KR20220141299A - Il2 오르토로그 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20220141299A
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cells
orthogonal
cell
receptor
ligand
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KR1020227027980A
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폴-조셉 페나플로르 아스푸리아
패트릭 제이. 루파르두스
리처드 비. 머피
마틴 옵트
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신테카인, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 직교 수용체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 직교 수용체는 직교 CD122이다. 일부 실시양태에서, 직교 수용체는 직교 인간 CD122 (hCD122)이다. 일부 실시양태에서, 직교 수용체는 적어도 하나의 STAT3 결합 모티프를 포함하는 직교 CD122이다.

Description

IL2 오르토로그 및 사용 방법
관련 특허 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 1월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 62/961,200; 2020년 4월 24일에 출원된 미국 가출원 번호 63/015,476; 및 2020년 4월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 63/016,256을 우선권 주장하며; 이들 가출원 각각은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
입양 세포 요법은 인간 대상체의 질환 치료에 효능이 있는 치료 양식으로서 기록되어 있다. 일부 경우에, 세포 요법은 환자로부터 절제된 종양 조직으로부터 수득된 생체외 확장된 종양 침윤 림프구 (TIL)를 포함하는 세포 산물의 투여를 포함한다. 예를 들어, 1992년 6월 30일에 허여된 미국 특허 번호 5,126,132A (Rosenberg) 및 문헌 [Spiess, et al. (1987) J Natl Cancer Inst 79:1067-1075]을 참조한다. 실질적으로 이러한 레지멘에 따라 입양 TIL 요법으로 치료받은 전이성 흑색종을 앓고 있는 대상체는 여러 I/II상 임상 시험에서 약 50%의 객관적인 종양 반응을 수득하였다. 예를 들어, 문헌 [Rosenberg, et al. (2011) Clin Cancer Res 17:4550-4557; Andersen, et al. (2016) Clin Cancer Res 22:3734-3745; and Besser, et al. (2013) Clin Cancer Res 19:4792-4800]을 참조한다. 흑색종 환자에서 관찰된 TIL 요법의 성공을 바탕으로, 다른 사람들은 자궁경부암 (문헌 [Stevanovic, et al. (2015) J Clin Oncol 33:1543-1550]), 신세포암 (문헌 [Andersen, et al. (2018) Cancer Immunol Res 6:222-235]), 유방암 (문헌 [Lee, et al. (2017) Oncotarget 8:113345-113359]), 비소세포 폐암 (문헌 [Ben-Avi, et al. (2018) Cancer Immunol Immunother 67:1221-1230]), 위장관암 (문헌 [Turcotte (2013) J Immunol 191:2217-2225 및 Turcotte, et al. (2014) Clin Cancer Res 20:331-343]), 담관암종 (문헌 [Tran, et al. (2014) Science 344:641-645]), 췌장암 (문헌 [Hall, et al. (2016) J Immunotherapy Cancer 4:61]), 두경부암 (문헌 [Junker, et al. (2011) Cytotherapy 13:822-834]) 및 난소암 (문헌 [Fujita, et al. (1995) Clin Cancer Res 1: 501-507])을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 다른 종양 유형으로부터 TIL을 수득할 수 있다는 것을 입증하였다.
인간 질환의 면역요법적 치료를 위해 다양한 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포 및 TIL)가 개발되었다. 인간 면역 세포는 치료 적용, 예컨대 암 세포, 세포내 병원체 및 자가면역에 관여한 세포의 인식 및 사멸에 사용하도록 조작되었다. 암 치료에 조작된 세포 요법을 사용하는 것은 특이적 기능을 제공하는 조작된 세포 (예컨대 T 세포)의 선택적 활성화 및 확장에 의해 촉진되며 암 세포를 선택적으로 공격한다. 입양 면역요법의 일부 예에서, T 세포는 대상체의 혈액 또는 종양 조직으로부터 단리되어, 생체외에서 프로세싱되며, 대상체에게 재주입된다. 따라서, 이러한 표적화된 조작된 세포 집단의 선택적 활성화를 가능하게 하는 조성물 및 방법이 바람직하다.
입양 세포 요법의 임상 적용에 대한 과제는 치료 유효성을 유지하고 최대화하기 위해 대상체에 투여한 후 입양 전달된 세포의 생육력을 유지하는 것이다. 대상체에 대한 투여 후 입양 전달된 세포의 생육력의 성공적인 유지는 이러한 입양 세포 요법에 대한 임상 반응을 촉진한다. 입양 세포 요법 레지멘으로 대상체에게 투여된 세포는 투여 후 수개월 또는 심지어 수년 동안 대상체에서 검출가능할 수 있지만, 투여된 세포 중 상당한 분율 (전형적으로 대다수)은 치료적 항종양 효능을 상실한 정지 상태에 빠진다. 이러한 입양 전달된 세포의 활성 상실은 종종 신생물성 질환의 재발 또는 회귀를 포함한 임상 효능의 상실과 상관관계가 있다.
인간 대상체에서의 임상 실시에서, 입양 전달된 세포 (예를 들어, TIL 요법 및 조작된 T 세포, 예컨대 CAR-T 세포)를 지원하기 위해, 대상체에게 투여된 후 입양 전달된 세포의 생육력을 지원하기 위해 흔히 사용되는 수단은 다능성 시토카인인 인터류킨-2의 전신 투여이다. 인간 인터류킨 2 (IL2)는 133개 아미노산의 4 알파-나선 다발 시토카인이다. IL2는 IL2, IL-4, IL-7, IL 9, IL-15 및 IL21을 포함하는 시토카인의 IL2 패밀리의 한 구성원이다. hIL2의 아미노산 서열 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)은 젠뱅크에서 수탁 로케이터 NP_000577.2로 찾을 수 있다. IL2는 항원 활성화된 T 세포에 의해 생산되며 면역 체계에 광범위한 영향을 미치며 면역 활성화, 억제 및 항상성 모두를 조절하는데 중요한 역할을 한다. IL2는 활성화된 T 림프구의 증식 및 확장을 촉진하고, 나이브 T 세포의 증식 및 활성화를 유도하고, B 세포의 성장을 강화시키며, NK 세포의 증식 및 확장을 촉진한다. 임상 경험은 HD-IL2 치료가 나이브 T 세포와 NK 세포를 활성화시킨다는 것을 입증해준다. 전임상 실험은 IL2 매개 급성 독성에 대한 우세한 메커니즘으로서 NK 세포가 연루되었음을 시사하였다 (Assier, et al. (2004) J Immunol 172:7661-7668). HD-IL2의 투여는 또한 CD8+ T 세포의 활성을 매개하는 CD25+ 조절 T 세포 (Treg)의 확장을 자극한다. NK 및 Treg의 확장은 통상적으로 부가의 독성, 예컨대 CRS를 초래하는 것으로 여겨진다.
TIL 또는 CAR-T 세포의 주입과 연계해서 또는 주입 직후에 조작된 종양 침윤 림프구 ("TIL") 또는 CAR-T 세포를 사용한 입양 세포 요법의 전형적인 현재의 임상 실시에서, 대상체는 대상체가 치료를 견딜 수 있는 한 8시간마다 고 용량 hIL2 (HD-hIL2) 720,000 IU/kg) hIL2를 정맥내 투여받는다. 입양 세포 요법과 연계한 HD-hIL2의 이러한 투여는 조작된 세포 산물의 생존 및 임상 효능을 더욱 증진시키는 것으로 생각된다 (Anderson, et al. (2016) Clinical Cancer Research 22:3734-3745). 통상적으로 사용되는 형태의 인간 IL2 (hIL2)는 성숙한 hIL2 분자의 위치 125에서의 시스테인이 세린으로 치환된 (C125S) hIL2 유사체인 알데스류킨 (프로류킨(Proleukin)®)이다.
그러나, hIL2의 전신 투여는 입양 전달된 세포의 집단을 넘어서는 비-특이적 자극 효과와 연관되며, 특히 고 용량에서 인간 대상체에서 상당한 독성과 연관된다. 입양 세포 요법 레지멘의 지원에 사용되는 것과 같은 고 용량 hIL2의 효과는 인간 대상체에서 상당한 독성을 초래하는 것으로 기록되어 있다. HD-hIL2를 입양 세포 전달 (ACT)과 연계해서 투여 시 관찰된 가장 흔한 부작용은 오한, 고열, 저혈압, 핍뇨, 및 전신 염증성 및 모세혈관 누출 증후군으로 인한 부종 뿐만 아니라 자가면역 현상, 예컨대 백반증 또는 포도막염에 대한 보고를 포함한다. HD-hIL2와 연관된 독성은 전문가의 관리가 필요하므로, 전형적으로 병원 환경에서 적용되며 중환자실에 입원해야 하는 경우가 흔하다 (Dutcher, et al. (2014) J Immunother Cancer 2(1): 26). HD-hIL2 치료는 주로 중간 친화성 수용체 (CD122/CD132)를 발현하는 나이브 T 세포 및 NK 세포, 및 고 친화성 삼량체 수용체 (CD25/CD122/CD132)를 발현하는 CD25+ 조절 T 세포 (Treg)를 포함한 대부분의 림프 세포를 활성화시킨다. HD-hIL2 단독요법은 또한 사망에 이를 수 있는 전신 모세혈관 누출 증후군을 유발할 수 있다. 이는 HD-IL2 요법의 사용을 심장 및 폐 기능이 정상인 대부분의 젊고 매우 건강한 환자로 제한한다. HD-IL2 요법은 전형적으로 병원 환경에서 적용되며 중환자실에 입원해야 하는 경우가 흔하다. 산화질소 신타제 억제제가 VLS의 증상을 개선하기 위해 제안되어 왔지만, VLS가 관찰될 때 통상적인 실시는 IL2 요법을 중단하는 것이다. HD IL2 치료와 연관된 VLS를 완화하기 위해, 저 용량 IL2 레지멘이 환자에게 시험되었다. 저 용량 IL2 치료 레지멘은 VLS 독성을 부분적으로 완화하지만, 이러한 더 낮은 독성은 신생물의 치료에서 최적의 치료 결과를 대가로 하여 달성되었다.
더욱이, 임상적으로 승인된 형태의 hIL2 (예를 들어, 프로류킨®)는 세포를 활성화된 상태로 유지하기 위해 IL2에 대한 조작된 T 세포의 충분한 노출을 유지하기 위해 IL2의 빈번한 투여를 필요로 하는 생체내에서 비교적 짧은 수명 (수 시간 가량)을 지니고 있다. 생체내 수명을 연장하기 위한 IL2의 변형이 문헌에 기재되어 있으나 (예를 들어, PEG화; 1993년 4월 27일에 허여된 미국 특허 번호 5,206,344 (Katre,et al.), 문헌 [Meyers, et al. (1991) Clinical Pharmacology and Therapeutics 13(1):307-313]), 야생형 hIL2의 이러한 장기간 작용 형태의 투여는 그럼에도 불구하고 모 분자와 유사한 독성 문제를 나타내며 이러한 작용제의 장기적인 노출은 이러한 독성을 악화시키는 역할을 할 수 있다. 결과적으로, 세포 기반 요법에 대한 중요한 과제는 내인성 신호전달 경로에 의한 조정과 독립적이고, 비-표적화된 내인성 세포와의 최소 교차 반응성을 나타내며, 조작된 세포 집단을 대상체에게 투여한 후 선택적으로 제어될 수 있는 원하는 조절가능한 증식 거동 신호를 조작된 세포에 부여하는 것이다.
현재의 실시에서, 입양 세포 요법 산물을 투여하기 전에, 대상체는 림프고갈 예비 레지멘 및 인터류킨-2 (IL-2)의 후속 지원을 받는다. 세포 요법 레지멘에서 세포의 용량은 전형적으로 매우 높기 때문에 (전형적으로 현재 CD19 CAR T 산물의 경우 106-108개 세포 범위의 단일 투여), 림프고갈 예비 레지멘은 Treg를 고갈시키고 세포성 "싱크"를 제거하며 입양 전달된 세포를 위한 "룸"을 제공하는 것으로 여겨진다. 그러나, 림프고갈은 환자를 환경적 요인에 취약하게 만들어 환자를 상당히 위태롭게 한다. 결과적으로, 세포 요법과 연계한 림프고갈 레지멘을 피하는 것이 환자에게 상당한 도움이 될 것이다.
세포 요법 산물의 제조의 과제는 그러한 '살아있는 약물'이 생육력 및 기능성을 보존하기 위해 환경을 면밀히 제어해야 한다는 것이다. 실제로, 환자로부터 유래되거나 (자가) 또는 단일 공여자 공급원으로부터 유래된 (동종이계) 단리된 세포는 대상체 또는 제어된 배양 조건으로부터 제거된 후 빠르게 기능을 상실하기 시작한다. 대상체 또는 제어된 배양 조건을 벗어난 상태에서 단리된 세포의 생육력을 성공적으로 유지하는 것이, 단리된 세포가 세포 산물 제조 워크플로 또는 환자 내로 재삽입하기 위한 기능성으로 복귀할 수 있게 한다. 입양 세포 요법에 사용하기 위한 세포의 생체외 제조 동안, 세포는 종종 외인성 hIL2의 존재 하에 배양된다. hIL2의 효과는 조작된 면역 세포와 비-조작된 면역 세포 둘 다를 포함하는 혼합 세포 집단에서 조작된 세포에 비-특이적이므로, IL2에 대한 이러한 노출은 세포 집단에서 원하는 치료상 유용한 세포 (예를 들어, CAR-T 세포 또는 항원 경험 TIL)의 확장 뿐만 아니라 임상적 혜택을 제공하지 않고 조작된 세포 산물의 투여를 복잡하게 하고 독성을 유발할 수 있는 단리된 조직 (예를 들어, 신생물 또는 혈액) 샘플으로부터의 다양한 바람직하지 않은 배경 세포의 확장을 초래한다. 결과적으로, 자가 세포 전달에 유용한 세포의 제조를 위한 현재의 생체외 확장 방법은 바람직한 치료상 유용한 세포의 백분율이 바람직하지 않은 세포로 오염되어 최적 이하의 세포 산물이 되는 세포 산물을 초래한다. 심각한 독성은 현재 ACT 프로토콜에서 중요한 문제로 남아 있기 때문에, ACT 요법에 사용하기 위해 원하는 효능 세포 (예를 들어, CAR-T 세포 또는 항원 경험 TIL) 산물이 강화된 보다 균질한 세포 집단을 포함하는 세포 산물의 제조를 가능하게 하는 방법이 바람직하다.
추가적으로, 현재의 세포 요법은 그의 복잡한 특성 및 종종 환자가 장기간 동안 주요 의료 기관 또는 그 근처에 있도록 하는 관련 독성 관리로 인해 비용이 많이 든다. 다량의 세포 치료제의 제조 또한 복잡하고 많은 시간이 소모된다. 현재 대략 3주인, 환자 세포의 추출에서부터 자가 세포 요법의 조작된 버전의 재주입까지의 시간 (소위 "정맥-대-정맥" 시간)을 줄이기 위해 많은 노력이 이루어지고 있다. 동종이계 또는 "기성품" 조작된 T 세포가 이러한 요법 지연을 피하고 이러한 개별화된 세포 요법과 연관된 비용을 피하기 위해 연구되고 있다. 현재 세포 요법의 지속성 결여는 또한 대용량의 조작된 세포를 필요로 하여 비용을 더욱 증가시키며 정맥 대 정맥 시간을 추가로 지연시킨다. 입증된 치료적 유용성과 가능성에도 불구하고, 세포 요법의 비용은 제한된 자원의 의료 시스템에 상당한 부담을 주며 결과적으로 도움이 필요한 환자에 대한 광범위한 가용성을 제한하는 효과를 가질 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법은 이러한 많은 문제를 다루고 있다.
CD122는 중간 및 고 친화성 IL2 수용체 복합체의 성분이다. 문헌 [Sockolosky, et al. (Science (2018) 359: 1037-1042)] 및 2018년 8월 16일에 공개된 미국 특허 출원 공보 US2018/0228841A1 (Garcia, et al.)에는 직교 수용체, 특히 직교 CD122를 발현하도록 조작된 세포의 선택적 자극을 용이하게 하는 직교 IL2/CD122 리간드/수용체 시스템이 기재되어 있다. 본 특허 출원은 WO 2019/104092 및 US 2018-0228842 A1의 개시내용 전체를 참조로 포함한다. 직교 CD122를 발현하는 조작된 T 세포와 이러한 직교 CD122에 대한 상응하는 직교 리간드 동족체 ("IL2 오르토로그")의 접촉은 직교 CD122를 발현하는 조작된 T 세포의 특이적 활성화를 촉진한다. 특히, 이러한 직교 IL2 수용체 리간드 복합체는 세포의 혼합 집단, 특히 T 세포의 혼합 집단에서 직교 수용체를 발현하도록 조작된 세포의 선택적 확장을 제공한다.
본 개시내용은 입양 세포 요법의 실시에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 직교 수용체는 직교 CD122이다. 일부 실시양태에서, 직교 수용체는 직교 인간 CD122 (hCD122)이다. 일부 실시양태에서, 직교 수용체는 적어도 하나의 STAT3 결합 모티프를 포함하는 직교 CD122이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 hCD122 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 hCD122 수용체 및 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서 CAR.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 hCD122 수용체를 코딩하는 핵산 서열 및 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 포유류 면역 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체에 대한 동족 리간드인 오르토로그를 제공한다. 일부 실시양태에서, 오르토로그는 IL2 오르토로그이다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 직교 CD122 수용체에 대한 리간드이다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 직교 hCD122 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 막횡단 수용체 단백질에 대한 동족 리간드이다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 위치 H133 및 Y134에서의 아미노산 치환을 포함하는 직교 hCD122 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 막횡단 수용체 단백질에 대한 동족 리간드이다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 위치 H133 및 Y134에서의 아미노산 치환을 포함하는 직교 hCD122에 대한 리간드이다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 아미노산 치환 H133D 및 Y134F를 포함하는 직교 hCD122에 대한 리간드이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 식 1의 hIL2 오르토로그를 포함하는 제약상 허용되는 제형을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 식 1의 hIL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 식 1의 hIL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 식 1의 hIL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터의 제약상 허용되는 제형을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 식 1의 hIL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합적으로 변형된 포유류 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 직교 포유류 면역 세포 (직교 면역 세포)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 직교 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서 T 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 세포독성 CD8+ T 세포, 나이브 CD4+ T 세포, 헬퍼 T 세포, 예를 들어 TH1, TH2, TH9, TH11, TH22, TFH; 조절 T 세포, 예를 들어 TR1, Treg, 유도성 Treg; 기억 T 세포, 예를 들어, 중심 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, NK 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL); 및 CAR-T 세포, 재조합적으로 변형된 TIL 및 TCR 조작된 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 이러한 T-세포의 조작된 변이체로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 Treg 세포를 제공한다. 본 발명은 대상체에서 직교 Treg의 증식 및/또는 활성화를 유발하기에 충분한 직교 리간드의 투여와 조합하여 치료상 유효량의 직교 Treg를 투여함으로써 이러한 대상체에서 면역 억제를 유도하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 직교 Treg는 임의로 표적화 도메인 (예를 들어, 조작된 TCR 또는 CAR)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 직교 Treg는 직교 CAR-Treg (oCAR-Treg)이다. 일부 실시양태에서 oCAR-Treg의 CAR의 ABD는 인간 인자 VIII와 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, oCAR-Treg의 CAR의 ABD는 동종항원과 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, oCAR-Treg의 CAR의 ABD는 HLA-A2와 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, oCAR-Treg는 CD19-oCAR-Treg이다. 직교 Treg는 염증성 질환과 연관된 질환의 치료에 유용하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 NK 세포를 제공한다. 본 발명은 대상체에서 직교 Treg의 증식 및/또는 활성화를 유발하기에 충분한 직교 리간드의 투여와 조합하여 치료상 유효량의 직교 NK (oNK) 세포를 투여함으로써 이러한 대상체에서 신생물성 질환을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, oNK 세포는 임의로 표적화 도메인 (예를 들어, 조작된 TCR 또는 CAR)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 직교 NK 세포는 직교 CAR-NK 세포 (oCAR-NK 세포)이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 CD122 폴리펩티드를 발현하도록 재조합적으로 변형된 포유류 면역 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 hCD122의 세포외 도메인을 포함하는 직교 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 포유류 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 위치 H133 및 Y134에서의 아미노산 치환을 포함하는 CD122의 세포외 도메인을 포함하는 직교 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 포유류 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 위치 H133 및 Y134에서의 아미노산 치환을 포함하는 직교 hCD122를 발현하도록 재조합적으로 변형된 포유류 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 아미노산 치환 H133D 및 Y134F를 포함하는 직교 hCD122를 발현하도록 재조합적으로 변형된 포유류 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체를 발현하는 포유류 세포에서 신호를 유도하기 위한 직교 수용체 및 그의 동족 직교 리간드 (오르토로그)의 사용 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체를 발현하도록 조작된 세포인 포유류 세포에서 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 직교 수용체를 발현하는 조작된 포유류 세포를 유효량의 동족 직교 리간드 (오르토로그)와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 이러한 접촉에 의해 유발되는 반응은 조작된 세포의 활성화, 조작된 세포의 활성화된 상태의 유지 및/또는 조작된 세포의 증식이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체를 발현하도록 조작된 세포인 포유류 세포에서 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 직교 수용체를 발현하는 조작된 포유류 세포를 유효량의 동족 직교 리간드 (오르토로그)와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 이러한 접촉에 의해 유발된 반응은 조작된 세포에서 STAT5 인산화 및/또는 STAT3 인산화의 증가이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체를 발현하도록 조작된 세포인 포유류 면역 세포에서 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 직교 수용체를 발현하는 조작된 포유류 세포를 유효량의 동족 직교 리간드 (오르토로그)와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 접촉은 생체외에서 (시험관내에서) 수행되며 이러한 접촉에 의해 유발되는 반응은 조작된 세포의 활성화, 조작된 세포의 활성화된 상태의 유지 및/또는 조작된 세포의 증식 유발이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 대상체로부터 면역 세포의 혼합 집단을 단리하는 단계; (b) 상기 단리된 면역 세포의 집단의 소정의 분율을, 형질감염된 세포에서 직교 수용체의 발현에 영향을 미칠 수 있는 재조합 벡터로 형질감염시키는 단계; (c) 직교 수용체를 발현하는 세포가 선택적으로 증식하여 직교 수용체를 발현하는 세포에 대한 세포의 집단을 강화시키도록 직교 수용체의 ECD와 특이적으로 결합하는 직교 리간드의 존재 하에 상기 혼합 면역 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는, 조작된 세포에 대해 실질적으로 강화된 조작된 면역 세포 산물을 제조하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체를 발현하도록 조작된 세포인 포유류 면역 세포에서 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 직교 수용체를 발현하는 조작된 포유류 세포를 유효량의 동족 직교 리간드 (오르토로그)와 접촉시키는 것을 포함하며, 이러한 접촉에 의해 유발되는 반응은 조작된 세포의 활성화, 조작된 세포의 활성화된 상태의 유지 및/또는 조작된 세포의 증식이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체를 발현하는 포유류 세포에서 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 생체외에서 (시험관내에서) 직교 수용체를 발현하는 포유류 세포를, 반응을 유발하기에 충분한 양의 동족 직교 리간드 (오르토로그)와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체를 발현하는 포유류 세포에서 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 생체내에서 직교 수용체를 발현하는 포유류 세포를, 반응을 유발시키기에 충분한 양의 동족 오르토로그 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 생체외 제1 오르토로그 (즉, 동족 리간드) 및 생체내 제2 오르토로그의 사용을 포함하는 사용 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 생체외 제1 오르토로그 및 생체내 제2 오르토로그의 사용을 포함하는 사용 방법을 제공하며, 여기서 제1 오르토로그 및 제2 오르토로그는 동일한 오르토로그 또는 상이한 오르토로그이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체를 발현하는 포유류 세포의 증식을 유발하기 위한 오르토로그의 사용 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체를 발현하는 포유류 세포의 활성화를 유발하기 위한 오르토로그의 사용 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체를 발현하는 포유류 세포의 증식을 유발하기 위한 생체외 및/또는 생체내 오르토로그의 사용 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 CD122를 발현하는 포유류 세포의 증식을 유발하기 위한 IL2 오르토로그의 사용 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 CD122를 발현하는 포유류 세포의 활성화를 유발시키기 위한 IL2 오르토로그의 사용 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 위치 H133 및 Y134에서의 아미노산 치환을 포함하는 CD122의 세포외 도메인을 포함하는 직교 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 포유류 세포의 활성화를 유발시키기 위한 오르토로그의 사용 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 위치 H133 및 Y134에서의 아미노산 치환을 포함하는 직교 CD122를 발현하도록 재조합적으로 변형된 포유류 세포의 활성화를 유발시키기 위한 오르토로그의 사용 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 아미노산 치환 H133D 및 Y134F를 포함하는 직교 CD122를 발현하도록 재조합적으로 변형된 포유류 세포의 활성화를 유발시키기 위한 오르토로그의 사용 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 포유류 세포에 대해 강화된 세포의 집단의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 포유류 세포에 대해 강화된 포유류 세포의 집단을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 수용체에 대한 동족 리간드인 오르토로그의 사용을 제공한다. 일부 실시양태에서, 오르토로그는 식 1의 오르토로그이다. 일부 실시양태에서, 오르토로그는 STK-007이다. 일부 실시양태에서 오르토로그는 STK-009이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 비-조작된 중간 친화성 (CD122/CD132) IL2 수용체 복합체 또는 고 친화성 (CD25/CD122/CD132) IL2 수용체 복합체에 대해 감소된 친화성을 나타내는 IL2 오르토로그를 제공하며, 이러한 IL2 오르토로그는 또한 CD25를 구성적으로 발현하는 세포 (예를 들어, Treg) 또는 CD25를 유도적으로 발현하는 세포 (예를 들어, 활성화된 CD8+ T 세포)에 대해 오르토로그 IL2의 활성을 선택적으로 편향시키는데 유용하다. 천연 야생형 CD122의 세포외 도메인 (ECD)에 대한 상당히 감소된 친화성을 가지지만 CD25의 ECD에 대한 결합은 유지하는 IL2 오르토로그는 또한 고 친화성 IL2 수용체 복합체 형성을 방해함으로써 야생형 IL2의 경쟁적 길항제로서 사용될 수 있으며, 결과적으로 자가면역 질환 또는 이식편 대 숙주 (GVH) 질환의 치료에 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 변형된 CD122 폴리펩티드 (직교 CD122)를 포함하는 막횡단 폴리펩티드의 세포외 도메인 (ECD)과 특이적으로 및 선택적으로 결합하는 IL2 오르토로그를 제공한다. 직교 CD122에 대한 IL2 오르토로그의 결합은 중간 또는 고 친화성 IL2 수용체와 결합하지만 직교 CD122를 발현하는 조작된 세포에 대한 선택성을 나타내는 IL2와 연관된 천연 세포내 신호전달 패턴의 활성화를 초래하는 세포내 신호전달의 형질도입 경로에 참여한다. IL2 오르토로그는 단독으로 또는 CD122가 내인성 고 친화성 또는 중간 친화성 IL2 수용체의 형태로 존재할 때, CD122 직교 수용체에 대한 IL2 오르토로그의 결합에 비해 야생형 CD122의 세포외 도메인에 대한 상당히 감소된 결합을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122의 세포외 도메인에 대한 IL2 오르토로그의 친화도는 야생형 CD122에 대한 야생형 IL2의 친화도에 필적한다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122의 세포외 도메인에 대한 IL2 오르토로그의 친화도는 야생형 CD122의 세포외 도메인에 대한 야생형 IL2의 친화도보다 더 크다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122의 세포외 도메인에 대한 IL2 오르토로그의 친화도는 야생형 CD122의 세포외 도메인에 대한 야생형 IL2의 친화도보다 더 낮다.
본 개시내용은 본 발명의 IL2 오르토로그를 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 특히, 본 개시내용은 숙주 세포에서 IL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열의 발현을 제공하기 위해 제어 요소에 작동가능하게 연결된 IL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 직교 수용체를 발현하는 조작된 포유류 세포를 추가로 제공한다. 본 발명은 직교 수용체를 발현하는 조작된 포유류 세포의 제약상 허용되는 제형을 제공한다.
본 개시내용은 조작된 세포 요법 산물의 제약상 허용되는 투여 형태를 생성하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 투여 형태는 T 세포의 집단을 포함하고, 여기서 T 세포의 집단은 조작된 T 세포의 하나 이상의 종이 실질적으로 풍부하고, 조작된 T 세포는 CD122 직교 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 수용체를 발현하는 것이고, 상기 방법은 본 발명의 IL2 오르토로그의 존재 하에 생체외에서 CD122 직교 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 수용체를 발현하는 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을, 하나 이상의 이러한 조작된 T 세포에서 세포 집단을 강화시키기에 충분한 기간 동안 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 포유류 세포로부터의 IL2 오르토로그의 발현 및 분비를 용이하게 하기 위해 제어 요소에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 IL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를, IL2 오르토로그의 계내 발현을 제공하기 위해 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 재조합 벡터는 암을 앓고 있는 대상체에게 종양내 투여된다. 일부 실시양태에서, 재조합 벡터는 재조합 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서 재조합 바이러스 벡터는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 또는 재조합 아데노바이러스 (rAd), 예를 들어 일부 실시양태에서, 인간 아데노바이러스 혈청형 3 및/또는 5로부터 유래된 복제 결핍 아데노바이러스이다. 일부 실시양태에서, 복제 결핍 아데노바이러스는 세포 주기 및/또는 아폽토시스 경로를 개시할 수 있는 바이러스의 능력을 방해하는 E1 영역에 대한 하나 이상의 변형을 갖는다. 복제 결핍 아데노바이러스 벡터는 임의로 E3 도메인에서의 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 아데노바이러스는 복제 적격 아데노바이러스이다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스는 신생물 세포에서 선택적으로 복제하도록 조작된 복제 적격 재조합 바이러스이다.
본 개시내용은 막횡단 수용체 단백질을 발현하는 조작된 T 세포의 적어도 하나 (대안적으로 2개, 3개, 4개 또는 그 초과)의 종을 포함하는 세포 요법 산물의 제약상 허용되는 투여 형태를 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 이러한 막횡단 수용체 단백질의 세포외 도메인은 CD122 직교 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하고, 여기서 세포 요법 산물 내의 조작된 세포의 분율은 세포 요법 산물 내의 총 세포 수의 적어도 30%, 대안적으로 적어도 40%, 대안적으로 적어도 50%, 대안적으로 적어도 60%, 대안적으로 적어도 70%, 대안적으로 적어도 80%, 또는 대안적으로 적어도 90%를 차지한다.
일부 실시양태에서, 치료 방법이 제공되며, 이러한 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 세포 집단을 도입하는 단계를 포함하며, 상기 세포 집단은 인간 직교 CD122의 ECD, 막횡단 도메인, 및 세포 막 전역에 걸쳐 있는 폴리펩티드의 ECD에 대한 리간드의 결합에 반응하여 세포내 신호를 제공하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포 막 전역에 걸쳐 있는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 인간 면역 세포를 포함하며, 상기 핵산 서열은 상기 막 전역에 걸쳐 있는 폴리펩티드의 전사 및 번역 및 세포 표면 제시를 용이하게 하기 위해 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된다. 이러한 세포 집단은 생체외에서 변형되고 대상체에 대해 자가 또는 동종이계인 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 방법은 (1) 세포 집단을 직교 CD122 ECD인 세포외 도메인을 포함하는 수용체를 포함하는 상기 조작된 세포를 활성화시키기에 충분한 농도 및 지속 기간 동안 특정 양의 동족 IL2 오르토로그와 생체외에서 접촉시키는 단계; 및 (2) 상기 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계; 및 (3) 조작된 세포의 투여 후 생체내에서 동족 IL2 오르토로그를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 도입된 세포 집단은 조작된 세포의 투여 후, 생체내에서 동족 직교 시토카인과 접촉된다.
본 개시내용은 유효량의 직교 리간드를 대상체에게 투여하는 포유류 대상체에서 생체내 직교 조작된 면역 세포 (예를 들어, 직교 CAR-T 세포)의 활성 형태를 연장 ("지속")하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 유효량의 직교 리간드의 투여와 연계해서 유효량의 직교 면역 세포를 포유류 대상체에게 투여함으로써 포유류 대상체의 생체내에서 직교 면역 세포 (예를 들어, 직교 CAR-T 세포)의 증식을 특이적으로 및 선택적으로 활성화 및/또는 유도하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 직교 CAR-T 세포 상에 발현되는 수용체에 대한 유효량의 동족 직교 리간드의 투여와 조합하여 유효량의 직교 CAR-T 세포를 포유류 대상체에게 투여함으로써 신생물성 질환을 앓고 있는 포유류 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 직교 CAR-T 세포 상에 발현된 수용체에 대한 유효량의 동족 직교 리간드의 투여와 연계해서 유효량의 직교 CAR-T 세포를 포유류 대상체에게 투여함으로써 미만성 (비-고형 종양) 신생물성 질환을 앓고 있는 포유류 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 직교 T 세포 상에 발현된 수용체에 대한 유효량의 동족 직교 리간드의 투여와 연계해서 유효량의 직교 T 세포를 포유류 대상체에게 투여함으로써 고형 종양의 존재를 특징으로 하는 신생물성 질환 (예를 들어, 림프종, 전립선암, 폐암, 방광암, HPV 관련 암, 예컨대 자궁경부암, 신경모세포종)을 앓고 있는 포유류 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 유효량의 직교 리간드를 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 소진된 직교 면역 세포의 활성을 복원시키는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 직교 CAR-T 세포 산물의 투여를 특징으로 하는 치료 레지멘에서 신생물성 질환의 재발을 앓고 있는 포유류 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 이러한 방법은 (i) 이전에 투여된 직교 CAR-T 세포의 활성을 복원시키기에 충분하게 이전에 투여된 직교 CAR-T 세포 상에 발현된 수용체에 대한 유효량의 동족 직교 리간드를 대상체에게 투여하는 단계; (ii) 충분한 기간 동안 직교 CAR-T 세포의 활성을 유지하기 위해 이전에 투여된 직교 CAR-T 세포 상에 발현된 수용체에 대한 유효량의 동족 직교 리간드를 대상체에게 주기적으로 투여하는 단계; (iii) 신생물성 질환의 존재에 대해 대상체를 평가하고 신생물성 질환의 증거가 없는 경우, 직교 리간드의 투여를 중단하거나 또는 신생물 세포의 면역 감시에 충분한 양의 직교 CAR-T 세포를 유지하기에 충분한 유지 투여 프로토콜에 따라 주기적으로 직교 리간드 투여를 계속하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 직교 CAR-T 세포의 투여에 이어 신생물 세포의 면역 감시에 충분한 양의 직교 CAR-T 세포를 유지하기에 충분한 유지 투여 프로토콜과 함께 직교 CAR-T 세포 상에 발현된 수용체에 대한 유효량의 동족 직교 리간드를 주기적으로 투여함으로써 CAR-T 세포 요법으로 신생물성 질환의 치료에서 재발을 예방 및/또는 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 직교 CAR-T 세포 산물의 사전 투여를 특징으로 하는 치료 레지멘에서 재발성 또는 불응성 신생물성 질환을 앓고 있는 포유류 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 이러한 방법은 (i) 이전에 투여된 직교 CAR-T 세포의 활성을 복원시키기에 충분할 정도로 이전에 투여된 직교 CAR-T 세포 상에 발현된 수용체에 대한 유효량의 동족 직교 리간드를 대상체에게 투여하는 단계; (ii) 치료 반응에 영향을 미치기에 충분한 기간 동안 직교 CAR-T 세포의 활성을 유지하기 위해 이전에 투여된 직교 CAR-T 세포 상에 발현된 수용체에 대한 유효량의 동족 직교 리간드를 대상체에게 주기적으로 투여하는 단계; (iii) 신생물성 질환의 존재에 대해 대상체를 평가하고 신생물성 질환의 증거가 없는 경우, 직교 리간드의 투여를 중단하거나 또는 신생물 세포의 면역 감시에 충분한 양의 직교 CAR-T 세포를 유지하기에 충분한 유지 투여 프로토콜에 따라 주기적으로 직교 리간드의 투여를 계속하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 신생물성 질환을 앓고 있는 포유류 대상체를 직교 hCD122 세포 및 이에 대한 직교 hIL2 리간드로 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 이러한 방법은 (i) 직교 hCD122 세포의 투여 전 2주 내지 1일의 기간 내에, 직교 CAR-T 상에 발현되는 수용체에 대한 직교 리간드의 치료상 유효 용량을 대상체에게 투여하는 단계 (즉, 프라이밍); (ii) 직교 hCD122 세포의 직교 CD122 수용체에 대한 동족 hIL2 리간드인 직교 리간드와 조합하여 치료상 유효량의 직교 hCD122 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계, 및 임의로 (iii) 신생물성 질환의 존재에 대해 대상체를 평가하고 신생물성 질환의 증거가 없는 경우, 직교 리간드의 투여를 중단하거나 또는 신생물 세포의 면역 감시를 유지하기에 충분한 수준의 순환 직교 CAR-T 세포를 유지하기에 충분한 용량으로 직교 리간드를 후속 투여하는 것을 계속하고, 임의로 재발 시에는, 이전에 투여된 직교 hCD122 세포의 직교 CD122 수용체에 대한 동족 hIL2 리간드인 직교 리간드의 치료상 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 바이러스에 의해 감염된 세포의 표면 상에 발현된 항원에 특이적인 표적화 도메인을 포함하는 직교 세포의 투여에 의해 만성 바이러스성 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 조성물 및 방법으로 치료할 수 있는 만성 바이러스성 감염의 예는 시토메갈로바이러스 (CMV), HTLV1, 단순 헤르페스 바이러스 유형 2 (HSV-2), 엡스타인-바 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6, 인간 헤르페스 바이러스 7, C형 간염 바이러스 (HCV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV1 및 HIV2)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 체크포인트 발현을 제거하도록 (즉, "체크포인트 녹아웃") 게놈적으로 변형된다. 이러한 체크포인트 녹아웃 세포의 예는 PD1 녹아웃 ("PD1KO") T 세포를 포함한다. PD1KO T 세포를 생성하기 위한 전략은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. PD1KO T 세포는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 문헌 [McGowan, et al. (121PD1 disrupted Car-T Cells In The Treatment of Solid Tumors: Promises and Challenges) Biomedicine and Pharmacotherapy Biomedicine & Pharmacotherapy, Volume 121 (2020, available online 13 NOV 2019) 109625, https://doi.org/10.1016/j.biopha.2019.109625)]은 다양한 임상 적용에서 연구되고 있는 조작된 및 단리된 PD1KO T 세포에 대한 광범위한 검토를 제공한다 (표 1 참조).
직교 면역 세포에서 PD1 기능을 완전히 제거하는 것에 대한 대안으로서, 일부 실시양태에서 본 개시내용의 직교 면역 세포는 직교 면역 세포에서 PD1 활성의 하향조절을 위한 메커니즘을 제공한다. 종양 세포 및 만성적으로 바이러스에 의해 감염된 세포 상에서의 PDL1의 발현은 이러한 세포가 인간 면역 세포 상에서 발현된 PD1과 결합함으로써 면역 감시를 피할 수 있게 한다. 여러 그룹이 PD1 발현을 녹아웃시키는 조작된 T 세포가 효과적이라는 것을 입증하였지만, PD1/PDL1 상호작용의 자기 내성 메커니즘에 의해 전형적으로 매개되는 상당한 표적 독성을 가질 수 있기 때문에 이들 세포는 무차별적이고 상당한 독성을 유발한다. 일부 실시양태에서, 하향조절은 특이적 표적화/활성화 도메인을 발현하도록 조작된 세포, 예컨대 CAR (예를 들어, oCAR-T 세포, oCAR NK 세포, oTCR 조작된 T 세포) 또는 내인성 결합 도메인을 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 오르토 TIL)의 경우 조작된 그의 표적에 대한 면역 세포의 결합에 의해 개시되는 신호전달에 반응하여 조건부이다. 면역 세포의 결합에 의해 상향조절된 인자는 직교 면역 세포에서 PD1 발현 제어 서열을 선택적으로 하향조절 하기 위해 이용될 수 있으며, 이로써 일단 직교 세포가 그의 적절한 표적과 상호작용하는 경우에만 PD1 발현이 하향-조절된다. 일부 실시양태에서, 도메인은 표적 항원에 대한 CAR의 결합이 표적 도메인과 표적의 상호작용 후 PD1 발현을 억제하는 세포내 신호전달을 초래하도록 CAR ICD로 조작될 수 있으며, 이에 의해 활성화된 직교 면역 세포가 하향조절을 회피할 수 있게 되고 PD1과 PDL1 발현 세포, 예를 들어, 만성적으로 바이러스에 의해 감염된 또는 종양 세포의 상호 작용에 의해 유발된 잠재적인 면역 회피를 가능하게 한다. 전술한 것에 더하여, 본 개시내용의 직교 면역 세포 내로 혼입될 수 있는 조작된 면역 세포의 PDL1 면역조정을 완화시키기 위한 다른 메커니즘은, 예를 들어, 2020년 12월 31일에 공개된 미국 특허 출원 공보 US2020/0407694A1 (Busser, et al.), 2018년 11월 15일에 공개된 미국 특허 출원 공보 US20180327470A1 (Li, et al.)를 참조한다.
이전에 논의된 바와 같이, 현재의 세포 요법의 중요한 문제는 일단 환자에게 투여된 후 전달된 세포의 증식을 지원하는 비독성 수단이 결여된다는 것이다.
본 개시내용은 인간 직교 세포를 제공하며, 이러한 세포는 포유류 면역 세포가 직교 hCD122 수용체를 발현하도록 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 직교 hCD122 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 포유류 면역 세포이다.
본 개시내용은 (a) 포유류 면역 세포가 직교 hCD122 수용체를 발현하도록 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 직교 hCD122 수용체를 코딩하는 핵산 서열, 및 (b) 포유류 면역 세포가 CAR을 발현하도록 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 포유류 면역 세포를 제공한다.
본 개시내용은 (a) 포유류 면역 세포가 직교 hCD122 수용체를 발현하도록 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 직교 hCD122 수용체를 코딩하는 핵산 서열, 및 (b) 포유류 면역 세포가 CAR을 발현하도록 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 직교 CD122 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 포유류 면역 세포의 투여에 의해 신생물성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 포유류 면역 세포가 직교 hCD122 수용체를 발현하도록 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 직교 hCD122 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 포유류 면역 세포의 투여 및 hCD122 수용체의 ECD와 결합하여 세포내 신호전달을 초래하는 직교 리간드의 투여를 포함하는, 인간 대상체에서 신생물성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 포유류 면역 세포의 투여 전에 투여된다.
본 발명은 현재의 세포 요법에 있어 중요한 문제는 일단 환자에게 투여되면, 전달된 세포의 증식을 지원하는 비-독성 수단이 결여된다는 것을 제공한다.
본 개시내용은 인간 직교 세포를 제공하며, 이러한 세포는 포유류 면역 세포가 직교 hCD122 수용체를 발현하도록 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 직교 hCD122 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 포유류 면역 세포이다.
본 개시내용은 (a) 포유류 면역 세포가 직교 hCD122 수용체를 발현하도록 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 직교 hCD122 수용체를 코딩하는 핵산 서열, 및 (b) 포유류 면역 세포가 CAR을 발현하도록 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 포유류 면역 세포를 제공한다.
본 개시내용은 (a) 포유류 면역 세포가 직교 hCD122 수용체를 발현하도록 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 직교 hCD122 수용체를 코딩하는 핵산 서열, 및 (b) 포유류 면역 세포가 CAR을 발현하도록 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 직교 CD122 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 포유류 면역 세포의 투여에 의해 신생물성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 포유류 면역 세포가 직교 hCD122 수용체를 발현하도록 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 직교 hCD122 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 포유류 면역 세포의 투여 및 hCD122 수용체의 ECD와 결합하여 세포내 신호전달을 초래하는 직교 리간드의 투여를 포함하는, 인간 대상체에서 신생물성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 포유류 면역 세포의 투여 전에 투여된다.
일부 실시양태에서, 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유류 대상체에서 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 대상체로부터 소정량의 면역 세포를 단리하는 단계;
(b) 단리된 면역 세포에 의한 핵산 서열의 흡수를 위한 조건 하에 상기 단리된 양의 단리된 면역 세포를 상기 핵산 서열과 접촉시키는 단계로서, 상기 핵산 서열은 막횡단 수용체를 코딩하고, 상기 막횡단 수용체는 세포외 도메인과 작동가능하게 소통하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 수용체의 상기 세포외 도메인은 직교 hCD122의 ECD 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 것인 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 단리된 양의 세포를 단계 (b)의 접촉에 의해 형질도입된 세포의 증식을 유도하기에 충분한 양의 직교 리간드와 생체외에서 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉은 형질도입된 세포가 집단의 세포의 적어도 20%를 차지하도록 하는 기간 동안 적용되는 것인 단계;
(d) 치료상 유효 용량의 직교 리간드의 투여와 조합하여 단계 (c)로부터 생산된 세포 집단의 세포의 치료상 유효량을 포유류 대상체에게 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 집단은 골수 세포, 림프구, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 종양 침윤 림프구 (TIL), T 세포, CD8+ T 세포, CD25+CD8+ T 세포, CAR-T 세포, NK 세포, CD4+ T 세포 및 Treg로 이루어진 군으로부터 선택된 종 인간 면역 세포 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단계 (a) 후에 그러나 단계 (b) 전에, 세포의 집단은 활성화된 면역 세포 또는 항원 경험 T 세포에 대해 상기 집단을 강화시키기 위해 생체외에서 조작된다.
일부 실시양태에서, 직교 hCD122 또는 그의 기능적 단편은 야생형 hCD122에 따라 넘버링된 위치 133 및/또는 134에서의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단계 (b)의 접촉은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열의 흡수를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 핵산 서열 및 수용체를 코딩하는 핵산 서열은 별도의 벡터 상에 제공되며, 각각의 핵산 서열은 포유류 면역 세포에서 작동가능한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 핵산 서열 및 수용체를 코딩하는 핵산 서열은 단일 벡터 상에 제공된다.
일부 실시양태에서, 핵산 서열은 동일한 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 벡터는 T2A 코딩 서열의 IRES 요소에 의해 분리된 2개의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.
일부 실시양태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다.
일부 실시양태에서, 단계 (b)에서 생체외에서 이용된 직교 리간드는 단계 (c)에서 생체내에서 사용된 직교 리간드와 상이하다.
일부 실시양태에서, 단계 (d) 이전에 대상체는 림프고갈 레지멘으로 치료받는다.
일부 실시양태에서, 단계 (d)에서 투여되는 초기 용량은 대상체의 체중 kg당 100,000 내지 1,000,000개의 활성화 면역 세포이다.
일부 실시양태에서, 직교 리간드의 투여는 대상체의 체중 kg당 100,000 내지 1,000,000개의 활성화 면역 세포의 수준을 적어도 2주의 기간 동안 유지하기 위해 대상체에게 주기적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 직교 리간드는 잔류 종양의 실질적인 징후가 없는 지점까지 투여되며, 이때 직교 리간드의 용량은 관찰 후 적어도 3개월의 기간 동안 체중 kg당 대략 10,000 내지 100,000개의 세포의 낮은 순환 수준의 직교 면역 세포를 유지하기에 충분한 수준으로 감소된다.
일부 실시양태에서, 직교 리간드는 잔류 종양의 실질적인 징후가 없는 지점까지 투여되며, 이때 직교 리간드의 투여가 종료된다.
일부 실시양태에서, 환자가 면역 세포 요법의 초기 과정으로부터 재발하는 경우, 상기 방법은 부가의 용량의 직교 조작된 세포의 부재 하에 직교 리간드의 치료상 유효량을 재발 중 환자에게 투여하여 직교 리간드가 이전에 투여된 직교 세포의 활성화 및/또는 증식을 유도하도록 하는 단계로서, 상기 직교 리간드는 재발된 종양의 완화가 관찰될 때까지 소정의 기간 동안 대상체에게 적용되는 것인 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 질환, 장애 또는 병태는 신생물성 질환이다.
일부 실시양태에서, 질환, 장애 또는 병태는 만성 바이러스성 질환이다.
일부 실시양태에서, 질환, 장애 또는 병태는 염증성 질환이다.
또한 하기 단계를 포함하는 프로세스에 의해 수득된 활성화된 직교 면역 세포의 집단에 대해 실질적으로 강화된 세포 산물이 제공된다:
(a) 포유류 대상체로부터 소정량의 면역 세포를 단리하는 단계;
(b) 단리된 면역 세포에 의한 핵산 서열의 흡수를 위한 조건 하에 상기 단리된 양의 단리된 면역 세포를 상기 핵산 서열과 접촉시키는 단계로서, 상기 핵산 서열은 막횡단 수용체를 코딩하고, 상기 막횡단 수용체는 세포외 도메인과 작동가능하게 소통하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 수용체의 상기 세포외 도메인은 직교 hCD122의 ECD 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 것인 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 단리된 양의 세포를 단계 (b)의 접촉에 의해 형질도입된 세포의 증식을 유도하기에 충분한 양의 직교 리간드와 생체외에서 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉은 형질도입된 세포가 집단의 세포의 적어도 20%를 차지하도록 하는 기간 동안 적용되는 것인 단계.
일부 실시양태에서, 세포 산물은 골수 세포, 림프구, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 종양 침윤 림프구 (TIL), T 세포, CD8+ T 세포, CD25+CD8+ T 세포, CAR-T 세포, NK 세포, CD4+ T 세포 및 Treg로 이루어진 군으로부터 선택된 종 인간 면역 세포 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포 산물은 상기 세포의 내인성 TCR 도메인이 결실되도록 추가로 조작된다.
본 발명은 첨부된 도면과 연계해서 판독했을 때 하기의 상세한 설명으로부터 가장 잘 이해된다. 일반적인 관례에 따라 도면의 다양한 특색은 비례하지 않는다는 것이 강조된다. 반면, 다양한 특색의 치수는 명확성을 위해 임의로 확대 또는 축소된다. 하기 도가 본 도면에 포함된다.
첨부된 도면의 도 1은 실시예 6에 기재된 바와 같은 실험으로부터의 293T 형질감염 상등액으로 처리된 NKL 세포에 대한 셀타이터글로(Celltiterglo) 값을 제공한다. 볼드체로 표시된, 각각의 상등액의 표시된 희석액을 받는 NKL 세포의 경우, 중복 셀타이터글로 값이 나란히 열에 표시된다.
첨부된 도면의 도 2는 실시예 6에 기재된 바와 같은 실험으로부터의 293T 형질감염 상등액으로 처리된 NKL hoRB 세포에 대한 셀타이터글로 값을 제공한다. 볼드체로 표시된, 각각의 상등액의 표시된 희석액을 받는 NKL hoRB 세포의 경우, 중복 셀타이터글로 값이 나란히 열에 표시된다.
도 3A-B는 CAR-T 또는 PBS 단독과 비교 시 직교 리간드를 사용한 CAR-T 직교 세포의 치료 효과를 입증하는 하기 실시예 7에 보다 충분히 기재된 바와 같은 파종성 생체내 RAJI 종양 연구의 결과를 제공한다.
도 4A-B는 직교 리간드 단독의 투여 (부가의 세포를 제공할 필요 없음)는 장기간 동안 항원 또는 종양 리간드 노출이 없는 경우에도 CAR T 세포의 항종양 활성을 복원시킬 수 있다는 것을 입증해 주는, 하기 실시예 8에서 보다 자세히 기재된 바와 같은 재시험감염 연구의 결과를 제공한다.
도 5A-B는 실시예 8에 보다 자세히 기재된 피하 RAJI-luc 림프종 재발 마우스 모델에서의 재투여 결과를 제공한다. 이러한 데이터는 STK-009 투여 단독으로도 이전 요법 과정으로부터 재발한 동물에서 CAR-T 세포의 항종양 활성의 효력을 발휘할 수 있음을 입증해준다.
도 6은 직교 리간드 (STK-009)가 직교 CAR-T 세포를 확장할 수 있고 줄기 세포 기억 CAR-T 세포 집단을 유지할 수 있음을 입증해주는, 실시예 8에 보다 자세히 기재된 바와 같은 데이터의 FACS 분석 결과의 히스토그램이다.
도 7A-C는 고형 종양 모델의 생체내 처리에서 직교 리간드와 조합된 직교 CAR-T 세포의 효능을 나타내는, 하기 실시예 11에 보다 자세히 기재된 바와 같은 피하 Raji 고형 종양 모델로부터 생성된 캘리퍼 측정된 데이터를 제공한다.
도 8은 직교 리간드 (STK-009)와 조합된 CD19 직교 CAR-T 세포의 투여가 고형 종양의 치료에 유효하다는 것을 보여주는 본원의 실시예 11에 기재된 바와 같은 실험으로부터 생성된 종양 반응 데이터의 물리적 측정의 그래프 표현을 제공한다.
도 9는 실시예 8에 기재된 바와 같은 피하 고형 종양 모델 연구와 관련된 카플란-마이어 생존 플롯을 제공한다. 제공된 데이터는 직교 리간드 (STK-009)와 조합된 CD19 직교 CAR-T 세포의 투여가 고형 종양의 치료에 유효하며 생존에 상당한 이점을 부여한다는 것을 입증해준다.
도 10은 실시예 8에 기재된 바와 같은 피하 고형 종양 모델 연구의 결론에 따라 희생된 마우스로부터 단리된 조직의 면역조직화학을 제공한다.
도입
본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위하여, 본 명세서 뿐만 아니라 하기에 특정 용어 및 문구를 정의한다. 본원에 제공된 정의는 비-제한적이며 관련 기술분야의 통상의 기술자가 알고 있는 지식의 관점에서 판독되어야 한다.
본 방법 및 조성물을 기재하기에 앞서, 본 개시내용은 기재된 특정한 방법 또는 조성물에 제한되지 않으며, 그 자체로 물론 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 전문 용어는 단지 특정한 실시양태를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 그러한 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 중간 값이 하한 단위의 10분의 1까지 구체적으로 개시되는 것으로 이해된다. 명시된 범위 내의 임의의 명시된 값 또는 중간 값과 그러한 명시된 범위 내의 임의의 다른 명시된 또는 중간 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 발명 내에 포괄된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로, 그 범위에 포함되거나 제외될 수 있으며, 더 작은 범위 내에 둘 중 하나가 포함되거나, 둘 다 포함되지 않거나 또는 둘 다가 포함되는 각각의 범위 또한 본 발명 내에 포괄되며, 명시된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 제한에 따른다. 명시된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 제한 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 방법과 동등하거나 유사한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 일부 잠재적 및 바람직한 방법 및 재료가 하기에 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 그 간행물이 인용되는 것과 연계해서 상기 방법 및/또는 재료를 개시하고 설명하기 위해 본원에 참조로 포함된다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상물을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "세포"에 대한 언급은 복수개의 이러한 세포를 포함하고 "펩티드"에 대한 언급은 하나 이상의 펩티드 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 그의 등가물, 예를 들어 폴리펩티드에 대한 언급 등을 포함한다.
본원에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 그 개시내용을 위해서만 제공된다. 본원의 어떠한 것도, 본 발명이 선행 발명에 의해서 그러한 간행물에 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 추가로, 제공된 발행일은 실제 발행일과 상이할 수 있으므로 별도로 확인해야 할 필요가 있을 수 있다.
본원에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 그 개시내용을 위해서만 제공된다. 본원의 어떠한 것도, 본 발명이 선행 발명에 의해서 그러한 간행물에 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 추가로, 제공된 발행일은 실제 발행일과 상이할 수 있으므로 별도로 확인해야 할 필요가 있을 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 하기 약어가 본원에 사용된다: 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 도 (℃)이고, 압력은 대기압 또는 그 부근이다. 하기를 포함한 표준 약어가 사용된다: bp = 염기쌍(들); kb = 킬로염기(들); pl = 피코리터(들); s 또는 sec = 초(들); min = 분(들); h 또는 hr = 시간(들); AA 또는 aa = 아미노산(들); kb = 킬로염기(들); nt = 뉴클레오티드(들); pg = 피코그램; ng = 나노그램; μg = 마이크로그램; mg = 밀리그램; g = 그램; kg = 킬로그램; dl 또는 dL = 데시리터; μl 또는 μL = 마이크로리터; ml 또는 mL = 밀리리터; l 또는 L = 리터; μM = 마이크로몰; mM = 밀리몰; M = 몰; kDa = 킬로달톤; i.m. = 근육내(로); i.p. = 복강내(로); SC 또는 SQ = 피하(로); QD = 매일; BID = 1일 2회; QW = 매주 1회; QM = 매달 1회; HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피; BW = 체중; U = 단위; ns = 통계적으로 유의미하지 않음; PBS = 인산염 완충 식염수; PCR = 폴리머라제 연쇄 반응; HSA = 인간 혈청 알부민; MSA = 마우스 혈청 알부민; DMEM = 둘베코 변형 이글 배지; EDTA = 에틸렌디아민테트라아세트산.
본 개시내용 전반에 걸쳐 단일 문자 또는 3 문자 코드에 따라 아미노산에 대한 언급이 이루어진다는 것이 이해될 것이다. 판독자의 편의를 위해, 단일 및 3 문자 아미노산 코드가 하기 표 1에 제공된다:
Figure pct00001
분자 생물학의 표준 방법은 과학 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 박테리아 세포에서의 클로닝 및 DNA 돌연변이유발 (Vol. 1), 포유류 세포 및 효모에서의 클로닝 (Vol. 2), 당접합체 및 단백질 발현 (Vol. 3) 및 생물정보학 (Vol. 4)에 대해 기재하는 문헌 [Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; and Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y.] 참조). 과학 문헌에는 면역침전, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 및 결정화를 포함한 단백질 정제 방법 뿐만 아니라 화학적 분석, 화학적 변형, 번역 후 변형, 융합 단백질의 생산, 및 단백질의 글리코실화 방법이 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vols. 1-2, John Wiley and Sons, Inc., NY] 참조).
B. 정의
달리 명시되지 않는 한, 하기 용어는 하기에 제시된 의미를 갖는 것으로 의도된다. 다른 용어는 본 명세서 전반에 걸쳐 다른 곳에서 정의된다.
활성화시키다: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "활성화시키다"는 리간드의 결합에 반응하는 수용체에 대한 효능제 리간드의 결합으로 인해 발생하는, 다성분 신호전달 캐스케이드에 참여하는 것에 의해 및/또는 직접적으로 생물학적 효과를 반영하는 수용체 또는 수용체 복합체와 관련하여 사용된다. 예를 들어, IL2 효능제 (IL2 효능제 리간드)가 IL2 수용체와 결합하는 것은 수용체의 신호전달을 "활성화시켜" 하나 이상의 세포내 생물학적 효과 (예를 들어, STAT5의 인산화)를 초래한다고 한다.
활성: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "활성"은 시험 시스템 (예를 들어, 검정) 또는 생물학적 또는 화학적 특성 (예를 들어, 분자의 또 다른 분자에 대한 결합 정도) 또는 물질 또는 세포의 물리적 특성 (예를 들어, 세포 막 전위의 변형)과 관련하여 분자의 특성을 설명하기 위해 분자에 대해 사용된다. 이러한 생물학적 기능의 예는 생물학적 작용제의 촉매 활성, 세포내 신호전달을 자극할 수 있는 능력, 유전자 발현, 세포 증식, 면역학적 활성, 예컨대 염증 반응을 조정할 수 있는 능력을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "활성"은 전형적으로 시험된 작용제 단위당 생물학적 활성의 수준, 예컨대 [촉매 활성]/[mg 단백질], [면역학적 활성]/[mg 단백질], 활성의 국제 단위 (IU), [STAT5 인산화]/[mg 단백질], [T-세포 증식]/[mg 단백질], 플라크 형성 단위 (pfu) 등으로서 표현된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "증식 활성"은 신생물성 질환, 염증성 질환, 섬유증, 이형성증, 세포 형질전환, 전이 및 혈관신생에서 관찰되는 바와 같이 조절 장애 세포 분열을 포함한 세포 증식 및 복제를 촉진하는 활성을 지칭한다.
