KR102276489B1 - 개선된 항vegfr-2 모노클로널 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생물 의약 기술분야에 관한 것으로, 개선된 항VEGFR-2 모노클로널 항체 및 그 응용을 제공한다. 본 발명에 의하면 컴퓨터 보조 모의 설계를 수행하여 새로운 파지항체 라이브러리를 설계하였고 여러차례 선별을 통하여 개선된 항VEGFR-2 모노클로널 항체를 얻었거 상기 항체의 친화력과 생물학 활성이 모두 원래 항체보다 높고 체외에서 양호하게 VEGFR-2와 그 리간드 VEGF의 결합을 억제하고 종양과 황반 변성 등 신생 혈관으로 인한 질병의 치료에 이용될 수 있다.

Description

개선된 항VEGFR-2 모노클로널 항체
본 발명은 생물 제약 기술 분야에 관한 것으로, 특히 개선된 항VEGFR-2 모노클로널 항체(Improved Anti-VEGFR-2 Monoclonal Antibody)에 관한 것이다.
종양의 성장이 새로운 혈관의 형성에 의거하여 이루어짐에 대하여 이미 종양 생물학 분야에서 철저히 연구하였다. 혈관이 신생되면 산소, 영양분, 성장 요소, 호르몬 및 단백질 가수 분해촉매를 제공하게 되어 종양 세포의 먼곳으로의 확산과 전이를 촉진하고 종양의 성장과 악화를 가속화한다. 혈관 신생은 아주 복잡한 동적 과정으로 많은 촉진/억제 혈관 신생분자에 의하여 조절된다. 혈관 신생 스위치는 혈관 신생의 촉진이 혈관 신생의 억제를 초과하는 악성 부호이다. VEGF/VEGFR축이 다중 신호 네트워크를 트리거하여 상피 세포 생존, 유사 분열, 전이와 분화, 혈관 침투, VEGF 및 그 수용체의 정상 및 병리적 혈관 신생 과정에서 중추적인 역할을 일으킨다. 여러가지 암에 있어서 증가된 종양 혈관화 작용과 종양 촉진 혈관 신생 인자의 발현이 종양의 계층과 악성 여부와 관련됨이 증명되었다.
혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF)는 혈관 투과 인자로도 불리우고 내피 세포의 특이성 유사 분열원으로 유효한 혈관 형성과 투과성 유도 인자이며, 감정된 대응되는 수용체는 VEGFR-1(Flt-1, FMS식 타이로신 키나아제1(FMS-like tyrosine 1)), VEGFR-2(KDR/Flk-1로도 불리움, 키나아제 합입 감합 수용체(kinase insert domain-containing receptor), 태아간 키나아제-1(fetal liver kinase-1)), VEGFR-3(Flt4), 뉴로필린-1(neuropilin-1), 뉴로필린-2이다. VEGFR-2는 혈관 내피 세포상의 주요 VEGF 수용체로, 당단백이고 세포 외 영역에 7개 면역글로불린 샘플 영역을 포함하고(리간드 결합 영역(ligand binding domains)과 수용체 이합체화 결합 영역(receptor dimerization structure domains)을 포함), 세포내에 타이로신 키나아제 촉매 결합 영역(tyrosine kinase catalysis structure domain)이 삽입되고 주로 내피 세포상에서 발현되며, 기타는 거핵 세포, 망막전구 세포(retina ancestor cells), 중간엽 줄기세포, 악성흑색종 세포, 뇌종양과 일부 백혈병 세포 등 종양 세포에서 발현된다. VEGF와 VEGFR-2 수용체는 핵심 혈관 내피 세포 특이 인자 신호 전달 경로의 분자로 종양 신생 혈관의 생성에 참여하고 VEGF의 주요 생물학적 기능은 모두 VEGFR-2를 통하여 실현되고, VEGFR-2와 VEGF가 결합된 후 이합체화가 일어나고 VEGFR-2 세포내의 타이로신 잔기 자신이 인산화되어 활성화되고 세포막/세포질 키나아제 연속단계 반응 신호(cytomembrane/cytoplasm kinase cascade reaction signals)를 세포핵으로 전달하여 혈관 내피 세포 증식, 생존, 세포 골격 재배열, 세포 이동 및 유전자 발현 등을 포함한 내피 세포의 일련의 변화를 가져오고 최종적으로 혈관 증생을 가져온다.
