BR112020014650A2 - vetores virais encapsulados em polímero para terapia genética - Google Patents

Abstract

A presente tecnologia refere-se a veículos de entrega de genes compreendendo um vetor retroviral revestido com um polímero ou uma mistura de polímeros para formar uma nanopartícula. Os vetores retrovirais compreendem um transgene e, em algumas modalidades, são desprovidos de proteína de envelope. A tecnologia inclui um método de produção de veículos de entrega de genes e um método de tratamento de uma doença por administração dos veículos de entrega de genes.

Description

“VETORES VIRAIS ENCAPSULADOS EM POLÍMERO PARA TERAPIA GENÉTICA” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade de Pedido Provisório US No. 62/618.156, depositado em 17 de janeiro de 2018 e intitulado “Viral Vector Nanoparticles for In Vitro and In Vivo Cell Targeting”, e de Pedido Provisório US No. 62/661.990, depositado em 24 de abril de 2018 e intitulado “Polymer-Encapsulated Viral Vectors Lacking Envelope Protein”, e de Pedido Provisório US No. 62/715.007, depositado em 6 de agosto de 2018 e intitulado “Polymer- Encapsulated Viral Vectors Lacking Envelope Protein”. Cada um destes pedidos provisórios é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

FUNDAMENTOS

[002] A terapia gênica entrega material genético exógeno para as células alvo a fim de corrigir anormalidades genéticas ou prover tratamento de uma doença modificando a função celular. Para esta finalidade, métodos de entrega de genes tanto virais como não virais têm sido usados, mas ambas as abordagens ainda apresentam deficiências significantes.

[003] Várias aplicações de vetores virais já foram transferidas para uso clínico, ou para terapia gênica ou protocolos de vacinação. No entanto, os vetores virais atualmente usados apresentam certas desvantagens. Por exemplo, é um desafio atingir o alvo de células específicas usando um vetor viral. Em alguns protocolos de terapia gênica, direcionamento de células é alcançado purificando as células alvo e transduzindo as mesmas ex vivo e expandindo as células transduzidas in vitro antes de reimplantar as mesmas no paciente. Em protocolos de vacinação, a injeção direta do vetor é realizada e a transdução de células não específicas é usada com frequência para elicitar uma resposta imune contra o produto de gene codificado pelo vetor. Para aumentar a eficácia e a segurança do tratamento, direcionamento de células poderia ser requerido.

[004] Há uma necessidade de sistemas à base de vetores virais aperfeiçoados para a entrega direcionada de material genético.

SUMÁRIO

[005] A tecnologia descrita aqui prevê composições de nanopartículas de vetor viral empacotado sintético e métodos para uso das mesmas para fornecer uma entrega intensificada de material genético para uso em aplicações de vacina e terapia gênica. As composições de vetor e métodos podem ser empregados em qualquer situação para a qual a transdução de células com um ou mais transgenes é utilizável. Por exemplo, elas podem ser usadas para tratamento de câncer, doenças infecciosas, doenças metabólicas, doenças neurológicas, ou condições inflamatórias, ou para corrigir defeitos genéticos.

[006] As composições de nanopartículas de vetor viral da presente tecnologia incluem um envoltório externo contendo um polímero ou uma mistura de polímeros que encapsulam o vetor. Em certas modalidades, o envoltório de polímero da nanopartícula contém uma ou mais espécies de poli(beta-amino éster) derivatizado de oligopeptídeos tendo a fórmula geral em que Pep é um peptídeo, tal como um oligopeptídeo, e R é OH, CH3, ou um grupo colesterol, e em que m está na faixa de 1 a 20, n está na faixa de 1 a 100, e o está na faixa de 1 a 10. Em modalidades preferidas, o peptídeo inclui pelo menos dois, ou pelo menos três aminoácidos, selecionados dentre o grupo consistindo em arginina (R), lisina (K), histidina (H), ácido glutâmico (E), ácido aspártico (D), e cisteína (C). Ver também WO2014/136100 e WO2016/116887 para descrição adicional de PBAEs derivatizados de oligopeptídeos que podem ser usados na presente tecnologia.

Cisteína pode ser incluída para fornecer um ponto de fixação covalente para o peptídeo ao polímero; embora ela carregue uma carga negativa leve a pH 7, ela não altera significativamente a carga se usada junto com aminoácidos positivamente carregados.

Peptídeos exemplares são CRRR (SEQ ID NO:1), CHHH (SEQ ID NO:2), CKKK (SEQ ID NO:3), CEEE (SEQ ID NO:4), e CDDD (SEQ ID NO:5). Em outras modalidades, qualquer aminoácido naturalmente ocorrendo pode ser incluído nas porções Pep.

A sequência do peptídeo é selecionada de modo a promover captação celular e direcionamento do vetor revestido com polímero.

Em modalidades tanto utilizando como desprovidas de proteínas de envelope viral, as sequências de oligopeptídeos e carga líquida são selecionadas de modo a promover captação celular e/ou captação endossômica e/ou escape endossômico de vetores virais encapsulados nos polímeros nas células alvo pretendidas.

Peptídeos em cada uma das duas extremidades do polímero tipicamente são iguais em uma dada molécula de polímero, mas podem ser diferentes.

Moléculas de polímero em uma mistura usada para revestir um vetor podem ser iguais ou diferentes; se diferentes, elas podem diferir na estrutura dorsal do polímero ou nos peptídeos terminais.

Em modalidades preferidas, o peptídeo em ambas as extremidades do polímero tem a sequência de aminoácidos de CRRR (SEQ ID NO:1), ou CHHH (SEQ ID NO:2), ou CKKK (SEQ ID NO:3), ou CEEE (SEQ ID NO:4), ou CDDD (SEQ ID NO:5). O polímero ou mistura de polímeros pode ter uma carga positiva líquida ou negativa, ou pode ser não carregado.

Oligopeptídeos contendo 2 ou mais resíduos de apenas um único tipo de aminoácido, tal como R, K, H, D, ou E, podem ser usados.

O polímero pode compreender um açúcar ou álcool de açúcar enxertado sobre a cadeia lateral fixada na estrutura dorsal do polímero.

Uma ou mais das moléculas de polímero encapsulando cada nanopartícula de vetor pode opcionalmente compreender uma porção de direcionamento ligada ao polímero em qualquer posição desejada na molécula de polímero, tal como em R.

As moléculas de polímero podem ser reticuladas ou não reticuladas.

As moléculas de polímero podem ser fixadas na superfície do vetor viral ou não covalentemente, ou covalentemente tal como por fixação covalente a uma molécula de lipídeo (por exemplo, colesterol, um fosfolipídeo, ou um ácido graxo) que se divide na bicamada do lipídeo do vetor, ou a uma proteína incrustada na bicamada do lipídeo.

Em algumas modalidades, o polímero apenas reveste o vetor, mas é fixado não especificamente, isto é, ele não é fixado ao vetor por interações específicas, covalentes ou não covalentes, mas somente por interações não específicas, tal como carga líquida, hidrofobicidade, ou interações de van der Waals.

Em certas modalidades, a razão do polímero ou mistura de polímeros para o vetor retroviral é de cerca de 1:100 a cerca de 5:1 em peso, ou o número de moléculas de polímero por partícula de vetor é de cerca de 106 a cerca de 1012.

[007] As nanopartículas de vetor viral compreendem um vetor viral. O vetor viral pode ser escolhido com base em características desejadas (por exemplo, imunogenicidade, capacidade de acomodar construtos de diferentes tamanhos, propriedades de integração e replicativas, nível de expressão, duração de expressão, tropismo do tecido ou características de direcionamento, capacidade de infectar células dividindo e/ou quiescentes, etc.), O vetor viral pode ser um vetor retroviral tal como um vetor lentiviral. Em modalidades preferidas, o vetor viral é um vetor retroviral. No entanto, a invenção também pode ser praticada com outros tipos de vírus e/ou vetores virais, incluindo os derivados de vírus de DNA ou RNA.

[008] As nanopartículas podem incluir uma ou mais porções de direcionamento que são expostas na superfície das nanopartículas de vetor encapsulado, tal como por associação covalente ou não covalente das porções de direcionamento com o revestimento de polímero. Uma espécie molecular de porção de direcionamento, ou mais do que uma espécie molecular diferente de porção de direcionamento, pode estar presente em cada nanopartícula de vetor viral. Porções de direcionamento podem ser, por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpo (incluindo Fab), scFvs, andaimes de proteína de tipo anticorpo, oligopeptídeos, aptâmeros, aptâmeros L-RNA, ou ligandos para receptores de superfície celular. Em uma modalidade, a porção de direcionamento é um anticorpo anti-CD3 ou aptâmero para direcionamento das nanopartículas em direção às células T. Em uma modalidade, o transgene codifica um receptor de antígeno quimérico. A nanopartícula é capaz de atuar como um veículo de entrega de genes por transdução das células in vivo em um indivíduo ao qual o veículo é administrado, ou transduzindo células in vitro. Em certas modalidades, a nanopartícula é capaz de transduzir um tipo específico de célula ou classe de células, geralmente através de ação da porção de direcionamento e/ou através de ação do polímero ou mistura de polímeros. Em algumas modalidades, o polímero de vetor revestido com partículas de polímero pode promover transdução celular, não somente por fixação às superfícies da célula alvo, mas através da captação endossômica, tal como por endocitose, micropinocitose, fagocitose, ou outros mecanismos, e escape endossômico (via fusão de membrana após uma redução em pH na vesícula endossômica). Em modalidades preferidas, a sequência de aminoácido de oligopeptídeos associados com o polímero pode especificamente promover a transdução celular través da via endossômica.

[009] Embora em algumas modalidades da presente tecnologia os vetores virais são pseudotipados, em outras modalidades os vetores são desprovidos de algumas proteínas de envelope virais ou de pseudotipagem. Em vetores pseudotipados, proteínas de envelope tal como o complexo HIV gp120-gp41 ou a glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G) formam estruturas tipo espícula sobre a superfície externa do envelope viral, o que facilita a fixação das partículas de vetor a células hospedeiras e entrada de vírus nas células hospedeiras. Pseudotipagem de proteínas tal como VSV-G também pode ser usada para proteger ou ligar o vetor durante purificação (por exemplo, proteção durante ultracentrifugação, ligação a uma coluna de afinidade ou outra matriz de afinidade, ou purificação do gel). No entanto, no contexto do empacotamento por polímero de um vetor viral, tais estruturas podem interferir com associação firme entre o envelope das partículas de vetor e os polímeros.

As proteínas de envelope viral também carregam uma carga dependente de pH, que pode limitar ou interferir com a associação de polímeros, particularmente polímeros carregados.

Além disso, vetores virais empacotados abrigando pseudotipagem de proteínas podem sofrer revestimento desestabilização e destruição in vitro e in vivo, assim, liberando vetor viral capaz de transduzir células não especificamente, potencialmente levando a uma redução no perfil de segurança.

Vetores desprovidos de proteínas de envelope podem intensificar o empacotamento de vetores virais usando polímeros.

Os vetores revestidos desprovidos de proteína de envelope mostram um perfil de segurança aperfeiçoado comparado com vetores tendo proteína de envelope, porque, após desestabilização ou destruição do revestimento, eles não são capazes de transduzir células in vitro ou in vivo.

As nanopartículas da presente tecnologia em que o vetor viral é desprovido de proteína de envelope viral têm um mecanismo de segurança incorporado para uso em terapia gênica ou imunoterapia, porque as nanopartículas são somente capazes de transduzir uma célula de mamífero acima de um número limiar de moléculas de polímero por vetor.

Abaixo deste número limiar de moléculas de polímero por vetor, a quantidade de polímero é insuficiente para revestir completamente o vetor, o que pode levar as nanopartículas a se tornarem estruturalmente instáveis ou sujeitas à dissociação de moléculas de polímero a partir da nanopartícula. Uma vez que tais vetores desprovidos de proteína de envelope perdem um revestimento eficaz de polímero, eles se tornam incapazes de transduzir células de mamíferos, incluindo células de humanos. Tais nanopartículas têm um perfil de segurança aperfeiçoado para uso in vivo comparado com um vetor ou vetor encapsulado em um polímero que é desprovido da característica de limiar.

[010] Em algumas modalidades, algumas proteínas de membrana, tais como proteínas que não são proteínas de envelope viral ou de fusão e não formam, de outra forma, estruturas de tipo espícula sobre a superfície externa da membrana, tais como proteínas a partir das células produzindo vetor não usadas para pseudotipagem, podem estar presentes na membrana de lipídeo da partícula de vetor viral. Em certas modalidades da presente tecnologia, proteínas de envelope viral são excluídas das partículas de vetor viral, tais como as que têm uma massa significante se salientando da superfície externa da bicamada de lipídeos do envelope, tal como pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, ou pelo menos 50% de sua massa se salientando a partir da superfície de envelope externo.

[011] As composições de nanopartículas opcionalmente podem conter componentes adicionais, tal como moléculas de lipídeos, tensoativos, ácidos nucleicos, moléculas de proteínas, ou fármacos de moléculas pequenas. A presente tecnologia também contempla formulações farmacêuticas ou composições contendo as nanopartículas juntas com um ou mais excipientes, carreadores, tampões, sais, ou líquidos, tornando o veículo de entrega apropriado para administração por via oral, intranasal, ou administração parenteral, tal como intravenosa, intramuscular, subcutânea, injeção peritumoral ou intratumoral, ou para a administração in vitro às células em um protocolo de transferência de genes ex vivo. Tais composições e formulações também podem ser liofilizadas para estabilizar as mesmas durante armazenamento.

[012] A nanopartícula de vetor viral da presente tecnologia pode servir como um veículo de entrega de genes. A nanopartícula inclui um vetor viral revestido em sua superfície exterior com uma camada contendo um polímero ou uma mistura de polímeros. Em algumas modalidades, o vetor viral é pseudotipado e possui uma proteína de envelope promotora de fusão e compreende um transgene. Em outras modalidades, o vetor viral é desprovido de qualquer proteína de envelope nativa ou recombinante e compreende um transgene. Em certas modalidades, o vetor retroviral especificamente é desprovido da proteína de envelope viral que poderia ser tipicamente incluída no envelope de vetores retrovirais similares. Em certas modalidades, o vetor viral especificamente é desprovido de quaisquer proteínas de envelope de vetor viral naturalmente ocorrendo ou modificadas, tal como VSV-G, HIV gp120, HIV gp41, MMTV gp52, MMTV gp36, MLV gp71 de tipo selvagem ou modificados, sincitina, proteína de envelope de vírus Sindbis de tipo selvagem ou modificado, glicoproteínas de hemaglutinina (H) e de fusão (F) do vírus do sarampo, e HEMO. Em outras modalidades, o vetor contém uma ou mais de tais proteínas de envelope.

