CN102250246A - 抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用 - Google Patents

抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及双特异性单克隆抗体药物，特别涉及抗肿瘤血管新生的抗人血管内皮生长因子（VEGF/VEGF-A）和人血小板衍生生长因子受体（PDGFR）的双特异性单克隆抗体药物；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体，其特征在于该抗体由抗VEGF单克隆抗体为基础，并在其FC段末端连接抗PDGFRβ单链抗体构成。本发明涉及的双特异性抗体是运用基因工程等技术手段，将识别VEGF和识别PDGFRβ的抗体片段构建在同一抗体分子中，能够特异性的与这两者结合，其抑制肿瘤组织血管新生的效果明显优于单独使用抗VEGF抗体，并且具有很好看肿瘤活性。

Description

抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用
技术领域
本专利涉及双特异性单克隆抗体药物，特别涉及抗肿瘤血管新生的抗人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)和人血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的双特异性单克隆抗体药物；
背景技术
早在一个多世纪以前，就有文献报道过肿瘤生长伴随着新生血管生成(Ferrara 2002)。但直到1939年，才由Ide及其同事首次提出，可能存在着某种肿瘤来源的血管生长刺激因子为肿瘤的生长提供血管供应(Ide et al.1939)。数年后，由于观察到血管密度的增高会先于肿瘤的快速生长，Algire等人认为“肿瘤的快速扩散取决于丰富的血管供给”(Algire et al.1945)。在上个世纪六十年代，Greenblatt、Shubik(Greenblatt et al.1968)和Ehrmann、Knoth(Ehrmann et al.1968)两个研究小组的实验相继提供初步证据，证实肿瘤的血管生成是由肿瘤细胞产生的某些可扩散因子介导。
1971年，美国科学家福克曼(Judah Folkman)在《新英格兰医学杂志》中提出，抗血管生成可能是一种有效的抗癌手段(Folkman 1971)。从七十年代早期开始，以这个前瞻性的假说为基础，福克曼及其研究小组致力于从人体和动物的肿瘤中分离某种‘肿瘤血管生成因子‘(Folkman et al.1971)。1978年，Gullino也提出了抑制血管生成能避免癌症的观点(Gullino 1978)。随后，多种血管源因子(如，表皮生长因子EGF，转化生长因子TGF-α、TGF-β，肿瘤生长因子TNF-α和血管生长素等)先后被发现(Folkman et al.1987)。
血管内皮生长因子(VEGF)
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF，也可写作VEGF-A)是一个血管生成的关键调节因子，对于VEGF基因家族在血管生成调节中所扮演的角色，人们已经深入研究了十多年之久(Ferrara 2002)。VEGF家族目前主要包括原型成员(VEGF-A)、胎盘生长因子(placenta growth factor，PlGF)(Maglione et al.1991)、VEGF-B(Olofsson et al.1996)、VEGF-C(Joukov et al.1996)、VEGF-D(Orlandini et al.1996)。其中VEGF-A是诱导肿瘤血管生成作用最强、特异性最高的血管生长因子。VEGF有3个高亲合性的酪氨酸激酶受体(RTKs)，分别为VEGFR-1(Flt-1)(Shibuya et al.1990；de Vries et al.1992)、VEGFR-2(KDR、Flk-1)(Yoshiji et al.1996；Elliset al.1998；Tomisawa et al.1999)和VEGFR3(Flt-4)(Joukov et al.1996)。KDR是血管形成的主要调控分子，具有明显的化学趋化和促分裂作用，与血管岛、血管形成和造血有关。
肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，血管生成使肿瘤能够获得足够的营养物质，是促成上述转变的关键环节。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过1～2mm3。肿瘤侵袭转移是肿瘤治疗失败的主要原因，而在肿瘤发生侵袭转移的多步骤过程中，血管生成均发挥着重要作用。
原位杂交研究已经发现VEGF mRNA在多种人类肿瘤中都有表达，包括肺癌(Volm et al.1997)、乳腺癌(Yoshiji et al.1996)、胃肠癌(Ellis et al.1998)、肾癌(Tomisawa et al.1999)和卵巢癌(Sowter et al.1997)。多家实验室使用多种抗VEGF的手段均已实现了肿瘤生长的抑制，这些方法包括：针对VEGF或其受体(VEGFRs)的抗体、可溶性受体，VEGFRs酪氨酸激酶的小分子抑制剂以及利用VEGF的突变异二聚体封闭其受体结合位点等。
1993年，费拉拉制备了VEGF的鼠源性抗体，在体外实验中，鼠源性抗体可以显著抑制数种人类癌细胞系的生长。从此，VEGF抗体的临床应用价值开始显露。为了降低鼠源性抗体的免疫原性，费拉拉将鼠源抗体的骨架换做了人源抗体IgG1的部分，由此诞生了基因泰克公司“重磅炸弹级”药物--贝伐单抗(Avastin)。它是一种抗VEGF的人源化抗体(IgG1)，93％的人源结构域和7％的鼠源结合区域组成，是全世界第一个被批准用于抑制血管生长的单克隆抗体药物，2004年2月美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准该药用于治疗转移性结肠癌(mCRC)、小细胞分子肺癌(6BM)和转移性肾癌。阿瓦斯汀区别于已有抗癌药物，以VEGF为药物靶点，加之抗体的特异性结合能力，使其临床疗效显著。在人体试验中，即使对于晚期的癌症患者，注射阿瓦斯汀也可延长寿命数月。2007年ASCO会议Souglakos报道Avastin联合靶向EGFR的单克隆抗体Cetuximab(西妥昔单抗)可以安全有效地治疗化疗失败的晚期转移性结直肠癌。基因泰克公司正在用Avastin对超过40种癌症进行适应症研究，希望可以生产出更多的单抗延伸产品。同时，他们也在研究将全抗体分子IgG切割之后，先将蛋白用原核细胞表达，然后再将其通过基因工程的手段连接为IgG。
除了癌症外，VEGF也是治疗包括老年性黄斑变性(AMD)，糖尿病引起的眼底病在内的多种眼科疾病关键。为了治疗这些疾病，在Avastin的基础上，基因泰克公司又将其全抗体分子结构进行简化，保留能够中和VEGF的抗体片段，同时将给药途径由静脉注射改为玻璃体直接注射，由此成就另一药物--Avastin的孪生姊妹兰尼单抗(Lucentis)。2006年，兰尼单抗被美国药监局批准用于治疗老年黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)，很快就成为治疗老年性黄斑变性，糖尿病引起的眼底病的首选药，占领北美市场80％以上的份额。
血小板衍生生长因子及其受体
血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)是普遍存在的一种由sis原癌基因编码的生长因子，最初从血小板α中分离得到，主要由巨核细胞合成，在组织损伤修复，血管生成和细胞分化过程中起到非常重要的作用(Heldin 1992)。PDGF分子是一个糖蛋白二聚体，可分为-AA，-BB和-AB三种类型。PDGF及其受体(Platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)在多种人体肿瘤中都有比较高的表达，如胰腺癌，小细胞肺癌，胃癌和乳腺癌等。
PDGFR是一种位于细胞表面的受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase，RTK)，可分为两个亚型：PDGFRα和PDGFRβ(Matsui et al.1989)。PDGFRβ可以特异性的与PDGF-BB或-AB结合(Herdaran et al.1991)而被激活。被激活后，两个PDGFR之间可以形成二聚体，并通过自身磷酸化激活下游的信号转到通路，以实现其调控细胞分化生长的功能。
近年来，针对VEGF的靶向型药物对治疗癌症以及老年性黄斑变性(AMD)取得了非常显著的疗效(Ferrara et al.2007)。但是这种针对VEGF的靶向治疗仍然存在许多不足，还有很多改进的空间。例如有的病人对该疗法具有一种内在的耐药性，另外一些癌症病人经治疗后，短期内取得了较好的疗效，但是这种疗效只能维持比较短的时间，之后肿瘤又重新生长(Jain et al.2005，Shojaei etal.2007，Gaur et al.2009)。对于这种对VEGF靶向治疗的抗性，又一种观点认为新生血管周细胞(pericytes)所分泌的PDGFRβ在其中起到了非常重要的作用(Abramsson et al.2003，Mancuso et al.2006，Bergers et al.2008)。
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体
