JP2023511274A - Ｉｌ２オルソログおよび使用法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、オルソゴナル受容体を提供する。いくつかの態様では、オルソゴナル受容体は、オルソゴナルCD122である。いくつかの態様では、オルソゴナル受容体は、オルソゴナルヒトCD122（hCD122）である。いくつかの態様では、オルソゴナル受容体は、少なくとも1つのSTAT3結合モチーフを含むオルソゴナルCD122である。TIFF2023511274000073.tif211169

Description

関連特許出願の相互参照
本出願は、2020年1月14日に出願された米国仮特許出願第62/961,200号；2020年4月24日に出願された米国仮特許出願第63/015,476号；および2020年4月27日に出願された米国仮特許出願第63/016,256号の各々に対する優先権の恩典を主張するものであり、それら仮特許出願の各々は、すべての目的のために参照により組み入れられる。
発明の背景
養子細胞療法は、ヒト対象の疾患の処置において有効性を有する治療法として報告されてきた。いくつかの例では、細胞療法は、患者からの切除腫瘍組織から得たエクスビボ拡大増殖された腫瘍浸潤リンパ球（TIL）を含む細胞製品の投与を伴う。例えば、Rosenbergの1992年6月30日に発表された米国特許第5,126,132A号（特許文献1）、およびSpiess, et al (1987) J Natl Cancer Inst 79:1067-1075（非特許文献1）を参照されたい。このレジメンに実質的に従って養子TIL療法で処置された転移性黒色腫を患っている対象は、いくつかの第I/II相臨床試験において50％前後の客観的腫瘍応答を得た。例えば、Rosenberg, et al. (2011) Clin Cancer Res 17:4550-4557（非特許文献2）；Andersen, et al. (2016) Clin Cancer Res 22:3734-3745（非特許文献3）；およびBesser, et al (2013) Clin Cancer Res 19:4792-4800（非特許文献4）を参照されたい。黒色腫患者にて観察されたTIL療法の成功を元に、他の研究者は、子宮頸がん（Stevanovic, et al (2015) J Clin Oncol 33:1543-1550（非特許文献5））、腎細胞がん（Andersen, et al (2018) Cancer Immunol Res 6:222-235（非特許文献6））、乳がん（Lee, et al (2017) Oncotarget 8:113345-113359（非特許文献7））、非小細胞肺がん（Ben-Avi, et al (2018) Cancer Immunol Immunother 67:1221-1230（非特許文献8））、消化器がん（Turcotte (2013) J Immunol 191:2217-2225（非特許文献9）およびTurcotte, et al (2014) Clin Cancer Res 20:331-343（非特許文献10））、胆管がん（Tran, et al (2014) Science 344:641-645（非特許文献11））、膵臓がん（Hall, et al (2016) J Immunotherapy Cancer 4:61（非特許文献12））、頭頸部がん（Junker, et al (2011) Cytotherapy 13:822-834（非特許文献13））および卵巣がん（Fujita, et al (1995) Clin Cancer Res 1: 501-507（非特許文献14））を非限定的に含めた、多種多様な他の腫瘍タイプからTILを得ることが可能であることを実証した。
多種多様な操作された免疫細胞（例えば、T細胞、NK細胞およびTIL）がヒト疾患の免疫療法的処置のために開発されてきた。ヒト免疫細胞は、がん細胞、細胞内病原体および自己免疫に関与する細胞の認識および殺傷などの治療用途において使用するために操作されてきた。操作された細胞療法のがんの処置における使用は、特異的な機能を提供すると共にがん細胞を選択的に攻撃するように指向される操作された細胞（T細胞など）の選択的活性化および拡大増殖によって容易になる。養子免疫療法のいくつかの例では、T細胞が、対象の血液または腫瘍組織から単離され、エクスビボで処理され、対象に再注入される。それゆえ、そのような標的とされる操作された細胞集団の選択的活性化を可能にする組成物および方法が望ましい。
養子細胞療法の臨床適用に関する課題は、対象への投与後にその治療有効性を維持および最大限に高めるために、養子移入された細胞の生存能力を維持することである。対象への投与後の養子移入された細胞の生存能力の維持の成功は、そのような養子細胞療法に対する臨床応答を容易にする。養子細胞療法レジメンで対象に投与された細胞は、投与後、対象において数ヶ月またはさらには数年検出可能であり得るが、投与された細胞のかなりの割合（典型的には、大部分）は、休止状態になり、これらの細胞は、治療的抗腫瘍有効性を喪失している。そのような養子移入された細胞の活性の喪失は、しばしば、新生物疾患の再発または再燃を含めた、臨床的有効性の喪失と相関する。
ヒト対象における臨床実践において、養子移入された細胞（例えば、TIL療法およびCAR-T細胞などの操作されたT細胞）を支援するために、対象への投与後の養子移入された細胞の生存能力を支援するための一般的に用いられている手段は、多能性サイトカインであるインターロイキン-2の全身投与である。ヒトインターロイキン2（IL2）は、133個のアミノ酸の4アルファ-ヘリックスバンドルサイトカインである。IL2は、IL2、IL-4、IL-7、IL 9、IL-15およびIL21を含む、サイトカインのIL2ファミリーのメンバーである。hIL2のアミノ酸配列（SEQ ID NO：1）は、GenbankにおいてアクセッションロケータNP_000577.2で見いだされる。IL2は、抗原活性化T細胞によって産生され、免疫系に対して広範囲の効果を発揮し、免疫活性化、抑制の両調節および恒常性において重要な役割を果たす。IL2は、活性化Tリンパ球の増殖および拡大増殖を促進し、ナイーブT細胞の増殖および活性化を誘導し、B細胞の成長を高め、そして、NK細胞の増殖および拡大増殖を促進する。臨床経験は、HD-IL2処置がナイーブT細胞およびNK細胞を活性化することを実証している。前臨床実験は、NK細胞が、IL2媒介急性毒性の支配的メカニズムに関係しているとした。Assier, et al. (2004) J Immunol 172:7661-7668（非特許文献15）。HD-IL2の投与はまた、CD8+ T細胞の活性を媒介するCD25+制御性T細胞（Treg）の拡大増殖を刺激する。NKおよびTregの拡大増殖は、CRSなどのさらなる毒性をもたらすと従来より考えられている。
操作された腫瘍浸潤リンパ球（「TIL」）またはCAR-T細胞の注入と同時またはその直後に用いる、TILまたはCAR-T細胞を使用した現在の養子細胞療法の典型的な臨床実践では、対象は、静脈内高用量hIL2（HD-hIL2）（720,000IU/kgのhIL2）を、対象がその処置に耐容性を示す限り、8時間毎に摂取する。この養子細胞療法と併せたHD-hIL2の投与は、操作された細胞製品の生存性および臨床的有効性をさらに増強すると考えられる。Anderson, et al (2016) Clinical Cancer Research 22:3734-3745（非特許文献3）。ヒトIL2（hIL2）の一般的に使用されている形態は、成熟hIL2分子の125位にあるシステインがセリンに置換された（C125S）hIL2類似体である、アルデスロイキン（Proleukin（登録商標））である。
しかしながら、hIL2の全身投与は、養子移入された細胞の集団を超越する非特異的な刺激作用を伴い、また、特に高用量では、ヒト対象において重大な毒性を伴う。養子細胞療法レジメンの支援において使用されるような高用量hIL2の作用は、ヒト対象において重大な毒性をもたらすと報告されている。養子細胞移入（ACT）と併せたHD-hIL2の投与から観察される最も多く見られる副作用としては、全身性の炎症および毛細血管漏出症候群に起因する悪寒、高熱、低血圧、乏尿および浮腫、ならびに白斑またはブドウ膜炎などの自己免疫現象の報告が挙げられる。HD-hIL2に関連する毒性は、専門的管理を必要とし、それゆえ、典型的には、HD-hIL2は病院において用いられ、しばしば集中治療室への入室を求められる。Dutcher, et al. (2014) J Immunother Cancer 2(1): 26（非特許文献16）。HD-hIL2処置は、中親和性受容体（CD122/CD132）を優勢発現するナイーブT細胞およびNK細胞、ならびに高親和性三量体受容体（CD25/CD122/CD132）を発現するCD25+制御性T細胞（Treg）を含めた、ほとんどのリンパ系細胞を活性化する。HD-hIL2単剤療法はまた、死に至る恐れのある全身性毛細血管漏出症候群を誘発し得る。このことから、HD-IL2療法の使用は、正常な心機能および肺機能を有する若くて極めて健康な患者にほぼ限定される。HD-IL2療法は、典型的には、病院において用いられ、しばしば集中治療室への入室を求められる。VLSの症状を改善するために一酸化窒素合成酵素阻害剤が提案されてきたが、VLSが観察された場合の慣行は、IL2療法の使用中止である。HD IL2処置に関連するVLSを軽減するために、低用量IL2レジメンが患者で試験されてきた。低用量IL2処置レジメンはVLS毒性を部分的に軽減する一方で、このより低い毒性は、新生物の処置では最適な治療結果を犠牲にして達成された。
さらには、hIL2の臨床的に承認された形態（例えば、Proleukin（登録商標））は、比較的短いインビボ寿命（おおよそ数時間）を有し、このことから、操作されたT細胞のIL2への十分な曝露を維持するためにIL2を頻繁に投薬して、細胞を活性化状態に保つ必要がある。そのインビボ寿命を延ばすためのIL2の修飾が文献に記載されているが（例えば、PEG化、1993年4月27日に発表されたKatreらの米国特許第5,206,344号（特許文献2）、Meyers, et al. (1991) Clinical Pharmacology and Therapeutics 13(1):307-313（非特許文献17））、野生型hIL2のそのような長期作用型の投与は、それにもかかわらず、親分子に似た毒性への懸念を提示し、そのような作用物質の長期曝露は、そのような毒性を悪化させることにつながる可能性がある。したがって、細胞ベース療法に関する重大な課題は、操作された細胞に、内因性のシグナル伝達経路によるモジュレーションから独立している、標的でない内因性細胞と最小限の交差反応性しか示さない、かつ操作された細胞集団を対象に投与した後に選択的に制御することができる、所望の調節可能な増殖性の挙動シグナルを付与することである。
現行では、養子細胞療法製品の投与前に、対象は、リンパ球枯渇準備レジメンおよび後続のインターロイキン-2（IL-2）支援に供される。細胞療法レジメンでの細胞の用量は、通常非常に高いので（通常、現在のCD19 CAR T製品について106～108個の範囲の細胞を単回投与）、リンパ球枯渇準備レジメンは、Tregを枯渇させ、細胞「シンク」を取り除き、養子移入された細胞のための「部屋」を提供すると考えられる。しかしながら、リンパ球枯渇は、患者を環境因子に対して脆弱にすることにより、患者を著しくに弱める。したがって、細胞療法との関連でリンパ球枯渇レジメンを回避することは、患者に大きな恩恵をもたらすだろう。
細胞療法製品の製造に関する課題は、そのような「生きた薬」が、生存能力および機能性を保つためにそれらの環境の厳密な制御を必要とすることである。実際に、単離された細胞は、患者に由来する（自家）か単一ドナー源に由来する（同種異系）かを問わず、対象または制御された培養条件から取り出された後、急速に機能を喪失し始める。対象または制御された培養条件の外部にある間の、単離された細胞の生存能力の維持の成功は、単離された細胞が、細胞製品製造ワークフローへのまたは患者への再挿入のための機能性を取り戻すことを可能にする。養子細胞療法において使用するための細胞のエクスビボ調製の間、細胞は、しばしば外因性hIL2の存在下で培養される。hIL2の作用は、操作された免疫細胞と操作されていない免疫細胞の両方を含む混合細胞集団中の操作された細胞に非特異的であるので、このIL2への曝露は、細胞集団中の所望の治療上有用な細胞（例えば、CAR-T細胞または抗原を経験したTIL）の拡大増殖だけでなく、単離された組織（例えば、新生物または血液）試料からの、臨床的有益性をもたらさず、操作された細胞製品の投薬を複雑にし、毒性に寄与し得る、多様な所望でないバックグラウンド細胞の拡大増殖も導く。したがって、自家細胞移入において有用な細胞の調製のための現在のエクスビボ拡大増殖法は、所望の治療上有用な細胞の割合が所望でない細胞で損なわれている細胞製品をもたらし、その結果、最適でない細胞製品を生じさせる。重大な毒性は、現在のACTプロトコルに関する引き続き重要な課題であるので、ACT療法において使用するための所望の効果的な細胞（例えば、CAR-T細胞または抗原を経験したTIL）が濃縮されたより均質な細胞集団を含む細胞製品の調製を可能にする方法が望ましい。
加えて、現在の細胞療法は、その複雑な性質および患者が主要医療施設またはその近傍に長期間留まることをしばしば要求する関連毒性の管理が原因で、非常に高価である。大用量の細胞治療薬の製造もまた複雑で時間がかかる。自家細胞療法の患者細胞の抽出からその操作されたバージョンの再注入までの時間（いわゆる「静脈から静脈への（vein-to-vein）」時間）を減少させることに多くの努力が傾けられており、この時間は、現在のところ大体3週間である。同種異系または「オフザシェルフ」の操作されたT細胞が、この療法における遅延を回避するために、またそのような個別化細胞療法に関連する費用を浮かせるために、現在調査中である。現在の細胞療法の持続性の欠如はまた、操作された細胞の大用量の要求にもつながり、これはさらに費用を増加させ、静脈から静脈への時間のさらなる遅延をもたらす。その実証された治療有用性および将来性にもかかわらず、細胞療法の費用は、限りある資源の医療制度に大きな負担をかけ、したがって、必要な患者へのそのより広範な利用可能性を限定する効果を有し得る。本開示の組成物および方法は、これらの課題の多くに取り組む。
CD122は、中親和性および高親和性のIL2受容体複合体の一成分である。Sockoloskyら（Science (2018) 359: 1037-1042）（非特許文献18）およびGarciaら（2018年8月16日に公開された米国特許出願公報US2018/0228841A1（特許文献3））は、オルソゴナル受容体、とりわけオルソゴナルCD122を発現するように操作された細胞の選択的刺激を容易にするためのオルソゴナルIL2/CD122リガンド／受容体系を記載している。本特許出願は、WO 2019/104092（特許文献4）およびUS 2018-0228842 A1（特許文献5）の開示を参照することによりその全体を組み入れる。オルソゴナルCD122を発現する操作されたT細胞と、そのようなオルソゴナルCD122に同族の対応するオルソゴナルリガンド（「IL2オルソログ」）との接触は、そのようなオルソゴナルCD122を発現する操作されたT細胞の特異的活性化を容易にする。特に、このオルソゴナルIL2受容体リガンド複合体は、混合細胞集団、特に混合T細胞集団における、オルソゴナル受容体を発現するように操作された細胞の選択的拡大増殖を提供する。
米国特許第5,126,132A号 米国特許第5,206,344号 米国特許出願公報US2018/0228841A1 WO 2019/104092 US 2018-0228842 A1
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本開示は、養子細胞療法の実施において有用な方法および組成物を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体を提供する。いくつかの態様では、オルソゴナル受容体は、オルソゴナルCD122である。いくつかの態様では、オルソゴナル受容体は、オルソゴナルヒトCD122（hCD122）である。いくつかの態様では、オルソゴナル受容体は、少なくとも1つのSTAT3結合モチーフを含むオルソゴナルCD122である。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナルhCD122受容体をコードする核酸配列を含む、組換えベクターを提供する。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナルhCD122受容体およびCARをコードする核酸配列を含む、組換えベクターを提供する。いくつかの態様では、CAR。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナルhCD122受容体をコードする核酸配列およびCARをコードする核酸配列を含む、組換え哺乳動物免疫細胞を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体に対する同族リガンドであるオルソログを提供する。いくつかの態様では、オルソログは、IL2オルソログである。いくつかの態様では、IL2オルソログは、オルソゴナルCD122受容体に対するリガンドである。いくつかの態様では、IL2オルソログは、オルソゴナルhCD122受容体の細胞外ドメインを含む膜貫通受容体タンパク質に対する同族リガンドである。いくつかの態様では、IL2オルソログは、H133およびY134位にアミノ酸置換を含むオルソゴナルhCD122受容体の細胞外ドメインを含む膜貫通受容体タンパク質に対する同族リガンドである。いくつかの態様では、IL2オルソログは、H133およびY134位にアミノ酸置換を含むオルソゴナルhCD122に対するリガンドである。いくつかの態様では、IL2オルソログは、アミノ酸置換H133DおよびY134Fを含むオルソゴナルhCD122に対するリガンドである。
いくつかの態様では、本開示は、式1のhIL2オルソログを含む、薬学的に許容される製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、式1のhIL2オルソログをコードする核酸配列を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、式1のhIL2オルソログをコードする核酸配列を含む、組換えベクターを提供する。
いくつかの態様では、本開示は、式1のhIL2オルソログをコードする核酸配列を含む組換えベクターの薬学的に許容される製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、組換えベクターを含む組換え改変された哺乳動物細胞であって、ベクターが式1のhIL2オルソログをコードする核酸配列を含む、哺乳動物細胞を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体を発現するように組換え改変されたオルソゴナル哺乳動物免疫細胞（オルソゴナル免疫細胞）を提供する。いくつかの態様では、オルソゴナル免疫細胞において、免疫細胞は、T細胞である。いくつかの態様では、T細胞は、ナイーブCD8+ T細胞、細胞傷害性CD8+ T細胞、ナイーブCD4+ T細胞、ヘルパーT細胞、例えば、TH1、TH2、TH9、TH11、TH22、TFH；制御性T細胞、例えば、TR1、Treg、誘導性Treg；メモリーT細胞、例えば、セントラルメモリーT細胞、エフェクターメモリーT細胞、NK細胞、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、ならびにCAR-T細胞、組換え改変TILおよびTCR操作細胞を非限定的に含むそのようなT-細胞の操作されたバリアントから選択される。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナルTreg細胞を提供する。本発明はさらに、対象においてオルソゴナルTregの増殖および／または活性化を引き起こすのに十分なオルソゴナルリガンドの投与と組み合わせた、オルソゴナルTregの治療有効量の投与による、対象における免疫抑制を誘導する方法を提供する。いくつかの態様では、オルソゴナルTregは、任意で、ターゲティングドメイン（例えば、操作されたTCRまたはCAR）を提供する。いくつかの態様では、オルソゴナルTregは、オルソゴナルCAR-Treg（oCAR-Treg）である。いくつかの態様では、oCAR-TregのCARのABDは、ヒト第VIII因子に特異的に結合する。いくつかの態様では、oCAR-TregのCARのABDは、同種抗原に特異的に結合する。いくつかの態様では、oCAR-TregのCARのABDは、HLA-A2に特異的に結合する。いくつかの態様では、oCAR-Tregは、CD19-oCAR-Tregである。オルソゴナルTregは、炎症性疾患に関連する疾患の処置において有用である。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナルNK細胞を提供する。本発明はさらに、対象においてオルソゴナルTregの増殖および／または活性化を引き起こすのに十分なオルソゴナルリガンドの投与と組み合わせた、オルソゴナルNK（oNK）細胞の治療有効量の投与による、対象における新生物疾患を処置する方法を提供する。いくつかの態様では、oNK細胞は、任意で、ターゲティングドメイン（例えば、操作されたTCRまたはCAR）を提供する。いくつかの態様では、オルソゴナルNK細胞は、オルソゴナルCAR-NK細胞（oCAR-NK細胞）である。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナルCD122ポリペプチドを発現するように組換え改変された哺乳動物免疫細胞を提供する。いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナルhCD122の細胞外ドメインを含むオルソゴナル受容体を発現するように組換え改変された哺乳動物細胞を提供する。いくつかの態様では、本開示は、H133およびY134位にアミノ酸置換を含むCD122の細胞外ドメインを含むオルソゴナル受容体を発現するように組換え改変された哺乳動物細胞を提供する。いくつかの態様では、本開示は、H133およびY134位にアミノ酸置換を含むオルソゴナルhCD122を発現するように組換え改変された哺乳動物細胞を提供する。いくつかの態様では、本開示は、アミノ酸置換H133DおよびY134Fを含むオルソゴナルhCD122を発現するように組換え改変された哺乳動物細胞を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体を発現する哺乳動物細胞においてシグナルを誘導するための、オルソゴナル受容体およびその同族オルソゴナルリガンド（オルソログ）の使用の方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体を発現するように操作された哺乳動物細胞において応答を引き起こす方法であって、オルソゴナル受容体を発現する操作された哺乳動物細胞を同族オルソゴナルリガンド（オルソログ）の有効量と接触させることを含み、そのような接触によって引き起こされる応答が、操作された細胞の活性化、操作された細胞の活性化状態の維持および／または操作された細胞の増殖である、方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体を発現するように操作された哺乳動物細胞において応答を引き起こす方法であって、オルソゴナル受容体を発現する操作された哺乳動物細胞を同族オルソゴナルリガンド（オルソログ）の有効量と接触させることを含み、そのような接触によって引き起こされる応答が、操作された細胞におけるSTAT5リン酸化および／またはSTAT3リン酸化の増加である、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体を発現するように操作された哺乳動物免疫細胞において応答を引き起こす方法であって、オルソゴナル受容体を発現する操作された哺乳動物細胞を同族オルソゴナルリガンド（オルソログ）の有効量と接触させることを含み、接触が、エクスビボ（インビトロ）で実施され、そのような接触によって引き起こされる応答が、操作された細胞の活性化、操作された細胞の活性化状態の維持および／または操作された細胞の増殖の誘発である、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、操作された細胞が実質的に濃縮された操作された免疫細胞製品を調製する方法であって、（a）対象から免疫細胞の混合集団を単離する工程；（b）該単離された免疫細胞の集団の一部に、トランスフェクトされる細胞においてオルソゴナル受容体の発現を達成可能な組換えベクターをトランスフェクトする工程；（c）該混合免疫細胞集団を、オルソゴナル受容体のECDに特異的に結合するオルソゴナルリガンドの存在下で、オルソゴナル受容体を発現する細胞が選択的に増殖して細胞集団からオルソゴナル受容体を発現する細胞が濃縮されるように、培養する工程を含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体を発現するように操作された哺乳動物免疫細胞において応答を引き起こす方法であって、オルソゴナル受容体を発現する操作された哺乳動物細胞を同族オルソゴナルリガンド（オルソログ）の有効量と接触させることを含み、そのような接触によって引き起こされる応答が、操作された細胞の活性化、操作された細胞の活性化状態の維持および／または操作された細胞の増殖である、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体を発現する哺乳動物細胞において応答を引き起こす方法であって、オルソゴナル受容体を発現する哺乳動物細胞をエクスビボ（インビトロ）で同族オルソゴナルリガンド（オルソログ）と応答を引き起こすのに十分な量で接触させることを含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体を発現する哺乳動物細胞において応答を引き起こす方法であって、オルソゴナル受容体を発現する哺乳動物細胞をインビボで同族オルソログリガンドと応答を引き起こすのに十分な量で接触させることを含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、第1のオルソログ（すなわち、同族リガンド）をエクスビボで、第2のオルソログをインビボで使用することを含む、使用の方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、第1のオルソログをエクスビボで、第2のオルソログをインビボで使用することを含む、使用の方法であって、第1のオルソログおよび第2のオルソログが、同じオルソログまたは異なるオルソログである、使用の方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体を発現する哺乳動物細胞の増殖を引き起こすためのオルソログの使用の方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体を発現する哺乳動物細胞の活性化を引き起こすためのオルソログの使用の方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体を発現する哺乳動物細胞の増殖を引き起こすためのエクスビボおよび／またはインビボでのオルソログの使用の方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナルCD122を発現する哺乳動物細胞の増殖を引き起こすためのIL2オルソログの使用の方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナルCD122を発現する哺乳動物細胞の活性化を引き起こすためのIL2オルソログの使用の方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、H133およびY134位にアミノ酸置換を含むCD122の細胞外ドメインを含むオルソゴナル受容体を発現するように組換え改変された哺乳動物細胞の活性化を引き起こすためのオルソログの使用の方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、H133およびY134位にアミノ酸置換を含むオルソゴナルCD122を発現するように組換え改変された哺乳動物細胞の活性化を引き起こすためのオルソログの使用の方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、アミノ酸置換H133DおよびY134Fを含むオルソゴナルCD122を発現するように組換え改変された哺乳動物細胞の活性化を引き起こすためのオルソログの使用の方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体を発現するように組換え改変された哺乳動物細胞が濃縮された細胞の集団の調製のための方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体を発現するように組換え改変された哺乳動物細胞が濃縮された哺乳動物細胞の集団を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナル受容体に対する同族リガンドであるオルソログの使用を提供する。いくつかの態様では、オルソログは、式1のオルソログである。いくつかの態様では、オルソログは、STK-007である。いくつかの態様では、オルソログは、STK-009である。
いくつかの態様では、本開示は、操作されていない中親和性（CD122/CD132）IL2受容体複合体または高親和性（CD25/CD122/CD132）IL2受容体複合体に対して減少した親和性を示し、かつ、CD25を構成的に発現する細胞（例えば、Treg）またはCD25を誘導的に発現する細胞（例えば、活性化されたCD8+ T細胞）にオルソログIL2の活性を選択的に偏向させるのに有用でもある、IL2オルソログを提供する。また、天然の野生型CD122の細胞外ドメイン（ECD）に対する親和性が有意に減少しているがCD25のECDへの結合を保持しているIL2オルソログも、高親和性IL2受容体複合体の形成を妨害することによって野生型IL2の競合的アンタゴニストとして使用でき、したがって、自己免疫疾患または移植片対宿主（GVH）疾患の処置において用いることができる。
いくつかの態様では、本開示は、修飾されたCD122ポリペプチド（オルソゴナルCD122）を含む膜貫通ポリペプチドの細胞外ドメイン（ECD）に特異的かつ選択的に結合する、IL2オルソログを提供する。IL2オルソログのオルソゴナルCD122への結合は、細胞内シグナル伝達の伝達経路に関与し、中親和性または高親和性のいずれかのIL2受容体へのIL2結合に関連する天然の細胞内シグナル伝達パターンの活性化をもたらすが、オルソゴナルCD122を発現する操作された細胞に対して選択性を示す。IL2オルソログは、野生型CD122の細胞外ドメインに対して、単独かまたはCD122が内因性の高親和性もしくは中親和性のIL2受容体の形態で存在する場合のいずれかに、CD122オルソゴナル受容体へのIL2オルソログの結合と比べて有意に低下した結合を示すことができる。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122の細胞外ドメインに対するIL2オルソログの親和性は、野生型CD122に対する野生型IL2の親和性と同等である。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122の細胞外ドメインに対するIL2オルソログの親和性は、野生型CD122の細胞外ドメインに対する野生型IL2の親和性よりも大きい。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122の細胞外ドメインに対するIL2オルソログの親和性は、野生型CD122の細胞外ドメインに対する野生型IL2の親和性よりも小さい。
本開示はさらに、本発明のIL2オルソログを製造する方法を提供する。特に、本開示は、IL2オルソログをコードする核酸配列の宿主細胞における発現を提供するために制御エレメントに機能的に連結されたIL2オルソログをコードする核酸配列を含む、組換え発現ベクターを提供する。
本発明はさらに、オルソゴナル受容体を発現する操作された哺乳動物細胞を提供する。本発明はさらに、オルソゴナル受容体を発現する操作された哺乳動物細胞の薬学的に許容される製剤を提供する。
本開示はさらに、投与剤形が、T細胞の集団を含み、T細胞の集団において、操作されたT細胞の1つまたは複数の種が実質的に濃縮されており、操作されたT細胞が、CD122オルソゴナルポリペプチドの細胞外ドメインを含む受容体を発現する、操作された細胞療法製品の薬学的に許容される投与剤形を作製する方法であって、CD122オルソゴナルポリペプチドの細胞外ドメインを含む受容体を発現する操作されたT細胞を含むT細胞の集団を、本発明のIL2オルソログの存在下、1つまたは複数のそのような操作されたT細胞の細胞集団を濃縮するのに十分な期間にわたってエクスビボ培養する工程を含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、哺乳動物細胞からのIL2オルソログの発現および分泌を容易にするために制御エレメントに機能的に連結された本明細書に記載されるIL2オルソログをコードする核酸配列を含む組換えベクターが、IL2オルソログのインサイチュー発現を提供するために対象に投与される。いくつかの態様では、組換えベクターは、がんを患っている対象に腫瘍内投与される。いくつかの態様では、組換えベクターは、組換えウイルスベクターである。いくつかの態様では、組換えウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）または組換えアデノウイルス（rAd）、例えば、いくつかの態様では、ヒトアデノウイルス血清型3および／または5に由来する複製欠損アデノウイルスである。いくつかの態様では、複製欠損アデノウイルスは、細胞周期および／またはアポトーシス経路を開始するウイルスの能力を妨害する、E1領域への1つまたは複数の改変を有する。複製欠損アデノウイルスベクターは、任意で、E3ドメイン中に欠失を含み得る。いくつかの態様では、アデノウイルスは、複製可能なアデノウイルスである。いくつかの態様では、アデノウイルスは、新生細胞中で選択的に複製するように操作された複製可能な組換えウイルスである。
本開示はさらに、膜貫通受容体タンパク質を発現する少なくとも1（あるいは2、3、4またはそれ以上）種の操作されたT細胞を含む、細胞療法製品の薬学的に許容される投与剤形を調製する方法であって、そのような膜貫通受容体タンパク質の細胞外ドメインが、CD122オルソゴナルポリペプチドの細胞外ドメインを含み、細胞療法製品中の操作された細胞の画分が、細胞療法製品中の細胞総数の少なくとも30％、あるいは少なくとも40％、あるいは少なくとも50％、あるいは少なくとも60％、あるいは少なくとも70％、あるいは少なくとも80％、あるいは少なくとも90％を含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、それを必要とする対象に細胞の集団を導入することを含む、治療的方法であって、該細胞集団が、ヒトオルソゴナルCD122のECD、膜貫通ドメイン、および該細胞膜通過ポリペプチドのECDへのリガンドの結合に応答して細胞内シグナルを提供する細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞膜通過ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、操作されたヒト免疫細胞を含み、該核酸配列が、該膜通過ポリペプチドの転写および翻訳および細胞表面提示を容易にするために発現制御エレメントに機能的に連結されている、治療的方法が提供される。そのような細胞集団は、エクスビボで改変されておりかつ対象に関して自家または同種異系である、細胞を含み得る。いくつかの態様では、治療的方法は、（1）細胞集団を、エクスビボで、ある量の同族IL2オルソログと、オルソゴナルCD122 ECDである細胞外ドメインを含む受容体を含む該操作された細胞を活性化するのに十分な濃度および期間にわたって接触させる段階；および（2）細胞集団を対象に投与する段階；および（3）操作された細胞の投与に続いて、同族IL2オルソログをインビボ投与する段階を含む。いくつかの態様では、導入された細胞集団は、操作された細胞の投与に続いて、同族オルソゴナルサイトカインとインビボで接触させる。
本開示はさらに、対象にオルソゴナルリガンドの有効量を投与することによって、オルソゴナルな操作された免疫細胞（例えば、オルソゴナルCAR-T細胞）の哺乳動物対象におけるインビボでの活性形態（「持続性」）を延長する方法を提供する。
本開示はさらに、哺乳動物対象にオルソゴナルリガンドの有効量の投与と併せてオルソゴナル免疫細胞の有効量を投与することによって、オルソゴナル免疫細胞（例えば、オルソゴナルCAR-T細胞）の哺乳動物対象におけるインビボでの増殖を特異的かつ選択的に活性化および／または誘導する方法を提供する。
本開示はさらに、哺乳動物対象にオルソゴナルCAR-T細胞上に発現される受容体に対する同族オルソゴナルリガンドの有効量の投与と組み合わせてオルソゴナルCAR-T細胞の有効量を投与することによって、新生物疾患を患っている哺乳動物対象を処置する方法を提供する。
本開示はさらに、哺乳動物対象にオルソゴナルCAR-T細胞上に発現される受容体に対する同族オルソゴナルリガンドの有効量の投与と併せてオルソゴナルCAR-T細胞の有効量を投与することによって、びまん性（非固形腫瘍）新生物疾患を患っている哺乳動物対象を処置する方法を提供する。
本開示はさらに、哺乳動物対象にオルソゴナルT細胞上に発現される受容体に対する同族オルソゴナルリガンドの有効量の投与と併せてオルソゴナルT細胞の有効量を投与することによって、固形腫瘍（例えば、リンパ腫、前立腺がん、肺がん、膀胱がん、子宮頸がんなどのHPV関連がん、神経芽腫）の存在によって特徴付けられる新生物疾患を患っている哺乳動物対象を処置する方法を提供する。
本開示はさらに、オルソゴナルリガンドの有効量を対象に投与することによって、対象における消耗したオルソゴナル免疫細胞の活性を回復させる方法を提供する。
本開示はさらに、オルソゴナルCAR-T細胞製品の投与によって特徴付けられる処置レジメンにおいて新生物疾患の再発を患っている哺乳動物対象を処置する方法であって、（i）対象に、過去に投与されたオルソゴナルCAR-T細胞の活性を回復させるのに十分な、過去に投与されたオルソゴナルCAR-T細胞上に発現される受容体に対する同族オルソゴナルリガンドの有効量を投与する工程；（ii）対象に、過去に投与されたオルソゴナルCAR-T細胞上に発現される受容体に対する同族オルソゴナルリガンドの有効量を、オルソゴナルCAR-T細胞の活性を維持するために十分な期間にわたって定期的に投与する工程；（iii）新生物疾患の存在および新生物疾患の証拠の欠如について対象を評価して、オルソゴナルリガンドの投与を中断する工程、または新生細胞の免疫監視に十分なオルソゴナルCAR-T細胞の量を維持するのに十分な維持投薬プロトコルに従ってオルソゴナルリガンドを定期的に投与することを継続する工程を含む、方法を提供する。
本開示はさらに、オルソゴナルCAR-T細胞の投与とそれに続く、新生細胞の免疫監視に十分なオルソゴナルCAR-T細胞の量を維持するのに十分な維持投薬プロトコルでのオルソゴナルCAR-T細胞上に発現される受容体に対する同族オルソゴナルリガンドの有効量の定期的投与によって、CAR-T細胞療法を用いた新生物疾患の処置における再発を予防および／または治療する方法を提供する。
本開示はさらに、オルソゴナルCAR-T細胞製品の先行投与によって特徴付けられる処置レジメンにおいて再発したまたは難治性の新生物疾患を患っている哺乳動物対象を処置する方法であって、（i）対象に、過去に投与されたオルソゴナルCAR-T細胞の活性を回復させるのに十分な、過去に投与されたオルソゴナルCAR-T細胞上に発現される受容体に対する同族オルソゴナルリガンドの有効量を投与する工程；（ii）対象に、過去に投与されたオルソゴナルCAR-T細胞上に発現される受容体に対する同族オルソゴナルリガンドの有効量を、オルソゴナルCAR-T細胞の活性を維持するために十分な期間にわたって定期的に投与して、治療的応答を達成する工程；（iii）新生物疾患の存在および新生物疾患の証拠の欠如について対象を評価して、オルソゴナルリガンドの投与を中断する工程、または新生細胞の免疫監視に十分なオルソゴナルCAR-T細胞の量を維持するのに十分な維持投薬プロトコルに従ってオルソゴナルリガンドを定期的に投与することを継続する工程を含む、方法を提供する。
本開示はさらに、新生物疾患を患っている哺乳動物対象をそのためのオルソゴナルhCD122細胞およびオルソゴナルhIL2リガンドを用いて処置する方法であって、（i）オルソゴナルhCD122細胞の投与の2週間前～1日前の期間内に、対象に、オルソゴナルCAR-T上に発現される受容体に対するオルソゴナルリガンドの治療有効用量を投与する工程（すなわち、プライミング）；（ii）対象に、オルソゴナルhCD122細胞のオルソゴナルCD122受容体に対する同族hIL2リガンドであるオルソゴナルリガンドと組み合わせて、オルソゴナルhCD122細胞の治療有効量を投与する工程、および任意で（iii）新生物疾患の存在および新生物疾患の証拠の欠如について対象を評価して、オルソゴナルリガンドの投与を中断する工程、または、オルソゴナルリガンドをその後に新生細胞の免疫監視を維持するのに十分な循環オルソゴナルCAR-T細胞のレベルを維持するのに十分な用量で投与することを継続する工程、および任意で、再発の場合には、過去に投与されたオルソゴナルhCD122細胞のオルソゴナルCD122受容体に対する同族hIL2リガンドであるオルソゴナルリガンドの治療有効量を投与する工程を含む、方法を提供する。
別の局面では、本開示は、ウイルス感染細胞の表面上に発現される抗原に特異的なターゲティングドメインを含むオルソゴナル細胞の投与によって、慢性ウイルス感染を処置する方法を提供する。本開示の組成物および方法で処置可能な慢性ウイルス感染の例としては、サイトメガロウイルス（CMV）、HTLV1、単純ヘルペスウイルス2型（HSV-2）、エプスタインバールウイルス、ヒトヘルペスウイルス6、ヒトヘルペスウイルス7、C型肝炎ウイルス（HCV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV1およびHIV2）が挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの態様では、操作されたT細胞は、チェックポイント発現を排除するようにゲノム改変される（すなわち、チェックポイントノックアウト）。そのようなチェックポイントノックアウト細胞の例としては、PD1ノックアウト（「PD1KO」）T細胞が挙げられる。PD1KO T細胞を作製するための戦略は、当技術分野において周知である。PD1KO T細胞は、当技術分野において周知である。McGowanら（121PD1 disrupted Car-T Cells In The Treatment of Solid Tumors: Promises and Challenges) Biomedicine and Pharmacotherapy Biomedicine & Pharmacotherapy, Volume 121 (2020, available online 13 NOV 2019) 109625, https://doi.org/10.1016/j.biopha.2019.109625）は、多様な臨床用途において検討されている操作されたおよび単離されたPD1KO T細胞の広範な批評を提供している（表1を参照のこと）。
オルソゴナル免疫細胞においてPD1機能を完全に排除することに代わる手段として、いくつかの態様では、本開示のオルソゴナル免疫細胞は、オルソゴナル免疫細胞におけるPD1活性のダウンレギュレーションの機序を提供する。腫瘍細胞および慢性ウイルス感染細胞上のPDL1の発現は、ヒト免疫細胞上に発現されるPD1に結合することによって、そのような細胞が免疫監視を回避するのを可能にする。複数のグループが、PD1発現をノックアウトする操作されたT細胞が効果的であることを実証しているが、これらの細胞はまた、無差別的でもあり、典型的にはPD1/PDL1相互作用の自己寛容機序によって媒介される重大な標的毒性を受けやすいので、重大な毒性を導く。いくつかの態様では、ダウンレギュレーションは、免疫細胞のその標的への結合によって開始されるシグナル伝達への応答に条件的であり、CARなどの特定のターゲティング／活性化ドメインを発現するように操作された細胞（例えば、oCAR-T細胞、oCAR NK細胞、oTCR操作T細胞）または内因性結合ドメインを発現するように操作された細胞（例えば、オルソTIL）のいずれの場合にも操作される。免疫細胞の結合によってアップレギュレーションされる因子を、オルソゴナル免疫細胞においてPD1発現制御配列を選択的にダウンレギュレーションするために用いることができ、その結果、オルソゴナル細胞がその適切な標的と相互作用したときのみPD1発現のダウンレギュレーションが起こる。いくつかの態様では、ドメインは、CAR ICDにおいて、CARの標的抗原への結合によってターゲティングドメインと標的との相互作用後にPD1発現を抑制する細胞内シグナル伝達が生じるように操作してもよく、それにより、活性化されたオルソゴナル免疫細胞は、ダウンレギュレーション、そして潜在的には、PD1とPDL1を発現する細胞、例えば、慢性ウイルス感染細胞または腫瘍細胞との相互作用によって引き起こされる免疫逃避を防ぐことが可能となる。前述したものに加えて、操作された免疫細胞のPDL1免疫調節を軽減するための他の機序を本開示のオルソゴナル免疫細胞に組み込んでもよい。例えば、2020年12月31日に公開されたBusserらの米国特許出願公報US2020/0407694A1、2018年11月15日に公開されたLiらの米国特許出願公報US20180327470A1を参照されたい。
先に考察したように、現在の細胞療法に関する重大な課題は、トランスフェクト細胞が患者に投与された後にその細胞の増殖を支援する非毒性手段の欠如である。
本開示は、ヒトオルソゴナル細胞を提供する。細胞は、哺乳動物免疫細胞がオルソゴナルhCD122受容体を発現するように1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されたオルソゴナルhCD122受容体をコードする核酸配列を含む、哺乳動物免疫細胞である。
本開示は、（a）哺乳動物免疫細胞がオルソゴナルhCD122受容体を発現するように1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されたオルソゴナルhCD122受容体をコードする核酸配列、および（b）哺乳動物免疫細胞がCARを発現するように1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されたキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸配列を含む、哺乳動物免疫細胞を提供する。
本開示は、組換え発現ベクターであって、（a）哺乳動物免疫細胞がオルソゴナルhCD122受容体を発現するように1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されたオルソゴナルhCD122受容体をコードする核酸配列、および（b）哺乳動物免疫細胞がCARを発現するように1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されたキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸配列を含む、ベクターを提供する。
本開示は、オルソゴナルCD122受容体をコードする核酸配列を含む哺乳動物免疫細胞の投与による、新生物疾患を処置する方法を提供する。
本開示は、哺乳動物免疫細胞がオルソゴナルhCD122受容体を発現するように1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されたオルソゴナルhCD122受容体をコードする核酸配列を含む哺乳動物免疫細胞の投与とhCD122受容体のECDに結合して細胞内シグナル伝達をもたらすオルソゴナルリガンドの投与とを含む、ヒト対象における新生物疾患を処置する方法を提供する。いくつかの態様では、リガンドは、哺乳動物免疫細胞の投与前に投与される。
本発明は、トランスフェクト細胞が患者に投与された後にその細胞の増殖を支援する非毒性手段の欠如である、現在の細胞療法に関する重大な課題を提供する。
本開示は、ヒトオルソゴナル細胞を提供する。細胞は、哺乳動物免疫細胞がオルソゴナルhCD122受容体を発現するように1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されたオルソゴナルhCD122受容体をコードする核酸配列を含む、哺乳動物免疫細胞である。
本開示は、（a）哺乳動物免疫細胞がオルソゴナルhCD122受容体を発現するように1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されたオルソゴナルhCD122受容体をコードする核酸配列、および（b）哺乳動物免疫細胞がCARを発現するように1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されたキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸配列を含む、哺乳動物免疫細胞を提供する。
本開示は、組換え発現ベクターであって、（a）哺乳動物免疫細胞がオルソゴナルhCD122受容体を発現するように1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されたオルソゴナルhCD122受容体をコードする核酸配列、および（b）哺乳動物免疫細胞がCARを発現するように1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されたキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸配列を含む、ベクターを提供する。
本開示は、オルソゴナルCD122受容体をコードする核酸配列を含む哺乳動物免疫細胞の投与による、新生物疾患を処置する方法を提供する。
本開示は、哺乳動物免疫細胞がオルソゴナルhCD122受容体を発現するように1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されたオルソゴナルhCD122受容体をコードする核酸配列を含む哺乳動物免疫細胞の投与とhCD122受容体のECDに結合して細胞内シグナル伝達をもたらすオルソゴナルリガンドの投与とを含む、ヒト対象における新生物疾患を処置する方法を提供する。いくつかの態様では、リガンドは、哺乳動物免疫細胞の投与前に投与される。
いくつかの態様では、以下の工程を含む、治療または予防を必要とする哺乳動物対象における疾患、障害または病態を治療または予防する方法が提供される：
（a）ある量の免疫細胞を該対象から単離する工程；
（b）該単離された量の単離された免疫細胞と核酸配列とを、該単離された免疫細胞によって該核酸配列が取り込まれる条件下で接触させる工程であって、該核酸配列が、膜貫通受容体をコードし、該膜貫通受容体が、細胞外ドメインと機能的に連絡する細胞内シグナル伝達ドメインを含み、該受容体の該細胞外ドメインが、オルソゴナルhCD122またはその機能的断片のECDを含む、工程；
（c）工程（b）からの単離された量の細胞を、エクスビボで、工程（b）の接触によって形質導入された細胞の増殖を誘導するのに十分な量のオルソゴナルリガンドと接触させる工程であって、該接触が、形質導入された細胞が集団の細胞の少なくとも20％を構成するように一定期間適用される、工程；
（d）オルソゴナルリガンドの治療有効用量の投与と組み合わせて、工程（c）から産生された細胞集団の細胞の治療有効量を該哺乳動物対象に投与する工程。
いくつかの態様では、集団は、骨髄細胞、リンパ球、末梢血単核細胞（PBMC）、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、T細胞、CD8+ T細胞、CD25+CD8+ T細胞、CAR-T細胞、NK細胞、CD4+ T細胞、およびTregからなる群より選択されるヒト免疫細胞の1つまたは複数の種を含む。
いくつかの態様では、工程（a）の後であるが工程（b）の前に、細胞の集団が、該集団から活性化免疫細胞または抗原を経験したT細胞が濃縮されるようにエクスビボで操作される。
いくつかの態様では、オルソゴナルhCD122またはその機能的断片は、野生型hCD122に従って番号付けされた133位および／または134位にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、工程（b）の接触は、キメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸配列の取り込みをさらに含む。
いくつかの態様では、CARをコードする核酸配列および受容体をコードする核酸配列は、別々のベクター上に提供され、各核酸配列は、哺乳動物免疫細胞において機能的な発現制御配列に機能的に連結されている。
いくつかの態様では、CARをコードする核酸配列および受容体をコードする核酸配列は、単一ベクター上に提供される。
いくつかの態様では、核酸配列は、同じ発現制御エレメントに機能的に連結される。
いくつかの態様では、ベクターは、T2Aコード配列のIRESエレメントによって分離されている2つの核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ベクターは、ウイルスベクターである。
いくつかの態様では、ベクターは、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。
いくつかの態様では、工程（b）においてエクスビボで用いられるオルソゴナルリガンドは、工程（c）においてインビボで使用されるオルソゴナルリガンドとは異なる。
いくつかの態様では、工程（d）の前に、対象は、リンパ球枯渇レジメンで処置される。
いくつかの態様では、工程（d）で投与される初期用量は、対象の体重1kg当たり活性免疫細胞100,000～1,000,000個である。
いくつかの態様では、オルソゴナルリガンドの投与は、対象に対して、対象の体重1kg当たり活性免疫細胞100,000～1,000,000個のレベルを維持するために少なくとも2週間の一定期間にわたって定期的になされる。
いくつかの態様では、オルソゴナルリガンドは、残留腫瘍の実質的な徴候のない点まで投与され、その時、オルソゴナルリガンドの用量が、観察後少なくとも3ヶ月間の一定期間にわたって、体重1kg当たりオルソゴナル免疫細胞およそ10,000～100,000個の細胞の低い循環レベルを維持するのに十分なレベルまで低減される。
いくつかの態様では、オルソゴナルリガンドは、残留腫瘍の実質的な徴候のない点まで投与され、その時、オルソゴナルリガンドの用量が終了する。
いくつかの態様では、患者が免疫細胞療法の初期コースから再発したら、該方法は、再発中の患者に、追加用量のオルソゴナルな操作された細胞の非存在下、過去に投与されたオルソゴナル細胞の活性化および／または増殖を誘導するような治療有効量のオルソゴナルリガンドを投与する工程をさらに含み、オルソゴナルリガンドは、再発した腫瘍の寛解が観察されるまで対象に一定期間適用される。
いくつかの態様では、疾患、障害または病態は、新生物疾患である。
いくつかの態様では、疾患、障害または病態は、慢性ウイルス疾患である。
いくつかの態様では、疾患、障害または病態は、炎症性疾患である。
また、以下の工程を含むプロセスによって得られる、活性化されたオルソゴナル免疫細胞の集団について実質的に濃縮された細胞製品も提供される：
（a）ある量の免疫細胞を哺乳動物対象から単離する工程；
（b）該単離された量の単離された免疫細胞と核酸配列とを、該単離された免疫細胞によって該核酸配列が取り込まれる条件下で接触させる工程であって、該核酸配列が、膜貫通受容体をコードし、該膜貫通受容体が、細胞外ドメインと機能的に連絡する細胞内シグナル伝達ドメインを含み、該受容体の該細胞外ドメインが、オルソゴナルhCD122またはその機能的断片のECDを含む、工程；
（c）工程（b）からの単離された量の細胞を、エクスビボで、工程（b）の接触によって形質導入された細胞の増殖を誘導するのに十分な量のオルソゴナルリガンドと接触させる工程であって、該接触が、形質導入された細胞が集団の細胞の少なくとも20％を構成するように一定期間適用される、工程。
いくつかの態様では、細胞製品は、骨髄細胞、リンパ球、末梢血単核細胞（PBMC）、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、T細胞、CD8+ T細胞、CD25+CD8+ T細胞、CAR-T細胞、NK細胞、CD4+ T細胞、およびTregからなる群より選択されるヒト免疫細胞の1つまたは複数の種を含む。
いくつかの態様では、細胞製品は、前記細胞の内因性TCRドメインを欠失させるようにさらに操作される。
本発明は、添付の図面と併せて読まれると、以下の詳細な説明から最も良く理解される。慣行によると、図面の様々な特徴は一定の縮尺ではないことが強調される。反対に、様々な特徴の寸法は、明瞭化のために任意に拡大または縮小されている。図面には以下の図が含まれる。
添付図の図1は、実施例6に記載している実験からの293Tトランスフェクション上清で処置したNKL細胞のCelltiterglo値を提供する。ボールド体で表示した各上清の表示の希釈物を受けたNKL細胞について、デュプリケートのCelltiterglo値を並列カラムに示す。 添付図の図2は、実施例6に記載している実験からの293Tトランスフェクション上清で処置したNKL hoRB細胞のCelltiterglo値を提供する。ボールド体で表示した各上清の表示の希釈物を受けたNKL hoRB細胞について、デュプリケートのCelltiterglo値を並列カラムに示す。 図3A～Bは、以下の実施例7により詳しく記載している播種性インビボRAJI腫瘍研究の結果を提供しており、CAR-Tオルソゴナル細胞をオルソゴナルリガンドと共に用いた処置の効果をCAR-TまたはPBS単独と比較して実証している。 図4A～Bは、以下の実施例8により詳しく記載している再負荷研究の結果を提供しており、オルソゴナルリガンド単独の投与（追加の細胞を提供する必要なし）が、長期の抗原または腫瘍リガンド曝露なしであってもCAR T細胞の抗腫瘍活性を回復可能であることを実証している。 図5A～Bは、実施例8により詳しく記載している皮下RAJI-lucリンパ腫再発マウスモデルにおける再投薬の結果を提供する。このデータは、STK-009単独の投与が、前治療コースから再発した動物においてCAR-T細胞の抗腫瘍活性を達成可能であることを実証している。 図6は、実施例8により詳しく記載しているデータのFACS解析結果のヒストグラムであり、オルソゴナルリガンド（STK-009）が、オルソゴナルCAR-T細胞を拡大増殖可能であり、幹細胞メモリーCAR-T細胞集団を保持することを実証している。 図7A～Cは、以下の実施例11により詳しく記載している皮下Raji固形腫瘍モデルから生成されたキャリパー測定データ（オルソゴナルリガンドと組み合わせたオルソゴナルCAR-T細胞の固形腫瘍モデルのインビボ処置における有効性に関する）を提供する。 図8は、本明細書の実施例11に記載している実験から生成された腫瘍応答データの物理的測定のグラフ表示を提供しており、CD19オルソゴナルCAR-T細胞のオルソゴナルリガンド（STK-009）と組み合わせた投与が固形腫瘍の処置において効果的であることを示している。 図9は、実施例8に記載している皮下固形腫瘍モデル研究に関するカプランマイヤー生存プロットを提供する。提供されたデータは、CD19オルソゴナルCAR-T細胞のオルソゴナルリガンド（STK-009）と組み合わせた投与が、固形腫瘍の処置において効果的であり、有意な生存上の利点を付与することを実証している。 図10は、実施例8に記載している皮下固形腫瘍モデル研究の終了後に屠殺したマウスから単離された組織の免疫組織化学を提供する。
詳細な説明
序論
本開示をより容易に理解できるようにするため、特定の用語および語句を以下ならびに本明細書全体にわたって定義する。本明細書に提供される定義は、非限定的であり、当業者の知っている知識を考慮して読まれるべきである。
本方法および組成物を説明する前に、本開示は、記載される特定の方法または組成物に限定されないこと、したがって、当然のことながら、変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書において使用される専門用語は、特定の態様を説明することだけを目的としており、限定することを意図していないことも理解されるべきである。
値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別途指示しない限り下限の十分の一まで、その範囲の上限値と下限値の間の各介在値もまた具体的に開示されることが理解される。規定の範囲内の任意の規定値または介在値とその規定の範囲内の任意の他の規定値または介在値との間のより小さな範囲の各々が、本発明内に包含される。これらのより小さな範囲の上限値および下限値は、独立にその範囲内に含まれても除外されてもよく、そのより小さな範囲に上限値と下限値のうちの一方が含まれるか、いずれも含まれないか、または両方が含まれるような各範囲もまた、規定の範囲における任意の具体的に除外される限界値に従って、本発明内に包含される。規定の範囲が、上限値と下限値のうちの一方または両方を含む場合、その含まれた上限値と下限値のうちの一方または両方を除外した範囲もまた、本発明に含まれる。
別途定義がなされない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、いくつかの有望で好ましい方法および材料をここに記載している。本明細書において言及されるすべての刊行物は、その刊行物と併せて引用される方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明確に別途指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意すべきである。したがって、例えば、「1つの細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「そのペプチド」への言及は、当業者に公知である、1つまたは複数のペプチドおよびその等価物、例えばポリペプチドへの言及を含む、といった具合である。
本明細書において考察される刊行物は、本出願の出願日前のその開示のためだけに提供される。本明細書において、本発明が、先行発明によって、係る刊行物に先行する資格を有しないことを承認するものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日と異なる場合があり、独立して確認される必要があり得る。
本明細書において考察される刊行物は、本出願の出願日前のその開示のためだけに提供される。本明細書において、本発明が、先行発明によって、係る刊行物に先行する資格を有しないことを承認するものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日と異なる場合があり、独立して確認される必要があり得る。
別途指示がなされない限り、以下の略称が本明細書において使用される：部は重量部であり、分子量は重平均分子量であり、温度はセルシウス度（℃）であり、圧力は大気圧または近大気圧である。以下を含む、標準的な略称が使用される：bp＝塩基対；kb＝キロベース；pl＝ピコリットル；sまたはsec＝秒；min＝分；hまたはhr＝時間；AAまたはaa＝アミノ酸；kb＝キロベース；nt＝ヌクレオチド；pg＝ピコグラム；ng＝ナノグラム；μg＝マイクログラム；mg＝ミリグラム；g＝グラム；kg＝キログラム；dlまたはdL＝デシリットル；μlまたはμL＝マイクロリットル；mlまたはmL＝ミリリットル；lまたはL＝リットル；μM＝マイクロモル濃度；mM＝ミリモル濃度；M＝モル濃度；kDa＝キロダルトン；i.m.＝筋肉内（筋肉内に）；i.p.＝腹腔内（腹腔内に）；SCまたはSQ＝皮下（皮下に）；QD＝毎日；BID＝毎日2回；QW＝毎週；QM＝毎月；HPLC＝高速液体クロマトグラフィー；BW＝体重；U＝ユニット；ns＝統計的に有意でない；PBS＝リン酸緩衝生理食塩水；PCR＝ポリメラーゼ連鎖反応；HSA＝ヒト血清アルブミン；MSA＝マウス血清アルブミン；DMEM＝ダルベッコ変法イーグル培地；EDTA＝エチレンジアミン四酢酸。
本開示を通して、アミノ酸は、一文字表記または三文字表記に従って参照されることが認識されよう。読者の便宜のために、一文字および三文字アミノ酸コードを下記表1に提供する：
（表１）アミノ酸の略称
Figure 2023511274000002
