CN114341170B

CN114341170B - 一种人源化抗vegfr2抗体及其应用

Info

Publication number: CN114341170B
Application number: CN202080045497.2A
Authority: CN
Inventors: 谢良志; 孙春昀; 郭二红; 代雅琪
Original assignee: Sinocelltech Ltd
Current assignee: Sinocelltech Ltd
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2020-07-17
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2040-07-17
Also published as: WO2021013061A1; CN114341170A

Abstract

提供一种人源化的抗VEGFR2抗体药物。还提供编码所述抗体的核酸序列(包括重/轻链可变区)、含有所述核酸序列的载体、药物组合物和试剂盒。所述抗体能特异性结合VEGFR2的第六结构域，独立于配体VEGF‑A而发挥作用，可直接抑制VEGFR2形成二聚体，从而阻断VEGFR2胞内区二聚化后引起的酪氨酸残基磷酸化及下游信号通路。同时，该抗体保留部分阻断VEGF‑C和VEGF‑D的作用，因而具有更佳的抑制血管生成作用。所述抗体还能激活NK细胞发生抗体依赖性细胞毒性(ADCC)反应，抑制肿瘤的生长和转移，可用于临床治疗黑色素瘤。

Description

一种人源化抗VEGFR2抗体及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗领域，涉及一种人源化抗VEGFR2的抗体及其应用。

背景技术

血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR2，也称为FLK-1或KDR)，主要分布在血管及淋巴管内皮细胞膜表面，是多种血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E)的主要功能性受体，可诱导内皮细胞的增殖、迁移以及血管通透性的改变，促进新生血管形成并维持其完整性。VEGFR2是VEGFR家族的主要成员，属于III型受体酪氨酸激酶，VEGFR2的胞外区含7个免疫球蛋白样结构域(即D1-D7)，包括配体VEGF结合结构域(D2-D3)和二聚化结构域(D4-D5和D7)，其胞内区含酪氨酸激酶结构域[1，19-20]。

VEGFR2的配体VEGF(包括VEGF-A、C、D、E等)，在正常人血浆中的浓度约为137±7.7pg/mL[2]，而胰腺癌、卵巢癌等患者血清中VEGF浓度显著上调，为200-400pg/mL，而肿瘤组织或者肿瘤囊肿积液中，VEGF的浓度则高达0.5-20ng/mL[2-4]。当肿瘤微环境中高浓度的VEGF二聚体结合VEGFR2后，诱导VEGFR2受体形成同源二聚体(主要)，亦可与VEGFR1或者VEGFR3形成异源二聚体(次要)，引起VEGFR2胞内区酪氨酸残基自磷酸化，活化下游磷脂酶C(PLC)等信号通路，促进肿瘤血管内皮细胞增殖和存活、介导肿瘤细胞迁移、改变血管通透性，最终引起肿瘤血管增生[5]。

肿瘤血管为肿瘤的发生发展输送充足的营养物质，并提供肿瘤细胞的逃逸通道。靶向血管新生的药物可阻断肿瘤的营养供给，从而达到“饿杀”肿瘤的效果。其中，VEGFR2抗体类药物可阻断VEGFR2与VEGF结合，比如，礼来(Eli Lilly)公司研发的第一个抗VEGFR2肿瘤治疗药物雷莫芦单抗(Cyramza)可通过抑制血管生成，降低血管通透性，在短时间内使肿瘤微环境重新获得平衡，从而获得良好的抑癌效果[6]。目前，雷莫芦单抗已在化疗/放疗失败后的胃/胃食管连接处癌[7]、化疗失败后的非小细胞肺癌[8]、化疗/放疗联合Avastin(VEGF抗体)失败后的结直肠癌[9]和转移性乳腺癌[10]等多种肿瘤中显示出良好的治疗效果，特别是在胃癌的二线治疗中显示出比VEGF单抗药物Avastin更佳的疗效。此外，由于VEGF在正常生理代谢中的重要作用，尽管Avastin在多种疾病中耐受良好，临床研究中发现Avastin具有胃穿孔等严重副作用[11]，而靶向VEGFR-2可保留VEGF结合VEGFR1同源二聚体的功能，保留了人正常组织新生血管的部分功能，因此，预期靶向VEGFR-2导致的胃肠道穿孔等系统性毒副作用更低，具有更好的安全性优势，而临床更需要兼顾安全和疗效的药物。

目前为止，雷莫芦单抗是唯一一款获FDA批准上市用于晚期胃癌、结肠癌及非小细胞肺癌的二线治疗的VEGFR2单克隆抗体药物，该药主要通过抑制VEGF-A与VEGFR2的结合来阻断VEGFR2的信号转导，然而，这种机制在高VEGF浓度时的抑癌作用受到限制，而本发明公开的抗体通过结合VEGFR2的第六结构域，独立于配体VEGF-A而发挥作用，可直接抑制VEGFR2形成二聚体，从而阻断VEGFR2胞内区二聚化后引起的酪氨酸残基磷酸化及下游信号通路。同时，该抗体还保留部分阻断VEGF-C和VEGF-D的能力，因而具有更佳的抑制血管生成作用。此外，所述抗体还能激活NK细胞发生抗体依赖性细胞毒性(ADCC)反应，抑制肿瘤的生长和转移，可用于临床治疗黑色素瘤。

发明内容

在一个方面，本发明提供一种分离的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的重链CDR1域、具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的重链CDR2域和具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的重链CDR3域的重链可变区，和具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的轻链CDR1域、具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的轻链CDR2域和具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的轻链CDR3域的轻链可变区。

在一个实施方式中，本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQID NO：8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：8具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个实施方式中，本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或嵌合抗体。

在一个实施方式中，本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQID NO：22所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：22具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：23具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的轻链可变区。

在一个实施方式中，本文所述的抗体进一步包含轻链恒定区和重链恒定区，优选地所述轻链恒定区为氨基酸序列为SEQ ID NO：25的kappa轻链恒定区的氨基酸序列或与SEQ ID NO：25具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述重链恒定区为与氨基酸序列为SEQ ID NO：24的IgG1重链恒定区的氨基酸序列或与SEQ IDNO：24具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方式中，本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段为IgG抗体，优选为IgG1抗体。

在一个实施方式中，本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体。

在一个实施方式中，本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段与重组人VEGFR2蛋白的结合亲和力KD为5-150pM，优选为10-70pM，更优选为38.8pM。

在一个实施方式中，本文所述的抗原结合片段为Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd′片段、单链抗体分子或单域抗体；其中单链抗体分子优选为scFv、di-scFv、tri-scFv、双体抗体或scFab。

在一个实施方式中，本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其结合表位是VEGFR2分子的Y565、L567、V576、L579、W591、K592、D620、V622、V637、R638。

在另一方面，本发明提供一种抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其与如以上所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段结合抗原上的相同表位。

在另一方面，本发明提供一种抗体-药物缀合物，其包含如本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂，优选地所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂通过接头连接。

在另一方面，本发明提供一种核酸，其编码如本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方式中，本文所述的核酸包含如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，或者其包含如SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供一种表达载体，其包含如本文所述的核酸。

在另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含如本文所述的核酸或如本文所述的表达载体。

在另一方面，本发明提供一种用于产生如本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段的方法，包括在适合于抗体表达的条件下培养如本文所述的宿主细胞，和从培养基中回收表达的抗体。

在另一方面，本发明提供一种药物组合物，包含如本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或如本文所述的抗体-药物缀合物或如本文所述的核酸或如本文所述的表达载体，及药学上可接受的载体。

在另一方面，本发明提供本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体-药物缀合物或本文所述的药物组合物，其用于治疗黑色素瘤。

在另一方面，本发明提供一种用于治疗黑色素瘤的方法，其包括向需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或如本文所述的抗体-药物缀合物或如本文所述的药物组合物，从而治疗所述黑色素瘤。

在另一方面，本发明提供本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或其抗原结合片段或本文所述的抗体-药物缀合物或本文所述的药物组合物在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。

