CN110520533A - 治疗癌症的vegfr-2 car免疫细胞 - Google Patents

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Abstract

提供了使用CAR治疗人类癌症的组合物和方法。本发明包括工程化的CAR(嵌合受体抗原)和表达对VEGFR具有高亲和力的此类CAR的基因修饰的免疫细胞。更具体地，细胞是识别实体瘤上VEGFR‑2的CAR‑T细胞，其用途，其组合物及其制备方法。本发明包括靶向肿瘤血管生成的治疗VEGFR‑2依赖的癌症的治疗方法。嵌合抗原受体(CAR)，其与VEGFR‑2、VEGFR‑2的表位或片段、或VEGFR‑2的变体结合。

Description

治疗癌症的VEGFR-2 CAR免疫细胞
发明领域
本发明涉及癌症免疫疗法，更具体地涉及用于治疗人类癌症的组合物和方法。本发明包括工程化的CAR(嵌合受体抗原)和表达对 VEGFR具有高亲和力的此类CAR的基因修饰的免疫细胞。更具体地，细胞是识别实体瘤上VEGFR-2的CAR-T细胞，其用途、其组合物及其制备方法。本发明包括靶向肿瘤血管生成的治疗VEGFR-2依赖的癌症的治疗方法。
发明背景
免疫系统调节在恶性肿瘤治疗方面显示出巨大的希望。除了再活化肿瘤微环境中存在的T细胞的检查点抑制剂之外，外源性转导的嵌合抗原受体(CAR)-T细胞在白血病治疗的临床试验中提供了充满希望的响应。
血管生成是新的血管形成的过程并且对肿瘤生长超出一定尺寸是必需的。血管生成促进了实体肿瘤的生长和转移。肿瘤分泌促血管生成因子血管内皮生长因子(VEGF)，其通过与血管内皮生长因子受体 (VEGFR)结合作用于局部的内皮细胞。
血管内皮生长因子，VEGF，是内皮细胞特异性有丝分裂原。因为通过特异性促进内皮细胞的增殖而起到血管生成诱导剂的作用，它在生长因子中是独特的。通过其高亲和力受体来介导VEGF的生物应答，所述受体在胚胎形成期间和肿瘤形成期间选择性地表达在内皮细胞上。血管内皮生长因子通过与许多受体结合来调节血管发育、血管生成和淋巴管生成。对于造血干细胞的募集以及单核细胞和巨噬细胞的迁移，VEGFR-1是必需的。VEGFR-2调节血管内皮功能并且VEGFR-3 调节淋巴内皮细胞功能。
亟需以肿瘤血管生成为目标的治疗或预防癌症的组合物和方法。该等需求包括使用具有临床活性的CAR治疗实体瘤，所述CAR识别在肿瘤细胞上表达的VEGFR-2从而帮助控制肿瘤相关的血管生成，从而试图限制/减少癌症进展/生长。
发明概述
多种肿瘤表达VEGFR-2。本文描述了靶向表达VEGFR-2的肿瘤的CAR和CAR-T细胞。本文所提供的抗VEGFR-2的CAR和CAR-T 细胞具有抑制/减少血管生成和诱导肿瘤蜕变的用途。
本发明提供了工程化以靶向实体瘤的CAR。一方面，基因工程化 T细胞以产生允许T细胞识别肿瘤细胞上特异蛋白(抗原)的表达CAR 的蛋白。然后在用于治疗前在实验室中使这些工程化的CAR-T细胞生长。其他方面，本文所述的CAR对VEGFR-2依赖的癌症具有高亲和力。本文所述的CAR的独特特异性来自使用sdAbs(单域抗体)代替工程化的CAR的scFv。由于其尺寸小，这提供了更高的亲和力。此类抗体还具有易于重折叠的自然倾向和生物物理稳定性。此外，它们可以识别常规抗体不可接近的表位并且能够被工程化。
本发明的某些方面是包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的人T细胞，其中所述CAR包含VEGFR-2结合结构域，其中所述CAR 还包含跨膜结构域、4-1BB共刺激信号区以及CD3ζ信号结构域，其中所述T细胞源于患有癌症的人。在某些方面，治疗表达VEGFR-2 的癌症。
在本文所述的某些方面，用于CAR和CAR-T细胞中的sdAbs是 VEGFR-2特异性的骆驼科单域抗体。在某些方面，sdAbs是VEGFR-2 以及其片段或其变体特异性的。
本发明的CAR构建体可以包含分离的或纯化的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含SEQ ID NO:2-30中的一种序列，或与其具有至少 85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少 91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％同一性的序列，或与其基本上同一的序列，所述抗体或其片段有或没有接头序列。在某些方面，接头序列可以包含在某些方面对化学结合有用的末端半胱氨酸。
适合于本发明的单域抗体的接头序列可选自SEQ ID NO:54-65。在某些方面，接头序列可以还包含C末端半胱氨酸，例如SEQ ID NO:66-69。本文可使用与这些接头序列相似的序列。
在某些方面，提供了表达本文所述的CAR的免疫细胞。免疫细胞通常是T细胞或CIK细胞，但也可以是自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性 T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。
本文所述的某些方面，提供了用于制备VEGFR-2特异性的CAR-T 的方法。在某些方面，所述方法可以是病毒性的或非病毒性的。更具体地，在某些方面中的方法是包含转座子的非病毒性方法。
本发明提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、一种或多种共刺激信号区以及CD3ζ信号结构域，所述抗原结合结构域是与VEGFR-2及其变体、片段和特定表位结合的sdAb。一方面，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO:79的核酸序列。在这一非限制性实例中，CAR包含 AB1(SEQ ID NO:2)。
一方面，CAR中的抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。通常，抗原结合片段是单域抗体或其片段。
一方面，CAR中的sdAb与表达VEGFR-2的实体瘤结合。
一方面，CAR中的共刺激信号区包含选自以下的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、及其任何组合。
本发明还提供了分离的CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号区和CD3ζ信号结构域。
本发明还提供了包含编码CAR的核酸序列的细胞，其中所述CAR 包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号区和CD3ζ信号结构域。
一方面，包含CAR的免疫细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、 CIK细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。
本发明还提供了包含编码CAR的核酸序列的载体，其中所述CAR 包含抗原结合结构域、共刺激信号区和CD3ζ信号结构域。
本发明还提供了用于减少哺乳动物中肿瘤生长的方法。一方面，该方法包括向哺乳动物给予有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域、共刺激信号区和CD3ζ信号结构域，其中所述抗原结合结构域是特异性识别VEGFR-2的sdAb。
本发明还提供了用于减少哺乳动物中与肿瘤相关的血管生成的方法。一方面，该方法包括向哺乳动物给予有效量的基因修饰以表达 CAR的细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域、共刺激信号区和 CD3ζ信号结构域，其中所述抗原结合结构域是特异性识别VEGFR-2 的sdAb。
本发明还包括治疗患有与VEGFR-2表达升高相关的肿瘤的哺乳动物的方法。一方面，该方法包括向哺乳动物给予有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，从而治疗哺乳动物，其中所述CAR包含VEGFR-2 特异性的sdAb、共刺激信号区和CD3ζ信号结构域。
一方面，细胞是自体T细胞。
另一方面，细胞是同种异体T细胞。
本发明还包括在被诊断患有癌症的人中产生持续存在的基因工程化的T细胞群的方法。一方面，该方法包括向人给予基因工程化以表达CAR的T细胞，其中所述CAR包含VEGFR-2特异性的抗原结合结构域、共刺激信号区和CD3ζ信号结构域，其中在给予后持续存在的基因工程化的T细胞群在人中持续存在至少一个月。
一方面，持续存在的基因工程化的T细胞群包含选至少一种选自给予至人的T细胞、给予至人的T细胞的子代及其组合的细胞。
一方面，持续存在的基因工程化的T细胞群包含记忆T细胞。
一方面，持续存在的基因工程化的T细胞群在给予后在人中持续存在至少三个月。另一方面，持续存在的基因工程化的T细胞群在给予后在人中持续存在至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。
本发明还提供了在被诊断患有癌症的人中扩增基因工程化的T细胞群的方法。一方面，该方法包括向人给予基因工程化以表达CAR的 T细胞，其中所述CAR包含VEGFR-2特异性的sdAb、共刺激信号区和CD3ζ信号结构域，其中所述给予的基因工程化的T细胞在人中产生子代T细胞群。
一方面，在人中子代T细胞包含记忆T细胞。
一方面，T细胞是自体T细胞或同种异体T细胞。
一方面，免疫细胞是CIK细胞，其能够是自体的或同种异体的。
另一方面，人对至少一种化学治疗剂有抗性。
一方面，癌症是表达VEGFR-2以及其变体或表位的任何癌症。此类癌症包括但不限于胰腺、乳腺、结直肠、肺、胃、卵巢和膀胱。
一方面，子代T细胞群在给予后在人中持续存在至少三个月。另一方面，子代T细胞群在给予后在人中持续存在至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。
本发明的某些方面的是嵌合抗原受体(CAR)，其与VEGFR-2、 VEGFR-2的表位或其片段、或VEGFR-2的变体结合。其他方面是本发明的CAR的功能部分，其保留CAR的部分生物活性。
某些方面，CAR包含用于与VEGFR-2结合的单域抗体或其片段。单域抗体可以包含选自SEQ ID No:2-30的序列。
某些方面，单域抗体或其片段属于骆驼科(Camelidae)种。
某些方面，CAR与VEGFR-2的表位结合。例如，但不限于美国专利第8,378,071号(其公开内容通过引用整体并入本文)中所描述的表位。
某些方面，CAR包含用于与VEGFR-2结合的互补决定区(CDR)1； CDR2；和CDR3。
某些方面，CAR包含氨基酸序列：
[信号肽-VHH-CD8铰链-CD28-4-1BB-CD3ζ-T2A-EGFRt]，
某些方面，其包含SEQ ID NO:78或其变体或片段或由SEQ ID NO:78或其变体或片段组成，诸如与其具有至少90％同一性的序列。 VHH序列包含AB1(SEQ ID NO:2)。SEQ IDNO:79代表编码CAR的核酸序列。
某些方面，CAR包含间隔分子、跨膜区和一种或多种细胞信号结构域，所述细胞信号结构域选自人CD8-α蛋白、人CD28蛋白、人CD3-ζ蛋白、人FcRy蛋白、CD27蛋白、OX40蛋白、人4-IBB蛋白、前述任一种的修饰形式以及前述的任何组合。
某些方面的是包含如本文所述的CAR的免疫细胞。细胞可以是T 细胞或细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞。某些方面，免疫细胞还可以包含至少第二CAR。
某些方面，免疫细胞包含任选地极度活跃的转座子/转座酶系统。某些方面，转座子/转座酶系统是睡美人转座子/转座酶系统。其他方面，转座子/转座酶系统是SB100X转座子/转座酶系统。
其他方面，CAR免疫细胞还可以包含自杀基因。
其他方面，提供了作为包含药物载体、稀释剂和/或赋形剂的组合物的CAR免疫细胞。可以将该组合物冷藏、冷冻或解冻。
本发明的某些方面是编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中所述CAR包含VEGFR-2结合部分和免疫细胞激活部分，其中所述 VEGFR-2结合部分与VEGFR-2或其变体或片段结合。
某些方面，VEGFR-2结合部分包含针对VEGFR-2或VEGFR-2 的变体或片段的单域单克隆抗体或其抗原结合部分。某些方面，VEGFR-2结合部分包含单克隆抗体的可变区。
某些方面，免疫细胞激活部分包含任一种或多种以下蛋白中的T 细胞信号结构域：人CD8-α蛋白、人CD28蛋白、人CD3-ζ蛋白、人 FcRy蛋白、CD27蛋白、OX40蛋白、人4-IBB蛋白及其变体或片段。
某些方面的是包含编码嵌合抗原受体(CAR)的一条或两条多肽链的核苷酸序列的核酸分子，其中所述CAR从N末端至C末端依次包含：
i)VEGFR-2特异性的抗原结合单域抗体；
ii)跨膜结构域；
iii)共刺激多肽，其中所述共刺激多肽是4-1BB多肽和/或OX-40 多肽；以及
iv)细胞内信号结构域。
某些方面，第一多肽包含在单域抗体和跨膜结构域之间插入的铰链区。
某些方面，铰链区是免疫球蛋白IgG铰链区或源于CD8的铰链。
某些方面，细胞内信号结构域包含免疫受体酪氨酸激活基序 (ITAM)。
某些方面，细胞内信号结构域包含选自CD3-ζ和ZAP70的ITAM。
某些方面，核苷酸序列与T细胞特异性启动子可操作地连接。
某些方面，核苷酸序列与NK细胞特异性启动子可操作地连接。
本发明的某些方面是由如本文所公开的核酸序列编码的嵌合抗原受体(CAR)。某些方面，CAR是VEGFR-2特异性的。
某些方面，本发明的CAR包含SEQ ID NO:2-30的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括保留结合VEGFR-2的活性的其片段和变体。
某些方面是包含如本文所述的核酸分子的载体。某些方面，核酸分子编码SEQ IDNO:78的多肽。
某些方面是表达如本文所述的核酸分子或CAR的宿主细胞。某些方面，宿主细胞是免疫细胞。
某些方面，宿主细胞选自T细胞和细胞因子诱导的杀伤CIK细胞，并且某些方面，还可以包含至少第二CAR。
某些方面，宿主细胞还可以包含任选地极度活跃的转座子/转座酶系统。某些方面，转座子/转座酶系统是睡美人转座子/转座酶系统。其他方面，转座子/转座酶系统是SB100X转座子/转座酶系统。
某些方面，宿主细胞还可以包含自杀基因。
某些方面是包含如本文所述的至少一种宿主细胞的细胞群。
某些方面是包含如本文所述的免疫细胞或宿主细胞的药物组合物。
某些方面是治疗或预防哺乳动物中表达VEGFR-2的癌症的方法，该方法包括以有效治疗或预防哺乳动物癌症的量向所述哺乳动物给予如本文所述的免疫细胞或宿主细胞。某些方面，肿瘤是实体瘤。某些方面，癌症是胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、肝细胞癌、卵巢癌或膀胱癌。
某些方面是用于在个体中减少表达VEGFR-2的肿瘤的生长或减小表达VEGFR-2的肿瘤的尺寸的方法，其中该方法包括给予包含 VEGFR-2特异性的CAR-T的组合物。
某些方面是用于在个体中减少表达VEGFR-2的肿瘤的血管生成的方法，其中该方法包括给予包含VEGFR-2特异性的CAR-T的组合物。
本发明的其他方面如下：
本发明的一方面是嵌合抗原受体(CAR)，其与VEGFR-2、VEGFR-2 的表位或片段、或VEGFR-2的变体结合。
本发明的另一方面，CAR包含用于与VEGFR-2结合的单域抗体或其片段。
本发明的一方面，CAR包含骆驼科(Camelidae)种的单域抗体或其片段。
本发明的一方面，CAR与VEGFR-2的表位结合。
本发明的一方面，CAR与在SEQ ID NO:1中发现的表位结合。
本发明的一方面，CAR包含互补决定区(CDR)1；CDR2；和/或 CDR3，其中所述CDR1、CDR2、和CDR3中至少之一与VEGFR-2 结合。
本发明的一方面，CAR包含SEQ ID NO:78的序列，或与SEQ ID NO:78至少90％同一性的序列。
本发明的一方面，CAR还包含间隔分子、跨膜区和一种或多种细胞信号结构域，所述细胞信号结构域选自人CD8-α蛋白、人CD28蛋白、人CD3-ζ蛋白、人FcRy蛋白、CD27蛋白、OX40蛋白、人4-IBB 蛋白、前述任一种的修饰形式以及前述的任何组合。
本发明的一方面，CAR包含选自SEQ ID NO:2-30或31-53及其变体及片段的序列，或与SEQ ID NO:2-30或31-53至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少 92％、至少93％、至少94％或至少95％同一性的序列，或与SEQ IDNO:2-30或SEQ ID NO:31-53中任一种基本同一的序列。
本发明的一方面，CAR还可以包含选自SEQ ID NO:54-65中任一种及其变体的接头序列。
本发明的某些方面，CAR接头序列还可以包含C末端半胱氨酸，并且其他方面，接头序列选自SEQ ID NO:66-69。本文可以使用与这些接头序列相似的序列。例如，KK是合适的接头序列以及那些包含 SEQ ID NO:54-69的序列的任一种的序列。
本发明的某些方面，接头序列包含GSEQKGGGEEDDGC及其变体。
本发明的一方面是包含如本文所述的CAR的免疫细胞。
本发明的一方面，免疫细胞是T细胞或细胞因子诱导的杀伤(CIK) 细胞。
本发明另一方面，免疫细胞还包含至少第二CAR。
本发明的某些方面，免疫细胞还包含任选地极度活跃的转座子/ 转座酶系统。某些方面，转座子/转座酶系统是睡美人转座子/转座酶系统。其他方面，转座子/转座酶系统是SB100X转座子/转座酶系统。
本发明的某些方面，免疫细胞还包含自杀基因。
本发明的某些方面，将包含本发明的CAR的免疫细胞配制成包含药物载体、稀释剂和/或赋形剂的组合物。
本发明的一方面是编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中所述CAR包含VEGFR-2结合部分和免疫细胞激活部分，其中所述 VEGFR-2结合部分与VEGFR-2或其变体或片段结合。
本发明的某些方面，VEGFR-2结合部分包含针对VEGFR-2或 VEGFR-2的变体或片段的单克隆抗体或其抗原结合部分。某些方面， VEGFR-2结合部分包含单克隆抗体的可变区。
本发明的一方面，免疫细胞激活部分包含以下任一种或多种蛋白中的T细胞信号传导结构域：人CD8-α蛋白、人CD28蛋白、人CD3-ζ蛋白、人FcRy蛋白、CD27蛋白、OX40蛋白、人4-IBB蛋白及其变体或片段。
本发明的一方面，核酸分子包含SEQ ID NO:31-53中至少之一的核酸序列和/或与SEQ ID NO:1的序列结合的核酸序列。
本发明的一方面是包含编码嵌合抗原受体(CAR)的一条或两条多肽链的核苷酸序列的核酸分子，其中所述CAR从N末端至C末端依次包含：
i)VEGFR-2特异性的抗原结合单域抗体；
ii)跨膜结构域；
iii)共刺激多肽，其中所述共刺激多肽是4-1BB多肽和/或OX-40 多肽；和
iv)细胞内信号结构域。
本发明的某些方面，第一多肽包含在单域抗体和跨膜结构域之间插入的铰链区。
本发明的某些方面，铰链区是免疫球蛋白IgG铰链区或源于CD8 的铰链。
本发明的某些方面，细胞内信号结构域包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
本发明的某些方面，细胞内信号结构域包含选自CD3-ζ和ZAP70 的ITAM。
本发明的某些方面，核苷酸序列与T细胞特异性启动子可操作地连接。
本发明的某些方面，核苷酸序列与NK细胞特异性启动子可操作地连接。
本发明的某些方面，核酸分子包含SEQ ID NO:79。
本发明的某些方面是由SEQ ID NO:79的核酸序列所编码的嵌合抗原受体(CAR)。
本发明的某些方面，本发明的CAR包含SEQ ID Nos:2-30中任一种及其片段和变体的氨基酸序列。
本发明的某些方面是包含SEQ ID NO:31-53中任一种的核酸分子的载体。
本发明的一方面是表达SEQ ID NO:79的核酸分子或SEQ ID NO:78的CAR的宿主细胞。
本发明的某些方面，宿主细胞是免疫细胞。某些方面，宿主细胞选自T细胞和细胞因子诱导的杀伤CIK细胞。
本发明的某些方面，宿主细胞还包含至少第二CAR。
某些方面，本发明的宿主细胞还包含任选地极度活跃的转座子/ 转座酶系统。某些方面，转座子/转座酶系统是睡美人转座子/转座酶系统。某些方面，转座子/转座酶系统是SB100X转座子/转座酶系统。
本发明的某些方面，本发明的宿主细胞还包括自杀基因。
本发明的一方面是包含本发明的至少一种宿主细胞的细胞群，所述宿主细胞包含针对VEGFR-2的CAR。
本发明的一方面是包含宿主细胞或免疫细胞的药物组合物，所述宿主细胞或免疫细胞包含针对VEGFR-2的CAR。
本发明的一方面是治疗或预防哺乳动物癌症的方法，该方法包括以有效治疗或预防哺乳动物癌症的量向所述哺乳动物给予包含针对 VEGFR-2的CAR的免疫细胞或宿主细胞。
本发明的某些方面，癌症是表达VEGFR-2的癌症。
本发明的某些方面，癌症是实体瘤。
本发明的一方面是减少肿瘤中血管生成的方法，该方法包括以有效减少血管生成的量向哺乳动物给予包含针对VEGFR-2的CAR的免疫细胞或宿主细胞。
本发明的另一方面是CAR盒，其具有包含信号肽-VHH-CD8铰链 -CD28-4-1BB-CD3ζ-T2A-EGFRt的结构并且具有SEQ ID NO:79的核酸序列。
本发明的另一方面是CAR盒，其有包含信号肽-VHH-CD8铰链 -CD28-4-1BB-CD3ζ-T2A-EGFRt的结构并且具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
本发明的某些方面，CD8α跨膜结构域、CD8α铰链结构域、4-1BB 共刺激信号区和CD3ζ信号结构域可以被美国专利第9,518,123号(其公开内容整体并入本文)中所显示的核酸序列编码。
本发明的一方面是包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的人 T细胞，其中所述CAR包含VEGFR-2抗原结合结构域，其中所述CAR 还包含跨膜结构域，4-1BB共刺激信号区和CD3ζ信号结构域，其中所述T细胞源于患有癌症的人。某些方面，在使用选自抗病毒剂、化学疗法、放射、免疫抑制剂和抗体的方式对人治疗之前，从由人获得的血液样本中分离人T细胞。
附图简要说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本文所述的典型方面的以下详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中示出了目前典型的方面。然而，应该理解，本发明不限于附图中所示方面的精确安排和手段。
图1示出了AB1(SEQ ID NO:2)、AB2(SEQ ID NO:11)、AB3(SEQ ID NO:19)和AB4(SEQ ID NO:25)的尺寸排阻柱色谱。
图2示出了AB1(SEQ ID NO:2)、AB2(SEQ ID NO:13)、AB3(SEQ ID NO:21)和AB4(SEQ ID NO:27)与人VEGFR-2/Fc的结合。
图3示出了AB1(SEQ ID NO:7)与人VEGFR-2/Fc结合的结合动力学。
图4示出了(a)本发明的单域抗VEGFR-2抗体对VEGFR-2的表位作图和(b)AB1(SEQID NO:2)、AB2(SEQ ID NO:13)、AB3(SEQ ID NO:23)和AB4(SEQ ID NO:27)的表位的重叠结合。
图5示出了AB1m(SEQ ID NO:9)、AB2(SEQ ID NO:13)、 AB3m(SEQ ID NO:23)和AB4(SEQ ID NO:27)对VEGFR-1、VEGFR-2 和VEGFR-3的抗体结合和交叉反应性。所有4个单域抗体用于制备脲酶(“DOS47”)偶联物。通过ELISA检测这些偶联物与抗原VEGFR-2结合的能力以及它们与VEGFR-1和VEGFR-3交叉反应的能力。所有4 种抗体偶联物都与重组的VEGFR2/Fc结合，观察到美洲驼抗体偶联物结合力最强(与图2中所测定的KD值一致)。所有抗体都显示了与 VEGFR1/Fc的一定的交叉反应性。任何抗体对VEGFR3/Fc均无可检测到的结合。
图6示出了AB1(SEQ ID NO:2)、AB2(SEQ ID NO:13)、AB3(SEQ ID NO:23)和AB4(SEQ ID NO:27)的VEGF竞争性测定的结果。进行此项试验以评价抗体是否识别接近VEGF结合袋的区域。以各种不同的摩尔比将抗体-脲酶偶联物与VEGF混合，然后测定对在ELISA平板所所捕获的VEGFR2/Fc的结合。两种人抗体偶联物(AB2-(SEQ ID NO:13)和AB3-(SEQ IDNO:21)DOS47)与VEGFR2的结合被VEGF抑制，这表明这些抗体和VEGF结合有重叠位点。只有AB1-DOS47的结合受到VEGF影响的程度最小，这表明AB1抗体和VEGF结合是不同的位点。有趣的是，VEGF的存在增强了AB4-DOS47与VEGFR2 的结合，这表明AB4抗体与VEGF/VEGFR2复合物的结合比其与单独的VEGFR2结合要好。
图7示出了以各种不同的摩尔比将AB1(SEQ ID NO:9)-DOS47(A) 和AB3(SEQ IDNO:23)-DOS47(B)抗体-脲酶偶联物与4种非偶联抗体 (SEQ ID NO:7、13、21和27)(或作为阴性对照的抗CEACAM6)中的每一种混合，然后测定对在ELISA平板上包被的VEGFR2/Fc的结合。每一种抗体-脲酶偶联物的结合都被相应的非偶联抗体所抑制。另外， AB3-脲酶偶联物被非偶联AB2抗体所抑制，这表明这两种人抗体共享至少部分重叠的表位。非偶联AB3抗体也部分抑制了AB1-DOS47的结合，虽然只是在非常高的摩尔比的情况下。
图8示出了抗体和抗体-脲酶偶联物与293/KDR细胞的结合，所述293/KDR细胞是已被转染从而稳定地表达VEGFR2(KDR)的 HEK293细胞。用抗体或抗体-脲酶偶联物染色293/KDR细胞并且通过流式细胞术测定结合。抗体AB1(SEQ ID NO:6)和AB2(SEQ ID NO:18) 与293/KDR细胞上表达的VEGFR2结合。
图9示出了通过交联剂并通过与半胱氨酸连接而活化后V21H1(SEQ ID NO:3)抗体的解卷积质谱，显示了未活化的抗体、被一种交联剂活化的抗体和被两种交联剂活化的抗体的分布。
图10示出了V21H4(SEQ ID NO:6)样品在不同复性时间点的 RP-HPLC色谱。蓝色线：复性时间0时的样品，SP汇集的组分与复性缓冲液混合后的瞬间。红色线：混合后2小时的复性时间点。绿色线：时间0后4小时的复性样品和添加1.2mM半胱氨酸后2小时的复性样品。在12.513分钟洗脱未折叠抗体和在10.958分钟洗脱折叠抗体。
图11：(A-C)来自BiopharmaLynx的V21H4(SEQ ID NO:6)样品的完整蛋白质谱的屏幕快照。(A)V21H4(SEQ ID NO:6)的解卷积光谱，显示通过在复性期间形成二硫键将一半的胱胺附着到C末端半胱氨酸。(B)用2mM TCEP还原后V21H4(SEQ ID NO:6)的解卷积光谱，显示C末端一半的胱胺的解离。(C)用碘乙酰胺烷基化后还原的V21H4 的解卷积光谱，显示C末端半胱氨酸可接近巯氢基活化的交联剂。(D) 通过交联剂并且通过与半胱氨酸的连接而活化后V21H4的解卷积质谱。由BM(PEG)2活化的V21H4抗体产生单一活化的种类。
图12：(A)V21H1-(SEQ ID NO:3)DOS47和V21H4-(SEQ ID NO:6) DOS47的SDS-PAGE。1、2或3红色标记的条带是簇数。泳道1：分子量梯带。泳道2：HPU。泳道3和4：V21H1-DOS47。泳道5和6: V21H4-DOS47。(B)V21H1、V21H4、高纯度脲酶(HPU)、V21H1-DOS47 和V21H4-DOS47的尺寸排阻色谱图。
图13：(A)与重组的VEGFR2/Fc结合的生物素-V21H4(SEQ ID NO:6)(黑色)、V21H1-DOS47(SEQ ID NO:3)(绿色)和V21H4-(SEQ ID NO:6)DOS47(红色)的ELISA。所示的结果是对每一样品进行2-5次实验的代表并且表现为一式三份测试样品的平均数和SE。(B)生物素-V21H4(黑色)和V21H4-DOS47(红色)与293/KDR细胞所表达的 VEGFR2的结合。通过流式细胞术量化结合。所示结果是对每一样品进行2-3次实验的代表并且表现为一式两份测试样品的平均数和SE。 (C)在不同的抗体/脲酶偶联比下V21H4-DOS47的脲酶酶活性。虚线代表未偶联脲酶活性。(D)不同的抗体-脲酶偶联比下V21H4-DOS47与重组的VEGFR2/Fc结合的ELISA。所示结果是对每一样品进行两次实验的代表并且表现为一式两份测试样品的平均数和SE。