VEGF/VEGFR2 신호 통로가 종양의 발생 발전에서 핵심 작용을 일으키므로 예를 들어 항VEGF 항체 베바시주맙(anti-VEGF antibody bevacizumab)과 항VEGFR-2의 항체 라무시루맙(anti-VEGFR-2 antibody ramucirumab) 등 VEGF/VEGFR2의 신호 통로에 대한 약물은 많다.
항체는 생물 의약 분야에서 기술 함량이 가장 높고 난도가 가장 큰 약물로, 2012년으로부터 전세계 매출액 톱 10위의 단품 약중의 6개가 항체유 약물이므로 항체유 약물 시장의 발전 잠재력은 아주 크다. 항체 약물 선별에 가장 널리 이용되고 있는 기술은 파지항체 라이브러리 기술이고(phage antibody library technology), 파지항체 라이브러리 기술은 파지 디스플레이 기술로부터 발전된 유전자 항체 공정의 새로운 기술로 서로다른 종류의 물질을 함유하는 모든 항체 가변 영역 유전자의 유전자풀을 파지 표면에 디스플레이된 단백질 라이브러리로 변환시켜 모노클로널 항체의 생산이 더욱 간단하고 빠르며 효율적으로 체외에서 수행될 수 있고 모노클로널 항체 인간화의 새로운 루트를 개척하여 인류의 모노클로널 항체 생산의 발전을 촉진하였다. 당사의 특허번호가 CN103333247 B인 특허가 바로 컴퓨터 보조 설계와 파지항체 라이브러리 기술(phage antibody library technology)에 의하여 선별하여 얻은 일련의 항VEGFR-2의 항체에 관한 것인데 항VEGFR-2의 항체 약물을 얻기 위하여 기반을 다졌고 진일보의 연구를 거쳐 상기 특허에 따른 항체가 친화력과 생물 활성 등 측면에서 진일보의 향상 가능성이 있음을 발견하였고 이에 기반하여 원래 연구에 근거하여 상기 항체에 개선성 최적화를 수행하였다.
본 발명은 개선된 항VEGFR-2 모노클로널 항체를 제공한다. 본 발명은 CN103333247B특허중의 친화력이 가장 높은 두개를 모델로 하여 컴퓨터 보조 모의 설계를 수행하여 새로운 파지항체 라이브러리(new phage antibody library)를 설계하였고 여러차례 선별을 통하여 하나의 친화력과 생물학 활성이 모두 높은 원 특허 항체의 새로운 항VEGFR-2 모노클로널 항체를 얻었다.
상기 목적을 실현하기 위하여, 본 발명에 따르면, 경쇄(light chain)와 중쇄(heavy chain)를 포함하고, 상기 경쇄 가변영역의 아미노산배열이 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3중의 임의의 한가지를 포함하고, 상기 중쇄 가변영역의 아미노산배열이 SEQ ID NO:4를 포함하는 개선된 항VEGFR-2 모노클로널 항체를 제공한다.
삭제
여기서, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 경쇄 가변영역 또는 상기 중쇄 가변영역을 포함하는 항체, 폴리펩티드(polypeptide) 또는 단백질을 제공한다.
여기서, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 경쇄 가변영역 또는 상기 중쇄 가변영역 아미노산배열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드배열(polynucleotide sequence)을 제공한다.
