JP6797959B2 - ターゲティング遺伝子治療のためのウイルスベクターナノカプセル、およびその調製 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１２月１４日に出願された「ＶＩＲＡＬ ＶＥＣＴＯＲ ＮＡＮＯＣＡＰＳＵＬＥ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ＡＮＤ ＩＴＳ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ」と題する、同時係属中の米国仮特許出願第６１／７３７，２３３号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下での利益を主張し、その内容は本明細書に参照によって組み込まれる。

連邦政府によって援助された研究および開発の下で行われた発明に対する権利に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた助成金番号第ＡＩ０６９３５０号、および米国国防総省、国防脅威削減局によって与えられた助成金番号第ＨＤＴＲＡ１−０９−１−０００１号の下、政府の援助を得て行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

発明の背景
特定の組織および器官に対するターゲティングされた遺伝子導入は、遺伝子送達の望ましい方法である。様々なウイルスベクターに基づく、ターゲティングされた遺伝子導入系を開発するための多くの試みが存在している。アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、それらの単純な結合および侵入機序（例えば、Ｎｉｃｋｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２，２７３−２９３，２００２（非特許文献1）を参照されたい）のために、ターゲティングされた遺伝子送達手法において使用されている。これらのベクターは、特定の細胞へのターゲティングのためにインビトロでの使用に成功しているものの、それらのインビボでの有用性はそれらの自然指向性によって限定されており（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，１０４０−１０４６，２００３（非特許文献2）を参照されたい）、特に肝細胞に限定されている（例えば、Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８，４８５−４９４，２００３（非特許文献3）を参照されたい）。

レトロウイルスベクターでの特定のターゲティングの用途はまた、問題があり、生きている動物におけるレトロウイルスベクターのターゲティングについての数少ない研究は有効ではない（例えば、Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，２６９−２７４，２００２（非特許文献4）、Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６，１９８２−１９８７，１９９９（非特許文献5）を参照されたい）。リガンド、ペプチド、または単鎖抗体をレトロウイルス受容体結合エンベロープサブユニット内に挿入することは、レトロウイルスベクターの宿主範囲を改変または制限するために使用される、最も一般的なアプローチになっている（例えば、Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，２６９−２７４，２００２（非特許文献4）、Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６，１９８２−１９８７，１９９９（非特許文献5）、Ｈａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，９７４７−９７５１，１９９５（非特許文献6）、Ｍａｒｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，２９５７−２９６２，１９９６（非特許文献7）、Ｎｉｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３，２８０−２８６，１９９６（非特許文献8）、Ｓｏｍｉａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，７５７０−７５７４，１９９５（非特許文献9）、Ｖａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，４６０９−４６１９，１９９４（非特許文献10）を参照されたい）。別のアプローチは、ウイルスベクターと細胞を抗体またはリガンドによって架橋することである（例えば、Ｂｏｅｒｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，９８６７−９８７２，１９９９（非特許文献11）、Ｒｏｕｘ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，９０７９−９０８３，１９８９（非特許文献12）を参照されたい）。一般的に、ほとんどの手法は、レトロウイルスエンベロープの修飾の結果としての一貫性のない特異性および低いウイルス力価に悩まされてきた（例えば、Ｈａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，９７４７−９７５１，１９９５（非特許文献6）、Ｍａｒｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，２９５７−２９６２，１９９６（非特許文献7）、Ｎｉｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３，２８０−２８６，１９９６（非特許文献8）、Ｓｏｍｉａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，７５７０−７５７４，１９９５（非特許文献9）、Ｖａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，４６０９−４６１９，１９９４（非特許文献10）、Ｋａｓａｈａｒａ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６，１３７３−１３７６，１９９４（非特許文献13）を参照されたい）。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの合成ポリマーによるアデノウイルスベクターの化学修飾は、アデノウイルスベクターに対する先天免疫反応を著しく低減し、既存の抗Ａｄ抗体を回避する（例えば、Ｋｒｅｐｐｅｌ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔｙｌｅ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６，１６−２９，２００８（非特許文献14）を参照されたい）。しかしながら、ＰＥＧ化アデノウイルスベクターを使用するインビボでのターゲティング効率は依然として十分ではなく、依然としてバックグラウンド感染力が肝細胞に存在する（例えば、Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８，９９−１０７，２００３（非特許文献15）を参照されたい）。ＰＥＧ化ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスベクターは血清による不活性化から阻止される（例えば、Ｃｒｏｙｌｅ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖ．７８，９１２−９２１，２００４（非特許文献16））ことが報告されたものの、化学修飾によるターゲティングレンチウイルスベクターは、これまで報告されていない。

制御可能なターゲティング能力を有するウイルスベクターの使用は、診療所におけるそのようなベクターの使用のために重要な含意を有する。この理由から、細胞または組織のそのようなターゲティングを向上または調節し得る新たな方法および材料が非常に望ましい。

Ｎｉｃｋｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２，２７３−２９３，２００２ Ｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，１０４０−１０４６，２００３ Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８，４８５−４９４，２００３ Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，２６９−２７４，２００２ Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６，１９８２−１９８７，１９９９ Ｈａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，９７４７−９７５１，１９９５ Ｍａｒｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，２９５７−２９６２，１９９６ Ｎｉｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３，２８０−２８６，１９９６ Ｓｏｍｉａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，７５７０−７５７４，１９９５ Ｖａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，４６０９−４６１９，１９９４ Ｂｏｅｒｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，９８６７−９８７２，１９９９ Ｒｏｕｘ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，９０７９−９０８３，１９８９ Ｋａｓａｈａｒａ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６，１３７３−１３７６，１９９４ Ｋｒｅｐｐｅｌ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔｙｌｅ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６，１６−２９，２００８ Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８，９９−１０７，２００３ Ｃｒｏｙｌｅ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖ．７８，９１２−９２１，２００４

正確な特異性を有する導入遺伝子を標的細胞または組織に導入する能力が、遺伝子治療のより容易な適用への鍵である。本明細書で開示されている本発明は、宿主細胞受容体特異性の認識が改変されたウイルスベクターを生成するためにナノテクノロジー技術を利用する、新規の方法、材料、および系を提供する。本明細書で開示されている本発明の機能する実施形態において、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質偽型レンチウイルスベクターの感染力は、ウイルスエンベロープ上にその場で合成された薄いポリマーシェルによって遮蔽され、当該ポリマーシェル上に環状ＲＧＤ（ｃＲＧＤ）ペプチドをコンジュゲートすることによって、当該遮蔽されたウイルスに新たな結合能力が付与された。これらのポリマーによってカプセル化されたウイルスベクターは、室温でのより高い安定性、インビボでの血清による不活性化に対する耐性、および高い効率で分裂細胞および非分裂細胞に感染する能力を含む、非常に望ましいいくつかの追加的な特徴を有することが更に示される。

本発明の実施形態は、例えば、１つまたは複数のターゲティング剤が連結された架橋された分解性ポリマーシェルによってカプセル化されたウイルスベクターを含む組成物を含む。ターゲティング剤は、典型的には、抗体、受容体、リガンド、およびペプチドなどのポリペプチドである。例えば、ターゲティング剤は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、または抗体の他の結合部分配列など）を含み得る。ターゲティング剤は、典型的には、選択された組織、細胞分化系列、腫瘍細胞などに対する特定の所望の親和性を有するように選択される。本発明の例示的な実施形態において、ウイルスベクターは水疱性口内炎インディアナウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）偽型レンチウイルスベクターであり、架橋された分解性ポリマーシェルは、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）、アクリルアミド、またはグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）のうちの少なくとも１つを含み、ターゲティング剤は環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ｃＲＧＤ）であり、ｃＲＧＢは腫瘍細胞上のα_Ｖβ_３インテグリンに対する親和性を有する。

本発明の一態様において、架橋された分解性ポリマーシェルをウイルスベクターの表面に作るために、化学修飾およびその場重合が用いられる。このポリマーシェルは、ウイルスベクターの本来の結合能力を一時的に遮蔽するように機能する。ターゲティング剤は、ポリマーによってカプセル化されたウイルスベクターを、腫瘍細胞、ニューロン、およびヒト動員ＰＢＭＣなどの特定の細胞に指向するように、ポリマー複合体の表面に連結される（図１を参照されたい）。その後、これらのターゲティング剤は、特定の細胞または組織についてのベクターのターゲティングを調節する。

本発明の実施形態はまた、重合可能な分子アンカーをウイルスベクターと反応させて重合可能な基を生成する段階；該重合可能な基を複数のモノマーと反応させてウイルスベクターをカプセル化するポリマーシェルを形成する段階；該ポリマーシェルを分解性架橋剤と連結させる段階；およびこの複合体に更にターゲティング剤を結合させる段階によって、カプセル化されたウイルスベクターを調製する方法を含む。本発明のいくつかの実施形態において、重合可能な分子アンカーは、ウイルスベクターによって発現されたタンパク質のリジンにコンジュゲートされる。本発明の特定の実施形態において、シェルは、特定の条件下（例えば、酸性環境）で分解され、それによりこれらの条件下でポリマーシェルからウイルスベクターを放出する、賦形剤（例えば、分解性架橋剤）から形成される。任意で、例えば、ウイルスタンパク質は水疱性口内炎インディアナウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）であり、分解性架橋剤はグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）である。本発明のいくつかの実施形態において、架橋剤は、プロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列を有するペプチドを含むように選択される。特定の実施形態において、ターゲティング剤は環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ｃＲＧＤ）であり、ｃＲＧＢは腫瘍細胞上のα_Ｖβ_３インテグリンに対する親和性を有する。

