JP2022519082A - 新規cd40結合抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
「ヒトCD40」という用語は、本明細書で使用される場合、配列番号24で示される、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー5(UniProtKB-P25942(TNR5_HUMAN))、イソ型Iとしても公知の、CD40タンパク質を指す。
上記に説明される通り、第1の主要な態様では、本発明は、ヒトCD40に結合することができる第1の抗原結合領域とヒトVγ9Vδ2-T細胞受容体に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む多重特異性抗体に関する。
・配列番号1で示されるVH CDR1配列、配列番号2で示されるVH CDR2配列、及び配列番号3で示されるVH CDR3配列、又は
・配列番号4で示されるVH CDR1配列、配列番号5で示されるVH CDR2配列、及び配列番号6で示されるVH CDR3配列
を含む。
・配列番号13で示される配列若しくは配列番号14で示される配列、又は
・配列番号13で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列、若しくは配列番号14で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列
を含むか、又はそれからなる。
・配列番号17で示される配列、若しくは
・配列番号17で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列、又は
・配列番号25、26、27、28、29、30、31、32、33及び34からなる群から選択される配列
を含むか、又はそれからなる。
・配列番号1で示されるVH CDR1配列、配列番号2で示されるVH CDR2配列、及び配列番号3で示されるVH CDR3配列、又は
・配列番号4で示されるVH CDR1配列、配列番号5で示されるVH CDR2配列、及び配列番号6で示されるVH CDR3配列
を含み、第2の抗原結合領域は、配列番号7で示されるVH CDR1配列、配列番号8で示されるVH CDR2配列、及び配列番号9で示されるVH CDR3配列を含む。
・配列番号1で示されるVH CDR1配列、配列番号2で示されるVH CDR2配列、及び配列番号3で示されるVH CDR3配列、又は
・配列番号4で示されるVH CDR1配列、配列番号5で示されるVH CDR2配列、及び配列番号6で示されるVH CDR3配列
を含み、第2の抗原結合領域は、配列番号10で示されるVH CDR1配列、配列番号11で示されるVH CDR2配列、及び配列番号12で示されるVH CDR3配列を含む。
・配列番号1で示されるVH CDR1配列、配列番号2で示されるVH CDR2配列、及び配列番号3で示されるVH CDR3配列、又は
・配列番号4で示されるVH CDR1配列、配列番号5で示されるVH CDR2配列、及び配列番号6で示されるVH CDR3配列
を含む。
・配列番号13で示される配列若しくは配列番号14で示される配列、又は
・配列番号13で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列、若しくは配列番号14で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列
を含むか、又はそれからなる。
VHHの生成
序文
ヒトCD40に特異的に結合する一価のVHHを生成した。その後、これらのVHHを、二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHHを生成するために使用した。
一価のVγ9Vδ2-TCR特異的VHHの生成
Vγ9Vδ2-T細胞受容体のVδ2鎖に結合するVγ9Vδ2-TCR特異的VHH 5C8(配列番号17)を、以前に生成した(de Bruinら (2016)、Clin Immunol 169:128~138)(WO2015156673)。
ラマ免疫化
CD40特異的VHHを、以前に説明されるように(de Bruinら (2016)、Clin Immunol 169:128~138、Lamerisら (2016)、Immunology 149(1)111~21)生成した。2頭のラマ(ラマ・グラマ(llama glama))を50*106個のMUTZ-3 DC(例えば、Masterson (2002) Blood 100:701を参照されたい)細胞により1週間の間隔で6回免疫化した。
RNAを、最後の免疫化の1週間後に得た末梢血リンパ球から単離し、cDNAに転写し、Ig重鎖コード遺伝子増幅に使用した(Rooversら (2007) Cancer Immunol Immunother 56(3):303~317)。ファージライブラリーを、VHHコード遺伝子の、断片をコードするMycタグ及びHis6タグを含有するファージミドベクターpUR8100へのライゲーション、並びに線維状バクテリオファージ上でのディスプレイのための大腸菌(E. coli)TG1への次なる形質転換により構築した。
CD40特異的VHHをディスプレイするファージについて富化するために、多選択ラウンドを行った。プレートを、IgG1-Fcタグ付けしたヒトCD40(71174、BPS Bioscience社、San Diego、CA、米国)でコーティングした。ファージを、1%ウシ血清アルブミン、1%乳汁、0.05%Tween 20及びヒトIgG(0.625mg/mL)を含有するPBSによりブロックし、その後、CD40でコーティングしたプレートに結合させた。溶離したファージを使用して、指数関数的に増殖している大腸菌TG1に感染させた。