투여하다/투여: 용어 "투여" 및 "투여하다"는 대상체의 시험관내, 생체내 또는 생체외 세포, 조직, 장기 또는 생물학적 유체를 작용제 (예를 들어, 오르토로그, IL2 오르토로그, 직교 수용체를 발현하는 조작된 세포, 직교 IL2 수용체를 발현하는 조작된 세포 (예를 들어, 직교 IL2 수용체를 발현하는 CAR-T 세포), 화학요법제, 항체), 또는 전술한 것 중 하나 이상을 포함하는 제약 제형과 접촉시키는 것을 포함한, 대상체의 접촉 행위를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 작용제의 투여는 국소 투여, 혈관내 주사 (정맥내 또는 동맥내 주입 포함), 피내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 두개내 주사, 종양내 주사, 경피, 경점막, 이온영동 전달, 림프내 주사, 위내 주입, 전립선내 주사, 방광내 주입 (예를 들어, 방광), 호흡 (예를 들어, 건조 분말 호흡기를 포함한 호흡 호흡기), 안구내 주사, 복강내 주사, 병변내 주사, 난소내 주사, 뇌내 주입 또는 주사, 뇌실내 주사 (ICVI) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에서 인정된 다양한 방법 중 임의의 것을 통해 달성될 수 있다. 용어 "투여"는 세포, 조직 또는 장기에 대한 작용제의 접촉 뿐만 아니라 세포, 조직 또는 장기와 접촉하고 있는 유체에 대한 작용제의 접촉을 포함한다.
유해 사례: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유해 사례"는 대상체에서 치료제 또는 예방제의 사용과 연관된 임의의 바람직하지 않은 경험을 지칭한다. 유해 사례가 반드시 치료제 또는 예방제 (예를 들어, IL2 오르토로그)의 투여로 인해 발생할 필요는 없지만, 관련 없는 상황에서 발생할 수 있다. 유해 사례는 전형적으로 경증, 중등도 또는 중증으로서 분류된다. 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 사용된 바와 같은 유래 사례의 분류는 미국 보건복지부, 국립보건원 국립암연구소에 의해 2017년 11월 27일자로 공개된 유해 사례에 대한 공통 전문 용어 기준 v5.0 (CTCAE)을 따른다.
친화도: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "친화도"는 제2 분자 (예를 들어, 수용체)에 대한 제1 분자 (예를 들어, 리간드)의 특이적 결합 정도를 지칭하며, 분자와 그의 표적 간의 해리 상수 (Koff)와 분자와 그의 표적 간의 연합 상수 (Kon)의 비인 Kd로서 표현된 결합 동역학에 의해 측정된다.
효능제: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "효능제"는 제2 작용제 ("표적")와 특이적으로 결합하고 표적과 상호작용하여 표적의 활성화에 있어서의 증가를 야기하거나 촉진하는 제1 작용제를 지칭한다. 일부 경우에, 효능제는 세포 활성화를 조정하거나, 활성화를 증진시키거나, 제2 작용제에 의한 활성화에 대해 세포를 감작시키거나, 또는 하나 이상의 유전자, 단백질, 리간드, 수용체, 세포 증식을 초래할 수 있는 생물학적 경로 또는 세포 주기 정지 또는 세포 사멸, 예컨대 아폽토시스를 초래하는 경로의 발현을 상향-조절하는 수용체 단백질의 활성화제이다. 일부 실시양태에서, 효능제는 수용체와 결합하고 수용체 상태를 변경시켜, 생물학적 반응을 초래하는 작용제이다. 이러한 반응은 수용체의 내인성 활성인자의 효과를 모방한다. 용어 "효능제"는 부분 효능제, 완전 효능제 및 초효능제를 포함한다. 효능제는 연구 중인 수용체 또는 부분 효능제에 의해 유도된 실질적으로 완전한 생물학적 반응 (즉, 자연적으로 발생하는 리간드/수용체 결합 상호작용과 연관된 반응)을 유도하는 경우 "완전 효능제"로서 기재될 수 있다. 효능제와 대조적으로, 길항제는 수용체와 특이적으로 결합할 수 있지만 수용체에 의해 전형적으로 시작되는 신호 캐스케이드를 초래하지 않으며 그 수용체에서 효능제의 작용을 변형시킬 수 있다. 역효능제는 효능제와 반대 방향의 약리학적 반응을 초래하는 작용제이다. "초효능제"는 표적 수용체에 대한 내인성 효능제보다 더 큰 최대 반응을 초래할 수 있는 효능제의 유형이며, 따라서 100% 초과의 천연 리간드의 활성을 갖는다. 초효능제는 전형적으로, 필적하는 검정에서 유사한 농도로 평가될 때 자연적으로 발생하는 형태의 분자의 평가가능한 정량적 또는 정성적 파라미터에서 반응의 110% 초과, 대안적으로 120% 초과, 대안적으로 130% 초과, 대안적으로 140% 초과, 대안적으로 150% 초과, 대안적으로 160% 초과, 또는 대안적으로 170% 초과를 나타내는 합성 분자이다. 완전 효능제와 연관된 생물학적 효과는 부분 효능제 또는 초효능제의 생물학적 효과와 정도 및/또는 종류에 있어서 상이할 수 있다는 점에 유의해야 한다.
길항제: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "길항제" 또는 "억제제"는 효능제의 작용(들)에 반대하는 분자를 지칭한다. 길항제는 효능제의 활성을 예방, 감소, 억제 또는 중화시키고, 길항제는 또한 확인된 효능제가 없는 경우에도 표적, 예를 들어 표적 수용체의 구성적 활성을 예방, 억제 또는 감소시킬 수 있다. 억제제는 예를 들어, 유전자, 단백질, 리간드, 수용체, 면역 체크포인트 경로를 포함한 생물학적 경로 또는 세포를 감소, 차단, 예방, 활성화 지연, 불활성화, 탈감작화 또는 하향 조절하는 분자이다.
항체: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 종합적으로: (a) 표적 분자와 특이적으로 결합하는 글리코실화 및 비-글리코실화 이뮤노글로불린 (포유류 이뮤노글로불린 클래스 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4를 포함하나 이에 제한되지는 않음) 및 (b) 표적 분자와 결합하기 위해 유래된 이뮤노글로불린과 경쟁하는 IgG(1-4)델타CH2, F(ab')2, Fab, ScFv, VH, VL, 테트라바디, 트리바디, 디아바디, dsFv, F(ab')3, scFv-Fc 및 (scFv)2를 포함하나 이에 제한되지는 않는 이뮤노글로불린 유도체를 지칭한다. 용어 항체는 임의의 특정한 포유류 종으로부터 유래된 이뮤노글로불린으로 제한되지 않으며 뮤린, 인간, 말, 낙타과, 항체, 인간 항체를 포함한다. 용어 항체는 전형적으로 낙타과 (낙타, 라마 및 알파카 포함)의 면역화로부터 수득된 바와 같은 소위 "중쇄 항체" 또는 "VHH" 또는 "나노바디스(Nanobodies)®"를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman, et al. (1993) Nature 363:446-448] 참조). 주어진 특이성을 갖는 항체는 또한 상어를 포함하나 이에 제한되지는 않는 연골 어류의 면역화로부터 수득된 VHH와 같은 비-포유류 공급원으로부터 유래될 수 있다. 용어 "항체"는 항원으로 면역화한 후 자연 공급원 또는 동물로부터 단리가능한 항체 뿐만 아니라 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, CDR 이식, 베니어화 또는 탈면역화 (예를 들어, T-세포 에피토프 제거) 항체를 포함한 조작된 항체를 포괄한다. 용어 "인간 항체"는 인간으로부터 수득된 항체 뿐만 아니라 인간 이뮤노글로불린 유전자를 포함하는 트랜스제닉 포유류로부터 수득 항체를 포함하여, 항원으로 자극하면 트랜스제닉 동물이 인간에 의해 생산된 항체의 특징적인 아미노산 서열을 포함하는 항체를 생산한다. 용어 항체는 모 항체와 및 그의 유도체, 예컨대 친화성 성숙된, 베니어화, CDR 이식, 인간화, 낙타화 (VHH의 경우), 또는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드에서 항체의 결합 도메인 (예를 들어 CDR)을 포함하는 결합 분자를 모두 포함한다. 용어 "항체"는 임의의 특정한 합성 수단으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며 자연 공급원으로부터 단리가능한 자연적으로 발생하는 항체 및 또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉인 트랜스제닉 동물로부터 단리된 항체 또는 그로부터 제조된 하이브리도마, 항체의 발현을 초래하는 핵산 구축물로 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 파지 디스플레이 라이브러리를 포함한 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체를 포함한, "재조합" 수단에 의해 제조되는 조작된 항체 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, "항체"는 포유류 이뮤노글로불린이다. 일부 실시양태에서, 항체는 결합 및 이펙터 기능을 제공하는 가변 및 불변 도메인을 포함하는 "완전한 길이의 항체"이다. 대부분의 경우, 완전한 길이의 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 각각의 경쇄는 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용어 "완전한 길이의 항체"는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 통상적인 IgG 이뮤노글로불린 구조를 지칭하는데 사용되며, 각각의 경쇄는 결합 및 이펙터 기능을 제공하는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 용어 항체는 하기에 보다 상세히 기재되는 바와 같이 융합 단백질 (예를 들어, Fc 융합물) 또는 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)에 대한 접합과 같은 작용 지속 기간을 연장하기 위한 변형을 포함하는 항체 접합체를 포함한다.
생물학적 샘플: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "생물학적 샘플" 또는 "샘플"은 대상체로부터 수득된 (또는 유래된) 샘플을 지칭한다. 예로써, 생물학적 샘플은 체액, 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 점액 분비물, 타액, 뇌척수액 (CSF), 기관지 폐포 세척액 (BALF), 눈의 체액 (예를 들어, 유리체액, 방수), 림프액, 림프절 조직, 비장 조직, 골수, 및 이들 조직 중 하나 이상으로부터 유래된 이뮤노글로불린 강화된 분획으로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 IL2 오르토로그의 제약 제형을 포함한 작용제인 하나 이상의 치료제에 반복적으로 노출되는 것과 같은 치유적 치료 레지멘에 노출된 대상체로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, 샘플은 최근 IL2 오르토로그에 노출된 적이 없는 대상체로부터 수득되거나, 또는 IL2 오르토로그의 계획된 투여 또는 IL2 오르토로그를 포함하는 치료 레지멘 이전에 대상체로부터 수득된다.
"CAR" 또는 " 키메라 항원 수용체": 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "키메라 항원 수용체" 및 "CAR"은 서열 내의 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지 배열된 다중 기능적 도메인: (a) 항원 결합 도메인 (ABD)을 포함하고, 임의로 "힌지" 도메인을 포함하는 세포외 도메인 (ECD), (b) 막횡단 도메인 (TD); 및 (c) 하나 이상의 세포질 신호전달 도메인 (CSD)을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용되며, 여기서 전술한 도메인은 하나 이상의 스페이서 도메인에 의해 임의로 연결될 수 있다. CAR은 또한 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 세포의 세포 표면 상의 CAR의 번역 후 프로세싱 및 제시 동안 통상적으로 제거되는 신호 펩티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. CAR은 관련 기술분야에 널리 공지된 원칙에 따라서 제조된다. 예를 들어, 문헌 [2010년 6월 22일에 허여된 미국 특허 번호 7,741,465 B1 (Eshhar, et al.); Sadelain, et al. (2013) Cancer Discovery 3(4):388-398; 2013년 3월 19일에 허여된 미국 특허 번호 8,399,645 (Campana and Imai); Jensen and Riddell (2015) Current Opinions in Immunology 33:9-15; Gross, et al. (1989) PNAS(USA) 86(24):10024-10028; Curran, et al. (2012) J Gene Med 14(6):405-15; 2019년 1월 8일에 허여된 미국 특허 번호 10,174,095 (Brogdon, et al.); Guedan, et al. (2019) Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors Molecular Therapy: Methods & Clinical Development Vol. 12: 145-156]을 참조한다. 명명법 관점에서, 통상적 실시에서 CAR은 "CD19 CAR"이 ABD가 CD19와 특이적으로 결합하는 CAR을 지칭하고, "BCMA CAR"이 이러한 CAR의 ABD가 BCMA와 특이적으로 결합하는 CAR을 지칭하도록 CAR의 항원 결합 도메인 (ABD)의 표적과 관련하여 지칭된다. 일부 실시양태에서 CAR의 ABD는 ABD가 하나 초과의 표적 항원, 예를 들어 CD19 및 CD20 종양 항원과 특이적으로 결합하도록 2가 (또는 다가)이다. 그러한 경우에, CAR은 통상적으로 그의 ABD의 다가 특성을 나타내는 "CD19/CD20" CAR로서 지칭될 것이다.
CAR-T 세포: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "키메라 항원 수용체 T-세포" 및 "CAR-T 세포"는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 T-세포를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 본원에 사용된 바와 같은, CAR-T 세포는 직교 CD122 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 변형된 수용체를 발현하도록 조작될 수 있다 (직교 CAR-T 세포). 명명법 관점에서, 통상적 실시에서 CAR-T 세포는 "CD19 CAR-T 세포"가 CAR을 포함하는 CAR-T 세포를 지칭하도록 CAR의 항원 결합 도메인의 표적과 관련하여 지칭되며, 여기서 CAR의 ABD는 CD19와 선택적으로 결합하고, "BCMA CAR-T 세포"는 CAR을 포함하는 CAR-T 세포를 지칭할 것이며, 여기서 CAR의 ABD는 BCMA와 선택적으로 결합한다. 본 발명의 직교 수용체를 혼입하도록 변형될 수 있는 상업적으로 입수가능한 CD19 CAR-T 세포 산물의 예는 액시캅타진 실로류셀(axicabtagene ciloleucel) [길리어드 파마슈티칼즈(Gilead Pharmaceuticals)로부터 상업적으로 입수가능한 예스카르타(Yescarta)®로서 판매됨] 및 티사겐레클류셀(tisagenlecleucel) [노바티스(Novartis)로부터 상업적으로 입수가능한 킴리아(Kymriah)®로서 판매됨]을 포함한다. 일부 실시양태에서 CAR의 ABD는 2가 (또는 다가)이므로, ABD가 하나 초과의 표적 항원, 예를 들어 CD19 및 CD20 종양 항원과 특이적으로 결합하도록 한다. 이러한 경우, 이러한 CAR을 포함하는 CAR-T 세포는 통상적으로 그의 ABD의 다가 특성을 언급하는 "CD19/CD20" CAR로서 지칭될 것이다.
CD25: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CD25", "IL2 수용체 알파", "IL2Rα", "IL2Ra", 및 "p55"는 Treg 세포에서 구성적으로 발현되고 활성화에 반응하여 다른 T 세포에서 유도적으로 발현되는 55 kD 폴리펩티드를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. CD25는 또한 문헌에서 "저 친화성" IL2 수용체로서 지칭된다. hIL2는 대략 10-8 M의 Kd로 hCD25와 결합한다. 인간 CD25 핵산 및 단백질 서열은 각각 젠뱅크 수탁 번호 NM__000417 및 NP_0004Q8로서 찾을 수 있다. 인간 CD25는 번역 후 제거되어 251개 아미노산 성숙 단백질이 되도록 하는 21개 아미노산 신호 서열을 포함하는 272개 아미노산 프리-단백질로서 발현된다. 프리-단백질의 아미노산 22-240 (성숙 단백질의 아미노산 1-219)은 세포외 도메인에 상응한다. 프리-단백질의 아미노산 241-259 (성숙 단백질의 아미노산 220-238)는 막횡단 도메인에 상응한다. 프리-단백질의 아미노산 260-272 (성숙 단백질의 아미노산 239-251)는 세포내 도메인에 상응한다. 성숙한 형태의 hCD25의 아미노산 서열 (프리-단백질의 신호 서열 없음)은 하기이다:
Figure pct00002
CD122: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CD122", "인터류킨-2 수용체 베타", "IL2Rb", "IL2Rβ", "IL15Rβ" 및 "p70-75"는 CD122 막횡단 단백질을 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 인간 CD122 (hCD122)는 단일 통과 유형 1 막횡단 수용체이며 551개 아미노산 프리-단백질로서 발현되며, 처음 26개 아미노산은 성숙한 525개 아미노산 단백질로부터 번역 후 절단되는 신호 서열을 포함한다. 프리-단백질의 아미노산 27-240 (성숙 단백질의 아미노산 1-214)은 세포외 도메인에 상응하며, 프리-단백질의 아미노산 241-265 (성숙 단백질의 아미노산 225-239)는 막횡단 도메인에 상응하며, 프리-단백질의 아미노산 266-551 (성숙 단백질의 아미노산 240-525)은 세포내 도메인에 상응한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 hCD122는 S57F 및 D365E (성숙한 hCD122 단백질에 따라 넘버링된 잔기)를 포함한 hCD122 단백질의 자연적으로 발생하는 변이체를 포함한다. hCD122는 유니프로트KB 데이터베이스에서 항목 P14784로서 언급된다. 인간 CD122 핵산 및 단백질 서열은 각각 젠뱅크 수탁 번호 NM_000878 및 NP_000869로서 찾을 수 있다. 신호 서열이 없는 성숙한 hCD122 단백질의 아미노산 서열은 하기와 같고:
Figure pct00003
또한 hCD122의 세포외 도메인 (ECD)의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00004
CD132: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CD132", "IL2 수용체 감마", "IL2Rg" 및 "IL2Rγ"는 유형 1 시토카인 수용체를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용되며 IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL21에 대한 수용체 복합체에 의해 공유되므로, "공통" 감마 쇄에 대한 언급이다. 인간 CD132 (hCD132)는 22개 아미노산 N-말단측 신호 서열을 포함하는 369개 아미노산 프리-단백질로서 발현된다. 프리-단백질의 아미노산 23-262 (성숙 단백질의 아미노산 1-240)는 세포외 도메인에 상응하며, 프리-단백질의 아미노산 263-283 (성숙 단백질의 아미노산 241-262)은 21개 아미노산의 막횡단 도메인에 상응하며, 프리-단백질의 아미노산 284-369 (성숙 단백질의 아미노산 262-347)는 세포내 도메인에 상응한다. hCD132는 유니프로트KB 데이터베이스에서 항목 P31785로서 언급된다. 인간 CD132 핵산 및 단백질 서열은 각각 젠뱅크 수탁 번호: NM_000206 및 NP_000197로서 찾을 수 있다. 성숙한 hCD132 단백질의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00005
CDR : 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 폴리펩티드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견되는 비-인접 항원 결합 부위를 지칭한다. CDR은 문헌 [Kabat et al., J. Biol . Chem . 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991) (본원에서 Kabat 1991로서 지칭되기도 함); Chothia et al., J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987) (본원에서 Chothia 1987로서 지칭되기도 함); 및 MacCallum et al., J. Mol. Biol . 262:732-745 (1996)]에 기재되어 있으며, 여기서 정의는 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중복 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체의 CDR 또는 이식된 항체 또는 그의 변이체를 지칭하기 위한 어느 하나의 정의를 적용하는 것은 본원에 정의되고 사용된 바와 같은 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 맥락에서, CDR 위치의 넘버링은 카바트 넘버링 규칙에 따라 제공된다.
순환 종양 세포: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "순환 종양 세포 (CTC)"는 종양 덩어리 (예를 들어, 신생물)로부터 말초 순환으로 떨어져 나온 종양 세포를 지칭한다.
필적하는: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "필적하는"은 평가가능한 정량적 또는 정성적 파라미터의 두 측정의 차이 정도를 기재하기 위해 사용된다. 예를 들어, 평가가능한 정량적 파라미터의 제1 측정 (예를 들어, CTLL-2 증식 또는 포스포-STAT5 검정에 의해 결정된 바와 같은 IL2 활성 수준)과 평가가능한 파라미터의 제2 측정이, 통상의 기술자가 그 상황에서 두 결과 간에 통계적으로 유의미한 효과 차이가 발생하지 않는다고 인식할 수 있는 범위를 벗어나지 않는 경우, 두 측정은 "필적하는"인 것으로 간주될 것이다. 일부 경우에, 한 측정이 또 다른 측정으로부터 35% 미만, 대안적으로 30% 미만, 대안적으로 25% 미만, 대안적으로 20% 미만, 대안적으로 15% 미만, 대안적으로 10% 미만, 대안적으로 7% 미만, 대안적으로 5% 미만, 대안적으로 4% 미만, 대안적으로 3% 미만, 대안적으로 2% 미만, 또는 1% 미만만큼 벗어난 경우, 두 측정은 "필적하는"인 것으로 간주될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 하나의 측정이 참조 표준으로부터 15% 미만, 대안적으로 10% 미만, 또는 대안적으로 5% 미만만큼 벗어난 경우, 참조 표준에 필적한다.
로부터 유래된: 아미노산 서열 (예를 들어, IL2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 "유래된" 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드)의 맥락에서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "로부터 유래된"은 폴리펩티드 또는 핵산이 참조 폴리펩티드 또는 핵산 (예를 들어, 자연적으로 발생하는 IL2 폴리펩티드 또는 IL2 코딩 핵산)의 서열에 기초한 서열을 가지고 있음을 나타내며, 단백질 또는 핵산이 만들어지는 공급원 또는 방법을 제한하려는 의도는 아니다. 예를 들어, 용어 "로부터 유래된"은 참조 아미노산 또는 DNA 서열의 상동체 또는 변이체를 포함한다.
유효 농도 (EC): 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유효 농도" 또는 그의 약어 "EC"는 시험 시스템에서 주어진 파라미터의 변화에 영향을 미치기에 충분한 양의 작용제 (예를 들어, IL2 오르토로그)의 농도를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 약어 "E"는 시험 시스템이 시험 작용제에 노출되었을 때 그 시험 시스템에서 관찰된 주어진 생물학적 효과의 크기를 지칭한다. 반응의 크기가 시험 작용제의 농도 ("C")의 인자로서 표현되는 경우, 약어 "EC"가 사용된다. 생물학적 시스템의 맥락에서, 용어 Emax는 활성화 시험 작용제의 포화 농도에 반응하여 관찰된 주어진 생물학적 효과의 최대 크기를 지칭한다. 약어 EC가 아래 첨자와 함께 제공되는 경우 (예를 들어, EC40, EC50 등), 그러한 첨자는 그 농도에서 관찰된 생물학적 반응의 Emax의 백분율을 지칭한다. 예를 들어, 시험 시스템에서 측정가능한 생물학적 파라미터가 유도되기에 충분한 시험 작용제의 농도가, 이러한 시험 작용제에 반응하여 이러한 측정가능한 생물학적 파라미터의 최대 수준의 30%인 경우, 이것은 이러한 생물학적 파라미터와 관련하여 시험 작용제의 "EC30"으로서 지칭된다. 유사하게, 용어 "EC100"은 그러한 작용제에 반응하여 측정가능한 파라미터의 최대 (100%) 반응을 초래하는 작용제의 유효 농도를 나타내기 위해 사용된다. 유사하게, 용어 EC50 (약력학 분야에서 통상적으로 사용됨)은 측정가능한 파라미터에서 최대의 절반값 (50%)의 변화를 초래하기에 충분한 작용제의 농도를 지칭한다. 용어 "포화 농도"는 온도 및 압력의 표준 조건 하에 특이적 용매 (예를 들어, 물)의 표준 용적에 용해될 수 있는 시험 작용제의 가능한 최대량을 지칭한다. 약력학에서, 약물의 포화 농도는 전형적으로, 사용가능한 모든 수용체가 약물에 의해 점유되기에 충분한 약물의 농도를 나타내는데 사용되며, EC50은 최대 효과의 절반을 제공하는 약물 농도이다.
강화된: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "강화된"은 샘플이 비-자연적으로 조작되어 관심 종 (예를 들어 분자 또는 세포)이 하기로 존재하는 것을 지칭한다: (a) 출발 샘플, 예컨대 생물학적 샘플 (예를 들어, 분자가 자연적으로 발생하거나 투여 후 존재하는 샘플) 중의 종의 농도보다 더 높은 농도 (예를 들어, 적어도 3배 초과, 대안적으로 적어도 5배 초과, 대안적으로 적어도 10배 초과, 대안적으로 적어도 50배 초과, 대안적으로 적어도 100배 초과, 또는 대안적으로 적어도 1000배 초과); 또는 (b) 분자가 만들어진 환경 (예를 들어, 재조합적으로 변형된 박테리아 또는 포유류 세포에서와 같음)보다 높은 농도. 일부 실시양태에서, 용어 "강화된"은 세포 집단과 동족 오르토로그를 접촉시킨 후 집단에서 직교 수용체를 발현하는 세포의 농도가 더 커지도록 (예를 들어, 적어도 3배 초과, 대안적으로는 적어도 5배 초과, 대안적으로는 적어도 10배 초과, 대안적으로는 적어도 50배 초과, 대안적으로는 적어도 100배 초과, 또는 대안적으로는 적어도 1000배 초과), 직교 수용체를 발현하는 세포에서 증식 반응을 유발시키기에 충분한 양의 동족 오르토로그와 세포 집단을 접촉시킨 후 직교 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 세포 집단과 관련하여 본원에 사용된다.
세포외 도메인: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "세포외 도메인" 또는 그의 약어 "ECD"는 세포의 원형질막 외부에 있는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 세포 표면 수용체)의 일부분을 지칭한다. ECD는 막횡단 단백질, 세포 표면 또는 막 연합 단백질, 분비 단백질, 세포 표면 표적화 단백질의 전체 세포질 외 부분을 포함할 수 있다.
hCD122: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "hCD122"는 자연적으로 발생하는 변이체를 포함한 자연적으로 발생하는 인간 CD122 폴리펩티드를 지칭한다. 자연적으로 발생하는 성숙한 hCD122의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2로서 제공된다.
동일성: 폴리펩티드 또는 DNA 서열과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "동일성"은 두 분자 간의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 분자 둘 다 내의 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛 (즉, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드)에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개의 아미노산 또는 2개의 뉴클레오티드 서열 간의 유사성은 동일한 위치의 수의 직접적인 함수이다. 일반적으로, 서열은 가장 높은 차수의 매치를 수득할 수 있도록 정렬된다. 필요한 경우, 공개된 기술 및 널리 이용가능한 컴퓨터 프로그램, 예컨대 GCS 프로그램 패키지 (문헌 [Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12:387, 1984]), BLASTP, BLASTN, FASTA (문헌 [Atschul et al., J. Molecular Biol. 215:403, 1990])를 사용하여 동일성을 계산할 수 있다. 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어, 예컨대 위스콘신 대학 생명공학 센터 (미국 위스콘신주 53705 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710)의 유전학 컴퓨터 그룹의 서열 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 디폴트 파라미터를 사용하여 측정될 수 있다. 서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트를 결정하는데 적합한 알고리즘은 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol . Biol . 215: 403-410 and Altschul, et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 각각 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명 공학 정보 센터 (NCBI) 웹 사이트를 통해 공개적으로 사용할 수 있다. 알고리즘은 먼저, 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양의 임계값 점수 T와 매치되거나 이를 충족하는 조회 서열 내의 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 고 득점 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 인접 단어 점수 임계값으로서 지칭된다 (상기 문헌 [Altschul, et al.] 참조). 이러한 초기 이웃 단어 적중은 검색을 시작하여 이를 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 시드 역할을 한다. 그런 다음 단어 적중은 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우, 파라미터 M (매칭 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 벌점 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스가 누적 점수 계산에 사용된다. 하기와 같은 경우 각각의 방향으로 단어 적중 확장이 중지된다: 누적 정렬 점수가 최대 달성 값으로부터 수량 X만큼 감소할 경우; 하나 이상의 음수 스코어링 잔기 정렬의 누적으로 인해 누적 점수가 0 또는 그 이하가 될 경우; 또는 두 서열 중 어느 하나의 끝에 도달했을 경우. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 28의 단어 크기 (W), 10의 기댓값 (E), M=1, N=-2를 디폴트로서 사용하며, 또한 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 3의 단어 크기 (W), 10의 기대값 (E), 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 디폴트로서 사용한다 (문헌 [Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)] 참조).
IL2: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "인터류킨-2" 또는 "IL2"는 IL2 활성을 보유하는 IL2 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, IL2는 성숙한 야생형 인간 IL2를 지칭한다. 성숙한 야생형 인간 IL2 (hIL2)는 문헌 [Fujita et al., PNAS USA, 80, 7437-7441 (1983)]에 기재된 바와 같이, 133개 아미노산 폴리펩티드 (프리-단백질의 신호 펩티드의 20개 미만의 N-말단측 아미노산)로서 발생한다. 성숙한 야생형 인간 IL2 (hIL2)의 자연적으로 발생하는 변이체의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00006
본원에 사용된 바와 같은, IL2 변이체의 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 5와 동일한 신호 펩티드를 제외한 IL2 서열 유니프로트 ID P60568을 기준으로 한다.
IL2 활성: 용어 "IL2 활성"은 세포를 유효량의 IL2 폴리펩티드와 접촉시키는 것에 대한 반응으로 나타나는 세포에 대한 하나 이상의 생물학적 효과를 지칭한다. 이전에 언급된 바와 같이, IL2는 다양한 세포 유형에 대해 하나 이상의 생물학적 효과를 초래하는 다면발현성 시토카인이다. IL2는 활성화된 T 림프구의 증식 및 확장을 촉진하고, 나이브 T 세포의 증식 및 활성화를 유도하고, B 세포 성장을 강화시키고, NK 세포의 증식 및 확장을 촉진한다. IL2 활성의 한 예는 CTLL-2 마우스 세포독성 T 세포를 사용하는 세포 증식 검정에서 측정될 수 있다 (문헌 [Gearing, A.J.H. and C.B. Bird (1987) in Lymphokines and Interferons, A Practical Approach. Clemens, M.J. et al. (eds): IRL Press. 295] 참조). 재조합 인간 IL2 (rhIL2)의 특이적 활성은 재조합 인간 IL2 WHO 국제 표준 (NIBSC 코드: 86/500)에 대항하여 보정된 대략 2.1 x 104 IU/μg이다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 관심 IL2 직교 폴리펩티드 리간드가 CD25에 대한 감소된 친화성을 나타내는 경우 (또는 감소된 친화성을 보유하도록 조작되는 경우), IL2 활성 수준은 IL2 수용체를 통한 신호전달을 제공하기 위해 CD25를 필요로 하지 않고 오히려 중간 친화성 CD122/CD132 수용체를 통해 신호전달이 가능한 인간 세포, 예컨대 YT 세포에서 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 직교 인간 IL2 리간드는 필적하는 검정에서 등가의 농도로 평가했을 때, WHO 국제 표준 (NIBSC 코드: 86/500) 야생형 성숙한 인간 IL2의 활성의 약 20% 미만, 대안적으로 약 10% 미만, 대안적으로 약 8% 미만, 대안적으로 약 6% 미만, 대안적으로 약 4% 미만, 대안적으로 약 2% 미만, 대안적으로 약 1% 미만, 대안적으로 약 0.5% 미만을 나타낼 수 있다.
IL2 오르토로그: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "IL2 오르토로그"는 IL2 모 폴리펩티드로부터 유래된 IL2의 변이체를 지칭하며, 여기서 IL2 오르토로그는 직교 CD122 ECD와 특이적으로 결합하고 야생형 CD122의 세포외 도메인에 대한 상당히 감소된 결합을 보인다. 일부 실시양태에서 IL2 오르토로그는 직교 CD122 ECD를 포함하는 수용체에 대한 특이적 결합을 나타내며, 반응을 유발하기에 충분한 양의 직교 CD122 폴리펩티드의 ECD를 포함하는 막 전역에 걸쳐 있는 수용체를 발현하는 세포의 접촉은 상기 막 전역에 걸쳐 있는 수용체의 세포내 도메인 (ICD)에 의해 생산된 신호의 특징적인 신호를 초래한다. 막 전역에 걸쳐 있는 수용체가 직교 CD122 ECD 및 CD122 ICD를 포함하는 경우, 이러한 수용체에 대한 IL2 오르토로그의 결합은 CD122/CD132 중간 친화성 IL2 수용체의 Cd25/CD122/CD132 고 친화성의 활성화의 특징적인 세포내 신호를 초래한다. IL2 오르토로그는 야생형 hCD122에 대해 상당히 감소된 결합을 나타낸다. 용어 IL2 오르토로그는 IL2 직교 변이체 및 변형된 IL2 오르토로그를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 인간 IL2의 자연적으로 발생하는 변이체로부터 유래되며 이러한 인간 IL2 오르토로그는 "hoCD122" 또는 "hoRb"로서 지칭될 수 있다. 특정의 변형된 IL2 폴리펩티드는 문헌 [Garcia, et al. (2018년 8월 16일에 공개된 미국 특허 출원 공보 US2018/0228842A1)]에 제공된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 IL2 오르토로그는 문헌 [Garcia, et al. (2018년 8월 16일에 공개된 미국 특허 출원 공보 US2018/0228842A1)]에 기재된 변형된 hIL2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122의 세포외 도메인에 대한 IL2 오르토로그의 친화도는 야생형 CD122의 ECD에 대한 야생형 IL2의 친화도에 필적한다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122의 ECD에 대한 IL2 오르토로그의 친화도는 야생형 CD122의 ECD에 대한 야생형 IL2의 친화도보다 더 크다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122의 ECD에 대한 IL2 오르토로그의 친화도는 야생형 CD122의 ECD에 대한 야생형 IL2의 친화도보다 더 작다.
반응을 일으키기에 충분한 양으로: 본원에 사용된 바와 같은 문구 "반응을 일으키기에 충분한 양으로"는 시험 시스템에 시험 작용제를 적용하기 전 (예를 들어, 기준선 수준) 및 후에 측정된 지표 수준에서의 검출가능한 변화를 제공하기에 충분한 시험 작용제의 양과 관련하여 사용된다. 일부 실시양태에서, 시험 시스템은 세포, 조직 또는 유기체이다. 일부 실시양태에서, 시험 시스템은 시험관내 시험 시스템, 예컨대 형광 검정이다. 일부 실시양태에서, 시험 시스템은 세포, 조직 또는 유기체에 대한 시험 작용제의 적용 전 및 후에 생물학적 기능을 반영하는 세포, 조직 또는 유기체의 파라미터 수준에서의 변화의 측정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지표 (예를 들어, 인산화된 STAT5의 농도)는 소정량의 시험 작용제 (예를 들어, IL2)의 투여에 대한 반응으로 검정에서 평가된 세포의 생물학적 기능 (예를 들어, IL2 수용체의 활성화)을 반영한다. 일부 실시양태에서, 시험 시스템은 세포, 조직 또는 유기체 (예를 들어, 발광성 신생물 세포를 주입한 마우스)에 대한 하나 이상의 시험 작용제 (예를 들어, IL2 오르토로그와 조합된 직교 CD122를 발현하는 CAR-T 세포)의 적용 전 및 후에 생물학적 조건 (예를 들어, 신생물의 존재)을 반영하는 세포, 조직 또는 유기체 (예를 들어, 상기 마우스)의 파라미터 (예를 들어, 발광) 수준에서의 변화의 측정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지표 (예를 들어, 인산화된 STAT5의 농도)는 소정량의 시험 작용제 (예를 들어, IL2)의 투여에 대한 반응으로 검정에서 평가된 세포 (예를 들어, T 세포)의 생물학적 기능 (예를 들어, IL2 수용체의 활성화)을 반영한다. "반응을 일으키기에 충분한 양"은 치료상 유효량으로 충분할 수 있지만 "반응을 일으키기에 충분한 양으로"는 치료상 유효량보다 더 많거나 적을 수 있다.
치료를 필요로 하는: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료를 필요로 하는"은 대상체가 치료를 필요로 하거나 치료로부터 잠재적으로 혜택을 얻을 대상체와 관련하여 의사 또는 기타 간병인이 내린 판단을 지칭한다. 이러한 판단은 의사 또는 간병인의 전문 지식 영역에 있는 다양한 요인을 기반으로 한다.
예방을 필요로 하는: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "예방을 필요로 하는"은 대상체가 예방적 관리를 필요로 하거나 이러한 관리로부터 잠재적으로 혜택을 얻을 대상체와 관련하여 의사 또는 기타 간병인이 내린 판단을 지칭한다. 이러한 판단은 의사 또는 간병인의 전문 지식 영역에 있는 다양한 요인을 기반으로 한다.
억제제: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "억제제"는 예를 들어, 유전자, 단백질, 리간드, 수용체 또는 세포를 감소, 차단, 예방, 활성화 지연, 불활성화, 둔감화 또는 하향 조절하는 분자를 지칭한다. 억제제는 또한 세포 또는 유기체의 구성적 활성을 감소, 차단 또는 불활성화시키는 분자로서 정의될 수 있다.
단리된: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "단리된"은 자연적으로 발생하는 경우, 자연적으로 발생할 수 있는 환경과 상이한 환경에 있는 관심 폴리펩티드와 관련하여 사용된다. "단리된"은 관심 폴리펩티드가 실질적으로 강화되고/거나 관심 폴리펩티드가 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 샘플 내에 있는 폴리펩티드를 포함하는 것을 의미한다. 폴리펩티드가 자연적으로 발생하지 않는 경우, "단리된"은 그러한 폴리펩티드가 합성 또는 재조합 수단에 의해 생성된 환경으로부터 분리되었음을 나타낸다.
직교 수용체의 세포내 도메인: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "직교 수용체의 세포내 도메인" 또는 "ICD-OR"은 막횡단 전역에 걸쳐 있는 직교 수용체를 발현하는 세포의 원형질막 내부에 있는 막횡단 전역에 걸쳐 있는 직교 수용체의 일부분을 지칭한다. ICD-OR은 세포가 유사분열에 들어가 세포 성장을 시작하도록 신호를 보내는 단백질 도메인을 지칭하는 하나 이상의 "증식 신호전달 도메인(들)" 또는 "PSD(들)"를 포함할 수 있다. 그 예는 JAK1, JAK2, JAK3, Tyk2, Ptk-2, 다른 포유류 또는 진핵 종으로부터의 야누스 키나제 패밀리의 상동 구성원을 포함하나 이에 제한되지는 않는 야누스 키나제, IL2 수용체 β 및/또는 γ 쇄 및 단백질의 야누스 키나제 패밀리와 상호작용하여 신호를 형질도입할 수 있는 단백질의 시토카인 수용체 슈퍼패밀리로부터의 다른 서브유닛, 또는 그의 일부분, 변형 또는 조합을 포함한다. 신호의 예는 STAT1, STAT3, STAT5a 및/또는 STAT5b 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 STAT 분자의 인산화를 포함한다.
"와 조합하여": 본원에 사용된 바와 같은 용어 "와 조합하여"는 대상체에 대한 다수의 작용제의 투여와 관련하여 사용될 때 대상체에 대한 제1 작용제와 적어도 하나의 추가적 (즉, 제2, 제3, 제4, 제5 등) 작용제의 투여를 지칭한다. 본 발명의 목적상, 제1 작용제의 투여로 인한 생물학적 효과가 제2 작용제의 투여 시에 대상체에서 지속되어 제1 작용제와 제2 작용제의 치료 효과가 중첩되는 경우 하나의 작용제 (예를 들어, IL2 오르토로그)는 제2 작용제 (예를 들어, 조작된 인간 면역 세포)와 조합하여 투여되는 것으로 간주된다. 예를 들어, 조작된 직교 세포 요법 작용제는 전형적으로 드물게 (전형적으로 단일 투여로만) 투여되는 반면, IL2 오르토로그는 직교 세포 작용제가 대상체에서 지속되는 동안 주기적으로 투여된다. 조작된 직교 세포 요법 작용제는 장기간 (수주 또는 수개월)에 걸쳐 치료 효과를 제공하고 제2 작용제 (예를 들어, IL2 오르토로그)의 투여는 제1 작용제의 치료 효과가 지속되는 동안 치료 효과를 제공하여, 제1 작용제가 제2 작용제의 투여 시점으로부터 상당한 간격의 시점 (예를 들어, 수일 또는 수주)에 투여되었더라도, 제2 작용제가 제1 작용제와 조합되어 투여되는 것으로 간주되도록 한다. 한 실시양태에서, 제1 작용제 및 제2 작용제가 동시에 (서로 30분 이내), 동시대에 또는 순차적으로 투여되는 경우, 하나의 작용제는 제2 작용제와 조합하여 투여되는 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 제1 작용제 및 제2 작용제가 서로 약 24시간 이내, 바람직하게 서로 약 12시간 이내, 바람직하게 서로 약 6시간 이내, 바람직하게 서로 약 2시간 이내, 또는 바람직하게 서로 약 30분 이내에 투여되는 경우 제1 작용제는 제2 작용제와 "동시대에" 투여되는 것으로 간주된다. 용어 "와 조합하여"는 또한 제1 작용제 및 제2 작용제가 단일 제약상 허용되는 제형으로 공동-제형화되고 이러한 공동-제형이 대상체에게 투여되는 상황에 적용되는 것으로 이해되어야 한다. 특정 실시양태에서, 직교 세포 및 IL2 오르토로그는 부가의 보충 작용제와 추가로 조합된다. 보충 작용제(들)는 순차적으로 투여되거나 적용되며, 예를 들어, 하나의 작용제는 하나 이상의 다른 작용제보다 먼저 투여된다. 다른 실시양태에서, IL2 뮤테인 및 보충 작용제(들)는 동시에 투여되며, 예를 들어 2종 이상의 작용제가 동시에 또는 거의 동시에 투여되고; 2종 이상의 작용제는 2종 이상의 별도의 제형에 존재하거나 단일 제형으로 조합될 수 있다 (즉, 공동-제형). 작용제가 순차적으로 또는 동시에 투여되는지 여부에 관계없이, 이들은 본 개시내용의 목적을 위해 조합하여 투여되는 것으로 간주된다.
고 친화성 IL2 수용체: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "고 친화성 IL2 수용체"는 CD25, CD122 및 CD132 단백질을 포함하는 삼량체 수용체 복합체 ("IL2Rαβγ"로서 지칭되기도 함)를 지칭한다. 야생형 hIL2 (서열식별번호: 5)는 고 IL2 친화성 수용체 복합체와 관련하여 대략 10-11 M의 Kd를 갖는다.
중간 친화성 IL2 수용체: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "중간 친화성 IL2 수용체"는 CD122 및 CD132를 포함하는 이량체 IL2 수용체 복합체 ("IL2Rβγ"로서 지칭되기도 함)를 지칭한다. 포유류 면역 세포의 표면 상에 발현된 중간 친화성 IL2 수용체와 IL2 분자의 연합은 세포에서 IL2 신호전달을 초래한다. 야생형 hIL2 (서열식별번호: 5)는 중간 친화성 CD122/CD132 (IL2Rβγ) 수용체 복합체에 대해 대략 10-9 M의 Kd를 갖는다.
카바트 넘버링: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "카바트 넘버링"은 관련 기술분야에서 인식되며 이뮤노글로불린의 중쇄 및 경쇄 영역에서 다른 아미노산 잔기보다 더 가변적인 (예를 들어, 초가변) 아미노산 잔기의 넘버링 시스템을 지칭한다 (Kabat, et al., (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93; Kabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 본 개시내용의 목적상, 항체의 가변 영역 내의 CDR의 위치 설정은 카바트 넘버링 또는 간단히 "카바트"를 따른다.
리간드: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "리간드"는 수용체와 특이적으로 결합하고 수용체의 활성 상의 변화 또는 그 수용체를 발현하는 세포에서의 반응에 영향을 미치도록 수용체에서의 변화를 일으키는 분자를 지칭한다. 한 실시양태에서, 용어 "리간드"는 수용체의 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있는 분자 또는 그의 복합체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "리간드"는 자연 및 합성 리간드를 포괄한다. "리간드"는 또한 소분자, 시토카인의 펩티드 유사체 및 항체의 펩티드 유사체를 포괄한다. 리간드와 수용체의 복합체를 "리간드-수용체 복합체"라고 한다. 리간드는 다단백질 또는 융합 단백질 (예를 들어, 항체-표적화된 리간드 융합 단백질)의 하나의 도메인을 포함할 수 있다.
전이: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "전이"는 원발성 종양으로부터 주변 조직 및 원위 장기로의 암성 세포의 확산을 설명한다.
변형된 IL2 오르토로그: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "변형된 IL2 오르토로그"는 하나 이상의 변형, 예컨대 PEG화, 글리코실화 (N- 및 O-연결), 아실화 또는 폴리시알릴화, 또는 혈청 알부민 (예를 들어, 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 소 혈청 알부민 (BSA))을 포함하는 알부민 융합 폴리펩티드, Fc-융합 단백질, 표적화된 IL2 오르토로그 융합 단백질 (예컨대 scFv-IL2 오르토로그 융합 단백질, VHH-IL2 직교 폴리펩티드 융합 단백질) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 폴리펩티드 운반체 분자와의 접합에 의해 (화학적 또는 융합 단백질로서) 변형된 IL2 오르토로그를 지칭하기 위해 사용된다. 변형된 IL2 오르토로그는 하나 이상의 특성, 예를 들어 면역원성 조정 (면역원과의 접합 또는 융합); 수 용해도, 생체 이용률, 혈청 반감기 및/또는 치료 반감기를 증가시키는 방법; 및/또는 생물학적 활성 조정을 증진시키기 위해 제조될 수 있다. 특정 변형은 또한 예를 들어, 검출 검정에 사용하기 위한 항체를 생성하거나 (예를 들어, 에피토프 태그) 또는 단백질 정제의 용이성을 제공하는데 (예를 들어, 폴리-His 태그) 유용할 수 있다. 변형된 IL2 오르토로그는 하나 이상의 특성, 예를 들어 면역원성 조정; 수 용해도, 생체 이용률, 혈청 반감기 및/또는 치료 반감기를 증가시키는 방법; 및/또는 생물학적 활성 조정을 증진시키기 위해 제조될 수 있다. 특정 변형은 또한 예를 들어, 검출 검정에 사용하기 위한 항체의 생성 (예를 들어, 에피토프 태그) 및 단백질 정제의 용이성을 제공하는데 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL2 오르토로그는 식 1의 변형을 갖는 것으로 포괄된 바와 같은 임의의 변형을 배제한, 서열식별번호: 5와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성이다.
조정하다: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "조정하다", "조정" 등은 생물학적 시스템 또는 생화학적 경로를 포함한 시스템에서 긍정적 또는 부정적 또는 직접 또는 간접적으로 반응을 유발시킬 수 있는 시험 작용제의 능력을 지칭한다. 용어 조정제는 효능제 (부분 효능제, 완전 효능제 및 초효능제 포함) 및 길항제 둘 다를 포함한다.
신생물성 질환: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "신생물성 질환"은 세포성 과증식 또는 조절되지 않은 (또는 조절 장애) 세포 복제로부터 발생하는 대상체에서의 장애 또는 병태를 지칭한다. 용어 신생물성 질환은 대상체에서 신생물의 존재로부터 발생하는 장애를 지칭한다. 신생물은 (1) 양성; (2) 전악성 (또는 "전암성"); 및 (3) 악성 (또는 "암성")으로서 분류될 수 있다. 용어 "신생물성 질환"은 신생물성 질환과 직접 및 간접적으로 연관되는 병태를 지칭하는 신생물-관련 질환, 장애 및 병태를 포함하고, 예를 들어 혈관신생 및 전암성 병태, 예컨대 이형성증 또는 무증상 다발성 골수종을 포함한다.
N-말단: 폴리펩티드의 구조의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은, "N-말단" (또는 "아미노 말단") 및 "C-말단" (또는 "카르복실 말단")은 각각 폴리펩티드의 최극단 아미노 및 카르복실을 지칭하며, 용어 "N-말단측" 및 "C-말단측"은 각각 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단에 대한 아미노산 서열의 상대적인 위치를 지칭하며, N-말단 및 C-말단에서의 잔기를 각각 포함할 수 있다. "바로 N-말단측" 또는 "바로 C-말단측"은 제2 아미노산 잔기에 상대적인 제1 아미노산 잔기의 위치를 지칭하며, 여기서 제1 및 제2 아미노산 잔기는 공유 결합되어 연속되는 아미노산 서열을 제공한다.
신생물성 질환: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "신생물성 질환"은 세포성 과증식 또는 조절되지 않은 (또는 조절 장애) 세포 복제로부터 발생하는 대상체에서의 장애 또는 병태를 지칭한다. 용어 신생물성 질환은 대상체에서 신생물의 존재로부터 발생하는 장애를 지칭한다. 신생물은 (1) 양성; (2) 전악성 (또는 "전암성"); 및 (3) 악성 (또는 "암성")으로서 분류될 수 있다. 용어 "신생물성 질환"은 신생물성 질환과 직접 및 간접적으로 연관되는 병태를 지칭하는 신생물-관련 질환, 장애 및 병태를 포함하고, 예를 들어 혈관신생 및 전암성 병태, 예컨대 이형성증을 포함한다.
핵산: 용어 "핵산", "핵산 분자", "폴리뉴클레오티드" 등은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 그의 유사체의 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예는 선형 및 원형 핵산, 메신저 RNA (mRNA), 상보적 DNA (cDNA), 재조합 폴리뉴클레오티드, 벡터, 프로브, 프라이머 등을 포함한다.
IL2에 따라 넘버링됨: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "IL2에 따라 넘버링됨"은 성숙한 야생형 IL2의 서열에서 아미노산이 정상적으로 발생하는 위치를 참조하여 특정한 아미노산의 위치를 확인하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, IL2는 hIL2 (서열식별번호: 5)이다. 예를 들어, hIL2와 관련하여, "R81"은 성숙한 야생형 hIL2의 서열에서 발생하는 제81번 (N-말단으로부터 넘버링된) 아미노산인 아르기닌을 지칭한다. 상이한 포유류 종의 IL2 분자의 아미노산 서열은 상이한 수와 서열의 아미노산을 가지고 있다는 점에 유의해야 한다. 결과적으로, 이러한 규칙에 따라 잔기를 언급할 때, 해당 IL2 종을 확인하는 것이 도움이 된다.
CD122에 따라 넘버링됨: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CD122에 따라 넘버링됨"은 성숙한 야생형 CD122 분자의 서열에서 아미노산이 정상적으로 발생하는 위치를 참조하여 특정한 아미노산의 위치를 확인하는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, CD122 분자는 인간 CD122 (서열식별번호: 2)이다. 예를 들어, 인간 CD122와 관련하여, H133은 성숙한 야생형 hCD122의 서열의 제133번 (N-말단으로부터 넘버링됨) 아미노산에 있는 히스티딘을 지칭한다.
CD122의 세포외 도메인에 따라 넘버링됨: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CD122의 세포외 도메인에 따라 넘버링됨" 또는 "CD122 ECD에 따라 넘버링됨"은 성숙한 야생형 CD122 분자의 세포외 도메인 (ECD) 서열에서 아미노산이 정상적으로 발생하는 위치를 참조하여 특정한 아미노산의 위치를 확인하는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, CD122 ECD 분자는 인간 CD122 ECD (서열식별번호: 3)이다. 예를 들어, 인간 CD122 ECD를 참조하여, H133은 성숙한 야생형 hCD122 ECD의 서열의 제133번 (N-말단으로부터 넘버링됨) 아미노산에 있는 히스티딘을 지칭한다.
작동가능하게 연결된: 용어 "작동가능하게 연결된"은 세포 내로 도입될 때 세포에서 특정한 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 수행할 수 있는 핵산을 제공하는 단일 핵산 서열로 조합될 때 상이한 기능을 코딩하는 핵산 서열 간의 관계를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 신호 서열에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되는 경우 그러한 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 연속되고, 분비 리더의 경우 연속되고 리딩 단계에 있음을 의미한다. 그러나, 특정 유전적 요소, 예컨대 인핸서는 효과를 제공하는 서열과 관련하여 반드시 연속될 필요는 없다.
직교 세포: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "직교 세포"는 직교 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 포유류 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 직교 세포는 직교 CD122 (oCD122) 폴리펩티드 또는 직교 CD122 ECD를 포함하는 수용체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 직교 세포는 변형된 인간 세포 ("인간 직교 세포")이다. 직교 세포는 면역 세포, 예를 들어 인간 면역 세포일 수 있다. "인간 직교 면역 세포"는 인간 직교 CD122 (hoCD122) 또는 인간 직교 CD122 ECD를 포함하는 키메라 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 인간 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, oCD122 (또는 oCD122 ECD를 포함하는 수용체)를 발현하도록 조작하기 위한 면역 세포는 골수 세포, 림프구, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 종양 침윤 림프구 (TIL), T 세포, CD8+ T 세포, CD25+CD8+ T 세포, CAR-T 세포, NK 세포, CD4+ T 세포, 및 조작된 TIL, 조작된 Treg 및 조작된 NK 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 Treg 조작된 버전으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 직교 세포는 인간 직교 CD122를 발현하도록 재조합적으로 변형된 인간 면역 세포로부터 유래된 CAR-T이다 ("hoCAR-T" 세포). 일부 실시양태에서, 직교 세포는 인간 직교 CD122 또는 oCD122 ECD를 포함하는 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 인간 대상체의 신생물로부터 단리된 TIL이다 ("hoTIL" 세포). 일부 실시양태에서, 직교 세포는 인간 직교 CD122 또는 oCD122 ECD를 포함하는 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 인간 대상체로부터 단리된 NK이다 ("hoNK" 세포). 일부 실시양태에서, 세포는 인간 직교 CD122 또는 oCD122 ECD를 포함하는 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 인간 조혈 줄기이다 ("hoHSC" 세포). 일부 실시양태에서, 직교 세포는 인간 직교 CD122 또는 oCD122 ECD를 포함하는 수용체를 발현하도록 추가로 변형된 비-천연 T 세포 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 인간 면역 세포로부터 유래된 TCR 조작된 세포이다 ("hoTCR 세포"). 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "직교 세포"는 직교 CD122 또는 oCD122 ECD를 포함하는 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 포유류 세포를 지칭한다. 직교 세포는 마커 단백질 (항생제 내성을 부여하는 단백질, 형광 단백질 또는 발광 단백질)을 코딩하는 핵산 분자; DNA 또는 RNA 결합 단백질, 전사 억제인자 또는 탈억제인자를 포함한 전사 인자, 프로-아폽토시스 단백질, 항아폽토시스 단백질 및 세포내 조절 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는 생물학적으로 활성인 세포내 단백질; 생물학적으로 활성인 치료 단백질, 예컨대 항체를 포함한 생물학적으로 활성인 분비된 단백질, 예컨대 성장 인자, 펩티드 호르몬, 시토카인 또는 케모카인을 포함하나 이에 제한되지는 않는 직교 세포에서의 발현을 촉진하기 위해 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 마커 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 도입을 포함한 재조합 변형을 포함한, 직교 CD122 폴리펩티드 또는 oCD122 ECD를 포함하는 수용체를 발현하는데 필요한 재조합 변형 이외의 재조합 변형을 혼입할 수 있다 (세포외 단백질은 전형적으로 직교 세포에서의 발현 후 세포외 수송을 촉진하기 위해 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 포함한다). 직교 세포에 대한 부가의 재조합 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 직교 세포 상에 발현된 직교 CD122 수용체는 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 제공하도록 변형된 인간 CD122 세포내 도메인 (ICD)을 포함할 수 있다.
직교 CD122: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "직교 CD122" 또는 "CD122 직교 수용체"는 CD122 폴리펩티드 변이체에 대한 동족 리간드인 IL2 오르토로그에 대한 특이적 결합을 초래하지만 자연적으로 발생하는 형태의 IL2과는 특이적으로 결합하지 않는 아미노산 치환을 포함하는 CD122 폴리펩티드 변이체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
직교 수용체: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "직교 수용체"는 수용체의 변이체를 지칭하며, 직교 수용체는 이러한 직교 수용체가 그의 동족 리간드에 대해 상당히 감소된 결합을 나타내지만 직교 수용체와 상호작용하도록 조작된 직교 리간드에 대해 특이적 결합을 나타내도록 하는 아미노산 서열에 대한 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 직교 수용체는 그의 동족 천연 리간드에 대해 상당히 감소된 결합을 나타내는 세포외 도메인을 포함할 수 있는 반면, 직교 리간드는 그의 동족 천연 수용체(들)의 ECD에 대해 상당히 감소된 결합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 동족 직교 수용체에 대한 직교 리간드의 친화성은 천연 수용체에 대한 천연 리간드의 친화성에 필적하는 친화성, 예를 들어 천연 시토카인 수용체 쌍 친화성의 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 100%인 친화성을 가지며, 천연 수용체에 대한 천연 시토카인의 친화성보다 더 높을 수 있고, 예를 들어 2X, 3X, 4X, 5X, 10X 또는 그 초과의 친화성을 나타낸다. 직교 수용체는 그것이 유래된 모 분자 (예를 들어, 직교 CD122) 또는 직교 수용체에 대한 직교 리간드가 유래된 동족 리간드 (예를 들어, 직교 IL2 수용체)에 의해 지칭될 수 있다.
오르토로그: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "오르토로그" 또는 "직교 리간드"는 직교 리간드/수용체 쌍의 리간드 성분을 지칭하고, 하기를 나타내는 폴리펩티드 변이체를 제공하기 위해 그의 1차 구조에 변형을 혼입하는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다: (a) 그의 천연 동족 수용체 (즉, 오르토로그가 유래된 모 폴리펩티드에 대한 천연 수용체)에 대한 상당히 감소된 친화성; 및 (b) 오르토로그에 대한 동족 수용체의 변이체인 조작된 직교 수용체에 대한 특이적 결합. 오르토로그가 직교 수용체 (재조합 DNA 기술에 의해 변형되어 제어 요소에 작동가능하게 연결된 직교 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 혼입하여 재조합적으로 변형된 세포에서 직교 수용체의 발현을 초래하는 세포의 표면에서 발현된다)와 결합하면, 활성화된 직교 수용체는 동족의 천연 반응을 모방하지만 직교 수용체를 발현하는 재조합적으로 변형된 세포 집단에 특이적인 생물학적 활성을 제공하기 위해 천연 세포 요소를 통해 형질도입되는 신호전달을 시작한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 오르토로그는 동족 수용체에 비해 직교 수용체에 대해 상당한 선택성을 가지며, 임의로 동족 수용체에 대해 상당히 감소된 효력을 보유한다. 선택성은 전형적으로 리간드/수용체 결합에 반응하여 유도된 활성에 특징적인 검정에서 측정된 활성에 의해 평가된다. 일부 실시양태에서, 오르토로그는 동일한 검정에서 측정된 바와 같이 EC50에서의 적어도 5배, 대안적으로 적어도 10배, 대안적으로 적어도 20배, 대안적으로 적어도 30배, 대안적으로 적어도 40배, 대안적으로 적어도 50배, 대안적으로 적어도 100배, 대안적으로 적어도 200배의 차이를 갖는다.
모 폴리펩티드: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "모 폴리펩티드" 또는 "모 단백질"은 후속적으로 변형되어 변이체 폴리펩티드를 생성하는 자연적으로 발생하는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 모 폴리펩티드는 야생형 (또는 천연) 폴리펩티드일 수 있다. 모 폴리펩티드는 폴리펩티드 자체 또는 모 폴리펩티드를 포함하는 조성물 (예를 들어, 모 폴리펩티드를 포함하는 글리코실화, PEG화, 융합 단백질)을 지칭할 수 있다.
부분 효능제: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "부분 효능제"는 주어진 수용체와 결합하고 이를 활성화시키지만 완전 작용제에 비해 수용체의 부분 활성화만을 갖는 분자를 지칭한다. 부분 효능제는 효능 효과 및 길항 효과 둘 다를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 완전 효능제와 부분 효능제 둘 다가 존재하는 경우, 부분 효능제는 수용체 결합을 놓고 완전 효능제와 경쟁함으로써 경쟁적 길항제로서 작용하여, 부분 효능제의 부재 하의 완전 효능제와 수용체의 접촉에 비해 수용체 활성화의 순 감소를 초래한다. 임상적으로, 부분 효능제는 부족한 양의 내인성 리간드가 존재할 때 원하는 최대 이하 반응을 제공하기 위해 수용체를 활성화시키는데 사용될 수 있거나, 또는 과도한 양의 내인성 리간드가 존재할 때 수용체의 과잉 자극을 감소시킬 수 있다. 부분 효능제에 의해 생산된 최대 반응 (Emax)은 그것의 고유 활성이라고 불리며 완전 효능제가 100% 반응을 생산하는 백분율 척도로 표시될 수 있다. 본 개시내용의 IL2 부분 효능제는 필적하는 검정에서 유사한 농도로 평가될 때 WHO 국제 표준 (NIBSC 코드: 86/500) 야생형 성숙한 인간 IL2의 활성의 10% 초과, 대안적으로 20% 초과, 대안적으로 30% 초과, 대안적으로 40% 초과, 대안적으로 50% 초과, 대안적으로 60% 초과, 또는 대안적으로 70% 초과를 가질 수 있다.