分子生物学における標準的な方法が科学文献に記載されている（例えば、Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；およびAusubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y.を参照されたく、これには、細菌細胞におけるクローニングおよびDNA変異誘発（第1巻）、哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング（第2巻）、糖コンジュゲートおよびタンパク質発現（第3巻）、ならびに生物情報学（第4巻）が記載されている）。科学文献は、タンパク質精製（免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化を含む）、ならびに、化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の産生およびタンパク質のグリコシル化のための方法を記載している（例えば、Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vols. 1-2, John Wiley and Sons, Inc., NYを参照のこと）。
B. 定義
別途指示のなされない限り、以下の用語は、以下に示される意味を有することが意図される。他の用語は、本明細書を通して他の場所で定義される。
活性化する：本明細書において使用される場合、「活性化する」という用語は、受容体または受容体複合体に関して、直接的におよび／または多成分系シグナル伝達カスケードにおける関与により、アゴニストリガンドの受容体への結合から該リガンドの結合に応答して生じる、生物学的効果を指すために使用される。例えば、IL2アゴニスト（IL2アゴニストリガンド）のIL2受容体への結合が、受容体のシグナル伝達を「活性化して」、1つまたは複数の細胞内生物学的効果（例えば、STAT5のリン酸化）を生成すると言うことができる。
活性：本明細書において使用される場合、「活性」という用語は、分子に関して、材料または細胞の試験系（例えば、アッセイ）または生物学的もしくは化学的性質（例えば、ある分子の別の分子への結合の程度）または物理的性質（例えば、細胞膜電位の変更）に関する分子の性質を説明するために使用される。そのような生物学的機能の例としては、生物薬剤の触媒活性、細胞内シグナル伝達、遺伝子発現、細胞増殖を刺激する能力、炎症反応などの免疫学的活性をモジュレートする能力が挙げられるが、それらに限定されない。「活性」は、典型的には、試験された作用物質の単位当たりの生物活性のレベル、例えば、［触媒活性］／［タンパク質mg］、［免疫学的活性］／［タンパク質mg］、活性の国際単位（IU）、［STAT5リン酸化］／［タンパク質mg］、［T-細胞増殖］／［タンパク質mg］、プラーク形成単位（pfu）などとして表される。本明細書において使用される場合、「増殖活性」という用語は、新生物疾患、炎症性疾患、線維症、異形成、細胞形質転換、転移および血管新生において観察されるような、未制御の細胞分裂を含めた細胞の増殖および複製を促進する活性のことを指す。
投与する／投与：「投与」および「投与する」という用語は、本明細書において互換的に使用され、対象（対象のインビトロ、インビボまたはエクスビボの細胞、組織、臓器または生体液を含む）を、作用物質（例えば、オルソログ、IL2オルソログ、オルソゴナル受容体を発現する操作された細胞、オルソゴナルIL2受容体を発現する操作された細胞（例えば、オルソゴナルIL2受容体を発現するCAR-T細胞）、化学療法剤、抗体）または前述の1つもしくは複数を含む医薬製剤と接触させる行為のことを指す。作用物質の投与は、局所投与、血管内注射（静脈内または動脈内注入を含む）、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、頭蓋内注射、腫瘍内注射、経皮、経粘膜、イオン導入送達、リンパ系内注射、胃内注入、前立腺内注射、膀胱内注入（例えば、膀胱）、吸入（例えば、ドライパウダー吸入器を含む呼吸器用吸入器）、眼内注射、腹部内注射、病巣内注射、卵巣内注射、大脳内注入または注射、脳室内注射（ICVI）などを非限定的に含む多様な当技術分野において認識される方法のいずれかを通じて達成され得る。「投与」という用語は、作用物質の細胞、組織または臓器への接触ならびに作用物質の流体への接触（この場合、流体は細胞、組織または臓器と接触している）を含む。
有害事象：本明細書において使用される場合、「有害事象」という用語は、対象における治療剤または予防剤の使用に関連する任意の望ましくない経験のことを指す。有害事象は、治療剤または予防剤（例えば、IL2オルソログ）の投与によって必ずしも引き起こされる必要はなく、無関係の状況から生じる場合がある。有害事象は、典型的には、軽度、中度または重度として分類される。本明細書において使用されるように、本明細書において使用される場合の有害事象の分類は、米国保健福祉省、米国国立衛生研究所および米国国立がん研究所によって2017年11月27日に公表されたCommon Terminology Criteria for Adverse Events v5.0（CTCAE）に従う。
親和性：本明細書において使用される場合、「親和性」という用語は、第1の分子（例えば、リガンド）の第2の分子（例えば、受容体）への特異的結合の程度のことを指し、Kd（分子とその標的との間の解離定数（Koff）と分子とその標的との間の結合定数（Kon）の比）として表される結合速度論によって測定される。
アゴニスト：本明細書において使用される場合、「アゴニスト」という用語は、第2の作用物質（「標的」）に特異的に結合し、標的と相互作用して、標的の活性化の増加を引き起こすまたは促進する、第1の作用物質のことを指す。いくつかの例では、アゴニストは、細胞活性化をモジュレートする、活性化を増強する、第2の作用物質によって細胞が活性化するように感作する、または1つもしくは複数の遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、生物学的経路の発現をアップレギュレーションすることで、細胞増殖または細胞周期停止もしくはアポトーシスなどによる細胞死をもたらす経路をもたらし得る、受容体タンパク質の活性化因子である。いくつかの態様では、アゴニストは、受容体に結合して受容体の状態を変化させ、その結果、生物学的応答をもたらす、作用物質である。その応答は、受容体の内因性活性化因子の作用を模倣する。「アゴニスト」という用語は、部分アゴニスト、完全アゴニストおよびスーパーアゴニストを含む。アゴニストは、研究中の受容体または部分アゴニストによって誘導される実質的に完全な生物学的応答（すなわち、天然に存在するリガンド／受容体の結合相互作用に関連する応答）を導くアゴニストの場合、「完全アゴニスト」として記載され得る。アゴニストと対照的に、アンタゴニストは、受容体に特異的に結合し得るが、典型的には受容体によって開始されるシグナルカスケードをもたらさず、その受容体におけるアゴニストの作用を改変し得る。逆アゴニストは、アゴニストのものとは方向が反対である薬理応答を生成する作用物質である。「スーパーアゴニスト」は、標的受容体に対して内因性アゴニストよりも大きな最大応答を生成可能であり、したがって天然リガンドの100％を超える活性を有する、アゴニストの一種である。スーパーアゴニストは、典型的には、同等なアッセイにおいて類似の濃度で評価したときに、天然に存在する形態の分子の評価可能な定量的または定性的パラメーターの110％超、あるいは120％超、あるいは130％超、あるいは140％超、あるいは150％超、あるいは160％超、あるいは170％超の応答を示す、合成分子である。完全アゴニストに関連する生物学的効果が、程度および／または種類に関して、部分アゴニストまたはスーパーアゴニストの生物学的効果と異なる場合があることに留意すべきである。
アンタゴニスト：本明細書において使用される場合、「アンタゴニスト」または「阻害剤」という用語は、アゴニストの作用に対抗する分子のことを指す。アンタゴニストは、アゴニストの活性を阻止するか、低減するか、阻害するかまたは中和し、アンタゴニストはまた、特定されたアゴニストがない場合であっても、標的、例えば、標的受容体の構成的活性を阻止する、阻害するまたは低減することもできる。阻害剤は、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、免疫チェックポイント経路を含む生物学的経路、または細胞を減少させる、遮断する、阻止する、活性化を遅らせる、不活性化する、脱感作する、またはダウンレギュレーションする、分子である。
抗体：本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、まとめて、（a）標的分子に特異的に結合する、グリコシル化されたおよびグリコシル化されていない免疫グロブリン（哺乳動物の免疫グロブリンクラスIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を非限定的に含む）ならびに（b）標的分子への結合に関して由来する免疫グロブリンと競合する、IgG（1-4）デルタCH2、F(ab')2、Fab、ScFv、VH、VL、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、dsFv、F(ab')3、scFv-Fcおよび(scFv)2を非限定的に含む、免疫グロブリン誘導体のことを指す。抗体という用語は、任意の特定の哺乳動物種に由来する免疫グロブリンに制限されるわけではなく、ネズミ科、ヒト科、ウマ科、ラクダ科の抗体、ヒト抗体を含む。抗体という用語は、典型的にはラクダ科（ラクダ、ラマおよびアルパカを含む）の免疫化から得られるような、いわゆる「重鎖抗体」または「VHH」または「Nanobodies（登録商標）」を含む（例えば、Hamers-Casterman, et al. (1993) Nature 363:446-448を参照のこと）。所与の特異性を有する抗体はまた、サメを非限定的に含む軟骨魚類の免疫化から得られるVHHなど、非哺乳動物源にも由来し得る。「抗体」という用語は、天然源からまたは抗原による免疫化後に動物から単離可能な抗体、ならびに、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、三重特異性のもの、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、CDRグラフティング、ベニアリングもしくは脱免疫化された（例えば、T-細胞エピトープを除去するため）抗体を包含する。「ヒト抗体」という用語は、ヒトから得られる抗体だけでなく、抗原で刺激するとトランスジェニック動物がヒトによって産生される抗体に特徴的なアミノ酸配列を含む抗体を産生するように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物から得られる抗体も含む。抗体という用語は、親抗体も、親和性成熟されたもの、ベニアリングされたもの、CDRグラフティングされたもの、ヒト化されたもの、ラクダ化されたもの（VHHの場合）、または非免疫グロブリン足場中に抗体の結合ドメイン（例えば、CDR）を含む分子などのその誘導体も含む。「抗体」という用語は、任意の特定の合成手段に限定されるものと解釈されるべきではなく、天然源から単離可能な天然に存在する抗体、ならびに、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックであるトランスジェニック動物またはそれから調製されたハイブリドーマから単離される抗体、抗体の発現をもたらす核酸構築物で形質転換された宿主細胞から単離される抗体、ファージディスプレイライブラリーを含むコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離される抗体を含めた「組換え」手段によって調製される操作された抗体分子を含む。一態様では、「抗体」は、哺乳動物の免疫グロブリンである。いくつかの態様では、抗体は、結合およびエフェクター機能を提供する可変および定常ドメインを含む「完全長抗体」である。ほとんどの場合、完全長抗体は、2本の軽鎖および2本の重鎖を含み、各軽鎖は、可変領域および定常領域を含む。いくつかの態様では、「完全長抗体」という用語は、2本の軽鎖および2本の重鎖を含む従来のIgG免疫グロブリン構造体のことを指すために使用され、各軽鎖は、結合およびエフェクター機能を提供する可変領域および定常領域を含む。抗体という用語は、以下により詳細に記載するような融合タンパク質（例えば、Fc融合物）またはポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）へのコンジュゲーションなどの作用持続時間を延長する改変を含む、抗体コンジュゲートを含む。
生体試料：本明細書において使用される場合、「生体試料」または「試料」という用語は、対象から得られる（または対象に由来する）試料のことを指す。例として、生体試料は、体液、血液、全血、血漿、血清、粘膜分泌液、唾液、脳脊髄液（CSF）、気管支肺胞洗浄液（BALF）、眼液（例えば、硝子体液、房水）、リンパ液、リンパ節組織、脾臓組織、骨髄、およびこれらの組織の1つまたは複数に由来する免疫グロブリン濃縮画分からなる群より選択される材料を含む。いくつかの態様では、試料は、1つまたは複数の治療剤への繰り返し曝露のような治療的処置レジメンに曝露されている対象から得られ、該治療剤は、IL2オルソログの医薬製剤を含む。他の態様では、試料は、IL2オルソログに最近曝露されていない対象から得られるか、IL2オルソログの計画的投与またはIL2オルソログを含む処置レジメンの前の対象から得られる。
「CAR」または「キメラ抗原受容体」：本明細書において使用される場合、「キメラ抗原受容体」および「CAR」という用語は、互換的に使用され、アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順序：（a）抗原結合ドメイン（ABD）を含み、任意で「ヒンジ」ドメインを含む、細胞外ドメイン（ECD）、（b）膜貫通ドメイン（TD）；および（c）1つまたは複数の細胞質シグナル伝達ドメイン（CSD）で配置された複数の機能性ドメインを含む、キメラポリペプチドのことを指し、前述のドメインは、任意で1つまたは複数のスペーサードメインによって連結され得る。CARはまた、CARの翻訳後プロセシングおよびCARをコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質転換された細胞の細胞表面上の提示の間に慣例的に除去されるシグナルペプチド配列をさらに含み得る。CARは、当技術分野において周知である原理に従って調製され得る。例えば、Eshhaarら（2010年6月22日に発表された米国特許第7,741,465 B1号）；Sadelain, et al (2013) Cancer Discovery 3 (4):388-398；Campana and Imai（2013年3月19日に発表された米国特許第8,399,645号）；Jensen and Riddell (2015) Current Opinions in Immunology 33:9-15；Gross, et al. (1989) PNAS (USA) 86 (24):10024-10028；Curran, et al. (2012) J Gene Med 14 (6):405-15；Brogdonら（2019年1月8日に発表された米国特許第10.174,095号）；Guedan, et al. (2019) Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors Molecular Therapy: Methods & Clinical Development Vol. 12: 145-156を参照されたい。命名法の観点から、慣行によれば、CARは、CARの抗原結合ドメイン（ABD）の標的に準拠して呼称され、「CD19 CAR」は、そのABDがCD19に特異的に結合するCARのことを指し、「BCMA CAR」は、そのABDがBCMAに特異的に結合するCARのことを指す、といった具合である。いくつかの態様では、CARのABDは、1を超える標的抗原、例えば、CD19およびCD20の腫瘍抗原に特異的に結合するように、二価（または多価）である。そのような例では、CARは、一般的に、そのABDの多価の性質を引用して「CD19/CD20」CARと呼称されるだろう。
CAR-T細胞：本明細書において使用される場合、「キメラ抗原受容体T-細胞」および「CAR-T細胞」という用語は、互換的に使用され、キメラ抗原受容体を発現するように組換え改変されているT-細胞のことを指す。本明細書において使用される場合、CAR-T細胞は、オルソゴナルCD122ポリペプチドの細胞外ドメインを含む修飾された受容体を発現するように操作され得る（オルソゴナルCAR-T細胞）。命名法の観点から、慣行によれば、CAR-T細胞は、CARの抗原結合ドメインの標的に準拠して呼称され、「CD19 CAR-T細胞」は、CARのABDがCD19に選択的に結合する、CARを含むCAR-T細胞のことを指し、「BCMA CAR-T細胞」は、CARのABDがBCMAに選択的に結合する、CARを含むCAR-T細胞のことを指す、といった具合である。本発明のオルソゴナル受容体を組み込むために改変され得る市販のCD19 CAR-T細胞製品の例としては、アキシカブタゲンシロルーセル（Yescarta（登録商標）という商品名でGilead Pharmaceuticalsから販売されている）およびチサゲンレクルユーセル（Kymriah（登録商標）という商品名でNovartisから販売されている）が挙げられる。いくつかの態様では、CARのABDは、1を超える標的抗原、例えば、CD19およびCD20の腫瘍抗原に特異的に結合するように、二価（または多価）である。そのような例では、そのようなCARを含むCAR-T細胞は、一般的に、そのABDの多価の性質を引用して「CD19/CD20」CARと呼称されるだろう。
CD25：本明細書において使用される場合、「CD25」、「IL2受容体アルファ」、「IL2Rα」、「IL2Ra」および「p55」という用語は、互換的に使用され、Treg細胞において構成的に発現され、活性化に応答して他のT細胞上に誘導的に発現される、55kDのポリペプチドのことを指す。CD25はまた、文献において「低親和性」IL2受容体とも称される。hIL2は、hCD25におよそ10-8MのKdで結合する。ヒトCD25の核酸およびタンパク質配列は、それぞれ、Genbankアクセッション番号NM__000417およびNP_0004Q8として見いだされ得る。ヒトCD25は、21アミノ酸のシグナル配列を含む、272アミノ酸のプレタンパク質として発現され、このシグナル配列は翻訳後に除去されて、251アミノ酸の成熟タンパク質となる。プレタンパク質のアミノ酸22～240（成熟タンパク質のアミノ酸1～219）は、細胞外ドメインに対応する。プレタンパク質のアミノ酸241～259（成熟タンパク質のアミノ酸220～238）は、膜貫通ドメインに対応する。プレタンパク質のアミノ酸260～272（成熟タンパク質のアミノ酸239～251）は、細胞内ドメインに対応する。成熟形態（プレタンパク質のシグナル配列なし）のhCD25のアミノ酸配列は、以下である：
Figure 2023511274000003
CD122：本明細書において使用される場合、「CD122」、「インターロイキン-2受容体ベータ」、「IL2Rb」、「IL2Rβ」、「IL15Rβ」および「p70-75」という用語は、互換的に使用され、CD122膜貫通タンパク質のことを指す。ヒトCD122（hCD122）は、1回貫通の1型膜貫通受容体であり、最初の26アミノ酸が525アミノ酸の成熟タンパク質から翻訳後に切断されるシグナル配列を含む、551アミノ酸のプレタンパク質として発現される。プレタンパク質のアミノ酸27～240（成熟タンパク質のアミノ酸1～214）は、細胞外ドメインに対応し、プレタンパク質のアミノ酸241～265（成熟タンパク質のアミノ酸225～239）は、膜貫通ドメインに対応し、プレタンパク質のアミノ酸266～551（成熟タンパク質のアミノ酸240～525）は、細胞内ドメインに対応する。本明細書において使用される場合、hCD122という用語は、S57FおよびD365E（成熟hCD122タンパク質に従って番号付けされた残基）を含むhCD122タンパク質の天然に存在するバリアントを含む。hCD122は、UniProtKBデータベースにおいてエントリーP14784と称される。ヒトCD122の核酸およびタンパク質配列は、それぞれ、Genbankアクセッション番号NM_000878およびNP_000869として見いだされ得る。シグナル配列のない成熟hCD122タンパク質のアミノ酸配列は、以下：
Figure 2023511274000004
であり、そして、hCD122の細胞外ドメイン（ECD）アミノ酸配列は、以下：
Figure 2023511274000005
である。
CD132：本明細書において使用される場合、「CD132」、「IL2受容体ガンマ」、「IL2Rg」および「IL2Rγ」という用語は、互換的に使用され、1型サイトカイン受容体のことを指し、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15およびIL21の受容体複合体によって共有され、ここでは「共有」ガンマ鎖と称される。ヒトCD132（hCD132）は、22アミノ酸のN末端シグナル配列を含む369アミノ酸のプレタンパク質として発現される。プレタンパク質のアミノ酸23～262（成熟タンパク質のアミノ酸1～240）は、細胞外ドメインに対応し、プレタンパク質のアミノ酸263～283（成熟タンパク質のアミノ酸241～262）は、21アミノ酸の膜貫通ドメインに対応し、プレタンパク質のアミノ酸284～369（成熟タンパク質のアミノ酸262～347）は、細胞内ドメインに対応する。hCD132は、UniProtKBデータベースにおいてエントリーP31785と称される。ヒトCD132の核酸およびタンパク質配列は、ぞれぞれ、Genbankアクセッション番号：NM_000206およびNP_000197として見いだされ得る。成熟hCD132タンパク質のアミノ酸配列は、以下である：
Figure 2023511274000006
CDR. 本明細書において使用される場合、「CDR」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖と軽鎖の両方の免疫グロブリンポリペプチドの可変領域内に見いだされる不連続な抗原結合部位のことを指す。CDRは、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)；Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991)（本明細書においてKabat 1991とも称される）；Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)（本明細書においてChothia 1987とも称される）；およびMacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)に記載されており、ここで、定義には、互いに比較したときのアミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。いずれにせよ、抗体またはグラフティングされた抗体またはそのバリアントのCDRのことを指すためのいずれの定義の適用も、本明細書において定義および使用された用語の範囲内にあることが意図される。本開示の文脈では、CDR位置の番号付けは、Kabatの番号付け規則に従って提供される。
循環腫瘍細胞：本明細書において使用される場合、「循環腫瘍細胞（CTC）」という用語は、腫瘍塊（例えば、新生物）から末梢循環へ流れてきた腫瘍細胞のことを指す。
同等な：本明細書において使用される場合、「同等な」という用語は、評価可能な定量的または定性的パラメーターの2つの測定結果における相違の程度を説明するために使用される。例えば、評価可能な定量的パラメーターの第1の測定結果（例えば、CTLL-2増殖またはホスホ-STAT5アッセイによって決定された場合のIL2活性のレベル）と評価可能なパラメーターの第2の測定結果が、その状況において2つの結果間で効果に統計的に有意な差を生まないと当業者が認める範囲を超えて逸脱しない場合、その2つの測定結果は、「同等な」と見なされるだろう。いくつかの例では、1つの測定結果が別の測定結果から35％未満、あるいは30％未満、あるいは25％未満、あるいは20％未満、あるいは15％未満、あるいは10％未満、あるいは7％未満、あるいは5％未満、あるいは4％未満、あるいは3％未満、あるいは2％未満、あるいは1％未満逸脱していれば、測定結果は「同等な」と見なされ得る。特定の態様では、1つの測定結果が参照基準から15％未満、あるいは10％未満、あるいは5％未満逸脱していれば、その測定結果は、参照基準と同等である。
由来する：本明細書において使用される場合、「由来する」という用語は、アミノ酸配列の文脈（例えば、IL2ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に「由来する」アミノ酸配列を含むポリペプチド）において、ポリペプチドまたは核酸が、参照ポリペプチドまたは核酸（例えば、天然に存在するIL2ポリペプチドまたはIL2をコードする核酸）のものに基づく配列を有することを指すものと意味されるが、タンパク質または核酸が得られる供給源または方法に関して限定するものと意味されない。例として、「由来する」という用語は、参照アミノ酸またはDNA配列のホモログまたはバリアントを含む。
有効濃度（EC）：本明細書において使用される場合、「有効濃度」またはその略称「EC」という用語は、互換的に使用され、試験系において所与のパラメーターの変化をもたらすのに十分な量の作用物質（例えば、IL2オルソログ）の濃度のことを指す。略称「E」は、試験系が試験物質に曝露されたときに、試験系において観察される所与の生物学的効果の大きさのことを指す。応答の大きさが試験物質の濃度の因数（「C」）として表される場合、略称「EC」が使用される。生物系の文脈において、Emaxという用語は、飽和濃度の活性化試験物質に応答して観察される所与の生物学的効果の最大値のことを指す。略称ECが添字付きで提供される場合（例えば、EC40、EC50など）、添字は、その濃度で観察される生物学的応答のEmaxの割合のことを指す。例えば、試験系において測定可能な生物学的パラメーターの誘導をもたらすのに十分な試験物質の濃度が、係る試験物質に応答して係る測定可能な生物学的パラメーターの最大レベルの30％である場合、これは、係る生物学的パラメーターに関して試験物質の「EC30」と称される。同様に、「EC100」という用語は、作用物質に応答して測定可能なパラメーターの最大（100％）応答をもたらす作用物質の有効濃度を表すために使用される。同様に、EC50（薬力学の分野において一般的に使用される）という用語は、測定可能なパラメーターの半最大（50％）変化をもたらすのに十分な作用物質の濃度のことを指す。「飽和濃度」という用語は、温度および圧力の標準条件下で特定の溶媒（例えば、水）の標準体積で溶解できる試験物質の最大可能量のことを指す。薬力学では、薬物の飽和濃度は、典型的には、すべての利用可能な受容体が薬物によって占有されるような十分な薬物の濃度を表すために使用され、EC50は、半最大効果を与える薬物濃度である。
濃縮された：本明細書において使用される場合、「濃縮された」という用語は、関心対象の種（例えば、分子または細胞）が（a）生体試料などの開始試料（例えば、分子が天然に存在する試料または分子が投与後に存在する試料）中の種の濃度よりも大きな（例えば、少なくとも3倍大きな、あるいは少なくとも5倍大きな、あるいは少なくとも10倍大きな、あるいは少なくとも50倍大きな、あるいは少なくとも100倍大きな、あるいは少なくとも1000倍大きな）濃度；あるいは（b）分子が作られた環境（例えば、組換え改変された細菌または哺乳動物細胞におけるような）よりも大きな濃度で存在するように、試料が非天然に操作されることを指す。いくつかの態様では、「濃縮された」という用語は、本明細書において、オルソゴナル受容体を発現する細胞を含む細胞の集団に関して、細胞の集団と同族オルソログとをオルソゴナル受容体を発現する細胞において応答（応答は増殖である）を引き起こすのに十分な量で接触させた後、集団中のオルソゴナル受容体を発現する細胞の濃度が、細胞の集団と同族オルソログとの接触後に、より大きくなる（例えば、少なくとも3倍大きくなる、あるいは少なくとも5倍大きくなる、あるいは少なくとも10倍大きくなる、あるいは少なくとも50倍大きくなる、あるいは少なくとも100倍大きくなる、あるいは少なくとも1000倍大きくなる）という場合に使用される。
細胞外ドメイン：本明細書において使用される場合、「細胞外ドメイン」またはその略称「ECD」という用語は、細胞の原形質膜の外側にある細胞表面タンパク質（例えば、細胞表面受容体）の部分のことを指す。ECDは、膜貫通タンパク質、細胞表面または膜関連タンパク質、分泌タンパク質、細胞表面ターゲティングタンパク質の細胞質外部分全体を含み得る。
hCD122：本明細書において使用される場合、「hCD122」という用語は、その天然に存在するバリアントを含む天然に存在するヒトCD122ポリペプチドのことを指す。天然に存在する成熟hCD122のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：2として提供される。
同一性：「同一性」という用語は、本明細書においてポリペプチドまたはDNA配列に関して使用される場合、2つの分子間のサブユニット配列同一性のことを指す。該分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニット（すなわち、同じアミノ酸残基またはヌクレオチド）によって占有される場合、該分子はその位置で同一である。2つのアミノ酸または2つのヌクレオチド配列間の類似性は、同一の位置の数の一次関数である。一般に、配列は、最も高いオーダーマッチが得られるように整列される。必要に応じて、GCSプログラムパッケージ（Devereux, et al., Nucleic Acids Res. 12:387, 1984）、BLASTP、BLASTN、FASTA（Atschul et al., J. Molecular Biol. 215:403, 1990）などの公開されている技術および広く利用可能なコンピュータープログラムを使用して同一性を計算することができる。配列同一性は、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group at the University of Wisconsin Biotechnology Center （1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）などの配列解析ソフトウェアを、そのデフォルトパラメーターと共に使用して測定することができる。配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するのに適したアルゴリズムは、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410およびAltschul, et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されている。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（NCBI）のウェブサイトを通じて公的に入手可能である。アルゴリズムは、最初に、データベース配列内の同じ長さのワードで整列させたときに、ある正の値の閾値スコアTにマッチするかまたはこれを満たす、クエリー配列内の長さWの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（HSP）を同定することを伴う。Tは、隣接ワードスコア閾値（Altschulら、前出）と称される。これらの初期の隣接ワードヒットは、これらを含有するより長いHSPを見つけ出す検索を開始するためのシードとして働く。累積アライメントスコアが増大し得る限り、ワードヒットはその後、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターM（マッチする残基の対についてのリウォードスコア；常に＞0）およびN（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜0）を使用して計算される。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスが使用される。各方向へのワードヒットの拡張は、累積アライメントスコアが、達成されたその最大値から量Xだけ低下した場合；1つまたは複数の負スコア残基のアライメントの累積のために、累積スコアが、ゼロ以下に低下した場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合に停止される。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは、アライメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとしてワードサイズ（W）28、期待値（E）10、M＝1、N＝-2、および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムは、デフォルトとしてワードサイズ（W）3、期待値（E）10、およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを用いる（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照のこと）。
IL2：本明細書において使用される場合、「インターロイキン-2」または「IL2」という用語は、IL2活性を保有するIL2ポリペプチドのことを指す。いくつかの態様では、IL2は、成熟野生型ヒトIL2のことを指す。成熟野生型ヒトIL2（hIL2）は、Fujita, et. al., PNAS USA, 80, 7437-7441 (1983)に記載されているように、133アミノ酸ポリペプチド（プレタンパク質のシグナルペプチドのN末端アミノ酸20個より小さい）として生じる。成熟野生型ヒトIL2（hIL2）の天然に存在するバリアントのアミノ酸配列は、以下：
Figure 2023511274000007
である。本明細書において使用される場合、IL2バリアントの残基の番号付けは、IL2配列UniProt ID P60568に基づき、SEQ ID NO：5のものと同じであるシグナルペプチドを除外する。
IL2活性：「IL2活性」という用語は、細胞をIL2ポリペプチドの有効量と接触させることに応答した、細胞に対する1つまたは複数の生物学的効果のことを指す。先に述べたように、IL2は、多様な細胞タイプに対して1つまたは複数の生物学的効果をもたらす多面発現性サイトカインである。IL2は、活性化Tリンパ球の増殖および拡大増殖を促進し、ナイーブT細胞の増殖および活性化を誘導し、B細胞の成長を高め、そして、NK細胞の増殖および拡大増殖を促進する。IL2活性の一例は、CTLL-2マウス細胞傷害性T細胞を使用した細胞増殖アッセイにおいて測定することができ、Gearing, A.J.H. and C.B. Bird (1987) in Lymphokines and Interferons, A Practical Approach. Clemens, M.J. et al. (eds): IRL Press. 295を参照されたい。組換えヒトIL2（rhIL2）の比活性は、およそ2.1×104IU/μgであり、これは、組換えヒトIL2 WHO国際標準（NIBSCコード：86/500）に対して校正される。いくつかの態様では、例えば、関心対象のIL2オルソゴナルポリペプチドリガンドがCD25に対して減少した親和性を示す（またはそれを保有するように操作される）場合、IL2活性のレベルは、IL2受容体を通じてシグナル伝達をもたらすためにCD25を必要としないが中親和性CD122/CD132受容体を通じてシグナル伝達可能であるYT細胞などのヒト細胞において評価され得る。いくつかの態様では、本開示のオルソゴナルヒトIL2リガンドは、同等なアッセイにおいて等価な濃度で評価したときに、WHO国際標準（NIBSCコード：86/500）野生型成熟ヒトIL2の活性の約20％未満、あるいは約10％未満、あるいは約8％未満、あるいは約6％未満、あるいは約4％未満、あるいは約2％未満、あるいは約1％未満、あるいは約0.5％未満を示し得る。
IL2オルソログ：本明細書において使用される場合、「IL2オルソログ」という用語は、IL2親ポリペプチドに由来するIL2のバリアントのことを指し、IL2オルソログは、オルソゴナルCD122 ECDに特異的に結合し、野生型CD122の細胞外ドメインへの有意に低下した結合を示す。一部の態様では、IL2オルソログは、オルソゴナルCD122 ECDを含む受容体への特異的結合を示し、（2）オルソゴナルCD122ポリペプチドのECDを含む膜通過受容体を発現する細胞と応答を引き起こすのに十分な量で接触させると、前記膜通過受容体の細胞内ドメイン（ICD）によって生成されるシグナルに特徴的なシグナルが生じる。膜通過受容体がオルソゴナルCD122 ECDおよびCD122 ICDを含む場合、そのような受容体へのIL2オルソログの結合は、CD122/CD132中親和性IL2受容体のCd25/CD122/CD132高親和性の活性化に特徴的な細胞内シグナルを生じる。IL2オルソログは、野生型hCD122への有意に低下した結合を示す。IL2オルソログという用語は、IL2オルソゴナルバリアントおよび修飾されたIL2オルソログを含む。いくつかの態様では、IL2オルソログは、ヒトIL2の天然に存在するバリアントに由来し、そのようなヒトIL2オルソログは、「hoCD122」または「hoRb」と称され得る。ある特定の修飾されたIL2ポリペプチドは、Garciaら（2018年8月16日に公開された米国特許出願公報US2018/0228842A1）に提供される。本明細書において使用される場合、IL2オルソログという用語は、2018年8月16日に公開されたGarciaらの米国特許出願公開US2018/0228842A1に記載されている修飾されたhIL2ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122の細胞外ドメインに対するIL2オルソログの親和性は、野生型CD122のECDに対する野生型IL2の親和性と同等である。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122のECDに対するIL2オルソログの親和性は、野生型CD122のECDに対する野生型IL2の親和性よりも大きい。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122のECDに対するIL2オルソログの親和性は、野生型CD122のECDに対する野生型IL2の親和性よりも小さい。
応答をもたらすのに十分な量で：本明細書において使用される場合、「応答を引き起こすのに十分な量で」という語句は、試験系への試験物質の適用前に測定された指示因子のレベル（例えば、ベースラインレベル）と適用後のレベルで検出可能な変化を提供するのに十分な試験物質の量に関して使用される。いくつかの態様では、試験系は、細胞、組織または生物である。いくつかの態様では、試験系は、蛍光アッセイなどのインビトロ試験系である。いくつかの態様では、試験系は、細胞、組織または生物への試験物質の適用前および後の生物学的機能を反映する、細胞、組織または生物のパラメーターのレベルの変化の測定を伴う。いくつかの態様では、指示因子（例えば、リン酸化STAT5の濃度）は、ある量の試験物質（例えば、IL2）の投与に応答した、アッセイにおいて評価される細胞の生物学的機能（例えば、IL2受容体の活性化）を反映する。いくつかの態様では、試験系は、細胞、組織または生物（例えば、発光新生細胞を注射したマウス）への1つまたは複数の試験物質（例えば、IL2オルソログと組み合わせた、オルソゴナルCD122を発現するCAR-T細胞）の適用前および後の生物学的状態（例えば、新生物の存在）を反映する、細胞、組織または生物（例えば、マウス）のパラメーター（例えば、発光）のレベルの変化の測定を伴う。いくつかの態様では、指示因子（例えば、リン酸化STAT5の濃度）は、ある量の試験物質（例えば、IL2）の投与に応答した、アッセイにおいて評価される細胞（例えば、T細胞）の生物学的機能（例えば、IL2受容体の活性化）を反映する。「応答をもたらすのに十分な量」は、治療有効量であるのに十分であり得るが、「応答を引き起こすのに十分な量で」は、治療有効量より多くても少なくてもよい。
処置を必要とする：「処置を必要とする」という用語は、本明細書において使用される場合、対象に関して医師または他の介護士によってなされる、対象が処置を必要とするかまたは処置から潜在的に恩恵を受けるとの判断を指す。この判断は、医師または介護士の専門知識の領域にある多様な要因に基づいてなされる。
予防を必要とする：本明細書において使用される場合、「予防を必要とする」という用語は、対象に関して医師または他の介護士によってなされる、対象が予防的ケアを必要とするかまたはそれから潜在的に恩恵を受けるとの判断を指す。この判断は、医師または介護士の専門知識の領域にある多様な要因に基づいてなされる。
阻害剤：本明細書において使用される場合、「阻害剤」という用語は、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体または細胞を減少させる、遮断する、阻止する、その活性化を遅らせる、不活性化する、脱感作する、またはダウンレギュレーションする分子のことを指す。阻害剤はまた、細胞または生物の構成的活性を低減する、遮断する、または不活性化する分子として定義することもできる。
単離された：本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、天然に存在している場合、それが天然に存在し得る環境とは異なる環境中にある、関心対象のポリペプチドに関して使用される。「単離された」は、関心対象のポリペプチドが実質的に濃縮されているおよび／または関心対象のポリペプチドが部分的もしくは実質的に精製されている試料内にあるポリペプチドを含むことを意味する。ポリペプチドが天然に存在しない場合、「単離された」は、ポリペプチドが、合成または組換えのいずれかの手段によって作られた環境から切り離されていることを示す。
オルソゴナル受容体の細胞内ドメイン：本明細書において使用される場合、「オルソゴナル受容体の細胞内ドメイン」または「ICD-OR」という用語は、膜通過オルソゴナル受容体を発現する細胞の原形質膜の内側にある膜通過オルソゴナル受容体の部分のことを指す。ICD-ORは、細胞に有糸分裂に進入して細胞増殖を開始するようシグナルを送るタンパク質ドメインのことを指す、1つまたは複数の「増殖シグナル伝達ドメイン」または「PSD」を含み得る。例としては、JAK1、JAK2、JAK3、Tyk2、Ptk-2を非限定的に含むヤヌスキナーゼ、他の哺乳動物または真核生物種由来のヤヌスキナーゼファミリーの相同メンバー、IL2受容体βおよび／またはγ鎖、ならびにヤヌスキナーゼファミリーのタンパク質と相互作用してシグナルを伝達し得るサイトカイン受容体スーパーファミリーのタンパク質由来の他のサブユニット、あるいはそれらの部分、改変または組み合わせが挙げられる。シグナルの例としては、STAT1、STAT3、STAT5aおよび／またはSTAT5bの1つまたは複数を非限定的に含む、1つまたは複数のSTAT分子のリン酸化が挙げられる。
「～と組み合わせた」：本明細書において使用される場合、「～と組み合わせた」という用語は、複数の作用物質を対象に投与することに関して使用される場合、対象に、第1の作用物質を少なくとも1つの追加（すなわち、第2、第3、第4、第5など）の作用物質と共に投与することを指す。本発明の目的として、第1の作用物質の投与から生じる生物学的効果が、第2の作用物質の投与時に、第1の作用物質の治療効果と第2の作用物質の治療効果が重複するように対象において持続する場合、1つの作用物質（例えば、IL2オルソログ）は、第2の作用物質（例えば、操作されたヒト免疫細胞）と組み合わせて投与されるものと見なされる。例えば、操作されたオルソゴナル細胞療法剤は、典型的には、低頻度で投与（典型的には、一度だけ投与）される一方で、IL2オルソログは、オルソゴナル細胞剤が対象において持続する間に定期的に投与される。操作されたオルソゴナル細胞療法剤は、延長された時間（数週間または数ヶ月）にわたって治療効果を提供し、第2の作用物質（例えば、IL2オルソログ）の投与は、第1の作用物質の治療効果がなお継続している間もその治療効果を提供するので、第1の作用物質が第2の作用物質の投与の時間からかなり離れた時点（例えば、数日または数週間）で投与されていたとしても、第2の作用物質は、第1の作用物質と組み合わせて投与されるものと見なされる。一態様では、第1および第2の作用物質が同時に（互いに30分以内）、同じ期間の間にまたは逐次に投与される場合、1つの作用物質は、第2の作用物質と組み合わせて投与されるものと見なされる。いくつかの態様では、第1および第2の作用物質が、互いに約24時間以内、好ましくは互いに約12時間以内、好ましくは互いに約6時間以内、好ましくは互いに約2時間以内、または好ましくは互いに約30分以内に投与される場合、第1の作用物質は、第2の作用物質と「同じ期間の間に」投与されると見なされる。「～と組み合わせた」という用語はまた、第1の作用物質と第2の作用物質が単一の薬学的に許容される製剤に合剤化されてその合剤が対象に投与されるという状況にも、適用されると理解されるものとする。ある特定の態様では、オルソゴナル細胞およびIL2オルソログは、追加の補助作用物質とさらに組み合わせられる。補助作用物質は、逐次に投与または適用され、例えば、この場合、1つの作用物質が、1つまたは複数の他の作用物質の前に投与される。他の態様では、IL2ムテインおよび補助作用物質は、同時に投与され、例えば、この場合、2つ以上の作用物質が、同じまたはほぼ同じ時点に投与される；2つ以上の作用物質は、2つ以上の別々の製剤中に存在してもよく、単一の製剤（すなわち、合剤）中に組み合わされてもよい。作用物質が逐次投与されるか同時投与されるかに関わらず、これらは、本開示の目的として組み合わせで投与されるものと見なされる。
高親和性IL2受容体：本明細書において使用される場合、「高親和性IL2受容体」という用語は、CD25、CD122およびCD132タンパク質を含む三量体受容体複合体（「IL2Rαβγ」とも称される）のことを指す。野生型hIL2（SEQ ID NO：5）は、高いIL2親和性受容体複合体に対しておよそ10-11MのKdを保有する。
中親和性IL2受容体：本明細書において使用される場合、「中親和性IL2受容体」という用語は、CD122およびCD132を含む二量体IL2受容体複合体（「IL2Rβγ」とも称される）のことを指す。IL2分子と哺乳動物免疫細胞の表面上に発現される中親和性IL2受容体との会合は、細胞においてIL2シグナル伝達をもたらす。野生型hIL2（SEQ ID NO：5）は、中親和性CD122/CD132（IL2Rβγ）受容体複合体に対しておよそ10-9MのKdを保有する。
Kabat番号付け：「Kabat番号付け」という用語は、本明細書において使用される場合、当技術分野において認められており、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖領域において他のアミノ酸残基よりも可変性である（例えば、超可変性の）アミノ酸残基の付番方式のことを指す（Kabat, et al., (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93; Kabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。本開示の目的として、抗体の可変領域におけるCDRの位置付けは、Kabat番号付けまたは単に「Kabat」に従う。
リガンド：本明細書において使用される場合、「リガンド」という用語は、受容体に特異的に結合して、受容体の活性の変化またはその受容体を発現する細胞における応答をもたらすような変化を受容体において引き起こす、分子のことを指す。一態様では、「リガンド」という用語は、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用できる分子またはその複合体のことを指す。本明細書において使用される場合、「リガンド」という用語は、天然および合成のリガンドを包含する。「リガンド」はまた、低分子、サイトカインのペプチド模倣体および抗体のペプチド模倣体も包含する。リガンドと受容体の複合体は、「リガンド-受容体複合体」と呼ばれる。リガンドは、ポリタンパク質または融合タンパク質（例えば、抗体-標的指向型リガンド融合タンパク質）の1つのドメインを含み得る。
転移：本明細書において使用される場合、「転移」という用語は、原発腫瘍から周囲組織および遠位臓器へのがん性細胞の伝播のことを説明する。
修飾されたIL2オルソログ：本明細書において使用される場合、「修飾されたIL2オルソログ」という用語は、ペグ化、グリコシル化（N-連結およびO-連結）、アシル化もしくはポリシアリル化などの1つもしくは複数の修飾によって、あるいは、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（HSA）もしくはウシ血清アルブミン（BSA））を含むアルブミン融合ポリペプチド、Fc-融合タンパク質、標的指向型IL2オルソログ融合タンパク質（例えば、scFv-IL2オルソログ融合タンパク質、VHH-IL2オルソゴナルポリペプチド融合タンパク質）などを非限定的に含む他のポリペプチドキャリア分子とのコンジュゲーション（化学的または融合タンパク質としてのいずれか）によって修飾されている、IL2オルソログのことを指すために使用される。修飾されたIL2オルソログは、1つまたは複数の性質を増強するために、例えば、免疫原性をモジュレートする（免疫原へのコンジュゲーションまたは融合）、水溶性、バイオアベイラビリティ、血清半減期および／もしくは治療半減期を増加させる方法；ならびに／または生物活性をモジュレートするために調製され得る。ある特定の修飾は、例えば、検出アッセイ（例えば、エピトープタグ）において使用するための抗体の生成にも、またはタンパク質精製（例えば、ポリHisタグ）を容易にするためにも有用であり得る。修飾されたIL2オルソログは、1つまたは複数の性質を増強するために、例えば、免疫原性をモジュレートする；水溶性、バイオアベイラビリティ、血清半減期および／もしくは治療半減期を増加させる方法；ならびに／または生物活性をモジュレートするために調製され得る。ある特定の修飾は、例えば、検出アッセイ（例えば、エピトープタグ）において使用するための抗体の作製にも、またタンパク質精製を容易にするためにも有用であり得る。いくつかの態様では、修飾されたIL2オルソログは、式1の修飾に包含されるような任意の修飾を除いて、SEQ ID NO：5に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％のアミノ酸配列同一性である。
モジュレートする：本明細書において使用される場合、「モジュレートする」、「モジュレーション」などの用語は、生物系または生化学経路を含む系において、応答を、正もしくは負または直接的もしくは間接的のいずれかで引き起こす、試験物質の能力のことを指す。モジュレーターという用語は、アゴニスト（部分アゴニスト、完全アゴニストおよびスーパーアゴニストを含む）とアンタゴニストの両方を含む。
新生物疾患：本明細書において使用される場合、「新生物疾患」という用語は、細胞の過増殖または未制御（もしくは脱制御）の細胞複製から生じる対象における障害または病態のことを指す。新生物疾患という用語は、対象における新生物の存在から生じる障害のことを指す。新生物は、（1）良性（2）前悪性（または「前がん性」）；および（3）悪性（または「がん性」）として分類され得る。「新生物疾患」という用語は、新生物疾患に直接的または間接的に関連する状態のことを指す新生物関連疾患、障害および病態を含み、かつ、例えば、血管新生および異形成またはくすぶり型多発性骨髄腫などの前がん性病態を含む。
N末端：本明細書においてポリペプチドの構造の文脈で使用される場合、「N末端」（または「アミノ末端」）および「C末端」（または「カルボキシ末端」）は、それぞれ、ポリペプチドの最も端にあるアミノ端およびカルボキシル端のことを指し、一方で、「N末端の」および「C末端の」という用語は、それぞれ、N末端およびC末端に対するポリペプチドのアミノ酸配列中の相対位置のことを指し、それぞれ、N末端およびC末端にある残基を含むことができる。「すぐN末端の」または「すぐC末端の」は、1番目と2番目のアミノ酸残基が共有結合して連続アミノ酸配列を提供している場合の、2番目のアミノ酸残基に対する1番目のアミノ酸残基の位置のことを指す。
新生物疾患：本明細書において使用される場合、「新生物疾患」という用語は、細胞の過増殖または未制御（もしくは脱制御）の細胞複製から生じる対象における障害または病態のことを指す。新生物疾患という用語は、対象における新生物の存在から生じる障害のことを指す。新生物は、（1）良性（2）前悪性（または「前がん性」）；および（3）悪性（または「がん性」）として分類され得る。「新生物疾患」という用語は、新生物疾患に直接的または間接的に関連する状態のことを指す新生物関連疾患、障害および病態を含み、かつ、例えば、血管新生および異形成などの前がん性病態を含む。
核酸：「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」などの用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さの、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかの、多量体形態のヌクレオチド、またはその類似体のことを指す。ポリヌクレオチドの非限定例としては、線状および環状核酸、メッセンジャーRNA（mRNA）、相補的DNA（cDNA）、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、プライマーなどが挙げられる。
IL2に従って番号付けされた：「IL2に従って番号付けされた」という用語は、本明細書において使用される場合、成熟野生型IL2の配列中の特定のアミノ酸が通常存在する位置を基準にして、その特定のアミノ酸の位置を特定することを指す。いくつかの態様では、IL2は、hIL2（SEQ ID NO：5）である。例えば、hIL2に関して、「R81」は、成熟野生型hIL2の配列中に存在する81番目（N末端から付番して）のアミノ酸がアルギニンであることを指す。異なる哺乳動物種のIL2分子のアミノ酸配列は、異なるアミノ酸数および配列を有することに留意すべきである。したがって、この慣例に従って残基を参照すれば、問題となっているIL2種を特定する助けになる。
CD122に従って番号付けされた：「CD122に従って番号付けされた」という用語は、本明細書において使用される場合、成熟野生型CD122分子の配列中の特定のアミノ酸が通常存在する位置を基準にして、その特定のアミノ酸の位置を特定することを指す。一態様では、CD122分子は、ヒトCD122（SEQ ID NO. 2）である。例えば、ヒトCD122に関して、H133は、成熟野生型hCD122の配列の133番目（N末端から付番して）のアミノ酸がヒスチジンであることを指す。
CD122の細胞外ドメインに従って番号付けされた：「CD122の細胞外ドメインに従って番号付けされた」または「CD122 ECDに従って番号付けされた」という用語は、本明細書において使用される場合、成熟野生型CD122分子の細胞外ドメイン（ECD）配列中の特定のアミノ酸が通常存在する位置を基準にして、その特定のアミノ酸の位置を特定することを指す。一態様では、CD122 ECD分子は、ヒトCD122 ECD（SEQ ID NO. 3）である。例えば、ヒトCD122 ECDに関して、H133は、成熟野生型hCD122 ECDの配列の133番目（N末端から付番して）のアミノ酸がヒスチジンであることを指す。
機能的に連結された：「機能的に連結された」という用語は、本明細書において、異なる機能をコードする核酸配列が単一核酸配列に組み合わされたときの、細胞に導入されたときに細胞において特定の核酸配列の転写および／または翻訳を達成可能な核酸を提供する、それらの間の関係性のことを指す。例えば、シグナル配列に関するDNAは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるなら、ポリペプチドの関するDNAに機能的に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼすなら、コード配列に機能的に連結されている；または、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように位置付けられているなら、コード配列に機能的に連結されている。一般に、「機能的に連結された」は、連結されているDNA配列が、隣接していること、また、分泌リーダーの場合には、隣接しかつリーディングフェーズにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーなどのある特定の遺伝エレメントは、それらの効果を提供する配列に関して隣接している必要はない。
オルソゴナル細胞：本明細書において使用される場合、「オルソゴナル細胞」という用語は、オルソゴナル受容体を発現するように組換え改変された哺乳動物細胞のことを指す。いくつかの態様では、オルソゴナル細胞は、オルソゴナルCD122（oCD122）ポリペプチドまたはオルソゴナルCD122 ECDを含む受容体を発現する。いくつかの態様では、オルソゴナル細胞は、改変されたヒト細胞（「ヒトオルソゴナル細胞」）である。オルソゴナル細胞は、免疫細胞、例えば、ヒト免疫細胞であり得る。「ヒトオルソゴナル免疫細胞」は、ヒトオルソゴナルCD122（hoCD122）またはヒトオルソゴナルCD122 ECDを含むキメラ受容体を発現するように組換え改変されたヒト免疫細胞である。いくつかの態様では、oCD122（またはoCD122 ECDを含む受容体）を発現するように操作するための免疫細胞は、骨髄細胞、リンパ球、末梢血単核細胞（PBMC）、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、T細胞、CD8+ T細胞、CD25+CD8+ T細胞、CAR-T細胞、NK細胞、CD4+ T細胞、およびTreg、操作されたTIL、操作されたTregおよび操作されたNK細胞を非限定的に含むそれらの操作されたバージョンからなる群より選択される。いくつかの態様では、オルソゴナル細胞は、ヒトオルソゴナルCD122を発現するように組換え改変されたヒト免疫細胞に由来するCAR-T（「hoCAR-T」細胞）である。いくつかの態様では、オルソゴナル細胞は、ヒトオルソゴナルCD122またはoCD122 ECDを含む受容体を発現するように組換え改変された、ヒト対象の新生物から単離されたTIL（「hoTIL」細胞）である。いくつかの態様では、オルソゴナル細胞は、ヒトオルソゴナルCD122またはoCD122 ECDを含む受容体を発現するように組換え改変された、ヒト対象から単離されたNK（「hoNK」細胞）である。いくつかの態様では、該細胞は、ヒトオルソゴナルCD122またはoCD122 ECDを含む受容体を発現するように組換え改変されたヒト造血幹細胞（「hoHSC」細胞）である。いくつかの態様では、オルソゴナル細胞は、ヒトオルソゴナルCD122またはoCD122 ECDを含む受容体を発現するようにさらに改変された、非天然T細胞受容体を発現するように組換え改変された、ヒト免疫細胞に由来するTCR操作細胞（「hoTCR細胞」）である。本明細書において使用される場合、「オルソゴナル細胞」という用語は、オルソゴナルCD122またはoCD122 ECDを含む受容体を発現するように組換え改変された哺乳動物細胞のことを指す。オルソゴナル細胞は、オルソゴナルCD122ポリペプチドまたはoCD122 ECDを含む受容体を発現させるために必要な組換え改変の他に、組換え改変を組み込んでもよく、これには、マーカータンパク質（抗生物質耐性を付与するタンパク質、蛍光タンパク質または発光タンパク質）；DNAまたはRNA結合タンパク質、転写抑制因子または抑制解除因子を含む転写因子、アポトーシス促進性タンパク質、抗アポトーシス性タンパク質および細胞内調節タンパク質を非限定的に含む、生物学的に活性な細胞内タンパク質；抗体などの生物学的に活性な治療用タンパク質を含む、成長因子、ペプチドホルモン、サイトカインまたはケモカインなどの生物学的に活性な分泌タンパク質（典型的には、オルソゴナル細胞において発現後に細胞外輸送を容易にするためのシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を含む、細胞外タンパク質）をコードする核酸分子を非限定的に含めた、オルソゴナル細胞における発現を容易にするために発現制御配列に機能的に連結されたマーカータンパク質をコードする核酸分子の導入を含む、組換え改変が含まれる。オルソゴナル細胞に対する追加の組換え改変は、当業者に明らかであろう。いくつかの態様では、オルソゴナル細胞上に発現されるオルソゴナルCD122受容体は、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを提供するように改変されたヒトCD122細胞内ドメイン（ICD）を含み得る。
オルソゴナルCD122：本明細書において使用される場合、「オルソゴナルCD122」または「CD122オルソゴナル受容体」という用語は、本明細書において互換的に使用され、CD122ポリペプチドバリアントに対する同族リガンドであるIL2オルソログへの特異的結合をもたらすがIL2の天然に存在する形態に特異的に結合しないアミノ酸置換を含む、CD122ポリペプチドバリアントのことを指す。
オルソゴナル受容体：本明細書において使用される場合、「オルソゴナル受容体」という用語は、受容体のバリアント、すなわち、その同族リガンドへの有意に低下した結合を示すが、相互作用するように操作されたオルソゴナルリガンドに対して特異的結合を示すような、アミノ酸配列に対する修飾を含むオルソゴナル受容体のことを指す。いくつかの態様では、オルソゴナル受容体は、その同族天然リガンドへの有意に低下した結合を示す細胞外ドメインを含み得る一方で、オルソゴナルリガンドは、その同族天然受容体のECDへの有意に低下した結合を示す。いくつかの態様では、同族オルソゴナル受容体に対するオルソゴナルリガンドの親和性は、天然受容体に対する天然リガンドの親和性と同等である親和性を示し、例えば、天然サイトカイン受容体対親和性の少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約100％であり、また、より高い、例えば、天然受容体に対する天然サイトカインの親和性の2×、3×、4×、5×、10×またはそれ以上であり得る親和性を有する。オルソゴナル受容体は、それが由来する親分子（例えば、オルソゴナルCD122）によって指し示されても、オルソゴナル受容体に対するオルソゴナルリガンドが由来する同族リガンド（例えば、オルソゴナルIL2受容体）によって指し示されてもよい。
オルソログ：本明細書において使用される場合、「オルソログ」または「オルソゴナルリガンド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、オルソゴナルリガンド／受容体対のリガンド成分のことを指し、また、（a）その天然同族受容体（すなわち、オルソログが由来する親ポリペプチドに対する天然受容体）への有意に低下した親和性；および（b）オルソログに対する同族受容体のバリアントである操作されたオルソゴナル受容体への特異的結合を示す、ポリペプチドバリアントを提供する修飾をその一次構造に組み込んだポリペプチドのことを指す。オルソログがオルソゴナル受容体（これは、組換え改変された細胞においてオルソゴナル受容体の発現をもたらすために制御エレメントに機能的に連結されたオルソゴナル受容体をコードする核酸配列が組み込まれるように組換えDNA技術によって改変された細胞の表面に発現される）に結合すると、活性化されたオルソゴナル受容体は、天然の細胞エレメントを通じて伝達されるシグナル伝達を開始して、その同族の天然の応答を模倣するがオルソゴナル受容体を発現する組換え改変された細胞集団に特異的である生物活性を提供する。本発明のいくつかの態様では、オルソログは、同族受容体と比べてオルソゴナル受容体に対して有意な選択性を保有し、任意で同族受容体に関して有意に低下した効力を保有する。選択性は、典型的には、リガンド／受容体結合に応答して誘導される活性に特徴的なアッセイにおいて測定される活性によって評価される。いくつかの態様では、オルソログは、同じアッセイで測定した場合、少なくとも5倍、あるいは少なくとも10倍、あるいは少なくとも20倍、あるいは少なくとも30倍、あるいは少なくとも40倍、あるいは少なくとも50倍、あるいは少なくとも100倍、あるいは少なくとも200倍の差のEC50を保有する。
親ポリペプチド：本明細書において使用される場合、「親ポリペプチド」または「親タンパク質」という用語は、互換的に使用され、バリアントポリペプチドを作製するためにその後改変される天然に存在するポリペプチドのことを指す。親ポリペプチドは、野生型（または天然）ポリペプチドであり得る。親ポリペプチドは、ポリペプチドそれ自体または親ポリペプチドを含む組成物（例えば、親ポリペプチドを含むグリコシル化された、ペグ化された融合タンパク質）のことを指し得る。
