CN110191898A - Cd33特异性嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于癌症疗法的嵌合抗原受体(CAR)，具体地，包含来自CD33单克隆抗体的scFv的CAR。提供了包含这类CAR的免疫效应细胞，以及治疗增殖性疾病诸如急性骨髓性白血病(AML)和复发的或难治性AML的方法。

Description

CD33特异性嵌合抗原受体
相关申请的交叉参考
本申请要求2016年6月8日提交的美国临时专利申请系列号62/347,503的优先权，通过引用将该申请全文纳入本文。
序列表的引用
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，并通过引用全文纳入本文。2017年6月6日创建的所述ASCII拷贝，命名为50471_709_601_SL.txt，大小为103,120字节。
背景技术
本文提供了用于在人中治疗癌症的方法和组合物。本发明还涉及特异性嵌合抗原受体和载体，用于治疗骨髓恶性肿瘤，例如，急性髓性白血病。
急性髓性白血病白血病(AML)是一种癌症，其中骨髓产生异常的成髓细胞。这是成人急性白血病的最常见形式(Siegel,R.,等,Cancer Statistics,CA Cancer J Clin,64(1):9-29(2014))。AML是一种进行性疾病，发病年龄中值为65至70岁。AML有许多名称，包括急性髓细胞白血病，急性髓性白血病，急性粒细胞白血病和急性非淋巴细胞白血病。“急性”表示该疾病的侵袭性，其可以快速进展，并且如果不治疗，在诊断后的几个月内是致命的。癌症起源于骨髓，但通过血液迅速传播到其他解剖学部位。在儿童和成人中观察到该疾病，但在老年人中更常见。患AML的可能性随着年龄的增长而增加，但一个人可以在任何年龄患AML。十位患有急性白血病的成人中约八位患有AML，并且六位患有白血病的儿童中约一位患有AML。预计平均每年有12,000例新的AML病例，当前美国约有30,000名患者带病存活或正在缓解。
在老年AML患者(≥65岁)中，生存中值较短(65至74岁患者为3.9个月，≥85岁患者为1.4个月)。对AML患者的治疗选择是有限的，并且结果通常是不好的，平均5年生存率为20％，并且对大于65的患者为小于5％的5年生存率(Thein,M.等,老年急性髓性白血病患者的结果：分析30余年的SEER数据(Outcome of older patients with acute myeloidleukemia:an analysis of SEER data over 3decades),Cancer,119(15):2720-7(2013))。AML的某些亚组具有特别差的结果，如患有染色体7异常、复杂核型、复发性和/或难治性AML和由先导性骨髓增生异常综合征(MDS)或骨髓增生性肿瘤(MPN)引起的AML的患者。65岁及以上患有AML的患者比年轻患者更有可能具有不利风险的细胞遗传学。这些细胞遗传学因素与化疗抗性相关，并且对疗法的反应率显著较低。除了反应率之外，由于耐受性差和治疗效果差，通常不将患有AML的老年患者认为是标准诱导化疗的候选者或选择不接受标准诱导化疗。在该亚组的患者中，诱导化疗与高比例的治疗相关死亡率和低完全反应(CR)比例相关。当前，尚未有针对没有接受标准诱导化疗的AML患者的批准疗法。疗法的缺乏和与细胞遗传学相关的不良反应率使AML对新药物的医疗需求未得到满足，这些新药物具有良好的安全性并具有临床效益。
造血作用的特点是由多能干细胞到更成熟的分化细胞表型的组织特异性分级分化。与稳态的造血作用相似，认为AML将产生在这种静止的干细胞群中积累的形式突变，而这产生白血病干细胞(LSC)。无法消除这种AML LSC群将导致复发和治疗失败。
虽然大多数AML患者藉由诱导化疗将实现缓解；尽管给予了缓解后巩固疗法，许多人仍会复发。复发可能在数周至数年之后发生。高达10％的患者会因诱导化疗而难以治愈。这两组的患者(复发性/难治性)构成特别差的风险组。尽管同种异体干细胞移植被认为是对于大多数这些患者的推荐方法，但仅在少数患者中是可行的并且与显着的发病率和死亡率相关(Hamadani,M.,Awan,F.和Copelan,E.,患有急性髓性白血病的成人的造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation in adults with acute myeloidleukemia),Biol Blood Marrow Transplant,5:556-67(2008))。此外，移植的难治性疾病的患者的预后差(Duval,M.等,复发性或主要诱导失效的急性白血病的造血干细胞移植(Hematopoietic stem-cell transplantation for acute leukemia in relapse orprimary induction failure),J Clin Oncol,28(23):3730-8(2010))并且患有复发性疾病的患者中的几乎一半是耐药的(chemorefractory)，并因此不适合移植(Hamadani,M.,Awan,F.和Copelan,E.,患有急性髓性白血病的成人的造血干细胞移植(Hematopoieticstem cell transplantation in adults with acute myeloid leukemia)Biol BloodMarrow Transplant,5:556-67(2008))，(Estey,E.,2013.急性髓性白血病：关于风险分层和管理的2013更新(Acute myeloid leukemia:2013update on risk-stratification andmanagement).Am J Hematol,88(4),pp.318-27)。正在为这组患者研究许多新型药物和方法。然而，一般来说，CR率低于30％(Litzow,M.等,改善患有复发性或难治性急性髓性白血病患者预后的三种新方案的失败:来自东部肿瘤协作组的报告(Failure of three novelregimens to improve outcome for patients with relapsed or refractory acutemyeloid leukaemia:a report from the Eastern Cooperative Oncology Group),Br JHaemotol,148:217-25(2010))，(Cortes,J.等,难治性和复发性急性髓性白血病中p53反义寡核苷酸(cenersen)2期随机研究加上有或没有阿糖胞苷的伊达比星治疗(Phase2randomized study of p53antisense oligonucleotide(cenersen)plus idarubicinwith or without cytarabine in refractory and relapsed acute myeloidleukemia),Cancer,118(2):418-27(2012))，(Kirschbaum,M.等,复发性、难治性或高风险髓性白血病中替吡法尼以一周使用一周停用方案进行1期剂量递增研究(A phase 1trialdose-escalation study of tipifarnib on a week-on,week-off schedule inrelapsed,refractory or high-risk myeloid leukemia),Leukemia,25(10):1543-7(2011))。
在AML患者中，细胞遗传学在预测治疗反应中是重要预后因素(Grimwade,D.等,诊断性细胞遗传学对AML结果的重要性：分析参与MRC AML 10试验的1,612名患者(Theimportance of diagnostic cytogenetics on outcome in AML:analysis of 1,612patients entered into the MRC AML 10trial).医学研究委员会成人和儿童白血病工作组(The Medical Research Council Adult and Children's Leukaemia WorkingParties),Blood,92(7):2322-33(1998))。患有其中白血病细胞具有易位t(8；21)、t(15；17)、t(16；16)或inv(16)的AML的患者在诱导化疗和强化缓解后巩固化疗中具有有利结果。然而，染色体5或7，11q23或复杂核型异常在当前可用的诱导和缓解后化疗中具有非常差的结果。具有正常核型或具有三体8的患者具有中度预后。患有AML、t(9；22)或t(4；11)的患者中实现了非常差的预后。患有t(9；22)AML患者很少(如果有的话)仅用化疗治愈。白血病胚细胞上表达的表面抗原的免疫表型测定可能有助于诊断，并且对骨髓性、T和B系白血病的治疗和预后具有重要意义。鉴于已经证明使用常规疗法长期增加AML存活率是难以捉摸的，需要新型治疗策略。
发明内容
本公开的一个方面涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中所述CAR包含：(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28中至少一个或其片段的共刺激信号传导结构域；(e)CD3ζ信号传导结构域；和任选地(f)截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t-1)。
本文所提供的是这样的载体，其包含骨架和编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。在某些实施方式中提供了载体，其还包含编码截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t-1)或全长或截短的CD20的核酸。
本文提供了这样的载体，其包含骨架和编码下述的核酸序列：(1)截短的表皮生长因子受体或其功能性片段；和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。
在某些实施方式中提供了这样的载体，其包含骨架和编码下述的核酸序列：(1)全长CD20和其功能性片段；和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。
在某些实施方式中提供了工程改造的细胞，例如，免疫效应细胞，其包含骨架和编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；(e)CD3ζ信号传导结构域；和(f)截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t-1)、全长CD20和截短的CD20(CD20t-1)中的至少一个。
在某些实施方式中提供了工程改造的细胞，例如，免疫效应细胞，其包含(1)截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t-1)；和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。
在某些实施方式中提供了工程改造的细胞，例如，免疫效应细胞，其包含(1)细胞标签，用作杀伤开关、选择标志物、生物标志物或其组合；和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。在某些实施方式中，共刺激信号传导结构域包含4-1BB和CD28中的至少一个。在实施方式中，细胞标签是HER1t、HER1t-1、CD20或CD20t-1。
本文提供了用于在人中刺激对靶细胞群或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括向人给予有效量的经遗传修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；(e)CD3ζ信号传导结构域；和(f)截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t-1)。
本文提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方式中，CD33抗原结合结构域包含下述至少一个：(a)与氨基酸序列SEQ ID NO:8(hM195scFv)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽；(b)与氨基酸序列SEQ ID NO:9和10(M2H12)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽；(c)与氨基酸序列SEQ ID NO:11和12(DRB2)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽；和(d)与氨基酸序列SEQ ID NO:14和15(My9-6)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
在一些情况中，CD33抗原结合结构域是与氨基酸序列SEQ ID NO:8(hM195scFv)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。在一些示例中，茎结构域是与氨基酸序列SEQ ID NO:22(CD8α铰链)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
在一些实施方式中，共刺激信号传导结构域包含4-1BB。在一些情况中，4-1BB的共刺激信号传导结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。在一些示例中，共刺激信号传导结构域包含CD28。在一些实施方式中，CD28的共刺激信号传导结构域包含与氨基酸序列SEQID NO:28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
在一些实施方式中，CD3ζ信号传导结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。在一些实施方式中，分离的核酸分子还包含截短的表皮生长因子受体。在一些情况中，截短的表皮生长因子受体是HER1t，并且包含与氨基酸序列SEQ ID NO:32具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。在一些示例中，截短的表皮生长因子受体是HER1t-1，并且包含与氨基酸序列SEQ ID NO:54具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
在一些实施方式中，所述CAR包含与包含SEQ ID NO:39、41、43、45、47、49、51、53或55的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
本文提供了载体，其包含骨架和编码下述的核酸序列：(1)包含HER1t、HER1t-1或其功能性变体中至少一个的截短的表皮生长因子受体；和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。
本文提供了载体，其包含骨架和编码下述的核酸序列：(1)全长CD20、截短的CD20(CD20t-1)或其功能性片段；和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方式中，载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在一些情况中，截短的表皮生长因子受体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:54具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。在一些示例中，载体包含编码截短的CD20(CD20t-1)或其功能性变体的核苷酸序列，其中所述CD20t-1包含与与氨基酸序列SEQ ID NO:56具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
在一些实施方式中，全长CD20包含与氨基酸序列SEQ ID NO:36具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。在一些情况中，载体还包含编码自切割性明脉扁刺蛾病毒(T2A)肽的核苷酸序列。在一些示例中，载体的骨架是睡美人(Sleeping Beauty)转座子DNA质粒或pFUGW。
在一些示例中，载体还包含启动子。在一些情况中，启动子是hEF1a1。在一些示例中，CD33抗原结合结构域包含下述至少一个：(a)与氨基酸序列SEQ ID NO:8(hM195scFv)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽；(b)与氨基酸序列SEQ ID NO:9和10(M2H12)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽；(c)与氨基酸序列SEQ ID NO:11和12(DRB2)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽；和(d)与氨基酸序列SEQ ID NO:14和15(My9-6)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
在一些实施方式中，CD33抗原结合结构域是与氨基酸序列SEQ ID NO:8(hM195scFv)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。在一些情况中，茎结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:22(CD8α铰链)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。在一些示例中，共刺激信号传导结构域包含4-1BB。在一些情况中，4-1BB的共刺激信号传导结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的核酸序列。
在一些情况中，载体的共刺激信号传导结构域包含CD28。在一些情况中，CD28的共刺激信号传导结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的核酸序列。在一些情况中，CD3ζ信号传导结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的核酸序列。
在一些实施方式中，所述载体是质粒。在一些情况中，各所述载体包含表达质粒。在一些示例中，非病毒载体是睡美人转座子。在一些实施方式中，免疫效应细胞包含本文所公开的核苷酸。
本文提供免疫效应细胞，其包含骨架和编码下述的核酸序列：(1)截短的表皮生长因子受体(HER1t)；和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。
本文还提供免疫效应细胞，其包含(1)细胞标签，用作杀伤开关、选择标志物、生物标志物或其组合；和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方式中，细胞标签包括HER1t、HER1t-1、CD20t-1或CD20。在一些情况中，细胞标签包括HER1t，并且所述HER1t包含多肽序列SEQ ID NO:32。在一些示例中，细胞标签包括HER1t-1，并且所述HER1t-1包含多肽序列SEQ ID NO:54。在一些情况中，免疫效应细胞包含本文所公开的载体。在一些实施方式中，细胞是T细胞、天然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或调节性T细胞。在一些示例中，当CD33抗原结合结构域与CD33结合时，细胞表现出抗肿瘤免疫。
本文提供了用于在有此需求的人中刺激对靶细胞群或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括向所述人对象给予有效量的经遗传修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；(e)CD3ζ信号传导结构域；和(f)截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t-1)。
在一些实施方式中，中，所述人已经被诊断为急性髓性白血病(AML)。在一些情况中，急性髓性白血病是复发性或难治性AML。
提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸，其中，所述CAR包含：(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的CD33抗原结合结构域；(b)具有氨基酸序列SEQ ID NO:22的茎结构域；(c)具有氨基酸序列SEQ ID NO:28的包含CD28的共刺激信号传导结构域；(d)HER1标签，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:32的HER1t和具有氨基酸序列SEQ ID NO:54的HER1t-1中的至少一个；(e)具有氨基酸序列SEQ ID NO:26的CD3ζ信号传导结构域。
本文还提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸，其中，所述CAR包含：(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的CD33抗原结合结构域；(b)具有氨基酸序列SEQ ID NO:22的茎结构域；(c)具有氨基酸序列SEQ ID NO:24的包含4-1BB的共刺激信号传导结构域；(d)HER1标签，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:32的HER1t和具有氨基酸序列SEQ ID NO:54的HER1t-1中的至少一个；(e)具有氨基酸序列SEQ ID NO:26的CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方式中，载体包含本文所公开的一个或多个多核苷酸。在一些情况中，所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在一些示例中，非病毒载体是睡美人转座子。在一些实施方式中，所述样品是多个载体。
提供了用于在免疫效应细胞中表达CAR的系统，所述系统包括一个或多个载体，所述载体编码本文所公开的分离的核酸。在一些实施方式中，所述免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。在一些情况中，所述系统还包括编码至少一个其他基因的核酸。在一些示例中，所述其他基因包含细胞因子。在一些实施方式中，所述细胞因子包含IL-2、IL-15、IL-12、IL-21以及IL-15和IL-15R的融合体中的至少一个。一些情况中，所述细胞因子呈分泌的形式。一些实施方式中，所述细胞因子呈膜结合的形式。
在一些情况中，所述系统包含一个载体。在一些示例中，所述一个或多个载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在一些实施方式中，非病毒载体是睡美人转座子。在一些情况中，所述系统还包括睡美人转座酶。在一些示例中，睡美人转座酶是SB11、SB100X或SB110。在一些情况中，所述免疫效应细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，在免疫效应细胞中表达CAR的方法包括用本文所公开的系统与所述免疫效应细胞接触。
本文提供了刺激工程改造的T细胞增殖和/或存活的方法，其包括：(a)由对象获得样品，所述样品包含T细胞或T细胞祖细胞；(b)用编码权利要求1-13和44-45中任一项所提供的分离的核酸的一个或多个载体和编码转座酶的载体转染所述细胞，以提供工程改造的表达CD33 CAR的T细胞群；(c)和任选地，离体培养CD33 CAR T细胞群2天或更少。
在一些实施方式中，该方法还包括用编码细胞因子的载体转染所述细胞。在一些情况中，细胞因子是包含IL-15和IL-15Rα的融合蛋白。在一些示例中，所述一个或多个载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在一些实施方式中，非病毒载体是睡美人转座子。在一些情况中，该方法还包括睡美人转座酶。在一些示例中，睡美人转座酶是SB11、SB100X或SB110。
附图简要说明
所附权利要求书中具体说明了本公开的特征。参考以下说明和附图更好地理解本发明的特征和优点，这些详述列出利用本发明原理的说明性实施方式：
图1是描述CD33异构体结构的示意图。
图2描述了CD33 CAR慢病毒载体图。
图3是睡美人转座子系统的示意图。
图4是慢病毒转导以产生CAR-T细胞的示意图。
图5描绘了过继转移的T细胞上CD33 CAR和HER1t的表达。
图6显示了通过Western印迹证明由慢病毒转导的细胞确认CD33 CAR表达。
图7显示了来自CD3/CD28珠刺激后的未转导的T细胞(UNT)和CD33CAR-T细胞(CD33CAR LV)的体外培养的总T细胞群中CD33 CAR-T细胞扩增绝对值和扩增倍数的数值扩增动力学。
图8提供了慢病毒转导后CD33 CAR-T细胞的拷贝数量评估。
图9A、9B和9C显示了CD33 CAR-T细胞的靶标特异性体外毒性。CD33特异性细胞毒性由铕标记的靶细胞(EL4、EL4/CD33和MOLM-13)测量。(图9A)通过流式细胞术测量的测试细胞系中的CD33表面表达水平。粗体阴影线显示用同型对照抗体的染色，而细阴影线显示抗-人CD33抗体染色(图9B和图9C)。
图10A、10B和10C显示了来自离体扩增的CD33 CAR-T细胞的细胞因子产生(IFNγ(图10A)、IL-2(图10B)和TNF(图10C)。
图11显示了表达HER1t的CD33 CAR-T细胞的西妥昔单抗诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
图12显示了AML肿瘤模型中治疗组的NSG小鼠存活曲线。
图13A和13B提供了通过fLUC生物发光测量的肿瘤负荷的定量分析。(图13A)腹部，和(图13B)背视图。
图14A和14B提供了来自CD33 CAR-T细胞处理的NSC小鼠血液、骨髓和脾样品的流式细胞术分析。
图15A和15B显示了各种LV转导的人T细胞上CD33 CAR和HER1t的表达。
图16A、16B和16C显示了这样的图表，所述图表描述了各种AML细胞系上CD33表达的流式细胞术结果(图16A)。图表描述了各种表达的CD33的AML细胞系中各种LV CD33 CAR的2小时铕释放试验的结果(图16B)。图表描述了在通过LV CD33 CAR识别各种表达的CD33的AML细胞系后，通过T细胞释放的细胞因子表达的结果(图16C)。
图17提供了这样的图表，其描述了表达CD33的白血病细胞系的CAR33-CD8a-CD28m-Z(睡美人)T细胞裂解物。
图18提供了描述了流式细胞术结果的图表，所述流式细胞术结果证明了CAR33-CD8a-CD28m-Z(睡美人)T细胞在表达CD33的靶细胞存在的情况下对CD107a脱粒和IFNγ产生的效果。
图19提供了描述流式细胞术结果的图表，所述流式细胞术结果证明了基因修饰的T细胞上CD33 CAR(睡美人)和HER1t的表达。
图20A-20B描述了本文所述CAR在表达CD33的AML细胞中的效果。
图20A提供了描述各种AML细胞系上CD33表达的流式细胞术结果的图表。
图20B提供图表，其描述了各种表达CD33的AML细胞系中
CAR33-CD8a-CD28m-Z(睡美人)的2小时铕释放试验的结果。
图21提供了序列表格，示例了用于本文所述方法和组合的核酸序列和多肽序列。
图22A-22C提供了本文所述组合物与肿瘤细胞接触后的效果，包括小鼠中的体内结果。图22A提供图表，描述了给予CAR-T细胞的小鼠在研究第11天(CAR-T细胞给予后3天)的血浆的细胞因子分析。收集来自小鼠的血浆，通过多重分析平台评估人细胞因子。显示了测量的几个分析物(GM-CSF，IFNγ，TNFα，IL-10，IL-18和IP-10)的平均±SEM。N＝11-15只小鼠/组，其包括在限定时间点用于组织收集的卫星组的一部分的小鼠。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；以盐水、未转导的T细胞和CD19-CAR-T细胞对各治疗组的图基氏多重比较测试的单因素方差分析(ANOVA)。图22B提供了描述血液样品代表性采样的图表，所述血液样品在CAR T细胞治疗后取自携带AML肿瘤的小鼠。荷载AML肿瘤的小鼠在第8天以单次给予盐水、未转导的T细胞、CD19-CAR-T细胞或以CD33-CAR-T细胞处理。标记2剂量的组仅在研究第15天接受第二个等效剂量的CD33-CAR-T细胞。由小鼠获得血液样品以评估CAR T细胞的存在和持续性以及MOLM-13肿瘤细胞的存在(基于CD123的表达)。(A)当小鼠变得垂死时，在第16天从仅用盐水、未转导的T细胞或CD19-CAR-T细胞处理的小鼠中采集血液样品。(B)在第18天从用CD33-CAR-T细胞处理的剩余小鼠中采集血液样品。显示的数据以FSC/SSC/人CD45+细胞门选。图22C.图表描述了针对ALM肿瘤细胞系(THP1和HL60)的细胞毒活性。
图23A-E描述了由AML患者T细胞生成CD33-CAR-T细胞，并且证明了对AML肿瘤细胞的细胞毒性活性。图23A.获得来自AML供体的PBMC，并表型表征CD33和CD3表达。图23B.使用基于珠的方法从PBMC部分分离T细胞，并且就CD33+肿瘤细胞对未触碰的部分进行表征。图23C.用LV-CD33-CAR构建体转导T细胞，并在培养的第14天显示CAR表达。图23D.在第0天(在试验开始时)和在第3天显示AML供体CD33-CAR-T细胞与MOLM-13或AML供体肿瘤细胞的共培养。所有细胞以FSC/SSC/活细胞门选。图23E.来自AML患者的CD33-CAR-T细胞与表达CD33的肿瘤细胞共培养后的细胞因子表达。在将CD33-CAR-T细胞(来自AML供体E261)与指定的肿瘤细胞共培养18小时的时间段后，进行胞内细胞因子染色。将T细胞进行细胞表面染色，然后固定/透化，然后对IFNγ和IL-2细胞因子染色。细胞基于FSC/SSC/活/CD3T细胞门选。AMLE261细胞指样品中存在的患者的自体CD33肿瘤细胞。
图24描述了NK细胞上CD33 CAR和HER1t的表达。
图25描述了CD33CAR NK细胞上HER1t和HER1t-1标签的表达。
图26描述了CD33CAR NK细胞上CD20t-1标签的表达。
图27证明了CD33-CAR NK细胞有效地裂解NK抗性CD33+AML细胞(ML-2，KG-1)。
图28证明了CD33-CAR NK细胞有效地以低E:T比裂解NK抗性AML细胞系(KG-1)。
发明详述
除非另有限定，在此使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域技术人员的通常理解一致。在描述和要求本发明时，将使用以下术语。
定义
术语“一种”或“一个”当与“包含”在权利要求和说明书中联用时，可表示“一个”，但也与“一个或多个”，“至少一个”和“一个或多于一个”的意思一致。
在整篇申请中，术语“约”用于表示包括装置，用于测定数值的方法，或存在于研究对象中的差异造成的包括固有误差的固有变动的值。通常术语表示视情况而定包括大约或少于1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％或20％可变性。
在权利要求中使用术语“或”表示和“/或”，除非特别指出仅替代方式，或替代方式互相排除，但公开内容支持仅指替代方式和“和/或的定义。”
如本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含”(和任何形式的包含，例如“含有”和“含”)，“具有”(以及任何形式的具有，例如“有”和“拥有”)，“包括”(以及任何形式的“包括”，例如“囊括”和“括入”)或“含有”(以及任何形式的含有，例如“含”和“包含”)都是纳入性或开放性的，并不排除额外的未提到的元素或方法步骤。考虑本说明书中所讨论的任何实施方式可以用任何本发明的方法或组合物实现，反之亦然。另外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
如本文所用，“合成的”或“工程改造的”是指通过化学过程和/或通过人类中介形成或表达的化合物，与天然来源的化合物相反。
述及“分离的”是指从其天然环境中除去核酸。述及“纯化的”是指给定的核酸，无论是从自然界(包括基因组DNA和mRNA)还是合成的(包括cDNA)中被除去和/或在实验室条件下扩增的核酸已经增加了纯度，其中“纯度”是相对术语，而不是“绝对纯度”。应该理解的是，核酸和蛋白质可以与稀释剂或佐剂一起配制，并且仍然为了实际目的而分离。例如，当用于引入细胞时，核酸通常与可接受的运载体或稀释剂混合。
本文所用“多核苷酸”或“寡核苷酸”是指任何长度的核苷酸聚合形式，不论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。该术语仅指该分子的一级结构。因此，该术语包括双链和单链DNA，三链DNA以及双链和单链RNA。例如，其还包括通过甲基化和/或通过加帽修饰的和未修饰形式的多核苷酸。该术语还旨在包括含非天然存在或合成核苷酸以及核苷酸类似物的分子。
术语“一个多肽”与术语“多个多肽”、“一个或多个肽”和“一个或多个蛋白”在本文中可互换使用，并且指氨基酸残基的聚合物。“成熟蛋白质”是全长的蛋白质，并且其任选地包括在给定细胞环境中针对蛋白质糖基化或其他修饰。
当核酸和/或核酸序列从共同的祖先核酸或核酸序列天然或人工衍生时，它们是“同源的”。当编码DNA从共同的祖先核酸或核酸序列天然或人工衍生时，蛋白质和/或蛋白质序列是同源的。同源分子可以被成为同源物。例如，如本文所述的任何天然存在的蛋白质可以通过任何可用的诱变方法进行修饰。当表达时，该诱变的核酸编码与由原始核酸编码的蛋白质同源的多肽。同源性通常从两个或多个核酸或蛋白质(或其序列)之间的序列相同性推导。用于建立同源性的序列之间的相同性的确切百分比随着所涉及的核酸和蛋白质而变化，但通常使用少至25％的序列相同性来建立同源性。更高水平的序列相同性，例如，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％或更高，也可用于建立同源性。用于确定序列相同性百分比的方法(例如，使用默认参数的BLASTP和BLASTN)在本文中描述并且通常是可用的。
在两个核酸序列或多肽的氨基酸序列的情况中，术语“相同”或“序列相同性”是指两个序列中的残基在相对于指定的比较窗的最大对应度下比对时相同。如本文所用“比较窗口”是指至少约20个(通常约50至约200个、更通常约100至约150个)连续位置的片段，其中在两个序列被最佳地对齐之后，序列可以与具有相同数目的连续位置的参比序列进行比较。比对序列的比较方法是本领域熟知的。用于比较的序列最佳比对可以通过,Adv.Appl.Math.,2:482(1981)的局部同源性算法进行；通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443(1970)的比对算法；通过Pearson和Lipman,Proc.Nat.Acad.SciU.S.A.,85:2444(1988)的相似性搜索法；通过计算机执行这些算法(包括，但不限于，加利福尼亚州芒廷维尤的智慧遗传公司(Intelligenetics,Mountain View,Calif.)的PC/Gene程序中的CLUSTAL，威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算组(GCG)，美国威斯康星州麦迪逊的科学路575号(575Science Dr.，Madison,WI))；CLUSTAL软件详细描述于Higgins和Sharp,Gene,73:237-244(1988)以及Higgins和Sharp,CABIOS,5:151-153(1989)；Corpet等,Nucleic Acids Res.,16:10881-10890(1988)；Huang等,Computer Applications in the Biosciences,8:155-165(1992)和Pearson等,Methodsin Molecular Biology,24:307-331(1994)。比对通常通过检查和手动比对来进行。
在一类实施方式中，本文所述多肽与参照多肽或其片段具有至少80％、85％、90％、98％、99％或100％的相同性，例如，通过使用默认参数的BLASTP(或CLUSTAL，或任何其他可用的对齐软件)所测试。相似地，也可以参照起始核酸来描述核酸，例如，它们可以与参照核酸或其片段有50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，98％，99％或100％相同性，例如通过使用默认参数的BLASTN(或CLUSTAL，或任何其他可用的比对软件)所测量。当一个分子被认为与较大分子具有一定百分比的序列相同性时，这意味着当两个分子是最佳比对时，较小分子中所述百分比的残基根据两个分子最佳比对的顺序在较大分子中找到匹配残基。
术语“基本上相同”应用于核酸或氨基酸序列是指以使用标准参数的上述程序，例如BLAST，相较于参照序列，核酸或氨基酸序列包含具有至少90％序列相同性或更多，至少95％，至少98％和至少99％的序列。例如，BLASTN程序(对核苷酸序列而言)采用的默认值如下：字长(W)1，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。对氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的默认值为：字长(W)3，期望值(E)10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1992))。序列相同性百分比通过在比较窗口中对比两种最佳比对序列而测定，其中比较窗口中多核苷酸序列的部分与参考序列(不含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即缺口)以最佳比对所述两种序列。该百分比如下计算：通过测定两种序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数产生匹配位置数，将该匹配位置数除以比较窗口中位置的总数，得到的结果乘以100产生序列相同性百分比。在实施方式中，基本相同性存在于至少约50个残基长度的序列区域上，至少约100个残基的区域上，并且在一些实施方式中，序列在至少约150个残基上为基本相同的。在实施方式中，序列在编码区的整个长度上基本相同。