通过实验室培养的癌细胞模型和小鼠模型所获的证据表明，共同抑制VEGF/VEGFR和PDGF/PDGFR的功能比单独针对VEGF/VEGFR能更有效的抑制肿瘤组织内新生血管的生长(Bergers et al.2003，Erber et al.2004，Pietras etal.2005，Jo et al.2006，Shen et al.2007)。目前，已经有一部分小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)被证实能够用于治疗癌症(Hiles et al.2008)。这些抑制剂能够与包括VEGFR和PDGFR在内的很多细胞内激酶结合，抑制其功能，从而达到治疗癌症的目的(Fabian et al.2005)。但是这些小分子抑制剂对人体具有一定的毒性，特别是其与化疗相结合的时候，毒性更大(Sosman et al.2007，Roodhart et al.2008)。相比抑制剂疗法，运用单一的，具有抗VEGF和PDGF信号通路双特异性的人源化抗体作为抗肿瘤药物，具有更大的优势和更光明的前景。
参考文献：
Abramsson A，Lindblom P，Betsholtz C.Endothelial and nonendothelial sources ofPDGF-B regulate pericyte recruitment and influence vascular pattern formation intumors.The Journal of clinical investigation.2003；112：1142-51.
Algire，G.H.，Chalkley，H.W.，Legallais，F.Y.& Park，H.D.Vascular reactionsof normal and malignant tissues in vivo.I.Vascular reactions of mice to wounds andto normal and neoplastic transplants.J.Natl Cancer Inst.1945，6，73-85.
Bergers G，Hanahan D.Modes of resistance to anti-angiogenic therapy.Naturereviews.2008；8：592-603.
Bergers G，Song S，Meyer-Morse N，Bergsland E，Hanahan D.Benefits of targetingboth pericytes and endothelial cells in the tumor vasculature with kinase inhibitors.J Clin Invest.2003；111：1287-95.
de Vries，C.et al.The fms-like tyrosine kinase，a receptor for vascularendothelial growth factor.Science.1992，255，989-991.
Ehrmann，R.L.& Knoth，M.Choriocarcinoma.Transfilter stimulation ofvasoproliferation in the hamster cheek pouch.Studied by light and electronmicroscopy.J.Natl.Cancer Inst.1968，41，1329-1341.
Ellis，L.M.et al.Vessel counts and vascular endothelial growth factorexpression in pancreatic adenocarcinoma.Eur.J.Cancer.1998，34，337-340.
Erber R，Thurnher A，Katsen AD，Groth G，Kerger H，Hammes HP，et al.Combinedinhibition of VEGF and PDGF signaling enforces tumor vessel regression byinterfering with pericyte-mediated endothelial cell survival mechanisms.FASEB J.2004；18：338-40.
Fabian MA，Biggs WH，3rd，Treiber DK，Atteridge CE，Azimioara MD，Benedetti MG，et al.A small molecule-kinase interaction map for clinical kinase inhibitors.NatBiotechnol.2005；23：329-36.
Ferrara，N.VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors.Nature Rev.Cancer.2002，2，795-803.
Ferrara N，Mass RD，Campa C，Kim R.Target ing VEGF-A to treat cancer andage-related macular degeneration.Annu Rev Med.2007；58：491-504.
Folkman J.Tumor angiogenesis：therapeutic implication[J].N Engl J Med，1971，285(21)：11821186.
Folkman，J.& Klagsbrun，M.Angiogenic factors.Science.1987，235，442-447.
Folkman，J.，Merler，E.，Abernathy，C.&Williams，G.Isolation of a tumor factorresponsible for angiogenesis.J.Exp.Med.1971，133，275-288.
Gaur P，Bose D，Samuel S，Ellis LM.Targeting tumor angiogenesis.Semin Oncol.2009；36：12-9.
Gullino，P.M.Angiogenesis and oncogenesis.J.Natl Cancer Inst.1978，61，639-643.
Heidaran MA，Pierce JH，Yu JC，Lombardi D，Artrip JE，Fleming TP，Thomason A，Aaronson SA.Role of alphaβreceptor heterodimer formation in βplatelet-derived growth factor(PDGF)receptor activation by PDGF-AB.J Biol Chem.1991；266(30)：20232-7.
Heldin CH.Structural and functional studies on platelet-derived growth factor.EMBO J.1992；11(12)：4251-9.
Hiles JJ，Kolesar JM.Role of sunitinib and sorafenib in the treatment ofmetastatic renal cell carcinoma.Am J Health Syst Pharm.2008；65：123-31.
Ide，A.G.，Baker，N.H.&Warren，S.L.Vascularization of theBrown Pearce rabbitepithelioma transplant as seen in thetransparent ear chamber.Am.J.Roentgenol.1939，42，891-899.
Jain RK.Antiangiogenic therapy for cancer：current and emerging  concepts.Oncology.2005；19：7-16.
Jo N，Mailhos C，Ju M，Cheung E，Bradley J，Nishijima K，et al.Inhibition ofplatelet-derived growth factor B signaling enhances the efficacy of anti-vascularendothelial growth factor therapy in multiple models of ocular neovascularization.Am J Pathol.2006；168：2036-53.
Joukov，V.et al.A novel vascular endothelial growth factor，VEGF-C，is a ligandfor the Flt4(VEGFR-3)and KDR(VEGFR-2)receptor tyrosine kinases.EMBO J.1996，15，1751.
Mancuso MR，Davis R，Norberg SM，O’Brien S，Sennino B，Nakahara T，et al.Rapidvascular regrowth in tumors after reversal of VEGF inhibition.J Clin Invest.2006；116：2610-21.
Matsui T，Heidaran M，Miki T，Popescu N，La Rochelle W，Kraus M，Pierce J，AaronsonS.Isolation of a novel receptor cDNA establishes the existence of two PDGF receptorgenes.Science.1989；243(4892)：800-4.