部分アゴニスト：本明細書において使用される場合、「部分アゴニスト」という用語は、所与の受容体に特異的に結合してその受容体を活性化するが、完全アゴニストと比べて受容体を部分的にしか活性化しない分子のことを指す。部分アゴニストは、アゴニスト作用とアンタゴニスト作用の両方を示し得る。例えば、完全アゴニストと部分アゴニストの両方が存在する場合、部分アゴニストは、完全アゴニストと受容体結合について競合することによって競合的アンタゴニストとして作用し、部分アゴニストの非存在下で受容体が完全アゴニストと接触する場合と比べて受容体活性化の正味の減少をもたらす。臨床では、部分アゴニストを使用して、適切でない量の内因性リガンドが存在する場合に受容体を活性化して所望の準最大応答を与えることができ、またはこれらは、過剰量の内因性リガンドが存在する場合に受容体の過剰刺激を低減することができる。部分アゴニストによって生成される最大応答（Emax）は、その内因活性と呼ばれ、完全アゴニストが100％の応答を生成するとした場合の百分率スケールで表され得る。本開示のIL2部分アゴニストは、同等なアッセイにおいて類似の濃度で評価した際にWHO国際標準（NIBSCコード：86/500）野生型成熟ヒトIL2の活性の10％超、あるいは20％超、あるいは30％超、あるいは40％超、あるいは50％超、あるいは60％超、あるいは70％超を有し得る。
PEG-IL2オルソログ：本明細書において使用される場合、「PEG-IL2オルソログ」という用語は、少なくとも1つのポリエチレングリコール（PEG）分子に共有結合されたIL2オルソログのことを指し、少なくとも1つのPEG分子は、IL2オルソログの少なくとも1つのアミノ酸残基に共有付着されている。PEG化されたポリペプチドはさらに、モノペグ化された、ジペグ化された、トリペグ化された（など）と称されてもよく、それぞれIL2オルソログに付着された1、2、3（またはそれ以上）のPEG部分を含むPEG-IL2オルソログを表す。いくつかの態様では、PEGは、IL2オルソログに直接的に共有付着されてもよく（例えば、リジン側鎖、システインのスルフヒドリル基またはN末端アミンを通じて）、または任意でPEGとIL2オルソログとの間にリンカーを用いてもよい。いくつかの態様では、PEG-IL2オルソログは、1を超えるPEG分子を含み、その各々は、異なるアミノ酸残基に付着される。いくつかの態様では、PEG-IL2オルソログは、SEQ ID NO：4に由来する（成熟ヒト野生型hIL2）。IL2のPEG化された形態およびIL2ポリペプチドのPEG化の方法論は、当技術分野において周知である（例えば、1990年6月5日に発表されたKatreらの米国特許4,931,544；1993年4月27日に発表されたKatreらの米国特許5,206,344；および2018年1月9日に発表されたBossardらの米国特許第9,861,705号を参照のこと）。いくつかの態様では、2017年12月28日に公開されたPtacinらの米国特許出願公報US20170369871A1に記載されているように、部位特異的PEG化が容易になるように、天然に存在しないアミノ酸側鎖を有する非天然アミノ酸の組み込みによってIL2ムテインを改変してもよい。他の態様では、2016年2月18日にWO2016/025385として公開されたGreveらのPCT国際特許出願番号PCT/US2015/044462に記載されているように、システイン側鎖を介した部位特異的PEG化が容易になるように、IL2分子内の様々な位置にシステイン残基を組み込んでもよい。
ポリペプチド：本明細書において使用される場合、本明細書において互換的に使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、遺伝的にコードされたおよび遺伝的にコードされていないアミノ酸、化学的にまたは生化学的に改変されたまたは誘導体化されたアミノ酸、ならびに改変されたポリペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる、任意の長さのアミノ酸の多量体形態のことを指す。この用語は、非相同アミノ酸配列を有する融合タンパク質；非相同および相同リーダー配列を有する融合タンパク質；N末端メチオニン残基を有するまたは有しない融合タンパク質；免疫学的にタグ化されたタンパク質を有する融合タンパク質；免疫学的に活性なタンパク質の融合タンパク質（例えば、抗原性ジフテリアまたは破傷風毒素断片）などを非限定的に含む、融合タンパク質を含む。
予防する：本明細書において使用される場合、「予防する」、「予防すること」、「予防」などの用語は、一般に遺伝、経験または環境因子に起因して特定の疾患、障害または病態を有する傾向がある対象の文脈において、疾患、障害、病態またはその症状の発生前に、対象の疾患、障害、病態などを発症するリスク（例えば、臨床症状の非存在によって判定されるような）またはその発生を遅延させるリスクを、一時的または永続的のいずれかで、予防、抑制、阻害または低減するために、対象に関して開始される一連の行為のことを指す。ある特定の例では、「予防する」、「予防すること」、「予防」という用語はまた、現在のその状態からより悪化した状態への疾患、障害または病態の進行を減速させることを指すためにも使用される。
受容体：本明細書において使用される場合、「受容体」という用語は、リガンドに特異的に結合するドメインを有するポリペプチドのことを指し、リガンドの結合は、ポリペプチドの少なくとも1つの生物学的性質を変化させる。いくつかの態様では、受容体は、細胞表面に関連しない「可溶性」受容体である。可溶性形態のhCD25は、hIL2に特異的に結合する可溶性受容体の一例である。いくつかの態様では、受容体は、細胞外ドメイン（ECD）およびECDを細胞表面に固定させるのに役立つ膜関連ドメインを含む、細胞表面受容体である。細胞表面受容体のいくつかの態様では、受容体は、典型的には膜貫通ドメイン（TM）と称される膜通過ドメインによって連結された細胞内ドメイン（ICD）および細胞外ドメイン（ECD）を含む、膜通過ポリペプチドである。受容体へのリガンドの結合は、受容体において立体構造変化をもたらし、その結果、測定可能な生物学的効果を生じる。受容体がECD、TMおよびICDを含む膜通過ポリペプチドであるいくつかの例では、ECDへのリガンドの結合は、ECDへのリガンドの結合に応答してICDの1つまたは複数のドメインによって媒介される測定可能な細胞内生物学的効果をもたらす。いくつかの態様では、受容体は、細胞内シグナル伝達を容易にする多成分複合体の一成分である。例えば、リガンドは、いかなる細胞内シグナル伝達単独にも関連していない細胞表面受容体に結合し得るが、リガンドが結合することにより、細胞内シグナル伝達カスケード（例えば、Jak/STAT経路）の活性化をもたらすヘテロ二量体（例えば、中親和性CD122/CD132 IL2受容体）、ヘテロ三量体（例えば、高親和性CD25/CD122/CD132 hIL2受容体）を含むヘテロ多量体またはホモ多量体（ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体）複合体の形成が容易になる。いくつかの態様では、受容体は、ECD、TMおよびICDドメインを含む膜通過単鎖ポリペプチドであり、ECD、TMおよびICDドメインは、同じまたは異なる天然に存在する受容体バリアントに由来する。いくつかの態様では、受容体は、hoCD122受容体であり得る。いくつかの態様では、受容体は、キメラ抗原受容体（CAR）である。
組換え：本明細書において使用される場合、「組換え」という用語は、形容詞として使用され、ポリペプチド、核酸または細胞が組換えDNA技術を使用して改変された方法のことを指す。組換えタンパク質は、組換えDNA技術を使用して産生されたタンパク質であり、たびたび、タンパク質がその方法で産生されたことを表すために小文字「r」を付けて略される（例えば、rhIL2）。同様に、組換えDNA技術を使用して外因性核酸（例えば、ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、mRNA、ウイルスまたは非ウイルスベクター、プラスミド、コスミドなど）を組み込むこと（例えば、トランスフェクション、形質導入、感染）により細胞が改変されているならば、細胞は、「組換え細胞」と称される。組換えDNA技術のための技法およびプロトコルは、当技術分野において周知であり、例えば、これらは、Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual（2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.）および他の標準的な分子生物学実験マニュアルにおいて見いだすことができる。
応答：例えば、細胞、組織、臓器または生物の「応答」という用語は、評価可能な生化学的または生理学的パラメーター（例えば、濃度、密度、接着、増殖、活性化、リン酸化、遊走、酵素活性、遺伝子発現レベル、遺伝子発現率、エネルギー消費率、分化のレベルまたは状態）の定量的または定性的変化を包含し、この変化は、遺伝的プログラミングなどの内部機構による活性化、刺激または処理と相関する。ある特定の状況では、「活性化」、「刺激」などの用語は、内部機構によってならびに外部または環境因子によって調節された場合の細胞活性化のことを指す；一方で、「阻害」、「ダウンレギュレーション」などの用語は、反対の効果のことを指す。CD3活性化初代ヒトT-細胞の増殖を評価するためのそのような標準的なプロトコルの例としては、Crouch, et al. (1993) “The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity” J. Immunol. Methods 160: 81-8に記載されているような培養物中に存在する細胞数に正比例するATP存在量に比例して発光シグナルを発生する生物発光アッセイ、あるいは、Promega Corporation（2800 Woods Hollow Road, Madison WI 53711）からそれぞれカタログ番号G9241およびG9681で市販されているCellTiter-Glo（登録商標）2.0 Cell Viability AssayまたはCellTiter-Glo（登録商標）3D Cell Viabilityキットなどの、製造業者により提供される説明書に実質的に従う標準化された市販のアッセイ系が挙げられる。いくつかの態様では、試験物質の投与に応答したT-細胞の活性化のレベルが、STAT5リン酸化のレベルを当技術分野において周知である方法に従って判定するなど、記載されているようなフローサイトメトリー法によって判定され得る。STAT5リン酸化は、前出のHortaら、前出のGarciaら、またはPhospho-STAT5（Tyr694）キット（Perkin-Elmer/cisbio（Waltham MA）からPart Number 64AT5PEGで市販されている）などの製造業者の指導に実質的に従う市販のキットに記載されているような、フローサイトメトリー技術を使用して測定され得る。添字付きで使用される略称ECACTの場合、これは、試験プロトコルに従って測定した場合に、試験物質の適用に応答してT細胞中で最大に対して表示した割合のSTAT5リン酸化を生成するのに十分な試験物質の濃度を示すために提供される。例証として、略称EC30 PROは、hIL2オルソログに関して、Phospho-STAT5（Tyr694）キットで測定した場合にそのようなhIL2オルソログに応答してT細胞中で最大レベルの30％のSTAT5リン酸化を伴う濃度を示すために使用され得る。
いくつかの例では、分子に対して確立されている、標準化されて受け入れられている生物活性の測定基準がある。例えば、hIL2効力に関して、国際単位（IU）でのhIL2効力の評価に関する標準的な方法論は、Wadhwa, et al. (2013) "The 2nd International standard for Interleukin-2 (IL2) Report of a collaborative study" Journal of Immunological Methods 397:1-7により詳しく記載されているように、標準化された手順に従ってネズミ科の細胞傷害性T細胞株CTLL-2で測定される。本開示の文脈において、ネズミ科のIL2受容体が、ヒトIL2受容体と、特に、細胞内シグナル伝達シグナリング（例えば、STAT5リン酸化）をもたらすために三量体受容体複合体のすべての成分が必要であることに関して、異なって機能することに留意すべきである。例えば、Horta, et al., (2019) "Human and murine IL2 receptors differentially respond to the human-IL2 component of immunocytokines" Oncoimmunology 8(6):e1238538-1, e1238538-15およびNemoto, et al. (1995) "Differences in the interleukin-2 (IL2) receptor system in human and mouse: alpha chain is require for formation of the functional mouse IL2 receptor" European J Immunology 25(11)3001-5を参照されたい。したがって、hIL2バリアントの活性を、特に、CD25に対する親和性またはCD25状態に関する細胞の活性化に関して評価するとき、ヒトの低、中および高親和性IL2受容体ならびに受容体複合体の生物学を再現するヒト細胞または系の使用が好ましく、ネズミ科試験系（例えば、ネズミ科細胞を使用したインビトロ試験系またはマウスにおけるインビボ）において選択的な結合または活性化を示す分子は、ヒト系（例えば、ヒト細胞を使用したインビトロ試験系またはヒト対象におけるインビボ）においてそのような選択的活性を再現し得ない。
選択的：本明細書において使用される場合、「選択的」という用語は、特定の細胞タイプに優先的に結合するおよび／またはそれを活性化する作用物質の性質のことを指すために使用される。いくつかの態様では、本開示は、操作されたCD122 ECDポリペプチドに選択的に結合するIL2バリアント（IL2オルソログ）であって、そのような同族CD122 ECDポリペプチドを含む受容体に結合することに応答して、そのようなCD122 ECDポリペプチドを含む受容体を発現する細胞が活性化されるような、IL2オルソログを提供する。いくつかの態様では、本開示は、hoCD122受容体を発現している免疫細胞の優先的活性化を呈するという点で選択的であるhIL2オルソログを提供する。選択性は、典型的には、リガンド／受容体結合に応答して誘導される活性に特徴的なアッセイにおいて測定される活性によって評価される。いくつかの態様では、IL2オルソログの選択性は、CD25を発現する細胞（例えば、YTCD25POSまたはYTCD25+細胞）の活性化と有意により低い（好ましくは検出不能な）レベルのCD25を呈する細胞（例えば、YTCD25NEGまたはYTCD25-細胞）の活性化を比較することによって測定される。いくつかの態様では、選択性は、比較的高いレベルのCD25を発現するT細胞（例えば、Treg）と比較的低いレベルのCD25を発現するT細胞（例えば、刺激されていないCD8+ T細胞）の活性化によって測定される。
有意に低下した結合：本明細書において使用される場合、「有意に低下した結合を示す」という用語は、修飾された形態の受容体（例えば、オルソゴナルCD122）に対するバリアントリガンド（例えば、オルソログ）の結合の、天然に存在する形態の受容体に対するバリアントリガンドの結合と比べた親和性に関して使用される。いくつかの態様では、オルソゴナルリガンドが、天然形態の受容体に、天然に存在するリガンドの20％未満、あるいは約10％未満、あるいは約8％未満、あるいは約6％未満、あるいは約4％未満、あるいは約2％未満、あるいは約1％未満、あるいは約0.5％未満の親和性で結合するなら、リガンド（例えば、オルソログ）は、天然形態のリガンドへの有意に低下した結合を示す。同様に、天然形態のリガンドが、オルソゴナル形態の受容体に、天然に存在する受容体の20％未満、あるいは約10％未満、あるいは約8％未満、あるいは約6％未満、あるいは約4％未満、あるいは約2％未満、あるいは約1％未満、あるいは約0.5％未満の親和性で結合するなら、オルソゴナル受容体は、天然形態のリガンドに関して有意に低下した結合を示す。
特異的に結合する：本明細書において使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、ある分子が別の分子に結合するための親和性の程度のことを指す。結合ペア（例えば、リガンド／受容体、抗体／抗原、抗体／リガンド、抗体／受容体結合ペア）の文脈において、結合ペアの第1の分子が試料中に存在する第2の分子以外の他の成分に有意な量で結合しない場合、結合ペアの第1の分子は、結合ペアの第2の分子に特異的に結合すると言われる。第2の分子に対する第1の分子の親和性が、試料中に存在する他の成分に対する第1の分子の親和性よりも少なくとも2倍大きい、あるいは少なくとも5倍大きい、あるいは少なくとも10倍大きい、あるいは少なくとも20倍大きい、あるいは少なくとも100倍大きい場合、結合ペアの第1の分子は、結合ペアの第2の分子に特異的に結合すると言われる。結合ペアの第1の分子が抗体である特定の態様では、抗体は、結合ペアの第2の分子（例えば、タンパク質、抗原、リガンドまたは受容体）に、抗体と結合ペアの第2の分子との間の平衡解離定数が、約106M超、あるいは約108M超、あるいは約1010M超、あるいは約1011M超、あるいは約1010M超、約1012M超であると、例えば、スキャッチャード解析（Munsen, et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239）によって判定された場合に、特異的に結合する。リガンドがIL2オルソログであり、受容体がオルソゴナルCD122 ECDを含む一態様では、IL2オルソログは、IL2オルソログ／オルソゴナルCD122 ECDの平衡解離定数が約105M超、あるいは約106M超、あるいは約107M超、あるいは約108M超、あるいは約109M超、あるいは約1010M超、あるいは約1011M超である場合に、特異的に結合する。特異的結合は、競合ELISAアッセイ、放射性リガンド結合アッセイ（例えば、飽和結合、スキャッチャードプロット、非線形曲線適合プログラムおよび競合結合アッセイ）；非放射性リガンド結合アッセイ（例えば、蛍光偏光（FP）、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）および表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、Drescher et al., Methods Mol Biol 493:323-343 (2009)を参照のこと、Biacore 8+、Biacore S200、Biacore T200などのGE Healthcare Bio-Sciences（GE Healthcare Bio-Sciences, 100 Results Way, Marlborough MA 01752）から市販されている装置を用いる)；液相リガンド結合アッセイ（例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）、および免疫沈降）；および固相リガンド結合アッセイ（例えば、マルチウェルプレートアッセイ、オンビーズリガンド結合アッセイ、オンカラムリガンド結合アッセイ、およびフィルターアッセイ））を非限定的に含む、当技術分野において公知の技術を使用して評価され得る。
対象：「レシピエント」、「個体」、「対象」および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、診断、処置または治療が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトのことを指す。処置を目的とした「哺乳動物」は、ヒト、飼育動物および家畜、ならびに動物園の動物、スポーツ動物またはペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどを含む、哺乳動物として分類される任意の動物のことを指す。いくつかの態様では、哺乳動物は、ヒトである。
患っている：本明細書において使用される場合、「患っている」という用語は、X線、CTスキャン、慣用の実験室の診断検査（例えば、血球数など）、ゲノムデータ、タンパク質発現データ、免疫組織化学を非限定的に含む、疾患、障害または病態の特定のために当分野において受け入れられている入手可能な情報に基づき、対象に関して医師によってなされる、対象が処置を必要とするかまたは処置から恩恵を受けるとの判定を指す。患っているという用語は、典型的には、特定の疾患状態と共に使用され、例えば、「新生物疾患を患っている」は、新生物が存在すると診断された対象のことを指す。
実質的に純粋な：本明細書において使用される場合、「実質的に純粋な」という用語は、成分（例えば、ポリペプチド）が、組成物の総含有量の約50％超、典型的には、総ポリペプチド含有量の約60％超を構成することを示す。より典型的には、「実質的に純粋な」は、組成物全体の少なくとも75％、少なくとも85％、少なくとも90％またはより多くが関心対象の成分である組成物のことを指す。いくつかの場合、ポリペプチドは、組成物の総含有量の約90％超、または約95％超を構成するだろう。
T-細胞：本明細書において使用される場合、「T-細胞」または「T細胞」という用語は、その従来の意味で使用され、胸腺において分化し、特異的な細胞表面抗原受容体を保有する、リンパ球のことを指し、細胞性および体液性免疫の開始または抑制を制御するものならびに抗原含有細胞を溶解するものを含む。いくつかの態様では、T細胞としては、非限定的に、ナイーブCD8+ T細胞、細胞傷害性CD8+ T細胞、ナイーブCD4+ T細胞、ヘルパーT細胞、例えば、TH1、TH2、TH9、TH11、TH22、TFH；制御性T細胞、例えば、TR1、Treg、誘導性Treg；メモリーT細胞、例えば、セントラルメモリーT細胞、エフェクターメモリーT細胞、NKT細胞、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、ならびにCAR-T細胞、組換え改変TILおよびTCR操作細胞を非限定的に含むそのようなT-細胞の操作されたバリアントが挙げられる。
治療有効量：「治療有効量」という語句は、本明細書において、対象に作用物質を、単独でまたは薬学的組成物もしくは処置レジメンの一部として、対象に投与されたときに疾患、障害または病態の任意の症状、局面または特徴に対して任意の検出可能な正の効果を有することが可能な量の単一用量でまたは一連の用量の一部として投与することに関して使用される。治療有効量は、関係する生理学的効果を測定することによって確定することができ、その量は、投薬レジメンに関連してかつ対象の病態の診断解析などに応じて調整され得る。作用物質の治療有効量を決定するための評価のパラメーターは、年齢、体重、性別、総体的な健康、ECOGスコア、観察可能な生理学的パラメーター、血液レベル、血圧、心電図、コンピュータ断層撮影法、X線などの証拠を非限定的に含む当技術分野において受け入れられている診断基準を使用して医師によって決定される。代替的に、または追加的に、臨床状況において一般的に評価される他のパラメーター、例えば、体温、心拍数、血液化学の正常化、血圧の正常化、コレステロールレベルの正常化、または疾患、障害もしくは病態の任意の症状、局面もしくは特徴、バイオマーカー（例えば、炎症性サイトカイン、IFN-γ、グランザイムなど）、血清腫瘍マーカーの低下、固形腫瘍における奏効評価基準（RECIST）の改善、免疫関連奏効基準（irRC）の改善、生存期間の増加、延長された無増悪生存期間、進行時間の延長、治療成功期間の増加、延長された無イベント生存期間、次治療開始までの期間の延長、客観的奏効率の改善、奏効期間の改善、腫瘍量の低下、完全奏効、部分奏効、病勢安定など（作用物質の投与に応答した対象の病態の改善の評価のために当分野における臨床医に依拠する）をモニタリングして、作用物質の治療有効量が対象に投与されたかどうかを判定することができる。本明細書において使用される場合、標的病変に関する「完全奏効（CR）」、「部分奏効（PR）」、「病勢安定（SD）」および「病勢進行（PD）」という用語、ならびに非標的病変に関する「完全奏効（CR）」、「不完全奏効／病勢安定（SD）」および病勢進行（PD）という用語は、RECIST基準で定義されるものと理解される。本明細書において使用される場合、「免疫関連完全奏効（irCR）」、「免疫関連部分奏効（irPR）」、「免疫関連病勢進行（irPD）」および「免疫関連病勢安定（irSD）」という用語は、免疫関連奏効基準（irRC）に従って定義されるとおりである。本明細書において使用される場合、「免疫関連奏効基準（irRC）」という用語は、Wolchok, et al. (2009) Guidelines for the Evaluation of Immune Therapy Activity in Solid Tumors: Immune-Related Response Criteria, Clinical Cancer Research 15(23): 7412-7420に記載されているような免疫療法に対する応答の評価システムのことを指す。治療有効量は、対象の処置過程を通して、投薬レジメンおよび／または対象の病態の評価ならびに前述の因子の変動に関連して調整され得る。一態様では、治療有効量は、単独でまたは別の作用物質と組み合わせて使用されたときに哺乳動物対象への投与過程で不可逆の深刻な有害事象をもたらさない作用物質の量である。
膜貫通ドメイン：「膜貫通ドメイン」または「TM」という用語は、膜通過ポリペプチド（例えば、CD122またはCD132またはCARなどの膜通過ポリペプチド）のドメインであって、膜通過ポリペプチドが細胞膜に会合しているとき、細胞膜に埋め込まれ、膜通過ポリペプチドの細胞外ドメイン（ECD）および細胞内ドメイン（ICD）とペプチジル連結の状態にある、ドメインのことを指す。膜貫通ドメインは、細胞外ドメインおよび／または細胞内ドメインのいずれかまたは両方と相同（天然に関連する）または非相同（天然に関連しない）であり得る。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、オルソゴナル受容体が由来する同族受容体のECDドメインに天然に関連する膜貫通ドメインである。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、オルソゴナル受容体が由来する同族受容体のICDドメインに天然に関連する膜貫通ドメインである。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、増殖シグナル伝達ドメインに天然に関連する膜貫通ドメインである。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、異なるタンパク質に天然に関連する膜貫通ドメインである。あるいは、オルソゴナル受容体の膜貫通ドメインは、原形質膜を通過する人工のアミノ酸配列であり得る。いくつかの態様では、オルソゴナル受容体の膜貫通ドメインは、オルソゴナル受容体が由来する同族受容体のICDに通常関連する膜貫通ドメインである。受容体が、第1の親受容体に由来する細胞内ドメインと第2の異なる親受容体に由来する第2の細胞外ドメインを含むキメラ受容体であるいくつかの態様では、キメラ受容体の膜貫通ドメインは、キメラ受容体が由来する親受容体のICDまたはECDのいずれかに通常関連する膜貫通ドメインである。
処置する：「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、疾患、障害もしくは病態またはその症状が対象において診断、観察などされた後に、対象を苦しめているそのような疾患、障害もしくは病態の根本原因の少なくとも1つ、またはそのような疾患、障害もしくは病態に関連する症状の少なくとも1つを、一時的または永続的のいずれかで、排除する、低減する、抑制する、軽減する、または改善するために対象に関して開始される一連の行為（IL2、CAR-T細胞、またはそれを含む薬学的組成物を投与することなど）のことを指す。処置は、疾患を患っている対象に関して執られる、対象において疾患の阻害をもたらす（例えば、疾患、障害または病態の発生を阻止するか、それに関連する1つまたは複数の症状を改善する）一連の行為を含む。
Treg細胞または制御性T細胞.「制御性T細胞」または「Treg細胞」という用語は、本明細書において使用される場合、エフェクターT細胞（Teff）を非限定的に含む他のT細胞の応答を抑制することができるCD4+ T細胞の一種のことを指す。Treg細胞は、CD4、IL2受容体のa-サブユニット（CD25）、および転写因子フォークヘッドボックスP3（FOXP3）の発現によって特徴付けられる（Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)）。「従来のCD4+ T細胞」とは、制御性T細胞以外のCD4+ T細胞のことを意味する。
バリアント：「タンパク質バリアント」または「バリアントタンパク質」または「バリアントポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、少なくとも1つのアミノ酸修飾が理由で親ポリペプチドとは異なるポリペプチドのことを指す。親ポリペプチドは、天然に存在するもしくは野生型（WT）のポリペプチドであり得るか、またはWTポリペプチドの修飾型バージョンであり得る。バリアントポリペプチドという用語は、ポリペプチドそれ自体、ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードする核酸配列のことを指し得る。いくつかの態様では、バリアントポリペプチドは、親ポリペプチドと比べて約1～約10のアミノ酸修飾、あるいは親と比べて約1～約5のアミノ酸修飾、あるいは親と比べて約1～約3のアミノ酸修飾、あるいは親と比べて1～2個のアミノ酸修飾、あるいは親と比べて単一アミノ酸のアミノ酸修飾を含む。バリアントは、バリアントが由来する親ポリペプチドに対して少なくとも約99％同一、あるいは少なくとも約98％同一、あるいは少なくとも約97％同一、あるいは少なくとも約95％同一、あるいは少なくとも約90％同一であり得る。
野生型：本明細書における「野生型」または「WT」または「天然」とは、対立遺伝子変異を含む天然に見いだされるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列のことを意味する。WTタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、IgGなどは、人工的に改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
特定の態様の説明
養子細胞療法：
「養子細胞療法」または単に「細胞療法」は、外的に操作された細胞、特に免疫細胞の投与のことを指すために使用される。養子細胞療法の1つの形態は、腫瘍組織から単離された外的に操作されたリンパ球（「腫瘍浸潤リンパ球」または「TIL」と称される）を用いる。そのようなTILは、腫瘍抗原に曝露されているので腫瘍細胞を攻撃可能であるが、そのようなTILは、不足しているかまたは「消耗している」のいずれかであり、そのため、これらは独立に腫瘍を排除することができないと考えられる。TIL療法では、単離されたTILは、数を増大させるためにエクスビボで培養され、活性化物質に曝露され、細胞が単離された患者に再注入される（「自家細胞療法」と称される）。TIL細胞療法は、ヒト対象の新生物疾患の処置において有効性を有する治療法として報告されている。例えば、1992年6月30日に発表されたRosenbergの米国特許第5,126,132A号、およびSpiess, et al (1987) J Natl Cancer Inst 79:1067-1075を参照されたい。
現行では、ヒトTIL細胞療法は、切除された腫瘍材料から得られたTILのエクスビボ拡大増殖と、対象にリンパ球枯渇準備レジメンを適用した後の対象への養子移入と、その後の養子移入された細胞のインターロイキン-2（IL-2）の投与による支援からなる。リンパ球枯渇準備レジメンは、Tregを枯渇させ、細胞「シンク」を取り除き、しばしば養子移入された細胞のための「製造室」として特徴付けられる。IL-2の全身投与は、再注入されたTILのインビボ持続性を支援する。典型的な臨床実践では、TILの注入直後、患者は、i.v.高用量IL-2（720,000IU/kg）を最大耐容まで8時間毎に摂取する。このIL-2を用いた後続支援は、TILの生存性および臨床的有効性をさらに増強させると考えられる。
臨床効果が実証されているものの、TIL細胞療法は、汎血球減少および発熱性好中球減少症を結果としてもたらすリンパ球枯渇準備レジメンならびに濃縮されたTIL細胞集団の再投与後の高用量IL-2を用いた支持療法から主に生じる、重大な毒性を伴う。養子細胞療法の支持レジメンにおいて典型的に使用される高用量IL2の作用は、重大な毒性をもたらすと多く報告されている。養子細胞移入（ACT）後のIL-2支持療法の使用から生じる最も多く見られる副作用としては、全身性の炎症および毛細血管漏出症候群に起因する悪寒、高熱、低血圧、乏尿および浮腫、ならびに白斑またはブドウ膜炎などの自己免疫現象の報告が挙げられる。
TIL細胞療法はまた、単離されたT細胞のエクスビボ拡大増殖から生じる課題も有する。TILのエクスビボ拡大増殖は、高用量IL2の存在下でかなりの期間実施される。IL-2は、活性化Tリンパ球の増殖および拡大増殖を促進し、B細胞の成長を高め、単球およびナチュラルキラー細胞を活性化する。しかしながら、TILの拡大増殖プロセスの間、頻度の増減があるものの異なるT-細胞クローンとのクローン間競争がある。投与しようとする最終TIL製品は、腫瘍特異的クローンが可能な限り濃縮されていることが望ましいので、hIL2の非特異的な性質は、腫瘍特異的な抗原を経験したT細胞クローンに対して選択的支援を提供できず、最も効果的な腫瘍反応性のT細胞クローンが、エクスビボ拡大増殖段階の間に、hIL2の非特異的T-細胞の増殖効果に起因して打ち負かされ、希釈される可能性がある。結果として、対象に再注入しようとするTIL細胞製品は、抗腫瘍TIL（腫瘍抗原を経験した細胞）の集団が、対象に再注入される細胞製品中、細胞総数に対して最適以下の画分（例えば、60％未満、あるいは50％未満、あるいは40％未満、あるいは30％未満）しか占めないことになり得る。加えて、エクスビボの刺激手順後のT細胞のT-細胞分化度は、再注入後のTILのインビボ生存性、増殖能および有効性に影響を及ぼし得る。Li, et al. (2010) J Immunol. 2010；184: 452-465。IL2の高い効力および培養TILの高用量IL2への曝露の効果は、その存在下でエクスビボ培養されたT細胞の最終分化、ならびに他のインビボ副作用に加えて自己免疫の介在および移植拒絶反応に関連している。
Liらは、以下のように述べている：
我々の研究から出現した重要な問題は、REPを実施する他の方法を使用することで、CD28発現の維持に関連する「より若い」表現型とACT中でのより良好なインビボ持続性が可能な他のエフェクター-メモリーマーカーとを有するREP後T細胞を生成できるかどうかである。言い換えれば、我々は、インビボでの継続的な細胞分裂および長期生存性に有利なメモリー表現型を維持しながら、大量の腫瘍反応性の細胞傷害性T細胞を生成することにより、両方の良いところを得ることができるか？ということである。
Liら、465ページ。さらに、Liらは、IL2を伴う現在のエクスビボプロトコルから得られるTILの最終分化の状態が現在のTIL療法にとって問題であることを示唆しており、またTILのエクスビボ調製においてIL-2の作用を回避するためにIL-15またはIL-21などの他のサイトカインを使用できる可能性を示唆している。とはいえ、ACT後の高用量IL2療法を用いたTILの支援は、治療成績の改善に関わるものである。しかしながら、高用量IL2療法は、ヒト対象において重大な毒性を伴い、先に述べたように、TIL療法が直面する主要な課題の1つである。したがって、腫瘍抗原を経験した所望のT細胞集団を分化および／または消耗に向かわせることなく、腫瘍抗原を経験したT細胞のエクスビボでの生存能力および／または増殖を支援する方法を提供することが望ましい。
操作された細胞療法
TIL細胞療法に加えて、またヒト免疫系が腫瘍を排除可能であるというその実証から一部発想を得て、免疫細胞を特に望ましい性質を有するように操作するために多種多様なアプローチが調査されている。臨床において実証されており、ヒトでの使用に承認されている操作された免疫細胞のそのようなカテゴリーの1つは、キメラ抗原受容体（CAR）を発現するように操作された免疫細胞の使用である。プレB細胞急性リンパ芽球性白血病（ALL）またはB細胞リンパ腫を有する患者に対しての早期臨床試験におけるCAR T細胞療法は、革命的であり、標準処置に難治性である患者への治療選択肢となる可能性を示唆した。これらの早期治験は、急性リンパ性白血病（ALL）とある特定のタイプのB細胞リンパ腫の両方に対して抗CD19 CAR T細胞製品の迅速なFDA承認をもたらした。CAR T療法を用いた血液悪性腫瘍疾患の処置での初期臨床応答がヒト対象で初期応答率90％以上との報告から、その処置は、非常に有望であり、このことが、CAR-Tの開発に関する重要な研究を活発にし、多種多様な新生物疾患の処置に関して多種多様なCAR-Tアプローチが様々な前臨床および臨床開発段階にある。
CAR-T細胞の主なターゲティングおよび活性化成分は、CAR、典型的には、腫瘍抗原特異的ターゲティングドメインと追加の構造（例えば、ヒンジ、膜貫通）ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、多機能性ポリタンパク質である。多種多様なCAR設計が文献にて提案されており、しばしば、主にシグナル伝達ドメインのアーキテクチャに基づいて第1世代、第2世代、第3世代または第4世代CARに分類される。第1世代CARという用語は、細胞内ドメインがたった1つのシグナル伝達ドメイン、例えばIgE FcεR1γまたはCD3ζ鎖に対する高親和性受容体に由来するシグナル伝達ドメインを通じて抗原結合からシグナルを伝達する、CARのことを指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原依存性T-細胞活性化のための1つまたは3つの免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ［ITAM］を含有する。ITAMに基づく活性化シグナルは、T-細胞に、抗原結合に応答して標的腫瘍細胞を溶解およびサイトカインを分泌する能力を与える。第2世代CARは、CD3ζシグナルに加えて共刺激シグナルを含む。送達された共刺激シグナルの同時送達は、CAR形質導入T-細胞によって誘導されるサイトカイン分泌および抗腫瘍活性を増強する。共刺激ドメインは、通常、CD3ζドメインと比べて膜近位である。第3世代CARは、例えばCD28、CD3ζ、OX40または4-1BBシグナル伝達領域を含む、3部からなるシグナル伝達ドメインを含む。第4世代または「強化CAR（armored car）」では、CAR T-細胞は、IL-12、IL-18、IL-7および／またはIL-10の発現などの免疫活性を増強する分子および／または受容体；4-1BBリガンド、CD-40リガンドを発現または遮断するようにさらに改変される。
細胞内シグナル伝達ドメインは、操作されたCAR-T細胞の活性化および増殖に重要である一方で、CAR-Tおよびその対応物の標的を明確にする細胞外ターゲティングドメイン（またはABD）は、臨床用途を有する。細胞外ターゲティング抗原結合ドメイン（ABD）は、典型的には、新生細胞に特徴的な細胞表面抗原（ペプチドまたは糖鎖のいずれか）に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、scFvまたはVHH）を含み、CAR-T細胞の選択的ターゲティングを提供する。自己免疫反応を含むCAR-T細胞の潜在的な副作用および毒性を最小限に抑えるために、ターゲティングのための腫瘍抗原を選択するに際して、そのような抗原は、処置しようとする対象の正常細胞よりも腫瘍細胞タイプ上にはるかにより多く見られることが好ましい。抗体結合分子が特定されているそのような腫瘍抗原およびそれらの臨床治療標的の例としては、CD19（例えば、血液悪性腫瘍、例えば、ALL、CLL、B細胞リンパ腫）、CD20（例えば、難治性または再発したCD20＋B細胞リンパ腫）、BCMA（例えば、多発性骨髄腫、Carpenter, et al. (2013) Clin Cancer Res; 19(8); 2048-60）、CD22（Pan, et al (2019) Leukemia 33, 2854-2866に記載されているような小児B前駆細胞型ALLを含むB細胞悪性腫瘍）、CD30（例えば、ホジキンリンパ腫を含むCD30+リンパ腫；Grover, (2019) BMC Cancer 19, 203）、CD70（例えば、急性骨髄性白血病（AML；Sauer, et al (2019) Blood 134 (Supplement_1): 1932）、Lewis Y（例えば、AML；Ritchie, et al (2013) Molecular Therapy 21(11): 2122-9）、GD2（例えば、神経膠腫；Mount, et al (2018) Nat Med 24, 572-579）、GD3（例えば、転移性黒色腫および神経外胚葉性腫瘍；Agnes, et al. (2010) DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-10-0043）、メソテリン（例えば、中皮腫、肺、膵臓、乳房、卵巣および他の固形腫瘍；Beatty, et. Al., (2014) Cancer Immunol Research 2(2)）、ROR-1（例えば、慢性リンパ性白血病；Aghebati-Maleki, et al (2017) Biomedicine and Pharmacology 88: 814-822）、CD44（例えば、AMLおよび多発性骨髄腫；Casuccia, et al (2013) Blood 122 (20): 3461-3472）、CD171（例えば、神経芽腫；Kunkele, et al (2017) Clin Cancer Research 23(2): 466-477）；EGP2、EphA2（例えば、膠芽腫；Yi, et al (2018) Molecular Therapy: Methods & Clinical Development 9:70-80）、ErbB2、ErbB3/4、FAP、FAR IL11Ra、PSCA（前立腺がん）、PSMA（前立腺がん）、NCAM、HER2、NY-ESO-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1（CLEC12A）PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、c-Met、糖脂質F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2Dリガンド、葉酸受容体（FRa）、およびWnt1抗原CD123が挙げられるが、それらに限定されない。加えて、ABDは、1を超える抗原に結合する能力を有するという点で多価であり得、とりわけ、1を超える腫瘍抗原に対して特異性を有し得る（例えば、Zah, et al (2016) Cancer Immunol Res；4(6); 498-508に記載されているようなCD19およびCD20；Tu, et al (2019) Frontiers in Oncology 9:1350に記載されているようなCD19およびCD22）。
そのような抗原の具体的な一例は、95kDaの糖タンパク質CD19である。CD19は、ほとんどのB細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性リンパ性白血病（CLL）、有毛細胞白血病および一部の急性骨髄性白血病（AML）によって発現されるが、CD19は、正常B細胞以外のほとんどの正常組織上に存在しない。複数のCAR-T製品候補が様々な臨床開発段階にあるが、抗CD19 CAR細胞製品のアキシカブタゲンシロルーセル（Yescarta（登録商標）という商品名でGilead Pharmaceuticalsから販売されている）およびチサゲンレクルユーセル（Kymriah（登録商標）という商品名でNovartisから販売されている）が現在のところ主要規制機関によってヒトでの使用に承認されている唯一のCAR-T細胞療法であり、多種多様な新生物疾患の処置に関して多種多様なCAR-T療法が様々な前臨床および臨床開発段階にある。
CAR T療法を用いた新生物疾患の処置での初期臨床応答がヒト対象で初期応答率90％以上との報告から、その処置は、非常に有望であり、承認された抗CD19 CAR剤を用いた臨床経験に関する相次ぐ文献は、そのような作用物質で処置された対象の大部分が疾患状態の再燃を経験していることを明らかにした。そのような患者における持続的応答の欠如は、主に、CAR-T細胞製品の投与後の低いCAR-T細胞持続性および／または抗原の喪失もしくはモジュレーションから生じるがん細胞抵抗性に原因がある。患者が耐容できる用量のIL2の投与は、養子移入された細胞の活性化された集団の長期の選択的維持を提供できず、新生物疾患の再発および再燃を導く。
本開示は、これらの問題を克服する方法および組成物を提供し、特に、操作された細胞の持続性が特に重要である固形腫瘍の処置における、CAR T療法を含む操作された養子細胞療法の使用の新しい可能性を切り開く。
養子移入されたヒト免疫細胞は、投与後、比較的急速にその活性を喪失することが広く認められている。したがって、この機能の急速な喪失に取り組むための典型的な手段は、（a）細胞が有効性を失う前に、腫瘍への細胞療法剤の曝露を最大限に高めるための過剰に高用量の細胞療法剤の投与、および／または（b）養子移入された細胞の有効性を支援しようと試みるHD-hIL2療法の全身投与である。これらのアプローチは共に、重大な毒性を示す。HD-hIL2療法に関連する毒性はすでに上で考察している。高用量の操作された細胞療法剤は、命に関わるサイトカイン放出症候群（CRS）を伴う。現在利用可能な製品は、処置された対象の多くですべてのグレードのCRSを、患者の大部分でグレード3以上のCRSを示している。重大な神経毒性も患者の多くで観察される。しかしながら、より少ない用量の細胞療法剤は、臨床成果の大幅な低下を伴った。加えて、主に細胞療法製品の持続性の欠如に起因して、細胞療法に当初よく応答していると思われた多くの患者が再発する。現在、既存のCD-19細胞療法剤で処置された患者のおよそ60％が再発するとの報告がある。Byrne M, et al (2019) Biology of Blood and Marrow Transplantation 25(11):344-251。
以下により詳しく記載している実験結果が示しているように、オルソゴナルリガンドと組み合わせたオルソゴナル細胞の投与は、現在の細胞療法の課題の多くに取り組み、以下を非限定的に含む、細胞療法に適する疾患の改善された処置の方法を提供する：
・他の免疫細胞の有意な全身性のオフターゲット活性化を伴うことなく、養子移入されたヒト免疫細胞の集団のインビボでの選択的拡大増殖を可能にする、組成物および方法；
・支持作用物質に関連する重大な毒性を伴うことなく、養子移入されたヒト免疫細胞における活性化されたオルソゴナル細胞の持続性を支援する、組成物および方法；
・効果的ではないと報告されている、類似の細胞療法製品の現在の投与量より大幅に（10～1000倍）低い、用量の初期用量の細胞療法剤を使用して、哺乳動物対象の新生物疾患の処置において細胞療法製品のインビボ治療有効性を達成する、組成物および方法；
・オルソゴナルリガンドの定期的投与によって延長された期間にわたってオルソゴナル免疫細胞の治療レベルを治療有効レベルで維持することを可能にする、組成物および方法；
・追加の操作されたオルソゴナル細胞の投与の必要なしに、過去に投与されたオルソゴナル細胞の有効性を復活させるためのオルソゴナルリガンドの投与によって新生物性状態の再発の処置を可能にする、組成物および方法；
・オルソゴナル細胞の活性および増殖の選択的モジュレーションを提供することで、活性化された形態のオルソゴナル細胞療法への対象の曝露の一時的または永続的な停止を、活性化オルソゴナルリガンドの除去によって、また「キルスイッチ」を含むように細胞をさらに操作するまたは免疫枯渇的もしくは免疫抑制的な処置レジメンを用いる必要なく可能にする、組成物および方法；細胞製品の投与後に哺乳動物対象において養子移入された細胞の増殖を高めることなく細胞が応答し、重大な毒性を伴わない；
・養子細胞療法前に対象の先行免疫枯渇の必要性を回避する、組成物および方法；
・オルソゴナルリガンド、特に、より少ない頻度の支持オルソゴナルリガンドの投薬を可能にする延長された作用持続時間を有する、オルソゴナルリガンドの医薬製剤；
・類似の適応症に対して既存の細胞療法剤より優れた明白な治療的抗腫瘍有効性を提供する、組成物および方法；および
・補助治療剤と組み合わせたときに増強された抗腫瘍有効性を提供する、組成物および方法。
本開示の組成物および方法の有用性および機能性を、特に、養子細胞療法の状況においてオルソゴナル系を経験した哺乳動物対象での新生物疾患状態を患っている哺乳動物対象の処置において実証するために、一連の実験を実施した。本開示の組成物および方法の有用性は、添付の実施例にさらに詳述しているような一連の実験および添付図に提供されるデータにて評価した。
簡潔に述べると、一連のインビトロおよびインビボ実験を、式1の代表的なヒトIL2オルソログ、すなわち、wt hIL2に従って番号付けされたアミノ酸置換のセット：［desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A］を含有し、以下のアミノ酸配列：
Figure 2023511274000008
を有する、hIL2バリアント（本明細書において「オルソIL2」および「hoIL2」と称されることもある）を使用して実行した。
STK-007の選択的な結合特性を確認するために、Biacore表面プラズモン共鳴研究を実施して、STK-007が、IL2受容体のCD25（IL2Ra）およびCD132（IL2Rg）成分への顕著な結合を保持し、hoRbへの特異的結合を示す一方で、wt hIL2がhoRbに有意に結合しないことを確認した。簡潔に述べると、wtCD25、wtCD122、hoCD122およびwtCD132のC末端HISタグ化バージョンを調製して抗HIS捕捉チップ上に固定し、Biacoreを使用して、STK-007およびwt hIL2分子の溶液（Shenandoah Biotechnology, Inc.）を固定された受容体サブユニット上に流すことによって結合を評価した。この実験の結果を添付図の図1に示す。パネルA、C、EおよびGは、それぞれ、wtCD25、wtCD122、wtCD132およびhoCD122へのSTK-007の結合を表す。パネルB、D、FおよびHは、それぞれ、wtCD25、wtCD122、wtCD132およびhoCD122へのwtIL2の結合を表す。提示したデータは、STK-007が、wtCD25およびwtCD132にwt hIL2と類似した結合を保持するが、wt CD122に対して極めて低い親和性を保持することを示す。しかしながら、STK-007は、wtIL2のwtCD122への結合と類似した親和性でhoCD122に結合する（パネルG）。同様に、wt hIL2は、wtCD25、wt CD122およびwtCD132に、hoCD122に対する極めて低い親和性と類似した結合を実証する。
インビボ研究のために、STK-007分子を、以下の構造：
Figure 2023511274000009
のN末端40kDa分岐PEG分子の付加によって修飾し、これによって、本明細書において以降STK-009と称される、以下の構造：
40kD-PEG-リンカー-desAla1-hIL2[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]-COOH［2］
を有する式2のhIL2オルソログ（また、本明細書において「PEGオルソ」、「PEGオルソIL2」または「PEGhoIL2」と称されることもある）をもたらした。これらの研究に使用される代表的なオルソゴナル細胞は、以下のアミノ酸配列：
Figure 2023511274000010
を有するオルソゴナルCD122（IL2Rb）受容体（本明細書において、「hoCD122」または「hoRb」（ヒトオルソ受容体ベータ）と称されることもある）を発現するように改変されたCD19オルソゴナルCAR-T細胞であった。hoRb受容体の細胞外ドメインは、2つのアミノ酸置換H133DおよびY134F（wt hCD122に従って番号付けされた）を含む。
これらの研究において使用される例示的なCARは、抗原結合ドメインとしてFMC63抗CD19 scFv、CD28膜貫通および共刺激ドメインならびにCD3zドメイン（図2、パネルA）を含み、アミノ酸配列：
Figure 2023511274000011
を有する抗CD19キメラ抗原受容体である。
図1Aに図示するように、CD19_28z CAR、T2AペプチドおよびhoRb配列：
Figure 2023511274000012
をコードする核酸配列を合成した。これらの構築物を合成し、第3世代pl4Synレンチウイルス骨格（Alstem Bio）のEF1a-プロモーターの下流にクローニングした。単離および刺激することで、SYNCAR-001とも称される「CD19_28zオルソCAR」T細胞を作製した。
播種性モデルにおいて、図3に提供されるデータによって実証されるように、PBSの投与は、腫瘍量を制御できず（図3、パネルA、群1、および図3、パネルB、左上）、その結果、研究のおよそ21日目に毒性のため動物を屠殺する必要があった。これに対して、CD19_28zオルソCAR T細胞の投与は、マウスの4/8で抗腫瘍応答を導いた（図3、パネルA、群2、および図3、パネルB、右上）。CD19_28zオルソCAR T細胞とSTK-009との両用量レベルでの併用処置（図3、パネルA、1μg（群3、および図3、パネルB、右下）および2μg（群4、および図3、パネルB、左下））は、CD19_28zオルソCAR T細胞処置単独と比較して、追加の抗腫瘍機能を提供した。
加えて、実施例8に記載される再負荷モデルから得られた図4に提供されるデータは、STK009再投薬が、長期の抗原または腫瘍リガンド曝露なしであっても、CAR T細胞の抗腫瘍活性を回復可能であることを実証している。
実施例9に記載される再発モデルは、図5に提供されるデータと共に、STK-009単独の投与が、前治療コースから再発した動物においてCAR-T細胞の抗腫瘍活性を達成可能であることを実証している。
加えて、実施例11において考察され、かつ図6に提供されるように、オルソゴナルリガンド（STK-009）と接触させたオルソゴナルCAR-T細胞は、インビボでSCM表現型を保持しており、このことは、より持続的な抗腫瘍効果を提供するCAR T細胞の増強された持続性を実証している。
特に注目すべきは、実施例12において考察される固形腫瘍モデルの固形腫瘍モデルから得られたデータと図7～10に提供されるデータである。このデータは、オルソゴナル同族リガンドと組み合わせたオルソゴナルCAR-T細胞が、固形腫瘍において応答を誘導可能であり、かつ、CAR-T細胞の固形腫瘍への浸潤を増加可能であることを実証しており、このことは、この系が、CARTなどの養子細胞移入プロトコルを使用して以前は処置可能でなかった固形腫瘍の処置において有用であることを実証している。
これらのデータは、オルソゴナル受容体（例えば、hoCART、hoTIL）を発現する治療用の操作された細胞の改善された持続性、同族オルソゴナルリガンドとの接触に応答して操作されたオルソゴナル免疫細胞を用量依存的様式で選択的かつ強力に活性化する能力、オルソゴナルリガンドを発現する細胞に対するリガンドの特異性を実証しており、毒性の有意な低下、典型的には、養子細胞療法プロトコルにおいて十分に裏付けられた毒性源であるhIL2などの非特異的なT細胞増殖物質の投与で観察されるような特異的オフターゲット毒性を提供しないことを実証する。
オルソゴナル受容体に対するオルソゴナルリガンドの選択性は、低いインビボ毒性を有する分子をもたらす。これは、高用量の本明細書に記載されるような長期作用性のPEG化されたオルソゴナルhIL2分子に曝露する非ヒト霊長類モデル毒性研究において実証された。この研究において観察されたようにオルソゴナルIL2化合物が高用量で持続性を示したにもかかわらず、治療有効用量よりも有意に大きな（おそらく少なくとも10倍～100倍大きな）用量で重大な毒性は観察されなかった。治療用細胞を選択的に活性化するオルソゴナルリガンドの選択性および有効性は、養子細胞療法を、BCMA CAR T細胞と併せて、くすぶり型多発性骨髄腫などの緩徐進行性の前がん状態の処置のような疾患の進行の予防のために、予防的方式で使用することを可能にする。
オルソゴナルリガンドは、CAR T細胞を再減弱化（re-enervating）することに成功し、操作された細胞の治療効果を細胞の再投与なく再構築する能力を与えることから、新生物疾患の再発、再燃および転移を予防する際のこの技術の有用性が実証される。
いくつかの態様では、本開示は、（a）対象に、オルソゴナルリガンドの治療有効量を投与する工程；（b）対象に、哺乳動物免疫細胞がオルソゴナルhCD122受容体を発現するように1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されたオルソゴナルhCD122受容体をコードする核酸配列を含む哺乳動物免疫細胞を投与する工程を含む、ヒト対象における疾患、障害または病態を処置する方法を提供する。
本開示は、オルソゴナルCD122受容体およびキメラ抗原受容体（その細胞外ドメインが腫瘍抗原に特異的に結合する）を発現する複数の操作されたT細胞の投与とオルソゴナルIL2リガンドの同時投与、ならびに式1のオルソゴナルIL2リガンドの定期的投与を含む維持療法の対象への投与による新生物疾患の再発の阻止による、新生物疾患を患っている対象を処置するための方法および組成物であって、処置段階において使用されるオルソゴナルリガンドが、維持段階において使用されるオルソゴナルリガンドと同じまたは異なる、方法および組成物を提供する。いくつかの態様では、オルソゴナルリガンドは、半減期が延長するように修飾される。一態様では、オルソゴナルリガンドは、ペグ化された融合タンパク質などである。一態様では、オルソゴナルリガンドは、40kDのN末端PEG部分を含む。該方法のいくつかの態様では、オルソゴナルリガンドは、第1の治療段階において、拡大増殖をもたらすのに十分な濃度を上回る（例えば、＞EC10 PRO）が顕著な分化を誘導するのに十分な濃度を下回る（例えば、＜EC90 ACT）リガンドで少なくとも24時間の期間、任意で、30日、60日、90日またはより長い日数にわたって投薬される。いくつかの態様では、維持段階は、任意で、オルソCAR T活性化を誘導するのに十分な式1のオルソゴナルリガンドの投与を含み、活性化のための濃度を超える血清中レベル（例えば、＞EC50 ACT）を少なくとも24時間の期間にわたって維持する。該方法のいくつかの態様では、オルソゴナルリガンドは、式1のオルソゴナルIL2リガンドをコードする核酸を含む組換えウイルスまたは非ウイルスベクターの投与によって対象に提供される。該方法のいくつかの態様では、新生物疾患は、固形腫瘍および血液悪性腫瘍から選択される。該方法のいくつかの態様では。該方法のいくつかの態様では、該方法は、処置段階および／または維持段階中に1つまたは複数の補助抗新生物剤をさらに含む。該方法のいくつかの態様では、処置段階および／または維持段階中の補助抗新生物剤は、同じまたは異なることができる。該方法のいくつかの態様では、補助新生物剤は、化学療法剤、低分子、チェックポイント阻害剤（抗PD1、Keytruda、Opdivo）、抗腫瘍抗原抗体（Herceptin）を非限定的に含む補助生物製剤、および／または物理的方法（外科手術、放射線照射など）からなる群より選択される。いくつかの態様では、オルソゴナル受容体は、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含むオルソゴナルCD122である。
転移の予防
本開示は、オルソゴナルCD122受容体およびキメラ抗原受容体（その細胞外ドメインが腫瘍抗原に特異的に結合する）を発現する複数の操作されたT細胞の投与と式1のオルソゴナルIL2リガンドの同時併用投与、ならびに式1のオルソゴナルIL2リガンドの定期的投与を含む維持療法の対象への投与による新生物疾患の転移の阻止による、新生物疾患を患っている対象を処置するための方法および組成物であって、処置段階において使用されるオルソゴナルリガンドが、維持段階において使用されるオルソゴナルリガンドと同じまたは異なる、方法および組成物を提供する。いくつかの態様では、オルソゴナルリガンドは、半減期が延長するように修飾される。一態様では、オルソゴナルリガンドは、ペグ化された融合タンパク質などである。一態様では、オルソゴナルリガンドは、40kDのN末端PEG部分を含む。該方法のいくつかの態様では、オルソゴナルリガンドは、第1の治療段階において、拡大増殖をもたらすのに十分な濃度を上回る（例えば、＞EC10 PRO）が顕著な分化を誘導するのに十分な濃度を下回る（例えば、＜EC90 ACT）リガンドで少なくとも24時間の期間、任意で、30日、60日、90日またはより長い日数にわたって投薬される。いくつかの態様では、維持段階は、任意で、オルソCAR T活性化を誘導するのに十分な式1のオルソゴナルリガンドの投与を含み、活性化のための濃度を超える血清中レベル（例えば、＞EC50 ACT）を少なくとも24時間の期間にわたって維持する。該方法のいくつかの態様では、オルソゴナルリガンドは、式1のオルソゴナルIL2リガンドをコードする核酸を含む組換えウイルスまたは非ウイルスベクターの投与によって対象に提供される。該方法のいくつかの態様では、新生物疾患は、固形腫瘍および血液悪性腫瘍から選択される。該方法のいくつかの態様では。該方法のいくつかの態様では、該方法は、処置段階および／または維持段階中に1つまたは複数の補助抗新生物剤をさらに含む。該方法のいくつかの態様では、処置段階および／または維持段階中の補助抗新生物剤は、同じまたは異なることができる。該方法のいくつかの態様では、補助新生物剤は、化学療法剤、低分子、チェックポイント阻害剤（抗PD1、Keytruda、Opdivo）、抗腫瘍抗原抗体（Herceptin）を非限定的に含む補助生物製剤、および／または物理的方法（外科手術、放射線照射など）からなる群より選択される。いくつかの態様では、オルソゴナル受容体は、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含むオルソゴナルCD122である。
血液悪性腫瘍のためのCD19 CAR：
一態様では、本開示は、式1のオルソゴナルIL2リガンドの治療有効量の投与と組み合わせたオルソゴナルCD19 CARの治療有効量の投与による、治療または予防を必要とする対象における血液悪性腫瘍を治療または予防する方法を提供する。
一態様では、本開示は、式1のオルソゴナルIL2リガンドの投与と組み合わせた、オルソゴナルCD122ポリペプチドおよびキメラ抗原受容体（その細胞外ドメインがCD19に特異的に結合する）を発現する複数の操作されたT細胞の投与の工程を含む、血液新生物疾患を患っている対象における再発および／または転移の予防の方法において使用するためのオルソゴナルCD19 CARを提供する。いくつかの態様では、CARは、本明細書に記載されるようなSYNCAR-001である。
いくつかの態様では、本発明は、オルソゴナルIL2リガンドと組み合わせたオルソゴナルCD19 CAR T細胞で以前に処置された対象における、初期オルソゴナルCD19 CAR-T/オルソゴナルIL2リガンド処置段階への部分奏効または完全奏効後の再発を予防する方法であって、処置段階の間に投与された濃度よりも低い濃度の式1のオルソゴナルIL2リガンドの定期的投与を含む維持療法コースの投与を含む、方法を提供する。処置段階の間に投与されるオルソゴナルリガンドは、維持段階の間に投与されるオルソゴナルリガンドと同じであっても異なっていてもよい。
いくつかの態様では、血液悪性腫瘍は、再発したまたは難治性の非ホジキンリンパ腫、再発したまたは難治性の骨髄腫、再発したまたは難治性の大細胞型B細胞リンパ腫、再発したまたは難治性のマントル細胞リンパ腫を非限定的に含む、再発したまたは難治性の血液悪性腫瘍である。再発した血液悪性腫瘍（例えば、再発した骨髄腫）は、患者が初期の治療コースに成功していたが疾患が再び現れた状況を伴う。難治性の血液悪性腫瘍は、積極的な処置にもかかわらず進行する疾患のことを指す。難治性の骨髄腫を患っている患者は、疾患が化学療法に対して奏効を示さず進行を継続するならば、原発性の難治性骨髄腫を有していたと称され、処置の開始時に初期奏効を有していたが処置がもはや効果を有さない場合、続発性の難治性患者と称される。
いくつかの態様では、オルソゴナルリガンドは、半減期が延長するように修飾される。一態様では、オルソゴナルリガンドは、ペグ化されたFc融合タンパク質、アルブミン融合物などである。一態様では、オルソゴナルリガンドは、40kDのN末端PEG部分を含む。
該方法のいくつかの態様では、オルソゴナルリガンドは、第1の治療段階において、拡大増殖をもたらすのに十分な濃度を上回る（例えば、＞EC10 PRO）が顕著な分化を誘導するのに十分な濃度を下回る（例えば、＜EC90 ACT）リガンドで少なくとも24時間の期間、あるいは1週間の期間、あるいは2週間の期間、あるいは少なくとも30日の期間、あるいは少なくとも60日の期間、あるいは少なくとも90またはそれよりも長い日数の期間にわたって投薬される。いくつかの態様では、維持段階は、任意で、オルソCAR T活性化を誘導するのに十分な式1のオルソゴナルリガンドの投与を含み、活性化のための濃度を超える血清中レベル（例えば、＞EC50 ACT）を少なくとも24時間の期間にわたって維持する。
