BR112020001059A2 - composições e métodos para o tratamento de beta-hemoglobinopatias - Google Patents

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Abstract

A presente invenção apresenta vetores de expressão compreendendo pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos, a saber, uma sequência de ácidos nucleicos codificando um RNAi anti-HPRT, e uma sequência de ácidos nucleicos codificando um gene de gama globina. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor lentiviral de auto-inativação. Em algumas modalidades, o gene de gama-globina é usado para corrigir geneticamente a doença de células falciformes ou ß-talassemia ou para reduzir os sintomas das mesmas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPO- SIÇÕES E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE BETA-HEMO- GLOBINOPATIAS",. Referência Remissiva a Pedidos Relacionados
[001] O presente pedido reivindica o benefício da data de depósi- to do Pedido de Patente US Provisório Nº 62/653,913, depositado em 6 de abril de 2018; o benefício da data de depósito do Pedido de Pa- tente US Provisório Nº 62/541,931, depositado em 7 de agosto de 2017; e também o benefício da data de depósito do Pedido de Patente US Provisório Nº 62/533,719 depositado em 18 de julho de 2017, cujas íntegras encontram-se aqui incorporadas a título de referência. Campo da Invenção
[002] Esta descrição refere-se de modo geral aos campos da bio- logia molecular e, em particular, a vetores e células hospedeiras trans- duzidas por vetores. Antecedentes da Invenção
[003] B-Hemoglobinopatias, incluindo beta-talassemia e doença de células falciformes (SCD), constituem um grupo heterogêneo de distúrbios comumente herdados que afetam a função ou os níveis de hemoglobina. SCD e B-talassemia são os distúrbios monogênicos mais comuns no mundo com aproximadamente 400.000 nascimentos afeta- dos anualmente. As manifestações clínicas aparecem tipicamente vá- rios meses depois do nascimento durante a troca da hemoglobina fetal (HbF) pela B-globina (HbA) adulta e podem ser severas com signicati- va morbididade e mortalidade. O transplante de medula óssea alogê- nica é curativo, mas limitado aos pacientes comum doador apropria- damente compatível. A terapia com genes autológos, que utiliza célu- las do próprio paciente, é uma opção terapêutica atraente.
[004] A p-talassemia é um distúrbio do sangue hereditário carac- terizado por níveis reduzidos de hemoglobina funcional. As B-
talassemias são causadas por mutações na subunidade beta da he- moglobina (doravante denominada "gene HBB"), que se acredita se- rem herdadas de maneira recessiva autossôsmica. A pB-talassemia maior, definida clinicamente transfusão-dependente, é causada pela síntese reduzida ou ausente da cadeia beta da hemoglobina. A severi- dade da doença depende da natureza da mutação com desfechos va- riáveis variando de anemia severa a indivíduos clinicamente assinto- máticos.
[005] Já foram descritas centenas de mutações diferentes que afetam os níveis de beta-globina via os efeitos em uma ampla gama de processos, incluindo transcrição, junção/processamento de mRNA, estabilidade do RNA, translação, e estabilidade dos peptídios da globi- na. Acredita-se que o baixo teor de beta-globina permite que o exces- so de cadeias alfa-globina precipite em precursores de eritroides. Acredita-se ainda que os agregados de alfa-globina causem danos às membranas celulares e levem à morte precoce os precursores de eri- troides. A eritropoiese ineficiente resultante encontrada nos pacientes, se severa, pode precisar de transfusões de sangue frequentes.
[006] A anemia de células falciformes ("SCA'") resulta de uma única mutação pontual no Éxon 1 do gene da beta-globina que leva à substituição do ácido glutâmico por valina na posição 6 na forma falci- forme mutada da hemoglobina, hemoglobina S (HbS). Existem outros genótipos, além da hemoglobina S ("HbSS") homozigótica, que podem resultar em SCD. Embora a SCA clássica seja com frequência definida como HbSS homozigótica, a hemoglobina C ("HbSC") homozigótica e a talassemia ("HbS/Bº") são genótipos comuns que apresentam es- sencialmente as mesmas manifestações da doença. A HbS polimeriza com a desoxigenação resultando em células sanguíneas vermelhas ("RBCs") em forma de foice que causam a oclusão da microvasculatu- ra. SCD caracteriza-se clinicamente pelo grau variável de anemia, e episódios de crise vaso-oculsiva levando ao dano de múltiplos órgãos e à morte precoce. Além da falciformidade, ocorrem hemólise excessi- va e um estado de inflamação crônica.
[007] Pacientes com SCD respondem por aproximadamente
75.000 hospitalizações por ano nos EUA, resultando em um gasto anual estimado de $475 milhões de doláres. No mundo todo, a SCD é o segundo distúrbio monogênico de maior incidência, perdendo ape- nas para a talassemia, com mais de 200.000 crianças nascendo anu- almente na África com esta doença. As opções de controle médico atualmente disponíveis para a SCD incluem o gerenciamento de su- porte da crise vaso-oclusiva, transfusões de longo prazo para evitar ou prevenir a reincidência de complicações severas da SCD tais como derrame ou síndrome torácica aguda, e indução de hemoglobina fetal (HbF) com hidroxiureia. Acredita-se que um transplante de células- tronco hematopoiéticas (HSC) alogênicas compatíveis seja curativo, porém limitado pela disponibilidade de doadores compatíveis, e tem potenciais complicações graves. Na vida fetal, o gene de gama-globina (que resulta em HbF; alfargama>?s) é o gene predominante expresso pelos locos da beta-globina e a expressão do gene de beta-globina é reprimida. Entretanto, depois do nascimento, a expressão do gene de gama-globina fetal diminui para níveis desprezíveis, com um aumento simultâneo na expressão de beta-globina. Na vida adulta, os transcri- tos de gama-globina fetal são altamente silenciados, i.e., a expressão gênica é regulada para prevenir ou reduzir a expressão de gama- globina. Esta alteração na expressão resulta em HbF reduzida com um aumento correspondente em HbA (alpha2betas). Sabe-se que a gama- globina possui propriedades antifalciformes e, assim, a adição desse gene é considerada para terapia genética.
[008] Hemoglobinopatias, especialmente a SCD, são os princi- pais alvos da terapia genética por diversas razões. Sua elevada preva-
lência, morbidade e mortalidade significativas, e o alto custo resultante dos cuidados médicos paliativos contínuos são prognóstico de que uma terapia curativa pode melhorar bastante o desfecho dos pacientes e reduzir significativamente os custos médicos associados. A terapia genética para B-hemoglobinopatias por meio da transferência lentiviral ex vivo de um gene de B-globina terapêutico para células-tronco/pro- genitoras (HSPC) hematopoiéticas CD34* autólogas vem sendo avali- ada em ensaios clínicos com humanos nos últimos 9 anos. O trans- plante de HSCs autólogas baseado na terapia mieloablativa resultou na independência das transfusões ou em uma redução nos volumes de transfusão nos pacientes com f-talassemia mais de 12 meses de- pois da terapia genética. Recentemente, foi reportada uma resposta curativa em um adolescente com SSD (vide Thompson et. al., "Gene therapy in patients with transfusion-dependent Beta-Thalassemia," N Engl J Med. 2018 Apr 19;378(16):1479-1493, cuja íntegra encontra-se aqui incorporada a título de referência). Apesar dos resultados promis- sores, a maioria dos indivíduos nesses ensaios não conseguiu atingir níveis de enxertia de HSPC autólogas de genes corrigidos nem um nível limiar de expressão da proteína terapêutica associado a um be- nefício clínico. Breve Sumário da Descrição
[009] Estratégias de terapia genética para modificar células-tron- co humanas representam uma grande promessa para a cura de muitas doenças humanas, inclusive hemoglobinopatias. Acredita-se que a en- xertia de células-tronco geneticamente modificadas pode ser melhora- da por células-tronco geneticamente manipuladas nas quais a expres- são de hipoxantina guanina fosforibossitransferase ("HPRT") é derru- bada, possibilitando assim a seleção de células geneticamente modifi- cadas conferindo resistência a um antimetabólito análogo de guanina.
[0010] Em um aspecto da presente descrição encontra-se uma composição incluindo componentes que introduzem um gene terapêu- tico em uma célula-tronco hematopoiética ("HSC") que também diminui simultaneamente a expressão de HPRT na HSC. Em algumas modali- dades, a composição inclui um primeiro componente desenhado para efetuar uma redução na expressão de HPRT (por exemplo, um agente desenhado para derrubar HPRT ou um agente desenhado para nocau- tear HPRT). Em algumas modalidades, a composição inclui um se- gundo componente, a saber, um ácido nucleico codificando um gene terapêutico. Em algumas modalidades, a composição inclui um vetor de expressão lentiviral incluindo um primeiro ácido nucleico codifican- do um agente desenhado para derrubar o gene de HPRT ou de algu- ma forma efetuar uma redução na expressão de HPRT; e uma segun- da sequência de ácidos nucleicos codificando o gene terapêutico. Em algumas modalidades, o vetor de expressão lentiviral pode ser incor- porado em uma nanocápsula, tal como uma nanocápsula adaptada para ser direcionada para HSCs. Em algumas modalidades, o gene terapêutico é gama globina.
[0011] Em algumas modalidades, o primeiro componente é dese- nhado para derrubar HPRT. Em algumas modalidades, o primeiro componente é um RNAi, tal como um siRNA, um shRNA ou um miR- NA. Em algumas modalidades, o primeiro componente é um oligonu- cleotídeo antissenso visa do para HPRT mRNA sem junçãos.
[0012] Em algumas modalidades, o primeiro componente é dese- nhado para nocautear HPRT. Em algumas modalidades, o primeiro componente é a fusion protein compreendendo uma proteína dedo-de- Zinco que se liga a um gene de hipoxantina-guanina HPRT endógena e um domínio de clivage, onde a proteína de fusão modifica o gene de endógena. Em algumas modalidades, um RNA guia simples (sgRNA) carregado com Cas9 pode ser usado para ser visa do para a região CCRS5 (sequência-alvo, -GAGCAAGCTCAGTTTACACC-3') nos locos do gene de CCR5 (cromossoma humano 3) para "repor" uma induzida SshHPRT por Pol-ll de forma a efetuar a "expressão derrubada" de HPRT (vide, por exemplo, SEQ ID NOS: 61 e 69). Em algumas moda- lidades, o primeiro componente desenhado para nocautear HPRT está incluído em um veículo de distribuição não viral. Em algumas modali- dades, o primeiro componente desenhado para nocautear HPRT está incluído em uma nanocápsula, tal como uma nanocápsula projetada para ser direcionada para HSCs. Em algumas modalidades, a compo- sição inclui (i) uma nanocápsula configurada para distribuir e/ou liberar o primeiro componente desenhado para nocautear HPRT; e (ii) um ve- tor de expressão lentiviral incluindo o segundo componente, i.e., o áci- do nucleico codificando o gene terapêutico.
[0013] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um vetor de expressão incluindo (i) uma primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um RNAi, um oligonucleotídeo antissenso, ou um agente para salto de éxons direcionado para um gene de HPRT; e (ii) uma segunda sequência de ácidos nucleicos codificando um gene terapêutico. Em algumas modalidades, o primeiro ácido nucleico codi- ficando o RNAi codifica uma pequena molécula de ácido ribonucleico tipo grampo de cabelo ("shRNA") direcionada para HPRT. Em algumas modalidades, o primeiro ácido nucleico codificando o ShRNA direcio- nado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30. Em algumas moda- lidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando o shR- NA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30. Em algu- mas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifican- do o ShRNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA direcionado para o gene de HPRT tem uma se- quência tendo pelo menos 97% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nu- cleicos codificando o ShRNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência de SEQ ID NO: 30.
[0014] Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 27 - 29. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identi- dade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 27 - 29. Em algumas mo- dalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 27 - 29. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nu- cleicos codificando o ShRNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 97% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 27 - 29. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência de SEQ ID NO: 27. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência de SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência de SEQ ID NO: 29.
[0015] Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 31. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 31. Em algumas modalidades, a primeira se- quência de ácidos nucleicos codificando o sShRNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identi- dade com aquela de SEQ ID NO: 31. Em algumas modalidades, a pri- meira sequência de ácidos nucleicos codificando o sShRNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 97% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 31Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA direcio- nado para o gene de HPRT tem uma sequência de SEQ ID NO: 31.
[0016] Em algumas modalidades, o segundo ácido nucleico codifi- cando o gene terapêutico é um ácido nucleico que pode corrigir gene- ticamente a doença de células falciformes ou a B-talassemia; ou redu- zir os sintomas das mesmas (inclusive os sintomas de SCD severa). Em outras modalidades, o ácido nucleico codificando o gene terapêuti- co é um ácido nucleico que pode corrigir geneticamente deficiências imunes, doenças hereditárias, doenças do sangue (por exemplo, he- mofíilia, distúrbios de hemoglobina), doenças neurológicas, e/ou doen- ças do armazenamento lisossômico; ou reduzir os sintomas das mes- mas. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor lentiviral. Em algu- mas modalidades, o gene terapêutico é gama globina. Em algumas modalidades, a segunda sequência de ácidos nucleicos codificando o gene terapêutico tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identi- dade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, a se- gunda sequência de ácidos nucleicos codificando o gene terapêutico tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, a segunda sequência de ácidos nucleicos codificando o gene terapêutico tem uma sequên- cia tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO:
55. Em algumas modalidades, a segunda sequência de ácidos nuclei- cos codificando o gene terapêutico tem uma sequência tendo pelo menos 97% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algu- mas modalidades, a segunda sequência de ácidos nucleicos codifi- cando o gene terapêutico tem uma sequência de SEQ ID NO: 55.
[0017] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um vetor de expressão lentiviral incluindo uma primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um sShRNA anti-HPRT ou um shRNA anti- HPRT embutidos em um micro-RNA; e uma segunda sequência de ácidos nucleicos codificando um gene terapêutico. Em algumas moda- lidades, os vetores de expressão lentiviralis são adequados para transduzir HSCs ex vivo. Em algumas modalidades, os vetores de ex- pressão lentivirais são adequados para produzir células geneticamente modificadas selecionáveis, tais como HSCs. Em algumas modalida- des, as HSCs transduzidas ex vivo podem ser administradas a um pa- ciente com necessidade de tratamento, por exemplo, para o tratamen- to de hemoglobinopatias, incluindo beta-talassemia e doença de célu- las falciformes.
[0018] Em algumas modalidades, o gene terapêutico is gama glo- bina gene. Em algumas modalidades, a segunda sequência de ácidos nucleicos codificando o gene gama globina é um gene gama globina híbrido incluindo uma mutação pontual que confere uma vantagem competitiva para a cadeia de a-globina, distorcendo a formação de HbF tetramérico versus HDS. Em algumas modalidades, a segunda sequência de ácidos nucleicos codificando o gene de gama-globina é operacionalmente ligada a um promotor de beta globina. Em algumas modalidades, a segunda sequência de ácidos nucleicos codificando o gene de gama-globina tem pelo menos 95% de identidade de sequên- cia com aquela de SEQ ID NO: 55.
[0019] Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos é operacionalmente ligada a um promotor de Pol Ill.
Em al- gumas modalidades, o promotor de Pol Ill é um promotor 7sk de RNA da linhagem celular HEK-293 de homo sapiens (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 32). Em algumas modalidades, o promotor de Pol Ill é um promotor 7sk que inclui uma única mutação em sua sequência de áci- dos nucleicos em comparação com a SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, o promotor de Pol Ill é um promotor 7sk que inclui várias mutações em sua sequência de ácidos nucleicos em comparação com a SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, o promotor de Pol Ill é um promotor 7sk que inclui uma deleção em sua sequência de ácidos nucleicos em comparação com a SEQ ID NO: 32. Em algumas moda- lidades, o promotor de Pol Ill é um promotor 7sk que inclui tanto uma mutação quanto uma deleção em sua sequência de ácidos nucleicos em comparação com a SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos é operacionalmente ligada a um promotor tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos é operacionalmente ligada a um promotor tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 33. Em algu- mas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos é opera- cionalmente ligada a um promotor tendo pelo menos 97% de identida- de com aquela de SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, a primei- ra sequência de ácidos nucleicos é operacionalmente ligada a um promotor tendo pelo menos 98% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nu- cleicos é operacionalmente ligada a um promotor tendo pelo menos 99% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 33. Em algumas mo- dalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos é operacional- mente ligada a um promotor tendo a SEQ ID NO: 33. Em algumas mo- dalidades, o vetor de expressão lentiviral compreende ainda uma se-
quência de controle de expressão tendo uma repetição terminal 5' comprida a montante da segunda sequência de ácidos nucleicos se- quence, e uma repetição terminal 3' comprida a jusante do ácido nu- cleico codificando o gene de gama-globina.
[0020] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um vetor compreendendo (i) uma sequência de ácidos nucleicos codi- ficando um sShRNA à base de micro-RNA direcionado para um gene de HPRT; e (ii) uma sequência de ácidos nucleicos codificando um gene terapêutico. Em algumas modalidades, o gene terapêutico é usado pa- ra corrigir geneticamente a anemia de células falciformes ou B- talassemia; ou reduzir os sintomas das mesmas. Em algumas modali- dades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA à base de micro-RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codifican- do o ShRNA à base de micro-RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA à base de micro-RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identi- dade com aquela de SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA à base de micro- RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência de SEQ ID NO: 67.
[0021] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA à base de micro-RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, a sequên- cia de ácidos nucleicos codificando o ShRNA à base de micro-RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo me-
nos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA à base de micro-RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma se- quência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA à base de micro-RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência de SEQ ID NO: 68.
[0022] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA à base de micro-RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, a sequên- cia de ácidos nucleicos codificando o ShRNA à base de micro-RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo me- nos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA à base de micro-RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma se- quência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA à base de micro-RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência de SEQ ID NO: 25.
[0023] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA à base de micro-RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a sequên- cia de ácidos nucleicos codificando o ShRNA à base de micro-RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo me- nos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA à base de micro-RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma se- quência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID
NO: 26. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA à base de micro-RNA direcionado para o gene de HPRT tem uma sequência de SEQ ID NO: 26.
[0024] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um vetor de expressão lentiviral adequado para transduzir células hu- manas (por exemplo, HSCs) compreendendo uma primeira sequência de ácidos nucleicos operacionalmente ligada a um primeiro promotor (por exemplo, um promotor de Pol Ill) e uma segunda sequência de ácidos nucleicos operacionalmente ligada a um segundo promotor (por exemplo, um promotor de pol ll), onde a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica um agente que derruba o HPRT ou de alguma forma diminui a expressão de HPRT, e onde a segunda sequência de ácidos nucleicos codifica um gene terapêutico. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 95% de iden- tidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 30. Em algumas mo- dalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 31. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos tem a sequência de SEQ ID NO: 31. Em algumas modalidades, o segundo ácido nucleico codifica gama globina (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOS: 3 ou 55). Em algumas modalidades, a segunda sequên- cia de ácidos nucleicos tem pelo menos 95% de identidade de se- quência com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, o primeiro promotor é um promotor 7sk. Em algumas modalidades, o promotor 7sk tem pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, o segundo pro- motor é um promotor de beta globina. Em algumas modalidades, o promotor de beta globina tem pelo menos 95% de identidade de se- quência com aquela de SEQ ID NO: 66. Em algumas modalidades, o vetor de expressão lentiviral tem uma sequência tendo pelo menos
85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: — 22. Em algumas modalidades, o vetor de expressão lentiviral tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5 — 22. Em algumas modalida- des, o vetor de expressão lentiviral tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5 — 22. Em algumas modalidades, o vetor de expressão lenti- viral tem uma sequência tendo pelo menos 96% de identidade de se- quência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5 — 22. Em algumas modalidades, o vetor de expressão lentiviral tem uma sequência tendo pelo menos 97% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5 — 22. Em algumas modalidades, o vetor de expressão lentiviral tem uma sequência tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5 — 22. Em algumas modalidades, o vetor de expressão lentiviral tem uma sequência tendo pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5 — 22.
