CN115315273A - Il-2直向同源物及其使用方法 - Google Patents

Il-2直向同源物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种正交受体。在一些实施方式中，该正交受体是正交CD122。在一些实施方式中，该正交受体是正交人CD122(hCD122)。在一些实施方式中，该正交受体是包含至少一个STAT3结合基序的正交CD122。

Description

IL-2直向同源物及其使用方法
相关专利申请的交叉参考
本申请要求2020年1月14日提交的美国临时专利申请号62/961,200；2020年4月24日提交的美国临时专利申请号63/015,476；和2020年4月27日提交的美国临时专利申请号63/016,256的优先权权益，其各自通过引用纳入用于所有目的。
背景技术
过继细胞疗法已被证明是一种在人对象的疾病治疗中具有功效的治疗方式。在一些情况下，细胞疗法涉及给予包含从患者切除的肿瘤组织获得的离体扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的细胞产物。参见，例如，Rosenberg(美国专利号5,126,132A，1992年6月30日授权，1992，和Spiess，等(1987)J Natl Cancer Inst79：1067-1075。在几项I/II期临床试验中，基本上按照该方案接受过继TIL治疗的转移性黑色素瘤患者获得了约50％的客观肿瘤缓解。参见，例如，Rosenberg，等(2011)Clin Cancer Res17：4550-4557；Andersen，等(2016)Clin Cancer Res 22：3734-3745；和Besser，等(2013)Clin Cancer Res 19：4792-4800。基于在黑色素瘤患者中观察到的TIL疗法的成功，其他人证明可以从多种其他肿瘤类型中获得TIL，包括但不限于：宫颈癌(Stevanovic，等(2015)J Clin Oncol33：1543-1550)、肾细胞癌(Andersen，等(2018)Cancer Immunol Res6：222-235)、乳腺癌(Lee，等(2017)Oncotarget 8：113345-113359)、非小细胞肺癌(Ben-Avi，等(2018)Cancer ImmunolImmunother 67：1221-1230)胃肠道癌(Turcotte(2013)J Immunol191：2217-2225和Turcotte，等(2014)Clin Cancer Res20：331-343)、胆管癌(Tran，等(2014)Science 344：641-645)、胰腺癌(Hall，等(2016)J Immunotherapy Cancer 4：61)头颈癌(Junker，等(2011)Cytotherapy 13：822-834)和卵巢癌(Fujita，等(1995)Clin Cancer Res 1：501-507)。
已经开发出多种工程改造的免疫细胞(例如T细胞、NK细胞和TIL)用于人疾病的免疫治疗。人免疫细胞已被工程改造用于治疗应用，例如识别和杀死癌细胞、细胞内病原体和参与自身免疫的细胞。通过选择性激活和扩增提供特定的功能且经导向以选择性攻击癌细胞的工程改造细胞(例如T细胞)，促进了工程改造细胞疗法在癌症治疗方面的应用。在一些过继免疫疗法的例子中，从对象的血液或肿瘤组织中分离出T细胞，对其进行离体处理，并回输进对象体内。因此，需要能够选择性地激活这种靶向工程改造细胞群的组合物和方法。
过继细胞疗法临床应用的一个挑战是维持过继转移细胞在给予对象之后的活力，以维持和最大化其治疗效果。在给予对象之后过继转移细胞的活力的成功维持有助于这种过继细胞疗法的临床缓解。尽管过继细胞治疗方案中给予对象的细胞在给予后数月甚至数年内仍可在对象体内检测到，但很大一部分(通常是大多数)给予的细胞进入静息状态，在静息状态中它们失去治疗性抗肿瘤功效。过继转移细胞的这种活性丧失通常与临床功效的丧失相关，包括肿瘤性疾病的复发或复现。
在人对象的临床实践中，为了支持过继转移的细胞(如TIL疗法和工程改造T细胞，如CAR-T细胞，通常采用的支持过继转移细胞在给予对象后的活力的方法是全身给予多能性细胞因子，白细胞介素-2。人白细胞介素2(IL2)是一个由133个氨基酸组成的4个α螺旋束的细胞因子。IL2是细胞因子IL2家族的成员，包括IL2、IL-4、IL-7、IL9、IL-15和IL21。hIL-2(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列可在Genbank中找到，登录号定位为NP_000577.2。IL-2由抗原激活的T细胞产生，对免疫系统产生广泛的影响，在调节免疫激活、抑制和内稳态方面发挥重要作用。IL2促进激活的T淋巴细胞的增殖和扩增，诱导初始T细胞的增殖和激活，增强B细胞的生长，并促进NK细胞的增殖和扩增。临床经验表明，HD-IL2治疗激活初始T细胞和NK细胞。临床前实验表明，NK细胞是IL2介导的急性毒性的主要机制。Assier，等(2004、)JImmunol 172：7661-7668；。给予HD-IL2还能刺激CD25+调节性T细胞(Treg)的扩增，其介导CD8+T细胞的活性。通常认为NK和Treg的扩增会导致附加毒性，如CRS。
在采用工程改造的肿瘤浸润淋巴细胞(“TIL”)或CAR-T细胞的过继细胞疗法的典型当前临床实践中，在输注TIL或CAR-T细胞的同时或之后不久，对象接受静脉内高剂量hIL2(HD-hIL2)720,000IU/kg)hIL2，每8小时一次(只要对象能够耐受此治疗)。给予HD-hIL2联合过继细胞疗法的被认为可进一步增强工程改造细胞产品的存活和临床功效。Anderson，等(2016)Clinical Cancer Research 22：3734-3745。人IL2(hIL2)的常用形式是阿地白介素
Figure BDA0003850638240000031
一种hIL2类似物，其在成熟hIL2分子的125位半胱氨酸被丝氨酸取代(C125S)。
然而，hIL2的全身给予与过继转移细胞群体之外的非特异性刺激作用有关，并且，特别是在高剂量下，与人对象的显著毒性有关。高剂量hIL2的作用，例如用于支持过继细胞治疗方案，已被证明在人对象中导致显著毒性。从与过继细胞转移(ACT)联合给予HD-hIL2中观察到的最普遍的副作用包括寒战、高烧、低血压、少尿和由于全身炎症和毛细血管渗漏综合征引起的水肿以及自身免疫现象(例如白癜风或葡萄膜炎)的报告。与HD-hIL2相关的毒性需要专家管控，因此通常应用于医院环境，并且经常需要进入重症监护室。Dutcher，等(2014)J Immunother Cancer 2(1)：26。HD-hIL2治疗激活大多数淋巴细胞，包括主要表达中等亲和力受体(CD122/CD132)的初始T细胞和NK细胞，和表达高亲和力三聚体受体(CD25/CD122/CD132)的CD25+调节性T细胞(Treg)。HD-hIL2单一疗法也可能诱导全身性毛细血管渗漏综合征(generalized capillary leak syndrome)，从而导致死亡。这将HD-IL2疗法的使用限制在大多数年轻、非常健康的心肺功能正常的患者身上。HD-IL2疗法通常在医院环境中应用，并且经常需要进入重症监护室。尽管已经提出一氧化氮合酶抑制剂可以改善VLS的症状，但是当观察到VLS时的常规做法是撤出IL2治疗。为了减轻与HD IL2治疗相关的VLS，已在患者中测试了低剂量IL2方案。虽然低剂量IL2治疗方案确实部分减轻了VLS毒性，但这种较低的毒性是以牺牲肿瘤治疗中的最佳治疗结果为代价的。
此外，临床批准的hIL2形式(例如
Figure BDA0003850638240000041
)具有相对较短的体内寿命(大约数小时)，需要频繁给药IL2以维持工程改造T细胞对IL2的充分暴露以维持细胞处于激活状态。尽管在文献中已经描述了修饰IL2以延长其体内寿命(例如，PEG化，Katre，等，美国专利号5,206,344，授权于1993年4月27日，Meyers，等(1991)Clinical Pharmacology andTherapeutics13(1)：307-313)这种长效形式的野生型hIL2的给予仍然存在与母体分子类似的毒性顾虑，并且这些试剂的长期暴露可能会起到加剧这种毒性的作用。因此，基于细胞的疗法的重大挑战是使工程改造的细胞具有所需的可调节的增殖行为信号，其独立于内源性信号转导通路的调控，表现出与非靶向内源细胞最小的交叉反应性，并且在工程改造细胞群给予对象之后可以选择性地受控。
在当前实践中，在给予过继细胞治疗产品之前，对象经历淋巴细胞清除准备方案和随后的白细胞介素-2(IL-2)支持。由于细胞治疗方案中的细胞剂量通常非常高(对于当前的CD19 CAR T产品，通常单次给予在106-108个细胞范围内)，淋巴细胞清除准备方案会耗竭Treg并去除细胞“库(sink)”，据信为过继转移细胞提供“空间(room)”。然而，淋巴细胞清除使患者容易受到环境因素的影响，从而显著损害了患者的利益。因此，避免淋巴细胞清除方案与细胞治疗相联将对患者有显著的好处。
制造细胞治疗产品的挑战是，这种“有生命的药物”需要密切控制其环境以保持活力和功能。在实践中，分离的细胞，无论是来自患者(自体)还是来自单一供体来源(同种异体)，在离开对象或受控的培养条件后，开始迅速失去功能。在离开对象或受控培养条件时，成功地维持分离细胞的活力，使分离细胞恢复功能，以重新插入细胞产品制造工作流程或患者体内。在用于过继细胞疗法的细胞的离体制备过程中，细胞经常在外源性hIL2存在下培养。由于hIL2的作用对包含工程改造和非工程改造的免疫细胞的混合细胞群中的工程改造细胞是非特异性的，因此这种对IL2的暴露在细胞群中不仅会导致所需的治疗有用细胞(例如CAR-T细胞或经历抗原的TIL)的扩增，而且也会从分离的组织(例如肿瘤或血液)样品中扩增多种不期望的背景细胞，其不提供临床益处，使工程改造的细胞产品的给药复杂化，并可能有助于毒性。因此，目前用于制备用于自体细胞转移的细胞的离体扩增方法导致细胞产物，其中所需的治疗有用细胞的百分比被不期望的细胞污染，从而导致次优的细胞产物。由于显著毒性仍然是当前ACT方案的显著问题，因此需要能够制备包含更均质细胞群的细胞产品的方法，这种细胞群富集有用于ACT治疗的所需有效细胞(例如，CAR-T细胞或经历抗原的TIL)产品。
此外，当前细胞疗法非常昂贵，因为其复杂性和相关毒性的管控通常需要患者长时间留在主要医疗中心或附近。大剂量细胞疗法的制造也很复杂且耗时。许多努力旨在减少从提取患者细胞到回输其工程改造形式的自体细胞疗法的时间(所谓的“静脉到静脉(vein-to-vein)”时间)，目前大约需要三周。目前正在研究同种异体或“现成的(off-the-shelf)”工程改造T细胞，以避免这种治疗延迟，并避免与这种个体化细胞疗法相关的费用。当前细胞疗法缺乏持久性，还导致需要大剂量的工程改造细胞，这进一步增加了成本并进一步延迟了静脉到静脉的时间。尽管细胞疗法已证明其治疗效用和前景，但细胞疗法的成本给资源有限的医疗保健系统带来了巨大压力，因此可能会限制它们对有需要的患者的更广泛可及性。本公开的组合物和方法解决了许多这些问题。
CD122是中等亲和力和高亲和力IL2受体复合物的组分。Sockolosky，等(Science(2018)359：1037-1042)和Garcia，等(美国专利申请公开US2018/0228841A1公开于2018年8月16日)描述了正交IL2/CD122配体/受体系统以促进选择性刺激工程改造以表达正交受体(特别是正交CD122)的细胞。本专利申请通过引用WO 2019/104092和US 2018-0228842A1)的公开将其全文纳入。表达正交(orthogonal)CD122的工程改造T细胞和与这种正交CD122同源的对应的正交配体(“IL2直向同源物(IL2 ortholog)”)接触，促进这种表达正交CD122的工程改造T细胞的特异性激活。特别是这种正交IL2受体配体复合物提供了细胞的混合群体，特别是T细胞的混合群体中工程改造以表达正交受体的细胞的选择性扩增。
发明内容
本发明提供了在过继细胞治疗实践中有用的方法和组合物。
在一些实施方式中，本发明提供正交受体。在一些实施方式中，该正交受体是正交CD122。在一些实施方式中，该正交受体是正交人CD122(hCD122)。在一些实施方式中，该正交受体是包含至少一个STAT3结合基序的正交CD122。
在一些实施方式中，本发明提供了包含编码正交hCD122受体的核酸序列的重组载体。
在一些实施方式中，本发明提供了包含编码正交hCD122受体和CAR的核酸序列的重组载体。在一些实施方式中，CAR。
在一些实施方式中，本发明提供了包含编码正交hCD122受体的核酸序列和编码CAR的核酸序列的重组哺乳动物免疫细胞。
在一些实施方式中，本发明提供了作为正交受体的同源配体的直向同源物。在一些实施方式中，直向同源物是IL2直向同源物。在一些实施方式中，IL2直向同源物是正交CD122受体的配体。在一些实施方式中，IIL2直向同源物是跨膜受体蛋白的同源配体，所述跨膜受体蛋白包含正交hCD122受体的胞外结构域。在一些实施方式中，IL2直向同源物是跨膜受体蛋白的同源配体，所述跨膜受体蛋白包含正交hCD122受体的胞外结构域，其包含H133和Y134位的氨基酸取代。在一些实施方式中，IL2直向同源物是包含H133和Y134位的氨基酸取代的正交hCD122的配体。在一些实施方式中，IL2直向同源物是包含氨基酸取代H133D和Y134F的正交hCD122的配体。
在一些实施方式中，本发明提供了包含式1的hIL2直向同源物的药学上可接受的制剂。
在一些实施方式中，本发明提供编码式1的hIL2直向同源物的核酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供包含编码式1的hIL2直向同源物的核酸序列的重组载体。
在一些实施方式中，本发明提供包含编码式1的hIL2直向同源物的核酸序列的重组载体的药学上可接受的制剂。
在一些实施方式中，本发明提供包含重组载体的重组修饰的哺乳动物细胞，所述载体包含编码式1的hIL2直向同源物的核酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供正交哺乳动物免疫细胞，其被重组修饰以表达正交受体(正交免疫细胞)。在一些实施方式中，正交免疫细胞免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，T细胞选自下组：初始CD8+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、初始CD4+T细胞、辅助T细胞，例如TH1、TH2、TH9、TH11、TH22、TFH；调节性T细胞，例如TR1、Treg、诱导型Treg；记忆性T细胞，例如中心记忆T细胞、效应记忆T细胞、NK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和此类T细胞的工程改造变体，包括但不限于CAR-T细胞、重组修饰TIL和TCR工程改造细胞。
在一些实施方式中，本发明提供正交Treg细胞。本发明进一步提供了在对象中诱导免疫抑制的方法，通过给予治疗有效量的正交Treg与给予足以引起对象中正交Treg增殖和/或激活的正交配体组合。在一些实施方式中，正交Treg任选地提供靶向结构域(例如，工程改造的TCR或CAR)。在一些实施方式中，该正交Treg是正交CAR-Treg(oCAR-Treg)。在一些实施方式中，oCAR-Treg的CAR的ABD特异性结合至人因子VIII。在一些实施方式中，oCAR-Treg的CAR的ABD特异性结合至人因子VIII。在一些实施方式中，oCAR-Treg的CAR的ABD特异性结合至HLA-A2。在一些实施方式中，oCAR-Treg是CD19-oCAR-Treg。正交Treg用于治疗与炎症性疾病相关的疾病。
在一些实施方式中，本发明提供正交NK细胞。本发明进一步提供了在对象中治疗肿瘤性疾病的方法，通过给予治疗有效量的正交NK(oNK)细胞与给予足以引起对象中正交Treg增殖和/或激活的正交配体组合。在一些实施方式中，oNK细胞任选地提供靶向结构域(例如，工程改造的TCR或CAR)。在一些实施方式中，该正交NK细胞是正交CAR-NK细胞(oCAR-NK细胞)。
在一些实施方式中，本发明提供哺乳动物免疫细胞，其被重组修饰以表达正交CD122多肽。在一些实施方式中，本发明提供哺乳动物免疫细胞，其被重组修饰以表达包含正交hCD122的胞外结构域的正交受体。在一些实施方式中，本发明提供哺乳动物细胞，其被重组修饰以表达包含在H133和Y134位含有氨基酸取代的CD122的胞外结构域的正交受体。在一些实施方式中，本发明提供哺乳动物细胞，其被重组修饰以表达在H133和Y134位含有氨基酸取代的正交hCD122。在一些实施方式中，本发明提供哺乳动物细胞，其被重组修饰以表达包含H133D和Y134F的氨基酸取代的正交hCD122。
在一些实施方式中，本发明提供正交受体及其同源正交配体(直向同源物)的使用方法，以在表达正交受体的哺乳动物细胞中诱导信号。在一些实施方式中，本发明提供了在哺乳动物细胞中引起响应的方法，所述细胞被工程改造以表达正交受体，所述方法包括使工程改造以表达正交受体的哺乳动物细胞与有效量的同源正交配体(直向同源物)接触，其中通过这种接触引起的响应是该工程改造细胞的激活、该工程改造细胞的激活状态的维持和/或该工程改造细胞的增殖。在一些实施方式中，本发明提供了在哺乳动物细胞中引起响应的方法，所述细胞被工程改造以表达正交受体，所述方法包括使工程改造以表达正交受体的哺乳动物细胞与有效量的同源正交配体(直向同源物)接触，其中通过这种接触引起的响应是在工程改造的细胞中STAT5磷酸化和/或STAT3磷酸化的增加。
在一些实施方式中，本发明提供了在哺乳动物免疫细胞中引起响应的方法，所述细胞被工程改造以表达正交受体，所述方法包括使工程改造以表达正交受体的哺乳动物细胞与有效量的同源正交配体(直向同源物)接触，其中该接触通过离体(体外)进行，通过这种接触引起的响应是该工程改造细胞的激活、该工程改造细胞的激活状态的维持和/或引起该工程改造细胞的增殖。
在一些实施方式中，本发明提供了一种制备基本工程改造细胞的工程改造免疫细胞产品的方法，该方法包括以下步骤：(a)从对象中分离混合的免疫细胞群；(b)用能够影响转染细胞中正交受体表达的重组载体转染所述分离的免疫细胞群的部分；(c)在存在特异性结合至正交受体的ECD的正交配体的情况下，培养所述混合免疫细胞群，使得表达正交受体的细胞选择性增殖，从而使细胞群富集表达正交受体的细胞。
在一些实施方式中，本发明提供了在哺乳动物免疫细胞中引起响应的方法，所述细胞被工程改造以表达正交受体，所述方法包括使工程改造以表达正交受体的哺乳动物细胞与有效量的同源正交配体(直向同源物)接触，通过这种接触引起的响应是该工程改造细胞的激活、该工程改造细胞的激活状态的维持和/或该工程改造细胞的增殖。
在一些实施方式中，本发明提供了在表达正交受体的哺乳动物细胞中引发响应的方法，该方法包括使所述表达正交受体的哺乳动物细胞离体(体外)接触足以引发响应的量的同源正交配体(直向同源物)。
在一些实施方式中，本发明提供了在表达正交受体的哺乳动物细胞中引发响应的方法，该方法包括使所述表达正交受体的哺乳动物细胞体外接触足以引发响应的量的同源直向同源物配体。
在一些实施方式中，本发明提供了使用方法，包括离体使用第一直向同源物(即同源配体)和体内使用第二直向同源物。在一些实施方式中，本发明提供使用方法，其包括离体使用第一直向同源物和体内使用第二直向同源物，其中该第一直向同源物和第二直向同源物是相同的直向同源物或不同的直向同源物。在一些实施方式中，本发明提供直向同源物的使用方法，以引发表达正交受体的哺乳动物细胞的增殖。
在一些实施方式中，本发明提供直向同源物的使用方法，以引发表达正交受体的哺乳动物细胞的激活。在一些实施方式中，本发明提供离体和/或体内直向同源物的使用方法，以引发表达正交受体的哺乳动物细胞的增殖。在一些实施方式中，本发明提供IL2直向同源物的使用方法，以引发表达正交CD122的哺乳动物细胞的增殖。
在一些实施方式中，本发明提供IL2直向同源物的使用方法，以引发表达正交CD122的哺乳动物细胞的激活。在一些实施方式中，本发明提供直向同源物的使用方法，以引发哺乳动物细胞的激活，所述哺乳动物细胞被重组修饰以表达包含在H133和Y134位含有氨基酸取代的CD122的胞外结构域的正交受体。
在一些实施方式中，本发明提供直向同源物的使用方法，以引发哺乳动物细胞的激活，所述哺乳动物细胞被重组修饰以表达在H133和Y134位含有氨基酸取代的正交CD122。在一些实施方式中，本发明提供直向同源物的使用方法，以引发哺乳动物细胞的激活，所述哺乳动物细胞被重组修饰以表达包含H133D和Y134F的氨基酸取代的正交CD122。
在一些实施方式中，本发明提供制备富含重组修饰以表达正交受体的哺乳动物细胞的细胞群的方法。在一些实施方式中，本发明提供富含重组修饰以表达正交受体的哺乳动物细胞的哺乳动物细胞群。
在一些实施方式中，本发明提供作为正交受体的同源配体的直向同源物的使用。在一些实施方式中，直向同源物是式1的直向同源物。在一些实施方式中，直向同源物是STK-007。在一些实施方式中，直向同源物是STK-009。
在一些实施方式中，本发明提供IL2直向同源物，其对于非工程改造的中等亲和力(CD122/CD132)IL2受体复合物或高亲和力(CD25/CD122/CD132)IL2受体复合物表现出减弱的亲和力，其也用于使直向同源物IL2的活性选择性地偏好组成型表达CD25的细胞(例如Treg)或诱导型表达CD25的细胞(例如激活的CD8+ T细胞)。对于天然野生型CD122胞外结构域(ECD)具有显著减弱的亲和力，但保留了对CD25的ECD的结合的IL2直向同源物，也可以用作野生型IL2的竞争性拮抗剂(通过干扰高亲和力IL2受体复合物形成)，并因此可以用于自身免疫疾病或移植物抗宿主(GVH)病的治疗中。
在一些实施方式中，本发明提供了IL2直向同源物，其特异性且选择性地结合至包含修饰的CD122多肽(正交CD122)的跨膜多肽的胞外结构域(ECD)。IL2直向同源物对正交CD122的结合参与胞内信号转导的转导通路，导致与IL2结合至中等亲和力或高亲和力IL2受体相关联的天然胞内信号转导模式的激活，但表现出对工程改造的表达正交CD122的细胞的选择性。相对于IL2直向同源物对CD122正交受体的结合，IL2直向同源物对野生型CD122(其不论以单独形式还是以内源高或中等亲和力IL12受体形式存在、)的胞外结构域可表现出显著减少的结合。在一些实施方式中，IL2直向同源物对正交CD122的胞外结构域的亲和力与野生型IL2对野生型CD122的亲和力相当。在一些实施方式中，IL2直向同源物对正交CD122的胞外结构域的亲和力大于野生型IL2对野生型CD122的胞外结构域的亲和力。在一些实施方式中，IL2直向同源物对正交CD122的胞外结构域的亲和力小于野生型IL2对野生型CD122的胞外结构域的亲和力。
本发明进一步提供了制备本发明的IL2直向同源物的方法。特别地，本发明提供重组表达载体，其包含编码可操作地连接至控制元件的IL2直向同源物的核酸序列，以在宿主细胞中提供编码IL2直向同源物的核酸序列的表达。
本发明进一步提供了工程改造的表达正交受体的哺乳动物细胞。本发明进一步提供了工程改造的表达正交受体的哺乳动物细胞的药学上可接受的制剂。
本发明还提供了产生工程改造的细胞治疗产品的药学上可接受的剂型的方法，所述剂型包含T细胞群，其中所述T细胞群基本富集一种或多种工程改造T细胞种类，所述工程改造的T细胞表达包含CD122正交多肽的胞外结构域的受体，所述方法包括在本发明的IL2直向同源物的存在下，离体培养所述包含表达含有CD122正交多肽的胞外结构域的受体的工程改造的T细胞的T细胞群，持续足以富集一种或多种此类工程改造的T细胞的细胞群的时间。
在一些实施方式中，重组载体，其包含编码操作性地连接至控制元件的本文所述的IL2直向同源物的核酸序列，以促进IL2直向同源物从哺乳动物细胞的表达和分泌，给予对象以提供IL2直向同源物的原位表达。在一些实施方式中，重组载体被瘤内给予患癌对象。在一些实施方式中，重组载体是重组病毒载体。在一些实施方式中重组病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)或重组腺病毒(rAd)，例如，在一些实施方式中，源自人腺病毒血清型3和/或5的复制缺陷的腺病毒。在一些实施方式中，复制缺陷的腺病毒具有一个或多个对E1区的修饰，这干扰病毒启动细胞循环和/或凋亡途径的能力。复制缺陷的腺病毒载体可以任选地在E3结构域中包含缺失。在一些实施方式中，腺病毒是复制能力型腺病毒。在一些实施方式中腺病毒是复制能力型重组病毒，其被工程改造为选择性地在肿瘤细胞中复制。
本发明进一步提供了制备细胞治疗产品的药学上可接受的剂型的方法，其包含至少一种(或2、3、4或更多种)工程改造T细胞，所述工程改造的T细胞表达跨膜受体蛋白，其中这种跨膜受体蛋白的胞外结构域包括CD122正交多肽的胞外结构域，其中在细胞治疗产品中，工程改造细胞部分占细胞治疗产品的总细胞数的至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％。
在一些实施方式中提供了治疗性方法，所述方法包括向有需要的对象引入细胞群，所述细胞群包含工程改造的人免疫细胞，其包含编码以下的核酸序列：包含人正交CD122的ECD的跨细胞膜多肽、跨膜结构域和胞内信号转导结构域，其响应于配体与所述跨细胞膜多肽的ECD的结合而产生胞内信号，所述核酸序列操作性地连接至表达控制元件，以促进所述跨膜多肽的转录和翻译和细胞表面呈递。这种细胞群可以包括已经离体修饰且对于对象而言是自体的或同种异体的细胞。在一些实施方式中，该治疗性方法包括：(1)将细胞群与一定量的同源IL2直向同源物以足以激活所述工程改造细胞的浓度和持续时间离体接触，所述工程改造细胞包含含有胞外结构域(其为正交CD122 ECD)的受体；和(2)将所述细胞群给予对象；和(3)在给予工程改造细胞之后，体内给予同源IL2直向同源物。在一些实施方式中，引入的细胞群体内解除同源正交细胞因子，随后给予工程改造的细胞。
本发明进一步提供了在哺乳动物对象体内延长正交工程改造免疫细胞(例如正交CAR-T细胞)的激活形式(“持久性”)的方法，给予对象有效量的正交配体。
本发明进一步提供了在哺乳动物对象体内特异性且选择性激活和/或诱导正交免疫细胞(例如正交CAR-T细胞)增殖的方法，通过给予哺乳动物对象有效量的正交免疫细胞联合给予有效量的正交配体。
本发明进一步提供了治疗患有肿瘤性疾病的对象的方法，通过给予哺乳动物对象有效量的正交CAR-T细胞，组合给予有效量的针对正交CAR-T细胞上表达的受体的同源正交配体。
本发明进一步提供了治疗患有弥漫性(非实体瘤)肿瘤性疾病的对象的方法，通过给予哺乳动物对象有效量的正交CAR-T细胞，联合给予有效量的针对正交CAR-T细胞上表达的受体的同源正交配体。
本发明进一步提供了治疗患有肿瘤性疾病的对象的方法，其特征在于存在实体瘤(例如淋巴瘤、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、HPV相关癌症如宫颈癌、成神经细胞瘤)，通过给予哺乳动物对象有效量的正交T细胞，联合给予有效量的针对正交T细胞上表达的受体的同源正交配体。
本发明进一步提供了恢复对象中耗尽的正交免疫细胞活性的方法，通过给予对象有效量的正交配体。
本发明进一步提供了治疗患有肿瘤疾病复发的对象的方法，在治疗方案中特征在于给予正交CAR-T细胞产品，该方法包括以下步骤：(i)给予对象有效量的针对先前给予的正交CAR-T细胞上表达的受体的同源正交配体，其足够恢复先前给予的正交CAR-T细胞的活性；(ii)定期给予对象有效量的针对先前给予的正交CAR-T细胞上表达的受体的同源正交配体，以使正交CAR-T细胞的活性维持足够长的时间；(iii)评估对象是否存在肿瘤性疾病，当缺乏肿瘤性疾病的证据时，根据足以维持足以对肿瘤细胞进行免疫监视的一定量的正交CAR-T细胞的维持给药方案，继续定期地给予正交配体或停止给予正交配体。
本发明进一步提供了在用CAR-T细胞疗法治疗肿瘤性疾病中预防和/或治疗复发的方法，通过给予正交CAR-T细胞，随后以足以维持足以对肿瘤细胞进行免疫监视的一定量的正交CAR-T细胞的维持给药方案，定期给予有效量的针对正交CAR-T细胞上表达的受体的同源正交配体。
本发明进一步提供了治疗患有复发的或难治性肿瘤疾病的对象的方法，在治疗方案中特征在于在先给予正交CAR-T细胞产品，该方法包括以下步骤：(i)给予对象有效量的针对先前给予的正交CAR-T细胞上表达的受体的同源正交配体，其足够恢复先前给予的正交CAR-T细胞的活性；(ii)定期给予对象有效量的针对先前给予的正交CAR-T细胞上表达的受体的同源正交配体，以使正交CAR-T细胞的活性维持足以引起治疗性缓解的时间；(iii)评估对象是否存在肿瘤性疾病，当缺乏肿瘤性疾病的证据时，根据足以维持足以对肿瘤细胞进行免疫监视的一定量的正交CAR-T细胞的维持给药方案，继续定期地给予正交配体或停止给予正交配体。
本发明进一步提供了用正交hCD122细胞和其正交hIL2配体治疗患有肿瘤性疾病的哺乳动物对象的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在给予正交hCD122细胞之前两周至一天的时间段内，给予对象治疗有效剂量的针对正交CAR-T上表达的受体的正交配体(即，引发)；(ii)给予对象治疗有效量的正交hCD122细胞，与正交配体组合，所述正交配体为针对正交hCD122细胞的正交CD122受体的同源hIL2配体，和任选地(iii)评估对象是否存在肿瘤性疾病，如果缺乏肿瘤性疾病的证据，停止给予正交配体或继续后续地给予正交配体，其剂量足以维持足以对肿瘤细胞进行免疫监视的循环正交CAR-T细胞的水平，以及任选地，在复发的情况下，给予治疗有效量的正交配体，所述正交配体为针对先前给予的正交hCD122细胞的正交CD122受体的同源hIL2配体。
在另一方面，本发明提供治疗慢性病毒感染的方法，通过给予包含对于病毒感染的细胞表面上表达的抗原特异的靶向结构域的正交细胞。适合用本发明的组合物和方法治疗的慢性病毒感染的例子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)、HTLV1、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)、爱泼斯坦-巴尔病毒、人疱疹病毒6型、人疱疹病毒7型、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV1和HIV2)。
在一些实施方式中，工程改造的T细胞经基因组修饰以消除检查点表达(即，检查点敲除的”)。这种检查点敲除细胞的例子包括PD1敲除(“PDlKO”)T细胞。创建PD1KO T细胞的策略在本领域中是众所周知的。PD1KO T细胞在本领域中是众所周知的。McGowan，等(121PD1破坏Car-T细胞治疗实体瘤：愿景和挑战(121PD1 disrupted Car-T Cells In TheTreatment of Solid Tumors：Promises and Challenges))Biomedicine andPharmacotherapy Biomedicine&Pharmacotherapy，卷121(2020，2019年11月13日可在线获得)109625，https：//doi.org/10.1016/j.biopha.2019.109625)提供了关于在多种临床应用中探索的工程改造和分离的PD1KO T细胞的广泛的综述(参见表1)。
替代完全消除正交免疫细胞中的PD1功能，在一些实施方式中，本发明的正交免疫细胞提供了一种下调正交免疫细胞中PD1活性的机制。PDL1在肿瘤细胞和慢性病毒感染细胞上的表达使这些细胞能够通过结合人免疫细胞上表达的PD1来逃避免疫监视。尽管有小组已经证明敲除PD1表达的工程改造的T细胞是有效的，但它们也是不加选择的并导致显著毒性，因为它们能够产生通常由PD1/PDL1相互作用的自我耐受机制介导的显著的靶毒性。在一些实施方式中，下调条件性响应于信号转导，所述信号转导是通过免疫细胞结合至其靶标，或工程改造的靶标引发的，在细胞被工程改造以表达特异性靶向/激活结构域的情况下，例如CAR(例如oCAR-T细胞、oCAR NK细胞、oTCR工程改造的T细胞)或内源结合结构域(例如正交(ortho)TIL))。免疫细胞结合上调的因子可用于选择性下调正交免疫细胞中的PD1表达控制序列，从而导致仅在正交细胞与其适当靶标相互作用时下调PD1表达。在一些实施方式中，可以将结构域工程改造到CAR ICD中，从而CAR与靶抗原的结合导致靶向结构域与靶标相互作用后抑制PD1表达的细胞内的信号传导，从而使激活的正交免疫细胞能够避免下调和PD1与表达PDL1的细胞(例如慢性病毒感染或肿瘤细胞)相互作用引起的免疫逃逸的可能性。除了上述之外，用于减轻工程改造的免疫细胞的PDL1免疫调节的其他机制可以纳入本发明的正交免疫细胞中。参见，例如，Busser，等美国专利申请公开US2020/0407694A1，公开于2020年12月31日，Li，等，美国专利申请公开US20180327470A1，公开于2018年11月15日。
如前所述，当前细胞疗法的重要问题是缺乏支持转移的细胞被给予患者后的增殖的无毒手段。
本发明提供了人正交细胞。细胞哺乳动物细胞，其包含编码正交hCD122受体的核酸序列，该核酸序列操作性地连接至一个或多个表达控制元件，使得该哺乳动物免疫细胞表达正交hCD122受体。
本发明提供了一种哺乳动物免疫细胞，其包括(a)编码正交hCD122受体的核酸序列，其操作性地连接至一个或多个表达控制元件，使得哺乳动物免疫细胞表达正交hCD122受体，和(b)编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其操作性地连接至一个或多个表达控制元件，使得哺乳动物免疫细胞表达CAR。
本发明提供了一种重组表达载体，该载体包括：(a)编码正交hCD122受体的核酸序列，其操作性地连接至一个或多个表达控制元件，使得哺乳动物免疫细胞表达正交hCD122受体，和(b)编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其操作性地连接至一个或多个表达控制元件，使得哺乳动物免疫细胞表达CAR。
本发明提供了一种通过给予哺乳动物细胞治疗肿瘤性疾病的方法，所述哺乳动物细胞包含编码正交CD122受体的核酸序列。
本发明提供了一种治疗人对象的肿瘤性疾病的方法，其包括给予哺乳动物免疫细胞，该哺乳动物免疫细胞包含编码正交hCD122受体的核酸序列，其操作性地连接至一个或多个表达控制元件，使得该哺乳动物免疫细胞表达正交hCD122受体，以及给予结合至hCD122受体的ECD并导致胞内信号转导的正交配体。在一些实施方式中，在给予哺乳动物免疫细胞之前给予配体。
本发明提供了当前细胞疗法的重要问题，即缺乏支持转移的细胞被给予患者后的增殖的无毒手段。
本发明提供了人正交细胞。细胞是哺乳动物细胞，其包含编码正交hCD122受体的核酸序列，该核酸序列操作性地连接至一个或多个表达控制元件，使得该哺乳动物免疫细胞表达正交hCD122受体。
本发明提供了一种哺乳动物免疫细胞，其包括(a)编码正交hCD122受体的核酸序列，其操作性地连接至一个或多个表达控制元件，使得哺乳动物免疫细胞表达正交hCD122受体，和(b)编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其操作性地连接至一个或多个表达控制元件，使得哺乳动物免疫细胞表达CAR。
本发明提供了一种重组表达载体，该载体包括：(a)编码正交hCD122受体的核酸序列，其操作性地连接至一个或多个表达控制元件，使得哺乳动物免疫细胞表达正交hCD122受体，和(b)编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其操作性地连接至一个或多个表达控制元件，使得哺乳动物免疫细胞表达CAR。
本发明提供了一种通过给予哺乳动物细胞治疗肿瘤性疾病的方法，所述哺乳动物细胞包含编码正交CD122受体的核酸序列。
本发明提供了一种治疗人对象的肿瘤性疾病的方法，其包括给予哺乳动物免疫细胞，该哺乳动物免疫细胞包含编码正交hCD122受体的核酸序列，其操作性地连接至一个或多个表达控制元件，使得该哺乳动物免疫细胞表达正交hCD122受体，以及给予结合至hCD122受体的ECD并导致胞内信号转导的正交配体。在一些实施方式中，在给予哺乳动物免疫细胞之前给予配体。
在一些实施方式中，提供了一种治疗或预防需要治疗或预防的哺乳动物对象中疾病、紊乱或病症的方法，所述方法包括步骤：
(a)从对象分离一定量的免疫细胞；
(b)使分离的一定量的分离免疫细胞与核酸序列接触，所述接触在使分离的免疫细胞摄取所述核酸序列的条件下进行，所述核酸序列编码跨膜受体，所述跨膜受体包括与胞外结构域操作性连通(operable communication)的胞内信号转导结构域，所述受体的胞外结构域包括正交hCD122或其功能片段的ECD；
(c)使步骤(b)的所述分离的一定量的细胞离体接触一定量的正交配体，所述正交配体的量足够诱导由步骤(b)的所述接触转导的细胞增殖，接触被实施一段时间，以使得转导的细胞占细胞群的至少20％；
(d)将治疗有效量的步骤(c)产生的细胞群的细胞给予哺乳动物对象，组合给予治疗有效剂量的正交配体。
在一些实施方式中，群体包含一种或多种人免疫细胞，其选自下组：骨髓细胞、淋巴细胞、外周血单核细胞(PBMC)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞、CD8+ T细胞、CD25+CD8+T细胞、CAR-T细胞、NK细胞、CD4+ T细胞和Treg。
在一些实施方式中，在步骤(a)之后步骤(b)之前，细胞群被离体操作使所述群体富集激活的免疫细胞或经历抗原的T细胞。
在一些实施方式中，正交hCD122或其功能片段包含在第133位和/或第134位具有氨基酸取代的氨基酸序列，根据野生型hCD122编号。
在一些实施方式中，步骤(b)的接触进一步包括摄取编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。
在一些实施方式中，编码CAR的核酸序列和编码受体的核酸序列在分开的载体上提供，每个核酸序列操作性地连接至在哺乳动物免疫细胞中具有操作性的表达控制序列。
在一些实施方式中，编码CAR的核酸序列和编码受体的核酸序列在单个载体上提供。
在一些实施方式中，核酸序列操作性地连接至相同的表达控制元件。
在一些实施方式中，载体包含被T2A编码序列的IRES元件分开的两个核酸序列。
在一些实施方式中，载体是病毒载体。
在一些实施方式中，载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。
在一些实施方式中，在步骤(b)中离体使用的正交配体与步骤(c)中体内使用的正交配体不同。
在一些实施方式中，其中在步骤(d)之前用淋巴细胞清除方案治疗对象。
在一些实施方式中，步骤(d)中的给予的初始剂量为每kg对象体重100,000至1,000,000个激活免疫细胞。
在一些实施方式中，所述正交配体的给予是定期给予所述对象，以在至少两周的时间段内维持每kg对象体重100,000至1,000,000个激活免疫细胞的水平。
在一些实施方式中，给予所述正交配体直到没有残留肿瘤的实质性迹象时，此时所述正交配体的剂量被减少到足以在该观察后至少3个月的时间内维持每kg体重约10,000至100,000个细胞的正交免疫细胞的低循环水平。
在一些实施方式中，给予所述正交配体直到没有残留肿瘤的实质性迹象时，此时所述正交配体的给药终止。
在一些实施方式中，如果所述患者从免疫细胞治疗的原疗程(initial course)复发，则所述方法进一步包括以下步骤：在没有附加剂量的正交工程改造细胞的情况下，给予所述复发的患者治疗有效量的正交配体，使得所述正交配体诱导先前给予的正交细胞的激活和/或增殖，所述正交配体被应用于所述对象一段时间，直到观察到复发肿瘤的缓解。
在一些实施方式中，病症的疾病、紊乱是肿瘤性疾病。
在一些实施方式中，病症的疾病、紊乱是慢性病毒性疾病。
在一些实施方式中，病症的疾病、紊乱是炎症性疾病。
还提供了一种基本富集激活的正交免疫细胞群的细胞产品，所述产品是通过包含以下步骤的过程获得的：
(a)从哺乳动物对象分离一定量的免疫细胞；
(b)使所述分离的一定量的分离免疫细胞与核酸序列接触，所述接触在使分离的免疫细胞摄取所述核酸序列的条件下进行，所述核酸序列编码跨膜受体，所述跨膜受体包括与胞外结构域操作性连通的胞内信号转导结构域，所述受体的胞外结构域包括正交hCD122或其功能片段的ECD；
(c)使步骤(b)的分离的一定量的细胞离体接触一定量的正交配体，所述正交配体的量足够诱导由步骤(b)的所述接触转导的细胞增殖，所述接触被实施一段时间，以使得所述转导的细胞占所述细胞群的至少20％。
在一些实施方式中，细胞产品包含一种或多种人免疫细胞，其选自下组：骨髓细胞、淋巴细胞、外周血单核细胞(PBMC)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞、CD8+ T细胞、CD25+CD8+ T细胞、CAR-T细胞、NK细胞、CD4+ T细胞和Treg。
在一些实施方式中，细胞产品被进一步操作以去除所述细胞的内源TCR结构域。
附图说明
结合附图，通过以下详述更好地理解本发明。需要强调，按照惯例，附图的各个特征不成比例。相反，各种特征的尺寸被任意放大或者缩小以清楚显示。附图部分包括如下的附图。
附图的图1提供了用来自描述于实施例6的实验的293T转染上清处理的NKL细胞的Celltiterglo值。对于接受指定稀释的每种上清的NKL细胞(用粗体表示)，重复的Celltiterglo值示于并排的列中。
附图的图2提供了用来自描述于实施例6的实验的293T转染上清处理的NKL hoRB细胞的Celltiterglo值。对于接受指定稀释的每种上清的NKL hoRB细胞(用粗体表示)，重复的Celltiterglo值示于并排的列中。
图3A-B提供了播散性体内RAJI肿瘤研究的结果，如以下实施例7中更全面描述的，证明了与单独的CAR-T或PBS相比，用正交配体处理CAR-T正交细胞的效果。
图4A-B提供了再激发(rechallenge)研究的结果，如下文实施例8中更全面描述的，证明了单独给予正交配体(无需另提供细胞)，甚至长时间没有抗原或肿瘤配体暴露，能够恢复CAR T细胞的抗肿瘤活性。
图5A-B提供了在实施例8中更充分描述的皮下RAJI-luc淋巴瘤复发小鼠模型中重新给药的结果。该数据证明单独给予STK-009能够在从先前的治疗过程中复发的动物中实现CAR-T细胞的抗肿瘤活性。
图6是FACS分析结果的直方图，如实施例8中更全面描述的数据，其证明正交配体(STK-009)能够扩增正交CAR-T细胞并保留干细胞记忆CAR-T细胞群。
图7A-C提供了从皮下Raji实体瘤模型产生的卡尺测量数据，如下文实施例11中更充分描述的，正交CAR-T细胞与正交配体组合在实体瘤模型的体内治疗中的功效。
图8提供了从如本文实施例11中所述的实验中产生的肿瘤缓解的物理测量数据的图形表示，表明CD19正交CAR-T细胞与正交配体(STK-009)的组合在实体瘤治疗中是有效的。
图9提供了与如实施例8中所述的皮下实体瘤模型研究相关的Kaplan-Meier生存图。所提供的数据证明，CD19正交CAR-T细胞与正交配体(STK-009)的组合给予有效治疗实体瘤并赋予显著的生存优势。
图10提供了从如实施例8所述的皮下实体瘤模型研究结束后处死的小鼠中分离的组织的免疫组织化学。
具体实施方式
引言
为了使本发明更容易被理解，下文以及整个说明书中对某些术语和短语进行了定义。本文提供的定义是非限制性的，应根据本领域技术人员的知识阅读。
在描述本发明的方法和组合物之前，应理解，本发明不限于所述的方法或组合物，因为它们当然可能变化。还应理解，本文中使用的术语仅意在描述特定实施方式，并不旨在进行限制。
提供数值范围时，也应视作具体公开了该范围的上限和下限之间以下限单位十分之一为间隔的各中间数值，除非上下文另有明确说明。本发明还包括设定范围内任何设定数值或中间数值和该设定范围内任何其它设定数值或中间数值之间的较小范围。取决于设定范围内任何明确排除的限值，所述范围可独立地包含或排除这些较小范围的上下限，本发明也包括这些较小范围不包含限值、包含任一或两个限值的各范围。设定范围包含一个或两个限值时，本发明也包括排除所述限值之一个或两个的范围。
除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但在此描述一些潜在和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用纳入本文，以公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。
应注意，本文和所附权利要求书所用的单数形式″一个″、″一种″和″所述″包括复数含义，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提到″细胞″包括多个这样的细胞，提到″所述肽″包括本领域技术人员已知的一或多个肽及其等同物，例如多肽，等等。
提供本文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际公开日期不同，这可能需要单独确认。
提供本文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际公开日期不同，这可能需要单独确认。
除非另有说明，本文使用以下缩写：份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度(℃)，压力是大气压或接近大气压。使用标准缩写，包括下述：bp＝碱基对；kb＝千碱基；pl＝皮升；s或sec＝秒；min＝分钟；h或hr＝小时；AA或aa＝氨基酸；kb＝千碱基；nt＝核苷酸；pg＝皮克；ng＝纳克；μg＝微克；mg＝毫克；g＝克；kg＝千克；dl或dL＝分升；μl或μL＝微升；ml或mL＝毫升；l或L＝升；μM＝微摩尔；mM＝毫摩尔；M＝摩尔；kDa＝千道尔顿；i.m.＝肌肉内(经肌肉内)；i.p.＝腹膜内(经腹膜内)；SC或SQ＝皮下(经皮下)；QD＝每日一次；BID＝每日两次；QW＝每周一次；QM＝每月一次；HPLC＝高效液相色谱；BW＝体重；U＝单元；ns＝无统计学显著性；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；PCR＝聚合酶链式反应；HSA＝人血清白蛋白；MSA＝小鼠血清白蛋白；DMEM＝达氏改良伊氏培养基；；EDTA＝乙二胺四乙酸。
应理解，在本公开内容中，根据单字母或三字母代码提及氨基酸。为了方便阅读者，单字母和三字母氨基酸代码在下表1中提供：
Figure BDA0003850638240000241
科学文献中描述了分子生物学的标准方法(参见，例如，Sambrook和Russell(2001)《分子克隆》(Molecular Cloning)，第3版，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，纽约冷泉港；和Ausubel，等(2001)《新编分子生物学指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，卷1-4，约翰威利父子公司(John Wileyand Sons，Inc.)纽约州纽约，其描述了在细菌细胞中克隆和DNA定点诱变(卷1)、哺乳动物细胞中和酵母中的克隆(卷2)、糖偶联物和蛋白质表达(卷3)，以及生物信息学(卷4))。科学文献描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶，以及化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的生产和蛋白糖基化(参见，例如，Coligan，等(2000)《新编蛋白质科学方案》(Current Protocols in Protein Science)，卷.1-2，约翰威利父子公司(John Wiley and Sons，Inc.)，NY)。
B.定义
除非另有说明，下述术语意在具有如下含义。在整个说明书中定义了其他术语。
激活：本文所用术语“激活”用于指受体或受体复合物以反映直接和/或通过参与多组分信号转导级联产生的生物学效应，该生物学效应是对配体的结合响应，由激动剂配体结合至受体产生的。例如，据称IL2激动剂(IL2激动剂配体)与IL2受体的结合“激活”该受体的信号转导以产生一种或多种胞内生物学效应(例如STAT5的磷酸化)。
活性：如本文所用术语“活性”是针对分子而言，以描述分子相对于测试系统(例如，试验)的特性或生物学或化学特性(例如该分子结合至另一分子的程度)或材料或细胞的物理学特性(例如细胞膜电位的改变)。这种生物学功能的例子包括但不限于生物剂的催化活性、刺激胞内信号转导的能力、基因表达、细胞增殖、调节免疫学活性(如炎症反应)的能力。“活性”通常表示为每个单元的测试试剂的生物活性水平，例如[催化活性]/[mg蛋白质]、[免疫活性]/[mg蛋白质]，活性的国际单位(IU)，[STAT5磷酸化]/[mg蛋白质]、[T-细胞增殖]/[mg蛋白质]、噬斑形成单位(plaque forming units)(pfu)等。如本文所用，术语“增殖活性”指促进细胞增殖和复制的活性，其包括在肿瘤疾病、炎症性疾病、纤维化、发育异常、细胞转化、转移和血管生成中观察到的失调的细胞分裂。
给药/给予：术语“给予”、“给药”和“施用”在本文中可互换使用，指的是接触对象的行为，包括用试剂与对象体外、体内或离体的细胞、组织、器官或生物流体接触(例如，直向同源物、IL2直向同源物、表达正交受体的工程改造的细胞、表达正交IL2受体的工程改造的细胞(例如表达正交IL2受体的CAR-T细胞)、化疗剂、抗体)或包含上述一种或多种的药物制剂。试剂的给予可以通过多种本领域认可的方法中的任一种实现，包括但不限于局部给予、血管内注射(包括静脉或动脉内输注)、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、颅内注射、瘤内注射、经皮、经粘膜、离子电渗透递送(iontophoretic delivery)、淋巴管内注射、胃内输注、前列腺内注射、膀胱内输注(如：膀胱)、吸入(例如呼吸道吸入器，包括干粉吸入器)、眼内注射、腹内注射、病灶内注射、卵巢内注射、脑内输注或注射、脑室内注射(ICVI)等。术语“给予”包括试剂与细胞、组织或器官的接触，以及试剂与液体的接触，其中液体与细胞、组织或器官接触。
不良事件：如本文所用，术语“不良事件”是指与在对象中使用治疗性或预防性试剂有关的任何不期望的经历。不良事件不一定是由给予治疗或预防试剂(例如IL2直向同源物)引起的，也可能由无关的情况引起。不良事件通常被分为轻度、中度或严重。如本文所使用的不良事件的分类符合美国卫生与公众服务部、国家卫生研究院和国家癌症研究所于2017年11月27日公布的不良事件通用术语标准v5.0(CTCAE)。
亲和力：如本文所用术语“亲和力”是指第一分子(例如配体)特异性结合至第二分子(例如受体)的程度，并通过以Kd表示的结合动力学衡量，其为分子与其靶标之间的解离常数(Koff)和分子与其靶标之间的缔合常数(Kon)的比率。