在另一方面，本发明提供一种药物组合，其包含如本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或其抗原结合片段或如本文所述的抗体-药物缀合物或如本文所述的药物组合物与一种或多种另外的治疗剂。

在另一方面，本发明提供一种试剂盒，其包含如本文所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或其抗原结合片段或如本文所述的抗体-药物缀合物或如本文所述的药物组合物，优选地，还进一步包含给药的装置。

在另一方面，本发明提供一种VEGFR2分子的表位，其为VEGFR2分子的Y565、L567、V576、L579、W591、K592、D620、V622、V637、R638。

附图说明

本发明结合附图进行说明，附图中：

图1显示了通过ELISA检测的抗VEGFR2嵌合抗体与重组蛋白VEGFR2-His的结合。

图2显示了通过FACS检测的抗VEGFR2嵌合抗体在293FT-VEGFR2细胞株上的结合。

图3显示了通过ELISA检测的抗VEGFR2嵌合抗体不阻断重组人VEGFR2-His与人VEGF-165重组蛋白的结合。

图4显示了抗VEGFR2嵌合抗体阻断VEGF-165对HUVEC细胞的增殖作用。

图5显示了通过ELSIA检测的VEGFR2-HS76与重组人VEGFR2-His的结合。

图6显示了通过FACS检测的VEGFR2-HS76在293FT-VEGFR2细胞株上的结合。

图7显示了通过ELISA检测的VEGFR2-HS76种属交叉结合。

图8显示了通过FACS检测VEGFR2-HS76不阻断VEGF-165与293FT-VEGFR2细胞结合。

图9显示了通过ELISA检测的VEGFR2-HS76阻断VEGFR2-Fc重组蛋白与VEGF-C的结合。

图10显示了通过ELISA检测的VEGFR2-HS76阻断VEGFR2-Fc重组蛋白与VEGF-D的结合。

图11-1显示了VEGFR2-HS76阻断高浓度VEGF-165对HUVEC细胞的增殖作用。

图11-2显示了VEGFR2-HS76阻断低浓度VEGF-165对HUVEC细胞的增殖作用。

图12显示了VEGFR2-HS76阻断VEGF-C对HUVEC细胞的增殖作用。

图13显示了通过CD16A重组报告基因检测的VEGFR2-HS76的ADCC作用。

图14显示了VEGFR2-HS76对B16-F1黑色素瘤移植C57BL/6J小鼠体重的影响。

图15显示了VEGFR2-HS76对B16-F1黑色素瘤移植C57BL/6J小鼠肿瘤体积的影响。

图16-1显示了CD1小鼠静脉单次注射VEGFR2-HS76的血清药物浓度-时间曲线。

图16-2显示了CD1小鼠皮下单次注射VEGFR2-HS76的血清药物浓度-时间曲线。

具体实施方式

本发明的各个方面涉及分离的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段、包含该抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物、编码该抗体或其抗原结合片段的核酸和表达载体、包含该核酸或表达载体的宿主细胞、产生该抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段的方法、包含该抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段的药物组合物、以及使用该抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段治疗黑色素瘤的方法以及包含该抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段的药物组合和试剂盒。

定义

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的技术领域的普通技术人员通常理解的含义。为了本发明的目的，定义以下术语，以同本技术领域通常理解的含义保持一致。

当用于本文和所附权利要求书中时，单数形式“一”、“一种”、“另一”和“所述”包括复数指代对象，除非上下文明确地另有指示。

术语“抗体”意指免疫球蛋白分子，是指表现所需生物学活性的抗体的任何形式。包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)，甚至包括抗体片段。典型地，全长抗体结构优选包含4条多肽链，通常通过二硫键相互连接的2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链包含重链可变区和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区。在此典型全长抗体结构外，其结构还包括其他衍生形式。

所述重链可变区和轻链可变区可进一步细分为更保守的区域(称为框架区(FR))和穿插其中的高变区(称为互补决定区(CDR))。

术语“互补决定区”(CDR，例如CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的这样一些氨基酸残基，其存在对于抗原结合来说是必需的。每个可变区通常具有3个被鉴别为CDR1、CDR2和CDR3的CDR区域。每个互补决定区可包含来自如Kabat所定义的“互补决定区”的氨基酸残基(Kabat等，Sequences of Proteins of Immulological Interest，5th Ed.PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.1991))和/或来自“高变环”的那些残基(Chothia和Lesk；J Mol Biol 196：901-917(1987))。

术语“构架”或“FR”残基是如本文中所定义的CDR残基之外的那些可变区残基。

每个重链可变区和轻链可变区通常包含3个CDR和最多达4个FR，所述CDR和FR从氨基末端至羧基末端以例如以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

给定抗体的互补性决定区(CDR)和框架区(FR)可以使用Kabat体系标识(Kabat等：Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生和公众服务部，PHS，NIH，NIH出版编号91-3242，1991)。

术语“恒定区”是指抗体的轻链和重链上的这样一些氨基酸序列，不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性。

根据其恒定区的氨基酸序列的抗原性差异，抗体的重链可以被分为α、δ、ε、γ和μ五类，当其与轻链组成完整的抗体，可被分为五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些类中的若干还可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可归入κ和λ。

“抗体的抗原结合片段”包含完整抗体分子的一部分，其保留母体抗体的至少某些结合特异性，通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd′片段、单链抗体分子(例如scFv，di-scFv或tri-scFv、双体抗体或scFab)、单域抗体。

术语“抗体片段”是指保留母体抗体的至少某些生物学特性的非完整抗体分子，其实例除上述“抗原结合片段”所述及的那些之外，还包括但不限于Fc片段。

术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”是指与一种或多种化学药物化学连接的结合蛋白如抗体或其抗原结合片段，其可以任选地是治疗剂或细胞毒性剂(如一种或多种细胞因子或化疗药物)。在优选的实施方案中，ADC包括抗体、细胞毒性或治疗药物，以及能够使药物与抗体连接或缀合的接头。ADC通常具有与抗体缀合的1至8个中任一值的药物，包括2、4、6或8的载药物质。可以包含在ADC中的药物的非限制性实例是有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂、用于基因治疗载体、烷化剂、抗血管生成剂、抗代谢药、含硼药剂、化疗保护剂、激素、抗激素剂、皮质类固醇、光活性治疗剂、寡核苷酸、放射性核素剂、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和放射致敏剂。

术语“嵌合抗体”是指重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而其余部分来源于不同来源或物种的抗体。“嵌合抗体”亦可以为如上定义的功能性的片段。“人源化抗体”是“嵌合抗体”的子集。

术语“人源化抗体”或“人源化抗原结合片段”在本文中被定义为这样的抗体或抗体片段：(i)来源于非人来源(例如，携带异源免疫系统的转基因小鼠)且基于人种系序列；或(ii)可变区是非人来源而恒定区是人来源的嵌合抗体；或者(iii)CDR移植的，其中可变区的CDR来自非人来源，而可变区的一个或多个构架区为人来源的，并且恒定区(如果有的话)是人来源的。“人源化”的目的是消除非人来源抗体在人体内的免疫原性，而同时最大可能地保留亲和力。选择与非人来源抗体构架序列最相似的人构架序列为模板进行人源化改造是有利的。在某些情况下，可能需要用非人构架中相应的残基替换人类构架序列中的一个或多个氨基酸，以避免亲和性的丧失。

“单克隆抗体”是指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即，所述包含单一抗体的群体除了可能以极少量存在的可能突变(例如天然突变)之外是相同的。因此，所述术语“单克隆”表明所述抗体的性质，即不是不相关抗体的混合物。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体均针对抗原上的单独一个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制剂的优点在于它们通常不会被其他抗体污染。所述术语“单克隆”不应被理解为需要通过任何特定的方法产生所述抗体。

抗体“特异性结合”目的抗原例如肿瘤相关的多肽抗原靶(本文中，PD-1)，即以足够的亲和力结合所述抗原以使得所述抗体可用作治疗性试剂，靶向表达所述抗原的细胞或组织，并且与其他蛋白质无显著交叉反应或者与除了上文提到的抗原靶的同源体和变体(例如突变形式、剪接变体，或蛋白水解作用截短的形式)以外的蛋白质无显著交叉反应。