3つの選択された一価のVHH並びにMycタグ及びHis6タグをコードする遺伝子セグメントを、pcDNA5ベクターに再クローニングし、これを使用して、HEK293T細胞にトランスフェクトした。VHHタンパク質を、高速タンパク質液体クロマトグラフィーを使用する逐次的サイズ排除、NiベースのHisタグ選択及びイミダゾールベースの溶出によりHEK293T上清から精製した。3つの異なるVHHタンパク質を、V19t(配列番号15)、V15t(配列番号16)及びV12t(配列番号36)と呼び、ここで、「t」は、VHHがC末端Mycタグ及びHis6タグを含有することを示す。VHH完全性及び純度を、SDS-PAGEゲルにおけるクーマシーブルー染色及び抗Mycタグ抗体を使用するウェスタンブロッティングにより確認した。VHHを、Nanodrop分光光度計を使用して定量した。
二重特異性VHH構築物V19-5C8t(配列番号19)、V15-5C8t(配列番号20)及びV12-5C8t(配列番号37)を生成するために、抗Vδ2-TCR-VHH(C末端)(配列番号17)を、Gly4Serリンカー(配列番号21)を伴って抗CD40-VHH(N末端)に接合した。Mycタグ及びHis6タグを含有する二重特異性VHHを、上記に説明されるようにHEK293Tトランスフェクションによって産生した。VHHタンパク質を、Talon樹脂上の固定イオン親和性クロマトグラフィー(635503、Clontech社、Mountain View、CA、米国)、続いてイミダゾールベースの溶出を使用して上清から精製した。
V19t VHHのフレームワーク領域3における推定上の糖鎖付加部位を特定し、その後、関連するセリン(76位)がリジンに変更された新しいVHH(V19S76Kt)(配列番号22)を産生及び精製した。
一価のVHHは、CD40をトランスフェクトした細胞に結合する
序文
一価の抗CD40 VHHの、CD40発現細胞に特異的に結合する能力を試験した。
細胞株
野生型(WT:wildtype)又はヒトCD40をトランスフェクトした胚腎臓細胞株HEK293Tを、10%ウシ胎児血清(F7524、Merck社、Kenilworth、NJ、米国)、200mM L-グルタミン(25030-123、Thermo Fisher Scientific社)、0.05mMβ-メルカプトエタノール(M6250、Merck社)及び10,000U/mLペニシリン/ストレプトマイシン(15140-122、Thermo Fisher Scientific社)を補充したダルベッコ変法イーグル培地(41965-039、Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA、米国)(以下、完全DMEMと呼ぶ)中で増殖させた。
CD40をトランスフェクトした細胞上のCD40発現を、PEをコンジュゲートした抗CD40抗体(IM1936U、Beckman Coulter社、Brea、CA、米国)との4℃で20分間のインキュベーションにより確認した。VHH結合を評定するために、細胞を、100nM V15t、100nM V19t又は媒体対照と37℃で30分間インキュベートした。結合したVHHを、マウス抗Mycタグ抗体(05-274、Merck社)及びAF488をコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体(A-11001、Thermo Fisher Scientific社)との4℃で20分間の逐次的インキュベーションにより検出した。
試料を、FACSCantoサイトメーター(BD Biosciences社、Franklin Lakes、NJ、米国)で測定し、Flowjo MacV10により解析した。
WT及びCD40をトランスフェクトしたHEK293T細胞を使用して、一価の抗CD40 VHHの結合を試験した。CD40発現を、CD40をトランスフェクトした細胞について確認した(図1A)。V19t、V15t及びV12tは、Mycタグの検出によって実証されるように、CD40発現細胞に結合した(図1B)。対照的に、抗CD40 VHHは、CD40陰性WT HEK293T細胞に結合しなかった。
抗CD40 VHH V19t及びV15tは、細胞表面で発現したCD40に特異的に結合し、V19tの結合親和性は、V19S76Ktにおいて保持された。
一価のVHHは、初代CLL細胞に結合する
序文
初代慢性リンパ球性白血病(CLL)細胞は、細胞表面上でCD40を発現する。したがって、抗CD40 VHHの初代CLL細胞への結合を試験した。
患者材料
末梢血(PB:peripheral blood)単核球(PBMC:peripheral blood mononuclear cell、≧95% CD5+CD19+)を、以前に説明されるように(Hallaertら (2008)、Blood 112(13):5141~9)、非処置CLL患者からのPB試料から単離し、凍結保存した。研究は、アムステルダムUMCの医学倫理委員会によって承認された。全ての対象からの書面のインフォームドコンセントを得た。解凍した細胞を、10%ウシ胎児血清(F7524、Merck社)、200mM L-グルタミン(25030-123、Thermo Fisher Scientific社)、0.05mMβ-メルカプトエタノール(M6250、Merck社)及び10.000U/mLペニシリン/ストレプトマイシン(15140-122、Thermo Fisher Scientific社)を補充したイスコフ変法ダルベッコ培地(IMDM:Iscove's Modified Dulbecco's Medium;12440-053、Thermo Fisher Scientific社)(以下、完全IMDMと呼ぶ)中で維持した。
初代CLL細胞上のCD40発現を確認し、VHH結合を実施例2で説明されるように試験した。
初代CLL細胞は、CD40を均一に発現した(図2A)。抗CD40 VHHは、試験した全ての試料において初代CLL細胞に明らかに結合したが、V15t及びV19tは、V12tよりも高い結合強度を有した(図2B)。
抗CD40 VHHは、初代CLL細胞に結合する。
一価のVHHは、CD40アゴニストではない
序文
CD40の、その同族リガンドCD40Lへの結合は、様々な生物学的応答を引き起こし得る。初代CLL細胞においてCD40刺激により誘導された効果は、細胞増殖、並びに共刺激性分子(すなわち、CD86)及びFas受容体(CD95)の発現の増大を含む。抗CD40 VHHの、CD40刺激を誘導する能力を、初代CLL細胞において試験した。
患者材料
