抗体的重链核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO: 40所示的核苷酸序列编码。在序列表中SEQ ID NO: 40所示的核苷酸序列中，由位置1至57的核苷酸组成的核苷酸序列编码信号序列，由位置58至426的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-126抗体的重链可变区，并且由位置427至1425位的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-126抗体的重链恒定区。在SEQ ID NO: 40中，编码上述可变区的核苷酸序列具有编码CDRH1的由核苷酸位置133-162的核苷酸序列组成的多核苷酸，编码CDRH2的由核苷酸位置205-234的核苷酸序列组成的多核苷酸，和编码CDRH3的由核苷酸位置352-393的核苷酸序列组成的多核苷酸。04-126抗体的重链可变区的核苷酸序列也显示在序列表中的SEQ ID NO: 41中。此外，SEQ ID NO:40的序列显示在图5中。
04-126抗体的轻链核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO: 42所示的核苷酸序列编码。在序列表中SEQ ID NO: 42所示的核苷酸序列中，由位置1至60的核苷酸组成的核苷酸序列编码信号序列，由位置61至384的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-126抗体的轻链可变区，并且由位置385至699位的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-126抗体的轻链恒定区。在SEQ ID NO: 42中，编码上述可变区的核苷酸序列具有编码CDRL1的由核苷酸位置127-159的核苷酸序列组成的多核苷酸，编码CDRL2的由核苷酸位置205-225的核苷酸序列组成的多核苷酸，和编码CDRL3的由核苷酸位置322至348的核苷酸序列组成的多核苷酸。04-126抗体的轻链可变区的核苷酸序列也显示在序列表中的SEQ ID NO: 43中。此外，SEQ ID NO:42的序列显示在图6中。
此外，在再次实施上述“3. 抗-GPR20抗体的产生”中的步骤(a)至(h)，以分别获得单克隆抗体的情况下，以及在通过其他方法单独获得单克隆抗体的情况下，可以获得具有与04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体等同的内化活性的抗体。这种抗体的一个实例可以包括与04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体结合的相同表位结合的抗体。如果新制备的单克隆抗体与04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体结合的部分肽或部分三维结构结合，则可以确定所述单克隆抗体结合与04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体结合的相同表位。此外，通过确认单克隆抗体与04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体竞争抗体与GPR20的结合(即单克隆抗体干扰04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体与GPR20的结合)，可以确定单克隆抗体结合与抗-GPR20抗体结合的相同表位，即使表位的特定序列或结构具有尚未确定。当确认单克隆抗体结合与04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体结合的相同表位时，则强烈预期单克隆抗体应当具有等同于04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体的抗原结合能力、生物活性和/或内化活性。
(3)其他抗体
本发明的抗体还包括为了降低对人的异源抗原性的目的而人工修饰的遗传重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体和人抗体，以及上述针对GPR20的单克隆抗体。这些抗体可以通过已知方法来产生。
嵌合抗体的实例可包括这样的抗体，其中可变区和恒定区彼此异源，例如通过将小鼠或大鼠衍生的抗体的可变区与人衍生的恒定区缀合而形成的嵌合抗体(参见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 81, 6851-6855,(1984))。
衍生自大鼠抗人GPR20抗体04-046抗体的嵌合抗体是由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含由SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列组成的重链可变区，所述轻链包含SEQID NO: 8中所示的轻链可变区，并且该嵌合抗体可以具有任何给定的人衍生的恒定区。
衍生自大鼠抗人GPR20抗体04-079抗体的嵌合抗体是由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含由SEQ ID NO: 13中所示的氨基酸序列组成的重链可变区，所述轻链包含SEQID NO: 18中所示的轻链可变区，并且该嵌合抗体可以具有任何给定的人衍生的恒定区。
衍生自大鼠抗人GPR20抗体04-126抗体的嵌合抗体是由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含由SEQ ID NO: 23中所示的氨基酸序列组成的重链可变区，所述轻链包含SEQID NO: 28中所示的轻链可变区，并且该嵌合抗体可以具有任何给定的人衍生的恒定区。
衍生自大鼠抗人GPR20抗体04-046抗体的嵌合抗体的具体实例可以包括衍生自大鼠抗人GPR20抗体04-046抗体的嵌合抗体04-046Ch (下文中，也称为“04-046Ch”)。04-046Ch抗体的氨基酸序列可以是由具重链和轻链组成的抗体，所述重链具有由序列表中SEQID NO: 44的位置20至472的氨基酸残基组成的氨基酸序列，并且所述轻链具有由序列表中SEQ ID NO: 45的位置21至233组成的氨基酸序列。应注意，在序列表中SEQ ID NO: 44所示的重链氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置20至142的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置143至472的残基组成的氨基酸序列是恒定区。SEQ ID NO: 44的序列显示在图7中。此外，在序列表中SEQ ID NO: 45所示的轻链序列中，由位置1至20的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置21至128的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置129至233的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。SEQ ID NO: 45的序列显示在图8中。
04-046Ch抗体的重链氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO: 46所示的核苷酸序列编码。由序列表中SEQ ID NO: 46所示核苷酸序列中位置1至57的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-046Ch抗体的信号序列。由序列表中SEQ ID NO: 46所示核苷酸序列中位置58至426的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-046Ch抗体的重链可变区序列。由序列表中SEQ ID NO:46所示核苷酸序列中位置427至1416的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-046Ch抗体的重链恒定区。SEQ ID NO: 46的序列显示在图7中。04-046Ch抗体的轻链氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO: 47所示的核苷酸序列编码。由序列表中SEQ ID NO: 47所示核苷酸序列中位置1至60的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-046Ch抗体的信号序列。由序列表中SEQ ID NO:47所示核苷酸序列中位置61至384的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-046Ch抗体的轻链可变区序列。由序列表中SEQ ID NO: 47所示核苷酸序列中位置385至699的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-046Ch抗体的轻链恒定区。SEQ ID NO: 47的序列显示在图8中。
人源化抗体的实例可包括通过仅将互补决定区(CDR)并入人衍生的抗体而形成的抗体(参见Nature(1986)321，p. 522-525)，通过根据CDR移植方法，将一些框架区中以及CDR序列中的氨基酸残基移植至人抗体形成的抗体(国际公开号WO90/07861)，和通过修饰一些CDR的氨基酸序列同时保留抗原结合能力而形成的抗体。
然而，衍生自04-046抗体、04-079或04-126抗体的人源化抗体不限于特定的人源化抗体，只要其保留04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体的所有6个CDR序列并且具有内化活性。此外，该人源化抗体不限于特定的人源化抗体，只要其在修饰04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体的一些CDR的氨基酸序列的同时，具有内化活性。
大鼠抗体04-046的人源化抗体的具体实例可包括以下任何给定组合：包含重链可变区的重链，所述重链可变区由以下任一组成(1) 由序列表中SEQ ID NO: 48、50、52、54或56的位置20至142位的氨基酸残基组成的氨基酸序列，(2)与上述氨基酸序列(1)具有至少95％或更高同源性的氨基酸序列，和(3) 在上述氨基酸序列(1)中包含一个或数个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；和包含轻链可变区的轻链，所述轻链可变区由以下任一组成(4) 由序列表中SEQ ID NO: 58、60、62或64的位置21至129位的氨基酸残基组成的氨基酸序列，(5)与上述氨基酸序列(4)具有至少95％或更高同源性的氨基酸序列，和(6)在上述氨基酸序列(4)中包含一个或数个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。
可选地，也可以使用具有人源化重链或轻链和衍生自大鼠抗体或嵌合抗体的另一条链的抗体。此类抗体的实例可包括以下任何给定组合：由以下任一组成的重链：(1) 由序列表中SEQ ID NO: 44中位置20至472的氨基酸残基组成的氨基酸序列，(2)与上述氨基酸序列(1)具有至少95％或更高同源性的氨基酸序列，和(3)在上述氨基酸序列(1)中包含一个或数个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；和包含轻链可变区的轻链，其由以下任一组成：(4) 由序列表中SEQ ID NO: 58、60、62或64的位置21至129位的氨基酸残基组成的氨基酸序列，(5)与上述氨基酸序列(4)具有至少95％或更高同源性的氨基酸序列，和(6)在上述氨基酸序列(4)中包含一个或数个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。此类抗体的其他实例可包括以下任何给定组合：包含重链可变区的重链，其由以下任一组成：(1) 由序列表中SEQ ID NO: 48、50、52、54或56的位置20至142位的氨基酸残基组成的氨基酸序列，(2)与上述氨基酸序列(1)具有至少95％或更高同源性的氨基酸序列，和(3)在上述氨基酸序列(1)中包含一个或数个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；和包含轻链可变区的轻链，其由以下任一组成：(4) 由序列表中SEQ ID NO: 45的位置21至233的氨基酸残基组成的氨基酸序列，(5)与上述氨基酸序列(4)具有至少95％或更高同源性的氨基酸序列，和(6)在上述氨基酸序列(4)中包含一个或数个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。其进一步的替代实例可包括由选自以下组合(7)至(19)的重链和轻链的任何组合组成的抗体：(7) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，(8) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ ID NO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，(9) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ ID NO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，(10) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ ID NO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链。
在SEQ ID NO: 48中，由位置45至54 (GYTFTSYYIS)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRH1，由位置69至78 (FINPGSGHTN)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRH2，并且由位置118至131 (GAGGFLRIITKFDY)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRH3。在SEQ ID NO: 50中，由位置45至54 (GYTFTSYYIS)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRH1，由位置69至78(FINPGSGHTN)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRH2，并且由位置118至131(GAGGFLRIITKFDY)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRH3。在SEQ ID NO: 52中，由位置45至54 (GYTFTSYYIS)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRH1，由位置69至78 (FINPGSGHTN)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRH2，并且由位置118至131 (GAGGFLRIITKFDY)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRH3。在SEQ ID NO: 54中，由位置45至54 (GYTFTSYYIS)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRH1，由位置69至78 (FINPGSGHTN)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRH2，并且由位置118至131 (GAGGFLRIITKFDY)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRH3。在SEQ ID NO: 56中，由位置45至54 (GYTFTSYYIS)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRH1，由位置69至78 (FINPGSGHTN)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRH2，并且由位置118至131(GAGGFLRIITKFDY)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRH3。
在SEQ ID NO: 58中，由位置44至54 (RASKSVSTYIH)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRL1，由位置70至76 (SASNLES)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRL2，并且由氨基酸位置109至117 (QQINELPYT)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRL3。在SEQ ID NO: 60中，由位置44至54 (RASKSVSTYIH)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRL1，由位置70至76(SASNLES)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRL2，并且由氨基酸位置109至117(QQINELPYT)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRL3。在SEQ ID NO: 62中，由位置44至54(RASKSVSTYIH)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRL1，由位置70至76 (SASDRES)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRL2，并且由氨基酸位置109至117 (QQINELPYT)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRL3。在SEQ ID NO: 64中，由位置44至54 (RASKSVSTYIH)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRL1，由位置70至76 (SAGNLES)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRL2，并且由氨基酸位置109至117 (QQINELPYT)的氨基酸残基组成的序列对应于CDRL3。
应注意，术语“数个”在本说明书中用于表示1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1或2。
本说明书中的氨基酸取代优选为保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是在与氨基酸侧链相关的氨基酸组内发生的取代。优选的氨基酸基团如下：酸性基团=天冬氨酸和谷氨酸；碱性基团=赖氨酸、精氨酸和组氨酸；非极性基团=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸；和不带电极性家族=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。其他优选的氨基酸基团如下：脂族羟基基团=丝氨酸和苏氨酸；含酰胺基团=天冬酰胺和谷氨酰胺；脂肪族基团=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；芳香族基团=苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。优选进行这种氨基酸取代而不损害具有原始氨基酸序列的物质的特性。
具有上述重链和轻链的优选组合的抗体的实例可包括：由具有以SEQ ID NO: 48中氨基酸位置20至142的氨基酸序列组成的可变区的重链和具有以SEQ ID NO: 64中氨基酸位置21至129的氨基酸序列组成的可变区的轻链组成的抗体，由具有以SEQ ID NO: 52中氨基酸位置20至142的氨基酸序列组成的可变区的重链和具有以SEQ ID NO: 60中氨基酸位置21至129的氨基酸序列组成的可变区的轻链组成的抗体，由具有以SEQ ID NO: 54中氨基酸位置20至142的氨基酸序列组成的可变区的重链和具有以SEQ ID NO: 58中氨基酸位置21至129的氨基酸序列组成的可变区的轻链组成的抗体，由具有以SEQ ID NO: 56中氨基酸位置20至142的氨基酸序列组成的可变区的重链和具有以SEQ ID NO: 58中氨基酸位置21至129的氨基酸序列组成的可变区的轻链组成的抗体，由具有以SEQ ID NO: 56中氨基酸位置20至142的氨基酸序列组成的可变区的重链和具有以SEQ ID NO: 62中氨基酸位置21至129的氨基酸序列组成的可变区的轻链组成的抗体，和由具有以SEQ ID NO: 50中氨基酸位置20至142的氨基酸序列组成的可变区的重链和具有以SEQ ID NO: 64中氨基酸位置21至129的氨基酸序列组成的可变区的轻链组成的抗体。
具有更优选组合的抗体的实例可包括：由具有以SEQ ID NO: 48中氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链和具有以SEQ ID NO: 64中氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的可变区的轻链组成的抗体，由具有以SEQ ID NO: 52中氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链和具有以SEQ ID NO: 60中氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的可变区的轻链组成的抗体，由具有以SEQ ID NO: 54中氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链和具有以SEQ ID NO: 58中氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的可变区的轻链组成的抗体，由具有以SEQ ID NO: 56中氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的的重链和具有以SEQ ID NO: 58中氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链组成的抗体，由具有以SEQ ID NO: 56中氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链和具有以SEQ ID NO: 62中氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链组成的抗体，和由具有以SEQ ID NO: 50中氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链和具有以SEQ ID NO: 64中氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链组成的抗体。
通过将显示与上述重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列高度同源的序列组合在一起，可以选择与上述抗体中的每一个具有等同的生物活性的抗体。此同源性通常为80％或更多、优选90％或更多、更优选95％或更多且最优选99％或更多的同源性。此外，通过相互组合包含对于重链或轻链的氨基酸序列的一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列，也可以选择与上述抗体中的每一个具有等同的生物活性的抗体。
两种氨基酸序列之间的同源性可以使用Blast算法2.2.2版的默认参数确定(Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, JinghuiZhang, Zheng Zhang, Webb Miller, 和David J. Lipman(1997), "Gapped BLAST andPSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", NucleicAcids Res.25: 3389-3402)。也可以通过互联网访问www.ncbi.nlm.nih.gov/blast使用Blast算法。
应注意，在序列表中SEQ ID NO: 48、50、52、54或56所示的重链氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置20至142的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置143至472的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。SEQ ID NO: 48的序列显示在图9中，SEQ ID NO: 50的序列显示在图10中，SEQ ID NO: 52的序列显示在图11中，SEQ ID NO: 54的序列显示在图12中，和SEQ ID NO: 56的序列显示在图13中。
此外，在序列表中SEQ ID NO: 58、60、62或64所示的轻链氨基酸序列中，由位置1至20的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置21至129的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置130至234的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。SEQID NO: 58的序列显示在图14中，SEQ ID NO: 60的序列显示在图15中，SEQ ID NO: 62的序列显示在图16中，和SEQ ID NO: 62的序列显示在图17中。
本发明的抗体的其他实例可以包括结合GPR20的人抗体。抗-GPR20人抗体是指仅具有衍生自人染色体的抗体的基因序列的人抗体。抗-GPR20人抗体可以通过使用具有人染色体片段的产生人抗体的小鼠的方法获得，所述人染色体片段包含人抗体的重链和轻链基因(参见Tomizuka, K.等人, Nature Genetics(1997)16, p. 133-143；Kuroiwa, Y. 等人, Nucl.Acids Res.(1998)26, p. 3447-3448；Yoshida, H. 等人, Animal CellTechnology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y.,Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999；Tomizuka,K.等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97, p. 722-727；等)。
这种产生人抗体的小鼠可以通过使用遗传修饰的动物特异性地产生，其内源免疫球蛋白重链和轻链的基因座已经被破坏，并且代之以使用酵母人工染色体(YAC)载体等引入人免疫球蛋白重链和轻链的基因座，随后从这种基因修饰动物产生敲除动物和转基因动物，并且随后将这些动物彼此繁殖。
另外，根据遗传重组技术，也可以通过使用编码这种人抗体的每条重链和轻链的cDNA，或优选用包含所述cDNA的载体转化真核细胞，并随后培养转化的细胞，产生遗传修饰的人单克隆抗体，从而可以从培养物上清液中获得抗体，来获得抗-GPR20人抗体。
在本文中，可以使用真核细胞，并优选哺乳动物细胞，例如CHO细胞、淋巴细胞或骨髓瘤，例如作为宿主。
此外，获得已从人抗体文库中选择的噬菌体展示衍生的人抗体的方法也是已知的(参见Wormstone，IM等人，Investigative Ophthalmology＆Visual Science.(2002)43(7), p.2301-2308；Carmen, S.等人, Briefings in Functional Genomics andProteomics(2002), 1 (2), p. 189-203；Siriwardena, D. 等人, Ophthalmology(2002)109 (3), p. 427-431；等)。
例如，可以应用噬菌体展示方法，其包括使人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)在噬菌体表面上表达，且然后选择与抗原结合的噬菌体(Nature Biotechnology(2005),23,(9), pp. 1105-1116)。
通过分析由于其与抗原的结合能力而被选择的噬菌体基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。
一旦确定了与抗原结合的scFv的DNA序列，就产生具有上述序列的表达载体，然后将产生的表达载体导入合适的宿主中并允许其在其中表达，从而产生人抗体(国际公开号WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438,和WO95/15388, Annu.Rev. Immunol(1994)12, p. 433-455, Nature Biotechnology(2005)23 (9), p. 1105-1116)。
如果新产生的人抗体与本说明书中描述的04-046抗体所结合的部分肽或部分三维结构结合，则可以是确定所述人抗体结合04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体结合的相同表位。此外，通过确认人抗体与04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体竞争抗体与GPR20的结合(即人抗体干扰04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体与GPR20的结合)，可以确定人抗体结合04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体所结合的相同表位，即使表位的特定序列或结构具有尚未确定。当确认人抗体结合04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体所结合的相同表位时，则强烈预期人抗体应当具有等同于04-046抗体、04-079抗体或04-126抗体的生物活性。
根据已知方法等评价通过上述方法获得的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体对抗原的结合活性，从而可以选择优选的抗体。
用于比较抗体特性的另一指标的一个实例可以包括抗体的稳定性。差示扫描量热计(DSC)是能够迅速而精确地测量热变性中点(Tm)的装置，所述热变性中点(Tm)充当蛋白的相对结构稳定性的良好指标。通过使用DSC测量Tm值并对获得的值进行比较，可以比较热稳定性的差异。已知抗体的保存稳定性与抗体的热稳定性具有一定的相关性(Lori Burton等人，Pharmaceutical Development and Technology(2007)12，第265-273页)，并且因此，可以使用热稳定性作为指标来选择的优选抗体。用于选择抗体的其他指标的其他实例包括在合适的宿主细胞中的高产率和在水溶液中的低凝集性。例如，由于具有最高产率的抗体并不总是表现出最高的热稳定性，因此有必要通过基于上述指标对其进行综合确定来选择最适合于对人施用的抗体。
本发明的抗体还包括抗体的修饰。所述修饰用于表示本发明的抗体，其是化学或生物学修饰的。这种化学修饰的实例包括化学部分与氨基酸骨架的结合，以及N-连接或O-连接的碳水化合物链的化学修饰。这种生物学修饰的实例包括已经历翻译后修饰的抗体(例如，N-连接或O-连接的糖基化、N-末端或C-末端加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化和甲硫氨酸的氧化)和由于允许使用原核生物宿主细胞表达，而向其N-末端添加甲硫氨酸残基的抗体。另外，这种修饰意味着还包括能够检测或分离本发明的抗体或抗原的标记抗体，例如酶标记抗体，荧光标记抗体和亲和标记抗体。本发明的抗体的这种修饰可用于改善抗体的血液中的稳定性和保留、降低抗原性、检测或分离抗体或抗原等。
此外，通过调节与本发明的抗体结合的糖链修饰(糖基化、去岩藻糖基化等)，可以增强抗体依赖性细胞毒性活性。作为调节抗体的糖链修饰的技术，国际公开号WO1999/54342、WO2000/61739和WO2002/31140等中描述的那些是已知的，但是技术不限于此。本发明的抗体还包括其中已经调节上述糖链修饰的抗体。
一旦分离出抗体基因，可以使用宿主和表达载体的适当组合将基因导入适当的宿主以产生抗体。抗体基因的具体实例可以是编码本说明书中描述的抗体的重链序列的基因和编码其中描述的抗体的轻链序列的基因的组合。在转化宿主细胞后，可以将这种重链序列基因和轻链序列基因插入单个表达载体中，或者可以将这些基因各自插入不同的表达载体中。
当真核细胞用作宿主时，可以使用动物细胞、植物细胞或真核微生物。具体地，动物细胞的实例可包括哺乳动物细胞，例如作为猴细胞的COS细胞(Gluzman，Y.，Cell(1981)23，p.175-182，ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658)、中国仓鼠卵巢细胞的二氢叶酸还原酶缺陷型细胞系(CHO细胞，ATCC CCL-61)(Urlaub，G.和Chasin，LA Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77, p. 4126-4220)，和FreeStyle 293F 细胞(Invitrogen Corp.)。
当原核细胞用作宿主时，例如可以使用大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
将目标抗体基因引入这些细胞中进行转化，并且随后在体外培养转化的细胞以获得抗体。在上述培养中，存在产率取决于抗体的序列而不同的情况，且因此可以使用产率作为指标，从具有等同结合活性的抗体选择容易作为药物产生的抗体。因此，本发明的抗体还包括通过上述抗体产生方法获得的抗体，其包括培养转化的宿主细胞的步骤和从上述步骤获得的培养物中收集目标抗体或抗体的功能片段的步骤。
已知在培养的哺乳动物细胞中产生的抗体的重链的羧基末端的赖氨酸残基缺失(Journal of Chromatography A, 705:129-134 (1995))，并且此外，已知在重链羧基末端的两个氨基酸残基甘氨酸和赖氨酸缺失，并且位于羧基末端的脯氨酸残基被新酰胺化(Analytical Biochemistry, 360:75-83 (2007))。然而，这些重链序列的缺失和修饰对抗体的抗原-结合活性和效应子功能(补体的活化、抗体依赖性细胞毒性等)没有影响。因此，根据本发明的抗体也包括已经历上述修饰的抗体，和所述抗体的功能片段，并且此类抗体的特定实例包括包含在重链羧基端的1或2个氨基酸缺失的缺失突变体，和通过酰胺化上述缺失突变体(例如其在羧基末端的脯氨酸残基被酰胺化的重链)形成的缺失突变体。然而，涉及根据本发明的抗体重链的羧基末端缺失的缺失突变体不限于上述缺失突变体，只要它们保留抗原结合活性和效应子功能即可。构成根据本发明的抗体的两条重链可以是选自全长抗体和上述缺失突变体的组的任一类型的重链，或者可以是选自上述组的任意两种类型的组合。各个缺失突变体的比例可受产生本发明抗体的培养的哺乳动物细胞的类型和培养条件的影响。根据本发明的抗体的主要成分的实例可包括其中在两条重链的每个羧基末端缺失一个氨基酸残基的抗体。