PEG-IL2 오르토로그: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "PEG-IL2 오르토로그"는 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자와 공유 결합된 IL2 오르토로그를 지칭하며, 적어도 하나의 PEG 분자는 IL2 오르토로그의 적어도 하나의 아미노산 잔기에 공유 부착된다. PEG화된 폴리펩티드는 각각 IL2 오르토로그에 부착된 1개, 2개, 3개 (또는 그 초과)의 PEG 모이어티를 포함하는 PEG-IL2 오르토로그를 나타내기 위해 모노PEG화된, 디PEG화된, 트리PEG화된 (등) 것으로서 추가로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG는 (예를 들어, 리신 측쇄, 시스테인의 술프히드릴 기 또는 N-말단측 아민을 통해) IL2 오르토로그에 직접 공유 부착되거나 또는 임의로 PEG와 IL2 오르토로그 사이에 링커를 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG-IL2 오르토로그는 각각 상이한 아미노산 잔기에 부착되는 하나 초과의 PEG 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG-IL2 오르토로그는 성숙한 인간 야생형 hIL2 (서열식별번호: 4)로부터 유래된다. IL2의 PEG화된 형태 및 IL2 폴리펩티드의 PEG화의 방법론은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 1990년 6월 5일에 허여된 미국 특허 번호 4,931,544 (Katre, et al.); 1993년 4월 27일에 허여된 미국 특허 번호 5,206,344 (Katre, et al.); 및 2018년 1월 9일에 허여된 미국 특허 번호 9,861,705 (Bossard, et al.) 참조). 일부 실시양태에서, IL2 뮤테인은 2017년 12월 28일에 공개된 미국 특허 출원 공보 US20170369871A1 (Ptacin, et al.)에 기재된 바와 같이 부위 특이적 PEG화를 촉진하기 위해 비-자연적으로 발생하는 아미노산 측쇄를 갖는 비-자연 아미노산의 혼입에 의해 변형될 수 있다. 다른 실시양태에서, 시스테인 잔기는 2016년 2월 18일에 WO2016/025385로서 공개된 PCT 국제 특허 출원 번호 PCT/US2015/044462 (Greve, et al.)에 기재된 바와 같이 시스테인 측쇄를 통한 부위-특이적 PEG화를 촉진하기 위해 IL2 분자 내의 다양한 위치에 혼입될 수 있다.
폴리펩티드: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 유전적으로 코딩된 아미노산 및 비-유전적으로 코딩된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 또는 유도체화된 아미노산, 및 변형된 폴리펩티드 백본을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭하기 위해 본원에 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어는 이종 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질; 이종 및 상동 리더 서열을 갖는 융합 단백질; N-말단 메티오닌 잔기가 있거나 없는 융합 단백질; 면역학적으로 태그부착된 단백질을 갖는 융합 단백질; 면역학적 활성 단백질의 융합 단백질 (예를 들어, 항원성 디프테리아 또는 파상풍 독소 단편) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 융합 단백질을 포함한다.
예방하다: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "예방하다", "예방하는 것", "예방" 등은 일시적 또는 영구적으로 대상체의 질환, 장애, 병태 등의 발병 위험 (예를 들어, 임상 증상의 부재에 의해 결정된 바와 같음)을 예방, 저해, 억제 또는 감소시키기 위해 또는 일반적으로 유전적, 경험적 또는 환경적 요인으로 인해 특정한 질환, 장애 또는 병태를 갖는 경향이 있는 대상체와 관련하여 그러한 것들의 시작을 지연시키기 위해 질환, 장애, 병태 또는 그의 증상이 시작되기 전에 대상체에 대해 개시되는 조치 과정을 지칭한다. 특정 경우에, 용어 "예방하다", "예방하는 것", "예방"은 또한 질환, 장애 또는 병태가 현재 상태에서 더 해로운 상태로 진행되는 것을 늦추는 것을 지칭하기 위해 사용된다.
수용체: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "수용체"는 리간드의 결합이 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 특성에 대한 변화를 초래하는 리간드와 특이적으로 결합하는 도메인을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 수용체는 세포 표면과 연합되지 않은 "가용성" 수용체이다. hCD25의 가용성 형태는 hIL2와 특이적으로 결합하는 가용성 수용체의 예이다. 일부 실시양태에서, 수용체는 세포외 도메인 (ECD) 및 ECD를 세포 표면에 고정시키는 역할을 하는 막 연합 도메인을 포함하는 세포 표면 수용체이다. 세포 표면 수용체의 일부 실시양태에서, 수용체는 전형적으로 막횡단 도메인 (TM)으로서 지칭되는 막 전역에 걸쳐 있는 도메인에 의해 연결된 세포내 도메인 (ICD) 및 세포외 도메인 (ECD)을 포함하는 막 전역에 걸쳐 있는 폴리펩티드이다. 수용체에 대한 리간드의 결합은 측정가능한 생물학적 효과를 초래하는 수용체의 입체형태적 변화를 초래한다. 일부 경우에, 수용체가 ECD, TM 및 ICD를 포함하는 막 전역에 걸쳐 있는 폴리펩티드인 경우, ECD에 대한 리간드의 결합은 ECD에 대한 리간드의 결합에 대한 반응으로 ICD의 하나 이상의 도메인에 의해 매개되는 측정가능한 세포내 생물학적 효과를 초래한다. 일부 실시양태에서, 수용체는 세포내 신호전달을 촉진하기 위한 다성분 복합체의 성분이다. 예를 들어, 리간드는 임의의 세포내 신호전달 단독과 연합되지 않지만 리간드 결합 시 세포내 신호전달 캐스케이드 (예를 들어, Jak/STAT 경로)의 활성화를 초래하는 이종이량체 (예를 들어, 중간 친화성 CD122/CD132 IL2 수용체), 이종삼량체 (예를 들어, 고 친화성 CD25/CD122/CD132 hIL2 수용체)를 포함한 이종다량체, 또는 동종다량체 (동종이량체, 동종삼량체, 동종사량체) 복합체의 형성을 촉진하는 세포 표면 분자와 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용체는 ECD, TM 및 ICD 도메인을 포함하는 막 전역에 걸쳐 있는 단일 쇄 폴리펩티드이며, 여기서 ECD, TM 및 ICD 도메인은 동일하거나 상이한 자연적으로 발생하는 수용체 변이체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 수용체는 hoCD122 수용체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다.
재조합: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "재조합"은 재조합 DNA 기술을 사용하여 변형된 폴리펩티드, 핵산 또는 세포에 의한 방법을 지칭하는 형용사로서 사용된다. 재조합 단백질은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산된 단백질이며 단백질이 생산된 방법을 나타내기 위해 주로 소문자 "r"이 약어로 붙는다 (예를 들어, rhIL2). 유사하게 세포가 재조합 DNA 기술을 사용하여 외인성 핵산 (예를 들어, ssDNA, dsDNA, ssRNA, dsRNA, mRNA, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터, 플라스미드, 코스미드 등)의 혼입 (예를 들어, 형질감염, 형질도입, 감염)에 의해 변형된 경우, 이러한 세포는 "재조합 세포"로서 지칭된다. 재조합 DNA 기술을 위한 기술 및 프로토콜은 문헌 [Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.] 및 기타 표준 분자 생물학 실험실 매뉴얼에서 찾을 수 있는 것과 같이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
반응: 예를 들어, 세포, 조직, 장기 또는 유기체의 "반응"이라는 용어는 평가가능한 생화학적 또는 생리학적 파라미터 (예를 들어, 농도, 밀도, 접착력, 증식, 활성화, 인산화, 이동, 효소 활성, 유전자 발현 수준, 유전자 발현 속도, 에너지 소비 속도, 분화 수준 또는 상태)에 있어서의 정량적 또는 정성적인 변화를 포괄하며, 여기서 이러한 변화는 활성화, 자극 또는 치료와 상관관계가 있거나, 또는 내부 메커니즘, 예컨대 유전적 프로그래밍과 상관관계가 있다. 특정 맥락에서 용어 "활성화", "자극" 등은 외부 또는 환경적 요인 뿐만 아니라 내부 메커니즘에 의해 조절되는 바와 같은 세포 활성화를 지칭하는 반면; 용어 "억제", "하향 조절" 등은 그 반대의 효과를 지칭한다. CD3 활성화된 1차 인간 T-세포의 증식을 평가하기 위한 이러한 표준 프로토콜의 예는 문헌 [Crouch, et al. (1993) "The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity " J. Immunol. Methods 160: 81-8]에 기재된 바와 같이 배양물에 존재하는 세포의 수에 정비례하는 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 신호를 생성하는 생물발광 검정, 또는 표준화된 상업적으로 입수가능한 검정 시스템, 예컨대 실질적으로 제조업체에 의해 제공한 지침에 따라 프로메가 코포레이션 (Promega Corporation; 미국 위스콘신주 53711 매디슨 우즈 할로우 로드 2800)으로부터 카탈로그 번호 G9241 및 G9681로서 상업적으로 입수가능한 셀타이터-글로® 2.0 세포 생육력 검정 또는 셀타이터-글로® 3D 세포 생육력 키트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시험 작용제의 투여에 대한 반응으로 T-세포의 활성화 수준은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 따라 STAT5 인산화 수준에 의해 결정된 바와 같이, 기재된 바와 같은 유동 세포계수 방법에 의해 결정될 수 있다. STAT5 인산화는 상기 문헌 [Horta, et al.; Garcia, et al.]에 기재된 바와 같은 유동 세포계수 기술을 사용하여 측정될 수 있거나, 또는 실질적으로 제조업체의 교시에 따라 상업적으로 입수가능한 키트, 예컨대 포스포-STAT5 (Tyr694) 키트 [퍼킨-엘머/시스바이오 (Perkin-Elmer/cisbio; 미국 매사추세츠주 월섬)로부터 부품 번호 64AT5PEG로서 상업적으로 입수가능함]를 사용하여 측정될 수 있다. 약어 ECACT가 아래 첨자와 함께 사용되는 경우, 이는 시험 프로토콜에 따라 측정된 바와 같은 시험 작용제의 적용에 대한 반응으로 T 세포에서 표시된 최대 STAT5 인산화 백분율을 초래하기에 충분한 시험 작용제의 농도를 나타내기 위해 제공된다. 예시로서, 약어 EC30 PRO는 포스포-STAT5 (Tyr694) 키트로 측정된 바와 같은 이러한 hIL2 오르토로그에 대한 반응으로 T 세포에서 STAT5 인산화의 최대 수준의 30%와 연관된 농도를 나타내기 위해 hIL2 오르토로그와 관련하여 사용될 수 있다.
일부 경우에, 분자에 대해 확립된 생물학적 활성의 표준화된 허용 측정 방법이 있다. hIL2 효능과 관련하여 예를 들어, 국제 단위 (IU)의 hIL2 효능 평가를 위한 표준 방법론은 문헌 [Wadhwa, et al. (2013) "The 2nd International standard for Interleukin -2 (IL2) Report of a collaborative study" Journal of Immunological Methods 397:1-7]에 보다 자세히 기재된 바와 같은 표준화 절차에 따라 뮤린 세포독성 T 세포주 CTLL-2에서 측정된다. 본 개시내용의 맥락에서, 특히 세포내 신호 형질도입 신호전달 (예를 들어, STAT5 인산화)을 제공하기 위한 삼량체 수용체 복합체의 모든 성분에 대한 필요성과 관련하여, 뮤린 IL2 수용체가 인간 IL2 수용체와 상이하게 기능한다는 점에 주목해야 한다. 예를 들어, 문헌 [Horta, et al., (2019) "Human and murine IL2 receptors differentially respond to the human-IL2 component of immunocytokines " Oncoimmunology 8(6):e1238538-1, e1238538-15 and Nemoto, et al. (1995) "Differences in the interleukin -2 (IL2) receptor system in human and mouse: alpha chain is require for formation of the functional mouse IL2 receptor" European J Immunology 25(11)3001-5]을 참조한다. 결과적으로, hIL2 변이체의 활성, 특히 CD25에 대한 친화도 또는 CD25 상태에 대한 세포 활성화를 평가할 때, 인간 저, 중간, 고 친화성 IL2 수용체 및 수용체 복합체의 생물학을 반복하는 인간 세포 또는 시스템의 사용이 선호되며 뮤린 시험 시스템 (예를 들어, 뮤린 세포를 사용하는 시험관내 시험 시스템 또는 마우스 생체내)에서 선택적 결합 또는 활성화를 나타내는 분자는 인간 시스템 (예를 들어, 인간 세포를 사용하는 시험관내 시험 시스템 또는 인간 대상체의 생체내)에서 이러한 선택적 활성을 반복하지 않을 수 있다.
선택적: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "선택적"은 특정한 세포 유형과 우선적으로 결합하고/거나 이를 활성화시키는 작용제의 특성을 지칭하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 조작된 CD122 ECD 폴리펩티드와 선택적으로 결합하여 이러한 CD122 ECD 폴리펩티드를 포함하는 수용체를 발현하는 세포가 이러한 동족 CD122 ECD 폴리펩티드를 포함하는 수용체에 대한 이러한 IL2 오르토로그의 결합에 반응하여 활성화되도록 하는 IL2 변이체 (IL2 오르토로그)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 이러한 오르토로그가 hoCD122 수용체를 발현하는 면역 세포의 우선적인 활성화를 나타낸다는 점에서 선택적인 hIL2 오르토로그를 제공한다. 선택성은 전형적으로 리간드/수용체 결합에 반응하여 유도된 활성에 특징적인 검정에서 측정된 활성에 의해 평가된다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그의 선택성은 CD25를 발현하는 세포 (예를 들어, YTCD25POS 또는 YTCD25+ 세포)의 활성화와 현저히 더 낮은 (바람직하게 검출 불가능한) 수준의 CD25를 나타내는 세포 (예를 들어, YTCD25NEG 또는 YTCD25- 세포)의 활성화를 비교함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 선택성은 비교적 낮은 수준의 CD25를 발현하는 T 세포 (예를 들어, 자극되지 않은 CD8+ T 세포)의 활성화와 비교한 비교적 높은 수준의 CD25를 발현하는 T 세포 (예를 들어, Treg)의 활성화에 의해 측정된다.
상당히 감소된 결합: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "상당히 감소된 결합을 나타낸다"는 자연적으로 발생하는 형태의 수용체에 대한 변이체 리간드의 결합에 비해 변형된 형태의 수용체 (예를 들어, 직교 CD122)에 대한 리간드 변이체 (예를 들어, 오르토로그)의 결합 친화도과 관련하여 사용된다. 일부 실시양태에서, 리간드 (예를 들어, 오르토로그)는 직교 리간드가 자연적으로 발생하는 리간드의 20% 미만, 대안적으로 약 10% 미만, 대안적으로 약 8% 미만, 대안적으로 약 6% 미만, 대안적으로 약 4% 미만, 대안적으로 약 2% 미만, 대안적으로 약 1% 미만, 또는 대안적으로 약 0.5% 미만의 친화도로 천연 형태의 수용체와 결합하는 경우 천연 형태의 수용체에 대해 상당히 감소된 결합을 나타낸다. 유사하게, 직교 수용체는 천연 형태의 리간드가 자연적으로 발생하는 수용체의 20% 미만, 대안적으로 약 10% 미만, 대안적으로 약 8% 미만, 대안적으로 약 6% 미만, 대안적으로 약 4% 미만, 대안적으로 약 2% 미만, 대안적으로 약 1% 미만, 또는 대안적으로 약 0.5% 미만의 친화도로 직교 형태의 수용체와 결합하는 경우 천연 형태의 리간드에 대해 상당히 감소된 결합을 나타낸다.
특이적으로 결합한다: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "특이적으로 결합한다"는 한 분자가 또 다른 분자와 결합하는 친화성의 정도를 지칭한다. 결합 쌍 (예를 들어, 리간드/수용체, 항체/항원, 항체/리간드, 항체/수용체 결합 쌍)의 맥락에서, 결합 쌍의 제1 분자가 샘플에 존재하는 다른 성분과 상당한 양으로 결합하지 않을 때, 이러한 결합 쌍의 제1 분자는 결합 쌍의 제2 분자와 특이적으로 결합한다고 한다. 제2 분자에 대한 제1 분자의 친화성이 샘플에 존재하는 다른 성분에 대한 제1 분자의 친화성보다 적어도 2배 초과, 대안적으로 적어도 5배 초과, 대안적으로 적어도 10배 초과, 대안적으로 적어도 20배 초과, 또는 대안적으로 적어도 100배 초과할 때, 결합 쌍의 제1 분자는 결합 쌍의 제2 분자와 특이적으로 결합한다고 한다. 결합 쌍의 제1 분자가 항체인 특정한 실시양태에서, 이러한 항체와 결합 쌍의 제2 분자 간의 평형 해리 상수가, 예를 들어 스캐차드(Scatchard) 분석 (문헌 [Munsen, et al. 1980 Analyt. Biochem. 107:220-239])에 의해 결정된 바와 같이 약 106 M 초과, 대안적으로 약 108 M 초과, 대안적으로 약 1010 M 초과, 대안적으로 약 1011 M 초과, 대안적으로 약 1010 M 초과, 약 1012 M 초과인 경우, 항체는 결합 쌍의 제2 분자 (예를 들어, 단백질, 항원, 리간드 또는 수용체)와 특이적으로 결합한다. 리간드가 IL2 오르토로그이고 수용체가 직교 CD122 ECD를 포함하는 한 실시양태에서, IL2 오르토로그/직교 CD122 ECD의 평형 해리 상수가 약 105 M 초과, 대안적으로 약 106 M 초과, 대안적으로 약 107 M 초과, 대안적으로 약 108 M 초과, 대안적으로 약 109 M 초과, 대안적으로 약 1010 M 초과, 또는 대안적으로 약 1011 M 초과인 경우, IL2 오르토로그는 특이적으로 결합한다. 특이적 결합은 경쟁 ELISA, 방사성 리간드 결합 검정 (예를 들어, 포화 결합, 스캐차드 플롯, 비선형 곡선 피팅 프로그램 및 경쟁 결합 검정); 비-방사성 리간드 결합 검정 (예를 들어, 형광 편광 (FP), 형광 공명 에너지 전달 (FRET)); 및 GE 헬스케어 바이오-사이언시스(GE Healthcare Bio-Sciences)로부터 상업적으로 입수가능한 기기, 예컨대 비아코어(Biacore) 8+, 비아코어 S200, 비아코어 T200 (GE 헬스케어 바이오-사이언시스; 미국 매사추세츠주 01752 말버러 리절츠 웨이 100)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정 (예를 들어, 문헌 [Drescher et al., (2009) Methods Mol Biol 493:323-343] 참조); 액체상 리간드 결합 검정 (예를 들어, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-qPCR), 및 면역침전); 및 고체상 리간드 결합 검정 (예를 들어, 멀티웰 플레이트 검정, 온-비드 리간드 결합 검정, 온-컬럼 리간드 결합 검정 및 필터 검정)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 평가될 수 있다.
대상체: 용어 "수용자", "개체", "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며 진단, 치료 또는 요법이 필요한 임의의 포유류 대상체, 특히 인간을 지칭한다. 치료 목적상 "포유류"는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원 동물, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 양, 염소, 돼지 등을 포함한, 포유류로서 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 포유류는 인간이다.
앓고 있는: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "앓고 있는"은 질환, 장애 또는 병태의 확인을 위해 X-선, CT-스캔, 기존의 실험실 진단 시험 (예를 들어, 혈구 계수 등), 게놈 데이터, 단백질 발현 데이터, 면역조직화학을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 분야에서 허용되는 이용가능한 정보에 기초하여 대상체와 관련하여, 대상체가 치료를 필요로 하거나 치료로부터 혜택을 받도록 의사가 내린 결정을 지칭한다. 용어 "앓고 있는"은 전형적으로 특정한 질환 상태, 예컨대 "신생물성 질환을 앓고 있는"과 연계해서 사용되며, 신생물이 존재하는 것으로 진단된 대상체를 지칭한다.
실질적으로 순수한: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 순수한"은 특정 성분 (예를 들어, 폴리펩티드)이 조성물의 총 함량의 약 50% 초과하며, 전형적으로 총 폴리펩티드 함량의 약 60% 초과한다는 것을 나타낸다. 보다 전형적으로, "실질적으로 순수한"은 총 조성물의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 그 초과가 관심 성분인 조성물을 지칭한다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 조성물의 총 함량의 약 90%를 초과하거나, 또는 약 95%를 초과할 것이다.
T-세포: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "T-세포" 또는 "T 세포"는 통상적으로 흉선에서 분화되고, 특이적 세포 표면 항원 수용체를 보유하고, 세포 매개 및 체액성 면역의 개시 또는 억제를 제어하는 일부 및 항원 보유 세포를 용해시키는 다른 일부를 포함하는 림프구를 지칭하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서 T 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 세포독성 CD8+ T 세포, 나이브 CD4+ T 세포, 헬퍼 T 세포, 예를 들어 TH1, TH2, TH9, TH11, TH22, TFH; 조절 T 세포, 예를 들어 TR1, Treg, 유도성 Treg; 기억 T 세포, 예를 들어, 중심 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, NKT 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL); 및 CAR-T 세포, 재조합적으로 변형된 TIL 및 TCR 조작된 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 이러한 T-세포의 조작된 변이체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
치료상 유효량: 단독으로 또는 제약 조성물 또는 치료 레지멘의 일부로서, 대상체에게 투여될 때 질환, 장애 또는 병태의 임의의 증상, 양상 또는 특징에 대해 임의의 검출가능하고 긍정적인 효과를 가질 수 있는 양의 단일 용량 또는 일련의 용량의 일부로서 대상체에게 작용제를 투여하는 것과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 문구 "치료상 유효량". 치료상 유효량은 관련된 생리학적 효과를 측정함으로써 확인할 수 있으며, 이는 투여 레지멘과 연계해서 및 대상체의 상태 등에 대한 진단 분석에 반응하여 조정될 수 있다. 작용제의 치료상 유효량을 결정하기 위한 평가 파라미터는 연령, 체중, 성별, 일반 건강, ECOG 점수, 관찰가능한 생리학적 파라미터, 혈액 수준, 혈압, 심전도, 컴퓨터 단층 촬영, X선 등의 지표를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 허용되는 진단 기준을 사용하여 의사에 의해 결정된다. 대안적으로 또는 또한, 치료상 유효량의 작용제가 대상체에게 투여되었는지 여부를 결정하기 위해, 작용제의 투여에 반응하여 대상체의 병태 개선 평가를 위해 관련 분야의 임상의가 의존하는, 임상 환경에서 통상적으로 평가되는 다른 파라미터, 예컨대 체온, 심박수, 혈액 화학의 정규화, 혈압의 정규화, 콜레스테롤 수치의 정상화, 또는 질환, 장애 또는 병태의 임의의 증상, 양상 또는 특징, 바이오마커 (예컨대 염증성 시토카인, IFN-γ, 그랜자임 등), 혈청 종양 마커의 감소, 고형 종양 반응 평가 기준 (RECIST) 개선, 면역 관련 반응 기준 (irRC) 개선, 생존 지속 기간 증가, 질환 진행이 없는 생존 지속 기간 연장, 질환이 진행되기까지의 시간 연장, 치료가 실패되기까지의 시간 증가, 악화되지 않는 생존 지속 기간 연장, 다음 치료까지의 시간 연장, 객관적인 반응률 개선, 반응 지속 기간 개선, 종양 부담 감소, 완전 반응, 부분 반응, 안정 질환 등을 모니터링할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 표적 병변에 대한 용어 "완전 반응 (CR)", "부분 반응 (PR)", "안정 질환 (SD)" 및 "진행성 질환 (PD)"; 및 비-표적 병변에 대한 용어 "완전 반응(CR)", "불완전 반응/안정 질환 (SD)" 및 진행성 질환 (PD)은 RECIST 기준에 정의된 바와 같이 이해된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "면역 관련 완전 반응 (irCR)", "면역 관련 부분 반응 (irPR)", "면역 관련 진행성 질환 (irPD)" 및 "면역 관련 안정 질환 (irSD)"은 면역 관련 반응 기준 (irRC)에 따라 정의된 바와 같다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "면역 관련 반응 기준 (irRC)"은 문헌 [Wolchok, et al. (2009) Guidelines for the Evaluation of Immune Therapy Activity in Solid Tumors: Immune-Related Response Criteria, Clinical Cancer Research 15(23): 7412-7420]에 기재된 바와 같이 면역요법에 대한 반응을 평가하기 위한 시스템을 지칭한다. 치료상 유효량은 투여 레지멘 및/또는 대상체의 상태 및 전술한 인자의 변동에 대한 평가와 연계해서 대상체의 치료 과정에 걸쳐 조정될 수 있다. 한 실시양태에서, 치료상 유효량은 단독으로 또는 또 다른 작용제와 조합하여 사용될 때 포유류 대상체에게 투여하는 과정에서 비가역적인 심각한 유해 사례를 일으키지 않는 작용제의 양이다.
막횡단 도메인: 용어 "막횡단 도메인" 또는 "TM"은 막 전역에 걸쳐 있는 폴리펩티드가 세포막과 연합될 때, 이는 세포막에 포매되고 막 전역에 걸쳐 있는 폴리펩티드의 세포외 도메인 (ECD) 및 세포내 도메인 (ICD)과 펩티딜 연결되어 있는 막 전역에 걸쳐 있는 폴리펩티드 (예를 들어, 막 전역에 걸쳐 있는 폴리펩티드, 예컨대 CD122 또는 CD132 또는 CAR))의 도메인을 지칭한다. 막횡단 도메인은 세포외 및/또는 세포내 도메인 중 어느 하나 또는 둘 다와 상동 (자연적으로 연합됨) 또는 이종 (자연적으로 연합되지 않음)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 직교 수용체가 유래되는 동족 수용체의 ECD 도메인과 천연적으로 연합된 막횡단 도메인이다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 직교 수용체가 유래되는 동족 수용체의 ICD 도메인과 천연적으로 연합된 막횡단 도메인이다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 증식 신호전달 도메인과 천연적으로 연합된 막횡단 도메인이다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 상이한 단백질과 천연적으로 연합된 막횡단 도메인이다. 대안적으로, 직교 수용체의 막횡단 도메인은 형질막 전역에 걸쳐 있는 인공 아미노산 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 직교 수용체의 막횡단 도메인은 직교 수용체가 유래되는 동족 수용체의 ICD와 정상적으로 연합된 막횡단 도메인이다. 일부 실시양태에서, 수용체가 제1 모 수용체로부터 유래된 세포내 도메인 및 제2 상이한 모 수용체로부터 유래된 제2 세포외 도메인을 포함하는 키메라 수용체인 경우, 키메라 수용체의 막횡단 도메인은 키메라 수용체가 유래되는 모 수용체의 ICD 또는 ECD와 정상적으로 연합된 막횡단 도메인이다.
치료하다: 용어 "치료하다", "치료하는 것", "치료" 등은 대상체에서 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 증상이 진단되었거나 관찰된 후, 대상체를 괴롭히는 그러한 질환, 장애 또는 병태의 근본 원인 중 적어도 한 가지, 또는 그러한 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상 중 적어도 한 가지를 일시적 또는 영구적으로 제거, 감소, 저해, 완화 또는 개선시키도록 이러한 대상체에 대해 개시되는 조치 과정 (예컨대 IL2, CAR-T 세포, 또는 이를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것)을 지칭한다. 치료는 질환을 앓고 있는 대상체에 대해 취해진 조치 과정을 포함하며, 여기서 조치 과정은 대상체에서 질환의 억제 (예를 들어, 질환, 장애 또는 병태의 발생을 정지시키거나 이와 연관된 한 가지 이상의 증상을 개선함)를 초래한다.
Treg 세포 또는 조절 T 세포: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "조절 T 세포" 또는 "Treg 세포"는 이펙터 T 세포 (Teff)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 T 세포의 반응을 억제할 수 있는 CD4+ T 세포 유형을 지칭한다. Treg 세포는 IL2 수용체 (CD25)의 a-서브유닛인 CD4 및 전사 인자 포크헤드 박스 P3 (FOXP3)의 발현을 특징으로 한다 (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004). "통상적인 CD4+ T 세포"는 조절 T 세포 이외의 CD4+ T 세포를 의미한다.
변이체: 용어 "단백질 변이체" 또는 "변이체 단백질" 또는 "변이체 폴리펩티드"는 적어도 하나의 아미노산 변형으로 인해 모 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 모 폴리펩티드는 자연적으로 발생하는 또는 야생형 (WT) 폴리펩티드일 수 있거나 WT 폴리펩티드의 변형된 버전일 수 있다. 용어 변이체 폴리펩티드는 폴리펩티드 자체, 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 이를 코딩하는 핵산 서열을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드는 모 폴리펩티드와 비교하여 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 변형, 대안적으로 모 폴리펩티드와 비교하여 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 변형, 대안적으로 모 폴리펩티드와 비교하여 약 1개 내지 약 3개의 아미노산 변형, 대안적으로 모 폴리펩티드와 비교하여 약 1개 내지 약 2개의 아미노산 변형, 대안적으로 모 폴리펩티드와 비교하여 단일 아미노산 변형을 포함한다. 변이체는 이러한 변이체가 유래되는 모 폴리펩티드와 적어도 약 99% 동일, 대안적으로 적어도 약 98% 동일, 대안적으로 적어도 약 97% 동일, 대안적으로 적어도 약 95% 동일, 또는 대안적으로 적어도 약 90% 동일할 수 있다.
야생형: 본원의 "야생형" 또는 "WT" 또는 "천연"은 대립형질 변이를 포함하여 자연에서 발견되는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. WT 단백질, 폴리펩티드, 항체, 이뮤노글로불린, IgG 등은 인간의 손에 의해 변형되지 않은 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
특정 실시양태의 설명
입양 세포 요법(들):
"입양 세포 요법" 또는 간단히 "세포 요법"은 외인성으로 조작된 세포, 특히 면역 세포의 투여를 지칭하기 위해 사용된다. 입양 세포 요법의 한 가지 형태는 종양 조직으로부터 단리된 외인성으로 조작된 림프구 ("종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"로서 지칭됨)를 사용한다. 이러한 TIL은 종양 항원에 노출되었으므로, 종양 세포를 공격할 수 있으나 이러한 TIL은 공급이 너무 부족하거나 또는 "소진"되어 독립적으로 종양을 제거할 수 없는 것으로 여겨진다. TIL 요법에서, 단리된 TIL은 생체외 배양되어 그 수를 확장하고, 활성화제에 노출되며 또한 세포가 단리된 환자에게 재주입되었다 ("자가 세포 요법"으로서 지칭됨). TIL 세포 요법은 인간 대상체에서 신생물성 질환의 치료에 효능을 갖는 치료 방식인 것으로 기록되어 있다. 예를 들어, 1992년 6월 30일에 허여된 미국 특허 번호 5,126,132A (Rosenberg) 및 문헌 [Spiess, et al. (1987) J Natl Cancer Inst 79:1067-1075]을 참조한다.
현재 실시에서, 인간 TIL 세포 요법은 절제된 종양 물질로부터 수득된 TIL의 생체외 확장 및 대상체에 림프고갈 예비 레지멘을 적용한 후 대상체 내로의 입양 전달 및 인터류킨-2 (IL-2) 투여에 의한 입양 전달된 세포의 후속 지원으로 이루어진다. 림프고갈 예비 레지멘은 Treg를 고갈시키고 세포성 "싱크"를 제거하며 종종 입양 전달된 세포를 위한 "룸을 만드는 것"으로 특징지어진다. IL-2의 전신 투여는 생체내 재주입된 TIL의 지속성을 지원한다. 전형적인 임상 실시에서, TIL 주입 직후 환자는 최대 내성에 도달할 때까지 8시간마다 고 용량 IL-2 (720,000 IU/kg)를 정맥내 투여받는다. IL-2로의 이러한 후속 지원은 TIL의 생존 및 임상 효능을 추가로 증진시키는 것으로 생각된다.
비록 그 임상 효과가 입증되었으나, TIL 세포 요법은 범혈구감소증 및 열성 호중구감소증을 초래하는 림프고갈 예비 레지멘 및 강화된 TIL 세포 집단의 재투여 후 고 용량 IL-2를 사용한 지원 레지멘으로부터 주로 발생하는 상당한 독성과 연관이 있다. 입양 세포 요법의 지원 요법에 전형적으로 사용되는 고 용량 IL2의 효과는 상당한 독성을 초래하는 것으로 널리 기록되어 있다. 입양 세포 전달 (ACT) 후 IL-2 지원 요법의 사용으로 인해 관찰되는 가장 흔한 부작용은 오한, 고열, 저혈압, 핍뇨, 및 전신 염증성 및 모세혈관 누출 증후군으로 인한 부종 뿐만 아니라 자가면역 현상, 예컨대 백반증 또는 포도막염에 대한 보고를 포함한다.
TIL 세포 요법은 또한 단리된 T 세포의 생체외 확장으로 인해 발생하는 문제를 가지고 있다. TIL의 생체외 확장은 상당한 기간 동안 고 용량 IL2의 존재 하에 수행된다. IL-2는 활성화된 T 림프구의 증식 및 확장을 촉진하고, B 세포 성장을 강화시키며 단핵구 및 자연 살해 세포를 활성화시킨다. 그러나, TIL 확장 프로세스 동안, 빈도가 증가하거나 감소하는 상이한 T-세포 클론과의 클론 간 경쟁이 있다. 투여될 최종 TIL 산물이 종양 특이적 클론에 대해 가능한 한 강화되는 것이 바람직하기 때문에, hIL2의 비-특이적 성질은 종양 특이적 항원 경험 T 세포 클론에 대한 선택적 지원을 제공하지 못하며, 가장 효과적인 종양 반응성 T 세포 클론은 hIL2의 비-특이적 T-세포 증식 효과로 인해 생체외 확장 단계 동안 경쟁에서 뒤처지고 희석될 수 있을 것이다. 결과적으로, 대상체에게 재주입될 TIL 세포 산물은 항종양 TIL (종양 항원 경험 세포)의 집단이 대상체에게 재주입되는 세포 산물의 총 세포 수의 최적 이하 분율 (예를 들어, 60% 미만, 대안적으로 50% 미만, 대안적으로 40% 미만, 대안적으로 30% 미만)을 나타낼 수 있다. 추가적으로, 생체외 자극 절차에 따른 T 세포의 T-세포 분화 정도는 재주입 후 생체내 TIL의 생존, 증식 능력 및 효능에 영향을 미칠 수 있다 (Li, et al. (2010) J Immunol. 2010; 184: 452-465). IL2의 높은 효능 및 고 용량 IL2에 대한 배양 TIL의 노출 효과는 생체외에서 그의 존재 하에 배양된 T 세포의 말단측 분화 뿐만 아니라 생체내 다른 부작용에 더하여 자가면역 및 이식 거부의 매개와 연관이 있었다.
상기 문헌 [Li, et al.]이 명시한 바와 같이:
우리의 연구로부터 나온 핵심 질문은 REP를 수행하는 다른 방법을 사용하는 것이 CD28 발현의 유지와 연관된 "더 젊은" 표현형을 갖는 REP-후 T 세포 및 ACT 동안 생체내에서 더 나은 지속성을 가질 수 있는 기타 이펙터-기억 마커 생성할 수 있는지 여부이다. 다시 말해서, 지속적인 세포 분열과 생체내 장기간 생존에 유리한 기억 표현형을 유지하면서도 많은 수의 종양 반응성 세포독성 T 세포를 생성함으로써 두 분야의 장점을 모두 가질 수 있는가? (Li, et al. at page 465).
더욱이, 상기 문헌 [Li, et al.]은 IL2를 수반하는 현재의 생체외 프로토콜로 인한 TIL의 말단측 분화 상태가 현재 TIL 요법의 문제이며 TIL의 생체외 준비에서 IL-2의 영향을 피하기 위해 다른 시토카인, 예컨대 IL-15 또는 IL-21의 잠재적 사용을 제안한다. 그러나, ACT 이후 고 용량 IL2 요법을 사용하는 TIL의 지원은 개선된 치료 결과와 연관이 있다. 그러나, 고 용량 IL2 요법은 인간 대상체에서 상당한 독성과 연관이 있으며, 이전에 언급된 바와 같이, TIL 요법이 직면한 주요 과제 중 하나이다. 결과적으로, 이러한 원하는 종양 항원 경험 T 세포의 집단을 분화 및/또는 소진으로 유도하지 않으면서 생체외에서 종양 항원 경험 T 세포의 생육력 및/또는 증식을 지원하는 방법을 제공하는 것이 바람직하다.
조작된 세포 요법
TIL 세포 요법 외에도, 부분적으로 인간 면역 체계가 종양을 제거할 수 있다는 입증에서 영감을 받아, 면역 세포가 특히 바람직한 특성을 갖도록 조작하기 위한 다양한 접근 방식이 연구되어 왔다. 임상적으로 입증되었으며 인간용으로 승인된 조작된 면역 세포의 그러한 범주 중 하나는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작된 면역 세포의 사용이다. 프리-B 세포 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 또는 B 세포 림프종 환자를 대상으로 한 초기 임상 시험에서 CAR T 세포 요법은 혁신적이었으며 또한 표준 치료에 불응성인 환자를 위한 치료 옵션의 가능성을 제시하였다. 이러한 초기 시험은 급성 림프구성 백혈병 (ALL)과 특정 유형의 B 세포 림프종 둘 다에 대한 항-CD19 CAR T 세포 산물에 대한 FDA의 신속한 승인을 가져왔다. CAR T 요법을 사용한 혈액 악성종양 질환 치료의 초기 임상 반응은 인간 대상체에서 보고된 초기 반응률이 90% 이상으로 매우 유망하며 CAR-T의 개발에 대한 중요한 연구를 촉진했으며 다양한 CAR-T 접근 방식이 다양한 신생물성 질환의 치료를 위한 다양한 전임상 및 임상 개발 단계에 있다.
CAR-T 세포의 1차 표적화 및 활성화 성분은 CAR이며, 전형적으로 종양 항원 특이적 표적화 도메인 및 부가의 구조 (예를 들어, 힌지, 막횡단) 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 다기능적 다단백질이다. 다양한 CAR 설계가 문헌에서 제안되었으며, 이는 주로 신호전달 도메인의 아키텍처를 기반으로 1세대, 2세대, 3세대 또는 4세대 CAR로 분류된다. 용어 1세대 CAR은 세포내 도메인이 단일 신호전달 도메인, 예를 들어 IgE FcεR1g 또는 CD3ζ 쇄에 대한 고 친화성 수용체로부터 유래된 신호전달 도메인을 통해서만 항원 결합으로부터의 신호를 전달하는 CAR을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 항원 의존성 T-세포 활성화를 위한 1개 또는 3개의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(들) [ITAM(들)]를 함유한다. ITAM-기반 활성화 신호는 T-세포에 표적 종양 세포를 용해하고 항원 결합에 대한 반응으로 시토카인을 분비할 수 있는 능력을 부여한다. 2세대 CAR은 CD3 ζ 신호 외에 공동-자극 신호를 포함한다. 전달된 공동-자극 신호의 동시 전달은 CAR-형질도입된 T-세포에 의해 유도된 시토카인 분비 및 항종양 활성을 증진시킨다. 공동-자극 도메인은 통상적으로 CD3ζ 도메인에 대해 막 근위부이다. 3세대 CAR은 3부 신호전달 도메인을 포함하며, 예를 들어 CD28, CD3ζ, OX40 또는 4-1BB 신호전달 영역을 포함한다. 4세대, 또는 "장갑차" CAR T-세포는 IL-12, IL-18, IL-7 및/또는 IL-10; 4-1BB 리간드, CD-40 리간드의 발현과 같은 면역 활성을 증진시키기 위해 분자 및/또는 수용체를 발현 또는 차단하도록 추가로 변형된다.
세포내 신호전달 도메인이 조작된 CAR-T 세포의 활성화 및 증식에 중요하긴 하지만, 임상 적용에서 CAR-T의 표적 및 그의 상응하는 것을 규정하는 것은 세포외 표적화 도메인 (또는 ABD)이다. 세포외 표적화 항원 결합 도메인 (ABD)은 전형적으로 CAR-T 세포의 선택적 표적화를 제공하기 위해 신생물 세포의 특징적인 세포 표면 항원 (펩티드 또는 글리칸)과 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv 또는 VHH)을 포함한다. 자가면역 반응을 포함한 CAR-T 세포의 잠재적인 부작용 및 독성을 최소화하기 위해, 표적화를 위한 종양 항원을 선택할 때, 항원이 치료받을 대상체의 정상 세포보다 종양 세포 유형에서 유의미하게 더 우세하도록 하는 것이 바람직하다. 항체 결합 분자가 확인되고 이들의 임상 치료 표적이 되는 이러한 종양 항원의 예는 CD19 (예를 들어, 혈액 악성종양, 예를 들어 ALL, CLL, B 세포 림프종), CD20 (예를 들어, 불응성 또는 재발성 CD20+ B 세포 림프종), BCMA (예를 들어, 다발성 골수종, 문헌 [Carpenter, et al. (2013) Clin Cancer Res; 19(8); 2048-60]), CD22 (문헌 [Pan, et al. (2019) Leukemia 33, 2854-2866]에 기재된 바와 같은 소아 B 세포 전구체 ALL을 포함한 B-세포 악성종양), CD30 (예를 들어, 호지킨 림프종을 포함한 CD30+ 림프종; 문헌 [Grover, (2019) BMC Cancer 19, 203]), CD70 (예를 들어, 급성 골수성 백혈병 (AML; 문헌 [Sauer, et al. (2019) Blood 134 (Supplement_1): 1932]), 루이스 Y (예를 들어, AML; 문헌 [Ritchie, et al. (2013) Molecular Therapy 21(11):2122-9]), GD2 (예를 들어, 신경교종; 문헌 [Mount, et al. (2018) Nat Med 24, 572-579]), GD3 (예를 들어, 전이성 흑색종 및 신경외배엽 종양; 문헌 [Agnes, et al. (2010) DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-10-0043]), 메소텔린 (예를 들어, 중피종, 폐, 췌장, 유방, 난소 및 기타 종양 등; 문헌 [Beatty, et al., (2014) Cancer Immunol Research 2(2)]), ROR-1 (예를 들어, 만성 림프구성 백혈병; 문헌 [Aghebati-Maleki, et al. (2017) Biomedicine and Pharmacology 88: 814-822]), CD44 (예를 들어, AML 및 다발성 골수종; 문헌 [Casuccia, et al. (2013) Blood 122 (20): 3461-3472]), CD171 (예를 들어, 신경모세포종; 문헌 [Kunkele, et al. (2017) Clin Cancer Research 23(2):466-477]); EGP2, EphA2 (예를 들어, 교모세포종; 문헌 [Yi, et al. (2018) Molecular Therapy: Methods & Clinical Development 9:70-80]), ErbB2, ErbB3/4, FAP, FAR IL11Ra, PSCA (전립선암), PSMA (전립선암), NCAM, HER2(, NY-ESO-1, MUC1, CD123, FLT3, B7-H3, CD33, IL1RAP, CLL1 (CLEC12A)PSA, CEA, VEGF, VEGF-R2, c-Met, 당지질 F77, FAP, EGFRvIII, MAGE A3, 5T4, WT1, KG2D 리간드, 엽산 수용체 (FRa) 및 Wnt1 항원을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. CD123. 추가적으로, ABD는 하나 초과의 항원과 결합할 수 있는 능력을 지니고 있다는 점에서, 특히 하나 초과의 종양 항원 (예를 들어, 문헌 [Zah, et al. (2016) Cancer Immunol Res; 4(6); 498-508]에 기재된 바와 같은 CD19 및 CD20; 문헌 [Tu, et al. (2019) Frontiers in Oncology 9:1350]에 기재된 바와 같은 CD19 및 CD22)에 대해 특이성을 가질 수 있다는 점에서 다가성일 수 있다.
이러한 항원의 한 가지 특정한 예는 95 kDa 당단백질 CD19이다. CD19는 대부분의 B 세포 림프종, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발 세포 백혈병 및 일부 급성 골수성 백혈병 (AML)에 의해 발현되지만 CD19는 정상 B 세포를 제외한 대부분의 정상 조직에는 존재하지 않는다. 다양한 임상 개발 단계에 있는 다수의 CAR-T 산물 후보가 있긴 하지만, 항-CD19 CAR 세포 산물 액시캅타진 실로류셀 (길리어드 파마슈티칼즈로부터 상업적으로 입수가능한 예스카르타®로서 판매됨) 및 티사겐레클류셀 (노바티스로부터 상업적으로 입수가능한 킴리아®로서 판매됨)이 현재 인간에게 사용하기 위해 주요 규제 기관에 의해 승인된 유일한 CAR-T 세포 요법이며, 다양한 CAR-T 요법은 다양한 신생물성 질환의 치료를 위한 다양한 전임상 및 임상 개발 단계에 있다.
CAR T 요법을 사용한 신생물성 질환 치료의 초기 임상 반응은 인간 대상체에서 보고된 초기 반응률이 90% 이상으로 매우 유망하며, 승인된 항-CD19 CAR 작용제에 대한 임상 경험과 관련된 문헌의 증가는 그러한 작용제로 치료된 대상체의 상당한 분율이 질환 상태의 재발을 겪는 것으로 밝혀졌다. 이러한 환자에서의 지속적인 반응 결여는 주로 CAR-T 세포 산물의 투여 후 불량한 CAR-T 세포 지속성 및/또는 항원 손실 또는 조정로 인한 암세포 내성에 기인한다. 환자가 견딜 수 있는 용량으로 IL2를 투여하는 것은 신생물성 질환의 재발 및 회귀를 초래하는 입양 전달된 세포의 활성화된 집단의 장기적인 선택적 유지를 제공하지 못한다.
본 개시내용은 이러한 문제를 극복하고 CAR T 요법을 비롯한 입양 조작된 세포 요법의 사용, 특히 조작된 세포의 지속성이 특히 핵심인 고형 종양의 치료를 위한 새로운 기회를 열어주는 방법 및 조성물을 제공한다.
입양 전달된 인간 면역 세포는 투여 후 비교적 빠르게 활성을 상실한다는 것이 널리 확립되어 있다. 결과적으로, 이러한 급속한 기능 상실을 해결하기 위한 전형적인 수단은 (a) 세포가 유효성을 상실하기 전에 종양에 대한 세포 요법제의 노출을 최대화하기 위한 과도하게 고 용량의 세포 요법제의 투여, 및/또는 (b) 입양 전달된 세포의 효능을 지원하기 위한 시도의 HD-hIL2 요법의 전신 투여이다. 이러한 접근 방식 둘 다는 상당한 독성을 나타낸다. HD-hIL2 요법과 연관된 독성은 이미 상기에서 논의되었다. 고 용량의 조작된 세포 요법제는 생명을 위협하는 시토카인 방출 증후군 (CRS)과 연관이 있다. 현재 입수가능한 산물은 치료를 받은 대부분의 대상체에서 모든 등급의 CRS를 나타내었으며, 상당한 분율의 환자에서 등급 3 이상의 CRS를 나타냈다. 대부분의 환자에서 상당한 신경독성이 또한 관찰된다. 그러나, 더 낮은 용량의 세포 요법제는 임상 결과의 상당한 감소와 연관이 있다. 추가적으로, 주로 세포 요법 산물의 지속성 결여로 인해, 처음에는 세포 요법에 잘 반응하는 것처럼 보이는 많은 환자가 재발한다. 현재, 기존의 CD-19 세포 요법제로 치료받은 환자의 대략 60%가 재발하는 것으로 보고되고 있다 (Byrne M, et al. (2019) Biology of Blood and Marrow Transplantation 25(11):344-251).
하기에 보다 자세히 기재되는 실험 결과가 명확하게 보여주는 바와 같이, 직교 리간드와 조합된 직교 세포의 투여는 현재의 세포 요법의 많은 문제를 해결하고 하기를 포함하나 그에 제한되지는 않는 세포 요법을 잘 받아들이는 질환의 개선된 치료 방법을 제공한다:
· 다른 면역 세포의 상당한 오프 타겟 전신 활성화 없이 생체내에서 입양 전달된 인간 면역 세포의 집단을 선택적으로 확장할 수 있게 하는 조성물 및 방법;
· 지원 작용제와 연관된 심각한 독성 없이 활성화된 직교 세포 입양 전달된 인간 면역 세포의 지속성을 지원하는 조성물 및 방법;
· 이전에 비효과적인 것으로 보고되었고 유사한 세포 요법 산물의 현재 투여량보다 현저히 더 낮은 (10-1000배) 용량으로 세포 요법제의 초기 용량을 사용하여 포유류 대상체에서 신생물성 질환의 치료에서 세포 요법 산물의 생체내 치료 유효성을 달성하는 조성물 및 방법;
· 직교 리간드의 주기적 투여에 의해 장기간 동안 치료상 유효 수준에서 직교 면역 세포의 치료 수준을 유지할 수 있게 하는 조성물 및 방법;
· 부가의 조작된 직교 세포를 투여할 필요 없이 이전에 투여된 직교 세포의 유효성을 되살리기 위해 직교 리간드의 투여에 의해 신생물성 병태의 재발을 치료할 수 있게 하는 조성물 및 방법;
· 활성화 직교 리간드를 제거하고 "킬 스위치"를 포함하거나 면역고갈 또는 면역억제 치료 레지멘을 이용하도록 세포를 추가로 조작할 필요 없이 활성화된 형태의 직교 세포 요법에 대한 대상체의 노출을 일시적 또는 영구적으로 중단할 수 있게 하는 직교 세포의 활성 및 증식의 선택적 조정을 제공하는 조성물 및 방법; 상당한 독성 없이 세포 산물을 투여한 후 포유류 대상체에서 입양 전달된 세포의 증식을 저해하지 않으면서 반응을 위한 세포;
· 입양 세포 요법 이전에 대상체의 사전 면역고갈에 대한 필요성을 피하는 조성물 및 방법;
· 직교 리간드, 특히 지원 직교 리간드의 덜 빈번한 투여를 가능하게 하는 연장된 작용 지속 기간을 갖는 직교 리간드의 제약 제형;
· 유사한 적응증에 대해 기존의 세포 요법제보다 우수한 입증가능한 치료적 항종양 효능을 제공하는 조성물 및 방법; 및
· 보충 치료제와 조합될 때 증진된 항종양 효능을 제공하는 조성물 및 방법.
특히 입양 세포 요법의 맥락에서 직교 시스템으로 고생하는 포유류 대상체에서 신생물성 질환 상태를 앓고 있는 포유류 대상체의 치료에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법의 유용성 및 기능성을 입증하기 위한 일련의 실험이 수행되었다. 본 개시내용의 조성물 및 방법의 유용성은 첨부된 실시예 및 첨부된 도면에 제공된 데이터에서 보다 충분히 상세하게 기재된 바와 같은 일련의 실험에서 평가되었다.
간단히 언급하면, wt hIL2에 따라 넘버링된 아미노산 치환 세트: [desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]를 함유하고 하기 아미노산 서열을 갖는 hIL2 변이체 (종종 본원에서 "오르토IL2" 및 "hoIL2"로서 지칭되기도 함)인 식 1의 대표적인 인간 IL2 오르토로그를 사용하여 일련의 시험관내 및 생체내 실험을 시행하였다:
Figure pct00007
STK-007의 선택적 결합 특성을 확인하기 위해, STK-007이 IL2 수용체의 CD25 (IL2Ra) 및 CD132 (IL2Rg) 성분에 대한 실질적인 결합을 유지하고 hoRb에 대한 특이적 결합을 나타내는 반면 wt hIL2는 hoRb와 유의미하게 결합하지 않는다는 것을 확인하기 위해 비아코어 표면 플라즈몬 공명 연구가 수행되었다. 간단히 언급하면, wtCD25, wtCD122, hoCD122 및 wtCD132의 C-말단측 HIS-태그부착된 버전을 제조하고 항-HIS 포획 칩에 고정화시키며 STK-007 및 wt hIL2 분자의 용액 [셰난도아 바이오테크놀로지, 인크.(Shenandoah Biotechnology, Inc.)]을 고정화된 수용체 서브유닛 위로 흐르게 함으로써 비아코어를 사용하여 결합에 대해 평가하였다. 이러한 실험의 결과가 첨부된 도면의 도 1에 제시되어 있다. 패널 A, C, E 및 G는 각각 wtCD25, wtCD122, wtCD132 및 hoCD122에 대한 STK-007의 결합을 나타낸다. 패널 B, D, F 및 H는 각각 wtCD25, wtCD122, wtCD132 및 hoCD122에 대한 wtIL2의 결합을 나타낸다. 제시된 데이터는 STK-007이 wt hIL2와 유사하게 wtCD25 및 wtCD132에 대한 결합을 유지하지만 wtCD122에 대한 친화도는 매우 낮다는 것을 나타낸다. 그러나, STK-007은 wtCD122에 대한 wtIL2의 결합과 유사한 친화도로 hoCD122 (패널 G)와 결합한다. 유사하게, wt hIL2는 hoCD122에 대한 매우 낮은 친화도와 유사한 wtCD25, wt CD122 및 wtCD132에 대한 결합을 명확하게 보여준다.
생체내 연구의 경우, STK-007 분자는 하기 구조의 N-말단측 40 kDa 분지형 PEG 분자를 부가함으로써 변형되었고:
Figure pct00008
이로써 하기 구조를 갖는 STK-009로서 후술되는 식 2의 hIL2 오르토로그가 생성되었다:
40kD-PEG-링커-desAla1-hIL2[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]-COOH. [2]
(종종 본원에서 "PEG오르토", "PEG오르토IL2" 또는 "PEGhoIL2"로서 지칭되기도 함). 이러한 연구에 사용된 대표적인 직교 세포는 하기 아미노산 서열을 갖는 직교 CD122 (IL2Rb) 수용체를 발현하도록 변형된 CD19 직교 CAR-T 세포였다:
Figure pct00009
(이는 종종 본원에서 "hoCD122" 또는 "hoRb" (인간 오르토 수용체 베타)로서 지칭되기도 함). hoRb 수용체의 세포외 도메인은 2개의 아미노산 치환 H133D 및 Y134F (wt hCD122에 따라 넘버링됨)를 포함한다.
이러한 연구에 사용된 예시적인 CAR은 항원 결합 도메인으로서의 FMC63 항-CD19 scFv, CD28 막횡단 및 공동자극 도메인 및 CD3z 도메인 (도 2, 패널 A)을 포함하고 하기 아미노산 서열을 갖는 항-CD19 키메라 항원 수용체이다:
Figure pct00010
도 1A에 예시된 바와 같이, CD19_28z CAR, T2A 펩티드 및 hoRb 서열을 코딩하는 핵산 서열이 합성되었다:
Figure pct00011
이러한 구축물은 3세대 pl4Syn 렌티바이러스 백본 [알스템 바이오(Alstem Bio)]의 EF1a-프로모터의 하류에 합성 및 클로닝되었다. SYNCAR-001로서 지칭되기도 한 "CD19_28z 오르토CAR" T 세포를 생성하도록 단리 및 자극되었다.
도 3에 제공된 데이터에 의해 입증된 바와 같은 파종성 모델에서, PBS의 투여는 종양 부담을 제어하는데 실패하여 (도 3, 패널 A, 군 1 및 도 3, 패널 B, 좌측 상단), 연구 약 제21일에 독성으로 인해 동물을 희생시켜야 하는 결과를 초래하였다. 대조적으로, CD19_28z 오르토CAR T 세포의 투여는 8마리 마우스 중 4마리에서 항종양 반응을 일으켰다 (도 3, 패널 A, 군 2 및 도 3, 패널 B, 우측 상단). 용량 수준 둘 다에서 CD19_28z 오르토CAR T 세포와 STK-009 둘 다의 조합 처리 (도 3, 패널 A, 1 μg (군 3 및 도 3, 패널 B 우측 하단) 및 2 μg (군 4 및 도 3, 패널 B 좌측 하단)는 CD19_28z 오르토CAR T 세포 처리 단독과 비교하여 부가의 항종양 기능을 제공하였다.
추가적으로, 실시예 8에 기재된 재시험감염 모델로부터 비롯된 도 4에 제공된 데이터는 STK009 재투여가 항원 또는 종양 리간드 노출이 없는 장기적인 기간 동안에도 CAR T 세포의 항종양 활성을 회복할 수 있다는 것을 입증해준다.
도 5에 제공된 데이터와 함께 실시예 9에 기재된 재발 모델은 STK-009 단독 투여가 사전 요법 과정으로부터 재발한 동물에서 CAR-T 세포의 항종양 활성을 달성할 수 있다는 것을 입증해준다.
추가적으로 실시예 11에서 논의되고 도 6에 제공된 바와 같이, 직교 리간드 (STK-009)와 접촉한 직교 CAR-T 세포는 생체내에서 SCM 표현형을 유지하여 CAR T 세포의 증진된 지속성을 입증하여 보다 지속적인 항종양 효과를 제공함을 입증하였다.
도 7-10에 제공된 데이터와 함께 실시예 12에서 논의된 고형 종양 모델로부터 수득된 고형 종양 모델의 데이터가 특히 주목할 만하다. 이러한 데이터는 직교 동족 리간드와 조합된 직교 CAR-T 세포가 고형 종양에서 반응을 유도할 수 있고 CAR-T 세포의 고형 종양으로의 침윤을 증가시킬 수 있으며, 이는 이러한 시스템이 CART와 같은 입양 세포 전달 프로토콜을 사용하여 이전에 치료할 수 없었던 고형 종양의 치료에 유용함을 입증해준다.
데이터는 직교 수용체를 발현하는 치료적 조작된 세포 (예를 들어, hoCART, hoTIL)의 개선된 지속성, 동족 직교 리간드와의 접촉에 반응하여 조작된 직교 면역 세포를 용량 의존적 방식으로 선택적으로 강력하게 활성화시킬 수 있는 능력, 비특이적 T 세포 증식제, 예컨대 입양 세포 요법 프로토콜에서 독성의 증거가 충분한 공급원인 hIL2의 투여에서 관찰되는 것과 같은 비특이적 오프 타겟 독성을 제공하지 않는 것과 전형적으로 연관된 독성의 상당한 감소를 입증하는 직교 리간드를 발현하는 세포에 대한 리간드의 특이성을 입증해준다.
직교 수용체에 대한 직교 리간드의 선택성은 생체내에서 독성이 낮은 분자를 생성한다. 이는 영장류가 본원에 기재된 바와 같이 장기간 작용하는 PEG화된 직교 hIL2 분자의 고 용량에 노출된 비-인간 영장류 모델 독성학 연구에서 입증되었다. 이러한 연구에서 관찰된 바와 같은 고 용량에서의 직교 IL2 화합물의 지속성에도 불구하고, 치료상 유효 용량보다 상당히 더 많은 (적어도 10배에서 100배 더 많은) 용량에서 유의미한 독성이 관찰되지 않았다. 치료 세포를 선택적으로 활성화시키기 위한 직교 리간드의 선택성과 효능은 BCMA CAR T 세포와 연계해서 서서히 진행되는 전암성 병태, 예컨대 무증상 다발성 골수종의 치료와 같은 질환의 진행 예방을 위한 예방 차원으로 입양 세포 요법의 사용을 가능하게 한다.
직교 리간드는 CAR T 세포의 재활성화에 성공하여 세포의 재진입 없이 조작된 세포의 치료 효과를 재건할 수 있는 능력을 가능하게 하여 신생물성 질환의 재발, 회귀 및 전이를 예방하는데 있어서의 상기 기술의 유용성을 입증해준다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 대상체에게 치료상 유효량의 직교 리간드를 투여하는 단계; (b) 포유류 면역 세포가 직교 hCD122 수용체를 발현하도록 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 직교 hCD122 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 포유류 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 그의 세포외 도메인이 종양 항원과 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 직교 CD122 수용체를 발현하는 복수개의 조작된 T 세포의 투여 및 직교 IL2 리간드의 동시대 투여 및 식 1의 직교 IL2 리간드의 주기적 투여를 포함하는 유지 요법의 대상체에 대한 투여에 의해 신생물성 질환의 재발 예방에 의해 신생물성 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공하며, 여기서 치료 단계에서 사용된 직교 리간드는 유지 단계에서 사용된 직교 리간드와 동일하거나 상이하다. 일부 실시양태에서, 직교 리간드는 반감기를 연장하도록 변형된다. 한 실시양태에서, 직교 리간드는 PEG화, 융합 단백질 등이다. 한 실시양태에서, 직교 리간드는 40 kD N 말단측 PEG 모이어티를 포함한다. 방법의 일부 실시양태에서, 직교 리간드는 확장을 제공하기에 충분한 농도 초과 (예를 들어, >EC10 PRO)이나 유의미한 분화를 유도하기에 충분한 농도 미만 (예를 들어, <EC90 ACT)으로 제1 치료 단계 리간드에서 적어도 24시간의 기간 동안, 임의로 30일, 60일, 90일 또는 그 초과의 기간 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 유지 단계는 활성화를 위한 농도를 초과하는 (예를 들어, >EC50 ACT) 혈청 수준을 유지하는 오르토 CAR T 활성화를 적어도 24시간의 기간 동안 유도하기에 충분한 식 1의 직교 리간드의 투여를 임의로 포함한다. 방법의 일부 실시양태에서, 직교 리간드는 식 1의 직교 IL2 리간드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 또는 비-바이러스 벡터의 투여에 의해 대상체에게 제공된다. 방법의 일부 실시양태에서, 신생물성 질환은 고형 종양 및 혈액 악성종양으로부터 선택된다. 방법의 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 치료 단계 및/또는 유지 단계 동안 하나 이상의 보충 항-신생물제를 추가로 포함한다. 방법의 일부 실시양태에서, 치료 단계 및/또는 유지 단계 동안 보충 항-신생물제는 동일하거나 상이할 수 있다. 방법의 일부 실시양태에서, 보충 신생물제는 화학요법제, 소분자, 체크포인트 억제제 (항-PD1, 케이트루다, 옵디보)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 보충 생물학적 제제, 항종양 항원 항체 (헤르셉틴) 및/또는 물리적 방법 (수술, 방사선 등)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 직교 수용체는 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함하는 직교 CD122이다.