非処置CLL患者からのPBMC(≧90% CD5+CD19+)を、実施例3で説明されるように得、凍結保存した。解凍した細胞を、完全IMDM中で維持した。
VHHのCD40への結合がアゴニスト効果を有するかどうかを評定するために、初代CLL PBMCをVHH、媒体対照又は組換え多量体CD40リガンド(rmCD40L;100ng/mL、Bioconnect社)の存在下で48時間培養した。
48時間後、細胞を回収し、洗浄し、AF700をコンジュゲートした抗CD19抗体(557921)、FITCをコンジュゲートした抗CD80抗体(6109965)、APCをコンジュゲートした抗CD86抗体(555660、全てBD Biosciences社)、PEをコンジュゲートした抗CD5抗体(12-0059-42、Thermo Fisher Scientific社)及びPECy7をコンジュゲートした抗CD95抗体(305621、Biolegend社、San Diego、CA、米国)と、4℃で20分間インキュベートした。或いは、48時間後、細胞を回収し、生存率をMitotracker Orange(37℃で25分間のインキュベーション)及びTo-pro-3(室温で10分間のインキュベーション;両方ともThermo Fisher Scientific社)を使用して測定した。試料を、FACSCantoサイトメーター(BD Biosciences社)で測定し、Flowjo MacV10により解析した。
rmCD40Lは、生存率並びにCD86及びCD95の発現における増大によって実証される通り、CD40刺激を有効に誘導した(図3A~図3C)。他方で、抗CD40 VHH V19t、V15t及びV12tは、試験した様々な濃度においてこれらの効果のいずれも誘導しなかった。
一価の抗CD40 VHHは、CD40のアゴニストではない。
一価のVHHは、CD40刺激と拮抗する
序文
CD40L結合は、CD40刺激を誘導し得る。CD40L及び抗CD40 VHHの両方は、CD40に結合し得るので、抗CD40 VHHがCD40Lで誘導されたCD40刺激を妨げ得るかどうかを試験した。
患者材料
非処置CLL患者からのPBMC(≧90% CD5+CD19+)を、実施例2で説明されるように得、凍結保存した。解凍した細胞を、完全IMDM中で維持した。
VHHがCD40刺激と拮抗するかどうかを試験するために、初代CLL PBMCをVHH又は媒体対照と37℃で30分間プレインキュベートし、続いて、rmCD40L(100ng/mL)の存在下で48時間培養した。
48時間後、細胞を、実施例4で説明されるように、フローサイトメトリーによって解析した。
rmCD40Lは、生存率並びにCD86及びCD95の発現における増大によって実証される通り、CD40刺激を有効に誘導した(図4A~図4C)。V15t又はV19tのいずれかとのプレインキュベーションは、用量依存的様式でCD40刺激を妨げた。しかしながら、V12tは、CD40Lで誘導した効果を遮断しなかった。
一価の抗CD40 VHH V15t及びV19tは、CD40刺激と拮抗する。
二重特異性VHH抗体は、CD40をトランスフェクトした細胞に結合する
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2-TCR VHH構築物V19S76K-5C8の、CD40発現細胞に特異的に結合する能力を試験した。
VHH生成
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2-TCR VHH V19S76K-5C8を、実施例1で説明されるように生成した。
野生型(WT)又はヒトCD40をトランスフェクトした胚腎臓細胞株HEK293Tを、完全DMEM中で増殖させた。
VHH結合を評定するために、細胞を、V19S76K-5C8(1μM)又は媒体対照と37℃で30分間インキュベートした。結合したVHHを、FITCをコンジュゲートしたヤギ抗ラマIgG重鎖及び軽鎖抗体(A160-100F、Bethyl Laboratories Inc.社、Montgomery、TX、米国)との4℃で20分間のインキュベーションにより検出した。
48時間後、細胞を、実施例2で説明されるように、フローサイトメトリーによって解析した。
V19S76K-5C8は、CD40発現HEK293T細胞に結合するが、CD40陰性WT HEK293T細胞には結合しない(図5)。
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、細胞表面に発現したCD40に特異的に結合する。
二重特異性VHH抗体は、CD40+及びVγ9Vδ2+細胞に結合する
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8の、CD40+及びVγ9Vδ2+細胞に結合する能力を試験した。
細胞株
CLL由来細胞株CIIを、完全IMDM中で増殖させた。精製したVγ9Vδ2-T細胞株を、以前に説明されるように(de Bruinら (2017)、Oncoimmunology 7(1):e1375641)生成した。簡潔に説明すると、Vδ2+-T細胞を、抗マウスIgGマイクロビーズ(Miltenyi Biotec社、Bergisch Gladbach、ドイツ)と組み合わせた、FITCをコンジュゲートした抗Vδ2 TCR(2257030、Sony社、San Jose、CA)を使用して健康なドナー(HD:healthy donor)PBMCから単離し、2人のHDからのPBMC、JY細胞、IL-7(10U/mL)、IL-15(10ng/mL、R&D Systems社)及びフィトヘマグルチニン(PHA:phytohaemagglutinin;R30852801、Thermo Fisher Scientific社)からなる照射済みフィーダーミックスを毎週伴って培養した。Vγ9Vδ2-T細胞株の純度を、90%超で維持した。
VHH結合を、実施例6で説明されるように試験した。
48時間後、細胞を、実施例2で説明されるように、フローサイトメトリーによって解析した。
V19S76K-5C8は、1.2nMの見かけのKdによりVγ9Vδ2+細胞に結合する(図6A及び図6B)。同様に、V19S76K-5C8は、フローサイトメトリーによって決定すると、10.9nMの見かけのKdによりCD40+ CII細胞に結合する(図6C及び図6D)。