本发明抗体同种型的实例可包括IgG (IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。其中，优选IgG1和IgG2。
抗体的生物学活性的实例通常可以包括抗原结合活性，通过与抗原结合而内化到表达抗原的细胞中的活性，中和抗原活性的活性，增强抗原活性的活性，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性，补体依赖性细胞毒性(CDC)活性和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。根据本发明的抗体的功能是对GPR20的结合活性，并且优选通过与GPR20结合而内化到表达GPR20的细胞中的活性。此外，本发明的抗体可具有ADCC活性、CDC活性和/或ADCP活性，以及细胞内化活性。
可以将获得的抗体纯化至同质状态。为了分离和纯化抗体，可以使用用于普通蛋白质的分离和纯化方法。例如，适当选择柱层析、过滤、超滤、盐析、透析、制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦，并且使之相互结合，以便可以分离和纯化抗体(Strategies forProtein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, DanielR. Marshak等人编, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；和Antibodies: ALaboratory Manual.Ed Harlow和David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但分离和纯化方法的实例不限于此。
所述层析的实例可以包括亲和层析、离子交换层析、疏水性层析、凝胶过滤层析、反向层析和吸附层析。
这些层析技术可以使用液相层析诸如HPLC或FPLC进行。
用于亲和层析的柱的实例可以包括蛋白A柱和蛋白G柱。涉及使用蛋白A的柱的实例可包括Hyper D、POROS和Sepharose FF(Pharmacia)。
此外，使用抗原固定的载体，可以通过利用抗体与抗原的结合活性来纯化抗体。
3. 抗GPR20抗体-药物缀合物
(1)药物
在上述“2. 抗-GPR20抗体的产生”中获得的抗-GPR20抗体可以通过接头结构部分与药物缀合，以制备抗GPR20抗体-药物缀合物。药物没有特别限制，只要其具有可以连接到接头结构的取代基或部分结构即可。根据缀合的药物，抗-GPR20抗体-药物缀合物可用于各种目的。这种药物的实例可以包括具有抗肿瘤活性的物质，对血液疾病有效的物质，对自身免疫疾病有效的物质，抗炎物质，抗微生物物质，抗真菌物质，抗寄生虫物质，抗病毒物质和抗麻醉物质。
(1)-1抗肿瘤化合物
下面将描述使用抗肿瘤化合物作为在本发明的抗-GPR20抗体-药物缀合物中缀合的化合物的实例。抗肿瘤化合物没有特别限制，只要该化合物具有抗肿瘤效果并且具有可以与接头结构连接的取代基或部分结构即可。在肿瘤细胞中切割部分或全部接头后，释放抗肿瘤化合物部分，使得抗肿瘤化合物显示出抗肿瘤效果。当在与药物的连接位置裂解接头时，抗肿瘤化合物以其原始结构释放以发挥其原有抗肿瘤效果。
在上述“2. 抗-GPR20抗体的产生”中获得的抗-GPR20抗体可以通过接头结构部分与抗肿瘤化合物缀合，以制备抗GPR20抗体-药物缀合物。
作为本发明中使用的抗肿瘤化合物的一个实例，可以优选使用喜树碱衍生物依沙替康(exatecan) ((1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13 (9H,15H)-二酮，由下式表示)。
[式6]
所述化合物可以通过例如美国专利公开号US2016/0297890中描述的方法或其他已知方法容易地获得，并且位置1的氨基可以优选用作与接头结构的连接位置。进一步地，依沙替康可以在肿瘤细胞中释放，而接头的部分仍然附着于其上。然而，即使在这种状态下，所述化合物也发挥出色的抗肿瘤效果。
由于依沙替康具有喜树碱结构，因此已知在酸性含水介质(例如，约3的pH)中平衡移向具有形成的内酯环(闭环)的结构，而在碱性水性介质(例如，约10的pH)中平衡移向具有打开的内酯环(开环)的结构。预期已经引入了对应于这种闭环结构和开环结构的依沙替康残基的药物缀合物也具有等同的抗肿瘤效果，并且毋庸置言，任何这样的药物缀合物都包括在本发明的范围内。
抗肿瘤化合物的其他实例可包括文献中描述的抗肿瘤化合物(PharmacologicalReviews，68，第3-19页，2016)。其具体实例可包括多柔比星、卡奇霉素、多拉司他汀10、澳瑞他汀类，如单甲基澳瑞他汀E (MMAE)和单甲基澳瑞他汀F(MMAF)；美登素类，如DM1和DM4；吡咯并苯二氮杂二聚体SG2000 (SJG-136)、喜树碱衍生物SN-38、倍癌霉素(duocarmycins)，如CC-1065、鹅膏蕈碱、柔红霉素、丝裂霉素C、博来霉素、环胞苷、长春新碱、长春碱、甲氨蝶呤、基于铂的抗肿瘤剂(顺铂及其衍生物)以及紫杉醇及其衍生物。
在抗体-药物缀合物中，每个抗体分子的缀合药物分子的数量是对其功效和安全性具有影响的关键因素。抗体-药物缀合物的产生通过指定反应条件，如用于反应的起始材料和试剂的量而进行，从而获得恒定数量的缀合药物分子。与低分子量化合物的化学反应不同，通常获得含有不同数量的缀合药物分子的混合物。定义每抗体分子的缀合药物分子的数量，并表示为平均值，即缀合药物分子的平均数。除非另有说明，即，除了代表包含在具有不同数量的缀合药物分子的抗体-药物缀合物混合物中的，具有特定数量的缀合药物分子的抗体-药物缀合物的情况外，根据本发明的缀合药物分子的数量通常表示平均值。与抗体分子缀合的依沙替康分子的数量是可控的，并且作为每抗体的缀合药物分子的平均数量，可以缀合约1至10个依沙替康分子。依沙替康分子的数量优选为2至8，更优选为5至8，进一步优选为7至8，还更优选为8。应注意，本领域技术人员可以基于本申请的实施例的描述，设计用于将所需数量的药物分子与抗体分子缀合的反应，并且可以获得具有受控数量的缀合依沙替康分子的抗体-药物缀合物。
(2)接头结构
现将描述在本发明的抗-GPR20抗体-药物缀合物中，将药物与抗-GPR20抗体缀合的接头结构。
在本申请的抗体-药物缀合物中，将抗-GPR20抗体与药物缀合的接头结构没有特别限制，只要可以使用所得抗体-药物缀合物即可。可以根据使用目的，适当选择和使用接头结构。接头结构的一个实例可包括已知文献中描述的接头(Pharmacol Rev 68：3-19，2016年1月，Protein Cell DOI 10.1007/s13238-016-0323-0等)。其进一步的具体实例可以包括VC(缬氨酸-瓜氨酸)、MC(马来酰亚胺己酰基)、SMCC(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)、SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯、SS(二硫化物)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯、SS/腙、腙和碳酸酯。
接头结构的另一个实例可包括美国专利公开号US2016/0297890中描述的接头结构(作为一个实例，在[0260]至[0289]段中描述的那些)。可以优选使用下面给出的任何接头结构。应注意，结构的左末端是与抗体的连接位置，并且其右末端是与药物的连接位置。此外，下面给出的接头结构中的GGFG表示由通过肽键连接的甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸组成的氨基酸序列。
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, 和
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
更优选以下：
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, 和
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
仍更优选以下：
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, 和
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
抗体连接到-(琥珀酰亚胺-3-基-N)的末端(例如，与“-CH2CH2CH2CH2CH2-”在“-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-”中的连接键相对的键(左侧键))，且抗肿瘤化合物连接到与形成-(琥珀酰亚胺-3-基-N)的末端相对的末端(上述实施例中，在右端的CH2-O-CH2-C(=O)-的羰基)。“-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-”具有由下式表示的结构：
[式7]
。
该部分结构的位置3是用于抗-GPR20抗体的连接位置。与位置3处的抗体的这种连接的特征在于形成硫醚键。该结构部分的1位的氮原子与包含该结构的接头内存在的亚甲基的碳原子连接。
在具有依沙替康作为药物的本发明的抗体-药物缀合物中，具有下文给出的任何结构的药物-接头结构部分优选用于与抗体缀合。对于这些药物-接头结构部分，每个抗体的平均缀合数可以是1至10，并且优选为2至8，更优选为5至8，进一步优选为7至8，并且还更优选为8。
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), 和
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
更优选以下：
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), 和
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
仍更优选以下：
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),和
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
进一步优选以下：
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)。
(3)产生抗体-药物缀合物的方法
可用于本发明的抗体-药物缀合物的抗体没有特别限制，只要它是具有内化活性的抗-GPR20抗体或抗体的功能片段，如上文“2. 抗-GPR20抗体的产生”部分和实施例中所述。
接下来，将参考具体实例描述产生本发明的抗体-药物缀合物的方法。应注意，在下面的描述中，每个反应方案中所示的化合物编号用于表示化合物。具体地，将每种化合物称为“式(1)的化合物”，“化合物(1)”等。对于其他化合物编号也是如此。
(3)-1产生方法1
由下面给出的式(1)表示的抗体-药物缀合物(其中抗-GPR20抗体经由硫醚连接至接头结构)，可以通过如下产生：使具有通过还原抗GPR20抗体从二硫键转化的巯基的抗体，与可通过已知方法(例如，可通过专利公开文献US2016/297890中描述的方法(例如，在[0336]至[0374]段中描述的方法)获得)的化合物(2)反应。例如，该抗体-药物缀合物可以通过以下方法产生：
[式8]
其中AB代表具有巯基的抗体，其中
L1具有由-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-表示的结构，且
L1'表示由下式表示的马来酰亚胺基：
[式9]
-L1-LX具有由下式中的任一个表示的结构：
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, 和
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
其中，更优选以下：
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, 和
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
进一步优选以下：
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, 和
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
-(NH-DX)具有由下式表示的结构：
[式10]
并且它代表通过去除依沙替康的位置1处的氨基的一个氢原子而衍生的基团。在上述反应方案中，式(1)化合物可以解释为具有如下结构，其中从药物到接头末端的一个结构部分与一个抗体连接。然而，该描述为了方便起见而给出，并且实际上存在很多其中多个上述结构部分与一个抗体分子连接的情况。对于下面描述的产生方法的说明也是如此。
具体地，抗体-药物缀合物(1)可以通过使可通过已知方法(例如，可通过专利公开文献US2016/297890中描述的方法(例如，在[0336]至[0374]段中描述的方法)获得)获得的化合物(2)与具有巯基的抗体(3a)反应而产生。
抗体(3a)上的巯基的提供可以通过本领域技术人员熟知的方法完成(Hermanson，GT，Bioconjugate Techniques，pp.56-136，pp.456-493，Academic Press(1996))。该方法的实例可以包括但不限于：Traut试剂与抗体的氨基反应；N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代链烷酸酯与抗体的氨基反应，随后与羟胺反应；N-琥珀酰亚胺基3-(吡啶基二硫代)丙酸酯与抗体反应，随后与还原剂反应；使抗体与还原剂如二硫苏糖醇，2-巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)反应，以还原抗体中的链间二硫键，从而形成巯基。
具体地，通过对抗体中每个链间二硫键使用0.3至3摩尔当量的TCEP作为还原剂，并使还原剂与抗体在含有螯合剂的缓冲液中反应，可以获得具有部分或完全还原的链间二硫键的抗体。螯合剂的实例可包括乙二胺四乙酸(EDTA)和二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)。螯合剂可以以1mM至20mM的浓度使用。可以使用磷酸钠、硼酸钠、乙酸钠等的溶液作为缓冲溶液。作为具体实例，通过使抗体与TCEP在4℃至37℃下反应1至4小时，可以获得具有部分或完全还原的巯基的抗体(3a)。
应注意，通过进行巯基与药物-接头部分的加成反应，药物-接头部分可通过硫醚键缀合。
然后，对于每个具有巯基的抗体(3a)，使用2至20摩尔当量的化合物(2)，可以产生其中每抗体缀合有2至8个药物分子的抗体-药物缀合物(1)。具体地，可以将含有溶解在其中的化合物(2)的溶液添加至含有用于反应的具有巯基的抗体(3a)的缓冲溶液中。在此方面，可以使用乙酸钠溶液、磷酸钠溶液、硼酸钠溶液等作为缓冲溶液。反应的pH为5至9，并且更优选地，反应可在pH 7附近进行。有机溶剂如二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)可用作溶解化合物(2)的溶剂。可以通过将含有溶解在有机溶剂中的化合物(2)的溶液以1至20％v/v添加到含有具有巯基的抗体(3a)的缓冲溶液中来进行反应。反应温度为0至37℃，更优选10至25℃，并且反应时间为0.5至2小时。可以通过使用含硫醇的试剂使未反应的化合物(2)的反应性失活，而终止反应。含硫醇的试剂是例如半胱氨酸或N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)。更具体地，可以通过向所用的化合物(2)中添加1-2摩尔当量的NAC，并在室温下温育所得混合物10-30分钟，而终止反应。
(4)抗体-药物缀合物的鉴定
可以根据下述常规程序，对产生的抗体-药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物(1))进行浓缩、缓冲液交换、纯化并测量抗体浓度以及每抗体分子的缀合药物分子的平均数，以鉴定抗体-药物缀合物(1)。
(4)-1常规程序A：抗体或抗体-药物缀合物的水溶液的浓缩
向Amicon Ultra(50,000 MWCO，Millipore Corporation)容器中，添加抗体或抗体-药物缀合物的溶液，并使用离心机(Allegra X-15R，Beckman Coulter, Inc.)，通过离心浓缩抗体或抗体-药物缀合物的溶液(在2000G至3800G离心5至20分钟)。
(4)-2常规程序B：抗体浓度的测量
使用UV检测器(Nanodrop 1000，Thermo Fisher Scientific Inc.)，根据制造商定义的方法进行抗体浓度的测量。在这方面，使用280nm吸光系数区分抗体(1.3 mLmg-1cm-1至1.8 mLmg-1cm-1)。
(4)-3常规程序C：抗体的缓冲液交换
根据制造商定义的方法，使用含有氯化钠(50mM)和EDTA (2mM)的磷酸盐缓冲(50mM，pH6.0) (在本说明书中称为PBS6.0/EDTA)平衡使用Sephadex G-25载体的NAP-25柱(目录号17-0852-02，GE Healthcare Japan Corporation)。以每NAP-25柱2.5mL的量施加抗体水溶液，并且然后收集用3.5mL PBS6.0/EDTA洗脱的级分(3.5mL)。通过常规程序A浓缩该级分。在使用常规程序B测量抗体浓度后，使用PBS6.0/EDTA将抗体浓度调节至20mg/mL。
(4)-4常用程序D：抗体-药物缀合物的纯化
使用任何商购可得的缓冲溶液平衡NAP-25柱，例如含有山梨糖醇(5％)的乙酸盐缓冲液(10mM，pH5.5；在本说明书中称为ABS)。将抗体-药物缀合物的水性反应溶液(约2.5mL)施加到NAP-25柱，并且然后用制造商定义的量的缓冲溶液进行洗脱，以收集抗体级分。将凝胶过滤纯化过程重复总共2或3次以获得抗体-药物缀合物，排除非缀合的药物接头和低分子量化合物(三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)和二甲基亚砜)，在所述凝胶过滤纯化过程中，将收集的级分再次施加到NAP-25柱，并用缓冲溶液进行洗脱。
(4)-5常规程序E：抗体-药物缀合物中抗体浓度和每抗体分子的缀合药物分子的平均数量的测量
抗体-药物缀合物中的缀合药物浓度可以通过如下计算：测量抗体-药物缀合物的水溶液在280nm和370nm的两个波长下的UV吸光度，且然后进行如下所示的计算。
在任何给定波长下的总吸光度等于系统中存在的所有光吸收化学物质的吸光度之和[吸光度的相加性]。因此，基于抗体和药物的缀合之前和之后，抗体和药物的摩尔吸光系数不变的假设，抗体-药物缀合物中的抗体浓度和药物浓度由以下等式表示。
等式(1)
等式(2)。
在本文中，A280表示抗体-药物缀合物的水溶液在280nm处的吸光度，A370表示抗体-药物缀合物的水溶液在370nm处的吸光度，AA，280表示抗体在280nm处的吸光度，AA，370表示抗体在370nm处的吸光度，AD，280表示缀合物前体在280nm处的吸光度，AD，370表示缀合物前体在370nm处的吸光度，εA，280表示抗体在280nm处的摩尔吸光系数，εA，370表示抗体在370nm处的摩尔吸光系数，εD，280表示缀合物前体在280nm处的摩尔吸光系数，εD，370表示缀合物前体在370nm处的摩尔吸光系数，CA表示抗体-药物缀合物中的抗体浓度，且CD表示抗体-药物缀合物中的药物浓度。
在此方面，关于εA,280，εA,370，εD,280和εD,370，使用预先准备的值(基于计算的估计值或通过化合物的UV测量获得的测量值)。例如，可以通过已知的计算方法(ProteinScience,1995, vol.4, 2411-2423)，从抗体的氨基酸序列预估εA,280。εA,370通常为零。εD,280和εD,370可以根据Lambert-Beer定律(吸光度=摩尔浓度✕摩尔吸光系数✕细胞通道长度)通过测量溶液的吸光度来获得，所用的缀合物前体以一定的摩尔浓度溶解于在所述溶液中。CA和CD可以通过测量抗体-药物缀合物的水溶液的A280和A370，且然后通过替换这些值来求解联立方程(1)和(2)来确定。此外，通过CD除以CA，可以确定每抗体的缀合药物分子的平均数。
(4)-6常规程序F：抗体-药物缀合物-(2)中每抗体分子的缀合药物分子的平均数的测量
除了上述“(4)-5常规程序E”之外，抗体-药物缀合物中每抗体分子的缀合药物分子的平均数也可以通过使用以下方法的高效液相层析(HPLC)分析来确定。在下文中，将描述当抗体通过二硫键与药物接头缀合时，通过HPLC测量缀合的药物分子的平均数的方法。参考该方法，本领域技术人员能够通过HPLC适当地测量缀合的药物分子的平均数，这取决于抗体和药物接头之间的连接模式。
F-1.用于HPLC分析的样品的制备(抗体-药物缀合物的还原)
将抗体-药物缀合物溶液(约1mg/mL，60μL)与二硫苏糖醇(DTT)(100mM，15μL)的水溶液混合。通过在37℃下孵育混合物30分钟，裂解抗体-药物缀合物的轻链和重链之间的二硫键。所得样品用于HPLC分析。
F-2.HPLC分析
在以下测量条件下进行HPLC分析。
HPLC系统：Agilent 1290 HPLC系统(Agilent Technologies, Inc.)
检测器：紫外吸收光谱仪(测量波长：280 nm)
柱：ACQUITY UPLC BEH苯基(2.1✕50mm，1.7μm，130埃；Waters Corp., P/N186002884)
柱温：80℃
流动相A：含有0.10％三氟乙酸(TFA)和15％ 2-丙醇的水溶液
流动相B：含有0.075％TFA和15％ 2-丙醇的乙腈溶液
梯度程序：14％-36％(0分钟-15分钟)，36％-80％(15分钟-17分钟)，80％-14％(17分钟-17.01分钟)和14％(17.01分钟-25分钟)
样品注射：10μL
或
HPLC系统：Agilent 1290 HPLC系统(Agilent Technologies, Inc.)
检测器：紫外吸收光谱仪(测量波长：280 nm)
柱：PLRP-S (2.1×50mm，8μm，1000埃；Agilent Technologies, Inc., P/N PL1912-1802)
柱温：80℃
流动相A：0.04％TFA水溶液
流动相B：含有0.04％TFA的乙腈溶液
梯度程序：29％-36％(0分钟-12.5分钟)，36％-42％(12.5分钟-15分钟)，42％-29％(15分钟-15.1分钟)和29％-29％(15.1分钟-25分钟)
样品注射：15μL。
F-3.数据分析
F-3-1. 按照缀合物药物分子的数目，抗体的轻链和重链分别用Li和Hi表示，其中i表示缀合药物分子的数目，即由L0，L1，H0，H1，H2，H3等表示根据本发明的缀合药物分子的数目。
与非缀合的抗体轻链(L0)和重链(H0)相比，与一个药物分子结合的轻链(L1)，与一个药物分子结合的重链(H1)，与两个药物分子结合的重链(H2)和与三个药物分子结合的重链(H3)，表现出与缀合的药物分子数量成比例的更高的疏水性，并且因此具有更大的保留时间。因此，这些链以L0和L1或H0，H1，H2和H3的顺序洗脱。通过与L0和H0的保留时间比较，可以将检测峰分配给L0，L1，H0，H1，H2和H3中的任何一个。
F-3-2. 由于药物接头吸收UV，根据以下表达式，使用轻链或重链和药物接头的摩尔吸光系数，响应于缀合的药物接头分子的数量校正峰面积值。
[表达式1]
[表达式2]
。
在此方面，通过已知的计算方法(Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423)，从每种抗体的轻链或重链的氨基酸序列估计的值可以用作抗体的轻链或重链的摩尔吸光系数(280nm)。在h046-H4e/L7的情况下，根据抗体的氨基酸序列，分别使用摩尔吸光系数26210和摩尔吸光系数68990作为轻链和重链的估计值。将如下化合物的实际测量的摩尔吸光系数(280nm)用作药物接头的摩尔吸光系数(280nm)，在所述化合物中，已通过每个药物接头与巯基乙醇或N-乙酰半胱氨酸的反应，将马来酰亚胺基团转化为琥珀酰亚胺硫醚。吸光度测定的波长可以由本领域技术人员适当设定，但优选为能够测定抗体峰的波长，更优选为280nm。
F-3-3.根据以下表达式，计算每个链的峰面积比(％)，以获得峰面积的校正值的总和。
[表达式3]
。
F-3-4. 根据以下表达式，计算抗体-药物缀合物中每抗体分子的缀合药物分子的平均数。
缀合药物分子的平均数=(L0峰面积比×0+L0峰面积比×1+H0峰面积比×0+H1峰面积比×1+H2峰面积比×2+H3峰面积比×3)/100×2。
在产生方法1中，通过式(2)表示的化合物是具有下式中任一种的化合物。
应注意，为了确保缀合物的量，可以混合已在类似条件下产生的具有几乎相同的缀合药物分子的平均数(例如，约±1)的多个缀合物，以制备一个新的批次。在此方面，药物分子的平均数落在混合之前的药物分子的平均数之间。
用于本发明中的抗体-药物缀合物的一个具体实例可包括其中药物-接头结构部分由下式表示的抗体-药物缀合物：
[式11]
其中A代表与抗体的连接位置，
其通过硫醚键缀合至本说明书中公开的抗-GPR20抗体。
在本发明中，由抗体-药物缀合物中的接头和药物组成的部分结构也称为“药物-接头结构”，“药物-接头结构部分”或“药物接头”。该药物接头连接至在抗体的链间二硫键位点(两个重链-重链位置和两个重链-轻链位置)形成的硫醇基团(换言之，半胱氨酸残基的硫原子)。
本发明的抗体-药物缀合物的一个具体实例可包括具有由下式表示的结构的抗体-药物缀合物：
[式12]
或具有由下式表示的结构的抗体-药物缀合物：
[式13]
。
在此方面，AB代表本说明书中公开的抗-GPR20抗体，并且抗体通过衍生自抗体的巯基与药物接头缀合。在此方面，n具有与所谓的DAR (药物与抗体比)相同的含义，并且表示每抗体的药物与抗体比率。具体地，n表示每抗体分子的缀合药物分子的数量，其是定义的数值并且表示为平均值，即缀合的药物分子的平均数。在由本发明的[式5]或[式6]表示的抗体-药物缀合物的情况下，在通过常规程序F的测量中，n可以是2至8，并且优选为5至8，更优选为7至8，并且更多优选为8。
本发明的抗体-药物缀合物的一个实例可包括具有由上述式[式10]或[式11]表示的结构的抗体-药物缀合物，其中由AB表示的抗体是具有选自下列组合(a)至(y)的任一组合中的重链和轻链的抗体，或抗体的功能片段，或抗体-药物缀合物的药理学上可接受的盐：具有选自下列组合(a)至(y)的任一组合中的重链和轻链的抗体，或抗体的功能片段：
(a) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成轻链，
(b) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(c) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(d) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(e) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(f) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(g) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(h) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(i) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(j) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(k) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(1) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(m) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(n) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(o) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(p) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(q) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(r) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(s) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(t) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(u) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(v) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(w) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(x) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，和
(y)具有选自(a)至(x)的任一种组合的抗体，其中重链或轻链包含选自以下的一种或两种或多种修饰：N-连接糖基化，O-连接的糖基化，N-末端加工，C-末端加工，脱酰胺化，天冬氨酸的异构化，甲硫氨酸的氧化，在N-末端添加甲硫氨酸残基，脯氨酸残基的酰胺化和在羧基末端的一个或两个氨基酸的缺失。
4.药物
由于上述“2. 抗-GPR20抗体的产生”部分或实施例中描述的本发明的抗GPR20抗体或抗体的功能片段结合肿瘤细胞表面上的GPR20并具有内化活性，所以它可以单独或与另外药物组合用作药物，且特别是作为癌症(例如胃肠道间质瘤)的治疗剂。
此外，本发明的抗-GPR20抗体或抗体的功能片段可用于检测表达GPR20的细胞。
此外，因为本发明的抗-GPR20抗体或抗体的功能片段具有内化活性，可以将其哟工作抗体-药物缀合物中的抗体。
上述“3. 抗GPR20抗体-药物缀合物”部分和实施例中描述的本发明的抗GPR20抗体-药物缀合物(其中，使用具有抗肿瘤活性(如细胞毒活性)的药物作为药物)，是具有内化活性的抗GPR20抗体和/或抗体的功能片段，和具有抗肿瘤活性(如细胞毒活性)的药物的缀合物。由于该抗-GPR20抗体-药物缀合物对表达GPR20的癌细胞显示出抗肿瘤活性，因此它可以用作药物，且特别是用作癌症的治疗剂和/或预防剂。
本发明的抗-GPR20抗体-药物缀合物可以吸收水分或具有吸附水，例如，当其留在空气中或经历重结晶或纯化程序时变成水合物。这种含水的化合物或药理学上可接受的盐也包括在本发明中。
当本发明的抗-GPR20抗体-药物缀合物具有碱性基团如氨基时，如果需要，它可以形成药理学上可接受的酸加成盐。这种酸加成盐的实例可包括：氢卤化物，如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐；无机酸盐，如硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐和磷酸盐；低级链烷磺酸盐，如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐和乙磺酸盐；芳基磺酸盐，如苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐；有机酸盐，如甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐和马来酸盐；氨基酸盐、如鸟氨酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。
当本发明的抗-GPR20抗体-药物缀合物具有酸性基团如羧基时，如果需要，它可以形成药理学上可接受的碱加成盐。这种碱加成盐的实例可包括：碱金属盐、如钠盐、钾盐和锂盐；碱土金属盐、如钙盐和镁盐；无机盐、如铵盐；和有机胺盐如二苄胺盐、吗啉盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、二乙胺盐、三乙胺盐、环己胺盐、二环己胺盐、N,N'-二苄基乙二胺盐、二乙醇胺盐、N-苄基-N-(2-苯基乙氧基)胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐和三(羟甲基)氨基甲烷盐。
本发明还可包括抗-GPR20抗体-药物缀合物，其中构成抗体-药物缀合物的一个或多个原子替换为原子的同位素。存在两种类型的同位素：放射性同位素和稳定同位素。同位素的实例可以包括氢的同位素(2H和3H)，碳的同位素(11C，13C和14C)，氮的同位素(13N和15N)，氧的同位素(15O，17O和18O)和氟的同位素(18F)。包含用这种同位素标记的抗体-药物缀合物的组合物可用作例如治疗剂，预防剂，研究试剂，测定试剂，诊断剂和体内诊断成像剂。每个用同位素标记的抗体-药物缀合物的每一种，以及以任何给定比率的用同位素标记的抗体-药物缀合物的混合物都包括在本发明中。用同位素标记的抗体-药物缀合物可以例如通过使用用同位素标记的起始材料(代替用于下文根据本领域已知的方法提及的，本发明的生产方法的原料)来制备。
例如，可以基于抑制细胞增殖反应的活性来测量体外细胞毒性。例如，培养过表达GPR20的癌细胞系，并将抗-GPR20抗体-药物缀合物以不同浓度添加到培养系统中。此后，可以测量其对病灶形成，集落形成和球体生长的抑制活性。在此方面，可以通过使用胃肠道间质瘤(GIST)衍生的癌细胞系，检验针对胃肠道间质瘤的细胞增殖抑制活性。
可以在实验动物中测量对癌症的体内治疗效果，例如，通过将抗-GPR20抗体-药物缀合物施用至已经移植了高度表达GPR20的肿瘤细胞系的裸鼠，且然后测量癌细胞的变化。在此方面，通过使用通过移植胃肠道间质瘤衍生细胞而从免疫缺陷小鼠衍生的动物模型，可以测量对胃肠道间质瘤的治疗效果。
应用本发明的抗-GPR20抗体-药物缀合物的癌症的类型没有特别限制，只要癌症在待治疗的癌细胞中表达GPR20即可。其实例可包括消化器官中的癌症，例如食道，胃，小肠和大肠，但癌症不限于此，只要癌症表达GPR20即可。更优选的癌症实例可包括胃肠道间质瘤(GIST)。
本发明的抗-GPR20抗体-药物缀合物可以优选施用至哺乳动物，且更优选施用至人。
在包含本发明的抗-GPR20抗体-药物缀合物的药物组合物中使用的物质可以合适地选自药物添加剂和本领域通常使用的类似物质，并类似地使用(就施用剂量或施用浓度而言)。
本发明的抗-GPR20抗体-药物缀合物可以作为包含一种或多种药学上相容的组分的药物组合物施用。例如，药物组合物通常包含一种或多种药物载体(例如，无菌液体(例如，水和油(包括石油和动物来源，植物来源或合成来源的油(例如，花生油，大豆油，矿物油和芝麻油)))。当静脉内施用药物组合物时，水是更典型的载体。盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物媒介物是本领域已知的。如果需要，组合物还可包含痕量的保湿剂，乳化剂或pH缓冲剂。合适的药物载体的实例公开在E. W. Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"中。处方与施用模式对应。
