CN116497065A - 病毒载体及其应用 - Google Patents

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陈世优
朱秀琴
李林昇
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赵光辉
李利佳
陈小锋
李文佳
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Abstract

本发明提出一组病毒载体。该组病毒载体包括：第一病毒载体，所述第一病毒载体携带第一核酸分子，所述第一核酸分子编码包膜蛋白；至少一个第二病毒载体，所述第二病毒载体携带第二核酸分子，所述第二核酸分子编码至少一个融合蛋白，所述融合蛋白包括至少一个单链抗体和所述包膜蛋白的C端结构域，所述单链抗体能够结合CD28或CD3，所述包膜蛋白的C端结构域包括包膜蛋白的跨膜区和胞内区，所述至少一个单链抗体的C端与所述包膜蛋白的C端结构域的N端相连；所述包膜蛋白与所述融合蛋白呈非融合形式。该组病毒载体导入受体细胞后，可包装出高病毒滴度的病毒，且该病毒可靶向感染未预先激活或预先激活的T细胞。

Description

病毒载体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及病毒载体及其应用，更具体地，本发明涉及病毒载体、一种获得慢病毒的方法、慢病毒、将慢病毒导入未激活T淋巴细胞的方法、表达目的基因的方法及获得CAR-T细胞的方法。
背景技术
基因治疗是通过修饰生物体的基因表达来达到治疗或治愈疾病的目的，根据发生基因传递的位置不同而分为体内(In vivo)基因治疗和体外(Ex vivo)基因治疗。体内治疗的策略是将治疗基因组装在特定的载体中，在人体内通过载体将治疗基因转导入患者细胞，目前主要使用腺相关病毒(adeno-associated viral vectors,AAV)载体。体外治疗策略是将患者细胞分离后，在体外培养期间对患者的细胞进行基因修饰，再将基因修饰后的细胞回输至患者体内，目前主要使用慢病毒载体(Lentiviral vectors,LV)。
对比体内和体外治疗策略我们可以知道，前者的药物是转基因载体，是通用化产品，产品的生产流程只涉及转基因载体的生产。后者的药物则是改造后的患者细胞，是个体化产品，并且只适用于可分离、体外培养的血液细胞相关疾病治疗，产品的生产流程复杂，涉及转基因载体的生产，患者细胞的分离、体外培养，细胞基因修饰，细胞回输。总的来说，体内基因治疗产品具有适应症广、生产工艺相对简单、通用化、可量产、成本低的巨大优势。
但是，目前使用AAV载体的体内基因治疗在有效性和安全性上都存在一定问题。关于有效性，基因转导进入患者细胞后，是以微环形式游离于宿主基因组之外的，会随着细胞的分裂、凋亡而丢失，导致药效逐渐减弱。关于安全性，AAV基因疗法在走向市场和在早期临床试验中死亡事件屡次发生，FDA已重点关注到该疗法的肝毒性、肾损伤、神经元损失的安全性问题。另外，业界一度认为AAV转导基因不整合到宿主基因组上，不会有致癌风险，具有较高的安全性；然而，不断有报道指出AAV转导基因会整合到宿主基因组上，并且有致癌性。
慢病毒载体转导的基因可穿透核膜，在分裂和非分裂细胞中均能高效整合到宿主基因组中，使得治疗基因可随细胞分裂而复制，持续稳定的存在于转导细胞中，可实现一次给药、终身治愈。目前慢病毒载体广泛于CAR-T生产、造血干细胞改造等体外基因治疗中，已积累了大量的临床前和临床数据，无任何因慢病毒载体转导基因插入宿主基因组而引发肿瘤的报道，证明了慢病毒本身的安全性。但慢病毒载体尚未在体内基因治疗取得突破，主要原因是其转导无靶向性，可能会因为脱靶对安全性造成影响，构建靶向型慢病毒载体，可提高相应的安全性。有文章报道将scFv或预设计锚蛋白重复蛋白(DARPin)连接到慢病毒载体的包膜蛋白上，可增强载体对某类细胞的转导效率，但是仍存在改造后载体脱靶率较高或未评价、生产滴度大幅下降导致无法用于工业生产的问题。
因此，需要开发新的技术来解决上述问题。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出一种具有靶向感染力且病毒滴度得到显著提高的病毒载体。
在本发明的第一方面，本发明提出了一组病毒载体。根据本发明的实施例，所述病毒载体包括：第一病毒载体，所述第一病毒载体携带第一核酸分子，所述第一核酸分子编码包膜蛋白；至少一个第二病毒载体，所述第二病毒载体携带第二核酸分子，所述第二核酸分子编码至少一个融合蛋白，所述融合蛋白包括至少一个单链抗体和所述包膜蛋白的C端结构域，所述单链抗体能够结合CD28或CD3，所述包膜蛋白的C端结构域包括包膜蛋白的跨膜区和胞内区，所述至少一个单链抗体的C端与所述包膜蛋白的C端结构域的N端相连；所述第一核酸分子与所述第二核酸分子被设置为表达所述包膜蛋白与所述融合蛋白，并且所述包膜蛋白与所述融合蛋白呈非融合形式。根据本发明实施例的病毒载体导入受体细胞后，可包装出高病毒滴度的病毒，且该病毒表达的单链抗体在与CD28或CD3结合的介导下，实现了病毒对免疫细胞的特异性靶向结合，进而实现病毒对免疫T细胞的特异性感染，并且，本申请包装出的病毒可以在体外、内直接转导未预先激活的或激活的T细胞。
根据本发明的实施例，上述病毒载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述病毒载体为反转录病毒、慢病毒或其他包膜病毒载体。
根据本发明的实施例，所述包膜病毒包括选自玻那病毒科(Bornaviridae)、尼亚马病毒科(Nyamaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、汉坦病毒科(Hantaviridae)、内罗病毒科(Nairoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、白纤病毒科(Phenuiviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、泡沫病毒(Spumavirus)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、丁型肝炎病毒科(Deltavirus)病毒的至少之一。
根据本发明的实施例，所述包膜蛋白为弹状病毒科水泡性口炎病毒的包膜G糖蛋白(VSV-G)或包膜G糖蛋白的突变体。水泡性口炎病毒的包膜G糖蛋白具有细胞膜吸附和融合能力，因此，根据本发明实施例的病毒载体所包装获得病毒具有细胞吸附和感染能力。
根据本发明的实施例，包膜G糖蛋白(VSV-G)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
KFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:1)。
根据本发明的实施例，所述包膜蛋白的突变体具有吸附能力减弱突变。根据本发明的具体实施例，所述包膜蛋白突变体的细胞膜吸附能力减弱，使得包装获得的病毒的非特异性吸附细胞能力减弱，但不影响其膜融合能力，病毒仍然具备感染细胞的能力。
根据本发明的实施例，所述包膜G糖蛋白的突变体具有K47Q和R354Q突变。具有K47Q和R354Q突变的包膜G糖蛋白突变体的细胞膜吸附能力减弱，但不影响其膜融合能力。因此，具有K47Q和R354Q突变的包膜G糖蛋白的突变体使得包装获得的病毒的非特异性吸附细胞的能力减弱，但不影响病毒感染细胞的能力。
根据本发明的实施例，所述包膜G糖蛋白的突变体具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
KFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPQSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMVGMISGTTTEQELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:2)。
根据本发明的实施例，所述单链抗体能够结合CD28。根据本发明的实施例，所述单链抗体能够特异性靶向结合CD28，为抗CD28的单链抗体。
根据本发明的实施例，所述单链抗体具有SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列。根据本发明实施例的单链抗体能够靶向结合CD28阳性细胞，如T细胞。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKE(SEQ ID NO:3)。
DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:4)。
根据本发明的实施例，所述单链抗体能够结合CD3。根据本发明的实施例，所述单链抗体能够特异性靶向结合CD3，为抗CD3的单链抗体。
据本发明的实施例，所述单链抗体具有SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列。根据本发明实施例的单链抗体能够靶向结合CD3阳性细胞，如T细胞。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:5)。
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR(SEQ ID NO:6)。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括第一单链抗体、第二单链抗体以及所述包膜蛋白的C端结构域，所述第一单链抗体能够结合CD28，所述第二单链抗体能够结合CD3，所述第一单链抗体的C端与所述第二单链抗体的N端相连，所述第二单链抗体的C端与所述包膜蛋白的C端结构域的N端相连；或，所述第二单链抗体的C端与所述第一单链抗体的N端相连，所述第一单链抗体的C端与所述包膜蛋白的C端结构域的N端相连。根据本发明的实施例的融合蛋白能够特异性靶向结合CD28和CD3。根据本发明的实施例的融合蛋白能够特异性靶向结合CD28和CD3阳性细胞，如T细胞。
根据本发明的实施例，所述第一单链抗体具有SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述第二单链抗体具有SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述包膜蛋白的C端结构域进一步包括包膜蛋白的至少部分胞外区。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白进一步包括第一连接肽，所述第一连接肽的N端与所述第一单链抗体的C端相连，所述第一连接肽的C端与所述第二单链抗体的N端相连；或，所述第一连接肽的N端与所述第二单链抗体的C端相连，所述第一连接肽的C端与所述第一单链抗体的N端相连。
根据本发明的实施例，所述第一连接肽具有SEQ ID NO:7～11任一所示的氨基酸序列。
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:7)。
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:8)。
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:9)。
EAAAKEAAAKEAAAKE(SEQ ID NO:10)。
EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK(SEQ ID NO:11)。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白进一步包括第二连接肽，所述第二连接肽的N端与所述至少一个单链抗体的C端相连，所述第二连接肽的C端与所述包膜蛋白的C端结构域的N端相连。
根据本发明的实施例，所述第二连接肽具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。进而将单链抗体区与包膜蛋白C端区隔开，减少二者功能干扰。
AAATTT(SEQ ID NO:12)。
根据本发明的实施例，所述包膜蛋白的C端结构域包括所述包膜蛋白的第386位氨基酸～第434位氨基酸与第495位氨基酸之间的肽链。
根据本发明的实施例，以包膜蛋白的N端第一个氨基酸作为第一位氨基酸，例如参考具有SEQ IDNO:1或2所示氨基酸序列的包膜G糖蛋白，所述包膜蛋白的C端结构域包括所述包膜蛋白的第386位氨基酸～第434位氨基酸与第495位氨基酸(C端第一个氨基酸)之间的肽链，也即包膜蛋白的C端结构域长度长于61个氨基酸且短于111个氨基酸(即不短于62个氨基酸且不长于110个氨基酸)，包装出来的慢病毒载体转导效率最高。
根据本发明的实施例，所述包膜蛋白的C端结构域包括所述包膜蛋白的第395位氨基酸～第425位氨基酸与第495位氨基酸之间的肽链。
根据本发明的实施例，包膜蛋白的C端结构域包含VSV-G蛋白的第425-495位氨基酸，第415-495位氨基酸，第405-495位氨基酸，或第395-495位氨基酸。
根据本发明的实施例，所述包膜蛋白的C端结构域具有SEQ ID NO:13、39、40或41所示的氨基酸序列。
FEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCI KLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:13)。
FGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:39)。
SQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQI YTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:40)。
DLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:41)。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19或20所示的氨基酸序列。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKEAAATTTFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:14)。
DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTTVTVSSAAATTTFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:18)。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKAAATTTFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:15)。
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRAAATTTFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:19)。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKAAATTTFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:16)。
DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRAAATTTFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:20)。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKEAAATTTFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:17)。
其中，具有SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的融合蛋白是包含能够结合CD28的单链抗体的融合蛋白，在本申请中，表达具有SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的融合蛋白的代号标记为：S1。
具有SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的融合蛋白是包含能够结合CD28的单链抗体的融合蛋白，在本申请中，表达具有SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的融合蛋白的代号标记为：S3。
具有SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的融合蛋白是包含能够结合CD3的单链抗体的融合蛋白，在本申请中，表达具有SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的融合蛋白的代号标记为：S2。
具有SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的融合蛋白是包含能够结合CD3的单链抗体的融合蛋白，在本申请中，表达具有SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的融合蛋白的代号标记为：S4。
具有SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的融合蛋白是包含能够结合CD28和CD3的单链抗体的融合蛋白，在本申请中，表达具有SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的融合蛋白的代号标记为：S12。
具有SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的融合蛋白是包含能够结合CD28和CD3的单链抗体的融合蛋白，在本申请中，表达具有SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的融合蛋白的代号标记为：S34。
具有SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的融合蛋白是包含能够结合CD28和CD3的单链抗体的融合蛋白。
根据本发明的实施例，所述病毒载体进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。进而第一核酸分子和第二核酸分子分别在第一启动子和第二启动子的调控下，实现对第一核酸分子和第二核酸分子的高效表达。
根据本发明的实施例，所述第一启动子和所述第二启动子分别独立地选自CMV、EF-1或RSV启动子。
根据本发明的实施例，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO:21或35所示的核苷酸序列。
AAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCAGATTTAAATTGGCATAATGACTTAATAGGCACAGCCTTACAAGTCAAAATGCCCCAAAGTCACAAGGCTATTCAAGCAGACGGTTGGATGTGTCATGCTTCCAAATGGGTCACTACTTGTGATTTCCGCTGGTATGGACCGAAGTATATAACACATTCCATCCGATCCTTCACTCCATCTGTAGAACAATGCAAGGAAAGCATTGAACAAACGAAACAAGGAACTTGGCTGAATCCAGGCTTCCCTCCTCAAAGTTGTGGATATGCAACTGTGACGGATGCCGAAGCAGTGATTGTCCAGGTGACTCCTCACCATGTGCTGGTTGATGAATACACAGGAGAATGGGTTGATTCACAGTTCATCAACGGAAAATGCAGCAATTACATATGCCCCACTGTCCATAACTCTACAACCTGGCATTCTGACTATAAGGTCAAAGGGCTATGTGATTCTAACCTCATTTCCATGGACATCACCTTCTTCTCAGAGGACGGAGAGCTATCATCCCTGGGAAAGGAGGGCACAGGGTTCAGAAGTAACTACTTTGCTTATGAAACTGGAGGCAAGGCCTGCAAAATGCAATACTGCAAGCATTGGGGAGTCAGACTCCCATCAGGTGTCTGGTTCGAGATGGCTGATAAGGATCTCTTTGCTGCAGCCAGATTCCCTGAATGCCCAGAAGGGTCAAGTATCTCTGCTCCATCTCAGACCTCAGTGGATGTAAGTCTAATTCAGGACGTTGAGAGGATCTTGGATTATTCCCTCTGCCAAGAAACCTGGAGCAAAATCAGAGCGGGTCTTCCAATCTCTCCAGTGGATCTCAGCTATCTTGCTCCTAAAAACCCAGGAACCGGTCCTGCTTTCACCATAATCAATGGTACCCTAAAATACTTTGAGACCAGATACATCAGAGTCGATATTGCTGCTCCAATCCTCTCAAGAATGGTCGGAATGATCAGTGGAACTACCACAGAACAGGAACTGTGGGATGACTGGGCACCATATGAAGACGTGGAAATTGGACCCAATGGAGTTCTGAGGACCAGTTCAGGATATAAGTTTCCTTTATACATGATTGGACATGGTATGTTGGACTCCGATCTTCATCTTAGCTCAAAGGCTCAGGTGTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAG(SEQ ID NO:21)。
AAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCAGATTTAAATTGGCATAATGACTTAATAGGCACAGCCTTACAAGTCAAAATGCCCAAGAGTCACAAGGCTATTCAAGCAGACGGTTGGATGTGTCATGCTTCCAAATGGGTCACTACTTGTGATTTCCGCTGGTATGGACCGAAGTATATAACACATTCCATCCGATCCTTCACTCCATCTGTAGAACAATGCAAGGAAAGCATTGAACAAACGAAACAAGGAACTTGGCTGAATCCAGGCTTCCCTCCTCAAAGTTGTGGATATGCAACTGTGACGGATGCCGAAGCAGTGATTGTCCAGGTGACTCCTCACCATGTGCTGGTTGATGAATACACAGGAGAATGGGTTGATTCACAGTTCATCAACGGAAAATGCAGCAATTACATATGCCCCACTGTCCATAACTCTACAACCTGGCATTCTGACTATAAGGTCAAAGGGCTATGTGATTCTAACCTCATTTCCATGGACATCACCTTCTTCTCAGAGGACGGAGAGCTATCATCCCTGGGAAAGGAGGGCACAGGGTTCAGAAGTAACTACTTTGCTTATGAAACTGGAGGCAAGGCCTGCAAAATGCAATACTGCAAGCATTGGGGAGTCAGACTCCCATCAGGTGTCTGGTTCGAGATGGCTGATAAGGATCTCTTTGCTGCAGCCAGATTCCCTGAATGCCCAGAAGGGTCAAGTATCTCTGCTCCATCTCAGACCTCAGTGGATGTAAGTCTAATTCAGGACGTTGAGAGGATCTTGGATTATTCCCTCTGCCAAGAAACCTGGAGCAAAATCAGAGCGGGTCTTCCAATCTCTCCAGTGGATCTCAGCTATCTTGCTCCTAAAAACCCAGGAACCGGTCCTGCTTTCACCATAATCAATGGTACCCTAAAATACTTTGAGACCAGATACATCAGAGTCGATATTGCTGCTCCAATCCTCTCAAGAATGGTCGGAATGATCAGTGGAACTACCACAGAAAGGGAACTGTGGGATGACTGGGCACCATATGAAGACGTGGAAATTGGACCCAATGGAGTTCTGAGGACCAGTTCAGGATATAAGTTTCCTTTATACATGATTGGACATGGTATGTTGGACTCCGATCTTCATCTTAGCTCAAAGGCTCAGGTGTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAG(SEQ ID NO:35)。
根据本发明的实施例，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO:22、23、24、25、32、33或34所示的核苷酸序列。
其中，具有SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的第二核酸分子编码的融合蛋白是包含能够结合CD28的单链抗体的融合蛋白，在本申请中，SEQ ID NO:22所示核苷酸序列编码的融合蛋白的代号标记为：S1。
具有SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的第二核酸分子编码的融合蛋白是包含能够结合CD3的单链抗体的融合蛋白，在本申请中，SEQ ID NO:23所示核苷酸序列编码的融合蛋白的代号标记为：S2。
具有SEQ ID NO:24所示核苷酸序列的第二核酸分子编码的融合蛋白是包含能够结合CD28和CD3的单链抗体的融合蛋白，在本申请中，SEQ ID NO:24所示核苷酸序列编码的融合蛋白的代号标记为：S12。
具有SEQ ID NO:25所示核苷酸序列的第二核酸分子编码融合蛋白是包含能够结合CD3和CD28的单链抗体的融合蛋白。在本申请中，SEQ ID NO:25所示核苷酸序列编码具有SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的融合蛋白。
具有SEQ ID NO:32所示核苷酸序列的融合蛋白是包含能够结合CD28的单链抗体的融合蛋白，在本申请中，SEQ ID NO:32所示核苷酸序列编码的融合蛋白的代号标记为：S3。
具有SEQ ID NO:33所示核苷酸序列的融合蛋白是包含能够结合CD3的单链抗体的融合蛋白，在本申请中，SEQ ID NO:33所示核苷酸序列编码的融合蛋白的代号标记为：S4。
具有SEQ ID NO:34所示核苷酸序列的融合蛋白是包含能够结合CD28和CD3的单链抗体的融合蛋白，在本申请中，SEQ ID NO:34所示核苷酸序列编码的的融合蛋白的代号标记为：S34。
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAGCTACTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATTGGATGTATTTATCCTGGAAATGTCAATACTAACTATAATGAGAAGTTCAAGGACAGGGCCACCCTGACCGTAGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTTCTGTACAAGATCACACTACGGCCTCGACTGGAACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAAAACATTTATGTTTGGTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCTTCCAACCTGCACACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGGTCAAACTTATCCGTACACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAGAGGCGGCCGCAACTACCACCTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAG(SEQ ID NO:22)。
GATATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGACGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAGCGGCCGCAACTACCACCTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAG(SEQ ID NO:23)。
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAGCTACTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATTGGATGTATTTATCCTGGAAATGTCAATACTAACTATAATGAGAAGTTCAAGGACAGGGCCACCCTGACCGTAGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTTCTGTACAAGATCACACTACGGCCTCGACTGGAACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAAAACATTTATGTTTGGTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCTTCCAACCTGCACACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGGTCAAACTTATCCGTACACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAGAGGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGATATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGACGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAGCGGCCGCAACTACCACCTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAG(SEQ ID NO:24)。
GATATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGACGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAGCTACTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATTGGATGTATTTATCCTGGAAATGTCAATACTAACTATAATGAGAAGTTCAAGGACAGGGCCACCCTGACCGTAGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTTCTGTACAAGATCACACTACGGCCTCGACTGGAACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAAAACATTTATGTTTGGTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCTTCCAACCTGCACACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGGTCAAACTTATCCGTACACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAGAGGCGGCCGCAACTACCACCTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAG(SEQ ID NO:25)。
GACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGAGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGTGAGAGTGTTGAATATTATGTCACAAGTTTAATGCAGTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTTTGCTGCATCCAACGTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAAACTTCAGCCTCAACATCCATCCTGTGGACGAGGATGATGTTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAGGAAGGTTCCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGAGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGACGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACTTGTACTGTCTCTGGGTTTTCATTAAGCGACTATGGTGTTCATTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGCTGGTGGAGGCACGAATTATAATTCGGCTCTCATGTCCAGAAAGAGCATCAGCAAAGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAGCTGATGACACAGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGATAAGGGATACTCCTATTACTATTCTATGGACTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAACTACCACCTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAG(SEQ ID NO:32)。
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCAGATTGTGTTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTTACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCACTTCAGGGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCGGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGATCAACCGTGCGGCCGCAACTACCACCTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAG(SEQ ID NO:33)。
GACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGAGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGTGAGAGTGTTGAATATTATGTCACAAGTTTAATGCAGTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTTTGCTGCATCCAACGTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAAACTTCAGCCTCAACATCCATCCTGTGGACGAGGATGATGTTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAGGAAGGTTCCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGAGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGACGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACTTGTACTGTCTCTGGGTTTTCATTAAGCGACTATGGTGTTCATTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGCTGGTGGAGGCACGAATTATAATTCGGCTCTCATGTCCAGAAAGAGCATCAGCAAAGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAGCTGATGACACAGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGATAAGGGATACTCCTATTACTATTCTATGGACTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCAGATTGTGTTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTTACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCACTTCAGGGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCGGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGATCAACCGTGCGGCCGCAACTACCACCTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAG(SEQ ID NO:34)。
根据本发明的实施例，所述第二核酸分子进一步包括编码信号肽的核酸序列。根据本发明的具体实施例，所述编码信号肽的核酸序列表达的信号肽位于融合蛋白前体蛋白的氨基末端，是包膜蛋白的膜定位端肽，在帮助包膜蛋白定位到内质网上，蛋白成熟后就水解脱离，因此，病毒颗粒上的融合蛋白并不含有该信号肽。
根据本发明的实施例，所述编码信号肽的核酸序列具有SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列。
ATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGGGGTGAATTGC(SEQ ID NO:26)。
根据本发明的实施例，所述第一核酸分子和第二核酸分子的拷贝数之比为1：1～4：1。需要说明的是，本申请所述的“第一核酸分子和第二核酸分子的拷贝数之比”是指当第一病毒载体和第二病毒载体为同一载体，即第一核酸分子和第二核酸分子在同一载体时，第一核酸分子和第二核酸分子在载体上的携带数量比，以尽可能保证第一核酸分子和第二核酸分子的蛋白表达量之比约为同比。发明人发现，当载体上携带所述第一核酸分子和第二核酸分子的数量比为1：1～4：1时，病毒滴度和病毒的感染效率均较高。
根据本发明的实施例，所述第一核酸分子和第二核酸分子的拷贝数之比为2：1～4：1。根据本发明的具体实施例，当载体上携带所述第一核酸分子和第二核酸分子的数量比为2：1～4：1时，病毒滴度和病毒的感染效率得到进一步提高。
根据本发明的实施例，所述第一核酸分子和第二核酸分子的拷贝数之比为2：1。发明人发现，当载体上携带所述第一核酸分子和第二核酸分子的数量比为2：1时，病毒滴度和病毒的感染效率会达到一个最佳的平衡。
根据本发明的实施例，所述第一病毒载体和第二病毒载体为同一载体。
根据本发明的实施例，所述第一病毒载体和第二病毒载体为同一载体，所述载体进一步包括：内部核糖体进入位点序列(IRES)，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间。内部核糖体进入位点前后的两个蛋白的表达通常是成比例的。内部核糖体进入位点序列的引入使得第一核酸分子和第二核酸分子分别独立的翻译表达，得到的包膜蛋白和融合蛋白呈非融合形式。内部核糖体进入位点序列的引入有效保证了包膜蛋白和融合蛋白的生物学作用，使得包装所获得的病毒的特异性结合吸附和感染能力显著，可直接转导未预先激活的T细胞，且病毒的滴度高。
根据本发明的实施例，所述第一病毒载体和第二病毒载体为同一载体，所述载体进一步包括：第三核酸分子，设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码第三连接肽，所述第三连接肽能够被切割。第三核酸分子的引入使得包膜蛋白和融合蛋白成非融合状态的表达，从而保证了包膜蛋白和融合蛋白的生物学作用，使得包装所获得的病毒的特异性结合吸附和感染能力显著，可直接转导未预先激活的T细胞，且病毒的滴度高。
根据本发明的实施例，所述第一病毒载体和第二病毒载体为pMD2.G、pCMV、pMD2.G突变体或pCMV的突变体。根据本发明实施例的第一病毒载体和第二病毒载体的种类不受特别限制，可以表达VSV-G的载体或可表达VSV-G或VSV-G突变体的载体的突变体均可使用。
根据本发明的实施例，进一步包括第三病毒载体和第四病毒载体，所述第三病毒载体携带目的基因，所述第四病毒载体携带病毒结构蛋白基因和病毒包装酶基因以及任选的调节因子rev基因。
