CN105646710A - 一种全人源化抗vegfr-2单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全人源化抗VEGFR-2的单克隆抗体，并同时公开了采用噬菌体抗体库技术筛选并利用基因工程方法制备所述新型抗VEGFR-2的单克隆抗体或其片段的方法。所述抗体可以是单价抗体或二价抗体。所述抗体可以同时阻断VEGF-A，VEGF-C，VEGF-D和VEGF-E的作用，因而具有更有效的抗血管生成效果，所述抗体可应用于治疗由肿瘤新生血管生成引起的疾病；所述的疾病包括但不局限于下列肿瘤：胃癌及食管胃交界腺癌、非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、肝细胞癌、转移性肝细胞癌、HER2阴性的转移性乳腺癌、转移性结直肠癌、转移性黑色素瘤、转移性肾细胞癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、实体肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型的全人源化抗VEGFR-2的单克隆抗体及其制备方法与用途，属于生物工程技术领域。
背景技术
肿瘤的形成需要周围正常基质、血液成分及淋巴管的支持，新血管的形成是肿瘤生长、侵袭和转移所必须的，研究表明，VEGF及其受体家族在这一过程中扮演非常重要的角色。已被鉴定的VEGF受体为VEGFR-1(Flt-1，fms样酪氨酸激酶)，VEGFR-2(又称为KDR/Flk-1，激酶插入嵌合受体、胎肝激酶-1)，VEGFR-3(Flt-4)，神经纤维蛋白-1(neuropilin-1)，神经纤维蛋白-2。人VEGF受体2(VEGFR-2)，又称为KDR(kinaseinsertdomain-containingreceptor，KDR)是VEGF的主要信号传导受体，其参与新生血管内皮细胞的迁移、增殖、生存，在肿瘤周围血管新生过程中具有重要的作用。因此，抑制VEGF/VEGFR-2途径是抑制肿瘤转移及生长的重要途径。
研究发现，肿瘤血管周围VEGFR-2的表达量与普通血管比较大3-5倍。普遍公认，VEGFR2具有促进细胞有丝分裂、血管形成及增加VEGF因子血管通透性的作用。除内皮细胞内的表达外，在一些肿瘤细胞表面也观察到VEGFR-2的过度表达(如卵巢癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、结肠癌及骨髓增生异常综合症的白血病前体细胞)，在健康的细胞中不表达。因此，相比较以VEGF为靶点，直接靶向肿瘤相关内皮细胞过量表达VEGFR-2抗体更有效低害。抗VEGFR-2抗体可以阻断多种VEGF配体对于受体的作用，而抗VEGF抗体可能仅对某种VEGF配体特异性作用，而对其他多种配体无效。同时因血管内皮细胞与血液直接接触，使药物更加容易到达作用位点。
噬菌体抗体库技术是在噬菌体展示基础上发展起来的，是迄今为止发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。使用该技术已经陆续构建成功免疫抗体库、天然抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库，也用于筛选出高特异的功能性抗体和改进抗体的品质。噬菌体抗体库技术基本路线为用RT-PCR方法扩增抗体全套可变区基因，重组到噬菌体载体中，并通过与丝状噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，把Fab段或ScFv表达到噬菌体表面。通过“吸附－洗脱－扩增”的富集过程，从中筛选出特异性抗体的可变区基因。经研究发现，外源蛋白在P和ⅢPⅥ蛋白的N末端融合表达不会影响噬菌体的完整性和活性。按照展示在噬菌体颗粒表面的抗体片段种类的不同，噬菌体抗体库主要有scFv抗体库和Fab抗体库两种。Fab抗体仅包括VHCH1和VKCK(或VLCL)，scFv是抗体的VH和VK(或VL)通过linker连接成的小分子抗体。Fab和scFv分子小，结构简单，易于穿过组织，表达效率高，有利于肿瘤等疾病的治疗。但这两种形式也分别具有各自的特点：ScFv具有分子小，肿瘤穿透力高的优点，Fab含有两条链，具有难组装、产量低的缺点；scFv的主要问题是易于形成二聚体，但是较易合成，耐受性好。
噬菌体抗体库模拟了天然抗体库，使得人们可以不经过复杂的免疫过程，而是直接利用抗原就可以从抗体库中筛选出特异性抗体成为可能。它既解决了人源性单抗的来源困难、人体杂交瘤系统的低效及鼠单抗的动物源性等难题，也使得单克隆抗体的制备变得简单易行，稳定有效，使人单克隆抗体的制备有了突破。该技术主要特点包括以下几个方面：
1)该技术不经免疫，绕过杂交瘤技术，省时省力，省去了细胞融合的步骤，避免了因杂交瘤不稳定而需要反复亚克隆的繁琐程序。
