TW202019973A - 辨識抗體-藥物結合物之藥物部位的蛋白質 - Google Patents
辨識抗體-藥物結合物之藥物部位的蛋白質 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202019973A TW202019973A TW108126606A TW108126606A TW202019973A TW 202019973 A TW202019973 A TW 202019973A TW 108126606 A TW108126606 A TW 108126606A TW 108126606 A TW108126606 A TW 108126606A TW 202019973 A TW202019973 A TW 202019973A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- antibody
- amino acid
- acid sequence
- drug
- protein
- Prior art date
Links
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 title claims abstract description 331
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 title claims abstract description 217
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 199
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 182
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims abstract description 128
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 128
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 99
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 23
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims abstract description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 358
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 68
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 68
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 56
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 55
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 49
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 36
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 25
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 claims description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 claims description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 claims description 6
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 claims description 5
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 5
- 238000003487 electrochemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 39
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 claims 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 135
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 127
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 127
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 108
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 59
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 57
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 57
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 53
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 45
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 28
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 27
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 27
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 25
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 20
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 18
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 17
- 102100038968 WAP four-disulfide core domain protein 1 Human genes 0.000 description 16
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 16
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 12
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 10
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 10
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 10
- -1 sensitizers Substances 0.000 description 10
- MEKOFIRRDATTAG-UHFFFAOYSA-N 2,2,5,8-tetramethyl-3,4-dihydrochromen-6-ol Chemical compound C1CC(C)(C)OC2=C1C(C)=C(O)C=C2C MEKOFIRRDATTAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 8
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 8
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 8
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 102100036939 G-protein coupled receptor 20 Human genes 0.000 description 7
- 101710108873 G-protein coupled receptor 20 Proteins 0.000 description 7
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100027212 Tumor-associated calcium signal transducer 2 Human genes 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M sodium;1-[6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCCC[C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 102100029756 Cadherin-6 Human genes 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 101100241858 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) OAC1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150117918 Tacstd2 gene Proteins 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 125000005605 benzo group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 4
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 201000011243 gastrointestinal stromal tumor Diseases 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 4
- 101150092906 pmt1 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- VHXNKPBCCMUMSW-FQEVSTJZSA-N rubitecan Chemical compound C1=CC([N+]([O-])=O)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 VHXNKPBCCMUMSW-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 4
- 229950009213 rubitecan Drugs 0.000 description 4
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100330728 Arabidopsis thaliana DAR7 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 3
- 0 CCCC[C@](C(C=C1N2Cc3c([C@](CCc4c(C)c(F)c5)NC(CCCNC(CNC([C@](Cc6ccccc6)NC(CNC(CNC(CCOCCOCCNC(CCN(C(CC6*)=O)C6=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)c4c5nc13)=C(CO1)C2=O)*1=O Chemical compound CCCC[C@](C(C=C1N2Cc3c([C@](CCc4c(C)c(F)c5)NC(CCCNC(CNC([C@](Cc6ccccc6)NC(CNC(CNC(CCOCCOCCNC(CCN(C(CC6*)=O)C6=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)c4c5nc13)=C(CO1)C2=O)*1=O 0.000 description 3
- 208000030808 Clear cell renal carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000794604 Homo sapiens Cadherin-6 Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 101150029408 PMT5 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 3
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 206010073251 clear cell renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 150000002596 lactones Chemical group 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000011330 nonpapillary renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- UVGHPGOONBRLCX-NJSLBKSFSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O UVGHPGOONBRLCX-NJSLBKSFSA-N 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100330723 Arabidopsis thaliana DAR2 gene Proteins 0.000 description 2
- ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N Bipyridyl Chemical class N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1 ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000800130 Bos taurus Thyroglobulin Proteins 0.000 description 2
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000003915 DNA Topoisomerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000323 DNA Topoisomerases Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010051066 Gastrointestinal stromal tumour Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N Oplophorus luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC(C(N1C=C(N2)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)=NC1=C2CC1=CC=CC=C1 YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000195452 Wasabia japonica Species 0.000 description 2
- 235000000760 Wasabia japonica Nutrition 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229960000956 coumarin Drugs 0.000 description 2
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- PAFZNILMFXTMIY-UHFFFAOYSA-N cyclohexylamine Chemical compound NC1CCCCC1 PAFZNILMFXTMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- ZVYVPGLRVWUPMP-FYSMJZIKSA-N exatecan Chemical class C1C[C@H](N)C2=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC3=CC(F)=C(C)C1=C32 ZVYVPGLRVWUPMP-FYSMJZIKSA-N 0.000 description 2
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N indium-111 Chemical compound [111In] APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical group 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- YAYGSLOSTXKUBW-UHFFFAOYSA-N ruthenium(2+) Chemical compound [Ru+2] YAYGSLOSTXKUBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950008834 seribantumab Drugs 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 2
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 2
- TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-N suberic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCC(O)=O TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 2
- YFTHZRPMJXBUME-UHFFFAOYSA-N tripropylamine Chemical compound CCCN(CCC)CCC YFTHZRPMJXBUME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 10043-66-0 Chemical compound [131I][131I] PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 0.000 description 1
- VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 2',7'-difluorofluorescein Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(F)C(=O)C=C2OC2=CC(O)=C(F)C=C21 VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 1
- 238000004780 2D liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KBDDIZRDKLGWGW-UHFFFAOYSA-N 3-[4-(3-aminopropylamino)butylamino]propylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].NCCCNCCCCNCCC[NH3+] KBDDIZRDKLGWGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 4-(3,4-diaminophenyl)benzene-1,2-diamine;hydron;tetrachloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HIDJWBGOQFTDLU-UHFFFAOYSA-N 4-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCCCC(O)=O HIDJWBGOQFTDLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-OUBTZVSYSA-N Ammonia-15N Chemical compound [15NH3] QGZKDVFQNNGYKY-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 1
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 1
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- OAHDWGNSUGTFME-XOBRGWDASA-N CC[C@@H](C(C=C1N2Cc3c([C@H](CCc4c(C)c(F)c5)NC(CCCN)=O)c4c5nc13)=C(CO1)C2=O)C1=O Chemical compound CC[C@@H](C(C=C1N2Cc3c([C@H](CCc4c(C)c(F)c5)NC(CCCN)=O)c4c5nc13)=C(CO1)C2=O)C1=O OAHDWGNSUGTFME-XOBRGWDASA-N 0.000 description 1
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 101000836696 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) Agglutinin-like protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-NJFSPNSNSA-N Carbon-14 Chemical compound [14C] OKTJSMMVPCPJKN-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- CCKHZEBKDIKXCR-WVOIHLJESA-N Cc(c(F)c1)c(CC/C(/c2c3CN45)=N\C(CO)=O)c2c1nc3C4=CC([C@@](C([O]=C1)=O)(O)[IH]#CC)=C1C5=O Chemical compound Cc(c(F)c1)c(CC/C(/c2c3CN45)=N\C(CO)=O)c2c1nc3C4=CC([C@@](C([O]=C1)=O)(O)[IH]#CC)=C1C5=O CCKHZEBKDIKXCR-WVOIHLJESA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 229940123780 DNA topoisomerase I inhibitor Drugs 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012739 FreeStyle 293 Expression medium Substances 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000823051 Homo sapiens Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 1
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010056045 K cadherin Proteins 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 description 1
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 description 1
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 description 1
- 101100504121 Mus musculus Ighg gene Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 244000131316 Panax pseudoginseng Species 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012327 Ruthenium complex Substances 0.000 description 1
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-AKLPVKDBSA-N Sulfur-35 Chemical compound [35S] NINIDFKCEFEMDL-AKLPVKDBSA-N 0.000 description 1
- 108700012457 TACSTD2 Proteins 0.000 description 1
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000000365 Topoisomerase I Inhibitor Substances 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- VWQVUPCCIRVNHF-OUBTZVSYSA-N Yttrium-90 Chemical compound [90Y] VWQVUPCCIRVNHF-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002494 anti-cea effect Effects 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N butanamide Chemical compound CCCC(N)=O DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSZJEPVVQWJCIF-UHFFFAOYSA-N butylazanide Chemical compound CCCC[NH-] MSZJEPVVQWJCIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 239000012230 colorless oil Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000003411 electrode reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 229950002519 elgemtumab Drugs 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229940055742 indium-111 Drugs 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N iodane Chemical compound [125IH] XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229950010079 lumretuzumab Drugs 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- LQNUZADURLCDLV-UHFFFAOYSA-N nitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1 LQNUZADURLCDLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000010915 one-step procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 229950010966 patritumab Drugs 0.000 description 1
- 229960002087 pertuzumab Drugs 0.000 description 1
- 238000011170 pharmaceutical development Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- PNNRZXFUPQQZSO-UHFFFAOYSA-N pyran Chemical compound [CH]1OC=CC=C1 PNNRZXFUPQQZSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCYJXDMUQGVQQS-UHFFFAOYSA-N pyridine;ruthenium Chemical class [Ru].C1=CC=NC=C1 WCYJXDMUQGVQQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003303 ruthenium Chemical class 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XHFLOLLMZOTPSM-UHFFFAOYSA-M sodium;hydrogen carbonate;hydrate Chemical class [OH-].[Na+].OC(O)=O XHFLOLLMZOTPSM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- HCERYFVYTBCLRR-UHFFFAOYSA-N tert-butyl N-[4-(cyclohexylamino)-4-oxobutyl]carbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCCCC(=O)NC1CCCCC1 HCERYFVYTBCLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003698 tetramethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical compound C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 229960000303 topotecan Drugs 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013520 translational research Methods 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
- A61K31/407—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. ketorolac, physostigmine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
- A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/68037—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a camptothecin [CPT] or derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Mycology (AREA)
Abstract
一種辨識抗體-藥物結合物的藥物部位之蛋白質,該抗體-藥物結合物係透過連接子而鍵結下式所示之藥物與抗體;及一種定量之方法,其係使用該蛋白質來定量在經投予上述之抗體-藥物結合物的哺乳動物中,該抗體-藥物結合物的血漿中濃度的方法;以及一種確認之方法,其係使用該蛋白質來確認在經投予上述之抗體-藥物結合物的哺乳動物中,該抗體-藥物結合物的組織分布的方法。
Description
本發明關於一種會辨識以依喜替康(exatecan)的衍生物作為構成要素之抗體-藥物結合物之藥物部位的蛋白質;及一種定量之方法,其係使用該蛋白質來定量在經投予上述之抗體-藥物結合物的哺乳動物中,該抗體-藥物結合物的血漿中濃度的方法;以及一種確認之方法,其係使用該蛋白質來確認在經投予上述之抗體-藥物結合物的哺乳動物中,該抗體-藥物結合物的組織分布的方法。
使得具有細胞毒性的藥物鍵結在會鍵結於表現在癌細胞表面的抗原且能夠內化(Internalization)至細胞的抗體而成的抗體-藥物結合物(Antibody-Drug Conjugate;ADC),是可期待藉由可將藥物選擇性地送達至癌細胞,使藥物累積在癌細胞內,而消滅癌細胞(非專利文獻1~5)。
與低分子化合物與抗體同樣地,在抗體-藥物結合物之醫藥品的開發來說,藥物動力學試驗(PK試驗)的實施是不可或缺的。這是因為在掌握了在動物中的PK試驗結果、藥理試驗結果及安全性試驗結果的相關性後,再進行在人類中的PK試驗,藉此能夠取得對於制定臨床試驗設計及考察在人類的有效
性及安全性是有用的資訊的緣故。
抗體-藥物結合物之PK試驗,基本上是進行:把投藥後的抗體-藥物結合物之血漿中濃度予以定量。作為用以定量抗體-藥物結合物之血漿中濃度的方法,可舉:ELISA法。例如,能夠透過經由下述步驟而定量抗體-藥物結合物之血漿中濃度:(1)使抗體-藥物結合物接觸於已固相化有抗原的盤,而使複合物形成的步驟;(2)使得能夠辨識該抗體-藥物結合物且經以標記物(marker)所標記化的蛋白質,與該複合物接觸,使形成更進一步的複合物的步驟;接著(3)透過因酵素反應等所致之顯色、發光等而檢測該標記物的步驟。
惟,當使用了會辨識抗體-藥物結合物之抗體部位之蛋白質的情況,會算出不僅是保持有藥物之狀態的抗體-藥物結合物,且亦包含藥物為游離狀態之抗體-藥物結合物(即,實質上僅是有抗體部位之物)的血漿中濃度,而無法進行正確的定量。
已知:透過使用了會辨識抗體-藥物結合物之藥物部位的蛋白質之ELISA法,來定量抗體-藥物結合物的血漿中濃度的方法(非專利文獻6~11)。
作為抗體-藥物結合物之一,而已知:以抗體與為拓樸異構酶I抑制劑之依喜替康的衍生物作為構成要素之抗體-藥物結合物(專利文獻1~7、非專利文獻12~15)。由於具有優良的抗腫瘤效果與安全性,現在該等抗體-藥物結合物的臨床試驗正在進行中。
針對上述以依喜替康的衍生物作為構成要素之抗體-藥物結合物,尚未知悉:定量保持有藥物之狀態下的血漿中
濃度的方法。
[專利文獻1]國際公開第2014/057687號
[專利文獻2]國際公開第2014/061277號
[專利文獻3]國際公開第2015/098099號
[專利文獻4]國際公開第2015/115091號
[專利文獻5]國際公開第2015/146132號
[專利文獻6]國際公開第2015/155976號
[專利文獻7]國際公開第2015/155998號
[非專利文獻1]Ducry, L., et al., Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13.
[非專利文獻2]Alley, S. C., et al., Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537.
[非專利文獻3]Damle N. K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452.
[非專利文獻4]Senter P. D., et al., Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637.
[非專利文獻5]Howard A. et al., J Clin Oncol 29: 398-405.
[非專利文獻6]Xie H. et al., J Pharmacol Exp Ther. (2004) 308(3), 1073-1082.
[非專利文獻7]Sanderson RJ. et al., Clinical Cancer Research (2005) Vol. 11, 843-852.
[非專利文獻8]Stephan JP. et al., Bioconjugate Chem. 2008, 19, 1673-1683.
[非專利文獻9]Stephan JP. et al., Bioanalysis (2011) 3(6), 677-700.
[非專利文獻10]Kaur S. et al., Bioanalysis (2013) 5(2), 201-226.
[非專利文獻11]Dere R. et al., Bioanalysis (2013) 5(9), 1025-1040.
[非專利文獻12]Ogitani Y. et al., Clinical Cancer Research (2016) 22(20), 5097-5108.
[非專利文獻13]Ogitani Y. et al., Cancer Science (2016) 107, 1039-1046.
[非專利文獻14]Doi T,et al., Lancet Oncol 2017; 18: 1512-22.
[非專利文獻15]Takegawa N, et al., Int. J. Cancer: 141, 1682-1689 (2017).