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CD40+細胞及びVγ9Vδ2+細胞の両方に結合する。
二重特異性VHH抗体は、CD40アゴニストではない
序文
一価の抗CD40 VHH V19tは、CD40刺激を誘導しない。V19を二重特異性VHH V19S76K-5C8に組み込んだ場合も、CD40刺激が起こらないかどうかを、初代CLL細胞を使用して試験した。
患者材料、アゴニスト活性及びフローサイトメトリー
VHHの結合がアゴニスト効果を有するかどうかを評定するために、初代CLL PBMCを、示される濃度のV19S76K-5C8、媒体対照又はrmCD40Lを伴って48時間培養し、実施例4で説明されるようにフローサイトメトリーによって解析した。
rmCD40Lは、CD80、CD86及びCD95の発現における増大によって実証されるように、CD40刺激を有効に誘導した(図7A~図7C)。対照的に、試験したV19S76K-5C8濃度のいずれも、CD80、CD86又はCD95の発現を増大させなかった。
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CD40のアゴニストではない。
二重特異性VHH抗体は、CD40刺激に拮抗する
序文
一価の抗CD40 VHH V19tは、CD40Lで誘導されたCD40刺激によって誘導された効果を妨げる。CD40アンタゴニスト活性が二重特異性V19S76K-5C8形式で保持されるかどうかを、初代CLL細胞を使用して試験した。
患者材料、アンタゴニスト活性及びフローサイトメトリー
VHHの結合がアンタゴニスト効果を有するかどうかを評定するために、初代CLL PBMCを、V19S76K-5C8又は媒体対照とプレインキュベートし、その後、rmCD40Lを伴って48時間培養し、実施例5で説明されるようにフローサイトメトリーによって解析した。
rmCD40Lは、CD80、CD86及びCD95のより高い発現をもたらし、これはCD40刺激を示した(図8A~図8C)。V19S76K-5C8とのプレインキュベーションは、用量依存的様式でCD40刺激の効果を妨げた。
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、アンタゴニストCD40活性を保持する。
二重特異性VHH抗体は、初代CLL細胞をベネトクラクスに感受性にする
序文
CD40刺激は、初代CLL細胞の、抗アポトーシスタンパク質Bcl-2の阻害剤であるベネトクラクス(ABT-199)への抵抗性をもたらす(Thijssenら (2015)、Haematologica 100(8):e302~6)。これは、おそらく、抗アポトーシスタンパク質Bcl-xLのアップレギュレーションによってもたらされる。V19S76K-5C8は、CD40刺激に拮抗するので、V19S76K-5C8の、CD40で誘導されたベネトクラクス抵抗性を元に戻す能力を試験した。
患者材料、アンタゴニスト活性及びベネトクラクス感受性
初代CLL PBMCを、V19S76K-5C8(1000nM)又は媒体対照とプレインキュベートし、その後、rmCD40Lを伴って48時間培養し、実施例8で説明されるようにフローサイトメトリーによって解析した。Cytofix/Cytoperm試薬(554722、BD Biosciences社)を、細胞内Bcl-xLの検出のために使用した(13835S、Cell Signaling社、Danvers、MA、米国)。48時間後、細胞を、示される濃度のベネトクラクス(Bioconnect社、Huissen、オランダ)を伴って24時間培養した。
生存率を、実施例4で説明されるように測定した。細胞を、実施例2で説明されるようにフローサイトメトリーによって解析した。
ベネトクラクスは、刺激していない初代CLL細胞において用量依存的様式で細胞死を誘導した(図9A)。rmCD40Lにより刺激した初代CLL細胞は、ベネトクラクスに、より感受性が低かった。しかしながら、rmCD40Lに加えてV19S76K-5C8を伴って培養した細胞は、刺激していないCLL細胞と同じくらいベネトクラクスに感受性であった。このことは、rmCD40L刺激に際して増大するが、rmCD40Lに先行してV19S76K-5C8インキュベーションが行われた場合、非刺激レベルに戻るBcl-xL発現と相関した(図9B)。
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、初代CLL細胞をベネトクラクスに感受性にする。
二重特異性VHH抗体はVγ9Vδ2-T細胞を活性化する
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、標的細胞上のCD40及びVγ9Vδ2-T細胞受容体の両方に結合し得る。V19S76K-5C8の、CD40+細胞の存在下でVγ9Vδ2-T細胞を活性化する能力を試験した。
細胞株
CD40+ CII細胞及びVγ9Vδ2-T細胞を、実施例7で説明されるように増殖させた。
Vγ9Vδ2-T細胞株を、V19S76K-5C8又は媒体対照と37℃で30分間インキュベートした。続いて、Vγ9Vδ2-T細胞を、CII細胞と1:1の比で、ブレフェルジンA(10μg/mL;B7651、Merck社)、GolgiStop(554724)及びPECy7をコンジュゲートした抗CD107a(561348、両方ともBD Biosciences社)の存在下で4時間共培養した。その後、細胞を洗浄し、表面染色を、固定可能生存率染料(Fixable Viability Dye)eFluor506(65-0866-14)、AF700をコンジュゲートした抗CD3抗体(56-0038-82、両方ともThermo Fisher Scientific社)及びFITCをコンジュゲートした抗Vγ9-TCR抗体(IM1463、Beckman Coulter社)により行った。Cytofix/Cytoperm試薬(554722)を、BUV395をコンジュゲートした抗IFN-γ(563563)、BV650をコンジュゲートした抗TNF-α(563418、全てBD Biosciences社)及びPE/Dazzle594をコンジュゲートした抗IL-2(500343、Biolegend社)による細胞内サイトカインの検出のために使用した。