2)扩大了筛选容量，模拟天然全套抗体库，抗体文库可以达到或超过1011库容，所以能包含B细胞全部克隆。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性。
3)可获得高亲和力的人源化抗体在噬菌体抗体库技术中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。
研究表明，血管内皮生长因子(VEGF)与血管内皮生长因子受体(VEGFR)的结合是触发血管生成的关键步骤。VEGF共有A、B、C、D、E五种不同的同形体(isoform)。VEGFR共有1、2、3三种不同的同形体。阻断它们之间的结合则抑制肿瘤血管生成。Avastin是一个VEGF-A的单克隆抗体。其作用机制是通过与VEGF-A结合，特异性阻断其与受体VEGFR-1或VEGFR-2的结合来达到抑制血管生成的目的。作为VEGF-A的单克隆抗体，Avastin只能阻断VEGF-A的诱导血管生成作用，而不能阻断VEGF-C，VEGF-D和VEGF-E的诱导血管生成作用。为了更好地抑制血管生成，急需研发一种能同时阻断VEGF-A，VEGF-C，VEGF-D和VEGF-E的作用的抗VEGFR-2抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全人源化抗VEGFR-2的单克隆抗体或其片段，编码该单克隆抗体或其片段的多核苷酸的载体、宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法及临床应用。由本发明涉及的抗体基因可变区的序列，可构建全长的抗体分子作为药物用于临床上由于肿瘤新生血管生成所导致的适应症的使用。这些适应症包括但不局限于下列肿瘤：胃癌及食管胃交界腺癌、非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、肝细胞癌、转移性肝细胞癌、HER2阴性的转移性乳腺癌、转移性结直肠癌、转移性黑色素瘤、转移性肾细胞癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、实体肿瘤。
本发明利用噬菌体展示抗体库的技术筛选出高亲和力的针对VEGFR-2(KDR)的抗体。首先建立噬菌体抗体库，通过固相抗原结合淘洗、MIRRORBALL鉴定，最终筛选出6个单克隆抗体，这6个单克隆均表现出较高的抗体亲和力，能够体外抑制人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)细胞增殖，具有很好的生化和生物学活性。
筛选出的6个抗VEGFR-2抗体的轻链可变区氨基酸序列分别如SEQIDNO：1、2、3、4、5、6所示；重链可变区氨基酸序列分别如SEQIDNO：7所示；恒定区氨基酸序列分别如SEQIDNO：8、9所示。本专利氨基酸的中英文名称及其英文缩写如下表。
SEQIDNO1至7序列具体如下：
SEQIDNO1：EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDSSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQHNTFPSTFGQGTKVEIK
SEQIDNO2：
DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSRLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANRFPPTFGPGTKVDIK
SEQIDNO3：DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYDASNLDTGVPSRFSGSGSGTYFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKAFPPTFGGGTKVDIK
SEQIDNO4：
DIQLTQSPSSVSASVGDRVTLTCRASQSIKRWLAWYQQKPGKAPRLLIYAASTLQSGVPSRFSGGGSGTDETLTINSLQPEDFAIYYCQQANSFPPTFGPGTKVDIK
SEQIDNO5：
DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPEDSATYYCQQYSRYPPTFGGGTKVEI
SEQIDNO6：
DIQLTQSPSSVSASVGDSVTITCRASQDISSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTINSLQPEDFATYFCQQADSFPPTFGQGTRLEIK
SEQIDNO7：
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTMVTVSS
本发明技术方案如下：
