JP7064635B2 - 抗ｇｐｒ２０抗体及び抗ｇｐｒ２０抗体－薬物コンジュゲート - Google Patents

抗ｇｐｒ２０抗体及び抗ｇｐｒ２０抗体－薬物コンジュゲート Download PDF

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Description

本発明は、ＧＰＲ２０に結合し、内在化作用を有する抗ＧＰＲ２０抗体、該抗ＧＰＲ２０抗体の製造方法、ならびに該抗体を含む抗体－薬物コンジュゲート、該抗体－薬物コンジュゲートを含む抗腫瘍剤等に関する。
がんは死亡原因の上位を占め、その罹患数は人口の高齢化と共に増加することが予想されているが、未だ治療ニーズは充分に満たされていない。従来の化学療法剤は、その選択性の低さから腫瘍細胞だけでなく正常細胞に対しても傷害性を持つことによる副作用や、充分な薬剤量を投与できないことで薬剤の効果を充分に得ることが出来ないことが問題となっている。このため近年では、がん細胞に特徴的な変異や高発現を示す分子、細胞のがん化に関与する特定の分子を標的としたより選択性の高い分子標的薬や抗体医薬の開発が行われている。
消化管間質腫瘍（Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｔｕｍｏｒ、
ＧＩＳＴ）は、食道から直腸までの消化管と腸間膜に発症する間葉系腫瘍であり、その発症率は年間１０万人に１～２人とされる（非特許文献１）。ＧＩＳＴの約８６％には受容体型チロシンキナーゼであるＫＩＴまたはＰＤＧＦＲＡの活性化変異が認められ、腫瘍細胞の増殖に寄与している。ＧＩＳＴ治療は外科的切除術を基本とするが、切除不能及び進行性、転移性のＧＩＳＴに対してはＩｍａｔｉｎｉｂ、Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂなどのチロシンキナーゼ阻害剤（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｙｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＴＫＩ）が処方されている（非特許文献２）。これらＴＫＩは上記変異を持つＧＩＳＴに対して多くの場合、顕著な有効性を示すが、継続した投与が必要であると共に、ＧＩＳＴを完全に消失させることはできず、最終的には標的であるＫＩＴ又はＰＤＧＦＲＡの二次変異やＲＡＳやＢＲＡＦなどの活性化変異、その他のシグナル伝達経路の活性化によって薬剤不応答性となり、病態が進行する。また、少数ではあるが、ＫＩＴやＰＤＧＦＲＡに変異を認めないｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ＧＩＳＴに対しては、これらＴＫＩは、ほとんど治療効果を示さない（非特許文献３）。このため、ＴＫＩ耐性ＧＩＳＴに有効な治療方法の開発が望まれていた。
ＧＰＲ２０（Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２０）は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーのクラスＡに属する、３５８アミノ酸からなる７回膜貫通型のタンパク質であり、Ｎ末端側を細胞外、Ｃ末端側を細胞内に持つ。ヒトＧＰＲ２０遺伝子は１９９７年に初めてクローニングされたが（非特許文献４）、その後２００８年に別の研究者によってクローニングされたヒトＧＰＲ２０遺伝子と比較して一部推定アミノ酸配列が異なっていた（非特許文献５）。ＮＣＢＩヒト全ゲノム配列解析のデータベースに登録された配列と同一である後者の配列が、現在ヒトＧＰＲ２０をコードするＤＮＡ配列及びアミノ酸配列として公的データベース上に公開されており、例えばＮＭ＿００５２９３、ＮＰ＿００５２８４（ＮＣＢＩ）等のアクセッション番号により参照可能である。
ＧＰＲ２０は、ヌクレオチドまたは脂質を認識するＧＰＣＲと類似したアミノ酸配列を有するが、その生理的機能や生体内におけるリガンドは同定されていない。ＧＰＲ２０をＨＥＫ２９３細胞に発現させた実験から、ＧＰＲ２０は、リガンドによる刺激が無い条件下でＧｉ型の３量体Ｇタンパク質を恒常的に活性化することが報告されている（非特許文献５）。
ＧＰＲ２０は心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、直腸、白血球でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現が確認されており、とりわけ小腸での高発現が報告されていた（非特許文献５）。脳内においては、視床、被殻、尾状核での発現が報告されていた（非特許文献４）。ＧＰＲ２０欠損マウスは、オープンフィールドテストにおいて総移動距離の増加を特徴とする多動性障害の表現型を示すことから、ＧＰＲ２０が中枢神経系における自発的活動性に関連することが示唆されていた（特許文献１）。また、ＧＰＲ２０はＧＩＳＴにおいて高発現していることが報告されており（非特許文献６）、ＧＰＲ２０の発現は、ＧＩＳＴの主要な転写制御因子であるｅｔｓ ｖａｒｉａｎｔ １（ＥＴＶ１）によって制御されていることが報告されている（非特許文献７）。
抗体は血中安定性が高く、標的抗原に特異的に結合することから副作用の軽減が期待されており、がん細胞表面に高発現している分子に対する抗体医薬が多数開発されている。腫瘍細胞を直接標的とした抗体医薬の作用機序としては、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、腫瘍増殖に関与する受容体のシグナル遮断やアポトーシス誘導などが挙げられる。
また、抗体の抗原結合能を利用した技術の一つとして、抗体－薬物コンジュゲート（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ＡＤＣ）が挙げられる。がんに対するＡＤＣは、がん細胞表面に発現している抗原に結合し、その結合によって抗原を細胞内に内在化できる抗体に、細胞傷害活性を有する薬物を結合させたものである。がんに対するＡＤＣは、がん細胞に効率的に薬物を送達できることによって、がん細胞内に薬物を蓄積させ、がん細胞を死滅させることが期待できる（非特許文献８）。ＡＤＣとしては例えば、抗ＣＤ３０モノクローナル抗体にモノメチルオーリスタチンＥを結合させたＡｄｃｅｔｒｉｓ（ブレンツキシマブ ベドチン）がホジキンリンパ腫と未分化大細胞リンパ腫の治療薬として認可されている。また、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体にエムタンシンを結合させたＫａｄｃｙｌａ（トラスツズマブ エムタンシン）がＨＥＲ２陽性の進行、再発乳癌の治療に用いられている。
抗腫瘍薬としてのＡＤＣに適した標的抗原の特徴としては、がん細胞表面で特異的に高発現し、正常細胞では低発現又は発現していないこと、細胞内に内在化できること、抗原が細胞表面から分泌されないことなどが挙げられる。また、ＡＤＣに適した抗体の重要な特徴としては、標的となる抗原に特異的に結合することに加えて、高い内在化能を有することが挙げられる。抗体の内在化能は標的抗原と抗体の両方の性質に依存するものであり、標的の分子構造から内在化に適した抗原結合部位を推定したり、抗体の結合強度や物性等から容易に内在化能の高い抗体を推測することは困難である。このため、標的抗原に対して高い内在化能を有する抗体を取得することは、有効性の高いＡＤＣを開発する上で重要な課題となっている（非特許文献９）。
これまでに、ＧＰＲ２０を標的とした抗腫瘍治療薬については、知られていない。また、細胞膜表面に発現するＧＰＲ２０に結合し、内在化活性を有する抗ＧＰＲ２０抗体及び該抗体用いたＡＤＣは報告されていなかった。
ＵＳ ２００３／００１８９８９
Ｃｏｒｌｅｓｓ Ｃ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ （２０１１） １１， ８６５－８７８ Ｄｅｍｅｔｒｉ Ｇ． Ｄ．， ｅｔ ａｌ． ＮＣＣＮ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｒｅｐｏｒｔ， Ｊ Ｎａｔｌ Ｃｏｍｐｒ Ｃａｎｃ Ｎｅｔｗ． （２０１０） ８， Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１－４１ Ｂａｕｅｒ Ｓ．， Ｊｏｅｎｓｕｕ Ｈ．， Ｄｒｕｇｓ． （２０１５） ７５， １３２３－１３３４． Ｏ’Ｄｏｗｄ Ｂ． Ｆ．， Ｇｅｎｅ １８７ （１９９７） ７５－８１ Ｈａｓｅ Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． （２００８） ２８３， １２７４７－１２７５５ Ａｌｌａｎｄｅｒ Ｓ． Ｖ．， ｅｔ ａｌ． ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ （２００１） ６１， ８６２４－８６２８ Ｃｈｉ Ｐ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ． （２０１０） ４６７（７３１７）：８４９－８５３ Ｈｅｉｄｉ Ｌ． Ｐｅｒｅｚ， ｅｔ ａｌ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． Ｔｏｄａｙ （２０１４） １９， ８６９－８８１ Ｐｅｔｅｒｓ Ｃ．， Ｂｒｏｗｎ Ｓ．， Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ （２０１５） ３５， ｅ００２２５
本発明の課題は、ＧＩＳＴ等のＧＰＲ２０陽性腫瘍細胞に対して特異的に結合する抗体、該抗体を含む抗体－薬物コンジュゲートの提供、該抗体－薬物コンジュゲートを用いた腫瘍に対する治療効果を有する医薬品及び、当該医薬品を用いた腫瘍の治療方法、該抗体、該抗体ー薬物コンジュゲートの製造方法等を提供することである。
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討し、ＧＰＲ２０がＧＩＳＴを特徴付ける分子の一つであり、ＧＩＳＴに特異的な治療標的になり得ると考え、抗ヒトＧＰＲ２０抗体の内在化活性と結合様式を調べたところ、特定の結合様式を示す抗体において高い内在化活性を有する抗ＧＰＲ２０抗体を見出した。更に、当該抗ＧＰＲ２０抗体に、細胞内で毒性を発揮する薬剤を特定の構造のリンカーを介して結合させた抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートが、ＧＰＲ２０を発現するＧＩＳＴ等のＧＰＲ２０陽性悪性腫瘍に対して抗腫瘍効果を発揮することを見出すことにより、本発明を完成させた。即ち、本発明は以下の発明を包含する。
すなわち本願発明は、
（１）以下の（ａ）及び（ｂ）に記載の特性を有することを特徴とする抗体又は当該抗体の機能性断片；
（ａ）ＧＰＲ２０に特異的に結合する、及び
（ｂ）ＧＰＲ２０に結合後、細胞内に取り込まれる内在化能を有する、
（２）ＧＰＲ２０が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである（１）に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドには特異的に結合し、アミノ酸番号１１３のアミノ酸をＹ（チロシン）から他のアミノ酸に置換したポリペプチドには特異的に結合しない、（１）又は（２）に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片、
（４）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドには特異的に結合し、アミノ酸番号１１３のアミノ酸をＹ（チロシン）からＦ（フェニルアラニン）に置換したポリペプチドには特異的に結合しない、（１）乃至（３）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片、
（５）配列番号１においてアミノ酸番号１乃至４８に記載のアミノ酸配列及びアミノ酸番
号１０８乃至１２５に記載のアミノ酸配列からなる高次構造に特異的に結合する（１）乃至（４）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片、
（６）配列番号１においてアミノ酸番号１乃至４８に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基及びアミノ酸番号１０８乃至１２５に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に特異的に結合する、（１）乃至（５）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片、
（７）特異的に結合するアミノ酸の少なくとも１つが配列番号１においてアミノ酸番号１１３のアミノ酸である、（１）乃至（６）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片、
（８）ＧＰＲ２０への結合に対して、以下の（ａ）乃至（ｃ）からなる群から選択されるいずれか１項に記載の抗体と競合阻害活性を有する（１）乃至（７）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号２０乃至４７５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号７のアミノ酸番号２１乃至２３３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体、
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号２０乃至４７５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１７のアミノ酸番号２１乃至２３３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体、及び、
（ｃ）配列番号２２のアミノ酸番号２０乃至４７５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２７のアミノ酸番号２１乃至２３３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体、
（９）以下の（ａ）乃至（ｃ）からなる群から選択されるいずれか１項に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、並びに（ｄ）乃至（ｈ）から選択されるいずれか１項に記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む（１）乃至（８）から選択されるいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片：
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
（ｂ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、及び、
（ｃ）配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
（ｅ）配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号９２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
（ｆ）配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号９３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
（ｇ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、及び
（ｈ）配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
（１０）以下の（ａ）乃至（ｅ）から選択されるいずれか１項に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む（１）乃至
（９）から選択されるいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片：
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、及び配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、及び配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号９２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、及び配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号９３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３
（ｄ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、及び
（ｅ）配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
（１１）以下の（ａ）乃至（ｃ）からなる群から選択されるいずれか１項に記載の重鎖の可変領域、及び（ｄ）乃至（ｈ）から選択されるいずれか１項に記載の軽鎖の可変領域を有する（１）乃至（１０）から選択されるいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片：
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、
（ｂ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、及び、
（ｃ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、
（ｄ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｅ）配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｆ）配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｇ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、及び、
（ｈ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（１２）以下の（ａ）乃至（ｅ）から選択されるいずれか１項に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む（１）乃至（１１）から選択されるいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片：
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｄ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｅ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、及び、配列番号２
８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（１３）定常領域がヒト由来定常領域である（１）乃至（１２）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片、
（１４）配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４５に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む（１３）に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
（１５）ヒト化されている（１）乃至（１４）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片、
（１６）以下の（ａ）乃至（ｈ）からなる群から選択されるいずれか１項に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、及び（ｉ）乃至（ｏ）からなる群から選択されるいずれか１項に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域を有する（１５）に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片：
（ａ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列、
（ｇ）（ａ）乃至（ｆ）の配列において各ＣＤＲ 配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（ｈ）（ａ）乃至（ｇ）の配列における各ＣＤＲ 配列以外のフレームワーク領域の配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、
（ｉ）配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列、
（ｊ）配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列、
（ｋ）配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列、
（ｌ）配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列、
（ｍ）配列番号４５においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列、
（ｎ）（ｉ）乃至（ｍ）の配列において各ＣＤＲ 配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び
（ｏ） （ｉ）乃至（ｎ）の配列における各ＣＤＲ 配列以外のフレームワーク領域の配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、
（１７）以下の（ａ）乃至（ｔ）からなる群から選択されるいずれか１項に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む（１６）に記載の抗体又は抗体の機能性断片：
（ａ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｂ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる、重鎖可変領域および配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｄ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｅ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｆ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｇ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｈ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｉ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｊ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｋ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｌ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｍ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｎ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｏ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｐ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｑ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｒ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（ｓ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、及び、
（ｔ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（１８）以下の（ａ）乃至（ｘ）から選択されるいずれか１項に記載の重鎖及び軽鎖を含む（１６）又は（１７）に記載の抗体又は抗体の機能性断片：
（ａ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｂ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる、重鎖および配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｃ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｄ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｅ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｆ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｇ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｈ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｉ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｊ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｋ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｌ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｍ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｎ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｏ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｐ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｑ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｒ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｓ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列か
らなる軽鎖、
（ｔ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｕ）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｖ）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｗ）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｘ）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（１９）機能性断片がＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’及びＦｖからなる群から選択される（１）乃至（１８）のいずれか１項に記載の抗体の機能性断片、
（２０）（１）乃至（１９）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片をコードするポリヌクレオチド、
（２１）以下の（ａ）乃至（ｅ）からなる群から選択されるいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む（２０）に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３をコードするポリヌクレオチド、並びに配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３をコードするポリヌクレオチド、並びに配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号９２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３をコードするポリヌクレオチド、並びに配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号９３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３をコードするポリヌクレオチド、並びに配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３をコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｅ）配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３をコードするポリヌクレオチド、並びに配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３をコードするポリヌクレオチド、
（２２）以下の（ａ）乃至（ｅ）からなる群から選択されるいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む（２０）又は（２１）に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｅ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド、
（２３）（２０）乃至（２２）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
（２４）（２３）に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞、
（２５）宿主細胞が真核細胞である（２３）に記載の宿主細胞、
（２６）（２４）又は（２５）に記載の宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体又は当該抗体の機能性断片を採取する工程を含むことを特徴とする当該抗体又は当該抗体の機能性断片の製造方法、
（２７）（２６）に記載の製造方法により得られることを特徴とする抗体又は当該抗体の機能性断片、
（２８）機能性断片がＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’及びＦｖからなる群から選択される（２７）に記載の抗体の機能性断片、
（２９）Ｎ－結合への糖鎖付加、Ｏ－結合への糖鎖付加、Ｎ末のプロセッシング、Ｃ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、Ｎ末にメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化及びカルボキシル末端において１つ又は２つのアミノ酸が欠失した重鎖からなる群より選択される１又は２以上の修飾を含む（１）乃至（１９）、（２７）及び（２８）からのいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片、
（３０）重鎖のカルボキシル末端において１つ又は２つのアミノ酸が欠失している（２９）に記載の抗体、
（３１）２本の重鎖の双方でカルボキシル末端において１つのアミノ酸が欠失している（３０）に記載の抗体、
（３２）重鎖のカルボキシル末端のプロリン残基が更にアミド化されている（２９）乃至（３１）のいずれか１項に記載の抗体、
（３３）抗体依存性細胞傷害活性を増強させるために糖鎖修飾が調節されている（１）乃至（１９）、及び（２６）乃至（３１）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片、
（３４）（１）乃至（１９）、及び（２７）乃至（３３）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片に薬物が結合している抗体－薬物コンジュゲート、
（３５）薬物が抗腫瘍性化合物である、（３４）に記載の抗体－薬物コンジュゲート、
（３６）
抗腫瘍性化合物が次式
Figure 0007064635000001
で示される抗腫瘍性化合物である（３５）に記載の抗体－薬物コンジュゲート、（３７）抗体と抗腫瘍性化合物が、次式（ａ）乃至（ｆ）：
（ａ） －（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
（ｂ） －（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
（ｃ） －（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
（ｄ） －（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
（ｅ） －（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
（ｆ） －（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－。
で示されるいずれかの構造のリンカーを介して、結合している（３５）又は（３６）に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
（ここで、抗体は、－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）の末端において結合する。抗腫瘍性化合物は、１位のアミノ基の窒素原子を結合部位として、－（ＣＨ２）ｎ２－Ｃ（＝Ｏ）－部分のカルボニル基に結合する。上記式中ＧＧＦＧは、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシンからなるペプチド結合でつながっているアミノ酸配列を示す。
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－は次式：
Figure 0007064635000002
で示される構造であり、このものの３位で抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含むリンカー構造内のメチレン基と結合する。）、
（３８）リンカーが以下の（ａ）乃至（ｃ）から選択されるいずれかの式で示される（３４）乃至（３７）のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート： （ａ） －（Ｓ
ｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
（ｂ） －（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
（ｃ） －（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
（３９）リンカーが以下（ａ）又は（ｂ）の式で示される（３４）乃至（３８）のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート： （ａ） －（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
（ｂ） －（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－。
（４０） リンカーが以下の（ａ）の式で示される、（３４）乃至（３９）のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート：
（ａ） －（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
（４１）
以下の式化３（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物－リンカー構造と、抗体とがチオエーテル結合によって結合した、（３４）乃至（４０）のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート
Figure 0007064635000003
（４２）以下の式化４：
で示される構造を有する、（３４）乃至（４０）のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート：
ここで、ＡＢは抗体又は該抗体の機能性断片を示す。ｎは抗体と結合している薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数を示す。抗体とリンカーは抗体由来のスルフヒドリル基を介して結合している、
Figure 0007064635000004
（４３） 以下の式化５：
で示される（３４）乃至（３９）のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート：
ここで、ＡＢは抗体又は該抗体の機能性断片を示す。ｎは抗体と結合している薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数を示す。抗体とリンカーは抗体由来のスルフヒドリル基を介して結合している、
Figure 0007064635000005
（４４）抗体が以下の（ａ）乃至（ｘ）からなる群から選択されるいずれか１項に記載の重鎖及び軽鎖を含む抗体又は当該抗体の機能性断片である、（４１）乃至（４３）のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート：
（ａ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｂ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｃ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｄ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｅ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｆ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｇ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｈ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｉ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｊ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｋ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｌ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｍ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｎ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｏ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｐ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｑ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｒ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｓ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｔ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列か
らなる軽鎖、
（ｕ）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｖ）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｗ）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｘ）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（４５）重鎖がＮ－結合への糖鎖付加、Ｏ－結合への糖鎖付加、Ｎ末のプロセッシング、Ｃ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、Ｎ末にメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化及びカルボキシル末端において１つ又は２つのアミノ酸が欠失した重鎖からなる群より選択される１又は２以上の修飾を含む抗体である、（４４）に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
（４６）選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が１から１０個の範囲である（３４）乃至（４５）のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、
（４７）選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２から８個の範囲である（３４）乃至（４６）のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、（４８）選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が３から８個の範囲である（３４）乃至（４７）のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、（４９）選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が７から８個の範囲である（３４）乃至（４８）のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、（５０）選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が８である（３４）乃至（４９）のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、
（５１）（１）乃至（１９）、及び（２７）乃至（３３）に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片、（３４）乃至（５０）に記載の抗体－薬物コンジュゲートから選択されるいずれか、その塩、又はそれらの水和物を含むことを特徴とする医薬組成物、
（５２）抗腫瘍薬であることを特徴とする、（５１）に記載の医薬組成物、
（５３）腫瘍がＧＰＲ２０が発現している腫瘍であることを特徴とする、（５２）に記載の医薬組成物、
（５４）腫瘍が消化管間質腫瘍であることを特徴とする、（５２）又は（５３）に記載の医薬組成物、
（５５）更に、他の抗腫瘍薬を含むことからなる、（５１）乃至（５４）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（５６）（１）乃至（１９）、及び（２７）乃至（３３）に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片、（３４）乃至（５０）に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物から選択されるいずれかを個体に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。（５７）腫瘍が、消化管間質腫瘍であることを特徴とする、（５６）に記載の治療方法、（５８）腫瘍が、チロシンキナーゼ阻害剤に抵抗性を示す腫瘍であることを特徴とする、（５６）又は（５７）に記載の治療方法、
（５９）（１）乃至（１９）、及び（２７）乃至（３３）に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片、（３４）乃至（５０）に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物から選択される少なくとも一つ、を含むことからなる医薬組成物及び少なくとも一つの抗腫瘍薬を、同時に、別々に又は連続して個体に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法、
（６０）抗腫瘍薬が、チロシンキナーゼ阻害剤であることを特徴とする、（５９）に記載の腫瘍の治療方法、
（６１）チロシンキナーゼ阻害剤が、スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）、レゴラフェニブ（Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）から選択される少なくとも１つである、（６０）に記載の腫瘍の治療方法、
（６２）腫瘍が、チロシンキナーゼ阻害剤に抵抗性を示す消化管間質腫瘍であることを特徴とする、（５６）乃至（６１）のいずれか１項に記載の腫瘍の治療方法、
（６３）（２４）又は（２５）に記載の宿主細胞を培養する工程、当該工程で得られた培養物から目的の抗体又は当該抗体の機能性断片を採取する工程、及び当該工程で得られた抗体又は当該抗体の機能性断片と薬物－リンカー中間化合物を反応させる工程を含むことを特徴とする、抗体－薬物コンジュゲートの製造方法、
からなる。
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体は、ＧＰＲ２０のＮ末端より１から４８番目のアミノ酸配列、及び１０８から１２５番目のアミノ酸配列の２つの細胞外領域からなる高次構造を認識し、内在化活性を有することを特徴とする。本発明の抗ＧＰＲ２０抗体に、細胞内で毒性を発揮する薬剤を特定の構造のリンカーを介して結合させた抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートは、ＧＰＲ２０を発現するがん細胞を有する患者に投与することによって、優れた抗腫瘍効果及び安全性を達成することが期待できる。即ち、本発明の抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートは、抗腫瘍剤として有用である。