术语“结合亲和力”是指分子的单个结合位点与其结合伴侣之间非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，用于本文时“结合亲和力”是指固有的结合亲和力，其反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间1∶1的相互作用。如本文所用，术语“KD”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。如本文所用，术语“kon”是指抗体与抗原结合的速率常数。如本文所用，术语“koff”是指抗体与抗体/抗原复合物解离的速率常数。“KD”、“结合速率常数k_on”和“解离速率常数k_off”通常用于描述分子(例如抗体)与其结合伴侣(例如抗原)之间的亲和力，即，配体结合特定蛋白的紧密程度。结合亲和力受非共价分子间相互作用的影响，例如氢键，静电相互作用，两个分子之间的疏水和范德华力。另外，配体与其靶分子之间的结合亲和力可能受到其他分子的存在的影响。亲和力可通过本领域中已知的常规方法来分析，包括本文描述的ELISA。

术语“表位”包括能够特异性结合至抗体或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链，或其组合)组成，并且通常具有特定三维结构特征以及特定的电荷特征。

术语“分离的”抗体是已经被鉴别并且从表达它的细胞的组分中分离的抗体。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，所述抗体的天然环境中的至少一种组分是不存在的。然而，通常情况下，分离的抗体是通过至少一个纯化步骤进行制备。

两条多肽或核酸序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同的残基的数目占残基总数的百分比，且基于比较的分子中较小者的大小来计算。在计算同一性百分数时，将正在比较的序列以产生序列之间最大匹配的方式比对，通过特定算法解决比对中的空位(如果存在的话)。确定两个序列之间同一性的优选计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包，包括GAP、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。上述程序可以公开地从国际生物技术信息中心(NCBI)和其他来源得到。熟知的SmithWaterman算法也可用于确定同一性。

术语“Fc受体”或“FcR”指与抗体Fc区结合的受体。优选天然序列的人FcR，且优选与IgG抗体结合的受体(γ受体)，其包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亚型，以及这些受体的变体。其它FcR均被包含在术语“FcR”中。该术语也包括新生儿受体(FcRn)其负责将母体的IgG转运至胎儿(Guyer等，免疫学杂志117：587(1976)和Kim等，免疫学杂志24：249(1994))。

术语“新生儿Fc受体”、简称“FcRn”，其结合IgG抗体Fc区。新生儿Fc受体(FcRn)在体内IgG类抗体的代谢命运中起重要作用。FcRn行使功能以从溶酶体降解途径营救IgG，从而降低其在血清中的清除率并加长半衰期。因此，IgG体外FcRn结合性质/特征指示它在血液循环中的体内药代动力学性质。

术语“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，其随抗体同种型而不同。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)、依赖抗体的吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞激活。

术语“效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应子功能的白细胞。在一个方面，所述效应细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从天然来源，例如，血液中分离。效应细胞通常是与效应子阶段相关联的淋巴细胞，并发挥作用，以产生细胞因子(辅助T细胞)、杀死被病原体感染的细胞(细胞毒性T细胞)或分泌抗体(分化的B细胞)。

″免疫细胞″包括具有造血的起源并在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞包括：淋巴细胞，例如B细胞和T细胞；天然杀伤细胞；髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中结合到在某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fcγ受体上的分泌Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至承载抗原的靶细胞，随后使用例如细胞毒素杀死所述靶细胞。为了评估目的抗体的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，例如记载于美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中的体外ADCC测定法。用于这类测定法的有用效应细胞包括PBMC和NK细胞。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体的存在下靶细胞的裂解。典型的补体途径的活化是通过将补体系统的第一组分(C1q)与结合至其相应抗原的(适当亚类的)抗体结合来起始。为了评估补体活化，可进行CDC测定法，例如记载于Gazzano-Santoro等，J.Immunol Methods 202：163(1996)中的CDC测定法。例如在美国专利No.6,194,551 B1和WO1999/51642中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列的多肽变体(具有变体Fc区的多肽)和具有增强或降低的C1q结合的多肽变体。

本发明的抗体的氨基酸序列和核苷酸序列

本发明首先采用重组人VEGFR2蛋白来免疫小鼠，然后通过噬菌体展示文库筛选获得与重组人VEGFR2蛋白特异性结合的高结合力scFv抗体克隆VEGFR2-MS76。之后采用PCR方法将编码VEGFR2-MS76 scFv抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列分别插入带人IgG1重链恒定区或人kappa轻链恒定区核苷酸序列的pSTEP2载体中，进行培养表达。采用蛋白A纯化柱进行纯化获得高纯度人鼠嵌合抗体VEGFR2-mhS76。ELISA测试表明该抗VEGFR2嵌合抗体与重组蛋白VEGFR2-His有较好的结合，且其具有较强的阻断VEGF-165对HUVEC细胞增殖的作用。

然后，采用经典的人源化方式CDR移植方法，选择与鼠轻链或重链可变区最接近的人抗体轻链或重链可变区为模板，将鼠抗体轻链/重链的各3个CDR分别插入到上述人源模板的相应位置，获得人源化的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)序列。由于鼠源框架区的关键位点对于维持CDR空间结构的稳定性和抗体活性至关重要，因此将关键点回复突变为鼠抗体的序列，最终获得人源化抗体VEGFR2-HS76。

本发明的核酸

本发明还涉及编码本发明的抗体或其部分的核酸分子。这些核酸分子的序列包括但不限于SEQ ID NO：3-7、26-33和36-37。

本发明的核酸分子不限于本文公开的序列，还包括其变体。本发明中变体可以参照它们在杂交中的物理特性来描述。本领域技术人员会认识到利用核酸杂交技术，核酸可用于鉴别其互补物以及其等同物或同系物。还会认识到杂交可以以低于100％互补性发生。然而，考虑到条件的适当选择，杂交技术可用于基于DNA序列与特定探针的结构相关性来区分所述DNA序列。对于这类条件的指导参见Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989和Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Sedman，J.G.，Smith，J.A.，&Struhl，K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York：JohnWiley and Sons。

重组载体和表达

本发明还提供了包含本发明的一个或多个核苷酸序列的重组构建体。通过将编码本发明的抗体的核酸分子插入载体例如质粒、噬粒、噬菌体或病毒载体中构建本发明的重组构建体。

本发明的抗体可通过在宿主细胞中重组表达编码轻链和重链或其部分的核苷酸序列来制备。为了以重组方法表达抗体，可用携带编码轻链和/或重链或其部分的核苷酸序列的一个或多个重组表达载体转染宿主细胞，以使得所述轻链和重链在所述宿主细胞中表达。标准重组DNA方法学被用于制备和/或获得编码重链和轻链的核酸、将这些核酸纳入重组表达载体中并且将所述载体引入至宿主细胞中，例如Sambrook，Fritsch and Maniatis(eds.)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbor，N.Y.，(1989)、Ausubel，F.M.等(eds.)Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates，(1989)和Boss等的美国专利No.4,816,397中记载的那些。

合适的宿主细胞为原核细胞和真核细胞。原核宿主细胞的实例为细菌，真核宿主细胞的实例为酵母、昆虫或哺乳动物细胞。应理解，包括选择调节序列的表达载体的设计受到多种因素的影响，例如宿主细胞的选择、所需的蛋白质的表达水平以及表达是组成型的还是可诱导型的。

细菌表达

通过将编码所需抗体的结构DNA序列连同合适的翻译起始和终止信号以及有功能的启动子插入可操作阅读框中，来构建可用于细菌的可用表达载体。所述载体会包含一个或多个表型选择标记以及复制起点以确保维持所述载体，以及根据需要在宿主内提供扩增。用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)以及假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)中的多个物种。

细菌载体可以是例如基于噬菌体、质粒或噬粒的。这些载体可含有选择标记和细菌复制起点，其来源于通常含有公知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的元件的可商购的质粒。转化合适的宿主菌株并使所述宿主菌株生长至适当细胞密度之后，通过适当的方法(例如，温度变化或化学诱导)将所选择的启动子去阻遏/诱导，并且将细胞培养额外的时间。通常通过离心收获细胞，通过物理或化学方法使细胞破裂，并且保留所得的粗提取物用于进一步纯化。