根据本发明的实施例，所述结构蛋白基因、病毒包装酶基因和调节因子rev基因设置于同一第四病毒载体或不同第四病毒载体上。例如，慢病毒载体psPAX2表达产物有结构蛋白gag、包装酶pol(包括逆转录酶、蛋白酶和整合酶)、调节因子rev，其中rev可一定程度提高产物滴度，但对慢病毒包装是非必需的。可将rev(pRSV-rev)和gag-pol(pMDLg-pRRE)分成两个质粒进行表达；或将rev(pRSV-rev)，gag(pCMV-gag)、pol(pCMV-gag)分为三质粒进行表达。
根据本发明的实施例，所述病毒包装酶包括逆转录酶、蛋白酶和整合酶的至少之一。
根据本发明的实施例，所述第三病毒载体为转移载体。
根据本发明的实施例，所述转移载体包含慢病毒包装信号。
根据本发明的实施例，所述慢病毒包装信号包括：Ψ。
根据本发明的实施例，所述转移载体为pLV载体。
根据本发明的实施例，所述第四病毒载体为psPAX2。
根据本发明的实施例，所述病毒载体是非致病性病毒。
根据本发明的实施例，所述第三病毒载体进一步携带目的基因，所述目的基因为编码嵌合抗原受体的核酸分子。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种获得慢病毒的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将前面所述的病毒载体导入第一受体细胞；将导入病毒载体的第一受体细胞进行培养，以便获得所述病毒。根据本发明实施例的方法所获得的慢病毒滴度高，且具有靶向结合和感染免疫细胞的能力显著提高，可直接转导未预先激活或已被激活的T细胞。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述病毒为慢病毒，所述第一病毒载体和第二病毒载体不为同一载体，所述第三病毒载体、第四病毒载体、第一病毒载体和第二病毒载体的质量比为1：1：1：0.25～2：1：1：1。根据本发明实施例所述的病毒载体的比例，慢病毒滴度和慢病毒感染效率均较高。
根据本发明的实施例，所述第三病毒载体、第四病毒载体、第一病毒载体和第二病毒载体的质量比为2：1：1：0.5。
根据本发明的实施例，所述第三病毒载体、第四病毒载体、第一病毒载体和第二病毒载体的质量比为1：1：1：0.5。
根据本发明的实施例，所述第三病毒载体、第四病毒载体、第一病毒载体和第二病毒载体的质量比为1：1：1：1。
发明人发现，当所述第三病毒载体、第四病毒载体、第一病毒载体和第二病毒载体的质量比为2：1：1：0.5、1：1：1：0.5、1或1：1：1：1时，慢病毒滴度和慢病毒感染效率会达到一个最佳的平衡。
根据本发明的实施例，所述第一受体细胞为293T。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒是通过前面所述的方法包装获得的。根据本发明实施例的慢病毒滴度高，且具有靶向结合和感染免疫细胞的能力，可直接转导未预先激活或预先激活的T细胞。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒表达包膜蛋白以及融合蛋白，所述融合蛋白包括至少一个单链抗体和所述包膜蛋白的C端结构域，所述单链抗体能够结合CD28或CD3，所述包膜蛋白的C端结构域包括包膜蛋白的跨膜区和胞内区，所述至少一个单链抗体的C端与所述包膜蛋白的C端结构域的N端相连。根据本发明实施例的慢病毒滴度高，且具有靶向结合和感染免疫细胞的能力，可直接转导未预先激活或预先激活的T细胞。
根据本发明的实施例，所述包膜蛋白为水泡性口炎病毒的包膜G糖蛋白或包膜G糖蛋白的突变体。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒表达包膜蛋白以及融合蛋白，所述融合蛋白包括第一单链抗体、第二单链抗体和所述包膜蛋白的C端结构域，所述第一单链抗体能够结合CD28，所述第二单链抗体能够结合CD3，所述包膜蛋白的C端结构域包括包膜蛋白的跨膜区和胞内区，所述第一单链抗体的C端与所述第二单链抗体的N端相连，所述第二单链抗体的C端与所述包膜蛋白的C端结构域的N端相连；或，所述第二单链抗体的C端与所述第一单链抗体的N端相连，所述第一单链抗体的C端与所述包膜蛋白的C端结构域的N端相连。根据本发明实施例的慢病毒滴度高，且具有靶向结合和感染免疫细胞的能力，可直接转导未预先激活或预先激活的T细胞。
根据本发明的实施例，所述包膜蛋白为水泡性口炎病毒的包膜G糖蛋白或包膜G糖蛋白的突变体。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种将慢病毒导入未激活T淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例，利用前面述的慢病毒载体电转或转染所述未激活T淋巴细胞或利用前面所述的慢病毒感染所述未激活T淋巴细胞。如前所述，所述病毒载体导入受体细胞后，可包装出高病毒滴度的病毒，且该病毒表达的单链抗体在与CD28或CD3结合的介导下，实现了病毒对免疫细胞的特异性靶向结合，进而实现病毒对免疫T细胞的感染，并且，根据本发明实施例提出的方法本可以在体外、内直接将慢病毒导入未预先激活的T细胞中。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种表达目的基因的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将整合有目的基因的前面所述的病毒载体或慢病毒导入第二受体细胞；将导入病毒载体或慢病毒的第二受体细胞进行培养，以便表达目的基因。根据本发明实施例的方法，有效实现了目的基因在受体细胞的表达。例如在本发明的实施例中，mCherry作为一种可携带的目的基因，为了验证根据本发明实施例的靶向载体平台的可行性，发明人采用mcherry基因作为一种标签基因，以表达荧光蛋白，进而在受体细胞中表征病毒转导阳性率。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述导入第二受体细胞是通过电转、转染或感染的方式进行的。需要说明的是，所述“电转”或“转染”是将病毒载体导入受体细胞的方法，所述“感染”是指病毒主动结合和融合细胞膜进而进入细胞的过程。其中，“电转”是指通过电刺激的方式，将病毒包装用载体导入受体细胞的方法，所述“转染”是指通过化学介导物，如脂质体，将病毒包装用载体导入受体细胞的方法。
根据本发明的实施例，所述第二受体细胞为免疫细胞。
根据本发明的实施例，所述第二受体细胞为T细胞。所述目的基因在T细胞中进行表达能够实现直接或间接的治疗作用，根据本发明实施例的方法实现了免疫细胞的激活，从而加强机体的免疫反应。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种获得CAR-T细胞的方法。根据本发明的实施例，包括：将前面所述的整合有嵌合抗原受体编码核酸的病毒载体或慢病毒导入T淋巴细胞；将导入病毒载体或慢病毒的T淋巴细胞进行培养，以便表达嵌合抗原受体。如前所述，所述病毒载体导入第一受体细胞后，可包装出高病毒滴度的病毒，且该病毒可表达单链抗体，因此，直接将所述病毒载体导入T淋巴细胞，或将包装出的高病毒滴度的病毒导入T淋巴细胞进行培养，获得的单链抗体在与CD28或CD3结合的情况下，实现了病毒对T淋巴细胞的特异性靶向结合，进而实现对免疫T细胞的感染，并且根据本发明实施例提出的方法可以在体外、内直接利用未预先激活或预先激活的T淋巴细胞获得CAR-T细胞，所述CAR-T细胞可有效抑制肿瘤细胞的生长。
根据本发明的实施例，所述导入T淋巴细胞是通过电转、转染或感染的方式进行的。需要说明的是，所述“电转”或“转染”是将病毒载体导入受体细胞的方法，所述“感染”是指病毒主动结合和融合细胞膜进而进入细胞的过程。其中，“电转”是指通过电刺激的方式，将病毒包装用载体导入受体细胞的方法，所述“转染”是指通过化学介导物，如脂质体，将病毒包装用载体导入受体细胞的方法。
根据本发明的实施例，所述“pMD2.G突变体”或“pMD2.G-Mut”均是指包含K47Q\R354Q突变位点的表达慢病毒包膜蛋白的质粒(VSV-G-K47Q\R354Q)。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种CAR-T细胞。根据本发明的实施例，所述CAR-T细胞是根据本发明第八方面所述的方法制备获得的。根据本发明实施例所制备的CAR-T细胞具有成本低、细胞活性高、纯度高并且对于肿瘤表现出良好的杀伤活性。、
在本发明的第十方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的病毒载体，本发明第四方面所述的慢病毒，本发明第八方面所述的CAR-T细胞。由前所述，前述的CAR-T细胞具有细胞活性高、细胞杀伤能力强、免疫激活效果好等优点，将前述的CAR-T细胞递送至机体内，有利于所CAR-T细胞对于肿瘤细胞发挥杀伤作用。
在本发明的第十一方面，本发明提出了一种药物组合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于激活免疫或治疗或预防疾病。发明人发现，含有病毒载体、慢病毒、CAR-T细胞的药物，对于恶性肿瘤的治疗和预后均有较优的疗效。
根据本发明的实施例，所述疾病为肿瘤。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的分别靶向CD28和CD3、CD3抗原的包膜融合蛋白(anti-CD28/3-G、anti-CD3-G)的结构模式图，其中，anti-CD28scFv表示CD28单链抗体的可变区序列，Anti-CD3scFv表示CD3单链抗体的可变区序列，VSV-G C-terminal表示慢病毒包膜蛋白的C端结构域；
图2是根据本发明实施例的pMD2.G突变体(pMD2.G-Mut)的图谱；
图3是根据本发明实施例的不同载体包装获得的靶向CD28和CD3的慢病毒的滴度结果图，其中，横坐标表示慢病毒的类别，每种慢病毒包含载体种类及比例如表1所示，纵坐标表示慢病毒感染HEK-293T细胞所测得的慢病毒滴度；
图4是根据本发明实施例的不同载体包装获得的靶向CD28和CD3的慢病毒感染HEK-293T细胞阳性率的检测结果图，其中，横坐标表示慢病毒的类别，每种慢病毒包含载体种类及比例如表1所示，纵坐标表示慢病毒感染HEK-293T细胞的mCherry阳性率；
图5是根据本发明实施例的不同慢病毒转染T细胞和Nalm-6细胞阳性率检测结果分析图，其中，横坐标表示慢病毒的类别，每种慢病毒包含载体种类以及比例如表1所示，纵坐标表示慢病毒感染HEK-293T细胞的mCherry阳性率；
图6是根据本发明实施例的包装获得的不同慢病毒的滴度结果分析图及感染293T、T细胞和Nalm-6细胞的能力分析图，其中，
图6-A表示不同慢病毒的滴度结果分析图，横坐标表示慢病毒的类别，每种慢病毒包含载体种类及比例如表2所示，纵坐标表示慢病毒感染HEK-293T细胞的滴度，
图6-B表示不同慢病毒转导HEK-293T细胞阳性率的检测结果图，横坐标表示慢病毒的类别，每种慢病毒包含载体种类及比例如表2所示，纵坐标表示慢病毒感染HEK-293T细胞的mCherry阳性率，
图6-C表示不同慢病毒感染T细胞和Nalm-6细胞混合体系后，T细胞和Nalm-6细胞的mCherry阳性率的检测结果图，横坐标表示慢病毒的类别，每种慢病毒包含载体种类及比例如表2所示，纵坐标表示慢病毒感染T细胞和Nalm-6细胞的mCherry阳性率；
图7是根据本发明实施例的不同慢病毒感染T细胞和Nalm-6或K562细胞混合体系后，T细胞、K562细胞和Nalm-6细胞的CAR阳性率的检测结果图，横坐标表示慢病毒的类别，每种慢病毒包含载体种类及比例如表3所示，纵坐标表示慢病毒感染T细胞、K562细胞和Nalm-6细胞的CAR阳性率，其中：
7-A和7-B分别表示不同慢病毒感染T细胞和Nalm-6细胞混合体系后，Nalm-6细胞和T细胞的CAR阳性率，
7-C表示不同慢病毒感染T细胞和K562细胞混合体系后，K562细胞的CAR阳性率；
图8是根据本发明实施例的不同慢病毒感染T细胞和Nalm-6或K562细胞混合体系后，T细胞、K562细胞和Nalm-6细胞的活细胞总数的检测结果图，横坐标表示慢病毒感染T细胞和Nalm-6或K562细胞混合体系的天数，每种慢病毒包含载体种类及比例如表3所示，纵坐标表示活细胞总数，其中：
图8-A表示不同慢病毒感染T细胞和Nalm-6细胞混合体系后，T细胞和Nalm-6细胞的活细胞总数，
图8-B表示不同慢病毒感染T细胞和K562细胞混合体系后，T细胞和K562细胞的活细胞总数；
图9是根据本发明实施例的小鼠接种T细胞和Nalm-6细胞验证实验的操作流程；
图10是根据本发明实施例的接种T细胞和Nalm-6后小鼠外周血白细胞流式检测结果图；
图11是根据本发明实施例的不同慢病毒转染T细胞阳性率检测结果分析图；
图12是根据本发明实施例的慢病毒载体制备CAR-T滴度结果图；
图13是根据本发明实施例的LV-CAR-2和LV-S2-CAR载体转导非激活T细胞效率比较结果图；
图14是根据本发明实施例的LV-CAR-2和LV-S2-CAR载体转导激活T细胞效率比较结果图；
图15是根据本发明实施例的体外CAR-T杀伤能力比较结果图；
图16是基于不同慢病毒载体的工艺制备CAR-T产品的体内药效比较；
图17是含有不同长度的VSV-G C端结构域的靶向CD3的融合蛋白所包装的慢病毒载体对CD3+Jurkat细胞的转导效率比较；
图18是scFv位于完整的VSV-G的N端的融合蛋白包装的慢病毒载体(LV-2)，以及VSV-G和含有scFv在VSV-G C端结构域的融合蛋白包装的慢病毒载体(LV-S2)的滴度比较。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。
根据本发明的具体实施例，本发明提供了一组新型具有靶向转染力的慢病毒载体，该组载体，一个携带包膜蛋白VSV-G或VSV-G突变体的编码区，以及一个携带由单链抗体scFv和VSV-G的C端结构域通过连接肽相连得到的融合蛋白的编码区。