各种递送系统是已知的，并且它们可用于施用本发明的抗-GPR20抗体-药物缀合物。施用途径的实例可包括但不限于皮内，肌内，腹膜内，静脉内和皮下途径。例如，可以通过注射或推注进行施用。根据具体的优选实施方案，通过注射进行上述抗体-药物缀合物的施用。肠胃外施用是优选的施用途径。
根据代表性实施方案，根据常规程序，将药物组合物作为适于静脉内施用于人的药物组合物开具。用于静脉内施用的组合物通常是无菌和等渗水性缓冲溶液中的溶液。如果需要，药物还可含有增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射区域的疼痛(例如，利多卡因)。通常，上述成分单独提供或在单位剂型中的混合物中一起提供，作为包含在容器中的冷冻干燥粉末或无水浓缩物，所述容器通过密封到例如，表示活性剂量的安瓿或小袋而获得。当药物通过注射施用时，可以使用例如含有无菌药物级的水或盐水的注射瓶施用。当药物通过注射施用时，可以提供无菌水或注射用盐水的安瓿，使得上述成分在施用前彼此混合。
本发明的药物组合物可以是仅包含本申请的抗-GPR20抗体-药物缀合物的药物组合物，或者可以是包含抗-GPR20抗体-药物缀合物和至少一种其他癌症治疗剂的药物组合物。本发明的抗-GPR20抗体-药物缀合物也可以与其他癌症治疗剂一起施用，并且可以由此增强抗癌作用。用于此目的的其他抗癌剂可以与抗体-药物缀合物一起，同时，分开或连续地施用于个体。另外，其他抗癌剂和抗-GPR20抗体-药物缀合物可各自以不同的施用间隔施用至受试者。这种癌症治疗剂的实例可包括酪氨酸激酶抑制剂，包括伊马替尼、舒尼替尼和瑞格非尼，CDK4/6抑制剂(包括帕博西林(palbociclib))，HSP90抑制剂(包括TAS-116)，MEK抑制剂(包括MEK162)和免疫检查点抑制剂(包括纳武单抗，派姆单抗和依匹单抗)，尽管癌症治疗剂不限于此，只要所述药物具有抗肿瘤活性即可。
这种药物组合物可以制备成冷冻干燥制剂或液体制剂形式的，具有选定组成和必需纯度的制剂。制备成冷冻干燥制剂制备的药物组合物可以是含有本领域中使用的适当药物添加剂的制剂。同样地，可以制备液体制剂，使得液体制剂含有本领域中使用的各种药物添加剂。
药物组合物的组成和浓度也根据施用方法而变化。关于包含在本发明的药物组合物中的抗-GPR20抗体-药物缀合物对抗原的亲和力，即抗-GPR20抗体-药物缀合物与抗原的解离常数(Kd值)，随亲和力增加(即，Kd值低)，即使其应用剂量减少，药物组合物也可以发挥药效。因此，抗体-药物缀合物的应用剂量也可以通过基于抗体-药物缀合物对抗原的亲和力的状态设定应用剂量来确定。当将本发明的抗体-药物缀合物施用至人时，其可以以例如约0.001至100mg/kg的剂量以1至180天的间隔时间一次或多次施用。它可以优选以0.1至50mg/kg的剂量施用，且更优选以1至15mg/kg的剂量，以2至3周的间隔时间多次施用。
实施例
在下文中，将在以下实施例中具体描述本发明。然而，这些实施例并不意在限制本发明的范围。此外，这些实施例不应以任何方式以限制的方式解释。应注意，在以下实施例中，除非另有说明，否则根据“"Molecular Cloning"(Sambrook, J., Fritsch, E. F.和Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989年出版)中描述的方法或本领域技术人员使用的实验手册中描述的其他方法，进行关于遗传操作的各个操作，或当使用商购可得的试剂或试剂盒时，所述实施例按照包括在所述商购可得的产品中的说明书实施。在本说明书中，除非另有说明，否则试剂、溶剂和起始材料可容易地从商购可得的来源获得。
实施例1：具有内化活性的大鼠抗人GPR20抗体的产生
1)-1人GPR20表达载体的构建
使用人脑衍生的cDNA作为模板，根据本领域技术人员已知的方法，通过PCR扩增编码人GPR20蛋白(NP_005284)的cDNA，并将扩增产物并入用于哺乳动物表达的载体中以产生人GPR20表达载体pcDNA3.1-hGPR20。人GPR20的氨基酸序列显示在序列表中的SEQ ID NO: 1中。EndoFree Plasmid Giga Kit (Qiagen NV)用于pcDNA3.1-hGPR20质粒DNA的大规模制备中。
1)-2大鼠免疫
对于免疫，使用6周龄的WKY/Izm雌性大鼠(Japan SLC, Inc.)。首先，用透明质酸酶(Sigma-Aldrich Co. LLC)预处理每只大鼠的后腿，且然后将人GPR20表达载体pcDNA3.1-hGPR20肌内注射到相同部位。随后，使用ECM830 (BTX)，使用双针电极在相同部位进行体内电穿孔。每两周一次，重复相同的体内电穿孔。在第79天，从大鼠收集淋巴结，且然后用于杂交瘤制备。
1)-3杂交瘤制备
使用Hybrimune杂交瘤生产系统(Cyto Pulse Sciences, Inc.)，将淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14细胞电融合，且然后将细胞悬浮并用ClonaCell-HY选择培养基D(StemCell Technologies Inc.)稀释，且然后在37℃和5％CO2的条件下培养。收集培养物中出现的单个杂交瘤集落作为单克隆杂交瘤，然后悬浮在ClonaCell-HY选择培养基E(StemCell Technologies Inc.)中，且然后在37℃和5％CO2的条件下培养。在细胞中度增殖后，产生单个杂交瘤细胞的冷冻储备物，同时从每个杂交瘤收集培养物上清液，并用于筛选产生抗-GPR20抗体的杂交瘤。
1)通过细胞-ELISA方法筛选产生抗体的杂交瘤
1)-4-1用于细胞-ELISA的抗原基因表达细胞的制备
在补充10％FBS的DMEM培养基中以5×105个细胞/10mL制备293α细胞(衍生自表达整联蛋白αv和整联蛋白β3的HEK293细胞的稳定表达细胞系)。根据使用Lipofectamine 2000(Invitrogen Corp.)的转染程序，将pcDNA3.1-hGPR20或作为阴性对照的pcDNA3.1的DNA引入293α细胞中，并以100μL/孔的量分配细胞到96孔板(Corning Inc.)。此后，将细胞在37℃和5％CO2的条件下在补充10％FBS的DMEM培养基中培养24至27小时。将获得的转染细胞以粘附状态用于细胞-ELISA。
1)-4-2细胞-ELISA
除去在实施例1)-4-1中制备的用表达载体转染的293α细胞的培养物上清液，且然后将来自每个杂交瘤的培养物上清液添加到用pcDNA3.1-hGPR20或pcDNA3.1转染的293α细胞中。将细胞在4℃下静置1小时。用补充5％FBS的PBS(+)洗涤孔中的细胞一次，且然后向孔中添加已经用补充5％FBS的PBS(+)稀释500倍的，在兔中产生的抗大鼠IgG-过氧化物酶抗体(Sigma-Aldrich Co. LLC)。将细胞在4℃下静置1小时。将孔中的细胞用补充5％FBS的PBS(+)洗涤三次，且然后以100μL/孔向孔中添加OPD显色溶液(通过将邻苯二胺二盐酸盐(WakoPure Chemical Industries, Ltd.)和H2O2溶解在OPD溶液(0.05 M柠檬酸三钠，0.1 M 12-水合磷酸氢二钠；pH 4.5)中，从而使所述物质分别变为0.4 mg/ml和0.6%(v/v)而制备)。偶尔搅拌进行显色反应。此后，向平板中添加1M HCl以(100μL/孔)终止显色反应，然后使用读板器(ENVISION：PerkinElmer, Inc.)测量490nm处的吸光度。为了选择产生与细胞膜表面上表达的人GPR20特异性结合的抗体的杂交瘤，选择如下杂交瘤，其产生培养上清液在用pcDNA3.1-hGPR20表达载体转染的293α细胞中显示出比在用对照pcDNA3.1转染的293α细胞中更高的吸光度。
1)-5通过流式细胞术筛选人GPR20结合抗体
1)-5-1制备表达抗原基因的细胞用于流式细胞术分析
将293T细胞以5×104个细胞/cm2接种于225cm2烧瓶(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)中，且然后将细胞在37℃和5％CO2的条件下在补充10％FBS的DMEM培养基中培养过夜。使用Lipofectamine 2000，将pcDNA3.1-hGPR20或作为阴性对照的pcDNA3.1引入293T细胞中，并在37℃和5％CO2的条件下进一步培养细胞过夜。用TrypLE Express (Life TechnologiesCorp.)处理用每种表达载体转染的293T细胞，且用补充10％FBS的DMEM洗涤细胞，且然后悬浮在补充5％FBS的PBS中。将所获的细胞悬液用于流式细胞术分析。
1)-5-2 流式细胞术分析
通过流式细胞术进一步证实，已通过实施例1)-4-2中的细胞-ELISA确定为阳性的杂交瘤产生的抗体对人GPR20的结合特异性。将实施例1)-5-1中制备的瞬时表达的293T细胞的悬浮液离心，且然后除去上清液。此后，通过添加来自每个杂交瘤的培养上清液，悬浮细胞。将细胞在4℃下静置1小时。用补充5％FBS的PBS洗涤细胞两次，且然后通过添加用补充5％FBS的PBS稀释500倍的抗大鼠IgG FITC缀合物(Sigma-Aldrich Co. LLC)，悬浮细胞。将细胞在4℃下静置1小时。将细胞用补充5% FBS的PBS洗涤2次，并随后重悬于补充5% FBS和2 μg/mL 7-氨基放线菌素D (Molecular Probes, Inc.)的PBS中，随后使用流式细胞仪(FC500；Beckman Coulter, Inc.)进行检测。使用Flowjo (Tree Star, Inc.)分析数据。通过设门控排除7-氨基放线菌素D阳性细胞，从分析中除去死细胞后，产生活细胞的FITC荧光强度的直方图。基于以下结果选择产生人GPR20结合抗体的杂交瘤(178个克隆)，其中与用对照pcDNA3.1转染的293T细胞相比，用pcDNA3.1-hGPR20转染的293T细胞中，抗体的直方图转到强荧光强度侧。图18显示了对于克隆编号04-002、04-006、04-013、04-014、04-020、04-021、04-037、04-046、04-047、04-060、04-067、04-068、04-079、04-084、04-114、04-115、04-117、04-125、04-126、04-127、04-133、04-139、04-143、04-145、04-151和04-163，以及对照(w/o 1st Ab)的结果，作为特异性结合人GPR20的抗体的实例。图18的横坐标描绘了克隆编号，并且其纵坐标描绘了基于MFI (平均荧光强度)的结合抗体的量。
1)-6筛选产生具有内化活性的抗-GPR20抗体的杂交瘤
使用与抑制蛋白质合成缀合的毒素(皂草素)缀合的抗大鼠IgG抗体试剂Rat-ZAP(Advanced Targeting Systems)，评估抗-GPR20抗体的内化活性。具体地，以3×103个细胞/孔将瞬时表达人GPR20的293α细胞接种在96孔板上，且然后在37℃和5％CO2的条件下培养过夜。将平板在冰上冷却后，向每个孔中添加20μL每种产生抗-GPR20抗体的杂交瘤的培养上清液，并将平板在4℃静置1小时。通过抽吸除去培养上清液后，向平板添加补充10％FBS和500ng/mL Rat-ZAP的DMEM，并将细胞在37℃和5％CO2的条件下培养3天。使用CellTiter-Glo (注册商标)发光细胞存活力测定，通过ATP的定量测量活细胞的数量。在该筛选中，Rat-ZAP以依赖于大鼠抗-GPR20抗体的内化活性的方式被摄入细胞，使得抑制蛋白质合成的皂草素被释放到细胞中，从而抑制细胞增殖。作为使用60％或更高的细胞增殖抑制率作为指标进行选择的结果，选择产生具有内化活性的抗-GPR20抗体的19个杂交瘤(克隆编号：04-002、04-006、04-013、04-014、04-021、04-037、04-046、04-047、04-067、04-068、04-079、04-114、04-115、04-125、04-126、04-127、04-133、04-139和04-163)。
1)-7大鼠单克隆抗体的亚类和类型的测定
使用大鼠单克隆抗体分型测试试剂盒(DS Pharma Biomedical Co., Ltd.)，测定大鼠抗人GPR20单克隆抗体的重链亚类和轻链类型。结果证实，克隆编号04-047和04-068具有IgG2a和κ链，并且克隆编号04-002、04-006、04-013、04-014、04-021、04-037、04-046、04-067、04-079、04-114、04-115、04-125、04-126、04-127、04-133、04-139和04-163具有IgG2b和κ链。
1)-8 制备大鼠抗人GPR20抗体
从杂交瘤培养上清液纯化大鼠抗人GPR20单克隆抗体。
首先，用ClonaCell-HY选择培养基E (StemCell Technologies Inc.)充分增加产生大鼠抗-GPR20单克隆抗体的各杂交瘤的体积，且然后将培养基更换为补充20％的UltraLow IgG FBS (Life Technologies Corp.)的Hybridoma SFM (Life TechnologiesCorp.)。此后，将杂交瘤培养4至5天。收获所得的培养上清液，并通过0.8-μm过滤器和0.2-μm过滤器除去其中的不溶物。
通过蛋白G亲和层析(在4-6℃)，在一个步骤中，从杂交瘤上清液纯化抗体。蛋白G亲和层析纯化后的缓冲液置换步骤在4-6℃下进行。首先，将杂交瘤的培养上清液施加于已填充蛋白G (GE Healthcare Biosciences Corp.)的用PBS平衡的柱。在全部培养溶液都已进入柱中后，以柱体积的两倍或更多倍的量的PBS洗涤该柱。随后，用0.1M甘氨酸/HCl水溶液(pH2.7)洗脱抗体，从而收集含有抗体的级分。立即通过添加1M Tris-HCl (pH9.0)，将收集的级分的pH调节至7.0-7.5。此后，使用Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(截留分子量：UF30K，Sartorius Inc.，4至6℃)，用PBS替换缓冲液，同时浓缩抗体，使抗体浓度调整为0.2mg/mL或更多。最后，通过Minisart-Plus过滤器(Sartorius Inc.)过滤抗体以获得纯化的抗体样品。
实施例2：大鼠抗-GPR20抗体的体外评估
2)-1 通过流式细胞术评价大鼠抗GPR20抗体的结合能力
为了评价GPR20结合能力，将通过1)-5-1中所示方法产生的由pcDNA3.1-hGPR20转染的293T细胞的悬浮液离心，且然后除去上清液。此后，通过添加具有内化活性的19种大鼠抗人GPR20单克隆抗体(克隆编号：04-002、04-006、04-013、04-014、04-021、04-037、04-046、04-047、04-067、04-068、04-079、04-114、04-115、04-125、04-126、04-127、04-133、04-139和04-163)，和已在1)-8中制备的两种大鼠抗人GPR20单克隆抗体(13-024和13-048)，或大鼠IgG对照(R＆D Systems, Inc.)中的每一种来悬浮细胞。将细胞在4℃下静置1小时。用补充5％FBS的PBS洗涤细胞两次，且然后通过添加用补充5% FBS的PBS稀释320倍的山羊抗大鼠IgG (H+L), PE缀合物(Beckman Coulter, Inc.)悬浮。将细胞在4℃下静置1小时。用补充5％FBS的PBS洗涤细胞两次，然后使用流式细胞仪(FC500；Beckman Coulter, Inc.)检测。结果显示于图19中。在图19中，横坐标表示抗体浓度(nM)，并且纵坐标表示基于MFI (平均荧光强度)的结合抗体的量。如图19所示，与用pcDNA3.1-hGPR20转染的293T细胞结合的大鼠抗人GPR20抗体的所有量均以浓度依赖性方式增加。另一方面，大鼠IgG2a和IgG2b同种型对照抗体没有表现出GPR20结合活性。
2)-2大鼠抗-GPR20抗体的内化活性
使用与抑制蛋白质合成的毒素(皂草素)缀合的抗大鼠IgG抗体试剂Rat-ZAP(Advanced Targeting Systems)，以1)-6中应用的相同方式评估纯化的大鼠抗-GPR20抗体的内化活性。具体地，将稳定表达包含其C-末端连接至EGFP的人GPR20的GPR20-EGFP蛋白的HEK293细胞以2.5×103个细胞/孔接种，并且然后在37℃和5％CO2的条件下培养过夜。此后，将每种大鼠抗-GPR20抗体(终浓度：0.012至1μg/mL)和Rat-ZAP (终浓度：0.5μg/mL)添加至培养物中。将细胞培养5天，且然后，使用CellTiter-Glo (注册商标)发光细胞存活力测定通过定量ATP测量活细胞数。通过添加每种抗-GPR20抗体引起的细胞增殖抑制作用，通过与定义为100%的没有抗体添加的活细胞数量的相对活性来表示。当以0.11或0.33μg/mL的终浓度添加时，每种抗-GPR20抗体显示出最大的细胞增殖抑制。图20显示了在每种抗体表现出最大细胞增殖抑制的浓度下的细胞存活率。据信在该实验中具有强内化活性的抗体表现出低的细胞存活率。大鼠IgG2a和IgG2b同种型对照抗体(R＆D Systems, Inc.)用作识别与GPR20无关的抗原的阴性对照抗体。
实施例3：测定编码大鼠抗-GPR20抗体可变区的cDNA的核苷酸序列
通过以下方法确定cDNA的核苷酸序列，所述cDNA编码在实施例2中评估其内化活性的21种大鼠抗-GPR20抗体(04-002、04-006、04-013、04-014、04-021、04-037、04-046、04-047、04-067、04-068、04-079、04-114、04-115、04-125、04-126、04-127、04-133、04-139、04-163、13-024和13-048)的每一个的可变区。
3)-1 cDNA合成
每种产生抗-GPR20抗体的杂交瘤的细胞裂解液(50 mM Tris-HCl (pH 7.5)，250 mMLiCl，5 mM EDTA (pH 8)，0.5％十二烷基硫酸锂(LiDS)，2.5 mM二硫苏糖醇(DTT))与寡聚dT25-缀合的磁珠(Dynabeads mRNA DIRECT Kit，Life Technologies Corp.)混合，从而使mRNA与磁珠结合。随后，用mRNA洗涤溶液A (10mM Tris-HCl (pH 7.5)，0.15M LiCl，1mMEDTA，0.1％LiDS，0.1％Triton X-100)和用于cDNA合成的溶液(50 mM Tris-HCl (pH8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0.5 mM dNTP, 0.2% Triton X-100, 1.2单位的RNA酶抑制剂(Life Technologies Corp.))洗涤磁珠各自一次，然后在其中已添加12单位的SuperScript III逆转录酶(Life Technologies Corp.)的用于cDNA合成的溶液中进行cDNA合成。随后，用3'加尾反应溶液(50mM磷酸钾，4mM MgCl2，0.5mM dGTP，0.2％Triton X-100, 1.2单位的RNA酶抑制剂(Life Technologies Corp.))洗涤磁珠，且随后使用其中已添加48单位的末端转移酶重组体(F.Hoffmann-La Roche, Ltd.)的反应溶液进行3'加尾反应。
3)-2大鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区基因片段的扩增和测序
用TE溶液(10mM Tris-HCl (pH 7.5)，1mM EDTA，0.1％Triton X-100)洗涤磁珠，且然后通过5'-RACE PCR扩增大鼠免疫球蛋白重链和轻链基因。具体地，将磁珠转移至PCR反应溶液(每种引物0.2μM，每种dNTP 0.2mM，PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.25单位(Takara BioInc.))，并且在35个循环中进行反应，每个循环包括94℃持续30秒，且68℃持续90秒。使用的引物组如下所述。在引物序列中，D代表由A，G或T组成的混合碱基，N代表A，C，G或T的混合碱基。
PCR引物组(用于重链)
5'-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3' (Nhe-多聚C-S) (SEQ ID NO: 66)
5'-TCACTGAGCTGGTGAGAGTGTAGAGCCC-3' (rIgγ-AS1) (SEQ ID NO: 67)
5'-TCACCGAGCTGCTGAGGGTGTAGAGCCC-3' (rIgγ-AS2) (SEQ ID NO: 68)。
PCR引物组 (用于轻链)
5'-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3' (Nhe-多聚C-S) (SEQ ID NO: 66)(与用于重链的相同)
5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3' (rIgκ-AS)(SEQ ID NO: 69)。
对通过上述PCR反应扩增的片段进行测序以分析其核苷酸序列。具有核苷酸序列5'-CTGGCTCAGGGAAATAGCC-3' (rIgγ-seq) (SEQ ID NO: 70)和5'-TCCAGTTGCTAACTGTTCC-3' (rIgκ-seq) (SEQ ID NO: 71)的寡核苷酸分别用作重链的测序引物和轻链的测序引物。
使用基因序列分析装置(“ABI PRISM 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems,Inc.”或“Applied Biosystems 3730xl Analyzer；Applied Biosystems, Inc.”)进行测序。在测序反应中，使用Dye Terminator Cycle测序系统和AmpliTaq DNA聚合酶(LifeTechnologies Corp.)，和GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Inc.)。
作为从测定的核苷酸序列(其编码22种大鼠抗-GPR20抗体的重链和轻链可变区)预测的氨基酸序列彼此比较的结果，将抗体分类为以下3组：A组(04-002、04-006、04-013、04-014、04-037、04-046、04-047、04-067、04-068、04-079、04-114、04-125、04-126、04-127、04-133、04-139和04-163)，B组(04-021和04-115)和C组(13-024和13-048)。
通过将它们与已知的恒定区序列连接来确定每种抗体的重链和轻链的全长序列。参考IMGT (国际ImMunoGeneTics信息系统(注册商标))中公开的AABR03048905 (IGHG2B*01)的核苷酸序列和氨基酸序列，使用大鼠重链IgG2b恒定区的核苷酸序列和氨基酸序列。参考也公开在此系统中的V01241 (IGKC*01)的核苷酸序列和氨基酸序列，使用大鼠轻链IgK恒定区的核苷酸序列和氨基酸序列。
04-046抗体的重链具有序列表中SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。在序列表中SEQ ID NO: 2所示的重链氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置20至142的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置143至475的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。前述可变区具有由序列表SEQ ID NO: 2中的位置45至54的氨基酸序列组成的CDRH1；由序列表SEQ ID NO: 2中的位置69至78的氨基酸序列组成的CDRH2；和由序列表SEQ ID NO: 2中的位置118至131的氨基酸序列组成的CDRH3。04-046抗体的重链可变区具有序列表中SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。04-046抗体的CDRH1具有序列表中SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，CDRH2的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列，且CDRH3的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。此外，04-046抗体的重链序列示于图1中。
04-046抗体的轻链具有序列表中SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。在序列表中SEQ ID NO: 7所示的轻链氨基酸序列中，由位置1至21的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置21至128的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置129至233的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。上述可变区具有由序列表中SEQ ID NO: 7的位置43至53的氨基酸序列组成的CDRL1；由序列表中SEQ ID NO: 7的位置69至75的氨基酸序列组成的CDRL2；和由序列表中SEQ ID NO: 7的位置108至116位的氨基酸序列组成的CDRL3。04-046抗体的轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。04-046抗体的CDRL1具有序列表中SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列，CDRL2的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，且CDRL3的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列。此外，04-046抗体的轻链序列示于图2中。
04-079抗体的重链具有序列表中SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列。在序列表中SEQ ID NO: 12所示的重链氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置20至142的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置143至475的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。前述可变区具有由序列表SEQ ID NO: 12中的位置45至54的氨基酸序列组成的CDRH1；由序列表SEQ ID NO: 12中的位置69至78的氨基酸序列组成的CDRH2；和由序列表SEQ ID NO: 12中的位置118至131的氨基酸序列组成的CDRH3。04-079抗体的重链可变区具有序列表中SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列。04-079抗体的CDRH1具有序列表中SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，CDRH2的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列，CDRH3的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。此外，04-079抗体的重链序列示于图3中。
04-079抗体的轻链具有序列表中SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列。在序列表中SEQ ID NO: 17所示的轻链氨基酸序列中，由位置1至20的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置21至128的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置129至233的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。上述可变区具有由序列表中SEQ ID NO: 17的位置43至53的氨基酸序列组成的CDRL1；由序列表中SEQ ID NO: 17的位置69至75的氨基酸序列组成的CDRL2；和由序列表中SEQ ID NO: 17的位置108至116位的氨基酸序列组成的CDRL3。04-079抗体的轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列。04-079抗体的CDRL1具有序列表中SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列，CDRL2的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列，且CDRL3的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。此外，04-079抗体的轻链序列示于图4中。
04-126抗体的重链具有序列表中SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列。在序列表中SEQ ID NO: 22所示的重链氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置20至142的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置143至475的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。前述可变区具有由序列表SEQ ID NO: 22中的位置45至54的氨基酸序列组成的CDRH1；由序列表SEQ ID NO: 22中的位置69至78的氨基酸序列组成的CDRH2；和由序列表SEQ ID NO: 22中的位置118至131的氨基酸序列组成的CDRH3。04-126抗体的重链可变区具有序列表中SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列。04-126抗体的CDRH1具有序列表中SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列，CDRH2的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列，且CDRH3的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。此外，04-126抗体的重链序列示于图5中。
04-126抗体的轻链具有序列表中SEQ ID NO: 27所示的氨基酸序列。在序列表中SEQ ID NO: 27所示的轻链氨基酸序列中，由位置1至20的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置21至128的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由位置129至233的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。上述可变区具有由序列表中SEQ ID NO: 27的位置43至53的氨基酸序列组成的CDRL1；由序列表中SEQ ID NO: 27的位置69至75的氨基酸序列组成的CDRL2；和由序列表中SEQ ID NO: 27的位置108至116位的氨基酸序列组成的CDRL3。04-126抗体的轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO: 28所示的氨基酸序列。04-126抗体的CDRL1具有序列表中SEQ ID NO: 29所示的氨基酸序列，CDRL2的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO: 30所示的氨基酸序列，且CDRL3的氨基酸序列具有序列表中SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。此外，04-126抗体的轻链序列示于图6中。
04-046抗体的重链氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO: 32所示的核苷酸序列编码。在序列表中SEQ ID NO: 32所示的核苷酸序列中，由位置58至426的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-046抗体的重链可变区，并且由位置427至1425位的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-046抗体的重链恒定区。在SEQ ID NO: 32中，编码上述可变区的核苷酸序列具有编码CDRH1的由核苷酸位置133-162的核苷酸序列组成的多核苷酸，编码CDRH2的由核苷酸位置205-234的核苷酸序列组成的多核苷酸，和编码CDRH3的由核苷酸位置352-393的核苷酸序列组成的多核苷酸。04-046抗体的重链可变区的核苷酸序列也显示在序列表中的SEQID NO: 33中。此外，SEQ ID NO: 32的序列显示在图1中。
04-046抗体的轻链氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO: 34所示的核苷酸序列编码。在序列表中SEQ ID NO: 34所示的核苷酸序列中，由位置61至384的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-046抗体的轻链可变区，并且由位置385至699位的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-046抗体的轻链恒定区。在SEQ ID NO: 34中，编码上述可变区的核苷酸序列具有编码CDRL1的由核苷酸位置127-159的核苷酸序列组成的多核苷酸，编码CDRL2的由核苷酸位置205-225的核苷酸序列组成的多核苷酸，和编码CDRL3的由核苷酸位置322-348的核苷酸序列组成的多核苷酸。04-046抗体的轻链可变区的核苷酸序列也显示在序列表中的SEQ IDNO: 35中。此外，SEQ ID NO: 34的序列显示在图2中。
04-079抗体的重链氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO: 36所示的核苷酸序列编码。在序列表中SEQ ID NO: 36所示的核苷酸序列中，由位置58至426的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-079抗体的重链可变区，并且由位置427至1425位的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-079抗体的重链恒定区。在SEQ ID NO: 36中，编码上述可变区的核苷酸序列具有编码CDRH1的由核苷酸位置133-162的核苷酸序列组成的多核苷酸，编码CDRH2的由核苷酸位置205-234的核苷酸序列组成的多核苷酸，和编码CDRH3的由核苷酸位置352-393的核苷酸序列组成的多核苷酸。04-079抗体的重链可变区的核苷酸序列也显示在序列表中的SEQID NO: 37中。此外，SEQ ID NO: 37的序列显示在图10中。