激动剂：如本文所用，术语“激动剂”是指特异性结合至第二试剂(“靶标”)并与靶标相互作用以引起或促进靶标激活的增加的第一试剂。在一些情况下，激动剂是受体蛋白的激活剂，可以调节细胞激活、增强激活、使细胞对第二试剂的激活敏感、或上调一个或多个基因、蛋白质、配体、受体、生物学通路，其可能导致细胞增殖或导致细胞周期停止，或导致细胞死亡(如通过凋亡)的通路的表达。在一些实施方式中，激动剂是结合至受体并改变受体状态，导致生物学响应的试剂。该响应模拟受体的内源性激活剂的效果。术语“激动剂”包括部分激动剂、完全激动剂和超级激动剂。当激动剂导致所研究的受体诱发的基本完全的生物响应(即与天然存在的配体/受体结合相互作用有关的响应)时，可将这种激动剂描述为“完全激动剂”，或者，激动剂也可以被描述为部分激动剂。与激动剂相反，拮抗剂可以特异性地结合至受体，但不导致通常由受体启动的信号级联，并且可以改变激动剂在该受体上的作用。反向激动剂是指产生与激动剂方向相反的药理反应的药剂。″超级激动剂″是能够产生大于靶受体的内源性激动剂的最大响应的激动剂，因此具有超过天然配体的100％的活性。超级激动剂通常是合成分子，在比较试验中以类似的浓度评估时，在分子的天然存在形式的可评估的定量或定性参数中，其表现出大于110％、或者大于120％、或者大于130％、或者大于140％、或者大于150％、或者大于160％、或者大于170％的响应。应该注意的是，与完全激动剂相关的生物效应可能在程度和/或种类上与部分或超级激动剂的那些生物效应不同。
拮抗剂：如本文所用，术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指与激动剂一种或多种作用相对的分子。拮抗剂可以防止、减少、抑制或中和激动剂的活性，而且拮抗剂也可以防止、抑制或减少靶标(如靶受体)的组成型活性，即使没有鉴定的激动剂。抑制剂是减少、阻断、防止、延迟激活、失活、脱敏或下调，例如，基因、蛋白质、配体、受体、生物学通路(包括免疫检查点通路)或细胞的分子。
抗体：如本文所用，术语“抗体”统称指：(a)糖基化的和非糖基化的免疫球蛋白(包括但不限于哺乳动物免疫球蛋白类别IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)，它们特异性结合至靶分子，和(b)免疫球蛋白衍生物，其包括但不限于IgG(1-4)ΔCH2、F(ab’)2、Fab、ScFv、VH、VL、四抗、三抗、双抗、dsFv、F(ab’)3、scFv-Fc和(scFv)2，它们与其来源的免疫球蛋白竞争结合至靶分子。术语抗体不限于来自任何特定哺乳动物物种(包括小鼠、人、马、骆驼)的免疫球蛋白、抗体、人抗体。术语抗体包括所谓的“重链抗体”或“VHH”或
Figure BDA0003850638240000271
通常获取自骆驼科(包括骆驼、美洲驼和羊驼)的免疫(参见，例如Hamers-Casterman，等(1993)Nature 363：446-448)。具有给定特异性的抗体也可以来源于非哺乳动物来源，例如从软骨鱼(包但不限于鲨鱼)的免疫中获得的VHH。术语“抗体”包括可从天然来源或用抗原免疫后从动物身上分离的抗体，以及工程改造抗体，包括单克隆抗体、双特异性抗体、三特异性、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植的、饰面(veneered)的或去免疫化的(例如，去除T细胞表位)抗体。术语“人抗体”包括从人获得的抗体，以及从包含人免疫球蛋白基因的转基因哺乳动物中获得的抗体，使得，在抗原刺激后，转基因动物产生包含人产生的抗体的氨基酸序列特征的抗体。该术语包括亲本抗体及其衍生物，如亲和成熟的、饰面的、CDR移植的、人源化的、骆驼源化的(在VHH的情况下)，或非免疫球蛋白支架中包含抗体的结合结构域(如CDR)的结合分子。术语″抗体″应解释为不限于任何特定的合成方式，包括可从天然来源分离的天然存在的抗体，以及通过″重组″手段制备的工程改造抗体分子，所述工程改造的抗体分子包括从转人免疫球蛋白基因的转基因动物或由其制备的杂交瘤分离的抗体，从转化了导致抗体表达的核酸构建体的宿主细胞中分离出的抗体，从组合抗体文库(包括噬菌体展示文库)中分离出的抗体。在一个实施方式中，“抗体”是哺乳动物的免疫球蛋白。在一些实施方式中，该抗体是“全长抗体”，其包括提供结合和效应功能的可变和恒定结构域。在大多数情况下，全长抗体包括两条轻链和两条重链，各轻链包括可变区和恒定区。在一些实施方式中，术语“全长抗体”用于指常规的IgG免疫球蛋白结构，包括两条轻链和两条重链，各轻链包括提供结合和效应功能的可变区和恒定区。术语抗体包括抗体偶联物，其包括为延长作用时间而进行的修饰，例如融合蛋白(例如，Fc融合体)或偶联至聚合物(例如聚乙二醇)，如在下文更详细地描述。
生物样品：如本文所用术语“生物样品”或“样品”表示获自(或源自)对象的样品。举例而言，生物样品包括选自下组的材料：体液、血液、全血、血浆、血清、粘液分泌物、唾液、脑脊液(CSF)、支气管肺泡灌洗液(BALF)、眼液(如玻璃体液、房水)、淋巴液、淋巴结组织、脾脏组织、骨髓，以及来自这些组织中一种或多种的富集了免疫球蛋白的部分。在一些实施方式中，样品获取自已经暴露于治疗性治疗方案的对象，例如重复暴露于一个或多个治疗剂，所述治疗剂包括IL2直向同源物的药物制剂。在其他实施方式中，样品获取自最近没有暴露于hIL2直向同源物的对象，或在计划给予hIL2直向同源物或包含IL2直向同源物的治疗方案之前从对象处获得。
CAR”或“嵌合抗原受体”：如本文所用，术语“嵌合抗原受体”和“CAR”可互换使用，指的是包含多个功能结构域的嵌合多肽，其从氨基端到羧基端的序列依次排列为：(a)包含抗原结合结构域(ABD)的胞外结构域(ECD)，任选地包含“铰链”结构域；(b)跨膜结构域(TD)；和(c)一个或多个胞质信号转导结构域(CSD)，其中上述结构域可以任选地由一个或多个间隔子结构域连接。CAR还可进一步包括信号肽序列，其通常在翻译后处理过程中被去除，并在用包含编码CAR的核酸序列的表达载体转化的细胞表面呈递CAR。CAR可以按照本领域众所周知的原理制备。参见，例如，Eshhaar等，美国专利号7,741,465 B1，2010年6月22日授权；Sadelain，等(2013)Cancer Discovery 3(4)：388-398；Campana和Imai(美国专利号8,399,645，2013年3月19日授权)Jensen和Riddell(2015)《新编免疫学观点》(CurrentOpinions in Immunology)33：9-15；Gross，等(1989)PNAS(USA)86(24)：10024-10028；Curran，等(2012)J Gene Med 14(6)：405-15；Brogdon，等(美国专利10.174,095，2019年1月8日授权)Guedan，等(2019)嵌合抗原受体的工程改造和设计(Engineering and Designof Chimeric Antigen Receptors)Molecular Therapy：Methods&Clinical Development第12卷：145-156。从命名法的角度来看，在常规实践中，CAR是指代CAR的抗原结合结构域(ABD)的靶标，因此“CD19 CAR”是指其ABD特异性结合至CD19的CAR，“BCMA CAR”是指其ABD特异性结合至BCMA的CAR，依此类推。在一些实施方式中，CAR的ABD是二价的(或多价的)，使得该ABD特异性结合至多于一个靶抗原，例如CD19和CD20肿瘤抗原。在一些情况下，CAR可以常规地被称为“CD19/CD20”CAR，指的是其ABD的多价性质。
CAR-T细胞：如本文所用，术语“嵌合抗原受体T-细胞”和“CAR-T细胞”可互换使用，指的是经过重组修饰以表达嵌合抗原受体的T细胞。如本文所用，CAR-T细胞可以被工程改造以表达包含正交CD122多肽的胞外结构域的修饰的受体(正交CAR-T细胞)。从命名法的角度来看，在常规实践中，CAR-T细胞是指代CAR的抗原结合结构域的靶标，因此“CD19 CAR-T细胞”是指包含CAR的CAR-T细胞，其中该CAR的ABD选择性结合至CD19，“BCMA CAR-T细胞”是指包含CAR的CAR-T细胞，其中该CAR的ABD选择性结合至BCMA，依此类推。可以被修饰以纳入本发明的正交受体的市售可得CD19 CAR-T细胞产品的例子包括阿基伦赛(axicabtageneciloleucel)(从吉利德制药公司(Gilead Pharmaceuticals)以名称
Figure BDA0003850638240000291
市售可得)和替沙伦赛(tisagenlecleucel)(从诺华(Novartis)以名称
Figure BDA0003850638240000301
市售可得)。在一些实施方式中，CAR的ABD是二价的(或多价的)，使得该ABD特异性结合至多于一个靶抗原，例如CD19和CD20肿瘤抗原。在一些情况下，CAR-T细胞包含此种CAR，可以常规地被称为“CD19/CD20”CAR，指的是其ABD多价性质。
CD25：如本文所用，术语“CD25”、“IL2受体α”、“IL-2Ro”、“IL2Ra”和“p55”可互换使用以指55kD的多肽，其在Treg细胞中组成型表达，并在响应激活诱导型表达于其他T细胞上。CD25在文献中也被称为″低亲和力″IL2受体。hIL2结合至hCD25的Kd约为10-8M。人CD25的核酸和蛋白序列可分别在Genbank登录号NM_000417和NP_0004Q8中找到。人CD25表达为272个氨基酸的前蛋白，其包含21个氨基酸的信号序列，信号序列在翻译后被去除，以产生251个氨基酸的成熟蛋白质。前蛋白的氨基酸22-240(成熟蛋白的氨基酸1-219)对应于胞外结构域。前蛋白的氨基酸241-259(成熟蛋白的氨基酸220-238)对应于跨膜结构域。前蛋白的氨基酸260-272(成熟蛋白的氨基酸239-251)对应于胞内结构域。hCD25的成熟形式的氨基酸序列(无前蛋白的信号序列)为：
Figure BDA0003850638240000302
CD122：如本文所用，术语“CD122”、“白细胞介素-2受体β”、“IL2Rb”、“IL2Rβ”、“IL15Rβ”和“p70-75”可互换使用，指CD122跨膜蛋白。人CD122(hCD122)是一个单通道的1型跨膜受体，表达为551个氨基酸的前蛋白，前26个氨基酸包括信号序列，其在成熟的525个氨基酸的蛋白质中翻译后被裂解。前蛋白的氨基酸27-240(成熟蛋白的氨基酸1-214)对应于胞外结构域，前蛋白的氨基酸241-265(成熟蛋白的氨基酸225-239)对应于跨膜结构域，前蛋白的氨基酸266-551(成熟蛋白的氨基酸240-525)对应于胞内结构域。如本文所用，术语hCD122包括hCD122蛋白的天然存在的变体，其包括S57F和D365E(按照成熟的hCD122蛋白的残基编号)。hCD122在UniProtKB数据库中被引为条目P14784。人CD122的核酸和蛋白序列可分别在Genbank登录号NM_000878和NP_000869中找到。无信号序列的成熟hCD122蛋白的氨基酸序列为：
Figure BDA0003850638240000311
Figure BDA0003850638240000321
hCD122的胞外结构域(ECD)的氨基酸序列为：
Figure BDA0003850638240000322
CD132：如本文所用，术语“CD132”、“IL2受体γ”、“IL2Rg和“IL2Rγ”可互换使用，指1型细胞因子受体，被IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的受体复合物共有，因此被称为“共有”γ链。人CD132(hCD132)表达为369个氨基酸的前蛋白，包括22个氨基酸的N-末端信号序列。前蛋白的氨基酸23-262(成熟蛋白的氨基酸1-240)对应于胞外结构域，前蛋白的氨基酸263-283(成熟蛋白的氨基酸241-262)对应于21个氨基酸的跨膜结构域，前蛋白的氨基酸284-369(成熟蛋白的氨基酸262-347)对应于胞内结构域。hCD132在UniProtKB数据库中被引为条目P31785。人CD132的核酸和蛋白质序列可分别在Genbank登录号NM_000206和NP_000197中找到。成熟hCD132蛋白的氨基酸序列为：
Figure BDA0003850638240000323
Figure BDA0003850638240000331
CDR.如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽免疫球蛋白多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。CDR已由Kabat等，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)；Kabat等，(1991)U.S.美国卫生及公共服务部，“免疫学热门蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”(本文中也称为Kabat1991)；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))(本文中也称为Chothia1987)；以及MacCallum等，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)描述，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。不过，述及抗体或移植抗体或其变体的CDR定义意在落在本文定义或所用术语范围之内。在本发明的上下文中，CDR位置的编号是根据Kabat编号法提供的。
循环肿瘤细胞：如本文所用的术语“循环肿瘤细胞(CTC)”是指从肿瘤块(例如，肿瘤)脱落到外周循环中的肿瘤细胞。
相当的：如本文所用，术语“相当的”用于描述可评价的定量或定性参数的两个测量结果的差异程度。例如，当可评价的定量参数(例如通过CTLL-2增殖或磷酸化-STAT5试验确定的IL2活性水平)的第一测量结果和该可评价参数的第二测量结果没有偏离本领域技术人员将会认为两个结果之间不会产生统计学显著性差异的范围，那么这两个测量将被视为“相当的”。在一些情况下，如果一个测量结果偏离另一个测量结果少于35％、或者少于30％、或者少于25％、或者少于20％、或者少于15％、或者少于10％、或者少于7％、或者少于5％、或者少于4％、或者少于3％、或者少于2％或者少于1％，则测量结果可被视为“相当的”。在特定的实施方式中，如果一个测量结果偏离参考标准少于15％、或者少于10％、或者少于5％，则该测量结果与参考标准是相当的。
来源于：如本文所用术语“来源于”，在氨基酸序列的上下文中(例如，包含“来源于”IL2多肽的氨基酸序列的多肽或多核苷酸序列)意为表示多肽或核酸具有基于参考多肽或核酸的序列(例如天然存在的IL2多肽或编码IL2的核酸)，不意在被限制为制备蛋白质或核酸的来源或方法。举例而言，术语“来源于”包括参考氨基酸或DNA序列的同源物或变体。
有效浓度(EC)：如本文所用，术语“有效浓度”或其缩写“EC”互换使用表示试剂(例如，IL2直向同源物)的浓度为足以使测试系统中给定参数产生变化的量。缩写“E”指的是当测试系统被暴露于测试试剂时，测试系统中观察到的给定生物学效应的量级。当响应的量级以测试试剂的浓度(“C”)的因数表示时，使用缩写“EC”。在生物系统的环境下，术语E最大指的是在响应于激活测试试剂的饱和浓度中观察到的给定生物学效应的最大量级。当提供带下标的缩写EC(例如，EC40、EC50等)时，下标是指在该浓度观察到生物学响应的E最大的百分比。例如，在测试系统中，响应于此测试试剂，测试试剂足以导致可测量的生物学参数减少这种可测量的生物学参数的最大水平的30％的浓度，针对此生物学参数，其被称为该测试试剂的“EC30”。类似地，术语“EC100”用于表示试剂的有效浓度，该浓度使得可测量参数对该试剂产生最大(100％)响应。类似地，术语EC50(其通常用于药代动力学领域)是指足以导致可测量参数半最大(50％)改变的试剂浓度。术语“饱和浓度”是指在标准温度和压力的条件下，测试试剂能够溶于标准体积的特定溶剂(例如水)的最大可能量。在药代动力学中，药物的饱和浓度通常用于表示足以使所有可用受体被药物占据的药物浓度，而EC50是给予半最大效应的药物浓度。
富集的：如本文所用的术语“富集的”是指对样品进行非天然操作，以使感兴趣的物质(例如分子或细胞)以以下情形存在：(a)比物质在起始样品(如生物样品，例如在该样品中分子天然存在或在给药后存在)中的浓度高(例如，至少高3倍、或者至少高5倍、或者至少高10倍、或者至少高50倍、或者至少高100倍、或者至少高1000倍)；或(b)浓度高于制备该分子的环境(例如，在重组修饰的细菌或哺乳动物细胞中)。在一些实施方式中，术语“富集的”在本文中用于指包含表达正交受体的细胞的细胞群体，该细胞群体与同源直向同源物以足以在表达正交受体的那些细胞中引起响应的量接触，所述响应是增殖，在与具有同源直向同源物的细胞群接触后，使得群体中表达正交受体的细胞浓度更高(例如，至少高3倍，或者至少高5倍，或者至少高10倍，或者至少高50倍，或者至少高100倍，或者至少高1000倍)。
胞外结构域：如本文所用术语“胞外结构域”或其缩写“ECD”是指细胞质膜外侧的细胞表面蛋白质部分(例如细胞表面受体)。ECD可以包括跨膜蛋白、细胞表面或膜相关蛋白、分泌蛋白、细胞表面靶向蛋白的整个胞质外部分。
hCD122：如本文所用术语“hCD122”是指天然存在的人CD122多肽，包括其天然存在的变体。天然存在的成熟hCD122的氨基酸序列作为SEQ ID NO：2提供。
同一性：对于多肽或DNA序列本文所用的的术语″同一性″是指两个分子之间的亚单位序列同一性。当两个分子中的亚单位位置被相同的单体亚单位(即相同的氨基酸残基或核苷酸)占据时，那么这两个分子在该位置是相同的。两个氨基酸或两个核苷酸序列之间的相似性是相同位置的量的直接函数。通常，比对序列以获得最高阶匹配。如有必要，可以用已公开的技术和广泛使用的计算机程序来计算同一性，如GCS程序包(Devereux等，Nucleic Acids Res.12：387，1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等，J.MolecularBiol.215：403，1990)。可以用序列分析软件测量序列同一性，如威斯康星大学生物技术中心(the University of Wisconsin Biotechnology Center)遗传学计算机组的序列分析软件包(1710大学大道(University Avenue)，威斯康星州麦迪逊53705)，使用其默认参数适合测定序列同一性百分数和序列相似性百分数的算法是BLAST和BLAST 2.0算法，分别描述于Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul等(1977)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)(NCBI)网站公开获得。此算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字命中(word hit)用作启动搜索的种子，以便找到含有它们的较长HSP。然后，沿各序列在两个方向上延伸该字命中，直到提高累积的比对评分。就核苷酸序列而言，采用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积评分。就氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸：累积比对评分比其最大获得值降低X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定该比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默认值如下：字长(W)28，期望值(E)10，M＝1，N＝-2，以及比较两条链。对氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的默认值为：字长(W)为3，期望值(E)为10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(1989))。
IL2：如本文所用，术语“白细胞介素-2”或″IL2”是指具有IL2活性的IL2多肽。在一些实施方式中，IL2是指成熟的野生型人IL2。成熟的野生型人IL2(hIL2)是133个氨基酸的多肽(减去前蛋白的信号肽的20个N-末端氨基酸)，如Fujita，等，PNAS USA，80，7437-7441(1983)所述。成熟的野生型人IL2(hIL2)的天然存在的变体的氨基酸序列是：
Figure BDA0003850638240000361
如本文所用，IL2变体的残基的编号是基于IL2序列UniProt ID P60568，不包括与SEQ ID NO：5的相同的信号肽。
IL2活性：术语“IL2活性”是指对细胞与有效量的IL2多肽接触响应的细胞上的一个或多个生物学效应。如前所述，IL2是一种多效性(pleitropic)细胞因子，可对多种细胞类型产生一种或多种生物学效应。IL2促进激活的T淋巴细胞的增殖和扩增，诱导初始T细胞的增殖和激活，增强B细胞的生长，并促进NK细胞的增殖和扩增。可以测量IL2活性的一个例子，在细胞增殖试验中使用CTLL-2小鼠细胞毒性T细胞，参见，Gearing，A.J.H.和C.B.Bird(1987)在《淋巴因子和干扰素：实用方法》(Lymphokines and Interferons，A PracticalApproach.)Clemens，M.J.等(编)：IRL出版社(IRL Press).295。重组人IL2(rhIL2)的比活性约为2.1x104IU/μg，其针对重组人IL2 WHO国际标准(NIBSC编码：86/500)校准。在一些实施方式中，例如当感兴趣的IL2正交多肽配体表现出(或被工程改造以具有)对CD25的减弱亲和力时，IL2活性的水平可以在人细胞(例如YT细胞)中评估，所述细胞不需要CD25来通过IL2受体提供信号转导，而是能够通过中等亲和力CD122/CD132受体信号转导。在一些实施方式中，当在对比实验中以等同浓度评估时，本发明的正交人IL2配体可以表现出WHO国际标准(NIBSC编码：86/500)野生型成熟人IL2的活性的低于20％、或者低于约10％、或者低于约8％、或者低于约6％、或者低于约4％、或者低于约2％、或者低于约1％、或者低于约0.5％。
IL2直向同源物：如本文所用，术语“IL-2直向同源物”是指衍生自IL2亲本多肽的IL2的变体，其中该IL2直向同源物特异性结合至正交CD122 ECD，且表现出对野生型CD122的胞外结构域的结合显著减少。在一些实施方式中，该IL2直向同源物表现出特异性结合至包含正交CD122 ECD的受体，并且(2)接触表达包含正交CD122多肽的ECD的跨膜受体的细胞，所述接触以足以引起响应的量实施，导致所述跨膜受体的胞内结构域(ICD)产生的信号的信号特征。当跨膜受体包含正交CD122 ECD和CD122 ICD时，IL2直向同源物结合至此受体产生CD122/CD132中等亲和力IL2受体的Cd25/CD122/CD132高亲和力的激活的胞内信号特征。IL2直向同源物对野生型hCD122表现出显著降低的结合。术语IL2直向同源物包括IL2正交变体和修饰的IL2直向同源物。在一些实施方式中，IL2直向同源物衍生自人IL2的天然存在的变体，这种人IL2直向同源物可称为“hoCD122”或“hoRb”。在Garcia，等(美国专利申请公开US2018/0228842A1，公开于2018年8月16日)中提供了某些修饰的IL2多肽。如本文所用，术语IL2直向同源物包含修饰的hIL2多肽，其描述于Garcia，等的美国专利申请公开US2018/0228842A1，公开于2018年8月16日。在一些实施方式中，IL2直向同源物对正交CD122的胞外结构域的亲和力与野生型IL2对野生型CD122的ECD的亲和力相当。在一些实施方式中，IL2直向同源物对正交CD122的ECD的亲和力大于野生型IL2对野生型CD122的ECD的亲和力。在一些实施方式中，IL2直向同源物对正交CD122的ECD的亲和力小于野生型IL2对野生型CD122的ECD的亲和力。
以足以产生响应/反应/缓解(response)的量：如本文所使用的短语“以足以产生响应/反应/缓解的量”用于指在对于测试系统应用测试试剂之前(如基线水平)和之后足以提供所测指标水平的可检测的变化的测试试剂的量。在一些实施方式中，测试系统是细胞、组织或生物体。在一些实施方式中，测试系统是体外测试系统，例如荧光试验。在一些实施方式中，测试系统涉及在将测试剂应用于细胞、组织或生物体之前和之后测量反映生物功能的细胞、组织或生物体的参数水平的变化。在一些实施方式中，指示剂(例如磷酸化STAT5的浓度)反映在试验中评估的细胞响应于给予一定量的测试试剂(例如IL2)的生物学功能(例如IL2受体的激活)。在一些实施方式中，测试系统涉及在将一种或多种测试试剂(例如表达正交CD122的CAR-T细胞与IL2直向同源物组合)应用于细胞、组织或生物体(例如小鼠)之前和之后，测量反映生物学状况(例如肿瘤的存在)的细胞、组织或生物体(例如用发光性肿瘤细胞注射的小鼠)的参数(例如发光)水平变化。在一些实施方式中，指示剂(例如磷酸化STAT5的浓度)反映在试验中评估的细胞响应于给予一定量的测试试剂(例如IL2)的细胞(例如T细胞)的生物学功能(例如IL2受体的激活)。“足以产生响应的量”可以是足以治疗有效的量，但“足以产生响应的量”可能多于或少于治疗有效量。
需要治疗的：本文所用术语“需要治疗的”是指医生或其他护理人员对对象作出的判断，关于对象和对象需要或将有可能从治疗中受益。这种判断是基于医生或护理人员的专业知识领域中的多种因素作出的。
需要预防的：本文所用术语“需要预防的”是指医生或其他护理人员对对象作出的判断，关于对象其对象需要或将有可能从预防护理中受益。这种判断是基于医生或护理人员的专业知识领域中的多种因素作出的。
抑制剂：如本文所用术语“抑制剂”是减少、阻断、防止、延迟激活、失活、脱敏或下调的分子，例如，基因、蛋白质、配体、受体或细胞。抑制剂也可以被定义为减少、阻断或失活细胞或生物体的组成型活性的分子。
分离的：如本文所使用的术语“分离的”是指感兴趣的多肽，如果是天然存在的，其环境与它可能天然存在的环境不同。“分离的”意指包括在样品中的多肽，其基本上富集了感兴趣的多肽和/或感兴趣的多肽被部分或基本上纯化了。如果多肽不是天然存在的，“分离的”表示该多肽已经从其通过合成或重组手段制备的环境中分离出来。
正交受体的胞内结构域：如本文所用术语″正交受体的胞内结构域″或″ICD-OR″是指跨膜正交受体的部分，它位于表达这种跨膜正交受体的细胞的质膜内。ICD-OR可以包括一个或多个″增殖信号转导结构域″或″PSD″，其指向细胞发出信号以进入有丝分裂并开始细胞生长的蛋白结构域。例子包括Janus激酶，包括但不限于JAK1、JAK2、JAK3、Tyk2、Ptk-2、来自其他哺乳动物或真核物种的Janus激酶家族的同源成员、IL2受体β和/或γ链以及来自细胞因子受体超家族蛋白的其他亚基，它们可能与Janus激酶家族的蛋白相互作用以转导信号，或其部分、修饰或组合。信号的例子包括一个或多个STAT分子的磷酸化，包括但不限于STAT1、STAT3、STAT5a和/或STAT5b的一个或多个。
“与......组合”：如本文所用，术语″与......组合″在指给予对象多种试剂时是指给予对象第一试剂至少一种其它(即第二、第三、第四、第五，等)试剂。出于本发明的目的，如果在给予第二试剂时，因给予第一试剂而产生的生物学效应在对象体内持续，使第一试剂和第二试剂的治疗作用叠加，则认为一种试剂(例如IL2直向同源物)与第二试剂(例如工程改造的人免疫细胞)组合给予。例如，工程改造的正交细胞治疗剂通常会不频繁地给予(通常只给予一次)，而IL2直向同源物则是定期给予，同时正交细胞剂在对象体内持续存在。工程改造的正交细胞治疗剂在较长的时间(数周或数月)内提供治疗作用，第二试剂(如IL2直向同源物)的给予在第一试剂的治疗作用仍在进行时提供其治疗作用，因此第二试剂被认为是与第一试剂组合给予，即使第一试剂的给予可能是在离第二试剂给予时间很远的时间点(如数天或数周)进行的。在一个实施方式中，如果第一和第二试剂同时(在彼此的30分钟内)、同期或依次给予，则认为一种试剂与第二试剂组合给予。在一些实施方式中，如果第一试剂和第二试剂在彼此约24小时内，优选在彼此约12小时内，优选在彼此约6小时内，优选在彼此约2小时内，或优选在彼此约30分钟内给予，则第一试剂被视为与第二试剂“同期”给予。术语“与......组合/联合”也应理解为适用于第一试剂和第二试剂共同配制在单一药学上可接受的制剂中并将该共同制剂给予对象的情况。在某些实施方式中，正交细胞和IL2直向同源物进一步与其他补充剂组合。一种或多种补充剂是依次给予或应用的，例如，在给予一种试剂后给予一个或多个其他试剂。在其他实施方式中，IL2突变蛋白和一种或多种补充剂同时给予，例如，在同一时间或大约同一时间给予两种或多种试剂；这两种或多种试剂可以存在于两种或多种分别的制剂中，或组合成单一制剂(即共同制剂)。无论这些试剂是依次或同时给予，出于本发明的目的，它们都被认为是组合给予的。
高亲和力IL2受体：如本文所用，术语“高亲和力IL2受体”指的是包含CD25、CD122和CD132蛋白的三聚体受体复合物(也称为“IL2Rαβγ”)。野生型hIL2(SEQ ID NO：5)对于高IL2亲和力受体复合物拥有约为10-11M的Kd。
中等亲和力IL2受体：如本文所用，术语“中等亲和力IL2受体”指的是包含CD122和CD132的二聚体IL2受体复合物(也称为“IL2Rβγ”)。IL2分子与在哺乳动物免疫细胞表面上表达的中等亲和力IL2受体的缔合导致细胞中IL2信号转导。野生型hIL2(SEQ ID NO：5)对于中等亲和力CD122/CD132(IL2Rβγ)受体复合物拥有约为10-9M的Kd。
Kabat编号：如本文所用的术语″Kabat编号″是本领域公认的术语，指的是对免疫球蛋白的重链和轻链区域中比其他氨基酸残基更可变的氨基酸残基(例如，高变的(hypervariable))进行编号的系统(Kabat，等，(1971)Ann.NY Acad.Sci.190：382-93；Kabat，等，(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第五版，美国卫生与公共服务部，NIH出版号91-3242)。出于本公开的目的，抗体可变区域中CDR的定位遵循Kabat编号或简称为″Kabat″。
配体：如本文所用，术语“配体”是指特异性结合受体并导致受体变化的分子，其使得受体的活性发生改变或在表达受体的细胞中发生反应。在一个实施方式中，术语“配体”是指可以作为受体的激动剂或拮抗剂的分子或其复合物。如本文所用，术语“配体”包括天然和合成的配体。“配体”也包括小分子，细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。配体和受体的复合物被称为“配体受体复合物”。配体可以包括多蛋白或融合蛋白的一个结构域(例如，抗体-靶向配体融合蛋白)。
转移：如本文所用术语“转移”描述了癌细胞从原发癌向周围组织和向远端器官的传播
修饰的IL2直向同源物：如本文所用术语“修饰的IL2直向同源物”用于指具有一个或多个修饰的IL-2直向同源物，例如聚乙二醇化、糖基化(N-和O-连接)、酰基化或多聚唾液酸化或通过与其他多肽运载体分子偶联(无论是化学还是融合蛋白)，包括但不限于白蛋白融合多肽，其包含血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA))、Fc-融合蛋白、靶向IL2直向同源物融合蛋白(例如scFv-IL2直向同源物融合蛋白、VHH-IL2正交多肽融合蛋白)等。可以制备修饰的IL2直向同源物，以增强一种或多种特性，例如，调节免疫原性(偶联或融合至免疫原)，增加水溶性、生物利用度、血清半衰期和/或治疗半衰期的方法；和/或调节生物活性。某些修饰也可用于，例如，产生用于检测试验的抗体(例如，表位标签)或提供以便于蛋白质纯化(例如聚-His标签)。可以制备修饰的IL2直向同源物，以增强一种或多种特性，例如，调节免疫原性；增加水溶性、生物利用度、血清半衰期和/或治疗半衰期的方法；和/或调节生物活性。某些修饰也可用于，例如，提高用于检测试验的抗体(例如，表位标签)和提供以便于蛋白质纯化。在一些实施方式中，修饰的IL2直向同源物是与SEQ IDNO：5至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性，不包括与式1的修饰所包含的任何修饰。
调节：如本文所用，术语“调节”、“调制”等是指测试试剂在系统(包括生物系统或生化途径)中引起响应的能力，可以是积极或消极的，也可以是直接或间接的。术语调节剂包括激动剂(包括部分激动剂、完全激动剂和超级激动剂)和拮抗剂。
肿瘤疾病：如本文所用，术语“肿瘤疾病”指的是对象中由细胞过度增殖或失控(或失调)的细胞复制引起的紊乱或病症。术语肿瘤疾病指对象中存在肿瘤引起的紊乱。肿瘤可以分类为：(1)良性(2)恶变前(或“癌前”)；和(3)恶性(或“癌性”)。术语“肿瘤疾病”包括肿瘤相关疾病、紊乱和病症，指的是与肿瘤疾病直接或间接相关的病症，包括例如血管生成和癌前病症，例如发育异常(dysplasia)或冒烟型多发性骨髓瘤(smoldering multiplemyeloma)。
N-末端：如本文在多肽结构的上下文中使用，“N-末端”(或“氨基末端”)和“C-末端”(或“羧基末端”)分别指多肽的极氨基端和羧基端，而术语“N-末端的”和“C-末端的”分别指多肽的氨基酸序列中朝向N-末端和C-末端的相对位置，并可分别包括N-末端和C-末端残基。“近邻N-末端的”或“近邻C-末端的”是指第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置，其中第一和第二氨基酸残基共价结合以提供连续的氨基酸序列。
肿瘤疾病：如本文所用，术语“肿瘤疾病”指的是对象中由细胞过度增殖或失控(或失调)的细胞复制引起的紊乱或病症。术语肿瘤疾病指对象中存在肿瘤引起的紊乱。肿瘤可以分类为：(1)良性(2)恶变前(或“癌前”)；和(3)恶性(或“癌性”)。术语“肿瘤疾病”包括肿瘤相关疾病、紊乱和病症，指的是与肿瘤疾病直接或间接相关的病症，包括例如血管生成和癌前病症，例如发育异常(dysplasia)。
核酸：术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”等在本文中可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸的非限制性例子包括线性和环形核酸、信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、载体、探针、引物等。
根据IL2编号：如本文所用术语″根据IL2编号″是指根据在成熟野生型IL2的序列中通常存在的氨基酸所在位置确定特定氨基酸的位置。在一些实施方式中，IL2是hIL2(SEQID NO：5)。例如，对于hIL2，“R81”指的是成熟野生型hIL2的序列中存在的第81个(从N-末端起编号)氨基酸处的精氨酸。应注意，不同哺乳动物物种的IL2分子的氨基酸序列具有不同的氨基酸数量和氨基酸序列。因此，当根据本约定提及残基时有助于鉴定所讨论的IL2物质。
根据CD122编号：如本文所用术语″根据CD122编号″是指根据在成熟野生型CD122分子的序列中通常存在的氨基酸所在位置确定特定氨基酸的位置。在一个实施方式中，CD122分子是人CD122(SEQ ID NO.2)。例如，对于人CD122，H133指的是成熟野生型hCD122的序列的第133个(从N-末端起编号)氨基酸处的组氨酸。
根据CD122的胞外结构域编号：如本文所用术语″根据CD122的胞外结构域编号″或″根据CD122 ECD编号″是指根据在成熟野生型CD122分子的胞外结构域(ECD)序列中，通常存在的氨基酸所在位置确定特定氨基酸的位置。在一个实施方式中，CD122 ECD分子是人CD122 ECD(SEQ ID NO.3)。例如，对于人CD122ECD，H133指的是成熟野生型hCD122 ECD的序列的第133个(从N-末端起编号)氨基酸处的组氨酸。
操作性地连接：术语“操作性地连接”在本文中是指编码不同功能的核酸序列在组合成单个核酸序列时的关系，该核酸在被引入细胞时，提供能够在细胞中实现特定核酸序列的转录和/或翻译的核酸。例如，如果它被表达为参与多肽分泌的前蛋白，信号序列的DNA操作性地连接至多肽的DNA；如果它影响序列的转录，启动子或增强子操作性地连接至编码序列；或如果它被定位以促进翻译，核糖体结合位点操作性地连接至编码序列。通常，″操作性地连接″意为被连接的DNA序列是连续的，而且在分泌型前导的情况下，是连续的并且处于阅读段。然而，某些遗传元件，如增强子，不需要与它们产生作用的序列连续。
正交细胞：如本文所用，术语“正交细胞”指的是已重组修饰以表达正交受体的哺乳动物细胞。在一些实施方式中正交细胞表达正交CD122(oCD122)多肽或包含正交CD122ECD的受体。在一些实施方式中，正交细胞是修饰的人细胞(“人正交细胞”)。正交细胞可以是免疫细胞，例如人免疫细胞。“人正交免疫细胞”是重组修饰以表达人正交CD122(hoCD122)或包含人正交CD122 ECD的嵌合受体)的人免疫细胞。在一些实施方式中，进行工程改造以表达oCD122(或包含oCD122 ECD的受体)的免疫细胞选自下组：骨髓细胞、淋巴细胞、外周血单核细胞(PBMC)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞、CD8+ T细胞、CD25+CD8+T细胞、CAR-T细胞、NK细胞、CD4+ T细胞和Treg其工程改造形式，包括但不限于工程改造的TIL，工程改造的Treg和工程改造的NK细胞。在一些实施方式中，正交细胞是衍生自人免疫细胞的CAR-T，其被重组修饰以表达人正交CD122(“hoCAR-T”细胞)。在一些实施方式中，正交细胞是分离自人对象的肿瘤的TIL，其已被重组修饰以表达人正交CD122或包含oCD122 ECD的受体(“hoTIL”细胞)。在一些实施方式中，正交细胞是分离自人对象的NK，其已被重组修饰以表达人正交CD122或包含oCD122 ECD的受体(“hoNK”细胞)。在一些实施方式中，该细胞是人造血干细胞，其已被重组修饰以表达人正交CD122或包含oCD122 ECD的受体(“hoHSC”细胞)。在一些实施方式中，正交细胞是衍生自人免疫细胞的TCR工程改造细胞，其已被重组修饰以表达非天然T细胞受体，进一步被修饰以表达人正交CD122或包含oCD122ECD的受体(“hoTCR细胞”)。如本文所用，术语“正交细胞”指的是已重组修饰以表达正交CD122或包含oCD122 ECD的受体的哺乳动物细胞。该正交细胞可以纳入重组修饰，还包含表达正交CD122多肽或包含含有重组修饰的oCD122 ECD的受体所必需的重组修饰，包括引入编码操作性地连接至表达控制元件以促进在正交细胞中的表达的标志物蛋白的核酸分子，包括但不限于编码标志物蛋白(赋予抗生素抗性的蛋白、荧光蛋白或发光蛋白)的核酸分子；胞内生物活性蛋白，包括但不限于DNA或RNA结合蛋白、转录因子，包括转录阻遏因子或去阻遏物(de-repressor)、促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白和胞内调控蛋白；分泌的生物活性蛋白，例如生长因子、肽激素、细胞因子或趋化因子，包括治疗性生物活性蛋白，例如抗体(胞外蛋白，通常包含信号肽或分泌前导序列以促进在正交细胞中表达后的胞外转运)。对于本领域技术人员而言，对于正交细胞的其它重组修饰是显而易见的。在一些实施方式中，在正交细胞上表达的正交CD122受体可以包含经修饰以提供一个或多个STAT3结合基序的人CD122胞内结构域(ICD)。
正交CD122：如本文所用术语“正交CD122”或“CD122正交受体”在本文中互换使用，指CD122多肽变体，其包含导致特异性结合至IL2直向同源物(其为这种CD122多肽变体的同源配体)但并不特异性结合至IL2的天然存在形式的氨基酸取代。
正交受体：如本文所用术语“正交受体”指的是受体的变体，正交受体包含对氨基酸序列的修饰，使得正交受体表现出对其同源配体的结合显著减少，但特异性结合工程改造为与正交受体相互作用的正交配体。在一些实施方式中，正交受体可以包含对其同源天然配体表现出结合显著减少的胞外结构域，而正交受体对其一个或多个同源天然受体的ECD表现出结合显著减少。在一些实施方式中，正交配体表现出对同源正交受体的亲和力与天然配体对天然受体的亲和力相当，例如，具有天然细胞因子受体对亲和力的至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约100％且可能更高，例如，是天然细胞因子对天然受体的亲和力的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍。正交受体可以由其衍生的亲本分子来称呼(例如正交CD122)或由正交受体的正交配体衍生的同源配体来称呼(例如正交IL2受体)。
直向同源物：如本文所用术语“直向同源物”或“正交配体”在本文中互换使用，指的是正交配体/受体对的配体组分，指一级结构中纳入修饰的多肽，以提供多肽变体，所述多肽变体表现出：(a)对其天然同源受体(即，该直向同源物衍生自的亲本多肽的天然受体)的亲和力显著减少；和(b)特异性结合工程改造的正交受体，所述正交受体为直向同源物的同源受体的变体。直向同源物结合至正交受体后(正交受体在细胞表面表达，所述细胞被重组DNA技术修饰以纳入编码正交受体的核酸序列，其操作性地连接至控制元件，以实现重组修饰细胞中正交受体的表达)，激活的正交受体起始信号转导，通过天然细胞元件转导，以提供模拟同源物的天然反应但对表达正交受体的重组修饰细胞群特异性的生物学活性。在本发明的一些实施方式中，相对于同源受体，直向同源物具有对正交受体的显著的选择性，且相对于同源受体，任选地具有显著减少的效力。通常在对配体/受体结合反应诱导的活性的表征试验中通过活性测量评估选择性。在一些实施方式中，在同一试验中测得的EC50中，直向同源物具有至少5倍、或者至少10倍、或者至少20倍、或者至少30倍、或者至少40倍、或者至少50倍、或者至少100倍、或者至少200倍的差异。
亲本多肽：如本文所用术语，“亲本多肽”，“亲本蛋白质”互换使用以指随后被修饰以产生变体多肽的天然存在的多肽。亲本多肽可以是野生型(或天然)多肽。亲本多肽可以指多肽自身或包含亲本多肽的组合物(例如糖基化的、聚乙二醇化的、包含亲本多肽的融合蛋白)。
部分激动剂：如本文所用，术语“部分激动剂”是指特异性结合结合至并激活给定受体的分子，但相对于完全激动剂，它只具有部分激活受体。部分激动剂可以同时表现激动和拮抗作用。例如，当完全激动剂和部分激动剂同时存在时，部分激动剂作为竞争性拮抗剂，通过与完全激动剂竞争对受体的结合，相对于在不存在部分激动剂的情况下受体与完全激动剂的接触，导致受体激活净减少。临床上，当内源性配体存在的数量不足时，部分激动剂可用于激活受体，以提供所需的亚最大反应，或者当内源性配体数量过多时，它们可减少对受体的过度刺激。部分激动剂产生的最大反应(E最大)被称为其固有活性，当完全激动剂产生100％的反应时，可以用百分比表示其固有活性。在比较试验中以类似的浓度评估时，本发明的IL2部分激动剂可以具有WHO国际标准(NIBSC编码：86/500)的野生型成熟人IL2的活性的大于10％、或者大于20％、或者大于30％、或者大于40％、或者大于50％、或者大于60％、或者大于70％。
PEG-IL2直向同源物：如本文所用的术语“PEG-IL2直向同源物”是指共价结合至至少一个聚乙二醇(PEG)分子的IL2直向同源物，至少一个PEG分子共价附接至IL2直向同源物的至少一个氨基酸残基。PEG化的多肽还可以称为单聚乙二醇化、二聚乙二醇化、三聚乙二醇化(等)，以表示分别包含附接至IL2直向同源物的一个、两个、三个(或更多)PEG部分的PEG-IL2直向同源物。在一些实施方式中，PEG可以直接地共价附接至IL2直向同源物(例如，通过赖氨酸侧链、半胱氨酸的巯基或N-末端胺)或任选地在PEG和IL2直向同源物之间采用接头。在一些实施方式中，PEG-IL2直向同源物包含多于一个的PEG分子，每个分子附接至不同的氨基酸残基上。在一些实施方式中，PEG-IL2直向同源物来源于(SEQ ID NO：4，成熟人野生型hIL2)。IL2的PEG化形式和IL2多肽的PEG化的方法是本领域众所周知的(参见，例如，Katre，等，美国专利4,931,544，1990年6月5日授权；Katre，等美国专利5,206,344，1993年4月27日授权；和Bossard，等，美国专利号9,861,705，2018年1月9日授权)。在一些实施方式中，IL2突变蛋白可以通过纳入非天然氨基酸进行修饰，具有非天然存在的氨基酸侧链以促进位点特异性PEG化，如Ptacin，等美国专利申请公开US20170369871A1所述，公开于2017年12月28日。在其他实施方式中，可以在IL2分子内的不同位置纳入半胱氨酸残基，以促进通过半胱氨酸侧链的位点特异性PEG化，如Greve等的PCT国际专利申请号PCT/US2015/044462，2016年2月18日以WO2016/025385公开。
多肽：如本文所用术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，并且指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的或非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸，和具有修饰的多肽主链的多肽。这些术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列的融合蛋白；具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；具有免疫学标签蛋白的融合蛋白；免疫学活性蛋白(例如抗原性白喉或破伤风毒素片段)的融合蛋白等等。
预防/防止：本文所用的术语“预防”、“防止”等是指在对象疾病、紊乱、病症或其症状发生之前启动的行动过程，使得暂时或永久地预防、减轻、抑制或减少对象患某种疾病、紊乱、病症或类似疾病的风险(例如通过没有临床症状来确定)，或推迟其发作，一般是在对象由于遗传、经验或环境因素而易患某种特定疾病、紊乱或病症的情况下。在某些情况下，术语“预防”、“防止”也被用来指减缓疾病、紊乱或病症从目前的状态向更有害的状态发展。
受体：如本文所用，术语“受体”是指具有特异性结合配体的结构域的多肽，该配体的结合导致该多肽的至少一种生物学特性的改变。在一些实施分数中，受体是“可溶性”受体，不与细胞表面关联。hCD25的可溶性形式是特异性结合hIL2的可溶性受体的例子。在一些实施方式中，受体是细胞表面受体，其包括胞外结构域(ECD)和膜关联结构域，后者用于将ECD锚定至细胞表面。在细胞表面受体的一些实施方式中，受体是跨膜多肽，其包括由通常称为跨膜结构域(transmembrane domain)(TM)的跨膜的结构域(membrane spanningdomain)连接的胞内结构域(ICD)和胞外结构域(ECD)。配体结合至受体导致受体的构象变化，从而产生可测量的生物学效应。在一些情况下，如果受体是包括ECD、TM和ICD的跨膜多肽，配体结合至ECD导致由ICD的一个或多个结构域介导的可测量的胞内生物学效应，以反应于配体结合至ECD。在一些实施方式中，受体是多组分复合物的组分，以促进胞内信号转导。例如，配体可以结合细胞表面分子，该分子不单独与任何胞内信号转导相关联，但在配体结合后促进异源多聚体(包括异二聚体(例如中等亲和力CD122/CD132 IL2受体)、异三聚体(如高亲和力CD25/CD122/CD132 hIL2受体)或同源多聚体(同二聚体、同三聚体、同四聚体)复合物的形成，导致胞内信号转导级联(如Jak/STAT途径)的激活。在一些实施方式中，受体是跨膜单链多肽，其包括ECD、TM和ICD结构域，其中ECD、TM和ICD结构域来源于相同或不同的天然存在的受体变体。在一些实施方式中，受体可以是hoCD122受体。在一些实施方式中，受体是嵌合抗原受体(CAR)。
重组：如本文所用，术语“重组的”用作形容词指使用重组DNA技术修饰多肽、核酸或细胞的方法。重组蛋白是使用重组DNA技术产生的蛋白，通常用小写“r”(例如rhIL2)表示产生蛋白的方法。类似地，如果细胞经修饰，通过使用重组DNA技术纳入(例如转染、转导、感染)外源核酸(例如ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、mRNA、病毒或非病毒载体、质粒、黏粒等)，则细胞被称为“重组细胞”。用于重组DNA技术的技术和方案是本领域众所周知的，例如，可以在Sambrook等(1989)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)(第2版，冷泉港实验室出版社，纽约州普莱恩维尤)中和其他标准分子生物学实验手册中找到。
反应/响应/缓解：术语“反应/响应/缓解”，例如，细胞、组织、器官或生物体的反应，包括可评估的生化或生理参数(例如，浓度、密度、粘附性、增殖、激活、磷酸化、迁移、酶活、基因表达水平、基因表达率、能量消耗率(rate of energy consumption)、分化水平或状态)的定量或定性变化，其中该变化与激活、刺激或处理相关，或内部机制(如遗传编程)相关。在某些情况下，术语“激活”、“刺激”等是指由内部机制以及外部或环境因素调节的细胞激活；而术语“抑制”、“下调”等则是指相反的效果。评估CD3激活的原代人T-细胞的增殖的这种标准方案的例子包括生物发光试验，该试验产生与存在的ATP的量成比例的发光信号，而ATP与存在于培养物中的细胞的量成正比，如Crouch，等(1993)“使用ATP生物发光衡量细胞增殖和细胞毒性”(“The use of ATP bioluminescence as a measure of cellproliferation and cytotoxicity”)J.Immunol.Methods 160：81-8所述，或标准化的市售可得的试验系统，例如
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2.0细胞活力试验或