例如，本文所公开的蛋白质的“功能性变体”包含具有至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个保守氨基酸取代的参考蛋白质的氨基酸序列。术语“保守氨基酸取代”或“保守突变”是指由一个氨基酸被具有共同性质的另一个氨基酸替代。定义各个氨基酸之间共同性质的功能方法是分析同源生物体的相应蛋白质之间氨基酸变化的归一化频率(Schulz,G.E.和Schirmer,R.H.,《蛋白质结构原理》(Principles ofProtein Structure),Springer-Verlag,纽约(1979)。根据这样的分析，可以定义多组氨基酸，其中一组中的氨基酸彼此优先交换，并且因此在其对整个蛋白质结构的影响中彼此最相似(Schulz,G.E.和Schirmer,R.H.，同上)。保守突变的实例包括上述亚组中的氨基酸的氨基酸取代，例如用赖氨酸取代精氨酸，反之亦然，从而可以保持正电荷；用谷氨酸取代天冬氨酸，反之亦然，从而可以保持负电荷；用丝氨酸取代苏氨酸，从而可以保持游离的-OH；和用谷氨酰胺取代天冬酰胺，从而可以保持游离的-NH2。
或者或另外，功能性变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸取代的参照蛋白质的氨基酸序列。“非保守突变”涉及不同组之间的氨基酸取代，例如，赖氨酸取代色氨酸，或苯丙氨酸取代丝氨酸等。在这样的情况下，优选的是非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能性变体的生物活性。非保守氨基酸取代可以增强功能变体的生物活性，从而与亲本CAR相比，功能变体的生物活性增加。
本文公开的蛋白质(包括其功能部分及功能变体)可以包含合成氨基酸代替一种或多种天然存在的氨基酸。这样的合成氨基酸是本领域已知的，并且包括，例如，氨基环己烷羧酸，正亮氨酸，α-氨基正癸酸，高丝氨酸，S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸，反式-3-和反式-4-羟基苯丙氨酸，4-氨基苯丙氨酸，4-硝基苯丙氨酸，4-氯苯丙氨酸，4-羧基苯丙氨酸，β-苯基丝氨酸，β-羟基苯丙氨酸，苯基甘氨酸，α-萘基丙氨酸，环己基丙氨酸，环己基甘氨酸，二氢吲哚-2-羧酸，1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸，氨基马来酸，氨基马来酸单酰胺，N'-苄基-N'-甲基-赖氨酸，N',N'-二苄基-赖氨酸，6-羟基赖氨酸，鸟氨酸，α-氨基环戊烷羧酸，α-氨基环己烷羧酸，α-氨基环庚烷羧酸，α-(2-氨基-2-降冰片烷)-羧酸，α,γ-二氨基丁酸，α,β-二氨基丙酸，高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
“CD33”是67kDa的单次跨膜糖蛋白，并且是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglecs)超家族的成员。CD33的特征在于负责唾液酸结合的V-组Ig样结构域和其胞外结构域中的C2-组Ig样结构域.或者，将CD33mRNA剪接将导致较短的同种型(CD33m)，其缺少V-组Ig样结构域，以及连接V-组和C2-组Ig样结构域的二硫键，如图1所示。在健康对象中，CD33主要表达为正常多能骨髓前体、单能集落形成细胞、单核细胞和成熟粒细胞存在的骨髓样分化抗原。CD33表达于超过80％的髓性白血病细胞，但是不在正常的造血干细胞或成熟粒细胞表达。(Andrews,R.等,L4F3抗原由单能和多能集落形成细胞表达而非其前体表达(The L4F3antigen is expressed by unipotent and multipotent colony-formingcells but not by their precursors),Blood,68(5):1030-5(1986))。已经报道了CD33表达于恶性骨髓细胞、活化的T细胞和活化的NK细胞，并且存在于绝大多数AML患者的至少一部分胚细胞(Pollard,J.等,关联CD33表达水平与疾病特征和对儿童AML中含有吉妥珠单抗奥佐米星的化疗的反应(Correlation of CD33expression level with diseasecharacteristics and response to gemtuzumab ozogamicin containing chemotherapyin childhood AML),Blood,119(16):3705-11(2012))。除了在AML母细胞上的广泛表达之外，CD33可以在AML的干细胞上表达。
术语“基本上纯化的”是指核酸序列、多肽、蛋白质或其它化合物，基本上是不含，即不含超过约50％，不含超过约70％，不含超过约90％的，与该核酸、多肽、蛋白质或其他化合物天然相关的多核苷酸、蛋白质、多肽和其他分子。
本文所用“编码序列”指编码蛋白质的核苷酸区段。该区域或序列的界限是在5'末端附近的起始密码子和在3'末端附近的终止密码子。编码序列还可以称为开放阅读框。
本文所用的“操作性连接”是指DNA区段与另一DNA区段的物理和/或功能连接，以允许该区段以其预期的方式起作用。当编码基因产物的DNA序列与调节序列(例如启动子，增强子和/或沉默子)以允许调节DNA序列的转录的方式直接或间接连接时，其与调控序列操作性连接。例如，当DNA序列相对于启动子的转录起始位点在正确的阅读框架中，当连接到启动子的转录起始位点下游的启动子并允许转录延伸进行通过DNA序列时，DNA序列操作性连接到启动子上。当增强子或沉默子以分别增加或减少DNA序列转录的方式连接到DNA序列时，其与编码基因产物的DNA序列操作性连接。增强子和沉默子可位于DNA序列的编码区的上游，下游或嵌入其中。如果信号序列被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则信号序列的DNA操作性连接到编码多肽的DNA。DNA序列与调节序列的连接通常通过在合适的限制性位点连接或通过使用本领域技术人员已知的限制性内切核酸酶插入序列中的衔接子或接头来完成。
术语“转录调节子”是指在这样的生化元件，其在某些环境条件下(例如，阻遏物或核抑制蛋白)起作用以阻止或抑制启动子驱动的DNA序列转录，或在某些环境条件下允许或刺激启动子驱动的DNA序列的转录(例如，诱导物或增强子)。
术语“诱导”是指相对于一些基础转录水平，转录调节子引起的核酸序列转录、启动子活性和/或表达的增加。
“启动子”是指启动编码序列转录的多核苷酸区域。启动子位于基因的转录起始位点附近，位于DNA的同一链和上游(朝向有义链的5'区域)。一些启动子是组成型的，因为它们在细胞中的所有情况中都是有活性的，而其他经调节成为响应特定刺激而变得有活性，例如诱导型启动子。
术语“启动子活性”是指其活性经测量的操作性连接启动子的核苷酸序列的表达程度。启动子活性可以通过确定产生的RNA转录本的量来直接测量，例如通过Northern印迹分析或通过由连接的核酸序列编码的产物的量间接测量，如连接启动子的报告物核酸序列。
如本文所用“诱导型启动子”是指通过转录调节子(例如生物或非生物因子)的存在或不存在而诱导活性的启动子。诱导型启动子是有用的，因为与其操作性连接的基因的表达可以在生物体的某些发育阶段或特定组织中打开或关闭。诱导型启动子的示例是醇调节的启动子，四环素调节的启动子，类固醇调节的启动子，金属调节的启动子，发病机制调节的启动子，温度调节的启动子和光调节的启动子。在一个实施方式中，诱导型启动子是遗传开关的一部分。
本文所用术语“增强子”是指这样的DNA序列，其增加例如与其操作性连接的核酸序列的转录。增强子可以位于与核酸序列编码区域距离数千碱基处，并且可以介导调节因子的结合，DNA甲基化的模式或DNA结构的变化。来自各种不同来源的大量增强子是本领域公知的，并且可作为克隆的多核苷酸或在克隆的多核苷酸内获得(例如来自保藏机构，诸如ATCC以及其他商业或个体来源)。包含启动子(如常用的CMV启动子)的许多多核苷酸也包含增强子序列。增强子可位于编码序列的上游、内部或下游。术语“Ig增强子”是指源自在免疫球蛋白(Ig)基因座内映射的增强子区域的增强子元件(这类增强子包括例如重链(μ)5'增强子、轻链(κ)5'增强子，κ和μ内含子增强子和3'增强子(主要参见Paul W.E.(编著),《基础免疫学》(Fundamental Immunology),第三版,纽约拉文出版社(1993),第353-363页；和美国专利号5,885,827)。
“表达载体”或“载体”是任何遗传元件，例如质粒、染色体、病毒、转座子，其表现为细胞内多核苷酸复制的自主单元。(即能够在其自身控制下复制)或通过插入宿主细胞染色体使其能够复制，使其与另一个多核苷酸区段接合，从而实现复制和/或表达该接合的区段。合适的载体包括但不限于质粒，转座子，噬菌体和粘粒。载体可含有多核苷酸序列，其是实现将载体连接或插入所需宿主细胞并影响所接合的区段表达所必需的。这些序列根据宿主生物而不同；它们包括影响转录的启动子序列，增加转录的增强子序列，核糖体结合位点序列和转录和翻译终止序列。或者，表达载体可以能够在不需要将载体连接或整合到宿主细胞DNA序列中的情况下直接表达其中编码的核酸序列产物。
载体还可以包括“可选择标志物基因”。本文所用术语“可选择标志物基因”是指这样的核酸序列，在对应的选择剂存在的情况下能够对于或针对表达核酸序列的细胞特异性地选择。合适的可选择标志物基因为本领域所知，并且述于例如国际专利申请公开WO1992/08796和WO 1994/28143；Wigler等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:3567(1980)；O’Hare等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:1527(1981)；Mulligan和Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:2072(1981)；Colberre-Garapin等,J.Mol.Biol.,150:1(1981)；Santerre等,Gene,30:147(1984)；Kent等,Science,237:901-903(1987)；Wigler等,Cell,11:223(1977)；Szybalska和Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:2026(1962)；Lowy等,Cell,22:817(1980)；和美国专利号5,122,464和5,770,359。
在一些实施方式中，载体是“附加型表达载体”或“附加体”，其能够在宿主细胞中复制，并且在适当的选择压力存在的情况下，作为宿主细胞内DNA的染色体外区段持续存在(参见例如，Conese等,Gene Therapy,11:1735-1742(2004))。代表性市售可得的附加型表达载体包括但不限于，利用Epstein Barr核抗原1(EBNA1)和EB病毒(EBV)复制起点(oriP)的附加型质粒。来自英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)的载体pREP4、pCEP4、pREP7和pcDNA3.1以及来自司查塔基公司(Stratagene)(加利福尼亚州拉由拉)的pBK-CMV表示使用T-抗原和SV40复制起点代替EBNA1和oriP的附加型载体的非限制性示例。
“转座子”或“转座元件”(TE)是可以改变其在基因组内的位置的载体DNA序列，有时产生或逆转突变并改变细胞的基因组大小。转座常常导致TE的重复。I型TE分两个阶段复制：首先将它们从DNA转录为RNA，然后将产生的RNA逆转录为DNA。然后将复制的DNA插入基因组的新位置。逆转录步骤由逆转录酶催化，其可以由TE本身编码。逆转录转座子的特征类似于逆转录病毒，如HIV。II型TE的切割和粘贴转座机制不涉及RNA中间体。转座由几种转座酶催化。一些转座酶非特异性结合DNA中的任何靶位点，而其他转座酶结合特定的DNA序列靶标。转座酶在靶位点处产生交错切口，产生单链5'或3'DNA突出端(粘性末端)。该步骤切去DNA转座子，然后将其连接到新的靶位点；该过程涉及填充间隙的DNA聚合酶的活性和封闭糖-磷酸主链的DNA连接酶的活性。这导致目标位点的复制。DNA转座子的插入位点可以通过短直接重复鉴定，所述短直接重复可以通过靶DNA中的交错切割产生并通过DNA聚合酶填充，后接一系列反向重复，所述反向重复对通过转座酶的TE切除十分重要。如果切割和粘贴TE在细胞周期的S期期间发生，当供体位点已被复制，但目标位点尚未被复制时，可以复制切割和粘贴TE。在I型和II型TE中，可以将转座分成“自主”或“非自主”。自主TE可以自己移动，而非自主TE需要另一个TE的存在而移动。这通常是因为非自主TE缺乏转座酶(对于II型)或逆转录酶(对于I型)。
“转座酶”是指通过切割和粘贴机制或复制转座机制结合转座子末端并催化转座子运动到基因组的另一部分的酶。
“睡美人(SB)转座子系统”是指用于将DNA序列引入脊椎动物染色体的合成DNA转座子系统。该系统的一些示例性实施方式述于例如美国专利号6,489,458、8,227,432、9,228,180和WO/2016/145146。睡美人转座子系统由睡美人(SB)转座酶和SB转座子组成。在实施方式中，睡美人转座子系统可包括SB11转座子系统、SB100X转座子系统或SB110转座子系统。
本文公开或考虑的核酸序列和载体可通过“转染”、“转化”或“转导”引入细胞。本文所用“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一个或多个外源多核苷酸引入宿主细胞中。本领域已知许多转染技术，包括例如，磷酸钙DNA共沉淀(参见例如MurrayE.J.(编著),《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology),第7卷,基因转移和表达方案,胡马纳出版社(Humana Press)(1991))；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。在合适的包装细胞中生长感染性颗粒后，可以将噬菌体或病毒载体引入宿主细胞中，其中许多包装细胞是可商购的。
本文所用术语“T细胞”或“T淋巴细胞是一种类型的淋巴细胞，其在细胞介导的免疫中起核心作用”通过在细胞表面上存在T细胞受体(TCR)，它们可以与其他淋巴细胞(例如B细胞和天然杀伤细胞(NK细胞))区分开。
“T辅助细胞”(TH细胞)在免疫过程协助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化。这些细胞也称为CD4+T细胞，因为它们在其表面表达CD4糖蛋白。当辅助T细胞通过MHC II型分子呈递肽抗原时，辅助T细胞被激活，所述MHC II型分子在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。一旦被激活，它们迅速分裂并分泌称之为细胞因子的小蛋白质，所述细胞因子调节或协助主动免疫应答。这些细胞可以分化成几种亚型之一，包括TH1、TH2、TH3、TH17、Th9或TFH，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。来自APC的信号传导指导T细胞成为特定的亚型。
“细胞毒性T细胞”(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还涉及移植排斥。这些细胞也称为CD8+T细胞，因为它们在其表面表达CD8糖蛋白。这些细胞通过与MHC I型分子相关的抗原结合来识别它们的靶标，所述MHC I型分子存在于所有有核细胞的表面上。通过调节T细胞分泌的IL-10、腺苷和其他分子，可以将CD8+细胞灭活至无反应性状态，而这预防自身免疫疾病。
“记忆T细胞”是抗原特异性T细胞的一个子集，其在感染消退后长期持续存在。它们在重新暴露于其同源抗原后迅速扩增至大量效应T细胞，从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包含三种亚型：中枢记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO、CD45RA和/或CCR7。
“调节T细胞”(Treg细胞)，之前称之为抑制T细胞，其在维持免疫耐受中起作用。它们的主要作用是在免疫反应结束时关闭T细胞介导的免疫，并抑制胸腺中逃脱负选择过程的自身反应性T细胞。
“天然杀伤T细胞”(NKT细胞-不要与先天免疫系统的自然杀伤细胞混淆)连接适应性免疫系统与先天免疫系统。不同于识别由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的肽抗原的常规T细胞，NKT细胞识别由称之为CD1d的分子呈递的糖脂抗原。一旦被激活，这些细胞可以进行归因于Th和Tc细胞的功能(即，细胞因子产生以及细胞溶解/细胞杀伤分子的释放)。它们还能够识别并消除一些肿瘤细胞和感染疱疹病毒的细胞。
本文所用“肿瘤抗原”是指在肿瘤细胞中产生或过表达的任何抗原物质。例如，其可以在宿主中引发免疫应答。或者，出于本公开的目的，肿瘤抗原可以是由健康和肿瘤细胞表达的蛋白质，但因为它们鉴定某种肿瘤类型，是合适的治疗靶标。在一个实施方式中，肿瘤抗原是CD33，其是用于治疗髓性恶性肿瘤(例如急性髓细胞性白血病(AML))的CAR T细胞疗法的靶标。
本文所用“AML”是指急性髓细胞性白血病，也称为急性髓细胞白血病，急性粒细胞白血病和急性非淋巴细胞白血病。AML与白血病的其他主要形式不同，因为基于发展白血病的细胞类型，它具有八种不同的亚型。因此，术语“AML”是指所有亚型，包括特殊分析时的髓细胞(M0)，未成熟的髓细胞(M1)，成熟的髓细胞(M2)，早幼粒细胞(M3)，髓单核细胞(M4)，单核细胞(M5)，红白血病(M6)和巨核细胞(M7)。本文所用“AML”还指急性髓性白血病——一种其中骨髓产生异常成髓细胞的癌症。这是成人急性白血病的最常见形式(Siegel,R.,Ma,J.,Zou,Z.和Jemal,A.,Cancer statistics,2014,CA Cancer J Clin,64(1):9-29(2014))。“复发的AML”是指经历过AML缓解间隔的对象。“难治性AML”是指其疾病对第一轮初始标准诱导治疗(例如，基于蒽环类和/或阿糖胞苷的治疗)没有反应的患者。在实施方式中，“难治性AML”是指其疾病对标准诱导疗法的一个或两个或更多个周期无反应的对象。
“过继T细胞转移”是指肿瘤特异性T细胞的分离和离体扩增，以实现比单独接种疫苗或患者的天然肿瘤反应所获得的更多数量的T细胞。然后将肿瘤特异性T细胞输注到癌症患者体内，试图经由可以攻击和杀伤癌症的T细胞使其免疫系统能够覆盖剩余的肿瘤。有许多形式的过继T细胞疗法用于癌症治疗；培养肿瘤浸润淋巴细胞或TIL，分离和扩增一种特定的T细胞或克隆，甚至使用经工程改造的T细胞以有效识别和攻击肿瘤。
“抗原识别部分或结构域”是指特异性结合抗原的分子或分子的部分。在一实施方式中，抗原识别部分是抗体、抗体样分子或其片段，而抗原是肿瘤抗原。
本文所用“抗体”是指单克隆或多克隆抗体。本文所用术语“单克隆抗体”是指由B细胞的单个克隆产生并结合相同表位的抗体。相反，“多克隆抗体”是指由不同B细胞产生并结合相同抗原的不同表位的抗体群。完整抗体通常由四个多肽组成：重(H)链多肽的两个相同拷贝和轻(L)链多肽的两个相同拷贝。每条重链含有1个N-末端可变区(VH)和3个C-末端恒定区(CH1、CH2和CH3)，每条轻链含有1个N-末端可变区(VL)和1个C-末端区。每对轻链和重链的可变区形成抗体的抗原结合位点。VH和VL区具有相似的一般结构，各区包含4个框架区，其序列相对保守。框架区通过3个互补决定区(CDR)连接。已知为CDR1，CDR2和CDR3的3个CDR形成抗体的“高变区”，其负责抗原结合。
“抗体样分子”可以是例如Ig-超家族成员的蛋白质，其能够选择性地结合结合伴侣。MHC分子和T细胞受体是这样的分子。在一实施方式中，抗体样分子是TCR。在一实施方式中，TCR经修饰以增加其MHC结合亲和力。
术语“抗体的片段”、“抗体片段”、“抗体的功能性片段”和“抗原结合部分”在本文中可互换使用，表示保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段或部分(通常参见，Holliger等,Nat.Biotech.,23(9):1126-1129(2005))。例如，抗体片段理想地包含一个或多个CDR、可变区(或其部分)、恒定区(或其部分)或其组合。抗体片段的示例包括但不限于，(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其是包含两个Fab片段的二价片段，所述Fab片段通过茎区的二硫键连接；(iii)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)单链Fv(scFv)，其是由通过合成接头连接的Fv片段的两个结构域(即VL和VH)组成的单价分子，其能够使2个结构域作为单个多肽链合成(参见例如，Bird等,Science,242:423-426(1988)；Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-5883(1988)；和Osbourn等,Nat.Biotechnol.,16:778(1998))和(v)双抗体，其是多肽链的二聚体，其中各多肽链包含通过肽接头连接VL的VH，所述肽接头太短而不能在相同多肽链上的VH和VL之间配对，从而驱动不同VH-VL多肽链上的互补结构域之间的配对，以生成具有两个功能性抗原结合位点的二聚体分子。本领域已知抗体片段，并且在例如美国专利公开号2009/0093024 A1中详述。
“嵌合抗原受体”也称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体。嵌合抗原受体(CAR)是经工程改造的受体，其将任意的特异性移植到免疫效应细胞上。CAR通常具有胞外结构域(胞外域)，其包含抗原结合结构域和茎区，跨膜结构域和胞内(胞内域)结构域。
涵盖术语“间隔子”或“铰链”区的“茎”区用于将抗原结合结构域与跨膜结构域连接。本文所用术语“茎结构域”通常是指作用为将跨膜结构域连接至多肽链中的胞外结构域或胞质结构域的任何寡核苷酸或多肽。在实施方式中，其足够灵活以允许抗原结合结构域在不同方向上定向以促进抗原识别。在一实施方式中，它是来自IgG1的铰链区。或者包括但不限于免疫球蛋白的CH2CH3区和CD3的部分。在一实施方式中，茎区是CD8α铰链(SEQ IDNO：22)。术语“功能性部分”当参照CAR使用时，是指本文所述CAR的任何部分或片段，这些部分或片段保留所述CAR(亲本CAR，所述部分或片段是该CAR的一部分)的生物学活性。参照编码亲本CAR的核酸序列，编码CAR的功能性部分的核酸序列可以编码包含例如约10％，25％，30％，50％，68％，80％，90％，95％或更多亲本CAR的蛋白质。
本文所用术语“功能性变体”指与参照多肽具有基本或显著序列相同性或相似性的蛋白质或多肽，并且保留其为变体的参照多肽的生物活性。例如，功能性变体涵盖本文所述CAR的那些变体(亲本CAR)，其保留了与亲本CAR识别靶细胞相似程度、相同程度或更高程度的能力。参照编码亲本CAR的核酸序列，编码CAR的功能性变体的核酸序列可以与编码亲本CAR的核酸序列具有例如约10％相同性，约25％相同性，约30％相同性，约50％相同性，约65％相同性，约70％相同性，约75％相同性，约80％相同性，约85％相同性，约90％相同性，约95％相同性或约99％相同性。
如本文所用“诱导型启动子”是指通过转录调节子(例如生物或非生物因子)的存在或不存在而诱导活性的启动子。诱导型启动子是有用的，因为与其操作性连接的基因的表达可以在生物体的某些发育阶段或特定组织中打开或关闭。诱导型启动子的示例是醇调节的启动子，四环素调节的启动子，类固醇调节的启动子，金属调节的启动子，发病机制调节的启动子，温度调节的启动子和光调节的启动子。诱导型启动子可以是基因开关的一部分。诱导型启动子可以是基因开关配体诱导型启动子。在一些情况中，诱导型启动子可以是基于小分子配体-诱导型两个多肽蜕皮激素受体的基因开关，例如基因开关。在一些情况中，基因开关可以选自基于蜕皮激素的受体组分，如以下中描述的任何系统(但不限于)中所述：PCT/US2001/009050(WO 2001/070816)；美国专利号7,091,038；7,776,587；7,807,417；8,202,718；PCT/US2001/030608(WO 2002/029075)；美国专利号8,105,825；8,168,426；PCT/1J52002/005235(WO 2002/066613)；美国专利申请号10/468,200(美国专利公开号20120167239)；PCT/US2002/005706(WO 2002/066614)；美国专利号7,531,326；8,236,556；8,598,409；PCT/U52002/005090(WO 2002/066612)；美国专利号15,959(美国专利公开号20060100416)；PCT/US2002/005234(WO 2003/027266)；美国专利号7,601,508；7,829,676；7,919,269；8,030,067；PCT/U52002/005708(WO 2002/066615)；美国专利申请号10/468,192(美国专利公开号20110212528)；PCT/US2002/005026(WO 2003/027289)；美国专利号7,563,879；8,021,878；8,497,093；PCT/US2005/015089(WO 2005/108617)；U.S.Pat.No.7,935,510；8,076,454；PCT/U52008/011270(WO 2009/045370)；美国专利申请号12/241,018(美国专利公开号20090136465)；PCT/US2008/011563(WO 2009/048560)；美国专利申请号12/247,738(美国专利公开号20090123441)；PCT/US2009/005510(WO 2010/042189)；美国专利申请号13/123,129(美国专利公开号20110268766)；PCT/US2011/029682(WO 2011/119773)；美国专利申请号13/636,473(美国专利公开号20130195800)；PCT/US2012/027515(WO 2012/122025)；和美国专利号9,402,919，其各自通过引用其全部内容纳入)。
本文所述“增殖性疾病”是指一种统一的概念，即细胞的过度增殖和细胞基质的转化显著地导致包括癌症在内的几种疾病的发病机制。
本文所用的“患者”是指诊断患有或怀疑具有或发生增殖性紊乱如癌症的哺乳动物对象。在一些实施方式中，术语“患者”是指具有比发生增殖性紊乱如癌症的平均可能性更高的可能性的哺乳动物对象。示例性的患者可以是人、猿、犬、猪、牛、猫、马、山羊、绵羊、啮齿动物和其他可以受益于本公开疗法的哺乳动物。示例性患者可以是雄性和/或雌性。
“给予/给药”在本文中是指向患者或对象提供一个或多个本文所述的组合物。通过举例而不是限制，可通过静脉内(i.v.)注射，皮下(s.c.)注射，皮内(i.d.)注射，腹膜内(i.p.)注射，或肌肉内(i.m.)注射给予组合物。可采用一种或多种这样的途径。胃肠外施用可以是例如通过推注或逐渐随时间灌注。或者或同时，可通过口服途径给药。另外，也可通过手术放置大丸剂或细胞团块，或放置医疗装置来给药。
“有需要的患者”或“有需要的对象”在本文中是指诊断患有或怀疑有增殖性紊乱如癌症的患者。在一实施方式中，患者患有或可能患有白血病，例如但不限于，急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓性白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓性白血病(CML)。
在一实施方式中，本文所述组合物可以有效治疗或预防增殖性紊乱量包含表达本文所述核酸序列的工程改造的细胞或宿主细胞，或包含本文所述至少一个核酸序列的载体。本文所用的术语“治疗”、“处理”等指获得所需的药理学和/或生理学作用。在实施方式中，作用是治疗性的，即该作用部分或完全治愈疾病和/或导致疾病的的不利症状。至此，本发明方法包括给予“治疗有效量”的组合物，所述组合物包含表达本发明核酸序列的宿主细胞，或包含本发明核酸序列的载体。
“治疗有效量”指按照一定剂量和必要时程能够实现所需治疗效果的量。治疗有效量会根据个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及本文所述组合物在一个或多个对象中引起所需响应的能力而不同。
或者，药理学和/或生理学作用可以是“预防性的”，即该作用完全或部分地预防疾病或其症状。
“预防有效量”指某一个量，其按照一定数量的剂量和必要时程，能够有效实现所需预防效果(例如，预防疾病发生)。
嵌合抗原受体
在本文所述的实施方式中，CAR可以包含用于靶标识别的胞外抗体衍生的单链可变域(scFv)，其中所述scFv可以通过柔性接头连接到跨膜结构域和/或一个或多个胞内信号传导结构域，例如，CD3ζ，用于T细胞活化。通常，当T细胞在体内被激活时，它们通过CD28的次级共刺激信号传导接收初级的抗原诱导TCR信号，诱导细胞因子(即，IL-2和IL-21)的产生，然后所述细胞因子以自分泌/旁分泌方式反馈回到信号传导环路。考虑到这一点，CAR可以包含信号传导结构域，例如，CD28胞质信号传导结构域或其他共刺激分子信号传导结构域，如4-1BB信号传导结构域。嵌合CD28共刺激通过上调抗细胞凋亡分子和产生IL-2以及扩增源自外周血单核细胞(PBMC)的T细胞来改善T细胞持久性。
在一实施方式中，CAR是源自对肿瘤相关抗原具有特异性的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)(例如CD33)与跨膜结构域和CD3ζ胞内域融合的融合体。这类分子导致响应scFv对其靶标的识别而传递ζ信号。
在一个实施方式中，CAR可具有胞外域(胞外)、跨膜结构域和胞内域(胞内)。在CAR胞外域的一个实施方式中，信号肽将新生蛋白导入内质网。例如，如果将在细胞膜中将受体糖基化并锚定。预计任何真核信号肽序列都是有功能的。通常，使用天然接合氨基末端大部分组分的信号肽(例如，在具有定向轻链-接头-重链的scFv中，使用轻链的天然信号)。在实施方式中，信号肽是GM-CSFRa(SEQ ID NO.16)或IgK(SEQ ID NO.34)。可使用的其他信号肽包括来自CD8α和CD28的信号肽。
抗原识别结构域可以是scFv。然而，可能有其他选择。预计来自天然T细胞受体(TCR)α和β单链的抗原识别结构域，因为它们具有简单的胞外域(例如，CD4胞外域，识别HIV感染的细胞)以及其他识别组分，如连接的例如细胞因子(其导致识别携带细胞因子受体的细胞)。以高亲和力结合给定靶标(例如，肿瘤相关抗原)的几乎任何物质都可用作抗原识别区域。
通常，CAR以二聚化形式存在并且表达这样的融合蛋白，所述融合蛋白连接胞外scFv(VH连接到VL)区域、茎结构域、跨膜结构域和胞内信号传导基序。第1代CAR的胞内域仅通过CD3-ζ信号传导诱导T细胞活化。第2代CAR通过CD3-ζ和CD28或其他胞内域如4-1BB或OX40提供活化信号传导。第3代CAR经由基于3个信号传导基序如CD28、4-1BB或OX40的含CD3-ζ的组合活化T细胞。
在实施方式中，本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)结构域，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在实施方式中，胞外结构域包含靶标特异性的结合元件，或者称为抗原结合部分或scFv和茎结构域。在实施方式中，胞内信号传导结构域或其他胞质信号传导结构域包含共刺激信号传导区和ζ链部分。
共刺激信号传导区域是指包含共刺激分子的胞内信号传导结构域的CAR的一部分。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的有效响应所需的。
在实施方式中，CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间纳入了茎结构域。本文所用术语“茎结构域”通常是指作用为将跨膜结构域连接至多肽链中的scFv或胞质结构域的任何寡核苷酸或多肽。茎结构域可以包括柔性铰链(如Fc铰链)，和任选的1个或2个Fc恒定结构域。在一些示例中，茎区包含来自IgG1的铰链区。在替代情况中，茎区包含免疫球蛋白的CH2CH3区和任选的CD3的部分。在一些情况中，茎区包含CD8α铰链区、IgG4-Fc12氨基酸铰链区(ESKYGPPCPPCP)(SEQ ID NO:62)或IgG4铰链区，如WO/2016/073755所述。
跨膜结构域可以来源于天然或合成来源。当所述来源是天然来源时，结构域源自任何膜结合或跨膜蛋白。合适的跨膜结构域可包括T细胞受体的α、β或ζ链的跨膜区；或来自CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的跨膜区。或者，跨膜结构域可以是合成的，并且可以包括疏水残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方式中，合成跨膜结构域的一个或两个末端存在苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，在一些实施方式中，介于2和10个氨基酸长度的短寡核苷酸或多肽接头形成位于CAR的胞质信号传导结构域和跨膜结构域之间的连接。在一些实施方式中，接头是甘氨酸-丝氨酸接头。在一些实施方式中，跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域。在其他实施方式中，跨膜结构域包括CD3ζ跨膜结构域。
胞内结构域可以包括一个或多个共刺激结构域。示例性共刺激结构域包括但不限于CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)、CD3-ζ或其片段或组合。在一些示例中，本文所述CAR包含一个或多个或两个或多个选自下述的共刺激结构域：CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合。在一些示例中，本文所述CAR包含一个或多个或两个或多个选自下述的共刺激结构域：CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合。在一些示例中，本文所述CAR包含一个或多个或两个或多个选自下述的共刺激结构域：CD8、CD28、4-1BB(CD137)、DAP10、DAP12或其片段或组合。在一些示例中，本文所述CAR包含一个或多个或两个或多个选自下述的共刺激结构域：CD28、4-1BB(CD137)或其片段或组合。在一些情况中，本文所述CAR包含共刺激结构域CD28和4-1BB(CD137)或其各自的片段。在一些情况中，本文所述CAR包含共刺激结构域CD28和OX40(CD134)或其各自的片段。在一些情况中，本文所述CAR包含共刺激结构域CD8和CD28或其各自的片段。在一些情况中，本文所述CAR包含共刺激结构域CD28或其片段。在一些情况中，本文所述CAR包含共刺激结构域4-1BB(CD137)或其片段。在一些情况中，本文所述CAR包含共刺激结构域OX40(CD134)或其片段。在一些情况中，本文所述CAR包含共刺激结构域CD8或其片段。在一些情况中，本文所述CAR包含至少一个共刺激结构域DAP10或其片段。在一些情况中，本文所述CAR包含至少一个共刺激结构域DAP12或其片段。
本文所述CAR的胞内信号传导结构域(也称之为胞质结构域)负责活化免疫细胞正常效应功能的至少一种，所述免疫细胞中已经放置了CAR。术语“效应功能”指细胞的特定功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指这样的蛋白质部分，其转导效应功能信号并引导细胞发挥特定功能。尽管通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但是在很多情况中，并不需要使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要该截短部分转导效应功能信号，则可以使用这种截短部分代替完整的链。因此术语胞内信号传导结构域表示包括足以转导效应功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。在一些实施方式中，胞内结构域还包括信号传导结构域，用于T细胞活化。在一些示例中，用于T细胞活化的信号传导结构域包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的结构域。在一些情况，用于T细胞活化的信号传导结构域包括源自CD3ζ的结构域。
在实施方式中，本文提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中所述CAR包含：(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或二者的共刺激信号传导结构域；(e)CD3ζ信号传导结构域；和任选地(f)截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t-1)。
包括在本发明范围内的是这样的核酸序列，其编码本文所述CAR的功能性部分。例如，功能性部分涵盖本文所述CAR的那些部分，其保留了与亲本CAR识别靶细胞或检测、治疗或预防疾病相似程度、相同程度或更高程度的能力。
在实施方式中，CAR在该部分的氨基或羧基末端或在两个末端包含其他氨基酸，所述其他氨基酸未在亲本CAR的氨基酸序列中发现。理想地，其他氨基酸不干扰功能性部分的生物学功能，例如，识别靶细胞，检测癌症，治疗或预防癌症等。更理想的是，与亲本CAR的生物学活性相比，其他氨基酸增强CAR的生物学活性。
本文所用术语“功能性变体”是指这样的CAR、多肽或蛋白质，其与本发明的核酸序列编码的CAR具有实质的或显著的序列相同性或相似性，所述功能性变体保留了作为变体的CAR的生物活性。例如，功能性变体涵盖本文所述CAR的那些变体(亲本CAR)，其保留了与亲本CAR识别靶细胞相似程度、相同程度或更高程度的能力。参照编码亲本CAR的核酸序列，编码CAR的功能性变体的核酸序列可以与编码亲本CAR的核酸序列具有例如约10％相同性，约25％相同性，约30％相同性，约50％相同性，约65％相同性，约80％相同性，约90％相同性，约95％相同性或约99％相同性。
本文所述CAR(包括其功能性部分和功能性变体)包括经糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、环化(例如通过二硫桥)，或转化成酸加成盐和/或任选的二聚化或聚合，或共轭。