本发明提供了一种新型全人源化抗VEGFR-2单克隆抗体或其片段，
所述单克隆抗体或其片段的蛋白序列如下所示：
1)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；
2)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；
3)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；
4)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示；
5)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示；
6)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示；
本发明所述的单克隆抗体包括可变区和恒定区，所述恒定区包括轻链恒定区和重链恒定区，所述重链恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种，优选为人IgG1。
本发明所述单克隆抗体轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO：8所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQIDNO：9所示。具体如下：
SEQIDNO8：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQIDNO9：
ASTKGPSVLPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
本发明所述单克隆抗体，重链恒定区序列SEQIDNO：9，所述重链恒定区的第9位氨基酸为亮氨酸，第97位氨基酸为精氨酸。
本发明所述的单克隆抗体的片段包括单链抗体scFv、Fab、F(ab’)2、scfv-FC的形式。
本发明提供了包含编码所述单克隆抗体或其片段的DNA分子的载体，所述载体是Pcantab-5E或pFUSEIgG1-FC。
本发明提供了一种转染上述载体的宿主细胞；所述宿主细胞为CHO细胞。
本发明进一步公开了上述全人源化抗VEGFR-2抗体的制备方法，所述方法为使用编码所述单克隆抗体或其片段的DNA表达载体转染宿主细胞，获得含有所述单克隆抗体或其片段的细胞培养上清液，并经纯化制备目的蛋白。该方法包括从噬菌体人源抗体库筛选获得高亲和力全人源化抗VEGFR-2单链抗体；全人源化抗VEGFR-2完整抗体分子真核表达载体的构建；全人源化抗VEGFR-2完整抗体分子在CHO细胞中的表达；全人源化抗VEGFR-2完整抗体分子的纯化。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有作为活性成分的单克隆抗体或其片段以及一种或几种药学上可接受的缓冲剂或表面活性剂。
作为优选，缓冲剂成分包括能调节pH的任何生理可用物质，例如柠檬酸盐、磷酸盐、组氨酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐及各自的酸或混合物。通常使用的缓冲剂成分是柠檬酸盐和/或其游离酸。
作为优选，表面活性剂是可以在药物组合物中用作表面活性剂的任何赋形剂，如聚乙烯山梨聚糖酯类(Tweens)等。
本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括全人源化抗VEGFR-2抗体或其片段以及一种或几种药学上可接受的可增大皮下组织间隙实现皮下注射给药的物质。
作为优选，所述可增大皮下组织间隙实现皮下注射给药的物质优选为透明质酸酶。
所述药物组合物通过注射剂的方式施用；所述的注射剂通过腹膜内注射、皮下注射或静脉注射的方式施用。
本发明提供了所述单克隆抗体或其片段用途为用于治疗由肿瘤新生血管生成引起的疾病，包括但不局限于下列肿瘤：胃癌及食管胃交界腺癌、非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、肝细胞癌、转移性肝细胞癌、HER2阴性的转移性乳腺癌、转移性结直肠癌、转移性黑色素瘤、转移性肾细胞癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、实体肿瘤。
本发明是利用ScFv噬菌体展示抗体库的技术和高通量筛选的方法，筛选出高亲和力的针对VEGFR-2(KDR)的全人源化抗体，本发明筛选的抗VEGFR-2的抗体可以同时阻断VEGF-A，VEGF-C，VEGF-D和VEGF-E的作用，因而具有更有效的抗血管生成效果，此抗体可应用于由肿瘤新生血管生成导致的疾病的治疗。
附图说明
图1目的抗体经ProteinA纯化后洗脱曲线；
图2目的抗体还原型SDS-PAGE分子量及纯度电泳图；