該方法のいくつかの態様では、オルソゴナルリガンドは、式1のオルソゴナルIL2リガンドをコードする核酸を含む組換えウイルスまたは非ウイルスベクターの投与によって対象に提供される。該方法のいくつかの態様では、新生物疾患は、固形腫瘍および血液悪性腫瘍から選択される。
該方法のいくつかの態様では、該方法は、処置段階および／または維持段階中に1つまたは複数の補助抗新生物剤をさらに含む。該方法のいくつかの態様では、処置段階および／または維持段階中の抗新生物剤は、同じまたは異なることができる。該方法のいくつかの態様では、補助新生物剤は、化学療法剤、低分子、チェックポイント阻害剤（抗PD1、Keytruda、Opdivo）、抗腫瘍抗原抗体（Herceptin）を非限定的に含む補助生物製剤、および／または物理的方法（外科手術、放射線照射など）からなる群より選択される。いくつかの態様では、オルソゴナル受容体は、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含むオルソゴナルCD122である。いくつかの態様では、CARの細胞外ドメインは、CDRを含むCD19に特異的に結合する抗体またはFMC63からなる群より選択される抗体の1つもしくは複数を含む。
いくつかの態様では、血液新生物疾患は、フィラデルフィア染色体陽性ALLを含む急性リンパ芽球性白血病（ALL）、慢性リンパ性白血病（CLL）、およびB細胞リンパ腫から選択される。いくつかの態様では、該方法は、1つまたは複数の化学療法剤の共投与をさらに含む。
血液悪性腫瘍がALLである場合、補助作用物質は、ビンクリスチンまたはビンクリスチンリポソーム（Marqibo）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）またはドキソルビシン（Adriamycin）、シタラビン（シトシンアラビノシド、ara-C）、L-アスパラギナーゼまたはPEG-L-アスパラギナーゼ（ペグアスパラガーゼまたはOncaspar）、6-メルカプトプリン（6-MP）、メトトレキサート、シクロホスファミド、プレドニゾン、デキサメタゾン、デララビン（delarabine）（Arranon）であり得る。血液悪性腫瘍がフィラデルフィア染色体陽性ALLである場合、補助作用物質は、イマチニブ（Gleevec（登録商標））、ダサチニブ（Sprycel（登録商標））、ニロチニブ（Tasigna（登録商標））、ポナチニブ（Iclusig（登録商標））、およびボスチニブ（Bosulif（登録商標））であり得る。
血液悪性腫瘍がCLLである場合、補助作用物質は、「FCR」（フルダラビン、シクロホスファミドおよびリツキシマブ）およびFR（フルダラビンおよびリツキシマブ）を非限定的に含むフルダラビン含有レジメン、PCR（ペントスタチン、シクロホスファミドおよびリツキシマブ）を非限定的に含むペントスタチン系治療レジメン、アレムツズマブ（Campath（登録商標））、クロラムブシル、オビヌツズマブ（Gazyva（登録商標）抗CD20 Mab）と組み合わせたクロラムブシル、イブルチニブを非限定的に含むチロシンキナーゼ阻害剤であり得る。
血液悪性腫瘍が難治性のまたは再発したCLLである場合、補助作用物質は、レナリドミド、オファツムマブ、ホスホイノシチド 3-キナーゼ（PI3K）阻害剤、例えばデュベリシブおよびイデラリシブ；ベネトクラクス単独、またはオビヌツズマブもしくはリツキシマブとの組み合わせ；の1つまたは複数から選択される。血液悪性腫瘍がB細胞リンパ腫、補助作用物質は、リツキシマブ（Rituxan（登録商標））、任意でシクロホスファミドと併用；オビヌツズマブまたはリツキシマブと併用したベンダムスチン；CHOP（シクロホスファミド、ドキソルビシンまたはヒドロキシダウノルビシン、ビンクリスチン（Oncovin（登録商標））、およびプレドニゾン）、任意でオビヌツズマブまたはリツキシマブと併用；CVP（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン）、任意でオビヌツズマブまたはリツキシマブと併用；レナリドミドおよびリツキシマブ；シクロホスファミド；クロラムブシル；およびイブリツモマブチウキセタン（ibritumomab tiuxetang）（Zevalin（登録商標））の1つまたは複数から選択される。
血液悪性腫瘍がバーキットリンパ腫である場合、補助作用物質は、CODOX-M（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンの、髄腔内メトトレキサートおよびシタラビンとの併用と、それに続く高用量全身メトトレキサート）、任意でリツキシマブと併用；用量調整EPOCH（エトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン）、任意でリツキシマブと併用；hyperCVAD（シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシンおよびデキサメタゾン）、任意で高用量メトトレキサートおよびシタラビンと併用、任意でリツキシマブと併用；RICE（リツキシマブ、イホスファミド、カルボプラチン、エトポシド）、任意で髄腔内メトトレキサートと併用；RIVAC（リツキシマブ、イホスファミド、シタラビン、エトポシド）、任意で髄腔内メトトレキサートおよびRGDP（リツキシマブ、ゲムシタビン、デキサメタゾン、シスプラチン）と併用；および任意でリツキシマブと併用したシタラビン；の1つまたは複数から選択される。
いくつかの態様では、オルソゴナル受容体は、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含むオルソゴナルCD122である。
本開示の方法の実施において有用な抗CD19 CARの例としては、以下の構築物が挙げられる。
CD19_28z：GMCSF受容体シグナルペプチド、FMC63 scFv、AAAスペーサー、CD28ヒンジおよび共刺激ドメインおよびCD3ゼータを含む、構築物：
Figure 2023511274000013
CD19_4-1bbz：CD8a受容体シグナルペプチド、FMC63 scFv、CD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン、4-1BBヒンジおよび共刺激ドメインおよびCD3ゼータを含む、構築物：
Figure 2023511274000014
ある代替的な態様では、CD19 CARは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2023511274000015
ある代替的な態様では、CD19 CARは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2023511274000016
BCMA CAR：
本開示は、オルソゴナルCD122ポリペプチドおよびキメラ抗原受容体（その細胞外ドメインがBCMAに特異的に結合する）を発現する複数の操作されたT細胞の投与と式1のオルソゴナルIL2リガンドの投与の対象が部分または完全奏効を達成するまでの第1の期間（処置段階）の併用、ならびに、式1のオルソゴナルIL2リガンドの定期的投与を含む維持療法の、少なくとも30日、任意で少なくとも90日、任意で少なくとも180日、または医師が必要と認めた場合により長い期間にわたる対象への投与による新生物疾患の転移の阻止による、多発性骨髄腫を患っている対象を処置するための方法および組成物を提供する。
本開示は、オルソゴナルCD122ポリペプチドおよびキメラ抗原受容体（その細胞外ドメインがBCMAに特異的に結合する）を発現する複数の操作されたT細胞の投与と式1のオルソゴナルIL2リガンドの同時併用投与、ならびにその後の式1のオルソゴナルIL2リガンドの定期的投与を含む維持療法の対象への投与による、多発性骨髄腫を患っている対象の処置において厳密な完全奏効を達成する方法および組成物を提供する。
前述の方法において、処置段階において使用されるオルソゴナルリガンドは、維持段階において使用されるオルソゴナルリガンドと同じであっても異なっていてもよい。いくつかの態様では、オルソゴナルリガンドは、半減期が延長するように修飾される。一態様では、オルソゴナルリガンドは、ペグ化された融合タンパク質などである。一態様では、オルソゴナルリガンドは、40kDのN末端PEG部分を含む。
該方法のいくつかの態様では、オルソゴナルリガンドは、第1の治療段階において、拡大増殖をもたらすのに十分な濃度を上回る（例えば、＞EC10 PRO）が顕著な分化を誘導するのに十分な濃度を下回る（例えば、＜EC90 ACT）リガンドで少なくとも24時間の期間、任意で、30日、60日、90日またはより長い日数にわたって投薬される。いくつかの態様では、維持段階は、任意で、オルソCAR T活性化を誘導するのに十分な式1のオルソゴナルリガンドの投与を含み、活性化のための濃度を超える血清中レベル（例えば、＞EC50 ACT）を少なくとも24時間の期間にわたって維持する。
該方法のいくつかの態様では、オルソゴナルリガンドは、式1のオルソゴナルIL2リガンドをコードする核酸を含む組換えウイルスまたは非ウイルスベクターの投与によって対象に提供される。該方法のいくつかの態様では、新生物疾患は、固形腫瘍および血液悪性腫瘍から選択される。該方法のいくつかの態様では。該方法のいくつかの態様では、該方法は、処置段階および／または維持段階中に1つまたは複数の補助抗新生物剤の投与をさらに含む。該方法のいくつかの態様では、処置段階および／または維持段階中の補助抗新生物剤は、同じまたは異なることができる。該方法のいくつかの態様では、補助新生物剤は、化学療法剤、低分子、チェックポイント阻害剤（抗PD1、Keytruda、Opdivo）、抗腫瘍抗原抗体（Herceptin）を非限定的に含む補助生物製剤、および／または物理的方法（外科手術、放射線照射など）からなる群より選択される。いくつかの態様では、オルソゴナル受容体は、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含むオルソゴナルCD122である。
いくつかの態様では、多発性骨髄腫の処置において有用な補助作用物質は、サリドマイド、レナリドミド、デキサメタゾン、ボルテゾミブ、ビンクリスチン、ドキソルビシン、デキサメタゾン、メルファラン、カルフィルゾミブ、シクロホスファミド、シスプラチン、エトポシド、ボルテゾミブ、プレドニゾン、ダラツムマブ、カルフィルゾミブ、およびイキサゾミブからなる群より選択される1つまたは複数の作用物質を含む。いくつかの態様では、多発性骨髄腫の処置において有用な補助作用物質は、テオルテゾミブ（theortezomib）／レナリドミド／デキサメタゾン；ボルテゾミブ／シクロホスファミド／デキサメタゾン；ボルテゾミブ／ドキソルビシン／デキサメタゾン；カルフィルゾミブ／レナリドミド／デキサメタゾン；イキサゾミブ／レナリドミド／デキサメタゾン；ボルテゾミブ／デキサメタゾン；ボルテゾミブ／サリドマイド／デキサメタゾン；レナリドミド／デキサメタゾン；デキサメタゾン／サリドマイド／シスプラチン／ドキソルビシン／シクロホスファミド／エトポシド／ボルテゾミブ（VTD-PACE）；レナリドミド／低用量デキサメタゾン；ダラツムマブ／ボルテゾミブ／メルファラン／プレドニゾン；カルフィルゾミブ／レナリドミド／デキサメタゾン；カルフィルゾミブ／シクロホスファミド／デキサメタゾン；およびイキサゾミブ／レナリドミド／デキサメタゾンを含む、多発性骨髄腫の処置において使用するための化学療法剤の併用処置レジメンを含む。
本開示は、オルソゴナルCD122ポリペプチドおよびキメラ抗原受容体（CAR）（前記CARの細胞外ドメインがBCMAに特異的に結合する）を発現する複数の操作されたT細胞の、式1のオルソゴナルIL2リガンドと組み合わせた投与、ならびにその後の式1のオルソゴナルIL2リガンドの定期的投与を含む維持療法の対象への投与による、くすぶり型多発性骨髄腫を患っている対象を処置するための方法および組成物を提供する。本開示は、オルソゴナルCD122ポリペプチドおよびキメラ抗原受容体（CAR）（前記CARの細胞外ドメインがBCMAに特異的に結合する）を発現する複数の操作されたT細胞の投与と式1のオルソゴナルIL2リガンドの同時併用投与、ならびに式1のオルソゴナルIL2リガンドの定期的投与を含む維持療法の対象への投与による新生物疾患のくすぶり型多発性骨髄腫から多発性骨髄腫への進行の阻止による、くすぶり型多発性骨髄腫を患っている対象におけるくすぶり型多発性骨髄腫から多発性骨髄腫への進行を阻止するための方法および組成物を提供する。いくつかの態様では、CARのABDは、BCMAに特異的に結合する。該方法は、処置段階および／または維持段階中に対象に投与される1つまたは複数の補助抗新生物剤をさらに含み、多発性骨髄腫の処置において有用な補助作用物質は、サリドマイド、レナリドミド、デキサメタゾン、ボルテゾミブ、ビンクリスチン、ドキソルビシン、デキサメタゾン、メルファラン、カルフィルゾミブ、シクロホスファミド、シスプラチン、エトポシド、ボルテゾミブ、プレドニゾン、ダラツムマブ、カルフィルゾミブ、およびイキサゾミブからなる群より選択されるの1つもしくは複数、または、ボルテゾミブ／レナリドミド／デキサメタゾン；ボルテゾミブ／シクロホスファミド／デキサメタゾン；ボルテゾミブ／ドキソルビシン／デキサメタゾン；カルフィルゾミブ／レナリドミド／デキサメタゾン；イキサゾミブ／レナリドミド／デキサメタゾン；ボルテゾミブ／デキサメタゾン；ボルテゾミブ／サリドマイド／デキサメタゾン；レナリドミド／デキサメタゾン；デキサメタゾン／サリドマイド／シスプラチン／ドキソルビシン／シクロホスファミド／エトポシド／ボルテゾミブ（VTD-PACE）；レナリドミド／低用量デキサメタゾン；ダラツムマブ／ボルテゾミブ／メルファラン／プレドニゾン；カルフィルゾミブ／レナリドミド／デキサメタゾン；カルフィルゾミブ／シクロホスファミド／デキサメタゾン；およびイキサゾミブ／レナリドミド／デキサメタゾンを含む多発性骨髄腫の処置において使用するための化学療法剤の併用処置レジメンを含む。
本発明の実施において有用な抗BCMA CARの例としては、以下の構築物が挙げられる。
BCMA4_41bbz CAR：CD8a受容体シグナルペプチド、BCMA4 scFv、CD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン、4-1BBヒンジおよび共刺激ドメインおよびCD3ゼータを含む、構築物：
Figure 2023511274000017
これは、以下のアミノ酸配列を用いて、T2aリンカーを使用してオルソCD122受容体と共発現させることができる：
Figure 2023511274000018
GSI5021_41bbz CAR：
Figure 2023511274000019
これは、以下のアミノ酸配列を用いて、T2aリンカーを使用してオルソCD122受容体と共発現させることができる：
Figure 2023511274000020
B2121 BCMA_41bbz）CAR
Figure 2023511274000021
これは、以下のアミノ酸配列を用いて、T2aリンカーを使用してオルソCD122受容体と共発現させることができる：
Figure 2023511274000022
BMCA10_41bbz CAR
Figure 2023511274000023
これは、以下のアミノ酸配列を用いて、T2aリンカーを使用してオルソCD122受容体と共発現させることができる：
Figure 2023511274000024
GD2 CAR
本開示は、オルソゴナルCD122ポリペプチドおよびキメラ抗原受容体（CAR）（前記CARの細胞外ドメインがGD2に特異的に結合する）を発現する複数の操作されたT細胞の投与と式1のオルソゴナルIL2リガンドの同時併用投与、ならびにその後の式1のオルソゴナルIL2リガンドの定期的投与を含む維持療法の対象への投与による、神経外胚葉起源の新生物疾患（ヒト神経芽腫および黒色腫を含む）または高リスク骨肉腫を患っている対象を処置するための方法および組成物を提供する。本開示は、オルソゴナルCD122ポリペプチドおよびキメラ抗原受容体（CAR）（前記CARの細胞外ドメインがBCMAに特異的に結合する）を発現する複数の操作されたT細胞の投与と式1のオルソゴナルIL2リガンドの同時併用投与、ならびに式1のオルソゴナルIL2リガンドの定期的投与を含む維持療法の対象への投与による新生物疾患のくすぶり型多発性骨髄腫から多発性骨髄腫への進行の阻止による、神経外胚葉起源の新生物疾患（ヒト神経芽腫および黒色腫を含む）の転移または再発を阻止するための方法および組成物を提供する。いくつかの態様では、CARの細胞外ドメインは、GD2に特異的に結合する。いくつかの態様では、CARのABDは、CDRを含むGD2に特異的に結合する抗体、または抗体3F8、hu14.18、14G2aの1つまたは複数を含み、任意で、シスプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミドならびにテニポシドおよびエトポシドなどのエピポドフィロトキシンを含む化学療法剤を共投与する。
前立腺がんのためのPSMA CAR
前立腺がんは、男性の世界で2番目に発生頻度の高い悪性腫瘍であり、年間の新規症例数は110万件と推定されている。前立腺がんは、307,000人の死亡に関わっており、がんの死亡原因第5位になっている。局在している原発腫瘍は、外科手術または局所放射線療法によって成功裏に処置できたが、これらの方法論は、疾患の進行した状態では満足のいく結果を提供していない。
前立腺特異的膜抗原（PSMA）は、すべての腫瘍段階で前立腺がん細胞の表面に発現され、特に、この疾患のより重度のアンドロゲン非依存性段階および転移性段階で増加した発現を示すため、抗原再指向免疫療法のための理想的な標的であると考えられる。PSMを標的とする多様な抗体が文献に記載されており、これらは、J591、3D8、D2Bおよび3/F11を非限定的に含むCARとの関連で使用するために改変され得る。
PSMAを標的とする多数のCAR T細胞が臨床開発中である（例えば、NCT01140373、NCT01929239、およびNCT03089203を参照のこと）。しかしながら、これらのPSMA CAR T細胞の腫瘍溶解効力についてはまだ不確かである。特に、3D8またはJ591 scFv ABDを使用した第1世代CARを発現する操作されたT細胞は、PSMA CAR T細胞の持続性の欠如が原因で低い効力を示した。第2および第3世代のCARが前立腺がんの処置において試験されているが、それらの成功は低水準のままであり、高用量のCAR Tまたは複数のCAR T注入を必要とした。Alzubi, et al (2020) Molecular Therapy Oncolytics 18:226-235。
先に考察したように、本開示の組成物および方法は、従来のCAR療法において観察され、臨床実践におけるPSMA CARの有効性の欠如に原因がある、持続性の欠如を克服する能力を提供する。本開示の方法および組成物は、臨床医が、長期間にわたってCARを活性な状態に維持することを可能にし、これによって、従来のCAR T細胞療法よりもはるかに大きな曝露（「曲線下面積」またはAUC）が可能になり、したがって、以前にCAR T療法に抵抗性であったがん、特に、効果的な処置のためにCARへの長期曝露を必要とする固形腫瘍を処置し、血管外漏出および固形腫瘍環境への浸透として達成する手段を提供する。従来の非オルソゴナルCAR T細胞は、過度の毒性またはCAR T細胞の複数回の投薬なしには必要とされる曝露の持続を提供できない。
本開示は、前立腺がんを処置する、任意で、再発または再燃を阻止する方法であって、式1のオルソゴナルリガンドと組み合わせたオルソゴナルPSMA CAR T細胞の治療有効量の投与を含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、PSMA CARを含むオルソゴナルPSMA CAR T細胞を提供する。PSMA_28z：CD8aシグナルペプチド、脱免疫化J591 scFv、AAAスペーサー、CD28ヒンジ／膜貫通／共刺激ドメインおよびCD3ゼータを含む、抗PSMA CAR：
Figure 2023511274000025
これは、以下のアミノ酸配列を用いて、T2aリンカーを使用してオルソCD122受容体と共発現させることができる：
Figure 2023511274000026
いくつかの態様では、PSMA CARは、PSMA_4-1BBzである：脱免疫化J591 scfv；CD8aシグナルペプチド、CD8ヒンジおよび膜貫通ドメインおよび4-1bb共刺激ドメインおよびCD3z：
Figure 2023511274000027
これは、以下のアミノ酸配列を用いて、T2aリンカーを使用してオルソCD122受容体と共発現させることができる:
Figure 2023511274000028
GPC3 CAR
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナルGPC3 CAR T細胞を提供する。いくつかの態様では、本開示の方法および組成物は、肝臓がんを非限定的に含むGPC3を発現するがんの処置において有用である。肝細胞がん（HCC）は、世界でがんの死亡原因第2位である。細胞表面糖タンパク質であるグリピカン-3は、HCC組織において過剰発現されるが、健康な成人の肝臓では発現されず、よって、CARのABDのための有用なターゲティングドメインを提供する。多様なGPCターゲティングドメインを、CARの構築において用いてもよく、肝臓がんの処置において使用するため、式1のIL2オルソログと併用するためにオルソゴナル細胞中に組み込むことができる。オルソゴナルGPC3 CAR T細胞の調製において使用され得るGPC3 CARの例としては、アミノ酸配列：
Figure 2023511274000029
を有するCAR GPC3_28z、およびアミノ酸配列
Figure 2023511274000030
を有するGPC3_4-1BBが挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの態様では、本開示は、HPV関連腫瘍の処置において使用するためのオルソゴナルなオルソゴナルHPV-16 E6 TCR細胞を提供する。本開示のオルソゴナル細胞中に組み込むことができるHPV-16 E6 CARの例としては、配列：
Figure 2023511274000031
または
Figure 2023511274000032
を有するCARが挙げられるが、それらに限定されない。
神経芽腫のためのGD2 CAR
GD2は、ほぼすべての神経芽腫、ほとんどの黒色腫および網膜芽細胞腫、ならびに多くのユーイング肉腫によって高度に発現され、また、より変動的な程度に、小細胞肺がん、神経膠腫、骨肉腫および軟組織肉腫によって発現される。したがって、GD2は、CAR T細胞療法の標的として特定されており、多様なGD2 CARが当技術分野において公知である。しかしながら、GD2を発現する腫瘍の処置において持続性が課題として残っている。したがって、オルソリガンドの投与によってオルソゴナル免疫細胞の作用持続時間を延長できれば、GD2細胞療法の開発において大いに役立つだろう。いくつかの態様では、本発明は、オルソGD2標的指向型免疫細胞を提供する。一態様では、オルソゴナルGD2免疫細胞、例えばオルソゴナルGD2 CAR-T細胞のターゲティングドメインは、アミノ酸配列：
Figure 2023511274000033
を有する14g2a scFvを組み込む。
細胞をより均質な細胞製品にする：
本開示は、操作された免疫細胞種を含む細胞製品を調製する方法であって、操作された細胞免疫種が、オルソゴナルCD122ポリペプチドの細胞外ドメインを含む受容体を発現するように組換え改変された免疫細胞であり、細胞製品が、操作された免疫細胞の少なくとも40％、あるいは少なくとも50％、あるいは少なくとも60％、あるいは少なくとも70％、あるいは少なくとも80％、あるいは少なくとも90％を含み、免疫細胞の集団を得るために培養する工程、操作された細胞製品の混合細胞集団中のオルソゴナルCD122受容体を発現する操作された免疫細胞をトランス選択的に拡大増殖させる工程を含む方法を提供する。現在、養子細胞療法およびCAR-T療法の成功を阻む最も大きな障壁は、特に、操作された細胞CAR T細胞の低い持続性が原因の高い疾患再発率である。
分子の選択性は、混合細胞集団中の操作された細胞を選択的に増殖させるための、オルソゴナルリガンドのエクスビボ使用を可能にする。したがって、本明細書に記載されるような技術は、治療用細胞が大幅に濃縮された細胞療法製品の調製において有用である。選別を行わないIL2による従来の非特異的なエクスビボ刺激は、望ましいTILまたはCAR細胞を相対的にごく一部（10％～20％）しか提供しない患者投与用の細胞集団を導く。オルソゴナルIL2を使用して、CARの調製段階中で選択的に活性化することができ、エクスビボの治療用hoCARsまたはhoTILの割合が大幅に高い細胞製品の作製が可能となる。これらのより均質な細胞製品は、新生物疾患の処置において使用して、より大きな有効性およびより小さな毒性をもたらすことができる。
いくつかの態様では、本開示は、疾患、障害または病態を患っている対象におけるそれらを処置する方法であって、
a. 対象に、膜貫通受容体分子の細胞外ドメイン（ECD）の発現および表面提示を達成可能な1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されたオルソゴナルhCD122のECDを含む膜貫通受容体分子をコードする核酸配列を含む、操作された哺乳動物細胞を投与すること；ならびに
b. 前記対象に、式#1のhIL2オルソログの治療有効用量を投与すること
による、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、少なくとも20％のhoCD122 T細胞を含む操作されたT細胞製品を調製する方法であって、
a. 哺乳動物対象からT細胞の集団を単離する工程；
b. 単離したT細胞の集団を、エクスビボで、哺乳動物T細胞における発現を容易にするために1つまたは複数の発現制御配列に機能的に連結されたhoCD122をコードする核酸配列を含む組換えベクターと、T細胞による組換えベクターの取り込みを可能にする条件下で接触させる工程；
c. 単離したT細胞の集団を請求項1記載のhIL2オルソログの有効量と接触させる工程
を含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、少なくとも20％の操作されたhoCD122 T細胞を含む細胞集団を提供する。
本開示はさらに、本発明のhIL2オルソログを製造する方法を提供する。特に、本開示は、hIL2オルソログをコードする核酸配列の宿主細胞における発現を提供するために制御エレメントに機能的に連結されたhIL2オルソログをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを提供する。
本開示はさらに、少なくとも10％、あるいは少なくとも20％、あるいは少なくとも30％、あるいは少なくとも40％、あるいは少なくとも50％、あるいは少なくとも60％、あるいは少なくとも70％のT細胞（例えば、T細胞、CD8+ T細胞、Treg、TIL、NK細胞、TCR改変細胞、CAR-T細胞など）を含む混合細胞集団を含む組成物であって、T細胞がオルソゴナルhCD122受容体ポリペプチドを発現するように組換え改変されている、組成物を提供する。本開示はさらに、投与剤形が、T細胞の集団を含み、T細胞の集団において、操作されたT細胞の1つまたは複数の種が実質的に濃縮されており、操作されたT細胞が、hCD122オルソゴナルポリペプチドの細胞外ドメインを含む受容体を発現する、操作された細胞療法製品の薬学的に許容される投与剤形を作製する方法であって、hCD122オルソゴナルポリペプチドの細胞外ドメインを含む受容体を発現する操作されたT細胞を含むT細胞の集団を、本発明のhIL2オルソログの存在下、1つまたは複数のそのような操作されたT細胞の細胞集団を濃縮するのに十分な期間にわたってエクスビボ培養する工程を含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、哺乳動物細胞からのhIL2オルソログの発現および分泌を容易にするために制御エレメントに機能的に連結された本明細書に記載されるhIL2オルソログをコードする核酸配列を含む組換えベクターを提供し、hIL2オルソログのインサイチュー発現を提供するために対象に投与される。いくつかの態様では、組換えベクターは、がんを患っている対象に腫瘍内投与される。いくつかの態様では、組換えベクターは、組換えウイルスベクターである。いくつかの態様では、組換えウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）または組換えアデノウイルス（rAd）、例えば、いくつかの態様では、ヒトアデノウイルス血清型3および／または5に由来する複製欠損アデノウイルスである。いくつかの態様では、複製欠損アデノウイルスは、細胞周期および／またはアポトーシス経路を開始するウイルスの能力を妨害する、E1領域への1つまたは複数の改変を有する。複製欠損アデノウイルスベクターは、任意で、E3ドメイン中に欠失を含み得る。いくつかの態様では、アデノウイルスは、複製可能なアデノウイルスである。いくつかの態様では、アデノウイルスは、新生細胞中で選択的に複製するように操作された複製可能な組換えウイルスである。
IL2オルソログ
命名法：
本開示は、IL2受容体ポリペプチドバリアントの多様なポリペプチドリガンドを提供する。置換、欠失または挿入のことを指すために、本明細書において以下の命名法が使用される。残基は、本明細書において、野生型分子において見られる天然に存在するアミノ酸の一文字または三文字アミノ酸コードとそれに続く成熟IL2分子のIL2アミノ酸位置によって指定することができ、例えば、「Cys125」または「C125」は、システイン残基が野生型hIL2分子の125位にあることを指す。IL2オルソログに関して、置換は、本明細書において、一文字アミノ酸コードと、それに続くIL2アミノ酸位置と、それに続く置換されている一文字アミノ酸コードによって指定される。例えば、修飾「K35A」を有するIL2オルソログは、野生型IL2配列の35位にあるリジン（K）残基がこの位置でアラニン（A）残基により置換されていることを指す。アミノ酸残基の欠失は、「des」と称され、その後にアミノ酸残基およびSEQ ID NO：4におけるその位置が続く。例えば、「des-Ala1」または「desA1」という用語は、野生型IL2配列のポリペプチドの1位でのアラニンの欠失のことを指す。同様に、オルソゴナルCD122におけるアミノ酸置換に関して、アミノ酸置換は、本明細書において、天然に存在するアミノ酸の一文字アミノ酸コードと、それに続く野生型IL2配列におけるその位置の数と、それに続くその位置で置換されているアミノ酸の一文字アミノ酸コードによって指定される。例えば、134位にあるチロシン残基がフェニルアラニン残基により置換されたhCD122オルソログでは、置換は「Y134F」と略される。
オルソログ（オルソゴナルCD122 ECDを含む受容体に対する同族リガンド）：
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナルCD122 ECDを含む受容体の同族リガンドであるIL2オルソログの使用の方法を提供する。いくつかの態様では、IL2オルソログは、オルソゴナルCD122に対するリガンドであり、そのICDは、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む。いくつかの態様では、IL2オルソログという用語は、H133および／またはY134位にアミノ酸置換を含むヒトCD122の細胞外ドメインを含む受容体に対するリガンドであるhIL2バリアントのことを指し、そのICDは、任意で、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む。いくつかの態様では、IL2オルソログは、H133および／またはY134位にアミノ酸置換を含むヒトCD122の細胞外ドメインを含む受容体に対する同族リガンドである。いくつかの態様では、IL2オルソログは、H133および／またはY134位にアミノ酸置換を含むヒトCD122の細胞外ドメインを含む受容体に対するリガンドであり、そのICDは、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む。いくつかの態様では、IL2オルソログは、H133およびY134位にアミノ酸置換を含むオルソゴナルヒトCD122に対するリガンドである。いくつかの態様では、IL2オルソログは、アミノ酸置換H133DおよびY134Fを含むオルソゴナルCD122に対するリガンドである。いくつかの態様では、本開示のオルソログは、H133およびY134位にアミノ酸置換を含むhCD122分子の細胞外ドメインを含む受容体の同族リガンドであるhIL2オルソログであり、そのICDは、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む。
いくつかの態様では、本開示のオルソログは、H133位にアミノ酸置換を含むhCD122分子の細胞外ドメインを含む受容体の同族リガンドであるhIL2オルソログである。いくつかの態様では、本開示のオルソログは、H133位にアミノ酸置換を含むhCD122分子の細胞外ドメインを含む受容体の同族リガンドであるhIL2オルソログであり、そのICDは、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む。いくつかの態様では、本開示のオルソログは、H133D位にアミノ酸置換を含むhCD122分子の細胞外ドメインを含む受容体の同族リガンドであるhIL2オルソログである。いくつかの態様では、本開示のオルソログは、H133D位にアミノ酸置換を含むhCD122分子の細胞外ドメインを含む受容体の同族リガンドであるhIL2オルソログであり、そのICDは、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む。いくつかの態様では、本開示のオルソログは、Y134位にアミノ酸置換を含むhCD122分子の細胞外ドメインを含む受容体の同族リガンドであるhIL2オルソログである。いくつかの態様では、本開示のオルソログは、Y134位にアミノ酸置換を含むhCD122分子の細胞外ドメインを含む受容体の同族リガンドであるhIL2オルソログであり、そのICDは、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む。いくつかの態様では、本開示のオルソログは、Y134F位にアミノ酸置換を含むhCD122分子の細胞外ドメインを含む受容体の同族リガンドであるhIL2オルソログである。いくつかの態様では、本開示のオルソログは、Y134F位にアミノ酸置換を含むhCD122分子の細胞外ドメインを含む受容体の同族リガンドであるhIL2オルソログであり、そのICDは、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む。
いくつかの態様では、本開示のオルソログは、Y134位にアミノ酸置換を含むhCD122分子の細胞外ドメインを含む受容体の同族リガンドであるhIL2オルソログであり、そのICDは、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む。いくつかの態様では、本開示のオルソログは、アミノ酸置換H133DおよびY134Fを含むオルソゴナルヒトCD122の細胞外ドメインを含む受容体の同族リガンドであるhIL2オルソログである。いくつかの態様では、本開示のオルソログは、アミノ酸置換H133DおよびY134Fを含むオルソゴナルヒトCD122の同族リガンドであるhIL2オルソログである。
IL2オルソログ（式#1）：一態様では、本開示は、hIL2オルソログを提供し、そのアミノ酸配列は、式#1で示されるポリペプチドに対して少なくとも80％、90％、95％、98％、99％または100％の同一性を有する：
Figure 2023511274000034
式中：
AA1は、A（野生型）または欠失である；
AA2は、P（野生型）または欠失である；
AA3は、T（野生型）、C、A、G、Q、E、N、D、R、K、P、または欠失である；
AA4は、S（野生型）または欠失である；
AA5は、S（野生型）または欠失である；
AA6は、S（野生型）または欠失である；
AA7は、T（野生型）または欠失である；
AA8は、K（野生型）または欠失である；
AA9は、K（野生型）または欠失である；
AA13は、Q（野生型）、Wまたは欠失である；
AA14は、L（野生型）、M、Wまたは欠失である；
AA15は、E（野生型）、K、D、T、A、S、Q、Hまたは欠失である；
AA16は、H（野生型）、NまたはQまたは欠失である；
AA18は、L（野生型）またはR、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、DまたはTである；
AA19は、L（野生型）、A、V、Iまたは欠失である；
AA20は、D（野生型）、T、S、M、L、または欠失である；
AA22は、Q（野生型）またはF、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T、Fまたは欠失である；
AA23は、M（野生型）、A、W、H、Y、F、Q、S、V、L、T、または欠失である；
AA27は、G（野生型）、K、Sまたは欠失である；
AA38は、R（野生型）、WまたはGである；
AA39は、M（野生型）、LまたはVである；
AA42は、F（野生型）またはKである；
AA51は、T（野生型）、Iまたは欠失である
AA55は、H（野生型）またはYである；
AA74は、Q（野生型）、N、H、Sである；
AA80は、L（野生型）、FまたはVである；
AA81は、R（野生型）、I、D、Y、Tまたは欠失である
AA85は、L（野生型）またはVである；
AA86は、I（野生型）またはVである；
AA88は、N（野生型）、EまたはQまたは欠失である；
AA89は、I（野生型）またはVである；
AA91は、V（野生型）、RまたはKである；
AA92は、I（野生型）またはFである；
AA97は、K（野生型）またはQである；
AA104は、M（野生型）またはAである；
AA109は、D（野生型）、Cまたは活性化された側鎖を有する非天然アミノ酸である；
AA113は、T（野生型）またはNである；
AA125は、C（野生型）、AまたはSである；
AA126は、Q（野生型）またはH、M、K、C、D、E、G、I、R、S、またはTである；および／あるいは
AA130は、S（野生型）、TまたはRである。
いくつかの態様では、本開示は、以下：
Figure 2023511274000035
のアミノ酸修飾のセットを含むhIL2ポリペプチドである、hIL2オルソログを提供する。
Cys125：いくつかの態様では、本開示は、125位にある不対システイン残基を排除することによって、かつ／または、直接発現されたIL2ポリペプチドのN末端Metならびに内因性細菌プロテアーゼによる翻訳後プロセシングによる1位のアラニンの排除によって、細菌細胞における組換え発現を容易にするhIL2オルソログを提供する。アミノ酸が欠けている場合、「des」と称される。いくつかの態様では、125位にあるシステインは、アラニンまたはセリンで置換される（C125AまたはC125S）。そのような変異は、典型的には、細菌において組換え発現されて封入体から単離されるとき、タンパク質のミスフォールディングを回避するために使用される。
いくつかの態様では、本発明のIL2オルソログは、以下：
Figure 2023511274000036
のアミノ酸修飾のセットの1つを含む。
CD122親和性を増加させるための変異
いくつかの態様では、hIL2オルソログは、hIL2配列の位置に、hCD122と接触するかまたはCD122と接触する他の位置の配向を変化させる1つまたは複数の変異を含有し、その結果としてCD122に対して増加した親和性を有するIL2オルソログがもたらされる。IL2のCD122への結合に関与するとして特定されているIL2残基は、L12、Q13、H16、L19、D20、M23、Q74、L80、R81、D84、L85、I86、S87、N88、I89、V91、I92、およびE95を含む。いくつかの態様では、IL2オルソログは、アミノ酸置換：Q74N、Q74H、Q74S、L80F、L80V、R81D、R81T、L85V、I86V、I89V、および／もしくはI92F、またはそれらの組み合わせの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、IL2オルソログは、アミノ酸置換：L80F、R81D、L85V、I86VおよびI92Fの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、IL2オルソログは、アミノ酸置換：N74Q、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V、およびI92Fの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、IL2オルソログは、アミノ酸置換：Q74N、L80V、R81T、L85V、I86V、およびI92Fの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、IL2オルソログは、アミノ酸置換：Q74H、L80F、R81D、L85V、I86VおよびI92Fの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、IL2オルソログは、アミノ酸置換：Q74S、L80F、R81D、L85V、I86VおよびI92Fの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、IL2オルソログは、アミノ酸置換：Q74N、L80F、R81D、L85V、I86VおよびI92Fの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、IL2オルソログは、アミノ酸置換：Q74S、R81T、L85V、およびI92Fの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、IL2オルソログは、［L80F-R81D-L85V-I86V-I92F］を含む。いくつかの態様では、本開示は、以下：
Figure 2023511274000037
のアミノ酸修飾のセットの1つを含むhIL2オルソログを提供する。
いくつかの態様では、オルソログは、IL2のCD122への親和性を増加させるとして特定されている置換L85Vを含む。いくつかの態様では、本開示は、以下：
Figure 2023511274000038
のアミノ酸修飾のセットの1つを含むhIL2ポリペプチドである、hIL2オルソログを提供する。
CD25親和性をモジュレートするための修飾
いくつかの態様では、IL2オルソログは、IL2配列の位置に、CD25と接触するかまたはCD25と接触する他の位置の配向を変化させる1つまたは複数の変異を含有し、その結果としてCD25に対して減少した親和性がもたらされる。変異は、公開された結晶構造に基づき、CD25に極めて接近していることが公知の領域にあるかまたはその近傍にあり得る（Wang, et al Science 310:1159 2005）。CD25と接触すると考えられるIL2残基は、K35、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、K64、P65、E68、V69、L72、およびY107を含む。いくつかの態様では、本開示のIL2オルソログは、R38A、F41AおよびF42A（Suave, et al (1991) PNAS (USA) 88:4636-4640）；P65L（Chen et al. Cell Death and Disease (2018) 9:989）；F42A/G/S/T/Q/E/N/R/K、Y45A/G/S/T/Q/E/N/D/R/K/および／またはL72G/A/S/T/Q/E/N/D/R/K（2012年9月27日に公開されたAstらの米国特許出願公報 2012/0244112A1；2016年2月23日に発表された米国特許第9266938B2号）の点変異の1つまたは複数を含む。置換の特定の組み合わせが、CD25への結合を低減させるとして特定されている。いくつかの態様では、本開示のIL2オルソログは、Carmenate, et al (2013) J Immunol 190:6230-6238に記載されているような［R38A-F42A-Y45A-E62A］；［F42A-Y45A-L72G］（Roche RG7461（RO6874281）；および／または［T41P-T51P］（Chang, et al (1995) Molecular Pharmacology 47:206-211）の置換のセットの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、本開示は、以下：
Figure 2023511274000039
のアミノ酸修飾のセットの1つを含むhIL2ポリペプチドである、hIL2オルソログを提供する。
CD132親和性をモジュレートするための修飾
本発明のいくつかの態様では、IL2オルソログは、IL2配列の位置に、CD132と接触するかまたはCD132と接触する他の位置の配向を変化させる1つまたは複数の変異を含有し、その結果としてCD132への結合を変化させる。例示的なIL2オルソログは、IL2配列の位置に、CD132と接触するかまたはCD122と接触する他の位置の配向を変化させる1つまたは複数の変異を含有し、その結果としてCD132への結合を変化させる。CD132と接触すると考えられるIL2残基は、Q11、L18、Q22、E110、N119、T123、Q126、S127、I129、S130、およびT133を含む。いくつかの態様では、IL2は、L18に修飾を含み、AA18は、L（野生型）またはR、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、DまたはTである；AA126は、Q（野生型）またはH、M、K、C、D、E、G、I、R、S、またはTである；および／または、AA22は、Q（野生型）またはF、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T、またはFである。
いくつかの態様では、本開示は、以下：
Figure 2023511274000040
のアミノ酸修飾のセットの1つを含むhIL2ポリペプチドである、hIL2オルソログを提供する。
リーダー配列の非存在下で直接的に細菌発現系において組換え産生される場合、内因性プロテアーゼは、N末端Met-Ala1残基の欠失をもたらし、「desAla1」IL2オルソログを提供する。いくつかの態様では、本開示は、以下：
Figure 2023511274000041
のアミノ酸修飾のセットの1つを含むhIL2ポリペプチドである、hIL2オルソログを提供する。
保存的アミノ酸置換
CD122オルソゴナル受容体に対するIL2オルソログの活性および選択性に寄与する前述の修飾に加えて、IL2オルソログは、その一次構造に、IL2の活性に対して最小限の効果しか提供しない1つまたは複数の修飾を含み得る。いくつかの態様では、本開示のIL2オルソログは、野生型IL-2アミノ酸配列内に1つまたは複数の保存的アミノ酸置換をさらに含み得る。そのような保存的置換は、DayhoffによるThe Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978)に、またArgosによるEMBO J., 8:779-785 (1989)に記載されているものを含む。保存的置換は、一般に、表XXXとして描写されている以下のチャートに従ってなされる。
（表Ｘ）例示的な保存的アミノ酸置換
Figure 2023511274000042
機能または免疫学的同一性における実質的な変化は、表3に示されるものより保存的でないアミノ酸置換を選択することによってなされ得る。例えば、小型の非荷電側鎖（例えば、グリシン）と大型の嵩高い荷電側鎖（アスパラギン）とのアミノ酸の置換を含む、より有意にポリペプチド骨格の構造に影響を及ぼすかまたは二次もしくは三次エレメントを崩壊する置換がなされ得る。特に、CD25、CD122および／またはCD123の1つまたは複数と相互作用するアミノ酸に関与するそのようなIL2残基の置換は、記載されているように、その受容体と会合したIL2の結晶構造から判別することができる。
CD122オルソゴナル受容体に対するIL2オルソログの活性および選択性に寄与する前述の修飾に加えて、IL2オルソログは、その一次構造に1つまたは複数の修飾を含み得る。上に提供したような一次構造への修飾は、任意で、置換：N30E；K32E；N33D；P34G；T37I、M39Q、F42Y、F44Y、P47G、T51I、E52K、L53N、Q57E、M104Aを非限定的に含む、IL2オルソログのIL2活性を実質的に減少させない修飾をさらに含み得る（米国特許第5,206,344号を参照のこと）。
グリコシル化部位の除去
本開示のIL2オルソログは、Thr3位に、IL2オルソログがCHOまたはHEK細胞などの哺乳動物細胞において発現されるときに脱グリコシル化されたIL2オルソログの産生を容易にするためのO-グリコシル化部位を排除する修飾を含み得る。したがって、ある特定の態様では、IL2オルソログは、ヒトIL-2の残基3に対応する位置に、IL-2のO-グリコシル化部位を排除する修飾を含む。一態様では、ヒトIL-2の残基3に対応する位置のIL-2のO-グリコシル化部位を排除する前記修飾は、アミノ酸置換である。例示的なアミノ酸置換は、生物活性を排除することなく3位のグリコシル化部位を除去する、T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K、およびT3Pを含む（米国特許第5,116,943号；Weiger et al., (1989) Eur. J. Biochem., 180:295-300を参照のこと）。具体的な態様では、前記修飾は、アミノ酸置換T3Aである。いくつかの態様では、本開示は、以下：
Figure 2023511274000043
のアミノ酸修飾のセットの1つを含むhIL2ポリペプチドである、hIL2オルソログを提供する。
IL2オルソログは、最初の2つのアミノ酸の欠失（desAla1-desPro2）、ならびに、選択的なN末端修飾、とりわけシステインのスルフヒドリル基のPEG化が容易になる、システイン残基によるThr3グリコシル化の置換を含み得る（例えば、1993年4月27日に発表されたKatreらの米国特許第5,206,344号を参照のこと）。いくつかの態様では、本開示は、以下：
Figure 2023511274000044
のアミノ酸修飾のセットの1つを含むhIL2ポリペプチドである、hIL2オルソログを提供する。
酸化安定化M104A：
IL2オルソログは、任意で、より酸化抵抗性のオルソログを提供するために、M104位に修飾、一態様ではアラニン残基によるメチオニン104の置換（M104A）をさらに含み得る（1988年6月21日に発表されたKothsらの米国特許4,752,585を参照のこと）。
N末端の欠失：
リーダー配列の非存在下で直接的に細菌発現系において組換え産生される場合、内因性プロテアーゼは、N末端Met-Ala1残基の欠失をもたらし、「desAla1」IL2オルソログを提供する。IL2オルソログは、最初の2つのアミノ酸の欠失（desAla1-desPro2）、ならびに、N末端修飾、とりわけシステインのスルフヒドリル基のPEG化が容易になる、システイン残基によるThr3グリコシル化の置換（T3C）を含み得る（例えば、1993年4月27日に発表されたKatreらの米国特許第5,206,344号を参照のこと）。
IL2オルソログは、1～9位、あるいは1～8位、あるいは1～7位、あるいは1～6位、あるいは1～5位、あるいは1～4位、あるいは1～3位、あるいは1～2位の1つまたは複数でのN末端アミノ酸の排除をさらに含み得る。いくつかの態様では、本開示は、以下：
Figure 2023511274000045
のアミノ酸修飾のセットの1つを含むhIL2ポリペプチドである、hIL2オルソログを提供する。
血管漏出症候群を最小限に抑えるための修飾
本開示のいくつかの態様では、IL2オルソログは、ヒトでのIL2療法の使用の実質的な負の用量制限的な副作用である血管漏出症候群を有効性の実質的な喪失なしに回避するためのアミノ酸置換を含む。2009年4月7日に発表されたEpsteinらの米国特許第7,514,073B2号を参照されたい。本開示のIL2オルソログに含まれるそのような修飾の例としては、R38W、R38G、R39L、R39V、F42KおよびH55Yの1つまたは複数が挙げられる。
親和性成熟：
いくつかの態様では、IL2オルソログは、オルソゴナルCD122に関してそれらの活性を増強するために親和性成熟されてもよい。「親和性成熟された」ポリペプチドは、1つまたは複数の残基に、変異を保有しない親ポリペプチドと比較してオルソゴナルポリペプチドの同族オルソゴナル受容体に対する親和性（またはその逆も同様）の改善をもたらす1つまたは複数の変異を有するものである。親和性成熟は、IL2オルソログの結合親和性を「親」ポリペプチドと比較して少なくとも約10％、あるいは少なくとも約50％、あるいは少なくとも約100％、あるいは少なくとも約150％、あるいは1～5倍増加させるために行うことができる。本発明の操作されたIL2オルソログは、上で考察したようにその同族オルソゴナル受容体を活性化するが、十分な量の分子を適切なアッセイ条件下で使用したELISAおよび／またはFACS解析によって評価したところ、野生型IL2受容体の有意に低下した結合および活性化を有する。
インビボの作用持続時間を延長するための修飾
上で考察したように、本開示の組成物は、対象において延長されたインビボ寿命および／または延長された作用持続時間を提供するように修飾されたIL2オルソログを含む。延長された寿命および／または作用持続時間を提供するためのそのような修飾としては、IL2オルソログの一次配列修飾、キャリア分子へのコンジュゲーション（例えば、アルブミン、アシル化、PEG化）、およびFc融合が挙げられる。
インビボの作用持続時間を延長するための配列修飾
上で考察したように、IL2オルソログという用語は、対象において延長されたインビボ寿命および／または延長された作用持続時間を提供するためのIL2オルソログの修飾物を含む。
いくつかの態様では、IL2オルソログは、長期のインビボ寿命をもたらすある特定のアミノ酸置換を含み得る。例えば、Dakshinamurthiら（International Journal of Bioinformatics Research (2009) 1(2):4-13）は、IL2ポリペプチド中の置換V91R、K97EおよびT113Nの1つまたは複数が、増強された安定性および活性を保有するIL2バリアントをもたらすだろうと述べている。いくつかの態様では、本開示のIL2オルソログは、V91R、K97EおよびT113N修飾の1つ、2つまたは3つすべてを含む。
コンジュゲートおよびキャリア分子
いくつかの態様では、IL2オルソログは、IL2オルソログにある特定の性質（例えば、対象において延長された作用持続時間）を提供するように修飾され、この修飾は、キャリア分子へのコンジュゲーションを通じて達成されてよく、延長された半減期などの所望の薬理学的性質が提供される。いくつかの態様では、IL2オルソログを、例えば当技術分野において公知であるようなPEG化、グリコシル化、脂肪酸アシル化などによって、IgGのFcドメイン、アルブミンまたは他の分子に共有連結させて、その半減期を延長させることができる。
アルブミン融合物
いくつかの態様では、IL2オルソログは、延長されたインビボ曝露を容易にすることが当技術分野において公知であるアルブミン分子（例えば、ヒト血清アルブミン）を有する融合タンパク質として発現される。
本発明の一態様では、hIL2オルソログは、アルブミンにコンジュゲートされ、本明細書において、「IL2オルソログアルブミン融合物」と称される。hIL2オルソログアルブミン融合物の文脈で使用される場合の「アルブミン」という用語は、ヒト血清アルブミン（HSA）、カニクイザル血清アルブミン、およびウシ血清アルブミン（BSA）などのアルブミンを含む。いくつかの態様では、HSAは、野生型HSA配列と比べてアミノ酸置換C34SまたはK573Pを含む。本開示によれば、アルブミンは、hIL2オルソログに、カルボキシ末端、アミノ末端、カルボキシル末端とアミノ末端の両方で、および内部でコンジュゲートすることができる（例えば、USP 5,876,969およびUSP 7,056,701を参照のこと）。本開示によって想定されるHSA-hIL2オルソログポリペプチドコンジュゲートでは、アルブミン分泌プレ配列およびそのバリアント、その断片およびバリアント、ならびにHSAバリアントなどの様々な形態のアルブミンを使用することができる。そのような形態は、一般に、1つまたは複数の所望のアルブミン活性を保有する。追加の態様では、本開示は、アルブミン、アルブミン断片およびアルブミンバリアントなどに直接的または間接的に融合されたhIL2オルソログポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、融合していない薬物分子よりも高い血漿安定性を有し、かつ／または、融合タンパク質は、融合していない薬物分子の治療活性を保持する。いくつかの態様では、間接的な融合は、下により詳しく考察するように、ペプチドリンカーまたはその修飾されたバージョンなどのリンカーによって行われる。
あるいは、hIL2オルソログアルブミン融合物は、アルブミン結合ドメイン（ABD）ポリペプチド配列およびIL2オルソログポリペプチドを含む融合タンパク質であるIL2オルソログを含む。上に示唆したように、アルブミン結合ドメイン（ABD）ポリペプチド配列およびhIL2オルソログポリペプチドを含む融合タンパク質は、例えば、遺伝子操作によって、HASをコードする核酸またはその断片が1つまたは複数のIL2オルソログ配列をコードする核酸に接続されるように達成することができる。いくつかの態様では、アルブミン結合ペプチドは、アミノ酸配列DICLPRWGCLW（SEQ ID NO：7）を含む。
IL2オルソログポリペプチドはまた、タンパク質；セファロース、アガロース、セルロースまたはセルロースビーズなどの多糖；ポリグルタミン酸またはポリリジンなどの重合アミノ酸；アミノ酸共重合体；不活化ウイルス粒子；ジフテリア、破傷風、コレラまたはロイコトキシン分子由来のトキソイドなどの不活化細菌毒素；不活化細菌、樹状細胞、サイログロブリン；破傷風トキソイド；ジフテリアトキソイド；ポリ（D-リジン：D-グルタミン酸）などのポリアミノ酸；ロタウイルスのVP6ポリペプチド；インフルエンザウイルスヘマグルチニン、インフルエンザウイルス核タンパク質；キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）；ならびにB型肝炎ウイルスコアタンパク質および表面抗原などの、大きなゆっくり代謝される巨大分子にコンジュゲートすることもできる。そのようなコンジュゲート形態は、所望であれば、本開示のポリペプチドに対する抗体を産生させるために使用することができる。
いくつかの態様では、IL2オルソログは、PEG化のために延長された作用持続時間を提供するXTENとコンジュゲートされ（化学的または融合タンパク質としてのいずれか）、大腸菌（E. coli）において組換え融合タンパク質として産生され得る。本開示のIL2オルソログとの併用に適したXTENポリマーは、Podust, et al. (2016) "Extension of in vivo half-life of biologically active molecules by XTEN protein polymers", J Controlled Release 240:52-66 and Haeckel et al. (2016) "XTEN as Biological Alternative to PEGylation Allows Complete Expression of a Protease- Activatable Killin-Based Cytostatic" PLOS ONE| DOI: 10.1371/journal. pone. 0157193 June 13, 2016に提供される。XTENポリマーは、XTENポリペプチドとIL2オルソログとの間にMMP-2切断部位などのプロテアーゼ感受性切断部位を含み得る融合タンパク質であり得る。
コンジュゲーションのための追加の候補成分および分子は、単離または精製に適したものを含む。特定の非限定的な例としては、結合分子、例えば、ビオチン（ビオチン-アビジン特異的結合ペア）、抗体、受容体、リガンド、レクチン、または固体支持体（例えば、プラスチックまたはポリスチレンビーズ、プレートまたはビーズ、磁気ビーズ、試験紙およびメンブレンを含む）を含む分子が挙げられる。
いくつかの態様では、IL-2ムテインをまた、本開示の他の箇所に記載しているような抗炎症化合物または抗新生物剤などの治療用化合物、治療用抗体（例えば、Herceptin）、免疫チェックポイントモジュレーター、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗PD1抗体）、がんワクチンを含む、追加の治療剤に連結させてもよい。抗菌剤としては、ゲンタマイシンを含むアミノグリコシド、リファンピシン、3'-アジド-3'-デオキシチミジン（AZT）およびアシクロビルなどの抗ウイルス化合物、フルコナゾールを含むアゾールなどの抗真菌剤、アンホテリシンBおよびカンジシジンなどのプリレマクロライド（plyre macrolides）、アンチモン剤などの抗寄生虫化合物などが挙げられる。IL2オルソログは、CSF、GSF、GMCSF、TNF、エリスロポエチン、免疫モジュレーターまたはインターフェロンもしくはインターロイキンなどのサイトカイン、神経ペプチド、HGH、FSHまたはLHなどの生殖ホルモン、甲状腺ホルモン、アセチルコリなどの神経伝達物質、エストロゲン受容体などのホルモン受容体のような追加のサイトカインにコンジュゲートさせてもよい。また、インドメタシン、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、スリンダク、ピロキシカムおよびナプロキセンなどの非ステロイド性抗炎症薬、ならびに麻酔薬または鎮痛薬も含まれる。また、治療だけでなく画像検査にも有用なものなどの放射性同位体も含まれる。
本開示のIL2オルソログは、周知の化学コンジュゲーション法を使用してそのようなキャリア分子に化学的にコンジュゲートされ得る。当技術分野において周知であるホモ官能性およびヘテロ官能性の架橋試薬などの二官能性の架橋試薬をこの目的に使用することができる。使用のためのこのタイプの架橋試薬は、IL-2ムテインにカップリングされる分子の性質に依存し、当業者によって容易に特定され得る。代替的にまたは追加的に、IL2オルソログおよび／またはそれにコンジュゲートされることが意図される分子は、2つが別々の反応でコンジュゲートできるように化学的に誘導体化されてもよく、これも同じく当技術分野において周知である。
PEG化：
いくつかの態様では、IL2オルソログは、1つまたは複数の水溶性ポリマーにコンジュゲートされる。本発明の実施において有用な水溶性ポリマーの例としては、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリ-プロピレングリコール（PPG）、多糖（ポリビニルピロリドン、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリオレフィンアルコール、多糖、ポリ-アルファ-ヒドロキシ酸）、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（POZ）、ポリ（N-アクリロイルモルホリン）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの態様では、IL2オルソログは、1つまたは複数のポリエチレングリコール分子にコンジュゲートされるかまたは「PEG化される」。IL2オルソログへのPEGの付着の方法または部位は様々あり得るが、ある特定の態様では、PEG化は、IL2オルソログの活性を変化させないか、または最小限にしか変化させない。
いくつかの態様では、特定の化学を使用して、N末端PEG化を容易にするために、システインを3位でトレオニンに置換してもよい（3TC）。
いくつかの態様では、PtacinらのPCT国際出願番号PCT/US2018/045257（2018年8月3日に出願され、2019年2月7日に国際公開番号WO 2019/028419Alとして公開された）が記載しているようなIL2オルソログの選択的PEG化（例えば、選択的なPEGコンジュゲーション化学を容易にする側鎖を有する非天然アミノ酸の組み込みによる）を用いて、IL2受容体複合体の1つまたは複数のサブユニット（例えば、CD25、CD132）に対して親和性が低下したIL2オルソログを作製することができる。例えば、アミノ酸34～45、61～72および105～109を含むCD25と相互作用するとして特定されたIL2の配列または残基にPEG化可能な特定の部分を有する非天然アミノ酸を組み込んだhIL2オルソログは、典型的には、CD25への結合が減少したIL2オルソログを提供する。同様に、アミノ酸18、22、109、126または119～133を含むhCD132と相互作用するとして特定されたIL2の配列または残基にPEG化可能な特定の部分を有する非天然アミノ酸を組み込んだhIL2オルソログは、hCD132への結合が減少したIL2オルソログを提供する。