[0025] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se uma sequência polinucleotídica incluindo (a) uma sequência codifican- do um shRNA direcionado para HPRT; (b) uma sequência codificando um gene de gama globina; (c) uma sequência codificando um primeiro promotor para induzir a expressão da sequência codificando o SRRNA direcionado para HPRT; (d) uma sequência codificando um segundo promotor para induzir a expressão da sequência codificando o gene de gama globina; (e) uma sequência codificando um elemento do trato polipurínico central; e (f) uma sequência codificando um elemento de resposta REv (SEQ ID NO: 56). Em algumas modalidades, o polinu- cleotídeo inclui ainda uma região de controle dos locos (SEQ ID NO: 57). Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica tem pelo menos 85% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5-
22. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica tem pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5 —
22. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica tem pelo menos 91% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5-
22. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica tem pelo menos 92% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5-
22. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica tem pelo menos 93% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5-
22. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica tem pelo menos 94% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5 —
22. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica tem pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5-
22. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica tem pelo menos 96% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5 —
22. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica tem pelo menos 97% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5 -—
22. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica tem pelo menos 98% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5 —
22. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica tem pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5 —
22. Em algumas modalidades, o primeiro promotor é um promotor de Pol Ill. Em algumas modalidades, o primeiro promotor é um promotor 7sk. Em algumas modalidades, o promotor 7sk tem pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 32. Em algu- mas modalidades, o segundo promotor é um promotor de pol Il. Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor de beta- globina. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica inclui entre 11.000 e 12.750 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a se- quência polinucleotídica inclui entre 11.500 e 12.000 nucleotídeos.
[0026] Em um outro aspecto da presente descriçãodescrição en-
contra-se uma composição farmacêutica compreendendo (a) um vetor, tal como um vetor de expressão, incluindo (i) uma sequência de ácidos nucleicos codificando um shRNA direcionado para um gene de HPRT; e (ii) uma sequência de ácidos nucleicos codificando um gene terapêu- tico (por exemplo, um gene de gama-globina); e (b) um veículo farma- ceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição far- macêutica é formulada como uma emulsão. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é formulada dentro de micelas. Em algu- mas modalidades, a composição farmacêutica é encapsulada em um polímero. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é en- capsulada em lipossoma. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é encapsulada dentro de micelas ou nanocápsulas.
[0027] Em um outro aspecto da presente descriçãodescrição en- contra-se um método para a produção de células geneticamente modi- ficadas, compreendendo: colocar as células em contato com um pri- meiro agente que "derruba" o gene de HPRT, e um segundo agente que introduz um gene terapêutico para expressão. Em algumas moda- lidades, as células são geneticamente modificadas por contato das cé- lulas com um vetor de expressão lentiviral incluindo sequências de ácidos nucleicos codificando tanto o primeiro quanto o segundo agen- te. Em algumas modalidades, as células são HSCs.
[0028] Em um outro aspecto da presente descriçãodescrição en- contra-se um método para a produção de células geneticamente modi- ficadas, compreendendo: colocar as células em contato com um pri- meiro agente que "nocauteia" o gene de HPRT, e um segundo agente que introduz um gene terapêutico para expressão. Em algumas moda- lidades, um veículo de distrubuição não viral é utilizado para introduzir o primeiro agente nas células; e um vetor de expressão lentiviral é uti- lizado para introduzir o segundo agente nas células. Em algumas mo- dalidades, o veículo de distrubuição não viral é uma nanocápsula. Em algumas modalidades, as células são HSCs.
[0029] Em um outro aspecto da presente descriçãodescrição en- contram-se HSCs (por exemplo, CD34* HSCs) que foram transduzidas com um vetor de expressão incluindo um gene terapêutico e um agen- te desenhado para reduzir a expressão de HPRT (por exemplo, por derrubamento ou por nocaute da HPRT). Em algumas modalidades, as HSCs transduzidas constituem um produto de terapia celular que pode ser administrado a um indivíduo com necessidade de tratamento. Em algumas modalidades, o gene terapêutico é um gene de gama globina. Em algumas modalidades, o gene de gama globina codifica um peptí- dio tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 4.
[0030] Em um outro aspecto da presente descriçãodescrição en- contram-se HSCs que foram transduzidas com um vetor de expressão incluindo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um gene de gama globina híbrida (por exemplo, SEQ ID NOS: 3 ou 55) e um um ácido nucleico codificando um sShRNA anti-HPRT (por exemplo, SEQ ID NOS: 1, 2, 30 ou 31). Em algumas modalidades, o sShRNA anti- HPRT é induzido por um promotor 7sk (por exemplo, SEQ ID NOS: 32 or 33). Em algumas modalidades, 7sk/sh734 é orientado seja para ci- ma ou para baixo na direção senso ou antissenso em relação a um cassete de gama-globina híbrida. Em algumas modalidades, as HSCs transduzidas constituem um produto de terapia celular que pode ser administrado (tal como em uma composição farmacêutica incluindo um veículo farmaceuticamente aceitável) a um indivíduo com necessidade de tratamento (por exemplo, um mamífero; um paciente humano) (por exemplo, para o tratamento da doença de células falciformes).
[0031] Em um outro aspecto da presente descriçãodescrição en- contra-se um método para tratar uma hemoglobinopaia em um pacien- te (por exemplo, um paciente humano) com necessidade de tratamen-
to compreendendo (a) transduzir HSCs com um vetor de expressão lentiviral, onde o vetor de expressão lentiviral inclui uma primeira se- quência de ácidos nucleicos codificando um sShRNA anti-HPRT ou um ShRNA anti-HPRT embutido em um micro-RNA; e uma segunda se- quência de ácidos nucleicos codificando um gene de gama globina; e (b) transplantar as HSCs transduzidas no paciente. Em algumas mo- dalidades, sa HSCs são autólogas ou alogênicas. Em algumas moda- lidades, o ShRNA anti-HPRT tem uma sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 30 ou 31. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando o gene de gama globina tem uma sequência de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, o paciente é previamente tratado com condicionamento mieloablativo antes do transplante das HSCs transduzidas (por exemplo, tal como um análogo de purina, incluindo 6-tioguanina ("6TG"); com um agente quimioterapêutico; com radiação; com um conjugado de anticorpo-droga, tal como aqueles descritos na Publicação de Patente US Nº 2017/0360954 e 2018/0147294, e na Publicação PCT Nº WO/2017/219025 e WO/2017/219029, cujas ínte- gras estão aqui incorporadas a título de referência). Em algumas mo- dalidades, as HSCs transduzidas são selecionadas in vivo subsequen- te ao transplante (por exemplo, tal como com 6TG). Em algumas mo- dalidades, metotrexato ("MTX") ou ácido micofenólico ("MPA") são administrados para melhorar quaisquer efeitos colaterais do transplan- te das HSCs transduzidas (por exemplo, doença do enxerto versus hospedeiro).
[0032] Acredita-se que com uma estratégia de condicionamento e quimiosseleção combinados (tal como com um análogo de purina), se- ja possível obter enxertia eficiente e elevada de células-tronco hema- topoiéticas contendo o gene de gama globina deficiente em HPRT, e acredita-se que esta enxertia elevada possa ser realizada com baixa toxicidade geral. Acredita-se que a enxertia melhorada e a quimiosse-
leção das HSCs de genes modificados, combinadas com a expressão específica para a linhagem do gene de gama globina, podem resultar em uma frequência suficiente de células sanguíneas vermelhas ex- pressando o transgene de gama globina terapêutico, tornando possível a formação de níveis mais altos de hemoglobina fetal para corrigir a SCD e/ou a beta talassemia. Como medida de segurança, células de- ficientes em HPRT podem serl selecionadas negativamente, tal como por introdução de MTX ou MPA, para inibir a enzima di-hidrofolato re- dutase (DHFR) na via sintética de novo da purina, eliminando assim as células deficientes em HPRT.
[0033] Acredita-se ainda que HSCs deficientes em HPRT possam ser selecionadas in vivo por meio de um esquema de um análogo de purina (por exemplo, 6TG) para melhorar a enxertia. Acredita-se ainda que as HSCs de genes modificados expandidas possam diferenciar-se em eritrócitos expressando o transgene de gama globina terapêutico. As composições de terapia genética descritas neste pedido têm o po- tencial não apenas de corrigir SCD e beta talassemia, como também melhoram bastante os atuais "padrões ouro" para transplante de célu- las-tronco hematopoiéticas autólogas. Os melhoramentos podem tor- nar possíveis (i) procedimentos ambulatoriais usando as HSCs de ge- nes modificados; (ii) poucos eventos adversos (AEs), incluindo evitar a infertilidade associada a outras terapias clínicas; (ii) administração oral de doses baixas para condicionamento (em comparação com o condi- cionamento IV com doses altas); (iv) seleção in vivo de células de ge- nes modificados; e/ou (v) baixo índice de mortalidade durante o proce- dimento em relação ao transplante e condicionamento. Breve Descrição das Figuras
[0034] As FIGURAS 1A e 1B apresenta representações esquemá- ticas de um vetor de expressão de acordo com certas modalidades da presente invenção.
[0035] A FIG. 2 apresenta um fluxograma ilustrando métodos para tratar um indivíduo com HSCs transduzidas, incluindo as etapas de condicionamento e quimiosseleção de acordo com certas modalidades da presente invenção.
[0036] A FIG. 3 ilustra a via de salvamento da purina.
[0037] A FIG. 4 ilustra a via de novo para a síntese de dTTP.
[0038] A FIG. 5 ilustra um processo para seleção de células defici- entes em HPRT na presença de 6TG.
[0039] A FIG. 6 apresenta um mapa de vetores de TL20c- 7SKYN'/sh734-rGbGY.
[0040] A FIG. 7 apresenta um mapa de vetores de TL20c- 7SK/sh734-rGbGY,
[0041] A FIG. 8 apresenta um mapa de vetores de TL20c- r7SKY'/sh734-rGbGY.
[0042] A FIG. 9 apresenta um mapa de vetores de TL20c- r7SK/sh734-rGbGY,
[0043] A FIG. 10 apresenta um mapa de vetores de TL20c-rGbGY- 7SKY!/sh734.
[0044] A FIG. 11 apresenta um mapa de vetores de TL20c- rGbGM-7SK/sh734.
[0045] A FIG. 12 apresenta um mapa de vetores de TL20c-rGbGY- r7SK"Y'/sh734.
[0046] A FIG. 13 apresenta um mapa de vetores de TL20c-rGbGY- r7SK/sh734.
[0047] A FIG. 14 apresenta um mapa de vetores de TL20c-rGbGY,
[0048] A FIG. 15 apresenta um mapa de vetores de TL20d- 7SKY!/sh734-rGbGM,
[0049] A FIG. 16 apresenta um mapa de vetores de TL20d- 7SK/sh734-rGbGY.
[0050] A FIG. 17 apresenta um mapa de vetores de TL20d-
r7SKY'/sh734-rGbGMY,
[0051] A FIG. 18 apresenta um mapa de vetores de TL20d- r7SK/sh734-rGbGY,
[0052] A FIG. 19 apresenta um mapa de vetores de TL20d-rGbGY,
[0053] A FIG. 20 apresenta um mapa de vetores de TL20d-rGbGY- 7SKYN'/sh734.
[0054] A FIG. 21 apresenta um mapa de vetores de TL20d-GbGY- 7SKIsh734.
[0055] A FIG. 22 apresenta um mapa de vetores de TL20d-rGbGY- r7SKY/sh734.
[0056] A FIG. 23 apresenta um mapa de vetores de TL20d-rGbGY- r7SK/sh734.
[0057] A FIG. 24 apresenta um esquema para ShRNAs baseados em micro-RNA induzidos por EF1a para nocaute de HPRT.
[0058] As FIGURAS 25A e 25B ilustram a seleção 6TG de K562 transfectadas transitoriamente com sh734, construtos de miRNA RNA distibuídos em nanocápsulas. 1x10º células K562 foram incubadas com nanocápsulas de EF1a-GFP/EF1a-sh734-3G/ EF1ia-sh211-3G I7sk-sh734 (200 ng de DNA) por 4 horas. 6TG foi adicionado ao meio de cultura até a concentração final de 1 UM no dia 2. A FIG. 25A ilustra a expressão de GFP de células K562 transfectadas com nanocápsulas de EF1a-GFP medida no dia 3. A FIG. 25B ilustra o número de células vivas usando TC10 nos dias 5 e 7.
[0059] A FIG. 26 apresenta um esquema de ShRNAs baseados em micro-RNA induzidos por EF1a com braço de homologia para jun- ção na região CCR5.
[0060] As FIGURAS 27A, 27B, e 27C ilustram a coloração com FAC de células K562 de controle para HPRT: não coloridas (FIG. 27A), células positivas para HPRT (FIG. 27B), e células K562 com jun- ção do locos de EF1a-sh211-3G nos locos de CCR5 (FIG. 27C). As portas mostram frequências de células que são negativas para HPRT. A FIG. 27A mostra que cerca de 99,6% das células não expressam HPRT. Em um controle, 100% das células não transduzidas (FIG. 27B) são de coloração positiva para expressão de HPRT.
[0061] A FIG. 28 ilustra um sh734 embutido na estrutura de miR- NA-3G, um cadafalso de miRNA de terceira geração derivado da es- trutura 16-2 de miRNA nativo (vide também SEQ ID NO: 26).
[0062] A FIG. 29 ilustra o sh211 embutido na estrutura de miRNA- 3G, um cadafalso de miRNA de 3º geração derivado da estrutura 16-2 de miRNA nativo (vide também SEQ ID NO: 25).
[0063] A FIG. 30A ilustra a estrutura secundária e os sítios de cli- vagem primários teóricos de DICER (setas) de sh734 (vide também SEQ ID NO: 30). A estrutura secundária tem um valor de MFE de cer- ca de -30.9kcal/mol.
[0064] A FIG. 30B ilustra uma versão modificada de sh734 (sh734.1) (vide também SEQ ID NO: 31). A estrutura secundária tem um valor de MFE igual a -36.16 Kkcal/mol.
[0065] A FIG. 31A ilustra a estrutura secundária do RNA structure e a energia livre mínima (ÕG) para sh211 (vide também SEQ ID NO: 28).
[0066] A FIG. 31B a estrutura secundária do RNA structure e a energia livre mínima (ÔG) para sh616 (vide também SEQ ID NO: 27).
[0067] A FIG 32A ilustra o desenho de novo de um miRNA734 arti- ficial (111nt). Os sítios alvos de 5' e 3! DROSHA e os sítios de corte de 5' e 3' Dicer estão indicados pelas setas na estrutura secundária do MIRNA 211 (vide também SEQ ID NO: 23).
[0068] A FIG. 32B ilustra o desenho de novo de um mIiRNA211 artificial (111nt) (vide também SEQ ID NO: 24).
[0069] A FIG. 33 ilustra a estrutura secundária de Ago-sh734 (mi- metizando a estrutura do miRNA451 humano) (vide também SEQ ID
NO: 58).
[0070] A FIG. 34 apresenta um fluxograma ilustrando um processo de quatro etapas para desenho de RNAi, escolha e estrutura do pro- motor, testes funcionais e avaliação da segurança. Em algumas moda- lidades, são usados algoritmos de desenho de siRNA para obter can- didatos de alvo de sShRNA target. Subsequentemente, um sistema de expressão de shRNA diferente com promotores diferentes (Pol Ill ou Pol 1I) e diferentes desenhos de shRNA (shRNA, miRNA de 3º genera- ção, miRNA de novo e Ago-shRNA dicer-independente) são desenha- dos e sintetizados para testes funcionais e estudos de segurança. Os testes funcionais são realizados pela medição do derrubamento de HPRT e seleção com 6-TG em linhagens celulares transduzidas. A vi- abilidade celular e a expressão de miRNA são analisados para avalia- ção da segurança. Testes pré-clínicos e estudos de segurança são realizados em células primárias in vitro incluindo células-tronco hema- topoiéticas e células progenitoras, e linhagens celulares consolidadas e in vivo em modelos de primatas murinos e não humanos.
[0071] A FIG. 35 ilustra mutações no promotor 7sk humano. Estão ilustradas as mutações (setas) e deleções introduzidas nos elementos do melhorador de sequência cis-distal (DSE) e nos elementos do me- lhorador de sequência proximal (PSE) (caixas compridas e largas) no promotor 7sk em relação à caixa TATA (caixas altas e finas).
[0072] A FIG. 36 ilustra a localização e a probabilidade de sítios de ligação de transcrição no promotor 7sk e ressalta os dois sítios de |i- gação do fator de transcrição de OCT mutados no melhorador de se- quência distal (DSE). Também estão mostrados os sítios de ligação previstos no promotor para os fatores de transcrição da linhagem de eritroide TAL-1 e GATA-1.
[0073] A FIG. 37 apresenta a provides hipoxantina fosforribosil- transferase 1 (HPRT1) de Homo sapiens de comprimento integral,
mMRNA NM 000194.2(SEQ ID NO: 59). A localização das sequência- alvo para os siRNA /sShRNA descritos estão em negrito na sequência de codificação do HPRT (texto sublinhado).
[0074] A FIG. 38 ilustra a estratégia de edição de genes CRISPR/Cas9 e sgRNA candidatos para derrubamento da expressão gênica de HPRT humano (vide SEQ ID NOS: 61 e 69).
[0075] A FIG. 39 apresenta a sequência de gama-globina híbrida sGbGY e ilustra as diferenças mostradas no texto em negrito e subli- nhado entre uma gama-globina endógena humana alinhada (vide SEQ ID NO: 55).
[0076] A FIG. 40A apresenta uma representação esquemática dos componentes do vetor pTL20c.
[0077] A FIG. 40B ilustta um mapa de vetores para o vetor pTL20c.
[0078] A FIG. 41 ilustra o transgene e sequências reguladoras re- levantes do vetor lentiviral SGbGY.
[0079] FIG. 42A apresenta uma representação esquemática dos pTL20c-sSGbGM vector.
[0080] A FIG. 42B ilustra um mapa de vetores para o vetor pTL20c-sSGbGM.
[0081] A FIG. 43A apresenta uma representação esquemática do vetor TL20c-rGbGM-7SK/sh734.
[0082] A FIG. 43B ilustra um mapa de vetores para o vetor TL20c- rGbGM-7SK/sh734.
[0083] A FIG. 44A ilustra que o estrutura de TL20 melhorou a efi- ciência de transdução de vetores lentivirais SIN pseudotipicados com VSV9.
[0084] A FIG. 44B apresenta os títulos médios obtidos a partir de sGbGY, pTL20c-sGbGM, e dos vetores TL20c-rGbGM-7SK/sh734.
[0085] A FIG. 45 apresenta a infectividade vetorial dos vetores sGbGY e the SGbGY-7SK/sh734.
[0086] A FIG. 46 ilustra a expressão equivalente de SGbGY e entre o monovetor (pTL20c-SGbGM) e o vetor dual (pTL20c-sGbGY- 7SKIsh734).
[0087] A FIG. 47 ilustra a expressão equivalente do transgene de Agama-globina em células K562 transduzidas com o vetor TL-20c- rGbGY ou com o vetor TL20c-rGbGM-7SK/sh734.
[0088] A FIG. 48 ilustra que a expressão do transgene sh7 perma- nece inalterada em células K562 durante a diferenciação de eritroides.
[0089] A FIG. 49A apresenta um gráfico indicando que células K562 tranduzidas com o monovetor GPbGM de controle negativo (TL20c-rGbGM) não apresentaram aumento no número de cópias do vetor durante o tratamento com 6TG.
[0090] A FIG. 49B apresenta um gráfico indicando que o construto repórter sh7 GFP de controle apresentou um aumento no número de cópias do vetor durante o tratamento com 6TG que estava associado à seleção positiva. Observou-se um declínico gradual no número de có- pias do vetor ao longo do tempo, apesar de a percentagem de células positivas para GFP ser mantida na cultura.
[0091] A FIG. 49C apresenta um gráfico indicando a cinética e a estabilidade da seleção 6TG de TL20c-rGbGM-7SK/sh734.
