JP7237960B2 - 標的細胞の選択的形質導入のためのアダプターベースのレトロウイルスベクター系 - Google Patents
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Description
i)シュードタイプレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子と、
ii)タグ付きポリペプチドと
を含む組成物であって、
前記シュードタイプレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子は、
a)抗原結合活性を有する1種のエンベロープタンパク質であって、その天然受容体のうちの少なくとも1つと相互作用せず、かつその外部ドメインにおいて、前記タグ付きポリペプチドのタグに対して特異的な抗原結合性ドメインを含むポリペプチドに融合している組換えタンパク質であり、かつ、パラミクソウイルス科に由来するG、HN、またはHタンパク質である、エンベロープタンパク質と、
b)パラミクソウイルス科に由来する融合活性を有する1種のエンベロープタンパク質とを含み、
前記タグ付きポリペプチドは、標的細胞の表面で発現する抗原に特異的に結合することにより、前記標的細胞に前記レトロウイルスベクター粒子を形質導入するか、または、前記標的細胞への前記ウイルス様粒子の取り込みを誘導する、組成物を提供する。
i)シュードタイプレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子と、
ii)タグ付きポリペプチドと
の組み合わせであって、
前記シュードタイプレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子は、
a)抗原結合活性を有する1種のエンベロープタンパク質であって、その天然受容体と相互作用せず、かつその外部ドメインにおいて、タグ付きポリペプチドのタグに対して特異的な抗原結合性ドメインを含むポリペプチドに融合している組換えタンパク質であり、かつ、パラミクソウイルス科に由来するG、HN、またはHタンパク質である、エンベロープタンパク質と、
b)パラミクソウイルス科に由来する融合活性を有する1種のエンベロープタンパク質と
を含み、
前記タグ付きポリペプチドは、標的細胞の表面で発現する抗原に特異的に結合することにより、標的細胞に前記レトロウイルスベクター粒子を形質導入するか、または、標的細胞へのウイルス様粒子の取り込みを誘導する、組み合わせを提供する。
ここで、前記タグ付きポリペプチドのタグは、
i)前記標的細胞の表面で発現する前記抗原に特異的に結合する抗原結合性部分(ABM)と、
ii)対象における自然発生分子またはその誘導体である標識部分(LaM)と、
iii)前記ABMと前記LaMとをコンジュゲートすることによりリンカー/標識エピトープ(LLE)を形成するリンカー部分(LiM)と
を含む、標的細胞結合性分子(TCBM)のリンカー/標識エピトープ(LLE)であり、
タグに対して特異的な前記ポリペプチドの前記抗原結合性ドメインは、リンカー/標識エピトープ(LLE)結合性ドメインであり、
前記LLE結合性ドメインは、前記自然発生分子よりも高い優先度で前記LLEに結合する。
a)天然受容体のうちの少なくとも1つと相互作用せず、かつその外部ドメインにおいて、前記タグ付きポリペプチドのタグに対して特異的な抗原結合性ドメインを含むポリペプチドに融合している組換えタンパク質であり、かつ、パラミクソウイルス科に由来するG、HN、またはHタンパク質である、抗原結合活性を有する1種のエンベロープタンパク質と、
b)パラミクソウイルス科に由来する融合活性を有する1種のエンベロープタンパク質と
を含む、シュードタイプレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子を提供し、
前記タグ付きポリペプチドは、標的細胞の表面で発現する抗原に特異的に結合することにより、標的細胞に前記レトロウイルスベクター粒子を形質導入するか、または、標的細胞へのウイルス様粒子の取り込みを誘導する。
パッケージング細胞株に、レトロウイルスgag/pol/rev遺伝子をコードする少なくとも1種のpsi陰性発現ベクター、psi陽性レトロウイルス発現ベクター、および本明細書において開示されるパラミクソウイルス科ウイルスエンベロープタンパク質をコードする1種または2種のpsi陰性発現ベクターをコトランスフェクトすることを含む。
a)本明細書において開示されるタグ付きポリペプチドと、標的細胞をプレインキュベーションするステップと、
b)前記レトロウイルスベクター粒子またはそのベクター様粒子を、ステップa)のプレインキュベートされた前記標的細胞に添加するステップと
を含む、インビトロ方法を提供する。