試料を、LSRFortessaサイトメーター(BD Biosciences社)で測定し、Flowjo MacV10により解析した。
Vγ9Vδ2-T細胞は、単独で、又はCII細胞と培養した場合、ほとんど脱顆粒しなかった(図10A)。しかしながら、V19S76K-5C8及びCD40+ CII細胞の両方が、存在する場合、Vγ9Vδ2-T細胞の大多数が脱顆粒した。V19S76K-5C8は、CD40+ CII細胞が存在しない場合、このレベルの脱顆粒を誘導しなかった。同様のパターンは、IFN-γ、TNF-α及びIL-2産生について観察された(図10B~図10D)。
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CD40+細胞の存在下でVγ9Vδ2-T細胞を活性化する。
二重特異性VHH抗体は、CD40+細胞への細胞傷害性を向上させる
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V15-5C8t及びV19-5C8は、CD40及びVγ9Vδ2-T細胞の両方に結合する。二重特異性VHHが、CD40+標的細胞への細胞傷害性も誘導するかどうかを試験した。
VHH生成
二重特異性V15-5C8t及びV19S76K-5C8 VHHを、実施例1で説明されるように生成した。
CD40+ CII細胞及びVγ9Vδ2-T細胞を、実施例7で説明されるように増殖させた。
CII標的細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE:carboxyfluorescein succinimidyl ester;C1157、Thermo Fisher Scientific社)で標識し、VHH又は媒体対照と37℃で30分間インキュベートした。その後、標的細胞を、Vγ9Vδ2-T細胞株と1:1の比で一晩共培養した。
生存率を、実施例4で説明されるように測定した。
Vγ9Vδ2-T細胞は、少量のCII標的細胞のみを溶解した(図11A)。CII標的細胞の溶解は、V19S76K-5C8が添加された場合、用量依存的様式で顕著に増大した。同様の結果は、V15-5C8t及びV12-5C8tで得られたが、V12-5C8tは、あまり強くなかった(データは示していない)。V19S76K-5C8の50%効果濃度は、9.1pMであった(図11B)。
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHHは、CD40+細胞への細胞傷害性を向上させる。
二重特異性VHH細胞傷害性はCD40特異的である
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CD40+標的細胞への細胞傷害性を増大させる。向上した細胞傷害性のCD40への特異性を試験した。
細胞株
野生型(WT)又はヒトCD40をトランスフェクトしたHEK293T細胞を、実施例2で説明されるように増殖させた。Vγ9Vδ2-T細胞を、実施例7で説明されるように増殖させた。
細胞傷害性実験、生存率測定及びフローサイトメトリーを、実施例12で説明されるように行った。
Vγ9Vδ2-T細胞は、WT及びCD40をトランスフェクトしたHEK293T細胞の両方の約20%を溶解した(図12)。V19S76K-5C8の添加は、CD40をトランスフェクトしたHEK293T細胞の溶解を強く向上させたが、CD40陰性WT HEK293T細胞の溶解は向上させなかった。V19S76K-5C8は、Vγ9Vδ2-T細胞なしでは、WT又はCD40をトランスフェクトしたHEK293T細胞のいずれかの溶解を誘導しなかった。
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CD40特異的様式で細胞傷害性を向上させる。
二重特異性VHH抗体は、初代CLL細胞に対する細胞傷害性を向上させる
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V15-5C8t、V19-5C8t及びV12-5C8tは、CD40+標的細胞の細胞傷害性を向上させ、ここで、初代CLL細胞への細胞傷害性に対する効果を評定した。
患者材料及び細胞株
初代CLL細胞を、実施例3で説明されるように得、凍結保存し、解凍した。Vγ9Vδ2-T細胞を、実施例7で説明されるように増殖させた。
細胞傷害性実験、生存率測定及びフローサイトメトリーを、実施例12で説明されるように行った。
Vγ9Vδ2-T細胞は、少量の初代CLL細胞を溶解し(図13)、それは、V12-5C8t(100nM;45.3%±4.0)によって、並びに特に、V15-5C8t(70.5%±7.3)及びV19-5C8t(68.5%±7.9)によって明らかに向上した。
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHHは、初代CLL細胞への細胞傷害性を向上させる。
二重特異性VHH抗体はCD40で刺激したCLL細胞に対して有効である
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、初代CLL細胞への細胞傷害性を増大させる。CD40刺激は、初代CLL細胞の、様々な薬物、例えば、ベネトクラクス(ABT-199;Thijssenら (2015)、Haematologica 100(8):e302~6)への抵抗性を増大させる。したがって、CD40で刺激した初代CLL細胞の、V19S76K-5C8で誘導した細胞傷害性への感受性を評定した。
患者材料及び細胞株
初代CLL細胞を、実施例3で説明されるように得、凍結保存し、解凍した。WT 3T3線維芽細胞又はヒトCD40Lをトランスフェクトした3T3線維芽細胞(3T40L)を、完全IMDM中で増殖させた。Vγ9Vδ2-T細胞を、実施例7で説明されるように増殖させた。
初代CLL細胞を、照射した3T3又は3T40L線維芽細胞上で72時間培養して、CD40刺激を誘導した。