[0092] A FIG. 49D apresenta um gráfico mostrando que a junção do isolador cHS4 Ins-100 do vetor TL20c-rGbGM-7SK/sh734 apresen- ta cinética e estabilidade da seleção 6TG equiparáveis em compara- ção com o vetor TL20c-rGbGM-7SK/sh734. Isto indica que a junção- junção do isolador não afeta adversamente a expressão ou resulta no silenciamento do transgene sh7 no construto lentiviral.
[0093] A FIG. 49E apresenta um gráfico indicando a cinética e a estabilidade da seleção 6TG de TL20c-rGbGM-r7SK/sh734.
[0094] A FIG. 49F apresenta um gráfico indicando a cinética e a estabilidade da seleção 6TG de TL20c-rGbGM-r7SK/sh734.
[0095] A FIG. 49G apresenta um gráfico indicando a cinética e a estabilidade da seleção 6TG de TL20c-r7SK/sh734-rGbGM.
[0096] A FIG. 49H mostra a relação sh734 / HPRT como uma me- dida da eficiência de derrubamento.
[0097] A FIG. 49! ilustra que um vetor lentiviral sh7 de controle ex- pressando GFP apresentou um aumento acentuado nas células de genes modificados sh7 14 dias depois de tratamento com 6TG. No dia 21, as culturas de K562 traduzidas com o construto repórter sh7-GFP continham 35 % de células GFP+ e aumentaram para 88% de células GFP + no dia 42 depois de tratamento com 6TG. Estas descobertas sugerem que sh7 é constitutivamente expresso em células K562 transduzidas por mais de 3 meses em cultura em níveis suficientes para a supessão de HPRT e a resistência de 6TG sem evidências de silenciamento ou toxicidade. O importante é que a população de célu- las selecionada manteve a estabilidade proliferativa de longo prazo por mais de dois meses depois de descontinuada a pressão seletiva de 6TG.
[0098] A FIG. 49J ilustra a seleção in vitro de células K562 trans- duzidas com construtos repórter sh734-GFP. Para estabelecer uma prova do conceito para que células transduzidas LV expressem sh734 RNA e confiram resistência a 6TG, monitoramos o enriquecimento de células K562 GFP+ de genes modificados em culturas tratadas por 14 dias com 6TG (300nM). Os dois vetores com sh734 posicionado a montante do GFP em qualquer orientação para o cassete repórter de GFP na orientação senso apresentaram tempo acentuadamente mais rápido para enriquecimento de células de genes modificados em com- paração com culturas tranduzidas com vetores onde o sh734 foi posi- cionado a jusante do GFP. Nas células K562, o nível de expressão re- lativo de sh734 / %GFP estava correlacionado com um derrubamento eficiente de HPRT e rápida seleção de 6TG.
[0099] A FIG. 49K apresenta uma tabela mostrando dados adicio- nais correspondentes aos gráficos apresentados na FIG. 49J.
[0010] A FIG. 50 ilustra que células K562 transduzidas com TL20c- rGbGM-7SK/sh734 expressando sh7 infra-regulam de forma eficiente o HPRT e conferem estabilidade de longo prazo de células resistentes a 6-TG.
[0011] As FIGURAS 51A e 51B ilustram que células K562 transdu- zidas com o vetor TL20c-rGbGM-7SK/sh734 ou com um construto re- pórter do monovetor sh7-GFP apresenta níveis similares de expressão e cinética de sh7 do derrubamento de HPRT e seleção 6TG.
[0012] As FIGURAS 52A, 52B, e 52C ilustram uma cultura esten- dida de CD34* sob a seleção 6TG seguida por diferenciação de eri- troides.
[0013] A FIG. 53 ilustra construtos de uma pluralidade de vetores diferentes, ilustrando de forma comparativa as diferenças entre os componentes de cada um dos vetores.
LISTAGEM DE SEQUÊCNCIAS
[0014] As sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos apre- sentadas neste pedido estão mostradas por meio de abreviações de letra padrão para bases nucleotídicas, e pelo código de três letras para aminoácidos, conforme definido em 37 C.F.R. 1.822. A listagem de sequências foi aprsentada como um arquivo de texto ASCII, chamado "2018-07-16 Calimmune-051WO ST25.txt" criado em 16 de julho de 2018, 323KB, aqui incorporado a título de referência. Descrição Detalhada Definições
[0015] Também deve ficar entendido que, a menos que claramen- te indicado em contrário, em todos os métodos reivindicados neste pe- dido que incluem mais de uma etapa ou ação, a ordem das etapas ou ações do método não está necessariamente limitada à ordem em que as etapas ou ações do método estão apresentadas.
[0016] Conforme usado neste pedido, os termos no singular "um", "uma", e "o/a" incluem seus correspondentes no plural, a menos que claramente indicado em contrário pelo contexto. Similarmente, a pala- vra "ou" destina-se a incluir "e", a menos que claramente indicado em contrário pelo contexto.
[0017] Conforme usado neste pedido, no relatório descritivo e nas reivindicações, a expressão "pelo menos um", com referência a uma lista de um ou mais elementos, deve ser interpretada como pelo me- nos um elemento selecionado dentre um ou mais dos elementos na lista de elementos, mas não necessariamente incluindo pelo menos um de todo e qualquer elemento especificamente relacionado na lista de elementos e não excluindo quaisquer combinações de elementos na lista de elementos. Esta definição também permite que possam es- tar opcionalmente presentes elementos diferentes daqueles especifi- camente identificados na lista de elementos à qual a expressão "pelo menos" se refere, relacionados ou não relacionados com aqueles ele- mentos especificamente identificados. Assim sendo, como um exem- plo não limitativo, "pelo menos um A e B" (ou, de forma equivalente, "pelo menos um de A ou B", ou, de forma equivalente, pelo menos um de A e/ou B"), pode indicar, em uma modalidade, pelo menos um, op- cionalmente incluindo mais de um A sem a presença de B (e opcio- nalmente incluindo elementos diferentes de B); em uma outra modali- dade, pelo menos um, opcionalmente incluindo mais de um B, sem a presença de A (e opcionalmente incluindo elementos diferentes de A); em ainda uma outra modalidade, pelo menos um, opcionalmente inclu- indo mais de um A, e pelo menos um, opcionalmente incluindo mais de um B (e opcionalmente incluindo outros elementos); etc.
[0018] Os termos "compreendendo", "incluindo", "tendo", entre ou-
tros, são usados intercambiavelmente e têm o mesmo significado. De maneira similar, "compreende", "inclui", "tem", entre outros, são usa- dos intercambiavelmente e têm o mesmo significado. Especificamente, cada termo é definido de forma consistente com a definição da legisla- ção patentária norte-americana de "compreendendo" e é, portanto, in- terpretado como um termo aberto significando "pelo menos os seguin- tes", e também é interpretado como não excludente de características, limitações, aspectos adicionais, etc. Dessa forma, por exemplo, "um dispositivo tendo os componentes a, b, e c" significa que o dispositivo inclui pelo menos os componentes a, b e c. De maneira similar, a ex- pressão: "um método envolvendo as etapas a, b, e c" significa que o método inclui pelo menos as etapas a, b, e c. Além disso, embora as etapas e processos possam estar apresentados neste pedido em uma ordem particular, um especialista na técnica vai perceber que a ordem das etapas e dos processos pode variar.
[0019] Conforme usado neste pedido, no relatório descritivo e nas reivindicações, "ou" deve ser interpretado como tendo o mesmo signi- ficado que "e/ou" como definido acima. Por exemplo, quando separan- do os itens de uma lista, "ou" ou "e/ou" devem ser interpretados como inclusivos, i.e., a inclusão de pelo menos um, porém incluindo também mais de um, de um número ou lista de elementos, e, opcionalmente, itens adicionais não listados. Somente os termos nitidamente indica- dos em contrário, tais como "somente um de" ou "exatamente um de", ou, quando usado nas reivindicações, "consistindo em", referir-se-ão à inclusão de exatamente um elemento de um número ou lista de ele- mentos. Em geral, o termo "ou", conforme usado neste pedido, deve ser interpretado apenas como indicando alternativas exclusivas (i.e., "um ou o outro, mas não ambos") quando precedido por termos de ex- clusivdade, tais como "ou um", "um de", "apenas um de" ou "exata- mente um de". "Consistindo essencialmente em", quando usado nas reivindicações, deve ter seu significado comum usado na área da le- gislação patentária.
[0020] Conforme usado neste pedido, os termos "administrar" ou "administrando" significa oferecer uma composição, formulação, ou agente específico a um indivíduo (por exemplo, um paciente humano, com necessidade de tratamento, incluindo aqueles descritos neste pe- dido.
[0021] Conforme usado neste pedido, os termos "transplante de células hematopoiéticas" ou "transplantação de células hematopoiéti- cas" referem-se a transplante de medula óssea, transplante de células- tronco de sangue periférico, transplante de sangue da veia umbilical, ou de qualquer outra fonte de células-tronco hematopoiéticas pluripo- tentes. Da mesma forma, os termos "transplante de células-tronco", ou "transplante", refere-se a uma composição compreendendo células- tronco que estão em contato com (por exemplo, suspendidas em) um veículo farmaceuticamente aceitável. Estas composições podem ad- ministradas a um indivíduo através de um cateter.
[0022] Conforme usado neste pedido, o termo "ácido nucleico fun- cional" refere-se a moléculas com capacidade de reduzir a expressão de uma proteína ao interagir diretamente com um transcrito que codifi- ca a proteína. Moléculas de siRNA, ribozimas e ácidos nucleicos antis- senso constituem ácidos nucleicos funcionais exemplificativos.
[0023] Conforme usado neste pedido, o termo "gene" refere-se, de modo amplo, a qualquer segmento de DNA associado a uma função biológica. Um gene abrange sequências incluindo, porém sem limita- ção, uma sequência codificadora, uma região promotora, uma sequên- cia cis-reguladora, um segmento de DNA não expresso é uma se- quência de reconhecimento específica para proteínsa reguladoras, segmento de DNA não expresso que contribui para a expressão gêni- ca, segmento de DNA desenhado para ter os parâmetros desejados,
ou combinações dos mesmos.
[0024] Conforme usado neste pedido, o termo "silenciamento gê- nico" descreve a infra-regulação, o derrubamento, a degradação, a ini- bição, a supressão, a repressão, a prevenção, ou a expressão reduzi- da de um gene, transcrito e/ou produto polipeptídico. Silenciamento e interferência gênicos também descrevem a prevenção da translação de transcritos de MRNA para um polipeptídio. Em algumas modalida- des, a translação é prevenida, inibida, ou reduzida pela degradação de transcritos de MRNA ou bloqueio da translação de MRNA.
[0025] Conforme usado neste pedido, o termo "expressão gênica" refere-se aos processos celulares por meio dos quais um polipeptídio biologicamente ativo é produzido a partir de uma sequência de DNA.
[0026] Conforme usado neste pedido, "HPRT" é uma enzima en- volvida no metabolismo da purina codificada pelo gene HPRT1. O HPRT1 fica localizado no cromossoma X, e, portanto, está presente em uma única cópia nos homens. O HPRT1 codifica a transferase que catalisa a conversão de hipoxantina em inosina monofosfato e de gua- nina em guanosina monofosfato ao transferir o grupo 5-fosforobosil de B-fosforibosil 1-pirofosfato para a purina. A enzima funciona principal- mente para salvar as purinas do DNA degradado para uso na síntese de purina renovada (vide também FIG. 37).
[0027] Conforme usado neste pedido, o termo "lentivírus" refere-se a um gênero de retrovírus que são capazes de infectar células em di- visão e não em divisão. Vários exemplos de lentivírus incluem HIV (ví- rus da imunodeficiência humana: incluindo HIV tipo 1, e HIV tipo 2), o agente etiológico da síndrome da imunodeficiência adquirida humana (AIDS); visna-maedi, que causa encefalite (visna) ou pneumonia (ma- edi) em carneiros, o vírus da artrite-encefalite caprina, que causa defi- ciência imunológica, artrite, e encefalopatia em cabras; vírus da ane- mia infecciosa equina, que causa anemia hemolítico autoimune, e en-
cefalopatia em cavalos; vírus da imunodeficiência felina (FIV), que causa deficiência imunológica em gatos; vírus da imunodeficiência bo- vina (BIV), que causa linfadenopatia, linfocitose, e possivelmente in- fecção no sistema nervoso central no gado bovino; e vírus da imuno- deficiência símia (SIV), que causa imunodeficiência e encefalopatia em primatas sub-humanos.
[0028] Conforme usado neste pedido, o termo "vetor lentiviral" é usado para designar qualquer forma de um ácido nucleico derivado de um lentivírus e usado para transferir material genético para uma célula via transduçãon. O termo abrange ácidos nucleicos vetores lentivirais, tais como DNA e RNA, formas encapsuladas desses ácidos nucleicos, e partículas virais nas quais os ácidos nucleicos vetores lentivirais fo- ram acondicionados.
[0029] Conforme usado neste pedido, os termos "derrubar" ou "derrubamento", quando usado em relação a um efeito do RNAi na ex- pressão gênica, significa que o nível de expressão gênica é inibido, ou é reduzido para um nível abaixo daquele geralmente observado quan- do examinado substancialmente nas mesmas condições, porém na ausência de RNAi.
[0030] Conforme usado neste pedido, o termo "reposição" refere- se à substituição de material genético endógeno (por exemplo, um ge- ne ou uma parte de um gene) por material genético exógeno (i.e., um ácido nucleico recombinante). O termo "reposição", conforme usado neste pedido, também inclui alterações de material genético pela intro- dução de uma ou mais cópias adicionais do ácido nucleico recombi- nante, com ou sem substituição do gene endógeno.
[0031] Conforme usado neste pedido, o termo "nocaute" refere-se à supressão parcial ou total da expressão de um gene endógeno. Isto geralmente é feito por deleção de uma parte do gene ou substituição de uma parte por uma segunda sequência, mas também pode ser causado por outras modificações feitas no gene tais como a introdução de códons de terminação, a mutação de aminoácidos críticos, a remo- ção de uma junção de íntrons etc. Por conseguinte, um construto de "nocaute" é uma sequência de ácidos nucleicos, tal como um construto de DNA, que, quando introduzido em uma célula, resulta na supressão (parcial ou total) da expressão de um polipeptídio ou proteína codifica- da pelo DNA endógeno na célula. Em algumas modalidades, um "no- caute" inclui mutações tais como uma mutação pontual, uma inserção, uma deleção, um deslocamento, ou uma mutação missense.
[0032] Conforme usado neste pedido, o termo "minicélula" refere- se a formas anucleadas de células bacterianas, produzidas por uma perturbação na coordenação, durante a fissão binária, da divisão celu- lar com segregação de DNA. As minicélulas distinguem-se de outras vesículas pequenas que são geradas e liberadas espontaneamente em determinadas situações, e ao contrário das minicélulas, não se de- vem a rearranjos genéticos específicos ou à expressão de genes epis- sômicos. As minicélulas da presente invenção são formas anucleadas de células de E. coli ou de outras células bacterianas, produzidas por uma perturbação na coordenação, durante a fissão binária, da divisão celular com segregação de DNA. A replicação cromossômica procarió- tica está vinculada à fissão binária normal, que envolve a formação de septos no meio das células. Em E. coli, por exemplo, uma mutação nos genes min, tal como minCD, pode remover a inibição da formação de septos nos polos das células durante a divisão celular, resultando na produção de uma célula-filha normal e uma minicélula anucleada. Vide de Boer et al., 1992; Raskin & de Boer, 1999; Hu & Lutkenhaus, 1999; Harry, 2001. As minicélulas distinguem-se de outras vesículas pequenas que são geradas e liberadas espontaneamente em determi- nadas situações, e ao contrário das minicélulas, não se devem a rear- ranjos genéticos específicos ou à expressão de genes epissômicos.
Para realização da presente descrição, é desejável que as minicélulas tenham paredes celulares intactas ("minicélulas intactas"). Além das mutações no óperon min, também são produzidas micelas anucleadas subsequente a uma gama de outros rearranjos ou mutações genéticas que afetam a formação de septos, por exemplo, na diviVB1 em B. sub- tilis. Vide Reeve e Cornett, 1975; Levin et al., 1992. Minicélulas tam- bém podem se formar subsequente a uma perturbação nos níveis de expressão gênica das proteínas envolvidas na divisão celu- lar/segregação cromossômica. Por exemplo, a superexpressão de mi- nE leva à divisão polar e à produção de minicélulas. De maneira simi- lar, minicélulas com menos cromossomas podem resultar de defeitos na segregação cromossômica, por exemplo, a mutação smc em Baci- Ilus subtilis (Britton et al., 1998), a deleção de spoOJ em B. subitilis (Ireton et al., 1994), a mutação mukB em E. coli (Hiraga et al., 1989), e a mutação parC em E. coli (Stewart e D'Ari, 1992). Os produtos gêni- cos podem ser fornecidos em trans. Quando superexpressos a partir um plasmídio com grande número de cópias, por exemplo, CafA po- dem aumentar a taxa de divisão celular e/ou inibir a distribuição cro- mossômica depois da replicação (Okada et al., 1994), resultando na formação de células em série e micelas anucleadas (Wachi et al., 1989; Okada et al., 1993). Minicells can be prepared from any bacterial cell of Gram-positive or Gram-negative origin.
[0033] Conforme usado neste pedido, o termo "mutado" refere-se a uma alteração em uma sequência, tal como uma sequência de nu- cleotídeos ou de aminoácidos, de uma versão nativa, do tipo selva- gem, padrão ou de referência da respectiva sequência, i.e., a sequên- cia não mutada. Um gene mutado pode resultar em um produto gênico mutado. Um produto gênico mutado diferente do produto gênico não mutado por um ou mais resíduos aminoacídicos. Em algumas modali- dades, um gene mutado que resulta em um produto gênico mutado pode ter uma identidade de sequência de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou mais com a sequência de nucleotídeos não mutada corres- pondente.
[0034] Conforme usado neste pedido, o termo "operacionalmente ligado" refere-se à ligação funcional entre uma sequência de controle da expressão de ácidos nucleicos (tal como um promoter, uma se- quência sinal, um melhorador ou conjunto de sítios de ligação ao fator de transcrição) e uma segunda sequência de ácidos nucleicos, onde a sequência de controle de expressão afeta a transcrição e/ou transla- ção do ácido nucleico correspondente à segunda sequência quando as moléculas apropriadas (por exemplo, proteínas ativadoras transcricio- nais) são ligadas à sequência de controle de expressão.
[0035] Conforme usado neste pedido, o termo "retrovírus" refere- se a vírus tendo o genoma de um RNA que é transcrito reversamente pela transcriptase reversa retroviral em uma cópia de cDNA que é in- tegrada no genoma da célula hospedeira. Vetores retrovirais e méto- dos para fazer vetores retrovirais são conhecidos na literatura. Em re- sumo, para construir um vetor retroviral, um ácido nucleico codificando um gene de interesse é inserido no genoma viral no lugar de determi- nar sequências virais para produzir um vírus que tem a replicação de- feituosa. Para produzir vírions, constrói-se uma linhagem de células de acondicionamento contendo os genes gag, pol, e env, porém sem as LTR e os componentes de acondicionamento (Mann et al., Cell, Vol. 33:153-159, 1983). Quando um plasmídio recombinante contendo um cCDNA, junto com as LTR retrovirais e as sequências de acondiciona- mento, é introduzido nessa linhagem celular, a sequência de acondici- onamento permite que o transcrito de RNA do plasmídio recombinante seja acondicionado em partículas virais, que são então secretadas no meio de cultura. O meio contendo os retrovírus recombinantes é então coletado, opcionalmente concentrado, e usado para transferência de genes.
[0036] Conforme usado neste pedido, os termos "RNA tipo grampo de cabelo pequeno" ou "shRNA" referem-se a moléculas de RNA compreendendo uma região antissenso, uma porção de alça e uma região senso, onde a região senso possui nucleotídeos complementa- es que formam pares de bases com a região antissenso para formar uma haste dúplex. Subsequente à pós-transcrição
[0037] Conforme usado neste pedido, o termo "indivíduo" refere-se a um mamífero tal como um ser humano, um camundongo ou um pri- mata. Tipicamente, o mamífero é um ser humano (homo sapiens).