ある特定の態様では、半減期の増加は、あらゆる生物活性の減少よりも大きい。ポリペプチド配列へのコンジュゲーションに適したPEGは、一般に、室温で水に可溶性であり、一般式 R(O-CH2-CH2)nO-R（式中、Rは、水素またはアルキルもしくはアルカノール基などの保護基であり、nは、1～1000の整数である）を有する。Rが保護基である場合、保護基は一般に、1～8個の炭素を有する。ポリペプチド配列にコンジュゲートされるPEGは、直鎖または分岐鎖であることができる。分岐鎖PEG誘導体の「星状PEG」およびマルチアームPEGが本開示によって想定される。
本開示において使用されるPEGの分子量は、任意の特定の範囲に制限されるわけではない。PEG-IL2オルソログのPEG成分は、約5kDa超、約10kDa超、約15kDa超、約20kDa超、約30kDa超、約40kDa超、または約50kDa超の分子質量を有することができる。いくつかの態様では、分子質量は、約5kDa～約10kDa、約5kDa～約15kDa、約5kDa～約20kDa、約10kDa～約15kDa、約10kDa～約20kDa、約10kDa～約25kDaまたは約10kDa～約30kDaである。直鎖または分岐鎖PEG分子は、約2,000～約80,000ダルトン、あるいは約2,000～約70,000ダルトン、あるいは約5,000～約50,000ダルトン、あるいは約10,000～約50,000ダルトン、あるいは約20,000～約50,000ダルトン、あるいは約30,000～約50,000ダルトン、あるいは約20,000～約40,000ダルトン、あるいは約30,000～約40,000ダルトンの分子量を有する。本発明の一態様では、PEGは、2本の20kDアームを含む40kDの分岐鎖PEGである。
本開示はまた、PEGが異なるn値を有する、したがって様々な異なるPEGが特定の比で存在する、コンジュゲートの組成物も想定する。例えば、いくつかの組成物は、n＝1、2、3および4であるコンジュゲートの混合物を含む。いくつかの組成物では、n＝1であるコンジュゲートの百分率は18～25％であり、n＝2であるコンジュゲートの百分率は50～66％であり、n＝3であるコンジュゲートの百分率は12～16％であり、n＝4であるコンジュゲートの百分率は最大で5％である。そのような組成物は、当技術分野において公知である反応条件および精製方法によって生産することができる。クロマトグラフィーを使用してコンジュゲート画分を分割してもよく、次いで、例えば、所望の数のPEGが付着しているコンジュゲートを含有する画分を特定し、未修飾タンパク質配列および他の数のPEGが付着しているコンジュゲートを含まないように精製する。
ポリペプチド配列へのコンジュゲーションに適したPEGは、一般に、室温で水に可溶性であり、一般式 R(O-CH2-CH2)nO-R（式中、Rは、水素またはアルキルもしくはアルカノール基などの保護基であり、nは、1～1000の整数である）を有する。Rが保護基である場合、保護基は一般に、1～8個の炭素を有する。
2つの広く使用されている第1世代活性化モノメトキシPEG（mPEG）は、スクシンイミジルカルボナートPEG（SC-PEG；例えば、Zalipsky, et al. (1992) Biotehnol. Appl. Biochem 15:100-114を参照のこと）およびベンゾトリアゾールカルボナートPEG（BTC-PEG；例えば、Dolenceらの米国特許第5,650,234号を参照のこと）であり、これらは、リジン残基と優先的に反応してカルバメート連結を形成するが、ヒスチジンおよびチロシン残基と反応することも知られている。PEG-アルデヒドリンカーの使用は、還元的アミノ化を通じてポリペプチドのN末端上の単一部位を標的とする。
ペグ化は、ポリペプチドのN末端にあるα-アミノ基、リジン残基の側鎖上のイプシロンアミノ基、およびヒスチジン残基の側鎖上のイミダゾール基で最も高頻度に起こる。ほとんどの組換えポリペプチドは、単一のアルファアミノ基および数多くのイプシロンアミノ基およびイミダゾール基を保有しているので、リンカー化学に応じて多数の位置異性体を作製することができる。当技術分野において公知である一般的なペグ化戦略を本明細書において適用することができる。
PEGは、ポリペプチド配列の1つまたは複数の遊離アミノ基またはカルボキシル基とポリエチレングリコールとの間の結合を仲介する末端反応性基（「スペーサー」）を介して、本開示のIL2オルソログに結合することができる。遊離アミノ基に結合できるスペーサーを有するPEGは、N-ヒドロキシスクシニルイミドポリエチレングリコールを含み、これは、ポリエチレングリコールのコハク酸エステルをN-ヒドロキシスクシニルイミドで活性化することによって調製することができる。
いくつかの態様では、IL2オルソログのPEG化は、部位特異的PEG化を容易にする固有の側鎖を持つ非天然アミノ酸の組み込みによって容易になる。そのようなポリペプチドの部位特異的ペグ化を達成するための機能的部分を提供するポリペプチドへの非天然アミノ酸の組み込みは、当技術分野において公知である。例えば、PtacinらのPCT国際出願番号PCT/US2018/045257（2018年8月3日に出願され、2019年2月7日に国際公開番号WO 2019/028419Alとして公開された）を参照されたい。一態様では、本発明のIL2オルソログは、IL2オルソログのD109位に非天然アミノ酸を組み込む。本発明の一態様では、IL2オルソログは、IL2オルソログの109位で、約20kD、あるいは約30kD、あるいは約40kDの分子量を有するPEG分子にPEG化されたものである。
ポリペプチド配列にコンジュゲートされるPEGは、直鎖または分岐鎖であることができる。分岐鎖PEG誘導体の「星状PEG」およびマルチアームPEGが本開示によって想定される。具体的な態様では、本発明の実施において有用なPEGとしては、10kDaの直鎖PEG-アルデヒド（例えば、Sunbright（登録商標）ME-100AL、NOF America Corporation, One North Broadway, White Plains, NY 10601 USA）、10kDaの直鎖PEG-NHSエステル（例えば、Sunbright（登録商標）ME-100CS、Sunbright（登録商標）ME-100AS、Sunbright（登録商標）ME-100GS、Sunbright（登録商標）ME-100HS、NOF）、20kDaの直鎖PEG-アルデヒド（例えば、Sunbright（登録商標）ME-200AL、NOF）、20kDaの直鎖PEG-NHSエステル（例えば、Sunbright（登録商標）ME-200CS、Sunbright（登録商標）ME-200AS、Sunbright（登録商標）ME-200GS、Sunbright（登録商標）ME-200HS、NOF）、20kDaの2アーム分岐鎖PEG-アルデヒド、すなわち2つの10kDA直鎖PEG分子を含む20kDA PEG-アルデヒド（例えば、Sunbright（登録商標）GL2-200AL3、NOF）、20kDaの2アーム分岐鎖PEG-NHSエステル、すなわち2つの10kDA直鎖PEG分子を含む20kDA PEG-NHSエステル（例えば、Sunbright（登録商標）GL2-200TS、Sunbright（登録商標）GL200GS2、NOF）、40kDaの2アーム分岐鎖PEG-アルデヒド、すなわち2つの20kDA直鎖PEG分子を含む40kDA PEG-アルデヒド（例えば、Sunbright（登録商標）GL2-400AL3）、40kDaの2アーム分岐鎖PEG-NHSエステル、すなわち2つの20kDA直鎖PEG分子を含む40kDA PEG-NHSエステル（例えば、Sunbright（登録商標）GL2-400AL3、Sunbright（登録商標）GL2-400GS2、NOF）、直鎖30kDa PEG-アルデヒド（例えば、Sunbright（登録商標）ME-300AL）、および直鎖30kDa PEG-NHSエステルが挙げられる。
先に述べたように、PEGは、IL2オルソログに直接またはリンカー分子を介して付着され得る。好適なリンカーは、一般に修飾されたポリペプチド配列と連結された成分および分子との間でいくらかの移動を許容するのに十分な長さの「フレキシブルリンカー」を含む。リンカー分子は、一般に、約6～50原子長である。リンカー分子はまた、例えば、アリールアセチレン、2～10の単量体単位を含有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸またはそれらの組み合わせであり得る。好適なリンカーは、容易に選択することができ、1個のアミノ酸（例えば、Gly）、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10～20、20～30、30～50または50個超のアミノ酸などの任意の好適な長さのものであることができる。フレキシブルリンカーの例としては、グリシンポリマー (G)n、グリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマーまたは他のフレキシブルリンカーが挙げられる。グリシンおよびグリシン－セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、それゆえ、成分間の中立的なつなぎ鎖として役立ち得る。さらなるフレキシブルリンカーの例としては、グリシンポリマー (G)n、グリシン－アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、グリシン－セリンポリマーが挙げられる。グリシンおよびグリシン－セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、それゆえ、成分間の中立的なつなぎ鎖として役立ち得る。これらのリンカー配列の多量体（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10～20、20～30、または30～50）を一緒に連結して、非相同アミノ酸配列を本明細書に開示されるポリペプチドにコンジュゲートするために使用され得るフレキシブルリンカーを提供することができる。
さらに、そのようなリンカーは、IL2オルソログを本明細書に記載されるような追加の非相同ポリペプチド成分に連結させるために使用してもよく、非相同アミノ酸配列は、シグナル配列および／またはアルブミン、Fc配列などの融合パートナーであり得る。
本開示の一態様では、IL2オルソログは、以下の構造のヒトIL2オルソログである：
［PEG］-［リンカー］n-［hoIL2］
式中、n＝0または1である、または
［PEG］-［リンカー］n-［desAla1-hIL2［E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A］
式中、n＝0または1である、または
本発明の別の態様では、IL2オルソログは、以下の構造のヒトIL2オルソログである：
Figure 2023511274000046
式中、n＝0または1である。
アシル化
いくつかの態様では、本開示のIL2オルソログは、Resh (2016) Progress in Lipid Research 63: 120-131に記載されているように、脂肪酸分子へのコンジュゲーションによってアシル化され得る。コンジュゲートされ得る脂肪酸の例としては、ミリスチン酸、パルミチン酸およびパルミトレイン酸が挙げられる。ミリストイレート（Myristoylate）は、典型的にはN末端グリシンに連結されるが、リジンもミリストイル化され得る。パルミトイル化は、典型的には、遊離システイン-SH基の酵素的修飾によって達成され、例えば、DHHCタンパク質は、S-パルミトイル化を触媒する。セリンおよびトレオニン残基のパルミトイル化は、典型的には、PORCN酵素を使用して酵素的に達成される。
アセチル化
いくつかの態様では、IL-2ムテインは、N末端アセチルトランスフェラーゼと例えばアセチルCoAを用いた酵素反応によって、N末端でアセチル化される。代替的に、またはN末端アセチル化に加えて、IL-2ムテインは、例えばリジンアセチルトランスフェラーゼを用いた酵素反応によって、1つまたは複数のリジン残基でアセチル化される。例えば、Choudhary et al. (2009) Science 325 (5942):834L2 ortho840を参照されたい。
Fc融合物
いくつかの態様では、IL2融合タンパク質は、IgG重鎖可変領域を欠いている抗体のIgGサブクラスに由来するFc領域を組み込み得る。「Fc領域」は、IgGをパパインで消化することで生成されるIgG C末端ドメインと相同である、天然に存在するまたは合成ポリペプチドであることができる。IgG Fcは、およそ50kDaの分子量を有する。変異体IL-2ポリペプチドは、Fc領域全体、またはその一部であるキメラポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持するより小さな部分を含むことができる。加えて、完全長または断片化Fc領域は、野生型分子のバリアントであることができる。すなわち、これらは、ポリペプチドの機能に影響し得るまたは影響し得ない変異を含有することができる；さらに以下に記載するように、天然活性は、いずれの場合にも必要ではなく、望まれるわけでもない。ある特定の態様では、IL-2ムテイン融合タンパク質（例えば、本明細書に記載されるようなIL-2部分アゴニストまたはアンタゴニスト）は、IgGl、IgG2、IgG3、またはIgG4 Fc領域を含む。例示的なFc領域は、補体結合およびFc受容体結合を阻害する変異を含むことができるか、または溶解性であり得る、すなわち、補体に結合できるかまたは細胞を抗体依存性補体溶解（ADCC）などの別の機序を介して溶解できる。
いくつかの態様では、IL2オルソログは、Fc融合キメラポリペプチド分子の機能性ドメインを含む。Fc融合コンジュゲートは、生物製剤の全身半減期を増加させると示されており、したがって、生物医薬品は、より少ない頻度の投与で済むことができる。Fcは、血管を覆う内皮細胞中の新生児Fc受容体（FcRn）に結合し、結合すると、Fc融合分子は、分解から保護され、循環中に再放出され、分子が循環中により長く維持される。このFc結合は、内因性IgGがその長期血漿半減期を保持する機序であると考えられている。さらに最近のFc融合技術は、生物製剤のわずか一部を抗体のFc領域に連結させることで、従来のFc融合コンジュゲートと比較して生物製剤の薬物動態および薬力学的性質を最適化している。Fc融合物の調製において有用な「Fc領域」は、IgGをパパインで消化することで生成されるIgG C末端ドメインと相同である、天然に存在するまたは合成のポリペプチドであることができる。IgG Fcは、およそ50kDaの分子量を有する。IL2オルソログは、Fc領域全体、またはその一部であるキメラポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持するより小さな部分を提供し得る。加えて、完全長または断片化Fc領域は、野生型分子のバリアントであることができる。典型的な説明では、二量体Fcの各一量体は、非相同ポリペプチドを担持し、非相同ポリペプチドは同じまたは異なる。
いくつかの態様では、IL2オルソログをFc融合物のフォーマットで投与しようとする場合、特に、Fc二量体の各サブユニットにコンジュゲートされたポリペプチド鎖が異なっている状況では、Fc融合物は、「ノブイントゥーホール（knob-into-hole）修飾」を保有するように操作されてもよい。ノブイントゥーホール修飾は、Ridgway, et al. (1996) Protein Engineering 9(7):617-621および1998年3月24日に発表された米国特許第5,731,168号により詳しく記載されている。ノブイントゥーホール修飾は、CH3ドメイン中の2つの免疫グロブリン重鎖間の界面での修飾のことを指し、ここでは、i）第1の重鎖のCH3ドメイン中、アミノ酸残基が、より大きな側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置き換わって、表面からの突起（「ノブ」）を作り、ii）第2の重鎖のCH3ドメイン中、アミノ酸残基が、より小さな側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置き換わって、それにより、第2のCH3ドメイン中の界面内に空洞（「ホール」）を生成し、その中で、第1のCH3ドメインの突き出ている側鎖（「ノブ」）を第2のCH3ドメイン中の空洞が受け入れている。一態様では、「ノブイントゥーホール修飾」は、一方の抗体重鎖にアミノ酸置換T366Wおよび任意でアミノ酸置換S354Cを含み、もう一方の抗体重鎖にアミノ酸置換T366S、L368A、Y407Vおよび任意でY349Cを含む。さらには、Fcドメインは、S354およびY349位で、Fe領域中の2つの抗体重鎖間で安定したジスルフィド架橋をもたらすシステイン残基の導入によって修飾されてもよい（Carter, et al. (2001) Immunol Methods 248, 7-15）。ノブイントゥーホールフォーマットは、「ノブ」修飾を有する第1のFc単量体上の第1のポリペプチド（例えば、IL2オルソログ）および「ホール」修飾を保有する第2のFc単量体上の第2のポリペプチドの発現を容易にするために使用され、ヘテロ二量体ポリペプチドコンジュゲートの発現が容易になる。
Fc領域は、「溶解性」または「非溶解性」であることができるが、典型的には非溶解性である。非溶解性のFc領域は、典型的には、高親和性のFc受容体結合部位およびClq結合部位を欠いている。ネズミ科IgG Fcの高親和性のFc受容体結合部位は、IgG Fcの235位にLeu残基を含む。したがって、Fc受容体結合部位は、Leu 235を変異または欠失させることによって阻害できる。例えば、Leu 235をGluで置換すると、Fc領域が高親和性Fc受容体に結合する能力を阻害する。ネズミ科Clq結合部位は、IgGのGlu 318、Lys 320およびLys 322残基を変異または欠失させることによって機能的に破壊することができる。例えば、Glu 318、Lys 320およびLys 322をAla残基で置換すると、IgG1 Fcが抗体依存性補体溶解を指令できなくなる。これに対して、溶解性のIgG Fc領域は、高親和性のFc受容体結合部位およびClq結合部位を有する。高親和性のFc受容体結合部位は、IgG Fcの235位にLeu残基を含み、Clq結合部位は、IgG1のGlu 318、Lys 320およびLys 322残基を含む。溶解性のIgG Fcは、これらの部位に野生型残基または保存的アミノ酸置換を有する。溶解性のIgG Fcは、細胞を、抗体依存性細胞傷害または補体指向性細胞溶解（CDC）の標的にすることができる。ヒトIgGに対する適切な変異も知られている（例えば、Morrison et al., The Immunologist 2:119-124, 1994；および Brekke et al., The Immunologist 2: 125, 1994を参照のこと）。
ある特定の態様では、本開示のIL2オルソログのアミノ末端またはカルボキシル末端を免疫グロブリンFc領域（例えば、ヒトFc）と融合して、融合コンジュゲート（または融合分子）を形成することができる。Fc融合コンジュゲートは、生物製剤の全身半減期を増加させると示されており、したがって、生物医薬品は、より少ない頻度の投与で済むことができる。Fcは、血管を覆う内皮細胞中の新生児Fc受容体（FcRn）に結合し、結合すると、Fc融合分子は、分解から保護され、循環中に再放出され、分子が循環中により長く維持される。このFc結合は、内因性IgGがその長期血漿半減期を保持する機序であると考えられている。さらに最近のFc融合技術は、生物製剤のわずか一部を抗体のFc領域に連結させることで、従来のFc融合コンジュゲートと比較して生物製剤の薬物動態および薬力学的性質を最適化している。
いくつかの態様では、Fcドメイン単量体は、米国特許第US10259859B2号（その教示全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているように、野生型ヒトIgG1、IgG2、またはIgG4 Fc領域と比べて少なくとも1つの変異を含む。本明細書に開示しているように、Fcドメイン単量体は、以下を含む：
（a）野生型ヒトIgG1と比べて以下のアミノ酸置換の1つ：
T366W、T366S、L368A、Y407V、T366Y、T394W、F405W、Y349T、Y349E、Y349V、L351T、L351H、L351N、L351K、P353S、S354D、D356K、D356R、D356S、E357K、E357R、E357Q、S364A、T366E、L368T、L368Y、L368E、K370E、K370D、K370Q、K392E、K392D、T394N、P395N、P396T、V397T、V397Q、L398T、D399K、D399R、D399N、F405T、F405H、F405R、Y407T、Y407H、Y407I、K409E、K409D、K409T、またはK409I；
あるいは
（b）（i）ヒトIgG1 Fc領域と比べてN297A変異；
（ii）ヒトIgG1 Fc領域と比べてL234A、L235AおよびG237A変異；
（iii）ヒトIgG1 Fc領域と比べてL234A、L235A、G237AおよびN297A変異；
（iv）ヒトIgG2 Fc領域と比べてN297A変異；
（v）ヒトIgG2 Fc領域と比べてA330SおよびP331S変異；
（vi）ヒトIgG2 Fc領域と比べてA330S、P331SおよびN297A変異；
（vii）ヒトIgG4 Fc領域と比べてS228P、E233P、F234V、L235AおよびdelG236変異；または
（viii）ヒトIgG4 Fc領域と比べてS228P、E233P、F234V、L235A、delG236およびN297A変異。
いくつかの態様では、Fcドメイン単量体は、以下を含む：
（a）野生型ヒトIgG1と比べて以下のアミノ酸置換の1つ：
T366W、T366S、L368A、Y407V、T366Y、T394W、F405W、Y349T、Y349E、Y349V、L35 IT、L351H、L351N、L351K、P353S、S354D、D356K、D356R、D356S、E357K、E357R、E357Q、S364A、T366E、L368T、L368Y、L368E、K370E、K370D、K370Q. K392E、K392D、T394N、P395N、P396T、V397T、V397Q、L398T、D399K、D399R、D399N、F405T、F405H、F405R、Y407T、Y407H、Y407I、K409E、K409D、K409T、またはK409I；
および
（b）Fcドメイン単量体は、以下をさらに含む：
（i）ヒトIgG1 Fc領域と比べてN297A変異；
（ii）ヒトIgG1 Fc領域と比べてL234A、L235AおよびG237A変異；
（iii）ヒトIgG1 Fc領域と比べてL234A、L235A、G237AおよびN297A変異；
（iv）ヒトIgG2 Fc領域と比べてN297A変異；
（v）ヒトIgG2 Fc領域と比べてA330SおよびP331S変異；
（vi）ヒトIgG2 Fc領域と比べてA330S、P331SおよびN297A変異；
（vii）ヒトIgG4 Fc領域と比べてS228P、E233P、F234V、L235AおよびdelG236変異；または
（viii）ヒトIgG4 Fc領域と比べてS228P、E233P、F234V、L235A、delG236およびN297A変異。
いくつかの態様では、該ポリペプチドは、ファゴサイトーシスアッセイにおいて野生型ヒトIgG Fc領域を有するポリペプチドと比較してファゴサイトーシスの低減を示す。いくつかの態様では、Fcドメイン単量体は、第2のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドに連結されて、Fcドメイン二量体を形成する。
キメラポリペプチド／融合タンパク質
いくつかの態様では、IL2オルソログは、キメラポリペプチドの機能性ドメインを含み得る。本開示のIL2オルソログ融合タンパク質は、当技術分野において公知の技術による組換えDNA方法論により、IL2オルソログをコードする核酸配列をIL2オルソログのN末端またはC末端のいずれかで融合パートナーをコードする核酸配列とインフレームに含む核酸配列を含む組換えベクターを構築することによって容易に生産されてもよく、該配列は、任意で、リンカーまたはスペーサーポリペプチドをインフレームにコードする核酸配列をさらに含む。
Flagタグ
他の態様では、IL2オルソログは、FLAG配列などの抗原タグとして機能する追加のポリペプチド配列を含むように修飾することができる。FLAG配列は、本明細書に記載されるように、ビオチン化された高特異性の抗FLAG抗体によって認識される（例えば、Blanar et al. (1992) Science 256:1014 and LeClair, et al. (1992) PNAS-USA 89:8145を参照のこと）。いくつかの態様では、IL2オルソログポリペプチドは、C末端c-mycエピトープタグをさらに含む。
Hisタグ
一部の態様では、本発明のIL2オルソログ（そのようなIL2オルソログの融合タンパク質を含む）は、1つまたは複数の遷移金属キレートポリペプチド配列を有する融合タンパク質として発現される。そのような遷移金属キレートドメインの組み込みは、1986年2月11日に発表されたSmithらの米国特許第4,569,794号に記載されているような固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）による精製を容易にする。本発明の実施において有用な遷移金属キレートポリペプチドの例は、前出のSmithらおよび1995年5月10日に発表されたDobeliらの米国特許第5,320,663号に記載されており、その教示全体は参照により組み入れられる。本発明の実施において有用な特定の遷移金属キレートポリペプチドは、6個のヒスチジンペプチド (His)6などの3～6個の連続ヒスチジン残基を含むペプチドであり、当技術分野においてしばしば「Hisタグ」と称される。
標的指向型IL2オルソログ融合タンパク質：
いくつかの態様では、IL2オルソログは、ターゲティングドメインに特異的に結合する細胞表面分子を発現する特定の細胞型または組織への選択的結合を容易にするためのポリペプチド配列（「ターゲティングドメイン」）を有する融合タンパク質として提供され、任意で、IL2オルソログ配列と融合タンパク質のターゲティングドメインの配列との間に1～40（あるいは2～20、あるいは5～20、あるいは10～20）アミノ酸のリンカー分子が組み込まれる。
他の態様では、オルソゴナルIL-2および抗体またはその抗原結合部分を含む、キメラポリペプチドを作製することができる。キメラタンパク質の抗体または抗原結合成分は、ターゲティング部分として役立ち得る。例えば、これを使用して、キメラタンパク質を特定の細胞サブセットまたは標的分子に局在させることができる。サイトカイン-抗体キメラポリペプチドを作製する方法は、例えば、米国特許第6,617,135号に記載されている。
いくつかの態様では、IL2オルソログ融合タンパク質のターゲティングドメインは、腫瘍細胞の細胞表面分子に特異的に結合する。CAR-T細胞のCARのECDがCD-19に特異的に結合する一態様では、IL2オルソログは、CD-19ターゲティング部分を有する融合タンパク質として提供され得る。例えば、CAR-T細胞のCARのECDがCD-19への特異的結合を提供するscFv分子である一態様では、IL2オルソログは、CD-19に特異的に結合する単鎖抗体（例えば、scFvまたはVHH）などの、CD-19ターゲティング部分を有する融合タンパク質として提供される。
いくつかの態様では、融合タンパク質は、IL-2ムテインおよび抗CD19 sdFv FMC63を含む（Nicholson, et al. (1997) Mol Immunol 34: 1157-1165）。同様に、CAR-T細胞のCARのECDがBCMAに特異的に結合するいくつかの態様では、IL2オルソログは、Kalledら（2015年5月9日に発表された米国特許9,034,324）に記載されているような抗BMCA抗体のCDRを含む抗体またはBrogdonら（2019年1月8日に発表された米国特許第10,174,095号）に記載されているようなCDRを含む抗体などの、BCMAターゲティング部分を有する融合タンパク質として提供される。いくつかの態様では、IL2オルソログは、Cheungら（2016年4月19日に発表された米国特許第9,315,585号）に記載されているようなCDR、またはME36.1（Thurin et al., (1987) Cancer Research 47:1229-1233）、14G2a、3F8（Cheung, et al., 1985 Cancer Research 45:2642-2649）、hu14.18、8B6、2E12もしくはic9に由来するCDRを含む抗体などの、GD2ターゲティング部分を有する融合タンパク質として提供される。
ある代替的な態様では、本開示の標的のIL2オルソログをCAR-T細胞療法と組み合わせて投与することで、例えば抗FMC63抗体による、CAR-T細胞の細胞外受容体に基づくCAR-T細胞へのIL2オルソログの標的送達を提供することができ、IL2活性をCAR-T細胞に標的指向させ、消耗したCAR-T細胞をインビボで回復させることができる。したがって、本開示の態様は、CAR-T細胞の特異的な細胞表面分子と相互作用するように設計された抗体またはリガンドへのそのようなIL2オルソログのコンジュゲーションによる、IL2オルソログの標的送達を含む。そのような分子の例としては、抗FMC63-hIL2オルソログが挙げられよう。
他の態様では、キメラポリペプチドは、変異体IL-2ポリペプチド、および変異体IL-2ポリペプチドの発現を増強するかまたは細胞局在を指令するように機能する非相同ポリペプチド、例えばAga2p凝集素サブユニットを含む（例えば、Boder and Wittrup, Nature Biotechnol. 15:553-7, 1997を参照のこと）。
タンパク質形質導入ドメイン融合タンパク質：
いくつかの態様では、IL2オルソログは、「タンパク質形質導入ドメイン」または「PTD」をさらに含む。PTDは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜または小胞膜の横断を容易にする、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物または有機もしくは無機分子である。IL2オルソログへのPTDの組み込みは、分子が膜を横断するのを容易にする。いくつかの態様では、PTDは、IL2オルソログのアミノまたはカルボキシ末端に共有連結される。いくつかの態様では、PTDは、PTD-IL2オルソログ融合タンパク質の一部として、分子のN末端またはC末端のいずれかに組み込まれる。
例示的なタンパク質形質導入ドメインとしては、最小デカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（HIV-1 TATの残基47～57に対応する）；細胞への侵入を指向するのに十分な多数のアルギニン残基を含むポリアルギニン配列（例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、または10～50個のアルギニン）；VP22ドメイン（Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96）；ドロソフィラ・アンテナペディア（Drosophila Antennapedia）タンパク質形質導入ドメイン（Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737）；短縮型ヒトカルシトニンペプチド（Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256）；ポリリジン（Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008）、トランスポータン（Wierzbicki, et al., (2014) Folio Histomchemica et Cytobiologica 52(4): 270-280 および Pooga, et a (1998) FASEB J 12(1)67-77に記載されており、AnaSpecからカタログ番号AS-61256で市販されている）；KALA（Wyman et al., (1997) Biochemistry 36(10) 3008-3017に記載されており、AnaSpecからカタログ番号AS-65459で市販されている）；アンテナペディアペプチド（Pietersz et al., (2001) Vaccine 19:1397に記載されており、AnaSpecからカタログ番号AS-61032で市販されている）；TAT 47-57（AnaSpecからカタログ番号AS-60023で市販されている）が挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの態様では、IL-2コンジュゲートは、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、12時間、18時間、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、14日、または30日を超えるヒト対象血漿半減期を含む。
いくつかの態様では、IL2オルソログをFc融合物のフォーマットで投与しようとする場合、特に、Fc二量体の各サブユニットにコンジュゲートされたポリペプチド鎖が異なっている状況では、Fc融合物は、「ノブイントゥーホール修飾」を保有するように操作されてもよい。ノブイントゥーホール修飾は、Ridgway, et al. (1996) Protein Engineering 9(7):617-621および1998年3月24日に発表された米国特許第5,731,168号により詳しく記載されている。ノブイントゥーホール修飾は、CH3ドメイン中の2つの免疫グロブリン重鎖間の界面での修飾のことを指し、ここでは、i）第1の重鎖のCH3ドメイン中、アミノ酸残基が、より大きな側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置き換わって、表面からの突起（「ノブ」）を作り、ii）第2の重鎖のCH3ドメイン中、アミノ酸残基が、より小さな側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置き換わって、それにより、第2のCH3ドメイン中の界面内に空洞（「ホール」）を生成し、その中で、第1のCH3ドメインの突き出ている側鎖（「ノブ」）を第2のCH3ドメイン中の空洞が受け入れている。一態様では、「ノブイントゥーホール修飾」は、一方の抗体重鎖にアミノ酸置換T366Wおよび任意でアミノ酸置換S354Cを含み、もう一方の抗体重鎖にアミノ酸置換T366S、L368A、Y407Vおよび任意でY349Cを含む。さらには、Fcドメインは、S354およびY349位で、Fe領域中の2つの抗体重鎖間で安定したジスルフィド架橋をもたらすシステイン残基の導入によって修飾されてもよい（Carter, et al. (2001) Immunol Methods 248, 7-15）。ノブイントゥーホールフォーマットは、「ノブ」修飾を有する第1のFc単量体上の第1のポリペプチド（例えば、IL2オルソログ）および「ホール」修飾を保有する第2のFc単量体上の第2のポリペプチドの発現を容易にするために使用され、ヘテロ二量体ポリペプチドコンジュゲートの発現が容易になる。
IL2オルソログの合成
本開示のIL2オルソログは、組換えまたは固相合成を含むポリペプチドの構築のための従来法によって生産され得る。
固相化学合成：
組換え分子生物学技術によって変化させた核酸分子の発現を介して変異体ポリペプチドを作製することに加えて、主題のIL2オルソログは、化学的に合成することができる。化学的に合成されるポリペプチドは、当業者によって日常的に作製される。化学合成は、記載される性質を示すIL2オルソログをコードするタンパク質配列の化学的手段によるペプチドの直接合成を含む。
いくつかの態様では、本開示のIL2オルソログは、化学合成によって調製され得る。IL2オルソログの化学合成は、液相または固相を介して進行し得る。固相ペプチド合成（SPPS）は、非天然アミノ酸および／またはペプチド／タンパク質骨格修飾の組み込みを可能にする。本開示のIL2オルソログを合成するために様々な形態のSPPSが利用可能であり、当技術分野において公知である（例えば、Ganesan A. (2006) Mini Rev. Med. Chem. 6:3-10；および Camarero J.A. et al., (2005) Protein Pept Lett. 12:723-8）。化学合成の過程で、アルファ機能および任意の反応性側鎖は、アミド結合を連結する条件下で安定であるが形成されたペプチド鎖を害することなく容易に開裂できる酸不安定基または塩基不安定基で保護され得る。
固相合成では、N末端またはC末端のいずれかのアミノ酸は、好適な支持材料にカップリングされ得る。好適な支持材料は、合成プロセスの段階的な縮合および開裂反応の試薬および反応条件に対して不活性であり、使用される反応媒体に溶解されないものである。市販の支持材料の例としては、反応性基および／またはポリエチレングリコールで修飾されているスチレン／ジビニルベンゼン共重合体；クロロメチル化スチレン／ジビニルベンゼン共重合体；ヒドロキシメチル化またはアミノメチル化スチレン／ジビニルベンゼン共重合体；などが挙げられる。保護されたアミノ酸の連続カップリングは、ペプチド合成における従来法に従い、典型的には自動ペプチド合成装置で行うことができる。
固相合成の最後に、側鎖保護基の開裂と同時に、ペプチドが支持材料から開裂される。得られたペプチドは、疎水性吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）および逆相HPLCを非限定的に含む様々なクロマトグラフ法によって精製することができる。
組換え産生：
あるいは、本開示のIL2オルソログは、組換えDNA技術によって産生される。ポリペプチドの組換え産生の典型的な実施では、所望のポリペプチドをコードする核酸配列が、発現が達成される宿主細胞に適した発現ベクターに組み込まれ、核酸配列は、ベクターによってコードされ標的宿主細胞において機能的な1つまたは複数の発現制御配列に機能的に連結されている。ポリペプチドに分泌リーダー配列（シグナルペプチド）が組み込まれていれば、宿主細胞の破壊を通じてまたは細胞培地から組換えタンパク質を回収できる。組換えタンパク質は、組み込みを含めたさらなる使用のために精製および濃縮され得る。IL2ポリペプチドの組換え産生のためのプロセスは、当技術分野において公知であり、1986年8月5日に発表されたFernandesおよびTaforoの米国特許第4,604,377号に記載されており、IL2オルソログは、1985年5月21日に発表されたMarkらの米国特許第4,512,584号、1983年8月30日に発表されたGillisの米国特許第4,401,756号に記載されており、それらの教示全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
IL2オルソログをコードする核酸配列の構築
いくつかの態様では、IL2オルソログは、IL2オルソログ（またはIL2オルソログを含む融合タンパク質）をコードする核酸配列を使用した組換え法によって産生される。所望のIL2オルソログをコードする核酸配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用した化学的手段によって合成することができる。
核酸分子は、ポリペプチドをコードする配列に限定されない；コード配列（例えば、IL2のコード配列）から上流または下流にある非コード配列の一部または全部を含めることもできる。分子生物学の分野における通常の技術を有する者は、核酸分子を単離するための日常的な手順を熟知している。これらは、例えば、ゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼで処理することによって、またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の遂行によって作製することができる。核酸分子がリボ核酸（RNA）である場合、分子は、例えば、インビトロ転写によって生産することができる。
IL2オルソログ（およびその融合物）をコードする核酸分子は、天然に存在する配列、または天然に存在するものとは異なるが遺伝子コードの縮重により同じポリペプチドをコードする配列を含有し得る。これらの核酸分子は、RNAまたはDNA（例えば、ゲノムDNA、cDNAまたは合成DNA、例えば、ホスホロアミダイト塩基合成によって生産されるもの）、あるいは、これらの種類の核酸内のヌクレオチドの組み合わせまたは修飾から構成され得る。加えて、核酸分子は、二本鎖または一本鎖（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか）であることができる。
IL2オルソログをコードする核酸配列は、特注の核酸配列を提供する様々な供給元から入手してもよい。本開示のIL2オルソログを生産するためのIL2ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、当技術分野において周知である遺伝子コードに基づき、コード配列に適切なヌクレオチド変化を導入することによって調製される。そのようなバリアントは、記載したような、残基の挿入、置換および／または指定の欠失を表す。最終構築物が本明細書に定義したような所望の生物活性を保有するという条件で、挿入、置換および／または指定の欠失が任意に組み合わされて、最終構築物に到達する。
IL2オルソログをコードするDNA配列を構築し、適切に形質転換された宿主においてそれらの配列を発現させるための方法としては、PCR支援変異誘発技術を使用することが挙げられるが、それらに限定されない。IL2ポリペプチドに対するアミノ酸残基の欠失または付加からなる変異を標準的な組換え技術で作製することもできる。欠失または付加の場合では、IL2をコードする核酸分子は、任意で適切な制限エンドヌクレアーゼで消化される。得られた断片は、直接発現できるか、または、例えば、第2の断片へのライゲーションによってさらに操作することができる。ライゲーションは、核酸分子の2つの末端が互いに重なり合う相補的ヌクレオチドを含有する場合に容易になり得るが、平滑末端断片もライゲーションすることができる。PCRで作製された核酸も、様々な変異体配列を作製するために使用することができる。
本開示のIL2オルソログは、直接的な組換え産生のみならず、非相同ポリペプチド、例えば、シグナル配列または成熟IL2オルソログのN末端もしくはC末端に特異的な切断部位を有する他のポリペプチドを有する融合ポリペプチドとしても組換え産生され得る。一般に、シグナル配列は、ベクターの一成分であり得るか、またはベクターに挿入されるコード配列の一部であり得る。選択される非相同シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。いくつかの態様では、シグナル配列は、IL2オルソログに天然に関連するシグナル配列（すなわち、ヒトIL2シグナル配列）である。シグナル配列の組み入れは、IL2オルソログが作られる組換え細胞からIL2オルソログを分泌することが望ましいかどうかに依存する。選択された細胞が原核生物であるならば、DNA配列がシグナル配列をコードしないことが一般に好ましい。選択された細胞が真核生物であるならば、シグナル配列がコードされることが一般に好ましく、野生型IL2シグナル配列が使用されることが最も好ましい。あるいは、異種哺乳動物シグナル配列、例えば、同種または関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルが好適であり得る。組換え宿主細胞がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母細胞である場合、2007年4月3日に発表されたSinghの米国特許第7,198,919 B1号に記載されているように、培養培地へのIL2オルソログの細胞外分泌を達成するためにアルファ接合因子分泌シグナル配列が用いられ得る。
発現させようとするIL2オルソログが、キメラ（例えば、IL2オルソログおよび非相同ポリペプチド配列を含む融合タンパク質）として発現される場合、キメラタンパク質は、IL2オルソログの全部または一部をコードする第1の配列および非相同ポリペプチドの全部または一部をコードする第2の配列を含むハイブリッド核酸分子によってコードされ得る。例えば、本明細書に記載される主題のIL2オルソログは、細菌によって発現されたタンパク質の精製を容易にするためにヘキサ-ヒスチジンタグに融合されても、または真核細胞において発現されたタンパク質の精製を容易にするためにヘマグルチニンタグに融合されてもよい。第1および第2によって、融合タンパク質のエレメントの配向への限定として理解されるべきではなく、非相同ポリペプチドは、IL2オルソログのN末端および／またはC末端のいずれにも連結させることができる。例えば、N末端をターゲティングドメインに連結させてもよく、C末端をヘキサ-ヒスチジンタグ精製ハンドルに連結させてもよい。
発現させようとするポリペプチド（または融合／キメラ）の完全アミノ酸配列を使用して、逆翻訳された遺伝子を構築することができる。IL2オルソログをコードするヌクレオチド配列を含有するDNAオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成して、次に、これらをライゲーションすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的アセンブリのための5'または3'オーバーハングを含有する。
コドン最適化：
いくつかの態様では、組換えタンパク質（IL2オルソログ、オルソゴナルCD122、またはCAR）をコードする核酸配列は、特定の宿主細胞型における発現を容易にするために「コドン最適化」され得る。哺乳動物、酵母および細菌宿主細胞を含む広範な発現系におけるコドン最適化のための技術は、当技術分野において周知であり、多種多様な宿主細胞型で発現させるためのコドン最適化配列を提供するオンラインツールがある。例えば、Hawash, et al., (2017) 9:46-53 および Mauro and Chappell in Recombinant Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols（David Hackerによって編集がなされた）（Human Press New York）を参照されたい。加えて、コドン最適化核酸配列の調製を支援するために自由に入手可能な多種多様なウェブベースのオンラインソフトウエアパッケージがある。
発現ベクター：
アセンブルしたら（合成、部位特異的変異誘発または別の方法によって）、IL2オルソログをコードする核酸配列は、発現ベクターに挿入される。様々な宿主細胞において使用するための多種多様な発現ベクターが利用可能であり、典型的には、発現のための宿主細胞に基づいて選択される。発現ベクターは、典型的には、以下の1つまたは複数を含むが、それらに限定されない：複製起点、1つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。ベクターとしては、ウイルスベクター、プラスミドベクター、組込み型ベクターなどが挙げられる。プラスミドは、非ウイルスベクターの例である。
組換えポリペプチドの効率的な発現を容易にするために、発現させようとするポリペプチド配列をコードする核酸配列は、選択された発現宿主において機能的である転写および翻訳の調節制御配列に機能的に連結される。
選択マーカー
発現ベクターは通常、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有する。この遺伝子は、選択培養培地中で成長させる形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換していない宿主細胞は、培養培地中で生存しないだろう。典型的な選択遺伝子は、（a）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（b）栄養要求性欠陥を補う、または（c）複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
調節制御配列：
本開示のIL2オルソログのための発現ベクターは、宿主生物によって認識され、IL2オルソログをコードする核酸配列に機能的に連結された調節配列を含有する。「調節制御配列」、「調節配列」または「発現制御配列」という用語は、本明細書において互換的に使用され、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）のことを指す。例えば、Goeddel (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego CA USA)を参照されたい。調節配列は、多くの種類の宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの、およびある特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。当業者には、発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得ることが認識されよう。発現制御配列を選択する際に、当業者によって理解される多種多様な要因が考慮されるべきである。これらには、例えば、配列の相対強度、その制御可能性、および主題のIL2オルソログをコードする実際のDNA配列との適合性、特に潜在的な二次構造に関するものが挙げられる。
プロモーター
いくつかの態様では、調節配列は、プロモーターであり、これは、例えば、発現が試みられる細胞型に基づいて選択される。プロモーターは、これらが機能的に連結された特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する、構造遺伝子の開始コドンの上流（5'）に位置する非翻訳配列（一般に、約100～1000bp以内）である。そのようなプロモーターは、典型的には、2つのクラス、すなわち誘導性プロモーターと構成的プロモーターに分類される。誘導性プロモーターは、それらの制御下にあるDNAから、培養条件における何らかの変化、例えば、栄養素の有無または温度の変化に応答して増加したレベルの転写を開始するプロモーターである。多種多様な有望な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。
T7プロモーターを細菌において使用することができ、ポリヘドリンプロモーターを昆虫細胞において使用することができ、サイトメガロウイルスまたはメタロチオネインプロモーターを哺乳動物細胞において使用することができる。また、高等真核生物の場合、組織特異的および細胞型特異的なプロモーターが広く利用可能である。これらのプロモーターは、体内の所与の組織または細胞型で核酸分子の発現を指令する能力からそのように呼ばれる。当業者は、多数のプロモーター、および核酸の発現を指令するために使用できる他の調節エレメントを十分把握している。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（ヒトアデノウイルス血清型5など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス（ネズミ幹細胞ウイルスなど）、B型肝炎ウイルスなどのウイルス、最も好ましくはシミアンウイルス40（SV40）のゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター、PGK（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、または免疫グロブリンプロモーターから、ヒートショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御され得るが、但し、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合可能であることを条件とする。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウイルス複製起点もまた含有するSV40制限断片として簡便に得られる。
エンハンサー
高等真核生物による転写は、しばしば、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加する。エンハンサーは、プロモーターに対して転写を増加させるように作用する、通常約10～300bpのDNAのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、相対的に配向および位置に非依存性であり、イントロン内、ならびにコード配列それ自体内で、転写ユニットの5'および3'に見いだされている。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ-フェトタンパク質、およびインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、コード配列の5'または3'位で発現ベクターに挿入され得るが、好ましくは、プロモーターから5'位に位置する。真核生物宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびmRNAの安定化に必要な配列も含有するだろう。そのような配列は、一般的に、真核生物またはウイルスのDNAまたはcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から利用可能である。上記成分の1つまたは複数を含有する好適なベクターの構築は、標準的な技術を用いる。
挿入された核酸分子の転写を容易にする配列に加えて、ベクターは、複製起点、および選択マーカーをコードする他の遺伝子を含有することができる。例えば、ネオマイシン耐性（neoR）遺伝子は、それが発現される細胞に対してG418耐性を付与し、したがって、トランスフェクトされた細胞の表現型選択を可能にする。マーカーまたはレポーター遺伝子の追加の例としては、ベータ-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、アデノシンデアミナーゼ（ADA）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、ハイグロマイシン-B-ホスホトランスフェラーゼ（HPH）、チミジンキナーゼ（TK）、lacZ（ベータ-ガラクトシダーゼをコードする）、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（XGPRT）が挙げられる。当業者は、所与の調節エレメントまたは選択マーカーが特定の実験状況における使用に適するかどうかを容易に判定することができる。
発現ベクターの適切なアセンブルは、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピング、および好適な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確認することができる。
IL2オルソログの産生のための宿主細胞
本開示はさらに、IL2オルソログをコードする核酸分子を含有かつ発現する原核細胞または真核細胞を提供する。本開示の細胞は、トランスフェクトされた細胞、すなわち、核酸分子、例えば変異体IL2ポリペプチドをコードする核酸分子が組換えDNA技術によって導入された細胞である。そのような細胞の子孫も本開示の範囲内と見なされる。
宿主細胞は、典型的には、選択された発現ベクターとのそれらの適合性、本発明のDNA配列によってコードされる産物の毒性、それらの分泌特性、ポリペプチドを正確に折り畳むそれらの能力、それらの発酵または培養要件、およびDNA配列によってコードされる産物の精製の容易さに従って選択される。本明細書におけるベクターへのDNAのクローニングまたはその中での発現のための好適な宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物の細胞である。
いくつかの態様では、組換えIL2オルソログまたはその生物学的に活性なバリアントはまた、酵母またはヒト細胞などの真核細胞において作製することができる。好適な真核生物宿主細胞は、昆虫細胞（培養昆虫細胞（例えば、Sf9細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターの例としては、pAc系列（Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）およびpVL系列（Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39）が挙げられる）；酵母細胞（酵母のS. セレビシエにおける発現のためのベクターの例としては、pYepSecl（Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234）、pMFa（Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943）、pJRY88（Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123）、pYES2（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.）およびpPicZ（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.）が挙げられる）；または哺乳動物細胞（哺乳動物発現ベクターとしては、pCDM8（Seed (1987) Nature 329:840）およびpMT2PC（Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187:195）が挙げられる）を含む。
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、マウスL細胞（L-M［TK-］、ATCC#CRL-2648）、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7、ATCC CRL 1651）；ヒト胎児腎臓株（HEK293細胞、または懸濁培養において成長させるためにサブクローニングされたHEK293細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（BHK、ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-DHFR（CHO）；マウスセルトリ細胞（TM4）；サル腎臓細胞（CV1 ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76、ATCC CRL-1 587）；ヒト子宮頚がん細胞（HELA、ATCC CCL 2）；イヌ腎臓細胞（MDCK、ATCC CCL 34）；バッファローラット肝臓細胞（BRL 3A、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138、ATCC CCL 75）；ヒト肝臓細胞（Hep G2、HB 8065）；マウス乳房腫瘍（MMT 060562、ATCC CCL51）；TRI細胞；MRC 5細胞；FS4細胞；およびヒト肝細胞がん株（Hep G2）である。哺乳動物細胞では、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40に由来する。
IL2オルソログは、細菌の大腸菌などの原核生物宿主、または昆虫細胞（例えば、Sf21細胞）などの真核生物宿主、または哺乳動物細胞（例えば、COS細胞、NIH 3T3細胞、またはHeLa細胞）において産生させることができる。これらの細胞は、American Type Culture Collection（Manassas, Va.）を含む多くの供給源から入手可能である。発現系を選択する際、成分が互いに適合可能であるかが唯一問題となる。熟練または通常の技能を有する者であれば、そのような決定を行うことができる。さらには、発現系を選択する際に指針が必要であれば、当業者は、Ausubelら（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1993）およびPouwelsら（Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 Suppl. 1987）に助言を求めることもできる。
いくつかの態様では、得られるIL2オルソログは、ムテインを産生するために使用される宿主生物に依存してグリコシル化されるかまたはグリコシル化されない。細菌が宿主として選択されるならば、産生されるIL2オルソログは、グリコシル化されない。他方で、真核細胞は、IL2オルソログをグリコシル化し得るが、おそらく天然IL2がグリコシル化されるのと同じ方法ではない。
原核生物と真核生物の両細胞のための他の追加の発現系については、Chapters 16 and 17 of Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)を参照されたい。Goeddel (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, Calif.)を参照されたい。
トランスフェクション：
発現構築物を、宿主細胞に導入して、それにより、本明細書に開示されるIL2オルソログを産生するかまたはその生物学的に活性なムテインを産生することができる。ベクターDNAは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核細胞または真核細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための好適な方法は、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual（2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.）および他の標準的な分子生物学実験マニュアルにおいて見いだすことができる。
標的細胞のトランスフェクションを容易にするために、標的細胞は、非ウイルスベクターの取り込みを容易にする条件下で、非ウイルスベクターに直接曝露され得る。哺乳動物細胞による外来核酸の取り込みを容易にする条件の例は、当技術分野において周知であり、これらには、化学的手段（例えば、Lipofectamine（登録商標）、Thermo-Fisher Scientific）、高塩濃度および磁場（エレクトロポレーション）が挙げられるが、それらに限定されない。
細胞培養：
細胞は、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するためまたは所望の配列をコードする遺伝子を増幅させるために適宜改変された従来の栄養素培地中で培養され得る。哺乳動物宿主細胞は、多種多様な培地中で培養され得る。Ham's F10（Sigma）、最小必須培地（（MEM）、Sigma）、RPMI 1640（Sigma）およびダルベッコ改変イーグル培地（（DMEM）、Sigma）などの市販の培地が宿主細胞を培養するのに適する。これらの培地のいずれかには、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝剤（HEPESなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質、微量元素、およびグルコースまたは等価なエネルギー源が補充され得る。任意の他の必要なサプリメントも、当業者に公知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、pHなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞と共に過去に使用されているものであり、当業者に明らかであろう。
組換えタンパク質の回収：組換え産生されたIL2オルソログポリペプチドは、分泌リーダー配列が用いられている場合、分泌ポリペプチドとして培養培地から回収することができる。あるいは、IL2オルソログポリペプチドを宿主細胞溶解物から回収することもできる。精製中のタンパク質による分解を阻害するために、細胞溶解物からの回収段階でフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）などのプロテアーゼ阻害剤を用いてもよく、付随的な混入物の成長を抑制するために抗生物質を含めてもよい。
精製：様々な精製工程が当技術分野において公知であり、例えば、アフィニティークロマトグラフィーが利用できる。アフィニティークロマトグラフィーは、通常生体高分子中に存在する高度に特異的な結合部位を利用して、分子を特定のリガンドに結合する能力で分離する。リガンドがタンパク質試料に明白に提示される様式で、共有結合によって、リガンドを不溶性の多孔質支持媒体に付着させ、それにより、ある分子種の天然の特異的結合を使用して、混合物から2番目の種を分離および精製する。一般的に、抗体がアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用される。サイズ選択工程を使用してもよく、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィーまたは分子篩クロマトグラフィーとしても知られている）は、タンパク質をそれらのサイズに従って分離するために使用される。ゲル濾過では、タンパク質溶液を、半透過性の多孔質樹脂が充填されたカラムに通す。半透過性の樹脂は、カラムで分離できるタンパク質のサイズを決定する細孔サイズ範囲を有する。
