KR20200128520A - 유전자 요법을 위한 중합체-캡슐화된 바이러스 벡터 - Google Patents

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KR20200128520A
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레나우드 베일란트
에멜린 세리
프레데릭 모울란
필리프 비숍
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Abstract

본 기술은 나노입자를 형성하기 위해 중합체 또는 중합체의 혼합물로 코팅 된 레트로바이러스 벡터를 포함하는 유전자 전달 비히클에 관한 것이다. 상기 레트로바이러스 벡터는 전이유전자를 포함하고 소정의 실시형태에서 외피 단백질이 결여되어 있다. 본 기술은 유전자 전달 비히클을 제조하는 방법 및 상기 유전자 전달 비히클을 투여함으로써 질환을 치료하는 방법을 포함한다.

Description

유전자 요법을 위한 중합체-캡슐화된 바이러스 벡터
관련 출원에 관한 상호참조
본 출원은 2018년 1월 17일에 출원되고 "시험관내 및 생체내 세포 표적화를 위한 바이러스 벡터 나노입자(Viral Vector Nanoparticles for In Vitro and In Vivo Cell Targeting)"를 발명의 명칭으로 하는 미국 가특허 출원 제62/618,156호 및 2018년 4월 24일에 출원되고 "외피 단백질이 결여된 중합체-캡슐화된 바이러스 벡터(Polymer-Encapsulated Viral Vectors Lacking Envelope Protein)"를 발명의 명칭으로 하는 미국 가특허 출원 제62/661,990호 및 2018년 8월 6일자로 출원되고 "외피 단백질이 결여된 중합체-캡슐화된 바이러스 벡터(Polymer-Encapsulated Viral Vectors Lacking Envelope Protein)"를 발명의 명칭으로 하는 미국 가특허 출원 제62/715,007호의 우선권을 주장한다. 이들 가특허 출원 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
유전자 요법은 세포 기능을 변경함으로써 유전적 이상을 교정하거나 질환의 치료를 제공하기 위해 외인성 유전 물질을 표적 세포에 전달한다. 이를 위해 바이러스성 유전자 전달 방법과 비-바이러스성 유전자 전달 방법 둘 다가 사용되었지만, 두 접근법 모두 여전히 심각한 단점이 있다.
다수의 바이러스 벡터 적용은 유전자 요법 또는 백신접종 프로토콜을 위해 이미 임상에 연결되어 있다. 그럼에도 불구하고, 현재 사용되는 바이러스 벡터는 소정의 단점이 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터를 사용하여 특정 세포를 표적화하는 것은 어렵다. 일부 유전자 요법 프로토콜에서, 세포 표적화는 표적 세포를 정제하고 이를 생체외에서 형질도입하고, 형질도입된 세포를 환자에게 재이식하기 전에 이를 시험관내에서 증대(expanding)시킴으로써 달성된다. 백신접종 프로토콜에서는, 벡터의 직접 주사가 수행되고, 벡터에 의해 코딩된 유전자 생성물에 대한 면역 반응을 유발하기 위해 비특이적 세포 형질도입이 종종 사용된다. 치료의 효능 및 안전성을 증가시키기 위해, 세포 표적화가 요구될 수 있다.
유전 물질의 표적화된 전달을 위한 개선된 바이러스 벡터-기반 시스템이 필요하다.
본원에 설명된 기술은 유전자 요법 및 백신 적용에 사용하기 위한 합성 패키징된 바이러스 벡터 나노입자 조성물 및 이를 사용하여 유전 물질의 향상된 전달을 제공하는 방법을 제공한다. 상기 벡터 조성물 및 방법은 하나 이상의 전이유전자(transgene)에 의한 세포의 형질도입이 유용한 임의의 상황에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터 조성물 및 방법은 암, 감염성 질환, 대사성 질환, 신경계 질환 또는 염증성 병태의 치료를 위해 또는 유전적 결함을 교정하기 위해 사용할 수 있다.
본 기술의 바이러스 벡터 나노입자 조성물은 벡터를 캡슐화하는 중합체 또는 중합체의 혼합물을 함유하는 외부 쉘을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 나노입자의 중합체 쉘은 하기 화학식을 갖는 올리고펩티드-유도체화된 폴리(베타-아미노 에스테르) 종 하나 이상을 함유한다:
Figure pct00001
상기 식에서, Pep는 올리고펩티드와 같은 펩티드이고, R은 OH, CH3 또는 콜레스테롤 기이며, m은 1 내지 20의 범위이고, n은 1 내지 100의 범위이고, o는 1 내지 10의 범위이다. 바람직한 실시형태에서, 펩티드는 아르기닌(R), 리신(K), 히스티딘(H), 글루탐산(E), 아스파르트산(D) 및 시스테인(C)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산을 포함한다. 본 기술에서 사용될 수 있는 올리고펩티드-유도체화된 PBAE에 대한 추가 설명은 WO2014/136100 및 WO2016/116887을 참조한다. 시스테인은 중합체에 대한 펩티드의 공유 부착점을 제공하기 위해 포함될 수 있고; 시스테인은 pH 7에서 약간의 음전하를 보유하지만, 양으로 하전된 아미노산과 함께 사용될 경우 전하를 크게 변화시키지 않는다. 예시적인 펩티드는 CRRR(서열번호 1), CHHH (서열번호 2), CKKK (서열번호 3), CEEE(서열번호 4) 및 CDDD(서열번호 5)이다. 다른 실시형태에서, 임의의 천연 발생 아미노산이 Pep 모이어티(moiety)에 포함될 수 있다. 펩티드의 서열은 중합체-코팅된 벡터의 세포 흡수 및 표적화를 촉진하도록 선택된다. 바이러스 외피 단백질을 이용하는 실시형태와 바이러스 외피 단백질이 결여된 실시형태 둘 다에서, 올리고펩티드 서열 및 순 전하는 의도된 표적 세포에서 중합체로 캡슐화된 바이러스 벡터의 세포 흡수 및/또는 엔도좀 흡수(endosomal uptake) 및/또는 엔도좀 탈출(endosomal escape)을 촉진하도록 선택된다. 중합체의 두 말단 각각의 펩티드는 전형적으로 소정의 중합체 분자상에서 동일하지만 상이할 수 있다. 벡터를 코팅하는 데 사용되는 혼합물 중의 중합체 분자는 동일하거나 상이할 수 있으며; 상이할 경우, 이들은 중합체 주쇄 또는 말단 펩티드에서 상이할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 중합체의 양쪽 말단에 있는 펩티드는 아미노산 서열 CRRR(서열번호 1) 또는 CHHH(서열번호 2) 또는 CKKK(서열번호 3) 또는 CEEE(서열번호 4) 또는 CDDD(서열번호 5)를 갖는다. 중합체 또는 중합체의 혼합물은 순 양전하 또는 음전하를 가질 수 있거나 하전되지 않을 수 있다. R, K, H, D 또는 E와 같은 단일 유형만의 아미노산의 잔기 2개 이상을 함유하는 올리고펩티드가 사용될 수 있다. 중합체는 중합체 주쇄에 부착된 측쇄 상으로 그래프트된 당 또는 당 알코올을 포함할 수 있다. 각각의 벡터 나노입자를 캡슐화하는 하나 이상의 중합체 분자는 중합체 분자상의 임의의 목적하는 위치, 예컨대 R에서 중합체에 연결된 표적화 모이어티를 임의로 포함할 수 있다. 중합체 분자는 가교결합되거나 비-가교결합될 수 있다. 중합체 분자는 비공유적으로 또는 공유적으로, 예컨대 벡터의 지질 이중층으로 분할되는 지질 분자(예를 들어, 콜레스테롤, 인지질 또는 지방산) 또는 지질 이중층에 매립된 단백질에의 공유 부착에 의해 바이러스 벡터 표면에 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체는 단지 벡터를 코팅하지만 비특이적으로 부착되는데, 즉 특이적 공유 또는 비공유 상호작용에 의해 벡터에 부착되지 않고 순전하, 소수성 또는 반데르발스 상호작용과 같은 비특이적 상호작용에 의해서만 벡터에 부착된다. 소정의 실시형태에서, 중합체 또는 중합체의 혼합물 대 레트로바이러스 벡터의 비는 중량을 기준으로 약 1:100 내지 약 5:1이거나, 벡터 입자당 중합체 분자의 수는 약 106 내지 약 1012개이다.
바이러스 벡터 나노입자는 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는 목적하는 특성(예를 들어, 면역원성, 상이한 크기의 작제물을 수용하는 능력, 통합 및 복제 특성, 발현 수준, 발현 기간, 조직 친화성(tissue tropism) 또는 표적화 특성, 분열 및/또는 휴지기 세포를 감염시키는 능력 등)에 기반하여 선택될 수 있다. 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 그러나, 본 발명은 DNA 또는 RNA 바이러스로부터 유래된 것들을 포함하는 다른 유형의 바이러스 및/또는 바이러스 벡터를 이용하여 실시될 수 있다.
나노입자는, 캡슐화된 벡터 나노입자의 표면에서 예컨대 표적화 모이어티와 중합체 코팅의 공유 또는 비공유 결합에 의해 노출되는 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티의 하나의 분자 종 또는 표적화 모이어티의 하나 이상의 상이한 분자 종이 각 바이러스 벡터 나노입자상에 존재할 수 있다. 표적화 모이어티는 예를 들어 항체, 항체 단편(Fab를 포함), scFv, 항체-유사 단백질 스캐폴드, 올리고펩티드, 압타머, L-RNA 압타머, 또는 세포 표면 수용체에 대한 리간드일 수 있다. 일 실시형태에서, 표적화 모이어티는 나노입자를 T-세포 쪽으로 표적화하기 위한 항-CD3 항체 또는 압타머이다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 키메라 항원 수용체를 코딩한다. 나노입자는 비히클이 투여되는 대상체에서 생체내에서 세포를 형질도입하거나 시험관내에서 세포를 형질도입함으로써 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 나노입자는 통상적으로 표적화 모이어티의 작용을 통해 및/또는 중합체 또는 중합체 혼합물의 작용을 통해 특정 유형의 세포 또는 특정 부류의 세포를 형질도입할 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체-코팅된 벡터 입자의 중합체는 표적 세포 표면에의 부착에 의해서 뿐만 아니라, 예컨대 세포내이입(endocytosis), 미세포음작용(micropinocytosis) 또는 기타 메커니즘에 의한 엔도좀 흡수 및 엔도좀 탈출(엔도좀 소포 내의 pH 감소 후 막 융합을 통해)을 통해서도 세포 형질도입을 촉진할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 중합체와 관련된 올리고펩티드의 아미노산 서열은 엔도좀 경로를 통한 세포 형질도입을 특이적으로 촉진할 수 있다.
본 기술의 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 슈도타이핑(pseudotyping)되는 한편, 다른 실시형태에서 벡터는 소정의 바이러스성 또는 슈도타이핑 외피 단백질이 결여되어 있다. 슈도타이핑된 벡터에서, HIV gp120-gp41 복합체 또는 소포성 구내염 바이러스(VSV-G) 당단백질과 같은 외피 단백질은 바이러스 외피의 외표면에 스파이크(spike)-유사 구조를 형성하고, 이는 벡터 입자의 숙주 세포에의 부착 및 숙주 세포 내로의 바이러스의 진입을 촉진한다. VSV-G와 같은 슈도타이핑 단백질은 또한 정제 동안 벡터를 보호하거나 벡터에 결합하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 초원심분리 동안의 보호, 친화성 컬럼 또는 다른 친화성 매트릭스에의 결합 또는 겔 정제). 그러나, 바이러스 벡터의 중합체 패키징과 관련하여, 이러한 구조는 벡터 입자 외피와 중합체 사이의 단단한 회합을 방해할 수 있다. 바이러스 외피 단백질은 또한 pH-의존성 전하를 보유하며, 이는 중합체, 특히 하전된 중합체의 회합을 제한하거나 방해할 수 있다. 또한, 슈도타이핑 단백질을 보유하는 패키징된 바이러스 벡터는 시험관내 및 생체내에서 코팅 불안정화 및 파괴를 겪을 수 있고, 이에 따라 세포를 비특이적으로 형질도입할 수 있는 바이러스 벡터를 방출하여 잠재적으로 안전성 프로파일의 감소를 유도할 수 있다. 외피 단백질이 결여된 벡터는 중합체를 사용하여 바이러스 벡터의 패키징을 향상시킬 수 있다. 외피 단백질이 결여된 코팅된 벡터는 코팅의 불안정화 또는 파괴 후에는 시험관내 또는 생체내에서 세포를 형질도입할 수 없기 때문에 이들은 외피 단백질을 갖는 벡터와 비교하여 개선된 안전성 프로파일을 나타낸다. 바이러스 벡터가 바이러스 외피 단백질이 결여된 본 기술의 나노입자는 벡터당 중합체 분자의 임계수 이상에서만 포유동물 세포를 형질도입할 수 있기 때문에, 상기 나노입자는 유전자 요법 또는 면역요법에 사용하기 위한 내장된 안전성 메커니즘을 갖는다. 상기 벡터당 중합체 분자의 임계수 미만에서, 중합체의 양은 벡터를 완전히 코팅하기에 불충분하고, 이는 나노입자가 구조적으로 불안정해지거나 나노입자로부터 중합체 분자가 해리되게 할 수 있다. 이러한 외피 단백질이 결여된 벡터가 효과적인 중합체 코팅을 상실하면, 이들은 인간 세포를 포함하는 포유동물 세포를 형질도입할 수 없게 된다. 이러한 나노입자는 임계 특징이 결여된 벡터 또는 중합체-캡슐화된 벡터와 비교하여 생체내 사용을 위한 개선된 안전성 프로파일을 갖는다.
일부 실시형태에서, 일부 막 단백질, 예컨대 바이러스 외피 또는 융합 단백질이 아니고 그 밖에 막 외표면상에 스파이크-유사 구조를 형성하지 않는 단백질, 예컨대 슈도타이핑에 사용되지 않는 벡터 생성 세포로부터의 단백질은 바이러스 벡터 입자의 지질 막 중에 존재할 수 있다. 본 기술의 소정의 실시형태에서, 외부 외피 표면으로부터 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50%의 덩어리 돌출(mass protruding)과 같은 외피 지질 이중층의 외표면으로부터 상당한 덩어리 돌출을 갖는 것들과 같은 바이러스 외피 단백질은 바이러스 벡터 입자에서 배제된다.
나노입자 조성물은 임의로 지질 분자, 계면활성제, 핵산, 단백질 분자 또는 소분자 약물과 같은 추가 성분을 함유할 수 있다. 본 기술은 또한 전달 비히클을 경구, 비강내 또는 비경구 투여, 예컨대 정맥내, 근육내, 피하, 종양주위 또는 종양내 주사에 적합하게 만들거나 생체외 유전자 전달 프로토콜에서 세포로의 시험관내 투여에 적합하게 만드는 하나 이상의 부형제, 담체, 완충액, 염 또는 액체와 함께 나노입자를 함유하는 약학적 제형 또는 조성물을 구상한다. 이러한 조성물 및 제형은 저장 동안 이들을 안정화하기 위해 동결건조될 수도 있다.