[0038] Conforme usado neste pedido, o termo "gene terapêutico" refere-se a um gene que pode ser administrado a um indivíduo com a finalidade de tratar ou prevenir uma doença.
[0039] Conforme usado neste pedido, os termos "transduzir" ou "transdução" refere-se à distribuição de um gene(s) usando um vetor viral ou retroviral por meio de infecção, e não de transfecção. Por exemplo, um gene anti-HPRT transportado por um vetor retroviral (um retrovírus modificando usado como um vetor para introdução de ácido nucleico em células) pode ser transduzido em uma célula através de infecção e integração de provírus. Assim, um "gene transduzido" é um gene que fora introduzido na célula via infecção lentiviral ou vetorial e integração de provírus. Vetores virais (por exemplo, "vetores de trans- dução") transduzem genes para "células avo" ou células hospedeiras.
[0040] Conforme usado neste pedido, os termos "tratamento", "tra- tando", ou "tratar", em relação a uma condição específica, referem-se à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de pevenir completamente ou parcialmente uma doença ou um sintoma da mesma e/ou pode ser te- rapêutico em termos de uma cura parcial ou total de uma doença e/ou um efeito adverso atribuível à doença. "Tratamento", conforme usado neste pedido, cobre qualquer tratamento de uma doença em um indi- víduo, particularmente em um ser humano, e inclui: (a) prevenir a ocor- rência da doença em um indivíduo que possa ser pré-disposto à doen- ça, mas que ainda não fora diagnosticado como tendo a doença; (b) inibir a doença, i.e., interromper seu desenvolvimento; e (c) aliviar a doença, i.e., causar a regressão da doença e/ou aliviar um ou mais sintomas da doença. "Tratamento" também abrange a distribuição de um agente ou a administração de uma terapia com a finalidade de proporcionar um efeito farmacológico, mesmo na ausência de uma do- ença ou condição. O termo "tratamento" é usado em algumas modali- dades para indicar a administração de um composto da presente in- venção para mitigar uma doença ou um distúrbio em um hospedeiro, de preferência em um indivíduo mamífero, mais preferivelmente em seres humanos. Dessa forma, o termo "tratamento" inclui: prevenção da ocorrência de um distúrbio em um hospedeiro, particularmente quando o hospedeiro tem pré-disposição de adquirir a doença, mais ainda não fora diagnosticado com a doença; inibição do distúrbio; e/ou alívio ou reversão do distúrbio. Visto que os métodos da presente in- venção estão voltados para a prevenção de distúrbios, fica entendido que o termo "prevenir" não exige que a doença seja totalmente preve- nida. Ao contrário, conforme usado neste pedido, o termo prevenir re- fere-se à habilidade do especialista na técnica em identificar uma po- pulação que seja suscetível a distúrbios, de modo que a administração dos compostos da presente invenção pode ocorrer antes da manifes- tação de uma doença. O termo não significa que a doença pode ser totalmente evitada.
[0041] Conforme usado neste pedido, o termo "vetor" refere-se a uma molécula ácido nucleico capaz de mediar a entrada de, por exemplo, transferência, transporte etc., de uma outra molécula de áci- do nucleico em uma célula. O ácido nucleico transferido geralmente é ligado à, por exemplo, inserido na, molécula de ácido nucleico vetor. Um vetor pode incluir sequências que direcionam a replicação autô- noma ou pode incluir sequências suficientes para permitir a integração no DNA da célula hospedeira. Como ficará evidente para um especia- lista na técnica, vetores virais podem incluir vários componentes virais, além dos ácidos nucleicos, que medeiam a entrada do ácido nucleico transferido. Numerosos vetores já são conhecidos na literatura e inclu- em, porém sem limitação, polinucleotídeos lineares, polinucleotídeos associados a compostos iônicos ou anfifílicos, plasmídios, e vetores virais. Exemplos de vetores virais incluem, porém sem limitação, veto- res adenovirais, vetores de vírus adeno-associado, vetores retrovirais (incluindo vetores lentivirais), entre outros.
VETORES DE EXPRESSÃO
[0042] A presente invenção apresenta, em algumas modalidades, vetores de expressão (por exemplo, vetores de expressão lentivirais) incluindo pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos para ex- pressão. Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucleicos codificam uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, RNA, mRNA) (por exemplo, uma molécula que pode ser encontrada no citoplasma de uma célula, por exemplo, uma célula hospedeira). Em algumas mo- dalidades, os vetores de expressão incluem uma primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um agente desenhado para derrubar o gene de HPRT ou de alguma efetuar uma redução na expressão de HPRT. Em algumas modalidades, os vetores de expressão incluem um segundo ácido nucleico codificando um gene terapêutico (por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos codificando um gene de gama globina ou um gene de gama globina mutado).
[0043] Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor lentiviral auto-inativante. Em outras modalidades, o vetor de expres- são é um vetor retroviral. Um genoma lentiviral geralmente é organiza-
do em uma repetição terminal longa (LTR) 5', o gene gag, o gene po- limerização, o gene env, os genes acessórios (nef, vif, vpr, vpu) e uma LTR 3'. A LTR viral é dividida em três regiões chamadas U3, Re U5. A região U3 contém os elementos melhoradors e promotores. A região UB5 contém os sinais de poliadenilação. A região R (repetição) separa as regiões U3 e U5 e as sequências transcritas da região R aparecem tanto na extremidade 5' quanto na extremidade 3' do RNA viral. Vide, por exemplo, "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)); O Narayan and Clements (1989) J. Gen. Virology, Vol. 70:1617-1639; Fields et al. (1990) Fundamental Virology Raven Press.; Miyoshi H, Blamer U, Takahashi M, Gage F H, Verma | M. (1998) J Virol., Vol. 72(10):8150 7, e Patente US Nº 6,013,516. Exemplos de vetores lentivirais que já foram usados para infectarr HSCs estão descritos nas publicações que se seguem, cada uma delas estando aqui incorporada em uma sua íntegra a título de referência: Evans et al., Hum Gene Ther., Vol. 10:1479-1489, 1999; Case et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 96:2988-2993, 1999; Uchida et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 95:11939-11944, 1998; Miyoshi et al., Science, Vol. 283:682-686, 1999; e Sutton et al., J. Virol., Vol. 72:5781-5788, 1998.
[0044] Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um lenti- vírus modificado, e, portanto, capaz de infectar tanto células em divi- são quanto células não em divisão. Em algumas modalidades, o ge- noma lentiviral modificado não possui genes para as proteínas lentivi- rais necessárias para replicação viral, prevenindo assim a replicação indesejada, tal como replicação nas células alvo. Em algumas modali- dades, as proteínas necessárias para replicação do genoma modifica- do são apresentadas em trans na linhagem de células de acondicio- namento durante a produção do retrovírus ou lentivírus recombinante.
[0045] Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreen-
de sequências das repetições terminais longas (LTRs) 5' e 3' de um lentivius. Em algumas modalidades, o vetor compreende as sequên- cias de R e US5 da LTR 5' de um lentivírus e uma LTR 3' inativada ou autoinativante de um lentivírus. Em algumas modalidades, as sequên- cias de LTR são sequências de LTR de HIV.
[0046] Componentes adicionais de um vetor de expressão lentivi- ral (e métodos de síntese e/ou produção de tais vetores) estão revela- dos na Publicação do Pedido de Patente US Nº 2018/0112220, cuja íntegra encontra-se aqui incorporada a título de referência. Agentes para derrubar o gene de HPRT ou diminuir sua expressão
[0047] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o agente desenhado para derrubar o gene de HPRT ou de alguma forma efetuar uma redução em sua expressão é um agente RNAi. Em algumas modalidades, o agente RNAi é um shRNA, um mi- cro-RNA, ou um hídrido do mesmo. Em outras modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos codificando o agente desenhado para der- rubar o gene de HPRT ou de alguma forma efetuar uma redução em sua expressão é um agente diferente de um RNAi, tal como um RNA antissenso, ou um oligonucleotídeo antissenso. Tanto agentes RNAi quanto agentes diferentes de RNAi estão descritos neste pedido. RNAi
[0048] Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreen- de uma primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um agente de interferência de RNA (RNAi). Interferência de RNA é uma aborda- gem de silenciamento pós-transcricional da expressão gênica pelo de- sencadeamento da degradação de transcritos homólogos através de um complexo processo enzimático de múltiplas etapas, por exemplo, um processo envolvendo RNA intereferente pequeno (siRNA) de fila- mento duplo sequência-específico. Um modelo simplificado para a via de RNAi baseia-se em duas etapas, cada uma delas envolvendo uma enzima ribonuclease. Na primeira etapa, o RNA desencadeador (ou um transcrito primáriao de dsRNA ou de miRNA) é processado em um RNA interferente curto (siRNA) pelas enzimas RNase || Dicer e Drosha. Na segunda etapa, siRNAs são carregados no complexo de silenciamento induzido pelo RNA do complexo efetor (RISC). O siRNA é desenrolado durante a montagem do RISC e o RNA de filamento simples hibridiza com o alvo do MRNA. Acredita-se que o silenciamen- to gênico seja um resultado da degradação nucleolítica do MRNA alvo pela enzima RNase H Argonaute (Slicer). Se o dúplex siRNA/MRNA contiver malpareamentos, o MRNA não será clivado. Em vez disso, o silenciamento gênico é resultado da inibição de translação.
[0049] Em algumas modalidades, o agente RNAi é um ácido nu- cleico inibitório ou silenciador. Conforme usado neste pedido, um "áci- do nucleico silenciador" refere-se a qualquer polinucleotídeo que seja capaz de interagir com uma sequência específica para inibir a expres- são gênica. Exemplos de ácidos nucleicos silenciadores incluem dú- plexes de RNA (por exemplo, siRNA, shRNA), ácidos nucleicos entre- laçados ("LNAs"), RNA antissenso, polinucleotídeos de DNA que codi- ficam sequências senso e/ou antissenso do siRNA ou shRNA, DNAzymses, ou ribozimas. O especialista na técnica vai perceber que a inibição de expressão gênica não tem que ser necessariamente ex- pressão gênica a partir de uma sequência específica citada, e pode ser, por exemplo, a expressão gênica a partir de uma sequência con- trolada por aquela sequência específica.
[0050] Embora o agente RNAi possa ser distribuído e expresso via um vetor de expressão, também é possível que o agente RNAi seja distribuído diretamente por meio do uso de uma nanocápsula adequa- da ou outro sistema de distribuição não viral, como descrito mais adi- ante neste relatório descritivo. Por exemplo, um siRNA ou miRNA po- de ser "acondicionado" em uma nanocápsula e distribuído diretamente,
como mencionado neste pedido.
[0051] Métodos para construção de RNAs interferentes são co- nhecidos na literatura. Por exemplo, o RNA interferente pode ser mon- tado a partir de dois oligonucleotídeos separados, onde um filamento é o filamento senso e o outro é o filamento antissenso, onde os filamen- tos antissenso e senso são autocomplementares (i.e., cada filamento compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleotídeos no outro filamento; tal como onde o fila- mento antissenso e o filamento senso formam um dúplex ou uma es- trutura de filamento duplo); o filamento antissenso compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico alvo ou a uma parte da mesma (i.e., um gene indesejado) e o filamento senso compreende uma sequência de nucleotídeos correspondente à sequência de ácidos nucleicos alvo ou a uma parte da mesma. Alternativamente, o RNA interferente pode ser montado a partir de um único oligonucleotídeo, onde as regiões senso e antissenso autocomplementares são ligadas por meio de ligadores à base de ácidos nucleicos ou não à base de ácidos nucleicos). O RNA interferente pode ser um polinucleotídeo com uma estrutura secundária dúplex, dúplex assimétrica, tipo grampo de cabelo ou tipo grampo de cabelo assimétrica, tendo regiões senso e antissenso autocomplementares, onde a região antissenso region compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico alvo separada ou uma parte da mesma, e a região senso tem uma sequên- cia de nucleotídeos correspondente à sequência de ácidos nucleicos alvo ou a uma parte da mesma. O RNA interferente pode ser um poli- nucleotídeo de codão simples circular tendo duas ou mais estruturas de alça e uma haste compreendendo regiões senso e antissenso au- tocomplementares, onde a região antissenso compreende uma se-
quência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleo- tídeos em uma molécula de ácido nucleico alvo ou em uma parte da mesma, e a região senso tem uma sequência de nucleotídeos corres- pondente à sequências de ácidos nucleicos alvo ou a uma parte da mesma, e onde o polinucleotídeo circular pode ser processado seja in vivo ou in vitro para gerar uma molécula de siRNA ativa capaz de me- diar a interferência de RNA.
[0052] Em algumas modalidades, a região codificadora de RNA interferente é uma molécula de RNA autocomplementar tendo uma região senso, uma região antissenso e uma região de alça. Quando expressa, esta molécula de RNA forma desejavelmente uma estrutura tipo "grampo de cabelo" e, neste pedido, é chamada de "shRNA." Em algumas modalidades, a região de alça gearlmente tem entre cerca de 2 e cerca de 10 nucleotídeos de comprimento (a título de exemplo apenas, vide SEQ ID NO: 35). Em outras modalidades, a região de alça tem de cerca de 6 a cerca de 9 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a região senso e a região antissenso region têm entre cerca de 15 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento. Subsequente ao processamento pós-transcricional, o RNA tipo grampo de cabelo pequeno é convertido em um siRNA por um evento de cliva- gem mediado pela enzima Dicer, que é uma membrana da família da RNase Ill. O siRNA então capaz de inibir a expressão de um gene com o qual ele compartilha homologia. Mais detalhes estão descritos por Brummelkamp et al., Science 296:550-553, (2002); Lee et al, Nature Biotechnol., 20, 500-505, (2002); Miyagishi e Taira, Nature Biotechnol 20:497-500, (2002); Paddison et al. Genes & Dev. 16:948-958, (2002); Paul, Nature Biotechnol, 20, 505-508, (2002); Sui, Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 99(6), 5515-5520, (2002); e Yu et al. Proc NatlAcadSci USA 99:6047-6052, (2002), cujas íntegras encontram-se aqui incorporadas a título de referência.
ShRNA
[0053] Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica um sShRNA direcionado para um gene de HPRT. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codi- ficando um ShRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma se- quência tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30 (doravante denominado "sh734"). Em outras modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um shRNA direci- onado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO:1. Em ainda outras mo- dalidades a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um ShRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30. Em outras modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifi- cando um ShRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma se- quência tendo pelo menos 97% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30. Em ainda outras modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um shRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 98% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30. Em ainda outras modalidades, a primeira sequên- cia de ácidos nucleicos codificando um shRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 99% de identi- dade com aquela de SEQ ID NO: 30. Em outras modalidades, a pri- meira sequência de ácidos nucleicos codificando um ShRNA direcio- nado para um gene de HPRT tem a sequência de SEQ ID NO: 30 (vi- de também FIG. 30A).
[0054] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 30 pode ser modificada. Em algumas modalidades, as modificações incluem: (i) a incorporação de uma sequência de alça de hsa-miR-22 (por exemplo, CCUGACCCA) (SEQ ID NO: 34); (ii) a adi-
ção de um espaçador nucleotídico 5' — 3', tal como um espaçador ten- do dois ou três nucleotídeos (por exemplo, TA); (iii) uma modificação no início 5', tal como a adição de um ou mais nucleotídeos (por exem- plo, G); e/ou (iv) a adição de dois nucleotídeos 5' e 3' à haste e à alça (por exemplo, 5' A e 3' T). Em geral, SshRNAs de primeira geração são processados em uma mistura heterogênea de RNAs pequenos, e já foi demonstrado que o acúmulo de transcritos precursores induz efeitos foram do alvo inespecíficos tanto sequência-dependente quanto se- quência-independente in vivo. Portanto, com base no atual entendi- mento do processamento e especificidade de DICER, foram aplicadas normas de desenho para desenhar aquela que otimizaria a estrutura do sh734 e a processabilidade e eficiência de DICER. (vide também Gu, S., Y. Zhang, L. Jin, Y. Huang, F. Zhang, M.C. Bassik, M. Kampmann, e M.A. Kay. 2014. Weak base pairing in both seed and 3' regions reduces RNAi off-targets and enhances si/shRNA designs. Nu- cleic Acids Research 42:12169-12176).
[0055] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 30 é modificada pela adição de dois nucleotídeos 5' e 3' (e.g. Ge C, respectivamente) à alça tipo grampo de cabelo (SEQ ID NO: 35), aumentando assim o filamento-guia de cerca de 19 nucleotí- deos para cerca de 21 nucleotídeos de comprimento e substituindo a alça pela alça de hsa-miR-22 CCUGACCCA (SEQ ID NO: 34), para dar a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 31. Em algumas mo- dalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando um shRNA di- recionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo me- nos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 31. Em outras mo- dalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um ShRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 31. Em outras modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codifi-
cando um ShRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma se- quência tendo pelo menos 97% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 31. Em outras modalidades, a primeira sequência de ácidos nu- cleicos codificando um ShRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 98% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 31. Em outras modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um sShRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 99% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 31. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando um sShRNA direcionado para um gene de HPRT tem a sequência de SEQ ID NO: 31. Acredita-se que o shR- NA codificado pela SEQ ID NO: 31 atinja derrubamento similar de HPRT em comparação com a SEQ ID NO: 30. Da mesma forma, acre- dita-se que uma célula que uma célula que foi deixada deficiente em HPRT através do derrubamento de HPRT via expressão do SshRNA codificado pela SEQ ID NO: 31 permite seleção com o uso de um aná- logo de tioguanina (por exemplo, 6TG).
[0056] Em algumas modalidades, o RNAi presente no vetor codifi- ca uma molécula de ácido nucleico, tal como uma molécula tendo a SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, as molécu- las de ácido nucleico são encontradas no citoplasma de uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta uma célula hospedeira incluindo pelo menos uma molécula de ácido nucleico selecionada dentre a SED ID NO: 1 ou a SEQ ID NO: 2.
[0057] Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um sShRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 27 (neste pedido doravante denominada "shHPRT 616"). Em outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codifi- cando um ShRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma se-
quência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO:27. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nuclei- cos codificando um sShRNA direcionado para um gene de HPRT shR- NA tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 27. Em outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando um shRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 97% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 27. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando um sShRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 98% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 27. Em ainda outras modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos codificando um shRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 99% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 27. Em outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando um ShRNA direcionado pa- ra um gene de HPRT tem a sequência de SEQ ID NO: 27 (vide tam- bém FIG. 31B).
[0058] Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um sShRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 28 (neste pedido doravante denominada "shnHPRT 211"). Em outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codifi- cando um SshRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma se- quência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO:28. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nuclei- cos codificando um sShRNA direcionado para um gene de HPRT shR- NA tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 28. Em outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando um sShRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 97% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 28. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando um sShRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 98% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 28. Em ainda outras modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos codificando um ShRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 99% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 28. Em outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando um sShRNA direcionado pa- ra um gene de HPRT tem a sequência de SEQ ID NO: 28 (vide tam- bém FIG. 31A).
[0059] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando um shRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 29 (neste pedido doravante denominada "shHPRT 734.1") (vide também FIG. 30B). Em outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando um shRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO:29. Em ainda outras modalidades, a sequência de áci- dos nucleicos codificando um ShRNA direcionado para um gene de HPRT shRNA tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identida- de com aquela de SEQ ID NO: 28. Em outras modalidades, a sequên- cia de ácidos nucleicos codificando um SshRNA direcionado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 97% de identi- dade com aquela de SEQ ID NO: 29. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando um ShRNA direcionado pa- ra um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 98% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 29. Em ainda outras modalida- des, a sequência de ácidos nucleicos codificando um ShRNA direcio- nado para um gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 99% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 29. Em outras modali-
dades, a sequência de ácidos nucleicos codificando um sShRNA direci- onado para um gene de HPRT tem a sequência de SEQ ID NO: 29 (vide também FIG. 30B). Micro-RNA
[0060] Micro-RNAs (miRs) são um grupo de RNAs não codificado- res que regulam pós-transcricionalmente a expressão de seus genes- alvo. Acredita-se que estas moléculas de filamento simples formem um complexo de silenciamento mediado por miRNA (miRISC) com outros proteínas que se ligam à região não transladada (UTR) 3' de seus MRNAs alvos de modo a impedir sua translação no citoplasma.