在细菌系统中，根据所表达的蛋白的目的用途，可有利地选择多种表达载体。例如，当要生产大量这样的蛋白用于生产抗体或用于筛选肽文库时，例如，可能需要指导易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。

哺乳动物表达和纯化

用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白表达的病毒元件，例如源于巨细胞病毒(CMV)的启动子和/或增强子(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)的启动子和/或增强子(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒的启动子和/或增强子(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。对病毒调节元件及其序列的进一步描述参见例如，Stinski的U.S.5,168,062、Bell等的U.S.4,510,245和Schaffner等的U.S.4,968,615。重组表达载体还可以包括复制起点和选择标记(参见例如，Axel等的U.S.4,399,216、U.S.4,634,665和U.S.5,179,017)。合适的选择标记包括赋予已经引入所述载体的宿主细胞对药物例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性的基因。例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因赋予对甲氨蝶呤的抗性，而neo基因赋予对G418的抗性。

将所述表达载体至宿主细胞中的转染可以利用标准技术例如电穿孔、磷酸钙沉淀和DEAE-葡聚糖转染来进行。

用于表达本文提供的抗体的合适的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)[包括dhfr-CHO细胞，记载于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中，使用DHFR选择标记，例如记载于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中]、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。

本发明的抗体可通过公知方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述公知方法包括但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白A亲和层析、蛋白G亲和层析、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石色谱法以及凝集素色谱法。高效液相色谱法(“HPLC”)也可用于纯化。参见例如，Colligan，CurrentProtocols in Immunology或Current Protocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY，N.Y.，(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各自以引用的方式全文纳入本文。

本发明的抗体的特性和功能

对本发明的人源化VEGFR2-HS76抗体进行特性和功能分析。分析结果表明，本发明的抗体具备以下优势：(1)VEGFR2-HS76结合重组人VEGFR2-His蛋白的能力明显高于雷莫芦单抗；VEGFR2-HS76抗体在293FT-VEGFR2细胞上的结合略好于雷莫芦单抗；且VEGFR2-HS76最大结合的MFI是雷莫芦单抗的1.3倍；VEGFR2-HS76具有很强结合重组人VEGFR2蛋白的能力，亲和力高于雷莫芦单抗；(实施例4.1)(2)VEGFR2-HS76保留部分阻断VEGFR2-Fc重组蛋白与VEGF-C或VEGF-D结合的能力，在抗体浓度为9000ng/mL时能阻断55％的VEGFR2-Fc重组蛋白与VEGF-C的结合，能阻断44％的VEGFR2-Fc重组蛋白与VEGF-D的结合；(实施例4.2.2)(3)VEGFR2-HS76对于阻断VEGF-C对HUVEC细胞增殖作用与雷莫芦单抗相当；(4)在阻断高浓度的VEGF-165(100ng/mL、1000ng/mL)对HUVEC细胞增殖作用下，VEGFR2-HS76显著优于雷莫芦单抗；(实施例4.3)(5)雷莫芦单抗介导ADCC作用的能力较弱，而VEGFR2-HS76具有很强的ADCC作用；(实施例4.4)(6)在C57BL/6J小鼠体内B16-F1黑色素瘤皮下移植模型中显示明显的肿瘤抑制作用；(实施例5)和(7)VEGFR2-HS76抗体在CD-1小鼠体内的免疫原性较弱。(实施例6)

用途

本发明的抗体可用于治疗黑色素瘤。本发明的抗体还可用于制备治疗所述病症的药物。

药物组合物

可将本发明的抗体与至少一种其他试剂(例如稳定化合物)制备成药物组合物，其包括本发明的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。任选地，所述药物组合物可包含另外的治疗剂。

试剂盒

本发明还涉及药物包装和包含一个或多个容器的试剂盒，所述容器含有上文提到的本发明的药物组合物。其上附有管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定形式提示，其反映该药物被上述机构批准用于人类给药。

制备和储存

本发明的药物组合物可以以本领域中已知的方式制备，例如通过常规的混合、溶解、造粒、锭剂制备、研磨、乳化、包裹、包埋或冻干方法。

在已经制备包含配制于可接受的载体中的本发明化合物的药物组合物之后，可以将它们放置在适当的容器中并贴上标签用于治疗所标明的病症。这类标签会包括给药的量、频率和方法。

药物组合

上述包含本发明的抗体的药物组合物还与一种或多种其他治疗剂，例如抗肿瘤剂组合，其中所得组合不会引起不可接受的不利影响。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买。

实施例

实施例1：VEGFR2特异性抗体的发现

1.1免疫

采用重组人VEGFR2蛋白(北京义翘神州科技有限公司，Cat.10012-H08H)免疫Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。该重组人VEGFR2蛋白(UniProt KB-P35968)的胞外区氨基酸序列为Met1-Glu764(SEQ ID NO：1)。

具体方法：将重组人VEGFR2蛋白与与弗氏佐剂(首免佐剂为弗氏完全佐剂，二到三次免疫用弗氏不完全佐剂)混合，使用混合物进行三次皮下注射免疫，每次免疫的蛋白剂量为50μg，免疫间隔依次为2周，3周。从第三次免疫起，每次免疫后七天经眼眶内眦静脉丛采血。采用ELISA方法，包被重组人VEGFR2蛋白以检测小鼠抗VEGFR2的血清效价。第三次免疫血清8000倍稀释后滴度达标(ELISA，OD＞1)后，第三次免疫46天后，使用25μg重组人VEGFR2蛋白进行静脉注射加强，4天之后处死小鼠，取小鼠的脾脏组织冻存于液氮中。

1.2噬菌体抗体展示文库构建

小鼠脾组织用TriPure Isolation Reagent试剂(Roche，Cat.No.11 667 165001)提取RNA，利用反转录试剂将RNA反转录获得cDNA文库。采用重叠延伸PCR法[13-14]，利用参考文献中2对引物扩增鼠抗体的轻链可变区序列，用另外1对引物扩增重链可变区序列，将编码鼠抗体的轻链和重链可变区序列的核苷酸序列拼接成编码scFv的核苷酸序列，轻重链可变区通过接头(SEQ ID NO：2)连接，产生的DNA片段经限制性内切酶Sfi I酶切后连接到噬菌体载体pComb3x(北京义翘神州科技有限公司)中，电转X-Blue感受态获得小鼠的噬菌体展示scFv抗体库。

1.3 VEGFR2 scFv抗体筛选、嵌合抗体的构建及生产

参考噬菌体抗体淘洗方法及流程[12]，将重组人VEGFR2蛋白包被在ELISA板上，加入抗体噬菌体孵育，洗去未结合的噬菌体，回收结合的噬菌体，如此重复，经多轮筛选富集获得抗VEGFR2阳性抗体噬菌体文库。从富集的文库中挑取单克隆噬菌体进行表达，用ELISA方法检测与重组人VEGFR2蛋白的结合，筛选获得一株与重组人VEGFR2特异性结合的高亲和力scFv抗体VEGFR2-MS76，并通过测序获得该scFv抗体的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。

采用PCR方法扩增VEGFR2-MS76 scFv抗体的重链可变区核苷酸序列，通过in-fusion方法插入到带编码人重链信号肽(SEQ ID NO：28)和人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：6)核苷酸序列的经ScaI+NheI(Fermentas)酶切的pSTEP2载体中获得嵌合抗体重链(SEQ IDNO：35)表达载体。PCR扩增VEGFR2-MS76 scFv抗体的轻链可变区核苷酸序列，通过in-fusion方法插入到带编码人轻链信号肽(SEQ ID NO：29)和人kappa恒定区(SEQ ID NO：7)核苷酸序列的经ScaI+BsiWI(Fermentas)酶切的pSTEP2载体中获得嵌合抗体轻链(SEQ IDNO：36)表达载体。提取嵌合抗体重/轻链表达载体质粒，共转HEK-293细胞进行培养表达7天，培养上清液采用蛋白A纯化柱纯化获得高纯度嵌合抗体VEGFR2-mhS76。