Pietras K，Hanahan D.A multitargeted，metronomic and maximum-tolerated dose“chemo-switch”regimen is antiangiogenic，producing objective responses andsurvival benefit in a mouse model of cancer.J Clin Oncol.2005；23：939-52.
Roodhart JM，Langenberg MH，Witteveen E，Voest EE.The molecular basis of classside effects due to treatment with inhibitors of the VEGF/VEGFR pathway.Curr ClinPharmacol.2008；3：132-43.
Shen J，Vil MD，Zhang H，Tonra JR，Rong LL，Damoci C，et al.An antibody directedagainst PDGF receptor βenhances the antitumor and the anti-angiogenic activitiesof an anti-VEGF receptor 2antibody.Biochem Biophys Res Commun.2007；357：1142-7.
Shibuya，M.et  al.Nucleotide sequence and  expression  of a novel humanreceptor-type tyrosine kinase(flt)closely related to the fms family.Oncogene.1990，8，519-527.
Shojaei F，Ferrara N.Antiangiogenic therapy for cancer：an update.Cancer J.2007；13：345-8.
Sosman JA，PuzanovI，Atkins MB.Opportunities and obstacles to combinationtargeted therapy in renal cell cancer.Clin Cancer Res.2007；13：764-9.
Sowter，H.M.et al.Expression and localization of the vascular endothelialgrowth factor family in ovarian epithelial tumors.Lab.Invest.1997，77，607-614.
Tomisawa，M.et al.Expression pattern of vascular endothelial growth factorisoform is closely correlated with tumour stage and vascularisation in renal cellcarcinoma.Eur.J.Cancer.1999，35，133-137.
Yoshij i，H.，Gomez，D.E.，Shibuya，M.& Thorgeirsson，U.P.Expression ofvascular endothelial growth factor，its receptor，and other angiogenic factors inhuman breast cancer.Cancer Res.1996，56，2013-2016.
发明内容
发明目的
本发明提供抗VEGF-PDGFR双特异性抗体，其运用基因工程等技术手段，将识别VEGF和识别PDGFR β的抗体片段构建在同一抗体分子中，能够特异性的与这两者结合，其抑制肿瘤组织血管新生的效果明显优于单独使用抗VEGF抗体。
技术方案
抗VEGF/PDGFR β双特异性抗体，其特征在于该抗体由抗VEGF单克隆抗体为基础，并在其FC段末端连接抗PDGFR β单链抗体构成。
FC段末端通过(GGGGS)3连接抗PDGFR β单链抗体。
抗VEGF单克隆抗体由Anti-VEGF A Fab VH-CH、Anti-VEGF A Fab VL-CL和Fc组成；其中Anti-VEGF A Fab VH-CH的氨基酸序列表为SEQ NO.3、Anti-VEGF A Fab VL-CL的氨基酸序列表为SEQ NO.4、Fc的氨基酸序列表SEQNO.5。
所述的抗PDGFRβ单链抗体由Anti-PDGFRβscFv VL和Anti-PDGFRβscFv VH通过(GGGGS)3连接而成组成；其中Anti-PDGFRβscFv VL的氨基酸序列表为SEQ NO.1、Anti-PDGFR βscFv VH的氨基酸序列表为SEQ NO.2。
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。
有益效果
1、本专利涉及的双特异性抗体是运用基因工程等技术手段，将识别VEGF和识别PDGFRβ的抗体片段构建在同一抗体分子中，能够特异性的与这两者结合，其抑制肿瘤组织血管新生的效果明显优于单独使用抗VEGF抗体，并且具有很好看肿瘤活性。
2、本专利涉及的双特异性抗体可以特异性结合VEGF-A和PDGFRβ分子，抑制其刺激新生血管生长的生物学功能。实验表明，该双特异性抗体单独结合VEGF-A或PDGFRβ的能力与抗VEGF-A或抗PDGFRβ单克隆抗体近似，并且其具有很强的同时与这两种抗原结合的能力。实验表明，同时抑制VEGF-A和PDGFRβ比单独抑制两者中的一种能够更好的抑制肿瘤血管的生长，因此使用该双特异性抗体即能有效的抑制肿瘤组织的生长，又能避免同时使用两种单克隆抗体时用药量的增加，给患者带来的不可预知的风险。
附图说明
图1.抗VEGF-PDGFRβ双特异性抗体结构示意图。该抗体由抗VEGF单克隆抗体为基础，并在其FC段末端连接抗PDGFRβ单链抗体(scFv)构成；
图2.抗VEGF-PDGFRβ双特异性抗体重链表达载体；
图3.抗VEGF Fab轻链表达载体；
图4.抗VEGF-PDGFRβ双特异性抗体(bsAb)同时结合hVEGF-A和PDGFR β测试(Biacore)。第一步，流动相中的bsAb与固定相中的hVEGF-A结合；第二步，hVEGF-A-bsAb复合物与流动相中的PDGFR β结合：0nM PDGFRβ(蓝线)，500nM PDGFR β(红线)。
图5.抗VEGF-PDGFR β双特异性抗体抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人脑血管周细胞(HBVP)生长体外试验：A.在2nM VEGF-A存在的条件下，HUVECs中分别加入anti-VEGF mAb(bevacizumab)，anti-VEGF scFv和anti-VEGF-PDGFR βbsAb，培养48小时；B.在0.4nM PDGFR β存在的条件下，HBVP中分别加入anti-PDGFR βmAb，anti-PDGFR βscFv和anti-VEGF-PDGFRβbsAb。(n＝4)；
图6.HUVECs和HBVP共培养，测试抗VEGF-PDGFR βbsAb对血管内皮细胞生长，及内皮细胞-周细胞结合的抑制作用：A.Bevacizumab，Bevacizumab+anti PDGFR β和anti-VEGF-PDGFR βbsAb(同为25nM)对新生血管生长的抑制效果；B.不同浓度的Bevacizumab和anti-VEGF-PDGFR βbsAb对新生血管生长的抑制效果。
图7.重组双特异性单克隆抗体在哺乳动物细胞中表达与生产流程图。构建好的表达载体转入细胞后，在96孔板中培养，筛选稳定表达的细胞株。筛选得到的细胞株逐级放大培养，最后在生物反应器中进行大规模生产。
具体实施方式
实施例1
抗VEGF-PDGFRbeta双特异性抗体的制备方法
1.抗VEGF-PDGFRbeta双特异性抗体(bsAb)核苷酸序列设计和合成：
根据该bsAb重链VHVEGF-CH1VEGF-CH2VEGF-CH3VEGF-(GGGGS)3-VHPDGFRbeta-(GGGGS)3-VLPDGFRbeta的氨基酸序列和连接形式设计重链核苷酸序列，并在该序列5’端加入Sac I酶切位点，KOZAK序列及前导序列，在其3’端加入Xho I酶切位点。设计3个3’端含EcoRI酶切位点的寡核苷酸引物，分别合成重链VHVEGF-CH1VEGF，CH2VEGF-CH3VEGF-(GGGGS)3和VHPDGFRbeta-(GGGGS)3-VLPDGFRbeta片断，应用PCR直接连接法(SDL PCR)合成全长2118bp的bsAb重链基因。
根据人抗VEGF-A IgG1轻链氨基酸序列，设计5’端含Not I酶切位点，KOZAK序列及前导序列，3’端含Psi I酶切位点的PCR引物，应用PCR法扩增全长639bp的人抗VEGF-A轻链基因。
2.抗VEGF-PDGFRbeta bsAb表达载体的构建：
将该bsAb重链基因用Sac I和Xho I双酶切，将轻链基因用Not I，Psi I双酶切后，用T4连接酶将重链基因连接到经Sac I和Xho I处理的真核表达载体中；将轻链基因连接到经Not I和Psi I处理的真核表达载体中。
这两个表达载体(包含phoA启动子)接着被转入BL21感受态大肠杆菌菌株。转化后的BL21菌株选取阳性克隆，在含50ug/mL的LB培养基(2mL)中于37℃过夜培养。之后菌株转入2L含50ug/mL的CRAP培养基中于30℃培养24小时。
菌液3000转常温离心弃上清，所得的大肠杆菌用Qiagen公司的质粒提取试剂盒裂解并提取质粒，获得含重链和轻链的表达载体。
纯化后的两个表达载体用电穿孔法同时转入CHO细胞中，在新霉素(neo)存在的条件下悬浮培养。重组抗体用亲和层析法(Protein A)和分子筛层析分离提纯分子量为200kDa左右的完整双特异性抗体分子。提纯后的各个组分通过SDS-PAGE法鉴定。
实施例2
抗原抗体结合实验
抗原抗体结合实验均使用Biacore T 100系统(GE Healthcare)高密度的VEGF-A(1000RU)通过共价结合固定于CM4芯片上，bsAb稀释至100nM并注入系统，使其以10uL/min的流速流过固定于芯片上的VEGF-A表面，共5分钟。PDGFR β(500nM)随后以30uL/min的流速注入，共10分钟。实验结果中的结合曲线由Biacore Evaluation Software vl.1.1自动生成。共结合实验得到的曲线与该双特异性抗体分别与VEGF-A或PDGFRβ结合生成的曲线基本一致，说明该抗体能够同时特异性结合VEGF-A和PDGFRβ。见图4.抗VEGF-PDGFRβ双特异性抗体(bsAb)同时结合hVEGF-A和PDGFRβ测试(Biacore)。第一步，流动相中的bsAb与固定相中的hVEGF-A结合；第二步，hVEGF-A-bsAb复合物与流动相中的PDGFR β结合：0nM PDGFR β(蓝线)，500nM PDGFR β(红线)。
实施例3
抗体抑制血管实验比较
HUVECs细胞接入96孔板，密度为每孔1000个细胞左右，于EGM-2MV培养基中37℃培养48小时，之后细胞于含1乘胰岛素-转铁因子-硒纳的无血清培养基中37℃培养。24小时后移除原培养基，换含有2.6nM hVEGF-A及不同浓度(0.0005nM-500nM)的抗VEGF-A全抗(bevazimumab)，抗VEGF-A Fab或bsAb，37℃培养24小时。之后细胞中加入1uCi/孔的3H-胸苷，37℃培养24小时。
HBVPs细胞接入96孔板中，密度为每孔500个细胞左右。细胞于含血清及PGS的培养基中37℃培养48小时，之后换无血清培养基37℃培养24小时。加入0.4nM PDGFR β以刺激细胞生长，同时加入不同浓度梯度(2000nM-0.02nM)的抗PDGFR β全抗体，抗PDGFR βscFv或bsAb，继续37℃培养24小时。每孔加入1uCi 3H-胸苷，培养6小时。
细胞DNA中插入的3H-胸苷量用Packard Top count测量，数据分析由GraphPad Prism software完成。该实验结果表明，抗VEGF-PDGFR βbsAb对VEGF或PDGFR β介导的内皮细胞生长有显著的抑制作用。而且该bsAb对VEGF介导的细胞生长，或者PDGFR β介导的细胞生长的抑制作用与分别使用bevacizumab或anti-PDGFR β单抗效果相近。见图5.抗VEGF-PDGFR β双特异性抗体抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人脑血管周细胞(HBVP)生长体外试验：A.在2nM VEGF-A存在的条件下，HUVECs中分别加入anti-VEGF mAb(bevacizumab)，anti-VEGF scFv和anti-VEGF-PDGFR βbsAb，培养48小时；B.在0.4nM PDGFRβ存在的条件下，HBVP中分别加入anti-PDGFRβmAb，anti-PDGFRβscFv和anti-VEGF-PDGFRβbsAb。(n＝4)
HUVECs细胞附着于Cytodex 3微载体上过夜培养，之后接种人间质干细胞，并将微载体置于含纤维蛋白胶(fibrin gel)的12孔板中(200个微载体/孔)。加入含2ng/mL人HGF的EGM-2培养基，每两天更换新鲜培养基。从第8天开始，加入不同浓度的bevacizumab，anti-PDGFR β单抗或抗VEGF-PDGFR βbsAb。培养7天后，细胞用4％的PFA于4℃固定过夜。HUVECs细胞用抗PECAM抗体及相应的偶联有荧光集团的二抗染色；周质细胞用anti-αSMA-Cy3染色。实验显示，同时加入bevacizumab和anti-PDGFR β单抗对内皮细胞出芽生长(模拟血管新生)有显著的抑制作用；另外加入抗VEGF-PDGFR βbsAb对内皮细胞出芽生长的抑制作用与同时使用两种单抗效果近似。图6.HUVECs和人间质干细胞共培养，测试抗VEGF-PDGFR βbsAb对血管内皮细胞生长，及内皮细胞-周细胞结合的抑制作用：A.Bevacizumab，Bevacizumab+anti PDGFR β和anti-VEGF-PDGFR βbsAb(同为25nM)对新生血管生长的抑制效果；B.不同浓度的Bevacizumab和anti-VEGF-PDGFR βbsAb对新生血管生长的抑制效果。
实施例4
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人鼻咽癌CNE裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验
取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试动物抗肿瘤的效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组尾静脉注射抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体，每天1次，阴性组同时给等量生理盐水。肿瘤体积计算公式：
TV＝0.52×a×b2
其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％
TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV
表3.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人鼻咽癌CNE裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
Figure BDA0000067296260000101
结果：见表3顺铂组10mg/kg，对人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤的抑瘤率为73.68％，但对实验动物的体重具有显著性的影响；恩度组2.5mg/kg，对人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤的抑瘤率为45.10％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高、中、低剂量组对人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤的抑瘤率为55.17％，61.25％，50.45％，对实验动物体重无显著性影响。
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体3mg/kg组对人鼻咽癌CNE移植瘤的生长有最好的抑制作用；与阳性对照顺铂组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。
实施例5
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人甲状腺癌SW-579裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验
取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试动物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组尾静脉注射抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体，每天1次，阴性组同时给等量生理盐水。肿瘤体积计算公式：
TV＝0.52×a×b2
其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％
TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV
表4.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人甲状腺癌SW-579裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
Figure BDA0000067296260000111
结果：见表4，5-Fu(5-氟尿嘧啶)组10mg/kg，对人甲状腺癌SW-579裸小鼠移植瘤的抑瘤率为80.95％，但5-Fu毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡；恩度组2.5mg/kg，对人甲状腺癌SW-579裸小鼠移植瘤的抑瘤率为19.84％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高、中、低剂量组对人甲状腺癌SW-579裸小鼠移植瘤的抑瘤率达40.48％，69.84％，55.56％，对裸鼠体重没有显著性影响。
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人甲状腺癌SW-579裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体3mg/kg组对人甲状腺癌SW-579移植瘤的生长有显著性的抑制作用；与阳性对照顺铂组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。
实施例6
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人胰腺癌SW-1990裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验
取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试动物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组尾静脉注射抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体，每天1次，阴性组同时给等量生理盐水。肿瘤体积计算公式：
TV＝0.52×a×b2
其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％
TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV
表5抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人胰腺癌SW-1990裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
Figure BDA0000067296260000121
Figure BDA0000067296260000131
结果：见表5，5-Fu组10mg/kg，对人胰腺癌SW-1990裸小鼠移植瘤的抑瘤率为78.52％；恩度组2.5mg/kg，对人胰腺癌SW-1990裸小鼠移植瘤的抑瘤率为35.16％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高、中、低剂量组对人胰腺癌SW-1990裸小鼠移植瘤的抑瘤率达77.09％，64.30％，48.77％。
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人胰腺癌SW-1990裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体6mg/kg组和抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体3mg/kg组都对人胰腺癌SW-1990移植瘤的生长有显著性的抑制作用。
实施例7
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人肺癌H460裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验
取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试动物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组尾静脉注射抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体，每天1次，阴性组同时给等量生理盐水。肿瘤体积计算公式：
TV＝0.52×a×b2
其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％
TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV
表6.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人肺癌H460裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
Figure BDA0000067296260000141
结果：见表6，紫杉醇组10mg/kg，对人肺癌H460裸小鼠移植瘤的抑瘤率为70.05％；恩度组2.5mg/kg，对人肺癌H460裸小鼠移植瘤的抑瘤率为23.46％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高、中、低剂量组对人肺癌H460裸小鼠移植瘤的抑瘤率达75.88％，60.64％，34.32％。
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人肺癌H460裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体6mg/kg组和抗VEGF/PDGFR β双特异性抗体3mg/kg组对人肺癌H460移植瘤的生长有显著性的抑制作用。
实施例8
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人食管癌Ec109裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验
取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试动物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组尾静脉注射抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体，每天1次，阴性组同时给等量生理盐水。肿瘤体积计算公式：
TV＝0.52×a×b2
其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％
TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV
表7.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人食管癌Ec109裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
Figure BDA0000067296260000151
Figure BDA0000067296260000161
结果：见表7，紫杉醇组10mg/kg，对人食管癌Ec109裸小鼠移植瘤的抑瘤率为69.41％；恩度组2.5mg/kg，对人食管癌Ec109裸小鼠移植瘤的抑瘤率为50.02％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高、中、低剂量组对人食管癌Ec109裸小鼠移植瘤的抑瘤率达59.54％，78.76％，50.21％％。
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人食管癌Ec109裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体3mg/kg组对人食管癌Ec109移植瘤的生长有显著性的抑制作用。
实施例9
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验
取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试动物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组尾静脉注射抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体，每天1次，阴性组同时给等量生理盐水。肿瘤体积计算公式：
TV＝0.52×a×b2
其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％
TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV
表8.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
Figure BDA0000067296260000171
结果：见表8，紫杉醇组10mg/kg，对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的抑瘤率为75.29％；恩度组2.5mg/kg，对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的抑瘤率为65.45％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高、中、低剂量组对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的抑瘤率达70.71％，81.57％，45.57％。
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体6mg/kg组和抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体3mg/kg组都对人乳腺癌MDA-MB-231移植瘤的生长有显著性的抑制作用。
实施例10
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人肾癌A498裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验
取对数生长期的人肾癌A498细胞株，在无菌条件下后制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表9.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人肾癌A498裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
Figure BDA0000067296260000181
结果：见表9，紫杉醇组10mg/kg，对人肾癌A498裸小鼠移植瘤的抑瘤率为85.53％；恩度组2.5mg/kg，对人肾癌A498裸小鼠移植瘤的抑瘤率为32.57％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高、中、低剂量组对人肾癌A498裸小鼠移植瘤的抑瘤率达71.49％，65.17％，57.33％。
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人肾癌A498裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体6mg/kg组和抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体3mg/kg组对人肾癌A498移植瘤的生长有显著性的抑制作用。
实施例11
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人胆囊癌GBC-SD裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验
取对数生长期的人胆囊癌GBC-SD细胞株，在无菌条件下后制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表10.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人胆囊癌GBC-SD裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
Figure BDA0000067296260000201