04-079抗体的轻链氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO: 38所示的核苷酸序列编码。在序列表中SEQ ID NO: 38所示的核苷酸序列中，由位置61至384的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-079抗体的轻链可变区，并且由位置385至699位的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-079抗体的轻链恒定区。在SEQ ID NO: 38中，编码上述可变区的核苷酸序列具有编码CDRL1的由核苷酸位置127-159的核苷酸序列组成的多核苷酸，编码CDRL2的由核苷酸位置205-225的核苷酸序列组成的多核苷酸，和编码CDRL3的由核苷酸位置322-348的核苷酸序列组成的多核苷酸。04-079抗体的轻链可变区的核苷酸序列也显示在序列表中的SEQ IDNO: 39中。此外，SEQ ID NO: 38的序列显示在图4中。
04-126抗体的重链氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO: 40所示的核苷酸序列编码。在序列表中SEQ ID NO: 40所示的核苷酸序列中，由位置58至426的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-126抗体的重链可变区，并且由位置427至1425位的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-126抗体的重链恒定区。在SEQ ID NO: 40中，编码上述可变区的核苷酸序列具有编码CDRH1的由核苷酸位置133-162的核苷酸序列组成的多核苷酸，编码CDRH2的由核苷酸位置205-234的核苷酸序列组成的多核苷酸，和编码CDRH3的由核苷酸位置352-393的核苷酸序列组成的多核苷酸。04-126抗体的重链可变区的核苷酸序列也显示在序列表中的SEQID NO: 41中。此外，SEQ ID NO: 40的序列显示在图5中。
04-126抗体的轻链氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO: 42所示的核苷酸序列编码。在序列表中SEQ ID NO: 42所示的核苷酸序列中，由位置61至384的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-126抗体的轻链可变区，并且由位置385至699位的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-126抗体的轻链恒定区。在SEQ ID NO: 42中，编码上述可变区的核苷酸序列具有编码CDRL1的由核苷酸位置127-159的核苷酸序列组成的多核苷酸，编码CDRL2的由核苷酸位置205-225的核苷酸序列组成的多核苷酸，和编码CDRL3的由核苷酸位置322-348的核苷酸序列组成的多核苷酸。04-1216抗体的轻链可变区的核苷酸序列也显示在序列表中的SEQID NO: 43中。此外，SEQ ID NO: 42的序列显示在图6中。
实施例4：抗-GPR20单克隆抗体的GPR20结合位点的分析
通过细胞-ELISA测量它们对如下的结合活性来分类抗人GPR20抗体的结合位点：小鼠GPR20，N末端FLAG标记的人GPR20和人/小鼠嵌合GPR20，其中分别用小鼠GPR20衍生的序列取代人GPR20的四个胞外区域(EC1，EC2，EC3和EC4)中的每一个。图21是人GPR20 (NP_005284)和小鼠GPR20 (NP_775541)的氨基酸序列之间的比较图。四个细胞外区域EC1至EC4由人GPR20的氨基酸序列中的位置表示。EC1对应于位置1至48，EC2对应于位置108至125，EC3对应于位置190至196，并且EC4对应于位置260至275。
4)-1小鼠GPR20表达载体的构建
根据本领域技术人员已知的方法，基于小鼠GPR20的Ref Seq序列NM_173365人工合成cDNA，且然后克隆到pcDNA-DEST40表达载体(Invitrogen Corp.)中以构建小鼠GPR20表达载体pcDNA-mGPR20。
4)-2 N末端FLAG标记的人GPR20和人/小鼠嵌合GPR20表达载体的构建
4)-2-1
在下面给出的表达载体的构建中，使用实施例1中产生的全长人GPR20表达载体pcDNA3.1-hGPR20作为模板，用下面给出的引物组进行各PCR反应。在该反应中，使用KOD FXDNA聚合酶(Toyobo Co., Ltd.)，且反应进行15个循环或10个循环，每个循环涉及98℃持续10秒，58℃持续30秒和68℃持续7分钟。此后，用限制酶DpnI处理获得的PCR产物。用该DpnI消化的DNA转化大肠杆菌TOP10 (Invitrogen Corp.)以构建表达载体，其用于N末端FLAG标记的人GPR20，和EC2或EC3或EC4被小鼠GPR20衍生的序列取代的人GPR20。每个PCR反应中使用的引物组如下。
PCR引物组(用于N末端FLAG标记的人GPR20)
5'-GACTACAAAGACGATGACGACAAGCCCTCTGTGTCTCCAGC-3' (NFLAG-1；SEQ ID NO: 72)
5'-CTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCCATGGTGGAGCCTGC-3' (NFLAG-2；SEQ ID NO: 73)。
PCR引物组(用于EC2被小鼠GPR20衍生序列取代的人GPR20)
5'-ACGCGCTTCGCTGTGTTCTACGGCGCCAG-3' (mEC2-1；SEQ ID NO: 74)
5'-CTGGCGCCGTAGAACACAGCGAAGCGCGT-3' (mEC2-2；SEQ ID NO: 75)。
PCR引物组(用于EC3被小鼠GPR20衍生序列取代的人GPR20)
5'-TGTCGGTGCTGGGCGTGAAGTCGGGTGGACGATCATGCTGCCGTGTCTT-3' (mEC3-1；SEQ IDNO: 76)
5'-AAGACACGGCAGCATGATCGTCCACCCGACTTCACGCCCAGCACCGACA-3' (mEC3-2；SEQ IDNO: 77)。
PCR引物组(用于EC4被小鼠GPR20衍生序列取代的人GPR20)
5'-TGGCGCTGTGGCCCAACGTACCTAAGCACACGAGCCTCGTGGT-3' (mEC4-1；SEQ ID NO: 78)
5'-ACCACGAGGCTCGTGTGCTTAGGTACGTTGGGCCACAGCGCCA-3' (mEC4-2；SEQ ID NO: 79)。
4)-2-2
使用In-Fusion (注册商标) HD克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)构建EC1被小鼠GPR20衍生的序列取代的人GPR20的表达载体。具体地，使用实施例1中产生的全长人GPR20表达载体pcDNA3.1-hGPR20作为模板，用下面给出的引物组和KOD FX DNA聚合酶(Toyobo Co., Ltd.，以10个循环进行PCR反应，每个循环包括98℃持续10秒，58℃持续30秒和68℃持续7分钟，以扩增包含载体序列的DNA片段。
PCR引物组(用于EC1被小鼠GPR20衍生序列取代的人GPR20 - 1)
5'-GCGCTGATGGCGGTGCACGGAGCCATCT-3' (mEC1-1；SEQ ID NO: 80)
5'-AGAGGGCATGGTGGAGCCTGCTTT-3' (mEC1-2；SEQ ID NO: 81)。
此外，使用4)-1中构建的全长小鼠GPR20表达载体pcDNA-mGPR20作为模板，以与上述相同的方式用下文给出的引物组，以20个循环进行PCR反应，以扩增编码小鼠GPR20的EC1区域的DNA片段。
PCR引物组(用于EC1被小鼠GPR20衍生序列取代的人GPR20 -2)
5'-AGGCTCCACCATGCCCTCTGCGTTGTCTATGA-3' (mEC1-3；SEQ ID NO: 82)
5'-CACCGCCATCAGCGCTTGCCACAGGCTGGGGAAGGTGGCTTGCA-3' (mEC1-4；SEQ ID NO:83)。
根据标准方法对上述两个DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Promega Corp.)分离具有目标大小的DNA片段。通过In-Fusion HD酶(ClontechLaboratories, Inc.)的反应将这两个DNA片段退火在一起，并用连接产物转化大肠杆菌TOP10 (Invitrogen Corp.)以构建EC1被小鼠GPR20衍生的序列取代的人GPR20的表达载体。
4)-3通过细胞-ELISA评估抗人GPR20抗体的结合特性
通过与实施例1中所示的细胞-ELISA方法相同的方法，检验了抗-GPR20抗体04-046、04-079、04-126、04-021、13-024和13-048对瞬时引入不同GPR20表达载体的293α细胞的结合活性。测量结果显示在图22(a)和22(b)中。在图22的横坐标上，EV描绘了对照，人GPR20描绘了表达人全长GPR20的细胞，FLAG-huGPR20描绘了表达N末端FLAG标记的人GPR20的细胞，小鼠GPR20描绘了表达小鼠GPR20的细胞，hGPR20_mECD1描绘了表达嵌合GPR20的细胞，其中人GPR20的ECD1被小鼠GPR20的ECD1取代，hGPR20_mECD2描绘了表达嵌合GPR20的细胞，其中人GPR20的ECD2被小鼠GPR20的ECD2取代，hGPR20_mECD3描绘了表达嵌合GPR20的细胞，其中人GPR20的ECD3被小鼠GPR20的ECD3取代和hGPR20_mECD4描绘了表达嵌合GPR20的细胞，其中人GPR20的ECD4被小鼠GPR20的ECD4取代。
在实施例3中所示的基于抗体序列相似性的三种分类中，组A中的04-046、04-079和04-126不与小鼠GPR20结合，并且由于人GPR20的EC1 (也被称为ECD1)或EC2 (也被称为ECD2)被源自小鼠GPR20的EC1或EC2取代，而丧失结合活性。这表明04-046、04-079和04-126识别由GPR20的EC1和EC2组成的构象。
B组中的04-021表现出对小鼠GPR20的弱结合活性，并且由于用小鼠GPR20衍生的EC1取代人GPR20的EC1，导致结合活性减弱至与对小鼠GPR20的结合活性相同的水平。此外，04-021没有表现出针对N末端FLAG标记的人GPR20的结合活性，表明该抗体识别GPR20 EC1的N-末端或其邻近区域。
C组中的13-024和13-048不与小鼠GPR20结合，并且由于用小鼠GPR20衍生的EC1取代人GPR20的EC1，结合活性显著降低，表明这些抗体结合到EC1。
从上述实验，表1显示了每种抗体识别的GPR20细胞外区域与图20中所示抗体的内化活性(如细胞存活率较低，则内化活性更强)之间的对应关系。
[表1]
当表格中“识别的GPR20细胞外区域”由人GPR20的氨基酸序列的范围指示时，EC1对应于位置1至48，EC2对应于位置108至125，EC3对应于位置190至196，且EC4对应于位置260至275。作为研究每种抗体的内化活性(如细胞存活率较低，则内化活性更高)与抗-GPR20抗体识别的区域之间的关系的结果，发现显示小于70％的细胞存活率并且因此似乎具有高内化活性的所有抗体都是来自A组的抗体。因此，证明展现高内化活性的抗体集中在A组的抗体中，其识别由人GPR20的EC1和EC2组成的构象。人GPR20的EC2仅在位置113处的酪氨酸残基与小鼠GPR20的EC2 (苯丙氨酸)不同，表明识别由EC1和EC2组成的构象的A组抗体识别该酪氨酸残基。
实施例5：人嵌合抗-GPR20抗体04-046Ch的制备
5)-1人嵌合抗-GPR20抗体表达载体的构建
5)-1-1嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK的构建
使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，将通过使用限制酶XbaI和PmeI消化质粒pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corp.)而获得的约5.4-kb片段与包含编码人κ链分泌信号和人κ链恒定区的DNA序列(SEQ ID NO: 84)的DNA片段连接，以制备pcDNA3.3/LK。
使用pcDNA3.3/LK作为模板，使用下面给出的引物组进行PCR，并且将获得的大约3.8-kb的片段磷酸化，且然后自连接以构建嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK，其具有信号序列，克隆位点和CMV启动子下游的人κ恒定区的DNA序列。
引物组
5'-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3' (3.3-F1；SEQ ID NO: 85)
5'-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3' (3.3-R1；SEQ ID NO: 86)。
5)-1-2 构建嵌合和人源化IgG1型重链表达载体pCMA-G1
使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，将通过使用XbaI和PmeI消化pCMA-LK以从其中除去编码κ链分泌信号和人κ链恒定区的DNA序列而获得的DNA片段连接到包含编码人重链信号序列和人IgG1恒定区中氨基酸的DNA序列(SEQID NO: 87)的DNA片段，以构建嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1，其具有信号序列，克隆位点和CMV启动子下游的人IgG1重链恒定区的DNA序列。
5)-1-3构建人嵌合抗-GPR20抗体重链表达载体
基于实施例3)-2中测定的大鼠抗-GPR20抗体04-046的重链可变区的氨基酸序列(SEQID NO: 3)构建人嵌合抗体重链表达载体。合成对应于核苷酸位置36至443的DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，其包括人嵌合抗-GPR20抗体04-046Ch的重链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 46)中的编码可变区的DNA序列。使用合成的DNA片段作为模板，用KOD-Plus-(Toyobo Co., Ltd.)和下文给出的引物组扩增包含编码人嵌合抗-GPR20抗体的重链可变区的DNA序列的DNA片段。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories,Inc.)，将扩增的DNA片段插入已用限制酶BlpI切割的嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1的位点中，从而构建人嵌合抗-GPR20抗体04-046Ch重链表达载体。将获得的表达载体命名为“pCMA/04-046Ch-H”。人嵌合抗-GPR20抗体04-046Ch的重链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 44中。SEQ ID NO: 46的核苷酸序列和SEQ ID NO: 44的氨基酸序列也显示在7中。
引物组
5'-AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC-3' (EG-Inf-F；SEQ ID NO: 88)
5'-GGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGC-3' (EG1-Inf-R；SEQ ID NO: 89)。
5)-1-4构建人嵌合抗-GPR20抗体轻链表达载体
基于实施例3)-2中测定的大鼠抗-GPR20抗体04-046的轻链可变区的氨基酸序列(SEQID NO: 8)构建人嵌合抗体轻链表达载体。合成对应于核苷酸位置38至399的DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，其包括人嵌合抗-GPR20抗体04-046Ch的轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 47)中的编码可变区的DNA序列。使用合成的DNA片段作为模板，用KOD-Plus-(Toyobo Co., Ltd.)和下文给出的引物组扩增包含编码人嵌合抗-GPR20抗体的轻链可变区的DNA序列的DNA片段。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories,Inc.)，将扩增的DNA片段插入已用限制酶BsiWI切割的嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK的位点中，从而构建人嵌合抗-GPR20抗体04-046Ch轻链表达载体。将获得的表达载体命名为“pCMA/04-046Ch-L”。人嵌合抗-GPR20抗体04-046Ch的轻链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 45中。SEQ ID NO: 47的核苷酸序列和SEQ ID NO: 45的氨基酸序列也显示在图8中。
引物组
5'-CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC-3' (CM-LKF；SEQ ID NO: 90)
5'-GGAGGGGGCGGCCACGGCTCTCTTCAGTTC-3' (046L-R；SEQ ID NO: 91)。
5)-2人嵌合抗-GPR20抗体的表达和纯化
5)-2-1人嵌合抗-GPR20抗体的表达
根据手册，培养并传代FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corp.)。将1.2×109个对数生长期的FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corp.)接种在3-L Fernbach ErlenmeyerFlask (Corning Inc.)上，然后用FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen Corp.)以2.0×106个细胞/mL稀释，并在90rpm下，在8％CO2培养箱中于37℃振荡培养1小时。将1.8mg聚乙烯亚胺(Polyscience＃24765)溶解在20mL Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corp.)中。同时，将使用NucleoBond Xtra (Takara Bio Inc.)制备的重链表达载体(0.24mg)和轻链表达载体(0.36mg)添加到20mL Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corp.)中。向20mL聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合溶液中添加20mL表达载体/Opti-Pro SFM混合溶液，并轻轻搅拌所得混合物。温育5分钟后，将混合物添加到FreeStyle 293F细胞。将细胞在90rpm下在8％CO2培养箱中在37℃下振荡培养4小时，且然后，向培养物添加600mL EX-CELL VPRO培养基(SAFC Biosciences Inc.)，18mL GlutaMAX I (GIBCO)，30mL Yeastolate超滤液(GIBCO)。将细胞在8％CO2培养箱中在37℃下以90rpm进一步振荡培养7天。将获得的培养上清液通过一次性胶囊滤器(Advantec＃CCS-045-E1H)过滤。
通过pCMA/04-046Ch-H和pCMA/04-046Ch-L的组合获得的人嵌合抗-GPR20抗体命名为“04-046Ch”。
5)-2-2通过两步法纯化04-046Ch
通过两步过程，即通过rProtein A亲和层析(4℃-6℃)和陶瓷羟基磷灰石(室温)，从实施例5)-2-1中获得的培养上清液纯化抗体。rProtein A亲和层析纯化后和陶瓷羟基磷灰石纯化后的缓冲液置换在4℃至6℃进行。将培养上清液施加于已用PBS平衡的MabSelectSuRe(GE Healthcare Biosciences Corp.，HiTrap柱)。在全部培养上清溶液都已进入柱中之后，以柱体积的两倍或更多倍的量，用PBS洗涤该柱。随后，使用2M精氨酸盐酸盐溶液(pH4.0)进行洗脱，从而收集含有抗体的级分。将该级分透析(Thermo Fisher ScientificInc.，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)，以用PBS替换缓冲液。此后，将用5mM磷酸钠/50mM MES/pH7.0的缓冲液稀释5倍的抗体溶液施加于已经用5mM NaPi/50mM MES/30mMNaCl/pH 7.0的缓冲液平衡的陶瓷羟基磷灰石柱(Bio-Rad Laboratories, Inc.，Bio-ScaleCHT 1-型陶瓷羟基磷灰石柱)。以线性浓度梯度的氯化钠进行洗脱，从而收集含有抗体的级分。将该级分透析(Thermo Fisher Scientific Inc.，Slide-A-Lyzer DialysisCassette)，以用HBSor (25mM组氨酸/5％山梨糖醇，pH6.0)代替缓冲液。用离心UF滤器装置VIVASPIN20 (截止分子量：UF10K，Sartorius Inc.，4℃)浓缩抗体，从而将IgG浓度调节至20mg/mL或更高。最后，通过Minisart-Plus过滤器(Sartorius Inc.)过滤抗体以获得纯化的样品。
5)-3评估人嵌合抗-GPR20抗体的结合活性
通过流式细胞术确认产生的人嵌合抗-GPR20抗体04-046Ch的GPR20结合活性。使用Lipofectamine 2000，通过与实施例1)-5-1中所应用的相同方法，将pcDNA3.1-hGPR20或pcDNA3.1瞬时导入293T细胞中。将细胞在37℃和5％CO2的条件下培养过夜，且然后制备细胞悬浮液。向获得的细胞悬浮液添加人嵌合抗-GPR20抗体04-046Ch或作为阴性对照的人IgG，并将获得的混合物在4℃静置1小时。此后，用补充5％FBS的PBS洗涤细胞两次，且然后通过添加用补充5％FBS的PBS稀释320倍的PE标记的F(ab')2片段抗人IgG，Fcγ抗体(Jackson ImmunoResearch Inc.)悬浮。将细胞在4℃下静置1小时。将细胞用含5% FBS的PBS洗涤2次，并随后重悬于补充5% FBS的PBS中，随后使用流式细胞仪(FC500；BeckmanCoulter Inc.)进行检测。使用Flowjo (Tree Star Inc.)分析数据。04-046Ch以抗体浓度依赖性方式与pcDNA3.1-hGPR20转染的293T细胞结合(图23(a))，而不与用阴性对照pcDNA3.1转染的293T细胞结合(图23(b))。图23中的横坐标表示抗体浓度，且纵坐标表示指示结合的抗体量的平均荧光强度。
实施例6：人源化抗-GPR20抗体的产生
6)-1人源化形式的抗-GPR20抗体04-046的设计
6)-1-1 04-046可变区的分子建模
04-046的可变区的分子建模通过已知为同源性建模的方法来进行(Methods inEnzymology, 203, 121-153,(1991))。将在蛋白质数据库中登记的人类免疫球蛋白的可变区的一级序列(Nuc. Acids Res. 35, D301-D303 (2007))(从X射线晶体结构推断的三维结构是可用的)，与实施例3)-2中测定的04-046的可变区域进行比较。选择1SY6和1LK3作为与04-046的重链和轻链可变区具有最高序列同一性的序列。通过将对应于04-046的重链和轻链的1SY6和1LK3的坐标相互组合，产生框架区的三维结构，以获得“框架模型”。随后，将每个CDR的代表性构象并入框架模型中。最后，为了获得具有046的可能可变区的分子模型，进行能量计算，以用于消除在能量方面不利的原子接触。使用商购可得的蛋白质三维结构分析程序Discovery Studio (Accelrys Inc.)进行上述程序。
6)-1-2 设计人源化h046的氨基酸序列
根据通常称为CDR移植的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033(1989))，构建04-046的人源化抗体(下文称为“人源化h046”)。基于框架区中的氨基酸同一性选择受体抗体。
将04-046的框架区的序列与KABAT等确定的人亚组共有序列的框架区进行比较(Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health ServiceNational Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。人γ链亚组1和人κ链亚组1的共有序列在其框架区中分别与重链和轻链具有高序列同一性，并且基于此，选择它们作为受体。关于受体，框架区中的氨基酸残基与04-046的氨基酸残基比对，从而鉴定了使用不同氨基酸的位置。使用上文构建的04-046的三维模型分析这些残基的位置，并且基于Queen等人给出的标准(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))，选择待移植到受体上的供体残基。将如此选择的几个供体残基引入受体抗体中，以按照以下实施例中描述的方式构建人源化h046的序列。
6)-2 04-046重链的人源化
6)-2-1 人源化的h046_H4b型重链
对于人嵌合抗体04-046Ch重链中的可变区部分(由SEQ ID NO: 44中所示的氨基酸序列中的位置20至142的氨基酸残基组成的氨基酸序列)，通过以下设计的人源化h046重链：在SEQ ID NO: 44中，用缬氨酸取代在氨基酸位置24的谷氨酰胺、用缬氨酸取代在氨基酸位置30的亮氨酸、用赖氨酸取代在氨基酸位置31的丙氨酸、用丙氨酸取代在氨基酸位置35的丝氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置39的异亮氨酸、用精氨酸取代在氨基酸位置57的赖氨酸、用丙氨酸取代在氨基酸位置40和59的苏氨酸、用脯氨酸取代在氨基酸位置60的苏氨酸、用甲硫氨酸取代在氨基酸位置67的异亮氨酸、用精氨酸取代在氨基酸位置86的赖氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置87的丙氨酸、用异亮氨酸取代在氨基酸位置89的亮氨酸、用丙氨酸取代在氨基酸位置91的缬氨酸、用苏氨酸取代在氨基酸位置99的苯丙氨酸、用谷氨酸取代在氨基酸位置101的谷氨酰胺、用精氨酸取代在氨基酸位置106的苏氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置107的脯氨酸、用谷氨酸取代在氨基酸位置108的天冬氨酸、用苏氨酸取代在氨基酸位置120的丝氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置122的异亮氨酸、用苏氨酸取代在氨基酸位置136的缬氨酸和用亮氨酸取代在氨基酸位置137的甲硫氨酸，被称为“人源化h046-H4b型重链”(也称为h046-H4b)。
人源化h046-H4b型重链的氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID NO: 48中。在SEQID NO: 48所示的氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的序列对应于信号序列，由位置20至142的氨基酸残基组成的序列对应于重链可变区，并且由位置143至472的氨基酸残基组成的序列对应于重链恒定区。编码SEQ ID NO: 48的氨基酸序列的核苷酸序列显示于序列表的SEQ ID NO: 49中。在SEQ ID NO: 49的核苷酸序列中，由位置1至57的核苷酸组成的序列编码信号序列，由位置58至426的核苷酸组成的序列对应于编码重链可变区的序列，并且由位置427至1416的核苷酸组成的序列对应于编码重链恒定区的序列。SEQ IDNO: 48的氨基酸序列也显示在图9中。
6)-2-2人源化h046-H4e型重链
对人嵌合抗体04-046Ch重链中的可变区部分，通过以下设计的人源化h046重链：在SEQID NO: 44中，用谷氨酸取代在氨基酸位置20的谷氨酰胺、用缬氨酸取代在氨基酸位置24的谷氨酰胺、用缬氨酸取代在氨基酸位置30的亮氨酸、用赖氨酸取代在氨基酸位置31的丙氨酸、用丙氨酸取代在氨基酸位置35的丝氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置39的异亮氨酸、用精氨酸取代在氨基酸位置57的赖氨酸、用丙氨酸取代在氨基酸位置59的苏氨酸、用脯氨酸取代在氨基酸位置60的苏氨酸、用甲硫氨酸取代在氨基酸位置67的异亮氨酸、用精氨酸取代在氨基酸位置86的赖氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置68和87的丙氨酸、用异亮氨酸取代在氨基酸位置89的亮氨酸、用丙氨酸取代在氨基酸位置91的缬氨酸、用苏氨酸取代在氨基酸位置99的苯丙氨酸、用谷氨酸取代在氨基酸位置101的谷氨酰胺、用精氨酸取代在氨基酸位置106的苏氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置107的脯氨酸、用谷氨酸取代在氨基酸位置108的天冬氨酸、用苏氨酸取代在氨基酸位置120的丝氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置122的异亮氨酸、用苏氨酸取代在氨基酸位置136的缬氨酸，和用亮氨酸取代在氨基酸位置137的甲硫氨酸，被称为“人源化h046-H4b型重链”(也称为h046-H4e)。
人源化h046-H4e型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 50中。在SEQID NO: 50的氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的序列对应于信号序列，由位置20至142的氨基酸残基组成的序列对应于重链可变区，并且由位置143至472的氨基酸残基组成的序列对应于重链恒定区。编码SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的核苷酸序列显示于序列表的SEQ ID NO: 51中。在SEQ ID NO: 51的核苷酸序列中，由位置1至57的核苷酸组成的序列编码信号序列，由位置58至426的核苷酸组成的序列对应于编码重链可变区的序列，并且由位置427至1416的核苷酸组成的序列对应于编码重链恒定区的序列。SEQ ID NO: 50的氨基酸序列也显示在图10中。
6)-2-3人源化h046-H5b型重链
对于人嵌合抗体04-046Ch重链中的可变区部分，通过以下设计的人源化h046重链：在SEQ ID NO: 44中，用缬氨酸取代在氨基酸位置24的谷氨酰胺、用缬氨酸取代在氨基酸位置30的亮氨酸、用赖氨酸取代在氨基酸位置31的丙氨酸、用丙氨酸取代在氨基酸位置35的丝氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置39的异亮氨酸、用精氨酸取代在氨基酸位置57的赖氨酸、用丙氨酸取代在氨基酸位置59的苏氨酸、用脯氨酸取代在氨基酸位置60的苏氨酸、用甲硫氨酸取代在氨基酸位置67的异亮氨酸、用精氨酸取代在氨基酸位置86的赖氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置87的丙氨酸、用异亮氨酸取代在氨基酸位置89的亮氨酸、用丙氨酸取代在氨基酸位置91的缬氨酸、用天冬酰胺取代在氨基酸位置99的苯丙氨酸、用谷氨酸取代在氨基酸位置101的谷氨酰胺、用精氨酸取代在氨基酸位置106的苏氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置107的脯氨酸、用谷氨酸取代在氨基酸位置108的天冬氨酸、用苏氨酸取代在氨基酸位置120的丝氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置122的异亮氨酸、用苏氨酸取代在氨基酸位置136的缬氨酸和用亮氨酸取代在氨基酸位置137的甲硫氨酸，被称为“人源化h046-H4b型重链”(也称为h046-H5b)。
人源化h046-H4b型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 52中。在SEQID NO: 52的氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的序列对应于信号序列，由位置20至142的氨基酸残基组成的序列对应于重链可变区，并且由位置143至472的氨基酸残基组成的序列对应于重链恒定区。编码SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的核苷酸序列显示于序列表的SEQ ID NO: 53中。在SEQ ID NO: 53的核苷酸序列中，由位置1至57的核苷酸组成的序列编码信号序列，由位置58至426的核苷酸组成的序列对应于编码重链可变区的序列，并且由位置427至1416的核苷酸组成的序列对应于编码重链恒定区的序列。SEQ ID NO: 52的氨基酸序列也显示在图11中。
6)-2-4人源化h046-H8型重链
关于SEQ ID NO: 44所示的人嵌合抗体04-046Ch重链中的可变区部分，通过用天冬酰胺取代在氨基酸位置80的苯丙氨酸而设计的人源化h046重链称为“人源化h046-H8型重链”(也称为“h046-H8”)。
人源化h046-H8型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 54中。在SEQ IDNO: 54的氨基酸序列中，由在位置1至19的氨基酸残基组成的序列，由在位置20至142的氨基酸残基组成的序列和在位置143至472的氨基酸残基组成的序列分别对应于信号序列、重链可变区和重链恒定区。编码SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的核苷酸序列显示于序列表的SEQ ID NO: 55中。在SEQ ID NO: 55的核苷酸序列中，由在位置1至57的核苷酸组成的序列，由在位置58至426的核苷酸组成的序列和由位置427至1416的核苷酸组成的序列分别编码信号序列、重链可变区序列，和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 54的氨基酸序列也显示在图12中。
6)-2-5人源化h046-H10型重链
关于SEQ ID NO: 44所示的人嵌合抗体04-046Ch重链中的可变区部分，通过在SEQ IDNO: 44中用缬氨酸取代在氨基酸位置39的异亮氨酸和用天冬酰胺取代在氨基酸位置99的苯丙氨酸而设计的人源化h046重链称为“人源化h046-H10型重链”(也称为“h046-H10”)。