전이의 예방
본 개시내용은 그의 세포외 도메인이 종양 항원과 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 직교 CD122 수용체를 발현하는 복수개의 조작된 T 세포의 투여 및 식 1의 직교 IL2 리간드의 동시대 조합 투여 및 식 1의 직교 IL2 리간드의 주기적 투여를 포함하는 유지 요법의 대상체에 대한 투여에 의해 신생물성 질환의 전이 예방에 의해 신생물성 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공하며, 여기서 치료 단계에서 사용된 직교 리간드는 유지 단계에서 사용된 직교 리간드와 동일하거나 상이하다. 일부 실시양태에서, 직교 리간드는 반감기를 연장하도록 변형된다. 한 실시양태에서, 직교 리간드는 PEG화, 융합 단백질 등이다. 한 실시양태에서, 직교 리간드는 40 kD N 말단측 PEG 모이어티를 포함한다. 방법의 일부 실시양태에서, 직교 리간드는 확장을 제공하기에 충분한 농도 초과 (예를 들어, >EC10 PRO)이나 유의미한 분화를 유도하기에 충분한 농도 미만 (예를 들어, <EC90 ACT)으로 제1 치료 단계 리간드에서 적어도 24시간의 기간 동안, 임의로 30일, 60일, 90일 또는 그 초과의 기간 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 유지 단계는 활성화를 위한 농도를 초과하는 (예를 들어, >EC50 ACT) 혈청 수준을 유지하는 오르토 CAR T 활성화를 적어도 24시간의 기간 동안 유도하기에 충분한 식 1의 직교 리간드의 투여를 임의로 포함한다. 방법의 일부 실시양태에서, 직교 리간드는 식 1의 직교 IL2 리간드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 또는 비-바이러스 벡터의 투여에 의해 대상체에게 제공된다. 방법의 일부 실시양태에서, 신생물성 질환은 고형 종양 및 혈액 악성종양으로부터 선택된다. 방법의 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 치료 단계 및/또는 유지 단계 동안 하나 이상의 보충 항-신생물제를 추가로 포함한다. 방법의 일부 실시양태에서, 치료 단계 및/또는 유지 단계 동안 보충 항-신생물제는 동일하거나 상이할 수 있다. 방법의 일부 실시양태에서, 보충 신생물제는 화학요법제, 소분자, 체크포인트 억제제 (항-PD1, 케이트루다, 옵디보)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 보충 생물학적 제제, 항종양 항원 항체 (헤르셉틴) 및/또는 물리적 방법 (수술, 방사선 등)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 직교 수용체는 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함하는 직교 CD122이다.
혈액 악성종양에 대한 CD19 CAR:
한 실시양태에서, 본 개시내용은 치료상 유효량의 식 1의 직교 IL2 리간드의 투여와 조합하여 치료상 유효량의 직교 CD19 CAR의 투여에 의한 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 혈액 악성종양을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 식 1의 직교 IL2 리간드의 투여와 조합하여, 그의 세포외 도메인이 CD19와 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 직교 CD122 폴리펩티드를 발현하는 복수개의 조작된 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 혈액 신생물성 질환을 앓고 있는 대상체에서 재발 및/또는 전이의 예방 방법에 사용하기 위한 직교 CD19 CAR을 제공한다. 일부 실시양태에서, CAR은 본원에 기재된 바와 같은 SYNCAR-001이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 초기 직교 CD19 CAR-T/직교 IL2 리간드 치료 단계에 대한 부분 반응 또는 완전한 반응 후 직교 IL2 리간드와 조합하여 직교 CD19 CAR T 세포로 이전에 치료받은 대상체에서 재발을 예방하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 치료 단계 동안 투여된 것보다 더 낮은 농도에서 식 1의 직교 IL2 리간드의 주기적 투여를 포함하는 유지 요법 과정의 투여를 포함한다. 치료 단계 동안 투여된 직교 리간드는 유지 단계 동안 투여된 직교 리간드와 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 혈액 악성종양은 재발성 또는 불응성 비-호지킨 림프종, 재발성 또는 불응성 골수종, 재발성 또는 불응성 거대 B 세포 림프종, 재발성 또는 불응성 외투 세포 림프종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 재발성 또는 불응성 혈액 악성종양이다. 재발성 혈액 악성종양 (예를 들어, 재발성 골수종)은 환자가 초기에 성공적인 요법 과정을 거쳤지만 질환이 다시 나타나는 상황을 포함한다. 불응성 혈액 악성종양은 적극적인 치료에도 불구하고 진행되는 질환을 지칭한다. 불응성 골수종을 앓고 있는 환자는 이러한 질환이 반응을 명확하게 나타내지 않고 화학요법에도 계속 진행되면 원발성 불응성 골수종이 있는 것으로 지칭되며 이차 불응성 환자는 치료 시작 시 초기 반응이 있었지만 그 치료가 더 이상 효과가 없다.
일부 실시양태에서, 직교 리간드는 반감기를 연장하도록 변형된다. 한 실시양태에서, 직교 리간드는 PEG화, Fc 융합 단백질, 알부민 융합물 등이다. 한 실시양태에서, 직교 리간드는 40 kD N 말단측 PEG 모이어티를 포함한다.
방법의 일부 실시양태에서, 직교 리간드는 확장을 제공하기에 충분한 농도 초과 (예를 들어, >EC10 PRO)이나 유의미한 분화를 유도하기에 충분한 농도 미만 (예를 들어, <EC90 ACT)으로 제1 치료 단계 리간드에서 적어도 24시간의 기간 동안, 대안적으로 1주의 기간 동안, 대안적으로 2주의 기간 동안, 대안적으로 적어도 30일의 기간 동안, 대안적으로 적어도 60일의 기간 동안, 또는 대안적으로 적어도 90의 기간 동안 또는 더 긴 시간 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 유지 단계는 활성화를 위한 농도를 초과하는 (예를 들어, >EC50 ACT) 혈청 수준을 유지하는 오르토 CAR T 활성화를 적어도 24시간의 기간 동안 유도하기에 충분한 식 1의 직교 리간드의 투여를 임의로 포함한다.
방법의 일부 실시양태에서, 직교 리간드는 식 1의 직교 IL2 리간드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 또는 비-바이러스 벡터의 투여에 의해 대상체에게 제공된다. 방법의 일부 실시양태에서, 신생물성 질환은 고형 종양 및 혈액 악성종양으로부터 선택된다.
방법의 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 치료 단계 및/또는 유지 단계 동안 하나 이상의 보충 항-신생물제를 추가로 포함한다. 방법의 일부 실시양태에서, 치료 단계 및/또는 유지 단계 동안 항-신생물제(들)는 동일하거나 상이할 수 있다. 방법의 일부 실시양태에서, 보충 신생물제는 화학요법제, 소분자, 체크포인트 억제제 (항-PD1, 케이트루다, 옵디보)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 보충 생물학적 제제, 항종양 항원 항체 (헤르셉틴) 및/또는 물리적 방법 (수술, 방사선 등)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 직교 수용체는 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함하는 직교 CD122이다. 일부 실시양태에서, CAR의 세포외 도메인은 FMC63으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항체 또는 CDR을 포함하는 CD19와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 혈액 신생물성 질환은 필라델피아 염색체 양성 ALL을 포함한 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 및 B-세포 림프종으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 화학요법제의 공동-투여를 추가로 포함한다.
혈액 악성종양이 ALL인 경우, 보충제는 빈크리스틴 또는 리포솜 빈크리스틴 (마르퀴보), 다우노루비신 (다우노마이신) 또는 독소루비신 (아드리아마이신), 시타라빈 (시토신 아라비노시드, ara-C), L-아스파라기나제 또는 PEG-L-아스파라기나제 (페가스파르가제 또는 온카스파르), 6-메르캅토퓨린 (6-MP), 메토트렉세이트, 시클로포스파미드, 프레드니손, 덱사메타손, 델라라빈 (아라논)일 수 있다. 혈액 악성종양이 필라델피아 염색체 양성 ALL인 경우, 보충제는 이마티닙 (글리벡(Gleevec)®), 다사티닙 (스프리셀(Sprycel)®), 닐로티닙 (타시그나(Tasigna)®), 포나티닙 (이클루식(Iclusig)®), 및 보수티닙 (보술리프(Bosulif)®)일 수 있다.
혈액 악성종양이 CLL인 경우, 보충제는 "FCR" (플루다라빈, 시클로포스파미드 및 리툭시맙) 및 FR (플루다라빈 및 리툭시맙)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 플루다라빈 함유 레지멘, PCR (펜토스타틴, 시클로포스파미드 및 리툭시맙)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 펜토스타틴 기반 치료 레지멘, 알렘투주맙 (캄파트(Campath)®), 클로람부실, 오비누투주맙과 조합된 클로람부실 (가지바(Gazyva)® 항-CD20 Mab), 이브루티닙을 포함하나 이에 제한되지는 않는 티로신 키나제 억제제일 수 있다.
혈액 악성종양이 불응성 또는 재발성 CLL인 경우, 보충제는 레날리도미드, 오파투무맙, 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제, 예컨대 두벨리십 및 이델라리십; 베네토클락스 단독 또는 오비누투주맙 또는 리툭시맙과의 조합 중 하나 이상으로부터 선택된다. 혈액 악성종양이 B 세포 림프종인 경우, 보충제는 임의로 시클로포스파미드와 조합된 리툭시맙 (리툭산(Rituxan)®); 오비누투줌 또는 리툭시맙과 조합된 벤다무스틴; 임의로 오비누투주맙 또는 리툭시맙과 조합된 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신 또는 히드록시다우노루비신, 빈크리스틴 (온코빈(Oncovin)®) 및 프레드니손); 임의로 오비누투주맙 또는 리툭시맙과 조합된 CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손); 레날리도미드 및 리툭시맙; 시클로포스파미드; 클로람부실; 및 이브리투모맙 티욱세탕 (제발린(Zevalin)®) 중 하나 이상으로부터 선택된다.
혈액 악성종양이 버킷 림프종인 경우, 보충제는 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 임의로 리툭시맙과 조합된 CODOX-M (시클로포스파미드, 독소루비신, 척수강내 메토트렉세이트를 동반한 빈크리스틴 및 시타라빈에 이어 고 용량 전신 메토트렉세이트); 임의로 리툭시맙과 조합된 용량 조정된 EPOCH (에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 시클로포스파미드, 독소루비신); 임의로 고 용량 메토트렉세이트와 조합된 하이퍼CVAD (시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신 및 덱사메타손) 및 임의로 리툭시맙과 조합된 시타라빈; 임의로 척수강내 메토트렉세이트와 조합된 RICE (리툭시맙, 이포스파미드, 카르보플라틴, 에토포사이드); 임의로 척수강내 메토트렉세이트 및 RGDP (리툭시맙, 젬시타빈, 덱사메타손, 시스플라틴)와 조합된 RIVAC (리툭시맙, 이포스파미드, 시타라빈, 에토포시드); 및 임의로 리툭시맙과 조합된 시타라빈.
일부 실시양태에서, 직교 수용체는 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함하는 직교 CD122이다.
본 개시내용의 방법의 실시에 유용한 항-CD19 CAR의 예는 하기 구축물을 포함한다:
CD19_28z: GMCSF 수용체 신호 펩티드, FMC63 scFv, AAA 스페이서, CD28 힌지 및 공동자극 도메인 및 CD3 제타를 포함하는 구축물:
Figure pct00012
CD19_4-1bbz: CD8a 수용체 신호 펩티드, FMC63 scFv, CD8 힌지 및 막횡단 도메인, 4-1BB 힌지 및 공동자극 도메인 및 CD3 제타를 포함하는 구축물:
Figure pct00013
대안적 실시양태에서, CD19 CAR은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00014
대안적 실시양태에서, CD19 CAR은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00015
BCMA CAR:
본 개시내용은 그의 세포외 도메인이 BCMA와 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 직교 CD122 수용체를 발현하는 복수개의 조작된 T 세포의 투여를, 대상체가 부분 또는 완전한 반응을 달성할 때까지 제1 기간 동안 (치료 단계) 식 1의 직교 IL2 리간드의 투여와 조합하고, 적어도 30일, 임의로 적어도 90일, 임의로 적어도 180일, 또는 의사에 의해 필요하다고 간주되는 경우 그 초과의 기간에 걸쳐 식 1의 직교 IL2 리간드를 주기적으로 투여하는 것을 포함하는 유지 요법의 대상체에 대한 투여에 의해 신생물성 질환의 전이를 예방함으로써 다발성 골수종을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 그의 세포외 도메인이 BCMA와 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 직교 CD122 폴리펩티드를 발현하는 복수개의 조작된 T 세포의 투여 및 식 1의 직교 IL2 리간드의 동시대 조합 투여 및 식 1의 직교 IL2 리간드의 주기적 투여를 포함하는 유지 요법의 대상체에 대한 후속 투여에 의해 다발성 골수종을 앓고 있는 대상체의 치료에서 엄격한 완전 반응을 달성하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
전술한 방법에서, 치료 단계에서 사용된 직교 리간드는 유지 단계에서 사용된 직교 리간드와 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 직교 리간드는 반감기를 연장하도록 변형된다. 한 실시양태에서, 직교 리간드는 PEG화, 융합 단백질 등이다. 한 실시양태에서, 직교 리간드는 40 kD N 말단측 PEG 모이어티를 포함한다.
방법의 일부 실시양태에서, 직교 리간드는 확장을 제공하기에 충분한 농도 초과 (예를 들어, >EC10 PRO)이나 유의미한 분화를 유도하기에 충분한 농도 미만 (예를 들어, <EC90 ACT)으로 제1 치료 단계 리간드에서 적어도 24시간의 기간 동안, 임의로 30일, 60일, 90일 또는 그 초과의 기간 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 유지 단계는 활성화를 위한 농도를 초과하는 (예를 들어, >EC50 ACT) 혈청 수준을 유지하는 오르토 CAR T 활성화를 적어도 24시간의 기간 동안 유도하기에 충분한 식 1의 직교 리간드의 투여를 임의로 포함한다.
방법의 일부 실시양태에서, 직교 리간드는 식 1의 직교 IL2 리간드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 또는 비-바이러스 벡터의 투여에 의해 대상체에게 제공된다. 방법의 일부 실시양태에서, 신생물성 질환은 고형 종양 및 혈액 악성종양으로부터 선택된다. 방법의 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 치료 단계 및/또는 유지 단계 동안 하나 이상의 보충 항-신생물제의 투여를 추가로 포함한다. 방법의 일부 실시양태에서, 치료 단계 및/또는 유지 단계 동안 보충 항-신생물제는 동일하거나 상이할 수 있다. 방법의 일부 실시양태에서, 보충 신생물제는 화학요법제, 소분자, 체크포인트 억제제 (항-PD1, 케이트루다, 옵디보)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 보충 생물학적 제제, 항종양 항원 항체 (헤르셉틴) 및/또는 물리적 방법 (수술, 방사선 등)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 직교 수용체는 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함하는 직교 CD122이다.
일부 실시양태에서, 다발성 골수종의 치료에 유용한 보충제는 탈리도미드, 레날리도미드, 덱사메타손, 보르테조밉, 빈크리스틴, 독소루비신, 덱사메타손, 멜팔란, 카르필조밉, 시클로포스파미드, 시스플라틴, 에토포시드, 보르테조밉, 프레드니손, 다라투무맙, 카르필조밉, 및 익사조밉으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다발성 골수종의 치료에 유용한 보충제는 테오르테조밉/레날리도미드/덱사메타손; 보르테조밉/시클로포스파미드/덱사메타손; 보르테조밉/독소루비신/덱사메타손; 카르필조밉/레날리도미드/덱사메타손; 익사조밉/레날리도미드/덱사메타손; 보르테조밉/덱사메타손; 보르테조밉/탈리도미드/덱사메타손; 레날리도미드/덱사메타손; 덱사메타손/탈리도미드/시스플라틴/독소루비신/시클로포스파미드/에토포사이드/보르테조밉 (VTD-PACE); 레날리도미드/저용량 덱사메타손; 다라투무맙/보르테조밉/멜팔란/프레드니손; 카르필조밉/레날리도미드/덱사메타손; 카르필조밉/시클로포스파미드/덱사메타손; 및 익사조밉/레날리도미드/덱사메타손을 포함하는 다발성 골수종의 치료에 사용하기 위한 화학요법제의 조합 치료 레지멘을 포함한다.
본 개시내용은 식 1의 직교 IL2 리간드와 조합하여, CAR의 세포외 도메인이 BCMA와 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 직교 CD122 폴리펩티드를 발현하는 복수개의 조작된 T 세포의 투여 및 식 1의 직교 IL2 리간드의 주기적 투여를 포함하는 유지 요법의 대상체에 대한 후속 투여에 의해 무증상 다발성 골수종을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 CAR의 세포외 도메인이 BCMA와 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 직교 CD122 폴리펩티드를 발현하는 복수개의 조작된 T 세포의 투여 및 식 1의 직교 IL2 리간드의 동시대 조합 투여 및 식 1의 직교 IL2 리간드의 주기적 투여를 포함하는 유지 요법의 대상체에 대한 투여에 의해 신생물성 질환의 무증상 다발성 골수종이 다발성 골수종으로 진행되는 것의 예방에 의해 무증상 다발성 골수종을 앓고 있는 대상체에서 무증상 다발성 골수종이 다발성 골수종으로 진행되는 것을 예방하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, CAR의 ABD는 BCMA와 특이적으로 결합한다. 방법은 탈리도미드, 레날리도미드, 덱사메타손, 보르테조밉, 빈크리스틴, 독소루비신, 덱사메타손, 멜팔란, 카르필조밉, 시클로포스파미드, 시스플라틴, 에토포시드, 보르테조밉, 프레드니손, 다라투무맙, 카르필조밉, 및 익사조밉으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용제 또는 보르테조밉/레날리도미드/덱사메타손; 보르테조밉/시클로포스파미드/덱사메타손; 보르테조밉/독소루비신/덱사메타손; 카르필조밉/레날리도미드/덱사메타손; 익사조밉/레날리도미드/덱사메타손; 보르테조밉/덱사메타손; 보르테조밉/탈리도미드/덱사메타손; 레날리도미드/덱사메타손; 덱사메타손/탈리도미드/시스플라틴/독소루비신/시클로포스파미드/에토포사이드/보르테조밉 (VTD-PACE); 레날리도미드/저용량 덱사메타손; 다라투무맙/보르테조밉/멜팔란/프레드니손; 카르필조밉/레날리도미드/덱사메타손; 카르필조밉/시클로포스파미드/덱사메타손; 및 익사조밉/레날리도미드/덱사메타손을 포함하는 다발성 골수종의 치료에 사용하기 위한 화학요법제의 조합 치료 레지멘을 포함하는 다발성 골수종의 치료에 유용한 보충제의 치료 단계 및/또는 유지 단계 동안 대상체에게 투여되는 하나 이상의 보충 항-신생물제를 추가로 포함한다.
본 발명의 실시에 유용한 항-BCMA CAR의 예는 하기 구축물을 포함한다:
BCMA4_41bbz CAR: CD8a 수용체 신호 펩티드, BCMA4 scFv, CD8 힌지 및 막횡단 도메인, 4-1BB 힌지 및 공동자극 도메인 및 CD3 제타를 포함하는 구축물
Figure pct00016
이는 하기의 아미노산 서열을 갖는 T2a 링커를 사용하여 오르토 CD122 수용체와 공동 발현될 수 있다:
Figure pct00017
GSI5021_41bbz CAR:
Figure pct00018
이는 하기의 아미노산 서열을 갖는 T2a 링커를 사용하여 오르토 CD122 수용체와 공동 발현될 수 있다:
Figure pct00019
B2121 BCMA_41bbz) CAR
Figure pct00020
이는 하기의 아미노산 서열을 갖는 T2a 링커를 사용하여 오르토 CD122 수용체와 공동 발현될 수 있다:
Figure pct00021
BMCA10_41bbz CAR
Figure pct00022
이는 하기의 아미노산 서열을 갖는 T2a 링커를 사용하여 오르토 CD122 수용체와 공동 발현될 수 있다:
Figure pct00023
GD2 CAR
본 개시내용은 CAR의 세포외 도메인이 GD2와 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 직교 CD122 폴리펩티드를 발현하는 복수개의 조작된 T 세포의 투여 및 식 1의 직교 IL2 리간드의 동시대 조합 투여 및 식 1의 직교 IL2 리간드의 주기적 투여를 포함하는 유지 요법의 대상체에 대한 후속 투여에 의해 신경외배엽 기원의 신생물성 질환 (인간 신경모세포종 및 흑색종 포함) 또는 고위험 골육종을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 CAR의 세포외 도메인이 BCMA와 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 직교 CD122 폴리펩티드를 발현하는 복수개의 조작된 T 세포의 투여 및 식 1의 직교 IL2 리간드의 동시대 조합 투여 및 식 1의 직교 IL2 리간드의 주기적 투여를 포함하는 유지 요법의 대상체에 대한 투여에 의해 신생물성 질환의 무증상 다발성 골수종이 다발성 골수종으로 진행되는 것의 예방에 의해 신경외배엽 기원의 신생물성 질환 (인간 신경모세포종 및 흑색종 포함)의 전이 또는 재발을 예방하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, CAR의 세포외 도메인은 GD2와 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서 CAR의 ABD는 CDR 또는 항체 3F8, hu14.18, 14G2a 중 하나 이상을 포함하는 GD2와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하며, 임의로 공동투여되는 화학요법제는 시스플라틴, 독소루비신, 시클로포스파미드 및 에피포도필로톡신, 예컨대 테니포시드 및 에토포시드를 포함한다.
전립선암에 대한 PSMA CAR
전립선암은 전 세계적으로 남성에게 두 번째로 흔한 악성종양으로, 연간 약 110만 건의 새로운 사례가 발생한다. 전립선암은 307,000건의 사망의 원인이 되어 암 사망의 다섯 번째 주요 원인이다. 국소 원발성 종양은 수술 또는 국소 방사선 요법으로 성공적으로 치료할 수 있지만, 이러한 방법론은 질환의 진행 상태에 대해 만족스러운 결과를 제공하지 않는다.
전립선 특이적 막 항원 (PSMA)은 모든 종양 단계에서 전립선암 세포의 표면에서 발현되고, 특히 질환의 더 심각한 안드로겐 비의존성 및 전이 단계에서 증가된 발현을 나타내기 때문에 항원-리디렉션 면역요법에 대한 이상적인 표적으로 간주된다. PSM을 표적으로 하는 다양한 항체는 문헌에 기재되어 있으며, 이는 J591, 3D8, D2B 및 3/F11을 포함하나 이에 제한되지는 않는 CAR의 맥락에서 사용하기 위해 변형될 수 있다.
PSMA를 표적으로 하는 다수의 CAR T 세포가 임상 개발 중이다 (예를 들어, NCT01140373, NCT01929239 및 NCT03089203 참조). 그러나, 이러한 PSMA CAR T 세포의 종양 용해 효능은 여전히 불확실한다. 특히, 3D8 또는 J591 scFvs ABD를 사용하여 1세대 CAR을 발현하는 조작된 T 세포는 PSMA CAR T 세포의 지속성 결여로 인해 낮은 효능을 나타냈다. 2세대 및 3세대 CAR이 전립선암 치료에 시도되었지만, 성공률은 여전히 낮으며 고 용량의 CAR T 또는 다중 CAR T 주입이 필요하다 (Alzubi, et al. (2020) Molecular Therapy Oncolytics 18:226-235).
이전에 논의된 바와 같이, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 통상적인 CAR 요법에서 관찰되며 임상 실시에서 PSMA CAR의 효능의 결여에 기여하는 지속성 결여를 극복할 수 있는 능력을 제공한다. 본 개시내용의 방법 및 조성물은 임상의가 장기간 동안 CAR을 활성 상태로 유지하여 기존 CAR T 세포 요법보다 훨씬 더 많은 노출 ("곡선 아래 면적" 또는 AUC)을 가능하게 하며 따라서 이전에 CAR T 요법에 내성이 있던 암, 특히 효과적인 치료를 위해 CAR에 장기간 노출을 필요로 하는 고형 종양을 치료하고 고형 종양 환경으로의 유출 및 침투를 달성하는 수단을 제공한다. 기존의 비-직교 CAR T 세포는 CAR T 세포의 과도한 독성 또는 다중 투여 없이는 필요한 노출 지속 기간을 제공할 수 없다.
본 개시내용은 치료상 유효량의 직교 PSMA CAR T 세포를 식 1의 직교 리간드와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 전립선암을 치료하고, 임의로 재발 또는 회귀를 예방하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 PSMA CAR T 세포를 제공하며, PSMA CAR은 PSMA_28z: CD8a 신호 펩티드, 탈면역화된 J591 scFv, AAA 스페이서, CD28 힌지/막횡단/공동자극 도메인 및 CD3제타를 포함하는 항-PSMA CAR이다:
Figure pct00024
이는 하기의 아미노산 서열을 갖는 T2a 링커를 사용하여 오르토 CD122 수용체와 공동 발현될 수 있다:
Figure pct00025
일부 실시양태에서, PSMA CAR은 PSMA_4-1BBz: 탈면역화된 J591 scfv; CD8a 신호 펩티드, CD8 힌지 및 막횡단 도메인 및 4-1bb 공동자극 도메인 및 CD3z이다:
Figure pct00026
이는 하기의 아미노산 서열을 갖는 T2a 링커를 사용하여 오르토 CD122 수용체와 공동 발현될 수 있다:
Figure pct00027
GPC3 CAR
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 GPC3 CAR T 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법 및 조성물은 간암을 포함하나 이에 제한되지는 않는 GPC3 발현 암의 치료에 유용하다. 간세포 암종 (HCC)은 전 세계 암 사망의 두 번째 주요 원인이다. 세포 표면 당단백질인 글리피칸-3은 HCC 조직에서 과다발현되지만 건강한 성인 간에서는 과다발현되지 않으므로 CAR의 ABD에 대한 유용한 표적화 도메인을 제공한다. 다양한 GPC 표적화 도메인은 간암 치료에 사용하기 위한 식 1의 IL2 오르토로그와 조합하여 사용하기 위해 직교 세포 내로 혼입될 수 있는 CAR의 구축에 이용될 수 있다. 직교 GPC3 CAR T 세포의 제조에 사용될 수 있는 GPC3 CAR의 예는 하기 아미노산 서열을 갖는 CAR GPC3_28z:
Figure pct00028
및 하기 아미노산 서열을 갖는 GPC3_4-1BB:
Figure pct00029
를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HPV 관련 종양의 치료에 사용하기 위한 직교 HPV-16 E6 TCR 세포를 제공한다. 본 개시내용의 직교 세포 내로 혼입될 수 있는 HPV-16 E6 CAR의 예는 하기 서열을 갖는 CAR을 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00030
또는:
Figure pct00031
신경모세포종을 위한 GD2 CAR
GD2는 거의 모든 신경모세포종, 대부분의 흑색종 및 망막모세포종, 많은 유잉 육종 및 보다 다양한 정도로, 소세포 폐암, 신경교종, 골육종 및 연조직 육종에 의해 고도로 발현된다. 결과적으로, GD2는 CAR T 세포 요법을 위한 표적으로 확인되었고 다양한 GD2 CAR이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 그러나, 지속성은 GD2 발현 종양의 치료에서 문제로 남아 있다. 결과적으로, 오르토 리간드의 투여를 통해 직교 면역 세포의 작용 지속 기간을 연장할 수 있는 능력은 GD2 세포 치료제의 개발에 상당한 도움이 될 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 오르토GD2 표적화된 면역 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 직교 GD2 면역 세포, 예를 들어, 직교 GD2 CAR-T 세포의 표적화 도메인은 하기 아미노산 서열을 갖는 14g2a scFv를 혼입한다:
Figure pct00032
세포를 보다 균질한 세포 산물로 만들기:
본 개시내용은 조작된 면역 세포 종을 포함하는 세포 산물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 조작된 세포 면역 종은 직교 CD122 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 면역 세포이고, 여기서 세포 산물은 조작된 면역 세포의 적어도 40%, 대안적으로 적어도 50%, 대안적으로 적어도 60%, 대안적으로 적어도 70%, 대안적으로 적어도 80%, 대안적으로 적어도 90%를 포함하며, 이러한 방법은 면역 세포의 집단을 수득하고, 조작된 세포 산물의 혼합 세포 집단에서 직교 CD122 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포를 트랜스 선택적 확장시키는 것을 포함한다. 현재 입양 세포 요법과 CAR-T 요법의 성공을 특히 가로막는 가장 핵심적인 장벽은 조작된 세포 CAR T 세포의 낮은 지속성으로 인한 높은 질환 재발률이다.
분자의 선택성은 생체외 직교 리간드 사용을 통해 혼합 세포 집단에서 조작된 세포를 선택적으로 증식할 수 있게 한다. 결과적으로, 본원에 기재된 바와 같은 기술은 치료 세포에 대해 실질적으로 강화된 세포 요법 산물의 제조에 유용하다. 분류 없이 IL2를 사용한 기존의 비특이적 생체외 자극은 바람직한 TIL 또는 CAR 세포의 비교적 작은 분율 (10%-20%)만을 제공하는 환자에게 투여하기 위한 세포 집단을 초래한다. 직교 IL2는 CAR의 준비 단계 동안 선택적으로 활성화시켜 생체외에서 상당히 더 높은 백분율의 치료적 hoCAR 또는 hoTIL을 갖는 세포 산물의 생성을 가능하게 하는데 사용될 수 있다. 이러한 보다 균질한 세포 산물은 신생물성 질환의 치료에 사용되어 더 큰 효능과 더 적은 독성을 초래할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 단계에 의해, 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다:
a. 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있는 대상체에게 막횡단 수용체 분자의 ECD의 발현 및 표면 제시에 영향을 줄 수 있는 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 직교 hCD122의 세포외 도메인 (ECD)을 포함하는 막횡단 수용체 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 포유류 세포를 투여하는 단계; 및
b. 상기 대상체에게 식 #1의 hIL2 오르토로그의 치료상 유효 용량을 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 적어도 20%의 hoCD122 T 세포를 포함하는 조작된 T 세포 산물을 제조하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 포유류 대상체로부터 T 세포의 집단을 단리하는 단계;
b. 단리된 T 세포의 집단을 T 세포에 의한 재조합 벡터의 흡수를 허용하는 조건 하에 포유류 T 세포에서의 발현을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 hoCD122를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터와 생체외에서 접촉시키는 단계;
c. 단리된 T 세포의 집단을 청구항 1의 hIL2 오르토로그의 유효량과 접촉시키는 단계.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 적어도 20%의 조작된 hoCD122 T 세포의 세포 집단을 제공한다.
본 개시내용은 본 발명의 hIL2 오르토로그를 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 특히, 본 개시내용은 숙주 세포에서 hIL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열의 발현을 제공하기 위해 제어 요소에 작동가능하게 연결된 hIL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 적어도 10%, 대안적으로 적어도 20%, 대안적으로 적어도 30%, 대안적으로 적어도 40%, 대안적으로 적어도 50%, 대안적으로 적어도 60%, 대안적으로 적어도 70%의 T 세포 (예를 들어, T 세포, CD8+ T 세포, Treg, TIL, NK 세포, TCR 변형된 세포, CAR-T 세포 등)를 포함하는 혼합 세포 집단을 포함하는 조성물을 추가로 제공하며, 여기서 T 세포는 직교 hCD122 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 재조합적으로 변형된다. 본 개시내용은 조작된 세포 요법 산물의 제약상 허용되는 투여 형태를 생성하는 방법을 추가로 제공하며, 이러한 투여 형태는 T 세포의 집단이 조작된 T 세포의 하나 이상의 종에 대해 실질적으로 강화된 T 세포의 집단을 포함하고, 조작된 T 세포는 hCD122 직교 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 수용체를 발현하고, 상기 방법은 본 발명의 hIL2 오르토로그의 존재 하에 생체외에서 hCD122 직교 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 수용체를 발현하는 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 하나 이상의 이러한 조작된 T 세포의 세포 집단을 강화시키기에 충분한 기간 동안 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 포유류 세포로부터의 hIL2 오르토로그의 발현 및 분비를 촉진하기 위해 제어 요소에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 hIL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 재조합 벡터는 hIL2 오르토로그의 계내 발현을 제공하기 위해 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 재조합 벡터는 암을 앓고 있는 대상체에게 종양내 투여된다. 일부 실시양태에서, 재조합 벡터는 재조합 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스 벡터는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 또는 재조합 아데노바이러스 (rAd), 예를 들어 일부 실시양태에서 인간 아데노바이러스 혈청형 3 및/또는 5로부터 유래된 복제 결핍 아데노바이러스이다. 일부 실시양태에서, 복제 결핍 아데노바이러스는 세포 주기 및/또는 아폽토시스 경로를 개시할 수 있는 바이러스의 능력을 방해하는 E1 영역에 대한 하나 이상의 변형을 갖는다. 복제 결핍 아데노바이러스 벡터는 임의로 E3 도메인에서의 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스는 복제 적격 아데노바이러스이다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스는 신생물 세포에서 선택적으로 복제하도록 조작된 복제 적격 재조합 바이러스이다.
IL2 오르토로그
명명법:
본 개시내용은 IL2 수용체 폴리펩티드 변이체의 다양한 폴리펩티드 리간드를 제공한다. 하기 명명법은 본원에서 치환, 결실 또는 삽입을 지칭하기 위해 사용된다. 잔기는 야생형 분자에서 발견되는 자연적으로 발생하는 아미노산의 1 문자 또는 3 문자 아미노산 코드에 의해 본원에서 지정될 수 있지만 성숙한 IL2 분자의 IL2 아미노산 위치가 뒤따르며, 예를 들어 "Cys125" 또는 "C125"는 야생형 hIL2 분자의 위치 125에 있는 시스테인 잔기를 지칭한다. IL2 오르토로그와 관련하여, 치환은 본원에서 1 문자 아미노산 코드 다음에 IL2 아미노산 위치에 이어 치환되는 1 문자 아미노산 코드로 지정된다. 예를 들어, 변형 "K35A"를 갖는 IL2 오르토로그는 야생형 IL2 서열의 위치 35에 있는 리신 (K) 잔기가 이러한 위치에 있는 알라닌 (A) 잔기로 치환된 것을 지칭한다. 아미노산의 결실은 "des"로서 지칭되며, 서열식별번호: 4 내에서의 아미노산 잔기와 그 위치가 뒤따른다. 예를 들어, 용어 "des-Ala1" 또는 "desA1"은 야생형 IL2 서열의 폴리펩티드의 위치 1에서의 알라닌의 결실을 지칭한다. 유사하게, 직교 CD122에서의 아미노산 치환과 관련하여, 아미노산 치환은 본원에서 자연적으로 발생하는 아미노산의 1 문자 아미노산 코드에 이어, 야생형 IL2 서열 내의 그의 위치의 번호에 이어 그 위치에서 치환되는 아미노산의 1 문자 아미노산 코드로써 지정된다. 예를 들어, 위치 134에서의 티로신 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 hCD122 오르토로그에서, 그 치환은 "Y134F"로 약칭된다.
오르토로그 (직교 CD122 ECD를 포함하는 수용체에 대한 동족 리간드): 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 CD122 ECD를 포함하는 수용체의 동족 리간드인 IL2 오르토로그의 사용 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 ICD가 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함하는 직교 CD122에 대한 리간드이다. 일부 실시양태에서, 용어 IL2 오르토로그는 위치 H133 및/또는 Y134에서의 아미노산 치환을 포함하는 인간 CD122의 세포외 도메인을 포함하는 수용체에 대한 리간드인 hIL2 변이체를 지칭하며, 그의 ICD는 임의로 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 위치 H133 및/또는 Y134에서의 아미노산 치환을 포함하는 인간 CD122의 세포외 도메인을 포함하는 수용체에 대한 동족 리간드이다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 위치 H133 및/또는 Y134에서의 아미노산 치환을 포함하는 인간 CD122의 세포외 도메인을 포함하는 수용체에 대한 리간드이며, 그의 ICD는 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 위치 H133 및 Y134에서의 아미노산 치환을 포함하는 직교 인간 CD122에 대한 리간드이다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 아미노산 치환 H133D 및 Y134F를 포함하는 직교 CD122에 대한 리간드이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 오르토로그는 위치 H133 및 Y134에서의 아미노산 치환을 포함하는 hCD122 분자의 세포외 도메인을 포함하는 수용체의 동족 리간드인 hIL2 오르토로그이며, 그의 ICD는 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 오르토로그는 위치 H133에서의 아미노산 치환을 포함하는 hCD122 분자의 세포외 도메인을 포함하는 수용체의 동족 리간드인 hIL2 오르토로그이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 오르토로그는 위치 H133에서의 아미노산 치환을 포함하는 hCD122 분자의 세포외 도메인을 포함하는 수용체의 동족 리간드인 hIL2 오르토로그이며, 그의 ICD는 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 오르토로그는 위치 H133D에서의 아미노산 치환을 포함하는 hCD122 분자의 세포외 도메인을 포함하는 수용체의 동족 리간드인 hIL2 오르토로그이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 오르토로그는 위치 H133D에서의 아미노산 치환을 포함하는 hCD122 분자의 세포외 도메인을 포함하는 수용체의 동족 리간드인 hIL2 오르토로그이며, 그의 ICD는 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 오르토로그는 위치 Y134에서의 아미노산 치환을 포함하는 hCD122 분자의 세포외 도메인을 포함하는 수용체의 동족 리간드인 hIL2 오르토로그이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 오르토로그는 위치 Y134에서의 아미노산 치환을 포함하는 hCD122 분자의 세포외 도메인을 포함하는 수용체의 동족 리간드인 hIL2 오르토로그이며, 그의 ICD는 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 오르토로그는 위치 Y134F에서의 아미노산 치환을 포함하는 hCD122 분자의 세포외 도메인을 포함하는 수용체의 동족 리간드인 hIL2 오르토로그이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 오르토로그는 위치 Y134F에서의 아미노산 치환을 포함하는 hCD122 분자의 세포외 도메인을 포함하는 수용체의 동족 리간드인 hIL2 오르토로그이며, 그의 ICD는 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 오르토로그는 위치 Y134에서의 아미노산 치환을 포함하는 hCD122 분자의 세포외 도메인을 포함하는 수용체의 동족 리간드인 hIL2 오르토로그이며, 그의 ICD는 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 오르토로그는 아미노산 치환 H133D 및 Y134F를 포함하는 직교 인간 CD122의 세포외 도메인을 포함하는 수용체의 동족 리간드인 hIL2 오르토로그이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 오르토로그는 아미노산 치환 H133D 및 Y134F를 포함하는 직교 인간 CD122의 동족 리간드인 hIL2 오르토로그이다.
IL2 오르토로그 (식 #1): 한 실시양태에서, 본 개시내용은 그의 아미노산 서열이 하기 식 #1의 폴리펩티드와 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 hIL2 오르토로그를 제공한다:
Figure pct00033
여기서:
AA1은 A (야생형)이거나 또는 결실되고/거나;
AA2는 P (야생형)이거나 또는 결실되고/거나;
AA3은 T (야생형), C, A, G, Q, E, N, D, R, K, P이거나 또는 결실되고/거나;
AA4는 S (야생형)이거나 또는 결실되고/거나;
AA5는 S (야생형)이거나 또는 결실되고/거나;
AA6은 S (야생형)이거나 또는 결실되고/거나;
AA7은 T (야생형)이거나 또는 결실되고/거나;
AA8은 K (야생형)이거나 또는 결실되고/거나;
AA9는 K (야생형)이거나 또는 결실되고/거나;
AA13은 Q (야생형), W이거나 또는 결실되고/거나;
AA14는 L (야생형), M, W이거나 또는 결실되고/거나;
AA15는 E (야생형), K, D, T, A, S, Q, H이거나 또는 결실되고/거나;
AA16은 H (야생형), N 또는 Q이거나 또는 결실되고/거나;
AA18은 L (야생형) 또는 R, L, G, M, F, E, H, W, K, Q, S, V, I, Y, H, D 또는 T이고/거나;
AA19는 L (야생형), A, V, I이거나 또는 결실되고/거나;
AA20은 D (야생형), T, S, M, L이거나 또는 결실되고/거나;
AA22는 Q (야생형) 또는 F, E, G, A, L, M, F, W, K, S, V, I, Y, H, R, N, D, T, F이거나 또는 결실되고/거나;
AA23은 M (야생형), A, W, H, Y, F, Q, S, V, L, T이거나 또는 결실되고/거나;
AA27은 G (야생형), K, S이거나 또는 결실되고/거나;
AA38은 R (야생형), W 또는 G이고/거나;
AA39는 M (야생형), L 또는 V이고/거나;
AA42는 F (야생형) 또는 K이고/거나;
AA51은 T (야생형), I이거나 또는 결실되고/거나;
AA55는 H (야생형) 또는 Y이고/거나;
AA74는 Q (야생형), N, H, S이고/거나;
AA80은 L (야생형), F 또는 V이고/거나;
AA81은 R (야생형), I, D, Y, T이거나 또는 결실되고/거나;
AA85는 L (야생형) 또는 V이고/거나;
AA86은 I (야생형) 또는 V이고/거나;
AA88은 N (야생형), E 또는 Q이거나 또는 결실되고/거나;
AA89는 I (야생형) 또는 V이고/거나;
AA91은 V (야생형), R 또는 K이고/거나;
AA92는 I (야생형) 또는 F이고/거나;
AA97은 K (야생형) 또는 Q이고/거나;
AA104는 M (야생형) 또는 A이고/거나;
AA109는 D (야생형), C 또는 활성화된 측쇄를 갖는 비-자연 아미노산이고/거나;
AA113은 T (야생형) 또는 N이고/거나;
AA125는 C (야생형), A 또는 S이고/거나;
AA126은 Q (야생형) 또는 H, M, K, C, D, E, G, I, R, S 또는 T이고/거나;
AA130은 S (야생형), T 또는 R이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 아미노산 변형 세트를 포함하는 hIL2 폴리펩티드인 hIL2 오르토로그를 제공한다:
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]
[H16N, L19V, D20N, Q22T, M23H, G27K];
[E15D, H16N, L19V, D20L, Q22T, M23H];
[E15D, H16N, L19V, D20L, Q22T, M23A],
[E15D, H16N, L19V, D20L, Q22K, M23A];
[E15S; H16Q; L19V, D20T; Q22K, M23L];
[E15S; H16Q; L19V, D20T; Q22K, M23S];
[E15S; H16Q; L19V, D20S; Q22K, M23S];
[E15S; H16Q; L19I, D20S; Q22K; M23L];
[E15S; L19V; D20M; Q22K; M23S];
[E15T; H16Q; L19V; D20S; M23S];
[E15Q; L19V; D20M; Q22K; M23S];
[E15Q; H16Q; L19V; D20T; Q22K; M23V];
[E15H; H16Q; L19I; D20S; Q22K; M23L];
[E15H; H16Q; L19I; D20L; Q22K; M23T]; 또는
[L19V; D20M; Q22N; M23S].
Cys125 : 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 위치 125에서의 짝을 이루지 않은 시스테인 잔기를 제거하고/거나 내인성 박테리아 프로테아제에 의한 번역 후 프로세싱에 의해 위치 1에서 알라닌 뿐만 아니라 직접 발현된 IL2 폴리펩티드의 N-말단측 Met를 제거함으로써 박테리아 세포에서의 재조합 발현을 촉진하는 hIL2 오르토로그를 제공한다. 아미노산이 누락된 경우, 이는 "des"로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 위치 125에서의 시스테인은 알라닌 또는 세린으로 치환된다 (C125A 또는 C125S). 이러한 돌연변이는 전형적으로 박테리아에서 재조합적으로 발현되고 봉입체로부터 단리될 때 단백질의 미스폴딩을 피하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 IL2 오르토로그는 하기 아미노산 변형 세트 중 하나를 포함한다:
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]; 또는
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L].
CD122 친화성을 증가시키기 위한 돌연변이
일부 실시양태에서, hIL2 오르토로그는 hCD122와 접촉하거나 또는 CD122와 접촉하는 다른 위치의 정위를 변경하여 CD122에 대한 증가된 친화성을 갖는 IL2 오르토로그를 초래하는 hIL2 서열의 위치 내의 하나 이상의 돌연변이를 함유한다. CD122에 대한 IL2의 결합에 관여하는 것으로 확인된 IL2 잔기는 L12, Q13, H16, L19, D20, M23, Q74, L80, R81, D84, L85, I86, S87, N88, I89, V91, I92, 및 E95를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 아미노산 치환: Q74N, Q74H, Q74S, L80F, L80V, R81D, R81T, L85V, I86V, I89V, 및/또는 I92F 중 하나 이상 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 아미노산 치환: L80F, R81D, L85V, I86V 및 I92F 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 아미노산 치환: N74Q, L80F, R81D, L85V, I86V, I89V, 및 I92F 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 아미노산 치환: Q74N, L80V, R81T, L85V, I86V, 및 I92F 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 아미노산 치환: Q74H, L80F, R81D, L85V, I86V 및 I92F 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 아미노산 치환: Q74S, L80F, R81D, L85V, I86V 및 I92F 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 아미노산 치환: Q74N, L80F, R81D, L85V, I86V 및 I92F 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 아미노산 치환: Q74S, R81T, L85V, 및 I92F 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 [L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 아미노산 변형 세트 중 하나를 포함하는 hIL2 오르토로그를 제공한다:
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A L80F-R81D-L85V-I86V-I92F];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]; 또는
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M].
일부 실시양태에서, 오르토로그는 CD122에 대한 IL2의 친화성을 증가시키는 것으로 확인된 치환 L85V를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 아미노산 변형 세트 중 하나를 포함하는 hIL2 폴리펩티드인 hIL2 오르토로그를 제공한다:
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V -Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126M]; 또는
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126M].
CD25 친화성을 조정하기 위한 변형
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 CD25와 접촉하거나 또는 CD25와 접촉하는 다른 위치의 정위를 변경하여 CD25에 대한 친화성을 감소시키는 IL2 서열의 위치 내의 하나 이상의 돌연변이를 함유한다. 돌연변이는 공개된 결정 구조에 기초하여 CD25에 매우 근접한 것으로 공지된 영역 내에 또는 그 근처에 있을 수 있다 (Wang, et al. Science 310:1159 2005). CD25와 접촉하는 것으로 여겨지는 IL2 잔기는 K35, R38, T41, F42, K43, F44, Y45, E61, E62, K64, P65, E68, V69, L72, 및 Y107을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IL2 오르토로그는 R38A, F41A 및 F42A (문헌 [Suave, et al. (1991) PNAS(USA)88:4636-4640]); P65L (문헌 [Chen et al. Cell Death and Disease (2018) 9:989]); F42A/G/S/T/Q/E/N/R/K, Y45A/G/S/T/Q/E/N/D/R/K/ 및/또는 L72G/A/S/T/Q/E/N/D/R/K (2012년 9월 27일에 공개된 미국 특허 출원 공보 2012/0244112A1 (Ast, et al.); 2016년 2월 23일에 허여된 미국 특허 번호 9266938B2)의 점 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 치환의 특정한 조합은 CD25에 대한 결합을 감소시키는 것으로 확인되었다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IL2 오르토로그는 문헌 [Carmenate, et al. (2013) J Immunol 190:6230-6238]에 기재된 바와 같은 치환 [R38A-F42A-Y45A-E62A]; [F42A-Y45A-L72G] (로슈 RG7461 (RO6874281)) 및/또는 [T41P-T51P] (문헌 [Chang, et al. (1995) Molecular Pharmacology 47:206-211]) 세트 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 아미노산 변형 세트 중 하나를 포함하는 hIL2 폴리펩티드인 hIL2 오르토로그를 제공한다:
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126M]; 또는
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126M].
CD132 친화성을 조정하기 위한 변형
본 발명의 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 CD132와 접촉하거나 또는 CD132와 접촉하는 다른 위치의 정위를 변경하여 CD132에 대한 결합을 변경시키는 IL2 서열의 위치 내의 하나 이상의 돌연변이를 함유한다. 예시적인 IL2 오르토로그는 CD132와 접촉하거나 또는 CD122와 접촉하는 다른 위치의 정위를 변경하여 CD132에 대한 결합을 변경시키는 IL2 서열의 위치 내의 하나 이상의 돌연변이를 함유한다. CD132와 접촉하는 것으로 여겨지는 IL2 잔기는 Q11, L18, Q22, E110, N119, T123, Q126, S127, I129, S130, 및 T133을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL2는 L18에서 AA18이 L (야생형) 또는 R, L, G, M, F, E, H, W, K, Q, S, V, I, Y, H, D 또는 T이고/거나; AA126이 Q (야생형) 또는 H, M, K, C, D, E, G, I, R, S, 또는 T이고/거나; AA22가 Q (야생형) 또는 F, E, G, A, L, M, F, W, K, S, V, I, Y, H, R, N, D, T, 또는 F인 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 아미노산 변형 세트 중 하나를 포함하는 hIL2 폴리펩티드인 hIL2 오르토로그를 제공한다:
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126M];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126M];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q126M];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126M];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126M];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126M];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126M];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V -Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L85V-Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126H];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126M];
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L85V-Q126H]; 또는
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126M].
리더 서열의 부재 하에 박테리아 발현 시스템에서 재조합적으로 직접 생산되는 경우, 내인성 프로테아제는 N-말단측 Met-Ala1 잔기를 결실시켜 "desAla1" IL2 오르토로그를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 아미노산 변형 세트 중 하나를 포함하는 hIL2 폴리펩티드인 hIL2 오르토로그를 제공한다:
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q126H];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126H];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q126M];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126H];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A-Q126H];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A-Q126H];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A-Q126H];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A-Q126M];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A-Q126H];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A-Q126H];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S-Q126H];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S-Q126H];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S-Q126H];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S-Q126M];
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S-Q126M]; 또는
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S-Q126M].
보존적 아미노산 치환
CD122 직교 수용체에 대한 IL2 오르토로그의 활성 및 선택성에 기여하는 전술한 변형에 더하여, IL2 오르토로그는 활성 IL2에 대한 최소 효과를 제공하는 1차 구조에 대한 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IL2 오르토로그는 야생형 IL-2 아미노산 서열 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 보존적 치환은 문헌 [Dayhoff in The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978), and Argos in EMBO J., 8:779-785 (1989)]에 기재된 것을 포함한다. 보존적 치환은 일반적으로 하기 표 XXX로서 표시된 차트에 따라 이루어진다:
Figure pct00034
기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변화는 표 3에 표시된 것보다 덜 보존적인 아미노산 치환을 선택함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 비하전된 작은 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 글리신)을 큰 전하의 벌키 측쇄를 갖는 아미노산 (아스파라긴)으로 치환하는 것을 포함하여, 폴리펩티드 백본의 구조에 보다 상당한 영향을 미치거나 2차 또는 3차 요소를 파괴하는 치환이 이루어질 수 있다. 특히, CD25, CD122 및/또는 CD123 중 하나 이상과 상호작용하는 아미노산에 관여하는 IL2 잔기의 치환은 문헌에 기재된 바와 같이, 그의 수용체와 연합하여 IL2의 결정 구조로부터 구별될 수 있다.
CD122 직교 수용체에 대한 IL2 오르토로그의 활성 및 선택성에 기여하는 전술한 변형에 더하여, IL2 오르토로그는 그의 1차 구조에 대한 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 상기 제공된 바와 같은 1차 구조에 대한 변형은 임의로 IL2 오르토로그의 IL2 활성을 실질적으로 감소시키지 않는 변형을 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 변형은 치환: N30E; K32E; N33D; P34G; T37I, M39Q, F42Y, F44Y, P47G, T51I, E52K, L53N, Q57E, M104A를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (미국 특허 번호 5,206,344 참조).
글리코실화 부위의 제거
본 개시내용의 IL2 오르토로그는 포유류 세포 예컨대 CHO 또는 HEK 세포에서 IL2 오르토로그가 발현될 때 아글리코실화된 IL2 오르토로그의 생산을 용이하게 하기 위해 위치 Thr3에서 O-글리코실화 부위를 제거하는 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서 IL2 오르토로그는 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 변형을 포함한다. 한 실시양태에서 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 상기 변형은 아미노산 치환이다. 예시적인 아미노산 치환은 생물학적 활성을 제거하지 않으면서 위치 3에서 글리코실화 부위를 제거하는 T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K, 및 T3P를 포함한다 (미국 특허 번호 5,116,943; 문헌 [Weiger et al., (1989) Eur. J. Biochem., 180:295-300] 참조). 구체적 실시양태에서, 상기 변형은 아미노산 치환 T3A이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 아미노산 변형 세트 중 하나를 포함하는 hIL2 폴리펩티드인 hIL2 오르토로그를 제공한다:
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S];
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S];
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S];
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S];
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A];
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A];
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A];
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A] ;
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A];
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A];
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K];
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L];
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S];
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S];
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S];
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S];
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A];
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A];
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A];
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A];
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A];
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A];
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]; 또는
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L].
IL2 오르토로그는 처음 2개의 아미노산의 결실 (desAla1-desPro2) 뿐만 아니라 선택적 N-말단측 변형, 특히 시스테인의 술프히드릴 기의 PEG화를 용이하게 하는 시스테인 잔기로의 Thr3 글리코실화의 치환을 포함할 수 있다 (예를 들어, 1993년 4월 27일에 허여된 미국 특허 번호 5,206,344 (Katre, et al.) 참조). 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 아미노산 변형 세트 중 하나를 포함하는 hIL2 폴리펩티드인 hIL2 오르토로그를 제공한다:
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S];
[desAla1-desPro2-T3C -E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S];
[desAla1-desPro2-T3C E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S];
[desAla1-desPro2-T3C -E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S];
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A];
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A];
[desAla1-desPro2-T3C E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A];
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A];
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A];
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K];
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]; 또는
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L].
산화 안정화된 M104A :
IL2 오르토로그는 임의로 위치 M104에서의 변형을 추가로 포함할 수 있으며, 한 실시양태에서는 보다 내산화성인 오르토로그를 제공하기 위해 메티오닌 104를 알라닌 잔기로 치환하는 것 (M104A)을 포함할 수 있다 (1988년 6월 21일에 허여된 미국 특허 번호 4,752,585 (Koths, et al.) 참조).
N 말단측 결실:
리더 서열의 부재 하에 박테리아 발현 시스템에서 직접 재조합적으로 생산되는 경우, 내인성 프로테아제는 "desAla1" IL2 오르토로그를 제공하기 위해 N-말단측 Met-Ala1 잔기를 결실시킨다. IL2 오르토로그는 N-말단측 변형, 특히 시스테인의 술프히드릴 기의 PEG화를 용이하게 하기 위해 처음 2개의 아미노산의 결실 (desAla1-desPro2) 뿐만 아니라 시스테인 잔기로의 Thr3 글리코실화의 치환 (T3C)을 포함할 수 있다 (예를 들어, 1993년 4월 27일에 허여된 미국 특허 번호 5,206,344 (Katre, et al.) 참조).
IL2 오르토로그는 위치 1-9, 대안적으로 위치 1-8, 대안적으로 위치 1-7, 대안적으로 위치 1-6, 대안적으로 위치 1-5, 대안적으로 위치 1-4, 대안적으로 위치 1-3, 대안적으로 위치 1-2 중 하나 이상에서의 N-말단측 아미노산의 제거를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 아미노산 변형 세트 중 하나를 포함하는 hIL2 폴리펩티드인 hIL2 오르토로그를 제공한다:
[desAla1-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A];
[desAla1-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K];
[desAla1-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A];
[desAla1-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L] ;
[desAla1-desPro2-desThr3-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A];
[desAla1-desPro2-desThr3-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K];
[desAla1-desPro2-desThr3-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A];
[desAla1-desPro2-desThr3-E15S-H16Q-L19V-D20L] ;
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A];
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K];
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A];
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-E15S-H16Q-L19V-D20L];
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A];
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K];
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A];
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-E15S-H16Q-L19V-D20L];
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-desSer6-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A];
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-desSer6-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K];
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-desSer6-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]; 또는
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-desSer6-E15S-H16Q-L19V-D20L].
혈관 누출 증후군을 최소화하기 위한 변형
본 개시내용의 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 효능의 실질적인 상실 없이 인간에서 IL2 요법의 사용의 실질적인 부정적 및 용량 제한 부작용인 혈관 누출 증후군을 피하기 위한 아미노산 치환을 포함한다. 2009년 4월 7일에 허여된 미국 특허 번호 7,514,073B2 (Epstein, et al.)를 참조한다. 본 개시내용의 IL2 오르토로그에 포함되는 이러한 변형의 예는 R38W, R38G, R39L, R39V, F42K 및 H55Y 중 하나 이상을 포함한다.
친화성 성숙:
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 직교 CD122에 대한 그의 활성을 증진시키기 위해 친화성 성숙될 수 있다. "친화성 성숙된" 폴리펩티드는 하나 이상의 잔기에 변경(들)을 보유하지 않는 모 폴리펩티드와 비교하여 동족 직교 수용체에 대한 직교 폴리펩티드의 친화성의 개선을 초래하거나 그 반대의 경우도 마찬가지인 하나 이상의 변경(들)을 갖는 것이다. 친화성 성숙은 "모" 폴리펩티드와 비교 시 적어도 약 10%, 대안적으로 적어도 약 50%, 대안적으로 적어도 약 100%, 대안적으로 적어도 약 150%, 또는 1배 내지 5배만큼 IL2 오르토로그의 결합 친화성을 증가시키기 위해 수행될 수 있다. 본 발명의 조작된 IL2 오르토로그는 상기 논의된 바와 같이 그의 동족 직교 수용체를 활성화시키지만, 적합한 검정 조건 하에 충분한 양의 분자를 사용하는 ELISA 및/또는 FACS 분석에 의해 평가될 때 야생형 IL2 수용체의 결합 및 활성화를 상당히 감소시킨다.
생체내 작용 지속 기간을 연장시키기 위한 변형
상기 논의된 바와 같이, 본 개시내용의 조성물은 대상체에서 연장된 생체내 수명 및/또는 연장된 작용 지속 기간을 제공하도록 변형된 IL2 오르토로그를 포함한다. 연장된 수명 및/또는 작용 지속 기간을 제공하기 위한 이러한 변형은 IL2 오르토로그의 1차 서열에 대한 변형, 운반체 분자에 대한 접합 (예를 들어 알부민, 아실화, PEG화) 및 Fc 융합을 포함한다.
생체내 작용 지속 기간을 연장시키기 위한 서열 변형
상기 논의된 바와 같이, 용어 IL2 오르토로그는 대상체에서 연장된 생체내 수명 및/또는 연장된 작용 지속 기간을 제공하기 위한 IL2 오르토로그의 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 연장된 생체내 수명을 초래하는 특정 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Dakshinamurthi, et al. (International Journal of Bioinformatics Research (2009) 1(2):4-13)]에는 IL2 폴리펩티드에서의 치환: V91R, K97E 및 T113N 중 하나 이상이 증진된 안정성 및 활성을 갖는 IL2 변이체를 발생시킬 것이라고 언급되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IL2 오르토로그는 V91R, K97E 및 T113N 변형 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함한다.
접합체 및 운반체 분자
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 IL2 오르토로그에 특정 특성 (예를 들어, 대상체에서 연장된 작용 지속 기간)을 제공하도록 변형되고, 이는 원하는 약리학적 특성, 예컨대 연장된 반감기를 제공하기 위해 운반체 분자에 대한 접합을 통해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는, 예를 들어 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 PEG화, 글리코실화, 지방산 아실화 등에 의해 IgG의 Fc 도메인, 알부민 또는 기타 분자에 공유적으로 연결되어 그의 반감기를 연장시킬 수 있다.
알부민 융합물
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 생체내 연장된 노출을 용이하게 하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 알부민 분자 (예를 들어, 인간 혈청 알부민)와의 융합 단백질로서 발현된다.