本発明の他の実施形態は、ウイルスベクターの細胞特異性を調節するための方法を含む。典型的には、そのような方法は、標的組織または標的細胞系列に対する第１の特異性を有するウイルスベクターを選択する段階；および、その後にインビボ環境で分解され得るポリマーシェルを形成するように分解性剤によって架橋された複数のポリマーから形成されたシェル内にウイルスベクターをカプセル化する段階を含む。そのような方法において、ポリマーシェル複合体に更にターゲティング剤が結合される。このターゲティング剤は、標的組織または標的細胞系列に対する第２の特異性（例えば、ある細胞系列または腫瘍特異的抗原に対する特異性）を有するように選択される。このようにしてウイルスベクターの細胞特異性が調節され得る。

[本発明1001]
以下を含む、組成物：
第1の組織指向性を有するウイルスベクター；
該ウイルスベクターをカプセル化する、架橋された分解性ポリマーシェル；および
該分解性ポリマーシェルに連結されたターゲティング剤。
[本発明1002]
前記ウイルスベクターが、水疱性口内炎インディアナウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）偽型レンチウイルスベクターである、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
前記架橋された分解性ポリマーシェルが、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）、アクリルアミド、またはグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）のうちの少なくとも1つを含む、本発明1001または1002の組成物。
[本発明1004]
前記架橋されたポリマーシェルが酸性環境において分解され、それにより前記ポリマーシェルから前記ウイルスベクターが放出される、本発明1001〜1003のいずれかの組成物。
[本発明1005]
前記ターゲティング剤が、抗体、ペプチド、または成長因子である、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1006]
前記ターゲティング剤が、腫瘍細胞、神経細胞、または末梢血単核細胞に結合する、本発明1001〜1005のいずれかの組成物。
[本発明1007]
前記ターゲティング剤が環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ｃＲＧＤ）であり、該ｃＲＧＢが腫瘍細胞上のα_Ｖβ₃インテグリンに対する親和性を有する、本発明1001〜1006のいずれかの組成物。
[本発明1008]
以下の段階を含む、カプセル化されたウイルスベクターを調製する方法：
重合可能な分子アンカーをウイルスベクターと反応させて、重合可能な基を生成する段階；
該重合可能な基を複数のモノマーと反応させて、該ウイルスベクターをカプセル化するポリマーシェルを形成する段階；
該ポリマーシェルを分解性架橋剤で架橋する段階；および
該ポリマーシェルにターゲティング剤を連結させる段階。
[本発明1009]
前記重合可能な分子アンカーが、前記ウイルスベクターによって発現されたタンパク質中のリジンにコンジュゲートされる、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記重合可能な基を複数のモノマーと反応させて前記ウイルスベクターの表面を覆うポリマーシェルを形成する段階が、その場で実施される、本発明1008または1009の方法。
[本発明1011]
前記ポリマーシェルが酸性環境において分解され、それにより前記ポリマーシェルから前記ウイルスベクターが放出される、本発明1008〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
少なくとも1つのウイルスタンパク質が水疱性口内炎インディアナウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）であるか、前記重合可能な分子アンカーがＮ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）であるか、前記モノマーがアクリルアミドであるか、または前記分解性架橋剤がグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）である、本発明1008〜1011の方法。
[本発明1013]
ＮＡＳ対ウイルスベクターのｍ／ｍ比が2×10⁴であり、かつ、モノマー対ウイルスのｗ／ｗ比が125である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記ターゲティング剤が、抗体、リガンド、または成長因子である、本発明1008〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記ターゲティング剤が、腫瘍細胞、神経細胞、または末梢血単核細胞に結合する、本発明1008〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記ターゲティング剤が環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ｃＲＧＤ）であり、該ｃＲＧＢが腫瘍細胞上のα_Ｖβ₃インテグリンに対する親和性を有する、本発明1008〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
ウイルスベクターの細胞特異性を調節する方法であって、該方法が、
標的組織または細胞系列に対する第1の特異性を有するウイルスベクターを選択する段階；および
該ウイルスベクターをポリマーシェル内にカプセル化する段階であって、該ポリマーシェルが、
インビボで分解されるポリマーシェルを形成するように分解性架橋剤によって架橋された複数のポリマーと、
該架橋された分解性ポリマーシェルに結合したターゲティング剤であって、標的組織または標的細胞系列に対する第2の特異性を有するように選択された、ターゲティング剤と、を含む、段階
を含み、
それにより該ウイルスベクターの該細胞特異性が調節され、
該第2の特異性が該第1の特異性とは異なる、前記方法。
[本発明1018]
前記ターゲティング剤がポリペプチドを含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記ターゲティング剤が環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ｃＲＧＤ）を含む、本発明1017または1018の方法。
[本発明1020]
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニア、ポックスウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される、本発明1017、1018、または1019の方法。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を示す一方で、限定ではなく例示のために提供されていることが理解されるべきである。本発明の範囲内の多くの変更および修正がその精神から逸脱することなく行われ得、本発明は全てのそのような修正を含む。

ウイルスベクターナノカプセルの製造。 ＲＧＤとコンジュゲートされたＶＳＶｇ−ＨＩＶレンチウイルスナノカプセルによって形質導入されたＨｅＬａ細胞（左：後、右：前）。 ターゲティング剤としてＲＧＤを使用しているＶＳＶｇ−ＨＩＶレンチウイルスナノカプセル。ポリマーの厚さおよび密度の違いが、ウイルス感染力の遮蔽の違いにつながる。最良の組み合わせは、ＮＡＳ：ウイルス＝２×１０^４とモノマー：ウイルス＝１２５である。 ＶＳＶｇ−ＨＩＶレンチウイルスナノカプセルのＴＥＭ写真（左：ＶＳＶｇ−ＨＩＶ、中：ナノカプセル（モノマー対ウイルスベクター＝１２５）、右：ナノカプセル（モノマー対ウイルスベクター＝２５０）。 ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスナノカプセルの合成および送達の概略図。Ｉ）ＮＡＳによるエンベロープタンパク質のリジン基の表面修飾、ＩＩ）修飾されたウイルスの表面でのモノマーおよび架橋剤のその場重合、ＩＩＩ）ポリマーシェルの表面へのターゲティング剤のコンジュゲート、ＩＶ）ナノウイルスの細胞へのターゲティング送達。 ポリマーシェルによるウイルス感染力の遮蔽。１×１０^５個のＨｅｌａ細胞を、等量のＶＳＶＧ、ｃＲＧＤ−ｎＶＳＶＧ、およびｎＶＳＶＧ（ｐ２４＝１０ｎｇ）で形質導入した。ＥＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによってモニタリングした。 ターゲティングされたナノウイルスの形質導入効率の最適化。ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルス（ｐ２４＝６０ｎｇ）を、異なる量のＮＡＳおよびモノマー（ｃＲＧＤ有り、無し）と反応させた。その後、ｐ２４＝１０ｎｇのウイルスを使用して、４時間、１×１０^５個のＨｅｌａ細胞に感染させた。ウイルスの形質導入を、感染の３日後のＥＧＦＰ発現によってモニタリングした（上部パネル）。ウイルスナノカプセルのサイズを、ＤＬＳによって測定した（底部パネル）。左のパネルはｃＲＧＤを有するウイルスであり、右のパネルはｃＲＧＤを有さないウイルスである。ＮＡＳ：ウイルス（ｍ／ｍ＝２×１０^４）およびモノマー：ウイルス（ｗ／ｗ＝１２５）の配合比で、ｃＲＧＤ−ｎＶＳＶＧによる最良の形質導入効率（３５％）を取得した一方で、ｎＶＳＶＧによる形質導入効率は０％である。ＶＳＶ−Ｇ偽型の形質導入効率は４２％である。 ナノウイルスによるＨｅｌａ細胞のターゲティングされた形質導入は、ｃＲＧＤに依存する。１×１０^５個のＨｅｌａ細胞を、図７から取得された最良の比のＮＡＳおよびモノマーを使用して、等量のＶＳＶＧ、ｃＲＧＤ−ｎＶＳＶＧ、およびｃＲＡＤ−ｎＶＳＶＧ（ｐ２４＝１０ｎｇ）で形質導入した。ＥＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによってモニタリングした。 ナノウイルスによるＨｅｌａ細胞のターゲティングされた形質導入は、ｃＲＧＤおよびインテグリンに依存する。１×１０^５個のＨｅｌａ細胞を、ｃＲＧＤ（１ｍｇ／ｍｌ）、ｃＲＡＤ（１ｍｇ／ｍｌ）、抗インテグリン抗体（２０ｕｇ／ｍｌ）、およびアイソタイプ対照（４０ｕｇ／ｍｌ）と１．５時間プレインキュベートし、その後、等量のＶＳＶＧおよびｃＲＧＤ−ｎＶＳＶＧ（ｐ２４＝１０ｎｇ）で形質導入した。 β−ラクタマーゼアッセイによるターゲティングナノウイルスの侵入キネティクス。ＶＳＶ−Ｇ偽型、およびＢｌａＭ−Ｖｐｒ融合タンパク質を組み込んでいるターゲティングナノウイルス（ｐ２４＝１３０ｎｇ）の両方を使用して、１×１０^５個のＨｅｌａ細胞を５、１５、３０、４５、６０、９０、および１２０分間形質導入した。β−ラクタマーゼ活性を有する細胞の割合（百分率）を、フローサイトメトリーによって測定した。 ターゲティングナノウイルスの融合および逆転写。Ａ）１×１０^５個のＨｅｌａ細胞を、空胞型Ｈ^＋−ＡＴＰａｓｅ阻害剤バフィロマイシン−Ａで３０分間処理、または処理せず、その後ＶＳＶ−ＧまたはｃＲＧＤ−ｎＶＳＶＧ（バフィロマイシン−Ａ有り、無し）（ｐ２４＝１０ｎｇ）で２時間形質導入した。Ｂ）ナノウイルスによる形質導入は、逆転写酵素ＡＺＴによって阻害される。１×１０^５個のＨｅｌａ細胞を、ＡＺＴで３０分間処理、または処理せず、その後ＶＳＶ−ＧまたはｃＲＧＤ−ｎＶＳＶＧ（ＡＺＴ有り、無し）（ｐ２４＝１０ｎｇ）で２時間形質導入した。 ヒト血清の存在下でのターゲティングナノウイルスの改善された安定性。ＶＳＶＧまたはｃＲＧＤ−ｎＶＳＶＧを、ＰＢＳ、熱不活性化（ＨＩ）ヒト血清（ＨＳ）、またはＨＳ（ｖ：ｖ＝１：１）で１時間プレインキュベートした。その後、前処理したウイルス（ｐ２４＝１０ｎｇ）を使用して、１×１０^５個のＨｅｌａ細胞を形質導入した。