图14：V21H4(SEQ ID NO:6)、HPU和V21H4-(SEQ ID NO:6) DOS47的Western印迹。用(A)抗美洲驼抗体或(B)抗脲酶抗体探测印迹。泳道MW：分子量梯带。泳道1：V21H4。泳道2:HPU。泳道3 和4:V21H4-DOS47。
图15：(A)通过BiopharmaLynx软件处理的HP脲酶(顶部)和 V21H4-(SEQ ID NO:6)DOS47(底部)样品的胰蛋白酶消化的原始的 LC-MS(TIC)色谱图的屏幕快照。(B)结合位点UC824-VC136的b/y碎片谱的屏幕快照，以由UC824-BM(PEG)2修饰的V21H4肽GGGEEDDGC(顶部)和由VC136-BM(PEG)2修饰的脲酶肽 LLCVSEATTVPLS(底部)作图。
图16是限制性消化图，示出了核酸内切酶的结果，验证插入的片段(CAR盒)的分子量。
图17示出了用于确定慢病毒滴定的qPCR标准曲线。
图18示出了CAR表达的FACS检测。
图19示出了靶肿瘤细胞与本发明的CAR-T的溶解的LDH测定，显示了体外抗VEGFR-2 CAR-T在肺细胞(NCI-H23)、乳腺细胞 (ZR-75-30)和白血病细胞(HL-60)的有效性。CON-T是未转导的对照T 细胞，CAR-T细胞是本发明的VHH-CAR-T细胞。
图20是示出IL-2和IFN-γ测定的标准曲线的图。
图21是示出对照T细胞和本发明的CAR-T细胞所产生的IL-2的 ELISA检测的图。
图22是示出对照T细胞和本发明的CAR-T细胞所产生的IFN-γ的ELISA检测的图。
发明详述
本发明涉及用于治疗癌症诸如实体瘤的组合物和方法。本发明合并转导T细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)的过继性细胞转移。
T细胞是基因修饰以稳定地表达期望的靶向VEGFR-2的CAR，本文称之为CAR T细胞或CAR修饰的T细胞。细胞经基因修饰以在其表面上稳定地表达如本文所述的新颖的抗体结合结构域，这赋予了新颖的VEGFR-2抗原特异性。
在一实施方案中，本发明的CAR包含具有抗原识别结构域的胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。在一实施方案中，使用天然地与CAR结构域之一相关的跨膜结构域。在另一实施方案中，能够通过氨基酸取代挑选或修饰跨膜结构域。至于细胞质结构域，能够设计本发明的CAR独自包含CD28和/或4-1BB信号结构域或与能够用于本发明的CAR的任何其他期望的细胞质结构域组合。在一实施方案中，能够设计CAR的细胞质结构域以便还包含CD3ζ的信号结构域。例如，CAR的细胞质结构域能够包括但不限于CD3ζ、4-1BB和CD28信号模块及其组合。因此，本发明提供CAR T细胞及其用于过继性疗法治疗表达VEGFR-2的癌症的方法。
在一实施方案中，能够通过将包含期望的CAR的慢病毒载体引入细胞中产生本发明的CAR T细胞，所述CAR例如包含抗VEGFR-2、 CD8α铰链和跨膜结构域、人4-1BB和CD3ζ信号结构域的CAR。本发明的CAR T细胞能够在体内复制，导致能够长期存在从而能够引起持续的肿瘤控制。
此外，使用淋巴细胞输注将基因修饰的表达CAR的T细胞用于癌症患者或处于患癌症风险患者的治疗。优选地，治疗中使用自体的淋巴细胞输注。使用本文所述的方法和本领域中众所周知的方法激活和扩增从需要治疗的患者体内收集的自体的PBMC，然后将其回输至患者。
本发明包括使用可以表达包含CD3ζ和4-1BB共刺激结构域的抗 VEGFR-2 CAR的T细胞(也称为CART/VEGFR-2T细胞)。本发明的 CART/VEGFR-2T细胞能够在体内进行稳健的T细胞扩增。
定义
除非另有解释，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。分子生物学中常用术语的定义可以在OxfordUniversity Press出版的Benjamin Lewin的基因V(Genes V)1994(ISBN 0-19-854287-9)；Blackwell Science Ltd.出版的Kendrew等人(编辑)的分子生物学百科全书(TheEncyclopedia of Molecular Biology)1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及 VCH PublisherInc.出版的Robert A.Meyers(编辑)的分子生物学和生物技术：全面的案头参考(Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference)1995(ISBN1-56081-569-8)中找到。尽管可以将与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料用于测试本发明的实践中，但本文描述了典型的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，而不是意在进行限制。
为理解本申请的范围，冠词“一(a)”、“一(an)”、“所述(the)”、和“所述(said)”意指有一个或多个要素。
此外，如本文所用的术语“包含(comprising)”和它的衍生词，意为开放式术语，其指定声明的特征、要素、成分、组、整数和/或步骤，但并不排除其他未声明的特征、要素、成分、组、整数和/或步骤。前文也应用了具有相似的含义的词语，诸如术语“包括(including)”、“具有(having)”和它们的衍生词。
应当理解，被描述为“包含”某些组分的任何方面也可以“由……组成”或“基本上由……组成”，其中“由……组成”具有封闭式或限制性含义并且“基本上由……组成”意指包括指定的组分但排除其他组分，除了作为杂质存在的物质、作为被用于提供组分的过程的结果而存在的不可避免的物质，以及为了达到本文所述的技术效果之外的目的而添加的组分。例如，使用短语“基本上由......组成”定义的组合物涵盖任何已知的药学上可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载体等。通常，基本上由一组组分组成的组合物将包含少于5％重量比、通常少于3％重量比、更通常少于1％重量比的未指定组分。
应当理解，可以通过附带条件或否定限制从要求保护的发明中明确排除本文中定义为被包括的任何组分。此外，本文所给的所有范围包括范围的端点，还包括任何中间的范围点，无论是否明确指明。
本文所使用的诸如“基本上”、“约”、“大约”的程度术语意为修正的术语的合理量的误差的，如此不会显著性地改变最后的结果。这些术语可涉及可测量值，诸如数量、时距等，意在涵盖相对于指定值的±20％或±10％、更通常为±5％、甚至更通常为±1％和更通常为±0.1％的变化，因为该等变化适合于进行所公开的方法。
如本文所用，“活化”系指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的免疫细胞的状态，所述免疫细胞诸如CIK细胞或T细胞。活化还能够与诱导的细胞因子产生以及可检测的效应物功能相关。术语“活化的T细胞”尤其是指正在进行细胞分裂的T细胞。
还应理解，对核酸或多肽所给定的所有碱基尺寸或氨基酸尺寸、所有分子重量或分子质量的值是大概的，并且是提供用于描述。尽管可以将与本文所述的那些类似或等同的方法和材料用于本公开的实践或测试中，合适的方法和材料所述如下。缩写词“例如(e.g.)”衍生于拉丁语exempli gratia，并且在本文用于表示非限制性实例。因此，缩写词“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。词语“或(or)”意在包括“和(and)”，除非上下文另有明确指示。
术语“抗体”，在本领域中也被称为“免疫球蛋白”(Ig)，在本文中系指由成对的重多肽链和轻多肽链构建的蛋白；存在多种Ig同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。当抗体正确折叠时，每条链折叠成多种不同的球状结构域，所述球状结构域由更线性的多肽序列连接。例如，免疫球蛋白轻链折叠成可变(VL)结构域和恒定(CL)结构域，而重链折叠成可变(VH)结构域和三个恒定(CH、CH2、CH3)结构域。重链和轻链可变结构域(VH和VL)的相互作用导致抗原结合区(Fv)的形成。每个结构域具有本领域技术人员熟悉的已经确定的结构。
轻链可变区和重链可变区负责结合靶标抗原，并因此能够在抗体之间显示出显著的序列多样性。恒定区显示较少的序列多样性，并且负责结合许多天然蛋白以引发重要的免疫事件。抗体的可变区含有分子的抗原结合决定簇，并因此决定抗体对其靶标抗原的特异性。大多数序列可变性发生在六个高变区中，每个可变重链和轻链各三个；高变区结合以形成抗原结合位点，并有助于结合和识别抗原决定簇。抗体对其抗原的特异性和亲和力是由高变区的结构以及它们呈现给抗原的表面的尺寸、形状和化学性质决定的。存在用于鉴定高可变性区的多种方案，两种最常见的是Kabat的那些方案以及Chothia和Lesk的那些方案。Kabat等人(1991a；1991b)基于VH和VL结构域的抗原结合区的序列可变性定义了“互补决定区”(CDR)。Chothia和Lesk(1987) 基于VH和VL结构域中结构环区的位置定义了“高变环”(H或L)。由于这些单独的方案定义了相邻或重叠的CDR和高变环区，因此抗体领域的技术人员通常可互换地利用术语“CDR”和“高变环”，并且它们可以如此在本文中使用。由于这个原因，形成抗原结合位点的区域，在包含VH和VL结构域的抗体的情况下，被称为CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2、CDR H3；或者在重链或轻链的抗原结合区的情况下，被称为CDR1、CDR2，CDR3。在本文中根据被开发以帮助可变结构域的比较的IMGT编号系统(Lefranc等人，2003)提及CDR/ 环。在该系统中，保守氨基酸(诸如Cys23、Trp41、Cys104、Phe/Trp 118 和在位置89处的疏水性残基)总是具有相同的位置。此外，提供了框架区(FR1：位置1至26；FR2：39至55；FR3：66至104；和FR4： 118至128)和CDR(CDR1：27至38，CDR2：56至65；和CDR3：105 至117)的标准化的界定。
如本文所提及，“抗体片段”可以包括本领域已知的任何合适的抗原结合抗体片段。抗体片段可以是天然存在的抗体片段，或者可以通过操作天然存在的抗体或通过使用重组方法获得。例如，抗体片段可以包括但不限于Fv、单链Fv(scFv；由用肽接头序列连接的VL和VH 组成的分子)、Fab、F(ab')2、单域抗体(sdAb；由单个VL或VH组成的片段)，以及这些中任一种的多价呈现。SEQ ID NO:2-30中任一种的抗体片段是本领域中技术人员所理解的保留了与VEGFR-2结合的生物活性的那些片段。
如本文所用，术语“合成抗体”意指使用重组DNA技术产生的抗体，诸如例如通过如本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语还应被解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子产生并且DNA分子表达抗体蛋白的抗体，或指定抗体的氨基酸序列，其中使用本领域可获得的并且众所周知的合成DNA或氨基酸序列的技术获得DNA或氨基酸序列。
在非限制性实例中，抗体片段可以是来源于天然存在的来源的 sdAb。骆驼科来源的重链抗体(Hamers-Casterman等人，1993)缺乏轻链，并因此它们的抗原结合位点由一个称为VHH的结构域组成。在鲨鱼中也观察到了sdAb，并被称为VNAR(Nuttall等人，2003)。可以基于人Ig重链和轻链序列工程化其他sdAb(Jespers等人，2004；To等人， 2005)。如本文所用，术语“sdAb”包括通过噬菌体展示或其他技术从任何来源的VH、VHH、VL或VNAR储库直接分离的那些sdAb，来源于上述sdAb的sdAb，重组产生的sdAb，以及通过人源化、亲和力成熟、稳定化、增溶如骆驼化或其他抗体工程化方法进一步修饰此类sdAb 而产生的那些sdAb。本发明还涵盖了保留sdAb的抗原结合功能和特异性的同源物、衍生物或片段。
SdAb是新型抗体分子的优良构建模块，由于其具有高热稳定性、高洗涤剂抗性、对蛋白酶的相对高抗性(Dumoulin等人，2002)和高产率(Arbabi-Ghahroudi等人，1997)；也可以通过从免疫文库中分离(Li 等人，2009)或通过体外亲和力成熟(Davies和Riechmann，1996)，将其工程化以具有非常高的亲和力。
本领域技术人员将熟知单域抗体的结构(参见，例如，蛋白质数据库中的3DWT、2P42)。sdAb包含保留免疫球蛋白折叠的单个免疫球蛋白结构域；最值得注意的是，仅三个CDR形成抗原结合位点。然而并且如本领域技术人员所理解的，并非所有CDR都可能是结合抗原所需的。例如但不希望是限制性的，CDR中的一个、两个或三个可以有助于通过本发明的sdAb结合和识别抗原。sdAb或可变结构域的CDR 在本文中称为CDR1、CDR2和CDR3，并且如Kabat等人(1991b)所定义编号。
表位：抗原决定簇。表位是分子上特定的化学基团或肽序列，所述表位是抗原性的，即引起特异的免疫应答。例如，在多肽上，抗体与特定的抗原表位特异性结合。连续的氨基酸或通过蛋白的三维折叠使非连续的氨基酸并列可以形成表位。通常暴露于变性溶剂来保留源于连续的氨基酸所形成表位，而用变性溶剂处理时通常会失去通过三维折叠而形成的表位。独特的空间构象中表位通常包括至少3种、更经常至少5种、大约9种、或8至10种氨基酸。检测表位的空间构象的方法包括，例如X射线晶体照像术和二维核磁共振。例如参见“Epitope Mapping Protocols”Methods in Molecular Biology,Vol 66, GlennE.Morris,Ed(1996)(分子生物学方法中“表位作图协议”第66 卷)。在一实施方案中，表位与诸如HLA分子或DR分子的MHC分子结合。这些分子与具有被大约8个至大约10个氨基酸诸如9个氨基酸分隔的正确的锚定氨基酸的多肽结合。
如本文所用的术语“抗原”或“Ag”被定义为引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将理解，任何大分子包括几乎所有的蛋白质或肽都可以作为抗原。此外，抗原可以源于重组或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所用的术语的“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且以多种组合排列这些核苷酸序列以引发所期望的免疫应答。此外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以被合成或可以源于生物样品。此类生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
如本文所用的术语“抗肿瘤效应”或“癌症治疗”系指可以通过减小肿瘤体积、减少肿瘤细胞数量、降低肿瘤生长速率、减少转移数量、稳定的疾病、增加预期寿命或改善与癌症病况相关的各种生理症状来证明的生物学效应。“抗肿瘤效应”也可以通过本文所述的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来证明。
根据本发明，术语“自体抗原”意指被免疫系统错误地识别为外来的任何自身抗原。自体抗原包含但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
如本文所用，术语“自体的”意指来源于相同个体的任何材料，其随后将被重新引入该个体。
“同种异体的”系指来源于相同物种的不同动物的移植物。
“异种的”系指来源于不同物种的移植物。
“同系同种”系指来源于相同个体的移植物。
如本文所用，术语“共刺激配体”包括抗原提呈细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)上的分子，其与T细胞上的同源共刺激分子特异性结合，从而提供信号，该信号除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合提供的主要信号外，还介导T细胞应答，包括但不限于增殖、激活、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、 CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、 3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还尤其涵盖与存在于T细胞上的共刺激分子诸如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、 CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、 LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体的特异性结合的抗体。
“共刺激分子”系指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而通过T细胞介导共刺激应答，诸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
如本文所用，“共刺激信号”系指与主要信号如TCR/CD3连接组合引起T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
如本文所用，“有效量”意指提供治疗或预防益处的量。
“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列如基因、cDNA或mRNA 用作在具有确定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列的生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板的固有性质和由此产生的生物学性质。因此，如果在细胞或其他生物系统中，对应于基因的mRNA的转录和翻译产生蛋白，则基因编码蛋白。可以将编码链和非编码链称为编码此基因或cDNA的蛋白或其他产物，所述编码链的核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供，所述非编码链用作基因或cDNA转录的模板。
如本文所用，“内源性的”系指来自生物体、细胞、组织或系统内部或生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何材料。
如本文所用，术语“外源性的”系指从生物体、细胞、组织或系统之外引入或在生物体、细胞、组织或系统之外产生的任何材料。
如本文所用，术语“表达”被定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”系指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供用于表达的其他元件。表达载体包括掺入重组多核苷酸的本领域已知的所有那些表达载体，诸如粘粒、质粒(例如裸露的或被包含在脂质体中的)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
“同源的”系指两条多肽之间或两条核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两条比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据，例如如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据时，那么分子在此位置处是同源的。两条序列之间的同源性百分比是两条序列共有的匹配或同源位置的数量除以比较的位置数乘以100的函数。例如，如果两条序列中10个位置中的6个是匹配的或同源的，那么这两条序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和 TATGGC共有50％的同源性。通常，当比对两条序列时，进行比较以给出最大同源性。
“分离的”意指从天然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是从其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境如例如宿主细胞中。
在本发明的上下文中，使用以下常见核酸碱基的缩写。“A”系指腺苷、“C”系指胞嘧啶、“G”系指鸟苷、“T”系指胸苷和“U”系指尿苷。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白或RNA 的短语核苷酸序列也可以在某种程度上包括内含子，编码蛋白的核苷酸序列在某些形式中可以含有内含子。
如本文所用，“慢病毒”系指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒中在能够感染非分裂细胞方面是独特的；它们可以将大量遗传信息递送至宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。源于慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。
“转座子”或“可转座元件”是可以改变其在基因组内的位置，有时产生或逆转突变并改变细胞基因组大小的DNA序列。转座经常导致转座子的复制。存在两种不同类型的转座子：II类转座子，它由直接从一个地方移动到另一个地方的DNA组成；和I类转座子，其是逆转录转座子，它首先将DNA转录成RNA，然后使用逆转录酶制备RNA 的DNA拷贝以插入新的位置。转座子通常与介导转座子移动的转座酶相互作用。转座子/转座酶系统的非限制性实例包括睡美人、 Piggybac、青蛙王子(Frog Prince)和白马王子(Prince Charming)。
如本文所用，术语“调节”意指在不存在治疗或化合物的情况下，与个体中的应答水平相比和/或与在其它方面相同，但未经治疗的个体中应答水平相比，介导个体中应答水平的可检测的增加或减少。该术语涵盖扰乱和/或影响天然信号或应答，从而在个体通常是人中介导有益的治疗应答。
术语“可操作地连接”系指调控序列和异源核酸序列之间的功能性连接，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，将第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则将启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在必要时在相同的阅读框中连接两个蛋白编码区。
术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”旨在表示相对于来自组织或器官的正常细胞中的表达水平，来自疾病区域例如患者的特定组织或器官内的实体瘤的细胞中肿瘤抗原的异常表达水平。可以通过本领域已知的标准测定来确定具有以肿瘤抗原过表达为特征的实体瘤或血液恶性肿瘤的患者。
免疫原性组合物的“肠胃外”给予包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射，或输注技术。
如本文所用，术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员通常知道核酸是多核苷酸，其可以被水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以被水解成核苷。如本文所用的，多核苷酸包括但不限于通过本领域可获得的任何手段获得的所有核酸序列，包括但不限于重组手段(即使用普通克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列)，和通过合成手段。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白序列或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括通过肽键彼此连接的包含两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白。如本文所用，该术语是指短链，其在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚体，并且是指较长的链，其通常在本领域被称为蛋白，其有很多种类型。“多肽”包括，例如生物活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文所用，术语“启动子”被定义为启动多核苷酸序列特异性转录所需的，由细胞合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。
如本文所用，术语“启动子/调控序列”意指与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物表达所需的核酸序列。在某些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列还可以包括增强子序列和基因产物表达所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是，例如，以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
“组成型”启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或所有生理条件下引起基因产物在细胞中产生。
“诱导型”启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上只有当对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才引起基因产物在细胞中产生。
“组织特异性”启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码基因或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上只有细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时才引起基因产物在细胞中产生。
如本文关于抗体使用的术语“特异性结合”意指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，与来自一种物种的抗原特异性结合的抗体也可以与来自一种或多种物种的抗原结合。但是，此类交叉物种反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性。在另一实例中，与抗原特异性结合的抗体也可以与抗原的不同等位基因形式结合。然而，此类交叉反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性。在某些情况下，可以将术语“特异性结合”或“特异性地结合”用于指抗体、蛋白或肽与第二化学物种的相互作用，以意味着相互作用取决于化学物种上特殊结构(如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体通常识别并结合至特定的蛋白结构而不是蛋白。如果抗体是特异性针对表位“A”的，则含有表位A的分子(或游离的、未标记的 A)在含有标记的“A”和抗体的反应中的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。
术语“表位”意指能够与抗体特异性结合的蛋白决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，丧失与前者而与非后者的结合。
术语“刺激”意指通过刺激分子(例如TCR/CD3复合物)与其同源配体的结合诱导的初级应答，从而介导信号转导事件，诸如但不限于经由TCR/CD3复合体的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，诸如TGF-β下调和/或细胞骨架结构重组等。
如本文所用，术语“刺激分子”意指T细胞上的分子，其与抗原提呈细胞上存在的同源刺激配体特异性结合。
如本文所用，“刺激配体”意指这样的配体：当其存在于抗原提呈细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)上时，可以与T细胞上的同源结合配偶体(在本文中被称为“刺激分子”)特异性结合，从而由T细胞介导初级应答，包括但不限于激活、启动免疫应答、增殖等。刺激性配体是本领域众所周知的，并且尤其涵盖载有肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体。
