KR20240004949A - B7h4 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체를 포함하는 제약 조성물 - Google Patents
B7h4 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체를 포함하는 제약 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 B7H4 및 CD3에 결합하는 항체를 포함하는 제약 조성물 및 단위 투여 형태에 관한 것이다. 본 발명은 특히 암 요법에서 치료 및 진단 절차를 위한 제약 조성물 및 단위 투여 형태의 용도를 추가로 제공한다.
Description
발명의 분야
본 발명은 B7H4 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체의 제약 조성물 및 단위 투여 형태, 및 상기 제약 조성물 또는 단위 투여 형태의 용도에 관한 것이다.
도입
B7H4 (B7-H4, V-세트 도메인 함유 T 세포 활성화 억제제 1 또는 VTCN1)는 단백질의 B7 패밀리의 구성원이며, 이 패밀리는 림프구 상의 수용체에 결합하는 세포-표면 단백질 리간드를 포함한다. B7 패밀리는 면역 반응의 조절에 있어서 중요한 역할을 한다. B7H4는 T 세포 활성화, 증식, 시토카인 생산 및 세포독성 활성을 억제함으로써 T 세포-매개 면역 반응을 음성적으로 조절한다 (Prasad et al., 2003, Immunity 18: 863-873). B7H4는 짧은 세포내 도메인, 소수성 막횡단 도메인, 및 4개의 보존된 시스테인 잔기 및 N-연결된 글리코실화를 위한 7개의 부위를 갖는 IgV- 및 IgC-유사 도메인을 갖는 세포외 도메인을 포함하는 유형 I 막횡단 단백질이다 (Sica et al., 2003, Immunity 18: 849-861). 지금까지, B7H4에 대한 수용체는 확인되지 않았다.
정상 성체 조직에서, B7H4 발현은 매우 제한된 반면, B7H4 발현은 다수의 암 조직에서 종양 세포 상에 발견된다 (Kaur and Janakiram, 2019, ESMO Open 4:e000554). 암에서, B7H4 발현은 암의 진행된 병기, 불량한 예후, 및 감소된 전체 환자 생존과 상관관계가 있다.
따라서, B7H4의 표적화는 암의 치료를 위해 제안되었다 (Podojil and Miller, Immunological Reviews, 2017: 276; 40-51). 현재, B7H4 결합 항체는 암 요법을 위해 개발 중이다. 예를 들어, FPA150은 T 세포 활성화의 B7H4-매개 억제를 완화시키고 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 나타내는 비-푸코실화 인간 항체이다 (Wainberg et al., 2019, Annals of Oncology 30, Suppl. 5, v489 (1198P). 이는 현재 진행성 고형 종양에서 단독요법으로서 또는 펨브롤리주맙과 조합되어 초기 임상 시험 중에 있다.
T 세포를 B7H4에 표적화하려는 노력이 또한 이루어졌다. B7H4/CD3-이중특이적 단일 쇄 항체, Fab scFv가 마우스 항-인간 B7H4 항체 및 마우스 항-인간 CD3 항체의 Fab 및 단일-쇄 가변 단편 (scFv) 구조에 기초하여 제조되었다 (Iizuka et al., 2019, Clin Cancer Res 25: 2925-2934). 스미스(Smith) 등은 마우스에서 B7H4-양성 인간 난소 종양 이종이식편에 대해 항종양 활성을 나타내지만, 또한 다중-기관 림프구성 침윤 및 치사 독성을 나타낸 B7H4-특이적 키메라 항원 수용체 (CAR)를 갖는 조작된 T 세포를 기재하였다 (Smith et al. 2016, Molecular Therapy, Vol.24 Iss. 11 pp 1987-99)
일부 진전이 이루어졌지만, 인간 사용에 효능이 있고/거나 안전한 B7H4를 표적화하는 항체-기반 암 요법의 개발에 대한 계속된 필요가 존재한다. 또한, 이러한 요법에 사용하기 위한 항체의 제약상 허용되는 제제가 필요하다.
발명의 개요
본 발명의 목적은 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 CD3, 예컨대 인간 CD3ε (엡실론)에 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 신규 제약 조성물을 제공하는 것이다. 추가의 목적은 광범위한 항체 농도 및/또는 온도에 걸쳐 제제가 안정한 항체의 제약 조성물을 제공하는 것이다. 추가의 목적은 제제가 적어도 3개월, 또는 심지어 그 초과, 예컨대 적어도 6개월 또는 적어도 12개월의 기간에 걸쳐 안정한 항체의 제약 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 IV 주입에 대해 잘 허용되는 항체의 제약 제제를 제공하는 것이다. 이러한 항체의 항원-결합 영역은 적어도 인간 프레임워크 영역, 예컨대 예를 들어 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다. 가장 바람직한 것은 모든 프레임워크 영역이 인간인 것이다. 이러한 항원-결합 영역은 인간화 및/또는 인간 항원-결합 영역이다. 이들 제약 조성물은 B7H4 발현 세포의 특이적 표적화 및 T 세포 매개 사멸이 요구되는 상태, 예를 들어 암과 같은 상태의 치료에 유용하다. 바람직하게는, 제약 조성물은 인간 용도, 예를 들어 의학적 치료에 적합하다. 치료에 적합할 수 있는 암은 고형 종양이다. 예를 들어 암 세포에서의 상기 B7H4 발현, 및 T 세포 매개 사멸은, 예를 들어 실시예 12에 제시된 바와 같이, 본 발명에 따라 B7H4의 비교적 낮은 발현, 예컨대 MCF-7 세포에서의 발현 내지 B7H4의 비교적 높은 발현, 예컨대 SK-BR3 세포에서의 발현의 범위일 수 있다. 보다 바람직하게는, 이러한 이중특이적 항체는 존재하는 경우 Fc 영역이 불활성이 되게 하는 불변 영역 내의 치환을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 IV 투여 둘 다에 적합하다.
제1 측면에서, 본 발명은 a) 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체로서, 여기서 상기 항원-결합 영역은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간화 및/또는 인간인 항체, 및 b) 완충제를 포함하는 제약 조성물을 제공하고, 여기서 조성물의 pH는 4.0 내지 8.0, 바람직하게는 4.5 내지 6.5, 가장 바람직하게는 5.0 내지 6.0이다. 완충제는 바람직하게는 히스티딘, 글루타메이트 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제약 조성물은 바람직하게는 비-이온성 부형제를 추가로 포함한다. 이러한 제약 조성물은 놀랍게도 항체의 높은 안정성, 예컨대 열 안정성 및 저장 안정성, 뿐만 아니라 높은 정도의 용해도를 제공하는 것으로 밝혀졌다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 CD3, 예컨대 인간 CD3ε (엡실론)에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체를 포함하며, 여기서 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 서열식별번호(SEQ ID NO): 25, 29 또는 31의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하고, 여기서 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 18, 19 및 21의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 23, GTN 및 24의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 바람직하게는, CDR 영역은 하기 기재된 IMGT 방법에 의해 결정된다.
추가 측면에서, 본 발명에 따른 상기 제약 조성물은 의학적 치료에 사용하기 위한 것이다.
도 1. B7H4-B7H3 키메라 분자를 사용한 결합에 관여하는 B7H4 도메인의 결정. B7H4 항체의 B7H4 도메인 특이성은 인간 B7H4 (I), 인간 B7H4-B7H3 키메라 분자 B7H3-IgV/B7H4-IgC (II) 또는 B7H4-IgV/B7H3-IgC (III), 또는 인간 B7H3 (IV)을 발현하도록 형질감염된 세포의 패널을 사용하여 결정하였다. 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. A = bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C4-FEAR; B = bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C3-FEAR; C = bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR; D = bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-FEAR; E = IgG1-B7H3-BRCA84D.
도 2. B7H4, B7H3 또는 B7H4-B7H3 키메라 분자에의 B7H4 항체의 결합. 인간 B7H4 또는 B7H4-B7H3 키메라 분자 B7H3-IgV/B7H4-IgC 또는 B7H4-IgV/B7H3-IgC를 발현하도록 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에의 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C2-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C3-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR의 결합을 유동 세포측정법을 사용하여 평가하였다.
도 3. ECD에 알라닌 돌연변이를 갖는 B7H4 변이체에의 B7H4 항체의 결합. 결합은 참조 항체에 비한 배수 변화로서 표현하였다. 배수 변화는 Log10(정규화된 gMFI[ala 돌연변이체]/정규화된 gMFI[wt])으로 정의하였다. 결합의 배수 변화가 평균 배수 변화 - 1.5 x SD보다 더 낮은 잔기는 '결합 돌연변이체의 소실'로 간주하였다. 결합에서 양성 배수 변화를 갖는 잔기는 참조 항체에 대한 결합 잔기의 소실이다. x-축 아래의 수는 아미노산 위치를 지칭한다. (A) 참조 항체로서 C2를 사용한 C1-N52S에 대한 결과. (B) 참조 항체로서 C1-N52S를 사용한 C2에 대한 결과. (C) 참조 항체로서 C2를 사용한 C3에 대한 결과.
도 4. 인간 및 시노몰구스 원숭이 B7H4에의 B7H4 항체 및 CD3xB7H4 이중특이적 항체의 결합. 인간 B7H4 또는 시노몰구스 원숭이 B7H4로 일시적으로 형질감염된 HEK-293F 세포에 대한 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (A) 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)의 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 비-형질감염된 HEK-293F 세포 (C)를 음성 대조군으로서 사용하였고; 이들에 대해 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 결합이 제시된다.
도 5. 토끼, 래트, 마우스, 개 및 돼지로부터의 B7H4에의 B7H4 항체 및 CD3xB7H4 이중특이적 항체의 결합. 토끼, 래트, 마우스, 개 또는 돼지로부터의 B7H4로 일시적으로 형질감염된 HEK-293F 세포에 대한 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (A) 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)의 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 비-형질감염된 HEK-293F 세포 (C)를 음성 대조군으로서 사용하였고; 이들에 대해 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 결합이 제시된다.
도 6. 상이한 종으로부터의 B7H4로 일시적으로 형질감염된 HEK-293F 세포에 대한 B7H4 항체의 결합. 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트 또는 돼지로부터의 B7H4로 형질감염된 HEK-293F 세포, 또는 형질감염되지 않은 HEK-293F 세포에의 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (A), IgG1-B7H4-C3-FEAR (B), IgG1-B7H4-C2-FEAR (C),IgG1-B7H4-C4-FEAR (D), 및 IgG1-B7H4-C5-FEAR (E)의 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. IgG1-b12를 비-결합 대조군 항체로서 사용하였다 (제시되지 않음).
도 7. MCF-7 및 MDA-MB-468 세포에의 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (A) 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)의 결합. 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. IgG1-b12 (C) 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR (D)을 비-결합 대조군 항체로서 사용하였다.
도 8. NIH-OVCAR-3, HCC1954 및 HeLa 세포에의 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A)의 결합. 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. BsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR (B)을 비-결합 대조군 항체로서 사용하였다.
도 9. SK-BR3 및 MDA-MB-486 세포에 대한 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A) 및 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)의 결합. 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR (C) 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR (D)을 비-결합 대조군 항체로서 사용하였다.
도 10. MDA-MB-486 및 HCC1954 세포에 대한 동종이량체 및 bsAb 포맷의 다양한 B7H4 항체의 결합. IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (A 동종이량체), IgG1-B7H4-C2-FEAR (B 동종이량체), IgG1-B7H4-C3-FEAR (C 동종이량체), IgG1-B7H4-C4-FEAR (D 동종이량체), IgG1-B7H4-C5-FEAR (E 동종이량체), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A bsAb), bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR [MDA-MB-468] 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C2-FEAR [HCC1954] (B bsAb), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C3-FEAR (C bsAb), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR (D bsAb), 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR (E bsAb)의 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR (F bsAb) 또는 IgG1-b12-K409R (F 동종이량체)을 비-결합 대조군 항체로서 사용하였다.
도 11. 이펙터 세포로서 정제된 T 세포를 다양한 이펙터 대 표적 비 (E:T)로 사용한 CD3xB7H4 이중특이적 항체에 의한 시험관내 SK-BR3 세포의 T 세포 매개 세포독성의 유도. bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR을 비-결합 대조군 항체로서 사용하였다. A = bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR; B = bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR; C = bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR.
도 12. 상이한 CD3 아암을 갖는 CD3xB7H4 이중특이적 항체의 존재 하에서의 시험관내 다양한 종양 세포주에서의 T 세포 매개 세포독성의 유도. bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR을 비-결합 대조군 항체로서 사용하였다. A = bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR; B = bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR; C = bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR, D = bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR.
도 13. B7H4 발현 수준 및 T 세포-매개 종양 세포 사멸의 IC50. (a) 종양 세포주 상의 B7H4 발현 수준의 정량적 유동 세포측정 분석. 개별 측정 (점), 기하 평균 (막대) 및 표준 편차 (오차 막대)가 제시된다. sABC = 특이적 항체 결합 능력. (b) 상이한 종양 세포주에 대한 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (I) 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (II)의 존재 하에서의 T 세포-매개 종양 세포 사멸의 IC50. 각각의 점은 개별 T 세포 공여자 (세포주당 4-6명의 공여자)로 수행된 실험을 나타내고, 수평선은 중앙값을 나타낸다. 세포주를 B7H4 발현 수준에 따라 순위화한다.
도 14. T 세포-종양 세포 공동-배양물에서의 B7H4 이중특이적 항체에 의한 T 세포 활성화. (a) 유동 세포측정법에 의해 결정된, 다양한 B7H4-양성 종양 세포주에 대한 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (I) 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (II)의 존재 하에서의 T 세포 활성화 (CD8+ 세포 상에서의 CD69의 %). (b) 각각의 표적 세포주에 대한, 3-5명의 공여자로부터 유래된 T 세포를 사용한 T 세포 활성화의 EC50. 각각의 점은 개별 T 세포 공여자로 수행된 실험을 나타내고; 수평선은 기하 평균을 나타낸다.
도 15. 멀티플렉스 U-플렉스 검정에 의해 결정된, 3-4명의 공여자로부터의 T 세포를 사용하여 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A) 및 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)에 대한 EC50, EC90 및 EC99에서의 T 세포-종양 세포 공동-배양물의 상청액 중의 IFNγ. 개별 측정치 (점), 기하 평균 (수평선) 및 표준 편차 (오차 막대)가 제시된다.
도 16. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A) 또는 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)의 단일 용량 IV 주입으로 처리된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서의 IL-6 및 MCP-1 수준.
도 17. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A) 또는 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)의 단일 IV 주입 후 평균 혈장 농도-시간 프로파일.
도 18. 다양한 원발성 고형 종양에서의 B7H4 mRNA 발현 수준. B7H4 mRNA 수준을 오믹소프트(Omicsoft) TCGA 데이터베이스로부터 추출하고, 온콜랜드(Oncoland) 소프트웨어를 사용하여 가시화하였다. 적응증은 B7H4 mRNA 발현의 중앙값에 따라 순위화된다. THYM = 흉선종, UVM = 포도막 흑색종, PCPG = 크롬친화세포종 및 부신경절종, ACC = 부신피질 암종, MESO = 중피종, SKCM = 피부 흑색종, READ = 직장 선암종, COAD = 결장 선암종, GMB = 다형성 교모세포종, SARC = 육종, LIHC = 간 간세포성 암종, LGG = 뇌 저등급 신경교종, KIRC = 신장 투명 신세포 암종, TGCT = 고환 배세포 종양, KICH = 신장 혐색소성, STAD = 위 선암종, THCA = 갑상선 암종, HNSC = 두경부 편평 세포 암종, PRAD = 전립선 선암종, LUAD = 폐 선암종, ESCA = 식도 암종, CESC = 자궁경부 편평 세포 암종 및 자궁경내막 선암종, KIRP = 신장 유두상 신세포 암종, UCS = 자궁 암육종, BLCA = 방광 요로상피 암종, PAAD = 췌장 선암종, LUSC = 폐 편평 세포 암종, BRCA = 유방 침습성 암종, UCEC = 자궁체부 자궁내막 암종, OV = 난소 장액성 낭선암종 및 CHOL = 담관암종.
표 1 - 아미노산 및 핵산 서열
상기 열거된 표에서의 CDR 영역 (CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 VH 및 VL 서열에서의 밑줄표시된 서열)은 IMGT에 따라 주석이 달렸다 (문헌 [Lefranc MP. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999 및 Brochet X. Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008)] 참조). 상기 표에 사용된 바와 같은 K405L 및 K409R에 대한 언급은 Eu-넘버링 지수에 따른다 (문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)]에 기재됨).
도 2. B7H4, B7H3 또는 B7H4-B7H3 키메라 분자에의 B7H4 항체의 결합. 인간 B7H4 또는 B7H4-B7H3 키메라 분자 B7H3-IgV/B7H4-IgC 또는 B7H4-IgV/B7H3-IgC를 발현하도록 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에의 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C2-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C3-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR의 결합을 유동 세포측정법을 사용하여 평가하였다.
도 3. ECD에 알라닌 돌연변이를 갖는 B7H4 변이체에의 B7H4 항체의 결합. 결합은 참조 항체에 비한 배수 변화로서 표현하였다. 배수 변화는 Log10(정규화된 gMFI[ala 돌연변이체]/정규화된 gMFI[wt])으로 정의하였다. 결합의 배수 변화가 평균 배수 변화 - 1.5 x SD보다 더 낮은 잔기는 '결합 돌연변이체의 소실'로 간주하였다. 결합에서 양성 배수 변화를 갖는 잔기는 참조 항체에 대한 결합 잔기의 소실이다. x-축 아래의 수는 아미노산 위치를 지칭한다. (A) 참조 항체로서 C2를 사용한 C1-N52S에 대한 결과. (B) 참조 항체로서 C1-N52S를 사용한 C2에 대한 결과. (C) 참조 항체로서 C2를 사용한 C3에 대한 결과.
도 4. 인간 및 시노몰구스 원숭이 B7H4에의 B7H4 항체 및 CD3xB7H4 이중특이적 항체의 결합. 인간 B7H4 또는 시노몰구스 원숭이 B7H4로 일시적으로 형질감염된 HEK-293F 세포에 대한 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (A) 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)의 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 비-형질감염된 HEK-293F 세포 (C)를 음성 대조군으로서 사용하였고; 이들에 대해 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 결합이 제시된다.
도 5. 토끼, 래트, 마우스, 개 및 돼지로부터의 B7H4에의 B7H4 항체 및 CD3xB7H4 이중특이적 항체의 결합. 토끼, 래트, 마우스, 개 또는 돼지로부터의 B7H4로 일시적으로 형질감염된 HEK-293F 세포에 대한 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (A) 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)의 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 비-형질감염된 HEK-293F 세포 (C)를 음성 대조군으로서 사용하였고; 이들에 대해 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 결합이 제시된다.
도 6. 상이한 종으로부터의 B7H4로 일시적으로 형질감염된 HEK-293F 세포에 대한 B7H4 항체의 결합. 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트 또는 돼지로부터의 B7H4로 형질감염된 HEK-293F 세포, 또는 형질감염되지 않은 HEK-293F 세포에의 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (A), IgG1-B7H4-C3-FEAR (B), IgG1-B7H4-C2-FEAR (C),IgG1-B7H4-C4-FEAR (D), 및 IgG1-B7H4-C5-FEAR (E)의 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. IgG1-b12를 비-결합 대조군 항체로서 사용하였다 (제시되지 않음).
도 7. MCF-7 및 MDA-MB-468 세포에의 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (A) 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)의 결합. 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. IgG1-b12 (C) 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR (D)을 비-결합 대조군 항체로서 사용하였다.
도 8. NIH-OVCAR-3, HCC1954 및 HeLa 세포에의 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A)의 결합. 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. BsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR (B)을 비-결합 대조군 항체로서 사용하였다.
도 9. SK-BR3 및 MDA-MB-486 세포에 대한 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A) 및 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)의 결합. 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR (C) 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR (D)을 비-결합 대조군 항체로서 사용하였다.
도 10. MDA-MB-486 및 HCC1954 세포에 대한 동종이량체 및 bsAb 포맷의 다양한 B7H4 항체의 결합. IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (A 동종이량체), IgG1-B7H4-C2-FEAR (B 동종이량체), IgG1-B7H4-C3-FEAR (C 동종이량체), IgG1-B7H4-C4-FEAR (D 동종이량체), IgG1-B7H4-C5-FEAR (E 동종이량체), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A bsAb), bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR [MDA-MB-468] 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C2-FEAR [HCC1954] (B bsAb), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C3-FEAR (C bsAb), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR (D bsAb), 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR (E bsAb)의 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR (F bsAb) 또는 IgG1-b12-K409R (F 동종이량체)을 비-결합 대조군 항체로서 사용하였다.
도 11. 이펙터 세포로서 정제된 T 세포를 다양한 이펙터 대 표적 비 (E:T)로 사용한 CD3xB7H4 이중특이적 항체에 의한 시험관내 SK-BR3 세포의 T 세포 매개 세포독성의 유도. bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR을 비-결합 대조군 항체로서 사용하였다. A = bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR; B = bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR; C = bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR.
도 12. 상이한 CD3 아암을 갖는 CD3xB7H4 이중특이적 항체의 존재 하에서의 시험관내 다양한 종양 세포주에서의 T 세포 매개 세포독성의 유도. bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR을 비-결합 대조군 항체로서 사용하였다. A = bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR; B = bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR; C = bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR, D = bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR.
도 13. B7H4 발현 수준 및 T 세포-매개 종양 세포 사멸의 IC50. (a) 종양 세포주 상의 B7H4 발현 수준의 정량적 유동 세포측정 분석. 개별 측정 (점), 기하 평균 (막대) 및 표준 편차 (오차 막대)가 제시된다. sABC = 특이적 항체 결합 능력. (b) 상이한 종양 세포주에 대한 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (I) 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (II)의 존재 하에서의 T 세포-매개 종양 세포 사멸의 IC50. 각각의 점은 개별 T 세포 공여자 (세포주당 4-6명의 공여자)로 수행된 실험을 나타내고, 수평선은 중앙값을 나타낸다. 세포주를 B7H4 발현 수준에 따라 순위화한다.
도 14. T 세포-종양 세포 공동-배양물에서의 B7H4 이중특이적 항체에 의한 T 세포 활성화. (a) 유동 세포측정법에 의해 결정된, 다양한 B7H4-양성 종양 세포주에 대한 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (I) 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (II)의 존재 하에서의 T 세포 활성화 (CD8+ 세포 상에서의 CD69의 %). (b) 각각의 표적 세포주에 대한, 3-5명의 공여자로부터 유래된 T 세포를 사용한 T 세포 활성화의 EC50. 각각의 점은 개별 T 세포 공여자로 수행된 실험을 나타내고; 수평선은 기하 평균을 나타낸다.
도 15. 멀티플렉스 U-플렉스 검정에 의해 결정된, 3-4명의 공여자로부터의 T 세포를 사용하여 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A) 및 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)에 대한 EC50, EC90 및 EC99에서의 T 세포-종양 세포 공동-배양물의 상청액 중의 IFNγ. 개별 측정치 (점), 기하 평균 (수평선) 및 표준 편차 (오차 막대)가 제시된다.
도 16. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A) 또는 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)의 단일 용량 IV 주입으로 처리된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서의 IL-6 및 MCP-1 수준.
도 17. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A) 또는 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)의 단일 IV 주입 후 평균 혈장 농도-시간 프로파일.
도 18. 다양한 원발성 고형 종양에서의 B7H4 mRNA 발현 수준. B7H4 mRNA 수준을 오믹소프트(Omicsoft) TCGA 데이터베이스로부터 추출하고, 온콜랜드(Oncoland) 소프트웨어를 사용하여 가시화하였다. 적응증은 B7H4 mRNA 발현의 중앙값에 따라 순위화된다. THYM = 흉선종, UVM = 포도막 흑색종, PCPG = 크롬친화세포종 및 부신경절종, ACC = 부신피질 암종, MESO = 중피종, SKCM = 피부 흑색종, READ = 직장 선암종, COAD = 결장 선암종, GMB = 다형성 교모세포종, SARC = 육종, LIHC = 간 간세포성 암종, LGG = 뇌 저등급 신경교종, KIRC = 신장 투명 신세포 암종, TGCT = 고환 배세포 종양, KICH = 신장 혐색소성, STAD = 위 선암종, THCA = 갑상선 암종, HNSC = 두경부 편평 세포 암종, PRAD = 전립선 선암종, LUAD = 폐 선암종, ESCA = 식도 암종, CESC = 자궁경부 편평 세포 암종 및 자궁경내막 선암종, KIRP = 신장 유두상 신세포 암종, UCS = 자궁 암육종, BLCA = 방광 요로상피 암종, PAAD = 췌장 선암종, LUSC = 폐 편평 세포 암종, BRCA = 유방 침습성 암종, UCEC = 자궁체부 자궁내막 암종, OV = 난소 장액성 낭선암종 및 CHOL = 담관암종.
표 1 - 아미노산 및 핵산 서열
상기 열거된 표에서의 CDR 영역 (CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 VH 및 VL 서열에서의 밑줄표시된 서열)은 IMGT에 따라 주석이 달렸다 (문헌 [Lefranc MP. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999 및 Brochet X. Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008)] 참조). 상기 표에 사용된 바와 같은 K405L 및 K409R에 대한 언급은 Eu-넘버링 지수에 따른다 (문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)]에 기재됨).
상세한 설명
정의
본원에 사용된 용어 "항체"는 전형적인 생리학적 및/또는 종양-특이적 조건 하에 유의한 기간, 예컨대 적어도 약 30분, 적어도 약 45분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간 또는 그 초과, 적어도 약 48시간 또는 그 초과, 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 초과 등의 반감기, 또는 임의의 다른 관련된 기능적으로-정의된 기간 (예컨대 항원에의 항체 결합과 연관된 생리학적 반응을 유도하고/거나, 촉진시키고/거나, 증진시키고/거나, 조정하는 데 충분한 시간 및/또는 항체가 내재화되기에 충분한 시간)으로 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 이뮤노글로불린 분자, 이뮤노글로불린 분자의 단편, 또는 이 중 어느 하나의 유도체를 지칭하는 것으로 의도된다. 항체는 항원과 상호작용할 수 있는 결합 영역 (또는 본원에 사용될 수 있는 결합 도메인, 둘 다 동일한 의미를 가짐), 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 영역을 포함하는 결합 영역 등을 포함한다. 항체는 면역계의 다양한 세포 (예컨대 이펙터 세포) 및 보체계의 성분, 예컨대 보체 활성화의 전형적 경로에서의 제1 성분인 C1q를 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있는 항체 (Ab)의 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "항체"는 모노클로날 항체 (mAb), 항체-유사 폴리펩티드, 키메라 항체, 인간화 항체, 뿐만 아니라 임의의 공지된 기술, 예컨대 효소적 절단, 펩티드 합성 및 재조합 DNA 기술에 의해 제공되는, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 '항체 단편' 또는 '그의 단편' (항원-결합 단편)을 포함한다. 용어 "항체"는 이중특이적 항체 및/또는 추가의 변형을 갖는 항체, 예를 들어 그의 항체-약물 접합체를 포함한다.
본 발명에 따라 정의된 바와 같은 항체는 본원의 개시내용이 달리 제한되지 않는 한 임의의 이소형을 보유할 수 있다.
항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 "항체" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) Fab' 또는 Fab 단편, 경쇄 가변 도메인 (VL), 중쇄 가변 도메인 (VH), 경쇄 불변 영역 (CL) 및 중쇄 불변 영역 도메인 1 (CH1) 도메인으로 이루어진 1가 단편, 또는 WO 2007/059782에 기재된 바와 같은 1가 항체; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 본질적으로 이루어지고 또한 도메인 항체 (Holt et al.; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90)로 불리는 dAb 단편 (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)); (vi) 카멜리드 또는 나노바디 레벳 (Revets et al.; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24) 및 (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질 쇄 (단일 쇄 항체 또는 단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨)로 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있으며, 예를 들어 문헌 [Revets et al.; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24 and Bird et al., Science 242, 423-426 (1988)]을 참조한다. 이러한 단일 쇄 항체는 달리 나타내거나 또는 문맥에 의해 명백하게 나타내지 않는 한 용어 항체 내에 포괄된다. 이러한 단편이 일반적으로 항체의 의미 내에 포함되지만, 이들은 집합적으로 및 각각 독립적으로 상이한 생물학적 특성 및 유용성을 나타내는 본 발명의 고유한 특색이다. 본 발명의 문맥에서 이들 및 다른 유용한 항체 단편은 본원에서 추가로 논의된다.
항체는 상이한 시험관내 또는 생체외 발현 또는 생산 시스템, 예를 들어 재조합적으로 변형된 숙주 세포, 하이브리도마 또는 항체를 코딩하는 핵산 서열의 시험관내 전사 및/또는 번역을 지지하는 세포 추출물을 사용하는 시스템에서 생산되고 그로부터 수집될 수 있다. 본 발명의 문맥에서 정의된 바와 같은 다수의 상이한 항체는 상기 언급된 바와 같은 생산 시스템에서 개별적으로 각각의 항체를 생산한 후, 항체를 혼합함으로써, 또는 동일한 생산 시스템에서 여러 항체를 생산함으로써 제공될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "이뮤노글로불린 중쇄" 또는 "이뮤노글로불린의 중쇄"는 이뮤노글로불린의 중쇄 중 하나를 지칭하는 것으로 의도된다. 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 이뮤노글로불린의 이소형을 정의하는 중쇄 불변 영역 (본원에서 CH로 약칭됨)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 본원에 사용된 용어 "이뮤노글로불린"은 2쌍의 폴리펩티드 쇄, 즉 한 쌍의 저분자량 경쇄 (L) 및 한 쌍의 중쇄 (H)로 이루어진 구조적으로 관련된 당단백질의 부류를 지칭하는 것으로 의도되며, 모든 4개는 디술피드 결합에 의해 잠재적으로 상호연결된다. 이뮤노글로불린의 구조는 잘 특징화되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))] 참조). 이뮤노글로불린의 구조 내에서, 2개의 중쇄는 소위 "힌지 영역"에서 디술피드 결합을 통해 상호-연결된다. 중쇄와 동등하게, 각각의 경쇄는 전형적으로 여러 영역; 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 1개의 도메인, CL로 구성된다. 또한, VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 불리는 초가변 영역 (또는 서열 및/또는 구조적으로 규정된 루프의 형태에서 초가변성일 수 있는 초가변 영역)으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
본원에 사용된 용어 "절반 분자", "Fab-아암" 및 "아암"은 1개의 중쇄-경쇄 쌍을 지칭한다. 이중특이적 항체가 제1 항체"로부터 유래된" 절반-분자 항체 및 제2 항체"로부터 유래된" 절반-분자 항체를 포함하는 것으로 기재된 경우에, 용어 "로부터 유래된"은 이중특이적 항체가 임의의 공지된 방법에 의해 각각의 상기 제1 및 제2 항체로부터의 상기 절반-분자를 생성된 이중특이적 항체로 재조합함으로써 생성되었음을 나타낸다. 이와 관련하여, "재조합"은 임의의 특정한 재조합 방법에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 따라서 예를 들어 절반-분자 교환에 의한 재조합, 뿐만 아니라 핵산 수준에서의 재조합 및/또는 동일한 세포에서의 2개의 절반-분자의 공동-발현을 통한 재조합을 포함한, 하기 본원에 기재된 이중특이적 항체를 생산하는 모든 방법을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항원-결합 영역" 또는 "결합 영역"은 항원에 결합할 수 있는 항체의 영역을 지칭한다. 항원은 임의의 분자, 예컨대 폴리펩티드일 수 있다. 항원은 예를 들어 세포, 박테리아 또는 비리온 상에 제시될 수 있다. 용어 "항원" 및 "표적"은, 문맥에 의해 모순되지 않는 한, 본 발명의 문맥에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 용어 "항원-결합 영역" 및 "항원-결합 부위"는, 문맥에 의해 모순되지 않는 한, 본 발명의 문맥에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
용어 "결합을 차단한다" 또는 "항체의 결합을 차단하는" 또는 "결합을 교차-차단하는" 또는 "결합을 교차-차단한다"는 특이적 항원에 결합된 하나의 항체가 동일한 항원에의 제2 항체의 결합을 방지하고, 그 반대의 경우를 지칭한다. 다른 항체의 부재 하에, 각각의 항체는 유의한 결합 반응에 의해 결정된 바와 같은 항원에 결합하는 능력을 갖는 반면, 항체 중 하나는 다른 항체가 존재하는 경우 결합 반응이 결여된다. 한 항체가 또 다른 항체의 결합을 차단하는 능력은, 예를 들어 본 출원에서 실시예 5에 및 압디케(Abdiche) 등 (Abdiche YN, Malashock DS, Pinkerton A, Pons J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 2009; 386(2): 172-180)에 의해 기재된 바와 같이, 전형적 샌드위치 에피토프 비닝 검정 포맷으로 생물층 간섭측정법에 의해 결정될 수 있다. 간략하게, 샌드위치 에피토프 비닝 검정에서, 용액 중의 항체를 먼저 고정화된 항체를 통해 포획되는 그의 특이적 항원에의 결합에 대해 시험한다. 본 발명의 문맥에서, 한 항체는 제2 항체의 존재 하에 항원에 결합할 수 있는 경우에 제2 항체의 결합을 차단하지 않고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 용어 "결합을 차단한다" 및 "항체의 결합을 차단하는" 및 "결합을 교차-차단하는" 및 "결합을 교차-차단한다"는 문맥에 의해 모순되지 않는 한 본 발명의 문맥에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 또 다른 항체의 결합을 차단하는 것으로 언급되는 항체는 또한 표적에의 결합에 대해 다른 항체와 경쟁하는 것으로 언급될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "KD" (M)는 특정한 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭하고, kd를 ka로 나눔으로써 수득된다. KD는 또한 "결합 친화도"로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "kd" (sec-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 또한 koff 값 또는 오프-레이트로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "ka" (M-1 x sec-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 또한 kon 값 또는 온-레이트로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "결합"은 항체를 리간드로서 및 항원을 분석물로서 사용하여 생물층 간섭측정법에 의해 결정할 때, 전형적으로 1E-6 M 이하, 예를 들어 5E-7 M 이하, 1E-7 M 이하, 예컨대 5E-8 M 이하, 예컨대 1E-8 M 이하, 예컨대 5E-9 M 이하, 또는 예컨대 1E-9 M 이하의 KD에 상응하는 결합 친화도로, 항체가 미리 결정된 항원 또는 표적에 결합하는 것을 지칭하고, 미리 결정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에의 결합에 대한 그의 친화도보다 적어도 10배 더 낮은, 예컨대 적어도 100배 더 낮은, 예를 들어 적어도 1,000배 더 낮은, 예컨대 적어도 10,000배 더 낮은, 예를 들어 적어도 100,000배 더 낮은 KD에 상응하는 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "B7H4"는 B7H4로 명명된 단백질을 지칭하며, 이는 또한 B7-H4; V-세트 도메인 함유 T 세포 활성화 억제제 1; 또는 VTCN1로 지칭된다. B7H4는 림프구 상의 수용체에 결합하는 세포-표면 단백질 리간드를 포함하는 단백질의 B7 패밀리의 구성원이다. B7H4는 짧은 세포내 도메인, 소수성 막횡단 도메인, 및 4개의 보존된 시스테인 잔기 및 N-연결된 글리코실화를 위한 7개의 부위를 갖는 IgV- 및 IgC-유사 도메인을 갖는 세포외 도메인을 포함하는 유형 I 막횡단 단백질이다 (Sica et al., 2003, Immunity 18: 849-861). B7H4 단백질은 다양한 종, 예컨대 인간 (호모 사피엔스(Homo sapiens)) B7H4 (유니프롯(Uniprot) 수탁 번호 Q7Z7D3), 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) B7H4 전사체 1 (유니프롯 수탁 번호 A0A2K5U6P5), 개 (카니스 파밀리아리스(Canis familiaris)) B7H4 (유니프롯 수탁 번호 F1P8R9), 토끼 (오리크톨라구스 쿠니쿨루스(Oryctolagus cuniculus)) B7H4 (유니프롯 수탁 번호 G1TQE8), 래트 (라투스 노르베기쿠스(rattus norvegicus)) B7H4 (유니프롯 수탁 번호 Q501W4), 마우스 (무스 무스쿨루스(mus musculus)) B7H4 (유니프롯 수탁 번호 Q7TSP5), 및 돼지 (수스 스크로파(sus scrofa)) B7H4 (유니프롯 수탁 번호 F1SAY4)로부터 공지되어 있다. 열거된 B7H4 서열의 천연 변이체가 존재할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "CD3"은 T-세포 보조-수용체 단백질 복합체의 일부이고 4개의 별개의 쇄로 구성된 인간 분화 클러스터 3 단백질을 지칭한다. CD3은 다양한 종에서 발견되고, 따라서, 문맥상 모순되지 않는 한, 용어 "CD3"은 인간 CD3으로 제한되지 않을 수 있다. 포유동물에서, 복합체는 CD3γ (감마) 쇄 (인간 CD3γ 쇄 유니프롯KB/스위스-프롯(Swiss-Prot) 번호 P09693, 또는 시노몰구스 원숭이 CD3γ 유니프롯KB/스위스-프롯 No Q95LI7), CD3δ (델타) 쇄 (인간 CD3δ 유니프롯KB/스위스-프롯 번호 P04234, 또는 시노몰구스 원숭이 CD3δ 유니프롯KB/스위스-프롯 번호 Q95LI8), 2개의 CD3ε (엡실론) 쇄 (인간 CD3ε: 유니프롯KB/스위스-프롯 번호 P07766 (본원에서 그의 서열은 서열식별번호: 13으로서 포함되고, 여기서 아미노산 잔기 1-22는 신호 펩티드를 나타내고, 아미노산 잔기 23-207은 성숙 CD3ε 폴리펩티드를 나타냄); 시노몰구스 원숭이 CD3ε 유니프롯KB/스위스-프롯 번호 Q95LI5; 또는 레수스 원숭이 CD3ε 유니프롯KB/스위스-프롯 번호 G7NCB9), 및 CD3ζ-쇄 (제타) 쇄 (인간 CD3ζ 유니프롯KB/스위스-프롯 번호 P20963, 시노몰구스 원숭이 CD3ζ 유니프롯KB/스위스-프롯 번호 Q09TK0)를 함유한다. 이들 쇄는 T 세포 수용체 (TCR)로 공지된 분자와 회합하고, T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. TCR 및 CD3 분자는 함께 TCR 복합체를 포함한다.