여기서, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 폴리뉴클레오티드배열 또는 조합을 포함하는 재조합 DNA 발현 담체를 제공하고, 상기 재조합 DNA 발현 담체에 항VEGFR-2 항체를 코딩한 상기 중쇄 가변영역, 중쇄 불변 영역, 경쇄 가변영역과 경쇄 불변 영역의 DNA 배열을 포함한다.
삭제
여기서, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 재조합 DNA 발현 담체를 트랜스펙션하는 숙주 세포를 제공하는데, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 대장균 또는 효모를 포함하고, 포유동물 세포를 포함하는 것이 바람직하고, HEK293E 세포, CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 또는 NS0 세포를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
여기서, 본 발명의 중쇄 불변 영역은 인간(human)의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 마우스(mouse)의 IgG1, IgG2a, IgG2b로부터 선택되는 것이다.
여기서, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 경쇄 가변영역 또는 상기 중쇄 가변영역을 포함하는 완전항체(complete antibody)를 제공한다.
여기서, 본 발명에 따르면 진일보로, 단편을 제공하고, 상기 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 ScFv를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
삭제
여기서, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 경쇄 가변영역 또는 상기 중쇄 가변영역을 포함하는 아미노산배열의 단쇄 항체（single-chain antibody）, 단일 도메인 항체, 이중 특이성 항체, 항체 약물 접합체(antibody medicine conjugate)와 키메라 항원 수용체T 세포 면역 치료법을 제공한다.
여기서, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 경쇄 가변영역 또는 상기 중쇄 가변영역을 포함하는 모노클로널 항체, 인공 담체, 약물 또는 약물 조합물을 제공한다.
여기서, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 경쇄 가변영역 또는 상기 중쇄 가변영역을 포함하는 검사 시제 또는 키트(kit)를 제공한다.
여기서, 상기 항체는 신생 혈관에 의한 질병의 치료에 이용될 수 있고 상기 질병은 종양과 황반 변성(macular degeneration)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
여기서, 상기 ScFv는 단쇄 항체(single-chain fragment variable)이고, 상기 HEK293E 세포는 인간 배아 신장 293E 세포(human embryonic kidney 293E cell)이며, CHO 세포는 중국 햄스터 난소 세포(chinese hamster ovary cell)이고, NS0 세포는 마우스 NS0 흉선암 세포(mouse NS0 thymoma cell)이다.
본 발명은 기존 기술에 비하여 하기와 같은 장점을 구비한다 :
본 발명에서 제공하는 항VEGFR-2 모노클로널 항체는 높은 친화력을 가지고 체외에서 양호하게 VEGFR-2와 그 리간드 VEGF의 결합을 억제하고 체외에서 우수한 생물학 활성을 가지며 개발 전망이 넓다.
본 발명에서 제공하는 항VEGFR-2 모노클로널 항체는 비소세포폐암, 전이성 비소세포폐암, 신경교종, 대장암, 간세포암, 전이성 간세포암, HER2 음성 전이성 유방암, 전이성 위선암, 전이성 대장암, 전이성 악성흑색종, 전이성 신장세포암 등 암 및 황반 변성(macular degeneration) 등 종양 신생 혈관의 생성으로 인한 질병의 치료에 이용될 수 있다.
도 1은 pScFvDisb-S 플라스미드 지도이다.
도 2는 기울기 ELISA 방법으로 항VEGFR-2 단쇄 항체의 상대적 친화력을 비교한 것을 나타내였다.
도 3은 단백질 발현 pTSE 플라스미드 지도이다.
도 4는 항VEGFR-2 모노클로널 항체와 KDR의 결합력 비교 결과이다.
도 5는 본 발명의 항체와 세포 표면의 VEGFR-2 결합 상황을 나타내였다.
도 6은 본 발명의 항체의 인간 제정맥 내피 세포（HUVEC）증식에 대한 억제 작용을 나타내였다.