본 발명의 한 실시양태에서, hIL2 오르토로그는 알부민과 접합되며, 이는 본원에서 "IL2 오르토로그 알부민 융합물"로서 지칭된다. hIL2 오르토로그 알부민 융합물의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "알부민"은 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA), 시노 혈청 알부민, 및 소 혈청 알부민 (BSA)을 포함한다. 일부 실시양태에서, HSA는 야생형 HSA 서열과 비교하여 C34S 또는 K573P 아미노산 치환을 포함한다. 본 개시내용에 따르면, 알부민은 카르복실 말단, 아미노 말단, 카르복실과 아미노 말단 둘 다에서, 및 내부적으로 hIL2 오르토로그와 접합될 수 있다 (예를 들어, USP 5,876,969 및 USP 7,056,701 참조). 본 개시내용에 의해 고려되는 HSA-hIL2 오르토로그 폴리펩티드 접합체에서, 다양한 형태의 알부민, 예컨대 알부민 분비 프리-서열 및 그의 변이체, 그의 단편 및 변이체, 및 HSA 변이체가 사용될 수 있다. 이러한 형태는 일반적으로 하나 이상의 원하는 알부민 활성을 보유한다. 추가적 실시양태에서, 본 개시내용은 알부민, 알부민 단편, 및 알부민 변이체 등과 직접 또는 간접적으로 융합된 hIL2 오르토로그 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 비융합 약물 분자보다 더 높은 혈장 안정성을 가지고/거나 융합 단백질은 비융합 약물 분자의 치료 활성을 유지한다. 일부 실시양태에서, 간접 융합은 하기에 보다 충분히 논의되는 바와 같이 링커, 예컨대 펩티드 링커 또는 그의 변형된 버전에 의해 영향을 받는다.
대안적으로, hIL2 오르토로그 알부민 융합물은 알부민 결합 도메인 (ABD) 폴리펩티드 서열 및 IL2 오르토로그 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질인 IL2 오르토로그를 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 알부민 결합 도메인 (ABD) 폴리펩티드 서열 및 hIL2 오르토로그 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질은, 예를 들어, HSA를 코딩하는 핵산 또는 그의 단편이 하나 이상의 IL2 오르토로그 서열을 코딩하는 핵산에 연결되도록 유전적 조작에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 알부민-결합 펩티드는 아미노산 서열 DICLPRWGCLW (서열식별번호: 7)를 포함한다.
IL2 오르토로그 폴리펩티드는 또한, 크고 느리게 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질; 폴리사카라이드, 예컨대 세파로스, 아가로스, 셀룰로스 또는 셀룰로스 비드; 중합체성 아미노산, 예컨대 폴리글루탐산 또는 폴리리신; 아미노산 공중합체; 불활성화된 바이러스 입자; 불활성화된 박테리아 독소, 에컨대 디프테리아, 파상풍, 콜레라 또는 류코톡신 분자로부터의 톡소이드; 불활성화된 박테리아, 수지상 세포, 티로글로불린; 파상풍 톡소이드; 디프테리아 톡소이드; 폴리아미노산, 예컨대 폴리(D-리신:D-글루탐산); 로타바이러스의 VP6 폴리펩티드; 인플루엔자 바이러스 혈구응집소, 인플루엔자 바이러스 핵단백질; 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH); 및 B형 간염 바이러스 코어 단백질 및 표면 항원과 접합될 수 있다. 이러한 접합된 형태는, 원하는 경우, 본 개시내용의 폴리펩티드에 대항한 항체를 생산하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 PEG화와 유사한 연장된 지속 기간을 제공하고 이. 콜라이(E. coli)에서 재조합 융합 단백질로서 생산될 수 있는 XTEN과 접합 (화학적으로 또는 융합 단백질로서)된다. 본 개시내용의 IL2 오르토로그와 연계해서 사용하기에 적합한 XTEN 중합체는 문헌 [Podust, et al. (2016) "Extension of in vivo half-life of biologically active molecules by XTEN protein polymers", J Controlled Release 240:52-66 and Haeckel et al. (2016) "XTEN as Biological Alternative to PEGylation Allows Complete Expression of a Protease- Activatable Killin -Based Cytostatic " PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0157193 June 13, 2016]에 제공되어 있다. XTEN 중합체 융합 단백질은 XTEN 폴리펩티드와 IL2 오르토로그 사이에 프로테아제 감수성 절단 부위, 예컨대 MMP-2 절단 부위를 혼입할 수 있다.
접합을 위한 부가의 후보 성분 및 분자는 단리 또는 정제에 적합한 것을 포함한다. 특정한 비-제한적 예는 결합 분자, 예컨대 비오틴 (비오틴-아비딘 특이적 결합 쌍), 항체, 수용체, 리간드, 렉틴; 또는 예를 들어, 플라스틱 또는 폴리스티렌 비드, 플레이트 또는 비드, 자기 비드, 시험 스트립 및 막을 포함한 고체 지지체를 포함하는 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, IL-2 뮤테인은 또한 치료 화합물, 예컨대 항염증 화합물 또는 항신생물제, 치료 항체 (예를 들어 헤르셉틴), 면역 체크포인트 조정제, 면역 체크포인트 억제제 (예를 들어 항-PD1 항체), 본 개시내용의 다른 곳에서 기재된 바와 같은 암 백신을 포함한 추가적 치료제에 연결될 수 있다. 항미생물제는 젠타마이신을 포함한 아미노글리코시드, 항바이러스 화합물, 예컨대 리팜피신, 3'-아지도-3'-데옥시티미딘 (AZT) 및 아실로비르, 항진균제, 예컨대 플루코나졸을 포함한 아졸, 플라이레 마크롤리드, 예컨대 암포테리신 B, 및 칸디시딘, 항기생충 화합물, 예컨대 안티몬 등을 포함한다. IL2 오르토로그는 부가의 시토카인, 예컨대 CSF, GSF, GMCSF, TNF, 에리트로포이에틴, 면역조정제 또는 시토카인, 예컨대 인터페론 또는 인터류킨, 신경 펩티드, 생식 호르몬, 예컨대 HGH, FSH 또는 LH, 갑상선 호르몬, 신경전달물질, 예컨대 아세틸콜린, 호르몬 수용체, 예컨대 에스트로겐 수용체와 접합될 수 있다. 또한 비스테로이드성 항염증제, 예컨대 인도메타신, 살리실산 아세테이트, 이부프로펜, 술린닥, 피록시캄, 및 나프록센, 및 마취제 또는 진통제가 포함된다. 또한 요법에 유용할 뿐만 아니라 영상화에 유용한 방사성 동위원소가 포함된다.
본 개시내용의 IL2 오르토로그는 널리 공지된 화학적 접합 방법을 사용하여 이러한 운반체 분자와 화학적으로 접합될 수 있다. 이러한 목적을 위해 관련 기술분야에 널리 공지된 이작용성 교차결합 시약, 예컨대 동종작용성 및 이종작용성 교차결합 시약이 사용될 수 있다. 사용할 교차결합 시약의 유형은 IL-2 뮤테인과 커플링될 분자의 성질에 따라 다르며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 대안적으로, 또는 또한, 접합되도록 의도된 분자 및/또는 IL2 오르토로그는 또한 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이 별도의 반응에서 둘이 접합될 수 있도록 화학적으로 유도체화될 수 있다.
PEG화 :
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 하나 이상의 수용성 중합체와 접합된다. 본 발명의 실시에 유용한 수용성 중합체의 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리사카라이드 (폴리비닐피롤리돈), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리올레핀 알콜, 폴리사카라이드, 폴리-알파-히드록시산, 폴리비닐 알콜 (PVA), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린 (POZ), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 그의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자와 접합되거나 또는 "PEG화"된다. IL2 오르토로그에 대한 PEG 부착의 방법 또는 부위는 다양할 수 있지만, 특정 실시양태에서 PEG화는 IL2 오르토로그의 활성을 변경시키지 않거나 최소한으로만 변경시킨다.
일부 실시양태에서, 특정한 화학을 사용하여 N-말단측 PEG화를 촉진하기 위해 위치 3에서 시스테인이 트레오닌을 대체할 수 있다 (3TC).
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그의 선택적 PEG화 (예를 들어, 2018년 8월 3일에 출원되고 2019년 2월 7일에 국제 공개 번호 WO 2019/028419Al로서 공개된 PCT 국제 출원 번호 PCT/US2018/045257 (Ptacin et al.)에 기재된 바와 같이 선택적 PEG 접합 화학을 용이하게 하기 위해 측쇄를 갖는 비-자연 아미노산의 혼입에 의함)는 IL2 수용체 복합체의 하나 이상의 서브유닛 (예를 들어, CD25, CD132)에 대한 친화성이 감소된 IL2 오르토로그를 생성하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 34-45, 61-72 및 105-109를 포함한 CD25와 상호작용하는 것으로 확인된 IL2의 서열 또는 잔기에서 PEG화 가능한 특이적 모이어티를 갖는 비-자연 아미노산을 혼입한 hIL2 오르토로그는 전형적으로, CD25에 대한 감소된 결합을 갖는 IL2 오르토로그를 제공한다. 유사하게, 아미노산 18, 22, 109, 126 및/또는 119-133을 포함한 hCD132와 상호작용하는 것으로 확인된 IL2의 서열 또는 잔기에서 PEG화 가능한 특이적 모이어티를 갖는 비-자연 아미노산을 혼입한 hIL2 오르토로그는 hCD132에 대한 감소된 결합을 갖는 IL2 오르토로그를 제공한다.
특정 실시양태에서, 반감기의 증가는 생물학적 활성의 임의의 감소보다 더 크다. 폴리펩티드 서열에 대한 접합에 적합한 PEG는 일반적으로 실온에서 물에 용해되며, 일반식 R(O-CH2-CH2)nO-R을 가지며, 여기서 R은 수소 또는 보호기, 예컨대 알킬 또는 알칸올 기이고, n은 1 내지 1000의 정수이다. R이 보호기인 경우, 이는 일반적으로 1 내지 8개의 탄소를 갖는다. 폴리펩티드 서열과 접합된 PEG는 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 PEG 유도체, "스타-PEG" 및 멀티-아암 PEG가 본 개시내용에 의해 고려된다.
본 개시내용에 사용된 PEG의 분자량은 임의의 특정한 범위로 제한되지 않는다. PEG-IL2 오르토로그의 PEG 성분은 약 5 kDa 초과, 약 10 kDa 초과, 약 15 kDa 초과, 약 20 kDa 초과, 약 30 kDa 초과, 약 40 kDa 초과, 또는 약 50 kDa 초과의 분자량을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자량은 약 5 kDa 내지 약 10 kDa, 약 5 kDa 내지 약 15 kDa, 약 5 kDa 내지 약 20 kDa, 약 10 kDa 내지 약 15 kDa, 약 10 kDa 내지 약 20 kDa, 약 10 kDa 내지 약 25 kDa 또는 약 10 kDa 내지 약 30 kDa이다. 선형 또는 분지형 PEG 분자는 약 2,000 내지 약 80,000 달톤, 대안적으로 약 2,000 내지 약 70,000 달톤, 대안적으로 약 5,000 내지 약 50,000 달톤, 대안적으로 약 10,000 내지 약 50,000 달톤, 대안적으로 약 20,000 내지 약 50,000 달톤, 대안적으로 약 30,000 내지 약 50,000 달톤, 대안적으로 약 20,000 내지 약 40,000 달톤, 대안적으로 약 30,000 내지 약 40,000 달톤의 분자량을 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에서, PEG는 2개의 20 kD 아암을 포함하는 40 kD 분지형 PEG이다.
본 개시내용은 또한 접합체의 조성물을 고려하며, 여기서 PEG는 상이한 n 값을 갖고, 따라서 다양한 상이한 PEG가 특이적 비로 존재한다. 예를 들어, 일부 조성물은 n=1, 2, 3 및 4인 접합체의 혼합물을 포함한다. 일부 조성물에서, n=1인 접합체의 백분율은 18-25%이고, n=2인 접합체의 백분율은 50-66%이고, n=3인 접합체의 백분율은 12-16%이고, n=4인 접합체의 백분율은 최대 5%이다. 이러한 조성물은 관련 기술분야에 공지된 반응 조건 및 정제 방법에 의해 생산될 수 있다. 크로마토그래피를 사용하여 접합체 분획을 분석할 수 있으며, 이어서 예를 들어, 원하는 수의 PEG가 부착되고, 변형되지 않은 단백질 서열이 없고, 다른 수의 PEG가 부착된 접합체로부터 정제된 접합체를 함유하는 분획이 확인된다.
폴리펩티드 서열에 대한 접합에 적합한 PEG는 일반적으로 실온에서 물에 용해되며, 일반식 R(O-CH2-CH2)nO-R을 가지며, 여기서 R은 수소 또는 보호기, 예컨대 알킬 또는 알칸올 기이고, n은 1 내지 1000의 정수이다. R이 보호기인 경우, 이는 일반적으로 1 내지 8개의 탄소를 갖는다.
널리 사용되는 2가지 1세대 활성화된 모노메톡시 PEG (mPEG)는 숙신이미딜 카르보네이트 PEG (SC-PEG; 예를 들어, 문헌 [Zalipsky, et al. (1992) Biotehnol. Appl. Biochem 15:100-114] 참조) 및 벤조트리아졸 카르보네이트 PEG (BTC-PEG; 예를 들어, 미국 특허 번호 5,650,234 (Dolence, et al.) 참조)이며, 이들은 리신 잔기와 우선적으로 반응하여 카르바메이트 연결을 형성하지만 히스티딘 및 티로신 잔기와도 반응하는 것으로 공지되어 있다. PEG-알데히드 링커의 사용은 환원성 아민화를 통해 폴리펩티드의 N-말단 상의 단일 부위를 표적으로 한다.
PEG화는 폴리펩티드의 N-말단의 α-아미노기, 리신 잔기의 측쇄 상의 엡실론 아미노기, 및 히스티딘 잔기의 측쇄 상의 이미다졸 기에서 가장 자주 발생할 수 있다. 대부분의 재조합 폴리펩티드는 단일 알파와 다수의 엡실론 아미노 및 이미다졸 기를 보유하기 때문에, 링커 화학에 따라 수많은 위치 이성질체가 생성될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 일반적인 PEG화 전략이 본원에 적용될 수 있다.
PEG는 하나 이상의 폴리펩티드 서열의 유리 아미노 또는 카르복실 기와 폴리에틸렌 글리콜 간의 결합을 매개하는 말단측 반응기 ("스페이서")를 통해 본 개시내용의 IL2 오르토로그와 결합될 수 있다. 유리 아미노기와 결합될 수 있는 스페이서를 갖는 PEG는 N-히드록시숙신일이미드 폴리에틸렌 글리콜을 포함하며, 이는 폴리에틸렌 글리콜의 숙신산 에스테르를 N-히드록시숙신일이미드로 활성화시킴으로써 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그의 PEG화는 부위 특이적 PEG화를 촉진하기 위해 독특한 측쇄를 보유하는 비-자연 아미노산의 혼입에 의해 촉진된다. 이러한 폴리펩티드의 부위 특이적 PEG화를 달성하기 위한 기능적 모이어티를 제공하기 위해 비-자연 아미노산을 폴리펩티드에 혼입하는 것은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 2018년 8월 3일에 출원되고 2019년 2월 7일에 국제 공개 번호 WO 2019/028419Al로서 공개된 PCT 국제 출원 번호 PCT/US2018/045257 (Ptacin et al.)을 참조한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 IL2 오르토로그는 IL2 오르토로그의 위치 D109에 비-자연 아미노산을 혼입한다. 본 발명의 한 실시양태에서, IL2 오르토로그는 약 20 kD, 대안적으로 약 30 kD, 대안적으로 약 40 kD의 분자량을 갖는 PEG 분자에 대해 IL2 오르토로그의 위치 109에서 PEG화된다.
폴리펩티드 서열과 접합된 PEG는 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 PEG 유도체, "스타-PEG" 및 멀티-아암 PEG가 본 개시내용에 의해 고려된다. 구체적인 실시양태에서 본 발명의 실시에 유용한 PEG는 10 kDa 선형 PEG-알데히드 [예를 들어, 선브라이트(Sunbright)® ME-100AL, NOF 아메리카 코포레이션 (NOF America Corporation; 미국 뉴욕주 10601 화이트 플레인스 원 노스 브로드웨이)], 10 kDa 선형 PEG-NHS 에스테르 (예를 들어, 선브라이트® ME-100CS, 선브라이트® ME-100AS, 선브라이트® ME-100GS, 선브라이트® ME-100HS, NOF), 20 kDa 선형 PEG-알데히드 (예를 들어, 선브라이트® ME-200AL, NOF), 20 kDa 선형 PEG-NHS 에스테르 (예를 들어, 선브라이트® ME-200CS, 선브라이트® ME-200AS, 선브라이트® ME-200GS, 선브라이트® ME-200HS, NOF), 2개의 10 kDa 선형 PEG 분자를 포함하는 20 kDa PEG-알데히드인 20 kDa 2-아암 분지형 PEG-알데히드 (예를 들어, 선브라이트® GL2-200AL3, NOF), 2개의 10 kDa 선형 PEG 분자를 포함하는 20 kDa PEG-NHS 에스테르인 20 kDa 2-아암 분지형 PEG-NHS 에스테르 (예를 들어, 선브라이트® GL2-200TS, 선브라이트® GL200GS2, NOF), 2개의 20 kDa 선형 PEG 분자를 포함하는 40 kDa PEG-알데히드인 40 kDa 2-아암 분지형 PEG-알데히드 (예를 들어, 선브라이트® GL2-400AL3), 2개의 20 kDa 선형 PEG 분자를 포함하는 40 kDa PEG-NHS 에스테르인 40 kDa 2-아암 분지형 PEG-NHS 에스테르 (예를 들어, 선브라이트® GL2-400AL3, 선브라이트® GL2-400GS2, NOF), 선형 30 kDa PEG-알데히드 (예를 들어, 선브라이트® ME-300AL) 및 선형 30 kDa PEG-NHS 에스테르를 포함한다.
이전에 언급된 바와 같이, PEG는 IL2 오르토로그에 직접 부착되거나 링커 분자를 통해 부착될 수 있다. 적합한 링커는 일반적으로 변형된 폴리펩티드 서열과 연결된 성분 및 분자 사이의 일부 이동을 허용하기에 충분한 길이의 "가요성 링커"를 포함한다. 링커 분자는 일반적으로 약 6-50개의 원자 길이이다. 링커 분자는 또한 예를 들어, 아릴 아세틸렌, 2-10개의 단량체 단위를 함유하는 에틸렌 글리콜 올리고머, 디아민, 이산, 아미노산, 또는 그의 조합일 수 있다. 적합한 링커는 쉽게 선택될 수 있으며 임의의 적합한 길이, 예컨대 1개의 아미노산 (예를 들어, Gly), 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50개 또는 50개 초과의 아미노산일 수 있다. 가요성 링커의 예는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체, 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 기타 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 구조화되지 않았으므로, 성분들 간의 중성 테더 역할을 할 수 있다. 가요성 링커의 추가적 예는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 글리신-세린 중합체를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 구조화되지 않았으므로, 성분들 간의 중성 테더 역할을 할 수 있다. 이러한 링커 서열의 다량체 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30 또는 30-50개)는 함께 연결되어, 이종 아미노산 서열을 본원에 개시된 폴리펩티드와 접합하는데 사용될 수 있는 가요성 링커를 제공할 수 있다.
추가로, 이러한 링커는 IL2 오르토로그를 본원에 기재된 바와 같은 부가의 이종 폴리펩티드 성분에 연결하는데 사용될 수 있으며, 이종 아미노산 서열은 신호 서열 및/또는 융합 파트너, 예컨대 알부민, Fc 서열 등일 수 있다.
본 개시내용의 한 실시양태에서, IL2 오르토로그는 하기 구조의 인간 IL2 오르토로그이다:
[PEG]-[링커]n-[hoIL2]
여기서 n = 0 또는 1임, 또는
[PEG]-[링커]n-[desAla1-hIL2[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]
여기서 n = 0 또는 1이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, IL2 오르토로그는 하기 구조의 인간 IL2 오르토로그이다:
Figure pct00035
여기서 n = 0 또는 1이다.
아실화
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IL2 오르토로그는 문헌 [Resh (2016) Progress in Lipid Research 63: 120-131]에 기재된 바와 같이 지방산 분자에 대한 접합에 의해 아실화될 수 있다. 접합될 수 있는 지방산의 예는 미리스테이트, 팔미테이트 및 팔미톨레산을 포함한다. 미리스토일레이트는 전형적으로 N-말단측 글리신에 연결되지만 리신이 또한 미리스토일화될 수 있다. 팔미토일화는 전형적으로 유리 시스테인 -SH 기, 예컨대 DHHC 단백질의 효소적 변형에 의해 S-팔미토일화를 촉매함으로써 달성된다. 세린 및 트레오닌 잔기의 팔미톨레일화는 전형적으로 PORCN 효소를 사용하여 효소적으로 달성된다.
아세틸화
일부 실시양태에서, IL-2 뮤테인은 N-말단측 아세틸트랜스퍼라제 및, 예를 들어 아세틸 CoA와의 효소적 반응에 의해 N-말단에서 아세틸화된다. 대안적으로, 또는 N-말단측 아세틸화에 더하여, IL-2 뮤테인은 하나 이상의 리신 잔기에서, 예를 들어 리신 아세틸트랜스퍼라제와의 효소적 반응에 의해 아세틸화된다. 예를 들어, 문헌 [Choudhary et al. (2009) Science 325 (5942):834L2 ortho840]을 참조한다.
Fc 융합물
일부 실시양태에서, IL2 융합 단백질은 IgG 중쇄 가변 영역이 결여된 항체의 IgG 서브클래스로부터 유래된 Fc 영역을 혼입할 수 있다. IL2 융합물의 제조에서 유용한 "Fc 영역"은 파파인에 의한 IgG의 소화에 의해 생산된 IgG C-말단측 도메인과 상동인 자연적으로 발생하는 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. IgG Fc는 대략 50 kDa의 분자량을 갖는다. 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 전체 Fc 영역, 또는 그것이 일부인 키메라 폴리펩티드의 순환 반감기를 연장할 수 있는 능력을 유지하는 더 작은 부분을 포함할 수 있다. 또한, 완전한 길이의 또는 단편화된 Fc 영역은 야생형 분자의 변이체일 수 있다. 즉, 이들은 폴리펩티드의 기능에 영향을 미칠 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 돌연변이를 함유할 수 있으며; 하기에 추가로 기재되는 바와 같이, 모든 경우에 천연 활성이 필요하거나 바람직한 것은 아니다. 특정 실시양태에서, IL-2 뮤테인 융합 단백질 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 부분 효능제 또는 길항제)은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다. 예시적인 Fc 영역은 보체 고정 및 Fc 수용체 결합을 억제하는 돌연변이를 포함할 수 있거나, 또는 용해성, 즉 또 다른 메커니즘, 예컨대 항체-의존성 보체 용해 (ADCC)를 통해 보체와 결합하거나 세포를 용해시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 Fc-융합 키메라 폴리펩티드 분자의 기능적 도메인을 포함한다. Fc 융합 접합체는 바이오 의약품의 전신 반감기를 증가시키는 것으로 나타났으며, 따라서 바이오 의약품은 투여를 덜 빈번하게 요구할 수 있다. Fc는 혈관을 따라 늘어선 내피 세포 내의 신생아 Fc 수용체 (FcRn)와 결합하고, 결합 시 Fc 융합 분자는 분해로부터 보호되어 순환계로 재방출되어 분자를 더 오래 순환시킨다. 이러한 Fc 결합은 내인성 IgG가 긴 혈장 반감기를 유지하는 메커니즘인 것으로 여겨진다. 보다 최근의 Fc-융합 기술은 바이오 의약품의 단일 카피를 항체의 Fc 영역에 연결하여 전통적인 Fc-융합 접합체와 비교 시 바이오 의약품의 약동학적 및 약력학적 특성을 최적화한다. Fc 융합물의 제조에 유용한 "Fc 영역"은 파파인에 의한 IgG의 소화에 의해 생산된 IgG C-말단측 도메인에 상동인 합성 또는 자연적으로 발생하는 폴리펩티드일 수 있다. IgG Fc는 대략 50 kDa의 분자량을 갖는다. IL2 오르토로그는 전체 Fc 영역, 또는 일부인 키메라 폴리펩티드의 순환 반감기를 연장시킬 수 있는 능력을 유지하는 더 작은 부분을 제공할 수 있다. 또한, 완전한 길이의 또는 단편화된 Fc 영역은 야생형 분자의 변이체일 수 있다. 전형적인 제시에서, 이량체 Fc의 각각의 단량체는 이종 폴리펩티드를 보유하고, 이종 폴리펩티드는 동일하거나 상이하다.
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그가 Fc 융합물의 형식으로 투여되는 경우, 특히 Fc 이량체의 각각의 서브유닛과 접합된 폴리펩티드 쇄가 상이한 상황에서, Fc 융합은 "놉-인투-홀 변형"을 갖도록 조작될 수 있다. 놉-인투-홀 변형은 문헌 [Ridgway, et al. (1996) Protein Engineering 9(7):617-621] 및 1998년 3월 24일에 허여된 미국 특허 번호 5,731,168에 더 자세히 기재되어 있다. 놉-인투-홀 변형은 CH3 도메인 내의 2개의 이뮤노글로불린 중쇄 사이의 경계면에서의 변형을 지칭하며, 여기서: i) 제1 중쇄의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기는 더 큰 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체되어 표면으로부터 돌출부 ("놉")를 생성하며, ii) 제2 중쇄의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기는 더 작은 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체되고, 이로 인해 제1 CH3 도메인의 돌출 측쇄 ("놉")가 제2 CH3 도메인 내의 공동에 의해 수용되는 제2 CH3 도메인의 경계면 내에 공동 ("홀")을 생성한다. 한 실시양태에서, "놉-인투-홀 변형"은 항체 중쇄 중 하나에서의 아미노산 치환 T366W 및 임의로 아미노산 치환 S354C를 포함하고, 항체 중쇄 중 다른 하나에서의 아미노산 치환 T366S, L368A, Y407V 및 임의로 Y349C를 포함한다. 더욱이, Fc 도메인은 위치 S354 및 Y349에서 시스테인 잔기의 도입에 의해 변형될 수 있으며, 이는 Fe 영역 내의 2개의 항체 중쇄 사이에 안정화 디술피드 브릿지를 초래한다 (Carter, et al. (2001) Immunol Methods 248, 7-15). 놉-인투-홀 형식은 "놉" 변형을 갖는 제1 Fc 단량체 상의 제1 폴리펩티드 (예를 들어, IL2 오르토로그)의 발현 및 "홀" 변형을 갖는 제2 Fc 단량체 상의 제2 폴리펩티드의 발현을 용이하게 하기 위해 사용되어 이종이량체 폴리펩티드 접합체의 발현을 용이하게 한다.
Fc 영역은 "용해성" 또는 "비-용해성"일 수 있지만, 전형적으로 비-용해성이다. 비-용해성 Fc 영역은 전형적으로 고 친화성 Fc 수용체 결합 부위 및 Clq 결합 부위가 결여되어 있다. 뮤린 IgG Fc의 고 친화성 Fc 수용체 결합 부위는 IgG Fc의 위치 235에 Leu 잔기를 포함한다. 따라서, Fc 수용체 결합 부위는 Leu 235를 돌연변이 또는 결실시킴으로써 억제될 수 있다. 예를 들어, Leu 235에 대한 Glu의 치환은 고 친화성 Fc 수용체와 결합할 수 있는 Fc 영역의 능력을 억제한다. 뮤린 Clq 결합 부위는 IgG의 Glu 318, Lys 320 및 Lys 322 잔기를 돌연변이 또는 결실시킴으로써 기능적으로 파괴될 수 있다. 예를 들어, Glu 318, Lys 320 및 Lys 322에 대한 Ala 잔기의 치환은 IgG1 Fc가 항체 의존성 보체 용해를 지시할 수 없도록 한다. 대조적으로, 용해성 IgG Fc 영역은 고 친화성 Fc 수용체 결합 부위 및 Clq 결합 부위를 갖는다. 고 친화성 Fc 수용체 결합 부위는 IgG Fc의 위치 235에 있는 Leu 잔기를 포함하며, Clq 결합 부위는 IgG1의 Glu 318, Lys 320 및 Lys 322 잔기를 포함한다. 용해성 IgG Fc는 이들 부위에 야생형 잔기 또는 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 용해성 IgG Fc는 항체 의존성 세포 세포독성 또는 보체 유도 세포용해 (CDC)에 대해 세포를 표적화할 수 있다. 인간 IgG에 대한 적절한 돌연변이가 또한 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Morrison et al., The Immunologist 2:119-124, 1994; and Brekke et al., The Immunologist 2: 125, 1994] 참조).
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 IL2 오르토로그의 아미노- 또는 카르복실-말단은 이뮤노글로불린 Fc 영역 (예를 들어 인간 Fc)과 융합되어 융합 접합체 (또는 융합 분자)를 형성할 수 있다. Fc 융합 접합체는 바이오 의약품의 전신 반감기를 증가시키는 것으로 나타났으며, 따라서 바이오 의약품은 덜 빈번한 투여를 요구할 수 있다. Fc는 혈관을 따라 늘어선 내피 세포 내의 신생아 Fc 수용체 (FcRn)와 결합하고, 결합 시 Fc 융합 분자는 분해로부터 보호되어 순환계로 재방출되어 분자를 더 오래 순환시킨다. 이러한 Fc 결합은 내인성 IgG가 긴 혈장 반감기를 유지하는 메커니즘인 것으로 여겨진다. 보다 최근의 Fc-융합 기술은 바이오 의약품의 단일 카피를 항체의 Fc 영역에 연결하여 전통적인 Fc-융합 접합체와 비교 시 바이오 의약품의 약동학적 및 약력학적 특성을 최적화한다.
일부 실시양태에서, Fc 도메인 단량체는 미국 특허 번호 US10259859B2에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 그의 전체 교시내용은 본원에 참조로 포함된다. 본원에 개시된 바와 같이, Fc 도메인 단량체는 하기를 포함한다:
(a) 야생형 인간 IgG1에 비해 하기 아미노산 치환 중 하나:
T366W, T366S, L368A, Y407V, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L351T, L351H, L351N, L351K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R, Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T, 또는 K409I;
또는
(b) (i) 인간 IgG1 Fc 영역에 비해 N297A 돌연변이;
(ii) 인간 IgG1 Fc 영역에 비해 L234A, L235A, 및 G237A 돌연변이;
(iii) 인간 IgG1 Fc 영역에 비해 L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이;
(iv) 인간 IgG2 Fc 영역에 비해 N297A 돌연변이;
(v) 인간 IgG2 Fc 영역에 비해 A330S 및 P331S 돌연변이;
(vi) 인간 IgG2 Fc 영역에 비해 A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이;
(vii) 인간 IgG4 Fc 영역에 비해 S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이; 또는
(viii) 인간 IgG4 Fc 영역에 비해 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이.
일부 실시양태에서, Fc 도메인 단량체는 하기를 포함하고:
(a) 야생형 인간 IgG1에 비해 하기 아미노산 치환 중 하나: T366W, T366S, L368A, Y407V, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L35 IT, L351H, L351N, L351K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R, Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T, 또는 K409I;
(b) Fc 도메인 단량체는 하기를 추가로 포함한다:
(i) 인간 IgG1 Fc 영역에 비해 N297A 돌연변이;
(ii) 인간 IgG1 Fc 영역에 비해 L234A, L235A, 및 G237A 돌연변이;
(iii) 인간 IgG1 Fc 영역에 비해 L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이;
(iv) 인간 IgG2 Fc 영역에 비해 N297A 돌연변이;
(v) 인간 IgG2 Fc 영역에 비해 A330S 및 P331S 돌연변이;
(vi) 인간 IgG2 Fc 영역에 비해 A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이;
(vii) 인간 IgG4 Fc 영역에 비해 S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이; 또는
(viii) 인간 IgG4 Fc 영역에 비해 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 폴리펩티드와 비교하여 식균 작용 검정에서 식균 작용의 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인 단량체는 제2 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드에 연결되어 Fc 도메인 이량체를 형성한다.
키메라 폴리펩티드/융합 단백질
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 키메라 폴리펩티드의 기능적 도메인을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 IL2 오르토로그 융합 단백질은 관련 기술분야에 공지된 기술에 의한 재조합 DNA 방법론에 의해 IL2 오르토로그의 N-말단 또는 C-말단에서 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열과의 프레임 내에서 IL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 구축함으로써 쉽게 생산될 수 있으며, 이러한 서열은 링커 또는 스페이서 폴리펩티드를 코딩하는 프레임 내 핵산 서열을 임의로 추가로 포함한다.
Flag 태그
다른 실시양태에서, IL2 오르토로그는 항원성 태그, 예컨대 FLAG 서열로서 기능하는 부가의 폴리펩티드 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. FLAG 서열은 본원에 기재된 바와 같이, 비오티닐화된 고도로 특이적인 항-FLAG 항체에 의해 인식된다 (예를 들어, 문헌 [Blanar et al. (1992) Science 256:1014 and LeClair, et al. (1992) PNAS-USA 89:8145] 참조). 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그 폴리펩티드는 C-말단측 c-myc 에피토프 태그를 추가로 포함한다.
His 태그
일부 실시양태에서, 본 발명의 IL2 오르토로그 (이러한 IL2 오르토로그의 융합 단백질 포함)는 하나 이상의 전이 금속 킬레이트 폴리펩티드 서열을 갖는 융합 단백질로서 발현된다. 이러한 전이 금속 킬레이트 도메인의 혼입은 1986년 2월 11일에 허여된 미국 특허 번호 4,569,794 (Smith et al.)에 기재된 바와 같이 정제 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)를 용이하게 한다. 본 발명의 실시에 유용한 전이 금속 킬레이트 폴리펩티드의 예는 그의 전체 교시 내용이 본원에 참조로 포함되는 상기 문헌 [Smith, et al.] 및 1995년 5월 10일에 허여된 미국 특허 번호 5,320,663 (Dobeli et al.)에 기재되어 있다. 본 발명의 실시에 유용한 특정한 전이 금속 킬레이트 폴리펩티드는 3-6개의 연속된 히스티딘 잔기를 포함하는 펩티드, 예컨대 6-히스티딘 펩티드 (His)6이며, 관련 기술분야에서 "His-태그"로서 흔히 지칭된다.
표적화된 IL2 오르토로그 융합 단백질:
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 표적화 도메인과 특이적으로 결합하고, 임의로 IL2 오르토로그 서열과 융합 단백질의 표적화 도메인의 서열 사이에 1-40개의 (대안적으로 2-20개, 대안적으로 5-20개, 대안적으로 10-20개의) 아미노산의 링커 분자를 혼입하는 세포 표면 분자를 발현하는 특정한 세포 유형 또는 조직에 대한 선택적 결합을 촉진하기 위해 폴리펩티드 서열 ("표적화 도메인")과의 융합 단백질로서 제공된다.
다른 실시양태에서, 직교 IL-2 및 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한 키메라 폴리펩티드가 생성될 수 있다. 키메라 단백질의 항체 또는 항원 결합 성분은 표적화 모이어티로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 이는 키메라 단백질을 세포 또는 표적 분자의 특정한 서브세트에 국한시키는데 사용될 수 있다. 시토카인-항체 키메라 폴리펩티드를 생성하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,617,135에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그 융합 단백질의 표적화 도메인은 종양 세포의 세포 표면 분자와 특이적으로 결합한다. CAR-T 세포의 CAR의 ECD가 CD-19와 특이적으로 결합하는 한 실시양태에서, IL2 오르토로그는 CD-19 표적화 모이어티와의 융합 단백질로서 제공될 수 있다. 예를 들어, CAR-T 세포의 CAR의 ECD가 CD-19에 대한 특이적 결합을 제공하는 scFv 분자인 한 실시양태에서, IL2 오르토로그는 CD-19 표적화 모이어티, 예컨대 CD-19와 특이적으로 결합하는 단일 쇄 항체 (예를 들어, scFv 또는 VHH)와의 융합 단백질로서 제공된다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 IL-2 뮤테인 및 항-CD19 sdFv FMC63을 포함한다 (Nicholson, et al. (1997) Mol Immunol 34: 1157-1165). 유사하게, CAR-T 세포의 CAR의 ECD가 BCMA와 특이적으로 결합하는 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 BCMA 표적화 모이어티, 예컨대 2015년 5월 9일에 허여된 미국 특허 번호 9,034,324 (Kalled et al.)에 기재된 바와 같은 항-BCMA 항체의 CDR을 포함하는 항체 또는 2019년 1월 8일에 허여된 미국 특허 번호 10,174,095 (Brogdon et al.)에 기재된 바와 같은 CDR을 포함하는 항체와의 융합 단백질로서 제공된다. 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 GD2 표적화 모이어티, 예컨대 2016년 4월 19일에 허여된 미국 특허 번호 9,315,585 (Cheung et al.)에 기재된 바와 같은 CDR, 또는 ME36.1 (문헌 [Thurin et al. (1987) Cancer Research 47:1229-1233]), 14G2a, 3F8 (문헌 [Cheung, et al. 1985 Cancer Research 45:2642-2649]), hu14.18, 8B6, 2E12, 또는 ic9로부터 유래된 CDR을 포함하는 항체와의 융합 단백질로서 제공된다.
대안적 실시양태에서, 본 개시내용의 표적화된 IL2 오르토로그는 CAR-T 세포 요법과 조합하여 투여되어, CAR-T 세포에 대한 IL2 활성을 표적화하고 생체내에서 소진된 CAR-T 세포를 젊어지게 하는 항-FMC63 항체에 의해서와 같이 CAR-T 세포의 세포외 수용체에 기초하여 CAR-T 세포에 IL2 오르토로그의 표적화된 전달을 제공할 수 있다. 결과적으로, 본 개시내용의 실시양태는 CAR-T 세포의 특이적 세포 표면 분자와 상호작용하도록 설계된 항체 또는 리간드에 대한 이러한 IL2 오르토로그의 접합에 의한 IL2 오르토로그의 표적화된 전달을 포함한다. 이러한 분자의 예는 항-FMC63-hIL2 오르토로그일 것이다.
다른 실시양태에서, 키메라 폴리펩티드는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드; 및 이러한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 발현을 증진시키거나 세포 국재화를 지시하는 기능을 하는 이종 폴리펩티드, 예컨대 Aga2p 응집소 서브유닛을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Boder and Wittrup, Nature Biotechnol. 15:553-7, 1997] 참조).
단백질 형질도입 도메인 융합 단백질:
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 추가로 "단백질 형질도입 도메인" 또는 "PTD"를 포함한다. PTD는 지질 이중층, 미셀, 세포막, 세포 소기관 막 또는 소포 막 횡단을 촉진하는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 또는 유기 또는 무기 분자이다. PTD를 IL2 오르토로그 내로 혼입하면, 분자가 막을 횡단하는 것이 촉진된다. 일부 실시양태에서, PTD는 IL2 오르토로그의 아미노 또는 카르복시 말단에 공유 연결되어 있다. 일부 실시양태에서, PTD는 분자의 N 또는 C 말단에서 PTD-IL2 오르토로그 융합 단백질의 일부로서 혼입된다.
예시적인 단백질 형질도입 도메인은 최소 데카펩티드 단백질 형질도입 도메인 (HIV-1 TAT의 잔기 47-57에 상응함); 세포 내로 직접 진입하기에 충분한 수의 아르기닌 잔기를 포함하는 폴리아르기닌 서열 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10-50개의 아르기닌); VP22 도메인 (문헌 [Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96]); 드로소필라 안테나페디아(Drosophila Antennapedia) 단백질 형질도입 도메인 (문헌 [Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737]); 말단절단된 인간 칼시토닌 펩티드 (문헌 [Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256]); 폴리리신 (문헌 [Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008]), 트랜스포르탄 (문헌 [Wierzbicki, et al., (2014) Folio Histomchemica et Cytobiologica 52(4): 270-280 및 Pooga, et a (1998) FASEB J 12(1)67-77]에 기재된 바와 같고 아나스펙(AnaSpec)으로부터 카탈로그 번호 AS-61256으로서 상업적으로 입수가능함); KALA (문헌 [Wyman et al., (1997) Biochemistry 36(10) 3008-3017]에 기재된 바와 같고 아나스펙으로부터 카탈로그 번호 AS-65459로서 상업적으로 입수가능함); 안테나페디아 펩티드 (문헌 [Pietersz et al., (2001) Vaccine 19:1397]에 기재된 바와 같고 아나스펙으로부터 카탈로그 번호 AS-61032로서 상업적으로 입수가능함); TAT 47-57 (아나스펙으로부터 카탈로그 번호 AS-60023으로서 상업적으로 입수가능함)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, IL-2 접합체는 인간 대상체에서 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일 또는 30일 초과의 혈장 반감기를 포함한다.
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그가 Fc 융합물의 형식으로 투여되는 경우, 특히 Fc 이량체의 각각의 서브유닛과 접합된 폴리펩티드 쇄가 상이한 상황에서, Fc 융합물은 "놉-인투-홀 변형"을 갖도록 조작될 수 있다. 놉-인투-홀 변형은 문헌 [Ridgway, et al. (1996) Protein Engineering 9(7):617-621] 및 1998년 3월 24일에 허여된 미국 특허 번호 5,731,168에 더 자세히 기재되어 있다. 놉-인투-홀 변형은 CH3 도메인 내의 2개의 이뮤노글로불린 중쇄 사이의 경계면에서의 변형을 지칭하며, 여기서: i) 제1 중쇄의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기는 더 큰 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체되어 표면으로부터 돌출부 ("놉")를 생성하며, ii) 제2 중쇄의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기는 더 작은 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체되고, 이로 인해 제1 CH3 도메인의 돌출 측쇄 ("놉")가 제2 CH3 도메인 내의 공동에 의해 수용되는 제2 CH3 도메인의 경계면 내에 공동 ("홀")을 생성한다. 한 실시양태에서, "놉-인투-홀 변형"은 항체 중쇄 중 하나에서의 아미노산 치환 T366W 및 임의로 아미노산 치환 S354C를 포함하고, 항체 중쇄 중 다른 하나에서의 아미노산 치환 T366S, L368A, Y407V 및 임의로 Y349C를 포함한다. 더욱이, Fc 도메인은 위치 S354 및 Y349에서 시스테인 잔기의 도입에 의해 변형될 수 있으며, 이는 Fe 영역 내의 2개의 항체 중쇄 사이에 안정화 디술피드 브릿지를 초래한다 (Carter, et al. (2001) Immunol Methods 248, 7-15). 놉-인투-홀 형식은 "놉" 변형을 갖는 제1 Fc 단량체 상의 제1 폴리펩티드 (예를 들어, IL2 오르토로그)의 발현 및 "홀" 변형을 갖는 제2 Fc 단량체 상의 제2 폴리펩티드의 발현을 용이하게 하기 위해 사용되어 이종이량체 폴리펩티드 접합체의 발현을 용이하게 한다.
IL2 오르토로그의 합성
본 개시내용의 IL2 오르토로그는 재조합 또는 고체상 합성을 포함한 폴리펩티드의 구축을 위한 통상적인 방법론에 의해 생산될 수 있다.
고체상 화학적 합성:
재조합 분자 생물학 기술에 의해 변경된 핵산 분자의 발현을 통해 돌연변이체 폴리펩티드를 생성하는 것 외에도, 대상 IL2 오르토로그는 화학적으로 합성될 수 있다. 화학적으로 합성된 폴리펩티드는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일상적으로 생성된다. 화학적 합성은 기재된 특성을 나타내는 IL2 오르토로그를 코딩하는 단백질 서열의 화학적 수단에 의한 펩티드의 직접적인 합성을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IL2 오르토로그는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. IL2 오르토로그의 화학적 합성은 액체상 또는 고체상을 통해 진행될 수 있다. 고체상 펩티드 합성 (SPPS)은 비-자연 아미노산 및/또는 펩티드/단백질 백본 변형의 혼입을 허용한다. 다양한 형태의 SPPS가 본 개시내용의 IL2 오르토로그를 합성하기 위해 이용가능하고 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ganesan A. (2006) Mini Rev. Med. Chem. 6:3-10; and Camarero J.A. et al., (2005) Protein Pept Lett. 12:723-8]). 화학적 합성 과정에서, 알파 기능 및 임의의 반응성 측쇄는 아미드 결합을 연결하는 조건에서 안정적이지만 형성된 펩티드 쇄를 손상시키지 않으면서 쉽게 절단될 수 있는 산-불안정 또는 염기-불안정 기로 보호될 수 있다.
고체상 합성에서, N-말단측 또는 C-말단측 아미노산은 적합한 지지체 물질과 커플링될 수 있다. 적합한 지지체 물질은 합성 프로세스의 단계적 응축 및 절단 반응을 위한 시약 및 반응 조건에 대해 불활성이고 사용되는 반응 매질에 용해되지 않는 물질이다. 상업적으로 입수가능한 지지체 물질의 예는 반응성 기 및/또는 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 스티렌/디비닐벤젠 공중합체; 클로로메틸화 스티렌/디비닐벤젠 공중합체; 히드록시메틸화 또는 아미노메틸화 스티렌/디비닐벤젠 공중합체 등을 포함한다. 보호된 아미노산의 연속적인 커플링은 전형적으로 자동화된 펩티드 합성기에서 펩티드 합성의 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다.
고체상 합성이 끝날 무렵, 펩티드는 지지체 물질로부터 절단되는 동시에 측쇄 보호기를 절단한다. 수득된 펩티드는 소수성 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 분포 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 역상 HPLC를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 크로마토그래피 방법에 의해 정제될 수 있다.
재조합 생산:
대안적으로, 본 개시내용의 IL2 오르토로그는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 폴리펩티드의 재조합 생산의 전형적인 실시에서, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 발현이 성취될 숙주 세포에 적합한 발현 벡터 내로 혼입되고, 핵산 서열은 벡터에 의해 코딩되고 표적 숙주 세포에서 기능적인 하나 이상의 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 재조합 단백질은 숙주 세포의 파괴를 통해 또는 분비 리더 서열 (신호 펩티드)이 폴리펩티드에 혼입되는 경우 세포 배지로부터 회수될 수 있다. 재조합 단백질은 혼입을 포함한 추가 사용을 위해 정제 및 농축될 수 있다. IL2 폴리펩티드의 재조합 생산을 위한 프로세스는 관련 기술분야에 공지되어 있으며 1986년 8월 5일에 허여된 미국 특허 번호 4,604,377 (Fernandes and Taforo)에 기재되어 있고, IL2 오르토로그는 1985년 5월 21일에 허여된 미국 특허 번호 4,512,584 (Mark, et al.), 1983년 8월 30일에 허여된 미국 특허 번호 4,401,756 (Gillis) (이들 특허의 전체 교시가 본원에 참조로 포함된다)에 기재되어 있다.
IL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열의 구축
일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 IL2 오르토로그 (또는 IL2 오르토로그를 포함하는 융합 단백질)를 코딩하는 핵산 서열을 사용하는 재조합 방법에 의해 생산된다. 원하는 IL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 화학적 수단에 의해 합성될 수 있다.
핵산 분자는 폴리펩티드를 코딩하는 서열에 제한되지 않으며; 코딩 서열 (예를 들어, IL2의 코딩 서열)로부터의 상류 또는 하류에 있는 비-코딩 서열의 일부 또는 전부가 또한 포함될 수 있다. 분자 생물학 기술분야의 통상의 기술자는 핵산 분자를 단리하기 위한 일상적인 절차에 익숙하다. 이들은, 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제를 통한 게놈 DNA의 처리, 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)의 수행에 의해 생성될 수 있다. 핵산 분자가 리보핵산 (RNA)인 경우, 분자는 예를 들어 시험관내 전사에 의해 생산될 수 있다.
IL2 오르토로그 (및 그의 융합물)를 코딩하는 핵산 분자는 자연적으로 발생하는 서열 또는 자연적으로 발생하는 것과 상이한 서열을 함유할 수 있지만, 유전 코드의 퇴행성으로 인해 동일한 폴리펩티드를 코딩한다. 이러한 핵산 분자는 RNA 또는 DNA (예를 들어, 게놈 DNA, cDNA, 또는 합성 DNA, 예컨대 포스포르아미다이트 기반 합성에 의해 생산된 것), 또는 이러한 유형의 핵산 내 뉴클레오티드의 조합 또는 변형으로 이루어질 수 있다. 또한, 핵산 분자는 이중 가닥 또는 단일 가닥 (즉, 센스 또는 안티센스 가닥)일 수 있다.
IL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열은 맞춤 제작된 핵산 서열을 제공하는 다양한 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 개시내용의 IL2 오르토로그를 생산하기 위한 IL2 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 관련 기술분야에 널리 공지된 유전 코드에 기초하여 코딩 서열에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써 제조된다. 이러한 변이체는 언급된 바와 같은 잔기의 삽입, 치환 및/또는 명시된 결실을 나타낸다. 삽입, 치환, 및/또는 명시된 결실의 임의의 조합은 최종 구축물이 본원에 정의된 바와 같은 원하는 생물학적 활성을 보유한 경우, 최종 구축물에 도달하도록 만들어진다.
IL2 오르토로그를 코딩하는 DNA 서열을 구축하고 적합하게 형질전환된 숙주에서 이들 서열을 발현하는 방법은 PCR 보조 돌연변이유발 기술을 사용하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. IL2 폴리펩티드에 대한 아미노산 잔기의 결실 또는 부가로 이루어진 돌연변이는 또한 표준 재조합 기술로 만들어질 수 있다. 결실 또는 부가의 경우, IL2를 코딩하는 핵산 분자는 임의로 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 소화된다. 그 결과로 생성된 단편은 직접 발현되거나, 또는 예를 들어, 이를 제2 단편에 라이게이션함으로써 추가로 조작될 수 있다. 핵산 분자의 두 말단이 서로 중첩되는 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 경우 라이게이션이 용이해질 수 있지만, 평활 말단 단편이 또한 라이게이션될 수 있다. PCR 생성 핵산은 또한 다양한 돌연변이체 서열을 생성하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 IL2 오르토로그는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서, 예를 들어 성숙한 IL2 오르토로그의 N-말단 또는 C-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 벡터에 삽입되는 코딩 서열의 일부일 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게, 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 것 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는 것)이다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 IL2 오르토로그와 천연적으로 연합된 신호 서열 (즉, 인간 IL2 신호 서열)이다. 신호 서열을 포함시키는 것은 그것이 만들어진 재조합 세포로부터 IL2 오르토로그를 분비하는 것이 바람직한지의 여부에 달려 있다. 선택된 세포가 원핵생물인 경우, 일반적으로 DNA 서열이 신호 서열을 코딩하지 않는 것이 바람직하다. 선택된 세포가 진핵생물인 경우, 일반적으로 신호 서열이 코딩되는 것이 바람직하고 야생형 IL2 신호 서열이 사용되는 것이 가장 바람직하다. 대안적으로, 이종 포유류 신호 서열, 예컨대 동일하거나 관련된 종의 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 헤르페스 gD 신호가 적합할 수 있다. 재조합 숙주 세포가 효모 세포, 예컨대 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)인 경우, 알파 교배 인자 분비 신호 서열은 2007년 4월 3일에 허여된 미국 특허 번호 7,198,919 B1 (Singh)에 기재된 바와 같이 배양 배지 내로의 IL2 오르토로그의 세포외 분비를 달성하기 위해 이용될 수 있다.
발현될 IL2 오르토로그가 키메라로서 발현되는 경우 (예를 들어, IL2 오르토로그 및 이종 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질), 키메라 단백질은 IL2 오르토로그의 전부 또는 일부를 코딩하는 제1 서열 및 이종 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 코딩하는 제2 서열을 포함하는 하이브리드 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 대상 IL2 오르토로그는 박테리아에 의해 발현된 단백질의 정제를 촉진하기 위해 헥사-히스티딘 태그와 융합되거나, 또는 진핵 세포에서 발현된 단백질의 정제를 촉진하기 위해 헤마글루티닌 태그와 융합될 수 있다. 첫째 및 둘째로, 융합 단백질의 요소의 정위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 되며 이종 폴리펩티드는 IL2 오르토로그의 N-말단 및/또는 C-말단에서 연결될 수 있다. 예를 들어, N-말단은 표적화 도메인에 연결될 수 있고 C-말단은 헥사-히스티딘 태그 정제 핸들에 연결될 수 있다.
발현되는 폴리펩티드 (또는 융합/키메라)의 완전한 아미노산 서열은 역-번역된 유전자를 구축하는데 사용될 수 있다. IL2 오르토로그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머가 합성될 수 있다. 예를 들어, 원하는 폴리펩티드의 일부분을 코딩하는 여러 개의 작은 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음 이를 라이게이션할 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 어셈블리를 위한 5' 또는 3' 오버행을 함유한다.
코돈 최적화:
일부 실시양태에서, 재조합 단백질 (IL2 오르토로그, 직교 CD122, 또는 CAR)을 코딩하는 핵산 서열은 특정한 숙주 세포 유형에서의 발현을 촉진하기 위해 "코돈 최적화"될 수 있다. 포유류, 효모 및 박테리아 숙주 세포를 포함한 광범위한 발현 시스템에서 코돈 최적화를 위한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며 다양한 숙주 세포 유형에서의 발현을 위한 코돈 최적화된 서열을 제공하기 위한 온라인 도구가 있다. 예를 들어, 문헌 [Hawash, et al., (2017) 9:46-53 and Mauro and Chappell in Recombinant Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols, edited by David Hacker (Human Press New York)]을 참조한다. 추가적으로, 코돈 최적화된 핵산 서열의 제조를 지원하기 위해 무료로 사용할 수 있는 다양한 웹 기반 온라인 소프트웨어 패키지가 있다.
발현 벡터:
일단 어셈블리되면 (합성, 부위 지정 돌연변이유발 또는 또 다른 방법에 의함), IL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열이 발현 벡터에 삽입될 것이다. 다양한 숙주 세포에서 사용하기 위한 다양한 발현 벡터가 이용가능하며, 전형적으로 발현을 위한 숙주 세포에 기초하여 선택된다. 발현 벡터는 전형적으로 하기 중 하나 이상을 포함하나 그에 제한되지는 않는다: 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열. 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 통합 벡터 등을 포함한다. 플라스미드는 비-바이러스 벡터의 예이다.
재조합 폴리펩티드의 효율적인 발현을 용이하게 하기 위해, 발현될 폴리펩티드 서열을 코딩하는 핵산 서열은 선택된 발현 숙주에서 기능적인 전사 및 번역 조절 제어 서열에 작동가능하게 연결된다.
선택가능한 마커
발현 벡터는 통상적으로 선택가능한 마커라고도 칭하는 선택 유전자를 함유한다. 이러한 유전자는 선택적 배양 배지에서 성장한 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 코딩한다. 선택 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 배양 배지에서 생존할 수 없다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결핍을 보완하는 단백질, 또는 (c) 복합 배지로부터 입수가능하지 않는 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다.
조절 제어 서열:
본 개시내용의 IL2 오르토로그에 대한 발현 벡터는 숙주 유기체에 의해 인식되고 IL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 함유한다. 용어 "조절 제어 서열", "조절 서열" 또는 "발현 제어 서열"은 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 예를 들어, 문헌 [Goeddel (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego CA USA]을 참조한다. 조절 서열은 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것 (예를 들어, 조직 특이적 조절 서열)을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 발현 벡터의 설계가 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 요인에 좌우될 수 있음을 이해할 것이다. 발현 제어 서열을 선택함에 있어서, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 다양한 요소들이 고려되어야 한다. 이들은, 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 그의 제어가능성, 및 특히 잠재적인 2차 구조와 관련하여 대상 IL2 오르토로그를 코딩하는 실제 DNA 서열과의 호환성을 포함한다.
프로모터
일부 실시양태에서, 조절 서열은, 예를 들어 발현이 요구되는 세포 유형에 기초하여 선택되는 프로모터이다. 프로모터는 작동가능하게 연결된 특정한 핵산 서열의 전사 및 번역을 제어하는 구조 유전자의 출발 코돈 (일반적으로 약 100 내지 1000 bp 이내)의 상류 (5')에 위치한 비-번역된 서열이다. 이러한 프로모터는 전형적으로 유도성 및 구성적의 두 부류로 나뉜다. 유도성 프로모터는 배양 조건에서의 일부 변화, 예를 들어, 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도 변화에 대한 반응으로 제어되는 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 시작하는 프로모터이다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 많은 수의 프로모터가 널리 공지되어 있다.
T7 프로모터는 박테리아에서 사용될 수 있고, 폴리헤드린 프로모터는 곤충 세포에서 사용될 수 있으며, 시토메갈로바이러스 또는 메탈로티오네인 프로모터는 포유류 세포에서 사용될 수 있다. 또한, 고등 진핵생물의 경우, 조직 특이적 및 세포 유형 특이적 프로모터가 널리 이용가능하다. 이러한 프로모터는 체내의 주어진 조직 또는 세포 유형에서 핵산 분자의 발현을 지시할 수 있는 능력에 따라 명명되었다. 숙련된 기술자는 핵산의 발현을 지시하는데 사용될 수 있는 수많은 프로모터 및 기타 조절 요소를 잘 알고 있다.
포유류 숙주 세포에서의 벡터로부터의 전사는, 예를 들어 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 인간 아데노바이러스 혈청형 5), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스 (예컨대 뮤린 줄기 세포 바이러스), B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 수득된 프로모터, 이종 포유류 프로모터로부터 유래된 것, 예를 들어 액틴 프로모터, PGK (포스포글리세레이트 키나제) 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 열-충격 프로모터로부터 유래된 것에 의해 제어될 수 있으며, 단 그러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 양립해야 한다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다.
인핸서
고등 진핵생물에 의한 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가된다. 인핸서는 DNA의 시스 작용 요소로, 통상적으로 약 10 내지 300 bp이며, 프로모터에 작용하여 전사를 증가시킨다. 인핸서는 인트론 내에서 뿐만 아니라 코딩 서열 자체 내에서 전사 단위에 대해 5' 및 3'에서 발견되어 상대적으로 방향과 위치에 독립적이다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유류 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-태아단백 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용한다. 그 예는 복제 기점의 후기 쪽의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 발현 벡터 내로 스플라이싱될 수 있으나, 바람직하게 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다. 진핵 숙주 세포에서 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3'의 비번역 영역으로부터 입수가능하다. 상기 열거된 성분 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 표준 기술을 이용한다.
삽입된 핵산 분자의 전사를 촉진하는 서열 이외에, 벡터는 복제 기점 및 선택가능한 마커를 코딩하는 기타 유전자를 함유할 수 있다. 예를 들어, 네오마이신 내성 (neoR) 유전자는 그것이 발현되는 세포에 G418 내성을 부여하고, 따라서 형질감염된 세포의 표현형 선택을 허용한다. 마커 또는 리포터 유전자의 추가적 예는 베타-락타마제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 아데노신 데아미나제 (ADA), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 히그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제 (HPH), 티미딘 키나제 (TK), lacZ (베타-갈락토시다제 코딩), 및 크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (XGPRT)를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 주어진 조절 요소 또는 선택가능한 마커가 특정한 실험 맥락에서 사용하기에 적합한지 여부를 쉽게 결정할 수 있다.
발현 벡터의 적당한 어셈블리는 뉴클레오티드 시퀀싱, 제한 매핑, 및 적합한 숙주에서 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확인될 수 있다.
IL2 오르토로그의 생산을 위한 숙주 세포
본 개시내용은 IL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열을 함유하고 이를 발현하는 원핵 또는 진핵 세포를 추가로 제공한다. 본 개시내용의 세포는 형질감염된 세포, 즉 핵산 분자, 예를 들어 돌연변이체 IL2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 재조합 DNA 기술에 의해 도입된 세포이다. 이러한 세포의 자손이 또한 본 개시내용의 범위 내에서 고려된다.
숙주 세포는 전형적으로, 선택된 발현 벡터와의 양립성, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩된 산물의 독성, 그의 분비 특징, 폴리펩티드를 올바르게 폴딩할 수 있는 능력, 그의 발효 또는 배양 요구 사항, 및 DNA 서열에 의해 코딩된 산물의 정제 용이성에 따라 선택된다. 본원의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현하기에 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다.
일부 실시양태에서, 재조합 IL2 오르토로그 또는 그의 생물학적 활성 변이체는 또한 진핵생물, 예컨대 효모 또는 인간 세포에서 만들 수 있다. 적합한 진핵 숙주 세포는 곤충 세포 [배양된 곤충 세포 (예를 들어, Sf9 세포)에서의 단백질의 발현에 이용가능한 배큘로바이러스 벡터의 예는 pAc 시리즈 (문헌 [Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165]) 및 pVL 시리즈 (문헌 [Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39])를 포함한다]; 효모 세포 [효모 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae)에서의 발현을 위한 벡터의 예는 pYepSecl (문헌 [Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234]), pMFa (문헌 [Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943]), pJRY88 (문헌 [Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123]), pYES2 (인비트로젠 코포레이션 (Invitrogen Corporation; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)), 및 pPicZ (인비트로젠 코포레이션; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)를 포함한다]; 또는 포유류 세포 [포유류 발현 벡터는 pCDM8 (문헌 [Seed (1987) Nature 329:840]) 및 pMT2PC (문헌 [Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187:195])를 포함한다]를 포함한다.