形質転換宿主によって産生されたIL2オルソログは、任意の好適な方法に従って精製することができる。IL2を精製するために様々な方法が公知である。例えば、Current Protocols in Protein Science, Vol 2. Eds: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploehg, David W. Speicher, Paul T. Wingfield, Unit 6.5（Copyright 1997, John Wiley and Sons, Inc.）を参照されたい。IL2オルソログは、大腸菌において生成された封入体から、または所与のムテインを産生する哺乳動物もしくは酵母のいずれかの培養物の条件培地から、陽イオン交換、ゲル濾過、および／または逆相液体クロマトグラフィーを使用して単離することができる。
組換えポリペプチドの実質的に精製された形態は、発現系から日常的な生化学的手順を使用して精製することができ、これを、例えば、本明細書に記載されるように治療剤として使用することができる。
IL2オルソログの生物活性は、当技術分野において公知である任意の好適な方法によってアッセイすることができ、実質的に精製された形態として、または分泌リーダー配列が発現に用いられている場合には細胞溶解物もしくは細胞培地の一部として評価され得る。そのような活性アッセイとしては、CTLL-2増殖、ホスホ-STAT5（pSTAT5）活性のT細胞における誘導、PHA-芽細胞増殖およびNK細胞増殖が挙げられる。
IL2オルソログの投与の経路：
本開示の治療的方法の態様では、処置を必要とする対象へのIL2オルソログ（および／またはIL2オルソログをコードする核酸）を含む医薬製剤の投与を伴う。対象への投与は、ボーラスとしてまたは一定期間にわたる連続注入による静脈内によって達成され得る。代替の投与経路としては、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、脊髄内、経口、局所、または吸入経路が挙げられる。IL2オルソログはまた、局所ならびに全身治療効果をもたらすために、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、結節内もしくは病変周囲経路によってまたはリンパに適切に投与される。
いくつかの態様では、主題のIL2オルソログ（および／またはIL2オルソログをコードする核酸）は、薬学的組成物を含む組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、ポリペプチドまたは核酸分子と薬学的に許容される担体とを含む。薬学的組成物は、その意図する投与経路と適合可能となるように製剤化され、IL2オルソログが治療または予防を必要とする対象に投与される治療用途に適合可能である。
IL2オルソログの製剤
本開示のIL2オルソログ（またはそれをコードする核酸）は、対象に薬学的に許容される投与剤形で投与され得る。好ましい製剤は、意図する投与様式および治療用途に左右される。
非経口製剤：いくつかの態様では、本開示の方法は、IL2オルソログの非経口投与を伴う。非経口の投与経路の例としては、例えば、静脈内、皮内、皮下、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与が挙げられる。非経口製剤は、非経口用途に使用される溶液または懸濁液を含み、ビヒクル、担体および緩衝液を含むことができる。非経口投与用の医薬製剤は、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌の注射用溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末を含む。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは多用量バイアルに封入することができる。一態様では、製剤は、非経口投与のための充填済みシリンジ中に提供される。
経口製剤：経口組成物は、使用される場合、一般に不活性希釈剤または食用担体を含む。経口による治療的投与のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物はまた、口腔洗浄薬として使用するために流体担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、次の成分のいずれか、または似た性質の化合物を含有することができる：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Primogel（商標）またはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはSterotes（商標）などの滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；あるいはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料などの香味剤。
吸入製剤：吸入による投与の場合では、主題のIL2オルソログ、またはそれらをコードする核酸は、好適な噴霧剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する圧縮容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達される。そのような方法は、米国特許第6,468,798号に記載されているものを含む。
粘膜および経皮：主題のIL2オルソログまたは核酸の全身投与は、経粘膜または経皮手段によるものであることもできる。経粘膜または経皮投与のために、バリアを透過させるのに適切な浸透剤が製剤において使用される。そのような浸透剤は、一般に当技術分野において公知であり、例えば、経粘膜投与については、洗浄剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは直腸送達用の坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いる）もしくは停留浣腸の使用を通じて達成することができる。経皮投与については、活性化合物は、一般に当技術分野において公知であるように、軟膏、膏薬、ゲルまたはクリーム中に製剤化され、エタノールまたはラノリンなどの透過促進剤を組み込んでもよい。
持続放出およびデポー製剤：本開示の方法のいくつかの態様では、IL2オルソログは、処置を必要とする対象に、IL2オルソログ剤の持続放出を提供する製剤で投与される。注射用組成物の持続放出製剤の例は、吸収を遅らせる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。一態様では、主題のIL2オルソログまたは核酸は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤など、変異体IL-2ポリペプチドが身体から急速排除されるのを防ぐ担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤は、標準的な技術を使用して調製することができる。それらの材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手することもできる。薬学的に許容される担体としてリポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する、感染細胞を標的とするリポソームを含む）を使用することもできる。これらは、当業者に公知の方法に従って、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されているように調製することができる。
一態様では、IL2オルソログ製剤は、1986年8月5日に発表されたFernandes and Taforoの米国特許第4,604,377号の教示に従って提供され、その教示は、参照により本明細書に組み入れられる。Yasuiらの米国特許第4,645,830号。
オルソログをコードする核酸の投与：
IL2オルソログを含むIL2オルソログタンパク質医薬製剤の対象への投与に代わる手段として、IL2オルソログは、対象に、IL2オルソログをコードする核酸構築物の薬学的に許容される製剤の対象への投与によって提供され、選択的なIL2オルソログへの対象の連続曝露が達成され得る。IL2オルソログをコードする組換えベクターの投与は、IL2オルソログの対象への延長送達、およびそのようなIL2オルソログと会合する同族オルソゴナル受容体を発現するように操作された対応する細胞の長期活性化を提供する。本開示の方法のいくつかの態様では、IL2オルソログをコードする核酸は、McCaffreyら（Nature 418:6893, 2002）、Xiaら（Nature Biotechnol. 20: 1006-1010, 2002）、またはPutnam（Am. J. Health Syst. Pharm. 53:151-160, 1996, erratum at Am. J. Health Syst. Pharm. 53:325, 1996）に記載されている方法を非限定的に含む、当技術分野において公知である方法を使用したトランスフェクションまたは感染によって対象に投与される。
オルソログをコードする非ウイルスベクター：一態様では、IL2オルソログは、非ウイルス送達系で提供され得る非ウイルスベクター中にIL2オルソログを入れた核酸発現構築物の形態で対象に投与され得る。非ウイルス送達系は、典型的には、核酸カーゴでの標的細胞の形質導入を容易にするための複合体であり、核酸は、陽イオン性脂質（DOTAP、DOTMA）、界面活性剤、生物製剤（ゼラチン、キトサン）、金属（金、磁鉄）および合成高分子（PLG、PEI、PAMAM）などの作用物質と複合体化されている。脂質ベクター系（Lee et al. (1997) Critical Reviews of Therapeutic Drug Carrier Systems 14:173-206）；ポリマー被覆リポソーム（1993年5月25日に発表されたMarinらの米国特許第5,213,804号；1991年5月7日に発表されたWoodleらの米国特許第5,013,556号）；陽イオン性リポソーム（1994年2月1日に発表されたEpandらの米国特許第5,283,185号；1996年11月26日に発表されたJessee, J. A.の米国特許第5,578,475号；1994年1月18日に発表されたRoseらの米国特許第5,279,833号；1994年8月2日に発表されたGebeyehuらの米国特許第5,334,761号）を含め、非ウイルス送達系の多数の態様が当技術分野において周知である。一態様では、IL2受容体をコードする非ウイルスベクター系中の核酸配列は、調節可能プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的もしくは腫瘍特異的プロモーター、または時間的に調節されたプロモーターの制御下にある。
オルソログをコードするウイルスベクター：別の態様では、IL2オルソログは、IL2オルソログをコードするウイルスベクター中の核酸発現構築物の形態で対象に投与され得る。「ウイルスベクター」および「ウイルス」という用語は、本明細書において互換的に使用され、タンパク質合成またはエネルギー生成機構を有しない任意の偏性細胞内寄生体のことを指す。ウイルスゲノムは、RNAまたはDNAであり得、脂質膜の被覆タンパク質構造に含有されている。ウイルスおよびウイルスベクターという用語は、本明細書において互換的に使用される。本発明の実施において有用なウイルスは、好ましくはバキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科またはアデノウイルス科から選択される、組換え改変されたエンベロープを持ったまたはエンベロープを持たないDNAおよびRNAウイルスを含む。ウイルスは、外因性導入遺伝子（例えば、IL2オルソログをコードする核酸配列）の発現を含むように組換えDNA技術によって改変され、複製欠損、条件付き複製または複製可能となるように操作してもよい。ウイルス骨格がウイルスベクターのパッケージングに必要な配列のみを含有し、任意で導入遺伝子発現カセットを含み得る、最小ベクター系を用いてもよい。「複製欠損」という用語は、野生型哺乳動物細胞中での複製が高度に弱毒化されたベクターのことを指す。そのようなベクターを大量に産生させるために、一般に産生細胞株がヘルパーウイルスの共トランスフェクションによって作られるか、または失われた機能を補完するようにゲノム改変される。「複製可能なウイルスベクター」という用語は、感染、DNA複製、パッケージングおよび感染細胞の溶解が可能であるウイルスベクターのことを指す。「条件付き複製ウイルスベクター」という用語は、本明細書において、特定の細胞型において選択的な発現を達成するように設計された複製可能なベクターのことを指すために使用される。そのような条件付き複製は、組織特異的、腫瘍特異的もしくは細胞型特異的なまたは他の選択的に誘導される調節制御配列を初期遺伝子（例えば、アデノウイルスベクターのE1遺伝子）に機能的に連結することによって達成され得る。対象への組換えウイルスまたは非ウイルスベクターの感染は、対象におけるIL2オルソログの長期発現を提供し、CD122オルソゴナル受容体を発現する操作されたT細胞の継続的で選択的な維持を提供することができる。一態様では、IL2受容体をコードするウイルスベクター系中の核酸配列は、調節可能プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的もしくは腫瘍特異的プロモーター、または時間的に調節されたプロモーターの制御下にある。
オルソゴナル受容体
いくつかの態様では、オルソゴナル受容体は、オルソゴナルECDへのオルソゴナルリガンドの結合が第2の受容体タンパク質に特徴的な細胞内シグナル伝達をもたらすように、細胞外ドメインが、第2の受容体タンパク質の膜貫通（TM）ドメインおよび／または細胞内ドメイン（ICD）に機能的に連結された（例えば、融合タンパク質として）第1の受容体タンパク質のオルソゴナル細胞外ドメインを含む、キメラ受容体である。オルソゴナルhCD122は、オルソゴナルhCD122への天然サイトカイン（すなわち、wt-hIL2）の結合を崩壊させるために野生型hCD122への天然サイトカイン（すなわち、野生型hIL2）の結合に関与する位置に1つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、欠失または置換）を含む、hCD122のバリアントである。hCD122へのhIL2の結合に関与するアミノ酸としては、アミノ酸R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136、および／またはQ214が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122は、アミノ酸R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136、および／またはQ214の1つまたは複数の置換または欠失を含む。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122は、アミノ酸Q70、T73、H133、および／またはY134の1つまたは複数の置換または欠失を含む。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122は、アミノ酸H133および／またはY134の1つまたは複数の置換または欠失を含む。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122は、アミノ酸H133および／またはY134の1つまたは複数の置換または欠失を含む。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122は、アミノ酸H133およびY134の1つまたは複数の置換または欠失を含む。
受容体ポリペプチドは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、前記ポリペプチドの細胞外ドメインは、以下の構造のアミノ酸配列を含む：
Figure 2023511274000047
式中：
AA70＝GlnまたはTyr；
AA73＝Thr、AspまたはTyr；
AA133＝His、Asp、GluまたはLys；および／または
AA134＝Tyr、Phe、GluまたはArg。
hCD122受容体のECDは、以下の表3に概説するようないくつかの二次構造特徴を含む。
（表３）hCD122 ECDの二次構造特徴
Figure 2023511274000048
hCD122のECD配列中に修飾を作製する際に、いくつかの態様では、タンパク質の二次構造を維持するために二次構造特徴の形成に関与するアミノ酸が保持される。一般に、ジスルフィド結合の維持が望ましい。いくつかの態様では、グリコシル化部位の欠失が望ましい場合がある。したがって、1つまたは複数のこれらのN連結されたグリコシル化部位を排除するために、成熟hCD122のECDの3、17、42および／または123の1つまたは複数の位置にアスパラギンの1つまたは複数の保存的アミノ酸置換（例えば、アラニンまたはイソロイシンとの）が組み込まれ得る。
一態様では、オルソゴナルCD122は、天然に存在する形態の成熟ヒトCD122（SEQ ID NO：1）に従って番号付けされた133および134位にアミノ酸修飾を含むヒトCD122である。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122は、アミノ酸置換H133DおよびY134を含むhCD122分子である。一態様では、オルソゴナル受容体は、ECDのアミノ酸配列が以下の配列の214アミノ酸ポリペプチドである、修飾されたヒトCD122である：
Figure 2023511274000049
一態様では、オルソゴナル受容体は、置換H133DおよびY134Fを有するhCD122のECDのアミノ酸配列（シグナルペプチドより小さい）ならびに以下のアミノ酸配列を有する野生型hCD122分子の膜貫通（TM）および細胞内ドメイン（ICD）を有する、修飾されたヒトCD122である：
Figure 2023511274000050
「hoCD122」または「hoIL2Rb」は、互換的に使用され、hCD122ポリペプチドのECD中のヒスチジン133（H133）およびチロシン134（Y134）位にアミノ酸置換を含む、hCD122のバリアントのことを指す。
一態様では、オルソゴナル受容体は、オルソゴナルhCD122のECDへの天然サイトカイン（すなわち、wt-hIL2）の結合を崩壊させるために野生型hCD122のECDへの天然サイトカイン（すなわち、野生型hIL2）の結合に関与する位置に1つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、欠失または置換）を含む、天然に存在する成熟CD122 ECDのバリアントを含む。hCD122 ECDへのhIL2の結合に関与するアミノ酸としては、アミノ酸R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136、および／またはQ214が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの態様では、オルソゴナル受容体は、アミノ酸R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136、および／またはQ214の1つまたは複数の置換または欠失を含む、CD122 ECDを含む。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122 ECD（またはhoCD122受容体）は、アミノ酸Q70、T73、H133、および／またはY134の1つまたは複数の置換または欠失を含む。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122は、アミノ酸H133および／またはY134の1つまたは複数の置換または欠失を含む。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122は、アミノ酸H133および／またはY134の1つまたは複数の置換または欠失を含む。いくつかの態様では、オルソゴナルCD122は、アミノ酸H133およびY134の1つまたは複数の置換または欠失を含む。
いくつかの態様では、オルソゴナル受容体は、133位にヒスチジンからアスパラギン酸（H133D）、グルタミン酸（H133E）もしくはリジン（H133K）へのアミノ酸置換および／または134位にチロシンからフェニルアラニン（Y134F）、グルタミン酸（Y134E）もしくはアルギニン（Y134R）へのアミノ酸置換を有するhoCD122 ECDを含む。一態様では、オルソゴナル受容体は、ECDがSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。一態様では、オルソゴナルCD122オルソは、アミノ酸置換H133DおよびY134Fを有するhCD122分子である。一態様では、hoCD122受容体は、SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
一態様では、オルソゴナル受容体は、hoCD122のECD（例えば、SEQ ID NO. 6）ならびにIL2共通ガンマ鎖ファミリーの受容体（例えば、IL4受容体II型受容体サブユニットa（hIL4Ra UniProt P24394）、IL-7受容体サブユニットa（hIL7Ra UniProt 16871）、IL9受容体（hIL9R UniProt Q01113）、およびIL21受容体（hIL21R UniProt Q9HBE5）中の第2の受容体の膜貫通および細胞内ドメインを含む、融合タンパク質である。これらの共通ガンマ鎖受容体ファミリーメンバーのアミノ酸配列および核酸配列が、シグナル、細胞外、膜貫通および細胞内ドメインの場所に加え、文献においてよく知られている。したがって、当業者は、オルソゴナルCD122 ECDをこれらの代わりの共通ガンマ鎖ファミリーメンバーの膜貫通および／または細胞内ドメインと共に含む融合タンパク質を容易に調製できるだろう。オルソゴナルキメラ融合受容体の例を配列情報と共に、以下の表5に提供する。
（表４）キメラオルソゴナル共通ガンマ鎖受容体
Figure 2023511274000051
STAT3モチーフを有するオルソゴナルCD122受容体
本開示は、天然STAT5認識モチーフに加えて1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む、オルソゴナルCD122を提供する。追加のSTAT3結合モチーフは、シグナル伝達を強化し、IL2応答も安定化させる。
STATタンパク質は、C末端での保存されたチロシン残基のリン酸化とそれに続く核への移行時に転写活性化因子として作用し、そこで、STATタンパク質は、DNAに結合して、標的遺伝子転写を活性化する。Hennighausen and Robinson (2008) Genes Dev. 2008; 22:711-21。STATファミリーにおいて7種のSTATタンパク質：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5BおよびSTAT6が特定されており、これらは、自然免疫および獲得免疫から細胞の増殖、分化および生存まで多様な経路において機能を有する。Basham et al., (2008) Nucleic Acids Res. 2008 Jun; 36(11): 3802-3818。
STAT結合モチーフは、典型的にはサイトカイン受容体中に存在し、それぞれのサイトカインリガンドの結合は、ヤヌスキナーゼ（JAK）ファミリー中のチロシンキナーゼを活性化し、それによって、細胞内ドメイン中のある特定のチロシン残基がリン酸化される。リン酸化された受容体は、STATを受容体上のSTAT認識モチーフに動員し、STATはリン酸化されることになる。リン酸化されたSTATは、二量体化して核に移行し、そこで多様な遺伝子の転写を開始する。前出のHennighausen。
これらのSTATタンパク質のうち、STAT5は、IL2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15およびIL21を含むサイトカインのそれらの同族受容体への結合によって活性化される。Lara E. Kallal & Christine A. Biron (2013) Changing partners at the dance, JAK-STAT, 2:1, e23504, DOI: 10.4161/jkst.23504, Page 2, Col. 2。例えば、CD122およびオルソゴナルCD122は、STAT5認識モチーフを含有し、STAT5を動員および活性化することができる。活性化されたSTAT5は、Cis、spi2.1およびSocs-1などの遺伝子の転写の活性化をもたらす。前出のBasham et al., Nucleic Acids Res。
STAT5結合モチーフは、YX1X2L（SEQ ID NO：19）の配列を有する。X1およびX2は、任意の天然アミノ酸であることができる。いくつかの場合、X1およびX2は、同じアミノ酸残基である。いくつかの場合、X1およびX2は、異なるアミノ酸残基である。一態様では、STAT5モチーフは、YLSL（SEQ ID NO：20）の配列を有する。
STAT3結合モチーフは、天然に存在する形態（野生型）のヒトCD122中には存在しない。それは、典型的には、IL-6、IL-10、IL21、IFNα、IFNβ、IFNγおよびIFNλに結合する他のサイトカイン受容体中に存在する。活性化されると、STAT3は、Bcl-XL、サバイビン、サイクリンD1、および活性化c-mycを標的とする。前出のKallalら。STAT3は、IL-6およびIL21を含むその受容体がgp130鎖を共有する多様なサイトカイン、オンコスタチンM（OSM）ならびに白血病阻止因子（LIF）によるチロシンリン酸化を通じて活性化され得る。STAT3は、腫瘍形成、血管新生および腫瘍転移を含む多様な生物学的機能、ならびに抗アポトーシスにおいて役割を有する。例えば、Sun et al. (2006) FEBS Lett. 580(25):5880-4 および Fukada, et al. (1996) Immunity 5(5): 449-460を参照されたい。オルソゴナルCD122の細胞内ドメインへの1つまたは複数の機能的STAT3シグナル伝達モチーフの組み込みは、オルソゴナルIL2を発現する改変細胞において、そのようなSTAT3修飾オルソゴナルCD122のECDへの同族IL2オルソログの結合に応答して抗アポトーシス因子をアップレギュレーションする。したがって、1つまたは複数の機能的STAT3ドメインを組み込んだ細胞内ドメインを含むオルソゴナルCD122を発現するオルソゴナル細胞は、増強された生存およびより長い寿命を有し、それゆえ、より長いインビボ作用持続時間を有する。
いくつかの態様では、本開示は、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを導入するように修飾されているヒトオルソゴナルCD122（無傷のSTAT5モチーフを含む）を提供し、そのように生産された修飾されたヒトCD122は、STAT5認識モチーフを保持しており、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを獲得している。
いくつかの態様では、修飾されたオルソゴナルCD122は、1個、2個、3個またはより多くのSTAT3結合モチーフを含み得る。いくつかの態様では、STAT3認識モチーフは、YX1X2Q（SEQ ID NO：21）のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、X1は、L、R、F、Mからなる群より選択され、X2は、R、K、H、およびPからなる群より選択される。いくつかの態様では、STAT3認識モチーフは、以下：
Figure 2023511274000052
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの態様では、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフは、オルソゴナルCD122 ICDのC末端に、またはオルソゴナルCD122のICDの内部配列として組み込まれ得る。
いくつかの場合、修飾されたヒトCD122は、ヒトCD122の細胞内ドメインのC末端に融合された1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む。いくつかの代表的な態様では、オルソゴナルCD122は、C末端STAT3認識ドメインの付加を含み、以下の構造のオルソゴナルCD122ポリペプチドが得られる：
オルソ-CD122-GGYLRQ；
オルソ-CD122-GGYLKQ；
オルソ-CD122-GGYRHQ；
オルソ-CD122-GGYLRQ；
オルソ-CD122-GGYFKQ；
オルソ-CD122-GGYLPQ；
オルソ-CD122-GGYMPQ；および
オルソ-CD122-GGYDKPH。
いくつかの場合、オルソゴナルCD122は、ヒトCD122にリンカーを通じて接続されているSTAT3結合モチーフを含む。リンカーは、天然に存在するタンパク質または合成配列に由来することができる。リンカーを設計するための方法は、例えば、Chen et al. (2013) Adv. Drug. Deliv. Rev. 65(10):1357-1369に開示されていように当技術分野において周知であり、その関連部分は、参照により本明細書に組み入れられる。好適なリンカーは、容易に選択することができ、1個のアミノ酸（例えば、Gly）、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10～20、または20～30個のアミノ酸などの任意の好適な長さのものであることができる。フレキシブルリンカーの例としては、グリシンポリマー (G)n、グリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマーおよび他のフレキシブルリンカーが挙げられる。グリシンおよびグリシン－セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、それゆえ、成分間の中立的なつなぎ鎖として役立ち得る。フレキシブルリンカーのさらなる例としては、グリシンポリマー (G)n、グリシン－アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、グリシン－セリンポリマーが挙げられる。グリシンおよびグリシン－セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、それゆえ、成分間の中立的なつなぎ鎖として役立ち得る。修飾されたオルソゴナルCD122は、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフおよび1つまたは複数のリンカー配列を含み得る。前記リンカー配列は、ヒトCD122とSTAT3結合モチーフの1つを接続してもよく、または個々のSTAT3結合モチーフを接続してもよい。1つまたは複数のリンカー配列は、同じまたは異なる配列を有し得る。
いくつかの態様では、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフは、オルソゴナルCD122の内部（すなわち、C末端にもN末端にもない）配列として存在する。この構成の修飾されたオルソゴナルCD122は、STAT3結合モチーフが生じるように変異させることができるオルソゴナルCD122 ICDアミノ酸配列内の好適な領域を特定することによって生産できる。一態様では、CD122の天然に存在するICD（典型的には、オルソゴナルCD122中に存在する）は、STAT3結合モチーフが生じるように最小限の修飾で容易に修飾され得る、STAT3結合モチーフと似た配列を保有する。例えば、4ヌクレオチド配列を含む領域は、チロシン残基から始まる。天然ヒトCD122中のそのような領域の1つは、天然ヒトCD122タンパク質のs355位と364位との間に位置するYFTYDPYSEEの配列をコードする。いくつかの態様では、この領域に含まれるYFTY、YDPYまたはYSEEの1つまたは2つがSTAT3認識モチーフで置換されて、本明細書に開示される修飾されたヒトCD122が生産される。
そのような修飾されたオルソゴナルCD122は、同族IL2リガンドに結合するとSTAT3およびSTAT5シグナル伝達を誘導することができ、その能力は、例えば、STAT修飾ICDを有するオルソゴナルCD122を発現する細胞と同族IL2オルソログとの接触に応答したリン酸化STAT3およびSTAT5のレベルをモニタリングすることによって確認することができる。例えば、修飾されたヒトCD122は、T細胞に導入かつその中で発現させることができ、ホスホ-STAT5およびホスホル-STAT3に特異的な抗体を使用して、STAT3およびSTAT5のリン酸化を検出する。STAT3およびSTAT5シグナル伝達を誘導する組換えタンパク質の能力を検出するための1つの例示的な方法は、Kagoya et al. (2018) Nat Med. 24(3):352-359に記載されている。
いくつかの態様では、本開示は、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む修飾されたヒトオルソゴナルCD122を発現する操作された細胞を刺激する方法であって、操作された細胞と修飾されたヒトオルソゴナルCD122の同族リガンドであるヒトIL2オルソログとを接触させ、それにより操作された細胞を刺激することを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む修飾されたヒトオルソゴナルCD122を発現する操作された細胞におけるSTAT3およびSTAT5の細胞内レベルを増加させる方法であって、操作された細胞と修飾されたヒトオルソゴナルCD122の同族リガンドであるヒトIL2オルソログとを、STAT3およびSTAT5の細胞内レベルが操作された細胞において増加するように接触させることを含む、方法を提供する。
STAT5およびSTAT3の選択的活性化の方法
いくつかの態様では、本開示は、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む修飾されたヒトオルソゴナルCD122を発現する操作されたT細胞を刺激する方法であって、操作されたT細胞と修飾されたヒトオルソゴナルCD122の同族リガンドであるヒトIL2オルソログとを接触させ、それにより操作されたT細胞を刺激することを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む修飾されたヒトオルソゴナルCD122を発現する操作されたT細胞におけるSTAT3およびSTAT5の細胞内レベルを増加させる方法であって、操作されたT細胞と修飾されたヒトオルソゴナルCD122の同族リガンドであるヒトIL2オルソログとを、STAT3およびSTAT5の細胞内レベルが前記細胞において増加するように接触させることを含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む修飾されたヒトオルソゴナルCD122を発現するCAR-T細胞を刺激する方法であって、CAR-T細胞と修飾されたヒトオルソゴナルCD122の同族リガンドであるヒトIL2オルソログとを接触させ、それにより操作されたT細胞を刺激することを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む修飾されたヒトオルソゴナルCD122を発現するCAR-T細胞におけるSTAT3およびSTAT5の細胞内レベルを増加させる方法であって、CAR-T細胞と修飾されたヒトオルソゴナルCD122の同族リガンドであるヒトIL2オルソログとを、STAT3およびSTAT5の細胞内レベルが前記CAR-T細胞において増加するように接触させることを含む、方法を提供する。
オルソゴナルな操作された細胞
本発明の実施において有用なオルソゴナル免疫細胞の調製は、単離された免疫細胞を、CD122オルソゴナル受容体をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質転換することによって達成される。本開示のIL2オルソログは、対応するオルソゴナルCD122受容体を発現するように操作されたそのような操作されたT細胞（例えば、ヒトT-細胞）を選択的に拡大増殖させる方法において用いられる。
本明細書に記載される構築物を用いた操作に有用な細胞としては、ナイーブT-細胞、セントラルメモリーT-細胞、エフェクターメモリーT-細胞またはそれらの組み合わせが挙げられる。上述したような操作のためのT細胞は、対象またはドナーから収集され、所望の細胞を濃縮する技術によって細胞混合物から分離されても、または分離なしで操作および培養されてもよい。あるいは、操作のためのT細胞は、他の細胞から分離されてもよい。正確な分離を提供する技術としては、蛍光活性化細胞分取装置が挙げられる。死細胞に関連する色素（例えば、ヨウ化プロピジウム）を用いることによって死細胞に対して細胞を選択してもよい。分離された細胞は、細胞の生存能力を維持する、通常収集チューブの底に血清のクッションを有する任意の適切な培地中に収集され得る。ウシ胎児血清（FCS）がしばしば補充されているdMEM、HBSS、dPBS、RPMI、イスコフ培地などを含む、様々な培地が市販されており、細胞の性質に応じて使用され得る。収集されて任意で濃縮された細胞集団は、直ちに遺伝子改変に使用してもよく、または液体窒素温度で凍結して保存してもよく、これは、融解して再使用可能である。細胞は、通常、10％ DMSO、50％ FCS、40％ RPMI 1640培地中に保存される。
いくつかの態様では、操作された細胞は、処置を必要とする個体から単離された免疫細胞、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の複合体混合物を含む。例えば、Yang and Rosenberg (2016) Adv Immunol. 130:279-94, "Adoptive T Cell Therapy for Cancer；Feldman et al (2015) Seminars in Oncol. 42(4):626-39 "Adoptive Cell Therapy-Tumor-Infiltrating Lymphocytes, T-Cell Receptors, and Chimeric Antigen Receptors"；Clinical Trial NCT01174121, "Immunotherapy Using Tumor Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Cancer"；Tran et al. (2014) Science 344(6184)641-645, "Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer"を参照されたい。
CAR-T細胞
本発明の一態様では、オルソゴナル受容体を発現するT-細胞は、キメラ抗原受容体を表面発現するように改変されているT-細胞（例えば、ヒトT-細胞）（「CAR-T」細胞）である。一態様では、改変されたT細胞は、同種異系CAR-T細胞である。同種異系CARにおいて、いくつかの態様では、同種異系CAR-Tは、内因性TCRaおよびTCRb機能を除去するように改変される。
本明細書において定義される場合、「CAR」は、アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順序：（a）抗原結合ドメイン（ABD）を含みかつ任意で「ヒンジ」ドメインを含む、細胞外ドメイン（ECD）、（b）膜貫通ドメイン（TD）；および（c）1つまたは複数の細胞質シグナル伝達ドメイン（CSD）で配置された複数の機能性ドメインを含む、キメラポリペプチドのことを指し、前述のドメインは、任意で1つまたは複数のスペーサードメインによって連結され得る。CARはまた、CARの翻訳後プロセシングおよびCARをコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質転換された細胞の細胞表面上の提示の間に慣例的に除去されるシグナルペプチド配列をさらに含み得る。CARは、当技術分野において周知である原理に従って調製され得る。Eshharら（2010年6月22日に発表された米国特許第7,741,465 B1号）；Sadelain, et al (2013) Cancer Discovery 3 (4):388-398；Campana and Imai（2013年3月19日に発表された米国特許第8,399,645号）；Jensen and Riddell (2015) Current Opinions in Immunology 33:9-15；Gross, et al. (1989) PNAS (USA) 86 (24):10024-10028；Curran, et al. (2012) J Gene Med 14 (6):405-15；Brogdonら（2019年1月8日に発表された米国特許第10.174,095号）；Guedan, et al. (2019) Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors Molecular Therapy: Methods & Clinical Development Vol. 12: 145-156を参照されたい。
本発明の実施において有用なCARは、当技術分野において周知である原理に従って調製される。例えば、Eshhaarら（2010年6月22日に発表された米国特許第7,741,465 B1号）；Sadelain, et al (2013) Cancer Discovery 3 (4):388-398（キメラ抗原受容体（CAR）設計の基本原理）；Jensen and Riddell (2015) Current Opinions in Immunology 33:9-15 （腫瘍を効果的かつ安全にターゲティングするためのキメラ抗原受容体の設計）；Gross, et al. (1989) PNAS(USA) 86(24):10024-10028（抗体型特異性を有する機能的受容体としての、免疫グロブリン-T-細胞受容体キメラ分子の発現）；Curran, et al. (2012) J Gene Med 14(6):405-15を参照されたい。本発明の文脈におけるCARの構築およびその機能性ドメインに関する考慮事項は、以下で考察する。
シグナル配列
本開示のCARは、シグナルペプチドを含み得る。本発明の実施において、任意の真核生物シグナルペプチド配列が用いられ得る。シグナルペプチドは、表面発現されたタンパク質の天然シグナルペプチドに由来し得る。本発明の一態様では、CARのシグナルペプチドは、ヒト血清アルブミンシグナルペプチド、プロラクチンアルブミンシグナルペプチド、ヒトIL2シグナルペプチド、ヒトトリプシノーゲン-2、ヒトCD-5、ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖、ヒトアズロシジン、ガウシアルシフェラーゼおよびそれらの機能的誘導体からなる群より選択されるシグナルペプチドである。シグナルペプチドを使用した分泌効率を増加させるための特定のアミノ酸置換は、Stern, et al. (2007) Trends in Cell and Molecular Biology 2:1-17およびKober, et al. (2013) Biotechnol Bioeng. 1110(4):1164-73に記載されている。あるいは、シグナルペプチドは、確立された原理に従って調製された合成配列であり得る。例えば、Nielsen, et al. (1997) Protein Engineering 10(1):1-6（原核生物および真核生物シグナルペプチドの特定ならびにそれらの切断部位の予測）；Bendtsen, et al (2004) J. Mol. Biol 340(4):783-795（シグナルペプチドの改善された予測、シグナルP 3.0）；Petersen, et al (2011) Nature Methods 8:785-796（シグナルP 4.0；シグナルペプチドと膜貫通領域との識別）を参照されたい。
細胞外抗原結合ドメイン
本明細書において使用される場合、抗原結合ドメイン（ABD）という用語は、標的細胞の表面上に発現される少なくとも1つの抗原に特異的に結合する少なくとも1つの結合ドメインを含有するポリペプチドのことを指す。いくつかの態様では、ABDは、標的細胞の表面上の同じ抗原または2つの異なる抗原に選択的に結合する2つの結合ドメインを有するポリペプチドを含む。ABDは、標的細胞の表面上に発現される1つまたは複数の抗原に特異的に結合する任意のポリペプチドであり得る。ABDは、ポリペプチドである。
CARのABDは、一価または多価であり、細胞表面腫瘍抗原に特異的に結合する1つまたは複数（例えば、1個、2個または3個）のポリペプチド配列（例えば、scFv、VHH、リガンド）を含み得る。いくつかの態様では、腫瘍抗原およびそのような細胞表面腫瘍に選択的に結合するABDを含むCARは、当技術分野において公知である（例えば、Dotti, et al., Immunol Rev. 2014 January；257(1)を参照のこと）。本開示の方法および組成物は、CARのABDが、CD123、CD19、CD20、BCMA、CD22、CD30、CD70、Lewis Y、GD3、GD3、メソテリン、ROR CD44、CD171、EGP2、EphA2、ErbB2、ErbB3/4、FAP、FAR IL11Ra、PSCA、PSMA、NCAM、HER2、NY-ESO-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1（CLEC12A）PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、メソテリン、c-Met、糖脂質F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2Dリガンド、葉酸受容体（FRa）およびWnt1抗原を非限定的に含む腫瘍抗原に特異的に結合するCAR療法との関連で有用である。これらの標的と反応性の抗体は、文献においてよく知られており、当業者は、CARのABDに組み込まれ得る単鎖抗体（例えば、scFv、CDRグラフティングVHHなど）のポリペプチド配列の構築のためにそのような抗体からCDRを単離可能である。
一態様では、ABDは、単鎖Fv（ScFv）である。ScFvは、ペプチドリンカーによって共有結合で接続された抗体の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域からなるポリペプチドである（Bird, et al. (1988) Science 242:423-426；Huston, et al. (1988) PNAS(USA) 85:5879-5883；S-z Hu, et al. (1996) Cancer Research, 56, 3055-3061；1990年8月7日に発表されたLadnerの米国特許第4946778号）。抗ターゲティング抗原ScFvの調製は、抗ターゲティング抗原ScFvが由来するターゲティング抗原に対するモノクローナル抗体の特定を伴う。モノクローナル抗体の作製およびハイブリドーマの単離は、当業者に周知の技術である。例えば、Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Second Edition, Chapter 7（E. Greenfield, Ed. 2014 Cold Spring Harbor Press）を参照されたい。免疫応答は、ミョウバン、アルミニウム塩、またはフロイント、SP-21などの当技術分野において周知であるアジュバントの共投与を通じて増強され得る。作製された抗体は、ファージディスプレイおよび指向性進化法などの当技術分野において周知の技術を通じて特定の望ましい特性を保有する抗体が選択されるように最適化され得る。例えば、Barbas, et al. (1991) PNAS (USA) 88:7978-82；1993年6月29日に発表されたLadnerらの米国特許第5,223,409号；Stemmer, W. (1994) Nature 370:389-91；1998年10月13日に発表されたGarrardの米国特許第5,821,047号；Camps, et al. (2003) PNAS (USA) 100(17): 9727-32；1986年6月3日に発表されたDulbeccoの米国特許第4,593,002号；2004年10月19日に発表されたMcCaffertyの米国特許第6,806,079号；2009年12月22日に発表されたMcCaffertyの米国特許第7,635,666号；2010年2月16日に発表されたMcCaffertyの米国特許第7,662,557号；2010年5月25日に発表されたMcCaffertyの米国特許第7,723,271号；および／またはMcCaffertyの米国特許第7,732,377号を参照されたい。モノクローナル抗体配列に基づいたScFvの作製は、当技術分野において周知である。例えば、The Protein Protocols Handbook, John M. Walker, Ed. (2002) Humana Press Section 150 “Bacterial Expression, Purification and Characterization of Single-Chain Antibodies” Kipriyanov, Sを参照されたい。
別の態様では、ABDは、ラクダまたはラマをターゲティング抗原で免疫化することによって得られる単一ドメイン抗体である。Muyldermans, S. (2001) Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302。
あるいは、ABDは、ペプチドライブラリの作製および所望の標的細胞の抗原結合特性を有する化合物の単離を通じて、完全に合成によって作製してもよい。そのような技術は、科学文献においてよく知られている。例えば、1999年11月12日に発表されたWiglerらの米国特許第6303313 B1号；2004年2月24日に発表されたKnappikらの米国特許第6696248 B1号、Binz, et al (2005) Nature Biotechnology 23:1257-1268；Bradbury, et al.(2011) Nature Biotechnology 29:245-254を参照されたい。
標的細胞が発現する抗原に対して親和性を有するABDに加えて、ARDはまた、追加の分子に対する親和性も有し得る。例えば、本発明のARDは、二重特異性であり得る、すなわち、第1の標的細胞が発現する抗原および第2の標的細胞が発現する抗原への特異的結合を提供可能である。二価単鎖ポリペプチドの例は、当技術分野において公知である。例えば、Thirion, et al. (1996) European J. of Cancer Prevention 5(6):507-511；DeKruif and Logenberg (1996) J. Biol. Chem 271 (13) 7630-7634；および2015年11月5日に公開されたKayらの米国特許出願公報番号2015/0315566を参照されたい。
ABDは、1を超える標的抗原に対して親和性を有し得る。例えば、本発明のABDは、キメラ二重特異性結合メンバーを含み得る、すなわち、第1の標的細胞が発現する抗原および第2の標的細胞が発現する抗原への特異的結合を提供可能である。キメラ二重特異性結合メンバーの非限定例としては、二重特異性抗体、二重特異性コンジュゲートモノクローナル抗体 (mab)2、二重特異性抗体断片（例えば、F(ab)2、二重特異性scFv、二重特異性ダイアボディ、単鎖二重特異性ダイアボディなど）、二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）、二重特異性コンジュゲート単一ドメイン抗体、ミカボディ（micabodies）およびその変異体などが挙げられる。キメラ二重特異性結合メンバーの非限定例としてはまた、Kontermann (2012) MAbs. 4(2): 182-197；Stamova et al. (2012) Antibodies, 1(2), 172-198；Farhadfar et al. (2016) Leuk Res. 49:13-21；Benjamin et al. Ther Adv Hematol. (2016) 7(3):142-56；Kiefer et al. Immunol Rev. (2016) 270(1):178-92；Fan et al. (2015) J Hematol Oncol. 8:130；May et al. (2016) Am J Health Syst Pharm. 73(1):e6-e13に記載されているキメラ二重特異性作用物質も挙げられる。いくつかの態様では、キメラ二重特異性結合メンバーは、二価単鎖ポリペプチドである。例えば、Thirion, et al. (1996) European J. of Cancer Prevention 5(6):507-511；DeKruif and Logenberg (1996) J. Biol. Chem 271 (13) 7630-7634；および2015年11月5日に公開されたKayらの米国特許出願公報番号2015/0315566を参照されたい。
いくつかの例では、キメラ二重特異性結合メンバーは、CAR T細胞アダプターであり得る。本明細書において使用される場合、「CAR T細胞アダプター」とは、CARの抗原認識ドメインに結合してCARを第2の抗原に再指向する、発現された二重特異性ポリペプチドのことを意味する。一般に、CAR T細胞アダプターは、それが指向されるCAR上のエピトープに特異的であるものと、結合すると結合シグナルを伝達してCARを活性化する結合パートナーに指向される第2のエピトープの、2つの結合領域を有する。有用なCAR T細胞アダプターとしては、例えば、Kim et al. (2015) J Am Chem Soc. 137(8):2832-5；Ma et al. (2016) Proc Natl Acad Sci U S A. 113(4):E450-8 および Cao et al. (2016) Angew Chem Int Ed Engl. 55(26):7520-4に記載されているものが挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの態様では、GD2に対する抗原結合ドメインは、mAb 14.18、14G2a、chl4.18、hul4.18、3F8、hu3F8、3G6、8B6、60C3、10B8、ME36.1および8H9から選択される抗体の抗原結合部分である。例えば、WO2012033885、WO2013040371、WO2013192294、WO2013061273、WO2013123061、WO2013074916、およびWO201385552を参照されたい。いくつかの態様では、GD2に対する抗原結合ドメインは、米国公報第20100150910号またはPCT公報第WO 2011160119号に記載されている抗体の抗原結合部分である。別の抗体は、S58（抗GD2、神経芽腫）である。Cotara（商標）［Perregrince Pharmaceuticals］は、再発性膠芽腫の処置のために記載されているモノクローナル抗体である。
いくつかの態様では、CARのABDは、scFvFMC-63およびそのヒト化バリアントを含む。
リンカー／ヒンジ
本発明の実施において有用なCARは、任意で、CARのドメインを連結する、特に、ARDとCARの膜貫通通過ドメインとを連結する、1つまたは複数のポリペプチドスペーサーを含み得る。CAR構造の必須エレメントはないが、スペーサードメインの包含が、ARDによる抗原認識を容易にするために望ましいと一般に見なされる。Moritz and Groner (1995) Gene Therapy 2(8) 539-546。本明細書に記載されるCAR-T T細胞技術との関連で使用される場合、「リンカー」、「リンカードメイン」および「リンカー領域」という用語は、本開示のCARのドメイン／領域のいずれかを一緒に連結する、約1～100アミノ酸長のオリゴまたはポリペプチド領域のことを指す。リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが相対的に自由に移動できるような、グリシンおよびセリンのようなフレキシブル残基から構成され得る。ある特定の態様は、2つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないようにすることが望まれる場合、より長いリンカーの使用を含む。
いくつかの態様では、リンカーは、非開裂性であるが、他の場合では、これらは開裂性である（例えば、2Aリンカー（例えば、T2A）、2A様リンカーまたはその機能的等価物、および前述の組み合わせ）。スペーサー機能を達成するのに必要な特定のアミノ酸配列はないが、スペーサーの典型的な性質は、ターゲティング抗原認識を容易にするためにARDの移動の自由を可能にするフレキシビリティである。同様に、CAR機能を保持しながらもスペーサー長に相当な寛大さがあることも見いだされている。Jensen and Riddell (2014) Immunol. Review 257(1) 127-144。本発明の実施において有用なCARの構築におけるスペーサーとして有用な配列としては、IgG1のヒンジ領域、免疫グロブリン1CH2-CH3領域、IgG4ヒンジ-CH2-CH3、IgG4ヒンジ-CH3、およびIgG4ヒンジが挙げられるが、それらに限定されない。ヒンジおよび膜貫通ドメインは、CD8-アルファのヒンジおよび膜貫通ドメインなど、同じ分子に由来し得る。Imai, et al. (2004) Leukemia 18(4):676-684。リンカーがピコルナウイルス2A様リンカー、ブタテッショウウイルスのCHYSEL配列（P2A）、ゾセア・アシグナウイルス（T2A）、またはその組み合わせ、バリアントおよび機能的等価物を含む本開示の態様が想定される。なおさらなる態様では、リンカー配列は、Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)-pro(2B)モチーフを含み、これは、2Aグリシンと2Bプロリンとの間で開裂をもたらす。
膜貫通ドメイン
CARは、ABD（またはリンカー、用いられる場合）をCARの細胞内細胞質ドメインにつなぐ膜貫通ドメインをさらに含むことができる。膜貫通ドメインは、真核生物の細胞膜において熱力学的に安定である任意のポリペプチド配列から構成される。膜貫通通過ドメインは、天然に存在する膜通過タンパク質の膜貫通ドメインに由来しても、または合成物であってもよい。合成の膜貫通ドメインを設計する際に、アルファ-ヘリックス構造を優先するアミノ酸が好ましい。CARの構築において有用な膜貫通ドメインは、アルファ-ヘリックス二次構造を有する形態を優先するおよそ10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、22、23、または24アミノ酸から構成される。アルファ-ヘリックス立体構造を優先するアミノ酸は、当技術分野において周知である。例えば、Pace, et al. (1998) Biophysical Journal 75: 422-427を参照されたい。アルファヘリックス立体構造が特に有利であるアミノ酸としては、メチオニン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸およびリジンが挙げられる。いくつかの態様では、CAR膜貫通ドメインは、I型膜通過タンパク質、例えばCD3ζ、CD4、CD8、CD28などからの膜貫通ドメインに由来し得る。
細胞内シグナル伝達ドメイン
CARポリペプチドの細胞質ドメインは、1つまたは複数の細胞内シグナルドメインを含む。一態様では、細胞内シグナルドメインは、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するT-細胞受容体（TCR）および共受容体の細胞質配列、ならびにその機能的誘導体およびサブ断片を含む。細胞質シグナル伝達ドメイン、例えばT細胞受容体ゼータ鎖に由来するものは、キメラ受容体が標的抗原と会合した後にTリンパ球増殖およびエフェクター機能のための刺激シグナルを生成するために、CARの一部として用いられる。細胞質シグナル伝達ドメインの例としては、CD27の細胞質ドメイン、CD28の細胞質ドメインS、CD137（4-1BBおよびTNFRSF9とも称される）の細胞質ドメイン、CD278（ICOSとも称される）の細胞質ドメイン、PI3キナーゼのp110α、βまたはδ触媒サブユニット、ヒトCD3 ζ鎖、CD134（OX40およびTNFRSF4とも称される）の細胞質ドメイン、FcεR1γおよびβ鎖、MB1（Igα）鎖、B29（Igβ）鎖など）、CD3ポリペプチド（δ、Δおよびε）、sykファミリーチロシンキナーゼ（Syk、ZAP70など）、srcファミリーチロシンキナーゼ（Lck、Fyn、Lynなど）ならびにCD2、CD5およびCD28などのT-細胞形質導入に関与する他の分子が挙げられるが、それらに限定されない。
共刺激ドメイン
いくつかの態様では、CARはまた、共刺激ドメインも提供し得る。「共刺激ドメイン」という用語は、一次特異的刺激が伝播される二次的な非特異的活性化機構を提供する、CARの刺激ドメイン、典型的にはエンドドメインのことを指す。共刺激ドメインは、メモリー細胞の増殖、生存または発生を増強するCARの部分のことを指す。共刺激の例としては、T細胞受容体を通じた抗原特異的シグナル伝達後の抗原非特異的T細胞共刺激、およびB細胞受容体を通じたシグナル伝達後の抗原非特異的B細胞共刺激が挙げられる。共刺激、例えば、T細胞共刺激、および関与する因子は、Chen & Flies. (2013) Nat Rev Immunol 13(4):227-42に記載されている。本開示のいくつかの態様では、CSDは、TNFRスーパーファミリーのメンバーの1つまたは複数、CD28、CD137（4-1BB）、CD134（OX40）、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40またはそれらの組み合わせを含む。
CARは、しばしば、第1世代、第2世代、第3世代または第4世代と称される。第1世代CARという用語は、細胞質ドメインがたった1つのシグナル伝達ドメイン、例えばIgE FcεR1γまたはCD3ζ鎖に対する高親和性受容体に由来するシグナル伝達ドメインを通じて抗原結合からシグナルを伝達する、CARのことを指す。該ドメインは、抗原依存性T-細胞活性化のための1つまたは3つの免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ［ITAM］を含有する。ITAMに基づく活性化シグナルは、T-細胞に、抗原結合に応答して標的腫瘍細胞を溶解およびサイトカインを分泌する能力を与える。第2世代CARは、CD3ζシグナルに加えて共刺激シグナルを含む。送達された共刺激シグナルの同時送達は、CAR形質導入T-細胞によって誘導されるサイトカイン分泌および抗腫瘍活性を増強する。共刺激ドメインは、通常、CD3ζドメインと比べて膜近位である。第3世代CARは、例えばCD28、CD3ζ、OX40または4-1BBシグナル伝達領域を含む、3部からなるシグナル伝達ドメインを含む。第4世代または「強化CAR（armored car）」では、CAR T-細胞は、IL-12、IL-18、IL-7および／またはIL-10の発現などの免疫活性を増強する分子および／または受容体；4-1BBリガンド、CD-40リガンドを発現または遮断するようにさらに改変される。
本発明のCARに組み込まれ得る細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、（アミノからカルボキシへ）：CD3ζ；CD28-41BB-CD3ζ；CD28-OX40-CD3ζ；CD28-41BB-CD3ζ；41BB-CD28-CD3ζおよび41BB-CD3ζが挙げられる。
本発明の実施において有用なCARアーキテクチャの例としては、ECDターゲティングドメインを例示している以下の例が挙げられるが、それらに限定されず、CARのICDのアーキテクチャとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：
Figure 2023511274000053
Figure 2023511274000054
Figure 2023511274000055
Figure 2023511274000056
Figure 2023511274000057
Figure 2023511274000058
。
さらには、より従来型の第1および第2世代のCARに加えて、CARという用語は、限定されないがスプリットCAR、ONスイッチCAR、二重特異性またはタンデムCAR、阻害性CAR（iCAR）および人工多能性幹（iPS）CAR-T細胞を含む、CARバリアントを含む。