[0061] Em algumas modalidades, sequências de sSshRNA são em- butidas em estruturas secundárias de micro-RNA ("shRNA à base de micro-RNA"). Em algumas modalidades, sequências de ácidos nuclei- cos de shRNA direcionadas para HPRT são embutidas em estruturas secundárias de micro-RNA. Em algumas modalidades, os sShRNAs à base de micro-RNA são direcionados para sequências codificadoras na HPRT para obter o derrubamento da expressão de HPRT, o que se acredita ser equivalente à utilização de sShRNA direcionado para HPRT sem saturação da via assistente e toxicidade celular ou efeitos fora do alvo. Em algumas modalidades, o ShRNA à base de micro-RNA é um micro-RNA shRNA artificial de novo. A produção de tais ShnRNAs à base de micro-RNA de novo está descrita por Fang, W. & Bartel, David P. The Menu of Features that Define Primary Micro-RNAs and Enable De Novo Design of Micro-RNA Genes. Molecular Cell 60, 131-145, cu- ja íntegra encontra-se aqui incorporada a título de referência.
[0062] Em algumas modalidades, o ShRNA à base de micro-RNA tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o ShRNA à base de mi- Ccro-RNA tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o ShRNA à base de micro-RNA tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o ShRNA à base de micro-RNA tem a sequência de SEQ ID NO: 67 ("MIRNA734-Denovo") (vide também FIG. 32A). A forma do RNA de SEQ ID NO: 67 é encontrada na SEQ ID NO: 23.
[0063] Em algumas modalidades, o ShRNA à base de micro-RNA tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, o sShRNA à base de mi- Cro-RNA tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, o ShnRNA à base de micro-RNA tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, o ShRNA à base de micro-RNA tem a sequência de SEQ ID NO: 68 ("MIRNA211-Denovo") (vide também FIG. 32B). A forma do RNA de SEQ ID NO: 68 é encontrada na SEQ ID NO: 24.
[0064] Em outras modalidades, o ShRNA à base de micro-RNA é um miRNA modificado com cadafalso de miRNA de terceira geração 16-2 (doravante "MIRNA-3G") (vide, por exemplo, FIGURAS 28 e 29). A síntese de tais moléculas de miRNA-3G está descrita por Watanabe, C., Cuellar, T.L. & Haley, B. "Quantitative evaluation of first, second, and third generation hairpin systems reveals the limit of mammalian vector-based RNAi," RNA Biology 13, 25-33 (2016), cuja íntegra en- contra-se aqui incorporada a título de referência.
[0065] Em algumas modalidades, o miRNA-3G tem uma sequên- cia tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO:
25. Em algumas modalidades, o mMIRNA-3G tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, o miRNA-3G tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 25. Em algu- mas modalidades, o miRNA-3G tem a sequência de SEQ ID NO: 25
("MIRNA211-3G") (vide também FIG. 29).
[0066] Em algumas modalidades, o miRNA-3G tem uma sequên- cia tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO:
26. Em algumas modalidades, o miRNA-3G tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, o miRNA-3G tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 25. Em outras modalidades, o miRNA-3G tem a sequência de SEQ ID NO: 26 ("miR- NA734-3G") (vide também FIG. 28).
[0067] Em algumas modalidades, o sh734 sShRNA é adaptado para mimetizar a estrutura de um mIiRNA-451 (vide SEQ ID NO: 60) com uma haste de pares de base de 17 nucleotídeos e uma alça de 4 nu- cleotídeos (o miR-451 regula a glicoproteína da proteína P transporta- dora de fármacos). Extraordinariamente, esta estrutura não requer processamento por DICER. Acredita-se que a estrutura do pre-451 MRNA seja clivado pela Ago2 e subsequentemente pela ribonuclease poli(A)-específica (PARN) para gerar o mimético estrutural miRNA-451 maduro. A estrutura secundária para uma sequência de Agosh734 semelhante ao miRNAH51 está mostrada na FIG. 33 deste pedido (SEQ ID NO: 58). Acredita-se que a Ago-sShRNA é um mimético da estrutura do miR-451 endógeno e pode apresentar a vantagem de ser independente da DICER. Acredita-se que isto restrinja os efeitos fora do alvo da carga viajante, com atividade exonucleolítica 3'-5' variável (23-26nt madura) (vide Herrera-Carrillo, E., e B. Berkhout. 2017. Dicer- independent processing of small RNA duplexes: mechanistic insights and applications. Nucleic Acids Res. 45:10369-10379). Também se acredita que existam vantagens na utilização do processamento alter- nativo de ShRNAs independente da dicer, incluindo efeitos fora do alvo eficientes e reduzidos da guia ativa de RNAi único, falta de saturação na maquinaria de RNAi Dicer celular, e é menos provável que dúple-
xes de RNA mais curtos desencadeiem uma respostas RIG-l inatas. Alternativas para RNAi
[0068] Como uma alternativa para a incorporação de um RNAi, em algumas modalidades, os vetores de expressão podem incluir uma se- quência de ácidos nucleicos que codifica oligonucleotídeos antissenso que ligam sítios no RNA mensageiro (mMRNA). Os oligonucleotídeos antissenso da presente invenção hibridizam especificamente com um ácido nucleico codificando uma proteína e interferem na transcrição ou translação da proteína. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo antissenso é direcionado para um DNA e interfere na sua replicação e/ou transcrição. Em outras modalidades, um oligonucleotídeo antis- senso hibridiza especificamente RNA, incluindo pre-mRNA (i.e., MGRNA precursor que é um filamento simples imaturo de mMRNA), e mRNA. Estes oligonucleotídeos antissenso podem afetar, por exemplo, a translocação do RNA para o sítio de translação da proteína, translação da proteína a partir do RNA, junção do RNA para produzir uma ou mais espécies de mRNA, e atividade catalítica que pode estar embuti- do no DNA ou ser facilitada pelo mesmo. O efeito global desta interfe- rência é modular, reduzir, ou inibir a expressão da proteína alvo.
[0069] Em algumas modalidades, os vetores de expressão incor- poram uma sequência de ácidos nucleicos codificando um agente para salto de éxons ou um transgene para salto de éxons. Conforme usado neste pedido, a expessão "transgene para salto de éxons" ou "agente para salto de éxons" refere-se a qualquer ácido nucleico que codifica um oligonucleotídeo antissenso que possa gerar salto de éxons. "Salto de éxons" refere-se a um éxon que é saltado e removido no nível de pre-mRNA durante a produção de proteína. Acredita-se que oligonu- cleotídeos antissenso podem interferir em sítios de splice ou em ele- mentos reguladores em um éxon. Isto pode levar a uma proteína trun- cada, parcialmente funcional, apesar da presença de uma mutação genética. Geralmente, os oligonucleotídeos antissenso podem ser mu- tação-específicos e se ligar a um sítio de mutação no pré-RNA men- sageiro para induzir salto de éxons.
[0070] Transgenes para salto de éxons codificam agentes que po- dem resultar em salto de éxons, e tais agentes são oligonucleotídeos antissenso. Os oligonucleotídeos antissenso podem interferir em sítios de splice ou em elementos reguladores em um éxon para levar a uma proteína truncada, parcialmente funcional, apesar da presença de uma mutação genética. Adicionalmente, os oligonucleotídeos antissenso podem ser mutação-específicos e se ligar a um sítio de mutação no pré-RNA mensageiro para induzir salto de éxons. Oligonucleotídeos antissenso para salto de éxons são conhecidos na literatura e geral- mente são chamados de AONs. Tais AONs incluem RNAs nucleares pequenos ("snRNAs"), que constituem uma classe de moléculas de RNA pequeno que ficam confinadas no núcleo e que estão envolvidas em reações de junção ou outras reações de processamento de RNA. Exemplos de oligonucleotídeos antissenso, métodos para desenhar os mesmos, e métodos de produção relacionados estão revelados, por exemplo, nas Publicações US Nº* 20150225718, 20150152415, 20150140639, 20150057330, 20150045415, 20140350076, 20140350067, e 20140329762, cujas íntegras encontram-se aqui in- corporadas a título de referência.
[0071] Em algumas modalidades, os vetores de expressão da pre- sente invenção incluem um ácido nucleico que codifica um agente pa- ra salto de éxons que resulta no salto de éxons durante a expressão de HPRT ou causa uma mutação de duplicação no HPRT (por exem- plo, uma mutação de duplicação no éxon 4) (vide Baba S, et al. Novel mutation in HPRT1 causing a junção error with multiple variations. Nu- cleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2017 Jan 2;36(1):1-6, cuja íntegra encontra-se aqui incorporada a título de referência). Em algumas mo-
dalidades, oligonucleotídeos antissenso modificados com fosforotioato para ter como alvo sequências na região codificadora de HPRT (vide FIG. 38) podem ligar transcritos de mMRNA e inibir a translação da pro- teína funcional. Além de sua incorporação em vetores de expressão, os oligonucleotídeos podem ser distribuídos via nanocápsulas, minicé- lulas, liposssomas ou outro veículo de tansfecção adequado. Por exemplo, de acordo com a presente invenção, minicélu7las podem in- cluir um ácido nucleico funcional, por exemplo, um siRNA ou shRNA, ou um vetor de expressão que codifica um ácido nucleico funcional que pode ser acondicionado de forma eficiente para distribuição in vi- vo.
[0072] Em algumas modalidades, o HPRT pode ser substituído por uma sequência mutada modificada por trans-junção de spliceossomas, facilitando assim o derrubamento de HPRT. Em algumas modalidades, isto (1) requer uma região codificadora mutada para substituir a se- quência codificadora em um RNA alvo, (2) um sítio de splice 5' ou 3', e/ou (3) um domínio de ligação, i.e., sequência de oligonucleotídeos antissenso, que seja complementar ao RNA de HPRT alvo. Em algu- mas modalidades, todos os três componentes são necessários. Gene Terapêutico
[0073] Como observado neste pedido, os vetores de expressão (por exemplo, os vetores de expressão lentivirais) da presente inven- ção também podem inclui uma segunda sequência de ácidos nucleicos codificando um gene terapêutico (por exemplo, gama globina), e assim o gene terapêutico pode corrigir um defeito em uma célula-alvo (por exemplo, HSCs). Como ficará entendido pelos especialistas na técni- ca, o termo "gene terapêutico" inclui sequências genômicas, sequên- cias de cDNA, e segmentos genéticos geneticamente manipulados menores que expressam, ou podem ser adaptados parar expressar, proteínas, polipeptídios, domínios, proteínas de fusão, e mutantes que conservam um pouco ou toda a função terapêutica do polipeptídio de comprimento integral codificado pelo gene terapêutico. Abrangido pela definição de "gene terapêutico" está um "gene terapêutico equivalente biologicamente funcional". Por conseguinte, sequências que possuem cerca de 70% de homologia de sequência a cerca de 99% de homolo- gia de sequência e qualquer intervalo ou qualquer de homologia de sequência que possa ser daí derivada, tal como, por exemplo, cerca de 70% a cerca de 80%, e mais preferivelmente cerca de 85% e cerca de 90%; ou ainda mais preferivelmente, entre cerca de 95% e cerca de 99%; de aminoácidos que são idênticos ou funcionalmente equivalen- tes aos aminoácidos do gene terapêutico serão sequências que são equivalentes biologicamente funcionais contanto que a atividade bioló- gica do polipeptídio seja conservada.
[0074] Em algumas modalidades, o gene terapêutico corrige um distúrbio de gene único. Em algumas modalidades, o gene terapêutico é usado para tratar imunodeficiências, doenças hereditárias, doenças do sangue (por exemplo, hemofíilia, distúrbios de hemoglobina), doen- ças do armazenamento lisossômico, doenças neurológicas, distúrbios angiogênicos, ou câncer.
[0075] Em algumas modalidades, o gene terapêutico é um gene codificando uma enzima adenosine desaminase, um gene codificando alfa-1-antitripsina, um gene codificando um regulador da condutância transmembranar da fibrose cisítica, um gene codificando a enzima ga- lactose-1-fosfato uridilitransferase, um gene codificando um fator de coagulação (por exemplo, Fator IX humano), um gene codificando um gene da lipoproteína lipase, um ou mais genes codificando as enzimas necessárias para a síntese de dopamina, um gene codificando o fator neurotrófico derivado da linhagem de células gliais (GDNF), um gene codificando a subunidade gama do receptor de interleucina-2 (IL-2RG), um gene codificando Gp91phox, um gene codificando a proteína da síndrome de Wiskott-Aldrich, um gene codificando uma proteína globi- na, um gene codificando uma proteína globina mutada (por exemplo, uma proteína tendo propriedades antifalciformes, um gene codificando uma beta-globina mutada, um gene codificando gama-globina, um ge- ne codificando um anticorpo anti-CD19, etc. Em outras modalidades, o gene terapêutico é selecionado do grupo que consiste em um gene de globina, um gene de esfingomielinase, um gene de alfa-L-iduronudase, um gene de huntingtin, um gene de neurofibromina 1, um gene de MLH1, um gene de MSH2, um gene de MSH6, um gene de PMS2, um gene regulador da condutância transmembranar da fibrose cisítica, um gene de hexosaminidase A, um gene de distrofina, um gene de FMRI, um gene de fenilalanina hidroxilase e um gene de de lipoproteína de baixa densidade.
[0076] Exemplos de classes de genes terapêuticos incluem, porém sem limitação, genes supressores de tumor, genes que induzem ou previnem a apoptose, genes codificando enzimsa, genes codificando anticorpos, genes codificando hormônios, genes codificando recepto- res, e genes codificando citocinas, quimiocinas, ou fatores angiogêni- cos. Exemplos específicos de genes terapêuticos incluem, porém sem limitação, Rb, CFTR, pl6, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS-I, zacl, scFV, ras, DCC, NF-I, NF-2, WT-Il, MEN-I, MEN-II, BRCAI, VHL, MMACI, FCC, MCC, BRCA?, IL-I, I1L-2, I1L-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, I1L-11 11-12, IL-15Ra, 11-15, 11-21, GM- CSF, G-CSF, timidi- na quinase, mda7, FUS), interferon alfa, interferon beta, interferon ga- ma, ADP, p53, ABLI, BLCI, BLC6, CBFAI, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETSI, ETS2, ETV6, FGR, FOX, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCLI, MYCN, NRAS, PIMI, PML, RET, SRC, TALI, TCL3, YES, MADHA4, RBI, TP53, WTI, TNF, BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, ApoAl, ApoATV, ApoE, RaplA, citosina desaminase, Fab, ScFv, BRCA?2, zacl,
ATM, HIC-l, DPC-4, FHIT, PTEN, INGI, NOEYI, NOEY2, OVCAI, MADR?2, 53BP2, IRF-l, zacl, DBCCR-I, rks-3, COX-I, TFPI, PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fins, trk, ret, gsp, hst, abl, EIA, p300, VEGF, FGF, trombospondina, BAI-l, GDAIF, MCC, 41BBL, CDB80, CD86, or OX40.
[0077] Outros exemplos de genes terapêuticos são genes supres- sores de tumor que incluem, porém sem limitação, FUS|, Gene 26 (CACNAZD?2), PL6, LUCA-I (HYALI), LUCA-2 (HYAL2), 123F2 (RAS- SFI), 101F6, Gene 21 (NPRL2), SEM A3, NF|, NF2, e p53.
[0078] Ainda outros exemplos de genes terapêuticos são genes codificando enzimas incluindo, porém sem limitação, ACP desaturase, ACP hidroxilase, ADP-glicose piroforilase, PDE8A (camp fosfodieste- rase), ATPase, álcool desidrogenase, amilase, amiloglucosidase, cata- lase, celulase, ciclo-oxigenase, descarboxilase, dextrinase, esterase, DNA polimerase, RNA polimerase, hialuron sintase, galactosidase, glucanase, glicose oxidase, GTPase, helicase, hemicelulase, hialuro- nidase, integrase, invertase, isomerase, quinase, lactase, lipase, lipo- xigenase, liase, lisozima, pectinesterase, uma peroxidase, uma fosfa- tase, uma fosfolipase, uma fosforilase, poligalacturonase, proteinase, peptidase, pulanase, recombinase, transcriptase reversa, topoisome- rase ou xilanase. Outros exemplos de genes terapêuticos são genes incluem os genes codificando carbamoil sintetase |, ornitina transcar- bamilase, arginossuccinato sintetase, arginossuccinato liase, arginase, fumarilacetoacetato hidrolase, fenilalanina hidroxilase, alfa-1 antitripsi- na, glicose-6-fosfatase, receptor de lipoproteínas de baixa densidade, porfobilinogênio desaminase, fator VIIl, fator IX, cistationa beta.- sintase, cetoácido descarboxilase de cadeia ramificada, albumina, iso- valeril-CoA desidrogenase, propionil CoA carboxilase, metil malonil CoA mutase, glutaril CoA desidrogenase, insulina, beta.-glucosidase, piruvato carboxilase, fosforilase hepática, fosforilase quinase, glicina descarboxilase, proteína H, proteína T, ATPase transportadora de co- bre na doença de Menkes, ATPase transportadora de cobre na doença de Wilson, citosina desaminase, hipoxantina-guanina fosforibosiltrans- ferase, galactose-1-fosfato uridiltransferase, fenilalanina hidroxilase, glucocerbrosidase, esfingomielinase, alfa- L-idurom ' dase, glicose-6- fosfato desidrogenase, HSV timidina quinase, ou timidina quinase hu- mana.
[0079] Outros exemplos de genes terapêuticos são genes incluem genes codificando hormônios incluindo, porém sem limitação, hormô- nio de crescimento, prolactina, lactogênio placentário, hormônio lutei- nizante, hormônio estimulante de folículos, gonadotropina coriônica, hormônio estimulante de "uiyroid", leptina, adrenocorticotropina, angio- tensina |, angiotensina Il, alfa-endorfina, hormônio estimulante de beta- melanócitos, colecistocinina endotelina |, galanina, peptídio inibitório gástrico, glucagon, insulina, lipotropinas, neurofisinas, somatostatina, calcitonina, peptídio relacionado com o gene da calcitonina, peptídio relacionado com o gene da beta-calcitonina, hipercalcemia do fator de malignidade, proteína relacionada com o hormônio paratireodiano, pro- teína relacionada com o hormônio paratireodiano, peptídio semelhante ao glucagon, pancreastatina, peptídio pancreático, peptídio YY, PHM, secretina, peptídio intestinal vasoativo, oxitocina, vasopressina, vaso- tocina, encefalinamida, metorfinamida, hormônio estimulante de alfa melanócitos, fator natriurético atrial, amilina, componente P de amiloi- de, hormônio liberador de corticotropina, hormônio liberador de hor- mônio de crescimento, hormônio liberador de hormônio luteinizante, neuropepítio Y, substância K, substância P, ou hormônio liberador de tirotropina. Gene da Gama-Globina
[0080] Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos codificando um gene de gama-
globina (vide, por exemplo, FIG. 39). Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos codificando o gene de gama-globina tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em outras modalidades, a sequência de ácidos nu- cleicos codificando o gene de gama-globina tem uma sequência tendo pelo menos 85% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codifican- do o gene de gama-globina tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em outras modali- dades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o gene de gama- globina tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o gene de gama-globina tem uma se- quência tendo pelo menos 97% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nuclei- cos codificando o gene de gama-globina tem uma sequência tendo pelo menos 98% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codifican- do o gene de gama-globina tem uma sequência tendo pelo menos 99% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Acredita-se que a mutação pontual no gene de gama globina de SEQ ID NO: 55 codifi- cando uma alteração aminoacídica G16D no polipeptídio tem maior afinidade para ligar a alfa globina sem alterar sua função, dessa forma melhorando bastante a eficiência de formação de HbF em RBCs e re- sultando em um efeito anti-falciforme muito mais eficiente que, se acredita, corrigirá o fenótipo de SCD. Os éxons 1, 2, e 3 do gene de gama globina estão apresentados como SEQ ID NOS: 51, 52, e 53, respectivamente.