본 발명의 상세한 실시방법은 실시예를 참조할 수 있고 실시예에서 설명한 실험 방법과 시제의 경우 특별한 설명이 없을 경우 통상적인 실험 방법과 시제를 말한다. 아래 실시예는 본 발명을 설명하고 해석하기 위한 것으로 본 발명을 제한하는 것이 아니다.
본 발명에 따르면 개선된 항VEGFR-2 모노클로널 항체를 제공하는데
경쇄와 중쇄를 포함하고 상기 경쇄 가변영역의 아미노산배열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3중의 임의의 한가지를 포함하고 상기 중쇄 가변영역의 아미노산배열은 SEQ ID NO:4를 포함하며, 그중,
SEQNO.1(VEGFR-2 light chain variable region sequence 1, VEGFR-2 경쇄 가변영역 배열1) : DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQAIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYEGSNLNTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDIK;
SEQ ID NO:2(VEGFR-2 light chain variable region sequence 2, VEGFR-2 경쇄 가변영역 배열2)： DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASDAIDQWLGWYQQKPGKAPKLLIYEASNLDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQANQFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDIK;
SEQ ID NO:3(VEGFR-2 light chain variable region sequence 3, VEGFR-2 경쇄 가변영역 배열3): DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDQWLGWYQQKPGKAPKLLIYEGSNLNTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQANQFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDIK;
SEQNO.4(VEGFR-2 heavy chain variable region sequence 1, VEGFR-2 중쇄 가변영역 배열1) :
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASAFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDLWGQGTMVTVSS이다
바람직하게, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 경쇄 가변영역 또는 상기 중쇄 가변영역을 포함하는 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 제공한다.
더욱 바람직하게, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 경쇄 가변영역 또는 상기 중쇄 가변영역 아미노산배열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드배열을 제공한다.
삭제
더욱 바람직하게, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 폴리뉴클레오티드배열 또는 조합을 포함하는 재조합 DNA 발현 담체를 제공하고, 상기 재조합 DNA 발현 담체에 항VEGFR-2 항체를 코딩한 상기 중쇄 가변영역, 중쇄 불변 영역, 경쇄 가변영역과 경쇄 불변 영역의 DNA 배열을 포함한다.
더욱 바람직하게, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 재조합 DNA 발현 담체를 트랜스펙션하는 숙주 세포를 제공하고, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 대장균 또는 효모를 포함하고, 포유동물 세포를 포함하는 것이 바람직하고, HEK293E 세포, CHO 세포 또는 NS0 세포를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
더욱 바람직하게, 본 발명의 중쇄 불변 영역은 인간의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 마우스의 IgG1, IgG2a, IgG2b로부터 선택된다.
더욱 바람직하게, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 경쇄 가변영역 또는 상기 중쇄 가변영역을 포함하는 완전항체를 제공하고, 상기 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 ScFv를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
삭제
더욱 바람직하게, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 경쇄 가변영역 또는 상기 중쇄 가변영역을 포함하는 아미노산배열의 단쇄 항체（single-chain antibody）, 단일 도메인 항체, 이중 특이성 항체, 항체 약물 접합체와 키메라 항원 수용체T 세포 면역 치료법을 제공한다.
더욱 바람직하게, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 경쇄 가변영역 또는 상기 중쇄 가변영역을 포함하는 모노클로널 항체, 인공 담체, 약물 또는 약물 조합물을 제공한다.
더욱 바람직하게, 상기 모노클로널 항체는 모두 인간의 항체(full-human antibody)으로부터 얻은 것이다.
더욱 바람직하게, 본 발명에 따르면 진일보로, 상기 경쇄 가변영역 또는 상기 중쇄 가변영역을 포함하는 검사 시제 또는 키트(kit)를 제공한다.