结果：见表10，紫杉醇组10mg/kg，对人胆囊癌GBC-SD裸小鼠移植瘤的抑瘤率为76.75％；恩度组2.5mg/kg，对人胆囊癌GBC-SD裸小鼠抑制瘤的抑瘤率为28.53％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高、中、低剂量组对人胆囊癌GBC-SD裸小鼠移植瘤的抑瘤率为58.21％，65.80％，54.85％。
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人胆囊癌GBC-SD小鼠移植瘤的抑瘤率的试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体3mg/kg组对人胆囊癌GBC-SD移植瘤的生长抑制作用最明显。
实施例12
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人结肠癌HT-29裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验
取对数生长期的人结肠癌HT-29细胞株，在无菌条件下后制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表11抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人结肠癌HT-29裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
Figure BDA0000067296260000202
Figure BDA0000067296260000211
结果：见表11，紫杉醇组10mg/kg，对人结肠癌HT-29裸小鼠移植瘤的抑瘤率为67.43％；恩度组2.5mg/kg，对人结肠癌HT-29裸小鼠移植瘤的抑瘤率为32.66％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高、中、低剂量组对人结肠癌HT-29裸小鼠移植瘤的抑瘤率为40.74％，62.04％，51.33％
因此，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人结肠癌HT-29裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体3mg/kg组对人结肠癌HT-29移植瘤的生长有显著性的抑制作用。
实施例13
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人卵巢癌SK-OV-3裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验
取对数生长期的人卵巢癌SK-OV-3细胞株，在无菌条件下后制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；顺铂组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表12.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人卵巢癌SK-OV-3裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
Figure BDA0000067296260000221
结果：见表12，顺铂组10mg/kg，对人卵巢癌SK-OV-3裸小鼠移植瘤的抑瘤率为75.43％；恩度组2.5mg/kg，对人卵巢癌SK-OV-3裸小鼠移植瘤的抑瘤率为22.62％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高、中、低剂量组对人卵巢癌SK-OV-3裸小鼠移植瘤的抑瘤率为59.59％，70.12％，50.08％。
因此，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人卵巢癌SK-OV-3裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体3mg/kg组对人卵巢癌SK-OV-3移植瘤的生长有显著性的抑制作用，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体6mg/kg组对人卵巢癌SK-OV-3移植瘤的生长也有一定的抑制作用。
实施例14
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人宫颈癌HeLa裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验
取对数生长期的人宫颈癌HeLa细胞株，在无菌条件下后制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表13.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人宫颈癌HeLa裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表13，紫杉醇组10mg/kg，对人宫颈癌HeLa裸小鼠移植瘤的抑瘤率为65.34％；恩度组2.5mg/kg，对人宫颈癌HeLa裸小鼠移植瘤的抑瘤率为52.42％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高、中、低剂量组对人宫颈癌HeLa裸小鼠移植瘤的抑瘤率为40.76％，72.04％，51.86％
因此，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人宫颈癌HeLa裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体3mg/kg组对人宫颈癌HeLa移植瘤的生长有显著性的抑制作用。
实施例15
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人前列腺癌DU-145裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验
取对数生长期的人前列腺癌DU-145细胞株，在无菌条件下后制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；顺铂组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表14.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人前列腺癌DU-145裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
Figure BDA0000067296260000241
结果：见表14，顺铂组10mg/kg，对人前列腺癌DU-145裸小鼠移植瘤的抑瘤率为71.38％；恩度组2.5mg/kg，对人前列腺癌DU-145裸小鼠移植瘤的抑瘤率为21.30％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高、中、低剂量组对人前列腺癌DU-145裸小鼠移植瘤的抑瘤率为46.24％，65.72％，56.38％。
因此，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人前列腺癌DU-145裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体3mg/kg组对人前列腺癌DU-145移植瘤的生长有显著性的抑制作用。
实施例16
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人膀胱癌HT1376裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验
取对数生长期的人膀胱癌HT1376细胞株，在无菌条件下后制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表15.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人膀胱癌HT1376裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
Figure BDA0000067296260000251
Figure BDA0000067296260000261
结果：见表15，紫杉醇组10mg/kg，对人膀胱癌HT1376裸小鼠移植瘤的抑瘤率为67.58；恩度组2.5mg/kg，对人膀胱癌HT1376裸小鼠移植瘤的抑瘤率为32.42％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高、中、低剂量组对人膀胱癌HT1376裸小鼠移植瘤的抑瘤率为40.70％，62.03％，51.80％。
因此，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人膀胱癌HT1376裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体3mg/kg组对人膀胱癌HT1376移植瘤的生长有显著性的抑制作用。
实施例17
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体体对人睾丸癌5637裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验
取对数生长期的人睾丸癌5637细胞株，在无菌条件下后制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；顺铂组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体体高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表16.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体体对人睾丸癌5637裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
Figure BDA0000067296260000262
Figure BDA0000067296260000271
结果：见表16，顺铂组10mg/kg，对人睾丸癌5637裸小鼠移植瘤的抑瘤率为80.54％；恩度组2.5mg/kg，对人睾丸癌5637裸小鼠移植瘤的抑瘤率为30.62％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高、中、低剂量组对人睾丸癌5637裸小鼠移植瘤的抑瘤率为58.22％，68.94％，39.56％。
因此，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人睾丸癌5637裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体3mg/kg组对人睾丸癌5637移植瘤的生长有显著性的抑制作用。
实施例18
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对肉瘤HT-1080裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验
取对数生长期的肉瘤HT-1080细胞株，在无菌条件下后制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；环磷酰胺组15mg/kg，每周给药1次；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体以3mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表17.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对肉瘤HT-1080裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
Figure BDA0000067296260000281
结果：见表17，环磷酰胺组10mg/kg，对肉瘤HT-1080裸小鼠移植瘤的抑瘤率为72.65％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体组对肉瘤HT-1080裸小鼠移植瘤的抑瘤率为60.32％。
实施例19
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制实验
去生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试动物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组尾静脉注射多肽，每天1次，阴性组同时给等量生理盐水。肿瘤体积计算公式：
TV＝0.52×a×b2
其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％
TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV
表18.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表18，紫杉醇组10mg/kg，对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植
瘤的抑瘤率为75.29％；恩度组2.5mg/kg，对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的抑瘤率为15.45％；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体高、中、低剂量组对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的抑瘤率达60.71％，61.57％，45.57％。
抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤生长抑制实验结果结果表明，与空白对照组相比，抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体3mg/kg组对人乳腺癌MDA-MB-231移植瘤的生长有显著性的抑制作用。
SEQUENCE LISTING
<110>  常州亚当生物技术有限公司
 <120>  抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用
<130> 
<160>  6    
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  113
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  1
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15     