根据本发明实施例的慢病毒载体具有如下特点：VSV-G突变体为减弱VSV-G吸附靶细胞能力的突变体，但是保留了细胞膜融合能力；scFv可为一个或多个串联；VSV-G的C端结构域中至少包括VSV-G的胞内区和跨膜区；一个病毒载体上可含有一种或多种融合蛋白。
此研究的优势：scFv与VSV-G的C端结构域形成的融合蛋白，具有与VSV-G相同的跨膜区和胞内区，使得该融合蛋白仍维持同基质蛋白的相互作用，使高效的组装到慢病毒颗粒包膜上，并且不干扰病毒颗粒的出芽，从而不对病毒滴度造成显著影响。慢病毒颗粒包膜上仍含有完整的VSV-G或其突变体，可以维持病毒颗粒的稳定性。通过scFv同相应抗原的结合，使得慢病毒颗粒主动靶向感染表达相应抗原的靶细胞，并且在相同感染复数条件下提高对靶细胞的感染效率。scFv功能背景清晰、安全性有保障，而且任何抗原都可筛选到与之特异性结合的scFv，使得此类慢病毒载体所包装的病毒可普遍适用于各类细胞的靶向感染。VSV-G替换为吸附靶细胞能力减弱的突变体，使得scFv同相应抗原之间的特异性结合力在病毒颗粒吸附过程中占据主导地位，进一步提高重组慢病毒的靶向性。本发明构建的慢病毒载体可直接转导未激活的血液细胞，简化生产工艺和降低成本，并且避免细胞激活带来的药效损耗；如直接转导T细胞而制备的CAR-T产品，低效靶比条件下体外杀伤能力最强。
根据本发明的具体实施例，本发明还提供了一类具有靶向转染基因能力的新型慢病毒载体的构建和使用方法，包括以下步骤(以靶向转染CD3+细胞的慢病毒载体为例)：
1.设计靶向CD3的单链抗体和VSV-G C端结构域形成的融合蛋白(CD3scFv-VSV-G-CT(简称antiCD3-G))，结构模式如图1所示。其中，VSV-G信号肽位于融合蛋白前体蛋白的N端。原VSV-G信号肽位于VSV-G前体蛋白的氨基末端，是VSV-G蛋白的膜定位端肽，在帮助VSV-G蛋白定位到内质网上，蛋白成熟后就水解脱离，因此，病毒颗粒上的VSV-G蛋白和融合蛋白都不含有该信号肽。
信号肽具有如下所示的氨基酸序列：
MKCLLYLAFLFIGVNC(SEQ ID NO:27)。
编码信号肽的基因具有如下所示的核苷酸序列：
ATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGGGGTGAATTGC(SEQ ID NO:26)。
anti-CD3scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:5)。
第二连接肽(Linker)的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
AAATTT(SEQ ID NO:12)。
VSV-G C-Terminal(VSV-G-CT)包含VSV-G蛋白的第405-495位(共91个)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
FEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCI KLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:13)。
2.构建CG融合膜蛋白表达质粒
以VSV-G信号肽-scFv-Linker-(VSV-G-CT)模式设计DNA序列委托基因合成公司(通用生物系统(安徽)有限公司)，并以pMD2.G质粒(VSV-G蛋白表达质粒)为载体构建融合蛋白表达质粒pMD2.antiCD28/3-G，其中，所述scFv包括CD28和/或CD3。
3.构建VSV-G弱吸附力突变体(参考文献Structural basis for therecognition of LDL-receptor family members by VSV glycoprotein.NatureCommunications.2018)
设计K47Q和R354Q双点突变体的DNA序列委托基因合成公司，以VSV-G表达质粒pMD2.G为载体，构建VSV-G-K47Q\R354Q表达质粒pMD2.G-Mut，研究发现，K47Q和R354Q突变只会降低VSV-G的膜吸附能力，不会影响VSV-G的膜融合能力。
4.慢病毒包装、收获
①将慢病毒载体包装质粒共转染293T细胞。
②转染48-72h后收集含病毒的培养上清；用0.45μm滤器过滤，直接PEG浓缩或经纯化后浓缩后分装，冻存于超低温冰箱内。
5.慢病毒载体靶向转染能力检测和分析
①转导目的基因为mCherry：将LVm-CD3ta-mCherry与其相应的对照慢病毒载体一起，经滴度测定、转导293T细胞、转导肿瘤细胞和T细胞后，评估其是否具有靶向转导T细胞的能力。
②转导目的基因为anti-hCD19-CAR:经上一步骤后，选择LVm-CD3ta载体装载anti-CD19-CAR目的基因，获得慢病毒载体LVm-CD3ta-CAR。和对照载体一起，滴度测定后，以MOI＝1转导混合的T细胞和肿瘤细胞(模拟体内T细胞和肿瘤细胞共存的状态)，转导后4、7、11天时分别检测各组细胞浓度、T细胞和肿瘤细胞的比例、CAR阳性率，分别绘制各细胞CAR阳性率变化折线图和各细胞生长曲线图。最终，评估LVm-CD3ta-CAR靶向转导T细胞生成CAR-T的能力和生成的CAR-T杀灭肿瘤细胞的能力。
6.在小鼠体内评估慢病毒载体LVm-CD3ta-CAR靶向转导T细胞生成CAR-T的能力和生成的CAR-T杀灭肿瘤细胞的能力
将肿瘤细胞和人T细胞混合后经尾静脉注射入小鼠体内，次日分别将慢病毒载体经尾静脉注射入小鼠体内。5周后，检测小鼠外周血内肿瘤细胞、T细胞含量及各细胞CAR阳性率。
下面将更详细地描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，以下实施中所述的“质粒”与“载体”具有相同的意义，可互换使用。
实施例1：慢病毒载体包装及产量评价
1.1包装一系列通过CD28和CD3靶向T细胞转导目的基因mCherry的慢病毒
1.1.1慢病毒包装信息
按表1中所示质粒及质量比(维持每组间pLV-mCherry和psPAX2质粒质量一致)共转染293T细胞，包装慢病毒。其中，pMD2.antiCD28/3-G质粒表达靶向CD3和CD28的融合蛋白(antiCD28/3-G)，pMD2.G-Mut质粒表达VSV-G吸附能力减弱突变体。
编码antiCD28/3-G的基因具有如下所示的核苷酸序列：
(SEQ ID NO:24)。
编码antiCD28/3-G的基因编码具有如下所示的氨基酸序列的融合蛋白：
(SEQ ID NO:16)。
表1：慢病毒包装
其中，pLV-mCherry为携带mCherry序列的转移质粒，携带目的基因为mCherry序列，psPAX2为表达慢病毒结构蛋白gag、非结构蛋白pol和rev的质粒，pMD2.G为表达慢病毒膜蛋白(VSV-G)的质粒，pMD2.G-Mut为表达慢病毒膜蛋白突变体(VSV-G-K47Q\R354Q)的质粒，pMD2.antiCD28/3-G为表达包含靶向CD28和CD3的scFv与VSV-G蛋白C端结构域的融合蛋白(antiCD28/3-G)的质粒，其中，VSV-G蛋白C端结构域具有SEQ ID NO:13所示氨基酸序列，其中，本实施例所用pMD2.G突变体的图谱如图2所示。
1.1.2慢病毒载体产量评价
1)慢病毒包装、收获、滴度测定及T细胞转染
按照表1获得的慢病毒载体分别经PEG浓缩后，分装冻存于超低温冰箱(<-75℃)内，用293T细胞进行滴度测定。
按表1设置的实验组，分别以MOI＝0.05对293T细胞进行转导，作为阳性对照；以病毒溶媒作为阴性对照，分别以MOI＝3、30、300分别对Nalm-6(CD28-CD3-)和T细胞(CD28+CD3+)进行转导，转导72h后，采用流式细胞术检测被转导细胞中mCherry+细胞百分比。
2)结果及分析
根据图3显示的结果，上述4种慢病毒滴度均无显著差异。图4的结果显示，在MOI＝0.05时，4种载体在293T细胞的转导阳性率相当，说明4种载体均具备转导细胞的能力。图5结果显示，在Nalm-6和T细胞中，LV和LV-CD28CD3ta均有较高的转导阳性率，无转导靶向性，但后者对T细胞的转导能力比前者更高。LVm无法转导Nalm-6细胞，仅能够少量转导T细胞，LVm-CD28CD3ta无法转导Nalm-6细胞，但可以转导T细胞，且转导能力和LV相当，说明LVm-CD28CD3ta可靶向转导T细胞。
实施例2：靶向CD3+T细胞的慢病毒载体靶向性评价
2.1包装一系列通过CD3靶向T细胞转导目的基因mCherry的慢病毒
按下表2中的质粒及比例，共转染HEK 293T细胞，包装慢病毒。
表2：慢病毒包装
慢病毒 慢病毒载体名称及比例
LV pLV-mCherry：psPAX2：pMD2.G＝2:1:1
LVm-CD3ta pLV-mCherry：psPAX2：pMD2.G-Mut：pMD2.antiCD3-G＝2:1:1:0.5
其中，pLV-mCherry为携带mCherry序列的转移质粒，携带目的基因为mCherry序列，psPAX2为表达慢病毒结构蛋白gag、非结构蛋白pol和rev的质粒，pMD2.G为表达慢病毒膜蛋白(VSV-G)的质粒，pMD2.G-Mut为表达慢病毒膜蛋白突变体(VSV-G-K47Q\R354Q)的质粒，pMD2.antiCD3-G为表达包含靶向CD3的scFv与VSV-G蛋白C端结构域的融合蛋白的质粒(antiCD3-G)，其中，VSV-G蛋白C端结构域具有SEQ ID NO:13所示氨基酸序列，其中，本实施例所用pMD2.G突变体的图谱如图2所示。
编码antiCD3-G的基因具有如下所示的核苷酸序列：
(SEQ ID NO:23)。
编码antiCD3-G的基因具有如下所示的氨基酸序列：
(SEQ ID NO:15)。
2.2靶向CD3+T细胞的慢病毒载体靶向性评价
1)慢病毒包装、收获、滴度测定及靶细胞转染
按表2设置实验组，分别共转染293T 48-72h后收集各组病毒液，分装冻存于超低温冰箱(<-75℃)内。用293T细胞进行滴度测定。
将上述2种慢病毒载体分别以MOI＝0.1对293T细胞进行转导，作为阳性对照组；以病毒溶媒作为阴性对照，分别以MOI＝2、10、50分别对Nalm-6(CD3-)和T细胞(CD3+)进行转导3-4天后，流式细胞术检测被感染细胞中mCherry+细胞百分比。
2)结果及分析
具体实验结果如图6所示，根据6-A的显示，上述2种慢病毒滴度无显著差异。图6-B显示，在MOI＝0.1时，上述2种载体在293T细胞的转导阳性率相当，说明2种载体均具备转导细胞的能力。图6-C显示，LV对Nalm-6和T细胞均可转导，但LVm-CD3ta仅无法转导Nalm-6细胞，可以转导T细胞且转导能力和LV相当，说明LVm-CD3ta可靶向转导T细胞。
实施例3：靶向CD3+T细胞的慢病毒载体转导能力及肿瘤杀伤效果检测
3.1包装一系列通过CD3靶向T细胞转导目的基因anti-hCD19 scFv-CTM4O(CAR)的慢病毒
按下表3中的质粒及比例，共转染HEK 293T细胞，包装慢病毒。
表3：慢病毒包装
其中，pLV-CAR为携带CAR序列的转移质粒，携带目的基因为anti-hCD19 scFv-CTM4O(CAR)，pMDLg-pRRE为表达慢病毒结构蛋白gag、非结构蛋白pol的质粒；pRSV-rev为表达调控蛋白rev的质粒，pMD2.G为表达慢病毒包膜蛋白(VSV-G)的质粒，pMD2.G-Mut为表达慢病毒膜蛋白突变体(VSV-G-K47Q\R354Q)的质粒，pMD2.antiCD3-G为表达包含靶向CD3的scFv与VSV-G蛋白C端结构域的融合蛋白的质粒(antiCD3-G，核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示)，其中，VSV-G蛋白C端结构域具有SEQ ID NO:13所示氨基酸序列，其中，本实施例所用pMD2.G突变体的图谱如图1所示。
编码anti-hCD19 scFv-CTM4O(CAR)的基因具有如下所示的核苷酸序列(加粗部分为编码Anti-hCD19 scFv的核苷酸序列)：
anti-hCD19 scFv-CTM4O(CAR)具有如下所示的氨基酸序列(加粗部分为Anti-hCD19 scFv的序列)：
3.2慢病毒载体转导
T细胞分别和肿瘤细胞Nalm-6或K562共培养状态(细胞数，T细胞：肿瘤细胞＝1：2)下，用慢病毒载体(MOI＝1)进行转导，等体积溶媒作为阴性对照，转导后4天、7天、11天时分别检测各组细胞数用以绘制生长曲线，检测各细胞CAR阳性率以评估载体靶向T细胞转导功能。肿瘤细胞Nalm-6为CD19+细胞，可被anti-CD19 CAR-T有效杀伤并刺激CAR-T特异性增殖；K562为CD19-对照细胞，不能被anti-CD19 CAR-T杀伤，也不能刺激CAR-T特异性增殖。用以绘制细胞生长曲线的细胞数按如下方式计算：
细胞数＝细胞密度×体积×流式对应的细胞比例。
3.3结果分析
各细胞的阳性率统计结果如图7所示，LV-CAR对T细胞和肿瘤细胞Nalm-6、K562均有较强转导能力，无转导靶向性；LVm-CD3ta仅对T细胞进行靶向性转导，day11(第11天)的CAR-T阳性率约为10％。day7以前CAR-T还在对肿瘤细胞进行杀伤，CAR-T细胞虽会特异性增殖，但自身也会大量死亡，故而day4和day7未检测到CAR阳性信号；在day7以后肿瘤细胞被杀伤殆尽，CAR-T细胞仍在特异性增殖，故而day11阳性率上升至10％左右。
各细胞的生长曲线如图8所示。在T细胞和K562共孵育条件下(如图8-B所示)，慢病毒载体转导不会影响K562和T细胞的生长速率。在T细胞和Nalm-6共孵育条件下(如图8-A所示)，LVm-CD3ta-CAR转导组Nalm-6day4以前生长速率最慢，day4以后Nalm-6细胞数开始急剧下降，最早体现出最强的肿瘤杀伤效果；LV转导组在day7以前Nalm-6细胞数仍在增加，但生长速率高于LVm-CD3ta组、低于NC组，说明肿瘤细胞的生长被抑制，但效果不如LVm-CD3ta；LV转导组在day7以后Nalm-6细胞数开始急剧下降至0，但此时NC组的Nalm-6细胞数也开始急剧下降，说明此期间内的肿瘤细胞数下降大部分是非CAR-T依赖的肿瘤杀伤作用导致的。