더욱 바람직하게, 상기 항체는 신생 혈관으로 인한 질병의 치료에 이용될 수 있고, 그중 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 전이성 비소세포폐암(metastatic non-small cell lung cancer), 신경교종(gliomas), 대장암(colorectal cancer), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 전이성 간세포암(metastatic hepatocellular carcinoma), HER2 음성 전이성 유방암, 전이성 위선암, 전이성 대장암, 전이성 악성흑색종, 전이성 신장세포암 등 암 및 황반 변성(macular degeneration) 등 질병을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
구체 실시예
아래 도면과 실시예를 결합하여 본 발명을 상세하게 설명한다.
실시예1 , 항VEGFR -2의 단쇄 항체의 바이오패닝
일련의 유전자 클론 방법을 이용하여 담체 pCom3 담체(purchased from the Biovector Science Lab, Inc.,중국 플라스미드 담체 군주 세포주 유전자 기탁 센토로부터 구입)를 개조하여 파지 단쇄 항체 라이브러리(phage single-chain antibody library)의 구축과 발현에 이용되도록 하였다. 개조후의 담체를 pScFvDisb-S로 명명하였고 그 플라스미드 지도는 도 1에 도시한 바와 같고 그 담체를 기반으로 특허 CN10333247B중의 항체 배열에 근거하여 새로운 완전 합성 파지항체 라이브러리(novel total synthetic phage antibody library)를 구축하였다.
VEGFR-2 세로외 영역을 항원으로 하여 면역 파이프를 피막하(coat)고 항원 피막량은 2ug/500ul/파이프이며, 4도에서 피막하여 하룻밤 지냈다. 다음 4％ 탈지분유/PBST（Phosphate Buffered Tween Solution）로 각각 면역 파이프와 완전 합성 파지항체 라이브러리(novel total synthetic phage antibody library)를 밀봉하여 실온에서 1시간 방치하였다. 밀봉된 파지항체 라이브러리（phage antibody library）를 면역 파이크에 투입하여 항원 항체 결합을 수행하였고 파지（phage） 투입량은 약 109~1012개이고, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST-PBS（PBST-Phosphate Buffered Solution）를 여러차례 세척하여 결합되지 않은 파지를 제겅하고 0.1M PH2.2의 글리신（glycine）으로 용출하고 1.5M PH8.8의 Tris-HCl로 용출된 파지항체(phage antibody） 용액을 PH 7.0 정도로 중화한다.
상기 중화후의 파지에 10ml를 감연시켜 대수기의 TG1 균액으로 성장시켰고 37도 부화기에 30min 방치하고 일부 균액을 취하여 기울기 희석하여 2YTAG 평판에 도포하여 파지산출량을 계산하였다. 남은 균액에 원심처리하여 상청액을 제거하고 균체를 침전시켜 소량의 배지에 재부유시켰고 흡수하여 2YTAG 큰 평판에 도포하여 다음 선별을 위하여 준비하였다.
상기 감염된 후 도포한 균체를 큰 평판으로부터 긁어내어 2YTAG 액체 배지에 접합하고 대수기까지 흔든 후 M13 보조 파지를 첨가하여 중복 감염시켰고 28도에서 하룻반 배양하여 파지를 확장시켰고 파지를 PEG6000-NaCl 침강 정화하여 다음 선별에 사용하였다. 파지 라이브러리(phage library) 농축 선별을 3차례 수행하였다.
실시예2 , 항VEGFR2 파지단쇄 항체의 양성 클론의 감정
3차예 선별을 경과한 후, 양호하게 분리된 모노클로널 집락을 선택하여 2YTAG 액체 배지가 첨가된 96공 심공플레이트에 접종하고 37도, 220rpm에서 대수기 생장기 배양하였고 매개 구멍에 약 1010의 보조 파지M13KO7를 투입하고 37도에서 30분간 정지시켜 감염시켰다. 4000rpm, 4도에서 15분간 원심처리하여 상청액을 제거하고 균체를 2YTAK를 사용하여 재부유 침적시켰고, 28도, 220rpm에서 하룻밤 배양하였다. 파지를 함유하는 상청액을 취하여 ELISA 감정을 수행하였고 동일한 담체와 동일한 구축 방법의 CN10333247B의 생물학 항체 배열(중쇄는 CN10333247B 배열의 No.3이고, 경쇄는 CN10333247B 배열의 No.9이다)의 파지를 양성 대조(O-1로 명명)로 하였다. 선별하여 친화력이 높은 모노클로널 항체 N-1, N-2와 N-3을 얻었고 유전자 측정을 통하여 원 특허 CN10333247B중의 배열과 다름이 확정되었다.