扩增重链可变区引物：

F1	GCTACCAGGGTGCTGAGTGAGGTCCAGCTGCAGCAG
		R1	TGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACTGA

扩增轻链可变区引物：

F2	GCCACAGGAGTGCATAGTGACATCCAGATGACTCAG
		R2	TGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGT

实施例2：VEGFR2嵌合抗体功能检测

2.1 ELISA方法检测嵌合抗体与重组蛋白VEGFR2-His结合

将浓度为2μg/mL的重组人VEGFR2-His蛋白(北京义翘神州科技有限公司，Cat.10012-H08H)包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1h后，分别加入100μL不同浓度的VEGFR2-mhS76嵌合抗体或同型阴性对照抗体H7N9(北京义翘神州科技有限公司)孵育1h，洗板去除未结合抗体，加入山羊F(ab′)₂抗人IgG F(ab′)2/HRP(Jackson ImmunoResearch)孵育后重复洗板，加入底物显色液进行显色，终止显色后，酶标仪读取OD₄₅₀。以重组人VEGFR2抗体浓度为横坐标，OD₄₅₀读数为纵坐标，利用GraphPad Prism6.0软件分析并绘制曲线图。结果见图1，嵌合抗体VEGFR2-mhS76与重组蛋白VEGFR2-His有较好的结合。

2.2 FACS检测嵌合抗体结合VEGFR2过表达细胞系

以对数生长期的VEGFR2稳定过表达细胞株293FT-VEGFR2-13-13(神州细胞工程有限公司，以下简称为293FT-VEGFR2)为实验材料，通过流式细胞仪FACS检测嵌合抗体在293FT-VEGFR2上的结合。293FT-VEGFR2细胞分装为5×10⁵个细胞/管，体积50μL，加入10μL不同浓度VEGFR2-mhS76或阴性对照抗体H7N9，于4℃混合孵育之后，用PBS清洗并离心去除未结合抗体，再加入FITC标记的山羊抗人IgG Fc抗体(北京义翘神州科技有限公司，SSA016)于4℃孵育，重复清洗并离心去上清，除去未结合的二抗，最后加入200μL PBS重悬细胞，400目滤网过滤至流式管中，随后用流式细胞仪检测。结果见图2，嵌合抗体VEGFR2-mhS76在293FT-VEGFR2细胞上有较好的特异性结合。

2.3 ELISA检测嵌合抗体阻断VEGF-165结合VEGFR2-His

将浓度为0.5μg/mL的重组VEGF-165蛋白(北京义翘神州科技有限公司，11066-HNAB，VEGF-165是VEGF-A最经典的剪切体)包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1h后，加入100μL浓度为1μg/mL的重组VEGFR2-His蛋白，蛋白孔中加入100μL不同浓度的VEGFR2-mhS76或雷莫芦单抗分子(阳性对照抗体，，在专利US2009/0306348中描述其能阻断VEGF与VEGFR2结合，由北京义翘神州科技有限公司生产)，设定仅加入VEGFR2-His蛋白未加入抗体的孔为阳性孔，洗板去除未结合抗体，样品室温孵育1h，洗板去除未结合的样品，加入C-His-R023/HRP(北京义翘神州科技有限公司)检测抗体孵育后，重复洗板，加入底物显色液进行显色，终止后用酶标仪读取OD₄₅₀，并计算抗体竞争配体的抑制率(％)＝(OD_阳性-OD_样品)/OD_阳性×100％，其中OD_阳性表示只加VEGFR2-His蛋白而不加抗体的OD值，OD_样品表示同时加VEGFR2-His蛋白和抗体的待测组OD值。结果如图3所示，雷莫芦单抗分子具有较强的阻断重组人VEGFR2-His蛋白与人VEGF-165蛋白结合的能力，而VEGFR2-mhS76则完全不封闭VEGF-165。

2.4嵌合抗体阻断VEGF-165对HUVEC细胞的增殖作用

人脐静脉内皮细胞HUVEC按4×10³个细胞/孔接种到96孔细胞培养板，在含有10％FBS及5％L-Gln的M199培养基(Gibco，11043023)中培养4h，然后按50μL/孔加入相应浓度的抗体VEGFR2-mhS76或雷莫芦单抗分子(北京义翘神州科技有限公司)，随后以10μL/孔加入终浓度为10ng/mL的VEGF-165，设置检测空白孔B(无细胞)、阴性对照组M(接种细胞，不加样品，加VEGF-165)和M’(接种细胞，不加样品及VEGF-165)。将96孔板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱内培养3天后，按10μL/孔加入WST-8显色液(南京旋光科技有限公司，GLT008)，将96孔板置于CO₂培养箱中，显色稳定后用酶标仪测定450nm、630nm的吸光度。结果以OD450减去OD630得到样品检测值，各孔检测值减去空白孔B扣除背景后计算中和率，中和率％＝(阴性对照M组OD值-样品OD值)/(阴性对照M组OD值-M’组OD值)×100％。结果见图4，嵌合抗体VEGFR2-mhS76具有较强的阻断VEGF-165对HUVEC细胞增殖的作用。

实施例3：鼠抗体人源化改造及生产

3.1鼠抗体VEGFR2-MS76轻链及重链CDR的确定

在实施例1.3中测定了VEGFR2-MS76 scFv抗体的核苷酸序列，据此核苷酸序列推导出VEGFR2-MS76 scFv抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列，见SEQ ID NO：8/9。参考Kabat[15]以及IMGT[16]编号方式，确定鼠抗体VEGFR2-MS76 scFv轻链及重链各3个CDR的氨基酸序列，参见表1。上述的轻链及重链各3个CDR在后续步骤中被移植且保留在最终获得的人源化抗体VEGFR2-HS76中，见实施例3.2和3.3。

表1：VEGFR2-MS76轻链及重链CDR序列

名称	序列
		LCDR1	HASQNINVWLS(SEQ ID NO：10)
LCDR2	KASNLHT(SEQ ID NO：11)
		LCDR3	QQGQSYPLT(SEQ ID NO：12)
HCDR1	GYSFTDYTMY(SEQ ID NO：13)
		HCDR2	YIDPYNGDTSYNQKFKG(SEQ ID NO：14)
HCDR3	ARGYYDAMAY(SEQ ID NO：15)

3.2鼠抗体CDR移植

鼠抗体人源化采用经典的CDR移植人源化方法[17-18]，首选与鼠轻链或重链可变区较接近的人抗体轻链或重链可变区为模板，将鼠抗体轻链或重链的各3个CDR(表1)插入到该人抗体的可变区中，获得人源化的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)氨基酸序列。所用VEGFR2-MS76的轻链可变区的人源模板为IGKV1-12*01，该模板与VEGFR2-MS76轻链的同源性为77.9％，重链可变区的人源模板为IGHV1-2*02，该模板与VEGFR2-MS76重链的同源性为63.3％。

3.3回复突变人源化可变区序列的框架区

由于鼠源框架区有某些关键氨基酸对于维持CDR空间结构的稳定性和抗体活性具有至关重要的作用，因此将关键点回复突变为鼠抗体的相应氨基酸序列，直至获得空间结构稳定的抗体，共进行了以下突变：根据Kabat编号，将轻链的第11位回复突变为L，第42位回复突变为N，第43位回复突变为I，第83位回复突变为I；重链的第48位回复突变为I，第66位回复突变为K，第67位回复突变为A，第69位回复突变为L。经CDR人源化移植和框架区回复突变获得的人源化抗体VEGFR2-HS76，其重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO：16/17所示；其含有信号肽的形式的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO：18/19所示，分别包含依次连接的重链/轻链信号肽序列(SEQ ID NO：20/21)；其人源化抗体重链/轻链的可变区序列(SEQ ID NO：22/23)；其人源化抗体IgG1重链恒定区/人kappa轻链恒定区序列(SEQ IDNO：24/25)。改造后的抗体与嵌合抗体相比，其亲和力相近，并达到完全的人源化，其CDR序列与鼠CDR序列完全一致，详见表1。