その後、細胞を回収し、実施例10で説明されるようにベネトクラクス(10nM)を伴って、又は実施例12で説明されるようにVγ9Vδ2-T細胞及びV19S76K-5C8と一晩培養した。生存率測定及びフローサイトメトリーを、実施例10で説明されるように行った。
ベネトクラクスは、刺激していないCLL細胞の大多数において細胞死を誘導したが、3T40Lで誘導したCD40刺激は、CLL細胞のベネトクラクスへの抵抗性を増大させた(図14)。対照的に、V19S76K-5C8は、刺激していないCLL細胞及びCD40で刺激したCLL細胞において同程度まで細胞傷害性を誘導した。
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CD40で刺激したCLL細胞に対して有効である。
二重特異性VHH抗体は、CLL患者からの自家Vγ9Vδ2-T細胞を活性化する
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CD40+細胞が存在する場合、Vγ9Vδ2-T細胞株を活性化する。V19S76K-5C8の、CLL患者自身のCLL細胞の存在下で患者からのVγ9Vδ2-Tを活性化する能力を試験した。
患者材料
CLL患者からのPBMCを、実施例3で説明されるように得、凍結保存し、解凍した。
CLL PBMCから、磁気ビーズを使用してCD19+ CLL細胞を部分的に枯渇させた(130-050-301、Miltenyi Biotec社。CD19枯渇後、PBMCのうちの±50%がCD19+であった)。その後、PBMCを、V19S76K-5C8(10nM)又は媒体対照を伴って、ブレフェルジンA、GolgiStop及び抗CD107aの存在下で一晩培養して、実施例11で説明されるようにサイトカイン産生及び脱顆粒を測定した。実施例11とは対照的に、表面染色は、PEをコンジュゲートした抗Vγ9-TCR(2256535、Sony社)、並びにFITCをコンジュゲートしたヤギ抗ラマIgG-重鎖及び軽鎖抗体(A160-100F、Bethyl Laboratories Inc.社)を含んだ。
CLL患者からのVγ9Vδ2-T細胞は、V19S76K-5C8を伴う培養後に、サイトカインIFN-γ(図15A)、TNF-α(図15B)及びIL-2(図15C)を産生した。同様に、V19S76K-5C8は、CD107a発現によって測定すると、Vγ9Vδ2-T細胞脱顆粒を誘導した(図15D)。
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CLL患者からの自家Vγ9Vδ2-T細胞を活性化する。
二重特異性VHH抗体は、自家Vγ9Vδ2-T細胞によってCLL細胞の細胞傷害性を誘導する
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CLL患者からの自家Vγ9Vδ2-T細胞を活性化する。これが、自家CLL細胞の溶解も引き起こすかどうかを決定した。
患者材料
CLL患者からのPBMCを、実施例3で説明されるように得、凍結保存し、解凍した。
CD3+細胞を、磁気ビーズを使用してCLL PBMCから単離して(純度≧93%;130-050-101、Miltenyi Biotec社)、同時にVγ9Vδ2-T細胞について富化した。CD19+ CLL細胞を、磁気ビーズを使用して同じ試料から単離した(純度≧93%;130-050-301、Miltenyi Biotec社)。CD3+細胞を、CD19+ CLL細胞と10:1の比で、V19S76K-5C8(10nM)又は媒体対照を伴って一晩培養した。
試料を、固定可能生存率染料eF780(65-0865-14)、PerCPeF710をコンジュゲートした抗CD3抗体、PEをコンジュゲートした抗CD5抗体(12-0059-42、全てThermo Fisher Scientific社)及びFITCをコンジュゲートした抗CD20抗体(A07772、Beckman Coulter社)とインキュベートした。その後、生存CLL細胞を、FACSCantoサイトメーター(BD Biosciences社)で計数ビーズ(01-1234-42、Thermo Fisher Scientific社)を使用して定量した。
V19S76K-5C8を伴う培養後、生存していたCLL細胞は、媒体対照を伴う培養よりもより少なく(図16)、V19S76K-5C8が誘導したCLL細胞の溶解を示した。
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、自家Vγ9Vδ2-T細胞によってCLL細胞の細胞傷害性を誘導する。
二重特異性VHHは初代多発性骨髄腫に対して活性である
CD40は、初代多発性骨髄腫(MM)細胞上でも発現し(Pellat-Deceunynckら (1994) Blood 84:2597)(図17A)、CD40刺激は、MM細胞の増殖を含む様々な生物学的効果を発揮するので、私たちは、MM患者からの初代骨髄試料におけるV19S76K-5C8の有効性を評定した。二重特異性VHHの存在下で一晩培養した場合、健康なドナー由来のVγ9Vδ2-T細胞は、初代MM細胞を溶解した(図17B)。
二重特異性VHHは、異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を妨げる
二重特異性VHHの、in vivoでの腫瘍増殖に対する効果を研究するために、免疫不全NSGマウスに、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるMM.1sの細胞を注入した。腫瘍細胞を成長させ、1週間生着させ、その後、マウスは、ヒトVγ9Vδ2-T細胞又はPBSのいずれかの3回の毎週のi.v.注射の第1回目、続いてV19S76K-5C8又はPBSの毎週2回のi.p.注射を受容した(図18A)。V19S76K-5C8単独も、Vγ9Vδ2-T細胞単独も、全生存期間を有意に改善しなかった。対照的に、V19S76K-5C8及びVγ9Vδ2-T細胞の両方で処置したマウスは、有意に長く生存し、対照群の47日に対して80日の全生存期間中央値であった(図18B)。
Claims (45)