「スプリットCAR」という用語は、CARの細胞外部分、ABDおよび細胞質シグナル伝達ドメインが2つの別個の分子上に存在するCARのことを指す。CARバリアントはまた、例えばスプリットCARを含む、条件付きで活性化可能なCARであるONスイッチCARも含み、この場合、スプリットCARの2つの部分の条件付きのヘテロ二量体化が薬理学的に制御される。CAR分子およびその誘導体（すなわち、CARバリアント）は、例えば、PCT出願番号US2014/016527、US1996/017060、US2013/063083；Fedorov et al. Sci Transl Med (2013); 5(215):215ra172；Glienke et al. Front Pharmacol (2015) 6:21；Kakarla & Gottschalk 52 Cancer J (2014) 20(2):151-5；Riddell et al. Cancer J (2014) 20(2):141-4；Pegram et al. Cancer J (2014) 20(2):127-33；Cheadle et al. Immunol Rev (2014) 257(1):91-106；Barrett et al. Annu Rev Med (2014) 65:333-47；Sadelain et al. Cancer Discov (2013) 3(4):388-98；Cartellieri et al., J Biomed Biotechnol (2010) 956304に記載されている；これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
「二重特異性またはタンデムCAR」という用語は、一次CARの活性を増幅または阻害することができる二次CAR結合ドメインを含むCARのことを指す。
「阻害性キメラ抗原受容体」または「iCAR」という用語は、本明細書において互換的に使用され、結合時に、二重抗原ターゲティングを使用し、二次CAR結合ドメインの阻害性シグナル伝達ドメインを備えた第2の抑制性受容体の会合が一次CAR活性化の阻害をもたらすことを通じて、活性なCARの活性化を停止するCARのことを指す。腫瘍組織とオフターゲット組織の両方に対して特異性を有するT細胞は、T細胞に導入された抗原特異的iCARを使用することによって腫瘍にのみ限局させることができ、オフターゲット組織が保護される（Fedorov, et al., (2013). Science Translational Medicine, 5:215）。阻害性CAR（iCAR）は、阻害性受容体シグナル伝達モジュール活性化を通じてCAR-T細胞の活性を調節するように設計される。このアプローチは、2つのCARの活性を組み合わせ、その1つは、活性化受容体によって活性化されたCAR-T細胞の応答を制限するドミナントネガティブシグナルを生成する。iCARは、正常組織によってのみ発現される特異的抗原に結合したときに反作用活性化因子のCARの応答をスイッチオフすることができる。このようにして、iCAR-T細胞は、がん細胞と健常な細胞とを識別し、形質導入T細胞の機能を抗原選択的に可逆的に遮断することができる。iCAR中のCTLA-4またはPD-1細胞内ドメインは、Tリンパ球に対して阻害性シグナルを誘発し、より低いサイトカイン産生、より効率の低い標的細胞溶解、および変化したリンパ球運動性を導く。いくつかの態様では、iCARは、阻害性抗原に特異的に結合する単鎖抗体（例えば、scFv、VHHなど）、抗原認識時に特異的にT細胞機能を阻害する膜貫通領域を介する免疫阻害性受容体（CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4（CD244）、BTLA（CD272）、KIR、TIM-3、TGFベータ受容体ドミナントネガティブ類似体などを非限定的に含む）に由来する1つまたは複数の細胞内ICDを含む。
「タンデムCAR」または「TanCAR」という用語は、2つの異なる腫瘍関連抗原の非依存的会合に応答して刺激または共刺激シグナルを送達するように設計された2つのキメラ受容体の会合を通じてT細胞の二重特異的活性化を媒介するCARのことを指す。
典型的には、キメラ抗原受容体T-細胞（CAR-T細胞）は、上記の教示に実質的に従いCARをコードする発現ベクターによる形質導入によって組換え改変されているT-細胞である。
いくつかの態様では、操作されたT細胞は、処置される個体に関して同種異系である。Graham et al. (2018) Cell 7(10) E155。いくつかの態様では、同種異系の操作されたT細胞は、完全にHLAが一致している。しかしながら、すべての患者が完全に一致しているドナーを有するわけではなく、HLA型に左右されないすべての患者に適した細胞製品が選択肢となる。
細胞製品は対象自身のT-細胞からなり得るので、対象に投与しようとする細胞集団は、必然的に可変である。したがって、最適な濃度が特定される。加えて、CAR-T細胞剤が可変であるので、そのような作用物質に対する応答も変動し得、したがって、CAR-T細胞処置の投与前に一連の薬理的免疫抑制またはB細胞枯渇で管理される治療関連毒性の断続的なモニタリングおよび管理を必要とする。通常、少なくとも1×106個の細胞/kg、少なくとも1×107個の細胞/kg、少なくとも1×108個の細胞/kg、少なくとも1×109個の細胞/kg、少なくとも1×1010個の細胞/kg、またはそれ以上が投与されるが、通常、これは、収集の過程で得られるT細胞の数によって制限を受ける。操作された細胞は、任意の生理学的に許容される媒体中で任意の簡便な投与経路、通常は血管内投与によって対象に注入されてよいが、細胞が適切な成長部位を見いだし得る他の経路によって導入してもよい。
本発明の実施において使用されるT細胞が同種異系のT細胞である場合、そのような細胞は、移植片対宿主病を低減するように改変されてもよい。例えば、本発明の操作された細胞は、遺伝子編集技術によって達成されるTCRαβ受容体ノックアウトであり得る。TCRαβは、ヘテロ二量体であり、それが発現されるためにはアルファとベータの両鎖が存在する必要がある。単一遺伝子がアルファ鎖（TRAC）をコードするが、ベータ鎖をコードする遺伝子は2つあるので、この目的のためにTRAC遺伝子座のKOが欠失されている。この欠失を達成するために、多数の異なるアプローチ、例えば、CRISPR/Cas9；メガヌクレアーゼ；操作されたI-CreIホーミングエンドヌクレアーゼなどが使用されてきた。例えば、Eyquem et al. (2017） Nature 543:113-117（TRACコード配列がCARコード配列に置換されている）；および Georgiadis et al. (2018） Mol. Ther. 26:1215-1227（TRAC遺伝子座にCARを直接組み込むことなしに、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（CRISPR）/Cas9によってTRACが破壊された、CAR発現に関連する）を参照されたい。GVHDを防ぐための代替戦略は、例えば短縮型のCD3ζをTCR阻害分子として使用して、TCRαβシグナル伝達の阻害剤を発現するようにT細胞を改変する。
CARをコードするベクター：
本発明の実施において有用なCAR T-細胞の調製は、単離されたT-細胞を、上記のCARポリタンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いて形質転換することによって達成される。ベクターは、RNAもしくはDNAのいずれかを含む非ウイルスベクターまたはウイルスベクターであり得る。
CD122および／またはCARの発現をもたらす発現ベクター。いくつかの態様では、ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。「非ウイルスベクター」という用語は、通常のゲノムとは区別され、標的細胞におけるコード配列の発現を達成可能な非選択的条件下での細胞生存に必須ではない、自己複製する染色体外環状DNA分子のことを指す。プラスミドは、非ウイルスベクターの例である。標的細胞のトランスフェクションを容易にするために、標的細胞は、非ウイルスベクターの取り込みを容易にする条件下で、非ウイルスベクターに直接曝露され得る。哺乳動物細胞による外来核酸の取り込みを容易にする条件の例は、当技術分野において周知であり、これらには、化学的手段（例えば、Lipofectamine（登録商標）、Thermo-Fisher Scientific）、高塩濃度および磁場（エレクトロポレーション）が挙げられるが、それらに限定されない。
発現カセット：
組換え発現ベクターは、オルソゴナルCD122および／またはCARの発現を指令するための1つまたは複数の発現カセットを含む。「発現カセット」という用語は、発現ベクターで形質転換しようとする宿主細胞中でポリペプチドの発現を達成可能な好適な遺伝子制御エレメントに機能的に連結された所望のポリペプチドをコードする、組換え（または合成）核酸構築物のことを指す。「機能的に連結された」という用語は、ポリヌクレオチドエレメントが機能的な関係で連結されていることを指す。核酸配列は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、「機能的に連結されている」。例えば、プロモーターは、それがポリペプチドの転写を制御するならば、コード配列に機能的に連結されている；リボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように位置付けられているなら、コード配列に機能的に連結されており、シグナルペプチドをコードする核酸は、それが、融合タンパク質として発現され、融合タンパク質を細胞膜に指向することにまたはポリペプチドの分泌に関与するならば、そのようなポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結されている。典型的には、機能的に連結されているヌクレオチド配列は、連続的である。しかしながら、エンハンサーは、一般にプロモーターから数キロ塩基離れている場合に機能し、イントロン配列は様々な長さであり得るので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは機能的に連結され得るが物理的に離れており、さらには異なる対立遺伝子または染色体からトランスでも機能し得る。
制御エレメント
発現を達成するのに必要な制御エレメントの具体的な種類は、形質転換しようとする細胞の種類に依存するだろう。本発明の実施では、形質転換しようとする細胞は、哺乳動物T-細胞である。制御エレメントという用語は、まとめて、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（「IRES」）、エンハンサー、mRNA発現のレベルを上昇させるための転写エンハンサー、好適なリボソーム結合部位をコードする配列、ならびにレシピエント細胞でのポリペプチドコード配列の複製、転写および翻訳に影響を及ぼす転写および翻訳を終結する配列のことを指す。発現ベクターはまた、通常、ベクターが宿主細胞とは無関係に複製することを可能にする複製起点も含有する。
発現カセットの一態様では、発現させようとする核酸配列（例えば、オルソゴナルCD122および／またはCARをコードする）は、プロモーター配列に機能的に連結される。「プロモーター」という用語は、その従来の意味で使用され、コード配列の転写の開始および速度が制御されるヌクレオチド配列のことを指す。プロモーターは、RNAポリメラーゼが結合する部位を含有し、また、調節因子（抑制因子または転写因子など）の結合のための部位も含有する。プロモーターは、天然に存在するものまたは合成のものであることができる。プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、外部刺激に応答して活性化される（誘導性）プロモーター、特定の細胞型または細胞状態において活性である（組織特異的または腫瘍特異的）プロモーター、および／または調節可能プロモーターであることができる。「誘導性プロモーター」という用語は、好ましくは（または単独で）ある特定の条件下でおよび／または外部の化学的もしくは他の刺激に応答して生物活性ポリペプチドの転写を容易にするプロモーターのことを指す。誘導性プロモーターの例は、科学文献において知られている（例えば、Yoshida et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 230:426-430 (1997)；Iida et al., J. Virol., 70(9): 6054-6059 (1996)；Hwang et al., J. Virol., 71(9): 7128-7131 (1997)；Lee et al., Mol. Cell. Biol., 17(9): 5097-5105 (1997)；および Dreher et al., J. Biol. Chem., 272(46): 29364-29371 (1997)を参照のこと）。放射線誘導性プロモーターの例としては、EGR-1プロモーターが挙げられる。Boothman et al., volume 138, supplement pages S68-S71 (1994)。いくつかの態様では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。いくつかの態様では、プロモーターは、腫瘍特異的プロモーターである。組織特異的プロモーターおよび腫瘍特異的プロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、膵臓特異的プロモーター（Palmiter et al., Cell, 50:435 (1987)）、肝臓特異的プロモーター（Rovet et al., J. Biol. Chem., 267:20765 (1992)；Lemaigne et al., J. Biol. Chem., 268:19896 (1993)；Nitsch et al., Mol. Cell. Biol., 13:4494 (1993)）、胃特異的プロモーター（Kovarik et al., J. Biol. Chem., 268:9917 (1993)）、下垂体特異的プロモーター（Rhodes et al., Genes Dev., 7:913 (1993)）、および前立腺特異的プロモーター（1997年12月16日に発表されたHendersonらの米国特許第5,698,443号）がある。一態様では、プロモーターは、ホスホグリセリンキナーゼ（PGK）プロモーターである。一態様では、プロモーターは、エロンガーゼファクター1アルファ（EF1a）プロモーターである。一態様では、プロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルス（エンハンサーネガティブ制御領域が欠失、dl587revプライマー結合部位が置換された）（「MND」）プロモーターである。
本発明の実施におけるように複数のポリペプチド（例えば、CARおよびオルソゴナルCD122ポリペプチド）を発現する際、各ポリペプチドが発現制御配列に機能的に連結されてもよく（単シストロン性）、または、複数のポリペプチドが多シストロン性構築物によってコードされてもよく、そこで、複数のポリペプチドが単一の発現制御配列の制御下で発現される。多シストロン性発現を容易にするために用いられ得るエレメントの例としては、内部リボソーム進入部位（IRES）エレメントまたは手足口病ウイルスタンパク質2A（FMVD2A）系またはT2Aペプチドが挙げられる。多種多様なIRES部位が公知である（例えば、Doudna JA, Sarnow P. Translation initiation by viral internal ribosome entry sites. In: Translational Control in Biology and Medicine；Mathews et al, Ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2007. pp. 129-154; http://www.IRESite.orgを参照のこと）。IRESエレメントの例としては、ピコルナウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、脳心筋炎ウイルスのIRES、手足口病ウイルスのアフトウイルスIRES、コオロギ麻痺ウイルス（CrPV）のIRES、A型肝炎ウイルスのA型肝炎IRES、C型肝炎ウイルスのC型肝炎IRES、豚熱またはウシ下痢ウイルスのペスチウイルスIRES、クリパウイルスIRES、および線維芽細胞成長因子-1 IRES、線維芽細胞成長因子-2 IRES、PDGF IRES、VEGF IRES、IGF-2 IRESなどの哺乳動物IRESエレメントが挙げられる。IRESエレメントの使用は、典型的には、多シストロン性メッセージの第2のタンパク質の有意により低い発現をもたらす。FMDV2A系の使用は、複数のタンパク質がポリタンパク質を機能性サブユニットへと切断する自己タンパク分解性FMDV2Aドメインを含有する融合タンパク質として最初に発現されるので、下流タンパク質をより効率的に産生させる。Ryan and Drew (1994) EMBO J. 13(4):928-933。多シストロン性コード配列の構築に応じて、とりわけ、制限エンドヌクレアーゼ部位を容易にするために、上流タンパク質のカルボキシ末端への少数のアミノ酸の付加においてFMDV2A系が頻繁に使用され得る。
任意のコードされたタンパク質：救済遺伝子／薬物抵抗性
CARおよび／またはオルソゴナルCD122をコードする発現ベクターは、任意で、「救済」遺伝子をコードする核酸配列を含む1つまたは複数の発現カセットを提供し得る。「救済遺伝子」は、形質導入細胞におけるその発現によって、細胞が外部因子による殺傷に感受性になるかまたは細胞内で細胞が殺傷されるような毒性条件を生じる、核酸配列である。救済遺伝子を提供することによって、形質導入された細胞の選択的な細胞殺傷が可能となる。したがって、救済遺伝子は、前記構築物が哺乳動物対象の細胞に組み込まれたときに、望ましくない形質導入細胞の伝播または複製可能なベクター系の効果を阻止する追加の安全措置を提供する。一態様では、救済遺伝子は、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子であり（例えば、1997年5月20日に発表されたWooらの米国特許第5,631,236号および1997年2月11日に発表されたFreemanらの米国特許第5,601,818号を参照のこと）、TK遺伝子産物を発現する細胞がガンシクロビルの投与による選択的殺傷に感受性になる。あるいは、誘導性プロモーターからの発現を誘導する外因性作用物質の投与による標的細胞殺傷を容易にするために、誘導性プロモーターがプロアポトティック遺伝子に機能的に連結されてもよい。
発現ベクターは、任意で、組換えベクターの選択またはその存在のスクリーニングを可能にするために含めることができる、追加の遺伝子、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子を提供し得る。そのような追加の遺伝子は、例えば、ネオマイシン耐性、多剤耐性、チミジンキナーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むことができる。
一態様では、非ウイルスベクターは、非ウイルス送達系で提供され得る。非ウイルス送達系は、典型的には、核酸カーゴでの標的細胞の形質導入を容易にするための複合体であり、核酸は、陽イオン性脂質（DOTAP、DOTMA）、界面活性剤、生物製剤（ゼラチン、キトサン）、金属（金、磁鉄）および合成高分子（PLG、PEI、PAMAM）などの作用物質と複合体化されている。脂質ベクター系（Lee et al. (1997) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 14:173-206）；ポリマー被覆リポソーム（1993年5月25日に発表されたMarinらの米国特許第5,213,804号；1991年5月7日に発表されたWoodleらの米国特許第5,013,556号）；陽イオン性リポソーム（1994年2月1日に発表されたEpandらの米国特許第5,283,185号；1996年11月26日に発表されたJessee, J. A.の米国特許第5,578,475号；1994年1月18日に発表されたRoseらの米国特許第5,279,833号；1994年8月2日に発表されたGebeyehuらの米国特許第5,334,761号）を含め、非ウイルス送達系の多数の態様が当技術分野において周知である。非ウイルスベクターを用いたT-細胞におけるCAR配列の発現効率は、トランスポゾン／トランスポザーゼ系の使用によって大幅に増加させることができ、例えば、いわゆるスリーピング・ビューティー（SB）トランスポゾン系（例えば、Geurts, et al. (2003) Mol Ther 8(1):108-117を参照のこと）およびpiggyBac系（例えば、Manuri, et al. (2010) Human Gene Therapy 21(4):427-437を参照のこと）を使用して、抗ターゲティング抗原CARをコードする核酸配列を含む非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）をヒトT-細胞に安定に導入することができる。
CARを作製するための非ウイルス遺伝子送達の代替手順は、Rabinovichら（2018年12月18日に発表された米国特許第10,155,038BS号、その教示全体は、参照により本明細書に組み入れられる）の教示に実質的に従って、CARをコードするmRNAベクターのトランスフェクションによって達成される。CARをコードするベクターがRNAベクターであるいくつかの態様では、任意で、RNAベクターは、1つまたは複数の追加の生物学的に活性な分子をコードし得る。例えば、ベクターがRNAベクターである場合、ベクターは、1つまたは複数の抗原の発現を抑制するために、細胞をリプログラミングする1つまたは複数のRNAをコードすることができる。例えば、以下により詳細に考察するように、RNAは、CTLA-4またはPD-1として抗原をコードするmRNAの発現を抑制する干渉RNAであり得る。この方法を使用して、ユニバーサルなドナー細胞を調製することができる。同種異系抗原の発現を変化させるために使用されるRNAは、単独でまたは標的細胞の脱分化をもたらすRNAと組み合わせて使用され得る。いくつかの態様では、生物学的に活性なRNAは、低分子干渉RNA（siRNA）である。siRNAは、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導し、それにより遺伝子発現を減少またはさらには阻害できる、二本鎖RNAである。一例では、siRNAは、siRNAと標的RNAとの間の配列同一性の領域内でmRNAなどの相同RNA分子の特異的分解を誘発する。例えば、WO 02/44321は、3'オーバーハング端と塩基対合したときに標的mRNAの配列特異的な分解が可能なsiRNAを開示しており、これらのsiRNAを製造する方法は、参照により本明細書に組み入れられる。
別の態様では、CARおよび／またはオルソゴナル受容体のための発現ベクターは、ウイルスベクターであり得る。本明細書において使用される場合、ウイルスベクターという用語は、その従来の意味で使用され、タンパク質合成またはエネルギー生成機構を有しない任意の偏性細胞内寄生体のことを指し、一般に、外因性導入遺伝子を哺乳動物細胞に送達するために一般的に用いられているエンベロープを持ったまたはエンベロープを持たない任意の動物ウイルスのことを指す。ウイルスベクターは、複製可能（例えば、実質的に野生型）、条件付き複製（ある特定の条件下で複製するように組換え操作された）または複製欠損（ウイルスの欠失した機能を補完可能な細胞株の非存在下で実質的に複製不能）であり得る。ウイルスベクターは、そのウイルスベクターが「選択的に複製する」ようにする、すなわち、ある特定の細胞型または表現型の細胞状態（例えば、がん性）において優先的に複製する、ある特定の改変を保有することができる。本発明の実施において有用なウイルスベクター系としては、例えば、天然に存在するまたは組換えのウイルスベクター系が挙げられる。本発明の実施において有用なウイルスの例としては、組換え改変されたエンベロープを持ったまたはエンベロープを持たないDNAおよびRNAウイルスが挙げられる。例えば、ウイルスベクターは、ヒトまたはウシアデノウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シンドビスウイルス、およびレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスを非限定的に含む）、ならびにB型肝炎ウイルスのゲノムに由来することができる。典型的には、関心対象の遺伝子がそのようなベクターに挿入されることで、遺伝子構築物が、典型的にはウイルスゲノム配列を伴ってパッケージングされ、それに続き、感受性宿主細胞の感染が起こり、その結果、関心対象の遺伝子（例えば、ターゲティング抗原）の発現がもたらされる。加えて、抗ターゲティング抗原CARをコードする発現ベクターはまた、mRNAベクターでもあり得る。ウイルスベクター系がトランスフェクションに用いられる場合、レトロウイルスまたはレンチウイルス発現ベクターを使用することでT-細胞への遺伝子移入の有効性が増強され、その結果、臨床適用のための大量のT-細胞培養に時間短縮をもたらすため、T-細胞をトランスフェクトするためにこれらの系が好ましい。特に、ガンマレトロウイルスが臨床グレードのT-細胞の遺伝子改変にとりわけ好ましく、治療効果を有することが示されている。Pule, et al. (2008) Nature Medicine 14(11):1264-1270。同様に、静止状態のT-細胞への組み込みが実証されていることから、自己不活性型レンチウイルスベクターも有用である。June, et al. (2009) Nat Rev Immunol 9(10):704-716。
CARおよび／またはオルソゴナル受容体をコードする発現ベクターは、CARおよび／またはオルソゴナル受容体に加えて、1つまたは複数のポリペプチドをコードし得る。本発明の実施におけるように複数のポリペプチドを発現する際、各ポリペプチドが発現制御配列に機能的に連結されてもよく（単シストロン性）、または、複数のポリペプチドが多シストロン性構築物によってコードされてもよく、そこで、複数のポリペプチドが単一の発現制御配列の制御下で発現される。一態様では、発現ベクターは、CARおよびオルソゴナルCD122をコードする核酸配列を含む多シストロン性発現カセットを含む。
一態様では、CARおよび／またはオルソゴナル受容体をコードする発現ベクターは、任意で、本明細書に記載されるように1つまたは複数のポリペプチド補助作用物質をさらにコードし得る。いくつかの態様では、ターゲティング抗原をコードする発現ベクターは、任意で、本明細書に記載されるように1つまたは複数のポリペプチド補助作用物質をさらにコードし得る。免疫学的モジュレーター。本発明の実施において有用な免疫学的モジュレーターの例としては、サイトカインが挙げられるが、それらに限定されない。そのようなサイトカインの例は、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-10、IL-12の1つまたは複数を非限定的に含むインターロイキン、TNF-アルファ、インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファ-2b、インターフェロン-ベータ、インターフェロン-ガンマ、GM-CSF、MIP1-アルファ、MIP1-ベータ、MIP3-アルファ、TGF-ベータおよび免疫応答をモジュレート可能な他の好適なサイトカインである。発現されたサイトカインは、細胞内発現に指向され得るか、細胞外提示または分泌のためにシグナル配列と共に発現され得る。CARのIL-12との共投与は、報告では、増強された抗腫瘍有効性をもたらすとされている（2017年9月05日にオンラインで公開されたYeku, et al Scientific Reports Vol. 7, Article number: 10541(2017)を参照のこと）。
複数の発現カセットの使用に代わる手段として、CARおよびオルソゴナルCD122ポリペプチドをコードする核酸配列は、多シストロン性構築物によってコードされてもよく、CARおよびオルソゴナルCD122ポリペプチドの核酸配列を含む発現カセットは、標的細胞における共発現を容易にするために内部リボソーム進入部位（IRES）エレメントまたは手足口病ウイルスタンパク質2A（FMVD2A）を用いる。一態様では、発現ベクターは、2つの発現カセットを含み、第1の発現カセットは、発現制御配列に機能的に連結されたCARをコードする核酸配列を含み、第2の発現カセッは、発現制御配列に機能的に連結されたオルソゴナルCD122をコードする核酸配列を含み、いずれの場合も、発現制御配列は、CARおよびオルソゴナルCD122の宿主発現に使用されるために細胞型（例えば、T細胞）において機能的である。一態様では、発現ベクターは、CARおよびオルソゴナルCD122をコードする核酸配列を含む多シストロン性発現カセットを含む。
発現ベクターは、任意で、「救済」遺伝子をコードする核酸配列を含む追加の発現カセットを提供し得る。「救済遺伝子」は、その発現によって、細胞が外部因子による殺傷に感受性になるかまたは細胞内で細胞が殺傷されるような毒性条件を生じる、核酸配列である。救済遺伝子を提供することによって、形質導入された細胞の選択的な細胞殺傷が可能となる。したがって、救済遺伝子は、前記構築物が哺乳動物対象の細胞に組み込まれたときに、望ましくない形質導入細胞の伝播または複製可能なベクター系の効果を阻止する追加の安全措置を提供する。一態様では、救済遺伝子は、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子であり（例えば、1997年5月20日に発表されたWooらの米国特許第5,631,236号および1997年2月11日に発表されたFreemanらの米国特許第5,601,818号を参照のこと）、TK遺伝子産物を発現する細胞がガンシクロビルの投与による選択的殺傷に感受性になる。
抗ターゲティング抗原CARをコードする発現ベクターを用いたT-細胞の形質転換
抗ターゲティング抗原CARをコードする発現ベクターを用いてT-細胞を形質転換するための前提条件は、T-細胞の供給源である。T-細胞は、処置しようとする哺乳動物対象から得てもよく、または当技術分野において入手可能な多様なT細胞株のいずれかであってもよい。形質転換のためのT-細胞は、典型的には、処置しようとする哺乳動物対象から得られる。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、脾臓組織および腫瘍を含め、哺乳動物対象の多数の供給源から得ることができる。一態様では、T-細胞は、アフェレーシスによって得られる。別の態様では、T細胞は、末梢血から単離され、抗CD3/抗CD28コンジュゲートビーズとのインキュベーションなどの当技術分野において周知である選択技術によって特定のT細胞（CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+およびCD45RO+T細胞など）を単離することができる。
選択されたT-細胞の集団は、抗ターゲティング抗原CARをコードする発現ベクターを用いて、本明細書上記の教示に実質的に従って形質転換される。形質転換後、T細胞は、一般に、例えば、米国特許6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；および米国特許出願公報第2006/0121005号に記載されているような方法を使用して活性化および拡大増殖することができる。一般に、本発明のT細胞は、細胞を、CD3 TCR複合体関連シグナルを刺激する作用物質（例えば、抗CD3抗体）およびT細胞の表面上の共刺激分子を刺激する作用物質（例えば、抗CD28抗体）を提供する表面と接触させて培養することによって拡大増殖される。T細胞培養に適する条件は、当技術分野において周知である。Lin, et al. (2009) Cytotherapy 11(7):912-922（Optimization and validation of a robust human T-cell culture method for monitoring phenotypic and polyfunctional antigen-specific CD4 and CD8 T-cell responses）；2015年1月16日にオンラインで公開されたSmith, et al. (2015) Clinical & Translational Immunology 4:e31（"Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement"）。標的細胞は、成長を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気＋5％ CO2）下で維持される。
オルソゴナル受容体を発現させるための免疫細胞の遺伝子改変
ベクターからのオルソゴナル受容体の発現に代わる手段として、当技術分野において公知の技術を使用してオルソゴナル受容体を発現するように細胞のゲノムを改変してもよい。いくつかの態様では、本開示の組成物および方法は、少なくとも1つのエンドヌクレアーゼを使用して式1のオルソゴナルhCD122のECDの修飾をヒト免疫細胞のゲノム配列に容易に組み込むことによってヒト免疫細胞を遺伝子改変する工程を含む。本明細書において使用される場合、「エンドヌクレアーゼ」という用語は、DNA分子またはRNA分子、好ましくはDNA分子内の核酸間の結合の開裂を触媒可能な野生型または変異型酵素のことを指すために使用される。本開示のエンドヌクレアーゼは、特異的な「標的」配列を有する核酸分子を認識してそれを開裂するという点で、配列特異的である。エンドヌクレアーゼはしばしば、標的配列に特徴的な特異性および配列同一性の程度に関して分類される。エンドヌクレアーゼは、約12塩基対（bp）長を超える、より好ましくは14～55bpのポリヌクレオチド認識部位を有するときに「稀少切断（rare-cutting）」エンドヌクレアーゼと称される。稀少切断エンドヌクレアーゼは、ある遺伝子座にある遺伝子を不活性化するために使用することができ、または、相同組換え（HR）によって、すなわち、ある遺伝子座でDNA二本鎖切断（DSB）を誘導してこの遺伝子座に遺伝子修復機序により外因性DNAを挿入することによって導入遺伝子を組み込むために使用することができる。稀少切断エンドヌクレアーゼの例としては、ホーミングエンドヌクレアーゼ（Grizot, et al (2009) Nucleic Acids Research 37(16):5405-5419）、操作されたジンクフィンガードメインの融合から生じるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）（Porteus M and Carroll D., Gene targeting using zinc finger nucleases (2005) Nature Biotechnology 23(3):967-973）、TALE-ヌクレアーゼ、CRISPR系からのCas9エンドヌクレアーゼ、または配列特異性が拡張された修飾制限エンドヌクレアーゼ（Eisenschmidt, et al. 2005；33(22): 7039-7047）が挙げられる。本発明のいくつかの態様では、免疫細胞（例えば、式1のオルソゴナル受容体ECDを発現するCAR-T）は、T-細胞受容体（TCR）の1つまたは複数の成分の不活性化を通じて同種反応性が低減するように改変される。そのようなT細胞の改変方法は、2013年11月28日に公開されたGalettoらの米国特許出願公報第US 2013/015884A1号に記載されており、機能性CD3複合体の回復をもたらすpTアルファを発現させることによるTCRアルファ欠損T-細胞の方法は、2019年10月21日に発表されたGalettoらの米国特許第10,426,795B2号に記載されている。その教示は、参照により本明細書に組み入れられる。
オルソリガンドとのオルソCAR-T細胞の使用
一態様では、本開示は、混合細胞集団からオルソゴナルCD122受容体を発現する操作された細胞の集団を選択的に拡大増殖させる方法であって、混合細胞集団と本開示のIL2オルソログとを、操作された細胞の増殖を容易にする条件下で接触させることを含む、方法を提供する。オルソゴナルCD122受容体を発現するCAR-T細胞の一態様では、オルソゴナル受容体を発現するCAR-T細胞はまた、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞のバックグラウンドまたは混合集団から本明細書に記載されるIL2オルソログの使用を通じて選択的に拡大増殖され得る。治療適用のためのT細胞の拡大増殖は、典型的には、細胞を、CD3 TCR複合体関連シグナルを刺激する作用物質およびT-細胞の表面上の共刺激分子を刺激する作用物質を提供する表面と接触させて培養することを伴う。従来の実施では、操作されたT-細胞は、特に臨床適用で使用するためのCAR-T細胞の調製において、細胞療法製品の投与前に、CD3/D28との接触によって刺激される。T-細胞のビーズベースの活性化を容易にするために、Invitrogen（登録商標）CTS Dynabeads（登録商標）CD3/28（Life Technologies, Inc. Carlsbad CA）またはMiltenyi MACS（登録商標）GMP ExpAct TregビーズまたはMiltenyi MACS GMP TransAct（商標）CD3/28ビーズ（Miltenyi Biotec, Inc.）を非限定的に含め多様な市販の製品が利用可能である。T-細胞培養に適する条件は、当技術分野において周知である。Lin, et al. (2009) Cytotherapy 11(7):912-922；2015年1月16日にオンラインで公開されたSmith, et al. (2015) Clinical & Translational Immunology 4:e31。標的細胞は、成長を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気＋5％ CO2）下で維持される。ここでは、CD122オルソゴナル受容体を発現する操作されたT細胞を含有する混合細胞集団は、一定濃度のIL2オルソログの存在下で、いくつかの態様では、少なくとも2時間、あるいは少なくとも3時間、あるいは少なくとも4時間、あるいは少なくとも6時間、あるいは少なくとも8時間、あるいは少なくとも12時間、あるいは少なくとも24時間、あるいは少なくとも48時間、あるいは少なくとも72時間、またはより長く培養される。そのようなエクスビボ状況下でのIL2オルソログの濃度は、その細胞集団において細胞増殖を誘導するのに十分である。T細胞増殖は、顕微鏡法によって容易に評価することができ、IL2オルソログの最適な濃度の決定は、オルソゴナルCD122受容体に対するIL2オルソログの相対活性に依存するだろう。
細胞をIL2オルソログとインビトロで接触させる場合、操作された細胞に、サイトカインが、受容体からのシグナル伝達を活性化するのに十分な用量および期間で加えられ、天然の細胞機構、例えば、アクセサリータンパク質、共受容体などを利用してもよい。任意の好適な培養培地が使用され得る。そのように活性化された細胞は、抗原特異性、サイトカインプロファイリングなどの決定に関する実験目的を含む任意の所望の目的に、およびインビボ送達のために使用され得る。
接触がインビボで実施される場合、オルソゴナルCD122受容体を発現するように改変されたCAR-T細胞を非限定的に含む操作された細胞の有効量を、オルソゴナルサイトカイン、例えばIL2の投与と組み合わせてまたはその前に、レシピエントに注入し、T細胞をそれらの天然の環境、例えばリンパ節などにおいて接触させる。投与量および頻度は、作用物質；投与の様式；IL2オルソログの性質などに応じて変動し得る。そのようなガイドラインは個々の状況に合わせて調整されることが当業者によって理解されよう。投与量はまた、投与の経路、例えば、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内注入などに合わせて変更してもよい。一般に、少なくとも約104個の操作された細胞/kg、少なくとも約105個の操作された細胞/kg；少なくとも約106個の操作された細胞/kg、少なくとも約107個の操作された細胞/kg、またはそれ以上が投与される。
操作された細胞がT細胞である場合、増強された免疫応答は、レシピエント中に存在する標的細胞に対する、例えば腫瘍細胞、感染細胞の排除に対するT細胞の細胞溶解応答の増加；自己免疫疾患の症状の減少；などとして出現し得る。操作されたT細胞集団を対象に投与しようとするいくつかの態様では、対象に、免疫抑制による治療コースが、操作されたT細胞集団の投与の前またはそれと組み合わせて提供される。そのような免疫抑制レジメンの例としては、全身性コルチコステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン）が挙げられるが、それらに限定されない。B細胞枯渇のための治療は、血清免疫グロブリンレベルを正常レベルに回復させるための確立された臨床投薬ガイドラインによる静脈内免疫グロブリン（IVIG）を含む。いくつかの態様では、本発明のCAR-T細胞療法の投与前に、対象を、任意で、リンパ球枯渇レジメンに供してもよい。そのようなリンパ球枯渇レジメンの一例は、対象へのフルダラビン（30mg/m2を静脈内に4日間にわたり毎日）およびシクロホスファミド（フルダラビンの初回用量から開始して500mg/m2をIVに2日間にわたり毎日）の投与からなる。
操作されたT細胞は、治療用途に適した、例えばヒト処置に適した薬学的組成物中に提供することができる。そのような細胞を含む治療用製剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と共に凍結するか、または投与のために水溶液の形態で調製することができる。細胞は、適正医療規範（good medical practice）に適合する様式で製剤化、配合および投与される。この状況において考慮される要因は、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、作用物質の送達部位、投与方法、投与スケジュールおよび医師に公知の他の要因を含む。
細胞は、任意の好適な手段、通常は非経口手段によって投与することができる。非経口注入としては、筋肉内、静脈内（ボーラスまたは緩徐注入）、動脈内、腹腔内、脊髄内または皮下投与が挙げられる。典型的な実施では、操作されたT細胞は、生理学的に許容される媒体中で、通常は血管内により対象に注入されるが、細胞が適切な成長部位を見いだし得る任意の他の都合のよい部位に導入してもよい。通常、少なくとも1×105個の細胞/kg、少なくとも1×106個の細胞/kg、少なくとも1×107個の細胞/kg、少なくとも1×108個の細胞/kg、少なくとも1×109個の細胞/kg、またはそれ以上が投与されるが、通常、これは、収集の過程で得られるT細胞の数によって制限を受ける。
例えば、本発明の実施において使用するためのhoRB細胞の投与のための典型的な範囲は、治療単位当たりの対象の体重1kg当たり約1×105個～5×108個の生存細胞の範囲である。したがって、体重に合わせて調整されたヒト対象における生存細胞の典型的な投与範囲は、治療単位当たりおよそ1×106個～およそ1×1013個の生存細胞、あるいはおよそ5×106個～およそ5×1012個の生存細胞、あるいはおよそ1×107個～およそ1×1012個の生存細胞、あるいはおよそ5×107個～およそ1×1012個の生存細胞、あるいはおよそ1×108個～およそ1×1012個の生存細胞、あるいはおよそ5×108個～およそ1×1012個の生存細胞、あるいはおよそ1×109個～およそ1×1012個の生存細胞の範囲である。一態様では、細胞の用量は、治療単位当たり2.5～5×109個の生存細胞の範囲である。
治療単位は、単回用量または一定期間にわたる複数回用量であり得る。いくつかの態様では、細胞は、単回用量で投与される。いくつかの態様では、細胞は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、30、60、90、120または180日の期間にわたって投与される、2以上の分割用量で投与される。そのような分割投薬プロトコルで投与される操作された細胞の量は、投与毎に同じであってもよく、または異なるレベルで提供されてもよい。特定の期間にわたる複数日の投薬プロトコルが、細胞の投与をモニタリングしている当業者（例えば、医師）によって、上で考察したような処置の有害作用およびそれらの調節を含む処置に対する対象の応答を考慮して提供され得る。
リンパ球枯渇の非存在
本開示の組成物および方法はまた、先行リンパ球枯渇の非存在下でのT細胞療法（とりわけ、CAR T細胞療法）による対象の処置のための方法を提供する。リンパ球枯渇は、典型的には、対象においてCAR T細胞療法と併せて実施されるが、それは、その後の混合細胞集団の投与と操作された細胞集団を対象において拡大増殖させるための非特異的な作用物質（例えば、IL2）の投与は、細胞療法製品の投与と組み合わせると、広範囲に活性化をもたらす作用物質の投与による広範囲に及ぶ免疫細胞の増殖および活性化ならびに細胞療法製品それ自体中のかなりの割合の操作されていない細胞の存在から生じる、有意な全身毒性（サイトカイン放出症候群または「サイトカインストーム」を含む）をもたらすからである。本開示の方法および組成物は、前述のエクスビボ法が用いられた際の操作されていない細胞の混入がほとんどない操作された細胞の実質的に精製された集団、ならびに／または、IL2などの非特異的増殖物質の実質的に低下したオフターゲット効果を提供するIL2オルソログによる操作されたT細胞の選択的活性化および拡大増殖を両方（またはいずれか）提供することによって、この有意な障害を取り除く。
例えば、CAR-T細胞療法の現在の臨床実践では、CAR-T細胞は、一般的に、宿主免疫回復の前に、CAR-T細胞の拡大増殖を容易にするためのリンパ球枯渇（例えば、アレムツズマブ（モノクローナル抗CD52）、プリン類似体などの投与による）と組み合わせて投与される。いくつかの態様では、CAR-T細胞は、アレムツズマブに対する耐性について改変されてもよい。本発明の一局面では、CAR-T療法に関連して現在用いられているリンパ球枯渇は、オルソゴナルリガンドを発現するCAR-Tによって不要になるかまたは軽減され得る。上で述べたように、リンパ球枯渇は、一般的に、CAR-T細胞の拡大増殖を可能にするために用いられる。しかしながら、リンパ球枯渇はまた、CAR-T細胞療法の主な副作用にも関連する。オルソゴナルリガンドは、特定のT-細胞集団を選択的に拡大増殖させる手段を提供するので、オルソゴナルリガンドを発現するCAR-Tの投与前のリンパ球枯渇の必要性が軽減され得る。本発明は、オルソゴナルリガンドを発現するCAR-Tの投与前にリンパ球枯渇を必要としないかまたはそれが軽減された、CAR-T細胞療法の実施を可能にする。
一態様では、本開示は、オルソゴナルリガンドCAR-Tの投与前にリンパ球枯渇の非存在下で、CAR-T細胞療法で処置可能な疾患、障害または病態（例えば、がん）を患っている対象をオルソゴナルリガンド発現CAR-Tの投与により処置する方法を提供する。一態様では、本開示は、1つまたは複数の表面抗原（例えば、腫瘍抗原）の発現によって特徴付けられる異常な細胞集団の存在に関連する疾患、障害（例えば、腫瘍）を患っている哺乳動物対象の処置の方法であって、（a）個体からT-細胞を含む生体試料を得る工程；（b）T-細胞の存在について生体試料を濃縮する工程；（c）T-細胞に、CARをコードする核酸配列およびオルソゴナルCD122受容体をコードする核酸配列を含む1つまたは複数の発現ベクターをトランスフェクトする工程であって、CARの抗原ターゲティングドメインが、異常な細胞集団上に存在する少なくとも1つの抗原に結合可能である、工程；（d）オルソゴナル受容体を発現するCAR-T細胞の集団をIL2オルソログ用いてエクスビボで拡大増殖させる工程；（e）オルソゴナル受容体を発現するCAR-T細胞の薬学的に有効な量を哺乳動物に投与する工程；ならびに（f）CAR-T細胞上に発現されるオルソゴナルCD122受容体に選択的に結合するIL2オルソログの治療有効量の投与によってオルソゴナルCD122受容体を発現するCAR-T細胞の成長をモジュレートする工程を含む、方法を提供する。一態様では、前述の方法は、CAR-T細胞療法のコースの開始前に哺乳動物のリンパ球枯渇または免疫抑制を伴う。別の態様では、前述の方法は、哺乳動物のリンパ球枯渇および／または免疫抑制の非存在下で実施される。
オルソリガンドを使用したオルソゴナル免疫細胞の閾値レベルの経時的な維持：
オルソゴナル免疫細胞をオルソゴナルリガンドと組み合わせて使用する本開示の方法の実施における一態様では、オルソゴナルリガンドは、ヒト対象の循環中でオルソゴナル細胞の治療有効循環レベルを維持する量で対象に投与され、オルソゴナルの治療有効循環レベルは、対象の体重1kg当たり約10,000個～約1,000,000個のオルソゴナル細胞、あるいは約20,000個～約500,000個のオルソゴナル細胞、あるいは約30,000個～約300,000個のオルソゴナル細胞、あるいは約30,000個～約200,000個のオルソゴナル細胞、あるいは約20,000個～約150,000個のオルソゴナル細胞、あるいは約50,000個～約150,000個のオルソゴナル細胞であり、オルソゴナルリガンド、例えば、式1のオルソゴナルリガンドの定期的投与によって、少なくとも1週間、あるいは少なくとも2週間、あるいは少なくとも3週間、あるいは少なくとも1ヶ月、あるいは少なくとも2ヶ月、あるいは少なくとも3ヶ月、あるいは少なくとも6ヶ月、あるいは少なくとも9ヶ月、あるいは少なくとも12ヶ月の期間にわたって維持される。操作された細胞の定量は、従来の抗体ベースの方法によって容易に決定され得る。CRPおよびフェリチンの過剰レベルが、CRSの発生を評価するために臨床で使用され、典型的には、担当医によってモニタリングされ、ヒト対象の応答が変動し得ることに合わせて、オルソゴナル細胞の最適な耐容可能でかつ効果的なレベルおよびそのようなレベルを維持するために必要なオルソゴナルリガンドのレベルが決定される。個々の患者についてのオルソゴナル細胞の最適な循環濃度の特定は、細胞療法の通常の実践者の技能の範囲内である。
先に述べたように、本開示は、初期オルソゴナル細胞療法処置に対して有意な臨床応答の証拠を示す対象を維持レジメンの投与により処置して再発または再燃を阻止する方法であって、より低いオルソゴナル細胞循環レベルが維持されるようにより低い用量のオルソゴナルリガンドが対象に定期的に投与され、オルソゴナルリガンド、例えば、式1のオルソゴナルリガンドの定期的投与によって、対象の体重1kg当たり約10,000個～約500,000個のオルソゴナル細胞、あるいは約10,000個～約200,000個のオルソゴナル細胞、あるいは約10,000個～約100,000個のオルソゴナル細胞が、少なくとも1週間、あるいは少なくとも2週間、あるいは少なくとも3週間、あるいは少なくとも1ヶ月、あるいは少なくとも2ヶ月、あるいは少なくとも3ヶ月、あるいは少なくとも6ヶ月、あるいは少なくとも9ヶ月、あるいは少なくとも12ヶ月の維持段階期間にわたって維持される、方法を提供する。
オルソリガンドとのオルソCAR-T細胞の使用
一態様では、本開示は、混合細胞集団からオルソゴナルCD122受容体を発現する操作された細胞の集団を選択的に拡大増殖させる方法であって、混合細胞集団と本開示のIL2オルソログとを、操作された細胞の増殖を容易にする条件下で接触させることを含む、方法を提供する。オルソゴナルCD122受容体を発現するCAR-T細胞の一態様では、オルソゴナル受容体を発現するCAR-T細胞はまた、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞のバックグラウンドまたは混合集団から本明細書に記載されるIL2オルソログの使用を通じて選択的に拡大増殖され得る。治療適用のためのT細胞の拡大増殖は、典型的には、細胞を、CD3 TCR複合体関連シグナルを刺激する作用物質およびT-細胞の表面上の共刺激分子を刺激する作用物質を提供する表面と接触させて培養することを伴う。従来の実施では、操作されたT-細胞は、特に臨床適用で使用するためのCAR-T細胞の調製において、細胞療法製品の投与前に、CD3/D28との接触によって刺激される。T-細胞のビーズベースの活性化を容易にするために、Invitrogen（登録商標）CTS Dynabeads（登録商標）CD3/28（Life Technologies, Inc. Carlsbad CA）またはMiltenyi MACS（登録商標）GMP ExpAct TregビーズまたはMiltenyi MACS GMP TransAct（商標）CD3/28ビーズ（Miltenyi Biotec, Inc.）を非限定的に含め多様な市販の製品が利用可能である。T-細胞培養に適する条件は、当技術分野において周知である。Lin, et al. (2009) Cytotherapy 11(7):912-922；2015年1月16日にオンラインで公開されたSmith, et al. (2015) Clinical & Translational Immunology 4:e31。標的細胞は、成長を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気＋5％ CO2）下で維持される。ここでは、CD122オルソゴナル受容体を発現する操作されたT細胞を含有する混合細胞集団は、一定濃度のIL2オルソログの存在下で、いくつかの態様では、少なくとも2時間、あるいは少なくとも3時間、あるいは少なくとも4時間、あるいは少なくとも6時間、あるいは少なくとも8時間、あるいは少なくとも12時間、あるいは少なくとも24時間、あるいは少なくとも48時間、あるいは少なくとも72時間、またはより長く培養される。そのようなエクスビボ状況下でのIL2オルソログの濃度は、その細胞集団において細胞増殖を誘導するのに十分である。T細胞増殖は、顕微鏡法によって容易に評価することができ、IL2オルソログの最適な濃度の決定は、オルソゴナルCD122受容体に対するIL2オルソログの相対活性に依存するだろう。
細胞をIL2オルソログとインビトロで接触させる場合、操作された細胞に、サイトカインが、受容体からのシグナル伝達を活性化するのに十分な用量および期間で加えられ、天然の細胞機構、例えば、アクセサリータンパク質、共受容体などを利用してもよい。任意の好適な培養培地が使用され得る。そのように活性化された細胞は、抗原特異性、サイトカインプロファイリングなどの決定に関する実験目的を含む任意の所望の目的に、およびインビボ送達のために使用され得る。
接触がインビボで実施される場合、オルソゴナルCD122受容体を発現するように改変されたCAR-T細胞を非限定的に含む操作された細胞の有効量を、オルソゴナルサイトカイン、例えばIL2の投与と組み合わせてまたはその前に、レシピエントに注入し、T細胞をそれらの天然の環境、例えばリンパ節などにおいて接触させる。投与量および頻度は、作用物質；投与の様式；IL2オルソログの性質などに応じて変動し得る。そのようなガイドラインは個々の状況に合わせて調整されることが当業者によって理解されよう。投与量はまた、投与の経路、例えば、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内注入などに合わせて変更してもよい。一般に、少なくとも約104個の操作された細胞/kg、少なくとも約105個の操作された細胞/kg；少なくとも約106個の操作された細胞/kg、少なくとも約107個の操作された細胞/kg、またはそれ以上が投与される。
操作された細胞がT細胞である場合、増強された免疫応答は、レシピエント中に存在する標的細胞に対する、例えば腫瘍細胞、感染細胞の排除に対するT細胞の細胞溶解応答の増加；自己免疫疾患の症状の減少；などとして出現し得る。操作されたT細胞集団を対象に投与しようとするいくつかの態様では、対象に、免疫抑制による治療コースが、操作されたT細胞集団の投与の前またはそれと組み合わせて提供される。そのような免疫抑制レジメンの例としては、全身性コルチコステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン）が挙げられるが、それらに限定されない。B細胞枯渇のための治療は、血清免疫グロブリンレベルを正常レベルに回復させるための確立された臨床投薬ガイドラインによる静脈内免疫グロブリン（IVIG）を含む。いくつかの態様では、本発明のCAR-T細胞療法の投与前に、対象を、任意で、リンパ球枯渇レジメンに供してもよい。そのようなリンパ球枯渇レジメンの一例は、対象へのフルダラビン（30mg/m2を静脈内に4日間にわたり毎日）およびシクロホスファミド（フルダラビンの初回用量から開始して500mg/m2をIVに2日間にわたり毎日）の投与からなる。
操作されたT細胞は、治療用途に適した、例えばヒト処置に適した薬学的組成物中に提供することができる。そのような細胞を含む治療用製剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と共に凍結するか、または投与のために水溶液の形態で調製することができる。細胞は、適正医療規範に適合する様式で製剤化、配合および投与される。この状況において考慮される要因は、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、作用物質の送達部位、投与方法、投与スケジュールおよび医師に公知の他の要因を含む。
細胞は、任意の好適な手段、通常は非経口手段によって投与することができる。非経口注入としては、筋肉内、静脈内（ボーラスまたは緩徐注入）、動脈内、腹腔内、脊髄内または皮下投与が挙げられる。典型的な実施では、操作されたT細胞は、生理学的に許容される媒体中で、通常は血管内により対象に注入されるが、細胞が適切な成長部位を見いだし得る任意の他の都合のよい部位に導入してもよい。通常、少なくとも1×105個の細胞/kg、少なくとも1×106個の細胞/kg、少なくとも1×107個の細胞/kg、少なくとも1×108個の細胞/kg、少なくとも1×109個の細胞/kg、またはそれ以上が投与されるが、通常、これは、収集の過程で得られるT細胞の数によって制限を受ける。
例えば、本発明の実施において使用するためのhoRB細胞の投与のための典型的な範囲は、治療単位当たりの対象の体重1kg当たり約1×105個～5×108個の生存細胞の範囲である。したがって、体重に合わせて調整されたヒト対象における生存細胞の典型的な投与範囲は、治療単位当たりおよそ1×106個～およそ1×1013個の生存細胞、あるいはおよそ5×106個～およそ5×1012個の生存細胞、あるいはおよそ1×107個～およそ1×1012個の生存細胞、あるいはおよそ5×107個～およそ1×1012個の生存細胞、あるいはおよそ1×108個～およそ1×1012個の生存細胞、あるいはおよそ5×108個～およそ1×1012個の生存細胞、あるいはおよそ1×109個～およそ1×1012個の生存細胞の範囲である。一態様では、細胞の用量は、治療単位当たり2.5～5×109個の生存細胞の範囲である。
治療単位は、単回用量または一定期間にわたる複数回用量であり得る。いくつかの態様では、細胞は、単回用量で投与される。いくつかの態様では、細胞は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、30、60、90、120または180日の期間にわたって投与される、2以上の分割用量で投与される。そのような分割投薬プロトコルで投与される操作された細胞の量は、投与毎に同じであってもよく、または異なるレベルで提供されてもよい。特定の期間にわたる複数日の投薬プロトコルが、細胞の投与をモニタリングしている当業者（例えば、医師）によって、上で考察したような処置の有害作用およびそれらの調節を含む処置に対する対象の応答を考慮して提供され得る。
リンパ球枯渇の非存在
本開示の組成物および方法はまた、先行リンパ球枯渇の非存在下でのT細胞療法（とりわけ、CAR T細胞療法）による対象の処置のための方法を提供する。リンパ球枯渇は、典型的には、対象においてCAR T細胞療法と併せて実施されるが、それは、その後の混合細胞集団の投与と操作された細胞集団を対象において拡大増殖させるための非特異的な作用物質（例えば、IL2）の投与は、細胞療法製品の投与と組み合わせると、広範囲に活性化をもたらす作用物質の投与による広範囲に及ぶ免疫細胞の増殖および活性化ならびに細胞療法製品それ自体中のかなりの割合の操作されていない細胞の存在から生じる、有意な全身毒性（サイトカイン放出症候群または「サイトカインストーム」を含む）をもたらすからである。本開示の方法および組成物は、前述のエクスビボ法が用いられた際の操作されていない細胞の混入がほとんどない操作された細胞の実質的に精製された集団、ならびに／または、IL2などの非特異的増殖物質の実質的に低下したオフターゲット効果を提供するIL2オルソログによる操作されたT細胞の選択的活性化および拡大増殖を両方（またはいずれか）提供することによって、この有意な障害を取り除く。
例えば、CAR-T細胞療法の現在の臨床実践では、CAR-T細胞は、一般的に、宿主免疫回復の前に、CAR-T細胞の拡大増殖を容易にするためのリンパ球枯渇（例えば、アレムツズマブ（モノクローナル抗CD52）、プリン類似体などの投与による）と組み合わせて投与される。いくつかの態様では、CAR-T細胞は、アレムツズマブに対する耐性について改変されてもよい。本発明の一局面では、CAR-T療法に関連して現在用いられているリンパ球枯渇は、オルソゴナルリガンドを発現するCAR-Tによって不要になるかまたは軽減され得る。上で述べたように、リンパ球枯渇は、一般的に、CAR-T細胞の拡大増殖を可能にするために用いられる。しかしながら、リンパ球枯渇はまた、CAR-T細胞療法の主な副作用にも関連する。オルソゴナルリガンドは、特定のT-細胞集団を選択的に拡大増殖させる手段を提供するので、オルソゴナルリガンドを発現するCAR-Tの投与前のリンパ球枯渇の必要性が軽減され得る。本発明は、オルソゴナルリガンドを発現するCAR-Tの投与前にリンパ球枯渇を必要としないかまたはそれが軽減された、CAR-T細胞療法の実施を可能にする。
一態様では、本開示は、オルソゴナルリガンドCAR-Tの投与前にリンパ球枯渇の非存在下で、CAR-T細胞療法で処置可能な疾患、障害または病態（例えば、がん）を患っている対象をオルソゴナルリガンド発現CAR-Tの投与により処置する方法を提供する。一態様では、本開示は、1つまたは複数の表面抗原（例えば、腫瘍抗原）の発現によって特徴付けられる異常な細胞集団の存在に関連する疾患、障害（例えば、腫瘍）を患っている哺乳動物対象の処置の方法であって、（a）個体からT-細胞を含む生体試料を得る工程；（b）T-細胞の存在について生体試料を濃縮する工程；（c）T-細胞に、CARをコードする核酸配列およびオルソゴナルCD122受容体をコードする核酸配列を含む1つまたは複数の発現ベクターをトランスフェクトする工程であって、CARの抗原ターゲティングドメインが、異常な細胞集団上に存在する少なくとも1つの抗原に結合可能である、工程；（d）オルソゴナル受容体を発現するCAR-T細胞の集団をIL2オルソログ用いてエクスビボで拡大増殖させる工程；（e）オルソゴナル受容体を発現するCAR-T細胞の薬学的に有効な量を哺乳動物に投与する工程；ならびに（f）CAR-T細胞上に発現されるオルソゴナルCD122受容体に選択的に結合するIL2オルソログの治療有効量の投与によってオルソゴナルCD122受容体を発現するCAR-T細胞の成長をモジュレートする工程を含む、方法を提供する。一態様では、前述の方法は、CAR-T細胞療法のコースの開始前に哺乳動物のリンパ球枯渇または免疫抑制を伴う。別の態様では、前述の方法は、哺乳動物のリンパ球枯渇および／または免疫抑制の非存在下で実施される。
オルソリガンドを使用したオルソゴナル免疫細胞の閾値レベルの経時的な維持：
オルソゴナル免疫細胞をオルソゴナルリガンドと組み合わせて使用する本開示の方法の実施における一態様では、オルソゴナルリガンドは、ヒト対象の循環中でオルソゴナル細胞の治療有効循環レベルを維持する量で対象に投与され、オルソゴナルの治療有効循環レベルは、対象の体重1kg当たり約10,000個～約1,000,000個のオルソゴナル細胞、あるいは約20,000個～約500,000個のオルソゴナル細胞、あるいは約30,000個～約300,000個のオルソゴナル細胞、あるいは約30,000個～約200,000個のオルソゴナル細胞、あるいは約20,000個～約150,000個のオルソゴナル細胞、あるいは約50,000個～約150,000個のオルソゴナル細胞であり、オルソゴナルリガンド、例えば、式1のオルソゴナルリガンドの定期的投与によって、少なくとも1週間、あるいは少なくとも2週間、あるいは少なくとも3週間、あるいは少なくとも1ヶ月、あるいは少なくとも2ヶ月、あるいは少なくとも3ヶ月、あるいは少なくとも6ヶ月、あるいは少なくとも9ヶ月、あるいは少なくとも12ヶ月の期間にわたって維持される。操作された細胞の定量は、従来の抗体ベースの方法によって容易に決定され得る。CRPおよびフェリチンの過剰レベルが、CRSの発生を評価するために臨床で使用され、典型的には、担当医によってモニタリングされ、ヒト対象の応答が変動し得ることに合わせて、オルソゴナル細胞の最適な耐容可能でかつ効果的なレベルおよびそのようなレベルを維持するために必要なオルソゴナルリガンドのレベルが決定される。個々の患者についてのオルソゴナル細胞の最適な循環濃度の特定は、細胞療法の通常の実践者の技能の範囲内である。