ラット抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６の重鎖のアミノ酸配列（配列番号２）及び重鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３２）を示す。 ラット抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号７）及び軽鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３４）を示す。 ラット抗ＧＰＲ２０抗体０４－０７９の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２）及び重鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す。 ラット抗ＧＰＲ２０抗体０４－０７９の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１７）及び軽鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す。 ラット抗ＧＰＲ２０抗体０４－１２６の重鎖のアミノ酸配列（配列番号２２）及び重鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４０）を示す。 ラット抗ＧＰＲ２０抗体０４－１２６の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２７）及び軽鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す。 ヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６Ｃｈの重鎖のアミノ酸配列（配列番号４４）及び重鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４６）を示す。 ヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６Ｃｈの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４５）及び軽鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４７）を示す。 ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂタイプ重鎖のアミノ酸配列（配列番号４８）を示す。 ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅタイプ重鎖のアミノ酸配列（配列番号５０）を示す。 ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂタイプ重鎖のアミノ酸配列（配列番号５２）を示す。 ヒト化ｈ０４６－Ｈ８タイプ重鎖のアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。 ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０タイプ重鎖のアミノ酸配列（配列番号５６）を示す。 ヒト化ｈ０４６－Ｌ１タイプ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５８）を示す。 ヒト化ｈ０４６－Ｌ２タイプ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６０）を示す。 ヒト化ｈ０４６－Ｌ６タイプ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６２）を示す。 ヒト化ｈ０４６－Ｌ７タイプ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６４）を示す。 ヒトＧＰＲ２０一過性発現細胞株と抗ヒトＧＰＲ２０抗体を産生するハイブリドーマの培養上清を反応させた際のフローサイトメトリー解析結果を示す。 フローサイトメトリー解析における、ラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体のヒトＧＰＲ２０発現細胞株に対する濃度依存的な結合を示す。 フローサイトメトリー解析における、ラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体のヒトＧＰＲ２０発現細胞株に対する濃度依存的な結合を示す。 フローサイトメトリー解析における、ラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体のヒトＧＰＲ２０発現細胞株に対する濃度依存的な結合を示す。 ラット抗ＧＰＲ２０抗体の内在化能を示す。縦軸は、ラット抗ＧＰＲ２０抗体とサポリン標識抗ラットＩｇＧ抗体をヒトＧＰＲ２０発現細胞株に添加した際の生存率（抗体未添加時の細胞生存率を１００％とした相対率）を示す。 ヒトＧＰＲ２０、マウスＧＰＲ２０のアミノ酸配列の対照図を示す。ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４で示したアミノ酸配列は細胞外領域を示し、カッコ内番号はヒトＧＰＲ２０アミノ酸番号による領域部位を示す。網掛け文字は、ヒト、マウス間で同じアミノ酸を示す。 各種抗ＧＰＲ２０抗体の結合特性を示す。ヒトＧＰＲ２０、マウスＧＰＲ２０、及びヒトＧＰＲ２０の細胞外領域ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４のうち、一つをマウスＧＰＲ２０の対応配列に置換したヒト／マウスキメラＧＰＲ２０タンパク質に対する抗ＧＰＲ２０抗体の結合性を示す。 各種抗ＧＰＲ２０抗体の結合特性を示す。ヒトＧＰＲ２０、マウスＧＰＲ２０、及びヒトＧＰＲ２０の細胞外領域ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４のうち、一つをマウスＧＰＲ２０の対応配列に置換したヒト／マウスキメラＧＰＲ２０タンパク質に対する抗ＧＰＲ２０抗体の結合性を示す。 ヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６ＣｈのヒトＧＰＲ２０特異的な結合を示す。 ヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６ＣｈのヒトＧＰＲ２０特異的な結合を示す。 ヒト化抗ＧＰＲ２０抗体のＧＰＲ２０結合性を示す。 ヒト化抗ＧＰＲ２０抗体及び抗体－薬物コンジュゲートのＧＰＲ２０結合性を示す。 ＧＰＲ２０発現細胞に対する抗体－薬物コンジュゲート（１）のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制活性を示す。 ＧＰＲ２０発現細胞に対する抗体－薬物コンジュゲート（７）、（８）、（９）のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制活性を示す。 ＧＩＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０細胞皮下移植ヌードマウスモデルにおける抗体－薬物コンジュゲート（１）、（２）の抗腫瘍効果を示す。 ＧＩＳＴ４３０細胞皮下移植ヌードマウスモデルにおける抗体－薬物コンジュゲート（１）、（２）の抗腫瘍効果を示す ＧＩＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０細胞皮下移植ヌードマウスモデルにおける抗体－薬物コンジュゲート（６）、（９）の抗腫瘍効果を示す。 ＧＩＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０細胞皮下移植ヌードマウスモデルにおける抗体－薬物コンジュゲート（３）、（５）、（６）、（１０）、（１１）、（１２）の抗腫瘍効果を示す。 ＧＩＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０細胞皮下移植ヌードマウスモデルにおける抗体－薬物コンジュゲート（１３）の抗腫瘍効果を示す。 ＧＩＳＴ０２０皮下移植ヌードマウスモデルにおける抗体－薬物コンジュゲート（４）、（１３）の抗腫瘍効果を示す。 ＧＩＳＴ１皮下移植ヌードマウスモデルにおける抗体－薬物コンジュゲート（１３）の抗腫瘍効果を示す。 胃癌細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７細胞皮下移植ヌードマウスモデルにおける抗体－薬物コンジュゲート（１４）及びＨＥＲ２を標的とした抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍効果を示す。 Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ治療に不応答性となった胃の消化管間質腫瘍患者由来腫瘍ＧＩＳＴ０７４皮下移植ヌードマウスモデルにおける抗体－薬物コンジュゲート（１４）の抗腫瘍効果を示す。 Ｉｍａｔｉｎｉｂ耐性変異を有するヒト消化管間質腫瘍細胞株ＧＩＳＴ４３０／６５４皮下移植ヌードマウスモデルにおける抗体－薬物コンジュゲート（３）とＳｕｎｉｔｉｎｉｂとの併用効果を示す。
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
本明細書中において、「がん」と「腫瘍」は同じ意味に用いている。
本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びそのｃＲＮＡも含まれる。
本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれる。
本明細中においては、「ポリペプチド」と「タンパク質」は区別せずに用いている。
本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
本明細書中において、「ＧＰＲ２０」は、ＧＰＲ２０タンパク質と同じ意味で用いている。
本明細書において、「細胞傷害活性」とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化を引き起こすことをいい、直接的な外傷にとどまらず、ＤＮＡの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷を引き起こすことをいう。
本明細書において、「細胞内で毒性を発揮する」とは、何らかの形で、細胞内で毒性を示すことをいい、直接的な外傷にとどまらず、ＤＮＡの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下、細胞増殖因子の作用の抑制などあらゆる細胞の構造や機能、代謝に影響をもたらすことをいう。
本明細書において、「エピトープ」とは、特定の抗ＧＰＲ２０抗体の結合するＧＰＲ２０の部分ペプチド又は部分立体構造を意味する。前記のＧＰＲ２０の部分ペプチドであるエピトープは免疫アッセイ法等当業者にはよく知られている方法によって、決定することができる。まず、抗原の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴヌクレオチド合成技術を用いることができる。例えば、ＧＰＲ２０のＣ末端又はＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組み換え技術を用いて作製した後、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、更に短いペプチドを合成してそれらのペプチドとの反応性を検討することによって、エピトープを決定することができる。また、複数の細胞外ドメインからなる膜タンパク質に結合する抗体が、複数のドメインからなる立体構造をエピトープとしている場合は、特定の細胞外ドメインのアミノ酸配列を改変することによって、立体構造を改変することによってどのドメインと結合するかを決定することができる。特定の抗体の結合する抗原の部分立体構造であるエピトープは、Ｘ線構造解析によって前記の抗体と隣接する抗原のアミノ酸残基を特定することによっても決定することができる。
本明細書において、「同一のエピトープに結合する」とは、共通のエピトープに結合する抗体を意味している。第一の抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に第二の抗体が結合すれば、第一の抗体と第二の抗体が同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、第一の抗体の抗原に対する結合に第二の抗体が競合する（即ち、第二の抗体が第一の抗体と抗原の結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、第一の抗体と第二の抗体の同一のエピトープに結合すると判定することができる。さらに、第一の抗体と第二の抗体が同一のエピトープに結合し、かつ第一の抗体が抗腫瘍活性や内在化活性等の特殊な効果を有する場合、第二の抗体も同様の活性を有することが期待できる。従って、抗ＧＰＲ２０抗体については、第一の抗体の抗ＧＰＲ２０抗体の結合する部分ペプチドに第二の抗ＧＰＲ２０抗体が競合することを確認することによって、第一の抗体と第二の抗体がＧＰＲ２０の同一のエピトープに結合する抗体と判定することができる。
本明細書における「ＣＤＲ」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を意味する。抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所のＣＤＲがあることが知られている。ＣＤＲは、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ３ヶ所に分離している。本明細書中においては、抗体のＣＤＲについて、重鎖のＣＤＲを重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖のＣＤＲを軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社）中、６８℃でハイブリダイズすること、又はＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７－１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１－２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することによって同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
１．ＧＰＲ２０
ＧＰＲ２０は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーのクラスＡに属する、３５８アミノ酸からなる７回膜貫通型のタンパク質であり、Ｎ末端側を細胞外、Ｃ末端側を細胞内に持つ。
本発明で用いるＧＰＲ２０タンパク質は、ヒト、非ヒト哺乳動物（ラット、マウス等）のＧＰＲ２０発現細胞から直接精製して使用するか、あるいは当該細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、また、ＧＰＲ２０をｉｎ ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作によって宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、ＧＰＲ２０ ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＧＰＲ２０を発現させることによって、該タンパク質を得ることが出来る。また、前記の遺伝子操作によるＧＰＲ２０発現細胞、あるいはＧＰＲ２０を発現している細胞株をＧＰＲ２０タンパク質として使用することも可能である。また、ＧＰＲ２０のｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを直接被免疫動物に投与し被免疫動物の体内でＧＰＲ２０を発現させることもできる。
ヒトＧＰＲ２０のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は公的データベース上に公開されており
、例えばＮＭ＿００５２９３、ＮＰ＿００５２８４（ＮＣＢＩ）等のアクセッション番号により参照可能である。
また、上記ＧＰＲ２０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、当該タンパク質と同等の生物活性を有するタンパク質もＧＰＲ２０に含まれる。
ヒトＧＰＲ２０タンパク質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に記載されており、細胞外領域は、配列表の配列番号１のアミノ酸番号１乃至４８からなる細胞外ドメイン（ＥＣ１）、アミノ酸番号１０８乃至１２５からなる細胞外ドメイン（ＥＣ２）、アミノ酸番号１９０乃至１９６からなる細胞外ドメイン（ＥＣ３）及びアミノ酸番号２６０乃至２７５からなる細胞外ドメイン（ＥＣ４）で構成されている。
２．抗ＧＰＲ２０抗体の製造
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体の一例として、配列表の配列番号１に示すＧＰＲ２０のＮ末端より１から４８番目のアミノ酸配列、及び１０８から１２５番目のアミノ酸配列の２つの細胞外領域からなる高次構造を認識し、かつ内在化活性を有する抗ＧＰＲ２０抗体を挙げることができる。
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体の他の一例として、配列表の配列番号１に示すＧＰＲ２０のＮ末端より１から４８番目のアミノ酸配列、及び１０８から１２５番目のアミノ酸配列の２つの細胞外領域からなる高次構造を認識し、少なくとも１１３番目のチロシンに結合し、内在化活性を有する抗ＧＰＲ２０抗体を挙げることができる。
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体の他の一例として、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合し、配列表の配列番号１のアミノ酸番号１１３のアミノ酸をチロシンから他のアミノ酸（たとえばフェニルアラニン）に置換したポリペプチドには結合せずに、内在化活性を有する抗ＧＰＲ２０抗体を挙げることができる。
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体は、いずれの種に由来してもよいが、好ましくは、ヒト、ラット、マウス及びウサギを例示できる。ヒト以外の種に由来する場合は、周知の技術を用いて、キメラ化又はヒト化することが好ましい。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体は腫瘍細胞を標的にできる抗体であり、すなわち腫瘍細胞を認識できる特性、腫瘍細胞に結合できる特性、そして腫瘍細胞内に取り込まれて内在化する特性等を備えている。したがって、本発明の抗ＧＰＲ２０抗体と抗腫瘍活性を有する化合物を、リンカーを介して結合させて抗体－薬物コンジュゲートとすることができる。
抗体の腫瘍細胞への結合性は、フローサイトメトリーを用いて確認できる。腫瘍細胞内への抗体の取り込みは、（１）治療抗体に結合する二次抗体（蛍光標識）を用いて細胞内に取り込まれた抗体を蛍光顕微鏡で可視化するアッセイ（Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ （２００８） １５， ７５１－７６１）、（２）治療抗体に結合する二次抗体（蛍光標識）を用いて細胞内に取り込まれた蛍光量を測定するアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ．
１５， ５２６８－５２８２， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００４）又は（３）治療抗体に結合するイムノトキシンを用いて、細胞内に取り込まれると毒素が放出されて細胞増殖が抑制されるというＭａｂ－ＺＡＰアッセイ（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２８：１６２－１６５， Ｊａｎｕａｒｙ ２０００）を用いて確認できる。イムノトキシンとしては、ジフテテリア毒素の触媒領域とプロテインＧとのリコンビナント複合タンパク質も使
用可能である。
本明細書で言う「高い内在化能」とは、当該抗体とサポリン標識抗ラットＩｇＧ抗体を投与したＧＰＲ２０発現細胞の生存率（抗体未添加時の細胞生存率を１００％とした相対率で表したもの）が、好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下であることを意味する。
本発明の抗腫瘍抗体－薬物コンジュゲートは抗腫瘍効果を発揮する化合物を結合させてあるので、抗体自体が抗腫瘍効果を有することは、好ましいが、必須ではない。抗腫瘍性化合物の細胞傷害性を腫瘍細胞において特異的・選択的に発揮させる目的からは、抗体が内在化して腫瘍細胞内に移行する性質のあることが重要であり、好ましい。
抗ＧＰＲ２０抗体は、この分野で通常実施される方法を用いて、抗原となるポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができるが、ＧＰＲ２０が７回膜貫通型のタンパク質であることから、立体構造を保持したＧＰＣＲを抗原として用いることが好ましい。そのような方法として、ＤＮＡ免疫法を挙げることができる。
抗原の由来はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来する抗原を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種抗原に結合する抗体とヒト抗原との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６， ｐ．４９５－４９７、Ｋｅｎｎｅｔ， Ｒ．ｅｄ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｐ．３６５－３６７， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによってハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
以下、具体的にＧＰＲ２０に対する抗体の取得方法を説明する。
（１）抗原の調製
抗原は抗原タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子操作によって宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、抗原遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現した抗原を精製すればよい。上記の遺伝子操作による抗原発現細胞、あるいは抗原を発現している細胞株を動物に免疫する方法を用いることによっても抗体を取得できる。
また、抗原タンパク質を用いずに、抗原タンパク質のｃＤＮＡを発現ベクターに組み込んで被免疫動物に投与し、被免疫動物の体内で抗原タンパク質を発現させ、抗原タンパク質に対する抗体を産生させることによっても抗体を取得することができる。
（２）抗ＧＰＲ２０モノクローナル抗体の製造
本発明で使用される抗ＧＰＲ２０抗体は、特に制限はないが、例えば、本願の配列表で示されたアミノ酸配列で特定される抗体を好適に使用することができる。本発明において使用される抗ＧＰＲ２０抗体としては、以下の特性を有するものが望ましい。
（１）以下の特性を有することを特徴とする抗体；
（ａ）ＧＰＲ２０に特異的に結合する
（ｂ）ＧＰＲ２０と結合することによってＧＰＲ２０発現細胞に内在化する活性を有する
（２）ＧＰＲ２０がヒトＧＰＲ２０である上記（１）に記載の抗体又は当該抗体、
（３）ヒトＧＰＲ２０のＮ末端より１から４８番目のアミノ酸配列、及び１０８から１２５番目のアミノ酸配列の２つの細胞外領域からなる高次構造を認識し、かつ内在化活性を有する。
本発明のＧＰＲ２０に対する抗体の取得方法は、抗ＧＰＲ２０抗体を取得できる限りにおいて、特に制限されないが、ＧＰＲ２０が膜貫通型のタンパク質であることから、高次構造を保持したＧＰＲ２０を抗原として用いることが好ましい。
好ましい抗体の取得方法の一例としてＤＮＡ免疫法を挙げることができる。ＤＮＡ免疫法とは、抗原発現プラスミドをマウスやラットなどの動物個体に遺伝子導入し、抗原を個体内で発現させることによって、抗原に対する免疫を誘導する手法である。遺伝子導入の手法には、直接プラスミドを筋肉に注射する方法や、リポソームやポリエチレンイミンなどの導入試薬を静脈注射する方法、ウイルスベクターを用いる手法、プラスミドを付着させた金粒子をＧｅｎｅ Ｇｕｎにより射ち込む手法、急速に大量のプラスミド溶液を静脈注射するＨｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ法などが存在する。発現プラスミドの筋注による遺伝子導入法に関して、発現量を向上させる手法として、プラスミドを筋注後、同部位にエレクトロポレーションを加えるｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎという技術が知られている（Ａｉｈａｒａ Ｈ， Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｊ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９８ Ｓｅｐ；１６（９）：８６７－７０又はＭｉｒ ＬＭ， Ｂｕｒｅａｕ ＭＦ， Ｇｅｈｌ Ｊ， Ｒａｎｇａｒａ Ｒ， Ｒｏｕｙ Ｄ， Ｃａｉｌｌａｕｄ ＪＭ， Ｄｅｌａｅｒｅ Ｐ， Ｂｒａｎｅｌｌｅｃ Ｄ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ， Ｓｃｈｅｒｍａｎ Ｄ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９９ Ａｐｒ １３；９６（８）：４２６２－７．）。本手法はプラスミドの筋注前にヒアルロニダーゼで筋肉を処理することにより、さらに発現量が向上する（ＭｃＭａｈｏｎ ＪＭ１， Ｓｉｇｎｏｒｉ Ｅ， Ｗｅｌｌｓ ＫＥ， Ｆａｚｉｏ ＶＭ， Ｗｅｌｌｓ ＤＪ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００１ Ａｕｇ；８（１６）：１２６４－７０）。また、ハイブリドーマの作製は公知の方法によって行うことができ、例えば、Ｈｙｂｒｉｍｕｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて行うこともできる。
具体的なモノクローナル抗体取得の例としては、以下を挙げることもできる。
（ａ）ＧＰＲ２０のｃＤＮＡを発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１：Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に組み込み、エレクトロポレーションや遺伝子銃等の方法によって、そのベクターを直接被免疫動物（例えば、ラットやマウス）に投与することによって、動物体内においてＧＰＲ２０を発現させることによって、免疫反応を誘起させることができる。エレクトロポレーション等によるベクターの投与は抗体価を上げるために必要であれば、１回でも複数回でもよく、好ましくは複数回である。
（ｂ）免疫反応を誘起された上述の動物より、抗体産生細胞を含む組織（例えばリンパ節）を採取する。
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）（例えば、マウスミエローマＳＰ２／０－ａｇ１４細胞）の調製、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性（内在化活性）、及びその結合特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定
ここで用いられる抗体価の測定法としては、例えば、フローサイトメトリー又はＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ法を挙げることができるがこれらの方法に制限されない。
このようにして樹立されたハイブリドーマ株の例としては、抗ＧＰＲ２０抗体産生ハイブリドーマ０４－０４６、０４－０７９及び０４－１２６を挙げることができる。なお、本明細書中においては、抗ＧＰＲ２０抗体産生ハイブリドーマ０４－０４６が産生する抗体を、「０４－０４６抗体」又は単に「０４－０４６」と記載し、ハイブリドーマ０４－０７９が産生する抗体を、「０４－０７９抗体」又は単に「０４－０７９」と記載し、ハイブリドーマ０４－１２６が産生する抗体を、「０４－１２６抗体」又は単に「０４－０１２６」と記載する。
０４－０４６抗体の重鎖は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。配列表の配列番号２に示される重鎖アミノ酸配列中で、１乃至１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１４３乃至４７５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。当該可変領域は、配列表の配列番号２において、４５乃至５４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、６９乃至７８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、１１８乃至１３１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する。０４－０４６抗体の重鎖可変領域は配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。０４－０４６抗体のＣＤＲＨ１は配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する。また、０４－０４６抗体の重鎖の配列は図１に記載されている。
０４－０４６抗体の軽鎖は、配列表の配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する。配列表の配列番号７に示される軽鎖アミノ酸配列中で、１乃至２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１２９乃至２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。当該可変領域は、配列表の配列番号７において、４３乃至５３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、６９乃至７５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、１０８乃至１１６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する。０４－０４６抗体の軽鎖可変領域は配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する。０４－０４６抗体のＣＤＲＬ１は配列表の配列番号９に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列表の配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する。また、０４－０４６抗体の軽鎖の配列は図２に記載されている。
０４－０７９抗体の重鎖は、配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する。配列表の配列番号１２に示される重鎖アミノ酸配列中で、１乃至１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１４３乃至４７５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。当該可変領域は、配列表の配列番号１２において、４５乃至５４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、６９乃至７８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、１１８乃至１３１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する。０４－０７９抗体の重鎖可変領域は配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する。０４－０７９抗体のＣＤＲＨ１は配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する。また、０４－０７９抗体の重鎖の配列は図３に記載されている。
０４－０７９抗体の軽鎖は、配列表の配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する。配列表の配列番号１７に示される軽鎖アミノ酸配列中で、１乃至２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１２９乃至２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。当該可変領域は、配列表の配列番号１７において、４３乃至５３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、６９乃至７５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、１０８乃至１１６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する。０４－０７９抗体の軽鎖可変領域は配列表の配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する。０４－０７９抗体のＣＤＲＬ１は配列表の配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列表の配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する。また０４－０７９抗体の軽鎖の配列は図４に記載されている。
０４－１２６抗体の重鎖は、配列表の配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する。配列表の配列番号２２に示される重鎖アミノ酸配列中で、１乃至１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１４３乃至４７５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。当該可変領域は、配列表の配列番号２２において、４５乃至５４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、６９乃至７８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、１１８乃至１３１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する。０４－１２６抗体の重鎖可変領域は配列表の配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する。０４－１２６抗体のＣＤＲＨ１は配列表の配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列表の配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する。また、０４－１２６抗体の重鎖の配列は図５に記載されている。
０４－１２６抗体の軽鎖は、配列表の配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する。配列表の配列番号２７に示される軽鎖アミノ酸配列中で、１乃至２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１２９乃至２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。当該可変領域は、配列表の配列番号２７において、４３乃至５３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、６９乃至７５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、１０８乃至１１６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する。０４－１２６抗体の軽鎖可変領域は配列表の配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有する。０４－１２６抗体のＣＤＲＬ１は配列表の配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列表の配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有する。また、０４－１２６抗体の軽鎖の配列は図６に記載されている。
０４－０４６抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号３２に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号３２に示されるヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列であり、５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０４６抗体の重鎖可変領域をコードしており、そして、４２７乃至１４２５番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０４６抗体の重鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３２において、ＣＤＲＨ１をコードするヌクレオチド番
号１３３乃至１６２に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２３４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ３をコードするヌクレオチド番号３５２乃至３９３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４－０４６抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号３３にも示されている。また、配列番号３２の配列は図１に記載されている。
０４－０４６抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号３４に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号３４に示されるヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列であり、６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０４６抗体の軽鎖可変領域をコードしており、そして、３８５乃至６９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０４６抗体の軽鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４において、ＣＤＲＬ１をコードするヌクレオチド番号１２７乃至１５９に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２２５に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ３をコードするヌクレオチド番号３２２乃至３４８に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４－０４６抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号３５にも示されている。また、配列番号３４の配列は図２に記載されている。
０４－０７９抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号３６に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号３６に示されるヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列であり、５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０７９抗体の重鎖可変領域をコードしており、そして、４２７乃至１４２５番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０７９抗体の重鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３６において、ＣＤＲＨ１をコードするヌクレオチド番号１３３乃至１６２に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２３４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ３をコードするヌクレオチド番号３５２乃至３９３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４－０７９抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号３７にも示されている。また、配列番号３６の配列は図３に記載されている。
０４－０７９抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号３８に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号３８に示されるヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列であり、６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０７９抗体の軽鎖可変領域をコードしており、そして、３８５乃至６９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０７９抗体の軽鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８において、ＣＤＲＬ１をコードするヌクレオチド番号１２７乃至１５９に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２２５に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ３をコードするヌクレオチド番号３２２乃至３４８に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４－０７９抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号３９にも示されている。また、配列番号３８の配列は図４に記載されている。
０４－１２６抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号４０に示されるヌクレオチ
ド配列によってコードされている。配列表の配列番号４０に示されるヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列であり、５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－１２６抗体の重鎖可変領域をコードしており、そして、４２７乃至１４２５番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－１２６抗体の重鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４０において、ＣＤＲＨ１をコードするヌクレオチド番号１３３乃至１６２に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２３４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ３をコードするヌクレオチド番号３５２乃至３９３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４－１２６抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号４１にも示されている。また、配列番号４０の配列は図５に記載されている。
０４－１２６抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号４２に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号４２に示されるヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列であり、６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－１２６抗体の軽鎖可変領域をコードしており、そして、３８５乃至６９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－１２６抗体の軽鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４２において、ＣＤＲＬ１をコードするヌクレオチド番号１２７乃至１５９に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２２５に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ３をコードするヌクレオチド番号３２２乃至３４８に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４－１２６抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号４３にも示されている。また、配列番号４２の配列は図６に記載されている。
さらに、「３．抗ＧＰＲ２０抗体の製造」（ａ）乃至（ｈ）の工程を再度実施して別途に独立してモノクローナル抗体を取得した場合や他の方法によって別途にモノクローナル抗体を取得した場合においても、０４－０４６抗体、０４－０７９抗体又は０４－１２６抗体と同等の内在化活性を有する抗体を取得することが可能である。このような抗体の一例として、０４－０４６抗体、０４－０７９抗体又は０４－１２６抗体と同一のエピトープに結合する抗体を挙げることができる。新たに作製されたモノクローナル抗体が、０４－０４６抗体、０４－０７９抗体又は０４－１２６抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に結合すれば、該モノクローナル抗体が０４－０４６抗体、０４－０７９抗体又は０４－１２６抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、０４－０４６抗体、０４－０７９抗体又は０４－１２６抗体のＧＰＲ２０に対する結合に対して該モノクローナル抗体が競合する（即ち、該モノクローナル抗体が、０４－０４６抗体、０４－０７９抗体又は０４－１２６抗体とＧＰＲ２０の結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、該モノクローナル抗体が抗ＧＰＲ２０抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。エピトープが同一であることが確認された場合、該モノクローナル抗体が０４－０４６抗体、０４－０７９抗体又は０４－１２６抗体と同等の抗原結合能、生物活性及び／又は内在化活性を有していることが強く期待される。
（３） その他の抗体
本発明の抗体には、上記ＧＰＲ２０に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト抗体等も含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１－６８５５，（１９８４）参照）。
ラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体０４－０４６抗体由来のキメラ抗体は、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号８に示される軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体であり、任意のヒト由来の定常領域を有していて良い。
ラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体０４－０７９抗体由来のキメラ抗体は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号１８に示される軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体であり、任意のヒト由来の定常領域を有していて良い。
ラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体０４－１２６抗体由来のキメラ抗体は、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２８に示される軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体であり、任意のヒト由来の定常領域を有していて良い。
また、ラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体０４－０４６抗体由来のキメラ抗体の具体例として、ラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体０４－０４６抗体由来のキメラ抗体０４－０４６Ｃｈ（以下、「０４－０４６Ｃｈ」とも記載する。）を挙げることができる。０４－０４６Ｃｈ抗体のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列表の配列番号４５の２１乃至２３３からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。なお、配列表の配列番号４４に示される重鎖配列中で、１乃至１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１４３乃至４７２番目の残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列番号４４の配列は図７に記載されている。また、配列表の配列番号４５に示される軽鎖配列中で、１乃至２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１２９乃至２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列番号４５の配列は図８に記載されている。
０４－０４６Ｃｈ抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号４６に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号４６に示されるヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０４６Ｃｈ抗体のシグナル配列をコードしており、配列表の配列番号４６に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０４６Ｃｈ抗体の重鎖可変領域配列をコードしており、配列表の配列番号４６に示されるヌクレオチド配列の４２７乃至１４１６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０４６Ｃｈ抗体の重鎖定常領域をコードしている。配列番号４６の配列は図７に記載されている。０４－０４６Ｃｈ抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号４７に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０４６Ｃｈ抗体のシグナル配列をコードしており、配列表の配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０４６Ｃｈ抗体の軽鎖可変領域配列をコードしており、配列表の配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の３８５乃至６９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０４６Ｃｈ抗体の軽鎖定常領域をコードしている。配列番号４７の配列は図８に記載されている。
ヒト化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２－５２５参照）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開第９０／０７８６１号）、更に、抗原に対する結合能を維持しつつ、一部のＣＤＲのアミノ酸配列を改変した抗体を挙げることができる。
但し、０４－０４６抗体、０４－０７９、又は０４－１２６抗体由来のヒト化抗体としては、０４－０４６抗体、０４－０７９抗体又は０４－１２６抗体の６種全てのＣＤＲ配列を保持し、内在化活性を有する限り、特定のヒト化抗体に限定されず、更に一部のＣＤＲのアミノ酸配列を改変しつつ内在化活性を有する限り、特定のヒト化抗体に限定されない。