용어 "항체 결합 영역"은 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 항원의 영역을 지칭한다. 항체 결합 영역은 생물층 간섭측정법을 사용한 에피토프 비닝에 의해, 알라닌 스캔에 의해, 또는 도메인 셔플 검정 (항원의 영역이 또 다른 종의 것과 교환된 항원 구축물을 사용하고 항체가 여전히 항원에 결합하는지 아닌지 여부를 결정함)에 의해 결정될 수 있다. 항체와의 상호작용에 관여하는 항체 결합 영역 내의 아미노산은 수소/중수소 교환 질량 분광측정법에 의해 및/또는 그의 항원에 결합된 항체의 결정학에 의해 결정될 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체에 의해 특이적으로 결합되는 항원 결정기를 의미한다. 에피토프는 통상적으로 분자의 표면 기, 예컨대 아미노산, 당 측쇄 또는 그의 조합으로 이루어지고, 통상적으로 특정한 3차원 구조적 특징, 뿐만 아니라 특정한 전하 특징을 갖는다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기, 및 결합에 직접 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 항원에 결합할 때 항체에 의해 효과적으로 차단되거나 커버되는 아미노산 잔기 (즉, 아미노산 잔기는 특이적 항체의 풋프린트 내에 있거나 그에 매우 인접함)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체", "모노클로날 Ab", "모노클로날 항체 조성물", "mAb" 등은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭하고, 전형적으로 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 모노클로날 항체는 전형적으로 고유한 모 세포의 모든 클론인 동일한 세포, 예컨대 예를 들어 하이브리도마, 안정한 세포주 등에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된, 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말 비인간 동물, 예컨대 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산될 수 있다. 인간 모노클로날 항체는 인간 B 세포 또는 형질 세포로부터 유래될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 재조합적으로 변형된 숙주 세포, 또는 항체를 코딩하는 핵산 서열의 시험관내 전사 및/또는 번역을 지지하는 세포 추출물을 사용하는 시스템으로부터 생산될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 이뮤노글로불린 부류 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM) 또는 그의 임의의 동종이형, 예컨대 IgG1m(za) 및 IgG1m(f)를 지칭한다. 추가로, 각각의 중쇄 이소형은 카파 (κ) 또는 람다 (λ) 경쇄와 조합될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "전장 항체"는 중쇄 및 경쇄의 1개의 쌍 또는 중쇄 및 경쇄의 2개의 상이한 쌍을 포함하는 항체 (예를 들어, 모 또는 변이체 항체)를 지칭하며, 각각의 쌍은 예컨대 그 이소형의 야생형 항체의 중쇄-경쇄 쌍에서 정상적으로 발견되는 중쇄 및 경쇄 불변 및 가변 도메인을 함유한다. 전장 변이체 항체에서, 중쇄 및 경쇄 불변 및 가변 도메인은 특히 전장 모 또는 야생형 항체와 비교할 경우 항체의 기능적 특성을 변형 및/또는 개선시키는 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 전장 항체는 (i) CDR 서열을 완전한 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 1종 이상의 적합한 벡터 내로 클로닝하는 단계, 및 (ii) 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 수득된 적합한 벡터를 적합한 발현 시스템에서 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산될 수 있다. CDR 서열 또는 전체 가변 영역 서열 중 어느 하나로부터 출발하는 경우 전장 항체를 생성하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 지식 내에 있다. 따라서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 따른 전장 항체를 생성하는 방법을 알고 있다.
본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 인간 항체 불변 도메인, 및 인간 가변 도메인에 대해 높은 수준의 서열 상동성을 함유하도록 변형된 비-인간 가변 도메인을 함유하는 유전자 조작된 비-인간 항체를 지칭한다. 이는 함께 항원 결합 부위를 형성하는 비-인간 항체 상보성-결정 영역 (CDR)을 상동 인간 수용자 프레임워크 영역 (FR) 상에 그라프팅함으로써 달성될 수 있다 (특히 WO 92/22653 및 EP 0629240 참조). 모 항체의 결합 친화도 및 특이성을 완전히 재구성하기 위해, 모 항체 (즉, 비-인간 항체)로부터의 프레임워크 잔기의 인간 프레임워크 영역으로의 치환 (복귀-돌연변이)이 요구될 수 있다. 구조적 상동성 모델링은 항체의 결합 특성에 중요한 프레임워크 영역 내의 아미노산 잔기를 확인하는 데 도움이 될 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 비-인간 CDR 서열, 주로 비-인간 아미노산 서열로의 1개 이상의 아미노산 복귀-돌연변이를 임의로 포함하는 인간 프레임워크 영역, 및 완전 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 임의로, 예를 들어 탈아미드화를 피하고/거나, "불활성 Fc 영역"을 제공하고/거나, 제조를 개선시키기 위한 변형을 포함하기 위해, 바람직한 특징, 예컨대 특정한 유용한 친화도 및 생화학적 특성을 갖는 인간화 항체를 수득하기 위해, 반드시 복귀-돌연변이일 필요는 없는 추가의 아미노산 변형이 적용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 프레임워크 영역 및 인간 이뮤노글로불린 불변 도메인으로부터 유래된 불변 도메인을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 삽입 또는 결실)를 포함할 수 있다. "인간 항체"는 인간, 본원 실시예에 기재된 것과 같은 트랜스제닉 동물, HIS 마우스 등에서 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 생성된 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다. 이러한 VH 및 VL 서열은 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 불변 도메인으로부터 유래된 불변 도메인에 융합된 인간 VH 및 VL 서열로 간주된다.
따라서, "인간 항체"는 조작된 항체일 수 있다. "인간 항체"는 추가의 조작에 적용될 수 있고, 예를 들어 탈아미드화를 피하고/거나, "불활성 Fc 영역"을 제공하고/거나, 이중특이적 항체 생성을 가능하게 하고/거나, 제조를 개선시키는 변형을 포함한다. 인간 항체는 또한 비-인간 세포에서, 예를 들어 CHO 세포 등에서 생산될 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 비-인간 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "Fc 영역"은 항체의 2개의 중쇄의 N-말단에서 C-말단으로의 방향으로 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 영역을 지칭한다. 항체의 Fc 영역은 면역계의 다양한 세포 (예컨대 이펙터 세포) 및 보체계의 성분을 포함한 숙주 조직 또는 인자에의 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "힌지 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 힌지 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 힌지 영역은 문헌 [Kabat Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)]에 제시된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 216-230에 상응한다. 그러나, 힌지 영역은 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 하위유형일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "CH1 영역" 또는 "CH1 도메인"은 이뮤노글로불린 중쇄의 CH1 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH1 영역은 카바트 (상기 동일 문헌)에 제시된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 118-215에 상응한다. 그러나, CH1 영역은 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 하위유형일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "CH2 영역" 또는 "CH2 도메인"은 이뮤노글로불린 중쇄의 CH2 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH2 영역은 카바트 (상기 동일 문헌)에 제시된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 231-340에 상응한다. 그러나, CH2 영역은 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 하위유형일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "CH3 영역" 또는 "CH3 도메인"은 이뮤노글로불린 중쇄의 CH3 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH3 영역은 카바트 (상기 동일 문헌)에 제시된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 341-447에 상응한다. 그러나, CH3 영역은 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 하위유형일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "Fc-매개 이펙터 기능"은 폴리펩티드 또는 항체가 세포 막 상의 그의 표적 또는 항원에 결합하는 결과인 기능을 지칭하는 것으로 의도되며, 여기서 Fc-매개 이펙터 기능은 폴리펩티드 또는 항체의 Fc 영역에 기인한다. Fc-매개 이펙터 기능의 예는 (i) C1q 결합, (ii) 보체 활성화, (iii) 보체-의존성 세포독성 (CDC), (iv) 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), (v) Fc-감마 수용체 (FcgR)-결합, (vi) 항체-의존성, FcγR-매개 항원 가교, (vii) 항체-의존성 세포성 식세포작용 (ADCP), (viii) 보체-의존성 세포성 세포독성 (CDCC), (ix) 보체-증진된 세포독성, (x) 항체에 의해 매개된 옵소닌화 항체의 보체 수용체에 대한 결합, (xi) 옵소닌화, 및 (xii) (i) 내지 (xi) 중 임의의 것의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "불활성화", "불활성" 또는 "비-활성화"는 적어도 임의의 FcγR에 결합할 수 없거나, FcγR의 Fc-매개 가교를 유도할 수 없거나, 또는 개별 항체의 2개의 Fc 영역을 통해 표적 항원의 FcγR-매개 가교를 유도할 수 없거나, 또는 C1q에 결합할 수 없는 Fc 영역을 지칭한다. 그의 예는 본원에 기재된 바와 같은 불변 도메인 내의 FEA 치환이다. 항체의 Fc 영역의 불활성은 단일특이적 또는 이중특이적 포맷의 항체를 사용하여 시험될 수 있다.
항체와 관련하여 사용되는 경우에 용어 "전장"은, 항체가 단편이 아니라, 자연에서 그 이소형에 대해 정상적으로 발견되는 것과 같은 특정한 이소형에 상응하는 모든 도메인, 예를 들어 IgG1 항체에 대한 VH, CH1, CH2, CH3, 힌지, VL 및 CL 도메인을 함유함을 나타낸다.
본 발명의 문맥에서 용어 "1가 항체"는 단지 1개의 항원-결합 도메인 (예를 들어 1개의 Fab 아암)을 갖는, 항원과 상호작용할 수 있는 항체 분자를 지칭한다. 이중특이적 항체와 관련하여, "1가 항체 결합"은 단지 1개의 항원-결합 도메인 (예를 들어 1개의 Fab 아암)을 갖는 1개의 항원에의 이중특이적 항체의 결합을 지칭한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "단일특이적 항체"는 1개의 항원, 1개의 에피토프에만 결합 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 항체는 단일특이적, 1가 항체 (단지 1개의 항원-결합 영역을 보유함) 또는 단일특이적, 2가 항체 (예를 들어 2개의 동일한 항원-결합 영역을 갖는 항체)일 수 있다.
용어 "이중특이적 항체"는 상이한 에피토프에 결합하는 2개의 항원-결합 도메인, 예를 들어 VH 및 VL 영역의 2개의 비-동일한 쌍, 2개의 비-동일한 Fab-아암 또는 비-동일한 CDR 영역을 갖는 2개의 Fab-아암을 갖는 항체를 지칭한다. 본 발명의 문맥에서, 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 특이성을 갖는다. 이러한 에피토프는 동일하거나 상이한 항원 또는 표적 상에 존재할 수 있다. 에피토프가 상이한 항원 상에 존재하는 경우에, 이러한 항원은 동일한 세포 또는 상이한 세포, 세포 유형 또는 구조, 예컨대 세포외 매트릭스 또는 소포 및 가용성 단백질 상에 있을 수 있다. 따라서, 이중특이적 항체는 다중 항원, 예를 들어 2개의 상이한 세포를 가교시킬 수 있다.
용어 "2가 항체"는 2개의 동일한 항원 상의 2개의 동일한 에피토프에 결합하는 2개의 항원-결합 영역을 갖거나, 또는 동일한 또는 상이한 항원(들) 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 따라서, 2가 항체는 단일특이적 항체 또는 이중특이적 항체일 수 있다.
용어 "아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 아미노산은 아민 (-NH2) 및 카르복실 (-COOH) 관능기를 각각의 아미노산에 특이적인 측쇄 (R 기)와 함께 함유하는 유기 화합물이다. 본 발명의 문맥에서, 아미노산은 구조 및 화학적 특징에 기초하여 분류될 수 있다. 따라서, 아미노산의 부류는 하기 표 중 하나 또는 둘 다에 반영될 수 있다:
R 기의 구조 및 일반적 화학적 특징화에 기초한 주요 분류
표 2
표 3
아미노산 잔기의 대안적 물리적 및 기능적 분류
한 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 치환은 보존적 또는 비-보존적 치환으로서 분류될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, "보존적 치환"은 하나의 아미노산의 유사한 구조적 및/또는 화학적 특징을 갖는 또 다른 아미노산으로의 치환이며, 이러한 하나의 아미노산 잔기의 상기 2개의 표 중 임의의 것에 정의된 바와 같은 동일한 부류의 또 다른 아미노산 잔기로의 치환이며: 예를 들어, 류신은 이소류신으로 치환될 수 있는데, 이는 이들이 둘 다 지방족, 분지형 소수성이기 때문이다. 유사하게, 아스파르트산이 글루탐산으로 치환될 수 있으며, 이는 이들이 둘 다 음으로 하전된 소형 잔기이기 때문이다.
본 발명의 문맥에서, 항체에서의 치환은 하기와 같이 표시된다:
원래의 아미노산 - 위치 - 치환된 아미노산;
아미노산에 대해 널리 인식된 명명법을 참조하면, 임의의 아미노산 잔기를 나타내기 위해 코드 "Xaa" 또는 "X"를 포함한 3 문자 코드 또는 1 문자 코드가 사용된다. 따라서, Xaa 또는 X는 전형적으로 20개의 자연 발생 아미노산 중 임의의 것을 나타낼 수 있다. 본원에 사용된 용어 "자연 발생"은 하기 아미노산 잔기 중 어느 하나를 지칭한다; 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌 및 시스테인.
따라서, 표기법 "K409R" 또는 "Lys409Arg"는 항체가 아미노산 위치 409에서 리신의 아르기닌으로의 치환을 포함함을 의미한다. 주어진 위치의 아미노산의 임의의 다른 아미노산으로의 치환은 원래 아미노산 - 위치; 또는 예를 들어 "K409"로 지칭된다. 원래의 아미노산(들) 및/또는 치환된 아미노산(들)이 모두는 아니지만 1개 초과의 아미노산(들)을 포함할 수 있는 변형의 경우에, 1개 초과의 아미노산은 "," 또는 "/"에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 위치 409에서의 리신의 아르기닌, 알라닌 또는 페닐알라닌으로의 치환은 "Lys409Arg,Ala,Phe" 또는 "Lys409Arg/Ala/Phe" 또는 "K409R,A,F" 또는 "K409R/A/F" 또는 "K409에서 R, A 또는 F"이다. 이러한 명칭은 본 발명의 문맥에서 상호교환가능하게 사용될 수 있지만, 동일한 의미 및 목적을 갖는다.
또한, 용어 "치환"은 다른 19개의 천연 아미노산 중 어느 하나로의 치환, 또는 비-천연 아미노산과 같은 다른 아미노산으로의 치환을 포괄한다. 예를 들어, 위치 409에서의 아미노산 K의 치환은 각각의 하기 치환을 포함한다: 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409G, 409H, 409I, 409L, 409M, 409N, 409Q, 409R, 409S, 409T, 409V, 409W, 409P, 및 409Y. 이는 명칭 409X와 동등하며, 여기서 X는 원래 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 이들 치환은 또한 K409A, K409C 등 또는 K409A,C, 등 또는 K409A/C/등으로 지정될 수 있다. 이는 본원에 언급된 각각의 모든 위치에 유사하게 동일하게 적용되며, 이러한 치환 중 어느 하나를 본원에 구체적으로 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 또한 아미노산 잔기의 결실을 포함할 수 있다. 이러한 결실은 "del"로 나타낼 수 있고, 예를 들어 K409del로 기재하는 것을 포함한다. 따라서, 이러한 실시양태의 경우에, 위치 409에서의 리신은 아미노산 서열로부터 결실되었다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 핵산, 예컨대 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 특정한 대상 세포를 지칭할 뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손을 또한 포함할 수 있는 것으로 의도됨이 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다. 재조합 숙주 세포는, 예를 들어 트랜스펙토마, 예컨대 CHO 세포, HEK-293 세포, Expi293F 세포, PER.C6 세포, NS0 세포, 및 림프구성 세포, 및 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 및 다른 진핵 숙주, 예컨대 식물 세포 및 진균을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "트랜스펙토마"는 항체 또는 표적 항원을 발현하는 재조합 진핵 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포, PER.C6 세포, NS0 세포, HEK-293 세포, Expi293F 세포, 식물 세포, 또는 진균, 예컨대 효모 세포를 포함한다.
본 발명의 목적상, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성은 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), 바람직하게는 버전 5.0.0 이후의 니들(Needle) 프로그램에서 실행되는 바와 같은 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 참조 서열의 길이에 걸쳐 결정된다. 사용된 파라미터는 갭 개방 페널티 10, 갭 연장 페널티 0.5, 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. 니들 표지된 "최장 동일성" (-nobrief 옵션을 사용하여 수득됨)의 결과는 퍼센트 동일성으로서 사용되고, 하기와 같이 계산된다:
(동일한 잔기 x 100)/(정렬 길이 - 정렬 내의 갭의 총수).
유사한 잔기의 보유는 또한 또는 대안적으로 BLAST 프로그램 (예를 들어, 표준 설정 BLOSUM62, 개방 갭=11 및 연장된 갭=1을 사용하여 NCBI를 통해 이용가능한 BLAST 2.2.8)의 사용에 의해 결정된 바와 같은 유사성 점수에 의해 측정될 수 있다. 적합한 변이체는 전형적으로 모 또는 참조 서열에 대해 적어도 약 45%, 예컨대 적어도 약 55%, 적어도 약 65%, 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 초과 (예를 들어, 약 99%)의 유사성을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "내재화된" 또는 "내재화"는 분자, 예컨대 본 발명에 따른 항체가 세포 막에 의해 포식되고 세포의 내부로 끌어당겨지는 생물학적 과정을 지칭한다. 내재화는 또한 "세포내이입"으로 지칭될 수 있다.
CD3xB7H4를 표적화하는 이중특이적 항체를 포함하는 제약 조성물 및 단위 투여 형태
본 발명의 제1 측면에서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체를 포함하는 제약 조성물 또는 단위 투여 형태가 제공되며, 여기서 상기 항원-결합 영역은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항원-결합 영역은 인간 가변 영역 및/또는 인간화 가변 영역이다. 예를 들어, 하나의 항원-결합 영역은 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 다른 항원-결합 영역은 인간화 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 또는, 항원-결합 영역 둘 다는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있거나, 또는 항원-결합 영역 둘 다는 인간화 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체를 포함하는 제약 조성물 또는 단위 투여 형태가 제공되며, 여기서 상기 항원-결합 영역은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간 프레임워크 영역을 포함한다. 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항체는 또한 본원에서 예를 들어 CD3xB7H4 항체로 지칭될 수 있다.
이러한 항체는 바람직하게는 이중특이적 항체이다. 상기 기재된 바와 같은 이러한 항체는 추가 실시양태에서 예컨대 예를 들어 실시예에 기재된 암 세포 및 T-세포에 결합할 수 있다. 선택될 수 있는 암 세포는 인간 B7H4를 발현하는 암 세포이고/거나 고형 종양의 것인 암 세포이다. 이러한 항체는 바람직하게는 암 세포의 T-세포 매개 세포 사멸을 유도할 수 있다.
결합 가능성은, 실시예에 제시된 바와 같이, 결합 검정에서, 예를 들어 예컨대 본원의 도 3 및 4에 제시된 전형적인 결합 곡선에 의해 제시된 바와 같이, 또는 예를 들어 실시예 3 및 4에 제시된 바와 같이 생물층 간섭측정법을 사용하여 결합 친화도를 결정함으로써 항체가 그의 표적에 결합하는 것을 포함하는 것으로 이해된다. 명시된 표적에 결합할 수 없는 항원-결합 영역은, 예를 들어 실시예 3에 제시된 바와 같은 전형적인 생물층 간섭측정법 검정에 사용된 최고 농도에서 < 0.05 nm의 반응을 갖는, 예를 들어 그의 표적에 대한 검출불가능한 결합 친화도를 갖는다. 임의의 경우에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 항원-결합 영역이 그의 표적에 결합할 수 있는지 여부를 결정하는 방법을 잘 알고 있다.
제1 측면에서, 본 발명은
a) 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체로서, 여기서 상기 항원-결합 영역은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간화 및/또는 인간인 항체, 및
b) 완충제
를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이며,
여기서 조성물의 pH는 4.0 내지 8.0이다.
pH가 4.5 내지 6.5인 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 조성물의 pH는 5.0 내지 6.5이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 조성물의 pH는 5.0 내지 6.0이다. 이들 pH 범위는 항체의 특히 높은 안정성, 특히 열 안정성을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 본 발명의 pH 범위에서 제약 조성물은 항체의 고도의 용해도를 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 완충제는 히스티딘, 글루타메이트, 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 c) 비-이온성 부형제를 추가로 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 비-이온성 부형제는 당 또는 당 알콜이다.
한 실시양태에서, 비-이온성 부형제는 소르비톨, 수크로스 또는 그의 혼합물로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 비-이온성 부형제는 소르비톨이다.
바람직한 실시양태에서, 비-이온성 부형제는 100 내지 300 mM, 예컨대 125-250 mM, 바람직하게는 250 mM의 농도로 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 비-이온성 부형제는 소르비톨이고, 이는 125-250 mM, 바람직하게는 250 mM의 농도로 존재한다.
바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 d) 계면활성제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 계면활성제는 글리세롤 모노올레에이트, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 도큐세이트, 인지질, 폴리에틸렌 알킬 에테르, 소듐 라우릴 술페이트 및 트리카프릴린, 벤즈알코늄 클로라이드, 시트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드 및 인지질, 알파 토코페롤, 글리세롤 모노올레에이트, 미리스틸 알콜, 인지질, 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자 오일 유도체, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 폴리옥실 히드록시스테아레이트, 폴리옥실글리세리드, 폴리소르베이트, 프로필렌 글리콜 디라우레이트, 프로필렌 글리콜 모노라우레이트, 소르비탄 에스테르 수크로스 팔미테이트, 수크로스 스테아레이트, 트리카프릴린 및 TPGS, 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트, 바람직하게는 폴리소르베이트 20 또는 80이다. 바람직한 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
바람직한 실시양태에서, 계면활성제는 약 0.005% 내지 0.4% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.1% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.09% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.06% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.05% w/v, 예컨대 0.02% w/v 또는 0.03% w/v 또는 0.04% w/v 또는 0.05% w/v, 바람직하게는 0.02% w/v의 농도로 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이고, 이는 제약 제제 중에 0.02% w/v 내지 0.04% w/v로 존재한다. 바람직하게는 이는 0.02% w/v이다.
바람직한 실시양태에서, 항체의 농도는 0.5 내지 100 mg/ml, 예컨대 1.0 내지 50 mg/ml, 또는 예컨대 5 내지 30 mg/ml, 예컨대 5 mg/ml, 또는 6 mg/ml, 또는 7 mg/ml, 또는 8 mg/ml, 또는 9 mg/ml, 또는 10 mg/ml, 또는 11 mg/ml, 또는 12 mg/ml, 또는 13 mg/ml, 또는 14 mg/ml, 또는 15 mg/ml, 또는 16 mg/ml, 또는 17 mg/ml, 또는 18 mg/ml, 또는 19 mg/ml, 또는 20 mg/ml, 또는 21 mg/ml, 또는 22 mg/ml, 또는 23 mg/ml, 또는 24 mg/ml, 또는 25 mg/ml, 또는 26 mg/ml, 또는 27 mg/ml, 또는 28 mg/ml, 또는 29 mg/ml, 30 mg/ml, 31 mg/ml, 32 mg/ml, 33 mg/ml, 34 mg/ml, 35 mg/ml, 36 mg/ml, 37 mg/ml, 38 mg/ml, 39 mg/ml, 40 mg/ml, 41 mg/ml, 42 mg/ml, 43 mg/ml, 44 mg/ml, 45 mg/ml, 46 mg/ml, 47 mg/ml, 48 mg/ml, 49 mg/ml, 50 mg/ml, 51 mg/ml, 52 mg/ml, 53 mg/ml, 54 mg/ml, 55 mg/ml, 56 mg/ml, 57 mg/ml, 58 mg/ml, 59 mg/ml, 또는 예컨대 60 mg/ml이다. 가장 바람직한 농도는 10 내지 20 mg/ml, 예컨대 20 mg/ml이다. 그러나, 이는 또한 10 mg/ml로 존재할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이는 15 mg/ml로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 이는 25 mg/ml로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 이는 30 mg/ml로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 이는 35 mg/ml로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 이는 40 mg/ml로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 이는 45 mg/ml로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 이는 50 mg/ml로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 이는 55 mg/ml로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 이는 60 mg/ml로 존재한다.
바람직한 실시양태에서, 완충제는 5 내지 40 mM, 예컨대 10-30 mM, 바람직하게는 20 mM의 농도로 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 완충제는 pH 5.1 내지 5.3, 예컨대 5.2의 20 mM 글루타메이트이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 완충제는 pH 5.7 내지 5.9, 예컨대 5.8의 20 mM 히스티딘이다.
바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 액체 조성물이다. 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 수성 조성물이다.
바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은
a) 5-50 mg/ml의 항체, 바람직하게는 5-25 mg/ml의 항체, 가장 바람직하게는 10-20 mg/ml의 항체,
b) 10 내지 20 mM 글루타메이트, 바람직하게는 15-20 mM 글루타메이트, 가장 바람직하게는 20 mM 글루타메이트,
c) 150 내지 350 mM 소르비톨, 바람직하게는 200-300 mM 소르비톨, 가장 바람직하게는 250 mM 소르비톨,
d) 폴리소르베이트, 바람직하게는 폴리소르베이트 80, 가장 바람직하게는 0.02% w/v 폴리소르베이트 80
를 포함하며,
여기서 조성물의 pH는 5.0 내지 6.0, 바람직하게는 5.1-5.3이다.
바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은
a) 10-20 mg/ml의 항체, b) 20 mM 글루타메이트, c) 250 mM 소르비톨, d) 0.02% w/v 폴리소르베이트 80을 포함하는 제약 조성물로서, 조성물의 pH가 5.1-5.3인 제약 조성물이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은
a) 10-20 mg/ml의 항체, b) 20 mM 히스티딘, c) 250 mM 소르비톨, d) 0.02% w/v 폴리소르베이트 80을 포함하는 제약 조성물로서, 조성물의 pH가 5.7-5.9인 제약 조성물이다.
또 다른 실시양태에서, 조성물은 정맥내 조성물이고/거나, 조성물은 정맥내 투여에 사용하기 위한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 제약 제제의 항체는 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 여기서 CDR1은 서열식별번호: 18에 따르고, CDR2는 서열식별번호: 19에 따르고, CDR3은 서열식별번호: 21에 따른다.
바람직한 실시양태에서, 제약 제제의 항체는 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 CDR1은 서열식별번호: 23에 따르고, CDR2는 GTN이고, CDR3은 서열식별번호: 24에 따른다.
바람직한 실시양태에서, 제약 제제의 항체는 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 가변 중쇄 (VH) 영역을 포함하고, 여기서 CDR1은 서열식별번호: 26에 따르고, CDR2는 서열식별번호: 30에 따르고, CDR3은 서열식별번호: 28에 따른다.
바람직한 실시양태에서, 제약 제제의 항체는 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 CDR1은 서열식별번호: 34에 따르고, CDR2는 GAS이고, CDR3은 서열식별번호: 35에 따른다.
바람직한 실시양태에서, 제약 제제의 항체는 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은
CDR1이 서열식별번호: 18에 따르고, CDR2가 서열식별번호: 19에 따르고, CDR3이 서열식별번호: 21에 따르는 중쇄 가변 영역 (VH), 및
CDR1이 서열식별번호: 23에 따르고, CDR2가 GTN이고, CDR3이 서열식별번호: 24에 따르는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은
CDR1이 서열식별번호: 26에 따르고, CDR2가 서열식별번호: 30에 따르고, CDR3이 서열식별번호: 28에 따르는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및
CDR1이 서열식별번호: 34에 따르고, CDR2가 GAS이고, CDR3이 서열식별번호: 35에 따르는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 제약 제제의 항체는 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 17의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 22의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하며, 여기서 CDR 영역은 IMGT에 따라 넘버링될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 제약 제제의 항체는 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 서열식별번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 제약 제제의 항체는 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 추가로 서열식별번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 불변 중쇄 영역 (CH) 및 서열식별번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 불변 경쇄 영역 (CL)을 포함하고,
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 서열식별번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하고, 추가로 서열식별번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 불변 중쇄 영역 (CH) 및 서열식별번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 불변 경쇄 영역 (CL)을 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제약 제제의 항체는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR, 또는 그의 바이오시밀러이다.
본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한, 예컨대 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 질환은 암이다. 바람직한 실시양태에서, 암은 암 세포에서의 B7H4의 발현을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 B7H4의 발현은 환자로부터 수득된 암 세포에서 결정된다.
바람직한 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 바람직하게는, 암은 폐암, NSCLC (ADC 또는 SQCC), 위암, 췌장암, 담관암종, 방광암, 자궁경부암, 두경부암, 유방암, 난소암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 암의 치료를 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 암은 자궁 암육종 (UCS), 방광 요로상피 암종 (BLCA), 췌장 선암종 (PAAD), 폐 편평 세포 암종 (LUSC), 유방 침습성 암종 (BRCA), 자궁체부 자궁내막 암종 (UCEC), 난소 장액성 낭선암종 (OV) 및 담관암종 (CHOL)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 본 발명의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 정맥내로 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 정맥내 투여를 위한 본 발명의 제약 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 용도는 암의 치료를 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
a) 5 pg 내지 120 mg의 양의, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체로서, 여기서 상기 항원-결합 영역은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간화 및/또는 인간인 항체, 및
b) 바람직하게는 히스티딘, 글루타메이트 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 완충제를 포함하는 단위 투여 형태에 관한 것이며,
여기서 단위 투여 형태의 pH는 4.0 내지 8.0, 바람직하게는 4.5 내지 6.5, 보다 바람직하게는 5.0 내지 6.0이다.
바람직하게는, 항체의 양은 40 pg 내지 8 g이다. 일부 실시양태에서, 항체의 양은 40 pg 내지 60 mg, 예컨대 40 pg, 50 pg, 100 pg, 150, 160 pg, 170 pg, 180 pg, 190 pg, 200 pg, 250 pg, 300 pg, 350 pg, 400 pg, 450 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg, 20 mg, 21 mg, 22 mg, 23 mg, 24 mg, 25 mg, 26 mg, 27 mg, 28 mg, 29 mg, 30 mg, 31 mg, 32 mg, 33 mg, 34 mg, 35 mg, 36 mg, 37 mg, 38 mg, 39 mg, 40 mg, 41 mg, 42 mg, 43 mg, 44 mg, 45 mg, 46 mg, 47 mg, 48 mg, 49 mg, 50 mg, 51 mg, 52 mg, 53 mg, 54 mg, 55 mg, 56 mg, 57 mg, 58 mg, 59 mg, 60 mg, 65 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 110 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg, 1000 mg, 1050 mg, 1100 mg, 1150 mg, 1200 mg, 1250 mg, 1300 mg, 1350 mg, 1400 mg, 1500 mg, 2000 mg, 3000 mg, 4000 mg, 5000 mg, 6000 mg, 또는 예컨대 7000 mg이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 단위 투여 형태의 총 부피는 20 ml 내지 200 ml이며, 여기서 투여 형태는 I.V. 투여를 위한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 단위 투여 형태는 비-이온성 부형제, 바람직하게는 당 또는 당 알콜을 포함한다. 바람직하게는, 비-이온성 부형제는 소르비톨, 수크로스 또는 그의 혼합물로부터 선택된다. 유리한 실시양태에서, 비-이온성 부형제는 100 내지 300 mM, 예컨대 125-250 mM, 바람직하게는 250 mM의 농도로 존재한다.
단위 투여 형태는 d) 계면활성제를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 글리세롤 모노올레에이트, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 도큐세이트, 인지질, 폴리에틸렌 알킬 에테르, 소듐 라우릴 술페이트 및 트리카프릴린, 벤즈알코늄 클로라이드, 시트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드 및 인지질, 알파 토코페롤, 글리세롤 모노올레에이트, 미리스틸 알콜, 인지질, 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자 오일 유도체, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 폴리옥실 히드록시스테아레이트, 폴리옥실글리세리드, 폴리소르베이트, 프로필렌 글리콜 디라우레이트, 프로필렌 글리콜 모노라우레이트, 소르비탄 에스테르 수크로스 팔미테이트, 수크로스 스테아레이트, 트리카프릴린 및 TPGS, 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트, 바람직하게는 폴리소르베이트 20 또는 80, 가장 바람직하게는 폴리소르베이트 80이다. 바람직한 실시양태에서, 계면활성제는 약 0.005% 내지 0.4% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.1% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.09% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.06% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.05% w/v, 예컨대 0.02% w/v 또는 0.03% w/v 또는 0.04% w/v 또는 0.05% w/v, 바람직하게는 0.02% w/v의 농도로 존재한다.
바람직한 실시양태에서, 단위 투여 형태 중 항체의 농도는 0.5 내지 100 mg/ml, 예컨대 1.0 내지 50 mg/ml, 또는 예컨대 5 내지 30 mg/ml, 예컨대 5 mg/ml, 또는 6 mg/ml, 또는 7 mg/ml, 또는 8 mg/ml, 또는 9 mg/ml, 또는 10 mg/ml, 또는 11 mg/ml, 또는 12 mg/ml, 또는 13 mg/ml, 또는 14 mg/ml, 또는 15 mg/ml, 또는 16 mg/ml, 또는 17 mg/ml, 또는 18 mg/ml, 또는 19 mg/ml, 또는 20 mg/ml, 또는 21 mg/ml, 또는 22 mg/ml, 또는 23 mg/ml, 또는 24 mg/ml, 또는 25 mg/ml, 또는 26 mg/ml, 또는 27 mg/ml, 또는 28 mg/ml, 또는 29 mg/ml, 30 mg/ml, 31 mg/ml, 32 mg/ml, 33 mg/ml, 34 mg/ml, 35 mg/ml, 36 mg/ml, 37 mg/ml, 38 mg/ml, 39 mg/ml, 40 mg/ml, 41 mg/ml, 42 mg/ml, 43 mg/ml, 44 mg/ml, 45 mg/ml, 46 mg/ml, 47 mg/ml, 48 mg/ml, 49 mg/ml, 50 mg/ml, 51 mg/ml, 52 mg/ml, 53 mg/ml, 54 mg/ml, 55 mg/ml, 56 mg/ml, 57 mg/ml, 58 mg/ml, 59 mg/ml, 또는 예컨대 60 mg/ml이다.
바람직한 실시양태에서, 완충제는 5 내지 40 mM, 예컨대 10-30 mM, 바람직하게는 20 mM의 농도로 단위 투여 형태에 존재한다.
바람직한 실시양태에서, 단위 투여 형태는 액체 단위 투여 형태이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 단위 투여 형태를 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 단위 투여 형태에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 단위 투여 형태 또는 본 발명의 제약 조성물을 포함하는 용기에 관한 것이다. 용기는 유리 또는 1종 이상의 중합체 물질로 제조될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 부분들의 키트에 관한 것이다:
a. 본 발명의 제약 조성물, 또는 본 발명의 임의의 것의 단위 투여 형태, b. 제약 조성물 또는 단위 투여 형태를 위한 리셉터클, 및 c. 희석에 대한 및/또는 사용에 대한 지침서.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 부분들의 키트에 관한 것이다:
a. 본 발명의 제약 조성물, 또는 본 발명의 임의의 것의 단위 투여 형태, b. 희석제, c. 단위 투여 형태를 위한 리셉터클, 및 d. 희석에 대한 및/또는 사용에 대한 지침서.
또 다른 측면에서, 본 발명은 부분들의 키트, 예컨대 동반 진단제로서 사용하기 위한/본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물로의 치료에 반응하는 경향을 갖는 환자를 환자의 집단 내에서 확인하기 위한, 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물; 및 상기 키트의 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 주사용수 중에서 a. 0.5 내지 120 mg/ml의 항체, 및 b. 완충제를 혼합하는 단계, 및 pH를 4.0-8.0, 바람직하게는 5.0-6.0으로 조정하는 단계를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 단위 투여 형태를 제조하는 방법에 관한 것이다:
a. 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 제조하거나 또는 제약 조성물을 제공하는 상기 기재된 방법의 단계에 의해 제약 조성물을 제조하는 단계; b. 희석제를 제공하는 단계, 및 c. 제약 조성물 및 희석제를 목적하는 항체 농도로 혼합하는 단계.
또 다른 측면에서, 본 발명은 임의의 상기 기재된 방법에 의해 수득가능한 제약 조성물 또는 단위 투여 형태에 관한 것이다.
이중특이적 포맷
본 발명은 B7H4-발현 종양 세포의 T 세포-매개 사멸을 효율적으로 촉진하는 이중특이적 CD3xB7H4 항체를 포함하는 제약 조성물 또는 단위 투여 형태를 제공한다. 특정한 용도를 위한 목적하는 기능적 특성에 따라, 특정한 항원-결합 영역은 본 발명에 의해 제공된 항체 또는 항원-결합 영역의 세트로부터 선택될 수 있다. 이중특이적 항체의 많은 상이한 포맷 및 용도가 관련 기술분야에 공지되어 있고, 문헌 [Kontermann; Drug Discov Today, 2015 Jul;20(7):838-47 and; MAbs, 2012 Mar-Apr;4(2):182-97]에 의해 검토되었다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 임의의 특정한 이중특이적 포맷 또는 그의 생산 방법에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 이중특이적 항체 분자의 예는 (i) 상이한 항원-결합 영역을 포함하는 2개의 아암을 갖는 단일 항체; (ii) 예를 들어 여분의 펩티드 링커에 의해 텐덤으로 연결된 2개의 scFv를 통해 2개의 상이한 에피토프에 대한 특이성을 갖는 단일 쇄 항체; (iii) 각각의 경쇄 및 중쇄가 짧은 펩티드 연결을 통해 텐덤으로 2개의 가변 도메인을 함유하는 것인 이중-가변-도메인 항체 (DVD-Ig) (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (iv) 화학적으로-연결된 이중특이적 (Fab')2 단편; (v) 각각의 표적 항원에 대한 2개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이적 항체를 생성하는 2개의 단일 쇄 디아바디의 융합체인 Tandab; (vi) 다가 분자를 생성하는 디아바디와 scFv의 조합인 플렉시바디(flexibody); (vii) Fab에 적용되는 경우에, 상이한 Fab 단편에 연결된 2개의 동일한 Fab 단편으로 이루어진 3가 이중특이적 결합 단백질을 생성할 수 있는, 단백질 키나제 A에서의 "이량체화 및 도킹 도메인"에 기초한 소위 "독 앤 락(dock and lock)" 분자; (viii) 예를 들어, 인간 Fab-아암의 양쪽 말단에 융합된 2개의 scFv를 포함하는 소위 스콜피온(Scorpion) 분자; 및 (ix) 디아바디를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 디아바디, 크로스-바디, 또는 듀오바디(DuoBody)®로도 공지된 제어된 Fab-아암 교환을 통해 수득된 이중특이적 항체 (예컨대 WO 2011131746 (젠맙(Genmab))에 기재됨)이다.