発明の詳細な説明
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術についての全ての用語、表現法、および他の科学的用語または専門用語は、本発明に関連する当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。本明細書で記載または言及される技術および手順のうちの多くは、よく理解され、当業者によって従来の方法論を使用して一般的に用いられる。本明細書で言及される全ての出版物は、出版物が引用されるものに関連する方法および／または材料を開示および説明するために、本明細書に参照によって組み込まれる。本明細書に引用される出版物は、それらの開示について、本出願の出願日より前に引用される。本明細書にあるいずれのものも、より早い優先日または発明の優先日のために、本発明者が出版物に先行する権限がないことの承認として解釈されるべきではない。更に、実際の出版物の日付は示されるそれとは異なることがあり、独立した実証を必要とし得る。好適な実施形態の記載において、本明細書の一部を形成し、本発明が実施され得る特定の実施形態を例示する目的で示される、添付の図面への言及がなされる。本発明の範囲から逸脱せずに、他の実施形態が利用され得ること、および構造的変更が行われ得ることが理解されるべきである。

当該技術分野においては一般的に、アデノウイルスベクターおよびＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターの、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの合成ポリマーによる化学修飾は、「ｇｒａｆｔｉｎｇ−ｏｎｔｏ」法を用いている。この手法は、線状ポリマーを活性化する段階と、ポリマーをウイルスベクターの表面にコンジュゲートする段階との２つの段階を含む。しかしながら、「ｇｒａｆｔｉｎｇ−ｏｎｔｏ」法は線状ポリマーをウイルス表面にコンジュゲートし得るのみであるため、ウイルス感染力の遮蔽は不完全である。本明細書で開示されている本発明は、当該技術におけるそのような限界に対処する方法、材料、および系を、宿主細胞特異性が改変されたウイルスベクターをポリマー化学技術を利用して生成することによって提供する。

本発明の一態様において、「ｇｒｏｗｉｎｇ−ｏｎｔｏ」プロセスは、制御可能な厚さおよび密度を有するポリマーネットワークを、ウイルスベクターの表面においてその場で成長させるために提供され、これは本来のウイルス感染力のより良好な遮蔽を提供する。更に、１つまたは複数の実施形態において、ポリマーシェルはｐＨ感応性であるように設計されるため、エンドサイトーシス後にエンドソーム内で除去され得る。エンドソーム内におけるウイルスベクターからのポリマーのこの遮蔽の解除は、より良好な感染活性につながる。更に、ターゲティング効率は、可能な限り多いターゲティング剤をウイルスナノカプセルの表面に導入することによって高められる。

本発明の別の態様において、ターゲティング遺伝子治療のための、高度に制御可能なポリマーシェルを有するウイルスナノカプセルを作製するための方法が提供される。このカプセル化アプローチは、多様化したターゲティング能力と血清による不活性化時のさらなる安定化とを有する内側ウイルスベクターを提供する。

コンジュゲートおよびその場重合によってウイルスベクターをカプセル化するために、種々のモノマーおよび架橋剤が使用され得る。抗体、ペプチド、または成長因子などのターゲティング剤は、ポリマーと共有的にコンジュゲートして、静脈内注射を通した特定の組織および器官へのターゲティングされた遺伝子導入を可能にする。

本明細書で提供される本発明は、ウイルスベクターおよびポリマーナノカプセルの両方の利点を組み合わせる。提供されるポリマーによってカプセル化されたウイルスベクターは、室温で高い安定性を有し、インビボでの血清による不活性化から阻止され得、高い効率で分裂細胞および非分裂細胞に感染し得る。化学修飾は、（レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターの再ターゲティングにおいて従来より用いられている）遺伝子修飾よりも優れた点を提供する。ウイルスエンベロープがアミノ酸変異によって乱されず、したがってポリマーによるカプセル化後にウイルス感染力が維持され得るためである。更に、異なる特性（例えば、特異性、電荷、環境に対する安定性）を付与するためのポリマーの化学修飾は、技術的にビリオンの遺伝子修飾よりも一層容易である。ナノカプセルによってウイルスベクターにもたらされる多様化した制御可能なターゲティング能力は、遺伝子およびタンパク質のターゲティング送達のためにウイルスベクターを用いる臨床的な用途に用いられ得る。

本明細書で開示されている本発明は、いくつかの実施形態を有する。本発明の１つの実施形態は、ウイルスベクターと該ウイルスベクターをカプセル化する分解性ポリマーシェルとを含む組成物である。本発明の組成物および方法において有用なウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニア、ポックスウイルスベクター、およびシンドビスウイルスベクターを含む。当該技術分野において公知であるように、これらのレトロウイルスベクターは、種々の組織について可変指向性を呈し得る（組織指向性とは、特定のウイルスによって感染され得、典型的にはその成長を支持し得る、宿主細胞および宿主組織を意味する）。そのような組成物において、ベクターを特定の細胞または組織に指向するため（例えば、ターゲティング剤によってターゲティングされる細胞または組織が、ウイルスベクターの指向性によってターゲティングされるものではないよう）にターゲティング剤が選択され、カプセル化されたウイルスベクターに連結されていてもよい。典型的な組成物において、分解性ポリマーシェルは（例えば、グリセロールジメタクリレートなどの作用物質を用いて）架橋されており、当該分解性ポリマーシェルにはターゲティング剤が連結されている。本発明の例示的な実施形態において、ウイルスベクターは水疱性口内炎インディアナウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）偽型レンチウイルスベクターである。

特定の実施形態において、ポリマーシェルを形成するポリマーは、１種または複数種の分解性化合物によって架橋されている。任意で、架橋剤は、グリセロールジメタクリレート、Ｎ，Ｎ'−メチレンビス（アクリルアミド）、１，４−ビス（アクリロイル）ピペラジン、エチレングリコールジアクリレート、Ｎ，Ｎ'−（１，２−ジヒドロキシ−エチレン）ビスアクリルアミド、またはポリ（エチレングリコール）ジアクリレートを含む分解性架橋剤である（例えば、国際公開第２０１３／００６７６２号を参照されたい）。本発明の特定の実施形態において、架橋されたポリマーネットワークは、特定の材料プロファイル、例えば、生理的ｐＨで３〜５ミリボルトの間の表面電荷を呈するように設計され得る。

本発明の実施形態において、ポリマーシェルの構造は、それがウイルスベクターを選択された環境内に放出することを可能にする様式で設計され得る。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、シェルのポリマー成分は、細胞外で典型的に見られるものなどの特定の環境条件下でポリマーシェルの完全性を維持する結合である、ジスルフィド含有架橋部分によって相互に連結され得る（例えば、国際公開第２０１２／１４２４１０号を参照されたい）。そのような結合は、他の環境条件下で分解される能力（例えば、細胞サイトゾル内で起こるもの）に関して選択され得る。この分解によってポリペプチドシェルの完全性が損なわれ、このシェルからのウイルスベクターの放出につながる。本明細書に開示されているように、例えば、異なる環境で生じる酸化還元の電位差を利用することによって、様々なウイルスベクター送達系が作成され得る。本発明の実施形態は、ウイルスベクターと、複数の重合可能なモノマーと、哺乳類細胞のサイトゾル内で還元されるジスルフィド結合を形成する能力について選択された架橋剤と、を含む混合物を組み合わせることによって本発明の組成物を形成することを含む。本発明の例示的な実施形態は、自然にはウイルスに感染されない細胞または組織へのウイルスベクターの細胞内送達のために本発明の組成物を使用するための方法を含む。

本発明の更に他の実施形態において、架橋剤は、プロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列を有するペプチドを含むように選択され、その結果、当該プロテアーゼが活性であるインビボ環境においてポリマーシェルが分解される（例えば、Ｂｉｗａｓ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１１ Ｆｅｂ２２；５（２）：１３８５−９４を参照されたい）。