如本文所用，“基本上纯化的”细胞是基本上无其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经从与在它天然存在状态下通常相关的其他细胞类型分离的细胞。在某些情况下，基本上纯化的细胞群是指同源的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经从与在它们的天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。某些方面，在体外培养细胞。其他方面，不在体外培养细胞。
如本文所用，“治疗”或“疗法”是获得有益的或期望的临床结果的方法。出于本文所述的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于减轻症状、减轻疾病程度、稳定(即不恶化)的疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态和缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。如果不接受治疗或疗法，“治疗”和“疗法”也可以意味着与预期的存活相比延长存活。因此，“治疗”或“疗法”是意在改变病症的病理而进行的干预。具体地，治疗或疗法可以直接预防、减缓或否则减少疾病或病症(诸如癌症)的病理，或者可以使细胞对通过其他治疗剂的治疗或疗法更易感。
术语“治疗有效量”、“有效量”、“足够量”意为当给予至包括哺乳动物的对象例如人时足以获得预期的结果的数量，例如有效治疗癌症的数量。本文所述的化合物的有效量根据诸如疾病状态、年龄、性别和对象的体重的因素而变化。如技术人员应理解的是，可以调整剂量或治疗方案以提供最佳的治疗反应。例如，在某些方面，给予治疗有效量的抗VEGFR-2 sdAb足以减少、抑制或预防与肿瘤进展或转移相关的血管的形成。
此外，具有治疗有效量的对象的治疗方案可以由单一给予组成，或者可替代地包括一系列施加。治疗期的长度取决于多种因素，诸如疾病的严重程度、对象的年龄、试剂的浓度、患者对试剂的应答性或它们的组合。还应理解，用于治疗的试剂的有效剂量可以在特殊治疗方案的过程中增加或减少。通过本领域已知的标准诊断测定可以得到剂量的变化并且变得显而易见。在某些方面，可以在用用于所讨论的疾病或病症(诸如癌症)的常规疗法治疗之前、期间或之后给予本文所述的抗体。
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”系指通过其将外源性核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括主要的主题细胞及其子代。
如本文所用，短语“在转录控制下”或“可操作地连接”意指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向，以控制通过RNA聚合酶的转录启动和多核苷酸的表达。
“载体”是物质组合物，其包含分离的核酸并且可以被用于将分离的核酸递送至细胞内部。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
术语“患者”、“个体(subject)”、“个体(individual)”等可以在本文中互换使用，并且是指适合于本文所述的方法的任何动物或其细胞，无论是体外还是原位。
此外，术语“患者”、“个体(subject)”和“个体(individual)”包括在其中可以引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物)。在某些非限制性方面，患者、对象或个体是哺乳动物并且包括人、狗、猫、小鼠、大鼠，以及它们的转基因物种。本文所用的术语“对象”指动物界的任何成员，通常是指哺乳动物。术语“哺乳动物”系指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人类、其他高等灵长类、家畜和动物园、运动会的动物或宠物，诸如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔子等。通常，哺乳动物是指人类。
与一种或多种其他治疗剂“组合”给予包括同时(并发的)给予和以任意顺序连续给予。
术语“药物可接受的”意指化合物或化合物组合与药物用途的制剂的其余组成部分相容，并且通常根据既定的政府标准(包括由美国食品和药品管理局颁布的那些标准)向人类给予是安全的。
术语“药物可接受的载体”包括但不限于溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂和/或吸收延迟剂等。药物可接受的载体的使用是众所周知的。
分离的：“分离的”生物组分(诸如蛋白质)已经基本上从在其中组分天然存在的生物体细胞中的其他生物成分(即染色体和染色体外DNA 和RNA、其他蛋白和细胞器)分离或纯化。已经被“分离的”的蛋白和肽包括通过标准纯化方法纯化的蛋白和肽。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的蛋白和肽，以及化学合成的蛋白和肽。
如本文所用的，“肿瘤”系指所有赘生的细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的以及所有癌前和癌性细胞和组织。
术语“癌症”和“癌性的”系指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长为特征的生理状况。如本文所用，癌症或癌性的被定义为以异常细胞迅速的和不受控制的生长为特征的疾病。癌症细胞能够局部传播或通过血液系统和淋巴系统传播到身体的其他部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
待治疗的癌症可以是任何类型的恶性肿瘤，并且一个方面，是肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌(例如腺癌)、胰腺癌、结肠癌(例如结直肠癌，诸如例如结肠腺癌和结肠腺瘤)、食管癌、口腔鳞癌、舌癌、胃癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴谱系的造血肿瘤(例如急性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤)、非霍奇金氏淋巴瘤(例如套细胞淋巴瘤)、霍奇金氏病、骨髓性白血病(例如急性骨髓性白血病(AML) 或慢性骨髓性白血病(CML))、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、甲状腺滤泡状癌、骨髓增生异常综合征(MDS)、间充质来源的肿瘤、软组织肉瘤、脂肪肉瘤、胃肠道间质肉瘤、恶性外周神经鞘肿瘤(MPNST)、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、间充质软骨肉瘤、淋巴肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、黑素瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤、脑肿瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、良性皮肤肿瘤(例如角化棘皮瘤)、乳腺癌(例如晚期乳腺癌)、肾癌、肾胚细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、前列腺癌(包括晚期疾病和激素难治性前列腺癌)、睾丸癌、骨肉瘤、头颈癌、表皮癌、多发性骨髓瘤(例如难治性多发性骨髓瘤)或间皮瘤。一方面，癌细胞源于实体瘤。典型地，癌细胞源于乳腺癌、结直肠癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺癌或前列腺癌。更典型地，癌细胞源于前列腺癌、肺癌、乳腺癌或黑素瘤。
“化学治疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂，诸如噻替派、CYTOXANTM环磷酰胺；烷基磺酸酯类，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷类，诸如苯佐替派 (benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺 (triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；乙酸原化合物(acetogenins)，诸如布拉他辛(bullatacin)和布拉它辛酮 (bullatacinone)；喜树碱类，诸如拓扑替康；苔藓抑素；callystatin； CC-1065及其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物；隐藻素类(cryptophycins)，诸如隐藻素1和隐藻素8；多拉司它汀(dolastatin)； duocarmycins，诸如合成类似物KW-2189和CB1-TM1；艾植塞洛素 (eleutherobin)；水鬼蕉碱；sarcodictyins；海绵抑制素；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲洛磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素类，诸如烯二炔抗生素类，例如卡奇霉素(calicheamicin)、尤其卡奇霉素γ1I和刺孢霉素ωI1，达内霉素(包括达内霉素A)，二膦酸盐类诸如氯膦酸盐，埃斯波霉素，新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团；阿克拉霉素；放线菌素；安曲霉素；重氮丝氨酸；博来霉素；放线菌素 C(cactinomycin)；卡柔比星(carabicin)；洋红霉素；嗜癌菌素；色霉素；放线菌素D(dactinomycin)；道诺霉素；地托比星；6-重氮-5-氧代-L- 正亮氨酸；ADRIAMYCINTM多柔比星，包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星和脱氧多柔比星；表柔比星；依索比星；伊达比星；麻西罗霉素；丝裂霉素类，诸如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢物，诸如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶 (5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，诸如卡鲁睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺药，诸如氨鲁米特、米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登素类，诸如美登新和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSKTM 多糖复合物；雷佐生；根霉素；西索菲兰；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类，诸如T-2毒素、疣孢菌素A、漆斑菌素A和蛇形菌素；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷("Ara-C")；紫杉烷类，诸如TAXOLTM紫杉醇、ABRAXANETM紫杉醇的无克列莫佛的白蛋白工程化纳米颗粒制剂、TAXOTERETM和多西他赛；苯丁酸氮芥；GEMZARTM吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂配位络合物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；长春新碱；NAVELBINETM长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康，诸如CPT11；拓扑异构酶抑制剂，诸如RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A类，诸如视黄酸；卡培他滨；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
该定义还包括用于调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂(SERMs)，包括例如它莫昔芬(包括NOLVADEXTM它莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基它莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮和FARESTON托瑞米芬；抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂(其调控肾上腺中的雌激素产生)，诸如例如4(5)-咪唑类、氨鲁米特、MEGASETM醋酸甲地孕酮、 AROMASINTM依西美坦、福美司坦、法倔唑、RIVISORTM伏氯唑、 FEMARATM来曲唑和ARIMIDEXTM阿那曲唑；以及抗雄激素类，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨 (1,3-二氧茂烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制参与异常细胞增殖的信号传导通路中基因表达的那些，诸如例如，PKC-α、 Ralf和H-Ras；核糖酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如，ANGIOZYMETM核糖酶)和HER2表达抑制剂；抗体，诸如抗VEGF抗体(例如， AVASTINTM抗体)；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTINTM疫苗、LEUVECTINTM疫苗和VAXIDTM疫苗；PROLEUKINTM rIL-2； LURTOTECANTM拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIXTM rmRH；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
某些方面，本文所述的抗体与其他常规抗癌治疗相加或协同作用。
“变体”是生物活性抗体或其具有与抗VEGFR-2 sdAb的序列不同(借助于在可比较的序列中插入、删除、修饰和/或取代一个或多个氨基酸残基)的氨基酸序列的片段，诸如SEQ ID NO:2-53中陈述的那些。变体通常具有与可比较的序列少于100％序列同一性。然而，一般地，生物活性变体会具有与可比较的序列至少大约70％氨基酸序列同一性，如至少大约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。变体包括保留VEGFR-2结合能力的至少10个氨基酸的肽片段。变体也包括其中一个或多个氨基酸残基被添加到N末端或C末端或可比较的序列中的多肽。例如N末端处“MQV”能够被“MKKQV”取代并且仍然保留与 VEGFR-2的结合能力。变体也包括其中许多氨基酸残基被删除或被一个或多个氨基酸残基任选地取代的多肽。也可以共价地修饰变体，例如通过不同于天然存在的氨基酸的部分取代或通过修饰氨基酸残基以产生非天然存在的氨基酸。
如本文所定义，“氨基酸同一性百分比”是在比对序列和如有必要引入缺口以获得最大的序列同一性百分比(并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分)后，候选序列与感兴趣的序列(诸如本发明的多肽)中的氨基酸残基的同一性百分比。没有N末端、C末端或内部扩展，候选序列的删除或插入都不应该解释为影响序列同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是本领域中众所周知的，诸如“BLAST”。
出于本文的目的，“活性的”或“活性”系指本文所述的sdAbs的生物学活性和/或免疫活性，其中“生物学的”活性指sdAbs所引起的生物学功能 (或抑制的或刺激的)。
因此，当“生物学活性的”或“生物活性”与“抗-VEGFR-2 sdAbs”共同使用时意指展示或共享VEGFR-2抗体的效应物功能的抗-VEGFR-2 sdAbs或其片段。此类抗体的生物活性之一是其至少部分地抑制血管形成的能力。
术语“抑制”或“抑制的”意指减小、限制、阻断或中和VEGFR-2的功能或活性。这些术语包括VEGFR-2的功能或活性的完全的抑制或部分的抑制。
如本文所用的“抗-VEGFR-2单域抗体”包括保留了VEGFR-2特异性的本发明的抗VEGFR-2抗体的修饰。此类修饰包括但不限于与诸如化学治疗剂(例如顺铂、紫杉醇、阿霉素)或细胞毒素(例如蛋白或非蛋白有机化学治疗剂)的效应物分子的接合。修饰还包括但不限于与可检测的报告部分地接合。延长了抗体半衰期(例如聚乙二醇化)的修饰也包括在内。通过本领域中已知的方法可以将蛋白和非蛋白制剂与抗体接合。接合方法包括直接的连接、经由共价地附着接头的连接和一对成员(例如抗生物素蛋白-生物素)的特异结合。此类方法包括，例如 Greenfield等,Cancer Research 50,6600-6607(1990)所描述的阿霉素的接合(通过引用的方式并入本文)和Amon等,Adv.Exp.Med.Biol.303, 79-90(1991)及Kiseleva等,MoI.Biol.(USSR)25,508-514(1991)所描述的那些，将二者都通过引用的方式并入本文。
本发明的抗体或其片段是VEGFR-2特异性的，所述VEGFR-2在许多实体瘤诸如但不限于乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和结肠癌中的表达是升高的。
VEGFR-2的序列(又称为KDR D1-7、sKDR D1-7、激酶插入结构域受体、蛋白-酪氨酸激酶受体Flk-1、CD309、III型受体酪氨酸激酶、 FLK1)可以是但不限于SEQ ID NO:1的序列：
范围：贯穿本公开，能够以范围形式呈现本文所述的各方面。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对本文所述范围的不可改变的限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，应该认为对诸如1至6的范围的描述具体公开了子范围，诸如1至3、1至4、 1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在该范围内的单个数字，例如 1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。
本文提及了许多专利申请、专利和出版物以帮助理解所述的方面。这些参考文献中的每一篇均通过引用的方式将其整体并入本文。
本发明涉及用于治疗癌症的组合物和方法，某些些方面为表达VEGFR-2的实体瘤。本发明涉及经转导以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞的过继性细胞转移的策略。CAR是将基于对所期望的抗原(例如，肿瘤抗原)具有特异性的抗体与活化细胞内结构域的T细胞受体组合以产生具有特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。基因修饰的T细胞疗法包括将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入T细胞，离体生长由此获得的引入基因的T细胞，然后将细胞输注至患者，其中CAR对肿瘤细胞的表面抗原具有特异性并且具有活化T细胞的能力。
本发明通常涉及该等T细胞的用途，所述T细胞经基因修饰以稳定表达对表达VEGFR-2、其片段和/或其表位的实体瘤具有特异性的 CAR。表达CAR的T细胞在本文中称为CAR-T细胞或CAR修饰的T 细胞。本发明的某些方面，将T细胞进行基因修饰以稳定表达CAR，所述CAR将VEGFR-2特异性的sdAb的抗原识别结构域与一种或多种细胞内共刺激结构域以及信号结构域组合成单个嵌合蛋白。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明的CAR具有针对血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)(在人中又称为激酶结构域区(KDR)并且在鼠中又称为胎肝激酶-1(Flk-1) 的特异性。VEGFR-2是血管内皮生长因子(VEGF)的受体，具有7个细胞外结构域，并且被血管内皮细胞选择性表达。肿瘤血管中肿瘤内皮细胞过表达VEGFR-2。此外，正常的细胞、非肿瘤细胞或非癌性细胞能够表达VEGFR-2。然而，在此类情况下，正常的细胞、非肿瘤细胞或非癌性细胞的VEGFR-2表达不如肿瘤细胞或癌细胞的表达稳健。就这一点而言，与正常的细胞、非肿瘤细胞或非癌性细胞的VEGFR-2 表达相比，肿瘤细胞或癌细胞能够过表达VEGFR-2或以显著地更高的水平表达VEGFR-2。VEGFR-2增强了肿瘤血管形成、生长和转移。不受特定理论的束缚，相信是通过结合VEGFR-2，CAR-T靶向并且破坏肿瘤血管中表达VEGFR-2的内皮细胞，攻击肿瘤血管，减少或消除肿瘤，促进免疫细胞对肿瘤部位的浸润，并且增强/扩大抗肿瘤应答。
抗血管生成的肿瘤理论提供了许多优势。例如，因为内皮细胞是基因稳定的，相信耐药性是不可能的。此外，血流使得易于接近血管内皮，并且相信对正常组织的副作用和毒性是有限的。此外，相信是肿瘤血管的破坏加速了肿瘤细胞的死亡。还相信是生成血管的内皮细胞均匀地上调抗原，例如VEGFR-2表达。而且，抗血管生成的肿瘤疗法可应用于包括血管供应的实体瘤。
一方面，本文描述了工程化的CARs。
在一具体的非限制性实例中，本文所述的CAR包含单域抗 VEGFR-2抗体，所述单域抗VEGFR-2抗体可包含任一下列序列(要注意的是，除了它们的SEQ ID NO之外，还通过它们的内部命名来定义序列，例如AB1、V21等。这些命名在本文可互换地使用，然而，如果就鉴定序列存在任何问题，则应认为SEQ ID NO是最重要的定义)。
SEQ ID NO:2-AB1；V21；在CDR下面划线
SEQ ID NO:3-V21H1；粗体的残基是附着脲酶的推定位置
SEQ ID NO:4-带有接头序列的AB1；V21H2
SEQ ID NO:5-带有接头序列的AB1m-2；V21H3
SEQ ID NO:6-AB1C；V21H4
SEQ ID NO:7-带有接头序列2的AB1；VR2-21
SEQ ID NO:8-AB1m
SEQ ID NO:9-带有接头序列的AB1m；V21N2K
SEQ ID NO:10-AB1m-2
SEQ ID NO:11-AB2；V18
SEQ ID NO:12-带有接头序列的AB2
SEQ ID NO:13-带有接头序列2的AB2；VR2-801-18
SEQ ID NO:14-V18H3
SEQ ID NO:15-AB2m
SEQ ID NO:16-带有接头序列的AB2m
SEQ ID NO:17-AB2m-2
SEQ ID NO:18-带有接头序列的AB2m-2；V18H2
SEQ ID NO:19-AB3；V45
SEQ ID NO:20-带有接头序列的AB3；V45H1
SEQ ID NO:21-带有接头序列2的AB3；VR2-801-45
SEQ ID NO:22-AB3m
SEQ ID NO:23-带有接头序列的AB3m；V45N2K
SEQ ID NO:24-V45H2
SEQ ID NO:25-AB4；V38
SEQ ID NO:26-带有接头序列的AB4
SEQ ID NO:27-带有接头2的AB4；VR2-38
SEQ ID NO:28-AB4m
SEQ ID NO:29-带有接头序列的AB4m
SEQ ID NO:30-AB4c；V38H3
或与其具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％同一性的序列，或与其基本同一的序列。
这些序列可以由得到所述氨基酸序列的任何核酸序列进行编码，应理解的是归因于遗传密码的简并性。可以编码以上所述的氨基酸序列的核酸序列的实例包括但不限于：
SEQ ID NO:31-AB1；V21
SEQ ID NO:32-AB1
SEQ ID NO:33-带有接头序列的AB1；V21H2
SEQ ID NO:34-带有接头序列2的AB1；VR2-21
SEQ ID NO:35-AB1c；V21H4
SEQ ID NO:36-AB1m-2
SEQ ID NO:37-带有接头序列的AB1m-2；V21H3
SEQ ID NO:38-AB2；V18
SEQ ID NO:39-AB2
SEQ ID NO:40-带有接头序列的AB2
SEQ ID NO:41-带有接头序列2的AB2；VR2-801-18
SEQ ID NO:42-AB2m-2
SEQ ID NO:43-带有接头序列的AB2m-2,V18H2
SEQ ID NO:44-AB3,V45
SEQ ID NO:45-AB3
SEQ ID NO:46-带有接头序列的AB3；V45H1
SEQ ID NO:47-带有接头序列2的AB3；VR2-801-45
SEQ ID NO:48-V45H2
SEQ ID NO:49-AB4；V38
SEQ ID NO:50-AB4
SEQ ID NO:51-带有接头序列的AB4
SEQ ID NO:52-带有接头序列2的AB4；VR2-38
SEQ ID NO:53-AB4c；V38H3
或与其具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％同一性的序列，或与其基本同一的序列。
适合于本发明的单域抗体的接头序列可以选自GSEQ(SEQ ID NO:54)、GSDEE(SEQID NO:55)、GSEEEDDDG(SEQ ID NO:56)、 GSEEEDDDGKK(SEQ ID NO:57)、GSEQKGGGEEDDG(SEQ ID NO:58)、GSEQKLISEEDLNHHHHH(SEQ ID NO:59)、 GSEQKLISEEDLNHHHHHH(SEQ IDNO:60)、GSEEDDDEEK(SEQ ID NO:61)、GSEQKGGGEEDDEE(SEQ ID NO:62)、GSEQKLISEEDLNGGGEDDEEG(SEQ ID NO:63)、 GSEQKLISEEDLNGGGEDEG(SEQ ID NO:64)和GSEQKGGGDEDG (SEQ ID NO:65)。某些方面，接头序列还可以包含C末端半胱氨酸，例如GSEQKGGGEEDDGC(SEQ ID NO:66)、 GSEQKLISEEDLNGGGEDDEEGC(SEQ ID NO:67)、GSEQKLISEEDLNGGGEDEGC(SEQ ID NO:68)和 GSEQKGGGDEDGC(SEQ ID NO:69)。与这些接头序列相似的序列可以用于本文。例如，KK是合适的接头序列以及任一包含SEQ ID NO:54-69的那些。
CAR包含与VEGFR-2、其表位、其片段或上述的变体结合的 VEGFR-2结合部分，并且还包含免疫细胞活化结构域。当由免疫细胞表达时，VEGFR-2结合部分是细胞外结构域或细胞外结构域的一部分，并且免疫细胞活化结构域是细胞内信号结构域或细胞内信号结构域的一部分，通常是T细胞抗原受体复合物ζ链(例如CD3ζ)的一部分。共刺激信号区也可以被包括在细胞内结构域中，并且是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的。间隔部分(也被称为铰链部分)通常被包括在细胞外结构域中以允许VEGFR-2结合部分有效地结合至其表位。细胞内和细胞外结构域通过跨越细胞质膜的跨膜结构域连接。
本发明的CAR的代表性的非限制性结构包含识别肿瘤细胞的 VEGFR-2的单域抗体、跨膜结构域和激活T细胞的TCR复合物CD3ζ的细胞内结构域(被称为第一代CAR)。一方面，CAR包含SEQ ID NO:78的序列：
或其片段或其变体。
如本领域技术人员所理解的，可以通过多种方法获得此类单域抗体的核酸序列。例如，核酸序列可以是SEQ ID NO:79的序列：
表达CAR的T细胞直接识别肿瘤细胞的表面抗原，不依赖于肿瘤细胞上主要组织相容性抗原I类的表达，并同时活化T细胞，从而表达CAR的T细胞可以有效杀伤肿瘤细胞。