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
            20                  25                  30         
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45             
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60                 
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80 
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95     
Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
            100                 105                 110        
Lys
 <210>  2
<211>  122
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15     
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr
            20                  25                  30         
Phe Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45             
Ser Gly Ile Ser Pro Ser Gly Gly Met Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60                 
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80 
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95     
Ala Lys Asp Gly Ile Pro Leu Ser Ile Ala Ala Pro Ile Asp Tyr Trp
            100                 105                 110        
 
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120        
<210>  3
<211>  219
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15     
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30         
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45             
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
    50                  55                  60                 
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80 
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95     
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
            100                 105                 110        
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Pro
        115                 120                 125            
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
    130                 135                 140                
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175    
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190        
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
        195                 200                 205            
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
    210                 215                 
<210>  4
<211>  213
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15     
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30         
 
 
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
        35                  40                  45             
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60                 
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80 
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
                85                  90                  95     
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110        
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Thr
        115                 120                 125            
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
    130                 135                 140                
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
                165                 170                 175    
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
            180                 185                 190        
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
        195                 200                 205            
Asn Arg Gly Glu Cys
    210             
<210>  5
<211>  222
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  5
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1               5                   10                  15     
Leu Phe Pro Pro Leu Pro Leu Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
            20                  25                  30         
Gly Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
        35                  40                  45             
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
    50                  55                  60                 
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65                  70                  75                  80 
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Gln Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
                85                  90                  95     
Lys Val Ser Gln Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
            100                 105                 110        
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
        115                 120                 125            
 
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
    130                 135                 140                
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145                 150                 155                 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
                165                 170                 175    
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
            180                 185                 190        
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
        195                 200                 205             
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215                 220        
<210>  6
<211>  5
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  6
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5  
 

Claims (5)

1.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体，其特征在于该抗体由抗VEGF单克隆抗体为基础，并在其FC段末端连接抗PDGFRβ单链抗体构成。
2.根据权利要求1所述的抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体，其特征在于FC段末端通过（GGGGS）3连接抗PDGFRβ单链抗体。
3.根据权利要求1所述的抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体，其特征在于抗VEGF 单克隆抗体由Anti-VEGF A Fab VH-CH、 Anti-VEGF A Fab VL-CL和Fc组成；其中Anti-VEGF A Fab VH-CH的氨基酸序列表为SEQ NO.3、Anti-VEGF A Fab VL-CL的氨基酸序列表为SEQ NO.4、Fc的氨基酸序列表SEQ NO.5。
4.根据权利要求1或2所述的抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体，其特征在于所述的抗PDGFRβ单链抗体由Anti-PDGFR β scFv VL和Anti-PDGFR βscFv VH通过(GGGGS)3连接而成组成；其中Anti-PDGFR β scFv VL的氨基酸序列表为SEQ NO.1、Anti-PDGFR βscFv VH的氨基酸序列表为SEQ NO.2。
5.抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。
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Cited By (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102250249A (zh) * 2011-06-18 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 一种抗VEGF/PDGFRbeta双特异性抗体及其应用
WO2013004842A2 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Genmab A/S Antibody variants and uses thereof
WO2014006217A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
CN103864935A (zh) * 2014-03-06 2014-06-18 中国药科大学 一种靶向egfr/kdr特异性双链抗体
WO2014108198A1 (en) 2013-01-10 2014-07-17 Genmab B.V. Human igg1 fc region variants and uses thereof