유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 마우스 L 세포 (L-M[TK-], ATCC#CRL-2648), SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 계통 (현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 HEK293 또는 HEK293 세포; 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO); 마우스 세르톨리 세포 (TM4); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 계통 (Hep G2)이다. 포유류 세포에서 발현 벡터의 제어 기능은 종종 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시토메갈로바이러스 및 원숭이 바이러스 40으로부터 유래된다.
IL2 오르토로그는 원핵 숙주, 예컨대 박테리움 이. 콜라이, 또는 진핵 숙주, 예컨대 곤충 세포 (예를 들어, Sf21 세포), 또는 포유류 세포 (예를 들어, COS 세포, NIH 3T3 세포 또는 HeLa 세포)에서 생산될 수 있다. 이러한 세포는 아메리간 타입 컬처 컬렉션 (미국 버지니아주 매너서스)을 포함한 많은 공급처로부터 입수가능하다. 발현 시스템을 선택하는데 있어서, 그 성분들이 서로 호환되는지 만이 중요하다. 전문가 또는 통상의 기술자가 그러한 결정을 내릴 수 있다. 더욱이, 발현 시스템을 선택하는데 지침이 필요한 경우, 통상의 기술자는 문헌 [Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1993) and Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 Suppl. 1987)]을 참조할 수 있다.
일부 실시양태에서, 수득된 IL2 오르토로그는 뮤테인을 생산하는데 사용되는 숙주 유기체에 따라 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 것이다. 박테리아가 숙주로서 선택되면, 생산된 IL2 오르토로그는 글리코실화되지 않을 것이다. 반면에, 진핵 세포는 IL2 오르토로그를 글리코실화할 것이며, 아마도 천연 IL2가 글리코실화되는 것과 동일한 방식이 아닐 수 있다.
원핵 및 진핵 세포 둘 다에 대한 기타 추가적 발현 시스템에 대해서는, 문헌 [Chapters 16 and 17 of Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)]을 참조한다. 문헌 [Goeddel (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, Calif.)]을 참조한다.
형질감염:
발현 구축물은 숙주 세포 내로 도입됨으로써 본원에 개시된 IL2 오르토로그를 생산하거나 그의 생물학적 활성 뮤테인을 생산할 수 있다. 벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키기 위한 적합한 방법은 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)] 및 기타 표준 분자 생물학 실험실 매뉴얼에서 찾을 수 있다.
표적 세포의 형질감염을 용이하게 하기 위해, 표적 세포는 비-바이러스 벡터의 흡수를 용이하게 하는 조건 하에 비-바이러스 벡터에 직접 노출될 수 있다. 포유류 세포에 의한 외래 핵산의 흡수를 용이하게 하는 조건의 예는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 화학적 수단 (예컨대 리포펙타민(Lipofectamine)®, 써모-피셔 사이언티픽(Thermo-Fisher Scientific)), 고염 및 자기장 (전기천공)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
세포 배양:
세포는 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 포유류 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 햄 F10 [시그마(Sigma)], 최소 필수 배지 ((MEM), 시그마), RPMI 1640 (시그마), 및 둘벡코 변형 이글 배지 ((DMEM), 시그마)가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 이들 배지 중 임의의 것은 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 인산염), 완충액 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오시드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제, 미량 원소, 및 글루코스 또는 등가의 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물이 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 조건이며 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
재조합 단백질의 회수: 재조합적으로 생산된 IL2 오르토로그 폴리펩티드는 분비 리더 서열이 이용되는 경우, 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 대안적으로, IL2 오르토로그 폴리펩티드는 또한 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 프로테아제 억제제, 예컨대 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF)는 정제 동안 단백질 분해를 억제하기 위해 세포 용해물로부터 회수 단계 동안 이용될 수 있으며, 항생제가 외래 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
정제: 다양한 정제 단계가 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 친화성 크로마토그래피가 사용된다. 친화성 크로마토그래피는 생물학적 거대분자에 통상적으로 존재하는 고도의 특이적 결합 부위를 이용하여, 특정한 리간드와 결합할 수 있는 능력에 따라 분자를 분리한다. 공유 결합은 리간드를 단백질 샘플에 명백히 제시하는 방식으로 리간드를 불용성, 다공성 지지 매체에 부착함으로써, 하나의 분자 종의 자연적인 특이적 결합을 사용하여 혼합물로부터 제2 종을 분리하고 정제한다. 항체가 친화성 크로마토그래피에 흔히 사용된다. 크기 선택 단계가 또한 사용될 수 있으며, 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피 (크기 배제 크로마토그래피 또는 분자 체 크로마토그래피로서 공지되기도 함)는 크기에 따라 단백질을 분리하는데 사용된다. 겔 여과에서, 단백질 용액은 반투과성의 다공성 수지로 채워진 칼럼을 통과한다. 반투과성 수지는 칼럼으로 분리될 수 있는 단백질의 크기를 결정하는 소정의 범위의 기공 크기를 갖는다.
형질전환된 숙주에 의해 생산된 IL2 오르토로그는 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. IL2를 정제하는 다양한 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Protein Science, Vol 2. Eds: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploehg, David W. Speicher, Paul T. Wingfield, Unit 6.5 (Copyright 1997, John Wiley and Sons, Inc.)]을 참조한다. IL2 오르토로그는 이. 콜라이에서 생성된 봉입체, 또는 양이온 교환, 겔 여과 및/또는 역상 액체 크로마토그래피를 사용하여 주어진 뮤테인을 생산하는 포유류 또는 효모 배양물로부터의 조건부 배지로부터 단리될 수 있다.
재조합 폴리펩티드의 실질적으로 정제된 형태는 일상적인 생화학적 절차를 사용하여 발현 시스템으로부터 정제될 수 있으며, 이는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 치료제로서 사용될 수 있다.
IL2 오르토로그의 생물학적 활성은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 검정될 수 있으며, 실질적으로 정제된 형태로서 또는 분비 리더 서열이 발현에 이용될 때 세포 용해물 또는 세포 배지의 일부로서 평가될 수 있다. 이러한 활성 검정은 CTLL-2 증식, T 세포에서 포스포-STAT5 (pSTAT5) 활성의 유도, PHA-모세포 증식 및 NK 세포 증식을 포함한다.
IL2 오르토로그의 투여 경로:
본 개시내용의 치료 방법의 실시양태는 치료를 필요로 하는 대상체에게 IL2 오르토로그 (및/또는 IL2 오르토로그를 코딩하는 핵산)를 포함하는 제약 제형을 투여하는 것을 포함한다. 대상체에 대한 투여는 정맥내에 의해, 볼루스로서 또는 소정의 기간 동안 연속 주입에 의해 달성될 수 있다. 대안적인 투여 경로는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로를 포함한다. IL2 오르토로그는 또한 국소 뿐만 아니라 전신 치료 효과를 발휘하기 위해 종양내, 종양주위, 병변내, 결절내 또는 병변주위 경로로 또는 림프에 적절하게 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상 IL2 오르토로그 (및/또는 IL2 오르토로그를 코딩하는 핵산)는 제약 조성물을 비롯한 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로 폴리펩티드 또는 핵산 분자 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화되며 IL2 오르토로그가 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여되는 치료 용도와 양립가능하다.
IL2 오르토로그의 제형
본 개시내용의 IL2 오르토로그 (또는 이를 코딩하는 핵산)는 제약상 허용되는 투여 형태로 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직한 제형은 의도된 투여 방식 및 치료적 적용에 의존한다.
비경구 제형: 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 IL2 오르토로그의 비경구 투여를 포함한다. 비경구 투여 경로의 예는, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경피 (국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구 제형은 비경구 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액을 포함하며, 비히클, 담체 및 완충제를 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제약 제형은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 비경구 제제는 앰풀, 일회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱으로 만든 다회 용량 바이알에 동봉될 수 있다. 한 실시양태에서, 제형은 비경구 투여를 위한 사전충전형 주사기에 제공된다.
경구 제형: 경구 조성물은, 사용되는 경우, 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구 치료 투여의 목적으로, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있으며 정제, 트로키제, 또는 캡슐제, 예를 들어 젤라틴 캡슐제의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강 세정제로서 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 제약상 적합한 결합제 및/또는 아주반트 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키제 등은 하기 성분, 또는 유사한 성질의 화합물 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 결합제 예컨대 미세결정질 셀룰로스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 전분 또는 락토스; 붕해제 예컨대 알긴산, 프리모겔(Primogel)™ 또는 옥수수 전분; 윤활제 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes)™; 유동촉진제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료.
흡입 제형: 흡입에 의한 투여의 경우, 대상 IL2 오르토로그 또는 이를 코딩하는 핵산은 적합한 추진제, 예를 들어, 기체 예컨대 이산화탄소, 또는 분무기를 함유하는 압력 용기 또는 디스펜서로부터의 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다. 이러한 방법은 미국 특허 번호 6,468,798에 기재된 방법을 포함한다.
경점막 및 경피 : 대상 IL2 오르토로그 또는 핵산의 전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의한 것일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 투과하고자 하는 장벽에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 경점막 투여를 위한 세척제, 담즙염, 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약 (예를 들어, 기존의 좌약 기제 예컨대 코코아 버터 및 기타 글리세리드를 수반함) 또는 직장 전달을 위한 정체 관장제의 사용을 통해 달성할 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형화되고 투과 증진제 예컨대 에탄올 또는 라놀린을 혼입할 수 있다.
연장 방출 및 데포 제형: 본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그는 IL2 오르토로그 작용제의 연장 방출을 제공하기 위한 제형으로 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 주사용 조성물의 연장 방출 제형의 예는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함함으로써 야기될 수 있다. 한 실시양태에서, 대상 IL2 오르토로그 또는 핵산은 이식체 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제형과 같이, 신체로부터의 신속한 제거로부터 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드를 보호할 담체와 함께 제조된다. 생분해성, 생체 적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형은 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼즈, 인크.(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 수득될 수 있다. 리포솜 현탁액 (바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체로 감염된 세포를 표적으로 하는 리포솜 포함)이 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어, 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같이, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
한 실시양태에서, IL2 오르토로그 제형은 그의 교시가 본원에 참조로 포함되는, 1986년 8월 5일에 허여된 미국 특허 번호 4,604,377 (Fernandes and Taforo) 및 미국 특허 번호 4,645,830 (Yasui, et al.)의 교시에 따라 제공된다.
오르토로그를 코딩하는 핵산의 투여:
IL2 오르토로그를 포함하는 IL2 오르토로그 단백질 제약 제형의 대상체에 대한 투여에 대한 대안으로, IL2 오르토로그는 선택적 IL2 오르토로그에 대한 대상체의 지속적인 노출을 달성하기 위해 대상체에게 IL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 구축물의 제약상 허용되는 제형을 투여함으로써 대상체에게 제공될 수 있다. IL2 오르토로그를 코딩하는 재조합 벡터의 투여는 IL2 오르토로그의 대상체로의 연장된 전달 및 이러한 IL2 오르토로그와 연관된 동족 직교 수용체를 발현하도록 조작된 상응하는 세포의 연장된 활성화를 제공한다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에서, IL2 오르토로그를 코딩하는 핵산은 문헌 [McCaffrey et al. (Nature 418:6893, 2002), Xia et al. (Nature Biotechnol. 20: 1006-1010, 2002), 또는 Putnam (Am. J. Health Syst. Pharm. 53: 151-160, 1996, erratum at Am. J. Health Syst. Pharm. 53:325, 1996]에 기재된 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 형질감염 또는 감염에 의해 대상체에게 투여된다.
오르토로그를 코딩하는 비-바이러스 벡터: 한 실시양태에서, IL2 오르토로그는 비-바이러스 벡터에서 IL2 오르토로그에 대한 핵산 발현 구축물의 형태로 대상체에게 투여될 수 있으며, 이는 비-바이러스 전달 시스템으로 제공될 수 있다. 비-바이러스 전달 시스템은 전형적으로 핵산 카고로 표적 세포의 형질도입을 용이하게 하는 복합체이며, 여기서 핵산은 작용제 예컨대 양이온성 지질 (DOTAP, DOTMA), 계면활성제, 생물학적 제제 (젤라틴, 키토산), 금속 (금, 자철) 및 합성 중합체 (PLG, PEI, PAMAM)와 복합체를 형성한다. 지질 벡터 시스템 (문헌 [Lee et al. (1997) Critical Reviews of Therapeutic Drug Carrier Systems 14:173-206]); 중합체 코팅된 리포솜 [1993년 5월 25일에 허여된 미국 특허 번호 5,213,804 (Marin et al.); 1991년 5월 7일에 허여된 미국 특허 번호 5,013,556 (Woodle, et al.)]; 양이온성 리포솜 [1994년 2월 1일에 허여된 미국 특허 번호 5,283,185 (Epand et al.); 1996년 11월 26일에 허여된 미국 특허 번호 5,578,475 (Jessee, J. A.); 1994년 1월 18일에 허여된 미국 특허 번호 5,279,833 (Rose et al.); 1994년 8월 2일에 허여된 미국 특허 번호 5,334,761 (Gebeyehu et al.)]을 포함한 비-바이러스 전달 시스템의 수많은 실시양태가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 한 실시양태에서, IL2 수용체를 코딩하는 비-바이러스 벡터 시스템 내의 핵산 서열은 조절가능한 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 또는 종양 특이적 프로모터, 또는 일시적으로 조절된 프로모터의 제어 하에 있다.
오르토로그를 코딩하는 바이러스 벡터: 또 다른 실시양태에서, IL2 오르토로그는 이러한 IL2 오르토로그를 코딩하는 바이러스 벡터에서 핵산 발현 구축물의 형태로 대상체에게 투여될 수 있다. 용어 "바이러스 벡터" 및 "바이러스"는 단백질 합성 또는 에너지 생성 메커니즘을 갖지 않는 절대 세포내 기생물 중 임의의 것을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 바이러스 게놈은 지질 막의 단백질의 코팅된 구조에 함유된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 용어 바이러스(들) 및 바이러스 벡터(들)는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본 발명의 실시에 유용한 바이러스는 재조합적으로 변형된 외피보유 또는 비-외피보유 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 바람직하게 바쿨로바이러스과, 파보바이러스과, 피코르노바이러스과, 헤르페스바이러스과, 폭스바이러스과, 또는 아데노바이러스과로부터 선택된다. 바이러스는 외인성 트랜스진 (예를 들어, IL2 오르토로그를 코딩하는 핵산 서열)의 발현을 포함하도록 재조합 DNA 기술에 의해 변형되고, 복제 결핍, 조건부 복제 또는 복제 적격이 되도록 조작될 수 있다. 바이러스 백본이 바이러스 벡터의 패키징에 필요한 서열만을 함유하고 임의로 트랜스진 발현 카세트를 포함할 수 있는 최소 벡터 시스템이 또한 이용될 수 있다. 용어 "복제 결핍"은 야생형 포유류 세포에서 복제에 대해 고도로 약독화된 벡터를 지칭한다. 이러한 벡터를 대량으로 생산하기 위해, 일반적으로 생산자 세포주는 헬퍼 바이러스와 공동 형질감염에 의해 생성되거나 또는 누락된 기능을 보완하도록 게놈적으로 변형된다. 용어 "복제 적격 바이러스 벡터"는 감염, DNA 복제, 패키징 및 감염된 세포의 용해가 가능한 바이러스 벡터를 지칭한다. 용어 "조건부 복제 바이러스 벡터"는 특정한 세포 유형에서의 선택적 발현을 달성하도록 설계된 복제 적격 벡터를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 이러한 조건부 복제는 조직 특이적, 종양 특이적 또는 세포 유형 특이적 또는 기타 선택적으로 유도된 조절 제어 서열을 초기 유전자 (예를 들어, 아데노바이러스 벡터의 E1 유전자)에 작동가능하게 연결함으로써 달성될 수 있다. 재조합 바이러스 또는 비-바이러스 벡터로 대상체를 감염시키면, 대상체에서 IL2 오르토로그의 장기간 발현을 제공할 수 있으며 CD122 직교 수용체를 발현하는 조작된 T 세포의 지속적인 선택적 유지를 제공할 수 있다. 한 실시양태에서, IL2 수용체를 코딩하는 바이러스 벡터 시스템 내의 핵산 서열은 조절가능한 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 또는 종양 특이적 프로모터, 또는 일시적으로 조절된 프로모터의 제어 하에 있다.
직교 수용체
일부 실시양태에서, 직교 수용체는 키메라 수용체이고, 여기서 세포외 도메인은 막횡단 (TM) 도메인에 작동가능하게 연결된 (예를 들어, 융합 단백질로서) 제1 수용체 단백질의 직교 세포외 도메인을 포함하고/거나 제2 수용체 단백질의 세포내 도메인 (ICD)을 포함하여, 직교 ECD에 대한 직교 리간드의 결합이 제2 수용체 단백질 특유의 세포내 신호전달 특징을 초래하도록 한다. 직교 hCD122는 이러한 직교 hCD122에 대한 천연 시토카인 (즉, wt-hIL2)의 결합을 방해하기 위해 야생형 hCD122에 대한 천연 시토카인 (즉, 야생형 hIL2)의 결합에 관여한 위치에서의 하나 이상의 아미노산 변형 (예를 들어, 결실 또는 치환)을 포함하는 hCD122의 변이체이다. hCD122에 대한 hIL2의 결합에 관여하는 아미노산은 아미노산 R41, R42, Q70, K71, T73, T74, V75, S132, H133, Y134, F135, E136, 및/또는 Q214를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122는 아미노산 R41, R42, Q70, K71, T73, T74, V75, S132, H133, Y134, F135, E136, 및/또는 Q214의 하나 이상의 치환 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122는 아미노산 Q70, T73, H133, 및/또는 Y134의 하나 이상의 치환 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122는 아미노산 H133 및/또는 Y134의 하나 이상의 치환 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122는 아미노산 H133 및/또는 Y134의 하나 이상의 치환 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122는 아미노산 H133 및 Y134의 하나 이상의 치환 또는 결실을 포함한다.
세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 수용체 폴리펩티드이며, 상기 폴리펩티드의 세포외 도메인은 하기 구조의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00036
여기서:
AA70 = Gln 또는 Tyr;
AA73 = Thr, Asp 또는 Tyr;
AA133 = His, Asp, Glu 또는 Lys; 및/또는
AA134 = Tyr, Phe, Glu 또는 Arg.
hCD122 수용체의 ECD는 하기 표 3에 요약된 바와 같은 몇 가지 2차 구조적 특색을 포함한다:
Figure pct00037
hCD122의 ECD 서열에 변형을 가할 때, 일부 실시양태에서, 2차 구조적 특색의 형성에 관여하는 아미노산은 단백질의 2차 구조를 유지하기 위해 보유된다. 일반적으로, 디술피드 결합의 유지가 바람직하다. 일부 실시양태에서 글리코실화 부위의 결실이 바람직할 수 있다. 결과적으로, 성숙한 hCD122의 ECD의 위치 3, 17, 42 및/또는 123 중 하나 이상에서 아스파라긴의 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 (예를 들어, 알라닌 또는 이소류신으로의 치환)이 혼입되어 하나 이상의 이러한 N-연결된 글리코실화 부위를 제거할 수 있다.
한 실시양태에서, 직교 CD122는 자연적으로 발생하는 형태의 성숙한 인간 CD122 (서열식별번호: 1)에 따라 넘버링된 위치 133 및 134에서의 아미노산 변형을 포함하는 인간 CD122이다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122는 아미노산 치환 H133D 및 Y134를 포함하는 hCD122 분자이다. 한 실시양태에서, 직교 수용체는 변형된 인간 CD122이며, 여기서 ECD의 아미노산 서열은 하기 서열의 214개 아미노산 폴리펩티드이다:
Figure pct00038
한 실시양태에서, 직교 수용체는 치환 H133D 및 Y134F를 갖는 hCD122의 ECD의 아미노산 서열 (신호 펩티드 제외) 및 하기 아미노산 서열을 갖는 야생형 hCD122 분자의 막횡단 (TM) 및 세포내 도메인 (ICD)를 갖는 변형된 인간 CD122이다:
Figure pct00039
"hoCD122" 또는 "hoIL2Rb"는 hCD122 폴리펩티드의 ECD 내의 위치 히스티딘 133 (H133) 및 티로신 134 (Y134)에서의 아미노산 치환을 포함하는 hCD122의 변이체를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다.
한 실시양태에서, 직교 수용체는 직교 hCD122의 ECD에 대한 천연 시토카인 (즉, wt-hIL2)의 결합을 방해하기 위해 야생형 hCD122의 ECD에 대한 천연 시토카인 (즉, 야생형 hIL2)의 결합에 관여하는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 변형 (예를 들어, 결실 또는 치환)을 포함하는 자연적으로 발생하는 성숙한 CD122 ECD의 변이체를 포함한다. hCD122 ECD에 대한 hIL2의 결합에 관여하는 아미노산은 아미노산 R41, R42, Q70, K71, T73, T74, V75, S132, H133, Y134, F135, E136, 및/또는 Q214를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 직교 수용체는 아미노산 R41, R42, Q70, K71, T73, T74, V75, S132, H133, Y134, F135, E136, 및/또는 Q214의 하나 이상의 치환 또는 결실을 포함하는 CD122 ECD를 포함한다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122 ECD (또는 hoCD122 수용체)는 아미노산 Q70, T73, H133 및/또는 Y134의 하나 이상의 치환 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122는 아미노산 H133 및/또는 Y134의 하나 이상의 치환 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122는 아미노산 H133 및/또는 Y134의 하나 이상의 치환 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 직교 CD122는 아미노산 H133 및 Y134의 하나 이상의 치환 또는 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, 직교 수용체는 위치 133에서 히스티딘에서 아스파르트산으로의 아미노산 치환 (H133D), 글루탐산으로의 아미노산 치환 (H133E) 또는 리신으로의 아미노산 치환 (H133K) 및/또는 위치 134에서 티로신에서 페닐알라닌으로의 아미노산 치환 (Y134F), 글루탐산으로의 아미노산 치환 (Y134E) 또는 아르기닌으로의 아미노산 치환 (Y134R)을 갖는 hoCD122 ECD를 포함한다. 한 실시양태에서, 직교 수용체는 ECD가 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 직교 CD122 오르토는 아미노산 치환 H133D 및 Y134F를 갖는 hCD122 분자이다. 한 실시양태에서, hoCD122 수용체는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 직교 수용체는 hoCD122의 ECD (예를 들어, 서열식별번호: 6) 및 수용체의 IL2 공통 감마 쇄 패밀리 내의 제2 수용체의 막횡단 및 세포내 도메인 (예를 들어, IL4 수용체 유형 II 수용체 서브유닛 a (hIL4Ra 유니프로트 P24394), IL-7 수용체 서브유닛 a (hIL7Ra 유니프로트 16871), IL9 수용체 (hIL9R 유니프로트 Q01113) 및 IL21 수용체 (hIL21R 유니프로트 Q9HBE5))를 포함하는 융합 단백질이다. 이들 공통 감마-쇄 수용체 패밀리 구성원의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 신호, 세포외, 막횡단 및 세포내 도메인의 위치 외에도 문헌에 널리 공지되어 있다. 결과적으로, 통상의 기술자는 이러한 대안적인 공통 감마 쇄 패밀리 구성원의 막횡단 및/또는 세포내 도메인을 갖는 직교 CD122 ECD를 포함하는 융합 단백질을 쉽게 제조할 수 있을 것이다. 서열 정보와 함께 직교 키메라 융합 수용체의 예가 하기 표 5에 제공된다:
Figure pct00040
STAT3 모티프가 있는 직교 CD122 수용체
본 개시내용은 천연 STAT5 인식 모티프에 더하여 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함하는 직교 CD122를 제공한다. 부가의 STAT3 결합 모티프는 신호전달을 부스트하며 또한 IL2 반응을 안정화시킨다.
STAT 단백질은 C 말단에서 보존된 티로신 잔기의 인산화에 이어 핵으로 전위될 때 전사 활성화제로서 작용하여, DNA와 결합하고 표적 유전자 전사를 활성화시킨다 (Hennighausen and Robinson (2008) Genes Dev. 2008; 22:711-21). 7개의 STAT 단백질: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B 및 STAT6이 STAT 패밀리에서 확인되었으며, 이들은 선천성 및 후천성 면역에서부터 세포 증식, 분화 및 생존에 이르기까지 다양한 경로에서 기능한다 (Basham et al., (2008) Nucleic Acids Res. 2008 Jun; 36(11): 3802-3818).
STAT 결합 모티프는 전형적으로 시토카인 수용체에 존재하며 각각의 시토카인 리간드의 결합은 세포내 도메인에서의 특정 티로신 잔기를 인산화하는 야누스 키나제 (JAK) 패밀리의 티로신 키나제를 활성화시킨다. 인산화된 수용체는 수용체 상의 STAT 인식 모티프에 STAT를 동원하고 이러한 STAT는 인산화된다. 인산화된 STAT는 이량체화되고 핵으로 전위되어 다양한 유전자의 전사를 시작한다 (상기 문헌 [Hennighausen] 참조).
이러한 STAT 단백질 중에서, STAT5는 IL2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL21을 포함한 시토카인이 동족 수용체와 결합함으로써 활성화된다 (Lara E. Kallal & Christine A. Biron (2013) Changing partners at the dance, JAK -STAT, 2:1, e23504, DOI: 10.4161/jkst.23504, Page 2, Col. 2). 예를 들어, CD122 및 직교 CD122는 STAT5 인식 모티프를 함유하고 STAT5를 동원하고 이를 활성화시킬 수 있다. 활성화된 STAT5는 유전자, 예컨대 Cis, spi2.1 및 Socs-1의 전사를 활성화시킨다 (상기 문헌 [Basham et al., Nucleic Acids Res] 참조).
STAT5 결합 모티프는 YX1X2L의 서열 (서열식별번호: 19)을 갖는다. X1 및 X2는 임의의 자연 아미노산일 수 있다. 일부 경우에, X1 및 X2는 동일한 아미노산 잔기이다. 일부 경우에, X1 및 X2는 상이한 아미노산 잔기이다. 한 실시양태에서, STAT5 모티프는 YLSL의 서열 (서열식별번호: 20)을 갖는다.
STAT3 결합 모티프는 자연적으로 발생하는 형태 (야생형) 인간 CD122에는 존재하지 않는다. 이는 전형적으로 IL-6, IL-10, IL21, IFNα, IFNβ, IFNγ, 및 IFNλ와 결합하는 다른 시토카인 수용체에 존재한다. 활성화 시, STAT3는 Bcl-XL, 서비빈, 시클린 D1 및 활성화 c-myc를 표적으로 한다 (상기 문헌 [Kallal, et al.] 참조). STAT3는 그의 수용체가 IL-6 및 IL21, 온코스타틴 M (OSM) 및 백혈병 억제 인자 (LIF)를 포함한 gp130 쇄를 공유하는 다양한 시토카인에 의한 티로신 인산화를 통해 활성화될 수 있다. STAT3는 종양형성, 혈관신생 및 종양 전이, 및 항-아폽토시스를 비롯한 다양한 생물학적 기능에서 역할을 한다. 예를 들어, 문헌 [Sun et al. (2006) FEBS Lett. 580(25):5880-4 and Fukada, et al. (1996) Immunity 5(5): 449-460]을 참조한다. 직교 CD122의 세포내 도메인에 하나 이상의 기능적 STAT3 신호전달 모티프의 혼입은 이러한 STAT3 변형된 직교 CD122의 ECD에 대한 동족 IL2 오르토로그의 결합에 반응하여 직교 IL2를 발현하는 변형된 세포에서 항-아폽토시스 인자를 상향조절한다. 결과적으로, 하나 이상의 기능적 STAT3 도메인을 혼입하는 세포내 도메인을 포함하는 직교 CD122를 발현하는 직교 세포는 증진된 생존 및 더 긴 수명을 가지며, 따라서 생체내에서 더 긴 작용 지속 기간을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 도입하도록 변형된 인간 직교 CD122 (무손상 STAT5 모티프를 포함함)를 제공하며 이렇게 생산된 변형된 인간 CD122는 STAT5 인식 모티프를 보유하고 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 획득한다.
일부 실시양태에서, 변형된 직교 CD122는 1개, 2개, 3개 또는 그 초과의 STAT3 결합 모티프를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, STAT3 인식 모티프는 YX1X2Q의 아미노산 서열 (서열식별번호: 21)을 갖는다. 일부 실시양태에서, X1은 L, R, F, M으로 이루어진 군으로부터 선택되며, X2는 R, K, H, 및 P로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, STAT3 인식 모티프는 YLRQ (서열식별번호: 11); YLKQ (서열식별번호: 12); YRHQ (서열식별번호: 13); YLRQ (서열식별번호: 14); YFKQ (서열식별번호: 15); YLPQ (서열식별번호: 16); YMPQ (서열식별번호: 17), 및 YDKPH (서열식별번호: 18)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 STAT3 결합 모티프는 직교 CD122 ICD의 C-말단에 또는 직교 CD122의 ICD의 내부 서열로서 혼입될 수 있다.
일부 경우에, 변형된 인간 CD122는 인간 CD122의 세포내 도메인의 C-말단과 융합된 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함한다. 일부 대표적인 실시양태에서, 직교 CD122는 하기 구조의 직교 CD122 폴리펩티드를 생성하는 C-말단측 STAT3 인식 도메인의 부가를 포함한다:
오르토-CD122-GGYLRQ;
오르토-CD122-GGYLKQ;
오르토-CD122-GGYRHQ;
오르토-CD122-GGYLRQ;
오르토-CD122-GGYFKQ;
오르토-CD122-GGYLPQ;
오르토-CD122-GGYMPQ; 및
오르토-CD122-GGYDKPH.
일부 경우에, 직교 CD122는 링커를 통해 인간 CD122에 연결된 STAT3 결합 모티프를 포함한다. 링커는 자연적으로 발생하는 단백질 또는 합성 서열로부터 유래될 수 있다. 링커를 설계하는 방법은, 예를 들어, 그 관련 부분이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Chen et al. (2013) Adv. Drug. Deliv. Rev. 65(10):1357-1369]에 개시된 바와 같이, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 적합한 링커는 쉽게 선택될 수 있으며 임의의 적합한 길이, 예컨대 1개의 아미노산 (예를 들어, Gly), 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 또는 20-30개의 아미노산일 수 있다. 가요성 링커의 예는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체, 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 기타 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 구조화되지 않았으므로, 성분들 간의 중성 테더 역할을 할 수 있다. 가요성 링커의 추가 예는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 글리신-세린 중합체를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 구조화되지 않았으므로, 성분들 간의 중성 테더 역할을 할 수 있다. 변형된 직교 CD122는 하나 이상의 STAT3 결합 모티프 및 하나 이상의 링커 서열을 포함할 수 있다. 상기 링커 서열은 인간 CD122와 STAT3 결합 모티프 중 하나를 연결하거나 개별 STAT3 결합 모티프를 연결할 수 있다. 하나 이상의 링커 서열은 동일하거나 상이한 서열을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 STAT3 결합 모티프는 직교 CD122의 내부 (즉, C 말단 및 N 말단 둘 다 아닌) 서열로서 존재한다. 이러한 구성의 변형된 직교 CD122는 STAT3 결합 모티프를 생성하기 위해 돌연변이될 수 있는 직교 CD122 ICD 아미노산 서열 내의 적합한 영역을 확인함으로써 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, CD122의 자연적으로 발생하는 ICD (이는 전형적으로 직교 CD122에 존재한다)는 최소 변형으로 STAT3 결합 모티프를 생성하도록 용이하게 변형될 수 있는 STAT3 결합 모티프와 유사한 서열을 보유한다. 예를 들어 티로신 잔기로 시작하는 4-뉴클레오티드 서열을 포함하는 영역이 있다. 천연 인간 CD122 내의 이러한 영역 중 하나는 천연 인간 CD122 단백질의 위치 s355와 위치 364 사이에 위치한 YFTYDPYSEE의 서열을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 이러한 영역에 포함된 YFTY, YDPY 또는 YSEE 중 1개 또는 2개는 STAT3 인식 모티프로 치환되어 본원에 개시된 변형된 인간 CD122를 생산한다.
이러한 변형된 직교 CD122는 동족 IL2 리간드와 결합할 때 STAT3 및 STAT5 신호전달을 유도할 수 있으며 그 능력은 예를 들어, STAT 변형된 ICD를 갖는 직교 CD122를 발현하는 세포를 동족 IL2 오르토로그와 접촉시킨 것에 대한 반응으로 인산화된 STAT3 및 STAT5의 수준을 모니터링함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 변형된 인간 CD122는 T 세포에 도입 및 발현될 수 있으며, 포스포-STAT5 및 포스포-STAT3에 특이적인 항체는 STAT3 및 STAT5의 인산화를 검출하는데 사용된다. STAT3 및 STAT5 신호전달을 유도할 수 있는 재조합 단백질의 능력을 검출하는 하나의 예시적인 방법은 문헌 [Kagoya et al. (2018) Nat Med. 24(3):352-359]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함하는 변형된 인간 직교 CD122를 발현하는 조작된 세포를 자극하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 조작된 세포를 변형된 인간 직교 CD122의 동족 리간드인 인간 IL2 오르토로그와 접촉시킴으로써 조작된 세포를 자극하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함하는 변형된 인간 직교 CD122를 발현하는 조작된 세포에서 STAT3 및 STAT5의 세포내 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 조작된 세포를 변형된 인간 직교 CD122의 동족 리간드인 인간 IL2 오르토로그와 접촉시켜, STAT3 및 STAT5의 세포내 수준이 조작된 세포에서 증가하도록 하는 것을 포함한다.
STAT5 STAT3의 선택적 활성화 방법
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함하는 변형된 인간 직교 CD122를 발현하는 조작된 T 세포를 자극하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 조작된 T 세포를 변형된 인간 직교 CD122의 동족 리간드인 인간 IL2 오르토로그와 접촉시킴으로써 조작된 T 세포를 자극하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함하는 변형된 인간 직교 CD122를 발현하는 조작된 T 세포에서 STAT3 및 STAT5의 세포내 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 조작된 T 세포를 변형된 인간 직교 CD122의 동족 리간드인 인간 IL2 오르토로그와 접촉시켜, STAT3 및 STAT5의 세포내 수준이 상기 세포에서 증가하도록 하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함하는 변형된 인간 직교 CD122를 발현하는 CAR-T 세포를 자극하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 CAR-T 세포를 변형된 인간 직교 CD122의 동족 리간드인 인간 IL2 오르토로그와 접촉시킴으로써 조작된 T 세포를 자극하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 STAT3 결합 모티프를 포함하는 변형된 인간 직교 CD122를 발현하는 CAR-T 세포에서 STAT3 및 STAT5의 세포내 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 CAR-T 세포를 변형된 인간 직교 CD122의 동족 리간드인 인간 IL2 오르토로그와 접촉시켜, STAT3 및 STAT5의 세포내 수준이 CAR-T 세포에서 증가하도록 하는 것을 포함한다.
직교 조작된 세포
본 발명의 실시에 유용한 직교 면역 세포의 제조는 CD122 직교 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 단리된 면역 세포를 형질전환시킴으로써 달성된다. 본 개시내용의 IL2 오르토로그는 상응하는 직교 CD122 수용체를 발현하도록 조작된 이러한 조작된 T 세포 (예를 들어, 인간 T-세포)를 선택적으로 확장하는 방법에 이용된다.
본원에 기재된 구축물로 조작하는데 유용한 세포는 나이브 T-세포, 중심 기억 T-세포, 이펙터 기억 T-세포 또는 그의 조합을 포함한다. 상기 기재된 바와 같은 조작을 위한 T 세포는 대상체로부터 수집되거나 또는 공여자는 원하는 세포를 풍부하게 하는 기술에 의해 세포 혼합물로부터 분리될 수 있거나 또는 분리 없이 조작 및 배양될 수 있다. 대안적으로, 조작을 위한 T 세포는 다른 세포로부터 분리될 수 있다. 정확한 분리를 제공하는 기술은 형광 활성화 세포 분류기를 포함한다. 세포는 죽은 세포와 연관된 염료 (예를 들어, 프로피디움 아이오다이드)를 이용함으로써 죽은 세포에 대항하여 선택될 수 있다. 분리된 세포는 통상적으로 수집 튜브 바닥에 혈청 쿠션이 있는, 세포의 생육력을 유지하는 임의의 적절한 배지에서 수집될 수 있다. 태아 송아지 혈청 (FCS)이 빈번히 보충된, dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, 이코브(Iscove)의 배지 등을 포함한 다양한 배지가 상업적으로 입수가능하며, 세포의 성질에 따라 사용될 수 있다. 수집되고 임의로 강화된 세포 집단은 유전적 변형을 위해 즉시 사용될 수 있거나 액체 질소 온도에서 동결되고 저장될 수 있으며, 이는 해동되고 재사용될 수 있다. 세포는 통상적으로 10% DMSO, 50% FCS, 40% RPMI 1640 배지에 저장될 것이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 면역 세포, 예를 들어 치료를 필요로 하는 개체로부터 단리된 종양 침윤 림프구 (TIL)의 복합 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Yang and Rosenberg (2016) Adv Immunol. 130:279-94, "Adoptive T Cell Therapy for Cancer; Feldman et al. (2015) Seminars in Oncol. 42(4):626-39 "Adoptive Cell Therapy-Tumor-Infiltrating Lymphocytes, T-Cell Receptors, and Chimeric Antigen Receptors"; Clinical Trial NCT01174121, "Immunotherapy Using Tumor Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Cancer"; Tran et al. (2014) Science 344(6184)641-645, "Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer"]을 참조한다.
CAR-T 세포
본 발명의 한 실시양태에서, 직교 수용체를 발현하는 T-세포는 키메라 항원 수용체를 표면 발현하도록 변형된 T-세포 (예를 들어, 인간 T-세포) ('CAR-T' 세포)이다. 한 실시양태에서, 변형된 T 세포는 동종이계 CAR-T 세포이다. 일부 실시양태에서, 동종이계 CAR-T는 내인성 TCRa 및 TCRb 기능을 제거하도록 변형된다.
본원에 정의된 바와 같은 "CAR"은 아미노에서 카르복시 말단으로 하기 순서로 배열된 다수의 기능적 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다: (a) 항원 결합 도메인 (ABD)을 포함하고 임의로 "힌지" 도메인을 포함하는 세포외 도메인 (ECD), (b) 막횡단 도메인 (TD); 및 (c) 하나 이상의 세포질 신호전달 도메인 (CSD), 여기서 전술한 도메인은 임의로 하나 이상의 스페이서 도메인에 의해 연결될 수 있다. CAR은 또한 이러한 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 세포의 세포 표면 상의 CAR의 번역 후 프로세싱 및 제시 동안 통상적으로 제거되는 신호 펩티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. CAR은 관련 기술분야에 널리 공지된 원리에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [2010년 6월 22일에 허여된 미국 특허 번호 7,741,465 B1 (Eshhar, et al.); Sadelain, et al. (2013) Cancer Discovery 3(4):388-398; 2013년 3월 19일에 허여된 미국 특허 번호 8,399,645 (Campana and Imai); Jensen and Riddell (2015) Current Opinions in Immunology 33:9-15; Gross, et al. (1989) PNAS(USA) 86(24):10024-10028; Curran, et al. (2012) J Gene Med 14(6):405-15; 2019년 1월 8일에 허여된 미국 특허 번호 10.174,095 (Brogdon, et al.); Guedan, et al. (2019) Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors Molecular Therapy: Methods & Clinical Development Vol. 12: 145-156]을 참조한다.
본 발명의 실시에 유용한 CAR은 관련 기술분야에 널리 공지된 원리에 따라 제조된다. 예를 들어, 문헌 [2010년 6월 22일에 허여된 미국 특허 번호 7,741,465 B1 (Eshhaar et al.); Sadelain, et al. (2013) Cancer Discovery 3(4):388-398 (The basic principles of chimeric antigen receptor (CAR) design); Jensen and Riddell (2015) Current Opinions in Immunology 33:9-15 (Designing chimeric antigen receptors to effectively and safely target tumors); Gross, et al. (1989) PNAS(USA) 86(24):10024-10028 (Expression of immunoglobulin -T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity); Curran, et al. (2012) J Gene Med 14(6):405-15]을 참조한다. 본 발명의 맥락에서 CAR 및 그의 기능적 도메인의 구축에 관한 고려사항이 하기에 논의된다.
신호 서열
본 개시내용의 CAR은 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 실시에서, 임의의 진핵 신호 펩티드 서열이 이용될 수 있다. 신호 펩티드는 표면 발현된 단백질의 천연 신호 펩티드로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, CAR의 신호 펩티드는 인간 혈청 알부민 신호 펩티드, 프로락틴 알부민 신호 펩티드, 인간 IL2 신호 펩티드, 인간 트립시노겐-2, 인간 CD-5, 인간 이뮤노글로불린 카파 경쇄, 인간 아주로시딘, 가우시아 루시페라제 및 그의 기능적 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 신호 펩티드이다. 신호 펩티드를 사용하여 분비 효율을 증가시키는 특정한 아미노산 치환은 문헌 [Stern, et al. (2007) Trends in Cell and Molecular Biology 2:1-17 및 Kober, et al. (2013) Biotechnol Bioeng. 1110(4):1164-73]에 기재되어 있다. 대안적으로, 신호 펩티드는 확립된 원칙에 따라 제조된 합성 서열일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Nielsen, et al. (1997) Protein Engineering 10(1):1-6 (Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites); Bendtsen, et al. (2004) J. Mol. Biol 340(4):783-795 (Improved Prediction of Signal Peptides SignalP 3.0); Petersen, et al. (2011) Nature Methods 8:785-796 (Signal P 4.0; discriminating signal peptides from transmembrane regions)]을 참조한다.
세포외 항원 결합 도메인
본원에 사용된 바와 같은, 용어 항원 결합 도메인 (ABD)은 표적 세포의 표면 상에 발현된 적어도 하나의 항원과 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합 도메인을 함유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, ABD는 표적 세포의 표면 상의 동일한 항원 또는 2개의 상이한 항원과 선택적으로 결합하는 2개의 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. ABD는 표적 세포의 표면 상에 발현된 하나 이상의 항원과 특이적으로 결합하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. ABD는 폴리펩티드이다.
CAR의 ABD는 1가 또는 다가일 수 있으며 세포 표면 종양 항원과 특이적으로 결합하는 하나 또는 다수 (예를 들어 1, 2, 또는 3개)의 폴리펩티드 서열 (예를 들어 scFv, VHH, 리간드)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포 표면 종양과 선택적으로 결합하는 ABD를 포함하는 CAR 및 종양 항원은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Dotti, et al., Immunol Rev. 2014 January; 257(1)] 참조). 본 개시내용의 방법 및 조성물은 CAR 요법과 연계해서 유용하며, 여기서 CAR의 ABD는 CD123, CD19, CD20, BCMA, CD22, CD30, CD70, 루이스 Y, GD3, GD3, 메소텔린, ROR CD44, CD171, EGP2, EphA2, ErbB2, ErbB3/4, FAP, FAR IL11Ra, PSCA, PSMA, NCAM, HER2, NY-ESO-1, MUC1, CD123, FLT3, B7-H3, CD33, IL1RAP, CLL1 (CLEC12A)PSA, CEA, VEGF, VEGF-R2, CD22, ROR1, 메소텔린, c-Met, 당지질 F77, FAP, EGFRvIII, MAGE A3, 5T4, WT1, KG2D 리간드, 엽산 수용체 (FRa), 및 Wnt1 항원을 포함하나 이에 제한되지는 않는 종양 항원과 특이적으로 결합한다. 이들 표적과 반응하는 항체는 문헌에 널리 공지되어 있으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 CAR의 ABD에 혼입될 수 있는 단일 쇄 항체의 폴리펩티드 서열 (예를 들어 scFv, CDR 이식 VHH 등)의 구축을 위해 이러한 항체로부터 CDR을 단리할 수 있다.
한 실시양태에서, ABD는 단일 쇄 Fv (ScFv)이다. ScFv는 펩티드 링커에 의해 공유 연결된 항체의 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된 폴리펩티드이다 (문헌 [Bird, et al. (1988) Science 242:423-426; Huston, et al. (1988) PNAS(USA) 85:5879-5883; S-z Hu, et al. (1996) Cancer Research, 56, 3055-3061; 1990년 8월 7일에 허여된 미국 특허 번호 4946778 (Ladner)]). 항-표적화 항원 ScFv의 제조는 항-표적화 항원 ScFv가 유래되는 표적화 항원에 대항한 모노클로날 항체의 확인을 포함한다. 모노클로날 항체의 생성 및 하이브리도마의 단리는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 기술이다. 예를 들어, 문헌 [Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Second Edition, Chapter 7 (E. Greenfield, Ed. 2014 Cold Spring Harbor Press)]을 참조한다. 면역 반응은 관련 기술분야에 널리 공지된 아주반트, 예컨대 명반, 알루미늄 염, 또는 프로인트, SP-21 등의 공동 투여를 통해 증진될 수 있다. 생성된 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술, 예컨대 파지 디스플레이 및 유도 진화를 통해 특정한 바람직한 특징을 갖는 항체를 선택하도록 최적화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Barbas, et al. (1991) PNAS(USA) 88:7978-82; 1993년 6월 29일에 허여된 미국 특허 번호 5,223,409 (Ladner, et al.); Stemmer, W. (1994) Nature 370:389-91; 1998년 10월 13일에 허여된 미국 특허 번호 5,821,047 (Garrard); Camps, et al. (2003) PNAS(USA) 100(17): 9727-32; 1986년 6월 3일에 허여된 미국 특허 번호 4,593,002 (Dulbecco); 2004년 10월 19일에 허여된 미국 특허 번호 6,806,079 (McCafferty); 2009년 12월 22일에 허여된 미국 특허 번호 7,635,666 (McCafferty); 2010년 2월 16일에 허여된 미국 특허 번호 7,662,557 (McCafferty); 2010년 5월 25일에 허여된 미국 특허 번호 7,723,271 (McCafferty); 및/또는 미국 특허 번호 7,732,377 (McCafferty)]을 참조한다. 모노클로날 항체 서열에 기초한 ScFv의 생성은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [The Protein Protocols Handbook, John M. Walker, Ed. (2002) Humana Press Section 150 "Bacterial Expression, Purification and Characterization of Single-Chain Antibodies" Kipriyanov, S]을 참조한다.
또 다른 실시양태에서, ABD는 표적화 항원으로 낙타 또는 라마의 면역화를 통해 수득된 단일 도메인 항체이다 (Muyldermans, S. (2001) Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302).
대안적으로, ABD는 펩티드 라이브러리의 생성 및 원하는 표적 세포 항원 결합 특성을 갖는 화합물 단리를 통해 완전히 합성적으로 생성될 수 있다. 이러한 기술은 과학 문헌에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [1999년 11월 12일에 허여된 미국 특허 번호 6303313 B1 (Wigler, et al.); 2004년 2월 24일에 허여된 미국 특허 번호 6696248 B1 (Knappik, et al.); Binz, et al. (2005) Nature Biotechnology 23:1257-1268; Bradbury, et al. (2011) Nature Biotechnology 29:245-254]을 참조한다.
표적 세포 발현된 항원에 대한 친화성을 갖는 ABD 외에도, ARD는 또한 부가의 분자에 대한 친화성을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ARD는 이중-특이적일 수 있으며, 즉 제1 표적 세포 발현된 항원 및 제2 표적 세포 발현된 항원에 대한 특이적 결합을 제공할 수 있다. 2가 단일 쇄 폴리펩티드의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Thirion, et al. (1996) European J. of Cancer Prevention 5(6):507-511; DeKruif and Logenberg (1996) J. Biol. Chem 271(13)7630-7634; 및 2015년 11월 5일에 공개된 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0315566 (Kay, et al.)]을 참조한다.
ABD는 하나 초과의 표적 항원에 대해 친화성을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ABD는 키메라 이중특이적 결합 구성원을 포함할 수 있으며, 즉 제1 표적 세포 발현된 항원 및 제2 표적 세포 발현된 항원에 대한 특이적 결합을 제공할 수 있다. 키메라 이중특이적 결합 구성원의 비-제한적 예는 이중특이적 항체, 이중특이적 접합된 모노클로날 항체 (mab)2, 이중특이적 항체 단편 (예를 들어, F(ab)2, 이중특이적 scFv, 이중특이적 디아바디, 단일 쇄 이중특이적 디아바디 등), 이중특이적 T 세포 인게이저 (BiTE), 이중특이적 접합된 단일 도메인 항체, 미카바디 및 그의 돌연변이체 등을 포함한다. 키메라 이중특이적 결합 구성원의 비-제한적인 예는 또한 문헌 [Kontermann (2012) MAbs . 4(2): 182-197; Stamova et al. (2012) Antibodies, 1(2), 172-198; Farhadfar et al. (2016) Leuk Res. 49:13-21; Benjamin et al. Ther Adv Hematol . (2016) 7(3):142-56; Kiefer et al. Immunol Rev. (2016) 270(1):178-92; Fan et al. (2015) J Hematol Oncol . 8:130; May et al. (2016) Am J Health Syst Pharm . 73(1):e6-e13]에 기재된 키메라 이중특이적 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 이중특이적 결합 구성원은 2가 단일 쇄 폴리펩티드이다. 예를 들어, 문헌 [Thirion, et al. (1996) European J. of Cancer Prevention 5(6):507-511; DeKruif and Logenberg (1996) J. Biol. Chem 271(13)7630-7634; 및 2015년 11월 5일에 공개된 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0315566 (Kay, et al.)]을 참조한다.
일부 경우에, 키메라 이중특이적 결합 구성원은 CAR T 세포 어댑터일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "CAR T 세포 어댑터"는 CAR의 항원 인식 도메인과 결합하고 CAR을 제2 항원으로 재지정하는 발현된 이중특이적 폴리펩티드를 의미한다. 일반적으로, CAR T 세포 어댑터는 결합 영역을 가질 것이며, 하나는 그것이 지시되는 CAR 상의 에피토프 및 결합될 때 CAR을 활성화시키는 결합 신호를 형질도입하는 결합 파트너에 대해 지시된 제2 에피토프에 특이적이다. 유용한 CAR T 세포 어댑터는 예를 들어, 문헌 [Kim et al. (2015) J Am Chem Soc. 137(8):2832-5; Ma et al. (2016) Proc Natl Acad Sci U S A. 113(4):E450-8 및 Cao et al. (2016) Angew Chem Int Ed Engl. 55(26):7520-4]에 기재된 어댑터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, GD2에 대항한 항원 결합 도메인은 mAb 14.18, 14G2a, chl4.18, hul4.18, 3F8, hu3F8, 3G6, 8B6, 60C3, 10B8, ME36.1, 및 8H9로부터 선택된 항체의 항원 결합 부분으로, 예를 들어, WO2012033885, WO2013040371, WO2013192294, WO2013061273, WO2013123061, WO2013074916, 및 WO201385552 참조한다. 일부 실시양태에서, GD2에 대항한 항원 결합 도메인은 미국 공개 번호: 20100150910 또는 PCT 공개 번호: WO 2011160119에 기재된 항체의 항원 결합 부분이다. 또 다른 항체는 S58 (항-GD2, 신경모세포종)이다. 코타라(Cotara)™ [페레그린스 파마슈티칼즈(Perregrince Pharmaceuticals)]은 재발성 교모세포종의 치료에 대해 기재된 모노클로날 항체이다.
일부 실시양태에서 CAR의 ABD는 scFvFMC-63 및 그의 인간화 변이체를 포함한다.
링커/ 힌지
본 발명의 실시에 유용한 CAR은 임의로 CAR의 도메인, 특히 ARD와 CAR의 막횡단 전역에 걸쳐 있는 도메인 사이의 연결을 연결하는 하나 이상의 폴리펩티드 스페이서를 포함할 수 있다. CAR 구조의 필수적인 요소는 아니지만, 스페이서 도메인을 포함하는 것은 일반적으로 ARD에 의한 항원 인식을 용이하게 하기 위해 바람직한 것으로 간주된다 (Moritz and Groner (1995) Gene Therapy 2(8) 539-546). 본원에 기재된 CAR-T T 세포 기술과 연계해서 사용된 바와 같은, 용어 "링커", "링커 도메인" 및 "링커 영역"은 본 개시내용의 CAR의 도메인/영역 중 임의의 것을 함께 연결하는 약 1개 내지 100개의 아미노산 길이의 올리고- 또는 폴리펩티드 영역을 지칭한다. 링커는 인접한 단백질 도메인이 서로에 대해 자유롭게 이동할 수 있도록 글리신 및 세린과 같은 가요성 잔기로 구성될 수 있다. 특정 실시양태는 2개의 인접한 도메인이 서로 입체적으로 간섭하지 않는 것을 보장하는 것이 바람직할 때 더 긴 길이의 링커를 사용하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 절단가능하지 않은 반면, 다른 실시양태에서는 가능하고 (예를 들어, 2A 링커 (예를 들어, T2A)), 2A-유사 링커 또는 그의 기능적 등가물, 및 전술한 것의 조합이다. 스페이서 기능을 달성하는데 필요한 특정한 아미노산 서열은 없지만, 스페이서의 전형적인 특성은 표적화 항원 인식을 용이하게 하기 위해 ARD의 자유 이동을 가능하게 하는 유연성이다. 유사하게, 스페이서 길이는 CAR 기능을 유지하면서 상당한 관대함이 있는 것으로 밝혀졌다 (Jensen and Riddell (2014) Immunol. Review 257(1) 127-144). 본 발명의 실시에 유용한 CAR의 구축에서 스페이서로서 유용한 서열은 IgG1의 힌지 영역, 이뮤노글로불린 1CH2-CH3 영역, IgG4 힌지-CH2-CH3, IgG4 힌지-CH3 및 IgG4 힌지를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 힌지 및 막횡단 도메인은 CD8-알파의 힌지 및 막횡단 도메인과 같은 동일한 분자로부터 유래될 수 있다 (Imai, et al. (2004) Leukemia 18(4):676-684). 링커가 피코르나바이러스 2A-유사 링커, 돼지 테스코바이러스 (P2A), 토세아 아시그나 바이러스 (T2A)의 CHYSEL 서열, 또는 그의 조합, 변이체 및 기능적 등가물을 포함하는 본 개시내용의 실시양태가 고려된다. 또 다른 실시양태에서, 링커 서열은 Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)-pro(2B) 모티프를 포함하며, 이는 2A 글리신과 2B 프롤린 사이의 절단을 초래한다.
막횡단 도메인
CAR은 ABD (또는 이용되는 경우, 링커)를 CAR의 세포내 세포질 도메인에 연결하는 막횡단 도메인을 추가로 포함한다. 막횡단 도메인은 진핵 세포막에서 열역학적으로 안정적인 임의의 폴리펩티드 서열로 구성된다. 막횡단 전역에 걸쳐 있는 도메인은 자연적으로 발생하는 막 전역에 걸쳐 있는 단백질의 막횡단 도메인으로부터 유래될 수 있거나 합성일 수 있다. 합성 막횡단 도메인을 설계하는데 있어서, 알파-나선 구조를 선호하는 아미노산이 바람직하다. CAR의 구축에 유용한 막횡단 도메인은 알파-나선 2차 구조를 갖는 형성을 선호하는 대략 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 22, 23, 또는 24개 아미노산으로 구성된다. 알파-나선 입체형태를 선호하는 아미노산은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Pace, et al. (1998) Biophysical Journal 75: 422-427]을 참조한다. 알파 나선 입체형태에서 특히 선호되는 아미노산은 메티오닌, 알라닌, 류신, 글루타메이트 및 리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 막횡단 도메인은 유형 I 막 전역에 걸쳐 있는 단백질, 예컨대 CD3ζ, CD4, CD8, CD28 등으로부터의 막횡단 도메인으로부터 유래될 수 있다.
세포내 신호전달 도메인
CAR 폴리펩티드의 세포질 도메인은 하나 이상의 세포내 신호 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호 도메인은 항원 수용체 맞물림 후 신호 형질도입을 개시하는 T-세포 수용체 (TCR) 및 공동-수용체의 세포질 서열 및 그의 기능적 유도체 및 하위 단편을 포함한다. 세포질 신호전달 도메인, 예컨대 T 세포 수용체 제타-쇄로부터 유래된 것은 키메라 수용체와 표적 항원의 맞물림 후 T 림프구 증식 및 이펙터 기능에 대한 자극 신호를 생산하기 위해 CAR의 일부로서 이용된다. 세포질 신호전달 도메인의 예는 CD27의 세포질 도메인, CD28의 세포질 도메인 S, CD137의 세포질 도메인 (4-1BB 및 TNFRSF9로서 지칭되기도 함), CD278의 세포질 도메인 (ICOS로서 지칭되기도 함), PI3 키나제의 p110α, β 또는 δ 촉매 서브유닛, 인간 CD3 ζ-쇄, CD134의 세포질 도메인 (OX40 및 TNFRSF4로서 지칭되기도 함), FcεR1γ 및 β 쇄, MB1 (Igα) 쇄, B29 (Igβ) 쇄 등), CD3 폴리펩티드 (δ, Δ 및 ε), syk 패밀리 티로신 키나제 (Syk, ZAP 70 등), src 패밀리 티로신 키나제 (Lck, Fyn, Lyn 등) 및 T-세포 형질도입에 관여하는 기타 분자, 예컨대 CD2, CD5 및 CD28을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
공동-자극 도메인
일부 실시양태에서, CAR은 또한 공동-자극 도메인을 제공할 수 있다. 용어 "공동-자극 도메인"은 1차 특이적 자극이 전파되는 2차 비-특이적 활성화 메커니즘을 제공하는 CAR의 자극 도메인, 전형적으로 엔도도메인을 지칭한다. 공동-자극 도메인은 기억 세포의 증식, 생존 또는 발달을 증진시키는 CAR의 일부분을 지칭한다. 공동-자극의 예는 T 세포 수용체를 통한 항원 특이적 신호전달 후의 항원 비특이적 T 세포 공동-자극 및 B 세포 수용체를 통한 신호전달 후의 항원 비특이적 B 세포 공동-자극을 포함한다. 공동-자극, 예를 들어 T 세포 공동-자극 및 관련된 인자는 문헌 [Chen & Flies. (2013) Nat Rev Immunol 13(4):227-42]에 기재되어 있다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, CSD는 TNFR 슈퍼패밀리의 구성원, CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), Dap10, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 또는 그의 조합 중 하나 이상을 포함한다.
CAR은 종종 1세대, 2세대, 3세대 또는 4세대로서 지칭된다. 용어 1세대 CAR은 세포질 도메인이 단일 신호전달 도메인, 예를 들어 IgE FcεR1γ 또는 CD3ζ 쇄에 대한 고 친화성 수용체로부터 유래된 신호전달 도메인을 통해서만 항원 결합으로부터의 신호를 전달하는 CAR을 지칭한다. 도메인은 항원 의존성 T-세포 활성화를 위한 1개 또는 3개의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(들) [ITAM(들)]를 함유한다. ITAM-기반 활성화 신호는 T-세포에 표적 종양 세포를 용해하고 항원 결합에 대한 반응으로 시토카인을 분비할 수 있는 능력을 부여한다. 2세대 CAR은 CD3 ζ 신호 외에 공동-자극 신호를 포함한다. 전달된 공동-자극 신호의 동시 전달은 CAR-형질도입된 T-세포에 의해 유도된 시토카인 분비 및 항종양 활성을 증진시킨다. 공동-자극 도메인은 통상적으로 CD3ζ 도메인에 대해 막 근위부이다. 3세대 CAR은 3부 신호전달 도메인을 포함하며, 예를 들어 CD28, CD3ζ, OX40 또는 4-1BB 신호전달 영역을 포함한다. 4세대, 또는 "장갑차" CAR T-세포는 IL-12, IL-18, IL-7 및/또는 IL-10; 4-1BB 리간드, CD-40 리간드의 발현과 같은 면역 활성을 증진시키기 위해 분자 및/또는 수용체를 발현 또는 차단하도록 추가로 변형된다.
본 발명의 CAR에 혼입될 수 있는 세포내 신호전달 도메인의 예는 (아미노에서 카르복시로): CD3ζ; CD28 - 41BB - CD3ζ; CD28 - OX40 - CD3ζ; CD28 - 41BB - CD3ζ; 41BB -CD-28 -- CD3ζ 및 41BB - CD3ζ를 포함한다.
본 발명의 실시에 유용한 CAR 아키텍처의 예는 ECD 표적화 도메인(들) 및 CAR의 ICD의 아키텍처를 예시하는 하기 예를 포함하나 그에 제한되지는 않는다:
항-CD20 - CD3ζ
항-CD20 - CD28 - 41BB - CD3ζ,
항-CD20 - CD28 - CD3ζ
항-CD20 - CD28 - OX40 - CD3ζ
항-CD20 - CD28 - 41BB - CD3ζ
항-CD20 - OX40 - CD3ζ
항-CD20 - OX40 - CD28 - CD3ζ
항-CD20 - 41BB - CD3ζ
항-CD20 - ICOS - CD3ζ
항-CD20 - ICOS - 41BB - CD3ζ
항-CD20 - 41BB - ICOS - CD3ζ
항-CD20 - 41BB - OX40 - CD3ζ,
항-CD20 - 41BB - CD28 - CD3ζ.