a)処置を必要とする対象に、本明細書において開示されるタグ付きポリペプチドの製剤を投与することであって、前記タグ付きポリペプチドが標的細胞に結合し、前記標的細胞が、造血細胞、優先的には免疫サブセット細胞、例えばT細胞またはNK細胞、NKT細胞、B細胞、マクロファージ、樹状細胞、または前記免疫サブセット細胞を生じさせることができる幹細胞であり、
b)本明細書において開示されるシュードタイプレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子の製剤を対象に投与することであって、前記シュードタイプレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子がタグ付きポリペプチドに結合することにより、標的細胞に前記レトロウイルスベクター粒子を形質導入するか、または、標的細胞へのウイルス様粒子の取り込みを誘導するものである
を含む、インビボ方法を提供する。
a)処置を必要とする対象に、本明細書において開示されるタグ付きポリペプチドの製剤を投与することであって、前記タグ付きポリペプチドが標的細胞に結合し、前記標的細胞が欠損幹細胞であり、
b)本明細書において開示されるシュードタイプレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子の製剤を対象に投与することであって、前記シュードタイプレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子がタグ付きポリペプチドに結合することにより、標的細胞に前記レトロウイルスベクター粒子を形質導入するか、または、標的細胞へのウイルス様粒子の取り込みを誘導するものである、
を含む、インビボ方法を提供する。
a)天然受容体のうちの少なくとも1つと相互作用しない組換えタンパク質であり、かつ、パラミクソウイルス科に由来するG、HN、またはHタンパク質である、抗原結合活性を有する1種のエンベロープタンパク質と、
b)パラミクソウイルス科に由来する融合活性を有する1種のエンベロープタンパク質と、
c)タグ付きポリペプチドのタグに対して特異的な抗原結合性ドメインを含む1種の膜タンパク質またはその断片と
を含み、
前記タグ付きポリペプチドは、標的細胞の表面で発現する抗原に特異的に結合することにより、標的細胞に前記レトロウイルスベクター粒子を形質導入するか、または、標的細胞へのウイルス様粒子(VLP)の選択的取り込みを誘導する。
本明細書において開示される適応可能なレトロウイルスベクター粒子系または本明細書において開示されるウイルス様粒子系に関する上述の用途に加えて、本発明のさらなる実施形態を以下に記載するが、これらの実施形態に限定する意図はない。
別段の定義がない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
天然受容体との相互作用が低減または消失した抗原結合活性を有するエンベロープタンパク質に、それぞれビオチン(配列番号1および2)、クローンBio3-18E)、およびデキストラン(配列番号13および14)に対して特異的なscFvを装備させた。ビオチン特異的scFvについては、本明細書において開示されるLLEの原理(図1C)が適用され得る。すなわち、scFV Bio3-18Eの抗原結合性ドメインは、遊離ビオチンまたは他のリンカーと連結したビオチンよりも高い優先度で、6-(6-アミノヘキサンアミド)ヘキサノイル部分または6-アミノヘキサノイル部分(LiM)に連結したビオチン(LaM)に結合する。LiMは、ビオチンと、標的結合性分子(TCBM)の抗原結合性部分(ABM)とを連結させる。
タグ付きポリペプチドのタグに対して特異的なシュードタイプレトロウイルスベクター粒子を、HEK-293T細胞の一過性トランスフェクションによって生成した。前日にT175フラスコ内のDMEM/10% FCS(Biowest、カタログ番号12362;Biochrom、カタログ番号S0415)に播種したHEK-293T細胞に、Hタンパク質をコードするプラスミド、Fタンパク質をコードするプラスミド、gag/pol/revをコードするパッケージングプラスミド、およびGFPをコードするpsi陽性移入ベクタープラスミドをトランスフェクトした。シュードタイプレトロウイルスベクター粒子をトランスフェクションの48時間後に採取した。細胞残屑を除去するため、上清を収集し、1000rpmで10分間遠心分離し、その後、0.45μmフィルターで濾過した。濃縮させるため、濾過した上清を、5350xgにて4℃で24時間にわたり、20%スクロース(Sigma Aldrich、カタログ番号84097-250g、PBS中20%w/v)のクッションによって遠心分離した。ペレット状のレトロウイルスベクターを250μlの予冷却したPBSに再懸濁し、アリコートをとり、後の使用のために-80℃で保管した。