상이한 부류의 이중특이적 항체의 예는 (i) 이종이량체화를 강제하는 상보적 CH3 도메인을 갖는 IgG-유사 분자; (ii) 분자의 2개의 측면이 각각 적어도 2개의 상이한 항체의 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부를 함유하는 것인 재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자; (iii) 전장 IgG 항체가 여분의 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부에 융합된 것인 IgG 융합 분자; (iv) 단일 쇄 Fv 분자 또는 안정화된 디아바디가 중쇄 불변-도메인, Fc-영역 또는 그의 일부분에 융합된 것인 Fc 융합 분자; (v) 상이한 Fab-단편이 함께 융합되고, 중쇄 불변-도메인, Fc-영역 또는 그의 일부분에 융합된 것인 Fab 융합 분자; 및 (vi) 상이한 단일 쇄 Fv 분자 또는 상이한 디아바디 또는 상이한 중쇄 항체 (예를 들어 도메인 항체, 나노바디)가 서로 융합되거나 또는 중쇄 불변-도메인, Fc-영역 또는 그의 일부분에 융합된 또 다른 단백질 또는 담체 분자에 융합된 것인 ScFv- 및 디아바디-기반 및 중쇄 항체 (예를 들어, 도메인 항체, 나노바디)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
상보적 CH3 도메인 분자를 갖는 IgG-유사 분자의 예는 트리오맙(Triomab)/쿼드로마(Quadroma) 분자 (트리온 파마(Trion Pharma)/프레세니우스 바이오테크(Fresenius Biotech); 로슈(Roche), WO 2011069104), 소위 노브-인투-홀(Knobs-into-Holes) 분자 (제넨테크(Genentech), WO 9850431), 크로스맙(CrossMAb) (로슈, WO 2011117329) 및 정전기적으로-매칭된 분자 (암젠(Amgen), EP 1870459 및 WO 2009089004; 추가이(Chugai), US 201000155133; 온코메드(Oncomed), WO 2010129304), LUZ-Y 분자 (제넨테크, 문헌 [Wranik et al. J. Biol. Chem. 2012, 287(52): 43331-9, doi: 10.1074/jbc.M112.397869. Epub 2012 Nov 1), DIG-바디 및 PIG-바디 분자 (파맙신(Pharmabcine), WO 2010134666, WO 2014081202), 가닥 교환 조작된 도메인 바디 (시드바디(SEEDbody)) 분자 (이엠디 세로노(EMD Serono), WO 2007110205), 비클로닉스(Biclonics) 분자 (메루스(Merus), WO 2013157953), Fc큰δAdp 분자 (레게네론(Regeneron), WO 201015792), 이중특이적 IgG1 및 IgG2 분자 (화이자(Pfizer)/리나트(Rinat), WO 11143545), 아지메트릭 스캐폴드 분자 (자임웍스(Zymeworks)/머크(Merck), WO 2012058768), mAb-Fv 분자 (젠코르(Xencor), WO 2011028952), 2가 이중특이적 항체 (WO 2009080254) 및 듀오바디(DuoBody)® 분자 (젠맙 A/S(Genmab A/S), WO 2011131746)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자의 예는 이중 표적화 (DT)-Ig 분자 (WO 2009058383), 투-인-원(Two-in-one) 항체 (제넨테크; 문헌 [Bostrom, et al. 2009. Science 323, 1610-1614.), 가교된 Mab (카르마노스 캔서 센터(Karmanos Cancer Center)), mAb2 (에프-스타(F-Star), WO 2008003116), 지바디 분자 (진제니아(Zyngenia); LaFleur et al. MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):208-18), 공통 경쇄로의 접근법 (크루셀(Crucell)/메루스, US 7,262,028), κλ바디 (노브이뮨(NovImmune), WO 2012023053) 및 CovX-바디 (CovX/화이자; Doppalapudi, V.R., et al. 2007. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17,501-506.)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
IgG 융합 분자의 예는 이중 가변 도메인 (DVD)-Ig 분자 (애보트(Abbott), US 7,612,181), 이중 도메인 이중 헤드 항체 (유니레버(Unilever); 사노피 아벤티스(Sanofi Aventis), WO 20100226923), IgG-유사 이중특이적 분자 (임클론(ImClone)/일라이 릴리(Eli Lilly), Lewis et al. Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8), Ts2Ab (메드이뮨(MedImmune)/AZ; Dimasi et al. J Mol Biol. 2009 Oct 30;393(3):672-92) 및 BsAb 분자 (지모제네틱스(Zymogenetics), WO 2010111625), 허큘레스(HERCULES) 분자 (비오젠 아이덱(Biogen Idec), US 007951918), scFv 융합 분자 (노파르티스(Novartis)), scFv 융합 분자 (창저우 아담 바이오테크 인크(Changzhou Adam Biotech Inc), CN 102250246) 및 TvAb 분자 (로슈, WO 2012025525, WO 2012025530)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
Fc 융합 분자의 예는 ScFv/Fc 융합체 (Pearce et al., Biochem Mol Biol Int. 1997 Sep;42(6):1179-88), 스콜피온 분자 (이머전트 바이오솔루션즈(Emergent BioSolutions)/트루비온(Trubion), 문헌 [Blankenship JW, et al. AACR 100th Annual meeting 2009 (Abstract # 5465)]; 지모제네틱스/BMS, WO 2010111625), 이중 친화도 재표적화 기술 (Fc-DART) 분자 (마크로제닉스(MacroGenics), WO 2008157379, WO 2010080538) 및 이중(ScFv)2-Fab 분자 (국립 항체 의학 연구 센터 - 중국)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
Fab 융합 이중특이적 항체의 예는 F(ab)2 분자 (메다렉스(Medarex)/암젠(AMGEN); 문헌 [Deo et al. J Immunol. 1998 Feb 15;160(4):1677-86]), 이중-작용 또는 비스-Fab 분자 (제넨테크(Genentech), 문헌 [Bostrom, et al. 2009. Science 323, 1610-1614.]), 독-앤-락 (DNL) 분자 (이뮤노메딕스(ImmunoMedics), WO 2003074569, WO 2005004809), 2가 이중특이적 분자 (바이오테크놀(Biotecnol), 문헌 [Schoonjans, J Immunol. 2000 Dec15;165(12):7050-7.]) 및 Fab-Fv 분자 (UCB-셀테크(Celltech), WO 2009040562 A1)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
ScFv-, 디아바디-기반 및 도메인 항체의 예는 이중특이적 T 세포 인게이저 (BiTE) 분자 (마이크로메트(Micromet), WO 2005061547), 탠덤 디아바디 분자 (TandAb) (아피메드(Affimed), 문헌 [Le Gall et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):357-66.]), 이중 친화도 재표적화 기술 (DART) 분자 (마크로제닉스, WO 2008157379, WO 2010080538), 단일-쇄 디아바디 분자 (로렌스(Lawrence), 문헌 [FEBS Lett. 1998 Apr 3;425(3):479-84]), TCR-유사 항체 (AIT, 리셉터로직스(ReceptorLogics)), 인간 혈청 알부민 ScFv 융합체 (메리맥(Merrimack), WO 2010059315) 및 콤바디(COMBODY) 분자 (에피젠 바이오테크(Epigen Biotech), 문헌 [Zhu et al. Immunol Cell Biol. 2010 Aug;88(6):667-75.]), 이중 표적화 나노바디 (애블링스(Ablynx), 문헌 [Hmila et al., FASEB J. 2010]) 및 이중 표적화 중쇄 단독 도메인 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물에 사용되는 이중특이적 항체는 임의의 이소형의 것일 수 있다. 예시적인 이소형은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 이소형 중 어느 하나를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 이중특이적 항체는 실시예에 제시된 바와 같이 인간 IgG1 이소형의 것이도록 선택될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역, 카파 또는 람다 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체의 두 중쇄는 IgG1 이소형의 것이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체의 2개의 중쇄는 각각 IgG1 및 IgG4 이소형의 것이다. 바람직하게는, 이중특이적 항체는 실시예에 제시된 바와 같이 인간 IgG1 이소형의 것이도록 선택될 수 있다. 임의로, 및 바람직하게는, 선택된 이소형의 중쇄 및 그의 Fc 서열은 이중특이적 항체의 생성을 가능하게 하고 불활성화를 도입하도록 본원에 기재된 바와 같이 힌지 및/또는 CH3 영역에서 변형될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 제1 CH3 영역을 포함하는 제1 Fc 서열을 갖는 제1 중쇄, 및 제2 CH3 영역을 포함하는 제2 Fc 서열을 갖는 제2 중쇄를 포함하는 Fc-영역을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 하는 것이다. 이들 상호작용 및 이를 달성할 수 있는 방법에 대한 보다 상세한 내용은 본원에 참조로 포함되는 WO 2011131746 및 WO 2013060867 (젠맙)에 제공된다.
본원에 추가로 기재된 바와 같이, 안정한 이중특이적 CD3xB7H4 항체는 각각 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 구성된 1개의 B7H4 항체 및 1개의 CD3 항체를 기초로 하여 높은 수율로 수득될 수 있으며, 각각의 항체는 CH3 영역에 단지 소수의 상당히 보존적인 (비대칭) 돌연변이를 함유한다. 비대칭 돌연변이는 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열이 동일하지 않은 위치에 1개 이상의 아미노산 치환을 함유함을 의미한다.
CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역
언급된 바와 같이, 본 발명은 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 제약 제제 또는 단위 투여 형태를 제공한다. 또한, 본 발명은 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 제약 제제를 제공하고, 여기서 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 서열식별번호: 13에 명시된 인간 CD3ε (엡실론), 예컨대 인간 CD3ε (엡실론)에 결합할 수 있다. 이러한 항원-결합 영역은 T 세포, 예컨대 1차 인간 T 세포 상에 제시된 바와 같이 인간 CD3ε (엡실론)에 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 항체는 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체일 수 있으며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은 하기를 포함한다:
서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 17의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 임의로
서열식별번호: 22의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄 영역으로부터 확인될 수 있다. 상기 가변 중쇄 및 경쇄 영역으로부터의 CDR 영역은 IMGT에 따라 주석이 달릴 수 있다 (문헌 [Lefranc MP. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999 및 Brochet X. Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008)] 참조). 따라서, 또한 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체가 개시되며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은 하기를 포함한다:
각각 서열식별번호: 18, 19 및 20 또는 18, 19 및 21의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 임의로
각각 서열식별번호: 23, GTN 및 24의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
추가로, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체가 개시되며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은 하기를 포함한다:
서열식별번호: 16의 서열, 또는 서열식별번호: 16의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 임의로
서열식별번호: 22의 서열 또는 서열식별번호: 22의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
인간 CD3에 결합할 수 있는 이러한 항원-결합 영역은 특히 WO 2015001085 및 WO 2017009442에 기재되어 있다. 인간 CD3에 결합할 수 있는 추가의 항원-결합 영역은 본원에 참조로 포함되는, 추가로 고려되고 본 발명에 따른 항체를 생성하기 위한 기초로서 역할을 할 수 있는 WO 2015001085 및 WO 2017009442에 개시되고 기재되어 있다.
본 발명에 따른 상기 항체는 1 - 1000 nM의 범위 내인 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 영역과 인간 CD3 사이의 평형 해리 상수 KD로 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 항체는 1 - 100 nM의 범위 내, 예컨대 5 - 100 nM의 범위 내, 10 - 100 nM의 범위 내, 1 - 80 nM의 범위 내, 1 - 60 nM의 범위 내, 1 - 40 nM의 범위 내, 1 - 20 nM의 범위 내, 5 - 80 nM의 범위 내, 5 - 60 nM의 범위 내, 5 - 40 nM의 범위 내, 5 - 20 nM의 범위 내, 10 - 80 nM의 범위 내, 10 - 60 nM의 범위 내, 10 - 40 nM의 범위 내, 또는 예컨대 10 - 20 nM의 범위 내인 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 영역과 인간 CD3 사이의 평형 해리 상수 KD로 결합할 수 있다. 예시적인 및 적합한 항원-결합 영역은 서열식별번호: 16의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 22의 경쇄 가변 영역 (VL) 영역을 포함한다. 이러한 가변 영역은 특히 WO 2015001085에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 항체는 서열식별번호: 16에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 22에 제시된 제시된 바와 같은 VL 서열을 포함하는 항원-결합 영역을 갖는 항체보다 인간 CD3ε에 대해 더 낮은 결합 친화도를 갖고, 바람직하게는 상기 친화도는 적어도 5배 더 낮거나, 예컨대 적어도 10배 더 낮거나, 예를 들어 적어도 20배 더 낮거나, 적어도 30배 더 낮거나, 적어도 40배 더 낮거나, 적어도 45배 더 낮거나 또는 예컨대 적어도 50배 더 낮다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 항체는 200 - 1000 nM의 범위 내, 예컨대 300 - 1000 nM의 범위 내, 400 - 1000 nM의 범위 내, 500 - 1000 nM의 범위 내, 300 - 900 nM의 범위 내, 400 - 900 nM의 범위 내, 400 - 700 nM의 범위 내, 500 - 900 nM의 범위 내, 500 - 800 nM의 범위 내, 500 - 700 nM의 범위 내, 600 - 1000 nM의 범위 내, 600 - 900 nM의 범위 내, 600 - 800 nM의 범위 내, 또는 예컨대 600 - 700 nM의 범위 내인 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 영역과 인간 CD3 항원-결합 사이의 평형 해리 상수 KD로 결합할 수 있다. 예시적인 적합한 항원-결합 영역은 서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 17의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 22의 경쇄 가변 영역 (VL) 영역을 포함한다. 이러한 가변 영역은 특히 WO 2017009442에 기재되어 있다.
상기 결합 친화도는 임의로 본원의 실시예 4에 제시된 바와 같은 생물층 간섭측정법에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 인간 CD3에 대한 결합 친화도를 갖는 본 발명에 따른 항체는 하기 단계를 포함하는 생물층 간섭측정법을 사용하여 결정된 결합 친화도를 가질 수 있다:
I) 항체를 항-인간 IgG Fc 포획 바이오센서 상에 600초 동안 1 μg/mL의 양으로 고정화시키는 단계;
II) 1.40 nM 내지 1000 nM 범위의 3배 희석 시리즈를 사용하여 인간 재조합 가용성 CD3ε (CD3E27-GSKa) (서열식별번호: 13의 성숙 단백질)의 1000초의 기간에 걸친 회합 및 2000초의 기간에 걸친 해리를 결정하는 단계;
III) 데이터를 완충제 대조군 (0 nM)에 대해 참조하는 단계.
또한, 상기 결합 친화도는 항체, 예컨대 단일특이적, 2가 항체, 예컨대 전장 IgG1인 항체를 사용하여 결정될 수 있다.
따라서, 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는
CD3에 결합하는 항원-결합 영역이 본원에 정의된 바와 같은 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역을 포함하고, 이는 서열식별번호: 16에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역과 비교할 경우, T31, N57, H101, G105, S110 및 Y114로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산 치환을 가지며, 위치는 서열식별번호: 16의 서열에 따라 넘버링되고;
야생형 경쇄 가변 (VL) 영역은 각각 서열식별번호: 23, GTN 및 서열식별번호: 24에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 것인 항체이다.
특히, 본 발명에 따른 항체는 CD3에 결합하는 항원-결합 영역이 본원에 정의된 바와 같은 중쇄 가변 (VH) 영역에 T31M, T31P, N57E, H101G, H101N, G105P, S110A, S110G, Y114M, Y114R, Y114V로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 포함하는 항체이다.
또한, 본 발명에 따른 항체는 CD3에 결합하는 항원-결합 영역이 아미노산 위치 31에서 M 또는 P, 또는 아미노산 위치 57에서 E, 또는 아미노산 위치 101에서 G 또는 N, 또는 아미노산 105에서 P, 또는 아미노산 위치 110에서 A 또는 G, 또는 아미노산 위치 114에서 M, R 또는 V를 갖는 본원에 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 위치는 서열식별번호: 16에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 (VH) 영역의 아미노산 위치 넘버링에 상응하는 것인 항체이다.
또한 추가로, 본 발명에 따른 항체는 본원에 정의된 바와 같은 CD3에 결합하는 항원-결합 영역의 중쇄 가변 (VH) 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 서열식별번호: 16의 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3과 비교할 경우 총 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환이 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체이다.
인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체를 포함하는 제약 제제가 추가로 개시되며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은 하기를 포함한다:
서열식별번호: 17의 서열, 또는 서열식별번호: 17의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 임의로
서열식별번호: 22의 서열 또는 서열식별번호: 22의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역
특히, 본 발명은 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체를 함유하는 제약 조성물 또는 단위 투여 형태를 제공하고, 여기서 상기 인간 B7H4는 서열식별번호: 1의 인간 B7H4이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 항체는 서열식별번호: 13에 명시된 바와 같은 인간 CD3ε (엡실론)에 결합할 수 있는 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 1의 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함한다.
특히, 본 발명의 조성물에 사용되는 항체는 인간 B7H4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 인간 B7H4의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 것인 항체이다. 바람직하게는, 상기 B7H4는 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포 상에서 발현된다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 조성물에 사용되는 항체는 인간 B7H4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 인간 B7H4의 IgC-유사 불변 영역에 결합할 수 있는 것인 항체이다. 또 다른 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 인간 B7H4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 B7H3-IgV/B7H4-IgC에 결합할 수 있는 것인 항체이다. B7H3-IgV/B7H4-IgC는 인간 B7H3과 B7H4 사이의 융합체를 나타내고, 여기서 B7H3 IgV-유사 도메인은 서열식별번호: 11에 상응하는 B7H4 IgC-유사 도메인과 융합된다. 상기 B7H3-IgV/B7H4-IgC는 본원의 실시예 7에 기재된 바와 같은 세포에 의해 발현된다. 또 다른 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 인간 B7H4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 B7H4-IgV/B7H3-IgC에 결합할 수 없는 것인 항체이다. B7H4-IgV/B7H3-IgC는 인간 B7H3과 B7H4 사이의 융합체를 나타내고, 여기서 B7H4 IgV-유사 도메인은 서열식별번호: 10에 상응하는 B7H3 IgC-유사 도메인과 융합된다. 상기 B7H4-IgV/B7H3-IgC는 본원의 실시예 7에 기재된 바와 같은 세포에 의해 발현된다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따라 고려되는, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 적합한 항원-결합 영역은 하기를 포함한다:
a) 서열식별번호: 25의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
b) 서열식별번호: 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
c) 서열식별번호: 36의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 40의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
d) 서열식별번호: 43의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 47의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
e) 서열식별번호: 50의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 54의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역; 또는
f) 서열식별번호: 31의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역
g) 서열식별번호: 65의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 69의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 제제의 항체는 서열식별번호: 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함한다.
CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄 영역으로부터 확인될 수 있다. 상기 가변 중쇄 및 경쇄 영역으로부터의 CDR 영역은 IMGT에 따라 주석이 달릴 수 있다 (문헌 [Lefranc MP. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999 및 Brochet X. Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008)] 참조). 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따라 고려되는, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 적합한 항원-결합 영역은 하기를 포함한다:
a) 각각 서열식별번호: 26, 27 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
b) 각각 서열식별번호: 26, 30 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
c) 각각 서열식별번호: 37, 38 및 39의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 41, DTS 및 서열식별번호: 42의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
d) 각각 서열식별번호: 44, 45 및 46의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 48, YTS 및 서열식별번호: 49의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
e) 각각 서열식별번호: 51, 52 및 53의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 55, GAS 및 서열식별번호: 56의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역; 또는
f) 각각 서열식별번호: 26, 32 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
g) 각각 서열식별번호: 66, 67 및 68의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 70, GAS 및 서열식별번호: 71의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 제제의 항체는 각각 서열식별번호: 26, 30 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따라 고려되는, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 추가의 적합한 항원-결합 영역은 하기를 포함한다:
a) 서열식별번호: 25의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
b) 서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
c) 서열식별번호: 36의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 40의 가변 경쇄 영역;
d) 서열식별번호: 43의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 47의 가변 경쇄 영역;
e) 서열식별번호: 50의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 54의 가변 경쇄 영역; 또는
f) 서열식별번호: 31의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역
g) 서열식별번호: 65의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 69의 가변 경쇄 영역.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 제제의 항체는 서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역을 포함하는, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함한다.
임의로, B7H4에 결합하는 상기 항원-결합 영역은 하기에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다:
a) 서열식별번호: 25의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
b) 서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
c) 서열식별번호: 36의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 40의 가변 경쇄 영역;
d) 서열식별번호: 43의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 47의 가변 경쇄 영역;
e) 서열식별번호: 50의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 54의 가변 경쇄 영역; 또는
f) 서열식별번호: 31의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역
g) 서열식별번호: 65의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 69의 가변 경쇄 영역.
바람직한 실시양태에서, B7H4에 결합하는 상기 항원-결합 영역은 서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 5E-7 M 이하, 예컨대 1E-7 M 이하의 KD 값에 상응하는 인간 B7H4에 대한 결합 친화도를 갖는, 예컨대 5E-7 내지 2E-10 M의 범위 내, 예컨대 2E-7 내지 1E-10 M 또는 1E-7 내지 5E-9 M의 범위 내인 KD 값에 상응하는 결합 친화도로 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 가질 수 있다.
상기 결합 친화도는 임의로 본원의 실시예 3에 제시된 바와 같은 생물층 간섭측정법에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 인간 B7H4에 대한 결합 친화도를 갖는 본 발명에 따른 항체는 하기 단계를 포함하는 생물층 간섭측정법을 사용하여 결정된 결합 친화도를 가질 수 있다:
I) 항체를 항-인간 IgG Fc 포획 바이오센서 상에 600초 동안 1 μg/mL의 양으로 고정화시키는 단계;
II) 1.56 nM 내지 100 nM 범위의 2배 희석 시리즈를 사용하여 인간 재조합 His 태그부착된 B7H4 단백질 (시노 바이올로지칼 카탈로그 번호 10738-H08H; C-말단 폴리히스티딘 태그를 갖는 인간 VTCN1 (유니프롯 등록 번호 Q7Z7D3) (Phe29-Ala258)을 코딩하는 DNA 서열의 구축물로부터 발현된 단백질)의 300초의 기간에 걸친 회합 및 1000초의 기간에 걸친 해리를 결정하는 단계;
III) 데이터를 완충제 대조군 (0 nM)에 대해 참조하는 단계.
또한, 상기 결합 친화도는 항체, 예컨대 단일특이적, 2가 항체, 예컨대 전장 IgG1인 항체를 사용하여 결정될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원 영역을 포함하는 본 발명에 따른 항체가 제공되고, 여기서 상기 항원-결합 영역은
서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체; 및
서열식별번호: 36의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 40의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 교차차단할 수 있고;
여기서 상기 항원-결합 영역은
서열식별번호: 43의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 47의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체;
서열식별번호: 50의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 54의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체; 및
서열식별번호: 65의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 69의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 교차차단할 수 없다.
또 다른 추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 상기 항체는 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원 영역을 포함하고, 여기서 상기 항원-결합 영역은
서열식별번호: 43의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 47의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체;
서열식별번호: 50의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 54의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체, 및
서열식별번호: 65의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 69의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 교차차단할 수 있고;
여기서 상기 항원-결합 영역은
서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체; 및
서열식별번호: 36의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 40의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 교차차단할 수 없다.
특히, "교차-차단", 또는 B7H4에 대한 또 다른 항체의 결합을 차단하는 본 발명에 따른 항체의 능력은 제1 항체에 결합된 B7H4에의 제2 항체의 결합을 차단하는 B7H4에 결합된 제1 항체의 능력으로서 정의된다. 교차차단은 실시예 5에 기재된 바와 같은 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 교차차단은 또한 예를 들어 하기 단계를 포함하는 절차로 결정될 수 있다:
i) 샘플을 제공하는 단계이며, 각각의 샘플은 B7H4에 결합하는 항체를 포함하는 것인 단계;
ii) 600초 동안 20 μg/mL의 양의 샘플의 세트로부터의 제1 항체를 아민 반응성 제2 세대 바이오센서 (AR2G) 상에 고정화시키는 단계;
iii) ARG2 바이오센서에 인간 B7H4 (100 nM의 인간 재조합 His 태그부착된 B7H4 단백질 (시노 바이올로지칼(Sino Biological) 카탈로그 번호 10738-H08H; C-말단 폴리히스티딘 태그를 갖는 인간 VTCN1 (유니프롯(Uniprot) 수탁 번호 Q7Z7D3) (Phe29-Ala258)을 코딩하는 DNA 서열의 구축물로부터 발현된 단백질)를 갖는 고정화된 항체를 로딩하는 단계;
iv) 300초 동안 10 μg/mL의 양의 샘플의 세트로부터의 제2 항체의 회합을 결정하는 단계.
제2 항체가 회합할 수 없는 경우에, 제1 항체는 제2 항체를 교차-차단하는 것으로 간주된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 또 다른 항체의 그의 표적에의 결합을 교차차단하는 항체의 능력을 결정하기 위한 적합한 기술에 친숙할 것이며, 본 출원은 결합 및 치환의 차단을 결정하는 데 적합한 절차를 개시한다. 추가 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 교차차단은 실시예 5에 기재된 바와 같이 결정된다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 상기 기재된 교차차단 특색에 따라 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 갖고, 여기서 인간 B7H4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역은 B7H3-IgV/B7H4-IgC (서열식별번호: 11)에 결합할 수 있고, 임의로 B7H4-IgV/B7H3-IgC (서열식별번호: 10)에 결합할 수 없다.
CD3 및 B7H4 항원-결합 영역 조합
본 개시내용은 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체를 포함하는 제약 조성물 또는 단위 투여 형태를 추가로 제공하며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 16의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 22의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고; 및
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 하기를 포함한다:
a) 서열식별번호: 25의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
b) 서열식별번호: 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
c) 서열식별번호: 36의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 40의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
d) 서열식별번호: 43의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 47의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
e) 서열식별번호: 50의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 54의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역; 또는
f) 서열식별번호: 31의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역
g) 서열식별번호: 65의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 69의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역.
다시, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄 영역으로부터 확인될 수 있다. 상기 가변 중쇄 및 경쇄 영역으로부터의 CDR 영역은 IMGT에 따라 주석이 달릴 수 있다 (문헌 [Lefranc MP. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999 및 Brochet X. Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008)] 참조). 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 가변 중쇄 및 경쇄 영역으로부터의 CDR 영역은 IMGT에 따라 주석이 달린다.
본 개시내용은 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 제약 조성물 및 단위 투여 형태를 추가로 제공하며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 17의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 22의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 하기를 포함한다:
a) 서열식별번호: 25의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
b) 서열식별번호: 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
c) 서열식별번호: 36의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 40의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
d) 서열식별번호: 43의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 47의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
e) 서열식별번호: 50의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 54의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역; 또는
f) 서열식별번호: 31의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역
g) 서열식별번호: 65의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 69의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 제약 조성물 및 단위 투여 형태를 제공하고, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 17의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 22의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함한다.
또한, 본 개시내용은 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 제약 조성물 및 단위 투여 형태를 추가로 제공하며, 여기서 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은
각각 서열식별번호: 18, 19 및 20의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 23, GTN 및 24의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고;
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 하기를 포함한다:
a) 각각 서열식별번호: 26, 27 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
b) 각각 서열식별번호: 26, 30 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
c) 각각 서열식별번호: 37, 38 및 39의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 41, DTS 및 서열식별번호: 42의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
d) 각각 서열식별번호: 44, 45 및 46의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 48, YTS 및 서열식별번호: 49의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
e) 각각 서열식별번호: 51, 52 및 53의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 55, GAS 및 서열식별번호: 56의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역; 또는
f) 각각 서열식별번호: 26, 32 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
g) 각각 서열식별번호: 66, 67 및 68의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 70, GAS 및 서열식별번호: 71의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역.
본 개시내용은 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 제약 조성물 및 단위 투여 형태를 추가로 제공하며, 여기서
CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은
각각 서열식별번호: 18, 19 및 21의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 23, GTN 및 24의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고;
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 하기를 포함한다:
a) 각각 서열식별번호: 26, 27 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
b) 각각 서열식별번호: 26, 30 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
c) 각각 서열식별번호: 37, 38 및 39의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 41, DTS 및 서열식별번호: 42의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
d) 각각 서열식별번호: 44, 45 및 46의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 48, YTS 및 서열식별번호: 49의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
e) 각각 서열식별번호: 51, 52 및 53의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 55, GAS 및 서열식별번호: 56의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역; 또는
f) 각각 서열식별번호: 26, 32 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
g) 각각 서열식별번호: 66, 67 및 68의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 70, GAS 및 서열식별번호: 71의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 제약 조성물 및 단위 투여 형태를 제공하고, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은
각각 서열식별번호: 18, 19 및 21의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 23, GTN 및 24의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고;
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은
각각 서열식별번호: 26, 30 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함한다.
인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 제약 조성물 및 단위 투여 형태가 추가로 개시되며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 16의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 22의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고;
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 하기를 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다:
a) 서열식별번호: 25의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
b) 서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
c) 서열식별번호: 36의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 40의 가변 경쇄 영역;
d) 서열식별번호: 43의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 47의 가변 경쇄 영역;
e) 서열식별번호: 50의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 54의 가변 경쇄 영역; 또는
f) 서열식별번호: 31의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역
g) 서열식별번호: 65의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 69의 가변 경쇄 영역.
인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 제약 조성물 및 단위 투여 형태가 추가로 개시되며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 17의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 22의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고;
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 하기를 갖는 항원-결합 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다:
a) 서열식별번호: 25의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
b) 서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
c) 서열식별번호: 36의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 40의 가변 경쇄 영역;
d) 서열식별번호: 43의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 47의 가변 경쇄 영역;
e) 서열식별번호: 50의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 54의 가변 경쇄 영역; 또는
f) 서열식별번호: 31의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역
g) 서열식별번호: 65의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 69의 가변 경쇄 영역.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 제약 조성물 및 단위 투여 형태를 제공하고, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 17의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 22의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고;
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 상기 이중특이적 항체에서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역은 중쇄 및 경쇄에 포함되고, 상기 중쇄는 상기 VH 영역 및 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 상기 VL 영역 및 카파 경쇄 불변 영역을 포함하고; 인간 CD3에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역은 중쇄 및 경쇄에 포함되고, 상기 중쇄는 상기 VH 영역 및 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 상기 VL 영역 및 람다 경쇄 불변 영역을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 CD3xB7H4 이중특이적 항체에서, 하나의 IgG1 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 60에 정의된 바와 같고, 다른 것은 서열식별번호: 61에 정의된 바와 같고, 여기서 상기 카파 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 63에 정의된 바와 같고, 상기 람다 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 64에 정의된 바와 같다. 임의로, 서열식별번호: 60 및 61에 정의된 바와 같은 상기 IgG1 중쇄 불변 영역 중에서, 말단 리신은 결실될 수 있는 것으로 이해된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 단위 투여 형태의 제약 제제의 CD3xB7H4 이중특이적 항체는
서열식별번호: 17의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 22의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL), 및 추가로 서열식별번호: 60에 정의된 바와 같은 IgG1 중쇄 불변 영역 및 서열식별번호: 64에 정의된 바와 같은 람다 경쇄 불변 영역을 포함하는 CD3 결합 영역,
및
서열식별번호: 29의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 33의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL), 및 추가로 서열식별번호: 61에 정의된 바와 같은 IgG1 중쇄 불변 영역 및 서열식별번호: 63에 정의된 바와 같은 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 B7H4 결합 영역을 포함하며, 임의로, 여기서 서열식별번호: 60 및 61에 정의된 바와 같은 상기 IgG1 중쇄 불변 영역은 말단 리신이 결실될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 바와 같이, 항체의 각각의 항원-결합 영역은 일반적으로 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 각각의 가변 영역은 각각 3개의 CDR 서열, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 각각 4개의 프레임워크 서열, FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함할 수 있다. 항체의 각각의 항원-결합 영역은 일반적으로 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함할 수 있고, 각각의 가변 영역은 각각 3개의 CDR 서열, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 각각 4개의 인간 프레임워크 서열, FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함할 수 있다. 이 구조는 바람직하게는 또한 본 발명에 따른 항체에서 발견된다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 중쇄 불변 영역 (CH) 및 2개의 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함할 수 있다. 불변 영역의 예는 특히 서열식별번호: 57-64에 제공된다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물 및 단위 투여 형태에 사용되는 항체는 제1 및 제2 중쇄, 예컨대 각각 적어도 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 제1 및 제2 중쇄를 포함한다. 안정한 이종이량체 항체는 CH3 영역 내에 단지 소수의 비대칭 돌연변이를 함유하는 2개의 동종이량체 출발 단백질을 기초로 하여, 예를 들어 WO 2008/119353 및 WO 2011/131746에 제공된 바와 같은 소위 Fab-아암 교환에 의해 고수율로 수득될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG1 중쇄에서의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환된 것인 제1 중쇄, 및 인간 IgG1 중쇄에서의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환된 것인 제2 중쇄를 포함하며, 여기서 상기 제1 및 상기 제2 중쇄의 상기 치환은 동일한 위치에 있지 않고, 여기서 아미노산 위치는 Eu 넘버링에 따라 넘버링된다. 예를 들어, 이러한 치환을 갖는 불변 도메인은 특히 서열식별번호: 58 및 62에 제공되며, 이는 이러한 치환을 갖지 않는 서열식별번호: 57과 비교될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "위치에 상응하는 아미노산"은 인간 IgG1 중쇄에서의 아미노산 위치 번호를 지칭한다. 다른 이뮤노글로불린에서의 상응하는 아미노산 위치는 인간 IgG1과의 정렬에 의해 발견될 수 있다. 달리 언급되거나 문맥상 모순되지 않는 한, 불변 영역 서열의 아미노산은 본원에서 EU-인덱스의 넘버링에 따라 넘버링된다 (문헌 [Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662, 680, 689]에 기재됨). 따라서, 또 다른 서열 내의 아미노산 또는 절편"에 상응하는" 한 서열 내의 아미노산 또는 절편은 표준 서열 정렬 프로그램, 예컨대 ALIGN, 클러스탈W 또는 유사한 것을 사용하여, 전형적으로 디폴트 설정에서 다른 아미노산 또는 절편과 정렬되고, 인간 IgG1 중쇄에 대해 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 것이다. 서열 또는 서열 내의 절편을 정렬하고 이에 의해 본 발명에 따른 아미노산 위치에 대한 서열 내의 상응하는 위치를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지된 것으로 간주된다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치의 아미노산이 상기 제1 중쇄에서 R이고, 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치의 아미노산이 상기 제2 중쇄에서 L이거나, 또는 그 반대의 경우인 항체의 제약 조성물 및 단위 투여 형태를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 항원-결합 영역에 추가로 2개의 중쇄의 Fc 서열을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 제1 및 제2 Fc 서열은 각각 임의의 인간 이소형, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgD, IgM 또는 IgA 이소형 또는 혼합된 이소형을 포함한 임의의 이소형의 것일 수 있다. 바람직하게는, Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 이소형 또는 혼합된 이소형, 예컨대 인간 IgG1 이소형이다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 전장 항체인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 이는 IgG1 유형의 것이다.
본 발명에 따른 항체는 항체를 불활성 또는 비-활성화 항체가 되게 하는 Fc 영역에서의 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 항체에서, 하나 또는 둘 다의 중쇄는 항체가 비-변형된 제1 및 제2 중쇄를 포함하는 것을 제외하고는 동일한 항체에 비해 더 적은 정도로 Fc-매개 이펙터 기능을 유도하도록 변형될 수 있다. Fc-매개 이펙터 기능은 Fcγ 수용체에 결합함으로써, C1q에 결합함으로써, 또는 FcγR의 Fc-매개 가교의 유도에 의해, T 세포 상의 Fc-매개 CD69 발현 (즉, CD3 항체-매개, Fcγ 수용체-의존성 CD3 가교의 결과로서의 CD69 발현)을 결정함으로써 측정될 수 있다. 특히, 중쇄 불변 서열은 Fc-매개 CD69 발현이 야생형 (비변형된) 항체와 비교할 경우 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 100%만큼 감소되도록 변형될 수 있으며, 여기서 상기 Fc-매개 CD69 발현은, 예를 들어 WO 2015001085의 실시예 3에 기재된 바와 같이 PBMC-기반 기능적 검정으로 결정된다. 중쇄 및 경쇄 불변 서열의 변형은 또한 상기 항체에의 C1q의 감소된 결합을 유발할 수 있다. 비변형된 항체와 비교하여, 감소는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100%일 수 있고, C1q 결합은 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 또한, Fc 영역은 상기 항체가 비변형된 항체와 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 100%만큼 감소된 Fc-매개 T-세포 증식을 매개하도록 변형될 수 있고, 여기서 상기 T-세포 증식은 PBMC-기반 기능적 검정으로 측정된다.
Fc-매개 이펙터 기능을 제거하기 위해 IgG1 이소형 항체의 불변 중쇄 영역에 아미노산 치환 및 그의 조합이 도입된 광범위한 상이한 비-활성화 항체 포맷이 개발되었다 (예를 들어, 문헌 [Chiu et al., Antibodies 2019 Dec; 8(4): 55; Liu et al., Antibodies, 2020 Nov 17;9(4):64; 29(10):457-66; Shields et al., J Biol Chem,. 2001 Mar 2;276(9):6591-604]).