[0081] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o gene de gama-globina tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 3. Em outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o gene de gama-globina tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identida- de com aquela de SEQ ID NO: 3. Em ainda outras modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos codificando o gene de gama-globina tem uma sequência tendo pelo menos 97% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 3. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o gene de gama-globina tem uma sequência tendo pelo menos 98% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 3. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codifi- cando o gene de gama-globina tem uma sequência tendo pelo menos 99% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 3.
[0082] Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreen- de um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos ten- do uma identidade de pelo menos cerca de 80% com aquela de SEQ ID NO: 4. Em outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codifica um aminoácido tendo uma identidade de pelo menos cerca de 85% com aquela de SEQ ID NO: 4. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codifica um aminoácido tendo uma identidade de pelo menos cerca de 90% com aquela de SEQ ID NO: 4. Em outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codifica um aminoácido tendo uma identidade de pelo menos cerca de 95% com aquela de SEQ ID NO: 4. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codifica um aminoácido tendo uma identidade de pelo menos cerca de 97% com aquela de SEQ ID NO: 4. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codifica um ami- noácido tendo uma identidade de pelo menos cerca de 98% com aquela de SEQ ID NO: 4. Em ainda outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codifica um aminoácido tendo uma identidade de pelo menos cerca de 99% com aquela de SEQ ID NO: 4.
[0083] Genes de gama globina, métodos de síntese dos mesmos, e sua incorporação em vetores estão descritos na Publicação de Pa- tente US Nº 2017/0145077, cuja íntegra encontra-se aqui incorporada a título de referência. Genes terapêuticos para tratamento de outras doenças
[0084] Ainda outros genes terapêuticos podem ser incorporados em uma expressão, incluindo os genes descritos abaixo.
[0085] Deficiência em adenosina desaminase-imunodeficiência combinada grave (ADA-SCID) resulta no acúmulo de metabólitos tóxi- cos que destroem o sistema imunológico, causando imunodeficiência combinada grave (ADA-SCID), frequentemente chamada de doença do "menino bolha". Em algumas modalidades, o segundo ácido nuclei- co dos vetores de expressão descritos neste pedido codifica a se- quência de cDNA humano de ADA.
[0086] A doença da imunodeficiência combinada grave (SCID-X1) é a forma mais comum de SCID, respondendo por 40-50% dos casos de SCID reportados ao redor do mundo. Mutações no gene IL2RG le- vam à expressão defeituosa da cadeia gama (yc) comum, uma subu- nidade compartilhada por um hospedeiro de receptores de citocinas, incluindo complexos de receptores de interleucina (IL)-2, 4,7,9,15,e 21, que desempenham um papel vital no desenvolvimento e na função de linfócitos. Em algumas modalidades, o segundo ácido nucleico dos vetores de expressão descritos neste pedido codifica a sequência de cDNA humano de yc.
[0087] A doença granulomatosa crônica (CGD) é causada por de- feitos nas subunidades (gp91phox, p22phox, p47phox, p40phox or p67phox) da NADPH oxidase derivada de fagócitos. Mutações no ge- ne CYBB - codificando a subunidade gp91phox — são responsáveis pela forma ligada ao X de CGD, que responde por aproximadamente 70% dos pacientes. A CGD ligada ao X caracteriza-se por infecções bacterianas e fúngicas graves e com risco de vida devido a uma pro- dução prejudicada de ânions de superóxido e outros intermediários de oxigênio reativo por neutrófilos, eosinófilos, monócitos e macrófagos. Um outro aspecto da doença é a inflamação granulomatosa crônica estéril que afeta órgãos tais como o intestino ou o pulmão, causada principalmente pela produção aumentada de citoxinas pró-inflama- tórias, apoptose retardada das células inflamatórias e secreção defici- ente dos mediadores anti-inflamatórios por neutrófilos ativados. O des- fecho pobre está associado a um histórico de infecções fúngicas inva- sivas, abscessos no fígado e inflamação granulomatosa crônica. As estratégias terapêuticas disponíveis incluem profilaxia contínua com antibióticos, administração de IFN-y, e HCT. Em algumas modalida- des, o segundo ácido nucleico dos vetores de expressão descritos neste pedido codifica a sequência de cDNA humano da subunidade.
[0088] Leucodistrovia metacromática (MLD) MLD é uma doença autossômica recessiva de armazenamento lisossômico rara causada por mutações no gene da arilsulfatase A (ARSA) que resultam em de- ficiência de enzimas e acúmulo do substrato não degradado cerebro- sídeo 3-sulfato (sulfatídeo) em céulas neurais e gliais no sistema ner- voso central e no sistema nervoso periférico. Este acúmulo de sulfatí- deo leva à desmielinização e neurodegeneração progressivas. Em al- gumas modalidades, o segundo ácido nucleico dos vetores de expres- são descritos neste pedido codifica a sequência de cCcDONA de ARSA humana.
[0089] Mucopolissacaridose | (MPS- |) ou síndrome de Hurler é um distúrbio de armazenamento lisossômico causado por uma deficiência da enzima alfa-L-iduronidase (IDUA). A doença caracteriza-se por ar- mazenamento inadequado de glicosaminoglicanas (GAGs) acompa- nhado de aumento e danos nos órgãos, excreção de quantidades anormais de GAGs na urina, e turnover de GAG interrompido que afe-
ta sobretudo os tecidos conjuntivos. As manifestações clínicas incluem anormalidades —esqueléticas, hepatoesplenomegalia, retardamento mental, e disfunção cardiovascular e respiratória. A deficiência de IDUA pode resultar em uma ampla gama de apresentações fenotípi- cas, e MPS | Hurler (MPS IH) representa a variante mais grave da do- ença neste espectro, caracterizada por uma doença crônica, progres- siva, e incapacitante envolvendo múltiplos órgãos e o sistema nervoso central. A doença é fatal na infância se não tratada, com morte usual- mente ocorrendo na primeira década de vida por causa de insuficiên- cia cardiorespiratória. Em algumas modalidades, o segundo ácido nu- cleico dos vetores de expressão descritos neste pedido codifica o cCDNA humano de alfa-iduronidase (IDUA).
[0090] Doença de Gaucher é a mais comum das doenças de ar- mazenamento lisossômico. Ela é uma doença autossômica recessiva de armazenamento lisossômico, causada por deficiência da enzima glucocerebrosidase (GBA), necessária para a degradação de glicoes- fingolipídios. As manifestações clínicas incluem hepatoesplenomega- lia, trombocitopenia, doença óssea e diátese hemorrágica, com fre- quência resultando em consulta com hematologistas. A terapia genéti- ca representa uma alternativa terapêutica para pacientes em terapia de reposição enzimática e para aqueles que não conseguem um doa- dor de medula óssea compatível. Em algumas modalidades, o segun- do ácido nucleico dos vetores de expressão descritos neste pedido codifica o CDNA humano do gene de GBA.
[0091] Doenças de armazenamento lisossômico (LSDs) são dis- túrbios metabólicos hereditários raros caracterizados por uma disfun- ção nos lisossomas. LSDs abrangem aproximadamente 70 doenças geneticamente distintas, com uma incidência coletiva de 1:5000 nas- cimentos vivos. Exemplos incluem doença de Fabry (deficiência em alfa-galactosidase A deficiency), doença de Pompe (deficiência em a-
glucosidase [GAA]), síndrome de Hunter (deficiência em iduronato-2- sulfatase [I2S]), síndrome de Sanfilippo (deficiência em uma das enzi- mas necessárias para romper o glicosaminoglicano heparan sulfato) e doença de Krabbe (deficiência em gal-actocerebrosidase). Da mesma forma, os distúrbios metabólicos hereditários são uma causa de distúr- bios metabólicos, e ocorrem quando um gene defeituoso causa defici- ência em uma enzima. Acredita-se que os vetores de expressão da presente invenção possam ser adaptados para incorporar uma segun- da sequência de ácidos nucleicos que codifica um gene adequado pa- ra uso no tratamento de qualquer uma das condições identificadas acima.
[0092] Deficiência em piruvato quinase (PKD) é uma doença me- tabólica monogênica causada por mutações no gene de PKLR que le- va à anemia hemolítica de sintomatologia variável e que pode ser fatal durante o período neonatal. O traço de herança recessiva de PKD e seu tratamento curativa por meio de transplante de medula óssea alo- gênica proporciona um cenário ideal para o desenvolvimento de abor- dagens de terapia genética. Em algumas modalidades, o segundo áci- do nucleico dos vetores de expressão descritos neste pedido codifica o cDNA humano de PKLR.
[0093] Adrenoleucodistrohia (ALD) é um distúrbio metabólico liga- do ao X raro causado por mutações no gene de ABCD1 que resulta em uma deficiência na proteína de adrenoleucodistrofia (ALDP) e sub- sequente acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito comprida (VLCFA). O acúmulo de VLCFA ocorre no plasma e em todos os tipos de tecido, mas afeta principalmente o córtex adrenal e a matéria bran- ca do cérebro e filamento espinhal, levando a uma gama de desfechos clínicos. A forma mais grave de ALD, o fenótipo cerebral inflamatório conhecido como ALD cerebral (CALD), envolve a destruição progres- siva de mielina, a bainha protetora das células nervosas no cérebro que são responsáveis pelo pensamento e controle muscular. As sín- dromes de CALD geralmente ocorrem no início da infância e progri- dem rapidamente se não forem tratadas, levando à perda severa da função neurológica e eventual morte na maioria dos pacientes. Em al- gumas modalidades, o segundo ácido nucleico dos vetores de expres- são descritos neste pedido codifica a proteína humana de adrenoleu- codistofia (ALDP).
[0094] Anemia de Fanconi (FA) é uma síndrome hereditária de in- suficiência da medula óssea. Um defeito em 1 de pelo menos 16 ge- nes de reparo de DNA leva à aplasia e maior risco de malignidades, sobretudo AML e MDS. Adicionalmente, é maior o risco de adenoma, adenocarcinomas e carcinomas de células escamosas. A maioria dos pacientes também apresenta a estatura baixa, várias anormalidades morfológicas e distúrbios de desenvolvimento. Tratamento suportivo inclui transfusões regulares de produtos sanguineos e reposição de hormônio do crescimento devido a endocrinopatias concomitantes em pacientes com FA. HSCT no cenário de compatibilidade do doador já foi a única opção de cura e é, portanto, uma opção atraente para tera- pia genética. Apesar da heterogeneidade nos genes afetados, mais de 60% dos pacientes têm mutações no gene de FANCA. Em algumas modalidades, o segundo ácido nucleico dos vetores de expressão descritos neste pedido codifica o cCDNA humano de FANCA. Promotores
[0095] Em algumas modalidades, diferentes promotores são usa- dos para induzir a expressão de cada uma das sequências de ácidos nucleicos incorporadas nos vetores de expressão revelados. Por exemplo, uma primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um RNAi (por exemplo, um sShRNA anti-HPRT) pode ser expressa a partir de um primeiro promotor, e uma segunda sequência de ácidos nuclei- cos codificando um gene terapêutico (por exemplo, um gene de gama-
globina) pode ser expressa a partir de um segundo promotor, onde o primeiro e o segundo promotores são diferentes. Da mesma forma, e como um outro exemplo, uma primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um sShRNA à base de micro-RNA para infra-regular o HPRT pode ser expressa a partir de um primeiro promotor e uma se- gunda sequência de ácidos nucleicos codificando um gene terapêutico (por exemplo, o gene de gama-globina) pode ser expressa a partir de um segundo promotor, onde o primeiro e o segundo promotores são diferentes.
[0096] Em algumas modalidades, os promotores podem ser pro- motores constitutivos ou promotores induzíveis como sabem os espe- cialistas na técnica. Em algumas modalidades, o promotor inclui pelo menos uma parte de uma LTR de HIV (por exemplo, TAR).
[0097] Exemplos de promotores adequados incluem, porém sem limitação, promotores de RNA polimerase | (pol |), polimerase II (pol Il), ou polimerase Ill (pol III). Por "promotor de RNA polimerase Ill" ou "promotor de RNA Pol Ill" ou "promotor de polimerase Ill" ou "promotor de pol Ill" entende-se qualquer promotor de invertebrado, vertebrado, ou mamífero, por exemplo, humano, murino, suíno, bovino, primata, símio, etc. que, em seu contexto nativo em uma célula, associa-se ou interage com a RNA polimerase Ill para transcrever seu gene operaci- onalmente ligado, ou qualquer variante do mesmo, natural ou geneti- camente manipulado, que vai interagir em uma célula hospedeira sele- cionada com uma RNA polimerase Ill para transcrever uma sequência de ácidos nucleicos ligada operacionalmente. Promotores de RNA de Pol Ills adequados para uso nos vetores de expressão da invenção incluem, porém sem limitação, U6 humano, U6 de camundongo, e ou- tros H1 humanos.
[0098] Exemplos de promotores de pol Il incluem, porém sem limi- tação, Ef1 alfa, CMV, e ubiquitina. Outros promotores de pol Il especí-
ficos incluem, porém sem limitação, o promotor de anquirina (Sabatino DE, et al., Proc Natl Acad Sd USA. (24):13294-9 (2000)), o promotor de espectrina (Gallagher PG, et al., J Biol Chem. 274(10):6062- 73, (2000)), o promotor do receptor de transferrina (Marziali G, et al., On- cogene. 21(52):7933-44, (2002)), o promotor da banda 3/transportador de ânions (Frazar TF, et al., Mol Cell Biol (14):4753-63, (2003)), o promotor da banda 4.1 (Harrison PR, et al., Exp Cell Res. 155(2):321- 44, (1984)), o promotor de Bcl- XI (Tian C, et al., Blood 15;101(6): 2235-42 (2003)), o promotor de EKLF (Xue L, et al., Blood. 103(11): 4078-83 (2004)). Epub 2004 Feb 5), o promotor de ADD2 (Yenerel MN, et al., Exp Hematol. 33(7):758-66 (2005)), o promotor de DYRK3 (Zhang D, et al., Genomics 85(1): 117-30 (2005)), o promotor de SOCS (Sarna MK, et al., Oncogene 22(21):3221-30 (2003)), o promo- tor de LAF (To MD, et al., bit J Cancer 1;1 15(4):568-74, (2005)), o pro- motor de PSMA (Zeng H, et al., JAndrol (2):215-21, (2005)), o promo- tor de PSA (Li HW, et al., Biochem Biophys Res Commun 334(4): 1287-91, (2005)), o promotor de Probasin (Zhang J, et al. 145(1):134- 48, (2004)). Epub 2003 Sep 18), ELAM-I promoter/E-Selectin (Walton T, et al., Anticancer Res. 18(3A):1357-60, (1998)), o promotor de si- napsina (Thiel G, et al., ProcNatl Acad Sd USA., 88(8):3431-5(1988)), o promotor do fator de Willebrand (Jahroudi N, Lynch DC.
Mol Cell - 520/.14(2):999-1008, (1994)), FLTI (Nicklin SA, et al., Hypertension 38(1):65-70, (2001)), o promotor de Tau (Sadot E, et al., JMol Biol. 256(5):805-12, (1996)), o promotor de tirosinase (Lillehammer T, et al., Cancer Gene Ther. (2005)), o promotor de pander (Burkhardt BR, et al., Biochim Biophys Acta. (2005)), o promotor da enolase neurônio- específica (Levy YS, et al.,, JMolNeurosci.21(2):121-32, (2003)), o promotor de hTERT (lto H, et al, Hum Gene Ther 16(6):685-98, (2005)), o elemento responsivo ao HRE (Chadderton N, et al., IntlRa- diat Oncol Biol Phys.62(1):2U-22, (2005)), o promotor de Ick (Zhang DJ,
et al., J Imnmunol. 174(11):6725- 31, (2005)), o promotor de MHCII (De Geest BR, et al., Blood. 101(7):2551-6, (2003), Epub 2002 Nov 21), e o promotor de CDI lc (Lopez-Rodriguez C, et al, J Biol Chem. 272(46):29120-6 (1997)).
[0099] Em algumas modalidades, o promotor que induz a expres- são do agente desenhado para derrubar o HPRT ou de alguma forma reduzir sua expressão é um promotor de RNA Pol Ill. Em algumas mo- dalidades, o promotor que induz a expressão do agente desenhado para derrubar o HPRT ou de alguma forma reduzir sua expressão é um promotor 7sk (por exemplo, um promotor 7SK de 78 K RNA huma- no). Em algumas modalidades, o promotor 7sk tem a sequência apre- sentada pelo ACESSO AY578685 (região promotora de 7SK RNA da linhagem celular HEK-293 de Homo sapiens, ACESSO AY578685).
[00100] Em algumas modalidades, o promotor 7Sk utilizado com- preende pelo menos uma mutação e/ou deleção em sua sequência de ácidos nucleicos em comparção com o promotor 7sk (vide FIGURAS e 36). Em outras modalidades, o promotor 7sk compreende múlti- plas mutações e/ou deleções em sua sequência de ácidos nucleicos em comparção com o promotor 7sk (ACESSO AY578685). Em ainda outras modalidades, o promotor 7sk tem 95% de identidade com a se- quência de SEQ ID NO: 32. Em ainda outras modalidades, o promotor 7Sk tem a sequência de SEQ ID NO: 32. Acredita-se que o promotor 7sk tenha expressado o sShRNA to HPRT em um nível moderado tenha sido mais eficaz que outros promotores de Pol Ill, por exemplo, U6 e H1. Acredita-se que a introdução tenha permitido a modulação da ex- pressão de sShRNA para HPRT em níveis terapêuticos.
[00101] Em algumas modalidades, o promotor 7sk tem uma se- quência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NOS: 32. Em algumas modalidades, o promotor 7sk tem uma sequên- cia tendo pelo menos 96% de identidade com aquela de SEQ ID NOS:
32. Em algumas modalidades, o promotor 7sk tem uma sequência tendo pelo menos 97% de identidade com aquela de SEQ ID NOS: 32. Em algumas modalidades, o promotor 7sk tem uma sequência tendo pelo menos 98% de identidade com aquela de SEQ ID NOS: 32. Em algumas modalidades, o promotor 7sk tem uma sequência tendo pelo menos 99% de identidade com aquela de SEQ ID NOS: 32. Em algu- mas modalidades, o promotor 7sk tem a sequência apresentada na SEQ ID NOS: 32.
[00102] Em algumas modalidades, mutações ou deleções funcio- nais no promotor 7sk são feitas nos elementos cis-reguladores para regular os níveis de expressão do transgene induzido por promotor, incluindo sh734 (vide SEQ ID NO: 33). (vide Boyd, D.C., Turner, P.C., Watkins, N.J., Gerster, T. & Murphy, S. Functional Redundancy of Promoter Elements Ensures Efficient Transcription of the Human 7SK Gene in vivo. Journal of Molecular Biology 253, 677-690 (1995). As mutações descritas são usadas para estabelecer a correlação entre os níveis de expressão de sh734 induzidos pelo promotor de Pol Ill e para introduzir funcionalidade para passar seleção estável na presença de terapia com 6TG e estabilidade e segurança de longo prazo. A locali- zação das mutações no promotor 7sk estão apresentadas na FIG. 35. As mutações no sítio de ligação de 7sSkM1 Oct no melhorador de se- quência distal (DSE) e os sítios de ligação de TAL-1 e GATA-1 estão mostrados na FIG. 36.