ラット抗体０４－０４６のヒト化抗体の実例としては、（１）配列表の配列番号４８、５０、５２、５４又は５６の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、（２）上記（１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び（３）上記（１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列のいずれか一つからなる重鎖可変領域を含む重鎖、並びに（４）配列番号５８、６０、６２又は６４の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、（５）上記（４）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び（６）上記（４）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列のいずれか一つからなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の任意の組合せを挙げることができる。
また、重鎖又は軽鎖の一方をヒト化し、他方をラット抗体やキメラ抗体の軽鎖又は重鎖とした抗体も用いることができる。そのような抗体の例としては、（１）配列表の配列番号４４の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、（２）上記（１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び（３）上記（１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列のいずれか一つからなる重鎖、並びに（４）配列番号５８、６０、６２又は６４の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、（５）上記（４）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び（６）上記（４）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列のいずれか一つからなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の任意の組合せを挙げることができる。そのような抗体の他の例としては、（１）配列表の配列番号４８、５０、５２、５４又は５６の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、（２）上記（１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び（３）上記（１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列のいずれか一つからなる重鎖可変領域を含む重鎖、並びに、（４）配列表の配列番号４５の２１乃至２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、（５）上記（４）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び（６）上記（４）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列のいずれか一つからなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の任意の組合せを挙げることができる。また、別の例としては、以下の（７）ないし（１０）から選択されるいずれかの重鎖及び軽鎖の組み合わせからなる抗体を挙げることができる：（７）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、（８）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、（９）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、（１０）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖。
配列番号４８において、４５乃至５４番目のアミノ酸残基からなる配列（ＧＹＴＦＴＳＹＹＩＳ）はＣＤＲＨ１、６９乃至７８番目のアミノ酸残基からなる配列（ＦＩＮＰＧＳＧＨＴＮ）はＣＤＲＨ２、１１８乃至１３１番目のアミノ酸残基からなる配列（ＧＡＧＧＦＬＲＩＩＴＫＦＤＹ）はＣＤＲＨ３を示す。配列番号５０において、４５乃至５４番目のアミノ酸残基からなる配列（ＧＹＴＦＴＳＹＹＩＳ）はＣＤＲＨ１、６９乃至７８番目のアミノ酸残基からなる配列（ＦＩＮＰＧＳＧＨＴＮ）はＣＤＲＨ２、１１８乃至１３１番目のアミノ酸残基からなる配列（ＧＡＧＧＦＬＲＩＩＴＫＦＤＹ）はＣＤＲＨ３を示す。配列番号５２において、４５乃至５４番目のアミノ酸残基からなる配列（ＧＹＴＦＴＳＹＹＩＳ）はＣＤＲＨ１、６９乃至７８番目のアミノ酸残基からなる配列（ＦＩＮＰＧＳＧＨＴＮ）はＣＤＲＨ２、１１８乃至１３１番目のアミノ酸残基からなる配列（ＧＡＧＧＦＬＲＩＩＴＫＦＤＹ）はＣＤＲＨ３を示す。配列番号５４において、４５乃至５４番目のアミノ酸残基からなる配列（ＧＹＴＦＴＳＹＹＩＳ）はＣＤＲＨ１、６９乃至７８番目のアミノ酸残基からなる配列（ＦＩＮＰＧＳＧＨＴＮ）はＣＤＲＨ２、１１８乃至１３１番目のアミノ酸残基からなる配列（ＧＡＧＧＦＬＲＩＩＴＫＦＤＹ）はＣＤＲＨ３を示す。配列番号５６において、４５乃至５４番目のアミノ酸残基からなる配列（ＧＹＴＦＴＳＹＹＩＳ）はＣＤＲＨ１、６９乃至７８番目のアミノ酸残基からなる配列（ＦＩＮＰＧＳＧＨＴＮ）はＣＤＲＨ２、１１８乃至１３１番目のアミノ酸残基からなる配列（ＧＡＧＧＦＬＲＩＩＴＫＦＤＹ）はＣＤＲＨ３を示す。
配列番号５８において、４４乃至５４番目のアミノ酸残基からなる配列（ＲＡＳＫＳＶＳＴＹＩＨ）はＣＤＲＬ１、７０乃至７６番目のアミノ酸残基からなる配列（ＳＡＳＮＬＥＳ）はＣＤＲＬ２、アミノ酸番号１０９乃至１１７番目のアミノ酸残基からなる配列（ＱＱＩＮＥＬＰＹＴ）はＣＤＲＬ３を示す。配列番号６０において、４４乃至５４番目のアミノ酸残基からなる配列（ＲＡＳＫＳＶＳＴＹＩＨ）はＣＤＲＬ１、７０乃至７６番目のアミノ酸残基からなる配列（ＳＡＳＮＬＥＳ）はＣＤＲＬ２、アミノ酸番号１０９乃至１１７番目のアミノ酸残基からなる配列（ＱＱＩＮＥＬＰＹＴ）はＣＤＲＬ３を示す。配列番号６２において、４４乃至５４番目のアミノ酸残基からなる配列（ＲＡＳＫＳＶＳＴＹＩＨ）はＣＤＲＬ１、７０乃至７６番目のアミノ酸残基からなる配列（ＳＡＳＤＲＥＳ）はＣＤＲＬ２、アミノ酸番号１０９乃至１１７番目のアミノ酸残基からなる配列（ＱＱＩＮＥＬＰＹＴ）はＣＤＲＬ３を示す。配列番号６４において、４４乃至５４番目のアミノ酸残基からなる配列（ＲＡＳＫＳＶＳＴＹＩＨ）はＣＤＲＬ１、７０乃至７６番目のアミノ酸残基からなる配列（ＳＡＧＮＬＥＳ）はＣＤＲＬ２、アミノ酸番号１０９乃至１１７番目のアミノ酸残基からなる配列（ＱＱＩＮＥＬＰＹＴ）はＣＤＲＬ３を示す。
なお、本明細書中における「数個」とは、１乃至１０個、１乃至９個、１乃至８個、１乃至７個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、又は１若しくは２個を意味する。
また、本明細書中におけるアミノ酸の置換としては保存的アミノ酸置換が好ましい。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換である。好適なアミノ酸グループは、以下のとおりである：酸性グループ＝アスパラギン酸、グルタミン酸；塩基性グループ＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；非極性グループ＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び非帯電極性ファミリー＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。他の好適なアミノ酸グループは次のとおりである：脂肪族ヒドロキシグループ＝セリン及びスレオニン；アミド含有グループ＝アスパ
ラギン及びグルタミン；脂肪族グループ＝アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；並びに芳香族グループ＝フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン。かかるアミノ酸置換は元のアミノ酸配列を有する物質の特性を低下させない範囲で行うのが好ましい。
上記重鎖及び軽鎖の好適な組合せの抗体としては、配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体、配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
さらに好適な組合せの抗体としては、配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番５０においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
上記の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列と高い相同性を示す配列を組み合わせることによって、上記の各抗体と同等の生物活性を有する抗体を選択することが可能である。このような相同性は、一般的には８０％以上の相同性であり、好ましくは９０％以上の相同性であり、より好ましくは９５％以上の相同性であり、最も好ましくは９９％以上の相同性である。また、重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を組み合わせることによっても、上記の各抗体と同等の生物活性を有する抗体を選択することが可能である。
二種類のアミノ酸配列間の相同性は、Ｂｌａｓｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．２．２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈaｆｆｅｒ， Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ， Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ， Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ， ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Ｂｌａｓｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍは、インターネットでｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔにアクセスすることによっても使用することができる。
なお、配列表の配列番号４８、５０、５２、５４又は５６に示される重鎖アミノ酸配列中で、１乃至１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１４３乃至４７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列番号４８の配列は図９に、配列番号５０の配列は図１０に、配列番号５２の配列は図１１に、配列番号５４の配列は図１２に、配列番号５６の配列は図１３に各々記載されている。
また、配列表の配列番号５８、６０、６２又は６４に示される軽鎖アミノ酸配列中で、１乃至２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列番号５８の配列は図１４に、配列番号６０の配列は図１５に、配列番号６２の配列は図１６に、配列番号６４の配列は図１７に各々記載されている。
本発明の抗体としては、さらに、ＧＰＲ２０に結合する、ヒト抗体を挙げることができる。抗ＧＰＲ２０ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗ＧＰＲ２０ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３－１４３，；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７－３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ ｖｏｌ．１０，ｐ．６９－７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２－７２７等を参照。）によって取得することができる。
このようなヒト抗体産生マウスは、具体的には、内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクター等を介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物として、ノックアウト動物及びトランスジェニック動物の作製及びこれらの動物同士を掛け合わせることによって作り出すことができる。
また、遺伝子組換え技術によって、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターによって真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することによって、この抗体を培養上清中から得ることもできる。
ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。
また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得
する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００２）４３（７），ｐ．２３０１－２３０８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００２），１（２），ｐ．１８９－２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９（３），ｐ．４２７－４３１等参照。）も知られている。
例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５－１１１６）を用いることができる。
抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。
抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによってヒト抗体を取得することができる（国際公開第９２／０１０４７号、同９２／２０７９１号、同９３／０６２１３号、同９３／１１２３６号、同９３／１９１７２号、同９５／０１４３８号、同９５／１５３８８号、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３－４５５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５－１１１６）。
新たに作製されたヒト抗体が、本明細書に記載の０４－０４６抗体、０４－０７９抗体又は０４－１２６抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に結合すれば、該ヒト抗体が０４－０４６抗体、０４－０７９抗体又は０４－１２６抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、０４－０４６抗体、０４－０７９抗体又は０４－１２６抗体のＧＰＲ２０に対する結合に対して該ヒト抗体が競合する（すなわち、該ヒト抗体が、０４－０４６抗体、０４－０７９抗体又は０４－１２６抗体とＧＰＲ２０の結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、該ヒト抗体が０４－０４６抗体、０４－０７９抗体又は０４－１２６抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。エピトープが同一であることが確認された場合、該ヒト抗体が０４－０４６抗体、０４－０７９抗体又は０４－１２６抗体と同等の生物活性を有していることが強く期待される。
以上の方法によって得られたキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体は、公知の方法等によって抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。
抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）は、蛋白の相対的構造安定性のよい指標となる熱変性中点（Ｔｍ）を素早く、また正確に測定することができる装置である。ＤＳＣを用いてＴｍ値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており（Ｌｏｒｉ Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）１２，ｐ．２６５－２７３）、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗体を選抜する必要がある。
本発明の抗体には抗体の修飾体も含まれる。当該修飾体とは、本発明の抗体に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ－結合又はＯ－結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、Ｎ－結合又はＯ－結合への糖鎖付加、Ｎ末又はＣ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化）されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによってＮ末にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、本発明の抗体又は抗原の検出又は単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティ標識体もかかる修飾物の意味に含まれる。このような本発明の抗体の修飾物は、抗体の安定性及び血中滞留性の改善、抗原性の低減、抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節すること（グリコシル化、脱フコース化等）によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、国際公開第１９９９／５４３４２号、同２０００／６１７３９号、同２００２／３１１４０号等が知られているが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体には当該糖鎖修飾を調節された抗体も含まれる。
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。抗体遺伝子の具体例としては、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子、及び軽鎖配列をコードする遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子と軽鎖配列遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。
真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。特に動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５－１８２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６－４２２０）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を挙げることができる。
原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。
これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換によって導入し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することによって抗体が得られる。当該培養においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。よって、本発明の抗体には、上記形質転換された宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体又は当該抗体の機能性断片を採取する工程を含むことを特徴とする当該抗体の製造方法によって得られる抗体も含まれる。
なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリシン残基が欠失することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，７０５：１２９－１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リシンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５－８３（２００７））。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用等）には影響を及ぼさない。従って、本発明に係る抗体には、当該修飾を受けた抗体及び当該抗体の機能性断片も含まれ、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）等も包含される。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体を構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であってもよいし、いずれか二種を組み合わせたものであってもよい。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
本発明の抗体のアイソタイプとしては、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２を挙げることができる。
抗体の生物活性としては、一般的には抗原結合活性、抗原と結合することによって該抗原を発現する細胞に内在化する活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性及び抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）を挙げることができるが、本発明に係る抗体が有する機能は、ＧＰＲ２０に対する結合活性であり、好ましくはＧＰＲ２０と結合することによってＧＰＲ２０発現細胞に内在化する活性である。さらに、本発明の抗体は、細胞内在化活性に加えて、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＰ活性を併せ持っていても良い。
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が、これらに限定されるものではない。
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。
これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（ファルマシア）等を挙げることができる。
また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
３．抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲート
（１）薬物
上記「２．抗ＧＰＲ２０抗体の製造」にて取得された抗ＧＰＲ２０抗体はリンカー構造部分を介して薬物を結合させることによって、抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートとすることができる。薬物としては、リンカー構造に結合できる置換基、部分構造を有するものであれば特に制限はない。抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートは結合する薬物に応じて種々の用途に用いることができる。そのような薬物の例としては、抗腫瘍活性を有する物質、血液疾患に対する効果を有する物質、自己免疫疾患に対する効果を有する物質、抗炎症物質、抗菌物質、抗真菌物質、抗寄生虫物質、抗ウイルス物質、抗麻酔物質等を挙げることができる。
（１）－１ 抗腫瘍化合物
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートに結合される化合物として抗腫瘍性化合物を用いる例について以下に述べる。抗腫瘍性化合物としては、抗腫瘍効果を有する化合物であって、リンカー構造に結合できる置換基、部分構造を有するものであれば特に制限はない。抗腫瘍性化合物は、リンカーの一部又は全部が腫瘍細胞内で切断されて抗腫瘍性化合物部分が遊離されて抗腫瘍効果が発現される。リンカーが薬物との結合部分で切断されれば抗腫瘍性化合物が本来の構造で遊離され、その本来の抗腫瘍効果が発揮される。
上記「２．抗ＧＰＲ２０抗体の製造」にて取得された抗ＧＰＲ２０抗体はリンカー構造部分を介して抗腫瘍性化合物を結合させることによって、抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートとすることができる。
本発明で使用される抗腫瘍性化合物の一つの例として、カンプトテシン誘導体であるエキサテカン（（１Ｓ，９Ｓ）－１－アミノ－９－エチル－５－フルオロ－２，３－ジヒドロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）－ジオン；次式：）
Figure 0007064635000006
を好適に使用することができる。同化合物は、例えば、米国特許公開公報ＵＳ２０１６／０２９７８９０号に記載の方法やその他の公知の方法で容易に取得でき、１位のアミノ基をリンカー構造への結合部位として好適に使用することができる。また、エキサテカンはリンカーの一部が結合した状態で腫瘍細胞内に遊離される場合もあるが、この様な状態で
も優れた抗腫瘍効果が発揮される化合物である。
エキサテカンはカンプトテシン構造を有するので、酸性水性媒体中（例えばｐＨ３程度）ではラクトン環が形成された構造（閉環体）に平衡が偏り、一方、塩基性水性媒体中（例えばｐＨ１０程度）ではラクトン環が開環した構造（開環体）に平衡が偏ることが知られている。このような閉環構造及び開環構造に対応するエキサテカン残基を導入した薬物コンジュゲートであっても同等の抗腫瘍効果が期待され、いずれのものも本発明の範囲に包含されることはいうまでもない。
他の抗腫瘍性化合物として例えば、文献（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ６８， ｐ３－１９， ２０１６）記載の抗腫瘍化合物を挙げることができ、その一例として、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、カルケマイシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ドラスタチン（Ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）１０、モノメチルオリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）等のオリスタチン類（Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、ＤＭ１、ＤＭ４等のメイタンシノイド類（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、ピロロベンゾジアゼピン（Ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）二量体のＳＧ２０００（ＳＪＧ－１３６）、カンプトテシンの誘導体であるＳＮ－３８、ＣＣ－１０６５等のデュオカルマイシン類（Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎｓ）、アマニチン（Ａｍａｎｉｔｉｎ）、ダウノルビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、シクロシチジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、白金系抗腫瘍剤（シスプラチン若しくはその誘導体）、タキソール若しくはその誘導体等を挙げることができる。
抗体－薬物コンジュゲートにおいて、抗体１分子への薬物の結合数は、その有効性、安全性に影響する重要因子である。抗体－薬物コンジュゲートの製造は、薬物の結合数が一定の数となるよう、反応させる原料・試薬の使用量等の反応条件を規定して実施されるが、低分子化合物の化学反応とは異なり、異なる数の薬物が結合した混合物として得られるのが通常である。抗体１分子への薬物の結合数は平均値、すなわち、平均薬物結合数として特定され、表記される。本発明でも原則として断りのない限り、すなわち、異なる薬物結合数をもつ抗体－薬物コンジュゲート混合物に含まれる特定の薬物結合数をもつ抗体－薬物コンジュゲートを示す場合を除き、薬物の結合数は平均値を意味する。抗体分子へのエキサテカンの結合数はコントロール可能であり、１抗体あたりの薬物平均結合数として、１から１０個程度のエキサテカンを結合させることができるが、好ましくは２から８個であり、より好ましくは５から８個であり、更に好ましくは７から８個であり、更により好ましくは８個である。なお、当業者であれば本願の実施例の記載から抗体に必要な数の薬物を結合させる反応を設計することができ、エキサテカンの結合数をコントロールした抗体－薬物コンジュゲートを取得することができる。
（２）リンカー構造
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートにおいて薬物を抗ＧＰＲ２０抗体に結合させるリンカー構造について述べる。
本願の抗体－薬物コンジュゲートにおいて、抗ＧＰＲ２０抗体と薬物とを結合するリンカー構造は、抗体－薬物コンジュゲートとして用いることができる限りにおいて特に制限されず、使用目的に応じて適宜選択して用いることができる。リンカー構造の一例としては、公知文献（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ ６８：３-１９， Ｊａｎｕａｒｙ ２０１６、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ＤＯＩ １０．１００７／ｓ１３２３８－０１６－０３２３－０等）に記載のリンカーを挙げることができ、更に具体的な例としては、ＶＣ（バリン－シトルリン：ｖａｌｉｎｅ－ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）、ＭＣ（マレインアミドカプロイル：ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）、ＳＭＣＣ（スクシニミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート：ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ） ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、ＳＰＰ（Ｎ－スクシニミジル ４－（２－ピリジルジチオ）ペンタン酸：Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｅｎｔａｎｏａｔｅ、ＳＳ（ジスルフィド：ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、ＳＰＤＢ（Ｎ－スクシミジル ４－（２－ピリジルジチオ）ブチラート）Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｂｕｔｙｒａｔｅ、ＳＳ／ヒドラゾン、ヒドラゾン及びカルボネート等を挙げることができる。
リンカー構造の他の一例としては、例えば、米国特許公開公報ＵＳ２０１６／０２９７８９０に記載のリンカー構造（一例として、段落［０２６０］乃至［０２８９］に記載のもの）を挙げることができ、以下の構造のものを好適に使用することができる。なお以下に示す構造の左端が抗体との結合部位であり、右端が薬物との結合部位である。また、下記のリンカー構造中のＧＧＦＧは、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシンからなるペプチド結合でつながっているアミノ酸配列を示す。
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－。
より好ましくは、次のものを挙げることができる。
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－。
さらにより好ましくは、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－。
を挙げることができる。
抗体は－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）の末端、（例えば、『－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－』においては、（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）が結合するのとは反対側の末端（左末端））で結合し、抗腫瘍性化合物は
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）とは反対側の末端（上記例では右末端の、ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－のカルボニル基で結合する。『－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－』は、次式
Figure 0007064635000007
で示される構造を有する。この部分構造における３位が抗ＧＰＲ２０抗体への結合部位である。この３位での該抗体との結合は、チオエーテルを形成して結合することが特徴である。この構造部分の１位の窒素原子は、この構造が含まれるリンカー内に存在するメチレンの炭素原子と結合する。
薬物をエキサテカンとする本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおいては、下記の構造の薬物－リンカー構造部分を抗体に結合させたものが好ましい。これらの薬物－リンカー構造部分は、１抗体あたりの平均結合数として、１から１０を結合させればよいが、好ましくは２から８であり、より好ましくは５から８であり、更に好ましくは７から８であり、更により好ましくは８である。
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）。
より、好ましくは、次のものである。
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）。
さらに、より好ましくは、次のものを挙げることができる。
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２
ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）。
更に、より好ましくは、次のものを挙げることができる。
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）
（３）抗体－薬物コンジュゲートの製造方法
本発明の抗体ー薬物コンジュゲートに用いることができる抗体は、上記「２．抗ＧＰＲ２０抗体の製造」の項及び実施例に記載の内在化活性を有する抗ＧＰＲ２０抗体及び該抗体の機能性断片であれば特に制限がない。
次に、本発明の抗体－薬物コンジュゲートの製造方法について具体例を挙げて説明する。なお、以下において、化合物を示すために、各反応式中に示される化合物の番号を用いる。すなわち、『式（１）の化合物』、『化合物（１）』等と称する。また、これ以外の番号の化合物についても同様に記載する。
（３）－１製造方法１
下記式（１）で示される抗体－薬物コンジュゲートのうち、チオエーテルを介して抗ＧＰＲ２０抗体とリンカー構造が結合しているものは抗ＧＰＲ２０抗体を還元してジスルフィド結合をスルフヒドリル基に変換した抗体に対して、既知の方法によって入手しうる化合物（２）（例えば、ＵＳ２０１６／２９７８９０号公開特許公報に記載の方法（例えば段落［０３３６］乃至［０３７４］に記載の方法）で入手可能）を反応させることによって製造することができる。例えば下記の方法によって製造することができる。
Figure 0007064635000008
［式中、ＡＢは、スルフヒドリル基を有する抗体を示す。
ここで、Ｌ１は、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－の構造で示される。
Ｌ１’は次式で示される、マレイミジル基を示す。］
Figure 0007064635000009
－Ｌ１－ＬＸは、以下の式で示されるいずれかの構造を有する。
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝
Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－。
これらのうちでより好ましくは、次のものである。
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－。
さらに、好ましくは、次のものを挙げることができる。
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、
－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－。
また、－（ＮＨ－ＤＸ）は次式：
Figure 0007064635000010
で示される構造であり、エキサテカンの１位のアミノ基の水素原子１個が除かれて生成する基を示す。また、上記の反応式において式（１）の化合物では、薬物からリンカー末端までの構造部分１個が１個の抗体に対して結合した構造として記載されているが、これは説明のための便宜的な記載であって、実際には当該構造部分が１個の抗体分子に対して複数個が結合している場合が多い。この状況は以下の製造方法の説明においても同様である。
すなわち、既知の方法によって入手しうる化合物（２）（例えば、ＵＳ２０１６／２９
７８９０号公開特許公報に記載の方法（例えば段落［０３３６］乃至［０３７４］に記載の方法）で入手可能）と、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）を反応させることによって、抗体－薬物コンジュゲート（１）を製造することができる。
スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）は、当業者周知の方法で得ることができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ｐｐ．５６－１３６、ｐｐ．４５６－４９３、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。例えば、Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬を抗体のアミノ基に作用させる；Ｎ－サクシンイミジルＳ－アセチルチオアルカノエート類を抗体のアミノ基に作用させた後、ヒドロキシルアミンを作用させる；Ｎ－サクシンイミジル３－（ピリジルジチオ）プロピオネートを作用させた後、還元剤を作用させる；ジチオトレイトール、２－メルカプトエタノール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）等の還元剤を抗体に作用させて抗体内鎖間部のジスルフィド結合を還元しスルフヒドリル基を生成させる；等の方法を挙げることができるがこれらに限定されることはない。
具体的には、還元剤としてＴＣＥＰを、抗体内鎖間部ジスルフィド一個当たりに対して０．３乃至３モル当量用い、キレート剤を含む緩衝液中で、抗体と反応させることで、抗体内鎖間部ジスルフィドが部分的もしくは完全に還元された抗体を得ることができる。キレート剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）等を挙げることができる。これ等を１ｍＭ乃至２０ｍＭの濃度で用いればよい。緩衝液としては、リン酸ナトリウムやホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム溶液等を用いることができる。具体的な例において、抗体は４℃乃至３７℃にて１乃至４時間ＴＣＥＰと反応させることで部分的もしくは完全に還元されたスルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）を得ることが出来る。
なお、ここでスルフヒドリル基を薬物－リンカー部分に付加させる反応を実施させることでチオエーテル結合によって薬物－リンカー部分を結合させることができる。
次に、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）一個あたり、２乃至２０モル当量の化合物（２）を使用して、抗体１個当たり２個乃至８個の薬物が結合した抗体―薬物コンジュゲート（１）を製造することができる。具体的には、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）を含む緩衝液に、化合物（２）を溶解させた溶液を加えて反応させればよい。ここで、緩衝液としては、酢酸ナトリウム溶液、リン酸ナトリウムやホウ酸ナトリウム、等を用いればよい。反応時のｐＨは５乃至９であり、より好適にはｐＨ７付近で反応させればよい。化合物（２）を溶解させる溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）等の有機溶媒を用いることができる。化合物（２）を溶解させた有機溶媒溶液を、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）を含む緩衝液に１乃至２０％ｖ／ｖを加えて反応させればよい。反応温度は、０乃至３７℃、より好適には１０乃至２５℃であり、反応時間は、０．５乃至２時間である。反応は、未反応の化合物（２）の反応性をチオール含有試薬によって失活させることによって終了できる。チオール含有試薬は例えば、システイン又はＮ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）である。より具体的には、ＮＡＣを、用いた化合物（２）に対して、１乃至２モル当量加え、室温で１０乃至３０分インキュベートすることにより反応を終了できる。
（４）抗体―薬物コンジュゲートの同定
製造した抗体－薬物コンジュゲート（例えば、抗体―薬物コンジュゲート（１））は、以下の共通操作によって濃縮、バッファー交換、精製、抗体濃度及び抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定を行い、抗体－薬物コンジュゲート（１）の同定を行うことができる。
（４）－１ 共通操作Ａ：抗体もしくは抗体－薬物コンジュゲート水溶液の濃縮
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（５０，０００ ＭＷＣＯ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の容器内に抗体もしくは抗体－薬物コンジュゲート溶液を入れ、遠心機（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－１５Ｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いた遠心操作（２０００Ｇ乃至３８００Ｇにて５乃至２０分間遠心）にて、抗体もしくは抗体－薬物コンジュゲート溶液を濃縮した。
（４）－２ 共通操作Ｂ：抗体の濃度測定
ＵＶ測定器（Ｎａｎｏｄｒｏｐ １０００，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を用いて、メーカー規定の方法に従い、抗体濃度の測定を行った。その際に、抗体ごとに異なる２８０ｎｍ吸光係数（１．３ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１乃至１．８ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１）を用いた。
（４）－３ 共通操作Ｃ：抗体のバッファー交換
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５担体を使用したＮＡＰ－２５カラム（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７－０８５２－０２，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｊａｐａｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、メーカー規定の方法に従い、塩化ナトリウム（５０ｍＭ）及びＥＤＴＡ（２ｍＭ）を含むリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）（本明細書でＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡと称する。）にて平衡化させた。このＮＡＰ－２５カラム一本につき、抗体水溶液２．５ｍＬをのせたのち、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡ３．５ｍＬで溶出させた画分（３．５ｍＬ）を分取した。この画分を共通操作Ａによって濃縮し、共通操作Ｂを用いて抗体濃度の測定を行ったのちに、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡを用いて２０ｍｇ／ｍＬに抗体濃度を調整した。
（４）－４ 共通操作Ｄ：抗体－薬物コンジュゲートの精製
市販のＳｏｒｂｉｔｏｌ（５％）を含む酢酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ５．５；本明細書でＡＢＳと称する。）等のいずれかの緩衝液でＮＡＰ－２５カラムを平衡化させた。このＮＡＰ－２５カラムに、抗体－薬物コンジュゲート反応水溶液（約２．５ｍＬ）をのせ、メーカー規定の量の緩衝液で溶出させることで、抗体画分を分取した。この分取画分を再びＮＡＰ－２５カラムにのせ緩衝液で溶出させるゲルろ過精製操作を計２乃至３回繰り返すことで、未結合の薬物リンカーや低分子化合物（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ），Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ），ジメチルスルホキシド）を除いた抗体－薬物コンジュゲートを得た。
（４）－５ 共通操作Ｅ：抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体濃度及び抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定
抗体－薬物コンジュゲートにおける結合薬物濃度は、抗体－薬物コンジュゲート水溶液の２８０ｎｍ及び３７０ｎｍの二波長におけるＵＶ吸光度を測定したのちに下記の計算を行うことで、算出することができる。
ある波長における全吸光度は系内に存在する全ての吸収化学種の吸光度の和に等しい［吸光度の加成性］ことから、抗体と薬物のコンジュゲーション前後において、抗体及び薬物のモル吸光係数に変化がないと仮定すると、抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体濃度及び薬物濃度は、下記の関係式で示される。
Ａ２８０＝ＡＤ，２８０＋ＡＡ，２８０＝εＤ，２８０ＣＤ＋εＡ，２８０ＣＡ 式（１）
Ａ３７０＝ＡＤ，３７０＋ＡＡ，３７０＝εＤ，３７０ＣＤ＋εＡ，３７０ＣＡ 式（２）
ここで、Ａ２８０は２８０ｎｍにおける抗体－薬物コンジュゲート水溶液の吸光度を示し、Ａ３７０は３７０ｎｍにおける抗体－薬物コンジュゲート水溶液の吸光度を示し、ＡＡ，２８０は２８０ｎｍにおける抗体の吸光度を示し、ＡＡ，３７０は３７０ｎｍにおける抗体の吸光度を示し、ＡＤ，２８０は２８０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体の吸光度を示し、ＡＤ，３７０は３７０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体の吸光度を示し、εＡ，２８０は２８０ｎｍにおける抗体のモル吸光係数を示し、εＡ，３７０は３７０ｎｍにおける抗体のモル吸光係数を示し、εＤ，２８０は２８０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体のモル吸光係数を示し、εＤ，３７０は３７０ｎｍにおけるコンジュゲート前駆体のモル吸光係数を示し、ＣＡは抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体濃度を示し、ＣＤは抗体－薬物コンジュゲートにおける薬物濃度を示す。
ここで、εＡ，２８０、εＡ，３７０、εＤ，２８０、εＤ，３７０は、事前に用意した値（計算推定値もしくは化合物のＵＶ測定から得られた実測値）が用いられる。例えば、εＡ，２８０は、抗体のアミノ酸配列から、既知の計算方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９５， ｖｏｌ．４， ２４１１－２４２３）によって推定することが出来る。εＡ，３７０は、通常、ゼロである。εＤ，２８０及びεＤ，３７０は、用いるコンジュゲート前駆体をあるモル濃度に溶解させた溶液の吸光度を測定することで、ランベルト・ベールの法則（吸光度＝ モル濃度×モル吸光係数× セル光路長）によって、得ることができる。抗体－薬物コンジュゲート水溶液のＡ２８０及びＡ３７０を測定し、これらの値を式（１）及び（２）に代入して連立方程式を解くことによって、ＣＡ及びＣＤを求めることができる。さらにＣＤをＣＡで除することで１抗体あたりの薬物平均結合数が求めることができる。
（４）－６ 共通操作Ｆ：抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定（２）
抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数は、前述の「（４）－５ 共通操作Ｅ」に加え、以下の方法を用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によっても求めることができる。以下に、抗体と薬物リンカーがジスルフィド結合している場合のＨＰＬＣによる薬物平均結合数の測定方法を記載する。当業者は、この方法を参照して、抗体と薬物リンカーとの結合様式に依存して適宜、ＨＰＬＣにより薬物平均結合数を測定し得る。
Ｆ－１．ＨＰＬＣ分析用サンプルの調製（抗体－薬物コンジュゲートの還元）
抗体－薬物コンジュゲート溶液（約１ｍｇ／ｍＬ、６０μＬ）をジチオトレイトール（ＤＴＴ）水溶液（１００ｍＭ、１５μＬ）と混合する。混合物を３７℃で３０分インキュベートすることで、抗体－薬物コンジュゲートの軽鎖及び重鎖間のジスルフィド結合を切断したサンプルを、ＨＰＬＣ分析に用いる。
Ｆ－２．ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析を、下記の測定条件にて行う。
ＨＰＬＣシステム：Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
検出器：紫外吸光度計（測定波長：２８０ｎｍ）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｐｈｅｎｙｌ（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ、１３０Å；Ｗａｔｅｒｓ、Ｐ／Ｎ １８６００２８８４）
カラム温度：８０℃
移動相Ａ：０．１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１５％２－プロパノールを含む水溶液
移動相Ｂ：０．０７５％ＴＦＡ、１５％２－プロパノールを含むアセトニトリル溶液
グラジエントプログラム：１４％－３６％（０分－１５分）、３６％－８０％（１５分
－１７分）、８０％－１４％（１７分―１７．０１分）、１４％（１７．０１分―２５分）
サンプル注入量：１０μＬ
もしくは、
ＨＰＬＣシステム：Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
検出器：紫外吸光度計（測定波長：２８０ｎｍ）
カラム：ＰＬＲＰ－Ｓ（２．１×５０ｍｍ、８μｍ、１０００Å；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐ／Ｎ ＰＬ１９１２－１８０２）
カラム温度：８０℃
移動相Ａ：０．０４％ＴＦＡ水溶液
移動相Ｂ：０．０４％ＴＦＡを含むアセトニトリル溶液
グラジエントプログラム：２９％－３６％（０分－１２．５分）、３６％－４２％（１２．５分－１５分）、４２％－２９％（１５分―１５．１分）、２９％－２９％（１５．１分―２５分）
サンプル注入量：１５μＬ
Ｆ－３．データ解析
Ｆ－３－１ 薬物の結合数に応じて抗体の軽鎖をＬｉ、重鎖をＨｉと表記する（ここでｉは結合している薬物の数を示す。すなわち、本発明において薬物結合数はＬ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と表記する。
薬物の結合していない抗体の軽鎖（Ｌ０）及び重鎖（Ｈ０）に対して、薬物が一つ結合した軽鎖：Ｌ１及び、薬物が1個結合した重鎖：Ｈ１、薬物が二つ結合した重鎖：Ｈ２、薬物が三つ結合した重鎖：Ｈ３は、結合した薬物の数に比例して疎水性が増し保持時間が大きくなることから、例えば、Ｌ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３の順に溶出される。Ｌ０及びＨ０との保持時間比較により検出ピークをＬ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３のいずれかに割り当てることができる。
Ｆ－３－２ 薬物リンカーにＵＶ吸収があるため、薬物リンカーの結合数に応じて、軽鎖、重鎖及び薬物リンカーのモル吸光係数を用いて下式に従ってピーク面積値の補正を行う。
Figure 0007064635000011
Figure 0007064635000012
ここで、各抗体における軽鎖及び重鎖のモル吸光係数（２８０ｎｍ）は、既知の計算方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９５， ｖｏｌ．４， ２４１１－２４２３）によって、各抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列から推定される値を用いることができる。ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７の場合、そのアミノ酸配列に従って、軽鎖のモル吸光係数として２６２１０を、重鎖のモル吸光係数として６８９９０を推定値として用いた。また、薬物リンカーのモル吸光係数（２８０ｎｍ）は、各薬物リンカーをメルカプトエタノール又はＮ－アセチルシステインで反応させ、マレイミド基をサクシニイミドチオエーテルに変換した化合物の実測のモル吸光係数（２８０ｎｍ）を用いた。吸光度を測定する波長は、当業者によって適宜設定され得るが、好ましくは、抗体のピークが測定され得る波長であり、より好ましくは２８０ｎｍである。
Ｆ－３－３ ピーク面積補正値合計に対する各鎖ピーク面積比（％）を下式に従って計算する。
Figure 0007064635000013
ＡＬｉ， ＡＨｉ：Ｌｉ， Ｈｉ各々のピーク面積補正値
Ｆ－３－４ 抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数を、下式に従って計算する。
薬物平均結合数＝（Ｌ０ピーク面積比×０＋Ｌ０ピーク面積比×１＋Ｈ０ピーク面積比×０＋Ｈ１ピーク面積比×１＋Ｈ２ピーク面積比×２＋Ｈ３ピーク面積比×３）／１００×２
なお、コンジュゲートの量を確保するために、同様な条件で作製して得られた平均薬物数が同程度の複数のコンジュゲート（例えば±１程度）を混合して新たなロットにすることができる。その場合、平均薬物数は混合前の平均薬物数の間に収まる。
本発明において使用される抗体－薬物コンジュゲートの一つの具体例としては、式
Figure 0007064635000014
（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物－リンカー構造部分と、本明細書で開示される抗ＧＰＲ２０抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗体－薬物コンジュゲートを挙げることができる。
本発明においては、抗体－薬物コンジュゲートのうち、リンカー及び薬物からなる部分
構造を、「薬物－リンカー構造」、「薬物ーリンカー構造部分」又は「薬物リンカー」とも称する。この薬物リンカーは抗体の鎖間のジスルフィド結合部位（２箇所の重鎖－重鎖間、及び２箇所の重鎖－軽鎖間）において生じたチオール基（言い換えれば、システイン残基の硫黄原子）に結合している。
本発明の抗体－薬物コンジュゲートの一つの具体例としては次式化：
Figure 0007064635000015
又は次式化：
Figure 0007064635000016
で示される構造を有するものも挙げることができる。
ここで、ＡＢは本明細書で開示される抗ＧＰＲ２０抗体を示し、抗体由来のスルフヒドリル基を介して薬物リンカーと結合している。ここで、ｎはいわゆるＤＡＲ（Ｄｒｕｇ－ｔｏ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏ）と同義であり、１抗体あたりの薬物抗体比を示す。すなわち、抗体１分子への薬物の結合数を示すが、これは平均値、すなわち、平均薬物結合数として特定され、表記される数値である。本発明の化５及び化１２で示される抗体－薬物コンジュゲートの場合、共通操作Ｆによる測定で、ｎは、２から８であればよく、好ましくは５から８であり、更に好ましくは７から８であり、更により好ましく８である。
本発明の抗体薬物－コンジュゲートの一例として、上記式化１２又は化１３に示される構造において、ＡＢで示される抗体が、以下の（ａ）乃至（ｙ）からなる群から選択されるいずれか１項に記載の重鎖及び軽鎖の抗体又はその機能性断片を含む、抗体－薬物コンジュゲート又はその薬理学上許容される塩を挙げることができる：
（ａ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｂ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｃ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｄ）配列番号４８においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｅ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｆ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｇ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｈ）配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｉ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｊ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｋ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｌ）配列番号５２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｍ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｎ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｏ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｐ）配列番号５４においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｑ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｒ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｓ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｔ）配列番号５６においてアミノ酸番号２０乃至４７４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｕ）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号５８においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｖ）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６０においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｗ）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６２においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｘ）配列番号４４においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｙ）重鎖又は軽鎖がＮ－結合への糖鎖付加、Ｏ－結合への糖鎖付加、Ｎ末のプロセッシング、Ｃ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、Ｎ末にメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化及びカルボキシル末端において１つ又は２つのアミノ酸欠失からなる群より選択される１又は２以上の修飾を含む、（ａ）乃至（ｘ）からなる群から選択されるのいずれか１項に記載の抗体。
４．医薬
上記、「２．抗ＧＰＲ２０抗体の製造」の項及び実施例に記載された本発明の抗ＧＰＲ２０抗体及び当該抗体の機能性断片は、腫瘍細胞表面のＧＰＲ２０に結合し、内在化活性を有することから、単独であるいは他の薬剤と組み合わせて、医薬として、特に消化管間質腫瘍等のがんの治療剤として用いることができる。
また、ＧＰＲ２０を発現している細胞の検出に用いることができる。
更に、、本発明の抗ＧＰＲ２０抗体及び当該抗体の機能性断片は、内在化活性を有することから、抗体－薬物コンジュゲートに用いる抗体として供することができる。
上記「３．抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲート」の項及び実施例に記載の本発明の抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートのうちで薬物として細胞傷害活性等の抗腫瘍活性を有する薬物が用いられているものは、内在化活性を有する抗ＧＰＲ２０抗体及び／又は当該抗体の機能性断片と細胞傷害活性等の抗腫瘍活性を有する薬物のコンジュゲートであり、ＧＰＲ２０を発現しているがん細胞に対して抗腫瘍活性を示すことから、医薬として、特にがんに対する治療剤及び／又は予防剤として使用することができる。
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートは、大気中に放置したり、又は再結晶や精製操作をすることにより、水分を吸収し、あるいは吸着水が付着するなどして、水和物になる場合があり、そのような水を含む化合物又は薬理学的に許容され得る塩も本発明に包含される。
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートが、アミノ基などの塩基性基を有する場合、所望により薬理学的に許容され得る酸付加塩を形成することができる。そのような酸付加塩としては、例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩などのハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩などの低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩などのアリ－ルスルホン酸塩；蟻酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、りんご酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；又はオルニチン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩などのアミノ酸塩などを挙げることができる。
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートが、カルボキシ基などの酸性基を有する場合、所望により薬理学的に許容され得る塩基付加塩を形成することができる。そのような塩基付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩などの無機塩；ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－Ｎ－（２－フェニルエトキシ）アミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。
本発明はまた、抗体－薬物コンジュゲートを構成する原子の１以上が、その原子の同位体で置換された抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートを包含し得る。同位体には放射性同位体及び安定同位体の２種類が存在し、同位体の例としては、例えば、水素の同位体（２Ｈ及び３Ｈ）、炭素の同位体（１１Ｃ、１３Ｃ及び１４Ｃ）、窒素の同位体（１３Ｎ及び１５Ｎ）、酸素の同位体（１５Ｏ、１７Ｏ及び１８Ｏ）、フッ素の同位体（１８Ｆ）などを挙げることができる。同位体で標識された抗体－薬物コンジュゲートを含む組成物は、例えば、治療剤、予防剤、研究試薬、アッセイ試薬、診断剤、インビボ画像診断剤などとして有用である。同位体で標識された抗体－薬物コンジュゲート、及び、同位体で標識された抗体－薬物コンジュゲートの任意の割合の混合物もすべて本発明に包含される。同位体で標識された抗体－薬物コンジュゲートは、当該分野で公知の方法により、例えば、後述する本発明の製造方法における原料の代わりに同位体で標識された原料を用いることにより、製造することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの殺細胞活性は例えば、細胞の増殖抑制活性で測定することができる。例えば、ＧＰＲ２０を過剰発現している癌細胞株を培養し、培養系に種々の濃度で抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートを添加し、フォーカス活性、コロニー形成及びスフェロイド増殖に対する抑制活性を測定することができる。ここで、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）由来がん細胞株を用いることで、消化管間質腫瘍に対する細胞増殖抑制活性を調べることができる。
ｉｎ ｖｉｖｏでの実験動物を用いたがんに対する治療効果は、例えば、ＧＰＲ２０を高発現している腫瘍細胞株を移植したヌードマウスに抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートを投与し、がん細胞の変化を測定することができる。ここで、消化管間質腫瘍由来の細胞を免疫不全マウスに移植した動物モデルを用いることで、消化管間質腫瘍に対する治療効果を測定することができる。
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートが適用されるがんの種類としては、治療対象となるがん細胞においてＧＰＲ２０を発現しているがんであれば特に制限されないが、例えば、食道、胃、小腸、大腸等の消化器がんを挙げることができるが、ＧＰＲ２０を発現している限りこれらに制限されない。より好ましいがんの例としては、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）を挙げることができる。
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートは、哺乳動物に対して好適に投与することができるが、より好ましくはヒトである。
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートが含まれる医薬組成物において使用される物質としては、投与量や投与濃度において、この分野において通常使用される製剤添加物その他から適宜選択して適用することができる。
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートは、１種以上の薬学的に適合性の成分を含む薬学的組成物として投与され得る。例えば、上記薬学的組成物は、代表的には、１種以上の薬学的キャリア（例えば、滅菌した液体（例えば、水及び油（石油、動物、植物、又は合成起源の油（例えば、ラッカセイ油、大豆油、鉱油、ごま油など）を含む））を含む。水は、上記薬学的組成物が静脈内投与される場合に、より代表的なキャリアである。食塩水溶液、ならびにデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液もまた、液体キャリアとして、特に、注射用溶液のために使用され得る。適切な薬学的賦形剤は、当該分野で公知である。上記組成物はまた、所望であれば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、又はｐＨ緩衝化剤を含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。その処方は、投与の態様に対応する。
種々の送達システムが公知であり、本発明の抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートを投与するために使用され得る。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮下の経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、例えば、注入又はボーラス注射によるものであり得る。特定の好ましい実施形態において、上記抗体－薬物コンジュゲートの投与は、注入によるものである。非経口的投与は、好ましい投与経路である。
代表的実施形態において、上記薬学的組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した薬学的組成物として、常習的手順に従って処方される。代表的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌の等張性の水性緩衝液中の溶液である。必要である場合、上記医薬はまた、可溶化剤及び注射部位での疼痛を和らげるための局所麻酔剤（例えば、リグノカイン）を含み得る。一般に、上記成分は、（例えば、活性剤の量を示すアンプル又はサシェなどに密封してシールされた容器中の乾燥凍結乾燥粉末又は無水の濃縮物として、別個に、又は単位剤形中で一緒に混合して、のいずれかで供給される。上記医薬が注入によって投与される予定である場合、それは、例えば、滅菌の製薬グレードの水又は食塩水を含む注入ボトルで投薬され得る。上記医薬が注射によって投与される場合、注射用滅菌水又は食塩水のアンプルは、例えば、上記成分が投与前に混合され得るように、提供され得る。
本発明の医薬組成物には本願の抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートのみを含む医薬組成物であってもよいし、抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲート及び少なくとも一つのこれ以外のがん治療剤を含む医薬組成物であってもよい。本発明の抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートは、他のがん治療剤と共に投与することもでき、これによって抗がん効果を増強させることができる。このような目的で使用される他の抗がん剤は、抗体－薬物
コンジュゲートと同時に、別々に、あるいは連続して個体に投与されてもよいし、それぞれの投与間隔を変えて投与してもよい。このようながん治療剤として、Ｉｍａｔｉｎｉｂ、Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂなどを含むチロシンキナーゼ阻害剤、Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂなどを含むＣＤＫ４／６阻害剤、ＴＡＳ－１１６などを含むＨＳＰ９０阻害剤、ＭＥＫ１６２などを含むＭＥＫ阻害剤、、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブなどを含む免疫チェックポイント阻害剤等を挙げることができるが、抗腫瘍活性を有する薬剤であれば限定されることはない。
このような医薬組成物は、選択された組成と必要な純度を持つ製剤として、凍結乾燥製剤あるいは液状製剤として製剤化すればよい。凍結乾燥製剤として製剤化する際には、この分野において使用される適当な製剤添加物が含まれる製剤であってもよい。また液剤においても同様にして、この分野において使用される各種の製剤添加物を含む液状製剤として製剤化することができる。
医薬組成物の組成及び濃度は投与方法によっても変化するが、本発明の医薬組成物に含まれる抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートは、抗体－薬物コンジュゲートの抗原に対する親和性、すなわち、抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）の点において、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、少量の投与量であっても薬効を発揮させことができる。したがって、抗体－薬物コンジュゲートの投与量の決定に当たっては、抗体－薬物コンジュゲートと抗原との親和性の状況に基づいて投与量を設定することもできる。本発明の抗体－薬物コンジュゲートをヒトに対して投与する際には、例えば、約０．００１～１００ｍｇ／ｋｇを１回あるいは１～１８０日間に１回の間隔で複数回投与すればよい。好適には、０．１～５０ｍｇ／ｋｇを、さらに好適には、１乃至１５ ｍｇ／ｋｇを２～３週間に１回の間隔で複数回投与すればよい。
以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、これらはいかなる意味においても限定的に解釈されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年発刊）に記載の方法及びその他の当業者が使用する実験書に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って行った。また、本明細書において、特に記載のない試薬、溶媒及び出発材料は、市販の供給源から容易に入手可能である。
実施例１：内在化活性を有するラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体の取得
１）－１ ヒトＧＰＲ２０発現ベクターの構築
ヒトＧＰＲ２０タンパク質（ＮＰ＿００５２８４）をコードするｃＤＮＡは、当業者に公知な方法に従いヒト脳由来ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法により増幅され、哺乳動物発現用ベクターに組み込むことによってヒトＧＰＲ２０発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０が作製された。ヒトＧＰＲ２０のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０プラスミドＤＮＡの大量調製は、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行った。
１）－２ ラット免疫
免疫には６週齢のＷＫＹ／Ｉｚｍラットの雌（日本エスエルシー社）が使用された。まずラット両足下腿部をＨｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）にて前処理後、同部位にヒトＧＰＲ２０発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０が筋肉内注射された。続けて、ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ社）を使用し、２ニードル電極を用いて
、同部位にインビボエレクトロポレーションを実施した。二週間に一度、同様のインビボエレクトロポーレーションを繰り返した後、７９日目にラットのリンパ節を採取し、ハイブリドーマ作製に用いた。
１）－３ ハイブリドーマ作製
リンパ節細胞とマウスミエローマＳＰ２／０－ａｇ１４細胞とをＨｙｂｒｉｍｕｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて電気細胞融合した後、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に懸濁し、希釈して３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で培養した。出現した各々のハイブリドーマコロニーは、モノクローンとして回収され、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に懸濁して３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で培養した。適度に細胞が増殖した後、各々のハイブリドーマ細胞の凍結ストックを作製すると共に、培養上清が回収され、抗ＧＰＲ２０抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングに用いられた。
１）－４ Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ法による抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
１）－４－１ Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ用抗原遺伝子発現細胞の調製
２９３α細胞（インテグリンαｖ及びインテグリンβ３を発現するＨＥＫ２９３由来の安定発現細胞株）を１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中５ｘ１０５細胞／１０ｍＬになるよう調製した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（インビトロジェン社）を用いた形質移入手順に従って、この２９３α細胞に対して、ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０もしくは陰性コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１のＤＮＡを導入し、９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１００μＬずつ分注後、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で２４から２７時間培養した。得られた形質移入細胞を接着状態のまま、Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡに使用した。
１）－４－２ Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ
実施例１）－４－１で調製した発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０又はｐｃＤＮＡ３．１導入２９３α細胞の各々に対しハイブリドーマ培養上清を添加し、４℃で１時間静置した。ｗｅｌｌ中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳ（＋）で１回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳ（＋）で５００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ－Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ
ｉｎ ｒａｂｂｉｔ（ＳＩＧＭＡ社）を加えて、４℃で１時間静置した。ｗｅｌｌ中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳ（＋）で３回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５ Ｍ クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ リン酸水素２ナトリウム・１２水 ｐＨ４．５）にｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社）、Ｈ２Ｏ２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ ＨＣｌを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。コントロールのｐｃＤＮＡ３．１導入２９３α細胞と比較し、ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０発現ベクター導入２９３α細胞の方でより高い吸光度を示した培養上清を産生するハイブリドーマが、細胞膜表面上に発現するヒトＧＰＲ２０に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマとして選択された。
１）－５ フローサイトメトリーによるヒトＧＰＲ２０結合抗体のスクリーニング
１）－５－１ フローサイトメトリー解析用抗原遺伝子発現細胞の調製
２９３Ｔ細胞を５×１０４細胞／ｃｍ２になるよう２２５ｃｍ２フラスコ（住友ベークライト社）に播種し、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。この２９３Ｔ細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０及び陰性コン
トロールとしてｐｃＤＮＡ３．１を各々Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて導入し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。各発現ベクターを導入した２９３Ｔ細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で処理し、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
１）－５－２ フローサイトメトリー解析
実施例１）－４－２のＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡで陽性と判定されたハイブリドーマが産生する抗体のヒトＧＰＲ２０に対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例１）－５－１で調製した一過性発現２９３Ｔ細胞の懸濁液を遠心し、上清を除去した後、各々に対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＳＩＧＭＡ社）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、２μｇ／ｍＬ ７－ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を含む５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＣ５００：ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社）で行った。７－ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のＦＩＴＣ蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるｐｃＤＮＡ３．１導入２９３Ｔ細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０導入２９３Ｔ細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしている抗体を産生するハイブリドーマをヒトＧＰＲ２０に結合する抗体産生ハイブリドーマとして１７８クローン選択した。図１８にヒトＧＰＲ２０に特異的に結合した抗体の例としてクローン番号０４－００２、０４－００６、０４－０１３、０４－０１４、０４－０２０、０４－０２１、０４－０３７、０４－０４６、０４－０４７、０４－０６０、０４－０６７、０４－０６８、０４－０７９、０４－０８４、０４－１１４、０４－１１５、０４－１１７、０４－１２５、０４－１２６、０４－１２７、０４－１３３、０４－１３９、０４－１４３、０４－１４５、０４－１５１及び０４－１６３、並びにコントロール（Ｗ／Ｏ
１ｓｔＡｂ）の結果を示す。図１８の横軸はクローン番号、縦軸はＭＦＩ（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）による抗体結合量を示す。
１）－６ 内在化活性を有する抗ＧＰＲ２０抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
抗ＧＰＲ２０抗体の内在化活性は、タンパク質合成を阻害する毒素（サポリン）を結合させた抗ラットＩｇＧ試薬Ｒａｔ－ＺＡＰ（ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて評価した。すなわち、ヒトＧＰＲ２０を一過性に発現させた２９３α細胞を３ｘ１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレートに播種して３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養後、プレートを氷上で冷やした上で抗ＧＰＲ２０抗体産生ハイブリドーマの培養上清２０μＬを添加し、４℃で１時間静置した。培養上清を吸引して除去した後、５００ ｎｇ／ｍＬのＲａｔ－ＺＡＰを含むＤＭＥＭ－１０％ＦＢＳを添加し、３日間３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。生存細胞数は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ＡｓｓａｙによるＡＴＰの定量で測定した。このスクリーニングでは、ラット抗ＧＰＲ２０抗体の内在化活性に依存してＲａｔ－ＺＡＰが細胞内に取り込まれ、タンパク合成を阻害するサポリンが細胞内に放出されることで、細胞増殖が抑制される。細胞増殖抑制率６０％以上を指標に選定した結果、内在化活性を有する抗ＧＰＲ２０抗体を産生する１９種のハイブリドーマ（クローン番号は、０４－００２、０４－００６、０４－０１３、０４－０１４、０４－０２１、０４－０３７、０４－０４６、０４－０４７、０４－０６７、０４－０６８、０４－０７９、０４－１１４、０４－１１５、０４－１２５、０４－１２６、０４－１２７、０４－１３３、０４－１３９及び０４－１６３）が選定された。
１）－７ ラットモノクローナル抗体のサブクラス、タイプの決定
ラット抗ヒトＧＰＲ２０モノクローナル抗体の重鎖のサブクラス、軽鎖のタイプは、ＲＡＴ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ ＴＥＳＴ ＫＩＴ（ＤＳファーマバイオメディカル社）により決定された。その結果、クローン番号０４－０４７及び０４－０６８はＩｇＧ２ａ、κ鎖、クローン番号０４－００２、０４－００６、０４－０１３、０４－０１４、０４－０２１、０４－０３７、０４－０４６、０４－０６７、０４－０７９、０４－１１４、０４－１１５、０４－１２５、０４－１２６、０４－１２７、０４－１３３、０４－１３９及び０４－１６３はＩｇＧ２ｂ、κ鎖であることが確認された。
１）－８ ラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体の調製
ラット抗ヒトＧＰＲ２０モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から精製した。
まず、ラット抗ＧＰＲ２０モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で充分量まで増殖させた後、Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を２０％添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に培地交換し、４－５日間培養した。本培養上清を回収し、０．８μｍのフィルターに通した後、さらに０．２μｍのフィルターに通して不溶物を除去した。
抗体は、上記のハイブリドーマ上清からＰｒｏｔｅｉｎＧアフィニティークロマトグラフィー（４～６℃下）１段階工程で精製された。ＰｒｏｔｅｉｎＧアフィニティークロマトグラフィー精製後のバッファー置換工程は４～６℃下で実施した。最初に、ＰＢＳで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）が充填されたカラムにハイブリドーマの培養上清をアプライした。培養上清液がカラムに全て入った後、カラム容量の２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に０．１ Ｍグリシン／塩酸水溶液（ｐＨ２．７）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。集めた画分は、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を直ちに加えてｐＨ７．０～７．５に調製した後に、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ＵＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ３０Ｋ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，４～６℃下）を用いてＰＢＳへのバッファー置換を行うと共に、０．２ｍｇ／ｍＬ以上の抗体濃度に濃縮した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製抗体サンプルとした。
実施例２：ラット抗ＧＰＲ２０抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
２）－１ フローサイトメトリーによるラット抗ＧＰＲ２０抗体の結合能評価
ＧＰＲ２０に対する結合能を評価するため、１）－５－１で示す方法により作製したｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０導入２９３Ｔ細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、１）－８で調製した内在化活性を有するラット抗ヒトＧＰＲ２０モノクローナル抗体１９種（クローン番号は、０４－００２、０４－００６、０４－０１３、０４－０１４、０４－０２１、０４－０３７、０４－０４６、０４－０４７、０４－０６７、０４－０６８、０４－０７９、０４－１１４、０４－１１５、０４－１２５、０４－１２６、０４－１２７、０４－１３３、０４－１３９及び０４－１６３）及びラット抗ヒトＧＰＲ２０モノクローナル抗体２種（１３－０２４、１３－０４８）、又はラットＩｇＧコントロール（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで３２０倍に希釈したＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）， ＰＥ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＦＣ５００：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で検出を行った。結果を図１９に示す。図１９において横軸は抗体濃度（ｎＭ）、縦軸はＭＦＩ（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）による抗体結合量を示す。図１９に示す通り、ラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体はいずれも、ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０導入２９３Ｔ細胞に対して濃度依存的に結合量が増加した。一方、ラットＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂアイソタイプコントロール抗体は、ＧＰＲ２０結合性を示さなかった。
２）－２ ラット抗ＧＰＲ２０抗体の内在化活性
精製したラット抗ＧＰＲ２０抗体の内在化活性は、１）－６と同様にタンパク質合成を阻害する毒素（サポリン）を結合させた抗ラットＩｇＧ抗体試薬Ｒａｔ－ＺＡＰ（ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて評価した。すなわち、ヒトＧＰＲ２０のＣ末端側にＥＧＦＰをつないだＧＰＲ２０－ＥＧＦＰタンパク質を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を２．５ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養後、ラット抗ＧＰＲ２０抗体（終濃度：０．０１２から１μｇ／ｍＬ）とＲａｔ－ＺＡＰ（終濃度：０．５μｇ／ｍＬ）を添加し、５日間培養後に生存細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ
Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ＡｓｓａｙによるＡＴＰの定量で測定した。抗ＧＰＲ２０抗体添加による細胞増殖抑制作用は、抗体を加えなかった時の生存細胞数を１００％とした相対活性で表記した。各抗ＧＰＲ２０抗体は終濃度０．１１又は０．３３μｇ／ｍＬで添加した際に最も細胞増殖を抑制した。図２０に各抗体の最も細胞増殖を抑制した濃度における細胞生存率を示す。本実験において内在化活性が強い抗体は低い細胞生存率を示すと考えられる。ラットＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂアイソタイプコントロール抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を、ＧＰＲ２０とは無関係な抗原を認識する陰性コントロール抗体として使用した。
実施例３：ラット抗ＧＰＲ２０抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
実施例２で内在化活性を評価した２１種のラット抗ＧＰＲ２０抗体（０４－００２、０４－００６、０４－０１３、０４－０１４、０４－０２１、０４－０３７、０４－０４６、０４－０４７、０４－０６７、０４－０６８、０４－０７９、０４－１１４、０４－１１５、０４－１２５、０４－１２６、０４－１２７、０４－１３３、０４－１３９、０４－１６３、１３－０２４、１３－０４８）の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、以下に方法により決定した。
３）－１ ｃＤＮＡ合成
抗ＧＰＲ２０抗体産生ハイブリドーマの細胞溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ ＬｉＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、０．５％ドデシル硫酸Ｌｉ（ＬｉＤＳ）、２．５ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ））を、オリゴｄＴ２５が結合した磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴ Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と混合し、ｍＲＮＡを磁気ビーズに結合させた。次に磁気ビーズをｍＲＮＡ洗浄溶液Ａ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ ＬｉＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＬｉＤＳ、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）とｃＤＮＡ合成用溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ ２ 、５ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１．２ｕｎｉｔ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で１回ずつ洗浄した後、１２ｕｎｉｔ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を加えたｃＤＮＡ合成用溶液でｃＤＮＡ合成を行った。続いて３’テーリング反応溶液（５０ｍＭ リン酸カリウム、４ｍＭ ＭｇＣｌ ２ 、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１．２ｕｎｉｔ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））で洗浄した後、４８ｕｎｉｔ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を加えた反応溶液で３’テーリング反応を行った。
３）－２ ラット免疫グロブリン重、軽鎖可変領域遺伝子断片の増幅及び配列決定
磁気ビーズをＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）にて洗浄後、５’－ＲＡＣＥ ＰＣＲ法を用いてラット免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子の増幅を行った。即ち、磁気ビーズをＰＣＲ反応溶液（０．２μＭ プライマー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２５ｕｎｉｔ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社））に移し、９４℃３０秒－６８℃９０秒の反応を３５サイクル行った。用いたプライマーセットは下記の通り。プライマー配列中におけるＤはＡ、Ｇ、Ｔからなる混合塩基、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの混合塩基であることを示している。
ＰＣＲプライマーセット（重鎖用）
５’－ＧＣＴＡＧＣＧＣＴＡＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＤＮ－３’（Ｎｈｅ－ｐｏｌｙＣ－Ｓ）（配列番号６６）
５’－ＴＣＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡＧＣＣＣ－３’（ｒＩｇγ－ＡＳ１）（配列番号６７）
５’－ＴＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＧＴＧＴＡＧＡＧＣＣＣ－３’（ｒＩｇγ－ＡＳ２）（配列番号６８）

ＰＣＲプライマーセット（軽鎖用）
５’－ＧＣＴＡＧＣＧＣＴＡＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＤＮ－３’（Ｎｈｅ－ｐｏｌｙＣ－Ｓ）（配列番号６６）（重鎖用と同じ）
５’－ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣ－３’（ｒＩｇκ－ＡＳ）（配列番号６９）
上記ＰＣＲ反応により増幅した断片について、塩基配列のシーケンス解析を実施した。重鎖用シーケンスプライマーとして５’－ＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＴＡＧＣＣ－３’（ｒＩｇγ－ｓｅｑ）（配列番号７０）、軽鎖用シーケンスプライマーとして５’－ＴＣＣＡＧＴＴＧＣＴＡＡＣＴＧＴＴＣＣ－３’（ｒＩｇκ－ｓｅｑ）（配列番号７１）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いた。