いくつかのターゲティング剤は、本明細書で開示されているポリマーシェルに連結され、本発明の組成物および方法において使用され得る。例えば、抗体は、本発明の実施形態において使用され得る用途の広い腫瘍ターゲティング剤であることが公知である（例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００５）１１；１２９を参照されたい）。更に、幅広い種類のリガンドがターゲティング剤として有用であり、本発明の実施形態での使用のために適合され得る（例えば、Ｂｒｕｍｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００８ Ｊａｎ；５（１）：８７−１０３；Ｖａｉｔｉｌｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．２０１２ Ｊｕｌ；５３（７）：１１２７−３４ ａｎｄ Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００９ Ｍａｒ；６（３）：２８５−３０４を参照されたい）。例えば、Ｐ−セレクチンに対するリガンド、内皮セレクチン（Ｅ−セレクチン）、およびＩＣＡＭ−１は炎症性内皮に被着することが見出されている（例えば、Ｂａｒｔｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ．２００７ Ｎｏｖ；１１（１１）：１４７３−９を参照されたい）。本発明の特定の実施形態は、腫瘍細胞上のα_Ｖβ_３インテグリンに対する親和性を有することが公知である、環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ｃＲＧＤ）分子を使用し得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２０１０；５１：１Ｓ−１５Ｓを参照されたい）。本発明の典型的な実施形態において、ターゲティング剤は、腫瘍細胞、神経細胞、または末梢血単核細胞に結合する。例えば、本発明の例示的な実施形態において、ターゲティング剤は、環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ｃＲＧＤ）であり、ｃＲＧＢは腫瘍細胞上のα_Ｖβ_３インテグリンに対する親和性を有する。

本発明の方法は、ウイルスベクターと、複数の重合可能なモノマーと、特定のインビボ環境で分解される能力（例えば、特定のインビボ環境で還元されるジスルフィド結合を形成する能力）について選択された架橋剤と、を含む混合物を形成する段階を含む。任意で、ポリマーシェルは、酸性環境（例えば、約ｐＨ６未満）で分解され、それによりポリマーシェルからウイルスベクターを放出する。あるいは、ポリマーシェルは、塩基性環境（例えば、約ｐＨ８を超える）で分解されるように設計され得、それによりポリマーシェルからウイルスベクターを放出する。本発明の典型的な実施形態において、架橋されたポリマーシェルは、酸性環境で分解されるように設計され、それによりポリマーシェルからウイルスベクターを放出する。本発明の例示的な実施形態において、架橋されたポリマーシェルは、７以上のｐＨ（または６以上のｐＨ）で安定したままであるように調節され得るが、７未満のｐＨ（または６未満のｐＨ、または５未満のｐＨ）で分解される。

任意で、架橋された分解性ポリマーシェルは、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）、アクリルアミド、またはグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）のうちの少なくとも１つを含む。そのような方法において、混合物は、まず複数の重合可能なモノマーおよび架橋剤がウイルスベクターの表面に吸着することが可能な条件に暴露される。その後、モノマーとウイルスベクターとの間の界面において複数の重合可能なモノマーおよび架橋剤の重合が開始され、その結果、ウイルスベクターを囲繞し保護する修飾可能なポリマーナノカプセルが形成される。本発明の特定の実施形態において、複数の重合可能なモノマーはアクリルアミドを含み、架橋剤はシスタミン部分を含み、重合はフリーラジカル反応開始剤を混合物に添加することによって開始される。

本発明の関連する実施形態は、保護ポリマーシェルによってカプセル化されたウイルスベクターを調製する方法を含む。これらの方法は、重合可能な分子アンカーをウイルスベクターと反応させて重合可能な基を生成する段階と、その後、当該重合可能な基を複数のモノマーに対して反応させて、ウイルスベクターをカプセル化するポリマーシェルを形成する段階とを含み得る。これらの方法は、ポリマーシェルを分解性架橋剤で架橋することを更に含み得る。これらの方法はまた、ターゲティング剤（例えば、抗体、リガンド、または成長因子）をポリマーシェルに連結させる段階を含み得る。本発明の一般的な実施形態において、ウイルスは特定の組織指向性を呈するように選択され、例えば、腫瘍細胞、神経細胞、または末梢血単核細胞に結合するように選択される。本発明の特定の方法において、ターゲティング剤は、ターゲティング剤によってターゲティングされる細胞または組織が、ウイルスベクターの指向性に関連するものと異なるように選択される。任意で、ターゲティング剤は、環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ｃＲＧＤ）であり、ｃＲＧＢは腫瘍細胞上のα_Ｖβ_３インテグリンに対する親和性を有する。

任意で、本方法において、重合可能な分子アンカーは、ベクタータンパク質のリジン、またはポリマーネットワーク上に見られる化学基に連結される（例えば、共有結合される）。通常は、ウイルスベクターの表面を覆うポリマーシェルを形成させるために重合可能な基を複数のモノマーに対して反応させ得るが、それはその場で実施され得る。本発明の例示的な実施形態において、ウイルスベクターによって発現する少なくとも１つのウイルスタンパク質は水疱性口内炎インディアナウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）であり、重合可能な分子アンカーはＮ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）であり、モノマーはアクリルアミドであり、かつ／または分解性架橋剤はグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）である。本発明の典型的な実施形態において、ＮＡＳ対ウイルスベクターのｍ／ｍ比は０．５×１０^４〜５×１０^４の間であり（好適には２×１０^４であり）、モノマー対ウイルスのｗ／ｗ比は５０〜５００の間である（好適には１２５である）。

本発明の他の実施形態は、ウイルスの指向性を制御する分子を一時的にマスキングすることによってウイルスベクターの細胞特異性を調節する方法を含む。典型的には、これらの方法において、標的組織または標的細胞系列に対する第１の特異性または指向性を有するウイルスベクターを選択する。これらの方法において、その後、ウイルスベクターはポリマーシェル内にカプセル化される。その結果、このポリマーシェルは、ウイルスベクター上に見られるその指向性を制御する分子を一時的にマスキングする。その際、これらの方法において、当該シェルは、インビボで分解されるポリマーシェルを形成するように、１種または複数種の選択されたインビボ環境で分解される能力について選択された架橋剤によって架橋された複数のポリマーを含む。更に、これらの方法において、当該架橋された分解性ポリマーシェルに対し、ターゲティング剤が、細胞が選択された組織および／または細胞をターゲティングすることを可能にする様式で結合され得る。典型的な方法において、ターゲティング剤は、ウイルスベクターの細胞特異性が調節されるように、ウイルスベクターのそれとは異なる標的組織または標的細胞系列に対する特異性を有するように選択される。

本発明の実施形態の汎用性および範囲を例示するために、いくつかの実施例を以下に提供する。

実施例１：ターゲティング遺伝子治療のためのウイルスベクターナノカプセル、およびその調製
我々は、化学修飾およびその場重合を用いて、設計された厚さおよび特性を有する、単一ウイルスベクター表面上の架橋された分解性ポリマーシェルを製造する。当該ポリマーシェルは、当該ウイルスベクターの本来の結合能を遮蔽する。抗体、ペプチド、または成長因子などのターゲティング剤がポリマーの表面に共有的にコンジュゲートし、ポリマーによってカプセル化されたウイルスベクターのターゲティングを、腫瘍細胞、ニューロン、およびヒト動員ＰＢＭＣを含む特定の細胞へと方向付ける（図１）。

ＲＧＤとコンジュゲートしたＶＳＶｇ−ＨＩＶレンチウイルスナノカプセルによるＨｅｌａ細胞の形質導入を図２に示す。形質導入を、細胞内のＥＧＦＰの発現によって示す。ウイルス形質導入に対する、ポリマーの異なる厚さおよび密度の影響を試験するために、ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスベクターを異なる濃度のＮＡＳおよびモノマーを用いてカプセル化した。図３に示すように、ＮＡＳおよびモノマーの濃度の増加は本来のウイルス感染力のより良好な遮蔽につながるが、ウイルスベクターの過剰遮蔽は、ＲＧＤとコンジュゲートしたウイルスナノカプセルの形質導入効率の低下にもつながり得る。したがって、ナノカプセルの設計においては、遮蔽とターゲティング形質導入効率とのバランスが必要である。

我々の試験において、我々は、ＮＡＳ：ウイルス（２×１０^４）およびモノマー：ウイルス（１２５）の組み合わせが、ＲＧＤとコンジュゲートしたウイルスナノカプセルによる形質導入効率に影響を与えずに、本来のウイルス感染力を完全に遮蔽し得ることを発見した（図３）。我々はまた、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によってウイルスナノカプセルのナノ構造を研究した。異なる厚さを有する天然ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスおよびＶＳＶｇ−ＨＩＶレンチウイルスナノカプセルの写真を、図４に示す。ポリマーが厚ければ厚いほど、ナノカプセルはより大きくなる。

実施例２：その場合成されたポリマーシェルによる、安定性が改善されたＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスベクターの再ターゲティング
正確な特異性を有する導入遺伝子を所望の標的細胞または標的組織に導入する能力は、遺伝子治療のより容易な適用への鍵である。ここで、我々は、宿主細胞受容体特異性の認識が改変されたレンチウイルスベクターをナノテクノロジーを用いて生成する方法を記載する。簡潔には、ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスベクターの感染力を、ウイルスエンベロープ上にてその場で合成された薄いポリマーシェルによって遮蔽し、当該ポリマーシェル上に環状ＲＧＤ（ｃＲＧＤ）ペプチドをコンジュゲートすることによって、当該遮蔽されたウイルスに対して新たな結合能力を付与した。我々は、結果として生じるウイルスを「ターゲティングナノウイルス」と称した。ターゲティングナノウイルスはＶＳＶ−Ｇ偽型とほぼ同等の力価を有し、高い形質導入効率でＨｅｌａ細胞に特異的に形質導入された。更に、ポリマーシェルによるＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスのカプセル化は、ＶＳＶ−Ｇ偽型が侵入して細胞と融合する経路、ならびに逆転写および遺伝子発現などの後続の事象を変更しなかった。更に、ターゲティングナノウイルスは、ヒト血清の存在下で改善された安定性を有し、ポリマーシェルによるヒト血清補体不活性化からのウイルスの保護を示した。ナノテクノロジーのこの新規の使用は、実験的および臨床的目的のための、ウイルスベクターの再方向付けのためにより一般的に適用され得るアプローチを実証する。