본 기술의 바이러스 벡터 나노입자는 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있다. 나노입자는 이의 외부 표면이 중합체 또는 중합체 혼합물을 함유하는 층으로 코팅된 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 슈도타이핑되고 융합-촉진 외피 단백질을 보유하고 전이유전자를 포함한다. 다른 실시형태에서, 바이러스 벡터는 임의의 고유한(native) 또는 재조합 외피 단백질이 결여되어 있고 전이유전자를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 특이적으로 유사한 레트로바이러스 벡터의 외피에 전형적으로 포함될 수 있는 바이러스 외피 단백질이 결여되어 있다. 소정의 실시형태에서, 바이러스 벡터는 특이적으로 야생형 또는 변형된 VSV-G, HIV gp120, HIV gp41, MMTV gp52, MMTV gp36, MLV gp71, 신시틴(syncytin), 야생형 또는 변형된 신드비스 바이러스 외피 단백질, 홍역 바이러스 헤마글루티닌(H) 및 융합(F) 당단백질 및 HEMO과 같은 임의의 천연 발생 또는 변형된 바이러스 벡터 외피 단백질이 결여되어 있다. 다른 실시형태에서, 벡터는 이러한 외피 단백질 중 하나 이상을 함유한다.
본 기술의 또 다른 측면은 상기 설명한 나노입자/유전자 전달 비히클(바이러스 벡터 나노입자)의 제조 방법이다. 상기 방법은 (a) 외피 단백질을 보유하거나 결여되고 전이유전자를 함유하는 바이러스 벡터를 제공하는 단계; (b) 중합체 또는 중합체의 혼합물을 제공하는 단계; 및 (c) 상기 바이러스 벡터를 상기 중합체 또는 중합체의 혼합물과 접촉시킴으로써, 바이러스 벡터와 중합체/중합체의 혼합물이 결합하여 중합체 또는 중합체의 혼합물로 코팅된 바이러스 벡터를 함유하는 나노입자를 형성하는 단계를 포함한다.
본 기술의 추가 측면은 상기 설명한 바이러스 벡터 나노입자(유전자 전달 비히클)를 사용하여 질환을 치료하는 생체내 방법이다. 상기 방법은 나노입자를 함유하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 비경구 투여함으로써, 대상체 내의 세포가 바이러스 벡터에 의해 형질도입되고 전이유전자가 형질도입된 세포에서 발현되는 것을 요구한다. 일 실시형태에서, 치료될 질환은 암이다. 생체내 투여의 경우에, VSV-G와 같은 바이러스 외피 단백질이 없는 실시형태는, 이들이 숙주에서 비표적화된 세포를 형질도입하는 능력이 결여되어 있고 그 밖에 외피 단백질에 의해 제공되는 세포 흡수 및/또는 엔도좀 흡수 및/또는 엔도좀 탈출을 회복하기 위한 중합체 캡슐화의 사용에 의해 제공되는 보다 특이적인 표적화로 인해 향상된 안정성 프로파일을 제공하므로 바람직하다.
본 기술의 또 다른 측면은 시험관내에서 세포를 형질도입하는 방법이다. 상기 방법은 단리된 살아있는 세포를 상기 설명한 바이러스 벡터 나노입자와 접촉시킴으로써 세포의 적어도 일부가 레트로바이러스 벡터에 의해 형질도입되고 치료 단백질 또는 마커 단백질이 형질도입된 세포에서 발현되는 단계를 포함한다.
본 기술의 또 다른 측면에서, 시험관내 배양물 중의 세포 또는 살아있는 유기체 내의 세포를 상기 설명한 나노입자/유전자 전달 비히클과 접촉시킴으로써 전이유전자가 상기 세포에서 발현되는 것을 요구하는 유전자 요법의 수행 방법이 제공된다. 전이유전자는 결함 유전자를 대체하거나 변형시키거나 결실 유전자를 대체할 수 있다.
본 기술은 다음의 실시형태의 목록으로 추가 요약될 수 있다.
1. 중합체 또는 중합체의 혼합물로 코팅된 바이러스 벡터를 포함하는 나노입자로서, 상기 바이러스 벡터가 전이유전자를 포함하고, 상기 나노입자가 전이유전자를 진핵 세포에 전달하기 위한 비히클로서 기능하는, 나노입자.
2. 실시형태 1에 있어서, 바이러스 벡터가 외피 단백질이 결여된 것인, 나노입자.
3. 실시형태 1 또는 실시형태 2에 있어서, 중합체 또는 중합체의 혼합물이 하기 화학식을 갖는 폴리(베타-아미노 에스테르)를 포함하는, 나노입자.
Figure pct00002
상기 화학식에서,
각 Pep는 올리고펩티드이고; R은 OH, CH3 또는 콜레스테롤이고; m은 1 내지 20의 범위이다. n은 1 내지 100의 범위이고, o는 1 내지 10의 범위이다.
4. 실시형태 3에 있어서, 각각의 올리고펩티드가 아르기닌(R), 글루탐산(E), 리신(K), 아스파르트산(D), 히스티딘(H) 및 시스테인(C)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3개의 아미노산 잔기를 포함하는, 나노입자.
5. 실시형태 3 또는 실시형태 4에 있어서, 적어도 하나의 올리고펩티드의 아미노산 서열이 CRRR(서열번호 1) 또는 CHHH(서열번호 2) 또는 CKKK(서열번호 3) 또는 CEEE(서열 번호 4) 또는 CDDD(서열 번호 5)인, 나노입자.
6. 상기 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 중합체 또는 중합체의 혼합물이 pH 7에서 순 양전하 또는 순 음전하를 갖는, 나노입자.
7. 상기 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자가 벡터당 108 내지 1012개의 중합체 분자를 함유하는, 나노입자.
8. 실시형태 7에 있어서, 상기 나노입자가 벡터당 약 109 내지 약 1010개의 중합체 분자를 함유하는, 나노입자.
9. 상기 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인, 나노입자.
10. 실시형태 9에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 나노입자.
11. 상기 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 중합체 분자에 연결된 하나 이상의 표적화 모이어티를 추가로 포함하는 나노입자.
12. 실시형태 11에 있어서, 표적화 모이어티가 항체, 항체 단편, scFv, 항체-유사 단백질 스캐폴드, 올리고펩티드, 압타머, L-RNA 압타머 및 세포 표면 수용체에 대한 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나노입자.
13. 실시형태 12에 있어서, 표적화 모이어티가 항-CD3 항체 또는 항-CD3 압타머인, 나노입자.
14. 상기 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 전이유전자가 키메라 항원 수용체를 코딩하는, 나노입자.
15. 상기 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 약 -15 mV 내지 약 +15 mV의 제타 전위를 갖는 나노입자.
16. 상기 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, VSV-G 외피 단백질이 결여된 나노입자.
17. 실시형태 16에 있어서, VSV-G 외피 단백질을 포함하는 유사한 나노입자와 비교하여 생체내 사용을 위한 개선된 안전성 프로파일을 갖는 나노입자.
18. 상기 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터가 바이러스 외피 단백질이 결여되어 있고, 상기 나노입자가 벡터당 중합체 분자의 임계수 이상에서만 포유동물 세포를 형질도입할 수 있는, 나노입자.
19. 실시형태 18에 있어서, 상기 벡터당 중합체 분자의 임계수 미만에서는, 중합체의 양이 벡터를 완전히 코팅하기에 불충분한, 나노입자.
20. 실시형태 18 또는 실시형태 19에 있어서, 상기 벡터당 중합체 분자의 임계수 미만에서는, 상기 나노입자가 구조적으로 불안정하거나 나노입자로부터 중합체 분자가 해리되는, 나노입자.
21. 실시형태 18 내지 실시형태 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 임계치가 결여된 벡터 또는 중합체-캡슐화된 벡터와 비교하여 생체내 사용을 위한 개선된 안전성 프로파일을 갖는 나노입자.
22. 상기 실시형태들 중 어느 하나의 나노입자의 제조 방법으로서,
(a) 전이유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 제공하는 단계;
(b) 중합체 또는 중합체의 혼합물 및 임의로 하나 이상의 표적화 모이어티를 제공하는 단계; 및
(c) 상기 바이러스 벡터를 상기 중합체 또는 중합체의 혼합물 및 임의로 하나 이상의 표적화 모이어티와 접촉시킴으로써 바이러스 벡터와 중합체 또는 중합체의 혼합물을 결합시켜 상기 나노입자를 형성하는 단계;
를 포함하는 방법.
23. 실시형태 22에 있어서, 바이러스 벡터가 외피 단백질이 결여된 것인, 방법.
24. 실시형태 22 또는 실시형태 23에 있어서, 단계(c)가 약 5.0 내지 약 6.5의 pH에서 수행되는, 방법.
25. 실시형태 24에 있어서, 단계(c)가 약 5.5 내지 6.0의 pH에서 수행되는, 방법.
26. 실시형태 22 내지 실시형태 25 중 어느 하나에 있어서, 중합체 또는 중합체의 혼합물이 하기 화학식을 갖는 폴리(베타-아미노 에스테르)를 포함하는, 방법.
Figure pct00003
상기 화학식에서,
각 Pep는 올리고펩티드이고; R은 OH, CH3 또는 콜레스테롤이고; m은 1 내지 20의 범위이고, n은 1 내지 100의 범위이고, o는 1 내지 10의 범위이다.
27. 실시형태 26에 있어서, 각각의 올리고펩티드가 R, E, K, D, H 및 C로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3개의 아미노산 잔기를 포함하는, 방법.
28. 실시형태 26에 있어서, 적어도 하나의 올리고펩티드의 아미노산 서열이 CRRR(서열번호 1) 또는 CHHH(서열번호 2) 또는 CKKK(서열번호 3) 또는 CEEE(서열 번호 4) 또는 CDDD(서열 번호 5)인, 방법.
29. 실시형태 22 내지 실시형태 28 중 어느 하나에 있어서, 중합체 또는 중합체의 혼합물이 pH 7에서 순 양전하 또는 순 음전하를 갖는, 방법.
30. 실시형태 22 내지 실시형태 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자가 벡터당 108 내지 1012개의 중합체 분자를 함유하는, 방법.
31. 실시형태 30에 있어서, 나노입자가 벡터당 약 109 내지 약 1010개의 중합체 분자를 함유하는, 방법.
32. 실시형태 22 내지 실시형태 31 중 어느 하나에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인, 방법.
33. 실시형태 32에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 방법.
34. 실시형태 22 내지 실시형태 33 중 어느 하나에 있어서, 벡터를 하나 이상의 표적화 모이어티와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 임의로 상기 표적화 모이어티가 중합체 또는 입자의 혼합물과 연결되는, 방법.
35. 실시형태 34에 있어서, 표적화 모이어티가 항체, 항체 단편, scFv, 항체-유사 단백질 스캐폴드, 올리고펩티드, 압타머, L-RNA 압타머 및 세포 표면 수용체에 대한 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
36. 실시형태 35에 있어서, 표적화 모이어티가 항-CD3 항체 또는 항-CD3 압타머인, 방법.
37. 실시형태 22 내지 실시형태 36 중 어느 하나에 있어서, 전이유전자가 키메라 항원 수용체를 코딩하는, 방법.
38. 실시형태 22 내지 실시형태 37 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터가 VSV-G 외피 단백질이 결여된 것인, 방법.
39. 실시형태 22 내지 실시형태 38 중 어느 하나에 있어서, 단계(c)가 중합체 또는 중합체의 혼합물이 순 양전하를 갖고 레트로바이러스 벡터가 음의 표면 전위를 갖는 pH에서 수행되는, 방법.
40. 질환의 치료 방법으로서, 실시형태 1 내지 실시형태 21 중 어느 하나의 나노입자 복수개를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 상기 대상체의 세포가 레트로바이러스 벡터에 의해 형질도입되고 전이유전자가 형질도입된 세포에서 발현되는 단계를 포함하는 방법.
41. 실시형태 40에 있어서, 질환이 암인, 방법.
42. 실시형태 40 또는 실시형태 41에 있어서, 대상체가 인간인, 방법.
43. 세포를 시험관내에서 형질도입하는 방법으로서, 배양된 세포를 실시형태 1 내지 실시형태 21 중 어느 하나의 나노입자 복수개와 접촉시킴으로써 배양된 세포의 적어도 일부가 레트로바이러스 벡터에 의해 형질도입되고 전이유전자가 형질도입된 세포에서 특이적으로 발현되는 단계를 포함하는 방법.
44. 실시형태 43에 있어서, 나노입자가 CD3-양성 세포로 표적화되고 전이유전자가 CD3-양성 세포에서 특이적으로 발현되는, 방법.
45. 실시형태 43 또는 실시형태 44에 있어서, 전이유전자가 키메라 항원 수용체를 코딩하는, 방법.
46. 유전자 요법의 수행 방법으로서, 시험관내 세포 또는 살아있는 유기체 내의 세포를 실시형태 1 내지 실시형태 21 중 어느 하나의 나노입자 복수개와 접촉시킴으로써 전이유전자가 상기 세포에서 발현되는 단계를 포함하는 방법.
47. 중합체 또는 중합체의 혼합물로 코팅된 바이러스 벡터를 포함하는 나노입자로서, 상기 바이러스 벡터가 외피 단백질의 감소된 수준을 포함하고 전이유전자를 포함하고, 상기 나노입자가 전이유전자를 진핵 세포에 전달하기 위한 비히클로서 기능하고, 상기 외피 단백질의 감소된 수준이 벡터의 세포 진입 및 벡터에 의한 세포의 형질도입을 촉진하기에 불충분한, 나노입자.
48. 실시형태 47에 있어서, 외피 단백질의 감소된 수준이 벡터가 유래된 기능성 바이러스의 외피 단백질의 양의 5% 이하인, 나노입자.
도 1a는 유전자 전달을 위한 나노입자의 실시형태의 개략도를 도시한다. 나노입자는 외피 단백질이 결여된 중합체-캡슐화된 바이러스 벡터 입자를 함유한다. 도 1b는 바이러스 벡터가 외피 단백질을 갖는, 유전자 전달을 위한 나노입자의 다른 실시형태의 개략도를 도시한다.
도 2는 바이러스 벡터가 다수의 중합체 층에 캡슐화되어 있는, 유전자 전달을 위한 나노입자의 실시형태의 개략도를 도시한다. 바이러스 벡터 외피 단백질은 도시되지는 않았지만 일부 실시형태에 존재할 수 있다.
도 3은 나노입자가 중합체 층(또는 중합체 다층이 사용될 경우에는 외부 중합체 층)에 부착된 표적화 모이어티를 포함하는, 유전자 전달을 위한 나노입자의 실시형태의 개략도를 도시한다.
도 4a 내지 도 4c는 세포를 GFP 전이유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하는 과정(도 4a), 항-VSV-G 항체를 사용하여 형질도입을 억제하는 과정(도 4b) 및 항체 매개된 억제를 벡터 입자의 중합체 캡슐화에 의해 방지하는 과정(도 4c)의 개략도이다
도 5a 내지 도 5c는 도 4a 내지 도 4c에 도시된 과정과 유사하지만 VSV-G 단백질이 결여된 렌티바이러스 벡터를 사용하는 과정의 개략도이다.