[013] Outro aspecto da tecnologia é um método de produção de veículo de entrega de nanopartículas/genes acima descrito (nanopartícula de vetor viral). O método inclui as etapas de: (a) fornecer um vetor viral ou possuindo ou desprovido de proteína de envelope e contendo um transgene; (b) fornecer um polímero ou uma mistura de polímeros; e (c) contatar o vetor viral e o polímero ou mistura de polímeros, pelo que o vetor viral e o polímero/mistura de polímeros combinam para formar a nanopartícula, que contém o vetor viral revestido com o polímero ou mistura de polímeros.

[014] Um aspecto adicional da tecnologia é um método in vivo de tratamento de uma doença usando as nanopartículas de vetor viral acima descritas (veículos de entrega de genes). O método requer a administração parenteral de uma composição contendo as nanopartículas a um indivíduo em necessidade do mesmo, por meio do qual as células dentro do indivíduo são transduzidas pelo vetor viral e o transgene é expressado nas células transduzidas. Em uma modalidade, a doença a ser tratada é câncer. Para a administração in vivo, modalidades em que proteínas de envelope viral, tal como VSV-G, estão ausentes são preferidas, porque elas proporcionam um perfil de segurança intensificado porque são desprovidas da capacidade de transduzir células não direcionadas no hospedeiro e devido a um direcionamento mais específico provido pelo uso da encapsulação de polímero para restaurar a captação celular e/ou captação endossômica e/ou escape endossômico de outra forma provido pela proteína de envelope.

[015] Ainda outro aspecto da tecnologia é um método de transdução de células in vitro. O método inclui contatar células vivas isoladas com as nanopartículas de vetor viral descritas acima, pelo que pelo menos algumas das células são transduzidas pelo vetor retroviral e a proteína terapêutica ou proteína marcadora é expressada nas células transduzidas.

[016] Em ainda outro aspecto da tecnologia, um método de realização de terapia gênica é previsto, que requer contatar as células em uma cultura in vitro ou células dentro de um organismo vivo com as nanopartículas/veículo de entrega de genes acima descritos, pelo que o transgene é expressado nas células. O transgene pode substituir ou modificar um gene deficiente ou substituir um gene faltando.

[017] A presente tecnologia pode ser resumida adicionalmente com a seguinte lista de modalidades.

[018] 1. Uma nanopartícula compreendendo um vetor viral revestido com um polímero ou uma mistura de polímeros, em que o vetor viral compreende um transgene, e em que a nanopartícula funciona como um veículo para entrega do transgene para células eucarióticas.

[019] 2. A nanopartícula de modalidade 1, em que o vetor viral é desprovido de proteína de envelope.

[020] 3. A nanopartícula de modalidade 1 ou modalidade 2, em que o polímero ou a mistura de polímeros compreende um poli(beta-amino éster) tendo a fórmula em que cada Pep é um oligopeptídeo; em que R é OH, CH3, ou colesterol; e em que m está na faixa de 1 a 20. n está na faixa de 1 a 100, e o está na faixa de 1 a 10.

[021] 4. A nanopartícula de modalidade 3, em que cada oligopeptídeo compreende pelo menos três resíduos de aminoácido selecionados dentre o grupo consistindo em arginina (R), ácido glutâmico (E), lisina (K), ácido aspártico (D), histidina (H), e cisteína (C).

[022] 5. A nanopartícula de modalidade 3 ou modalidade 4, em que a sequência de aminoácido de pelo menos um dos oligopeptídeos é CRRR (SEQ ID NO:1), ou CHHH (SEQ ID NO:2), ou CKKK (SEQ ID NO:3), ou CEEE (SEQ ID NO:4), ou CDDD (SEQ ID NO:5).

[023] 6. A nanopartícula de qualquer uma das modalidades precedentes, em que o polímero ou mistura de polímeros tem uma carga positiva líquida ou uma carga negativa líquida a pH 7.

[024] 7. A nanopartícula de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a nanopartícula contém de 108 a 1012 moléculas de polímero por vetor.

[025] 8. A nanopartícula de modalidade 7, em que a nanopartícula contém de cerca de 109 a cerca de 1010 moléculas de polímero por vetor.

[026] 9. A nanopartícula de qualquer uma das modalidades precedentes, em que o vetor viral é um vetor retroviral.

[027] 10. A nanopartícula de modalidade 9, em que o vetor retroviral é um vetor lentiviral.

[028] 11. A nanopartícula de qualquer uma das modalidades precedentes, compreendendo adicionalmente uma ou mais porções de direcionamento ligadas a uma ou mais moléculas de polímero.

[029] 12. A nanopartícula de modalidade 11, em que a porção de direcionamento é selecionada dentre o grupo consistindo em anticorpos, fragmentos de anticorpo, scFvs, andaimes de proteína de tipo anticorpo, oligopeptídeos, aptâmeros, aptâmeros L-RNA, e ligandos para receptores de superfície celular.

[030] 13. A nanopartícula de modalidade 12, em que a porção de direcionamento é um anticorpo anti-CD3 ou um aptâmero anti-CD3.

[031] 14. A nanopartícula de qualquer uma das modalidades precedentes, em que o transgene codifica um receptor de antígeno quimérico.

[032] 15. A nanopartícula de qualquer uma das modalidades precedentes que tem um potencial zeta de cerca de -15 mV a cerca de +15 mV.

[033] 16. A nanopartícula de qualquer uma das modalidades precedentes que é desprovida de proteína de envelope VSV-G.

[034] 17. A nanopartícula de modalidade 16 que tem um perfil de segurança aperfeiçoado para uso in vivo comparado com uma nanopartícula similar compreendendo proteína de envelope VSV-G.

[035] 18. A nanopartícula de qualquer uma das modalidades precedentes, em que o vetor viral é desprovido de proteína de envelope viral, e em que a nanopartícula é somente capaz de transduzir uma célula de mamífero acima de um número limiar de moléculas de polímero por vetor.

[036] 19. A nanopartícula de modalidade 18, em que abaixo de dito número limiar de moléculas de polímero por vetor, a quantidade de polímero é insuficiente para revestir completamente o vetor.

[037] 20. A nanopartícula de modalidade 18 ou modalidade 19, em que abaixo de dito número limiar de moléculas de polímero por vetor, a nanopartícula é estruturalmente instável ou sujeita à dissociação de moléculas de polímero da nanopartícula.

[038] 21. A nanopartícula de qualquer uma das modalidades 18-20, que tem um perfil de segurança aperfeiçoado para uso in vivo comparado com um vetor ou vetor encapsulado em um polímero que é desprovido de dito limiar.

[039] 22. Um método de produção da nanopartícula de qualquer uma das modalidades precedentes, o método compreendendo as etapas de: (a) fornecer um vetor viral compreendendo um transgene; (b) fornecer um polímero ou uma mistura de polímeros e, opcionalmente, uma ou mais porções de direcionamento; e (c) contatar o vetor viral e o polímero ou a mistura de polímeros e, opcionalmente, a uma ou mais porções de direcionamento, pelo que o vetor viral e o polímero ou a mistura de polímeros combinam para formar dita nanopartícula.

[040] 23. O método de modalidade 22, em que o vetor viral é desprovido de proteína de envelope.

[041] 24. O método de modalidade 22 ou modalidade 23, em que etapa (c) é realizada a um pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,5.

[042] 25. O método de modalidade 24, em que etapa (c) é realizada a um pH de cerca de 5,5 a 6,0.

[043] 26. O método de qualquer uma das modalidades 22- 25, em que o polímero ou a mistura de polímeros compreende um poli(beta-amino éster) tendo a fórmula em que cada Pep é um oligopeptídeo; em que R é OH, CH3, ou colesterol; e em que m está na faixa de 1 a 20, n está na faixa de 1 a 100, e o está na faixa de 1 a 10.

[044] 27. O método de modalidade 26, em que cada oligopeptídeo compreende pelo menos três resíduos de aminoácido selecionados dentre o grupo consistindo em R, E, K, D, H, e C.

[045] 28. O método de modalidade 26, em que a sequência de aminoácido de pelo menos um dos oligopeptídeos é CRRR (SEQ ID NO:1), ou CHHH (SEQ ID NO:2), ou CKKK (SEQ ID NO:3), ou CEEE (SEQ ID NO:4), ou CDDD (SEQ ID NO:5).

[046] 29. O método de qualquer uma das modalidades 22- 28, em que o polímero ou mistura de polímeros tem uma carga positiva líquida ou uma carga negativa líquida a pH 7.

[047] 30. O método de qualquer uma das modalidades 22- 29, em que a nanopartícula contém de 108 a 1012 moléculas de polímero.

[048] 31. O método de modalidade 30, em que a nanopartícula contém de cerca de 109 a cerca de 1010 moléculas de polímero.

[049] 32. O método de qualquer uma das modalidades 22- 31, em que o vetor retroviral é um vetor retroviral.

[050] 33. O método de modalidade 32, em que o vetor retroviral é um vetor lentiviral.

[051] 34. O método de qualquer uma das modalidades 22- 33, compreendendo adicionalmente contatar o vetor com uma ou mais porções de direcionamento, opcionalmente em que as porções de direcionamento são ligadas ao polímero ou mistura de partículas.

[052] 35. O método de modalidade 34, em que a porção de direcionamento é selecionada dentre o grupo consistindo em anticorpos, fragmentos de anticorpo, scFvs, andaimes de proteína de tipo anticorpo, oligopeptídeos, aptâmeros, aptâmeros L-RNA, e ligandos para receptores de superfície celular.

[053] 36. O método de modalidade 35, em que a porção de direcionamento é um anticorpo anti-CD3 ou um aptâmero anti-CD3.

[054] 37. O método de qualquer uma das modalidades 22- 36, em que o transgene codifica um receptor de antígeno quimérico.

[055] 38. O método de qualquer uma das modalidades 22- 37, em que o vetor viral é desprovido de proteína de envelope VSV-G.

[056] 39. O método de qualquer uma das modalidades 22- 38, em que etapa (c) é realizada a um pH onde o polímero ou a mistura de polímeros tem uma carga positiva líquida e o vetor retroviral tem um potencial de superfície negativo.

[057] 40. Um método de tratamento de uma doença, o método compreendendo administrar uma composição compreendendo uma pluralidade de nanopartículas de qualquer uma das modalidades 1-21 a um indivíduo em necessidade do mesmo, pelo que as células do indivíduo são transduzidas pelo vetor retroviral e o transgene é expressado nas células transduzidas.

[058] 41. O método de modalidade 40, em que a doença é câncer.

[059] 42. O método de modalidade 40 ou modalidade 41, em que o indivíduo é humano.

[060] 43. Um método de transdução de células in vitro, o método compreendendo contatar células cultivadas com uma pluralidade de nanopartículas de qualquer uma das modalidades 1-21, pelo que pelo menos algumas das células cultivadas são transduzidas pelo vetor retroviral e o transgene é especificamente expressado nas células transduzidas.

[061] 44. O método de modalidade 43, em que as nanopartículas são dirigidas para células positivas CD3 e o transgene é especificamente expressado em células positivas CD3.

[062] 45. O método de modalidade 43 ou modalidade 44, em que o transgene codifica um receptor de antígeno quimérico.

[063] 46. Um método de realização de terapia gênica, o método compreendendo contatar células in vitro ou dentro de um organismo vivo com uma pluralidade de nanopartículas de qualquer uma das modalidades 1-21, pelo que o transgene é expressado nas células.

[064] 47. Uma nanopartícula compreendendo um vetor viral revestido com um polímero ou uma mistura de polímeros, em que o vetor viral compreende um nível reduzido de proteína de envelope, e compreende um transgene, em que a nanopartícula funciona como um veículo para entrega do transgene para células eucarióticas, e em que o nível reduzido de proteína de envelope é insuficiente para promover a entrada celular do vetor e transdução das células pelo vetor.

[065] 48. A nanopartícula de modalidade 47, em que o nível reduzido de proteína de envelope é 5% ou menos de uma quantidade de proteína de envelope em um vírus funcional a partir do qual o vetor foi derivado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[066] Figura 1A mostra um diagrama esquemático de uma modalidade de uma nanopartícula para entrega de genes. A nanopartícula contém uma partícula de vetor viral encapsulada em polímero que é desprovida de proteína de envelope. Figura 1B mostra um diagrama esquemático de outra modalidade de uma nanopartícula para entrega de genes, em que o vetor viral tem proteínas de envelope.

[067] Figura 2 mostra um diagrama esquemático de uma modalidade de uma nanopartícula para entrega de genes, em que o vetor viral é encapsulado em camadas múltiplas de polímero. Proteínas de envelope de vetor viral, embora não mostradas, podem estar presentes em algumas modalidades.

[068] Figura 3 mostra um diagrama esquemático de uma modalidade de uma nanopartícula para entrega de genes, em que a nanopartícula inclui uma porção de direcionamento fixada à camada de polímero (ou camada de polímero externo se uma multicamada de polímero for usada).

[069] Figuras 4A-4C são representações esquemáticas de um processo de transdução de uma célula com um vetor lentiviral contendo um transgene GFP (Figura 4A), inibindo a transdução usando um anticorpo anti-VSV-G (Figura 4B), e prevenindo a inibição mediada por anticorpo por encapsulação do polímero das partículas de vetor (Figura 4C).

[070] Figuras 5A-5C são representações esquemáticas de um processo similar ao mostrado em Figuras 4A-4C, mas usando um vetor lentiviral desprovido de proteína VSV-G.

[071] Figuras 6A-6F mostram resultados de medições de potencial zeta em vetores lentivirais ‘bald’ (isto é, sem envelope) encapsulados nos polímeros PBAE indicados.