예를 들어 IgG1 이소형 항체에서 변형될 수 있는 아미노산 위치의 예는 위치 L234 및 L235를 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함할 수 있고, 여기서 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서, Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 각각 F 및 E이다. 아미노산 위치 L234 및 L235의 변형에 추가로, 추가의 위치가 변형될 수 있는 것으로 이해된다.
또한, D265A 아미노산 치환은 모든 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키고 ADCC를 방지할 수 있다 (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. (276):6591-604). 따라서, 본 발명에 따른 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서, Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 A이다. 본 발명의 추가 실시양태는 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서, 예컨대 둘 다에서, 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산이 각각 F, E, 및 A인 항체를 제공한다. 본 출원에서, 3개의 아미노산 치환 L234F, L235E 및 D265A의 조합 및 추가로 상기 본원에 개시된 K409R 또는 F405L 돌연변이를 갖는 항체는 각각 접미어 "FEAR" 또는 "FEAL"로 명명될 수 있다.
야생형 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 본원에서 서열식별번호: 57로서 확인된다. 상기 개시된 실시양태와 일치하게, 본 발명의 항체는 F405L 치환을 보유하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있고, 서열식별번호: 58에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있고/거나 K409R 치환을 보유하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있고, 서열식별번호: 62에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
L234F, L235E 및 D265A 치환을 보유하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 본원에서 서열식별번호: 59로서 확인된다. L234F, L235E, D265A 및 F405L 치환을 보유하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 본원에서 서열식별번호: 60으로 확인된다. L234F, L235E, D265A 및 K409R 치환을 보유하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 본원에서 서열식별번호: 61로서 확인된다.
서열식별번호: 57-62에 열거된 불변 영역 서열은 말단 리신 (K)을 열거하며, 이러한 서열은 본원의 실시예 섹션에 사용되었다. 이러한 리신의 기원은 이들 Fc 영역이 유래된 인간에서 발견되는 자연 발생 서열이다. 재조합 항체의 세포 배양 생산 동안, 이러한 말단 리신은 내인성 카르복시펩티다제(들)에 의한 단백질분해에 의해 절단되어, 동일한 서열을 갖지만 C-말단 리신이 결여된 불변 영역을 생성할 수 있다. 항체의 제조 목적을 위해, 이러한 말단 리신을 코딩하는 DNA는 항체가 리신 없이 생산되도록 서열로부터 생략될 수 있다. 말단 리신을 코딩하거나 코딩하지 않는 핵산 서열로부터 생산된 항체는 서열에 있어서 및 기능에 있어서 실질적으로 동일한데, 이는 말단 리신의 프로세싱 정도가 예를 들어 CHO-기반 생산 시스템에서 생산된 항체를 사용하는 경우에 전형적으로 높기 때문이다 (Dick, L.W. et al. Biotechnol. Bioeng. 2008;100: 1132-1143). 따라서, 본 발명에 따른 항체는 본원에 열거된 바와 같은 말단 리신을 코딩하지 않거나 갖지 않으면서 생성될 수 있는 것으로 이해된다. 제조 목적을 위해, 항체는 따라서 말단 리신을 갖지 않고 생성될 수 있다.
본 발명은 추가로 항체의 제약 조성물 및 단위 투여 형태를 제공하며, 여기서
a) B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 인간이고,
b) CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 인간화이다.
또한, 본 발명은 항체의 제약 조성물 및 단위 투여 형태를 제공하며, 여기서
a) B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 인간이고/거나,
CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 인간화이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체는 카파 (κ) 경쇄를 포함한다. 이중특이적 항체인 카파 경쇄에 관한 본 발명의 특정 실시양태의 서열은 상기 개시된 바와 같은 B7H4 항체 경쇄의 CDR1, -2 및 -3 서열을 포함한다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 항체는 람다 (λ) 경쇄를 포함한다. 이중특이적 항체에 관한 본 발명의 특정한 실시양태에서, 람다 경쇄는 상기 개시된 바와 같은 CD3 항체 경쇄의 CDR1, -2 및 -3 서열, 특히 상기 개시된 바와 같은 CD3에 대해 감소된 친화도를 갖는 CD3 항체의 CDR1, -2 및 -3 서열을 포함한다. 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 본원에서 서열식별번호: 63으로서 포함되고, 람다 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 본원에서 서열식별번호: 64로서 포함된다.
특정한 실시양태에서, 항체는 람다 (λ) 경쇄 및 카파 (κ) 경쇄를 포함하며; 예를 들어 항체는 CD3에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 중쇄 및 람다 경쇄, 및 B7H4에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 중쇄 및 카파 경쇄를 갖는다.
따라서, 추가 실시양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체에서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역은 중쇄 및 경쇄에 포함되고, 상기 중쇄는 상기 VH 영역 및 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 상기 VL 영역 및 카파 경쇄 불변 영역을 포함하고; 인간 CD3에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역은 중쇄 및 경쇄에 포함되고, 상기 중쇄는 상기 VH 영역 및 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 상기 VL 영역 및 람다 경쇄 불변 영역을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 이중특이적 항체에서, 하나의 IgG1 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 60에 정의된 바와 같고, 다른 것은 서열식별번호: 61에 정의된 바와 같고, 상기 카파 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 63에 정의된 바와 같고, 상기 람다 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 64에 정의된 바와 같다. 서열식별번호: 60 및 61에 정의된 상기 IgG1 중쇄 불변 영역은 그의 말단 리신이 결실될 수 있는 것으로 이해된다.
결합, 세포독성 및 T-세포 활성화
인간 CD3 및 인간 B7H4에 결합할 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 항체, 예컨대 이중특이적 항체는 유리하게는 T 세포를 인간 B7H4 발현 암 세포에 표적화하고, 이로써 상기 암 세포의 T-세포 매개 사멸을 유도할 수 있다. 실시예 섹션에 제시된 바와 같이, 이러한 항체에서 감소된 또는 불활성 Fc-기능성을 가짐으로써, B7H4 발현 수준이 다양한 광범위한 암에 대해 효능이 있으면서, 안전하고 효과적이며 충분한 항체가 인간 환자에게 투여될 수 있다.
언급된 바와 같이, 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 Fc-매개 이펙터 기능이 없거나 또는 감소되고, 추가로 항체는:
a) 본원의 실시예 9 및 10에 기재된 바와 같이 B7H4-발현 인간 종양 세포에 결합할 수 있고/거나,
b) 본원의 실시예 11 및 12에 기재된 바와 같이 검정 시에, 예를 들어 정제된 PBMC 또는 T 세포를 이펙터 세포로서 사용하는 경우에 B7H4-발현 인간 종양 세포의 농도-의존성 세포독성을 매개할 수 있고/거나,
c) 본원의 실시예 11 및 12에 기재된 바와 같이 검정 시에, 예를 들어 이펙터 세포로서 정제된 PBMC 또는 T 세포를 사용하는 경우에 MCF-7, MDA-MB-468, SK-BR3, NIH-OVCAR-3, HCC1954 및 NCI-H1650으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 인간 B7H4-발현 종양 세포주의 농도-의존성 세포독성을 매개할 수 있고/거나,
d) 예를 들어 본원의 실시예 13에 기재된 바와 같이 검정 시에, B7H4-발현 인간 종양 세포의 존재 하에 시험관내에서 T 세포를 활성화시킬 수 있고/거나;
e) 예를 들어 본원의 실시예 13에 기재된 바와 같이 검정 시에, MCF-7, MDA-MB-468, SK-BR3, NIH-OVCAR-3, HCC1954 및 NCI-H1650으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 B7H4-발현 인간 종양 세포주의 존재 하에 시험관내에서 T-세포를 활성화시킬 수 있고/거나,
f) 예를 들어 본원의 실시예 11 및 12에 기재된 바와 같이 검정 시에, B7H4-발현 인간 종양 세포의 세포독성을 유도할 수 있고/거나,
g) 예를 들어 본원의 실시예 11 및 12에 기재된 바와 같이 검정 시에, MCF-7, MDA-MB-468, SK-BR3, NIH-OVCAR-3, HCC1954 및 NCI-H1650으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 B7H4-발현 인간 종양 세포주에서 T 세포 매개 세포독성을 유도할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항체는 Fc-매개 이펙터 기능이 없거나 또는 감소될 수 있고, 또한 T-세포 매개 세포독성 항체를 유도할 수 있으며, 여기서 세포독성은 하기를 포함하는 시험관내 IC50 검정에서 평가된다:
i) 건강한 인간 공여자 백혈구 연층으로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 또는 정제된 T-세포를 제공하는 단계,
ii) B7H4-발현 종양 세포, 예컨대 MCF-7, MDA-MB-468, SK-BR3, NIH-OVCAR-3, HCC1954 및 NCI-H1650으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 B7H4-발현 종양 세포주를 제공하는 단계;
iii) 상기 PBMC 또는 상기 정제된 T-세포를 상기 B7H4-발현 종양 세포의 다수의 샘플과 조합하는 단계이며, 여기서 상기 PBMC 또는 상기 정제된 T-세포로부터의 T-세포 대 선택된 종양 세포의 수의 비는 8:1인 단계;
iv) 상기 항체를 상기 샘플에, 예를 들어 선택된 인간 B7H4 발현 종양 세포에 대해 0.0128ng/mL 내지 10,000ng/mL 범위의 희석 시리즈로 제공하는 단계, 및
v) 단계 iv)에서 수득된 샘플을, 예를 들어 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하는 단계; 및 후속적으로
vi) B7H4-발현 종양 세포의 생존율을 평가하는 단계,
vii) 각각의 희석 샘플에 대한 생존 세포의 백분율을 결정하는 단계, 및
viii) IC50을 측정하는 단계.
단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 대신에, 정제된 T-세포가 또한 단계 i)에서 제공될 수 있다.
따라서, 항체는 0.001-2 마이크로그램/ml 범위의 IC50을 가질 수 있으며, 여기서 IC50은 하기 단계를 포함하는 시험관내 세포독성 검정에서 결정된다:
i) 건강한 인간 공여자 백혈구 연층으로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 제공하는 단계,
ii) B7H4-발현 종양 세포, 예컨대 MCF-7, MDA-MB-468, SK-BR3, NIH-OVCAR-3 및 HCC1954로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 B7H4-발현 종양 세포주를 제공하는 단계;
iii) 상기 PBMC를 상기 B7H4-발현 종양 세포의 다수의 샘플과 조합하는 단계이며, 여기서 상기 PBMC로부터의 T-세포 대 선택된 종양 세포의 수의 비는 8:1인 단계;
iv) 상기 항체를 상기 샘플에, 예를 들어 선택된 인간 B7H4 발현 종양 세포에 대해 0.0128ng/mL 내지 10,000ng/mL 범위의 희석 시리즈로 제공하는 단계, 및
v) 단계 iv)에서 수득된 샘플을, 예를 들어 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하는 단계; 및 후속적으로
vi) B7H4-발현 종양 세포의 생존율을 평가하는 단계,
vii) 각각의 희석 샘플에 대한 생존 세포의 백분율을 결정하는 단계, 및
viii) IC50을 측정하는 단계.
따라서, 항체는 0.001-5 마이크로그램/ml 범위의 IC50을 가질 수 있으며, 여기서 IC50은 하기 단계를 포함하는 시험관내 세포독성 검정에서 결정된다:
i) 건강한 인간 공여자 백혈구 연층으로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 또는 정제된 T-세포를 제공하는 단계,
ii) B7H4-발현 종양 세포, 예컨대 MCF-7, MDA-MB-468, SK-BR3, NIH-OVCAR-3, HCC1954 및 NCI-H1650으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 B7H4-발현 종양 세포주를 제공하는 단계;
iii) 상기 PBMC 또는 상기 정제된 T-세포를 상기 B7H4-발현 종양 세포의 다수의 샘플과 조합하는 단계이며, 여기서 상기 PBMC 또는 상기 정제된 T-세포로부터의 T-세포 대 선택된 종양 세포의 수의 비는 8:1인 단계;
iv) 상기 항체를 상기 샘플에, 예를 들어 선택된 인간 B7H4 발현 종양 세포에 대해 0.0128ng/mL 내지 10,000ng/mL 범위의 희석 시리즈로 제공하는 단계, 및
v) 단계 iv)에서 수득된 샘플을, 예를 들어 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하는 단계; 및 후속적으로
vi) B7H4-발현 종양 세포의 생존율을 평가하는 단계,
vii) 각각의 희석 샘플에 대한 생존 세포의 백분율을 결정하는 단계, 및
viii) IC50을 측정하는 단계.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 0.001-5 마이크로그램/ml 범위의 IC50을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 0.001-2 마이크로그램/ml 범위의 IC50을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 0.001-0.03 마이크로그램/ml 범위의 IC50을 가질 수 있다. 추가 실시양태에서, IC50은 0.05 - 2 마이크로그램/ml의 범위일 수 있다. 또 다른 추가 실시양태에서, IC50은 0.05 - 5 마이크로그램/ml의 범위일 수 있다. 상기 IC50은 실시예 12에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
추가 실시양태에서, T 세포 활성화를 매개하는 본 발명에 따른 항체의 능력은 하기 단계를 포함하는 시험관내 검정에서 결정된다:
i) 건강한 인간 공여자 백혈구 연층으로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 제공하는 단계,
ii) B7H4-발현 종양 세포를 제공하는 단계;
iii) 다수의 샘플에서 PBMC 및 B7H4-발현 종양 세포를 조합하는 단계이며, 여기서 PBMC 대 종양 세포의 수의 비는 8:1인 단계;
iv) 상기 항체를 예를 들어 0.0128 ng/mL 내지 10,000ng/mL 범위로 상기 샘플에 희석 시리즈로 제공하는 단계, 및
v) 샘플을, 예를 들어 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하는 단계; 및
vi) 후속적으로 시토카인을 검출하는 단계.
예를 들어 검출될 수 있는 예시적인 시토카인은 예를 들어 IFN-γ, 예컨대 예를 들어 실시예 13에 기재된 것이다. 바람직하게는, B7H4-발현 종양 세포는 인간 B7H4-발현 종양, 예컨대 원발성 종양, 또는 MCF-7, MDA-MB-468, SK-BR3, NIH-OVCAR-3 및 HCC1954로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 세포주이다.
B7H4 항체
또 다른 측면에서, 본 발명은
인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체이며, 여기서 인간 B7H4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역은
a) 서열식별번호: 25의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
b) 서열식별번호: 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
c) 서열식별번호: 31의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
d) 각각 서열식별번호: 26, 27 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
e) 각각 서열식별번호: 26, 30 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
f) 각각 서열식별번호: 26, 32 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
g) 서열식별번호: 25의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역; 또는
h) 서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
i) 서열식별번호: 31의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
j) 서열식별번호: 25의 각각의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VH) 가변 영역을 갖는 것
을 포함하는 것인 항체를 포함하는 제약 조성물 또는 단위 투여 형태에 관한 것이며,
여기서 제약 조성물 또는 단위 투여 형태는 완충제를 추가로 포함하고, 조성물의 pH는 4.0 내지 8.0이다.
이러한 항체는 CD3에 결합하는 항원-결합 영역을 반드시 포함하지는 않는다. 이러한 항체는 예를 들어 B7H4를 검출하기 위한 키트 및 검정에서 유용할 수 있다. 이러한 항체는 또한 암의 치료에 유용할 수 있다. 따라서, 이러한 항체는 B7H4에 결합하는 단일특이적 항체일 수 있다. 이러한 항체는 2가 항체일 수 있다.
제약 조성물 또는 단위 투여 형태의 pH는 4.5 내지 6.5인 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물 또는 단위 투여 형태의 pH는 5.0 내지 6.5이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물 또는 단위 투여 형태의 pH는 5.0 내지 6.0이다. 바람직한 실시양태에서, 완충제는 히스티딘, 글루타메이트, 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 c) 비-이온성 부형제를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 비-이온성 부형제는 당 또는 당 알콜이다. 바람직한 실시양태에서, 비-이온성 부형제는 소르비톨, 수크로스 또는 그의 혼합물로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 비-이온성 부형제는 100 내지 300 mM, 예컨대 125-250 mM, 바람직하게는 250 mM의 농도로 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 d) 계면활성제를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트, 바람직하게는 폴리소르베이트 20 또는 80, 가장 바람직하게는 폴리소르베이트 80이다. 바람직한 실시양태에서, 계면활성제는 약 0.005% 내지 0.4% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.1% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.09% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.06% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.05% w/v, 예컨대 0.02% w/v 또는 0.03% w/v 또는 0.04% w/v 또는 0.05% w/v, 바람직하게는 0.02% w/v의 농도로 존재한다. 본 발명의 제1 측면에 대해 상기 기재된 임의의 특색 또는 실시양태는 마찬가지로 본 발명의 이러한 측면에 적용될 수 있다.
바람직하게는, 이러한 항체는 인간 IgG1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체이다. 예를 들어, 중쇄 불변 영역은 예컨대 서열식별번호: 57-62에 열거되어 있다. 바람직한 경쇄 불변 영역은 예컨대 서열식별번호: 63에 열거된 카파 경쇄이다.
한 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물 또는 단위 투여 형태의 항체는 아미노산 잔기 S151, V157, D158, Y159, E164, L166, W173, P175, P177, V179, W181, F199, M208, V210, T222, Y223, V240, E242 및 I245 중 하나 이상을 포함하는 인간 B7H4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합할 수 있고; 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1에서의 그의 위치를 지칭한다. 추가의 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 아미노산 잔기 V157, D158, Y159, E164, L166 중 하나 이상을 포함하는 인간 B7H4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합할 수 있고; 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1에서의 그의 위치를 지칭한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 아미노산 잔기 S151, V157, D158, Y159, E164, L166, W173, P175, P177, V179, W181, F199, M208, V210, T222, Y223, V240, E242 및 I245를 포함하는 인간 B7H4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합할 수 있고; 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1에서의 그의 위치를 지칭한다. 추가 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 아미노산 잔기 V157, D158, Y159, E164, L166을 포함하는 인간 B7H4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합할 수 있고; 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1에서의 그의 위치를 지칭한다.
본원의 실시예 7에 제공된 결과에 기초하여, 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이들 아미노산 잔기 (즉, S151, V157, D158, Y159, E164, L166, W173, P175, P177, V179, W181, F199, M208, V210, T222, Y223, V240, E242 및 I245) 중 임의의 1개 이상이, 예컨대 비-공유 상호작용에 의해; 예를 들어 항체의 CDR 서열 내의 아미노산 잔기와 항체의 결합에 직접 관여하는 것으로 가정된다.
상기 에피토프 또는 항체 결합 영역에 의해 포함된 아미노산 잔기 및 임의로 결합에 간접적으로 관여하는 1개 이상의 추가의 아미노산 잔기는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1의 세포외 도메인 서열을 갖는 인간 B7H4의 알라닌 스캐닝에 의해 확인될 수 있다. 알라닌 스캐닝은 특히 본원의 실시예 7에 제시된 바와 같이 또는 본질적으로 제시된 바와 같이 수행될 수 있다.
추가로, 알라닌 스캐닝은 하기 단계를 포함하는 절차에 의해 수행될 수 있다:
i) 인간 배아 신장 세포, 예를 들어 HEK 293 세포에서, 시스테인 및 알라닌을 제외한 인간 B7H4의 세포외 도메인 내의 아미노산 잔기가 개별적으로 알라닌으로 치환된 돌연변이체 인간 B7H4 폴리펩티드 및 상응하는 야생형 B7H4 폴리펩티드를 개별적으로 발현시켜, 각각의 돌연변이체 또는 야생형 B7H4에 대해 40-60.000개 세포, 예컨대 50.000개 세포를 포함하는 샘플을 제공하는 단계,
ii) 각각의 샘플에서 세포를 20 μL의 상기 항체와 함께 인큐베이션하고 (여기서 상기 항체는 단일 중쇄 및 단일 경쇄로 이루어지고, 상기 항체는 예를 들어 유동 세포측정법 분석에 적합한 표지, 예컨대 엠네오그린 표지로 표지되고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션됨), 후속적으로 FACS 완충제 (예를 들어 포스페이트-완충 염수 [PBS; 론자(Lonza), 카탈로그 번호 BE17-517] + 0.1% [w/v] BSA [로슈(Roche), 카탈로그 번호 10735086001] + 0.02% [w/v] 아지드화나트륨 [NaN3; 에멜카 바이오사이언스(EMELCA Bioscience), 카탈로그 번호 41920044-3])로 세척하고, 각각의 샘플에서 세포를 30 μL FACS 완충제 중에 재현탁시키는 단계,
iii) 각각의 샘플에 대해, 상기 샘플에서 생존 단일 세포 집단에 대한 형광 강도의 기하 평균 (gMFI)으로서 세포당 결합된 항체의 평균 양을 결정하고, 각각의 시험 항체에 대한 데이터를 하기 방정식을 사용하여 비-교차 차단 B7H4-특이적 참조 항체의 결합 강도에 대해 정규화하는 단계:
여기서 'aa 위치'는 알라닌으로 돌연변이된 위치를 지칭하고,
여기서 배수-변화 또는 Z-점수는 하기 계산에 따라 항체의 결합의 소실 또는 획득을 표현하도록 계산되고:
여기서 아미노산을 알라닌으로 대체할 때 특정한 항체에 의한 결합의 소실 또는 획득이 없는 아미노산 위치는 결과 '0'으로서 주어질 것이고, 결합의 획득은 '>0'을 생성할 것이고, 결합의 소실은 '<0'을 생성할 것이고, 여기서 결합의 배수 변화가 평균 배수 변화 - 1.5 x SD (여기서 SD는 특정한 시험 항체에 대한 4회의 독립적 실험으로부터의 계산된 배수 변화의 표준 편차임)보다 더 낮은 B7H4 아미노산 잔기만이 '결합 돌연변이체의 소실'로 간주되었고, 여기서 특정한 B7H4 돌연변이체에 대한 참조 항체의 gMFI가 평균 gMFI 대조군 Ab의 평균 gMFI - 2.5 x SD보다 더 낮은 경우에, 데이터는 분석에서 배제되었다.
또한, 이러한 항체는 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 이외에 또 다른 항원-결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체일 수 있다. 이러한 또 다른 항원-결합 영역은 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역일 수 있다. 인간 CD3에 결합할 수 있는 이러한 항원-결합 영역은 본원에 기재되고 개시된 바와 같은 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역일 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물 또는 단위 투여 형태는 이중특이적 항체를 포함하며, 여기서 인간 B7H4에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역은 중쇄 및 경쇄에 포함되고, 상기 중쇄는 상기 VH 영역 및 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 상기 VL 영역 및 카파 경쇄 불변 영역을 포함하고; 여기서 인간 CD3에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역은 중쇄 및 경쇄에 포함되고, 상기 중쇄는 상기 VH 영역 및 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 상기 VL 영역 및 람다 경쇄 불변 영역을 포함한다. 보다 바람직하게는, 이러한 이중특이적 항체에서, 하나의 IgG1 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 60에 정의된 바와 같고, 다른 것은 서열식별번호: 61에 정의된 바와 같고, 상기 카파 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 63에 정의된 바와 같고, 상기 람다 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 64에 정의된 바와 같다. 임의로, 서열식별번호: 60 및 61에 정의된 바와 같은 상기 IgG1 중쇄 불변 영역 중에서, 말단 리신은 결실될 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 제약 조성물 또는 단위 투여 형태의 고도로 바람직한 이중특이적 항체는 실시예 섹션에 기재되고 사용된 바와 같고, BsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR로서 지칭된다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물 또는 단위 투여 형태는 인간 CD3 및 인간 B7H4에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 포함하고, 이는 하기를 포함하는 것으로 제공된다:
- 인간 CD3에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄이며, 여기서 상기 제1 중쇄는 서열식별번호: 17에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 본원에 정의된 바와 같은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 경쇄는 서열식별번호: 22에 의해 정의된 바와 같은 경쇄 가변 영역 및 인간 람다 경쇄 불변 영역을 포함하는 것인 제1 중쇄 및 제1 경쇄; 및
- 인간 B7H4에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 제2 중쇄 및 제2 경쇄이며, 여기서 상기 제2 중쇄는 서열식별번호: 29에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 본원에 정의된 바와 같은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 상기 제2 경쇄는 서열식별번호: 33에 의해 정의된 바와 같은 경쇄 가변 영역 및 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 것인 제2 중쇄 및 제2 경쇄.
본원에 정의된 바와 같은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역은 본원에 정의된 바와 같은 치환 (예를 들어 FEAR/FEAL) 등을 포괄할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 인간 IgG1 중쇄 불변 영역은 그의 말단 리신 (K)이 결실될 수 있는 것으로 이해된다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물 또는 단위 투여 형태는 인간 CD3 및 인간 B7H4에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 포함하고, 이는 하기를 포함하는 것으로 제공된다:
- 인간 CD3에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄이며, 여기서 상기 제1 중쇄는 서열식별번호: 17에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 60에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 경쇄는 서열식별번호: 22에 의해 정의된 바와 같은 경쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 64에 의해 정의된 바와 같은 경쇄 불변 영역을 포함하는 것인 제1 중쇄 및 제1 경쇄; 및
- 인간 B7H4에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 제2 중쇄 및 제2 경쇄이며, 여기서 상기 제2 중쇄는 서열식별번호: 29에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 61에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 상기 제2 경쇄는 서열식별번호: 33에 의해 정의된 바와 같은 경쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 63에 의해 정의된 바와 같은 경쇄 불변 영역을 포함하는 것인 제2 중쇄 및 제2 경쇄.
마찬가지로, 인간 IgG1 중쇄 불변 영역은 그의 말단 리신 (K)이 결실될 수 있는 것으로 이해된다.
또 다른 추가의 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물 또는 단위 투여 형태는 인간 CD3 및 인간 B7H4에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 포함하고, 이는 하기를 포함하는 것으로 제공된다:
- 인간 CD3에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄이며, 여기서 상기 제1 중쇄는 서열식별번호: 17에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 60에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 불변 영역으로 이루어지고, 여기서 상기 제1 경쇄는 서열식별번호: 22에 의해 정의된 바와 같은 경쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 64에 의해 정의된 바와 같은 경쇄 불변 영역으로 이루어지는 것인 제1 중쇄 및 제1 경쇄; 및
- 인간 B7H4에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 제2 중쇄 및 제2 경쇄이며, 여기서 상기 제2 중쇄는 서열식별번호: 29에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 61에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 불변 영역으로 이루어지고, 여기서 상기 제2 경쇄는 서열식별번호: 33에 의해 정의된 바와 같은 경쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 63에 의해 정의된 바와 같은 경쇄 불변 영역으로 이루어지는 것인 제2 중쇄 및 제2 경쇄.
또 다른 추가의 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물 또는 단위 투여 형태는 인간 CD3 및 인간 B7H4에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 포함하고, 이는 하기를 포함하는 것으로 제공된다:
- 인간 CD3에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄이며, 여기서 상기 제1 중쇄는 서열식별번호: 17에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 말단 리신 (K)이 결실된 서열식별번호: 60에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 불변 영역으로 이루어지고, 여기서 상기 제1 경쇄는 서열식별번호: 22에 의해 정의된 바와 같은 경쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 64에 의해 정의된 바와 같은 경쇄 불변 영역으로 이루어지는 것인 제1 중쇄 및 제1 경쇄; 및
인간 B7H4에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 제2 중쇄 및 제2 경쇄이며, 여기서 상기 제2 중쇄는 서열식별번호: 29에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 말단 리신 (K)이 결실된 서열식별번호: 61에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 불변 영역으로 이루어지고, 여기서 상기 제2 경쇄는 서열식별번호: 33에 의해 정의된 바와 같은 경쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 63에 의해 정의된 바와 같은 경쇄 불변 영역으로 이루어지는 것인 제2 중쇄 및 제2 경쇄.
이중특이적 항체의 제조 방법
전통적인 방법, 예컨대 하이브리드 하이브리도마 및 화학적 접합 방법 (Marvin and Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26:649)이 본 발명의 이중특이적 항체의 제조에 사용될 수 있다. 상이한 중쇄 및 경쇄로 이루어진 2종의 항체를 숙주 세포에서 공동 발현시키면, 목적하는 이중특이적 항체에 추가로, 가능한 항체 생성물의 혼합물이 생성되며, 이어서 이를, 예를 들어 친화도 크로마토그래피 또는 유사한 방법에 의해 단리할 수 있다.
상이한 항체 구축물의 공동-발현 시에 기능적 이중특이적 생성물의 형성을 촉진하는 전략, 예를 들어 문헌 [Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219)]에 기재된 방법이 또한 사용될 수 있다. 상이한 항체를 생산하는 래트 및 마우스 하이브리도마의 융합은 우선적인 종-제한된 중쇄/경쇄 쌍형성으로 인해 제한된 수의 이종이량체 단백질을 유도한다. 동종이량체에 비해 이종이량체의 형성을 촉진하는 또 다른 전략은 돌출부가 제1 중쇄 폴리펩티드 상에 도입되고 상응하는 공동이 제2 중쇄 폴리펩티드 내에 도입되어, 돌출부가 이들 2개의 중쇄의 계면에서 공동 내에 위치하여 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해할 수 있도록 하는 "놉-인투-홀" 전략이다. "돌출부"는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄로 대체함으로써 구축된다. 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 보상성 "공동"은 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것으로 대체함으로써 제2 폴리펩티드의 계면에서 생성된다 (미국 특허 5,731,168). EP1870459 (츄가이(Chugai)) 및 WO 2009089004 (암젠(Amgen))는 숙주 세포에서의 상이한 항체 도메인의 공동-발현 시 이종이량체 형성을 촉진하기 위한 다른 전략을 기재한다. 이들 방법에서, CH3 도메인 둘 다에서 CH3-CH3 계면을 구성하는 1개 이상의 잔기는, 동종이량체 형성이 정전기적으로 불리하고 이종이량체화가 정전기적으로 유리하도록 하전된 아미노산으로 대체된다. WO 2007110205 (머크)는 IgA 및 IgG CH3 도메인 사이의 차이를 이용하여 이종이량체화를 촉진하는 또 다른 전략을 기재한다.
이중특이적 항체를 생산하기 위한 또 다른 시험관내 방법이 WO 2008119353 (젠맙)에 기재되어 있으며, 여기서 이중특이적 항체는 환원 조건 하에 인큐베이션 시 2개의 단일특이적 IgG4- 또는 IgG4-유사 항체 사이의 "Fab-아암" 또는 "절반-분자" 교환 (중쇄 및 부착된 경쇄의 스와핑)에 의해 형성된다. 생성된 생성물은 상이한 서열을 포함할 수 있는 2개의 Fab 아암을 갖는 이중특이적 항체이다.
본 발명의 이중특이적 CD3xB7H4 항체를 제조하는 바람직한 방법은 하기 단계를 포함하는, WO 2011131746 및 WO 13060867 (젠맙)에 기재된 방법을 포함한다:
a) Fc 영역을 포함하는 제1 항체를 제공하는 단계이며, 여기서 상기 Fc 영역은 제1 CH3 영역을 포함하는 것인 단계;
b) 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 항체를 제공하는 단계이며, 여기서 상기 Fc 영역은 제2 CH3 영역을 포함하고, 여기서 제1 항체는 CD3 항체이고 제2 항체는 B7H4 항체이거나, 또는 그 반대의 경우인 단계;
여기서 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 하는 것임;
c) 상기 제1 항체를 상기 제2 항체와 함께 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계; 및
d) 상기 이중특이적 CD3xB7H4 항체를 수득하는 단계.
한 실시양태에서, 상기 제1 항체는 상기 제2 항체와 함께 힌지 영역 내의 시스테인이 디술피드-결합 이성질체화를 겪도록 하기에 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션되고, 여기서 생성된 이종이량체 항체에서 상기 제1 및 제2 항체 사이의 이종이량체 상호작용은 37℃에서 24시간 후에 0.5 mM GSH에서 Fab-아암 교환이 발생하지 않도록 하는 것이다.
이론에 제한되지 않으면서, 단계 c)에서, 모 항체의 힌지 영역 내의 중쇄 디술피드 결합이 환원되고, 이어서 생성된 시스테인이 또 다른 모 항체 분자 (원래 상이한 특이성을 가짐)의 시스테인 잔기와 중쇄간 디술피드 결합을 형성할 수 있다. 이러한 방법의 한 실시양태에서, 단계 c)에서의 환원 조건은 환원제, 예를 들어 2-메르캅토에틸아민 (2-MEA), 디티오트레이톨 (DTT), 디티오에리트리톨 (DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), L-시스테인 및 베타-메르캅토-에탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 환원제, 바람직하게는 2-메르캅토에틸아민, 디티오트레이톨 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀으로 이루어진 군으로부터 선택된 환원제의 첨가를 포함한다. 추가 실시양태에서, 단계 c)는, 예를 들어 환원제의 제거에 의해, 예를 들어 탈염에 의해 조건을 비-환원성 또는 덜 환원성이 되도록 회복시키는 것을 포함한다.
이 방법을 위해, 본원에 기재된 임의의 CD3 및 B7H4 항체가 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, CD3 및 B7H4 항체는 각각 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 CD3xB7H4 항체를 수득하도록 선택될 수 있다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 상기 제1 및/또는 제2 항체는 전장 항체이다.
제1 및 제2 항체의 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 이소형의 것일 수 있다. 이러한 방법의 한 실시양태에서, 상기 제1 및 상기 제2 항체 둘 다의 Fc 영역은 IgG1 이소형의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체의 Fc 영역 중 하나는 IgG1 이소형의 것이고, 다른 것은 IgG4 이소형의 것이다. 후자의 실시양태에서, 생성된 이중특이적 항체는 IgG1의 Fc 영역 및 IgG4의 Fc 영역을 포함하고, 따라서 이펙터 기능의 활성화와 관련하여 흥미로운 중간 특성을 가질 수 있다.
추가의 실시양태에서, 항체 출발 단백질 중 하나는 단백질 A에 결합하지 않도록 조작되었으며, 따라서 생성물을 단백질 A 칼럼에 통과시킴으로써 이종이량체 단백질을 상기 동종이량체 출발 단백질로부터 분리할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 동종이량체 출발 항체의 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 하는 것이다. 이들 상호작용 및 이들이 달성될 수 있는 방법에 대한 보다 상세한 내용은 WO 2011131746 및 WO 2013060867 (젠맙)에 제공되며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특히, 안정한 이중특이적 CD3xB7H4 항체는 각각 CD3 및 B7H4에 결합하고 CH3 영역 내에 단지 소수의 상당히 보존적인 비대칭 돌연변이를 함유하는 2개의 동종이량체 출발 항체를 기초로 하여 본 발명의 상기 방법을 사용하여 높은 수율로 수득될 수 있다. 비대칭 돌연변이는 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열이 동일하지 않은 위치에서 아미노산 치환을 함유함을 의미한다.
실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, 본 발명에 따라 B7H4 및 CD3 둘 다에 결합할 수 있는 항체를 생산하는 방법이 제공된다:
a) B7H4에 결합할 수 있는 항체를 제공하는 단계이며, 상기 항체는 본원에 정의된 바와 같은 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 것인 단계;
b) CD3에 결합할 수 있는 항체를 제공하는 단계이며, 상기 항체는 본원에 정의된 바와 같은 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 것인 단계;
c) 힌지 영역 내의 시스테인이 디술피드-결합 이성질화를 겪도록 하기에 충분한 환원 조건 하에 B7H4에 결합할 수 있는 상기 항체를 CD3에 결합할 수 있는 상기 항체와 함께 인큐베이션하는 단계, 및
d) B7H4 및 CD3에 결합할 수 있는 상기 항체를 수득하는 단계.
상기 방법에서, B7H4 및/또는 CD3에 결합할 수 있는 항체를 제공하는 단계는 하기를 포함할 수 있다:
- 상기 항체 또는 상기 항체들을 생산하기 위한 발현 벡터를 함유하는 세포를 제공하는 단계; 및
- 세포가 상기 항체 또는 상기 항체들을 생산하도록 하는 단계, 및 후속적으로
- 상기 항체 또는 상기 항체들을 수득하고, 이로써 상기 항체 또는 상기 항체들을 제공하는 단계.
바람직하게는, 항체는 본 발명의 제약 조성물 내의 제약상 허용되는 담체 내에 포함된다. 본 발명의 제약 조성물은 B7H4 및 CD3 둘 다를 표적화하는 본 발명의 이중특이적 항체를 함유할 수 있다. 제약 조성물은 또한 B7H4를 표적화하는 항체를 포함할 수 있다. 제약 조성물은 또한 본 발명에 따른 B7H4를 표적화하는 항체 및/또는 이중특이적 항체를 포함하는 항체의 조합물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 바람직하게는 의약으로서 사용하기 위한 것이다. 본 발명에 따른 제약 조성물은 바람직하게는 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 이중특이적 항체는 다수의 목적을 위해 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 이중특이적 항체는 전이성 암 및 불응성 암을 포함한 다양한 형태의 암의 치료에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 암은 고형 종양 유형의 것일 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 B7H4를 발현하는 세포의 특이적 표적화 및 T 세포-매개 사멸이 바람직한 치료 세팅에서 유용할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 제약 조성물의 이중특이적 B7H4xCD3 항체의 투여를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 이중특이적 항체의 투여를 포함하는, 대상체에서 B7H4를 발현하는 세포를 수반하는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항체의 치료 유효량의 투여를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 인간 B7H4에 결합할 수 있는 본 발명의 단일특이적 항체의 치료 유효량의 투여를 포함하는, 대상체에서 B7H4를 발현하는 세포를 수반하는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법 및 용도에서 고려될 수 있는 적합한 질환은 암이다. 상기 암은 가장 바람직하게는 B7H4의 발현을 특징으로 한다. 암에서의 B7H4의 발현은 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 PCR, 면역염색, 또는 FACS 분석, 즉 B7H4 전사체 및/또는 단백질의 발현을 검출하는 것을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 인간 B7H4에 결합할 수 있는 본원에 기재된 항체는 예를 들어 면역염색 및/또는 FACS 분석 등에 사용될 수 있다.
B7H4를 발현할 수 있는 암은 유방암, 자궁/자궁내막암, 자궁 암육종 암, 난소암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (편평 세포 암종 및 선암종), 두경부 편평 세포 암종, 방광암, 식도암, 담관암종, 췌장암, 위암, 신암 및 전립선암을 포함한다.