3.4人源化单克隆抗体VEGFR2-HS76生产

用表2中的引物，通过全基因合成方法获得重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：30)，采用in-fusion方法插入到带重链信号肽核苷酸序列(SEQ ID NO：28)和人IgG1恒定区核苷酸序列(SEQ ID NO：32)的经ScaI+NsbI(Fermentas)酶切的pSTEP2载体中获得重链(SEQ ID NO：26)表达载体。同理，用表3引物通过全基因合成的方法获得轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：31)，采用in-fusion方法插入到带轻链信号肽核苷酸序列(SEQ ID NO：29)和人kappa恒定区核苷酸序列(SEQ ID NO：7)的经ScaI+BsiWI(Fermentas)酶切的pSTEP2载体中获得轻链(SEQ ID NO：27)表达载体。提质粒后共转HEK-293细胞，培养表达7天，培养上清采用蛋白A纯化柱纯化获得高纯度抗体。

表2全基因合成重链可变区引物

表3全基因合成轻链可变区引物

实施例4：人源化抗体VEGFR2-HS76特性分析

4.1人源化抗体VEGFR2-HS76与VEGFR2抗原结合的亲和力分析

4.1.1人源化抗体VEGFR2-HS76与重组人VEGFR2-His蛋白的结合

将不同浓度(0.5ng/mL、1.4ng/mL、4.1ng/mL、12.3ng/mL、37ng/mL、111.1ng/mL、333.3ng/mL、1000ng/mL、3000ng/mL和9000ng/mL)的重组人VEGFR2-His蛋白包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1h后，分别加入100μL浓度为2μg/mL的VEGFR2-HS76、雷莫芦单抗(Eli Lilly，C839381C)和阴性对照抗体H7N9-R1孵育1h，之后洗板去除未结合抗体，加入二抗山羊抗人IgG Fc/HRP孵育后重复洗板，底物显色液进行显色，终止后酶标仪读取OD450。以重组人VEGFR2-His蛋白浓度为横坐标，OD450读数为纵坐标，利用GraphPad Prism 6.0软件拟合S型曲线并分析抗体与重组人VEGFR2-His蛋白结合的EC₅₀。结果见图5，人源化分子VEGFR2-HS76与重组人VEGFR2-His的特异性结合EC₅₀为49.5ng/mL，R²＝0.999；雷莫芦单抗结合的EC₅₀为308.9ng/mL，R²＝0.999；VEGFR2-HS76结合重组人VEGFR2-His蛋白的能力明显高于雷莫芦单抗。

4.1.2人源化抗体VEGFR2-HS76与重组293FT-VEGFR2细胞的结合

用流式细胞仪FACS检测人源化抗体VEGFR2-HS76及雷莫芦单抗(Eli Lilly，C839381C)在VEGFR2过表达细胞上的结合，H7N9-R1为阴性对照抗体。293FT-VEGFR2细胞分别分装为3×10⁵个细胞/管，体积为50μL，加入不同浓度(2nM、6nM、17nM、51nM、154nM、463nM和1389nM)的VEGFR2-HS76、雷莫芦单抗和H7N9-R1抗体各10μL，于4℃混合孵育之后PBS洗液清洗，离心去除未结合抗体，加入山羊抗人IgG Fc-FITC二抗4℃孵育，重复清洗并离心去上清，除去未结合的二抗，最后加入200μL PBS重悬细胞，400目滤网过滤至流式管中，在流式细胞仪上进行检测。如图6所示，VEGFR2-HS76抗体在293FT-VEGFR2细胞上的结合略好于雷莫芦单抗，VEGFR2-HS76最大结合的MFI是雷莫芦单抗的1.3倍。

4.1.3人源化抗体VEGFR2-HS76与重组人VEGFR2蛋白结合的亲和力检测

利用Octet生物分子相互作用分析系统(型号：Octet RED，厂家：Fortebio)测定多个浓度点(0.42nM、0.90nM、1.74nM、3.47nM、6.94nM)的VEGFR2-HS76和雷莫芦单抗(EliLilly，C839381C)与生物素化VEGFR2的亲和力。表4显示，VEGFR2-HS76与重组人VEGFR2蛋白结合亲和力KD值为38.8pM，结合速率常数k_on值为4.30E+05M^-1s^-1，解离速率常数k_off值为1.67E-05s^-1。而雷莫芦单抗与VEGFR2蛋白结合的KD值为45.8pM，结合速率常数k_on值为3.86E+05M^-1s^-1，解离速率常数k_off值为1.77E-05s^-1，从结果可以看出VEGFR2-HS76具有很强结合重组人VEGFR2蛋白的能力，亲和力略好于雷莫芦单抗。

表4 OCTET检测VEGFR2-HS76与VEGFR2-生物素结合

4.1.4人源化抗体VEGFR2-HS76种属交叉

将浓度为80μg/mL和20μg/mL的重组小鼠mKDR-His蛋白(北京义翘神州科技有限公司，Cat：50998-M08H)分别包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1h，分别加入100μL浓度为2μg/mL的VEGFR2-HS76和雷莫芦单抗分子(北京义翘神州科技有限公司)孵育1h，洗板去除未结合抗体，加入山羊抗人IgG Fc/HRP二抗孵育后，重复洗板，加入底物显色液进行显色，终止后酶标仪读取OD₄₅₀。以蛋白浓度为横坐标，OD450读数为纵坐标，利用GraphPad Prism 6.0软件做柱状图。结果如图7显示，VEGFR2-HS76与重组小鼠mKDR-His蛋白有交叉结合，而雷莫芦单抗分子则无交叉结合。

4.2配体封闭

4.2.1人源化抗体VEGFR2-HS76不阻断VEGF-165与293FT-VEGFR2细胞结合

用流式细胞仪FACS检测人源化抗体VEGFR2-HS76及雷莫芦单抗(Eli Lilly，C839381C)对VEGFR2过表达细胞与重组蛋白VEGF-165结合的影响，H7N9-R1为阴性对照抗体。293FT-VEGFR2细胞分别分装为3×10⁵个细胞/管，体积为50μL，加入不同浓度(2777.8nM、925.9nM、308.6nM、102.9nM、34.3nM、11.4nM和3.8nM)的VEGFR2-HS76、雷莫芦单抗和H7N9-R1抗体各10μL，于4℃孵育20min之后加入2.5μg体内生物素标记的VEGF-165蛋白(北京义翘神州科技有限公司，11066-H27H-B)混合孵育，设定未加入抗体仅有VEGF-165蛋白的细胞孔为阳性对照孔，PBS洗液清洗，离心去除未结合抗体，加入Strepavidin Alexafluor488二抗4℃孵育，重复清洗并离心去上清，除去未结合的二抗，最后加入200μL PBS重悬细胞，400目滤网过滤至流式管中，在流式细胞仪上检测。根据VEGF-165蛋白与VEGFR2过表达细胞结合的平均荧光强度(MFI)分析抗体阻断二者结合的抑制率(％)，抑制率(％)＝(MFI_阳性-MFI_样品)/MFI_阳性*100％，MFI_阳性为无抗体仅加入VEGF-165蛋白与VEGFR2细胞结合的MFI值，MFI_样品为加入抗体后VEGF-165蛋白与VEGFR2细胞结合的MFI值。结果如图8所示，VEGFR2-HS76抗体不阻断VEGF-165蛋白与VEGFR2过表达细胞的结合。