人源化h046-H10型重链的氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID NO: 56中。在SEQID NO: 56的氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的序列对应于信号序列，由位置20至142的氨基酸残基组成的序列对应于重链可变区，并且由位置143至472的氨基酸残基组成的序列对应于重链恒定区。编码SEQ ID NO: 56的氨基酸序列的核苷酸序列显示于序列表的SEQ ID NO: 57中。在SEQ ID NO: 57的核苷酸序列中，由位置1至57的核苷酸组成的序列编码信号序列，由位置58至426的核苷酸组成的序列编码重链可变区的序列，并且由位置427至1416的核苷酸组成的序列编码重链恒定区的序列。SEQ ID NO: 56的氨基酸序列也显示在图13中。
6)-3 04-046轻链的人源化
6)-3-1 人源化的h046-L1型轻链
对于人嵌合抗体04-046Ch轻链中的可变区部分，通过以下设计的人源化h046轻链：在SEQ ID NO: 45中，用异亮氨酸取代在氨基酸位置22的苏氨酸、用谷氨酰胺取代在氨基酸位置23的缬氨酸、用甲硫氨酸取代在氨基酸位置24的亮氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置29的丙氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置31的丙氨酸、用丙氨酸取代在氨基酸位置32的缬氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置34的亮氨酸、用天冬氨酸取代在氨基酸位置36的谷氨酰胺、用苏氨酸取代在氨基酸位置41的丝氨酸、用赖氨酸取代在氨基酸位置58的精氨酸、用脯氨酸取代在氨基酸位置59的丝氨酸、用赖氨酸取代在氨基酸位置61的谷氨酰胺、用丙氨酸取代在氨基酸位置62的谷氨酰胺、用丝氨酸取代在氨基酸位置95的天冬氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置96的脯氨酸、用亮氨酸取代在氨基酸位置97的缬氨酸、用谷氨酰胺取代在氨基酸位置98的谷氨酸、用谷氨酸取代在氨基酸位置100的天冬氨酸、用苯丙氨酸取代在氨基酸位置102的异亮氨酸、用苏氨酸取代在氨基酸位置104的天冬酰胺、用谷氨酰胺取代在氨基酸位置119的丙氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置123的亮氨酸、用异亮氨酸取代在氨基酸位置125的亮氨酸、和用苏氨酸取代在氨基酸位置128的丙氨酸、和将丝氨酸插入氨基酸位置29和30之间，被称为“人源化h046-L1型轻链”(也称为“h046-L1”)。
人源化h046-L1型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 58中。在SEQ IDNO: 58的氨基酸序列中，由位置1至20的氨基酸残基组成的序列对应于信号序列，由位置21至129的氨基酸残基组成的序列对应于轻链可变区，并且由位置130至234的氨基酸残基组成的序列对应于轻链恒定区。编码SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的核苷酸序列显示于序列表的SEQ ID NO: 59中。在SEQ ID NO: 58的核苷酸序列中，由位置1至60的核苷酸组成的序列编码信号序列，由位置61至387的核苷酸组成的序列编码轻链可变区序列，并且由位置388至702的核苷酸组成的序列编码轻链恒定区序列。SEQ ID NO: 58的氨基酸序列也显示在图14中。
6)-3-2人源化h046-L2型轻链
对于人嵌合抗体04-046Ch轻链中的可变区部分，通过以下设计的人源化h046轻链：在SEQ ID NO: 45中，用异亮氨酸取代在氨基酸位置22的苏氨酸、用谷氨酰胺取代在氨基酸位置23的缬氨酸、用甲硫氨酸取代在氨基酸位置24的亮氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置29的丙氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置21的丙氨酸、用丙氨酸取代在氨基酸位置32的缬氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置34的亮氨酸、用天冬氨酸取代在氨基酸位置36的谷氨酰胺、用苏氨酸取代在氨基酸位置41的丝氨酸、用赖氨酸取代在氨基酸位置58的精氨酸、用脯氨酸取代在氨基酸位置59的丝氨酸、用赖氨酸取代在氨基酸位置61的谷氨酰胺、用丝氨酸取代在氨基酸位置95的天冬氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置96的脯氨酸、用亮氨酸取代在氨基酸位置97的缬氨酸、用谷氨酰胺取代在氨基酸位置98的谷氨酸、用谷氨酸取代在氨基酸位置100的天冬氨酸、用苯丙氨酸取代在氨基酸位置102的异亮氨酸、用苏氨酸取代在氨基酸位置104的天冬酰胺、用谷氨酰胺取代在氨基酸位置119的丙氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置123的亮氨酸、用异亮氨酸取代在氨基酸位置125的亮氨酸、和用苏氨酸取代在氨基酸位置128的丙氨酸、和将丝氨酸插入氨基酸位置29和30之间，被称为“人源化h046-L2型轻链”(也称为“h046-L2”)。
人源化h046-L2型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 60中。在SEQ IDNO: 60的氨基酸序列中，由位置1至20的氨基酸残基组成的序列对应于信号序列，由位置21至129的氨基酸残基组成的序列对应于轻链可变区，并且由位置130至234的氨基酸残基组成的序列对应于轻链恒定区。编码SEQ ID NO: 60的氨基酸序列的核苷酸序列显示于序列表的SEQ ID NO: 61中。在SEQ ID NO: 61的核苷酸序列中，由位置1至60的核苷酸组成的序列编码信号序列，由位置61至387的核苷酸组成的序列编码轻链可变区序列，并且由位置388至702的核苷酸组成的序列编码轻链恒定区序列。SEQ ID NO: 60的氨基酸序列也显示在图15中。
6)-3-3人源化h046-L6型轻链
对于人嵌合抗体04-046Ch轻链中的可变区部分，通过以下设计人源化h046轻链：在SEQID NO: 45中，用谷氨酰胺取代在氨基酸位置23的缬氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置29的丙氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置31的丙氨酸、用丙氨酸取代在氨基酸位置32的缬氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置34的亮氨酸、用天冬氨酸取代在氨基酸位置36的谷氨酰胺、用苏氨酸取代在氨基酸位置41的丝氨酸、用赖氨酸取代在氨基酸位置58的精氨酸、用脯氨酸取代在氨基酸位置59的丝氨酸、用赖氨酸取代在氨基酸位置61的谷氨酰胺、用天冬氨酸取代在氨基酸位置72的天冬酰胺、用精氨酸取代在氨基酸位置73的亮氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置95的天冬氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置96的脯氨酸、用亮氨酸取代在氨基酸位置97的缬氨酸、用谷氨酰胺取代在氨基酸位置98的谷氨酸、用谷氨酸取代在氨基酸位置100的天冬氨酸、用苯丙氨酸取代在氨基酸位置102的异亮氨酸、用谷氨酰胺取代在氨基酸位置119的丙氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置123的亮氨酸、用异亮氨酸取代在氨基酸位置125的亮氨酸、和用苏氨酸取代在氨基酸位置128的丙氨酸、和将丝氨酸插入氨基酸位置29和30之间，被称为“人源化h046-L6型轻链”(也被称为“h046-L6”)。
人源化h046-L6型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 62中。在SEQ IDNO: 62的氨基酸序列中，由位置1至20的氨基酸残基组成的序列对应于信号序列，由位置21至129的氨基酸残基组成的序列对应于轻链可变区，并且由位置130至234的氨基酸残基组成的序列对应于轻链恒定区。编码SEQ ID NO: 62的氨基酸序列的核苷酸序列显示于序列表的SEQ ID NO: 63中。在SEQ ID NO: 63的核苷酸序列中，由位置1至60的核苷酸组成的序列编码信号序列，由位置61至387的核苷酸组成的序列编码轻链可变区序列，并且由位置388至702的核苷酸组成的序列编码轻链恒定区序列。CDRL2的氨基酸序列(SASDRES)显示在序列表中的SEQ ID NO: 92中。
SEQ ID NO: 62的氨基酸序列也显示在图16中。
6)-3-4 人源化的hLA212-L7型轻链
对于SEQ ID NO: 45中所示的人嵌合抗体04-046Ch轻链中的可变区部分，通过以下设计的人源化h046轻链：用谷氨酰胺取代在氨基酸位置23的缬氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置29的丙氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置31的丙氨酸、用丙氨酸取代在氨基酸位置32的缬氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置34的亮氨酸、用天冬氨酸取代在氨基酸位置36的谷氨酰胺、用苏氨酸取代在氨基酸位置41的丝氨酸、用赖氨酸取代在氨基酸位置58的精氨酸、用脯氨酸取代在氨基酸位置59的丝氨酸、用赖氨酸取代在氨基酸位置61的谷氨酰胺、用甘氨酸取代在氨基酸位置73的丝氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置95的天冬氨酸、用丝氨酸取代在氨基酸位置96的脯氨酸、用亮氨酸取代在氨基酸位置97的缬氨酸、用谷氨酰胺取代在氨基酸位置98的谷氨酸、用谷氨酸取代在氨基酸位置100的天冬氨酸、用苯丙氨酸取代在氨基酸位置102的异亮氨酸、用谷氨酰胺取代在氨基酸位置119的丙氨酸、用缬氨酸取代在氨基酸位置123的亮氨酸、用异亮氨酸取代在氨基酸位置125的亮氨酸、和用苏氨酸取代在氨基酸位置128的丙氨酸，和将丝氨酸插入氨基酸位置29和30之间，被称为“人源化h046-L7型轻链”(也被称为“h046-L7”)。
人源化h046-L7型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 64中。在SEQ IDNO: 64的氨基酸序列中，由位置1至20的氨基酸残基组成的序列对应于信号序列，由位置21至129的氨基酸残基组成的序列对应于轻链可变区，并且由位置130至234的氨基酸残基组成的序列对应于轻链恒定区。编码SEQ ID NO: 64的氨基酸序列的核苷酸序列显示于序列表的SEQ ID NO: 65中。在SEQ ID NO: 65的核苷酸序列中，由位置1至60的核苷酸组成的序列编码信号序列，由位置61至387的核苷酸组成的序列编码轻链可变区的序列，并且由位置388至702的核苷酸组成的序列编码轻链恒定区的序列。CDRL2的氨基酸序列(SAGNLES)显示在序列表中的SEQ ID NO: 93中。
SEQ ID NO: 64的氨基酸序列也显示在图17中。
6)-4 通过重链和轻链的组合设计人源化h046
设计由人源化h046-H4e型重链和人源化h046-L1型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H4e/L1”(也称为“h046-H4e/L1”)。设计由人源化h046-H4e型重链和人源化h046-L2型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H4e/L2”(也称为“h046-H4e/L2”)。设计由人源化h046-H4e型重链和人源化h046-L6型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H4e/L6”(也称为“h046-H4e/L6”)。设计由人源化h046-H4e型重链和人源化h046-L7型轻链组成的抗体，命名为“人源化h046-H4e/L7”(也称为“h046-H4e/L7”)。设计由人源化h046-H4b型重链和人源化h046-L1型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H4b/L1”(也称为“h046-H4b/L1”)。设计由人源化h046-H4b型重链和人源化h046-L2型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H4b/L2”(也称为“h046-H4b/L2”)。设计由人源化h046-H4b型重链和人源化h046-L6型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H4b/L6”(也称为“h046-H4b/L6”)。设计由人源化h046-H4b型重链和人源化h046-L7型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H4b/L7”(也称为“h046-H4b/L7”)。设计由人源化h046-H5b型重链和人源化h046-L1型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H5b/L1”(也称为“h046-H5b/L1”)。设计由人源化h046-H5b型重链和人源化h046-L2型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H5b/L2”(也称为“h046-H5b/L2”)。设计由人源化h046-H5b型重链和人源化h046-L6型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H5b/L6”(也称为“h046-H5b/L6”)。设计由人源化h046-H5b型重链和人源化h046-L7型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H5b/L7”(也称为“h046-H5b/L7”)。设计由人源化h046-H8型重链和人源化h046-L1型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H8/L1”(也称为“h046-H8/L1”)。设计由人源化h046-H8型重链和人源化h046-L2型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H8/L2”(也称为“h046-H8/L2”)。设计由人源化h046-H8型重链和人源化h046-L6型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H8/L6”(也称为“h046-H8/L6”)。设计由人源化h046-H8型重链和人源化h046-L7型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H8/L7”(也称为“h046-H8/L7”)。设计由人源化h046-H10型重链和人源化h046-L1型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H10/L1”(也称为“h046-H10/L1”)。设计由人源化h046-H10型重链和人源化h046-L2型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H10/L2”(也称为“h046-H10/L2”)。设计由人源化h046-H10型重链和人源化h046-L6型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H10/L6”(也称为“h046-H10/L6”)。设计由人源化h046-H10型重链和人源化h046-L7型轻链组成的抗体，并命名为“人源化h046-H10/L7”(也称为“h046-H10/L7”)。设计由人嵌合c046重链和人源化h046-L1型轻链组成的抗体，并命名为“人嵌合c046/L1”(也称为“h046-Hwt/L1”)。设计由人嵌合c046重链和人源化h046-L2型轻链组成的抗体，并命名为“人嵌合c046/L2”(也称为“h046-Hwt/L2”)。设计由人嵌合c046重链和人源化h046-L6型轻链组成的抗体，并命名为“人嵌合c046/L6”(也称为“h046-Hwt/L6”)。设计由人嵌合c046重链和人源化h046-L7型轻链组成的抗体，并命名为“人嵌合c046/L7”(也称为“h046-Hwt/L7”)。如此设计的抗体可以根据实施例6)-5和6)-7产生，并且可以根据实施例6)-6、8)和9)进行评估。
6)-5人源化抗-GPR20抗体的表达-(1)
6)-5-1人源化h046重链表达载体的构建
6)-5-1-1人源化h046-H4b型重链表达载体的构建
合成SEQ ID NO: 94所示的DNA片段A (GENEART，人工基因合成服务)。通过与实施例5)-1-3所应用的相同方法，将合成的DNA片段插入已用限制酶BlpI切割的嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1的位点中，从而构建质粒A。通过使用KOD-Plus-突变试剂盒(Toyobo Co., Ltd.)，以质粒A作为模板并使用下面给出的引物组，通过引入突变，构建人源化h046-H4b型重链表达载体。构建的表达载体命名为“pCMA/h046-H4b”。人源化h046-H4b型重链的核苷酸序列显示在SEQ ID NO: 49中，且其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 48中。
引物组：
5'-ATCAACCCTGGCAGCGGCCACACCAACTAC-3' (Hb-F；SEQ ID NO: 95)
5'-GAAGCCCATGTACTTCAGGCCCTGTCCAGGGG-3' (Hb-R；SEQ ID NO: 96)。
6)-5-1-2人源化h046-H5b型重链表达载体的构建
合成SEQ ID NO: 97所示的DNA片段B (GENEART，人工基因合成服务)。通过与实施例5)-1-3所应用的相同方法，将合成的DNA片段插入已用限制酶BlpI切割的嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1的位点中，从而构建质粒B。通过与6)-5-1-1中所应用的相同方法，使用质粒B作为模板引入突变，以构建人源化h046-H5b型重链表达载体。构建的表达载体命名为“pCMA/h046-H5b”。人源化h046-H5b型重链的核苷酸序列显示在SEQ ID NO:53中，且其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 52中。
6)-5-1-3人源化h046-H8型重链表达载体的构建
使用下面给出的引物组和KOD-Plus-突变试剂盒(Toyobo Co., Ltd.)，以实施例5)-1-3中构建的pCMA/04-046Ch-H作为模板引入突变，从而构建人源化h046-H8型重链表达载体。构建的表达载体命名为“pCMA/h046-H8”。人源化h046-H8型重链的核苷酸序列显示在SEQID NO: 55中，且其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 54中。
引物组：
5'-AACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCCCCGACGAC-3' (H08-F；SEQ ID NO: 98)
5'-GGCGGTGCTGCTGCTCTTGTCCACGGTCAG-3' (H08-R；SEQ ID NO: 99)。
6)-5-1-4人源化h046-H10型重链表达载体的构建
使用下面给出的引物组和KOD-Plus-突变试剂盒(Toyobo Co., Ltd.)，以实施例6)-5-1-3中构建的pCMA/h046-H8作为模板引入突变，从而构建人源化h046-H10型重链表达载体。构建的表达载体命名为“pCMA/h046-H10”。人源化h046-H10型重链的核苷酸序列显示在SEQID NO: 57中，且其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 56中。
5'-GTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACC-3' (H10-F；SEQ ID NO: 100)
5'-CTTCACGCTGCTGCCAGGCTTGGCCAGTTC-3' (H10-R；SEQ ID NO: 101)。
6)-5-2人源化h046轻链表达载体的构建
6)-5-2-1人源化h046-L1型轻链表达载体的构建
合成对应于核苷酸位置37至402的DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，所述DNA片段包括编码SEQ ID NO: 59所示的人源化h046-L1核苷酸序列中的可变区的DNA序列。使用合成的DNA片段作为模板，用KOD-Plus-(Toyobo Co., Ltd.)和下面给出的引物组扩增包含编码人源化h046-L1可变区的DNA序列的DNA片段。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，将扩增的DNA片段插入已经用限制酶BsiWI切割的实施例5)-1-1中构建的嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK的位点中，以构建人源化h046-L1表达载体。获得的表达载体命名为“pCMA/h046-L1”。人源化h046-L1的氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 58中。
引物组
5'-CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC-3' (CM-LKF；SEQ ID NO: 90)
5'-GGAGGGGGCGGCCACCGTACG-3' (KCL-Inf-R；SEQ ID NO: 102)。
6)-5-2-2 人源化h046-L2型轻链表达载体的构建
合成DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，其包含编码对应于SEQ ID NO: 61中所示的人源化h046-L2核苷酸序列中的核苷酸位置37至402的人源化h046-L2可变区的DNA序列。通过与实施例6)-5-2-1中所应用的相同方法构建人源化h046-L2表达载体。获得的表达载体命名为“pCMA/h046-L2”。人源化h046-L2的氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 60中。
6)-5-2-3人源化h046-L6型轻链表达载体的构建
合成DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，其包含编码对应于SEQ ID NO: 63所示的人源化h046-L6核苷酸序列中的核苷酸位置37至402的人源化h046-L6可变区的DNA序列。通过与实施例6)-5-2-1中所应用的相同方法构建人源化h046-L6表达载体。获得的表达载体命名为“pCMA/h046-L6”。人源化h046-L6的氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 62中。
6)-5-2-4人源化h046-L7型轻链表达载体的构建
合成DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，其包含编码对应于SEQ ID NO: 65中所示的人源化h046-L7核苷酸序列中的核苷酸位置37至402的人源化h046-L2可变区的DNA序列。通过与实施例6)-5-2-1中所应用的相同方法构建人源化h046-L7表达载体。获得的表达载体命名为“pCMA/h046-L7”。人源化h046-L7的氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 64中。
6)-5-3人源化h046抗体的小规模生产
根据手册，培养并传代FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corp.)。用FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen Corp.)，将1×107个对数生长期的FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corp.)稀释至9.6mL，然后接种于30mL Square Storage Bottle(Nalgene)中，并在8％CO2培养箱中在37℃下以90rpm振荡培养1小时。将30μg聚乙烯亚胺(Polyscience＃24765)溶解于200μL的Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.)中。同时，将使用NucleoBond Xtra (Takara Bio Inc.)制备的轻链表达载体(6μg)和重链表达载体(4μg)加入200μL的Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.)。向200μL聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合溶液中添加200μL表达载体/Opti-Pro SFM混合溶液，并轻轻搅拌所得混合物。温育5分钟后，将混合物加入FreeStyle 293F细胞。将细胞以90rpm在8％CO2培养箱中在37℃下振荡培养7天。将获得的培养上清液通过Minisart-Plus过滤器(Sartorius Inc.)过滤，以获得用于评价的样品。
通过pCMA/h046-H4b和pCMA/h046-L7的组合获得人源化h046-H4b/L7。通过pCMA/h046-H5b和pCMA/h046-L2的组合获得人源化h046-H5b/L2。通过pCMA/04-046Ch-H和pCMA/h046-L6的组合获得人源化的h046-Hwt/L6。通过pCMA/h046-H8和pCMA/h046-L1的组合获得人源化h046-H8/L1。通过pCMA/h046-H10和pCMA/h046-L1的组合获得人源化h046-H10/L1。通过pCMA/h046-H10和pCMA/h046-L6的组合获得人源化h046-H10/L6。
6)-6人源化抗-GPR20抗体的体外评估
6)-6-1人源化抗-GPR20抗体的结合活性的评估
通过流式细胞术确认实施例6)-5-3中产生的人源化抗-GPR20抗体的GPR20结合活性。使用Lipofectamine 2000，通过与实施例1)-5-1中所应用的相同方法，将pcDNA3.1-hGPR20瞬时导入293T细胞中。将细胞在37℃和5％CO2的条件下培养过夜，且然后制备细胞悬浮液。向获得的细胞悬浮液添加各人源化抗-GPR20抗体，并将获得的混合物在4℃静置1小时。此后，用补充5％FBS的PBS洗涤细胞两次，且然后通过添加用补充5％FBS的PBS稀释320倍的PE标记的F(ab')2片段抗人IgG，Fcγ抗体(Jackson ImmunoResearch Inc.)悬浮。将细胞在4℃下静置1小时。用补充5％FBS的PBS洗涤细胞两次，且然后重悬于补充5％FBS的PBS中，然后使用流式细胞仪(BD FACSCant II；BD Biosciences)进行检测。使用Flowjo (Tree StarInc.)分析数据。结果证实，所产生的人源化抗-GPR20抗体与用pcDNA3.1-hGPR20转染的293T细胞结合。图24显示了关于特异性结合人GPR20的人源化抗-GPR20抗体的结果。在图24的直方图中，横坐标表示PE的荧光强度，表示结合的抗体的量，且纵坐标表示细胞计数。阴影直方图显示未与抗-GPR20抗体反应的阴性对照，并且开放直方图显示，当每种抗-GPR20抗体反应时，通过抗体与细胞表面上的GPR20的结合增强荧光强度。
6)-6-2人源化抗-GPR20抗体的内化活性的评估
通过与1)-6中所应用的相同方法，使用与抑制蛋白质合成的毒素(皂草素)缀合的抗人IgG抗体试剂Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems)，评估实施例6)-5-3中产生的人源化抗-GPR20抗体的内化活性。具体地，将稳定表达包含其C-末端连接至EGFP的人GPR20的GPR20-EGFP蛋白的HEK293细胞以2.5×103个细胞/孔接种，并且然后在37℃和5％CO2的条件下培养过夜。将每种人源化抗-GPR20抗体(终浓度：0.015至1.27μg/mL)和Hum-ZAP (终浓度：1μg/mL)加入培养物中。将细胞培养4天，且然后使用CellTiter-Glo (注册商标)发光细胞存活力测定，通过定量ATP测量活细胞的数量。结果，在实施例6)-5-3中产生的人源化抗-GPR20抗体，人源化h046-H4b/L7，人源化h046-H5b/L2，人源化h046-Hwt/L6，人源化h046-H8/L1，人源化h046-H10/L1和人源化h046-H10/L6通过抗体内化显示出细胞增殖抑制作用。
6)-7人源化抗-GPR20抗体的大规模生产-(2)
6)-7-1人源化h046重链表达载体的构建
6)-7-1-1人源化h046-H4b型重链表达载体的构建
合成DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，其包含编码人源化h046_H4b型重链的序列，对应于序列表中SEQ ID NO: 103所示的人源化h046_H4b型重链的核苷酸序列(2)的核苷酸位置58至1416。使用合成的DNA片段，按照Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案，构建人源化h046_H4b型重链表达载体。构建的表达载体命名为“GSV-h046_H4b”。
6)-7-1-2人源化h046-H5b型重链表达载体的构建
合成DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，其包含编码人源化h046_H5b型重链的序列，对应于序列表中SEQ ID NO: 104所示的人源化h046_H5b型重链的核苷酸序列(2)的核苷酸位置58至1416。使用合成的DNA片段，按照Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案，构建人源化h046_H5b型重链表达载体。构建的表达载体命名为“GSV-h046_H5b”。
6)-7-1-3人源化h046-Hwt型重链表达载体的构建
合成DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，其包含编码人源化h046_Hwt型重链的序列，对应于序列表中SEQ ID NO: 105所示的人源化h046_Hwt型重链的核苷酸序列(2)的核苷酸位置58至1416。使用合成的DNA片段，按照Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案，构建人源化h046_Hwt型重链表达载体。构建的表达载体命名为“GSV-h046_Hwt”。
6)-7-1-4人源化h046-H8型重链表达载体的构建
合成DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，其包含编码人源化h046_H8型重链的序列，对应于序列表中SEQ ID NO: 106所示的人源化h046_H8型重链的核苷酸序列(2)的核苷酸位置58至1416。使用合成的DNA片段，按照Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案，构建人源化h046_H8型重链表达载体。构建的表达载体命名为“GSV-h046_H8”。
6)-7-1-5人源化h046-H10型重链表达载体的构建
合成DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，其包含编码人源化h046_H10型重链的序列，对应于序列表中SEQ ID NO: 107所示的人源化h046_H10型重链的核苷酸序列(2)的核苷酸位置58至1416。使用合成的DNA片段，按照Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案，构建人源化h046_H10型重链表达载体。构建的表达载体命名为“GSV-h046_H10”。
6)-7-1-6人源化h046-H4e型重链表达载体的构建
合成DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，其包含编码人源化h046_H4e 型重链的序列，对应于序列表中SEQ ID NO: 51所示的人源化h046_H4e型重链的核苷酸序列的核苷酸位置58至1416。使用合成的DNA片段，按照Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案，构建人源化h046_H4e型重链表达载体。构建的表达载体命名为“GSV-h046_H4e”。
6)-7-2人源化h046轻链表达载体的构建
6)-7-2-1人源化h046-L1型轻链表达载体的构建
合成DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，其包含编码人源化h046_L1型轻链的序列，对应于序列表中SEQ ID NO: 108所示的人源化h046_L1型轻链的核苷酸序列(2)的核苷酸位置61至702。使用合成的DNA片段，按照Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案，构建人源化h046_L1型轻链表达载体。构建的表达载体命名为“GSV-h046_L1”。
6)-7-2-2人源化h046-L2型轻链表达载体的构建
合成DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，其包含编码人源化h046_L2型轻链的序列，对应于序列表中SEQ ID NO: 109所示的人源化h046_L2型轻链的核苷酸序列(2)的核苷酸位置61至702。使用合成的DNA片段，按照Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案，构建人源化h046_L2型轻链表达载体。构建的表达载体命名为“GSV-h046_L2”。
6)-7-2-3人源化h046-L6型轻链表达载体的构建
合成DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，其包含编码人源化h046_L6型轻链的序列，对应于序列表中SEQ ID NO: 110所示的人源化h046_L6型轻链的核苷酸序列(2)的核苷酸位置61至702。使用合成的DNA片段，根据Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案，构建人源化h046_L6型轻链表达载体。构建的表达载体命名为“GSV-h046_L6”。
6)-7-2-4人源化h046-L7型轻链表达载体的构建
合成DNA片段(GENEART，人工基因合成服务)，其包含编码人源化h046_L7型轻链的序列，对应于序列表中SEQ ID NO: 111所示的人源化h046_L7型轻链的核苷酸序列的核苷酸位置61至702。使用合成的DNA片段，按照Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案，构建人源化h046_L7型轻链表达载体。构建的表达载体命名为“GSV-h046_L7”。