シークエンス解析は遺伝子配列解析装置（「ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」あるいは「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」）を用いて実施し、シークエンス反応は、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びＧｅｎｅＡｍｐ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。
決定された２２種のラット抗ＧＰＲ２０抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列から予想されるアミノ酸配列を相互に比較した結果、以下の３つのグループに分類された。
グループＡ（０４－００２、０４－００６、０４－０１３、０４－０１４、０４－０３７、０４－０４６、０４－０４７、０４－０６７、０４－０６８、０４－０７９、０４－１１４、０４－１２５、０４－１２６、０４－１２７、０４－１３３、０４－１３９、０４－１６３）、グループＢ（０４－０２１、０４－１１５）、グループＣ（１３－０２４、１３－０４８）。各抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列は、公知の定常領域の配列とつなぎ合わせることにより決定された。ラットの重鎖ＩｇＧ２ｂの定常領域の塩基配列とアミノ酸配列はＩＭＧＴ， ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）に掲載されているＡＡＢＲ０３０４８９０５（ＩＧＨＧ２Ｂ＊０１）の塩基配列とアミノ酸配列を参照した。また、ラットの軽鎖ＩｇＫの定常領域の塩基配列とアミノ酸配列は同システムに掲載されているＶ０１２４１（ＩＧＫＣ＊０１）の塩基配列とアミノ酸配列を参照した。
０４－０４６抗体の重鎖は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。配列表の配列番号２に示される重鎖アミノ酸配列中で、１乃至１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１４３乃至４７５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。当該可変領域は、配列表の配列番号２において、４５乃至５４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、６９乃至７８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、１１８乃至１３１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する。０４－０４６抗体の重鎖可変領域は配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。０４－０４６抗体のＣＤＲＨ１は配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する。また、０４－０４６抗体の重鎖の配列は図１に記載されている。
０４－０４６抗体の軽鎖は、配列表の配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する。配列表の配列番号７に示される軽鎖アミノ酸配列中で、１乃至２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１２９乃至２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。当該可変領域は、配列表の配列番号７において、４３乃至５３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、６９乃至７５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、１０８乃至１１６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する。０４－０４６抗体の軽鎖可変領域は配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する。０４－０４６抗体のＣＤＲＬ１は配列表の配列番号９に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列表の配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する。また、０４－０４６抗体の軽鎖の配列は図２に記載されている。
０４－０７９抗体の重鎖は、配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する。配列表の配列番号１２に示される重鎖アミノ酸配列中で、１乃至１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１４３乃至４７５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。当該可変領域は、配列表の配列番号１２において、４５乃至５４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、６９乃至７８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、１１８乃至１３１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する。０４－０７９抗体の重鎖可変領域は配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する。０４－０７９抗体のＣＤＲＨ１は配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する。また、０４－０７９抗体の重鎖の配列は図３に記載されている。
０４－０７９抗体の軽鎖は、配列表の配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する。配列表の配列番号１７に示される軽鎖アミノ酸配列中で、１乃至２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１２９乃至２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。当該可変領域は、配列表の配列番号１７において、４３乃至５３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、６９乃至７５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、１０８乃至１１６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する。０４－０７９抗体の軽鎖可変領域は配列表の配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する。０４－０７９抗体のＣＤＲＬ１は配列表の配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列表の配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する。また０４－０７９抗体の軽鎖の配列は図４に記載されている。
０４－１２６抗体の重鎖は、配列表の配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する。配列表の配列番号２２に示される重鎖アミノ酸配列中で、１乃至１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１４３乃至４７５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。当該可変領域は、配列表の配列番号２２において、４５乃至５４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、６９乃至７８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、１１８乃至１３１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する。０４－１２６抗体の重鎖可変領域は配列表の配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する。０４－１２６抗体のＣＤＲＨ１は配列表の配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列表の配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する。また、０４－１２６抗体の重鎖の配列は図５に記載されている。
０４－１２６抗体の軽鎖は、配列表の配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する。配列表の配列番号２７に示される軽鎖アミノ酸配列中で、１乃至２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１２９乃至２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。当該可変領域は、配列表の配列番号２７において、４３乃至５３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、６９乃至７５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、１０８乃至１１６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する。０４－１２６抗体の軽鎖可変領域は配列表の配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有する。０４－１２６抗体のＣＤＲＬ１は配列表の配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列表の配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有する。また、０４－１２６抗体の軽鎖の配列は図６に記載されている。
０４－０４６抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号３２に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号３２に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０４６抗体の重鎖可変領域をコードしており、そして、４２７乃至１４２５番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０４６抗体の重鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３２において、ＣＤＲＨ１をコードするヌクレオチド番号１３３乃至１６２に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２３４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ３をコードするヌクレオチド番号３５２乃至３９３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４－０４６抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号３３にも示されている。また、配列番号３２の配列は図１に記載されている。
０４－０４６抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号３４に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号３４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０４６抗体の軽鎖可変領域をコードしており、そして、３８５乃至６９９番目のヌクレオチドからなるヌク
レオチド配列は０４－０４６抗体の軽鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４において、ＣＤＲＬ１をコードするヌクレオチド番号１２７乃至１５９に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２２５に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ３をコードするヌクレオチド番号３２２乃至３４８に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４－０４６抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号３５にも示されている。また、配列番号３４の配列は図２に記載されている。
０４－０７９抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号３６に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号３６に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０７９抗体の重鎖可変領域をコードしており、そして、４２７乃至１４２５番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０７９抗体の重鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３６において、ＣＤＲＨ１をコードするヌクレオチド番号１３３乃至１６２に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２３４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ３をコードするヌクレオチド番号３５２乃至３９３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４－０７９抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号３７にも示されている。また、配列番号３７の配列は図１０に記載されている。
０４－０７９抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号３８に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号３８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０７９抗体の軽鎖可変領域をコードしており、そして、３８５乃至６９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－０７９抗体の軽鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８において、ＣＤＲＬ１をコードするヌクレオチド番号１２７乃至１５９に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２２５に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ３をコードするヌクレオチド番号３２２乃至３４８に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４－０７９抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号３９にも示されている。また、配列番号３８の配列は図４に記載されている。
０４－１２６抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号４０に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号４０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－１２６抗体の重鎖可変領域をコードしており、そして、４２７乃至１４２５番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－１２６抗体の重鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４０において、ＣＤＲＨ１をコードするヌクレオチド番号１３３乃至１６２に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２３４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ３をコードするヌクレオチド番号３５２乃至３９３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４－１２６抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号４１にも示されている。また、配列番号４０の配列は図５に記載されている。
０４－１２６抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号４２に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号４２に示されるヌクレオチド配列の
６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－１２６抗体の軽鎖可変領域をコードしており、そして、３８５乃至６９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４－１２６抗体の軽鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４２において、ＣＤＲＬ１をコードするヌクレオチド番号１２７乃至１５９に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２２５に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ３をコードするヌクレオチド番号３２２乃至３４８に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４－１２６抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号４３にも示されている。また、配列番号４２の配列は図６に記載されている。
実施例４：抗ＧＰＲ２０モノクローナル抗体のＧＰＲ２０結合部位の解析
マウスＧＰＲ２０、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを付加したヒトＧＰＲ２０、ヒトＧＰＲ２０の４つの細胞外領域（ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４）各々をマウスＧＰＲ２０由来の配列に置換したヒト／マウスキメラＧＰＲ２０に対する結合性をＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ法で測定することにより、抗ヒトＧＰＲ２０抗体の結合部位の分類を行った。図２１はヒトＧＰＲ２０（ＮＰ＿００５２８４）、マウスＧＰＲ２０（ＮＰ＿７７５５４１）のアミノ酸配列の対照図であり、４つの細胞外領域ＥＣ１からＥＣ４はヒトＧＰＲ２０のアミノ酸配列番号で表されており、ＥＣ１は１－４８、ＥＣ２は１０８－１２５、ＥＣ３は１９０－１９６、ＥＣ４は２６０－２７５であることを示す。
４）－１ マウスＧＰＲ２０発現ベクターの構築
当業者に公知な方法に従いマウスＧＰＲ２０のＲｅｆ Ｓｅｑ配列ＮＭ＿１７３３６５を基にｃＤＮＡを人工合成してｐｃＤＮＡ－ＤＥＳＴ４０発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングすることで、マウスＧＰＲ２０発現ベクターｐｃＤＮＡ－ｍＧＰＲ２０を構築した。
４）－２ Ｎ末端にＦＬＡＧタグを付加したヒトＧＰＲ２０、ヒト／マウスキメラＧＰＲ２０の発現ベクター構築
４）－２－１
以下の発現ベクター構築においては、実施例１で作製した全長ヒトＧＰＲ２０発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０を鋳型とし、以下のプライマーセットを用いて各々ＰＣＲ反応を行った。この反応にはＫＯＤ ＦＸ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を用い、９８℃－１０秒、５８℃－３０秒、６８℃－７分、１５サイクル又は１０サイクルで反応を行った後、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩで処理した。このＤｐｎＩ消化したＤＮＡを大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に形質転換することで、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを付加したヒトＧＰＲ２０並びにＥＣ２又はＥＣ３又はＥＣ４をマウスＧＰＲ２０由来配列に置換したヒトＧＰＲ２０の発現ベクターを構築した。各ＰＣＲに用いたプライマーセットは以下の通り。

ＰＣＲプライマーセット（Ｎ末端にＦＬＡＧタグを付加したヒトＧＰＲ２０用）
５’―ＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣ―３’（ＮＦＬＡＧ－１； 配列番号７２）
５’―ＣＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＴＧＣ―３’（ＮＦＬＡＧ－２； 配列番号７３）

ＰＣＲプライマーセット（ＥＣ２をマウスＧＰＲ２０由来配列に置換したヒトＧＰＲ２０用）
５’―ＡＣＧＣＧＣＴＴＣＧＣＴＧＴＧＴＴＣＴＡＣＧＧＣＧＣＣＡＧ―３’（ｍＥＣ２－１； 配列番号７４）
５’―ＣＴＧＧＣＧＣＣＧＴＡＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＴ―３’（ｍＥＣ２－２； 配列番号７５）

ＰＣＲプライマーセット（ＥＣ３をマウスＧＰＲ２０由来配列に置換したヒトＧＰＲ２０用）
５’―ＴＧＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧＴＣＴＴ―３’（ｍＥＣ３－１；配列番号７６）
５’―ＡＡＧＡＣＡＣＧＧＣＡＧＣＡＴＧＡＴＣＧＴＣＣＡＣＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＡ―３’（ｍＥＣ３－２；配列番号７７）

ＰＣＲプライマーセット（ＥＣ４をマウスＧＰＲ２０由来配列に置換したヒトＧＰＲ２０用）
５’―ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＣＣＣＡＡＣＧＴＡＣＣＴＡＡＧＣＡＣＡＣＧＡＧＣＣＴＣＧＴＧＧＴ―３’（ｍＥＣ４－１；配列番号７８）
５’―ＡＣＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＡＧＧＴＡＣＧＴＴＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣＡ―３’（ｍＥＣ４－２；配列番号７９）
４）－２－２
ＥＣ１をマウスＧＰＲ２０由来配列に置換したヒトＧＰＲ２０発現ベクター構築は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて行った。即ち、実施例１で作製した全長ヒトＧＰＲ２０発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０を鋳型とし、以下のプライマーセットとＫＯＤ ＦＸ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を用いて、９８℃－１０秒、５８℃－３０秒、６８℃－７分、１０サイクルでＰＣＲ反応を行い、ベクター配列を含むＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマーセット（ＥＣ１をマウスＧＰＲ２０由来配列に置換したヒトＧＰＲ２０用１）
５’―ＧＣＧＣＴＧＡＴＧＧＣＧＧＴＧＣＡＣＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴ―３’（ｍＥＣ１－１；配列番号８０）
５’―ＡＧＡＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴ―３’（ｍＥＣ１－２；配列番号８１）
また、４）－１で構築した全長マウスＧＰＲ２０発現ベクターｐｃＤＮＡ－ｍＧＰＲ２０を鋳型として、以下のプライマーセットを用いて同様にＰＣＲ反応を２０サイクル行い、マウスＧＰＲ２０のＥＣ１領域をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマーセット（ＥＣ１をマウスＧＰＲ２０由来配列に置換したヒトＧＰＲ２０用２）
５’―ＡＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＴＣＴＧＣＧＴＴＧＴＣＴＡＴＧＡ―３’（ｍＥＣ１－３；配列番号８２）
５’―ＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＧＣＴＴＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＴＧＣＡ―３’（ｍＥＣ１－４；配列番号８３）
上記２種のＤＮＡ断片を定法に従いアガロースゲル電気泳動し、目的サイズのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社）を用いて単離した。これら２つのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の反応により連結し、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に形質転換することで、ＥＣ１をマウスＧＰＲ２０由来配列に置換したヒトＧＰＲ２０発現ベクターを構築した。
４）－３ Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＧＰＲ２０抗体の結合特性評価
実施例１で示したＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ法と同様の方法で、各種ＧＰＲ２０発現ベクターを一過性に導入した２９３α細胞に対する抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６、０４－０７９、０４－１２６、０４－０２１、１３－０２４、及び１３－０４８の結合活性を調べた。測定結果を図２２（ａ）及び図２２（ｂ）に示す。図２２の横軸のＥＶはコントロール、ｈｕｍａｎ ＧＰＲ２０はヒト全長ＧＰＲ２０が発現した細胞、ＦＬＡＧ－ｈｕＧＰＲ２０はＮ末端にＦＬＡＧタグを付加したヒトＧＰＲ２０が発現した細胞、ｍｏｕｓｅ ＧＰＲ２０はマウスＧＰＲ２０が発現した細胞、ｈＧＰＲ２０＿ｍＥＣＤ１はヒトＧＰＲ２０のＥＣＤ１をマウスのＧＰＲ２０のＥＣＤ１で置換したキメラＧＰＲ２０が発現した細胞、、ｈＧＰＲ２０＿ｍＥＣＤ２はヒトＧＰＲ２０のＥＣＤ２をマウスのＧＰＲ２０のＥＣＤ２で置換したキメラＧＰＲ２０が発現した細胞、ｈＧＰＲ２０＿ｍＥＣＤ３はヒトＧＰＲ２０のＥＣＤ３をマウスのＧＰＲ２０のＥＣＤ３で置換したキメラＧＰＲ２０が発現した細胞、ｈＧＰＲ２０＿ｍＥＣＤ４はヒトＧＰＲ２０のＥＣＤ４をマウスのＧＰＲ２０のＥＣＤ４で置換したキメラＧＰＲ２０が発現した細胞を示す。
実施例３で示した抗体配列の類似性に基づく３つの分類の中で、グループＡの０４－０４６、０４－０７９及び０４－１２６は、マウスＧＰＲ２０に結合せず、且つヒトＧＰＲ２０のＥＣ１（ＥＣＤ１ともいう）又はＥＣ２（ＥＣＤ２ともいう）をマウス由来のＧＰＲ２０に置換すると結合性を失っていた。このことは、０４－０４６、０４－０７９及び０４－１２６はＧＰＲ２０のＥＣ１とＥＣ２からなる高次構造を認識していることを示す。
グループＢの０４－０２１は、マウスＧＰＲ２０に対して弱い結合性を示し、ヒトＧＰＲ２０のＥＣ１をマウス由来のＧＰＲ２０に置換すると結合性がマウスＧＰＲ２０に対する結合性と同程度まで減弱していた。また、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを付加したヒトＧＰＲ２０に結合性を示さなかったことから、ＧＰＲ２０のＥＣ１のＮ末端付近を認識していることが示された。
グループＣの１３－０２４及び１３－０４８は、マウスＧＰＲ２０に結合せず、且つヒトＧＰＲ２０のＥＣ１をマウス由来のＧＰＲ２０に置換すると著しく結合性が低下したことから、ＥＣ１に結合していることが示された。
以上の実験から各抗体が認識するＧＰＲ２０の細胞外領域と図２０で示した抗体の内在化活性（細胞生存率が低い程強い内在化活性を有する）の対応関係を表１に示す。
Figure 0007064635000017
表中の認識するＧＰＲ２０細胞外領域をヒトＧＰＲ２０のアミノ酸配列の範囲で表すと、ＥＣ１は１－４８、ＥＣ２は１０８－１２５、ＥＣ３は１９０－１９６、ＥＣ４は２６０－２７５に相当する。各抗体の内在化活性（細胞生存率が低い程、内在化活性は高い）と抗ＧＰＲ２０抗体の認識領域の関係を検討した結果、高い内在化活性を有すると思われる、細胞生存率７０％未満の抗体は全てグループＡ由来の抗体であることが明らかとなった。すなわち、ヒトＧＰＲ２０のＥＣ１とＥＣ２からなる高次構造を認識するグループＡの抗体に高い内在化活性を示す抗体が集中していることが示された。ＥＣ２についてはマウスＧＰＲ２０と比較し、ヒトＧＰＲ２０の１１３番目のチロシン残基のみが異なる（マウスではフェニルアラニン）ことから、ＥＣ１とＥＣ２からなる高次構造を認識するグループＡの抗体はこのチロシン残基を認識していることが示唆された。
実施例５：ヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６Ｃｈの作製
５）－１ ヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体の発現ベクターの構築
５）－１－１キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫの構築
プラスミドｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、配列番号８４に示すヒトκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを作製した。
ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを鋳型として、下記プライマーセットでＰＣＲを行い、得られた約３．８ｋｂのフラグメントをリン酸化後セルフライゲーションすることによりＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、及びヒトκ鎖定常領域を持つ、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを構築した。
プライマーセット
５’－ＴＡＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣ－３’（３．３－Ｆ１；配列番号８５）
５’－ＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴＴＧ－３’（３．３－Ｒ１；配列番号８６）
５）－１－２ キメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１の構築
ｐＣＭＡ－ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化してκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたＤＮＡ断片と、配列番号８７に示すヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をもつキメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を構築した。
５）－１－３ ヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体の重鎖発現ベクターの構築
実施例３）－２で決定した配列番号３のラット抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６の重鎖の可変領域のアミノ酸配列を基にヒトキメラ化抗体重鎖の発現ベクターを構築した。配列番号４６に示すヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６Ｃｈの重鎖のヌクレオチド配列のうち、可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むヌクレオチド番号３６乃至４４３に相当するＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片をテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットでヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することによりヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６Ｃｈの重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／０４－０４６Ｃｈ－Ｈ」と命名した。ヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６Ｃｈの重鎖のアミノ酸配列を配列番号４４に示した。配列番号４６のヌクレオチド配列及び配列番号４４のアミノ酸配列は、図７にも記載されている。
プライマーセット
５’－ＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣ－３’（ＥＧ－Ｉｎｆ－Ｆ；配列番号８８）
５’－ＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣ－３’（ＥＧ１－Ｉｎｆ－Ｒ；配列番号８９）
５）－１－４ ヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体の軽鎖発現ベクターの構築
実施例３）－２で決定した配列番号８のラット抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を基にヒトキメラ化抗体軽鎖の発現ベクターを構築した。配列番号４７に示すヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６Ｃｈの軽鎖のヌクレオチド配列のうち、可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むヌクレオチド番号３８乃至３９９に相当するＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片をテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットでヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を
含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することによりヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６Ｃｈの軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／０４－０４６Ｃｈ－Ｌ」と命名した。ヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６Ｃｈの軽鎖のアミノ酸配列を配列番号４５に示した。配列番号４７のヌクレオチド配列及び配列番号４５のアミノ酸配列は、図８にも記載されている。
プライマーセット
５’－ＣＴＧＴＧＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣ－３’（ＣＭ－ＬＫＦ；配列番号９０）
５’－ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＡＣＧＧＣＴＣＴＣＴＴＣＡＧＴＴＣ－３’（０４６Ｌ－Ｒ；配列番号９１）
５）－２ ヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体の発現、精製
５）－２－１ ヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体の発現
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養を行った。対数増殖期の１．２×１０９個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３Ｌ Ｆｅｒｎｂａｃｈ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して２．０×１０６細胞／ｍＬに調製した後に、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーター内で９０ｒｐｍで１時間振とう培養した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ ＃２４７６５）１．８ｍｇをＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２０ｍＬに溶解し、次にＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ（ＴａＫａＲａ社）を用いて調製した重鎖発現ベクター（０．２４ｍｇ）及び軽鎖発現ベクター（０．３６ｍｇ）を２０ｍＬのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に添加した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ混合液２０ｍＬに、発現ベクター／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ混合液２０ｍＬを加え穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで４時間、９０ｒｐｍで振とう培養後に６００ｍＬのＥＸ－ＣＥＬＬ ＶＰＲＯ培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１８ｍＬのＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ社）、及び３０ｍＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）を添加し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｃａｐｓｕｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ （Ａｄｖａｎｔｅｃ ＃ＣＣＳ－０４５－Ｅ１Ｈ）でろ過した。
ｐＣＭＡ／０４－０４６Ｃｈ－ＨとｐＣＭＡ／０４－０４６Ｃｈ－Ｌとの組合せによって取得されたヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体を「０４－０４６Ｃｈ」と命名した。
５）－２－２ ０４－０４６Ｃｈの二段階工程精製
実施例５）－２－１で得られた培養上清から抗体をｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー（４－６℃下）とセラミックハイドロキシアパタイト（室温下）の二段階工程で精製した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックハイドロキシアパタイト精製後のバッファー置換は４－６℃下で実施した。ＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ＨｉＴｒａｐカラム）に培養上清をアプライした。培養上清がカラムに全て入ったのち、カラム容量２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳに置換した後、５ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭ ＭＥＳ／ｐＨ７．０のバッファーで５倍希釈した抗体溶液を、５ｍＭ ＮａＰｉ／５０ｍＭ ＭＥＳ／３０ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ７．０のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシアパタイトカラム（日本バイオラッド、Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ Ｔｙｐｅ―１ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｃｏｌｕｍｎ）にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓｈａ，Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％ ソルビトール、ｐＨ６．０）への液置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ＵＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、４℃下）にて濃縮し、ＩｇＧ濃度を２０ｍｇ／ｍＬ以上に調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。
５）－３ ヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体の結合性評価
作製したヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６ＣｈのＧＰＲ２０結合性をフローサイトメトリー法により確認した。実施例１）－５－１と同様の方法でｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０、又はｐｃＤＮＡ３．１をそれぞれ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて一過性に導入し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した後、細胞懸濁液を調製した。これらの細胞懸濁液にヒトキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６Ｃｈ又は陰性コントロールとしてヒトＩｇＧを加えて４℃で１時間静置した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄し、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで３２０倍に希釈したＰＥ標識Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ抗ヒトＩｇＧ， Ｆｃγ抗体（ＪＡＣＫＳＯＮ
ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣ社）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＣ５００：ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で行った。０４－０４６Ｃｈは陰性コントロールであるｐｃＤＮＡ３．１導入２９３Ｔ細胞には結合せず（図２３（ｂ））、ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０導入２９３Ｔ細胞に抗体濃度依存的に結合した（図２３（ａ））。図２３において横軸は抗体濃度を示し、縦軸は結合量をＭｅａｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（平均蛍光強度）で示す。
実施例６：ヒト化抗ＧＰＲ２０抗体の作製
６）－１ 抗ＧＰＲ２０抗体０４－０４６のヒト化体デザイン
６）－１－１ ０４－０４６の可変領域の分子モデリング
０４－０４６の可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１－１５３，（１９９１））によって実行した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５，Ｄ３０１－Ｄ３０３（２００７））に登録されているヒト免疫グロブリンの可変領域の１次配列（Ｘ線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である）を、実施例３）－２で決定された０４－０４６の可変領域と比較した。１ＳＹ６と１ＬＫ３が０４－０４６の重鎖と軽鎖の可変領域に対して最も高い配列同一性を有する配列として選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、０４－０４６の重鎖及び軽鎖に対応する１ＳＹ６と１ＬＫ３の座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。次いで、それぞれのＣＤＲについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。最後に、エネルギーの点で０４－０４６の可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー計算を行った。上記手順を、市販のタンパク質立体構造解析プログラムＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）を用いて行った。
６）－１－２ ヒト化ｈ０４６に対するアミノ酸配列の設計
０４－０４６をヒト化した抗体（以下、「ヒト化ｈ０４６」という。）の構築を、ＣＤ
Ｒグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９））として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸同一性に基づいて選択された。
０４－０４６のフレームワーク領域の配列を、ＫＡＢＡＴ ｅｔ ａｌ． （Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））において既定されるヒトのサブグループ・コンセンサス配列のフレームワーク領域と比較した。重鎖についてはヒトγ鎖サブグループ１のコンセンサス配列が、軽鎖についてはヒトκ鎖サブグループ１のコンセンサス配列が、そのフレームワーク領域において高い配列同一性を有することに基づいて、アクセプターとして選択された。アクセプターについてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、０４－０４６についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築された０４－０４６の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。選択された幾つかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化ｈ０４６の配列を以下の実施例に記載されるように構築した。
６）－２ ０４－０４６重鎖のヒト化
６）－２－１ ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ タイプ重鎖
配列番号４４に示されるヒトキメラ化抗体０４－０４６Ｃｈの重鎖のうち、可変領域部分（配列番号４４に示されるアミノ酸配列中の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列）配列番号４４におけるアミノ酸番号２４のグルタミンをバリンに、３０番のロイシンをバリンに、３１番のアラニンをリジンに、３５番のセリンをアラニンに、３９番のイソロイシンをバリンに、５７番のリジンをアルギニンに、４０番５９番）のスレオニンをアラニンに、６０番）のスレオニンをプロリンに、６７番のイソロイシンをメチオニンに、８６番のリジンをアルギニンに、８７番のアラニンをバリンに、８９番のロイシンをイソロイシンに、９１番のバリンをアラニンに、９９番のフェニルアラニンをスレオニンに、１０１番のグルタミンをグルタミン酸に、１０６番のスレオニンをアルギニンに、１０７番のプロリンをセリンに、１０８番のアスパラギン酸をグルタミン酸に、１２０番のセリンをスレオニンに、１２２番のイソロイシンをバリンに、１３６番のバリンをスレオニンに、１３７番のメチオニンをロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ０４６重鎖を「ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ タイプ重鎖」（「ｈ０４６－Ｈ４ｂ」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４８に記載されている。配列番号４８に示されるアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列はシグナル配列を示し、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる配列は重鎖可変領域を示し、１４３乃至４７２番目のアミノ酸残基からなる配列は重鎖定常領域を示す。配列番号４８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４９に記載されている。配列番号４９のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列はシグナル配列を示し、５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなる配列は重鎖可変領域の配列を示し、４２７乃至１４１６番目のヌクレオチドからなる配列は重鎖定常領域の配列を示す。配列番号４８のアミノ酸配列は、図９にも記載されている。