4.2.2人源化抗体VEGFR2-HS76阻断VEGFR2重组蛋白与VEGF-C或VEGF-D结合

将浓度为5μg/mL的重组VEGFR2-Fc(北京义翘神州科技有限公司，10012-H02H)蛋白包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1h后，分别加入100μL浓度为0.5μg/mL的重组VEGF-C-His(北京义翘神州科技有限公司)蛋白，或2μg/mL的重组VEGF-D-His(北京义翘神州科技有限公司)蛋白，蛋白孔同时加入不同浓度(4.12ng/mL、12.35ng/mL、37.04ng/mL、111.11ng/mL、333.33ng/mL、1000ng/mL、3000ng/mL和9000ng/mL)的VEGFR2-HS76、雷莫芦单抗(Eli Lilly，C839381C)和阴性对照抗体H7N9-R1共同孵育1h，其中设定仅加入VEGF-C-His蛋白或VEGF-D-His未加入抗体的孔为阳性孔，洗板去除未结合抗体，加入C-His-R023/HRP检测抗体孵育后重复洗板，加入底物显色液进行显色，终止后酶标仪读取OD450，根据OD450读值计算不同浓度抗体阻断重组人VEGFR2蛋白与人VEGF-165蛋白结合的竞争抑制率％，抑制率(％)＝(OD_阳性-OD_样品)/OD_阳性×100％，其中OD_阳性表示只加VEGFR2-His蛋白而不加抗体组的OD值，OD_样品表示同时加VEGFR2-His蛋白和抗体的待测组OD值。以抗体浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，利用GraphPad Prism 6.0软件分别拟合S型曲线并分析抗体阻断VEGFR2-Fc蛋白与VEGF-C或VEGF-D结合的EC₅₀。结果见图9和图10，VEGFR2-HS76保留部分阻断VEGFR2-Fc重组蛋白与VEGF-C或VEGF-D结合的能力，在抗体浓度为9000ng/mL时能阻断55％的VEGFR2-Fc重组蛋白与VEGF-C的结合，能阻断44％的VEGFR2-Fc重组蛋白与VEGF-D的结合。

4.3人源化抗体VEGFR2-HS76阻断不同浓度VEGF-165或VEGF-C对HUVEC细胞的增殖作用

HUVEC细胞按4×10³个细胞/孔接种到96孔细胞培养板，在含有10％FBS及5％L-Gln的M199培养基(Gibco，11043023)中培养4h，然后按50μL/孔加入相应浓度的VEGFR2-HS76、雷莫芦单抗(Eli Lilly，C839381C)和阴性对照抗体H7N9-R1，随后以10μL/孔加入终浓度为100ng/mL、1000ng/mL的VEGF-165或者终浓度为1000ng/mL的VEGF-C，设置检测空白孔B(无细胞)、阴性对照组M(接种细胞，不加样品，加VEGF-165或VEGF-C)和M’(接种细胞，不加样品及VEGF-165或VEGF-C)。将96孔板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱内培养3天后，按10μL/孔加入WST-8显色液(南京旋光科技有限公司，GLT008)，将96孔板置于CO₂培养箱中，显色稳定后用酶标仪测定450nm、630nm的吸光度。结果以OD450减去OD630得到样品检测值，各孔检测值减去空白孔B扣除背景后计算中和率，中和率％＝(阴性对照M组OD值-样品OD值)/(阴性对照M组OD值-M’组OD值)×100％，采用统计软件GraphPad Prism的自动分析功能计算标准曲线，横坐标为样品浓度，纵坐标为中和率，用四参数回归方程拟合得到“S”型曲线，计算样品半数有效浓度(EC50)。结果如图11、12和表5，VEGFR2-HS76对于阻断VEGF-C对HUVEC细胞增殖作用与雷莫芦单抗相当，而在阻断高浓度的VEGF-165(100ng/mL、1000ng/mL)对HUVEC细胞增殖作用下，VEGFR2-HS76显著优于雷莫芦单抗。

表5.VEGFR2-HS76中和不同浓度的VEGF-165或VEGF-C对HUVEC细胞增殖作用的EC50及最大中和率

4.4人源化抗体VEGFR2-HS76的ADCC

本实施例中采用重组CD16A报告基因系统方法测定VEGFR2-HS76介导的ADCC效应，效应细胞为Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A，而靶细胞为293FT-VEGFR2，当两种细胞共培养的同时加入VEGFR2-HS76或雷莫芦单抗(Eli Lilly，C839381C)和阴性对照抗体H7N9-R1后，VEGFR2-HS76或雷莫芦单抗的Fab段与靶细胞上过表达的VEGFR2结合，其Fc段可与过表达FcγIII型受体(CD16A)的效应细胞结合，从而激活效应细胞Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A并促进NFAT-RE介导的生物发光。具体而言，将靶细胞293FT-VEGFR2按2×10⁴个细胞/孔接种于96孔板，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养过夜，去掉上清，用含0.5g/L PF68(北京义翘神州科技有限公司)的无酚红RPMI 1640培养基清洗两遍，然后按40μL/孔加入不同浓度的抗体，随后以40μL/孔加入1×10⁵个效应细胞Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A，每组设3个复孔，同时设靶细胞、效应细胞和阴性对照组(加靶细胞及效应细胞，不加样品)。置于37℃、5％CO₂条件下培养4h后，按20μL/孔加入Passive Lysis 5X Buffer(Promega，E1941)，震荡混匀后每孔取20μL上清液转移至96孔白底板，通过LB960-微孔板式发光检测仪检测荧光信号。利用GraphPad Prism软件分析并绘制量效曲线，横坐标为样品的浓度，纵坐标为化学发光强度(RLU)，计算EC50及诱导倍数(样品RLU/阴性对照组RLU)。如图13和表7所示，雷莫芦单抗介导ADCC作用的能力较弱，而VEGFR2-HS76具有很强的ADCC作用。

表7.VEGFR2-HS76介导ADCC作用的EC50及最大诱导倍数

4.5表位分析

4.5.1人源化抗体VEGFR2-HS76与结构域蛋白结合

实施例4.2显示VEGFR2-HS76不能够阻断配体VEGF-165与VEGFR2的结合，表明VEGFR2-HS76的结合区域与配体VEGF结合表位存在差异。为了确定VEGFR2-HS76抗体的表位，本实施例通过设计不同结构域蛋白，瞬转到HEK293F细胞中，上清液通过镍柱亲和层析进行纯化获得蛋白溶液，采用ELISA法检测VEGFR2-HS76与VEGFR2胞外区不同结构域蛋白的结合，结果详见表8，上市抗体雷莫芦单抗和VEGF-A均结合在VEGFR2胞外区结构域2-3(结构域2-3)上，而VEGFR2-HS76结合在结构域6(结构域6)上。

表8 VEGFR2-HS76与VEGFR2胞外区结构域结合

4.5.2丙氨酸突变扫描VEGFR2的第六结构域确认VEGFR2-HS76关键位点

为进一步确认VEGFR2-HS76结合的关键位点，在VEGFR2胞外区结构域6上设计一系列丙氨酸单点突变蛋白，将突变体瞬转到HEK293F细胞中，上清液通过ELISA测定VEGFR2与VEGFR2-HS76、雷莫芦单抗和配体VEGF-A的结合能力，结果显示VEGFR2-HS76与VEGFR2突变体结合存在不同程度的下降(详见表9)，而雷莫芦单抗，VEGFA结合不受影响，证明VEGFR2-HS76在VEGFR2的结构域6上结合的关键位点为：Y565A、L567A、V576A、L579A、W591A、K592A、D620A、V622A、V637A、R638A，部分影响结合的位点为：N561A、K585A、E609A、L624A、K632A。VEGFR2形成二聚化主要区域为D4-D5和D7结构域[19-20]，VEGFR2-HS76结合D6结构域后，可能通过空间位阻抑制VEGFR2形成二聚体，从而阻断VEGFR2胞内区磷酸化传导的下游信号通路。

表9 VEGFR2-HS76与VEGFR2胞外区丙氨酸突变体结合

实施例5：VEGFR2-HS76抗体对C57BL/6J小鼠体内B16-F1黑色素瘤皮下移植模型的生长抑制作用

PBS重悬处于对数生长期的B16-F1细胞(中国典型培养物保藏中心细胞库)，以5×10⁵个/0.1mL接种于C57BL/6J小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)的右侧肋部皮下，共接种46只。当肿瘤体积达到约250mm³左右时，采用excel软件将动物按瘤体积随机分6组，每组5只。其中第1组为溶剂对照组，第4和5组为不同剂量的实验组(VEGFR2-HS76)，第2、3、6组为与本申请无关的其他抗VEGF抗体，因此不呈现其相关数据。分组当天开始给药，给药途径为腹腔注射(I.P.)，给药方案见表10，每周给药2次，连续给药4次，末次给药后3天处死小鼠，取瘤组织进行检测。通过计算生存率和肿瘤生长抑制率(TGI(％))来评价药物的抗肿瘤作用：TGI(％)＜60％为无效；TGI(％)≥60％，且经统计学处理治疗组瘤体积显著低于溶剂对照组(P＜0.05)为有效，即对肿瘤生长具有显著抑制作用。