[072] Figura 7 mostra resultados de transdução de células HEK293T com vetor lentiviral contendo um transgene GFP como uma função de tempo de incubação em tampões de formulação variando em composição e pH.

[073] Figuras 8A-8H mostram a estabilidade física de um vetor lentiviral desprovido de proteína VSV-G como uma função de p24 livre liberado após o aumento dos tempos de incubação (horas) nos tampões de formulação indicados variando em composição e pH. Figuras 8A-8D mostram p24 associado a LV, e Figuras 8E-8H mostram p24 livre liberado a partir do LV.

[074] Figura 9 mostra resultados de transdução de células HEK293T com vetor lentiviral desprovido de proteína VSV-G e contendo um transgene GFP como uma função de razão de polímero R /partícula de vetor, composição do tampão de formulação e pH.

[075] Figura 10 mostra resultados de um experimento similar ao mostrado em Figura 9, mas usando mistura de polímeros R/H em que ambos os polímeros foram ou não conjugados com colesterol.

[076] Figura 11 mostra resultados de um experimento similar ao mostrado em Figura 9 mas usando um vetor lentiviral pseudotipado contendo um transgene GFP.

[077] Figura 12 mostra resultados de expressão de GFP e viabilidade celular após transdução usando lentivetores

VSV-G+ encapsulados usando os polímeros PBAE indicados e razões de molécula de polímero/célula, com e sem anticorpo VSV-G. Os dados são normalizados, com a transdução na ausência do anticorpo se igualando a 100%.

[078] Figuras 13A – 13D mostram resultados de expressão de mCherry e viabilidade celular após transdução usando lentivetores VSV-G- (‘bald’) encapsulados usando os polímeros PBAE indicados e razões de molécula de polímero/célula.

[079] Figuras 14A – 14F mostram resultados de transdução de vetores lentivirais VSV-G+ não encapsulados em linfócitos humanos (14A), LV ‘bald’ não encapsulado (14B), LV ‘bald’ encapsulado em PBAE (14C), e LV ‘bald’ encapsulado em PBAE com porção de direcionamento de modelo PGA-anti-CD3 Fab (14D), todos analisados por classificação de células ativada por fluorescência (comparando marcação de anticorpo CD3 e expressão de GFP). Em Figura 14E, os linfócitos também foram transduzidos com um CAR específico para CD19, e células expressando CD3 são traçadas em gráfico contra a expressão de CAR CD19. Em Figura 14F, os mesmos linfócitos como usados para o experimento mostrado em Figura 9E foram contatados com células de câncer CD19+ humanas (células Ramos) e citotoxicidade contra as células de câncer avaliada por perda de células CD19+ após 4 horas.

[080] Figura 15 mostra resultados de transdução (expressão de GFP) em diferentes populações de PBMCs de camundongos após tratamento com cada um dos vetores e títulos indicados.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[081] As composições de nanopartículas de vetor viral empacotadas que permitem uma entrega intensificada de material genético para terapia gênica e aplicações em vacina são fornecidas. Estas composições incluem um vetor viral encapsulado por polímero ou uma mistura de polímeros. O envoltório do polímero proporciona proteção da partícula do vetor viral na corrente sanguínea e tecidos após a administração parenteral a um indivíduo e, em algumas modalidades, pode auxiliar na entrega do vetor para a sua célula alvo.

[082] Figuras 1A e 1B mostram duas modalidades de nanopartículas de vetor viral, também referidas aqui como veículos de entrega de genes, de acordo com a presente tecnologia. A estrutura básica do veículo é a da nanopartícula 10, que contém um vetor retroviral encapsulado por envoltório do polímero 11. O vetor retroviral inclui envelope de membrana 12, capsídeo de proteína 13 disposto dentro do envelope, e uma ou mais moléculas de ácido nucleico 14 dispostas dentro do capsídeo. O envelope viral é uma estrutura à base de bicamadas de lipídeos que, em modalidade mostrada em Figura 1B, contém um ou mais tipos de envelope viral ou proteínas de fusão 20 incrustadas dentro ou fixadas na membrana de bicamada; tais proteínas de fusão ou envelope estão faltando na modalidade mostrado em Figura 1A. O envelope de vetor viral, com ou sem proteínas de envelope, é encapsulado, de modo completo tanto funcionalmente como essencialmente, por matriz polimérica 11. A partícula de vetor pode ser encapsulada por mais do que um envoltório de polímero (ver, por exemplo, Figura 2), isto é, pode ser encapsulada por um envoltório de polímero de múltiplas camadas. Figura 3 mostra uma modalidade em que a porção de direcionamento 40 é associada com o envoltório do polímero.

[083] Em algumas modalidades, a presente tecnologia provê uma nova geração de vetores virais sintéticos, particularmente vetores lentivirais, em que as partículas de vetor viral são desprovidas de uma proteína de envelope viral. Esta nova tecnologia de plataforma confere várias vantagens comparadas com o uso de partículas de vetor viral contendo uma proteína de envelope, incluindo a produção mais barata de partículas de vetor viral por transfecção transiente. 1) Devido à remoção do plasmídeo codificando para proteína de envelope viral e devido ao fato de que o vetor não está transduzindo as células produtoras durante a produção, a deleção de proteína de envelope aumenta o tempo de produção utilizável e assim os rendimentos de vetores produzidos 2) Vetores desprovidos de proteína de envelope são mais seguros para uso para a terapia gênica in vivo, porque os vetores não revestidos, desprovidos de uma proteína de envelope viral, não podem transduzir células, e porque eles têm reduzida imunogenicidade, 3) Vetores desprovidos de proteína de envelope fornecem uma maior precisão e eficiência de transdução devido ao uso de direcionamento mediado por polímero específico. 4) Os vetores virais encapsulados em polímeros, particularmente vetores lentivirais, são mais estáveis em baixo pH do que os vetores virais comuns (não revestido), o que melhora sua estabilidade e eficácia em uso, especialmente quando estão envolvidos mecanismos de captação endossômica. Eliminação de proteína de envelope viral a partir das partículas de vetor viral é especialmente compatível com o uso de partículas de vetor viral revestidas com polímero, porque ela essencialmente elimina a capacidade das partículas de vetor não revestidas de transduzir células, e o revestimento de polímero pode fornecer um direcionamento específico; assim, o risco de transdução de células não direcionadas é drasticamente reduzido. Além disso, a eliminação de proteína de envelope viral promove a firme associação de moléculas de polímero com a superfície do envelope de vetor, provendo uma melhor estabilidade e direcionamento mais confiável comparado com as partículas de vetor viral revestidas com polímero contendo proteínas de envelope viral.

[084] A fim de produzir a forma nanoparticulada do vetor, moléculas de polímero devem ser firmemente aderidas às partículas de vetor. A associação frouxa das moléculas de polímero com o vetor pode levar à deslaminação e perda do envoltório de polímero a partir da superfície das partículas de vetor viral, com subsequente perda de atividade. Vetores virais com base em retrovírus tipicamente possuem uma estrutura de núcleo ou capsídeo, que contém um transgene e outras sequências de ácido nucleico necessárias, e estrutura de núcleo é, por sua vez, circundada por um envelope de membrana. O envelope tipicamente contém uma proteína de fusão viral que auxilia na fixação e fusão do envelope viral com a membrana de célula hospedeira, permitindo a entrada celular do vetor viral. No entanto, na modalidade da presente tecnologia, o papel de direcionamento de células, fixação, e entrada é assumido (e restaurado no caso de LV ‘bald’) pelo envoltório de polímero das partículas de vetor nanoparticulado, que podem atuar na captação celular e/ou nível endossômico para transduzir as células, tornando desnecessária a proteína de fusão viral. Além disso, a presença no envelope de vetor de uma proteína de fusão viral interfere com a fixação firme e estável de moléculas de polímero para o envelope. Assim, em certas modalidades da presente tecnologia, as nanopartículas do vetor viral foram modificadas por engenharia genética para serem desprovidas de proteínas de envelope, particularmente desprovidas de proteínas de fusão viral ou “espícula”. O resultado é uma estrutura de nanopartícula mais robusta e um vetor mais estável que exibe maior atividade e uma meia-vida mais longa quando administrado a um paciente, tal como por administração intravenosa. Nanopartículas de poli(beta-amino éster)

[085] Na presente tecnologia, para um vetor viral “desprovido de proteína de envelope” significa que o envelope, em particular a bicamada de lipídeos, do envelope do vetor é desprovido de quaisquer proteínas tipicamente encontradas na superfície do vírus envelopado, em ou sua forma naturalmente ocorrendo ou modificada, tal como o complexo de proteína Env ou glicoproteínas de envelope viral exemplificadas por complexo HIV gp120-gp41, glicoproteína de vírus de estomatite vesicular (VSV-G), hemaglutinina de vírus influenza, proteínas de vírus H e F de sarampo, e proteína de envelope de vírus Sindbis de tipo selvagem ou modificado. Tais proteínas, que as nanopartículas de vetor da presente tecnologia são desprovidas de, deveriam, se presentes, se projetar para fora da bicamada de lipídeos do envelope de vetor e interferir com o contato estável necessário entre a camada externa de polímero e a bicamada de lipídeos. Em diferentes modalidades, nanopartículas de vetor viral da presente tecnologia podem ou i) ser desprovidas de proteína de envelopes completamente, ii) essencialmente ser desprovidas de proteínas de envelope (isto é, conter somente uma quantidade de traço tal como 0,1% ou menos de partículas de vetor viral típicas), ou iii) ter uma quantidade pequena de proteína de envelope, tal como menos que 10%, menos que 5%, menos que 3%, menos que 2%, ou menos que 1% da quantidade típica. Uma quantidade típica de proteína de envelope é uma quantidade presente em uma partícula de vetor viral que se baseia na proteína de envelope para entrada e transdução celular, ou uma quantidade encontrada no envelope de uma partícula de vírus intacta e funcional. O envelope do vetor viral pode ser modificado para ser completamente desprovido de proteína de envelope, por exemplo, por eliminação de qualquer gene codificando uma proteína de envelope durante expressão nas células a partir do que o vetor é produzido. Proteínas incrustadas na membrana ou fixadas na membrana, que não formam estruturas de tipo espícula sobre a superfície externa do envelope podem estar, no entanto, presentes na bicamada de lipídeos das nanopartículas de vetor viral em certas modalidades.

[086] Em uma modalidade, os polímeros usados para formar a nanopartícula de vetor viral incluem uma ou mais espécies de poli(beta-amino éster) (PBAE) tendo a fórmula em que Pep é um oligopeptídeo e R é OH, CH3, ou colesterol, uma molécula de fosfolipídeo, ou uma cadeia de acila ou ácido graxo, em que m preferivelmente está na faixa de 1 a 20. n preferivelmente está na faixa de 1 a 100, e o está na faixa de 1 a 10. Outros polímeros e misturas dos mesmos um com o outro e com PBAE também podem ser usados para encapsular partículas de vetor viral. Além disso, mecanismos de revestimento usando lipídeos, tal como na forma de lipossomas de lipídeos unilamelares ou multilamelares ou estruturas de tipo de micelas, incluindo tensoativos e/ou moléculas de lipídeos, podem ser usados também. Tais revestimentos podem ser especialmente utilizáveis para encapsular partículas de vetor viral desprovidas de proteínas de envelope (vetores ‘bald’).

[087] PBAEs foram descritos como vetores de entrega de polinucleotídeo não viral capazes de condensar ambos, DNA e RNA, em nanopartículas discretas (Green, J.J. et al. Acc. Chem. Res. 41, 749-759 (2008)), embora eles mostrem uma baixa eficiência de transdução e alta toxicidade. PBAEs podem ser formados a partir da reação de monômeros di(éster acrilato) com monômeros amina, resultando em polímeros tendo grupos acrilato terminais que podem ser funcionalizados com modificações terminais. Os grupos terminais são funcionalidades ou unidades constitucionais que estão em uma extremidade de uma macromolécula ou oligômero. A modificação terminal de PBAEs permite o aperfeiçoamento de suas propriedades biológicas.

[088] A modificação química nos términos de PBAEs com aminas primárias, por exemplo, produz uma maior eficácia de transfecção do que polímeros terminados em acrilato. Alternativamente, PBAEs podem ser modificados na extremidade com oligopeptídeos, que podem direcionar o vetor para tipos particulares de células, dependendo da sequência específica de oligopeptídeos. Um “oligopeptídeo”, como definido aqui,

compreende uma fita de pelo menos dois, ou em algumas modalidades, pelo menos três, aminoácidos ligados juntos por ligações de peptídeo. Exemplos de PBAEs modificados de modo apropriado são descritos em WO2014/136100 e WO2016/116887, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.

[089] Em algumas modalidades, o peptídeo oligopeptídeo compreende um, dois, três, quatro, cinco, ou mais aminoácidos selecionados dentre o grupo consistindo em arginina (R), ácido glutâmico (E), lisina (K), ácido aspártico (D), histidina (H), e cisteína (C). Em algumas modalidades, o oligopeptídeo contém um, dois, três, ou mais aminoácidos que são positivamente carregados (tal como R, K, ou H), ou pelo menos carregados parcialmente positivamente, sob condições fisiológicas. Em outras modalidades, o oligopeptídeo contém um ou mais aminoácidos negativamente carregados (tal como D ou E), ou na ausência de aminoácidos positivamente carregados ou misturados com aminoácidos positivamente carregados. Dados mostrados nos Exemplos revelam que a inclusão de aminoácidos negativamente carregados melhora o desempenho de vetores lentivirais ‘bald’, provavelmente por melhora do escape endossômico. Os oligopeptídeos em cada extremidade do polímero ou os polímeros compreendendo a mistura de polímeros são preferivelmente idênticos.

[090] A nanopartícula de PBAE assegura que o vetor permanece intacto durante transito através de circulação do paciente. A nanopartícula pode auxiliar na blindagem do vetor viral a partir do sistema imune do hospedeiro, por exemplo, assegurando que as nanopartículas reivindicadas possam manter uma elevada eficácia de transdução mesmo na presença de anticorpos neutralizantes de envelope anti-viral. Além disso, a partícula pode assegurar que o vetor transfecta somente as células imunes desejadas: as modificações de nanopartículas e/ou a presença de porções de direcionamento podem dirigir a nanopartícula especificamente para os tecidos de interesse.