[00103] Em algumas modalidades, o promotor 7sk tem uma se- quência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NOS: 33. Em algumas modalidades, o promotor 7sk tem uma sequên- cia tendo pelo menos 96% de identidade com aquela de SEQ ID NOS:
33. Em algumas modalidades, o promotor 7sk tem uma sequência tendo pelo menos 97% de identidade com aquela de SEQ ID NOS: 33. Em algumas modalidades, o promotor 7sk tem uma sequência tendo pelo menos 98% de identidade com aquela de SEQ ID NOS: 33. Em algumas modalidades, o promotor 7sk tem uma sequência tendo pelo menos 99% de identidade com aquela de SEQ ID NOS: 32. Em algu- mas modalidades, o promotor 7sk tem a sequência apresentada na SEQ ID NOS: 33.
[00104] Em algumas modalidades, o promotor que induz a expres- são de uma sequência de ácidos nucleicos codificando um gene tera- pêutico é um promotor de H1, um promotor de U6, ou um promotor de 7SK mutante. Em algumas modalidades, o promotor que induz a ex- pressão de uma sequência de ácidos nucleicos codificando gama- globina é um promotor de beta-globina, tal como ilustrado nas FIGU- RAS 1A e 1B. Em algumas modalidades, o promotor de beta-globina é o promotor de beta-globina humana do tipo selvagem. Em outras mo- dalidades, o promotor de beta globina tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 66. Em outras modalidades, o promotor de beta globina tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 66. Em outras modalidades, o promotor de beta globina tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 99% de identidade de sequên- cia com aquela de SEQ ID NO: 66. Em ainda outras modalidades, o promotor de beta globina tem a sequência de ácidos nucleicos of SEQ ID NO: 66. Acredita-se que o promotor de beta globina seja vantajoso uma vez que ele está sujeito à regulação normal do promotor de beta globina humana expresso nas células sanguíneas vermelhas.
[00105] Em outras modalidades, o promotor é um promotor tecido- específico. Vários exemplos não limitativos de promotores tecido- específicos que podem ser usados incluem Ick (vide, por exemplo, Garvin et al., Mol. Cell Biol. 8:3058-3064, (1988)) e Takadera et al., Mol. Cell Biol. 9:2173-2180, (1989)), miogenina (Yee et al., Genes and
7T1/141 Development 7:1277-1289 (1993), e thyl (Gundersen et al., Gene 113:207-214, (1992)).
[00106] Também se contempla que uma combinação de promoto- res (por exemplo, UDC e H1 promoters) pode ser usada para obter a expressão desejada do gene terapêutico e/ou do RNA interferente. Em algumas modalidades, o vetor de expressão inclui um promotor de pol Il e um promotor de Pol Ill, por exemplo, o promotor de Pol Il beta- globina para expressão de gama-globina e o promotor de Pol Ill 7SK para derrubamento do HPRT. Promotores com especificidade para te- cidos são vantajosos no sentido de que direcionar especificamente a expressão do gene de interesse e do RNA interferente, controlando assim o efeito biológico, conforme desejado. Exemplos de vetores tendo um ácido nucleico codificando um ShRNA direcionado para um gene de HPRT e um ácido nucleico codificando um gene de gama-globina
[00107] Exemplos de vetores de expressão lentivirais desenhados para derrubar o HPRT e causar a expressão de uma gama globina es- tão descritos abaixo. Qualquer um dos vetores de expressão citados é adequado para a transdução de HSCs, tal como ex vivo.
[00108] Em algumas modalidades, o vetor de expressão lentiviral inclui (a) uma sequência codificando um RNAi direcionado para HPRT; (b) uma sequência codificando um gene de gama globina; (c) uma se- quência codificando um primeiro promotor para induzir a expressão da sequência codificando o RNAi direcionado para HPRT; (d) uma se- quência codificando um segundo promotor para induzir a expressão da sequência codificando o gene de gama globina; e (e) uma sequência codificando um trato de polipurina central (cPPT); e (f) uma sequência codificando um elemento de resposta REv (RRE). Em algumas moda- lidades, o cPPT compreende cerca de 85 pares de base da sequência Vif do HIV do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o RRE com-
preende cerca de 26 pares de base da sequência Rev, cerca de 25 pares de base da sequência tat, e cerca de 769 pares de base da se- quência de Env do HIV do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o vetor lentiviral inclui ainda uma região de controle de locos. Em algu- mas modalidades, o vetor lentiviral inclui ainda uma repetição terminal longa autoinativante. A criação de uma SIN LTR é conseguida por ina- tivação da região U3 da 3' LTR (de preferência por deleção de uma parte da mesma, por exemplo, por remoção de uma sequência TATA). A alteração é transferida para a 5' LTR depois da transcricção reversa, eliminando assim a unidade transcricional das LTRs no provírus, o que se acredita impedir a mobilização por vírus competente para replica- ção. Um melhoramento adicional da segurança é proporcionado pela substituição da região U3 da 5' LTR por um promotor heterólogo para induzir a transcrição do genoma viral durante a produção de partículas virais. Em algumas modalidades, o vetor de expressão lentiviral tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, or pelo menos 99% de iden- tidade de sequência to one of SEQ ID NOS: 5 — 22. Em algumas mo- dalidades, o RNAi é um sShRNA.
[00109] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 5 (TL20c-7skM1/sh734-rGbGM). Em ou- tras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos ten- do pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 5. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequên- cia com aquela de SEQ ID NO: 5. Em ainda outras modalidades, o ve- tor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 5 (vide tam- bém FIG. 6).
[00110] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 6 (TL20c-7sKk/sh734-rGbGM). Em outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 6. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 6. Em ainda outras modalidades, o vetor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 6 (vide também FIG. 7).
[00111] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 7 (TL20c-r7skM1/sh734-rGbGM). Em ou- tras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos ten- do pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 7. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequên- cia com aquela de SEQ ID NO: 7. Em ainda outras modalidades, o ve- tor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 7 (vide tam- bém FIG. 8).
[00112] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 8 (TL20c-r7sk/sh734-rGbGM). Em outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 8. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 8. Em ainda outras modalidades, o vetor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 8 (vide também FIG. 9).
[00113] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de
T4/141 ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 9 (TL20c-rGbGM-7skM1/sh734). Em ou- tras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos ten- do pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 9. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequên- cia com aquela de SEQ ID NO: 9. Em ainda outras modalidades, o ve- tor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 9 (vide tam- bém FIG. 10).
[00114] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 10 (TL20c-rGbGM-7sk/sh734). Em outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 10. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 10. Em ainda outras modalidades, o vetor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 10 (vide também FIG. 11).
[00115] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 11 (TL20c-rGbGM-r7skM1/sh734). Em ou- tras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos ten- do pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 11. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequên- cia com aquela de SEQ ID NO: 11. Em ainda outras modalidades, o vetor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 11 (vide também FIG. 12).
[00116] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 12 (TL20c-rGbGM-r7sk/sh734). Em outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 12. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 12. Em ainda outras modalidades, o vetor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 12 (vide também FIG. 13).
[00117] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 13 (TL20c-rGbGM). Em outras modalida- des, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 13. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nu- cleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 13. Em ainda outras modalidades, o vetor tem a se- quência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 13 (vide também FIG. 14).
[00118] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 14 (TL20d-7skM1/sh734-rGbGM). Em ou- tras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos ten- do pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 14. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequên- cia com aquela de SEQ ID NO: 14. Em ainda outras modalidades, o vetor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 14 (vide também FIG. 15).
[00119] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 15 (TL20d-7sk/sh734-rGbGM). Em outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 15. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 15. Em ainda outras modalidades, o vetor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 15 (vide também FIG.16).
[00120] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 16 (TL20d-r7skM1/sh734-rGbGM). Em outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 16. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 16. Em ainda outras modalida- des, o vetor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 16 (vide também FIG. 17).
[00121] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 17 (TL20d-r7sk/sh734-rGbGM). Em outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 17. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 17. Em ainda outras modalidades, o vetor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 17 (vide também FIG. 18).
[00122] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência
7TT7I141 com aquela de SEQ ID NO: 18 (TL20d-GbGM). Em outras modalida- des, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 18. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nu- cleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 18. Em ainda outras modalidades, o vetor tem a se- quência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 18 (vide também FIG. 19).
[00123] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 19 (TL20d-rGbGM-7skM1/sh734). Em ou- tras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos ten- do pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 19. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequên- cia com aquela de SEQ ID NO: 19. Em ainda outras modalidades, o vetor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 19 (vide também FIG. 20).
[00124] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 20 (TL20d-GbGM-7sk/sh734). Em outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 20. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 20. Em ainda outras modalidades, o vetor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 20 (vide também FIG. 21).
[00125] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 21 (TL20d-rGbGM-r7skM1/sh734). Em outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 21. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 21. Em ainda outras modalida- des, o vetor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 21 (vide também FIG. 22).
[00126] Em algumas modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 22 (TL20d-rGbGM-r7sk/sh734). Em outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 22. Em ainda outras modalidades, o vetor tem uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 22. Em ainda outras modalidades, o vetor tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 22 (vide também FIG. 23). Produção de vetores
[00127] Em algumas modalidades, um cassete de expressão, tal como aquele tendo um transgene específico para expressão, é inseri- do em um vetor de expressão, tal como um vetor de expressão lentivi- ral, para proporcionar um vetor tendo pelo menos um transgene para expressão. Por exemplo, um cassete de expressão tendo um transge- ne para expressão pode ser inserido em um vetor pTL20c (SEQ ID NO: 47) (FIGURAS 40A e 40B) ou em um vetor pTL20d (i.e., PTL2Oc, porém sem o isolador de CHS4 (SEQ ID NO: 49)) de acordo com os métodos descritos na Publicação de Patente US Nº 2018/0112233, cuja íntegra encontra-se aqui incorporada a título de referência. Um exemplo de inserção de um cassete de expressão no vetor pTL20c está descrito no Exemplo 1 deste pedido.
[00128] Subsequente à inserção do cassete de expressão no vetor de expressão, um segundo cassete de expressão é inserido no vetor tendo o pelo menos um transgene para expressão. Por exemplo, um cassete de expressão incluindo uma sequência de ácidos nucleicos para derrubar o HPRT ou de alguma forma reduzir sua expressão po- de ser inserido no vetor tendo o pelo menos um transgene para ex- pressão. Um exemplo de inserção de um cassete de expressão inclu- indo um sShRNA anti-HPRT no vetor tendo o pelo menos um transgene para expressão está descrito no Exemplo 1 deste pedido. Distribuição não viral de agentes para infra-reqular o HPRT e/ou introduzir um transgene
[00129] Em algumas modalidades, os agentes desenhados para derrubar o gene de HPRT (incluindo construções de expressão inclu- indo um RNAi) podem ser distribuídos através de uma nanocápsula diferente de um veículo de distribuição não viral. A distribuição de tal agente por este método representa uma alternativa para efetuar a in- frarregulação de HPRT por meio de um RNAi expresso ou outro agen- te a partir de um vetor de expressão. Conforme descrito neste pedido, é possível distribuir RNA antissenso, oligonucleotídeos desenhados para saltar éxons, ou maquinario de edição de genes por meio de na- nocápsulas.
[00130] Em geral, uma nanocápsula é um sistema vesicular que apresenta uma estrutura núcleo-envoltório típica na qual moléculas ativas ficam confinadas em um reservatório ou cavidade que é envol- vida por uma membrana ou revestimento polimérico. Em algumas mo- dalidades, o envoltório de uma nanocápsula típica é feito de uma membrana ou revestimento polimérico. Em algumas modalidades, as nanocápsulas são derivadas de um material polimérico biodegradável ou bioerodível.
[00131] Em algumas modalidades, a nanocápsula é uma nanocáp-
sula enzimaticamente degradável. Em algumas modalidades, a nano- cápsula consiste em um núcleo de proteína única e um envoltório po- limérico fino reticulados por peptídios. Em algumas modalidades, uma nanocápsula deve ser selecionada de forma que ela seja especifica- mente reconhecível e capaz de ser clivada por uma protease. Em al- gumas modalidades, os reticuladores cliváveis incluem uma sequênia ou estrutura peptídica que é um substrato de uma protease ou outra enzima.
[00132] Nanocápsulas adequadas incluem aquelas descritas na Pa- tente US Nº 9,782,357; aquelas descritas nas Publicações de Pedido de Patente US Nº* 2017/0354613, 2015/0071999 e 2015/035975; e aquelas descritas nas Publicações PCT Nºº WO?2016/085808, WO?2017/06380, e WO2017/205541, cujas íntegras encontram-se aqui incorporadas a título de referência. Outras nanocápsulas adequadas, seus métodos de síntese, e/ou métodos de encapsulação, estão ainda descritos na Publicação de Patente US Nº 2011/0274682, cuja íntegra encontra-se aqui incorporada a título de referência. Ainda outras nano- cápsulas adequadas para incorporação e distribuição de agentes de- senhados para reduzir a expressão do gene de HPRT estão descritos nas Publicações PCT Nºº WO?2013/138783, WOZ2013/033717, e WO?2014/093966, cujas íntegras encontram-se aqui incorporadas a título de referência.
[00133] Em algumas modalidades, as nanocápsulas são adaptadas para serem direcionados para tipos de células específicos (por exem- plo, células T, células-tronco hematopoiéticas CD34 e células progeni- toras) in vivo. Por exemplo, as nanocápsulas podem incluir uma ou mais porções direcionadoras acopladas a uma nanocápsula poliméri- ca. Em algumas modalidades, a porção direcionadora distribui as na- nocápsulas poliméricas para um tipo de célula específico, onde o tipo de célula é selecionado do grupo que compreende células imunes, cé-
lulas sanguíneas, células cardíacas, células pulmonares, células ópti- cas, células hepáticas, células renais, células cerebrais, células do sis- tema nervoso central, células do sistema nervoso periférico, células cancerosas, células infectadas com vírus, células-tronco, células da pele, células intestinais, e/ou células auditivas. Em algumas modalida- des, as porções direcionadoras são anticorpos. Cargas úteis adequa- das para estas nanocápsulas incluem oligonucleotídeos sintéticos, ShRNAs, miRNAs, e HPRT direcionado para Ago-shRNAs. Em algu- mas modalidades, as cargas úteis podem ser expressas em cassetes de promtores induzidos por Pol Ill ou Pol Il.
[00134] Em outras modalidades, agentes para infra-regular o HPRT podem ser formulados em bio-nanocápsulas, que são cápsulas de ta- manho nanométrico produzidas por um micro-organismo geneticamen- te modificado. Em algumas modalidades, uma bio-nanocápsula é uma partícula derivada de uma proteína viral ou derivada de uma proteína viral modificada, tal como uma partícula de antígeno da superfície de um vírus (por exemplo, um antígeno da superfície do vírus da hepatite B (HBsAg)). Em outras modalidades, uma bio-nanocápsula é uma cápsula de tamanho nanométrico compreendendo uma membrana bi- camada lipídica e uma partícula derivada de uma proteína viral ou de- rivada de uma proteína viral modificada tal como uma partícula de an- tígeno da superfície de um vírus. Tais partículas podem ser purificadas a partir de células eucarióticas, tais como leveduras, células de inse- tos, e células de mamíferos. O tamanho de uma cápsula pode variar entre cerca de 10 nm e cerca de 500 nm. Em outras modalidades, o tamanho da cápsula pode variar entre cerca de 20 nm e cerca de 250 nm. Em ainda outras modalidades, o tamanho da cápsula pode variar entre cerca de 80 nm e cerca de 150.
[00135] Em algumas modalidades, é apresentada uma formulação de nanocápsulas que tanto "corrige" um gene "fixando" a mutação ge-
nética original (tal como pelo emprego de edição/engenharia genômi- ca) como simultaneamente distribui e insere um cassete de transcrição codificando um mecanismo para derruvar o HPRT. RNA Antissenso
[00136] RNA antissenso (asRNA) é um RNA de filamento simples que é complementar ao filamento de um RNA mensageiro (mMRNA) transcrito em uma célula. Sem querermos nos ater a uma teoria em particular, acredita-se que um RNA antissenso possa ser introduzido em uma célula para inibir a translação de um mRNA complementar por meio de pareamento de base com o mesmo e obstrução física do ma- quinaria de translação. A referida outra msneira, RNAs antissenso são moléculas de RNA de filamento simples que apresentam uma relação complementar com mRNAs específicos.
[00137] Os RNAs antissenso podem ser utilizados para regulação de genes e especificamente para direcionar moléculas de MRNA que são usadas na síntese de proteínas. O RNA antissenso pode parear fisicamente e ligar-se ao MRNA complementar, inibindo assim a capa- cidade do mMRNA de ser processado no maquinário de translação. Além dos construtos distribuídos para siRNA/ShRNA LV, oligonucleotí- deos antissenso modificados com fosforotioato podem ser utilizados para ser direcionado para sequências na região codificadora de HPRT MRNA (vide FIG 37). Esses oligonucleotídeos podem ser distribuídos para populações de células específicas e células de sítios anatômicos usando nanopartículas direcionadas, como descrito acima. Salto de éxons
[00138] Como observado neste pedido, salto de éxons pode ser uti- lizado para criar um defeito no gene de HPRT que resulta em deficiên- cia em HPRT. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo (inclusi- ve um oligonucleotídeo modificado) pode ser distribuído por meio de uma nanocápsula, o oligonucleotídeo sendo desenhado para ser dire-
cionado para um HPRT mRNA não spliced e mediar seja o término prematuro ou o salto de um íntron requerido para atividade. Uma mu- tação de duplicação de HPRT, por exemplo, por exemplo, uma muta- ção de duplicação no éxon 4, (vide Baba S, et al., "Novel mutation in HPRT1 causing a junção error with multiple variations," Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2017 Jan 2;36(1):1-6) poderia ser introduzi- da para provocar um erro de junção e inativação funcional da proteína HPRT. Substituição de HPRT por uma sequência mutada modificada por trans-junção de espliceosomas é uma estratégia terapêutica po- tencial para derrubar o HPRT. Acredita-se que isto requeira (1) uma região codificadora mutada para substituir a sequência codificadora no RNA alvo, (2) um sítio de splice 5' ou 3', e (3) um domínio de ligação, por exemplo, uma sequência de oligonucleotídeos antissenso, que é complementar ao RNA alvo.
[00139] Os oligonucleotídeos podem ser estruturalmente modifica- dos para que fiquem resistentes à nuclease. Em algumas modalida- des, os oligonucleotídeos possuem estruturas modificadas ou ligações internucleosídicas não naturais. Tais oligonucleotídeos tendo estrutu- ras modificadas incluem aqueles que conservam um átomo de fósforo na estrutura e aqueles que não possuem um átomo de fósforo na es- trutura. Em algumas modalidades, oligonucleotídeos modificados que não possuem um átomo de fósfor em sua estrutura internucleosídeos também podem ser considerados como sendo oligonucleotídeos. Em outras modalidades, os oligonucleotídeos são modificados de modo que tanto o açúcar como a ligação inter-nucleosídeos, i.e., a estrutura, das unidades nucleotídicas sejam substituídos por grupos novos. As unidades base são mantidas para hibridização com um composto-alvo de ácido nucleico apropriado. Um composto oligomérico deste tipo, um mimético de oligonucleotídeo que mostrou ter propriedades de hibridi- zação excelentes, é chamado de ácido nucleico peptídico (PNA). Em compostos PNA, o açúcar-estrutura de um oligonucleotídeo é substitu- ído por uma estrutura contendo amida, em particular uma estrutura aminoetilglicina. As nucleo-bases são retidas e são direta ou indireta- mente ligadas a átomos de aza nitrogênio da porção amida da estrutu- ra. Oligonucleotídeos modificados também podem conter uma ou por- ções açúcar substituído. Oligonucleotídeos também podem incluir mo- dificações ou substituições na nucleobase (frequentemente chamada- simplesmente de "base", na literatura). Certas nucleobases são parti- cularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos da invenção. Estas incluem, sem limitação, pirimidinas 5- substituídas. 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e O-6 substituídas, incluindo substituições 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5- propinilcitosina. 5-metilcitosina que mostraram aumentar a estabilidade do dúplex de ácido nucleico por 0,6-1,2ºC e são substituições de base ora preferidas, ainda mais particularmente quando combinadas com modificações no açúcar 2'-O-metoxietílico.