本發明課題在於提供一種會辨識以依喜替康的衍生物作為構成要素之抗體-藥物結合物之藥物部位的蛋白質,及一種定量之方法,其係使用該蛋白質來定量在經投予上述之抗體-藥物結合物的哺乳動物中,該抗體-藥物結合物的血漿中濃度的方法;以及一種確認之方法,其係使用該蛋白質來確認在經投予上述之抗體-藥物結合物的哺乳動物中,該抗體-藥物結
合物的組織分布的方法。
本發明人等為了解決上述課題進行了深入探討時,發現到:透過特定的免疫篩選(immunoscreening)所取得之蛋白質,會專一性地辨識以依喜替康的衍生物作為構成要素之抗體-藥物結合物的藥物部位。又,確立了一種定量之方法,其係使用該蛋白質之定量在經投予上述之抗體-藥物結合物的哺乳動物中之該抗體-藥物結合物的血漿中濃度的方法;及一種確認之方法,其係使用該蛋白質之確認在經投予上述之抗體-藥物結合物的哺乳動物中之該抗體-藥物結合物的組織分布的方法。
即,本發明提供以下[1]至[51]。
[1]一種蛋白質,其辨識抗體-藥物結合物的藥物部位,該抗體-藥物結合物係透過連接子而鍵結下式
[2]如[1]之蛋白質,其中在抗體-藥物結合物中的藥物連接子是下式所示:
(式中,A表示與抗體的鍵結位置,且該藥物連接子是透過硫醚鍵與抗體鍵結)。
[3]如[1]之蛋白質,其中在抗體-藥物結合物中的藥物連接子是下式所示:
(式中,A表示與抗體的鍵結位置,且該藥物連接子是透過硫醚鍵與抗體鍵結)。
[4]如[1]之蛋白質,其中在抗體-藥物結合物中的藥物連接子是下式所示:
(式中,A表示與抗體的鍵結位置,且該藥物連接子是透過硫醚鍵與抗體鍵結)。
[5]如[1]之蛋白質,其中抗體-藥物結合物是下式所示:
(式中,藥物連接子是透過硫醚鍵與抗體鍵結,n表示每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數)。
[6]如[1]之蛋白質,其中抗體-藥物結合物是下式所示:
(式中,藥物連接子是透過硫醚鍵與抗體鍵結,n表示每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數)。
[7]如[1]之蛋白質,其中抗體-藥物結合物為下式所示:
(式中,藥物連接子是透過硫醚鍵與抗體鍵結,n表示每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數)。
[8]如[1]至[7]中任一項之蛋白質,其中在抗體-藥物結合物中的每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數為2至8的範圍。
[9]如[1]至[8]中任一項之蛋白質,其中在抗體-藥物結合物中抗體為抗HER2抗體、抗HER3抗體、抗TROP2抗體、抗B7-H3抗體、抗GPR20抗體、或抗CDH6抗體。
[10]如[1]至[9]中任一項之蛋白質,其對於該抗體-藥物結合物的辨識性實質上不因在抗體-藥物結合物中的每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數的差異而不同。
[11]一種辨識下式所示之藥物之蛋白質,
[12]一種辨識下式所示之藥物之蛋白質,
[13]一種辨識下式所示之藥物之蛋白質,
[14]一種辨識下式所示之藥物之蛋白質,
[15]如[1]至[14]中任一項之蛋白質,其特徵為抗體。
[16]如[15]之蛋白質,其特徵係
a)由下述重鏈以及輕鏈構成之抗體,
該重鏈包含由序列識別號1所示之胺基酸序列構成之CDRH1、由序列識別號2所示之胺基酸序列構成之CDRH2、及由序列識別號3所示之胺基酸序列構成之CDRH3,
該輕鏈包含由序列識別號4所示之胺基酸序列構成之CDRL1、由序列識別號5所示之胺基酸序列構成之CDRL2、及由序列識別號6所示之胺基酸序列構成之CDRL3;
b)由下述重鏈以及輕鏈構成之抗體,
該重鏈包含由序列識別號7所示之胺基酸序列構成之CDRH1、由序列識別號8所示之胺基酸序列構成之CDRH2、及由序列識別號3所示之胺基酸序列構成之CDRH3,
該輕鏈包含由序列識別號4所示之胺基酸序列構成之CDRL1、由序列識別號5所示之胺基酸序列構成之CDRL2、及由序列識別號6所示之胺基酸序列構成之CDRL3;
c)由下述重鏈以及輕鏈構成之抗體,
該重鏈包含由序列識別號9所示之胺基酸序列構成之CDRH1、由序列識別號10所示之胺基酸序列構成之CDRH2、及由序列識別號3所示之胺基酸序列構成之CDRH3,
該輕鏈包含由序列識別號4所示之胺基酸序列構成之CDRL1、由序列識別號5所示之胺基酸序列構成之CDRL2、及由序列識別號6所示之胺基酸序列構成之CDRL3;或者,
d)由下述重鏈以及輕鏈構成之抗體,
該重鏈包含由序列識別號11所示之胺基酸序列構成之CDRH1、由序列識別號12所示之胺基酸序列構成之CDRH2、及由序列識別號13所示之胺基酸序列構成之CDRH3,
該輕鏈包含由序列識別號14所示之胺基酸序列構成之CDRL1、由WAS所示之三肽構成的CDRL2、及由序列識別號6所示之胺基酸序列構成之CDRL3。
[17]如[16]之蛋白質,其特徵係由下述重鏈及輕鏈構成的抗體;其中該重鏈包含由序列識別號15中胺基酸編號20至141記載的胺基酸序列構成的重鏈可變區,該輕鏈包含由序列識別號16中胺基酸編號21至127記載的胺基酸序列構成的輕鏈可變區。
[18]如[17]之蛋白質,其特徵為小鼠抗體。
[19]如[17]之蛋白質,其特徵係由下述重鏈及輕鏈構成的抗體;其中該重鏈是由序列識別號15中胺基酸編號20至477
記載的胺基酸序列構成,該輕鏈是由序列識別號16中胺基酸編號21至234記載的胺基酸序列構成。
[20]如[17]之蛋白質,其特徵為嵌合抗體。
[21]如[17]之蛋白質,其特徵為兔嵌合化抗體。
[22]如[17]之蛋白質,其特徵係由下述重鏈及輕鏈構成的抗體;其中該重鏈是由序列識別號19中胺基酸編號20至464記載的胺基酸序列構成,該輕鏈是由序列識別號20中胺基酸編號21至233記載的胺基酸序列構成。
[23]如[15]之蛋白質,其特徵係如[19]或者[22]之抗體的重鏈羧基末端的離胺酸殘基缺失的抗體。
[24]如[15]之蛋白質,其特徵係由與如[19]或者[22]之抗體的胺基酸序列具有至少95%的同一性之胺基酸序列構成的抗體。
[25]如[15]之蛋白質,其特徵係由與如[19]或者[22]之抗體的胺基酸序列具有至少99%的同一性之胺基酸序列構成的抗體。
[26]如[15]之蛋白質,其特徵在於就對藥物的辨識性而言,是與如[19]或者[22]之抗體競爭的抗體。
[27]如[1]至[14]中任一項之蛋白質,其特徵係如[15]至[26]中任一項之抗體的抗原結合片段。
[28]如[27]之蛋白質,其中抗體的抗原結合片段是Fab、F(ab’)2、Fab’或者Fv。
[29]一種定量之方法,其係使用如[1]至[28]中任一項之蛋白質,定量在經投予抗體-藥物結合物的哺乳動物中,該抗體-藥物結合物的血漿中濃度的方法。
[30]如[29]之方法,其特徵在於包含下述步驟:(1)使血漿中的抗體-藥物結合物接觸於已被固相化有抗體-藥物結合物之目標抗原的盤而使複合物形成的步驟;(2)使經以標記物(marker)所標記化之如[1]至[28]中任一項之蛋白質接觸,而使形成更進一步的複合物的步驟;接著(3)檢測該標記物的步驟。
[31]如[29]之方法,其特徵在於包含下述步驟:(1)使血漿中的抗體-藥物結合物接觸於已固相化有如[1]至[28]中任一項之蛋白質的盤,而使複合物形成的步驟;(2)使得能夠辨識該抗體-藥物結合物之抗體部位,且經以標記物所標記化的第二蛋白質接觸,使更進一步的複合物形成的步驟;接著(3)檢測該標記物的步驟。
[32]一種定量之方法,其係使用如[1]至[28]中任一項之蛋白質,定量在經投予抗體-藥物結合物的哺乳動物中,從該抗體-藥物結合物游離出的藥物的血漿中濃度的方法。
[33]如[32]之方法,其特徵在於包含下述步驟:(1)在經以標記物所標記化之競爭藥物的存在下,使血漿中從抗體-藥物結合物游離出的藥物接觸於已固相化有如[1]至[28]中任一項之蛋白質的盤,而使複合物形成的步驟;(2)檢測該標記物的步驟。
[34]一種確認之方法,其係使用如[1]至[28]中任一項之蛋白質,確認在經投予抗體-藥物結合物的哺乳動物中,該抗體-藥物結合物及/或從該抗體-藥物結合物游離出的藥物的組織分布的方法。
[35]如[34]之方法,其特徵在於包含下述步驟:(1)使組織中的抗體-藥物結合物及/或從該抗體-藥物結合物游離出的藥物與如[1]至[28]中任一項之蛋白質接觸而使複合物形成的步驟;
(2)使得能夠辨識如[1]至[28]中任一項之蛋白質,且經以標記物所標記化的第二蛋白質接觸,而使更進一步的複合物形成的步驟;接著(3)檢測該標記物的步驟。
[36]如[34]之方法,其特徵在於包含下述步驟:(1)使組織中的抗體-藥物結合物及/或從該抗體-藥物結合物游離出的藥物,與經以標記物所標記化的如[1]至[28]中任一項之蛋白質接觸而使複合物形成的步驟;接著(2)檢測該標記物的步驟。
[37]如[30]、[31]、[33]、[35]或者[36]之方法,其中標記物為顯色試劑,且該標記物的檢測是透過感知該標記物的顯色而進行。
[38]如[30]、[31]、[33]、[35]或者[36]之方法,其中標記物為酵素,且該標記物的檢測是透過感知因該酵素與基質的反應而產生之發光或者顯色而進行。
[39]如[30]、[31]、[33]、[35]或者[36]之方法,其中標記物為發光物質,且該標記物的檢測是透過感知基於電化學反應的該標記物之發光而進行。
[40]一種聚核苷酸,其編碼如[1]至[28]中任一項之蛋白質。
[41]一種載體,其包含如[40]之聚核苷酸。
[42]一種形質轉換宿主細胞,其包含如[40]之聚核苷酸。
[43]一種形質轉換宿主細胞,其包含如[41]之載體。
[44]如[1]至[28]中任一項之蛋白質之製造方法,其包含下述步驟:培養如[42]或者[43]之宿主細胞的步驟;接著,從前述培養步驟所獲得之培養產物純化蛋白質的步驟。
[45]一種組成物,其包含如[1]至[28]中任一項之蛋白質。
[46]一種套組,包含如[1]至[28]中任一項之蛋白質,或者如[45]之組成物。
[47]如[46]之套組,其係用以定量在經投予抗體-藥物結合物的哺乳動物中,抗體-藥物結合物及/或從該抗體-藥物結合物游離出的藥物的血漿中濃度。
[48]如[46]之套組,其係用以確認在經投予抗體-藥物結合物的哺乳動物中,抗體-藥物結合物及/或從該抗體-藥物結合物游離出的藥物的組織分布。
[49]一種抗體,其係包含下述重鏈及輕鏈而成,該重鏈包含由序列識別號15中胺基酸編號20至141記載的胺基酸序列構成的重鏈可變區,該輕鏈包含由序列識別號16中胺基酸編號21至127記載的胺基酸序列構成的輕鏈可變區。
[50]如[49]之抗體,其係包含下述重鏈及輕鏈而成,該重鏈是由序列識別號15中胺基酸編號20至477記載的胺基酸序列構成,該輕鏈是由序列識別號16中胺基酸編號21至234記載的胺基酸序列構成。
[51]如[49]之抗體,其係包含下述重鏈及輕鏈而成,該重鏈是由序列識別號19中胺基酸編號20至464記載的胺基酸序列構成,該輕鏈是由序列識別號20中胺基酸編號21至233記載的胺基酸序列構成。
依據本發明,提供了:一種會辨識以依喜替康的衍生物作為構成要素之抗體-藥物結合物的藥物部位之蛋白質;及一種使用該蛋白質之在經投予上述之抗體-藥物結合物的哺乳動物中定量該抗體-藥物結合物的血漿中濃度的方法及確認組織
分布的方法。
[圖1]顯示小鼠抗體1A3重鏈的胺基酸序列(序列識別號15)。
[圖2]顯示小鼠抗體1A3輕鏈的胺基酸序列(序列識別號16)。
[圖3]顯示編碼小鼠抗體1A3重鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列(序列識別號17)。
[圖4]顯示編碼小鼠抗體1A3輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列(序列識別號18)。
[圖5]顯示兔嵌合化抗體1A3重鏈的胺基酸序列(序列識別號19)。
[圖6]顯示兔嵌合化抗體1A3輕鏈的胺基酸序列(序列識別號20)。
[圖7]顯示抗HER2抗體重鏈的胺基酸序列(序列識別號21)。
[圖8]顯示抗HER2抗體輕鏈的胺基酸序列(序列識別號22)。
[圖9]顯示抗HER3抗體重鏈的胺基酸序列(序列識別號23)。
[圖10]顯示抗HER3抗體輕鏈的胺基酸序列(序列識別號24)。
[圖11]顯示抗TROP2抗體重鏈的胺基酸序列(序列識別號25)。
[圖12]顯示抗TROP2抗體輕鏈的胺基酸序列(序列識別號26)。
[圖13]顯示抗B7-H3抗體重鏈的胺基酸序列(序列識別號27)。
[圖14]顯示抗B7-H3抗體輕鏈的胺基酸序列(序列識別號28)。
[圖15]顯示在以小鼠抗體1A3作為捕捉試劑(capture reagent)的情況下,HER2-ADC(I)(DAR8)及HER2-ADC(I)(DAR4)的校準曲線。
[圖16]顯示在以小鼠抗體8B2作為捕捉試劑的情況下,HER2-ADC(I)(DAR8)及HER2-ADC(I)(DAR4)的校準曲線。
[圖17]顯示在以小鼠抗體11B1作為捕捉試劑的情況下,HER2-ADC(I)(DAR8)及HER2-ADC(I)(DAR4)的校準曲線。
[圖18]顯示在以小鼠抗體1A3作為檢測試劑的情況下,HER2-ADC(I)(DAR8)及HER2-ADC(I)(DAR4)的校準曲線。
[圖19]顯示在以小鼠抗體8B2作為檢測試劑的情況下,HER2-ADC(I)(DAR8)及HER2-ADC(I)(DAR4)的校準曲線。
[圖20]顯示在以小鼠抗體11B1作為檢測試劑的情況下,HER2-ADC(I)(DAR8)及HER2-ADC(I)(DAR4)的校準曲線。
[圖21]顯示在以小鼠抗體1A3作為檢測試劑的情況下,
B7-H3-ADC(I)(DAR8)及B7-H3-ADC(I)(DAR4)的校準曲線。
[圖22]顯示在以小鼠抗體8B2作為檢測試劑的情況下,B7-H3-ADC(I)(DAR8)及B7-H3-ADC(I)(DAR4)的校準曲線。
[圖23]顯示在以小鼠抗體11B1作為檢測試劑的情況下,B7-H3-ADC(I)(DAR8)及B7-H3-ADC(I)(DAR4)的校準曲線。
[圖24]顯示用以測定HER2-ADC(I)的小鼠血漿中濃度的校準曲線。
[圖25]顯示用以測定HER3-ADC(I)的猿血漿中濃度的校準曲線。
[圖26]顯示用以測定TROP2-ADC(I)的猿血漿中濃度的校準曲線。
[圖27]顯示用以測定B7-H3-ADC(I)的猿血漿中濃度的校準曲線。
[圖28]顯示編碼人類輕鏈訊息序列及人類κ鏈恒定區的胺基酸序列的核苷酸序列(序列識別號29)。
[圖29]顯示編碼兔嵌合化抗體1A3重鏈的胺基酸序列的核苷酸序列(序列識別號30)。
[圖30]顯示編碼兔嵌合化抗體1A3輕鏈的胺基酸序列的核苷酸序列(序列識別號31)。
[圖31]顯示抗GPR20抗體重鏈的胺基酸序列(序列識別號32)。
[圖32]顯示抗GPR20抗體輕鏈的胺基酸序列(序列識別號
33)。
[圖33]顯示抗CDH6抗體重鏈的胺基酸序列(序列識別號34)。
[圖34]顯示抗CDH6抗體輕鏈的胺基酸序列(序列識別號35)。
[圖35]顯示使用了兔嵌合化抗體1A3的免疫染色圖像。比較對已皮下移植過人類頭頸部癌細胞株FaDu的裸鼠投予了TROP2-ADC(I)或者Anti-TROP2 Ab之情況的染色圖像。
[圖36]顯示使用了兔嵌合化抗體1A3的免疫染色圖像。比較對已皮下移植過過度表現GPR20的人類胃腸道基質腫瘤(Gastrointestinal stromal tumor)細胞株GIST-T1/GPR20的裸鼠投予了GPR20-ADC(I)之情況,或者未投予之情況的染色圖像。
[圖37]顯示使用了小鼠抗體1A3的免疫染色圖像。比較對已皮下移植過由透明細胞型腎細胞癌患者所採取之腫瘤組織的裸鼠,投予了CDH6-ADC(I)之情況,或者未投予之情況的染色圖像。
[圖38]顯示使用了小鼠抗體1A3的免疫染色圖像。比較對已皮下移植過由透明細胞型腎細胞癌患者所採取之腫瘤組織的裸鼠,投予CDH6-ADC(I),並預先將小鼠抗體1A3與化合物(2)或者SN-38混合之後,使用於免疫染色之情況,或者,並非那樣的情況的染色圖像。
[圖39]顯示用以測定GPR20-ADC(I)的小鼠血漿中濃度的校準曲線。
[圖40]顯示用以測定HER2-ADC(I)的人類血清中濃度的
校準曲線。
[圖41]顯示競爭抑制用化合物對於小鼠抗體1A3辨識HER2-ADC(I)的抑制率。
以下,針對用以實施本發明的合適形態進行說明。再者,於以下說明的實施形態是顯示本發明代表性實施形態之一例,而本發明的範圍並不因此而受到限縮解釋。
在本發明中,所謂「蛋白質」是與「胜肽」或者「多肽」同義。
本發明之蛋白質,合適地是抗體或者抗體的抗原結合片段,但只要是與抗體同樣地具有會辨識抗原之機能的蛋白質的話,為抗體及抗體的抗原結合片段以外的蛋白質(抗體替代物(antibody alternative))亦可。就抗體替代物而言,可舉例如:纖維接合素(Fibronectin)、蛋白質A(ProteinA)、脂質載運蛋白(Lipocalin)、TrxA、A-domain、錨蛋白重複(Ankyrin repeat)、APPI、Ras-binding AF-6等支架蛋白(Kasper Binz H.et al.,Current Opinion in Biotechnology 2005,16:459-469,Kasper Binz H.et al.,Nature Biotechnology 23(10)2005,1257-1268,Skerra A.,Current Opinion in Biotechnology 2007,18:295-304,Nygren P.,FEBS Journal 275(2008)2668-2676,Gronwall C.et al.,Journal of Biotechnology 140(2009)254-269)。
在本發明中,所謂「抗體」表示具有會辨識特定抗原之機能的糖蛋白質。就抗體的具體例而言,可舉:多株抗體、單株抗體、嵌合抗體、兔源化抗體(rabbitized antibody)、人源化抗體、及人類抗體等。
在本發明中,有時將「抗原」用於「免疫原」的含意中。
在本發明中,所謂「抗體的抗原結合片段」是意指保持有會辨識抗原之機能的抗體部分片段,與「抗體的機能性片段」同義。就抗體的抗原結合片段而言,可舉例如:Fab、F(ab’)2、scFv、Fab’、單鏈免疫球蛋白(single strand immunoglobulin)等,但並非被限定於該等。這樣的抗體的機能性片段,在能夠透過將抗體的全長分子以木瓜酶(papain)、胃蛋白酶(pepsin)等酵素進行處理所獲得者之外,亦可為使用重組基因而在適當的宿主細胞所產生的重組蛋白質。
所謂本發明之蛋白質會「辨識」抗原,是意指本發明之蛋白質因分子間力(靜電交互作用、凡得瓦力、氫鍵等)而與抗原結合。本發明之蛋白質會「辨識」抗原是,例如,能夠透過檢測各種因免疫化學的手法產生的訊息而確認。
所謂本發明之蛋白質對於抗原的「辨識性」不同,是意指本發明之蛋白質對於抗原的鍵結的強度或性質實質上不同。本發明之蛋白質對於抗原的「辨識性」是否不同,例如,是能夠透過比較因各種免疫化學的手法產生的訊息的強度,或者透過比較表示抗原的濃度與訊息的強度之相關性的校準曲線而確認。
所謂本發明之蛋白質進行辨識的「部位」是意指
本發明之蛋白質進行辨識的對象中之特定的部分結構。亦有將本發明之蛋白質進行辨識的對象稱為「抗原」,並將本發明之蛋白質進行辨識之特定的部位稱為「表位(epitope)」。
已知在抗體的重鏈及輕鏈來說,分別有三處的互補決定區(CDR:Complementarity determining region)。互補決定區亦被稱為超變異區(hypervariable domain),是在抗體的重鏈及輕鏈的可變區內,且是一級結構的變異性特別高的部位,在重鏈及輕鏈之多肽鏈的一級結構上,通常分別分離為三處。在本發明來說,就抗體的互補決定區而言,是將重鏈的互補決定區自重鏈胺基酸序列的胺基末端側起標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3,並將輕鏈的互補決定區自輕鏈胺基酸序列之胺基末端側起標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。該等部位在立體結構上彼此接近,決定對抗原的專一性。
在本發明中,所謂「基因」意指包含編碼蛋白質之胺基酸的核苷酸序列之核苷酸或其互補鏈,例如,為含有編碼蛋白質之胺基酸的核苷酸序列之核苷酸或是其互補鏈的聚核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA、cRNA等是包含於「基因」的含意中。這樣的基因是單股、雙股或是三股以上的核苷酸,且DNA鏈與RNA鏈的聯合體(association)、在單股核苷酸鏈上混合存在核糖核苷酸(RNA)與去氧核糖核苷酸(DNA)者以及包含那樣之核苷酸鏈的雙股或是三股以上的核苷酸亦包含於「基因」的含意中。
在本發明中,「核苷酸」與「核酸」為同義,例如:DNA、RNA、探針、寡核苷酸、聚核苷酸、引子等亦包含於「核苷酸」的含意中。這樣的核苷酸是由單股、雙股或是三
股以上構成的核苷酸,且DNA鏈與RNA鏈的聯合體、在單股核苷酸鏈上混合存在核糖核苷酸(RNA)與去氧核糖核苷酸(DNA)者及包含那樣的核苷酸鏈之雙股或是三股以上的聯合體亦包含於「核苷酸」的含意中。
在本發明中,於「細胞」來說,亦包含源自動物個體的各種細胞、繼代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、重組細胞及微生物等。