도 6a 내지 도 6f는 표시된 PBAE 중합체로 캡슐화된 볼드(bald) 렌티바이러스 벡터에 대한 제타 전위 측정 결과를 보여준다.
도 7은 조성 및 pH가 다양한 제형 완충액에서 항온배양 시간의 함수로서 GFP 전이유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터로의 HEK293T 세포의 형질도입 결과를 도시한다.
도 8a 내지 도 8h는 조성 및 pH가 다양한 표시된 제형 완충액에서 항온배양 시간(h)을 증가시킨 후 방출된 유리 p24의 함수로서 VSV-G 단백질이 결여된 렌티바이러스 벡터의 물리적 안정성을 도시한다. 도 8a 내지 도 8d는 LV 회합된 p24를 도시하고, 도 8e 내지 도 8h는 LV로부터 방출된 유리 p24를 도시한다.
도 9는 R 중합체/벡터 입자 비, 제형 완충액 조성 및 pH의 함수로서, VSV-G 단백질이 결여되고 GFP 전이유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터로의 HEK293T 세포의 형질도입 결과를 도시한다.
도 10은 도 9에 도시된 것과 유사하지만 두 중합체 모두가 콜레스테롤과 접합되었거나 접합되지 않은 R/H 중합체 혼합물을 사용한 실험의 결과를 도시한다.
도 11은 도 9에 도시된 것과 유사하지만 GFP 전이유전자를 함유하는 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터를 사용한 실험의 결과를 도시한다.
도 12는 VSV-G 항체의 존재 및 부재하에, 표시된 PBAE 중합체 및 중합체 분자/세포 비를 사용하여 캡슐화된 VSV-G+ 렌티벡터를 사용하여 형질도입한 후의 GFP 발현 및 세포 생존력의 결과를 도시한다. 데이터는 항체의 부재 하의 형질도입이 100%와 동일하다고 가정하여 정규화한다.
도 13a 내지 도 13d는 표시된 PBAE 중합체 및 중합체 분자/세포 비를 사용하여 캡슐화된 VSV-G-(볼드) 렌티벡터를 사용하여 형질도입한 후의 mCherry 발현 및 세포 생존력의 결과를 도시한다.
도 14a 내지 도 14f는 인간 림프구 비-캡슐화된 VSV-G+ 렌티바이러스 벡터(14a), 비캡슐화된 볼드 LV(14b), PBAE-캡슐화된 볼드 LV(14c) 및 모델 표적화 모이어티 PGA-항-CD3 Fab를 갖는 PBAE-캡슐화된 볼드 LV(14d)의 형질도입 결과를 도시한다. 도 14e에서, 림프구는 또한 CD19에 특이적인 CAR로 형질도입되었으며, CD3을 발현하는 세포는 CD19 CAR 발현에 대해 플롯팅되어 있다. 도 14f에서, 도 9e에 도시된 실험에 사용된 것과 동일한 림프구를 인간 CD19+ 암 세포(라모스(Ramos) 세포)와 접촉시키고, 암 세포에 대항한 세포독성을 4시간 후 CD19+ 세포의 손실에 의해 평가하였다.
도 15는 각각의 표시된 벡터 및 역가로 처리한 후 마우스 PBMC의 상이한 집단에서의 형질도입(GFP 발현) 결과를 도시한다.
유전자 요법 및 백신 적용을 위한 유전 물질의 전달을 향상시킬 수 있는 패키징된 바이러스 벡터 나노입자 조성물이 제공된다. 이들 조성물은 중합체 또는 중합체의 혼합물에 의해 캡슐화된 바이러스 벡터를 포함한다. 중합체 쉘은 대상체에게 비경구 투여 후 혈류 및 조직에서 바이러스 벡터 입자의 보호를 제공하고, 일부 실시형태에서 벡터를 이의 표적 세포에 전달하는 것을 도울 수 있다.
도 1a 및 1b는 본원에서 유전자 전달 비히클로도 지칭되는 본 기술에 따른 바이러스 벡터 나노입자의 2가지 실시형태를 도시한다. 본 비히클의 기본 구조는 중합체 쉘(11)에 의해 캡슐화된 레트로바이러스 벡터를 함유하는 나노입자(10)의 구조이다. 레트로바이러스 벡터는 막 외피(12), 외피 내에 배치된 단백질 캡시드(13) 및 캡시드 내에 배치된 하나 이상의 핵산 분자(14)를 포함한다. 바이러스 외피는 도 1b에 도시된 실시형태에서 이중층 막 내에 매립된 또는 이중층 막에 부착된 한 가지 이상의 유형의 바이러스 외피 또는 융합 단백질(20)을 함유하는 지질 이중층-기반 구조이며; 이러한 외피 또는 융합 단백질은 도 1a에 도시된 실시형태에서는 결여되어 있다. 외피 단백질을 갖거나 갖지 않는 바이러스 벡터 외피는 기능적으로도 본질적으로도 완전히 중합체 매트릭스(11)에 의해 캡슐화된다. 벡터 입자는 복수의 중합체 쉘에 의해 캡슐화될 수 있고(예를 들어, 도 2를 참조), 즉 다층 중합체 쉘에 의해 캡슐화될 수 있다. 도 3은 표적화 모이어티(40)가 중합체 쉘과 회합되어 있는 실시형태를 도시한다.
일부 실시형태에서, 본 기술은 바이러스 벡터 입자가 바이러스 외피 단백질이 결여된 신세대 합성 바이러스 벡터, 특히 렌티바이러스 벡터를 제공한다. 이러한 신규 플랫폼 기술은 일시적 형질감염에 의한 바이러스 벡터 입자의 저렴한 생산을 포함하여, 외피 단백질을 함유하는 바이러스 벡터 입자를 사용할 때와 비교하여 몇 가지 이점을 제공한다. 1) 바이러스 외피 단백질을 코딩하는 플라스미드의 제거로 인해 및 벡터가 생산 동안 생산 세포를 형질도입하지 않는다는 사실로 인해, 외피 단백질을 제거하는 것은 유용한 생산 시간을 증가시켜 생산된 벡터의 수율을 증가시킨다. 2) 바이러스 외피 단백질이 결여된 비코팅된 벡터가 세포를 형질도입할 수 없고 감소된 면역원성을 가지기 때문에, 외피 단백질이 결여된 벡터는 생체내 유전자 요법에서 사용하기에 더 안전하다. 3) 외피 단백질이 결여된 벡터는 특이적 중합체-매개 표적화의 사용으로 인해 더 높은 형질도입 정확성과 효율을 제공한다. 4) 중합체-캡슐화된 바이러스 벡터, 특히 렌티바이러스 벡터는 낮은 pH에서 통상적인(비코팅된) 바이러스 벡터보다 더 안정적이며, 이것은 특히 엔도좀 흡수 메커니즘이 관여할 때 이의 사용 안정성 및 유효성을 개선시킨다. 바이러스 벡터 입자로부터 바이러스 외피 단백질의 제거는, 이것이 세포를 형질도입하는 비코팅된 벡터 입자의 능력을 본질적으로 제거하고 중합체 코팅이 특이적 표적화를 제공할 수 있기 때문에, 중합체-코팅된 바이러스 벡터 입자의 사용에 특히 적합하다; 따라서, 비표적화된 세포를 형질도입할 위험이 급격히 감소된다. 또한, 바이러스 외피 단백질의 제거는 중합체 분자와 벡터 외피의 표면과의 단단한 회합을 촉진하여, 바이러스 외피 단백질을 함유하는 중합체 코팅된 바이러스 벡터 입자와 비교하여 더욱 우수한 안정성 및 더욱 확실한 표적화를 제공한다.
벡터의 나노미립자 형태를 생성하기 위해, 중합체 분자는 벡터 입자에 단단히 부착되어야 한다. 중합체 분자와 벡터의 느슨한 회합은 바이러스 벡터 입자의 표면으로부터 중합체 쉘의 적층박리 및 손실을 초래할 수 있으며, 후속적으로 활성이 손실될 수 있다. 레트로바이러스에 기초한 바이러스 벡터는 전형적으로 전이유전자 및 다른 필수적인 핵산 서열을 함유하는 코어 구조 또는 캡시드를 가지며, 코어 구조는 결과적으로 막 외피로 둘러싸여 있다. 외피는 전형적으로 바이러스 외피와 숙주 세포막의 부착 및 융합을 도와서 바이러스 벡터의 세포 진입을 가능하게 하는 바이러스 융합 단백질을 함유한다. 그러나, 본 기술의 실시형태에서, 세포 표적화, 부착 및 진입의 역할은 세포 흡수 및/또는 엔도좀 수준에서 세포를 형질도입하는 작용을 하여 바이러스 융합 단백질을 불필요하게 만들 수 있는 나노미립자 벡터 입자의 중합체 쉘에 의해 추정된다(볼드 LV의 경우에 복원된다). 또한, 벡터 외피 내에 바이러스 융합 단백질이 존재하는 것은 외피에 대한 중합체 분자의 단단하고 안정한 부착을 방해한다. 따라서, 본 기술의 소정의 실시형태에서, 바이러스 벡터 나노입자는 외피 단백질이 결여되도록, 특히 바이러스 융합 또는 "스파이크" 단백질이 결여되도록 조작되었다. 그 결과는 보다 견고한 나노입자 구조, 및 예컨대 정맥내 투여에 환자에게 투여될 때 보다 우수한 활성 및 보다 긴 반감기를 나타내는 보다 안정한 벡터이다.
폴리(베타-아미노 에스테르) 나노입자
본 기술에서, 바이러스 벡터가 "외피 단백질이 결여된다"는 것은 외피, 특히 벡터 외피의 지질 이중층에는, HIV gp120-gp41 복합체, 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G), 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 홍역 바이러스 H 및 F 단백질 및 야생형 또는 변형된 신드비스 바이러스 외피 단백질로 예시되는 Env 단백질 복합체 또는 바이러스 외피 당단백질과 같은 천연 발생 형태 또는 변형된 형태로 외피형 바이러스의 표면에서 전형적으로 발견되는 어떠한 단백질도 전혀 없다는 것을 의미한다. 본 기술의 벡터 나노입자에는 결여되어 있는 이러한 단백질은, 존재한다면, 벡터 외피의 지질 이중층으로부터 외부로 돌출하여 외부 중합체 층과 지질 이중층 사이에 요구되는 안정한 접촉을 방해할 것이다. 상이한 실시형태에서, 본 기술의 바이러스 벡터 나노입자는 i) 외피 단백질이 완전히 결여되어 있거나, ii) 외피 단백질이 본질적으로 결여되어 있거나(즉, 전형적인 바이러스 벡터 입자의 0.1% 이하와 같은 미량만을 함유함), iii) 전형적인 양의 10% 미만, 5% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만과 같은 소량의 외피 단백질을 갖는다. 외피 단백질의 전형적인 양은 세포 진입 및 형질도입을 위해 외피 단백질에 의존하는 바이러스 벡터 입자에 존재하는 양이거나 온전한 기능성 바이러스 입자의 외피에서 발견되는 양이다. 바이러스 벡터의 외피는 예를 들어 벡터가 생성되는 세포에서의 발현 동안 외피 단백질을 코딩하는 임의의 유전자를 제거함으로써 외피 단백질이 완전히 결여되도록 조작할 수 있다. 그러나, 외피의 외표면상에 스파이크-유사 구조를 형성하지 않는 막-매립형 또는 막 부착형 단백질이 소정의 실시형태에서 바이러스 벡터 나노입자의 지질 이중층에 존재할 수 있다.
일 실시형태에서, 바이러스 벡터 나노입자를 형성하는 데 사용되는 중합체는 하기 화학식을 갖는 폴리(베타-아미노 에스테르)의 종 하나 이상을 함유한다:
Figure pct00004
상기 식에서, Pep는 올리고펩티드이고, R은 OH, CH3 또는 콜레스테롤, 인지질 분자 또는 지방산 또는 아실 쇄이며, m은 바람직하게는 1 내지 20의 범위이고, n은 바람직하게는 1 내지 100의 범위이고, o는 1 내지 10의 범위이다. 다른 중합체 및 이들 서로의 혼합물 및 PBAE와의 혼합물도 바이러스 벡터 입자를 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 단일 라멜라(unilamellar) 또는 다중 라멜라(multilamellar) 지질 리포좀 또는 계면활성제 및/또는 지질 분자를 포함하는 미셀-유사 구조의 형태와 같은 지질을 사용하는 추가의 코팅 메커니즘이 또한 사용될 수 있다. 이러한 코팅은 외피 단백질이 결여된 바이러스 벡터 입자("볼드" 벡터)를 캡슐화하는데 특히 유용할 수 있다.
PBAE는 낮은 형질도입 효율 및 높은 독성을 나타내지만, DNA 및 RNA 둘 다를 별개의 나노입자로 축합할 수 있는 비-바이러스 폴리뉴클레오티드 전달 벡터로서 설명된 바 있다(Green, J.J. et al. Acc. Chem. Res. 41, 749-759 (2008)). PBAE는 디(아크릴레이트 에스테르) 단량체와 아민 단량체의 반응으로부터 형성될 수 있으며, 말단 변형으로 작용화될 수 있는 말단 아크릴레이트 기를 갖는 중합체를 생성한다. 말단 기는 거대분자 또는 올리고머의 말단에 있는 작용기 또는 구성 단위이다. PBAE의 말단 변형은 생물학적 특성의 개선을 가능하게 한다.
예를 들어, 1급 아민을 이용한 PBAE의 말단의 화학적 변형은 아크릴레이트-말단화 중합체보다 더 높은 형질감염 효능을 야기한다. 대안적으로, PBAE는 올리고펩티드로 말단 변형될 수 있으며, 이는 특이적 올리고펩티드 서열에 따라 벡터를 특정 세포 유형으로 표적화할 수 있다. 본원에 정의된 "올리고펩티드"는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 적어도 2개 또는 일부 실시형태에서 적어도 3개의 일련의 아미노산을 포함한다. 적합하게 변형된 PBAE의 예는 WO2014/136100 및 WO2016/116887에 기재되어 있으며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 올리고펩티드 펩티드는 아르기닌(R), 글루탐산 (E), 리신(K), 아스파르트산(D), 히스티딘(H) 및 시스테인(C)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고펩티드는, 생리학적 조건 하에, 양으로 하전된(예컨대, R, K 또는 H) 또는 적어도 부분적으로 양으로 하전된 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 아미노산을 함유한다. 다른 실시형태에서, 올리고펩티드는 양으로 하전된 아미노산의 부재 하의 또는 양으로 하전된 아미노산과 혼합된 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산(예컨대, D 또는 E)을 함유한다. 본 실시예에 제시된 데이터는 음으로 하전된 아미노산의 포함이 아마도 엔도좀 탈출을 개선시킴으로써 볼드 렌티바이러스 벡터의 성능을 개선시킨다는 것을 보여준다. 중합체 또는 중합체의 혼합물을 포함하는 중합체들의 각 말단에 있는 올리고펩티드는 바람직하게는 동일하다.