LC-LC-ビオチンを用いた抗体またはその断片などのタンパク質のランダムな標識を、当技術分野において周知のプロトコールに従って行った。抗体またはその断片を、製造元の説明に従い、平衡したAmicon Ultra-15フィルターユニットの上に流すことにより、1×PBS/2mM EDTA/0.5% BSAに再緩衝した(rebuffered)。再緩衝したタンパク質にビオチン-LC-LC-NHSを添加し、その後、室温(21℃)で1時間インキュベートした。残りのビオチン-LC-LC-NHSをゲル濾過によって除去した。収集した画分のタンパク質含有量を判定した。タグ付き抗体またはその断片を、前記抗体またはその断片の抗原を発現する細胞株においてインキュベートすることにより、ビオチン化を確認した。結合したタグ付き抗体を、蛍光色素コンジュゲート抗ビオチン抗体(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-104-563)およびフローサイトメトリーによって検出した。
タグ付きポリペプチドの非存在下でHT1080細胞に対するシュードタイプレトロウイルスベクター粒子の力価測定を行った。そこで、ビオチン-LC-LC-NHSを使用することにより、細胞表面上のタンパク質をLC-LC-ビオチンでランダムに標識した。1mlのPBSに再懸濁したHT1080にビオチン-LC-LC-NHSを追加し、その後、4℃で常に混合しながらインキュベートした。無細胞上清を除去した後、細胞を洗浄し、細胞が完全に接着性になるまで、1×105細胞/ウェルで24ウェル内の培養培地(DMEM、10% FCS)中に播種した。蛍光色素コンジュゲーション抗ビオチン抗体(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-090-856)での染色およびフローサイトメトリーにより、ビオチン化の成功を確認した(図4A)。Polybrene(登録商標)(Sigma Aldrich、カタログ番号H9268-5G)を含有するDMEM中に、GFPコードベクター粒子を連続希釈した。形質導入の72時間後、GFP陽性細胞の比を判定するフローサイトメトリーにより、形質導入効率を判定した(図4A)。GFP陽性細胞の比、希釈係数、および適用されたレトロウイルスの容量を使用すると、レトロウイルスベクター力価(すなわち容量当たりの形質導入単位(TU/ml)が計算される(図4B)。
非ビオチン化HT1080細胞の形質導入を、記載したとおり(実施例4)に行う。
タグ特異的レトロウイルスベクターおよび選択された抗原に対して特異的なタグ付きポリペプチドを標的細胞に選択的に形質導入するため、前述のように(実施例5)、無血清培地に標的細胞を播種した。タグ付き抗体またはタグ付きFab断片を100ng/ml~1000ng/mlの濃度で細胞に添加した(図7、11、12)。少なくとも30分間にわたって4℃でタグ付きポリペプチドと共に細胞をインキュベートした。その後、GFPコードレトロウイルスベクターを添加した。混合細胞集団における選択性が、48ウェルプレート内で1×106細胞/mlの総密度において等量のRaji細胞およびSupT1細胞で示された。Raji特異的な形質導入プロトコールを適用した(図8)。
適応可能なレトロウイルスベクター系の性能および適用性は、細胞、タグ特異的レトロウイルスベクター、およびタグ付きポリペプチドをすべて組み合わせる最も良い順序を判定することによって容易に向上した。したがって、2つの成分をプレインキュベートし、その後、第3の成分を添加した。このアッセイは、ポリペプチドとしてのα-CD20-Ab-Tag、GFPをコードするタグ特異的レトロウイルスベクター、および標的細胞としてのRaji細胞(CD20+)または非標的細胞としてのJurkat細胞(CD20-)を用いて行った。第1に、1μg/mlのα-CD20-Ab-TagおよびMOI0.05のレトロウイルスベクター用量を使用し、α-CD20-Ab-Tagおよびレトロウイルスベクターを、Raji細胞では300μl、またはJurkat細胞では150μlのRPMIに合わせた。4℃で30分間のインキュベーションの後、RajiまたはJurkatのいずれかの標的細胞を、プレインキュベートしたレトロウイルスベクター/タグ付きポリペプチドミックスに再懸濁した。形質導入の少なくとも72時間後にフローサイトメトリーを行った(図5A)。
この実施例では、シュードタイプレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子を使用して、未知のタグ付きポリペプチドを規定の細胞または細胞のミックスのいずれかと共にインキュベートすることにより、未知のタグ付きポリペプチドの特異性を判定する。シュードタイプレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子は、未知のタグ付きポリペプチドが結合する細胞型を判定することを可能にするマーカーをコードする。このアプローチは、制限されるものではないが例えばマウスモデルを使用して、インビトロまたはインビボで実施され得る。