在本發明中,所謂「抗體-藥物結合物」意指抗體與藥物是透過連接子而鍵結之鍵結體。
在本發明中,所謂「藥物連接子」意指抗體-藥物結合物之中,由連接子及藥物構成的部分結構。
本發明之蛋白質特徵是在於辨識下式
所示之藥物(以下稱為「化合物(1)」)、與抗體透過連接子而鍵結之抗體-藥物結合物(以下稱為「本發明涉及的抗體-藥物結合物」)的藥物部位。
化合物(1)是被稱為依喜替康(IUPAC名:(1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-1,2,3,9,12,15-六氫-9-羥基-4-
甲基-10H,13H-苯并[de]吡喃并[3’,4’:6,7]吲并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮((1S,9S)-1-amino-9-ethyl-5-fluoro-1,2,3,9,12,15-hexahydro-9-hydroxy-4-methyl-10H,13H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinoline-10,13-dione);(亦可表示為化學名稱:(1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3’,4’:6,7]吲并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮((1S,9S)-1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinoline-10,13(9H,15H)-dione)))的抗腫瘤藥,已知具有拓樸異構酶I抑制活性。
再者,本發明之蛋白質亦能夠辨識化合物(1)本身。
在本發明涉及的抗體-藥物結合物中之抗體無特別限制,可舉例如:抗HER2抗體、抗HER3抗體、抗TROP2抗體、抗B7-H3抗體、抗CD3抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD37抗體、抗CD56抗體、抗CD98抗體、抗DR5抗體、抗EGFR抗體、抗EPHA2抗體、抗FGFR2抗體、抗FGFR4抗體、抗FOLR1抗體、抗VEGF抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD70抗體、抗PSMA抗體、抗CEA抗體、抗間皮素(Mesothelin)抗體、抗A33抗體、抗CanAg抗體、抗Cripto抗體、抗G250抗體、抗MUC1抗體、抗GPNMB抗體、抗整合素(Integrin)抗體、抗肌腱蛋白-C(Tenascin-C)抗體、抗SLC44A4抗體、抗GPR20抗體、及抗CDH6抗體;合適地可舉:抗HER2抗體、抗HER3抗體、
抗TROP2抗體、抗B7-H3抗體、抗GPR20抗體、及抗CDH6抗體。
在本發明中,所謂「抗HER2抗體」是會專一性地鍵結至HER2(人類表皮生長因子受體第2型(Human Epidermal Growth Factor Receptor Type 2);ErbB-2),較佳表示具有會因與HER2鍵結而內化至HER2表現細胞之活性的抗體。
就抗HER2抗體而言,可舉例如:曲妥珠單抗(Trastuzumab)(美國專利第5821337號)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)(國際公開第01/00245號),合適地可舉:曲妥珠單抗。
在本發明中,所謂「抗HER3抗體」是會專一性地鍵結於HER3(人類表皮生長因子受體第3型(Human Epidermal Growth Factor Receptor Type 3);ErbB-3),較佳表示具有會因與HER3鍵結而內化至HER3表現細胞之活性的抗體。
就抗HER3抗體而言,可舉例如:帕曲妥單抗(Patritumab;U3-1287)、U1-59(國際公開第2007/077028號)、MM-121(絲里班圖單抗(Seribantumab))、國際公開2008/100624號記載之抗ERBB3抗體、RG-7116(倫雪珠單抗(Lumretuzumab))、及LJM-716(依根妥單抗(Elgemtumab)),合適地可舉:帕曲妥單抗、及U1-59。
在本發明中,所謂「抗TROP2抗體」是會專一性地鍵結於TROP2(TACSTD2:腫瘤關聯鈣訊息傳遞因子2(Tumor-associated calcium signal transducer 2);EGP-
1),較佳表示具有會因與TROP2鍵結而內化至TROP2表現細胞之活性的抗體。
就抗TROP2抗體而言,可舉例如:hTINA1-H1L1(國際公開第2015/098099號)。
在本發明中,所謂「抗B7-H3抗體」是會專一性地鍵結於B7-H3(B細胞抗原# 7同源物(B cell antigen # 7 homolog)3;PD-L3;CD276),較佳表示具有會因與B7-H3鍵結而內化至B7-H3表現細胞之活性的抗體。
就抗B7-H3抗體而言,可舉例如:M30-H1-L4(國際公開第2014/057687號)。
在本發明中,所謂「抗GPR20抗體」是會專一性地鍵結於GPR20(G蛋白耦合受體20(G Protein-coupled receptor 20)),較佳表示具有會因與GPR20鍵結而內化至GPR20表現細胞之活性的抗體。
就抗GPR20抗體而言,可舉例如:h046-H4e/L7(國際公開第2018/135501號)。
在本發明中,所謂「抗CDH6抗體」是會專一性地鍵結於CDH6(黏附蛋白-6(Cadherin-6)),較佳表示具有會因與CDH6鍵結而內化至CDH6表現細胞之活性的抗體。
就抗CDH6抗體而言,可舉例如:H01L02(國際公開第2018/212136號)。
本發明之蛋白質,合適地是特徵係在於會專一性地辨識:
具有下式
所示之藥物連接子之抗體-藥物結合物(以下稱為「抗體-藥物結合物(I)」)的藥物部位
(式中,A表示與抗體的鍵結位置,且該藥物連接子是透過硫醚鍵與抗體鍵結)、
具有下式
所示之藥物連接子之抗體-藥物結合物(以下稱為「抗體-藥物結合物(II)」)的藥物部位
(式中,A表示與抗體的鍵結位置,且該藥物連接子是透過硫醚鍵與抗體鍵結)、或
具有下式
所示之藥物連接子之抗體-藥物結合物(以下,稱為「抗體-藥物結合物(III)」)的藥物部位
(式中,A表示與抗體的鍵結位置,且該藥物連接子是透過硫醚鍵與抗體鍵結)。
抗體-藥物結合物(I)~(III)的藥物連接子是鍵結於在抗體的鏈間的雙硫鍵部位(2處的重鏈-重鏈間,及2處的重鏈-輕鏈間)產生的硫醇基(換言之,半胱胺酸殘基的硫原子)。
本發明之蛋白質,更合適地,特徵係在於會專一性地辨識抗體-藥物結合物(I)的藥物部位。
抗體-藥物結合物(I)亦能以下式表示。
於此處,藥物連接子是藉由硫醚鍵而與抗體鍵結。又,n是與所謂的平均藥物鍵結數(DAR;Drug-to-
Antibody Ratio)同義,表示每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數。
再者,本發明涉及的抗體-藥物結合物之抗體每一分子的平均藥物鍵結數的算出,例如,能夠透過下述方法進行:藉由測定在280nm及370nm這二波長中抗體-藥物結合物與其結合作用前驅物的UV吸光度而算出的方法(UV法),或者透過HPLC測定來定量經以還原劑處理抗體-藥物結合物所獲得之各斷片(fragment)並算出的方法(HPLC法)。
抗體-藥物結合物(I)是在轉移至癌細胞內之後,連接子部分被剪切,而游離下式
所示之化合物(以下稱為「化合物(2)」)。
化合物(2)被認為是藉由剪切本發明所使用之抗體-藥物結合物的連接子部分而產生之下式
所示之化合物(以下稱為「化合物(3)」)的胺縮醛(aminal)結構進行分解,藉此而產生。
化合物(2)被認為是抗體-藥物結合物(I)的抗腫瘤活性之本體,已被確認具有拓樸異構酶I抑制作用(Ogitani Y.et al.,Clinical Cancer Research,2016,Oct 15;22(20):5097-5108,Epub 2016 Mar 29)。
再者,本發明之蛋白質亦能夠辨識從抗體-藥物結合物(I)游離出的化合物(2)本身。
抗體-藥物結合物(II)亦能以下式表示。
於此處,藥物連接子是透過硫醚鍵而與抗體鍵結。又,n與DAR同義,表示每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數。
抗體-藥物結合物(II)是在轉移至癌細胞內之後,連接子部分被剪切,而游離下式
所示之化合物(以下稱為「化合物(4)」)。
再者,本發明之蛋白質亦能夠辨識從抗體-藥物結
合物(II)游離出的化合物(4)本身。
抗體-藥物結合物(III)亦能以下式表示。
於此處,藥物連接子是透過硫醚鍵而與抗體鍵結。又,n是與DAR同義,表示每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數。
抗體-藥物結合物(III)是在轉移至癌細胞內之後,連接子部分被剪切,而游離下式
所示之化合物(以下稱為「化合物(5)」)。
再者,本發明之蛋白質亦能夠辨識從抗體-藥物結合物(III)游離出的化合物(5)本身。
在本發明中,所謂「抗HER2抗體-藥物結合物」是表示在本發明涉及的抗體-藥物結合物中的抗體為抗HER2抗體的抗體-藥物結合物。
抗HER2抗體合適地是:包含由序列識別號21中
胺基酸編號1至449記載的胺基酸序列構成之重鏈及由序列識別號22中胺基酸編號1至214記載的胺基酸序列構成之輕鏈而成之抗體;或者是包含由序列識別號21記載的胺基酸序列構成之重鏈及由序列識別號22記載的胺基酸序列構成之輕鏈而成之抗體。
抗HER2抗體-藥物結合物之每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數,合適地是從2至8,更合適地是從3至8,進一步更合適地是從7至8,進一步更合適地是從7.5至8,進一步更合適地是約8。
抗HER2抗體-藥物結合物能夠參考國際公開第2015/115091號等的記載而製造。
在本發明中,所謂「抗HER3抗體-藥物結合物」是表示在本發明涉及的抗體-藥物結合物中的抗體是抗HER3抗體的抗體-藥物結合物。
抗HER3抗體合適地是含有下述重鏈、以及輕鏈的抗體:該重鏈包含由序列識別號23中胺基酸編號26至35記載的胺基酸序列構成的CDRH1、由序列識別號23中胺基酸編號50至65記載的胺基酸序列構成的CDRH2、及由序列識別號23中胺基酸編號98至106記載的胺基酸序列構成的CDRH3,該輕鏈包含由序列識別號24中胺基酸編號24至39記載的胺基酸序列構成的CDRL1、由序列識別號24中胺基酸編號56至62記載的胺基酸序列構成的CDRL2、及由序列識別號24中胺基酸編號95至103記載的胺基酸序列構成的CDRL3;
更合適地是包含下述重鏈及輕鏈之抗體:該重鏈包含由序列識別號23中胺基酸編號1至117記載的胺基酸序列構成的重
鏈可變區;該輕鏈包含由在該序列識別號24中胺基酸編號1至113記載的胺基酸序列構成的輕鏈可變區;
進一步更合適地是:包含由序列識別號23記載的胺基酸序列構成之重鏈、及由序列識別號24記載的胺基酸序列構成之輕鏈而成之抗體;或者是該抗體之重鏈羧基末端的離胺酸殘基缺失的抗體。
抗HER3抗體-藥物結合物之每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數,合適地是從2至8,更合適地是從3至8,進一步更合適地是從7至8,進一步更合適地是從7.5至8,進一步更合適地是約8。
抗HER3抗體-藥物結合物是能夠參考國際公開第2015/155998號等的記載而製造。
在本發明中,所謂「抗TROP2抗體-藥物結合物」是表示在本發明涉及的抗體-藥物結合物中的抗體為抗TROP2抗體的抗體-藥物結合物。
抗TROP2抗體,合適地是包含下述重鏈以及輕鏈的抗體:該重鏈包含由序列識別號25中胺基酸編號50至54記載的胺基酸序列構成的CDRH1、由序列識別號25中胺基酸編號69至85記載的胺基酸序列構成的CDRH2、及由序列識別號25中胺基酸編號118至129記載的胺基酸序列構成的CDRH3,該輕鏈包含由序列識別號26中胺基酸編號44至54記載的胺基酸序列構成的CDRL1、由序列識別號26中胺基酸編號70至76記載的胺基酸序列構成的CDRL2、及由序列識別號26中胺基酸編號109至117記載的胺基酸序列構成的CDRL3;
更合適地是包含下述重鏈及輕鏈的抗體:該重鏈包含由序列識別號25中胺基酸編號20至140記載的胺基酸序列構成的重鏈可變區,該輕鏈包含由序列識別號26中胺基酸編號21至129記載的胺基酸序列構成的輕鏈可變區;
進一步更合適地是:包含由序列識別號25中胺基酸編號20至470記載的胺基酸序列構成之重鏈、及由序列識別號26中胺基酸編號21至234記載的胺基酸序列構成之輕鏈而成之抗體;或者,該抗體的重鏈羧基末端的離胺酸殘基缺失的抗體。
抗TROP2抗體-藥物結合物之每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數,合適地是從2至8,更合適地是從3至5,進一步更合適地是從3.5至4.5,進一步更合適地是約4。
抗TROP2抗體-藥物結合物能夠參考國際公開第2015/098099號等的記載而製造。
在本發明中,所謂「抗B7-H3抗體-藥物結合物」是表示在本發明涉及的抗體-藥物結合物中的抗體為抗B7-H3抗體的抗體-藥物結合物。
抗B7-H3抗體,合適地是包含下述重鏈以及輕鏈的抗體:該重鏈包含由序列識別號27中胺基酸編號50至54記載的胺基酸序列構成的CDRH1、由序列識別號27中胺基酸編號69至85記載的胺基酸序列構成的CDRH2、及由序列識別號27中胺基酸編號118至130記載的胺基酸序列構成的CDRH3,該輕鏈包含由序列識別號28中胺基酸編號44至53記載的胺基酸序列構成的CDRL1、由序列識別號28中胺基酸編號69至75記載的胺基酸序列構成的CDRL2、及由序列識別號28中胺基酸編號108至116記載的胺基酸序列構成的
CDRL3;
更合適地是包含下述重鏈、及輕鏈的抗體:該重鏈包含由序列識別號27中胺基酸編號20至141記載的胺基酸序列構成的重鏈可變區,該輕鏈包含由序列識別號28中胺基酸編號21至128記載的胺基酸序列構成的輕鏈可變區;
進一步更合適地是:包含由序列識別號27中胺基酸編號20至471記載的胺基酸序列構成之重鏈、及由序列識別號28中胺基酸編號21至233記載的胺基酸序列構成之輕鏈而成之抗體;或者,該抗體的重鏈羧基末端的離胺酸殘基缺失的抗體。
抗B7-H3抗體-藥物結合物之每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數,合適地是從2至8,更合適地是從3至5,進一步更合適地是從3.5至4.5,進一步更合適地是約4。
抗B7-H3抗體-藥物結合物能夠參考國際公開第2014/057687號等的記載而製造。
在本發明中,所謂「抗GPR20抗體-藥物結合物」是表示在本發明涉及的抗體-藥物結合物中的抗體為抗GPR20抗體的抗體-藥物結合物。
抗GPR20抗體,合適地是包含下述重鏈、以及輕鏈的抗體:該重鏈包含由序列識別號32中胺基酸編號45至54記載的胺基酸序列構成的CDRH1、由序列識別號32中胺基酸編號69至78記載的胺基酸序列構成的CDRH2、及由序列識別號32中胺基酸編號118至131記載的胺基酸序列構成的CDRH3,該輕鏈包含由序列識別號33中胺基酸編號44至54記載的胺基酸序列構成的CDRL1、由序列識別號33中胺基酸編號70至76記載的胺基酸序列構成的CDRL2、及由序列識別
號33中胺基酸編號109至117記載的胺基酸序列構成的CDRL3;
更合適地是包含下述重鏈及輕鏈的抗體:該重鏈包含由序列識別號32中胺基酸編號20至142記載的胺基酸序列構成的重鏈可變區,該輕鏈包含由序列識別號33中胺基酸編號21至129記載的胺基酸序列構成的輕鏈可變區;
進一步更合適地是:包含由序列識別號32中胺基酸編號20至472記載的胺基酸序列構成之重鏈、及由序列識別號33中胺基酸編號21至234記載的胺基酸序列構成之輕鏈而成之抗體;或者,該抗體的重鏈羧基末端的離胺酸殘基缺失的抗體。
抗GPR20抗體-藥物結合物之每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數,合適地是從2至8,更合適地是從3至8,進一步更合適地是從7至8,進一步更合適地是從7.5至8,進一步更合適地是約8。
抗GPR20抗體-藥物結合物是能夠參考國際公開第2018/135501號等的記載而製造。
在本發明中,所謂「抗CDH6抗體-藥物結合物」是表示在本發明涉及的抗體-藥物結合物中的抗體為抗CDH6抗體的抗體-藥物結合物。
抗CDH6抗體合適地是包含下述重鏈以及輕鏈的抗體:該重鏈包含由序列識別號34中胺基酸編號45至54記載的胺基酸序列構成的CDRH1、由序列識別號34中胺基酸編號69至78記載的胺基酸序列構成的CDRH2、及由序列識別號34中胺基酸編號118至130記載的胺基酸序列構成的CDRH3,該輕鏈包含由序列識別號35中胺基酸編號44至54記載的胺基
酸序列構成的CDRL1、由序列識別號35中胺基酸編號70至76記載的胺基酸序列構成的CDRL2、及由序列識別號35中胺基酸編號109至116記載的胺基酸序列構成的CDRL3;
更合適地是包含下述重鏈及輕鏈的抗體:該重鏈包含由序列識別號34中胺基酸編號20至141記載的胺基酸序列構成的重鏈可變區,該輕鏈包含由序列識別號35中胺基酸編號21至128記載的胺基酸序列構成的輕鏈可變區;
進一步更合適地是:包含由序列識別號34中胺基酸編號20至471記載的胺基酸序列構成之重鏈、及由序列識別號35中胺基酸編號21至233記載的胺基酸序列構成之輕鏈而成之抗體;或者,該抗體的重鏈羧基末端的離胺酸殘基缺失的抗體。
抗CDH6抗體-藥物結合物之每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數,合適地是從2至8,更合適地是從3至8,進一步更合適地是從7至8,進一步更合適地是從7.5至8,進一步更合適地是約8。
抗CDH6抗體-藥物結合物能夠參考國際公開第2018/212136號等的記載而製造。
本發明之蛋白質合適地能夠以抗體(以下稱為「本發明之抗體」)的形式取得。本發明之抗體是能夠藉由下述而獲得:將化合物(1)或其衍生物與載體蛋白透過連接子而鍵結之抗原蛋白質對動物進行免疫,採取在活體內所產生的抗體並進行純化。
上述之抗原蛋白質,例如能夠使用將載體蛋白附加至下式
所示之化合物(以下稱為「化合物(6)」)而成之物。
就載體蛋白而言,即使是如低分子化合物及胜肽般之小的抗原,只要是能夠誘發免疫反應般的蛋白質的話,未被特別限定,例如可使用:牛甲狀腺球蛋白、及牛血清白蛋白(BSA)、及鑰孔帽貝血藍素(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)。
所獲得之抗血清能夠藉由使用了陽性對照及陰性對照之ELISA法,而挑選具有所期望之性質者。
就陽性對照而言,可舉例如:化合物(1)、化合物(2)、化合物(6),可挑選可觀察到由該等的陽性對照所致之高的抑制(inhibition)效果的抗血清。
再者,已知:化合物(1)具有的內酯環,在酸性水性溶劑中(例如pH3左右)平衡偏向閉環體,在鹼性水性溶劑中(例如pH10左右)則平衡偏向開環體;但從挑選與內酯環的開閉無關而會辨識化合物(1)之基本骨架本身之抗體的觀點來看,內酯環經還原過的化合物,例如下式
所示之化合物(以下稱為「化合物(7)」)亦能夠作為陽性對照使用;能夠挑選可觀察到由此陽性對照所致之高的抑制效果的抗血清。惟,從挑選會同程度地辨識化合物(1)與化合物(7)之抗體的觀點來看,對化合物(7)的辨識性相較化合物(1)是特別高的抗體較佳是除外。
進一步,本發明涉及的抗體-藥物結合物(合適地是抗體-藥物結合物(I)、(II)、及(III))亦能夠作為陽性對照使用,能夠挑選可觀察到由該等陽性對照所致之高的抑制效果的抗血清。
另一方面,從要把會辨識從化合物(1)的基本骨架脫離的部分之抗體除外的觀點來看,例如,能夠使用由連接子附近之部分結構的,環己烷環構成的化合物之式
所示之化合物(以下稱為「化合物(8)」)作為陰性對照。
能夠把可觀察到因該陰性對照所致之高的抑制效果的抗血清除外。
透過選殖如以上般進行而挑選出之抗血清,而能夠取得會產生本發明之抗體的細胞。
接著,能夠按照公知的方法(例如,Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497,Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibodies,p.365-367,Plenum Press,N.Y.(1980)),藉由使得會產生本發明之抗體之細胞與骨髓瘤細胞(myeloma cell)融合而建立融合瘤,而獲得單株抗體。這般之方法的具體例,被記載於國際公開第WO09/48072號小冊(2009年4月16日公開)及第WO10/117011號(2010年10月14日公開)小冊。
所獲得之抗體可進行純化至均勻。抗體的分離、純化是使用通常在蛋白質所使用之分離、純化方法即可。例如適宜選擇、組合:管柱層析、過濾器過濾、超過濾、鹽析、透析、製備用聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電聚焦電泳(isoelectric focusing electrophoresis)等的話,能夠將抗體予以分離、純化(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996),Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)),但並非被限定於該等。