PBAE 나노입자는 벡터가 환자의 순환을 통해 수송되는 동안 온전한 상태로 유지되는 것을 보장한다. 나노입자는 숙주의 면역계로부터 바이러스 벡터를 보호하는데 도움을 주어, 예를 들어 청구된 나노입자가 항-바이러스 외피 중화 항체의 존재 하에서도 높은 형질도입 효율을 유지할 수 있는 것을 보장할 수 있다. 게다가, 입자는 벡터가 목적하는 면역 세포만을 형질감염시키는 것을 보장할 수 있다: 나노입자 변형 및/또는 표적화 모이어티의 존재는 나노입자를 관심대상의 조직으로 특이적으로 유도할 수 있다.
바람직하게는, 본 기술에 사용된 PBAE는 1,000 내지 100,000 g/mol, 보다 바람직하게는 2,000 내지 50,000 g/mol 및 보다 더욱 바람직하게는 5,000 내지 40,000 g/mol의 분자량을 갖는다.
바이러스 벡터 외피를 코팅하는 중합체 층 또는 쉘은 단일의 균질한 중합체 층을 형성할 수 있거나, 동일하거나 상이한 중합체 또는 상이한 순 전하 또는 가교결합 정도를 갖는 중합체의 2개 이상의 중첩 층을 형성할 수 있다. 다른 비-PBAE 중합체는 PBAE와 혼합되거나 PBAE 층의 위 또는 아래에 첨가되어 중합체 쉘을 형성할 수 있다.
나노입자의 표면 전하(또는 표면 전위 또는 제타 전위)는 조직 표적화 및 세포 형질도입에 중요하며 중합체 변형을 통해 미세하게 조정될 수 있다. 바람직하게는, 생리학적 사용 조건 하에 나노입자의 제타 전위는 약 -30 mV 내지 약 +30 mV의 범위 또는 보다 바람직하게는 약 -15 mV 내지 약 +15 mV의 범위이다. 중합체 나노입자는 한 가지 유형의 중합체 또는 복수 유형의 중합체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체 코팅은 단일 층 코팅, 이중 층 코팅 또는 다층 코팅을 형성한다. 도 2는 레트로바이러스 벡터를 캡슐화하는 상이한 중합체 코팅의 제1 층(30), 제2 층(31) 및 제3 층(32)을 포함하는 벡터 나노입자의 실시형태를 도시한다. 일부 실시형태에서, 다층 코팅은 음이온성 중합체 및 양이온성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 중합체는 하나 이상의 PBAE를 포함한다. 일부 실시형태에서, 음이온성 중합체는 폴리글루탐산(PGA), 콘드로이틴 설페이트 및/또는 히알루론산이다. 소정의 실시형태에서, 바이러스 벡터는 교호 순 전하를 갖는 교호 층, 즉 양으로 하전된 층에 음으로 하전된 층이 뒤따르고 그 다음에 양으로 하전된 층이 있는 것과 같은 2개 이상의 중합체 층 내에 캡슐화된다. 일부 실시형태에서, 나노입자의 순 전하는 pH 7에서 양의 값이다. 일부 실시형태에서, 나노입자의 순 전하는 pH 7에서 음의 값이다. 일부 실시형태에서, 나노입자의 순 전하는 조직-의존적이다. 일부 실시형태에서, 입자는 음으로 하전되어 있지만, 종양 미세환경에서는 양으로 하전된다. 일부 실시형태에서, 입자는 소정의 화학 결합의 붕괴 또는 절단을 통해 약산성 종양 미세환경 및 엔도좀/리소좀에 반응하며, 이로 인해 아래의 PBAE 층이 노출되고 "양성자-스펀지" 효과를 발휘한다.
본원에서 사용되는 용어 "나노입자"는 약 1 내지 약 1000 nm의 직경을 갖는 고체 입자를 지칭한다. 본 기술의 나노입자의 평균 직경은 당업계에 공지된 방법, 바람직하게는 동적 광산란에 의해 결정될 수 있다. 특히, 본 기술은 여과된 PBS로 적절하게 희석된 샘플 및 맬버른 인스트루먼트(Malvern Instruments)(영국)의 ZETASIZER 기기 중 하나와 같은 적절한 기기을 사용하여 90°의 산란각 및 25℃의 온도에서 동적 광산란에 의해 분석할 때 약 1 내지 약 1000 nm의 직경을 갖는 고체 입자인 나노입자에 관한 것이다. 입자가 x nm의 직경을 갖는다고 언급되는 경우에, 일반적으로 이러한 평균에 대한 입자의 분포가 있을 것이지만, 개수를 기준으로 입자의 적어도 50%(예를 들어, > 60%, >70%, >80%, >90% 또는 그 이상)는 x ± 20% 범위 내의 직경을 가질 것이다.
나노입자의 직경은 약 5 nm 내지 약 999 nm일 수 있고, 바람직하게는 약 50 nm 내지 약 400 nm, 더욱 바람직하게는 약 100 nm 내지 약 300 nm이다. 대안적으로, 나노입자의 직경은 약 10 내지 약 100 nm일 수 있다. 일 실시형태에서, 나노입자는 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만 및 바람직하게는 1% 미만의 응집도를 나타낸다. 바람직하게는 나노입자는 투과 전자 현미경 또는 또 다른 방법에 의해 결정시 실질적으로 응집되지 않는다.
레트로바이러스 벡터
레트로바이러스는 안정한 방식으로 숙주 게놈에 통합하는 능력을 갖는 RNA 바이러스이다. 바람직한 실시형태에서, 유전자 전달 비히클 내의 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 렌티바이러스 벡터는 레트로바이러스 과의 느린 바이러스의 속을 대표하는 렌티바이러스로부터 유래된다. 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 시미안 면역결핍 바이러스(SIV), 말 전염성 뇌염 바이러스(EIAV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV), 소 면역결핍 바이러스(BIV) 및 고양이 면역결핍 바이러스(FIV)를 포함한다. 렌티바이러스는 분열 세포 및 비-분열 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 또한, 이들은 이들의 숙주에서 무기한으로 존속하고 지속적으로 복제할 수 있다. 본원에 기재된 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 캡시드를 갖지만 외피 단백질이 결여되어 있다. 바람직하게는, 벡터는 의도된 숙주 또는 치료 대상체의 세포에서 비-복제성이다. 바람직하게는, 벡터는 비-표적화된 세포를 형질도입하지 않거나 이의 유전자 발현을 변경하지 않는다. 바람직하게는, 벡터는 병원성, 특히 비-표적화된 세포의 의도하지 않은 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타나는 병원성을 유발하는 임의의 유전자가 결여되어 있다.
렌티바이러스 벡터는 면역요법을 위한 도구로서 몇 가지 장점을 나타낸다. 이들은 다른 벡터에 비해 독성이 적고 수지상 세포를 포함하는 비-분열 세포를 형질도입할 수 있다(He et al. 2007, Expert Rev Vaccines, 6(6):913-24). 그러나, 렌티바이러스는 생체내 복제에 요구되는 보조 유전자(예를 들어, vif, vpr, vpu, nef, tat 및 rev)의 존재로 인해 다른 레트로바이러스보다 더 복잡하다.
통합적이지만 복제-결함성인 렌티바이러스 벡터의 생체생산은 렌티바이러스의 시스(cis)- 및 트랜스(trans)-작용 서열의 분리에 기초한다. 비-분열 세포에서의 형질도입은 렌티바이러스 게놈 내의 2개의 시스-작용 서열, 중심 폴리푸린 트랙(cPPT) 및 중심 종결 서열(CTS)의 존재를 필요로 한다. 이는 수지상 세포(DC)를 포함하는 비-분열 세포의 핵 내로의 유전자 이입의 효율을 최대화하는 삼중-가닥 DNA "플랩(flap)"의 형성을 초래한다(Zennou et al., 2000, Cell, 101(2) 173-85; Arhel et al., 2007, EMBO J, 26(12):3025-25 37). 또한, LTR U3 서열의 제거는 바이러스 프로모터 및 인핸서 서열이 전혀 없고 보다 안전한 "자가-불활성화" 벡터를 초래하였다.
렌티바이러스 벡터를 함유하는 렌티바이러스 입자는 DNA 플라스미드, 예를 들어 (i) Gag, Pol, Rev, Tat, 및 임의로 전달 작제물의 패키징에 필요한 구조 단백질 또는 효소를 발현하는 패키징 플라스미드; (ii) 패키징, 역전사 및 통합에 필요한 발현 카세트 및 HIV 시스-작용 인자를 함유하는 프로바이러스 전달 플라스미드; 및 (iii) 광범위한 세포, 특히 수지상 세포(DC) 및 대식세포를 포함하는 항원 제시 세포(APC)를 형질도입할 수 있는 혼합된 입자(슈도타입)의 형성을 가능하게 하는 단백질인 소포성 구내염 바이러스(VSV-G)의 당단백질과 같은 외피 단백질을 코딩하는 플라스미드의 조합을 사용하여 HEK 293 세포의 일시적 형질감염(T 항원의 존재 또는 부재, 현탁액 중에서 부착성 또는 성장)에 의해 생성할 수 있다. 본 기술에서, 외피 단백질을 코딩하는 플라스미드는 소정의 실시형태에서 완전히 생략되는 반면, 다른 실시형태에서는 이것이 포함되지만 이의 발현은 낮은 수준으로 유지된다. 렌티바이러스 입자 벡터는 또한 패키징 유전자 및 프로바이러스 코딩 DNA를 세포 게놈 내로 안정하게 삽입함으로써 연속적으로 생성할 수 있다. 통합 된 플라스미드와 일시적 형질감염의 조합도 사용할 수 있다. 그러나, 소정의 실시형태에서, 본원에 설명된 유전자 전달 비히클에 사용하기에 적합한 렌티바이러스 벡터는 외피 단백질이 없다는 것을 유의해야 한다.
외피 단백질이 결여된 비-통합 렌티바이러스 벡터도 유전자 전달 비히클에 사용될 수 있다. 비-통합 렌티바이러스 벡터의 예는 문헌[Coutant et al., PLOS ONE 7(11):e48644 (2102); Karwacz et al., J. Virol. 83(7):3094-3103 (2009); Negri et al., Molecular Therapy 15(9):1716-1723 (2007); and Hu et al., Vaccine 28:6675-6683 (2010)]에서 찾아볼 수 있다.
프로바이러스 서열의 5'LTR에는 U3이 없기 때문에, 전이유전자의 발현은 내부 프로모터에 의해 구동된다. 강력한 인핸서의 존재로 인해 CMV 프로모터와 같은 바이러스 프로모터를 사용하지 않는 것이 바람직하다. 유비퀴틴, PGK, β-액틴, GAPDH, β-키네신 등을 코딩하는 인간 유전자에 대한 프로모터와 같은 편재성 프로모터(ubiquitous promoter)가 사용될 수 있다. 대안적으로, 인간 MHC 클래스 I 유전자에 대한 프로모터와 같이 T-세포 및 APC에서 활성인 프로모터가 사용될 수 있다. 모든 경우에, 프로모터는 바람직하게는 인핸서를 함유하지 않는다. 프로모터는 바람직하게는 표적 세포에서 전이유전자의 치료적 발현 수준을 달성하도록 선택된다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 표적 세포에 특이적이며, 즉 표적 세포에서 전이유전자의 치료적 발현 수준을 가능하게 하고, 바람직하게는 비-표적 세포에서보다 표적 세포에서 더 높은 수준의 전이유전자 발현을 가능하게 하고; 소정의 실시형태에서, 프로모터는 비-표적 세포에서 전이유전자의 발현을 거의 가능하지 않게 하거나 전혀 가능하지 않게 한다.
바이러스 벡터의 중합체 캡슐화
세포를 형질감염시키기 위해 중합체-캡슐화된 비히클을 사용하는 이전의 기술들은 PBAE와 같은 중합체로 직접 코팅된 플라스미드 또는 다른 핵산 분자를 수반하였다. 이러한 기술들 중 일부는 핵산 분자를 사용하여 형질감염을 달성하였다 (US2016/0145348A1, Mangraviti et al. 2015, Anderson et al. 2004, WO2016/116887). pH 7에서 PBAE 중합체의 열악한 안정성이 보고되었다(Lynn et al. 2000). 이러한 제제는 세포 독성을 유발하여 중합체-코팅된 플라스미드 또는 다른 핵산 분자에 노출시 세포 사멸을 초래할 수 있다. 따라서, 생체내 또는 시험관내에서 세포에 투여되는 PBAE-캡슐화된 벡터의 용량은, 독성 효과를 피하기 위해, 유용한 형질도입에 필요한 최소한으로 유지되어야 한다. 그러나, PBAE-캡슐화된 바이러스 벡터는 유리하게는 낮은 pH에서 분해에 저항한다.
본 발명자들의 지식에 따르면, LV와 같은 바이러스 벡터의 중합체 캡슐화는 이전에는 달성되지 않았다. 본 발명자들은 세포를 형질도입시 낮은 독성과 높은 효과를 갖는 안정한 중합체-캡슐화된 LV 입자를 생성하는 LV 및 다른 바이러스 벡터의 중합체 캡슐화 방법을 개발하였다. 생존가능한 캡슐화된 벡터를 생성하는데 있어 중요한 요소는 사용된 중합체의 유형(예를 들어, 이의 전하 및 전하 분포), 중합체 분자 대 벡터 입자의 비 및 캡슐화에 사용된 pH를 포함한다. 이들 파라미터의 효과를 조사하고 하기 실시예 1 및 2에서 설명한다.
PBAE 중합체 및 LV를 사용하여, 표적 세포의 효율적인 형질도입을 가능하게하는 입자를 생성하는 성공적인 캡슐화는 벡터 입자당 약 108 내지 1011개의 중합체 분자를 필요로 하고; 비가 높을수록 독성이 발생할 수 있다. 또한, 성공적인 캡슐화를 위한 최적의 pH는 LV가 VSV-G+를 함유하는지 또는 그렇지 않은지(VSV-G- 또는 "볼드" LV) 여부에 따라 다르다. VSV-G+ LV의 경우에, pH 5에서 높은 수준의 VSV-G 항체-내성 형질도입에 의해 지시되는 바와 같이 PBAE를 이용한 최적의 캡슐화는 약 pH 5에서 발생하지만, 더 높은 pH 값에서는 캡슐화가 거의 발생하지 않거나 전혀 발생하지 않았다. 대조적으로, VSV-G- LV의 경우에, 최적의 PBAE 캡슐화 효율은 약 5.0, 5.5, 6.0 또는 6.5, 또는 5.0 내지 6.5, 또는 5.0 내지 6.0, 또는 5.5 내지 6.0, 또는 5.5 내지 6.5와 같은 더 폭넓고 낮은 pH 범위에서 발생한다. 반면에 VSV-G- LV의 경우에, 최적의 PBAE 캡슐화 효율은 약 5.0, 5.5, 6.0 또는 6.5, 또는 5.0 내지 6.5, 또는 5.0 내지 6.0, 또는 5.5 내지 6.0, 또는 5.5 내지 6.5와 같은 낮은 pH 범위에서 발생한다. 실시예 2를 참조한다. 마지막으로, 형질도입된 세포의 생존력에 영향을 미치지 않는 성공적인 캡슐화를 위한 최적의 pH는 LV가 VSV-G+를 함유하는지 여부에 관계없이 동일하며, 예컨대 5.0 또는 5.5이다.