为了增强第一代CAR活化T细胞的能力，将作为T细胞的共刺激分子的CD28的细胞内结构域与第一代CAR连接，从而可以制备第二代CAR。将源于作为肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的(例如)CD137(4-1BB)或CD134(OX40)的细胞内结构域与第一代CAR串联连接，从而还可以制备第三代CAR。因此，本发明包括许多靶向 VEGFR-2的CAR分子。
本发明的CAR包括其功能部分。当涉及CAR时，术语“功能部分”系指本发明的CAR的任何部分或片段，所述部分或片段保留CAR的生物活性，其中这是部分CAR(亲代CAR)。功能部分包括，例如，与亲代CAR相比，保留以相似的程度、相同的程度或更高的程度识别靶细胞或检测、治疗或预防疾病的能力的CAR的那些部分。关于亲代 CAR，功能部分能够包含，例如亲代CAR的大约10％、25％、30％、 50％、68％、80％、90％、95％或更多。
在部分的氨基末端或羧基末端或在这两末端，功能部分能够包含额外的氨基酸，额外的氨基酸不在亲代CAR的氨基酸序列中。期望的的是，额外的氨基酸不干扰功能部分的生物功能，例如识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更期望的是，与亲代CAR的生物活性比较，额外的氨基酸增强生物活性。
本发明的范围所包括的是本文所述的发明的CAR、多肽和蛋白的功能性变体。本文所用的术语“功能性变体”系指具有与亲代CAR、多肽或蛋白基本或显著同一性或相似性的序列的CAR、多肽或蛋白，所述功能性变体保留CAR、多肽或蛋白的生物活性(与VEGFR-2结合)，其中CAR、多肽或蛋白是变体。功能性变体包括，例如与亲代CAR、多肽或蛋白相比，保留以相似的程度、相同的程度或更高的程度识别靶细胞的能力的本文所述的CAR、多肽或蛋白(亲代CAR、多肽或蛋白)的那些变体。关于亲代CAR、多肽或蛋白，例如功能性变体能够是与亲代CAR、多肽或蛋白的氨基酸序列大约30％、50％、75％、80％、 90％、98％或更多的同一性。
例如，功能性变体能够包含带有至少一个保守氨基酸取代的亲代 CAR、多肽或蛋白的氨基酸序列。可替代地或另外地，功能性变体能够包含带有至少一个非保守氨基酸取代的亲代CAR、多肽或蛋白的氨基酸序列。在这种情况下，对非保守氨基酸取代而言，通常不干扰或不抑制功能性变体的生物活性。非保守氨基酸取代可以增强功能性变体的生物活性，从而使得与亲代CAR、多肽或蛋白相比，功能性变体的生物活性增加。
本发明的CAR的氨基酸取代是典型的保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是本领域中已知的，并且包括其中具有某些物理和/或化学特性的氨基酸与另一具有相同或相似化学或物理特性的氨基酸进行交换的氨基酸取代。例如，保守氨基酸取代可以是酸性氨基酸被另一酸性氨基酸取代(例如Asp或Glu)、带有非极性侧链的氨基酸被另一带有非极性侧链的氨基酸取代(例如Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、 Trp、Val等)、碱性氨基酸被另一碱性氨基酸取代(Lys、Arg等)、带有极性侧链的氨基酸被另一带有极性侧链的氨基酸取代(Asn、Cys、Gln、 Ser、Thr、Tyr等)等。
CAR、多肽或蛋白基本上由本文所述的特定的氨基酸序列组成，从而使得其他组分例如其他氨基酸不会实质上改变功能性变体的生物活性。
本发明实施方案的CAR、多肽和蛋白(包括功能性部分和功能性变体)能够是任何长度，即能够包含任何数量的氨基酸，条件是CAR、多肽或蛋白(或其功能性部分或功能性变体)保留它们的生物活性，例如，与VEGFR-2特异性结合的能力、治疗或预防宿主疾病的能力等。例如，多肽能够是大约50个至大约5000个氨基酸长度，诸如50个、 70个、75个、100个、125个、150个、175个、200个、300个、400 个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个或更多个氨基酸的长度。就这一点而言，本发明的多肽还包含寡肽。
本发明实施方案的CAR、多肽和蛋白(包括本发明的功能性部分和功能性变体)能够包含替代一个或多个天然存在的氨基酸的合成氨基酸。此类合成氨基酸是本领域中已知的，并且包括，例如，氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-羟脯胺酸和反式-4-羟脯胺酸、4-氨基苯基丙氨酸、4- 硝基苯基丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸、4-羧基苯基丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单翔安、N’-苯基-N’-甲基-赖氨酸、N’,N’-二苄基-赖氨酸、 6-羟赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-环庚烷胺羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α-γ-二氨基丁酸、α-β-二氨基丙酸、苯基丁氨酸以及α-叔亮氨酸。
本发明实施方案的CAR、多肽和蛋白(包括功能性部分和功能性变体)能够是糖基化的、酰胺化的、羧基化的、磷酸化的、酯化的、N- 酰化的、例如经由二硫键环化的、或转化为酸加成盐和/或任选地二聚化的或聚合的或结合的。
VEGFR-2结合部分
典型的方面，本文所述的CAR对VEGFR-2、其片段、其表位和任何前述的VEGFR-2、其片段、其表位的变体有特异性。本发明的 VEGFR-2结合部分使其与细胞/肿瘤表面上携带的VEGFR-2以期望的亲和力结合，导致(1)受体下调而减少血管生成和(2)免疫细胞活化，其中提供VEGFR-2结合部分以在肿瘤微环境中引发细胞毒性活性并释放细胞因子，并进一步扩增。
不希望受理论束缚，相信该抗体/VEGFR-2表位相互作用具有有利水平的亲和力(不太高且不太低)，使得抗体能够结合第一细胞上的表位并活化细胞杀伤，然后继续结合第二或其他细胞上的其他表位并且活化其他细胞杀伤。
因此，本文还描述了CAR，其包含在VEGFR-2结合部分内的互补决定区(CDR)1；CDR2和CDR3，其中抗体或其片段是VEGFR-2特异性的。
术语“抗体”和“抗体片段”(“其片段”)如上所定义。如前所述，抗体或其片段可以是sd Ab。sd Ab可以是骆驼科来源的(例如，来自骆驼科 (Camelidae)种)或来源于骆驼科VHH，因此可以基于骆驼科框架区；或者，可以将上所述的CDR移植到VNAR、VHH或VL框架区上。在另一可替代的方案中，可以将上述高变环移植到其他类型的抗体片段(Fv、 scFv、Fab)的框架区上。
本发明还涵盖使用本领域已知的任何合适方法例如但不限于 CDR移植法和镶饰的“人源化”的抗体片段。抗体或抗体片段的人源化包括用如在人类共有序列中发现的人对应物替代序列中的氨基酸，而不丧失抗原结合能力或特异性；当引入人类个体中时，这种方法降低了抗体或其片段的免疫原性。在CDR移植的过程中，可以将本文定义的一个或多于一个的重链CDR融合或移植到人可变区(VH和VL)，或其他人抗体片段框架区(Fv、scFv、Fab)。在此类情况下，保留了所述一个或多于一个的高变环的构象，并且还保留了sdAb对其靶标(即毒素A和B)的亲和力和特异性。
在至少以下专利中描述了CDR移植：美国专利第6,180,370号、美国专利第5,693,761号、美国专利第6,054,297号、美国专利第 5,859,205号和欧洲专利第626390号(在此通过引用的方式将其公开的内容整体并入)。镶饰，在本领域中也称为“可变区表面重修”，涉及人源化抗体或片段的溶剂暴露位置；因此，保留可能对CDR构象重要的隐藏的非人源化残基，同时最小化针对溶剂暴露区的免疫反应的可能性。在至少以下专利中描述了镶饰：美国专利第5,869,619号、美国专利第5,766,886号、美国专利第5,821,123号和欧洲专利第519596号(在此通过引用的方式将其公开的内容整体并入)。本领域技术人员将充分熟悉制备此类人源化抗体片段的方法。
基本同一的序列可以包含一个或多个保守氨基酸突变。本领域已知参比序列的一个或多个保守氨基酸突变可以产生与参比序列相比在生理、化学或功能性质上没有实质变化的突变肽；在此类情况下，参比序列和突变序列被认为是“基本同一的”多肽。保守氨基酸突变可以包括氨基酸的添加、删除或取代；保守氨基酸取代在本文中被限定为将氨基酸残基取代为具有类似化学性质(例如大小、电荷或极性)的另一氨基酸残基。
在非限制性实例中，保守突变可以是氨基酸取代。此类保守氨基酸取代可以将碱性、中性、疏水性或酸性氨基酸取代为同一组中的另一种。术语“碱性氨基酸”意指侧链pK值大于7的亲水性氨基酸，其通常在生理pH下带正电荷。碱性氨基酸包括组氨酸(His或H)、精氨酸(Arg或R)和赖氨酸(Lys或K)。术语“中性氨基酸”(也称为“极性氨基酸”)意指具有在生理pH下不带电荷的侧链的亲水性氨基酸，但其具有两个原子共用的电子对被其中一个原子更紧密地保持的至少一个键。极性氨基酸包括丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys 或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰胺(Asn或N)和谷氨酰胺(Gln或Q)。术语“疏水性氨基酸”(也称为“非极性氨基酸”)意指包括根据 Eisenberg(1984)的归一化的共有疏水性标度展现出大于零的疏水性氨基酸。疏水性氨基酸包括脯氨酸(Pro或P)、异亮氨酸(Ile或I)、苯丙氨酸(Phe或F)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、色氨酸(Trp或 W)、蛋氨酸(Met或M)、丙氨酸(Ala或A)和甘氨酸(Gly或G)。“酸性氨基酸”系指侧链pK值小于7的亲水性氨基酸，其通常在生理pH下带负电荷。酸性氨基酸包括谷氨酸(Glu或E)和天冬氨酸(Asp或D)。
序列同一性用于评价两条序列的相似性；通过计算当比对两条序列以获得残基位置之间的最大对应性时相同的残基百分比来确定。可以使用任何已知方法来计算序列同一性；例如，计算机软件可用于计算序列同一性。不希望受到限制，能够通过软件计算序列同一性，诸如由瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)维护(以及在ca.expasy.org/tools/blast/中找到)的NCBI BLAST2服务、 BLAST-P、Blast-N或FASTA-N，或本领域已知的任何其他合适的软件。
本发明的基本同一的序列可以是至少85％同一的；在另一实例中，基本同一的序列可以是在氨基酸水平上与本文所述的序列至少70、 75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％(或其间的任何百分比) 同一的。具体方面，基本同一的序列保留了参比序列的活性和特异性。在非限制性实施方案中，序列同一性的差异可能是由于保守氨基酸突变导致的。
本发明的单域抗体或其片段还可以包含另外的序列以帮助重组抗体或其片段的表达、检测或纯化。可以使用本领域技术人员已知的任何此类序列或标签。例如，但不希望是限制性的，抗体或其片段可以包含靶向或信号序列(例如但不限于ompA)、检测标签、示例性标签盒包括Strep标签或其任何变体；参见，例如，美国专利第7,981,632号， His标签、具有序列基序DYKDDDDK的Flag标签、Xpress标签、Avi 标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、HA标签、Myc标签、Nus标签、S标签、SBP标签、Softag 1、Softag 3、V5标签、CREB结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、绿色荧光蛋白(GFP)、硫氧还蛋白标签或其任意组合；纯化标签(例如但不限于His5或His6)，或其组合。
在另一实例中，另外的序列可以是生物素识别位点，诸如Cronan 等人在WO 95/04069中或Voges等人在WO/2004/076670中描述的。还如本领域技术人员所知的，可以将接头序列与另外的序列或标签结合使用。
更具体地，标签盒可以包含细胞外组分，其能够高亲和力或亲合力与抗体特异性结合。在单链融合蛋白结构内，标签盒可以位于(a)紧邻连接子区的氨基末端，(b)插入在接头序列模块之间并连接接头序列模块，(c)紧邻结合结构域的羧基末端，(d)插入在结合结构域(例如scFv) 与效应子结构域之间并将结合结构域(例如scFv)与效应子结构域连接，(e)插入结合结构域亚基之间并连接结合结构域亚基，或(f)在单链融合蛋白的氨基末端。在某些实施方案中，可以将一个或多个连接氨基酸设置在标签盒与疏水性部分之间并将标签盒与疏水性部分连接，或者设置在标签盒与连接子区之间并将标签盒与连接子区连接，或者设置在标签盒与接头序列模块之间并将标签盒和接头序列模块连接，或设置在标签盒与结合结构域之间并将标签盒和结合结构域连接。
跨膜结构域
具体的方面，CAR包含跨膜结构域，其与CAR的细胞外结构域和细胞内结构域融合。一方面，使用天然地与CAR中的一个结构域相关联的跨膜结构域。在某些情况下，能够通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
跨膜结构域可以源于天然来源或合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可以源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本发明中具体使用的跨膜区可以源于(即至少包含其跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、 CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。通常，本文所述的CAR中的跨膜结构域是CD28跨膜结构域。
或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。通常，在合成的跨膜结构域的每个末端都会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，通常长度为2至10个氨基酸的短的寡肽接头序列或多肽接头序列，可以形成CAR的跨膜结构域与细胞质信号结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头序列。
间隔序列结构域
在CAR的细胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的细胞质结构域和跨膜结构域之间，可以掺入间隔序列结构域，也被称为铰链结构域。如本文所用的，术语“间隔序列结构域”通常意指任何寡肽或多肽，其功能是将跨膜结构域与多肽链中的细胞外结构域或细胞质结构域连接，并且从细胞表面提升VEGFR-2结合结构域。间隔序列结构域可以包含多达300个氨基酸，通常为10至100个氨基酸，且最通常为25至50个氨基酸。间隔序列可以包含以下之一，例如：人IgG1 Fc 结构域、IgG1铰链、IgG1铰链-CD8茎、CD8茎、IgG1铰链-CD28茎和CD28茎。
细胞质结构域
本文所述的CAR的细胞质结构域或另外的细胞内信号结构域负责活化其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”系指细胞的专门功能。T细胞的效应子功能例如可以是细胞裂解活性或包括细胞因子的分泌在内的辅助活性。因此，术语“细胞内信号结构域”系指转导效应子功能信号并指导细胞执行专门功能的蛋白的部分。虽然通常能够利用整个细胞内信号结构域，但在许多情况下，不必使用整条链。在使用细胞内信号结构域的截短部分的情形下，可以使用此类截短部分代替完整链，只要它转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内信号结构域意指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号结构域的任何截短部分。
用于本文所述CAR的细胞内信号结构域的典型实例包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列以及在抗原受体参与后配合启动信号转导的共同受体，以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何合成序列。
一级细胞质信号序列以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的一级细胞质信号序列可以含有信号基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM。
含有在本发明中具体使用的一级细胞质信号序列的ITAM的实例包括源于以下的那些ITAM：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、 CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。特别典型的是，本文所述的 CAR中的细胞质信号分子包含来源于CD3ζ的细胞质信号序列。
典型的方面，能够将CAR的细胞质结构域设计为自身包含CD3-ζ信号结构域，或者包含与在本文描述的CAR的上下文中有用的任何其他期望的细胞质结构域组合的CD3-ζ信号结构域。例如，CAR的细胞质结构域能够包含CD3ζ链部分以及一个或多个共刺激信号区。共刺激信号区系指包含共刺激分子的细胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。
可以以随机或指定的顺序将本文描述的CAR的细胞质信号部分内的细胞质信号序列彼此连接。任选地，通常长度在2和10个氨基酸之间的短寡肽接头序列或多肽接头序列可形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头序列。
一方面，细胞质结构域被设计成为包含CD3-ζ的信号结构域和 CD28的信号结构域。另一方面，细胞质结构域被设计为包含CD3-ζ的信号结构域和4-1BB的信号结构域。又一方面，细胞质结构域被设计为包含CD3-ζ的信号结构域以及CD28和4-1BB的信号结构域。
一方面，本文所述的CAR中的细胞质结构域被设计为包含CD28 和/或4-1BB的信号结构域以及CD3-ζ的信号结构域。
载体
本文描述了其中插入本发明的DNA的载体。源于逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于源于肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。
简而言之，通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子可操作地连接并将构建体掺入表达载体中来实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。载体能够适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和用于调控所期望的核酸序列表达的启动子。
使用标准基因递送方案，也可以将本发明的表达构建体用于核酸免疫接种和基因疗法。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利第5,399,346号、第5,580,859号、第5,589,466号，通过引用的方式将其整体并入本文。另一方面，本发明提供了基因疗法载体。
能够将核酸(SEQ ID NO:31-53或80)克隆到许多类型的载体中。例如，能够将核酸克隆到载体中，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，可以以病毒载体的形式将表达载体提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是众所周知知的，并且例如描述于Sambrook等人 (2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册), Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork)和其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点以及一种或多种可选择的标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利第6,326,193号，在此通过引用的方式将其内容整体并入)。
已经开发了许多用于将基因转移到哺乳动物细胞中的基于病毒的系统。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。能够使用本领域已知的技术将选定的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后能够分离重组病毒并在体内或离体递送至个体的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域中已知的。某些方面，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。一方面，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件例如增强子调控转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30至110bp的区域，尽管最近已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔能够在活性开始下降之前增加至相距50bp。根据启动子，似乎单个元件能够协同或独立地起作用以激活转录。
合适的启动子的一实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒 (MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、 MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子(Epstein-Barr virus immediate early promoter)、劳斯肉瘤病毒启动子以及人类基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本文描述的部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其当需要此类表达时能够启动其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者当不需要表达时能够关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体还能够含有选择标志物基因或报告基因或两者，以便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。其他方面，选择标志物可以在单独的DNA片段上被携带并被用于共转染程序。可以将选择标志物和报告基因两者侧接适当的调控序列以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择标志物包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。
将报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和用于评价调控序列的功能。通常，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不被受体生物体或组织表达并且编码多肽的基因，其表达通过一些易于检测的特性例如酶活性表现出来。在将DNA引入受体细胞后，在适当的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000FEBSLetters(FEBS快报)479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的，并可以通过使用已知技术制备或商业上获得。通常，显示报告基因最高表达水平的具有最小5’侧翼区的构建体被鉴定为启动子。可以将此类启动子区与报告基因连接，并被用于评价试剂调节启动子驱动的转录的能力。
将基因引入细胞并将其表达到细胞中的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文中，通过本领域的任何方法能够容易地将载体引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物学手段将表达载体转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。用于将多核苷酸引入宿主细胞的典型方法是磷酸钙转染。
用于将目标多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA 和RNA载体。病毒载体并且尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物例如人类细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体能够源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利第5,350,674号和第5,585,362号。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。另一方面，可以将核酸与脂质缔合。可以将与脂质相缔合的核酸包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，由与脂质体和寡核苷酸相缔合的连接分子与脂质体连接，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质结合，以悬浮液形式包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、作为胶束或具有“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物的化合物类，如脂肪酸类、醇类、胺类、氨基醇类和醛类。
能够从商业来源获得适合使用的脂质。例如，能够从Sigma,St. Louis,Mo.获得二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)；能够从K&K实验室(普莱恩维尤,N.Y.)获得磷酸二鲸蜡脂(“DCP”)；能够从 Calbiochem-Behring获得胆固醇(“Choi”)；可以从Avanti Polar Lipids公司(阿拉巴马州伯明翰)获得二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质。能够在约-20℃下储存脂质的氯仿或氯仿/甲醇储液。将氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是上位术语，其涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单一和多层脂质载体。能够将脂质体表征为具有囊泡结构，所述囊泡结构有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有被水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质 (Ghosh等人，1991Glycobiology 5:505-10)。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质体-核酸复合物。
无论用于将外源性核酸引入宿主细胞或以其它方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法，为了证实宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种测定。此类测定包括，例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，诸如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段 (ELISA和Western印迹)或通过本文所述的测定以鉴定落入本文所述范围内的试剂。
转座子/转座酶系统
用于将DNA引入细胞的典型方法包括DNA缩合试剂如磷酸钙、聚乙二醇等，含脂质的试剂如脂质体、多层囊泡等，以及病毒介导的策略。