[091] Preferivelmente, os PBAEs empregados na presente tecnologia têm um peso molecular de 1.000 a 100.000 g/mol, mais preferivelmente de 2,000 a 50.000 g/mol, e ainda mais preferivelmente de 5.000 a 40.000 g/mol.

[092] A camada de polímero ou envoltório que reveste o envelope de vetor viral pode formar uma camada homogênea única de polímero, ou pode formar duas ou mais camadas de sobreposição dos mesmos ou de diferentes polímeros, ou polímeros tendo diferentes cargas líquidas ou graus de reticulação. Outros polímeros não PBAE podem ser intermisturados com PBAE ou adicionados acima ou abaixo de uma camada de PBAE para formar o envoltório de polímero.

[093] A carga de superfície (ou potencial de superfície ou potencial zeta) das nanopartículas é importante para direcionamento ao tecido e transdução celular e pode ser ajustada muito finamente via modificações de polímero. Preferivelmente, o potencial zeta das nanopartículas sob condições fisiológicas de uso está na faixa de cerca de -30 mV a cerca de +30 mV, ou mais preferivelmente na faixa de cerca de -15 mV a cerca de +15 mV. A nanopartícula polimérica pode incluir um tipo de polímero ou mais do que um tipo de polímero. Em algumas modalidades, o revestimento de polímero forma um revestimento de camada única, um revestimento de camada dupla, ou um revestimento de multicamadas. Figura 2 mostra uma modalidade da nanopartícula de vetor que inclui primeira camada 30, segunda camada 31, e terceira camada 32 de diferentes revestimentos poliméricos encapsulando o vetor retroviral. Em algumas modalidades, o revestimento de multicamadas inclui um polímero aniônico e um catiônico. Em algumas modalidades, o polímero catiônico inclui um ou mais PBAEs. Em algumas modalidades, o polímero aniônico é ácido poliglutâmico (PGA), sulfato de condroitina e/ou ácido hialurônico. Em certas modalidades, o vetor viral é encapsulado dentro de duas ou mais camadas de polímeros, tal como camadas alternantes tendo cargas elétricas líquidas alternantes, isto é, uma camada positivamente carregada é seguida por uma camada negativamente carregada, e então por uma camada positivamente carregada. Em algumas modalidades, a carga líquida da nanopartícula é positiva a pH 7. Em algumas modalidades, a carga líquida da nanopartícula é negativa a pH 7. Em algumas modalidades, a carga líquida da nanopartícula é dependente do tecido. Em algumas modalidades, a partícula é negativamente carregada, mas, no microambiente do tumor, ela se torna positivamente carregada. Em algumas modalidades, a partícula responde ao microambiente do tumor fracamente ácido e endo/lissosoma através da desintegração ou clivagem de algumas ligações químicas, pelas quais a camada de PBAE embaixo fica exposta e exerce um efeito de “esponja de prótons”.

[094] Como usado aqui, o termo “nanopartículas” refere-se a uma partícula sólida com um diâmetro de cerca de 1 a cerca de 1000 nm. O diâmetro médio das nanopartículas da presente tecnologia pode ser determinado por métodos conhecidos na arte, preferivelmente por espalhamento de luz dinâmica. Em particular, a tecnologia refere-se a nanopartículas que são partículas sólidas com um diâmetro de cerca de 1 a cerca de 1000 nm quando analisadas por espalhamento de luz dinâmica a um ângulo de espalhamento de 90° e a uma temperatura de 25°C, usando uma amostra apropriadamente diluída com PBS filtrado e um instrumento apropriado tal como um dos instrumentos ZETASIZER de Malvern Instruments (UK). Onde uma partícula é dita como tendo um diâmetro x nm, irá ocorrer geralmente uma distribuição de partículas de cerca desta média, mas pelo menos 50% por número (por exemplo >60%, >70%, >80%, >90%, ou mais) das partículas terão um diâmetro dentro da faixa x ± 20%.

[095] O diâmetro da nanopartícula pode ser de cerca de 5 nm a cerca de 999 nm, e preferivelmente de cerca de 50 nm a cerca de 400 nm, mais preferivelmente de cerca de 100 nm a cerca de 300 nm. Alternativamente, o diâmetro da nanopartícula pode ser de cerca de 10 a cerca de 100 nm. Em uma modalidade, as nanopartículas exibem um grau de aglomeração de menos do que 10%, preferivelmente menos que 5 %, e preferivelmente menos que 1%. Preferivelmente as nanopartículas são substancialmente não aglomeradas, como determinado por microscopia eletrônica de transmissão ou outro método. Vetores retrovirais

[096] Retrovírus são vírus de RNA que possuem a capacidade de se integrar no genoma hospedeiro em um modo estável. Em modalidades preferidas, o vetor retroviral no veículo de entrega de genes é um vetor lentiviral. Vetores lentivirais são derivados de lentivírus, que representam um gênero de vírus lentos da família Retroviridae. Lentivírus incluem vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da imunodeficiência de símios (SIV), vírus de encefalite infecciosa equina (EIAV), vírus de encefalite de artrite caprina (CAEV), vírus da imunodeficiência bovina (BIV) e vírus da imunodeficiência felina (FIV). Lentivírus podem integrar no genoma de células dividindo e não se dividindo. Além disso, eles podem persistir indefinidamente em seus hospedeiros e replicar continuamente. Em algumas modalidades descritas aqui, o vetor lentiviral tem um capsídeo, mas é desprovido de proteína de envelope. Preferivelmente, o vetor não é replicativo em células do hospedeiro pretendido ou indivíduo sob tratamento. Preferivelmente, o vetor não transduz ou altera a expressão de genes de células não direcionadas. Preferivelmente, o vetor é desprovido de quaisquer genes que causem virulência, particularmente virulência manifestada como induzindo a morte de células involuntária de células não direcionadas.

[097] Vetores lentivirais exibem várias vantagens como ferramentas para imunoterapia. Eles são menos tóxicos, comparados com outros vetores e são capazes de transduzir células não se dividindo, incluindo células dendríticas (He et al. 2007, Expert Rev Vaccines, 6(6):913-24). No entanto, lentivírus são mais complexos do que outros retrovírus devido à presença de genes acessórios (por exemplo, vif, vpr, vpu, nef, tat, e rev), que são requeridos para replicação in vivo.

[098] Bioprodução de vetores lentivirais integrativos, mas defeituosos na replicação, é baseada na separação de sequências cis- e trans-atuantes dos lentivírus. Transdução em células não se dividindo requer a presença de duas sequências cis-atuantes no genoma lentiviral, no trato de polipurina central (cPPT) e na sequência de terminação central (CTS). Isto leva à formação de um “flap” de DNA fita tripa que maximiza a eficácia de importação de genes nos núcleos de células não se dividindo, incluindo células dendríticas (DCs) (Zennou et al., 2000, Cell, 101(2) 173-85; Arhel et al., 2007, EMBO J, 26(12):3025-25 37). Além disso, remoção da sequência LTR U3 resultou em vetores de “auto- inativação” que são completamente desprovidos de sequências de promotor e intensificador viral e são mais seguros.

[099] Partículas lentivirais, que contêm vetores lentivirais, podem ser produzidas por transfecção transiente de células HEK 293 (com ou sem o antígeno T, aderente ou cultivado em suspensão) usando uma combinação de plasmídeos DNA, por exemplo: (i) um empacotamento de plasmídeo expressando Gag, Pol, Rev, Tat e, opcionalmente, proteínas estruturais ou enzimas necessárias para empacotamento do construto de transferência; (ii) um plasmídeo de transferência proviral contendo um cassete de expressão e fatores cis-atuantes de HIV necessários para empacotamento, transcrição reversa, e integração; e (iii) um plasmídeo codificando uma proteína de envelope, tal como a glicoproteína de vírus de estomatite vesicular (VSV-G), uma proteína que permite a formação de partículas mistas (pseudotipos) que podem transduzir uma ampla variedade de células, especialmente células de apresentação ao antígeno (APCs), incluindo células dendríticas (DCs) e macrófagos. Na presente tecnologia, o plasmídeo codificando uma proteína de envelope é omitida completamente em certas modalidades, enquanto que, em outras modalidades, ela é incluída, mas sua expressão é mantida em um nível baixo. Os vetores de partícula lentiviral também podem ser produzidos continuamente estavelmente inserindo os genes de empacotamento e DNA codificando proviral no genoma celular. Uma combinação de plasmídeos integrados e transfecção transiente também pode ser usada. Deve ser notado que, no entanto, em certas modalidades, vetores lentivirais apropriados para uso no veículo de entrega de genes descritos aqui são desprovidos de proteína de envelope.

[100] Vetores lentivirais não integrantes, desprovidos da proteína de envelope, também podem ser usados nos veículos de transferência de genes. Exemplos de vetores lentivirais não integrantes são encontrados em Coutant et al., PLOS ONE 7(11):e48644 (2102); Karwacz et al., J. Virol. 83(7):3094- 3103 (2009); Negri et al., Molecular Therapy 15(9):1716-1723 (2007); e Hu et al., Vaccine 28:6675–6683 (2010).

[101] Como o 5’LTR da sequência proviral é desprovido de U3, a expressão do transgene é dirigida por um promotor interno. Os promotores virais, tal como o promotor CMV, preferivelmente não são usados devido à presença de intensificadores fortes. Promotores ubíquos podem ser usados, tal como promotores para os genes humanos codificando ubiquitina, PGK, β-actina, GAPDH, β-quinesina e similares. Alternativamente, promotores ativos em células T e APCs podem ser usados, tal como o promotor para genes MHC classe I humanos. Em todos os casos, o promotor preferivelmente não contém um intensificador. O promotor é preferivelmente selecionado de modo a alcançar um nível terapêutico de expressão do transgene nas células alvo. Em algumas modalidades, o promotor é específico para as células alvo, isto é, ele permite um nível terapêutico de expressão do transgene nas células alvo, e preferivelmente permite um maior nível de expressão de transgene em células alvo do que em células não alvo; em certas modalidades, o promotor permite pouca ou nenhuma expressão do transgene em células não alvo. Encapsulação por Polímero de Vetores virais

[102] As tecnologias anteriores usando veículos encapsulados em polímeros para transfectar células têm envolvido plasmídeos ou outras moléculas de ácido nucleico que são diretamente revestidas com polímeros tal como PBAE. Algumas de tais tecnologias têm obtido transfecção usando moléculas de ácido nucleico (US2016/0145348A1, Mangraviti et al. 2015, Anderson et al. 2004, WO2016/116887). A estabilidade fraca de polímeros de PBAE a pH 7 foi relatada (Lynn et al. 2000). Tais preparações podem causar toxicidade celular, resultando em morte celular quando da exposição a plasmídeos revestidos com polímero ou outras moléculas de ácido nucleico. Assim, a dose de vetor encapsulado em PBAE administrado a células in vivo ou in vitro deve ser mantida no mínimo necessário para a transdução utilizável, de modo a evitar efeitos tóxicos. No entanto, vetores virais encapsulados em PBAE com vantagem resistem à degradação em baixo pH.

[103] Conforme o conhecimento dos presentes inventores, encapsulação por polímero de vetores virais tais como LV não tinha sido previamente alcançada. Os inventores desenvolveram métodos para a encapsulação por polímero de LV e outros vetores virais que resultam em partículas de LV encapsuladas em polímeros estáveis com baixa toxicidade e elevada eficácia em células transduzindo. Fatores importantes para produzir vetores encapsulados viáveis incluem o tipo de polímero usado (por exemplo, sua carga e distribuição de carga), a razão de moléculas de polímero para partícula de vetor, e o pH usado para encapsulação. O efeito destes parâmetros foi investigado e é descrito em Exemplos 1 e 2 abaixo.

[104] Usar polímeros de PBAE e LV, encapsulação com sucesso, resultando em partículas capazes de transdução eficaz de células alvo, requer cerca de 108 a 1011 moléculas de polímero por partícula de vetor; maiores razões podem produzir toxicidade. Além disso, o pH ótimo para a encapsulação com sucesso difere dependendo de se o LV contém VSV-G+ ou não (VSV-G- ou LV ‘bald’). Para LV VSV-G+, encapsulação ótima com PBAE ocorre a cerca de pH 5, como indicado pelo nível elevado de transdução resistente a anticorpo VSV-G a pH 5, enquanto uma pequena ou nenhuma encapsulação ocorreu em maiores valores de pH. Em contraste, para LV VSV-G-, uma ótima eficácia de encapsulação de PBAE ocorre sobre uma faixa de pH mais ampla ou menor, tal como cerca de 5,0, 5,5, 6,0, ou 6,5, ou 5,0-6,5, ou 5,0-6,0, ou 5,5-6,0, ou 5,5-6,5, enquanto que para LV VSV-G-, eficácia ótima de encapsulação de PBAE ocorre em uma menor faixa de pH, tal como cerca de 5,0, 5,5, 6,0, ou 6,5, ou 5,0-6,5, ou 5,0-6,0, ou 5,5-6,0, ou 5,5-6,5. Ver Exemplo 2. Finalmente, o pH ótimo para a encapsulação com sucesso que não impacta a viabilidade de células transduzidas é a mesma caso o LV contenha VSV-G+ ou não, tal como 5,0 ou 5,5.

[105] As nanopartículas podem ser formadas por mistura de uma solução compreendendo os materiais requeridos e, então, incubando a solução. Por exemplo, nanopartículas podem ser formadas por mistura de uma solução compreendendo PBAE com uma solução compreendendo o vetor viral, então, incubando a solução. Em algumas modalidades, a solução contém um açúcar, tal como glicose. Em algumas modalidades a solução contém 5% glicose. Em algumas modalidades, a solução contém um tampão. Em algumas modalidades, o tampão é acetato de sódio, e a concentração final do tampão de acetato de sódio é de 2 a 50 mM, de 10 a 30 mM, ou cerca de 25 mM. Em algumas modalidades, o tampão é tampão Tris-HCl, e a concentração final de tampão Tris-HCl é de 2 a 40 mM, de 5 a 30 mM, ou de 15 a 25 mM. Em algumas modalidades, a solução é incubada durante pelo menos 5 minutos. Em algumas modalidades, a solução é incubada durante pelo menos 30 minutos. Em algumas modalidades, a solução é incubada durante a noite. A solução pode ser incubada a 4 a 40°C, ou a 17 a 25°C; preferivelmente, a solução é incubada a 4°C.