先に述べたように、本開示は、初期オルソゴナル細胞療法処置に対して有意な臨床応答の証拠を示す対象を維持レジメンの投与により処置して再発または再燃を阻止する方法であって、より低いオルソゴナル細胞循環レベルが維持されるようにより低い用量のオルソゴナルリガンドが対象に定期的に投与され、オルソゴナルリガンド、例えば、式1のオルソゴナルリガンドの定期的投与によって、対象の体重1kg当たり約10,000個～約500,000個のオルソゴナル細胞、あるいは約10,000個～約200,000個のオルソゴナル細胞、あるいは約10,000個～約100,000個のオルソゴナル細胞が、少なくとも1週間、あるいは少なくとも2週間、あるいは少なくとも3週間、あるいは少なくとも1ヶ月、あるいは少なくとも2ヶ月、あるいは少なくとも3ヶ月、あるいは少なくとも6ヶ月、あるいは少なくとも9ヶ月、あるいは少なくとも12ヶ月の維持段階期間にわたって維持される、方法を提供する。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様をより詳しく例証するために提示される。しかしながら、これらは、決して、本発明の幅広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例1. ヒトIL2発現ベクターpcDNA3.1/hygro(+)-huIL2の作製
ヒトIL2 DNA ORF（Genbank NM_000586.3）を合成し（Life Technologies GeneArt Service, Carlsbad, CA）、Platinum SuperFi II DNAポリメラーゼキット（item #12361050, ThermoFisher）を製造業者のプロトコルに従って使用し、プライマー：
Figure 2023511274000059
（NheI制限部位を組み込んだ）、および
Figure 2023511274000060
（ApaI制限部位を組み込んだ）
を使用したPCRを介して増幅させた。PCR断片を1％アガロースゲル（item #54803, Lonza, Rockland, ME）上で可視化し、ゲルから切り出して、QIAquick PCR Purification kit（item #28106, Qiagen, Germany）を製造業者のプロトコルに従って使用して精製した。
精製したPCR断片および哺乳動物発現ベクターpcDNA 3.1/Hygro(+)（#V87020, ThermoFisher）をNheIおよびApaI（#R0111Sおよび#R0114L, New England Biolabs, Ipswich, MA）制限酵素で消化した。Quick Dephosphorylation kit（#M0508L, New England Biolabs）を製造業者のプロトコルに従って用いて発現ベクターをさらに処理した。Rapid DNA Ligation Kit（#11635379001, Sigma Aldrich, St. Louis, MO）を製造業者のプロトコルに従って使用してPCR断片をpcDNA 3.1/Hygro(+)にライゲーションし、One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli（#C404006, Life Technologies, Carlsbad, CA）中に形質転換し、100ug/mlのカルベニシリン（#L1010, Teknova, Hollister, CA）を含有するLB寒天プレート上にプレーティングし、37℃で一晩成長させた。
翌日、個々の細菌コロニーを選び取り、これを使用して、100ug/mlのアンピシリン（#A9626, Teknova）を含むLB Broth（#10855-001, Life Technologies）中で3mlの細菌培養を開始した。培養物を37℃で一晩成長させた。
翌日、大腸菌をペレット化し（6,000rpmで10分間、卓上遠心機#5424、Eppendorf, Hauppauge, NY）、QIAprep Spin Miniprep Kit（#27106, Qiagen）を使用してDNA発現ベクターを単離した。プラスミドDNAを配列検証した（MCLab, South San Francisco, CA）。
実施例2. ヒトIL2 ORTHO発現ベクターpcDNA3.1/hygro(+)-huIL2-ORTHOの作製：
ヒトIL2 ORFに6つの変異（E35S、H36Q、L39V、D40L、Q42KおよびM43A；すべての番号付けは、完全長ヒトIL2 ORF NM_000586.3番号付けに基づく）を導入した発現ベクターを、pcDNA3.1/Hygro(+)内ヒトIL2発現ベクターに関する実施例1の教示に実質的に従い、以下を例外としてアセンブルした。PCRに使用する初期テンプレートDNAは、E35S、H36Q、L39V、D40L、Q42KおよびM43A変異を加えて合成した。
実施例3. pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2発現ベクターへの変異の導入またはpcDNA3.1/hygro(+)-huIL2 IRTHO発現ベクターへの逆変異の導入
すべての変異または逆変異（pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2-ORTHO中の変異を野生型ヒトIL2 ORFに適合するように戻す）を、Quik Change II Site Directed Mutagenesis Kit（#200524, Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を製造業者のプロトコルに実質的に従って使用して、pcDNA3.1/Hygro(+)-huIL2またはpcDNA3.1/Hygro(+)-huIL2-ORTHO発現ベクターに導入した。
表5は、作製された変異、変異が導入されるテンプレート、および変異を導入するために使用するプライマーセットを列記する。Quik Change PCR反応物の大腸菌への形質転換、ならびにプラスミドDNAの単離および配列解析は、pcDNA3.1/Hygro-huIL2発現ベクターの作製におけるものと実質的に同じプロトコルを使用して実施した。
（表７）QuikChange変異誘発および変異に関する配列情報
Figure 2023511274000061
Figure 2023511274000062
Figure 2023511274000063
実施例4. HEK293細胞中の一過性トランスフェクション
すべての発現ベクターをHEK293細胞（#CRL-1573, ATCC, Manassas, VA）に一過性トランスフェクトした。約1E6個のHEK293細胞を、6ウェル組織培養プレートの各ウェルの10％ウシ胎児血清（#SH30071.03, Fisher Scientific, Chicago, IL）を補充したDMEM（#10569044, Life Technologies）2ml中にプレーティングし、37℃および5％ CO2で一晩成長させた。
翌日、Lipofectamine 3000 Reagent（#L3000150, Life Technologies）を製造業者のプロトコルに従って使用し、トランスフェクション1回当たり2.5ugのDNA、5ulのP3000試薬および7.5ulのLipofectamine 3000を使用して細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を37℃、5％ CO2で48～72時間成長させ、次いで、馴化培地を採取した。
実施例5. タンパク質発現の分析
タンパク質発現を、Human IL2 V-PLEX ELISA kit（#K151QQD-4, Mesoscale Diagnostics, Baltimore, MD）を製造業者のプロトコル（トランスフェクト培地を最初に1：4、次いで1：2に段階希釈した）に従って使用したELISAによって測定した。このELISAキットに対して製造業者の予めプログラムされた設定を使用してMeso Quickplex SQ120（Mesoscale Diagnostics）でプレートを読み取った。キット内のヒトIL2標準を使用して、馴化培地試料中の概算発現レベルを計算した。下記表8は、発現されたタンパク質についての概算発現レベルを詳述する。
（表８）ヒトIL2オルソログの発現レベル
Figure 2023511274000064
実施例6. hoCD122を発現する細胞株におけるオルソログの活性の評価
IL2オルソログをNKL細胞における活性について評価した（Robertson, et al (1996) Experimental Hematology 24(3):406-15）。ヒトオルソゴナルCD122を発現する細胞株（hoNKL hoRB）を作製するために、hoRB CD122をコードしYFPを共発現する（MSCV-hoRb-IRES-YFP）レトロウイルスを、当技術分野において公知の手順に従ってNKL細胞に感染させた。
NKL細胞およびNKL hoRB細胞を、以下の通り、IL2オルソログをトランスフェクトした293T細胞からの上清と接触させた：細胞を、RPMI 1640（ThermoFisher）、10パーセントのウシ胎児血清（ThermoFisher）、1パーセントのペニシリン／ストレプトマイシン（ThermoFisher）、1パーセントのglutamax（ThermoFisher）からなる成長培地中に50万個の細胞/mlで播種した。培養の2日後、細胞を、96ウェルプレート（Falcon）に、25000個の細胞／ウェルで成長培地100μl中に播種した。トランスフェクトした293T細胞上清の2倍段階希釈物を成長培地中に作製し、各希釈物100μlをデュプリケートでNKL細胞およびNKL hoRB細胞のプレートに1：2～1：256の範囲の最終滴定で加えた。プレートを加湿インキュベーター（ThermoFisher）に移し、セ氏37度、5パーセントの二酸化炭素で3日間インキュベートした。
プレートをインキュベーターから取り出し、室温で30分間維持した。プレートを400×gで5分間遠心し、上清を廃棄した。PBS中のCelltiterglo（Promega）の1：1希釈物を1ウェル当たり50μl加えることによって細胞を溶解した。細胞溶解物をオービタルシェーカー（VWR Scientific）上で600rpmにて2分間混合し、その後、室温で10分間保持した。溶解物を黒色透明底の96ウェルプレート（Costar）に移し、Envision 2103 Multilabel Plate Reader（Perkin Elmer）内でNKL細胞溶解物（図1）およびNKL hoRB細胞溶解物（図2）の発光をカウント毎秒として読み取った。
NKL細胞およびNKL hoRB細胞の増殖に対する各IL2バリアントの効果を比較するために、上清で処置した細胞のcelltiterglo値を、成長培地単独、空のベクタートランスフェクション、野生型IL2トランスフェクションからの293T上清、またはヒトオルソゴナルIL2トランスフェクションからの上清で処置した対照細胞で得られた値と比較した。これらの実験からのデータを添付した図面の図2および3に提示する。
実施例7 播種性RAJI-lucリンパ腫マウスモデルにおけるオルソCAR T細胞の有効性
同族オルソゴナルリガンドと組み合わせたオルソゴナルCAR-T細胞の有効性をマウス白血病モデルにおいて以下の通り評価した。この研究で使用したCD19キメラ抗原受容体タンパク質（本明細書において以降「CD19_28z」と称される）は、以下の構造を有した：GMCSF受容体シグナルペプチド、FMC63 抗CD19 scFv、AAAリンカー、CD28ヒンジ／膜貫通／共刺激ドメインおよびCD3ゼータ。CD19_28zのアミノ酸配列は、以下の通りである：
Figure 2023511274000065
この研究の遂行において使用したオルソゴナルT細胞は、単離されたT細胞にレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることによる当技術分野において公知の技術によって作製した。前述のCD19_28z CAR、T2AリンカーポリペプチドおよびヒトオルソゴナルCD122オルソゴナル受容体（hoCD122）は、以下のアミノ酸配列：
Figure 2023511274000066
を有し、単一のレンチウイルスプラスミドを使用して、オルソゴナルCAR-T細胞の作製が可能となる。得られたオルソゴナルCAR-T細胞は、CD19_28zオルソCAR T細胞と呼ばれ、SYNCAR-001とも称される。
健常ドナーの一次血液単核細胞（primary blood mononuclear cell）（PBMC）をFicoll-Paque分離（Global Life Sciences Solutions）を介してleukopaksから単離した。CD4およびCD8 T細胞をCD4およびCD8マイクロビーズで染色し、MACS磁気分離カラム（Miltenyi Biotec）を使用して単離した。細胞を抗CD3（クローンOKT3、Miltenyi Biotec）および抗CD28抗体（クローンCD28.2、BD Biosciences）で刺激した。刺激の48時間後、細胞をレンチウイルスで形質導入し、野生型IL-2（Miltenyi Biotec）を含む完全OpTmizer T細胞培地（Gibco）中で維持した。形質導入の48時間後、細胞を洗浄し、WT IL-2を含有する培地中で維持するかまたはSTK-009を含有する培地に切り替えた。細胞を拡大増殖させ、残りの製造期間中、1E6個の細胞/mlで維持した。細胞数および生存度をVi-Cell XR（Beckman Coulter）を使用して分析した。14日目に、細胞をCryoStor CS10細胞凍結培地（STEMCELL）中に凍結した。
これらの研究において使用されるhoCD122受容体に対するオルソゴナル同族リガンドは、アルデヒドリンカーを有するモノペグ化された40kDの分岐鎖（2×20kD）PEG分子、すなわち40kDaの2アーム分岐鎖PEG-アルデヒド（2つの20kDAのリンカーPEG分子を含む40kDA PEG-アルデヒド）（Sunbright（登録商標）GL2-400AL3, NOF America Corporation, One North Broadway, White Plains, NY 10601 USA）を含む、本明細書に記載のSTK-009として記載される式1の化合物であった。
6～8週齢の雌のNOD scidガンマ（NSG）マウスは、Jackson Laboratory（600 Main Street, Bar Harbor, ME USA 04609）から得た。研究開始前に、動物を計量し、良好な健康状態にあることを確かめるために臨床診察を行った。その後、研究期間中、体重を追跡した。1ケージ当たり動物を5匹収容し、9日間順応させた。CD19_28zオルソCAR T細胞（2E6の総T細胞、1E6のCAR+ T細胞）とSTK-009の組み合わせによる処置のために動物を5つの群に階層化して、組み合わせのインビボ有効性の潜在能を評価した。STK-009皮下投薬は、一日おきに実施する。研究計画の遂行の詳細を以下の表9に提供する。
（表９）研究設計
Figure 2023511274000067
IVISイメージャー（Perkin Elmer）を使用して腫瘍細胞数を週2回定量した。マウスに、D-ルシフェリン（PBS中15mg/mlのD-ルシフェリン）100ulを腹腔内注射した。制御した低流量イソフルラン曝露（Kent Scientific Somnosuite）を介してマウスを麻酔下に置いた。関心対象の領域（ROI）を個々のマウス毎に描出し、Living Imageソフトウェア（Perkin Elmer）を使用して、発光を直接測定する全フラックス（光子／秒）を測定した。研究5日目にマウスを撮像し、その後は週2回撮像した。後肢麻痺が検出されたら（PBSコホートでは21日目）マウスを殺処分（taken down）した。
研究0日目に、尾静脈への静脈内注射によってマウスに5×105個のRaji-fluc-puro腫瘍細胞を移植し、5日間成長させた。腫瘍移植後、5日後に処置を開始した。研究5日目に、マウスに、ビヒクル（PBS）、またはCD19_28zオルソCAR T細胞をビヒクル（PBS）、1μgのSTK-009、2μgのSTK-009、もしくは10μgのSTK-009の皮下投薬と組み合わせて腹腔内投薬した。PBSおよびSTK-009の投薬を17日目（10μg）または19日目（1μg、2μg）まで一日おきに実施した。CD19_28zオルソCAR T細胞を-80℃で保存した。注射の当日、CD19_28zオルソCAR T細胞を融解し、スピンダウンし、2E6の総T細胞／200マイクロリットルPBSの濃度で再懸濁した。マウスに、オルソCAR T細胞（2E6の総T細胞、1E6のCAR+ T細胞）を腹腔内注射した。8匹のマウス／コホートに、PBS、CD19_28zオルソCAR T細胞およびPBS/STK-009を皮下投与した。ビヒクルまたはSTK-009を17日目（10μg）または19日目（1μg、2μ g）まで一日おきに投与した。すべての動物から下顎頬側の出血によって採血し、血液から遠心によって血漿を血漿収集チューブに単離した。血液試料をFACS解析によって直ちに解析し、血漿をさらなる分析のために-80℃で凍結した。脾臓、腎臓、肝臓および後肢をIHC処理のためにホルムアルデヒド中で固定した。
実験の結果を添付図の図3に提供する。生物発光データを以下の表10に提供する。
（表１０）播種性Raji-Luc研究からの生物発光データ
Figure 2023511274000068
Figure 2023511274000069
図3および上記表に提供されるデータによって実証されるように、PBSの投与は、腫瘍量を制御できず（図3、パネルA、群1、および図3、パネルB、左上）、その結果、研究のおよそ21日目に毒性のため動物を屠殺する必要があった。CD19_28zオルソCAR T細胞の投与は、マウスの4/8で抗腫瘍応答を導いた（図3、パネルA、群2、および図3、パネルB、右上）。CD19_28zオルソCAR T細胞とSTK-009との両用量レベルでの併用処置（図3、パネルA、1μg（群3、および図3、パネルB、右下）および2μg（群4および図3、パネルB、左下）は、CD19_28zオルソCAR T細胞処置単独と比較して、追加の抗腫瘍機能を提供した。
先に述べたように、動物の体重は前述の研究過程を通して決定された。有意な体重減少は、確立された毒性の尺度である。オルソゴナルリガンドの添加ありまたはなしのオルソゴナルCAR-T細胞を用いた処置群における前述の研究での動物の体重は、一般に良好な耐容性を示し、oCD19 CAR TまたはSTK-009リガンドに関連する全身毒性の証拠はほとんどなかった。
実施例8. 皮下Rajiリンパ腫の固形腫瘍モデル
皮下リンパ腫モデルのために、6～8週齢のNSGおよびNSG MHC I/II KOマウス（Jackson laboratories）に、50：50比の5E5のRaji-fluc-puro細胞とフェノールレッドフリーマトリゲル（Corning）を皮下注射した。4日後、マウスを記載したように撮像し、無作為化し、PBSまたはSTK-009のいずれかを皮下注射した。5日目に、マウスを、PBS、SYNCAR T細胞のいずれか、およびPBSまたはSTK-009のいずれかで皮下処置した。マウスに、PBSまたはSTK-009のいずれかの皮下注射を一日おきに行い、体重が研究開始時の体重の90％未満に低下したら一旦停止した。腫瘍のキャリパー測定を週2回行って、後続のサイトカインおよびフローサイトメトリー解析のためにマウスから週1回血を取り、同時に、最大で週5回体重を計量した。
実施例9. 組織学分析および免疫組織化学
組織に対して抗ヒトCD4、CD8、グランザイムB、CD3および抗マウスCD11bについて免疫組織化学分析を実施した。FFPEブロックを4um厚に切片化した。スライドを、一連のキシレン中にて、徐々に希釈アルコールから水中にて脱パラフィン化した。Dako自動免疫染色装置でのIHC染色の開始前に、室温で、クエン酸塩ベースの低pH抗原賦活化でスライドを処理した。内因性ペルオキシダーゼを3％過酸化水素で5分間クエンチし、続いて、一次抗体と室温で1時間インキュベーションした。その後、組織をHRPコンジュゲートポリマー二次試薬と30分間、続いて、DABまたはTSAコンジュゲートAlexa fluor 488、594もしくは647とインキュベートしてシグナルを可視化した。発色検出および分析のためにヒトCD3、マウスCD11bをDABで染色した。蛍光検出を使用した定量化のために抗ヒトCD4、CD8およびグランザイムBを多重化した。二重標識化のために、2つの手順の間に2番目の抗原賦活化工程を含めることによって染色を連続で実施し、第1のマーカーから任意の未結合試薬を溶出除去した。適切な交差反応性対照を品質検査のために含めた。蛍光染色が終了次第、組織をDAPIで対比染色し、Prolong Gold水性封入剤を使用してカバーガラスに封入した。発色染色が終了次第、試料をヘマトキシリンで対比染色し、撮像のためにカバーガラスに封入した。
全スライドスキャニングおよびシグナル定量化を、Akoya VectraマルチスペクトルイメージングシステムおよびAkoya Vectra InForm解析ソフトウェアスイートを使用して実施した。使用した一次抗体は、CD4：R&D Systems、AF-379-NA、5ug/mlで1時間、ヤギポリクローナル；CD8：Dako、M7103、クローンC8/144B、1：500で1時間、マウスモノクローナル；グランザイムB：Cell Signaling、46890s、クローンD6E9W、1：500で1時間、ウサギモノクローナル；CD3：Lab Vision、RM-9107-S、クローンSP7、1：200で1時間、ウサギモノクローナル；CD11b：Abcam、ab216445、クローンEPR1344、1：3000で1時間、ウサギモノクローナルであり、使用した二次抗体は、Leica Powervisionの抗ウサギ-HRP、Leica Powervisionの抗マウス-HRP、Vector Immpressの抗ヤギ-HRPである。
（表１１）播種性Raji-Luc研究からの体重データ（g/マウス）
Figure 2023511274000070
Figure 2023511274000071
実施例9：RAJI-lucリンパ腫再負荷マウスモデル
以下の実験は、上記実施例8に記載される研究の継続である。34日目に、処置の初期段階から効果的に治癒したマウス（CD19オルソCAR T細胞＋1ug STK-009処置マウス）（図3中の群3、パネルA）を2つの群に分割し、PBSまたはSTK-009のいずれかを一日おきに連続して投薬した。投薬のスケジュールは、添付図の図5のパネルAに提示する（図4A）。逆三角形は、STK-009の用量投与を表す。追加のCD19オルソCAR T細胞を投与せず、STK-009オルソゴナルリガンドのみ投与したことに留意すべきである。
43日目に、処置群マウスおよびPBS群マウスに、5E5のRAJI-luc細胞および50％マトリゲルを右後方脇腹に皮下注射した。腫瘍量を先に記載したように隔週で評価した。PBS群は、過度の腫瘍量のため注射後21日目（64日目）に安楽死させ（図4B、第1のパネル）、PBSで処置したマウスの2/4で腫瘍の成長を制御できた（図4B、第2のパネル）一方で、STK-009で処置したマウスすべて（4/4）で腫瘍成長を制御できた（図2B、第3のパネル）。
これらのデータは、STK009再投薬が、長期の抗原または腫瘍リガンド曝露なしであっても、CAR T細胞の抗腫瘍活性を回復可能であることを実証している。
実施例10. 再発後のRAJI-lucリンパ腫のSTK-009処置
以下の実験は、上記実施例8に記載される研究の継続である。34日目に、CD19オルソCAR T細胞およびPBSで処置して（すなわち、STK-009オルソゴナルリガンドによる処置に対してナイーブ）再発したマウス（図3中の群2、パネルA、n＝4）をさらなる処置のために単離した。図5のパネルBに指摘しているように、これらのマウスは、研究のおよそ20日目に再発した。1ugのSTK-009による一日おきの16日間の皮下投与によってすべてのマウスを処置した（合計8用量、図5のパネルA）。腫瘍量を先に記載したように隔週で評価した。
図5のパネルBに提供されるデータに指摘しているように、研究下の4匹のマウスすべてで、この場合もCAR-T細胞の追加投与なしでのSTK-009の投薬後、腫瘍退縮の徴候が示された。このデータは、STK-009単独の投与が、前治療コースから再発した動物においてCAR-T細胞の抗腫瘍活性を達成可能であることを実証している。
実施例11. 細胞の表現型の評価
以下は、上記実施例8に記載される研究の処置群におけるT-細胞の量（Y軸）および表現型（図の説明に提供されるように陰影付き）の評価である。簡潔に述べると、研究20日目、25日目および32日目に試料を得た（X軸）。FACS解析によって細胞を定量し、データを添付図の図6のヒストグラムに提供する。図6に提供されるデータから実証されるように、オルソゴナルリガンド（STK-009）は、オルソゴナルCAR-T細胞を拡大増殖可能であり、幹細胞メモリーCAR-T細胞集団を保持する。CAR-T細胞の寿命は、インビボで、幹細胞メモリー（SCM）表現型から、セントラルメモリー（CM）表現型へ、エフェクターメモリー（EM）表現型へ、エフェクターメモリーCD45+ RA（EMRA）表現型へと進行する、エフェクターT細胞運命への分化によって制限される。添付図の図6上に提供されるデータから実証されるように、処置を停止したら、オルソゴナルリガンド（STK-009）で処置したオルソゴナルCAR-T細胞のおよそ60％がSCM表現型を保持していた。
実施例12. 皮下固形腫瘍モデルにおけるオルソゴナルCAR-T／リガンド系の効果の評価
以下の研究は、NSGマウスにおいて成長した皮下固形腫瘍RAJI腫瘍の制御における、CD19_28zオルソCAR T細胞（実施例8に実質的に従って調製した）と組み合わせた、STK-009（実施例8に実質的に従って調製した）のインビボ有効性を評価するために実行した。マウスは、実施例8に提供したように入手および処置した。研究設計は、以下の表12に提供する。
（表１２）研究設計
Figure 2023511274000072
5E5のRaji-fluc-puro腫瘍細胞（Imanis Life Sciences #CL-161）を、体積100マイクロリットルのPBS＋100マイクロリットルのマトリゲル（Corning）中にて、右脇腹に皮下注射した。腫瘍移植後、6日後に処置を開始した。6日目に、マウスに、ビヒクル（PBS）、またはCD19_28zオルソCAR T細胞をビヒクル（PBS）、1μgのSTK-009もしくは10μgのSTK-009の皮下投薬と組み合わせて腹腔内投薬した。PBSおよびSTK-009の投薬は、一日おきに実施した。マウスに、CD19_28zオルソCAR T細胞（2E6の総T細胞、1E6のCAR+ T細胞）を腹腔内注射した。CD19_28zオルソCAR T細胞を-80℃で保存した。注射の当日、CD19_28zオルソCAR T細胞を融解し、スピンダウンし、2E6の総T細胞／200マイクロリットルPBSの濃度で再懸濁した。STK-009を分割して-80℃で保存し、投薬時にビヒクル（PBS）でさらに希釈した。ビヒクルまたはSTK-009を75日目まで一日おきに投与した。50日目に、CD19_28zオルソCAR T細胞＋STK-009 1μg群のマウスの処置を10μgまで増加させた。
マウスを撮像し、腫瘍のキャリパー測定を毎週行った。腫瘍サイズおよび細胞数を、それぞれキャリパーおよびIVISイメージャー（Perkin Elmer）を使用して毎週測定した。撮像のために、マウスに、D-ルシフェリン（PBS中15mg/mlのD-ルシフェリン）100ulを腹腔内注射した。制御した低流量イソフルラン曝露（Kent Scientific Somnosuite）を介してマウスを麻酔下に置いた。関心対象の領域（ROI）を個々のマウス毎に描出し、Living Imageソフトウェア（Perkin Elmer）を使用して、発光を直接測定する全フラックス（光子／秒）を測定した。腫瘍の長さおよび幅についてキャリパー測定を行った。式：1/2 L×W2を使用して腫瘍体積を計算した。IVIS撮像がより高感度であったため60日目にキャリパー測定を停止した。すべての動物から下顎頬側の出血によって採血し、血液から遠心によって血漿を血漿収集チューブに単離した。血液試料をFACS解析によって直ちに解析し、血漿をさらなる分析のために-80℃で凍結した。腫瘍、脾臓、腎臓、肝臓、肺および後肢をIHC処理のためにホルムアルデヒド中で固定した。すべての試料を分析のために適切に保存した。腫瘍体積が＞2000mm3を超えたらマウスを殺処分した。データを添付図の図9～12に提供する。
図7～10に示しているように、CD19_28zオルソCAR T細胞のこの用量（4E5のCAR+ T細胞、典型的には有効用量以下と見なされる用量）での投与は、それでもなお、有意な抗腫瘍有効性を実証した。
図7のパネルAは、4つの処置条件にてキャリパーで測定した場合のこの皮下研究での腫瘍体積の結果を提供する。図7のパネルBは、4つの処置条件にてキャリパーで測定した場合のこの皮下研究での腫瘍体積の結果を提供しており、STK-009がCAR-T細胞をインビボ拡大増殖させ、SCM表現型のCAR-T細胞を拡大増殖させることを示している（図7のパネルC）。CD19_28zオルソCAR T細胞とSTK-009（1μg、10μg）の併用処置は、CD19_28zオルソCAR T細胞処置単独と比較して、用量依存的に有意な抗腫瘍機能を提供した。
図8のパネルAは、図の説明に示した4つの処置条件にて中央腫瘍発光によって測定した場合のこの皮下研究での腫瘍体積の結果を提供する。図8のパネルBは、表示の4つの処置群について示した、4つの処置条件にて中央腫瘍発光によって測定した場合のこの皮下研究での腫瘍体積の結果を提供する。1μgのSTK-009をすでに受けているマウスにおいてSTK-009の投与量を増加させることで抗腫瘍有効性を増強できるかどうかを調べるために、投薬を50日目に10μgに増加させた（図8、パネルB、左下）。用量を1μgから10μgへ増加させた後に腫瘍量の有意な減少が観察された。
図9は、表示の各処置群における動物の生存のカプランマイヤー生存プロットである。このデータによって実証されるように、CD19_28zオルソCAR T細胞とSTK-009の併用処置は、マウスの生存を、PBSおよびCD19_28zオルソCAR T細胞の単独処置と比較して有意に延長させた。
図10は、皮下RAJI固形腫瘍におけるCAR-T浸潤の免疫組織学的分析の10×（差し込み図40×）顕微鏡写真である。これらのスライドから示されるように、STK-009は、SC RAJI腫瘍のCAR-T浸潤および腫瘍拒絶を誘導する。この分析は、高用量STK-009で処置した腫瘍中に生存RAJI細胞が存在しないことを示した。
いくつかの態様では、細胞製品は、前記細胞の内因性TCRドメインを欠失させるようにさらに操作される。
[本発明1001]
以下の工程を含む、治療または予防を必要とする哺乳動物対象における疾患、障害または病態を治療または予防する方法：
（a）ある量の免疫細胞を該対象から単離する工程；
（b）該単離された量の単離された免疫細胞と核酸配列とを、該単離された免疫細胞によって該核酸配列が取り込まれる条件下で接触させる工程であって、該核酸配列が、膜貫通受容体をコードし、該膜貫通受容体が、細胞外ドメインと機能的に連絡する細胞内シグナル伝達ドメインを含み、該受容体の該細胞外ドメインが、オルソゴナルhCD122またはその機能的断片のECDを含む、工程；
（c）工程（b）からの単離された量の細胞を、エクスビボで、工程（b）の接触によって形質導入された細胞の増殖を誘導するのに十分な量のオルソゴナルリガンドと接触させる工程であって、該接触が、形質導入された細胞が集団の細胞の少なくとも20％を構成するように一定期間適用される、工程；
（d）オルソゴナルリガンドの治療有効用量の投与と組み合わせて、工程（c）から産生された細胞集団の細胞の治療有効量を該哺乳動物対象に投与する工程。
[本発明1002]
前記集団が、骨髄細胞、リンパ球、末梢血単核細胞（PBMC）、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、T細胞、CD8+ T細胞、CD25+CD8+ T細胞、CAR-T細胞、NK細胞、CD4+ T細胞、およびTregからなる群より選択されるヒト免疫細胞の1つまたは複数の種を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
工程（a）の後であるが工程（b）の前に、細胞の集団が、該集団から活性化免疫細胞または抗原を経験したT細胞が濃縮されるようにエクスビボで操作される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
オルソゴナルhCD122またはその機能的断片が、野生型hCD122に従って番号付けされた133位および／または134位にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
工程（b）の接触が、キメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸配列の取り込みをさらに含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
CARをコードする核酸配列および前記受容体をコードする核酸配列が、別々のベクター上に提供され、各核酸配列が、哺乳動物免疫細胞において機能的な発現制御配列に機能的に連結される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
CARをコードする核酸配列および前記受容体をコードする核酸配列が、単一ベクター上に提供される、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記核酸配列が、同じ発現制御エレメントに機能的に連結される、本発明1007の方法。
[本発明1009]
ベクターが、T2Aコード配列のIRESエレメントによって分離されている前記2つの核酸配列を含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
ベクターが、ウイルスベクターである、本発明1009の方法。
[本発明1011]
ベクターが、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、本発明1010の方法。
[本発明1012]
工程（b）においてエクスビボで用いられるオルソゴナルリガンドが、工程（c）においてインビボで使用されるオルソゴナルリガンドとは異なる、本発明1001～1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
工程（d）の前に、対象が、リンパ球枯渇レジメンで処置される、本発明1001～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
工程（d）で投与される初期用量が、対象の体重1kg当たり活性免疫細胞100,000～1,000,000個である、本発明1001～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
オルソゴナルリガンドの投与が、対象に対して、対象の体重1kg当たり活性免疫細胞100,000～1,000,000個のレベルを維持するために少なくとも2週間の期間にわたって定期的になされる、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
オルソゴナルリガンドが、残留腫瘍の実質的な徴候のない点まで投与され、その時、オルソゴナルリガンドの用量が、観察後少なくとも3ヶ月間の期間にわたって、体重1kg当たりオルソゴナル免疫細胞およそ10,000～100,000個の細胞の低い循環レベルを維持するのに十分なレベルまで低減される、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
オルソゴナルリガンドが、残留腫瘍の実質的な徴候のない点まで投与され、その時、オルソゴナルリガンドの用量が終了する、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1018]
患者が免疫細胞療法の初期コースから再発したら、再発中の患者に、追加用量のオルソゴナルな操作された細胞の非存在下、過去に投与されたオルソゴナル細胞の活性化および／または増殖を誘導するような治療有効量のオルソゴナルリガンドを投与する工程をさらに含み、該オルソゴナルリガンドが、再発した腫瘍の寛解が観察されるまで一定期間にわたって対象に適用される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
疾患、障害または病態が、新生物疾患である、本発明1001～1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
疾患、障害または病態が、慢性ウイルス疾患である、本発明1001～1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
疾患、障害または病態が、炎症性疾患である、本発明1001～1019のいずれかの方法。
[本発明1022]
以下の工程を含むプロセスによって得られる、活性化されたオルソゴナル免疫細胞の集団について実質的に濃縮された細胞製品：
（a）ある量の免疫細胞を哺乳動物対象から単離する工程；
（b）該単離された量の単離された免疫細胞と核酸配列とを、該単離された免疫細胞によって該核酸配列が取り込まれる条件下で接触させる工程であって、該核酸配列が、膜貫通受容体をコードし、該膜貫通受容体が、細胞外ドメインと機能的に連絡する細胞内シグナル伝達ドメインを含み、該受容体の該細胞外ドメインが、オルソゴナルhCD122またはその機能的断片のECDを含む、工程；
（c）工程（b）からの単離された量の細胞を、エクスビボで、工程（b）の接触によって形質導入された細胞の増殖を誘導するのに十分な量のオルソゴナルリガンドと接触させる工程であって、該接触が、形質導入された細胞が集団の細胞の少なくとも20％を構成するように一定期間適用される、工程。
[本発明1023]
骨髄細胞、リンパ球、末梢血単核細胞（PBMC）、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、T細胞、CD8+ T細胞、CD25+CD8+ T細胞、CAR-T細胞、NK細胞、CD4+ T細胞、およびTregからなる群より選択されるヒト免疫細胞の1つまたは複数の種を含む、本発明1022の細胞製品。
[本発明1024]
細胞製品が、前記細胞の内因性TCRドメインを欠失させるようにさらに操作されている、本発明1023の組成物。
簡潔に述べると、一連のインビトロおよびインビボ実験を、式1の代表的なヒトIL2オルソログ、すなわち、wt hIL2に従って番号付けされたアミノ酸置換のセット：［desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A］を含有し、以下のアミノ酸配列：
Figure 2023511274000084
を有する、hIL2バリアント（本明細書において「オルソIL2」および「hoIL2」と称されることもある）を使用して実行した。
インビボ研究のために、STK-007分子を、以下の構造：
Figure 2023511274000085
のN末端40kDa分岐PEG分子の付加によって修飾し、これによって、本明細書において以降STK-009と称される、以下の構造：
40kD-PEG-リンカー-desAla1-hIL2[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]-COOH［2］
を有する式2のhIL2オルソログ（また、本明細書において「PEGオルソ」、「PEGオルソIL2」または「PEGhoIL2」と称されることもある）をもたらした。これらの研究に使用される代表的なオルソゴナル細胞は、以下のアミノ酸配列：
Figure 2023511274000086
を有するオルソゴナルCD122（IL2Rb）受容体（本明細書において、「hoCD122」または「hoRb」（ヒトオルソ受容体ベータ）と称されることもある）を発現するように改変されたCD19オルソゴナルCAR-T細胞であった。hoRb受容体の細胞外ドメインは、2つのアミノ酸置換H133DおよびY134F（wt hCD122に従って番号付けされた）を含む。
これらの研究において使用される例示的なCARは、抗原結合ドメインとしてFMC63抗CD19 scFv、CD28膜貫通および共刺激ドメインならびにCD3zドメイン（図2、パネルA）を含み、アミノ酸配列：
Figure 2023511274000087
を有する抗CD19キメラ抗原受容体である。
図1Aに図示するように、CD19_28z CAR、T2AペプチドおよびhoRb配列：
Figure 2023511274000088
をコードする核酸配列を合成した。これらの構築物を合成し、第3世代pl4Synレンチウイルス骨格（Alstem Bio）のEF1a-プロモーターの下流にクローニングした。単離および刺激することで、SYNCAR-001とも称される「CD19_28zオルソCAR」T細胞を作製した。
CD19_28z：GMCSF受容体シグナルペプチド、FMC63 scFv、AAAスペーサー、CD28ヒンジおよび共刺激ドメインおよびCD3ゼータを含む、構築物：
Figure 2023511274000089
CD19_4-1bbz：CD8a受容体シグナルペプチド、FMC63 scFv、CD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン、4-1BBヒンジおよび共刺激ドメインおよびCD3ゼータを含む、構築物：
Figure 2023511274000090
ある代替的な態様では、CD19 CARは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2023511274000091
ある代替的な態様では、CD19 CARは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2023511274000092
BCMA4_41bbz CAR：CD8a受容体シグナルペプチド、BCMA4 scFv、CD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン、4-1BBヒンジおよび共刺激ドメインおよびCD3ゼータを含む、構築物：
Figure 2023511274000093
これは、以下のアミノ酸配列を用いて、T2aリンカーを使用してオルソCD122受容体と共発現させることができる：
Figure 2023511274000094
GSI5021_41bbz CAR：
Figure 2023511274000095
これは、以下のアミノ酸配列を用いて、T2aリンカーを使用してオルソCD122受容体と共発現させることができる：
Figure 2023511274000096
B2121 BCMA_41bbz）CAR
Figure 2023511274000097
これは、以下のアミノ酸配列を用いて、T2aリンカーを使用してオルソCD122受容体と共発現させることができる：
Figure 2023511274000098
BMCA10_41bbz CAR
Figure 2023511274000099
これは、以下のアミノ酸配列を用いて、T2aリンカーを使用してオルソCD122受容体と共発現させることができる：
Figure 2023511274000100
いくつかの態様では、本開示は、PSMA CARを含むオルソゴナルPSMA CAR T細胞を提供する。PSMA_28z：CD8aシグナルペプチド、脱免疫化J591 scFv、AAAスペーサー、CD28ヒンジ／膜貫通／共刺激ドメインおよびCD3ゼータを含む、抗PSMA CAR：
Figure 2023511274000101
これは、以下のアミノ酸配列を用いて、T2aリンカーを使用してオルソCD122受容体と共発現させることができる：
Figure 2023511274000102
いくつかの態様では、PSMA CARは、PSMA_4-1BBzである：脱免疫化J591 scfv；CD8aシグナルペプチド、CD8ヒンジおよび膜貫通ドメインおよび4-1bb共刺激ドメインおよびCD3z：
Figure 2023511274000103
これは、以下のアミノ酸配列を用いて、T2aリンカーを使用してオルソCD122受容体と共発現させることができる:
Figure 2023511274000104
GPC3 CAR
いくつかの態様では、本開示は、オルソゴナルGPC3 CAR T細胞を提供する。いくつかの態様では、本開示の方法および組成物は、肝臓がんを非限定的に含むGPC3を発現するがんの処置において有用である。肝細胞がん（HCC）は、世界でがんの死亡原因第2位である。細胞表面糖タンパク質であるグリピカン-3は、HCC組織において過剰発現されるが、健康な成人の肝臓では発現されず、よって、CARのABDのための有用なターゲティングドメインを提供する。多様なGPCターゲティングドメインを、CARの構築において用いてもよく、肝臓がんの処置において使用するため、式1のIL2オルソログと併用するためにオルソゴナル細胞中に組み込むことができる。オルソゴナルGPC3 CAR T細胞の調製において使用され得るGPC3 CARの例としては、アミノ酸配列：
Figure 2023511274000105
を有するCAR GPC3_28z、およびアミノ酸配列
Figure 2023511274000106
を有するGPC3_4-1BBが挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの態様では、本開示は、HPV関連腫瘍の処置において使用するためのオルソゴナルなオルソゴナルHPV-16 E6 TCR細胞を提供する。本開示のオルソゴナル細胞中に組み込むことができるHPV-16 E6 CARの例としては、配列：
Figure 2023511274000107
または
Figure 2023511274000108
を有するCARが挙げられるが、それらに限定されない。
神経芽腫のためのGD2 CAR
GD2は、ほぼすべての神経芽腫、ほとんどの黒色腫および網膜芽細胞腫、ならびに多くのユーイング肉腫によって高度に発現され、また、より変動的な程度に、小細胞肺がん、神経膠腫、骨肉腫および軟組織肉腫によって発現される。したがって、GD2は、CAR T細胞療法の標的として特定されており、多様なGD2 CARが当技術分野において公知である。しかしながら、GD2を発現する腫瘍の処置において持続性が課題として残っている。したがって、オルソリガンドの投与によってオルソゴナル免疫細胞の作用持続時間を延長できれば、GD2細胞療法の開発において大いに役立つだろう。いくつかの態様では、本発明は、オルソGD2標的指向型免疫細胞を提供する。一態様では、オルソゴナルGD2免疫細胞、例えばオルソゴナルGD2 CAR-T細胞のターゲティングドメインは、アミノ酸配列：
Figure 2023511274000109
を有する14g2a scFvを組み込む。
IL2オルソログ（式#1）：一態様では、本開示は、hIL2オルソログを提供し、そのアミノ酸配列は、式#1で示されるポリペプチド(SEQ ID NO: 50)に対して少なくとも80％、90％、95％、98％、99％または100％の同一性を有する：
Figure 2023511274000110
式中：
AA1は、A（野生型）または欠失である；
AA2は、P（野生型）または欠失である；
AA3は、T（野生型）、C、A、G、Q、E、N、D、R、K、P、または欠失である；
AA4は、S（野生型）または欠失である；
AA5は、S（野生型）または欠失である；
AA6は、S（野生型）または欠失である；
AA7は、T（野生型）または欠失である；
AA8は、K（野生型）または欠失である；
AA9は、K（野生型）または欠失である；
AA13は、Q（野生型）、Wまたは欠失である；
AA14は、L（野生型）、M、Wまたは欠失である；
AA15は、E（野生型）、K、D、T、A、S、Q、Hまたは欠失である；
AA16は、H（野生型）、NまたはQまたは欠失である；
AA18は、L（野生型）またはR、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、DまたはTである；
AA19は、L（野生型）、A、V、Iまたは欠失である；
AA20は、D（野生型）、T、S、M、L、または欠失である；
AA22は、Q（野生型）またはF、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T、Fまたは欠失である；
AA23は、M（野生型）、A、W、H、Y、F、Q、S、V、L、T、または欠失である；
AA27は、G（野生型）、K、Sまたは欠失である；
AA38は、R（野生型）、WまたはGである；
AA39は、M（野生型）、LまたはVである；
AA42は、F（野生型）またはKである；
AA51は、T（野生型）、Iまたは欠失である
AA55は、H（野生型）またはYである；
AA74は、Q（野生型）、N、H、Sである；
AA80は、L（野生型）、FまたはVである；
AA81は、R（野生型）、I、D、Y、Tまたは欠失である
AA85は、L（野生型）またはVである；
AA86は、I（野生型）またはVである；
AA89は、I（野生型）またはVである；
AA91は、V（野生型）、RまたはKである；
AA92は、I（野生型）またはFである；
AA97は、K（野生型）またはQである；
AA104は、M（野生型）またはAである；
AA109は、D（野生型）、Cまたは活性化された側鎖を有する非天然アミノ酸である；
AA113は、T（野生型）またはNである；
AA125は、C（野生型）、AまたはSである；
AA126は、Q（野生型）またはH、M、K、C、D、E、G、I、R、S、またはTである；および／あるいは
AA130は、S（野生型）、TまたはRである。
あるいは、hIL2オルソログアルブミン融合物は、アルブミン結合ドメイン（ABD）ポリペプチド配列およびIL2オルソログポリペプチドを含む融合タンパク質であるIL2オルソログを含む。上に示唆したように、アルブミン結合ドメイン（ABD）ポリペプチド配列およびhIL2オルソログポリペプチドを含む融合タンパク質は、例えば、遺伝子操作によって、HASをコードする核酸またはその断片が1つまたは複数のIL2オルソログ配列をコードする核酸に接続されるように達成することができる。いくつかの態様では、アルブミン結合ペプチドは、アミノ酸配列DICLPRWGCLW（SEQ ID NO：22）を含む。
本発明の別の態様では、IL2オルソログは、以下の構造のヒトIL2オルソログである：
Figure 2023511274000111
式中、n＝0または1である。
Hisタグ
一部の態様では、本発明のIL2オルソログ（そのようなIL2オルソログの融合タンパク質を含む）は、1つまたは複数の遷移金属キレートポリペプチド配列を有する融合タンパク質として発現される。そのような遷移金属キレートドメインの組み込みは、1986年2月11日に発表されたSmithらの米国特許第4,569,794号に記載されているような固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）による精製を容易にする。本発明の実施において有用な遷移金属キレートポリペプチドの例は、前出のSmithらおよび1995年5月10日に発表されたDobeliらの米国特許第5,320,663号に記載されており、その教示全体は参照により組み入れられる。本発明の実施において有用な特定の遷移金属キレートポリペプチドは、6個のヒスチジンペプチド (His)6 (SEQ ID NO: 52)などの3～6個の連続ヒスチジン残基を含むペプチド(SEQ ID NO: 51)であり、当技術分野においてしばしば「Hisタグ」と称される。
発現させようとするIL2オルソログが、キメラ（例えば、IL2オルソログおよび非相同ポリペプチド配列を含む融合タンパク質）として発現される場合、キメラタンパク質は、IL2オルソログの全部または一部をコードする第1の配列および非相同ポリペプチドの全部または一部をコードする第2の配列を含むハイブリッド核酸分子によってコードされ得る。例えば、本明細書に記載される主題のIL2オルソログは、細菌によって発現されたタンパク質の精製を容易にするためにヘキサ-ヒスチジンタグ(SEQ ID NO: 52)に融合されても、または真核細胞において発現されたタンパク質の精製を容易にするためにヘマグルチニンタグに融合されてもよい。第1および第2によって、融合タンパク質のエレメントの配向への限定として理解されるべきではなく、非相同ポリペプチドは、IL2オルソログのN末端および／またはC末端のいずれにも連結させることができる。例えば、N末端をターゲティングドメインに連結させてもよく、C末端をヘキサ-ヒスチジンタグ(SEQ ID NO: 52)精製ハンドルに連結させてもよい。
受容体ポリペプチドは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、前記ポリペプチドの細胞外ドメインは、以下の構造のアミノ酸配列を含む：
Figure 2023511274000112
式中：
AA70＝GlnまたはTyr；
AA73＝Thr、AspまたはTyr；
AA133＝His、Asp、GluまたはLys；および／または
AA134＝Tyr、Phe、GluまたはArg。
いくつかの態様では、修飾されたオルソゴナルCD122は、1個、2個、3個またはより多くのSTAT3結合モチーフを含み得る。いくつかの態様では、STAT3認識モチーフは、YX1X2Q（SEQ ID NO：21）のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、X1は、L、R、F、Mからなる群より選択され、X2は、R、K、H、およびPからなる群より選択される。いくつかの態様では、STAT3認識モチーフは、以下：
Figure 2023511274000113
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの場合、修飾されたヒトCD122は、ヒトCD122の細胞内ドメインのC末端に融合された1つまたは複数のSTAT3結合モチーフを含む。いくつかの代表的な態様では、オルソゴナルCD122は、C末端STAT3認識ドメインの付加を含み、以下の構造のオルソゴナルCD122ポリペプチドが得られる：
オルソ-CD122-GGYLRQ（「GGYLRQ」はSEQ ID NO: 54として開示）；
オルソ-CD122-GGYLKQ（「GGYLKQ」はSEQ ID NO: 55として開示）；
オルソ-CD122-GGYRHQ（「GGYRHQ」はSEQ ID NO: 56として開示）；
オルソ-CD122-GGYLRQ（「GGYLRQ」はSEQ ID NO: 54として開示）；
オルソ-CD122-GGYFKQ（「GGYFKQ」はSEQ ID NO: 58として開示）；
オルソ-CD122-GGYLPQ（「GGYLPQ」はSEQ ID NO: 59として開示）；
オルソ-CD122-GGYMPQ（「GGYMPQ」はSEQ ID NO: 60として開示）；および
オルソ-CD122-GGYDKPH（「GGYDKPH」はSEQ ID NO: 61として開示）。
いくつかの態様では、1つまたは複数のSTAT3結合モチーフは、オルソゴナルCD122の内部（すなわち、C末端にもN末端にもない）配列として存在する。この構成の修飾されたオルソゴナルCD122は、STAT3結合モチーフが生じるように変異させることができるオルソゴナルCD122 ICDアミノ酸配列内の好適な領域を特定することによって生産できる。一態様では、CD122の天然に存在するICD（典型的には、オルソゴナルCD122中に存在する）は、STAT3結合モチーフが生じるように最小限の修飾で容易に修飾され得る、STAT3結合モチーフと似た配列を保有する。例えば、4ヌクレオチド配列を含む領域は、チロシン残基から始まる。天然ヒトCD122中のそのような領域の1つは、天然ヒトCD122タンパク質のs355位と364位との間に位置するYFTYDPYSEE (SEQ ID NO: 62)の配列をコードする。いくつかの態様では、この領域に含まれるYFTY (SEQ ID NO: 63)、YDPY (SEQ ID NO: 64)またはYSEE (SEQ ID NO: 65)の1つまたは2つがSTAT3認識モチーフで置換されて、本明細書に開示される修飾されたヒトCD122が生産される。
実施例1. ヒトIL2発現ベクターpcDNA3.1/hygro(+)-huIL2の作製
ヒトIL2 DNA ORF（Genbank NM_000586.3）を合成し（Life Technologies GeneArt Service, Carlsbad, CA）、Platinum SuperFi II DNAポリメラーゼキット（item #12361050, ThermoFisher）を製造業者のプロトコルに従って使用し、プライマー：
Figure 2023511274000114
（NheI制限部位を組み込んだ）、および
Figure 2023511274000115
（ApaI制限部位を組み込んだ）
を使用したPCRを介して増幅させた。PCR断片を1％アガロースゲル（item #54803, Lonza, Rockland, ME）上で可視化し、ゲルから切り出して、QIAquick PCR Purification kit（item #28106, Qiagen, Germany）を製造業者のプロトコルに従って使用して精製した。
（表７）QuikChange変異誘発および変異に関する配列情報
Figure 2023511274000116
Figure 2023511274000117
Figure 2023511274000118
実施例7 播種性RAJI-lucリンパ腫マウスモデルにおけるオルソCAR T細胞の有効性
同族オルソゴナルリガンドと組み合わせたオルソゴナルCAR-T細胞の有効性をマウス白血病モデルにおいて以下の通り評価した。この研究で使用したCD19キメラ抗原受容体タンパク質（本明細書において以降「CD19_28z」と称される）は、以下の構造を有した：GMCSF受容体シグナルペプチド、FMC63 抗CD19 scFv、AAAリンカー、CD28ヒンジ／膜貫通／共刺激ドメインおよびCD3ゼータ。CD19_28zのアミノ酸配列は、以下の通りである：
Figure 2023511274000119
この研究の遂行において使用したオルソゴナルT細胞は、単離されたT細胞にレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることによる当技術分野において公知の技術によって作製した。前述のCD19_28z CAR、T2AリンカーポリペプチドおよびヒトオルソゴナルCD122オルソゴナル受容体（hoCD122）は、以下のアミノ酸配列：
Figure 2023511274000120
を有し、単一のレンチウイルスプラスミドを使用して、オルソゴナルCAR-T細胞の作製が可能となる。得られたオルソゴナルCAR-T細胞は、CD19_28zオルソCAR T細胞と呼ばれ、SYNCAR-001とも称される。

Claims (24)

  1. 以下の工程を含む、治療または予防を必要とする哺乳動物対象における疾患、障害または病態を治療または予防する方法：
    （a）ある量の免疫細胞を該対象から単離する工程；
    （b）該単離された量の単離された免疫細胞と核酸配列とを、該単離された免疫細胞によって該核酸配列が取り込まれる条件下で接触させる工程であって、該核酸配列が、膜貫通受容体をコードし、該膜貫通受容体が、細胞外ドメインと機能的に連絡する細胞内シグナル伝達ドメインを含み、該受容体の該細胞外ドメインが、オルソゴナルhCD122またはその機能的断片のECDを含む、工程；
    （c）工程（b）からの単離された量の細胞を、エクスビボで、工程（b）の接触によって形質導入された細胞の増殖を誘導するのに十分な量のオルソゴナルリガンドと接触させる工程であって、該接触が、形質導入された細胞が集団の細胞の少なくとも20％を構成するように一定期間適用される、工程；
    （d）オルソゴナルリガンドの治療有効用量の投与と組み合わせて、工程（c）から産生された細胞集団の細胞の治療有効量を該哺乳動物対象に投与する工程。
  2. 前記集団が、骨髄細胞、リンパ球、末梢血単核細胞（PBMC）、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、T細胞、CD8+ T細胞、CD25+CD8+ T細胞、CAR-T細胞、NK細胞、CD4+ T細胞、およびTregからなる群より選択されるヒト免疫細胞の1つまたは複数の種を含む、請求項1記載の方法。
  3. 工程（a）の後であるが工程（b）の前に、細胞の集団が、該集団から活性化免疫細胞または抗原を経験したT細胞が濃縮されるようにエクスビボで操作される、請求項1記載の方法。
  4. オルソゴナルhCD122またはその機能的断片が、野生型hCD122に従って番号付けされた133位および／または134位にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
  5. 工程（b）の接触が、キメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸配列の取り込みをさらに含む、請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
  6. CARをコードする核酸配列および前記受容体をコードする核酸配列が、別々のベクター上に提供され、各核酸配列が、哺乳動物免疫細胞において機能的な発現制御配列に機能的に連結される、請求項5記載の方法。
  7. CARをコードする核酸配列および前記受容体をコードする核酸配列が、単一ベクター上に提供される、請求項5記載の方法。
  8. 前記核酸配列が、同じ発現制御エレメントに機能的に連結される、請求項7記載の方法。
  9. ベクターが、T2Aコード配列のIRESエレメントによって分離されている前記2つの核酸配列を含む、請求項8記載の方法。
  10. ベクターが、ウイルスベクターである、請求項9記載の方法。
  11. ベクターが、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項10記載の方法。
  12. 工程（b）においてエクスビボで用いられるオルソゴナルリガンドが、工程（c）においてインビボで使用されるオルソゴナルリガンドとは異なる、請求項1～11のいずれか一項記載の方法。
  13. 工程（d）の前に、対象が、リンパ球枯渇レジメンで処置される、請求項1～12のいずれか一項記載の方法。
  14. 工程（d）で投与される初期用量が、対象の体重1kg当たり活性免疫細胞100,000～1,000,000個である、請求項1～13のいずれか一項記載の方法。
  15. オルソゴナルリガンドの投与が、対象に対して、対象の体重1kg当たり活性免疫細胞100,000～1,000,000個のレベルを維持するために少なくとも2週間の期間にわたって定期的になされる、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
  16. オルソゴナルリガンドが、残留腫瘍の実質的な徴候のない点まで投与され、その時、オルソゴナルリガンドの用量が、観察後少なくとも3ヶ月間の期間にわたって、体重1kg当たりオルソゴナル免疫細胞およそ10,000～100,000個の細胞の低い循環レベルを維持するのに十分なレベルまで低減される、請求項1～15のいずれか一項記載の方法。
  17. オルソゴナルリガンドが、残留腫瘍の実質的な徴候のない点まで投与され、その時、オルソゴナルリガンドの用量が終了する、請求項1～15のいずれか一項記載の方法。
  18. 患者が免疫細胞療法の初期コースから再発したら、再発中の患者に、追加用量のオルソゴナルな操作された細胞の非存在下、過去に投与されたオルソゴナル細胞の活性化および／または増殖を誘導するような治療有効量のオルソゴナルリガンドを投与する工程をさらに含み、該オルソゴナルリガンドが、再発した腫瘍の寛解が観察されるまで一定期間にわたって対象に適用される、請求項17記載の方法。
  19. 疾患、障害または病態が、新生物疾患である、請求項1～18のいずれか一項記載の方法。
  20. 疾患、障害または病態が、慢性ウイルス疾患である、請求項1～19のいずれか一項記載の方法。
  21. 疾患、障害または病態が、炎症性疾患である、請求項1～19のいずれか一項記載の方法。
  22. 以下の工程を含むプロセスによって得られる、活性化されたオルソゴナル免疫細胞の集団について実質的に濃縮された細胞製品：
    （a）ある量の免疫細胞を哺乳動物対象から単離する工程；
    （b）該単離された量の単離された免疫細胞と核酸配列とを、該単離された免疫細胞によって該核酸配列が取り込まれる条件下で接触させる工程であって、該核酸配列が、膜貫通受容体をコードし、該膜貫通受容体が、細胞外ドメインと機能的に連絡する細胞内シグナル伝達ドメインを含み、該受容体の該細胞外ドメインが、オルソゴナルhCD122またはその機能的断片のECDを含む、工程；
    （c）工程（b）からの単離された量の細胞を、エクスビボで、工程（b）の接触によって形質導入された細胞の増殖を誘導するのに十分な量のオルソゴナルリガンドと接触させる工程であって、該接触が、形質導入された細胞が集団の細胞の少なくとも20％を構成するように一定期間適用される、工程。
  23. 骨髄細胞、リンパ球、末梢血単核細胞（PBMC）、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、T細胞、CD8+ T細胞、CD25+CD8+ T細胞、CAR-T細胞、NK細胞、CD4+ T細胞、およびTregからなる群より選択されるヒト免疫細胞の1つまたは複数の種を含む、請求項22記載の細胞製品。
  24. 細胞製品が、前記細胞の内因性TCRドメインを欠失させるようにさらに操作されている、請求項23記載の組成物。
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