6)-7-3人源化抗-GPR20抗体表达载体的构建
6)-7-3-1人源化h046-H4b/L7表达载体的构建
根据Lonza的GS Gene Expression System(注册商标)的方案，由构建的表达载体“GSV-h046_H4b”和“GSV-h046_L7”构建人源化h046-H4b/L7表达载体。将获得的表达载体命名为“DGV-h046_H4bL7-GS”。
6)-7-3-2人源化h046-H5b/L2表达载体的构建
根据Lonza的GS Gene Expression System(注册商标)的方案，从构建的表达载体“GSV-h046_H5b”和“GSV-h046_L2”构建人源化h046-H5b/L2表达载体。将获得的表达载体命名为“DGV-h046_H5bL2-GS”。
6)-7-3-3人源化h046-Hwt/L6表达载体的构建
根据Lonza的GS Gene Expression System(注册商标)的方案，从构建的表达载体“GSV-h046_Hwt”和“GSV-h046_L6”构建人源化h046-Hwt/L6表达载体。将获得的表达载体命名为“DGV-h046_HwtL6-GS”。
6)-7-3-4人源化h046-H8/L1表达载体的构建
根据Lonza的GS Gene Expression System(注册商标)的方案，由构建的表达载体“GSV-h046_H8”和“GSV-h046_L1”构建人源化h046-H8/L1表达载体。将获得的表达载体命名为“DGV-h046_H8L1-GS”。
6)-7-3-5人源化h046-H10/L1表达载体的构建
根据Lonza的GS Gene Expression System(注册商标)的方案，由构建的表达载体“GSV-h046_H10”和“GSV-h046_L1”构建人源化h046-H10/L1表达载体。将获得的表达载体命名为“DGV-h046_H10L1-GS”。
6)-7-3-6人源化h046-H10/L6表达载体的构建
根据Lonza的GS Gene Expression System(注册商标)的方案，从构建的表达载体“GSV-h046_H10”和“GSV-h046_L6”构建人源化h046-H10/L6表达载体。将获得的表达载体命名为“DGV-h046_H10L6-GS”。
6)-7-3-7人源化h046-H4e/L7表达载体的构建
根据Lonza的GS Gene Expression System(注册商标)的方案，由构建的表达载体“GSV-h046_H4e”和“GSV-h046_L7”构建人源化h046-H4e/L7表达载体。将获得的表达载体命名为“DGV-h046_H4eL7-GS”。
6)-7-4生产人源化抗-GPR20抗体的细胞的制备
6)-7-4-1生产人源化h046-H4b/L7的细胞的制备
用实施例6)-7-3-1中根据Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案构建的人源化h046-H4b/L7表达载体DGV-h046_H4bL7-GS转染CHOK1SV细胞(Lonza)，由此构建产生人源化h046-H4b/L7的细胞系。获得的生产细胞系命名为“GPR1-12”。
6)-7-4-2生产人源化h046-H5b/L2的细胞的制备
用实施例6)-7-3-2中根据Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案构建的人源化h046-H5b/L2表达载体DGV-h046_H5bL2-GS转染CHOK1SV细胞(Lonza)，由此构建产生人源化h046-H5b/L2的细胞系。获得的生产细胞系命名为“GPR2-15”。
6)-7-4-3生产人源化h046-Hwt/L6的细胞的制备
用实施例6)-7-3-3中根据Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案构建的人源化h046-Hwt/L6表达载体DGV-h046_H4wtL6-GS转染CHOK1SV细胞(Lonza)，由此构建产生人源化h046-Hwt/L6的细胞系。获得的生产细胞系命名为“GPR3-2”。
6)-7-4-4生产人源化h046-H8/L1的细胞的制备
用实施例6)-7-3-4中根据Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案构建的人源化h046-H8/L1表达载体DGV-h046_H8L1-GS转染CHOK1SV细胞(Lonza)，由此构建产生人源化h046-H8/L1的细胞系。获得的生产细胞系命名为“GPR4-1”。
6)-7-4-5生产人源化h046-H10/L1的细胞的制备
用实施例6)-7-3-5中根据Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案构建的人源化h046-H10/L1表达载体DGV-h046_H10L1-GS转染CHOK1SV细胞(Lonza)，由此构建产生人源化h046-H10/L1的细胞系。获得的生产细胞系命名为“GPR5-10”。
6)-7-4-6生产人源化h046-H10/L6的细胞的制备
用实施例6)-7-3-6中根据Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案构建的人源化h046-H10/L6表达载体DGV-h046_H10L6-GS转染CHOK1SV细胞(Lonza)，由此构建产生人源化h046-H10/L6的细胞系。获得的生产细胞系命名为“GPR6-7”。
6)-7-4-7生产人源化h046-H4e/L7的细胞的制备
用实施例6)-7-3-7中根据Lonza的GS Gene Expression System (注册商标)的方案构建的人源化h046-H4e/L7表达载体DGV-h046_H4eL7-GS转染CHOK1SV细胞(Lonza)，由此构建产生人源化h046-H4e/L7的细胞系。获得的生产细胞系命名为“GPE-23”。
6)-7-5生产人源化抗-GPR20抗体的细胞的培养
6)-7-5-1生产人源化h046-H4b/L7的细胞的培养
使用培养装置Wave反应器(GE Healthcare Japan Corp.)培养实施例6)-7-4-1中制备的人源化h046-H4b/L7生产细胞系“GPR1-12”。将生产细胞系“GPR1-12”在C36 (JX Energy)培养基中解冻，且然后在37℃，5％CO2培养箱中以120rpm培养。将获得的培养液用C36培养基稀释，且然后在37℃，5％CO2培养箱中以120rpm扩增培养。将获得的培养液用C36培养基以30✕104个细胞/mL的细胞密度稀释，且然后转移到WAVE CELLBAG (GE HealthcareBiosciences Corp.)，然后在37℃ 5％CO2中培养10天，空气供应速率为0.3 L/min，转速为18至24 rpm，角度为6至8°。从培养开始后第3天，每天以6％的初始培养体积/天的量向培养物中添加FM4Ae2培养基(自制)。将获得的培养液通过深层过滤器Millistak MC0HC054H1(Merck Millipore)粗略过滤，且然后通过连接于Flexboy Bags的0.22-μm过滤器(Sartorius Inc.)过滤。将该滤液命名为“h046-H4b/L7培养上清液”。
6)-7-5-2生产人源化h046-H5b/L2的细胞的培养
以与实施例6)-7-5-1中所应用的相同方式，培养和扩增实施例6)-7-4-2中制备的人源化h046-H5b/L2生产细胞系“GPR2-15”，且然后使用培养装置Wave反应器(GE HealthcareJapan Corp.)对细胞进行补料分批培养。将获得的培养物用C36培养基以30×104个细胞/mL的细胞密度稀释，且然后转移到WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience)中，然后培养11天。过滤获得的培养液，且将获得的滤液命名为“h046-H5b/L2培养上清液”。
6)-7-5-3生产人源化h046-Hwt/L6的细胞的培养
以与实施例6)-7-5-1中所应用的相同方式，培养和扩增实施例6)-7-4-3中制备的人源化h046-Hwt/L6生产细胞系“GPR3-2”，且然后使用培养装置Wave反应器(GE HealthcareJapan Corp.)对细胞进行补料分批培养。将获得的培养物用C36培养基以30×104个细胞/mL的细胞密度稀释，且然后转移到WAVE CELLBAG(GE Healthcare Bioscience)中，然后培养14天。过滤获得的培养液，且将获得的滤液称为“h046-Hwt/L6培养上清液”。
6)-7-5-4生产人源化h046-H8/L1的细胞的培养
以与实施例6)-7-5-1中所应用的相同方式，培养和扩增实施例6)-7-4-4中制备的人源化h046-H8/L1生产细胞系“GPR4-1”，且然后使用培养装置Wave反应器(GE HealthcareJapan Corp.)对细胞进行补料分批培养。将获得的培养物用C36培养基以30×104个细胞/mL的细胞密度稀释，且然后转移到WAVE CELLBAG(GE Healthcare Bioscience)中，然后培养11天。过滤获得的培养液，且将获得的滤液命名为“h046-H8/L1培养上清液”。
6)-7-5-5生产人源化h046-H10/L1的细胞的培养
以与实施例6)-7-5-1中所应用的相同方式，培养和扩增实施例6)-7-4-5中制备的人源化h046-H10/L1生产细胞系“GPR5-10”，且然后使用培养装置Wave反应器(GE HealthcareJapan Corp.)对细胞进行补料分批培养。将获得的培养物用C36培养基以30×104个细胞/mL的细胞密度稀释，且然后转移到WAVE CELLBAG(GE Healthcare Bioscience)中，然后培养10天。过滤获得的培养液，且将获得的滤液命名为“h046-H10/L1培养上清液”。
6)-7-5-6生产人源化h046-H10/L6的细胞的培养
以与实施例6)-7-5-1中所应用的相同方式，培养和扩增实施例6)-7-4-6中制备的人源化h046-H10/L6细胞系“GPR6-7”，且然后使用培养装置Wave反应器(GE Healthcare JapanCorp.)对细胞进行补料分批培养。将获得的培养物用C36培养基以30×104个细胞/mL的细胞密度稀释，且然后转移到WAVE CELLBAG(GE Healthcare Bioscience)中，然后培养12天。过滤获得的培养液，且将获得的滤液命名为“h046-H10/L6培养上清液”。
6)-7-5-7生产人源化h046-H4e/L7的细胞的培养
以与实施例6)-7-5-1中所应用的相同方式，培养和扩增实施例6)-7-4-7中制备的人源化h046-H4e/L7细胞系“GPE-23”，且然后使用培养装置Wave反应器(GE Healthcare JapanCorp.)对细胞进行补料分批培养。将获得的培养物用C36培养基以30×104个细胞/mL的细胞密度稀释，且然后转移到WAVE CELLBAG(GE Healthcare Bioscience)中，然后培养11天。过滤获得的培养液，且将获得的滤液命名为“h046-H4e/L7培养上清液”。
6)-7-6人源化抗-GPR20抗体的纯化
6)-7-6-1人源化h046-H4b/L7的纯化
通过三步法纯化实施例6)-7-5-1中获得的“h046-H4b/L7培养上清液”，即通过rProtein A亲和层析，阴离子交换层析和阳离子交换层析纯化。首先，将培养上清液施加于已用PBS平衡的rProtein A亲和层析树脂。在全部培养液都已进入柱后，用PBS、含有精氨酸的缓冲溶液，和PBS洗涤柱。随后，用乙酸盐缓冲液洗脱柱中的剩余物质，且然后收集280nm处的吸收峰。将收集的溶液用Tris缓冲液中和，且然后通过玻璃纤维过滤器AP20 (MerckMillipore)粗略过滤。此后，将溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为rProtein A纯化汇集物。
随后，将rProtein A纯化汇集物施加于已用PBS平衡的阴离子交换层析树脂。在施加的全部溶液都已进入柱后，供应PBS。收集供应PBS时的流通级分和280nm处的吸收峰。用乙酸调节收集的溶液的pH。将溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为AEX纯化汇集物。
随后，将AEX纯化汇集物施加于已用乙酸盐缓冲液平衡的阳离子交换层析树脂。在施加的全部溶液都已进入柱后，用乙酸盐缓冲液洗涤柱。此后，使用含有高浓度NaCl的乙酸盐缓冲液进行洗脱，并收集280nm处的吸收峰。将收集的溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为CEX纯化汇集物。
用Pellicon 3 Cassette 30kDa (Merck Millipore)，将CEX纯化汇集物浓缩至抗体浓度为20mg/mL，且然后用组氨酸缓冲液(25mM组氨酸，5％山梨糖醇，pH6.0)替换缓冲液。最后，将溶液通过0.22-μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，以获得纯化的样品。将该纯化的样品命名为“h046_H4b/L7”。
6)-7-6-2人源化h046-H5b/L2的纯化
通过三步法纯化实施例6)-7-5-2中获得的“h046-H5b/L2培养上清液”，即通过rProtein A亲和层析，阴离子交换层析和阳离子交换层析纯化。首先，将培养上清液施加于已用PBS平衡的rProtein A亲和层析树脂。在全部培养液都已进入柱后，用PBS，含有精氨酸的缓冲溶液，和PBS洗涤柱。随后，用乙酸盐缓冲液洗脱柱中的剩余物质，且然后收集280nm处的吸收峰。将收集的溶液用Tris缓冲液中和，且然后通过玻璃纤维过滤器AP20 (MerckMillipore)粗略过滤。此后，将溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为rProtein A纯化汇集物。
随后，将rProtein A纯化汇集物施加于已用PBS平衡的阴离子交换层析树脂。在施加的全部溶液都已进入柱后，供应PBS。收集供应PBS时的流通级分和280nm处的吸收峰。用乙酸调节收集的溶液的pH。将溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV(Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为AEX纯化汇集物。
随后，将AEX纯化汇集物施加于已用乙酸盐缓冲液平衡的阳离子交换层析树脂。在施加的全部溶液都已进入柱后，用乙酸盐缓冲液洗涤柱。此后，使用含有高浓度NaCl的乙酸盐缓冲液进行洗脱，并收集280nm处的吸收峰。将收集的溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为CEX纯化汇集物。
用Pellicon 3 Cassette 30kDa (Merck Millipore)，将CEX纯化汇集物浓缩至抗体浓度为40 mg/mL，且然后用组氨酸缓冲液(25mM组氨酸，5％山梨糖醇，pH6.0)替换缓冲液。最后，将溶液通过0.22-μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，以获得纯化的样品。将该纯化的样品命名为“h046_H5b/L2”。
6)-7-6-3人源化h046-Hwt/L6的纯化
通过三步法纯化实施例6)-7-5-3中获得的“h046-Hwt/L6培养上清液”，即通过rProtein A亲和层析，阴离子交换层析和阳离子交换层析纯化。首先，将培养上清液施加于已用PBS平衡的rProtein A亲和层析树脂。在全部培养液都已进入柱后，用PBS，含有精氨酸的缓冲溶液，和PBS洗涤柱。随后，用乙酸盐缓冲液洗脱柱中的剩余物质，且然后收集280nm处的吸收峰。用Tris缓冲液中和收集的溶液。将溶液通过0.5/0.2μm过滤器MilliporeExpress SHC (Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为rProtein A纯化汇集物。
随后，将rProtein A纯化汇集物施加于已用PBS平衡的阴离子交换层析树脂。在施加的全部溶液都已进入柱后，供应PBS。收集供应PBS时的流通级分和280nm处的吸收峰。用乙酸调节收集的溶液的pH。将溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为AEX纯化汇集物。
随后，将AEX纯化汇集物施加于已用乙酸盐缓冲液平衡的阳离子交换层析树脂。在施加的全部溶液都已进入柱后，用乙酸盐缓冲液洗涤柱。此后，使用含有高浓度NaCl的乙酸盐缓冲液进行洗脱，并收集280nm处的吸收峰。将收集的溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为CEX纯化汇集物。
用Pellicon 3 Cassette 30kDa (Merck Millipore)将CEX纯化汇集物浓缩至抗体浓度为40 mg/mL，且然后用组氨酸缓冲液(25mM组氨酸，5％山梨糖醇，pH6.0)替换缓冲液。最后，将溶液通过0.22-μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，以获得纯化的样品。将该纯化的样品命名为“h046-Hwt/L6”。
6)-7-6-4人源化h046-H8/L1的纯化
通过三步法纯化实施例6)-7-5-4中获得的“h046-H8/L1培养上清液”，即通过rProteinA亲和层析，阴离子交换层析和阳离子交换层析纯化。首先，将培养上清液施加于已用PBS平衡的rProtein A亲和层析树脂。在全部培养液都已进入柱后，用PBS，含有精氨酸的缓冲溶液，和PBS洗涤柱。随后，用乙酸盐缓冲液洗脱柱中的剩余物质，且然后收集280nm处的吸收峰。用Tris缓冲液中和收集的溶液。将溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV (MerckMillipore)过滤，并将所得滤液定义为rProtein A纯化汇集物。
随后，将rProtein A纯化汇集物施加于已用PBS平衡的阴离子交换层析树脂。在施加的全部溶液都已进入柱后，供应PBS。收集供应PBS时的流通级分和280nm处的吸收峰。用乙酸调节收集的溶液的pH。将溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为AEX纯化汇集物。
随后，将AEX纯化汇集物施加于已用乙酸盐缓冲液平衡的阳离子交换层析树脂。在施加的全部溶液都已进入柱后，用乙酸盐缓冲液洗涤柱。此后，使用含有高浓度NaCl的乙酸盐缓冲液进行洗脱，并收集280nm处的吸收峰。将肉鸡的溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为CEX纯化汇集物。
用Pellicon 3 Cassette 30kDa (Merck Millipore)将CEX纯化汇集物浓缩至抗体浓度为40 mg/mL，且然后用组氨酸缓冲液(25mM组氨酸，5％山梨糖醇，pH6.0)替换缓冲液。最后，将溶液通过0.22-μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，以获得纯化的样品。将该纯化的样品命名为“h046-H8/L1”。
6)-7-6-5人源化h046-H10/L1的纯化
通过三步法纯化实施例6)-7-5-5中获得的“h046-H10/L1培养上清液”，即通过rProtein A亲和层析，阴离子交换层析和阳离子交换层析纯化。首先，将培养上清液施加于已用PBS平衡的rProtein A亲和层析树脂。在全部培养液都已进入柱后，用PBS，含有精氨酸的缓冲溶液，和PBS洗涤柱。随后，用乙酸盐缓冲液洗脱柱中的剩余物质，且然后收集280nm处的吸收峰。将收集的溶液用Tris缓冲液中和，且然后通过玻璃纤维过滤器AP20 (MerckMillipore)粗略过滤。此后，将溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为rProtein A纯化汇集物。
随后，将rProtein A纯化汇集物施加于已用PBS平衡的阴离子交换层析树脂。在施加的全部溶液都已进入柱后，供应PBS。收集供应PBS时的流通级分和280nm处的吸收峰。用乙酸调节收集的溶液的pH。将溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV(Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为AEX纯化汇集物。
随后，将AEX纯化汇集物施加于已用乙酸盐缓冲液平衡的阳离子交换层析树脂。在施加的全部溶液都已进入柱后，用乙酸盐缓冲液洗涤柱。此后，使用含有高浓度NaCl的乙酸盐缓冲液进行洗脱，并收集280nm处的吸收峰。将收集的溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为CEX纯化汇集物。
用Pellicon 3 Cassette 30kDa(Merck Millipore)将CEX纯化汇集物浓缩至抗体浓度为40 mg/mL，且然后用组氨酸缓冲液(25mM组氨酸，5％山梨糖醇，pH6.0)替换缓冲液。最后，将溶液通过0.22-μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，以获得纯化的样品。将该纯化的样品命名为“h046-H10/L1”。
6)-7-6-6人源化h046-H10/L6的纯化
通过三步法纯化实施例6)-7-5-6中获得的“h046-H10/L6培养上清液”，即通过rProtein A亲和层析，阴离子交换层析和阳离子交换层析纯化。首先，将培养上清液施加于已用PBS平衡的rProtein A亲和层析树脂。在全部培养液都已进入柱后，用PBS，含有精氨酸的缓冲溶液，和PBS洗涤柱。随后，用乙酸盐缓冲液洗脱柱中的剩余物质，且然后收集280nm处的吸收峰。用Tris缓冲液中和收集的溶液。将溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV(MerckMillipore)过滤，并将所得滤液定义为rProtein A纯化汇集物。
随后，将rProtein A纯化汇集物施加于已用PBS平衡的阴离子交换层析树脂。在施加的全部溶液都已进入柱后，供应PBS。收集供应PBS时的流通级分和280nm处的吸收峰。用乙酸调节收集的溶液的pH。将溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为AEX纯化汇集物。
随后，将AEX纯化汇集物施加于已用乙酸盐缓冲液平衡的阳离子交换层析树脂。在施加的全部溶液都已进入柱后，用乙酸盐缓冲液洗涤柱。此后，使用含有高浓度NaCl的乙酸盐缓冲液进行洗脱，并收集280nm处的吸收峰。将溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV(Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为CEX纯化汇集物。
用Pellicon 3 Cassette 30kDa(Merck Millipore)将CEX纯化汇集物浓缩至抗体浓度为40 mg/mL，且然后用组氨酸缓冲液(25mM组氨酸，5％山梨糖醇，pH6.0)替换缓冲液。最后，将溶液通过0.22-μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，以获得纯化的样品。将该纯化的样品命名为“h046-H10/L6”。
6)-7-6-7人源化h046-H4e/L7的纯化
通过三步法纯化实施例6)-7-5-7中获得的“h046-H4e/L7培养上清液”，即通过rProtein A亲和层析，阴离子交换层析和阳离子交换层析纯化。首先，将培养上清液施加于已用PBS平衡的rProtein A亲和层析树脂。在全部培养液都已进入柱后，用PBS，含有精氨酸的缓冲溶液，和PBS洗涤柱。随后，用乙酸盐缓冲液洗脱柱中的剩余物质，且然后收集280nm处的吸收峰。用Tris缓冲液中和收集的溶液。将溶液通过0.5/0.2μm过滤器MilliporeExpress SHC (Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为rProtein A纯化汇集物。
随后，将rProtein A纯化汇集物施加于已用PBS平衡的阴离子交换层析树脂。在施加的全部溶液都已进入柱后，供应PBS。收集供应PBS时的流通级分和280nm处的吸收峰。用乙酸调节收集的溶液的pH。将溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为AEX纯化汇集物。
随后，将AEX纯化汇集物施加于已用乙酸盐缓冲液平衡的阳离子交换层析树脂。在施加的全部溶液都已进入柱后，用乙酸盐缓冲液洗涤柱。此后，使用含有高浓度NaCl的乙酸盐缓冲液进行洗脱，并收集280nm处的吸收峰。将溶液通过0.22μm过滤器Stericup-GV(Merck Millipore)过滤，并将所得滤液定义为CEX纯化汇集物。
用Pellicon 3 Cassette 30kDa(Merck Millipore)将CEX纯化汇集物浓缩至抗体浓度为40 mg/mL，且然后用组氨酸缓冲液(25mM组氨酸，5％山梨糖醇，pH6.0)替换缓冲液。最后，将溶液通过0.22-μm过滤器Stericup-GV (Merck Millipore)过滤，以获得纯化的样品。将该纯化的样品命名为“h046-H4e/L7”。
实施例7：抗-GPR20抗体-药物缀合物的产生
7)-1抗体-药物缀合物的产生-(1)
[式14]
步骤1：抗体-药物缀合物(1)
抗体的还原：通过使用产生方法1中描述的常规程序B (使用1.47mLmg-1cm-1作为280nm吸光系数)和常规程序C，用PBS6.0/EDTA将实施例5)-2中产生的04-046Ch调节至10mg/mL。向该溶液(3.40mL)中添加9.4mM TCEP(Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) 的水溶液(0.104 mL；每抗体分子5.0当量)和1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque, Inc.；0.170mL)。在确认溶液具有7.4±0.1内的pH之后，通过在37℃下将溶液温育1小时来还原抗体中的链间二硫键。
抗体和药物接头之间的缀合：将上述溶液在15℃温育10分钟。随后，向其中添加N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}甘氨酰基甘氨酰基-L-苯丙氨酰基-N-(4- {[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H苯并[de]吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-4-氧代丁基)甘氨酰胺在二甲基亚砜中的10mM溶液(0.189mL；每抗体分子8.6当量)，并将所得混合物在15℃下温育1小时，以使药物接头与抗体缀合。随后，向其中添加100mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC)的水溶液(0.0284mL；每抗体分子12.9当量)，并将所得混合物在室温下进一步搅拌20分钟以终止药物接头的反应。
纯化：通过产生方法1中描述的常规程序D纯化上述溶液，以获得14.0mL含有抗体-药物缀合物“046Ch-ADC2”的溶液。
表征：使用产生方法1中描述的常规程序E(使用εD,280 = 4964和εD,370 = 18982)，获得以下特征值。
抗体浓度：2.26mg/mL，抗体产率：31.6mg(93％)，和每抗体分子的缀合药物分子平均数(n)：5.6。
7)-2抗体-药物缀合物的产生(2)
[式15]
步骤1：抗体-药物缀合物(2)
抗体的还原：通过使用产生方法1中描述的常规程序B (使用1.47mLmg-1cm-1作为280nm吸光系数)和常规程序C，用PBS6.0/EDTA将实施例5)-2中产生的04-046Ch调节至10mg/mL。向该溶液(3.40mL)中添加9.4mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)(0.104mL；每抗体分子5.0当量)和1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque, Inc.；0.0509mL)的水溶液。在确认溶液具有7.0±0.1内的pH之后，通过在37℃下将溶液温育1小时来还原抗体中的链间二硫键。
抗体和药物接头之间的缀合：将上述溶液在15℃温育10分钟。随后，向其中添加N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰甘氨酰基-L-苯丙氨酰基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1-H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺在二甲基亚砜中的9.3M溶液(0.176 mL；每抗体分子8.6当量)，并将获得的混合物在15℃温育1小时使药物接头与抗体缀合。随后，向其中添加100mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC)的水溶液(0.0284mL；每抗体分子12.9当量)，并将所得混合物在室温下进一步搅拌20分钟以终止药物接头的反应。
纯化：通过产生方法1中描述的常规程序D纯化上述溶液，以获得14.0mL含有抗体-药物缀合物“046Ch-ADC1”的溶液。
表征：使用产生方法1中描述的常规程序E (使用εD,280 = 5178和εD,370 =20217)，获得以下特征值。
抗体浓度：2.23 mg/mL，抗体产率：31.2 mg(92%)，和每抗体分子的缀合药物分子平均数(n)：5.6。
7)-3抗体-药物缀合物的产生(3)
[式16]
步骤1：抗体-药物缀合物(3)
抗体的还原：通过使用产生方法1中描述的常规程序B (使用1.31mLmg-1cm-1作为280nm吸光系数)和常规程序C，用PBS6.0/EDTA将实施例6)-7-6-1中产生的h046-H4b/L7调节至10mg/mL。向该溶液(6.25mL)添加10mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)的水溶液(0.237 mL；每抗体分子5.5当量)和1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque, Inc.；0.0940 mL)。在确认溶液具有7.0±0.1内的pH之后，通过在37℃下将溶液温育1小时来还原抗体中的链间二硫键。
抗体和药物接头之间的缀合：将上述溶液在15℃温育10分钟。随后，向其中添加N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰甘氨酰基-L-苯丙氨酰基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1-H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4': 6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺在二甲基亚砜中的10 mM溶液(0.388 mL；每抗体分子9.0当量)，并将获得的混合物在15℃温育1小时使药物接头与抗体缀合。随后，向其中添加100mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC)的水溶液(0.0390mL；每抗体分子9.0当量)，并将所得混合物在室温下进一步搅拌20分钟以终止药物接头的反应。
纯化：通过产生方法1中描述的常规程序D纯化上述溶液，以获得30.0mL含有抗体-药物缀合物“h046-H4b/L7-ADC1”的溶液。
表征：使用产生方法1中描述的常规程序E和F (使用εD,280 = 5178和εD,370 =20217)，获得以下特征值。
抗体浓度：2.03 mg/mL，抗体产率：61.0 mg(97%)，通过常规程序E测量的每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：5.5和通过常规程序F测量的每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：7.8。
7)-4抗体-药物缀合物的产生(4)
[式17]
步骤1：抗体-药物缀合物(4)
抗体的还原：通过使用产生方法1中描述的常规程序B(使用1.31 mLmg-1cm-1作为280nm吸光系数)和常规程序C，用PBS6.0/EDTA将实施例6)-7-6-1中产生的h046-H4b/L7调节至10mg/mL。将该溶液(300mL)置于1000mL聚碳酸酯锥形瓶中，且然后加入1M磷酸氢二钾水溶液(4.80mL)，且然后加入10mM TCEP水溶液(11.3mL；每抗体5.5当量)，在室温下使用磁力搅拌器搅拌。在确认溶液具有7.0±0.1内的pH之后，搅拌终止，并通过在37℃下将溶液温育2小时来还原抗体中的链间二硫键。
抗体与药物接头之间的缀合：将上述溶液冷却至15℃。此后，在搅拌下，逐渐向其滴加含有10mM N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰甘氨酰基-L-苯丙氨酰-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1-H,12H-苯并[de]吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺的DMSO溶液(18.5 mL；每抗体分子9.0当量)。将获得的混合物在15℃下搅拌30分钟以使药物接头与抗体缀合。随后，在搅拌下向其中添加100mM NAC水溶液(1.85mL；9.0当量/抗体分子)，并将获得的混合物在室温下进一步搅拌20分钟以终止未反应的药物接头的反应。
纯化：使用由超滤膜(Merck Japan, Ltd., Pellicon XL Cassette，Ultracell30 KDa)，管泵(Cole-Parmer International, USA, MasterFlex泵型号77521-40，泵头型号7518-00)和管(Cole-Parmer International，USA，MasterFlex管L/S16)构成的超滤装置，通过超滤纯化所得溶液。具体地，在向反应溶液中滴加作为用于纯化的缓冲溶液的ABS(总共3.00L)同时，进行超滤纯化，以用ABS替换缓冲液并进一步浓缩溶液，同时除去非缀合药物接头和其他低分子量试剂。对获得的纯化的溶液进行微滤(0.22μm，PVDF膜，2次)，以获得83.0mL含有抗体-药物缀合物“h046-H4b/L7-ADC1”的溶液。
表征：使用常规程序E和F(使用εD,280 = 5178和εD,370 =20217)，获得以下特征值。
抗体浓度：23.1 mg/mL，抗体产率：2.94 g(98%)，通过常规程序E测量的每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：5.8和通过常规程序F测量的每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：7.4。
7)-5抗体-药物缀合物的产生(5)
[式18]
步骤1：抗体-药物缀合物(5)