[106] Em algumas modalidades, as nanopartículas são formadas usando deposição camada-por-camada de polímeros iônicos sobre partículas de retrovírus, assim, formando vetores virais revestidos com múltiplas camadas. Em algumas modalidades, uma solução contendo polímeros iônicos é contatada com uma solução contendo partículas de vetor viral. A razão de polímero para partículas de vetor viral pode estar na faixa de cerca de 1:100 a cerca de 5:1 em peso. A razão pode ser variada de modo a assegurar que as nanopartículas contenham, em média, uma única partícula de vetor viral por nanopartícula revestida com polímero. Por exemplo, a razão em peso de todos os polímeros para vetor viral pode ser de cerca de 1:100 a cerca de 1:1, ou de cerca de 1:50 a cerca de 1:1, ou de cerca de 1:20 a cerca de 1:1, ou de cerca de

1:10 a cerca de 2:1, ou de cerca de 1:1 a cerca de 5:1. Em algumas modalidades, um ou mais polímeros são adicionados a uma suspensão de partículas de retrovírus em glicose ou outro açúcar compatível com liofilização e injeção direta após reconstituição em um humano ou outro indivíduo. Em algumas modalidades, polímeros negativamente carregados e positivamente carregados são adicionados sequencialmente para formar camadas de polímeros tendo cargas alternantes. Em algumas modalidades, os polímeros são adicionados em intervalos de 30 min. Em algumas modalidades, existem cinco camadas de polímeros. Em algumas modalidades, os vetores virais revestidos com camadas múltiplas têm uma carga negativa líquida a pH 7. Em algumas modalidades, os vetores virais revestidos com camadas múltiplas têm uma carga positiva líquida a pH 7. O número e a polaridade das camadas podem ser escolhidos de modo a otimizar a eficácia de transdução de tipos de células particulares de interesse.

[107] Preferivelmente, nanopartículas são formadas a um pH em que a carga de superfície da partícula de vetor viral, potencial de superfície, ou potencial zeta são opostos aos de um ou mais polímeros que formam o envoltório de polímero em torno da partícula de vetor viral. Em algumas modalidades, o pH está acima do ponto isoelétrico de uma ou mais proteínas de envelope retroviral, ou do envelope como um todo. Por exemplo, o pH pode estar em ou acima cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,4, 5,4, 5,5, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,5, 6,8, ou 7,0. Em algumas modalidades, as nanopartículas são formadas em uma solução tendo um pH de cerca de 5. Porções de direcionamento

[108] O veículo de entrega do vetor de nanopartícula pode ser dirigido para células alvo específicas ou tecidos requerendo terapia, ou em que a expressão de proteína pelo vetor é desejada. Outra modalidade da porção de direcionamento é mostrada em Figura 3, em que o veículo de entrega contém porções de direcionamento covalentemente ou não covalentemente fixadas à superfície do polímero. Porções de direcionamento podem direcionar ao alvo células ou classes de células ou in vivo ou in vitro. Exemplos de porções de direcionamento incluem proteínas (por exemplo, anticorpos, incluindo anticorpos de humano, camundongo, camelídeo e tubarão, anticorpos de cadeia única, nanocorpos, diacorpos, e fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos), peptídeos, ácidos nucleicos tais como aptâmeros ou oligonucleotídeos, ou ligandos que se ligam aos receptores de superfície celular ou componentes de matriz extracelular.

[109] Em uma modalidade, o veículo de entrega é direcionado em particular a células T para expressão de uma ou mais proteínas terapêuticas, tal como proteínas de receptor de antígeno quimérico (CAR), de modo a intensificar a morte de células (por exemplo, células de tumor ou células de patógenos) às quais o receptor quimérico se liga. Em uma modalidade preferida, as células alvo para o vetor são células T (como células CD3+ T) ou células NK. Direcionamento pode ser alcançado usando uma ou mais aptâmeros de DNA ou anticorpos tendo especificidade para uma proteína sobre a superfície das células alvo. O aptâmero ou anticorpo serve como uma porção de direcionamento quando integrado na nanopartícula e exposto à superfície da nanopartícula. Por exemplo, a porção de direcionamento pode especificamente se ligar a CD3 ou CD8, ou uma combinação de CD3 e CD8.

Alternativamente, ou em adição a, a porção de direcionamento pode especificamente se ligar a uma proteína de superfície encontrada somente em células T naïve, tal como CD45RA, CCR7, CD62L, CD27, CD28, IL7-Ra, ou DC-SIGN. Combinações destas porções de direcionamento também podem ser usadas.

[110] Direcionamento não é limitado à tecnologia CAR ou células hematológicas, no entanto. Qualquer tipo de célula pode ser direcionado ao alvo. Por exemplo, em algumas aplicações de terapia gênica, um tipo de tecido ou célula específico (por exemplo, células hematopoiéticas, miócitos, células de ilhotas, etc..) pode ser direcionado ao alvo de acordo com a necessidade para reparar ou substituir uma função defeituosa. Em outras aplicações, células quiescentes podem ser direcionadas ao alvo sobre células se dividindo de modo a reduzir o risco de eventos de recombinação). Em ainda outras aplicações, células se dividindo tal como células de câncer podem ser direcionadas ao alvo, por exemplo em uma vacina para câncer. Transgenes e seus produtos de expressão

[111] O vetor viral no veículo de entrega de genes descrito aqui contém um ou mais transgenes que, após entrar em uma célula, se tornam expressado nas células e produz produtos de expressão. O vetor viral pode conter um, dois, três, ou mais transgenes. Os transgenes são moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer proteína, polipeptídeo ou peptídeo naturalmente ocorrendo ou artificial (isto é, recombinante), incluindo uma proteína terapêutica ou uma proteína marcadora. Tais proteínas expressadas em vetor preferivelmente têm um valor terapêutico no indivíduo em que elas são expressadas, e são assim proteínas terapêuticas. Um tipo de proteína terapêutica é um receptor de antígeno quimérico (CAR). CARs para uso na tecnologia descrita aqui são receptores de antígeno recombinantes, tal como receptores de célula T, com especificidade de ligação para antígenos de superfície celular que não requerem processamento de peptídeo ou expressão de HLA a fim de se ligar. A porção de ligação ao antígeno - pode ser um scFv derivado de um anticorpo, de um Fab selecionado de uma biblioteca, ou pode ser um ligando naturalmente ocorrendo para um receptor de superfície de célula. Também pode ser um nanocorpo (VHH). O restante da molécula de CAR acopla o domínio de ligação ao antígeno a domínios de transdução de sinal intracelular. Especificamente, um CAR da tecnologia inclui um ou mais de cada um dos seguintes domínios: um domínio de ligação ao antígeno extracelular, uma dobradiça e domínio transmembrana, e domínios de sinalização intracelular (CD3zeta, e/ou CD28 ou 41-BB/OX40). Detalhes adicionais de CARs apropriados para uso no veículo de entrega de genes e sequências para codificar os mesmos em um vetor lentiviral são encontrados em WO2016/012623A1, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[112] Outros genes que podem ser entregues usando os veículos de entrega de genes da presente tecnologia incluem interleucinas e citocinas, tal como interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL- 11 IL-12, GM-CSF, e G-CSF. Genes codificando antígenos, tais como antígenos virais, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos ou antígenos parasiticos, também podem ser entregues. Os vírus cujos antígenos podem ser expressados incluem picornavírus, coronavírus, togavírus, flavirvírus,

rhabdovírus, paramixovírus, ortomixovírus, buniavírus, arenvírus, reovírus, retrovírus, papovavírus, parvovírus, herpesvírus, poxvírus, hepadnavírus, e vírus espongiforme. Os alvos virais preferidos incluem influenza, vírus herpes simplex 1 e 2, sarampo, varíola, pólio ou HIV. Patógenos incluem tripanossomos, tênias, lombrigas, helmintos. Os antígenos de tumor, tal como antígeno fetal ou antígeno específico da próstata também podem ser direcionados ao alvo deste modo. Administração de um vetor de acordo com a presente tecnologia para fins de vacinação pode ser realizada de acordo com qualquer estratégia de vacinação conhecida. Vacinação de um indivíduo pode ser realizada de acordo com qualquer esquema desejado; preferivelmente, a vacinação é somente requerida raramente, tal como anualmente ou bienalmente, e proporciona uma proteção imunológica de longo prazo contra o agente infeccioso.

[113] Um transgene de vetor viral também pode codificar uma proteína anti-ponto regulador. Exemplos de proteínas anti-ponto regulador que podem ser codificados pelo transgene são inibidores de CTLA-4, PD1, PDL1, LAG-3, TIM 3, B7-H3, ICOS, IDO, 4-1BB, CD47, e combinações dos mesmos. Usos dos veículos de entrega de genes

[114] Os veículos de entrega de genes da presente tecnologia podem ser usados em qualquer aplicação que requer transdução eficaz de material genético em células de interesse, tal como células de mamíferos ou células humanas por meio de um vetor retroviral, tal como um vetor lentiviral. Os veículos de entrega transduzem células com elevada eficácia e exibem baixa toxicidade e baixa imunogenicidade. Eles podem integrar permanentemente material genético no genoma da célula hospedeira, tornando o sistema particularmente apropriado para uma marcação permanente de células e sua progênie. Porque os veículos apresentam alta especificidade, baixa toxicidade, e alta capacidade de transdução mesmo in vivo, eles são particularmente apropriados para aplicações de transferência de genes e terapia gênica para ambas as terapias em humanos e animais, assim como em modelos animais, assim permitindo a investigação dos mecanismos moleculares subjacentes a diferentes funções biológicas e sua tradução em terapia. No entanto, algumas preparações de nanopartículas encapsuladas em polímeros de vetor viral podem ser limitadas à transdução de alguns tipos celulares, tais como preferencialmente transduzindo células se dividindo e não transduzindo células não se dividindo.

[115] Os veículos de entrega da presente tecnologia podem ser usados para geneticamente modificar células para aplicações em biotecnologia, tais como fabricação de produtos biológicos e melhorias de gado e plantas. A inserção precisa e estável do gene ou genes de interesse é essencial para essas atividades e pode ser realizada de forma consistente com o veículo da tecnologia. Os veículos podem ser usados para inserir genes não originalmente presentes em células usadas para fins de fabricação, como células transformadas (células de ovário de hamster chinês (CHO), células HEK293) ou células primárias. Alternativamente, os veículos podem ser usados para "nocautear" certos genes presentes nessas células, como genes envolvidos na glicosilação de proteínas, uma causa comum de imunogenicidade. Os veículos podem, por exemplo, ser usados para prevenir, tratar ou curar doenças que afetam o gado, ou para melhorar seu valor econômico, acelerando o crescimento e a maturação.

[116] O veículo de entrega de genes pode ser usado para entregar material genético como parte de terapia gênica in vitro ou in vivo. O veículo de entrega de genes pode ser empregado em terapia gênica para substituir uma versão mudada causando doença de um gene por uma cópia saudável do gene; inativar ou “nocautear” um gene que não está funcionando de modo apropriado, e/ou introduzir um novo gene em uma célula, tal como para combater uma doença. O uso de vetores retrovirais, em geral, permite a inserção permanente de material genético em uma célula de interesse. O uso de vetores lentivirais, em particular, permite a inserção permanente de material genético mesmo em células não se dividindo.

[117] Os veículos de entrega de genes são capazes de transdução de células in vivo, levando à expressão funcional do transgene e, assim, podem ser usados para conduzir terapia gênica. O veículo de entrega de vetor pode ser administrado parenteralmente, tal como intravenosamente, intramuscularmente ou intra-tumor. Alternativamente, o veículo de entrega de vetor pode ser administrado externamente, tal como oralmente ou intranasalmente. O veículo de entrega de genes pode ser administrado por qualquer outra via apropriada, incluindo intracerebral e pulmonar.

[118] Os veículos de entrega de genes da presente tecnologia são também capazes de transdução de células in vitro, levando à expressão funcional do transgene e, assim, podem ser usados para conduzir terapia gênica in vitro e ex vivo. As células do paciente podem ser obtidas (por exemplo, por meio de amostra de sangue ou medula óssea ou biópsia) e colocadas em contato com um dos veículos de entrega de vetor descritos em um ambiente de laboratório. As células transduzidas podem então ser devolvidas ao paciente e ajudar a tratar a doença.

[119] As doenças que podem ser tratadas com terapia genética usando veículos de entrega de genes da tecnologia incluem doenças hereditárias, como imunodeficiência combinada grave (SCID), doença granulomatosa crônica (CGD), síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS), leucemia linfoblástica 30 aguda recorrente (ALL), adrenoleucodistrofia (ALD), hemofilia B, deficiência de adenosina desaminase (ADA), fibrose cística (CF), beta-talassemia, doença falciforme, distrofia muscular de Duchenne, hipercolesterolemia familiar e cegueira hereditária. As doenças tratáveis também incluem doenças neurodegenerativas, como doença de Parkinson, mal de Alzheimer e doença de Huntington. Elas incluem ainda doenças adquiridas, como doenças cardíacas, diabetes, distúrbios osteoarticulares e doenças infecciosas (por exemplo, gripe, HIV, hepatite, entre outras). Doenças tratáveis adicionais incluem câncer, como câncer de próstata, pâncreas, cérebro, pele, fígado, cólon, mama e rim. Exemplo 1. Produção de vetores lentivirais revestidos com polímeros

[120] Os vetores lentivirais revestidos com polímeros para uso em estudos de transdução de células foram obtidos usando os seguintes materiais e métodos.

Materiais

[121] O plasmídeo de vetor de transferência foi pARA- CMV-GFP ou pARA-CMV-mCherry ou pARA ou pAra-hUBC-CD19.