综上所述，在T细胞和肿瘤细胞共孵育条件下，一定程度上模拟了动物体内T细胞和肿瘤细胞共存的条件，LVm-CD3ta可以实现对T细胞的靶向性转导，并生成CAR-T对肿瘤细胞进行高效、特异性的杀伤。
实施例4：LVm-CD3ta-CAR在血液瘤模型小鼠中进行肿瘤杀伤功能验证
4.1慢病毒载体LVm-CD3ta-CAR在NCG小鼠Nalm-6血液瘤模型中功能验证
基于实施例3获得的慢病毒载体LVm-CD3ta-CAR对其进行功能验证，具体的实验操作如下：
1)NCG小鼠检疫合格后，安排接种计划，具体实验流程如图9所示，T细胞和肿瘤细胞接种饲喂具体实施方式如下：
将培养的Nalm-6细胞进行细胞计数和活力检测，当活力在95％以上时可用于接种；离心去除培养基，加PBS调整细胞密度为2.0E+06cells/mL。将液氮冻存的T细胞复苏后，进行细胞计数和活力检测，当活力在80％以上时可用于接种；用PBS调整细胞密度为1.0E+07cells/mL；将调整好细胞密度的Nalm-6和T细胞悬液按体积1:1混合均匀，按200μL/只进行小鼠尾静脉接种，接种时间记为day-1。
2)慢病毒载体给药：
将前一天接种细胞后的小鼠随机分为3组，将LV-CAR和LVm-CD3ta-CAR分别用慢病毒载体溶媒稀释至6.0E+07TU/mL；尾静脉给药，NC组按200μL/只接种溶媒，LV-CAR组按200μL/只接种LV-CAR稀释液，LVm-CD3ta-CAR组按200μL/只接种LVm-CD3ta-CAR稀释液；接种时间记为day0。
3)小鼠血液内肿瘤细胞和CAR-T细胞检测
Day35对各组小鼠进行眼眶采血，获得裂红素裂解红细胞→细胞死活染料\抗体孵育→流式细胞术检测各细胞比例。
4.2结果分析
具体的实验结果如图10所示，Q1门内为hCD19+hCD3-细胞，是Nalm-6肿瘤细胞；Q2门内为非关注细胞；Q3门内为hCD19-hCD3+细胞，是接种的人T细胞；Q4门内为hCD19-hCD3-细胞，是小鼠血液内其它白细胞。
在NC组中，看到小鼠外周血白细胞中74.7％为Nalm-6细胞、3.3％为T细胞，说明Nalm-6生长迅速，有较好的成瘤性。
在LV-CAR组中，小鼠外周血白细胞中71.1％为Nalm-6细胞、2.38％为T细胞，和NC组无明显差异，而且所有细胞群内都检测到了CAR阳性细胞，说明LV-CAR在小鼠内转导细胞无靶向性，且生成的CAR-T细胞对肿瘤细胞无法进行有效的杀伤。
在LVm-CD3ta-CAR组中，小鼠外周血白细胞中未检测到Nalm-6细胞、16.9％为T细胞，仅在T细胞中检测到了CAR阳性细胞，说明LVm-CD3ta-CAR在小鼠内可对T细胞进行靶向性转导，且生成的CAR-T细胞对Nalm-6肿瘤细胞可进行高效的杀伤，并且在此过程中刺激CAR-T细胞的特异性增殖。
综上所述，在Nalm-6血液瘤NCG小鼠模型中，LVm-CD3ta-CAR静脉给药，可在小鼠体内实现对T细胞的靶向转导并生成有正常功能的CAR-T细胞，体现出抗肿瘤疗效。
实施例5：构建一系列装载mCherry的慢病毒载体转导T细胞
5.1慢病毒包装信息
本发明使用表4中所示质粒及质量比共转染293T细胞，包装慢病毒。
表4慢病毒载体包装质粒及比例
慢病毒载体 质粒名称及比例
LV-mCherry pLV-mCherry：pMDLg-pRRE：pRSV-rev：pMD2.G＝1:1:1:1
LV-S2-mCherry pLV-mCherry：pMDLg-pRRE：pRSV-rev：pMD2.G：pMD2.S2＝1:1:1:1:0.5
LV-S12-mCherry pLV-mCherry：pMDLg-pRRE：pRSV-rev：pMD2.G：pMD2.S12＝1:1:1:1:0.5
LV-S3-mCherry pLV-mCherry：pMDLg-pRRE：pRSV-rev：pMD2.G：pMD2.S3＝1:1:1:1:0.5
LV-S4-mCherry pLV-mCherry：pMDLg-pRRE：pRSV-rev：pMD2.G：pMD2.S4＝1:1:1:1:0.5
LV-S34-mCherry pLV-mCherry：pMDLg-pRRE：pRSV-rev：pMD2.G：pMD2.S34＝1:1:1:1:0.5
其中，pLV-mCherry为携带mCherry序列的转移质粒；pMDLg-pRRE为表达慢病毒结构蛋白gag、非结构蛋白pol的包装质粒；pRSV-rev为表达调控蛋白rev的调控质粒；pMD2.G为表达包膜蛋白VSV-G的包膜质粒；pMD2.S2/pMD2.S12/pMD2.S3/pMD2.S4/pMD2.S34为表达包含靶向CD3、CD28或CD3和CD28的scFv与VSV-G蛋白C端结构域的融合蛋白S2/S12/S3/S4/S34的质粒，其中，VSV-G蛋白C端结构域具有SEQ ID NO:13所示氨基酸序列，所述融合蛋白S2含有如SEQ ID NO:15所示氨基酸序列，所述融合蛋白S12含有如啊所示的氨基酸序列，所述融合蛋白S3含有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述融合蛋白S4含有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述融合蛋白S34含有如SEQ ID NO:20所示氨基酸序列。
5.2慢病毒载体收获和保存
转染后48-72h，收集含病毒的培养上清，用0.45μm滤器过滤，经PEG浓缩后，分装冻存于超低温冰箱(<-75℃)内。
5.3慢病毒载体转染T细胞评价
以上慢病毒载体分别对T细胞进行转导，转导后7天，通过流式细胞术检测各组细胞mCherry表达阳性率，即转导阳性率。
5.4结果及分析
结果见图11，其中NC为转导时使用不含慢病毒载体的溶媒的阴性对照组。
图11的结果表明，含特异性结合T细胞表面抗原(CD3\CD28)scFv的一系列融合蛋白作为膜蛋白包装到慢病毒载体表面，可提高装载mCherry基因的慢病毒载体对T细胞的转导效率。其中，LV-S2-mCherry、LV-S12-mCherry、LV-S3-mCherry、LV-S4-mCherry和LV-S34-mCherry转导阳性率提高幅度较大，为LV-mCherry的3倍以上。
实施例6：构建装载anti-CD19-CAR(简称CAR)的慢病毒载体用于转导T细胞
6.1根据实施例5结果，包装转导阳性率提高幅度最大的慢病毒载体，用以装载CAR基因，比较转导效率。按下表5中的质粒及比例，共转染293T细胞，包装慢病毒载体。
表5慢病毒载体包装质粒及比例
其中，pLV-CAR2为携带CAR序列的转移质粒，携带目的基因anti-hCD19 scFv-CAR；
编码anti-hCD19 scFv-CAR2的基因具有如SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列：
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGAATTCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCTGTTGGCTTACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCTAGACTCACAGATGTGACCCTAAAGCGCGGCCGCAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGCCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGTAGCTGCCGCTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGCGTGAAATTTAGCCGCAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGCCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGCCGGGGCCGCGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAAGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGCCGCCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGC(SEQ ID NO:30)。
anti-hCD19 scFv-CAR2具有如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSEFTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCCWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:31)。
6.2慢病毒载体收获、纯化、保存
转染后48-72h，收集含病毒的培养上清，用0.45μm滤器过滤，留取部分样品进行作为原液样品进行滴度测定；其余样品经纯化浓缩后，分装冻存于超低温冰箱(<-75℃)内。
6.3慢病毒载体滴度测定
a.将293T细胞按合适密度接种至24孔板内，培养过夜，以使细胞贴壁；
b.取出样品，通过2倍梯度稀释法，将病毒样品进行稀释，稀释病毒液中添加8μg/mL的polybrene；
c.取出弃293T培养平板内培养基，任选两孔胰酶消化后细胞计数，计算每孔平均细胞数(A)；其余孔弃原培养基，加入0.4mL病毒稀释液，室温，1000×g，离心40分钟后，37℃、5％CO2静置培养16h后，更换为新鲜含8％FBS的DMEM；
d.培养72h后，流式细胞术检测各孔细胞CAR表达阳性率(B)；
e.滴度计算：选取CAR表达阳性率在2％-20％的孔的数值进行计算：滴度(PFU/mL)＝BxA/(0.4/对应稀释倍数)。
6.4慢病毒载体转染T细胞评价
以上慢病毒载体分别以MOI＝2对非激活T细胞或激活T细胞进行转导，转导后2、4、7天，通过流式细胞术检测各组细胞CAR表达阳性率，即转导阳性率。
6.5不同慢病毒载体制备CAR-T杀伤能力比较
a.按表6所示进行细胞铺板，37℃、5％CO2静置培养；
表6Nalm6细胞铺板示意表格
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备注：表6中K562肿瘤细胞铺板同上；靶：靶细胞；E，即effector cells，CAR-T细胞；T，target cells，Nalm6或K562细胞；“靶+lysis”和“靶+NC”只铺靶细胞；T(NegCtrl)：未做转导的T细胞。
b.共孵育18～20小时后，[靶+lysis]组每孔加入20μl lysis buffer，充分混匀，37℃细胞培养箱中裂解30分钟；
c.将所有细胞轻轻地转移到新的圆底96孔板中，室温400×g离心5分钟。每孔取100μL上清于平底96孔板中，用于LDH细胞杀伤检测，Cytotoxicity LDH assay kit(DOJINDO MOLECULAR，CK12)；
d.每孔样品中加入100μL working solution，混匀，37℃孵育，30-60分钟；每孔加入50μL stop solution，混匀，测定490nm处吸光值；
e.数据处理：
阳性对照(PS)＝(靶+lysis)-(靶+NC)
实验组杀伤(EFF)＝(E/T＝n)-(onlyT,E/T＝n)
Cytotoxicity＝100％*(EFF)/(PS)
6.6结果及分析
1)CAR-T滴度检测
原液滴度比较结果如图12所示，根据图12的结果可知，LV-CAR2和LV-S2-CAR2载体的生产滴度无显著差异。
2)CAR转导非激活T细胞效率检测
分别将LV-CAR2和LV-S2-CAR2载体以MOI＝2对非激活的T细胞进行转导，其中NC为转导时加不含慢病毒载体的溶媒的阴性对照组(Negative Control)。转导后2天(day 2)、4天(day 4)、7天(day 7)，通过流式细胞术，分别检测各细胞的CAR表达阳性率。各细胞的CAR表达阳性率比较结果如图13所示；
图13显示LV-CAR2和LV-S2-CAR2载体转导非激活的T细胞效率比较：LV-CAR2转导之初有大量的CAR阳性细胞，但大部分为低CAR信号细胞，并且随着培养时间延长CAR阳性细胞比例大幅降低(day2:58.5％，day4:38.7％，day7:9.73％)，说明这部分低CAR信号的细胞并不是基因稳定整合至宿主细胞中表达而形成的，选用day7的阳性率数据用于评估LV-CAR2对非激活T细胞的转导效率更为准确。LV-S2-CAR2转导后CAR阳性细胞比率逐渐升高，在day4以后趋于稳定(day2:8.33％，day4:42.8％，day7:41.6％)，可能原因是非激活T细胞中逆转录和整合反应较慢，并且蛋白表达不旺盛，在day2时CAR的表达量还不足以被有效检测到。day7时的CAR阳性细胞率，LV-S2-CAR2是LV-CAR2的4.28倍。
以上结果说明，传统的慢病毒载体LV将CAR基因转导至非激活T细胞中的效率极低，而本方案构建的LV-S2慢病毒载体可以高效的转导非激活的T细胞，并形成CAR稳定表达的CAR-T细胞。
3)CAR转导激活T细胞效率检测
分别将LV-CAR2和LV-S2-CAR2载体以MOI＝2对预先用CD3/CD28磁珠激活3天的T细胞进行转导，其中NC为转导时加不含慢病毒载体的溶媒的阴性对照组(NegativeControl)。转导后2天(day 2)、4天(day 4)、7天(day 7)，通过流式细胞术，分别检测各细胞的CAR表达阳性率。各细胞的CAR表达阳性率比较结果如图14所示：