緒言
レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターの安定的な組込みが、遺伝子送達のために一般的に利用されている（例えば、Ａｉｕｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６０，４４７−４５８、Ａｉｕｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６，２４１０−２４１３、Ｃａｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６，８１８−２３、およびＣａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８，６６９−６７２を参照されたい）。現在のベクターは、典型的にはＶＳＶ−Ｇエンベロープで偽型化されているために幅広い宿主範囲を有する（例えば、Ｍａｒｓｈ ａｎｄ Ｈｅｌｅｎｉｕｓ（１９８９）Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ３６，１０７−５１を参照されたい）ため、当該ベクターの使用は、所望の標的細胞および標的組織が形質導入のために精製および／または物理的に単離され得る用途に限定されている。混合された集団内で特定の細胞をターゲティングし得るレトロウイルスベクターの作製は、遺伝子治療のより一般的な用途を可能にする。主要な障害は、ビリオン安定性および力価を同時に維持しながら、特異的にターゲティングするためのベクターエンベロープの修飾であった（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，９７４７−９７５１、Ｋａｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６，１３７３−１３７６、Ｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，２９５７−２９６２、Ｎｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３，２８０−２８６、Ｓｏｍｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，７５７０−７５７４、Ｖａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，４６０９−４６１９、Ｙｕ ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ（２００５）Ａｄｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９９，１４７−６７）。更に、ウイルスエンベロープは、ヘパリン硫酸、ラミニン、インテグリン、炭水化物、脂質などに対する結合などの、非標的細胞特異的である様々な受容体結合部分をコードする（Ｈａｙｗｏｏｄ（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８，１−５）。

いくつかのレトロウイルス系が、ベクターを特定の細胞に再方向付けすると報告されているが、安定した形質導入の高い力価を維持しながらターゲティングを達成するものはほとんど存在しない（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，９７４７−９７５１、Ｋａｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６，１３７３−１３７６、Ｖａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，４６０９−４６１９）。特定のターゲティングを達成するためのレンチウイルスベクターの修飾は、２つのアプローチを必要とする。第１に、ベクターに対する修飾は、それらが固有の細胞表面分子を新たな受容体として利用して、所望の標的細胞に対するベクター結合を再方向付けし得るように行われなくてはならない。我々は、インビトロおよびインビボでの修飾シンドビスウイルスエンベロープ偽型を使用するターゲティングされた形質導入の達成に成功した（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１１，１８５−９６、Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５，８０１６−８０２０、Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ａｎｄ Ｃｈｅｎ（２００５）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ４，８５４−６、Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４，６９２３−３４、Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１，５４９−５８、Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０，７１−８１、Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ４，８５４−６、Ｐａｒｉｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０，２４２−８、Ｐａｒｉｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１５，１９７３−１９８１）。我々の初期の構築物は、細胞表面分子に対する抗体、または特定の細胞表面分子に結合するリガンドの共有結合に関して遺伝子組み換えされた抗体などの、親和性試薬とのコンジュゲートによって修飾されたシンドビスウイルスエンベロープ偽型から構成された。我々は、我々のベクターが、腫瘍をターゲティングするために、マウスモデルにおいて利用され得ることを実証した（Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ４，８５４−６、Ｐａｒｉｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１５，１９７３−１９８１）。第２の相補的なアプローチは、非特異的な結合を低減することである。我々は、シンドビスエンベロープの本来の受容体結合を除去する、いくつかの特定の変異体を作製した。しかしながら、残留低レベルの非特異的結合は、ターゲティングされた形質導入を困難にした。我々は、近年、細胞表面の受容体へと架橋する分子に対するビリオンホスファチジルセリンの結合を通して媒介される非特異的結合の１つの供給源を特定した（Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ９，２８６−９８）。

ターゲティングのためのウイルスエンベロープの遺伝子修飾および代謝的修飾に加えて、アデノウイルスおよびＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスについてのウイルスベクターの化学修飾もまた報告された。これまで、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの合成ポリマーによるアデノウイルスベクターおよびＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスベクターの化学修飾は、「ｇｒａｆｔｉｎｇ−ｏｎｔｏ」法を用いている。この手法は、線状ポリマーを活性化する段階と、ポリマーをウイルスベクターの表面にコンジュゲートする段階の２つの段階を含む。「ｇｒａｆｔｉｎｇ−ｏｎｔｏ」法は、線状ポリマーをウイルス表面にコンジュゲートし得るのみであるため、ウイルス感染力の遮蔽は不完全である。例えば、ＰＥＧによるアデノウイルスベクターの修飾は、アデノウイルスベクターに対する先天免疫反応を著しく低減し、既存の抗Ａｄ抗体を回避する（Ｇｉｏｒｄａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２，６９７−７１０、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９２，２４−３４、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｓｉｅｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０３，４１１１−８、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｓｉｅｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ １１９，３９００−７）。しかしながら、ＰＥＧ化アデノウイルスベクターを使用するインビボでのターゲティング効率は依然として十分ではなく、バックグラウンド感染力は肝細胞において依然として存在する（Ｋｒｅｐｐｅｌ ａｎｄ Ｋｏｃｈａｎｅｋ ２００８）。ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質はウイルス様粒子上に取得しがたい堅固な物理的安定性を付与し、それによって、超遠心法による濃縮中および複数回の凍結融解サイクル中に生じる剪断力による破壊が阻止される。しかしながら、ＶＳＶ−Ｇ偽型ベクターのインビボでの使用は、ウイルス粒子に対する先天免疫反応によって妨害され続ける（ＤｅＰｏｌｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２，２１８−２２）。この効果は、大部分が古典的補体経路を通して媒介される（Ｂｅｅｂｅ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ（１９８１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２６，１５６２−８）。ＰＥＧ化ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスベクターはヒト血清補体不活性化から阻止されることが報告されたものの（Ｃｒｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８，９１２−２１）、ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスベクターを新たな受容体に再方向付けするための化学修飾はこれまで報告されていない。

我々は以前に、薄い架橋されたネットワークシェルを有する有機ポリマーナノカプセル内に単一のタンパク質分子がカプセル化された小さなナノカプセル群を合成した（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５，４８−５３、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２８，１１００８−９）。「ｇｒａｆｔｉｎｇ−ｏｎｔｏ」法とは異なり、当該架橋されたネットワークシェルは、２段階の「ｇｒｏｗｉｎｇ−ｏｎｔｏ」プロセスによってタンパク質表面において合成された。第１に、重合可能な分子アンカーであるＮ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）を使用して、タンパク質のリジンと反応させて、重合可能な基を生成した。ＩＩ）その後、これらの重合可能な基は、アクリルアミドなどのモノマーのビニル基と反応して、ウイルス表面にポリマーを形成する。グリセロールジメタクリレート（ＧＭＡ）などの架橋剤を反応に含めて、ポリマー構造を安定化した。これらのナノカプセルは、均一なサイズ（約２０ｎｍ）、高いタンパク質活性保持、および極めて優れたタンパク質安定性を示した。そのようなナノカプセルは、ＴＡＴペプチドコンジュゲートを介したタンパク質形質導入と比較して２桁高い細胞内送達効率を呈し、更に、当該ポリマーシェルはプロテアーゼによる攻撃および熱による不活性化からタンパク質を保護し、タンパク質ペイロードの半減期を大いに増加させる。ナノカプセルのインビトロ毒性は、ＴＡＴペプチドコンジュゲートを用いる場合よりも低かった。近年の研究はまた、マウスモデルのインビボでの送達および低毒性における成功を示している。我々はまた、ＥＧＦＰナノカプセルのターゲティング送達を、当該ナノカプセル上に抗ＣＤ４抗体をコンジュゲートすることによってＣＤ４発現細胞へと方向付けた。

この研究において、我々は、当該その場重合法を適用して、架橋されたポリマーシェルを有するＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスをカプセル化し、ターゲティング能力、感染力、および遺伝子治療のための安定性が改善されたターゲティングナノウイルスを生成した。

材料および方法
ウイルス産生および力価
従前に記載されたように、全てのレンチウイルスベクターを、２９３Ｔ細胞のリン酸カルシウム媒介一過性トランスフェクションによって産生した（Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，８０１６−８０２０、Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ａｎｄ Ｃｈｅｎ（２００５）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ４，８５４−６）。簡潔には、２９３Ｔ細胞（１．８×１０^７細胞）を、１２．５μｇのｐＣＭＶＲ８．２＿ＶＰＲと、（ｃｐｐｔ２ｅと称する）中央ポリプリントラクトを有する１２．５μｇのＳＩＮ１８−ＲｈＭＬＶ−Ｅと、５μｇのＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドとでトランスフェクトした。ベータラクタマーゼを有するＶＳＶ−Ｇ偽型ウイルスのパッケージングの生成のために、ベータラクタマーゼ−Ｖｐｒ融合タンパク質をコードするプラスミドを６ｕｇ含めた。ウイルスベクターを、抗生物質を有するＡＩＭ Ｖ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で採取した。レンチウイルスベクターを、ＳＷ３２ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）による９０分間、４℃、２８，０００ＲＰＭの超遠心法によって濃縮した。ペレットを、１００倍少ない量のＰＢＳで再懸濁した。ウイルス力価を、抗ｐ２４Ｇａｇ酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。レポーター遺伝子発現を、フローサイトメトリーによってモニタリングした。データを、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）上で収集し、ＦＣＳ発現（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて分析した。