麻疹ウイルスH、Fタンパク質をコードするプラスミドの代わりにNipahのGおよびFタンパク質をコードするプラスミドを使用することにより、前述(実施例2)のプロトコールを改変することによって、Nipahエンベロープタンパク質でシュードタイピングされたアダプター-LVを生成した。ポリペプチドとしてのα-CD20-Ab-Tagの存在下でRaji細胞に対するシュードタイプレトロウイルスベクター粒子の力価測定を行った。前述のように、Raji特異的な形質導入プロトコールを適用した。GFPコードレトロウイルスベクター粒子をRPMI中で連続希釈した。形質導入の72時間後、EGFP陽性細胞の比を判定するフローサイトメトリーにより、形質導入効率を判定した。測定されたGFP陽性細胞の比、希釈係数、および適用されたレトロウイルスの容量を使用して、レトロウイルスベクター力価(すなわち容量当たりの形質導入単位(TU/ml)を計算した。前述(実施例5)のように、無血清培地に播種したCD19陽性、CD20陽性のRaji細胞に、タグ特異的なNipahエンベロープタンパク質でシュードタイピングされたレトロウイルスベクターを選択的に形質導入した。タグ付きアダプターを、4℃で少なくとも30分間にわたり、100ng/mlの濃度で細胞に添加した。その後、GFPをコードするNipahエンベロープタンパク質でシュードタイピングされたレトロウイルスベクターを添加した。形質導入の3日後、フローサイトメトリー分析により、形質導入効率を判定した(図13)。
レトロウイルスベクターの産生プロトコール(実施例2)を改変することにより、シュードタイプレトロウイルスVLPを産生した。タグ特異的麻疹Hをコードするプラスミド、麻疹Fタンパク質をコードするプラスミド、gag/pol/revをコードするプラスミド、およびマトリックスとカプシドタンパク質との間に挿入された最適な導入遺伝子を含有するgag/pol/rev/導入遺伝子コードプラスミドを、HEK細胞にトランスフェクトした。導入遺伝子としては、eGFPまたは単量体赤色蛍光タンパク質を使用した。蛍光タンパク質は、フランキングHIV-1プロテアーゼ切断部位を付加することにより、成熟粒子中に放出される(Uhligら(2015年))。前述(実施例4)のように、VLPの力価測定を行った。これとは反対に、VLPの添加の4時間後に分析を既に行った。蛍光タンパク質を選択的に移入するため、タグ特異的VLPを、SupT1細胞によって発現される抗原に対して特異的なタグ付きもしくはタグなしのアダプター分子の非存在下(w/o)または存在下において、無血清培地中のCD4陽性、CD8陽性のSupT1細胞に添加した(実施例5)。アダプター濃度は、100ng/ml(α-CD8-ABについては10ng/ml)に設定した。4℃で少なくとも30分間にわたり、細胞をアダプターと共にインキュベートした後、VLPを0.05のMOIで添加した。4時間後、タンパク質移入率をフローサイトメトリーによって測定した(図14Aおよび14B)。
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Claims (16)
- i)シュードタイプレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子と、
ii)タグ付きポリペプチドと
を含む組成物であって、
前記シュードタイプレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子は、
a)抗原結合活性を有する1種のエンベロープタンパク質であって、その天然受容体のうちの少なくとも1つと相互作用せず、かつその外部ドメインにおいて、前記タグ付きポリペプチドのタグに対して特異的な抗原結合性ドメインを含むポリペプチドに融合している組換えタンパク質であり、かつ、パラミクソウイルス科に由来するG、HN、またはHタンパク質である、前記エンベロープタンパク質と、
b)パラミクソウイルス科に由来する融合活性を有する1種のエンベロープタンパク質と、を含み、
前記タグ付きポリペプチドは、標的細胞の表面で発現する抗原に特異的に結合することにより、前記標的細胞に前記レトロウイルスベクター粒子を形質導入するか、または、前記標的細胞への前記ウイルス様粒子の取り込みを誘導する、組成物。 - 抗原結合活性を有する前記エンベロープタンパク質が、ヒト指向性ではない、請求項1に記載の組成物。