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3D细胞活力试剂盒，其可商购自普洛麦格公司(Promega Corporation)，伍兹霍尔路2800号(2800WoodsHollow Road)，麦迪逊WI 53711，货号G9241和G9681，并分别基本按照制造商提供的说明书进行。在一些实施方式中，响应于测试试剂的给予的T细胞的激活水平可以通过所述流式细胞术方法测定，如通过STAT5磷酸化水平测定，根据本领域众所周知的方法。可以使用流式细胞术技术测量STAT5磷酸化，如Horta，等，同上，Garcia，等，同上，所述，或使用市售试剂盒，例如磷酸-STAT5(Tyr694)试剂盒(商购自铂金埃尔默/cisbio(Perkin-Elmer/cisbio)，马萨诸塞州沃尔瑟姆，部件号64AT5PEG)，基本根据制造商的教导进行。当缩写ECACT与下标一起使用时，表示根据测试方案测量，响应于测试试剂的应用，测试试剂的浓度足以在T细胞中产生最大STAT5磷酸化的指示的百分比。作为说明，缩写EC30 PRO可用于hIL2直向同源物，以指示用磷酸-STAT5(Tyr694)试剂盒测定的，响应于这种hIL2直向同源物，与T细胞中STAT5磷酸化的最大水平的30％关联的浓度。
在一些情况下，已经为分子建立了标准化的认可的生物活性的度量。例如，对于hIL2效力，以国际单位(IU)评估hIL2效力的标准方法是在鼠细胞毒性T细胞系CTLL-2中按照Wadhwa，等(2013)“白细胞介素-2(IL2)的第二国际标准：合作研究的报告(The 2ndInternational standard for Interleukin-2(IL2)Report of a collaborativestudy)”Journal of Immunological Methods 397：1-7中更充分描述的标准化程序测量的。在本发明的上下文中应注意，鼠IL2受体功能与人IL2受体不同，特别是对于需要三聚体受体复合物的所有组分来提供胞内信号转导的信号转导(例如STAT5磷酸化)。参见，例如，Horta，等，(2019)人和鼠IL2受体对免疫细胞因子的人-IL2组分的响应不同(“Human andmurine IL2receptors differentially respond to the human-IL2 component ofimmunocytokines”)Oncoimmunology 8(6)：e1238538-1，e1238538-15和Nemoto，等(1995)人和小鼠的白细胞介素-2(IL2)受体系统差异：功能性小鼠IL2受体的形成需要α链(“Differences in the interleukin-2(IL2)receptor system in human and mouse；alpha chain is require for formation of the functional mouse IL2 receptor”)European J Immunology 25(11)3001-5。因此，在评估hIL2变体的活性时，特别是在与CD25的亲和力或与CD25状态有关的细胞激活方面，优选使用重现人低、中、高亲和力IL2受体和受体复合物的生物学特性的人细胞或系统，在鼠测试系统(例如体外测试系统)中表现出选择性结合或激活的分子可能在人系统(例如使用人细胞的体外测试系统或人对象的体内)测试系统中不能重现这种选择性活性。
选择性：如本文所用，术语“选择性”用于是指某一试剂优先结合至和/或激活该特定细胞类型的特性。在一些实施方式中，本发明提供IL2变体(IL2直向同源物)，其选择性结合至工程改造的CD122 ECD多肽，从而，响应于此种IL2直向同源物与包含此种同源CD122ECD多肽的受体的结合，表达包含此种CD122 ECD多肽的受体的细胞被激活。在一些实施方式中，本发明提供了hIL2直向同源物，其为选择性的，即此直向同源物表现出对表达hoCD122受体的免疫细胞的优先激活。通常在对配体/受体结合反应诱导的活性的表征试验中通过活性测量评估选择性。在一些实施方式中，IL2直向同源物的选择性是通过比较表达CD25的细胞(例如YTCD25POS或YTCD25+细胞)的激活对比表现出显著更低(优选不可检测的)的CD25水平的细胞(例如YTCD25NEG或YTCD25-细胞)的激活来度量的。在一些实施方式中，选择性通过表达CD25的水平相对高的T细胞(例如Treg)的激活对比表达CD25的水平相对低的T细胞(非刺激的CD8+细胞)的激活来度量。
显著减少的结合：如本文所用，使用术语“表现出显著减少的结合”指相对于变体配体对其受体的天然存在形式的结合，变体配体(例如直向同源物)对受体的修饰形式(例如正交CD122)的结合亲和力。在一些实施方式中，如果正交配体对受体的天然形式的结合为天然存在的配体的小于20％、或小于约10％、或小于约8％、或小于约6％、或小于约4％、或小于约2％、或小于约1％、或小于约0.5％，则相对于配体的天然形式，配体(例如直向同源物)表现出显著减少结合。类似地，如果配体的天然形式对受体的正交形式的结合为天然存在受体的亲和力的小于20％、或小于约10％、或小于约8％、或小于约6％、或小于约4％、或小于约2％、或小于约1％、或小于约0.5％，则相对于配体的天然形式，正交受体表现出显著减少结合。
特异性结合：如本文所用的术语“特异性结合”是指一个分子结合至另一个分子的亲和性/亲和力的程度。在结合对(如配体/受体、抗体/抗原、抗体/配体、抗体/受体结合对)的上下文中，当结合对的第一分子不以显著量结合至样品中存在的其他组分时，就称作结合对的第一分子特异性结合至结合对的第二分子。当结合对的第一分子对第二分子的亲和力比第一分子对样品中存在的其他组分的亲和力至少大2倍、或至少大5倍、或至少大10倍、或至少大20倍、或至少大100倍时，结合对的第一分子被称为特异性结合至结合对的第二分子。在结合对中的第一分子是抗体的特定实施方式中，如果结合对的抗体和第二分子之间的平衡解离常数大于约106M、或者大于约108M、或者大于约1010M、或者大于约1011M、或者大于约1010M、或者大于约1012M，例如通过Scatchard分析确定，则该抗体特异性结合至结合对中的第二分子(例如，蛋白质、抗原、配体或受体)(Munsen，等(1980)Analyt.Biochem.107：220-239)。在一个实施方式中，其中配体是IL2直向同源物，受体包括正交CD122 ECD，如果IL2直向同源物/正交CD122 ECD的平衡解离常数大于约105M、或大于约106M、或大于约107M、或大于约108M、或大于约109M、或大于约1010M、或大于约1011M，则该IL2直向同源物特异性结合。特异性结合可使用本领域已知的技术进行评估，包括但不限于竞争ELISA、放射性配体结合试验(例如，饱和结合、斯卡查德图(Scatchard plot)、非线性曲线拟合程序和竞争结合试验)；非放射性配体结合试验(例如，荧光偏振(fluorescence polarization)(FP)、荧光共振能量转移(FRET)和表面等离子体共振试验(参见，例如，Drescher等，Methods MolBiol493：323-343(2009)，使用商购自GE医疗生命科学公司(GE Healthcare Bio-Sciences)的仪器，例如Biacore 8+、Biacore S200、Biacore T200(GE医疗生命科学公司，地址：100Results Way，Marlborough MA 01752))；液相配体结合试验(例如，实时聚合酶链式反应(RT-qPCR)和免疫沉淀)；和固相配体结合试验(例如，多孔板试验、珠上配体结合试验、柱上配体结合试验和过滤试验)。
对象：术语“受体”、“个体”、“对象”和“患者”在本文中可互换使用，并指任何需要诊断、处理或治疗的哺乳动物对象，特别是人。用于治疗目的的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养和农场动物、非人灵长类动物，以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、奶牛、绵阳、山羊、猪等。在一些实施方式中，哺乳动物为人。
患有：如本文所用，术语“患有”是指医生根据本领域公认的鉴定疾病、紊乱或病症的现有信息(包括但不限于X-射线、CT-扫描、常规实验室诊断测试(例如血细胞计数等)、基因组数据、蛋白质表达数据、免疫组织化学)对对象做出的其需要或将受益于治疗的判断。术语患有通常与特定疾病状态结合使用，例如“患有肿瘤疾病”指患者被诊断为携带肿瘤。
基本上纯的：如本文所用术语“基本上纯的”表示组分(例如多肽)占该组合物总含量的大于约50％，通常占多肽总含量的大于约60％。更通常地，“基本上纯的”是指组合物中总组合物的至少75％、至少85％、至少90％或更多是感兴趣的组分。在一些情况下，多肽将占到组合物总含量的大于约90％，或大于约95％。
T-细胞：如本文所用术语“T-细胞”或“T细胞”以其常规意义使用，是指在胸腺中分化的淋巴细胞，拥有特定细胞表面抗原受体，包括一些控制细胞介导的免疫和体液免疫和其他裂解携带抗原的细胞的起始或抑制的。在一些实施方式中，T细胞包括但不限于初始CD8+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、初始CD4+T细胞、辅助T细胞，例如TH1、TH2、TH9、TH11、TH22、TFH；调节性T细胞，例如TR1、Treg、诱导型Treg；记忆性T细胞，例如中心记忆T细胞、效应记忆T细胞、NKT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和此类T细胞的工程改造变体，包括但不限于CAR-T细胞、重组修饰TIL和TCR工程改造细胞。
治疗有效量：本文使用的短语“治疗有效量”是指向对象给予试剂，单独地或作为药物组合物或治疗方案的一部分，以单剂量或作为系列剂量的一部分，以能够对疾病、紊乱或病症的任何症状、方面或特征产生任何可检测的、积极影响的量。治疗有效量可以通过测量相关的生理效应来确定，并且可以结合给药方案和对对象病情的诊断分析等来调整。用于确定试剂的治疗有效量的评估参数由医生使用公认的诊断标准确定，包括但不限于指标例如年龄、体重、性别、总体健康状况、ECOG评分、可观察到的生理参数、血液浓度、血压、心电图、计算机断层扫描、X-射线等。或者或此外，还可以监测临床情境中通常评估的其他参数，以确定是否对对象给予了治疗有效量的试剂，如体温，心率，血液化学的正常化，血压的正常化，胆固醇水平的正常化，或疾病、紊乱或病症的任何症状、方面或特征，生物标志物(如炎症细胞因子、IFN-γ、颗粒酶等)，血清肿瘤标志物的减少，实体瘤反应评估标准(RECIST)的改善、免疫相关缓解标准(irRC)的改善、生存期的延长、无进展生存期的延长、进展时间的延长、治疗失败时间的延长、无事件生存期的延长、下次治疗时间的延长、客观缓解率的改善、缓解持续时间的改善、肿瘤负担的减轻、完全缓解、部分缓解、稳定的疾病等，本领域的临床医生基于这些评估对象对给予试剂的反应的状况改善。如本文所用，涉及靶病灶的术语“完全缓解(CR)”、“部分缓解(PR)”、“稳定的疾病(SD)”和“进展性疾病(PD)”，涉及非靶病灶的术语“完全缓解(CR)”、“不完全缓解/稳定的疾病(SD)”和“进展性疾病(PD)”，应理解为RECIST标准中所定义。如本文所用术语“免疫相关完全缓解(irCR)”、“免疫相关部分缓解(irPR)”、“免疫相关进展性疾病(irPD)”和“免疫相关稳定的疾病(irSD)”如根据免疫相关缓解标准(irRC)定义。如本文所用，术语“免疫相关缓解标准(irRC)”是指用于评估免疫治疗的缓解的体系，如描述于Wolchok，等(2009)评估实体瘤中免疫治疗活性的指南：免疫相关缓解标准(Guidelines for the Evaluation of Immune TherapyActivity in Solid Tumors：Immune-Related Response Criteria)，Clinical CancerResearch 15(23)：7412-7420。在对象疗程期间，可以根据给药方案和/或对象病情的评估及前述因素的变化调整治疗有效量。在一个实施方式中，治疗有效量是在哺乳动物对象给药过程中当单独使用或与另一试剂组合使用时不导致不可逆的严重不良事件的试剂的量。
跨膜结构域：术语″跨膜结构域″或″TM″是指跨膜多肽(如CD122或CD132或CAR等跨膜多肽)的结构域，当该跨膜多肽与细胞膜相关联时，该结构域嵌入细胞膜中，并与跨膜多肽的胞外结构域(ECD)和胞内结构域(ICD)以肽基键连接(peptidyl linkage)。跨膜结构域可以与胞外和/或胞内结构域中的一个或两个同源(天然相关联)或异源(不天然相关联)。在一些实施方式中，跨膜结构域是与衍生正交受体的同源受体的ECD结构域天然相关联的跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是与衍生正交受体的同源受体的ICD结构域天然相关联的跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是与增殖信号转导结构域天然相关联的跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是与不同蛋白质天然相关联的跨膜结构域。或者，正交受体的跨膜结构域可以是跨越质膜的人工氨基酸序列。在一些实施方式中，正交受体的跨膜结构域是与衍生正交受体的同源受体的ICD通常相关联的跨膜结构域。在一些实施方式中，在受体是包括源自第一亲本受体的胞内结构域和源自第二不同亲本受体的第二胞外结构域的嵌合受体的情况下，嵌合受体的跨膜结构域是通常与衍生嵌合受体的亲本受体的ICD或ECD相关联的跨膜结构域。
治疗：术语“治疗”、“疗法”、“处理”等是指在诊断、观察到对象的疾病、紊乱或病症或其症状后，起始的行动过程(例如给予IL2、CAR-T细胞或包含其的药物组合物)或类似情况，以便暂时或永久地消除、减少、抑制、减轻或改善困扰对象的这种疾病、紊乱或病症的至少一个根本原因，或与这种疾病、紊乱或病症相关的至少一个症状。治疗包括对患有疾病的对象采取的行动过程，其中该行动过程导致对象的疾病被抑制(例如，阻止疾病、紊乱或病症的发展或改善与此相关的一个或多个症状)。
Treg细胞或调节性T细胞。本文所用的术语“调节性T细胞”或“Treg细胞”是指CD4+T细胞的类型，其能够抑制其他T细胞的反应，包括但不限于效应T细胞(Teff)。Treg细胞特征在于表达CD4、IL2受体的a亚基(CD25)和转录因子叉头盒P3(FOXP3)(Sakaguchi，AnnuRev Immunol 22，531-62(2004)。“常规CD4+ T细胞”意指除调节性T细胞以外的CD4+T细胞。
变体：术语″蛋白质变体″或″变体蛋白质″或″变体多肽″在本文中可互换使用，指的是由于至少一个氨基酸修饰而与亲本多肽不同的多肽。该亲本多肽可以是天然存在的或野生型(WT)多肽，也可以是WT多肽的修饰形式。术语变体多肽可以指多肽本身、包含多肽的组合物或编码其的核酸序列。在一些实施方式中，变体多肽相对于亲本多肽包括约1至约10个氨基酸修饰，或者相对于亲本的约1至约5个氨基酸修饰，或者相对于亲本的约1至约3个氨基酸修饰，或者相对于亲本的1至2个氨基酸修饰，或者相对于亲本的单一氨基酸修饰。变体可以与其所衍生的亲本多肽有至少约99％的同一性、或至少约98％的同一性、或至少约97％的同一性、或至少约95％的同一性、或至少约90％的同一性。
野生型：“野生型”或“WT”或“天然”在本文中是指在自然界中存在的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。WT蛋白，多肽，抗体，免疫球蛋白，IgG等具有未经人工修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
对某些实施方式的描述
一种或多种过继细胞治疗：
“过继细胞治疗”或简单的“细胞治疗”是指给予外源性操纵的细胞，特别是免疫细胞。过继细胞疗法的一种形式是采用从肿瘤组织中分离的外源性操纵的淋巴细胞(称为“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”)。据信这种TIL已经暴露于肿瘤抗原，因此能够攻击肿瘤细胞，但这种TIL或是供应不足，或是已经“耗尽”，以至于它们无法独立消除肿瘤。在TIL治疗中，分离的TIL离体培养以扩大其数量，暴露于激活剂中并回输到被分离出细胞的患者体内(称为“自体细胞治疗”)。TIL细胞治疗已被证明是一种在人对象的肿瘤性疾病的治疗中具有功效的治疗方式。参见，例如，Rosenberg(美国专利号5,126,132A，1992年6月30日授权，1992，和Spiess，等(1987)J Natl Cancer Inst79：1067-1075。
在当前实践，人TIL细胞治疗由以下组成：离体扩增从切除的肿瘤材料中获得的TIL，并在对对象应用淋巴细胞清除准备方案后过继转移到对象中，以及随后通过给予白细胞介素-2(IL-2)支持过继转移的细胞。淋巴细胞清除准备方案会耗竭Treg并去除细胞“库(sink)”，通常表征为为过继转移的细胞“腾出空间(making room)”。全身给予IL-2支持回输的TIL在体内的持久性。在典型的临床实践中，在输注TIL后不久，患者接受静脉内高剂量IL-2(每8小时720,000IU/kg，直到最大耐受。这种随后的IL-2支持被认为能进一步增强TIL的存活和临床功效。
尽管已证明有临床效果，但TIL细胞治疗与显著毒性相关联，主要来自导致全血细胞减少症(pancytopenia)和发热性中性粒细胞减少症(febrile neutropenia)的淋巴细胞清除准备方案，以及在重新给予富集的TIL细胞群后使用高剂量IL-2的支持性治疗。通常用于过继性细胞治疗的支持性方案的高剂量IL2的作用已被充分证明会导致显著毒性。过继细胞转移(ACT)后使用IL-2支持性治疗引起的最普遍的副作用包括寒战、高烧、低血压、少尿和由于全身炎症和毛细血管渗漏综合征引起的水肿以及自身免疫现象(例如白癜风或葡萄膜炎)的报告。
TIL细胞疗法也面临着来自分离的T细胞的离体扩增的挑战。TIL的离体扩增在高剂量IL2存在的情况下进行了相当长的一段时间。IL-2促进激活的T淋巴细胞的增殖和扩增，增强B细胞的生长，并激活单核细胞和自然杀伤细胞。然而，在TIL扩增过程中，不同的T细胞克隆在频率上有增有减，存在着克隆间竞争。由于希望给予的最终TIL产品尽可能富集肿瘤特异性克隆，因此hIL2的非特异性性质不能为肿瘤特异的、经历抗原的T细胞克隆提供选择性支持，由于hIL2的非特异性T细胞增殖作用，最有效的肿瘤反应性T细胞克隆可能会在离体扩增阶段处于竞争劣势并被稀释。结果，待回输给对象的TIL细胞产品可能具有其中抗肿瘤TIL(经历肿瘤抗原的细胞)群体占回输给对象的细胞产品中细胞总数的次优分数(例如，小于60％、或者小于50％、或者小于40％，或者小于30％)。此外，离体刺激程序后T细胞的T细胞分化程度会影响回输后TIL在体内的存活、增殖能力和功效。Li，等(2010)JImmunol.2010；184：452-465。IL2的高效力和培养的TIL暴露于高剂量IL2的效果与在其存在下离体培养的T细胞的终末分化有关，也与自身免疫的介导和移植排斥以及其他体内副作用有关。
如Li，等所述：
我们研究中出现的一个关键问题是，使用其他方法进行REP，是否能产生能够在ACT期间更好地在体内持续存在的具有与CD28表达的保持和其他效应记忆标志物相关联的“更年轻”表型的REP后(post-REP)T细胞。换言之，我们能否通过产生大量肿瘤反应性细胞毒性T细胞，同时保持有利于持续细胞分裂和体内长期存活的记忆表型，从而实现两全其美？
Li，et al，第465页。此外，Li等人提出，由当前涉及IL2的离体方案导致的TIL终末分化状态是当前TIL治疗的一个问题，并提出其他细胞因子如IL-15或IL-21用以避免IL-2在TIL的离体制备中的影响的潜在用途。尽管，在ACT后用高剂量IL2治疗支持TIL与改善的治疗转归相关。然而，高剂量IL2治疗与人对象的显著毒性相关联，如前所述，是TIL治疗面临的主要挑战之一。因此，需要提供一种方法来支持经历肿瘤抗原的T细胞离体的活力和/或增殖，而不驱动所需的这些经历肿瘤抗原的T细胞群分化和/或耗竭。
工程改造细胞疗法
除了TIL细胞疗法之外，部分受其证明人免疫系统能够消除肿瘤的启发，已经研究了多种方法来工程改造具有特别理想特性的免疫细胞。一类已临床证明并被批准用于人的工程改造免疫细胞是使用已被工程改造以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞。在涉及前B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)或B细胞淋巴瘤患者的早期临床试验中，CAR T细胞疗法具有革命性意义，并为对标准治疗难治性的患者提示了治愈选择的可能性。这些早期试验导致FDA迅速批准了用于急性淋巴细胞白血病(ALL)和某些类型B细胞淋巴瘤的抗-CD19 CART细胞产品。用CAR T疗法治疗血液系统恶性肿瘤疾病的初步临床缓解非常有前景，据报道，人对象的初始缓解率为90％或更高，这刺激了对CAR-T开发的重要研究，用于治疗多种肿瘤性疾病的多种CAR-T方法处于临床前和临床开发的不同阶段。
CAR-T细胞的主要靶向和激活组分是CAR，通常是一种多功能多聚蛋白，其包含肿瘤抗原特异性靶向结构域和附加的结构(例如铰链、跨膜)和胞内信号转导结构域。文献中已经提出了各种的CAR设计，并且通常主要根据信号转导结构域的结构将其分为第一代、第二代、第三代或第四代CAR。术语第一代CAR指的是CAR其中的胞内结构域仅通过单个信号转导结构域传递来自抗原结合的信号，例如来自CD3ζ链或IgE FcεR1g的高亲和力受体的信号转导结构域。该胞内信号转导结构域包含一个或三个基于免疫受体酪氨酸的激活基序[ITAM]，用于抗原依赖的T细胞激活。基于ITAM的激活信号使T细胞具有对抗原结合反应进行裂解靶肿瘤细胞和分泌细胞因子的能力。第二代CAR除了CD3ζ信号外，还包括共刺激信号。递送的共刺激信号的共同递送增强细胞因子的分泌和CAR转导的T细胞诱导的抗肿瘤活性。共刺激结构域通常是相对于CD3ζ结构域的膜近端。第三代CAR包括三方信号转导结构域，例如包括CD28、CD3ζ、OX40或4-1BB信号转导区。在第四代，或“武装(armored car)”CART细胞被进一步修饰，以表达或阻断分子和/或受体，以增强免疫活性，例如表达IL-12、IL-18、IL-7和/或IL-10；4-1BB配体、CD-40配体。
虽然胞内信号转导结构域对工程改造的CAR-T细胞的激活和增殖很重要，但定义CAR-T的靶标及其对应的临床应用的是胞外靶向结构域(或ABD)。胞外靶向结合抗原结构域(ABD)通常包含特异性结合至肿瘤细胞特征的细胞表面抗原(肽或聚糖)以提供对CAR-T细胞的选择性靶向的抗体或抗体片段(例如，scFv或VHH)。为了最小化CAR-T细胞的潜在副作用和毒性，包括自身免疫反应，在选择用于靶向的肿瘤抗原时，优选该抗原在肿瘤细胞类型上比待治疗对象的正常细胞上更普遍。已鉴定的抗体结合分子及其临床治疗靶点的此类肿瘤抗原的例子包括但不限于：CD19(例如，血液系统恶性肿瘤，例如ALL、CLL、B细胞淋巴瘤)、CD20(例如难治性或复发性CD20+B-细胞淋巴瘤)、BCMA(例如多发性骨髓瘤，Carpenter，等(2013)Clin Cancer Res；79(8)；2048-60)、CD22(B细胞恶性肿瘤，包括小儿B细胞前体ALL，如描述于Pan，等(2019)Leukemia 33，2854-2866)、CD30(例如CD30+淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤；Grover，(2019)BMC Cancer 19，203)、CD70(例如急性髓性白血病(AML；Sauer，等(2019)Blood 134(补充_1)：1932)，Lewis Y(例如AML；Ritchie，等(2013)MolecularTherapy21(11)：2122-9)、GD2(例如神经胶质瘤；Mount，等(2018)Nat Med 24，572-579)、GD3(例如转移性黑色素瘤和神经外胚层肿瘤(neuroecodermal tumor)；Agnes，等(2010)DOI：10.1158/1078-0432.CCR-10-0043，间皮素(例如间皮瘤、肺、胰腺、乳腺、卵巢和其他实体瘤；Beatty，等，(2014)Cancer Immunol Research2(2))、ROR-1(例如，慢性淋巴细胞性白血病；Aghebati-Maleki，等(2017)《生物医学和药理学》(Biomedicine and Pharmacology)88：814-822)、CD44(例如AML和多发性骨髓瘤；Casuccia，等(2013)Blood 122(20)：3461-3472)、CD171(例如成神经细胞瘤；Kunkele，等(2017)Clin Cancer Research 23(2)：466-477)；EGP2、EphA2(例如成胶质细胞瘤；Yi，等(2018)《分子疗法：方法与临床发展》(Molecular Therapy：Methods&Clinical Development)9：70-80)、ErbB2、ErbB3/4、FAP、FAR IL11Ra、PSCA(前列腺癌)、PSMA(前列腺癌)、NCAM、HER2(，NY-ESO-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、c-Met、糖脂F77(GlycolipidF77)、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(FRa)和Wnt1抗原。CD123。此外，ABD可能是多价的，因为它具有结合多于一种抗原的能力，尤其是对于多于一种肿瘤抗原的特异性(例如，CD19和CD20，描述于Zah，等(2016)Cancer Immunol Res；4(6)；498-508；CD19和CD22，描述于Tu，等(2019)Frontiers in Oncology 9：1350)。
这种抗原的一个具体例子是95kDa糖蛋白CD19。CD19由大多数B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病和一些急性髓性白血病(AML)表达，但CD19不存在于大多数正常组织中，除了正常B细胞。尽管在临床开发的不同阶段有多个CAR-T候选产品，但抗-CD19CAR细胞产品阿基伦赛(axicabtagene ciloleucel)(以名称
Figure BDA0003850638240000601
销售，可从吉利德制药公司(Gilead Pharmaceuticals)购买)和替沙伦赛(tisagenlecleucel)(以名称
Figure BDA0003850638240000602
销售，可从诺华(Novartis)购买)是当前仅有的主要监管部门批准用于人的CAR-T细胞疗法，多种CAR-T疗法正处于临床前和临床开发的各个阶段，用于治疗多种肿瘤疾病。
用CAR T疗法治疗肿瘤性疾病的初始临床缓解非常有前景，据报道在人对象中的初始缓解率为90％或更高，有关已批准抗-CD19 CAR药物临床经验的文献越来越多地揭示了用这种药物治疗的对象中有相当部分经受了疾病状态的复发。此类患者持久缓解的缺乏主要归因于给予CAR-T细胞产品后CAR-T细胞持久性差和/或抗原丢失或调节导致的癌细胞耐药性。以患者可以耐受的剂量给予IL2不能长期选择性地维持过继转移细胞的激活群体，从而导致肿瘤性疾病的复发和复现。
本发明提供了克服这些问题的方法和组合物，并开辟了使用包括CAR T疗法在内的过继工程改造细胞疗法的新机会，特别是在工程改造细胞的持久性特别值得注意的实体瘤的治疗中。
众所周知，过继转移的人免疫细胞在给予后相对迅速地失去其活性。因此，解决这种功能快速丧失的典型方法是：(a)给予过高剂量的细胞治疗剂，以在细胞失去效力之前最大限度地使细胞治疗剂暴露于肿瘤，和/或(b)全身给予HD-hIL2治疗，以尝试支持过继转移细胞的功效。这两种方法都具有显著的毒性。上文已经讨论了与HD-hIL2治疗相关的毒性。高剂量的工程改造细胞治疗剂与威胁生命的细胞因子释放综合征(CRS)相关。当前可用的产品在大多数接受治疗的对象中显示出所有级别的CRS，在很大一部分患者中显示出3级或更高级别的CRS。在大多数患者中也观察到显著的神经毒性。然而，较低剂量的细胞治疗剂与临床转归的显著下降有关。此外，主要由于细胞治疗产品缺乏持久性，许多起初对细胞治疗响应良好的患者复发。目前，据报道，使用现有CD-19细胞治疗药物治疗的患者中约有60％复发。Byrne M，等(2019)《血液和骨髓移植生物学》(Biology of Blood and MarrowTransplantation)25(11)：344-251。如下文更详细描述的实验结果证明，正交细胞与正交配体组合给予解决了当前细胞疗法的许多问题，并提供了治疗适合细胞疗法的疾病的改进的方法，包括但不限于：
能够在体内选择性扩增过继转移的人免疫细胞群而无显著脱靶的其他免疫细胞的全身激活的组合物和方法；
支持激活的正交细胞过继转移的人免疫细胞的持久性而没有与支持剂相关的显著毒性的组合物和方法；
在治疗哺乳动物对象的肿瘤性疾病时使用先前被报道为无效且显著(10-1000倍)低于目前相似细胞治疗产品剂量的初始剂量的细胞治疗剂以实现细胞治疗产品的体内治疗效力的组合物和方法；
通过定期给予正交配体，能够将正交免疫细胞的治疗水平维持在治疗有效水平持续延长时间的组合物和方法；
能够通过给予正交配体来治疗肿瘤性病症的复发，以恢复先前给予的正交细胞的效力，而无需给予附加的工程改造的正交细胞的组合物和方法；
提供对正交细胞的活性和增殖的选择性调节的组合物和方法，其能够通过去除激活型正交配体而无需进一步工程改造细胞以包括“杀伤开关”或采用免疫耗竭或免疫抑制治疗方案而使对象暂时或永久停止暴露于正交细胞疗法的激活形式；一种细胞，其在不产生显著毒性的情况下给予该细胞产物后，以不增强哺乳动物对象中的过继转移细胞的增殖的形式进行响应；
避免了在过继细胞疗法之前对对象进行在先免疫清除的需要的组合物和方法；
正交配体的药物制剂，特别是具有延长作用持续时间的正交配体，使得支持性正交配体的给药频率降低；
对于类似适应症，提供优于现有细胞治疗剂的可证明的治疗性抗肿瘤功效的组合物和方法；和
当与补充治疗剂组合时提供增强的抗肿瘤功效的组合物和方法。
进行了一系列实验以证明本发明的组合物和方法的效用和功能性，特别是治疗患有肿瘤性疾病病症的哺乳动物对象，该哺乳动物对象在过继细胞疗法的情况中经受正交系统。在一系列实验中评估了本发明的组合物和方法的效用，如在所附实施例和附图中提供的数据中更全面地详述。
简而言之，使用式1的代表性人IL2直向同源物进行了一系列体外和体内实验，所述式1的代表性人IL2直向同源物为hIL2变体，其包含氨基酸取代组：[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]，根据wt hIL2编号并具有氨基酸序列：
Figure BDA0003850638240000621
在本文中有时也称为“正交IL2(orthoIL2)”和“hoIL2”。
为了确认STK-007的选择性结合特性，进行了Biacore表面等离子体共振研究，以确认STK-007保留了与IL2受体的CD25(IL2Ra)和CD132(IL2Rg)组分的基本结合，并表现出特异性结合至hoRb，而wt hIL2没有显著结合至hoRb。简而言之，制备了wtCD25、wtCD122、hoCD122和wtCD132的C-末端加HIS-标签形式，并将其固定在抗-HIS捕获芯片上，并使用Biacore通过流动STK-007和wt hIL2分子的溶液(雪兰多生物技术公司(ShenandoahBiotechnology，Inc.))对固定的受体亚基进行了结合评估。这些实验的结果示于附图图1中。分图A、C、E和G分别代表STK-007结合至wtCD25、wtCD122、wtCD132和hoCD122。分图B、D、F和H分别代表wtIL2结合至wtCD25、wtCD122、wtCD132和hoCD122。呈现的数据表明，STK-007保留了与wtCD25和wtCD132的结合，类似于wt hIL2，但对wt CD122的亲和力非常低。然而，STK-007确实结合至hoCD122具有亲和力，(分图G)类似于wtIL2对wtCD122的结合。类似地，wt hIL2显示出结合至wtCD25、wt CD122和wtCD132，类似于对hoCD122的非常低的亲和力。
对于体内研究，STK-007分子通过添加N-末端40kDa支链PEG分子结构被修饰：
Figure BDA0003850638240000631
其产生了式2的hIL2直向同源物，下文称为STK-009，其结构为
40kD-PEG-接头-desAla1-hIL2[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]-COOH.[2]
(在本文中有时也称为“PEG正交(PEGortho)”、“PEG正交IL2(PEGorthoIL2)”或“PEGhoIL2”。用于这些研究的代表性正交细胞是经修饰以表达正交CD122(IL2Rb)受体的CD19正交CAR-T细胞，其具有氨基酸序列：
Figure BDA0003850638240000632
Figure BDA0003850638240000641
在本文中有时也称为“hoCD122”或“hoRb”(人正交受体β)。hoRb受体的胞外结构域包含两个氨基酸取代H133D和Y134F(根据wt hCD122编号)。
这些研究中使用的示例性CAR是一种抗-CD19嵌合抗原受体，其包含作为抗原结合结构域的FMC63抗-CD19 scFv、CD28跨膜和共刺激结构域以及CD3z结构域(图2，分图A)，并且具有氨基酸序列：
Figure BDA0003850638240000642
合成核酸序列，其编码：CD19 28z CAR、T2A肽和hoRb序列
Figure BDA0003850638240000643
Figure BDA0003850638240000651
如图1A所示。这些构建体是在第三代p14Syn慢病毒骨架(Alstem Bio)的EF1a-启动子下游合成和克隆的。分离并刺激以产生“CD19_28z正交CAR(CD19_28z orthoCAR)”T细胞也被称为SYNCAR-001。
在图3中提供的数据所示的播散模型(disseminated model)中，给予PBS未能控制肿瘤负荷(图3，分图A，第1组和图3，分图B，左上)，导致由于毒性动物需要在研究的大约第21天被处死。相较之下，CD19_28z正交CAR T细胞的给予导致4/8小鼠产生抗肿瘤缓解(图3，分图A，第2组和图3，分图B，右上)。CD19_28z正交CAR T细胞与STK-009在两种剂量水平(图3，分图A，1μg(第3组，和图3，分图B右下)和2μg(第4组和图3，分图B左下)的组合治疗，与单独的CD19_28z正交CAR T细胞治疗相比，提供了附加抗肿瘤功能。
此外，图4中提供的来自实施例8中描述的再激发模型的数据表明，这些数据表明，即使是长时间没有抗原或肿瘤配体暴露，STK009再给药能够恢复CAR T细胞的抗肿瘤活性。
实施例9中描述的复发模型以及图5中提供的数据证明单独给予STK-009能够在从先前的治疗过程中复发的动物中实现CAR-T细胞的抗肿瘤活性。
此外，如实施例11中所讨论的并提供于图6的，与正交配体(STK-009)接触的正交CAR-T细胞在体内保留了SCM表型，这表明CAR T细胞的持久性增强，从而提供了更持久的抗肿瘤作用。
特别值得注意的是，实施例12中讨论的实体瘤模型中从实体瘤模型获得的数据与图7-10提供的数据。该数据表明，正交CAR-T细胞与正交同源配体组合能够在实体瘤中诱导响应并增加CAR-T细胞到实体瘤中的浸润，这表明该系统可用于治疗先前无法使用过继细胞转移方案(如CART)治疗的实体瘤。
数据表明了表达正交受体的治疗性工程改造的细胞(例如hoCART、hoTIL)持久性改善，以剂量依赖性方式选择性地且有效地激活的能力，工程改造的正交免疫细胞响应于与同源正交配体的接触，配体对表达正交配体的细胞的特异性，证明了毒性的显著减少，所述毒性通常与不提供非特异性脱靶的毒性相关，例如由给予非特异性T细胞增殖剂(例如hIL2)观察到的，hIL2是过继细胞疗法方案中有据可查的毒性来源。
正交配体对正交受体的选择性导致分子在体内具有低毒性。这在非人灵长类动物模型毒理学研究中得到证实，其中灵长类动物暴露于如本文所述的高剂量长效PEG化正交hIL2分子。尽管在本研究中观察到高剂量正交IL2化合物的持续性，但在显著大于治疗有效剂量(可能至少10倍至100倍)的剂量下没有观察到显著的毒性。正交配体选择性激活治疗性细胞的选择性和功效使得过继细胞疗法能够在用于预防疾病进展的预防性基础上使用，例如治疗缓慢进展的癌前病症，例如冒烟型多发性骨髓瘤(smoldering multiplemyeloma)，联合使用BCMA CAR T细胞。
正交配体成功地重振(re-enervating)CAR T细胞，从而能够在不重新入院(readmission)的情况下实现重建工程改造细胞的治疗效果，证明了该技术在预防肿瘤性疾病复发、复现和转移方面的效用。
在一些实施方式中，本发明提供了治疗人对象的疾病障碍或病症的方法，其包括以下步骤：(a)给予对象治疗有效量的正交配体；(b)给予对象哺乳动物免疫细胞，其包含编码正交hCD122受体的核酸序列，该核酸序列操作性地连接至一个或多个表达控制元件，使得该哺乳动物免疫细胞表达正交hCD122受体。
本发明提供了通过给予表达正交CD122受体和嵌合抗原受体的多个工程改造T细胞治疗患有肿瘤性疾病的对象的方法和组合物，所述受体的胞外结构域特异性结合至肿瘤抗原，并且同时给予正交IL2配体通过向所述对象给予维持治疗来预防所述肿瘤性疾病的复发，所述维持治疗包括定期给予式1的正交IL2配体，其中在治疗阶段中使用的正交配体与用于维持阶段的正交配体相同或不同。在一些实施方式中，正交配体被修饰以延长半衰期。在一些实施方式中，正交配体是聚乙二醇化的，融合蛋白等。在一个实施方式中，正交配体包含40kD N-末端的PEG部分。在该方法的一些实施方式中，在第一治疗阶段中正交配体以高于足以提供扩增(例如＞EC10 PRO)但低于足以诱导显著分化(例如＜EC90 ACT)的浓度给药持续一段时间(至少24小时，任选地30、60、90天或更长时间)。在一些实施方式中，维持阶段任选地包括给予足以诱导正交CAR T激活的式1的正交配体，维持血清水平超过激活浓度(例如＞EC50 ACT)至少24小时。在该方法的一些实施方式中，通过给予包含编码式1的正交IL2配体的核酸的重组病毒或非病毒载体向对象提供正交配体。在该方法的一些实施方式中，肿瘤性疾病选自实体瘤和血液系统恶性肿瘤。在该方法的一些实施方式中。在该方法的一些实施方式中，该方法还包括在治疗阶段和/或维持阶段期间的一种或多种补充性抗肿瘤剂。在该方法的一些实施方式中，治疗阶段和/或维持阶段期间的补充性抗肿瘤剂可以相同或不同。在该方法的一些实施方式中，补充肿瘤剂选自化疗剂、小分子、补充生物制剂，包括但不限于检查点抑制剂(抗-PD1、Keytruda、Opdivo)、抗肿瘤抗原抗体(赫赛汀)，和/或物理方法(手术、放射等)。在一些实施方式中，该正交受体是包含一个或多个STAT3结合基序的正交CD122。
转移的预防
本发明提供了通过给予表达正交CD122受体和嵌合抗原受体的多个工程改造T细胞治疗患有肿瘤性疾病的对象的方法和组合物，所述受体的胞外结构域特异性结合至肿瘤抗原，并且同时组合给予正交IL2配体式1和通过向所述对象给予维持治疗来预防所述肿瘤性疾病的转移，所述维持治疗包括定期给予式1的正交IL2配体，其中在治疗阶段中使用的正交配体与用于维持阶段的正交配体相同或不同。在一些实施方式中，正交配体被修饰以延长半衰期。在一些实施方式中，正交配体是聚乙二醇化的，融合蛋白等。在一个实施方式中，正交配体包含40kD N-末端的PEG部分。在该方法的一些实施方式中，在第一治疗阶段中正交配体以高于足以提供扩增(例如＞EC10 PRO)但低于足以诱导显著分化(例如＜EC90 ACT)的浓度给药持续一段时间(至少24小时，任选地30、60、90天或更长时间)。在一些实施方式中，维持阶段任选地包括给予足以诱导正交CAR T激活的式1的正交配体，维持血清水平超过激活浓度(例如＞EC50 ACT)至少24小时。在该方法的一些实施方式中，通过给予包含编码式1的正交IL2配体的核酸的重组病毒或非病毒载体向对象提供正交配体。在该方法的一些实施方式中，肿瘤性疾病选自实体瘤和血液系统恶性肿瘤。在该方法的一些实施方式中。在该方法的一些实施方式中，该方法还包括在治疗阶段和/或维持阶段期间的一种或多种补充性抗肿瘤剂。在该方法的一些实施方式中，治疗阶段和/或维持阶段期间的补充性抗肿瘤剂可以相同或不同。在该方法的一些实施方式中，补充肿瘤剂选自化疗剂、小分子、补充生物制剂，包括但不限于检查点抑制剂(抗-PD1、Keytruda、Opdivo)、抗肿瘤抗原抗体(赫赛汀)，和/或物理方法(手术、放射等)。在一些实施方式中，该正交受体是包含一个或多个STAT3结合基序的正交CD122。
CD19 CAR用于血液系统恶性肿瘤：
在一个实施方式中，本发明提供了一种通过给予治疗有效量的正交CD19 CAR与给予治疗有效量的式1的正交IL2配体组合以治疗或预防需要治疗或预防的对象的血液系统恶性肿瘤的方法。
在一个实施方式中，本发明提供了正交CD19 CAR，其用于预防患有血液系统肿瘤性疾病的对象的复发和/或转移的方法，该方法包括步骤：给予表达正交CD122多肽和嵌合抗原受体(其胞外结构域特异性结合至CD19)的多个工程改造T细胞，，并组合给予式1的正交IL2配体。在一些实施方式中，CAR是如本文所述的SYNCAR-001。
在一些实施方式中，本发明提供了预防对初始正交CD19 CAR-T/正交IL2配体治疗阶段的部分缓解或完全缓解后对象复发的方法，所述对象先前经正交CD19 CAR-T细胞与正交IL2配体组合治疗，该方法包括给予维持治疗疗程，其包括以低于治疗阶段期间给予浓度的浓度定期给予式1的正交IL2配体。在治疗阶段给予的正交配体可以与维持阶段给予的正交配体相同或不同。
在一些实施方式中，血液系统恶性肿瘤是复发性或难治性血液系统恶性肿瘤，包括但不限于复发性或难治性非霍奇金淋巴瘤、复发性或难治性骨髓瘤、复发性或难治性大B细胞淋巴瘤、复发性或难治性套细胞淋巴瘤。复发性血液系统恶性肿瘤(例如，复发性骨髓瘤)包括患者初始治疗成功但疾病再次出现的情况。难治性血液系统恶性肿瘤是指尽管积极治疗仍进展的疾病。如果该疾病没有表现出缓解并在化疗中继续进展，患有难治性骨髓瘤的患者被称为患有原发性难治性骨髓瘤，而继发性难治性患者在治疗起始时有初始缓解但治疗不再有效。
在一些实施方式中，正交配体被修饰以延长半衰期。在一些实施方式中，正交配体是聚乙二醇化的，Fc融合蛋白，白蛋白融合体等。在一个实施方式中，正交配体包含40kD N-末端的PEG部分。
在该方法的一些实施方式中，在第一治疗期中正交配体以高于足以提供扩增(例如＞EC10 PRO)但低于足以诱导显著分化(例如＜EC90 ACT)的浓度给药持续一段时间(至少24小时，或一周、或两周、或至少30天、或至少60天、或至少90天或更长时间)。在一些实施方式中，维持阶段任选地包括给予足以诱导正交CAR T激活的式1的正交配体，维持血清水平超过激活浓度(例如＞EC50 ACT)至少24小时。
在该方法的一些实施方式中，通过给予包含编码式1的正交IL2配体的核酸的重组病毒或非病毒载体向对象提供正交配体。在该方法的一些实施方式中，肿瘤性疾病选自实体瘤和血液系统恶性肿瘤。
在该方法的一些实施方式中，该方法还包括在治疗阶段和/或维持阶段期间的一种或多种补充性抗肿瘤剂。在该方法的一些实施方式中，治疗阶段和/或维持阶段期间的一种或多种抗肿瘤剂可以相同或不同。在该方法的一些实施方式中，补充肿瘤剂选自化疗剂、小分子、补充生物制剂，包括但不限于检查点抑制剂(抗-PD1、Keytruda、Opdivo)、抗肿瘤抗原抗体(赫赛汀)，和/或物理方法(手术、放射等)。在一些实施方式中，该正交受体是包含一个或多个STAT3结合基序的正交CD122。在一些实施方式中，CAR的胞外结构域包含特异性结合至包含CDR的CD19的抗体或一种或多种选自FMC63的抗体。
在一些实施方式中，血液系统肿瘤性疾病选自急性淋巴细胞白血病(ALL)，包括费城染色体阳性ALL(Philadelphia Chromosome Positive ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和B细胞淋巴瘤。在一些实施方式中，该方法进一步包括共同给予一种或多种化疗剂。
当血液系统恶性肿瘤是ALL时，补充剂可以是长春新碱或脂质体长春新碱(Marqibo)、柔红霉素(daunorubicin)(道诺霉素(daunomycin))或多柔比星(doxorubicin)(阿霉素(Adriamycin))、阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)，ara-C)、L-天冬酰胺酶或PEG-L-天冬酰胺酶(培门冬酶(pegaspargase)或Oncaspar)、6-巯基嘌呤(6-MP)、甲氨蝶呤、环磷酰胺、泼尼松、地塞米松、地拉滨(delarabine)(Arranon)。当血液系统恶性肿瘤为费城染色体阳性ALL时，补充剂可以是伊马替尼(Imatinib)
Figure BDA0003850638240000711
达沙替尼(dasatinib)
Figure BDA0003850638240000712
尼罗替尼(nilotinib)
Figure BDA0003850638240000713
普纳替尼(ponatinib)
Figure BDA0003850638240000714
和博舒替尼(bosutinib)
Figure BDA0003850638240000715
当血液系统恶性肿瘤为CLL时，补充剂可以是包含氟达拉滨的方案，包括但不限于“FCR”(氟达拉滨、环磷酰胺和利妥昔单抗)和FR(氟达拉滨和利妥昔单抗)，基于喷司他丁的治疗方案，包括但不限于PCR(喷司他丁、环磷酰胺和利妥昔单抗)，阿仑单抗
Figure BDA0003850638240000716
苯丁酸氮芥，苯丁酸氮芥与奥贝努妥珠单抗(
Figure BDA0003850638240000717
抗-CD20Mab)组合，酪氨酸激酶抑制剂(包括但不限于依鲁替尼(ibrutinib))。
当血液系统恶性肿瘤为难治性或复发性CLL时，补充剂选自以下的一种或多种：来那度胺、奥法木单抗、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂(例如杜韦利西布(duvelisib)和依达拉西布(idelalisib)；维奈托克(venetoclax)单独使用或与奥贝努妥珠单抗(obinutuzumab)或利妥昔单抗组合。当血液系统恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤时，补充剂选自以下的一种或多种：利妥昔单抗
Figure BDA0003850638240000718
任选地与环磷酰胺组合的；苯达莫司汀(bendamustine)与奥贝努妥珠(obinutuzum)或利妥昔单抗组合；CHOP(环磷酰胺、多柔比星或羟基柔红霉素(hydroxydaunorubicin)、长春新碱
Figure BDA00038506382400007111
和泼尼松)，任选地与奥贝努妥珠单抗(obinutuzumab)或利妥昔单抗组合；CVP(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松)，任选地与奥贝努妥珠单抗(obinutuzumab)或利妥昔单抗组合；来那度胺和利妥昔单抗；环磷酰胺；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；和替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetang)
Figure BDA00038506382400007110
当血液系统恶性肿瘤是伯基特淋巴瘤(Burkitts Lymphoma)时，补充剂选自以下中的一种或多种：CODOX-M(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱与鞘内甲氨蝶呤和阿糖胞苷，随后是高剂量全身性甲氨蝶呤)，任选地与利妥昔单抗组合；剂量调节的EPOCH(依托泊苷、泼尼松、长春新碱、环磷酰胺、多柔比星)，任选地与利妥昔单抗组合；高CVAD(hyperCVAD)(环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和地塞米松)，任选地与高剂量甲氨蝶呤和阿糖胞苷组合，任选地与利妥昔单抗组合；RICE(利妥昔单抗、异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷)，任选地与鞘内甲氨蝶呤联合；RIVAC(利妥昔单抗、异环磷酰胺、阿糖胞苷、依托泊苷)，任选地与鞘内甲氨蝶呤和RGDP(利妥昔单抗、吉西他滨、地塞米松、顺铂)组合；以及阿糖胞苷任选地与利妥昔单抗组合。
在一些实施方式中，该正交受体是包含一个或多个STAT3结合基序的正交CD122。
用于本发明的方法的实践的抗-CD19 CAR的例子包括以下构建体：
CD19_28z：构建体，其包含GMCSF受体信号肽、FMC63 scFv、AAA间隔子、CD28铰链和共刺激结构域以及CD3ζ：
Figure BDA0003850638240000721
CD19_4-1bbz：构建体，其包含CD8a受体信号肽、FMC63 scFv、CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB铰链和共刺激结构域和CD3ζ：
Figure BDA0003850638240000722
Figure BDA0003850638240000731
在一个替代性实施方式中，CD19 CAR包含氨基酸序列：
Figure BDA0003850638240000732
在一个替代性实施方式中，CD19 CAR包含氨基酸序列：
Figure BDA0003850638240000733
Figure BDA0003850638240000741
BCMA CAR：
本发明提供了用于治疗患有多发性骨髓瘤的对象的方法和组合物，通过在第一时间段内给予多个表达正交CD122多肽和嵌合抗原受体的工程改造T细胞，其胞外结构域特异性结合至BCMA，并组合给予式1的正交IL2配体，直到对象实现部分或完全缓解(治疗阶段)，并通过给予所述对象维持治疗预防所述肿瘤性疾病的转移，维持治疗包括在至少30天内定期给予式1的正交IL2配体，如果医师认为有必要，任选地至少90天，任选地至少180天或更长。
本发明提供了通过给予表达正交CD122多肽和嵌合抗原受体的多个工程改造的T细胞在患有多发性骨髓瘤的对象中实现严格完全缓解(stringent complete response)的方法和组合物，所述CAR的胞外结构域特异性结合至BCMA，同时组合给予式1的正交IL2配体，随后给予所述对象包括定期给予式1的正交IL2配体的维持治疗。
在上述方法中，用于治疗阶段的正交配体可以与用于维持阶段的正交配体相同或不同。在一些实施方式中，正交配体被修饰以延长半衰期。在一些实施方式中，正交配体是聚乙二醇化的，融合蛋白等。在一个实施方式中，正交配体包含40kD N-末端的PEG部分。