나노입자는 필요한 물질을 포함하는 용액을 혼합한 다음, 용액을 배양함으로써 형성할 수 있다. 예를 들어, 나노입자는 PBAE를 포함하는 용액과 바이러스 벡터를 포함하는 용액을 혼합한 다음, 용액을 항온배양함으로써 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용액은 글루코스와 같은 당을 함유한다. 일부 실시형태에서, 용액은 5% 글루코스를 함유한다. 일부 실시형태에서, 용액은 완충액을 함유한다. 일부 실시형태에서, 완충액은 나트륨 아세테이트이고, 나트륨 아세테이트 완충액의 최종 농도는 2 내지 50 mM, 10 내지 30 mM, 또는 약 25 mM이다. 일부 실시형태에서, 완충제는 Tris-HCl 완충제이고, Tris-HCl 완충제의 최종 농도는 2 내지 40mM, 5 내지 30mM 또는 15 내지 25mM이다. 일부 실시형태에서, 용액은 적어도 5분 동안 항온배양한다. 일부 실시형태에서, 용액은 적어도 30분 동안 항온배양한다. 일부 실시형태에서, 용액은 밤새 항온배양한다. 용액은 4 내지 40℃ 또는 17 내지 25℃에서 항온배양할 수 있으며; 바람직하게는, 용액은 4℃에서 항온배양한다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 레트로바이러스 입자상으로의 이온성 중합체의 층상 침착을 사용하여 다층-코팅된 바이러스 벡터를 형성함으로써 형성한다. 일부 실시형태에서, 이온성 중합체를 함유하는 용액은 바이러스 벡터 입자를 함유하는 용액과 접촉시킨다. 중합체 대 바이러스 벡터 입자의 비는 중량을 기준으로 약 1:100 내지 약 5:1의 범위일 수 있다. 나노입자가 평균적으로 중합체-코팅된 나노입자당 단일 바이러스 벡터 입자를 함유하도록 비를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 모든 중합체 대 바이러스 벡터의 중량비는 약 1:100 내지 약 1:1 또는 약 1:50 내지 약 1:1 또는 약 1:20 내지 약 1:1 또는 약 1:10 내지 약 2:1 또는 약 1:1 내지 약 5:1일 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 중합체는 인간 또는 다른 대상체로의 재구성 후 동결건조 및 직접 주사와 양립할 수 있는 글루코스 또는 다른 당 중의 레트로바이러스 입자의 현탁액에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 중합체 및 양으로 하전된 중합체를 순차적으로 첨가하여 교호 전하를 갖는 중합체 층을 형성한다. 일부 실시형태에서, 중합체는 30분 간격으로 첨가된다. 일부 실시형태에서, 5개의 중합체 층이 존재한다. 일부 실시형태에서, 다층-코팅된 바이러스 벡터는 pH 7에서 순 음전하를 갖는다. 일부 실시형태에서, 다층 코팅된 바이러스 벡터는 pH 7에서 순 양전하를 갖는다. 층의 수 및 극성은 관심대상의 특정 세포 유형의 형질도입 효율을 최적화하도록 선택될 수 있다.
바람직하게는, 나노입자는 바이러스 벡터 입자 표면 전하, 표면 전위 또는 제타 전위가 바이러스 벡터 입자 주변에 중합체 쉘을 형성하는 하나 이상의 중합체의 것과 반대가 되는 pH에서 형성된다. 일부 실시형태에서, pH는 하나 이상의 레트로바이러스 외피 단백질 또는 외피 전체의 등전점의 pH보다 높다. 예를 들어, pH는 약 4.0, 4.5, 5.0, 5.4, 5.4, 5.5, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.5, 6.8 또는 7.0 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 약 5의 pH를 갖는 용액에서 형성된다.
표적화 모이어티
나노입자 벡터 전달 비히클은 요법을 요구하거나 벡터에 의한 단백질 발현이 요망되는 특정 표적 세포 또는 조직으로 표적화될 수 있다. 표적화 모이어티의 다른 실시형태는 도 3에 도시되어 있으며, 여기서 전달 비히클은 중합체 표면에 공유 적으로 또는 비공유적으로 부착된 표적화 모이어티를 함유한다. 표적화 모이어티는 생체내 또는 시험관내에서 특정 세포 또는 세포 부류를 표적화 할 수 있다. 표적화 모이어티의 예는 단백질(예를 들어, 인간, 마우스, 낙타 및 상어 항체를 포함하는 항체, 단일사슬 항체, 나노바디, 디아바디 및 항체의 항원-결합 단편), 펩티드, 압타머 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산, 또는 세포-표면 수용체 또는 세포외 매트릭스의 성분에 결합하는 리간드를 포함한다.
일 실시형태에서, 전달 비히클은 키메라 수용체가 결합하는 세포(예를 들어, 종양 세포 또는 병원체 세포)의 사멸을 향상시키도록 키메라 항원 수용체(CAR) 단백질과 같은 하나 이상의 치료 단백질의 발현을 위해 특히 T-세포에서 표적화된다. 바람직한 실시형태에서, 벡터에 대한 표적 세포는 T-세포(CD3+ T 세포로서) 또는 NK 세포이다. 표적화는 표적 세포의 표면상의 단백질에 대한 특이성을 갖는 하나 이상의 DNA 압타머 또는 항체를 사용하여 달성될 수 있다. 압타머 또는 항체는 나노입자 내로 통합되고 나노입자의 표면에서 노출될 때 표적화 모이어티로서 작용한다. 예를 들어, 표적화 모이어티는 CD3 또는 CD8, 또는 CD3과 CD8의 조합에 특이적으로 결합할 수 있다. 대안적으로 또는 이에 추가하여, 표적화 모이어티는 CD45RA, CCR7, CD62L, CD27, CD28, IL7-Ra 또는 DC-SIGN과 같은 나이브(naive) T-세포에서만 발견되는 표면 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 표적화 모이어티들의 조합이 사용될 수도 있다.
그러나, 표적화는 CAR 기술 또는 혈액 세포로 제한되지 않는다. 어떠한 세포 유형이라도 표적화될 수 있다. 예를 들어, 소정의 유전자 요법 적용에서, 결함 기능을 복원하거나 교체할 필요성에 따라 특정 조직 또는 세포 유형(예를 들어, 조혈세포, 근육세포, 섬세포 등)이 표적화될 수 있다. 다른 적용에서, 재조합 이벤트의 위험을 감소시키기 위해 분할 세포보다 휴지기 세포가 더 표적화될 수 있다). 또 다른 적용에서, 예를 들어 암 백신에서 암 세포와 같은 분열 세포가 표적화될 수 있다.
전이유전자 및 이의 발현 생성물
본원에 설명된 유전자 전달 비히클의 바이러스 벡터는, 세포에 진입한 후, 세포에서 발현되어 발현 생성물을 생성하는 하나 이상의 전이유전자를 함유한다. 바이러스 벡터는 1개, 2개, 3개 이상의 전이유전자를 함유할 수 있다. 전이유전자는 치료 단백질 또는 마커 단백질을 포함하는 임의의 천연 발생 또는 인공(즉, 재조합) 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다. 이러한 벡터-발현된 단백질은 바람직하게는 이들이 발현되는 대상체에서 치료적 가치를 가지며, 따라서 치료적 단백질이다. 치료적 단백질의 한 유형은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 본원에 설명된 기술에 사용하기 위한 CAR은 결합하기 위해 펩티드 프로세싱 또는 HLA 발현을 필요로 하지 않는 세포 표면 항원에 대한 결합 특이성을 갖는, T-세포 수용체와 같은 재조합 항원 수용체이다. 항원-결합 부분은 항체로부터 유래된 scFv, 라이브러리로부터 선택된 Fab일 수 있거나 세포 표면 수용체에 대한 천연 발생 리간드일 수 있다. 이것은 또한 나노바디(VHH)일 수 있다. CAR 분자의 나머지는 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 커플링시킨다. 구체적으로, 본 기술의 CAR은 다음 각각의 도메인 중 하나 이상을 포함한다: 세포외 항원-결합 도메인, 힌지 및 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 세포내 신호전달 도메인(CD3제타 및/또는 CD28 또는 41-BB/OX40). 유전자 전달 비히클에 사용하기에 적합한 CAR 및 렌티바이러스 벡터에서 이를 코딩하는 서열에 대한 추가의 세부사항은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO2016/012623A1에서 찾아볼 수 있다.
본 기술의 유전자 전달 비히클을 사용하여 전달할 수 있는 다른 유전자는 인터루킨 1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 IL-12, GM-CSF 및 G-CSF와 같은 인터루킨 및 사이토카인을 포함한다. 바이러스 항원, 세균 항원, 진균 항원 또는 기생충 항원과 같은 항원을 코딩하는 유전자가 또한 전달될 수 있다. 항원이 발현될 수 있는 바이러스는 피코르나바이러스, 코로나바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 랍도바이러스, 파라믹소바이러스, 오르토믹소바이러스, 분야바이러스(bunyavirus), 아렌바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 파포바바이러스, 파보바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 헤파드나바이러스 및 해면형 바이러스(spongeform virus)를 포함한다. 바람직한 바이러스 표적은 인플루엔자, 단순포진 바이러스 1 및 2, 홍역, 천연두, 폴리오 또는 HIV를 포함한다. 병원체는 트리파노소마, 촌충, 회충, 연충을 포함한다. 태아 항원 또는 전립선 특이적 항원과 같은 종양 항원도 이러한 방식으로 표적화될 수 있다. 백신접종 목적을 위한 본 기술에 따른 벡터의 투여는 임의의 공지된 백신접종 전략에 따라 수행될 수 있다. 개체의 백신접종은 임의의 목적하는 스케줄에 따라 수행될 수 있으며; 바람직하게는 백신접종은 매해 또는 2년마다 1회와 같이 드물게만 요구되며, 감염원에 대한 장기간의 면역학적 보호를 제공한다.
바이러스 벡터 전이유전자는 또한 항-체크포인트 단백질(anti-checkpoint protein)을 코딩할 수 있다. 전이유전자에 의해 코딩될 수 있는 항-체크포인트 단백질의 예는 CTLA-4, PD1, PDL1, LAG-3, TIM 3, B7-H3, ICOS, IDO, 4-1BB, CD47 및 이들의 조합의 억제제이다.
유전자 전달 비히클의 사용
본 기술의 유전자 전달 비히클은 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포 또는 인간 세포와 같은 관심대상의 세포에서 유전 물질의 효과적인 형질도입을 요구하는 임의의 적용에서 사용될 수 있다. 전달 비히클은 높은 효율로 세포를 형질도입하고 낮은 독성 및 낮은 면역원성을 나타낸다. 이들은 유전 물질을 숙주 세포 게놈 내로 영구적으로 통합시켜, 시스템이 세포 및 이의 자손의 영구적 표지에 특히 적합하게 만든다. 본 비히클은 생체내에서도 높은 특이성, 낮은 독성 및 높은 형질도입 능력을 나타내기 때문에, 본 비히클은 인간 및 동물의 요법뿐만 아니라 동물 모델에서의 유전자 전달 및 유전자 치료 적용 둘 다에 특히 적합하고, 이에 따라 상이한 생물학적 기능의 기저가 되는 분자적 메커니즘의 조사 및 이를 요법으로 옮기는 것을 가능하게 한다. 그러나, 중합체-캡슐화된 바이러스 벡터 나노입자의 일부 제제는 우선적으로 분열 세포를 형질도입하고 비분열 세포는 형질도입하지 않는 것과 같은 소정의 세포 유형을 형질도입하는 것으로 제한될 수 있다.
본 기술의 전달 비히클은 생물제제 제조 및 가축과 식물 개량과 같은 생명공학 적용을 위해 세포를 유전자 조작하는 데 사용될 수 있다. 관심대상의 유전자 또는 유전자들의 정확하고 안정한 삽입은 이러한 활동에 필수적이며 본 기술의 비히클을 이용하여 일관되게 달성될 수 있다. 비히클은 형질전환된 세포(중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HEK293 세포) 또는 1차 세포와 같은 제조 목적으로 사용되는 세포에 원래 존재하지 않는 유전자를 삽입하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 비히클은 이들 세포에 존재하는 소정의 유전자, 예컨대 면역원성의 일반적인 원인인 단백질 글리코실화에 관여하는 유전자를 "녹아웃(knock out)"하는 데 사용될 수 있다. 비히클은 예를 들어 성장 및 성숙을 가속화함으로써 가축에 영향을 미치는 질환을 예방, 치료 또는 치유하거나 이의 경제적 가치를 개선시키는 데 사용될 수 있다.
유전자 전달 비히클을 사용하여 시험관내 또는 생체내 유전자 요법의 일부로서 유전 물질을 전달할 수 있다. 유전자 전달 비히클을 유전자 요법에서 이용하여, 유전자의 질환-유발 돌연변이 버젼을 건강한 유전자 카피로 대체하고; 적절하게 기능하지 않는 유전자를 불활성화 또는 "녹아웃"하고/하거나 질환과 싸우는 것과 같이 세포에 새로운 유전자를 도입할 수 있다. 레트로바이러스 벡터의 사용은 일반적으로 유전 물질을 관심대상의 세포에 영구적으로 삽입할 수 있게 한다. 렌티바이러스 벡터의 사용은 특히, 심지어 비-분열 세포 내로도 유전 물질을 영구적으로 삽입할 수 있게 한다.
유전자 전달 비히클은 생체내에서 세포를 형질도입하여 전이유전자의 기능적 발현을 유도할 수 있고, 따라서 유전자 요법을 수행하는 데 사용될 수 있다. 벡터 전달 비히클은 비경구로, 예컨대 정맥내, 근육내 또는 종양내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 벡터 전달 비히클은 외부에서, 예컨대 경구 또는 비강으로 투여될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 뇌내 및 폐를 포함하는 임의의 다른 적합한 경로로 투여될 수 있다.
본 기술의 유전자 전달 비히클은 또한 시험관내에서 세포를 형질도입할 수 있어, 전이유전자의 기능적 발현을 유도하고 따라서 시험관내 및 생체외에서 유전자 요법을 수행하는 데 사용될 수 있다. 환자의 세포는 (예를 들어, 혈액 또는 골수 샘플 또는 생검을 통해) 수득할 수 있고 실험실 환경에서 설명된 벡터 전달 비히클 중 하나와 접촉시킬 수 있다. 그 다음, 형질도입된 세포를 환자에게 복귀시키고 질환을 치료하는데 도움을 줄 수 있다.