然而，所有这些方法都有其局限性。例如，存在与DNA缩合试剂和病毒介导的策略相关的尺寸限制。此外，能够转染到细胞中的核酸的量在病毒策略中受到限制。并非所有方法都有助于将递送的核酸插入细胞核酸中，并且虽然DNA缩合方法和含脂质的试剂相对容易制备，但是将核酸插入病毒载体中可能是劳动密集型的。此外，病毒介导的策略可以是细胞类型或组织类型特异性的，并且当在体内使用时，使用病毒介导的策略能够产生免疫学问题。
为了克服这些问题，一合适的工具是转座子。转座子或可转座元件包括其上游和下游具有末端重复序列的(短)核酸序列。活跃的转座子编码促进核酸切除和插入靶DNA序列的酶。
目前，已知两类转座子，即I类和II类转座子。
I类转座子，又被称逆转录转座子或逆转录子，包括逆转录病毒样逆转录转座子和非逆转录病毒样逆转录转座子。它们通过复制自己并将拷贝粘贴回基因组的多个位置的来起作用。最初，逆转录转座子将自身复制为RNA(转录)，但不是被翻译，而是通过逆转录酶(通常由转座子本身编码)将RNA复制为DNA并插回到基因组中。I类转座子的典型代表包括例如Copia(果蝇)、Ty1(酵母)、THE-1(人类)、Bs1(玉米)、 F-元件、L1(人类)或Cin4(玉米)。
作为第一步，必须使用标准方法(例如病毒感染等)将II类转座子转染到细胞中。之后，该II类转座子，也被称为“仅DNA转座子”，通过剪切和粘贴机制而不是通过复制和粘贴来移动，并在该机制中使用转座酶。不同类型的转座酶可以以不同的方式起作用。某些可以与 DNA分子的任何部分结合，并且靶位点能够位于任何位置，而其他位点与特定序列结合。然后转座酶剪切靶位点以产生粘性末端，释放转座子并将其连接至靶位点。典型的II类代表包括P元件(果蝇)、 Ac-Ds(玉米)、TN3和IS1(大肠杆菌(E.coli))、Tam3(金鱼草)等。
特别地，使用II类转座子，元件编码的转座酶催化转座子从其原始位置的切除并促进其插入基因组中的其他位置(Plasterk,1996 Curr. Top.Microbiol.Immunol.204,125-143)。转座子家族的自主成员能够表达活跃的转座酶-转座的反式作用因子-并因此能够自行转座。非自主元件具有突变的转座酶基因，但可保留顺式作用DNA序列。这些顺式作用DNA序列也被称为末端反向重复序列(IR)。某些反向重复序列可以包括一条或多条直接重复序列。通常将这些序列嵌入元件的末端反向重复序列(IR)中，这是在存在来自另一元件的互补转座酶的情况下动员所需的。到目前为止，除了Tol2(见下文)之外，没有从脊椎动物中分离单个自主元件；所有转座子样序列都是有缺陷的，显然是由于一个叫做“垂直失活”的过程导致的(Lohe等人，1995 Mol.Biol.Evol. 12,62-72)。根据一系统发育模型(Hartl等人，1997 Trends Genet.13, 197-201)，真核基因组中非自主元件与自主元件的比率由于转座的反式互补性质而增加。该过程导致基因组中活跃的转座酶产生拷贝的最终消失是不可避免的状态。因此，DNA转座子能够被视为基因组的暂时组成部分，为了避免消失，必须找到在新宿主中建立自己的方法。实际上，物种之间的水平基因传递被认为是转座子进化中的重要过程之一(Lohe等人，1995，同上和Kidwell,1992.Curr.Opin.GenetDev.2, 868-873)。
能够在实验室条件下模拟水平基因转移的自然过程。在植物中， Ac/Ds和Spm家族的转座子已经被常规转染到异源物种中(Osborne和 Baker，1995 Curr.Opin.CellBiol.7,406-413)。然而，在动物中，由于需要天然宿主产生的因子，将活跃的转座子系统从一物种转移到另一物种的主要障碍有转座的物种特异性。
如上所讨论的转座子系统可能发生在脊椎动物和无脊椎动物系统中。在脊椎动物中，由DNA中间体移动的DNA转座子移动元件的发现是相对较近的(Radice,A.D.等人，1994.Mol.Gen.Genet.244, 606-612)。从那时起，已经从不同的鱼物种、非洲爪蟾属和人类基因组中分离出真核转座子的Td/mariner以及hAT(hobo/Ac/Tam)超家族的无活性、高度突变的成员(Oosumi等人，1995.Nature 378,873；Ivies 等人，1995.MoI.Gen.Genet.247,312-322；Koga等人,1996.Nature 383, 30；Lam等人,1996.J.MoI.Biol.257,359-366和Lam,W.L.等人，Proc. Natl.Acad Sci.USA 93,10870-10875)。
无脊椎动物和脊椎动物转座子都具有模式生物体中转基因和插入诱变的潜力。特别地，同一物种中的可替代转座子系统的可用性为遗传分析开辟了新的可能性。例如，piggyβac转座子能够在稳定插入的 P元件存在下在果蝇中被动员(Hacker等人，(2003),Proc Natl Acad Sci U S A 100,7720-5.)。因为基于P元件和基于piggyBac的系统显示出不同的插入位点偏好(Spradling等人(1995),Proc Natl Acad Sci U S A 92, 10824-30,Hacker等人(2003),Proc Natl Acad Sci U S A 100,7720-5)，能够大大增加能够被转座子插入失活的苍蝇基因数量。P元件载体也已经被用于通过稳定的种系转化将mariner转座子的组分插入黑腹果蝇 (D.melanogaster)的基因组中。在这些转基因苍蝇中，能够研究mariner 转座而不会意外地动员P元件(Lohe和Hartl，(2002),Genetics 160, 519-26)。
在脊椎动物中，目前已知并使用了三种活跃的转座子：青鳉 (medaka)中的Tol2元件，以及重构的转座子睡美人(SB)和青蛙王子 (FP)。脊椎动物中另一有趣的转座子系统是PiggyBac转座子系统(Ding 等人，Cell,2005)。
Tol2元件是青鳉中hAT转座子家族的活跃成员。它是通过引起日本青鳉(Oryziaslatipes)(东亚的小型淡水鱼)的白化表型的隐性突变而发现的。发现该突变是由于在酪氨酸酶基因的第五个外显子中插入 4.7-kb长的TE导致的。该元件的DNA序列(命名为To/2)类似于hAT 家族的转座子，包括果蝇的hobo、玉米的Acoi和金鱼草的Tam3。
睡美人(SB)是来自鱼类的Tc1/mariner样元件，并且在多种脊椎动物培养的细胞系、胚胎干细胞以及体内小鼠体细胞和生殖谱系细胞中展现出高转座活性。
青蛙王子(FP)也是一种Tc1/marinner样元件，其最近从北部豹蛙 (美洲豹蛙(Rana pipiens))的基因组转座子拷贝中被重新激活。使用开放阅读框捕获方法鉴定不间断的转座酶编码区，并且这些序列的多数规则共识揭示了活跃转座酶基因。因此，与SB的“复活”程序相反，美洲豹蛙中基因组元件的相对年轻状态使得对源于单一物种的转座子拷贝的多数规则共识成为可能。SB和FP转座子明显不同，在它们的转座酶序列中仅共享-50％的同一性。
如上所述的转座子，特别是Tol2、SB和FP，以及piggyback(Ding 等人，Cell 2005)不相互作用，因此可以在其他的存在下被用作基因工具，这显著扩大了这些元素的实用性。这些转座子插入表达的基因而非非编码DNA的偏好以及对基因内插入位点的偏好可能是显著不同的。如果是这样的话，能够以互补的方式利用这些转座子系统的不同插入模式。例如，可以使用不同的转座子系统将几个转基因依次转染到细胞中，而不会意外地且不需要地动员已经插入的转基因。此外，通过在全基因组筛选中组合不同的转座子系统，能够通过转座子载体诱变的靶基因座的数量可以显著增加。
除了宿主中转座活性的变化以及靶位点特异性的差异之外，各种元件的不同结构特性在某些应用中也可能是有利的。例如，能够利用转座子插入来错误表达基因并寻找功能获得性表型。Rorth,P.(1996,A modular misexpression screen in Drosophiladetecting tissue-specific phenotypes(在检测组织特异性表型的果蝇中模块化错误表达的筛选). Proc Natl Acad Sci U S A 93,12418-22.)使用携带从该元件指向的诱导型启动子的经修饰的P元件转座子以迫使宿主基因在转座子插入位点附近表达，并检测组织特异性表型。此类实验设置的先决条件是转座子IR允越过IR通读转录/翻译。
如上已经解释的，DNA转座子已被开发为无脊椎动物模型生物中的基因转移载体，并且最近在脊椎动物中也是如此。它们还成为人类基因疗法中逆转录病毒系统的强有力竞争对手。如上所述，用于遗传分析和治疗方法的最有用的可转座元件(TE)是经由“剪切和粘贴”机制在宿主基因组中移动的II类TE，因为它们易于实验室处理并且具有可控性质。睡美人(以下简称为“SB”)属于“剪切和粘贴”转座子的 Tcl/mariner家族。这些可动DNA元件被简单地组织，在它们侧接有末端反向重复序列(ITR)的基因组中编码转座酶蛋白。ITR携带转座所必需的转座酶结合位点。通过将转座酶来源与携带ITR的可转座DNA 分开，可以很容易地控制它们的活性，从而产生非自主的TE。在此类双组分系统中，转座子只能通过补充转座酶蛋白的fr3/75来移动。实际上，根据实验需要，可以在ITR元件之间定位任何目标序列。转座将导致从载体DNA中切除元件并随后将单拷贝整合到新的序列环境中。
一般来说，转座子介导的染色体进入似乎比病毒方法更有优势，因为一方面如果与病毒系统相比，转座子不那么有利于活跃基因和5’调控区，并因此不太容易诱变，另一方面由于它们的染色体进入目标基因的特殊机制在生理上受到更多的控制。
SB已被证明是几种脊椎动物模型生物体中功能基因组学的有价值的工具(Miskey,C,Izsvak,Z.,Kawakami,K.和Ivies,Z.(2005)；DNA transposons in vertebratefunctional genomics(脊椎动物功能基因组学中的DNA转座子).Cell MoI.Life.Sci.62:629-641)并显示出人类基因治疗应用的前景(Ivies,Z.和Izsvak,Z.(2006).Transposonsfor gene therapy(用于基因治疗的转座子)；Curr.Gene Ther.6:593-607)。然而，对于所有这些应用，系统的转座活性是可用性和效率的关键问题。尽管如今是已知的并被描述为有功能性和有价值的，转座酶活性可能是仍然导致SB系统达到其极限的因素之一。因此，转座活性的显著改善可能在两个方向上突破当前实验障碍。
某些方面，将SB10转座酶的极度活跃的变体用于本文所述的方法。具体的方面，极度活跃的变体可以是WO 2009/003671(其通过引用的方式整体并入本文)描述的变体。例如，选自SB10转座酶的变体的多肽，包含与根据SEQ ID No.8的天然SB10转座酶的序列差异1 至20个氨基酸的氨基酸序列，所述1至20个氨基酸包括至少一种以下突变或突变组：K14R、K13D、K13A、K30R、K33A、T83A、I100L、 R115H、R143L、R147E、A205K/H207V/K208R/D210E； H207V/K208R/D210E；R214D/K215A/E216V/N217Q；M243H；M243Q； E267D；T314N和G317E。
SEQ ID NO:8如下所示：
“突变(mutation)”或“突变(mutations)”在本文中被定义为已知氨基酸序列的一个或多个氨基酸分别被一个或多个其他氨基酸交换，并且如果特别指出，也可以是“突变组(group of mutations)”或“突变组 (groups of mutations)”。“突变组”或“突变组”在本文中被定义为组的交换，例如来自原始序列的3或4个氨基酸分别在指定位置处被3或4 个其它氨基酸交换。作为定义，将以下代码用于识别上述突变。“X编号Z”表示位于“编号”位置的原始氨基酸序列的氨基酸“X”被交换为氨基酸“Z”，而“XNo.Y/X'No.'Z'/X"No."Z"”旨在表示在该突变中，在“编号”位置处的氨基酸“X”、在“编号'”位置中的氨基酸“X'”和在“编号"”位置中的氨基酸“X"”分别同时被交换为氨基酸“Z”、“Z'”和“Z"”。如果定义“突变组合”，则使用“//”来分隔和指示该组合中的“同时突变”，否则与单个斜线“/”相同。
在另一典型方面，变体相差至少2个，或至少1至8个，通常为 2至7个上述突变或突变组，甚至更典型地相差至少4至7个以上列出的突变或突变组。
在另一个中，SB10转座酶的变体选自包含以下突变组合的变体：
·变体1：K14R//R214D/K215A/E216V/N217Q；
·变体2：K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；
·变体3：K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/ K215A/E216V/N217Q//M243H；
·变体4：K13D/K33Λ/T83A//H207V/K208R/D210E//M243Q；
·变体5：K13A/K33A//R214D/K215A/E216V/N217Q；
·变体6：K33A/T83A//R214D/K215A/E216V/N217Q//G317E；
·变体7：K14R/T83A/M243Q；
·变体8：K14R/T83A/1100L/M243Q；
·变体9：K14R/T83A/R143L/M243Q；
·变体10：K14R/T83A/R147E/M243Q；
·变体11：K14R/T83A/M243Q/E267D；
·变体12：K14R/T83A/M243Q/T314N；
·变体13：K14R/K30R/I100I7/A205K/H207V/K208R/D210E// R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；
·变体14：K14R/K30R/R143I7/A205K/H207V/K208R/D210E// R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；
·变体15：K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E// R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；
·变体16：K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E// R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D；
·变体17：K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E// R214D/K215A/E216V/N217Q//M243 H/T314N；
·变体18：K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E// R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E；
·变体19：K14R/K33A/R1 15H//R214D/K215A/E216V/N217Q/ /M243H；
·变体20：K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E// R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N；
·变体21：K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E// R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D；
·变体22：K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E// R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N；
·变体23：K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E// R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E；
·变体24：K14R/K33A/R1 15H/R143L//R214D/K215A/E216V/ N217Q//M243H；
·变体25：K14R/K33A/R1 15H/R147E//R214D/K215A/E216V/ N217Q//M243H；
·变体26：K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q// M243H/E267D；
·变体27：K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q// M243H/T314N；
·变体28：K14R/K33A/R1 15H//R214D/K215A/E216V/N217Q// M243H/G317E；
·变体29：K14R/T83A/M243Q/G317E；
·变体30：K13A/K33A/T83A//R214D/K215A/E216V/N217Q
在一典型方面，转座酶是SB100X转座酶，其在上面的列表中被标记为变体27。
免疫细胞
在本文所述的免疫细胞的扩增和遗传修饰之前，从个体获得免疫细胞的来源。应当理解，可以使用任何免疫细胞来源，并且它们可以是自体的、同种异体的、同系同种的或异种的。典型方面，免疫细胞是自体的或同种异体的。
例如，PBMC能够通过任何已知方法来获得，然后被刺激成为CIK 细胞，如例如WO2016/071513中所述，其通过引用的方式整体并入。然后能够将CIK细胞制成CIK CAR细胞。或者，T细胞能够通过任何已知方法来获得，并且随后被用于产生CAR-T细胞。
无论是在免疫细胞的基因修饰之前还是之后表达如本文所述的 CAR，通常能够使用如下中描述的方法来活化和扩增免疫细胞：例如美国专利第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964 号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575 号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843 号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041 号；美国专利申请公开第20060121005号；和WO 2016/071513(它们通过引用的方式整体并入本文)。
治疗应用
本文所述的CAR和表达CAR的免疫细胞能够阻断VEGFR-2并降低它的活化能力。结合还活化CAR-T细胞或CIK CAR细胞并刺激免疫细胞杀死癌细胞。这些抗体优于用于化学疗法的药物的优点在于它们对过表达VEGFR-2的肿瘤更具特异性。因此，这会导致总体细胞毒性和癌细胞化学抗性降低。另外，由于它们的小尺寸，本文所述的 CAR具有组织穿透能力。
本发明涵盖用慢病毒载体(LV)转导或用转座子转染的细胞(例如T 细胞)。例如，LV或转座子编码CAR，其将特定抗体的抗原识别结构域与CD3-ζ、CD28、4-1BB或它们的任意组合的细胞内结构域组合。因此，转导的T细胞引发CAR介导的T细胞应答，因此可以帮助减少肿瘤生长并诱导细胞杀伤。
本发明提供了CAR用于将原代T细胞的特异性重定向至肿瘤抗原-VEGFR-2的用途。因此，本发明还提供了用于刺激哺乳动物中T 细胞介导的对靶细胞群或组织的免疫应答的方法，其包括向哺乳动物给予表达CAR的T细胞的步骤，其中CAR包含与预定靶标特异性相互作用的结合部分、含有例如人CD3ζ的细胞内结构域的ζ链部分和共刺激信号区。
一方面，本发明包括一种类型的细胞疗法，其中对T细胞或CIK 细胞进行基因修饰以表达针对VEGFR-2的CAR，并将CAR-T或 CIK-CAR细胞输注给需要所述方法的接受者。输注的细胞能够杀死接受者体内的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR-T和CIK-CAR细胞能够在体内复制，这导致能够引起持续的肿瘤控制的长期持久性。
一方面，本文所述的靶向于VEGFR-2的CAR-T或CIK-CAR细胞能够进行稳健的体内细胞扩增，并可持续延长的时间。另一方面，本文所述的CAR-T细胞进化为特异性记忆T细胞，其可以被重新活化以抑制任何其他的肿瘤形成或生长。不希望受任何特定理论的束缚，CAR-T细胞一旦遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，可以在体内分化成中枢记忆样状态。
此外，通过CAR修饰的T或CIK细胞引发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答。此外，CAR介导的免疫应答可以是过继性免疫疗法方法的一部分，其中CAR修饰的T细胞诱导CAR中抗原结合部分特异性免疫应答。例如，VEGFR-2特异性CAR-T或CIK细胞引发对表达VEGFR-2的细胞的特异性免疫应答。
一方面，本文描述的CAR的抗原结合部分被设计用于治疗表达特定抗原的特定癌症。例如，本文描述的CAR通常是VEGFR-2特异性的，并且可以用于治疗与VEGFR-2相关的癌症和病症，如胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、肝细胞癌和结肠癌。
本文所述的CAR修饰的T细胞还可以用作哺乳动物离体免疫和/ 或体内疗法的疫苗类型。通常，哺乳动物是人。
关于离体免疫，在将细胞给予哺乳动物之前，体外发生以下三种中的至少一种：i)细胞扩增，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/ 或iii)冷冻保存细胞。
离体程序是本领域众所周知的，并在下面更全面地讨论。简而言之，从哺乳动物(通常是人)分离细胞，并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即体外转导或转染)。可以将CAR修饰的细胞给予哺乳动物接受者以提供治疗益处。哺乳动物接受者可以是人，并且CAR 修饰的细胞相对于接受者能够是自体的。或者，相对于接受者，细胞能够是同种异体的、同系同种的或异种的。
用于离体扩增造血干细胞和祖细胞的程序描述于通过引用的方式并入本文的美国专利第5,199,942号中，所述程序可以用于本文所述的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于细胞离体扩增的任何特定方法。简而言之，T细胞的离体培养和扩增包括：(1) 从外周血采集物或骨髓外植体收集来自哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；以及(2)离体扩增此类细胞。除了美国专利第5,199,942号中描述的细胞生长因子，其他因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体能够用于培养和扩增细胞。
除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗之外，本发明还提供用于体内免疫的组合物和方法，以引发患者中针对抗原的免疫应答。
具体地，本文所述的CAR修饰的T细胞用于治疗表达VEGFR-2 的癌症。某些方面，本文所述的细胞用于治疗处于进展中的表达 VEGFR-2的癌症风险的患者。因此，本发明提供了用于治疗或预防表达VEGFR-2的癌症的方法，其包括向需要所述方法的个体给予治疗有效量的本文所述的CAR修饰的T细胞。
本发明的CAR修饰的T细胞可以被单独给予，或作为与稀释剂和/或与其他组分如IL-2或其他细胞因子或细胞群组合的药物组合物给予。简而言之，本发明的药物组合物可以包含与一种或多种药物或生理可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的如本文所述的靶细胞群。此类组合物可以包含缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸(诸如甘氨酸)；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(诸如氢氧化铝)和防腐剂。通常配制本发明的组合物用于静脉内给予。
可以将本发明的药物组合物以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式给予。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，给予的量和频率将由诸如患者状态以及患者疾病的类型和严重性等因素确定。
当提及“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，能够由医生考虑患者(个体)的年龄、体重、肿瘤尺寸、感染或转移程度以及状态的个体差异确定待给予的本发明组合物的精确量。通常，能够以104至109个细胞/kg体重、通常为105至106个细胞 /kg体重的剂量、包括那些范围内的所有整数值的剂量给予包含本文所述的T细胞的药物组合物。也可以以这些剂量多次给予T细胞组合物。能够通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来给予细胞(参见，例如，Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。通过监测患者的疾病病征并相应地调整治疗，医学领域的技术人员能够容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
某些方面，可能需要将活化的T细胞给予个体，然后随后重新抽血(或进行单采血液成分术)，从活化本发明的T细胞，并用这些活化和扩增的T细胞再输注给患者。该过程可以每几周进行多次。某些方面，能够从10cc至400cc的抽血来活化T细胞。某些方面，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血来活化T细胞。不受理论束缚，使用这种多次抽血/多次再输注方案可用于选出某些T细胞群。
可以任何方便的方式给予所述组合物，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。可以皮下、皮内、肿瘤内、结内、髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内将本文所述的组合物给予患者。一方面，通过皮内或皮下注射将本发明的T细胞组合物给予患者。另一方面，通常通过i.v.注射给予本发明的T细胞组合物。可以将T细胞的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位内。
在本发明的某些方面，使用本文所述的方法或本领域已知的其他方法，将活化和扩增的细胞，其中将T细胞扩增至治疗水平，与任何数量的相关治疗方式联合(例如，之前、同时或之后)给予患者，所述相关治疗方式包括但不限于化学疗法，放射，免疫抑制剂，如环孢菌素、咪唑硫嘌呤、氨甲蝶呤、霉酚酸酯和FK506，抗体或其他免疫清除剂(immunoablative agents)，如CAM PATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法，细胞毒素，氟达拉滨，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，FR901228，细胞因子和辐射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人,Cell 66:807-815,1991；Henderson 等人,Immun 73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun 5:763-773,1993)。另一方面，将本发明的细胞组合物与骨髓移植，使用化疗剂如氟达拉滨，外部束照射疗法(XRT)，环磷酰胺或抗体如 OKT3或CAMPATH的T细胞消融疗法联合(例如，之前、同时或之后) 给予患者。另一方面，在B细胞消融疗法如与CD20反应的试剂如美罗华后给予本发明的细胞组合物。例如，一方面，个体可以接受高剂量化学疗法的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。某些方面，在移植后，个体接受本文所述的扩增的免疫细胞的输注。另一方面，在手术之前或之后给予扩增的细胞。
待给予患者的上述治疗的剂量将随着正在治疗病况的确切性质和治疗的接受者而变化。能够根据本领域公认的实践来进行人给予剂量的缩放。例如，对于成年患者，CAMPATH的剂量将通常在1至约100 mg的范围内，通常每天给予一次，持续1至30天的时间段。典型的每日剂量为每天1至10mg，但在某些情况下，可以使用每天高达40mg 的较大剂量(描述于美国专利第6,120,766号中)。