在该方法的一些实施方式中，在第一治疗阶段中正交配体以高于足以提供扩增(例如＞EC10 PRO)但低于足以诱导显著分化(例如＜EC90 ACT)的浓度给药持续一段时间(至少24小时，任选地30、60、90天或更长时间)。在一些实施方式中，维持阶段任选地包括给予足以诱导正交CAR T激活的式1的正交配体，维持血清水平超过激活浓度(例如＞EC50 ACT)至少24小时。
在该方法的一些实施方式中，通过给予包含编码式1的正交IL2配体的核酸的重组病毒或非病毒载体向对象提供正交配体。在该方法的一些实施方式中，肿瘤性疾病选自实体瘤和血液系统恶性肿瘤。在该方法的一些实施方式中。在该方法的一些实施方式中，该方法还包括在治疗阶段和/或维持阶段期间给予一种或多种补充抗肿瘤剂。在该方法的一些实施方式中，治疗阶段和/或维持阶段期间的补充抗肿瘤剂可以相同或不同。在该方法的一些实施方式中，补充肿瘤剂选自化疗剂、小分子、补充生物制剂，包括但不限于检查点抑制剂(抗-PD1、Keytruda、Opdivo)、抗肿瘤抗原抗体(赫赛汀)，和/或物理方法(手术、放射等)。在一些实施方式中，该正交受体是包含一个或多个STAT3结合基序的正交CD122。
在一些实施方式中，用于治疗多发性骨髓瘤的补充剂包括一种或多种选自下组的试剂：沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、地塞米松、硼替佐米、长春新碱、多柔比星、地塞米松、美法仑、卡非佐米(carfilzomib)、环磷酰胺、顺铂、依托泊苷、硼替佐米、泼尼松(prednisone)、达雷木单抗(daratumumab)、卡非佐米和伊沙佐米(ixazomib)。在一些实施方式中，用于治疗多发性骨髓瘤的补充剂包括用于治疗多发性骨髓瘤的化疗剂的组合治疗方案，其包括：西奥替佐米(theortezomib)/来那度胺/地塞米松；硼替佐米/环磷酰胺/地塞米松；硼替佐米/多柔比星/地塞米松；卡非佐米/来那度胺/地塞米松；伊沙佐米(ixazomib)/来那度胺/地塞米松；硼替佐米/地塞米松；硼替佐米/沙利度胺(thalidomide)/地塞米松；来那度胺/地塞米松；地塞米松/沙利度胺/顺铂/多柔比星/环磷酰胺/依托泊苷/硼替佐米(VTD-PACE)；来那度胺/低剂量地塞米松；达雷木单抗/硼替佐米/美法仑/泼尼松；卡非佐米/来那度胺/地塞米松；卡非佐米/环磷酰胺/地塞米松；和伊沙佐米/来那度胺/地塞米松。
本发明提供了通过给予表达正交CD122多肽和嵌合抗原受体(CAR)的多个工程改造的T细胞来治疗患有冒烟型多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma、)的对象的方法和组合物，所述CAR的胞外结构域特异性结合至BCMA，与式1的正交IL2配体组合，随后给予所述对象包括定期给予式1的正交IL2配体的维持治疗。本发明提供了通过给予表达正交CD122多肽和嵌合抗原受体(CAR)的多个工程改造的T细胞来预防患有缓慢进展性多发性骨髓瘤的患者中缓慢进展型多发性骨髓瘤进展为多发性骨髓瘤方法和组合物，所述CAR的胞外结构域特异性结合至BCMA，并且同时组合给予式1的正交IL2配体，通过给予所述对象包括定期给予式1的正交IL2配体的维持治疗，以预防所述对象的所述肿瘤性疾病由冒烟型多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma)进展为多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，CAR的ABD特异性结合至BCMA。该方法进一步包括在治疗阶段和/或维持阶段给予对象一种或多种补充抗肿瘤剂，所述补充剂可用于治疗多发性骨髓瘤，其包括一种或多种选自下组的试剂：沙利度胺、来那度胺、地塞米松、硼替佐米、长春新碱、多柔比星、地塞米松、美法仑、卡非佐米、环磷酰胺、顺铂、依托泊苷、硼替佐米、泼尼松、达雷木单抗、卡非佐米和伊沙佐米(ixazomib)，或用于治疗多发性骨髓瘤的化疗剂的组合治疗方案，包括：硼替佐米/来那度胺/地塞米松；硼替佐米/环磷酰胺/地塞米松；硼替佐米/多柔比星/地塞米松；卡非佐米/来那度胺/地塞米松；伊沙佐米(ixazomib)/来那度胺/地塞米松；硼替佐米/地塞米松；硼替佐米/沙利度胺/地塞米松；来那度胺/地塞米松；地塞米松/沙利度胺/顺铂/多柔比星/环磷酰胺/依托泊苷/硼替佐米(VTD-PACE)；来那度胺/低剂量地塞米松；达雷木单抗/硼替佐米/美法仑/泼尼松；卡非佐米/来那度胺/地塞米松；卡非佐米/环磷酰胺/地塞米松；和伊沙佐米(ixazomib)/来那度胺/地塞米松。
用于本发明的实践的抗-BCMA CAR的例子包括以下构建体：
BCMA4_41bbz CAR：构建体，其包含CD8a受体信号肽、BCMA4 scFv、CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB铰链和共刺激结构域和CD3ζ，
Figure BDA0003850638240000771
其可以使用T2a接头与正交CD122(ortho CD122)受体共表达，其具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0003850638240000772
Figure BDA0003850638240000781
GSI5021_41bbz CAR：
Figure BDA0003850638240000782
Figure BDA0003850638240000791
其可以使用T2a接头与正交CD122(ortho CD122)受体共表达，其具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0003850638240000792
Figure BDA0003850638240000801
B2121 BCMA_41bbz)CAR
Figure BDA0003850638240000802
其可以使用T2a接头与正交CD122(ortho CD122)受体共表达，其具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0003850638240000803
Figure BDA0003850638240000811
BMCA10_41bbz CAR
Figure BDA0003850638240000812
Figure BDA0003850638240000821
其可以使用T2a接头与正交CD122(ortho CD122)受体共表达，其具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0003850638240000822
Figure BDA0003850638240000831
GD2 CAR
本发明提供了通过给予表达正交CD122多肽和嵌合抗原受体(CAR)的多个工程改造的T细胞来治疗患有神经外胚层起源的肿瘤性疾病(包括人成神经细胞瘤和黑色素瘤)或高风险骨肉瘤的对象的方法和组合物，所述CAR的胞外结构域特异性结合至GD2，并且同时组合给予式1的正交IL2配体，随后给予所述对象包括定期给予式1的正交IL2配体的维持治疗。本发明提供了用于预防神经外胚层起源的肿瘤性疾病(包括人成神经细胞瘤和黑色素瘤)的转移或复发的方法和组合物，其通过：给予表达正交CD122多肽和嵌合抗原受体(CAR)的多个工程改造的T细胞，所述CAR的胞外结构域特异性结合至BCMA，并且同时组合给予式1的正交IL2配体，以及通过给予所述对象包括定期给予式1的正交IL2配体的维持治疗，以预防所述肿瘤性疾病由冒烟型多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma)进展为多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，CAR的胞外结构域特异性结合至GD2.在一些实施方式中，CAR的ABD包含特异性结合GD2的抗体，其包含CDR或抗体3F8、hu14.18、14G2a中的一种或多种，任选地共同给予化疗剂，包括顺铂、多柔比星、环磷酰胺和表鬼臼毒素(epipodophyllotoxins)，例如替尼泊苷和依托泊苷。
用于前列腺癌的PSMA CAR
前列腺癌是全球男性中第二常见的恶性肿瘤，据估计每年有110万新发病例。前列腺癌与307,000例死亡有关，使其成为癌症死亡的第五大原因。尽管局部原发性肿瘤可以通过手术或局部放射疗法成功治疗，但这些方法不能为疾病的晚期状态提供令人满意的结果。
前列腺特异性膜抗原(PSMA)被认为是抗原重定向免疫治疗的理想靶标，因为它在所有肿瘤阶段都在前列腺癌细胞表面表达，特别是在更严重的雄激素非依赖性和转移性疾病的阶段中表达增加。文献中描述了多种靶向PSM的抗体，这些抗体可以被修饰用于CAR的情况，包括但不限于J591、3D8、D2B和3/F11。
许多靶向PSMA的CAR T细胞正在临床开发中(参见例如NCT01140373、NCT01929239和NCT03089203)。然而，这些PSMA CAR T细胞的溶瘤效力仍不确定。具体来说，由于PSMACAR T细胞缺乏持久性，使用3D8或J591scFv ABD的表达第一代CAR的工程改造T细胞显示出低效力。尽管第二代和第三代CAR已在前列腺癌治疗中进行了尝试，但它们的成功率仍然很低，并且需要高剂量的CAR T或多次CAR T输注。Alzubi，等(2020)Molecular TherapyOncolytics 18：226-235。
如前所述，本发明的组合物和方法提供了克服在常规CAR治疗中观察到并归因于PSMA CAR在临床实践中缺乏功效的持久性缺乏的能力。本公开的方法和组合物使临床医生能够将CAR维持在活性状态一段延长的时间，从而使得能够比常规的CAR T细胞疗法实现更大的暴露(“曲线下面积”或AUC)，并且因此提供了用于治疗先前对CAR T疗法有抗性的癌症的手段，特别是需要长时间暴露于CAR以进行有效治疗并实现外渗和渗透到实体肿瘤环境中的实体瘤。常规的非正交CAR T细胞无法在没有过度毒性或多次给药CAR T细胞的情况下提供所需的暴露持续时间。
本发明提供了一种治疗前列腺癌、任选地预防复发或复现的方法，该方法包括给予治疗有效量的正交PSMA CAR T细胞与式1的正交配体的组合。
在一些实施方式中，本发明提供正交PSMA CAR T细胞。包含PSMA CAR，是PSMA_28z：抗-PSMA CAR，其包含CD8a信号肽、去免疫化J591scFv、AAA间隔子、CD28铰链/跨膜/共刺激结构域和CD3ζ：
Figure BDA0003850638240000841
Figure BDA0003850638240000851
其可以使用T2a接头与正交CD122(ortho CD122)受体共表达，其具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0003850638240000852
Figure BDA0003850638240000861
在一些实施方式中，PSMA CAR是PSMA_4-1BBz：去免疫化J591scfv；CD8a信号肽，CD8铰链和跨膜结构域以及4-1bb共刺激结构域和CD3z：
Figure BDA0003850638240000862
其可以使用T2a接头与正交CD122受体共表达，其具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0003850638240000871
GPC3 CAR
在一些实施方式中，本发明提供正交GPC3 CAR T细胞。在一些实施方式中，本发明的方法和组合物可用于治疗表达GPC3的癌症，包括但不限于肝癌。肝细胞癌(HCC)是全球癌症死亡的第二大原因。磷脂酰肌醇聚糖-3(Glypican-3)是细胞表面糖蛋白，在HCC组织中过表达，但在健康成人肝脏中不表达，因此为CAR的ABD提供了有用的靶向域。多种GPC靶向结构域可用于构建CAR，CAR可被纳入正交细胞中以与式1的IL2直向同源物组合用于治疗肝癌。可用于制备正交GPC3 CAR T细胞的GPC3 CAR的例子包括但不限于具有以下氨基酸序列的CAR GPC3_28z：
Figure BDA0003850638240000881
和具有以下氨基酸序列的GPC3_4-1BB：
Figure BDA0003850638240000882
Figure BDA0003850638240000891
在一些实施方式中，本发明提供了用于治疗HPV相关肿瘤的正交正交HPV-16E6TCR细胞。可以纳入本发明的正交细胞中的HPV-16E6 CAR的例子包括但不限于具有以下序列的CAR：
Figure BDA0003850638240000892
或：
Figure BDA0003850638240000893
Figure BDA0003850638240000901
用于成神经细胞瘤的GD2 CAR
GD2在几乎所有的成神经细胞瘤、大多数黑色素瘤和成视网膜细胞瘤、许多尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)中高度表达，以及，在不同程度上，在小细胞肺癌、神经胶质瘤、骨肉瘤(osteosarcoma)和软组织肉瘤中高度表达。因此，GD2被鉴定为CAR T细胞治疗的靶标，并且多种GD2 CAR在本领域中是已知的。然而，持久性仍然是治疗表达GD2的肿瘤的一个问题。因此，通过给予正交配体来延长正交免疫细胞的作用持续时间的能力将在GD2细胞疗法的开发中具有显著的益处。在一些实施方式中，本发明提供了一种靶向正交GD2(orthoGD2)的免疫细胞。在一个实施方式中，正交GD2免疫细胞的靶向结构域，例如，正交GD2 CAR-T细胞，包含具有以下氨基酸序列的14g2a scFv：
Figure BDA0003850638240000902
Figure BDA0003850638240000911
将细胞制成同质性更高的细胞产品：
本公开提供了制备包含工程改造的免疫细胞物质的细胞产品的方法，其中工程改造的细胞免疫物质是已经被重组修饰以表达包含正交CD122多肽的胞外结构域的受体的免疫细胞，并且其中所述细胞产品占工程改造免疫细胞的至少40％、或者至少50％、或者至少60％、或者至少70％、或者至少80％、或者至少90％，该方法包括培养获得免疫细胞群，在工程改造细胞产品的混合细胞群中反式选择性扩增表达正交CD122受体的工程改造的免疫细胞。目前，阻碍过继细胞疗法，特别是CAR-T疗法成功的最重要障碍是由于工程改造细胞CART细胞的持久性差导致的疾病复发率高。
该分子的选择性使得能够离体使用正交配体来选择性地增殖混合细胞群中的工程改造的细胞。因此，本文所述的技术可用于制备显著富集治疗性细胞的细胞治疗产品。在没有分选的情况下用IL2进行的常规非特异性离体刺激导致用于给予患者的细胞群仅提供相对较小部分(10％-20％)的所需TIL或CAR细胞。正交IL2可用于在CAR的制备阶段选择性激活，从而能够产生具有显著更高百分比的离体治疗性hoCAR或hoTIL的细胞产品。这些更同质的细胞产品可用于治疗肿瘤性疾病，从而产生更大的功效和更低的毒性。
在一些实施方式中本发明提供一种治疗对象所患有的疾病、紊乱或病症的方法，通过给予所述对象：
a.工程改造的哺乳动物细胞，其包括编码含有正交hCD122的胞外结构域(ECD)的跨膜受体分子的核酸序列，该核酸序列操作性地连接至一个或多个能够作用于所述跨膜受体分子的ECD的表达和表面呈递的表达控制元件；和
b.给予所述患者治疗有效剂量的式#1所述的hIL2直向同源物。在一些实施方式中本发明提供了一种制备工程改造的T细胞产品的方法，所述T细胞产品包括至少20％的hoCD122 T细胞，所述方法包括步骤：
a.从哺乳动物对象分离T细胞群；
b.将所述离体分离的T细胞群与重组载体接触，所述重组载体包括编码hoCD122的核酸序列，其操作性地连接至一个或多个表达控制序列，使得在允许所述重组载体被T细胞摄取的情况下，促进在哺乳动物T细胞中的表达；
c.将所述分离的T细胞群接触有效量的如权利要求1所述的hIL2直向同源物。
在一些实施方式中本发明提供了至少20％工程改造的hoCD122 T细胞的细胞群。
本发明进一步提供了制备本发明的hIL2直向同源物的方法。特别地，本发明提供重组表达载体，其包含编码操作性地连接至控制元件的hIL2直向同源物的核酸序列，以在宿主细胞中提供编码hIL2直向同源物的核酸序列的表达。
本发明进一步提供了包含混合细胞群的组合物，其包含至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％的T细胞(例如T细胞、CD8+ T细胞、Treg、TIL、NK细胞、TCR修饰的细胞、CAR-T细胞等)，其中T细胞已经被重组修饰以表达正交hCD122受体多肽。本发明还提供了产生工程改造的细胞治疗产品的药学上可接受的剂型的方法，所述剂型包含T细胞群，其中所述T细胞群是基本上富集了一种或多种工程改造T细胞种类的，所述工程改造的T细胞表达包含hCD122正交多肽的胞外结构域的受体，所述方法包括在本发明的hIL2直向同源物的存在下，离体培养所述包含表达含有hCD122正交多肽的胞外结构域的受体的工程改造的T细胞的T细胞群，持续足以富集一种或多种此类工程改造的T细胞的细胞群的时间。
在一些实施方式中，本发明提供了重组载体，其包含编码操作性地连接至控制元件的本文所述的hIL2直向同源物的核酸序列，以促进hIL2直向同源物从哺乳动物细胞的表达和分泌，给予对象以提供hIL2直向同源物的原位表达。在一些实施方式中，重组载体被瘤内给予患癌对象。在一些实施方式中，重组载体是重组病毒载体。在一些实施方式中重组病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)或重组腺病毒(rAd)，例如，在一些实施方式中，源自人腺病毒血清型3和/或5的复制缺陷的腺病毒。在一些实施方式中，复制缺陷的腺病毒具有一个或多个对E1区的修饰，这干扰病毒启动细胞循环和/或凋亡途径的能力。复制缺陷的腺病毒载体可以任选地在E3结构域中包含缺失。在一些实施方式中，腺病毒是复制能力型腺病毒。在一些实施方式中腺病毒是复制能力型重组病毒，其被工程改造为选择性地在肿瘤细胞中复制。
IL2直向同源物
命名法：
本发明提供IL2受体多肽变体的多个多肽配体。本文使用以下命名法以表示取代、缺失或插入。在本文中残基可以用野生型分子中发现的天然存在氨基酸的一字母或三字母氨基酸代码指定，但后接成熟IL2分子的IL2氨基酸位置，例如“Cys125”或“C125”是指野生型hIL2分子的第125位的半胱氨酸残基。对于IL2直向同源物，本文指定取代是通过一字母氨基酸代码后接IL2的氨基酸位置，后接取代的一字母氨基酸代码。例如，具有“K35A”修饰的IL2直向同源物是指野生型IL2序列的第35位的赖氨酸(K)残基在该位置被丙氨酸(A)残基取代。氨基酸残基的缺失被称为“des”，后接氨基酸残基及其在SEQ ID NO：4中的位置。例如术语“des-Ala1”或“desA1”是指野生型IL2序列的多肽的第1位的丙氨酸缺失。类似地，对于正交CD122中的氨基酸取代，本文指定氨基酸取代是通过天然存在的氨基酸的一字母氨基酸代码，后接其在野生型IL2序列中的位置编号，后接在该位置的取代的氨基酸的一字母氨基酸代码。例如，具有在第134位用苯丙氨酸取代酪氨酸残基的hCD122直向同源物，该取代被缩写为“Y134F”。
直向同源物(针对包含正交CD122 ECD的受体的同源配体)：在一些实施方式中，本发明提供IL2直向同源物的使用方法，IL2直向同源物为包含正交CD122 ECD的受体的同源配体。在一些实施方式中，IL2直向同源物是正交CD122的配体，所述正交CD122的ICD包含一个或多个STAT3结合基序。在一些实施方式中，术语IL2直向同源物指的是hIL2变体，其为包含H133和/或Y134位的氨基酸取代的人CD122的胞外结构域的受体的配体，所述受体的ICD任选地包含一个或多个STAT3结合基序。在一些实施方式中，IL2直向同源物是指包含H133和/或Y134位的氨基酸取代的人CD122的胞外结构域的受体的同源配体。在一些实施方式中，IL2直向同源物是指包含H133和/或Y134位的氨基酸取代的人CD122的胞外结构域的受体的配体，所述受体的ICD包含一个或多个STAT3结合基序。在一些实施方式中，IL2直向同源物是指包含H133和Y134位的氨基酸取代的正交人CD122的配体。在一些实施方式中，IL2直向同源物是指包含氨基酸取代H133D和Y134F的正交CD122的配体。在一些实施方式中，本发明的直向同源物为hIL2直向同源物，其为包含H133位和Y134位的氨基酸取代的hCD122分子的胞外结构域的受体的同源配体，所述受体的ICD包含一个或多个STAT3结合基序。
在一些实施方式中，本发明的直向同源物是hIL2直向同源物，其为包含H133位的氨基酸取代的hCD122分子的胞外结构域的受体的同源配体。在一些实施方式中，本发明的直向同源物为hIL2直向同源物，其为包含H133位的氨基酸取代的hCD122分子的胞外结构域的受体的同源配体，所述受体的ICD包含一个或多个STAT3结合基序。在一些实施方式中，本发明的直向同源物是hIL2直向同源物，其为包含H133D位的氨基酸取代的hCD122分子的胞外结构域的受体的同源配体。在一些实施方式中，本发明的直向同源物为hIL2直向同源物，其为包含H133D位的氨基酸取代的hCD122分子的胞外结构域的受体的同源配体，所述受体的ICD包含一个或多个STAT3结合基序。在一些实施方式中，本发明的直向同源物是hIL2直向同源物，其为包含含有Y134位的氨基酸取代的hCD122分子的胞外结构域的受体的同源配体。在一些实施方式中，本发明的直向同源物为hIL2直向同源物，其为包含含有Y134位的氨基酸取代的hCD122分子的胞外结构域的受体的同源配体，所述受体的ICD包含一个或多个STAT3结合基序。在一些实施方式中，本发明的直向同源物是hIL2直向同源物，其为包含含有Y134F位的氨基酸取代的hCD122分子的胞外结构域的受体的同源配体。在一些实施方式中，本发明的直向同源物为hIL2直向同源物，其为包含含有Y134F位氨基酸取代的hCD122分子的胞外结构域的受体的同源配体，所述受体的ICD包含一个或多个STAT3结合基序。
在一些实施方式中，本发明的直向同源物为hIL2直向同源物，其为包含含有Y134位的氨基酸取代的hCD122分子的胞外结构域的受体的同源配体，所述受体的ICD包含一个或多个STAT3结合基序。在一些实施方式中，本发明的直向同源物是hIL2直向同源物，其为包含氨基酸取代H133D和Y134F的正交人CD122的胞外结构域的受体的同源配体。在一些实施方式中，本发明的直向同源物是hIL2直向同源物，其为包含氨基酸取代H133D和Y134F的正交人CD122的同源配体。
IL2直向同源物(式#1)：在一个实施方式中，本发明提供了hIL2直向同源物，其氨基酸序列与式#1的多肽具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性：
Figure BDA0003850638240000951
其中：
AA1是A(野生型)或缺失；
AA2是P(野生型)或缺失；
AA3是T(野生型)、C、A、G、Q、E、N、D、R、K、P或缺失；
AA4是S(野生型)或缺失；
AA5是S(野生型)或缺失；
AA6是S(野生型)或缺失；
AA7是T(野生型)或缺失；
AA8是K(野生型)或缺失；
AA9是K(野生型)或缺失；
AA13是Q(野生型)、W或缺失；
AA14是L(野生型)、M、W或缺失；
AA15是E(野生型)、K、D、T、A、S、Q、H或缺失；
AA16是H(野生型)、N或Q或缺失；
AA18是L(野生型)或R、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、D或T；
AA19是L(野生型)、A、V、I或缺失；；
AA20是D(野生型)、T、SML或缺失；；
AA22是Q(野生型)或F、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T、F或缺失；
AA23是M(野生型)、A、W、H、Y、F、Q、S、V、L、T或缺失；
AA27是G(野生型)、K、S或缺失；
AA38是R(野生型)、W或G；
AA39是M(野生型)、L或V；
AA42是F(野生型)或K；
AA51是T(野生型)、I或缺失
AA55是H(野生型)或Y；
AA74是Q(野生型)、N、H、S；
AA80是L(野生型)、F或V；
AA81是R(野生型)、I、D、Y、T或缺失
AA85是L(野生型)或V；
AA88是N(野生型)、E或Q或缺失；
AA86是I(野生型)或V；
AA89是I(野生型)或V；
AA91是V(野生型)、R或K；
AA92是I(野生型)或F；
AA97是K(野生型)或Q；
AA104是M(野生型)或A；
AA109是D(野生型)、C或具有激活的侧链的非天然氨基酸；
AA113是T(野生型)或N；
AA125是C(野生型)、A或S；
AA126是Q(野生型)或H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T；
和/或
AA130是S(野生型)、T或R。
在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]
[H16N，L19V，D20N，Q22T，M23H，G27K]；
[E15D，H16N，L19V，D20L，Q22T，M23H]；
[E15D，H16N，L19V，D20L，Q22T，M23A]，
[E15D，H16N，L19V，D20L，Q22K，M23A]；
[E15S；H16Q；L19V，D20T；Q22K，M23L]；
[E15S；H16Q；L19V，D20T；Q22K，M23S]；
[E15S；H16Q；L19V，D20S；Q22K，M23S]；
[E15S；H16Q；L19I，D20S；Q22K；M23L]；
[E15S；L19V；D20M；Q22K；M23S]；
[E15T；H16Q；L19V；D20S；M23S]；
[E15Q；L19V；D20M；Q22K；M23S]；
[E15Q；H16Q；L19V；D20T；Q22K；M23V]；
[E15H；H16Q；L19I；D20S；Q22K；M23L]；
[E15H；H16Q；L19I；D20L；Q22K；M23T]；或
[L19V；D20M；Q22N；M23S]。
Cys125：在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物以促进细菌细胞中的重组表达，通过消除125位处的未配对半胱氨酸残基和/或消除直接表达的IL2多肽的N-末端Met以及通过内源细菌蛋白酶翻译后加工消除1位处的丙氨酸。当氨基酸丢失时，它被称为“des”。在一些实施方式中，125位处的半胱氨酸被取代为丙氨酸或丝氨酸(C125A或C125S)。当在细菌中重组表达和从包涵体中分离时，这种突变通常用于避免蛋白的错误折叠。
在一些实施方式中，该IL2直向同源物或本发明包含以下氨基酸修饰组之一：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；或
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L]。
增加CD122亲和力的突变
在一些实施方式中，hIL2直向同源物在hIL2序列的位置中包含一个或多个突变，其或接触hCD122或改变接触CD122的其他位置的取向，导致IL2直向同源物具有对于CD122的增加的亲和力。被鉴定为参与IL2结合至CD122的IL2残基包括L12、Q13、H16、L19、D20、M23、Q74、L80、R81、D84、L85、I86、S87、N88、189V91、I92和E95。在一些实施方式中，IL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：Q74N、Q74H、Q74S、L80F、L80V、R81D、R81T、L85V、I86V、I89V和/或I92F或其组合。在一些实施方式中，IL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方式中，IL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：N74Q、L80F、R81D、L85V、I86V、189V和192F。在一些实施方式中，IL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：Q74N、L80V、R81T、L85V、186V和I92F。在一些实施方式中，IL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V和192F。在一些实施方式中，IL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方式中，IL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方式中，IL2直向同源物包含一个或多个氨基酸取代：Q74S、R81T、L85V和I92F。在一些实施方式中，IL2直向同源物包含[L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]。在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物，其包含以下几组氨基酸修饰之一：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23AL80F-R81D-L85V-I86V-I92F]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]；或
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]。
在一些实施方式中，直向同源物包含被鉴定为增加IL2对CD122亲和力的取代L85V。在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126M]；或
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126M]。
调节CD25亲和力的修饰
在一些实施方式中，IL2直向同源物在IL2序列的位置中包含一个或多个突变，其或接触CD25或改变接触CD25的其他位置的取向，导致正交IL2对于CD25的亲和力减少。突变可以是位于或靠近已知非常接近CD25的区域，基于发表的晶体结构(Wang，等Science 310：11592005)。据信接触CD25的IL2残基包括K35、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、K64、P65、E68、V69、L72和Y107。在一些实施方式中，本发明的IL2直向同源物包含一个或多个点突变：R38A、F41A和F42A(Suave等(1991)PNAS(USA)88：4636-4640)；P65L(Chen等CellDeath and Disease(2018)9：989)；F42A/G/S/T/Q/E/N/R/K，Y45A/G/S/T/Q/E/N/D/R/K/和/或L72G/A/S/T/Q/E/N/D/R/K(Ast，等美国专利申请公开2012/0244112A1，公开于2012年9月27日；美国专利号9266938B2，授权于2016年2月23日)。取代的特定组合已经被鉴定为减少对CD25的结合。在一些实施方式中，本发明的IL2直向同源物包含一个或多个下组取代：[R38A-F42A-Y45A-E62A]，描述于Carmenate，等(2013)J Immunol 190：6230-6238；[F42A-Y45A-L72G](Roche RG7461(RO6874281)；和/或[T41P-T51P](Chang，等(1995)MolecularPharmacology 47：206-211)。在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126M]；或
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126M]。
调节CD132亲和力的修饰
在本发明的一些实施方式中，IL2直向同源物在IL2序列的位置中包含一个或多个突变，其或接触CD132或改变接触CD132的其他位置的取向，导致对CD132的结合改变。示例性IL2直向同源物在IL2序列的位置中包含一个或多个突变，其或接触CD132或改变接触CD122的其他位置的取向，导致对CD132的结合改变。据信接触CD132的IL2残基包括Q11、L18、Q22、E110、N119、T123、Q126、S127、I129、S130和T133。在一些实施方式中，IL2包含修饰，在L18 AA18为L(野生型)或R、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、D或T；AA126为Q(野生型)或H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T；和/或AA22为Q(野生型)或F、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T或F。
在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M]；
[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L85V-Q126H]；或
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126M]。
当在细菌表达系统中重组生产时，在没有前导序列的情况下，内源性蛋白酶导致N-末端Met-Ala1残基缺失，以提供“desAla1”IL2直向同源物。在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A-Q126H]；
[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A-Q126H]；
[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A-Q126H]；
[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S-Q126H]；
[desA1a1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S-Q126M]；或
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S-Q126M]。
保守氨基酸取代
除了前述有助于IL直向同源物对CD122正交受体的活性和选择性的修饰之外，IL2直向同源物可以包含对其一级结构的一个或多个修饰，提供对活性IL2的最小影响。在一些实施方式中，本发明的IL2直向同源物可以进一步包含在野生型IL-2氨基酸序列中的一个更保守的氨基酸取代。这种保守取代包括那些由Dayhoff描述于《蛋白质序列和结构图册5》(The Atlas of Protein Sequence and Structure 5)(1978)，以及由Argos描述于EMBOJ.，8：779-785(1989)。通常根据表XXX中示出的以下表格进行保守取代。
Figure BDA0003850638240001041
通过选择比表3中示出的那些更不保守的氨基酸取代，可以进行功能或免疫学特性中的实质性改变。例如，可以进行更显著地影响多肽骨架结构或破坏二级或三级元件的取代，包括用大电荷的大侧链(天冬酰胺)取代具有小的无电荷侧链的氨基酸(例如甘氨酸)。特别是那些参与与CD25、CD122和/或CD123的一个或多个相互作用的IL2残基的取代，这可以从IL2与其描述的受体相缔合的晶体结构中看出
除了前述有助于IL2直向同源物对CD122直向同源受体的活性和选择性的修饰之外，正交IL2可以包含对其一级结构的一个或多个修饰。如上文提供的对一级结构的修饰可以任选地进一步包括不实质性降低IL2直向同源物的IL2活性的修饰，包括但不限于修饰：N30E；K32E；N33D；P34G；T37I、M39Q、F42Y、F44Y、P47G、T51I、E52K、L53N、Q57E、M104A(参见美国专利号5,206,344)。
去除糖基化位点
本发明的IL2直向同源物可以包含消除Thr3位的O-糖基化位点的修饰，以在哺乳动物细胞(例如CHO或HEK细胞)中表达IL2直向同源物时促进非糖基化IL2直向同源物的产生。因此，在某些实施方式中IL2直向同源物包含消除IL-2的对应于人IL-2的残基3位置的O-糖基化位点的修饰。在一些实施方式中所述消除IL-2的对应于人IL-2的残基3位置的O-糖基化位点的修饰是氨基酸修饰。示例性的氨基酸取代包括T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K和T3P，其去除位置3处的糖基化位点而没有消除生物学活性(参见美国专利号5,116,943；Weiger等，(1989)Eur.J.Biochem.，180：295-300)。在特定的实施方式中，所述修饰是氨基酸取代T3A。在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；或
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L]。
IL2直向同源物可以包含头两个氨基酸的缺失(desAla1-desPro2)，以及用半胱氨酸残基取代Thr3糖基化以促进选择性N-末端修饰，特别是半胱氨酸的巯基基团的聚乙二醇化(参见，例如，Katre，等美国专利号5,206,344，授权于1993年4月27日)。在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[desAla1-desPro2-T3C E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[desAla1-desPro2-T3C E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；或
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L]。
氧化稳定化的M104A：
本文公开的IL2直向同源物可以任选地进一步包含M104位处的修饰，在一个实施方式中用丙氨酸残基取代甲硫氨酸104(M104A)以提供更抗氧化的直向同源物(参见Koths，等，美国专利4,752,585，1988年6月21日授权)。
N末端缺失：
当在细菌表达系统中重组生产时，在没有前导序列的情况下，内源性蛋白酶导致N-末端Met-Ala1残基缺失，以提供“desAla1”IL2直向同源物。IL2直向同源物可以包含头两个氨基酸的缺失(desAla1-desPro2)，以及用半胱氨酸残基(T3C)取代Thr3糖基化以促进N-末端修饰，特别是半胱氨酸的巯基基团的聚乙二醇化(参见，例如，Katre，等美国专利号5,206,344，授权于1993年4月27日)。
IL2直向同源物可以进一步包含消除在1-9位的一个或多个N-末端氨基酸，或1-8位、或1-7位、或1-6位、或1-5位、或1-4位、或1-3位、或1-2位。在一些实施方式中，本发明提供hIL2直向同源物，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[desAla1-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[desAla1-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L]；
[desAla1-desPro2-desThr3-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-desPro2-desThr3-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-desPro2-desThr3-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[desAla1-desPro2-desThr3-E15S-H16Q-L19V-D20L]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAlal-desPro2-desThr3-desSer4-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-E15S-H16Q-L19V-D20L]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSef4-desSer5-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-E15S-H16Q-L19V-D20L]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-desSer6-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-desSer6-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-desSer6-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；或
[desAla1-desPro2-desThr3-desSer4-desSer5-desSer6-E15S-H16Q-L19V-D20L]。
最小化血管渗漏综合征的修饰
在本发明的一些实施方式中，IL2直向同源物包含氨基酸取代以避免血管渗漏综合征，血管渗漏综合征是在人中使用IL2疗法的实质性负面和剂量限制性的副作用，而不会出现效力上的实质性损失。参见，Epstein，等，美国专利号7,514,073B2，2009年4月7日授权。本发明的IL2直向同源物中包含的这种修饰的例子包括一个或多个R38W、R38G、R39L、R39V、F42K和H55Y。
亲和力成熟：
在一些实施方式中，IL2直向同源物可经亲和成熟以增强其对正交CD122的活性。“亲和成熟的”多肽是在一个或多个残基上具有一个或多个改变的多肽，与不拥有这些一个或多个改变的亲本多肽相比，这导致正交多肽对同源正交受体的亲和力改进，或反之亦然。与“亲本”多肽相比，可进行亲和成熟增加IL2直向同源物的结合亲和力至少约10％、或至少约50％、或至少约100％、或至少约150％、或1-5倍。在合适的试验条件下使用足够量的分子通过ELISA和/或FACS分析评估时，本发明的工程改造的IL2直向同源物激活其同源正交受体，如上所述，但显著减少对野生型IL2受体的结合和激活。
延长体内作用时间的修饰
如上所述，本发明的组合物包括已经被修饰以提供用于延长体内寿命和/或延长在对象中的作用时间的IL2直向同源物。这种提供延长的寿命和/或作用时间的修饰包括对IL2直向同源物一级序列的修饰、偶联至运载体分子(例如白蛋白、酰化、PEG化)和Fc融合体。
延长体内作用时间的序列修饰
如上所述，术语IL2直向同源物包括IL2直向同源物的修饰，以提供用于延长体内寿命和/或延长在对象中的作用时间。
在一些实施方式中，IL2直向同源物可以包含某些氨基酸取代，其导致延长体内寿命。例如，Dakshinamurthi，等(Intemational Journal of Bioinformatics Research(2009)1(2)：4-13)描述在IL2多肽中一个或多个取代V91R、K97E和T113N将产生拥有增强的稳定性和活性的IL2变体。在一些实施方式中，本发明的IL2直向同源物包含一个、两个或全部三个V91R、K97E和T113N修饰。
偶联物和运载体分子
在一些实施方式中IL2直向同源物被修饰，为IL2直向同源物提供某些特性(例如延长的对象中作用时间)，这可以通过偶联至运载体分子以提供所需的药理学特性，例如延长半衰期来实现。在一些实施方式中，IL2直向同源物可以共价地连接至IgG的Fc结构域、白蛋白或其他分子以延长其半衰期，例如，通过本领域已知的聚乙二醇化、糖基化、脂肪酸酰化等。
白蛋白融合
在一些实施方式中，IL2直向同源物被表达为与白蛋白分子(例如人血清白蛋白)的融合蛋白质，其在本领域中是已知的，以促进延长体内暴露。
在本发明的实施方式中，hIL2直向同源物被偶联至白蛋白，在本文中称为“IL2直向同源物白蛋白融合体”。在hIL2直向同源物白蛋白融合体的上下文中使用术语“白蛋白”时，包含白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、食蟹猴血清白蛋白(cyno serum albumin)和牛血清白蛋白(BSA)。在一些实施方式中，相对于野生型HSA序列，该HSA包含C34S或K573P氨基酸取代。根据本发明，白蛋白可以被偶联至hIL2直向同源物，在羧基末端、氨基末端、羧基及氨基末端和内部(参见，例如，USP 5,876,969和USP 7,056,701)。在本公开所预期的HSA-hIL2直向同源物多肽偶联物中，可以使用多种形式的白蛋白，例如白蛋白分泌前序列(albumin secretion pre-sequence)及其变体、其片段和变体和HSA变体。这种形式通常具有一种或多种所需的白蛋白活性。在其他实施方式中，本发明涉及包含hIL2直向同源物多肽直接或间接融合至白蛋白、白蛋白片段和白蛋白变体等的融合蛋白，其中融合蛋白比未融合的药物分子具有更高的血浆稳定性和/或融合蛋白保留了未融合药物分子的治疗活性。在一些实施方式中，直接融合是通过接头实现的，例如肽接头或其修饰的形式，如下文更充分地讨论的。
或者，hIL2直向同源物白蛋白融合体包含IL2直向同源物，其为包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和IL2直向同源物多肽的融合蛋白。如上所述，包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和hIL2直向同源物多肽的融合蛋白能够，例如，通过遗传操作实现，使得编码HSA的核酸或其片段被接合至编码一种或多种IL2直向同源物序列的核酸。在一些实施方式中，白蛋白结合肽包括氨基酸序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO：7)。
IL2直向同源物多肽还可以偶联至大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质；多糖，例如琼脂糖(sepharose)、琼脂糖(agarose)、纤维素或纤维素珠；聚氨基酸，例如聚谷氨酸或聚赖氨酸；氨基酸共聚物；灭活的病毒颗粒；灭活的细菌毒素，例如来自白喉、破伤风、霍乱的类毒素或白细胞毒素分子；灭活的细菌、树突细胞、甲状腺球蛋白；破伤风类毒素；白喉类毒素；聚氨基酸例如聚(D-赖氨酸：D-谷氨酸)；轮状病毒VP6多肽；流感病毒血蓝蛋白(hemaglutinin)、流感病毒核蛋白；钥孔戚血蓝素(Keyhole Limpet Hemocyanin)(KLH)；和乙肝病毒核心蛋白和表面抗原，如果需要，这种偶联形式可用于产生针对本公开的多肽的抗体。
在一些实施方式中，IL2直向同源物与XTEN偶联(通过化学方式或以融合蛋白形式)，其提供了延伸的类似于聚乙二醇化的延长的持续时间，可在大肠杆菌中以重组融合蛋白形式生产。适合与本发明的IL2直向同源物偶联的XTEN聚合物提供于Podust，等(2016)“通过XTEN蛋白聚合物延长生物活性分子的体内半衰期(Extension of in vivo half-life of biologically active molecules by XTEN protein polymers)”，J ControlledRelease 240：52-66和Haeckel等(2016)“XTEN作为PEG化的生物学替代方案，允许完全表达基于蛋白酶可激活的杀伤性细胞抑制剂(XTEN as Biological Alternative toPEGylation Allows Complete Expression of a Protease-Activatable Killin-BasedCytostatic)”PLOS ONE|DOI：10.1371/journal.pone.0157193，2016年6月13日。XTEN聚合物融合蛋白可以在XTEN多肽和IL2直向同源物之间纳入蛋白酶敏感裂解位点，例如MMP-2裂解位点。
其他用于偶联的候选组分和分子包括其他适于分离或纯化的组分和分子。特定的非限制性例子包括结合分子，例如生物素(生物素-亲和素特异性结合对)、抗体、受体、配体、凝集素或包含固体支持物(包括，例如塑料或聚苯乙烯珠、板或珠、磁珠、测试条和膜)的分子。
在一些实施方式中，IL-2突变蛋白还可以被连接至其他治疗剂，包括治疗性化合物，例如抗炎化合物或抗肿瘤剂、治疗性抗体(例如赫赛汀)、免疫检查点调节剂、免疫检查点抑制剂(例如抗-PD1抗体)、癌症疫苗，如本文他处所述。抗微生物剂包括氨基糖苷类(包括庆大霉素)，抗病毒化合物，例如利福平(rifampicin)、3′-叠氮-3′-脱氧胸苷(AZT)和阿昔洛韦(acyclovir)，抗真菌剂，例如唑类，包括氟康唑(fluconazole)、大环内酯类(plyremacrolide)，例如两性霉素B和杀念菌素(candicidin)，抗寄生生物化合物，例如含锑剂(antimonial)等。IL2直向同源物可以被偶联至其他细胞因子如CSF、GSF、GMCSF、TNF、促红细胞生成素(erythropoietin)，免疫调节剂或细胞因子，例如干扰素或白细胞介素，神经肽，生殖激素，例如HGH、FSH或LH，甲状腺激素，神经递质，如乙酰胆碱，激素受体，例如雌激素受体。还包括非甾体抗炎药，例如吲哚美辛、醋酸水杨酸、布洛芬、舒林酸、吡罗昔康和萘普生，以及麻醉剂或镇痛剂。还包括放射性同位素，如那些对成像以及治疗有用的放射性同位素。
本发明的IL2直向同源物可以使用众所周知的化学偶联方法化学偶联至此类运载体分子。双功能交联剂例如本领域已知的同功能和异功能交联剂可用于此目的。使用的交联剂的类型取决于将要偶联至IL-2突变蛋白的分子的性质，本领域技术人员可以很容易地确定。或者或另外，IL2直向同源物和/或意在与之偶联的分子可以被化学衍生化，使得二者在单独地反应中被偶联，这也是本领域众所周知的。
PEG化：
在一些实施方式中，IL2直向同源物偶联至一个或多个水溶性聚合物。在本发明实践中有用的水溶性聚合物的例子包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、多糖(聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚烯烃醇(polyolefinic alcohol)、多糖、聚-α-羟基酸、聚乙烯醇(PVA)、聚磷腈、聚噁唑啉(polyoxazoline)(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)，或其组合。