６）－２－２ ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅタイプ重鎖
配列番号４４に示されるヒトキメラ化抗体０４－０４６Ｃｈの重鎖のうち可変領域部分の配列番号４４の２０番のグルタミンをグルタミン酸に、配２４番のグルタミンをバリン
に、３０番のロイシンをバリンに、３１番のアラニンをリジンに、３５番のセリンをアラニンに、３９番のイソロイシンをバリンに、５７番のリジンをアルギニンに、５９番のスレオニンをアラニンに、６０番のスレオニンをプロリンに、６７番のイソロイシンをメチオニンに、８６番のリジンをアルギニンに、６８番８７番のアラニンをバリンに、８９番のロイシンをイソロイシンに、９１番のバリンをアラニンに、９９番のフェニルアラニンをスレオニンに、１０１番目のグルタミンをグルタミン酸に、１０６番）のスレオニンをアルギニンに、１０７番）のプロリンをセリンに、１０８番のアスパラギン酸をグルタミン酸に、１２０番のセリンをスレオニンに、１２２番のイソロイシンをバリンに、１３６番のバリンをスレオニンに、１３７番のメチオニンをロイシンに、それぞれ置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ０４６重鎖を「ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ タイプ重鎖」（「ｈ０４６－Ｈ４ｅ」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５０に記載されている。配列番号５０のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列はシグナル配列、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる配列は重鎖可変領域、１４３乃至４７２番目のアミノ酸残基からなる配列は重鎖定常領域を示す。配列番号５０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５１に記載されている。配列番号５１のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列はシグナル配列、５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなる配列は重鎖可変領域の配列、４２７乃至１４１６番目のヌクレオチドからなる配列は重鎖定常領域の配列をコードしている。配列番号５０のアミノ酸配列は、図１０にも記載されている。
６）－２－３ ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ タイプ重鎖
配列番号４４に示されるヒトキメラ化抗体０４－０４６Ｃｈの重鎖のうち、可変領域部分の配列番号４４の２４番のグルタミンをバリンに、３０番のロイシンをバリンに、３１番のアラニンをリジンに、３５番のセリンをアラニンに、３９番のイソロイシンをバリンに、５７番のリジンをアルギニンに、５９番のスレオニンをアラニンに、６０番のスレオニンをプロリンに、６７番のイソロイシンをメチオニンに、８６番のリジンをアルギニンに、８７番のアラニンをバリンに、８９番のロイシンをイソロイシンに、９１番のバリンをアラニンに、９９番のフェニルアラニンをアスパラギンに、１０１番のグルタミンをグルタミン酸に、１０６番）のスレオニンをアルギニンに、１０７番のプロリンをセリンに、１０８番のアスパラギン酸をグルタミン酸に、１２０番のセリンをスレオニンに、１２２番のイソロイシンをバリンに、１３６番）のバリンをスレオニンに、１３７番ののメチオニンをロイシンに、それぞれ置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ０４６重鎖を「ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ タイプ重鎖」（「ｈ０４６－Ｈ５ｂ」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５２に記載されている。配列番号５２のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列はシグナル配列、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる配列は重鎖可変領域、１４３乃至４７２番目のアミノ酸残基からなる配列は重鎖定常領域を示す。配列番号５２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５３に記載されている。配列番号５３のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列はシグナル配列、５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなる配列は重鎖可変領域配列、４２７乃至１４１６番目のヌクレオチドからなる配列は重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号５２のアミノ酸配列は、図１１にも記載されている。
６）－２－４ ヒト化ｈ０４６－Ｈ８ タイプ重鎖
配列番号４４に示されるヒトキメラ化抗体０４－０４６Ｃｈの重鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号８０目のフェニルアラニンをアスパラギンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ０４６重鎖を「ヒト化ｈ０４６－Ｈ８ タイプ重鎖」（「ｈ０４６－Ｈ８
」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ０４６－Ｈ８ タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５４に記載されている。配列番号５４のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる配列、１４３乃至４７２番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号５４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５５に記載されている。配列番号５５のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなる配列、４２７乃至１４１６番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号５４のアミノ酸配列は、図１２にも記載されている。
６）－２－５ ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０ タイプ重鎖
配列番号４４に示されるヒトキメラ化抗体０４－０４６Ｃｈの重鎖のうち可変領域部分の配列番号４４の３９番のイソロイシンをバリンに、９９番のフェニルアラニンをアスパラギンに、それぞれ置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ０４６重鎖を「ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０ タイプ重鎖」（「ｈ０４６－Ｈ１０」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０ タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５６に記載されている。配列番号５６のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列はシグナル配列、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる配列は重鎖可変領域、１４３乃至４７２番目のアミノ酸残基からなる配列重鎖定常領域を示す。配列番号５６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５７に記載されている。配列番号５７のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列はシグナル配列、５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなる配列は重鎖可変領域配列、４２７乃至１４１６番目のヌクレオチドからなる配列は重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号５６のアミノ酸配列は、図１３にも記載されている。
６）－３ ０４－０４６軽鎖のヒト化
６）－３－１ ヒト化ｈ０４６－Ｌ１タイプ軽鎖
配列番号４５に示されるヒトキメラ化抗体０４－０４６Ｃｈの軽鎖のうち可変領域部分の配列番号４５の２２番のスレオニンをイソロイシンに、２３番のバリンをグルタミンに、２４番のロイシンをメチオニンに、２９番のアラニンをセリンに、３１番のアラニンをセリンに、３２番のバリンをアラニンに、３４番のロイシンをバリンに、３６番のグルタミンをアスパラギン酸に、４１番のセリンをスレオニンに、５８番のアルギニンをリジンに、５９番のセリンをプロリンに、６１番のグルタミンをリジンに、６２番のグルタミンをアラニンに、９５番のアスパラギン酸をセリンに、９６番のプロリンをセリンに、９７番のバリンをロイシンに、９８番のグルタミン酸をグルタミンに、１００番）のアスパラギン酸をグルタミン酸に、１０２番のイソロイシンをフェニルアラニンに、１０４番のアスパラギンをスレオニンに、１１９番のアラニンをグルタミンに、１２３番のロイシンをバリンに、１２５番のロイシンをイソロイシンに、１２８番のアラニンをスレオニンに置き換え、２９番と３０番の間にセリンを挿入することを伴い設計されたヒト化ｈ０４６軽鎖を「ヒト化ｈ０４６－Ｌ１タイプ軽鎖」（「ｈ０４６－Ｌ１）」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ０４６－Ｌ１タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５８に記載されている。配列番号５８のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列はシグナル配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列は軽鎖可変領域、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列は軽鎖定常領域を示す。配列番号５８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５９に記載されている。配列番号５８のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列はシグナル配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列は軽鎖可変領域配列、３８８乃至７
０２番目のヌクレオチドからなる配列は軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号５８のアミノ酸配列は、図１４にも記載されている。
６）－３－２ ヒト化ｈ０４６－Ｌ２タイプ軽鎖
配列番号４５に示されるヒトキメラ化抗体０４－０４６Ｃｈの軽鎖のうち可変領域部分の配列番号４５の２２番のスレオニンをイソロイシンに、２３番のバリンをグルタミンに、２４番のロイシンをメチオニンに、２９番のアラニンをセリンに、２１番のアラニンをセリンに、３２番）のバリンをアラニンに、３４番目のロイシンをバリンに、３６番のグルタミンをアスパラギン酸に、４１番のセリンをスレオニンに、５８番のアルギニンをリジンに、５９番のセリンをプロリンに、６１番のグルタミンをリジンに、９５番のアスパラギン酸をセリンに、９６番のプロリンをセリンに、９７番のバリンをロイシンに、９８番のグルタミン酸をグルタミンに、１００番のアスパラギン酸をグルタミン酸に、１０２番のイソロイシンをフェニルアラニンに、１０４番のアスパラギンをスレオニンに、１１９番のアラニンをグルタミンに、１２３番のロイシンをバリンに、１２５番のロイシンをイソロイシンに、１２８番のアラニンをスレオニンに置き換え、２９番目と３０番目の間にセリンを挿入することを伴い設計されたヒト化ｈ０４６軽鎖を「ヒト化ｈ０４６－Ｌ２タイプ軽鎖」（「ｈ０４６－Ｌ２）」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ０４６－Ｌ２タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６０に記載されている。配列番号６０のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列はシグナル配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列は軽鎖可変領域、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列は軽鎖定常領域に相当する。配列番号６０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号６１記載されている。配列番号６１のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列はシグナル配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列は軽鎖可変領域配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列は軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号６０のアミノ酸配列は、図１５にも記載されている。
６）－３－３ ヒト化ｈ０４６－Ｌ６タイプ軽鎖
配列番号４５に示されるヒトキメラ化抗体０４－０４６Ｃｈの軽鎖のうち可変領域部分の配列番号４５の２３番のバリンをグルタミンに、２９番のアラニンをセリンに、３１番のアラニンをセリンに、３２番のバリンをアラニンに、３４番のロイシンをバリンに、３６番のグルタミンをアスパラギン酸に、４１番のセリンをスレオニンに、５８番のアルギニンをリジンに、５９番のセリンをプロリンに、６１番のグルタミンをリジンに、７２番のアスパラギンをアスパラギン酸に、７３番のロイシンをアルギニンに、９５番のアスパラギン酸をセリンに、９６番のプロリンをセリンに、９７番のバリンをロイシンに、９８番のグルタミン酸をグルタミンに、１００番のアスパラギン酸をグルタミン酸に、１０２番のイソロイシンをフェニルアラニンに、１１９番のアラニンをグルタミンに、１２３番のロイシンをバリンに、１２５番のロイシンをイソロイシンに、１２８番のアラニンをスレオニンに置き換え、２９番目と３０番目の間にセリンを挿入することを伴い設計されたヒト化ｈ０４６軽鎖を「ヒト化ｈ０４６－Ｌ６タイプ軽鎖」（「ｈ０４６－Ｌ６）」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ０４６－Ｌ６タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６２に記載されている。配列番号６２のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列はシグナル配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列は軽鎖可変領域、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列は軽鎖定常領域を示す。配列番号６２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号６３に記載されている。配列番号６３のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列はシグナル配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列は軽鎖可変領域配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列は軽鎖定常領域配列をコードしている。ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（ＳＡＳＤＲＥＳ）は、配列表の配列番号９２に記載されている。
配列番号６２のアミノ酸配列は、図１６にも記載されている。
６）－３－４ ヒト化ｈ０４６－Ｌ７タイプ軽鎖
配列番号４５に示されるヒトキメラ化抗体０４－０４６Ｃｈの軽鎖のうち可変領域部分の２３番のバリンをグルタミンに、２９番のアラニンをセリンに、３１番のアラニンをセリンに、３２番のバリンをアラニンに、３４番のロイシンをバリンに、３６番のグルタミンをアスパラギン酸に、４１番のセリンをスレオニンに、５８番のアルギニンをリジンに、５９番のセリンをプロリンに、６１番のグルタミンをリジンに、７１番のセリンをグリシンに、９５番のアスパラギン酸をセリンに、９６番のプロリンをセリンに、９７番のバリンをロイシンに、９８番のグルタミン酸をグルタミンに、１００番のアスパラギン酸をグルタミン酸に、１０２番のイソロイシンをフェニルアラニンに、１１９番のアラニンをグルタミンに、１２３番のロイシンをバリンに、１２５番のロイシンをイソロイシンに、１２８番のアラニンをスレオニンに置き換え、２９番目と３０番目の間にセリンを挿入することを伴い設計されたヒト化ｈ０４６軽鎖を「ヒト化ｈ０４６－Ｌ７タイプ軽鎖」（「ｈ０４６－Ｌ７）」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ０４６－Ｌ７タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６４に記載されている。配列番号６４のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列はシグナル配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列は軽鎖可変領域、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列軽鎖定常領域を示す。配列番号６４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号６５に記載されている。配列番号６５のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列はシグナル配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列は軽鎖可変領域配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列は軽鎖定常領域配列をコードしている。ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（ＳＡＧＮＬＥＳ）は、配列表の配列番号９３に記載されている。
配列番号６４のアミノ酸配列は、図１７にも記載されている。
６）－４ 重鎖及び軽鎖の組み合わせによるヒト化ｈ０４６の設計
ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ１」（「ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ２」（「ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ６タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ６」（「ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ６」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ７タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７」（「ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ１」（「ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ２」（「ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ６タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ６」（「ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ６」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ７タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７」（「ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ１」（「ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２」（「ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ６タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ６」（「ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ６」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ７タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ７」（「ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ７」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ８ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１」（「ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ８ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ２」（「ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ８ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ６タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ６」（「ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ６」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ８ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ７タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ７」（「ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ７」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１」（「ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ２」（「ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ６タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６」（「ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０ タイプ重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ７タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ７」（「ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ７」と呼ぶこともある）と命名した。ヒトキメラｃ０４６重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒトキメラｃ０４６／Ｌ１」（「ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒトキメラｃ０４６重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒトキメラｃ０４６／Ｌ２」（「ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒトキメラｃ０４６重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ６タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒトキメラｃ０４６／Ｌ６」（「ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６」と呼ぶこともある）と命名した。ヒトキメラｃ０４６重鎖及びヒト化ｈ０４６－Ｌ７タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒトキメラｃ０４６／Ｌ７」（「ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ７」と呼ぶこともある）と命名した。以上により設計した抗体は、実施例６）－５及び実施例６）－７に準じて作製し、実施例６）－６及び実施例８）、実施例９）に準じて評価することができる。
６）－５ ヒト化抗ＧＰＲ２０抗体の発現（１）
６）－５－１ ヒト化ｈ０４６の重鎖発現ベクターの構築
６）－５－１－１ ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂタイプ重鎖発現ベクターの構築
配列番号９４に示すＤＮＡ断片Ａを合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片を実施例５）－１－３と同様の方法でキメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に挿入しプラスミドＡを構築した。プラスミドＡをテンプレートとし、下記プライマーセットとＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂタイプ重鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｈ４ｂ」と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂタイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列番号４９に示し、アミノ酸配列を配列番号４８に示した。
プライマーセット：
５’－ＡＴＣＡＡＣＣＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣ－３’（Ｈｂ－Ｆ；配列番号９５）
５’－ＧＡＡＧＣＣＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＧ－３’（Ｈ
ｂ－Ｒ；配列番号９６）
６）－５－１－２ ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂタイプ重鎖発現ベクターの構築
配列番号９７に示すＤＮＡ断片Ｂを合成し（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）、合成したＤＮＡ断片を実施例５）－１－３と同様の方法でキメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に挿入しプラスミドＢを構築した。プラスミドＢをテンプレートとし、６）－５－１－１と同様の方法で変異を導入することによりヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂタイプ重鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｈ５ｂ」と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂタイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列番号５３に示し、アミノ酸配列を配列番号５２に示した。
６）－５－１－３ ヒト化ｈ０４６－Ｈ８タイプ重鎖発現ベクターの構築
実施例５）－１－３で構築したｐＣＭＡ／０４－０４６Ｃｈ－Ｈをテンプレートとして、下記プライマーセットとＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりヒト化ｈ０４６－Ｈ８タイプ重鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｈ８」と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ８タイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列番号５５に示し、アミノ酸配列を配列番号５４に示した。
プライマーセット：
５’－ＡＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＣＧＡＣ－３’（Ｈ０８－Ｆ；配列番号９８）
５’－ＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＧＧＴＣＡＧ－３’（Ｈ０８－Ｒ；配列番号９９）
６）－５－１－４ ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０タイプ重鎖発現ベクターの構築
実施例６）－５－１－３で構築したｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｈ８をテンプレートとして、下記プライマーセットとＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりヒト化ｈ０４６－Ｈ１０タイプ重鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｈ１０」と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０タイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列番号５７に示し、アミノ酸配列を配列番号５６に示した。
５’－ＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣ－３’（Ｈ１０－Ｆ；配列番号１００）
５’－ＣＴＴＣＡＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＴＴＣ－３’（Ｈ１０－Ｒ；配列番号１０１）
６）－５－２ ヒト化ｈ０４６の軽鎖発現ベクターの構築
６）－５－２－１ ヒト化ｈ０４６－Ｌ１タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列番号５９に示すヒト化ｈ０４６－Ｌ１のヌクレオチド配列のうち、可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むヌクレオチド番号３７乃至４０２に相当するＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片をテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットでヒト化ｈ０４６－Ｌ１の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を増幅し、実施例５）－１－１で構築したキメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することによりヒト化ｈ０４６－Ｌ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｌ１」と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｌ１のアミノ酸配列を配列番号５８に示した。
プライマーセット
５’－ＣＴＧＴＧＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣ－３’（ＣＭ－ＬＫＦ；配列番号９０）
５’－ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＡＣＣＧＴＡＣＧ－３’（ＫＣＬ－Ｉｎｆ－Ｒ；配列番号１０２）
６）－５－２－２ ヒト化ｈ０４６－Ｌ２タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列番号６１に示すヒト化ｈ０４６－Ｌ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるヒト化ｈ０４６－Ｌ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。実施例６）－５－２－１と同様の方法でヒト化ｈ０４６－Ｌ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｌ２」と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｌ２のアミノ酸配列を配列番号６０に示した。
６）－５－２－３ ヒト化ｈ０４６－Ｌ６タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列番号６３に示すヒト化ｈ０４６－Ｌ６のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるヒト化ｈ０４６－Ｌ６の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。実施例６）－５－２－１と同様の方法でヒト化ｈ０４６－Ｌ６発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｌ６」と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｌ６のアミノ酸配列を配列番号６２に示した。
６）－５－２－４ ヒト化ｈ０４６－Ｌ７タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列番号６５に示すヒト化ｈ０４６－Ｌ７のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるヒト化ｈ０４６－Ｌ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。実施例６）－５－２－１と同様の方法でヒト化ｈ０４６－Ｌ７発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｌ７」と命名した。ヒト化ｈ０４６－Ｌ７のアミノ酸配列を配列番号６４に示した。
６）－５－３ ヒト化ｈ０４６抗体の小スケール生産
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養を行った。対数増殖期の１×１０７個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で９．６ｍＬに希釈した後に、３０ｍＬ Ｓｑｕａｒｅ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｂｏｔｔｌｅ（Ｎａｌｇｅｎｅ社）に播種し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーター内で９０ｒｐｍで１時間振とう培養した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ ＃２４７６５）３０μｇをＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２００μＬに溶解し、次にＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ（ＴａＫａＲａ社）を用いて調製した軽鎖発現ベクター（６μｇ）及び重鎖発現ベクター（４μｇ）を２００μＬのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に添加した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ混合液２００μＬに、発現ベクター／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ混合液２００μＬを加え穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）ろ過し、評価用のサンプルとした。
ｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｈ４ｂとｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｌ７との組合せによって、ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｈ５ｂとｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｌ２との組合せによって、ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２を取得した。ｐＣＭＡ／０４
－０４６Ｃｈ－ＨとｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｌ６との組合せによって、ヒト化ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｈ８とｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｌ１との組合せによって、ヒト化ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１を取得したｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｈ１０とｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｌ１との組合せによって、ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｈ１０とｐＣＭＡ／ｈ０４６－Ｌ６との組み合わせによって、ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６を取得した。
６）－６ ヒト化抗ＧＰＲ２０抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
６）－６－１ ヒト化抗ＧＰＲ２０抗体の結合性評価
実施例６）－５－３で作製したヒト化抗ＧＰＲ２０抗体のＧＰＲ２０結合性をフローサイトメトリー法により評価した。実施例１）－５－１と同様の方法でｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０を２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて一過性に導入し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した後、細胞懸濁液を調製した。これらの細胞懸濁液にヒト化抗ＧＰＲ２０抗体を加えて４℃で１時間静置した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄し、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで３２０倍に希釈したＰＥ標識Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ抗ヒトＩｇＧ， Ｆｃγ抗体（ＪＡＣＫＳＯＮ ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣ社）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔ ＩＩ：ＢＤ バイオサイエンス社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社）で行った。その結果、作製したヒト化抗ＧＰＲ２０抗体はｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０導入２９３Ｔ細胞に結合することを確認した。図２４にヒトＧＰＲ２０に特異的に結合したヒト化抗ＧＰＲ２０抗体の結果を示す。図２４のヒストグラムにおいて、横軸は抗体結合量を表すＰＥの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。網掛けは、抗ＧＰＲ２０抗体を反応させていない陰性コントロールであり、白抜きは、各抗ＧＰＲ２０抗体を反応させた際に、細胞表面のＧＰＲ２０に抗体が結合したことによって蛍光強度が増強したことを示す。
６）－６－２ ヒト化抗ＧＰＲ２０抗体の内在化活性評価
実施例６）－５－３で作製したヒト化抗ＧＰＲ２０抗体の内在化活性は、１）－６と同様の方法でタンパク質合成を阻害する毒素（サポリン）を結合させた抗ヒトＩｇＧ抗体試薬Ｈｕｍ－ＺＡＰ（ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて評価した。すなわち、ヒトＧＰＲ２０のＣ末端側にＥＧＦＰをつないだＧＰＲ２０－ＥＧＦＰタンパク質を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を２．５ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養後、ヒト化抗ＧＰＲ２０抗体（終濃度：０．０１５から１．２７μｇ／ｍＬ）とＨｕｍ－ＺＡＰ（終濃度：１μｇ／ｍＬ）を添加し、４日間培養後に生存細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏTM Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ＡｓｓａｙによるＡＴＰの定量で測定した。その結果、実施例６）－５－３で作製したヒト化抗ＧＰＲ２０抗体である、ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７、ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２、ヒト化ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６、ヒト化ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１、ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１及びヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６において、抗体内在化による細胞増殖抑制作用を示した。
６）－７ ヒト化抗ＧＰＲ２０抗体の大量調製（２）
６）－７－１ ヒト化ｈ０４６の重鎖発現ベクターの構築
６）－７－１－１ ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂタイプ重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号１０３に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｈ４ｂタイプ重鎖のヌクレオチド配列（２）のヌクレオチド番号５８乃至１４１６に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｈ４ｂタイプ重鎖をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片を用い、Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じてヒト化ｈ０４６＿Ｈ４ｂ
タイプ重鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｈ４ｂ」と命名した。
６）－７－１－２ ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂタイプ重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号１０４に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｈ５ｂタイプ重鎖のヌクレオチド配列（２）のヌクレオチド番号５８乃至１４１６に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｈ５ｂタイプ重鎖をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片を用い、Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じてヒト化ｈ０４６＿Ｈ５ｂタイプ重鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｈ５ｂ」と命名した。
６）－７－１－３ ヒト化ｈ０４６－Ｈｗｔタイプ重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号１０５に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｈｗｔタイプ重鎖のヌクレオチド配列（２）のヌクレオチド番号５８乃至１４１６に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｈｗｔタイプ重鎖をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片を用い、Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じてヒト化ｈ０４６＿Ｈｗｔタイプ重鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｈｗｔ」と命名した。
６）－７－１－４ ヒト化ｈ０４６－Ｈ８タイプ重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号１０６に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｈ８タイプ重鎖のヌクレオチド配列（２）のヌクレオチド番号５８乃至１４１６に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｈ８タイプ重鎖をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片を用い、Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じてヒト化ｈ０４６＿Ｈ８タイプ重鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｈ８」と命名した。
６）－７－１－５ ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０タイプ重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号１０７に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｈ１０タイプ重鎖のヌクレオチド配列（２）のヌクレオチド番号５８乃至１４１６に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｈ１０タイプ重鎖をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片を用い、Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じてヒト化ｈ０４６＿Ｈ１０タイプ重鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｈ１０」と命名した。
６）－７－１－６ ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅタイプ重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号５１に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｈ４ｅタイプ重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号５８乃至１４１６に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｈ４ｅタイプ重鎖をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片を用い、Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じてヒト化ｈ０４６＿Ｈ４ｅタイプ重鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｈ４ｅ」と命名した。
６）－７－２ ヒト化ｈ０４６の軽鎖発現ベクターの構築
６）－７－２－１ ヒト化ｈ０４６－Ｌ１タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号１０８に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｌ１タイプ軽鎖のヌクレオチド配列（２）のヌクレオチド番号６１乃至７０２に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｌ１タイプ軽鎖をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片をＬｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、ヒト化ｈ０４６＿Ｌ１タイプ軽鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｌ１」と命名した。