就層析法而言可舉:親和力層析法、離子交換層析法、疏水性層析法、凝膠過濾層析法、逆相層析法、吸附層析法等。該等層析法能夠使用HPLC或FPLC等液體層析法而進行。就使用於親和力層析法的管柱而言,可舉:蛋白質A(Protein A)管柱、蛋白質G(Protein G)管柱。例如作為蛋白質A(Protein A)管柱,可舉:Hyper D、POROS、
SepharoseF.F.(Pharmacia)等。又,亦能夠使用已固定化有抗原的載體,利用對於抗原的鍵結性而純化抗體。
進一步,本發明之抗體,合適地特徵是在於:對於該抗體-藥物結合物的辨識性實質上不會因在本發明涉及的抗體-藥物結合物中的每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數(DAR)的差異而不同。是具有這樣的性質之抗體一事,例如,是可將對於高DAR(DAR8)之抗體-藥物結合物的校準曲線,與對低DAR(DAR4)之抗體-藥物結合物的校準曲線進行比較,實質上無差異,藉此而確認。
就如此進行所取得之本發明之抗體的實例而言,可舉:小鼠抗體1A3。小鼠抗體1A3之重鏈可變區的胺基酸序列是顯示在序列識別號15中胺基酸編號20至141記載的胺基酸序列,編碼其之核苷酸序列是顯示在序列識別號17中核苷酸編號58至423記載的核苷酸序列。小鼠抗體1A3之輕鏈可變區的胺基酸序列是顯示在序列識別號16中胺基酸編號21至127記載的胺基酸序列,編碼其之核苷酸序列是顯示在序列識別號18中核苷酸編號61至381記載的核苷酸序列。
本發明之抗體,是保持源自小鼠抗體1A3之6種全部的CDR序列,且是會專一性地辨識本發明涉及的抗體-藥物結合物之藥物部位的抗體即可。CDR序列的確定來說,已知數種方法,可舉例如:Abm的定義、Chothia的定義、Kabat的定義、及Imgt(註冊商標)(The international ImMunoGeneTics information system(註冊商標))的定義。本發明之抗體的CDR序列可為透過任一方法所定義者。
依Abm的定義的話,本發明之抗體的重鏈可變區
是保有由序列識別號1所示之胺基酸序列構成之CDRH1(GFTFSDYGMV)、由序列識別號2所示之胺基酸序列構成之CDRH2(YISSGSSAIY)、及由序列識別號3所示之胺基酸序列構成之CDRH3(PPRYDVYSAWFAY),本發明之抗體的輕鏈可變區是保有由序列識別號4所示之胺基酸序列構成之CDRL1(KASQDVGSAVV)、由序列識別號5所示之胺基酸序列構成之CDRL2(WASTRHT)、及由序列識別號6所示之胺基酸序列構成之CDRL3(QQYSSYPVT)。
依Chothia的定義的話,本發明之抗體的重鏈可變區是保有由序列識別號7所示之胺基酸序列構成之CDRH1(GFTFSDY)、由序列識別號8所示之胺基酸序列構成之CDRH2(SSGSSA)、及由序列識別號3所示之胺基酸序列構成之CDRH3(PPRYDVYSAWFAY),本發明之抗體的輕鏈可變區是保有由序列識別號4所示之胺基酸序列構成之CDRL1(KASQDVGSAVV)、由序列識別號5所示之胺基酸序列構成之CDRL2(WASTRHT)、及由序列識別號6所示之胺基酸序列構成之CDRL3(QQYSSYPVT)。
依Kabat的定義的話,本發明之抗體的重鏈可變區是保有由序列識別號9所示之胺基酸序列構成之CDRH1(DYGMV)、由序列識別號10所示之胺基酸序列構成之CDRH2(YISSGSSAIYYADTVKG)、及由序列識別號3所示之胺基酸序列構成之CDRH3(PPRYDVYSAWFAY),本發明之抗體的輕鏈可變區是保有由序列識別號4所示之胺基酸序列構成之CDRL1(KASQDVGSAVV)、由序列識別號5所示之胺基酸序列構成之CDRL2(WASTRHT)、及由序列識別號6所示之
胺基酸序列構成之CDRL3(QQYSSYPVT)。
依Imgt(註冊商標)的定義的話,本發明之抗體的重鏈可變區是保有由序列識別號11所示之胺基酸序列構成之CDRH1(GFTFSDYG)、由序列識別號12所示之胺基酸序列構成之CDRH2(ISSGSSAI)、及由序列識別號13所示之胺基酸序列構成之CDRH3(ARPPRYDVYSAWFAY),本發明之抗體的輕鏈可變區是保有由序列識別號14所示之胺基酸序列構成之CDRL1(QDVGSA),由WAS(色胺酸-丙胺酸-絲胺酸)所示之三肽構成的CDRL2、及由序列識別號6所示之胺基酸序列構成之CDRL3(QQYSSYPVT)。
在本發明之抗體來說,在上述的單株抗體之外,亦包含:以降低異種抗原性等為目標而經人為改變之基因重組型抗體,例如:嵌合(Chimeric)抗體、人源化(Humanized)抗體、或者兔源化(Rabbit type)抗體、小鼠源化抗體等。該等抗體能夠使用已知的方法而製造。
就嵌合抗體而言,可舉:抗體的可變區與恒定區互為異種之抗體,例如:把源自小鼠或者大鼠之抗體的可變區接合至源自人類的恒定區而成的嵌合抗體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984))。又,就其它的例而言,可舉:把源自小鼠或者大鼠之抗體的可變區接合至源自兔的恒定區而成的嵌合抗體(兔嵌合化抗體)。
就兔嵌合化抗體更具體的例而言,可舉由包含下述重鏈以及輕鏈構成的抗體(兔嵌合化抗體1A3):該重鏈是由包含源自小鼠抗體1A3的重鏈可變區與兔抗體重鏈的恒定區構成,該輕鏈是由包含源自小鼠抗體1A3抗體的輕鏈可變區與兔
抗體輕鏈的恒定區構成。兔嵌合化抗體1A3的重鏈是由序列識別號19中胺基酸編號20至464記載的胺基酸序列構成,兔嵌合化抗體1A3的輕鏈是由序列識別號20中胺基酸編號21至233記載的胺基酸序列構成。
多使用小鼠作為癌症研究的非臨床動物模型,當使用了小鼠抗體的情況,為了避免與內源性小鼠IgG的競爭,使用方法變得會受到限定。於是,透過使用兔嵌合化抗體,將源自小鼠之樣品、源自人類之樣品兩者在同一平台下變得能夠比較評價,對於轉譯研究(translational research)可變得有用。
就人源化抗體而言,可舉:僅將互補決定區(CDR;complementarity determining region)組入至源自人類之抗體而成的抗體(參照Nature(1986)321,p.522-525)、在CDR的序列之外亦將一部分的框架的胺基酸殘基移植至人類抗體而成的抗體(國際公開第WO90/07861號小冊)。就兔源化抗體而言,可舉:僅將互補決定區(CDR;complementarity determining region)組入至源自兔之抗體而成的抗體、在CDR的序列之外亦將一部分的框架的胺基酸殘基移植至兔抗體而成的抗體。
再者,已知在哺乳類培養細胞所生產之抗體的重鏈的羧基末端的離胺酸殘基缺失(Journal of Chromatography A,705:129-134(1995)),又,同樣地已知重鏈羧基末端的甘胺酸、離胺酸這2個胺基酸殘基缺失,且新位於羧基末端的脯胺酸殘基被醯胺化(Analytical Biochemistry,360:75-83(2007))。惟該等重鏈序列的缺失及修飾,不會對抗體的抗原
結合能力及效應子功能(effector function)(補體的活化及抗體依賴性細胞毒殺作用等)造成影響。因此,在本發明來說亦包含經受該修飾的抗體,可舉:在重鏈羧基末端中1或者2個胺基酸經缺失的缺失體、及經醯胺化的該缺失體(例如,羧基末端部位的脯胺酸殘基經醯胺化的重鏈)等。惟,只要保有抗原結合能力及效應子功能,本發明涉及的抗體重鏈之羧基末端的缺失體並不被限定於上述的種類。構成本發明涉及的抗體的2條的重鏈,可為選擇自於由完全長及上述之缺失體構成之群組的重鏈的任一種,亦可為組合任二種而得者。各缺失體的量比雖可能受到產生本發明涉及的抗體之哺乳類培養細胞的種類及培養條件的影響,但就本發明涉及的抗體之主成分而言,可舉:在2條重鏈雙方羧基末端的1個胺基酸殘基是缺失的情況。
本發明之抗體,是維持著本發明之抗體的性質的話,亦可為由帶有與小鼠抗體1A3或者兔嵌合化抗體1A3的胺基酸序列至少95%的同一性(合適地是至少99%的同一性)的胺基酸序列構成的抗體。
二種類的胺基酸序列間的同一性能夠透過使用Blast(Nucl.Acids Res.,25,p.3389-3402(1997))的預設參數(default parameter)而確定。Blast亦可透過利用網際網路存取www.ncbi.nlm.nih.gov/blast而使用。
又,針對對於在本發明涉及的抗體-藥物結合物中之藥物部位的辨識性,本發明之抗體亦可是會與小鼠抗體1A3或者兔嵌合化抗體1A3競爭的抗體。
透過以上方法所獲得之抗體,能夠針對對於在本發明涉及的抗體-藥物結合物中之藥物部位的辨識性進行評價,
並選出合適的抗體。就比較抗體的性質之際之另外之指標的一例而言,可舉:抗體的穩定性。示差掃描熱析儀(DSC)是能夠快速又正確地測定會是蛋白之相對結構穩定性之良好指標的熱變性中點(Tm)的方法。使用DSC來測定Tm值,比較該值,藉此可比較熱穩定性的差異。已知抗體的保存穩定性與抗體的熱穩定性顯示某種程度的相關性(Lori Burton,et.al.,Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,p.265-273),以熱穩定性作為指標,能夠選出合適的抗體。就用以選出抗體的其它指標而言,可舉:在適切的宿主細胞中產量高、及在水溶液中的凝聚性低。例如,產量最高的抗體並不一定會顯示最高的熱穩定性,因此需要基於以上敘述的指標進行綜合性地判斷而選出最適合的抗體。
又,亦已知使用適切的連接子來連結抗體的重鏈及輕鏈的全長序列,來取得單鏈免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)的方法(Lee,H-S,et al.,Molecular Immunology(1999)36,p.61-71,Shirrmann,T.et al.,mAbs(2010),2,(1)p.1-4)。這樣的單鏈免疫球蛋白透過進行二聚體化,能夠保持與原來為四聚體的抗體類似的結構與活性。又,本發明之抗體亦可為具有單一的重鏈可變區且不具有輕鏈序列的抗體。這樣的抗體被稱為單域抗體(single domain antibody:sdAb)或者奈米抗體(nanobody),已被報告實際上在駱駝或者駱馬被觀察到,保持有抗原結合能力(Muyldemans S.et al.,Protein Eng.(1994)7(9),1129-35,Hamers-Casterman C.et al.,Nature(1993)363(6428)446-8)。上述之抗體亦可解釋為本發明中之抗體的抗原結合性片段的一
種。
在暫時將抗體基因單離後,導入至適當的宿主而製作抗體的情況來說,能夠使用適當的宿主與表現載體的組合。就抗體基因的具體例而言,可舉:組合了於本說明書所記載之編碼抗體之重鏈序列的基因,及編碼輕鏈序列的基因而成者。在將宿主細胞進行形質轉換之際來說,重鏈序列基因與輕鏈序列基因是能夠被插入至同一表現載體,又亦可能被插入至各別的表現載體。當使用真核細胞作為宿主的情況,可使用:動物細胞、植物細胞、真核微生物。就動物細胞而言,(1)哺乳類細胞,可舉例如:為猿的細胞之COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182,ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)及中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞,ATCC CCL-61)的二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)。又,當使用原核細胞的情況,可舉例如:大腸菌、枯草菌。透過形質轉換將把為目標的抗體基因導入至該等細胞,透過在體外(in vitro)培養被形質轉換過的細胞可獲得抗體。在以上的培養法來說,有因抗體的序列而產量不同的情況,能夠從帶有同等之鍵結活性的抗體之中以產量為指標挑選作為醫藥的生產是容易者。
本發明之抗體就同型(isotype)來說沒有限制,可舉例如:IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD或者是IgE等,可較佳列舉:IgG或者IgM,進一步可較佳列舉:IgG1或者IgG2。
又,本發明之抗體亦可為具有抗體之抗原結合部
的抗體之抗原結合性片段或者其修飾物。或利用木瓜酶、胃蛋白酶等蛋白質分解酵素處理抗體,或者是透過基因工程手法來改變抗體基因,而使在適當的培養細胞中表現,而能夠獲得該抗體的片段。在這樣的抗體片段之中,能夠把保持有抗體全長分子所帶有之機能全部或者一部分的片段稱為抗體的抗原結合性片段。
例如,就抗體的片段而言,可舉:Fab、F(ab’)2、Fv、或者利用適當的連接子使重鏈及輕鏈的Fv連結而成的單鏈Fv(scFv)、雙體抗體(diabody;diabodies)、線狀抗體、及由抗體片段所形成之多專一性抗體等。又,作為在還原條件下處理過F(ab’)2而成的抗體之可變區的一價片段的Fab’亦包含於抗體的片段。
進一步,本發明之抗體亦可為對於至少2種類不同抗原具有專一性的多專一性抗體。通常這樣的分子是會鍵結於2種類的抗原者(即,雙專一性抗體(bispecific antibody)),本發明中之「多專一性抗體」是包含對於其以上(例如,3種類)的抗原具有專一性的抗體。
本發明之多專一性抗體可為由全長構成的抗體,或者那樣的抗體的片段(例如,F(ab’)2雙專一性抗體)。雙專一性抗體亦能夠使2種類抗體的重鏈與輕鏈(HL對)鍵結而製作,而透過使得會產生不同單株抗體的融合瘤融合而製作會產生雙專一性抗體之融合細胞亦可製作(Millstein et al.,Nature(1983)305,p.537-539)。
本發明之抗體可為單鏈抗體(亦記載為scFv)。單鏈抗體可透過利用多肽的連接子來連結抗體的重鏈可變區與輕
鏈可變區而獲得(Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113(Rosenberg及Moore編、Springer Verlag,New York,p.269-315(1994)、Nature Biotechnology(2005),23,p.1126-1136)。又,亦能夠把利用多肽連接子使2個scFv鍵結所製作之BiscFv片段作為雙專一性抗體使用。
製作單鏈抗體的方法是本技術領域所周知(參照例如:美國專利第4,946,778號、美國專利第5,260,203號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,455,030號等)。在此scFv中,重鏈可變區與輕鏈可變區是透過不會作出結合物般的連接子所連結,較佳為透過多肽連接子所連結(Huston,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988),85,p.5879-5883)。在scFv中之重鏈可變區及輕鏈可變區可源自同一抗體,亦可源自各別的抗體。就連結可變區的多肽連接子而言,例如可使用由12~19殘基構成的任意的單鏈胜肽。
編碼scFv的DNA是可透過下述而獲得:把編碼前述抗體的重鏈或者重鏈可變區之DNA及編碼輕鏈或者輕鏈可變區之DNA中,編碼該等序列之中全部或者所期望的胺基酸序列的DNA部分作為模板,並使用規定其兩端的引子對而透過PCR法進行擴增,接著,進一步把編碼多肽連接子部分的DNA、及以使得其兩端分別與重鏈、輕鏈連結的方式規定的引子對予以組合,而進行擴增。
又,若編碼scFv的DNA一旦被製作,則可按照常法獲得含有該等的表現載體,及由該表現載體被形質轉換過的宿主,又,透過使用其之宿主,可按照常法獲得scFv。該等
抗體片段能夠與前述同樣地進行而取得基因並使表現,並透過宿主而使之產生。
本發明之抗體亦可為進行大量化而提高了對抗原的親和性者。就進行大量化的抗體而言,可為1種類的抗體,亦可為會辨識同一抗原的多個表位的多個抗體。就將抗體進行大量化的方法而言,可舉:IgG CH3結構域與2個scFv的鍵結、與鏈霉親和素(streptavidin)的鍵結、螺旋-轉角-螺旋模體(helix-turn-helix motif)的導入等。
本發明之抗體亦可為多株抗體,其係胺基酸序列不同的多種類之抗體的混合物。就多株抗體之一例而言,可舉:CDR不同之多種類抗體的混合物。就那樣的多株抗體而言,可使用:將產生不同抗體之細胞的混合物予以培養,並從該培養物所純化出的抗體(參照WO2004/061104號)。
亦能夠使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子鍵結的抗體作為抗體的修飾物。
本發明之抗體,進一步亦可是該等抗體與其它的藥劑形成了結合物者(免疫結合物(Immunoconjugate)))。就這樣的抗體之例而言,可舉:該抗體與放射性物質或具有藥理作用之化合物鍵結著之物(Nature Biotechnology(2005)23,p.1137-1146)。
本發明之蛋白質是能夠利用於ELISA(酵素連結免疫吸附分析法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay))法、ECL(電致化學發光(Electrochemi luminescence))法、RIA(放射免疫
測定法(Radio Immunoassay))法、ELISPOT(酶聯免疫斑點法(Enzyme-Linked ImmunoSpot))法、斑點雜交(dot blotting)法、歐氏二重擴散(Ouchterlony)法、CIE(對流免疫電泳(Counterimmunoelectrophoresis))法、CLIA(化學發光免疫檢定(Chemiluminescent immuno assay))、及FCM(流動式細胞測量術(Flow Cytometry))等檢測方法,以及免疫組織化學(immunohistochemistry:IHC)法,合適地能夠利用於ELISA法、ECL法、以及IHC法。
就ELISA法及ECL法而言,例如,能夠利用於來定量在經投予本發明之抗體-藥物結合物的哺乳動物(就本發明中「哺乳動物」而言,可舉例如:人類、小鼠、大鼠、猿、兔等,但只要是哺乳動物未被限定於該等)中,該抗體-藥物結合物的血漿中濃度的方法。
具體地包含下述步驟:(1)使血漿中的抗體-藥物結合物接觸於已固相化有抗體-藥物結合物之目標抗原的盤而使複合物形成的步驟;(2)使經以標記物所標記化的,本發明之蛋白質接觸,而使更進一步的複合物形成的步驟;接著(3)檢測該標記物的步驟。
又,亦可包含下述步驟:(1)使血漿中的抗體-藥物結合物接觸於已固相化有本發明之蛋白質的盤而使複合物形成的步驟;(2)使能夠辨識該抗體-藥物結合物之抗體部位,且經以標記物所標記化的第二蛋白質接觸,而使更進一步的複合物形成的步驟;接著(3)檢測該標記物的步驟。
又,ELISA法及ECL法亦是能夠利用於,定量在經投予本發明之抗體-藥物結合物的哺乳動物中,從該抗體-
藥物結合物游離出的藥物(例如:化合物(1)、化合物(2)、化合物(4)、及化合物(5))的血漿中濃度的方法。
具體地是包含下述步驟:(1)在經以標記物所標記化之競爭藥物的存在下,使血漿中之從抗體-藥物結合物游離出的藥物接觸於已固相化有本發明之蛋白質的盤,而使複合物形成的步驟;(2)檢測該標記物的步驟。
就IHC法而言,例如能夠利用於定量在經投予本發明之抗體-藥物結合物的哺乳動物中,該抗體-藥物結合物及/或從該抗體-藥物結合物游離出的藥物的組織分布的方法。
具體地是包含下述步驟:(1)使組織中之抗體-藥物結合物及/或從該抗體-藥物結合物游離出的藥物與本發明之蛋白質接觸而使複合物形成的步驟;(2)使能夠辨識本發明之蛋白質,且經以標記物所標記化的第二蛋白質接觸,而使更進一步的複合物形成的步驟;接著(3)檢測該標記物的步驟。
又,亦可包含下述步驟:(1)使組織中之抗體-藥物結合物及/或從該抗體-藥物結合物游離出的藥物,與經以標記物所標記化的本發明之蛋白質接觸,而使複合物形成的步驟,接著(2)檢測該標記物的步驟。
再者,在本發明中所謂「標記物」意指會生成可檢測之訊息的,或者會對於其它的基質進行引導使生成可檢測的信號的,任意物質。就這樣的標記物而言,可舉例如:螢光物質、酵素、酵素片段、酵素基質(enzyme substrate)、酵素抑制劑、輔酶、觸媒、染料、發光物質、增感劑、及放射性物質。
在本發明中,所謂「經以標記物所標記化的」意
指標記物是直接或者透過任意的部分結構(例如連接子)而鍵結著。由生物素與親和素(avidin)(或者鏈霉親和素)的相互作用所致之鍵結亦包含於此。
為了將本發明之蛋白質以標記物進行標記化,例如,使得以標記物作為構成要素之試劑(具活性酯基者),與本發明之蛋白質的離胺酸殘基反應而使醯胺鍵形成的話即可,但未被限定於此。
當標記物為螢光物質的情況,該標記物的檢測是可透過感知該標記物的螢光而進行。