[122] Um plasmídeo resistente à canamicina codificado para o provírus (um DNA pró-viral recombinante não patogênico e não replicativo derivado de HIV-1, cepa NL4-3), no qual um cassete de expressão foi clonado. O inserto continha o transgene, o promotor para expressão do transgene e sequências adicionadas para aumentar a expressão do transgene e para permitir ao vetor lentiviral transduzir todos os tipos de células, incluindo as não mitóticas. As sequências de codificação correspondiam ao gene codificando a proteína fluorescente verde (GFP) ou mCherry (proteína fluorescente vermelha) ou CD19. O promotor era o promotor de ubiquitina humana ou o promotor CMV. Ele era desprovido de qualquer sequência intensificadora e promovia a expressão do gene em um nível elevado de modo ubíquo. As sequências não codificantes e os sinais de expressão corresponderam a sequências de repetição de terminal longo (LTR) com os elementos cis-ativos completos para o 5'LTR (U3-R-U5) e o deletado para o 3'LTR, portanto desprovido da região de promotor (ΔU3-R-U5). Para os experimentos de transcrição e integração, sequências de encapsidação (SD e 5'Gag), o sítio de trato de Polipurina central/terminação central para a translocação nuclear dos vetores e o sítio de poliadenilação BGH, foram adicionados.

[123] O plasmídeo de empacotamento foi pARA-Pack. O plasmídeo resistente a canamicina foi codificado pelas proteínas lentivirais estruturais (GAG, POL, TAT e REV) e usado em trans para a encapsidação do provírus lentiviral.

As sequências codificantes correspondiam a um gene policistrônico gag-pol-tat-rev, codificando para as proteínas estruturais (Matriz MA, Capsídeo CA e Nucleocapsídeo NC), enzimáticas (Protease PR, Integrase IN e Transcriptase reversa RT) e regulatórias (TAT e REV). As sequências não codificantes e sinais de expressão correspondiam a um promotor mínimo a partir de CMV para iniciação da transcrição, um sinal de poliadenilação a partir do gene de insulina para terminação da transcrição, e um Elemento Responsivo a HIV-1 Rev (RRE) participando para a exportação nuclear do RNA de empacotamento.

[124] O plasmídeo de envelope, quando usado, foi pENV1. Esta glicoproteína codificada por plasmídeo resistente a canamicina G a partir do vírus de estomatite vesicular (VSV-G) cepa Indiana, foi usada para a pseudotipagem de alguns dos vetores lentivirais. Os genes VSV-G foram otimizados no códon para expressão em células humanas, e o gene foi clonado em plasmídeo pVAX1 (Invitrogen). As sequências codificantes correspondiam a gene VSV-G otimizado no códon, e as sequências não codificantes e sinais de expressão correspondiam a um promotor de CMV para a iniciação da transcrição, e o sítio de poliadenilação BGH para estabilizar o RNA. Produção de partículas de vetor lentiviral - (“Bald”) VSV-G

[125] Células LV293 foram semeadas a 5 x105 células/mL em 2 X 3000 mL frascos Erlenmeyer (Corning, 431252) em 1000 mL de meio de produção LVmax (Gibco, A3583401). Os dois frascos Erlenmeyer foram incubados a 37°C, 65 rpm sob CO2 a 8% umedecido. O dia após a semeadura, a transfecção transiente foi realizada. Reagente transfectante PEIPro (PolyPlus, 115-010) foi misturado com plasmídeo de vetor de transferência (pARA-CMV-GFP ou pARA-CMV-mCherry ou pARA ou pAra-hUBC-CD19) e plasmídeo de empacotamento (pARA-Pack). Após incubação a temperatura ambiente, a mistura PEIPro/Plasmídeo foi adicionada gota a gota à linhagem de célula e incubada a 37°C, 65 rpm sob CO2 a 8% umedecido no dia 3, a produção de lentivetor foi estimulada por butirato de sódio a uma concentração final de 5 mM. A mistura em bruto foi incubada a 37°C, 65 rpm sob CO2 a 8% umedecido 24 horas. Após clarificação por filtração profunda a 5 e 0,5 µm (Pall, 609-122U), a mistura em bruto límpida foi incubada 1 hora a temperatura ambiente para tratamento com DNase.

[126] A purificação do lentivetor foi realizada por cromatografia (membrana Q mustang) e eluída por gradiente NaCl. Filtração de fluxo tangencial foi realizada em uma membrana de 100 kDa HYDROSORT (Sartorius, 3M81446802E-SW), que permitiu reduzir o volume e formular em tampão específico a pH 7, assegurando pelo menos 2 anos de estabilidade. Após filtração estéril a 0m22 µm (Millipore, SLGVM33RS), o produto de fármaco em bruto foi cheio em frasquinhos de vidro de 2 mL com alíquotas menores do que 1 ml, então, rotulados, congelados e armazenados a < -70°C.

[127] O número de LV ‘bald’ foi avaliado por quantificação de título físico. O ensaio foi realizado por detecção e quantificação da proteína de núcleo HIV-1 p24 associada a lentivírus somente (Kit de titulação de Lentivírus P24 ELISA Cell Biolabs QUICK TITER). Produção, purificação e quantificação de polímero 5 PBAE

[128] Os polímeros de poli(β-amino éster) foram sintetizados após um procedimento em duas etapas similar ao descrito por Dosta et al. 5-amino-1-pentanol (Sigma-Aldrich

3.9 g, 38 mmol) e 1-hexilamina (Sigma-Aldrich 3,9 g, 38 mmol) foram misturados em um frasco de fundo redondo e combinados com diacrilato de 1,4-butanodiol (Aldrich 18 g, 82 mmol) em uma razão molar 2.1:1 de monômeros diacrilato para amina. A mistura foi aquecida a 90°C com agitação durante 20 h. Então, ela foi resfriada a temperatura ambiente para formar um óleo sólido viscoso amarelo claro e armazenado a -20°C até uso posterior.

[129] As estruturas sintetizadas foram confirmadas por espectroscopia 1H-RMN. Os espectros de RMN foram registrados em um dispositivo 400 MHz Varian (Varian NMR Instruments, Claredon Hills, IL) e metanol-d4 foi usado como solvente. A determinação de peso molecular foi conduzida em um sistema HPLC Elite LaChrom (VWR-Hitachi) equipado com uma coluna GPC SHODEX KF-603 (6,0 x cerca de 150 mm), e THF como fase móvel. O peso molecular foi calculado por comparação com tempos de retenção de padrões poliestireno. Peso molecular médio em peso (Mw) foi 4400, e peso molecular médio em número (Mn) foi 2900.

[130] PBAEs modificados por oligopeptídeos foram obtidos por modificação na extremidade de polímero terminado em acrilato C6 com oligopeptídeo terminado em tiol a uma razão molar de 1:2,5 em sulfóxido de dimetila (DMSO). O seguinte procedimento sintético para obter polímero PBAE modificado na extremidade tri-arginina, C6-CR3, é mostrado como um exemplo: uma solução de C6 (113 mg, 0,054 mmol) dissolvida em DMSO (1,1 mL) e uma solução de cloridrato H-

Cys-Arg-Arg-Arg-NH2 (CR3 - 95% pureza – adquirida de Ontores) (99 mg, 0,13 mmol) em DMSO (1 mL) foram misturados em um frasquinho de tampa de rosca forrado com teflon e agitado em um banho de água com uma temperatura controlada de 20°C durante 20 h. O polímero capeado foi precipitado com 5 volumes de éter dietílico, após centrifugação (10 min a 3000 g), o polímero foi lavado com 2 volumes de mistura fresca de éter dietílico e acetona (7:3 v/v), então, o resíduo foi seco sob vácuo antes de ser formado em um estoque de 100 mg/mL em DMSO, que foi armazenado a -20°C.

[131] Em um exemplo adicional, polímero PBAE modificado na extremidade tri-lisina, C6-CK3 foi obtido por mistura de uma solução de C6 (100 mg, 0,048 mmol) dissolvida em DMSO (1,1 mL) e uma solução de cloridrato de H-Cys-Lys- Lys-Lys-NH2 (CK3) (78 mg, 0,12 mmol) em DMSO (1,8 mL) e processando a reação de copulação como previamente descrito para C6-CR3. Para o polímero PBAE modificado na extremidade tri-histidina, C6-CH3, a solução de C6 (65 mg, 0,031 mmol) dissolvida em DMSO (1,1 mL) que foi misturada com uma solução de cloridrato de H-Cys-His-His-His-NH2 (CH3) (53 mg, 0,078 mmol) em DMSO (1,2 mL). O polímero PBAE modificado na extremidade tri-aspartato, C6-CD3, a solução de C6 (96 mg, 0,046 mmol) dissolvida em DMSO (1,1 mL) que foi misturada com uma solução de cloridrato de H-Cys-Asp-Asp-Asp-NH2 (CD3) (96 mg, 0,046 mmol) em DMSO (1,7 mL). Finalmente, o polímero de PBAE modificado na extremidade tri-glutamato, C6-CE3, a solução de C6 (280 mg, 0,13 mmol) dissolvida em DMSO (1,1 mL) que foi misturada com uma solução de cloridrato de H- Cys-Glu-Glu-Glu-NH2 (CE3) (184 mg, 0,34 mmol) em DMSO (4,6 mL).

[132] A estrutura química dos PBAEs modificados por oligopeptídeos foi confirmada por espectroscopia de 1H-RMN pelo desaparecimento de sinais acrilato e a presença de sinais tipicamente associados com porções de aminoácidos. O teor de peptídeo livre residual foi quantificado por detecção UV (comprimento de onda 220 nm) após separação por sistema UPLC ACQUITY (Waters) equipado com uma coluna BEH C18 (130 A, 1,7 µm, 2,1x50 mm, temperatura 35°C) usando um gradiente de acetonitrila. Produção de Fab-PGA

[133] Ácido poliglutâmico 15 kDa (PGA) (Alamanda Polymers) foi dissolvido em tampão MES pH 6,0 a 20 mg.mL–1,, então sonicado durante 10 min em um sonicador de banho. 1,8 mL de solução PGA foi adicionado a 0,9 mL de etil-N′-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida-HCl (4 mg.mL-1, 16 equiv.) e 0,9 ml de sulfo-NHS (2,75 p/p EDC) ambos em tampão MES pH 6,0 e a solução foi misturada a temperatura ambiente durante 15 min. O PGA ativado resultante foi adicionado a uma solução de fragmento CD3ε F(ab′)2 anti-camundongo (InVivoMAb) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma razão molar 4:1 e misturado a temperatura ambiente durante 2 h. Os reagentes em excesso e PGA não ligado foram removidos por filtração (coluna 30.000 MWCO Vivaspin) e o tampão foi trocado 7 vezes contra PBS. A concentração do anticorpo foi determinada usando um Espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Cinética de estabilidade de LV VSV-G+ como uma função de pH

[134] 10 µL de produto de fármaco pseudotipando Lentivetores ou lentivetores ‘bald’ foram diluídos em 10 µL de tampões diferentes (pH 5 a 7) durante tempos diferentes (0, 15, 30, 60, 90 e 120 minutos) a +4°C.

[135] Titulação para a pseudotipagem de Lentivetores foi realizada por citometria de fluxo como a seguir. Células HEK293T (8×105 células/cavidade) foram semeadas em placas de 24 cavidades e incubadas a 37°C em uma atmosfera de CO2umedecida a 5%. Após 4 h, o meio de cultura foi removido e 300 µL de DMEM fresco contendo 10% FBS, 1% PS e 10 μL ow de cada condição foram adicionados a cada cavidade. Após 2 h, cada cavidade foi suplementada com 0,5 mL de meio de cultura fresco. Três dias após infecção, as células HEK293T em cada cavidade foram tripsinizadas, fixadas (solução BD CellFIX #340181) e o número de células positivas para fluorescência foi determinado usando citometria de fluxo (AttuneNXT; Invitrogen, Inc.).

[136] A seguinte formula foi usada para converter a porcentagem de células expressando GFP para uma diluição específica em TU: TU/ml = (% de células expressando eGFP/100) × número total de HEK293T células no momento da infecção/volume de estoque de vírus adicionado (mL).

[137] A titulação para os lentivetores ‘bald’ foi realizada por quantificação de título físico. O ensaio foi realizado por detecção e quantificação da proteína de núcleo p24 HIV-1 associada ao lentivírus somente (kit de titulação de Lentivírus P24 ELISA Cell Biolabs’ QUICK TITER). As amostras de pré-tratamento permitem distinguir o p24 livre dos Lentivetores destruídos. Encapsulação de LV VSV-G+ e LV ‘bald’ com PBAE modificado com oligopeptídeo

[138] Encapsulação de vetores lentivirais foi realizada como a seguir. Vetores lentivirais foram diluídos em 25 mM de tampão citrato a pH 5,0 (ou em um sistema tampão apropriado em um pH definido diferente) para preparar um volume final de 75 µL por réplica. Os polímeros de PBAE foram diluídos no mesmo tampão como para os vetores lentivirais (75 µL por réplica) e turbilhonados 2 s para homogeneização. Os polímeros diluídos foram adicionados aos vetores diluídos em uma razão 1:1 (v/v), as misturas foram suavemente turbilhonadas durante 10 s e incubadas 30 minutos a +4 °C. Finalmente, um volume igual de meio de cultura (150 µL) foi adicionado às reações de encapsulação antes da transferência às células. Revestimento de LV VSV-G+ e LV ‘bald’ encapsulados em PBAE com PGA-Fab

[139] O método de encapsulação previamente descrito foi modificado como a seguir. Vetores lentivirais foram diluídos em 25 mM de tampão citrato a pH 5,0 (ou em um sistema tampão apropriado em um pH definido) para preparar um volume final de 75 µL por réplica. PBAEs foram diluídos no mesmo tampão como para os vetores lentivirais (75 µL por réplica) e turbilhonados 2 s para homogeneização. Os polímeros diluídos foram adicionados aos vetores diluídos em uma razão 1:1 (v/v). As misturas foram suavemente turbilhonadas durante 10 s e incubadas 30 minutos a +4°C. Polímeros PGA-Fab diluídos em 25 mM de tampão citrato a pH 5,0 (ou em um sistema tampão apropriado em um pH definido) foram adicionados à mistura de encapsulação e suavemente turbilhonados 10 s para homogeneização. A mistura de reação de revestimento foi incubada 30 minutos a +4°C e o volume foi completado até 300 µL com meio de cultura antes de ser transferida para células. Exemplo 2. Medições de potencial zeta de vetores lentivirais encapsulados em PBAE

[140] Medições de carga de superfície de partícula dos complexos LV/PBAE/PGA-Fab foram determinadas por espalhamento de luz dinâmica (DLS) a temperatura ambiente com um laser Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Reino Unido, 4-mW) usando um comprimento de onda de 633 nm). Medições foram realizadas por mistura de 200 µL de complexos com 800 µL de solução tampão D-PBS 1x (pH 7,1). Os resultados foram traçados como média e desvio padrão de 3 medições analisadas por intensidade, e são mostrados em Figuras 6A- 6F. Os resultados mostraram uma modificação do potencial de superfície pela encapsulação das partículas de vetor com polímero de acordo com a carga do polímero, indicando encapsulação bem-sucedida com polímero. Exemplo 3. Transdução de células HEK293T por vetores lentivirais revestidos com polímeros.