본 기술의 유전자 전달 비히클을 사용한 유전자 요법으로 치료할 수 있는 질환은 중증 복합 면역결핍(SCID), 만성 육아종병(CGD), 비스코트-얼드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome: WAS), 재발성 급성 30 림프모구 백혈병(relapsed acute 30 lymphoblastic leukemia: ALL), 부신백질이영양증(ALD), 혈우병 B, 아데노신 데아미나제(ADA) 결핍증, 낭포성 섬유증(CF), 베타-탈라세미아, 겸상 적혈구 질환, 뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 가족성 고콜레스테롤 혈증 및 유전성 실명과 같은 유전 장애를 포함한다. 치료 가능한 질환은 또한 파킨슨병, 알츠하이머병 및 헌팅턴병과 같은 신경퇴행성 장애를 포함한다. 이러한 질환은 심장 질환, 당뇨병, 골관절 장애 및 감염성 질환(예를 들어, 특히 인플루엔자, HIV, 간염)과 같은 후천성 질환을 포함한다. 추가의 치료 가능한 질환은 전립선암, 췌장암, 뇌암, 피부암, 간암, 결장암, 유방암 및 신장암과 같은 암을 포함한다.
실시예 1. 중합체-코팅된 렌티바이러스 벡터의 생산
세포 형질도입 연구에 사용하기 위한 중합체-코팅된 렌티바이러스 벡터는 하기 물질 및 방법을 사용하여 제조하였다.
물질
전달 벡터 플라스미드는 pARA-CMV-GFP 또는 pARA-CMV-mCherry 또는 pARA 또는 pAra-hUBC-CD19였다.
카나마이신-내성 플라스미드는 발현 카세트가 클로닝된 프로바이러스(HIV-1로부터 유래된 비병원성 및 비복제성 재조합 프로바이러스 DNA)를 코딩하였다. 삽입체는 전이유전자, 전이유전자 발현을 위한 프로모터 및 전이유전자 발현을 증가시키고 렌티바이러스 벡터가 비-유사분열 세포 유형을 포함하는 모든 세포 유형을 형질도입할 수 있게 하기 위해 첨가된 서열을 함유하였다. 코딩 서열은 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 mCherry(적색 형광 단백질) 또는 CD19를 코딩하는 유전자에 상응한다. 프로모터는 인간 유비퀴틴 프로모터 또는 CMV 프로모터였다. 상기 프로모터는 임의의 인핸서 서열이 없고, 편재 방식으로 높은 수준에서 유전자 발현을 촉진하였다. 비-코딩 서열 및 발현 신호는 5'LTR(U3-R-U5)에 대한 전체 시스-활성 요소 및 3'LTR에 대해 결실된 1개를 갖는 긴 말단 반복 서열(LTR)에 상응하고, 따라서 프로모터 영역(ΔU3-R-U5)이 결여된다. 전사 및 통합 실험을 위해, 캡슐화 서열(SD 및 5'Gag), 벡터의 핵 전좌를 위한 중심 폴리푸린 트랙/중심 종결 부위 및 BGH 폴리아데닐화 부위를 첨가하였다.
패키징 플라스미드는 pARA-Pack이었다. 카나마이신 내성 플라스미드는 렌티바이러스 프로바이러스의 캡슐화에 사용되는 구조적 렌티바이러스 단백질(GAG, POL, TAT 및 REV)을 코딩하였다. 코딩 서열은 구조적(매트릭스 MA, 캡시드 CA 및 뉴클레오캡시드 NC), 효소적(프로테아제 PR, 인테그라제 IN 및 역전사효소 RT) 및 조절성(TAT 및 REV) 단백질을 코딩하는 폴리시스트론성(polycistronic) 유전자 gag-pol-tat-rev에 상응하였다. 비-코딩 서열 및 발현 신호는 전사 개시를 위한 CMV로부터의 최소 프로모터, 전사 종결을 위한 인슐린 유전자로부터의 폴리아데 닐화 신호 및 패키징 RNA의 핵 수송에 참여하는 HIV-1 Rev 반응성 요소(RRE)에 상응한다 .
사용된 외피 플라스미드는 pENV1이었다. 이러한 카나마이신-내성 플라스미드는 일부 렌티바이러스 벡터의 슈도타이핑을 위해 사용된 수포성 구내염 바이러스(VSV-G) 인디아나 스트레인(strain)으로부터의 당단백질 G를 코딩하였다. VSV-G 유전자를 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화하고, 상기 유전자를 pVAX1 플라스미드(Invitrogen)로 클로닝하였다. 코딩 서열은 코돈-최적화된 VSV-G 유전자에 상응하였고, 비코딩 서열 및 발현 신호는 전사 개시를 위한 CMV로부터의 최소 프로모터 및 RNA를 안정화시키기 위한 BGH 폴리아데닐화 부위에 상응하였다.
VSV-G - ("볼드") 렌티바이러스 벡터 입자의 생성
LV293 세포를 1000 mL의 LVmax 생산 배지(Gibco, A3583401) 중 2×3000 mL 에를렌마이어 플라스크(Corning, 431252)에 5×105 세포/mL로 시딩(seeding)하였다. 2개의 에를렌마이어를 가습된 8% CO2 하에 37℃, 65 rpm에서 항온배양하였다. 시딩한 다음날, 일시적 형질감염을 수행하였다. PEIPro 형질감염 시약(PolyPlus, 115-010)을 전이 벡터 플라스미드(pARA-CMV-GFP 또는 pARA-CMV-mCherry 또는 pARA 또는 pAra-hUBC-CD19) 및 패키징 플라스미드(pARA-Pack)와 혼합하였다. 실온에서 항온배양한 후, 혼합물 PEIPro/플라스미드를 세포주에 한 방울씩 적가하고 가습된 8% CO2 하에 37℃, 65 rpm에서 항온배양하였다. 3일차에, 렌티벡터 생산을 5 mM 최종 농도에서 나트륨 부티레이트에 의해 자극하였다. 벌크 혼합물을 가습된 8% CO2 하에 24시간 동안 37℃, 65 rpm에서 항온배양하였다. 5 ㎛ 및 0.5 ㎛(Pall, 609-122U)에서 심층 여과에 의해 정화한 후, 정화된 벌크 혼합물을 DNase 처리를 위해 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다.
렌티벡터 정제는 크로마토그래피(Q 머스탱 막)에 의해 수행하고 NaCl 구배에 의해 용출하였다. 접선 유동 여과를 100 kDa HYDROSORT 막(Sartorius, 3M81446802E-SW)에서 수행하였고, 이로써 용적을 감소시키고 pH 7에서 특정 완충액 중에서 제형화하여 적어도 2년의 안정성을 보장하였다. 0.22 ㎛(Millipore, SLGVM33RS)에서 멸균 여과한 후, 벌크 약제품을 1 ml 미만의 분취량으로 2 mL 유리 바이알에 충전시킨 후, 표지를 부착하고 동결시키고 < -70℃에서 저장하였다.
볼드 LV 수는 물리적 역가 정량에 의해 평가하였다. 렌티바이러스 관련 HIV-1 p24 코어 단백질만을 검출 및 정량하여 검정을 수행하였다(P24 ELISA Cell Biolabs QUICK TITER Lentivirus Titer Kit).
5 PBAE 중합체의 제조, 정제 및 정량
폴리(β-아미노 에스테르) 중합체는 도스타(Dosta) 등에 의해 기술된 바와 유사한 2단계 절차에 따라 합성하였다. 5-아미노-1-펜탄올(Sigma-Aldrich 3.9 g, 38 mmol) 및 1-헥실아민(Sigma-Aldrich 3.9 g, 38 mmol)을 환저 플라스크에서 혼합하고 디아크릴레이트 대 아민 단량체의 2.1:1 몰비로 1,4-부탄디올 디아크릴레이트(Aldrich 18)와 조합하였다. 혼합물을 20시간 동안 교반하면서 90℃로 가열하였다. 이어서, 이를 실온으로 냉각시켜 담황색 점성 고체 오일을 형성하고, 추가 사용까지 -20℃에서 저장하였다.
합성된 구조를 1H-NMR 분광법에 의해 확인하였다. NMR 스펙트럼을 400 MHz 베리안(Varian NMR Instruments, 일리노이주 클레어던 힐스)으로 기록하고 메탄올-d4를 용매로서 사용하였다. 분자량 측정은 GPC SHODEX KF-603 컬럼(6.0×약 150 mm)이 장착된 HPLC 엘리트 LaChrom 시스템(VWR-Hitachi) 및 이동상으로서 THF에서 수행하였다. 폴리스티렌 표준물의 체류 시간과 비교하여 분자량을 계산하였다. 중량 평균 분자량(Mw)은 4400이고, 수평균 분자량(Mn)은 2900이었다.
올리고펩티드-개질된 PBAE는 디메틸 설폭시드(DMSO) 중 1:2.5 몰비에서 티올-말단화 올리고펩티드를 이용하여 아크릴레이트-말단 중합체 C6를 말단-변형시켜 수득하였다. 트리-아르기닌 말단-변형된 PBAE 중합체, C6-CR3을 수득하기 위한 하기 합성 절차를 일례로서 제시한다: DMSO(1.1mL)에 용해된 C6(113mg, 0.054mmol)의 용액 및 DMSO(1 mL) 중의 하이드로클로라이드 H-Cys-Arg-Arg-Arg-NH2(CR3-95% 순도- Ontores로부터 구입)(99 mg, 0.13 mmol)의 용액을 테플론-라이닝(teflon-lined) 스크류 캡 바이알에서 혼합하고 20시간 동안 20℃의 제어된 온도로 수조에서 교반하였다. 캡핑된 중합체를 5용적의 디에틸 에테르로 침전시켰다. 원심분리(3000 g에서 10분) 후, 중합체를 디에틸 에테르와 아세톤(7:3 v/v)의 새로운 혼합물 2용적으로 세척한 다음, 잔사를 DMSO 중의 100 mg/mL의 스톡으로 형성하기 전에 진공 하에 건조시키고, 이를 -20℃에서 저장하였다.
추가의 예에서, 트리-리신 말단-변형된 PBAE 중합체, C6-CK3는 DMSO(1.1 mL)에 용해된 C6(100 mg, 0.048 mmol)의 용액과 DMSO(1.8 mL) 중의 하이드로클로라이드 H-Cys-Lys-Lys-Lys-NH2(CK3)(78 mg, 0.12 mmol)의 용액을 혼합하고 C6-CR3에 대해 전술한 바와 같이 커플링 반응을 처리하여 수득하였다. 트리-히스티딘 말단-변형된 PBAE 중합체, C6-CH3의 경우, C6(65mg, 0.031mmol)의 용액을 DMSO(1.1 mL)에 용해시키고 이를 DMSO(1.2 mL) 중의 하이드로클로라이드 H-Cys-His-His-His-NH2(CH3)(53 mg, 0.078 mmol)의 용액과 혼합하였다. 트리-아스파르테이트 말단-변형된 PBAE 중합체, C6-CD3의 경우, C6(96 mg, 0.046 mmol)의 용액을 DMSO(1.1 mL)에 용해시키고 이를 DMSO(1.7 mL) 중의 하이드로클로라이드 H-Cys-Asp-Asp-Asp-Asp-NH2(CD3)(96 mg, 0.046 mmol)의 용액과 혼합하였다. 마지막으로, 트리-글루타메이트 말단 변형된 PBAE 중합체, C6-CE3의 경우, C6(280 mg, 0.13 mmol)의 용액을 DMSO(1.1 mL)에 용해시키고 이를 DMSO(4.6 mL) 중의 하이드로클로라이드 H-Cys-Glu-Glu-Glu-NH2(CE3)(184 mg, 0.34 mmol)와 혼합하였다.
올리고펩티드-개질된 PBAE의 화학적 구조는 아크릴레이트 신호의 소멸 및 아미노산 모이어티와 전형적으로 관련된 신호의 존재에 의해 1H-NMR 분광분석법으로 확인하였다. 잔류 유리 펩티드 함량을 아세토니트릴 구배를 사용하여 BEH C18 컬럼(130A, 1.7 ㎛, 2.1×50 mm, 온도 35℃)이 장착된 UPLC ACQUITY 시스템(Waters)으로 분리한 후 UV 검출(파장 220 nm)에 의해 정량하였다.
Fab-PGA의 생산
15 kDa 폴리글루탐산(PGA)(Alamanda Polymers)을 MES 완충액 pH 6.0에 20 mg.mL-1까지 용해시킨 다음, 욕조 초음파기에서 10분 동안 초음파 처리하였다. 1.8 mL의 PGA 용액을, 둘 다 MES 완충액 pH 6.0 중의 0.9 mL의 에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드-HCl(4mg.mL-1, 16당량)와 0.9 ml의 설포-NHS(2,75 w/w EDC)에 첨가하고, 용액을 실온에서 15분 동안 혼합하였다. 생성된 활성화된 PGA를 4:1 몰비로 포스페이트-완충 식염수(PBS) 중의 항-마우스 CD3ε F(ab')2 단편(InVivoMAb)의 용액에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 혼합하였다. 과량의 시약 및 연결되지 않은 PGA를 여과(30,000 MWCO Vivaspin 스핀 컬럼)로 제거하고 완충액을 PBS와 7회 교환하였다. 항체 농도는 NanoDrop 2000 분광광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 측정하였다.
pH의 함수로서 VSV-G + LV의 안정성 동역학
10 μL의 의약품 슈도타이핑 렌티벡터 또는 볼드 렌티벡터를 +4℃에서 상이한 시간(0분, 15분, 30분, 60분, 90분 및 120분) 동안 10 μL의 상이한 완충액에 희석시켰다.
슈도타이핑 렌티벡터에 대한 역가측정을 다음과 같이 유세포측정법에 의해 수행하였다. HEK293T 세포(8×105 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 시딩하고 5% CO2 가습된 대기에서 37℃에서 항온배양하였다. 4시간 후, 배양 배지를 제거하고, 각각의 조건에서 10% FBS, 1% PS 및 10 μL를 함유하는 300 μL의 새로운 DMEM을 각각의 웰에 첨가하였다. 2시간 후, 각각의 웰에 0.5 mL 새로운 배양 배지를 보충하였다. 감염 3일 후, 각 웰 내의 HEK293T 세포를 트립신 처리하고 고정시키고(BD CellFIX 용액 #340181)하고 형광-양성 세포의 수를 유세포측정법(AttuneNXT; Invitrogen, Inc.)을 사용하여 측정하였다.
다음 식을 사용하여 특정 희석에 대한 GFP-발현 세포의 백분율을 TU로 전환시켰다:
TU/ml =(eGFP/100을 발현하는 세포의 비율/%) × 감염시 HEH293T 세포의 총 수/첨가된 바이러스 스톡의 용적(mL)
볼드 렌티벡터에 대한 역가측정은 물리적 역가 정량에 의해 수행하였다. 분석은 렌티바이러스 회합된 HIV-1 p24 코어 단백질만을 검출 및 정량(P24 ELISA Cell Biolabs' QUICK TITER Lentivirus Titer Kit)하여 수행하였다. 전처리 샘플은 유리 p24를 파괴된 렌티벡터와 구별할 수 있게 한다.