６）－７－２－２ ヒト化ｈ０４６－Ｌ２タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号１０９に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｌ２タイプ軽鎖のヌクレオチド配列（２）のヌクレオチド番号６１乃至７０２に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｌ２タイプ軽鎖をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片をＬｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、ヒト化ｈ０４６＿Ｌ２タイプ軽鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｌ２」と命名した。
６）－７－２－３ ヒト化ｈ０４６－Ｌ６タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号１１０に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｌ６タイプ軽鎖のヌクレオチド配列（２）のヌクレオチド番号６１乃至７０２に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｌ６タイプ軽鎖をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片をＬｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、ヒト化ｈ０４６＿Ｌ６タイプ軽鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｌ６」と命名した。
６）－７－２－４ ヒト化ｈ０４６－Ｌ７タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号１１１に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｌ７タイプ軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号６１乃至７０２に示されるヒト化ｈ０４６＿Ｌ７タイプ軽鎖をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片をＬｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、ヒト化ｈ０４６＿Ｌ７タイプ軽鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｌ７」と命名した。
６）－７－３ ヒト化抗ＧＰＲ２０抗体発現ベクターの構築
６）－７－３－１ ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７発現ベクターの構築
構築した発現ベクター「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｈ４ｂ」及び「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｌ７」から、Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ＤＧＶ－ｈ０４６＿Ｈ４ｂＬ７－ＧＳ」と命名した。
６）－７－３－２ ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２発現ベクターの構築
構築した発現ベクター「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｈ５ｂ」及び「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｌ２」から、Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ＤＧＶ－ｈ０４６＿Ｈ５ｂＬ２－ＧＳ」と命名した。
６）－７－３－３ ヒト化ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６発現ベクターの構築
構築した発現ベクター「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｈｗｔ」及び「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｌ６」から、Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標
）のプロトコールに準じて、ヒト化ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ＤＧＶ－ｈ０４６＿ＨｗｔＬ６－ＧＳ」と命名した。
６）－７－３－４ ヒト化ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１発現ベクターの構築
構築した発現ベクター「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｈ８」及び「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｌ１」から、Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、ヒト化ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ＤＧＶ－ｈ０４６＿Ｈ８Ｌ１－ＧＳ」と命名した。
６）－７－３－５ ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１発現ベクターの構築
構築した発現ベクター「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｈ１０」及び「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｌ１」から、Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ＤＧＶ－ｈ０４６＿Ｈ１０Ｌ１－ＧＳ」と命名した。
６）－７－３－６ ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６発現ベクターの構築
構築した発現ベクター「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｈ１０」及び「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｌ６」から、Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ＤＧＶ－ｈ０４６＿Ｈ１０Ｌ６－ＧＳ」と命名した。
６）－７－３－７ ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７発現ベクターの構築
構築した発現ベクター「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｈ４ｅ」及び「ＧＳＶ－ｈ０４６＿Ｌ７」から、Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ＤＧＶ－ｈ０４６＿Ｈ４ｅＬ７－ＧＳ」と命名した。
６）－７－４ ヒト化抗ＧＰＲ２０抗体生産細胞の作製
６）－７－４－１ ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７生産細胞の作製
Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、実施例６）－７－３－１で構築したヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７発現ベクター、ＤＧＶ－ｈ０４６＿Ｈ４ｂＬ７－ＧＳをＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）にトランスフェクションし、ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７生産株を構築した。得られた生産株を「ＧＰＲ１－１２」と命名した。
６）－７－４－２ ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２生産細胞の作製
Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、実施例６）－７－３－２で構築したヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２発現ベクター、ＤＧＶ－ｈ０４６＿Ｈ５ｂＬ２－ＧＳをＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）にトランスフェクションし、ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２生産株を構築した。得られた生産株を「ＧＰＲ２－１５」と命名した。
６）－７－４－３ ヒト化ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６生産細胞の作製
Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、実施例６）－７－３－３で構築したヒト化ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６発現ベクター、ＤＧＶ－ｈ０４６＿ＨｗｔＬ６－ＧＳをＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）にトランスフェクションし、ヒト化ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６生産株を構築した。得られた生産株を「ＧＰＲ３－２」と命名した。
６）－７－４－４ ヒト化ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１生産細胞の作製
Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、実施例６）－７－３－４で構築したヒト化ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１発現ベクター、ＤＧＶ－ｈ０４６＿Ｈ８Ｌ１－ＧＳをＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）にトランスフェクションし、ヒト化ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１生産株を構築した。得られた生産株を「ＧＰＲ４－１」と命名した。
６）－７－４－５ ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１生産細胞の作製
Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、実施例６）－７－３－５で構築したヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１発現ベクター、ＤＧＶ－ｈ０４６＿Ｈ１０Ｌ１－ＧＳをＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）にトランスフェクションし、ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１生産株を構築した。得られた生産株を「ＧＰＲ５－１０」と命名した。
６）－７－４－６ ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６生産細胞の作製
Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、実施例６）－７－３－６で構築したヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６発現ベクター、ＤＧＶ－ｈ０４６＿Ｈ１０Ｌ６－ＧＳをＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）にトランスフェクションし、ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６生産株を構築した。得られた生産株を「ＧＰＲ６－７」と命名した。
６）－７－４－７ ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７生産細胞の作製
Ｌｏｎｚａ社のＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のプロトコールに準じて、実施例６）－７－３－７で構築したヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７発現ベクター、ＤＧＶ－ｈ０４６＿Ｈ４ｅＬ７－ＧＳをＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）にトランスフェクションし、ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７生産株を構築した。得られた生産株を「ＧＰＥ－２３」と命名した。
６）－７－５ ヒト化抗ＧＰＲ２０抗体生産細胞の培養
６）－７－５－１ ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７生産細胞の培養
実施例６）－７－４－１で作製したヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７生産株「ＧＰＲ１－１２」の培養は、培養装置Ｗａｖｅ ｒｅａｃｔｏｒ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いて実施した。生産株「ＧＰＲ１－１２」をＣ３６（ＪＸエネルギー社）培地を用いて解凍し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内にて１２０ｒｐｍで培養した。得られた培養液をＣ３６培地で希釈し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内にて１２０ｒｐｍで拡大培養した。得られた培養液を細胞密度３０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＣ３６培地で希釈してＷＡＶＥ ＣＥＬＬＢＡＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に仕込み、３７℃、５％ ＣＯ２、エアー供給量０．３Ｌ／分、揺動１８－２４ｒｐｍ、角度６－８°で１０日間培養した。培養開始３日目よりＦＭ４Ａｅ２培地（自家調製）を１日あたり、仕込み量の６％分を毎日添加した。得られた培養液をデプスフィルターＭｉｌｌｉｓｔａｋ ＭＣ０ＨＣ０５４Ｈ１（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で粗ろ過後、Ｆｌｅｘｂｏｙ Ｂａｇｓに付属の０．２２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過した。このろ過液を「ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７ 培養上清」と命名した。
６）－７－５－２ ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２生産細胞の培養
実施例６）－７－５－１と同様に、実施例６）－７－４－２で作製したヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２生産株「ＧＰＲ２－１５」を培養、拡大し、培養装置Ｗａｖｅ ｒｅａｃｔｏｒ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いてフェッドバッチ培養を実施した。細胞密度３０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＣ３６培地で希釈してＷＡＶＥ ＣＥＬＬＢＡＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に仕込み、１１日間培
養した。得られた培養液をろ過し、このろ過液を「ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２ 培養上清」と命名した。
６）－７－５－３ ヒト化ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６生産細胞の培養
実施例６）－７－５－１と同様に、実施例６）－７－４－３で作製したヒト化ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６生産株「ＧＰＲ３－２」を培養、拡大し、培養装置Ｗａｖｅ ｒｅａｃｔｏｒ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いてフェッドバッチ培養を実施した。細胞密度３０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＣ３６培地で希釈してＷＡＶＥ ＣＥＬＬＢＡＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に仕込み、１４日間培養した。得られた培養液をろ過し、このろ過液を「ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６ 培養上清」と命名した。
６）－７－５－４ ヒト化ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１生産細胞の培養
実施例６）－７－５－１と同様に、実施例６）－７－４－４で作製したヒト化ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１生産株「ＧＰＲ４－１」を培養、拡大し、培養装置Ｗａｖｅ ｒｅａｃｔｏｒ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いてフェッドバッチ培養を実施した。細胞密度３０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＣ３６培地で希釈してＷＡＶＥ ＣＥＬＬＢＡＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に仕込み、１１日間培養した。得られた培養液をろ過し、このろ過液を「ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１ 培養上清」と命名した。
６）－７－５－５ ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１生産細胞の培養
実施例６）－７－５－１と同様に、実施例６）－７－４－５で作製したヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１生産株「ＧＰＲ５－１０」を培養、拡大し、培養装置Ｗａｖｅ ｒｅａｃｔｏｒ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いてフェッドバッチ培養を実施した。細胞密度３０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＣ３６培地で希釈してＷＡＶＥ ＣＥＬＬＢＡＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に仕込み、１０日間培養した。得られた培養液をろ過し、このろ過液を「ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１ 培養上清」と命名した。
６）－７－５－６ ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６生産細胞の培養
実施例６）－７－５－１と同様に、実施例６）－７－４－６で作製したヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６生産株「ＧＰＲ６－７」を培養、拡大し、培養装置Ｗａｖｅ ｒｅａｃｔｏｒ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いてフェッドバッチ培養を実施した。細胞密度３０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＣ３６培地で希釈してＷＡＶＥ ＣＥＬＬＢＡＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に仕込み、１２日間培養した。得られた培養液をろ過し、このろ過液を「ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６ 培養上清」と命名した。
６）－７－５－７ ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７生産細胞の培養
実施例６）－７－５－１と同様に、実施例６）－７－４－７で作製したヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７生産株「ＧＰＥ－２３」を培養、拡大し、培養装置Ｗａｖｅ ｒｅａｃｔｏｒ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いてフェッドバッチ培養を実施した。細胞密度３０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＣ３６培地で希釈してＷＡＶＥ ＣＥＬＬＢＡＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に仕込み、１１日間培養した。得られた培養液をろ過し、このろ過液を「ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７ 培養上清」と命名した。
６）－７－６ ヒト化抗ＧＰＲ２０抗体の精製
６）－７－６－１ ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７の精製
実施例６）－７－５－１で得られた「ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７ 培養上清」を、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーの三段階工程で精製した。最初に、培養上清を、ＰＢＳで平衡化したｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマト樹脂にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳ、アルギニンを含む緩衝液、ＰＢＳでカラムを洗浄した。次に、酢酸緩衝液で溶出し、２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液をＴｒｉｓ緩衝液で中和し、グラスファイバーフィルター ＡＰ２０（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で粗ろ過後、０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをｒＰｒｏｔｅｉｎＡ精製プールとした。
次に、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ精製プールを、ＰＢＳで平衡化した陰イオン交換クロマト樹脂にアプライした。アプライ液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳを通液した。素通り画分及びＰＢＳ通液時における２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液を酢酸でｐＨ調整し、０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをＡＥＸ精製プールとした。
次に、ＡＥＸ精製プールを、酢酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマト樹脂にアプライした。アプライ液がカラムに全て入ったのち、酢酸緩衝液でカラムを洗浄した。次に高濃度のＮａＣｌを含む酢酸緩衝液を用いて溶出し、２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液を０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをＣＥＸ精製プールとした。
ＣＥＸ精製プールを、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ３ Ｃａｓｓｅｔｔｅ ３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて抗体濃度２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した後、ヒスチジンバッファー（２５ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、ｐＨ６．０）に置換した。最後に０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものを精製サンプルとした。精製サンプルを「ｈ０４６＿Ｈ４ｂ／Ｌ７」と命名した。
６）－７－６－２ ヒト化ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２の精製
実施例６）－７－５－２で得られた「ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２ 培養上清」を、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーの三段階工程で精製した。最初に、培養上清を、ＰＢＳで平衡化したｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマト樹脂にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳ、アルギニンを含む緩衝液、ＰＢＳでカラムを洗浄した。次に、酢酸緩衝液で溶出し、２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液をＴｒｉｓ緩衝液で中和し、グラスファイバーフィルター ＡＰ２０（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で粗ろ過後、０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをｒＰｒｏｔｅｉｎＡ精製プールとした。
次に、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ精製プールを、ＰＢＳで平衡化した陰イオン交換クロマト樹脂にアプライした。アプライ液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳを通液した。素通り画分及びＰＢＳ通液時における２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液を酢酸でｐＨ調整し、０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをＡＥＸ精製プールとした。
次に、ＡＥＸ精製プールを、酢酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマト樹脂にアプライした。アプライ液がカラムに全て入ったのち、酢酸緩衝液でカラムを洗浄した。次に高濃度のＮａＣｌを含む酢酸緩衝液を用いて溶出し、２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液を０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをＣＥＸ精製プールとした。
ＣＥＸ精製プールを、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ３ Ｃａｓｓｅｔｔｅ ３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて抗体濃度４０ｍｇ／ｍＬに濃縮した後、ヒスチジンバッファー（２５ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、ｐＨ６．０）に置換した。最後に０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものを精製サンプルとした。精製サンプルを「ｈ０４６＿Ｈ５ｂ／Ｌ２」と命名した。
６）－７－６－３ ヒト化ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６の精製
実施例６）－７－５－３で得られた「ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６ 培養上清」を、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーの三段階工程で精製した。最初に、培養上清を、ＰＢＳで平衡化したｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマト樹脂にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳ、アルギニンを含む緩衝液、ＰＢＳでカラムを洗浄した。次に、酢酸緩衝液で溶出し、２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液をＴｒｉｓ緩衝液で中和し、０．５／０．２μｍのフィルターであるＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをｒＰｒｏｔｅｉｎＡ精製プールとした。
次に、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ精製プールを、ＰＢＳで平衡化した陰イオン交換クロマト樹脂にアプライした。アプライ液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳを通液した。素通り画分及びＰＢＳ通液時における２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液を酢酸でｐＨ調整し、０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをＡＥＸ精製プールとした。
次に、ＡＥＸ精製プールを、酢酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマト樹脂にアプライした。アプライ液がカラムに全て入ったのち、酢酸緩衝液でカラムを洗浄した。次に高濃度のＮａＣｌを含む酢酸緩衝液を用いて溶出し、２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液を０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをＣＥＸ精製プールとした。
ＣＥＸ精製プールを、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ３ Ｃａｓｓｅｔｔｅ ３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて抗体濃度４０ｍｇ／ｍＬに濃縮した後、ヒスチジンバッファー（２５ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、ｐＨ６．０）に置換した。最後に０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものを精製サンプルとした。精製サンプルを「ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６」と命名した。
６）－７－６－４ ヒト化ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１の精製
実施例６）－７－５－４で得られた「ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１ 培養上清」を、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーの三段階工程で精製した。最初に、培養上清を、ＰＢＳで平衡化したｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマト樹脂にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳ、アルギニンを含む緩衝液、ＰＢＳでカラムを洗浄した。次に、酢酸緩衝液で溶出し、２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液をＴｒｉｓ緩衝液で中和し、０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをｒＰｒｏｔｅｉｎＡ精製プールとした。
次に、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ精製プールを、ＰＢＳで平衡化した陰イオン交換クロマト樹脂にアプライした。アプライ液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳを通液した。素通り画分及びＰＢＳ通液時における２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液を酢酸でｐＨ調
整し、０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをＡＥＸ精製プールとした。
次に、ＡＥＸ精製プールを、酢酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマト樹脂にアプライした。アプライ液がカラムに全て入ったのち、酢酸緩衝液でカラムを洗浄した。次に高濃度のＮａＣｌを含む酢酸緩衝液を用いて溶出し、２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液を０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをＣＥＸ精製プールとした。
ＣＥＸ精製プールを、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ３ Ｃａｓｓｅｔｔｅ ３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて抗体濃度４０ｍｇ／ｍＬに濃縮した後、ヒスチジンバッファー（２５ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、ｐＨ６．０）に置換した。最後に０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものを精製サンプルとした。精製サンプルを「ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１」と命名した。
６）－７－６－５ ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１の精製
実施例６）－７－５－５で得られた「ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１ 培養上清」を、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーの三段階工程で精製した。最初に、培養上清を、ＰＢＳで平衡化したｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマト樹脂にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳ、アルギニンを含む緩衝液、ＰＢＳでカラムを洗浄した。
次に、酢酸緩衝液で溶出し、２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液をＴｒｉｓ緩衝液で中和し、グラスファイバーフィルター ＡＰ２０（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で粗ろ過後、０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをｒＰｒｏｔｅｉｎＡ精製プールとした。
次に、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ精製プールを、ＰＢＳで平衡化した陰イオン交換クロマト樹脂にアプライした。アプライ液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳを通液した。素通り画分及びＰＢＳ通液時における２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液を酢酸でｐＨ調整し、０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをＡＥＸ精製プールとした。
次に、ＡＥＸ精製プールを、酢酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマト樹脂にアプライした。アプライ液がカラムに全て入ったのち、酢酸緩衝液でカラムを洗浄した。次に高濃度のＮａＣｌを含む酢酸緩衝液を用いて溶出し、２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液を０．２２μｍフィルターであるステリカップ‐ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをＣＥＸ精製プールとした。
ＣＥＸ精製プールを、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ３ Ｃａｓｓｅｔｔｅ ３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて抗体濃度４０ｍｇ／ｍＬに濃縮した後、ヒスチジンバッファー（２５ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、ｐＨ６．０）に置換した。最後に０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものを精製サンプルとした。精製サンプルを「ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１」と命名した。
６）－７－６－６ ヒト化ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６の精製
実施例６）－７－５－６で得られた「ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６ 培養上清」を、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーの三段階工程で精製した。最初に、培養上清を、ＰＢＳで
平衡化したｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマト樹脂にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳ、アルギニンを含む緩衝液、ＰＢＳでカラムを洗浄した。次に、酢酸緩衝液で溶出し、２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液をＴｒｉｓ緩衝液で中和し、０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをｒＰｒｏｔｅｉｎＡ精製プールとした。
次に、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ精製プールを、ＰＢＳで平衡化した陰イオン交換クロマト樹脂にアプライした。アプライ液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳを通液した。素通り画分及びＰＢＳ通液時における２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液を酢酸でｐＨ調整し、０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをＡＥＸ精製プールとした。
次に、ＡＥＸ精製プールを、酢酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマト樹脂にアプライした。アプライ液がカラムに全て入ったのち、酢酸緩衝液でカラムを洗浄した。次に高濃度のＮａＣｌを含む酢酸緩衝液を用いて溶出し、２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液を０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをＣＥＸ精製プールとした。
ＣＥＸ精製プールを、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ３ Ｃａｓｓｅｔｔｅ ３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて抗体濃度４０ｍｇ／ｍＬに濃縮した後、ヒスチジンバッファー（２５ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、ｐＨ６．０）に置換した。最後に０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものを精製サンプルとした。精製サンプルを「ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６」と命名した。
６）－７－６－７ ヒト化ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７の精製
実施例６）－７－５－７で得られた「ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７ 培養上清」を、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーの三段階工程で精製した。最初に、培養上清を、ＰＢＳで平衡化したｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマト樹脂にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳ、アルギニンを含む緩衝液、ＰＢＳでカラムを洗浄した。
次に、酢酸緩衝液で溶出し、２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液をＴｒｉｓ緩衝液で中和し、０．５／０．２μｍのフィルターであるＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをｒＰｒｏｔｅｉｎＡ精製プールとした。
次に、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ精製プールを、ＰＢＳで平衡化した陰イオン交換クロマト樹脂にアプライした。アプライ液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳを通液した。素通り画分及びＰＢＳ通液時における２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液を酢酸でｐＨ調整し、０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをＡＥＸ精製プールとした。
次に、ＡＥＸ精製プールを、酢酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマト樹脂にアプライした。アプライ液がカラムに全て入ったのち、酢酸緩衝液でカラムを洗浄した。次に高濃度のＮａＣｌを含む酢酸緩衝液を用いて溶出し、２８０ｎｍの吸収ピークを回収した。回収液を０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものをＣＥＸ精製プールとした。
ＣＥＸ精製プールを、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ３ Ｃａｓｓｅｔｔｅ ３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて抗体濃度４０ｍｇ／ｍＬに濃縮した後、ヒスチジンバ
ッファー（２５ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、ｐＨ６．０）に置換した。最後に０．２２μｍフィルターであるステリカップ－ＧＶ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものを精製サンプルとした。精製サンプルを「ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７」と命名した。
実施例７：抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートの作製
７）－１ 抗体－薬物コンジュゲートの作製（１）
Figure 0007064635000018
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（１）
抗体の還元：実施例５）－２にて作製した０４－０４６Ｃｈを、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．４７ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（３．４０ｍＬ）に９．４ｍＭ ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．１０４ｍＬ；抗体一分子に対して５．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．１７０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．４±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内鎖間部のジスルフィド結合を還元した。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃で１０分間インキュベートした。次いでＮ－｛３－［２－（２－｛［３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）プロパノイル］アミノ｝エトキシ）エトキシ］プロパノイル｝グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－（４－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－４－オキソブチル）グリシンアミドの１０ｍＭ ジメチルスルホキシド溶液（０．１８９ｍＬ；抗体一分子に対して８．６当量）を加え、１５℃で１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０２８４ｍＬ；抗体一分子に対して１２．９当量）を加え、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲート「０４６Ｃｈ－ＡＤＣ２」を含有する溶液を１４．０ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（εＤ，２８０＝４９６４、εＤ，３７０＝１８９８２を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：２．２６ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：３１．６ｍｇ（９３％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．６
７）－２ 抗体－薬物コンジュゲート（２）の作製
Figure 0007064635000019
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（２）
抗体の還元：実施例５）－２にて作製した０４－０４６Ｃｈを、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．４７ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（３．４０ｍＬ）に９．４ｍＭ ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．１０４ｍＬ；抗体一分子に対して５．０当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０５０９ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内鎖間部のジスルフィド結合を還元した。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃で１０分間インキュベートした。次いでＮ－［６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）メチル］グリシンアミドの９．３Ｍ ジメチルスルホキシド溶液（０．１７６ｍＬ；抗体一分子に対して８．６当量）を加え、１５℃で１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０２８４ｍＬ；抗体一分子に対して１２．９当量）を加え、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲート「０４６Ｃｈ－ＡＤＣ１」を含有する溶液を１４．０ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ（εＤ，２８０＝５１７８、εＤ，３７０＝２０２１７を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：２．２３ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：３１．２ｍｇ（９２％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．６