[141] A fim de testar o efeito do revestimento de polímero sobre a capacidade de transdução de vetores lentivirais, polímeros de poli(beta-amino éster) conjugados a peptídeo foram preparados e usados para revestir vetores lentivirais e testar a transdução de células HEK293T. Os vetores lentivirais carregavam um transgene de proteína fluorescente verde (GFP), e transdução foi quantificada por expressão de GFP nas células hospedeiras transduzidas (ver Figura 4A). Peptídeos tendo diferentes grupos de aminoácidos carregados foram conjugados à estrutura dorsal do polímero para testar o efeito de carga. As partículas de vetor com e sem proteína VSV-G em seus envelopes foram revestidas com polímero. A eficácia de encapsulação de polímero foi avaliada por determinação da capacidade de transdução dos vetores na presença de anticorpo para VSV-G, que tinha a capacidade de bloquear a transdução que é dependente em proteínas VSV-G expostas (ver Figura 4B), mas não irá bloquear a transdução por vetor que é efetivamente encapsulado no polímero e não se baseia em VSV-G exposto para a transdução (ver Figura 4C). Similares experimentos foram realizados com LV desprovido de VSV-G; esta estratégia é mostrada em Figuras 5A-5C. Estes “LV ‘bald’” não foram capazes de realizar a transdução devido ao fato de serem desprovidos de proteína VSV-G, mas se tornaram capazes de transdução após sua encapsulação por polímeros de PBAE. A transfecção permitida pelo polímero não foi esperada para ser bloqueada por Ab anti VSV-G.

[142] Os vetores encapsulados foram preparados como a seguir. As diluições de vetor foram preparadas em um primeiro conjunto de microtubos de 1,5mL em um volume final de 150µL por réplica, e as diluições de polímero foram preparadas em um segundo conjunto de microtubos de 1,5mL com os mesmos volumes finais. O polímero diluído foi então adicionado ao vetor diluído e a mistura foi homogeneizada por uso de pipeta de modo suave para evitar quaisquer bolhas ou espumas. As misturas de encapsulação foram incubadas 30 minutos a +4°C.

[143] Para a quantificação de transdução, células foram semeadas em placas de 24 cavidades a uma densidade de 8 × 104 células por cavidade em meio completo contendo 10% FBS e incubadas durante 4 h para aderência. Para testar a neutralização de transdução por anticorpo anti-VSV-G, 300µL de vetor encapsulado foram misturados ou com 300µL de meio de cultura de células completo ou com 300µL de soro de coelho anti-VSVg policlonal diluído 100 vezes em meio de cultura de células completo, e incubados 30 minutos a 37°C, 5%CO2. Células foram então transduzidas por substituição do meio com 300 μL de vetor em meio de neutralização de anticorpo ou meio de cultura desprovido de anticorpo, seguido por incubação a 37°C, 5%CO2 durante 2h. Após adsorção, 1mL de meio completo foi adicionado a cada cavidade. Em 72h após a transdução, as células foram tripsinizadas e recolocadas em suspensão em 200µL de cellfix 1X, e a porcentagem de células expressando GFP foi determinada com um citômetro de fluxo Attune NxT usando o canal BL1.

[144] Os polímeros usados nos experimentos de encapsulação foram polímeros de poli(beta-amino éster) (PBAE) como mostrado na fórmula abaixo, conjugados a peptídeos carregados (Pep) e opcionalmente colesterol (R). O polímero R refere-se a PBAE conjugado ao peptídeo CRRR (mesmo peptídeo em ambas as extremidades). O polímero H refere-se a PBAE conjugado ao peptídeo CHHH. O polímero E refere-se a PBAE conjugado ao peptídeo CEEE. O polímero D refere-se a PBAE conjugado ao peptídeo CDDD. Misturas dos peptídeos foram testadas em diferentes razões indicadas nas tabelas abaixo. R/H refere-se a uma mistura 60/40 de polímeros R e H. Polímeros indicados com “chol” foram também conjugados a colesterol como o grupo R indicado na estrutura abaixo. O valor de “m” foi 3 e o valor de “o” foi 1.

[145] As seguintes tabelas mostram a mistura de polímeros e razão de moléculas de polímeros por partícula de LV usadas para encapsulação e testadas para capacidade de transdução.

Tabela 1. Revestimento de polímeros sados para testar o efeito de carga.

Tabela 2. Revestimentos adicionais de polímeros usados para testar o efeito de carga.

Tabela 3. Revestimento de polímeros usados com LV desprovido de VSV-G.

[146] A fim de testar o efeito do revestimento de polímero sobre a capacidade de transdução de vetor revestido com polímeros lentivirais desprovidos de proteína de envelope viral, peptídeos tendo aminoácidos carregados diferentes foram conjugados à estrutura dorsal do polímero, e os polímeros resultantes foram usados para revestir vetores lentivirais e testar a transdução de células HEK293T.

[147] Os dados de expressão de GFP foram obtidos como resultados de citômetro de fluxo após transdução com vetores tendo as razões indicadas de moléculas de polímero por partícula de vetor lentiviral (LV). Sob cada condição, a adição de soro de coelho anti-VSV-G policlonal reduziu a taxa de transdução com uma razão de 109, mas Ab falhou em redução a transdução a razões de 1010 e 1011, indicando que pelo menos cerca de 1010 polímeros por partícula de LV eram necessários para uma encapsulação eficaz. Os dados também confirmaram que LVs encapsulados em polímeros foram capazes de realizar de modo eficaz a transdução, e que polímero positivamente carregado é o mais eficaz, com a eficácia de transdução diminuindo com introdução aumentada de carga negativa no polímero.

[148] Um experimento similar foi realizado usando polímero de PBAE conjugado a colesterol. Os resultados foram similares ao polímero que não foi conjugado a colesterol para ambos os polímeros R e E.

[149] Um experimento similar foi realizado usando LVs que são desprovidos da proteína de envelope VSV-G (“LV bald”). Os resultados indicaram que LVs ‘bald’ não revestidos não foram capazes de induzir a transdução. No entanto, LVs ‘bald’ encapsulados em polímero foram capazes de transduzir de modo eficaz as células em razões de molécula de polímero/LV de 109,1010, ou 1011. Como esperado, a adição de

Ab anti-VSV-G não teve efeito. Os polímeros positivamente carregados foram muito mais eficazes do que os polímeros neutros ou negativamente carregados. Similares resultados foram obtidos usando polímero conjugado a colesterol, e também para misturas de polímeros contendo peptídeos R+H e D, com ou sem colesterol. Exemplo 4. Efeito do pH durante revestimento por polímero de vetores lentivirais ±VSV-G.

[150] LVs revestidos com PBAE desprovidos de VSV-G ou expressando VSV-G foram preparados e sua transdução de células Jurkat realizada como descrito em Exemplo 3, exceto que as células foram cultivadas em suspensão e o pH da solução de revestimento foi variada. O tampão acetato foi usado a pH entre 4,5 e 6, tampão citrato foi usado a pH entre 4,5 e 6, tampão histidina foi usado a pH entre 6 e 7, e tampão Tris foi usado como pH entre 7 e 8. Em cada uma das condições de pH, o número de moléculas de polímero por partícula de LV foi variado de 106 a 1010. A estabilidade do LV VSV-G+ é mostrada em Figura 7. Os vetores eram estáveis sobre a faixa de pH de 4,5 a 8,0 e podem ser mantidos nestas faixas de pH por até 120 min.

[151] Figuras 8A-8H mostram os resultados de um experimento para testar a estabilidade de partículas de LV ‘bald’ em tampões de diferentes pHs sem encapsulação com polímero. Para LV VSV-G+, integridade foi avaliada por medição de sua capacidade para transduzir células HEK293T e causar expressão de GFP (detectada por FACS). Para LV (bald) VSV-G-, integridade foi avaliada por medição da liberação de proteína p24 (um indicador de lise das partículas de vetor; p24 foi medido em sobrenadantes por ELISA), porque nenhuma transdução foi possível usando LV ‘bald’ não revestido com polímero. A integridade física foi determinada após 15, 30, 60, 90 e 120 minutos em tampões de diferentes pHs. Os resultados indicaram nenhuma perda de integridade para ambos os tipos de LV até 120 min, embora as maiores condições de pH foram levemente menos favoráveis para a viabilidade de LV do que nas condições de menores pHs. Os dados brutos para a retenção e liberação de p24 de LV ‘bald’ são mostrados em Figuras 8A-8H.

[152] Figura 9 mostra os resultados para encapsulação de LV ‘bald’ em diferentes valores de pH, seguido por transdução de células HEK293T e expressão de GFP detectados por FACS. Como esperado de outros experimentos discutidos em Exemplo 1, revestimento de polímero completo do LV ‘bald’, resultando em LV capaz de transdução, requereu pelo menos cerca de 109 moléculas de PBAE por partícula de LV a fim de obter partículas viáveis. Uma dependência clara do pH foi observada para o processo de revestimento. Maior pH (pH 7) praticamente não deu LV infeccioso, enquanto que o revestimento a pH na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 6,5 deu bons resultados de transdução. O derivado R/H PBAE (PBAE conjugado a peptídeos CRRR misturados com PBAE-CHHH a uma razão de 60/40 vol/vol, ver Exemplo 1) foi usado para revestimento nesse experimento. Significativamente, Figura 9 também mostra que encapsulação parcial por polímero resulta em uma falta de capacidade de transdução, que demonstra que o uso de vetores virais desprovidos de proteína de envelope irá intensificar o perfil de segurança. Sem esta característica, partículas de vetor cujo revestimento de polímero está perdido, parcialmente ou completamente, ou se torna parcialmente degradado, ou partículas de vetor que foram revestidas de modo incompleto durante produção, poderiam representar uma questão de segurança devido a transdução possível de células não direcionadas ao alvo.

[153] Figura 10 mostra resultados de um experimento similar ao mostrado em Figura 9, mas usando uma mistura (60/40) dos polímeros R-colesterol-PBAE e H-colesterol-PBAE. A adição de colesterol diminuiu a razão de polímero/ partícula de LV requerida para encapsular completamente o LV ‘bald’ em baixo pH.

[154] Um experimento testando o revestimento do LV VSV-G+ em diferentes valores de pH é mostrado em Figura 11. O polímero R-PBAE foi usado para encapsulação, e a sensibilidade para anticorpo anti-VSV-G+ também foi testada. Os resultados indicam pequena sensibilidade ao pH para taxas globais de transdução, mas a sensibilidade do anticorpo (indicativa de revestimento incompleto de polímero) foi maior a pH 6,5 do que em menores valores de pH. Além disso, indicação de revestimento mais completo em menor pH é vista como uma transdução de linha de base maior na presença de anticorpo anti-VSV-G a pH 5. Exemplo 4. Transdução de linfócitos usando vetores lentivirais ±VSV-G encapsulados Transdução de células Jurkat e linfócitos humanos

[155] Para a quantificação de transdução, células Jurkat foram semeadas em placas de 24 cavidades a uma densidade de 8x104 células por cavidade em meio completo contendo 10% FBS e 1 % penicilina/estreptomicina. 300 µL de vetor encapsulado foram adicionados às células. Após 2 h incubação a 37°C, 5 % CO2, 500 µL de meio completo fresco foram adicionados a cada cavidade. A porcentagem de células expressando transgenes GFP ou mCherry foi determinada 72 h após a transdução com um citômetro de fluxo Attune NxT (Thermo Fisher) usando o canal BL1 ou YL1, respectivamente. O fenótipo de células transduzidas expressando transgene GFP foi determinado por citometria de fluxo colorindo com diferentes anticorpos específicos para os seguintes tipos de célula seguindo as instruções do fabricante (BD Biosciences): CD3 (T linfócitos) e CD19 (B linfócitos).

[156] A transdução de linfócitos humanos foi realizada com o mesmo método exceto que 105 células/cavidade foram semeadas. Citotoxicidade

[157] Os linfócitos humanos foram semeados em placas de 24 cavidades a uma densidade de 5x105 células por cavidade em meio completo contendo 10% FBS e 1 % penicilina/estreptomicina. 300 µL de vetor expressando CAR encapsulado em CD19 foram adicionados às células. Após 2 h de incubação, 500 µL de meio completo fresco foram adicionados a cada cavidade. Após 48 h incubação a 37 °C, 5 % CO2, células de tumor Ramos CD19-positivas foram adicionadas em razões de linfócitos/ células de tumor de 50:1 ou 1:1. Após 4 h incubação a 37 °C, 5% CO2, células expressando CAR CD19 foram coloridas com proteína L e detectadas com um citômetro de fluxo ATTUNE NXT (Thermo Fisher) usando o canal YL1. As células positivas para linfócitos CD19e foram quantificadas por citometria de fluxo colorindo com anticorpos específicos CD19- ou CD3- (BD Biosciences) de acordo com instruções do fabricante.