在一些实施方式中，IL2直向同源物偶联至一个或多个聚乙二醇分子或“聚乙二醇化/PEG化”。尽管PEG附接至IL2直向同源物的方法或位点可能不同，在某些实施方式中PEG化不改变或仅在最小程度上改变IL2直向同源物的活性。
在一些实施方式中，半胱氨酸可以被取代为第3位的苏氨酸(3TC)以促进使用特定化学方法的N-末端PEG化。
在一些实施方式中，IL2直向同源物的选择性PEG化(，例如通过纳入具有侧链的非天然氨基酸以促进选择性PEG偶联化学反应，如描述于Ptacin，等(2018年8月3日提交的PCT国际申请号PCT/US2018/045257，并于2019年2月7日作为国际公开号WO 2019/028419Al公开)可用于产生对IL2受体复合物的一个或多个亚基(如CD25、CD132)的亲和力降低的IL2直向同源物。例如，其中在IL2的经鉴定为与CD25相互作用的那些序列或残基(包括氨基酸34-45、61-72和105-109)处纳入具有可PEG化的特定部分的非天然氨基酸的hIL2直向同源物通常能提供对CD25结合性减弱的IL2直向同源物。相似地，其中在IL2的经鉴定为与hCD132相互作用的那些序列或残基(包括氨基酸18、22、109、126或119-133)处纳入具有可PEG化的特定部分的非天然氨基酸的hIL2直向同源物通常能提供对hCD132结合性减弱的IL2直向同源物。
在某些实施方式中，半衰期的增加大于生物学活性的任何减少。适合偶联至多肽序列的PEG通常在室温溶于水，并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R是氢或保护基团，例如烷基或烷醇基，其中n是1-1000的整数。当R是保护基团时，其通常具有1-8个碳。偶联至多肽序列的PEG可以是直链的或支链的。本发明考虑了支化PEG衍生物，“星形-PEG(star-PEG)”和多臂PEG。
本发明中使用的PEG的分子量不限于任何特定范围。PEG-IL2直向同源物的PEG组分可以具有大于约5kDa、大于约10kDa、大于约15kDa、大于约20kDa、大于约30kDa、大于约40kDa、或大于约50kDa的分子量。在一些实施方式中，分子量为约5kDa至约10kDa，约5kDa至约15kDa，约5kDa至约20kDa，约10kDa至约15kDa，约10kDa至约20kDa，约10kDa至约25kDa或约10kDa至约30kDa。直链或支链PEG分子的分子量从约2,000至约80,000道尔顿，或者约2,000至约70,000道尔顿，或者约5,000至约50,000道尔顿，或者约10,000至约50,000道尔顿，或者约20,000至约50,000道尔顿，或者约30,000至约50,000道尔顿，或者约20,000至约40,000道尔顿，或者约30,000至约40,000道尔顿。在本发明的一个实施方式中，PEG为包含两个20kD臂的40kD支链PEG。
本公开还考虑了偶联物的组合物，其中PEG具有不同的n值，因此在特定的比率下存在多种不同的PEG。例如，一些组合物包含偶联物的混合物，其中n＝1、2、3和4。在一些组合物中，n＝1的偶联物的百分比为18-25％，n＝2的偶联物的百分比为50-66％，n＝3的偶联物的百分比为12-16％，n＝4的偶联物的百分比多达5％。这种组合物可以通过本领域已知的反应条件和纯化方法生产。层析可用于分辨偶联物的馏分，然后鉴定包含具有例如附接所需数量的PEG的偶联物的馏分，从未修饰的蛋白质序列和具有附接其他数量PEG的偶联物中纯化出来。
适合偶联至多肽序列的PEG通常在室温溶于水，并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R是氢或保护基团，例如烷基或烷醇基，其中n是1-1000的整数。当R是保护基团时，其通常具有1-8个碳。
两种广泛使用的第一代激活的单甲氧基PEG(mPEG)是琥珀酰亚胺基碳酸酯PEG(SC-PEG；参见，例如，Zalipsky，等(1992)Biotehnol.Appl.Biochem15：100-114)和苯并三唑甲酯PEG(BTC-PEG；参见，例如Dolence，等美国专利号5,650,234)，其优选与赖氨酸残基反应以形成氨基甲酸酯连接，但也已知与组氨酸和酪氨酸残基反应。使用PEG-醛接头通过还原性胺化靶向多肽的N-末端单个位点。
聚乙二醇化经常发生在多肽N-末端的α-氨基基团，赖氨酸残基侧链上的ε氨基基团和组氨酸残基侧链上的咪唑基团。由于大多数重组多肽具有单个α基团和若干ε基团和咪唑基团，根据接头的化学性质，可以产生许多位置异构体。本领域中已知的一般聚乙二醇化策略可本文中应用。
PEG可以通过末端反应性基团(“间隔子″)结合至本发明的IL2直向同源物，该基团在一个或多个多肽序列的游离氨基或羧基与聚乙二醇之间介导结合。具有可结合至游离氨基基团的间隔子的PEG包括N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇，它可以通过用N-羟基琥珀酰亚胺激活聚乙二醇的琥珀酸酯来制备。
在一些实施方式中，通过纳入带有独特侧链的非天然氨基酸以促进特定位点的PEG化来促进IL2直向同源物的PEG化。将非天然氨基酸纳入多肽以提供功能部分以实现此类多肽的位点特异性聚乙二醇化是本领域中已知的。参见，例如Ptacin，等，(PCT国际申请号PCT/US2018/045257，2018年8月3日提交并公开于2019年2月7日，国际公开号WO 2019/028419A1。在一个实施方式中，本发明的IL2直向同源物在IL2直向同源物的D109位纳入非天然氨基酸。在本发明的一个实施方式中，IL2直向同源物是IL2直向同源物的109位PEG化的，PEG分子分子量约为20kD，或约30kD，或约40kD。
偶联至多肽序列的PEG可以是直链的或支链的。本发明考虑了支化PEG衍生物，“星形-PEG(star-PEG)”和多臂PEG。本发明的实践中有用的具体实施方式PEG包括10kDa直链PEG-醛(例如，
Figure BDA0003850638240001151
ME-100AL、NOF美国公司(NOF America Corporation)，北百老汇(One North Broadway)，纽约州白原市(White Plains，NY)10601USA)、10kDa直链PEG-NHS酯(例如，
Figure BDA0003850638240001152
ME-100CS，
Figure BDA0003850638240001153
ME-100AS，
Figure BDA0003850638240001154
ME-100GS，
Figure BDA0003850638240001155
ME-100HS，NOF)、20kDa直链PEG-醛(例如
Figure BDA0003850638240001156
ME-200AL，NOF、20kDa直链PEG-NHS酯(例如，
Figure BDA0003850638240001157
ME-200CS，
Figure BDA0003850638240001158
ME-200AS，
Figure BDA0003850638240001159
ME-200GS，
Figure BDA00038506382400011510
ME-200HS，NOF)、20kDa 2-臂支链PEG-醛，该20kDA PEG-醛，其包含两个10kDA直链PEG分子(例如，
Figure BDA00038506382400011511
GL2-200AL3，NOF)、20kDa 2-臂支链PEG-NHS酯，该20kDAPEG-NHS酯，其包含两个10kDA直链PEG分子(例如，
Figure BDA00038506382400011512
GL2-200TS，
Figure BDA00038506382400011513
GL200GS2，NOF)、40kDa 2-臂支链PEG-醛，该40kDA PEG-醛，其包含两个20kDA直链PEG分子(例如，
Figure BDA00038506382400011514
GL2-400AL3)、40kDa 2-臂支链PEG-NHS酯，该40kDA PEG-NHS酯，其包含两个20kDA直链PEG分子(例如，
Figure BDA00038506382400011515
GL2-400AL3，
Figure BDA00038506382400011516
GL2-400GS2，NOF)、直链30kDa PEG-醛(例如，
Figure BDA00038506382400011517
ME-300AL)和直链30kDa PEG-NHS酯。
如前所述，PEG可以直接或通过接头分子附接至IL2直向同源物。合适的接头包括“柔性接头”，其长度通常足以允许修饰的多肽序列与连接的组分和分子之间有一些移动。接头分子通常约6-50个原子长。接头分子也可以是，例如，芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。合适的接头可以容易地选择，可以是任何合适的长度，例如1个氨基酸(如Gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50或超过50个氨基酸。柔性接头的例子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以用作组分之间的中性系链(tether)。柔性接头的其他例子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以用作组分之间的中性系链(tether)。这些接头序列的多聚体(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30或30-50)可以连接在一起，以提供柔性接头，可用于将异源氨基酸序列偶联至本文公开的多肽。
此外，这种接头可用于将IL2直向同源物连接至本文所述的其他异源多肽组分，异源氨基酸序列可以是信号序列和/或融合伴侣，例如，白蛋白、Fc序列等。
在本发明的一个实施方式中，IL2直向同源物是人IL2直向同源物，其结构为：
[PEG]-[接头]n-[hoIL2]
其中n＝0或1，和
[PEG]-[接头]n-[desAla1-hIL2[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]
其中n＝0或1，和
在本发明的另一个实施方式中，IL2直向同源物是人IL2直向同源物，其结构为：
40kD-PEG-(接头)n-PTSSSTKKTQLQLSQLLVLLKAILNGINNYKNPKLTRM
Figure BDA0003850638240001161
其中n＝0或1。
酰化
在一些实施方式中，本发明的IL2直向同源物可以是通过偶联至脂肪酸分子酰化的，如描述于Resh(2016)《脂质研究进展》(Progress in Lipid Research)63：120-131。可被偶联的脂肪酸的例子包括肉豆蔻酸、棕榈酸和棕榈油酸。肉豆蔻酸通常被连接至N-末端甘氨酸，但赖氨酸也可以被肉豆蔻酰化。棕榈酰化通常通过对游离的半胱氨酸-SH基团的酶促修饰来实现，例如DHHC蛋白催化S-棕榈酰化。丝氨酸和苏氨酸残基的棕榈酰化通常通过使用PORCN酶酶促实现。
乙酰化
在一些实施方式中，IL-2突变蛋白在N-末端通过与N-末端乙酰转移酶和，例如，乙酰CoA的酶促反应被乙酰化。替代地或除了N-末端乙酰化之外，IL-2突变蛋白在一个或多个赖氨酸残基处乙酰化，例如通过与赖氨酸乙酰转移酶的酶促反应。参见，例如，Choudhary等(2009)Science 325(5942)：834L2ortho840。
Fc融合体
在一些实施方式中，IL2融合蛋白可以纳入来源于IgG抗体亚类的Fc区，其缺乏IgG重链可变区。″Fc区″可以是天然存在或合成的多肽，其与用木瓜蛋白酶消化IgG产生的IgGC-末端结构域同源。IgG Fc的分子量约为50kDa。突变的IL-2多肽可以包含整个Fc区，或保留延长其作为嵌合多肽的部分的循环半衰期能力的较小部分。此外，全长或片段的Fc区可以是野生型分子的变体。即，它们可以包含可能影响或不影响多肽功能的突变；正如下文进一步描述的那样，在所有情况下都不需要或不希望有天然活性。在某些实施方式中，IL-2突变蛋白融合蛋白(如本文所述的IL-2部分激动剂或拮抗剂)包括IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。示例性Fc区可以包括抑制补体固定和Fc受体结合的突变，或者它可以是裂解性的，即能够结合补体或通过另一种机制如抗体依赖性补体裂解(ADCC)来裂解细胞。
在一些实施方式中，IL2直向同源物包含Fc融合体嵌合多肽分子的功能域。Fc融合体偶联物已被证明可以增加生物药物的全身半衰期，因此，生物药物产品可以不需要频繁给药。Fc结合至衬垫在血管的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn)，结合后，Fc融合分子被保护，不被降解并重新释放到循环中，使分子在循环中保持更长的时间。这种Fc结合被认为是内源性IgG保持其长血浆半衰期的机制。最近的Fc融合体技术将一份生物药物的单拷贝连接至抗体的Fc区，与传统的Fc融合体偶联物相比，优化了生物药物的药代动力学和药效动力学特性。用于制备Fc融合体的″Fc区″可以是天然存在或合成的多肽，其与用木瓜蛋白酶消化IgG产生的IgG C-末端结构域同源。IgG Fc的分子量约为50kDa。IL2直向同源物可以提供整个Fc区，或保留延长其作为一部分的嵌合多肽的循环半衰期能力的较小部分。此外，全长或片段的Fc区可以是野生型分子的变体。在一个典型的呈现中，二聚体Fc的每个单体携带异源多肽，异源多肽是相同或不同的。
在一些实施方式中，当IL2直向同源物要以Fc融合体的形式给予时，特别是在那些偶联至Fc二聚体的各个亚单位的多肽链不同的情况下，Fc融合体可以被工程改造为具有“杵臼(knob-into-hole)修饰”。杵臼修饰更全面地描述于Ridgway，等(1996)《蛋白质工程改造》(Protein Engineering)9(7)：617-621和1998年3月24日授权的美国专利号5,731，168。杵臼修饰是指在CH3结构域中两个免疫球蛋白重链之间界面的修饰，其中：i)在第一条重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链的氨基酸残基(例如，酪氨酸或色氨酸)替代，从表面产生突起(“杵”)和ii)在第二条重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链的氨基酸残基(如丙氨酸或苏氨酸)替代，从而在第二CH3结构域的界面内产生空腔(“臼”)，其中第一CH3结构域的突出侧链(“杵”)被第二CH3结构域中的空腔接收。在一个实施方式中，“杵臼修饰”包括抗体重链之一中的氨基酸取代T366W和任选地氨基酸取代S354C，和另一个抗体重链中的氨基酸取代T366S、L368A、Y407V和任选地Y349C。此外，Fc结构域可以通过在S354和Y349位置引入半胱氨酸残基进行修饰，从而在Fe区的两个抗体重链之间产生稳定的二硫键(Carter，等(2001)Immunol Methods 248，7-15)。杵臼形式用于促进在具有“杵”修饰的第一Fc单体上第一多肽(如IL2直向同源物)的表达和在具有“臼”修饰的第二Fc单体上的第二多肽的表达，以促进异二聚体多肽偶联物的表达。
Fc区可以是″溶解性″或″非溶解性″的，但通常是非溶解性的。非溶解性Fc区通常缺乏高亲和力Fc受体结合位点和Clq结合位点。鼠IgG Fc的高亲和力Fc受体结合位点包括IgG Fc第235位的Leu残基。因此，Fc受体结合位点可以通过突变或缺失Leu235而被抑制。例如，用Glu取代Leu235抑制Fc区结合至高亲和力Fc受体的能力。通过突变或缺失IgG的Glu318、Lys 320和Lys 322残基，可以在功能上破坏鼠Clq结合位点。例如，用Ala残基取代Glu318、Lys 320和Lys 322，使IgG1 Fc不能引导抗体依赖性补体裂解。与此相反，溶解性IgG Fc区具有高亲和力Fc受体结合位点和Clq结合位点。高亲和力的Fc受体结合位点包括IgG Fc的235位Leu残基，而Clq结合位点包括IgG1的Glu 318、Lys 320和Lys 322残基。溶解性IgG Fc在这些位点具有野生型残基或保守的氨基酸取代。溶解性IgG Fc可以针对细胞进行抗体依赖性细胞毒性或补体定向细胞溶解(CDC)。人IgG的适当突变也是已知的(参见，例如，Morrison等，The Immunologist 2：119-124，1994；和Brekke等，The Immunologist 2：125，1994)。
在某些实施方式中，本发明的IL2直向同源物的氨基或羧基末端可与免疫球蛋白Fc区(如人Fc)融合，形成融合体偶联物(或融合分子)。Fc融合体偶联物已被证明可以增加生物药物的全身半衰期，因此，生物药物产品可以不需要频繁给药。Fc结合至衬垫在血管的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn)，结合后，Fc融合分子被保护，不被降解并重新释放到循环中，使分子在循环中保持更长的时间。这种Fc结合被认为是内源性IgG保持其长血浆半衰期的机制。最近的Fc融合体技术将一份生物药物的单拷贝连接至抗体的Fc区，与传统的Fc融合体偶联物相比，优化了生物药物的药代动力学和药效动力学特性。
在一些实施方式中，Fc结构域单体包括相对于野生型人IgG1、IgG2或IgG4 Fc区域的至少一个突变，如美国专利号US10259859B2所述，其全部教导通过引用纳入本文。如本文所公开的，Fc结构域单体包括：
(a)相对于野生型人IgG1的下列氨基酸取代之一：
T366W、T366S、L368A、Y407V、T366Y、T394W、F405W、Y349T、Y349E、Y349V、L351T、L351H、L351N、L351K、P353S、S354D、D356K、D356R、D356S、E357K、E357R、E357Q、S364A、T366E、L368T、L368Y、L368E、K370E、K370D、K370Q、K392E、K392D、T394N、P395N、P396T、V397T、V397Q、L398T、D399K、D399R、D399N、F405T、F405H、F405R、Y407T、Y407H、Y407I、K409E、K409D、K409T或K409I；
或
(b)(i)N297A突变，相对于人IgG1 Fc区；
(ii)L234A、L235A和G237A突变，相对于人IgG1 Fc区；
(iii)L234A、L235A、G237A和N297A突变，相对于人IgG1 Fc区；
(iv)N297A突变，相对于人IgG2 Fc区；
(v)A330S和P331S突变，相对于人IgG2 Fc区；
(vi)A330S、P331S和N297A突变，相对于人IgG2 Fc区；
(vii)S228P、E233P、F234V、L235A和delG236突变，相对于人IgG4 Fc区；或
(viii)S228P、E233P、F234V、L235A、delG236和N297A突变，相对于人IgG4 Fc区。
在一些实施方式中，Fc结构域单体包括：
(a)相对于野生型人IgG1的下列氨基酸取代之一：T366W、T366S、L368A、Y407V、T366Y、T394W、F405W、Y349T、Y349E、Y349V、L35 IT、L351H、L351N、L351K、P353S、S354D、D356K、D356R、D356S、E357K、E357R、E357Q、S364A、T366E、L368T、L368Y、L368E、K370E、K370D、K370Q.K392E、K392D、T394N、P395N、P396T、V397T、V397Q、L398T、D399K、D399R、D399N、F405T、F405H、F405R、Y407T、Y407H、Y407I、K409E、K409D、K409T或K409I；和
(b)Fc结构域单体进一步包括：
(i)N297A突变，相对于人IgG1 Fc区；
(ii)L234A、L235A和G237A突变，相对于人IgG1 Fc区；
(iii)L234A、L235A、G237A和N297A突变，相对于人IgG1 Fc区；
(iv)N297A突变，相对于人IgG2 Fc区；
(v)A330S和P331S突变，相对于人IgG2 Fc区；
(vi)A330S、P331S和N297A突变，相对于人IgG2 Fc区；
(vii)S228P、E233P、F234V、L235A和delG236突变，相对于人IgG4Fc区；或
(viii)S228P、E233P、F234V、L235A、delG236和N297A突变，相对于人IgG4 Fc区。
在一些实施方式中，与具有野生型人IgG Fc区的多肽相比，该多肽在吞噬试验中表现出吞噬作用的降低。在一些实施方式中，Fc结构域单体连接至包含第二Fc结构域单体的第二多肽，形成Fc结构域二聚体。
嵌合多肽/融合蛋白
在一些实施方式中，IL2直向同源物可以包含嵌合多肽的功能域。本发明的IL2直向同源物融合蛋白可以通过本领域已知的技术通过重组DNA方法容易地生产，通过构建重组载体，该载体包含核酸序列，该核酸序列包括在框内的编码IL2直向同源物的核酸序列与编码IL2直向同源物的N-末端或C-末端融合伴侣的核酸序列，该序列可任选地进一步包括在框内的编码接头或间隔子多肽的核酸序列。
Flag标签
在其他的实施方式中，IL2直向同源物可以被修饰为包括功能为抗原标签的其他多肽序列，例如FLAG序列。如本文所述，FLAG序列可被生物素化、高特异性的抗-FLAG抗体识别(参见例如，Blanar等(1992)Science 256：1014和LeClair，等(1992)PNAS-USA 89：8145)。在一些实施方式中，IL2直向同源物多肽进一步包括C-末端的c-myc表位标签。
His标签
在一些实施方式中，本发明的IL2直向同源物(包括这种IL2直向同源物的融合蛋白)被表达为具有一个或多个过渡金属螯合多肽序列的融合蛋白。纳入这种过渡金属螯合结构域促进纯化固定化金属亲和层析(IMAC)，如Smith等1986年2月11日授权的美国专利第4,569,794号所述。在本发明的实践中有用的过渡金属螯合多肽的例子描述于Smith等(同上)以及Dobeli等的1995年5月10日授权的美国专利第5,320,663号，其中的全部教导通过引用纳入此处。在本发明的实践中有用的具体过渡金属螯合多肽是包含3-6个连续的组氨酸残基的肽，例如6-组氨酸肽(His)6，在本领域经常被称为“His-标签”。
靶向的IL2直向同源物融合蛋白：
在一些实施方式中，IL2直向同源物被提供为具有多肽序列(“靶向结构域”)的融合蛋白，以促进选择性地结合到特定的表达特异性结合至这种靶向域的细胞表面分子的细胞类型或组织，任选地在IL2直向同源物序列和融合蛋白的靶向结构域序列之间纳入1-40(或2-20、或5-20、或10-20)个氨基酸的接头分子。
在其他实施方式中，可以产生包含正交IL-2和其抗体或抗原结合部分的嵌合多肽。嵌合蛋白的抗体或抗原结合组分可以作为靶向部分。例如，它可以用来将嵌合蛋白定位到特定的细胞亚群或靶分子。产生细胞因子-抗体嵌合多肽的方法描述于，例如，美国专利号6,617,135。
在一些实施方式中，IL2直向同源物融合蛋白的靶向结构域特异性地结合至肿瘤细胞的细胞表面分子。在一个实施方式中，其中CAR-T细胞的CAR的ECD特异性地结合至CD-19，IL2直向同源物可以作为具有CD-19靶向部分的融合蛋白提供。例如，在一个实施方式中，其中CAR-T细胞的CAR的ECD是提供特异性结合至CD-19的scFv分子，IL2直向同源物作为与CD-19靶向部分(例如特异性结合至CD-19的单链抗体(例如scFv或VHH))的融合蛋白提供。
在一些实施方式中，融合蛋白包括IL-2突变蛋白和抗-CD19 sdFv FMC63(Nicholson，等(1997)Mol Immunol34：1157-1165)。类似地，在一些实施方式中，其中CAR-T细胞的CAR的ECD特异性结合至BCMA，IL2直向同源物作为与BCMA靶向部分的融合蛋白提供，所述靶向部分例如包含Kalled等(美国专利9,034,324，2015年5月9日授权)所述的抗BMCA抗体的CDR的抗体或包含Brogdon等(美国专利号10,174,095，2019年1月8日授权)所述的CDR的抗体。在一些实施方式中，IL2直向同源物作为与GD2靶向部分的融合蛋白提供，例如包含Cheung等(美国专利号9,315,585，2016年4月19日授权)所述CDR，或来自ME36.1(Thurin等，(1987)Cancer Research 47：1229-1233)、14G2a、3F8(Cheung等，1985CancerResearch 45：2642-2649)、hu14.18、8B6、2E12或ic9的CDR的抗体。
在替代性实施方式中，本发明的靶向IL2直向同源物可与CAR-T细胞疗法组合给予，以提供基于CAR-T细胞的胞外受体的IL2直向同源物至CAR-T细胞的靶向递送，例如通过和抗-FMC63抗体，以将IL2活性靶向CAR-T细胞，并再生体内耗尽的CAR-T细胞。因此，本公开的实施方式包括通过将这种IL2直向同源物偶联至设计为与CAR-T细胞的特定细胞表面分子相互作用的抗体或配体来靶向递送IL2直向同源物。这种分子的例子可以是抗-FMC63-hIL2直向同源物。
在其他实施方式中，嵌合多肽包括突变IL-2多肽和异源多肽，其功能为增强突变IL-2多肽的表达或指导细胞定位，例如Aga2p凝集素亚基(参见，例如，Boder和Wittrup，Nature Biotechnol.15：553-7，1997)。
蛋白质转导结构域融合蛋白：
在一些实施方式中，IL2直向同源物进一步包括“蛋白质转导结构域”或“PTD”。PTD是多肽、多核苷酸、碳水化合物、或有机或无机分子，其有利于穿越脂质双分子层、胶束、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜。PTD纳入IL2直向同源物有利于分子穿越膜。在一些实施方式中，PTD共价连接至IL2直向同源物的氨基或羧基末端。在一些实施方式中，PTD作为PTD-IL2直向同源物融合蛋白的部分，纳入分子的N末端或C末端。
示例性的蛋白质转导结构包括但不限于最小的十肽蛋白转导结构域(对应于HIV-1TAT的残基47-57)；聚精氨酸序列，其包括足以指导进入细胞的精氨酸残基数量(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或10-50个精氨酸)；VP22结构域(Zender等(2002)Cancer Gene Ther.9(6)：489-96)；果蝇触角足突变(Drosophila Antennapedia)蛋白转导结构域(Noguchi等(2003)Diabetes52(7)：1732-1737)；截短的人降血钙素肽(Trehin等(2004)Pharm.Research21：1248-1256)；聚赖氨酸(Wender等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：13003-13008)、转运蛋白(如描述于Wierzbicki，等，(2014)Folio Histomchemica etCytobiologica 52(4)：270-280和Pooga，等(1998)FASEB J 12(1)67-77且可以商购自AnaSpec，目录号AS-61256)；KALA(如描述于Wyman等，(1997)Biochemistry 36(10)3008-3017且可商购自AnaSpec，目录号AS-65459)；触角足突变肽(如描述于Pietersz等，(2001)Vaccine 19：1397且可商购自AnaSpec，目录号AS-61032)；TAT 47-57(可商购自AnaSpec，目录号AS-60023)。
在一些实施方式中，IL-2偶联物在人对象体内的血浆半衰期大于4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、或30天。
在一些实施方式中，当IL2直向同源物要以Fc融合体的形式给予时，特别是在那些偶联至Fc二聚体的各个亚单位的多肽链不同的情况下，Fc融合体可以被工程改造为具有“杵臼(knob-into-hole)修饰”。杵臼修饰更全面地描述于Ridgway，等(1996)《蛋白质工程改造》(Protein Engineering)9(7)：617-621和1998年3月24日授权的美国专利号5,731,168。杵臼修饰是指在CH3结构域中两个免疫球蛋白重链之间界面的修饰，其中：i)在第一条重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链的氨基酸残基(例如，酪氨酸或色氨酸)替代，从表面产生突起(“杵”)和ii)在第二条重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链的氨基酸残基(如丙氨酸或苏氨酸)替代，从而在第二CH3结构域的界面内产生空腔(“臼”)，其中第一CH3结构域的突出侧链(“杵”)被第二CH3结构域中的空腔接收。在一个实施方式中，“杵臼修饰”包括抗体重链之一中的氨基酸取代T366W和任选地氨基酸取代S354C，和另一个抗体重链中的氨基酸取代T366S、L368A、Y407V和任选地Y349C。此外，Fc结构域可以通过在S354和Y349位置引入半胱氨酸残基进行修饰，从而在Fe区的两个抗体重链之间产生稳定的二硫键(Carter，等(2001)Immunol Methods 248，7-15)。杵臼形式用于促进在具有“杵”修饰的第一Fc单体上第一多肽(如IL2直向同源物)的表达和在具有“臼”修饰的第二Fc单体上的第二多肽的表达，以促进异二聚体多肽偶联物的表达。
IL2直向同源物的合成
本发明的IL2直向同源物可以通过用于构建多肽的常规方法生产，包括重组或固相合成。
固相化学合成：
除了通过已经通过重组分子生物技术改变的核酸分子的表达产生突变多肽之外，主体IL2直向同源物可以化学合成。化学合成多肽可以由本领域技术人员常规地生产。化学合成包括通过化学方式进行的编码表现出所述特性的IL2直向同源物的蛋白质序列的肽的直接合成。
在一些实施方式中，本发明的IL2直向同源物可以通过化学合成制备。IL2直向同源物的化学合成可以通过液相或固相进行。固相肽合成(SPPS)允许纳入非天然氨基酸和/或肽/蛋白质骨架修饰。可用于合成本发明的IL2直向同源物的SPPS的多种形式是本领域已知的(例如，Ganesan A.(2006)Mini Rev.Med.Chem.6：3-10；和Camarero等，(2005)ProteinPept Lett.12：723-8)。在化学合成的过程中，α官能团和任何反应性侧链可以用酸不稳定或碱不稳定基团保护，其在进行连接酰胺键的条件下是稳定的，但在不损害已形成的肽链的情况下容易被裂解。
在固相合成中，N-末端或C-末端氨基酸可以被偶联至合适的支持材料。合适的支持材料是那些对合成过程中逐步缩合和裂解反应的试剂盒反应条件惰性的材料，并且不溶解于正在使用的反应介质。市售可得的支持材料的例子包括用活性基团和/或聚乙二醇修饰的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；氯甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；羟甲基化或氨基甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物等。被保护氨基酸的连续偶联可以根据肽合成中的常规方法进行，通常在自动肽合成仪中进行。
在固相合成结束时，从支持材料上将肽裂解下来，同时裂解侧链保护基团。所获得的肽可以通过多种层析方法纯化，包括但不限于疏水吸附层析、离子交换层析、分配层析、高压液相色谱和反相HPLC。
重组生产：
或者，通过重组DNA技术生产本发明的IL2直向同源物。在多肽的重组生产的典型实践中，编码所需多肽的核酸序列被纳入适合用于将要完成表达的宿主细胞的表达载体中，核酸序列被操作性地连接至该载体编码的一个或多个表达控制序列，并在目标宿主细胞中发挥功能。如果在多肽中纳入分泌前导序列(信号肽)，重组蛋白可以通过破坏宿主细胞或从细胞介质中回收。重组蛋白可以被纯化和浓缩用于进一步用途，包括纳入。IL2多肽的重组生产的过程是本领域已知的，描述于Femandes和Taforo，美国专利号4,604,377，1986年8月5日授权，以及IL2直向同源物描述于Mark等美国专利号4,512,584，1985年5月21日授权，Gillis，美国专利号4,401,756，1983年8月30日授权，其全部教导通过引用纳入本文。
编码IL2直向同源物的核酸序列的构建
在一些实施方式中，IL2直向同源物通过重组方法生产，使用编码IL2直向同源物(或包含IL2直向同源物的融合蛋白)的核酸序列。编码所需IL2直向同源物的核酸序列可以使用寡核苷酸合成仪通过化学方式合成。
核酸序列不限于编码多肽的序列；也可以包括位于编码序列(例如，IL2的编码序列)的上游或下游的部分或全部非编码序列。分子生物学的本领域技术人员熟知用于分离核酸分子的常规操作。例如，他们可以用限制性核酸内切酶处理基因组DNA或通过进行聚合酶链式反应(PCR)产生。如果核酸分子是核糖核酸(RNA)，分子可以，例如，通过体外转录产生。
编码IL2直向同源物的核酸分子(及其融合体)可以包含天然存在的序列或不同于天然存在序列的序列，但由于遗传密码的简并性，其编码相同的多肽。这些核酸分子可以由以下组成：RNA或DNA(例如基因组DNA、eDNA或合成DNA，例如通过基于亚磷酰胺的合成(phosphoramidite-based synthesis)产生的)或这些类型核酸内核苷酸的组合或修饰。此外，核酸分子可以是双链的或单链的(即正义链或反义链)。
编码IL2直向同源物的核酸序列可以获取自提供定制核酸序列的多种商业来源。生产本发明的IL2直向同源物的IL多肽的氨基酸序列变体是基于本领域众所周知的遗传密码将合适的核苷酸变化纳入编码序列来制备的。这种变体表示所指出的残基的插入、取代和/或特异性缺失。插入、取代和/或特异性缺失的任何组合都可以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有本文定义的所需生物活性。
构建编码IL2直向同源物的DNA序列和在合适的转化的宿主中表达这些序列的方法包括但不限于使用PCR-辅助诱变技术。也可以用标准重组技术向IL2多肽中制造由氨基酸残基缺失或添加组成的突变。如果缺失或添加，编码IL2的核酸分子任选地用合适的限制性核酸内切酶消化。所得片段可以直接表达，或通过，例如，连接至第二片段来进一步操作。如果核酸分子的两个末端包含相互重叠的互补核苷酸，则可以促进连接，但也可以连接平末端片段。PCR产生的核酸也可以用于产生多种突变序列。
本发明的IL2直向同源物不仅可以直接重组生产，而且可以与异源多肽(例如信号序列或其他在成熟IL2直向同源物的N-末端或C-末端具有特定裂解位点的多肽)的融合多肽形式生产。通常，信号序列可以是载体的组分，也可以是插入到载体中的编码序列的部分。所选择的异源信号序列优选是被宿主细胞识别和处理(即被信号肽酶裂解)的序列。在一些实施方式中，信号序列是与IL2直向同源物天然相关联的信号序列(即人IL2信号序列)。信号序列的包含取决于其是否需要从制备的重组细胞分泌IL2直向同源物。如果所选细胞是原核细胞，通常优选DNA序列不编码信号序列。如果所选细胞是真核细胞，通常优选编码信号序列，最优选使用野生型IL2信号序列。或者，异源哺乳动物信号序列也是合适的，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。当重组宿主细胞是酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)时，可以使用α交配因子分泌信号序列(alphamating factor secretion signal sequence)以实现IL2直向同源物的胞外分泌，进入培养基，如描述于Singh，美国专利号7,198,919 B1，2007年4月3日授权。
如果要表达的IL2直向同源物待以嵌合体(chimera)形式表达(例如包含IL2直向同源物和异源多肽序列的融合蛋白)，则嵌合蛋白可以由杂交核酸分子编码，其包含编码所有或部分IL-2直向同源物的第一序列和编码所有或部分异源多肽的第二序列。例如，本文所述的主体IL-2直向同源物可以被融合至六-组氨酸标签，以促进细菌表达的蛋白的纯化，或融合至血凝素标签，以促进真核细胞中表达的蛋白的纯化。所谓第一和第二，不应理解为限制融合蛋白的元件取向，异源多肽可以被连接至IL2直向同源物的N-末端和/或C-末端。例如，N-末端可以被连接至靶向部分，C-末端连接至六-组氨酸标签纯化柄。
要表达的多肽(或融合体/嵌合体)的完整氨基酸序列可以被用于构建回译基因(back-translated gene)。可以合成含有编码IL2直向同源物的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成编码部分所需多肽的一些小寡核苷酸，然后连接。单个的寡核苷酸通常包含5’或3’突出端用于互补组装。
密码子优化：
在一些实施方式中，编码重组蛋白(IL2直向同源物、正交CD122或CAR)的核酸序列可以是“密码子优化”的以促进在特定宿主细胞类型中的表达。在多种表达系统，包括哺乳动物、酵母和细菌宿主细胞中密码子优化的技术是本领域众所周知的，且有在线工具以提供用于在多种宿主细胞类型中表达的密码子优化的序列。参见例如，Hawash，等(2017)9：46-53和Mauro和Chappell在《哺乳动物细胞中重组蛋白表达：方法和方案》(Recombinant Protein Expression in Mammalian Cells：Methods and Protocols)，David Hacker编(胡马纳出版社(Human Press)纽约)。此外，有多种基于网络的在线软件可以免费使用，以协助制备密码子优化的核酸序列。
表达载体：
组装(通过合成、定点诱变或另一方式)后，编码IL2直向同源物的核酸序列将被插入表达载体。可以使用用于多种宿主细胞中的多种表达载体，通常是基于用于表达的宿主细胞选择。表达载体通常包含但不限于以下一个或多个：复制起点，一个或多个标志物基因，增强子元件、启动子和转录终止序列。载体包括病毒载体、质粒载体、整合载体等。质粒是非病毒载体的例子。
为了促进重组多肽的高效表达，要表达的编码多肽序列的核酸序列被操作性地连接至在所选的表达宿主中发挥功能的转录和翻译调控序列。
可选择标志物
表达载体通常包含选择基因，也被称为可选择标志物。该基因编码转化的宿主细胞在选择性培养基中生长的存活或生长所必需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞无法在培养基中存活。典型的选择基因编码蛋白质，其将(a)赋予对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性；(b)弥补营养缺陷型缺陷；或(c)提供无法从复合培养基中获得的关键营养素。
调控序列：
用于本发明的IL2直向同源物的表达载体包含调节序列，其被宿主生物体识别且操作性地连接至编码IL2直向同源物的核酸序列。术语“调控序列”、“调节序列”或“表达控制序列”在本文中可互换使用，指启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。参见，例如Goeddel(1990)于《基因表达技术：酶学方法》(Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology)185(学术出版社(Academic Press)，美国加利福尼亚州圣地亚哥。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中引导组成型表达的核苷酸序列，和仅在某些宿主细胞中引导表达的核苷酸序列(例如，组织特异性调节序列)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可能取决于例如要转化的宿主细胞的选择，所需蛋白质的表达水平等因素。在表达控制序列的选择中，本领域技术人员理解将要考虑多种因素。这些包括，例如，序列的相对强度、它的可控性，以及它与编码主体IL2直向同源物的实际DNA序列的相容性，特别是关于潜在的二级结构。
启动子
在一些实施方式中，调节序列是启动子，其选择基于，例如，寻求在其中表达的细胞类型。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5′)的非翻译序列(通常在约100到1000bp内)，其控制与其操作性地连接的特定核酸序列的转录和翻译。这种启动子通常分为两类，诱导型的和组成型的。诱导型启动子是对培养条件的某些变化(如营养物的存在或不存在或温度的变化)反应，从其控制下的DNA启动增加转录水平的启动子。多种潜在的宿主细胞所识别的大量启动子是众所周知的。
在细菌中可以使用T7启动子，在昆虫细胞中可以使用多角体蛋白启动子，在哺乳动物细胞中可以使用巨细胞病毒或金属硫蛋白(metallothionein)启动子。另外，在高等的真核细胞的情况下广泛使用组织特异性和细胞特异性启动子。这些启动子以其在给定的体内组织或细胞类型中核酸分子的指导表达的能力而命名。技术人员知晓许多可用于核酸的指导表达的启动子和其他调节元件。
哺乳动物宿主细胞中载体的转录可以被控制，由，例如，从病毒基因组中获得的启动子，例如多瘤病毒、牛痘病毒、腺病毒(如人类腺病毒血清型5)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒(如鼠干细胞病毒)、乙肝病毒和最理想的猿猴病毒40(SV40)，来自异源哺乳动物的启动子，例如，肌动蛋白启动子、PGK(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白启动子，来自热休克启动子，只要这些启动子与宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地以SV40限制性片段形式获得，该片段也含有SV40病毒的复制起点。
增强子
高等真核生物的转录通常通过在载体中插入增强子序列来增加。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约为10至300bp，它作用于启动子以增加其转录。增强子的取向和位置相对独立，在转录单元的5′和3′处、内含子内以及编码序列本身内都有发现。现在已经从哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)中得知了许多增强子序列。然而，通常人们会使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括复制起点后侧的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以被剪接到表达载体中编码序列的5′或3′的位置，但优选是位于离启动子5′的位置。用于真核宿主细胞的表达载体还将包含用于终止转录和用于稳定化mRNA所必需的序列。这种序列通常可以从真核生物或病毒DNA或cDNA的5′，偶尔3′非翻译区获得。含有一个或多个上述组分的合适载体的构建采用了标准技术。
除了促进插入核酸分子的转录的序列之外，载体可以包含复制起点和其他编码可选择标志物的基因。例如，新霉素-抗性(neoR)基因赋予其表达细胞G418抗性，因而允许对转染的细胞进行表型选择。标志物或报告基因的其他例子包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、lacZ(编码β-半乳糖苷酶)和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。本领域技术人员可以容易地确定给定的调节元件或可选择标志物适合或不适合用于特定表达环境。
表达载体的正确组装可以通过核酸测序、限制性图谱和在合适宿主中生物活性多肽的表达来确认。
用于生产IL2直向同源物的宿主细胞
本发明进一步提供原核或真核细胞，其包含和表达编码IL2直向同源物的核酸分子。本发明的细胞是转染的细胞，即核酸分子进入的细胞，例如已经通过重组DNA技术引入编码突变IL2多肽的核酸分子的。这种细胞的子代也被认为在本发明的范围内。
通常根据它们与所选表达载体的相容性、本发明DNA序列编码的产物的毒性、它们的分泌特性、它们正确折叠多肽的能力、它们的发酵或培养要求、以及DNA序列编码的产物的纯化难易程度来选择宿主细胞。用于克隆或表达本文载体中DNA的合适宿主细胞是上述的原核细胞、酵母或高等真核细胞。
在一些实施方式中重组IL2直向同源物或其生物活性变体也可以在真核细胞中制备，例如酵母或人细胞。合适的真核宿主细胞包括昆虫细胞(例如在培养的昆虫细胞中可用于蛋白表达的杆状病毒载体(例如Sf9细胞)包括pAc系列(Smith等(1983)Mol.CellBiol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39))；酵母细胞(例如用于在酵母啤酒酵母(S.cerenvisiae)(包括pYepSecl)中表达的载体(Baldari等(1987)EMBO J.6：229-234)，pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30：933-943)，pJRY88(Schultz等(1987)Gene 54：113-123)，pYES2(英杰公司(Invitrogen Corporation)，加利福尼亚州圣地亚哥)和pPicZ(英杰公司，加利福尼亚州圣地亚哥))；或哺乳动物细胞(哺乳动物表达载体包括pCDM8(Seed(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBOJ.6：187：195))。
有用的哺乳动物宿主细胞系的例子为，小鼠L细胞(L-M[TK-]，ATCC号CRL-2648)、由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(HEK293或HEK293细胞亚克隆，在悬浮培养中生长；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。在哺乳动物细胞中，表达载体的控制功能通常通过病毒调控元件提供。例如，常用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2型、巨细胞病毒和猿猴病毒40。
IL2直向同源物可以在原核宿主中，例如细菌大肠杆菌，或在真核宿主中，例如昆虫细胞(例如Sf21细胞)或哺乳动物细胞(例如COS细胞、NIH 3T3细胞或HeLa细胞)中生产。这些细胞可以从许多来源获得，包括美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马萨纳斯)。在选择表达系统时，最重要的是各组分之间相容。本领域技术人员能够做这种决定。此外，如果在选择表达系统时需要指导，本领域技术人员可以查阅Ausubel等(《新编分子生物学方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley和Sons，纽约州纽约，1993)和Pouwels等(《克隆载体：实验室手册》(Cloning Vectors：A Laboratory Manual)，1985增刊1987)。
在一些实施方式中，获得的IL2直向同源物将是糖基化的或未糖基化的，取决于用于生产突变蛋白的宿主生物体。如果选择细菌作为宿主，那么生产的IL2直向同源物将是未糖基化的。另一方面，真核细胞将糖基化该IL2直向同源物，虽然或许与天然-IL2糖基化的方式不同。
关于用于原核和真核细胞的其他表达系统，参见Sambrook等(1989)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(第2版，冷泉港实验室出版社，纽约州普莱恩维尤)的第16和17章。参见，Goeddel(1990)于《基因表达技术：酶学方法》(GeneExpression Technology：Methods in Enzymology)185(学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥)。
转染：
该表达构建体可以被引入宿主细胞以从而生产本文公开的IL2直向同源物，或以生产其生物学活性突变蛋白。载体DNA可以通过常规转化或转染技术被引入原核或真核细胞。关于用于转化或转染宿主细胞的合适的方法可以在Sambrook等(1989)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(第2版，冷泉港实验室出版社，纽约州普莱恩维尤)中和其他标准分子生物学实验手册中找到。
为了促进目标细胞的转染，可以在有利于摄取非病毒载体的条件下使目标细胞直接暴露于非病毒载体。促进哺乳动物细胞摄取外源核酸的条件的例子在本领域是众所周知的，包括但不限于化学手段(例如
Figure BDA0003850638240001321
赛默飞世尔科技(Thermo-FisherScientific))，高盐和磁场(电穿孔)。
细胞培养：
细胞可以在被改良为适合用于诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售可得的培养基如汉姆氏F10(Ham′s F10)(西格玛(Sigma))、最小必需培养基((MEM)，西格玛)、RPMI1640(西格玛)和达氏改良的伊氏培养基((DMEM)，西格玛)都适合培养宿主细胞。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素和葡萄糖或等同的能量来源。任何其他必需的补充剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包含在内。培养条件，如温度、pH值等，是以前用于选择表达的宿主细胞的条件，对普通技术人员来说是显而易见的。
重组蛋白回收：
如果使用分泌前导序列，重组生产的IL2直向同源物多肽可以以分泌多肽形式从培养基中回收。或者，IL2直向同源物多肽也可以从宿主细胞裂解物中回收。蛋白酶抑制剂，例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)可以在从细胞裂解物种回收阶段中使用，以抑制纯化过程中的蛋白酶降解，并可包括抗生素以防止外源污染物的生长。
纯化：各种纯化步骤是本领域已知的，并且可以寻用，例如亲和层析。亲和层析利用了通常存在于生物大分子中的高度特异性结合位点，根据分子与特定配体结合的能力将其分离。共价键将配体附接至不溶性的多孔支持介质上，使配体明显地呈现在蛋白质样品上，从而利用一种分子种类的天然特异性结合，从混合物中分离和纯化第二种类。抗体通常用于亲和层析。也可以使用尺寸选择步骤，例如，凝胶过滤层析(也被称为尺寸排阻或分子筛层析)用于根据蛋白质的尺寸进行分离。在凝胶过滤中，蛋白质溶液通过由半透性多孔树脂填充的柱。半透性树脂具有孔径范围，决定了可以用该柱分离的蛋白质的大小。