N-1：경쇄 가변영역 SEQ ID NO:1; 중쇄 가변영역SEQ ID NO:4;
N-2：경쇄 가변영역 SEQ ID NO:2; 중쇄 가변영역SEQ ID NO:4;
N-3：경쇄 가변영역 SEQ ID NO:3; 중쇄 가변영역SEQ ID NO:4.
실시예3 , 파지를 기울기 희석하고 항VEGFR2 단쇄 항체의 친화력을 ELISA 비교
실시예2에서 얻은 클론에 모노클로널 파지의 디스플레이와 정화를 수행하고 파지의 기울기 희석을 수행하여 ELISA 실험으로 친화력을 감정을 수행하였다.
pH 9.6의 탄산염 완충용액을 이용하여 VEGFR-2 세로외 영역을 피막하고 20ng/구멍/100ul, 4도에서 피막하여 하룻밤 경과하였다. PBST 세척을 3회 수행하고 4％milk-PBST 37도에서 1 h 밀봉하였다. 정화후의 파지를 4％milk-PBST 5배 기울기로 희석시키고 각 구멍에 100ul 희석후의 샘플을 투입하고, 실온에서 1시간 방치하였다. PBST로 ELISA플레이트를 세척하고 4％milk-PBST 희석후의 HRP-anti-M13 모노클로널 항체를 ELISA플레이트에 투입하고 실온에서 1h 방치하였다. TMB 발색 키트로 실온에서 10분간 발색시켰다. 2M H2SO4로 종료한 후 450nm/630nm 수치를 읽었다. 그 결과는 도 2에 도시한 바와 같고 선별된 3주의 서로다른 단쇄 항체는 모두 VEGFR-2와 특이성 결합을 수행할 수 있고 결합 능력은 모두 O-1을 초과하였다.
실시예4, 항KDR 완전 항체의 제조
상기 3개 항체 N-1, N-2와 N-3의 중쇄VH와 경쇄k 유전자를 각각 중쇄와 경쇄 불변 영역 유전자가 장착된 담체pTSE(도 3을 참조)로 클론하여 인간 IgG1의 불변 영역(SEQ ID NO:5를 참조)와 k쇄의 불변 영역(SEQ ID NO:6을 참조)의 pTSE 담체를 코딩하였다(pTSE 담체, 도 3에 도시, 제조 과정에 대하여서는 CN103525868A 명세서 제3페이지 [0019]단락을 참조).
삭제
SEQNO.5(constant region sequence of human IgG1, 인간 IgG1의 불변 영역 배열): ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG;
SEQ ID NO:6(constant region sequence of chain κ, k쇄의 불변 영역 배열): RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC;
HEK293E 세포를 순간 트랜스펙션하여 완전 항체 발현을 수행하였다. AKTA기기를 사용하여 protein A를 친화 칼럼 정화하여 완전 항체 단백질을 얻었다. BCA 키트를 사용하여 단백질 농도 측정을 수행하였다.