- ヒトCD40に結合することができる第1の抗原結合領域とヒトVγ9Vδ2 T細胞受容体に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む多重特異性抗体。
- 二重特異性抗体である、請求項1に記載の多重特異性抗体。
- 前記第1の抗原結合領域が、シングルドメイン抗体である、請求項1又は2に記載の多重特異性抗体。
- 前記第2の抗原結合領域が、シングルドメイン抗体である、請求項1から3のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第1の抗原結合領域及び第2の抗原結合領域が、ペプチドリンカーを介して共有結合している、請求項1から4のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記ペプチドリンカーが、配列番号21で示される配列を含むか、又はそれからなる、請求項5に記載の多重特異性抗体。
- 前記第1の抗原結合領域が、前記第2の抗原結合領域のN末端に位置する、請求項1から6のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- CD40に一価で結合し、ヒトVγ9Vδ2 T細胞受容体に一価で結合する、請求項1から7のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- ヒトCD40のアゴニストではない、請求項1から8のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- ヒトCD40のアンタゴニストである、請求項1から9のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- ヒトCD40発現細胞をベネトクラクスに感受性にすることができる、請求項1から10のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- ヒトCD40への結合について、配列番号13で示される配列を有する抗体と競合し、且つ/又はヒトCD40への結合について、配列番号14で示される配列を有する抗体と競合する、請求項1から11のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- ヒトCD40上の、配列番号13で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合するか、又はヒトCD40上の、配列番号14で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合する、請求項1から12のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第1の抗原結合領域が、
・配列番号1で示されるVH CDR1配列、配列番号2で示されるVH CDR2配列、及び配列番号3で示されるVH CDR3配列、又は
・配列番号4で示されるVH CDR1配列、配列番号5で示されるVH CDR2配列、及び配列番号6で示されるVH CDR3配列
を含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。 - 前記第1の抗原結合領域が、ヒト化されている、請求項1から14のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第1の抗原結合領域が、
・配列番号13で示される配列若しくは配列番号14で示される配列、又は
・配列番号13で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列、若しくは配列番号14で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列
を含むか、又はそれからなる、請求項1から15のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。 - ヒトVγ9Vδ2 T細胞を活性化することができる、請求項1から16のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 慢性リンパ球性白血病患者からのヒトCD40発現細胞、及び/又は多発性骨髄腫患者からのヒトCD40発現細胞の死滅を媒介することができる、請求項1から17のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- CD40Lで刺激した、慢性リンパ球性白血病患者からのヒトCD40発現細胞の死滅を媒介することができる、請求項1から18のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- ヒトVδ2に結合することができる、請求項1から19のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- ヒトVδ2への結合について、配列番号17で示される配列を有する抗体と競合するか、又はヒトVδ2への結合について、配列番号18で示される配列を有する抗体と競合する、請求項1から20のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- ヒトVδ2上の、配列番号17で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合するか、又はヒトVδ2上の、配列番号18で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合する、請求項1から21のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第2の抗原結合領域が、配列番号7で示されるVH CDR1配列、配列番号8で示されるVH CDR2配列、及び配列番号9で示されるVH CDR3配列を含むか、又は配列番号10で示されるVH CDR1配列、配列番号11で示されるVH CDR2配列、及び配列番号12で示されるVH CDR3配列を含む、請求項1から22のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第2の抗原結合領域が、ヒト化されている、請求項1から23のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第2の抗原結合領域が、