图3目的抗体与靶点结合活性ELISA分析图；
图4目的抗体抑制人脐带静脉内皮细胞增殖活性图；
具体实施方式
以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。因此，凡基于本发明所述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本文引用的参考文献以其全文通过引用并入本文。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1抗体库的构建与筛选分离
1、抗体库的构建
本发明中所用单链抗体库是人的天然抗体库，其主要构建流程是：
(1)从人外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，Trizol提取总mRNA并逆转录为cDNA；
(2)根据人免疫球蛋白基因序列库(如Kabatdatabase，V-base，IMGT等)，设计一组数对带有简并序列的抗体重链和轻链引物通过PCR技术扩增不同的VH和VL基因片段，通过linker区拼接成全长scFv单链抗体；
所用引物碱基序列如下：
VHback(扩增重链可变区VH引物)
HuVH1B/7A-BACK5‘-CAGRTGCAGCTGGTGCARTCTGG-3‘
HuVH1C-BACK5‘-SAGGTCCAGCTGGTRCAGTCTGG-3’
HuVH2B-BACK5‘-CAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGG-3‘
HuVH3B-BACK5‘-SAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3‘
HuVH3C-BACK5’-GAGGTGCAGCTGGTGGAGWCYGG-3‘
HuVH4B-BACK5‘-CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG-3‘
HuVH4C-BACK5‘-CAGSTGCAGCTGCAGGAGTCSGG-3‘
HuVH5B-BACK5’-GARGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3‘
HuVH6A-BACK5‘-CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG-3‘
VHforward
HuJH1/2-FOR5′ˊ-TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3‘
HuJH3-FOR5‘-TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC-3‘
HuJH4/5-FOR5’-TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC-3’
HuJH6-FOR5‘-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3‘
Vκback/Vλback(扩增轻链可变区Vκ、Vλ引物)
HuVκ1B-BACK5‘-GACATCCAGWTGACCCAGTCTCC-3‘
HuVκ2-BACK5‘-GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC-39
HuVκ3B-BACK5‘-GAAATTGTGWTGACRCAGTCTCC-3‘
HuVκ4B-BACK5‘-GATATTGTGATGACCCACACTCC-3‘
HuVκ5-BACK5‘-GAAACGACACTCACGCAGTCTCC-3‘
HuVκ6-BACK5’-GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC-3‘
HuVλ1A-BACK5’-CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACC-3‘
HuVλ1B-BACK5‘-CAGTCTGTGYTGACGCAGCCGCC-3‘
HuVλ1C-BACK5‘-CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCC-3‘
HuVλ2-BACK5‘-CARTCTGCCCTGACTCAGCCT-3‘
HuVλ3A-BACK5‘-TCCTATGWGCTGACTCAGCCACC-3‘
HuVλ3B-BACK5‘-TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC-3‘
HuVλ4-BACK5‘-CACGTTATACTGACTCAACCGCC-3’
HuVλ5-BACK5‘-CAGGCTGTGCTGACTCAGCCGTC-3‘