图14显示LV-CAR2和LV-S2-CAR2载体转导激活的T细胞效率比较：二者均能转导激活的T细胞，并形成CAR稳定表达的CAR-T细胞，但本发明构建的LV-S2慢病毒载体转导效率约为传统慢病毒载体LV的两倍。
4)体外CAR-T杀伤能力检测
LDH法检测CAR-T(day4)细胞杀伤能力。其中效应细胞(effector cells)细胞数以各CAR-T细胞中CAR阳性细胞数进行计算，靶细胞为Nalm6细胞(CD19阳性)，靶细胞的阴性对照细胞为K562(CD19阴性)。T细胞组为CAR-T细胞阴性对照组。结果如图15所示：
根据图15的结果，体外CAR-T杀伤能力比较：在相同效靶比的条件下，LV-S2-CAR2载体制备的CAR-T细胞杀伤能力均高于LV-CAR2载体制备的CAR-T细胞，说明LV-S2载体除了在提高转导阳性率的同时，还有其他未知的作用可促进其制备的CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力。在低效靶比(0.1)条件下，LV-S2-CAR2转导非激活的T细胞制备的CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力最强，而在临床给药时，CAR-T和肿瘤细胞也是处于一个低效靶比的条件，暗示着LV-S2-CAR2转导非激活的T细胞制备的CAR-T很可能在临床试验中展现出比现有技术(LV载体转导激活T细胞制备的CAR-T)更好的药效。
实施例7：基于不同慢病毒载体的工艺制备的CAR-T产品在小鼠体内的药效比较
a.传统工艺CAR-T样品制备：将冻存的T细胞复苏后，用包被有CD3/CD28抗体的磁珠激活T细胞，3天后，去除磁珠；添加Lentiboost助转导试剂，用LV-CAR2慢病毒载体转导激活的T细胞，转导后2～7天冻存CAR-T细胞，并检测阳CAR阳性细胞比例。
b.新工艺1(LV-S2-CAR2)CAR-T样品制备：将冻存的T细胞复苏后培养2天后，添加Lentiboost助转导试剂，用LV-S2-CAR2慢病毒载体转导未激活的T细胞，约24小时后冻存CAR-T细胞。
c.新工艺2(LV-S2-CAR2)CAR-T样品制备：将冻存的T细胞复苏后培养2天后，添加Ploybrene助转导试剂，用LV-S2-CAR2慢病毒载体转导未激活的T细胞，约24小时后冻存CAR-T细胞。
d.将新工艺1和新工艺2制备的冻存CAR-T细胞复苏后，培养3-7天，分别检测CAR阳性细胞比例。
e.用1E+06Nalm6-luciferase cells/mouse，静脉注射，NCG雌鼠进行造模，5-7天后进行活体呈像检测肿瘤负荷，并根据肿瘤负荷进行分组，分组当天给药。
f.将a、b和c制备的样品复苏，PBS重悬细胞，用未转导的T细胞将各样品的CAR-T阳性细胞比例稀释至一致；G1：Vehicle为PBS；G2：T cells为未转导的T细胞；G3：传统工艺(LV-CAR2)为步骤a制备样品；G4：新工艺1(LV-S2-CAR2)为步骤b制备样品；G5：新工艺2(LV-S2-CAR2)为步骤c制备样品；G5：blank为未接种肿瘤细胞的空白对照小鼠；其中G2～G5组的T细胞总量一致，G3～G5的CAR阳性细胞总数一致，均为1E+06cells/mouse。
g.给药后5、8、12、15天分别进行活体呈像，检测各组小鼠肿瘤负荷，绘制肿瘤负荷曲线，结果如图16所示。
根据图16的结果，基于不同慢病毒载体的工艺制备的CAR-T产品在小鼠体内的药效比较：在相同实验条件下，基于靶向慢病毒载体LV-S2-CAR2载体的两种新工艺制备CAR-T样品比现有技术的传统慢病毒工艺制备CAR-T样品在小鼠体内的药效有非常显著的提升，说明LV-S2-CAR2此类靶向慢病毒载体在制备CAR-T产品工艺中具备令人意外的优越性。
实施例8：含有不同长度的VSV-G CT结构域的靶向CD3的融合蛋白包装的慢病毒载体功能比较
a.包装一系列通过CD3靶向T细胞转导目的基因mCherry的慢病毒
按下表7中的质粒及比例，共转染HEK 293T细胞，包装慢病毒。
表7：慢病毒包装
表7中，pLV-mCherry为携带mCherry序列的转移质粒；psPAX2为表达慢病毒结构蛋白gag、非结构蛋白pol的包装质粒、调控蛋白rev的包装质粒；pMD2.G-Mut为表达包膜蛋白VSV-G突变体(VSV-G-K47Q\R354Q)的包膜质粒；pMD2.antiCD3-G-1～11为表达包含靶向CD3的scFv与不同长度VSV-G蛋白C端结构域的融合蛋白antiCD3-G-1～11的质粒；其中，anti-CD3 scFv具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述融合蛋白antiCD3-G-1～11依次含有的VSV-G蛋白C端结构域为VSV-G的455-495位氨基酸，445-495位氨基酸，435-495位氨基酸，425-495位氨基酸，415-495位氨基酸，405-495位氨基酸，395-495位氨基酸，385-495位氨基酸，375-495位氨基酸，365-495位氨基酸，355-495位氨基酸序列。
VSV-G蛋白C端结构域包含VSV-G蛋白的第455-495位(共41个)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。
IIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:36)。
VSV-G蛋白C端结构域包含VSV-G蛋白的第445-495位(共51个)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示。
WKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:37)。
VSV-G蛋白C端结构域包含VSV-G蛋白的第435-495位(共61个)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示。
IELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ IDNO:38)。
VSV-G蛋白C端结构域包含VSV-G蛋白的第425-495位(共71个)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。
FGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:39)。
VSV-G蛋白C端结构域包含VSV-G蛋白的第415-495位(共81个)氨基酸，其氨基酸序列如SEQID NO:40所示。
SQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:40)。
VSV-G蛋白C端结构域包含VSV-G蛋白的第405-495位(共91个)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
FEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:13)。
VSV-G蛋白C端结构域包含VSV-G蛋白的第395-495位(共101个)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示。
DLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:41)。
VSV-G蛋白C端结构域包含VSV-G蛋白的第385-495位(共111个)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示。
YMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIA SFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:42)。
VSV-G蛋白C端结构域包含VSV-G蛋白的第375-495位(共121个)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示。
RTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEG WFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:43)。
VSV-G蛋白C端结构域包含VSV-G蛋白的第365-495位(共131个)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示。
DVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGL SKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ IDNO:44)。
VSV-G蛋白C端结构域包含VSV-G蛋白的第355-495位(共141个)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示。
ELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPD DESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNR LGK(SEQ ID NO:45)。
融合蛋白antiCD3-G-1氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKAAATTTIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ IDNO:46)。
融合蛋白antiCD3-G-2氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKAAATTTWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:47)。
融合蛋白antiCD3-G-3氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示。,
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKAAATTTIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:48)。
融合蛋白antiCD3-G-4氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKAAATTTFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:49)。
融合蛋白antiCD3-G-5氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKAAATTTSQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:50)。
其中antiCD3-G-6即为所述融合蛋白S2，含有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
融合蛋白antiCD3-G-7氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKAAATTTDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:51)。
融合蛋白antiCD3-G-8氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKAAATTTYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:52)。
融合蛋白antiCD3-G-9氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKAAATTTRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:53)。
融合蛋白antiCD3-G-10氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKAAATTTDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:54)。
融合蛋白antiCD3-G-11氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKAAATTTELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:55)。
b.慢病毒载体收获、纯化、保存
转染后48-72h，收集含病毒的培养上清，用0.45μm滤器过滤，经纯化浓缩后，分装冻存于超低温冰箱(<-75℃)内。
c.慢病毒滴度测定
取出冻存样品化冻后，进行滴度测定，滴度测定和计算参考实施例6步骤6.3。
d.所有载体均以MOI＝5转导CD3+Jurkat细胞，3-7天后，流式细胞术检测mCherry阳性细胞百分比。各组阳性细胞百分比均除以LVm-CD3ta-6，绘制柱状图，如图17所示。
根据图17的结果，含有不同长度的VSV-G C端结构域的靶向CD3的融合蛋白，包装的慢病毒载体对CD3+Jurkat细胞的转导效率比较：LVm-CD3ta-4、LVm-CD3ta-5、LVm-CD3ta-6、LVm-CD3ta-7的转导效率最高，其余慢病毒载体转导效率明显下降；即当融合蛋白所包含的VSV-G C端结构域在长于435-495位氨基酸且短于385-495位氨基酸，即包含所述包膜蛋白的第386位氨基酸～第434位氨基酸与第495位氨基酸之间的肽链，VSV-G C端结构域长度长于61AA且短于111AA范围内时，包装出来的慢病毒载体转导效率最高。