アクリル−ｃＲＧＤの合成
ｃＲＧＤとして標識化される、環状［Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＰＥＧ−ＰＥＧ）］を、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から発注した。アクリル−ｃＲＧＤの調製を、ｃＲＧＤをアクリル酸、ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＡＳ）と反応させることによって達成した。簡潔には、ｃＲＧＤ（５ｍｇ）を１ｍＬのｐＨ＝８、５０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ緩衝液中に溶解し、ＮＡＳ（１．２ｍｇ）を１００ｕＬのＤＭＳＯ中に溶解した。その後、ＮＡＳ溶液をｃＲＧＤ溶液中に徐々に室温で添加した。一晩の反応の後、１×ＰＢＳ緩衝液をストックとして混合物を０．０２％に希釈した。

ナノウイルスの合成およびサイズ特性評価
１００×濃縮ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスを、１×ＰＢＳ緩衝液中で４℃で一晩透析した。ウイルス力価を、抗ｐ２４Ｇａｇ ＥＬＩＳＡによって測定した。５ｍｇのＮ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）（Ｓｉｇｍａ＃Ａ８０６０）を、０．１ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解し、氷冷の１×ＰＢＳ緩衝液で０．００２％に希釈した。ＮＡＳ溶液を、異なるモル比（ｍ／ｍ）１×１０^４、２×１０^４、５×１０^４、および１×１０^５でウイルスに添加（ｐ２４＝６０ｎｇ）した。反応を１時間、４℃で実行した。１μＬの１００ｍＭ、ｐＨ＝７、ＴＲＩＳ緩衝液をマイクロチューブに添加し、ＮＡＳによる表面修飾を停止させた。２％（ｗ／ｖ）のアクリルアミド（Ｓｉｇｍａ＃Ａ３５５３）と、２％（ｗ／ｖ）のＧＭＡ（Ｓｉｇｍａ＃４３６８９５）と、０．５％（ｗ／ｖ）のＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ３６７８）と、０．１％（ｗ／ｖ）のＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン（Ｓｉｇｍａ＃Ｔ９２８１）とを含有するカクテル溶液を、２×１０^４のモル比のアクリルオキシ化ｃＲＧＤ（０．０２％）と共にまたは無しで、１２５、２５０、５００、７５０の異なる重量比（ｗ／ｗ）でＮＡＳ修飾ウイルスに添加して、表面でのラジカル重合を開始させた。反応を、４℃で更に６０分間進行させた。ウイルスおよびナノウイルス（ｐ２４＝６０ｎｇ）のサイズ分布を、Ｍａｌｖｅｒｎ粒径分析計Ｎａｎｏ−ＺＳを有する動的光散乱（ＤＬＳ）によって１×ＰＢＳ緩衝液中で測定した。

ウイルス形質導入
ＶＳＶ−Ｇ偽型およびターゲティングナノウイルス（ｐ２４＝１０ｎｇ）の両方を使用して、１×１０^５個のＨｅｌａ細胞を４時間形質導入し、その後、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、５００μｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／１％ＧＰＳ中で２日間培養した。レポーター遺伝子発現（ＥＧＦＰ）を、フローサイトメトリーによってモニタリングした。ブロッキングアッセイのために、ｃＲＧＤ（１ｍｇ／ｍｌ）か、ｃＲＡＤ（１ｍｇ／ｍｌ）か、抗インテグリン抗体の混合物（２０μｇ／ｍｌの抗インテグリンαＶβ３およびαＶβ５抗体の両方）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）か、またはアイソタイプ対照抗体（４０μｇ／ｍｌ）を、感染の３０分前および感染中にウイルスと共にインキュベートした。融合アッセイのために、バフィロマイシン−Ａ（Ｓｉｇｍａ，Ｂ１７９３）を、形質導入の３０分前および形質導入中に１２５ｎＭの最終濃縮のウイルスと共にインキュベートした。逆転写アッセイのために、ＡＺＴ（Ｓｉｇｍａ，Ａ２１６９）を、ウイルス感染中に２５μＭの最終濃縮のウイルスと共にインキュベートした。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリー分析の前に２日間、ＡＺＴの存在下で培養を続けた。

侵入アッセイ
Ｖｐｒ−β−ラクタマーゼ融合タンパク質を組み込んだ、ＶＳＶ−Ｇ偽型およびターゲティングナノウイルスの両方（ｐ２４＝１３０ｎｇ）を使用し、１×１０^５個のＨｅｌａ細胞を５、１５、３０、４５、６０、９０、および１２０分間形質導入した。細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄した。ベータラクタマーゼ基質ＣＣＦ２−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋ１０３９）を、企業プロトコルに従って、暗所で室温で２時間、細胞と共にインキュベートした。蛍光を、フローサイトメトリーによってモニタリングした。

結果
ターゲティングナノウイルスの合成
ウイルスエンベロープは、タンパク質、脂質、および炭水化物からなる。タンパク質がエンベロープの主成分であるため、我々は、合成タンパク質ナノカプセルについての我々の従来の方法が、ウイルスナノカプセルを合成するために適用され得ると考えた。我々は、ビリオンの周囲で合成される架橋されたポリマーシェルは、ウイルスの本来の感染力を除去し、ポリマーシェルの表面にコンジュゲートされたリガンドを介して新たな標的結合能力が付与され得ると仮定する。ターゲティングウイルスナノカプセルを合成するために、我々は、３段階の手順を使用して、ＥＧＦＰを発現するＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスベクターを修飾した（図５）。Ｉ）重合可能な分子アンカーであるＮ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）を使用し、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質のリジンと反応させて、重合可能な基を生成した。ＩＩ）その後、これらの重合可能な基は、モノマー（アクリルアミド）のビニル基と反応して、ウイルス表面にポリマーを形成する。架橋剤（ＧＭＡ）を反応に含めて、ポリマー構造を安定化した。架橋剤はｐＨ６未満で分解可能であり、それにより、エンドソームなどの酸性環境においてポリマーシェルからのビリオンの放出が可能となる。ＩＩＩ）その後、ポリマー上の過剰ビニル基との反応（マイケル付加反応）を介してポリマーシェル上に化学的にコンジュゲートされたターゲティング分子によって、新たな結合活性が付与される。Ｈｅｌａ細胞をターゲティングするために、我々は、α_Ｖβ_３インテグリンに対する強い親和性および選択性を示しかつ腫瘍内皮および腫瘍細胞上に十分に発現される環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ｃＲＧＤ）とコンジュゲートされているターゲティングナノウイルスを生成した。

タンパク質およびウイルスナノカプセルの両方の合成において、重合段階は、重合可能な分子アンカー（ＮＡＳ）の、ウイルスのタンパク質またはエンベロープタンパク質のリジンとの反応と共に開始する。重合の機序は類似するものの、単一のタンパク質と比較して、ウイルスをカプセル化するためのいくつかの違いが存在する。第１に、ウイルスのサイズ（約１００ｎｍ）は、単一のタンパク質（約１０ｎｍ）よりも大きい。ビリオンを完全にカプセル化するために、ＮＡＳおよびモノマーの量、ならびに反応時間は調整される必要がある。第２に、ウイルスは４℃で安定する。ウイルス安定性、ひいてはそれらの感染力を維持するために、我々は、これまでタンパク質について使用された２５℃の代わりに、反応温度を４℃に最適化した。第３に、効率的な重合は、高濃縮の基質を必要とする。我々は、ウイルスを濃縮して、重合段階を促進するための１００μｇ／ｍＬの高濃縮を達成した。