就這樣的螢光物質而言,可舉例如:DyLight(註冊商標)350、DyLight(註冊商標)405、DyLight(註冊商標)488、DyLight(註冊商標)550、DyLight(註冊商標)594、DyLight(註冊商標)633、DyLight(註冊商標)650、DyLight(註冊商標)680、DyLight(註冊商標)747、DyLight(註冊商標)755、DyLight(註冊商標)800、Alexa Fluor(註冊商標)350、Alexa Fluor(註冊商標)405、Alexa Fluor(註冊商標)488、Alexa Fluor(註冊商標)532、Alexa Fluor(註冊商標)546、Alexa Fluor(註冊商標)555、Alexa Fluor(註冊商標)568、Alexa Fluor(註冊商標)594、Alexa Fluor(註冊商標)647、Alexa Fluor(註冊商標)680、Alexa Fluor(註冊商標)750、BODIPY(註冊商標)FL、香豆素(Coumarin)、Cy(註冊商標)3、Cy(註冊商標)5、Cy(註冊商標)、螢光黃(Fluorescein)(FITC)、俄勒岡綠(Oregon Green)(註冊商標)、太平藍(Pacific Blue)、太平綠(Pacific Green)、太平橙(Pacific Orange)、四甲基玫瑰紅
(Tetramethylrhodamine)(TRITC)、德州紅(Texas Red)(註冊商標)。
又,如Qdot(註冊商標)525、Qdot(註冊商標)565、Qdot(註冊商標)605、Qdot(註冊商標)655、Qdot(註冊商標)705、及Qdot(註冊商標)800般之奈米晶體、及如異藻藍蛋白(Allophycocyanin)(APC)、R-藻紅素(R-Phycoerythrin)(R-PE)、青色螢光蛋白(cyan fluorescent protein)(CFP)、綠螢光蛋白(Green Fluorescent Protein)(GFP)、及紅螢光蛋白(Red Fluorescent Protein)(RFP)般之螢光蛋白質亦能夠作為螢光物質使用。
當標記物為酵素的情況,該標記物的檢測是可透過感知因該酵素與基質的反應而產生之發光或者顯色而進行。
就這樣的酵素而言,可舉例如:過氧化酶(例如,山葵過氧化酶;HRP等),此情況,就酵素的基質而言,可舉例如:TMB(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺)、DAB(3,3’-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽)、OPD(鄰苯二胺),及ABTS(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)。
又,就其它的酵素而言,可舉:鹼性磷酸酶,此情況,就酵素的基質而言,可舉例如:BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯)、及PNPP(ρ-硝基苯基磷酸酯)。
又,其它的酵素就而言,可舉:螢光素酶,此情況,就酵素的基質就而言,可舉例如:螢光素(Luciferin)、及腔腸素(Coelenterazine)類。
進一步,就其它的酵素而言,可舉:β-半乳糖苷酶,此情況,就酵素的基質而言,可舉例如:鄰硝基苯β-D-半
乳哌喃糖苷(ONPG)。
當標記物為發光物質的情況,該標記物的檢測是可透過感知基於電化學反應之該標記物的發光而進行。
就這樣的發光物質而言,可舉例如:釕錯合物,合適地可舉:釕-吡啶錯合物,更合適地可舉:釕(II)參(聯吡啶)錯合物(ruthenium(II)tris(bipyridyl)complexes)。
上述的電化學反應,例如能夠在三丙胺(TPA)的共存下進行。具體地是透過電極反應使產生TPA陽離子自由基與3價的釕錯合物之後,TPA陽離子自由基立刻失去氫離子,成為帶有強力還原作用之TPA自由基,而透過此與3價之釕錯合物進行反應而產生發光。
當標記物為放射性物質的情況,該標記物的檢測是可透過感知該標記物發出的放射線而進行。
就這樣的放射性物質而言,可舉例如:氚(3H)、碳-14(14C)、氮-15(15N)、硫-35(35S)、釔-90(90Y)、鎝-99(99Tc)、銦-111(111In)、碘-125(125I)、及碘-131(131I)等。
藉由使含有pH緩衝劑、滲透壓調節劑、鹽類、穩定化劑、防腐劑、顯色劑、增感劑、抗凝聚劑等,本發明之蛋白質能夠作為組成物(以下稱為「本發明之組成物」。)使用。
本發明之蛋白質(或者本發明之組成物),可作為與用以進行檢測所使用之材料及試劑組合而成的套組(以下稱為「本發明之套組」。)使用。試劑是可因應該等的穩定性,在同一或者別個的容器中以液體或者被冷凍乾燥的狀態被提供。於
本發明之套組中所提供之試劑的量及比例,可被選擇以對特定的用途提供最適合的結果。在本發明之套組來說,在本發明之蛋白質(或者本發明之組成物)以外,例如,可包含:用以利用標記物進行標記的試劑、酵素的基質、阻斷試劑、聚合物試劑、抗原修復液、校正液(calibrator)、稀釋用緩衝液、洗淨用緩衝液、固相化用緩衝液、固相化抗體、檢測用抗體、及微量多孔盤(Microtiter plate)等。又,亦可包含用以使用本發明之套組的說明手冊等。使用本套組,變得能夠確認抗體-藥物結合物及/或從該抗體-藥物結合物游離出的藥物的組織分布,及定量血漿中濃度等。
以下,透過實施例更具體地說明本發明,但本發明並非被限定於該等,該等無論如何不被限縮解釋。再者,在下述實施例中關於基因操作的各操作只要只要沒有特別指明,或是透過記載於「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著,由Cold Spring Harbor Laboratory Press於1989年出刊)的方法進行,或者,當使用市售之試劑或套組的情況,按照市售品的說明手冊進行了使用。又,在本說明書中,未特別記載的試劑、溶劑及起始材料是可自市售之供給源容易地取得。
i)8-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-N-(4-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3’,4’:6,7]吲并[1,2-b]喹啉-
1-基]胺基}-4-側氧基丁基)-8-側氧基辛醯胺(化合物(6))的合成
於4-胺基-N-[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3’,4’:6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]丁醯胺(0.032g,0.050mmoL)(利用記載於國際公開第2014/057687號之實施例1步驟2所獲得之化合物)的N,N-二甲基甲醯胺(0.5mL)溶液中,添加三乙胺(7μL,0.050mmoL)、辛二酸二(N-琥珀醯亞胺基)(20.4mg,0.055mmoL),並在室溫下攪拌了20分鐘。將溶劑進行減壓餾去,並把所獲得之殘留物利用矽膠(silica gel)管柱層析[氯仿~氯仿:甲醇=9:1(v/v)]進行純化,獲得了呈淡黃色固體的標題化合物(16.0mg,41%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:0.87(3H,t,J=7.6Hz),1.18-1.37(4H,m),1.40-1.50(2H,m),1.54-1.64(2H,m),1.65-1.74(2H,m),1.78-1.93(2H,m),2.02(2H,t,J=7.6Hz),2.09-2.20(4H,m),2.40(3H,s),2.60-2.68(2H,m),2.80(4H,s),3.00-3.08(2H,m),3.13-3.21(2H,m),5.19(2H,dd,J=32.0,18.0Hz),5.37-5.47(2H,m),5.53-5.60(1H,m),6.52(1H,s),7.30(1H,s),7.74-7.82(2H,m),8.44(1H,d,J=8.5Hz).
MS(APCI)m/z:774(M+H)+
ii)4-胺基-N-[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9,10-二羥基-4-甲基-13-側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3’,4’:6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]丁醯胺 三氟乙酸鹽(化合物(7))的合成
將三級丁基(4-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3’,4’:6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-4-側氧基丁基)胺甲酸酯(0.092g,0.148mmoL)(利用記載於國際公開第2014/057687號之實施例1步驟1所獲得之化合物)溶解於甲醇(1.6mL),進行了冰冷。添加硼氫化鈉(0.028g,0.740mmoL)並在冰冷下攪拌了20分鐘。利用甲醇(10mL)及氯仿(50mL)進行稀釋,添加10%檸檬酸水溶液,並利用氯仿進行了萃取。將所獲得之有機層利用10%檸檬酸水溶液、接著利用飽和食鹽水進行洗淨,利用硫酸鈉進行乾燥,並進行了過濾。將溶劑進行減壓餾去,利用矽膠管柱層析-[氯仿:甲醇=100:0~95:5(v/v)]將所獲得之殘留物進行純化,獲得了淺黃色固體的三級丁基(4-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-13-側氧基-
2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3’,4’:6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-4-側氧基丁基)胺甲酸酯(0.078g,85%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:0.89(3H,t,J=7.4Hz),1.31(9H,s),1.62-1.73(4H,m),2.08-2.18(4H,m),2.39(3H,s),2.91(2H,q,J=6.5Hz),3.12-3.20(2H,m),4.49(1H,d,J=17.2Hz),4.61(1H,d,J=17.2Hz),4.97(1H,s),4.99(1H,d,J=4.7Hz),5.10(2H,d,J=18.8Hz),5.21(2H,d,J=18.8Hz),5.54-5.58(1H,m),6.74-6.82(2H,m),7.33(1H,s),7.78(1H,d,J=11.0Hz),8.40(1H,d,J=8.6Hz).
將利用上述步驟1獲得之化合物(0.078g,0.125mmoL)添加二氯甲烷(2mL),進行冰冷,添加三氟乙酸(2mL)並攪拌了40分鐘。將溶劑進行減壓餾去,利用矽膠管柱層析[氯仿~氯仿:甲醇:水=7:3:1(v/v/v)之分配有機層]將所獲得之殘留物進行了純化。把所獲得之固體溶解於甲醇,並濾取添加醚而生成出的沉澱,進行真空乾燥,獲得了黃色固體的標題化合物(0.045g,56%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:0.89(3H,t,J=7.4Hz),1.71(2H,q,J=7.4Hz),1.80-1.88(2H,m),2.09-2.19(2H,m),2.27(2H,t,J=7.0Hz),2.40(3H,s),2.84(2H,t,J=7.6Hz),3.13-3.20(2H,m),4.50(1H,d,J=17.2Hz),4.62(1H,d,J=17.2Hz),4.97-
5.02(2H,m),5.09(1H,d,J=18.8Hz),5.21(1H,d,J=18.8Hz),5.55-5.59(1H,m),6.79(1H,d,J=4.7Hz),7.34(1H,s),7.64-7.75(3H,m),7.79(1H,d,J=11.3Hz),8.53(1H,d,J=8.6Hz).
MS(APCI)m/z:523(M+H)+
將4-(三級丁氧羰基胺基)丁酸(0.492g,2.42mmoL)溶解於二氯甲烷(15mL)及N,N-二甲基甲醯胺(2mL),添加N-羥基琥珀醯亞胺(0.279g,2.42mmoL),及EDCI(1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochloride))(0.464g,2.42mmoL)並在室溫下攪拌了30分鐘。將該反應溶液滴加於環己胺(0.200g,2.02mmoL)的二氯甲烷溶液(2mL),並在室溫下攪拌了20分鐘。利用二氯甲烷稀釋反應液,添加10%檸檬酸水溶液,並利用二氯甲烷進行了萃取。利用飽和重碳酸鈉水洗淨所獲得的有機層,利用硫酸鈉進行乾燥,並進行了過濾。將溶劑進行減壓餾去,利用矽膠管柱層析-[己烷:乙酸乙酯=50:50~25:75(v/v)]將所獲得的
殘留物進行純化,獲得了無色油狀的N-[4-(環己基胺基)-4-側氧基-丁基]胺甲酸三級丁酯(0.308g,54%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.08-1.23(4H,m),1.29-1.42(2H,m),1.44(9H,s),1.66-1.75(2H,m),1.77-1.83(2H,m),1.86-1.95(2H,m),2.17(2H,t,J=7.0Hz),3.11-3.21(2H,m),3.69-3.82(1H,m),4.75(1H,brs),5.89(1H,brs).
將利用上述步驟1獲得之化合物(0.200g,0.703mmoL)溶解於乙酸乙酯(50mL)及二烷(10mL)。添加4N鹽酸二烷(10mL)並攪拌了2小時。濾取生成出的沉澱並進行真空乾燥,獲得了無色固體的標題化合物(0.098g,63%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:1.06-1.30(5H,m),1.50-1.58(1H,m),1.62-1.82(6H,m),2.16(2H,t,J=7.2Hz),2.69-2.79(2H,m),3.45-3.58(1H,m),4.73(1H,brs),7.89(1H,d,J=7.8Hz),7.96-8.10(2H,m).
MS(APCI)m/z:185(M+H)+
按照記載於國際公開第2014/057687號的製造方法,使用抗B7-H3抗體(包含:由序列識別號27中胺基酸編號20至471
記載的胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號28中胺基酸編號21至233記載的胺基酸序列構成的輕鏈而成的抗體),製造了:下式
所示之藥物連接子(式中,A表示與抗體的鍵結位置)與抗B7-H3抗體透過硫醚鍵而鍵結之抗B7-H3抗體-藥物結合物(在本發明中稱為「B7-H3-ADC(I)」)。
按照記載於國際公開第2014/057687號的製造方法,使用抗B7-H3抗體(包含:由序列識別號27中胺基酸編號20至471記載的胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號28中胺基酸編號21至233記載的胺基酸序列構成的輕鏈而成的抗體),製造了:下式
所示之藥物連接子(式中,A表示與抗體的鍵結位置)與抗B7-H3抗體透過硫醚鍵而鍵結之抗B7-H3抗體-藥物結合物(在本發明中稱為「B7-H3-ADC(II)」)。
按照記載於國際公開第2014/057687號之製造方法,使用抗B7-H3抗體(包含:由序列識別號27中胺基酸編號20至471記載的胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號28中胺基酸編號21至233記載的胺基酸序列構成的輕鏈而成的抗體),製造了:下式
所示之藥物連接子(式中,A表示與抗體的鍵結位置)與抗B7-H3抗體透過硫醚鍵而鍵結之抗B7-H3抗體-藥物結合物(在本發明中稱為「B7-H3-ADC(III)」)。
按照記載於國際公開第2015/115091號的製造方法,使用抗HER2抗體(包含:由序列識別號21中胺基酸編號1至449記載的胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號22中胺基酸編號1至214記載的胺基酸序列構成的輕鏈而成的抗體),製造了:下式
所示之藥物連接子(式中,A表示與抗體的鍵結位置)與抗HER2抗體透過硫醚鍵而鍵結之抗HER2抗體-藥物結合物(在本發明中稱為「HER2-ADC(I)」)。
按照記載於國際公開第2015/155998號之製造方法,使用抗HER3抗體(包含:由序列識別號23記載的胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號24記載的胺基酸序列構成的輕鏈而成的抗體),製造了:下式
所示之藥物連接子(式中,A表示與抗體的鍵結位置)與抗HER3抗體透過硫醚鍵而鍵結之抗HER3抗體-藥物結合物(在本發明中稱為「HER3-ADC(I)」)。
按照記載於國際公開第2015/098099號之製造方法,使用抗TROP2抗體(包含:由序列識別號25中胺基酸編號20至470記載的胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號26中胺基酸編號21至234記載的胺基酸序列構成的輕鏈而的抗體),製造了:下式
所示之藥物連接子(式中,A表示與抗體的鍵結位置)與抗TROP2抗體透過硫醚鍵而鍵結之抗TROP2抗體-藥物結合物
(在本發明中稱為「TROP2-ADC(I)」)。
抗原蛋白質是使用了在化合物(6)附加了作為載體蛋白之牛甲狀腺球蛋白而成者(以下稱為「抗原蛋白質(1)」)及附加了BSA而成者(以下稱為「抗原蛋白質(2)」)。
在免疫來說使用了BALB/cAnNCrlCrlj(BALB/c)小鼠(4個體)及B6D2F1/Crlj(BDF1)小鼠(4個體)的雌性(日本查爾斯河股份有限公司)。對皮下及皮內進行投予:初次是投予混合了抗原蛋白質(1)與弗氏完全佐劑(Freund’s Complete Adjuvant)(和光純藥公司製)者,第2次以後是投予混合了抗原蛋白質(1)與弗氏不完全佐劑(Freund’s Incomplete Adjuvant)(和光純藥公司製)者。每7日進行投予合計4次。
分別將免疫前及投予4次後之BALB/c小鼠(4個體)及BDF1小鼠(4個體)的血清從200倍稀釋至204800倍,確認了相對於陽性對照之抗原蛋白質(2)及B7-H3-ADC(II)、相對於陰性對照之BSA的抗體力價。將抗原蛋白質(2)、B7-H3-ADC(II)、及BSA固相化於ELISA用免疫盤(immunoplate),使經稀釋過之免疫前及投予4次後的小鼠血清在37℃下反應了
30分鐘。洗淨後,使結合有山葵過氧化酶的抗鼠IgG(IgG)(抗鼠IgG-HRP)在37℃下反應30分鐘。洗淨後,添加鄰苯二胺二鹽酸鹽(o-phenylenediamine dihydrochloride)(OPD)溶液,於顯色停止後測定了490nm的吸光度。在全部的個體中確認到:相對於陽性對照的抗體力價是上升的。
將作為陽性對照之化合物(6)、化合物(7)及化合物(1),作為陰性對照之化合物(8)添加至投予4次後的BALB/c小鼠(4個體)及BDF1小鼠(4個體)的血清,算出了相對於抗原蛋白質(2)的未吸收率。將經50000倍稀釋之小鼠的血清與已製備為12.5、25、50、100μg/mL之化合物(6)、化合物(8)、化合物(7)及化合物(1)進行混合,並在4℃下使反應過一晚之後,添加於將抗原蛋白質(2)固相化過之ELISA用免疫盤,並在37℃下使反應了30分鐘。洗淨後,使抗鼠IgG-HRP在37℃下反應了30分鐘。洗淨後,添加OPD溶液,於顯色停止後測定了490nm的吸光度。透過以下式算出了未吸收率。
未吸收率(%)=(a/b)×100
a:陽性對照或者陰性對照之添加濃度12.5μg/mL的吸光度
b:陽性對照或者陰性對照無添加的吸光度
任一小鼠血清皆在陽性對照的化合物(6)及化合物(1)觀察到高的抑制效果,而依個體有在化合物(7)觀察到高的抑制效果。又,在陰性對照的化合物(8)來說,在任一血漿皆未觀察到高的抑制效果。其中,從具有在化合物(7)觀察到高的抑制效果且在
化合物(8)未觀察到高的抑制效果之血清的BALB/c小鼠及BDF1小鼠分別選擇1個個體,並採取淋巴結及脾臟而使用於製作融合瘤。
利用PEG法將在iv)選擇出之個體的淋巴結細胞及脾臟細胞,和小鼠骨髓瘤進行了細胞融合。使用出現之融合瘤的培養上清液來進行了產生抗體的融合瘤的篩選。
將抗原蛋白質(2)固相化於ELISA用免疫盤,並使2倍稀釋過的產生抗體之融合瘤上清液在37℃下反應了120分鐘。洗淨後,使抗鼠IgG-HRP在37℃下反應了30分鐘。洗淨後,添加OPD溶液,並於顯色停止後測定了490nm的吸光度。選擇了產生OD值顯示0.2以上的數值之培養上清液的融合瘤11株作為陽性。
針對在vi)中選擇出作為陽性的11株,使用化合物(6)、化合物(1)、B7-H3-ADC(II)、B7-H3-ADC(I)及B7-H3-ADC(III)作為陽性對照,以及使用化合物(8)及化合物(7)作為反應性確認用化合物,實施了抑制型ELISA(inhibition ELISA)。以使得最終濃度成為25μg/mL的方式將陽性對照及反應性確認用化合物添加至經2倍稀釋過之在vi)中作為陽性選擇出之11株的培養上清液。在4℃下使反應了一晚後,添加於
已固相化抗原蛋白質(2)之ELISA用免疫盤,並使在37℃下反應了30分鐘。洗淨後,使抗鼠IgG-HRP在37℃下反應了30分鐘。洗淨後,添加OPD溶液,並於顯色停止後測定了490nm的吸光度。選擇相對於抗原蛋白質(2)的反應性高,且觀察到由陽性對照所致之抑制效果的8株供至一次選殖。