在本发明的某些方面，包含本发明的CAR-T的组合物可以冷藏储存直至使用或冷冻(然后解冻)直至需要使用。可以配制并以CAR-T细胞的“库”的形式提供该组合物，以用于VEGFR-2癌症的治疗性治疗。
在本发明的实施方案中，在试剂盒中提供用于细胞疗法的细胞，并且在某些情况下，细胞基本上是试剂盒的唯一组分。试剂盒可包含制备所期望的细胞的试剂和材料。在具体实施方案中，试剂和材料包括用于扩增所期望的序列的引物、核苷酸、合适的缓冲液或缓冲试剂、盐等，并且在某些情况下，试剂包括载体和/或编码如本文所述的CAR 的DNA和/或其调控元件。
在具体实施方案中，试剂盒中有一个或多个适于从个体中提取一个或多个样品的装置。该装置可以是注射器、手术刀等。
在本发明的某些情况下，除细胞疗法实施方案外，试剂盒还包括第二癌症疗法，诸如例如化学疗法、激素疗法和/或免疫疗法。可以针对个体的特定癌症定制试剂盒，并且试剂盒包括针对个体的相应的第二癌症疗法。
实验实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且除非另有说明，否则不旨在为限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应该被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
以下实施例不包括常规方法的详细说明，所述常规方法诸如载体和质粒的构建，编码多肽的基因插入到此类载体和质粒，或将质粒引入到宿主细胞中所用的那些。此类方法是本领域普通技术人员众所周知的那些并且在许多出版物(包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册),2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press)中有描述。
无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实施例制备和利用本发明的化合物并实施所要求保护的方法。因此，以下实施例具体指出了本发明的典型方面，并且不应解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
发现概述
VEGFR-2在许多类型的人类癌症如乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌和非小细胞肺腺癌中过表达。在某些动物模型中，通过抗体靶向 VEGFR-2可以减少/防止血管生成而减缓了肿瘤进展。产生抗体以靶向VEGFR-2。AB1是从整个癌细胞免疫的美洲驼文库中分离的骆驼科单域抗体。抗体以高亲和力与VEGFR-2特异性结合，并在体外抑制表达VEGFR-2的癌细胞的增殖。
AB1骆驼科抗体靶向VEGFR-2的细胞外结构域并且通过重组的 VEGFR2/Fc对美洲驼的免疫而产生。产生和筛选噬菌体展示文库以鉴定对VEGFR-2具有高结合亲和力的抗体。挑选出来的抗体在E.coli. BL21(DE3)pT7系统中表达。通过SEC、LC-MS肽作图和ELISA描述纯化抗体的特征。
工程化CAR-T细胞以表达与CD28和4-1BB共刺激分子和CD3ζ链组合的骆驼科抗VEGFR-2抗体(AB1)。抗VEGFR-2 CAR-T细胞与表达VEGFR-2的细胞系共孵育导致如通过LDH释放所测量的剂量依赖性靶细胞毒性。另外，因为在细胞培养基中检测到高水平的IL-2和IFN-γ，确认了T细胞活性。这些结果表明抗VEGFR-2 CAR-T可用于直接靶向表达VEGFR-2的肿瘤。
实施例1：抗VEGFR-2抗体的产生
为了产生靶向VEGFR-2的细胞外结构域的骆驼科单域抗体，用重组的VEGFR-2/Fc免疫美洲驼。产生和筛选噬菌体展示文库以鉴定对 VEGFR-2具有高结合亲和力的单域抗体。
为了产生靶向VEGFR-2的细胞外结构域的人单域抗体，筛选人 VH文库以鉴定对VEGFR-2具有高结合亲和力的单域抗体。
将融合伴侣序列MKAIFVLKGSLDRDPEFDDE(SEQ ID NO:71)添加至SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:11(AB1和AB2)序列的N末端，以便通过积累包涵体中所表达的蛋白并且有效地简化蛋白纯化和复性过程来提高抗体的产量。
制备并进一步研究4种抗体。在E.coli.BL21(DE3)pT7系统中表达所选的抗体。这些抗体中的两个(AB2(SEQ ID NO:13)和AB3(SEQ ID NO:21))基于人抗体支架，而SEQ IDNO:7和27(AB1和AB4)这两个是美洲驼来源的。这些抗体展示出足够质量从而被认为是特异性结合VEGFR-2的潜在候选者的结合动力学(表1)。
表1.抗体的特征描述
实施例2：人VEGFR-2/Fc结合剂
使用Biacore 3000系统通过SPR检测人SEQ ID NO:13(AB2)和 SEQ ID NO:21(AB3)以及美洲驼SEQ ID NO:7(AB1)和SEQ ID NO:27 (AB4)与固定化人和鼠VEGFR-2/Fc相互作用的结合动力学。分别将作为参比蛋白的12,000RU的人VEGFR2/Fc(R&D系统)、14,000RU的鼠VEGFR-2/Fc(R&D系统)或7500RU的BSA(Sigma)固定在研究等级CM5-传感器芯片上(Biacore)。使用制造商供应的氨基偶联试剂盒以 10mM醋酸盐pH 4.5中含50μg/ml蛋白浓度进行固定。所有抗体样品都通过Superdex 75柱(GE Healthcare)以分离单体形式使其进行 Biacor分析。
在各种情况下，都在25℃下、包含150mM NaCl,3mM EDTA和 0.005％表面活性剂P20的pH 7.4的10mM HEPES中以40μl/min的流速进行分析。用10mM HCl的3至8秒接触时间再生表面。用 BIAevaluation 4.1软件分析数据。所有四个抗体主要显示了单体峰(图 1，尺寸排阻柱色谱)。尺寸排阻柱色谱的条件：机器：FPLC(GE healthcare)；Superdex75HR 10/30柱(Amersham,Cat.No.17-1047-01, Id No.9937116)；电泳缓冲液：HBS-EP(10mM HEPES,150mM NaCl, 3mM EDTA,pH7.4,0.005％P20)；以及稀释4次4x HBS-E并且添加 10％P20表面活性剂以制备成最终的0.005％。样品体积：200μl。泵速： 0.5ml/min。
在150至200nM浓度时没有抗体显示与固定化鼠VEGFR-2/Fc结合，而所有抗体显示与固定化人VEGFR-2/Fc结合(表1和图2)。这些数据表明抗体是物种特异性的。SEQ ID NO:7(AB1)在SPR表面上解离不良并且使传感图数据与标准动力学模型的直接契合复杂化(图2)。因此，由图3所示的转换数据估算SEQ ID NO:7(AB1)动力学常数。
实施例3：人及美洲驼抗体与人VEGFR-2/Fc结合
图2示出了显示(a)SEQ ID NO:13(AB2)、(b)SEQ ID NO:21(AB3)、 (c)SEQ ID NO:7(AB1)、(d)SEQ ID NO:27(AB4)在浓度分别为(a)0.1、 0.2、0.3、0.5、1和2μM，(b)0.2、0.3、0.5、0.75、1、1.5、2和3μM， (c)0.15、0.25、0.5、1、2和4μM，(d)75、150、225、300、375、525 和750nM时与固定化人VEGFR-2/Fc的结合的传感图重叠。
实施例4：AB1与人VEGFR-2/Fc结合的动力学常数分析
图3示出了AB1在0.1、0.15、0.25、0.5、0.75、1、2和4μM浓度时的衍生数据。对常数与-ks(接收显示低于1μM浓度)进行绘图。
实施例5：表位作图
两种不同的抗体以>4x KD浓度相继共同注入。4A和图4B示出了结果。SEQ ID NO:13(AB2)、SEQ ID NO:21(AB3)和SEQ ID NO:27(AB4) 见到明显的重叠。SEQ ID NO:7(AB1)见到某些重叠。
竞争性ELISA测定也提供了表位信息(图7)。AB3(SEQ ID NO:23)- 脲酶偶联物被非偶联AB2(SEQ ID NO:13)抗体所抑制，这表明这两种人抗体共享至少部分重叠的表位。非偶联AB3(SEQ ID NO:21)抗体也部分地抑制AB1(SEQ ID NO:9)-DOS47的结合，尽管只有在非常高的摩尔比时。
实施例6：VEGFR-2结合以及VEGFR-1和VEGFR-3的交叉反应
所有四种单域抗体都用于制备脲酶(“DOS47”)偶联物。测试了这些偶联物与抗原VEGFR-2结合的能力，还测试了其与VEGFR-1和 VEGFR-3交叉反应的能力(图5)。所有四种偶联物都能够靶向 VEGFR-2并与VEGFR-1有某些交叉反应，但是未观察到可检测的与 VEGFR-3的结合。显示了SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:23 和SEQ ID NO:27(分别是AB1,AB2,AB3和AB4,包含接头序列)的结果。
实施例7：VEGF竞争性测定
还测试脲酶偶联物与VEGF竞争性结合的能力。进行该测试以评价抗体是否识别靠近VEGF结合袋的区域。图6提供了钙分析的一个实例。从其中可以看到，两种人抗体-脲酶偶联物(AB2-(SEQ ID NO:13) 和AB3-(SEQ ID NO:23)DOS47)与VEGFR-2的结合被VEGF竞争性地抑制。然而，发现达到平衡的最大抑制对AB2-(SEQ ID NO:13)DOS47 而言是～40％，对AB3-(SEQ ID NO:23)DOS47而言是～60％。这表明 AB2和AB3只在靠近VEGF结合袋时结合。VEGF对AB1-(SEQ ID NO:9)DOS47偶联物与VEGFR-2的结合具有最小限度的影响。因此，看起来AB1的结合位点远离VEGF结合袋。VEGF的存在增强了 AB4-(SEQ ID NO:27)DOS47与VEGFR2的结合，这表明AB4抗体与 VEGF/VEGFR2偶联物的结合比其与单独的VEGFR2的结合要好。
实施例8：抗体与293/KDR细胞上表达的VEGFR-2结合
进行流式细胞术实验以测试抗体和/或抗体-脲酶偶联物与 293/KDR细胞的结合。293/KDR细胞是已被稳定地转染以表达人 VEGFR-2的293细胞(也叫作KDR)。图8A示出了生物素化的AB1抗体(SEQ ID NO:6)与293/KDR细胞的结合。这种结合被摩尔数过量的游离的AB1抗体所抑制，但是不被不相干的抗体所抑制。图8B示出了AB1-(SEQ ID NO:6)脲酶偶联物和AB2-(SEQ ID NO:18)脲酶偶联物与293/KDR细胞的结合。图8所示的结果确认了本文所述的AB1和 AB2抗体与293/KDR细胞上表达的VEGFR-2结合。
实施例9
V21-DOS47由骆驼科单域抗VEGFR2抗体(V21)和酶脲酶(DOS47) 组成。偶联物与VEGFR2特异性结合并且脲酶将内源性尿素转变为对肿瘤细胞有毒的氨。之前，我们开发了类似的抗体-脲酶偶联物 L-DOS47，其目前用于非小细胞肺癌的临床试验中。尽管由从L-DOS47 产生中学来的参数来设计V21-DOS47，还必需另外的工作来生产 V21-DOS47。在该研究中，我们描述了两种V21抗体版本的表达和纯化：V21H1(SEQ ID NO:3)和V21H4(SEQ IDNO:6)。使用不同的化学交联剂使每个与脲酶偶联。通过包括SDS-PAGE、SEC、蛋白质印迹和LC-MSE肽图谱在内的一组分析技术来描述偶联物的特征。通过 ELISA和流式细胞术测定确定结合特征。
为了改善偶联物在生理pH下的稳定性，通过将若干氨基酸残基添加至C末端调整V21抗体的pI。对V21H4而言，还添加末端半胱氨酸供偶联化学使用。在E.coli BL21(DE3)pT7系统中表达修饰的 V21受体。使用异型双功能交联剂琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺丙酰胺基)-二甘醇]酯(SM(PEG)2)，其靶向抗体中的赖氨酸残基，使V21H1 与脲酶偶联。使用同型双功能交联剂1,8-二(马来酰亚胺基)二甘醇 (BM(PEG)2)，其靶向添加至抗体C末端的半胱氨酸，使V21H4与脲酶偶联。因为抗体易于制备而且纯化水平高，并且使用可易于转移的 cGMP生产方法能够有效地产生和纯化偶联物，决定了V21H4-DOS47 是优质的偶联物。另外，因为天然的赖氨酸残基是未变性的，所以 V21H4-DOS47保留了比V21H1-DOS47高的结合活性。
我们已经开发了抑制血管生成的抗体-药物偶联物(ADC)途径。不同于绝大多数通过阻止VEGFR-2二聚化或通过抑制激酶活性来中断激酶信号级联的抗血管生成剂，我们的抗体-药物偶联物，V21-DOS47，通过诱导靶细胞的细胞毒活性杀伤表达VEGFR-2的细胞。与我们早先的抗肿瘤免疫偶联物L-DOS47(Tian等，2015)相似，V21-DOS47由骆驼科抗体和酶脲酶(来源于杰克豆，洋刀豆(Canavalia ensiformis))组成： V21抗体与VEGFR2结合，从而将偶联物靶向于表达VEGFR2的细胞，而脲酶将内源性尿素原位转变为氨以诱导细胞毒性。因为VEGFR2不仅仅在肿瘤血管中表达，而且在各种肿瘤的表面上已经鉴定出 VEGFR2(Itakura等，2000；Tanno等，2004；Guo等，2010)，V21 DOS47 靶向VEGFR2+血管内皮细胞和VEGFR2+肿瘤细胞。氨的提升的局部浓度也可以中和肿瘤微血管周围的酸性环境，否则所述酸性环境有利于癌细胞生长(Wong等，2005)。因为脲酶是不带有已知的哺乳动物同系物的植物产物，它有可能是免疫原性的，尽管并不期望自身免疫反应。目前在临床试验中测试LDOS47并且结果显示形成了抗脲酶抗体，但是没有观察到已知的严重免疫毒性。脲酶免疫原性的全部影响仍在研究中。
骆驼科抗体的一优势是与常规的免疫球蛋白(大约150kDa)相比它们相对小的尺寸(大约15kDa)。当抗体与脲酶偶联时，这尤其重要，因为脲酶是分子量544kDa的大蛋白。通过使用美洲驼抗体，多种抗体能够与每个脲酶分子偶联而总体分子量增加相对较小。这允许保留了可接受的生物分布谱的高亲和力治疗剂的产生。骆驼科抗体其他的益处(De Gens等，2006；Maass等，2007；Harmsen和De Haard，2007) 是它们易于克隆并且重组性表达(Arbabi Ghahroudi等，1997；Frenken 等，2000)，通常热稳定性和化学稳定性高于常规IgG(van der Linden 等，1999；Dumoulin等，2002)，并且它们与常规抗体识别不了的表位结合(Lauwereys等，1998)。另外，它们不怎么有免疫原性，因为人 VH和骆驼科VHH结构域共享了大约80％序列同一性(Muyldermans等，2001)并且肾脏清除率是高的(Cortez-Retamozo等，2002)。
抗体-脲酶偶联物是复合的大的蛋白：具有多种抗体/脲酶，偶联物的分子量能够达到680kDa。这对大规模生产提出了挑战。在我们早先的报告中，我们描述了设计用于处理这些挑战的偶联物化学和分离程序(Tian等，2015)。在该研究中，我们评估了另外的抗体生产和偶联物化学方法以产生新颖的抗体-脲酶偶联物，V21-DOS47。
为了生产针对VEGFR2高亲和力的抗体，用重组的VEGFR2免疫美洲驼并且产生VHH噬菌体展示文库。通过用重组的VEGFR2淘选该文库，分离V21抗体。将额外的氨基酸残基添加至V21抗体的C 末端以实现以下多重目标：使抗体pI最优化，使靶抗体表达至细菌的包涵体，并且为交联化学提供独特的靶标。在该报告中，我们描述了两种V21抗体版本，命名为V21H1和V21H4，和用于每个抗体与脲酶偶联的不同的方法。使用包括尺寸排阻柱色谱(以评估蛋白纯度)、 SDS-PAGE(以检测与每个脲酶偶联的抗体的平均数量)和ESI质谱分析法(以鉴定抗体和脲酶上的偶联位点)在内的各种分析技术来描述这两种抗体-脲酶偶联物的特征。检查偶联物比率的效应，并且比较这两种偶联物与相同偶联物比率的结合。通过流式细胞术确认与细胞表面所表达的VEGFR2的结合。
材料和方法
高纯度脲酶的纯化(HPU)
自BioVectra Inc(Charlottetown,PE Canada)购买天然的脲酶 (Cat#U-80,236U/mg)。在用于结合之前，纯化天然的脲酶以移除杰克豆基质蛋白污染物，如刀豆球蛋白和伴刀豆球蛋白A。室温下将一百万单位的天然脲酶溶解在430ml高纯度(HP)水中。用10％(v/v)醋酸将溶液调到pH 5.15，然后在4℃下以9000rcf离心40分钟。将含有脲酶的上清液冷却至4℃并且通过添加冷冻过的乙醇分份至25％(v/v)最终浓度，同时维持温度在0-8℃。混合物搅拌过夜然后在4℃下以9000rcf 离心40分钟。将球团再悬浮在150ml的醋酸盐-EDTA缓冲液(10mM 醋酸钠，1mM EDTA，1mM TCEP，pH 6.5)，然后在4℃下以9000rcf 离心40分钟。使用Minimate TFF系统(Masterflex型号7518-00带有 Minimate TFF胶囊，MWCO100kDa)将上清液浓缩至75ml，用200ml 醋酸盐-EDTA缓冲液渗滤3次，然后浓缩至100ml。收集渗滤的脲酶溶液，然后用50ml醋酸盐-EDTA缓冲液将胶囊和连接管中滤过的溶液驱逐出系统，并且添加到所收集的溶液(总体积～150ml)。使用 Bio-Rad Biologic LP系统，通过阴离子交换色谱分析法，进一步地纯化乙醇分份的脲酶溶液。以3.5ml/min流速将脲酶溶液加载到35ml DEAE柱(DEAE琼脂糖凝胶快速流，GE Healthcare，Cat#17-0709-01)，所述DEAE柱用150ml IEC缓冲液A(20mM咪唑，1mM TCEP，pH 6.5) 预平衡。用100ml IEC缓冲液A，随后用80ml 40％缓冲液B(含0.180M NaCl的缓冲液A)洗涤柱。用100％缓冲液B，以3.5ml/min流速洗脱脲酶并且汇集A280>0.1的组分。使用带有100kDa MWCO膜的 Minimate胶囊将汇集的组分浓缩至6至8mg/ml的靶蛋白浓度，然后针对醋酸盐-EDTA缓冲液(20mM醋酸钠，1mMEDTA，pH 6.5)进行渗滤。高纯度脲酶(HPU)储存在-80℃。源于这种纯化方法的产量通常>55％的起始活性。
V21H1和V21H4的表达
这两种抗体都在带有卡那霉素作为选择抗生素的E.coli BL21 (DE3)pT7系统中表达。根据制造商的使用说明进行BL21(DE3)组分 E.coli细胞(Sigma,B2935-10x50μl)的转化。将来自于转化平板上的一个菌落无菌地接种在200ml补充了50mg/L卡那霉素的LB培养基(LB media EZ mix.Sigma Cat#L76581,20g/L)中。在37℃下以200rpm孵育培养物。一旦培养物达到大于0.6的OD600，就将50ml培养物转移到四个2L的烧瓶中，每个烧瓶包含1L含有50mg/L卡那霉素的LB 培养基。在37℃下以200rpm在振动器孵育器中孵育烧瓶。一旦培养物达到0.9-1.0的OD600，就通过添加1mM IPTG来诱导抗体表达并且在37℃下以200rpm过夜孵育。通过离心收获细胞，等分量，一个/2L 培养物。
V21H1的纯化
大多数的V21H1蛋白在E.coli细胞溶质溶液中表达，并不是在包涵体中。通过声波降解法(Misonix 3000超声发声器，tip Part#4406；每个超声处理循环：超声处理30秒，冷却4分钟，功率为8)在冰水浴中 10分钟将一等分的细胞球团溶解在100ml裂解缓冲液(50mMTris, 25mM NaCl,pH 6.5)中。在4℃下以9000rcf离心裂解物30分钟。为了移除最丰富的细菌基质蛋白，将上清液与冰冷的乙醇混合至最终浓度10％(v/v)并且在冰水浴中孵育30分钟，随后在4℃下以9000rcf 离心30分钟。将上清液与冰冷的乙醇混合至最终浓度45％(v/v)并且在冰水浴中搅拌60分钟，随后在4℃下以9000rcf离心30分钟。将球团再悬浮在200ml的洗涤缓冲液(50mM醋酸盐,0.1％Triton X-100, 1mM DTT,25mM NaCl,pH 5.0)中。在4℃下以9000rcf离心30分钟后，将球团再悬浮在100ml补充了2mM DTT的SP缓冲液A(50mM醋酸盐,8M尿素,pH 4.0)中，通过0.45μm过滤器进行过滤。以2ml/min 将过滤的溶液加载到带有蠕动泵的1ml SP FF柱(GE Healthcare, catalog#17-5054-01)，然后将柱与ACTA FPLC系统(Amersham Bioscience,UPC-920)连接。以1ml/min用10ml SP缓冲液A洗涤柱后，通过0-50％的梯度SP缓冲液B(含0.7M NaCl的SP缓冲液A)以 1ml/min流速洗脱V21H1抗体超过30分钟。检测峰值组分的OD280并且用1.967/mg/ml的消光系数计算浓度。将DTT添加至SP柱峰值组分至最终浓度1mM并且用2M Tris碱调整溶液的pH至8-8.5。通过逐滴地添加pH调整过的SP峰值组分至复性缓冲液(100mM Tris, 10μM CuSO4,pH 8.8)进行抗体的复性并且在4℃下连续搅拌直至完成复性。通过完整蛋白质LC-MS监控复性过程。复性后，在将其装载到1ml QHP柱之前，在4℃下以9000rcf将溶液离心30分钟。柱与FPLC 系统连接并且用10ml Q缓冲液A(50mM HEPES,pH 7.0)以1ml/min的流速洗涤柱。通过0-40％梯度Q缓冲液B(含0.7MNaCl的Q Buffer A) 以1ml/min的流速在40分钟内洗脱抗体。合并来自8L细胞培养物的峰值组分，浓缩至2至4mg/ml并且针对20mM HEPES、pH 7.1在4℃下透析过夜(MWCO 5-8kDa，体积比为1:50)。通过0.22μm针头式过滤器过滤最终的V21H1抗体溶液并且在4℃下储存。
V21H4的纯化
与V21H1对照，大多数的V21H4蛋白都在E.coli包涵体中表达。将来自每一2L培养物的细胞球团再悬浮在100ml裂解缓冲液(50mM Tris,25mM NaCl,pH 6.5)中并且与溶菌酶混合至最终浓度0.2mg/ml。在室温下孵育细胞悬液30分钟，然后通过声波降解法在冰水浴中裂解 10分钟(Misonix 3000超声发声器,tip Part#4406；每一超声处理循环：超声处理30秒，冷却4分钟，功率为8)。在4℃下以9000rcf离心裂解物30分钟。用400ml Pellet洗涤缓冲液(50mM Tris,25mM NaCl,pH 6.5,1％Triton X-100,2mM DTT)洗涤球团两次并且用包含2mM DTT 的50mM醋酸洗涤球团一次。将球团再悬浮在100ml补充了2mM DTT 的SP缓冲液A(50mM醋酸盐,8M尿素,pH 4.0)中并且在4℃下以 9000rcf离心30分钟。通过0.45μm过滤器将由此得到的上清液过滤。以5ml/min的流速将过滤的上清液加载到5ml SP-XL柱(GEHealthcare, 目录#17-1152-01)。用50ml SP缓冲液A洗涤柱后，通过0至50％的梯度SP缓冲液B(含0.7M NaCl的SP缓冲液A)以5ml/min的流速洗脱蛋白超过30分钟。当A280>700mU时，收集峰值组分。将DTT添加至合并的SP峰值组分至最终浓度1.0mM并且用饱和的Tris碱调整其pH至pH 8.6-8.7。通过混合SP峰值组分与复性缓冲液(50mM Tris, 2M尿素,1.0mM DTT pH8.6-8.7)启动复性。在室温下搅拌2小时后，将1.2mM胱胺添加至复性混合物。在室温下继续进行复性并且通过 RP-HPLC(Agilent 1100系统；ZORBAX-C3柱,PN883750-909；溶剂 A:含0.025％(v/v)TFA的水；溶剂B:含0.025％TFA的乙腈；梯度： 20至60％B，超过30分钟，流速0.25ml/min。各个时间点收集100μl 样品并且通过立即添加1.0μl无水甲酸进行酸化。将每一样品的30μl 注射到柱中以记录色谱图)监控复性。在以流速5ml/min将其装载到 5mlQHP柱(GE Healthcare,17-1154-01)前，在4℃下以9000rcf离心由此得到的复性混合物30分钟。用50ml Q缓冲液A(50mM HEPES,pH 8.7)洗涤柱后，通过0至70％的梯度Q缓冲液B(含0.7M NaCl的Q 缓冲液A)洗脱蛋白。当A280>700mU时，收集峰值组分。合并Q峰值组分，浓缩至6至10mg/ml，用10mM HEPES,pH 7.1交换的缓冲液。通过0.22μm过滤器过滤最终的V21H4抗体溶液并且在4℃下储存。
V21H1与脲酶的偶联
涡旋的同时，通过将70.4μl SM(PEG)2(DMF中10.0mg/ml)储备溶液添加至V21H1抗体，以抗体：交联剂为1:2.4的分子比，用交联剂活化10mg V21H1抗体。在室温下孵育反应溶液90分钟。通过将 300mM Tris缓冲液(pH 7.6)添加至最终浓度10mM并且在室温下孵育 10分钟淬火反应。用20ml包含50mM NaCl和1mM EDTA,pH 7.1的 50mM Tris缓冲液预平衡过的G25脱盐柱移除未偶联的、水解的、淬火的交联剂。移除过量的交联剂后，合并脱盐柱组分并且收集100μl 样品用于完整蛋白质谱分析和肽作图分析以评估V21H1抗体上的活化位点。在冰水浴中冷冻剩余的合并的组分5分钟。解冻20mg高纯度脲酶(HPU)并且在另一冰水浴中孵育5分钟。将冷冻的HPU溶液倒入活化的V21H1抗体溶液并同时搅拌。继续在冰水浴中搅拌5分钟，然后将反应溶液转移至室温下的工作台。偶联反应后，在室温下孵育溶液90分钟，将半胱氨酸溶液(含200mM半胱氨酸的Tris,pH 7-7.5) 添加至最终浓度5mM以淬灭反应。在4℃下以2000rcf通过离心分离在15ml离心机过滤器(MWCO 100kDa)中将反应溶液浓缩至大约4ml。在SEC分离前将由此得到的浓缩的反应溶液分成三等分。通过将反应溶液的每一等分加载到与AKATA FPLC系统连接的Superose 6 100/300GL柱(GE)进行分离。通过用SEC缓冲液(50mM NaCl,0.2mM EDTA,pH 7.2)以0.5ml/min等流速洗脱蛋白，合并A280>200mU的主峰值组分。将来自于所有三个SEC分离的峰值组分合并并且针对1L 配制缓冲液(10mM组氨酸,1％(w/v)蔗糖,0.2mM EDTA,pH7.0)透析。通过0.22μm过滤器过滤由此得到的偶联溶液并且分成0.8ml的等份。在-80℃下储存等份。
V21H4与脲酶的偶联
将20mg V21H4与TCEP(含100mMTCEP的300mM Tris缓冲液, pH 7-7.5)混合至最终浓度1.5mM并且在室温下孵育60分钟。使用 Tris-EDTA缓冲液(50mM Tris,1mM EDTA,pH7.1)通过25ml G25脱盐柱移除过量的TCEP和由此得到的半胱胺。将由此得到的脱盐组分汇集到40ml烧杯中并且用Tris-EDTA稀释至总体积30ml。通过将 0.420ml BM(PEG)2储备溶液(含10mg/ml BM(PEG)2的DMF)迅速分散至烧杯中的V21H4抗体溶液并同时搅拌来活化反应。室温下孵育10 分钟后，将反应溶液转移到200ml带有过滤膜(MWCO 5kD)的Amicon 渗滤浓缩器并与Tris-EDTA缓冲液混合至100ml。通过将渗滤浓缩器与70psi氮源连接移除过量的交联剂，并将其浓缩至20ml，并同时搅拌。稀释和浓缩的5个循环后，将渗滤浓缩器与氮源拆离并收集100μl 样品以检测抗体活化位点(使用完整蛋白质谱分析和肽作图分析)。将Tris-EDTA缓冲液添加至浓缩器以稀释溶液达至50ml标记物。在冰水浴中冷冻带有活化V21H4抗体的浓缩器10分钟并同时搅拌。在4℃下完全解冻后，在另一冰水浴中孵育80mgHPU 5分钟并将其倒入浓缩器中活化V21H4抗体溶液中并同时在它的冰水浴中搅拌。冰水浴中搅拌5分钟后，将带有反应溶液的浓缩器移到实验室工作台并且在室温下孵育90分钟。通过将半胱氨酸(含100mM半胱氨酸的300mM Tris, pH 7-7.5)添加至最终浓度5mM淬灭偶联反应。室温下淬灭反应5分钟后，将反应溶液转移至另一容器并清洁浓缩器和再安装新的过滤膜 (MWCO 100kDa)。将反应溶液转移回浓缩器并且将配制缓冲液(10mM 组氨酸,1％(w/v)蔗糖和0.2mM EDTA,pH 7.0)添加至160ml标记物。将浓缩器与10psi氮源连接并且浓缩至20ml并同时搅拌。稀释-浓缩循环重复4次后，将渗滤浓缩器与氮源拆离并且将V21H4-DOS47偶联溶液转移至新的容器并稀释至40ml。通过0.22μm过滤器过滤偶联溶液并且分成0.8ml的等份。在-80℃下储存等份。
排阻色谱(SEC)