抗原结合部分
在实施方式中，本文所述CAR包含靶标特异性的结合元件，或者称为抗原结合部分。在实施方式中，本文所述CAR经工程改造以通过工程改造所需抗原结合部分的方式靶向感兴趣的肿瘤抗原，所述所需抗原结合部分特异性地结合肿瘤细胞上的抗原。在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性紊乱抗原”或“与过度增殖性紊乱相关的抗原”是指特定的过度增殖性紊乱(例如癌症)常见的抗原。
在实施方式中，本文所述CAR的抗原结合部分对CD33(CD33 CAR)具有特异性。当CD33特异性CAR在细胞表面上表达时，其将T细胞的特异性重定向至人CD33。在实施方式中，抗原结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含通过柔性接头(如甘氨酸-丝氨酸接头或Whitlow接头)连接的靶抗原特异性单克隆抗-CD33抗体的可变结构域轻链(VL)和可变结构域重链(VH)。在实施方式中，scFv是M195，m2H12，DRB2和/或My9-6。在实施方式中，scFv是人源化的，例如hM195。在一些实施方式中，抗原结合部分可包含这样的VH和VL，所述VH和VL是(例如从N到C末端)定向连接的VH-接头-VL或VL-接头-VH。
在实施方式中，本文所述CAR包含抗原结合部分，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:1(hM195VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的VL多肽。
在实施方式中，本文所述CAR包含抗原结合部分，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:3(hM195VH)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的VH多肽。
在实施方式中，本文所述CAR包含人源化抗-CD33mAB克隆hM195的抗原结合部分VL(SEQ ID NO:1)和VH(SEQ ID NO:3)以及Gly-Ser接头(SEQ ID NO:6)或该接头的功能性变体。
在实施方式中，本文所述CAR包含抗原结合部分，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:8(hM195VH，VL和接头)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
在实施方式中，本文所述CAR包含抗原结合部分，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:9(M2H12VH)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的VH多肽。
在实施方式中，本文所述CAR包含抗原结合部分，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:10(M2H12VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的VL多肽。
在实施方式中，本文所述CAR包含抗原结合部分，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:11(DRB2VH)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的VH多肽。
在实施方式中，本文所述CAR包含抗原结合部分，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:12(DRB2VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的VL多肽。
在实施方式中，本文所述CAR包含抗原结合部分，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:13(My9-6VH)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的VH多肽。
在实施方式中，本文所述CAR包含抗原结合部分，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:14(My9-6VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的VL多肽。
在实施方式中，抗原结合结构域具有GM-CSFRa信号肽，其与氨基酸序列SEQ IDNO:16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性。
茎结构域
在实施方式中，本发明的的CD33 CAR包括茎结构域，所述茎结构域提供抗原结合部分和T细胞膜之间的分离。在实施方式中，茎结构域建立最佳的效应物-靶标的膜间距离。在实施方式中，茎结构域为抗原结合结构域达到其靶标提供了灵活性。在一实施方式中，茎结构域是CD8α铰链结构域。
在一些实施方式中，CD8α铰链结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
跨膜结构域
在一些实施方式中，CAR包括与该CAR茎结构域的胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然关联CAR中结构域之一的跨膜结构域。在实施方式中，跨膜结构域是跨越膜的疏水性α螺旋。
跨膜结构域可以来源于天然或合成来源。当所述来源是天然来源时，结构域源自任何膜结合或跨膜蛋白。具体用于该发明的跨膜区域包括源自T-细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154的那些(即包含至少它们的跨膜区域)。或者，跨膜结构域可以是合成的，再这样的情况中，其将主要包括疏水残基，如亮氨酸和缬氨酸。在实施方式中，合成跨膜结构域的各末端会有苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，在实施方式中，介于2和10个氨基酸长度的较短接头形成位于CAR的胞质信号传导结构域和跨膜结构域之间的连接。在实施方式中，接头是甘氨酸-丝氨酸接头。
在实施方式中，本文所述的CAR中的跨膜结构域是CD8α跨膜结构域。在实施方式中，CD8α跨膜结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
在实施方式中，本文所述的CAR中的跨膜结构域是CD28跨膜结构域。在实施方式中，CD28跨膜结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
胞质结构域(共刺激结构域和信号传导结构域)
本文所述CAR的胞质结构域(也称之为胞内信号传导结构域)负责活化免疫细胞正常效应功能的至少一种，所述免疫细胞中已经放置了CAR。术语“效应功能”指细胞的特定功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指这样的蛋白质部分，其转导效应功能信号并引导细胞发挥特定功能。尽管通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但是在很多情况中，并不需要使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要该截短部分转导效应功能信号，可以使用这种截短部分代替完整的链。因此术语胞内信号传导结构域表示包括足以转导效应功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本文所述CAR的胞内信号传导结构域的示例可以包括，T细胞受体(TCR)和共同受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列，其中所述共同受体与TCR共同起作用以在抗原受体接合后启动信号传导。
通过TCR生成的单一信号通常不足以完全活化T细胞，并且还需要第二或共刺激信号。因此，T细胞活化可以说是由两个不同类型的胞质信号序列介导的：引发通过TCR的抗原依赖性主活化的那些(初级胞质信号传导序列)和以非抗原依赖性方式作用提供次或共刺激信号的那些(刺激胞质信号传导序列)。
初级胞质信号传导序列可以刺激方式，或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式作用的初级胞质信号传导序列可包含信号传导基序，这些基序又称基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
特别适用于本发明的包含ITAM的初级胞质信号传导序列的示例包括源自TCRζ，FcRγ，FcRβ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，和CD66d。在某些特定实施方式中，本文所述CAR中的胞质信号传导结构域包括来源于CD3ζ的胞质信号传导序列。
在实施方式中，可以将CAR的胞质结构域设计成包括CD3ζ信号传导结构域自身或与其它任何所需胞质结构域组合，所述胞质结构域可以用于本文所述CAR的情况中。例如，CAR的胞质结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区域是指包含共刺激分子的胞内信号传导结构域的CAR的一部分。共刺激分子是除了抗原受体和其配体的细胞表面分子，其为淋巴细胞对抗原有效应答所需。这类分子的示例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和与CD83特异性结合的配体等。在实施方式中，共刺激分子可以一起使用，例如CD28和4-1BB或CD28和OX40。因此，虽然本发明主要以4-1BB和CD28作为共刺激信号元件示例，但其他共刺激元件也在本发明的范围内。
本文所述CAR胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，介于2至10个氨基酸长度的短寡肽接头或多肽接头可形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。
在一实施方式中，胞质结构域包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一实施方式中，胞质结构域包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在另一实施方式中，胞质结构域包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28和4-1BB的信号传导结构域。
在一实施方式中，本文所述CAR中的胞质结构域包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域，其中，所述4-1BB信号传导结构域包含与多肽序列SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽序列，而所述CD3-ζ信号传导结构域包含与多肽序列SEQ ID NO:26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽序列。
在一实施方式中，将本文所述CAR中的胞质结构域设计成包含CD28信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域，其中，所述CD28的信号传导结构域包含与多肽序列SEQ ID NO:28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽序列，而所述CD3-ζ的信号传导结构域包含与多肽序列SEQ ID NO:26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽序列。
在一实施方式中，本文所述CAR中的胞质结构域包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域，其中，所述4-1BB信号传导结构域包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列而所述CD3-ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列。
其他遗传元件
尽管细胞疗法对于人类疾病的治疗具有很大希望，但来自细胞本身或其转基因产物的显著毒性阻碍了临床研究。在本文所述实施方式中，可以使已经注入哺乳动物(例如，人)包含本文所述CAR的免疫效应细胞脱落，如果毒性从它们的使用产生，以便调节这类免疫效应细胞的作用。因此，实施方式中的某些，除了本文所述治疗性CD33特异性嵌合抗原受体，还将第二基因导入本文所述的的工程改造的效应细胞。第二基因实际上是一个“杀伤开关”，其允许消耗含有CD33 CAR的细胞。在某些实施方式中，“杀伤开关”是HER1标签或CD20标签，其包含HER1多肽或CD20多肽，其至少包含HER1或CD20的抗体结合表位或其功能片段，和任选地，信号多肽序列或其片段。
在某些实施方式中，第二基因是HER1标签，其是表皮生长因子受体(HER1)或其片段或变体。在实施方式中，第二基因是HER1标签，其是截短的人表皮生长因子受体1(例如，HER1t或HER1t-1)。在一些情况下，第二基因是截短的人表皮生长因子受体1的变体。在实施方式中，HER1、HER1t和HER1t-1中的至少一种通过允许消耗输注的CAR-T细胞来提供安全机制，所述消耗输注的CAR-T细胞通过给予FDA批准的西妥昔单抗或任何识别HER1、HER1t和/或HER1t-1的抗体来实现。在实施方式中，HER1t基因包含与核酸序列SEQ ID NO:32具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的核苷酸序列。在实施方式中，HER1t-1基因包含与核酸序列SEQ ID NO:54具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的核苷酸序列。该截断的HER1序列，例如HER1t和HER1t-1消除EGF配体结合、EGFR的同源-和异源-二聚化以及EGFR介导的信号传导的可能性，同时保持结合受体的西妥昔单抗的完整(Ferguson,K.,2008.表皮生长因子受体调节基于结构的观察(A structure-based view of Epidermal Growth FactorReceptor regulation).Annu Rev Biophys,第37卷,第353-373页)。
在其他实施方式中，除了本发明的治疗性CD33特异性嵌合抗原受体，导入的第二基因是CD20标签。在一些情况中，CD20标签是全长CD20多肽，或截短的CD20多肽(CD20t-1)。在一些情况中，CD20标签，例如CD20或CD20t-1也通过允许消耗输注的CAR-T细胞来提供安全机制，所述消耗输注的CAR-T细胞通过FDA批准的利妥昔单抗治疗。在某些实施方式中，CD20标签具有与序列SEQ ID NO:36至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽序列。在某些实施方式中，CD20标签是CD20t-1标签，并且具有与序列SEQ ID NO:56至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽序列。在一些实施方式中，CD20标签由CD20基因编码，其包含与核酸序列SEQ ID NO:35具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的核苷酸序列。在一些实施方式中，CD20标签由CD20t-1基因编码，其包含与核酸序列SEQ ID NO:57具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的核苷酸序列。
在实施方式中，包含本文所述CAR的CAR载体还包含全长CD20标签，其包含与核酸序列SEQ ID NO:36具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的核酸序列。
在实施方式中，编码杀伤标签的基因(例如，HER1t、HER1t-1、CD20或CD20t-1标签)经由与自切割肽(例如但不限于明脉扁刺蛾(Thosea asigna)病毒(T2A)肽)同框而在3'末端与CD33 CAR遗传融合。在实施方式中，T2A肽具与氨基酸序列SEQ ID NO:30具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸序列。
在实施方式中，将杀伤标签与CD33 CAR同框地克隆到pFUGW慢病毒质粒骨架。在其他实施方式中，将两个基因克隆到睡美人转座子载体中。在其他实施方式中，将杀伤标签克隆到分开的慢病毒载体中。在其他实施方式中，将杀伤标签如HER1t、HER1t-1、CD20或CD20t-1克隆到分开的睡美人转座子载体中。在某些实施方式中，所述标签具有信号肽，例如，GM-CSFRa信号肽，其中，该GM-CSFRa信号肽与氨基酸序列SEQ ID NO:16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性。在某些实施方式中，信号肽是这样的IgK，其具有与核酸序列SEQ ID NO:34至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的序列。在一些情况中，信号肽可以选自IgE和CD8α，其变体或片段。
编码CAR和本文所述的杀伤标签的示例性载体示于图2。
示例性CAR开放阅读框
本文所述方法和组合物所涵盖的示例性CAR和人CD33受体开放阅读框列于表1中。
表1
在实施方式中，本文所提供的是编码CAR的分离的核酸，其中，所述CAR包含与SEQID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQID NO:51或SEQ ID NO:53的氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
在表1中以“hM195scFv”所列的各实施方式中，CAR抗原结合部分是这样的hM195scFV，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。在实施方式中，hM195scFv具有GM-CSFRa信号肽，所述信号肽与氨基酸序列SEQ ID NO:16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性。
在表1中以“CD8a”的各实施方式中，CAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽，并且茎结构域是CD8a，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
在表1中以“CD28m”的各实施方式中，CAR的胞内结构域包含具有这样氨基酸序列的CD28，所述氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO:28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性。
在表1中以“T2A”的各实施方式中，CAR ORF包括自切割明脉扁刺蛾(Thoseaasigna)病毒(T2A)肽，其能够由单个载体产生多个基因产物。在实施方式中，T2A肽具有这样的氨基酸序列，其与氨基酸序列SEQ ID NO:30具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性。
在表1中“HER1t”的实施方式中，CAR ORF包括截短的表皮生长因子受体(HER1t)，其通过允许消耗输注的CAR-T细胞来提供安全机制，所述消耗输注的CAR-T细胞通过给予FDA批准的西妥昔单抗治疗来实现。本文所述的HER1t基因可以包含与氨基酸序列SEQ IDNO:31具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽序列。除非在表1中另有说明，HER1t标签具有GM-CSFRa信号肽(“GM-CSFRsp”)(SEQ IDNO:16)。在某些实施方式中，可以用其他标签，例如HER1t-1或CD20t-1取代HER1t。在表1中“IgKsp”的实施方式中，信号肽是具有与氨基酸序列SEQ ID NO:34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸序列的IgK。
在表1中“4-1BB”的实施方式中，CAR ORF包含具有这样多肽序列的共刺激分子，所述多肽序列与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性。
在表1中“FL CD20”的实施方式中，CAR ORF包含全长CD20标签，其包含具有与氨基酸序列SEQ ID NO:36具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽序列。CD20通过允许消耗输注的CAR-T细胞提供了一种安全机制，所述消耗输注的CAR-T细胞通过给予FDA批准的利妥昔单抗疗法来实现。在表1中的某些实施方式中，CAR ORF可以处于用于基因转录的诱导型启动子的控制下。在一方面，诱导型启动子可以是基因开关配体诱导型启动子。在一些情况中，诱导型启动子可以是基于小分子配体-诱导型两个多肽蜕皮激素受体的基因开关，例如基因开关。
细胞因子
在一些实施方式中，将本文所述CAR与一个或多个其他治疗剂给予对象，所述其他治疗剂其包括但不限于细胞因子。在一些情况中，细胞因子包含至趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子或其变体或组合中的至少一个。一些情况中，细胞因子是白细胞介素。在一些情况中，白细胞介素是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33和其功能性变体和片段中的至少一个。在一些实施方式中，细胞因子可以是膜结合的或分泌的。在实施方式中，细胞因子是可溶性IL-15、可溶性IL-15/IL-15Rα复合物(例如，ALT-803)。在某些情况中，白细胞介素可以包含膜结合的IL-15(mbIL-15)或IL-15和IL-15R的融合体。在一些实施方式中，mbIL-15是膜结合的嵌合IL-15，其可以与本文所述经修饰的免疫效应细胞共表达。在一些实施方式中，mbIL-15包括全长IL-15(例如，天然IL-15多肽)或其片段或变体，在框内与全长IL-15Rα及其功能性片段或变体融合。在一些情况中，IL-15通过接头间接地连接于IL-15Rα。在一些示例中，mbIL-15如Hurton等,“栓系的IL-15在肿瘤特异性T细胞中增强抗肿瘤活性并促进干细胞存储子集(Tethered IL-15augments antitumoractivity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells),”PNAS 2016所述。在一些情况中，细胞因子在与CAR相同的免疫效应细胞中表达。在一些实施方式中，上述细胞因子可以处于用于基因转录的诱导型启动子的控制下。在一方面，诱导型启动子可以是基因开关配体诱导型启动子。在一些情况中，诱导型启动子可以是基于小分子配体-诱导型两个多肽蜕皮激素受体的基因开关，例如基因开关。
在其他实施方式中，白熬本文所述CAR的免疫效应细胞表达膜结合的IL-15(“mIL-15或mbIL-15”)。在本发明的方面，mbIL-15包含IL-15和IL-5Rα之间的融合蛋白。在其他实施方式中，mbIL-15具有这样的氨基酸序列，其与氨基酸序列SEQ ID NO:37具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性。
在一些实施方式中，mbIL-15表达细胞标签，诸如本文所述的HER1t、HER-1t-1、CD20t-1或CD20。mbIL-15可以在框内与HER1t、HER-1t-1、CD20t-1或CD20框内表达。
在一些实施方式中，mbIL-15可以处于用于基因转录的诱导型启动子的控制下。在一方面，诱导型启动子可以是基因开关配体诱导型启动子。在一些情况中，诱导型启动子可以是基于小分子配体-诱导型两个多肽蜕皮激素受体的基因开关，例如基因开关。
基于病毒的传递系统
本发明还提供了递送系统，如基于病毒的系统，其中插入了本发明的核酸。代表性的病毒表达载体包括但不限于，基于腺病毒的载体(例如，购自库赛尔有限公司(CrucellInc.)(荷兰莱顿)的基于腺病毒的Per.C6系统)，基于慢病毒的病毒(例如，来自说明技术公司(Life Technologies)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)的基于慢病毒的pLPI)和逆转录病毒(例如，pFB-ERV加pCFB-EGSH)，疱疹病毒。在一实施方式中，病毒载体是慢病毒载体。源自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于源自肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外的优点。通常，并且在实施方式中，合适的载体含有在至少一个生物体中起作用的复制起点，启动子序列，方便的限制性内切核酸酶位点和一个或多个可选择的标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
在实施方式中，提供这样的慢病毒载体，其包含骨架和编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；(e)CD3ζ信号传导结构域。任选地，载体还包含编码截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t-1)、CD20t-1或全长CD20的核酸。
在一些情况中，提供了这样的载体，其包含骨架和编码下述的核酸序列：(1)截短的表皮生长因子受体如HER1t或HERt-1或其功能性片段；和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。
在一些情况中，提供了这样的载体，其包含骨架和编码下述的核酸序列：(1)全长CD20、截短的CD20或其功能性片段；和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。
在实施方式中，将编码CD33特异性CAR的核酸克隆到包含慢病毒骨架组分的载体。示例性的骨架组分包括但不限于，pFUGW和pSMPUW。pFUGW慢病毒载体骨架是自失活性(SIN)慢病毒载体骨架并且去除了不必要的HIV-1病毒序列，导致肿瘤形成、有害突变和感染性颗粒再生的可能性降低。在实施方式中，编码CD33 CAR的载体还在单个构建体中编码mbIL-15。在实施方式中，将CD33 CAR和mbIL-15编码在两个分开的慢病毒载体上。在一些实施方式中，mbIL-15用截短的表皮生长因子受体标签表达。在实施方式中，CD33 CAR可以与mbIL-15和来自单个慢病毒载体的细胞标签共表达。在其他实施方式中，CD33 CAR可以处于诱导型启动子的控制下。在另一实施方式中，mbIL-15可以处于诱导型启动子的控制下。在一方面，诱导型启动子可以是基因开关配体诱导型启动子。在一些情况中，诱导型启动子可以是基于小分子配体-诱导型两个多肽蜕皮激素受体的基因开关，例如基因开关。
在一实施方式中，本文所述的CD33 CAR包含抗-CD33scFv、人CD8铰链和跨膜结构域，以及人4-1BB和CD3ζ信号传导结构域。在另一实施方式中，本发明的CD33 CAR包含抗-CD33scFv、人CD8铰链和跨膜结构域、人4-1BB和CD3ζ信号传导结构域，并且任选地，截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t-1)标签。其他合适的载体包括整合表达载体，其可以随机整合到宿主细胞的DNA中，或者可以包括重组位点，以实现表达载体和宿主细胞的染色体之间的特异性重组。这类整合表达载体可以利用宿主细胞染色体的内源性表达控制序列以实现所需蛋白质的表达。以位点特异性方式整合的载体的示例包括，例如，来自英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)的flp-in系统的组分(例如，pcDNATM5/FRT)或cre-lox系统，如可以存在于司查塔基公司(Stratagene)(加利福尼亚州拉由拉市)的pExchange-6核心载体。随机整合到宿主细胞染色体中的载体的示例包括，例如，来自英杰公司(加利福尼亚州卡尔斯巴德)的pcDNA3.1(当在不存在T-抗原的情况下导入时)和来自普洛麦格公司(Promega)(威斯康星州麦迪逊市)的pCI或ppFN10A(ACT)FLEXITM。其他启动子元件，例如，增强子调控转录启动的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域中，但是最近已经证明数个启动子在起始位点的下游也含有功能元件。启动子元件之间的间隙通常是柔性的，使得当元件翻转或相对于彼此移动时保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始减弱之前，启动子元件之间的间距可增加到50bp。取决于启动子，单个元件似乎可协同或单独发挥作用以激活转录。
合适的启动子的一个示例是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其操作性连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。
合适的启动子的另一个示例是人延伸生长因子1α1(hEF1a1)。在实施方式中，包含本文所述CAR的载体构建体包含hEF1a1功能性变体。
然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于，猿猴病毒40(SV40)早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)，人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子，MoMuLV启动子，禽白血病病毒启动子，EB病毒立即早期启动子，鲁斯氏肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，诸如但不限于，肌动蛋白启动子，肌球蛋白启动子，血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了这样的分子开关能够启动与其可操作连接的多核苷酸序列表达，当需要这种表达时，或者关闭该表达，或者当不需要表达时。诱导型启动子的示例包括但不限于，金属硫蛋白启动子，糖皮质激素启动子，孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估本文所述CAR或其部分的表达，待导入细胞的表达载体还可含有可选择的标志物基因或报告基因或两者，以便于从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标志物可以在分开的DNA片段上携带并用于共转染程序。可选择标志物和报告基因都可以侧接适当的调节序列，以使其能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标志物包括例如抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因(neo)和氨苄青霉素抗性基因等。在一些实施方式中，截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t-1)标签可用作可选择的标志物基因。
报告基因可用于鉴定潜在转染的细胞和用于评估调节序列的功能。通常，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或由其表达的基因，并且其编码这样的多肽，所述多肽的表达通过一些易于检测的特性(例如，酶活性)体现。在将DNA导入受体细胞后，在适当的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等,FEBS Letters479:79-82(2000))。合适的表达系统是众所周知的，并且可以使用已知的技术制备或商业获得。通常，具有显示报告基因最高表达水平的最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这类启动子区可以与报告基因连接，并用于评估用于调节启动子驱动的转录的试剂的能力。
在实施方式中，本文所述载体可以包含驱动转基因表达的hEF1a1启动子，增强转录的牛生长激素聚A序列，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，以及源自pFUGW质粒的LTR序列。
人们熟知导入和表达的基因插入细胞中的方法。在表达载体的上下文中，可以通过本领域的任何方法将载体容易地导入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物学方式将表达载体转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞(例如免疫效应细胞)的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法为本领域所熟知。参见例如，Sambrook等.(《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual),冷泉港出版社,纽约(2001))。在实施方式中，将多核苷酸引入宿主细胞的方法是磷酸钙转染或聚乙烯亚胺(PEI)转染。
用于将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞(例如免疫效应细胞)的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物(例如人细胞)中最广泛使用的方法。其他病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸导入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物，纳米胶囊，微球，珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂，胶束，混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载剂的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。
在使用病毒递送系统的情况中，示例性递送载体是脂质体。脂质制剂可用于将核酸导入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质关联。与脂质相关的核酸可以被包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸相关的连接分子与脂质体接合，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散于含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，其作为脂质中的悬浮液包含，包含胶束或与之复合，或以其他方式与脂质关联。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“塌陷”结构存在。他们还可以简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪滴，其天然存在于细胞质以及含有长链脂族烃及其衍生物的化合物类，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质可获自商业来源。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以获自密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,Mo.)；磷酸二十六烷基酯(“DCP”)可以获自从K&K实验室(纽约州普莱恩维尤)；胆固醇(“Choi)可以获自卡巴开-贝林公司(Calbiochem-Behring)；肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以获自阿凡提极性脂质制品有限公司(Avanti Polar Lipids,Inc.)(阿拉巴马州的伯明翰)。在氯仿或氯仿/甲醇脂质储液可以储存在约-20℃。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。”脂质体“是通用术语，包括通过产生封闭的脂质双分子层或聚集体形成的各种单层和多层脂质载体。脂质体可以表征为具有囊泡结构，该囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有水性介质隔开的多重脂质层。当磷脂悬浮在过量水溶液中时其自动形成。脂质组分进行自重排列，然后形成闭合结构并将水包埋在内，并溶解脂双层之间的溶质(Ghosh等,Glycobiology 5:505-10(1991))。然而，还包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。
基于非病毒的传递系统
也可以使用基于非病毒的递送系统，如“睡美人(SB)转座子系统”将编码本发明所述CAR的核酸导入免疫效应细胞，所述SB转座子系统是指用于将DNA序列导入脊椎动物染色体的合成DNA转座子系统。示例性的SB转座子系统述于例如美国专利号6,489,458和8,227,432中，并且示于图3。睡美人转座子系统由睡美人(SB)转座酶和SB转座子组成。