TGI(％)的计算方法如下：

TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100，其中：

Ti：治疗组在给药第i天的肿瘤体积均值，

T0：治疗组在给药第0天的肿瘤体积均值，

Vi：溶剂对照组在给药第i天的肿瘤体积均值，

V0：溶剂对照组在给药第0天的肿瘤体积均值。

表10试验分组及给药方案

a：给药容积依实验动物体重按10μL/g计算。

除溶剂对照组部分动物因肿瘤体积过大出现死亡外，试验组动物在给药期间活动、进食等状态良好，VEGFR2-HS76低、高剂量组和溶剂对照组给药后7天内动物体重无显著性差异(P＞0.05)。所有动物体重变化情况见图14及表11。

表11 VEGFR2-HS76对B16-F1黑色素瘤移植C57BL/6J人源化小鼠体重的影响

a：均数±标准差；

b：实验组体重与溶剂对照组体重在给药7天后统计学比较，t检验；

c：组1实验终点为2只小鼠，组4实验终点为5只，组5实验终点为4只。

首次给药10天后，因肿瘤生长过快(肿瘤体积均大于2000mm³)对所有动物实施安乐死，剥取肿瘤组织，测量并计算肿瘤体积，结果见表12和图15。试验结束时，实验低剂量组(VEGFR2-HS76-20mpk)平均肿瘤体积为3200.44mm³，小鼠生存率100％，TGI(％)＜60％，明显低于溶剂对照组的4947.05mm³，表明VEGFR2-HS76低剂量组具有明显的抗肿瘤作用。实验高剂量组(VEGFR2-HS76-40mpk)在第7天的平均肿瘤体积为1394mm³，TGI为61％，提示该抗体具有抗肿瘤作用。此外，虽然HS76与鼠KDR有部分结合，但是其结合能力显著弱于与人KDR的结合，预期HS76在人体内的抑瘤效果更好。

表12 VEGFR2-HS76对B16-F1黑色素瘤移植C57BL/6J小鼠肿瘤体积影响

a：均数±标准误；

b：组1当天实验动物为4只；

c：组1当天实验动物为2只，组5当天实验动物为4只；

d：组1当天实验动物为2只，组5当天实验动物为2只；

与溶剂对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；天数：第一次给药后的天数。

实施例6：VEGFR2-HS76抗体在CD1小鼠体内的药代动力学和免疫原性研究

抗体VEGFR2-HS76按1mg/kg或5mg/kg剂量分别经尾静脉或者皮下注射单次给予CD1小鼠，每组6只，雌雄各半。于药前、药后0.5h(仅尾静脉注射组)、2h、4h、6h、24h、48h、72h、96h、168h、336h、504h、672h采集血液，利用ELISA方法对小鼠血清中VEGFR2-HS76的浓度进行检测，并采用Phoenix-WinNonlin(Pharsight)6.4软件中非房室模型(NCA)计算药代动力学参数。抗药抗体的检测点为给药后168h、336h、504h、672h，抗药抗体筛选以SCP＝0.062(1.3NC)为阈值，以大于等于1.3倍的NC判定为阳性结果，小于1.3倍的NC为阴性结果。

VEGFR2-HS76抗体尾静脉注射给予CD-1小鼠，由血清药物浓度可以看出1mg/kg、5mg/kg剂量的VEGFR2-HS76抗体在CD-1小鼠体内基本呈线性药代动力学特征，血清中药物浓度随给药剂量增加而增大，雌雄之间无明显差异，血清药物浓度及血清中药物暴露量与给药剂量呈正相关(如图16-1)。5mg/kg剂量的VEGFR2-HS76抗体皮下给予CD-1小鼠，动物雌雄间未见明显差异，32h血药浓度达峰(如图16-2)。静脉和皮下给药的C_max分别为87.47和29.62μg/mL，AUC_last分别为10117.15和9804.09h*μg/mL，皮下给药的绝对生物利用度为96.91％。两种给药方式的t_1/2、Vz、Cl等参数基本一致(表10)。

表10单次给予VEGFR2-HS76后在CD1小鼠体内的药代动力学参数

静脉1mg/kg剂量组ADA均为阴性；5mg/kg剂量组1只动物(1975)在672h ADA检测结果为弱阳性；皮下注射5mg/kg剂量组2只动物(1951、1948)分别在168h和672h ADA检测结果为弱阳性，其中1只动物(1951)仅在168h检测出ADA，后续时间点检测均为阴性(详见表11)；以上个体虽为ADA阳性，但值接近SCP，不排除假阳性的可能性，整体来说VEGFR2-HS76抗体在CD-1小鼠体内的免疫原性较弱。

表11单次尾静脉或皮下给予VEGFR2-HS76后在CD1小鼠体内的ADA

序列表

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Claims

1.一种分离的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示的重链CDR1域、氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示的重链CDR2域和氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示的重链CDR3域，且其中所述轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的轻链CDR1域、氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的轻链CDR2域和氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示的轻链CDR3域。

2.如权利要求1所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，包含氨基酸序列如SEQ IDNO：8所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的轻链可变区。

3.如权利要求1所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或嵌合抗体。

4.如权利要求3所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ IDNO：23所示的轻链可变区。

5.如权利要求1-4任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体进一步包含轻链恒定区和重链恒定区。

6.如权利要求5所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的kappa轻链恒定区，和/或所述重链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的IgG1重链恒定区。

7.如权利要求1-4中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其为IgG抗体。

8.如权利要求7所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其为IgG1抗体。

9.如权利要求1-4中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其为单克隆抗体。

10.如权利要求1-4中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其与重组人VEGFR2蛋白的结合亲和力K_D为5-150pM。

11.如权利要求10所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述结合亲和力K_D为10-70pM。

12.如权利要求10所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述结合亲和力K_D为38.8pM。

13.如权利要求1-4任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2或单链抗体分子。

14.如权利要求13所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述单链抗体分子为scFv、di-scFv、tri-scFv、双体抗体或scFab。

15.如权利要求1-4任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其结合表位是VEGFR2分子的Y565、L567、V576、L579、W591、K592、D620、V622、V637、R638。

16.一种抗体-药物缀合物，其包含如权利要求1-15任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂。

17.如权利要求16所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂通过接头连接。

18.一种核酸，其编码根据权利要求1-15任一项的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段。

19.如权利要求18所述的核酸，其包含如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列和如SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列，或者其包含如SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列。

20.一种表达载体，其包含如权利要求18或19所述的核酸。

21.一种宿主细胞，其包含如权利要求18或19所述的核酸或如权利要求20所述的表达载体。

22.一种用于产生如权利要求1-15任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段的方法，包括在适合于抗体表达的条件下培养如权利要求21所述的宿主细胞，和从培养基中回收表达的抗体。

23.一种药物组合物，包含如权利要求1-15任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或如权利要求16或17所述的抗体-药物缀合物或如权利要求18-19任一项所述的核酸或如权利要求20所述的表达载体，及药学上可接受的载体。

24.如权利要求1-15任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或如权利要求16或17所述的抗体-药物缀合物或如权利要求23所述的药物组合物在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。

25.一种药物组合，其包含如权利要求1-15任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或如权利要求16或17所述的抗体-药物缀合物或如权利要求23所述的药物组合物与一种或多种另外的治疗剂。

26.一种试剂盒，其包含如权利要求1-15任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或如权利要求16或17所述的抗体-药物缀合物或如权利要求23所述的药物组合物。

27.如权利要求26所述的试剂盒，其还进一步包含给药的装置。