７）－３ 抗体－薬物コンジュゲート（３）の作製
Figure 0007064635000020
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（３）
抗体の還元：実施例６）－７－６－１にて作製したｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．３１ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（６．２５ｍＬ）に１０ｍＭ ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．２３７ｍＬ；抗体一分子に対して５．５当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０９４０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内鎖間部のジスルフィド結合を還元した。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃で１０分間インキュベートした。次いでＮ－［６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）メチル］グリシンアミドの１０ｍＭ ジメチルスルホキシド溶液（０．３８８ｍＬ；抗体一分子に対して９．０当量）を加え、１５℃で１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０３９０ｍＬ；抗体一分子に対して９．０当量）を加え、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲート「ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７－ＡＤＣ１」を含有する溶液を３０．０ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ及びＦ（（εＤ，２８０＝５１７８、εＤ，３７０＝２０２１７を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：２．０３ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：６１．０ｍｇ（９７％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．５；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．８。
７）－４ 抗体－薬物コンジュゲート（４）の作製
Figure 0007064635000021
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（４）
抗体の還元：実施例６）－７－６－１にて作製したｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．３１ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用）を用いて、及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（３００ｍＬ）をポリカーボネート製の１０００ｍＬ三角フラスコ容器に入れ、マグネティックスターラー撹拌下、室温で１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（４．８０ｍＬ）を加えた後、１０ｍＭ ＴＣＥＰ水溶液（１１．３ｍＬ；抗体一分子に対して５．５当量）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に撹拌を停止し、３７℃で２時間インキュベートすることにより抗体内鎖間部のジスルフィド結合を還元した。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃に冷却後、撹拌下、Ｎ－［６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４
’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）メチル］グリシンアミドの１０ｍＭ含むＤＭＳＯ溶液（１８．５ｍＬ；抗体一分子に対して９．０当量）をゆっくり滴下して加えた。１５℃で３０分間撹拌し、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、撹拌下、１００ｍＭ ＮＡＣ水溶液（１．８５ｍＬ；抗体一分子に対して９．０当量）を加え、さらに室温で２０分間撹拌し、未反応の薬物リンカーの反応性を停止させた。
精製：この溶液に対して、限外ろ過膜（メルク株式会社、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ Ｃａｓｓｅｔｔｅ、Ｕｌｔｒａｃｅｌｌ ３０ＫＤａ）、チューブポンプ（米国コールパーマー社マスターフレックスポンプ ｍｏｄｅｌ ７７５２１－４０、ポンプヘッド ｍｏｄｅｌ ７５１８－００）及びチューブ（米国コールパーマー社マスターフレックスチューブ Ｌ／Ｓ１６）で構成された限外ろ過装置を用い、限外ろ過精製を行った。すなわち、反応液に精製緩衝液としてＡＢＳ（計３．００Ｌ）を滴下しながら限外ろ過精製を行うことで、未結合の薬物リンカー及び他の低分子量試薬を除去するとともに緩衝液をＡＢＳへ置換し、さらに濃縮まで行った。得られた精製溶液に対して、精密ろ過（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ膜、２回）を行い、標記抗体－薬物コンジュゲート「ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７－ＡＤＣ１」を含有する溶液を８３．０ｍＬ得た。
特性評価：共通操作Ｅ及びＦ（εＤ，２８０＝５１７８、εＤ，３７０＝２０２１７を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：２３．１ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：２．９４ｇ（９８％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．８；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．４。
７）－５ 抗体－薬物コンジュゲート（５）の作製
Figure 0007064635000022
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（５）
実施例６）－７－６－２にて作製したｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２（２８０ｎｍ吸光係数として１．３１ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用）を用いて、実施例７－３工程１と同様の方法により、標記抗体－薬物コンジュゲート「ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２－ＡＤＣ１」を得た。
抗体濃度：２．０４ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：６１．３ｍｇ（９８％），共通操作Ｅにて
測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．４；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．９。
７）－６ 抗体－薬物コンジュゲート（６）の作製
Figure 0007064635000023
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（６）
実施例６）－７－６－３にて作製したｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６（２８０ｎｍ吸光係数として１．３１ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用）を用いて、実施例７－３工程１と同様の方法により、標記抗体－薬物コンジュゲート「ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６－ＡＤＣ１」を得た。
抗体濃度：２．０３ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：６０．９ｍｇ（９５％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．６；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．８。
７）－７ 抗体－薬物コンジュゲート（７）の作製
Figure 0007064635000024
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（７）
抗体の還元：実施例６）－７－６－１にて作製したｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．３１ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（５．００ｍＬ）に１０ｍＭ ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．１９３ｍＬ；抗体一分子に対して５．５当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０７５２ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内鎖間部のジスルフィド結合を還元した。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃で１０分間インキュベートした。次いでＮ－｛３－［２－（２－｛［３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）プロパノイル］アミノ｝エトキシ）エトキシ］プロパノイル｝グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－（４－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－４－オキソブチル）グリシンアミドの１０ｍＭ ジメチルスルホキシド溶液（０．３１５ｍＬ；抗体一分子に対して９．０当量）を加え、１５℃で１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０３１６ｍＬ；抗体一分子に対して９．０当量）を加え、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲート「ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７－ＡＤＣ２」を含有する溶液を２４．０ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ及びＦ（εＤ，２８０＝４９６４、εＤ，３７０＝１８９８２を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：２．０７ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：４９．６ｍｇ（９９％），共通操作Ｅにて測
定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．１；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．６。
７）－８ 抗体－薬物コンジュゲート（８）の作製
Figure 0007064635000025
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（８）
抗体の還元：実施例６）－７－６－２にて作製したｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．３１ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（６．２５ｍＬ）に１０ｍＭ ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．２３７ｍＬ；抗体一分子に対して５．５当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０９４０ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内鎖間部のジスルフィド結合を還元した。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃で１０分間インキュベートした。次いでＮ－｛３－［２－（２－｛［３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）プロパノイル］アミノ｝エトキシ）エトキシ］プロパノイル｝グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－（４－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－４－オキソブチル）グリシンアミドの１０ｍＭ ジメチルスルホキシド溶液（０．３８８ｍＬ；抗体一分子に対して９．０当量）を加え、１５℃で１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０３９０ｍＬ；抗体一分子に対して９．０当量）を加え、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲート「ｈ０４６－Ｈ５ｂ／Ｌ２－ＡＤＣ２」を含有する溶液を３０．０ｍＬ
得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ及びＦ（εＤ，２８０＝４９６４、εＤ，３７０＝１８９８２を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：２．０７ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：６２．２ｍｇ（９９％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．０；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．７。
７）－９ 抗体－薬物コンジュゲート（９）の作製
Figure 0007064635000026
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（９）
実施例６）－７－６－３にて作製したｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６（２８０ｎｍ吸光係数として１．３１ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用）を用いて、実施例７）－８工程１と同様の方法により、標記抗体－薬物コンジュゲート「ｈ０４６－Ｈｗｔ／Ｌ６－ＡＤＣ２」を得た。
抗体濃度：２．１０ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：６２．９ｍｇ（９９％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：６．１；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．４。
７）－１０ 抗体－薬物コンジュゲート（１０）の作製
Figure 0007064635000027
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（１０）
実施例６）－７－６－４にて作製したｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１（２８０ｎｍ吸光係数として１．３１ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用）を用いて、実施例７）－３工程１と同様の方法により、標記抗体－薬物コンジュゲート「ｈ０４６－Ｈ８／Ｌ１－ＡＤＣ１」を得た。
抗体濃度：１．７５ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：５２．６ｍｇ（８６％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．６；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．９。
７）－１１ 抗体－薬物コンジュゲート（１１）の作製
Figure 0007064635000028
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（１１）
実施例６）－７－６－５にて作製したｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１（２８０ｎｍ吸光係数として１．３１ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用）を用いて、実施例７）－３工程１と同様の方法により、標記抗体－薬物コンジュゲート「ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ１－ＡＤＣ１」を得た。
抗体濃度：１．８５ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：５５．６ｍｇ（９０％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．６；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．９。
７）－１２ 抗体－薬物コンジュゲート（１２）の作製
Figure 0007064635000029
 工程１：抗体－薬物コンジュゲート（１２）
実施例６）－７－６－６にて作製したｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６（２８０ｎｍ吸光係数として１．３１ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用）を用いて、実施例７）－３工程１と同様の方法により、標記抗体－薬物コンジュゲート「ｈ０４６－Ｈ１０／Ｌ６－ＡＤＣ１」を得た。
抗体濃度：１．８３ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：５５．０ｍｇ（８７％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．５；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：８．０。
７）－１３ 抗体－薬物コンジュゲート（１３）の作製
Figure 0007064635000030
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（１３）
抗体の還元：実施例６）－７－６－７にて作製したｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７を、製造方法１に記載した共通操作Ｂ（２８０ｎｍ吸光係数として１．３１ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用）及びＣを用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１１．０ｍＬ）に１０ｍＭ ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．４１２ｍＬ；抗体一分子に対して５．５当量）及び１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．１６５ｍＬ）を加えた。本溶液のｐＨが７．０±０．１内であることを確認した後に、３７℃で１時間インキュベートすることによって、抗体内鎖間部のジスルフィド結合を還元した。
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃で１０分間インキュベートした。次いでＮ－［６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）メチル］グリシンアミドの１０ｍＭ ジメチルスルホキシド溶液（０．６７４ｍＬ；抗体一分子に対して９．０当量）を加え、１５℃で１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．０６７４ｍＬ；抗体一分子に対して９．０当量）を加え、さらに室温にて２０分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
精製：上記溶液を、製造方法１に記載した共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲート「ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７－ＡＤＣ１」を含有する溶液を３４．５ｍＬ得た。
特性評価：製造方法１に記載した共通操作Ｅ及びＦ（εＤ，２８０＝５１７８、εＤ，３７０＝２０２１７を使用）を使用して、下記の特性値を得た。
抗体濃度：３．０１ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１０４ｍｇ（９５％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．６；共通操作Ｆにて測定された
抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．７。
７）－１４ 抗体－薬物コンジュゲート（１４）の作製
Figure 0007064635000031
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（１４）
実施例６）－７－６－７にて作製したｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７（２８０ｎｍ吸光係数として１．３１ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用）を用いて、実施例７－１３工程１と同様の方法により、標記抗体－薬物コンジュゲート「ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７－ＡＤＣ１」を得た。
抗体濃度：３．１４ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１０８ｍｇ（９９％），共通操作Ｅにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：５．６；共通操作Ｆにて測定された抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．６。
実施例８：抗体－薬物コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性評価
８）－１－１ ヒト化抗ＧＰＲ２０抗体及び抗体－薬物コンジュゲートの結合性評価
実施例６）－７－６で作製したヒト化抗ＧＰＲ２０抗体、並びに実施例７で作製した抗体－薬物コンジュゲートのＧＰＲ２０結合性をフローサイトメトリー法により評価した。実施例６）－６－１と同様の方法でｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０を一過性に導入した２９３Ｔ細胞に対する結合を、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔ ＩＩ：ＢＤ バイオサイエンス社）で解析した結果、抗体濃度依存的な結合性を確認した。図２５にその代表的な反応例を示す。図２５において横軸は抗体濃度（ｎＭ）、縦軸はＭＦＩ（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）による抗体結合量を示す。図２５に示す通り、ヒト化抗ＧＰＲ２０抗体ｈ０４６－Ｈ４ｂ／Ｌ７及びｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７、並びに抗体－薬物コンジュゲート（４）、（１３）は、ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０導入２９３Ｔ細胞に対して濃度依存的に結合量が増加した。
８）－２ ＧＩＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０安定発現細胞株の作製
ＧＩＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０安定発現細胞株は、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞（コスモバイオ社より入手可能）にヒトＧＰＲ２０発現用組換えレトロウイルスを感染させることにより作製した。
８）－２－１ ヒトＧＰＲ２０発現レトロウイルスベクターの作製
ヒトＧＰＲ２０発現レトロウイルスベクターは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて作製した。即ち、実施例１で作製したヒトＧＰＲ２０発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲ２０を鋳型とし、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った。この反応にはＫＯＤ ＦＸ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を用い、９８℃－１０秒、５８℃－３０秒、６８℃－２分、３０サイクルで反応を行った後、得られたＧＰＲ２０ ｃＤＮＡ断片を含むＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で目的サイズのＤＮＡを抽出した。このＤＮＡ断片と、制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩで消化したレトロウイルスベクターｐＬＰＣＸ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｅｍｉｘとを混合し、連結反応をした後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に形質転換することで、ヒトＧＰＲ２０発現レトロウイルスベクターｐＬＰＣＸ－ＧＰＲ２０を構築した。ＰＣＲに用いたプライマーセットは以下の通り。

ＰＣＲプライマーセット（ｐＬＰＣＸとＧＰＲ２０ ｃＤＮＡ断片とのＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング用）
５’―ＣＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡ―３’（ＬＰＣＸ－１；配列番号１１２）
５’―ＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＣＡＴＴＡＧ―３’（ＬＰＣＸ－１；配列番号１１３）
８）－２－２ ＧＩＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０安定発現細胞株の樹立
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（インビトロジェン社）を用いてレトロウイルスパッケージング細胞２９３－１０Ａ１にｐＬＰＣＸ－ＧＰＲ２０を一過性に導入し、７２時間後に組換えレトロウイルスを含む培養上清を回収し、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞培養系に添加することで同細胞に感染させた。感染３日後にＧＩＳＴ－Ｔ１細胞を１ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、０．３から１μｇ／ｍＬのＰｕｒｏｍｙｃｉｎを添加した培地で３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で長期間培養することでＧＰＲ２０を安定的に発現する細胞株ＧＩＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０を樹立した。
８）－３ ＧＩＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０細胞に対するＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制活性評価
ＧＩＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０細胞を１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中２．５ｘ１０３細胞／１００μＬ／ｗｅｌｌになるよう９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。実施例７で作製した抗体－薬物コンジュゲートを終濃度０．０３２から１００ ｎＭとなるように添加した。７乃至１１日間培養後に生存細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ＡｓｓａｙによるＡＴＰの定量で測定した。図２６にヒトキメラ化抗体から作製した抗体－薬物コンジュゲート（１）、図２７にヒト化抗体から作製した抗体－薬物コンジュゲート（７）、（８）、（９）を各々添加した際の濃度依存的な細胞増殖抑制活性を示す。本実験におけるｈＩｇＧ－ＡＤＣ２は、ＧＰＲ２０とは無関係な抗原を認識するヒトＩｇＧから作製した抗体－薬物コンジュゲートであり、陰性コントロールとして使用した。
実施例９：抗体－薬物コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍効果は、ヒト消化管間質腫瘍由来の細胞を免疫不全マウスに移植した動物モデルを用いて評価した。５－６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ ヌードマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ－Ｆｏｘｎｌｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ、日本チャールス・リバー社）を実験使用前にＳＰＦ条件化で４乃至７日間馴化した。マウスには滅菌した固形飼料（ＦＲ－２，Ｆｕｎａｂａｓｈｉ Ｆａｒｍｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を給餌し、滅菌した水道水
（５－１５ｐｐｍ次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加して調製）を与えた。移植した腫瘍の長径及び短径を電子式デジタルノギス（ＣＤ－１５ＣＸ，Ｍｉｔｕｔｏｙｏ Ｃｏｒｐ．）で１週間に１乃至２回測定し、以下に示す計算式により腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］２
抗体－薬物コンジュゲートは全てＡＢＳ緩衝液（１０ｍＭ－Ａｃｅｔａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ， ５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ， ｐＨ５．５）（ＮＡＣＡＬＡＩ）で希釈し、１０ｍＬ／ｋｇの液量を尾静脈内投与した。また、コントロール群（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）としてＡＢＳ緩衝液を同様に投与した。１群あたり５乃至６匹のマウスを実験に用いた。
９）－１ 抗腫瘍効果（１）
８）－１－２で作製したＧＩＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０細胞をマトリゲル（コーニング社）に懸濁し、５×１０６ｃｅｌｌｓを雌ヌードマウスの右側腹部に皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ１４に無作為に群分けを実施した。抗体－薬物コンジュゲート（１）、（２）をＤａｙ１４に１０ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。陰性対照としてヒトＩｇＧを用いて作製した抗体－薬物コンジュゲートを１０ｍｇ／ｋｇの用量で同様に投与した。抗体－薬物コンジュゲート（１）、（２）の投与によって腫瘍体積が著しく減少し、いずれも腫瘍を縮退させる効果を発揮した（図２８）。なお、図中、横軸は日数、縦軸は腫瘍体積を示す。ｈＩｇＧ－ＡＤＣ１及びｈＩｇＧ－ＡＤＣ２は、ＧＰＲ２０とは無関係な抗原を認識するヒトＩｇＧから作製した抗体－薬物コンジュゲートであり、陰性コントロールとして使用した。
９）－２ 抗腫瘍効果（２）
２×１０７ｃｅｌｌｓのヒト消化管間質腫瘍細胞株ＧＩＳＴ４３０（Ｂｒｉｇｈａｍ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌより入手）を雌ヌードマウスの右側腹部に皮下移植して（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ２９に無作為に群分けを実施した。抗体－薬物コンジュゲート（１）、（２）をＤａｙ２９、３６、４３に１０ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（１）、（２）の投与によって腫瘍体積がコントロール群に比べて著しく減少し、いずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図２９）。
９）－３ 抗腫瘍効果（３）
実施例９）－１と同様にＧＩＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０細胞を雌ヌードマウスに皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ２４に無作為に群分けを実施した。抗体－薬物コンジュゲート（６）、（９）をＤａｙ２４に１０ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（６）、（９）の投与によって腫瘍体積が著しく減少し、いずれも腫瘍を縮退させる効果を発揮した（図３０）。
９）－４ 抗腫瘍効果（４）
実施例９）－１と同様にＧＩＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０細胞を雌ヌードマウスに皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ１７に無作為に群分けを実施した。抗体－薬物コンジュゲート（３）、（５）、（６）、（１０）、（１１）、（１２）をＤａｙ１７に全て１ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（３）、（５）、（６）、（１０）、（１１）、（１２）の投与によって腫瘍体積が著しく減少し、いずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図３１）。
９）－５ 抗腫瘍効果（５）
実施例９）－１と同様にＧＩＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０細胞を雌ヌードマウスに皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ１７に無作為に群分けを実施した。抗体－薬物コンジュゲート（１３）をＤａｙ１７に０．３、１、３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（１３）の投与によって用量依存的に腫瘍体積が減少し、１ｍｇ／ｋｇ以上の用量で腫瘍を退縮させる効果を発揮した（図３２）。
９）－６ 抗腫瘍効果（６）
小腸の消化管間質腫瘍患者より摘出した腫瘍を免疫不全マウスの皮下にブロック移植することにより継代維持したＧＩＳＴ０２０（医薬基盤・健康・栄養研究所より入手）を雌ヌードマウスの右側腹部に皮下移植して（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ５５に無作為に群分けを実施した。抗体－薬物コンジュゲート（４）、（１３）をＤａｙ５５、７５に１０ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（４）、（１３）の投与によって腫瘍体積がコントロール群に比べて著しく減少し、いずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図３３）。
９）－７ 抗腫瘍効果（７）
食道の消化管間質腫瘍患者より摘出した腫瘍を免疫不全マウスの皮下にブロック移植することにより継代維持したＧＩＳＴ１（富山大学より入手）を雌ヌードマウスの右側腹部に皮下移植して（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ３８に無作為に群分けを実施した。抗体－薬物コンジュゲート（１３）をＤａｙ３８、５９に３、１０ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（１３）の投与によって腫瘍体積がコントロール群に比べて著しく減少し、いずれも腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図３４）。
９）－８ 抗腫瘍効果（８）
ＨＥＲ２ 分子を強発現しているがＧＰＲ２０を発現していない胃癌細胞株 ＮＣＩ－Ｎ８７を１×１０７ｃｅｌｌｓを雌ヌードマウスの右側腹部に皮下移植して（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ６に無作為に群分けを実施した。抗体－薬物コンジュゲート（１４）をＤａｙ６に３、１０ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与したが、抗体－薬物コンジュゲート（１４）は、顕著な腫瘍増殖抑制効果を示さなかった。一方、抗ＨＥＲ２抗体から作製した－薬物コンジュゲートの投与によって、腫瘍体積がコントロール群に比べて著しく減少し、腫瘍増殖抑制効果を発揮した（図３５）。
９）－９ 抗腫瘍効果（９）
Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ治療に不応答性となった胃の消化管間質腫瘍患者由来腫瘍を免疫不全マウスの皮下にブロック移植することにより継代維持されたＧＩＳＴ０７４（医薬基盤・健康・栄養研究所より入手）を雌ヌードマウスの右側腹部に皮下移植し（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ２９に無作為に群分けを実施した。抗体－薬物コンジュゲート（１４）をＤａｙ２９、５０に１０ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内投与した。抗体－薬物コンジュゲート（１４）の投与により、腫瘍増殖が完全に抑制された（図３６）。一方、Ｉｍａｔｉｎｉｂ，
Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ， Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂを各々９０、３０、４ ｍｇ／ｋｇで図３６の三角印で示した日に一日１回経口投与した場合には、腫瘍の増殖は完全には抑制されなかった。このことから、抗体－薬物コンジュゲート（１４）は、標準治療薬である3種のチロシンキナーゼ阻害剤に抵抗性を示す消化管間質腫瘍に対しても抗腫瘍効果を発揮した。
９）－１０ 抗腫瘍効果（１０）
ＫＩＴ遺伝子に Ｖ６５４ＡのＩｍａｔｉｎｉｂ耐性変異を有するヒト消化管間質腫瘍細胞株ＧＩＳＴ４３０／６５４（Ｂｒｉｇｈａｍ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌより入手）モデルにおいて、Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂとの併用効果を評価した。２×１０７ｃｅｌｌｓのＧＩＳＴ４３０／６５４を雌ヌードマウスの右側腹部に皮下移植して（Ｄａｙ０）、Ｄａｙ２１に無作為に群分けを実施した。図３７に示すように、抗体－薬物コンジュゲート（3）はＤａｙ２１に１０ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈内に1回投与した。Ｉｍａｔｉｎｉｂ及びＳｕｎｉｔｉｎｉｂは各々１５０、４０ ｍｇ／ｋｇの用量で三角印をした日に一日１回経口投与した。ＧＩＳＴ４３０／６５４モデルにおいて、Ｉｍａｔｉｎｉｂは腫瘍増殖を全く抑制しなかったが、抗体－薬物コンジュゲート（３）及びＳｕｎｉｔｉｎｉｂを投与した群では、腫瘍増殖の抑制が観察された。抗体－薬物コンジュゲート（３）とＳｕｎｉｔｉｎｉｂの併用群では、単剤より更に強い薬効が観察され、腫瘍の縮退が認められた。
本発明により、内在化活性を有する抗ＧＰＲ２０抗体及び該抗体を含む抗体－薬物コンジュゲートが提供された。該抗体－薬物コンジュゲートは消化管間質腫瘍に対する治療薬等として用いることができる。
配列番号４４：０４－０４６Ｃｈ重鎖のアミノ酸配列
配列番号４５：０４－０４６Ｃｈ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号４６：０４－０４６Ｃｈ抗体重鎖のヌクレオチド配列
配列番号４７：０４－０４６Ｃｈ軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号４８：ｈ０４６－Ｈ４ｂのアミノ酸配列
配列番号４９：ｈ０４６－Ｈ４ｂのヌクレオチド配列（１）
配列番号５０：ｈ０４６－Ｈ４ｅのアミノ酸配列
配列番号５１：ｈ０４６－Ｈ４ｅのヌクレオチド配列
配列番号５２：ｈ０４６－Ｈ５ｂのアミノ酸配列
配列番号５３：ｈ０４６－Ｈ５ｂのヌクレオチド配列（１）
配列番号５４：ｈ０４６－Ｈ８のアミノ酸配列
配列番号５５：ｈ０４６－Ｈ８のヌクレオチド配列（１）
配列番号５６：ｈ０４６－Ｈ１０のアミノ酸配列
配列番号５７：ｈ０４６－Ｈ１０のヌクレオチド配列（１）
配列番号５８：ｈ０４６－Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号５９：ｈ０４６－Ｌ１のヌクレオチド配列（１）
配列番号６０：ｈ０４６－Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号６１：ｈ０４６－Ｌ２のヌクレオチド配列（１）
配列番号６２：ｈ０４６－Ｌ６のアミノ酸配列
配列番号６３：ｈ０４６－Ｌ６のヌクレオチド配列（１）
配列番号６４：ｈ０４６－Ｌ７のアミノ酸配列
配列番号６５：ｈ０４６－Ｌ７のヌクレオチド配列（１）
配列番号６６：ＰＣＲプライマー Ｎｈｅ－ｐｏｌｙＣ－Ｓ
配列番号６７：ＰＣＲプライマー ｒＩｇγ－ＡＳ１
配列番号６８：ＰＣＲプライマー ｒＩｇγ－ＡＳ２
配列番号６９：ＰＣＲプライマー ｒＩｇκ－ＡＳ
配列番号７０：ＰＣＲプライマー ｒＩｇγ－ｓｅｑ
配列番号７１：ＰＣＲプライマー ｒＩｇκ－ｓｅｑ
配列番号７２：ＰＣＲプライマー ＮＦＬＡＧ－１
配列番号７３：ＰＣＲプライマー ＮＦＬＡＧ－２
配列番号７４：ＰＣＲプライマー ｍＥＣ２－１
配列番号７５：ＰＣＲプライマー ｍＥＣ２－２
配列番号７６：ＰＣＲプライマー ｍＥＣ３－１
配列番号７７：ＰＣＲプライマー ｍＥＣ３－２
配列番号７８：ＰＣＲプライマー ｍＥＣ４－１
配列番号７９：ＰＣＲプライマー ｍＥＣ４－２
配列番号８０：ＰＣＲプライマー ｍＥＣ１－１
配列番号８１：ＰＣＲプライマー ｍＥＣ１－２
配列番号８２：ＰＣＲプライマー ｍＥＣ１－３
配列番号８３：ＰＣＲプライマー ｍＥＣ１－４
配列番号８５：ＰＣＲプライマー ３．３－Ｆ１
配列番号８６：ＰＣＲプライマー ３．３－Ｒ１
配列番号８８：ＰＣＲプライマー ＥＧ－Ｉｎｆ－Ｆ
配列番号８９：ＰＣＲプライマー ＥＧ１－Ｉｎｆ－Ｒ
配列番号９０：ＰＣＲプライマー ＣＭ－ＬＫＦ
配列番号９１：ＰＣＲプライマー ０４６Ｌ－Ｒ
配列番号９２：ｈ０４６－Ｌ６のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号９３：ｈ０４６－Ｌ７のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号９４：ＤＮＡ断片Ａ
配列番号９５：ＰＣＲプライマー Ｈｂ－Ｆ
配列番号９６：ＰＣＲプライマー Ｈｂ－Ｒ
配列番号９７：ＤＮＡ断片Ｂ
配列番号９８：Ｈ０８－Ｆ
配列番号９９：Ｈ０８－Ｒ
配列番号１００：Ｈ１０－Ｆ
配列番号１０１：Ｈ１０－Ｒ
配列番号１０２：ＰＣＲプライマー ＫＣＬ－Ｉｎｆ－Ｒ
配列番号１０３：ｈ０４６－Ｈ４ｂのヌクレオチド配列（２）
配列番号１０４：ｈ０４６－Ｈ５ｂのヌクレオチド配列（２）
配列番号１０５：ｈ０４６－Ｈｗｔのヌクレオチド配列（２）
配列番号１０６：ｈ０４６－Ｈ８のヌクレオチド配列（２）
配列番号１０７：ｈ０４６－Ｈ１０のヌクレオチド配列（２）
配列番号１０８：ｈ０４６－Ｌ１のヌクレオチド配列（２）
配列番号１０９：ｈ０４６－Ｌ２のヌクレオチド配列（２）
配列番号１１０：ｈ０４６－Ｌ６のヌクレオチド配列（２）
配列番号１１１：ｈ０４６－Ｌ７のヌクレオチド配列（２）
配列番号１１２：ＰＣＲプライマー ＬＰＣＸ－１
配列番号１１３：ＰＣＲプライマー ＬＰＣＸ－２

Claims (12)

  1. 抗ＧＰＲ２０抗体を還元条件で処理した後に次の化合物：Ｌ１’－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）を反応させることを特徴とする、
    次の薬物－リンカー構造：
    －Ｌ１－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）
    をチオエーテル結合を介して結合させた抗体－薬物コンジュゲートの製造方法。
    （式中、Ｌ１’ は、次式：
    Figure 0007064635000032
     で示される、窒素原子が結合部位であるマレイミジル基であり、
    Ｌ１は、次式：
    Figure 0007064635000033
     で示される－（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ－３－ｙｌ－Ｎ）－の構造であり、このものの３位で抗体と結合し、１位の窒素原子上でこれを含むリンカー構造内のメチレン基と結合し、－（ＮＨ－ＤＸ）は、次式：
    Figure 0007064635000034
     で示される、１位のアミノ基の窒素原子が結合部位となっている基であり、
    －ＧＧＦＧ－は、－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－のテトラペプチド残基を示し、
    抗ＧＰＲ２０抗体は、以下の（ａ）に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、並びに（ｂ）に記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む抗体である
    （ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、
    （ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号９３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３
    。）
  2. 抗ＧＰＲ２０抗体が、配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含んでなる抗体である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 抗ＧＰＲ２０抗体が、配列番号５０においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号６４においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 抗ＧＰＲ２０抗体が、Ｎ－結合への糖鎖付加、Ｏ－結合への糖鎖付加、Ｎ末のプロセッシング、Ｃ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、Ｎ末にメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化及びカルボキシル末端において１つ又は２つのアミノ酸が欠失した重鎖からなる群より選択される１又は２以上の修飾を含む請求項１乃至３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 抗ＧＰＲ２０抗体が、重鎖のカルボキシル末端において１つ又は２つのアミノ酸を欠失している抗体である、請求項４に記載の製造方法。
  6. 抗ＧＰＲ２０抗体が、２本の重鎖の双方でカルボキシル末端において１つのアミノ酸が欠失している請求項４又は５に記載の製造方法。
  7. 抗ＧＰＲ２０抗体が、重鎖のカルボキシル末端のプロリン残基が更にアミド化されている請求項４又は５に記載の製造方法。
  8. 薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が１から１０個の範囲である請求項１乃至７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が２から８個の範囲である請求項１乃至８のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 選択された１種の薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が３から８個の範囲である請求項１乃至９のいずれか１項に記載の製造方法。
  11. 薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が７から８個の範囲である請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 薬物－リンカー構造の１抗体あたりの平均結合数が８である請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の製造方法。
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