DNA转座子以简单的切割和粘贴方式从一个DNA位点易位至另一个DNA位点。转座是一个精确的过程，其中从一个DNA分子切下一个确定的DNA片段并移动到相同或不同DNA分子或基因组中的另一个位点。与其他Tc1/mariner型转座酶一样，SB转座酶将转座子插入受体DNA序列中的TA二核苷酸碱基对。插入位点可以在同一DNA分子的其他地方，或在另一个DNA分子(或染色体)中。在哺乳动物基因组中，包括人类，大约有2亿个TA位点。TA插入位点在转座子整合过程中重复。TA序列的这种重复是转座的标志，并用于确定一些实验中的机制。转座酶可以在转座子内编码，或转座酶可以由另一来源提供，在这种情况中，转座子成为非自主元件.非自主转座子作为遗传工具是最有用的，因为在插入后它们不能独立地继续切除和重新插入。预计SB转座子用作非病毒载体，用于将基因导入脊椎动物的基因组以及用于基因疗法。简言之，睡美人(SB)系统(Hackett等,Mol Ther 18:674-83,(2010))适用于遗传修饰T细胞(Cooper等,Blood 105:1622-31,(2005))。这涉及两个步骤：(i)表达SB转座子的DNA质粒的电转移[即，嵌合抗原受体(CAR)，用以重定向T细胞的特异性(Jin等,Gene Ther 18:849-56,(2011)；Kebriaei等,Hum Gene Ther23:444-50,(2012))和SB转座酶和(ii)在源自K562细胞系的设计人人工抗原呈递细胞(AaPC)上稳定表达整合子的T细胞的繁殖和扩增(也称之为AaPC(活化和繁殖细胞)。在一实施方式中，SB转座子系统包括编码tdIL-15、IL-21和/或嵌合抗原受体的编码序列。这类系统述于例如Singh等,Cancer Res(8):68(2008).2018年4月15日和Maiti等,J Immunother.36(2):112–123(2013)中，通过引用其全部内容纳入本文。
在某些实施方式中，本文所述CD33 CAR和mbIL-15在转座子DNA质粒载体中编码，并且该SB转座酶在分开的载体中编码。在某些实施方式中，本文所述CD33 CAR在转座子DNA质粒载体中编码，mb-IL15在第二转座子DNA质粒载体中编码，而SB转座酶在第三DNA质粒载体中编码。在一些实施方式中，mbIL-15编码有杀伤标签，如HER1t、HRt-1、CD20或CD20t-1。
无论用于将外源核酸引入宿主细胞中还是以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法，为了证实重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种试验。这类试验包括，例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”试验，例如Southern和Northern印迹，RT-PCR和PCR；“生物化学”试验，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如，通过免疫学手段(ELISA和Western印迹)或通过本文所述试验鉴定落入本发明范围内的试剂。
在实施方式中，使用SB11转座子系统、SB100X转座子系统、SB110转座子系统，piggyBac转座子系统(参见例如，Wilson等,“(人细胞中PiggyBac转座子介导的基因转移)PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells,”Molecular Therapy15:139-145(2007)，通过引用其全部内容纳入本文)和/或piggyBat转座子系统(参见例如，Mitra等,“来自蝙蝠小棕蝠(Myotis lucifugus)的piggyBat功能性表征揭示了活性哺乳动物DNA转座子(Functional characterization of piggyBat from the bat Myotislucifugus unveils an active mammalian DNA transposon),”Proc.Natl.Acad.Sci USA110:234-239(2013)将CD33 CAR和其他遗传元件递送到细胞。其他转座酶或转座子系统提供于下述中：美国专利号7,148,203；8,227,432；美国专利公开号2011/0117072；Mates等,Nat Genet,41(6):753-61(2009).doi:10.1038/ng.343.Epub 2009年5月3日,Gene Ther.,18(9):849-56(2011).doi:10.1038/gt.2011.40.Epub 2011年5月31日和Ivics等,Cell.91(4):501-10,(1997)，其各通过引用其全部内容纳入本文。
在其他实施方式中，CD33 CAR和其他遗传元件如细胞因子、mbIL-15和/或HER1t/HER1t-1/CD20/CD20t-1标签可以通过重组酶和整合表达载体整合到免疫效应细胞的DNA中。这类载体可以随机整合到宿主细胞的DNA中，或者可以包括重组位点，以实现表达载体和宿主细胞的染色体之间的特异性重组。这类整合表达载体可以利用宿主细胞染色体的内源性表达控制序列以实现所需蛋白质的表达。在一些实施方式中，通过在供体多核苷酸上存在这样的序列来促进靶向整合，所述序列与侧接整合位点的序列同源。例如，使用本文所述供体多核苷酸的靶向整合可以遵循常规转染技术实现，例如，用于通过同源重组产生基因敲除或敲入的技术。在其他实施方式中，通过在供体多核苷酸上存在这样的序列或通过使细胞与供给多核苷酸在位点特异性重组酶存在的情况下接触来促进靶向整合，所述序列与侧接整合位点的序列同源。通过位点特异性重组酶或简单地述及重组酶意指在相容的重组位点之间催化保守位点特异性重组的多肽。本文所用位点特异性重组酶包括天然多肽以及保留活性的衍生物、变体和/或片段，以及编码保留活性的重组酶的天然多核苷酸、衍生物、变体和/或片段。
重组酶可以在导入靶向载体之前、同时或之后导入靶向的细胞。重组酶可以作为蛋白质直接导入细胞，例如，使用脂质体，包被的颗粒或显微注射。或者，可以使用合适的表达载体将编码重组酶的多核苷酸(DNA或信使RNA)导入细胞。上述靶向载体组分能够用于构建含有编码感兴趣重组酶序列的表达盒。然而，重组酶的表达可以其他方式调节，例如，通过将重组酶的表达置于可调节启动子的控制下(即，可以选择性诱导或抑制其表达的启动子)。
重组酶可以来自整合酶或解离酶家族。重组酶的整合酶家族具有超过一百个成员，包括例如FLP、Cre和λ整合酶。整合酶家族也称为酪氨酸家族或λ整合酶家族，其使用催化酪氨酸的羟基对DNA的磷酸二酯键进行亲核攻击。通常，酪氨酸家族的成员最初切割DNA，后来形成双链断裂。酪氨酸家族整合酶的示例包括Cre、FLP、SSV1和λ整合酶。解离酶家族也称为丝氨酸重组酶家族，在其中保守的丝氨酸残基与DNA靶位点形成共价连接(Grindley,等,(2006)Ann Rev Biochem 16:16)。
在一实施方式中，重组酶是分离的多核苷酸序列，其包含编码选自下述的重组酶的核酸序列：SPβc2重组酶，SF370.1重组酶，Bxb1重组酶，A118重组酶和φRv1重组酶。丝氨酸重组酶的示例述于美国专利号9,034,652中，其全部内容通过引用并入本文，其通过引用全文纳入本文。
用于本发明实践的重组酶可以如前所述经重组产生或纯化。具有所需重组酶活性的多肽可以通过蛋白质硫酸铵沉淀，纯化领域中已知的方法纯化至所需纯度，包括但不限于，尺寸分级，亲和色谱，HPLC，离子交换层析，肝素琼脂糖亲和色谱(例如，Thorpe和Smith,Proc.Nat.Acad.Sci.95:5505-5510,1998.)。
在一实施方式中，可以通过任何合适的方法将重组酶导入包含重组接合位点(此处需要产生重组)的真核细胞中。本领域熟知将功能性蛋白质导入细胞的方法，例如，通过显微注射或其他方法。导入纯化的重组酶蛋白确保了蛋白质及其功能的瞬时存在，这通常是优选的实施方式。或者，编码重组酶的基因可以包括在用于转化细胞的表达载体中，其中编码重组酶的多核苷酸与介导真核细胞中多核苷酸表达的启动子操作性连接。还可以通过编码重组酶多肽的信使RNA将重组酶多肽导入真核细胞中。通常优选的是，重组酶仅存在于将核酸片段插入经修饰的基因组所必需的时间。因此，预计缺乏与大多数表达载体相关的持久性是不利的。可以在导入感兴趣的外源多核苷酸之前、之后或同时将重组酶基因导入细胞。在一实施方式中，重组酶基因存在于携带待插入的多核苷酸的载体内；重组酶基因甚至可以包括在多核苷酸内。
在一实施方式中，用于位点特异性重组的方法包括提供第一重组位点和第二重组位点；使第一和第二重组位点与原核重组酶多肽接触，导致重组位点之间的重组，其中重组酶多肽可介导第一和第二重组位点之间的重组，第一重组位点是attP或attB，第二重组位点是attB或attP，而重组酶选自下述：单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)噬菌体重组酶，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)噬菌体重组酶，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)噬菌体重组酶，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)噬菌体重组酶和垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)噬菌体重组酶，前提是当第一重组接合位点是attB是，第二重组接合位点是attP，而当第一重组接合位点是attP时，第二重组接合位点是attB。
实施方式进一步提供了将位点特异性重组酶导入基因组经修饰的细胞中。一实施方式涉及用于在真核细胞中获得位点特异性重组的方法，包括提供包含第一重组接合位点和第二重组接合位点的真核细胞；使第一和第二重组接合位点与原核重组酶多肽接触，导致重组接合位点之间的重组，其中重组酶多肽可介导第一和第二重组接合位点之间的重组，第一重组接合位点是噬菌体基因组重组接合位点(attP)或细菌基因组重组接合位点(attB)，第二重组接合位点是attB或attP，而重组酶选自下述：单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)噬菌体重组酶，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)噬菌体重组酶，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)噬菌体重组酶，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)噬菌体重组酶和垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)噬菌体重组酶前提是当第一重组接合位点是attB时，第二重组接合位点是attP，而当第一重组接合位点是attP时，第二个重组接合位点是attB。在一实施方式中，选择重组酶选自：A118重组酶，SF370.1重组酶，SPβc2重组酶，φRv1重组酶和Bxb1重组酶。在一实施方式中，重组导致整合。
包含CD33 CAR和载体的细胞
本文提供了表达本文所述CAR的工程改造的细胞。在某些实施方式中，本文所述工程改造的细胞是免疫效应细胞。在实施方式中，本文提供了这样的免疫效应细胞，其包含骨架和编码下述的核酸序列：(1)截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t-1)；和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。
在某些实施方式中是包含嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞，其中所述CAR包含：(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；(e)CD3ζ信号传导结构域；和(f)截短的表皮生长因子受体(HER1t或HER1t-1)。
在实施方式中，本文提供的是这样的免疫效应细胞，其包含(1)细胞标签，用作杀伤开关、选择标志物、生物标志物或其组合；和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。在实施方式中，细胞标签是HER1t、HER1t-1、CD20t-1或CD20。
在实施方式中，免疫效应细胞是T细胞、天然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。在实施方式中，当CD33抗原结合结构域与CD33结合时，细胞表现出抗肿瘤免疫。
修饰的免疫效应细胞
提供了经修饰以表达本文所述的一个或多个异源基因或多肽的免疫效应细胞。提供了经修饰以表达本文所述CD33 CAR和HER1t、HER1t-1、CD20和CD20t-1标签中至少一个的免疫效应细胞。在一些情况中提供了经修饰以表达本文所述CD33 CAR、mbIL-15和HER1t、HER1t-1、CD20和CD20t-1标签中至少一个的免疫效应细胞。
本文所用术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是一种类型的淋巴细胞，其在细胞介导的免疫中起核心作用通过在细胞表面上存在T细胞受体(TCR)，它们可以与其他淋巴细胞(例如B细胞和天然杀伤细胞(NK细胞))区分开。
在一些实施方式中，经修饰的免疫效应细胞是包含T细胞和/或天然杀伤细胞的经修饰的免疫细胞。T细胞或T淋巴细胞是参与细胞介导的免疫的白细胞亚型。示例性T细胞包括T辅助细胞，细胞毒性T细胞，TH17细胞，干细胞记忆T细胞(TSCM)，幼稚T细胞，记忆T细胞，效应T细胞，调节T细胞或天然杀伤T细胞。
“T辅助细胞”(TH细胞)在免疫过程协助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化。在一些示例中，TH被称为CD4+T细胞，因为它们在细胞表面表达CD4糖蛋白。当辅助T细胞通过MHC II型分子呈递肽抗原时，辅助T细胞被激活，所述MHC II型分子在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。一旦被激活，它们迅速分裂并分泌称之为细胞因子的小蛋白质，所述细胞因子调节或协助主动免疫应答。这些细胞可以分化成几种亚型之一，包括TH1、TH2、TH3、TH17、Th9或TFH，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。来自APC的信号传导指导T细胞成为特定的亚型。
“细胞毒性T细胞”(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还涉及移植排斥。这些细胞也称为CD8+T细胞，因为它们在其表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通过与MHC I型分子相关的抗原结合来识别它们的靶标，所述MHC I型分子存在于所有有核细胞的表面上。通过调节T细胞分泌的IL-10、腺苷和其他分子，可以将CD8+细胞灭活至无反应性状态，而这预防自身免疫疾病。
“记忆T细胞”是抗原特异性T细胞的一个子集，其在感染消退后长期持续存在。它们在重新暴露于其同源抗原后迅速扩增至大量效应T细胞，从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包含三种亚型：干细胞记忆T细胞(TSCM)，中枢记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞表达细胞表面蛋白CD45RO、CD45RA和/或CCR7。
“调节T细胞”(Treg细胞)，之前称之为抑制T细胞，其在维持免疫耐受中起作用。它们的主要作用是在免疫反应结束时关闭T细胞介导的免疫，并抑制胸腺中逃脱负选择过程的自身反应性T细胞。
天然杀伤T细胞(NKT细胞)将先天免疫系统与适应性免疫系统联系起来。不同于识别由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的肽抗原的常规T细胞，NKT细胞识别由称之为CD1d的分子呈递的糖脂抗原。一旦被激活，这些细胞可以进行归因于Th和Tc细胞的功能(即，细胞因子产生以及细胞溶解/细胞杀伤分子的释放)。它们还能够识别并消除一些肿瘤细胞和感染疱疹病毒的细胞。
天然杀伤(NK)细胞是先天免疫系统的一类细胞毒性淋巴细胞。在一些示例中，NK细胞提供针对病毒感染和/或肿瘤形成的第一道防线。NK细胞可检测被感染细胞或癌细胞上存在的MHC，触发细胞因子释放，随后诱导裂解和凋亡。NK细胞可以在不存在抗体和/或MHC的情况中进一步检测应激细胞，从而允许快速免疫应答。
修饰的免疫效应细胞剂量
在一些实施方式中，向有需要的对象给予一定量经修饰的免疫效应细胞并且基于诱导细胞因子相关毒性的功效和潜力来确定所述量。在一些情况中，一定量经修饰的免疫效应细胞包含约105至约109经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况中，一定量经修饰的免疫效应细胞包含约105至约108经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况中，一定量经修饰的免疫效应细胞包含约105至约107经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况中，一定量经修饰的免疫效应细胞包含约106至约109经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况中，一定量经修饰的免疫效应细胞包含约106至约108经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况中，一定量经修饰的免疫效应细胞包含约107至约109经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况中，一定量经修饰的免疫效应细胞包含约105至约106经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况中，一定量经修饰的免疫效应细胞包含约106至约107经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况中，一定量经修饰的免疫效应细胞包含约107至约108经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些情况中，一定量经修饰的免疫效应细胞包含约108至约109经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些示例中，一定量经修饰的免疫效应细胞包含约109经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些示例中，一定量经修饰的免疫效应细胞包含约108经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些示例中，一定量经修饰的免疫效应细胞包含约107经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些示例中，一定量经修饰的免疫效应细胞包含约106经修饰的免疫效应细胞/kg。在一些示例中，一定量经修饰的免疫效应细胞包含约105经修饰的免疫效应细胞/kg。
在一些实施方式中，CAR-T细胞是CD33特异性CAR-T细胞。在一些情况中，一定量的CD33特异性CAR-T细胞包含约105至约109CAR-T细胞/kg。在一些情况中，一定量的CD33特异性CAR-T细胞包含约105至约108CAR-T细胞/kg。在一些情况中，一定量的CD33特异性CAR-T细胞包含约105至约107CAR-T细胞/kg。在一些情况中，一定量的CD33特异性CAR-T细胞包含约106至约109CAR-T细胞/kg。在一些情况中，一定量的CD33特异性CAR-T细胞包含约106至约108CAR-T细胞/kg。在一些情况中，一定量的CD33特异性CAR-T细胞包含约107至约109CAR-T细胞/kg。在一些情况中，一定量的CD33特异性CAR-T细胞包含约105至约106CAR-T细胞/kg。在一些情况中，一定量的CD33特异性CAR-T细胞包含约106至约107CAR-T细胞/kg。在一些情况中，一定量的CD33特异性CAR-T细胞包含约107至约108CAR-T细胞/kg。在一些情况中，一定量的CD33特异性CAR-T细胞包含约108至约109CAR-T细胞/kg。在一些示例中，一定量的CD33特异性CAR-T细胞包含约109CAR-T细胞/kg。在一些示例中，一定量的CD33特异性CAR-T细胞包含约108CAR-T细胞/kg。在一些示例中，一定量的CD33特异性CAR-T细胞包含约107CAR-T细胞/kg。在一些示例中，一定量的CD33特异性CAR-T细胞包含约106CAR-T细胞/kg。在一些示例中，一定量的CD33特异性CAR-T细胞包含约105CAR-T细胞/kg。
免疫效应细胞来源
在某些方面，本文所述实施方式包括制备和/或扩增抗原特异性的重定向免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞或NK T细胞)的方法，其包括用包含编码CAR的DNA(或RNA)构建体的表达载体转染细胞，然后任选地，用饲养细胞、重组抗原或受体抗体刺激细胞以使细胞增殖。在某些方面，经工程改造以表达CAR的细胞(或细胞群)是干细胞、iPS细胞、免疫效应细胞或这些细胞的前体。
免疫效应细胞的来源可以包括同种异体和自体来源。在一些情况中，免疫效应细胞可以分化自干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)。因此，用于根据实施方式进行工程改造的细胞可以分离自脐带血、外周血、人胚胎干细胞或iPSC。例如，同种异体T细胞可以经修饰，以包括嵌合抗原受体(并且任选地，缺少功能性TCR)。在一些方面，免疫效应细胞是原代细胞，如源自人外周血单核细胞(PBMC)的T细胞。PBMC可以收集自外周血或用G-CSF(粒细胞集落刺激因子)刺激后的骨髓或脐带血。转染或转导后(例如，使用CAR表达构建体)，细胞可以立即输注或可以冷冻保存。在某些方面，转染后，细胞可以在基因转移到细胞后的约1、2、3、4、5天或更长时间内作为大量群体离体繁殖数天、数周或数月。另一方面，转染后，将转染子克隆并将这样的克隆体外扩增，所述克隆证明存在单个整合或附加体保持的表达盒或质粒的克隆，并且将嵌合抗原受体的表达体外扩增。选择用于扩增的克隆显示出特异性识别和裂解表达抗原的靶细胞的能力。可以通过以IL-2或结合共同γ链的其他细胞因子(例如，IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和其他)的刺激来扩增重组T细胞。可以通过以人工抗原呈递细胞的刺激来扩增重组T细胞。重组T细胞可以在人工抗原呈递细胞上或以抗体如OKT3扩增，所述抗体在T细胞表面上交联CD3。可以使用基于磁珠的分离方法和/或荧光激活细胞分选技术进一步选择重组T细胞的亚组，并用AaPC进一步培养。在另一方面，可以冷冻保存遗传修饰的细胞。
T细胞还可由许多来源获得，包括骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。本发明的某些实施方式中，可以使用本领域现有的任何数量的T细胞系。在本发明的某些实施方式中，使用本领域技术人员已知的许多技术(如，分离)可由收集自对象的单位血液T获得细胞。在实施方式中，通过单采获得来自个体循环血液的细胞。单采产物通常包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核血液白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方式中，通过单采收集的细胞经清洗以去除血浆部分，并将该细胞置于合适的缓冲液或培养基中以供后施处理步骤。在本发明的一个实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞。在另一实施方式中，清洗溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁，或缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。在不存在钙的情况下的初始活化步骤导致放大的活化。本领域普通技术人员将容易理解的，清洗步骤可通过本领域已知的方法实现，如根据生产商的说明书通过使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。清洗后，细胞可以重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如无Ca2+PBS、无Mg2+PBS、勃脉力(PlasmaLyte)A或其它具有不具有缓冲液的盐溶液。或者，可以去除单采样品中不需要的组分，并且将细胞直接重悬于培养基中。
在其他实施方式中，通过将红血细胞分裂并将单核细胞耗尽由外周血淋巴细胞分离T细胞，例如，通过梯度的离心或通过对流离心洗脱法。诸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞的T细胞特异性亚群可以通过正或负选择技术进一步分离。例如，在一实施方式中，通过用抗-CD3/抗-CD28(即3x28)偶联的珠(如 M-450CD3/CD28T)孵育足以阳性选自所需T细胞的一段时间来分离T细胞。在一个实施方式中，该时间段是约30分钟。在另一个实施方式中，该时间段是在30分钟至36小时的范围内或更长，以及其间所有整数值。在另一个实施方式中，该时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在另一实施方式中，该时间段是10至24小时。在一实施方式中，该孵育时间段是约24小时。为了由白血病患者分离T细胞，使用诸如24小时的较长孵育时间可以提高细胞产率。在任何T细胞相较于其它细胞类型较少的情况下，可以使用较长的孵育时间以分离T细胞，如在由肿瘤组织或免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中。此外，较长孵育时间的使用可以增强捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞结合CD3/CD28珠的时间和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文后续所述)，可在培养开始时或在过程中的其他时间点优先进行对于或针对T细胞亚群的选择。此外，通过增加或降低珠上或其它表面上抗-CD3和/或抗-CD28抗体的比例，可在培养开始时或在其他所需时间点优先进行对于或针对T细胞亚群的选择。本领域技术人员将会意识到，在本发明中也可以使用多轮选择。在某些实施方式中，人们可能会细胞进行选择步骤，并且将“未选择的”细胞用于活化和扩增过程中。“未选择的”细胞也可以同样进行更多轮的选择。
通过负选择进行的T细胞群富集可以通过与这样抗体的组合实现，所述抗体针对负选择细胞独有的表面标志物。一种方法是通过使用单克隆抗体混合物的负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述单克隆抗体混合物针对呈递至负选择的细胞上的细胞表面标志物。例如，为了通过负选择针对CD4+细胞进行富集，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR，和CD8的抗体。在某些实施方式中，人们可能希望针对这样的调节T细胞进行富集或针对这样的调节T细胞进行正选择，所述调节体细胞表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+。或者，在某些实施方式中，T调节细胞被抗-C25偶联的珠或其它相似的选择方法消耗。
对于通过正或负选择分离所需细胞群，可以不同的细胞或表面(例如，颗粒，如珠)浓度。在某些实施方式中，人们可能希望显著地降低珠和细胞混合在一起的体积(即，升高细胞的浓度)以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用了20亿细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用了10亿细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，使用了大于1亿细胞/ml。在另一个实施方式中，使用了1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万细胞/ml的浓度。在其它一个实施方式中，使用了7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿细胞/ml的浓度。在另一些实施方式中，使用了1.25亿或1.5亿/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产率增加、细胞活化和细胞扩增。此外，高细胞浓度的使用允许更有效地捕获这样的细胞，所述细胞可能较弱表达感兴趣的靶抗原，如CD28-负T细胞，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(即白血病血液、肿瘤组织等)。这样的细胞群可能具有治疗价值，并且将会是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在相关实施方式中，人们可能希望使用较低浓度的细胞。通过将T细胞和表面(例如，诸如珠的颗粒)的混合物显著地稀释使颗粒和细胞之间的相互作用最小化。这选择了这样的细胞，其表达大量所需待结合颗粒的抗原。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度中比CD8+T细胞更有效地被捕获。在一个实施方式中，使用的细胞浓度是5x106/ml。在其他实施方式中，使用的浓度可以是约1x105/ml至1x106/ml，并且可以是其间任何整数。
在其他实施方式中，细胞可以在选择器上在2-10℃或室温下以各种速度孵育各种时间。
也可以将用于刺激的T细胞在清洗步骤后冷冻。经过移除血浆和血小板的清洗步骤后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。本领域中已知许多冷冻溶液和参数并且可以用于本文中，一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或这样的培养基，其含有10％右旋糖酐40和5％右旋糖，20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或31.25％勃脉力-A，31.25％右旋糖5％，0.45％NaCl，10％右旋糖酐40和5％右旋糖，20％人血清白蛋白，和7.5％DMSO或其他合适的细胞冷冻培养基，其包含例如羟乙基淀粉(Hespan)和勃脉力A，然后将该细胞以1°/分钟冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用控制冷冻的其他方法，以及在-20℃或液氮中进行不受控制的立即冷冻。
在某些实施方式中，将冷冻保存的细胞解冻并如本文所述清洗，并在使用本法所述方法活化前将其在室温静止1小时。
在某些实施方式中还提供了在当本文所述扩增细胞可能需要之前的时间段内由对象收集血液样品或单采产品。如此，可以在需要的任何时间点收集待扩增细胞的来源，并且分离且冷冻所需细胞(如T细胞)，后续用于针对将受益于T细胞疗法的各种疾病或病症(入本文所述的那些)的T细胞疗法。在一实施方式中，血液样品或单采血液成分取自健康对象。在某些实施方式中，血液样品或单采血液成分取自这样的整体健康对象，其处于患并风险，但是尚未患病，并且将感兴趣的细胞分离且冷冻待用。在某些实施方式中，可以扩增、冷冻并在后续时间使用T细胞。在某些实施方式中，样品收集自刚被诊断出患有本文所述特定疾病但是尚未进行任何治疗的患者。在另一实施方式中，在进行任何相关治疗方式之前将细胞从来自对象的血液样品或单采血液成分中分离，所述相关治疗方式包括但不限于下述试剂的治疗，如那他珠单抗、依法利珠单抗、抗病毒剂、化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂，如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、霉酚酸酯和FK506，抗体或其他免疫净化剂(immunoablative agent)，如CAMPATH、抗-CD3抗体、癌得星(cytoxan)、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228和辐射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢霉素和FK506)或抑制对于生长因子诱导的信号传导十分重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等,Cell 66:807-815,(1991)；Henderson等,Immun 73:316-321,(1991)；Bierer等,Curr.Opin.Immun5:763-773,(1993))。在另一实施方式中，针对患者将细胞分离并冷冻，用于随后与骨髓或干细胞移植联用(例如，之前，同时或之后)，T细胞净化(ablative)疗法使用诸如氟达拉滨、外线束放射治疗(XRT)、环磷酰胺的化疗剂或诸如OKT3或CAMPATH的抗体。在另一实施方式中，在下述之前分离细胞并且可以将其冷冻，用于随后B细胞净化疗法后的治疗，如与CD20反应的试剂，例如，利妥昔(Rituxan)。
在本发明的另一实施方式中，从治疗后的患者直接获得T细胞。就此而言，已经观察到在某些癌症治疗后，特别是用损害免疫系统的药物的治疗，在治疗后不久，患者正常将从治疗中恢复期间，获得的T细胞量可能是最佳的或改善其体外扩增能力。类似地，在使用本文所述方法体外操纵后，这些细胞可以处于增强的移植和体外扩增的优选状态。因此，在本发明的上下文中考虑了在该恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血细胞系的其他细胞。此外，在某些实施方式中，可以使用调动(例如，用GM-CSF调动)和调节方案来在受试者中产生这样的条件，其有利于特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增，特别是在治疗后确定一段时间。说明性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。
T细胞的活化和扩增
无论是在工程改造T细胞以表达本文所述的CAR之前或之后，通常使用例如美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005中所述的方法可以活化和扩增T细胞。
通常，本文所述T细胞通过与这样的表面接触而扩增，所述表面接合有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂以及刺激T细胞表面共刺激分子的配体。具体而言，可以如本文所述刺激T细胞群，如通过与抗-CD3抗体或其抗原结合片段接触，或固定于表面的抗-CD2抗体接触，或通过与和钙离子载体联合的蛋白质激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)接触。为了共刺激T细胞表面的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群在适于刺激T细胞增殖的条件下可与抗-CD3抗体或抗-CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，考虑抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。可以使用抗-CD28抗体的示例包括9.3，B-T3，XR-CD28(Diaclone，法国贝桑松市)，也可以使用本领域所公知的其它方法(Berg等,TransplantProc.30(8):3975-3977,(1998)；Haanen等,J.Exp.Med.190(9):13191328,(1999)；Garland等,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,(1999))。
在某些实施方式中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可由不同的方案提供。例如，提供各信号的试剂可以在溶液中或偶联于表面。当偶联于表面时，试剂可以偶联于相同的表面(即，“顺式”形成)或分开的表面(即，“反式”形成)。或者，一种试剂可以偶联于表面，而另一种在溶液中。在一实施方式中，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，而提供主要活化信号的试剂在溶液中或偶联于表面。在某些实施方式中，两种试剂可以在溶液中。在另一实施方式中，试剂可以是可溶形式，然后交联于表面，如表达Fc受体的细胞或抗体或与试剂结合的其他结合剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810，考虑了用于在本发明中激活和扩增T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)。
在一实施方式中，将两种试剂固定在珠上，在相同的珠上即“顺式”，或于分开的珠上即“反式”。举例来说，提供初级激活信号的试剂是抗-CD3抗体或其抗原结合片段，而提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并将两种试剂以相同的分子量共固定于相同的珠。在一实施方式中，1：1比例结合珠的各抗体用于T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面，使用一定比例结合珠的抗CD3：CD28抗体，从而使相较于使用1：1的比例所观察到的扩增，该一定比例观察到的T细胞扩增增加。在一特定实施方式中，相较于使用1：1比例所观察到的扩增，观察到约1-约3倍增加。在一实施方式中，结合珠的CD3：CD28抗体的比例范围为100：1-1：100，以及期间所有整数值。在本发明的一个方面，相比抗-CD3抗体，更多的抗-CD28抗体与颗粒结合，即CD3：CD28的比例小于1。在本发明的某些实施方式中，结合珠的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2：1。在一特定实施方式中，使用1：100的CD3：CD28比例的结合珠的抗体。在另一实施方式中，使用1：75的CD3：CD28比例的结合珠的抗体。在另一实施方式中，使用1:50的CD3:CD28比例的结合珠的抗体。在另一实施方式中，使用1:30的CD3:CD28比例的结合珠的抗体。在实施方式中，使用1:10的CD3:CD28比例的结合珠的抗体。在另一实施方式中，使用1：3的CD3：CD28比例的结合珠的抗体。在另一实施方式中，使用3：1的CD3：CD28比例的结合珠的抗体。