带有996PAD的Waters 2695HPLC系统应用Empower 2软件进行数据采集和处理。色谱图记录范围在210-400±4nm，在280nm处提取用于处理的信号。在Superose 6 100/300GL柱(GE)上进行分离。在10mM磷酸盐,50mM NaCl,0.2mM EDTA,pH 7.2中洗脱蛋白。一定体积的无水样品注射后以0.5ml/min等流速进行分离。柱温度保持在室温而样品温度控制在5±2℃。
SDS-PAGE
应用Bio-Rad迷你型凝胶蛋白电泳试剂盒和带有ImageLab软件的 Bio-RAD分子成像仪凝胶Doc XR+以分析V21-DOS47偶联比。将10μg 蛋白样品与60μl蛋白凝胶加样缓冲液混合并且加热混合物至70℃持续10分钟。将变性样品(10μL/孔)加载至4至20％Tris-甘氨酸凝胶 (Invitrogen,REF#XP04200)并且以恒定电压150V、电流<40mA进行电泳直至电泳前面到达凝胶底部。洗涤、染色、脱色后，用凝胶Doc XR+ 成像仪扫描凝胶图像用于分析。SDS-PAGE也用于计算所偶联的抗体/ 脲酶分子的平均数量。通过质询主要簇中五条泳道的强度来确定该情况(见Tian等人,2015有进一步的细节)。所报告的所有偶联比都是平均值。
ELISA测定
室温下用100μL/孔山羊抗人IgG-Fc(Sigma,PBS中5μg/mL)来包被96孔板6小时，然后在2至8℃下用200μL/孔3％BSA/PBS封闭板过夜。用T-TBS(50mM Tris,0.15M NaCl,pH7.6,包含0.05％ Tween-20)洗涤2次后，添加100μL/孔VEGFR1/Fc,VEGFR2/Fc或 VEGFR3/Fc(R&D系统，0.25μg/mL TB-TBS(0.1％BSA/T TBS))，然后在室温下孵育平板1小时并温和地振动。用T-TBS洗涤3次后，添加100μL/孔抗体-脲酶偶联物或生物素化的抗体稀释液(TB-TBS中)然后在室温下孵育平板2小时并温和地振动。对于抗体-脲酶偶联物，用 T-TBS洗涤平板3次，添加100μL/孔兔抗脲酶(TB-TBS中1/6,000或 1/10,000倍稀释，Rockland)并且在室温下孵育平板1小时并温和地振动。对于所有样品，用T-TBS洗涤平板3次，添加100μL/孔山羊抗兔AP(TB-TBS中1/8,000-倍稀释，Sigma)以检测抗体-脲酶偶联物或添加链霉亲和素-碱性磷酸盐(0.5μg/mL TB-TBS,Sigma)以检测生物素化的抗体，并且在室温下孵育平板1小时并温和地振动。用T-TBS洗涤 3次后，添加100μL/孔底物(4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物，Fluka， 1mg/mL二乙醇胺底物缓冲液，Pierce)至每一孔并在室温下孵育5至 15分钟并温和地振动。通过用紫外-可见分光光度计扫描平板获得每一孔的405nm(A405)吸光度。
脲酶活性测定
脲酶催化尿素至氨的水解作用。一个单元的脲酶活性被定义为在 25℃、pH 7.3释放1微摩尔氨/分钟的酶的数量。在样品稀释缓冲液 (0.02M磷酸钾，包含1mM EDTA和0.1％(w/v)BSA,pH 7.3)中稀释 V21H4-DOS47样品。将100μl已稀释的样品与2.00ml 0.25M尿素(包含0.3M磷酸钠和0.5mM EDTA的磷酸盐缓冲液中,pH 7.3)混合，并且在25±0.1℃下孵育5分钟，然后通过添加1.00ml 1.0N HCl淬灭反应。为确定酶反应溶液中产生的铵离子的浓度，在15ml测试管中将 100μl已淬灭的反应溶液与2.00ml苯酚溶液(0.133M苯酚，包含0.25mM亚硝基铁氰化钠)混合。30秒后，将2.50ml NaOH-NaOCL溶液(0.14N NaOH，包含0.04％次氯酸钠)添加至测试管，混合，并在 37℃下孵育15分钟。在638nm处检测溶液的吸光度，用试剂反应溶液(无样品)作为空白。根据下列的方程式计算脲酶酶活性：U/ml＝D x(A x Tc x Te)/(5x E x Sc x Se)，其中A＝638nm处的吸光度，Tc＝显色反应的总体积(4.60ml)，Te＝酶反应的总体积(3.10ml)，E＝靛酚的摩尔消光系数/测定条件(20.10mM- 1.cm-1)，Sc＝显色反应的样品体积 (0.10ml)，Se＝酶反应的样品体积(0.10ml)和D＝稀释时间。按照制造商的使用说明用Sigma总蛋白试剂盒(TP0200)检测每一样品的蛋白浓度。通过脲酶活性(U/ml)除以受测试蛋白的数量(mg/ml)计算偶联物的脲酶活性/mg。通过活性/mg偶联物除以脲酶所组成的偶联物质量的比例计算特异的脲酶活性。
Western印迹
通过SDS-PAGE凝胶电泳溶解V21H4-DOS47测试样品和对照，然后使用Bio-Rad印迹试剂盒将其转移到硝酸纤维膜。将1.2μg HPU 及4.0μg作为对照的V21H4和2.0μg V21H4-DOS47样品与60.0μl的蛋白凝胶加样缓冲液混合。通过加热至60℃ 10分钟使由此得到的样品混合物变性并将10μl每一样品加载至每一泳道。平行地跑胶来制备副本印迹以用于脲酶和V21H4抗体探针探查。对于脲酶检测，使用兔抗脲酶IgG(Rockland)。为检测V21H4抗体，使用兔抗美洲驼IgG (ImmunoReagents Inc.)。与AP(Sigma)偶联的山羊抗兔IgG用作第二可视化抗体。用包含NBT/BCIP的AP缓冲液进行Western印迹的最终发展期。
质谱分析法
使用Waters Xevo G2 QTOF质谱仪和超高效液相色谱系统H级进行所有的质谱分析。锁定质量785.8426Da用于实时点对点质量校准。通过Masslynx V4.1软件控制LC-MS数据采集。
完整蛋白质谱分析
室温下交联剂活化的抗体样品与5mM半胱氨酸反应30分钟，在水中稀释至0.5至1mg/ml，通过添加无水甲酸酸化到最终浓度1％ (v/v)。使用A BEH300 C4(1.7μm,2.1x50mm)柱。柱温度设定在60℃并且将溶剂A(含0.025％v/v TFA的水)和溶剂B(含0.025％TFA的乙腈)用于超高效液相色谱(UPLC)分离。使用梯度20至60％溶剂B，以 0.15ml/min的流速，超过30分钟，进行UPLC。在500至3500Da的 M/Z范围，分辨率模式(扫描速率0.3/s，毛细管电压3.0kV，样品锥电压40V，提取锥电压4.0kV)进行LC-MS TIC(总离子计数)数据采集。离子源温度设定在100℃，去溶剂化温度设定在350℃。去溶剂化气体流速是600L/小时。以流速6.0μl/min，100f mole/μl Glu-Fib B获取实时锁定质量TIC原始数据集(扫描/20s)。在完整蛋白模式中，以10000 的分辨率，用BioPharmalynx软件(v1.2)处理质谱原始数据。质量匹配容差设定为30ppm，并且将包含二硫键的每一抗体的蛋白序列输入作为匹配蛋白用于蛋白质匹配研究。
V21H1-SM(PEG)2-Cys和V21H4-BM(PEG)2-Cys的胰蛋白酶消化
室温下交联剂活化的抗体样品与10mM半胱氨酸反应30分钟，然后用100mM碳酸氢氨稀释至0.5mg/ml。将无水乙醇添加至已稀释的样品溶液至最终浓度20％(v/v)。以蛋白质：蛋白酶比率为20:1添加胰蛋白酶/Lys-C混合物(Promega,Ref#V507A)并且在37℃下消化16 至20小时。将DTT添加至消化过的样品达到最终浓度10mM并在37℃下孵育30分钟以减少核心二硫键。在质谱分析前通过将无水甲酸添加至1％(v/v)使消化停止。
V21H4-DOS47的胰蛋白酶消化
100μg V21H4-DOS47与DTT混合至最终浓度10mM，并且添加无水乙腈至最终浓度20％(v/v)。为了减少二硫键并使偶联的蛋白变性，在60℃下加热样品混合物30分钟。室温下以16000rcf通过离心 5分钟使变性的蛋白沉淀物成球团状。将5.0μl 0.20M碘乙酰胺和100μl 水添加至球团然后通过涡旋混合。室温下以16000rcf离心悬浮物5分钟并丢弃上清液。将由此得到的球团在Tris-胍缓冲液(4M氯化胍， 50mM Tris,10mM CaCl2和10mM碘乙酰胺，pH 8.0)中溶解。在室温暗处进行这种烷化反应30分钟后，用5mM DTT淬灭反应。用Tris缓冲液(50mM Tris,10mM CaCl2 pH 8.0)稀释由此得到的溶液4次。以蛋白质：蛋白酶比率为25:1，将胰蛋白酶/LysC混合物添加至已稀释的样品溶液。在37℃下进行消化16至20小时后，通过添加无水甲酸至1％(v/v)使反应停止。
V21H1-SM(PEG)2-Cys、V21H4-BM(PEG)2-Cys和V21H4-DOS47胰蛋白酶消化物的LC-MSE肽作图
BEH300 C18(1.7μm,2.1x 150mm)柱用于UPLC分离。柱温度设定在60℃。溶剂A(含0.075％v/v甲酸的水)和溶剂B(含0.075％甲酸的乙腈)用于肽洗脱。以0.15mL/min的流速进行UPLC。50分钟内梯度0至30％的溶剂B用于V21H1-SM(PEG)2-Cys和 V21H4-BM(PEG)2-Cys样品的胰蛋白酶消化物的分离。对于 V21H4-DOS47的胰蛋白酶消化物，使用150分钟内梯度0至45％的溶剂B。在M/Z范围为50-2000Da、以分辨率模式(扫描速率0.3/s、毛细管电压3.0kV、样品锥电压25V和提取锥电压4.0kV)进行LC-MSE TIC(总离子计数)数据采集。离子源温度设定在100℃并且去溶剂化温度设定在350℃。去溶剂化气体流速为600L/小时。以流速为3.0μL/min 用100fmole/μL Glu-Fib B获取实时锁定质量TIC原始数据集(扫描/20s)。伴随仪器设置，将两种交替的扫描功能用于数据采集。第一扫描功能获取样品中完整肽离子的MS光谱而没有能量作用于碰撞细胞。第二扫描功能获取相同质量范围内的数据；然而，碰撞能量20至60eV 蔓延。这一扫描等同于非选择性串联质谱(MS/MS)扫描，并且允许来自于之前扫描离子的MSE片段光谱的收集。这种高能量碰撞诱发任意剪切肽主链键的片段化。对于每一剪切的C-N肽主链键，所产生的氨基末端离子称为“b”离子并且所产生的C末端离子称为“y”离子。在表 1至3中，标题为“MS/MS b/y可能的”纵列表示如果蛋白中所有肽键都等可能地被破坏，每一肽所产生的b和y离子的理论最大值。标题为“MS/MS b/y发现的”纵列表示每一肽所鉴定的b和y离子的实际数量。 b/y离子的鉴定提供了肽身份的清晰的确认。在肽图模式中以20000 分辨率用BiopharmaLynx软件(v1.2)处理质谱原始数据。锁定质量 785.8426Da用于实时点对点质谱校准。低能量MS离子强度阈值设定为3000计数并且MSE高能量离子强度阈值设定为300计数。质量匹配容差设定在10ppm(MS数据集)和20ppm(MSE数据集)。在质量匹配搜索究中包括带有1个缺失的裂解位点的肽。分别将V21H1、V21H4 和脲酶(Uniprot P07374)蛋白序列输入到肽匹配/鉴定的序列文库中。包括脱酰胺基N、脱氨基琥珀酰亚胺N、氧化M、+K、+Na和半胱氨酸经碘乙酰胺C(对烷基化的半胱氨酸而言)的可变的修饰用于肽图分析。 SM(PEG)2-Cys(429.1206Da)被设定为用以鉴定V21H1偶联物的活化位点的可变的修饰，而BM(PEG)2-Cys(431.1362Da)被输入用作鉴定 V21H4偶联物的活化位点的可变修饰。对V21H4-DOS47胰蛋白酶消化物而言，GGGEEDDGC-BM(PEG)2(SEQ ID NO:72)(1145.3453Da) 被设定为用以鉴定脲酶上偶联位点的可变修饰。
流式细胞术
使用非酶性细胞分解缓冲剂(Sigma)从烧瓶中分离293或293/KDR 细胞。以300xg离心细胞5分钟，然后以106个细胞/mL将其再悬浮在染色缓冲液(含有Ca2+和Mg2+、0.02％NaN3、2％FBS的PBS)中。将100μL细胞添加至96孔平板的孔。以350x g离心平板4分钟，移除缓冲液，然后将细胞再悬浮在50μL抗体-脲酶偶联物或生物素化的抗体(在染色缓冲液中稀释)，然后在2至8℃下孵育1小时。为了用抗体-脲酶偶联物染色细胞，将细胞用染色缓冲液洗涤3次然后以5.8 μg/mL再悬浮在鼠抗脲酶(Sigma,目录#U-4879)(在染色缓冲液中稀释)在2至8℃下孵育30分钟。对于所有样品，用染色缓冲液洗涤细胞3 次然后以3μg/mL再悬浮在AF488-抗-鼠IgG(Jackson, cat#115-545-164)(在染色缓冲液中稀释)，对于抗体-脲酶样品，或用PE SA(Biolegend,cat#405204)以133ng/mL(在染色缓冲液中稀释)用于生物素化的抗体。在2至8℃暗处孵育所有细胞30分钟。染色缓冲液洗涤3次，然后再悬浮在1％多聚甲醛(在PBS中稀释)中。室温下孵育平板15分钟，用锡纸包裹。然后如以上所述离心平板，移除多聚甲醛并且将细胞再悬浮在染色缓冲液中。平板包裹在锡纸中并且在2至8℃下储存直到使用Guava流式细胞分析仪和guavaSoft软件(Millipore)进行分析。S/N值是偶联293/KDR细胞的V21H4-DOS47与偶联293细胞的V21H4-DOS47之比或生物素-V21H4与偶联293/KDR细胞的生物素-同种型对照抗体(抗CEACAM6)之比。
结果
V21H1的产生和纯化
当产生用于免疫偶联药物的单域抗体时，必须以高产量并且使用包括表达、蛋白复性和纯化在内的可控制的方法来制备高纯度抗体。其他注意事项包括以下：抗体的pI应是在生理pH下使抗体-偶联物是稳定的和可溶的那种，抗体的特性应适合于偶联化学，并且偶联反应期间抗体残基的修饰不应折中抗体与其抗原结合的亲和力。
V21骆驼科抗体具有122个氨基酸(SEQ ID NO:2)。为了产生 V21H1(SEQ ID NO:3)，将11个氨基酸添加至V21抗体的C末端。根据偶联物稳定性和溶解性的需要，通过添加这些氨基酸，抗体的pI从8.75 变为5.44。异型双功能化学交联剂SM(PEG)2与氨基和巯基基团反应并且被挑选用于V21H1与脲酶的偶联：
步骤1
步骤2
步骤1是使用SM(PEG)2的抗体活化。步骤2是活化的抗体与脲酶的偶联。
V21序列的核心有5个赖氨酸残基，其中两个(Lys66和Lys101)分别位于CDR2和CDR3序列中。因为利用SM(PEG)2通过氨基偶联化学可修饰这些氨基酸，潜在地改变了抗体活性，将两个额外的赖氨酸残基添加至抗体C末端以使这种可能性最小化。
V21H1主要在BL21(DE3)细菌的胞质溶液中表达，实质上在包涵体中不表达。因此，在细胞溶解后，通过乙醇结晶化和阳离子交换色谱法从细菌蛋白中分离出抗体。抗体复性后，通过阴离子交换色谱法进一步地纯化天然抗体。为确认纯化抗体的分子量匹配设计的蛋白序列，进行LC-MS完整蛋白分析。从LC-MS TIC色谱图中没有检测出杂质蛋白并且检测到的V21H1的分子量匹配其蛋白序列在30ppm质量匹配误差内(数据未显示)计算出来的理论值。然而，纯化V21H1的产量非常低(培养的4至6mg/L)并且所用的纯化方法不适合大规模的 cGMP生产。
V21H1的交联剂活化
pH 7.0，使用早先在抗体-脲酶偶联物L-DOS47的生产中发现的SIAB活化AFAIKL2抗体最佳的条件，V21H1被SM(PEG)2活化。因为NHS-酯反应对于SIAB和SM(PEG)2是相同的并且AFAIKL2和 V21H1反应产物的LC-MS光谱是相似的(数据未示出)，这些条件对于 SM(PEG)2活化V21H1应该也是最佳的。
只有SM(PEG)2的NHS-酯基团能够与V21H1反应。V21H1抗体中两个半胱氨酸形成二硫键，从而不能与交联剂末端的马来酰亚胺基反应。来自于抗体N-末端的一级胺和来自于蛋白序列的赖氨酸残基都能够潜在地与交联剂的NHS-酯反应。然后携带抗体的交联剂末端的马来酰亚胺基与脲酶分子表面上的半胱氨酸反应。由于它周围的天然结构，每一氨基都被活化的可能性取决于它的可接近性。为了避免在第二反应步骤中形成脲酶二聚体和多聚体，理想的是只有一个氨基/抗体被NHS-酯活化。然而，因为每一抗体存在着许多一级胺，统计学上不可避免的是一些V21H1抗体将会被多于一个的交联剂分子活化。挑选最佳的活化条件，使被多于一个的交联剂所活化的抗体百分比最小化并同时使活化抗体的总数量最大化。为了评价活化分布，用过量的半胱氨酸与SM(PEG)2活化的V21H1反应并且通过完整质谱分析评估。质谱显示于图9中。大约50％的V21H1被SM(PEG)2活化并且大约30％活化的抗体被两个交联剂活化。因此，只有35％的V21H1抗体活化对于脲酶交联反应是最佳的。
为了检测SM(PEG)2靶向于V21H1的哪个赖氨酸，对 V21H1-SM(PEG)2-Cys进行胰蛋白酶消化，随后LC-MSE分析。胰蛋白酶剪切精氨酸和赖氨酸残基(除非脯氨酸立即C末端到K或R)的C末端侧的肽主链键。如果赖氨酸被SM(PEG)2活化，赖氨酸的极性和侧链结构就会改变并且空间上被阻断。因此，这一胰蛋白酶位点就不再容易接近蛋白酶。例如，如果V21H1的K66被SM(PEG)2活化，它就与SM(PEG)2-Cys连接并且不再受到胰蛋白酶消化；因此，应该观察到分子量2862.3018(2431.1656+431.1362)Da的峰，所述峰代表与 -SM(PEG)2-Cys连接的赖氨酸在肽中间， (ELVAAISWSDDSTYYANSVK66GR)-SM(PEG)2-Cys。在LC-MSE肽作图分析中，-SM(PEG)2-Cys(431.1362Da)作为可变修饰，通过搜索所有携带赖氨酸的肽和N末端的肽，能够鉴定所有可能地活化位点。沿着偶联位点检测到的胰蛋白酶肽在表2中列出。
表2：所鉴定的肽和V21H1-(PEG)2-Cys的活化位点的列表。
粗框(也是阴影蓝色)所包围的胰蛋白酶肽的集合表示用于计算对于每一活化位点活化的％的相关肽组。nd＝未检测到。
检测到所有胰蛋白酶肽质量匹配误差小于5ppm并且氨基酸序列复原100％。假设ESI灵敏度不受改性剂结合的影响，通过比较交联接头序列修饰的肽的强度与所有相关的肽的总强度评估活化百分比。在所使用的活化条件下，CDR2中的赖氨酸残基K66被交联剂基本上活化 (全部活化的V21H1抗体的～25％)；然而在交联剂活化期间CDR3中 K101没有被修饰。出人意料的是，出于偶联化学目的而故意添加的两个C末端赖氨酸残基没有被交联剂修饰。
V21H4的生产和纯化
设计抗体V21H4以改进V21H1生产、纯化和交联剂活化期间所鉴定出的问题。V21H4抗体的氨基酸序列在SEQ ID NO:6中显示。关于V21H1，将大量氨基酸残基添加至V21抗体C末端(C123-C136)并且调整抗体的pI从8.75至5.43。关于V21H1，SM(PEG)2交联剂活化的抗体CDR2区中K66的存在是令人关心的事情，因为这可能削弱抗体结合亲和力。从而使用不同的交联剂BM(PEG)2，将半胱氨酸残基(C136) 添加至V21H4用于巯基-巯基交联：
步骤1
步骤2
步骤1是使用BM(PEG)2抗体的活化。步骤2是活化的抗体与脲酶的偶联。
C末端半胱氨酸的包含还允许抗体在细菌内含体中表达。因为 V21抗体的两个核心半胱氨酸残基形成二硫键并且不能用于化学偶联，额外的C末端半胱氨酸残基提供了靶向偶联的独特的活化位点。
V21H4以高水平在包涵体中表达。细胞溶解后，通过离心将抗体从细菌基质蛋白中分离出来。通过阳离子交换色谱法纯化变性的抗体以移除核酸和其他蛋白。以可容易控制的方式进行V21H4抗体的复性并且通过HPLC监控(图10)。
通过将阳离子交换柱的峰值组分与复性缓冲液混合来启动复性过程。因为没有胱胺的折叠过程是非常慢的，但是将胱胺添加至最终浓度1.2mM后室温下两小时内完成折叠。阴离子交换色谱法用于分离正确折叠的蛋白并且通常观察到大于80％的产量。纯化的V21H4的典型产量是20至40mg/L培养物，这比V21H1的产量高得多。另外，用于生产和纯化V21H4的方法能够按比例增加并且符合cGMP程序。
V21H4的交联剂活化
V21H4的C末端半胱氨酸是脲酶偶联所必需的。然而，因为胱胺包含在V21H4复性缓冲液中，通过与一半的胱胺形成二硫键修饰C 末端半胱氨酸(胱胺-H)。通过LC-MS完整蛋白分析确认该情况(图11A)。因此，必须移除一半的胱胺并且半胱氨酸必须随后可用于由交联剂引起的活化。另外，使用可控制的温和的还原作用，在用于偶联目的的天然条件下，必须发生该移除并且必须不能还原抗体内部的二硫键。如图11B中所示，在室温下pH 7.1用2mMTCEP还原V21H4 一小时后，所检测到的抗体分子质量是4667.94Da，提示保护性的一半的胱胺已被移除。为了确认去保护的半胱氨酸残基对交联试剂是有效的，将10mM碘乙酰胺添加至去保护的V21H4抗体。室温下 pH7.5-8.0持续30分钟后，检测由此得到的分子质量是14724.83Da(图11C)，提示半胱氨酸残基的羧甲基(57.05Da)被烷基化。总之，能够移除C末端一半的胱胺并且由此得到的去保护的半胱氨酸可用于化学偶联。还用胰蛋白酶消化烷基化的抗体并且通过LC-MSE肽作图评估。 LC-MSE肽图(数据未示出)覆盖100％氨基酸序列并且C末端半胱氨酸是特异地且有效地被烷基化，在靶向的巯基交联化学中确认去保护的还原反应的特异性和C末端半胱氨酸的适合性。
V21H4抗体被交联剂BM(PEG)2活化。因为BM(PEG)2是同型双功能交联剂，可能的是BM(PEG)2的两个马来酰亚胺基能够与两个V21H4分子反应和连接，引起不能与脲酶偶联的抗体二聚体的产生。产生抗体二聚体的频率取决于试剂的分子比、天然疏水性、半胱氨酸残基的环境和反应溶液中分子的相对移动性。以交联剂与抗体分子比率为10:1进行该反应。另外，交联剂的分子量是308.29Da，比抗体分子量少了大约50倍。为评估活化的V21H4抗体，将100μl活化的抗体溶液与过量的半胱氨酸反应并且通过完整质谱分析评估(图11D)。在所用的实验条件下，多于99％的V21H4与单一交联剂偶联，留下交联剂的另一马来酰亚胺基基团可用于随后的脲酶反应。
为了确认C末端半胱氨酸是BM(PEG)2的唯一靶标，用胰蛋白酶消化V21H4-BM(PEG)2-Cys，随后进行LC-MSE分析。如果C末端半胱氨酸被交联剂活化，应该检测到代表交联剂活化的肽 GGGEEDDGC136-BM(PEG)2-Cys(SEQ ID NO:73)的质量为 1266.3652Da的峰。如果在交联剂活化之前核心二硫键被TCEP还原，然后应该鉴定到两个峰：代表肽LSC23AASGR-BM(PEG)2-Cys(SEQ ID NO:74)(1192.4852Da)的一个峰，代表SAVYLQMNSLKPEDTAVYYC97AAHK-BM(PEG)2-Cys(SEQ ID NO:75)(3130.4087Da)的另一个峰。沿着交联剂活化位点检测到的胰蛋白酶肽在表3中列出。
表3：所鉴定的肽和V21H4-(PEG)2-Cys的活化位点的列表。
粗框(也是阴影蓝色)所包围的胰蛋白酶肽的集合表示用于计算对于每一活化位点活化的％的相关肽组。nd＝未检测到。
检测到所有胰蛋白酶肽质量匹配误差小于5ppm并且氨基酸序列复原100％。如所期待的，多于90％的C末端半胱氨酸被交联剂活化，并且只检测到微量的交联剂活化的核心半胱氨酸残基(Cys23和Cys97)。这是比V21H1与SM(PEG)2中所观察到的更令人期望的方案，其中包括CDR2中那个在内的多数赖氨酸是靶向的。
V21H1和V21H4与脲酶的偶联以及初始特征描述
杰克豆脲酶是同型六聚体酶，每个亚基大约91kDa。在15个未结合的半胱氨酸残基/亚基中，5个在天然结构的表面并且通过马来酰亚胺基交联剂可用于与单域抗体连接(Takishima等，1998)。不同的偶联化学反应广泛地用于蛋白偶联。无铜点击化学优选地用于蛋白标记和蛋白-药物偶联(Thirumurugan等，2013)并且是我们的抗体与脲酶偶联的潜在的选择。然而，进行点击化学前需要NHS-酯或马来酰亚胺基的活化步骤。因此，传统的交联化学反应更简单并且适合于该特定的情况。
V21H1和V21H4交联后，分别将它们与脲酶偶联以产生V21H1 DOS47和V21H4-DOS47。在这两种情况下，巯基化学都用于抗体-接头序列与脲酶的偶联。进行SDS-PAGE以评估这两种结合(图12A)。
在偶联期间，6个单体脲酶亚基中的每一个都能够潜在地交联多达 5个抗体分子；因此，在变性SDS-PAGE条件下，预期V21H1 DOS47 和V21H4-DOS47都可以产生6条范围在～90至180kDa的不连续的条带。然而，看起来最多4个抗体与每一脲酶偶联，因为只观察到5条不连续的条带(图12A，簇1)。这提示脲酶表面上的5个半胱氨酸残基中的一个几乎没有或没有与马来酰亚胺反应的能力。
除了预期的5条不连续的条带之外，在V21H1-DOS47和 V21H4-DOS47都观察到额外的条带簇。对于V21H1-DOS47而言，两个额外的簇是明显的。簇2(有效MW为～200至250Da)和簇3(有效 MW为>300Da)很可能是通过V21H1物种携带多个SM(PEG)2交联剂产生的脲酶二聚体和多聚体。虽然这些较高分子量物种可能由多个天然脲酶分子组成，通过尺寸排阻色谱法观察到的低水平的(少于5％)二聚体和多聚体峰提示这些物种的大多数是由单一天然脲酶分子的亚基间的键组成而不是分子间的键。
对于V21H4-DOS47而言，依因为只有C末端半胱氨酸被BM(PEG)2活化，理论上应该只有一个条带簇存在。然而，如泳道5和6所展示的，V21H4-DOS47泳道中观察到额外的簇(MW为≥超过150kDa)。第二簇可能由非共价的二聚体组成，由于偶联的亚基在凝胶中迁移而形成所述非共价的二聚体。通过SDS-PAGE毛细管电泳(未示出)确认该情况，在其中没有观察到二聚体簇。因此，V21H4-DOS47不包含交联的脲酶二聚体或多聚体。
SDS-PAGE也用于检测对于每一天然脲酶六聚体-抗体偶联的抗体：脲酶结偶联比。簇1中的条带强度(图12A)取决于与不同数量的抗体分子偶联的脲酶单体的相对丰度。ImageLab软件用于产生对应于条带强度的柱状图并且整合每一柱状图的峰值面积。对于天然脲酶六聚体而言的偶联比(CR)如下计算：
CR＝6*(PK1*0+PK2*1+PK3*2+PK4*3+PK5*4)/(PK1+PK2+PK3+PK4+PK5)
其中PKi(i＝1-5)是与i-1抗体分子偶联的脲酶单体的峰值面积。
尽管与每一脲酶单体偶联的抗体数量是可变的，可预测的是抗体数量较少的可变性/脲酶六聚体，因为单体任意地簇集而形成六聚体。通过天然的V21H4-DOS47的SEC确认该情况，在其中观察到迁移成紧密峰 (图12B)。V21H4-DOS47结合方法可再生产地生产8.7至9.2个抗体/脲酶的偶联物(基于3批次)。
通过尺寸排阻色谱法(SEC)在天然条件下评估抗体、HP脲酶和偶联物的有效分子量(图12B)。
在可比较的时间(35.9分钟)洗脱V21H1和V21H4抗体。26分钟时洗脱游离的HP脲酶。因为对于V21H1-DOS47和V21H4-DOS47而言，抗体分子与脲酶分子偶联，使得偶联物大于游离的脲酶，偶联物洗脱早于游离的脲酶。然而，令人感兴趣的是在V21H4-DOS47时间之前的1分钟 V21H1-DOS47洗脱(22.80与23.80分钟)。两种偶联物具有几乎相同的偶联比(对于V21H1-DOS47而言为8.8个抗体/脲酶，而对V21H4-DOS47 而言为8.7个抗体/脲酶)。V21H4抗体比V21H1多3个氨基酸(159.20Da)；然而，与对应物V21H1-DOS47相比，理论上更大的V21H4-DOS47偶联物在SEC中显现出较小的有效分子尺寸。这意味着在天然条件下 V21H4-DOS47比V21H1-DOS47紧凑。
每一物种的大多数是单体形式，每一单体峰的前面出现小的二聚体峰。值得注意的是为了获得高纯度(96％)，V21H1-DOS47偶联程序需要SEC步骤。SEC步骤移除被两个交联剂活化的V21H1抗体所产生的脲酶多聚体。然而，生产V21H4-DOS47不需要SEC步骤，因为V21H4抗体只被一个交联剂活化。对V21H4-DOS47而言，只使用渗滤法移除未偶联的V21H4抗体，通常获得大于97％的纯度。因为SEC方法不容易转移到大规模的GMP过程，生产临床使用的V21H1-DOS47在技术上更难并且昂贵。
V21H1-DOS47和V21H4-DOS47的活性
进行ELISA测定以评估V21H1-DOS47(9.2个抗体/脲酶), V21H4-DOS47(8.8个抗体/脲酶)和生物素-V21H4与重组的 VEGFR2/Fc(图13A)的结合。V21H4 DOS47(EC50＝44pM)与VEGFR2/Fc结合，其具有比V21H1-DOS47(EC50＝226pM)与 VEGFR2/Fc的结合高大约5倍的亲和力。因为经由CDR2中存在的赖氨酸大量的V21H1与脲酶偶联，这样的情况并不令人惊讶。V21H4 DOS47还与VEGFR2/Fc结合，其具有比单独的V21H4抗体(EC50＝1.8 nM)与VEGFR2/Fc结合高大约40倍亲和力。这最可能是由于偶联物的多价性质的缘故。因为V21H4-DOS47是优良的偶联物，所以随后只对V21H4-DOS47进行特征描述。