使用实施例6)-7-6-2中产生的h046-H5b/L2 (使用1.31 mLmg-1cm-1作为280nm吸光系数)，与实施例7-3的步骤1中所应用的相同方法，获得抗体-药物缀合物“h046-H5b/L2-ADC1”。
抗体浓度：2.04 mg/mL，抗体产率：61.3 mg(98%)，通过常规程序E测量每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n):5.4和通过常规程序F测量每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：7.9。
7)-6抗体-药物缀合物的产生(6)
[式19]
步骤1：抗体-药物缀合物(6)
使用实施例6)-7-6-3中产生的h046-Hwt/L6 (使用1.31mLmg-1cm-1作为280nm吸光系数)，与实施例7-3的步骤1中所应用的相同方法，获得抗体-药物缀合物“h046-Hwt/L6-ADC1”。
抗体浓度：2.03 mg/mL，抗体产率：60.9 mg(95%)，通过常规程序E测量每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n):5.6和通过常规程序F测量每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：7.8。
7)-7抗体-药物缀合物的产生(7)
[式20]
步骤1：抗体-药物缀合物(7)
抗体的还原：通过使用产生方法1中描述的常规程序B(使用1.31 mLmg-1cm-1作为280nm吸光系数)和常规程序C，用PBS6.0/EDTA将实施例6)-7-6-1中产生的h046-H4b/L7调节至10mg/mL。向该溶液(5.00mL)添加10mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)的水溶液(0.193 mL；每抗体分子5.5当量)和1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque, Inc.；0.0752 mL)。在确认溶液具有7.0±0.1内的pH之后，通过在37℃下将溶液温育1小时来还原抗体中的链间二硫键。
抗体和药物接头之间的缀合：将上述溶液在15℃温育10分钟。随后，向其中添加N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}甘氨酰基甘氨酰基-L-苯丙氨酰基-N-(4-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H苯并[de]吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-4-氧代丁基)甘氨酰胺在二甲基亚砜中的10mM溶液(0.315mL；每抗体分子9.0当量)，并将所得混合物在15℃下温育1小时，以使药物接头与抗体缀合。随后，向其中添加100mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC)的水溶液(0.0316mL；每抗体分子9.0当量)，并将所得混合物在室温下进一步搅拌20分钟以终止药物接头的反应。
纯化：通过产生方法1中描述的常规程序D纯化上述溶液，以获得24.0mL含有抗体-药物缀合物“h046-H4b/L7-ADC2”的溶液。
表征：使用产生方法1中描述的常规程序E和F (使用εD,280 = 4964和εD,370 =18982)，获得以下特征值。
抗体浓度：2.07 mg/mL，抗体产率：49.6 mg(99%)，通过常规程序E测量的每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：6.1和通过常规程序F测量的每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：7.6。
7)-8抗体-药物缀合物的产生(8)
[式21]
步骤1：抗体-药物缀合物(8)
抗体的还原：通过使用产生方法1中描述的常规程序B (使用1.31mLmg-1cm-1作为280nm吸光系数)和常规程序C，用PBS6.0/EDTA将实施例6)-7-6-2中产生的h046-H5b/L2调节至10mg/mL。向该溶液(6.25mL)中添加10mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)的水溶液(0.237 mL；每抗体分子5.5当量)和1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque, Inc.；0.0940 mL)。在确认溶液具有7.0±0.1内的pH之后，通过在37℃下将溶液温育1小时来还原抗体中的链间二硫键。
抗体和药物接头之间的缀合：将上述溶液在15℃温育10分钟。随后，向其中添加N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}甘氨酰基甘氨酰基-L-苯丙氨酰基-N-(4-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H苯并[de]吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-4-氧代丁基)甘氨酰胺在二甲基亚砜中的10mM溶液(0.388mL；每抗体分子9.0当量)，并将所得混合物在15℃下温育1小时，以使药物接头与抗体缀合。随后，向其中添加100mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC)的水溶液(0.0390mL；每抗体分子9.0当量)，并将所得混合物在室温下进一步搅拌20分钟以终止药物接头的反应。
纯化：通过产生方法1中描述的常规程序D纯化上述溶液，以获得30.0mL含有抗体-药物缀合物“h046-H5b/L2-ADC2”的溶液。
表征：使用产生方法1中描述的常规程序E和F (使用εD,280 = 4964和εD,370 =18982)，获得以下特征值。
抗体浓度：2.07 mg/mL，抗体产率：62.2 mg(99%)，通过常规程序E测量的每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：6.0和通过常规程序F测量的每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：7.7。
7)-9抗体-药物缀合物的产生(9)
[式22]
步骤1：抗体-药物缀合物(9)
使用实施例6)-7-6-3中产生的h046-Hwt/L6 (使用1.31mLmg-1cm-1作为280nm吸光系数)，通过实施例7)-8的步骤1中应用的相同方法，获得抗体-药物缀合物“h046-Hwt/L6-ADC2”。
抗体浓度：2.10 mg/mL，抗体产率：62.9 mg(99%)，通过常规程序E测量的每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：6.1和通过常规程序F测量的每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：7.4。
7)-10抗体-药物缀合物的产生(10)
[式23]
步骤1：抗体-药物缀合物(10)
使用实施例6)-7-6-4中产生的h046-H8/L1 (使用1.31mLmg-1cm-1作为280nm吸光系数)，通过实施例7)-3的步骤1中应用的相同方法，获得抗体-药物缀合物“h046-H8/L1-ADC1”。
抗体浓度：1.75 mg/mL，抗体产率：52.6 mg(86%)，通过常规程序E测量每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：5.6和通过常规程序F测量每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：7.9。
7)-11抗体-药物缀合物的产生(11)
[式24]
步骤1：抗体-药物缀合物(11)
使用实施例6)-7-6-5中产生的h046-H10/L1 (使用1.31mLmg-1cm-1作为280nm吸光系数)，通过实施例7)-3的步骤1中应用的相同方法，获得抗体-药物缀合物“h046-H10/L1-ADC1”。
抗体浓度：1.85mg/mL，抗体产率：55.6mg(90％)，通过常规程序E测量每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：5.6和通过常规程序F测量每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：7.9。
7)-12抗体-药物缀合物的产生(12)
[式25]
步骤1：抗体-药物缀合物(12)
使用实施例6)-7-6-6中产生的h046-H10/L6 (使用1.31mLmg-1cm-1作为280nm吸光系数)，通过实施例7)-3的步骤1中应用的相同方法，获得抗体-药物缀合物“h046-H10/L6-ADC1”。
抗体浓度：1.83 mg/mL，抗体产率：55.0 mg(87%)，通过常规程序E测量的每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：5.5和通过常规程序F测量的每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：8.0。
7)-13抗体-药物缀合物的产生(13)
[式26]
步骤1：抗体-药物缀合物(13)
抗体的还原：通过使用产生方法1中描述的常规程序B (使用1.31mLmg-1cm-1作为280nm吸光系数)和常规程序C，用PBS6.0/EDTA将实施例6)-7-6-7中产生的h046-H4e/L7调节至10mg/mL。向该溶液(11.0mL)中添加10mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)的水溶液(0.412 ml；每抗体分子5.5当量)和1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque, Inc.；0.165 mL)。在确认溶液具有7.0±0.1内的pH之后，通过在37℃下将溶液温育1小时来还原抗体中的链间二硫键。
抗体和药物接头之间的缀合：将上述溶液在15℃温育10分钟。随后，向其中添加N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰甘氨酰基-L-苯丙氨酰基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1-H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺在二甲基亚砜中的10 mM的溶液(0.0674 mL；每抗体分子9.0当量)，并将获得的混合物在15℃温育1小时使药物接头与抗体缀合。随后，向其中添加100mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC)的水溶液(0.0674mL；每抗体分子9.0当量)，并将所得混合物在室温下进一步搅拌20分钟以终止药物接头的反应。
纯化：通过产生方法1中描述的常规程序D纯化上述溶液，以获得34.5mL含有抗体-药物缀合物“h046-H4e/L7-ADC1”的溶液。
表征：使用产生方法1中描述的常规程序E和F (使用εD,280 = 5178和εD,370 =20217)，获得以下特征值。
抗体浓度：3.01 mg/mL，抗体产率：104 mg(95%)，通过常规程序E测量的每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：5.6和通过常规程序F测量的每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：7.7。
7)-14抗体-药物缀合物的产生(14)
[式27]
步骤1：抗体-药物缀合物(14)
使用实施例6)-7-6-7中产生的h046-H4e/L7 (使用1.31mLmg-1cm-1作为280nm吸光系数)，通过实施例7-13的步骤1中应用的相同方法，获得抗体-药物缀合物“h046-H4e/L7-ADC1”。
抗体浓度：3.14 mg/mL，抗体产率：108 mg(99%)，通过常规程序E测量每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：5.6和通过常规程序F测量每抗体分子的缀合药物分子的平均数(n)：7.6。
实施例8：评估抗体-药物缀合物的体外活性
8)-1-1评估人源化抗-GPR20抗体和抗体-药物缀合物的结合活性
通过流式细胞术评估实施例6)-7-6中产生的人源化抗-GPR20抗体和实施例7中产生的抗体-药物缀合物的GPR20结合活性。作为使用流式细胞仪(BD FACSCant II；BDBiosciences)，通过实施例6)-6-1中所应用的相同方法，分析它们与使用pcDNA3.1-hGPR20瞬时转染的293T细胞的结合的结果，确认了抗体浓度依赖性结合活性。其代表性的反应实例显示在图25中。在图25中，横坐标表示抗体浓度(nM)，并且纵坐标表示基于MFI (平均荧光强度)的结合抗体的量。如图25所示，人源化抗-GPR20抗体h046-H4b/L7和h046-H4e/L7以及抗体-药物缀合物(4)和(13)与pcDNA3.1-hGPR20转染的293T细胞结合的量以浓度依赖性方式增加。
8)-2稳定表达的细胞系GIST-T1/GPR20的生成
通过使用用于人GPR20表达的重组逆转录病毒感染GIST-T1细胞(可从Cosmo Bio Co.,Ltd.获得)产生稳定的细胞系GIST-T1/GPR20。
8)-2-1制备人GPR20表达逆转录病毒载体
使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)制备人GPR20表达逆转录病毒载体。具体地，使用实施例1中产生的人GPR20表达载体pcDNA3.1-hGPR20作为模板，用下面给出的引物组进行PCR反应。在该反应中，使用KOD FX DNA聚合酶(Toyobo Co.,Ltd.)，并且以30个循环进行反应，每个循环涉及98℃持续10秒，58℃持续30秒和68℃持续2分钟。此后，将获得的包含GPR20 cDNA片段的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen NV)提取具有目标大小的DNA。使用In-Fusion HD酶预混物，将该DNA片段与已用限制酶EcoRI和NotI消化的逆转录病毒载体pLPCX (ClontechLaboratories, Inc.)混合。在连接反应后，使用连接产物转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen Corp.)以构建人GPR20表达逆转录病毒载体pLPCX-GPR20。PCR中使用的引物组如下。
PCR引物组(用于pLPCX和GPR20 cDNA片段的In-Fusion克隆)
5'-CTCAAGCTTCGAATTCACCATGCCCTCTGTGTCTCCA-3' (LPCX-1；SEQ ID NO: 112)
5'-TTGGCCGAGGCGGCCTCCTAAGCCTCGGGCCCATTAG-3' (LPCX-1; SEQ ID NO: 113)。
8)-2-2稳定表达细胞系GIST-T1/GPR20的建立
使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp.)，将pLPCX-GPR20瞬时导入逆转录病毒包装细胞293-10A1中。72小时后，收集含有重组逆转录病毒的培养上清液，且然后添加到GIST-T1细胞培养系统，使细胞感染病毒。感染后3天，将GIST-T1细胞以1个细胞/孔接种于96孔板上，且然后在37℃和5％CO2的条件下在已添加0.3至1μg/ mL嘌呤霉素的培养基中长时间培养，从而建立稳定表达GPR20的细胞系GIST-T1/GPR20。
8)-3评估ADC对GIST-T1/GPR20细胞的体外细胞增殖抑制活性
将GIST-T1/GPR20细胞以2.5×103个细胞/100μL/孔接种于96孔板上，在补充10％FBS的DMEM培养基中，且然后将细胞在37℃和5％CO2的条件下培养过夜。将实施例7中产生的每种抗体-药物缀合物加入细胞中，使得终浓度为0.032至100nM。培养7至11天后，使用CellTiter-Glo (注册商标)发光细胞活力测定，通过ATP的定量测量活细胞数。图26显示在将由人嵌合抗体产生的抗体-药物缀合物(1)加入细胞时的浓度依赖性细胞增殖抑制活性，和图27显示在将由人源化抗体产生的药物缀合物(7)，(8)和(9)的每一种加入细胞中时的浓度依赖性细胞增殖抑制活性。该实验中的hIgG-ADC2是由识别与GPR20无关的抗原的人IgG产生的抗体-药物缀合物，并用作阴性对照。
实施例9：抗体-药物缀合物的体内抗肿瘤作用
使用通过移植人胃肠道间质瘤衍生细胞而由免疫缺陷小鼠衍生的动物模型来评估抗体-药物缀合物的抗肿瘤作用。在用于实验之前，使5至6周龄的雌性BALB/c裸鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj，Charles River Laboratories Japan Inc.)在SPF条件下适应环境4至7天。给小鼠喂食灭菌的固体饲料(FR-2，Funabashi Farms Co., Ltd)并给予无菌自来水(其通过向自来水添加5-15ppm次氯酸钠溶液制备)。使用电子数字卡尺(CD-15CX，MitutoyoCorp.)每周一次或两次测量移植肿瘤的最长直径和最短直径，且然后根据以下等式计算肿瘤体积。
肿瘤体积(mm3)= 1/2✕最长直径(mm)✕[最短直径(mm)]2。
用ABS缓冲液(10mM乙酸盐缓冲液，5％山梨糖醇，pH5.5)(Nacalai Tesque, Inc.)稀释每种抗体-药物缀合物，并将稀释液以10mL/kg的体积静脉内施用至每只小鼠的尾部。以与上述相同的方式将ABS缓冲液施用对照组(媒介物组)。在实验中，使用每组5或6只小鼠。
9)-1抗肿瘤作用-(1)
将在8)-1-2中制备的GIST-T1/GPR20细胞悬浮于Matrigel (Corning Inc.)中，并将细胞悬浮液以5×106个细胞的剂量皮下移植到每只雌性裸鼠的右胁腹区域(第0天)。在第14天，将小鼠随机分组。在第14天，将抗体-药物缀合物(1)或(2)以10mg/kg的剂量静脉内施用于每只小鼠的尾部。作为阴性对照，以与上述相同的方式以10mg/kg的剂量施用使用人IgG产生的抗体-药物缀合物。抗体-药物缀合物(1)或(2)的施用显著降低肿瘤体积，并且抗体-药物缀合物均对肿瘤消退有效(图28)。应注意，在图中，横坐标表示天数，并且纵坐标表示肿瘤体积。hIgG-ADC1和hIgG-ADC2是由识别与GPR20无关的抗原的人IgG产生的抗体-药物缀合物，并用作阴性对照。
9)-2抗肿瘤作用-(2)
将人胃肠道间质肿瘤细胞系GIST430的2×107个细胞(得自Brigham Women'sHosptial)皮下移植到每只雌性裸鼠的右胁腹区域(第0天)。在第29天，将小鼠随机分组。在第29、36和43天，将抗体-药物缀合物(1)或(2)以10mg/kg的剂量静脉内施用于每只小鼠的尾部。与对照组相比，抗体-药物缀合物(1)或(2)的施用显著降低肿瘤体积，并且两种抗体-药物缀合物均发挥肿瘤生长抑制作用(图29)。
9)3抗肿瘤作用-(3)
以实施例9)-1所应用的相同方式，将GIST-T1/GPR20细胞皮下移植到雌性裸鼠(第0天)。在第24天，将小鼠随机分组。在第24天，将抗体-药物缀合物(6)或(9)以10mg/kg的剂量静脉内施用于每只小鼠的尾部。抗体-药物缀合物(6)或(9)的施用显著降低肿瘤体积，并且两种抗体-药物缀合物均对肿瘤消退有效(图30)。
9)-4抗肿瘤作用-(4)
以实施例9)-1所应用的相同方式，将GIST-T1/GPR20细胞皮下移植到雌性裸鼠(第0天)。在第17天，将小鼠随机分组。在第17天，将抗体-药物缀合物(3)，(5)，(6)，(10)，(11)或(12)以1mg/kg的剂量静脉内施用至每只小鼠的尾部。抗体-药物缀合物(3)，(5)，(6)，(10)，(11)或(12)的施用显著降低肿瘤体积，并且所有抗体-药物缀合物都发挥抑制肿瘤生长效果(图31)。
9)-5抗肿瘤作用-(5)
以实施例9)-1所应用的相同方式，将GIST-T1/GPR20细胞皮下移植到雌性裸鼠(第0天)。在第17天，将小鼠随机分组。在第17天，将抗体-药物缀合物(13)以0.3、1或3mg/kg的剂量静脉内施用于每只小鼠的尾部。抗体-药物缀合物(13)的施用以剂量依赖性方式降低肿瘤体积，并且所述抗体-药物缀合物在1mg/kg或更多的剂量下对肿瘤消退有效(图32)。
9)-6抗肿瘤作用-(6)
将GIST020 (得自National Institutes of Biomedical Innovation, Health andNutrition；通过将从小肠中具有胃肠道间质瘤的患者切除的肿瘤块皮下移植到免疫缺陷小鼠而传代和维持)，皮下移植到雌性裸鼠的右胁腹区域(第0天)。在第55天，将小鼠随机分组。在第55天和第75天，将抗体-药物缀合物(4)或(13)以10mg/kg的剂量静脉内施用于每只小鼠的尾部。与对照组相比，抗体-药物缀合物(4)或(13)的施用显著降低肿瘤体积，并且两种抗体-药物缀合物均发挥肿瘤生长抑制作用(图33)。
9)-7抗肿瘤作用-(7)
GIST1 (得自University of Toyama；通过将从食道中具有胃肠道间质瘤的患者切除的肿瘤块皮下移植到免疫缺陷小鼠而传代和维持)，皮下移植到雌性裸鼠的右胁腹区域(第0天)。在第38天，将小鼠随机分组。在第38和59天，将抗体-药物缀合物(13)以3或10mg/kg的剂量静脉内施用于每只小鼠的尾部。与对照组相比，抗体-药物缀合物(13)的施用显著降低肿瘤体积，并且所述抗体-药物缀合物发挥肿瘤生长抑制作用(图34)。
9)-8抗肿瘤作用-(8)
将强烈表达HER2分子但不表达GPR20的胃癌细胞系NCI-N87的1×107个细胞，皮下移植到雌性裸鼠的右胁腹区域(第0天)。在第6天，将小鼠随机分组。在第6天，将抗体-药物缀合物(14)以3或10mg/kg的剂量静脉内施用于每只小鼠的尾部。然而，抗体-药物缀合物(14)没有表现出显著的肿瘤生长抑制作用。另一方面，与对照组相比，由抗HER2抗体产生的药物缀合物的施用显著降低肿瘤体积，并且所述抗体-药物缀合物发挥肿瘤生长抑制作用(图35)。
9)-9抗肿瘤作用-(9)
GIST074 (得自National Institutes of Biomedical Innovation, Health andNutrition；通过将肿瘤块皮下移植到免疫缺陷小鼠而传代和维持，其中所述肿瘤块源自在胃中具有对瑞格非尼治疗无反应的胃肠道间质瘤的患者)，皮下移植到雌性裸鼠的右胁腹区域(第0天)。在第29天，将小鼠随机分组。在第29天和第50天，将抗体-药物缀合物(14)以10mg/kg的剂量静脉内施用于每只小鼠的尾部。抗体-药物缀合物(14)的施用完全抑制肿瘤生长(图36)。另一方面，当伊马替尼、舒尼替尼和瑞格非尼分别以90、30和4 mg/kg的剂量在图36中三角形标记所示日期每天一次口服施用时，肿瘤生长没有完全抑制。从这些结果明显可见，即便是对充当标准治疗药物的3种酪氨酸激酶抑制剂表现出抗性的胃肠道间质瘤，抗体-药物缀合物(14)也发挥抗肿瘤作用。
9)-10抗肿瘤作用-(10)
在具有人胃肠道间质瘤细胞系GIST430/654 (得自Brigham Women's Hosptial；其在KIT基因中具有伊马替尼抗性突变V654A)的模型中评估了与舒尼替尼组合使用的效果。将2×107个GIST430/654细胞皮下移植到每只雌性裸鼠的右胁腹区域(第0天)。在第21天，将小鼠随机分组。如图37所示，在第21天，将抗体-药物缀合物(3)以10mg/kg的单剂量静脉内施用于每只小鼠的尾部。在三角形标记所示日期，将伊马替尼和舒尼替尼分别以150和40mg/kg的剂量口服施用，每天一次。在GIST430/654模型中，伊马替尼没有抑制肿瘤生长，而在施用抗体-药物缀合物(3)或舒尼替尼的组中观察到肿瘤生长的抑制。在抗体-药物缀合物(3)和舒尼替尼的组合使用组中，观察到比单一药剂引起的更强的药效，并且发现肿瘤消退。
工业实用性
本发明提供具有内化活性的抗-GPR20抗体和包含所述抗体的抗体-药物缀合物。所述抗体-药物缀合物可用作胃肠道间质瘤等的治疗药物。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 44：04-046Ch重链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 45：04-046Ch轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 46：04-046Ch抗体重链的核苷酸序列
SEQ ID NO: 47：04-046Ch轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO: 48：h046-H4b的氨基酸序列
SEQ ID NO: 49：h046-H4b的核苷酸序列(1)
SEQ ID NO: 50：h046-H4e的氨基酸序列
SEQ ID NO: 51：h046-H4e的核苷酸序列
SEQ ID NO: 52：h046-H5b的氨基酸序列
SEQ ID NO: 53：h046-H5b的核苷酸序列(1)
SEQ ID NO: 54：h046-H8的氨基酸序列
SEQ ID NO: 55：h046-H8的核苷酸序列(1)
SEQ ID NO: 56：h046-H10的氨基酸序列
SEQ ID NO: 57：h046-H10的核苷酸序列(1)
SEQ ID NO: 58：h046-L1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 59：h046-L1的核苷酸序列(1)
SEQ ID NO: 60：h046-L2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 61：h046-L2的核苷酸序列(1)
SEQ ID NO: 62：h046-L6的氨基酸序列
SEQ ID NO: 63：h046-L6的核苷酸序列(1)
SEQ ID NO: 64：h046-L7的氨基酸序列
SEQ ID NO: 65：h046-L7的核苷酸序列(1)
SEQ ID NO: 66：PCR引物Nhe-聚C-S
SEQ ID NO: 67：PCR引物rIgγ-AS1
SEQ ID NO: 68：PCR引物rIgγ-AS2
SEQ ID NO: 69：PCR引物rIgκ-AS
SEQ ID NO: 70：PCR引物rIgγ-seq
SEQ ID NO: 71：PCR引物rIgκ-seq
SEQ ID NO: 72：PCR引物NFLAG-1
SEQ ID NO: 73：PCR引物NFLAG-2
SEQ ID NO: 74：PCR引物mEC2-1
SEQ ID NO: 75：PCR引物mEC2-2
SEQ ID NO: 76：PCR引物mEC3-1
SEQ ID NO: 77：PCR引物mEC3-2
SEQ ID NO: 78：PCR引物mEC4-1
SEQ ID NO: 79：PCR引物mEC4-2
SEQ ID NO: 80：PCR引物mEC1-1
SEQ ID NO: 81：PCR引物mEC1-2
SEQ ID NO: 82：PCR引物mEC1-3
SEQ ID NO: 83：PCR引物mEC1-4
SEQ ID NO: 85：PCR引物3.3-F1
SEQ ID NO: 86：PCR引物3.3-R1
SEQ ID NO: 88：PCR引物EG-Inf-F
SEQ ID NO: 89：PCR引物EG1-Inf-R
SEQ ID NO: 90：PCR引物CM-LKF
SEQ ID NO: 91：PCR引物046L-R
SEQ ID NO: 92：h046-L6 CDRL2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 93：h046-L7 CDRL2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 94：DNA片段A
SEQ ID NO: 95：PCR引物Hb-F
SEQ ID NO: 96：PCR引物Hb-R
SEQ ID NO: 97：DNA片段B
SEQ ID NO: 98：H08-F
SEQ ID NO: 99：H08-R
SEQ ID NO: 100：H10-F
SEQ ID NO: 101：H10-R
SEQ ID NO: 102：PCR引物KCL-Inf-R
SEQ ID NO: 103：h046-H4b的核苷酸序列(2)
SEQ ID NO: 104：h046-H5b的核苷酸序列(2)
SEQ ID NO: 105：h046-Hwt的核苷酸序列(2)
SEQ ID NO: 106：h046-H8的核苷酸序列(2)
SEQ ID NO: 107：h046-H10的核苷酸序列(2)
SEQ ID NO: 108：h046-L1的核苷酸序列(2)
SEQ ID NO: 109：h046-L2的核苷酸序列(2)
SEQ ID NO: 110：h046-L6的核苷酸序列(2)
SEQ ID NO: 111：h046-L7的核苷酸序列(2)
SEQ ID NO: 112：PCR引物LPCX-1
SEQ ID NO: 113：PCR引物LPCX-2。

Claims (63)

1.具有以下特性(a)和(b)的抗体或所述抗体的功能片段：
(a) 特异性结合GPR20，和
(b) 具有允许在结合GPR20后细胞摄取的内化能力。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗体的功能片段，其中所述GPR20是由SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列组成的分子。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或抗体的功能片段，其特异性结合由SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列组成的多肽，并且不特异性结合氨基酸位置113处的氨基酸Y (酪氨酸)被不同的氨基酸取代的多肽。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其特异性结合由SEQ IDNO: 1中所示的氨基酸序列组成的多肽，并且不特异性结合氨基酸位置113处的氨基酸Y(酪氨酸)被F (苯丙氨酸)取代的多肽。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其特异性结合由SEQ IDNO: 1中的氨基酸位置1至48的氨基酸序列和氨基酸位置108至125的氨基酸序列组成的构象。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其特异性结合SEQ IDNO: 1中选自氨基酸位置1至48的氨基酸序列的至少一个氨基酸和选自氨基酸位置108至125的氨基酸序列的至少一个氨基酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其中所述抗体或所述功能片段特异性结合的至少一个氨基酸是SEQ ID NO: 1的氨基酸位置113处的氨基酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其针对选自下列抗体(a)至(c)的任一种抗体，具有对结合GPR20的竞争性抑制活性：
(a) 具有重链和轻链的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 2的氨基酸位置20至475的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 7的氨基酸位置21至233的氨基酸序列组成，
(b) 具有重链和轻链的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 12的氨基酸位置20至475的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 17的氨基酸位置21至233的氨基酸序列组成，和
(c) 具有重链和轻链的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 22的氨基酸位置20至475的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 27的氨基酸位置21至233的氨基酸序列组成的轻链组成。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其包含选自以下组合(a)至(c)中的任一组合的CDRH1、CDRH2和CDRH3，和选自以下组合(d)至(h)中的任一组合的CDRL1、CDRL2和CDRL3：
(a) 由SEQ ID NO: 4中所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 6中所示的氨基酸序列组成的CDRH3，
(b) 由SEQ ID NO: 14中所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 15中所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 16中所示的氨基酸序列组成的CDRH3，
(c) 由SEQ ID NO: 24中所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 25中所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 26中所示的氨基酸序列组成的CDRH3，
(d) 由SEQ ID NO: 9中所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 10中所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 11中所示的氨基酸序列组成的CDRL3，
(e) 由SEQ ID NO: 9中所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 92中所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 11中所示的氨基酸序列组成的CDRL3，
(f) 由SEQ ID NO: 9中所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 93中所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 11中所示的氨基酸序列组成的CDRL3，
(g) 由SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 20中所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 21中所示的氨基酸序列组成的CDRL3，和
(h) 由SEQ ID NO: 29中所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 30中所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 31中所示的氨基酸序列组成的CDRL3。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其包含选自以下组合(a)至(E)中的任一组合的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及CDRL1、CDRL2和CDRL3：