1：500-500：1和期间任何整数值的颗粒与细胞比例可以用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比例可以取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸的珠只能结合几个细胞，而较大的珠可以结合许多细胞。在某些实施方式中，细胞与颗粒比例的范围是从1:100到100:1和其间的任何整数值，并且在另一实施方式中，可用于刺激T细胞的该比例包括1:9到9:1和其间的任何整数值。如上所述，导致T续表刺激的抗-CD3-和抗-CD28-偶联的颗粒与T细胞的比例可以不同，然而，某些值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，其中一个比例是每个T细胞至少1:1颗粒。在一个实施方式中，使用1:1或更小的颗粒与细胞比例。在一特定实施方式中，颗粒:细胞比例是1:5。在其它实施方式中，颗粒与细胞的比例可以根据刺激当天而变化。例如，在一实施方式中，颗粒与细胞的比例在第1天为从1：1-10：1，并且在这之后每天或每隔一天向细胞添加其他颗粒多至10天，达到从1：1-1：10的最终比例(基于添加当天的细胞计数)。在一特定实施方式中，颗粒与细胞的比例在刺激的第1天为1：1，并在刺激的第3天和第5天调整成1：5。在另一实施方式中，每天或每隔一天添加颗粒至第1天的最终比例为1：1，并在刺激的第3天和第5天为1：5。在另一实施方式中，颗粒与细胞的比例在刺激的第1天为2：1，并在刺激的第3天和第5天调整成1：10。在另一实施方式中，每天或每隔一天添加颗粒至第1天的最终比例为1：1，并在刺激的第3天和第5天成1：10。本领域技术人员将理解的是，各种其他比例可适用于本发明。特别地，比例将根据粒度大小和细胞大小和类型而变化。
在本文所述其他实施方式中，将免疫效应细胞(如T细胞)与试剂涂覆的珠组合，随后分离珠和细胞，然后将细胞培养。在另一实施方式中，在培养之前，试剂涂覆的珠和细胞不是分开的，而是一起培养的。在另一个实施方式中，首先通过施加力(例如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
举例来说，可以通过允许抗-CD3和抗-CD28接合的顺磁珠(3×28珠)与T细胞接触来连接细胞表面蛋白。在一实施方式中，细胞(例如，104-109T细胞)和珠(例如，以1:1比例的 M-450CD3/CD28T顺磁珠，或来自美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotec)的微)在缓冲液中组合，例如PBS(不含二价阳离子如钙和镁)。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解任何细胞浓度均可以使用。例如，靶细胞在样品中可能非常罕见并且仅占0.01％的样品或整个样品(即100％)均可包含感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数都在本发明的范围内。在某些实施方式中，人们可能希望显著地降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，升高细胞的浓度)以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用了约20亿细胞/ml的浓度。在另一实施方式中，使用了大于1亿细胞/ml。在另一实施方式中，使用了1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万细胞/ml的浓度。在另一实施方式中，使用了7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿细胞/ml的浓度。在其他实施方式中，使用了1.25亿或1.5亿/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产率增加、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞这样的细胞群可能具有治疗价值，并且在某些实施方式中将会是所需的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在本文所述的一实施方式中，可以将混合物培养几小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在另一个实施方式中，可以培养混合物21天。在本发明的一实施方式中，珠和T细胞一起培养约8天。在另一实施方式中，珠和T细胞一起培养2-3天。也可能需要几个刺激周期，从而使T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或，X-vivo 15，(隆萨公司(Lonza)))，其可以包括增殖和存活必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)，白细胞介素-2(IL-2)，胰岛素，IFN-γ，IL-4，IL-7，GM-CSF，IL-10，IL-12，IL-15，TGFβ和TNF-α或其它本领域技术人员已知用于细胞生长的添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于，表面活性剂，质体酸盐和还原剂，如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20，优选添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，要么是无血清，要么补充了适量血清(或血浆)或确定了一组激素，和/或足以使T细胞生长和扩增量的细胞移植。例如青霉素和链霉素的抗抗生素仅包括在试验培养物中，不包括在待输注到对象中的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
已经暴露于不同刺激时间的T细胞可能展现出不同的特征。例如，典型的血液或单采(apheresed)外周血单核细胞产物具有辅助T细胞群(TH，CD4+)，其比细胞毒性或抑制性T细胞群(TC，CD8+)更大。通过刺激CD3和CD28受体的T细胞的离体扩增产生T细胞群，其在大约第8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，T细胞群包含逐渐增多TC细胞群。相应地，取决于治疗的目的，用主要包括TH细胞的T细胞群输注对象可以是有有利的。相似地，如果TC细胞的抗原特异性亚组已经被分离，将该亚组扩增至更大的程度可能是有益的。
此外，除了CD4和CD8标志物，其它表型标志物显著变化，但是很大程度上，在细胞扩增过程中可重复地进行。因此，这样的可重复性使其能够针对特定目的定制活化的T细胞产物。
一些情况中，实施方式的免疫效应细胞(例如，T细胞)与活化和繁殖细胞(AaPC)共培养以帮助细胞扩增.AaPC也可称为人工抗原呈递细胞(aAPC).例如，抗原呈递细胞(APC)能够用于制备实施方式的治疗性组合物和细胞疗法产品。在一方面，AaPC可以是转基因K562细胞。对于抗原呈递系统的制备和使用的一般指导，参见，例如美国专利号6,225,042、6,355,479、6,362,001和6,790,662；美国专利申请公开号2009/0017000和2009/0004142；国际公开号WO2007/103009，其各自通过应用纳入本文。在实施方式的另一方面，培养转基因CAR细胞包括在树突细胞存在下培养转基因CAR细胞或活化和繁殖刺激表达CAR的免疫效应细胞扩增的细胞(AaPC)。在更进一步的方面，AaPC包含在AaPC表面表达的CAR结合抗体或其片段。在一些情况中，AaPC可以包含活化活化或共刺激T细胞的其他分子。在一些情况中，其他分子可以包括膜结合的Cγ细胞因子。在更进一步的方面，AaPC被灭活或辐照，或已经过测试并证实不含感染性物质。在更进一步的方面，在AaPC存在下培养转基因CAR细胞包括在包含可溶性细胞因子如IL-15、IL-21和/或IL-2的培养基中培养转基因CAR细胞。细胞可以以下述比例培养：约10：1至约1:10；约3：1至约1：5；约1：1至约1：3(免疫效应细胞与AaPC)；或从中衍生的任何范围。例如，T细胞和AaPC的共培养可以为约1：1、约1：2或约1：3的比例。
在一方面，AaPC可以表达CD137L。在其他方面，AaPC可以进一步表达CD19、CD64、CD86或mIL15。在某些方面，AaPC可以表达至少一个抗-CD3抗体克隆，例如OKT3和/或UCHT1。在一方面，AaPC可以经灭活(例如，辐照)。在一方面，AaPC已经过测试并证实不含感染性物质。产生这类AaPC的方法是本领域熟知的。在一方面，培养CAR修饰的T细胞群与AaPC可以包括以下述比例培养细胞：约10：1至约1:10；约3：1至约1：5；约1：1至约1：3(T细胞与AaPC)；或从中衍生的任何范围。例如，T细胞和AaPC的共培养可以约1：1、约1：2或约1：3的比例。在一方面，培养步骤可以进一步包括以氨基二膦酸盐(例如唑来膦酸)培养。
在另一方面，培养和/或刺激转基因CAR细胞群不超过7、14、21、28、35、42天、49、56、63或70天。在实施方式中，刺激包括共培养转基因CAR T细胞与AaPC以促进CAR阳性T细胞的生长。在另一个方面，刺激转基因CAR细胞群不超过：1X刺激，2X刺激，3X刺激，4X刺激，5X刺激，5X刺激，6X刺激，7X刺激，8X刺激，9X刺激或10X刺激。在一些示例中，在AaPC存在的情况下不离体培养转基因细胞。在一些具体的示例中，实施方式的方法还包括在转染和/或培养步骤后，富集表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)的细胞群。富集可以包括荧光激活细胞分选(FACS)和分选表达CAR的细胞。在另一方面，分选表达CAR的细胞包括使用CAR结合抗体。富集还可以包括CD56+细胞的消耗。在实施方式的另一方面，方法还包括冷冻保存转基因CAR细胞群的样品。
在一些情况中，AaPC与最佳长度的肽一起孵育，所述肽允许肽与MHC分子直接结合，无需额外处理。或者，细胞可以表达感兴趣的抗原(即，在MHC非依赖性抗原识别的情况中)。此外，在一些情况中，APC可以表达通常与特定CAR多肽或与CAR多肽结合的抗体(例如，通用活化和繁殖细胞(uAPC)。这类方法在WO/2014/190273中公开，其通过引用纳入本文。除了肽-MHC分子或感兴趣的抗原之外，AaPC系统还可以包含至少一个外源辅助分子。可以使用任何合适数量和组合的辅助分子。辅助分子可选自辅助分子诸如共刺激分子和粘附分子。示例性的共刺激分子包括CD70和B7.1(B7.1之前称之为B7，也称之为CD80)，其还与T细胞表面上的CD28和/或CTLA-4分子结合，从而影响，例如，T细胞扩增，Th1分化，短期T细胞存活和细胞因子(如白细胞介素(IL)-2)分泌。粘附分子可以包括结合碳水化合物的糖蛋白，如选择蛋白，跨膜结合糖蛋白，如整联蛋白，钙依赖性蛋白质，如钙粘蛋白，和单通道跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白，如细胞间粘附分子(ICAM)，其促进例如细胞与细胞或细胞与基质的接触。示例性的粘附分子包括LFA-3和ICAM，如ICAM-1。能够用于选择、克隆、制备和表达示例性辅助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的技术、方法和试剂在例如美国专利号6,225,042、6,355,479和6,362,001中示例，通过引用纳入。
选择成为AaPC的细胞，优选在胞内抗原加工、胞内肽运输和/或胞内MHC I型或II型分子-肽加载方面存在缺陷，或者是冷血的(即，对温度挑战的敏感性低于哺乳动物细胞系)，或具有缺陷和冷血特性。优选地，选择成为AaPC的细胞也缺少将至少一个内源性对应物(例如，如上所述的内源性MHC I型或II型分子和/或内源性辅助分子)表达到外源性MHCI型或II型分子的能力以及协助引入细胞的分子组分。此外，在其修饰以产生AaPC之前，AaPC优选保留获自细胞的缺陷和冷血性质。示例性的AaPC由与抗原加工(TAP)缺陷细胞系(如昆虫细胞系)相关的转运蛋白构建或衍生。示例性的冷血昆虫细胞系是果蝇细胞系，如Schneider 2细胞系(参见例如，制备、生长和培养Schneider2细胞的Schneider 1972说明性方法(Schneider 1972Illustrative methods for the preparation,growth,andculture of Schneider 2cells)，其在美国专利号6,225,042、6,355,479和6,362,001中提供。
在一实施方式中，AaPC也进行冻融循环。在示例性冻融循环中，冷冻AaPC可以通过将含有AaPC的合适容器与适量的液氮、固体二氧化碳(即，干冰)或类似的低温材料接触，从而使其发生迅速冷冻。然后将冷冻的APC解冻，或者通过将AaPC从低温物质中除去并暴露于室温条件下，或者通过促进解冻过程解冻，其中使用温水浴或暖手以促进更短的解冻时间。获自，在解冻之前，可以将AaPC冷冻并储存一段延长的时间。冷冻的AaPC也可以解冻，然后在进一步使用前冻干。最好地是，可能对冻融过程产生不利影响的防腐剂，诸如二甲基亚砜(DMSO)，聚乙二醇(PEG)和其他防腐剂不存在于含有经历冻融循环的AaPC的介质中，或被基本上除去，如通过将AaPC转移到基本上没有这种防腐剂的介质上。
在其他实施方式中，异种核酸和AaPC内源的核酸可以通过交联灭活，从而在灭活后基本上不出现细胞生长，核酸的复制或表达。在一实施方式中，在外源性MHC和辅助分子表达、呈递这类分子于AaPC表面上并用选定的一个或多个肽加载呈递的MHC分子之后的时间点处AaPC失活。因此，这类失活且选择的肽加载的AaPC虽然基本上不能增殖或复制，但保留了选择的肽呈递功能。优选地，交联还产生在没有显著降低AaPC的抗原呈递细胞功能的情况下基本上不含污染微生物(如细菌和病毒)的AaPC。因此，交联保持了重要的AaPC功能，同时有助于减轻对使用AaPC开发的细胞疗法产品安全性的担忧。对于涉及交联和AaPC的方法，参见例如，美国专利申请公开号20090017000，通过引用将其纳入本文。
在某些实施方式中，进一步提供了经工程改造的抗原呈递细胞(APC)。例如，这类细胞可以如上所述使用以离体繁殖免疫效应细胞。在其他方面，工程改造的APC本身可以给予患者，并因此刺激免疫效应细胞的体内扩增。实施方式的工程改造的APC本身可以用作治疗剂。在其他实施方式中，工程改造的APC可以用作治疗剂，其可以刺激对靶抗原具有特异性的内源性免疫效应细胞的活化和/或增加对靶抗原特异性的过继转移的免疫效应细胞的活性或持久性。
本文所用术语“工程改造的APC”是指包含至少第一转基因的细胞，其中所述第一转基因编码HLA。这类工程改造的APC可以进一步包含用于表达抗原的第二转基因，从而使抗原呈递于与HLA复合的APC的表面。在一些方面，工程改造的APC可以是呈递抗原的细胞类型(例如，树突细胞)。在其他方面，工程化的APC可以由通常不存在抗原的细胞类型产生，如T细胞或T细胞祖细胞(称之为“T-APC”)。因此，在一些方面，实施方式的工程改造的APC包含编码靶抗原的第一转基因和编码人白细胞抗原(HLA)的第二转基因，从而使HLA在与靶抗原表位复合的工程改造的APC的表面上表达。在某些具体方面，工程改造的APC中表达的HLA是HLA-A2。
在一些方面，实施方式的工程改造的APC可以进一步包含编码共刺激分子的至少第三转基因。共刺激刺激分子可以是共刺激细胞因子，其可以是一种膜结合的Cγ细胞因子。在某些方面，共刺激细胞因子是IL-15，如膜结合的IL-15。在一些其他方面，工程改造的APC可包含编辑的(或缺失的)基因。例如，可以编辑抑制基因，例如PD-1、LIM-3、CTLA-4或TCR，以减少或消除基因的表达。实施方式的工程改造的APC可以进一步包含编码感兴趣的任何靶抗原的转基因。例如，靶抗原可以是感染性疾病抗原或肿瘤相关抗原(TAA)。
在本公开的一实施方式中，本文所述免疫效应细胞在护理点位置被修饰。在一些情况中，护理点位置位于对象附近的设施(例如，医疗机构)或医院。在一些情况中，通过工程改造/导入嵌合受体和/或细胞因子到免疫效应细胞中修饰免疫效应细胞，然后迅速输注到对象中。在一些实施方式中，通过本文所述的载体经电穿孔修饰这类免疫效应细胞。在其他实施方式中，载体是非病毒或病毒载体。在一情况中，非病毒载体是睡美人转座子洗头功能。在一些情况中，修饰的免疫效应细胞不进行繁殖和活化步骤。在一些情况中，修饰的免疫效应细胞不进行孵育和培养步骤。在一些情况中，通过工程改造/导入的嵌合受体和细胞因子到免疫效应细胞中修饰免疫效应细胞，然后迅速输注到对象中。在一些情况中，通过工程改造/导入的嵌合受体和细胞因子到免疫效应细胞中修饰免疫效应细胞，然后在至少0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时内迅速输注到对象。在其他情况中，通过工程改造/导入嵌合受体和细胞因子到细胞中修饰NK或T细胞，然后在0天，<1天，<2天，<3天，<4天，<5天，<6天或<7天内输注到对象中。在一些情况中，免疫效应细胞的来源可以包括同种异体和自体来源。在一情况中，免疫效应细胞可以是T细胞或NK细胞。在一情况中，嵌合受体可以是CD33 CAR。在另一情况中，细胞因子可以是mbIL-15。在另一情况中，表达CD33 CAR的免疫效应细胞可以是包括HER1t或HER1t-1标签。在另一情况中，HER1t标签可以包含SEQ ID NO:32或54或其变体或片段。在一情况中，mbIL-15是SEQ ID NO:37或54或其变体或片段。在另一情况中，mbIl-15还可以包含HER1t或HER1t-1标签。在另一个情况中，CD33 CAR和/或mbIL-15的表达通过本文所述的基因开关表达系统调节。
治疗性应用
在本文所述实施方式中，用慢病毒载体(LV)转导免疫效应细胞(例如，T细胞)。例如，LV编码CAR，其组合CD33的抗原识别结构域与CD8α铰链及其变体的茎结构域，CD3-ζ的细胞内结构域，CD28，4-1BB或其任何组合以及胞内结构域CD3ζ。因此，在一些情况中，转导的T细胞可以引发CAR介导的T细胞应答。
在本文所述实施方式中提供了使用CAR将原代T细胞的特异性重定向至CD33肿瘤抗原。因此，本发明还提供了用于刺激哺乳动物中对靶细胞群或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括向哺乳动物给予表达CAR的T细胞的步骤，其中CAR包含与CD33特异性相互作用的结合部分，茎结构域，包含例如人CD3ζ胞内结构域的ζ链部分和共刺激信号传导区。
在一实施方式中，本公开包括一类细胞疗法，其中T细胞经遗传修饰以表达本发明的CD33特异性CAR，并且将CAR T细胞输注给有需要的受体。输注的细胞能够杀死受体中的肿瘤细胞。不同于抗体疗法，CAR T细胞能够在体内复制，产生可导致持续的肿瘤控制的长期持久性。
在一实施方式中，本文所述CAR T细胞可以进行强烈的体内T细胞扩增，并可持续延长的时间。在另一实施方式中，本发明的CAR T细胞进化成特异性记忆T细胞，其可以被再活化以抑制任何额外的肿瘤形成或生长。
本文所述的CAR修饰的T细胞还可以用作一类疫苗，用于哺乳动物体外免疫和/或体内疗法。在实施方式中，哺乳动物是人。对于离体免疫，在将免疫效应细胞给予哺乳动物之前，体外发生以下至少一种情况：i)细胞扩增，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
离体过程是众所周知的，并在下面更全面地讨论。简言之，细胞分离自哺乳动物(例如人)并用表达本文所公开的CAR的载体进行遗传修饰(即，体外转导或转染)。可以将CAR修饰的细胞给予哺乳动物受体以提供治疗益处。哺乳动物受体可以是人，并且CAR修饰的细胞相对于受体可以是自体的。或者，细胞相对于受体可以是同种异体的、同源的或异种的。
用于体外扩增造血干细胞和祖细胞的方法描述于美国专利号5,671,808中，通过引用将其纳入本文，其可以应用于本发明的细胞。本领域已知其他合适的方法，因此本发明不限于细胞离体扩增的任何特定方法。简而言之，T细胞的离体培养和扩增包括：(1)由外周血收获物或骨髓外植体收集哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；(2)离体扩增这类细胞。除了美国专利号5,199,942中所述细胞生长因子，其他因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体可用于培养和扩增细胞。
除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗之外，本发明还提供用于体内免疫的组合物和方法，以引起针对患者中抗原的免疫应答。
通常，如本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗和预防免疫受损个体中出现的疾病。具体地，本发明的CAR-修饰的T细胞用于治疗骨髓性恶性肿瘤，例如急性髓性白血病(AML)。在某些实施方式中，本发明的细胞用于治疗处于发展出AML风险的患者。因此，本发明提供了用于治疗或预防AML的方法，其包括给予有此需要的对象治疗有效量的本发明的CAR修饰的T细胞。在实施方式中，如本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗复发性或难治性AML。
简而言之，本发明的药物组合物可包含本文所述的靶细胞群，以及一个或多个药学上或生理学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包括缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；糖类，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。在实施方式中，配制本发明的组合物用于静脉内给药。
本文所述药物组合物可以适合待治疗(或预防)疾病的方式给予。通过诸如患者状态这样的因素以及患者疾病的类型和严重程度确定给药的数量和频率，尽管合适的剂量可以通过临床试验确定。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，考虑到个体在年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度和患者(对象)状态中的不同，可由医生确定待给予的本发明组合物的精确量。通常地，包括本文所述的T细胞的药物组合物可以104至109细胞/kg体重、105至106细胞/kg体重的剂量给予，包括该范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以以这些剂量多次给予。通过使用免疫治疗中通常所知的输注技术可以给予细胞(参见例如，Rosenberg等,New Eng.J.of Med.319:1676,(1988))。通过监测患者的疾病的症状并相应地调整治疗，医疗技术领域的技术人员可以容易地确定对于特定患者的优选剂量和治疗方案。
在某些实施方式中，可能需要将活化的T细胞给予对象，随后重新采血(或进行单采)，根据本发明从中活化T细胞，并用这些活化和扩增的T细胞重新再输注于患者。该过程可以每隔几周进行多次。在某些实施方式中，T细胞可以活化自10cc至400cc的血液采集。在某些实施方式中，T细胞活化自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液采集。并不受限于理论，使用多次血液采集/多次再输注方案可用于选择某些T细胞群。在另一实施方式中，可能需要在患者通过放疗或化疗而进行淋巴耗尽后给予对象活化的T细胞。
可以各种方便的方式给予本文所述组合物，包括气溶胶吸入、注射、服用、输液、植入或移植。本文所述组合物可以通过静脉(i.v.)注射经皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内，或腹腔内给予患者。在一实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射给予患者。在另一实施方式中，本发明的T细胞组合物通过静脉注射给予。T细胞的组合物可以直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。
待给予患者的上述治疗的剂量将随着所治疗病症的确切性质和治疗的受体而变化可以根据本领域公认的实践来进行人类施用剂量的缩放。例如，上述治疗的剂量可以是1×104CAR+细胞/kg至5×106CAR+细胞/kg的范围。示例性剂量可以是1x104CAR+细胞/kg、1x105CAR+细胞/kg、3x105CAR+细胞/kg、1x106CAR+细胞/kg或5x106CAR+细胞/kg。对于成人或儿科患者，可以相应地调整适当的剂量。
或者，给予哺乳动物(例如，人)的免疫效应细胞的典型量可以是例如，在100万至1000亿细胞的范围；然而，低于或高于该示例性范围的量在本发明的范围内。例如，发明的宿主细胞的剂量可以是约100万至约500亿(例如，约500万细胞、约2500万细胞、约5亿细胞、约10亿细胞、约50亿细胞、约200亿细胞、约300亿细胞、约400亿细胞或由前述任何两个值定义的范围)，约1000万至约1000亿细胞(例如，约2000万细胞、约3000万细胞、约4000万细胞、约6000万细胞、约7000万细胞、约8000万细胞、约9000万细胞、约100亿细胞、约250亿细胞、约500亿细胞、约750亿细胞、约900亿细胞或由前述任何两个值定义的范围)，约1亿细胞至约500亿细胞(例如，约1.2亿细胞、约2.5亿细胞、约3.5亿细胞、约4.5亿细胞、约6.5亿细胞、约8亿细胞、约9亿细胞、约30亿细胞、约300亿细胞、约450亿细胞或由前述任何两个值定义的范围)。
治疗或预防功效可以通过定期评估治疗的对象来监测。对于数天或更长时间的重复给药，可根据所述病症重复治疗直至疾病症状得到所需阻遏。然而，其他剂量方案可能是有用的并且在本发明的范围内。所需剂量的递送可以通过单次推注(bolus)给予所述组合物，通过多次推注给予所述组合物或通过连续输注给予组合物。
包含表达所公开核酸序列的免疫效应细胞的组合物或包含那些核酸序列的载体可以与一个或多个其他治疗剂一起给药，所述其他治疗剂可以共同给予哺乳动物。述及“共同给予”是指在足够接近的时间给予一个或多个其他治疗剂和包含本发明宿主细胞或本发明载体的组合物，以增强一个或多个其他治疗剂的作用，或反之亦然。在这方面，包含本文所述免疫效应细胞或本文所述载体的组合物可以与一个或多个其他治疗剂同时给予，或者首先给予该组合物，然后给予一个或多个其他治疗剂，或者反之亦然。或者，可以同时给予包含所公开的免疫效应细胞或本文所述载体的组合物以及一个或多个其他治疗剂。
可以包括在组合物或与该组合物共同给予(或包括在药盒中)的治疗剂的示例是白细胞介素、细胞因子、干扰素、佐剂和化学治疗剂，所述组合物包含本发明的宿主细胞和/或本发明的载体。在实施方式中，其他治疗剂是IFN-α，IFN-β，IFN-γ，GM-CSF，G-CSF，M-CSF，LT-β，TNF-α，生长因子和hGH，人Toll样受体(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10)的配体。
Bcl-2、STAT3或STAT5抑制剂也可以包含在组合物中或与组合物共同给予(或包括在药盒中)。癌细胞可过表达抗凋亡蛋白如Bcl-2或具有持续活化的途径(即，STAT5和STAT3)，其导致对天然凋亡介质或药理学试剂异常高的抗性。考虑了将药物途径和免疫疗法组合以利用超过一个细胞凋亡途径，以增加肿瘤细胞死亡并降低治疗抗性。小分子抑制剂的使用可以使肿瘤细胞内的促凋亡分子和抗凋亡分子之间的平衡充分地偏移，以使它们在与肿瘤特异性T细胞相遇时对死亡敏感或降低对杀伤的抗性。已经在恶性血液病诸如急性髓性白血病(AML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)和实体瘤(即，黑素瘤、乳腺癌和卵巢癌)中发现Bcl-2表达升高。已经在AML、CLL、慢性髓性白血病、大颗粒淋巴细胞白血病和白血病细胞系中观察到持续活化的STAT3或STAT5。考虑了将靶向Bcl-2、STAT3或STAT5的小分子抑制剂包括在本发明的组合物中，与本发明的组合物共同给予和/或与本发明的组合物共培养。一种bcl-2抑制剂是ABT-737。该化合物是一组BH3模拟小分子抑制剂(SMI)的一部分，其靶向这些Bcl-2家族蛋白，但不是A1或Mcl-1。ABT-737与之前的BCL-2抑制剂不同，因为该化合物表面上对Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w具有更高的亲和力。ABT-199是一种所谓的BH3模拟药物，旨在阻断患有慢性淋巴细胞白血病患者的Bcl-2蛋白质功能。
STAT3和STAT5抑制剂包括但不限于述于Fagard等,用于癌症疗法的STAT3抑制剂(STAT3inhibitors for cancer therapy),JAK-STAT,2:1(2013),e22882,DOI:10.4161/jkst.22882和Furqan,等,Journal of Hematology&Oncology 2013,6:90doi:10.1186/1756-8722-6-90中的那些。除了JAK/STAT途径效应物外，还有三个主要类别的负调节子：SOCS(细胞因子信号传导的抑制因子)、PIAS(活化的stat的蛋白质抑制剂)和PTP。酪氨酸磷酸酶逆转JAK的活性。它们中表征最好的是SHP-1，虫蛀小鼠基因的产物。SHP-1含有两个SH2结构域，并且可以与磷酸化的JAK或磷酸化受体结合，以促进这些活化的信号传导分子的去磷酸化。其他酪氨酸磷酸酶如CD45似乎在通过受体子集调节JAK/STAT信号传导中起作用。因此，考虑了JAK/STAT途径是本公开组合物的药物靶标。
“消泡剂”减少了加工过程中的起泡，起泡会导致水分散体凝结、成品薄膜中的气泡、或通常损害加工。示例性的消泡剂包括硅乳剂或倍半油酸山梨坦(sorbitansesquoleate)。
“抗氧化剂”包括，例如，丁基化羟基甲苯(BHT)，抗坏血酸钠，抗坏血酸，偏亚硫酸氢钠和生育酚。在某些实施方式中，抗氧化剂在需要时增强化学稳定性。
本文所述的制剂可受益于抗氧化剂，金属螯合剂，含硫醇的化合物和其他一般稳定剂。这种稳定剂的实例包括但不限于：(a)约0.5％至约2％w/v甘油，(b)约0.1％至约1％w/v蛋氨酸，(c)约0.1％至约2％w/v硫代甘油，(d)约1mM至约10mM EDTA，(e)约0.01％至约2％w/v抗坏血酸，(f)0.003％至约0.02％w/v聚山梨醇酯80，(g)0.001％至约0.05％w/v聚山梨醇酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)硫酸右旋糖酐，(k)环糊精，(l)戊聚糖多硫酸酯和其他类肝素，(m)二价阳离子如镁和锌；或(n)其组合。
“粘合剂”赋予粘性并包括例如海藻酸及其盐；纤维素衍生物，如羧甲基纤维素，甲基纤维素(例如，)，羟丙基甲基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素(例如，)，乙基纤维素(例如，)和微晶纤维素(例如，)；微晶右旋糖；直链淀粉；镁铝硅酸盐；多糖酸；膨润土；明胶；聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物；交聚维酮；聚维酮；淀粉；预胶化淀粉；黄蓍胶，糊精，糖，如蔗糖(如)，葡萄糖，右旋糖，糖蜜，甘露醇，山梨糖醇，木糖醇(如)和乳糖；天然或合成树胶，如阿拉伯树胶，黄蓍胶，茄替胶，等足类动物外壳(isapol husk)粘液，聚乙烯吡咯烷酮(如 CL、 CL、 XL-10)，落叶松阿拉伯半乳聚糖，聚乙二醇，蜡，海藻酸钠等。
“运载体”或“运载体物质”包括药剂学中任何常用的赋形剂，并且应基于与本文公开的化合物(如依鲁替尼和抗癌剂的化合物)的相容性以及所需剂量形式的释放特性来选择。示例性的运载体物质包括例如，粘合剂，悬浮剂，崩解剂，填充剂，表面活性剂，增溶剂，稳定剂，润滑剂，润湿剂，稀释剂等。“药学上相容的载体材料”可以包括但不限于，阿拉伯胶，明胶，胶体二氧化硅，甘油磷酸钙，乳酸钙，麦芽糖糊精，甘油，硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，胆固醇，胆固醇酯，酪蛋白酸钠，大豆卵磷脂，牛磺胆酸，磷脂酰胆碱，氯化钠，磷酸三钙，磷酸二钾，纤维素和纤维素偶联物，硬脂酰乳酸钠糖，角叉菜胶，甘油单酯，甘油二酯，预胶化淀粉等。参见例如，《雷明顿：药物科学与实践》(Remington:The Science andPractice of Pharmacy),第19版(Easton,Pa.:马克出版公司(Mack PublishingCompany),1995)；Hoover,John E.,《雷明顿药物科学》(Remington’s PharmaceuticalSciences),马克出版公司.,Easton,宾夕法尼亚州1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.,编著,《药物剂型和药物递送系统》(Pharmaceutical Dosage Forms),Marcel Decker,纽约州纽约市,1980；和《药物剂型和药物递送系统》(Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems),第17版(Lippincott Williams和Wilkins1999)。
“分散剂”和/或“粘度调节剂”包括通过液体介质或造粒方法或混合方法来控制药物扩散和均匀性的物质。在一些实施方式中，这些试剂还有助于涂覆或侵蚀基质的有效性。示例性的扩散促进剂/分散剂包括例如，亲水聚合物，电解质，60或80，PEG，聚乙烯吡咯烷酮(PVP；商品名为)和基于碳水化合物的分散剂，例如羟丙基纤维素(例如，HPC，HPC-SL和HPC-L)，羟丙基甲基纤维素(例如，HPMC K100，HPMC K4M，HPMC K15M和HPMC K100M)，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，乙酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯(HPMCAS)，非结晶纤维素，硅酸铝镁，三乙醇胺，聚乙烯醇(PVA)，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)，4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯酚聚合物与乙烯氧化物和甲醛(也称为泰洛沙泊(tyloxapol))，泊洛沙姆(poloxamer)(例如，和它们是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；和泊洛沙胺(poloxamine)(例如Tetronic 908，也称为Poloxamine其是源自顺式加成环氧乙烷和环氧乙烷到乙二胺的四官能嵌段共聚物(新泽西州帕西波尼的巴斯夫公司(BASF Corporation，Parsippany，NJ))，聚乙烯吡咯烷酮K12，聚乙烯吡咯烷酮K17，聚乙烯吡咯烷酮K25，或聚乙烯吡咯烷酮K30，聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S-630)，聚乙二醇，例如，聚乙二醇可具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，聚山梨醇酯-80，海藻酸钠，树胶，例如，黄蓍胶和阿拉伯树胶，瓜尔胶，黄原胶，包括黄原胶，糖，纤维素，例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，聚山梨醇酯-80，海藻酸钠，聚乙氧基化山梨醇酐单月桂酸酯，聚乙氧基化山梨醇酐单月桂酸酯，聚维酮，卡波姆(carbomer)，聚乙烯醇(PVA)，藻酸盐，壳聚糖及其组合。增塑剂如纤维素或三乙基纤维素也可用作分散剂。增塑剂诸如纤维素或三乙基纤维素也可以用作分散剂。在脂质体分散体和自乳化分散体中特别有用的分散剂是二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱，来自蛋的天然磷脂酰胆碱，来自蛋的天然磷脂酰甘油，胆固醇和肉豆蔻酸异丙酯。
一种或多种侵蚀促进剂与一种或多种扩散促进剂的组合也可用于本发明的组合物中。
术语“稀释剂”是指用于在递送前稀释感兴趣化合物的化合物。稀释剂也可用于稳定化合物，因为它们可以提供更稳定的环境。将溶解于缓冲溶液中的盐(其也可以提供pH控制或维持)用作本领域的稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些实施方式中，稀释剂增加组合物的体积以促进压缩或产生足够的体积用于胶囊填充的均匀混合物。这些化合物包括例如，乳糖，淀粉，甘露醇，山梨糖醇，右旋糖，微晶纤维素，如磷酸氢钙，二水磷酸二钙；磷酸三钙，磷酸钙；无水乳糖，喷雾干燥的乳糖；预胶化淀粉，可压缩的糖，如Di-(Amstar)；甘露醇，羟丙基甲基纤维素，乙酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯，基于蔗糖的稀释剂，糖果糖(confectioner’s sugar)；一元硫酸钙一水合物，硫酸钙二水合物；乳酸钙三水合物，葡聚糖；水解的谷物固体，直链淀粉；粉状纤维素，碳酸钙；甘氨酸，高岭土；甘露醇，氯化钠；肌醇，膨润土等。
“填充剂”包括化合物，如乳糖，碳酸钙，磷酸钙，磷酸氢钙，硫酸钙，微晶纤维素，纤维素粉末，右旋糖，葡聚糖，右旋糖酐，淀粉，预胶化淀粉，蔗糖，木糖醇，乳糖醇，甘露醇，山梨糖醇，氯化钠，聚乙二醇等。
“润滑剂”和“助流剂”是防止、减少或抑制材料粘附或摩擦的化合物。示例性的润滑剂包括，例如，硬脂酸，氢氧化钙，滑石，硬脂酰富马酸钠，碳氢化合物，如矿物油，或氢化的植物油，如氢化的大豆油高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐，如铝，钙，镁，锌，硬脂酸，硬脂酸钠，甘油，滑石，蜡，硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇(例如，PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇，如CarbowaxTM，油酸钠，苯甲酸钠，山嵛酸甘油酯，聚乙二醇，十二烷基硫酸镁或钠，胶体二氧化硅，如SyloidTM，Cab-O-淀粉，如玉米淀粉，硅油，表面活性剂等。
“增塑剂”是用于软化微胶囊化物质或薄膜涂层以使其不易碎的化合物。合适的增塑剂包括，例如，聚乙二醇，如PEG 300，PEG 400，PEG 600，PEG1450，PEG 3350和PEG 800，硬脂酸，丙二醇，油酸，三乙基纤维素和三乙酸甘油酯。在一些实施方式中，增塑剂还可以用作分散剂或润湿剂。