HuVλ6-BACK5‘-AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA-3‘
HuVλ7/8-BACK5‘-CAGRCTGTGGTGACYCAGGAGCC-3‘
HuVλ9-BACK5‘-CWGCCTGTGCTGACTCAGCCMCC-3‘
(3)将获得的scFv经过SfiⅠ酶切，切胶回收后与经过SfiⅠ酶切的噬粒PS100连接，连接产物经过纯化后回收定量，电转化感受态细胞TG1，构建抗体库。得到库容量为5.5×109的全套抗体库，通过扩增纯化得到噬菌体展示抗体库的滴度为3.5×1011CFU/mL；用50％甘油/PBS溶液调整噬菌体储液浓度，使其达到1013转染单位/ml；将储液以每管1ml的量分装，储存于-80℃；每轮筛选使用一管，通过聚乙二醇沉淀的方法除去甘油，将噬菌体重悬于1ml后期筛选所使用的缓冲液中；
(4)抗体库的鉴定及抗体基因序列分析
随机挑取数个VH+Vκ和VH+Vλ克隆进行测序，结果表明它们都是由人抗体V区基因组成的scFv基因序列，该抗体库的阳性重组率为100％。DASTAR分析结果表明，抗体库基因序列各不相同，表明初级抗体库具有较好的多样性。同时，序列分析结果表明有75％的scFv序列翻译完全正确。
2、筛选目的抗体，其方法如下：
(1)将VEGFR-2蛋白固定在免疫管上；加入噬菌体抗体库，将免疫管封口，旋转仪上混合
90分钟；
(2)加入PBST洗涤10次，再用PBS洗涤10次，去除未结合的噬菌体抗体；
(3)在免疫管中加入1ml三乙胺，将结合在免疫管上的噬菌体抗体洗脱；将洗脱下来的噬菌体重新感染对数生长期的TG1大肠杆菌，过夜培养，扩增噬菌体，PEG/NaCl沉淀纯化的噬菌体用于下一轮筛选；共进行3～4轮噬菌体库富集筛选；
(4)3～4轮筛选后，将洗脱下来的噬菌体感染TG1细胞，涂布平板，挑取单克隆菌落；
(5)对挑选的噬菌体克隆进行鉴定，挑选与VEGFR-2亲和力结合力高的克隆。
3、单克隆噬菌体鉴定
最后一轮的洗脱产物测滴度，挑100个单克隆噬菌体做mirrorball检测，将链霉亲和素化微珠(购自Invitrogen公司)、生物素化VEGFR-2、单克隆噬菌体上清、兔抗FD噬菌体抗体(购自Jackson公司)、羊抗兔-FITC二抗(购自Jackson公司)加进96孔板，孵育过夜读数，结果显示阳性60个，弱阳性20个，阴性20个。测定了40个抗体序列，得到6个独特单克隆抗体，可变区序列分别如SEQIDNO：1-6所示。
实施例2高表达量工程细胞株的构建与表达
1、抗体的克隆与转染
(1)将筛选的可变区序列为SEQIDNO：1-6所组成的单链抗体采用常规基因克隆的方法，克隆到FC融合真核表达载体Pcantab-5E或pFUSEIgG1-FC表达全长抗体的载体中。通过酶切和测序的方法鉴定抗体基因的正确插入，然后进行转染和抗体分泌表达。
(2)转染前24小时，消化后将1×105/mL细胞密度的HEK293T/17细胞接种于6孔板中，培养过夜。取两支装200ul无血清培养基的试管，加入1ugDNA工作液，混匀，室温孵5分钟，将2ulPEI(聚乙烯亚胺聚合物)稀释液快速加入DNA稀释液中，立即涡旋15秒，室温孵育30分钟到1小时(无浑浊)；
(3)弃细胞培养上清液(尽量保留细胞)，加入700uL培养基，将PEI、DNA混合液快速、逐滴、轻柔地沿壁加入细胞中，培养4-6h，换成2mL的新鲜的培养基，培养48h，取少量上清做ELISA，检测转染效率，剩下细胞继续培养2-4天。
2、抗体表达细胞株的构建和表达
所用的宿主细胞可以是谷氨酰胺合成酶GS表达系统或者二氢叶酸还原酶DHFR表达体系。构建细胞株的方法如下：
(1)lipo2000转染方法将目的质粒转入到CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞，ChineseHamserOvary)中。培养基为无蛋白无血清无动物成分，培养条件是36-38℃，5-10％CO2的潮湿无菌环境。转染24小时后，细胞接种到96孔板、不含谷氨酰胺但含有100～1000ug/mlG418及25微摩尔浓度MSX(L-蛋氨酸亚砜胺，若为DHFR表达系统则添加MTX，并添加4mM/L谷氨酰胺)的CD-CHO(Gibco公司)培养基中。
(2)每三天更换一次培养基。通过12天的培养和筛选，活细胞长成显微镜可见的克隆。转移50个克隆到24孔板中继续培养9天。使用FCELISA的方法测定克隆的PCD(pg/cell/day)；选取PCD最好的13个克隆继续放大到50毫升中培养并测定PCD。其中最好的6个克隆进一步采用有限稀释法挑选亚克隆。大概21天后，测定第二轮筛选亚克隆的PCD。最高PCD的3个克隆(A139、A140、A141)作为候选细胞株建立细胞库。
3、抗体的纯化和SDS-PAGE分析
取转染后细胞培养的上清液。采用GEHiscale50/20亲和层析柱层析，分离目的蛋白，实验流程如下：