利用極限稀釋法將在vii)選擇出之8株進行了選殖。以使得成為60細胞/96孔盤的方式將融合瘤進行播種,將小鼠胸腺細胞各添加5×106細胞/孔,並使用含有10%FBS的TIL(股份有限公司免疫生物研究所)進行了培養。進行與vii)同樣的抑制型ELISA(inhibition ELISA),選擇出被確認到專一性的8株x6的次選殖體(subclone)。
確認了在viii)選擇出之8株x6的次選殖體對於B7-H3-ADC(II)及B7-H3-ADC(I)的反應性。利用固定化緩衝液(immobilized buffer)將B7-H3 C1結構域LotB7_OmJ1(B7-H3 C1 domain LotB7_OmJ1)稀釋為1μg/mL,並在Maxi-Sorp盤各添加100μL後,在4℃下進行了一晚固相化。次日,除去盤的培養基,將含有5%BSA的PBS各添加180μL,在室溫下靜置了3小時。利用含有0.05%Tween20的PBS進行2次洗淨後,將已製備為0.1μg/mL之B7-H3-ADC(II)、及B7-H3-ADC(I)各添加100μL後,在室溫下靜置了大約1小時。利用含有0.05%Tween20的PBS洗淨2次後,
將從900μg/mL以公比3 7階段稀釋之融合瘤上清液各添加50μL後,在室溫下靜置了1小時。利用含有0.05%Tween20的PBS洗淨2次後,將稀釋過5000倍之Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG,Fcγ Fragment Specific(過氧化酶親和純化山羊抗小鼠IgG,Fcγ片段專一性)(Jackson Immuno Research LABORATORIES,INC.)各添加100μL,並在室溫下靜置了1小時。利用含有0.05%Tween20的PBS洗淨3次後,將HRP基質(OPD tablet)各添加100μL並進行顯色反應,將1M HCl各添加100μL而使顯色反應停止之後,利用ARVO(PerkinElmer公司)測定了450nm的吸光度。在8株x6的次選殖體全部中確認到對於B7-H3-ADC(II)及B7-H3-ADC(I)的反應性。其中,將反應性高的4株x6的次選殖體供至一次校準曲線確認。
利用ELISA確認了在ix)選擇出之4株x6的次選殖體對B7-H3-ADC(I)(DAR7)與B7-H3-ADC(I)(DAR5)的反應性。利用被覆緩衝液(Coating Buffer)將AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG,Fcγ fragment specific(Jackson Immuno Research Inc.)稀釋為1μg/mL,並在Maxi-Sorp盤各添加100μL後,在4℃下進行了一晚固相化。次日,除去盤的培養基,並在利用PBS洗淨後,將含有10%BSA的PBS各添加100μL,在37℃下靜置了2.5小時。除去盤的培養基,並利用含有2%BSA、0.2%聚山梨醇酯(Polysorbate)20(以下,稱為「PS20」)的PBS將融合瘤4株x6的次選殖體稀釋為10、25
及100ng/mL,並在盤中各添加100μL,在37℃下靜置了1小時。利用含有0.05%PS20的PBS洗淨4次後,利用含有2%BSA、0.2%Tween20的PBS將B7-H3-ADC(I)(DAR7)及B7-H3-ADC(I)(DAR5)稀釋為1、2.5、10、25、100、250ng/mL,並在盤中各添加100μL,在37℃下靜置了1小時。把利用含有0.05%PS20的PBS洗淨4次後,利用含有2%BSA、0.2%PS20的PBS進行過7500倍稀釋的山羊抗人類-HRP(Goat Anti-Human kappa-HRP)(Southern Biotechnology Associates,Inc.)各添加100μL,並在室溫下靜置了1小時。利用含有0.05%PS20的PBS洗淨4次後,以100μL/孔添加TMB soluble reagent(ScyTek Laboratories)來進行顯色反應,並添加100μL/孔之TMB stop buffer(ScyTek Laboratories)來使顯色反應停止之後,利用VersaMax(Molecular Devices公司製)測定450nm的吸光度(參考(reference)650nm),透過以下式算出相對誤差,選擇出值小的選殖體。
相對誤差(%)={(DAR7的測定值)/(DAR5的測定值)-1}×100
從其中,將4株x2的次選殖體供至二次選殖。
進行在x)中選擇出之4株x2的次選殖體之二次選殖,透過在各選殖體從陽性孔之中選出3孔而選擇合計24選殖體,與vi)同樣地實施了相對於抗原蛋白質(2)之抗體力價的確認。進一步使用化合物(6)、化合物(1)、B7-H3-ADC(II)、B7-H3-
ADC(I)及B7-H3-ADC(III)作為陽性對照,以及使用化合物(8)及化合物(7)作為反應性確認用化合物,與vii)同樣地實施了抑制型ELISA(inhibition ELISA)。
在xi)中選擇出之24選殖體中,與化合物(1)進行比較,針對除了對化合物(7)的反應性特別高之6選殖體外之18選殖體,利用Gyrolab xP工作站(Gyrolab xP workstation)(GYROS PROTEIN Technologies)確認了對於HER2-ADC(I)(DAR8)、HER2-ADC(I)(DAR4)、及HER2-ADC(I)(DAR2)的反應性及校準曲線。捕捉試劑是使用Biotin-SP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG,Fcγ specific(生物素-SP-結合的親和純化山羊抗小鼠IgG,Fcγ專一性)(Jackson Immuno Research LABORATORIES,INC.),利用含有0.01%PS20的PBS而製備為172.5nM。細胞培養上清液是利用Rexxip CCS(GYROS PROTEIN Technologies)而製備為200ng/mL。HER2-ADC(I)(DAR8)、HER2-ADC(I)(DAR4)、及HER2-ADC(I)(DAR2)皆是利用含有0.01%PS20的PBS,從1000ng/mL以4倍公比6階段稀釋並製備。檢測試劑是使用:利用Alexa Fluor(註冊商標)647標籤套組(labeling kit)(Thermo Fisher Scientific Inc.)將Goat Anti Human kappa(Southern Biotechnology Associates,Inc.)予以標記過者,並利用Rexxip F製備為10nM。把於上述製備出之試劑、細胞培養上清液及校準曲線試料置入96孔PCR盤,與
Gyrolab Bioaffy 200一起組裝至Gyrolab xP工作站,並利用4-Step(2xC)-A-D(wizard method)進行了測定。校準曲線是使用Gyrolab評估器軟體(Gyrolab Evaluator Software)以4-參數邏輯模型(加權;效果(Response))進行迴歸。經評價之18選殖體皆不依賴HER2-ADC(I)的DAR,又,由於亦未觀察到株間的反應性的差異,而在同一株選擇IgG濃度高的3選殖體(1A3、8B2、11B1),進行了少量生產。
針對在xii)中選擇出之3選殖體(1A3、8B2、11B1),利用無血清培養基(ASF104(N))進行轉瓶培養器培養,在回收培養上清液後利用0.45μm的過濾器進行過濾,並利用蛋白質A管柱進行純化。將經蛋白質A純化過之3選殖體從5μg/Ml以2倍公比已進行10階段稀釋的溶液50μL,添加至經添加50ng/孔/50μL抗原蛋白質(2)並固相化之ELISA用免疫盤,並使在37℃下反應了30分鐘。洗淨後,使抗鼠IgG-HRP在37℃下反應了30分鐘。洗淨後,添加OPD溶液,於顯色停止後測定了490nm的吸光度。任一蛋白質A純化抗體皆顯示了與抗原蛋白質(2)的良好反應性。
針對在xiii)中經蛋白質A純化之3選殖體(1A3、8B2、11B1),使用Gyrolab xP工作站來確認了對於HER2-ADC(I)(DAR8)、及HER2-ADC(I)(DAR4),以及B7-H3-ADC(I)(DAR8)、及B7-H3-ADC(I)(DAR4)的反應性。
捕捉試劑是使用:利用EZ-Link NHS-LC-Biotin(Thermo Fisher Scientific Inc.)將蛋白質A純化後的3選殖體進行過生物素標記者,並利用含有0.01%PS20的PBS製備為700nM。HER2-ADC(I)(DAR8)與HER2-ADC(I)(DAR4)是利用Rexxip HN,任一者皆從1000ng/mL以4倍公比6階段地進行稀釋並製備。檢測試劑是使用利用Alexa Fluor(註冊商標)647標籤套組將Goat Anti Human kappa(Southern Biotechnology Associates,Inc.)標記過之物,並利用Rexxip F製備為10nM。把製備出之試劑及抗體-藥物結合物(校準曲線試料)置入96孔PCR盤,與Gyrolab Bioaffy 200一起組裝至Gyrolab xP工作站,並利用200-3W-001-A(wizard method)進行了測定。校準曲線是使用Gyrolab評估器軟體以4-參數邏輯模型(加權;效果)進行了迴歸。將選殖體1A3的校準曲線顯示於圖15,選殖體8B2的校準曲線顯示於圖16,選殖體11B1的校準曲線顯示於圖17。針對任一選殖體皆顯示與HER2-ADC(I)之間不依賴於DAR的反應性。
進一步作為捕捉試劑,使用利用EZ-Link NHS-LC-Biotin進行過生物素標記之人類Her2/ErbB2蛋白(Human Her2/ErbB2 Protein)(ACROBiosystems)、及同樣地進行過生物素標記之B7-H3 C1結構域(B7-H3 C1 domain),並利用含有0.01%PS20的PBS製備為700nM。針對HER2-ADC(I)(DAR8)及HER2-ADC(I)(DAR4)、以及B7-H3-ADC(I)(DAR8)及B7-H3-ADC(I)(DAR4)是利用Rexxip HN,任一者皆從1000ng/ml以4倍公比6階段地進
行稀釋並製備。檢測試劑是使用利用DyLight650(註冊商標)標籤套組(Thermo Fisher Scientific Inc.)標記過的蛋白質A純化後的3選殖體(1A3、8B2、11B1)者,並利用Rexxip F製備為10nM。把製備出之試劑及抗體-藥物結合物的校準曲線試料置入96孔PCR盤,與Gyrolab Bioaffy 200一起組裝至Gyrolab xP工作站,並利用200-3W-001-A(wizard method)進行了測定。校準曲線是使用Gyrolab評估器軟體以4-參數邏輯模型(加權;效果)進行了迴歸。針對與HER2-ADC(I)的反應性,將選殖體1A3的校準曲線顯示於圖18,選殖體8B2的校準曲線顯示於圖19,選殖體11B1的校準曲線顯示於圖20。又,針對與B7-H3-ADC(I)的反應性,將選殖體1A3的校準曲線顯示於圖21,選殖體8B2的校準曲線顯示於圖22,選殖體11B1的校準曲線顯示於圖23。針對任一選殖體皆是顯示與HER2-ADC(I)及B7-H3-ADC(I)之間不依賴於DAR的反應性。
由以上結果,確認到:針對任一選殖體皆是不依賴於DAR以及抗體部分的差異地顯示對於抗體-藥物結合物的反應性,並且在捕捉試劑與檢測試劑之任一方皆可使用。決定選擇此中訊息值最大的選殖體1A3,並使用於本發明涉及的抗體-藥物結合物之檢測。
在xiv)取得之選殖體1A3涉及的小鼠單株抗體(以下稱為「小鼠抗體1A3」)的同型,是透過Mouse monoclonal isotyping test kit(AbD Serotec公司製)所確定。其結果確
認到同型是IgG2b,κ鏈。
由產生小鼠抗體1A3的融合瘤,使用TRIzol Reagent(LIFE TECHNOLOGIES)來製備了總RAN(total RNA)。實施了經純化過之小鼠抗體1A3之N末端胺基酸序列分析(埃德曼降解法(edman degradation))。進一步,透過抗體基因選殖,分析了選殖體1A3的核苷酸序列。抗體基因選殖的結果,重鏈可變區、輕鏈可變區皆分別獲得1種類的序列,且確認到:經純化之小鼠抗體1A3之N末端胺基酸序列分析的結果與透過抗體基因選殖所獲得之選殖體1A3之核苷酸序列之N末端胺基酸序列是一致的。
將小鼠抗體1A3重鏈的胺基酸序列記於序列識別號15。序列識別號15中胺基酸編號1至19記載的胺基酸序列是表示訊息序列,胺基酸編號20至141記載的胺基酸序列是表示重鏈可變區,胺基酸編號142至477記載的胺基酸序列是表示重鏈恒定區的胺基酸序列。
將小鼠抗體1A3輕鏈的胺基酸序列記於序列識別號16。序列識別號16中胺基酸編號1至20記載的胺基酸序列是表示訊息序列,胺基酸編號21至127記載的胺基酸序列是表示輕鏈可變區,胺基酸編號128至234記載的胺基酸序列是表示輕鏈恒定區的胺基酸序列。
將編碼小鼠抗體1A3重鏈的胺基酸序列的核苷酸序列記於序列識別號17。序列識別號17中核苷酸編號1至57記載的核苷酸序列是表示訊息序列,核苷酸編號58至423記載
的核苷酸序列是編碼重鏈可變區的胺基酸序列。
將編碼小鼠抗體1A3輕鏈的胺基酸序列的核苷酸序列記於序列識別號18。序列識別號18中核苷酸編號1至60記載的核苷酸序列表示訊息序列,核苷酸編號61至459記載的核苷酸序列是編碼重鏈可變區的胺基酸序列。
又,進行了CDR的分析。
根據Abm的定義,可判定:小鼠抗體1A3重鏈可變區是保有:由序列識別號1所示之胺基酸序列構成之CDRH1(GFTFSDYGMV)、由序列識別號2所示之胺基酸序列構成之CDRH2(YISSGSSAIY)、及由序列識別號3所示之胺基酸序列構成之CDRH3(PPRYDVYSAWFAY),小鼠抗體1A3輕鏈可變區是保有:由序列識別號4所示之胺基酸序列構成之CDRL1(KASQDVGSAVV)、由序列識別號5所示之胺基酸序列構成之CDRL2(WASTRHT)、及由序列識別號6所示之胺基酸序列構成之CDRL3(QQYSSYPVT)。
根據Chothia的定義,可判明:小鼠抗體1A3重鏈可變區是保有:由序列識別號7所示之胺基酸序列構成之CDRH1(GFTFSDY)、由序列識別號8所示之胺基酸序列構成之CDRH2(SSGSSA)、及由序列識別號3所示之胺基酸序列構成之CDRH3(PPRYDVYSAWFAY),小鼠抗體1A3輕鏈可變區是保有:由序列識別號4所示之胺基酸序列構成之CDRL1(KASQDVGSAVV)、由序列識別號5所示之胺基酸序列構成之CDRL2(WASTRHT)、及由序列識別號6所示之胺基酸序列構成之CDRL3(QQYSSYPVT)。
根據Kabat的定義,可判明:小鼠抗體1A3重鏈
可變區是保有:由序列識別號9所示之胺基酸序列構成之CDRH1(DYGMV)、由序列識別號10所示之胺基酸序列構成之CDRH2(YISSGSSAIYYADTVKG)、及由序列識別號3所示之胺基酸序列構成之CDRH3(PPRYDVYSAWFAY),小鼠抗體1A3輕鏈可變區是保有:由序列識別號4所示之胺基酸序列構成之CDRL1(KASQDVGSAVV)、由序列識別號5所示之胺基酸序列構成之CDRL2(WASTRHT)、及由序列識別號6所示之胺基酸序列構成之CDRL3(QQYSSYPVT)。
根據Imgt(註冊商標)的定義,可判明:小鼠抗體1A3重鏈可變區是保有:由序列識別號11所示之胺基酸序列構成之CDRH1(GFTFSDYG)、由序列識別號12所示之胺基酸序列構成之CDRH2(ISSGSSAI)、及由序列識別號13所示之胺基酸序列構成之CDRH3(ARPPRYDVYSAWFAY),小鼠抗體1A3輕鏈可變區是保有:由序列識別號14所示之胺基酸序列構成之CDRL1(QDVGSA)、由WAS(色胺酸-丙胺酸-絲胺酸)所示之三肽構成的CDRL2、及由序列識別號6所示之胺基酸序列構成之CDRL3(QQYSSYPVT)。
使用在實施例2取得之小鼠抗體1A3,構建了HER2-ADC(I)的小鼠血漿中濃度、以及HER3-ADC(I)、TROP2-ADC(I)、及B7-H3-ADC(I)的猿血漿中濃度測定法。小鼠抗體1A3是可進行DyLight650(註冊商標)或者Alexa Fluor(註冊商標)647標記作為檢測試劑而使用,使用任一方皆能夠測定本發明涉及的抗體-藥物結合物之血漿中濃度。進一步能夠不依賴
於DAR以及抗體部分的差異地作成校準曲線,能夠使用於本發明涉及的抗體-藥物結合物之血漿中濃度測定。
利用Gyrolab xP工作站來構建了HER2-ADC(I)的小鼠血漿中濃度測定法。使用作為捕捉試劑之生物素化小鼠抗-(抗HER2 Ab)個體遺傳型Ab[Biotinylated Mouse Anti-(Anti-HER2 Ab)idiotype Ab](於此處,「(抗-HER2 Ab)」表示包含由序列識別號21中胺基酸編號1至449記載的胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號22中胺基酸編號1至214記載的胺基酸序列構成的輕鏈而成之抗體)(13C1)(IBL),並利用含有0.1%PS20的PBS來製備為350nM。校準曲線試料是進行製備使得利用Rexxip HN進行過100倍稀釋的小鼠血漿中HER2-ADC(I)的濃度成為0、0.150、0.200、0.600、1.60、4.00、16.0、40.0、100、140μg/mL。檢測試劑是使用經以DyLight650(註冊商標)標籤套組將小鼠抗體1A3標籤化而得者,並利用Rexxip F製備為10nM。將該等製備出之試劑及校準曲線試料置入96孔PCR盤,與Gyrolab Bioaffy 200一起組裝於Gyrolab xP工作站。測定wizard是使用了200-3W-002-A(PMT1)。迴歸分析是使用Gyrolab評估器(Gyrolab Evaluator)3.3.9.175以5-參數邏輯模型進行。將校準曲線顯示於圖24。
利用Gyrolab xP工作站來構建了總抗體(Total抗體)(抗HER2抗體及HER2-ADC(I))的小鼠血漿中濃度測定法。使用生物素化小鼠抗-(抗HER2Ab)個體遺傳型
Ab[Biotinylated Mouse Anti-(Anti-HER2 Ab)idiotype Ab](13C1)(IBL)作為捕捉試劑,並利用含有0.1%PS20的PBS製備為350nM。校準曲線試料是進行製備使得利用Rexxip HN進行過100倍稀釋的小鼠血漿中HER2-ADC(I)的濃度成為0、0.150、0.200、0.600、1.60、4.00、16.0、40.0、100、140μg/mL。檢測試劑是利用Rexxip F將Alexa Fluor(註冊商標)647抗人類IgG,Fcγ抗體(Jakckson Immno Research Laboratories,Inc.)製備為10nM。將該等製備出之試劑及校準曲線試料置入96孔PCR盤,與Gyrolab Bioaffy 200一起組裝於Gyrolab xP工作站。測定wizard是使用了200-3W-002-A(PMT1)。迴歸分析是使用Gyrolab評估器3.3.9.175來以5-參數邏輯模型進行。
將濃度測定結果顯示於表1。
利用Gyrolab xP工作站來構建HER3-ADC(I)的猿血漿中濃度測定法,並取得了驗證。使用經以EZ-連接硫代-NHS-LC-生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin)(Thermo Fisher Scientific Inc.)進行過生物素標記的HER3(Recombinant Human ErbB-3/HER3 Protein,ACRObiosystems)作為捕捉試劑,並利用含有0.1%PS20的PBS製備為700nM。校準曲線試料是使用進行製備使得在猿血漿中HER3-ADC(I)的
濃度成為0、0.0750、0.100、0.250、0.750、2.25、6.75、20.0、38.0、48.0μg/mL者,進一步利用含有聚山梨醇酯20的PBS及Rexxip AN(GYROS PROTEIN Technologies)進行了100倍稀釋。檢測試劑是使用利用Alexa Fluor(註冊商標)647標籤套組將小鼠抗體1A3標籤化而得者,並利用Rexxip F製備為10nM。將該等製備出之試劑及校準曲線試料置入96孔PCR盤,並組裝於Gyrolab xP工作站。測定wizard是使用了200-3W-002-A(PMT5)。迴歸分析是使用Gyrolab評估器3.3.7.171並以4-參數邏輯模型(權重:效果)進行。將校準曲線顯示於圖25。
利用Gyrolab xP工作站構建TROP2-ADC(I)的猿血漿中濃度測定法,取得了驗證。使用經以EZ-連接硫代-NHS-LC-生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin)進行過生物素標記的新hTrop2(Lot編號V35,第一三共(股))作為捕捉試劑,並利用含有0.1%PS20的PBS製備為350nM。校準曲線試料是使用進行製備使得在猿血漿中TROP2-ADC(I)的濃度成為0、0.00750、0.0100、0.0250、0.0750、0.250、0.750、2.50、7.50、10.0μg/mL者,進一步利用Rexxip HN(GYROS PROTEIN Technologies)進行了10倍稀釋。檢測試劑是使用將小鼠抗體1A3利用Alexa Fluor(註冊商標)647標籤套組標籤化過者,並利用Rexxip F製備為10nM。將該等製備出之試劑及校準曲線試料置入96孔PCR盤,並組裝至Gyrolab xP工作站。測定wizard是使用了200-3W-002-A(PMT1)。迴歸分