“增溶剂”包括化合物例如三乙酸甘油酯，柠檬酸三乙酯，油酸乙酯，辛酸乙酯，十二烷基硫酸钠，二十二碳四烯酸钠(sodium doccusate)，维生素E TPGS，二甲基乙酰胺，N-甲基吡咯烷酮，N-羟乙基吡咯烷酮，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素，羟丙基环糊精，乙醇，正丁醇，异丙醇，胆固醇，胆汁盐，聚乙二醇200-600，四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)，还氧二元醇(transcutol)，丙二醇和二甲基异山梨醇等。
“稳定剂”包括诸如任何抗氧化剂、缓冲剂、酸、防腐剂等的化合物。
“悬浮剂”包括化合物例如聚乙烯吡咯烷酮，例如，聚乙烯吡咯烷酮K12，聚乙烯吡咯烷酮K17，聚乙烯吡咯烷酮K25，或聚乙烯吡咯烷酮K30，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)，聚乙二醇，例如，聚乙二醇可具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，乙酸羟甲基纤维素硬脂酸酯，聚山梨醇酯-80，羟乙基纤维素，海藻酸钠，树胶，例如黄蓍胶和树胶阿拉伯胶，瓜尔胶，黄原胶，包括黄原胶，糖，纤维素，例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素，羟乙基纤维素，聚山梨醇酯-80，海藻酸钠，聚乙氧基化山梨醇酐单月桂酸酯，聚乙氧基化山梨醇酐单月桂酸酯，聚维酮等。
“表面活性剂”包括化合物例如如十二烷基硫酸钠，多库酯钠，吐温60或80，三乙酸甘油酯，维生素E TPGS，山梨醇酐单月桂酸酯，聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，聚山梨醇酯，泊咯沙姆(polaxomer)，胆汁盐，单硬脂酸甘油酯，环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物，例如，(巴斯夫公司)等。其他表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如，聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；和聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛基苯酚10，辛苯聚醇40。在一些实施方式中，可以包括表面活性剂以增强物理稳定性或用于其它目的。
“粘度增强剂”包括，例如，甲基纤维素，黄原胶，羧甲基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，卡波姆，聚乙烯醇，海藻酸盐，阿拉伯胶，壳聚糖及其组合。
“润湿剂”包括这样的化合物，如油酸，单硬脂酸甘油酯，单油酸山梨聚糖酯，单月桂酸山梨聚糖酯，油酸三乙醇胺，聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，多库酯钠，油酸钠，十二烷基硫酸钠，二十二碳五烯酸钠，三醋精，吐温80，维生素ETPGS，铵盐等。
药盒和组合物
本公开的一个方面涉及药盒和组合物，其包括第一载体，所述第一载体包含编码本发明CD33特异性CAR的编码区和任选的出于安全原因而包括的基因，例如HER1t或HER1t-1及其功能性变体，或CD20或CD20t-1及其功能性变体。这些药盒和组合物可包括各自编码不同的蛋白质或蛋白质子集的多种载体。这些载体可以是病毒型，非病毒型，附加型或整合型。在一些实施方式中，载体是转座子，例如，睡美人转座子。
在一些实施方式中，药盒和组合物不仅包括载体，还包括细胞和试剂，例如白介素，细胞因子，白细胞介素和化疗剂，佐剂，润湿剂或乳化剂。在一实施方式中，细胞是T细胞。在一实施方式中，药盒和组合物包含IL-2。在一实施方式中，药盒和组合物包含IL-21。在一实施方式中，药盒和组合物包含Bcl-2、STAT3或STAT5抑制剂。在实施方式中，药盒包括IL-15或mbIL-15。
在某些实施方式中，本文公开了药盒和制品用于本文所述的一种或多种方法。这类药盒包括运载体、包装或容器，其经分隔可容纳一个或多个容器例如小瓶、管等，每个容器包含一种用于本文所述方法的单独元素。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。在一实施方式中，容器由各种材料如玻璃或塑料制成。
本文提供的制品含有包装材料。药用包装材料的示例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、包、容器、瓶和任何适用于所需制剂和期望的给药和治疗方式的包装材料。
例如，一个或多个容器包括CAR-T细胞(例如，本文所述的CD33特异性CAR-T细胞)，并且任选地还包括本文所公开的细胞因子和/或化疗剂。任选地，这类药盒包括与其在本文所述方法中的用途相关的识别描述或标签或说明。
药盒一般包含列出组分和/或使用说明的标签，以及带有使用说明的包装插页。一般装有一套说明书。
在一些实施方式中，标签在容器上或与容器相关联。在一实施方式中，当形成标签的字母、数字或其它字符是模塑或蚀刻到容器本身中时，标签在容器上；当容器存在容纳该容器的接收容器或载体中时，标签与该容器附在一起，例如作为包装插页。在一实施方式中，标签用作指示待用于具体治疗性应用的内容物。标签还指示使用内容物的说明，如在本文所述的方法中。
序列
表2中提供了本文所提供的实施方式中包括的某些序列的代表性列表
实施例
提供这些实施例仅用于说明目的，而不是限制本文所提供的权利要求的范围。
实施例1
通过慢病毒载体传递CD33 CAR。基于HIV-1衍生的载体骨架构建CD33 CAR慢病毒载体。经由框内明脉扁刺蛾(Thosea asigna)病毒2A肽(T2A)将HER1t基因在3'末端与CD33CAR基因融合。如下所述，将两个基因克隆到pFUGW慢病毒质粒骨架中。
对于CD33 CAR慢病毒，将VSV-G(水泡性口炎病毒的糖蛋白(VSV-G))用作HIV-1包膜蛋白的替代物，导致改善的载体稳定性、靶细胞向性和转导效率(Cronin,J.,Zhang,X.和Reiser,J.,通过假型化改变慢病毒载体的向性(Altering the tropism of lentiviralvectors through pseudotyping),Curr Gene Ther,5(4):387-98(2005))。
生产期间，CD33 CAR病毒颗粒组装并从转染的HEK293T细胞的表面萌发。VSV-G蛋白由pMND-VSVG辅助质粒提供，载体核型和酶蛋白pΔ8.9so(GagPol)辅助质粒提供，而有效RNA基因组运输和包装成病毒颗粒所需的Rev蛋白由pRSV-Rev质粒提供。从CD33 CAR载体中删除所有其他HIV-1辅助蛋白，包括Vpu、Vif、Vpr、Nef和Tat。
pFUGW慢病毒载体骨架是SIN慢病毒载体骨架。
调节元件
LV-CD33 CAR载体含有人延伸因子1α1(EF1A1)启动子和牛生长激素聚A序列以驱动转基因的表达，以及Kozak核糖体起始序列。该载体使用土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)以及源自pFUGW质粒的LTR序列。复制起点基于pUC19质粒。图2是CD33 CAR慢病毒载体图。
实施例2
制备CD33 CAR载体的方法
LV-CD33 CAR载体由三个来源组装而成:
(1)由先前构建的载体获得下述内容，用限制酶PacI和BlpI消化：
(a)pFUGW骨架组件
(b)用GM-CSFRα信号肽驱动抗CD33scFv的人延伸因子1α1启动子(EF1A1)启动子和增强子
(c)CD8α铰链和跨膜区。
(2)获得作为合成基因的4-1BB信号传导结构域模块。
(3)通过PCR扩增含有T2A转录接头，GM-CSFRα信号肽，HER1t耗尽标志物，牛生长激素聚A和侧翼克隆位点的区域。
使用提供给各盒的同源区，在体外组装反应中将三个DNA盒一起退火。得到的慢病毒载体相对于慢病毒基因组以反方向包含感兴趣的转基因(CD33 CAR和HER1t)。转化到Stbl4大肠杆菌菌株后，通过菌落PCR鉴定阳性菌落，并通过Sanger测序验证三片(three-piece)插入物。整个质粒序列通过亿明达公司(Illumina)下一代测序验证。
使用磷酸钙沉淀转染4种质粒——LV-CD33 CAR载体质粒和3种辅助质粒——pΔ8.9so(GagPol)；pMND-VSVG；和pRSV-Rev，在含有10％FBS的DMEM中的HEK-293T细胞中产生载体。
质粒转染后约18小时，用含有全能核酸酶(Benzonase)(50U/mL)的培养基进行完全培养基交换。更换培养基约24小时后，收获含有载体的上清液，将其标记为收获#1。用新鲜培养基重新培养细胞并返回培养箱。使用过滤器澄清收获1上清液，并在2–8℃下储存过夜。
次日，将细胞用显微镜检查，并且将含有载体的上清液再次收获作为收获#2，将其如前所述过滤。将收获1上清液与过滤的收获2上清液组合，并将汇集的上清液通过0.45μm的过滤器进行进一步的澄清。使用阴离子交换膜色谱法将澄清的载体收获物纯化，并使用中空纤维装置浓缩并渗滤到所选培养基中。将纯化的LV-CD33 CAR载体填充并在<-80℃下储存。
实施例3
递送系统效率
用LV-CD33 CAR慢病毒载体转导来自健康供体的T细胞通常在转导后12-14天导致25-50％的细胞稳定共表达CD33 CAR和HER1t。图4描述了用于产生CAR-T细胞的典型慢病毒转导示意图。图5显示了来自健康供体T细胞在慢病毒转导后12天的CD33 CAR和HER1t表达的代表性数据。使用人T细胞活化剂CD3/CD28珠活化纯化的人CD3+T细胞，然后用CD33 CAR慢病毒载体以5感染复数(MOI)转导。细胞在含有IL-2的培养基中生长12天。转导后12天进行流式细胞术分析以分别通过蛋白L和西妥昔单抗mAb测量的CD33 CAR和HER1t表达。
图6通过Western印迹证实来自慢病毒转导的细胞的CD33 CAR表达。培养扩增的未转导或慢病毒转导的CD33 CAR-T细胞，并使用具有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液产生细胞裂解物。还对供体产生的样品进行BCA测定，以在还原条件下将加载到凝胶上的蛋白质的量标准化。蛋白质转移后，封闭膜，然后用1μg/ml的抗-抗体(克隆8D3)探测，然后用山羊-抗小鼠辣根过氧化物酶检测抗体。条带通过化学发光检测并在数字成像系统上捕获。16kDa条带表示内源表达的而60kDa条带表示表达信号传导部分的CD33CAR。只有CD33 CAR-T细胞显示60kDa条带以及内源性条带，而未转导细胞和Jurkat T细胞仅有内源性存在。
图7显示了慢病毒载体转导后培养物中CD33 CAR-T细胞的离体生长。起始细胞群为2.5x105，而显示的数据是来自4个独立的T细胞供体的平均值±SEM。CD33 CAR-T细胞被有效转导并离体扩增至一定水平，该水平转化为达到临床相关剂量。
实施例4
遗传物质整合
递送的遗传物质以前病毒基因组的形式整合。使用慢病毒转导在T细胞中导入的转基因在研究的时间长度内是稳定的。图8是慢病毒转导后CD33 CAR-T细胞的拷贝数量评估。利用液滴数字PCR(ddPCR)来确定在使用5的MOI慢病毒转导来自健康供体270169(D270169)的人SUPT1T细胞或T细胞后整合到宿主基因组中的基因拷贝的数量。基因组DNA(gDNA)在转导后至少14天后获得.使用伯乐公司(Bio-Rad)的ddPCR系统(QX200TM AutoDGddPCR系统)设置ddPCR反应,所述系统具有基于Taqman的引物和设置用于检测CD33 CAR的探针。将RNA酶P用作标准化参考基因，用于基于每个细胞将具有RNA酶P基因的2个拷贝的假设，评估拷贝数变异(CNV)。通过流式细胞术确认SUPT1/CD33 CAR和D270169/CD33 CAR-T细胞上的CD33 CAR表达，并且报道分别为约80％和约30％(数据未显示)。对于D270169/CD33CAR-T细胞，在试验中测量的样品(指定为测量的)来自混合群体，并进行其他计算以确定CAR表达T细胞的拷贝数插入物(称之为反向计数的(Backcalculated))。数据以来自2个实验的各细胞的平均拷贝数±SD示出。
实施例5
动物和培养细胞模型以评估基因转移系统的功效
通过转移的基因的表达所测量的慢病毒介导的基因转移的效率通过转导的细胞的流式细胞术评估(图5)。转导的T细胞的扩增在转导后12-14天在培养基中离体进行以实现相关剂量(图7)。
在临床前分析期间以慢病毒转导在T细胞表面上观察到的CD33 CAR水平(图8)足以在体外有效且特异性地消除不同的CD33阳性靶肿瘤细胞系(图9)以及增强携带CD33阳性肿瘤小鼠的存活至比对照组统计学显著高的水平(图12)。同样参见图5和6进一步的支持数据。
在体外和体内模型中测试CD33 CAR-T细胞的功能能力。
体外测试CD33 CAR-T细胞包括表达CD33的AML细胞系的细胞毒性以及转导小鼠EL4细胞系以在表面上表达人CD33，和与CD33阳性靶细胞共培养后分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α细胞因子。CD33 CAR-T细胞共表达HER1t蛋白质，以允许通过给予西妥昔单抗使输注的CAR-T细胞耗尽。还体外评估了西妥昔单抗通过ADCC消除CD33 CAR-T细胞的能力。
CD33 CAR-T细胞以剂量依赖性方式对靶细胞具有特异性细胞毒性(图9)。通过2小时铕释放试验测量10：1(B)的效应物：靶标(E：T)比和1：1(B)的E：T比的CD33 CAR-T细胞的细胞毒性。在10：1相对1：1比例的E：T比例之间观察到CD33 CAR-T细胞对靶细胞的剂量依赖性细胞毒性；然而，仅当靶细胞在表面上表达CD33时，才观察到显著的细胞毒性。未转导的T细胞并未显示任何测试的靶细胞显著的细胞毒性。图表中示出的数据是来自4个不同供体的平均值±SEM，**p值<0.01和***p值<0.001。
CD33 CAR-T细胞在与不同靶细胞系共培养后，相较于未转导的T细胞，其特异性地分泌的各种细胞因子的水平升高(图10)。在与表达CD33的各种靶AML细胞系共培养后，评估来自未转导的T细胞和CD33 CAR-T细胞的细胞因子产生。鼠EL4细胞系用作人CD33表达的阴性对照。将T细胞以10：1的效应物：靶标(E：T)比例共培养过夜，并使用QBeads(Intellicyt)收集培养物上清液用于多重细胞因子分析。多重分析测试人IFNγ、IL-2和TNF分泌到培养基中的表达。当与具有相同靶细胞的未转导的T细胞的基础表达水平比较时，在CD33 CAR-T细胞与表达CD33的靶细胞共培养后检测到高水平的IFNγ、IL-2和TNF细胞因子。绘制的值表示一式两份测试的样品的平均值±SD。
西妥昔单抗能够以剂量依赖性方式清除在表面上表达HER1t的CD33 CAR-T细胞(图11)。使用以5：1的E：T比例与纯化的效应NK细胞共温育24小时的PKH26标记的靶细胞，通过流式细胞术分析7-AAD摄取来确定ADCC。用西妥昔单抗观察到CD33 CAR-T细胞的特异性剂量依赖性ADCC。绘制的值表示一式两份测试的样品的平均值±SD。
还使用经转导以表达fLUC(以通过生物发光成像监测肿瘤负荷)的AML细胞系MOLM-13(MOLM-13/fLUC)在免疫缺陷NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ,NOD scidγ)小鼠中的体内异种移植模型中测试了CD33 CAR-T细胞特异性降低肿瘤负荷的能力。研究设计的细节如表2所示。当与由生理盐水、未转导的T细胞和非特异性CD19 CAR-T细胞组成的对照处理组相比，在携带MOLM-13/fLUC肿瘤的NSG小鼠中给予CD33 CAR-T细胞减少了肿瘤负荷并将平均存活率提高至统计学显著水平(P<0.001)，所述非特异性CD19 CAR-T细胞由与CD33 CAR-T细胞相同的健康T细胞供体产生。CD33 CAR-T细胞在携带肿瘤的小鼠中体内增殖(图14)。在将CD33 CAR-T细胞注入NSG小鼠之前对CD33 CAR-T细胞进行流式细胞术分析，并在处理的小鼠中检测各种组织中的CD33 CAR-T细胞，以记录体内CAR-T细胞的持久性和扩增。(图14A)用CD33 CAR慢病毒转导健康供体T细胞并离体扩增。在注射CD33 CAR-T细胞用于治疗之前，进行流式细胞术分析以评估CD33 CAR表达水平。显示的群以FSC/SSC/活/CD3+细胞门选。(图14B)在第18天(将CD33 CAR-T细胞通过全身静脉注射到尾静脉后10天)对重新获自携带MOLM-13肿瘤、CD33 CAR-T处理的小鼠的血液、骨髓和脾脏样品进行流式细胞术分析，以检测CD33 CAR-T细胞的存在。数据来自代表性小鼠，其中群体基于FSC/SSC/hCD45/hCD3表达进行门选。
在第0天以经修饰以表达萤火虫荧光素酶(fLUC)基因(MOLM-13/fLUC)的5x105MOLM-13细胞系静脉注射(IV)免疫缺陷的NSG小鼠。通过经由IVIS成像的生物发光表达在在第7天确认携带肿瘤的小鼠，然后随机分成不同的处理组。在第8天，通过IV注射以下来处理小鼠：仅用生理盐水，未转导的T细胞(107总T细胞/小鼠)，没有细胞标签或具有HER1t细胞标签的CD33 CAR-T细胞(1107CD33 CAR-T细胞/小鼠)或CD19 CAR T细胞(107CD19 CAR-T细胞/小鼠)。此外，另一组小鼠在第15天接受第二剂量的具有HER1t细胞标签的CD33 CART细胞和(107CD33 CAR+T细胞/小鼠)。在研究过程中，使用生物发光成像，通过fLUC表达，评估整体肿瘤负荷。图12中示出来自不同处理组的存活曲线。盐水、未转导的T细胞和CD19CAR-T细胞中小鼠的中值存活时间是第15天。用不含细胞标签的CD33 CAR T细胞处理的小鼠的存活增强，而用CD33 CAR-T细胞(1或2剂量)处理的所有小鼠至第29天具有完全存活。
对于不同的处理组，来自腹侧和背侧视图的平均通量值在图13中绘制。示出的值是以光子/秒表示的总通量值，其中示出各组的平均值±SEM。实心向上箭头表示各组的CAR-T给药日，第15天虚线向上箭头表示2剂量组的第二CD33 CAR-T剂量。
表3-在NSG小鼠中评估CD33 CAR-T细胞体内功效的研究设计
实施例6
细胞因子分析：在方案中的特定时间点或当小鼠濒临死亡时收集来自小鼠的血浆样品，并且出于人道原因实施安乐死。为了获得血浆，将血液收集在EDTA收集管中，然后在室温下以5,000xg旋转15分钟，然后将所得血浆转移到干净的收集管中。将血浆冷冻并储存在-80℃直至测定。人细胞因子/趋化因子/生长因子Panel 1试剂盒(电子生物公司(eBioscience))是一种基于45重磁珠的试剂盒，用于下述分析物的多重检测：脑源性神经营养因子(BDNF)，表皮生长因子(EGF)，嗜酸性粒细胞趋化因子，成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，GROα(CXCL1)，肝细胞生长因子(HGF)，干扰素(IFN)α，IFNγ，白细胞介素(IL)-1受体α(IL-1RA)，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12p70，IL-13，IL-15，IL-17A，IL-18，IL-21，IL-22，IL-23，IL-27，IL-31，干扰素γ诱导蛋白10(IP-10；也称之为CXCL10)，白血病抑制因子(LIF)，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1，称之为CCL2)，巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α；也称之作为CCL3)，MIP-1β(也称之为CCL4)，β-神经生长因子(NGFβ)，正常T细胞表达和分泌的活性调节蛋白(RANTES，也称之为CCL5)，血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)，胎盘生长因子-1(PIGF-1)，干细胞因子(SCF)，基质衍生因子-1α(SDF-1α，也称之为CXCL12α)，肿瘤坏死因子α(TNFα)，TNFβ(也称之为淋巴毒素α)，血管内皮生长因子-α(VEGF-A)和血管内皮生长因子-D(VEGF-D)试验按照生产商说明进行该实验。在Bio-Rad Bio-Plex Bio-200仪器(伯乐公司，加利福尼亚州赫尔克里斯)上收集数据，运行Bio-Plex管理软件6.1版。
使用第11天取自小鼠的血浆评估人细胞因子和生长因子表达。参见，图22A。由于MOLM-13和转移到NSG小鼠中的T细胞是人源的，人细胞因子的测量能够进一步具体检查CAR-T细胞作用于肿瘤细胞的作用机制。在仅接受盐水处理的携带MOLM-13肿瘤小鼠中，检测到一些人系统细胞因子如MCP-1和MIP1-β(数据未显示)以及其他几种生长因子，但细胞因子如IFNγ和TNFα的水平低于检测范围(图22A)。相较于仅盐水处理的组，用未转导的T细胞处理的携带MOLM-13肿瘤的小鼠也持续显示相似的细胞因子和生长因子表达模式。未转导的T细胞组中观察到的细胞因子和生长因子水平在该小鼠模型系统中提供了人T细胞和肿瘤细胞的混合物的基线值。CD33-CAR-T细胞的细胞因子表达数据的分析(无论CAR T细胞是否共表达细胞标签)显示除了GM-CSF，IL-10，IL-18和IP-10以外的IFNγ和TNF生产的显著水平。相反，相较于仅盐水或未转导的T细胞组小鼠，将CD19-CAR-T细胞给予携带MOLM-13肿瘤的小鼠显示了细胞因子如GM-CSF，IFNγ，IL-18的水平略有升高；然而，这些细胞因子的表达水平当与给予CD33-CAR-T(无细胞标签)或CD33-CAR-T(有细胞标签)或CD33的(有细胞标签，2剂)的小鼠中检测到的相同细胞因子的水平相比时没有显著升高。
在研究中的特定时间采集血液样品，以通过流式细胞术评估肿瘤细胞以及过继转移的T细胞的存在。如图22B所示，可在第16天小鼠的外周血中检测到MOLM-13/fLUC细胞的存在。为了避免低估或MOLM-13细胞中CD33抗原丢失的可能性，利用CD123抗体鉴定肿瘤细胞。在从仅给予盐水，未转导的T细胞或CD19-CAR-T细胞的小鼠获得的外周血样品中检测到MOLM-13肿瘤细胞。此外，在第16天和早在第11天，当开始血液的细胞分析时，在血液中检测到来自给予未转导的T细胞或CD19-CAR-T细胞的小鼠的转移的T细胞。来自给予CD33-CAR-T细胞的小鼠的血液显示很少至没有MOLM-13肿瘤细胞存在，而T细胞群明显存在。
图22C显示了针对其他AML肿瘤细胞系(THP1和HL60)的细胞毒性活性。重定向CD33-CAR-T细胞的细胞毒性功能的其他证据是通过检测免疫效应细胞与CD33肿瘤共培养后的细胞因子表达来提供的。在与CD33-CAR-T细胞共培养后，评估了数个表达CD33的肿瘤细胞系的IFNγ、TNF(也称为TNFα)和IL-2表达的诱导。相较于来自相同供体的未转导的T细胞，CD33-CAR-T细胞与表达CD33的肿瘤细胞的共培养导致IFNγ、NF和IL-2的表达显著增加(图10)。此外，从亲本EL4细胞系中没有检测到细胞因子表达，所述亲本EL4细胞系用作阴性肿瘤靶标对照。进行胞内细胞因子染色(ICS)作为靶标特异性的额外确认。CD33-CAR-T细胞证明在与表达CD33的MOLM-13、THP-1或HL-60肿瘤细胞共培养后，IFNγ和IL-2均在细胞水平上表达，然而与鼠EL4细胞共培养时未显示任何显著的细胞因子表达高于仅用T细胞观察到的水平(图23E)。
CD33-CAR-T细胞由获自患有复发性AML疾病的AML患者(供体E261)的细胞产生。简言之，将来自AML供体的冷冻保存的PBMC解冻，并选择T细胞和用抗-CD3/抗-CD28珠扩增。用CD33-CAR LV颗粒转导T细胞，并在培养物中扩增T细胞。表征解冻的PMBC样品揭示，该供体中低频率的T细胞存在于PBMC样品中，主要由CD33+细胞组成(图23A)。将T细胞分离、活化和扩增，用于LV转导以产生CD33-CAR-T细胞。T细胞分离后的剩余细胞是CD33+(图E-B)，并使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)细胞因子维持培养。对于该AML供体，约41％T细胞在细胞表面上表达CD33-CAR，如在LV转导后培养12天后所评估(图23C)。在流式细胞术中证明了细胞毒活性，所述流式细胞术基于来自该供体的CD33-CAR-T细胞与MOLM-13肿瘤细胞或患者自身的表达CD33的肿瘤细胞的共培养试验。通过对细胞上CD3(T细胞)和CD33表达(肿瘤)染色，在检查的时间点(第0天和第3天)评估剩余细胞群，仅与CD33-CAR-T细胞共培养能够消除表达CD33的肿瘤细胞，然而在与未转导(UNT)T细胞的共培养物中未观察到细胞杀伤(图23D)。
此外，通过使用胞内细胞因子染色的流式细胞术评估，由AML供体产生的CD33-CAR-T细胞也诱导IFNγ和IL-2表达。在将CD33-CAR-T细胞(来自AML供体E261)与指定的肿瘤细胞共培养18小时的时间段后，进行胞内细胞因子染色。将T细胞进行细胞表面染色，然后固定/透化，然后对IFNγ和IL-2细胞因子染色。细胞基于FSC/SSC/活/CD3T细胞门选。CD33-CAR-T细胞单独的共培养物或与鼠EL4肿瘤细胞的共培养物并未显示IFNγ或IL-2的任何表达；然而在与MOLM-13或与来自特定供体细胞的肿瘤细胞共同培养后，观测到两个细胞因子的表达增加(图23E)。此外，细胞因子表达由表达CD33-CAR的细胞特异性地诱导，而不表达CAR的T细胞未显示细胞因子表达。
实施例7
构建具有各种信号传导结构域的慢病毒CD33 CAR并测试其表达。按照图4所示的示意图，将具有以下CD33 CAR的慢病毒颗粒转导到预活化的人T细胞中，所述CD33 CAR：仅具有信号传导结构域，具有CD28-CD3z(称之为CD28z)信号传导结构域，或具有HER1t共表达的CD28-CD3z结构域。流式细胞术分析在转导后12-14天对T细胞进行。CD33表达经由蛋白L染色检测，而HER1t经由西妥昔单抗染色检测(图15A和B)。
为了证明CD33 CAR(具有不同的信号传导结构域)识别其靶标的特异性，针对各种肿瘤细胞系进行共培养试验。CD33表达在测试的细胞系中显示(图16A)。注意到K562细胞内源性地表达CD33，因此在K562/CD123中观察到表达；转化K562/CD33系以过表达CD33。EL4是不表达人CD33的鼠细胞系。细胞毒性通过使用DELFIA BATDA试剂标记各种肿瘤靶细胞系(DELFIA EuTDA细胞毒性试验；帕金埃尔默公司(Perkin Elmer))来确定，然后将CD33 CART细胞或未转导的T细胞(UNT)与标记的肿瘤细胞以20：1的效应物：靶标(E：T)比的比例共培养。2小时后，由试验收获上清液，然后通过加入DELFIA铕试验研究，并在时间分辨荧光仪上读取。(图16B)利用20：1效应物：靶标(E：T)比例并孵育18小时，CD33 CAR T细胞与表达CD33的肿瘤细胞共培养产生稳健的IFNγ，收获培养物上清液并根据生产商的说明通过ELISA测定来测试IFNγ产生。在共培养物中，未转导的T细胞(UNT)仅检测到很少IFNγ至没有检测到IFNγ(图16C)。
源自经诊断患有AML的患者的冷冻保存的PBMC样品的T细胞慢病毒转导以类似于上文概述的用于来自健康供体T细胞的转导T细胞的方法进行。简而言之，使用抗-CD3/CD28珠活化来自PBMC样品的分离的T细胞，然后用处于不同MOI的CD33 CAR-41BBz-T2A-HER1t进行慢病毒转导。转导的T细胞培养物在14天的培养期内扩增。通过蛋白L染色测定的CAR表达在整个培养扩增期间进行评估。在T细胞表面上观测CD33 CAR的水平(数据未显示)。利用供体的自体的表达CD33+的肿瘤细胞以及AML肿瘤细胞系证明了CD33 CAR T细胞的细胞毒活性。在一个示例中，使用低E：T比例建立共培养物。在不同时间点进行流式细胞术分析以确定T细胞的存在和频率，并评估不同时间点存在于共培养物中的表达CD33的肿瘤细胞。CD33CAR-T细胞与自体的表达CD33的肿瘤细胞的共培养物展现出细胞毒活性，如通过CD33+肿瘤细胞的减少或缺失(数据未显示)所确定。用已知的AML肿瘤细胞系(如MOLM-13)观测到类似的发现。
实施例8
睡美人CD33 CAR
在睡美人转座酶-转座酶系统中构建并生成不同的CD33 CAR构建体。例如，以各种EF1a启动子长度(短、中和长)制备CD33-CD8a-CD28TM-CD3z构建体还制备并测试具有HER1t细胞标签的CD33 CAR构建体。
使用基于睡美人的转座子系统经电穿孔将CAR构建体导入细胞中以介导构建体的基因组整合。在第0天，将2000万PBMC重悬于100μL的Amaxa人T细胞核转染溶液(目录号VPA-1002；隆萨公司(Lonza)，瑞士巴塞尔)混合有15μg的转座子和5μg的转座酶(pKan-CMV-SB11)，并使用程序U-14进行电穿孔。第二天(第1天)，将细胞计数，通过使用西妥昔单抗的蛋白L和HER1t染色对CAR表达进行表面染色。用γ-辐照(100Gy)或丝裂霉素C处理的AaPC以1：1的比例刺激细胞。使用的AaPC细胞是表达CD64-CD86-41BBL-CD19-mbIL-15/IL15Ra-ROR1抗原的K562-AaPC，其具有内源性表达的CD33。用AaPC以1：1的比例刺激CAR T细胞。仅对第一轮刺激，用IL-21(30ng/ml)补充培养物，并且对余下的刺激，用重组人IL-2(50IU/ml)和IL-21(30ng/ml)(Pepro Tech公司)补充培养物。在各刺激周期结束时对T细胞培养物进行表型分型，通常持续7天。利用蛋白L染色或以重组CD33/Fc蛋白染色通过多参数流式细胞术检测对培养物进行CAR表达的表型分型。还密切监测培养物的NK细胞生长(定义为CD3negCD56+群)，并且根据生产商的说明，当使用针对CD56的磁珠(干细胞技术公司(StemCell Technologies)和/或美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))的总细胞群的百分比超过的10％时，从CAR T细胞培养物中去除培养物。使用流式细胞术检测用AaPC刺激后来自多个供体PBMC的CD33 CAR表达。
为了证明CD33 CAR(具有不同的信号传导结构域)识别其靶标的特异性，针对各种肿瘤细胞系进行共培养试验。注意到K562细胞内源性表达CD33，而EL4是不表达人CD33的鼠细胞系。细胞毒性通过使用DELFIA BATDA试剂标记各种肿瘤靶细胞系(DELFIA EuTDA细胞毒性试验；帕金埃尔默公司(Perkin Elmer))来确定，然后将CD33 CAR T细胞或未转导的T细胞(UNT)与标记的肿瘤细胞以10：1的效应物：靶标(E：T)比和2：1的E：T比的比例共培养。2小时后，由试验收获上清液，然后通过加入DELFIA铕试验研究，并在时间分辨荧光仪上读取。(图17)。
脱粒试验和IFNγ胞内细胞因子染色
CD107a也称为溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1)，其在细胞晚期核内体-溶酶体中组成型表达，但在脱粒细胞表面上瞬时表达。建立脱粒试验是为了以基于每个细胞的同时细胞内IFNγ检测来评估CD33 CAR T识别具有或不具有CD33表达的不同的靶细胞的能力。简言之，将CD33 CAR T细胞与靶细胞以10：1的E：T比例在96孔板中共培养。靶细胞包括K562/CD19(具有内源性CD33表达)、THP-1和EL-4(鼠细胞系)。在共培养开始时，将荧光偶联的CD107a或同种型抗体与运输抑制剂混合物(含有莫能菌素和布雷菲德菌素，1X；电子生物公司)一起加入，并在37℃孵育4小时。在孵育期结束时，细胞在平板中沉淀，并对细胞表面抗原进行染色，以检测CAR表达和T细胞标志物。细胞表面染色后，细胞也根据生产商的说明以可固定的细胞活力染料(电子生物公司)染色，然后洗涤，然后用Fix/Perm溶液(BD生命科学公司)固定。固定样品后，在Perm/Wash溶液(BD生命科学公司)中洗涤细胞，然后用荧光偶联的抗-人IFNγ抗体进行胞内染色。洗涤样品，然后重悬于适当染色缓冲液中，在LSR II流式细胞仪(BD生命科学公司)上获得数据。如图18所示，仅在表达CD33的THP-1细胞系和K562衍生物中观测到CD107a脱粒的显著表达，而仅免疫效应细胞以及与EL-4共培养中观测到最小的脱粒。胞内IFNγ表达观察到类似的模式。
实施例9
使用基于睡美人的转座子系统经电穿孔将CAR构建体导入细胞中以介导构建体的基因组整合。在第0天，将2000万PBMC重悬于100μL的Amaxa人T细胞核转染溶液(目录号VPA-1002；隆萨公司(Lonza)，瑞士巴塞尔)混合有15μg的转座子(对CD33 CAR-CD8-CD28z)和5μg的转座酶(pKan-CMV-SB11)，并使用程序U-14进行电穿孔。第二天(第1天)，将细胞计数，通过使用西妥昔单抗的蛋白L和HER1t染色对CAR表达进行表面染色。用γ-辐照(100Gy)或丝裂霉素C处理的AaPC以1：1的比例刺激细胞。使用的AaPC细胞是表达CD64-CD8641BBL-CD19-mbIL-15/IL15Ra-ROR1抗原的K562-AaPC。用AaPC以1：1的比例刺激CAR T细胞。仅对第一轮刺激，用IL-21(30ng/ml)补充培养物，并且对余下的刺激，用重组人IL-2(50IU/ml)和IL-21(30ng/ml)(Pepro-Tech公司)补充培养物。在各刺激周期结束时对T细胞培养物进行表型分型，通常持续7天。利用蛋白L染色或以重组CD33/Fc蛋白染色通过多参数流式细胞术检测对培养物进行CAR T细胞表达的表型分型。还密切监测培养物的NK细胞生长(定义为CD3negCD56+群)，并且根据生产商的说明，当使用针对CD56的磁珠(干细胞技术公司(StemCell Technologies)和/或美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))的总细胞群的百分比超过的10％时，从CAR T细胞培养物中去除培养物。使用流式细胞术检测用AaPC刺激后来自各个供体PBMC的CD33 CAR表达。来自代表性供体的数据总结于表3(CD33 CAR-CD8-CD28z)和表4(具有或不具有HER1t细胞标签的CD33-CAR-CD8-4-1BBz)。图19进一步证明了具有HER1t标签的睡美人CD33 CAR-CD28z构建体的表达。
表4显示了不同PBMC供体中的示例性睡美人CD33-CD8a-CD28z CAR的表达
表5显示了不同PBMC供体中的具有不具有HER1t标签的示例性睡美人CD33-CD8-41BBz CAR的表达
实施例10
NK细胞的慢病毒转导还用与各种HER1t标签(SEQ ID NO:32和54)和C20t标签偶联的CD33 CAR进行。图25-27显示了NK细胞上CD33 CAR和HER1t和CD20t-1标签的表达。图28-29还显示了CD33 CAR NK细胞以不同的E：T比例有效裂解NK抗性CD33+AML细胞。当与不同靶细胞共培养时，CD33 CAR NK细胞产生细胞因子(例如IFNγ、TNF-a、IL-6、RANTES、GM-CSF、IL-10、MIP-1a和MIP-1b)(数据未显示)。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明领域普通技术人员通常所理解的同样含义。
虽然本文显示和描述了本公开的优选实施方式，但本领域技术人员显然了解这些实施方式仅以举例方式提供。本领域技术人员在不背离本公开的情况下可以作出多种改变、变化和替代。应当理解的是，可以在实践本公开时采用本文描述的实施方式的各种替代方案，或者这里描述的这些实施方式或方面中的一个或多个的组合。下列权利要求书确定了本公开范围，这些权利要求范围内的方法和结构以及其等同物均为本发明所涵盖。
序列表
<110> 英特瑞克斯顿股份有限公司（INTREXON CORPORATION）
<120> CD33特异性嵌合抗原受体
<130> 50471-709.601
<140>
<141>
<150> 62/347,503
<151> 2016-06-08
<160> 62
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 2
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 2
gacattcaga tgacccagtc tccgagctct ctgtccgcat cagtaggaga cagggtcacc 60
atcacatgca gagccagcga aagtgtcgac aattatggca ttagctttat gaactggttc 120
caacagaaac ccgggaaggc tcctaagctt ctgatttacg ctgcatccaa ccaaggctcc 180
ggggtaccct ctcgcttctc aggcagtgga tctgggacag acttcactct caccatttca 240
tctctgcagc ctgatgactt cgcaacctat tactgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300
acgttcggtc aagggaccaa ggtggagatc aaa 333
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 4
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggagctc agtgaaggtt 60
tcctgcaaag cttctggcta caccttcact gactacaaca tgcactgggt gaggcaggct 120
cctggccaag gcctggaatg gattggatat atttatcctt acaatggtgg taccggctac 180
aaccagaagt tcaagagcaa ggccacaatt acagcagacg agagtactaa cacagcctac 240
atggaactct ccagcctgag gtctgaggac actgcagtct attactgcgc aagagggcgc 300
cccgctatgg actactgggg ccaagggact ctggtcactg tctcttca 348
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的寡核苷酸"
<400> 5
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45
<210> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 7
gacattcaga tgacccagtc tccgagctct ctgtccgcat cagtaggaga cagggtcacc 60
atcacatgca gagccagcga aagtgtcgac aattatggca ttagctttat gaactggttc 120