WO2015001085A1 (en) 2013-07-05 2015-01-08 Genmab B.V. Humanized or chimeric cd3 antibodies
WO2015109898A1 (zh) * 2014-01-24 2015-07-30 上海恒瑞医药有限公司 VEGF与PDGFRβ双特异性融合蛋白及其用途
WO2016005593A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Genmab A/S Antibodies binding axl
WO2017009258A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Genmab A/S Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
US9650444B2 (en) 2013-01-09 2017-05-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PDGFR-beta antibodies and uses thereof
CN107206074A (zh) * 2014-12-22 2017-09-26 西雅图免疫公司 双特异性四价抗体及其制备和使用方法
CN107428824A (zh) * 2014-06-28 2017-12-01 科达制药 Pdgf/vegf双重拮抗剂
WO2018011421A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Genmab A/S Multispecific antibodies against cd40 and cd137
WO2018083126A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
WO2018146317A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
WO2018162749A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Genmab A/S Antibodies against pd-l1
WO2018178396A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Genmab Holding B.V. Bispecific anti-cd37 antibodies, monoclonal anti-cd37 antibodies and methods of use thereof
WO2018224609A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Genmab B.V. Therapeutic antibodies based on mutated igg hexamers
CN109021104A (zh) * 2017-06-12 2018-12-18 上海睿智化学研究有限公司 一种抗人血小板衍生生长因子β受体的抗体及其应用
WO2019025545A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Genmab A/S BINDING AGENTS BINDING TO PD-L1 AND CD137 AND THEIR USE
CN109608449A (zh) * 2010-12-13 2019-04-12 阵列生物制药公司 作为iii型受体酪氨酸激酶抑制剂的化合物
WO2019145455A1 (en) 2018-01-24 2019-08-01 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
WO2019175198A2 (en) 2018-03-12 2019-09-19 Genmab A/S Antibodies
WO2019211472A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
WO2019243636A1 (en) 2018-06-22 2019-12-26 Genmab Holding B.V. Anti-cd37 antibodies and anti-cd20 antibodies, compositions and methods of use thereof
WO2020012036A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Genmab A/S Variants of cd38 antibody and uses thereof
WO2020012038A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Genmab A/S Trogocytosis-mediated therapy using cd38 antibodies
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
WO2020070313A1 (en) 2018-10-04 2020-04-09 Genmab Holding B.V. Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd37 antibodies
WO2020094744A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 Genmab A/S Antibody formulation
WO2020225456A1 (en) 2019-05-09 2020-11-12 Genmab B.V. Dosage regimens for a combination of anti-dr5 antibodies for use in treating cancer
WO2021089850A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
US11066465B2 (en) 2015-12-30 2021-07-20 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
WO2021144457A1 (en) 2020-01-16 2021-07-22 Genmab A/S Formulations of cd38 antibodies and uses thereof
CN113166249A (zh) * 2018-10-05 2021-07-23 首尔大学校产学协力团 Pdgf受体抗体及其用途
US11071771B2 (en) 2014-10-17 2021-07-27 Kodiak Sciences Inc. Butyrylcholinesterase zwitterionic polymer conjugates
WO2021156258A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 BioNTech SE Treatment involving antigen vaccination and binding agents binding to pd-l1 and cd137
WO2021185934A1 (en) 2020-03-18 2021-09-23 Genmab A/S Antibodies binding to b7h4
US11155610B2 (en) 2014-06-28 2021-10-26 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
WO2022018294A1 (en) 2020-07-23 2022-01-27 Genmab B.V. A combination of anti-dr5 antibodies and an immunomodulatory imide drug for use in treating multiple myeloma
WO2022029011A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 BioNTech SE Binding agents for coronavirus s protein
WO2022049220A2 (en) 2020-09-02 2022-03-10 Genmab A/S Antibody therapy
WO2022069724A1 (en) 2020-10-02 2022-04-07 Genmab A/S Antibodies capable of binding to ror2 and bispecific antibodies binding to ror2 and cd3
WO2022189667A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Genmab A/S Non-activating antibody variants
WO2022234146A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Genmab A/S PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING BISPECIFIC ANTIBODIES BINDING TO B7H4 and CD3
WO2022268740A1 (en) 2021-06-21 2022-12-29 Genmab A/S Combination dosage regime of cd137 and pd-l1 binding agents
WO2023031473A1 (en) 2021-09-06 2023-03-09 Genmab B.V. Antibodies capable of binding to cd27, variants thereof and uses thereof
WO2023057571A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Genmab A/S Antibodies binding to cd30 and cd3
WO2023174952A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Genmab A/S Binding agents binding to epcam and/or cd137
WO2023218051A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023218046A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
US11845805B2 (en) 2020-09-10 2023-12-19 Genmab A/S Bispecific antibody against CD3 and CD20 in combination therapy for treating diffuse large B-cell lymphoma
US11858995B2 (en) 2020-09-10 2024-01-02 Genmab A/S Bispecific antibodies against CD3 and CD20 for treating chronic lymphocytic leukemia
US11912784B2 (en) 2019-10-10 2024-02-27 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102250249A (zh) * 2011-06-18 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 一种抗VEGF/PDGFRbeta双特异性抗体及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102250249A (zh) * 2011-06-18 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 一种抗VEGF/PDGFRbeta双特异性抗体及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《mAbs》 20120228 Robert Mabry等 "A dual-targeting PDGFRbeta/VEGF-A molecule assembled from stable antibody fragments demonstrates anti-angiogenic activity in vitro and in vivo" 20-34 1-5 第2卷, 第1期 *
《Protein Engineering, Design & Selection》 20091231 Robert Mabry等 "Engineering of stable bispecific antibodies targeting IL-17A and IL-23" 1-13 1-5 , *
ROBERT MABRY等: ""A dual-targeting PDGFRβ/VEGF-A molecule assembled from stable antibody fragments demonstrates anti-angiogenic activity in vitro and in vivo"", 《MABS》 *
ROBERT MABRY等: ""Engineering of stable bispecific antibodies targeting IL-17A and IL-23"", 《PROTEIN ENGINEERING, DESIGN & SELECTION》 *

Cited By (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109608449A (zh) * 2010-12-13 2019-04-12 阵列生物制药公司 作为iii型受体酪氨酸激酶抑制剂的化合物
CN102250249A (zh) * 2011-06-18 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 一种抗VEGF/PDGFRbeta双特异性抗体及其应用
WO2013004842A2 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Genmab A/S Antibody variants and uses thereof
EP3970746A2 (en) 2011-07-06 2022-03-23 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
WO2014006217A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