올리고펩티드-변형된 PBAE를 이용한 VSV-G + LV 및 볼드 LV의 캡슐화
렌티바이러스 벡터의 캡슐화는 다음과 같이 수행하였다. 렌티바이러스 벡터를 25mM 시트레이트 완충액 pH 5.0(또는 상이한 정의된 pH의 적절한 완충액 시스템)에 희석하여 복제당 75 μL의 최종 용적을 제조하였다. PBAE 중합체를 렌티바이러스 벡터(복제당 75 μL)와 동일한 완충액에 희석시키고 균질화를 위해 2초 동안 볼텍싱(vortex)하였다. 희석된 중합체를 희석된 벡터에 1:1 비(v/v)로 첨가하고, 혼합물을 10초 동안 완만하게 볼텍싱하고 +4℃에서 30분 동안 항온배양하였다. 마지막으로, 동일 용적의 배양 배지(150 μL)를 세포로 이전하기 전에 캡슐화 반응에 첨가하였다.
PGA-Fab를 이용한 PBAE-캡슐화된 VSV-G + LV 및 볼드 LV의 코팅
이전에 설명한 캡슐화 방법은 다음과 같이 수정하였다. 렌티바이러스 벡터를 25mM 시트레이트 완충액 pH 5.0(또는 정의된 pH의 적절한 완충액 시스템)에 희석시켜 복제당 75 μL의 최종 용적을 제조하였다. PBAE를 렌티바이러스 벡터(복제당 75 μL)와 동일한 완충액에 희석시키고 균질화를 위해 2초 동안 볼텍싱하였다. 희석 된 중합체를 희석된 벡터에 1:1 비(v/v)로 첨가하였다. 혼합물을 10초 동안 완만하게 볼텍싱하고 +4℃에서 30분 동안 항온배양하였다. 25 mM 시트레이트 완충액 pH 5.0(또는 정의된 pH의 적절한 완충제 시스템)에 희석된 PGA-Fab 중합체를 캡슐화 혼합물에 첨가하고 균질화를 위해 10초 동안 완만하게 볼텍싱하였다. 코팅 반응 혼합물을 +4℃에서 30분 동안 항온배양하고, 세포로 옮기기 전에 배양 배지를 이용하여 용적이 300 μL가 되도록 하였다.
실시예 2. PBAE-캡슐화된 렌티바이러스 벡터의 제타 전위 측정.
633 nm의 파장을 사용하는 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd, 영국, 4-mW 레이저)를 사용하여 실온에서 동적 광산란(DLS)에 의해 LV/PBAE/PGA-Fab 복합체의 입자 표면 전하 측정을 결정하였다). 200 μL의 복합체를 800 μL의 D-PBS 1x 완충 용액(pH 7.1)과 혼합하여 측정을 수행하였다. 결과를 강도에 의해 분석한 3회 측정의 평균 및 표준 편차로서 플롯팅하였고, 이를 도 6a 내지 도 6f에 도시한다. 그 결과는 중합체의 전하에 따라 중합체로의 벡터 입자의 캡슐화에 의한 표면 전위 변형을 보여주었고, 이는 중합체로의 캡슐화가 성공적임을 가리킨다.
실시예 3. 중합체-코팅된 렌티바이러스 벡터에 의한 HEK293T 세포의 형질도입.
렌티바이러스 벡터의 형질도입 능력에 미치는 중합체 코팅의 효과를 시험하기 위해, 펩티드-접합된 폴리(베타-아미노 에스테르) 중합체를 제조하고 이를 사용하여 렌티바이러스 벡터를 코팅하고 HEK293T 세포의 형질도입을 시험하였다. 렌티바이러스 벡터는 녹색 형광 단백질(GFP) 전이유전자를 보유하였고, 형질도입된 숙주 세포에서의 GFP 발현에 의해 형질도입을 정량하였다(도 4a 참조). 하전된 아미노산의 상이한 군을 갖는 펩티드를 중합체 주쇄에 접합시켜 전하의 효과를 시험하였다. 외피에 VSV-G 단백질이 있는 벡터 입자와 외피에 VSV-G 단백질이 없는 벡터 입자를 중합체 코팅하였다. 중합체 캡슐화의 효과는 노출된 VSV-G 단백질에 의존하는 형질도입을 차단하는 능력을 갖는 VSV-G에 대한 항체의 존재 하에 벡터의 형질도입 능력을 결정함으로써 평가하였지만(도 4b 참조), 효과적으로 중합체 캡슐화되고 형질도입을 위해 노출된 VSV-G에 의존하지 않는 벡터에 의한 형질도입을 차단하지는 않을 것이다(도 4c 참조). VSV-G가 결여된 LV로 유사한 실험을 수행하였다; 이 전략은 도 5a 내지 도 5c에 도시되어 있다. 이들 "볼드 LV"는 VSV-G 단백질의 결여로 인해 형질도입을 수행할 수 없었지만, PBAE 중합체에 의한 캡슐화 후 형질도입이 가능해졌다. 중합체로 인해 가능한 형질감염은 항 VSV-G Ab에 의해 차단 될 것으로 예상되지 않았다.
캡슐화된 벡터는 다음과 같이 제조하였다. 벡터 희석액을 1.5mL 마이크로튜브의 제1 세트에서 복제당 150μL의 최종 용적으로 제조하고, 중합체 희석액을 1.5mL 마이크로튜브의 제2 세트에서 동일한 최종 용적으로 제조하였다. 이어서, 희석된 중합체를 희석된 벡터에 첨가하고, 임의의 기포 또는 발포를 피하기 위해 혼합물을 완만하게 피펫팅함으로써 균질화하였다. 캡슐화 혼합물을 +4℃에서 30분 동안 항온배양하였다.
형질도입의 정량을 위해, 세포를 10 % FBS를 함유하는 완전 배지에서 웰당 8×104 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에 시딩하고 4시간 동안 항온배양하여 부착시켰다. 항-VSV-G 항체에 의한 형질도입의 중화를 시험하기 위해, 300μL의 캡슐화된 벡터를 300μL의 완전 세포 배양 배지 또는 완전 세포 배양 배지에 100배 희석된 300μL의 폴리클로날 항-VSVg 토끼 혈청과 혼합하고 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 항온배양하였다. 이어서, 항체 중화 배지 또는 항체가 결여된 배양 배지에서 배지를 300 μL의 벡터로 대체하여 세포를 형질도입한 후, 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 항온배양하였다. 흡착 후, 1mL의 완전 배지를 각 웰에 첨가하였다. 형질도입 72시간 후, 세포를 트립신 처리하고 200μL의 Cellfix 1X에 재현탁시키고, GFP를 발현하는 세포의 백분율을 BL1 채널을 사용하여 Attune NxT 유세포측정기로 측정하였다.
캡슐화 실험에 사용된 중합체는 하전된 펩티드(Pep) 및 임의로 콜레스테롤(R)에 접합된 하기 화학식에 나타낸 바와 같은 폴리(베타-아미노 에스테르)중합체(PBAE)이다. 중합체 R은 펩티드 CRRR에 접합된 PBAE(양쪽 말단의 동일한 펩티드)를 지칭한다. H 중합체는 펩티드 CHHH에 접합된 PBAE를 지칭한다. E 중합체는 펩티드 CEEE에 접합된 PBAE를 지칭한다. D 중합체는 펩티드 CDDD에 접합된 PBAE를 지칭한다. 펩티드의 혼합물을 하기 표에 나타낸 상이한 비율로 시험하였다. R/H는 중합체 R과 중합체 H의 60/40 혼합물을 지칭한다. "chol"로 표시된 중합체는 또한 하기 구조에 나타낸 R 기로서 콜레스테롤에 접합되었다. "m"의 값은 3이고 "o"의 값은 1이다.
Figure pct00005
하기 표는 캡슐화에 사용되고 형질도입 능력에 대해 시험된 중합체 혼합물 및 LV 입자당 중합체 분자의 비를 나타낸다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
바이러스 외피 단백질이 결여된 중합체-코팅된 렌티바이러스 벡터의 형질도입 능력에 미치는 중합체 코팅의 효과를 시험하기 위해, 상이한 하전된 아미노산을 갖는 펩티드를 중합체 주쇄에 접합시키고, 생성된 중합체를 사용하여 렌티바이러스 벡터를 코팅하고 HEK293T 세포의 형질도입을 시험하였다.
GFP 발현 데이터는 렌티바이러스 벡터 입자(LV)당 중합체 분자의 표시된 비를 갖는 벡터로 형질도입시킨 후 유세포측정기 결과로서 수득되었다. 각각의 조건 하에, 폴리클로날 항-VSV-G 토끼 혈청의 첨가는 109의 비에서 형질도입률을 감소시켰지만, Ab는 1010 및 1011의 비에서는 형질도입을 감소시키지 못하였고, 이는 LV 입자당 적어도 약 1010개 중합체가 효과적인 캡슐화를 위해 필요하였음을 가리킨다. 본 데이터는 또한 중합체-캡슐화된 LV가 효과적으로 형질도입을 수행할 수 있으며, 양으로 하전된 중합체가 가장 효과적이고 중합체 내의 음전하의 도입이 증가함에 따라 형질도입 효율이 감소함을 확인시켜주었다.
콜레스테롤-접합된 PBAE 중합체를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 결과는 R 중합체와 E 중합체 둘 다에 대해 콜레스테롤에 접합되지 않은 중합체와 유사하였다.
VSV-G 외피 단백질이 결여된 LV("볼드 LV")를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 결과는 비코팅된 볼드 LV가 형질도입을 유도할 수 없었음을 나타냈다. 그러나, 중합체 캡슐화된 볼드 LV는 109, 1010 또는 1011의 중합체 분자/LV 비에서 세포를 효과적으로 형질도입할 수 있었다. 예상한 바와 같이, 항-VSV-G Ab의 첨가는 효과가 없었다. 양으로 하전된 중합체는 중성 또는 음으로 하전된 중합체보다 훨씬 더 효과적이었다. 콜레스테롤 접합된 중합체를 사용할 때 및 또한 콜레스테롤이 있거나 없는 펩티드 R+H 및 D를 함유하는 중합체 혼합물에 대해서도 유사한 결과가 수득되었다.
실시예 4. 렌티바이러스 벡터±VSV-G의 중합체 코팅 동안 pH의 효과 .
VSV-G가 결여된 또는 VSV-G를 발현하는 PBAE-코팅된 LV를 생성하고, 세포를 현탁액에서 성장시키고 코팅 용액의 pH를 변화시킨 것을 제외하고는 실시예 3에서 설명한 바와 같이 Jurkat 세포의 형질도입을 수행하였다. 아세테이트 완충액은 pH 4.5 내지 6에서 사용하고, 시트레이트 완충액은 pH 4.5 내지 6에서 사용하고, 히스티딘 완충액은 pH 6 내지 7에서 사용하고, Tris 완충액은 pH 7 내지 8에서 사용하였다. 각 pH 조건에서, LV 입자당 중합체 분자의 수는 106 내지 1010으로 다양하였다. VSV-G+ LV의 안정성은 도 7에 도시되어 있다. 벡터는 4.5 내지 8.0의 pH 범위에 걸쳐 안정하였으며 최대 120분 동안 이러한 pH에서 유지될 수 있다.
도 8a 내지 도 8h는 중합체 캡슐화 없이 상이한 pH 완충액에서의 볼드 LV 입자의 안정성을 시험한 실험의 결과를 도시한다. VSV-G+ LV의 경우, HEK293T 세포를 형질도입하고 GFP 발현을 유발하는 능력(FACS에 의해 검출)을 측정함으로써 완전성을 평가하였다. VSV-G-(볼드) LV의 경우, 중합체-비코팅된 볼드 LV를 사용해서는 형질도입이 불가능했기 때문에, p24 단백질의 방출(벡터 입자 용해의 지표; p24는 ELISA에 의해 상청액에서 측정됨)을 측정함으로써 완전성을 평가하였다. 물리적 완성은 상이한 pH 완충액에서 15분, 30분, 60분, 90분 및 120분 후에 측정하였다. 더 높은 pH 조건이 더 낮은 pH 조건보다 LV 생존력에 대해 약간 덜 유리하였지만, 그 결과는 최대 120분까지 어떠한 LV 유형에 대해서도 완전성 손실이 없다는 것을 나타냈다. 볼드 LV p24 체류 및 방출에 대한 원시 데이터는 도 8a 내지 도 8h에 도시되어 있다.
도 9는 상이한 pH 값에서 볼드 LV의 캡슐화 후, HEK293T 세포의 형질도입 및 FACS에 의해 검출된 GFP 발현에 대한 결과를 도시한다. 실시예 1에서 논의된 다른 실험으로부터 예상되는 바와 같이, 형질도입 가능한 LV를 초래하는 볼드 LV의 완전한 중합체 코팅은 생존 가능한 입자를 수득하기 위해 LV 입자당 적어도 약 109개의 PBAE 분자를 필요로 하였다. 코팅 과정 동안 명확한 pH 의존성이 관찰되었다. 더 높은 pH(pH 7)는 실질적으로 감염성 LV를 제공하지 않았고, 반면에 약 5.0 내지 약 6.5 범위의 pH에서의 코팅은 우수한 형질도입 결과를 제공하였다. R/H PBAE 유도체(60/40 vol/vol의 비에서 PBAE-CHHH와 혼합된 CRRR 펩티드에 접합된 PBAE, 실시예 1을 참조)를 본 실험에서 코팅에 사용하였다. 중요하게도, 도 9는 또한 중합체에 의한 부분적 캡슐화가 형질도입 능력의 부족을 초래함을 도시하며, 이는 외피 단백질이 결여된 바이러스 벡터의 사용이 안전성 프로파일을 향상시킬 것임을 입증한다. 이러한 특징이 없이, 중합체 코팅이 부분적으로 또는 완전히 손실되어 있거나 부분적으로 분해되는 벡터 입자 또는 생산 동안 불완전하게 코팅된 벡터 입자는 비표적화된 세포가 형질도입도리 가능성으로 인해 안전성 문제를 나타낼 수 있다.
도 10은 도 9에 도시된 것과 유사하지만 R-콜레스테롤-PBAE와 H-콜레스테롤 -PBAE 중합체의 혼합물(60/40)을 사용한 실험의 결과를 도시한다. 콜레스테롤의 첨가는 낮은 pH에서 볼드 LV를 완전히 캡슐화하는데 요구되는 중합체/LV 입자 비를 저하시켰다.
상이한 pH 값에서 VSV-G+ LV의 코팅을 시험하는 실험이 도 11에 도시되어 있다. R-PBAE 중합체를 캡슐화에 사용하였고, 항-VSV-G+ 항체에 대한 민감성도 시험하였다. 결과는 전체 형질도입률에 대한 pH 민감성이 거의 없음을 나타내지만, 항체 민감성(불완전한 중합체 코팅을 가리킴)은 더 낮은 pH 값보다 pH 6.5에서 더 컸다. 더 낮은 pH에서 더 많은 경쟁 코팅의 추가 표시는 pH 5에서 항-VSV-G 항체의 존재 하에 더 높은 기준선 형질도입으로서 나타난다.