由转化的宿主生产的IL2直向同源物可以根据任何合适的方法纯化。用于纯化IL2的各种方法是已知的。参见，例如《新编蛋白质科学方案》(Current Protocols in ProteinScience)，卷2.编者：John E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploehg，David W.Speicher，Paul T.Wingfield，第6.5单元(1997，约翰威利父子公司(John Wiley and Sons，Inc.)版权所有。IL2直向同源物可以从大肠杆菌中产生的包涵体中分离出来，或从生产特定突变蛋白的哺乳动物或酵母培养物的条件培养基中，使用阳离子交换、凝胶过滤和或反相液相色谱分离出来。
重组多肽的基本纯化形式可以用常规的生化程序从表达系统中纯化出来，并可以如本文所述，作为治疗剂使用。
IL2直向同源物的生物学活性可以通过任何合适的本领域已知方法评估，并且可以作为基本纯化形式评估，或者当使用分泌前导序列表达时作为细胞裂解物或细胞培养基的部分评估。这种活性试验包括CTLL-2增殖、T细胞中磷酸化-STAT5(pSTAT5)活性的诱导、PHA-原始增殖(PHA-blast proliferation)和NK细胞增殖。
IL2直向同源物的给予途径：在本发明的治疗性方法的实施方式中，包括给予需要治疗的对象包含IL2直向同源物(和/或编码IL2直向同源物的核酸)的药物制剂。给予对象可以通过静脉内，以推注或通过一段时间内连续输注的方式实现。给予的替代性途径包括肌肉内、腹膜内、脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。IL2直向同源物还可以适合地通过瘤内、癌旁、病灶内、结内或病灶周围途径给予，或给予淋巴以发挥局部以及全身治疗作用。
在一些实施方式中，主体IL2直向同源物(和/或编码IL2直向同源物的核酸)可以被纳入组合物，包括药物组合物。这种组合物通常包括多肽或核酸分子和药学上可接受的运载体。制备药物组合物以相容于其意在给予的途径，且相容于治疗用途，用于给予需要治疗或预防的对象IL2直向同源物。
IL2直向同源物的制剂
本发明的IL2直向同源物(或编码其的核酸)可以以药学上可接受的剂型被给予对象。优选制剂取决于预期的给药方式和治疗应用。
肠胃外制剂：在一些实施方式中，本发明的方法包括IL2直向同源物的肠胃外给予。肠胃外途径的示例包括，例如静脉内、皮内、皮下、透皮(局部)、经粘膜和直肠给药。肠胃外制剂包括用于肠胃外应用的溶液或悬浮液，可以包括载剂和缓冲剂。适于肠胃外给药的药物制剂包括无菌水性溶液(水溶性时)或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。胃肠外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。在一个实施方式中，在用于肠胃外给予的预先填充的注射器中提供制剂。
口服制剂：如果使用口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用运载体。对于口服治疗给药目的，可用赋形剂将活性化合物掺入并以片剂、含片或胶囊的形式使用，例如明胶胶囊。口服组合物也可以使用液体运载体制备以用作漱口水。可以包含药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊、含片等可含有任何以下成分或具有相似特性的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，崩解剂例如海藻酸、羧甲基淀粉(PrimogelTM)或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或完全氢化植物油(SterotesTM)；助流剂例如二氧化硅胶体；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯、或橙调味剂。
吸入制剂：在通过吸入给药的情况下，主体IL2直向同源物或编码它的核酸以来自含合适推进剂(例如，如二氧化碳气体)或喷雾剂的受压容器或分配器的气雾剂喷雾形式递送。这类方法包括描述于美国专利号6,468,798中的那些。
粘膜和透皮：也可以通过经粘膜或透皮方式全身给予主体IL2直向同源物或核酸。对于经粘膜或透皮给药，在制剂中采用适合渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂通常为本领域已知，并包括例如用于经粘膜给药的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂栓剂(例如使用常规的栓剂基料，如可可油或其它甘油酯)或滞留灌肠剂的形式制备化合物用于直肠递送。对于透皮给药，将活性化合物配制成药膏、软膏、凝胶或霜剂，如本领域通常已知的那样，并可纳入渗透促进剂，如乙醇或羊毛脂。
延长释放和储库制剂：在本发明的方法的一些实施方式中，IL2直向同源物在提供IL2直向同源物试剂的延长释放的制剂中被给予需要治疗的对象。可注射组合物的延长释放制剂的例子可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现。在一个实施方式中，用运载体制备主体IL2直向同源物或核酸，其将保护该突变的IL-2多肽不被身体快速清除，如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。可以使用标准技术制备这种制剂。所述材料还可购自阿尔扎公司(AlzaCorporation)和诺华制药股份有限公司(Nova Pharmaceuticals，Inc.)。脂质体悬浮液(包含用单克隆抗体对病毒抗原靶向感染的细胞的脂质体)还可以用作药学上可接受的运载体。这些可按本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利号4,522,811中所述。
在一个实施方式中，提供IL2直向同源物制剂，根据Femandes和Taforo，美国专利号4,604,377，1986年8月5日授权，其教导通过引用纳入本文。和Yasui，等美国专利号4,645,830。
编码直向同源物的核酸的给予：
给予对象hIL2直向同源物蛋白的替代方案，包含hIL2直向同源物的药物制剂，IL2直向同源物可以通过给予对象编码IL2直向同源物的核酸构建体的药学上可接受的制剂来提供给对象，以实现对象持续暴露于选择性的hIL2直向同源物。编码IL2直向同源物的重组载体的给予，提供了IL2直向同源物对对象的延长递送，和对应的与这种IL2直向同源物相关的、工程改造为表达同源正交受体的细胞的延长激活。在本发明的方法的一些实施方式中，编码IL2直向同源物的核酸通过转染或感染给予对象，使用本领域已知的方法，包括但不限于描述于McCaffrey等(Nature 418：6893，2002)，Xia等(Nature Biotechnol.20：1006-1010，2002)，或Putnam(Am.J.Health Syst.Pharm.53：151-160，1996，erratum于Am.J.Health Syst.Pharm.53：325，1996)中的方法。
编码该直向同源物的非病毒载体：在一个实施方式中，IL2直向同源物可以以在非病毒递送系统中提供的非病毒载体中的IL2直向同源物的核酸表达构建体的形式给予对象。非病毒递送系统通常是复合物以促进用核酸载物转导目标细胞，其中核酸与试剂复合，所述试剂例如阳离子脂质(DOTAP、DOTMA)、表面活性剂、生物制品(明胶、壳聚糖)、金属(金、磁铁)和合成聚合物(PLG、PEI、PAMAM)。非病毒递送系统的许多实施方式是本领域众所周知的，包括脂质载体系统(Lee等(1997)治疗性药物运载体系统的关键性综述(CriticalReviews of Therapeutic Drug Carrier Systems)14：173-206)；聚合物涂覆脂质体(Marin等，美国专利号5,213,804，授权于1993年5月25日；Woodle，等，美国专利号5,013,556，授权于1991年5月7日)；阳离子脂质体(Epand等，美国专利号5,283,185，授权于1994年2月1日；Jessee，J.A.，美国专利号5,578,475，授权于1996年11月26日；Rose等，美国专利号5,279,833，授权于1994年1月18日；Gebeyehu等，美国专利号5,334,761，授权于1994年8月2日)。在一个实施方式中，非病毒载体系统中编码IL2受体的核酸序列是在可调节启动子、诱导型启动子、组织特异性或肿瘤特异性启动子或时间调节启动子的控制下。
编码该直向同源物的病毒载体：
在另一个实施方式中，IL2直向同源物可以以编码IL2直向同源物的病毒载体中核酸表达构建体的形式给予对象。术语“病毒载体”和“病毒”在本文中可互换使用，指任何没有蛋白质合成或能量产生机制的专性胞内寄生体。病毒基因组可以是含有脂质膜的蛋白质的包被结构的RNA或DNA。术语病毒和病毒载体在本文中可互换使用。在本发明的实践中有用的病毒包括重组修饰的包膜或非包膜DNA和RNA病毒，优选选自杆状病毒科(baculoviridiae)、细小病毒科(parvoviridiae)、微小RNA病毒科(picornoviridiae)、疱疹病毒科(herpesviridiae)、痘病毒科(poxviridae)或腺病毒科(adenoviridiae)。该病毒通过DNA重组技术修饰以包含表达外源性转基因(例如编码IL2直向同源物的核酸序列)，并可被工程改造为复制缺陷型、条件性复制型或复制能力型。也可采用最小载体系统，其中病毒骨架仅包含病毒载体包装所需的序列，任选地包含转基因表达盒。术语“复制缺陷型”是指在野生型哺乳动物细胞中的复制高度减弱的载体。为了大量生产这种载体，通常通过与辅助病毒共转染或通过基因组修饰来补充缺失的功能，从而建立生产者细胞系。术语“复制能力型病毒载体”是指能够感染、DNA复制、包装和裂解受感染细胞的病毒载体。本文使用的术语“条件性复制型病毒载体”指的是有复制能力的载体，其被设计成在特定的细胞类型中实现选择性表达。这种条件性复制可以通过将组织特异性、肿瘤特异性或细胞类型特异性或其他选择性诱导的调控控制序列操作性地连接至早期基因(如腺病毒载体的E1基因)来实现。用重组病毒或非病毒载体感染对象可以在对象中提供IL2直向同源物的长期表达，并提供表达CD122正交受体的工程改造T细胞的连续选择性维持。在一个实施方式中，在病毒载体系统中编码IL2受体的核酸序列是在可调节启动子、诱导型启动子、组织特异性或肿瘤特异性启动子或时间调节启动子的控制下。
正交受体
在一些实施方式中，正交受体是嵌合受体，其中胞外结构域包含第一受体蛋白的正交胞外结构域，其操作性地连接(例如作为融合蛋白)至第二受体蛋白的跨膜(TM)结构域和/或胞内结构域(ICD)，从而该正交配体与正交ECD的结合导致第二受体蛋白的胞内信号转导特征。正交hCD122是hCD122的变体，其包含一个或多个氨基酸修饰(例如缺失或取代)，所述修饰在涉及天然细胞因子(即野生型hIL2)至野生型hCD122的结合的位置，从而破坏天然细胞因子(即wt-hIL2)与正交hCD122的结合。涉及hIL2至hCD122结合的氨基酸包括但不限于氨基酸R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136和/或Q214。在一些实施方式中，正交CD122包含一个或多个氨基酸取代或缺失R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136和/或Q214。在一些实施方式中，正交CD122包含一个或多个氨基酸取代或缺失：Q70、T73、H133和/或Y134。在一些实施方式中，正交CD122包含一个或多个氨基酸取代或缺失：H133和/或Y134。在一些实施方式中，正交CD122包含一个或多个氨基酸取代或缺失：H133和/或Y134。在一些实施方式中，正交CD122包含一个或多个氨基酸取代或缺失：H133和Y134。
包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的受体多肽，所述多肽的胞外结构域包含以下结构的氨基酸序列：
Figure BDA0003850638240001381
Figure BDA0003850638240001391
其中：
AA70＝Gln或Tyr；
AA73＝Thr、Asp或Tyr；
AA133＝His、Asp、Glu或Lys；和/或
AA134＝Tyr、Phe、Glu或Arg。
hCD122受体的ECD包含下表3中总结的一些二级结构特征：
Figure BDA0003850638240001392
当在hCD122的ECD序列中制作修饰时，在一些实施方式中，涉及二级结构特征形成的氨基酸被保留以维持蛋白质的二级结构。通常，二硫键的维持是需要的。在一些实施方式中，糖基化位点的缺失可能是需要的。因而，可以在hCD122的ECD成熟的第3、17、42和/或123位或更多的位置纳入一个或多个天冬酰胺的保守氨基酸取代(例如用丙氨酸或异亮氨酸)，以消除一个或多个这些N-连接的糖基化位点。
在一个实施方式中，正交CD122是包含第133和134位的氨基酸修饰的人CD122，根据天然存在形式的成熟人CD122(SEQ ID NO：1)编号。在一些实施方式中，正交CD122是具有氨基酸取代H133D和Y134的hCD122分子。在一个实施方式中，该正交受体是修饰的人CD122，其中ECD的氨基酸序列是214个氨基酸的多肽，序列为：
Figure BDA0003850638240001401
在一个实施方式中，正交受体受体是修饰的人CD122，其具有的氨基酸序列(减去信号肽)，为具有取代H133D和Y134F的hCD122的ECD的氨基酸序列和野生型hCD122分子的跨膜(TM)和胞内结构域(ICD)，其具有氨基酸序列：
Figure BDA0003850638240001402
Figure BDA0003850638240001411
“hoCD122”或“hoIL2Rb”互换使用，以指hCD122多肽的变体，其包含在hCD122多肽的ECD的133位组氨酸(H133)和134位酪氨酸(Y134)处的氨基酸取代。
在一个实施方式中，正交受体包含天然存在的成熟CD122 ECD的变体，其包含一个或多个氨基酸修饰(例如缺失或取代)，所述修饰在涉及天然细胞因子(即野生型hIL2)至野生型hCD122的ECD的结合的位置，从而破坏天然细胞因子(即wt-hIL2)与正交hCD122的ECD的结合。涉及hIL2至hCD122 ECD的结合的氨基酸包括但不限于氨基酸R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136和/或Q214。在一些实施方式中，正交受体包含含有一个或多个氨基酸取代或缺失的CD122 ECD：R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136和/或Q214。在一些实施方式中，正交CD122 ECD(或hoCD122受体)包含一个或多个氨基酸取代或缺失：Q70、T73、H133和/或Y134。在一些实施方式中，正交CD122包含一个或多个氨基酸取代或缺失：H133和/或Y134。在一些实施方式中，正交CD122包含一个或多个氨基酸取代或缺失：H133和/或Y134。在一些实施方式中，正交CD122包含一个或多个氨基酸取代或缺失：H133和Y134。
在一些实施方式中，正交受体包含具有133位的从组氨酸到天冬氨酸(H133D)、谷氨酸(H133E)或赖氨酸(H133K)的氨基酸取代和/或在134位从酪氨酸到苯丙氨酸(Y134F)、谷氨酸(Y134E)或精氨酸(Y134R)的氨基酸取代的hoCD122 ECD。在一个实施方式中，正交受体是多肽，其中的ECD包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一个实施方式中，正交CD122正交是具有氨基酸取代H133D和Y134F的hCD122分子。在一个实施方式中，hoCD122受体是多肽，其包含SEQ ID NO：7)的氨基酸序列。
在一个实施方式中，在受体的IL2共有γ链家族(例如IL4受体II型受体亚基a(hIL4Ra UniProt P24394)，IL-7受体亚基a(hIL7Ra UniProt 16871)，IL9受体(hIL9RUniProt Q01113)和IL21受体(hIL21R UniProt Q9HBE5)中，正交受体是融合蛋白，其包含hoCD122的ECD(例如.SEQ ID NO.6)和第二受体的跨膜和胞内结构域。这些共有γ-链受体家族成员的氨基酸序列和核酸序列在文献中是众所周知的，此外还有信号结构域、胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的位置。因而，普通技术人员很容易地能够制备包含正交CD122 ECD与这些替代性的共有γ链家族成员的跨膜和/或胞内结构域的融合蛋白。下表5提供了正交嵌合融合受体的例子以及序列信息：
Figure BDA0003850638240001431
Figure BDA0003850638240001441
具有STAT3基序的正交CD122受体
本发明提供正交CD122，其包括天然STAT5识别基序和一个或多个STAT3结合基序。附加的STAT3结合基序增强信号转导并稳定IL2反应。
STAT蛋白在C末端保守的酪氨酸残基处被磷酸化后，作为转录激活因子发挥作用，然后转位到核内，在那里它们结合至DNA并激活目的基因转录。Hennihgausen和Robinson(2008)Genes Dev.2008；22：711-21。在STAT家族中，已经鉴定了七种STAT蛋白：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6，从先天和获得性免疫到细胞增殖、分化和存活，它们在多种途径中具有功能。Basham等，(2008)Nucleic Acids Res.2008年6月；36(11)：3802-3818。
STAT结合基序通常存在于细胞因子受体中，它们分别结合细胞因子配体激活Janus激酶(JAK)家族的酪氨酸激酶，这磷酸化胞内结构域中的某些酪氨酸残基。磷酸化的受体将STAT招募至受体上的STAT识别基序且STAT变成磷酸化的。磷酸化的STAT二聚体化并转位到核，在那里它们启动各种基因的转录。Hennihgausen，同上。
在这些STAT蛋白中，STAT5可以通过结合至其同源受体的细胞因子(，包括IL2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL21)激活。Lara E.Kallal和Christine A.Biron(2013)在舞蹈中改变伙伴(Changing partners at the dance，JAK-STAT)，2∶1，e23504，DOI：10.4161/jkst.23504，第2页，第2栏。例如，CD122和正交CD122包含STAT5识别基序并可以招募和激活STAT5。激活的STAT5导致基因(例如Cis、spi2.1和Socs-1)的转录的激活。Basham等.，Nucleic Acids Res，同上。
STAT5结合基序具有YX1X2L((SEQ ID NO：19)的序列。X1和X2可以是任何天然氨基酸。在一些情况下，X1和X2是相同的氨基酸残基。在一些情况下，X1和X2是不同的氨基酸残基。在一个实施方式中，STAT5基序具有YLSL(SEQ ID NO：20)的序列。
STAT3结合基序不存在于天然存在形式(野生型)的人CD122中。它通常存在于结合至IL-6、IL-10、IL21、IFNa、IFNβ、IFNγ和IFNλ的其他细胞因子中。激活后，STAT3靶向Bcl-XL、存活蛋白、细胞周期蛋白D1，并激活c-myc。Kallal，等，同上。STAT3可以通过酪氨酸磷酸化被多种细胞因子激活，这些细胞因子的受体共有gp130链，包括IL-6和IL21、制瘤素M(OSM)和白血病抑制因子(LIF)。STAT3在多种生物学功能中发挥作用，包括肿瘤发生、血管生成和肿瘤转移，以及抗凋亡。参见例如Sun等(2006)，FEBS Lett.580(25)：5880-4和Fukada等(1996)Immunity 5(5)：449-460。在正交CD122的胞内结构域纳入一个或多个功能性STAT3信号转导基序，在表达正交IL2的修饰的细胞中上调抗凋亡因子，以反应于同源IL2直向同源物至这种STAT3修饰的正交CD122的ECD的结合。因此，表达包含纳入了一个或多个功能性STAT3结构域的细胞内结构域的正交CD122的正交细胞具有更高的存活率和更长的寿命，因此在体内具有更长的作用时间。
在一些实施方式中，本发明提供了人正交CD122(包括完整的STAT5基序)已经被修饰以引入一个或多个STAT3结合基序，这样产生的修饰的人CD122保留STAT5识别基序并获得一个或多个STAT3结合基序。
在一些实施方式中，修饰的正交CD122可以包括一个、两个、三个或更多STAT3结合基序。在一些实施方式中，STAT3识别基序具有氨基酸序列YX1X2Q(SEQ ID NO：21)。在一些实施方式中，X1选自下组：L、R、F、M，X2选自下组：R、K、H和P。在一些实施方式中，STAT3识别基序具有选自下组的氨基酸序列：YLRQ(SEQ ID NO：11)；YLKQ(SEQ ID NO：12)；YRHQ (SEQ IDNO：13)；YLRQ(SEQ ID NO：14)；YFKQ(SEQ ID NO：15)；YLPQ(SEQ ID NO：16)；YMPQ(SEQ IDNO：17)和YDKPH(SEQ ID NO：18)。
在一些实施方式中，一个或多个STAT3结合基序可以被纳入正交CD122ICD的C-末端或作为正交CD122 ICD的内部序列(internal sequence)纳入。
在一些情况下，修饰的人CD122包含一个或多个融合至人CD122的胞内结构域的C-末端的STAT3结合基序。在一些有代表性的实施方式中，正交CD122包括添加C-末端STAT3识别结构域，产生以下结构的正交CD122多肽：
正交-CD122-GGYLRQ；
正交-CD 122-GGYLKQ；
正交-CD122-GGYRHQ；
正交-CD122-GGYLRQ；
正交-CD122-GGYFKQ；
正交-CD122-GGYLPQ；
正交-CD122-GGYMPQ；和
正交-CD122-GGYDKPH。
在一些情况下，正交CD122包含STAT3结合基序，其通过接头连接至人CD122。接头可以来自天然存在的蛋白质或合成序列。设计接头的方法在本领域是众所周知的，例如描述于Chen等(2013)Adv.Drug.Deliv.Rev.65(10)：1357-1369，其相关部分通过引用纳入本文。合适的接头可以容易地选择，可以是任何合适的长度，例如1个氨基酸(如Gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20或20-30个氨基酸。柔性接头的例子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以用作组分之间的中性系链(tether)。柔性接头的其他例子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以用作组分之间的中性系链(tether)。修饰的正交CD122可包含一个或多个STAT3结合基序和一个或多个接头序列。所述接头序列可以连接人CD122和STAT3结合基序之一或连接单独的STAT3结合基序。一个或多个接头序列可以有相同或不同的序列。
在一些实施方式中，一个或多个STAT3结合基序作为正交CD122的内部(即，不在C或N末端)序列存在。这种构造的修饰的正交CD122可以通过在正交CD122 ICD氨基酸序列中鉴定合适的区来产生，该区可以被突变以创建STAT3结合基序。在一个实施方式中，天然存在的CD122的ICD(其通常存在于正交CD122中)拥有类似于STAT3结合基序的序列，其可能已经被修饰以创建具有最小修饰的STAT3结合基序。例如包含以酪氨酸残基开始的四个核苷酸序列的区。天然人CD122中的一个这样的区编码YFTYDPYSEE的序列，其位于天然人CD122蛋白的s355位和364位之间。在一些实施方式中，该区中包含的YFTY、YDPY或YSEE中的一个或两个被STAT3识别基序取代，以产生本文所公开的修饰的人CD122。
这种修饰的正交CD122能够在与同源IL2配体结合时诱导STAT3和STAT5信号转导，并且这种能力可以通过例如监测使表达具有STAT修饰的ICD的正交CD122的细胞与同源IL2直向同源物接触时的磷酸化STAT3和STAT5水平来证实。例如，可以在T细胞中引入并表达修饰的人CD122，并使用对磷酸化-STAT5和磷酸化-STAT3特异的抗体来检测STAT3和STAT5的磷酸化。一种检测重组蛋白诱导STAT3和STAT5信号转导能力的示例性方法描述于Kagoya等(2018)Nat Med.24(3)：352-359。
在一些实施方式中，本发明提供了一种刺激工程改造细胞的方法，所述工程改造细胞表达包含一个或多个STAT3结合基序的修饰的人正交CD122，所述方法包括将所述工程改造细胞与人IL2直向同源物(其为修饰的人正交CD122的同源配体)接触，从而刺激工程改造的细胞。在一些实施方式中，本发明提供了一种增加表达包含一个或多个STAT3结合基序的修饰的人正交CD122的工程改造细胞中的STAT3和STAT5胞内水平的方法，所述方法包括将所述工程改造细胞与人IL2直向同源物(其为修饰的人正交CD122的同源配体)接触，从而增加工程改造的细胞中STAT3和STAT5的胞内水平。
选择性激活STAT5 STAT3的方法
在一些实施方式中，本发明提供了一种刺激工程改造T细胞的方法，所述工程改造T细胞表达包含一个或多个STAT3结合基序的修饰的人正交CD122，所述方法包括将所述工程改造T细胞与人IL2直向同源物(其为修饰的人正交CD122的同源配体)接触，从而刺激工程改造的T细胞。在一些实施方式中，本发明提供了一种增加表达包含一个或多个STAT3结合基序的修饰的人正交CD122的工程改造T细胞中的STAT3和STAT5胞内水平的方法，所述方法包括将所述工程改造T细胞与人IL2直向同源物(其为修饰的人正交CD122的同源配体)接触，从而增加所述细胞中STAT3和STAT5的胞内水平。
在一些实施方式中，本发明提供了一种刺激CAR-T细胞的方法，所述CAR-T细胞表达包含一个或多个STAT3结合基序的修饰的人正交CD122，所述方法包括将所述CAR-T细胞与人IL2直向同源物(其为修饰的人正交CD122的同源配体)接触，从而刺激工程改造的T细胞。在一些实施方式中，本发明提供了一种增加表达包含一个或多个STAT3结合基序的修饰的人正交CD122的CAR-T细胞中的STAT3和STAT5胞内水平的方法，所述方法包括将所述CAR-T细胞与人IL2直向同源物(其为修饰的人正交CD122的同源配体)接触，从而增加所述CAR-T细胞中STAT3和STAT5的胞内水平。
正交工程改造细胞
在本发明的实践中有用的正交免疫细胞的制备是通过用包含编码CD122正交受体的核酸序列的表达载体转化分离的免疫细胞而实现的。本发明的IL2直向同源物被应用于选择性扩增这种工程改造的T细胞(例如人T-细胞)的方法中，所述细胞被工程改造以表达相应的正交CD122受体。
用于以本文所述构建体进行工程改造的细胞包括初始T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或其组合。上述用于工程改造的T细胞是从对象或供者处收集的，可以通过富集所需细胞的技术从细胞混合物中分离出来，或者可以不经分离而进行工程改造和培养。或者，用于工程改造的T细胞可以与其他细胞分离。提供精确分离的技术包括荧光激活细胞分选机。通过使用与死细胞相关的染料(如碘化丙啶)，可以对死细胞进行细胞选择。分离出的细胞可被收集在任何适当的培养基中，以保持细胞的活力，通常在收集管的底部有血清垫。多种培养基是市售可得的，可根据细胞的性质使用，包括dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、Iscove氏培养基等，通常补充胎牛血清(FCS)。收集的和任选地富集的细胞群可立即用于遗传修饰，或可在液氮温度下冷冻并储存，解冻后能够重新使用。细胞通常会被储存在10％DMSO、50％FCS、40％RPMI 1640培养基中。
在一些实施方式中，工程改造的细胞包括免疫细胞的复杂混合物，例如，从需要治疗的个体中分离的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。参见，例如，Yang和Rosenberg(2016)AdvImmunol.130：279-94，“过继T细胞疗法用于癌症(Adoptive T Cell Therapy forCancer)；Feldman等(2015)肿瘤学研讨会(Seminars in Oncol.)42(4)：626-39“过继细胞疗法-肿瘤-浸润淋巴细胞，T细胞受体和嵌合抗原受体(Adoptive Cell Therapy-Tumor-Infiltrating Lymphocytes，T-Cell Receptors，and Chimeric Antigen Receptors)”；Clinical Trial NCT01174121，“使用肿瘤浸润淋巴细胞的免疫疗法用于患转移癌的患者(Immunotherapy Using Tumor Infiltrating Lymphocytes for Patients WithMetastatic Cancer)”；Tran等(2014)Science344(6184)641-645，“在上皮癌患者中基于突变-特异性CD4+ T细胞的癌症免疫疗法(Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial caneer)”。
CAR-T细胞
在本发明的一个实施方式中，表达正交受体的T细胞是T-细胞(例如，人T-细胞)，其被修饰为表面表达嵌合抗原受体(‘CAR-T’细胞)。在一个实施方式中，修饰的T细胞是同种异体CAR-T细胞。在同种异体CAR-中在一些实施方式中，同种异体CAR-T被修饰为去除内源TCRa和TCRb功能。
如本文所定义的，“CAR”指的是包含多个功能结构域的嵌合多肽，其从氨基端到羧基端的序列依次排列为：(a)包含抗原结合结构域(ABD)的胞外结构域(ECD)，任选地包含“铰链”结构域；(b)跨膜结构域(TD)；和(c)一个或多个胞质信号转导结构域(CSD)，其中上述结构域可以任选地由一个或多个间隔子结构域连接。CAR还可进一步包括信号肽序列，其通常在翻译后处理过程中被去除，并在用包含编码CAR的核酸序列的表达载体转化的细胞表面呈递CAR。CAR可以按照本领域众所周知的原理制备。参见，例如，Eshhaar等，美国专利号7,741,465 B1，2010年6月22日授权；Sadelain，等(2013)Cancer Discovery3(4)：388-398；Campana和Imai(美国专利号8,399,645，2013年3月19日授权)Jensen和Riddell(2015)《新编免疫学观点》(Current Opinions in Immunology)33：9-15；Gross，等(1989)PNAS(USA)86(24)：10024-10028；Curran，等(2012)J Gene Med 14(6)：405-15；Brogdon，等(美国专利10.174,095，2019年1月8日授权)Guedan，等(2019)嵌合抗原受体的工程改造和设计(Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors)Molecular Therapy：Methods&Clinical Development第12卷：145-156。
在本发明的实践中有用的CAR可以按照本领域众所周知的原理制备。参见，例如，Eshhaar等，美国专利号7,741,465 B1，2010年6月22日授权；Sadelain，等(2013)CancerDiscovery 3(4)：388-398(嵌合抗原受体(CAR)设计的基本原则(The basic principlesof chimeric antigen receptor(CAR)design))；Jensen和Riddell(2015)《新编免疫学观点》(Current Opinions in Immunology)33：9-15(设计嵌合抗原受体以有效地安全地靶向肿瘤(Designing chimeric antigen receptors to effectively and safely targettumors))；Gross，等(1989)PNAS(USA)86(24)：10024-10028(免疫球蛋白-T-细胞受体嵌合分子作为功能性受体的表达与抗体类型特异性(Expression of immunoglobulin-T-cellreceptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-typespecificity))；Curran，等(2012)J Gene Med 14(6)：405-15。关于本发明的上下文中CAR的构造及其功能结构域的考虑将在下文中讨论。
信号序列
本发明的CAR可以包含信号肽。本发明的实践中可以使用任何真核信号肽序列。该信号肽可以衍生自表面表达的蛋白质的天然信号肽。在本发明的一个实施方式中，CAR的信号肽是选自下组的信号肽：人血清白蛋白信号肽、催乳素白蛋白信号肽、人IL2信号肽、人胰蛋白酶原-2、人CD-5、人免疫球蛋白κ轻链、人天青杀素(azurocidin)、Gaussia荧光素酶及其功能衍生物。使用信号肽以增加分泌效率的具体的氨基酸取代描述于Stern，等(2007)细胞和分子生物学趋势(Trends in Cell and Molecular Biology)2：1-17和Kober，等(2013)Biotechnol Bioeng.1110(4)：1164-73。替代地，信号肽可以是根据已经建立的原则制备的合成序列。参见例如Nielsen，等(1997)Protein Engineering10(1)：1-6(原核和真核信号肽的鉴定和其裂解位点的预测(Identification of prokaryotic and eukaryoticsignal peptides and prediction of their cleavage sites))；Bendtsen，等(2004)J.Mol.Biol 340(4)：783-795(改进的信号肽预测信号P3.0(Improved Prediction ofSignal Peptides SignalP 3.0))；Petersen，等(2011)Nature Methods8：785-796(信号P4.0；从跨膜区分辨信号肽(Signal P4.0；discriminating signal peptides fromtransmembrane regions))。
胞外抗原结合结构域
如本文所用，术语抗原结合结构域(ABD)是指包含特异性结合至靶细胞表面表达的至少一个抗原的至少一个结合结构域的多肽。在一些实施方式中，ABD包含具有两个结合结构域的多肽，其选择性地结合至靶细胞表面的同一或两个不同抗原。ABD可以是任何多肽，其可以特异性结合至靶细胞表面表达的一个或多个抗原。ABD是多肽，其
CAR的ABD可以是单价或多价的，包含特异性地结合至细胞表面肿瘤抗原的一个或多个(如1、2或3个)多肽序列(如scFv、VHH、配体)。在一些实施方式中，肿瘤抗原和包含选择性地结合至这种细胞表面肿瘤的ABD的CAR在本领域是已知的(参见，例如，Dotti，等，Immunol Rev.2014年1月；257(1)。本发明的方法和组合物与CAR疗法偶联使用，其中CAR的ABD特异性结合肿瘤抗原，包括但不限于CD123、CD19、CD20、BCMA、CD22、CD30、CD70、LewisY、GD3、GD3、间皮素、ROR CD44、CD171、EGP2、EphA2、ErbB2、ErbB3/4、FAP、FAR IL1IRa、PSCA、PSMA、NCAM、HER2、NY-ESO-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、间皮素、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(FRa)和Wnt1抗原。与这些靶标反应的抗体在文献中是众所周知的，本领域的技术人员能够从这些抗体中分离出CDR，用于构建单链抗体的多肽序列(例如scFv、CDR移植的VHH等)，其可以被纳入CAR的ABD。
在一个实施方式中，ABD是单链Fv(ScFv)。ScFv是包含通过肽接头共价连接的抗体的免疫球蛋白重链和轻链的可变区的多肽(Bird，等(1988)Science242：423-426；Huston，等(1988)PNAS(USA)85：5879-5883；S-z Hu，等(1996)Cancer Research，56，3055-3061；Ladner，美国专利号4946778，授权于1990年8月7日)。抗靶向抗原ScFv的制备包括鉴定针对靶向抗原的单克隆抗体，而抗靶向抗原ScFv就是由该单克隆抗体衍生而来。单克隆抗体的产生和杂交瘤的分离是本领域技术人员众所周知的技术。参见例如，《单克隆抗体：实验室手册(Monoclonal Antibodies：A Laboratory Manual)》，第二版第7章(E.Greenfield，编2014年，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)).可以通过共同给予例如明矾、铝盐或弗氏、SP-21等本领域众所周知的佐剂来增强免疫反应。产生的抗体可以通过本领域众所周知的技术(如噬菌体展示和定向进化)进行优化，以选择具有特定所需特征的抗体。参见，例如Barbas，等(1991)PNAS(USA)88：7978-82；Ladner，等美国专利号5,223,409，授权于1993年6月29日；Stemmer，W.(1994)Nature 370：389-91；Garrard美国专利号5,821,047，授权于1998年10月13日；Camps，等(2003)PNAS(USA)100(17)：9727-32；Dulbecco美国专利号4,593,002，授权于1986年6月3日；McCafferty美国专利号6,806,079，授权于2004年10月19日；McCafferty，美国专利号7,635,666授权于2009年12月22日；McCafferty，美国专利号7,662,557授权于2010年2月16日；McCafferty，美国专利号7,723,271授权于2010年5月25日；和/或McCafferty美国专利号7,732,377。基于单克隆抗体序列的ScFv的产生在本领域中是众所周知的。参见，例如，《蛋白质方案手册(The Protein Protocols Handbook)》，JohnM.Walker，编(2002)胡马纳出版社(Humana Press)第150节“单链抗体的细菌表达、纯化和表征(Bacterial Expression，Purification and Characterization of Single-ChainAntibodies)”Kipriyanov，S。
在另一个实施方式中，ABD是通过用靶向抗原免疫骆驼或美洲驼获得的单域抗体。Muyldermans，S.(2001)Reviews in Molecular Biotechnology 74：277-302。
替代地，ABD可以通过生成肽文库和分离具有所需靶细胞抗原结合特性的化合物而完全合成。这些技术在科学文献中是众所周知的。参见例如，Wigler，等美国专利号6303313B1，授权于199年11月12日；Knappik，等美国专利号6696248 B1，授权于2004年2月24日，Binz，等(2005)Nature Biotechnology 23：1257-1268；Bradbury，等(2011)NatureBiotechnology29：245-254。
除了ABD对靶细胞表达的抗原有亲和力外，ARD也可以对其他分子有亲和力。例如，本发明的ARD可以是双特异性的，即有能力提供对第一靶细胞表达的抗原和第二靶细胞表达的抗原的特异性结合。二价单链多肽的例子在本领域是已知的。参见例如，Thirion，等(1996)European J.of Cancer Prevention5(6)：507-511；DeKruif和Logenberg(1996)J.Biol.Chem 271(13)7630-7634；和Kay，等美国专利申请公开号2015/0315566，公开于2015年11月5日。
ABD可以具有对于多于一个靶抗原的亲和力。例如，本发明的ABD可以包含嵌合双特异性结合成员，即有能力提供对第一靶细胞表达的抗原和第二靶细胞表达的抗原的特异性结合。嵌合双特异性结合成员的非限制性例子包括双特异性抗体、双特异性偶联单克隆抗体(mab)2、双特异性抗体片段(例如F(ab)2、双特异性scFv、双特异性双抗、单链双特异性双抗等)、双特异性T细胞接合(bispecific T cell engager)(BiTE)、双特异性偶联单域抗体、mica抗体(micabody)及其突变体等。嵌合双特异性结合成员的非限制性例子还包括那些描述于以下的嵌合双特异性试剂：Kontermann(2012)MAbs.4(2)：182-197；Stamova等(2012)Antibodies，1(2)，172-198；Farhadfar等(2016)Leuk Res.49：13-21；Benjamin等Ther Adv Hematol.(2016)7(3)：142-56；Kiefer等Immunol Rev.(2016)270(1)：178-92；Fan等(2015)J Hematol Oncol.8：130；May等(2016)Am J Health Syst Pharm.73(1)：e6-e13。在一些实施方式中，嵌合的双特异性结合成员是二价单链多肽。参见例如，Thirion，等(1996)European J.of Cancer Prevention 5(6)：507-511；DeKruif和Logenberg(1996)J.Biol.Chem271(13)7630-7634；和Kay，等美国专利申请公开号2015/0315566，公开于2015年11月5日。
在一些情况下，嵌合双特异性结合成员可以是CAR T细胞衔接子(adapter)。如本文所用，“CAR T细胞衔接子”是指表达的双特异性多肽，它与CAR的抗原识别结构域结合，并将CAR重定向到第二抗原。通常，CAR T细胞衔接子将具有两个结合区，一个对于其所指向的CAR上的表位特异，第二个表位指向结合伴侣，当结合时，转导结合信号激活CAR。有用的CART细胞衔接子包括但不限于：例如，那些描述于：Kim等(2015)J Am Chem Soc.137(8)：2832-5；Ma等(2016)Proc Natl Acad Sci U S A.113(4)：E450-8和Cao等(2016)Angew Chem IntEd Engl.55(26)：7520-4。
在一些实施方式中，针对GD2的抗原结合结构域是抗体的抗原结合部分，其选自mAb14.18、14G2a、chl4.18、hul4.18、3F8、hu3F8、3G6、8B6、60C3、10B8、ME36.1和8H9，参见例如，WO2012033885、WO2013040371、WO2013192294、WO2013061273、WO2013123061、WO2013074916和WO201385552。在一些实施方式中，针对GD2的抗原结合结构域是抗体的抗原结合部分，描述于美国公开号：20100150910或PCT公开号：WO 2011160119。另一个抗体是S58(抗-GD2，成神经细胞瘤)。CotaraTM[佩莱格林制药公司(PerregrincePharmaceuticals)]是单克隆抗体，被描述用于治疗复发性成胶质细胞瘤。
在一些实施方式中，CAR的ABD包括scFvFMC-63和其人源化变体
接头/铰链
在本发明实践中有用的CAR可以任选地包括连接CAR的结构域的一个或多个多肽间隔子，特别是ARD与CAR的跨膜结构域之间的接头。虽然不是CAR结构的必要元件，但通常认为包含间隔子结构域以促进ARD的抗原识别是需要的。Moritz和Groner(1995)GeneTherapy 2(8)539-546。与本文所述的CAR-T T细胞技术一起使用时，术语“接头”、“接头结构域”和“接头区”是指长度约为1至100个氨基酸的寡肽或多肽区，其将本发明的CAR的任何结构域/区连接在一起。接头可包含甘氨酸和丝氨酸等柔性残基，以便相邻的蛋白结构域可以自由地相对移动。当需要确保两个相邻的结构域互相不发生空间干扰时，某些实施方式包括使用较长的接头。
在一些实施方式中，接头是不可裂解的，而在其他实施方式中，接头是可裂解的(例如，2A接头(例如T2A))，2A-样接头或其功能性等同物，以及上述的组合。没有特定的氨基酸序列是实现间隔子功能所必需的，但间隔子的典型特性是柔性，以使ARD自由移动，以促进靶向抗原识别。类似地，人们发现，在保留CAR功能的同时，间隔子的长度也有相当的宽松性。Jensen和Riddell(2014)Immunol.Review 257(1)127-144。在本发明的实践中有用的CAR的构造中用作间隔子的序列包括但不限于IgG1的铰链区、免疫球蛋白1CH2-CH3区、IgG4铰链-CH2-CH3、IgG4铰链-CH3和IgG4铰链。铰链和跨膜结构域可以来自同一分子，如CD8-a的铰链和跨膜结构域。Imai，等(2004)Leukemia18(4)：676-684。考虑本发明的实施方式，其中接头包括微小核糖核酸病毒(picornaviral)2A-样接头、猪捷申病毒(porcineteschovirus)的CHYSEL序列(P2A)、明脉扁刺蛾病毒(T2A)或其组合、变体和功能性等同物。在仍进一步的实施方式中，接头序列包括Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)-pro(2B)基序，其导致2A甘氨酸和2B脯氨酸之间的裂解。
跨膜结构域
CAR可进一步包括跨膜结构域，将ABD(或接头，如果采用的话)接合至CAR的胞内胞质结构域。跨膜结构域包含任何在真核细胞膜中热力学上稳定的多肽序列。跨膜结构域可以来自天然存在的跨膜蛋白的跨膜结构域，也可以是合成的。在设计合成的跨膜结构域时，优选使用有利于α-螺旋结构的氨基酸。用于构建CAR的跨膜结构域包含约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、22、23或24个有利于形成具有α-螺旋二级结构的氨基酸。具有有利于α-螺旋构象的氨基酸在本领域是众所周知的。参见，例如Pace，等(1998)Biophysical Journal75：422-427。特别有利于α螺旋构象的氨基酸包括甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸。在一些实施方式中，CAR跨膜结构域可来自于I型跨膜蛋白的跨膜结构域，如CD3ζ、CD4、CD8、CD28等。
胞内信号转导结构域
CAR多肽的胞质结构域包括一个或多个胞内信号结构域。在一个实施方式中，胞内信号结构域包括在抗原受体接合后启动信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列，以及其功能性衍生物和亚片段。胞质信号转导结构域，例如那些来自T细胞受体ζ-链的信号域，被用作CAR的部分，以在嵌合受体与靶抗原接合后产生刺激T淋巴细胞增殖和效应功能的信号。胞质信号转导结构域的例子包括但不限于CD27的胞质结构域、CD28的胞质结构域S、CD137的胞质结构域(也被称为4-1BB和TNFRSF9)、CD278的胞质结构域(也称为ICOS)，PI3激酶的p110α、β或6催化亚基、人CD3ζ-链，CD134的胞质结构域(也称为OX40和TNFRSF4)、FceR1γ和β链、MB1(Igα)链、B29(Igβ)链等等)、CD3多肽(δ、Δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和其他参与T细胞转导的分子，如CD2、CD5和CD28。
共刺激结构域
在一些实施方式中，CAR还提供共刺激结构域。术语“共刺激结构域”，是指CAR的刺激结构域，通常是胞内结构域(endodomain)，其提供二级非特异性激活机制，通过该机制传播一级特异性刺激。共刺激结构域指的是CAR的部分，其能增强记忆细胞的增殖、生存或发育。共刺激的例子包括在通过T细胞受体的抗原特异性信号转导后，抗原非特异性T细胞共刺激，和在通过B细胞受体的信号转导后，抗原非特异性B细胞共刺激。共刺激，例如T细胞共刺激，以及所涉及的因素已描述于Chen和Flies.(2013)Nat Rev Immunol13(4)：227-42。在本发明的一些实施方式中，CSD包括一个或多个TNFR超家族成员，CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其组合。
CAR通常称为第一代、第二代、第三代或第四代。术语第一代CAR指的是CAR其中的胞质结构域仅通过单个信号转导结构域传递来自抗原结合的信号，例如来自CD3ζ链或IgEFcεR1γ的高亲和力受体的信号转导结构域。该结构域包含一个或三个基于免疫受体酪氨酸的激活基序[ITAM]，用于抗原依赖的T细胞激活。基于ITAM的激活信号赋予T细胞对抗原结合反应进行裂解靶肿瘤细胞和分泌细胞因子的能力。第二代CAR除了CD3ζ信号外，还包括共刺激信号。递送的共刺激信号的共同递送增强细胞因子的分泌和CAR转导的T细胞诱导的抗肿瘤活性。共刺激结构域通常是相对于CD3ζ结构域的膜近端。第三代CAR包括三方信号转导结构域，例如包括CD28、CD3ζ、OX40或4-1BB信号转导区。在第四代，或“武装(armoredcar)”CAR T细胞被进一步修饰，以表达或阻断分子和/或受体，以增强免疫活性，例如表达IL-12、IL-18、IL-7和/或IL-10；4-1BB配体、CD-40配体。
包含可纳入本发明的CAR的胞内信号转导结构域的例子包括(氨基到羧基)：CD3ζ；CD28-41BB-CD3ζ；CD28-OX40-CD3ζ；CD28-41BB-CD3ζ；41BB-CD-28-CD3ζ和41BB-CD3ζ。
在本发明的实践中有用的CAR架构的例子包括但不限于以下例子，这些例子阐释了一种或多种ECD靶向结构域和CAR的ICD的架构，包括但不限于：
抗-CD20-CD3ζ
抗-CD20-CD28-41BB-CD3ζ，
抗-CD20-CD28-CD3ζ
抗-CD20-CD28-OX40-CD3ζ
抗-CD20-CD28-41BB-CD3ζ
抗-CD20-OX40-CD3ζ
抗-CD20-OX40-CD28-CD3ζ
抗-CD20-41BB-CD3ζ
抗-CD20-ICOS-CD3ζ
抗-CD20-ICOS-41BB-CD3ζ
抗-CD20-41BB-ICOS-CD3ζ
抗-CD20-41BB-OX40-CD3ζ，
抗-CD20-41BB-CD28-CD3ζ.