B7H4를 발현할 수 있는 암은 위의 암, 담관암종, 방광암, 비소세포 폐암 (특히 편평 NSCLC), 췌장암, 자궁경부암, 두경부암, 유방암 (삼중 음성 유방암 포함), 난소암 및 자궁암과 같은 암을 포함한다. 바람직할 수 있는 암의 유형은 자궁 암육종 (UCS), 방광 요로상피 암종 (BLCA), 췌장 선암종 (PAAD), 폐 편평 세포 암종 (LUSC), 유방 침습성 암종 (BRCA), 자궁체부 자궁내막 암종 (UCEC), 난소 장액성 낭선암종 (OV) 및 담관암종 (CHOL)으로부터 선택된 암이다.
추가의 실시양태에서, 암으로 진단된 환자는 암 세포에서 B7H4 발현의 평가에 적용될 수 있고, B7H4가 검출되는 경우 (이는 낮은 수준 내지 높은 범위일 수 있음), 상기 환자는 본 발명에 따른 항체를 사용한 치료를 위해 선택될 수 있다. 위의 암, 담관암종, 방광암, 비소세포 폐암 (특히 편평 NSCLC), 췌장암, 자궁경부암, 두경부암, 유방암 (삼중 음성 유방암 포함), 난소암 또는 자궁암을 갖는 것으로 진단된 환자는 이러한 시험에 적용될 수 있다. 추가 실시양태에서, 자궁 암육종 (UCS), 방광 요로상피 암종 (BLCA), 췌장 선암종 (PAAD), 폐 편평 세포 암종 (LUSC), 유방 침습성 암종 (BRCA), 자궁체부 자궁내막 암종 (UCEC), 난소 장액성 낭선암종 (OV) 또는 담관암종 (CHOL)을 갖는 것으로 진단된 환자는 이러한 시험에 적용될 수 있다. 그러나, 치료를 위한 환자를 선택하는 데 있어서 이러한 평가를 포함하는 것이 반드시 요건은 아닐 수 있다.
키트
본 발명은 상기 개시된 바와 같은 항체를 포함하는 제약 조성물 또는 단위 투여 형태를 포함하는 부분들의 키트, 예컨대 동반 진단제로서 사용하기 위한/환자의 집단 내에서 상기 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 상기 본원에 정의된 바와 같은 면역접합체 또는 항체-약물 접합체 (ADC)를 사용한 치료에 반응하는 경향을 갖는 환자를 확인하기 위한, 또는 환자의 치료에 사용되는 경우에 상기 항체 또는 면역접합체 또는 ADC의 효능 또는 항종양 활성을 예측하기 위한 키트이며, 키트는 상기 정의된 바와 같은 항체; 및 상기 키트의 사용에 대한 지침서를 포함하는 것인 키트를 추가로 제공한다.
부분들의 키트, 예컨대 동반 진단제로서 사용하기 위한/제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체를 사용한 치료에 반응하는 경향을 갖는 환자를 환자의 집단 내에서 확인하기 위한, 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체; 및 상기 키트의 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 이중특이적 CD3xB7H4 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 B7H4 항체를 포함하는 진단 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 환자로부터 유래된 샘플에서 CD3- 및 B7H4 발현 세포 사이의 가교를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다:
i) 본원에 개시된 바와 같은 실시양태 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체; 및
ii) 상기 키트의 사용 지침서.
한 실시양태에서, 본 발명은 이중특이적 CD3xB7H4 항체, 및 B7H4 발현 세포 및 CD3 발현 세포의 가교를 검출하기 위한 1종 이상의 시약을 포함하는 용기를 포함하는, 암의 진단을 위한 키트를 제공한다. 시약은 예를 들어 형광 태그, 효소 태그, 또는 다른 검출가능한 태그를 포함할 수 있다. 시약은 또한 효소 반응을 위한 2차 또는 3차 항체 또는 시약을 포함할 수 있고, 여기서 효소 반응은 시각화될 수 있는 생성물을 생산한다.
추가 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 본원에 개시된 바와 같은 실시양태 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체의 투여 시에 환자로부터 유래된 샘플에서 CD3- 및 B7H4-발현 세포 사이의 가교가 발생하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것이다:
(i) 샘플을 본원에 개시된 바와 같은 실시양태 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체와, 상기 이중특이적 항체와 CD3-발현 세포 및 B7H4-발현 세포 사이에 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 단계; 및
(ii) 복합체가 형성되었는지를 분석하는 단계.
본 발명의 구체적 실시양태
1. a) 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체로서, 여기서 상기 항원-결합 영역은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간화 및/또는 인간인 항체, 및
b) 완충제
를 포함하는 제약 조성물로서,
여기서 조성물의 pH는 4.0 내지 8.0인 제약 조성물.
2. 실시양태 1에 있어서, 조성물의 pH가 4.5 내지 6.5인 제약 조성물.
3. 실시양태 1에 있어서, 조성물의 pH가 5.0 내지 6.0인 제약 조성물.
4. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 완충제가 히스티딘, 글루타메이트 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
5. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, c) 비-이온성 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
6. 실시양태 5에 있어서, 비-이온성 부형제가 당 또는 당 알콜인 제약 조성물.
7. 실시양태 5 또는 6에 있어서, 비-이온성 부형제가 소르비톨, 수크로스 또는 그의 혼합물로부터 선택된 것인 제약 조성물.
8. 실시양태 5-7 중 어느 하나에 있어서, 비-이온성 부형제가 100 내지 300 mM, 예컨대 125-250 mM, 바람직하게는 250 mM의 농도로 존재하는 것인 제약 조성물.
9. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, d) 계면활성제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
10. 실시양태 9에 있어서, 계면활성제가 글리세롤 모노올레에이트, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 도큐세이트, 인지질, 폴리에틸렌 알킬 에테르, 소듐 라우릴 술페이트 및 트리카프릴린, 벤즈알코늄 클로라이드, 시트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드 및 인지질, 알파 토코페롤, 글리세롤 모노올레에이트, 미리스틸 알콜, 인지질, 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자 오일 유도체, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 폴리옥실 히드록시스테아레이트, 폴리옥실글리세리드, 폴리소르베이트, 프로필렌 글리콜 디라우레이트, 프로필렌 글리콜 모노라우레이트, 소르비탄 에스테르 수크로스 팔미테이트, 수크로스 스테아레이트, 트리카프릴린 및 TPGS, 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
11. 실시양태 9 또는 10에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트인 제약 조성물.
12. 실시양태 11에 있어서, 폴리소르베이트가 폴리소르베이트 20 또는 80, 바람직하게는 폴리소르베이트 80인 제약 조성물.
13. 실시양태 9-12 중 어느 하나에 있어서, 계면활성제가 약 0.005% 내지 0.4% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.1% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.09% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.06% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.05% w/v, 예컨대 0.02% w/v 또는 0.03% w/v 또는 0.04% w/v 또는 0.05% w/v, 바람직하게는 0.02% w/v의 농도로 존재하는 것인 제약 조성물.
14. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체의 농도가 0.5 내지 100 mg/ml, 예컨대 1.0 내지 50 mg/ml, 또는 예컨대 5 내지 30 mg/ml, 예컨대 5 mg/ml, 또는 6 mg/ml, 또는 7 mg/ml, 또는 8 mg/ml, 또는 9 mg/ml, 또는 10 mg/ml, 또는 11 mg/ml, 또는 12 mg/ml, 또는 13 mg/ml, 또는 14 mg/ml, 또는 15 mg/ml, 또는 16 mg/ml, 또는 17 mg/ml, 또는 18 mg/ml, 또는 19 mg/ml, 또는 20 mg/ml, 또는 21 mg/ml, 또는 22 mg/ml, 또는 23 mg/ml, 또는 24 mg/ml, 또는 25 mg/ml, 또는 26 mg/ml, 또는 27 mg/ml, 또는 28 mg/ml, 또는 29 mg/ml, 30 mg/ml, 31 mg/ml, 32 mg/ml, 33 mg/ml, 34 mg/ml, 35 mg/ml, 36 mg/ml, 37 mg/ml, 38 mg/ml, 39 mg/ml, 40 mg/ml, 41 mg/ml, 42 mg/ml, 43 mg/ml, 44 mg/ml, 45 mg/ml, 46 mg/ml, 47 mg/ml, 48 mg/ml, 49 mg/ml, 50 mg/ml, 51 mg/ml, 52 mg/ml, 53 mg/ml, 54 mg/ml, 55 mg/ml, 56 mg/ml, 57 mg/ml, 58 mg/ml, 59 mg/ml, 또는 예컨대 60 mg/ml인 제약 조성물.
15. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 완충제가 5 내지 40 mM, 예컨대 10-30 mM, 바람직하게는 20 mM의 농도로 존재하는 것인 제약 조성물.
16. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 수성 조성물인 제약 조성물.
17. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서,
a) 5-50 mg/ml의 항체,
b) 10 내지 20 mM 글루타메이트 또는 히스티딘,
c) 150 내지 350 mM 소르비톨 또는 수크로스,
d) 폴리소르베이트
를 포함하는 제약 조성물로서,
여기서 조성물의 pH가 5.0 내지 6.0인 제약 조성물.
18. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서,
a) 10-20 mg/ml의 항체, b) 20 mM 글루타메이트, c) 250 mM 소르비톨, d) 0.02% w/v 폴리소르베이트 80을 포함하는 제약 조성물로서, 조성물의 pH가 5.1-5.3인 제약 조성물, 및
a) 10-20 mg/ml의 항체, b) 20 mM 히스티딘, c) 250 mM 수크로스, d) 0.02% w/v 폴리소르베이트 80을 포함하는 제약 조성물로서, 조성물 pH가 5.4-5.6인 제약 조성물
로 이루어진 군으로부터 선택된 제약 조성물.
19. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 액체 조성물인 제약 조성물.
20. 실시양태 1-19 중 어느 하나에 있어서, 정맥내 조성물이고/거나, 정맥내 투여에 사용하기 위한 제약 조성물.
21. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
22. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 단위 투여 형태인 제약 조성물.
23. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 2-8℃, 예컨대 5℃의 저장 온도에서 적어도 6개월, 예컨대 적어도 9개월 또는 적어도 12개월 동안 제약 용도에 대해 안정한 제약 조성물.
24. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 이중특이적 항체인 제약 조성물.
25. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 암 세포 및 T 세포에 결합할 수 있는 것인 제약 조성물.
26. 실시양태 25에 있어서, 암 세포가 상기 인간 B7H4를 발현하는 것인 제약 조성물.
27. 실시양태 25 또는 26에 있어서, 암 세포가 고형 종양의 것인 제약 조성물.
28. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 T 세포 매개 세포 사멸을 유도할 수 있는 것인 제약 조성물.
29. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 인간 CD3ε (엡실론), 예컨대 서열식별번호: 13에 명시된 바와 같은 인간 CD3ε (엡실론)에 결합할 수 있는 것인 제약 조성물.
30. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, CD3에 결합하는 항원-결합 영역이 하기를 포함하는 것인 제약 조성물:
서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 17의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH),
및
서열식별번호: 22의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
31. 실시양태 1-29 중 어느 하나에 있어서, CD3에 결합하는 항원-결합 영역이 하기를 포함하는 것인 제약 조성물:
각각 서열식별번호: 18, 19 및 20 또는 18, 19 및 21의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH);
및
각각 서열식별번호: 23, GTN 및 24의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
32. 실시양태 1-29 중 어느 하나에 있어서, CD3에 결합하는 항원-결합 영역이 하기를 포함하는 것인 제약 조성물:
서열식별번호: 17의 서열, 또는 서열식별번호: 17의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH);
및
서열식별번호: 22의 서열 또는 서열식별번호: 22의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
33. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, CD3에 결합하는 항원-결합 영역과 CD3 사이의 해리 평형 상수 KD가 1 - 100 nM의 범위 내, 예컨대 5 - 100 nM의 범위 내, 10 - 100 nM의 범위 내, 1 - 80 nM의 범위 내, 1 - 60 nM의 범위 내, 1 - 40 nM의 범위 내, 1 - 20 nM의 범위 내, 5 - 80 nM의 범위 내, 5 - 60 nM의 범위 내, 5 - 40 nM의 범위 내, 5 - 20 nM의 범위 내, 10 - 80 nM의 범위 내, 10 - 60 nM의 범위 내, 10 - 40 nM의 범위 내, 또는 예컨대 10 - 20 nM의 범위 내인 제약 조성물.
34. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 서열식별번호: 16에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 22에 제시된 VL 서열을 포함하는 항원-결합 영역을 갖는 항체보다 인간 CD3ε에 대해 더 낮은 결합 친화도를 갖고, 바람직하게는 상기 친화도가 적어도 5배 더 낮은, 예컨대 적어도 10배 더 낮은, 예를 들어 적어도 20배 더 낮은, 적어도 30배 더 낮은, 적어도 40배 더 낮은, 적어도 45배 더 낮은 또는 예컨대 적어도 50배 더 낮은 것인 제약 조성물.
35. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, CD3에 결합하는 항원-결합 영역이 200 - 1000 nM의 범위 내, 예컨대 300 - 1000 nM의 범위 내, 400 - 1000 nM의 범위 내, 500 - 1000 nM의 범위 내, 300 - 900 nM의 범위 내, 400 - 900 nM의 범위 내, 400 - 700 nM의 범위 내, 500 - 900 nM의 범위 내, 500 - 800 nM의 범위 내, 500 - 700 nM의 범위 내, 600 - 1000 nM의 범위 내, 600 - 900 nM의 범위 내, 600 - 800 nM의 범위 내, 또는 예컨대 600 - 700 nM의 범위 내인 평형 해리 상수 KD를 갖는 것인 제약 조성물.
36. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, CD3에 결합하는 항원-결합 영역이 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역을 포함하고,
중쇄 가변 (VH) 영역이, 서열식별번호: 16에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역과 비교할 경우, T31, N57, H101, G105, S110 및 Y114로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 있는 아미노산 치환을 가지며, 위치는 서열식별번호: 16의 서열에 따라 넘버링되고;
야생형 경쇄 가변 (VL) 영역은 각각 서열식별번호: 23, GTN 및 서열식별번호: 24에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 것인
제약 조성물.
37. 실시양태 36에 있어서, CD3에 결합하는 항원-결합 영역이 중쇄 가변 (VH) 영역에 T31M, T31P, N57E, H101G, H101N, G105P, S110A, S110G, Y114M, Y114R, Y114V로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 포함하는 것인 제약 조성물.
38. 실시양태 30-32 중 어느 하나에 있어서, CD3에 결합하는 항원-결합 영역의 중쇄 가변 (VH) 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 서열식별번호: 16의 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3과 비교할 경우 총 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환이 바람직하게는 실시양태 36 또는 실시양태 37에 정의된 바와 같은 아미노산 치환을 포함하는 것인 제약 조성물.
39. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 인간 B7H4가 서열식별번호: 1의 인간 B7H4인 제약 조성물.
40. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 인간 B7H4의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 것인 제약 조성물.
41. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 인간 B7H4의 IgC-유사 불변 영역에 결합할 수 있는 것인 제약 조성물.
42. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 11의 서열을 갖는 B7H3-IgV/B7H4-IgC에 결합할 수 있는 것인 제약 조성물.
43. 실시양태 42에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 10의 서열을 갖는 B7H4-IgV/B7H3-IgC에 결합할 수 없는 것인 제약 조성물.
44. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 하기를 포함하는 것인 제약 조성물:
a) 서열식별번호: 25의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
b) 서열식별번호: 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
c) 서열식별번호: 36의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 40의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
d) 서열식별번호: 43의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 47의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
e) 서열식별번호: 50의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 54의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역; 또는
f) 서열식별번호: 31의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역
g) 서열식별번호: 65의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 69의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역.
45. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 하기를 포함하는 것인 제약 조성물:
a) 각각 서열식별번호: 26, 27 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
b) 각각 서열식별번호: 26, 30 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
c) 각각 서열식별번호: 37, 38 및 39의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 41, DTS 및 서열식별번호: 42의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
d) 각각 서열식별번호: 44, 45 및 46의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 48, YTS 및 서열식별번호: 49의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
e) 각각 서열식별번호: 51, 52 및 53의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 55, GAS 및 서열식별번호: 56의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역; 또는
f) 각각 서열식별번호: 26, 32 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
g) 각각 서열식별번호: 66, 67 및 68의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 70, GAS 및 서열식별번호: 71의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역.
46. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 하기를 포함하는 것인 제약 조성물:
a) 서열식별번호: 25의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
b) 서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
c) 서열식별번호: 36의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 40의 가변 경쇄 영역;
d) 서열식별번호: 43의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 47의 가변 경쇄 영역;
e) 서열식별번호: 50의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 54의 가변 경쇄 영역; 또는
f) 서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
g) 서열식별번호: 65의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 69의 가변 경쇄 영역.
47. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 5E-7 M 이하, 예컨대 1E-7 M 이하의 KD 값에 상응하는 결합 친화도를 갖는, 예컨대 5E-7 내지 2E-10 M의 범위 내, 예컨대 2E-7 내지 1E-10 M 또는 1E-7 내지 5E-9 M의 범위 내의 KD 값에 상응하는 결합 친화도를 갖는 것인 제약 조성물.
48. 실시양태 47에 있어서, 결합 친화도가 임의로 본원의 실시예 3에 제시된 바와 같은 생물층 간섭측정법에 의해 결정되는 것인 제약 조성물.
49. 실시양태 47 또는 48에 있어서, 결합 친화도가 하기 단계를 포함하는 생물층 간섭측정법을 사용하여 결정되는 것인 제약 조성물:
I) 항체를 항-인간 IgG Fc 포획 바이오센서 상에 600초 동안 1 μg/mL의 양으로 고정화시키는 단계;
II) 1.56 nM 내지 100 nM 범위의 2배 희석 시리즈를 사용하여 인간 재조합 His 태그부착된 B7H4 단백질 (시노 바이올로지칼 카탈로그 번호 10738-H08H; C-말단 폴리히스티딘 태그를 갖는 인간 VTCN1 (유니프롯 등록 번호 Q7Z7D3) (Phe29-Ala258)을 코딩하는 DNA 서열의 구축물로부터 발현된 단백질)의 300초의 기간에 걸친 회합 및 1000초의 기간에 걸친 해리를 결정하는 단계;
III) 데이터를 완충제 대조군 (0 nM)에 대해 참조하는 단계.
50. 실시양태 47 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 결합 친화도가 단일특이적 2가 항체, 예컨대 전장 IgG1인 항체인 상기 실시양태 중 어느 한 실시양태에 정의된 바와 같은 항체를 사용하여 결정되는 것인 제약 조성물.
51. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원 영역을 포함하고, 상기 항원-결합 영역은
서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체; 및
서열식별번호: 36의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 40의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 교차차단할 수 있고;
여기서 상기 항원-결합 영역은
서열식별번호: 43의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 47의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체;
서열식별번호: 50의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 54의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체; 및
서열식별번호: 65의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 69의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 교차차단할 수 없는 것인 제약 조성물.
52. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원 영역을 포함하고, 상기 항원-결합 영역은
서열식별번호: 43의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 47의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체,
서열식별번호: 50의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 54의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체; 및
서열식별번호: 65의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 69의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 교차차단할 수 있고;
여기서 상기 항원-결합 영역은
서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체 및
서열식별번호: 36의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 40의 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 교차차단할 수 없는 것인 제약 조성물.
53. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 서열식별번호: 11의 B7H3-IgV/B7H4-IgC에 결합할 수 있고, 임의로 서열식별번호: 10의 B7H4-IgV/B7H3-IgC에는 결합할 수 없는 것인 제약 조성물.
54. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 각각의 항원-결합 영역이 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 상기 가변 영역이 각각 3개의 CDR 서열, 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 4개의 프레임워크 서열, 각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 것인 제약 조성물.
55. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서,
B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 인간이고,
CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 인간화인 제약 조성물.
56. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서,
B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 인간이고/거나,
CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 인간화인 제약 조성물.
57. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 2개의 중쇄 불변 영역 (CH) 및 2개의 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 것인 제약 조성물.
58. 실시양태 57에 있어서, 2개의 중쇄 불변 도메인 및 2개의 경쇄 불변 영역이 인간으로부터 유래된 것인 제약 조성물.
59. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 전장 항체인 제약 조성물.
60. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 IgG1 이소형의 것인 제약 조성물.
61. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 각각의 상기 제1 및 제2 중쇄가 적어도 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 중쇄에서 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 하나가 치환되고, 상기 제2 중쇄에서 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 하나가 치환되고, 여기서 상기 제1 및 상기 제2 중쇄의 상기 치환은 동일한 위치에 있지 않고, 아미노산 위치는 Eu 넘버링에 따라 넘버링되는 것인 제약 조성물.
62. 실시양태 61에 있어서, 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치의 아미노산이 상기 제1 중쇄에서 R이고, 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치의 아미노산이 상기 제2 중쇄에서 L이거나, 또는 그 반대의 경우인 제약 조성물.
63. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 제1 및 임의로 제2 중쇄를 포함하고, 제1 중쇄 및 존재하는 경우 제2 중쇄는, 항체가 동일한 비-변형된 항체에 비해 더 적은 정도로 Fc-매개 이펙터 기능을 유도하도록 변형된 것인 제약 조성물.
64. 실시양태 63에 있어서, 항체가 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서, Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 각각 F 및 E인 제약 조성물.
65. 실시양태 63 또는 실시양태 64에 있어서, 항체가 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서, Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 A인 제약 조성물.
66. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 카파 (κ) 경쇄를 포함하는 것인 제약 조성물.
67. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 람다 (λ) 경쇄를 포함하는 것인 제약 조성물.
68. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 람다 (λ) 경쇄 및 카파 (κ) 경쇄를 포함하고; 예를 들어 항체가 CD3에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 중쇄 및 람다 경쇄, 및 B7H4에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 중쇄 및 카파 경쇄를 갖는 것인 제약 조성물.
69. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원 결합 영역이 중쇄 및 경쇄에 포함되고, 상기 중쇄가 상기 VH 영역 및 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄가 상기 VL 영역 및 카파 경쇄 불변 영역을 포함하고; 인간 CD3에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역이 중쇄 및 경쇄에 포함되고, 상기 중쇄가 상기 VH 영역 및 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄가 상기 VL 영역 및 람다 경쇄 불변 영역을 포함하는 것인 제약 조성물.
70. 실시양태 69에 있어서, 하나의 IgG1 중쇄 불변 영역이 서열식별번호: 60에 정의된 바와 같고, 다른 것이 서열식별번호: 61에 정의된 바와 같고, 상기 카파 경쇄 불변 영역이 서열식별번호: 63에 정의된 바와 같고, 상기 람다 경쇄 불변 영역이 서열식별번호: 64에 정의된 바와 같은 것인 제약 조성물.
71. 실시양태 70에 있어서, 서열식별번호: 60 및 61에 정의된 바와 같은 상기 IgG1 중쇄 불변 영역이 그의 말단 리신이 결실된 것인 제약 조성물.
72. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 Fc-매개 이펙터 기능이 없거나 또는 감소되고, 항체가
a) 본원의 실시예 9 및 10에 기재된 바와 같이 B7H4-발현 인간 종양 세포에 결합할 수 있고/거나,
b) 본원의 실시예 11 및 12에 기재된 바와 같이 검정 시에, 예를 들어 정제된 PBMC 또는 T 세포를 이펙터 세포로서 사용하는 경우에 B7H4-발현 인간 종양 세포의 농도-의존성 세포독성을 매개하고/거나,
c) 본원의 실시예 11 및 12에 기재된 바와 같이 검정 시에, 예를 들어 이펙터 세포로서 PBMC 또는 T 세포를 사용하는 경우에 MCF-7, MDA-MB-468, SK-BR3, NIH-OVCAR-3, HCC1954 및 NCI-H1650으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 인간 B7H4-발현 종양 세포주에서 농도-의존성 세포독성을 매개할 수 있고/거나,
d) 예를 들어 본원의 실시예 13에 기재된 바와 같이 검정 시에, B7H4-발현 인간 종양 세포의 존재 하에 시험관내에서 T 세포를 활성화시킬 수 있고/거나;
e) 예를 들어 본원의 실시예 13에 기재된 바와 같이 검정 시에, MCF-7, MDA-MB-468, SK-BR3, NIH-OVCAR-3, HCC1954 및 NCI-H1650으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 B7H4-발현 인간 종양 세포주의 존재 하에 시험관내에서 T 세포를 활성화시킬 수 있고/거나,
f) 예를 들어 본원의 실시예 11 및 12에 기재된 바와 같이 검정 시에, B7H4-발현 인간 종양 세포의 세포독성을 유도할 수 있고/거나,
g) 예를 들어 본원의 실시예 11 및 12에 기재된 바와 같이 검정 시에, MCF-7, MDA-MB-468, SK-BR3, NIH-OVCAR-3, HCC1954 및 NCI-H1650으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 B7H4-발현 인간 종양 세포주에서 T 세포 매개 세포독성을 유도할 수 있는 것인
제약 조성물.
73. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 0.001-5 마이크로그램/ml 범위의 IC50을 가지며, 여기서 IC50은 하기를 포함하는 시험관내 세포독성 검정으로 결정되는 것인 제약 조성물:
i) 건강한 인간 공여자 백혈구 연층으로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 정제된 T 세포를 제공하는 단계,
ii) B7H4-발현 종양 세포를 제공하는 단계;
iii) PBMC 또는 정제된 T 세포, 및 MCF-7, MDA-MB-468, SK-BR3, NIH-OVCAR-3, HCC1954 및 NCI-H1650으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 B7H4-발현 종양 세포주를 복수의 샘플에서 조합하는 단계이며, 여기서 상기 PBMC 또는 정제된 T-세포로부터의 T-세포 대 선택된 종양 세포의 수의 비는 8:1인 단계;
iv) 상기 항체를 예를 들어 0.0128 ng/mL 내지 10,000ng/mL 범위로 상기 샘플에 희석 시리즈로 제공하는 단계, 및
v) 샘플을, 예를 들어 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하고; 후속적으로
vi) B7H4-발현 종양 세포의 생존율을 평가하는 단계,
vii) 각각의 희석 샘플에 대한 생존 세포의 백분율을 결정하는 단계, 및
viii) IC50을 측정하는 단계.
74. 실시양태 73에 있어서, IC50이 0.001-0.03 마이크로그램/ml의 범위인 제약 조성물.
75. 실시양태 73에 있어서, IC50이 0.05 - 5 마이크로그램/ml의 범위인 제약 조성물.
76. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하고, 상기 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 하기를 포함하는 것인 제약 조성물:
a) 서열식별번호: 25의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
b) 서열식별번호: 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
c) 각각 서열식별번호: 26, 27 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
d) 각각 서열식별번호: 26, 30 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
e) 서열식별번호: 25의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역; 또는
f) 서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역.
77. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 2가 항체인 제약 조성물.
78. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역이 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 여기서 CDR1이 서열식별번호: 18에 따르고, CDR2가 서열식별번호: 19에 따르고, CDR3이 서열식별번호: 21에 따른 것인 제약 조성물.
79. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역이 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 CDR1이 서열식별번호: 23에 따르고, CDR2가 GTN이고, CDR3이 서열식별번호: 24에 따른 것인 제약 조성물.
80. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 가변 중쇄 (VH) 영역을 포함하고, 여기서 CDR1이 서열식별번호: 26에 따르고, CDR2가 서열식별번호: 30에 따르고, CDR3이 서열식별번호: 28에 따른 것인 제약 조성물.
81. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 CDR1이 서열식별번호: 34에 따르고, CDR2가 GAS이고, CDR3이 서열식별번호: 35에 따른 것인 제약 조성물.
82. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하고, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은
CDR1이 서열식별번호: 18에 따르고, CDR2가 서열식별번호: 19에 따르고, CDR3이 서열식별번호: 21에 따르는 중쇄 가변 영역 (VH), 및
CDR1이 서열식별번호: 23에 따르고, CDR2가 GTN이고, CDR3이 서열식별번호: 24에 따르는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은
CDR1이 서열식별번호: 26에 따르고, CDR2가 서열식별번호: 30에 따르고, CDR3이 서열식별번호: 28에 따르는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및
CDR1이 서열식별번호: 34에 따르고, CDR2가 GAS이고, CDR3이 서열식별번호: 35에 따르는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 제약 조성물.
83. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하고, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 17의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 22의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은
서열식별번호: 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 것인 제약 조성물.
84. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR, 또는 그의 바이오시밀러인 제약 조성물.
85. 실시양태 1 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 제약 조성물.
86. 실시양태 85에 있어서, 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 의약으로서 사용하기 위한 제약 조성물.
87. 실시양태 86에 있어서, 질환이 암인 제약 조성물.
88. 실시양태 87에 있어서, 암이 암 세포에서의 B7H4의 발현을 특징으로 하는 것인 제약 조성물.
89. 실시양태 88에 있어서, 상기 B7H4의 발현이 환자로부터 수득된 암 세포에서 결정되는 것인 제약 조성물.
90. 실시양태 87-89에 있어서, 암이 고형 종양인 제약 조성물.
91. 실시양태 87 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 암이 폐암, NSCLC (ADC 또는 SQCC), 위암, 췌장암, 담관암종, 방광암, 자궁경부암, 두경부암, 유방암, 난소암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
92. 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 실시양태 1-84 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환을 치료하는 방법.
93. 실시양태 92에 있어서, 암의 치료를 위한 방법.
94. 실시양태 93에 있어서, 암이 자궁 암육종 (UCS), 방광 요로상피 암종 (BLCA), 췌장 선암종 (PAAD), 폐 편평 세포 암종 (LUSC), 유방 침습성 암종 (BRCA), 자궁체부 자궁내막 암종 (UCEC), 난소 장액성 낭선암종 (OV) 및 담관암종 (CHOL)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
95. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 실시양태 1 내지 84 중 어느 하나의 제약 조성물을 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
96. 실시양태 95에 있어서, 조성물이 정맥내로 투여되는 것인 방법.
97. 암의 치료를 위한 실시양태 1-84 중 어느 하나의 제약 조성물의 용도.
98. 정맥내 투여를 위한, 실시양태 1-84 또는 97 중 어느 하나의 제약 조성물의 용도.
99. a) 5 pg 내지 1200 mg의 양의, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체로서, 여기서 상기 항원-결합 영역은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간화 및/또는 인간인 항체,
및
b) 바람직하게는 히스티딘, 글루타메이트 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 완충제를 포함하는 단위 투여 형태로서,
여기서 단위 투여 형태의 pH는 4.0 내지 8.0, 바람직하게는 4.5 내지 6.5, 보다 바람직하게는 5.0 내지 6.0인 단위 투여 형태.
100. 실시양태 99에 있어서, 항체가 실시양태 24-84 중 어느 한 실시양태에 정의된 바와 같은 것인 단위 투여 형태.
101. 실시양태 99 또는 100에 있어서, 항체의 양이 20 mg 내지 1000 mg인 단위 투여 형태.
102. 실시양태 99 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 항체의 양이 40 mg 내지 1000 mg, 예컨대 40 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 160 mg, 170 mg, 180 mg, 190 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 또는 예컨대 1 g인 단위 투여 형태.
103. 실시양태 99 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 총 부피가 20 ml 내지 200 ml이고, 투여 형태가 I.V. 투여를 위한 것인 단위 투여 형태.
104. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 실시양태 99 내지 103 중 어느 하나의 단위 투여 형태를 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
105. 암의 치료에 사용하기 위한 실시양태 99 내지 103 중 어느 하나의 단위 투여 형태.
106. 실시양태 99-103 중 어느 하나의 단위 투여 형태 또는 실시양태 1-84 중 어느 하나의 제약 조성물을 포함하는 용기.
107. a. 실시양태 1-84 중 어느 하나의 제약 조성물, 또는 실시양태 99-103 중 어느 하나의 단위 투여 형태,
b. 제약 조성물 또는 단위 투여 형태를 위한 리셉터클,
c. 희석에 대한 및/또는 사용에 대한 지침서
를 포함하는 부분들의 키트.
108. a. 실시양태 1-84 중 어느 하나의 제약 조성물, 또는 실시양태 99-103 중 어느 하나의 단위 투여 형태,
b. 희석제,
c. 단위 투여 형태를 위한 리셉터클, 및
d. 희석에 대한 및/또는 사용에 대한 지침서
를 포함하는 부분들의 키트.
109. 부분들의 키트, 예컨대 동반 진단제로서 사용하기 위한/실시양태 1-84 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 제약 조성물로의 치료에 반응하는 경향을 갖는 환자를 환자의 집단 내에서 확인하기 위한, 실시양태 1-84 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 제약 조성물; 및 상기 키트의 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트.
110. 주사용수 중에서
a. 0.5 내지 120 mg/ml의 항체, 및
b. 완충제
를 혼합하는 단계
및 pH를 4.0-8.0, 바람직하게는 5.0-6.0으로 조정하는 단계
를 포함하는, 실시양태 1-84 중 어느 한 실시양태에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 제조하는 방법.
111. a. 실시양태 110의 방법의 단계에 의해 제약 조성물을 제조하거나, 또는 실시양태 1-84 중 어느 한 실시양태에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 제공하는 단계,
b. 희석제를 제공하는 단계,
c. 제약 조성물 및 희석제를 목적하는 항체 농도로 혼합하는 단계
를 포함하는, 실시양태 99 내지 103 중 어느 한 실시양태에 정의된 바와 같은 단위 투여 형태를 제조하는 방법.
112. 실시양태 110 또는 111에 정의된 바와 같은 임의의 방법에 의해 수득가능한 제약 조성물 또는 단위 투여 형태.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1 - B7H4 항체의 생성 및 스크리닝 물질
B7H4 구축물의 발현
다양한 전장 B7H4 변이체를 코딩하는 구축물을 생성하였다: 인간 (호모 사피엔스) B7H4 (유니프롯 수탁 번호 Q7Z7D3), 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스) B7H4 전사체 1 (유니프롯 수탁 번호 A0A2K5U6P5), 개 (카니스 파밀리아리스) B7H4 (유니프롯 수탁 번호 F1P8R9), 토끼 (오리크톨라구스 쿠니쿨루스) B7H4 (유니프롯 수탁 번호 G1TQE8), 래트 (라투스 노르베기쿠스) B7H4 (유니프롯 수탁 번호 Q501W4), 마우스 (무스 무스쿨루스) B7H4 (유니프롯 수탁 번호 Q7TSP5), 및 돼지 (수스 스크로파) B7H4 (유니프롯 수탁 번호 F1SAY4) (표 1 참조).
또한, C-말단 His 태그 및 C 태그를 갖는 인간 IgG1 Fc 도메인에 융합된 세포외 도메인 (인간 B7H4의 ECD (유니프롯 수탁 번호 Q7Z7D3으로부터의 aa 25-259)에 대한 구축물 (B7H4ECD-FcHisC) (서열식별번호: 12)을 생성하였다. 서열식별번호: 1에서, 아미노산 잔기 1-24는 신호 펩티드이고; 따라서 성숙 B7H4ECD-FcHisC 단백질은 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 25-259에 상응한다.
구축물은 클로닝에 적합한 제한 부위 및 최적 코작 (GCCGCCACC) 서열을 함유하였다 (Kozak, M., Gene 1999;234(2):187-208). B7H4 구축물의 전장 및 ECD를 CMV 프로모터 및 HSV-TK 폴리A 신호로 이루어진 발현 카세트에 플랭킹된 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 역전된 말단 반복부를 함유하는 포유동물 발현 벡터인 pSB에 클로닝하였다.
전장 B7H4 변이체를 일시적으로 발현하는 HEK-293F 세포주의 생성
프리스타일(Freestyle)™ 293-F (현탁 성장 및 화학적으로 규정된 프리스타일 배지 [HEK-293F]에 적합화된 HEK-293 서브클론) 세포를 인비트로젠(Invitrogen) (카탈로그 번호 R790-07)으로부터 입수하고, 293펙틴 (인비트로젠, 카탈로그 번호 12347-019)을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 상기 기재된 구축물로 형질감염시켰다.
His-태그부착된 B7H4의 정제
B7H4ECD-FcHisC를 본질적으로 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 Expi293F 발현 플랫폼 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 미국 매사추세츠주 월섬, 카탈로그 번호 A14527)을 사용하여 발현시켰다.
His-태그는 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피 Ni-NTA를 사용한 정제를 가능하게 한다. His-태그부착된 단백질은 칼럼 물질에 강하게 결합하는 반면, 배양물 상청액에 존재하는 다른 단백질은 His-태그부착된 단백질과 비교하여 결합하지 않거나 약하게 결합하고, 통과액에서 용리된다. 약하게 결합된 단백질을 제거하기 위해 칼럼을 세척하였다. 이어서, 강하게 결합된 His-태그부착된 단백질을 Ni2+에의 His의 결합과 경쟁하는 이미다졸을 함유하는 완충제로 용리하였다. 용리액을 탈염 칼럼 상에서 완충제 교환에 의해 제거하였다.
면역화
옴니래트(OmniRat)® 동물 (완전 인간 이디오타입을 갖는 항체의 다양화된 레퍼토리를 발현하는 트랜스제닉 래트; 리간드 파마슈티칼스 인크.(Ligand Pharmaceuticals Inc.), 미국 샌디에고)을 동일한 부피의 아주반트 (시그마(Sigma) 아주반트 시스템 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스, 카탈로그 번호 S6322) 또는 CFA, 완전 프로인트 아주반트 (제1 주사) 및 IFA, 불완전 프로인트 아주반트 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스, 카탈로그 번호 F5881/F5506) (후속 주사)와 혼합된 PBS 중 50 μg B7H4ECD-FcHisC로 양쪽 뒷다리의 혹에 피하 주사 (7주 동안 매주 2회)하고, 이어서 아주반트 없이 PBS 중 항원을 최종 부스팅 s.c. 주사함으로써 면역화시켰다.