caacagaaac ccgggaaggc tcctaagctt ctgatttacg ctgcatccaa ccaaggctcc 180
ggggtaccct ctcgcttctc aggcagtgga tctgggacag acttcactct caccatttca 240
tctctgcagc ctgatgactt cgcaacctat tactgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300
acgttcggtc aagggaccaa ggtggagatc aaaggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 360
tcgggtggcg gcggatctca ggttcagctg gtgcagtctg gagctgaggt gaagaagcct 420
gggagctcag tgaaggtttc ctgcaaagct tctggctaca ccttcactga ctacaacatg 480
cactgggtga ggcaggctcc tggccaaggc ctggaatgga ttggatatat ttatccttac 540
aatggtggta ccggctacaa ccagaagttc aagagcaagg ccacaattac agcagacgag 600
agtactaaca cagcctacat ggaactctcc agcctgaggt ctgaggacac tgcagtctat 660
tactgcgcaa gagggcgccc cgctatggac tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 720
tcttca 726
<210> 8
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val
130 135 140
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr
165 170 175
Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser
180 185 190
Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 9
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Phe Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Thr Ser Glu Asn Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Tyr Glu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 10
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ile Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
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Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Val Val His Trp Leu Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
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Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Val Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Tyr Arg Tyr Glu Val Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
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<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 12
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Asp Ser Pro Leu Arg Trp Ile Phe
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Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Tyr Pro Leu Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
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Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Ser
20 25 30
Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的寡核苷酸"
<400> 15
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atcccc 66
<210> 16
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 16
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 17
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的寡核苷酸"
<400> 17
atctacatct gggcccctct ggccggcacc tgtggcgtgc tgctgctgag cctggtcatc 60
accctgtact gcaaccaccg gaat 84
<210> 18
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 18
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
20 25
<210> 19
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的寡核苷酸"
<400> 19
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 20
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 20
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 21
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 21
aagcccacca ccacccctgc ccctagacct ccaaccccag cccctacaat cgccagccag 60
cccctgagcc tgaggcccga agcctgtaga cctgccgctg gcggagccgt gcacaccaga 120
ggcctggatt tcgcctgcga c 141
<210> 22
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 22
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 23
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 23
aagagaggcc ggaagaaact gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 60
accacccagg aagaggacgg ctgcagctgc cggttccccg aggaagagga aggcggctgc 120
gaactg 126
<210> 24
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 24
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 25
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 25
cgggtgaagt tcagccggag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg ccggagggag gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 120
cgggaccctg agatgggcgg caagccccgg agaaagaacc ctcaggaggg cctgtataac 180
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240
cggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaga 336
<210> 26
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 26
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 27
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 27
aggagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc ccggaggcct 60
ggccccaccc ggaagcacta ccagccctac gcccctccca gggacttcgc cgcctaccgg 120
agc 123
<210> 28
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 28
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 29
<211> 54
<212> DNA
<213> 明脉扁刺蛾病毒（Thosea asigna virus）
<400> 29
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54
<210> 30
<211> 18
<212> PRT
<213> 明脉扁刺蛾病毒（Thosea asigna virus）
<400> 30
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 31
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 31
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 600
gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct 660
gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga 720
cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg acggccccca ctgcgtcaag 780
acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac aacaccctgg tctggaagta cgcagacgcc 840
ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac tgcacctacg gatgcactgg gccaggtctt 900
gaaggctgtc caacgaatgg gcctaagatc ccgtccatcg ccactgggat ggtgggggcc 960
ctcctcttgc tgctggtggt ggccctgggg atcggcctct tcatg 1005
<210> 32
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 32
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的寡核苷酸"
<400> 33
atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtcccagg atccagtggg 60
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 34
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly
20
<210> 35
<211> 891
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 35
atgacaacac ccagaaattc agtaaatggg actttcccgg cagagccaat gaaaggccct 60
attgctatgc aatctggtcc aaaaccactc ttcaggagga tgtcttcact ggtgggcccc 120
acgcaaagct tcttcatgag ggaatctaag actttggggg ctgtccagat tatgaatggg 180
ctcttccaca ttgccctggg gggtcttctg atgatcccag cagggatcta tgcacccatc 240
tgtgtgactg tgtggtaccc tctctgggga ggcattatgt atattatttc cggatcactc 300
ctggcagcaa cggagaaaaa ctccaggaag tgtttggtca aaggaaaaat gataatgaat 360
tcattgagcc tctttgctgc catttctgga atgattcttt caatcatgga catacttaat 420
attaaaattt cccatttttt aaaaatggag agtctgaatt ttattagagc tcacacacca 480
tatattaaca tatacaactg tgaaccagct aatccctctg agaaaaactc cccatctacc 540
caatactgtt acagcataca atctctgttc ttgggcattt tgtcagtgat gctgatcttt 600
gccttcttcc aggaacttgt aatagctggc atcgttgaga atgaatggaa aagaacgtgc 660
tccagaccca aatctaacat agttctcctg tcagcagaag aaaaaaaaga acagactatt 720
gaaataaaag aagaagtggt tgggctaact gaaacatctt cccaaccaaa gaatgaagaa 780
gacattgaaa ttattccaat ccaagaagag gaagaagaag aaacagagac gaactttcca 840
gaacctcccc aagatcagga atcctcacca atagaaaatg acagctctcc t 891
<210> 36
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 36
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu
260 265 270
Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser
275 280 285
Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro
290 295
<210> 37
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 37
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp
20 25 30
Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp
35 40 45
Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu
50 55 60
Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr
65 70 75 80
Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly
85 90 95
Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys
100 105 110
Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe
115 120 125
Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln Ile Thr
145 150 155 160
Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser
165 170 175
Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys
180 185 190
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala
195 200 205
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
210 215 220
Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu
245 250 255
Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala
260 265 270
Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr
275 280 285
Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser
290 295 300
Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln
305 310 315 320
Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile
325 330 335
Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu
340 345 350
Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu
355 360 365
Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg
370 375 380
Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu
385 390 395
<210> 38
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 38
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca ttcagatgac ccagtctccg agctctctgt ccgcatcagt aggagacagg 120
gtcaccatca catgcagagc cagcgaaagt gtcgacaatt atggcattag ctttatgaac 180
tggttccaac agaaacccgg gaaggctcct aagcttctga tttacgctgc atccaaccaa 240
ggctccgggg taccctctcg cttctcaggc agtggatctg ggacagactt cactctcacc 300
atttcatctc tgcagcctga tgacttcgca acctattact gtcagcaaag taaggaggtt 360
ccgtggacgt tcggtcaagg gaccaaggtg gagatcaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 420
ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtt cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaag 480
aagcctggga gctcagtgaa ggtttcctgc aaagcttctg gctacacctt cactgactac 540
aacatgcact gggtgaggca ggctcctggc caaggcctgg aatggattgg atatatttat 600
ccttacaatg gtggtaccgg ctacaaccag aagttcaaga gcaaggccac aattacagca 660
gacgagagta ctaacacagc ctacatggaa ctctccagcc tgaggtctga ggacactgca 720
gtctattact gcgcaagagg gcgccccgct atggactact ggggccaagg gactctggtc 780
actgtctctt caaagcccac caccacccct gcccctagac ctccaacccc agcccctaca 840
atcgccagcc agcccctgag cctgaggccc gaagcctgta gacctgccgc tggcggagcc 900
gtgcacacca gaggcctgga tttcgcctgc gacatctaca tctgggcccc tctggccggc 960
acctgtggcg tgctgctgct gagcctggtc atcaccctgt actgcaacca ccggaatagg 1020
agcaagcgga gcagaggcgg ccacagcgac tacatgaaca tgaccccccg gaggcctggc 1080
cccacccgga agcactacca gccctacgcc cctcccaggg acttcgccgc ctaccggagc 1140
cgggtgaagt tcagccggag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaaccagctg 1200
tacaacgagc tgaacctggg ccggagggag gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 1260
cgggaccctg agatgggcgg caagccccgg agaaagaacc ctcaggaggg cctgtataac 1320
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 1380
cggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 1440
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaga 1476
<210> 39
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 39
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln
65 70 75 80
Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
145 150 155 160
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
Phe Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr
195 200 205
Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr
210 215 220
Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
325 330 335
His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met
340 345 350
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
355 360 365
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
435 440 445
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
450 455 460
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
465 470 475 480
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 40
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 40
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca ttcagatgac ccagtctccg agctctctgt ccgcatcagt aggagacagg 120
gtcaccatca catgcagagc cagcgaaagt gtcgacaatt atggcattag ctttatgaac 180
tggttccaac agaaacccgg gaaggctcct aagcttctga tttacgctgc atccaaccaa 240
ggctccgggg taccctctcg cttctcaggc agtggatctg ggacagactt cactctcacc 300
atttcatctc tgcagcctga tgacttcgca acctattact gtcagcaaag taaggaggtt 360
ccgtggacgt tcggtcaagg gaccaaggtg gagatcaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 420
ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtt cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaag 480
aagcctggga gctcagtgaa ggtttcctgc aaagcttctg gctacacctt cactgactac 540
aacatgcact gggtgaggca ggctcctggc caaggcctgg aatggattgg atatatttat 600
ccttacaatg gtggtaccgg ctacaaccag aagttcaaga gcaaggccac aattacagca 660
gacgagagta ctaacacagc ctacatggaa ctctccagcc tgaggtctga ggacactgca 720
gtctattact gcgcaagagg gcgccccgct atggactact ggggccaagg gactctggtc 780
actgtctctt caaagcccac caccacccct gcccctagac ctccaacccc agcccctaca 840
atcgccagcc agcccctgag cctgaggccc gaagcctgta gacctgccgc tggcggagcc 900
gtgcacacca gaggcctgga tttcgcctgc gacatctaca tctgggcccc tctggccggc 960
acctgtggcg tgctgctgct gagcctggtc atcaccctgt actgcaacca ccggaatcgg 1020
gtgaagttca gccggagcgc cgacgcccct gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac 1080
aacgagctga acctgggccg gagggaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg 1140
gaccctgaga tgggcggcaa gccccggaga aagaaccctc aggagggcct gtataacgaa 1200
ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggcgg 1260
aggggcaagg gccacgacgg cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctac 1320
gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc aga 1353
<210> 41
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 41
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln
65 70 75 80
Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
145 150 155 160
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
Phe Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr
195 200 205
Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr
210 215 220
Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
325 330 335
His Arg Asn Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
340 345 350
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
355 360 365
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
370 375 380
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
405 410 415
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
420 425 430
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
435 440 445
Pro Pro Arg
450
<210> 42
<211> 2619
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 42
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca ttcagatgac ccagtctccg agctctctgt ccgcatcagt aggagacagg 120
gtcaccatca catgcagagc cagcgaaagt gtcgacaatt atggcattag ctttatgaac 180
tggttccaac agaaacccgg gaaggctcct aagcttctga tttacgctgc atccaaccaa 240
ggctccgggg taccctctcg cttctcaggc agtggatctg ggacagactt cactctcacc 300
atttcatctc tgcagcctga tgacttcgca acctattact gtcagcaaag taaggaggtt 360
ccgtggacgt tcggtcaagg gaccaaggtg gagatcaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 420
ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtt cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaag 480
aagcctggga gctcagtgaa ggtttcctgc aaagcttctg gctacacctt cactgactac 540
aacatgcact gggtgaggca ggctcctggc caaggcctgg aatggattgg atatatttat 600
ccttacaatg gtggtaccgg ctacaaccag aagttcaaga gcaaggccac aattacagca 660
gacgagagta ctaacacagc ctacatggaa ctctccagcc tgaggtctga ggacactgca 720
gtctattact gcgcaagagg gcgccccgct atggactact ggggccaagg gactctggtc 780
actgtctctt caaagcccac caccacccct gcccctagac ctccaacccc agcccctaca 840
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gtgcacacca gaggcctgga tttcgcctgc gacatctaca tctgggcccc tctggccggc 960
acctgtggcg tgctgctgct gagcctggtc atcaccctgt actgcaacca ccggaatagg 1020
agcaagcgga gcagaggcgg ccacagcgac tacatgaaca tgaccccccg gaggcctggc 1080
cccacccgga agcactacca gccctacgcc cctcccaggg acttcgccgc ctaccggagc 1140
cgggtgaagt tcagccggag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaaccagctg 1200
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tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccagactcg agggcggcgg agagggcaga 1500
ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg gccctaggat gcttctcctg 1560
gtgacaagcc ttctgctctg tgagttacca cacccagcat tcctcctgat cccacgcaaa 1620
gtgtgtaacg gaataggtat tggtgaattt aaagactcac tctccataaa tgctacgaat 1680
attaaacact tcaaaaactg cacctccatc agtggcgatc tccacatcct gccggtggca 1740
tttaggggtg actccttcac acatactcct cctctggatc cacaggaact ggatattctg 1800
aaaaccgtaa aggaaatcac agggtttttg ctgattcagg cttggcctga aaacaggacg 1860
gacctccatg cctttgagaa cctagaaatc atacgcggca ggaccaagca acatggtcag 1920
ttttctcttg cagtcgtcag cctgaacata acatccttgg gattacgctc cctcaaggag 1980
ataagtgatg gagatgtgat aatttcagga aacaaaaatt tgtgctatgc aaatacaata 2040
aactggaaaa aactgtttgg gacctccggt cagaaaacca aaattataag caacagaggt 2100
gaaaacagct gcaaggccac aggccaggtc tgccatgcct tgtgctcccc cgagggctgc 2160
tggggcccgg agcccaggga ctgcgtctct tgccggaatg tcagccgagg cagggaatgc 2220
gtggacaagt gcaaccttct ggagggtgag ccaagggagt ttgtggagaa ctctgagtgc 2280
atacagtgcc acccagagtg cctgcctcag gccatgaaca tcacctgcac aggacgggga 2340
ccagacaact gtatccagtg tgcccactac attgacggcc cccactgcgt caagacctgc 2400
ccggcaggag tcatgggaga aaacaacacc ctggtctgga agtacgcaga cgccggccat 2460