항-HER2 - CD3ζ
항-HER2 - CD28 - 41BB - CD3ζ,
항-HER2 - CD28 - CD3ζ
항-HER2 - CD28 - OX40 - CD3ζ
항-HER2 - CD28 - 41BB - CD3ζ
항-HER2 - OX40 - CD3ζ
항-HER2 - OX40 - CD28 - CD3ζ
항-HER2 - 41BB - CD3ζ
항-HER2 - ICOS - CD3ζ
항-HER2 - ICOS - 41BB - CD3ζ
항-HER2 - 41BB - ICOS - CD3ζ
항-HER2 - 41BB - OX40 - CD3ζ,
항-HER2 - 41BB - CD28 - CD3ζ.
항-CEA - CD3ζ
항-CEA - CD28 - 41BB - CD3ζ,
항-CEA - CD28 - CD3ζ
항-CEA - CD28 - OX40 - CD3ζ
항-CEA - CD28 - 41BB - CD3ζ
항-CEA - OX40 - CD3ζ
항-CEA - OX40 - CD28 - CD3ζ
항-CEA - 41BB - CD3ζ
항-CEA - ICOS - CD3ζ
항-CEA - ICOS - 41BB - CD3ζ
항-CEA - 41BB - ICOS - CD3ζ
항-CEA - 41BB - OX40 - CD3ζ,
항-CEA - 41BB - CD28 - CD3ζ.
항-VEGF - CD3ζ
항-VEGF - CD28 - 41BB - CD3ζ,
항-VEGF - CD28 - CD3ζ
항-VEGF - CD28 - OX40 - CD3ζ
항-VEGF - CD28 - 41BB - CD3ζ
항-VEGF - OX40 - CD3ζ
항-VEGF - OX40 - CD28 - CD3ζ
항-VEGF - 41BB - CD3ζ
항-VEGF - ICOS - CD3ζ
항-VEGF - ICOS - 41BB - CD3ζ
항-VEGF - 41BB - ICOS - CD3ζ
항-VEGF - 41BB - OX40 - CD3ζ,
항-VEGF - 41BB - CD28 - CD3ζ.
항-CD19 - CD3ζ
항-CD19 - CD28 - 41BB - CD3ζ,
항-CD19 - CD28 - CD3ζ
항-CD19 - CD28 - OX40 - CD3ζ
항-CD19 - CD28 - 41BB - CD3ζ
항-CD19 - OX40 - CD3ζ
항-CD19 - OX40 - CD28 - CD3ζ
항-CD19 - 41BB - CD3ζ
항-CD19 - ICOS - CD3ζ
항-CD19 - ICOS - 41BB - CD3ζ
항-CD19 - 41BB - ICOS - CD3ζ
항-CD19 - 41BB - OX40 - CD3ζ,
항-CD19 - 41BB - CD28 - CD3ζ.
항-EGFR - CD3ζ
항-EGFR - CD28 - 41BB - CD3ζ,
항-EGFR - CD28 - CD3ζ
항-EGFR - CD28 - OX40 - CD3ζ
항-EGFR - CD28 - 41BB - CD3ζ
항-EGFR - OX40 - CD3ζ
항-EGFR - OX40 - CD28 - CD3ζ
항-EGFR - 41BB - CD3ζ
항-EGFR - ICOS - CD3ζ
항-EGFR - ICOS - 41BB - CD3ζ
항-EGFR - 41BB - ICOS - CD3ζ
항-EGFR - 41BB - OX40 - CD3ζ, 및
항-EGFR - 41BB - CD28 - CD3ζ.
항-CD19 - CD3ζ
항-CD19 - CD28 - 41BB - CD3ζ,
항-CD19 - CD28 - CD3ζ
항-CD19 - CD28 - OX40 - CD3ζ
항-CD19 - CD28 - 41BB - CD3ζ
항-CD19 - OX40 - CD3ζ
항-CD19 - OX40 - CD28 - CD3ζ
항-CD19 - 41BB - CD3ζ
항-CD19 - ICOS - CD3ζ
항-CD19 - ICOS - 41BB - CD3ζ
항-CD19 - 41BB - ICOS - CD3ζ
항-CD19 - 41BB - OX40 - CD3ζ,
항-CD19 - 41BB - CD28 - CD3ζ.
항-PSMA - CD3ζ
항-PSMA - CD28 - 41BB - CD3ζ,
항-PSMA - CD28 - CD3ζ
항-PSMA - CD28 - OX40 - CD3ζ
항-PSMA - CD28 - 41BB - CD3ζ
항-PSMA - OX40 - CD3ζ
항-PSMA - OX40 - CD28 - CD3ζ
항-PSMA - 41BB - CD3ζ
항-PSMA - ICOS - CD3ζ
항-PSMA - ICOS - 41BB - CD3ζ
항-PSMA - 41BB - ICOS - CD3ζ
항-PSMA - 41BB - OX40 - CD3ζ,
항-PSMA - 41BB - CD28 - CD3ζ.
항-BCMA - CD3ζ
항-BCMA - CD28 - 41BB - CD3ζ,
항-BCMA - CD28 - CD3ζ
항-BCMA - CD28 - OX40 - CD3ζ
항-BCMA - CD28 - 41BB - CD3ζ
항-BCMA - OX40 - CD3ζ
항-BCMA - OX40 - CD28 - CD3ζ
항-BCMA - 41BB - CD3ζ
항-BCMA - ICOS - CD3ζ
항-BCMA - ICOS - 41BB - CD3ζ
항-BCMA - 41BB - ICOS - CD3ζ
항-BCMA - 41BB - OX40 - CD3ζ,
항-BCMA - 41BB - CD28 - CD3ζ.
항-메소텔린 - CD3ζ
항-메소텔린 - CD28 - 41BB - CD3ζ,
항-메소텔린 - CD28 - CD3ζ
항-메소텔린 - CD28 - OX40 - CD3ζ
항-메소텔린 - CD28 - 41BB - CD3ζ
항-메소텔린 - OX40 - CD3ζ
항-메소텔린 - OX40 - CD28 - CD3ζ
항-메소텔린 - 41BB - CD3ζ
항-메소텔린 - ICOS - CD3ζ
항-메소텔린 - ICOS - 41BB - CD3ζ
항-메소텔린 - 41BB - ICOS - CD3ζ
항-메소텔린 - 41BB - OX40 - CD3ζ,
항-메소텔린 - 41BB - CD28 - CD3ζ.
[항-CD19 & 항-CD20] - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD20] - CD28 - 41BB - CD3ζ,
[항-CD19 & 항-CD20] - CD28 - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD20] - CD28 - OX40 - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD20] - CD28 - 41BB - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD20] - OX40 - CD3ζ
[[항-CD19 & 항-CD20] - OX40 - CD28 - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD20] - 41BB - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD20] - ICOS - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD20] - ICOS - 41BB - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD20] - 41BB - ICOS - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD20] - 41BB - OX40 - CD3ζ,
[항-CD19 & 항-CD20] - 41BB - CD28 - CD3ζ.
항-EGFR - CD3ζ
항-EGFR - CD28 - 41BB - CD3ζ,
항-EGFR - CD28 - CD3ζ
항-EGFR - CD28 - OX40 - CD3ζ
항-EGFR - CD28 - 41BB - CD3ζ
항-EGFR - OX40 - CD3ζ
항-EGFR - OX40 - CD28 - CD3ζ
항-EGFR - 41BB - CD3ζ
항-EGFR - ICOS - CD3ζ
항-EGFR - ICOS - 41BB - CD3ζ
항-EGFR - 41BB - ICOS - CD3ζ
항-EGFR - 41BB - OX40 - CD3ζ, 및
항-EGFR - 41BB - CD28 - CD3ζ.
[항-CD19 & 항-CD22] - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD22] - CD28 - 41BB - CD3ζ,
[항-CD19 & 항-CD22] - CD28 - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD22] - CD28 - OX40 - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD22] - CD28 - 41BB - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD22] - OX40 - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD22] - OX40 - CD28 - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD22] - 41BB - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD22] - ICOS - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD22] - ICOS - 41BB - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD22] - 41BB - ICOS - CD3ζ
[항-CD19 & 항-CD22] - 41BB - OX40 - CD3ζ, 및
[항-CD19 & 항-CD22] - 41BB - CD28 - CD3ζ.
더욱이, 보다 통상적인 1세대 및 2세대 CAR 외에도, 용어 CAR은 분할 CAR, 온-스위치 CAR, 이중특이적 또는 직렬 CAR, 억제 CAR (iCAR) 및 유도 다능성 줄기 (iPS) CAR-T 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 CAR 변이체를 포함한다.
용어 "분할 CAR"은 CAR의 세포외 부분, ABD 및 세포질 신호전달 도메인이 2개의 별도의 분자에 존재하는 CAR을 지칭한다. CAR 변이체는 또한 예를 들어, 분할 CAR의 2개 부분의 조건부 이종이량체화가 약리학적으로 제어되는 분할 CAR을 포함하는 조건부 활성화가능한 CAR인 온-스위치 CAR을 포함한다. CAR 분자 및 그의 유도체 (즉, CAR 변이체)는 예를 들어, PCT 출원 번호 US2014/016527, US1996/017060, US2013/063083; 문헌 [Fedorov et al. Sci Transl Med (2013) ;5(215):215ra172; Glienke et al. Front Pharmacol (2015) 6:21; Kakarla & Gottschalk 52 Cancer J (2014) 20(2):151-5; Riddell et al. Cancer J (2014) 20(2):141-4; Pegram et al. Cancer J (2014) 20(2):127-33; Cheadle et al. Immunol Rev (2014) 257(1):91-106; Barrett et al. Annu Rev Med (2014) 65:333-47; Sadelain et al. Cancer Discov (2013) 3(4):388-98; Cartellieri et al., J Biomed Biotechnol (2010) 956304] (이들 문헌의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 기재되어 있다.
용어 "이중특이적 또는 직렬 CAR"은 1차 CAR의 활성을 증폭하거나 억제할 수 있는 2차 CAR 결합 도메인을 포함하는 CAR을 지칭한다.
용어 "억제 키메라 항원 수용체" 또는 "iCAR"은 결합 iCAR이 이중 항원 표적화를 사용하여 2차 CAR 결합 도메인의 억제 신호전달 도메인이 장착된 제2 억제 수용체의 맞물림을 통해 활성 CAR의 활성화를 차단하여 1차 CAR 활성화의 억제를 초래하는 CAR를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 종양과 오프 타겟 조직 둘 다에 대해 특이성을 갖는 T 세포는 오프 타겟 조직을 보호하기 위해 T 세포 내로 도입된 항원 특이적 iCAR을 사용함으로써만 종양으로 제한될 수 있다 (Fedorov, et al., (2013). Science Translational Medicine, 5:215). 억제 CAR (iCAR)은 억제 수용체 신호전달 모듈 활성화를 통해 CAR-T 세포 활성을 조절하도록 설계된다. 이러한 접근 방식은 2개의 CAR의 활성을 조합하며, 그 중 하나는 활성화 수용체에 의해 활성화된 CAR-T 세포의 반응을 제한하는 우성 음성 신호를 생성한다. iCAR은 정상 조직에 의해서만 발현되는 특이적 항원과 결합될 때 반작용 활성인자 CAR의 반응을 끌 수 있다. 이러한 방식으로, iCAR-T 세포는 암세포를 건강한 세포와 구별할 수 있으며, 항원 선택적 방식으로 형질도입된 T 세포의 기능성을 가역적으로 차단할 수 있다. iCAR 내의 CTLA-4 또는 PD-1 세포내 도메인은 T 림프구에 대한 억제 신호를 촉발하여, 시토카인 생산 감소, 표적 세포 용해 효율 저하, 및 림프구 운동성 변경을 초래한다. 일부 실시양태에서, iCAR은 억제 항원과 특이적으로 결합하는 단일 쇄 항체 (예를 들어 scFv, VHH 등), 항원 인식 시 T 세포 기능을 특이적으로 억제하는 막횡단 영역을 통해 ICD 면역억제 수용체 (CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4 (CD244), BTLA (CD272), KIR, TIM-3, TGF베타 수용체 우성 음성 유사체 등을 포함하나 이에 제한되지는 않음)로부터 유래된 하나 이상의 세포내를 포함한다.
용어 "직렬 CAR" 또는 "TanCAR"은 2개의 상이한 종양 연관 항원의 독립적인 맞물림에 반응하여 자극 또는 공동자극 신호를 전달하도록 설계된 2개의 키메라 수용체의 맞물림을 통해 T 세포의 이중특이적 활성화를 매개하는 CAR을 지칭한다.
전형적으로, 키메라 항원 수용체 T-세포 (CAR-T 세포)는 실질적으로 상기 교시에 따라 CAR을 코딩하는 발현 벡터로 형질도입함으로써 재조합적으로 변형된 T-세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 치료되는 개체에 대해 동종이계이다 (Graham et al. (2018) Cell 7(10) E155). 일부 실시양태에서, 동종이계 조작된 T 세포는 완전히 HLA 매칭된다. 그러나 모든 환자에게 완전히 매칭되는 공여자가 있는 것은 아니며 HLA 유형에 관계없이 모든 환자에게 적합한 세포성 산물이 대안을 제공한다.
세포 산물은 대상체 자신의 T-세포로 이루어질 수 있기 때문에, 대상체에게 투여되는 세포의 집단은 필연적으로 가변적이다. 결과적으로 최적 농도를 확인하는 것은, 추가적으로 CAR-T 세포 작용제는 가변적이기 때문에 이러한 작용제에 대한 반응은 다양할 수 있으므로 CAR-T 세포 치료를 투여하기 전에 약리학적 면역억제 또는 B 세포 고갈 과정으로 관리되는 요법 관련 독성에 대한 지속적인 모니터링 및 관리를 수반한다. 통상적으로, 적어도 1x106개 세포/kg이 투여될 것이며, 적어도 1x107개 세포/kg, 적어도 1x108개 세포/kg, 적어도 1x109개 세포/kg, 적어도 1x1010개 세포/kg, 또는 그 초과이며, 통상적으로 수집 중에 수득된 T 세포의 수에 의해 제한된다. 조작된 세포는 임의의 생리학상 허용되는 배지에서 임의의 편리한 투여 경로, 정상적으로 혈관내로 대상체에게 주입될 수 있지만, 세포가 성장을 위한 적절한 부위를 찾을 수 있는 다른 경로에 의해 도입될 수도 있다.
본 발명의 실시에 사용된 T 세포가 동종이계 T 세포인 경우, 이러한 세포는 이식편 대 숙주 질환을 감소시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조작된 세포는 유전자 편집 기술에 의해 달성된 TCRαβ 수용체 녹-아웃일 수 있다. TCRαβ는 이종이량체이며, 발현되기 위해서는 알파 및 베타 쇄가 모두 존재해야 한다. 단일 유전자는 알파 쇄 (TRAC)을 코딩하는 반면, 베타 쇄를 코딩하는 유전자는 2개이므로, 따라서 이러한 목적을 위해 TRAC 로커스 KO가 결실되었다. 수많은 상이한 접근 방식, 예를 들어, CRISPR/Cas9; 메카뉴클레아제; 조작된 I-CreI 귀소 엔도뉴클레아제 등이 이러한 결실을 수행하기 위해 사용되었다. 예를 들어, TRAC 코딩 서열이 CAR 코딩 서열로 대체된 문헌 [Eyquem et al. (2017) Nature 543:113-117]; 및 CAR을 TRAC 로커스에 직접 혼입하지 않고서도 클러스터된 규칙적으로 공간을 둔 짧은 팔린드롬성 반복부 (CRISPR)/Cas9에 의한 TRAC 파괴와 CAR 발현을 연계한 문헌 [Georgiadis et al. (2018) Mol. Ther. 26:1215-1227]를 참조한다. GVHD를 예방하기 위한 대안적 전략은, 예를 들어 TCR 억제 분자로서 말단절단된 형태의 CD3ζ를 사용하여 T 세포가 TCRαβ 신호전달의 억제제를 발현하도록 변형시킨다.
CAR을 코딩하는 벡터:
본 발명의 실시에 유용한 CAR T-세포의 제조는 단리된 T-세포를 상기 기재된 CAR 폴리단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환함으로써 달성된다. 벡터는 RNA 또는 DNA를 포함하는 비-바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있다.
CD122 및/또는 CAR의 발현에 영향을 미치는 발현 벡터. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터일 수 있다. 용어 "비-바이러스 벡터"는 정상 게놈과 구별되고 표적 세포에서 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 비선택적 조건 하에 세포 생존에 필수적이지 않은 자가 복제하는 염색체외 원형 DNA 분자를 지칭한다. 플라스미드는 비-바이러스 벡터의 예이다. 표적 세포의 형질감염을 용이하게 하기 위해, 표적 세포는 비-바이러스 벡터의 흡수를 용이하게 하는 조건 하에 비-바이러스 벡터에 직접 노출될 수 있다. 포유류 세포에 의한 외래 핵산의 흡수를 용이하게 하는 조건의 예는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 화학적 수단 (예컨대 리포펙타민®, 써모-피셔 사이언티픽), 고염 및 자기장 (전기천공)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
발현 카세트:
재조합 발현 벡터는 직교 CD122 및/또는 CAR의 발현을 지시하기 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 용어 "발현 카세트"는 발현 벡터로 형질전환될 숙주 세포에서 폴리펩티드의 발현에 영향을 미칠 수 있는 적합한 유전적 제어 요소에 작동가능하게 연결된 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 (또는 합성) 핵산 구축물을 지칭한다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 기능적 관계에서 폴리뉴클레오티드 요소의 연결을 지칭한다. 핵산 서열은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터가 폴리펩티드의 전사를 제어하는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며; 리보솜 결합 부위는 번역을 허용하는 위치에 있는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고; 신호 펩티드를 코딩하는 핵산은 융합 단백질로서 발현되고 융합 단백질을 세포막으로 지시하거나 폴리펩티드의 분비에 참여하는 경우 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 전형적으로, 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열은 연속된다. 그러나, 인핸서는 일반적으로 수 킬로염기만큼 프로모터로부터 분리될 때 기능하고 인트론 서열은 가변 길이일 수 있기 때문에, 일부 폴리뉴클레오티드 요소는 작동가능하게 연결되지만 물리적으로 멀리 떨어져 있을 수 있으며 심지어 상이한 대립유전자 또는 염색체로부터 트랜스로 기능할 수도 있다.
제어 요소
발현에 영향을 미치는데 필요한 제어 요소의 특이적 유형은 형질전환될 세포 유형에 따라 다를 것이다. 본 발명의 실시에서, 형질전환될 세포는 포유류 T-세포이다. 용어 제어 요소는 프로모터 서열, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인, 복제 기점, 내부 리보솜 진입 부위 ("IRES"), 인핸서, mRNA 발현 수준을 상승시키는 전사 인핸서, 적합한 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 수용자 세포에서 폴리펩티드 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역에 영향을 미치는 전사 및 번역을 종료시키는 서열을 총칭한다. 발현 벡터는 또한 통상적으로 벡터가 숙주 세포와 독립적으로 복제할 수 있도록 하는 복제 기점을 함유한다.
발현 카세트의 한 실시양태에서, 발현될 핵산 서열 (예를 들어, 직교 CD122 및/또는 CAR를 코딩함)은 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 용어 "프로모터"는 코딩 서열의 전사 개시 및 속도가 제어되는 뉴클레오티드 서열을 지칭하기 위해 통상적인 의미로 사용된다. 프로모터는 RNA 폴리머라제가 결합하는 부위를 함유하고 또한 조절 인자 (예컨대 억제인자 또는 전사 인자)의 결합을 위한 부위를 함유한다. 프로모터는 자연적으로 발생하거나 합성될 수 있다. 프로모터는 구성적으로 활성일 수 있고, 외부 자극에 반응하여 활성화될 수 있고 (유도성), 특정한 세포 유형 또는 세포 상태에서 활성인 (조직 특이적 또는 종양 특이적) 프로모터, 및/또는 조절가능한 프로모터일 수 있다. 용어 "유도성 프로모터"는 바람직하게 특정 조건 하에서 및/또는 외부 화학적 또는 기타 자극에 대한 반응으로 생체활성 폴리펩티드의 전사를 촉진하는 프로모터를 지칭한다. 유도성 프로모터의 예는 과학 문헌에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Yoshida et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 230:426-430 (1997); Iida et al., J. Virol., 70(9): 6054-6059 (1996); Hwang et al., J. Virol., 71(9): 7128-7131 (1997); Lee et al., Mol. Cell. Biol., 17(9): 5097-5105 (1997); and Dreher et al., J. Biol. Chem., 272(46): 29364-29371 (1997)] 참조). 방사선 유도성 프로모터의 예는 EGR-1 프로모터를 포함한다 (Boothman et al., volume 138, supplement pages S68-S71 (1994)). 일부 실시양태에서 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 일부 실시양태에서 프로모터는 종양 특이적 프로모터이다. 조직 특이적 프로모터 및 종양 특이적 프로모터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 췌장 특이적 프로모터 (문헌 [Palmiter et al., Cell, 50:435 (1987)]), 간 특이적 프로모터 (문헌 [Rovet et al., J. Biol. Chem., 267:20765 (1992); Lemaigne et al., J. Biol. Chem., 268:19896 (1993); Nitsch et al., Mol. Cell. Biol., 13:4494 (1993)]), 위 특이적 프로모터 (문헌 [Kovarik et al., J. Biol. Chem., 268:9917 (1993)]), 뇌하수체 특이적 프로모터 (문헌 [Rhodes et al., Genes Dev., 7:913 (1993)]), 및 전립선 특이적 프로모터 (문헌 [1997년 12월 16일에 허여된 미국 특허 번호 5,698,443 (Henderson et al.)])이다. 한 실시양태에서 프로모터는 포스포글리세라제 키나제 (PGK) 프로모터이다. 한 실시양태에서 프로모터는 신장효소 인자 1 알파 (EF1a) 프로모터이다. 한 실시양태에서, 프로모터는 근증식성 육종 바이러스 (인핸서 음성 제어 영역 결실된 dl587rev 프라이머 결합 부위 치환됨) ("MND") 프로모터이다.
본 발명의 실시에서와 같이 다중 폴리펩티드 (예를 들어, CAR 및 직교 CD122 폴리펩티드)를 발현하는 경우, 각각의 폴리펩티드는 발현 제어 서열 (모노시스트론)에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 다중 폴리펩티드가 폴리시스트론 구축물에 의해 코딩될 수 있으며, 여기서 다중 폴리펩티드는 단일 발현 제어 서열의 제어 하에 발현된다. 폴리시스트론 발현을 용이하게 하기 위해 이용될 수 있는 요소의 예는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소 또는 구제역 바이러스 단백질 2A (FMVD2A) 시스템 또는 T2A 펩티드를 포함한다. 다양한 IRES 부위가 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Doudna JA, Sarnow P. Translation initiation by viral internal ribosome entry sites. In: Translational Control in Biology and Medicine; Mathews et al., Ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2007. pp. 129-154; http://www.IRESite.org] 참조). IRES 요소의 예는 폴리오바이러스의 피코르나바이러스 IRES, 리노바이러스, 뇌심근바이러스, 구제역 바이러스의 아프토바이러스 IRES, IRES 크리켓 마비 바이러스 (CrPV), A형 간염 바이러스의 A형 간염 IRES, C형 간염 바이러스의 C형 간염 IRES, 돼지열병 또는 소 설사 바이러스의 페스티바이러스 IRES, 크리파바이러스 IRES, 및 포유류 IRES 요소, 예컨대 섬유모세포 성장 인자-1 IRES, 섬유모세포 성장 인자-2 IRES, PDGF IRES, VEGF IRES, IGF-2 IRES를 포함한다. IRES 요소를 사용하면 전형적으로 폴리시스트론 메시지의 제2 단백질 발현이 현저히 낮아진다. FMDV2A 시스템을 사용하면 다중 단백질이 먼저, 다중 단백질을 기능적 서브유닛으로 절단하는 자가단백질분해 FMDV2A 도메인을 함유하는 융합 단백질로서 발현되기 때문에 하류 단백질을 보다 효율적으로 생산할 수 있다 (Ryan and Drew (1994) EMBO J. 13(4):928-933). 폴리시스트론 코딩 서열의 구축에 따라, 특히 제한 엔도뉴클레아제 부위를 용이하게 하기 위해, FMDV2A 시스템의 사용은 종종 상류 단백질의 카르복시 말단에 적은 수의 아미노산을 부가할 수 있다.
임의적 코딩된 단백질: 구제 유전자/약물 내성:
CAR 및/또는 직교 CD122를 코딩하는 발현 벡터는 임의로 "구제" 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 제공할 수 있다. "구제 유전자"는 핵산 서열이며, 형질도입된 세포에서의 그의 발현이 세포를 외부 인자에 의한 사멸에 대해 감수성으로 만들거나 세포가 사멸되도록 세포에서 독성 상태를 유발한다. 구제 유전자를 제공하는 것은 형질도입된 세포의 선택적 세포 사멸을 가능하게 한다. 따라서 구제 유전자는 형질도입된 세포의 바람직하지 않은 확산 또는 복제 적격 벡터 시스템의 효과를 방지하기 위해 상기 구축물이 포유류 대상체의 세포에 혼입될 때 부가의 안전 예방책을 제공한다. 한 실시양태에서, 구제 유전자는 티미딘 키나제 (TK) 유전자이며 (예를 들어, 1997년 5월 20일에 허여된 미국 특허 번호 5,631,236 (Woo, et al.) 및 1997년 2월 11일에 허여된 미국 특허 번호 5,601,818 (Freeman, et al.) 참조), 여기서 TK 유전자 산물을 발현하는 세포는 간시클로비르의 투여에 의한 선택적 사멸에 대해 감수성이다. 대안적으로, 유도성 프로모터는 이러한 유도성 프로모터로부터 발현을 유도하는 외인성 물질의 투여에 의해 표적화된 세포 사멸을 촉진하기 위해 프로아폽토시스 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
발현 벡터는 임의로 부가의 유전자, 예컨대 약물 내성을 코딩하는 것을 제공하며, 재조합 벡터의 존재에 대한 선택 또는 스크리닝을 허용할 수 있다. 이러한 부가의 유전자는, 예를 들어 네오마이신 내성, 다중 약물 내성, 티미딘 키나제, 베타-갈락토시다제, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 비-바이러스 전달 시스템에 제공될 수 있다. 비-바이러스 전달 시스템은 전형적으로 핵산 카고로 표적 세포의 형질도입을 용이하게 하는 복합체이며, 여기서 핵산은 작용제, 예컨대 양이온성 지질 (DOTAP, DOTMA), 계면활성제, 생물학적 제제 (젤라틴, 키토산), 금속 (금, 자성 철) 및 합성 중합체 (PLG, PEI, PAMAM)와 복합체 형성된다. 비-바이러스 전달 시스템의 수많은 실시양태는 지질 벡터 시스템 (문헌 [Lee et al. (1997) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 14:173-206]); 중합체 코팅된 리포솜 (1993년 5월 25일에 허여된 미국 특허 번호 5,213,804 (Marin et al.); 1991년 5월 7일에 허여된 미국 특허 번호 5,013,556 (Woodle, et al.)); 양이온성 리포솜 (1994년 2월 1일에 허여된 미국 특허 번호 5,283,185 (Epand et al.); 1996년 11월 26일에 허여된 미국 특허 번호 5,578,475 (Jessee, J. A.); 1994년 1월 18일에 허여된 미국 특허 번호 5,279,833 (Rose et al.); 1994년 8월 2일에 허여된 미국 특허 번호 5,334,761 (Gebeyehu et al.))을 포함하며 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 비-바이러스 벡터를 사용한 T-세포에서의 CAR 서열의 발현 효율은 항-표적화 항원 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 비-바이러스 벡터 (예를 들어, 플라스미드)를 인간 T-세포 내로 안정적으로 도입하기 위해 사용될 수 있는 트랜스포존/트랜스포사제 시스템, 예컨대 소위 수면 미용 (SB) 트랜스포존 시스템 (예를 들어, 문헌 [Geurts, et al. (2003) Mol Ther 8(1):108-117] 참조) 및 피기백(piggyBac) 시스템 (예를 들어, 문헌 [Manuri, et al. (2010) Human Gene Therapy 21(4):427-437] 참조)을 사용함으로써 상당히 증가될 수 있다.
CAR을 생성하기 위한 비-바이러스 유전자 전달을 위한 대안적 절차는 문헌 [2018년 12월 18일에 허여된 미국 특허 번호 10,155,038BS (Rabinovich, et al.)]의 교시 (그의 전체 교시가 본원에 참조로 포함된다)에 실질적으로 따라 CAR을 코딩하는 mRNA 벡터의 형질감염에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 벡터가 RNA 벡터인 경우, 임의로 RNA 벡터는 하나 이상의 부가의 생물학적 활성 분자를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 벡터가 RNA 벡터인 경우, 벡터는 하나 이상의 항원의 발현을 방지하기 위해 세포를 재프로그래밍하는 하나 이상의 RNA(들)를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 하기에 더 자세히 논의되는 바와 같이, RNA는 CTLA-4 또는 PD-1과 같은 항원을 코딩하는 mRNA의 발현을 방지하는 간섭 RNA일 수 있다. 이러한 방법은 만능 공여자 세포를 준비하는데 사용될 수 있다. 동종이계 항원의 발현을 변경하는데 사용되는 RNA는 단독으로 또는 표적 세포의 탈분화를 초래하는 RNA와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 활성 RNA는 짧은 간섭 RNA (siRNA)이다. siRNA는 이중 가닥 RNA로, 서열 특이적 전사 후 유전자 침묵을 유도함으로써 유전자 발현을 감소시키거나 심지어 억제할 수 있다. 하나의 예에서, siRNA는 siRNA와 표적 RNA 둘 사이의 서열 동일성 영역 내에서 상동 RNA 분자, 예컨대 mRNA의 특이적 분해를 촉발한다. 예를 들어, WO 02/44321은 3' 오버행 말단과 염기쌍을 이루는 경우 표적 mRNA의 서열 특이적 분해가 가능한 siRNA를 개시하고 있으며, 이러한 siRNA의 제조 방법에 대해 본원에 참조로 포함된다.
또 다른 실시양태에서, CAR 및/또는 직교 수용체에 대한 발현 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 바이러스 벡터는 단백질 합성 또는 에너지 생성 메커니즘이 없는 절대 세포내 기생충 중 임의의 것을 지칭하기 위해 통상적인 의미로 사용되며 일반적으로 외인성 트랜스진을 포유류 세포에 전달하는데 통상적으로 이용되고 있는 외피보유 또는 비-외피보유 동물 바이러스 중 임의의 것을 지칭한다. 바이러스 벡터는 복제 적격 (예를 들어, 실질적으로 야생형), 조건부 복제 (특정 조건에서 복제하도록 재조합적으로 조작됨) 또는 복제 결핍 (바이러스의 결실된 기능을 보완할 수 있는 세포주의 부재 하에 복제가 실질적으로 불가능함)일 수 있다. 바이러스 벡터는 "선택적으로 복제"하도록 하는 특정 변형을 가질 수 있으며, 즉 특정 세포 유형 또는 표현형 세포 상태, 예를 들어, 암성에서 우선적으로 복제한다. 본 발명의 실시에 유용한 바이러스 벡터 시스템은, 예를 들어, 자연적으로 발생하는 또는 재조합 바이러스 벡터 시스템을 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 바이러스의 예는 재조합적으로 변형된 외피보유 또는 비-외피보유 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 인간 또는 소 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스, 신드비스 바이러스, 및 레트로바이러스 (라우스 육종 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않음) 및 B형 간염 바이러스의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 전형적으로, 관심 유전자는 전형적으로 수반되는 바이러스 게놈 서열과 함께, 유전자 구축물의 패키징을 허용하기 위해 이러한 벡터에 삽입되며, 이어서 관심 유전자 (예를 들어, 표적화 항원)의 발현을 초래하는 감수성 숙주 세포가 감염된다. 추가적으로, 항-표적화 항원 CAR을 코딩하는 발현 벡터는 또한 mRNA 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터 시스템이 형질감염에 이용되는 경우, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 발현 벡터가 T-세포를 형질감염시키는데 선호되며, 이는 이러한 시스템을 사용하는 것이 T-세포에 대한 유전자 전달의 증진된 효능으로 인해 임상 적용을 위한 상당한 양의 T-세포 배양 시간을 단축시키기 때문이다. 특히, 감마 레트로바이러스는 임상 등급 T-세포의 유전적 변형에 특히 바람직하며 치료 효과가 있는 것으로 나타났다 (Pule, et al. (2008) Nature Medicine 14(11):1264-1270). 유사하게, 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터는 정지 T-세포에 통합되는 것으로 입증되었기 때문에 또한 유용하다 (June, et al. (2009) Nat Rev Immunol 9(10):704-716).
CAR 및/또는 직교 수용체를 코딩하는 발현 벡터는 CAR 및/또는 직교 수용체 외에 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 본 발명의 실시에서와 같이 다중 폴리펩티드를 발현하는 경우, 각각의 폴리펩티드는 발현 제어 서열 (모노시스트론)에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 다중 폴리펩티드는 폴리시스트론 구축물에 의해 코딩될 수 있으며, 여기서 다중 폴리펩티드는 단일 발현 제어 서열의 제어 하에 발현된다. 한 실시양태에서, 발현 벡터는 CAR 및 직교 CD122를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 발현 카세트를 포함한다.
한 실시양태에서, CAR 및/또는 직교 수용체를 코딩하는 발현 벡터는 임의로 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드 보충제를 추가로 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 항원을 코딩하는 발현 벡터는 임의로 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드 보충제를 추가로 코딩할 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 면역학적 조정제의 예는 시토카인을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 시토카인의 예는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-12, TNF-알파, 인터페론 알파, 인터페론 알파-2b, 인터페론-베타, 인터페론-감마, GM-CSF, MIP1-알파, MIP1-베타, MIP3-알파, TGF-베타 및 면역 반응을 조정할 수 있는 기타 적합한 시토카인 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인터류킨이다. 발현된 시토카인은 세포내 발현을 위해 지시되거나 또는 세포외 제시 또는 분비를 위한 신호 서열로 발현될 수 있다. CAR과 IL-12를 공동-투여하는 것은 항종양 효능을 증진시키는 것으로 보고되었다 (문헌 [Yeku, et al. Scientific Reports Vol. 7, Article number: 10541(2017) Published online: 05 September 2017] 참조).
다중 발현 카세트의 사용에 대한 대안으로, CAR 및 직교 CD122 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 폴리시스트론 구축물에 의해 코딩될 수 있으며, 발현 카세트는 핵산 서열 CAR 및 직교 CD122 폴리펩티드를 포함하며 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소 또는 구제역 바이러스 단백질 2A (FMVD2A)를 이용하여 표적 세포에서의 공동-발현을 촉진한다. 한 실시양태에서, 발현 벡터는 2개의 발현 카세트를 포함하며, 제1 발현 카세트는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고 제2 발현 카세트는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 직교 CD122를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 각각의 경우에 발현 제어 서열은 CAR 및 직교 CD122의 숙주 발현에 사용될 세포 유형 (예를 들어, T 세포)에서 기능적이다. 한 실시양태에서, 발현 벡터는 CAR 및 직교 CD122를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 발현 카세트를 포함한다.
발현 벡터는 임의로 "구제" 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 부가의 발현 카세트를 제공할 수 있다. "구제 유전자"는 핵산 서열로, 그의 발현은 세포가 외부 인자에 의한 사멸에 대해 감수성이 되도록 하거나 세포가 사멸되도록 세포에서 독성 상태를 유발한다. 구제 유전자를 제공하는 것은 형질도입된 세포의 선택적 세포 사멸이 가능하게 한다. 따라서, 구제 유전자는 형질도입된 세포의 바람직하지 않은 확산 또는 복제 적격 벡터 시스템의 효과를 방지하기 위해 상기 구축물이 포유류 대상체의 세포 내로 혼입될 때 부가의 안전 예방책을 제공한다. 한 실시양태에서, 구제 유전자는 티미딘 키나제 (TK) 유전자이며 (예를 들어, 1997년 5월 20일에 허여된 미국 특허 번호 5,631,236 (Woo, et al.) 및 1997년 2월 11일에 허여된 미국 특허 번호 5,601,818 (Freeman, et al.) 참조), 여기서 TK 유전자 산물을 발현하는 세포는 간시클로비르의 투여에 의한 선택적 사멸에 대해 감수성이다.
항- 표적화 항원 CAR을 코딩하는 발현 벡터를 이용한 T-세포 형질전환
항-표적화 항원 CAR을 코딩하는 발현 벡터를 이용하여 T-세포를 형질전환시키기 위한 전제 조건은 T-세포의 공급원이다. T-세포는 치료될 포유류 대상체로부터 수득될 수 있거나 또는 관련 기술분야에서 이용가능한 다양한 T 세포주 중 임의의 것일 수 있다. 형질전환을 위한 T-세포는 전형적으로 치료될 포유류 대상체로부터 수득된다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 비장 조직 및 종양을 포함한 포유류 대상체의 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 한 실시양태에서, T-세포는 성분채집술에 의해 수득된다. 또 다른 실시양태에서, T 세포는 말초 혈액으로부터 단리되며 특정한 T 세포 (예컨대 CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+T 세포)는 관련 기술분야에 널리 공지된 선택 기술, 예컨대 항-CD3/항-CD28 접합된 비드와의 인큐베이션에 의해 단리될 수 있다.
선택된 T-세포의 집단은 실질적으로 상기 언급된 교시에 따라 항-표적화 항원 CAR을 코딩하는 발현 벡터로 형질전환된다. 형질전환 후, T 세포는 일반적으로 예를 들어, 미국 특허 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7, 144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0121005에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화 및 확장될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 T 세포는 CD3 TCR 복합체 연관된 신호를 자극하는 작용제 (예를 들어, 항-CD3 항체) 및 T 세포의 표면 상의 공동-자극 분자를 자극하는 작용제 (예를 들어, 항-CD28 항체)를 제공하는 표면과 접촉하여 세포를 배양함으로써 확장된다. T 세포 배양에 적절한 조건은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 [Lin, et al. (2009) Cytotherapy 11(7):912-922 (Optimization and validation of a robust human T-cell culture method for monitoring phenotypic and polyfunctional antigen-specific CD4 and CD8 T-cell responses); Smith, et al. (2015) Clinical & Translational Immunology 4:e31 published online 16 January 2015 ("Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno -free CTS Immune Cell Serum Replacement")]. 표적 세포는 성장을 지원하는데 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도 (예를 들어, 37℃) 및 대기 (예를 들어, 공기 + 5% CO2) 하에 유지된다.
직교 수용체를 발현하기 위한 면역 세포의 유전적 변형
벡터로부터의 직교 수용체의 발현에 대한 대안으로, 세포의 게놈은 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 직교 수용체를 발현하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 식 1의 직교 hCD122의 ECD에 대한 변형을 인간 면역 세포의 게놈 서열 내로 혼입하는 것을 용이하게 하기 위해 적어도 하나의 엔도뉴클레아제를 사용함으로써 인간 면역 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "엔도뉴클레아제"는 DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게 DNA 분자 내의 핵산 간의 결합 절단을 촉매할 수 있는 야생형 또는 변이체 효소를 지칭하기 위해 사용된다. 본 개시내용의 엔도뉴클레아제는 핵산 분자를 특이적 "표적" 서열로 인식하고 절단한다는 점에서 서열 특이적이다. 엔도뉴클레아제는 종종 표적 서열에 특징적인 특이성 및 서열 동일성의 정도와 관련하여 분류된다. 엔도뉴클레아제는 이러한 엔도뉴클레아제가 약 12개 염기쌍 (bp) 초과 길이, 보다 바람직하게 14-55 bp인 폴리뉴클레오티드 인식 부위를 가질 때 "희귀-커팅" 엔도뉴클레아제로서 지칭된다. 희귀-커팅 엔도뉴클레아제는 로커스에서 유전자를 불활성화시키거나 또는 상동 재조합 (HR), 즉 로커스에서 DNA 이중 가닥 절단 (DSB)을 유도하고 유전자 복구 메커니즘에 의해 이러한 로커스에서 외인성 DNA를 삽입함으로써 트랜스진을 통합하는데 사용될 수 있다. 희귀-커팅 엔도뉴클레아제의 예는 귀소 엔도뉴클레아제 (문헌 [Grizot, et al. (2009) Nucleic Acids Research 37(16):5405-5419]), 조작된 징크-핑거 도메인의 융합으로 인한 키메라 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN) (문헌 [Porteus M and Carroll D., Gene targeting using zinc finger nucleases (2005) Nature Biotechnology 23(3):967-973]), TALE-뉴클레아제, CRISPR 시스템으로부터의 Cas9 엔도뉴클레아제 또는 확장된 서열 특이성에 대한 변형된 제한 엔도뉴클레아제 (문헌 [Eisenschmidt, et al. 2005; 33(22): 7039-7047])를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 면역 세포 (예를 들어, 식 1의 직교 수용체 ECD를 발현하는 CAR-T)는 T-세포 수용체 (TCR)의 하나 이상의 성분의 불활성화를 통해 동종반응성을 감소시키도록 변형된다. T 세포의 이러한 변형을 위한 방법은 문헌 [2013년 11월 28일에 공개된 미국 특허 출원 공개 번호 US 2013/015884A1 (Galetto, et al.)]에 기재되어 있으며 또한 기능적 CD3 복합체의 복원을 초래하는 pT알파를 발현함으로써 TCR알파 결핍 T-세포에 대한 방법은 문헌 [2019년 10월 21일에 허여된 미국 특허 번호 10,426,795B2 (Galetto, et al.)]에 기재되어 있고, 그의 교시는 본원에 참조로 포함된다.
오르토 리간드와 오르토 CAR-T 세포의 사용
한 실시양태에서, 본 개시내용은 혼합 세포 집단으로부터 직교 CD122 수용체를 발현하는 조작된 세포의 집단을 선택적으로 확장하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 조작된 세포의 증식을 촉진하는 조건 하에 혼합 세포 집단을 본 개시내용의 IL2 오르토로그와 접촉시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 직교 CD122 수용체가 CAR-T 세포를 발현할 때, CAR-T 세포를 발현하는 직교 수용체는 또한 본원에 기재된 IL2 오르토로그의 사용을 통해 형질도입 및 비-형질도입 세포의 배경 또는 혼합 집단으로부터 선택적으로 확장될 수 있다. 치료적 적용을 위한 T 세포의 확장은 전형적으로 CD3 TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 작용제 및 T-세포의 표면 상의 공동-자극 분자를 자극하는 작용제를 제공하는 표면과 접촉하여 세포를 배양하는 것을 수반한다. 통상적인 실시에서, 특히 임상 적용에 사용하기 위한 CAR-T 세포의 제조에서, CD3/D28과의 접촉에 의해 세포 요법 산물의 투여 전에 조작된 T-세포가 자극된다. 인비트로젠(Invitrogen)® CTS 다이나비즈(Dynabeads)® CD3/28 [라이프 테크놀로지스, 인크.(Life Technologies, Inc.; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)] 또는 밀테니(Miltenyi) MACS® GMP ExpAct Treg 비즈 또는 밀테니 MACS GMP 트랜스액트(TransAct)™ CD3/28 비즈 [밀테니 바이오텍, 인크.(Miltenyi Biotec, Inc.)]를 포함하나 이에 제한되지는 않는 T-세포의 비드 기반 활성화를 촉진하기 위한 다양한 상업적으로 입수가능한 산물이 있다. T-세포 배양에 적절한 조건은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (Lin, et al. (2009) Cytotherapy 11(7):912-922; Smith, et al. (2015) Clinical & Translational Immunology 4:e31 published online 16 January 2015). 표적 세포는 성장을 지원하는데 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도 (예를 들어, 37℃) 및 대기 (예를 들어, 공기 + 5% CO2)에서 유지된다. 여기서 CD122 직교 수용체를 발현하는 조작된 T 세포를 함유하는 혼합 세포 집단은 소정의 농도의 IL2 오르토로그의 존재 하에서 배양된다. 일부 실시양태에서 적어도 2시간, 대안적으로 적어도 3시간, 대안적으로 적어도 4시간, 대안적으로 적어도 6시간, 대안적으로 적어도 8시간, 대안적으로 적어도 12시간, 대안적으로 적어도 24시간, 대안적으로 적어도 48시간, 대안적으로 적어도 72시간, 또는 그 초과 동안 실시된다. 이러한 생체외 상황에서 IL2 오르토로그의 농도는 세포 집단에서 세포성 증식을 유도하기에 충분하다. T 세포 증식은 현미경적 방법에 의해 쉽게 평가될 수 있으며, IL2 오르토로그의 최적 농도의 결정은 직교 CD122 수용체에 대한 IL2 오르토로그의 상대적 활성에 좌우될 것이다.
세포가 시험관내에서 IL2 오르토로그와 접촉되는 경우, 시토카인은 수용체로부터의 신호전달을 활성화시키기에 충분한 기간 및 용량으로 조작된 세포에 부가되며, 이는 천연 세포성 기구, 예를 들어 보조 단백질, 공동-수용체 등을 활용할 수 있다. 임의의 적합한 배양 배지가 사용될 수 있다. 이렇게 활성화된 세포는 항원 특이성의 결정, 시토카인 프로파일링 등과 관련된 실험 목적을 포함한 임의의 원하는 목적을 위해 및 생체내 전달을 위해 사용될 수 있다.
생체내에서 접촉이 수행되는 경우, 직교 CD122 수용체를 발현하도록 변형된 CAR-T 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 조작된 세포의 유효 용량이 직교 시토카인, 예를 들어, IL2의 투여와 조합하여 또는 투여 전에 수용자에게 주입되고, 그의 천연 환경, 예를 들어 림프절 등에서 T 세포와 접촉하는 것이 가능하게 된다. 투여량 및 빈도는 작용제; 투여 방식; IL2 오르토로그의 성질 등에 따라 달라질 수 있다. 이러한 지침은 개별 상황에 맞게 조정될 것임을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 수 있을 것이다. 투여량은 또한 투여 경로, 예를 들어, 근육내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내 주입 등에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 적어도 약 104개의 조작된 세포/kg, 적어도 약 105개의 조작된 세포/kg; 적어도 약 106개의 조작된 세포/kg, 적어도 약 107개의 조작된 세포/kg, 또는 그 초과가 투여된다.
조작된 세포가 T 세포인 경우, 증진된 면역 반응은 수용자에게 존재하는 표적 세포에 대한 T 세포의 세포용해 반응의 증가, 예를 들어, 종양 세포, 감염된 세포의 제거; 자가면역 질환의 증상 감소 등으로서 나타날 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 T 세포 집단이 대상체에게 투여되는 경우, 대상체는 조작된 T 세포 집단의 투여 전 또는 투여와 조합하여 면역억제 요법 과정을 제공받는다. 이러한 면역억제 레지멘의 예는 전신 코르티코스테로이드 (예를 들어, 메틸프레드니솔론)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. B 세포 고갈에 대한 요법은 혈청 이뮤노글로불린 수준의 정상 수준을 회복하기 위해 확립된 임상 투여 지침에 의한 정맥내 이뮤노글로불린 (IVIG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 CAR-T 세포 요법의 투여 전에, 대상체는 임의로 림프고갈 레지멘을 받을 수 있다. 이러한 림프고갈 레지멘의 한 예는 플루다라빈 (4일 동안 매일 30 mg/m2 정맥내) 및 시클로포스파미드 (플루다라빈의 제1 용량으로 시작하여 2일 동안 매일 500 mg/m2 IV)를 대상체에게 투여하는 것으로 이루어진다.
조작된 T 세포는 치료용, 예를 들어 인간 치료에 적합한 제약 조성물에 제공될 수 있다. 이러한 세포를 포함하는 치료 제형은 동결되거나, 또는 수용액의 형태로 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 함께 투여되도록 제조될 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 세포는 우수한 의료 관행과 일치하는 방식으로 제형화, 복용 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려해야 할 요소는 치료 중인 특정한 장애, 치료 중인 특정한 포유류, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의료 종사자에게 공지된 기타 요인을 포함한다.
세포는 임의의 적합한 수단, 통상적으로 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내 (볼루스 또는 느린 주입), 동맥내, 복강내, 척수강내 또는 피하 투여를 포함한다. 전형적인 관행에서, 조작된 T 세포는 생리학상 허용되는 배지 중에 대상체에게 정상적으로는 혈관내 주입되지만, 세포가 성장을 위한 적절한 부위를 찾을 수 있는 임의의 다른 편리한 부위에도 도입될 수 있다. 통상적으로, 적어도 1x105개의 세포/kg, 적어도 1x106개의 세포/kg, 적어도 1x107개의 세포/kg, 적어도 1x108개의 세포/kg, 적어도 1x109개의 세포/kg, 또는 그 초과가 투여될 것이며, 통상적으로 수집 동안 수득된 T 세포의 수에 의해 제한된다.
예를 들어, 본 발명의 실시에 사용하기 위한 hoRb 세포의 투여에 대한 전형적인 범위는 요법 과정당 대상체 체중 kg당 약 1x105개 내지 5x108개의 생육성 세포 범위이다. 결과적으로, 체중에 대해 조정된, 인간 대상체에서 생육성 세포의 투여에 대한 전형적인 범위는 요법의 과정당 대략 1x106개 내지 대략 1x1013개의 생육성 세포, 대안적으로 대략 5x106개 내지 대략 5x1012개의 생육성 세포, 대안적으로 대략 1x107개 내지 대략 1x1012개의 생육성 세포, 대안적으로 대략 5x107개 내지 대략 1x1012개의 생육성 세포, 대안적으로 대략 1x108개 내지 대략 1x1012개의 생육성 세포, 대안적으로 대략 5x108개 내지 대략 1x1012개의 생육성 세포, 대안적으로 대략 1x109개 내지 대략 1x1012개의 생육성 세포 범위이다. 한 실시양태에서, 세포의 용량은 요법의 과정당 2.5-5x109개의 생육성 세포의 범위 내에 있다.
요법의 과정은 단일 용량 또는 소정의 기간에 걸친 다중 용량을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 단일 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28, 30, 60, 90, 120 또는 180일의 기간에 걸쳐 투여되는 2회 이상의 분할 용량으로 투여된다. 이러한 분할 투여 프로토콜에서 투여되는 조작된 세포의 수량은 각각의 투여에서 동일할 수 있거나 상이한 수준으로 제공될 수 있다. 기간에 따른 수-일 투여 프로토콜은 치료의 부작용 및 상기 논의된 바와 같은 조정을 포함한 치료에 대한 대상체의 반응을 고려하여 세포의 투여를 모니터링하는 숙련된 기술자 (예를 들어, 의사)에 의해 제공될 수 있다.
림프고갈의 부재
본 개시내용의 조성물 및 방법은 또한 사전 림프고갈의 부재 하에 T 세포 요법 (특히 CAR T 세포 요법)으로 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 혼합 세포 집단의 후속 투여 및 대상체에서 조작된 세포의 집단을 확장하기 위한 비-특이적 작용제 (예를 들어, IL2)의 투여를 세포 요법 산물의 투여와 조합하는 것은 광범위한 활성화를 초래하는 작용제의 투여에 의한 면역 세포의 광범위한 증식 및 활성화로부터 발생하는 상당한 전신 독성 (시토카인 방출 증후군 또는 "시토카인 폭풍"을 포함함)을 초래할 뿐 아니라 세포 요법 산물 자체에 상당한 분율의 비-조작된 세포가 존재하기 때문에, 림프고갈은 전형적으로 CAR T 세포 요법과 연계해서 대상체에서 수행된다. 본 개시내용의 방법 및 조성물은 전술한 생체외 방법이 이용될 때 비-조작된 세포에 의한 오염이 거의 없는 조작된 세포의 실질적으로 정제된 집단 및/또는 IL2와 같은 비-특이적 증식제의 실질적으로 감소된 오프-타겟 효과를 제공하는 IL2 오르토로그를 사용한 조작된 T 세포의 선택적 활성화 및 확장 둘 다 (또는 둘 중 하나)를 제공함으로써 이러한 중대한 장애물을 제거한다.
예를 들어, CAR-T 세포 요법의 현재 임상 사례에서, CAR-T 세포는 통상적으로 림프고갈과 조합하여 투여 (예를 들어, 알렘투주맙 (모노클로날 항-CD52), 퓨린 유사체 등의 투여에 의함)되어, 숙주 면역 회복 전에 CAR-T 세포의 확장을 촉진한다. 일부 실시양태에서, CAR-T 세포는 알렘투주맙에 대한 내성을 위해 변형될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, CAR-T 요법과 연합되어 현재 이용되는 림프고갈은 본 발명의 CAR-T를 발현하는 직교 리간드에 의해 제거되거나 감소될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 림프고갈은 통상적으로 CAR-T 세포의 확장을 가능하게 하기 위해 이용된다. 그러나, 림프고갈은 또한 CAR-T 세포 요법의 주요 부작용과 연관이 있다. 직교 리간드가 특정한 T-세포 집단을 선택적으로 확장하는 수단을 제공하기 때문에, CAR-T를 발현하는 직교 리간드의 투여 전에 림프고갈에 대한 필요성이 감소될 수 있다. 본 발명은 CAR-T를 발현하는 직교 리간드의 투여 전에 림프고갈 없이 또는 감소된 림프고갈로 CAR-T 세포 요법의 실행을 가능하게 한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 리간드 CAR-T의 투여 전에 림프고갈의 부재 하에 CAR-T를 발현하는 직교 리간드의 투여에 의해 CAR-T 세포 요법으로 치료할 수 있는 질환, 장애 또는 병태 (예를 들어, 암)를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 표면 항원 (예를 들어 종양 항원(들))의 발현을 특징으로 하는 세포의 비정상적인 집단 (예를 들어 종양)의 존재와 연관된 질환, 장애를 앓고 있는 포유류 대상체의 치료 방법을 제공하며, 이러한 방법은 (a) 개체로부터 T-세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) T-세포의 존재에 대해 생물학적 샘플을 강화시키는 단계; (c) CAR을 코딩하는 핵산 서열 및 직교 CD122 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 T-세포를 형질감염시키는 단계이며, CAR의 항원 표적화 도메인은 세포의 비정상적인 집단 상에 존재하는 적어도 하나의 항원과 결합할 수 있는 것; (d) IL2 오르토로그를 사용하여 생체외에서 CAR-T 세포를 발현하는 직교 수용체의 집단을 확장시키는 단계; (e) CAR-T 세포를 발현하는 직교 수용체의 제약상 유효량을 포유류에게 투여하는 단계; 및 (f) CAR-T 세포 상에서 발현되는 직교 CD122 수용체와 선택적으로 결합하는 IL2 오르토로그의 치료상 유효량의 투여에 의해 CAR-T 세포를 발현하는 직교 CD122 수용체의 성장을 조정하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 전술한 방법은 CAR-T 세포 요법의 과정의 개시 전에 포유류의 림프고갈 또는 면역억제와 연관된다. 또 다른 실시양태에서, 전술한 방법은 포유류의 림프고갈 및/또는 면역억제의 부재 하에 실시된다.
오르토 리간드를 사용하여 시간이 지남에 따라 직교 면역 세포의 한계치 수준 유지:
한 실시양태에서 직교 리간드와 조합하여 직교 면역 세포를 사용하는 현재 개시된 방법의 실시에서, 직교 리간드는 인간 대상체의 순환에서 직교 세포의 치료상 유효한 순환 수준을 유지하는 양으로 대상체에게 투여되며, 여기서 직교 세포의 치료상 유효한 순환 수준은 대상체 체중 kg당 약 10,000 내지 약 1,000,000개의 직교 세포, 대안적으로 약 20,000 내지 약 500,000개의 직교 세포, 대안적으로 약 30,000 내지 약 300,000개의 직교 세포, 대안적으로 약 30,000 내지 약 200,000개의 직교 세포, 대안적으로 약 20,000 내지 약 150,000개의 직교 세포, 대안적으로 약 50,000 내지 약 150,000개의 직교 세포이고, 직교 리간드, 예를 들어 식 1의 직교 리간드의 주기적 투여에 의해 적어도 1주, 대안적으로 적어도 2주, 대안적으로 적어도 3주, 대안적으로 적어도 1개월, 대안적으로 적어도 2개월, 대안적으로 적어도 3개월, 대안적으로 적어도 6개월, 대안적으로 적어도 9개월, 대안적으로 적어도 12개월의 기간 동안 유지된다. 조작된 세포의 정량화는 통상적인 항체 기반 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 과도한 수준의 CRP 및 페리틴은 임상적으로 CRS의 발병을 평가하는데 사용되며 전형적으로 주치의가 직교 세포의 최적의 허용가능하고 효과적인 수준을 결정하고 인간 대상체의 반응이 가변적일 수 있는 수준을 유지하는데 필요한 직교 리간드의 수준을 모니터링할 것이다. 개별 환자에 대한 직교 세포의 최적 순환 농도의 확인은 세포 요법의 일반 의사의 기술 범위 내에 있다.
이전에 언급된 바와 같이, 본 개시내용은 유지 레지멘의 투여에 의해 재발 또는 회귀를 방지하기 위해 초기 직교 세포 요법 치료에 대해 유의미한 임상 반응의 증거를 나타내는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 직교 리간드의 더 낮은 용량이 대상체 체중 kg당 약 10,000 내지 약 500,000개의 직교 세포, 대안적으로 약 10,000 내지 약 200,000개의 직교 세포, 대안적으로 약 10,000 에서 약 100,000개의 직교 세포의 더 낮은 순환 수준을 유지하도록 대상체에게 주기적으로 투여되며, 직교 리간드, 예를 들어, 식 1의 직교 리간드의 주기적 투여에 의해 적어도 1주, 대안적으로 적어도 2주, 대안적으로 적어도 3주, 대안적으로 적어도 1개월, 대안적으로 적어도 2개월, 대안적으로 적어도 3개월, 대안적으로 적어도 6개월, 대안적으로 적어도 9개월, 대안적으로 적어도 12개월의 유지 단계 기간 동안 유지된다.
오르토 리간드와 오르토 CAR-T 세포의 사용
한 실시양태에서, 본 개시내용은 혼합 세포 집단으로부터 직교 CD122 수용체를 발현하는 조작된 세포의 집단을 선택적으로 확장하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 조작된 세포의 증식을 촉진하는 조건 하에 혼합 세포 집단을 본 개시내용의 IL2 오르토로그와 접촉시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 직교 CD122 수용체가 CAR-T 세포를 발현할 때, CAR-T 세포를 발현하는 직교 수용체는 또한 본원에 기재된 IL2 오르토로그의 사용을 통해 형질도입 및 비-형질도입 세포의 배경 또는 혼합 집단으로부터 선택적으로 확장될 수 있다. 치료적 적용을 위한 T 세포의 확장은 전형적으로 CD3 TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 작용제 및 T-세포의 표면 상의 공동-자극 분자를 자극하는 작용제를 제공하는 표면과 접촉하여 세포를 배양하는 것을 수반한다. 통상적인 실시에서, 특히 임상 적용에 사용하기 위한 CAR-T 세포의 제조에서, CD3/D28과의 접촉에 의해 세포 요법 산물의 투여 전에 조작된 T-세포가 자극된다. 인비트로젠® CTS 다이나비즈® CD3/28 (라이프 테크놀로지스, 인크.; 미국 캘리포니아주 칼즈배드) 또는 밀테니 MACS® GMP ExpAct Treg 비즈 또는 밀테니 MACS GMP 트랜스액트™ CD3/28 비즈 (밀테니 바이오텍, 인크.)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 T-세포의 비드 기반 활성화를 촉진하기 위한 다양한 상업적으로 입수가능한 산물이 있다. T-세포 배양에 적절한 조건은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (Lin, et al. (2009) Cytotherapy 11(7):912-922; Smith, et al. (2015) Clinical & Translational Immunology 4:e31 published online 16 January 2015). 표적 세포는 성장을 지원하는데 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도 (예를 들어, 37℃) 및 대기 (예를 들어, 공기 + 5% CO2)에서 유지된다. 여기서 CD122 직교 수용체를 발현하는 조작된 T 세포를 함유하는 혼합 세포 집단은 소정의 농도의 IL2 오르토로그의 존재 하에서 배양된다. 일부 실시양태에서 적어도 2시간, 대안적으로 적어도 3시간, 대안적으로 적어도 4시간, 대안적으로 적어도 6시간, 대안적으로 적어도 8시간, 대안적으로 적어도 12시간, 대안적으로 적어도 24시간, 대안적으로 적어도 48시간, 대안적으로 적어도 72시간, 또는 그 초과 동안 실시된다. 이러한 생체외 상황에서 IL2 오르토로그의 농도는 세포 집단에서 세포성 증식을 유도하기에 충분하다. T 세포 증식은 현미경적 방법에 의해 쉽게 평가될 수 있으며, IL2 오르토로그의 최적 농도의 결정은 직교 CD122 수용체에 대한 IL2 오르토로그의 상대적 활성에 좌우될 것이다.