항체 생성
면역화된 동물로부터의 림프절 세포를 최종 부스팅 3일 후에 표준 절차에 따라 마우스 골수종 SP2.0 세포에 융합시켰다. B7H4 특이적 항체를 생산하는 하이브리도마로부터의 RNA를 추출하고, 5'-RACE-상보적 DNA (cDNA)를 제조업체의 지침에 따라 SMART RACE cDNA 증폭 키트 (클론테크)를 사용하여 100 ng 총 RNA로부터 제조하였다. VH 및 VL 코딩 영역을 PCR에 의해 증폭시키고, 라이게이션 비의존성 클로닝에 의해 p33G1f, p33카파 및 p33람다 발현 벡터 (각각 코돈 최적화된 인간 IgG1 m(f), 카파 및 람다 불변 도메인을 갖는 pcDNA3.3 기반 벡터)에 인 프레임으로 직접 클로닝하였다 (Aslanidis, C. and P.J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990;18(20): 6069-74). 이들 발현 벡터로부터의 가변 도메인을 서열분석하고, CDR을 IMGT 정의에 따라 주석을 달았다 (Lefranc MP. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999 및 Brochet X. Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008)). 정확한 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 갖는 클론을 발현시키고, 항원에의 결합에 대해 시험하였다. 항원 특이적 스크리닝 검정을 수행한 후, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 서열을 유전자 합성하고, 하기 아미노산 돌연변이: L234F, L235E, D265A 및 K409R (FEAR)을 함유하며 여기서 아미노산 위치 번호는 Eu 넘버링에 따른 것인 인간 IgG1 중쇄 (서열식별번호: 60에 상응함)를 포함하는 발현 벡터 내로, 및 인간 카파 또는 람다 경쇄를 포함하는 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 항체의 일부에 대해, 가변 도메인에 점 돌연변이를 갖는 변이체를 생성하여 잠재적으로 비목적하는 디술피드 가교 형성을 생성할 수 있는 시스테인 잔기를 제거하거나, 아스파라긴을 세린 또는 배선 잔기로 대체하여 잠재적 N-연결 글리코실화 부위를 제거하였다. 예를 들어, C1 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로부터, CDR2에서의 치환에 상응하는 N52S 치환을 갖는 변이체를 제조하였고 (표 1, 서열식별번호: 25 및 29 참조), 추가의 변이체는 N52Q 치환 (서열식별번호: 31)을 가질 수 있다.
항원 특이적 스크리닝 검정
면역화된 동물의 혈청, 또는 하이브리도마 및 트랜스펙토마 배양 상청액 내의 B7H4 항체의 존재를 균질 결합 검정에서 결정하였다. 샘플을 인간 B7H4, 시노몰구스 원숭이 B7H4 또는 뮤린 B7H4를 발현하는 전장 B7H4 변이체를 발현하도록 제조된 구축물로 일시적으로 형질감염된 HEK-293F 세포, 또는 HEK-293F 야생형 세포 (음성 대조군)에의 항체의 결합에 대해 분석하였다. 샘플을 세포에 첨가하여 B7H4에의 항체 결합을 허용하였다. 후속적으로, 항체 결합을 적절한 형광 접합체 (아피니퓨어(AffiniPure) 염소 항-래트 IgG (H+L) 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 647; 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 카탈로그 번호 112-605-143; 아피니퓨어 염소 항-인간 IgG Fc 감마-알렉사 플루오르® 647; 잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-605-098)를 사용하여 검출하였다. 세포 (2.5 x 105개 세포/ml)를 항체의 백본에 따라 염소 항-인간 아피니퓨어 염소 항-인간 IgG Fc 감마-알렉사 플루오르® 647 (0.2 μg/ml; 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 109-605-098) 또는 아피니퓨어 염소 항-래트 IgG (H+L) 알렉사 플루오르® 647 (0.2 μg/ml; 잭슨 이뮤노리서치, 112-605-143)과 혼합하였다. 시험 및 대조군 항체의 연속 희석물 (2배 희석 단계로 0.003 내지 3 μg/mL 범위)을 제조하고, 2 μl 항체 희석물을 1536 웰 플레이트 (그라이너(Greiner), 카탈로그 번호 789866)에서 5 μl의 세포/접합체 혼합물에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 9시간 동안 인큐베이션한 후, 이미지엑스프레스 벨로스 레이저 스캐닝 세포측정기(ImageXpress Velos Laser Scanning Cytometer) (몰레큘라 디바이시스, 엘엘씨(Molecular Devices, LLC), 미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 형광 강도를 결정하고, 총 형광을 판독물로서 사용하였다. 카운트가 50 초과이고, 카운트 x 형광이 음성 대조군보다 적어도 3배 더 높은 경우에 샘플을 양성으로 언급하였다.
B7H4 항체 패널 생성으로부터의 결과
생산된 193개의 하이브리도마 중 176개로부터, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열이 성공적으로 수득되었다. 시험된 351개의 중쇄/경쇄 조합 중에서, 98개는 상기 기재된 바와 같은 인간 B7H4-형질감염된 HEK-293F 세포를 사용한 항원 스크리닝 검정에서 결합을 보여주었다. 35개의 항체를 선택하였다: 원래 서열을 갖는 26개 및 가변 도메인에 도입된 점 돌연변이를 갖는 9개의 변이체. 항체를 1가 결합 항체 (CD3 이중특이적 항체로서) 및 2가 결합 항체 (IgG1 분자로서)로서 생산하고, 하기 기재된 바와 같이 종양 세포에의 결합에 대해 시험하였다. 생성된 패널로부터의 항체 중에서, 그의 상응하는 VH 및 VL 항체 가변 도메인 코딩 서열이 표 1에 열거된 단지 항체 B7H4-C1 및 그의 변이체 B7H4-C1-N52S만이 하기 기재된 바와 같은 종양 세포에 결합된 항체를 제공하였다.
추가의 B7H4 항체
실시예에서, WO 2014159835 (그에서 서열식별번호: 38 및 35로 지칭됨) (본원에서 B7H4-C2에 상응하고, 가변 도메인의 관련 서열은 본원에서 표 1에 열거되고, 서열식별번호: 43 및 47을 포함함); WO 2014159835 (그에서 서열식별번호: 56 및 55로 지칭됨) (본원에서 B7H4-C3에 상응하고, 가변 도메인의 관련 서열은 본원에서 표 1에 열거되고, 서열식별번호: 36 및 40을 포함함); WO 2009073533 (그에서 서열식별번호: 2 및 7로 지칭됨) (본원에서 B7H4-C4에 상응하고, 가변 도메인의 관련 서열은 본원에서 표 1에 열거되고, 서열식별번호: 50 및 54를 포함함); 및 US20190085080A1 (본원에서 B7H4-C5에 상응하고, 가변 도메인의 관련 서열은 본원에서 표 1에 열거되고, 서열식별번호: 65 및 69를 포함함)에 이전에 기재된 가변 도메인을 함유하는 B7H4에 대해 특이적인 추가의 항체를 사용하였다. 상응하는 VH 및 VL 항체 가변 도메인 코딩 서열을 합성하고, 코돈 최적화된 인간 IgG1m(f) 및 카파 또는 람다 불변 도메인, 또는 그의 변이체를 갖는 pcDNA3.3 기반 벡터 내로 클로닝하여, 단일특이적 및 이중특이적 항체를 생산하였다. 항체 IgG1-B7H4-CX-FEAL을 언급하는 경우, 이는 B7H4-CX 가변 영역을 갖고, IgG1 이소형의 것이고, 중쇄의 불변 영역에 아미노산 치환 L234F, L235E, D265A 및 F409R을 갖는 항체를 나타낸다.
IgG1-b12 항체
항체 b12, HIV-1 gp120 특이적 항체 (Barbas, CF. J Mol Biol. 1993 Apr 5; 230(3):812-23)를 일부 실시예에서 음성 대조군 IgG1로서 또는 대조군 이중특이적 항체의 비-결합 대조군 Fab-아암으로서 사용하였다. 이러한 대조군 항체에 대한 코돈 최적화된 항체 코딩 서열을 합성하고, 코돈 최적화된 인간 IgG1m(f) 및 카파 불변 도메인, 또는 그의 변이체를 갖는 pcDNA3.3 기반 벡터 내로 클로닝하였다. 가변 중쇄 (VH) 영역의 서열 및 가변 경쇄 (VL) 영역의 서열은 각각 서열식별번호: 14 및 15로서 본원에 포함된다.
실시예 2 - CD3xB7H4 이중특이적 항체의 생성을 위한 인간화 CD3 항체
인간화 항체 IgG1-huCD3-H1L1 (그의 가변 중쇄 및 경쇄 영역 서열이 본원에서 서열식별번호: 16 및 22에 열거됨)의 생성은 WO 2015/001085의 실시예 1에 기재되어 있다. IgG1-huCD3-H1L1은 본원에서 'IgG1-huCD3'로 지칭된다. 항체 IgG1-huCD3-H1L1-FEAL은 하기 본원에 기재된 바와 같이, 제어된 Fab-아암 교환을 통한 이중특이적 항체의 생성을 가능하게 하는 아미노산 치환 (F405L)에 추가로, Fc 도메인에 3개의 아미노산 치환 (L234F, L235E, D265A)을 갖는 그의 변이체이다. 이러한 돌연변이는 이들이 도입된 항체의 표적 결합에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어 US 2015/0337049 및 문헌 [Engelberts et al., 2020, EBioMedicine 52: 102625] 참조).
인간화 항체 IgG1-huCD3-H1L1-H101G (그의 가변 중쇄 및 경쇄 영역 서열이 본원에서 서열식별번호: 17 및 22로서 열거됨)의 생성은 WO 2017/009442의 실시예 2에 기재되어 있다. IgG1-huCD3-H1L1-H101G는 'IgG1-huCD3-H101G'로 지칭될 것이다. 이 변이체는 가변 중쇄 영역 서열에 치환 H101G를 포함하고 (서열식별번호: 16 및 17 비교), IgG1-huCD3-H1L1과 동일한 경쇄를 갖는다. 항체 IgG1-huCD3-H101G-FEAL은 아미노산 치환 L234F, L235E, D265A 및 F405L을 갖는 그의 변이체이다.
실시예 3 - 생물층 간섭측정법을 사용한 B7H4 결합 친화도 결정
B7H4 항체의 표적 결합 친화도를 옥텟(Octet) HTX 기기 (포르테바이오(ForteBio)) 상에서 무표지 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 결정하였다. 30℃에서 1,000 RPM으로 진탕시키면서 실험을 수행하였다. 처음에, 인간 및 마우스 B7H4에 대한 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR, IgG1-B7H4-C2-FEAR, IgG1-B7H4-C3-FEAR, 및 IgG1-B7H4-C4-FEAR의 친화도를 BLI를 사용하여 결정하였다. 항-인간 IgG Fc 포획 (AHC) 바이오센서 (포르테바이오, 카탈로그 번호 18-5060)를 10 mM 글리신 (시그마-알드리치, 카탈로그 번호 15527) 완충제 pH 1.7에 5초 동안 노출에 의해 사전-컨디셔닝하고, 이어서 샘플 희석제 (포르테바이오, 카탈로그 번호 18-1048)에서 5초 동안 중화시켰으며; 둘 다의 단계를 2회 반복하였다. 이어서, AHC 센서에 항체 (샘플 희석제 중 1 μg/mL)를 600초 동안 로딩하였다. 샘플 희석제에서의 기준선 측정 (100초) 후, 인간 B7H4 (시노 바이올로지칼(Sino Biological), 카탈로그 번호 10738-H08H-100) 또는 마우스 B7H4 (알앤디 시스템즈 (R&D Systems), 카탈로그 번호 2154-B7-050)의 회합 (300초) 및 해리 (1,000초)를 인간 및 마우스 B7H4에 대해 각각 1.56 - 100 nM (0.04 - 2.68 μg/mL) 및 5.9 - 375 nM (0.16 - 10 μg/mL)의 농도 범위를 사용하여, 샘플 희석제 중에서의 2배 희석 단계로 결정하였다. 그의 아미노산 서열에 기초한 인간 B7H4 및 마우스 B7H4 (ECD-His 태그부착된 분자로서)의 이론적 분자 질량 (각각 26.8 kDa 및 26.6 kDa)을 계산에 사용하였다. 각각의 항체에 대해 참조 센서를 사용하였고, 이를 항원 대신에 샘플 희석제와 함께 인큐베이션하였다. AHC 센서를 10 mM 글리신 완충제 pH 1.7에 5초 동안 노출에 의해 재생시킨 후, 샘플 희석제 중에서 5초 동안 중화시켰으며; 둘 다의 단계를 2회 반복하였다. 이어서, 동역학 측정의 다음 주기를 위해 센서에 다시 항체를 로딩하였다.
데이터 획득 소프트웨어 v9.0.0.49d (포르테바이오)를 사용하여 데이터를 획득하고, 데이터 분석 소프트웨어 v9.0.0.12 (포르테바이오)로 분석하였다. 데이터 트레이스를 참조 센서의 차감에 의해 항체마다 보정하였다. Y-축을 기준선의 마지막 10초에 대해 정렬하고, 해리에 대한 단계간 보정 정렬 및 사비츠키-골레이 필터링을 적용하였다. 반응이 < 0.05 nm인 데이터 트레이스는 분석에서 배제하였다. 데이터를 각각 300초 및 200초로 설정된 회합 및 해리 시간에 대한 관심 윈도우를 사용하여 1:1 글로벌 풀(Global Full) 피트 모델로 피팅하였다.
제2 실험에서, 인간 및 마우스 B7H4에 대한 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR, IgG1-B7H4-C2-FEAR, IgG1-B7H4-C3-FEAR, IgG1-B7H4-C4-FEAR, 및 IgG1-B7H4-C5-FEAR의 친화도를 BLI를 사용하여 결정하였다. 실험을 상기 기재된 바와 같이, 일부 작은 예외를 두고 수행하였다. 사전컨디셔닝 단계를 5회 반복하였다. 인간 또는 마우스 B7H4의 회합 (200초) 및 해리 (1,000초)를 샘플 희석제 중에서 2배 희석 단계로 0.78 - 800 nM의 농도 범위를 사용하여 결정하였다. 데이터 획득 소프트웨어 v12.0.1.8 (포르테바이오)을 사용하여 데이터를 획득하고, 데이터 분석 소프트웨어 v12.0.1.2 (포르테바이오)로 분석하였다. 데이터를 1,000초 해리 시간이 사용된 IgG1-B7H4-C2-FEAR을 제외하고, 200초의 회합 시간에 대한 관심 윈도우 및 200초의 해리 시간에 대한 관심 윈도우를 사용하여 1:1 글로벌 풀 피트 모델로 피팅하였다. R2 값, 곡선의 육안 검사 및 해리 단계 동안의 적어도 5% 신호 붕괴를 기초로 해리 시간을 선택하였다. 100 nM 초과의 항원 농도로 생성된 데이터 트레이스는 50 nM 미만의 친화도를 갖는 항체에 대한 분석에서 배제하였다.
또한, 시노몰구스 원숭이 B7H4에 대한 친화도를 BLI에 의해 결정하였다. 제1 실험에서, 시노몰구스 원숭이 B7H4에 대한 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C3-FEAR, 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR의 친화도를 결정하였다. 아민 반응성 제2 세대 (AR2G) 바이오센서 (포르테바이오, 카탈로그 번호 18-5092)를 300초 동안 20 mM EDC (N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드) (포르테바이오, 카탈로그 번호 18-1033) 및 10 mM s-NHS (N-히드록시술포숙신이미드 나트륨 염) (포르테바이오, 카탈로그 번호 18-1067)와의 반응에 의해 활성화시켰다. 활성화된 센서에 10 mM 아세트산나트륨 pH 4.0 (포르테바이오, 카탈로그 번호 18-1068) 중 10 μg/mL 재조합 hIgG1 Fc-태그부착된 시노몰구스 원숭이 B7H4 (크리에이티브 바이오마트(Creative BioMart), 카탈로그 번호 VTCN1-1517R)를 600초 동안 로딩하고, 1 M 에탄올아민 pH 8.5 (포르테바이오, 카탈로그 번호 18-1071)로 300초 동안 켄칭하였다. 샘플 희석제 (300초; 포르테바이오, 카탈로그 번호 18-1048)에서의 기준선 측정 후에, CD3xB7H4 이중특이적 항체에 의한 기능적 1가 B7H4 결합의 회합 (100초) 및 해리 (1,000초) (표 8에 나타낸 바와 같음)를 0.23 - 15 μg/mL (1.56 - 100 nM)의 농도 범위를 사용하여, 샘플 희석제 중에서의 2배 희석 단계로 결정하였다. 항체의 150 kDa의 분자 질량을 계산에 사용하였다. 각각의 항체에 대해 참조 센서를 사용하였고, 이를 항체 대신에 샘플 희석제와 함께 인큐베이션하였다.
데이터 획득 소프트웨어 v9.0.0.49d (포르테바이오)를 사용하여 데이터를 획득하고, 데이터 분석 소프트웨어 v9.0.0.12 (포르테바이오)로 분석하였다. 데이터 트레이스를 참조 센서의 차감에 의해 항체마다 보정하였다. Y-축을 기준선의 마지막 10초에 대해 정렬하고, 해리에 대한 단계간 보정 정렬 및 사비츠키-골레이 필터링을 적용하였다. 반응이 < 0.05 nm인 데이터 트레이스는 분석에서 배제하였다. 데이터를 각각 100초 및 200초로 설정된 회합 및 해리 시간에 대한 관심 윈도우를 사용하여 1:1 글로벌 풀 피트 모델로 피팅하였다.
시노몰구스 원숭이 B7H4에 대한 B7H4 항체의 친화도를 결정하기 위한 제2 실험에서, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR의 친화도를 결정하였다. 실험을 상기 기재된 바와 같이, 일부 작은 예외를 두고 수행하였다. 샘플 희석제에서 600초의 기준선 측정 후에, CD3xB7H4 이중특이적 항체에 의한 기능적 1가 B7H4 결합의 회합 (200초) 및 해리 (1,000초) (표 9에 지시된 바와 같음)를 대략 0.1 - 116 μg/mL (0.78 - 800 nM)의 농도 범위를 사용하여, 샘플 희석제 중에서의 2배 희석 단계로 결정하였다. 각 항체의 특정 분자 질량 (대략 145 kDa)을 계산에 사용하였다. 데이터 획득 소프트웨어 v12 (포르테바이오)를 사용하여 데이터를 획득하고, 데이터 분석 소프트웨어 v12 (포르테바이오)로 분석하였다. 반응이 < 0.03 nm인 데이터 트레이스는 분석에서 배제하였다. 데이터를 200초의 회합 시간 및 해리 시간에 대한 관심 윈도우를 사용하여 1:1 글로벌 풀 피트 모델로 피팅하였다. R2 값, 곡선의 육안 검사 및 해리 단계 동안의 적어도 5% 신호 붕괴를 기초로 해리 시간을 선택하였다. 200 nM 초과의 항체 농도로 생성된 데이터 트레이스는 50 nM 미만의 친화도를 갖는 항체에 대한 분석에서 배제하였다. 모든 결과는 적어도 0.98의 R2로 결정하였다.
"KD" (M)는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭하고, kd를 ka로 나눔으로써 수득된다. "kd" (sec-1)는 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 이는 때때로 또한 koff 값 또는 오프-레이트로 지칭된다. "ka" (M-1 x sec-1)는 항체-항원 상호작용의 회합 속도 상수를 지칭한다. 이는 때때로 또한 kon 값 또는 온-레이트로 지칭된다.
표 4 및 5는 인간 B7H4에 대해 지시된 항체의 회합 속도 상수 ka (1/Ms), 해리 속도 상수 kd (1/s) 및 평형 해리 상수 KD (M)가 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 제1 및 제2 실험의 결과를 보여준다.
표 4. 무표지 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 바와 같은 인간 B7H4 세포외 도메인에 대한 항체의 결합 친화도. ND = 결정되지 않음.
표 5. 무표지 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 바와 같은 인간 B7H4 세포외 도메인에 대한 항체의 결합 친화도.
1 n=3 실험의 평균 결과가 제시된다.
표 6 및 7은 마우스 B7H4에 대해 지시된 항체의 ka (1/Ms), kd (1/s), 및 KD (M)를 생물층 간섭측정법에 의해 결정한 2가지 실험의 결과를 보여준다.
표 6. 무표지 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 바와 같은 마우스 B7H4 세포외 도메인에 대한 항체의 결합 친화도. ND = 결정되지 않음; - = 결합 없음 (사용된 최고 농도에서 <0.05 nm의 반응).
표 7. 무표지 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 바와 같은 마우스 B7H4 세포외 도메인에 대한 항체의 결합 친화도. - = 결합 없음 (사용된 최고 농도에서 <0.05 nm의 반응).
표 8 및 9는 시노몰구스 원숭이 B7H4에 대해 지시된 항체의 ka (1/Ms), kd (1/s), 및 KD (M)를 생물층 간섭측정법에 의해 결정한 2가지 실험의 결과를 보여준다.
표 8. 무표지 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 바와 같은 시노몰구스 원숭이 B7H4 세포외 도메인에 대한 기능적 1가 항체의 결합 친화도.
표 9. 무표지 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 바와 같은 시노몰구스 원숭이 B7H4 세포외 도메인에 대한 기능적 1가 항체의 결합 친화도.
a n=3 실험의 평균 결과가 제시된다.
b 0.98의 엄격한 품질 제어 R2 역치를 충족시키지 않았다.
실시예 4 - 생물층 간섭측정법을 사용한 CD3 결합 친화도 결정
IgG1-huCD3-FEAL 및 IgG1-huCD3-H101G-FEAL의 결합 친화도를 WO 2017/009442의 실시예 7에 기재된 바와 같이 결정하였다.
간략하게, 재조합 가용성 CD3ε (CD3E27-GSKa) (서열식별번호: 13의 성숙 단백질)에 대한 IgG1-huCD3-FEAL 포맷의 선택된 CD3 항체의 결합 친화도를 포르테바이오 옥텟 HTX (포르테바이오) 상에서 생물층 간섭측정법을 사용하여 결정하였다. 항-인간 Fc 포획 바이오센서 (포르테바이오, 카탈로그 번호 18-5060)에 hIgG (1 μg/mL)를 600초 동안 로딩하였다. 기준선 측정 (200초) 후에, CD3E27-GSKa의 회합 (1000초) 및 해리 (2000초)를 27.11 μg/mL - 0.04 μg/mL (1000 nM - 1.4 nM)의 CD3E27-GSKa 농도 범위를 사용하여 3배 희석 단계 (샘플 희석제, 포르테바이오, 카탈로그 번호 18-5028)로 결정하였다. 계산을 위해, 아미노산 서열에 기초한 CD3E27-GSKa의 이론적 분자 질량, 즉 27.11 kDa을 사용하였다. 30℃에서 1000 rpm으로 진탕시키면서 실험을 수행하였다. 각각의 항체를 적어도 2회의 독립적인 실험에서 시험하였다. 데이터를 포르테바이오 데이터 분석 소프트웨어 v8.1로, 1:1 모델 및 1000초 회합 시간 및 100초 해리 시간으로의 글로벌 풀 피트를 사용하여 분석하였다. 데이터 트레이스를 참조 곡선의 차감에 의해 보정하고 (바이오센서 상의 항체, 샘플 희석제만을 사용한 측정), Y-축을 기준선의 마지막 10초에 대해 정렬하고, 단계간 보정뿐만 아니라 사비츠키-골레이 필터링을 적용하였다. 반응이 <0.05 nm인 데이터 트레이스는 분석에서 제외하였다.
표 10은 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 재조합 CD3ε에 대한 회합 속도 상수 ka (1/Ms), 해리 속도 상수 kd (1/s) 및 평형 해리 상수 KD (M)를 보여준다. IgG1-huCD3-FEAL은 IgG1-huCD3-H101G-FEAL (KD: 683 nM)과 비교하여 재조합 CD3ε에 대해 비교적 높은 (KD: 15 nM) 결합 친화도를 나타냈다.
표 10: 무표지 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 바와 같은 재조합 CD3ε에 대한 단일특이적 2가 CD3 항체의 결합 친화도
실시예 5 - 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 B7H4 항체의 교차-차단
전통적인 샌드위치 포맷의 항체 교차-차단 분석 (에피토프 비닝)을 옥텟 HTX 기기 (포르테바이오) 상에서 BLI에 의해 수행하였다. IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR, IgG1-B7H4-C2-FEAR, IgG1-B7H4-C3-FEAR, 및 IgG1-B7H4-C4-FEAR을 사용한 제1 교차-차단 실험을 30℃에서 1,000 RPM으로 진탕시키면서 수행하였다.
아민 반응성 제2 세대 (AR2G) 바이오센서 (포르테바이오, 카탈로그 번호 18-5092)를 20 mM EDC (N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드) (시그마-알드리치, 카탈로그 번호 03449) 및 10 mM s-NHS (N-히드록시술포숙신이미드 나트륨 염) (시그마-알드리치, 카탈로그 번호 56485)의 용액으로 300초 동안 활성화시켰다. 활성화된 AR2G 센서에 10 mM 아세트산나트륨 pH 6.0 (포르테바이오, 카탈로그 번호 18-1070) 중 20 μg/mL 제1 항체를 600초 동안 로딩하고, 1 M 에탄올아민 pH 8.5 (포르테바이오 카탈로그 번호 18-1071)로 300초 동안 켄칭하였다. 샘플 희석제 (50초; 포르테바이오, 카탈로그 번호 18-1048)에서의 기준선 측정 후, 고정화된 항체를 함유하는 AR2G 바이오센서에 인간 B7H4 (샘플 희석제 중에 희석된 100 nM 또는 2.68 g/mL; 시노 바이올로지칼, 카탈로그 번호 10738-H08H)를 300초 동안 로딩하였다. 아미노산 서열에 기초한 인간 B7H4의 이론적 분자 질량 (26.8 kDa)을 계산에 사용하였다. 제2 항체 (샘플 희석제 중 10 μg/mL)의 회합 (300초)을 결정하였다. 센서를 10 mM 글리신 (리델-드 하엔(Riedel-de Haeen), 카탈로그 번호 15527) 완충제 pH 2.5에 5초 동안 노출에 의해 재생시킨 후, 샘플 희석제 중에서 5초 동안 중화시켰으며; 둘 다의 단계를 2회 반복하였다. 이어서, 고정화된 제1 항체를 함유하는 센서를 기준선 단계에서 시작하여 다시 사용하였다.
데이터 획득 소프트웨어 v9.0.0.49d (포르테바이오)를 사용하여 데이터를 획득하고, 데이터 분석 HT 소프트웨어 v10.0.17 (포르테바이오)로 분석하였다. 고정화된 제1 항체로부터의 B7H4의 해리를 보정하기 위해 참조 곡선 (제2 항체 대신 샘플 희석제)을 차감하여 데이터 트레이스를 보정하였다. Y-축을 회합 단계의 시작에 대해 정렬하고, 사비츠키-골레이 필터링을 적용하였다. 제2 항체의 보정된 회합 반응을 매트릭스 포맷으로 플롯팅하였다. 일반적으로, 반응 > 0.05 nm은 비-교차-차단 항체로 간주되었고, 반응 < 0.05 nm은 차단 항체 쌍으로 간주되었다.
교차-차단 실험을 반복하여 IgG1-B7H4-C5-FEAR을 또한 포함시키고, 약간의 적응을 포함하여 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 22℃에서 1,000 RPM으로 진탕시키면서 실험을 수행하였다. 데이터 획득 소프트웨어 v12.0.1.8 (포르테바이오)을 사용하여 데이터를 획득하고, 데이터 분석 HT 소프트웨어 v12.0.1.55 (포르테바이오)로 분석하였다. 일반적으로, > 0.1 nm의 반응은 비-교차-차단 항체로 간주되었고, < 0.1 nm의 반응은 항체 쌍을 차단하는 것으로 간주되었다.
초기 교차-차단 실험을 항체 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR, IgG1-B7H4-C3-FEAR, IgG1-B7H4-C4-FEAR 및 IgG1-B7H4-C2-FEAR에 대해 수행하였다. 결과를 표 11에 요약한다. 또한 IgG1-B7H4-C5-FEAR을 포함하는 교차-차단 실험의 제2 세트를 수행하였다. 이들 결과를 표 12에 요약한다. 제1 행은 고정화된 항체를 보여주고; 제1 열은 용액 중의 항체 (상기 '제2 항체'로 지칭됨)를 보여준다. 용액 중 항체의 보정된 회합 반응이 제시된다. 항체의 교차-차단은 암회색으로 표시되고, 비-차단 항체 조합은 표시되지 않으며 (투명한 배경), 이는 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR, IgG1-B7H4-C3-FEAR, 및 IgG1-B7H4-C5-FEAR이 서로 교차-차단하고 IgG1-B7H4-C4-FEAR 및 IgG1-B7H4-C2-FEAR과는 교차-차단하지 않으며, 그 반대의 경우도 마찬가지라는 것을 보여준다.
표 11: 생물층 간섭측정법을 사용한 제1 항체 교차-차단 실험.
제1 열은 고정화된 항체를 보여주고, 제1 열은 용액 중의 항체를 보여준다. 용액 중 항체의 보정된 회합 반응이 제시된다. 항체의 교차-차단은 암회색으로 표시되고, 비-차단 항체 조합은 표시되지 않는다 (투명 배경).
표 12: 생물층 간섭측정법을 사용한 제2 항체 교차-차단 실험.
제1 열은 고정화된 항체를 보여주고, 제1 열은 용액 중의 항체를 보여준다. 용액 중 항체의 보정된 회합 반응이 제시된다. 항체의 교차-차단은 암회색으로 표시되고, 비-차단 항체 조합은 표시되지 않는다 (투명 배경).
실시예 6 - 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성
이중특이적 항체는 WO 2011147986, WO 2011131746 및 WO 2013060867 (젠맙) 및 문헌 [Labrijn et al. (Labrijn et al., PNAS 2013, 110: 5145-50; Gramer et al., MAbs 2013, 5: 962- 973)]에 기재된 바와 같은 2-MEA-유도 Fab-아암 교환인 듀오바디® 플랫폼 기술을 사용하여 시험관내에서 생성하였다. 이 방법에 의한 이중특이적 항체의 생산을 가능하게 하기 위해, CH3 도메인에 특이적 점 돌연변이를 보유하는 IgG1 분자를 생성하였다: 하나의 모 IgG1 항체에서 F405L 돌연변이 (본 출원에서 CD3 항체), 다른 모 IgG1 항체에서 K409R 돌연변이 (본 출원에서 B7H4 또는 대조군, HIV-1 gp120-특이적 항체). 이들 돌연변이 이외에도, 모 IgG1 항체는 치환 L234F, L235E, D265A (FEA)를 포함하였다.
이중특이적 항체를 생성하기 위해, 2종의 모 항체를 PBS 완충제 (포스페이트 완충 염수; 8.7 mM HPO4 2-, 1.8 mM H2PO4 -, 163.9 mM Na+, 140.3 mM Cl-, pH 7.4) 중에서 동일한 질량 양으로 혼합하였다. 2-메르캅토에틸아민-HCl (2-MEA)을 75 mM의 최종 농도로 첨가하고, 반응 혼합물을 31℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 쇄간 디술피드 결합의 재-산화 및 무손상 이중특이적 항체의 형성을 허용하기 위해 제조자의 프로토콜에 따라 10 kDa 분자량 컷오프 슬라이드-에이-라이저(Slide-A-Lyzer) 캐리지 (써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 PBS 완충제 내로의 투석에 의해 2-MEA를 제거하였다.
하기 항체를 실시예에서 사용하였다:
B7H4 항체
IgG1-B7H4-C1-FEAR (서열식별번호: 25 및 서열식별번호: 33에 제시된 VH 및 VL 서열을 가짐).
IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (서열식별번호: 29 및 서열식별번호: 33에 제시된 VH 및 VL 서열을 가짐).
IgG1-B7H4-C2-FEAR (서열식별번호: 43 및 서열식별번호: 47에 제시된 VH 및 VL 서열을 가짐).
IgG1-B7H4-C3-FEAR (서열식별번호: 36 및 서열식별번호: 40에 제시된 VH 및 VL 서열을 가짐).
IgG1-B7H4-C4-FEAR (서열식별번호: 50 및 서열식별번호: 54에 제시된 VH 및 VL 서열을 가짐).
IgG1-B7H4-C5-FEAR (서열식별번호: 65 및 서열식별번호: 69에 제시된 VH 및 VL 서열을 가짐).
주석 IgG1은 IgG1 이소형의 전장 항체가 제조되었음을 나타내고, FEAR 주석은 중쇄 불변 영역이 아미노산 치환 L234F, L235E, D265A 및 K409R을 함유하고, 경쇄 불변 영역이 카파 유형임 (각각 서열식별번호: 61 및 63)을 나타낸다.
CD3 항체
IgG1-huCD3-FEAL (서열식별번호: 16 및 서열식별번호: 22에 제시된 VH 및 VL 서열을 가짐).
IgG1-huCD3-H101G-FEAL (서열식별번호: 17 및 서열식별번호: 22에 제시된 VH 및 VL 서열을 가짐).
주석 IgG1은 IgG1 이소형의 전장 항체가 제조되었음을 나타내고, FEAL 주석은 중쇄 불변 영역이 아미노산 치환 L234F, L235E, D265A 및 F405L을 함유하고, 경쇄 불변 영역이 람다 유형임 (각각 서열식별번호: 60 및 64)을 나타낸다.
대조군 항체
IgG1-b12-K409R (서열식별번호: 14 및 서열식별번호: 15에 제시된 VH 및 VL 서열을 가짐).
주석 IgG1은 IgG1 이소형의 전장 항체가 제조되었음을 나타내고, K409R 주석은 중쇄 불변 영역이 아미노산 치환 K409R을 함유하고 경쇄 불변 영역이 카파 유형임 (각각 서열식별번호: 62 및 63)을 나타낸다.
이중특이적 항체
상기 기재된 CD3 및 B7H4 항체를 조합하여 인간 CD3에 결합할 수 있는 하나의 항원-결합 영역 및 B7H4에 결합할 수 있는 다른 항원-결합 영역을 갖는 이중특이적 항체를 생성하여, 이소형 IgG1의 이중특이적 항체를 제공였으며, 이는 bsIgG1로 주석이 달린다.
bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-FEAR
bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR
bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR
bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C3-FEAR
bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C4-FEAR
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C2-FEAR
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C3-FEAR
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR
bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR (서열식별번호: 14 및 서열식별번호: 15에 제시된 VH 및 VL 서열을 갖는 b12 아암의 경우)
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR
실시예 7 - B7H4-B7H3 키메라 분자 및 B7H4 알라닌 스캐닝 라이브러리를 사용한 결합에 관여하는 B7H4 도메인 및 기능적 에피토프의 결정
종점 분석을 사용한 B7H4-B7H3 키메라 분자를 사용한 도메인 맵핑
B7H4 항체의 B7H4 도메인 특이성은 인간 B7H4, 인간 B7H3 (세포외 도메인에서 충분한 아미노산 서열 차이를 갖는 구조적으로 대등한 단백질) 또는 2개의 상이한 인간 B7H4-B7H3 키메라 분자를 발현하도록 형질감염된 세포의 패널을 사용하여 결정하였다. 인간 B7H4, 인간 B7H3 (유니프롯 수탁 번호 Q5ZPR3-1; 서열식별번호: 9), 또는 B7H3의 IgV 도메인 및 B7H4의 IgC 도메인을 함유하는 키메라 분자 (B7H3-IgV/B7H4-IgC; 서열식별번호: 11), 또는 B7H4의 IgV 도메인 및 B7H3의 IgC 도메인을 함유하는 키메라 분자 (B7H4-IgV/B7H3-IgC; 서열식별번호: 10)를 코딩하는 발현 구축물을 제조하였다. HEK 세포를 일시적으로 형질감염시켜 이들 구축물을 발현시켰다.
세포 (3 x 104개 세포/웰)를 폴리스티렌 96-웰 둥근-바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원(Greiner bio-one), 카탈로그 번호 650101)에서 50 μL PBS/0.1% BSA/0.02% 아지드 (FACS 완충제) 중 항체의 연속 희석물 (3배 희석 단계로 0.0046 내지 10 μg/mL 범위)과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충제 중에서 2회 세척한 후, 세포를 2차 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 2차 항체로서, R-피코에리트린 (PE)-접합된 염소-항-인간 IgG F(ab')2 (염색 완충제 중 1:500; 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 인크.(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), 펜실베니아주 웨스트 그로브, 카탈로그 번호 109-116-098)를 사용하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충제 중에서 2회 세척하고, 20 μL FACS 완충제 중에 재현탁시키고, 아이큐(iQue) 스크리너 (인텔리시트 코포레이션 (Intellicyt Corporation), 미국) 상에서 분석하였다. 10 μg/mL에서의 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C4-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C3-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR의 결합을, 하기의 10 μg/mL의 결합의 % 평균 형광 강도 (MFI)로서 결정하였다:
· B7H3 발현 세포에의 IgG1-B7H3-BRCA84D (WO 2011109400에서 항체 BRCA84D에 대해 기재된 바와 같은 CDR 서열을 갖는 상기 기재된 바와 같이 생성된 B7H3-특이적 IgG1 항체),
· B7H3-IgV/B7H4-IgC 발현 세포에의 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C4-FEAR,
· B7H4-IgV/B7H3-IgC 발현 세포에의 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR,
· 및 B7H4 발현 세포에의 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C3-FEAR.
도 1은 B7H4의 IgC 도메인이 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C4-FEAR의 결합에 관여하고, B7H4의 IgC 및 IgV 도메인 둘 다가 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C3-FEAR의 결합에 관여하고, B7H4의 적어도 IgV 도메인이 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR의 결합에 관여한다는 것을 보여준다. 그로부터의 가변 도메인이 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR을 생성하는데 사용된 C2 항체에 대해, 이는 IgV 도메인에 결합하는 것으로 기재되었으며; 도 1에서의 데이터는 IgC 도메인이 또한 결합에 관여한다는 것을 나타낸다 (WO 2014159835 및 문헌 [Leong et al. 2015, Mol. Pharmaceutics 12, 1717-1729]).