실시예 4. 캡슐화된 렌티바이러스 벡터±VSV-G를 이용한 림프구의 형질도입.
Jurkat 세포 및 인간 림프구의 형질도입
형질도입의 정량을 위해, Jurkat 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토 마이신을 함유하는 완전 배지에서 웰당 8×104 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 300 μL의 캡슐화된 벡터를 세포에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 항온배양한 후, 500μL의 새로운 완전 배지를 각 웰에 첨가하였다. GFP 또는 mCherry 전이유전자를 발현하는 세포의 백분율은 형질전환 72시간 후에 각각 BL1 또는 YL1 채널을 사용하여 Attune NxT 유세포측정기(Thermo Fisher)로 결정하였다. GFP 전이유전자를 발현하는 형질도입된 세포의 표현형은 제조업자의 지침서(BD Biosciences)에 따라 다음 세포 유형에 특이적인 상이한 항체를 이용하여 유세포측정 염색에 의해 결정하였다: CD3(T 림프구) 및 CD19(B 림프구).
인간 림프구의 형질도입은 105 세포/웰이 시딩된 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하였다.
세포독성
인간 림프구를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 완전 배지에서 웰당 5×105 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 300 μL의 캡슐화된 CAR CD19 발현 벡터를 세포에 첨가하였다. 2시간 동안 항온배양 후, 500 μL의 새로운 완전 배지를 각 웰에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 항온배양한 후, CD19-양성 라모스 종양 세포를 50:1 또는 1:1의 림프구/종양 세포 비로 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 항온배양한 후, CAR CD19를 발현하는 세포를 단백질 L로 염색하고 YL1 채널을 사용하여 ATTUNE NXT 유세포측정기(Thermo Fisher)로 검출하였다. CD19-양성 세포 및 림프구를 제조업자의 지침서(BD Biosciences)에 따라 CD19- 또는 CD3-특이적 항체를 사용하여 유세포측정 염색에 의해 정량하였다.
마우스 PBMC 제조 및 형질도입
새로이 생성된 마우스 말초혈 단핵구(PBMC)를 FICOLL-PAQUE PREMIUM 1.084(GE Healthcare)로 충전된 LEUCOSEP 튜브(Greiner bio-one)를 사용하여 헤파린 처리된 전혈로부터 단리하였다. DPBS로 혈액 희석한 후, PBMC를 FICOLL 밀도 구배상에서 분리하고, DPBS로 2회 세척하고, 배양 배지에서 목적하는 세포 밀도까지 재현탁시켰다.
세포를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 배지에서 웰당 2×105 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 300 μL의 캡슐화된 벡터를 세포에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 항온배양한 후, 500μL의 새로운 완전 배지를 각 웰에 첨가하였다. GFP를 발현하는 세포의 백분율을 BL1 채널을 사용하여 Attune NxT 유세포측정기로 형질도입 48시간 후 측정하였다. GFP 전이유전자를 발현하는 형질도입된 세포의 표현형을 제조업자 지침서(BD Biosciences)에 따라 하기 세포 유형에 특이적인 상이한 항체를 사용하여 유세포측정 염색에 의해 결정하였다: CD4(헬퍼 T 림프구), CD8(세포독성 림프구), CD19(B 림프구), Ly-6G(과립구), CD11b(대식세포), CD11c(수지상 세포) 및 F4/80(단핵구).
도 12는 항-VSV-G 항체의 존재 및 부재 하에 표시된 PBAE-캡슐화된 LV로 형질도입된 Jurkat 세포의 GFP 발현 및 세포 생존력을 나타낸다. 결과는 100%로서 항체가 없는 조건에 대해 정규화한다. 광범위한 캡슐화 중합체 및 중합체/벡터 비는 항체에 의한 억제를 차단할 수 없었으며, 이는 VSV-G 단백질이 형질도입을 조사하고 매개한 모든 조건 하에 중합체 코팅을 통해 돌출되었음을 나타낸다.
도 13a 내지 도 13d에서, mCherry 발현은 콜레스테롤 접합의 존재 및 부재 하에, 다양한 상이한 중합체/벡터 비 및 중합체 순 전하에서의 표시된 PBAE 중합체에 의해 캡슐화된 볼드 LV에 의한 Jurkat 세포의 형질도입의 척도로서 도시되어 있다.
상이한 벡터를 사용한 인간 림프구 형질도입의 결과는 도 14a 내지 도 14d에 도시되어 있다. 림프구당 벡터 입자의 수는 각 도면에서 좌측에서 우측으로 증가한다. 도 14a는 전형적인 VSV-G+ LV에 대해 수득된 결과를 도시한다; 도 14b에 도시된 비캡슐화된 VSV-G-(볼드) LV의 경우와 마찬가지로, 형질도입이 거의 관찰되지 않았다. 그러나, 10E+4 PGA-Fab의 존재 또는 부재 하에 LV당 1.10e+9 PBAE의 비에서R/H(60/40 vol/vol)로 볼드 LV를 캡슐화하는 것은 도 14c에 도시된 바와 같이 성공적인 용량-의존적 형질도입을 유도하였다. 도 14d에 도시된 실험에서, PBAE-캡슐화된 볼드 LV에 표적화 모이어티(PGA Fab)를 첨가한 후 강력한 형질도입이 또한 수득되었다. 그 결과가 도 14e에 도시된 실험은 CD19에 특이적인 CAR로의 인간 림프구의 추가 형질도입이 LV 전이유전자의 강력한 형질도입과 양립할 수 있음을 입증한다. 또한, 도 14f에 도시된 결과는 CD19-특이적 CAR 형질도입된 인간 림프구가 CD19-양성 암 세포에 대항해 세포독성 작용을 할 수 있음을 나타낸다.
도 15는 마우스 PBMC를 VSV-G+ 비캡슐화된 LV(좌측의 2개 막대) 또는 PBAE-캡슐화된 볼드 LV(우측의 2개 막대)로 형질감염시킨 실험의 결과를 도시한다. 캡슐화된 볼드 LV는 PBMC 제제에 존재하는 각각의 세포 유형에 대해 VSV-G+ 벡터보다 훨씬 더 강력한 형질도입을 나타냈다.
참고문헌 :
Figure pct00009
Figure pct00010
본원에서 사용되는 "본질적으로 구성된(consisting essentially of)"은 청구범위의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계가 포함되는 것을 허용한다. 본원에서 용어 "포함하는(comprising)"에 대한 임의의 언급은, 특히 조성물의 성분의 설명 또는 장치의 구성요소의 설명에서 "본질적으로 구성된(consisting essentially of)" 또는 "구성된(consisting of)"과 서로 교환될 수 있다.
본 기술은 소정의 바람직한 실시예들과 관련하여 설명되었지만, 당업자라면 전술한 명세서를 기반으로, 본원에 제시된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변화, 등가물 치환 및 다른 변경을 실행할 수 있을 것이다.

Claims (48)

  1. 중합체 또는 중합체의 혼합물로 코팅된 바이러스 벡터를 포함하는 나노입자로서, 상기 바이러스 벡터가 전이유전자(transgene)를 포함하고, 상기 나노입자가 전이유전자를 진핵 세포에 전달하기 위한 비히클로서 기능하는, 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 바이러스 벡터가 외피 단백질이 결여된 것인, 나노입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중합체 또는 중합체의 혼합물이 하기 화학식을 갖는 폴리(베타-아미노 에스테르)를 포함하는, 나노입자.
    Figure pct00011

    상기 화학식에서,
    각 Pep는 올리고펩티드이고; R은 OH, CH3 또는 콜레스테롤이고; m은 1 내지 20의 범위이다. n은 1 내지 100의 범위이고, o는 1 내지 10의 범위이다.
  4. 제3항에 있어서, 각각의 올리고펩티드가 아르기닌(R), 글루탐산(E), 리신(K), 아스파르트산(D), 히스티딘(H) 및 시스테인(C)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3개의 아미노산 잔기를 포함하는, 나노입자.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 적어도 하나의 올리고펩티드의 아미노산 서열이 CRRR(서열번호 1) 또는 CHHH(서열번호 2) 또는 CKKK(서열번호 3) 또는 CEEE(서열 번호 4) 또는 CDDD(서열 번호 5)인, 나노입자.
  6. 제1항 내지 제5항에 있어서, 중합체 또는 중합체의 혼합물이 pH 7에서 순 양전하 또는 순 음전하를 갖는, 나노입자.
  7. 제1항 내지 제6항에 있어서, 상기 나노입자가 벡터당 108 내지 1012개의 중합체 분자를 함유하는, 나노입자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 나노입자가 벡터당 약 109 내지 약 1010개의 중합체 분자를 함유하는, 나노입자.
  9. 제1항 내지 제8항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인, 나노입자.
  10. 제9항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 나노입자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 중합체 분자에 연결된 하나 이상의 표적화 모이어티를 추가로 포함하는 나노입자.
  12. 제11항에 있어서, 표적화 모이어티가 항체, 항체 단편, scFv, 항체-유사 단백질 스캐폴드, 올리고펩티드, 압타머, L-RNA 압타머 및 세포 표면 수용체에 대한 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나노입자.
  13. 제12항에 있어서, 표적화 모이어티가 항-CD3 항체 또는 항-CD3 압타머인, 나노입자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 전이유전자가 키메라 항원 수용체를 코딩하는, 나노입자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 약 -15 mV 내지 약 +15 mV의 제타 전위를 갖는 나노입자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, VSV-G 외피 단백질이 결여된 나노입자.
  17. 제16항에 있어서, VSV-G 외피 단백질을 포함하는 유사한 나노입자와 비교하여 생체내 사용을 위한 개선된 안전성 프로파일을 갖는 나노입자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 바이러스 외피 단백질이 결여되어 있고, 상기 나노입자가 벡터당 중합체 분자의 임계수 이상에서만 포유동물 세포를 형질도입할 수 있는, 나노입자.
  19. 제18항에 있어서, 상기 벡터당 중합체 분자의 임계수 미만에서는, 중합체의 양이 벡터를 완전히 코팅하기에 불충분한, 나노입자.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 벡터당 중합체 분자의 임계수 미만에서는, 상기 나노입자가 구조적으로 불안정하거나 나노입자로부터 중합체 분자가 해리되는, 나노입자.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 임계치가 결여된 벡터 또는 중합체-캡슐화된 벡터와 비교하여 생체내 사용을 위한 개선된 안전성 프로파일을 갖는 나노입자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 나노입자의 제조 방법으로서,
    (a) 전이유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 제공하는 단계;
    (b) 중합체 또는 중합체의 혼합물 및 임의로 하나 이상의 표적화 모이어티를 제공하는 단계; 및
    (c) 상기 바이러스 벡터를 상기 중합체 또는 중합체의 혼합물 및 임의로 하나 이상의 표적화 모이어티와 접촉시킴으로써 바이러스 벡터와 중합체 또는 중합체의 혼합물을 결합시켜 상기 나노입자를 형성하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 바이러스 벡터가 외피 단백질이 결여된 것인, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 단계(c)가 약 5.0 내지 약 6.5의 pH에서 수행되는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 단계(c)가 약 5.5 내지 6.0의 pH에서 수행되는, 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 또는 중합체의 혼합물이 하기 화학식을 갖는 폴리(베타-아미노 에스테르)를 포함하는, 방법.
    Figure pct00012

    상기 화학식에서,
    각 Pep는 올리고펩티드이고; R은 OH, CH3 또는 콜레스테롤이고; m은 1 내지 20의 범위이고, n은 1 내지 100의 범위이고, o는 1 내지 10의 범위이다.
  27. 제26항에 있어서, 각각의 올리고펩티드가 R, E, K, D, H 및 C로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3개의 아미노산 잔기를 포함하는, 방법.
  28. 제26항에 있어서, 적어도 하나의 올리고펩티드의 아미노산 서열이 CRRR(서열번호 1) 또는 CHHH(서열번호 2) 또는 CKKK(서열번호 3) 또는 CEEE(서열 번호 4) 또는 CDDD(서열 번호 5)인, 방법.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 또는 중합체의 혼합물이 pH 7에서 순 양전하 또는 순 음전하를 갖는, 방법.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 벡터당 108 내지 1012개의 중합체 분자를 함유하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 나노입자가 벡터당 약 109 내지 약 1010개의 중합체 분자를 함유하는, 방법.
  32. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  34. 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터를 하나 이상의 표적화 모이어티와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 임의로 상기 표적화 모이어티가 중합체 또는 입자의 혼합물과 연결되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 표적화 모이어티가 항체, 항체 단편, scFv, 항체-유사 단백질 스캐폴드, 올리고펩티드, 압타머, L-RNA 압타머 및 세포 표면 수용체에 대한 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 표적화 모이어티가 항-CD3 항체 또는 항-CD3 압타머인, 방법.
  37. 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 전이유전자가 키메라 항원 수용체를 코딩하는, 방법.
  38. 제22항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 VSV-G 외피 단백질이 결여된 것인, 방법.
  39. 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(c)가 중합체 또는 중합체의 혼합물이 순 양전하를 갖고 레트로바이러스 벡터가 음의 표면 전위를 갖는 pH에서 수행되는, 방법.
  40. 질환의 치료 방법으로서, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 나노입자 복수개를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 상기 대상체의 세포가 레트로바이러스 벡터에 의해 형질도입되고 전이유전자가 형질도입된 세포에서 발현되는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 질환이 암인, 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 대상체가 인간인, 방법.
  43. 세포를 시험관내에서 형질도입하는 방법으로서, 배양된 세포를 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 나노입자 복수개와 접촉시킴으로써 배양된 세포의 적어도 일부가 레트로바이러스 벡터에 의해 형질도입되고 전이유전자가 형질도입된 세포에서 특이적으로 발현되는 단계를 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 나노입자가 CD3-양성 세포로 표적화되고 전이유전자가 CD3-양성 세포에서 특이적으로 발현되는, 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 전이유전자가 키메라 항원 수용체를 코딩하는, 방법.
  46. 유전자 요법의 수행 방법으로서, 시험관내 세포 또는 살아있는 유기체 내의 세포를 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 나노입자 복수개와 접촉시킴으로써 전이유전자가 상기 세포에서 발현되는 단계를 포함하는 방법.
  47. 중합체 또는 중합체의 혼합물로 코팅된 바이러스 벡터를 포함하는 나노입자로서, 상기 바이러스 벡터는 외피 단백질의 감소된 수준을 포함하고 전이유전자를 포함하고, 상기 나노입자가 전이유전자를 진핵 세포에 전달하기 위한 비히클로서 기능하고, 상기 외피 단백질의 감소된 수준이 벡터의 세포 진입 및 벡터에 의한 세포의 형질도입을 촉진하기에 불충분한, 나노입자.
  48. 제47항에 있어서, 외피 단백질의 감소된 수준이 벡터가 유래된 기능성 바이러스의 외피 단백질의 양의 5% 이하인, 나노입자.
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