Ｈｅｌａ細胞における、ｃＲＧＤとコンジュゲートしたターゲティングナノウイルスの形質導入の最適化
ターゲティングナノウイルスのポリマーシェルの組成、サイズ、および分解性は、それらの送達効率および効力に影響を与える最も重要なパラメータである。ＮＡＳの量は、後続の重合、ひいてはポリマー間の間隙距離のための表面アンカーの量を決定する。モノマーの量は、ポリマーの長さ、ひいてはポリマーシェルのサイズを制御する。ＮＡＳおよびモノマーの濃度の上昇は本来のウイルス感染力のより良好な遮蔽につながったが、ウイルスベクターの過剰遮蔽はターゲティングナノウイルスの形質導入効率の減少にもつながり得る。したがって、ターゲティングナノウイルスの設計において、遮蔽およびターゲティング形質導入効率のバランスが必要となる。まず、我々は、ＮＡＳ：ビリオン比（ｍ：ｍ＝１×１０^４）とモノマー：ビリオン比（ｗ：ｗ＝２５０）を試験し、ＶＳＶ−Ｇ偽型の５８％と比較して、ｃＲＧＤとのコンジュゲート有りで２６％、ｃＲＧＤとのコンジュゲート無しで１１％の形質導入効率を達成し、これはポリマーシェルによるウイルス感染力の部分的な除去を示した（図６）。最適なターゲティング形質導入効率および最小のバックグラウンド感染力を達成するために、我々は、異なる量のＮＡＳおよびモノマー（ｃＲＧＤ有り、無し）の一連の組み合わせを更に試験した（図７）。我々は、ＨｅＬａ細胞におけるターゲティングナノウイルスの形質導入効率を検査した。図７に示すように、ｃＲＧＤ無しでのナノウイルスの形質導入は、ｃＲＧＤ有りでのナノウイルスの形質導入よりも常に低く、これはポリマーシェルがＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスの本来の感染力を遮蔽し、ｃＲＧＤがウイルスに対して新たな結合能力を付与したことを示している。我々の試験において、我々は、ＮＡＳ：ウイルス（ｍ／ｍ＝２×１０^４）およびモノマー：ウイルス（ｗ／ｗ＝１２５）の組み合わせが本来のウイルス感染力を完全に遮蔽することができ、ｃＲＧＤ有りの場合の結果は形質導入効率３５％であり、これは同量のｐ２４を有するＶＳＶ−Ｇ偽型（４２％）とほぼ同等である（図７）ことを発見し、これにより、ターゲティングナノウイルスの高い感染力はポリマーシェルの間隙距離およびサイズの調整によって達成され得ることが示された。ｃＲＧＤ無しでのナノウイルスの形質導入効率は、この組み合わせ比で０％であった。我々はまた、動的光散乱（ＤＬＳ）によってナノウイルスのサイズを決定した。ナノウイルスのサイズは約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍの範囲であった（図７）。予想通り、ナノウイルスのサイズは、モノマーの量の増加と共に増加した。ｃＲＧＤ有りまたは無しでのナノウイルスのサイズは、ほぼ同等であった（図７）。別のＲＧＤ発現細胞、すなわちヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において、ＮＡＳ対ウイルス比およびモノマー対ウイルス比が最適な場合のターゲティングナノウイルスの形質導入効率を試験すると、８．１％の形質導入効率が、ＶＳＶＧ偽型による１１．７％の形質導入効率、およびｃＲＧＤ無しのナノウイルスによる０．２％の形質導入効率と共に観察された。この結果は、様々なＲＧＤ発現細胞においてターゲティングナノウイルスを使用する可能性を示している。

４℃および凍結融解サイクル下でのターゲティングナノウイルスの安定性
ＶＳＶＧ偽型レンチウイルスは、４℃での短期間の保管中、または−７０℃で冷凍され解凍される際に安定である。ターゲティングナノウイルスがＶＳＶＧ偽型とほぼ同等の安定性を有するかどうかを検査するために、我々は、４℃で４時間、８時間、および２４時間保管後、ならびに凍結融解サイクル下での、ターゲティングナノウイルスによる形質導入を試験した。実験データは、種々の時点で、ＶＳＶＧ偽型およびターゲティングナノウイルスの両方について感染力の損失が存在しないことを示しており、これはターゲティングナノウイルスが、ＶＳＶＧ偽型のように、４℃で少なくとも２４時間安定であることを示していた。凍結融解サイクル下にある場合、ＶＳＶＧ偽型およびターゲティングナノウイルスの感染力は、２サイクルの凍結融解後は安定であったが、３回目の凍結融解サイクルで著しく低減し、これは、ターゲティングナノウイルスがＶＳＶＧ偽型のように、感染力の著しい損失なく、少なくとも２回冷凍および融解され得ることを示していた。

Ｈｅｌａ細胞に対するターゲティングナノウイルスによる形質導入は、ＲＧＤとインテグリンの相互作用によって特異的に媒介される
ターゲティング形質導入の特異性を確認するために、我々は、Ｈｅｌａ細胞において非特異的ペプチド、すなわち環状ＲＡＤ（ｃＲＡＤ）とコンジュゲートしたターゲティングナノウイルスの形質導入を試験し、形質導入がないことを観察し、これはＨｅｌａ細胞におけるナノウイルスの形質導入が、ｃＲＡＤではなくｃＲＧＤによって付与されたことを示していた（図８）。我々はまた、可溶性ｃＲＧＤまたはｃＲＡＤによってＨｅＬａ細胞をブロッキングし、その後、ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスまたはｃＲＧＤとコンジュゲートしたターゲティングナノウイルス（ｃＲＧＤ−ｎＶＳＶＧ）のいずれかで細胞を形質導入した。ｃＲＧＤまたはｃＲＡＤのいずれかでのブロッキングは、ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスによる形質導入効率に対して影響を有さなかった（図９）。ｃＲＡＤではなく、ｃＲＧＤによるブロッキングは、ｃＲＧＤ−ｎＶＳＶＧによる形質導入を、ブロッキング分子が不在の場合の形質導入の４０％に阻害した（図９）。これらの結果は、Ｈｅｌａ細胞におけるｃＲＧＤ−ｎＶＳＶＧによる形質導入が、ｃＲＧＤ特異的であることを更に支持する。

インテグリンは、細胞の表面におけるＲＧＤペプチドに対する受容体である。したがって、我々は、ｃＲＧＤ−ｎＶＳＶＧによる形質導入がインテグリンに依存するかどうかを更に試験した。我々は、抗インテグリン抗体によってＨｅｌａ細胞をブロッキングし、続いて、ＶＳＶ−Ｇ偽型またはｃＲＧＤ−ｎＶＳＶＧの形質導入を行った。抗インテグリン抗体は、ｃＲＧＤ−ｎＶＳＶＧによる形質導入を抑制したが、ＶＳＶ−Ｇ偽型による形質導入は抑制せず（図９）、これは細胞表面におけるｃＲＧＤの結合が、インテグリンに依存することを示していた。アイソタイプ抗体は、ＶＳＶ−Ｇ偽型またはｃＲＧＤ−ｎＶＳＶＧのいずれに対しても影響を有さなかった。可溶性ｃＲＧＤペプチドまたは抗インテグリン抗体による不完全なブロッキングは、おそらく細胞表面インテグリンに対するターゲティングナノウイルスの多価結合との競合が原因である。

ターゲティングナノウイルスの侵入キネティクス
我々は、古典的な標準ＶＳＶ−Ｇ偽型と比較した、ターゲティングナノウイルスのウイルス学的特性を検査した。まず、我々は、これまでウイルスの細胞内への侵入の測定として使用されているβ−ラクタマーゼ（ＢｌａＭ）アッセイによってウイルスの侵入キネティクスにアクセスした。ＢｌａＭ−Ｖｐｒ融合タンパク質を、ＶＳＶ−Ｇ偽型およびターゲティングナノウイルスの両方の中に組み込んだ。続いて、内因性細胞質エステラーゼによってＢｌａＭの基質となるように変換されてサイトゾル内に保持されるＣＣＦ２−ＡＭを細胞に加えることによって、サイトゾルＢｌａＭ活性を検出した。ＣＣＦ２−ＡＭは、ＢｌａＭによって切断されると、緑色から青色の蛍光への推移を呈する。ＢｌａＭ活性を、ウイルスの細胞との３７℃でのインキュベートの５、１５、３０、４５、６０、９０、および１２０分後に検査した。図１０に示すように、５、１５、３０分で、ＢｌａＭ活性は、ターゲティングナノウイルス形質導入細胞と比較して、ＶＳＶ−Ｇ偽型形質導入細胞においてわずかに高かった。３０分間のインキュベーション後、どちらのウイルス形質導入細胞においてもＢｌａＭ活性について著しい差は観察されなかった（図１０）。これらの結果は、最初の３０分以内に、ＶＳＶ−Ｇ偽型がターゲティングナノウイルスよりもわずかに速く細胞に侵入し、ＢｌａＭを放出することを示していた。ターゲティングナノウイルスからのＢｌａＭの放出の遅延は、ウイルス膜の融合が生じる前の、架橋剤の分解、ひいてはポリマーシェルの分解が原因であり得る。

ターゲティングナノウイルスの融合
天然ＶＳＶ−Ｇウイルスは、エンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、エンドソームで融合する。空胞型Ｈ^＋−ＡＴＰａｓｅの阻害剤であるバフィロマイシン−Ａは、エンドソーム内のｐＨを中和し、ひいてはｐＨに依存したウイルス融合、および続く形質導入を阻害するために使用されている。ターゲティングナノウイルスのポリマーシェルの架橋剤は低いｐＨで分解され、それによりビリオンの放出が可能となる。したがって、我々は、ターゲティングナノウイルスもまた、エンドサイトーシスを介して細胞に侵入し得、架橋剤がエンドソームで分解されて、融合のためのＶＳＶ−Ｇタンパク質を暴露すると仮定した。エンドソームがターゲティングナノウイルスの融合部位であるかどうかを確認するために、ＶＳＶ−Ｇ偽型およびターゲティングナノウイルスを使用して、バフィロマイシン−Ａ有りまたは無しでＨｅＬａ細胞を形質導入した。バフィロマイシンＡの存在下で、ＶＳＶ−Ｇ偽型およびターゲティングナノウイルスの両方の形質導入は阻害され（図１１Ａ）、これは両方のウイルスがエンドソームを介して侵入および融合し、ポリマーシェルによる遮蔽がウイルスの結合のみを除去し、融合は除去しなかったことを示していた。

ターゲティングナノウイルスの形質導入は、逆転写阻害剤によって阻害され得る
ターゲティングナノウイルスの形質導入中に逆転写が生じることを確認するために、逆転写阻害剤であるＡＺＴを使用して形質導入をブロッキングした。ＶＳＶ−Ｇ偽型およびターゲティングナノウイルスを使用して、ＡＺＴ有りまたは無しでＨｅＬａ細胞を形質導入した。ＡＺＴ無しの場合、両ウイルスが、それぞれ４３％および３９％の形質導入効率でＨｅＬａ細胞を形質導入した（図１１Ｂ）。ＡＺＴ有りの場合、両方の形質導入がブロッキングされ（図１１Ｂ）、それにより、ターゲティングナノウイルスによる感染力には逆転写が必要であることが実証された。