전체 용량-반응 곡선의 분석을 사용한 B7H4-B7H3 키메라 분자를 사용한 도메인 맵핑
전체 용량-반응 곡선의 분석에 의해 B7H4 항체의 B7H4 도메인 특이성을 보다 상세히 연구하기 위해 추가의 실험을 수행하였다. 이들 실험에서, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR의 도메인 특이성을 또한 결정하였다. 인간 B7H4 또는 B7H4-B7H3 키메라 분자 B7H3-IgV/B7H4-IgC 또는 B7H4-IgV/B7H3-IgC를 발현하도록 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에의 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C2-FEAR, bsIgG1-huCD-H101G-FEALxB7H4-C3-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR의 연속 희석물 (3배 희석 단계로 0.014 내지 30 μg/mL)의 결합을 상기 기재된 바와 같이 결정하였다. 도 2는 알라닌 스캐닝 라이브러리 실험의 발견과 일치하게, B7H4의 IgC 도메인이 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 결합에 관여함을 제시하는 용량-반응 곡선을 보여준다. 또한, IgV 도메인은 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C2-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR의 결합에 관여하는 반면, IgC 및 IgV 도메인 둘 다는 bsIgG1-huCD3-H101GFEALxB7H4-C3-FEAR의 결합에 관여하는 것으로 보인다.
B7H4 알라닌 스캐닝 라이브러리를 사용한 B7H4 항체의 결합에 대한 B7H4 아미노산 잔기의 기여의 결정
라이브러리 설계
인간 B7H4 (유니프롯 Q7Z7D3-1) 단일 잔기 알라닌 라이브러리를 합성하였고 (진아트(GeneArt)), 여기서 인간 B7H4의 세포외 도메인 내의 모든 아미노산 잔기는 알라닌 또는 시스테인을 함유하는 위치를 제외하고 알라닌으로 개별적으로 돌연변이되었다. 항원의 구조적 파괴의 기회를 최소화하기 위해 시스테인을 돌연변이시키지 않았다. 라이브러리를 CMV/TK-폴리A 발현 카세트, Amp 저항성 유전자 및 pBR322 복제 기점을 함유하는 pMAC 발현 벡터에 클로닝하였다.
라이브러리 생산 및 스크리닝
항체 C1-N52S, C2 및 C3을 엠네온그린 태그를 갖는 WO 2007059782에 기재된 바와 같은 재조합 1가 항체로서 생성하였다. 야생형 B7H4 및 알라닌 돌연변이체를 제조업체의 지침 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))에 따라 프리스타일 HEK293 세포에서 개별적으로 발현시켰다. 형질감염 1일 후에, 세포를 수거하였다. 대략 50,000개의 세포를 20 μL 엠네오그린 표지된 관심 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 150 μL FACS 완충제를 첨가하고, 세포를 FACS 완충제로 2회 세척하였다. 세포를 30 μL 신선한 FACS 완충제 중에 재현탁시키고, 아이큐 스크리너(iQue Screener) (인텔리시트 코포레이션(Intellicyt Corporation), 미국)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
전체 실험을 이중으로 2회 수행하였다.
데이터 분석
모든 샘플에 대해, 세포당 평균 항체 결합을 비게이팅된 세포 집단에 대한 형광 강도의 기하 평균 (gMFI)으로서 결정하였다. gMFI는 B7H4 돌연변이체에 대한 항체의 친화도 및 세포당 B7H4 돌연변이체의 발현 수준에 의해 영향을 받는다. 특이적 알라닌 돌연변이는 돌연변이체 B7H4의 표면 발현 수준에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 그리고 일반적으로 각각의 B7H4 돌연변이체에 대한 발현 차이를 보정하기 위해, 데이터를 하기 방정식을 사용하여 비-교차 차단 B7H4 특이적 참조 항체의 결합 강도에 대해 정규화하였다:
여기서 C2는 C1-N52S 및 C3에 대한 참조 항체로서 사용되었고, C1-N52S는 C2에 대한 참조 항체로서 사용되었고, 'aa 위치'는 B7H4의 특정한 ala 돌연변이체 또는 야생형 (wt) B7H4 중 어느 하나를 지칭한다.
항체의 결합의 소실 또는 획득을 선형 배수 변화 스케일로 표현하기 위해, 하기 계산을 사용하였다:
대부분의 경우에 결합의 획득은 특이적 ala 돌연변이체에의 참조 항체의 결합의 소실에 의해 유발될 것이다.
이들 계산 시에, 아미노산을 알라닌으로 대체할 때 특정한 항체에 의한 결합의 소실 또는 획득이 없는 아미노산 위치는 결과 '0'으로서 주어질 것이고, 결합의 획득은 '>0'을 생성할 것이고, 결합의 소실은 '<0'을 생성할 것이다. 샘플 변이에 대해 보정하기 위해, 결합의 배수 변화가 평균 배수 변화 - 1.5 x SD (여기서 SD는 특정한 시험 항체에 대한 4회의 독립적 실험으로부터의 계산된 배수 변화의 표준 편차임)보다 더 낮은 B7H4 아미노산 잔기만이 '결합 돌연변이체의 소실'로 간주되었다.
특정한 B7H4 돌연변이체에 대한 참조 항체의 gMFI가 평균 gMFI대조군 Ab의 평균 gMFI - 2.5 x SD보다 더 낮은 경우에, 데이터는 분석으로부터 배제되었다 (이들 B7H4 돌연변이체에 대해 발현 수준이 충분하지 않은 것으로 가정되었기 때문).
도 3은 ECD에 ala 돌연변이를 갖는 B7H4 변이체에의 B7H4 항체의 결합의 배수 변화를 보여주고, 여기서 결합의 배수 변화가 평균 배수 변화 - 1.5 x SD보다 더 낮은 아미노산 잔기는 주석이 달린다. 배수 변화는 도 3에서 Z-점수로 표시된다. 결과는 하기를 나타낸다:
· 항체 C1-N52S의 결합은 적어도 인간 B7H4의 IgC 도메인에 있는 aa S151, V157, D158, Y159, E164, L166, W173, P175, P177, V179, W181, F199, M208, V210, T222, Y223, V240, E242 및 I245에 의존하고,
· 항체 C2의 결합은 적어도 인간 B7H4의 IgV에 있는 aa R98, G99, R116, K118, N119 및 D124에 의존하고,
· 항체 C3의 결합은 적어도 인간 B7H4의 IgC 도메인에 있는 aa N156, E164, V217 및 R248에 의존하고,
· 항체 C1-N52S, C2 및 C3은 B7H4 상의 별개의 기능적 에피토프를 인식한다.
실시예 8 - 다양한 종으로부터의 B7H4에의 B7H4 단일특이적 및 CD3xB7H4 이중특이적 항체의 결합
먼저, 인간 B7H4 또는 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스) B7H4로 일시적으로 형질감염된 HEK-293F 세포에의 이중특이적 CD3xB7H4 항체 및 단일특이적 B7H4 항체의 결합을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 비-형질감염된 HEK-293F 세포를 음성 대조군으로서 사용하였고; 이들 세포는 (또한) CD3을 발현하지 않는 것으로 확인되었다.
세포 (3 x 104개 세포/웰)를 폴리스티렌 96-웰 둥근-바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원(Greiner bio-one), 카탈로그 번호 650180)에서 100 μL PBS/0.1% BSA/0.02% 아지드 (염색 완충제) 중 항체의 연속 희석물 (4배 희석 단계로 0.000458 내지 30 μg/mL 범위)과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 실험은 기술적으로 이중으로 수행하였다. 염색 완충제 중에서 2회 세척한 후, 세포를 4℃에서 30분 동안 50 μL 2차 항체 중에서 인큐베이션하였다. 2차 항체로서, R-피코에리트린 (PE)-접합된 염소-항-인간 IgG F(ab')2 (FACS 완충제 중 1:500; 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 인크.(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), 펜실베니아주 웨스트 그로브, 카탈로그 번호 109-116-098)를 사용하였다. 세포를 염색 완충제 중에서 2회 세척하고, 토프로(Topro)-3 (1:10,000 희석)을 함유하는 30 μL FACS 완충제 중에 재현탁시키고, 아이큐 스크리너 (인텔리사이트 코포레이션, 미국) 상에서 분석하였다. 결합 곡선을 그래프패드 프리즘 V7.02 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 비-선형 회귀 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)를 사용하여 분석하였다.
도 4는 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 둘 다가 인간 B7H4 또는 시노몰구스 원숭이 B7H4를 발현하는 세포에 결합하였음을 보여준다.
다음으로, 개, 토끼, 래트, 마우스 또는 돼지로부터의 B7H4로 일시적으로 형질감염된 HEK-293F 세포에의 결합을 상기 기재된 바와 같이 결정하였다. 도 5는 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR이 개, 토끼, 래트 및 마우스로부터의 B7H4에 다양한 정도로 결합하였다는 것을 보여준다; 각각의 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 겉보기 친화도 (EC50)는 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR의 것보다 더 낮았다. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR은 돼지 B7H4에 결합할 수 없었던 반면, IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR은 시험된 최고 항체 농도에서만 약하게 결합하였다.
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 및 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR의 인간 및 시노몰구스 원숭이 B7H4에의 결합에 대한 EC50은 유사한 범위 내에 있었다.
상이한 종 (인간, 시노몰구스, 마우스, 래트, 토끼, 개 및 돼지)으로부터의 B7H4에의 IgG1-B7H4-C1-052S-FEAR, IgG1-B7H4-C3-FEAR, IgG1-B7H4-C4-FEAR, IgG1-B7H4-C2-FEAR 및 IgG1-B7H4-C5-FEAR의 결합을 비교하기 위해 유사한 연구를 수행하였다. 도 6은 인간 및 시노몰구스 B7H4로 형질감염된 HEK 세포에의 결합이 시험된 항체에 대해 유사하였음을 보여준다. 유사한 결과가 토끼 및 개 B7H4를 발현하는 세포에서 수득되었다. 그러나, IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR의 마우스 B7H4에의 결합은 IgG1-B7H4-C3-FEAR, IgG1-B7H4-C4-FEAR,IgG1-B7H4-C2-FEAR, 및 IgG1-B7H4-C5-FEAR의 결합에 비해 더 낮은 것으로 보였고, 이는 실시예 3에서의 결과와 일치한다. 또한, gG1-B7H4-C1-N52S-FEAR 및 IgG1-B7H4-C3-FEAR의 래트 B7H4에의 결합은 IgG1-B7H4-C4-FEAR, IgG1-B7H4-C2-FEAR, 및 IgG1-B7H4-C5-FEAR에 비해 더 낮은 것으로 보였다. 또한, IgG1-B7H4-C4-FEAR, IgG1-B7H4-C2-FEAR 및 IgG1-B7H4-C5-FEAR은 돼지 B7H4에 결합하였지만, IgG1-B7H4-C1-052S-FEAR의 결합은 매우 약하였고, 시험된 최고 항체 농도에서만 명백하였다. IgG1-B7H4-C3-FEAR의 돼지 B7H4에의 결합은 검출불가능하였다.
실시예 9 - B7H4-발현 인간 종양 세포주에 대한 B7H4 단일특이적 및 CD3xB7H4 이중특이적 항체의 결합
B7H4-발현 인간 종양 세포주 MCF-7 (유방 선암종; ATCC, 카탈로그 번호 HTB-22), MDA-MB-468 (유방 선암종; ATCC, 카탈로그 번호 HTB-132) 및 SK-BR3 (유방 선암종; ATCC, 카탈로그 번호 HTB-30)에의 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR 및/또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 및/또는 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 결합, 및 B7H4-발현 인간 종양 세포주 NIH-OVCAR-3 (난소 선암종; ATCC, 카탈로그 번호 HTB-161) 또는 HCC1954 (유방 관 암종; ATCC, 카탈로그 번호 CRL-2338)에의 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 결합을 결정하였다. 또한, MDA-MB-468 및 HCC1954 세포에의 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR, IgG1-B7H4-C2-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C2-FEAR, IgG1-B7H4-C3-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C3-FEAR, IgG1-B7H4-C4-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR, IgG1-B7H4-C5-FEAR, 및/또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR의 결합을 결정하였다. 고형 종양 세포주는 전형적으로 CD3을 발현하지 않는다. 음성 대조군으로서, 검출가능한 B7H4 발현을 나타내지 않은 종양 세포주 HeLa (자궁경부 선암종; ATCC, 카탈로그 번호 CCL-2)를 사용하였다. 결합을 상기 기재된 바와 같이 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
도 7은 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR이 MCF-7 및 MDA-MB-468 세포에 대해 대등한 용량-의존성 결합을, 대등한 최대 결합 수준으로 나타냈다는 것을 보여준다.
도 8은 NIH-OVCAR-3 및 HCC1954 세포에의 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 용량-의존성 결합, 및 비-B7H4 발현 세포주인 HeLa에 대한 검출가능한 결합의 결여를 보여준다.
MDA-MB-486 및 SK-BR3 세포를 사용하여, B7H4-발현 종양 세포에의 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 결합을 비교하였다. 도 9는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR이 이들 세포에 대해 대등한 용량-의존성 결합을, 대등한 최대 결합 수준으로 나타냈다는 것을 보여준다.
도 10은 MDA-MB-468 및 HCC1954 세포에의 동종이량체 또는 이중특이적 항체 포맷의 C1-N52S, C2, C3, C4, 및 C5 B7H4 항체의 용량-의존성 결합을 보여준다. C4 및 C5에 기반한 항체는 가장 효율적인 결합을 나타냈고, C1-N52S 및 C2에 기반한 항체는 중간 결합 효율을 나타냈고, C3에 기반한 항체는 가장 낮은 결합 효율을 나타냈다. 최대 결합은 C1-N52S, C2, C4 및 C5에 기초한 항체 사이에 대등하였지만, C3에 기초한 항체에 대해서는 더 낮았다.
실시예 10 - 원발성 종양 세포에의 B7H4 항체의 결합
난소암 환자로부터의 원발성 종양 세포를 디스커버리 라이프 사이언시스(Discovery Life Sciences) (미국 알라바마주 헌츠빌; 환자 ID 110045042)로부터 입수하였다. 종양 세포에의 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR의 결합을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다: 세포를 폴리스티렌 96-웰 둥근-바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원, 카탈로그 번호 650180)에 2 x 104개 세포/웰로 시딩하고, 원심분리하고, PBS 중에 1:1000 희석된 50 μl 고정가능 생존율 염색 FVS-BV510 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 카탈로그 번호 564406)과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 염색 완충제 중에서 세척한 후, 세포를 FITC-표지된 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR 및 CD3의 패널 (EF450 표지됨; 이바이오사이언스(eBioscience), 카탈로그 번호 48-0037-42), CD45 (BV786 표지됨; 바이오레전드, 카탈로그 번호 304048), CD14 (PE-Cy7 표지됨; 비디 바이오사이언시스, 카탈로그 번호 557742), CD86 (PerCP-Cy5.5 표지됨; 바이오레전드(Biolegend), 카탈로그 번호 305420), CD163 (APC-Cy7 표지됨; 바이오레전드, 카탈로그 번호 333622) 및 EpCAM (AF700 표지됨; 알앤디 시스템스(R&D systems), 카탈로그 번호 FAB9601N) 특이적 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척한 후, 염색 완충제 중에 재현탁시키고, FACS 포르테사(Fortessa) (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 분석하였다. 단일 세포를 산란 FSC/SSC에 기초하여 게이팅하고, 살아있는 세포를 FVS-BV510 양성 세포의 배제에 의해 확인하였다. 종양 세포는 EpCAM 양성 세포로서 확인되었다.
유동 세포측정 분석은 IgG1-B7H4-N52S-FEAR이 EpCAM-양성 살아있는 종양 세포에 결합하지만 난소암 샘플의 해리된 종양 세포 현탁액 내의 단핵구 또는 T 세포에는 결합하지 않음을 보여주었다.
실시예 11 - 이펙터 세포로서 정제된 T 세포를 다양한 이펙터 대 표적 비로 사용한, CD3xB7H4 이중특이적 항체에 의한 시험관내 T 세포 매개 세포독성의 유도
이중특이적 항체 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 존재 하에 T 세포-매개 종양 세포 사멸의 효율을 결정하기 위해, 이펙터 대 표적 세포 (E:T) 비를 달리하면서, 표적 세포로서 B7H4-양성 종양 세포주 및 이펙터 세포로서 정제된 T 세포를 사용하여 시험관내 세포독성 검정을 수행하였다.
건강한 인간 공여자 백혈구 연층 (산퀸(Sanquin), 네덜란드 암스테르담)으로부터 T 세포를 수득하고, 로제트셉(RosetteSep)™ 인간 T 세포 풍부화 칵테일 (스템셀 테크놀로지스(Stemcell Technologies), 프랑스, 카탈로그 번호 15061)을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 단리하였다. SK-BR3 세포 (16,000개 세포/웰)를 편평 바닥 96-웰 플레이트 (그라이너-바이오-원, 네덜란드, 카탈로그 번호 655180) 내로 시딩하고, 37℃에서 4시간 동안 부착되도록 두었다. T 세포를 종양 세포에 2:1, 4:1 또는 8:1의 이펙터 대 표적 (E:T) 비로 첨가하였다. bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 연속 희석물을 첨가하고 (10,000 내지 0.0128 ng/mL 범위의 최종 농도; 5배 희석물), 플레이트를 37℃ 하에 72시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 세포를 10% 알라마르블루(r) 용액 (인비트로젠, 카탈로그 번호 DAL1100) 150 μl/웰과 함께 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포독성에 대한 양성 대조군으로서, 세포를 16 μg/mL 페닐아르신 옥시드 (PAO; 시그마-알드리치, 카탈로그 번호 P3075; 디메틸술폭시드 [DMSO; 시그마-알드리치, 카탈로그 번호 D2438] 중에 용해됨)와 함께 인큐베이션하였다. 종양 세포 배양물의 및 따라서 생존 종양 세포의 대사 활성의 척도로서의 알라마르블루 형광을 엔비전(EnVision) 플레이트 판독기 (퍼킨엘머(PerkinElmer)) 상에서 615 nm (OD615)에서 측정하였다. PAO-처리된 종양 세포 샘플의 흡광도를 0% 생존율로 설정하고, 비처리된 종양 세포 샘플의 흡광도를 100% 생존율로 설정하였다. '생존 세포 백분율'을 하기와 같이 계산하였다:
% 생존 세포 = ([샘플의 흡광도 - PAO-처리된 표적 세포의 흡광도]/
[비처리된 표적 세포의 흡광도 - PAO-처리된 표적 세포의 흡광도]) x 100.
용량-반응 곡선 및 IC50 값은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) V7.02 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 비-선형 회귀 분석 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)을 사용하여 생성하였다.
도 11은 T 세포 매개 세포독성이 모든 E:T 비에서 관찰되었고, 최대 종양 세포 사멸 (10% 미만의 생존 종양 세포)이 8:1의 E:T 비에서 관찰되었음을 보여준다.
실시예 12 - CD3xB7H4 이중특이적 항체에 의한 다양한 종양 세포주에서의 시험관내 세포독성의 유도 및 B7H4 발현 수준과의 상관관계
다양한 B7H4 발현 종양 세포주의 이중특이적 항체 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 T 세포-매개 사멸을 8:1의 E:T 비를 사용하여 상기 기재된 바와 같은 시험관내 세포독성 검정에서 결정하였다. 하기 세포주를 사용하였다: MCF-7, MDA-MB-486, SK-BR3, NIH-OVCAR-3, HCC1954, 및 NCI-H1650. 각각의 인큐베이션으로부터, T 세포를 함유하는 150 μL 상청액을 U-바닥 96 웰 배양 플레이트 (셀스타(CellStar), 카탈로그 번호 650180)로 옮긴 후, 세척 및 알라마르블루 인큐베이션 (하기 기재된 바와 같이 T 세포 활성화 및 시토카인 방출을 결정하기 위함)을 수행하였다.
이들 종양 세포주에 대해, B7H4의 발현을 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR을 사용하여 정량적 유동 세포측정법 (인간 IgG 보정기, 바이오시텍스(BioCytex))에 의해 제조업체의 지침에 따라 정량화하여 B7H4를 검출하였다.
도 12는 시험관내 MCF-7, MDA-MB-486, SK-BR3, NIH-OVCAR-3 및 HCC1954 세포에서 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 둘 다가 용량-의존성 T 세포 매개 세포독성을 유도하였음을 보여준다. 최대 세포독성 활성 (<10% 생존 종양 세포)이 두 bsAb 변이체에 대해 달성되었지만, 이는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR과 비교하여 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR에 대해 더 낮은 농도에서 발생하였다 (표 13).
bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (도 13b) 중 어느 하나에 대해서도 종양 세포 용해와 B7H4 발현 수준 간의 유의적 관계가 관찰되지 않았다 (도 13a). 도 13b는 각각의 세포주에 대해 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 존재 하에 4-6명의 공여자로부터 유래된 T 세포를 사용한 T 세포-매개 사멸의 IC50을 보여주며, 여기서 세포주는 B7H4 발현의 최저 수준에서 최고 수준으로 배열된다. 이는 T 세포 매개 사멸이 광범위한 B7H4 발현 수준에 걸쳐 발생할 수 있음을 의미한다.
표 13은 5종의 세포주 및 4종의 공여자의 패널에 걸친 결과를 요약한다.
표 13. CD3xB7H4 이중특이적 항체에 의한 다양한 종양 세포주에서의 시험관내 세포독성의 유도.
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR은 또한 시험된 NCI-H1650 NSCLC 세포주의 용량-의존성 T-세포 매개 세포독성을 유도하였다.
실시예 13 - B7H4-양성 종양 세포의 존재 하에 CD3xB7H4 이중특이적 항체에 의한 시험관내 T 세포 활성화 및 시토카인 생산의 유도
실시예 12에 기재된 시험관내 T 세포-매개 세포독성 실험 동안 수집된 상청액을 함유하는 U-바닥 96 웰 배양 플레이트를 4℃에서 3분 동안 원심분리하고 (300 x g), 그 후에 75 μL의 상청액을 시토카인 생산 측정을 위해 새로운 플레이트로 옮기고, T 세포를 유지하여 T 세포 활성화를 평가하였다 (하기 기재됨). 시토카인 생산을 제조업체의 지침에 따라 멀티플렉스 U-플렉스 검정 (메소 스케일 디스커버리, 미국, 카탈로그 번호 K15049K)에 의해 분석하였다.
T 세포를 T 세포 마커 CD3 (1:200; 이바이오사이언스, 클론 OKT3, 이플루오르450에 접합됨), CD4 (1:50; 이바이오사이언스, 클론 OKT4, APC-이플루오르780에 접합됨), CD8 (1:100; 바이오레전드, 클론 RPA-T8, AF700에 접합됨) 및 T 세포 활성화 마커 CD69 (1:50; 비디 바이오사이언시스, 클론 AB2439, APC에 접합됨), CD25 (1:50; 이바이오사이언스, 클론 BC96, PE-Cy7에 접합됨) 및 CD279/PD1 (1:50; 바이오레전드, 클론 EH12.2H7, BV605에 접합됨)에 대해 염색하였다. 울트라콤프(Ultracomp) 비드 (5 μL; 인비트로젠, 카탈로그 번호 01-2222-42)로 염색된 단일 샘플을 포함시키고, 유동 세포측정기의 보상 조정에 사용하였다. 4℃에서 30분 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS/0.1% BSA/0.02% 아지드 (염색 완충제)로 3회 세척하였다. 세포를 120 μL 염색 완충제 중에 재현탁시키고, FACS 포르테사 (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 분석하였다. 데이터를 플로우조(FlowJo) (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 프로세싱하였다.
용량-반응 곡선, EC50, EC90 및 EC99 값을 그래프패드 프리즘 V7.02 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 비-선형 회귀 분석 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)을 사용하여 계산하였다.
도 14a는 CD8+ T 세포 상에서의 활성화 마커 CD69의 발현 (유동 세포측정법에 의해 결정됨)에 의해 정의된 바와 같은, B7H4-양성 종양 세포주에 대한 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 존재 하에서의 T 세포 활성화를 보여준다. 도 14b는 각각의 종양 세포주에 대한, 3-4명의 공여자로부터 유래된 T 세포를 사용한 T 세포 활성화의 EC50을 보여준다.
전체적으로, CD8+ T 세포의 하위세트 (최고 항체 농도에서 대략 20-50%)는 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 존재 하에 활성화가 되었다. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR에 의해 유도된 T 세포 활성화는 일반적으로, bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR에 의해 유도된 것보다 더 높은 농도에서 발생하였다 (도 14a). 이중특이적 항체 둘 다에 대한 T 세포 활성화의 EC50은 사용된 표적 세포주 사이에서 및 공여자 사이에서 가변적이었다 (도 14b).
시토카인의 생산을 메조스케일 디스커버리 U-플렉스 멀티플렉스 ELISA에 의해 종양 세포-T 세포 배양물의 상청액에서 평가하였다. 4명의 공여자로부터의 T 세포를 사용하여 세포주 패널에 걸쳐 분석된 10종의 시토카인 중에서, 시토카인 수준의 유의한 증가가 IFN-감마 및 IL-8 (>2000 pg/ml)에 대해 주로 관찰되었다. IL-4, IL-6 및 IL-13은 훨씬 더 낮은 수준 (<500 pg/ml)으로 조정된 반면, IL-1베타, IL-2, IL-10, IL-12p70, 및 TNF알파 수준은 일반적으로 50 pg/ml 미만이었다. IFN-감마 변화가 강력하고 일관되게 검출되었고, IFN-감마가 시토카인 방출 증후군을 갖는 환자의 혈청에서 상승된 핵심 시토카인 중 하나이기 때문에, 이 시토카인에 대한 데이터가 제시된다.
도 15는 세포주마다 분석된 적어도 3명의 공여자로부터의 T 세포를 사용하여, bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 존재 하에 종양 세포의 50%, 90% 및 99%에서 T 세포 매개 세포독성을 유도한 항체 농도 (각각 EC50, EC90, EC99)에서의 T 세포-종양 세포 공동-배양물의 상청액 중 IFN-감마의 수준을 보여준다. 시토카인 생산 수준은 공여자마다 및 표적 종양 세포주마다 다양하였다. 그럼에도 불구하고, 동일한 수준 (%)의 종양 세포 사멸을 유도한 항체 농도에서, 일반적으로 보다 낮은 시토카인 생산 수준이 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR에의 노출 후의 수준과 비교하여 T 세포-종양 세포 공동-배양물의 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR에의 노출 후에 관찰되었다. 따라서, 동일한 수준의 종양 세포 사멸에서, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR과의 인큐베이션은 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR보다 더 낮은 시토카인 생산을 발생시켰다.
실시예 14 - 시노몰구스 원숭이에서의 CD3xB7H4 이중특이적 항체의 비-임상 안전성 연구
bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 비-임상 안전성 프로파일을 프랑스 시톡스랩(Citoxlab)에서 비-인간 영장류 (시노몰구스 원숭이, 마카카 파시쿨라리스, 마우리티우스(Mauritius)로부터 기원함)에서 평가하였다. 시노몰구스 원숭이는 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 CD3 아암의 종-특이성에 기초하여, 및 또한 인간 및 시노몰구스 B7H4에의 B7H4 아암의 유사한 결합 및 추가의 약리학적 발견으로 인해 비-임상 안전성 연구를 위한 유일한 관련 종으로 간주되었다. 이들 연구는 동물 건강 규제 (과학적 목적을 위해 사용되는 동물의 보호에 대한 2010년 9월 22일의 협의회 지침 번호 2010/63/EU 및 2013년 2월 1일의 프랑스 감독 번호 2013-118)에 따라 수행되었다.
연구의 목적은 CD3xB7H4 이중특이적 항체의 잠재적 독성 및 독성동태학을 결정하는 것이었다. 여기서는 단지 독성동태학의 결과 및 혈장 중 시토카인 수준의 결정만이 기재된다.
2개의 별개의 연구에서, 동물을 정맥내 (IV) 주입에 의해 단일 용량의 0.1, 1, 3 또는 10 mg/kg bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 또는 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (용량당 1마리의 암컷 동물)로 처리하였다. 주입일은 연구에서 제1일로서 지시되었다. 혈액 샘플을 독성동태학적 프로파일 및 혈장 시토카인 수준의 평가를 위해 투여 전 2회 및 투여 0.5시간, 2시간, 4시간, 12시간, 24시간 및 48시간 후에, 및 추가로 독성동태학을 위해 투여 168, 336 및 504시간 후에 수득하였다.
시토카인 수준
혈장 샘플을 루미넥스(Luminex) xMAP 기술을 사용하여 시토카인 수준 (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, TNF, IL-12p70, IL-15 및 CCL2/MCP1)에 대해 분석하였다.
시노몰구스 원숭이에의 BsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 투여는 혈장 시토카인 수준에서 단지 미미한 변화만을 생성하였으며, 이는 시험 화합물과 무관한 것으로 간주된 반면, bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR의 투여는 도 16에 제시된 바와 같이 IL-6 및 MCP-1 수준의 용량-의존성 증가를 발생시켰다.
BsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 항체와 비교하여 이중특이적 BsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR로의 처리 후에 생성된 보다 낮은 시토카인 수준은 임상 세팅에서 이점을 제공할 수 있다.
독성동태학
CD3xB7H4 이중특이적 항체의 혈장 농도를 포괄적 IgG PK ECLIA 방법을 사용하여 결정하였다. 정맥내 주입 주사 투여 경로와 일치하는 비-구획 접근법을 사용하여 세르타라 피닉스 윈논린(Certara Phoenix WinNonlin) 약동학적 소프트웨어 버전 8.1을 사용하여 독성동태학적 파라미터를 추정하였다. 도 17은 CD3xB7H4 이중특이적 항체 둘 다의 독성동태학적 프로파일이 투여 후 7일까지 고도로 대등하였음을 보여주고, 둘 다는 용량-관련 혈장 노출을 보여준다.
약동학적 모델링 연습에 착수하여 보다 낮은 CD3 친화도를 갖는 BsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 변이체에 의해 요구되는 계획된 임상 용량 범위가 지속불가능하게 높을 것인지 여부를 평가하였다. 시노몰구스 원숭이에서의 관찰에 의해 알아낸 PK 모델을 사용하였다. 시험관내에서 관찰된 바와 같은 T 세포 매개 세포 사멸에 대한 EC50 내지 EC90과 동일한 1-주 평균 혈장 노출을 발생시킬 것으로 예상되는 임상 용량 범위가 유도되었다. 생성된 용량 범위는 실현가능한 것으로 간주되었고, 이러한 측면은 다른 것에 비해 한 유형의 이중특이적 항체 (BsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 대 BsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR)를 선험적으로 선호하는 이유를 제공하지 않았다.
실시예 15 - 다양한 인간 암 적응증에서의 B7H4 발현
B7H4 mRNA 수준을 오믹소프트 TCGA 데이터베이스로부터 추출하고, 온콜랜드 소프트웨어 (퀴아젠(Qiagen), 미국)를 사용하여 가시화하였다.
도 18은 발현의 중앙값에 따라 순위화된, 다양한 원발성 고형 종양에서의 B7H4 mRNA 발현 수준을 보여준다. mRNA 발현은 광범위한 암 적응증에서 발견되었고, 각각의 적응증 내에서 다양하였으며, 가장 높은 중앙 발현은 자궁 암육종 (UCS), 방광 요로상피 암종 (BLCA), 췌장 선암종 (PAAD), 폐 편평 세포 암종 (LUSC), 유방 침습성 암종 (BRCA), 자궁체부 자궁내막 암종 (UCEC), 난소 장액성 낭선암종 (OV) 및 담관암종 (CHOL)에서 발견되었다.
결장암, 폐암 (소세포 폐암, SCLC 및 비소세포 폐암, NSCLC), 위암, 췌장암, 방광암, 자궁경부암, 두경부암, 유방암 (삼중-음성 유방암, TNBC 포함), 난소암, 식도암, 신장암, 전립선암 및 자궁암 및 담관암종에서의 B7H4의 단백질 발현을 조직 마이크로어레이 (TMA; 모두 바이오맥스(BioMax)로부터 구입함) 상에서 면역조직화학 (IHC)에 의해 분석하였다. 염색 전에, 새로 절단된 TMA 절편 (5 μm)을 탈파라핀화하고, 표적 회복 용액 pH 9 (다코(DAKO), S2367; 97℃에서 30분, 60분 냉각)와 함께 인큐베이션하였다. B7H4 IHC를 랩비전(LabVision) 자동염색기 플랫폼 상에서 30분 (RT) 동안 최적 희석 (1:25; 최종 농도 2.6 μg/mL)으로 상업용 토끼 항-인간 B7-H4 모노클로날 항체 (클론 D1M8I, #14572, 셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies))를 사용하여 수행하였다. 후속적으로, 절편을 항-토끼 IgG 중합체 (엔비전TM 플렉스+ 토끼 (다코, S2022))와 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 다코 액체 DAB+ 기질 발색원 시스템 (다코, K3468)과 함께 인큐베이션하였다. 헤마톡실린 (다코, S3301)을 사용하여 유핵 세포를 검출하였다. 시토케라틴 (관심 종양 영역, ROI를 결정하기 위함) IHC를 벤타나 벤치마크(Ventana Benchmark) 상에서 옵티뷰 검출을 사용하여 마우스 항-시토케라틴 항체 믹스 (클론 AE1/AE3)로 수행하였다. 시토케라틴을 DAB로 가시화하고, 핵을 디폴트 벤타나 시약을 사용하여 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 염색된 TMA 절편을 악시오스캔(AxioScan) (자이스(Zeiss)) 상에서 20x 배율로 디지털화하였다. 초기에, 수동 점수화를 수행하여 평균 B7H4 염색 강도 (음성-낮음-중간-높음) 및 >10% B7H4-양성 종양 세포를 갖는 종양 코어의 백분율을 결정하였다.
후속적으로, 자동화 점수화를 수행하였다. 종양 ROI를 B7H4에 대해 염색된 것에 인접한 TMA 절편 상에서 시토케라틴 마스크를 사용하여 정의하였다. 종양 ROI에서의 B7H4 염색 강도를 정량화하고 (음성, 약함 (1), 중간 (2) 또는 강함 (3)), B7H4 백분율 양성 종양 세포의 백분율 (0 - 100% 범위)을 HALO 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. 각각의 적응증에 대해, >10% B7H4-양성 종양 세포를 갖는 종양 코어의 백분율을 결정하였다.
표 14는 바이오맥스 TMA의 IHC 분석에 의해 결정된 B7H4 단백질 발현을 보여준다. 결장암, 전립선암, 신장암 및 소세포 폐암 샘플에서는 B7H4 발현이 없거나 매우 낮은 B7H4 발현이 관찰되었다. 다른 적응증으로부터의 샘플에서, B7H4 발현은 다양하였고, B7H4 발현의 증가는 위암, 췌장암, 담관암종, 식도암, 방광암, 비소세포 폐암 (특히 편평 NSCLC), 자궁경부암, 두경부암, 유방암 (삼중 음성 유방암 [TNBC] 및 비-TNBC), 난소암 및 자궁암에서 발견되었다.
표 14. 바이오맥스 TMA의 IHC 분석에 의해 결정된 B7H4 단백질 발현. ND = 결정되지 않음.
실시예 16 - 다양한 pH 값에서의 열 안정성 및 콜로이드 안정성
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (20 mg/mL)의 다양한 제제를 표 15에 예시된 바와 같이 4.0 내지 8.0의 pH 범위에 걸쳐 다양한 완충제 (아세테이트, 글루타메이트, 숙시네이트, 시트레이트, 히스티딘, 포스페이트 및 트리스)를 사용하여 상이한 pH 값으로 제조하였다.
표 15. 다양한 pH 값을 갖는 시험 제제
시차 주사 형광측정법 (DSF)을 수행하여 항체의 열 안정성에 대한 각각의 pH 및 완충제 조합의 효과를 결정하였다. DSF 분석은 20-95℃로부터의 열 경사를 이용하여 단백질 언폴딩을 유도하고, 증가하는 열 응력의 과정에 걸쳐 샘플의 형광 프로파일을 측정함으로써 열 상태 전이를 평가한다. 입체형태 상태 전이는 고유 형광 프로파일에서의 별개의 변화가 관찰될 때 조명될 수 있다. 이러한 별개의 변화는 주로 입체형태 이동으로부터 발생하는 소수성 방향족 잔기 (예를 들어 트립토판) 주위의 국부 화학적 환경의 변화에 기인한다. 데이터는 각각의 온도에서 형광 방출의 평균 파장인 배리센트릭 평균 (BCM)을 비교함으로써 보고된다. 방향족 잔기가 언폴딩으로 인해 노출됨에 따라, 형광 방출은 에너지가 감소하는 경향이 있다. 이는 BCM이 노이즈 변동을 초과하여 증가하는 온도에서 보이는 최소 언폴딩 온도 (T개시), 및 BCM 대 온도 곡선에서 변곡점이 발생하는 곳에서 보이는 용융 온도 값 (Tm)의 측정을 가능하게 한다.
정적 광 산란 (SLS) 측정을 266 nm 및 473 nm에서 결정하여 단백질 콜로이드 안정성을 평가하였다. 샘플을 조명하는 데 사용되는 레이저로부터의 정적 광 산란의 강도는 입사 파장과 동일한 자릿수 크기의 입자의 존재에 비례한다. 따라서, 이러한 분석은 온도 경사에 걸쳐 단백질 응집에 민감하다. 정적 광 산란을 266 nm에서 측정하여 보다 작은 응집체 입자 크기를 검출할 뿐만 아니라 473 nm에서 측정하여 보다 큰 응집체 종을 검출한다. 단백질이 응집하기 시작하는 온도인 응집 개시 온도 (Tagg)는 이들 데이터로부터 결정된다. 이들 데이터는 카운트 강도의 큰 변화에 의해 가장 잘 분석되고 - 보다 높은 카운트는 보다 많은 광이 단백질 응집체의 회합으로 인해 산란되었음을 나타낸다. 증가하는 온도 경사에 걸쳐, SLS 카운트의 변화는 전형적으로 유의한 단백질 응집에 기인하고, SLS 카운트의 최소 변화는 부분 응집에 기인하고, 온도 경사에 걸쳐 SLS 카운트의 변화가 없음은 무시할만한 단백질 응집을 나타낸다. SLS 분석은 노트북 방법 NB9828p9, 시차 주사 형광측정법, 정적 광 산란, 및 모세관-기반 동적 광 산란을 사용하여 수행하였다.