(1)将缓冲液充满管道并排除气泡，在10ml/min流速下连接柱子；
(2)用除热源洗涤液洗涤1小时(10ml/min)；
(3)用超纯水洗涤3个CV后，用3个CV的平衡液平衡介质，UV校零；
(4)40ml/min的流速下上样，共上样1.9L；
(5)用平衡液洗去未结合成分至回到UV基线(约2倍CV)；
(6)用洗涤液1作为第一步洗涤，洗脱体积为5倍CV；
(7)用5倍CV的洗涤液2平衡介质；
(8)用2～3倍CV的洗脱缓冲液进行洗脱，当OD280上升至50mAu开始收集洗脱蛋白于1L已除热源的塑料瓶中，当基线下降至300mAu左右时停止收集洗脱蛋白(共收集406ml，浓度为10.12mg/ml)。缓慢加入2MTris母液将其pH调节为3.8，室温下放置1h后缓慢调节pH至6.5，2-8℃放置30min，并用0.22um膜过滤去除浑浊样微粒，置于-20℃保存。
洗脱曲线如图1所示。取纯化后的蛋白，采用还原条件的SDS-PAGE方法，分析纯化产物分子量，重链50.0±5.0kD，轻链27.0±2.7kD；还原SDS-PAGE方法测定产品纯度，单体≥95％，结果如图2所示。
实施例3抗体的生化和生物学功能的鉴定
1、抗体的亲和力检测
运用BiacoreT100(BiacoreAB，Uppsala，Sweden)检测3个克隆(A139、A140、A141)的目的抗体样品的亲和力常数。将参比品VEGF165(R&D公司产品)通过氨基共价结合与CM5生物传感芯片(GEHealthcare)上，测定待测抗体的RU响应值，根据结果确定合适的抗体浓度，通常在100-200RU为宜。然后测试抗原VEGFR2的浓度，确定抗原浓度范围和接触时间。最后使用kinetics/affinity方法，测定测试抗体的动力学参数和亲和力。结果见表1。
表1亲和力试验结果
由表中可以看出，不同抗体表现出不同动力学特性，A140具有最快的结合活性，A141解离常数最大。比较各抗体Kd值：A140＜A139＜VEGF165＜A141，说明全人源化抗体A140的亲和力显著高于A141，明显高于VEGF165，略高于A139。抗体氨基酸测序结果(SEQIDNO：9)，与人Iggamma-1chainCregion氨基酸序列(Uniprot登录号#P01857)对比，发现A140重链恒定区氨基酸第9位由F突变为L，第97位由天然K突变为R，抗体亲和力高于A139。
2、抗体的结合特异性检测
参考《重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白受体结合活性检测方法的改进》，中国生物制品学杂志2012年9月第25卷第9期方法：
抗VEGFR2单抗通过与靶标抗原VEGFR2的特异结合而发挥作用，本方法直接包被VEGFR2来检测不同浓度的供试品与其结合的能力。采用夹心ELISA法对系列稀释的抗VEGFR2单抗供试品(A139，A140)和参比品进行检测，使用四参数方程拟合，建立试验成立标准的规定，保证参比品和供试品反应曲线的平行或一致，计算二者的半数有效浓度(EC50)，分析其受体结合活性。
计算公式：样品相对抗原结合活性(％)＝参比品EC50/样品EC50×100％。
抗体结合活性为参比品的100.4％，结果如图3所示。A140结合活性、生物学活性与参比品一致。
3、抗体的细胞抑制生物学活性
具体步骤为：
(1)稀释：分别取参比品和样品(抗体原液)，采用无血清的EBM-2培养基，稀释至20μg/ml作为第一个上样浓度，再在96孔细胞培养板中按2倍稀释度进行系列稀释，共稀释10个稀释度。
(2)接板：取HUVEC细胞，消化计数后，按1.5×105cells/ml，100μl/孔接种于稀释好样品的96孔板内。
(3)染色：细胞核样品共同培养4d后，采用Alamarblue进行染色，20μl/孔，根据各浓度的荧光值，拟合4参数曲线，计算EC50值。
(4)计算：样品相对生物学活性(％)＝参比品EC50/样品EC50×100％
结果表明，抗体生物学活性为参比品的80～125％，符合质量标准。全人源化抗体A139、A140、A141以及VEGF165-1和VEGF165-2均可有效抑制VEGF引起的HUVEC细胞增殖，且相对生物活性A140>A139>A141。如图4所示，是抗体A140抑制HUVEC细胞增殖活性结果。
实施例4抗体的组合物筛选
选择不同的制剂配方，经DOE高通量筛选，按含抗体10mg/ml浓度灌装50ml/瓶，进行高温、震荡、冻融加速试验，检测不溶性微粒，样品纯度(包括聚体、降解物)等指标，并采用DSC(Differentialscanningcalorimetry)作制剂稳定性分析。结果见表2
结果表明，各抗体组合物配方不溶性颗粒检测均符合2010版药典规定；SEC-HPLC分析样品纯度≥95％，聚体≤1％；结合DSCpH6.0、pH6.5、pH7.0三个制剂的Tm1值进行比较(样品pH6.0：Tm1为73.07，pH6.5为Tm1：72.04，pH7.0为72.36；)，结果表明在pH6.0～pH7.0的条件下样品的稳定性总体表现的较好。