实施例9：不同靶向CD3的慢病毒载体滴度比较
a.包装一系列通过CD3靶向T细胞转导目的基因mCherry的慢病毒
按下表8中的质粒及比例，共转染HEK 293T细胞，包装慢病毒。
表8：：慢病毒包装
慢病毒 慢病毒载体名称及比例
LV-S2 pLV-mCherry：psPAX2：pMD2.G：pMD2.S2＝2:1:1:0.5
LV-2 pLV-mCherry：psPAX2：pMD2.VSV-G-antiCD3＝2:1:1:0.5
pLV-mCherry为携带mCherry序列的转移质粒；psPAX2为表达慢病毒结构蛋白gag、非结构蛋白pol的包装质粒、调控蛋白rev的包装质粒；pMD2.G为表达包膜蛋白VSV-G的包膜质粒；pMD2.S2为表达包含靶向CD3的scFv与VSV-G蛋白C端结构域的融合蛋白的质粒，其中，VSV-G蛋白C端结构域具有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列，所述融合蛋白含有如SEQ IDNO:15所示氨基酸序列；pMD2.VSV-G-antiCD3为表达含靶向CD3的scFv在完整VSV-G蛋白N端的融合蛋白VSV-G-antiCD3的质粒，所述融合蛋白VSV-G-antiCD3具有如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKAAATTTKFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ IDNO:56)
b.慢病毒包装和滴度测定
慢病毒包装方法参见实施例1；
转染后48-72h，收集含病毒的培养上清，用0.45μm滤器过滤后，进行滴度测定，滴度测定和计算参考实施例6步骤6.3。
其滴度结果如图18所示。根据图18的结果，和现有技术的scFv位于完整的VSV-G的N端的融合蛋白包装的慢病毒载体(LV-2)相比，VSV-G和含有scFv在VSV-G C端结构域的融合蛋白包装的慢病毒载体(LV-S2)的滴度显著提高，LV-2滴度仅7.8E+03TU/mL，LV-S2滴度为5.8E+07TU/mL。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (29)

1.一组病毒载体，其特征在于，包括：
第一病毒载体，所述第一病毒载体携带第一核酸分子，所述第一核酸分子编码包膜蛋白；
至少一个第二病毒载体，所述第二病毒载体携带第二核酸分子，所述第二核酸分子编码至少一个融合蛋白，所述融合蛋白包括至少一个单链抗体和所述包膜蛋白的C端结构域，所述单链抗体能够结合CD28或CD3，所述包膜蛋白的C端结构域包括包膜蛋白的跨膜区和胞内区，所述至少一个单链抗体的C端与所述包膜蛋白的C端结构域的N端相连；
所述第一核酸分子与所述第二核酸分子被设置为表达所述包膜蛋白与所述融合蛋白，并且所述包膜蛋白与所述融合蛋白呈非融合形式。
2.根据权利要求1所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体为反转录病毒、慢病毒或其他包膜病毒载体。
3.根据权利要求2所述的病毒载体，其特征在于，所述包膜病毒包括选自玻那病毒科(Bornaviridae)、尼亚马病毒科(Nyamaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、汉坦病毒科(Hantaviridae)、内罗病毒科(Nairoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、白纤病毒科(Phenuiviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、泡沫病毒(Spumavirus)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、丁型肝炎病毒科(Deltavirus)病毒的至少之一；
任选地，所述包膜蛋白为弹状病毒科水泡性口炎病毒的包膜G糖蛋白或包膜G糖蛋白的突变体；
任选地，所述包膜G糖蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的病毒载体，其特征在于，所述包膜蛋白的突变体具有吸附能力减弱突变；
任选地，所述包膜G糖蛋白的突变体具有K47Q和R354Q突变；
任选地，所述包膜G糖蛋白的突变体具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的病毒载体，其特征在于，所述单链抗体能够结合CD28，任选地，所述单链抗体具有SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列；
任选地，所述单链抗体能够结合CD3，任选地，所述单链抗体具有SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列；
任选地，所述融合蛋白包括第一单链抗体、第二单链抗体以及所述包膜蛋白的C端结构域，所述第一单链抗体能够结合CD28，所述第二单链抗体能够结合CD3，所述第一单链抗体的C端与所述第二单链抗体的N端相连，所述第二单链抗体的C端与所述包膜蛋白的C端结构域的N端相连；或，所述第二单链抗体的C端与所述第一单链抗体的N端相连，所述第一单链抗体的C端与所述包膜蛋白的C端结构域的N端相连；
任选地，所述第一单链抗体具有SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列；
任选地，所述第二单链抗体具有SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列；
任选地，所述包膜蛋白的C端结构域进一步包括包膜蛋白的至少部分胞外区。
6.根据权利要求1～5任一项所述的病毒载体，其特征在于，所述融合蛋白进一步包括第一连接肽，所述第一连接肽的N端与所述第一单链抗体的C端相连，所述第一连接肽的C端与所述第二单链抗体的N端相连；或，所述第一连接肽的N端与所述第二单链抗体的C端相连，所述第一连接肽的C端与所述第一单链抗体的N端相连；
任选地，所述第一连接肽具有SEQ ID NO:7、8、9、10或11所示的氨基酸序列；
任选地，所述融合蛋白进一步包括第二连接肽，所述第二连接肽的N端与所述至少一个单链抗体的C端相连，所述第二连接肽的C端与所述包膜蛋白的C端结构域的N端之间相连；
任选地，所述第二连接肽具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1～6任一项所述的病毒载体，其特征在于，所述包膜蛋白的C端结构域包括所述包膜蛋白的第386位氨基酸～第434位氨基酸与第495位氨基酸之间的肽链；
优选地，所述包膜蛋白的C端结构域包括所述包膜蛋白的第395位氨基酸～第425位氨基酸与第495位氨基酸之间的肽链；
任选地，所述包膜蛋白的C端结构域包含VSV-G蛋白的第425-495位氨基酸，第415-495位氨基酸，第405-495位氨基酸，或第395-495位氨基酸；
任选地，所述包膜蛋白的C端结构域具有SEQ ID NO:13、39、40或41所示的氨基酸序列；
任选地，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19或20所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的病毒载体，其特征在于，进一步包括：
第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及
第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。
9.根据权利要求8所述的病毒载体，其特征在于，所述第一启动子和所述第二启动子分别独立地选自CMV、EF-1或RSV启动子。
10.根据权利要求1所述的病毒载体，其特征在于，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO:21或35所示的核苷酸序列；
任选地，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO:22、23、24、25、32、33或34所示的核苷酸序列；
任选地，所述第二核酸分子进一步包括编码信号肽的核酸序列；
任选地，所述编码信号肽的核酸序列具有SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列；
任选地，所述第一核酸分子和第二核酸分子的拷贝数之比为1：1～4：1。
11.根据权利要求1所述的病毒载体，其特征在于，所述第一病毒载体和第二病毒载体为同一载体。
12.根据权利要求11所述的病毒载体，其特征在于，进一步包括：
内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间。
13.根据权利要求11所述的病毒载体，其特征在于，进一步包括：
第三核酸分子，设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码第三连接肽，所述第三连接肽能够被切割。
14.根据权利要求1所述的病毒载体，其特征在于，所述第一病毒载体和第二病毒载体为pMD2.G、pCMV、pMD2.G突变体或pCMV的突变体。
15.根据权利要求1所述的病毒载体，其特征在于，进一步包括第三病毒载体和第四病毒载体，所述第三病毒载体携带目的基因，所述第四病毒载体携带病毒结构蛋白基因和病毒包装酶基因以及任选的调节因子rev基因；
任选地，所述结构蛋白基因、病毒包装酶基因和调节因子rev基因设置于同一第四病毒载体或不同第四病毒载体上；
任选地，所述病毒包装酶包括逆转录酶、蛋白酶和整合酶的至少之一。
16.根据权利要求15所述的病毒载体，其特征在于，所述第三病毒载体为转移载体，所述转移载体含有慢病毒包装信号，
任选地，所述慢病毒包装信号包括：Ψ；
任选地，所述转移载体为pLV；
任选地，所述第四病毒载体为psPAX2。
17.根据权利要求15或16所述的病毒载体，其特征在于，所述目的基因为编码嵌合抗原受体的核酸分子。
18.一种获得慢病毒的方法，其特征在于，将权利要求1～17任一项所述的病毒载体导入第一受体细胞；将导入病毒载体的第一受体细胞进行培养，以便获得所述病毒。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述病毒为慢病毒，所述第一病毒载体和第二病毒载体不为同一载体，所述第三病毒载体、第四病毒载体、第一病毒载体和第二病毒载体的质量比为1：1：1：0.25～2：1：1：1，
优选地，所述第三病毒载体、第四病毒载体、第一病毒载体和第二病毒载体的质量比为2：1：1：0.5；
优选地，所述第三病毒载体、第四病毒载体、第一病毒载体和第二病毒载体的质量比为1：1：1：0.5；
优选地，所述第三病毒载体、第四病毒载体、第一病毒载体和第二病毒载体的质量比为1：1：1：1；
任选地，所述第一受体细胞为293T。
20.一种慢病毒，其特征在于，是通过权利要求18或19所述的方法包装获得的。
21.一种慢病毒，其特征在于，表达包膜蛋白以及融合蛋白，所述融合蛋白包括至少一个单链抗体和所述包膜蛋白的C端结构域，所述单链抗体能够结合CD28或CD3，所述包膜蛋白的C端结构域包括包膜蛋白的跨膜区和胞内区，所述至少一个单链抗体的C端与所述包膜蛋白的C端结构域的N端相连，
任选地，所述包膜蛋白为水泡性口炎病毒的包膜G糖蛋白或包膜G糖蛋白的突变体。
22.一种慢病毒，其特征在于，表达包膜蛋白以及融合蛋白，所述融合蛋白包括第一单链抗体、第二单链抗体和所述包膜蛋白的C端结构域，所述第一单链抗体能够结合CD28，所述第二单链抗体能够结合CD3，所述包膜蛋白的C端结构域包括包膜蛋白的跨膜区和胞内区，所述第一单链抗体的C端与所述第二单链抗体的N端相连，所述第二单链抗体的C端与所述包膜蛋白的C端结构域的N端相连；或，所述第二单链抗体的C端与所述第一单链抗体的N端相连，所述第一单链抗体的C端与所述包膜蛋白的C端结构域的N端相连，
任选地，所述包膜蛋白为水泡性口炎病毒的包膜G糖蛋白或包膜G糖蛋白的突变体。
23.一种将慢病毒导入未激活T淋巴细胞的方法，其特征在于，利用权利要求1～17任一项所述的慢病毒载体电转或转染所述未激活T淋巴细胞或利用权利要求20～22任一项所述的慢病毒感染所述未激活T淋巴细胞。
24.一种表达目的基因的方法，其特征在于，包括：
将整合有目的基因的权利要求1～17任一项所述的病毒载体或权利要求20～22任一项所述的慢病毒导入第二受体细胞；
将导入病毒载体或慢病毒的第二受体细胞进行培养，以便表达目的基因；
任选地，所述导入第二受体细胞是通过电转、转染或感染的方式进行的；
任选地，所述第二受体细胞为T细胞。
25.一种获得CAR-T细胞的方法，其特征在于，包括：
将整合有嵌合抗原受体编码核酸的权利要求1～17任一项所述的病毒载体或权利要求20～22任一项所述的慢病毒导入T淋巴细胞；
将导入病毒载体或慢病毒的T淋巴细胞进行培养，以便表达嵌合抗原受体；
任选地，所述导入T淋巴细胞是通过电转、转染或感染的方式进行的。
26.一种CAR-T细胞，其特征在于，是依据权利要求25所述的方法制备获得的。
27.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～17任一项所述的病毒载体、权利要求20～22任一项所述的慢病毒或权利要求26所述的CAR-T细胞。
28.权利要求1～17任一项所述的病毒载体、权利要求20～22任一项所述的慢病毒、权利要求26所述的CAR-T细胞或权利要求27所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于激活免疫或治疗或预防疾病。
29.根据权利要求28所述的用途，其特征在于，所述疾病为肿瘤。
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