(a) 由SEQ ID NO: 4中所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 6中所示的氨基酸序列组成的CDRH3，以及由SEQID NO: 9中所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 10中所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 11中所示的氨基酸序列组成的CDRL3，
(b) 由SEQ ID NO: 4中所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 6中所示的氨基酸序列组成的CDRH3，以及由SEQID NO: 9中所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 92中所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 11中所示的氨基酸序列组成的CDRL3，
(c) 由SEQ ID NO: 4中所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 6中所示的氨基酸序列组成的CDRH3，以及由SEQID NO: 9中所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 93中所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 11中所示的氨基酸序列组成的CDRL3，
(d) 由SEQ ID NO: 14中所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 15中所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 16中所示的氨基酸序列组成的CDRH3，以及由SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 20中所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 21中所示的氨基酸序列组成的CDRL3，和
(e) 由SEQ ID NO: 24中所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 25中所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 26中所示的氨基酸序列组成的CDRH3，以及由SEQ ID NO: 29中所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 30中所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 31中所示的氨基酸序列组成的CDRL3。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其具有选自以下可变区(a)至(c)的任一重链可变区和选自以下可变区(d)至(h)的任一轻链可变区：
选自以下的重链可变区
(a) 由SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列组成的重链可变区，
(b) 由SEQ ID NO: 13中所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和
(c) 由SEQ ID NO: 23中所示的氨基酸序列组成的重链可变区，
(d) 由SEQ ID NO: 8中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(e) 由SEQ ID NO: 62中氨基酸位置21至129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(f) 由SEQ ID NO: 64中氨基酸位置21至129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(g) 由SEQ ID NO: 18中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区，和
(h) 由SEQ ID NO: 28中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其包含选自以下组合(a)至(e)的任一组合中的重链可变区和轻链可变区：
(a) 由SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 8中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(b) 由SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 62中氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(c) 由SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 64中氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(d) 由SEQ ID NO: 13中所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 18中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区，和
(e) 由SEQ ID NO: 23中所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 28中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其中所述恒定区是人衍生的恒定区。
14.根据权利要求13所述的抗体或抗体的功能片段，其包含由SEQ ID NO: 44中所示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 45中所示的氨基酸序列组成的轻链。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其是人源化的。
16.根据权利要求15所述的抗体或抗体的功能片段，其具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由选自以下氨基酸序列(a)至(h)的任一氨基酸序列组成，所述轻链可变区由由选自以下氨基酸序列(i)至(o)的任一氨基酸序列组成：
(a) SEQ ID NO: 48中氨基酸位置20至142的氨基酸序列，
(b) SEQ ID NO: 50中氨基酸位置20至142的氨基酸序列，
(c) SEQ ID NO: 52中氨基酸位置20至142的氨基酸序列，
(d) SEQ ID NO: 54中氨基酸位置20至142的氨基酸序列，
(e) SEQ ID NO: 56中氨基酸位置20至142的氨基酸序列，
(f) SEQ ID NO: 44中氨基酸位置20至142的氨基酸序列，
(g) 与(a)至(f)的序列中除每个CDR序列以外的框架区序列具有至少95％或更高同源性的氨基酸序列，
(h) 在(a)至(g)的序列中除每个CDR序列以外的框架区序列中包含一个或数个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列，
(i) SEQ ID NO: 58中氨基酸位置21至129的氨基酸序列，
(j) SEQ ID NO: 60中氨基酸位置21至129的氨基酸序列，
(k) SEQ ID NO: 62中氨基酸位置21至129的氨基酸序列，
(l) SEQ ID NO: 64中氨基酸位置21至129的氨基酸序列，
(m) SEQ ID NO: 45中氨基酸位置21至128的氨基酸序列，
(n) 与(i)至(m)的序列中除每个CDR序列以外的框架区序列具有至少95％或更高同源性的氨基酸序列，和
(o) 在(i)至(n)的序列中除每个CDR序列以外的框架区序列中包含一个或数个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。
17.根据权利要求16所述的抗体或抗体的功能片段，其包含选自以下组合(a)至(t)的任一组合中的重链可变区和轻链可变区：
(a) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 58中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(b) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 60中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(c) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 62中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(d) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 64中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(e) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 58中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(f) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 60中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(g) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 62中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(h) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 64中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(i) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 58中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(j) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 60中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(k) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 62中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(l) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 64中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(m) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 58中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(n) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 60中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(o) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 62中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(p) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 64中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(q) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 58中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(r) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 60中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，
(s) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 62中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区，和
(t) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20-142的氨基酸序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 64中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区。
18.根据权利要求16或17的抗体或抗体的功能片段，其包含选自以下组合(a)至(x)的任一组合中的重链和轻链：
(a) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成轻链，
(b) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(c) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(d) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(e) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(f) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(g) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(h) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(i) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(j) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(k) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(1) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(m) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(n) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(o) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(p) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(q) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(r) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(s) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(t) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(u) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(v) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(w) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，和
(x) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链。
19.根据权利要求1-18中任一项的抗体的功能片段，其中所述功能片段选自Fab、F(ab)2、Fab'和Fv。
20.一种多核苷酸，其编码权利要求1-19中任一项的抗体或抗体的功能片段。
21.根据权利要求20所述的多核苷酸，其包含选自以下组合(a)至(e)的任一组合中的多核苷酸：
(a) 编码由SEQ ID NO: 4中所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 6中所示的氨基酸序列组成的CDRH3的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 9中所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 10中所示的氨基酸序列组成的CDRL2和由SEQ ID NO: 11中所示的氨基酸序列组成的CDRL的多核苷酸，
(b) 编码由SEQ ID NO: 4中所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 6中所示的氨基酸序列组成的CDRH3的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 9中所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 92中所示的氨基酸序列组成的CDRL2和由SEQ ID NO: 11中所示的氨基酸序列组成的CDRL3的多核苷酸，
(c) 由SEQ ID NO: 4中所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 6中所示的氨基酸序列组成的CDRH3的多核苷酸，和由SEQ ID NO: 9中所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 93中所示的氨基酸序列组成的CDRL2和由SEQ ID NO: 11中所示的氨基酸序列组成的CDRL3的多核苷酸，
(d) 编码由SEQ ID NO: 14中所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 15中所示的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 16中所示的氨基酸序列组成的CDRH3的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 20中所示的氨基酸序列组成的CDRL2和由SEQ ID NO: 21中所示的氨基酸序列组成的CDRL3的多核苷酸，和
(e) 编码由SEQ ID NO: 24中所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 25中所示的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 26中所示的氨基酸序列组成的CDRH3的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 29中所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 30中所示的氨基酸序列组成的CDRL2和由SEQ ID NO: 31中所示的氨基酸序列组成的CDRL3的多核苷酸。
22.根据权利要求20或21的多核苷酸，其包含选自以下组合(a)至(e)的任一组合中的多核苷酸：
(a) 编码由SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列组成的重链可变区的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 8中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区的多核苷酸，
(b) 编码由SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列组成的重链可变区的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 62中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区的多核苷酸，
(c) 编码由SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列组成的重链可变区的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 64中的氨基酸位置21-129的氨基酸序列组成的轻链可变区的多核苷酸，
(d) 编码由SEQ ID NO: 13中所示的氨基酸序列组成的重链可变区的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 18中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区的多核苷酸，和
(e) 编码由SEQ ID NO: 23中所示的氨基酸序列组成的重链可变区的多核苷酸，和编码由SEQ ID NO: 28中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区的多核苷酸。
23.一种表达载体，其包含根据权利要求20-22中任一项的多核苷酸。
24.使用权利要求23的表达载体转化的宿主细胞。
25.根据权利要求23的宿主细胞，其中宿主细胞是真核细胞。
26.一种目标抗体或抗体的功能片段的生产方法，其包括培养根据权利要求24或25的宿主细胞的步骤，和从通过上述步骤获得的培养物收集目标抗体或所述抗体的功能片段的步骤。
27.通过权利要求26所述的生产方法获得的抗体或抗体的功能片段。
28.根据权利要求27所述的抗体的功能片段，其中所述功能片段选自Fab、F(ab)2、Fab'和Fv。
29.根据权利要求1-19、27和28中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其包含选自以下的一种或两种或更多种修饰：N-连接糖基化、O-连接糖基化、N-末端加工、C-末端加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化、向N-末端添加甲硫氨酸残基、脯氨酸残基的酰胺化和包含在羧基末端一个或两个氨基酸缺失的重链。
30.根据权利要求29的抗体，其中在其重链的羧基末端缺失一个或两个氨基酸。
31.根据权利要求30的抗体，其中在其两条重链的每个羧基末端缺失一个氨基酸。
32.根据权利要求29-32中任一项的抗体，其中在其重链的羧基末端的脯氨酸残基进一步被酰胺化。
33.根据权利要求1-19和26-31中任一项所述的抗体或抗体的功能片段，其中调节糖链修饰以增强抗体依赖性细胞毒性活性。
34.一种抗体-药物缀合物，其包含与药物缀合的根据权利要求1-19和27-33中任一项的抗体或抗体的功能片段。
35.根据权利要求34所述的抗体-药物缀合物，其中所述药物是抗肿瘤化合物。
36.根据权利要求35所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗肿瘤化合物是由下式代表的抗肿瘤化合物：
[式1]
。
37.根据权利要求35或36所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体经由具有选自以下式(a)至(f)的任何结构的接头与所述抗肿瘤化合物缀合：
(a) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
(b) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
(c) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
(d) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
(e) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-，和
(f) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-，
其中所述抗体连接至-(琥珀酰亚胺-3-基-N)的末端，所述抗肿瘤化合物连接至-(CH2)n2-C(=O)-部分的羰基，以在位置1处的氨基基团的氮原子作为连接位置，GGFG代表由通过肽键连接的甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸组成的氨基酸序列，和
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-具有由下式代表的结构：
[式2]
其在其位置3处与所述抗体连接，并且在位置1处的氮原子上与含有此结构的接头结构中的亚甲基连接。
38.根据权利要求34-37中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头由选自以下式(a)至(c)的任何式表示：
(a) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
(b) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,和
(c) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
39.根据权利要求34-38中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头由以下式(a)或(b)表示：
(a) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, 和
(b) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
40.根据权利要求34-39中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头由以下式(a)表示：
(a) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-。
41.根据权利要求34-40中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体通过硫醚键缀合至由以下式[式3]表示的药物接头(其中A代表与所述抗体的连接位置)：
[式3]
。
42.根据权利要求34-40中任一项所述的抗体-药物缀合物，其具有由以下式[式4]表示的结构，其中AB代表所述抗体或抗体的功能片段，n代表每抗体中与抗体缀合的药物-接头结构的单元的平均数，并且所述抗体经由衍生自所述抗体的巯基与所述接头连接：
[式4]
。
43.根据权利要求34-41中任一项所述的抗体-药物缀合物，其由以下式[式5]表示，
其中AB代表所述抗体或抗体的功能片段，n代表每抗体中与抗体缀合的药物-接头结构的单元的平均数，并且所述抗体经由衍生自所述抗体的巯基与所述接头连接：
[式5]
。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体是包含选自以下组合(a)至(x)的任一组合中的重链和轻链的抗体，或所述抗体的功能片段：
(a) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成轻链，
(b) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(c) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(d) 由SEQ ID NO: 48中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(e) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(f) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(g) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(h) 由SEQ ID NO: 50中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(i) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(j) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(k) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(1) 由SEQ ID NO: 52中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(m) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(n) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(o) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(p) 由SEQ ID NO: 54中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(q) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(r) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(s) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(t) 由SEQ ID NO: 56中的氨基酸位置20至474的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(u) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 58中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(v) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 60中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，
(w) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 62中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链，和
(x) 由SEQ ID NO: 44中的氨基酸位置20至472的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ IDNO: 64中的氨基酸位置21至234的氨基酸序列组成的轻链。
45.根据权利要求44的抗体-药物缀合物，其中所述抗体的重链包含选自以下的一种或两种或更多种修饰：N-连接糖基化、O-连接糖基化、N-末端加工、C-末端加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化、向N-末端添加甲硫氨酸残基、脯氨酸残基的酰胺化和包含在羧基末端一个或两个氨基酸缺失的重链。
46.根据权利要求34-45中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中每抗体所缀合的所选药物-接头结构的平均数在1至10的范围内。
47.根据权利要求34-46中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中每抗体所缀合的所选药物-接头结构的平均数在2至8的范围内。
48.根据权利要求34-47中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中每抗体所缀合的所选药物-接头结构的平均数在3至8的范围内。
49.根据权利要求34-48中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中每抗体所缀合的所选药物-接头结构的平均数在7至8的范围内。
50.根据权利要求34-49中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中每抗体所缀合的所选药物-接头结构的平均数为8。
51.一种药物组合物，其包含选自根据权利要求1-19和27-33的抗体或抗体的功能片段和根据权利要求34-50的抗体-药物缀合物的任何组分，所述组分的盐或所述组分或所述盐的水合物。
52.根据权利要求51所述的药物组合物，其是抗肿瘤药。
53.根据权利要求52所述的抗肿瘤药，其中所述肿瘤是表达GPR20的肿瘤。
54.根据权利要求50或51所述的抗肿瘤药，其中所述肿瘤是胃肠道间质瘤。
55.根据权利要求49-54中任一项所述的药物组合物或抗肿瘤药，其还包含另外的抗肿瘤药。
56.一种治疗肿瘤的方法，其包括向个体施用选自根据权利要求1-19和27-33的抗体或抗体的功能片段，根据权利要求34-50的抗体-药物缀合物的任何组分，这些组分的盐，以及这些成分或所述盐的水合物。
57.根据权利要求56所述的治疗方法，其中所述肿瘤是胃肠道间质瘤。
58.根据权利要求56或57所述的治疗方法，其中所述肿瘤是对酪氨酸激酶抑制剂展示出抗性的肿瘤。
59.一种治疗肿瘤的方法，其包括向个体同时、分别或连续施用包含选自根据权利要求1-19和27-33的抗体或抗体的功能片段、根据权利要求34-50的抗体-药物缀合物的至少一种组分、这些组分的盐，以及这些成分或所述盐的水合物，以及至少一种抗肿瘤药的药物组合物。
60.根据权利要求59所述的治疗肿瘤的方法，其中所述抗肿瘤药是酪氨酸激酶抑制剂。
61.根据权利要求60所述的治疗肿瘤的方法，其中酪氨酸激酶抑制剂是选自舒尼替尼、伊马替尼和瑞格非尼中的至少一种。
62.根据权利要求56-61中任一项的治疗肿瘤的方法，其中所述肿瘤是对酪氨酸激酶抑制剂展示出抗性的胃肠道间质瘤。
63.抗体-药物缀合物的生产方法，其包括培养根据权利要求24或25的所述宿主细胞的步骤，从通过上述步骤获得的培养物中收集目标抗体或抗体的功能片段的步骤，以及使通过上述步骤获得的抗体或抗体的功能片段与药物-接头中间体化合物反应的步骤。
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