析是使用Gyrolab評估器3.3.7.171以4-參數邏輯模型(權重:效果)進行。將校準曲線顯示於圖26。
利用Gyrolab xP工作站構建B7-H3-ADC(I)的猿血漿中濃度測定法,並取得了驗證。使用經以EZ-連接硫代-NHS-LC-生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin)(Thermo Fisher Scientific Inc.)進行過生物素標記的B7-H3 C1結構域(B7-H3 C1 domain)(Lot編號B7_OmJ1,第一三共(股))作為捕捉試劑,並利用含有0.1%PS20的PBS製備為700nM。校準曲線試料是使用進行製備使得在猿血漿中B7-H3-ADC(I)的濃度成為0、0.0750、0.100、0.250、0.750、2.25、6.75、20.0、38.0、48.0μg/mL者,進一步利用含有聚山梨醇酯20的PBS及Rexxip HN(GYROS PROTEIN Technologies)進行了50倍稀釋。檢測試劑是使用將小鼠抗體1A3以Alexa Fluor(註冊商標)647標籤套組進行過標籤化而得者,並利用Rexxip F製備為10nM。將該等製備出之試劑及校準曲線試料置入96孔PCR盤,組裝至Gyrolab xP工作站。測定wizard是使用了200-3W-001-A(PMT5)。迴歸分析是使用Gyrolab評估器3.3.7.171並以4-參數邏輯模型(權重:效果)進行。將校準曲線顯示於圖27。
將源自人類之腫瘤皮下移植至高度免疫缺陷小鼠
(NOG小鼠)。在投予本發明涉及的抗體-藥物結合物後,採取該腫瘤組織並製作石蠟包埋標本,探討小鼠抗體1A3的染色性。將由未投予本發明涉及的抗體-藥物結合物之NOG小鼠採取出之腫瘤組織作為陰性對照。脫石蠟及抗原修復是使用自動染色Link用預處理系統(Autostainer Link用預處理系統)(PT Link:DAKO公司製)、及抗原修復液(目標檢索溶液低pH(Target Retrieval Solution Low pH):DAKO公司製)而實施。其後的染色作業是使用自動染色裝置(DAKO自動染色機Link48(DAKO Autostainer Link48):DAKO公司製)來實施。利用EnVision FLEX洗淨緩衝液(EnVision FLEX WASH BUFFER)(DAKO公司製)洗淨之後,添加過氧化酶阻斷劑(Peroxidase Block)3% H2O2(DAKO公司製)進行孵育(incubate),利用EnVision FLEX洗淨緩衝液進行洗淨。添加無血清的蛋白質阻斷劑(Protein Block serum free)(DAKO公司製),進行孵育,並利用鼓風(Air blow)除去液。利用REAL抗體稀釋劑(REAL Antibody Diluent)(DAKO公司製)來稀釋小鼠抗體1A3,並使反應。利用EnVision FLEX洗淨緩衝液洗淨後,添加EnVision+系統- HRP標記聚合物抗小鼠(EnVision+ System-HRP Labelled Polymer Anti-Mouse)# K4000(DAKO公司製),並進行了孵育後,利用EnVision FLEX洗淨緩衝液進行了洗淨。
添加DAKO Liquid DAB+基質色素原系統(Substrate Chromogen System)並進行了孵育之後,利用EnVision FLEX洗淨緩衝液進行洗淨。添加EnVision FLEX蘇木精(EnVision FLEX Hematoxylin)並進行了孵育之後,
利用EnVision FLEX洗淨緩衝液及離子交換水進行洗淨。
確認:小鼠抗體1A3對於經投予本發明涉及的抗體-藥物結合物之NOG小鼠顯示良好的染色性,且伴隨小鼠抗體1A3濃度的增加,染色強度會增加。又,確認:小鼠抗體1A3對於未投予本發明涉及的抗體-藥物結合物之NOG小鼠沒有顯示染色性。再者,已知由於NOG小鼠缺損B細胞,而未觀察到因源自小鼠的內源性IgG所致之背景染色(Ito M,et al.Blood 100(9):3175-3182,2002)。
預先將小鼠抗體1A3與化合物(2)或者SN-38進行混合後,使用於免疫染色。混合比是基於分子量設為抗體1A3:化合物(2):SN-38=0.1:0.04:0.03。染色是利用與i)同樣的方法來實施。
確認:小鼠抗體1A3的染色性會因與化合物(2)的混合而消失。又,確認:小鼠抗體1A3的染色性不因與SN-38的混合而消失。
小鼠抗體1A3的兔嵌合化抗體(以下稱為「兔嵌合化抗體1A3」)如以下進行了設計。兔嵌合化抗體的序列是由IMGT(註冊商標)參照兔的重鏈恒定區IGHG*02與兔的輕鏈恒定區IGKC2*01,並連接至選殖體1A3之各個可變區而藉此設計。
將兔嵌合化抗體1A3重鏈的胺基酸序列記於序列識別號19。序列識別號19中胺基酸編號1至19記載的胺基酸序列表示訊息序列,胺基酸編號20至141記載的胺基酸序列表示重鏈可變區,胺基酸編號142至464記載的胺基酸序列表示重鏈恒定區的胺基酸序列。
將兔嵌合化抗體1A3輕鏈的胺基酸序列記於序列識別號20。序列識別號20中胺基酸編號1至20記載的胺基酸序列表示訊息序列,胺基酸編號21至127記載的胺基酸序列表示輕鏈可變區,胺基酸編號128至233記載的胺基酸序列表示輕鏈恒定區的胺基酸序列。
使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司),將利用限制酶XbaI及PmeI消化質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ(Invitrogen公司)而得之約5.4kb的斷片、與具有編碼人類輕鏈訊息序列及人類κ鏈恒定區的胺基酸序列的核苷酸序列(序列識別號29)的DNA片段予以鍵結,而製作了pcDNA3.3/LK。
從pcDNA3.3/LK除去新黴素表現單元,藉此構建了pCMA-LK。
合成出具有編碼兔嵌合化抗體1A3重鏈之胺基酸序列(序列識別號19)的核苷酸序列(序列識別號30)的DNA片段(GENEART公司)。序列識別號30中核苷酸編號26至82記載
的核苷酸序列是表示訊息序列,核苷酸編號83至448記載的核苷酸序列是編碼重鏈可變區的胺基酸序列,核苷酸編號449至1417記載的核苷酸序列是編碼恒定區的胺基酸序列。
使用In-Fusion HD PCR選殖套組(CLONTECH公司),將合成出之DNA片段、與利用XbaI及PmeI消化pCMA-LK而除掉編碼輕鏈訊息序列及人類κ鏈恒定區的胺基酸序列的核苷酸序列(序列識別號29)的DNA片段予以鍵結,藉此構建了表現兔嵌合化抗體1A3重鏈的載體。
合成了具有編碼兔嵌合化抗體1A3輕鏈的胺基酸序列(序列識別號20)之核苷酸序列(序列識別號31)的DNA片段(GENEART公司)。序列識別號31中核苷酸編號26至85記載的核苷酸序列表示訊息序列,核苷酸編號86至406記載的核苷酸序列編碼輕鏈可變區的胺基酸序列,核苷酸編號407至724記載的核苷酸序列編碼恒定區的胺基酸序列。利用與iii)同樣的方法來構建了表現兔嵌合化抗體1A3輕鏈的載體。
自由式(FreeStyle)293F細胞(Invitrogen公司)是按照手冊,進行了繼代、培養。將對數生長期之2.4×109個自由式293F細胞(Invitrogen公司)播種於Optimum Growth 5L燒瓶(Optimum Growth 5L Flask)(Thomson公司),並利用自由式293表現培養基(FreeStyle293 expression medium)(Invitrogen公司)進行稀釋而製備為1.88×106細胞
/mL。將0.48mg之兔嵌合化抗體1A3重鏈表現載體與0.72mg之兔嵌合化抗體1A3輕鏈表現載體與3.6mg之聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine)(Polyscience #24765)添加於40mL之Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)並平穩地攪拌,在進一步放置5分鐘後添加至自由式293F細胞。在37℃、8%CO2孵育器中以90rpm振盪培養4小時後,添加1200mL之EX-CELL VPRO培養基(SAFC Biosciences公司)、18mL之GlutaMAX I(GIBCO公司)、及60mL之Yeastolate Ultrafiltrate(GIBCO公司),並在37℃、8%CO2溫孵育器中以90rpm振盪培養7日,將所獲得之培養上清液利用一次性膠囊過濾器(Disposable Capsule Filter)(Advantec # CCS-045-E1H)進行過濾,藉此獲得了包含兔嵌合化抗體1A3的培養上清液。
將在v)所獲得之培養上清液利用rProtein A親和力層析法的1階段步驟進行了純化。將培養上清液上樣至被填充有經以PBS平衡化過之MabSelectSuRe的管柱(GE Healthcare Bioscience公司製)之後,利用管柱容量2倍以上的PBS洗淨了管柱。接著利用2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)進行溶析,並收集了含有抗體的劃份。將該劃份透過透析(Thermo Scientific公司,Slide-A-Lyzer透析卡匣(Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette))進行了緩衝液取代為PBS。利用離心式UF過濾裝置(Centrifugal UF Filter Device)VIVASPIN20(截斷分子量(molecular cutoff)UF10K,Sartorius公司)將抗體濃
縮,並將IgG濃度製備為2mg/mL以上。最後利用Minisart-Plus過濾器(Minisart-Plus filter)(Sartorius公司)進行過濾,獲得了兔嵌合化抗體1A3的純化樣品。
按照記載於國際公開第2018/135501號的製造方法,使用抗GPR20抗體(包含:由序列識別號32中胺基酸編號20至472記載的胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號33中胺基酸編號21至234記載的胺基酸序列構成的輕鏈而成的抗體),製造了:下式
按照記載於國際公開第2018/212136號的製造方法,使用抗CDH6抗體(包含由序列識別號34中胺基酸編號20至471記載的胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號35中胺基酸編號21至233記載的胺基酸序列構成的輕鏈而成的抗體),製造了:下式
將人類頭頸部癌細胞株FaDu皮下移植至免疫缺陷小鼠(裸鼠)。在投予TROP2-ADC(I)後採取該腫瘤組織並製作石蠟包埋標本,探討了兔嵌合化抗體1A3的染色性。又,將由投予了抗TROP2抗體(包含:由序列識別號25中胺基酸編號20至470記載的胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號26中胺基酸編號21至234記載的胺基酸序列構成的輕鏈而成的抗
體,以下稱為「抗TROP2 Ab」。)之裸鼠採取出之腫瘤組織設為陰性對照。脫石蠟及抗原修復是使用自動染色Link用預處理系統(PT Link:DAKO公司製)、抗原修復液(目標檢索溶液低pH:DAKO公司製),在97℃下實施了40分鐘。其後的染色作業是使用自動染色裝置(DAKO自動染色機Link48:DAKO公司製)在室溫下實施。利用EnVision FLEX洗淨緩衝液(DAKO公司製)進行了1次洗淨後,添加REAL過氧化酶阻斷溶液(REAL Peroxidase-Blocking Solution)(DAKO公司製)進行5分鐘孵育,並利用EnVision FLEX洗淨緩衝液進行了1次洗淨。添加無血清的蛋白質阻斷劑(DAKO公司製),進行30分鐘孵育,利用鼓風(Air blow)除去液。利用REAL抗體稀釋劑(DAKO公司製)將兔嵌合化抗體1A3稀釋為0.1μg/mL,並使反應了30分鐘。利用EnVision FLEX洗淨緩衝液洗淨3次後,添加EnVision+系統-HRP標記聚合物抗兔(EnVision+ System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit)(DAKO公司製),進行了30分孵育後,利用EnVision FLEX洗淨緩衝液進行了2次洗淨。
添加DAKO Liquid DAB+Substrate Chromogen System且孵育共計10分之後,利用EnVision FLEX洗淨緩衝液進行了1次洗淨。添加EnVision FLEX蘇木精進行了5分鐘孵育後,利用EnVision FLEX洗淨緩衝液及離子交換水進行了共計3次洗淨。
於圖35顯示典型的染色圖像。兔嵌合化抗體1A3對經投予TROP2-ADC(I)之動物的皮下腫瘤組織是會顯示良好的染色性,而另一方面,兔嵌合化抗體1A3對於經投予抗
TROP2 Ab之動物的皮下腫瘤組織則未顯示出染色性。
將過度表現GPR20的人類胃腸道基質腫瘤細胞株GIST-T1/GPR20皮下移植至免疫缺陷小鼠(裸鼠)。在投予GPR20-ADC(I)後採取該腫瘤組織並製作石蠟包埋標本,探討了兔嵌合化抗體1A3的染色性。又,把由不投予GPR20-ADC(I)的小鼠採取出之腫瘤組織設為陰性對照。以與i)同樣的方法進行了染色。
於圖36顯示典型的染色圖像。兔嵌合化抗體1A3對於投予GPR20-ADC(I)之動物的皮下腫瘤組織是顯示良好染色性,而另一方面,兔嵌合化抗體1A3對於不投予GPR20-ADC(I)之動物的皮下腫瘤組織未顯示出染色性。
把由透明細胞型腎細胞癌患者所採取之腫瘤組織皮下移植至高度免疫缺陷小鼠(NOG小鼠)。在投予CDH6-ADC(I)後採取其腫瘤組織並製作石蠟包埋標本,探討了小鼠抗體1A3的染色性。又,把由未投予CDH6-ADC(I)的NOG小鼠採取出的腫瘤組織設為陰性對照。脫石蠟及抗原修復是使用自動染色Link用預處理系統(PT Link:DAKO公司製)、抗原修復液(目標檢索溶液低pH:DAKO公司製),在97℃下實施
了40分鐘。其後的染色作業是使用自動染色裝置(DAKO自動染色機Link48:DAKO公司製)並在室溫下實施。利用EnVision FLEX洗淨緩衝液(DAKO公司製)進行了1次洗淨後,添加過氧化酶阻斷劑3% H2O2(DAKO公司製)並進行5分鐘孵育,利用EnVision FLEX洗淨緩衝液進行了1次洗淨。添加無血清的蛋白質阻斷劑(DAKO公司製)並進行30分鐘孵育,利用鼓風(Air blow)除去液。利用REAL抗體稀釋劑(DAKO公司製)將小鼠抗體1A3稀釋為0.03μg/mL~0.3μg/mL,並使進行了60分鐘反應。利用EnVision FLEX洗淨緩衝液洗淨3次後,添加EnVision+系統-HRP標記聚合物抗小鼠(EnVision+ System-HRP Labelled Polymer Anti-Mouse)# K4000(DAKO公司製),並進行了30分鐘孵育後,利用EnVision FLEX洗淨緩衝液進行了2次洗淨。
添加DAKO Liquid DAB+Substrate Chromogen System並進行了共計10分鐘的孵育後,利用EnVision FLEX洗淨緩衝液進行了1次洗淨。添加EnVision FLEX蘇木精並進行了5分鐘孵育後,利用EnVision FLEX洗淨緩衝液及離子交換水進行了共計3次洗淨。
於圖37顯示典型的染色圖像。小鼠抗體1A3對於投予CDH6-ADC(I)的動物是顯示良好的染色性,且伴隨小鼠抗體1A3濃度的增加染色強度會增加。另一方面,小鼠抗體1A3對於不投予CDH6-ADC(I)的動物未顯示染色性。再者,由於NOG小鼠缺損B細胞,未觀察到由源自小鼠之內源性IgG所致之背景染色(Ito M,et al.Blood 100(9):3175-3182,2002)。
預先將小鼠抗體1A3與化合物(2)或者SN-38混合之後,使用於免疫染色。
再者,化合物(2)是下式
SN-38是下式
混合比是基於分子量而設為小鼠抗體1A3:化合物(2):SN-38=0.1:0.04:0.03。染色是以與i)同樣的方法實施。
於圖38顯示典型的染色圖像。小鼠抗體1A3的染色性會因與化合物(2)的混合而消失,但小鼠抗體1A3的染色性在與SN-38的混合是不會消失。由此,顯示了:小鼠抗體1A3會專一性地辨識組織中的化合物(2)。
利用Gyrolab xP工作站(GYROS PROTEIN Technologies)來構建了GPR20-ADC(I)的小鼠血漿中濃度測定法。使用以標籤套組(ChromaLink生物素蛋白標記套組(ChromaLink Biotin Protein Labeling Kit,Solulink))將小鼠抗體1A3進行生物素標籤化者作為捕捉試劑,並利用含有0.1%PS20的PBS製備為700nM。校準曲線試料是利用Rexxip AN(GYROS PROTEIN Technologies)將在小鼠血漿中以GPR20-ADC(I)的濃度成為0、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000ng/mL的方式調製所得者進行了10倍稀釋。檢測試劑是使用將小鼠抗-(抗GPR20 Ab)(於此處,「(抗GPR20 Ab)」表示包含:由序列識別號32中胺基酸編號20至472記載的胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號33中胺基酸編號21至234記載的胺基酸序列構成的輕鏈而成的抗體)個體遺傳型(idiotype)Ab(71C1)(IBL)利用DyLight650(註冊商標)標籤套組進行過標籤化者,並利用Rexxip F(GYROS PROTEIN Technologies)製備為10nM。將該等製備出之試劑及校準曲線試料置入96孔PCR盤,組裝於Gyrolab xP工作站。使用Bioaffy200,且wizard是利用200-3W-002-A(PMT1)進行了測定。迴歸分析是使用Gyrolab評估器3.3.9.175並以4-參數邏輯模型(權重:效果)進行。將校準曲線顯示於圖39。
構建了使用了ECL之HER2-ADC(I)的人類血清中濃度測定法。在將小鼠抗體1A3塗覆至高結合盤(High Bind plate)(Meso Scale Diagnostics,LLC:MSD)後,將盤進行了洗淨。將利用阻斷緩衝液(添加BSA之含PS20的PBS)來阻斷後製備為0、200、400、800、1600、3200、6400、12800、20000及25600ng/mL的HER2-ADC(I),利用檢測稀釋液進行1000倍稀釋而作成了校準曲線試料。進一步,將以EZ-連接硫代-NHS-LC-生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC Biotin)(Thermo Fisher Scientific Inc.)進行生物素標記的生物素化小鼠抗(抗HER2)個體遺傳型Ab[Biotinylated Mouse Anti-(Anti-HER2)idiotype Ab](13C1)(IBL)與磺基標籤鏈霉親和素(sulfo-tag streptavidin)(MSD)進行預孵育而製備出檢測溶液。在添加校準曲線試料後經孵育及洗淨過的盤中添加檢測溶液,使複合物形成。利用純化水將4×Read Buffer T(MSD)進行2倍稀釋,並添加至洗淨後的盤並利用MSD SECTOR Imager 6000(控制軟體(control software):MSD Discovery Workbench Version 3.0.18)進行了測定。迴歸分析是以4-參數邏輯模型(權重:1/效果2)進行。將校準曲線顯示於圖40。
使用Gyrolab xP工作站(GYROS PROTEIN Technologies)來透過HER2-ADC(I)的競爭抑制驗證了小鼠抗體1A3所辨識之化學結構。就競爭抑制用化合物而言,選定了化合物(1)、化合物(2)、化合物(7)、化合物(8)、化合物(9)、
化合物(10)、化合物(11)、癌康定(Topotecan)、及魯比替康(Rubitecan)。
再者,化合物(1)是下式
化合物(2)是下式
化合物(7)是下式
化合物(8)是下式
化合物(9)是下式
化合物(10)是下式
化合物(11)是下式
癌康定是下式
魯比替康是下式
使用以標籤套組(ChromaLink Biotin Protein LABELING Kit,Solulink)將小鼠抗體1A3進行生物素標籤化者作為捕捉試劑,並利用含有0.1%PS20的PBS製備為700nM。將為競爭抑制用化合物之化合物(1)、化合物(2)、化合物(7)、化合物(8)、化合物(9)、化合物(10)、化合物(11)、癌康定、及魯比替康各自溶解於DMSO後,利用10%或是20%DMSO in Rexxip HN(GYROS PROTEIN Technologies)進行稀釋,在製備為0、1及100μg/mL後,等量添加700nM的小鼠抗體1A3溶液並進行混和,使在室溫‧暗處下反應1小時以上。HER2-ADC(I)是利用Rexxip HN製備為0、0.244、0.977、3.91、15.6、62.5、250、1000ng/mL。檢測試劑是使用將小鼠抗(抗HER2 Ab)個體遺傳型Ab[Mouse Anti-(Anti-HER2 Ab)idiotype Ab](13C1)(IBL)以