T개시 및 Tm 둘 다에서의 경향은 pH에 비하여 관찰될 수 있으며, 보다 높은 pH는 표 16에 나타난 바와 같이 열 안정성을 증가시키는 경향이 있다. pH 5.0 이상에서, 대부분의 제제는 T개시 50℃ 이상을 나타냈으며, 이는 비교적 안정한 베이스 제제를 나타낸다. pH 및 T개시 값을 비교함으로써, 보다 높은 pH에서, 보다 많은 열 에너지가 단백질 언폴딩을 유도하는 데 요구되고, 이러한 경향은 Tm 및 T개시 값 둘 다가 정체기인 ~pH 6.5까지 유지된다는 것이 명백하다. 보다 낮은 pH는 표면 및 용매 접근가능한 아미노산 측쇄 전하를 이동시켜 단백질, 즉 Asp (pK=3.9), Glu (pK=4.2) 및 His (pK=6.0)의 천연 폴드를 탈안정화시키는 정전기적 상호작용의 유도 및 파괴를 초래할 가능성이 있다. SLS Tagg 값을 2개의 입사 파장, 각각 266 nm 및 473 nm에서 기록하고, DSF와 동시에 20-95℃로부터의 온도 경사 동안 측정하였다. 이는 각각의 제제에서 항체의 단백질 응집 성향 및 콜로이드 안정성의 분석을 가능하게 하였다. 두 파장 모두에 대해 보다 높은 pH가 보다 높은 Tagg를 보유하는 경향을 갖는 차이가 관찰되었다; 표 16 참조.
표 16. DSF 및 SLS 결과
전반적으로, DSF 데이터는 5.0 미만의 pH 값이 50℃ 미만의 T개시 값을 암시하며, 그 값의 초과에서는 감소 이익을 가짐을 보여준다. SLS로부터 수득된 Tagg 값은 아세테이트, 글루타메이트, 숙시네이트 및 히스티딘을 함유하는 제제 (또한 ≤6.5의 pH 범위에 상응함)가 다른 완충제 시스템에 비해 더 낮은 응집 성향 및 더 높은 응집의 열 개시를 갖는다는 것을 입증한다. 또한, 보다 높은 pH 값은 탈아미드화와 상관관계가 있는 경향이 있으며, 이는 5.0 내지 6.5의 특히 바람직한 pH 범위를 시사한다.
실시예 17 - 추가의 부형제를 사용한 열 안정성 및 콜로이드 안정성
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (20 mg/mL)의 다양한 제제를 다양한 pH (pH=5.0에서 글루타메이트, pH=5.5에서 숙시네이트, pH=5.5에서 히스티딘, 및 pH=6.0에서 히스티딘) 및 상이한 부형제 (NaCl, 아르기닌, 소르비톨, 및 수크로스)의 세트로 제조하였다 (표 17 참조).
표 17. 상이한 완충제, pH 값 및 부형제를 사용한 시험 제제
시차 주사 형광측정법 (DSF) 및 정적 광 산란 (SLS) 측정을 상기 실시예 16에 기재된 바와 같이 수행하였다. 하기 표 18에 요약된 바와 같이, 하전된 부형제를 갖는 제제 (아르기닌 및 NaCl; 제제 A, B, E, F, I, J, M, N)는 비-이온성 부형제 (소르비톨, 수크로스)를 갖는 그의 각각의 대응물과 비교하여 T개시 및 Tm 둘 다에 대해 더 낮은 값을 생성하였다.
표 18. DSF 및 SLS 결과
유사하게, SLS에 의해 밝혀진 바와 같이, 비-이온성 부형제는 266 nm에서 보다 낮은 정도의 응집을 나타냈고, 473 nm에서는 응집이 검출되지 않았다 (숙시네이트-기반 제제를 제외함). 전반적으로, 비-이온성 부형제를 갖는 제제는 탁월한 열 안정성을 나타냈으며, 완충제는 시험된 제제 중에서 히스티딘, 글루타메이트 및 숙시네이트로 순위화하였다.
실시예 18 - 다양한 제제의 용해도, 열 안정성, 콜로이드 안정성
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (20 mg/mL)의 다양한 제제를 하기 표 19에 따라 제조하였다.
표 19. 상이한 완충제, pH 값 및 부형제를 사용한 시험 제제
표 19의 제제를 동적 광 산란 (DLS)에 의해 평가하여 크기 및 크기 균질성을 측정하였다.
데이터는 표 20에 요약되어 있다. 평균 유체역학적 직경은 6.4 nm (20 mM 글루타메이트, 250 mM 소르비톨, pH 5.0) 내지 19.6 nm (20 mM 히스티딘, 250 mM 소르비톨, pH 6.0) 범위였다. 단량체 유체역학적 직경은 5.3 nm (20 mM 글루타메이트, 250 mM 소르비톨 pH 5.0) 내지 13.1 (20 mM 숙시네이트, 150 mM NaCl pH 5.5) 범위였다. 평균 다분산 지수 (PDI) 값은 0.06 (20 mM 히스티딘, 125 소르비톨, 75 mM NaCl pH 5.5) 내지 2.79 (20 mM 히스티딘, 250 mM 소르비톨 pH 6.0) 범위였다. 단량체 %PD는 19.6% 내지 31.4% 범위였으며, 이는 비교적 낮은 다분산도를 나타낸다.
표 20. DLS 결과
최고 5개의 평균 PDI 값 중 4개가 또한 각각 최저 및 최고 pH (pH 5.0 및 pH 6.0)를 갖는 4종의 제제에서 나타났으며, 이는 pH 값이 항체의 용해도에서 유의한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
시차 주사 형광측정법 (DSF) 및 정적 광 산란 (SLS) 측정을 상기 실시예 16에 기재된 바와 같이 수행하였다. 결과를 표 21에 요약한다.
표 21. DSF 및 SLS 결과
T개시 및 Tm 값을 비교할 때, 비-하전된 부형제인 수크로스 및 소르비톨은 안정성을 개선하는 경향이 있다. SLS의 경우에, 비-하전된 부형제 및 글루타메이트 또는 히스티딘 중 어느 하나를 함유하는 모든 제제가 숙시네이트-기반 및 하전된 부형제 함유 제제와 비교하여 473 nm에서 응집의 결여 및 266 nm에서 매우 낮은 응집의 비교 규모를 나타낸다는 것이 명백하다.
DSF 측정으로부터의 결과 이외에도, 이들 데이터는 열 안정화 부형제로서의 수크로스 및 소르비톨의 역할을 추가로 뒷받침한다. 비-이온성 부형제 및 글루타메이트 또는 히스티딘 중 어느 하나를 함유하는 제제는 용해도 연구 과정 전반에 걸쳐 전반적으로 보다 우수한 특징화 프로파일을 나타냈다. 또한, 부형제로서 소르비톨 또는 수크로스를 갖는 히스티딘 및 글루타메이트 완충 제제는 샘플 제조 단계 동안 가장 빠른 교환 및 농도 속도를 나타냈고, 이는 비이온성 부형제가 항체를 가용화하는 데 역할을 한다는 것을 시사한다.
실시예 19 - 다양한 제약 조성물의 저장 안정성
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (20 mg/mL)의 총 36종의 제제를 제조하고, 4주 기간에 걸쳐 2가지 유지 조건, 각각 5±3℃ 및 40±2℃/75±5% RH에 적용하였다. 본 실험에서 제조된 제제는 표 22에 제시된다.
표 22. 상이한 완충제, pH 값, 부형제 및 폴리소르베이트 80을 사용한 시험 제제
두 조건 (5±3℃ 및 40±2℃/75±5% RH)에 대한 4-주 시점 샘플의 순도를 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정하였고, 이들 데이터는 표 23에 요약된다.
표 23. 상이한 조건 하에 4-주 저장 후의 불순물
5±3℃ 조건에서, 순도는 98.5% 내지 99.2%의 좁은 범위를 나타냈다. 40±2℃/75±5% RH 조건에 대해 보다 넓은 범위의 94.3% 내지 98.6% 순도가 관찰되었다. 부형제로서 250 mM 소르비톨 또는 수크로스를 갖는 제제는 제제 21 (20 mM 히스티딘, 250 mM 소르비톨, pH 5.5)을 제외하고 2가지 조건 사이에 가장 낮은 차이를 나타냈다.
이들 제제 중에서, 부형제 군 내의 보다 낮은 pH와 상관관계가 있는 보다 높은 순도의 경향이 관찰된다. 소르비톨-기반 제제는 또한 수크로스 제제를 약간 능가하였고, 글루타메이트- 및 히스티딘-기반 제제 둘 다는 숙시네이트-기반 대응물보다 더 우수하였다.
실시예 20 - 2종의 바람직한 제약 조성물의 저장 안정성
본 실시예의 목적은 2가지 별개의 제제: 20 mM 글루타메이트, 250 mM 소르비톨, 0.02% PS80, pH 5.2 및 20 mM 히스티딘, 250 mM 수크로스, 0.02% PS80, pH 5.5 중에서 20 mg/mL의 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR에 대한 3, 6 및 12개월 안정성을 조사하기 위한 것이다. 이들 제제는 각각 상기 표 22의 제제 6 및 25이다.
2가지 제제의 샘플의 제조를 위해, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR 항체의 부피를 제제 완충제 (20 mM 글루타메이트, 250 mM 소르비톨, 0.02% PS80, pH 5.2 또는 20 mM 히스티딘, 250 mM 수크로스, 0.02% PS80, pH 5.5) 내로 실온에서 최소 완충제로 40의 샘플 부피로 투석하였다. 투석 후, pH는 제제 6의 경우 5.2 ± 0.1이고 제제 25의 경우 5.5인 것으로 확인되었다. 물질의 농도를 20 ± 2 mg/mL로 조정하고, 0.02%의 최종 농도로 PS80으로 보충하고, 최종적으로 층류 후드에서 0.22 μm PVDF 필터를 통해 여과하였다. 샘플을 1-mL의 부피로 2-mL 유형 I 유리 바이알에 개별적으로 충전하고, 최대 12개월 동안 안정하게 두었다.
제제를 함유하는 바이알을 -75℃에서 12개월 동안 및 5℃, 25℃/60%RH 및 40℃/75%RH에서 6개월 동안 세워 저장하였다. 초기 시점 (T0)은 5회의 동결/해동 주기, 48-시간 교반 (대조군 포함) 또는 전형적인 저장 조건 (5℃)으로 조건화된 개별 샘플을 포함하였다. 안정성 샘플을 분석하고, 결과를 표 24에 요약하였다.
표 24. 상이한 조건 하에 3, 6 및 12개월 저장 후의 안정성.
전반적으로, 두 제제는 초기 (방출) 샘플 또는 각각의 대조군과 비교할 경우, 5X 동결/해동 및 48시간 교반 조건에서 최소의 변화를 보였다. 추가로, 두 제제 모두 -75℃에서 12개월까지, 5℃에서 6개월까지 및 약간 더 적은 정도로 25℃/60%RH에서 6개월까지 보관하였을 때, 생성물 안정성에 있어서 최소의 변화를 보였다.
SEC 데이터는 제제 6이 40℃에서 제제 25보다 약간 더 우수하며, 여기서 총 불순물은 제제 6의 경우 15.7%이고, 제제 25의 경우 16.9%라는 것을 보여준다.
전체적으로, 결과는 20 mg/mL의 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR이 20 mM 글루타메이트, 250 mM 소르비톨, 0.02% PS80, pH 5.2 또는 20 mM 히스티딘, 250 mM 수크로스, 0.02% PS80, pH 5.5 중에서 공칭 조건 하에 최대 12개월 동안 안정하다는 것을 입증하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> Genmab A/S
<120> PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING BISPECIFIC ANTIBODIES
BINDING TO B7H4 and CD3
<130> P0175-WO-PCT
<160> 71
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 282
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 1
Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile
1 5 10 15
Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
20 25 30
Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile
35 40 45
Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu
50 55 60
Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val
65 70 75 80
His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met
85 90 95
Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn
100 105 110
Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr
115 120 125
Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu
130 135 140
Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn
145 150 155 160
Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln
165 170 175
Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser
180 185 190
Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met
195 200 205
Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser
210 215 220
Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val
225 230 235 240
Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser
245 250 255
Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe Phe Ala Ile Ser Trp Ala Leu
260 265 270
Leu Pro Leu Ser Pro Tyr Leu Met Leu Lys
275 280
<210> 2
<211> 282
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 2
Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile
1 5 10 15
Phe Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
20 25 30
Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile
35 40 45
Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu
50 55 60
Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Ile Gly Leu Val
65 70 75 80
His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met
85 90 95
Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn
100 105 110
Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr
115 120 125
Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu
130 135 140
Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn
145 150 155 160
Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln
165 170 175
Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser
180 185 190
Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met
195 200 205
Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser
210 215 220
Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val
225 230 235 240
Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser
245 250 255
Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe Leu Ala Ile Ser Trp Ala Leu
260 265 270
Leu Pro Leu Ala Pro Tyr Leu Met Leu Lys
275 280
<210> 3
<211> 282
<212> PRT
<213> Canis familiaris
<400> 3
Met Ala Ser Pro Gly Gln Asn Ile Phe Trp Ser Ile Ile Ser Val Ile
1 5 10 15
Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
20 25 30
Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Leu Thr Ser Ala Gly Asn Ile
35 40 45
Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu
50 55 60
Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Met Gly Leu Val
65 70 75 80
His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Asp Leu Ser Asp Gln Asp Glu Met
85 90 95
Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Gly Gly Asn
100 105 110
Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr
115 120 125
Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu
130 135 140
Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Ile Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn
145 150 155 160
Ala Ser Ser Glu Asn Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln
165 170 175
Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Ala Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser
180 185 190
Glu Val Phe Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met
195 200 205
Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser
210 215 220
Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val
225 230 235 240
Thr Asp Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser
245 250 255
Lys Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Phe Phe Ala Ile Ser Trp Val Leu
260 265 270
Leu Pro Leu Ser Ser Tyr Leu Met Leu Lys
275 280
<210> 4
<211> 282
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 4
Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Ile Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile
1 5 10 15
Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
20 25 30
Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Leu Thr Ser Ala Gly Asn Ile
35 40 45
Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Arg Leu
50 55 60
Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Val Gly Leu Val
65 70 75 80
His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Asp Leu Ser Asp Gln Asp Glu Met
85 90 95
Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Thr Asp Gln Val Ile Val Gly Asn
100 105 110
Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr
115 120 125
Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu
130 135 140
Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Leu Asp Tyr Asn
145 150 155 160
Ala Ser Ser Glu Ser Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln
165 170 175
Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser
180 185 190
Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met
195 200 205
Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Val Asn Asn Thr Tyr Ser
210 215 220
Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val
225 230 235 240
Thr Asp Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser Ser Leu Gln Leu Leu Asn Ser
245 250 255
Arg Ala Ala Pro Ser Val Ser Pro Arg Ser Ala Val Gly Trp Leu Leu
260 265 270
Leu Pro Leu Ser Ser Tyr Val Met Leu Lys
275 280
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 5
Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Ile Phe Trp Ser Ile Ile Asn Val Ile
1 5 10 15
Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Val Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
20 25 30
Gly Lys His Phe Ile Thr Val Thr Thr Phe Thr Ser Ala Gly Asn Ile
35 40 45
Gly Glu Asp Gly Thr Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu
50 55 60
Asn Gly Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Ile Lys Gly Leu Val
65 70 75 80
His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Asp Leu Ser Gln Gln His Glu Met
85 90 95
Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Val Val Gly Asn
100 105 110
Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr
115 120 125
Thr Cys Tyr Ile His Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu
130 135 140
Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Ile Asn Val Asp Tyr Asn
145 150 155 160
Ala Ser Ser Glu Ser Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln
165 170 175
Pro Thr Val Ala Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser
180 185 190
Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met
195 200 205
Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser
210 215 220
Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val
225 230 235 240
Thr Asp Ser Glu Val Lys Arg Arg Ser Gln Leu Glu Leu Leu Asn Ser
245 250 255
Gly Pro Ser Pro Cys Val Ser Ser Val Ser Ala Ala Gly Trp Ala Leu
260 265 270
Leu Ser Leu Ser Cys Cys Leu Met Leu Arg
275 280
<210> 6
<211> 283
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Ile Phe Trp Ser Ile Ile Asn Ile Ile
1 5 10 15
Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
20 25 30
Gly Lys His Phe Ile Thr Val Thr Thr Phe Thr Ser Ala Gly Asn Ile
35 40 45
Gly Glu Asp Gly Thr Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu
50 55 60
Asn Gly Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Ile Lys Gly Leu Val
65 70 75 80
His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Asp Leu Ser Gln Gln His Glu Met
85 90 95
Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Val Val Gly Asn
100 105 110
Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr
115 120 125
Thr Cys Tyr Ile Arg Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu
130 135 140
Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Ile Asn Val Asp Tyr Asn
145 150 155 160
Ala Ser Ser Glu Ser Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln
165 170 175
Pro Thr Val Ala Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser
180 185 190
Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met
195 200 205
Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser
210 215 220
Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val
225 230 235 240
Thr Asp Ser Glu Val Lys Arg Arg Ser Gln Leu Gln Leu Leu Asn Ser
245 250 255
Gly Pro Ser Pro Cys Val Phe Ser Ser Ala Phe Val Ala Gly Trp Ala
260 265 270
Leu Leu Ser Leu Ser Cys Cys Leu Met Leu Arg
275 280
<210> 7
<211> 282
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 7
Met Ala Ser Leu Gly Gln Val Val Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile
1 5 10 15
Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Phe Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
20 25 30
Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Leu Thr Ser Ala Gly Asn Ile
35 40 45
Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu
50 55 60
Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Thr Gly Leu Val
65 70 75 80
His Glu Phe Lys Lys Gly Lys Asp Asp Leu Ser Asp Gln Asp Glu Met
85 90 95
Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn
100 105 110
Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr
115 120 125
Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Lys Leu Glu
130 135 140
Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Ile Pro Glu Val Asn Val Asp Ser Asn
145 150 155 160
Ala Ser Ser Glu Ser Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln
165 170 175
Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser
180 185 190
Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Pro Glu Asn Val Thr Met
195 200 205
Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Thr Thr Tyr Ser
210 215 220
Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Arg Val
225 230 235 240
Thr Asp Ser Glu Ile Lys Arg Gln Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser
245 250 255
Lys Ala Ser Leu Cys Leu Ser Ser Phe Val Ala Ile Ser Trp Val Leu
260 265 270
Leu Pro Leu Cys Pro Tyr Leu Met Leu Lys
275 280
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Nucleic acid motif for translation
<400> 8
Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys
1 5
<210> 9
<211> 534
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 9
Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln
20 25 30
Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu
35 40 45
Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn
50 55 60
Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala
65 70 75 80
Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe
85 90 95
Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val
100 105 110
Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp
115 120 125
Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys
130 135 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr
145 150 155 160
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val
165 170 175
Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr
180 185 190
Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu
195 200 205
Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn
210 215 220
Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr Ile Thr Pro Gln
225 230 235 240
Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val
245 250 255
Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro
260 265 270
Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr
275 280 285
Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly
290 295 300
Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln
305 310 315 320
Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly
325 330 335
Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val
340 345 350
Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu
355 360 365
Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser
370 375 380
Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln
385 390 395 400
Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu
405 410 415
Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala
420 425 430
Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp
435 440 445
Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Pro Pro
450 455 460
Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Val Cys Leu Ile Ala Leu
465 470 475 480
Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys
485 490 495
Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly
500 505 510
Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp
515 520 525
Asp Gly Gln Glu Ile Ala
530
<210> 10
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Domain swap
<400> 10
Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile
1 5 10 15
Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
20 25 30
Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile
35 40 45
Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu
50 55 60
Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val
65 70 75 80
His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met
85 90 95
Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn
100 105 110
Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr
115 120 125
Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu
130 135 140
Tyr Lys Thr Gly Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro
145 150 155 160
Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser
165 170 175
Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly
180 185 190
Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln
195 200 205
Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala Asn
210 215 220
Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala
225 230 235 240
His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Pro Pro Glu
245 250 255
Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Val Cys Leu Ile Ala Leu Leu
260 265 270
Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys Glu
275 280 285
Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly Ser
290 295 300
Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp Asp
305 310 315 320
Gly Gln Glu Ile Ala
325
<210> 11
<211> 273
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Domain swap
<400> 11
Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln
20 25 30
Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu
35 40 45
Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn
50 55 60
Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala
65 70 75 80
Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe
85 90 95
Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val
100 105 110
Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp
115 120 125
Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Phe Ser Met Pro
130 135 140
Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu
145 150 155 160
Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val
165 170 175
Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu
180 185 190
Asn Ser Glu Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val
195 200 205
Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys
210 215 220
Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser
225 230 235 240
His Leu Gln Leu Leu Asn Ser Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe
245 250 255
Phe Ala Ile Ser Trp Ala Leu Leu Pro Leu Ser Pro Tyr Leu Met Leu
260 265 270
Lys
<210> 12
<211> 484
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Tagged protein
<400> 12
Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr
1 5 10 15
Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys
20 25 30
Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu
35 40 45
Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp
50 55 60
Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe
65 70 75 80
Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val
85 90 95
Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys
100 105 110
Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met
115 120 125
Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys
130 135 140
Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln
145 150 155 160
Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu
165 170 175
Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn
180 185 190
Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala
195 200 205
Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg
210 215 220
Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser Lys Ala Ser Ile Glu Gly Arg Met
225 230 235 240
Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
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180 185 190
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210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu
275 280 285
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<223> Constant region
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<213> Homo Sapiens
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Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
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20 25 30
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Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Phe Thr
1 5
Claims (59)
- a) 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체,
b) 완충제를 포함하는 제약 조성물로서,
여기서 조성물의 pH는 4.0 내지 8.0인 제약 조성물. - 제1항에 있어서, 인간 B7H4 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 인간화 및/또는 인간인 제약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물의 pH가 4.5 내지 6.5, 예컨대 5.0 내지 6.0, 예컨대 5.2 내지 5.5인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제가 히스티딘, 글루타메이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, c) 비-이온성 부형제, 예컨대 당 또는 당 알콜을 추가로 포함하는 제약 조성물.
- 제5항에 있어서, 비이온성 부형제가 소르비톨, 수크로스 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 것인 제약 조성물.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 비-이온성 부형제가 100 내지 300 mM, 예컨대 125-250 mM, 바람직하게는 250 mM의 농도로 존재하는 것인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, d) 계면활성제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
- 제8항에 있어서, 계면활성제가 글리세롤 모노올레에이트, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 도큐세이트, 인지질, 폴리에틸렌 알킬 에테르, 소듐 라우릴 술페이트 및 트리카프릴린, 벤즈알코늄 클로라이드, 시트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드 및 인지질, 알파 토코페롤, 글리세롤 모노올레에이트, 미리스틸 알콜, 인지질, 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자 오일 유도체, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 폴리옥실 히드록시스테아레이트, 폴리옥실글리세리드, 폴리소르베이트, 프로필렌 글리콜 디라우레이트, 프로필렌 글리콜 모노라우레이트, 소르비탄 에스테르 수크로스 팔미테이트, 수크로스 스테아레이트, 트리카프릴린 및 TPGS, 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트이고, 임의로 폴리소르베이트가 폴리소르베이트 20 또는 80, 바람직하게는 폴리소르베이트 80인 제약 조성물.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 약 0.005% 내지 0.4% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.1% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.09% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.06% w/v, 예컨대 약 0.01 내지 0.05% w/v, 예컨대 0.02% w/v 또는 0.03% w/v 또는 0.04% w/v 또는 0.05% w/v, 바람직하게는 0.02% w/v의 농도로 존재하는 것인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 농도가 0.5 내지 100 mg/ml, 예컨대 1.0 내지 50 mg/ml, 또는 예컨대 5 내지 30 mg/ml, 예컨대 5 mg/ml, 또는 6 mg/ml, 또는 7 mg/ml, 또는 8 mg/ml, 또는 9 mg/ml, 또는 10 mg/ml, 또는 11 mg/ml, 또는 12 mg/ml, 또는 13 mg/ml, 또는 14 mg/ml, 또는 15 mg/ml, 또는 16 mg/ml, 또는 17 mg/ml, 또는 18 mg/ml, 또는 19 mg/ml, 또는 20 mg/ml, 또는 21 mg/ml, 또는 22 mg/ml, 또는 23 mg/ml, 또는 24 mg/ml, 또는 25 mg/ml, 또는 26 mg/ml, 또는 27 mg/ml, 또는 28 mg/ml, 또는 29 mg/ml, 30 mg/ml, 31 mg/ml, 32 mg/ml, 33 mg/ml, 34 mg/ml, 35 mg/ml, 36 mg/ml, 37 mg/ml, 38 mg/ml, 39 mg/ml, 40 mg/ml, 41 mg/ml, 42 mg/ml, 43 mg/ml, 44 mg/ml, 45 mg/ml, 46 mg/ml, 47 mg/ml, 48 mg/ml, 49 mg/ml, 50 mg/ml, 51 mg/ml, 52 mg/ml, 53 mg/ml, 54 mg/ml, 55 mg/ml, 56 mg/ml, 57 mg/ml, 58 mg/ml, 59 mg/ml, 또는 예컨대 60 mg/ml인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제가 5 내지 40 mM, 예컨대 10-30 mM, 바람직하게는 20 mM의 농도로 존재하는 것인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 조성물인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 5-50 mg/ml의 항체,
b) 10 내지 20 mM 글루타메이트 또는 히스티딘,
c) 150 내지 350 mM 소르비톨 또는 수크로스,
d) 폴리소르베이트
를 포함하는 제약 조성물로서,
여기서 조성물의 pH가 5.0 내지 6.0인 제약 조성물. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 10-20 mg/ml의 항체, b) 20 mM 글루타메이트, c) 250 mM 소르비톨, d) 0.02% w/v 폴리소르베이트 80을 포함하는 제약 조성물로서, 조성물의 pH가 5.1-5.3인 제약 조성물, 및
a) 10-20 mg/ml의 항체, b) 20 mM 히스티딘, c) 250 mM 수크로스, d) 0.02% w/v 폴리소르베이트 80을 포함하는 제약 조성물로서, 조성물 pH가 5.4-5.6인 제약 조성물
로 이루어진 군으로부터 선택된 제약 조성물. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 조성물인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥내 조성물이고/거나, 정맥내 투여에 사용하기 위한 제약 조성물.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 2-8℃, 예컨대 5℃의 저장 온도에서 적어도 6개월, 예컨대 적어도 9개월 또는 적어도 12개월 동안 제약 용도에 대해 안정한 제약 조성물.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 이중특이적 항체인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 2가 항체인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, CD3에 결합하는 항원-결합 영역이
서열식별번호(SEQ ID NO): 17의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH),
및
서열식별번호: 22의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
을 포함하는 것인 제약 조성물. - 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, CD3에 결합하는 항원-결합 영역이
서열식별번호: 18, 19 및 21의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)
및
각각 서열식별번호: 23, GTN 및 24의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
을 포함하는 것인 제약 조성물. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, CD3에 결합하는 항원-결합 영역이
서열식별번호: 17의 서열, 또는 서열식별번호: 17의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH);
및
서열식별번호: 22의 서열 또는 서열식별번호: 22의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
을 포함하는 것인 제약 조성물. - 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이
a) 서열식별번호: 25의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
b) 서열식별번호: 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
c) 서열식별번호: 36의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 40의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
d) 서열식별번호: 43의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 47의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역;
e) 서열식별번호: 50의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 54의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역; 또는
f) 서열식별번호: 31의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역
g) 서열식별번호: 65의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 69의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역
을 포함하는 것인 제약 조성물. - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 것인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이
a) 각각 서열식별번호: 26, 27 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
b) 각각 서열식별번호: 26, 30 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
c) 각각 서열식별번호: 37, 38 및 39의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 41, DTS 및 서열식별번호: 42의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
d) 각각 서열식별번호: 44, 45 및 46의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 48, YTS 및 서열식별번호: 49의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
e) 각각 서열식별번호: 51, 52 및 53의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 55, GAS 및 서열식별번호: 56의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역; 또는
f) 각각 서열식별번호: 26, 32 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역;
g) 각각 서열식별번호: 66, 67 및 68의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 70, GAS 및 서열식별번호: 71의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역
을 포함하는 것인 제약 조성물. - 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 26, 30 및 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및 각각 서열식별번호: 34, GAS 및 서열식별번호: 35의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 것인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이
a) 서열식별번호: 25의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
b) 서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
c) 서열식별번호: 36의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 40의 가변 경쇄 영역;
d) 서열식별번호: 43의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 47의 가변 경쇄 영역;
e) 서열식별번호: 50의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 54의 가변 경쇄 영역; 또는
f) 서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역;
g) 서열식별번호: 65의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 69의 가변 경쇄 영역
을 포함하는 것인 제약 조성물. - 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역을 포함하는 것인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하고, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역이
CDR1이 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하고, CDR2가 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하고, CDR3이 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및
CDR1이 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하고, CDR2가 GTN의 아미노산 서열을 포함하고, CDR3이 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이
CDR1이 서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고, CDR2가 서열식별번호: 30의 아미노산 서열을 포함하고, CDR3이 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역, 및
CDR1이 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고, CDR2가 GAS의 아미노산 서열을 포함하고, CDR3이 서열식별번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 제약 조성물. - 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하고, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역이
서열식별번호: 17의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 22의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
여기서 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이
서열식별번호: 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역; 및 각각 서열식별번호: 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 것인 제약 조성물. - 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하고, 여기서 CD3에 결합하는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 17의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 22의 가변 경쇄 영역을 포함하고, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 29의 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 33의 가변 경쇄 영역을 포함하는 것인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 인간이고/거나,
CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 인간화인
제약 조성물. - 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 2개의 중쇄 불변 영역 (CH) 및 2개의 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하며, 바람직하게는 여기서 2개의 중쇄 불변 도메인 및 2개의 경쇄 불변 영역은 인간으로부터 유래된 것인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 전장 항체인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG1 이소형의 것인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 각각의 상기 제1 및 제2 중쇄가 적어도 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 중쇄에서 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 하나가 치환되고, 상기 제2 중쇄에서 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 하나가 치환되고, 여기서 상기 제1 및 상기 제2 중쇄의 상기 치환은 동일한 위치에 있지 않고, 아미노산 위치는 Eu 넘버링에 따라 넘버링되는 것인 제약 조성물.
- 제38항에 있어서, 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치의 아미노산이 상기 제1 중쇄에서 R이고, 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치의 아미노산이 상기 제2 중쇄에서 L이거나, 또는 그 반대의 경우인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 제1 및 임의로 제2 중쇄를 포함하고, 제1 중쇄 및 존재하는 경우 제2 중쇄는, 항체가 동일한 비-변형된 항체에 비해 더 적은 정도로 Fc-매개 이펙터 기능을 유도하도록 변형된 것인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서, Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 각각 F 및 E인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서, Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 A인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 람다 (λ) 경쇄 및 카파 (κ) 경쇄를 포함하고; 예를 들어 항체가 CD3에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 중쇄 및 람다 경쇄, 및 B7H4에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 중쇄 및 카파 경쇄를 갖는 것인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원 결합 영역이 중쇄 및 경쇄에 포함되고, 상기 중쇄가 상기 VH 영역 및 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄가 상기 VL 영역 및 카파 경쇄 불변 영역을 포함하고; 인간 CD3에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역이 중쇄 및 경쇄에 포함되고, 상기 중쇄가 상기 VH 영역 및 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄가 상기 VL 영역 및 람다 경쇄 불변 영역을 포함하는 것인 제약 조성물.
- 제44항에 있어서, 하나의 IgG1 중쇄 불변 영역이 서열식별번호: 60에 정의된 바와 같고, 다른 것이 서열식별번호: 61에 정의된 바와 같고, 상기 카파 경쇄 불변 영역이 서열식별번호: 63에 정의된 바와 같고, 상기 람다 경쇄 불변 영역이 서열식별번호: 64에 정의된 바와 같은 것인 제약 조성물.
- 제45항에 있어서, 서열식별번호: 60 및 61에 정의된 바와 같은 상기 IgG1 중쇄 불변 영역이 그의 말단 리신이 결실된 것인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR, 또는 그의 바이오시밀러인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 제약 조성물.
- 제48항에 있어서, 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 의약으로서 사용하기 위한 제약 조성물.
- 제49항에 있어서, 질환이 암이고, 임의로 암이 암 세포에서의 B7H4의 발현을 특징으로 하고, 임의로 암이 고형 종양인 제약 조성물.
- 제50항에 있어서, 암이 폐암, NSCLC (ADC 또는 SQCC), 위암, 췌장암, 담관암종, 방광암, 자궁경부암, 두경부암, 유방암, 난소암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
- 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환을 치료하는 방법.
- 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
- 암의 치료를 위한 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 제약 조성물의 용도.
- a) 5 pg 내지 1200 mg의 양의, 인간 B7H4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 및 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체로서, 여기서 상기 항원-결합 영역은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간화 및/또는 인간인 항체,
및
b) 바람직하게는 히스티딘, 글루타메이트 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 완충제
를 포함하는 단위 투여 형태로서,
여기서 단위 투여 형태의 pH는 4.0 내지 8.0, 바람직하게는 4.5 내지 6.5, 보다 바람직하게는 5.0 내지 6.0인 단위 투여 형태. - 제55항에 있어서, 항체가 제20항 내지 제47항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인 단위 투여 형태.
- 제55항 또는 제56항에 있어서, 항체의 양이 20 mg 내지 1000 mg, 예컨대 200 mg 내지 600 mg, 예컨대 300 mg 내지 400 mg인 단위 투여 형태.
- a. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 제약 조성물 또는 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항의 단위 투여 형태,
b. 제약 조성물 또는 단위 투여 형태를 위한 리셉터클,
c. 희석에 대한 및/또는 사용에 대한 지침서
를 포함하는 부분들의 키트. - 주사용수 중에서
a. 0.5 내지 120 mg/ml의 항체, 및
b. 완충제
를 혼합하는 단계
및 pH를 4.0-8.0, 바람직하게는 5.0-6.0으로 조정하는 단계
를 포함하는, 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 제조하는 방법.
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| US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
| DE69830901T2 (de) | 1997-05-02 | 2006-05-24 | Genentech Inc., San Francisco | ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen |
| US20100081792A1 (en) | 2001-06-28 | 2010-04-01 | Smithkline Beecham Corporation | Ligand |
| AU2003209446B2 (en) | 2002-03-01 | 2008-09-25 | Immunomedics, Inc. | Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance |
| PT2314629E (pt) | 2002-07-18 | 2014-01-22 | Merus B V | Produção recombinante de misturas de anticorpos |
| EP1638510B1 (en) | 2003-07-01 | 2015-09-02 | Immunomedics, Inc. | Multivalent carriers of bi-specific antibodies |
| US7235641B2 (en) | 2003-12-22 | 2007-06-26 | Micromet Ag | Bispecific antibodies |
| US7741568B2 (en) | 2005-01-13 | 2010-06-22 | The Wiremold Company | Downward facing receptacle assembly for cable raceway |
| EP3623473A1 (en) | 2005-03-31 | 2020-03-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Process for production of polypeptide by regulation of assembly |
| US7612181B2 (en) | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
| KR20080090406A (ko) | 2005-11-28 | 2008-10-08 | 젠맵 에이/에스 | 재조합 １가 항체 및 그의 제조 방법 |
| NZ591252A (en) | 2006-03-17 | 2012-06-29 | Biogen Idec Inc | Methods of designing antibody or antigen binding fragments thereof with substituted non-covarying amino acids |
| PT1999154E (pt) | 2006-03-24 | 2013-01-24 | Merck Patent Gmbh | Domínios proteicos heterodiméricos modificados |
| AT503902B1 (de) | 2006-07-05 | 2008-06-15 | F Star Biotech Forsch & Entw | Verfahren zur manipulation von immunglobulinen |
| ES2667863T3 (es) | 2007-03-29 | 2018-05-14 | Genmab A/S | Anticuerpos biespecíficos y métodos de producción de los mismos |
| PL2158221T3 (pl) | 2007-06-21 | 2019-02-28 | Macrogenics, Inc. | Kowalencyjne diaciała i ich zastosowania |
| ES2622460T3 (es) | 2007-09-26 | 2017-07-06 | Ucb Biopharma Sprl | Fusiones de anticuerpos con doble especificidad |
| EP2050764A1 (en) | 2007-10-15 | 2009-04-22 | sanofi-aventis | Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof |
| WO2009073533A2 (en) | 2007-11-30 | 2009-06-11 | Medarex, Inc. | Anti-b7h4 monoclonal antibody-drug conjugate and methods of use |
| US8227577B2 (en) | 2007-12-21 | 2012-07-24 | Hoffman-La Roche Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
| DK2235064T3 (en) | 2008-01-07 | 2016-01-11 | Amgen Inc | A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects |
| WO2010015792A1 (en) | 2008-08-06 | 2010-02-11 | Argenta Discovery Limited | Nitrogen containing heterocyclic compounds useful as bifunctional modulators of m3 receptors and beta-2 receptors |
| US8927694B2 (en) | 2008-11-18 | 2015-01-06 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Human serum albumin linkers and conjugates thereof |
| AU2009335798B2 (en) | 2008-12-19 | 2014-11-27 | Macrogenics, Inc. | Covalent diabodies and uses thereof |
| MX2011009810A (es) | 2009-03-27 | 2011-09-30 | Zymogenetics Inc | Composiciones y metodos para usar proteinas de union multiespecificas que comprenden una combinacion anticuerporeceptor. |
| CN102459346B (zh) | 2009-04-27 | 2016-10-26 | 昂考梅德药品有限公司 | 制造异源多聚体分子的方法 |
| KR101224468B1 (ko) | 2009-05-20 | 2013-01-23 | 주식회사 파멥신 | 신규한 형태의 이중표적항체 및 그 용도 |
| US9493578B2 (en) | 2009-09-02 | 2016-11-15 | Xencor, Inc. | Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens |
| BR112012012983A2 (pt) | 2009-12-04 | 2020-09-15 | Genentech Inc | método para sintetizar um anticorpo multiespecífico, método para sintetizar um painel de anticorpos multiespecíficos, método para sintetizar um análogo de anticorpo, método para sintetizar um painel de análogos de anticorpo e composições |
| NZ701539A (en) | 2010-03-04 | 2015-04-24 | Macrogenics Inc | Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof |
| TWI426920B (zh) | 2010-03-26 | 2014-02-21 | Hoffmann La Roche | 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體 |
| US9150663B2 (en) | 2010-04-20 | 2015-10-06 | Genmab A/S | Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof |
| EP2569337A1 (en) | 2010-05-14 | 2013-03-20 | Rinat Neuroscience Corp. | Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them |
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