실시예5 , 완전 항체와 VEGFR2 세포외 영역의 결합 실험
pH9.6의 탄산염 완충용액을 이용하여 VEGFR 세포외 영역을 피막하여 20ng/구멍/100ul, 4도에서 피막하여 하룻밤 경과하였다. 300ul/구멍 PBST로 3차례 세척하고 4％milk-PBST를 첨가하여 37도에서 1h 밀봉하였다. 서로다른 희석도의 생물소 표기의 완전 항체를 첨가하였다. 인간의 IgG(hIgG)를 대조군으로 하고 각종 완전 항체의 최고 농도는 100ng/ml이고, 5배 희석하여 8개 기울기로 하였고 37도에서 2~3h 부화시켰다. 300ul/구멍 PBST로 5회 세척하고 4％milk-PBST로 1: 10000 희석시킨 스트렙트아비딘(streptavidin)을 첨가하여 37도에서 1h 부화시켰다. 300ul/구멍 PBST로 8회 세척하고 TMB 발색 키트를 사용하여 100ul/구멍, 신온에서 10min 발색시킨 후, 2M H2SO4로 종료하였다. 450nm/630nm 수치를 읽었다. 그 결과는 도 4에 도시한 바와 같고 모든 항체는 양호하게 세포 표면의 KDR 분자와 결합되었고 그중, N3의 친화력이 상대적으로 높고 N-1, N-2, N-3은 모두 원래의 O-1를 초과하였다.
실시예6, 완전 항체와 세포 표면 VEGFR-2의 결합 특이성 분석
본 발명에서 VEGFR-2를 과도 발헌한 CHO 세포를 이용하여 서로다른 완전항체와 세포 표면 VEGFR-2의 결합 상황을 검측하였고, 인간의 IgG(hIgG)를 대조로 하였다. 0.25％ 판크레아틴으로(pancreatin)소화, 원심하여 세포를 수집하였다. 이와 동시에 각종 항체를 희석시켰으며 최고 농도는 100nM이고 4배 기울기 희석시켰다. 수집한 세포를 PBS+1％BSA로 3회 세척하고 PBS+1％BSA를 첨가하여 세포를 재부유시킨 후, 세포를 96공 플레이트에 포집하였고, 각 구멍에 1Х105개 세포가 있고 100ul 희서괸 완전항체를 첨가하여 실온에서 1시간 부화시켰다. 원심 처리하여 상청액을 제거하고 PBS로 세포를 3회 세척하고 희석된 Alexa488 표기의 항인 IgG FC 항체를 이용하여 세포를 재부유시키고 실온에서 어두운 곳에서 1시간 부화시키고 PBS로 3회 세척하였고, 그 다음 100ul PBS로 재부유시키고 흐름식 세포기로 형광 강도를 검측하였다. 결과를 Graphpad Prism로 분석하였다. 그 결과, N3은 세포 발현된 VEGFR-2와 양호하게 결합하고 N1, N2, N3의 결합 능력은 모두 O-1를 초과하였다(도 5를 참조).
실시예7 , 완전 항체의 HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cell) 세포 증식 억제 실험
인간 제정맥 내피 세포(HUVEC)는 이미 혈관 내피 세포 증식, 세포 신호 경로와 여러가지 종양 발생 메커니즘의 연구에 이용되었고 본 발명에서 서로다른 항VEGFR-2 항체의 HUVEC 세포 증식에 대한 억제 작용을 연구하였다. HUVEC 세포가 80％ 존재도로 성장하였을 때, 신선한 5％FBS를 함유하는 EGM 배지로 바꾸고 6시간 후 판크레아틴로 소화시켰고, 그 다음 무혈청 배지에서 소화된 세포를 4~5회 세척하였고 매번 원심 처리후 배지를 께끗이 하였고 세포를 재부유시켜 수량을 통계하였으며 5000개 세포를 각각 96구멍 플레이트에 접송하였고 96구멍 플레이트의 가장지리 구멍은 포기하였고 100ul 무혈청 배지의 각 구멍에서 하룻밤 기근 배양하였다.14~16시간 후, 상청액을 제거하고 50ul VEGF/ECM(200ng/ml)를 첨가하여 최종 농도가 100ng/ml에 달하도록 하였고 서로다른 농도의 다른 항체와 혼합하여 24시간 배양하였다. 그 다음 CCK-8을 첨가하고 세포 증식 상황을 검측하였다. 그 결과, N1, N2와 N3의 IC50(ng/L)는 각각 12.76, 17.32, 10.53이고 O-1의 IC50(ng/L)는 18.59이며, N1, N2, N3의 혈관 내피 세포 증식 억제 능력은 모두 O-1을 초과하였고, 그중 N3이 가장 우수하였다(도 6을 참조). 실시예5~7을 종합하면 N1, N2, N3은 분자와 세포학 수준의 결과에서 모두 원 특허 CN103525868A의 최적의 항체O-1을 초과하였고 이는 본 특허중의 후보 분자가 진일보로 개발과 응용 전망이 있음을 말한다.