・配列番号17で示される配列、若しくは
・配列番号17で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列、又は
・配列番号25、26、27、28、29、30、31、32、33及び34からなる群から選択される配列
を含むか、又はそれからなる、請求項1から24のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。 - 前記第1の抗原結合領域が、
・配列番号1で示されるVH CDR1配列、配列番号2で示されるVH CDR2配列、及び配列番号3で示されるVH CDR3配列、又は
・配列番号4で示されるVH CDR1配列、配列番号5で示されるVH CDR2配列、及び配列番号6で示されるVH CDR3配列
を含み、前記第2の抗原結合領域が、配列番号7で示されるVH CDR1配列、配列番号8で示されるVH CDR2配列、及び配列番号9で示されるVH CDR3配列を含む、請求項1から25のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。 - ヒトCD40に結合することができる第1の抗原結合領域を含む抗体であって、ヒトCD40への結合について、配列番号13で示される配列を有する抗体と競合し、且つ/又はヒトCD40への結合について、配列番号14で示される配列を有する抗体と競合する、抗体。
- ヒトCD40上の、配列番号13で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合するか、又はヒトCD40上の、配列番号14で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合する、請求項27に記載の抗体。
- 前記第1の抗原結合領域が、
・配列番号1で示されるVH CDR1配列、配列番号2で示されるVH CDR2配列、及び配列番号3で示されるVH CDR3配列、又は
・配列番号4で示されるVH CDR1配列、配列番号5で示されるVH CDR2配列、及び配列番号6で示されるVH CDR3配列
を含む、請求項27又は28に記載の抗体。 - 前記第1の抗原結合領域が、
・配列番号13で示される配列若しくは配列番号14で示される配列、又は
・配列番号13で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列、若しくは配列番号14で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列
を含むか、又はそれからなる、請求項27から29のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記第1の抗原結合領域が、シングルドメイン抗体である、請求項27から30のいずれか一項に記載の抗体。
- 単一特異性抗体、例えば、一価の抗体である、請求項27から31のいずれか一項に記載の抗体。
- ヒトCD40又はVδ2ではない抗原に結合する第2の抗原結合領域を含む、請求項27から31のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項9から11で定義される特性のうちの1つ又は複数を有する、請求項27から33のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、又は請求項27から34のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、又は請求項27から34のいずれか一項に記載の抗体。
- がんの処置における使用のための、請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、又は請求項27から34のいずれか一項に記載の抗体。
- 慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、頭頸部がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、乳がん、結腸がん、前立腺がん、B細胞リンパ腫/白血病、バーキットリンパ腫又はB細胞急性リンパ芽球性白血病の処置における使用のための、請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、又は請求項27から34のいずれか一項に記載の抗体。
- 慢性リンパ球性白血病又は多発性骨髄腫の処置における使用のための請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 請求項36から39のいずれか一項に規定の使用のための、請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、又は請求項27から34のいずれか一項に記載の抗体であって、前記使用が、Bcl-2ブロッカー、例えば、ベネトクラクスとの組合せである、多重特異性抗体又は抗体。
- 請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、又は請求項27から34のいずれか一項に記載の抗体の、それを必要とするヒト対象への投与を含む、疾患を処置する方法。
- 前記疾患が、がんである、請求項41に記載の方法。
- 請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、又は請求項27から34のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸構築物。
- 請求項43に記載の核酸構築物を含む発現ベクター。
- 請求項43に記載の核酸構築物、又は請求項44に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
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