Preparação e transdução de PBMCs de camundongo

[158] Células mononucleares de sangue periférico recentemente preparadas de camundongo (PBMCs) foram isoladas de sangue total heparinizado usando tubos LEUCOSEP (Greiner bio--one) cheios com FICOLL-PAQUE PREMIUM 1,084 (GE Healthcare). Após a diluição do sangue com DPBS, as PBMCs foram separadas em um gradiente de densidade FICOLL, lavadas duas vezes com DPBS e recolocadas em suspensão para a densidade de célula desejada em meio de cultura.

[159] As células foram semeadas em placas de 24 cavidades a uma densidade de 2 x 105 células por cavidade em meio RPMI contendo 10% FBS e 1 % penicilina/estreptomicina. 300 µL de vetor encapsulado foram adicionados às células. Após 2 h incubação a 37°C, 5 % CO2, 500 µL de meio completo fresco foram adicionados a cada cavidade. A porcentagem de células expressando GFP foi determinada 48 h após a transdução com um citômetro de fluxo Attune NxT usando o canal BL1. O fenótipo de células transduzidas expressando transgene GFP foi determinado por citometria de fluxo colorindo com diferentes anticorpos específicos para os seguintes tipos de células seguindo as instruções do fabricante (BD Biosciences): CD4 (linfócitos T auxiliares), CD8 (linfócitos citotóxicos), CD19 (B linfócitos), Ly-6G (granulócitos), CD11b (macrófagos), CD11c (células dendríticas) e F4/80 (monócitos).

[160] Figura 12 mostra a expressão de GFP e viabilidade celular de células Jurkat transduzidas com o LV encapsulado em PBAE indicado, na presença e ausência de anticorpo anti- VSV-G. Os resultados são normalizados para a condição menos de anticorpo como 100%. Uma ampla variedade de polímeros de encapsulação e razões de polímero/vetor não foram capazes de bloquear a inibição pelo anticorpo, indicando que a proteína VSV-G se projetou através do revestimento de polímero sob todas as condições sondadas e transdução mediada.

[161] Em Figuras 13A-13D, expressão de mCherry é mostrada como uma medição de transdução de células Jurkat por LV ‘bald’ encapsulado pelos polímeros de PBAE indicados, com e sem conjugação de colesterol, e em uma variedade de diferentes razões de polímero/vetor e carga líquida de polímero.

[162] Os resultados de transdução de linfócitos humanos usando diferentes vetores são mostrados em Figuras 14A-14D. O número de partículas de vetor por linfócito aumenta da esquerda para a direita em cada figura. Figura 14A mostra os resultados obtidos for LV VSV-G+ típico; pequena transdução foi observada, como também foi o caso para o LV (bald) VSV-G- não encapsulado mostrado em Figura 14B. No entanto, a encapsulação do LV ‘bald’ com R/H (60/40 vol/vol), razão 1.10e+9 PBAE por LV com ou sem 10E+4 PGA-Fab levou a uma transdução de sucesso e dependente de dose. Como mostrado em Figura 14C. No experimento mostrado em Figura 14D, transdução forte também foi obtida após adição de uma porção de direcionamento (PGA Fab) para o LV ‘bald’ encapsulado em PBAE. O experimento cujos resultados são mostrados em Figura 14E demonstra que transdução adicional de linfócitos humanos com um CAR específico para CD19 foi compatível com uma forte transdução do transgene de LV. Além disso, os resultados mostrados em Figura 14F revelam que linfócitos transduzidos por CAR específico para CD19 foram capazes de ação citotóxica contra células de câncer positivas para CD19.

[163] Figura 15 mostra os resultados de experimentos em que PBMCs de camundongo foram transfectados com ou LV não encapsulado em VSV-G+ (duas barras à esquerda) ou LV ‘bald’ encapsulado em PBAE- (duas barras à direita). O LV ‘bald’ encapsulado mostrou uma transdução muito mais forte do que os vetores VSV-G+ para cada tipo de célula presente na preparação de PBMC. Referências: Nayerossadat, Maedeh, T, Ali, PA. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery, Adv Biomed Res, 2102, 1:27 Green, JJ Langer, R, and Anderson, DG, A. Combinatorial Polymer Library Approach Yields Insight into Nonviral Gene Delivery, Acc. Chem. Res, 2008, 41 (6), pp 749–759 He Y, Munn D, Falo LD Jr. Recombinant lentivector as a genetic immunization vehicle for antitumor immunity, Expert Rev Vaccines, 2007 Dec;6(6):913-24 Zennou V, Petit C, Guetard D, Nerhbass U, Montagnier L, Charneau P. HIV-1 genome nuclear import is mediated by a central DNA flap, Cell. 2000 Apr 14;101(2):173- 85 Arhel NJ, Souquere-Besse S, Munier S, Souque P, Guadagnini S, Rutherford S, Prévost MC, Allen TD, Charneau P. HIV-1 DNA Flap formation promotes uncoating de the pre- integration complex at the nuclear pore, EMBO J. 2007 Jun 20;26(12):3025-37 Coutant F, Sanchez David RY, Félix T, Boulay A, Caleechurn L, Souque P, Thouvenot C, Bourgouin C, Beignon

AS, Charneau P. A nonintegrative lentiviral vector-based vaccine provides long-term sterile protection against malaria, PLoS One. 2012;7(11) Karwacz K, Mukherjee S, Apolonia L, Blundell MP, Bouma G, Escors D, Collins MK, Thrasher AJ. Nonintegrating lentivector vaccines stimulate prolonged T-cell and antibody responses and are effective in tumor therapy, J Virol. 2009 Apr;83(7):3094-103 Anderson, DJ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101:16028-33. Lynn DM, Langer, R, J. Am Chem Soc 2000, 122:10761-10768. Mangraviti, et al., ACS Nano 2015, 9:1236-1249. Negri DR, Michelini Z, Baroncelli S, Spada M, Vendetti S, Buffa V, Bona R, Leone P, Klotman ME, Cara A. Successful immunization with a single injection de non- integrating lentiviral vector, Mol Ther. 2007 Sep;15(9):1716-23 Hu B, Dai B, Wang P. Vaccines delivered by integration-deficient lentiviral vectors targeting dendritic cells induces strong antigen-specific immunity, Vaccine. 2010 Sep 24;28(41):6675-83 Montenarh M. Biochemical properties de the growth suppressor/oncoprotein p53. Oncogene. 1992 Sep;7(9):1673-80

[164] Como aqui usado, "consistindo essencialmente em" permite a inclusão de materiais ou etapas que não afetam materialmente as características básicas e novas da reivindicação. Qualquer enumeração aqui do termo "compreendendo", particularmente em uma descrição de componentes de uma composição ou em uma descrição de elementos de um dispositivo, pode ser trocada por "consistindo essencialmente em" ou "consistindo em".

[165] Embora a presente tecnologia tenha sido descrita em conjunto com certas modalidades preferidas, a pessoa versada na arte, após a leitura do relatório descritivo acima, será capaz de efetuar várias modificações, substituição de equivalentes, e outras alterações nas composições e métodos especificados aqui.

Claims (48)

REIVINDICAÇÕES

1. Nanopartícula, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor viral revestido com um polímero ou uma mistura de polímeros, em que o vetor viral compreende um transgene, e em que a nanopartícula funciona como um veículo para entrega do transgene às células eucarióticas.

2. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vetor viral é desprovido de proteína de envelope.

3. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o polímero ou a mistura de polímeros compreende um poli(beta-amino éster) tendo a fórmula em que cada Pep é um oligopeptídeo; em que R é OH, CH3, ou colesterol; e em que m está na faixa de 1 a 20, n está na faixa de 1 a 100, e o está na faixa de 1 a 10.

4. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que cada oligopeptídeo compreende pelo menos três resíduos de aminoácido selecionados dentre o grupo consistindo em arginina (R), ácido glutâmico (E), lisina (K), ácido aspártico (D), histidina (H), e cisteína (C).

5. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácido de pelo menos um dos oligopeptídeos é CRRR (SEQ ID NO:1), ou CHHH (SEQ ID NO:2), ou CKKK (SEQ ID NO:3), ou CEEE (SEQ ID NO:4), ou CDDD (SEQ ID NO:5).

6. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o polímero ou mistura de polímeros tem uma carga positiva líquida ou uma carga negativa líquida a pH 7.

7. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a nanopartícula contém de 108 a 1012 moléculas de polímero por vetor.

8. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a nanopartícula contém de cerca de 109 a cerca de 1010 moléculas de polímero por vetor.

9. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o vetor viral é um vetor retroviral.

10. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o vetor retroviral é um vetor lentiviral.

11. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma ou mais porções de direcionamento ligadas a uma ou mais moléculas de polímero.

12. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a porção de direcionamento é selecionada dentre o grupo consistindo em anticorpos, fragmentos de anticorpo, scFvs, andaimes de proteína de tipo anticorpo, oligopeptídeos, aptâmeros, aptâmeros L-RNA, e ligantes para receptores de superfície celular.

13. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a porção de direcionamento é um anticorpo anti-CD3 ou um aptâmero anti-CD3.

14. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o transgene codifica um receptor de antígeno quimérico.

15. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que tem um potencial zeta de cerca de -15 mV a cerca de +15 mV.

16. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que é desprovida de proteína de envelope VSV-G.

17. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que têm um perfil de segurança aperfeiçoado para uso in vivo comparado com uma nanopartícula similar compreendendo proteína de envelope VSV-G.

18. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o vetor viral é desprovido de proteína de envelope viral, e em que a nanopartícula é somente capaz de transduzir uma célula de mamífero acima de um número limiar de moléculas de polímero por vetor.

19. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que abaixo de dito número limiar de moléculas de polímero por vetor, a quantidade de polímero é insuficiente para revestir completamente o vetor.

20. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que abaixo de dito número limiar de moléculas de polímero por vetor, a nanopartícula é estruturalmente instável ou sujeita à dissociação de moléculas de polímero a partir da nanopartícula.

21. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-20, caracterizada pelo fato de que tem um perfil de segurança aperfeiçoado para uso in vivo comparado com um vetor ou vetor encapsulado em polímero que é desprovido de dito limiar.

22. Método de produção de nanopartícula, conforme definida em qualquer uma das reivindicações precedentes, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer um vetor viral compreendendo um transgene; (b) fornecer um polímero ou uma mistura de polímeros e, opcionalmente, uma ou mais porções de direcionamento; e (c) contatar o vetor viral e o polímero ou a mistura de polímeros e, opcionalmente, a uma ou mais porções de direcionamento, pelo qual o vetor viral e o polímero ou a mistura de polímeros se combinam para formar dita nanopartícula.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é desprovido de proteína de envelope.

24. Método, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que etapa (c) é realizada a um pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,5.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que etapa (c) é realizada a um pH de cerca de 5,5 a 6,0.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-25, caracterizado pelo fato de que o polímero ou a mistura de polímeros compreende um poli(beta-amino éster) tendo a fórmula em que cada Pep é um oligopeptídeo; em que R é OH, CH3, ou colesterol; e em que m está na faixa de 1 a 20, n está na faixa de 1 a 100, e o está na faixa de 1 a 10.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que cada oligopeptídeo compreende pelo menos três resíduos de aminoácido selecionados dentre o grupo consistindo em R, E, K, D, H, e C.

28. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de pelo menos um dos oligopeptídeos é CRRR (SEQ ID NO:1), ou CHHH (SEQ ID NO:2), ou CKKK (SEQ ID NO:3), ou CEEE (SEQ ID NO:4), ou CDDD (SEQ ID NO:5).

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-28, caracterizado pelo fato de que o polímero ou mistura de polímeros tem uma carga positiva líquida ou uma carga negativa líquida a pH 7.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-29, caracterizado pelo fato de que a nanopartícula contém de 108 a 1012 moléculas de polímero.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a nanopartícula contém de cerca de 109 a cerca de 1010 moléculas de polímero.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-31, caracterizado pelo fato de que o vetor retroviral é um vetor retroviral.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o vetor retroviral é um vetor lentiviral.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-33, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente contatar o vetor com uma ou mais porções de direcionamento, opcionalmente em que as porções de direcionamento são ligadas ao polímero ou mistura de partículas.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a porção de direcionamento é selecionada dentre o grupo consistindo em anticorpos, fragmentos de anticorpo, scFvs, andaimes de proteína de tipo anticorpo, oligopeptídeos, aptâmeros, aptâmeros L-RNA, e ligantes para receptores de superfície celular.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a porção de direcionamento é um anticorpo anti-CD3 ou um aptâmero anti-CD3.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-36, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um receptor de antígeno quimérico.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-37, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é desprovido de proteína de envelope VSV-G.

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-38, caracterizado pelo fato de que etapa (c) é realizada a um pH onde o polímero ou a mistura de polímeros tem uma carga positiva líquida e o vetor retroviral tem um potencial de superfície negativo.

40. Método de tratamento de uma doença, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma composição compreendendo uma pluralidade de nanopartículas, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1-21, a um indivíduo em necessidade do mesmo, pelo qual as células do indivíduo são transduzidas pelo vetor retroviral e o transgene é expressado nas células transduzidas.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a doença é câncer.

42. Método, de acordo com a reivindicação 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é humano.

43. Método de transdução de células in vitro, o método caracterizado pelo fato de que compreende contatar células cultivadas com uma pluralidade de nanopartículas, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1-21, pelo qual pelo menos algumas das células cultivadas são transduzidas pelo vetor retroviral e o transgene é especificamente expressado nas células transduzidas.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que as nanopartículas são dirigidas para células positivas CD3 e o transgene é especificamente expressado em células positivas CD3.

45. Método, de acordo com a reivindicação 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um receptor de antígeno quimérico.

46. Método de realização de terapia gênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende contatar as células in vitro ou dentro de um organismo vivo com uma pluralidade de nanopartículas, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1-21, por meio do que o transgene é expressado nas células.

47. Nanopartícula, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor viral revestido com um polímero ou uma mistura de polímeros, em que o vetor viral compreende um nível reduzido de proteína de envelope, e compreende um transgene, em que a nanopartícula funciona como um veículo para entrega do transgene para células eucarióticas, e em que o nível reduzido de proteína de envelope é insuficiente para promover entrada celular do vetor e transdução das células pelo vetor.

48. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo fato de que o nível reduzido de proteína de envelope é 5% ou menos de uma quantidade de proteína de envelope em um vírus funcional a partir do qual o vetor foi derivado.