본 발명의 상기 항체는 신생 혈관으로 인한 질병의 치료에 응용될 수 있고 그 질병은 비소세포폐암, 전이성 비소세포폐암, 신경교종, 대장암, 간세포암, 전이성 간세포암, HER2 음성의 전이성 유방암, 전이성 위선암, 전이성 대장암, 전이성 악성흑색종, 전이성 신장세포암 등 암 및 황반 변성 등 질병을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
구체 실시예는 본 발명을 예?戮쳄岵막? 설명하기 위한 것으로 본 발명의 구체적인 실현이 이러한 방식에 한정되지 않음을 이 분야의 기술자는 이해할 수 있고 본 발명의 방법 사상과 기술방안에 따라 수행되는 각종 비 실질적 개선 또는 개선없이 본 발명의 사상과 기술방안을 직접 기타 상황에 응용한 것은 모두 본 발명의 보호범위에 속한다.
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Claims (12)

  1. 경쇄 가변영역과 중쇄 가변영역을 포함하고, 경쇄 가변영역의 아미노산배열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3중의 임의의 한가지를 포함하며, 중쇄 가변영역의 아미노산배열은 SEQ ID NO:4를 포함하는 것을 특징으로 하는 항VEGFR-2 모노클로널 항체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    중쇄 불변 영역이 인간의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 마우스의 IgG1, IgG2a, IgG2b로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항VEGFR-2 모노클로널 항체.
  3. 청구항 1에 기재된 항VEGFR-2 모노클로널 항체의 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질.
  4. 청구항 1에 기재된 항VEGFR-2 모노클로널 항체의 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역 아미노산배열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 청구항 4에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 재조합 DNA 발현 담체에 항VEGFR-2 항체를 코딩한 상기 중쇄 가변영역, 중쇄 불변 영역, 상기 경쇄 가변영역과 경쇄 불변 영역의 DNA 배열을 포함하는 재조합 DNA 발현 담체.
  6. 청구항 5에 기재된 재조합 DNA 발현 담체를 트랜스펙션하고, 포유동물 세포, 곤충 세포, 대장균 또는 효모를 포함하는 숙주 세포.
  7. 청구항 6에 있어서,
    HEK293E 세포, CHO 세포 또는 NS0 세포를 포함하는 숙주 세포.
  8. 청구항 1에 기재된 항VEGFR-2 모노클로널 항체를 포함하는 완전항체.
  9. 청구항 1에 기재된 항VEGFR-2 모노클로널 항체를 포함하고,
    단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 ScFv을 포함하지만 이에 한정되지 않는 단편.
  10. 청구항 1에 기재된 항VEGFR-2 모노클로널 항체의 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역을 포함하는 이중 특이성 항체.
  11. 청구항 1에 기재된 항VEGFR-2 모노클로널 항체의 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역을 포함하고, 신생 혈관으로 인한 질병의 예방 또는 치료에 사용되며, 상기 질병은 종양 또는 황반 변성인 약물 조합물.
  12. 청구항 1에 기재된 항VEGFR-2 모노클로널 항체의 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역을 포함하고 신생 혈관으로 인한 질병 치료에 이용되며, 상기 질병은 종양 또는 황반 변성인 항체.
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