抗-HER2-CD3ζ
抗-HER2-CD28-41BB-CD3ζ，
抗-HER2-CD28-CD3ζ
抗-HER2-CD28-OX40-CD3ζ
抗-HER2-CD28-41BB-CD3ζ
抗-HER2-OX40-CD3ζ
抗-HER2-OX40-CD28-CD3ζ
抗-HER2-41BB-CD3ζ
抗-HER2-ICOS-CD3ζ
抗-HER2-ICOS-41BB-CD3ζ
抗-HER2-41BB-ICOS-CD3ζ
抗-HER2-41BB-OX40-CD3ζ，
抗-HER2-41BB-CD28-CD3ζ.
抗-CEA-CD3ζ
抗-CEA-CD28-41BB-CD3ζ，
抗-CEA-CD28-CD3ζ
抗-CEA-CD28-OX40-CD3ζ
抗-CEA-CD28-41BB-CD3ζ
抗-CEA-OX40-CD3ζ
抗-CEA-OX40-CD28-CD3ζ
抗-CEA-41BB-CD3ζ
抗-CEA-ICOS-CD3ζ
抗-CEA-ICOS-41BB-CD3ζ
抗-CEA-41BB-ICOS-CD3ζ
抗-CEA-41BB-OX40-CD3ζ，
抗-CEA-41BB-CD28-CD3ζ.
抗-VEGF-CD3ζ
抗-VEGF-CD28-41BB-CD3ζ，
抗-VEGF-CD28-CD3ζ
抗-VEGF-CD28-OX40-CD3ζ
抗-VEGF-CD28-41BB-CD3ζ
抗-VEGF-OX40-CD3ζ
抗-VEGF-OX40-CD28-CD3ζ
抗-VEGF-41BB-CD3ζ
抗-VEGF-ICOS-CD3ζ
抗-VEGF-ICOS-41BB-CD3ζ
抗-VEGF-41BB-ICOS-CD3ζ
抗-VEGF-41BB-OX40-CD3ζ，
抗-VEGF-41BB-CD28-CD3ζ.
抗-CD19-CD3ζ
抗-CD19-CD28-41BB-CD3ζ，
抗-CD19-CD28-CD3ζ
抗-CD19-CD28-OX40-CD3ζ
抗-CD19-CD28-41BB-CD3ζ
抗-CD19-OX40-CD3ζ
抗-CD19-OX40-CD28-CD3ζ
抗-CD19-41BB-CD3ζ
抗-CD19-ICOS-CD3ζ
抗-CD19-ICOS-41BB-CD3ζ
抗-CD19-41BB-ICOS-CD3ζ
抗-CD19-41BB-OX40-CD3ζ，
抗-CD19-41BB-CD28-CD3ζ.
抗-EGFR-CD3ζ
抗-EGFR-CD28-41BB-CD3ζ，
抗-EGFR-CD28-CD3ζ
抗-EGFR-CD28-OX40-CD3ζ
抗-EGFR-CD28-41BB-CD3ζ
抗-EGFR-OX40-CD3ζ
抗-EGFR-OX40-CD28-CD3ζ
抗-EGFR-41BB-CD3ζ
抗-EGFR-ICOS-CD3ζ
抗-EGFR-ICOS-41BB-CD3ζ
抗-EGFR-41BB-ICOS-CD3ζ
抗-EGFR-41BB-OX40-CD3ζ，和
抗-EGFR-41BB-CD28-CD3ζ.
抗-CD19-CD3ζ
抗-CD19-CD28-41BB-CD3ζ，
抗-CD19-CD28-CD3ζ
抗-CD19-CD28-OX40-CD3ζ
抗-CD19-CD28-41BB-CD3ζ
抗-CD19-OX40-CD3ζ
抗-CD19-OX40-CD28-CD3ζ
抗-CD19-41BB-CD3ζ
抗-CD19-ICOS-CD3ζ
抗-CD19-ICOS-41BB-CD3ζ
抗-CD19-41BB-ICOS-CD3ζ
抗-CD19-41BB-OX40-CD3ζ，
抗-CD19-41BB-CD28-CD3ζ.
抗-PSMA-CD3ζ
抗-PSMA-CD28-41BB-CD3ζ，
抗-PSMA-CD28-CD3ζ
抗-PSMA-CD28-OX40-CD3ζ
抗-PSMA-CD28-41BB-CD3ζ
抗-PSMA-OX40-CD3ζ
抗-PSMA-OX40-CD28-CD3ζ
抗-PSMA-41BB-CD3ζ
抗-PSMA-ICOS-CD3ζ
抗-PSMA-ICOS-41BB-CD3ζ
抗-PSMA-41BB-ICOS-CD3ζ
抗-PSMA-41BB-OX40-CD3ζ，
抗-PSMA-41BB-CD28-CD3ζ.
抗-BCMA-CD3ζ
抗-BCMA-CD28-41BB-CD3ζ，
抗-BCMA-CD28-CD3ζ
抗-BCMA-CD28-OX40-CD3ζ
抗-BCMA-CD28-41BB-CD3ζ
抗-BCMA-OX40-CD3ζ
抗-BCMA-OX40-CD28-CD3ζ
抗-BCMA-41BB-CD3ζ
抗-BCMA-ICOS-CD3ζ
抗-BCMA-ICOS-41BB-CD3ζ
抗-BCMA-41BB-ICOS-CD3ζ
抗-BCMA-41BB-OX40-CD3ζ，
抗-BCMA-41BB-CD28-CD3ζ.
抗-间皮素-CD3ζ
抗-间皮素-CD28-41BB-CD3ζ，
抗-间皮素-CD28-CD3ζ
抗-间皮素-CD28-OX40-CD3ζ
抗-间皮素-CD28-41BB-CD3ζ
抗-间皮素-OX40-CD3ζ
抗-间皮素-OX40-CD28-CD3ζ
抗-间皮素-41BB-CD3ζ
抗-间皮素-ICOS-CD3ζ
抗-间皮素-ICOS-41BB-CD3ζ
抗-间皮素-41BB-ICOS-CD3ζ
抗-间皮素-41BB-OX40-CD3ζ，
抗-间皮素-41BB-CD28-CD3ζ.
[抗-CD19&抗-CD20]-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD20]-CD28-41BB-CD3ζ，
[抗-CD19&抗-CD20]-CD28-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD20]-CD28-OX40-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD20]-CD28-41BB-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD20]-OX40-CD3ζ
[[抗-CD19&抗-CD20]-OX40-CD28-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD20]-41BB-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD20]-ICOS-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD20]-ICOS-41BB-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD20]-41BB-ICOS-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD20]-41BB-OX40-CD3ζ，
[抗-CD19&抗-CD20]-41BB-CD28-CD3ζ.
抗-EGFR-CD3ζ
抗-EGFR-CD28-41BB-CD3ζ，
抗-EGFR-CD28-CD3ζ
抗-EGFR-CD28-OX40-CD3ζ
抗-EGFR-CD28-41BB-CD3ζ
抗-EGFR-OX40-CD3ζ
抗-EGFR-OX40-CD28-CD3ζ
抗-EGFR-41BB-CD3ζ
抗-EGFR-ICOS-CD3ζ
抗-EGFR-ICOS-41BB-CD3ζ
抗-EGFR-41BB-ICOS-CD3ζ
抗-EGFR-41BB-OX40-CD3ζ，和
抗-EGFR-41BB-CD28-CD3ζ.
[抗-CD19&抗-CD22]-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD22]-CD28-41BB-CD3ζ，
[抗-CD19&抗-CD22]-CD28-CD3ζ
[抗-CD 19&抗-CD22]-CD28-OX40-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD22]-CD28-41BB-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD22]-OX40-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD22]-OX40-CD28-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD22]-41BB-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD22]-ICOS-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD22]-ICOS-41BB-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD22]-41BB-ICOS-CD3ζ
[抗-CD19&抗-CD22]-41BB-OX40-CD3ζ，和
[抗-CD19&抗-CD22]-41BB-CD28-CD3ζ。
此外，除了更常规的第一和第二代CAR，术语CAR还包括CAR变体，包括但不限于分裂CAR、开-开关CAR、双特异性或串联CAR、抑制性CAR(iCAR)和诱导多能干(iPS)CAR-T细胞。
术语“分裂CAR”是指CAR，其中CAR的胞外部分、ABD和胞质信号转导结构域存在于两个不同的分子上。CAR变体还包括开-开关CAR，其为条件性可激活的CAR，例如，包括分裂CAR，其中分裂CAR的两个部分的条件性异源二聚体是药理学受控的。CAR分子及其衍生物(即CAR变体)被描述于，例如，在PCT申请号US2014/016527、US1996/017060、US2013/063083中；Fedorov等Sci Transl Med(2013)；5(215)：215ra172；Glienke等Front Pharmacol(2015)6：21；Kakarla和Gottschalk 52Cancer J(2014)20(2)：151-5；Riddell等Cancer J(2014)20(2)：141-4；Pegram等Cancer J(2014)20(2)：127-33；Cheadle等Immunol Rev(2014)257(1)：91-106；Barrett等Annu Rev Med(2014)65：333-47；Sadelain等CancerDiscov(2013)3(4)：388-98；Cartellieri等，J Biomed Biotechnol(2010)956304；其公开内容通过引用全文纳入本文。
术语“双特异性或串联CAR”是指包含能够放大或抑制一级CAR的活性的二级CAR结合结构域的CAR。
术语“抑制性嵌合抗原受体”或“iCAR”在本文中可互换使用，指的是CAR其中结合iCAR使用双重抗原靶向，通过配备二级CAR结合结构域的抑制性信号转导结构域的第二抑制性受体的接合，关闭活性CAR的激活，导致一级CAR的激活的抑制。可以通过使用引入T细胞的抗原特异性iCAR来保护脱靶组织，从而将对肿瘤和脱靶组织都具有特异性的T细胞只限制在肿瘤上(Fedorov，等Science Translational Medicine，5：215)抑制性CARs(iCAR)被设计为通过抑制性受体信号转导模块的激活来调控CAR-T细胞的活性。这种方法组合了两个CAR的活性，其中一个产生显性负信号，限制由激活受体激活的CAR-T细胞的反应。iCAR当结合至仅由正常组织表达的特异性抗原时，可以关闭抵消激活子CAR反应。通过这种方式，iCAR-T细胞可以区分癌细胞和健康细胞，并以抗原选择性的方式可逆地阻断转导的T细胞的功能。iCAR中的CTLA-4或PD-1胞内结构域触发T淋巴细胞上的抑制性信号，导致细胞因子产生减少，靶细胞裂解效率降低，淋巴细胞运动性改变。在一些实施方式中，iCAR包括单链抗体(如scFv、VHH等)，其特异性结合至抑制性抗原，一个或多个胞内衍生自ICD免疫抑制受体(包括但不限于CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4(CD244)、BTLA(CD272)、KIR、TIM-3、TGFβ受体显性负类似物(dominant negative analog)等)，通过跨膜区，在识别抗原时特异性地抑制T细胞功能。术语“串联CAR”或“TanCAR”是指通过两个嵌合受体的接合介导T细胞的双特异性激活的CAR，这两个嵌合受体设计为对两个不同的肿瘤相关抗原的独立接合反应而递送刺激或共刺激性信号。
通常，嵌合抗原受体T-细胞(CAR-T细胞)是通过转导编码CAR的表达载体而重组修饰的T细胞，基本根据上述教导。
在一些实施方式中，工程改造的T细胞对于被治疗的个体是同种异体的。Graham等(2018)Cell7(10)E155。在一些实施方式中同种异体工程改造T细胞是完全HLA匹配的。然而并非所有患者都具有完全匹配的供者，适合所有患者的独立于HLA类型的细胞产品提供了替代方案。
由于细胞产品可能由对象自身的T细胞组成，所以要给予对象的细胞群必然是可变的。因而鉴定最优浓度此外，由于CAR-T细胞试剂是可变的，对这种试剂的反应也可能不同，因此涉及到持续监测和管控与治疗有关的毒性，其通过在给予CAR-T细胞治疗之前进行药物免疫抑制或B细胞耗竭的过程来管理。通常，至少将要给予1x106个细胞/kg，至少1x107个细胞/kg，至少1x108个细胞/kg，至少1x109个细胞/kg，至少1x1010个细胞/kg，或更多，通常受收集期间获得的T细胞数量限制。工程改造细胞可以在任何生理上可接受的介质中通过任何方便的给药途径输注给对象，通常是血管内，尽管其也可以通过其他途径引入细胞能够找到适合生长的部位。
如果用于本发明的实践的T细胞是同种异体T细胞，这种细胞可以被修饰以减少移植物抗宿主病。例如，本发明的工程改造细胞可以是通过基因编辑技术实现TCRαβ受体敲除的。TCRαβ是异二聚体，α和β链都需要存在才能被表达。一个基因编码α链(TRAC)，2个基因编码β链，因此为此目的缺失TRAC基因座KO。许多不同的方法被用于完成此缺失，例如CRISPR/Cas9；兆核酸酶(meganuclease)；工程改造的I-CreI归巢内切核酸酶等。参见，例如，Eyquem等(2017)Nature543：113-117，其中TRAC编码序列被CAR编码序列替代；和Georgiadis等(2018)Mol.Ther.26：1215-1227，其将CAR表达与TRAC破坏通过规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9连接起来，而不直接将CAR纳入TRAC基因座。防止GVHD的替代性策略修饰T细胞以表达TCRαβ信号转导的抑制剂，例如使用CD3ζ的截短形式作为TCR抑制分子。
编码CAR的载体：
在本发明的实践中有用的CAR-T细胞的制备是通过用包含编码本文所述的CAR多蛋白的核酸序列的表达载体转化分离的T细胞而实现的。该载体可以是包含RNA或DNA的非病毒载体或病毒载体。
表达载体来实现CD122和/或CAR的表达。在某些实施方式中，载体可以是病毒载体或非病毒载体。术语″非病毒载体″是指自主复制的染色体外环状DNA分子，与正常基因组不同，在非选择性条件下对细胞生存不是必要的，能够在目标细胞中实现编码序列的表达。质粒是非病毒载体的例子。为了促进目标细胞的转染，可以在有利于摄取非病毒载体的条件下使目标细胞直接暴露于非病毒载体。促进哺乳动物细胞摄取外源核酸的条件的例子在本领域是众所周知的，包括但不限于化学手段(例如
Figure BDA0003850638240001661
赛默飞世尔科技(Thermo-Fisher Scientific))，高盐，磁场(电穿孔)。
表达盒：重组表达载体包含一个或多个表达盒以指导正交CD122和/或CAR的表达。术语“表达盒是指”编码所需多肽的重组(或合成)核酸构建体，其操作性地连接至合适的遗传控制元件，能够在用表达载体转化的宿主细胞中实现该多肽的表达。术语″操作性连接″是指功能关系中多核苷酸元件的连接。当将核酸序列置于与另一核酸序列的功能性关系中时，核酸序列被“操作性地连接”。例如，如果启动子控制多肽的转录，它就与编码序列操作性地连接；如果核糖体结合点的位置允许翻译，它就与编码序列操作性地连接，如果编码信号肽的核酸以融合蛋白的形式表达，并参与将融合蛋白引导到细胞膜上或多肽的分泌，它就与编码这种多肽的核酸序列操作性地连接。通常，操作性连接的核苷酸序列是连续的。然而，由于增强子通常在与启动子相隔几千碱基的情况下发挥功能，而且内含子序列的长度不一，一些多核苷酸元件可能是操作性连接的，但在物理上却很遥远，甚至可能从不同的等位基因或染色体上反式发挥作用。
控制元件
为实现表达所需的控制元件的具体类型将取决于要转化的细胞类型。在本发明的实践中，要转化的细胞是哺乳动物的T细胞。术语控制元件统称为启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(″IRES″)、增强子、提高mRNA表达水平的转录增强子、编码合适的核糖体结合位点的序列、以及终止转录和翻译的序列，它们影响受体细胞中多肽编码序列的复制、转录和翻译。表达载体通常还包含复制起点，允许载体独立于宿主细胞进行复制。
在表达盒的一个实施方式中，要表达的核酸序列(例如编码正交CD122和/或CAR的)操作性地连接至启动子序列。术语″启动子″在其常规意义上指的是控制编码序列转录的起始和速率的核苷酸序列。启动子包含RNA聚合酶结合的位点，也包含调节因子(如阻遏物或转录因子)的结合位点。启动子可以是天然存在的或合成的。启动子可以是组成型活性的，反应于外部刺激激活的(诱导型)，在特定细胞类型或细胞状态下活性的(组织特异性或肿瘤特异性)启动子，和/或可调节的启动子。术语″诱导型启动子″是指优选(或仅)在某些条件下和/或反应于外部化学或其他刺激时促进生物活性多肽的转录的启动子。诱导型启动子的例子的例子在科学文献中是已知的(参见，例如，Yoshida等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，230：426-430(1997)；Iida等，J.Virol.，70(9)：6054-6059(1996)；Hwang等，J.Virol.，71(9)：7128-7131(1997)；Lee等，Mol.Cell.Biol.，17(9)：5097-5105(1997)；和Dreher等，J.Biol.Chem.，272(46)：29364-29371(1997)。辐射诱导型启动子的例子包括EGR-1启动子。Boothman等，卷138，补充页S68-S71(1994)。在一些实施方式中，启动子是组织特异性启动子。在一些实施方式中，启动子是肿瘤特异性启动子。组织特异性启动子和肿瘤特异性启动子是本领域众所周知的，例如，胰腺特异性启动子(Palmiter等，Cell，50：435(1987))、肝特异性启动子(Rovet等，J.Biol.Chem.，267：20765(1992)；Lemaigne等，J.Biol.Chem.，268：19896(1993)；Nitsch等，Mol.Cell.Biol.，13：4494(1993))，胃特异性启动子(Kovarik等，J.Biol.Chem.，268：9917(1993))，垂体特异性启动子(Rhodes等，Genes Dev.，7：913(1993))和前列腺特异性启动子(Henderson等，美国专利号5,698,443，授权于1997年12月16日)。在一个实施方式中，启动子是磷酸甘油酶激酶(PGK)启动子。在一个实施方式中，启动子是延伸酶因子1α(EF1a)启动子。在一个实施方式中，启动子是肌增生性(myoproliferative)肉瘤病毒(增强子负控制区缺失d1587rev引物结合位点取代)(“MND”)启动子。
在本发明的实践中，当表达多个多肽(例如CAR和正交CD122多肽)时，每个多肽可以操作性地连接至表达控制序列(单顺反子的(monocistronic))，或多个多肽可以由多顺反子构建体编码，其中多个多肽在一个表达控制序列的控制下表达。可用于促进多顺反子表达的元件的例子，内部核糖体进入位点(IRES)元件或口蹄疫病毒蛋白2A(FMVD2A)系统或T2A肽。多种IRES位点是已知的(参见例如Doudna JA，Sarnow P.通过病毒内部核糖体进入位点的翻译起始(Translation initiation by viral internal ribosome entrysites.)于：《生物学和药学中的翻译控制(Translational Control in Biology and Medicine)》；Mathews等，编著冷泉港，NY：冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)；2007.第129-154页；http：//www.IRESite.org)。IRES元件的例子包括鼻病毒(rhinovirus)、脑心肌炎病毒(encepahlomyocardits virus)、脊髓灰质炎病毒的微小核糖核酸病毒IRES、口蹄疫病毒的口蹄疫病毒(aphthovirus)IRES、蟋蟀麻痹病毒(cricket paralysis virus)(CrPV)的IRES、甲型肝炎病毒的甲型肝炎病毒IRES、丙型肝炎病毒的丙型肝炎IRES、猪瘟(swine fever)或牛腹泻病毒的瘟病毒(pestivirus)IRES、蟋蟀麻痹病毒(cripavirus)IRES，以及哺乳动物的IRES元件，如成纤维细胞生长因子-1IRES、成纤维细胞生长因子-2IRES、PDGF IRES、VEGF IRES、IGF-2IRES。使用IRES元件通常会导致多顺反子信息的第二蛋白的表达量显著降低。使用FMDV2A系统可以更高效地生产下游蛋白，因为多个蛋白首先被表达为融合蛋白，其中包含自身酶解(autoproteolytic)FMDV2A结构域，其将多聚蛋白裂解为功能性亚基。Ryan和Drew(1994)EMBO J.13(4)：928-933。根据多顺反子编码序列的构建，特别是为了促进限制性核酸内切酶位点，使用FMDV2A系统经常可能在上游蛋白的羧基末端增加少量的氨基酸。.
任选的编码的蛋白质：挽救基因/药物抗性：
编码CAR的表达载体和/或正交CD122可以任选地提供包含编码“挽救”基因的核酸序列的一个或多个表达盒。“挽救基因”是核酸序列，其在转导细胞中的表达使细胞易受外部因素的杀伤，或导致细胞中的毒性状况，使细胞被杀伤。提供挽救基因可以实现转导细胞的选择性细胞杀伤。因此，当所述构建体被纳入哺乳动物对象的细胞中时，挽救基因提供了附加的安全预防措施，以防止转导细胞的不需要的扩散或复制能力载体系统的影响。在一个实施方式中，挽救基因是胸苷激酶(TK)基因(参见例如，Woo，等美国专利号5,631,236授权于1997年5月20日，以及Freeman，等美国专利号5,601,818，授权于1997年2月11日)，其中表达TK基因产物的细胞容易受到给予更昔洛韦(gancyclovir)的选择性杀伤。替代地，诱导型启动子可以操作性地连接至促凋亡基因，以通过给予诱导诱导型启动子表达的外源性药剂来促进靶向杀伤细胞。
表达载体可以任选地提供附加的基因，如编码耐药性的基因，可以包括在其中，以便选择或筛选重组载体的存在。这样的附加基因可以包括，例如，编码新霉素抗性、多药耐药性、胸苷激酶、p-半乳糖苷酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)和氯霉素乙酰转移酶的基因。
在一个实施方式中，非病毒载体可以在非病毒递送系统中提供。非病毒递送系统通常是复合物以促进用核酸载物转导目标细胞，其中核酸与试剂复合，所述试剂例如阳离子脂质(DOTAP、DOTMA)、表面活性剂、生物制品(明胶、壳聚糖)、金属(金、磁铁)和合成聚合物(PLG、PEI、PAMAM)。非病毒递送系统的许多实施方式是本领域众所周知的，包括脂质载体系统(Lee等(1997)Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.14：173-206)；聚合物涂覆脂质体(Marin等，美国专利号5,213,804，授权于1993年5月25日；Woodle，等，美国专利号5,013,556，授权于1991年5月7日)；阳离子脂质体(Epand等，美国专利号5,283,185，授权于1994年2月1日；Jessee，J.A.，美国专利号5,578,475，授权于1996年11月26日；Rose等，美国专利号5,279,833，授权于1994年1月18日；Gebeyehu等，美国专利号5,334,761，授权于1994年8月2日)。通过使用转座子/转座酶系统，如所谓的睡美人(Sleeping Beauty)(SB)转座子系统，可以大大增加用非病毒载体在T细胞中表达CAR序列的效率(参见例如，Geurts，等(2003)Mol Ther8(1)：108-117)和piggyBac系统(参见例如，Manuri，等(2010)Human GeneTherapy21(4)：427-437)可用于将包含编码抗-靶向抗原CAR的核酸序列的非病毒载体(如质粒)稳定地引入到人T细胞。
在非病毒基因递送以创建CAR的替代性程序中，通过转染编码CAR的mRNA载体来实现，基本根据Rabinovich等人(美国专利号10,155,038BS于2018年12月18日授权，其全部教导通过引用纳入)的教导。在一些实施方式中，当编码CAR的载体是RNA载体时，任选地RNA载体可以编码一个或多个附加的生物活性分子。例如，当载体是RNA载体时，该载体可以编码一个或多个RNA，对细胞进行重编程以阻止一个或多个抗原的表达。例如，如下文更详细地讨论的那样，RNA可以是一种干扰RNA，防止编码抗原的mRNA如CTLA-4或PD-1的表达。本方法可用于制备通用供体细胞。用于改变同种异体抗原表达的RNA可单独使用或与导致靶细胞去分化的RNA组合。在一些实施方式中，生物活性RNA是短干扰RNA(siRNA)。siRNA是一种双链RNA，其可以诱导序列特异性转录后基因沉默，从而减少甚至抑制基因表达。在一个例子中，siRNA引发同源RNA分子的特异性降解，例如mRNA，在siRNA和靶RNA之间的序列同一性区域内。例如，WO 02/44321公开了当与3′悬垂端碱基配对时，能够对靶mRNA进行序列特异性降解的siRNA，本文通过引用纳入制作这些siRNA的方法。
在另一个实施方式中，CAR和/或正交受体的表达载体可以是病毒载体。如本文所用，术语病毒载体以其常规含义使用是指不具有蛋白质合成或能量产生机制的任何一种专性胞内寄生生物，通常是指任何一种通常用于向哺乳动物细胞递送外源转基因的包膜或非包膜动物病毒。病毒载体可以是复制能力型(例如，基本上野生型)，条件性复制型的(重组工程改造以在某些条件下复制)或复制缺陷型的(在没有能够补充病毒的缺失功能的细胞系的情况下，基本上不能复制)。病毒载体可以拥有某些修饰，使其″选择性复制″，即它在某些细胞类型或表型的细胞状态下优先复制，例如癌症。在本发明的实践中有用的病毒载体系统包括，例如，天然存在的或重组的病毒载体系统。在本发明实践中有用的病毒的例子包括重组修饰的包膜或非包膜DNA和RNA病毒。例如，病毒载体可以衍生自人或牛的腺病毒、疫苗病毒、慢病毒、疱疹病毒、腺相关病毒、人免疫缺陷病毒、辛德毕斯病毒(sindbis virus)和逆转录病毒(包括但不限于劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))以及乙肝病毒的基因组。通常，感兴趣的基因被插入此类载体，以允许基因构建体的包装，通常伴随着病毒的基因组序列，然后感染敏感的宿主细胞，导致感兴趣的基因(例如靶向抗原)的表达。此外，编码抗-靶向抗原CAR的表达载体也可以是mRNA载体。当采用病毒载体系统进行转染时，优选逆转录病毒或慢病毒表达载体来转染T细胞，因为使用这些系统可以增强基因转移到T细胞的效率，从而减少培养大量T细胞用于临床应用的时间。特别地，γ逆转录病毒特别优选用于临床级T细胞的遗传修饰，并已被证明具有治疗效果。Pule，等(2008)Nature Medicine14(11)：1264-1270。类似地，自失活慢病毒载体也是有用的，因为它们已经被证明可以整合到静息T细胞中。June，等(2009)Nat Rev Immunol9(10)：704-716。
编码CAR和/或正交受体的表达载体除了编码CAR和/或正交受体外，还可以编码一个或多个多肽。在本发明的实践中，当表达多个多肽时，每个多肽可以操作性地连接至表达控制序列(单顺反子的(monocistronic))，或多个多肽可以由多顺反子构建体编码，其中多个多肽在一个表达控制序列的控制下表达。在一个实施方式中，表达载体包含多顺反子表达盒，其包含编码CAR和正交CD122的核酸序列。
在一个实施方式中，编码CAR和/或正交受体的表达载体任选地进一步编码本文所述的一种或多种多肽补充剂。在一些实施方式中，编码靶向抗原的表达载体可以任选地进一步编码如本文所述的一个或多个多肽补充剂。免疫调节剂。在本发明的实践中有用的免疫调节剂的例子包括但不限于细胞因子。这种细胞因子的例子是白细胞介素，包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-10、IL-12、TNF-α、干扰素α、干扰素α-2b、干扰素β、干扰素γ、GM-CSF、MIP1-α、MIP1-β、MIP3-α、TGF-β和其他能够调节免疫反应的合适的细胞因子。所表达的细胞因子可以定向为胞内表达，或用信号序列表达为胞外呈递或分泌。据报道，CAR与IL-12的共同给予导致了增强的抗肿瘤疗效(参见Yeku，等Scientiffc Reports卷.7，文章号：10541(2017)在线公开于2017年9月05日。
替代使用多个表达盒，编码CAR和正交CD122多肽的核酸序列可由多顺反子构建体编码，该表达盒包括核酸序列CAR和正交CD122多肽，采用内部核糖体进入位点(IRES)元件或口蹄疫病毒蛋白2A(FMVD2A)以促进在目标细胞中共表达。在一个实施方式中，表达载体包含两个表达盒，第一表达盒包含编码CAR的核酸序列操作性地连接至表达控制序列，第二表达盒包含编码正交CD122的核酸序列操作性地连接至表达控制序列，在每种情况下，表达控制序列在用于承载CAR和正交CDl22表达的细胞类型(如T细胞)中具有功能性。在一个实施方式中，表达载体包含多顺反子表达盒，其包含编码CAR和正交CD122的核酸序列。
该表达载体可以任选地提供附加的表达盒，其包含编码“挽救”基因的核酸序列。“挽救基因”是核酸序列，其在细胞中的表达使细胞易受外部因素的杀伤，或导致细胞中的毒性状况，使细胞被杀伤。提供挽救基因可以实现转导细胞的选择性细胞杀伤。因此，当所述构建体被纳入哺乳动物对象的细胞中时，挽救基因提供了附加的安全预防措施，以防止转导细胞的不需要的扩散或复制能力载体系统的影响。在一个实施方式中，挽救基因是胸苷激酶(TK)基因(参见例如，Woo，等美国专利号5,631,236授权于1997年5月20日，以及Freeman，等美国专利号5,601,818，授权于1997年2月11日)，其中表达TK基因产物的细胞容易受到给予更昔洛韦(gancyclovir)的选择性杀伤。
用编码抗-靶向抗原CAR的表达载体转化T-组胞
用编码抗靶向抗原CAR的表达载体转化T-细胞的先决条件是T细胞的来源。T细胞可以从要治疗的哺乳动物获得，也可以是本领域内可得的各种T细胞系。用于转化的T细胞通常从要治疗的哺乳动物身上获得。T细胞可以获自哺乳动物主体的许多来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、脾脏组织和肿瘤。在一个实施方式中，T细胞是通过抽血获得的。在另一个实施方式中，T细胞从外周血中分离出来，特定的T细胞(例如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞)可以通过本领域众所周知的选择技术分离出来，例如与抗-CD3/抗-CD28偶联珠的孵育。
用编码抗-靶向抗原CAR的表达载体转化选择的T细胞群，基本根据见下文教导。转化后，T细胞可以被激活和扩增，通常使用如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开第2006/0121005号中所述的方法。通常，通过培养细胞扩增本发明的T细胞，其与刺激CD3 TCR复合物相关信号的试剂(例如抗-CD3抗体)和刺激T细胞表面共刺激分子的试剂(例如抗-CD28抗体)的表面接触。适合用于T细胞培养的条件在本领域中是众所周知的。Lin，等(2009)Cytotherapy11(7)：912-922(用于监测表型和多功能抗原-特异性CD4和CD8 T细胞反应的强力人T细胞培养方法的优化和验证(Optimization and validation of a robusthuman T-cell culture method for monitoring phenotypic and polyfunctionalantigen-specific CD4 and CD8 T-cell responses))；Smith，等(2015)Clinical&Translational Immunology 4：e31，在线公开于2015年1月16日(“使用新型无异体(Xeno-free)CTS免疫细胞血清替换进行用于过继免疫疗法的人T细胞离体扩增(“Ex vivoexpansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement”))。目标细胞在支持生长所必需的条件下维持，例如，合适的温度(例如37°)和气氛(例如空气加5％CO2)
遗传修饰免疫细胞以表达正交受体
为替代从载体表达正交受体，可以使用本领域已知的技术修饰细胞的基因组以表达正交受体。在一些实施方式中，本发明的组合物和方法包括通过使用至少一种核酸内切酶对人免疫细胞进行遗传修饰的步骤，以促进将式1的正交hCD122的ECD的修饰纳入人免疫细胞的基因组序列。如本文所用，术语“核酸内切酶”是用于指能够催化裂解DNA或RNA分子(优选DNA分子)内核酸之间的键的野生型或变体酶。本发明的核酸内切酶具有序列特异性，因为它们识别并裂解特定“靶”序列的核酸分子。核酸内切酶通常根据靶序列的特异性和序列同一性特征的程度进行分类。当这种核酸内切酶具有长度大于约12个碱基对(bp)(更优选14-55bp)的多核苷酸识别位点时，被称为“稀有切割(rare-cutting)”核酸内切酶。稀有切割核酸内切酶可用于灭活基因座处的基因或通过同源重组(HR)整合转基因，即通过诱导基因座处的DNA双链断裂(DSB)和通过基因修复机制在该基因座处插入外源DNA。稀有切割核酸内切酶的例子包括归巢核酸内切酶(Grizot，等(2009)Nucleic Acids Research 37(16)：5405-5419)、由工程改造的锌指结构域融合体产生的嵌合锌指核酸酶(ZFN)(PorteusM和Carroll D.，使用锌指核酸酶的基因靶向(Gene targeting using zinc fingernucleases)(2005)Nature Biotechnology 23(3)：967-973、TALE-核酸内切酶，来自CRISPR系统的Cas9核酸内切酶作为或修饰的限制性核酸内切酶以扩展序列特异性(Eisenschmidt，等2005；33(22)：7039-7047)。在本发明的一些实施方式中，免疫细胞(例如表达式1的正交受体ECD的CAR-T)被修饰以通过失活T细胞受体(TCR)的多于一个组分来降低同种异体反应性(alloreactivity)。在Galetto，等公开于2013年11月28日的美国专利申请公开号US 2013/015884A1中描述了T细胞的这种修饰的方法，在Galetto，等授权于2019年10月21日的美国专利号10,426,795B2中描述了通过表达pTα导致恢复功能性CD3复合物的TCRα缺陷T细胞的方法，其教导通过引用纳入本文。
正交CAR-T细胞与正交配体的用途
在一些实施方式中，本发明提供了从混合的细胞群中选择性扩增表达正交CD122受体的工程改造的细胞群的方法，该方法包括在促进工程改造细胞的扩增的条件下，使混合的细胞群与本发明的IL2直向同源物接触。在一个实施方式中，当表达正交CD122受体的CAR-T细胞时，通过使用本文所述的IL2直向同源物，表达正交受体的CAR-T细胞也被从背景或混合的转导和非转导细胞群中选择性扩增。用于治疗性应用的T细胞的扩增通常包括培养细胞，其与提供刺激CD3 TCR复合物相关信号的试剂，和刺激T细胞表面共刺激分子的试剂的表面接触。在常规实践中，在给予细胞治疗产品之前，刺激工程改造的T细胞，通过将其与CD3/D28接触，特别是在制备用于临床应用的CAR-T细胞中。多种或市售的产品可以用于促进基于珠的T细胞激活，包括但不限于
Figure BDA0003850638240001751
CTS
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CD3/28(生命科技公司(Life Technologies，Inc.)加利福尼亚州卡尔巴斯德)或Miltenyi
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GMPExpAct Treg珠，或Miltenyi MACS GMP TransActTM CD3/28珠(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec，Inc.))。适合用于T细胞培养的条件在本领域中是众所周知的。Lin，等(2009)Cytotherapy11(7)：912-922；Smith，等(2015)Clinical&TranslationalImmunology 4：e31，在线发表于2015年1月16日。目标细胞在支持生长所必需的条件下维持，例如，合适的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO2)其中含有表达CD122正交受体的工程改造的T细胞的混合细胞群在存在一定浓度的IL2直向同源物的情况下进行培养。在一些实施方式中培养至少2小时、或者至少3小时、或者至少4小时、或者至少6小时、或者至少8小时、或者至少12小时、或者至少24小时、或者至少48小时、或者至少72小时，或者更多。在这种离体情况下，IL2直向同源物的浓度足以诱导该细胞群的细胞增殖。T细胞增殖可以很容易地通过显微镜方法评估，确定IL2直向同源物的最佳浓度将取决于IL2直向同源物对正交CD122受体的相对活性。
当细胞在体外与IL2直向同源物接触时，该细胞因子被添加到工程改造的细胞中，其剂量和时间足以激活来自受体的信号转导，这可以利用天然细胞机制，例如辅助蛋白、共受体等。可以使用任何合适的培养基。这样激活的细胞可用于任何需要的目的，包括与确定抗原特异性、细胞因子概况分析等有关的实验目的，以及用于体内递送。
在体内进行接触时，将有效剂量的工程改造的细胞，包括但不限于修饰为表达正交CD122受体的CAR-T细胞，与正交细胞因子(例如IL2)的给予相结合或在给予之前输给受者，并允许在其原生环境中，例如在淋巴结等处接触T细胞。剂量和频率可根据试剂；给予方式；IL2直向同源物的性质等而变化。本领域的技术人员将理解，这种指南将根据个体的情况进行调整。剂量也可因给予途径而变化，例如，肌肉内注射、腹膜内注射、皮内注射、皮下注射、静脉注射等。通常，给予至少约104个工程改造细胞/kg、至少约105个工程改造细胞/kg、至少约106个工程改造细胞/kg、至少约107个工程改造细胞/kg，或更多。
当工程改造细胞是T细胞时，增强的免疫反应可以表现为T细胞对受者中存在的靶细胞的T细胞的细胞溶解反应的增加，例如对肿瘤细胞、感染细胞的消除；自身免疫性疾病症状的减少；等等。在一些实施方式中，当工程改造的T细胞群被给予对象时，在给予工程改造T细胞群之前、或与给予工程改造T细胞群组合，向对象提供免疫抑制疗程。这种免疫抑制方案的例子包括但不限于全身性皮质类固醇(例如，甲基强的松龙)。B细胞耗竭的治疗包括按既定的临床给药指南静脉内免疫球蛋白(IVIG)，以恢复血清免疫球蛋白的正常水平。在一些实施方式中，在给予本发明的CAR-T细胞疗法之前，对象任选地经历淋巴清除方案。这种淋巴清除方案的一个例子由以下组成：给予对象氟达拉滨(每天30mg/m2静脉内给予，持续4天)和环磷酰胺(从第一剂氟达拉滨开始，每天500mg/m2 IV，持续2天)。
工程改造T细胞可以被提供在适合治疗用途(例如用于人治疗)的药物组合物中。包含这些细胞的治疗制剂可以冷冻，或用生理上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂制备用于给药(《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)第16版，Osol，A.Ed.(1980))，以水性溶液的形式。细胞将以符合良好医学实践的方式进行配制、确定剂量和给药。就此而言的考量因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体临床状况、病因、试剂递送部位、给药方法、给药安排，以及医务人员所知的其它因素。
细胞可以通过任何合适的方式给药，通常是肠胃外。肠胃外输注包括肌内、静脉内(推注或缓慢输注)、动脉内、腹膜内、鞘内或皮下给予。在典型的实践中，工程改造T细胞可以在生理上可接受的介质中输注给对象，通常是血管内，尽管其也可以被引入任何其他方便的部位，在那里细胞可以找到适合生长的部位。通常，至少将要给予1x105个细胞/kg，至少1x106个细胞/kg，至少1x107个细胞/kg，至少1x108个细胞/kg，至少1x109个细胞/kg，或更多，通常受收集期间获得的T细胞数量限制。
例如，用于本发明的实践中的hoRb细胞的典型给药范围为每疗程每kg对象体重约1x105至5x108个活细胞。因此，根据体重调整后，每个疗程人对象给予活细胞的典型范围为约1x106至约1x1013个活细胞，或者约5x106至约5x1012个活细胞，或者约1x107至约1x1012个活细胞，或者约5x107到约1x1012个活细胞，或者约1x108到约1x1012个活细胞，或者约5x108到约1x1012个活细胞，或者约1x109到约1x1012个活细胞。在一个实施方式中，每个疗程细胞的剂量在2.5-5x109个活细胞的范围内。
疗程可以是单剂量或在一段时期内的多剂量。在一些实施方式中，细胞以单剂量给予。在一些实施方式中，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、30、60、90、120或180天的时间内，以两次或更多次分剂量给予细胞。在这种分次给药方案中，工程改造细胞的数量在每次给药中可以是相同的，也可以以不同水平提供。在时间段内的多天给药方案可由熟练技术人员(如医生)提供，监测细胞的给予，考虑对象对治疗的反应，包括治疗的不良反应及其调节，如上文所述。
不存在淋巴清除
本发明的组合物和方法还提供了一种在没有事先淋巴清除的情况下用T细胞疗法(特别是CAR T细胞疗法)治疗对象的方法。淋巴清除通常与CAR T细胞疗法共同在对象中进行，因为随后给予混合细胞群和给予非特异性试剂(例如IL2)以扩增对象体内的工程改造细胞群，组合给予细胞治疗产品的行为，导致显著的全身性毒性(包括细胞因子释放综合征或“细胞因子风暴”)，这是因为通过给予导致广泛激活的试剂，以及细胞治疗产品本身中相当部分的非工程改造细胞，而导致免疫细胞广泛增殖和激活。本发明的方法和组合物通过以下两点(或其中之一)避免了这一重大障碍：当采用前述离体方法时，提供基本纯化的工程改造细胞群，基本上没有非工程改造细胞的污染，和/或用IL2直向同源物选择性激活和扩增工程改造T细胞，这大大减少非特异性增殖剂如IL2的脱靶效应。
例如，在目前CAR-T细胞治疗的临床实践中，CAR-T细胞通常与淋巴清除(例如，通过给予阿仑单抗(单克隆抗-CD52)、嘌呤类似物等)组合给予，以促进CAR-T细胞在宿主免疫恢复之前的扩增。在一些实施方式中，CAR-T细胞可被修饰为对阿仑单抗具有抗性。在本发明的一个方面，目前采用的与CAR-T疗法相关联的淋巴清除可由表达CAR-T的正交配体避免或减少。如上所述，通常采用淋巴清除来实现CAR-T细胞的扩增。然而，淋巴清除也与CAR-T细胞治疗的主要副作用有关。由于正交配体提供了选择性扩增特定T细胞群的手段，可以减少在给予表达正交配体的CAR-T之前对淋巴清除的需要。本发明使CAR-T细胞治疗的实践在给予表达正交配体的CAR-T之前无需或减少了淋巴清除。
在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗患有可通过CAR-T细胞疗法治疗的疾病、紊乱或病症(例如癌症)的对象的方法，其通过给予表达正交配体的CAR-T，在给予正交配体CAR-T之前不进行淋巴清除。在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗哺乳动物对象的方法，该对象患有与异常细胞群(例如肿瘤)的存在有关的疾病、紊乱，所述细胞群特征为表达一种或多种表面抗原(例如一种或多种肿瘤抗原)，该方法包括以下步骤：(a)从该个体获得包含T细胞的生物样品；(b)富集生物样品中的T细胞；(c)用一个或多个表达载体转染T细胞，该载体包含编码CAR的核酸序列和编码正交CD122受体的核酸序列，CAR的抗原靶向结构域能够结合至异常细胞群上存在的至少一种抗原；(d)用IL2直向同源物离体扩增表达正交受体的CAR-T细胞群；(e)给予哺乳动物药学有效量的表达正交受体的CAR-T细胞；以及(f)通过给予治疗有效量的IL2直向同源物调节表达正交CD122受体的CAR-T细胞的生长，该IL2可选择性地结合至CAR-T细胞上表达的正交CD122受体。在一个实施方式中，上述方法与开始CAR-T细胞治疗疗程之前的哺乳动物的淋巴清除或免疫抑制相关联。在另一个实施方式中，上述方法是在没有对哺乳动物进行淋巴清除和/或免疫抑制的情况下实施的。