- 前記形質導入または前記取り込みの誘導が、前記タグ付きポリペプチドの存在下において、非標的細胞よりも、前記標的細胞において少なくとも10倍高い、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記パラミクソウイルス科ウイルスが、モルビリウイルス属またはヘニパウイルス属のウイルスである、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
- パラミクソウイルス科のウイルスのGまたはHタンパク質に由来する前記タンパク質から、前記GまたはHタンパク質の細胞質領域の少なくとも一部が欠如している、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
- パラミクソウイルス科に由来する融合活性を有する前記エンベロープタンパク質から、前記エンベロープタンパク質の細胞質領域の少なくとも一部が欠如している、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記モルビリウイルス属のウイルスが、麻疹ウイルスまたは麻疹ウイルスのEdmonston株である、請求項4に記載の組成物。
- 前記レトロウイルスベクター粒子が、レンチウイルス粒子またはガンマレトロウイルスベクター粒子である、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記タグ付きポリペプチドのポリペプチドが、抗体またはその抗原結合性断片であり、前記抗体またはその抗原結合性断片が、前記標的細胞の表面で発現する前記抗原に結合し、前記タグ付きポリペプチドのタグが、ハプテンである、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記タグ付きポリペプチドのポリペプチドが、抗原結合性部分(ABM)であり、
前記タグ付きポリペプチドのタグが、
i)抗原結合性部分(ABM)であって、前記標的細胞の表面で発現する前記抗原に特異的に結合するABMと、
ii)標識部分(LaM)であって、ビオチンであるLaMと、
iii)前記ABMと前記LaMとをコンジュゲートすることによりリンカー/標識エピトープ(LLE)を形成するリンカー部分(LiM)と
を含む、標的細胞結合性分子(TCBM)のリンカー/標識エピトープ(LLE)であり、
タグに対して特異的な前記ポリペプチドの前記抗原結合性ドメインが、リンカー/標識エピトープ(LLE)結合性ドメインであり、
前記LLE結合性ドメインが、前記ビオチンよりも高い優先度で前記LLEに結合する、
請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記LLE結合性ドメインが、前記ビオチンよりも少なくとも2倍高い親和性で前記LLEに結合する、請求項10に記載の組成物。
- 前記LiMが、6-(6-アミノヘキサンアミド)ヘキサノイル部分または6-アミノヘキサノイル部分である、請求項10または11に記載の組成物。
- 前記LLE結合性ドメインが、配列番号1(VH)および配列番号2(VL)の配列を含む、請求項12に記載の組成物。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の組成物を含む、医薬組成物。
- シュードタイプレトロウイルスベクター粒子を標的細胞に形質導入するための、またはそのウイルス様粒子のタンパク質を送達するためのインビトロ方法であって、
a)タグ付きポリペプチドと、標的細胞をプレインキュベーションするステップと、
b)前記レトロウイルスベクター粒子またはそのベクター様粒子を、ステップa)のプレインキュベートされた前記標的細胞に添加するステップと
を含み、
前記シュードタイプレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子は、
a)抗原結合活性を有する1種のエンベロープタンパク質であって、その天然受容体のうちの少なくとも1つと相互作用せず、かつその外部ドメインにおいて、前記タグ付きポリペプチドのタグに対して特異的な抗原結合性ドメインを含むポリペプチドに融合している組換えタンパク質であり、かつ、パラミクソウイルス科に由来するG、HN、またはHタンパク質である、前記エンベロープタンパク質と、
b)パラミクソウイルス科に由来する融合活性を有する1種のエンベロープタンパク質と、を含み、
前記タグ付きポリペプチドは、標的細胞の表面で発現する抗原に特異的に結合することにより、前記標的細胞に前記レトロウイルスベクター粒子を形質導入するか、または、前記標的細胞への前記ウイルス様粒子の取り込みを誘導するものである、インビトロ方法。 - 薬学的に許容しうる担体をさらに含む、請求項14に記載の医薬組成物。
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