세포가 시험관내에서 IL2 오르토로그와 접촉되는 경우, 시토카인은 수용체로부터의 신호전달을 활성화시키기에 충분한 기간 및 용량으로 조작된 세포에 부가되며, 이는 천연 세포성 기구, 예를 들어 보조 단백질, 공동-수용체 등을 활용할 수 있다. 임의의 적합한 배양 배지가 사용될 수 있다. 이렇게 활성화된 세포는 항원 특이성의 결정, 시토카인 프로파일링 등과 관련된 실험 목적을 포함한 임의의 원하는 목적을 위해 및 생체내 전달을 위해 사용될 수 있다.
생체내에서 접촉이 수행되는 경우, 직교 CD122 수용체를 발현하도록 변형된 CAR-T 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 조작된 세포의 유효 용량이 직교 시토카인, 예를 들어, IL2의 투여와 조합하여 또는 투여 전에 수용자에게 주입되고, 그의 천연 환경, 예를 들어 림프절 등에서 T 세포와 접촉하는 것이 가능하게 된다. 투여량 및 빈도는 작용제; 투여 방식; IL2 오르토로그의 성질 등에 따라 달라질 수 있다. 이러한 지침은 개별 상황에 맞게 조정될 것임을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 수 있을 것이다. 투여량은 또한 투여 경로, 예를 들어, 근육내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내 주입 등에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 적어도 약 104개의 조작된 세포/kg, 적어도 약 105개의 조작된 세포/kg; 적어도 약 106개의 조작된 세포/kg, 적어도 약 107개의 조작된 세포/kg, 또는 그 초과가 투여된다.
조작된 세포가 T 세포인 경우, 증진된 면역 반응은 수용자에게 존재하는 표적 세포에 대한 T 세포의 세포용해 반응의 증가, 예를 들어, 종양 세포, 감염된 세포의 제거; 자가면역 질환의 증상 감소 등으로서 나타날 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 T 세포 집단이 대상체에게 투여되는 경우, 대상체는 조작된 T 세포 집단의 투여 전 또는 투여와 조합하여 면역억제 요법 과정을 제공받는다. 이러한 면역억제 레지멘의 예는 전신 코르티코스테로이드 (예를 들어, 메틸프레드니솔론)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. B 세포 고갈에 대한 요법은 혈청 이뮤노글로불린 수준의 정상 수준을 회복하기 위해 확립된 임상 투여 지침에 의한 정맥내 이뮤노글로불린 (IVIG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 CAR-T 세포 요법의 투여 전에, 대상체는 임의로 림프고갈 레지멘을 받을 수 있다. 이러한 림프고갈 레지멘의 한 예는 플루다라빈 (4일 동안 매일 30 mg/m2 정맥내) 및 시클로포스파미드 (플루다라빈의 제1 용량으로 시작하여 2일 동안 매일 500 mg/m2 IV)를 대상체에게 투여하는 것으로 이루어진다.
조작된 T 세포는 치료용, 예를 들어 인간 치료에 적합한 제약 조성물에 제공될 수 있다. 이러한 세포를 포함하는 치료 제형은 동결되거나, 또는 수용액의 형태로 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 함께 투여되도록 제조될 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 세포는 우수한 의료 관행과 일치하는 방식으로 제형화, 복용 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려해야 할 요소는 치료 중인 특정한 장애, 치료 중인 특정한 포유류, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의료 종사자에게 공지된 기타 요인을 포함한다.
세포는 임의의 적합한 수단, 통상적으로 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내 (볼루스 또는 느린 주입), 동맥내, 복강내, 척수강내 또는 피하 투여를 포함한다. 전형적인 관행에서, 조작된 T 세포는 생리학상 허용되는 배지 중에 대상체에게 정상적으로는 혈관내 주입되지만, 세포가 성장을 위한 적절한 부위를 찾을 수 있는 임의의 다른 편리한 부위에도 도입될 수 있다. 통상적으로, 적어도 1x105개의 세포/kg, 적어도 1x106개의 세포/kg, 적어도 1x107개의 세포/kg, 적어도 1x108개의 세포/kg, 적어도 1x109개의 세포/kg, 또는 그 초과가 투여될 것이며, 통상적으로 수집 동안 수득된 T 세포의 수에 의해 제한된다.
예를 들어, 본 발명의 실시에 사용하기 위한 hoRb 세포의 투여에 대한 전형적인 범위는 요법 과정당 대상체 체중 kg당 약 1x105개 내지 5x108개의 생육성 세포 범위이다. 결과적으로, 체중에 대해 조정된, 인간 대상체에서 생육성 세포의 투여에 대한 전형적인 범위는 요법의 과정당 대략 1x106개 내지 대략 1x1013개의 생육성 세포, 대안적으로 대략 5x106개 내지 대략 5x1012개의 생육성 세포, 대안적으로 대략 1x107개 내지 대략 1x1012개의 생육성 세포, 대안적으로 대략 5x107개 내지 대략 1x1012개의 생육성 세포, 대안적으로 대략 1x108개 내지 대략 1x1012개의 생육성 세포, 대안적으로 대략 5x108개 내지 대략 1x1012개의 생육성 세포, 대안적으로 대략 1x109개 내지 대략 1x1012개의 생육성 세포 범위이다. 한 실시양태에서, 세포의 용량은 요법의 과정당 2.5-5x109개의 생육성 세포의 범위 내에 있다.
요법의 과정은 단일 용량 또는 소정의 기간에 걸친 다중 용량을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 단일 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28, 30, 60, 90, 120 또는 180일의 기간에 걸쳐 투여되는 2회 이상의 분할 용량으로 투여된다. 이러한 분할 투여 프로토콜에서 투여되는 조작된 세포의 수량은 각각의 투여에서 동일할 수 있거나 상이한 수준으로 제공될 수 있다. 기간에 따른 수-일 투여 프로토콜은 치료의 부작용 및 상기 논의된 바와 같은 조정을 포함한 치료에 대한 대상체의 반응을 고려하여 세포의 투여를 모니터링하는 숙련된 기술자 (예를 들어, 의사)에 의해 제공될 수 있다.
림프고갈의 부재
본 개시내용의 조성물 및 방법은 또한 사전 림프고갈의 부재 하에 T 세포 요법 (특히 CAR T 세포 요법)으로 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 혼합 세포 집단의 후속 투여 및 대상체에서 조작된 세포의 집단을 확장하기 위한 비-특이적 작용제 (예를 들어, IL2)의 투여를 세포 요법 산물의 투여와 조합하는 것은 광범위한 활성화를 초래하는 작용제의 투여에 의한 면역 세포의 광범위한 증식 및 활성화로부터 발생하는 상당한 전신 독성 (시토카인 방출 증후군 또는 "시토카인 폭풍"을 포함함)을 초래할 뿐 아니라 세포 요법 산물 자체에 상당한 분율의 비-조작된 세포가 존재하기 때문에, 림프고갈은 전형적으로 CAR T 세포 요법과 연계해서 대상체에서 수행된다. 본 개시내용의 방법 및 조성물은 전술한 생체외 방법이 이용될 때 비-조작된 세포에 의한 오염이 거의 없는 조작된 세포의 실질적으로 정제된 집단 및/또는 IL2와 같은 비-특이적 증식제의 실질적으로 감소된 오프-타겟 효과를 제공하는 IL2 오르토로그를 사용한 조작된 T 세포의 선택적 활성화 및 확장 둘 다 (또는 둘 중 하나)를 제공함으로써 이러한 중대한 장애물을 제거한다.
예를 들어, CAR-T 세포 요법의 현재 임상 사례에서, CAR-T 세포는 통상적으로 림프고갈과 조합하여 투여 (예를 들어, 알렘투주맙 (모노클로날 항-CD52), 퓨린 유사체 등의 투여에 의함)되어, 숙주 면역 회복 전에 CAR-T 세포의 확장을 촉진한다. 일부 실시양태에서, CAR-T 세포는 알렘투주맙에 대한 내성을 위해 변형될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, CAR-T 요법과 연합되어 현재 이용되는 림프고갈은 본 발명의 CAR-T를 발현하는 직교 리간드에 의해 제거되거나 감소될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 림프고갈은 통상적으로 CAR-T 세포의 확장을 가능하게 하기 위해 이용된다. 그러나, 림프고갈은 또한 CAR-T 세포 요법의 주요 부작용과 연관이 있다. 직교 리간드가 특정한 T-세포 집단을 선택적으로 확장하는 수단을 제공하기 때문에, CAR-T를 발현하는 직교 리간드의 투여 전에 림프고갈에 대한 필요성이 감소될 수 있다. 본 발명은 CAR-T를 발현하는 직교 리간드의 투여 전에 림프고갈 없이 또는 감소된 림프고갈로 CAR-T 세포 요법의 실행을 가능하게 한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 직교 리간드 CAR-T의 투여 전에 림프고갈의 부재 하에 CAR-T를 발현하는 직교 리간드의 투여에 의해 CAR-T 세포 요법으로 치료할 수 있는 질환, 장애 또는 병태 (예를 들어, 암)를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 표면 항원 (예를 들어 종양 항원(들))의 발현을 특징으로 하는 세포의 비정상적인 집단 (예를 들어 종양)의 존재와 연관된 질환, 장애를 앓고 있는 포유류 대상체의 치료 방법을 제공하며, 이러한 방법은 (a) 개체로부터 T-세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) T-세포의 존재에 대해 생물학적 샘플을 강화시키는 단계; (c) CAR을 코딩하는 핵산 서열 및 직교 CD122 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 T-세포를 형질감염시키는 단계이며, CAR의 항원 표적화 도메인은 세포의 비정상적인 집단 상에 존재하는 적어도 하나의 항원과 결합할 수 있는 것; (d) IL2 오르토로그를 사용하여 생체외에서 CAR-T 세포를 발현하는 직교 수용체의 집단을 확장시키는 단계; (e) CAR-T 세포를 발현하는 직교 수용체의 제약상 유효량을 포유류에게 투여하는 단계; 및 (f) CAR-T 세포 상에서 발현되는 직교 CD122 수용체와 선택적으로 결합하는 IL2 오르토로그의 치료상 유효량의 투여에 의해 CAR-T 세포를 발현하는 직교 CD122 수용체의 성장을 조정하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 전술한 방법은 CAR-T 세포 요법의 과정의 개시 전에 포유류의 림프고갈 또는 면역억제와 연관된다. 또 다른 실시양태에서, 전술한 방법은 포유류의 림프고갈 및/또는 면역억제의 부재 하에 실시된다.
오르토 리간드를 사용하여 시간이 지남에 따라 직교 면역 세포의 한계치 수준 유지:
한 실시양태에서 직교 리간드와 조합하여 직교 면역 세포를 사용하는 현재 개시된 방법의 실시에서, 직교 리간드는 인간 대상체의 순환에서 직교 세포의 치료상 유효한 순환 수준을 유지하는 양으로 대상체에게 투여되며, 여기서 직교 세포의 치료상 유효한 순환 수준은 대상체 체중 kg당 약 10,000 내지 약 1,000,000개의 직교 세포, 대안적으로 약 20,000 내지 약 500,000개의 직교 세포, 대안적으로 약 30,000 내지 약 300,000개의 직교 세포, 대안적으로 약 30,000 내지 약 200,000개의 직교 세포, 대안적으로 약 20,000 내지 약 150,000개의 직교 세포, 대안적으로 약 50,000 내지 약 150,000개의 직교 세포이고, 직교 리간드, 예를 들어 식 1의 직교 리간드의 주기적 투여에 의해 적어도 1주, 대안적으로 적어도 2주, 대안적으로 적어도 3주, 대안적으로 적어도 1개월, 대안적으로 적어도 2개월, 대안적으로 적어도 3개월, 대안적으로 적어도 6개월, 대안적으로 적어도 9개월, 대안적으로 적어도 12개월의 기간 동안 유지된다. 조작된 세포의 정량화는 통상적인 항체 기반 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 과도한 수준의 CRP 및 페리틴은 임상적으로 CRS의 발병을 평가하는데 사용되며 전형적으로 주치의가 직교 세포의 최적의 허용가능하고 효과적인 수준을 결정하고 인간 대상체의 반응이 가변적일 수 있는 수준을 유지하는데 필요한 직교 리간드의 수준을 모니터링할 것이다. 개별 환자에 대한 직교 세포의 최적 순환 농도의 확인은 세포 요법의 일반 의사의 기술 범위 내에 있다.
이전에 언급된 바와 같이, 본 개시내용은 유지 레지멘의 투여에 의해 재발 또는 회귀를 방지하기 위해 초기 직교 세포 요법 치료에 대해 유의미한 임상 반응의 증거를 나타내는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 직교 리간드의 더 낮은 용량이 대상체 체중 kg당 약 10,000 내지 약 500,000개의 직교 세포, 대안적으로 약 10,000 내지 약 200,000개의 직교 세포, 대안적으로 약 10,000 에서 약 100,000개의 직교 세포의 더 낮은 순환 수준을 유지하도록 대상체에게 주기적으로 투여되며, 직교 리간드, 예를 들어, 식 1의 직교 리간드의 주기적 투여에 의해 적어도 1주, 대안적으로 적어도 2주, 대안적으로 적어도 3주, 대안적으로 적어도 1개월, 대안적으로 적어도 2개월, 대안적으로 적어도 3개월, 대안적으로 적어도 6개월, 대안적으로 적어도 9개월, 대안적으로 적어도 12개월의 유지 단계 기간 동안 유지된다.
실시예
본 발명의 바람직한 실시양태를 보다 완전하게 설명하기 위해 하기 실시예가 제시된다. 그러나, 이들은 어떠한 방식으로든 본 발명의 광범위한 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1. 인간 IL2 발현 벡터 pcDNA3 .1/ 히그로 (+)- huIL2의 생성
인간 IL2 DNA ORF (젠뱅크 NM_000586.3)를 합성하고 [라이프 테크놀로지스 젠아트 서비스 (Life Technologies GeneArt Service; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)], 제조업체의 프로토콜에 따라 백금 슈퍼파이(SuperFi) II DNA 폴리머라제 키트 [물품 #12361050, 써모피셔(ThermoFisher)]를 사용하고, NheI 제한 부위를 혼입한 5' TATAGTCAGCGCCACcCATGTACAGGATGCAACTCCTGTC 3', 및 ApaI 제한 부위를 혼입한 5' TATAGGGCCCTATCAAGTCAGTGTTGAGATG 3' 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 증폭시켰다. PCR 단편은 1% 아가로스 겔 [물품 #54803, 론자 (Lonza; 미국 메인주 록랜드)] 상에서 시각화되고, 이러한 겔로부터 절제되고, 제조업체의 프로토콜에 따라 QIAquick PCR 정제 키트 [물품 #28106, 퀴아젠 (Qiagen; 독일)]를 사용하여 정제되었다.
정제된 PCR 단편 및 포유류 발현 벡터 pcDNA 3.1/히그로(+) (#V87020, 써모피셔)는 NheI 및 ApaI [#R0111S 및 #R0114L, 뉴잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs; 미국 매사추세츠주 입스위치)] 제한 효소로 소화되었다. 발현 벡터는 제조업체의 프로토콜에 따라 신속 탈인산화 키트 (#M0508L, 뉴잉글랜드 바이오랩스)로 추가로 처리되었다. PCR 단편은 제조업체의 프로토콜에 따라 신속 DNA 라이게이션 키트 [#11635379001, 시그마 알드리치 (Sigma Aldrich; 미국 미주리주 세인트루이스)]를 사용하여 pcDNA 3.1/히그로(+)에 라이게이션하고 원 샷 TOP10 화학적으로 적격한 이. 콜라이 (#C404006, 라이프 테크놀로지스; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)로 형질전환시키고, 100 ug/ml 카르베니실린을 함유하는 LB 한천 플레이트 [#L1010, 테크노바 (Teknova; 미국 캘리포니아주 홀리스터)] 상에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 성장시켰다.
그 다음 날 개별 박테리아 콜로니를 선택하여 100 ug/ml 암피실린 (#A9626, 테크노바)을 포함한 LB 브로쓰 (#10855-001, 라이프 테크놀로지스)에서 3 ml 박테리아 배양을 시작하는데 사용하였다. 배양물을 37℃에서 밤새 성장시켰다.
그 다음 날 이. 콜라이를 펠릿화하고 [6,000 rpm, 10분, 테이블탑 원심분리기 #5424, 에펜도르프 (Eppendorf; 미국 뉴욕주 하우파주)], DNA 발현 벡터를 QIA프렙 스핀 미니프렙 키트 (#27106, 퀴아젠)를 사용하여 단리하였다. 플라스미드 DNA는 서열 검증되었다 (MCLab; 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코).
실시예 2. 인간 IL2 오르토 발현 벡터 pcDNA3 .1/ 히그로 (+)- huIL2 -오르토의 생성:
인간 IL2 ORF 내로 6개의 돌연변이 (E35S, H36Q, L39V, D40L, Q42K 및 M43A; 모든 넘버링은 완전한 길이의 인간 IL2 ORF NM_000586.3 넘버링을 기반으로 함)를 도입한 발현 벡터는 pcDNA3.1/히그로(+)에서 인간 IL2 발현 벡터에 대한 실시예 1의 교시에 실질적으로 따라, 하기를 제외하고 어셈블리되었다: PCR에 사용된 초기 주형 DNA는 E35S, H36Q, L39V, D40L, Q42K 및 M43A 돌연변이로 합성되었다.
실시예 3. pcDNA3 .1/ 히그로 (+)- huIL2 내로의 돌연변이의 도입 또는 pcDNA3.1/히그로(+)-huIL2 오르토 발현 벡터 내로의 역돌연변이의 도입.
모든 돌연변이 또는 역돌연변이 (pcDNA3 .1/ 히그로 (+)- huIL2 -오르토에서의 돌연변이를 야생형 인간 IL2 ORF와 매치되도록 되돌리는 것)는 제조업체의 프로토콜에 실질적으로 따라 퀵 체인지 II 부위 지정 돌연변이유발 키트 [#200524, 애질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies; 미국 캘리포니아주 산타클라라)]를 사용하여 pcDNA3.1/히그로(+)-huIL2 또는 pcDNA3 .1/ 히그로 (+)- huIL2 -오르토 발현 벡터 내로 도입되었다.
표 5는 생성된 돌연변이, 돌연변이가 도입된 주형, 및 돌연변이를 도입하기 위해 사용된 프라이머 세트를 나열한 것이다. 이. 콜라이 내로의 퀵 체인지 PCR 반응물의 형질전환 뿐만 아니라 플라스미드 DNA의 단리 및 서열 분석은 pcDNA3.1/히그로-huIL2 발현 벡터의 생성에서와 실질적으로 동일한 프로토콜을 사용하여 수행되었다.
Figure pct00041
Figure pct00042
실시예 4. HEK293 세포에서의 일시적 형질감염
모든 발현 벡터는 HEK293 세포 (#CRL-1573, ATCC; 미국 버지니아주 매너서스)로 일시적으로 형질감염되었다. 대략 1E6개의 HEK293 세포를 10% 소 태아 혈청 [#SH30071.03, 피셔 사이언티픽 (Fisher Scientific; 미국 일리노이주 시카고)]이 보충된 2 ml의 DMEM (#10569044, 라이프 테크놀로지스)의 6 웰 조직 배양 플레이트의 각각의 웰에 플레이팅하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 성장시켰다.
그 다음 날 세포는 형질감염당 2.5 ug DNA, 5 ul P3000 시약 및 7.5 ul 리포펙타민 3000을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 3000 시약 (#L3000150, 라이프 테크놀로지스)를 사용하여 형질감염되었다. 형질감염된 세포를 37℃, 5% CO2에서 48 - 72시간 동안 성장시킨 다음, 조건부 배지를 수거하였다.
실시예 5. 단백질 발현의 분석
단백질 발현은 제조업체의 프로토콜에 따라 (형질감염된 배지는 처음에 1:4로 희석한 다음 순차적으로 1:2로 희석하였다) 인간 IL2 V-PLEX ELISA 키트 [#K151QQD-4, 메소스캐일 다이아그노스틱스 (Mesoscale Diagnostics; 미국 메릴랜드주 볼티모어)]를 사용하여 ELISA에 의해 측정되었다. 플레이트는 이러한 ELISA 키트에 대한 제조업체의 사전 프로그램된 설정을 사용하여 메소 퀵플렉스 SQ120 (메소스캐일 다이아그노스틱스)에서 판독되었다. 키트 내의 인간 IL2 표준이 조건부 배지 샘플에서의 대략적인 발현 수준을 계산하는데 사용되었다. 하기 표 8은 발현된 단백질에 대한 대략적인 발현 수준을 상세히 설명한다.
Figure pct00043
실시예 6. hoCD122를 발현하는 세포주에서 오르토로그의 활성 평가
IL2 오르토로그는 NKL 세포에서의 활성에 대해 평가되었다 (Robertson, et al. (1996) Experimental Hematology 24(3):406-15). 인간 직교 CD122를 발현하는 세포주 (hoNKL hoRB)를 생성하기 위해, NKL 세포를 관련 기술분야에 공지된 절차에 따라 hoRB CD122를 코딩하고 YFP를 공동-발현하는 레트로바이러스로 감염시켰다 (MSCV-hoRb-IRES-YFP).
NKL 및 NKL hoRB 세포를 하기와 같이 IL2 오르토로그로 형질감염된 293T 세포로부터의 상등액과 접촉시켰다: 세포는 RPMI 1640 (써모피셔), 10퍼센트 소 태아 혈청 (써모피셔), 1퍼센트 페니실린/스트렙토마이신 (써모피셔), 1퍼센트 글루타맥스 (써모피셔)로 이루어진 성장 배지에서 5십만개 세포/ml로 시딩되었다. 2일간 배양한 후, 세포는 100 μl의 성장 배지에서 웰당 25,000개의 세포로 96-웰 플레이트 [팔콘(Falcon)]에 시딩되었다. 형질감염된 293T 세포 상등액의 2배 연속 희석액을 성장 배지에서 만들고 각각의 희석액 100 μl를 1:2 내지 1:256 범위의 최종 적정에서 NKL 및 NKL hoRB 세포 플레이트에 이중으로 부가하였다. 플레이트를 가습 인큐베이터 (써모피셔)로 옮기고 섭씨 37도, 5퍼센트 이산화탄소에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 인큐베이터로부터 꺼내고 실온에서 30분 동안 유지하였다. 플레이트를 400 x g에서 5분 동안 원심분리시키고 상등액은 폐기시켰다. 세포는 PBS 중 셀타이터글로 (프로메가)의 1:1 희석액을 웰당 50 μl로 부가함으로써 용해되었다. 세포 용해물은 궤도 진탕기 (VWR 사이언티픽)에서 600 rpm에서 2분 동안 혼합된 다음 실온에서 10분 동안 유지되었다. 용해물을 흑색의 투명 바닥 96 웰 플레이트 [코스타르(Costar)]로 옮기고, NKL 세포 용해물 (도 1) 및 NKL hoRB 세포 용해물 (도 2)에 대한 발광을 엔비젼(Envision) 2103 멀티라벨 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머)에서 초당 카운트로서 판독되었다.
각각의 IL2 변이체가 NKL 세포와 NKL hoRB 세포 증식에 미치는 영향을 비교하기 위해, 상등액으로 처리된 세포에 대한 셀타이터글로 값을 성장 배지 단독으로 처리되거나, 빈 벡터 형질감염으로부터의 293T 상등액으로 처리되거나, 야생형 IL2 형질감염으로 처리되거나, 또는 인간 직교 IL2 형질감염으로부터의 상등액으로 처리된 대조군 세포에 대해 수득된 값과 비교하였다. 이들 실험으로부터의 데이터는 첨부 도면의 도 2 및 3에 제시되어 있다.
실시예 7. 파종성 RAJI -luc 림프종 마우스 모델에서 오르토CAR T 세포의 효능
동족 직교 리간드와 조합된 직교 CAR-T 세포의 효능을 하기와 같이 마우스 백혈병 모델에서 평가하였다. 본 연구에 사용된 CD19 키메라 항원 수용체 단백질 (이하 "CD19_28z"로서 지칭됨)은 하기 구조를 갖는다: GMCSF 수용체 신호 펩티드, FMC63 항-CD19 scFv, AAA 링커, CD28 힌지/막횡단/공동자극 도메인 및 CD3제타. CD19_28z의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00044
본 연구의 시행에 사용된 직교 T 세포는 단리된 T 세포를 렌티바이러스 벡터로 형질감염시킴으로써 관련 기술분야에 공지된 기술에 의해 생성되었으며, 전술한 CD19_28z CAR, T2A 링커 폴리펩티드 및 인간 직교 CD122 직교 수용체 (hoCD122)는 하기 아미노산 서열:
Figure pct00045
을 가지며, 이는 단일 렌티바이러스 플라스미드를 사용하여 직교 CAR-T 세포를 생성하는 것을 허용하였다. 그 결과로 생성된 직교 CAR-T 세포는 SYNCAR-001로 지칭되기도 한 CD19_28z 오르토CAR T 세포로 지정되었다.
건강한 공여자 1차 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜-파크 분리 [글로벌 라이프 사이언스 솔루션즈(Global Life Sciences Solutions)]를 통해 류코팩(leukopak)으로부터 단리하였다. CD4 및 CD8 T 세포를 CD4 및 CD8 마이크로비드로 염색하고 MACS 자기 분리 컬럼 (밀테니이 바이오텍)을 사용하여 단리하였다. 세포를 항-CD3 (클론 OKT3, 밀테니이 바이오텍) 및 항-CD28 항체 [클론 CD28.2, BD 바이오사이언시스(BD Biosciences)]로 자극하였다. 자극 48시간 후, 세포를 렌티바이러스로 형질도입하고 야생형 IL-2 (밀테니이 바이오텍)가 포함된 완전한 OpTmizer T 세포 배지 [깁코(Gibco)]에서 유지하였다. 형질도입 48시간 후, 세포를 세척하고 WT IL-2 함유 배지에서 유지하거나 STK-009 함유 배지로 전환하였다. 나머지 제조 기간 동안 세포를 확장하고 1E6개 세포/ml로 유지하였다. 세포 카운트와 생육력은 Vi-Cell XR [베크만 쿨터(Beckman Coulter)]을 사용하여 수행되었다. 제14일에, 세포를 크라이오스토르(CryoStor) CS10 세포 동결 배지 (STEMCELL)에서 동결시켰다.
이들 연구에 사용된 hoCD122 수용체에 대한 직교 동족 리간드는 알데히드 링커를 갖는 모노PEG화된 40 kD 분지형 (2x20 kD) PEG 분자, 2개의 20 kDa 선형 PEG 분자를 포함하는 40 kDa PEG-알데히드인 40 kDa 2-아암 분지형 PEG-알데히드 (선브라이트® GL2-400AL3, NOF 아메리카 코포레이션; 미국 뉴욕주 10601 화이트 플레인스 원 노스 브로드웨이)를 포함하는 본 명세서에 기재된 STK-009로서 기재된 식 1의 화합물이었다.
6 내지 8주령의 암컷 NOD scid 감마 (NSG) 마우스를 더 잭슨 래보라토리 (The Jackson Laboratory; 미국 메인주 04609 바 하버 메인 스트리트 600)로부터 수득하였다. 연구를 시작하기 전에, 동물이 건강한지 확인하기 위해 이들의 체중을 측정하고 임상 검사를 받았다. 이후 체중을 연구 기간 동안 추적하였다. 동물은 케이지당 5마리씩 수용되었고 9일 동안 순응되었다. 동물을 CD19_28z 오르토CAR T 세포 (2E6 총 T 세포, 1E6 CAR+ T 세포) 및 STK-009의 조합으로 처리하고 5개 군으로 계층화하여 생체내 조합 효능에 대한 잠재력을 평가하였다. STK-009 피하 투여는 격일로 수행되었다. 연구 계획의 시행에 대한 자세한 내용은 하기 표 9에 제공되어 있다.
Figure pct00046
종양 세포 수는 IVIS 영상화기 [퍼킨 엘머(Perkin Elmer)]를 사용하여 매주 2회 정량화되었다. 마우스에 100 ul의 D-루시페린 (PBS 중 15 mg/ml D-루시페린)을 복강내 주사하였다. 마우스는 제어된 저 유량 이소플루란 노출 [켄트 사이언티픽 솜노수이트(Kent Scientific Somnosuite)]을 통해 마취 하에 두었다. 각각의 개별 마우스 주위에 관심 영역 (ROI)을 그리고 직접적으로 발광을 측정하는 총 플럭스 (광자/초)를 리빙 영상 소프트웨어 (퍼킨 엘머)를 사용하여 측정하였다. 마우스는 연구 제5일에 영상화되었고 그 이후에는 매주 2회 영상화되었다. 마우스는 뒷다리 마비가 검출되었을 때 (PBS 코호트에서 제21일) 제거되었다.
연구 제0일에, 마우스에게 5 x 105개의 Raji-fluc-puro 종양 세포를 이식하고 꼬리 정맥에 정맥내 주사하고 5일 동안 성장하도록 두었다. 종양 이식 후 5일 후에 처리를 시작하였다. 연구 제5일에, 피하 용량의 비히클 (PBS), 1 μg의 STK-009, 2 μg의 STK-009, 또는 10 μg의 STK-009와 조합된 CD19_28z 오르토CAR T 세포 또는 비히클 (PBS)를 마우스에게 복강내 투여하였다. PBS 및 STK-009 투여는 제17일 (10 μg) 또는 제19일 (1 μg, 2 μg)까지 격일로 수행되었다. CD19_28z 오르토CAR T 세포는 -80도에서 저장되었다. 주사 당일, CD19_28z 오르토CAR T 세포를 해동하고, 스핀 다운시키고, 2E6개의 총 T 세포/200 마이크로리터 PBS의 농도로 재현탁시켰다. 오르토CAR T 세포 (2E6개의 총 T 세포, 1E6개의 CAR+ T 세포)를 마우스에게 복강내 주사하였다. 코호트당 8마리의 마우스에게 PBS, CD19_28z 오르토CAR T 세포 및 PBS/STK-009를 피하 투여하였다. 비히클 또는 STK-009는 제17일 (10 μg) 또는 제19일 (1 μg, 2 μg)까지 격일로 투여되었다. 하악 볼 출혈에 의해 모든 동물로부터 혈액을 수집하고 혈장 수집 튜브에서 원심분리를 통해 혈액으로부터 혈장을 단리하였다. 혈액 샘플은 FACS 분석을 통해 즉시 분석되었으며 혈장은 향후 분석을 위해 -80도로 동결되었다. 비장, 신장, 간 및 뒷다리는 IHC 프로세싱을 위해 포름알데히드로 고정되었다.
실험 결과는 첨부된 도면의 도 3에 제공되어 있다. 생물발광 데이터가 하기 표 10에 제공된다.
표 10. 파종성 Raji -Luc 연구로부터의 생물발광 데이터
Figure pct00047
Figure pct00048
도 3 및 상기 표에 제공된 데이터에 의해 입증된 바와 같이, PBS의 투여는 종양 부담을 제어하는데 실패하여 (도 3, 패널 A, 군 1 및 도 3, 패널 B, 좌측 상단), 연구 약 제21일에 독성으로 인해 동물을 희생시켜야 하는 결과를 초래하였다. CD19_28z 오르토CAR T 세포의 투여는 8마리 마우스 중 4마리에서 항종양 반응을 일으켰다 (도 3, 패널 A, 군 2 및 도 3, 패널 B, 우측 상단). 용량 수준 둘 다에서 두 CD19_28z 오르토CAR T 세포와 STK-009 둘 다의 조합 처리 (도 3, 패널 A, 1 μg (군 3 및 도 3, 패널 B 우측 하단) 및 2 μg (군 4 및 도 3, 패널 B 좌측 하단)는 CD19_28z 오르토CAR T 세포 처리 단독과 비교하여 부가의 항종양 기능을 제공하였다.
이전에 언급된 바와 같이, 동물의 체중은 전술한 연구 과정 전반에 걸쳐 측정되었다. 상당한 체중 감소는 독성의 확립된 척도이다. 직교 리간드의 부가가 있거나 없는 직교 CAR-T 세포를 사용한 처리군에서 전술한 연구에서 동물의 체중은 일반적으로 내약성이 우수했으며 oCD19 CAR T 또는 STK-009 리간드와 연관된 전신 독성의 증거는 거의 없었다.
실시예 8. 피하 Raji 림프종 고형 종양 모델
피하 림프종 모델의 경우, 6-8주령 NSG 및 NSG MHC I/II KO 마우스 (잭슨 래보라토리즈)에게 5E5개의 Raji-fluc-puro 세포와 페놀-레드 프리 매트리겔 [코닝(Corning)]을 50:50 비를 피하 주사하였다. 4일 후, 마우스를 기재된 바와 같이 영상화하고, 무작위 배정하며 PBS 또는 STK-009를 피하 주사하였다. 제5일에, 마우스를 PBS, SYNCAR T 세포, 및 PBS 또는 STK-009 중 하나로 피하 처리하였다. 마우스는 격일로 PBS 또는 STK-009의 피하 주사를 받았고 체중이 연구 시작 시의 체중의 90% 미만으로 떨어지면 일시 중지되었다. 종양 캘리퍼 측정은 1주에 2회 이루어졌으며, 후속 시토카인 및 유동 세포계수 분석을 위해 마우스를 1주에 1회 채혈한 반면, 체중은 1주에 최대 5회 측정하였다.
실시예 9. 조직학 분석 및 면역조직화학
면역조직화학 분석은 항-인간 CD4, CD8, 그랜자임B, CD3 및 항-마우스 CD11b에 대한 조직에서 수행되었다. FFPE 블록은 4 um 두께로 절단되었다. 슬라이드는 일련의 크실렌에서 탈-파라핀화되고 알콜은 물로 점진적으로 희석되었다. 슬라이드는 실온에서 다코(Dako) 자동 염색기에서 IHC 염색을 시작하기 전에 시트레이트 기반 낮은 pH 항원 복구로 처리되었다. 내인성 퍼옥시다제를 3% 과산화수소로 5분 동안 켄칭한 후, 1차 항체를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 조직을 HRP-접합된 중합체 2차 시약과 함께 30분 동안 인큐베이션한 다음, DAB 또는 TSA-접합된 알렉사 플루오르(Alexa fluor) 488, 594 또는 647과 인큐베이션하여 신호를 시각화하였다. 인간 CD3, 마우스 CD11b는 발색 검출 및 분석을 위해 DAB로 염색되었다. 항-인간 CD4, CD8 및 그랜자임B는 형광 검출을 사용한 정량화를 위해 다중화되었다. 이중 표지화를 위해, 제1 마커로부터 결합되지 않은 임의의 시약을 용출하기 위해 두 절차 사이에 제2 항원 복구 단계를 포함함으로써 순차적인 방식으로 염색을 수행하였다. 품질 검사를 위해 적절한 교차 반응성 제어가 포함되었다. 형광 염색이 완료되면, 조직을 DAPI로 대조염색하고 프로롱 골드(Prolong Gold) 수성 마운팅 배지를 사용하여 커버 슬리핑하였다. 발색 염색이 완료되면, 샘플을 헤마톡실린으로 대조염색하고 영상화를 위해 커버 슬리핑하였다.
전체 슬라이드 스캐닝 및 신호 정량화는 아코야 벡트라(Akoya Vectra) 다중 스펙트럼 영상화 시스템과 아코야 벡트라 인폼 분석 소프트웨어 제품군을 사용하여 수행되었다. 사용된 1차 항체는 CD4: R&D 시스템즈(R&D Systems), AF-379-NA, 5 ug/ml 1시간 동안, 염소 폴리클로날; CD8: 다코, M7103, 클론 C8/144B, 1:500 1시간 동안, 마우스 모노클로날; 그랜자임B: 세포 신호전달, 46890s, 클론 D6E9W, 1:500 1시간 동안, 토끼 모노클로날; CD3: 랩 비젼(Lab Vision), RM-9107-S, 클론 SP7, 1:200 1시간 동안, 토끼 모노클로날; CD11b: 압캠(Abcam), ab216445, 클론 EPR1344, 1:3000 1시간 동안, 토끼 모노클로날이고 사용된 2차 항체는 라이카 파워비젼(Leica Powervision) 항-토끼-HRP, 라이카 파워비젼 항-마우스-HRP, 벡터 임프레스(Vector Immpress) 항-염소-HRP이다.
표 11 파종성 Raji -Luc 연구로부터의 체중 데이터 (g/마우스)
Figure pct00049
Figure pct00050
실시예 9: RAJI -luc 림프종 재시험감염 마우스 모델
하기 실험은 상기 실시예 8에 기재된 연구의 연속이다. 제34일에, 처리의 초기 단계로부터 효과적으로 치유된 마우스 (CD19 오르토CAR T 세포 + 1 ug STK-009 처리된 마우스 (도 3 패널 A의 군 3))를 2개의 군으로 나누고 격일로 PBS 또는 STK-009를 지속적으로 투여하였다. 투여 일정은 첨부 도면의 도 5 패널 A에 제시되어 있다 (도 4A). 역삼각형은 STK-009의 용량의 투여를 나타낸다. 부가의 CD19 오르토CAR T 세포는 투여되지 않았고, STK-009 직교 리간드만 투여되었다는 점에 유의해야 한다.
제43일에, 처리 군 마우스 및 PBS 군 마우스에게 5E5개의 RAJI-luc 세포 및 50% 마트리겔을 우측 후방 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 부담은 이전에 기재된 바와 같이 격주로 평가되었다. PBS 군은 과도한 종양 부담으로 인해 주사 후 21일 (제64일)에 안락사되었으며 (도 4B, 첫 번째 패널), PBS로 처리된 4마리 마우스 중 2마리는 종양의 성장을 제어할 수 있었으며 (도 4B, 두 번째 패널), STK-009로 처리된 모든 마우스 (4마리 중 4마리 모두)는 종양 성장을 제어할 수 있었다 (도 2B, 세 번째 패널).
이러한 데이터는 STK009 재투여가 항원 또는 종양 리간드 노출이 없는 장기간에도 CAR T 세포의 항종양 활성을 회복할 수 있음을 입증해준다.
실시예 10. 재발 후 RAJI -luc 림프종의 STK -009 처리
하기 실험은 상기 실시예 8에 기재된 연구의 연속이다. 제34일에, CD19 오르토CAR T 세포 및 PBS로 처리되고 (즉, STK-009 직교 리간드로 처리되지 않은 나이브) 재발된 마우스 (도 3, 패널 A의 군 2, n=4)는 추가 처리를 위해 단리되었다. 도 5, 패널 B에 나타난 바와 같이 이들 마우스는 연구 약 제20일에 재발을 나타냈다. 모든 마우스는 16일 동안 격일로 1 ug의 STK-009의 피하 투여로 처리되었다 (총 8회 투여, 도 5 패널 A). 종양 부담은 이전에 기재된 바와 같이 격주로 평가되었다.
도 5, 패널 B에 제공된 데이터에서 언급된 바와 같이, 본 연구에서의 4마리 마우스 모두는 CAR-T 세포의 부가의 투여 없이 STK-009 투여 후 종양 퇴행의 징후를 나타냈다. 이러한 데이터는 STK-009 단독의 투여만으로도 이전 요법 과정에서 재발한 동물에서 CAR-T 세포의 항종양 활성의 효력을 발휘할 수 있음을 입증해준다.
실시예 11. 세포의 표현형 평가
하기는 상기 실시예 8에 기재된 연구의 처리 군에서 T-세포 수량 (Y-축) 및 표현형 (도 범례에 제공된 바와 같은 음영)의 평가이다. 간단히 언급하면, 연구 제20일, 제25일 및 제32일에 샘플을 수득하였다 (X축). 세포는 FACS 분석에 의해 정량화되었으며 데이터는 첨부된 도면의 도 6의 히스토그램에 제공되어 있다. 도 6에 제공된 데이터로부터 입증된 바와 같이, 직교 리간드 (STK-009)는 직교 CAR-T 세포를 확장시킬 수 있으며 줄기 세포 기억 CAR-T 세포 집단을 보유한다. CAR-T 세포의 장수는 줄기 세포 기억 (SCM) 표현형에서 중심 기억 (CM) 표현형, 이펙터 기억 (EM) 표현형, 이펙터 기억 CD45+ RA (EMRA) 표현형으로 진행하는 과정에서 이펙터 T 세포 운명으로 분화함으로써 생체내에서 제한된다. 첨부된 도면의 도 6에 제공된 데이터로부터 입증된 바와 같이, 처리 중단 시, 직교 리간드 (STK-009)로 처리된 직교 CAR-T 세포의 약 60%가 SCM 표현형을 유지하였다.
실시예 12. 피하 고형 종양 모델에서 직교 CAR-T/리간드 시스템의 효과 평가
하기 연구는 NSG 마우스에서 피하 고형 종양 RAJI 종양 성장의 제어에서, CD19_28z 오르토CAR T 세포 (실질적으로 실시예 8에 따라 제조됨)와 조합된 STK-009 (실질적으로 실시예 8에 따라 제조됨)의 생체내 효능을 평가하기 위해 수행되었다. 마우스는 실시예 8에 제공된 바와 같이 수득되고 처리되었다. 연구 설계는 하기 표 12에 제공되어 있다.
Figure pct00051
5E5개의 Raji-fluc-puro 종양 세포 [이마니스 라이프 사이언시스(Imanis Life Sciences) #CL-161]를 우측 옆구리에 100마이크로리터 PBS + 100마이크로리터 매트리겔 (코닝)의 용적으로 피하 주사하였다. 종양 이식 후 6일 후에 처리를 시작하였다. 제6일에, 마우스에게 비히클 (PBS)을 복강내 투여하거나, 또는 피하 용량의 비히클 (PBS), 1 μg의 STK-009 또는 10 μg의 STK-009와 조합하여 CD19_28z 오르토CAR T 세포를 복강내 투여하였다. PBS 및 STK-009 투여는 격일로 수행되었다. 마우스에게 CD19_28z 오르토CAR T 세포 (2E6개의 총 T 세포, 1E6 CAR+ T 세포)를 복강내 주사하였다. CD19_28z 오르토CAR T 세포는 -80도에서 저장되었다. 주사 당일, CD19_28z 오르토CAR T 세포를 해동하고, 스핀 다운시키고, 2E6개의 총 T 세포/200마이크로리터 PBS의 농도로 재현탁시켰다. STK-009를 등분하여 -80도에서 저장하였으며 투여 시 비히클 (PBS)로 추가 희석하였다. 비히클 또는 STK-009는 제75일까지 격일로 투여되었다. 제50일에, CD19_28z 오르토CAR T 세포 + STK-009 1 μg 군의 마우스 처리를 10 μg으로 증가시켰다.
마우스를 영상화하고 종양 캘리퍼 측정을 매주 수행하였다. 종양 크기와 세포 수는 각각 캘리퍼 및 IVIS 영상화기 (퍼킨 엘머)를 사용하여 매주 측정되었다. 영상화를 위해, 마우스에게 100 ul의 D-루시페린 (PBS 중 15 mg/ml D-루시페린)을 복강내 주사하였다. 마우스는 제어된 저 유량 이소플루란 노출 (켄트 사이언티픽 솜노수이트)을 통해 마취 하에 두었다. 각각의 개별 마우스 주위에 관심 영역 (ROI)을 그리고 직접적으로 발광을 측정하는 총 플럭스 (광자/초)를 리빙 영상 소프트웨어 (퍼킨 엘머)를 사용하여 측정하였다. 종양의 길이와 폭을 캘리퍼 측정으로 측정하였다. 종양 용적은 공식 ½ L x W2를 사용하여 계산되었다. 캘리퍼 측정은 IVIS 영상화가 더 민감했기 때문에 제60일에 중단되었다. 하악 볼 출혈에 의해 모든 동물로부터 혈액을 수집하고 혈장 수집 튜브에서 원심분리를 통해 혈액으로부터 혈장을 단리하였다. 혈액 샘플은 FACS 분석을 통해 즉시 분석되었으며 혈장은 향후 분석을 위해 -80도로 동결되었다. 종양, 비장, 신장, 간, 폐, 및 뒷다리는 IHC 프로세싱을 위해 포름알데히드로 고정되었다. 모든 샘플은 분석을 위해 적절하게 저장되었다. 마우스는 종양 용적이 > 2000 mm3를 초과할 경우 제거되었다. 그 데이터는 첨부된 도면의 도 9-12에 제공되어 있다.
도 7-10에 나타낸 바와 같이, 이러한 용량에서의 CD19_28z 오르토CAR T 세포 (4E5개의 CAR+ T 세포; 전형적으로 유효량 이하의 용량으로 간주되는 용량)의 투여는 그럼에도 불구하고 상당한 항종양 효능을 입증해주었다.
도 7 패널 A는 4가지 처리 조건에서 캘리퍼로 측정된 바와 같이 이러한 피하 연구에서의 종양 용적 결과를 제공한다. 도 7 패널 B는 STK-009가 생체내에서 CAR-T 세포를 확장하고 SCM 표현형 CAR-T 세포를 확장한다는 것을 나타내는 4가지 처리 조건에서 캘리퍼로 측정된 바와 같은 이러한 피하 연구에서의 종양 용적 결과를 제공한다 (도 7 패널 C). CD19_28z 오르토CAR T 세포와 STK-009 (1 μg, 10 μg) 둘 다의 조합 처리는 용량 의존적 방식으로 CD19_28z 오르토CAR T 세포 처리 단독과 비교하여 상당한 항종양 기능을 제공하였다.
도 8, 패널 A는 도 범례에 표시된 4가지 처리 조건에서 중앙값 종양 발광에 의해 측정된 바와 같은 이러한 피하 연구에서의 종양 용적 결과를 제공한다. 도 8, 패널 B는 표시된 바와 같이 4개의 처리 군에서 표시된 4가지 처리 조건에서 중앙값 종양 발광에 의해 측정된 바와 같은 이러한 피하 연구에서의 종양 용적의 결과를 제공한다. STK-009의 투여량 증가가 이미 1 μg의 STK-009를 투여받은 마우스에서 항종양 효능을 증진시킬 수 있는지 여부를 다루기 위해, 제50일에 투여량을 10 μg으로 증가시켰다 (도 8, 패널 B, 좌측 하단). 용량을 1 μg에서 10 μg으로 증가시킨 후 종양 부담의 유의미한 감소가 관찰되었다.
도 9는 표시된 바와 같은 각각의 처리 군에서 동물의 생존에 대한 카플란-마이어 생존 플롯이다. 이러한 데이터에 의해 입증된 바와 같이, CD19_28z 오르토CAR T 세포와 STK-009의 조합 처리는 PBS 및 CD19_28z 오르토CAR T 세포 처리 단독과 비교하여 마우스의 생존을 상당히 연장시켰다.
도 10은 피하 RAJI 고형 종양에서 CAR-T 침윤의 면역조직화학 분석의 10x (40x 삽입) 현미경 사진이다. 이들 슬라이드로부터 예시된 바와 같이, STK-009는 SC RAJI 종양의 CAR-T 침윤 및 종양 거부를 유도한다. 그 분석은 고 용량 STK-009로 처리된 종양에서 생육가능한 RAJI 세포가 없음을 나타내었다.
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110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu 130 135 140 Lys Pro Gly Ala Ser Val Met Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser 145 150 155 160 Phe Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Asn Ile Gly Lys Ser 165 170 175 Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr 180 185 190 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser 195 200 205 Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 210 215 220 Val Tyr Tyr Cys Val Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 50 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> A or not present <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> P or not present <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> T, C, A, G, Q, E, N, D, R, K, P, or not present <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> S or not present <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> S or not present <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> S or not present <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> T or not present <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> K or not present <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> K or not present <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Q, W, or not present <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> L, M, W, or not present <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> E, K, D, T, A, S, Q, H, or not present <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> H, N, Q, or not present <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> L, R, G, M, F, E, H, W, K, Q, S, V, I, Y, H, D, or T <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> L, A, V, I, or not present <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> D, T, S, M, L, or not present <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Q, F, E, G, A, L, M, F, W, K, S, V, I, Y, H, R, N, D, T, F, or not present <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> M, A, W, H, Y, F, Q, S, V, L, T, or not present <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> G, K, S, or not present <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> R, W, or G <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> M, L, or V <220> <221> MOD_RES <222> (42)..(42) <223> F or K <220> <221> MOD_RES <222> (51)..(51) <223> T, I, or not present <220> <221> MOD_RES <222> (55)..(55) <223> H or Y <220> <221> MOD_RES <222> (74)..(74) <223> Q, N, H, or S <220> <221> MOD_RES <222> (80)..(80) <223> L, F, or V <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(81) <223> R, I, D, Y, T, or not present <220> <221> MOD_RES <222> (85)..(85) <223> L or V <220> <221> MOD_RES <222> (86)..(86) <223> I or V <220> <221> MOD_RES <222> (89)..(89) <223> I or V <220> <221> MOD_RES <222> (91)..(91) <223> V, R, or K <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(92) <223> I or F <220> <221> MOD_RES <222> (97)..(97) <223> K or Q <220> <221> MOD_RES <222> (104)..(104) <223> M or A <220> <221> MOD_RES <222> (109)..(109) <223> D, C, or a non-natural amino acid with an activated side chain <220> <221> MOD_RES <222> (113)..(113) <223> T or N <220> <221> MOD_RES <222> (125)..(125) <223> C, A, or S <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(126) <223> Q, H, M, K, C, D, E, G, I, R, S, or T <220> <221> MOD_RES <222> (130)..(130) <223> S, T, or R <400> 50 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Gln Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Leu Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Ile Leu Asn Xaa Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Xaa Xaa Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Xaa Glu Leu Lys Xaa Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Xaa Ser Lys Asn Phe His Xaa 65 70 75 80 Xaa Pro Arg Asp Xaa Xaa Ser Asn Xaa Asn Xaa Xaa Val Leu Glu Leu 85 90 95 Xaa Gly Ser Glu Thr Thr Phe Xaa Cys Glu Tyr Ala Xaa Glu Thr Ala 100 105 110 Xaa Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Xaa Xaa Ser Ile 115 120 125 Ile Xaa Thr Leu Thr 130 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic His tag <220> <221> SITE <222> (1)..(6) <223> This sequence may encompass 3-6 residues <400> 51 His His His His His His 1 5 <210> 52 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 52 His His His His His His 1 5 <210> 53 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (70)..(70) <223> Q or Y <220> <221> MOD_RES <222> (73)..(73) <223> T, D, or Y <220> <221> MOD_RES <222> (133)..(133) <223> H, D, E, or K <220> <221> MOD_RES <222> (134)..(134) <223> Y, F, E, or R <400> 53 Ala Val Asn Gly Thr Ser Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala 1 5 10 15 Asn Ile Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser 20 25 30 Cys Gln Val His Ala Trp Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys 35 40 45 Glu Leu Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu 50 55 60 Gly Ala Pro Asp Ser Xaa Lys Leu Xaa Thr Val Asp Ile Val Thr Leu 65 70 75 80 Arg Val Leu Cys Arg Glu Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln 85 90 95 Asp Phe Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu 100 105 110 Gln Val Val His Val Glu Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile 115 120 125 Ser Gln Ala Ser Xaa Xaa Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg 130 135 140 Thr Leu Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu 145 150 155 160 Lys Gln Lys Gln Glu Trp Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr 165 170 175 Gln Tyr Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr 180 185 190 Thr Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala 195 200 205 Ala Leu Gly Lys Asp Thr 210 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Gly Gly Tyr Leu Arg Gln 1 5 <210> 55 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Gly Gly Tyr Leu Lys Gln 1 5 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Gly Gly Tyr Arg His Gln 1 5 <210> 57 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 caactgagcc agttactggt gctcttaaag gccattttga atggaattaa taattacaag 60 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Gly Gly Tyr Phe Lys Gln 1 5 <210> 59 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Gly Gly Tyr Leu Pro Gln 1 5 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Gly Gly Tyr Met Pro Gln 1 5 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Gly Gly Tyr Asp Lys Pro His 1 5 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu 1 5 10 <210> 63 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Tyr Phe Thr Tyr 1 <210> 64 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Tyr Asp Pro Tyr 1 <210> 65 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Tyr Ser Glu Glu 1 <210> 66 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 66 tatagtcagc gccacccatg tacaggatgc aactcctgtc 40 <210> 67 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 tatagggccc tatcaagtca gtgttgagat g 31 <210> 68 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 caaagaaaac acagctacaa ctggagcagt tactggtgct cttaaaggc 49 <210> 69 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 69 gcctttaaga gcaccagtaa ctgctccagt tgtagctgtg ttttctttg 49 <210> 70 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 70 cagctacaac tgagccattt actggtgctc ttaaa 35 <210> 71 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 71 tttaagagca ccagtaaatg gctcagttgt agctg 35 <210> 72 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 72 ctgagccagt tactgctgct cttaaaggcc 30 <210> 73 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 73 ggcctttaag agcagcagta actggctcag 30 <210> 74 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 74 aactgagcca gttactggtg gatttaaagg ccattttgaa tg 42 <210> 75 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 75 cattcaaaat ggcctttaaa tccaccagta actggctcag tt 42 <210> 76 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 76 tgagccagtt actggtgctc ttacaggcca ttttga 36 <210> 77 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 77 tcaaaatggc ctgtaagagc accagtaact ggctca 36 <210> 78 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 78 ctggtgctct taaagatgat tttgaatgga attaa 35 <210> 79 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 79 ttaattccat tcaaaatcat ctttaagagc accag 35 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 80 cacagctaca actgtcgcat ttactgctgg 30 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 81 ccagcagtaa atgcgacagt tgtagctgtg 30 <210> 82 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 82 gctacaactg gagcagttac tgctggattt ac 32 <210> 83 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 gtaaatccag cagtaactgc tccagttgta gc 32 <210> 84 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 84 ctggagcatt tactggtgga tttacagatg attttg 36 <210> 85 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 85 caaaatcatc tgtaaatcca ccagtaaatg ctccag 36 <210> 86 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 86 gagcatttac tgctgctatt acagatgatt ttg 33 <210> 87 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 87 caaaatcatc tgtaatagca gcagtaaatg ctc 33 <210> 88 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 88 catttactgc tggatttaaa gatgattttg aatgg 35 <210> 89 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 89 ccattcaaaa tcatctttaa atccagcagt aaatg 35 <210> 90 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 90 ctggagcatt tactgctgga tttacaggcg attttgaatg gaattaataa ttaca 55 <210> 91 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 91 tgtaattatt aattccattc aaaatcgcct gtaaatccag cagtaaatgc tccag 55 <210> 92 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 92 caaagaaaac acagctacaa ctgagccagt tactgctgga tttacagatg 50 <210> 93 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 93 catctgtaaa tccagcagta actggctcag ttgtagctgt gttttctttg 50

Claims (24)

  1. 하기 단계를 포함하는, 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유류 대상체에서 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법:
    (a) 대상체로부터 소정량의 면역 세포를 단리하는 단계;
    (b) 단리된 면역 세포에 의한 핵산 서열의 흡수를 위한 조건 하에 상기 단리된 양의 단리된 면역 세포를 상기 핵산 서열과 접촉시키는 단계로서, 상기 핵산 서열은 막횡단 수용체를 코딩하고, 상기 막횡단 수용체는 세포외 도메인과 작동가능하게 소통하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 수용체의 상기 세포외 도메인은 직교 hCD122의 ECD 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 것인 단계;
    (c) 단계 (b)로부터의 단리된 양의 세포를 단계 (b)의 접촉에 의해 형질도입된 세포의 증식을 유도하기에 충분한 양의 직교 리간드와 생체외에서 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉은 형질도입된 세포가 집단의 세포의 적어도 20%를 차지하도록 하는 기간 동안 적용되는 것인 단계;
    (d) 치료상 유효 용량의 직교 리간드의 투여와 조합하여 단계 (c)로부터 생산된 세포 집단의 세포의 치료상 유효량을 포유류 대상체에게 투여하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 집단이 골수 세포, 림프구, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 종양 침윤 림프구 (TIL), T 세포, CD8+ T 세포, CD25+CD8+ T 세포, CAR-T 세포, NK 세포, CD4+ T 세포 및 Treg로 이루어진 군으로부터 선택된 종 인간 면역 세포 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 (a) 후에 그러나 단계 (b) 전에, 세포의 집단이, 활성화된 면역 세포 또는 항원 경험 T 세포에 대해 상기 집단을 강화시키도록 생체외에서 조작되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 직교 hCD122 또는 그의 기능적 단편이 야생형 hCD122에 따라 넘버링된 위치 133 및/또는 134에서의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 접촉이 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열의 흡수를 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, CAR을 코딩하는 핵산 서열 및 수용체를 코딩하는 핵산 서열이 별도의 벡터 상에 제공되며, 각각의 핵산 서열은 포유류 면역 세포에서 작동가능한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, CAR을 코딩하는 핵산 서열 및 수용체를 코딩하는 핵산 서열이 단일 벡터 상에 제공되는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 핵산 서열이 동일한 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 벡터가 T2A 코딩 서열의 IRES 요소에 의해 분리된 2개의 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 벡터가 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 생체외에서 이용된 직교 리간드가 단계 (c)에서 생체내에서 사용된 직교 리간드와 상이한 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d) 전에 대상체가 림프고갈 레지멘으로 치료받는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서 투여되는 초기 용량이 대상체의 체중 kg당 100,000 내지 1,000,000개의 활성화 면역 세포인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 직교 리간드의 투여가 적어도 2주의 기간 동안 대상체의 체중 kg당 100,000 내지 1,000,000개의 활성화 면역 세포의 수준을 유지하도록 대상체에게 주기적으로 투여되는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 직교 리간드가 잔류 종양의 실질적인 징후가 없는 지점까지 투여되며, 이때 직교 리간드의 용량은 관찰 후 적어도 3개월의 기간 동안 체중 kg당 대략 10,000 내지 100,000개의 세포의 낮은 순환 수준의 직교 면역 세포를 유지하기에 충분한 수준으로 감소되는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 직교 리간드가 잔류 종양의 실질적인 징후가 없는 지점까지 투여되며, 이때 직교 리간드의 투여가 종료되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 환자가 면역 세포 요법의 초기 과정으로부터 재발하는 경우, 부가의 용량의 직교 조작된 세포의 부재 하에 직교 리간드의 치료상 유효량을 재발 중 환자에게 투여하여 직교 리간드가 이전에 투여된 직교 세포의 활성화 및/또는 증식을 유도하도록 하는 단계로서, 이러한 직교 리간드는 재발된 종양의 완화가 관찰될 때까지 소정의 기간 동안 대상체에게 적용되는 것인 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 질환, 장애 또는 병태가 신생물성 질환인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 질환, 장애 또는 병태가 만성 바이러스성 질환인 방법.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 질환, 장애 또는 병태가 염증성 질환인 방법.
  22. 하기 단계를 포함하는 프로세스에 의해 수득된 활성화된 직교 면역 세포의 집단에 대해 실질적으로 강화된 세포 산물:
    (a) 포유류 대상체로부터 소정량의 면역 세포를 단리하는 단계;
    (b) 단리된 면역 세포에 의한 핵산 서열의 흡수를 위한 조건 하에 상기 단리된 양의 단리된 면역 세포를 상기 핵산 서열과 접촉시키는 단계로서, 상기 핵산 서열은 막횡단 수용체를 코딩하고, 상기 막횡단 수용체는 세포외 도메인과 작동가능하게 소통하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 수용체의 상기 세포외 도메인은 직교 hCD122의 ECD 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 것인 단계;
    (c) 단계 (b)로부터의 단리된 양의 세포를 단계 (b)의 접촉에 의해 형질도입된 세포의 증식을 유도하기에 충분한 양의 직교 리간드와 생체외에서 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉은 형질도입된 세포가 집단의 세포의 적어도 20%를 차지하도록 하는 기간 동안 적용되는 것인 단계.
  23. 제22항에 있어서, 세포 산물이 골수 세포, 림프구, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 종양 침윤 림프구 (TIL), T 세포, CD8+ T 세포, CD25+CD8+ T 세포, CAR-T 세포, NK 세포, CD4+ T 세포 및 Treg로 이루어진 군으로부터 선택된 종 인간 면역 세포 중 하나 이상을 포함하는 것인 세포 산물.
  24. 제23항에 있어서, 세포 산물이 상기 세포의 내인성 TCR 도메인이 결실되도록 추가로 조작되는 것인 조성물.
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