通过流式细胞术评估V21H4抗体和V21H4-DOS47偶联物与表达 VEGFR2的细胞(293/KDR)结合的能力(图13B)。与重组的 VEGFR/Fc(EC50＝1.8nM,图13A)具有相似的亲和力的生物素-V21H4 (EC50＝1.6nM)与293/KDR细胞结合。这提示ELISA测定中VEGFR2 抗体表位在VEGFR2/Fc和293/KDR细胞的细胞表面是同等可接近的。令人感兴趣的是，V21H4-DOS47(EC50＝1.2nM)与293/KDR细胞的结合与生物素-V21H4抗体(EC50＝1.6nM)与这些细胞的结合是非常相似的。尽管ELISA测定中观察到V21H4-DOS47相比于V21H4抗体与 VEGFR2/Fc的亲和力有改进，但就细胞结合而言，没有观察到这种情况。这提示293/KDR细胞表面上表达的VEGFR2的密度低于ELISA 平板的孔中的VEGFR2的密度。
若干因素有助于确认理想的抗体/脲酶偶联比。在偶联反应期间，通过与V21抗体连接改变脲酶分子；因此，取决于偶联比，脲酶活性可能受到影响。另一方面，抗体-脲酶复合体的亲和性随着更多的抗体与脲酶偶联而增加。为评估偶联比对脲酶酶活性和结合活性的影响，通过调整V21H4/HPU摩尔比生产带有不同偶联比(1.4至9.4个V21H4/ 脲酶)的V21H4-DOS47偶联物。
未修饰的脲酶活性是大约4500U/mg。当抗体与脲酶偶联时，失去大约40％的活性(图13C)。然而，脲酶酶活性不依赖于所偶联的抗体数量，因为在所有测试的偶联比下活性仍然是一致的。使用重组的 VEGFR2/Fc进行ELISA测定以评估带有不同数量的抗体/脲酶的偶联物的结合(图13D)。当抗体/脲酶从1.4增加到2.3时，偶联物与 VEGFR2/Fc的结合是改进的，如EC50值从226pM降低到93pM所示。再添加一个抗体(3.3个抗体/脲酶)将EC50进一步减少至58pM。然而，随后的抗体/脲酶的添加具有有限的优势：9.4个抗体/脲酶时，EC50是31pM。因此，当存在大于3.3个抗体/脲酶时只有轻微的改进。因此， 3.3个抗体/脲酶的偶联比对于最佳的脲酶活性和偶联物结合是足够的。
V21H4-DOS47的其他特征描述
进行V21H4-DOS47的双组Western印迹(图14)以确认通过 SDS-PAGE所见到的条带模式。在Western印迹中，凝胶中所形成的二聚体和多聚体簇比其在SDS-PAGE中显现的更加突出(图12A)。当用抗脲酶抗体探测时，脲酶条带在分子量～85kDa处是可视化的，与1 至4个抗体结合的脲酶亚基条带与通过SDS-PAGE所见到的模式相匹配。当用抗美洲驼抗体探测时，未观察到游离的脲酶亚基条带并且抗体-脲酶偶联物条带与当用抗脲酶抗体探测时所见到的模式相同。通过抗美洲驼抗体和抗脲酶抗体而使V21H4-DOS47可视化的能力表明偶联物中存在这两种物种。
使用ESI-LC-MSE肽作图分析以确认V21H4和脲酶的身份并且鉴定V21H4-DOS47的偶联位点。V21H4-DOS47和HPU的LC-MS(TIC) 色谱图在图15A中示出。
鉴定的肽覆盖了100％V21H4和脲酶蛋白序列，质量匹配误差小于4ppm。通过升高的能量MS/MS和鉴定的至少一半的b/y离子来确认所有鉴定的肽带有大于3个残基。因为只有V21H4的C末端 GGGEEDDGC(SEQ ID NO:76)(837.2446Da)与不同的脲酶携带半胱氨酸的肽结合，偶联位点(表示为UCx-VC136，其中x是脲酶蛋白序列中的氨基酸)是被GGGEEDDGC-BM(PEG)2(SEQ ID NO:72)(1145.3453 Da)修饰的那些脲酶肽。为鉴定那些共价的偶联位点。通过 BiopharmaLynx处理来自于V21H4-DOS47样品胰蛋白酶消化物的ESI LC-MSE原始数据并且针对脲酶蛋白序列用对于所有15个脲酶半胱氨酸残基均适用的1145.3453Da的可变的改性剂进行搜索。为了评价每一偶联位点的相对频率，将偶联的肽UCx-UC136的肽强度与所有涉及 UCx的肽的总强度比较以产生结合％(表4)。
表4：ESI LC-MSE肽作图分析。V21H4-(PEG)2-Cys修饰的脲酶半胱氨酸残基的鉴定。na＝不适用的
每一脲酶亚基的15个半胱氨酸残基中，只有4个是偶联的(与通过SDS-PAGE所观察到的条带一致，图12A)。最可接近的半胱氨酸是 C824(26.7％)，随后依次是C663(4.2％)、C59(2.6％)和C207(0.6％)。未检测到半胱氨酸残基C592的偶联，所述C592对脲酶酶活性是必不可少的。这与脲酶活性在所有偶联比下都是可比较的的观察结果是一致的(图13B)。
还通过-UCx(UCx+308.1008Da)修饰的V21H4肽鉴定偶联位点。通过针对作为V21H4的C末端半胱氨酸的可变的改性剂的-Ucx的 V21H4抗体蛋白序列进行搜索而完成(表3)。鉴定的胰蛋白酶肽中，它们的0.4％是未变性的(T:012)。这微量的肽可能是由穿过核心序列的 C23和C97的交联剂所活化的V21H4的一部分。或者，这种肽可能是附着在C末端的一半半胱氨酸的微量V21H4，所述C末端的一半半胱氨酸在TCEP还原步骤中未去保护化。这些结果与对-VC136修饰的脲酶肽所观察到的那些是一致的。大部分V21H4 C-末端半胱氨酸经由C824(59％)与脲酶偶联，C663(27％)、C59(12％)和C207(1.2％)处偶联较少。
通过脲酶和V21H4肽的b/y离子作图来确认偶联位点的身份。16个可能的V21H4 b/y离子中，从三个主要的脲酶偶联位点鉴定只有几个(4-7)。这可能是GGGEEDDGC(SEQ IDNO:76)残基的ESI离子化特性的结果，引起离子化环境中正电荷中心的缺少。然而，通过考虑 V21H4和脲酶蛋白能够评估MS/MS b/y片段剖面图(图15B)。例如，，以LLCVSEATTVPLSR(SEQ ID NO:77)进行搜索，所述 LLCVSEATTVPLSR(SEQ ID NO:77)是作为改性剂的来自V21H4侧的 (GGGEEDDGC)-结合(1145.3453Da)修饰的脲酶肽，鉴定序列是(LLCVSEATTVPLSR)-结合-(GGGEEDDGC)并且具有2633.1472的肽质量的偶联的肽UC663-UC133的质量匹配偏差为2.1ppm。，以 GGGEEDDGC进行搜索，所述GGGEEDDGC是作为改性剂的来自脲酶侧的(LLCVSEATTVPLSR)-结合(1795.9026Da)修饰的V21H4 C末端肽，鉴定相同的肽的质量匹配偏差为2.1ppm。以来自于V21H4侧的改性剂修饰的脲酶肽进行搜索，用来自脲酶侧的13个b/y片段离子对该偶联肽的MSE碰撞诱发的MS/MS光谱作图。还以来自脲酶侧的改性剂修饰的V21H4肽进行搜索，用来自脲酶策的7个b/y离子对相同的光谱作图。
讨论
抗体药物偶联物作为有希望的抗癌药物类别变得显眼。通过直接递送药物至靶位点，减少了非特异的副作用。我们早先已描述了 L-DOS47的生产和特征，其为由酶脲酶和抗-CEACAM6抗体组成的ADC(Tian等人，2015)。L-DOS47目前处于治疗非小细胞肺癌的临床I/II期试验。在该研究中，产生和特征描述了靶向VEGFR2的偶联物 V21H4-DOS47。尽管L-DOS47和V21H4-DOS47都通过脲酶与美洲驼抗体的偶联而产生，还需要相当多的研究来生产成功的V21H4-DOS47 偶联物。例如，使用与L DOS47中相同的接头序列SIAB(SIAB是短的且刚性的接头)所产生的初始V21-DOS47偶联物不如使用PEG2类接头序列(相对长且有弹性)成功，现在本文所证明的是偶联物的结合活性被显著地改进了。
在该研究中，我们开发了偶联和纯化V21-DOS47免疫偶联物的程序以适合于大规模cGMP生产。单域骆驼科抗体对于产生抗体-酶偶联物的用途是理想的。它们的小分子尺寸允许负担得起的大量生产它们。重要的是，目前通过在C末端添加短的氨基酸标签对其进行修饰。标签发挥几种功能，包括抗体pI的修正、靶标抗体表达的提升和特异的反应位点的添加。因为脲酶的pI在4.8-5.1的范围，未变性的核心抗体所产生的抗体-脲酶偶联物将生产出大约7的pI的偶联物。在这一 pI，偶联物是不稳定的并且在偶联期间和偶联后形成沉淀物。短的C 末端肽标签的添加调整抗体的pI从8.75到5.43导致在偶联和纯化期间是稳定的pI 4.8-5.5的偶联物。通过靶向细菌包涵体表达C末端标签也改进了抗体生产的产量。这允许只使用离子交换色谱法进行抗体纯化。因为V21序列包含CDR2和CDR3序列中各自的两个赖氨酸残基，赖氨酸-巯基交联化学可以修饰这些赖氨酸残基，其折中了偶联物与它的靶标抗原的结合亲和力。由于这个原因，V21H4的C末端标签中包括C末端半胱氨酸残基以用于巯基-巯基交联化学。LC-MSE特征描述确认了CDR2赖氨酸残基受赖氨酸-巯基交联化学的修饰并且 ELISA结合测定确认了通过巯基-巯基交联化学所生产的 V21H4-DOS47的亲和力比通过赖氨酸-巯基交联化学生产的 V21H1-DOS47结合物的亲和力强大约6倍。
尽管C末端半胱氨酸残基的添加在V21H4-DOS47偶联中表现得非常有用，应理解的是当与其他美洲驼抗体一起工作时，如果能够使用该策略，在检测之前需要评估任何核心半胱氨酸残基的状态。这是因为巯基-巯基化学独特地靶向C末端半胱氨酸，仅因核心半胱氨酸残基以二硫键连接从而不能进行修饰。
蛋白质复性可能是慢的不能再生的过程。通常，通过稀释或透析进行复性，并且过程能够耗费若干天。另外，产量通常是低的 (Yamaguchi和Miyazaki,2014)。DTT/胱胺氧化还原电对的引入导致短的且可再生的产生高产量的活性V21H4抗体的复性过程，这对大规模生产是有用的。
抗体与脲酶偶联的优势之一是相比于单独的抗体，偶联物明显增加的亲和力。通过簇集多个抗体/脲酶，亲和性增加，因为复合物的相对解离率比游离的抗体慢。然而，抗体亲和性的改进必须平衡添加抗体至脲酶的潜在不利的影响，这包括脲酶活性的损害和偶联物增加的免疫原性。另外，高偶联比增加了生产成本和复杂性。每一抗体-脲酶偶联物可具有不同的理想的偶联比，因为靶抗原的可用性不同并且脲酶表面呈现的抗体的定向和活性随不同的偶联化学而改变。在该研究中，我们观察到偶联比大于3.3，只有少许抗原结合的改进。这与L-DOS47 形成对比，其中结合增加直至8个抗体与每一脲酶偶联。与L-DOS47 相比，用于产生V21H4-DOS47的更有弹性的接头序列的使用可部分地解释这种差异，因为抗体更容易接近靶抗原。然而，两种偶联物之间的差异最可能是由于这个事实：L-DOS47的抗体组分AFAIKL2对其靶抗原的亲和力比V21对VEGFR2的亲和力低得多(数据未示出)。从而，抗体多聚化对AFAIKL2具有比对V21更加显著的影响。
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实施例10
构建表达V21细胞外结构域的CAR-T载体。然后测试该载体抗表达VEGFR-2的肿瘤细胞的活性。使用LDH释放测定来测量细胞毒性并且通过测量分泌到周围组织培养基中的IL-2和IFN-γ细胞因子水平评估T细胞活性。
方案1.CAR载体的构建
合成全长的嵌合抗原受体并且亚克隆到慢病毒载体。通过Sanger 测序确认插入。嵌合抗原受体的结构如下所示：
方案2.慢病毒的制备
1.准备15cm培养皿并且以5x106个细胞/培养皿孵育；添加25mL 完全培养基(DMEM高浓度葡萄糖，10％FBS，盘尼西林-链霉素)并且将培养皿置于37℃、5％CO2孵育器中过夜。
2.室温下解冻100μM PEI和慢病毒封装系统 (Lenti-EF1a-VHH-3rd-CAR,pGP,pVSVG)并且通过来回吸取将其彻底地混合；将2mL PBS添加至6孔平板中的一个孔，并且分别添加10μg Lenti-EF1a-VHH-3rd-CAR、4μg pGP、2μg pVSVG；然后添加18μL 100 μM PEI并且在静置于室温下10分钟之前混合均匀以形成DNA/PEI复合物。
3.将DNA/PEI复合物滴加至15cm培养皿并且来回摇动皿以混合均匀；将培养皿置于37℃、5％CO2孵育器中6至8小时；然后更新培养基。
4. 48小时后，收获包含慢病毒颗粒的培养基并且用0.45μm膜过滤上清液；然后在4℃下以50000xg离心2小时；离心后，移除生物柜中的上清液并且添加500μL PBS缓冲液以再悬浮球团；把病毒等分并且在-80℃下保存。
方案3.慢病毒滴定法
1.从液氮中复原HT1080，调整细胞直到其处于对数生长期。
2.将HT1080细胞以50000个细胞/孔接种到新的24孔平板。添加培养基至500μL的最终体积，然后将平板置于5％CO2、37℃孵育器中过夜。
3.将10μL的浓缩的慢病毒添加至孔，同时添加聚凝胺至浓度6 μg/mL。
4.将平板置于5％CO2、37℃孵育器中96小时。
5.用PBS洗涤细胞。用基因组DNA纯化试剂盒(Lifetech， CAT#K0512)提取基因组DNA。通过NanoDrop2000检测提取的基因组 DNA的浓度。
6.稀释PUCWPRE和PUCALB质粒10次。制备用于荧光定量 PCR的标准样品。
7根据下表制备用于PCR反应的预混合溶液。
PCR引物的信息
8.将5μL/孔的标准的或基因组的DNA样品添加至96孔平板。将15μL/孔的预混合溶液添加至平板中。纸膜密封平板并离心1分钟。
根据下列程序进行PCR反应。
方案4.原代T细胞的分离
1.通过反相端到端混合淋巴细胞分离液试剂。
2.将15mL的淋巴细胞分离液添加至50mL管中。
3.用PBS+2％FBS以1:1稀释血液样品
4.仔细缓慢地在淋巴细胞分离液试剂上分层堆放稀释的样品。
5.在20℃下以800xg离心20分钟。
6.离心后，抽出白色细胞层至新试管中，并且用PBS洗涤细胞1 次。
7.调整细胞密度为1*108个细胞/mL(总体积在2.5mL中)并将细胞置于5mL圆底试管中。
8.将100μl/mL的混合物添加至管中并在室温下孵育15分钟。
9.混合球珠并将50μl的球珠/mL添加至样品，在室温下孵育10 分钟。
10.添加完全培养基直至体积达到2.5mL，将试管置于磁铁中并室温下静待5分钟。
11.孵育后，将试管保持在磁铁中并倒入液体。
12.用X-vivo 15培养基再悬浮细胞并且添加10％人AB血清、300 U/mL IL-2、5ng/mL IL-15和10ng/mL IL-7。
方案5.慢病毒对T细胞的转导
1.调整细胞密度为1*106个细胞/mL，添加细胞因子和抗体以激活原代T细胞48小时。细胞因子和抗体由300U/mL IL-2、10ng/mL IL-7、5 ng/mL IL-15、1μg/mL抗-CD3(OKT3)和2μg/mL抗-CD28组成。
2.设定MOI至20并且计算用于转导的慢病毒的体积
病毒体积(mL)＝(MOI*细胞数量)/病毒滴度
3. 37℃水浴中迅速解冻慢病毒；添加6μg/mL聚凝胺和病毒，并且彻底地混合；纸膜密封平板并且以800xg离心1小时。
4.离心后，剥离纸膜并且将平板置于在37℃、5％CO2的孵育器24 小时。
5.在以250xg离心10分钟后，移除上清液，然后用新鲜的培养基再悬浮细胞球团并且持续地培养细胞额外3至6天。
方案6.CAR表达验证
1.收集2x 10-6个CAR-T细胞，以每管1x 10-6个CAR-T细胞，将细胞分成2管。在100μL PBS中再悬浮细胞。
2.将10μL抗-EGFR抗体添加至其中一管并且在室温下孵育30分钟。
3.以800x g离心5分钟，移除上清液并且用1mL PBS洗涤细胞3 次。
4.将10μL APC-抗-人IgG添加至这两个试管并且在室温下暗处孵育30分钟。
5.以800x g离心5分钟，移除上清液并且用1mL PBS洗涤细胞3 次。
6.在500μL PBS中再悬浮细胞并且通过FACS检测T细胞表面上的 CAR。
方案7.CAR-T对靶肿瘤细胞的裂解
1.调整靶细胞直至其处于对数生长期。通常，在测定前传代细胞2 次。
2.用胰蛋白酶提起贴壁细胞并且调整细胞密度至5x105个细胞/mL；将100μL细胞悬液接种在96孔平板的每一孔中。将100μL无菌水添加至所有未使用的孔以使测定孔的蒸发最小化。将平板置于5％CO2、37℃的孵育器中过夜。
3.通过离心收获步骤2中制备的CAR-T细胞并且用无FBS的 RPMI1640培养基再悬浮细胞球团；取出包含靶肿瘤细胞的96孔平板并且完全地抽出培养物且用无菌的PBS洗涤细胞；根据E/T比将CAR-T细胞添加至每一孔并且补充最终体积至100μL/孔；同时保留4个没有T细胞的包含靶细胞的孔分别作为最大裂解和最小裂解。将平板置于5％ CO2、37℃的孵育器6小时。
4.培养后，取出平板并且将细胞裂解缓冲液添加至最大裂解孔；以 1200xg离心平板5分钟并且转移50μL上清液至新的平板并且添加LDH 检测试剂。最终用多重扫描光谱记录OD值。
计算靶细胞裂解的公式：
方案8.通过ELISA测定检测细胞因子
1.调整靶细胞直至其处于对数生长期。通常，在测定前传代细胞2 次。
2.用胰蛋白酶提起贴壁细胞并且调整细胞密度至5x105个细胞/mL；将100μL细胞悬液接种在96孔平板的每一孔中。将100μL无菌水添加至所有未使用的孔以使测定孔的蒸发最小化。将平板置于在5％CO2、 37℃的孵育器中过夜。
3.通过离心收获CAR-T细胞并且用无FBS的1640培养基再悬浮细胞球团；取出包含靶肿瘤细胞的96孔平板并且完全地抽出培养物且用无菌的PBS洗涤细胞；根据E/T比将CAR-T细胞添加至每一孔并且补充最终体积至100μL/孔；将平板置于5％CO2、37℃的孵育器6小时。
4.培养后，在室温下以1200xg离心平板5分钟。转移50μL上清液用于使用ELISA测定试剂盒的IL-2和IFN-γ的检测。
5.用GraphPad Prism 6.0分析数据。
CAR和CAR-T的结果
VHH的蛋白序列是SEQ ID NO:2的那个。
CAR构建验证
用EcoRI-BamHI消化重组的慢病毒载体并且产生了1500bp左右的片段(预估的片段是大约1518bp)。核酸内切酶消化的结果显示插入片段的分子量与设计一致(图16)。
CAR测序验证
进一步地测序重组的载体并且发现构建的质粒的序列与设计一致。
慢病毒滴定
表1.这一病毒的Ct值
病毒滴定计算的公式：
表2.慢病毒滴度
样品 慢病毒滴度
VHH-CAR 1.13*10<sup>8</sup>TU/mL
慢病毒滴定的结果显示慢病毒载体是以高滴度制备的。所使用的 qPCR标准曲线显示在图17中。
CAR表达验证
在慢病毒载体中，截短的EGFR(结构域III&IV)通过肽与 VHH-CAR连接并且EGFRt的表达受相同启动子所驱动。因此，EGFRt 的检测反映了CAR表达的信息。FACS结果显示慢病毒转导是成功的并且转导效率(68.5％)是令人满意的(图18)。注意：慢病毒感染两回合后40％至60％转导效率被认为是可以的。
通过CAR-T靶肿瘤细胞的裂解
分别把NCI-H23细胞、HL-60细胞和ZR-75-30细胞当作是靶细胞，并且如图19中所示的以不同的E/T比与未转导的对照T细胞和 CAR-T细胞共培养。共培养后，收获上清液用于使用LDH测定试剂盒的LDH检测(图19)。裂解测定结果显示靶向VEGFR-2的CAR-T 细胞能够以“剂量依赖的”方式杀伤靶细胞。未转导的T细胞也显示出某些细胞溶解效应，这归因于活化的T细胞的非特异性杀伤效应。
通过ELISA测定细胞因子的检测
分别把NCI-H23细胞、HL-60细胞和ZR-75-30细胞当作是靶细胞，并且如下图所示的以不同的E/T比与未转导的对照T细胞和 CAR-T细胞共培养。通过ELISA测定检测IL-2和IFN-γ的分泌水平(图 21和图22)。所使用的标准曲线显示在图20中。细胞因子释放测定结果显示与靶细胞共孵育后CAR-T细胞比未转导的T细胞分泌更多的细胞因子，这表明靶细胞的识别和CAR-T细胞的活化。
提出以上描述和实例仅仅说明本发明而非意在限制。本发明所公开的方面和本发明的实施方案中每一个可以认为是单独地或与本发明的其他方面、实施方案和变化组合。另外，除非另有说明，本发明的方法的步骤没有限制于任何特定的进行顺序。
本领域技术人员可想到合并本发明的精神和物质的所公开的实施方案的修改并且此类修改们在本发明的范围内。而且，本文所引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。

Claims (56)

1.嵌合抗原受体(CAR)，其与VEGFR-2、VEGFR-2的表位或片段、或VEGFR-2的变体结合。
2.如权利要求1所述的CAR，其中所述CAR包含用于与VEGFR-2结合的单域抗体或其片段。
3.如权利要求2所述的CAR，其中所述单域抗体或其片段属于骆驼科(Camelidae)种。
4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的CAR，其中所述CAR与VEGFR-2的表位结合。
5.如权利要求4所述的CAR，其中所述CAR与SEQ ID NO:1中发现的表位结合。
6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的CAR，其中所述CAR包含互补决定区(CDR)1；CDR2和/或CDR3，其中CDR1、CDR和CDR3中至少之一与VEGFR-2结合。
7.如权利要求1至6中任一权利要求所述的CAR，其中所述CAR包含至少一个具有选自SYAMG、AISWSDDSTYYANSVKG、HKSLQRPDEYTY的序列的CDR和与结合VEGFR-2的序列至少70％同一性的序列。
8.如权利要求1至7中任一权利要求所述的CAR，其包含SEQ ID NO:78的序列或与SEQID NO:78至少90％同一性的序列。
9.如权利要求1至8中任一权利要求所述的CAR，其包含间隔分子、跨膜区和一种或多种细胞信号结构域，所述细胞信号结构域选自人CD8-α蛋白、人CD28蛋白、人CD3-ζ蛋白、人FcRy蛋白、CD27蛋白、OX40蛋白、人4-IBB蛋白、前述任一种的修饰形式以及前述的任何组合。
10.如权利要求1至9中任一权利要求所述的CAR，其包含选自SEQ ID NO:2-30或其片段或变体的序列。
11.如权利要求1至9中任一权利要求所述的CAR，其包含选自SEQ ID NO:2-30或与SEQID NO:2-30至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％同一性的序列，或与SEQ ID NO:2-30基本同一的序列。
12.如权利要求10或11所述的CAR，其中所述序列包含选自SEQ ID NO:54-69的接头序列。
13.如权利要求12所述的CAR，其中所述接头序列可以还包含C末端半胱氨酸。
14.如权利要求13所述的CAR，其中所述接头序列包含GSEQKGGGEEDDGC或其变体。
15.免疫细胞，其包含权利要求1至14中任一权利要求所述的CAR。
16.如权利要求15所述的免疫细胞，其中所述细胞是T细胞或细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞。
17.如权利要求15或16所述的免疫细胞，其还包含至少第二CAR。
18.如权利要求15至17中任一权利要求所述的免疫细胞，其还包含任选地极度活跃的转座子/转座酶系统。
19.如权利要求18所述的免疫细胞，其中所述转座子/转座酶系统是睡美人转座子/转座酶系统。
20.如权利要求18或19所述的免疫细胞，其中所述转座子/转座酶系统是SB100X转座子/转座酶系统。
21.如权利要求15至20中任一权利要求所述的免疫细胞，其还包含自杀基因。
22.如权利要求15至21中任一权利要求所述的免疫细胞，其被配制成包含药物载体、稀释剂和/或赋形剂的组合物。
23.编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中所述CAR包含VEGFR-2结合部分和免疫细胞激活部分，其中所述VEGFR-2结合部分与VEGFR-2或其变体或片段结合。
24.如权利要求23所述的核酸分子，其中所述VEGFR-2结合部分包含针对VEGFR-2或VEGFR-2的变体或片段的单克隆抗体或其抗原结合部分。
25.如权利要求24所述的核酸分子，其中所述VEGFR-2结合部分包含所述单克隆抗体的可变区。
26.如权利要求23至25中任一权利要求所述的核酸分子，其中所述免疫细胞激活部分包含任一种或多种以下蛋白中的T细胞信号结构域：人CD8-α蛋白、人CD28蛋白、人CD3-ζ蛋白、人FcRy蛋白、CD27蛋白、OX40蛋白、人4-IBB蛋白及其变体或片段。
27.如权利要求23至26中任一权利要求所述的核酸分子，其包含SEQ ID NO:31-53中至少之一的核酸序列和/或编码与SEQ ID NO:1的序列结合的多肽的核酸序列。
28.包含编码嵌合抗原受体(CAR)的一条或两条多肽链的核苷酸序列的核酸分子，其中所述CAR从N-末端至C-末端依次包含：
i)VEGFR-2特异性的抗原结合单域抗体；
ii)跨膜结构域；
iii)共刺激多肽，其中所述共刺激多肽是4-1BB多肽和/或OX-40多肽；以及
iv)细胞内信号结构域。
29.如权利要求28所述的核酸分子，其中第一多肽包含在所述单域抗体与所述跨膜结构域之间插入的铰链区。
30.如权利要求29所述的核酸分子，其中所述铰链区是免疫球蛋白IgG铰链区或源于CD8的铰链。
31.如权利要求28至30中任一权利要求所述的核酸分子，其中所述细胞内信号结构域包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
32.如权利要求31所述的核酸分子，其中包含ITAM的所述细胞内信号结构域选自CD3-ζ和ZAP70。
33.如权利要求28至32中任一权利要求所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列与T细胞特异性启动子可操作地连接。
34.如权利要求28至33中任一权利要求所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列与NK细胞特异性启动子可操作地连接。
35.权利要求34所述的核酸分子，其包含SEQ ID NO:79。
36.由权利要求25至35中任一权利要求所述的核酸序列编码的嵌合抗原受体(CAR)。
37.如权利要求36所述的CAR，其包含SEQ ID NO:2-38中任一种的氨基酸序列。
38.载体，其包含权利要求25至35中任一权利要求所述的核酸分子。
39.宿主细胞，其表达权利要求25至35中任一权利要求所述的核酸分子，或权利要求28或29所述的CAR。
40.如权利要求40所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是免疫细胞。
41.如权利要求41所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自T细胞和细胞因子诱导的杀伤CIK细胞。
42.如权利要求40至42中任一权利要求所述的宿主细胞，其还包含至少第二CAR。
43.如权利要求40至43中任一权利要求所述的宿主细胞，其还包含任选地极度活跃的转座子/转座酶系统。
44.如权利要求44所述的宿主细胞，其中所述转座子/转座酶系统是睡美人转座子/转座酶系统。
45.如权利要求44或45所述的宿主细胞，其中所述转座子/转座酶系统是SB100X转座子/转座酶系统。
46.如权利要求40至46中任一权利要求所述的宿主细胞，其还包含自杀基因。
47.细胞群，其包含至少一种权利要求40至47中任一权利要求所述的宿主细胞。
48.药物组合物，其包含权利要求15至22中任一权利要求所述的免疫细胞，或权利要求40至47中任一权利要求所述的宿主细胞。
49.治疗或预防哺乳动物癌症的方法，所述方法包括以有效治疗或预防所述哺乳动物癌症的量向所述哺乳动物给予权利要求15至22中任一权利要求所述的免疫细胞或权利要求40至47中任一权利要求所述的宿主细胞。
50.如权利要求50所述的方法，其中所述癌症是表达VEGFR-2的癌症。
51.如权利要求50或51所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
52.减少肿瘤中血管生成的方法，所述方法包括以有效减少血管生成的量向所述哺乳动物给予权利要求15至22中任一权利要求所述的免疫细胞或权利要求40至47中任一权利要求所述的宿主细胞。
53.CAR盒，其具有包含信号肽-VHH-CD8铰链-CD28-4-1BB-CD3ζ-T2A-EGFRt的结构并且具有SEQ ID NO:79的核酸序列。
54.CAR盒，具有包含信号肽-VHH-CD8铰链-CD28-4-1BB-CD3ζ-T2A-EGFRt的结构并且具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
55.人T细胞，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中所述CAR包含VEGFR-2抗原结合结构域，其中所述CAR还包含跨膜结构域、4-1BB共刺激信号区域和CD3ζ信号结构域，其中所述T细胞源于患有癌症的人。
56.如权利要求56所述的人T细胞，其中在使用选自抗病毒剂、化学疗法、放射、免疫抑制剂和抗体的方式对人治疗之前，从由人获得的血液样本中分离所述人T细胞。
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