DyLight650(註冊商標)標籤套組進行過標籤化者,並利用Rexxip F(GYROS PROTEIN Technologies)製備為10nM。將上述溶液組裝至Gyrolab xP工作站,並使用Gyrolab Bioaffy 200以200-3W-002-A(PMT5)進行了測定。迴歸分析是使用Gyrolab評估器3.4.0.24以4-參數邏輯模型(權重:效果)進行。依每個競爭抑制用化合物的濃度製作HER2-ADC(I)的校準曲線,算出將HER2-ADC(I)濃度在250ng/mL時的效果與不添加化合物(濃度0ng/mL)相比較所得之抑制率(%)。
將抑制率圖表顯示於圖41。化合物(1)、化合物(2)、化合物(7)、及化合物(9)顯示了強的競爭抑制。另一方面,化合物(8)、化合物(10)、化合物(11)、癌康定、及魯比替康未顯示競爭抑制。由此結果顯示了:小鼠抗體1A3會專一性地辨識由化合物(1)的基本骨架構成且保持4位上之甲基的化學結構。
序列識別號1:CDRH1
序列識別號2:CDRH2
序列識別號3:CDRH3
序列識別號4:CDRL1
序列識別號5:CDRL2
序列識別號6:CDRL3
序列識別號7:CDRH1
序列識別號8:CDRH2
序列識別號9:CDRH1
序列識別號10:CDRH2
序列識別號11:CDRH1
序列識別號12:CDRH2
序列識別號13:CDRH3
序列識別號14:CDRL1
序列識別號15:小鼠抗體1A3重鏈的胺基酸序列
序列識別號16:小鼠抗體1A3輕鏈的胺基酸序列
序列識別號17:編碼小鼠抗體1A3重鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列
序列識別號18:編碼小鼠抗體1A3輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列
序列識別號19:兔嵌合化抗體1A3重鏈的胺基酸序列
序列識別號20:兔嵌合化抗體1A3輕鏈的胺基酸序列
序列識別號21:抗HER2抗體重鏈的胺基酸序列
序列識別號22:抗HER2抗體輕鏈的胺基酸序列
序列識別號23:抗HER3抗體重鏈的胺基酸序列
序列識別號24:抗HER3抗體輕鏈的胺基酸序列
序列識別號25:抗TROP2抗體重鏈的胺基酸序列
序列識別號26:抗TROP2抗體輕鏈的胺基酸序列
序列識別號27:抗B7-H3抗體重鏈的胺基酸序列
序列識別號28:抗B7-H3抗體輕鏈的胺基酸序列
序列識別號29:編碼人類輕鏈訊息序列及人類κ鏈恒定區的胺基酸序列的核苷酸序列
序列識別號30:編碼兔嵌合化抗體1A3重鏈的胺基酸序列的核苷酸序列
序列識別號31:編碼兔嵌合化抗體1A3輕鏈的胺基酸序列的核苷酸序列
序列識別號32:抗GPR20抗體重鏈的胺基酸序列
序列識別號33:抗GPR20抗體輕鏈的胺基酸序列
序列識別號34:抗CDH6抗體重鏈的胺基酸序列
序列識別號35:抗CDH6抗體輕鏈的胺基酸序列
<110> 第一三共股份有限公司
<120> 辨識抗體-藥物結合物之藥物部位的蛋白質
<130> FP1911
<150> JP2018-140912
<151> 2018-07-27
<160> 35
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 1
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 2
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 3
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 4
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 6
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 7
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 8
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 9
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 10
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 11
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 12
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 13
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 14
<210> 15
<211> 477
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 15
<210> 16
<211> 234
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 16
<210> 17
<211> 504
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 17
<210> 18
<211> 459
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 18
<210> 19
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成胜肽
<400> 19
<210> 20
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成胜肽
<400> 20
<210> 21
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HER2抗體的重鏈
<400> 21
<210> 22
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HER2抗體的輕鏈
<400> 22
<210> 23
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HER3抗體的重鏈
<400> 23
<210> 24
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HER3抗體的輕鏈
<400> 24
<210> 25
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TROP2抗體的重鏈
<400> 25
<210> 26
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TROP2抗體的輕鏈
<400> 26
<210> 27
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗B7-H3抗體的重鏈
<400> 27
<210> 28
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗B7-H3抗體的輕鏈
<400> 28
<210> 29
<211> 449
<212> DNA
<213> 智人
<400> 29
<210> 30
<211> 1442
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 30
<210> 31
<211> 749
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<400> 31
<210> 32
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GPR20抗體的重鏈
<400> 32
<210> 33
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GPR20抗體的輕鏈
<400> 33
<210> 34
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CDH6抗體的重鏈
<400> 34
<210> 35
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CDH6抗體的輕鏈
<400> 35
Claims (51)
- 如請求項1至7中任一項之蛋白質,其中在抗體-藥物結合物中的每一抗體的藥物連接子的平均鍵結數為2至8的範圍。
- 如請求項1至8中任一項之蛋白質,其中在抗體-藥物結合物中的抗體為抗HER2抗體、抗HER3抗體、抗TROP2抗體、抗B7-H3抗體、抗GPR20抗體、或抗CDH6抗體。
- 如請求項1至9中任一項之蛋白質,其中對該抗體-藥物結合物的辨識性實質上不因在抗體-藥物結合物中的每一 抗體的藥物連接子的平均鍵結數的差異而不同。
- 如請求項1至14中任一項之蛋白質,其為抗體。
- 如請求項15之蛋白質,其係a)包含:包含由序列識別號1所示之胺基酸序列構成之CDRH1、由序列識別號2所示之胺基酸序列構成之CDRH2、及由序列識別號3所示之胺基酸序列構成之CDRH3之重鏈,以及包含由序列識別號4所示之胺基酸序列構成之CDRL1、由序列識別號5所示之胺基酸序列構成之CDRL2、及由序列識別號6所示之胺基酸序列構成之CDRL3之輕鏈而成之抗體;b)包含:包含由序列識別號7所示之胺基酸序列構成之CDRH1、由序列識別號8所示之胺基酸序列構成之CDRH2、及由序列識別號3所示之胺基酸序列構成之CDRH3之重鏈,以及包含由序列識別號4所示之胺基酸序列構成之CDRL1、由序列識別號5所示之胺基酸序列構成之CDRL2、及由序列識別號6所示之胺基酸序列構成之CDRL3之輕鏈而成之抗體;c)包含:包含由序列識別號9所示之胺基酸序列構成之CDRH1、由序列識別號10所示之胺基酸序列構成之CDRH2、及由序列識別號3所示之胺基酸序列構成之CDRH3之重鏈,以及包含由序列識別號4所示之胺基酸序列構成之CDRL1、由序列識別號5所示之胺基酸序列構成之CDRL2、及由序列識別號6所示之胺基酸序列構成之CDRL3之輕鏈而成之抗體;或者,d)包含:包含由序列識別號11所示之胺基酸序列構成之CDRH1、 由序列識別號12所示之胺基酸序列構成之CDRH2、及由序列識別號13所示之胺基酸序列構成之CDRH3的重鏈,以及包含由序列識別號14所示之胺基酸序列構成之CDRL1、由WAS所示之三肽構成的CDRL2、及由序列識別號6所示之胺基酸序列構成之CDRL3之輕鏈而成之抗體。
- 如請求項16之蛋白質,其係包含下述重鏈及輕鏈而成的抗體;其中該重鏈包含由序列識別號15中胺基酸編號20至141記載的胺基酸序列構成的重鏈可變區,該輕鏈包含由序列識別號16中胺基酸編號21至127記載的胺基酸序列構成的輕鏈可變區。
- 如請求項17之蛋白質,其為小鼠抗體。
- 如請求項17之蛋白質,其係包含下述重鏈及輕鏈而成的抗體;其中該重鏈是由序列識別號15中胺基酸編號20至477記載的胺基酸序列構成,該輕鏈是由序列識別號16中胺基酸編號21至234記載的胺基酸序列構成。
- 如請求項17之蛋白質,其為嵌合抗體。
- 如請求項17之蛋白質,其為兔嵌合化抗體。
- 如請求項17之蛋白質,其係包含下述重鏈及輕鏈而成的抗體;其中該重鏈是由序列識別號19中胺基酸編號20至464記載的胺基酸序列構成,該輕鏈是由序列識別號20中胺基酸編號21至233記載的胺基酸序列構成。
- 如請求項15之蛋白質,其係如請求項19或22之抗體的重鏈羧基末端的離胺酸殘基缺失的抗體。
- 如請求項15之蛋白質,其係由與如請求項19或22之抗體的胺基酸序列具有至少95%的同一性之胺基酸序列構成 的抗體。
- 如請求項15之蛋白質,其係由與請求項19或22之抗體的胺基酸序列具有至少99%的同一性之胺基酸序列構成的抗體。
- 如請求項15之蛋白質,其就對藥物的辨識性而言,是與如請求項19或22之抗體競爭的抗體。
- 如請求項1至14中任一項之蛋白質,其係如請求項15至26中任一項之抗體的抗原結合片段。
- 如請求項27之蛋白質,其中抗體的抗原結合片段是Fab、F(ab’)2、Fab’或者Fv。
- 一種定量抗體-藥物結合物的血漿中濃度之方法,其係使用如請求項1至28中任一項之蛋白質,定量在經投予抗體-藥物結合物的哺乳動物中,該抗體-藥物結合物的血漿中濃度的方法。
- 如請求項29之方法,其包含下述步驟:(1)使血漿中的抗體-藥物結合物接觸於已被固相化有抗體-藥物結合物之目標抗原的盤而使複合物形成的步驟;(2)使經以標記物(marker)所標記化之如請求項1至28中任一項之蛋白質與該複合物接觸,而使形成更進一步的複合物的步驟;接著(3)檢測該標記物的步驟。
- 如請求項29之方法,其包含下述步驟:(1)使血漿中的抗體-藥物結合物接觸於已固相化有如請求項1至28中任一項之蛋白質的盤,而使複合物形成的步驟;(2)使得能夠辨識該抗體-藥物結合物之抗體部位,且經以標記物所標記化的第二蛋白質與該複合物接觸,使更進一步的複合物形成的步驟;接著 (3)檢測該標記物的步驟。
- 一種定量從抗體-藥物結合物游離出的藥物的血漿中濃度之方法,其係使用如請求項1至28中任一項之蛋白質,定量在經投予抗體-藥物結合物的哺乳動物中,從該抗體-藥物結合物游離出的藥物的血漿中濃度的方法。
- 如請求項32之方法,其包含下述步驟:(1)在經以標記物所標記化之競爭藥物的存在下,使血漿中從抗體-藥物結合物游離出的藥物接觸於已固相化有如請求項1至28中任一項之蛋白質的盤,而使複合物形成的步驟;(2)檢測該標記物的步驟。
- 一種確認之方法,其係使用如請求項1至28中任一項之蛋白質,確認在經投予抗體-藥物結合物的哺乳動物中,該抗體-藥物結合物及/或從該抗體-藥物結合物游離出的藥物的組織分布的方法。
- 如請求項34之方法,其包含下述步驟:(1)使組織中的抗體-藥物結合物及/或從該抗體-藥物結合物游離出的藥物與如請求項1至28中任一項之蛋白質接觸而使複合物形成的步驟;(2)使得能夠辨識如請求項1至28中任一項之蛋白質,且經以標記物所標記化的第二蛋白質與該複合物接觸,而使更進一步的複合物形成的步驟;接著(3)檢測該標記物的步驟。
- 如請求項34之方法,其包含下述步驟:(1)使組織中的抗體-藥物結合物及/或從該抗體-藥物結合物游離出的藥物,與經以標記物所標記化的如請求項1至28中任一項之蛋白質接觸而使複合物形成的步驟;接著(2)檢測該標記物的步驟。
- 如請求項30、31、33、35或36之方法,其中標 記物為螢光物質,且該標記物的檢測是透過感知該標記物發出的螢光而進行。
- 如請求項30、31、33、35或36之方法,其中標記物為酵素,且該標記物的檢測是透過感知因該酵素與基質的反應而產生之發光或顯色而進行。
- 如請求項30、31、33、35或36之方法,其中標記物為發光物質,且該標記物的檢測是透過感知基於電化學反應的該標記物之發光而進行。
- 一種聚核苷酸,其編碼如請求項1至28中任一項之蛋白質。
- 一種載體,其包含如請求項40之聚核苷酸。
- 一種形質轉換宿主細胞,其包含如請求項40之聚核苷酸。
- 一種形質轉換宿主細胞,其包含如請求項41之載體。
- 如請求項1至28中任一項之蛋白質之製造方法,其包含下述步驟:培養如請求項42或43之宿主細胞的步驟;接著,從前述培養步驟所獲得之培養產物純化蛋白質的步驟。
- 一種組成物,其包含如請求項1至28中任一項之蛋白質。
- 一種套組,其包含如請求項1至28中任一項之蛋白質,或者如請求項45之組成物。
- 如請求項46之套組,其係用以定量在經投予抗體-藥物結合物的哺乳動物中,抗體-藥物結合物及/或從該抗體-藥物結合物游離出的藥物的血漿中濃度。
- 如請求項46之套組,其係用以確認在經投予抗體-藥物結合物的哺乳動物中,抗體-藥物結合物及/或從該抗體-藥物結合物游離出的藥物的組織分布。
- 一種抗體,其係包含下述重鏈及輕鏈而成,該重鏈包含由序列識別號15中胺基酸編號20至141記載的胺基酸序列構成的重鏈可變區,該輕鏈包含由序列識別號16中胺基酸編號21至127記載的胺基酸序列構成的輕鏈可變區。
- 如請求項49之抗體,其係包含下述重鏈及輕鏈而成,該重鏈是由序列識別號15中胺基酸編號20至477記載的胺基酸序列構成,該輕鏈是由序列識別號16中胺基酸編號21至234記載的胺基酸序列構成。
- 如請求項49之抗體,其係包含下述重鏈及輕鏈而成,該重鏈是由序列識別號19中胺基酸編號20至464記載的胺基酸序列構成,該輕鏈是由序列識別號20中胺基酸編號21至233記載的胺基酸序列構成。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018140912 | 2018-07-27 | ||
JP2018-140912 | 2018-07-27 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202019973A true TW202019973A (zh) | 2020-06-01 |
TWI846717B TWI846717B (zh) | 2024-07-01 |
Family
ID=
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP7502549B2 (ja) | 2024-06-18 |
US20210169852A1 (en) | 2021-06-10 |
KR20210040059A (ko) | 2021-04-12 |
EP3831853A4 (en) | 2022-06-01 |
JP2024045098A (ja) | 2024-04-02 |
WO2020022475A1 (ja) | 2020-01-30 |
CA3107732A1 (en) | 2020-01-30 |
CN112533958A (zh) | 2021-03-19 |
JPWO2020022475A1 (ja) | 2021-08-12 |
EP3831853A1 (en) | 2021-06-09 |
JP7406488B2 (ja) | 2023-12-27 |
AU2019311596A1 (en) | 2021-01-28 |
IL280296A (en) | 2021-03-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7406488B2 (ja) | 抗体-薬物コンジュゲートの薬物部位を認識する蛋白質 | |
TWI523865B (zh) | 針對her-3之抗體類及其用途 | |
US20200002430A1 (en) | Fn14 Binding Proteins and Uses Thereof | |
KR20140104944A (ko) | 항-axl 항체 및 그의 용도 | |
CN107810197B (zh) | 鉴定包含结合多肽的细菌的方法 | |
US20180142032A1 (en) | Anti-lamp1 antibodies and antibody drug conjugates, and uses thereof | |
WO2015089283A1 (en) | Antibodies that bind activatable antibodies and methods of use thereof | |
JP2023540526A (ja) | ネクチン-4抗体およびそれの使用 | |
US20150079612A1 (en) | Assays, Antibodies, Immunogens and Compositions Related to 5-FU | |
KR102580319B1 (ko) | 항 ceacam6 항체 및 사용 방법 | |
JP2015527987A (ja) | 薬物モニタリングのための抗トファシチニブ抗体およびその使用 | |
US20190284274A1 (en) | Erfe specific antibodies compositions and methods of use | |
AU2019348815A1 (en) | Antagonists | |
TWI846717B (zh) | 辨識抗體-藥物結合物之藥物部位的蛋白質 | |
AU2021209740A1 (en) | SEMG2 antibody and use thereof | |
TW201840588A (zh) | 抗gpr20抗體 | |
US10538580B2 (en) | Anti-equol antibody composition and use therefor | |
US20240117069A1 (en) | Materials and Methods for Monitoring Cancer by Administering an Anti-MCL1 Antibody | |
WO2024133132A1 (en) | Anti-tgfbeta receptor 1 antibodies and uses thereof | |
KR20240004375A (ko) | Il-38-특이적 항체 |