US10023642B2 (en) 2013-01-09 2018-07-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PDGFR-beta antibodies and uses thereof
US9650444B2 (en) 2013-01-09 2017-05-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PDGFR-beta antibodies and uses thereof
EP3738979A1 (en) 2013-01-10 2020-11-18 Genmab A/S Inert format
WO2014108198A1 (en) 2013-01-10 2014-07-17 Genmab B.V. Human igg1 fc region variants and uses thereof
WO2014108483A1 (en) 2013-01-10 2014-07-17 Genmab B.V. Inert format
WO2015001085A1 (en) 2013-07-05 2015-01-08 Genmab B.V. Humanized or chimeric cd3 antibodies
EP3693385A1 (en) 2013-07-05 2020-08-12 Genmab A/S Humanized or chimeric cd3 antibodies
WO2015104346A1 (en) 2014-01-09 2015-07-16 Genmab B.V. Humanized or chimeric cd3 antibodies
CN105026433B (zh) * 2014-01-24 2018-10-19 上海恒瑞医药有限公司 VEGF与PDGFRβ双特异性融合蛋白及其用途
WO2015109898A1 (zh) * 2014-01-24 2015-07-30 上海恒瑞医药有限公司 VEGF与PDGFRβ双特异性融合蛋白及其用途
CN105026433A (zh) * 2014-01-24 2015-11-04 上海恒瑞医药有限公司 VEGF与PDGFRβ双特异性融合蛋白及其用途
CN103864935A (zh) * 2014-03-06 2014-06-18 中国药科大学 一种靶向egfr/kdr特异性双链抗体
US11155610B2 (en) 2014-06-28 2021-10-26 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
CN107428824A (zh) * 2014-06-28 2017-12-01 科达制药 Pdgf/vegf双重拮抗剂
WO2016005593A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Genmab A/S Antibodies binding axl
EP3763738A1 (en) 2014-07-11 2021-01-13 Genmab A/S Antibodies binding axl
US11071771B2 (en) 2014-10-17 2021-07-27 Kodiak Sciences Inc. Butyrylcholinesterase zwitterionic polymer conjugates
US10717783B2 (en) 2014-12-22 2020-07-21 Zeren Gao Bispecific tetravalent antibodies and methods of making and using thereof
CN107206074B (zh) * 2014-12-22 2023-12-01 西雅图免疫公司 双特异性四价抗体及其制备和使用方法
CN107206074A (zh) * 2014-12-22 2017-09-26 西雅图免疫公司 双特异性四价抗体及其制备和使用方法
EP3730520A1 (en) 2015-07-10 2020-10-28 Genmab A/S Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
WO2017009258A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Genmab A/S Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
US11066465B2 (en) 2015-12-30 2021-07-20 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
WO2017121877A1 (en) 2016-01-13 2017-07-20 Genmab A/S Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
WO2018011421A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Genmab A/S Multispecific antibodies against cd40 and cd137
WO2018083126A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
WO2018146317A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
WO2018162749A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Genmab A/S Antibodies against pd-l1
WO2018178396A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Genmab Holding B.V. Bispecific anti-cd37 antibodies, monoclonal anti-cd37 antibodies and methods of use thereof
WO2018224609A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Genmab B.V. Therapeutic antibodies based on mutated igg hexamers
CN109021104A (zh) * 2017-06-12 2018-12-18 上海睿智化学研究有限公司 一种抗人血小板衍生生长因子β受体的抗体及其应用
WO2019025545A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Genmab A/S BINDING AGENTS BINDING TO PD-L1 AND CD137 AND THEIR USE
WO2019145455A1 (en) 2018-01-24 2019-08-01 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
WO2019175198A2 (en) 2018-03-12 2019-09-19 Genmab A/S Antibodies
WO2019211472A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
WO2019243636A1 (en) 2018-06-22 2019-12-26 Genmab Holding B.V. Anti-cd37 antibodies and anti-cd20 antibodies, compositions and methods of use thereof
WO2020012038A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Genmab A/S Trogocytosis-mediated therapy using cd38 antibodies
WO2020012036A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Genmab A/S Variants of cd38 antibody and uses thereof
WO2020070313A1 (en) 2018-10-04 2020-04-09 Genmab Holding B.V. Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd37 antibodies
CN113166249A (zh) * 2018-10-05 2021-07-23 首尔大学校产学协力团 Pdgf受体抗体及其用途
WO2020094744A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 Genmab A/S Antibody formulation
WO2020225456A1 (en) 2019-05-09 2020-11-12 Genmab B.V. Dosage regimens for a combination of anti-dr5 antibodies for use in treating cancer
US11912784B2 (en) 2019-10-10 2024-02-27 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
WO2021089850A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
WO2021144457A1 (en) 2020-01-16 2021-07-22 Genmab A/S Formulations of cd38 antibodies and uses thereof
WO2021156258A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 BioNTech SE Treatment involving antigen vaccination and binding agents binding to pd-l1 and cd137
WO2021155916A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 BioNTech SE Treatment involving antigen vaccination and binding agents binding to pd-l1 and cd137
WO2021185934A1 (en) 2020-03-18 2021-09-23 Genmab A/S Antibodies binding to b7h4
US11261254B1 (en) 2020-03-18 2022-03-01 Genmab A/S Antibodies
WO2022018294A1 (en) 2020-07-23 2022-01-27 Genmab B.V. A combination of anti-dr5 antibodies and an immunomodulatory imide drug for use in treating multiple myeloma
WO2022029011A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 BioNTech SE Binding agents for coronavirus s protein
WO2022049220A2 (en) 2020-09-02 2022-03-10 Genmab A/S Antibody therapy
US11858995B2 (en) 2020-09-10 2024-01-02 Genmab A/S Bispecific antibodies against CD3 and CD20 for treating chronic lymphocytic leukemia
US11845805B2 (en) 2020-09-10 2023-12-19 Genmab A/S Bispecific antibody against CD3 and CD20 in combination therapy for treating diffuse large B-cell lymphoma
WO2022069724A1 (en) 2020-10-02 2022-04-07 Genmab A/S Antibodies capable of binding to ror2 and bispecific antibodies binding to ror2 and cd3
WO2022189667A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Genmab A/S Non-activating antibody variants
WO2022234146A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Genmab A/S PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING BISPECIFIC ANTIBODIES BINDING TO B7H4 and CD3
WO2022268740A1 (en) 2021-06-21 2022-12-29 Genmab A/S Combination dosage regime of cd137 and pd-l1 binding agents
WO2023031473A1 (en) 2021-09-06 2023-03-09 Genmab B.V. Antibodies capable of binding to cd27, variants thereof and uses thereof
WO2023057571A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Genmab A/S Antibodies binding to cd30 and cd3
WO2023174952A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Genmab A/S Binding agents binding to epcam and/or cd137
WO2023174521A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Genmab A/S Binding agents binding to epcam and cd137
WO2023218051A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023218046A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy

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