使用正交配体在一段时间内维持正交免疫细胞的阈值水平：
在本公开的使用正交免疫细胞与正交配体组合的方法的实践的一个实施方式中，正交配体以一定量给予对象，以维持人对象的循环中的治疗有效量的正交细胞的循环水平，其中治疗有效量的正交循环水平为每kg对象体重约10,000至约1,000,000个正交细胞、或约20,000至约500,000个正交细胞、或约30,000至约300,000个正交细胞、或约30,000至约200,000个正交细胞、或约20,000至约150,000个正交细胞、或约50,000至约150,000个正交细胞，通过周期性给予正交配体，例如式1的正交配体维持一段时间，至少一周、或至少两周、或至少3周、或至少一个月、或至少两个月、或至少3个月或至少6个月或至少9个月或至少12个月。工程改造细胞的定量可以很容易地通过传统的基于抗体的方法确定。过高的CRP和铁蛋白(Ferritin)水平在临床上被用来评估CRS的发病情况，通常由主治医生进行监测，以确定正交细胞的最佳可耐受和有效水平以及维持这种水平所需的正交配体水平，因为人对象的反应可能是可变的。为个体患者鉴定最优正交细胞循环浓度属于普通细胞疗法的从业者的技能范围。
如前所述，本发明提供治疗对于初始正交细胞疗法治疗表现出显著临床缓解证据的对象的方法，通过给予维持方案防止复发或复现，其中低剂量的正交配体被定期给予对象以维持低循环水平的正交细胞，其为约10,000至约500,000个正交细胞、或约10,000至约200,000个正交细胞、或约10,000至约100,000个正交细胞(每kg对象体重)，通过周期性给予正交配体，例如式1的正交配体，维持至少一周、或至少两周、或至少3周、或至少一个月、或至少两个月、或至少3个月或至少6个月或至少9个月或至少12个月的维持阶段期。
正交CAR-T细胞与正交配体的用途
在一些实施方式中，本发明提供了从混合的细胞群中选择性扩增表达正交CD122受体的工程改造的细胞群的方法，该方法包括在促进工程改造细胞的扩增的条件下，使混合的细胞群与本发明的IL2直向同源物接触。在一个实施方式中，当表达正交CD122受体的CAR-T细胞时，通过使用本文所述的IL2直向同源物，表达正交受体的CAR-T细胞也被从背景或混合的转导和非转导细胞群中选择性扩增。用于治疗性应用的T细胞的扩增通常包括培养细胞，其与提供刺激CD3 TCR复合物相关信号的试剂，和刺激T细胞表面共刺激分子的试剂的表面接触。在常规实践中，在给予细胞治疗产品之前，刺激工程改造的T细胞，通过将其与CD3/D28接触，特别是在制备用于临床应用的CAR-T细胞中。多种或市售的产品可以用于促进基于珠的T细胞激活，包括但不限于
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GMPExpAct Treg珠，或Miltenyi MACS GMP TransActTM CD3/28珠(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec，Inc.))。适合用于T细胞培养的条件在本领域中是众所周知的。Lin，等(2009)Cytotherapy 11(7)：912-922；Smith，等(2015)Clinical&TranslationalImmunology 4：e31，在线发表于2015年1月16日。目标细胞在支持生长所必需的条件下维持，例如，合适的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO2)其中含有表达CD122正交受体的工程改造的T细胞的混合细胞群在存在一定浓度的IL2直向同源物的情况下进行培养。在一些实施方式中培养至少2小时、或者至少3小时、或者至少4小时、或者至少6小时、或者至少8小时、或者至少12小时、或者至少24小时、或者至少48小时、或者至少72小时，或者更多。在这种离体情况下，IL2直向同源物的浓度足以诱导该细胞群的细胞增殖。T细胞增殖可以很容易地通过显微镜方法评估，确定IL2直向同源物的最佳浓度将取决于IL2直向同源物对正交CD122受体的相对活性。
当细胞在体外与IL2直向同源物接触时，该细胞因子被添加到工程改造的细胞中，其剂量和时间足以激活来自受体的信号转导，这可以利用天然细胞机制，例如辅助蛋白、共受体等。可以使用任何合适的培养基。这样激活的细胞可用于任何需要的目的，包括与确定抗原特异性、细胞因子概况分析等有关的实验目的，以及用于体内递送。
在体内进行接触时，将有效剂量的工程改造的细胞，包括但不限于修饰为表达正交CD122受体的CAR-T细胞，与正交细胞因子(例如IL2)的给予相结合或在给予之前输给受者，并允许在其原生环境中，例如在淋巴结等处接触T细胞。剂量和频率可根据试剂；给予方式；IL2直向同源物的性质等而变化。本领域的技术人员将理解，这种指南将根据个体的情况进行调整。剂量也可因给予途径而变化，例如，肌肉内注射、腹膜内注射、皮内注射、皮下注射、静脉注射等。通常，给予至少约104个工程改造细胞/kg、至少约105个工程改造细胞/kg、至少约106个工程改造细胞/kg、至少约107个工程改造细胞/kg，或更多。
当工程改造细胞是T细胞时，增强的免疫反应可以表现为T细胞对受者中存在的靶细胞的T细胞的细胞溶解反应的增加，例如对肿瘤细胞、感染细胞的消除；自身免疫性疾病症状的减少；等等。在一些实施方式中，当工程改造的T细胞群被给予对象时，在给予工程改造T细胞群之前、或与给予工程改造T细胞群组合，向对象提供免疫抑制疗程。这种免疫抑制方案的例子包括但不限于全身性皮质类固醇(例如，甲基强的松龙)。B细胞耗竭的治疗包括按既定的临床给药指南静脉内免疫球蛋白(IVIG)，以恢复血清免疫球蛋白的正常水平。在一些实施方式中，在给予本发明的CAR-T细胞疗法之前，对象任选地经历淋巴清除方案。这种淋巴清除方案的一个例子由以下组成：给予对象氟达拉滨(每天30mg/m2静脉内给予，持续4天)和环磷酰胺(从第一剂氟达拉滨开始，每天500mg/m2 IV，持续2天)。
工程改造T细胞可以被提供在适合治疗用途(例如用于人治疗)的药物组合物中。包含这些细胞的治疗制剂可以冷冻，或用生理上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂制备用于给药(《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)第16版，Osol，A.Ed.(1980))，以水性溶液的形式。细胞将以符合良好医学实践的方式进行配制、确定剂量和给药。就此而言的考量因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体临床状况、病因、试剂递送部位、给药方法、给药安排，以及医务人员所知的其它因素。
细胞可以通过任何合适的方式给药，通常是肠胃外。肠胃外输注包括肌内、静脉内(推注或缓慢输注)、动脉内、腹膜内、鞘内或皮下给予。在典型的实践中，工程改造T细胞可以在生理上可接受的介质中输注给对象，通常是血管内，尽管其也可以被引入任何其他方便的部位，在那里细胞可以找到适合生长的部位。通常，至少将要给予1x105个细胞/kg，至少1x106个细胞/kg，至少1x107个细胞/kg，至少1x108个细胞/kg，至少1x109个细胞/kg，或更多，通常受收集期间获得的T细胞数量限制。
例如，用于本发明的实践中的hoRb细胞的典型给药范围为每疗程每kg对象体重约1x105至5x108个活细胞。因此，根据体重调整后，每个疗程人对象给予活细胞的典型范围为约1x106至约1x1013个活细胞，或者约5x106至约5x1012个活细胞，或者约1x107至约1x1012个活细胞，或者约5x107到约1x1012个活细胞，或者约1x108到约1x1012个活细胞，或者约5x108到约1x1012个活细胞，或者约1x109到约1x1012个活细胞。在一个实施方式中，每个疗程细胞的剂量在2.5-5x109个活细胞的范围内。
疗程可以是单剂量或在一段时期内的多剂量。在一些实施方式中，细胞以单剂量给予。在一些实施方式中，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、30、60、90、120或180天的时间内，以两次或更多次分剂量给予细胞。在这种分次给药方案中，工程改造细胞的数量在每次给药中可以是相同的，也可以以不同水平提供。在时间段内的多天给药方案可由熟练技术人员(如医生)提供，监测细胞的给予，考虑对象对治疗的反应，包括治疗的不良反应及其调节，如上文所述。
不存在淋巴清除本发明的组合物和方法还提供了一种在没有事先淋巴清除的情况下用T细胞疗法(特别是CAR T细胞疗法)治疗对象的方法。淋巴清除通常与CAR T细胞疗法共同在对象中进行，因为随后给予混合细胞群和给予非特异性试剂(例如IL2)以扩增对象体内的工程改造细胞群，组合给予细胞治疗产品的行为，导致显著的全身性毒性(包括细胞因子释放综合征或“细胞因子风暴”)，这是因为通过给予导致广泛激活的试剂，以及细胞治疗产品本身中相当部分的非工程改造细胞，而导致免疫细胞广泛增殖和激活。本发明的方法和组合物通过以下两点(或其中之一)避免了这一重大障碍：当采用前述离体方法时，提供基本纯化的工程改造细胞群，基本上没有非工程改造细胞的污染，和/或用IL2直向同源物选择性激活和扩增工程改造T细胞，这大大减少非特异性增殖剂如IL2的脱靶效应。
例如，在目前CAR-T细胞治疗的临床实践中，CAR-T细胞通常与淋巴清除(例如，通过给予阿仑单抗(单克隆抗-CD52)、嘌呤类似物等)组合给予，以促进CAR-T细胞在宿主免疫恢复之前的扩增。在一些实施方式中，CAR-T细胞可被修饰为对阿仑单抗具有抗性。在本发明的一个方面，目前采用的与CAR-T疗法相关联的淋巴清除可由表达CAR-T的正交配体避免或减少。如上所述，通常采用淋巴清除来实现CAR-T细胞的扩增。然而，淋巴清除也与CAR-T细胞治疗的主要副作用有关。由于正交配体提供了选择性扩增特定T细胞群的手段，可以减少在给予表达正交配体的CAR-T之前对淋巴清除的需要。本发明使CAR-T细胞治疗的实践在给予表达正交配体的CAR-T之前无需或减少了淋巴清除。
在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗患有可通过CAR-T细胞疗法治疗的疾病、紊乱或病症(例如癌症)的对象的方法，其通过给予表达正交配体的CAR-T，在给予正交配体CAR-T之前不进行淋巴清除。在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗哺乳动物对象的方法，该对象患有与异常细胞群(例如肿瘤)的存在有关的疾病、紊乱，所述细胞群特征为表达一种或多种表面抗原(例如一种或多种肿瘤抗原)，该方法包括以下步骤：(a)从该个体获得包含T细胞的生物样品；(b)富集生物样品中的T细胞；(c)用一个或多个表达载体转染T细胞，该载体包含编码CAR的核酸序列和编码正交CD122受体的核酸序列，CAR的抗原靶向结构域能够结合至异常细胞群上存在的至少一种抗原；(d)用IL2直向同源物离体扩增表达正交受体的CAR-T细胞群；(e)给予哺乳动物药学有效量的表达正交受体的CAR-T细胞；以及(f)通过给予治疗有效量的IL2直向同源物调节表达正交CD122受体的CAR-T细胞的生长，该IL2可选择性地结合至CAR-T细胞上表达的正交CD122受体。在一个实施方式中，上述方法与开始CAR-T细胞治疗疗程之前的哺乳动物的淋巴清除或免疫抑制相关联。在另一个实施方式中，上述方法是在没有对哺乳动物进行淋巴清除和/或免疫抑制的情况下实施的。
使用正交配体随时间推移维持正交免疫细胞的阈值水平：
在本公开的使用正交免疫细胞与正交配体组合的方法的实践的一个实施方式中，正交配体以一定量给予对象，以维持人对象的循环中的治疗有效量的正交细胞的循环水平，其中治疗有效量的正交循环水平为每kg对象体重约10,000至约1,000,000个正交细胞、或约20,000至约500,000个正交细胞、或约30,000至约300,000个正交细胞、或约30,000至约200,000个正交细胞、或约20,000至约150,000个正交细胞、或约50,000至约150,000个正交细胞，通过周期性给予正交配体，例如式1的正交配体，维持至少一周、或至少两周、或至少3周、或至少一个月、或至少两个月、或至少3个月或至少6个月或至少9个月或至少12个月的一段时间。工程改造细胞的定量可以很容易地通过传统的基于抗体的方法确定。过高的CRP和铁蛋白(Ferritin)水平在临床上被用来评估CRS的发病情况，通常由主治医生进行监测，以确定正交细胞的最佳可耐受和有效水平以及维持这种水平所需的正交配体水平，因为人对象的反应可能是可变的。为个体患者鉴定最优正交细胞循环浓度属于普通细胞疗法的从业者的技能范围。
如前所述，本发明提供治疗对于初始正交细胞疗法治疗表现出显著临床缓解证据的对象的方法，通过给予维持方案防止复发或复现，其中低剂量的正交配体被定期给予对象以维持低循环水平的正交细胞，其为每kg对象体重约10,000至约500,000个正交细胞、或约10,000至约200,000个正交细胞、或约10,000至约100,000个正交细胞，通过周期性给予正交配体，例如式1的正交配体，维持至少一周、或至少两周、或至少3周、或至少一个月、或至少两个月、或至少3个月或至少6个月或至少9个月或至少12个月的维持阶段期。
实施例
呈现以下实施例以更充分地说明本发明的优选实施方式。然而，它们不应解释为对本发明范围的限制。
实施例1.人IL2表达载体pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2的产生
人IL2 DNA ORF(Genbank NM_000586.3)被合成(生命技术公司(LifeTechnologies)GeneArt服务，加利福尼亚州卡尔斯巴德)并通过PCR使用Platinum SuperFiII DNA聚合酶试剂盒(货号12361050，赛默飞世尔(ThermoFisher))扩增，按照制造商的方案，并使用引物：
5’TATAGTCAGCGCCACcCATGTACAGGATGCAACTCCTGTC 3’
其纳入NheI限制性位点，和
5’TATAGGGCCCTATCAAGTCAGTGTTGAGATG 3’
其纳入ApaI限制性位点。PCR片段在1％的琼脂糖凝胶(货号54803，隆萨公司(Lonza)，缅因州洛克兰(Rockland，ME))上可视化，从凝胶上切除并纯化，使用QIAquickPCR纯化试剂盒(货号28106，凯杰公司(Qiagen)，德国)，根据制造商的方案。
纯化的PCR片段和哺乳动物表达载体pcDNA 3.1/Hygro(+)(编号V87020，赛默飞世尔)用NheI和ApaI(编号R0111S和编号R0114L，新英格兰生物实验室公司(New EnglandBiolabs)，马萨诸塞州伊普斯维奇)限制酶消化。表达载体用快速去磷酸化试剂盒(编号M0508L，新英格兰生物实验室公司)根据制造商的方案进一步处理。PCR片段被连接至pcDNA3.1/Hygro(+)，使用快速DNA连接试剂盒(编号11635379001，西格玛奥德里奇(SigmaAldrich)，密苏里州圣路易斯)，根据制造商的方案，转化到One Shot TOP10化学感受态的大肠杆菌(编号C404006，生命技术公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)中，接种到LB琼脂板上，其含有100ug/ml羧苄青霉素(编号L1010，Teknova，加利福尼亚州霍利斯特)并在37C生长过夜。
次日，挑出单菌落并用于在含有100ug/ml氨苄青霉素(编号A9626，Teknova)的LB肉汤(编号10855-001，生命技术公司)中开始3ml细菌培养。培养物在37C下生长过夜。
次日，沉淀大肠杆菌(6，000rpm，10分钟，台式离心机，编号5424，Eppendorf，纽约州霍波格)，以及使用QIAprep Spin小抽试剂盒(编号27106，凯杰公司)分离DNA表达载体。质粒DNA经过序列验证(MCLab，加利福尼亚州南旧金山)。
实施例2人IL2 ORTHO表达载体pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2-ORTHO的产生
表达载体将六个突变引入人IL2 ORF(E35S、H36Q、L39V、D40L、Q42K和M43A；所有编号基于全长人IL2 ORF NM_000586.3编号)，基本按照pcDNA3.1/Hygro(+)中人IL2表达载体的实施例1中教导组装，除了以下不同之处：合成用于PCR的初始模板DNA，含有E35S、H36Q、L39V、D40L、Q42K和M43A突变。
实施例3.将突变引入pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2或回复突变引入pcDNA3.1/hygro (+)-huIL2 IRTHO表达载体。
所有突变或回复突变(将pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2-ORTHO中的突变恢复到与野生型IL2 ORF匹配)被引入pcDNA3.1/Hygro(+)-huIL2或pcDNA3.1/Hygro(+)-huIL2-ORTHO表达载体，使用Quik Change II定点诱变试剂盒(编号200524，安捷伦科技公司(AgilentTechnologies)，加利福尼亚州圣克拉拉)基本按照制造商的方案操作。
表5列出了产生的突变，引入突变的模板，以及用于引入突变的引物组。将QuikChange PCR反应转化进大肠杆菌中，以及质粒DNA的分离和序列分析，是使用与产生pcDNA3.1/Hygro-huIL2表达载体基本相同的方案进行的。
Figure BDA0003850638240001861
Figure BDA0003850638240001871
Figure BDA0003850638240001881
Figure BDA0003850638240001891
实施例4.HEK293细胞中的瞬时转染
所有表达载体被瞬时转染进HEK293细胞(编号CRL-1573，ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)。约1E6 HEK293细胞被接种到6孔组织培养板的各孔中的补充有10％胎牛血清(编号SH30071.03，Fisher Scientific，美国伊利诺伊州芝加哥)的2ml DMEM(编号10569044，生命技术公司)中，并在37C和5％CO2下生长过夜。
第二天用Lipofectamine 3000试剂(编号L3000150，生命技术公司)转染细胞，按照制造商的方案，每次转染使用2.5ug DNA、5ul P3000试剂和7.5ul Lipofectamine3000。.转染的细胞在37C，5％CO2生长48-72小时然后收获条件培养基。
实施例5.蛋白质表达分析
通过ELISA测量蛋白质表达，使用人IL2 V-PLEX ELISA试剂盒(编号K151QQD-4，Mesoscale Diagnostics，马里兰州巴尔的摩市)，按照制造商的方案(转染培养基最初以1∶4稀释，然后1∶2连续稀释)。在Meso Quickplex SQ120(Mesoscale Diagnostics)上使用制造商为该ELISA试剂盒预设的设置读取平板。该试剂盒中的人IL2标准品被用来计算条件培养基样品中的近似表达水平。下表8具体示出了表达的蛋白的大约表达水平。
Figure BDA0003850638240001901
Figure BDA0003850638240001911
实施例6.在表达hoCD122的细胞系中直向间源物的活性的评估
在NKL细胞中评估IL2直向同源物的活性(Robertson，等(1996)ExperimentalHematology 24(3)：406-15)。为了产生表达人正交CD122的细胞系(hoNKL hoRB)，根据本领域已知的程序，用编码hoRB CD122和共表达YFP的逆转录病毒(MSCV-hoRb-IRES-YFP)感染NKL细胞。
NKL和NKL hoRB细胞与来自用IL2直向同源物转染的293T细胞的上清接触，如下：细胞被接种在生长培养基中，其由RPMI 1640(赛默飞世尔(ThermoFisher))、10％胎牛血清(赛默飞世尔)、1％青霉素/链霉素(赛默飞世尔)、1％glutamax(赛默飞世尔)组成，0.5x106个细胞/ml。培养2天后，细胞被接种到96孔板(Falcon)中，每孔100μl生长培养基中25,000个细胞。将转染的293T细胞上清在生长培养基中进行两倍的连续稀释，并将100μl各稀释液设双重复加入NKL和NKL hoRB细胞的平板中，最终滴定范围为1∶2至1∶256。平板被转移到加湿培养箱(赛默飞世尔)，在37摄氏度、5％的二氧化碳条件下孵育三天。
将培养箱中的板取出，并在室温保持30分钟。板在400x g离心5分钟并弃去上清。通过每孔添加50μl的Celltiterglo(普洛麦格公司(Promega))的PBS的1∶1稀释液裂解细胞。细胞裂解物在定轨摇床(VWR科学公司(VWRScientific))上以600rpm混合两分钟，然后在室温下保持10分钟。裂解物被转移到黑色透明底的96孔板(科斯塔(Costar))，NKL细胞裂解物(图1)和NKLhoRB细胞裂解物(图2)的发光在Envision 2103多标签读板仪(铂金埃尔默(Perkin Elmer))中以每秒计数读取。
为了比较每种IL2变体对NKL细胞和NKL hoRB细胞增殖的影响，将用上清处理的细胞的celltiterGlo值与单独用生长培养基、来自空载体转染的293T上清、野生型IL2转染、或人正交IL2转染的上清处理的对照细胞获取的值进行比较。这些实验的数据列于附图的图2和3。
实施例7正交T细胞(orthoCAR T cell)在播散性RAJI-luc淋巴瘤小鼠模型中的疗 效
在小鼠白血病模型中评估了正交CAR-T细胞与同源正交配体组合的疗效，具体如下。本研究中使用的CD19嵌合抗原受体蛋白(以下称为“CD19_28z”)具有以下结构：GMCSF受体信号肽、FMC63抗-CD19 scFv、AAA接头、CD28铰链/跨膜/共刺激结构域和CD3ζ。CD19_28z的氨基酸序列如下：
Figure BDA0003850638240001921
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用于本研究的正交T细胞是通过本领域已知的技术产生的，通过用慢病毒载体转染分离的T细胞，前述CD19_28z CAR，T2A接头多肽和具有以下氨基酸序列的人正交CD122正交受体(hoCD122)：
Figure BDA0003850638240001932
Figure BDA0003850638240001941
允许使用单一慢病毒质粒来产生正交CAR-T细胞。所得的正交CAR-T细胞记作CD19_28z正交CAR T细胞(CD19_28z orthoCAR T cell)，也称为SYNCAR-001。
通过Ficoll-Paque分离(全球生命科学解决方案(Global Life SciencesSolutions))从白细胞单采(leukopaks)中分离出健康的供者原代血液单核细胞(PBMC)。CD4和CD8 T细胞用CD4和CD8微珠染色，用MACS磁分离柱(美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotec))分离。用抗-CD3(克隆OKT3，美天旎生物技术公司)和抗-CD28抗体(克隆CD28.2，BD生物科学公司(BD Biosciences))刺激细胞。刺激后48小时，用慢病毒转导细胞，并在含有野生型IL-2(美天旎生物技术公司)的完整OpTmizer T细胞培养基(吉布可公司(Gibco))中维持。转导后48小时，洗涤细胞并保持在含有WT IL-2的培养基中，或换成含有STK-009的培养基。在剩余的制造过程中，细胞被扩增并维持在1E6个细胞/ml。使用Vi-Cell XR(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))进行细胞计数和活力。在第14天，用CryoStor CS10细胞冷冻介质(干细胞技术公司(STEMCELL))冷冻细胞。
这些研究中使用的hoCD122受体的正交同源配体是说明书中描述为STK-009的式1的化合物，其包括单聚乙二醇化的40kD的支链(2x20kD)PEG分子与醛接头，40kDa 2臂支链PEG-醛，该40kDA PEG-醛包含两个20kDA线性PEG分子(
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GL2-400AL3，(NOF美国公司(NOF America Corporation))，北百老汇(One North Broadway)，纽约州白原市(WhitePlains，NY)10601USA。
6至8周龄的雌性NOD scid γ(NSG)小鼠获取自杰克逊实验室(The JacksonLaboratory)，主街600号(600Main Street)，美国缅因州巴港(Bar Harbor，ME USA)04609)。在研究开始前，对动物进行称重并给予临床检查，以确保它们处于良好的健康状态。然后在研究期间对体重进行跟踪。每只笼子里饲养5只动物，适应为9天。动物被分入5组，用CD19_28z正交CART细胞(CD19_28zorthoCAR T cell)(2E6总T细胞，1E6 CAR+T细胞)和STK-009组合治疗，以评估体内组合疗效的潜力。STK-009的皮下给药每隔一天进行一次。研究计划的进行细节见下表9。
Figure BDA0003850638240001951
使用IVIS成像仪(铂金埃尔默(Perkin Elmer))每周两次量化肿瘤细胞数量。小鼠腹膜内注射100ul D-荧光素(PBS中15mg/ml D-荧光素)。通过受控的低流速异氟烷暴露(肯特科学(Kent Scientific)Somnosuite)将小鼠置于麻醉状态。在每只小鼠周围画出一个感兴趣的区域(ROI)，用Living Image软件(铂金埃尔默(Perkin Elmer))测量直接测量发光的总流量(光子/秒)。在研究的第5天对小鼠进行成像，此后每周两次。当检测到小鼠后肢瘫痪时(PBS组的第21天)，小鼠被解剖(taken down)。
在研究的第0天，小鼠被植入5x105个Raji-fluc-puro肿瘤细胞，在尾静脉内注射，并允许其生长5天。肿瘤植入后，5天后开始治疗。在研究的第5天，小鼠腹膜内给予载剂(PBS)或CD19_28z正交CAR T细胞，并组合皮下给予载剂(PBS)、1μg STK-009、2μgS TK-009或10g STK-009。PBS和STK-009的给予每隔一天进行一次，直到第17天(10μg)或第19天(1μg，2μg)。CD19_28z正交CAR T细胞被储存在-80度。在注射当天，CD19_28z正交CAR T细胞被解冻，旋降，并以2E6总T细胞/200微升PBS的浓度重悬。小鼠腹膜内注射正交CAR T细胞(2E6总T细胞，1E6 CAR+ T细胞)。8只小鼠/群皮下给予PBS、CD19_28z正交CAR T细胞和PBS/STK-009。载剂和STK-009每隔一天给予一次，直到第17天(10μg)或第19天(1μg，2μg)。通过下颌颊部出血(mandibular cheek bleed)收集所有动物的血液，并通过在血浆收集管中离心从血液中分离血浆。血液样品立即通过FACS分析分析，血浆在-80度下冷冻以备将来分析。脾、肾、肝和后肢被固定在甲醛中进行IHC处理。
实验结果在附图图3中提供。生物发光数据在下表10中提供。
表10.来自播散性Raji-Luc研究的生物发光数据
Figure BDA0003850638240001971
Figure BDA0003850638240001981
如图3和上表所提供的的数据证明，给予PBS未能控制肿瘤负荷(图3，分图A，第1组和图3，分图B，左上)，导致由于毒性动物需要在研究的大约第21天被处死。CD19_28z正交CAR T细胞的给予导致4/8小鼠产生抗肿瘤缓解(图3，分图A，第2组和图3，分图B，右上)。CD19_28z正交CAR T细胞与STK-009在两种剂量水平(图3，分图A，1μg(第3组，和图3，分图B右下)和2μg(第4组和图3，分图B左下)的组合治疗，与单独的CD19_28z正交CAR T细胞治疗相比，提供了附加的抗肿瘤功能。
如前所述，在前述研究的整个过程中，动物的体重被确定。显著的体重损失是毒性的既定度量。在前述研究中，使用正交CAR-T细胞的治疗组和加和不加正交配体的治疗组，动物的体重普遍耐受性良好，几乎没有证据表明与oCD19 CAR T或STK-009配体有关的全身毒性。
实施例8.皮下Raji淋巴瘤实体瘤模型
对于皮下淋巴瘤模型，6-8周龄的NSG和NSG MHC I/II KO小鼠(杰克逊实验室(Jackson laboratories))皮下注射50：50比率的5E5 Raji-fluc-puro细胞和无酚红基质胶(Matrigel)(康宁(Corning))。4天后，小鼠按所述进行成像，随机分配并皮下注射PBS或STK-009。第5天，小鼠用皮下PBS、SYNCAR T细胞，和或PBS或STK-009治疗。小鼠每隔一天接受一次PBS或STK-009的皮下注射，一旦体重下降到研究开始时体重的90％以下就暂停。肿瘤卡尺测量每周两次，小鼠放血每周一次，用于随后的细胞因子和流式细胞术分析，而体重每周最多测量5次。
实施例9.组织学分析和免疫组织化学
对组织进行抗-人CD4、CD8、颗粒酶B、CD3和抗-小鼠CD11b的免疫组织化学分析。FFPE块以4um的厚度进行切片。玻片在一系列的二甲苯和逐渐稀释的酒精比水中进行脱蜡处理。在室温下使用Dako自动染色机开始IHC染色之前，用基于柠檬酸盐的低pH的抗原修复(retrieval)处理玻片。用3％的过氧化氢淬灭内源性过氧化物酶5分钟，然后在室温下由一抗孵育1小时。组织随后用HRP-偶联的聚合物二级试剂孵育30分钟，然后用DAB或TSA-偶联的Alexa fluor488、594或647来显示信号。人CD3、小鼠CD11b用DAB染色进行显色检测和分析。抗人CD4、CD8和颗粒酶B被复合使用，使用荧光检测进行定量。对于双标记，通过在两个程序之间加入第二抗原修复步骤，以洗脱第一标记物的任何未结合的试剂，按顺序方式进行染色。包括适当的交叉反应对照用于质量检查。荧光染色完成后，用DAPI对组织进行复染(counterstained)，并使用Prolong Gold水性封固剂进行封盖。显色染色完成后，用苏木精进行复染并封盖进行成像。
使用Akoya Vectra多光谱成像系统和Akoya Vectra InForm分析软件套件进行全玻片扫描和信号量化。使用的一抗为：CD4：R&D系统公司(R&DSystems)，AF-379-NA，5ug/ml持续1小时，山羊多克隆；CD8：Dako，M7103，克隆C8/144B，1∶500持续1小时，小鼠多克隆；颗粒酶B：细胞信号技术公司(Cell Signaling)，46890s，克隆D6E9W，1∶500持续1小时，兔单克隆；CD3：实验室版本(Lab Vision)，RM-9107-S，克隆SP7，1∶200持续1小时，兔单克隆；CD11b：Abcam，ab216445，克隆EPR1344，1∶3000持续1小时，兔单克隆，以及，使用的二抗为莱卡(Leica)Powervision抗-兔-HRP，莱卡Powervision抗-小鼠-HRP，Vector Immpress抗-山羊-HRP。
表11播散性Raji-Luc研究的体重数据(g/小鼠)
Figure BDA0003850638240002011
Figure BDA0003850638240002021
Figure BDA0003850638240002031
实施例9：RAJI-luc淋巴瘤再激发小鼠模型
下面的实验是上述实施例8中描述的研究的继续。在第34天，将初始阶段治疗有效治愈的小鼠(CD19正交CAR T细胞+1ug STK-009治疗的小鼠，(图3分图A中的第3组)分成两组，每隔一天连续给予PBS或STK-009。给药时间表见附图图5的分图A。(图4A)。倒三角形代表STK-009的给药剂量。应注意，没有给予附加的CD19正交CAR T细胞，只给予了STK-009的正交配体。
第43天，治疗组小鼠和PBS组小鼠在右后胁腹皮下注射5E5 RAJI-luc细胞和50％的基质胶(matrigel)。如前所述，每两周评估肿瘤负荷。PBS组由于肿瘤负荷过重而在注射后21天(第64天)被安乐死(图4B，第一分图)，2/4的只用PBS治疗的小鼠能够控制肿瘤的生长(图4B，第二分图)，而所有用STK-009治疗的小鼠(4/4)能够控制肿瘤的生长(图2B，第三分图)。
这些数据证明，STK009重新给药能够恢复CAR T细胞的抗肿瘤活性，即使长时间没有抗原或肿瘤配体暴露也是如此。
实施例10.复发后的RAJI-luc淋巴瘤的STK-009治疗
下面的实验是上述实施例8中描述的研究的继续。在第34天，那些用CD19正交CART细胞和PBS治疗的小鼠(即原初STK-009正交配体治疗)和复发的小鼠(图3中的第2组，分图A，n＝4)被分离出来进行进一步治疗。如图5中分图B所示，这些小鼠在研究的第20天左右出现了复发。所有小鼠通过皮下给予1ug pfSTK-009进行治疗，每隔一天一次，持续16天(共8剂，图5分图A)。如前所述，每两周评估肿瘤负荷。
如图5分图B提供的数据所示，研究中的所有四只小鼠在给予STK-009后都出现了肿瘤消退的迹象，同样不需要另给予CAR-T细胞。该数据证明单独给予STK-009能够在从先前的治疗过程中复发的动物中实现CAR-T细胞的抗肿瘤活性。
实施例11.细胞表型评估
以下是对上述实施例8中描述的研究中的治疗组的T细胞数量的评估(Y轴)和表型的评估(图例中提供的阴影)。简言之，在研究第20、25和32天获得样品(X轴)。细胞通过FACS分析进行量化，数据在附图的图6的直方图中提供。如图6提供的数据所示，正交配体(STK-009)能够扩增正交CAR-T细胞并保留干细胞记忆CAR-T细胞群。CAR-T细胞的长效性(Longeivity)在体内受限于分化为效应T细胞命运，分化过程是从干细胞记忆(SCM)表型，到中央记忆(CM)表型，到效应记忆(EM)表型，到效应记忆CD45+RA(EMRA)表型。如附图图6提供的数据所示，停止治疗后，用正交配体(STK-009)处理的正交CAR-T细胞中约60％保留了SCM表型。
实施例12.正交CAR-T/配体系统在皮下实体瘤模型中的效果评估
以下研究是为了评估STK-009(基本按照实施例8制备)与CD19_28z正交CAR T细胞(基本按照实施例8制备)组合在控制NSG小鼠皮下实体瘤RAJI肿瘤生长中的体内疗效。小鼠是如实施例8中提供的获得和处理的。该研究设计提供于下表12。
Figure BDA0003850638240002051
将5E5 Raji-fluc-puro肿瘤细胞(Imanis生命科学(Imanis Life Sciences)#CL-161)以100微升PBS+100微升基质胶(Matrigel)(康宁)的体积皮下注射到右胁腹中。肿瘤植入后，6天后开始治疗。第6天，小鼠腹膜内给予载剂(PBS)或CD19_28z正交CAR T细胞，并组合皮下给予载剂(PBS)、1μg STK-009或10g STK-009。PBS和STK-009的给予每隔一天进行一次。小鼠腹膜内注射CD19_28z正交CAR T细胞(2E6总T细胞，1E6 CAR+ T细胞)。CD19_28z正交CAR T细胞被储存在-80度。在注射当天，CD19_28z正交CAR T细胞被解冻，旋降，并以2E6总T细胞/200微升PBS的浓度重悬。STK-009被等分并储存在-80度，并在给药时用载剂(PBS)进一步稀释。载剂或STK-009每隔一天给予，直到第75天。在第50天，CD19_28z正交CAR T细胞+STK-0091μg组的小鼠的治疗增加到10μg。
每周对小鼠进行成像并进行肿瘤卡尺测量。每周分别用卡尺和IVIS成像仪(铂金埃尔默(Perkin Elmer)测量肿瘤大小和细胞数量。为了成像，小鼠被腹膜内注射100ul D-荧光素(PBS中15mg/ml D-荧光素)。通过受控的低流速异氟烷暴露(肯特科学(KentScientific)Somnosuite)将小鼠置于麻醉状态。在每只小鼠周围画出一个感兴趣的区域(ROI)，用Living Image软件(铂金埃尔默(Perkin Elmer))测量直接测量发光的总流量(光子/秒)。对肿瘤的长和宽进行了卡尺测量。使用公式1/2Lx W2计算肿瘤体积。在第60天停止卡尺测量，因为IVIS成像更灵敏。通过下颌颊部出血(mandibular cheek bleed)收集所有动物的血液，并通过在血浆收集管中离心从血液中分离血浆。血液样品立即通过FACS分析分析，血浆在-80度下冷冻以备将来分析。肿瘤、脾、肾、肝、肺和后肢被固定在甲醛中进行IHC处理。所有样品都被适当保存以备分析。如果肿瘤体积超过＞2000mm3，小鼠被解剖。数据在附图的图9-12中提供。
如图7-10所示，以这种剂量(4E5 CAR+ T细胞，该剂量通常被认为是亚有效(sub-efficacious)剂量)给予CD19_28z正交CAR T细胞，但仍显示出显著的抗肿瘤疗效。
图7分图A提供了在四种治疗条件下用卡尺测量的皮下研究的肿瘤体积结果。图7分图B，提供了在四种治疗条件下用卡尺测量的皮下研究的肿瘤体积结果，表明STK-009在体内扩增CAR-T细胞并扩增SCM表型的CAR-T细胞(图7分图C)。与单独的CD19_28z正交CAR T细胞治疗相比，CD19_28z正交CAR T细胞和STK-009(1μg，10μg)的组合治疗以剂量依赖的方式提供了显著的抗肿瘤功能。
图8，分图A提供了该皮下研究中肿瘤体积的结果，该结果由图例中所示的四种治疗条件下的中位肿瘤发光衡量。图8，分图B提供了该皮下研究中肿瘤体积的结果，该结果通过如所示的四个治疗组所示的四种治疗条件下的中位肿瘤发光衡量。为了解决增加STK-009的剂量是否能增强已经接受1μg STK-009的小鼠中的抗肿瘤疗效，在第50天将剂量增加到10μg(图8，分图B，左下)。剂量从1μg增加到10μg后，观察到肿瘤负荷显著下降。
图9是每个处理组的动物生存率的Kaplan-Meier生存图，如图所示。如该数据所证明的，与单独的PBS和CD19_28z正交CAR T细胞治疗相比，CD19_28z正交CAR T细胞和STK-009的组合治疗显著延长了小鼠的生存期。
图10是对皮下RAJI实体瘤中CAR-T浸润的免疫组织化学分析的10x(插图40x)显微照片。从这些玻片中说明了STK-009诱导CAR-T浸润和SC RAJI肿瘤的肿瘤排斥。分析表明，在高剂量STK-009处理的肿瘤中没有活的RAJI细胞。

Claims (24)

1.一种治疗或预防需要治疗或预防的哺乳动物对象中疾病、紊乱或病症的方法，所述方法包括步骤：
(a)从所述对象分离一定量的免疫细胞；
(b)使所述分离的一定量的分离免疫细胞与核酸序列接触，所述接触在使分离的免疫细胞摄取所述核酸序列的条件下进行，所述核酸序列编码跨膜受体，所述跨膜受体包括与胞外结构域操作性连通的胞内信号转导结构域，所述受体的所述胞外结构域包括正交hCD122或其功能片段的ECD；
(c)使步骤(b)的所述分离的一定量的细胞离体接触一定量的正交配体，所述正交配体的量足够诱导由步骤(b)的所述接触转导的细胞增殖，所述接触被实施一段时间，以使得所述转导的细胞占所述细胞群的至少20％；
(d)将治疗有效量的步骤(c)产生的所述细胞群的细胞给予所述哺乳动物对象，组合给予治疗有效剂量的正交配体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述群包含一种或多种人免疫细胞，其选自下组：骨髓细胞、淋巴细胞、外周血单核细胞(PBMC)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞、CD8+T细胞、CD25+CD8+T细胞、CAR-T细胞、NK细胞、CD4+T细胞和Treg。
3.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之后步骤(b)之前，所述细胞群被离体操作以使所述群富集激活的免疫细胞或经历抗原的T细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述正交hCD122或其功能片段包含在第133位和/或第134位具有氨基酸取代的氨基酸序列，根据野生型hCD122编号。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述接触进一步包括摄取编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述编码CAR的核酸序列和所述编码受体的核酸序列在分开的载体上提供，每个核酸序列操作性地连接至在哺乳动物免疫细胞中具有操作性的表达控制序列。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述编码CAR的核酸序列和编码受体的核酸序列在单个载体上提供。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述核酸序列操作性地连接至相同的表达控制元件。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述载体包含被T2A编码序列的IRES元件分开的所述两个核酸序列。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中离体使用的正交配体与步骤(c)中体内使用的正交配体不同。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之前用淋巴细胞清除方案治疗对象。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的给予的初始剂量为每kg对象体重100,000至1,000,000个激活免疫细胞。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述正交配体的给予是定期给予所述对象，以在至少两周的时间段内维持每kg对象体重100,000至1,000,000个激活免疫细胞的水平。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，给予所述正交配体直到没有残留肿瘤的实质性迹象时，此时所述正交配体的剂量被减少到足以在该观察结果后至少3个月的时间内维持每kg体重约10,000至100,000个细胞的正交免疫细胞的低循环水平。
17.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，给予所述正交配体直到没有残留肿瘤的实质性迹象时，此时所述正交配体的给药终止。
18.如权利要求17中任一项所述的方法，其中，如果所述患者从免疫细胞治疗的原疗程复发，则所述方法进一步包括以下步骤：在没有附加剂量的正交工程改造细胞的情况下，给予所述复发的患者治疗有效量的正交配体，使得所述正交配体诱导先前给予的正交细胞的激活和/或增殖，所述正交配体被应用于所述对象一段时间，直到观察到复发肿瘤的缓解。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述疾病、紊乱或病症是肿瘤性疾病。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述疾病、紊乱或病症是慢性病毒性疾病。
21.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述疾病、紊乱或病症是炎症性疾病。
22.一种基本富集激活的正交免疫细胞群的细胞产品，所述产品是通过包含以下步骤的过程获得的：
(a)从哺乳动物对象分离一定量的免疫细胞；
(b)使所述分离的一定量的分离免疫细胞与核酸序列接触，所述接触在使分离的免疫细胞摄取所述核酸序列的条件下进行，所述核酸序列编码跨膜受体，所述跨膜受体包括与胞外结构域操作性连通的胞内信号转导结构域，所述受体的所述胞外结构域包括正交hCD122或其功能片段的ECD；
(c)使步骤(b)的所述分离的一定量的细胞离体接触一定量的正交配体，所述正交配体的量足够诱导由步骤(b)的所述接触转导的细胞增殖，所述接触被实施一段时间，以使得所述转导的细胞占所述细胞群的至少20％。
23.如权利要求22所述的细胞产品，其中所述细胞产品包含一种或多种人免疫细胞，其选自下组：骨髓细胞、淋巴细胞、外周血单核细胞(PBMC)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞、CD8+T细胞、CD25+CD8+T细胞、CAR-T细胞、NK细胞、CD4+T细胞和Treg。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述细胞产品被进一步操作以去除所述细胞的内源TCR结构域。
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