表2SEC-HPLC纯度检测
最终确定抗体组合物较优配方3组(含抗体10mg/ml)，即F1：甘氨酸：9.98mg/ml，组氨酸：0.65mg/ml，盐酸组氨酸：1.22mg/ml，氯化钠：4.383mg/ml，吐温80:0.1mg/ml，pH：6.0±0.2；F2：磷酸二氢钠：0.4mg/ml，磷酸氢二钠1.32mg/ml，氯化钠8.48mg/ml，0.01％吐温80，pH：6.5±0.2；F3：磷酸二氢钠：0.4mg/ml，磷酸氢二钠1.32mg/ml，氯化钠8.48mg/ml，柠檬酸2mg/ml，pH：5.8±0.2。
实施例5抗体的组合物筛选
选择实施例4中F1的组合物，选取抗体浓度为120mg/ml的样品三份，其中一份添加透明质酸酶16000U/ml(标记为S1)，另两份不添加(标记为S2和S3)。其中S1及S2于37℃高温避光条件进行抗体稳定性考察，主要指标为活性和纯度。S3为2-8℃避光保存的活性对照样品，结果见表3。
结果表明，两份样品制备及放置过程活性及纯度均一致，表明添加透明质酸酶对产品稳定性无影响，本品此组合物有用于皮下注射给药的可能性。
表3组合物活性及纯度变化
Claims (10)
1.一种全人源化抗VEGFR-2单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其片段的蛋白序列如下所示：
1)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；
或2)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；
或3)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；
或4)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示；
或5)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示；
或6)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述的单克隆抗体包括可变区和恒定区，所述恒定区包括轻链恒定区和重链恒定区，所述重链恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种，优选为人IgG1。
3.根据权利要求2所述单克隆抗体或其片段,其特征在于，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO：8；重链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO：9所示。
4.根据权利要求1-3所述单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述单克隆抗体的片段包括单链抗体scFv、Fab、F(ab’)2、scfv-FC的形式。
5.一种制备权利要求4所述单克隆抗体或其片段的方法，所述方法为使用编码所述单克隆抗体或其片段的DNA表达载体转染宿主细胞，获得含有所述单克隆抗体或其片段的细胞培养上清液，并经纯化制备目的蛋白。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体或其片段以及一种或几种药学上可接受的缓冲剂或表面活性剂。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物通过注射剂的方式施用；所述注射剂通过腹膜内注射、皮下注射、肌肉注射或静脉注射的方式施用。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体或其片段以及一种或几种药学上可接受的可增大皮下组织间隙实现皮下注射给药的物质。
9.根据权利要求8所述药物组合物,其特征在于，所述可增大皮下组织间隙实现皮下注射给药的物质优选为透明质酸酶。
10.权利要求1-3中任一项的单克隆抗体或其片段在制备治疗由肿瘤新生血管生成引起的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述的疾病包括但不局限于下列肿瘤：胃癌及食管胃交界腺癌、非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、肝细胞癌、转移性肝细胞癌、HER2阴性的转移性乳腺癌、转移性结直肠癌、转移性黑色素瘤、转移性肾细胞癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、实体肿瘤。
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