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tgtccaacga atgggcctaa gatcccgtcc atcgccactg ggatggtggg ggccctcctc 2580
ttgctgctgg tggtggccct ggggatcggc ctcttcatg 2619
<210> 43
<211> 873
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 43
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln
65 70 75 80
Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
145 150 155 160
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
Phe Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr
195 200 205
Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr
210 215 220
Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
325 330 335
His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met
340 345 350
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
355 360 365
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
435 440 445
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
450 455 460
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
465 470 475 480
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly
485 490 495
Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn
500 505 510
Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu
515 520 525
Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly
530 535 540
Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn
545 550 555 560
Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile
565 570 575
Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu
580 585 590
Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly
595 600 605
Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala
610 615 620
Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln
625 630 635 640
Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg
645 650 655
Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys
660 665 670
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675 680 685
Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys
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Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys
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725 730 735
Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg
740 745 750
Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu
755 760 765
Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys
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Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys
785 790 795 800
Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala
805 810 815
Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly
820 825 830
Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile
835 840 845
Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val
850 855 860
Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
865 870
<210> 44
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 44
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca ttcagatgac ccagtctccg agctctctgt ccgcatcagt aggagacagg 120
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ggctccgggg taccctctcg cttctcaggc agtggatctg ggacagactt cactctcacc 300
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<210> 45
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 45
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln
65 70 75 80
Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
145 150 155 160
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
Phe Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr
195 200 205
Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr
210 215 220
Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260
<210> 46
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 46
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca ttcagatgac ccagtctccg agctctctgt ccgcatcagt aggagacagg 120
gtcaccatca catgcagagc cagcgaaagt gtcgacaatt atggcattag ctttatgaac 180
tggttccaac agaaacccgg gaaggctcct aagcttctga tttacgctgc atccaaccaa 240
ggctccgggg taccctctcg cttctcaggc agtggatctg ggacagactt cactctcacc 300
atttcatctc tgcagcctga tgacttcgca acctattact gtcagcaaag taaggaggtt 360
ccgtggacgt tcggtcaagg gaccaaggtg gagatcaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 420
ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtt cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaag 480
aagcctggga gctcagtgaa ggtttcctgc aaagcttctg gctacacctt cactgactac 540
aacatgcact gggtgaggca ggctcctggc caaggcctgg aatggattgg atatatttat 600
ccttacaatg gtggtaccgg ctacaaccag aagttcaaga gcaaggccac aattacagca 660
gacgagagta ctaacacagc ctacatggaa ctctccagcc tgaggtctga ggacactgca 720
gtctattact gcgcaagagg gcgccccgct atggactact ggggccaagg gactctggtc 780
actgtctctt caaagcccac caccacccct gcccctagac ctccaacccc agcccctaca 840
atcgccagcc agcccctgag cctgaggccc gaagcctgta gacctgccgc tggcggagcc 900
gtgcacacca gaggcctgga tttcgcctgc gacatctaca tctgggcccc tctggccggc 960
acctgtggcg tgctgctgct gagcctggtc atcaccctgt actgcaacca ccggaataag 1020
agaggccgga agaaactgct gtacatcttc aagcagccct tcatgcggcc cgtgcagacc 1080
acccaggaag aggacggctg cagctgccgg ttccccgagg aagaggaagg cggctgcgaa 1140
ctgcgggtga agttcagccg gagcgccgac gcccctgcct accagcaggg ccagaaccag 1200
ctgtacaacg agctgaacct gggccggagg gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga 1260
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aacgaactgc agaaagacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag 1380
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<210> 47
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 47
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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195 200 205
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210 215 220
Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
325 330 335
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Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
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Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
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Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
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Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
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Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
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465 470 475 480
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485 490
<210> 48
<211> 2622
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 48
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
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<210> 49
<211> 874
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 49
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<210> 50
<211> 2442
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 50
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<210> 51
<211> 814
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 51
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
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<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 53
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180 185 190
His Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr
195 200 205
Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu
210 215 220
Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr
225 230 235 240
Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly
245 250 255
Val Val His Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala
260 265 270
Leu Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg
275 280 285
<210> 54
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 54
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
210 215 220
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
225 230 235 240
Ser Lys Arg Ser
<210> 55
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 55
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctctggtg gcggtggctc gggcggtggt 600
gggtcgggtg gcggcggatc tggtggcggt ggctcgtttt gggtgctggt ggtggttggt 660
ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 720
agtaagagga gc 732
<210> 56
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 56
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu
260
<210> 57
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 57
atgaccacac cacggaactc tgtgaatggc accttcccag cagagccaat gaagggacca 60
atcgcaatgc agagcggacc caagcctctg tttcggagaa tgagctccct ggtgggccca 120
acccagtcct tctttatgag agagtctaag acactgggcg ccgtgcagat catgaacgga 180
ctgttccaca tcgccctggg aggactgctg atgatcccag ccggcatcta cgcccctatc 240
tgcgtgaccg tgtggtaccc tctgtggggc ggcatcatgt atatcatctc cggctctctg 300
ctggccgcca cagagaagaa cagcaggaag tgtctggtga agggcaagat gatcatgaat 360
agcctgtccc tgtttgccgc catctctggc atgatcctga gcatcatgga catcctgaac 420
atcaagatca gccacttcct gaagatggag agcctgaact tcatcagagc ccacacccct 480
tacatcaaca tctataattg cgagcctgcc aacccatccg agaagaattc tccaagcaca 540
cagtactgtt attccatcca gtctctgttc ctgggcatcc tgtctgtgat gctgatcttt 600
gccttctttc aggagctggt catcgccggc atcgtggaga acgagtggaa gaggacctgc 660
agccgcccca agtccaatat cgtgctgctg tccgccgagg agaagaagga gcagacaatc 720
gagatcaagg aggaggtggt gggcctgacc gagacatcta gccagcctaa gaatgaggag 780
gatatcgag 789
<210> 58
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的寡核苷酸"
<400> 58
ctgtgcgcac gcccacgccg cagccccgcc caagaagatg gcaaagtcta catcaacatg 60
ccaggcaggg gc 72
<210> 59
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 59
Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val
1 5 10 15
Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
20
<210> 60
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 60
tacttcctgg gccggctggt ccctcggggg cgaggggctg cggaggcagc gacccggaaa 60
cagcgtatca ctgagaccga gtcgccttat caggagctcc agggtcagag gtcggatgtc 120
tacagcgacc tcaacacaca gaggccgtat tacaaa 156
<210> 61
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 61
Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala
1 5 10 15
Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu
20 25 30
Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg
35 40 45
Pro Tyr Tyr Lys
50
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注＝"人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 62
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10

Claims (73)

1.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸，其中，所述CAR包含
(a)CD33抗原结合结构域；
(b)茎结构域；
(c)跨膜结构域；
(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；
(e)CD3ζ信号传导结构域。
2.如权利要求1所述的分离的核酸，其中，所述CD33抗原结合结构域包含以下的至少一种：
(a)与氨基酸序列SEQ ID NO:8(hM195scFv)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽；
(b)与氨基酸序列SEQ ID NO:9和10(M2H12)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽；
(c)与氨基酸序列SEQ ID NO:11和12(DRB2)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽；和
(d)与氨基酸序列SEQ ID NO:14和15(My9-6)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
3.如权利要求1或2所述的分离的核酸，其中，所述CD33抗原结合结构域是与氨基酸序列SEQ ID NO:8(hM195scFv)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
4.如权利要求1或2所述的分离的核酸，其中，所述茎结构域是与氨基酸序列SEQ IDNO:22(CD8α铰链)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
5.如权利要求1-4中任一项所述的分离的核酸，其中，所述共刺激信号传导结构域包含4-1BB。
6.如权利要求5所述的分离的核酸，其中，4-1BB共刺激信号传导结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
7.如权利要求1-5中任一项所述的分离的核酸，其中，所述共刺激信号传导结构域包含CD28。
8.如权利要求7所述的分离的核酸，其中，CD28共刺激信号传导结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
9.如权利要求1-8中任一项所述的分离的核酸，其中，所述CD3ζ信号传导结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
10.如权利要求1-9中任一项所述的分离的核酸，所述分离的核酸还包含截短的表皮生长因子受体。
11.如权利要求10所述的分离的核酸，其中，所述截短的表皮生长因子受体是HER1t并且包含与氨基酸序列SEQ ID NO:32具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
12.如权利要求10所述的分离的核酸，其中，所述截短的表皮生长因子受体是HER1t-1并且包含与氨基酸序列SEQ ID NO:54具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
13.如权利要求1所述的分离的核酸，其中，所述CAR包含与SEQ ID NO:39、41、43、45、47、49、51、53或55中所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
14.一种载体，包含骨架和编码以下的核酸序列：
(1)包含HER1t、HER1t-1或其功能性变体中至少其一的截短的表皮生长因子受体；和
(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含
(a)CD33抗原结合结构域；
(b)茎结构域；
(c)跨膜结构域；
(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和
(e)CD3ζ信号传导结构域。
15.一种载体，包含骨架和编码以下的核酸序列：
(1)全长CD20、截短的CD20(CD20t-1)或其功能性变体；和
(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含
(a)CD33抗原结合结构域；
(b)茎结构域；
(c)跨膜结构域；
(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和
(e)CD3ζ信号传导结构域。
16.如权利要求14或15所述的载体，其中，所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
17.如权利要求14所述的载体，其中，所述截短的表皮生长因子受体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:54具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
18.如权利要求15所述的载体，所述载体包含编码截短的CD20(CD20t-1)或其功能性变体的核苷酸序列，其中所述CD20t-1包含与氨基酸序列SEQ ID NO:56具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
19.如权利要求15所述的载体，其中，所述全长CD20包含与氨基酸序列SEQ ID NO:36具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
20.如权利要求14-19中任一项所述的载体，所述载体还包含编码自切割性明脉扁刺蛾病毒(T2A)肽的核苷酸序列。
21.如权利要求14-20中任一项所述的载体，其中，所述骨架是睡美人转座子DNA质粒或pFUGW。
22.如权利要求14-21中任何一项所述的载体，所述载体还包含启动子。
23.如权利要求22所述的载体，其中，所述启动子是hEF1a1。
24.如权利要求14-23中任一项所述的载体，其中，所述CD33抗原结合结构域包含以下的至少一种：
(a)与氨基酸序列SEQ ID NO:8(hM195scFv)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽；
(b)与氨基酸序列SEQ ID NO:9和10(M2H12)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽；
(c)与氨基酸序列SEQ ID NO:11和12(DRB2)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽；和
(d)与氨基酸序列SEQ ID NO:14和15(My9-6)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
25.如权利要求14-24中任一项所述的载体，其中，所述CD33抗原结合结构域是与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
26.如权利要求14-25中任一项所述的载体，其中，所述茎结构域包含与氨基酸序列SEQID NO:22(CD8α铰链)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的多肽。
27.如权利要求14-26中任一项所述的载体，其中，所述共刺激信号传导结构域包含4-1BB。
28.如权利要求27所述的载体，其中，4-1BB共刺激信号传导结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的核酸序列。
29.如权利要求14-26中任一项所述的载体，其中，所述共刺激信号传导结构域包含CD28。
30.如权利要求29所述的载体，其中，CD28共刺激信号传导结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的核酸序列。
31.如权利要求14-30中任一项所述的载体，其中，所述CD3ζ信号传导结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的核酸序列。
32.如权利要求14-31中任一项所述的载体，其中，所述载体包括质粒。
33.如权利要求14-31所述的载体，其中，所述载体各包括表达质粒。
34.如权利要求16所述的载体，其中，所述非病毒载体是睡美人转座子。
35.一种免疫效应细胞，包含权利要求1-13中任一项所述的核苷酸。
36.一种免疫效应细胞，包含骨架和编码以下的核酸序列：(1)截短的表皮生长因子受体(HER1t)；和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。
37.一种免疫效应细胞，包含(1)细胞标签，用作杀伤开关、选择标志物、生物标志物或其组合；和(2)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含(a)CD33抗原结合结构域；(b)茎结构域；(c)跨膜结构域；(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；和(e)CD3ζ信号传导结构域。
38.如权利要求37所述的免疫效应细胞，其中，所述细胞标签包括HER1t、HER1t-1、CD20t-1或CD20。
39.如权利要求38所述的免疫效应细胞，其中，所述细胞标签包括HER1t，并且所述HER1t包含多肽序列SEQ ID NO:32。
40.如权利要求38所述的免疫效应细胞，其中，所述细胞标签包括HER1t-1，并且所述HER1t-1包含多肽序列SEQ ID NO:54。
41.一种免疫效应细胞，包含权利要求14-34中任一项所述的载体。
42.如权利要求35-41中任一项所述的免疫效应细胞，其中，所述细胞是T细胞、天然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或调节性T细胞。
43.如权利要求42所述的免疫效应细胞，其中，当所述CD33抗原结合结构域结合CD33时，所述细胞表现出抗肿瘤免疫性。
44.一种用于在有需要的人对象中刺激针对靶细胞群或组织的由T细胞介导的免疫应答的方法，包括向所述人对象给予有效量的经遗传修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包含
(a)CD33抗原结合结构域；
(b)茎结构域；
(c)跨膜结构域；
(d)包含4-1BB或CD28或两者的共刺激信号传导结构域；
(e)CD3ζ信号传导结构域；和
(f)截短的表皮生长因子受体(HER1t)。
45.如权利要求44所述的方法，其中，所述人已经被诊断为急性髓性白血病。
46.如权利要求45所述的方法，其中，所述急性髓性白血病是复发的AML或难治性AML。
47.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸，其中，所述CAR包含：
(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的CD33抗原结合结构域；
(b)具有氨基酸序列SEQ ID NO:22的茎结构域；
(c)具有氨基酸序列SEQ ID NO:28的含CD28共刺激信号传导结构域；
(d)HER1标签，所述HER1标签包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:32的HER1t和具有氨基酸序列SEQ ID NO:54的HER1t-1中的至少一个；
(e)具有氨基酸序列SEQ ID NO:26的CD3ζ信号传导结构域。
48.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸，其中，所述CAR包含：
(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的CD33抗原结合结构域；
(b)具有氨基酸序列SEQ ID NO:22的茎结构域；
(c)具有氨基酸序列SEQ ID NO:24的含4-1BB共刺激信号传导结构域；
(d)HER1标签，所述HER1标签包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:32的HER1t和具有氨基酸序列SEQ ID NO:54的HER1t-1中的至少一个；
(e)具有氨基酸序列SEQ ID NO:26的CD3ζ信号传导结构域。
49.一种载体，包含权利要求47和48中任一项中的多核苷酸的任一个或多个。
50.如权利要求49所述的载体，其中，所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
51.如权利要求50所述的载体，其中，所述非病毒载体是睡美人转座子。
52.如权利要求49所述的载体，其中，所述载体是多个载体。
53.一种用于在免疫效应细胞中表达CAR的系统，所述系统包含一个或多个载体，所述一个或多个载体编码权利要求1-13和47-48中任一项所提供的分离的核酸。
54.如权利要求53所述的系统，其中，所述免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。
55.如权利要求53-54中任一项所述的系统，所述系统还包含编码至少一个其他基因的核酸。
56.如权利要求55所述的系统，其中，所述其他基因包含细胞因子。
57.如权利要求56所述的系统，其中，所述细胞因子包含IL-15和IL-15Rα的融合体、IL-2、IL-15、IL-12和IL-21中的至少一个。
58.如权利要求56所述的系统，其中，所述细胞因子呈分泌形式。
59.如权利要求56所述的系统，其中，所述细胞因子呈膜结合形式。
60.如权利要求53-59中任一项所述的系统，其中，所述系统包含一个载体。
61.如权利要求53-60中任一项所述的系统，其中，所述一个或多个载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
62.如权利要求61所述的系统，其中，所述非病毒载体是睡美人转座子。
63.如权利要求62所述的系统，所述系统还包含睡美人转座酶。
64.如权利要求63所述的系统，其中，所述睡美人转座酶是SB11、SB100X或SB110。
65.如权利要求53-64中任一项所述的系统，其中，所述免疫效应细胞是哺乳动物细胞。
66.一种在免疫效应细胞中表达CAR的方法，包括使所述免疫效应细胞与权利要求53-65中任一项所述的系统接触。
67.一种刺激经工程改造的T细胞的增殖和/或存活的方法，包括：
(a)获得来自对象的样品，所述样品包含T细胞或T细胞祖细胞；
(b)用编码权利要求1-13和47-48中任一项所提供的分离的核酸的一个或多个载体和编码转座酶的载体转染所述细胞，以提供经工程改造的表达CD33 CAR的T细胞群；
(c)和任选地，离体培养CD33 CAR T细胞群2天或更少。
68.如权利要求67所述的方法，所述方法还包括用编码细胞因子的载体转染所述细胞。
69.如权利要求68所述的方法，其中，所述细胞因子是包含IL-15和IL-15Rα的融合蛋白。
70.如权利要求66-69中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
71.如权利要求70所述的方法，其中，所述非病毒载体是睡美人转座子。
72.如权利要求71所述的方法，所述方法还包括睡美人转座酶。
73.如权利要求72所述的方法，其中，所述睡美人转座酶是SB11、SB100X或SB110。
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