ヒト血清の存在下でのターゲティングナノウイルスの安定性
ヒト細胞内で産生されるＶＳＶ−Ｇ偽型ＨＩＶベクターは、ヒト血清補体によって不活性化され得ることが報告されており、これは臨床的用途における治療ベクターのためにはエンベロープのより高い安定性が必要とされることを示している。我々は、ターゲティングナノウイルスのポリマーシェルが、ヒト血清補体による不活性化からの保護をウイルスに提供し得るかどうかを更に検査した。ＶＳＶ−Ｇ偽型またはターゲティングナノウイルスを、１：１の比で、ＰＢＳ、熱不活性化ヒト血清、または非不活性化ヒト血清と共に、感染前および感染を通して３０分間インキュベートした。図１２に示すように、ヒト血清処理の後、ＶＳＶ−Ｇ偽型の形質導入効率は低減し、これは公開されたデータと一貫性がある。ヒト血清の存在下において、ターゲティングナノウイルスによる形質導入は、ＶＳＶ−Ｇ偽型と比較して５倍高かった（図１２）。ＰＢＳまたは熱不活性化ヒト血清による処理の場合は、ＶＳＶ−Ｇ偽型およびターゲティングナノウイルスの形質導入効率は、ほぼ同等であった。これらのデータによって、ＶＳＶ−Ｇ偽型がヒト血清補体によって不活性化され得、ポリマーシェルがターゲティングナノウイルスをヒト血清による不活性化から保護し得ることが実証された。

考察
ヒト疾患の治療のための遺伝子治療の成功した適用は、発現の望ましい部位への、治療遺伝子の効率的かつ安全な送達を必要とする。最も有効なアプローチは、特定の細胞および組織が存在し、それを形質導入するベクターを開発することであろう。特定の細胞および組織をターゲティングし得るレトロウイルスベクターを開発するための、数多くの努力がこれまで行われてきた。典型的には、これは天然エンベロープの修飾、および／または他のウイルスエンベロープでの偽型化を伴った。天然エンベロープにおける修飾はウイルス力価の大きな低減につながり、他のウイルスエンベロープでの偽型化は多くの異なる型の細胞および組織のターゲティングに対して一般的に適用可能でないため、これらのアプローチは一般的に適用可能ではなかった。

我々は、これまで、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ｉ級、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ１４６、ＣＤ３４、黒色腫細胞のＰ−糖タンパク質、およびインビトロまたはインビボのいずれかの前立腺幹細胞抗原をターゲティングし得る、シンドビスウイルスエンベロープタンパク質の修飾型で偽型化されたターゲティングレンチウイルスベクターを開発し、記載した。過去のレトロウイルスターゲティングベクターに対する、このベクターの際立った特性は、それが高い力価で産生され得ること、ならびに、血流を介して全身に投与された後に特定の細胞および組織へと進み得ることであった。しかしながら、シンドビスウイルスエンベロープ、および本来の結合を付与するエンベロープドメインの遺伝子除去についての我々の広範な分析にも関わらず、我々は、依然として、いくつかの細胞型、特に顕著には内皮細胞において残留標的外感染力を観察した。我々は、この感染力が、ウシ胎仔血清中のウシタンパク質Ｓ、またはそのヒトホモログであるＧａｓ６によって付与されることを発見した。Ｇａｓ６は、複数のウイルスエンベロープタンパク質の偽型の本来の感染力を改善する。Ｇａｓ６は、ウイルスの標的細胞に対する結合、架橋ビリオンエンベロープホスファチジルセリンのＡｘｌに対する結合、ＴＡＭ受容体チロシンキナーゼの標的細胞に対する結合を媒介する。本来のビリオンエンベロープタンパク質間の相互作用および新規の相互作用（例えばビリオンホスファチジルセリンを介した相互作用）は、ビリオンと細胞との間の結合を除去するためおよび新規の特異性を付与するための他の手段を我々に考えさせる。

我々は、ビリオン成分と標的細胞との間の相互作用を阻止することによって非特異的ターゲティングを低減するために、ポリマーシェルによってビリオンをカプセル化する新規のナノテクノロジーを設計した。実際、我々の結果は、ＶＳＶ−Ｇ偽型の感染力がポリマーシェルによって完全に除去され得ることを示した。ターゲティング送達のために、我々は、ｃＲＧＤペプチドをポリマーシェルに更にコンジュゲートして、ターゲティング形質導入をＨｅｌａ細胞へと方向付けた。ＲＧＤはα_Ｖβ_３インテグリンを特異的にターゲティングし、腫瘍血管新生および腫瘍成長を阻害するための抗癌薬を送達するための、リガンドと考えられた。我々は、線状ＲＧＤと比べてより大きな安定性および選択性を付与するｃＲＧＤペプチドを選択し、ターゲティングナノウイルスのターゲティング送達の概念の証明として、Ｈｅｌａ細胞をターゲティングした。所望の再ターゲティング特性のための遺伝子修飾とは異なり、３段階の化学アプローチを使用して、レンチウイルスベクターを新規のターゲティングナノウイルスに形質転換した。１）アンカー分子を、エンベロープタンパク質の特定のアミノ酸（リジン）に対してコンジュゲートさせ、２）これらのアンカーから、その場重合を通して、薄い分解性ポリマーネットワークを成長させ、３）リガンド（ｃＲＧＤペプチド）をナノウイルスのポリマーシェルとコンジュゲートさせて、所望の受容体に対する結合を再方向付けする。エンドサイトーシスを介して内部移行されると、ポリマーの酸分解性結合が反応し、ビリオンを放出し、ビリオンの細胞質内への融合および侵入を可能にする。このナノ工学アプローチは、いくつかの利点を有する。第１に、ポリマーシェルは、ビリオンエンベロープを細胞との相互作用から遮蔽し、我々が報告した、エンベロープタンパク質とＮ−グリカンおよび脂質との間の相互作用による特異的結合および標的外結合の両方を阻止する。更に、我々は、標的外形質導入に寄与するであろう、他の糖質、タンパク質、および脂質を介した、未だに特性化されていないエンベロープ細胞相互作用が存在することを予想する。我々は、侵入、融合、および逆転写に関わる後続の段階に影響を与えずに、全てのそのような相互作用を阻止するために、ナノウイルスシェルの重合を最適化した。

ターゲティングおよび低減した標的外感染力の特性を付与することに加えて、ターゲティングナノウイルスはまた、ヒト血清における高い力価および改善された安定性などの、際立った特性を示す。ＶＳＶ−Ｇエンベロープは、それが濃縮され、高い力価を達成することを可能にする堅固な物理的安定性を有するものの、それをターゲティングのために形質転換する試みは成功していない。我々のターゲティングナノウイルスは、ＶＳＶ−Ｇエンベロープおよびポリマーシェルの両方の利点を組み合わせて、高い形質導入効率および改善された安定性を有するターゲティングを達成することに成功している。

この実施例は、ポリマーナノテクノロジーによる効率的なターゲティング送達のための、ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスのカプセル化を実証している。本技術はまた、他のリガンドを使用するターゲティング送達を可能にする。

結論
これは、本発明の好適な実施形態の記載を結論付ける。本発明の１つまたは複数の実施形態についての前述の記載は、例示および説明の目的のために提示されている。それは、包括的であること、または本発明を開示される正確な形態に制限することが意図されない。上記の教示に照らして、多くの修正および変更が可能である。

本明細書に引用された全ての出版物、特許、および特許出願は、全ての目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。

Claims (7)

1. ウイルスベクターの細胞特異性を調節する方法であって、該方法が、
   ウイルスエンベロープと標的組織または標的細胞系列に対する第1の特異性とを有するウイルスベクターを選択する段階、および
   該ウイルスベクターをポリマーシェルにカプセル化する段階であって、
   該ウイルスベクターを薄いポリマーシェル内にカプセル化するように、該ウイルスエンベロープ上で直接重合されたモノマーから該ポリマーシェルが形成され、かつ
   該ポリマーシェルが、
   インビボで分解されるポリマーシェルを形成するように分解性架橋剤によって架橋された複数のポリマーと
   該架橋された分解性ポリマーシェルに結合したターゲティング剤であって、該架橋された分解性ポリマーシェルが、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）、アクリルアミド、およびグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）を含み、かつ該ターゲティング剤が標的組織または標的細胞系列に対する第2の特異性を有するように選択された、ターゲティング剤と、を含む、段階
   を含み
   それにより、該ウイルスベクターの該細胞特異性が調節される、前記方法。
2. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニア、ポックスウイルスベクター、およびシンドビスウイルスベクターからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
3. 前記ウイルスベクターが、水疱性口内炎インディアナウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）偽型レンチウイルスベクターである、請求項１記載の方法。
4. 前記架橋されたポリマーシェルが酸性環境において分解され、それにより前記ポリマーシェルから前記ウイルスベクターが放出される、請求項１記載の方法。
5. 前記ターゲティング剤が、抗体である、請求項１記載の方法。
6. 前記ターゲティング剤が、末梢血単核細胞に結合する、請求項１記載の方法。
7. 前記ターゲティング剤が環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ｃＲＧＤ）であり、該ｃＲＧＢが腫瘍細胞上のα_Ｖβ₃インテグリンに対する親和性を有する、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。

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