Técnicas de edição de genes
[00140] A presente invenção também apresenta composições para a inserção direcionada de um transgene (doador) incluindo uma se- quência codificadora de proteína, por exemplo, uma proteína que não possui ou é deficiente em um indivíduo com beta-talassemia ou com a doença de células falciformes. Em certas modalidades, a integração direcionada de um cassete gênico corretivo no genoma de uma célula é obtida por meio de proteínas de ligação de DNA altamnte específicas (por exemplo, meganucleases, ZFNs, TALENs, sistemas CRISPR/ Cas). Os cassetes gênicos integrados no gene-alvo podem ser trans- portados em um vetor viral ou não viral e/ou podem ser integrados com a ajuda de uma ou mais nucleases. Meganucleases são versões construídas de enzimas de restrição de ocorrêncaia natural que tipi- camente possuem sequências de reconhecimento de DNA ampliadas
(por exemplo, 1440 bp). ZFNs e TALENs são proteínas de fusão arti- ficialis compostas de um domínio de ligação de DNA geneticamente manipulado fundido a domínio nuclease inespecífico da enzima de res- trição Fokl. Domínios de repetição de dedo-de-zinco e TALE com es- pecificidades customizadas podem ser unidos um com outro em arran- jos que se ligam a sequências de DNA ampliadas.
[00141] Em algumas modalidades, uma abordagem CRISPR (des- crita abaixo) é utilizada para nocautear o HPRT, combinada com uma estratégia de "reposição" para corrigir a mutação de SCD ou para con- verter um promotor de gama globina endógena em beta-globina para, segundo se acredita, impedir a repressão e permitir a expressão cons- titutiva de Hb fetal em células adultas.
[00142] Em algumas modalidades, é possível usar uma abordagem de edição de genes para nocautear o HPRT. Por exemplo, células iso- ladas podem ser tratadas com um CRISPR/Cas9 RNP direcionado pa- ra HPRT. Um sistema CRISPR/Cas é desenhado para ligar-se a um sítio-alvo em uma região de interesse (por exemplo, um gene altamen- te expresso, um gene associado a uma doença ou um gene de porto seguro) em um genoma, onde o sistema CRISPR/Cas compreende uma nuclease de CRIPSR/Cas e um crRNA/tracrRNA geneticamente manipulado (ou RNA guia simples). Em algumas modalidades, o sis- tema CRISPR/Cas reconhece um alvo em um gene de HPRT. saRNA candidatos derrubamento do HPRT estão mostrados na FIG 38. Lista- das estão sequências de mutações pontuais aceitas ("PAM") normais e reversas incluindo escores de especificidade e eficiência e coorde- nadas de cromossas de HPRT direcionadas (onde PAM refere-se à substituição de um aminoácido simples na estrutura primária de uma proteína por outro aminoácido simples). Em algumas modalidades, a proteína Cas9 é complexada com RNA guia em uma partícula de RNP (ribonucleoproteína). Em algumas modalidades, as partículas incluem ainda um DNA de filamento simples para inserção direcionada nos lo- cos de HPRT rompidos.
[00143] Síndrome de Lesch-Nyhan é um distúrbio genético raro do metabolismo de purina devido a mutações funcionais no gene de HPRT. As mutações que resultam na síndrome de Lesch-Nyhan são altamente heterogêneas e proporcionam alvos funcionais para CRISPR/Cas9 e outras abordagens de edição de genes para edição de genes ex vivo de células T, células T progenitoras, células HSC e progenitoras (Gasperini, M., G.M. Findlay, A. McKenna, J.H. Milbank, C. Lee, M.D. Zhang, D.A. Cusanovich, e J. Shendure. 2017. CRISPR/ Cas9-Mediated Scanning for Regulatory Elements Required for HPRT1 Expression via Thousands of Large, Programmed Genomic Deletions. The American Journal of Human Genetics 101:192-205). Uma muta- ção nova fora identificada no éxon 4 de HPRT1 que se acredita causar junção aberrante e perda da função de HPRT. Em algumas modalida- des, a mutação natural poderia ser explorada para reproduzir o erro de spicing usando uma abordagem de edição de genes (Baba, Shimpei Saito, Takashi Yamada, Yasukazu Takeshita, Eri Nomura, Noriko Ya- mada, Kenichiro Wakamatsu, Nobuaki Sasaki, Masayuki Nucleosides Nucleotídeos Nucleic Acids Nucleosides, Nucleotíides & Nucleic Acids, 2017, Vol.36(1), p.1-6.
[00144] Nanocápsulas direcionadas para essses tipos específicos de células podem propocionar uma distribuição in vivo eficiente. Mae- der ML et al. Genome-editing Technologies for Gene and Cell Therapy, Mol Ther. 2016 Mar;24(3):430-46), descrevem várias técnicas de edi- ção de genes, incluindo métodos mediados pela CRISPR/Cas9 nu- clease, e estas divulgações cujas íntegras encontram-se aqui incorpo- radas a título de referência.
[00145] Outras técnicas de edição de genes que usam certas nu- cleases estão descritas nas Patentes US Nº* 8,895,264, 9,616,090,
9,624,498, 9,650,648 e 9,22105 e no Pedido PCT Nº PCT/US12/61896, cujas íntegras encontram-se aqui incorporadas a título de referência. Em algumas modalidades, é possível utilizar uma proteína dedo-de-zinco (ZFP) que se liga a um sítio-alvo em um gene de HPRT em um genoma, onde a ZFP compreende um ou mais domí- nios de ligação de dedo-de-zinco geneticamente manipulados. Em al- gumas modalidades, ZFPs são usados como um par de nucleases de dedo-de-zinco (ZFNs) que dimerizam e em seguida clivam uma região genômica alvo de interesse, onde as ZFNs compreendem um ou mais domínios de ligação de dedo-de-zinco geneticamente manipulados e um domínio de clivagem ou meio domínio de clivagem de nucleases. Uma "proteína de ligação de DNA de dedo-de-zinco" (ou domínio de ligação) é uma proteína, ou um domínio dentro de uma proteína maior, que liga o DNA de maneira específica para sequência através de um ou mais dedos-de-zinco, que são regiões da sequência de aminoáci- dos dentro do domínio de ligação cuja estrutura é estabilizada através da coordenação de íon de zinco. O termo proteína de ligação de DNA de dedo-de-zinco geralmente é abreviado por proteína dedo-de-zinco ou ZFP. Em algumas modalidades, a edição de genes é realizada usando uma proteína de fusão compreendendo uma proteína dedo-de- zinco que se liga a um gene endógeno de hipoxantina-guanina HPRT e a um domínio de clivagem, onde a proteína de fusão modifica o gene de HPRT endógeno. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão compreendendo uma ZFP pode ser incorporada em uma nanocápsula para distribuição, a ligação de ZFP sendo capaz de se ligar a um sítio- alvo em uma região de interesse em um locos de HPRT.
[00146] Em algumas modalidades, é possível utilizar uma proteína TALE (efetor semelhante ao ativador de transcrição) que se liga ao sítio-alvo em um gene de HPRT em um genoma, onde a TALE com- preende um ou mais domínios de ligação de DNA de TALE manipula-
dos geneticamente. Em algumas modalidades, a TALE é uma nu- clease (TALEN) que cliva uma região genômica alvo de interesse, on- de a TALEN compreende um ou mais domínios de ligação de DNA de TALE manipulados geneticamente e um domínio de clivagem ou meio domínio de clivagem de nuclease. Domínios de clivam e meios domí- nios de clivagem de ZFNs e/ou de TALENs podem ser obtidos, por exemplo, a partir de várias endonucleases de restrição e/ou de endo- nucleases residentes. Em algumas modalidades, os meios domínios de clivagem são derivados de uma endonuclease de restrição Tipo IIS (por exemplo, Fok |). A eficiência do nocaute de TAL, dos métodos de edição de genes por CRISPR/Cas9 e das abordagens de derrubamen- to de siRNA que resultam em perda de expressão do gene funcional de HPRT é determinada por HPRT qPCR. O derrubamento da expres- são de HPRT usando o miRNA2Z11-3g está mostrado na FIG. 27.
[00147] Em outras modalidades, utiliza-se um vetor codificando um RNA guia direcionado para HPRT.
[00148] Em ainda outras modalidades, uma arquitetura de nuclease híbrida que combina uma TALE com a especificidade para sequências de clivagem de um domínio de clivagem de meganuclease, neste pe- dido doravante denominada a "megaTAL." Em algumas modalidades, a megaTAL é fornecida pela fusão de domínios efetores mínimos de TAL ao terminal N de uma meganuclease derivada da família de en- donucleases residentes LAGLIDADG. Em algumas modalidades, uma megaTAL manipulada geneticamente para nocautear o HPRT. Méto- dos manipulação genética de uma megaTAL adequada estão descritos por "Boissel S, Jarjour J, Astrakhan A, et al. megaTALs: A Rare- Cleaving Nuclease Architecture for Therapeutic Genome Engineering. Nucleic Acids Research. 2014;42(4):2591-2601," cuja íntegra encon- tra-se aqui incorporada a título de referência.
[00149] As nucleases, os polinucleotídeos codificando estas nu-
cleases, polinucleotídeos doadores e composições compreendendo as proteínas e/ou os polinucleotídeos descritos neste pedido podem ser distribuídos in vivo ou ex vivo por qualquer meio adequado, por exem- plo, métodos de distribuição das nucleases descritas neste pedido es- tão descritos, por exemplo, nas Patentes US Nº* 6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; e 7,163,824, cujas íntegras encontram-se aqui incorporadas a título de referência. Células hospedeiras
[00150] A presente invenção também apresenta uma célula hospe- deira compreendendo os novos vetores de expressão da presente in- venção. Uma "célula hospedeira" ou "célula-alvo" significa uma célula que deve ser transformada por meio dos métodos e vetores de ex- pressão da presente invenção. Em algumas modalidades, as células hospedeiras são células de mamíferos nas quais o vetor de expressão pode ser expresso. Células de mamíferos adequadas incluem, porém sem limitação, células humanas, células murinas, células de primatas não humanos (por exemplo, células de macado rhesus), células pro- genitoras humanas ou células-tronco, células 293, células HeLa, célu- las D17, células MDCK, células BHK, e células Cf2Th. Em certas mo- dalidades, a célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão da invenção é uma célula hematopoiética, tal como uma célula proge- nitora/célula-tronco hematopoiética (por exemplo, célula progenito- ra/célula-tronco hematopoiética CD34-positiva (HPSC)), um monócito, um macrófago, uma célula mononuclear de sangue periférico, um lin- fócito T CD4+, um linfócito T CD8+ T, ou uma célula dendrítica.
[00151] As células hematopoiéticas (por exemplo, HPSC, linfócitos T CD4+, linfócitos T CD8+ T, e/ou monócitos/macrófagos) a serem transduzidos com um vetor de expressão da invenção podem ser alo- gênicas, autólogas, ou de um parente compatível, as HPSC são, em algumas modalidades, CD34-positivas e podem isoladas da medula óssea ou do sangue periférico do paciente. A HPSC CD34-positiva iso- lada (e/ou outra célula hematopoiética descrita neste pedido) é, em algumas modalidades, transduzida com um vetor de expressão des- crito neste pedido.
[00152] Em algumas modalidades, as células hospedeiras ou célu- las hospedeiras transduzidas são combinadas com um veículo farma- ceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, as células hospe- deiras ou células hospedeiras transduzidas são formuladas com PLASMA-LYTE A (por exemplo, uma solução isotônica estéril e não pirogênica para administração intravenosa; onde um litro de PLASMA- LYTE A tem uma concentração iônica de 140 mEq de sódio, 5 mEq de potássio, 3 mEq de magnésio, 98 mEq de cloreto, 27 mEq de acetato, e 23 mEq de gluconato). Em outras modalidades, as células hospedei- ras ou células hospedeiras transduzidas são formuladas em uma solu- ção de PLASMA-LYTE A, a solução compreendendo entre cerca de 8% e cerca de 10% de dimetil sulfóxido (DMSO). Em algumas modali- dades, menos de cerca de 2x107 células hospedeiras/células hospe- deiras transduzidas estão presentes por mL de uma formulação inclu- indo PLASMA-LYTE A e DMSO.
[00153] Em algumas modalidades, as células hospedeiras ficam substancialmente deficientes em HPRT depois de transdução com um vetor de acordo com a presente invenção, por exemplo, tendo pelo menos uma redução de 50% na expressão de HPRT. Em algumas modalidades, as células hospedeiras incluem uma molécula de ácido nucleico incluindo pelo menos uma dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ou SEQ ID NO: 3. Composições farmacêuticas
[00154] A presente invenção também apresenta composições, in- cluindo composições farmacêuticas, compreendendo um ou mais veto-
res de expressão e/ou veículos de distribuição não virais (por exemplo, nanocápsulas) descritos neste pedido. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem uma quantidade eficaz de pelo menos um dos vetores de expressão e/ou dos veículos de distri- buição não virais descritos neste pedido e um veículo farmaceutica- mente aceitável. Por exemplo, em certas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma quantidade eficaz de um vetor de ex- pressão e um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma quantidade eficaz pode ser facilmente determinada pelos especialistas na técnica com base em fatores tais como tamanho do corpo, peso corporal, ida- de, saúde, sexo do indivíduo, etnia, e títulos virais.
[00155] As expressões "farmaceuticamente aceitável" ou "farmaco- logicamente aceitável" referem-se a entidades moleculares e composi- ções que não produzem reações adversas, alérgicas, ou outras rea- ções indesejadas quando adminihstradas a um animal ou a um ser humano. Por exemplo, um vetor de expressão pode ser formulado com um veículo farmaceuticamente aceitável. Conforme usado neste pedi- do, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui solventes, tampões, soluções, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores da absorção, entre outros, aceitáveis para uso na formulação de fármacos, tais como fár- macos adequados para administração a seres humanos. Métodos para a formulação de compostos com veículos farmacêuticos são conheci- dos na literatura e estão descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Science, (17th ed. Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1985); e Goodman & Gillman's: The Pharmacological Basis of The- rapeutics (11th Edition, McGraw-Hill Professional, 2005); cujas ínte- gras encontram-se aqui incorporadas a título de referência.
[00156] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas podem compreender qualquer um dos vetores de expressão, nano-
cápsulas, ou composições descritas neste pedido em qualquer con- centração que possibilit o silenciamento do ácido nucleico administra- do até atingir uma concentração na faixa de cerca de 0,1 mg/kg a cer- ca de 1 mg/kg. Em algumas modalidades, as composições farmacêuti- cas podem compreender o vetor de expressão em uma quantidade de cerca de 0,1% a cerca de 99,9% em peso. Veículos farmaceuticamen- te aceitáveis adequados para inclusão em qualquer composição far- macêutica incluem água, água tamponada, soluções salinas tais como, por exemplo, solução salina normal ou soluções salinas balanceadas tais como soluções balanceadas de Hank ou de Earle), glicina, ácido hialurônico etc. A composição farmacêutica pode ser formulada para administração parenteral, tal como administração intravenosa, intra- muscular ou subcutânea. As composições farmacêuticas para adminis- tração parenteral podem compreender soluções, dispersões, suspen- sões ou emulsões aquosas ou não aquosas estéreis e farmaceutica- mente aceitáveis, assim como pós estéreis para reconstituição em so- luções ou dispersões injetáveis estéreis. Exemplos de veículos, sol- ventes, diluentes ou veículos aquosos e não aquosos adequados in- cluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polieti- leno glicol etc.), carboximetilcelulose e misturas dos mesmos, óleos vegetais (tal como óleo de oliva), ésteres orgânicos injetáveis (por exemplo, oleato de etila).
[00157] A composição farmacêutica pode ser formulada para admi- nistração oral. Formas de dosagem orais para administração oral po- dem incluir, por exemplo, comprimidos, drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos. Nestas formas de dosagem, a composição pode compreen- der pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável tal como citra- to de sódio e/ou fosfato dicálcio e/ou cargas ou redutores tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol, e ácido silícico; aglutinan- tes tais como carboxilmetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirroli-
dona, sacarose e acácia; umectantes tais como glicerol; agentes de- sintegrantes tal como agar-agar, carbonato de cálcio, amido de batata ou de tapioca, ácido algínico, silicatos, e carbonato de sódio; agentes umidificantes tais como álcool acetílico, monoestearato de glicerol; ab- sorventes tais como as argilas caulim e bentonita; e/ou lubrificantes tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietileno glicol sólido, lauril sulfato de sódio, e misturas dos mesmos. As formas de dosagem líquidas para administração oral podem incluir, por exem- plo, emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuti- camente aceitáveis. As formas de dosagem líquidas podem incluir di- luentes inertes tais como água ou outros solventes, agentes solubili- zantes e/ou emulsificantes tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de ben- zila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, dimetil formamida, óleos (tais como, por exemplo, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de germe, óleo de rícino, óleo de oliva, óleo de gergelim), glicerol, ál- cool tetra-hidrofurfurílico, polietileno glicóis e ésteres de ácidos graxos de sorbitana, e misturas dos mesmos.
[00158] As composições farmacêuticas podem compreender melho- radores de penetração para melhorar sua distribuição. Melhoradores de penetração podem incluir ácidos graxos tais como ácido oleico, áci- do láurico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteá- rico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, reclineato, mono- oleína, dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidônico, 1-monocaprato de glicerila, mono- e diglicerídeos e sais fisiologicamente aceitáveis dos mesmos. As composições podem incluir ainda agentes quelantes tais como, por exemplo, ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA), áci- do cítrico, salicilatos (por exemplo, salicilato de sódio, 5-metoxis- salicilato, homovanilato).
[00159] As composições farmacêuticas podem compreender qual-
quer um dos vetores de expressão revelados neste pedido em uma forma encapsulada. Por exemplo, os vetores de expressão podem ser encapsulados em polímeros biodegradáveis tais como polilactídeo- poliglicolídeo, poli(ortoésteres) e polifanidridos), ou podem ser encap- sulados em lipossomas ou dispersados em uma microemulsão. Os |i- possomas podem ser, por exemplo, lipofectina ou lipofectamina. Em um outro exemplo, uma composição pode compreender os vetores de expressão revelados neste pedido em minicélulas bacterianas anucle- adas ou sobre as mesmas (Giacalone et al., Cell Microbiology 2006, 8(10): 1624-33). Os vetores de expressão divulgados neste pedido po- dem ser combinados com nanopartículas.
KITS
[00160] Em algumas modalidades apresenta-se um Kkit compreen- dendo um vetor de expressão ou uma composição compreendendo um vetor de expressão descrito neste pedido. O kit pode incluir um re- cipiente, onde o recipiente pode ser uma garrafa compreendendo o vetor de expressão ou a composição em uma forma de dosagem oral ou parenteral, cada forma de dosagem compreendendo uma dose uni- tária do vetor de expressão. O kit pode compreender um rótulo ou si- milar, indicando tratamento de um indivíduo de acordo com os méto- dos descritos neste pedido.
[00161] Em algumas modalidades, o kit pode incluir agentes ativos adicionais. Os agentes ativos adicionais podem ser acondicionados em um recipiente diferente daquele que abriga o vetor ou a composi- ção compreendendo o vetor. Por exemplo, em algumas modalidades, O kit pode compreender uma ou mais doses de um análogo de purina (por exemplo, 6TG) e opcionalmente instruções para dosagem do aná- logo de purina para condicionamento e/ou quimiosseleção (como as etapas descritas mais adiante neste pedido). Em outras modalidades, O kit pode compreender uma ou mais doses de MTX or MPA e opcio-
nalmente instruções para dosagem do MTX ou MPA para seleção ne- gativa como descrito neste pedido.
[00162] Em ainda outras modalidades, o kit pode incluir uma ou mais imunotoxinas internalizantes ou conjugados de anticorpo-droga, tais como aqueles descritos nas Publicações de Patentes US Nºº 2017/0360954 e 2018/0147294; e nas Publicações PCT Nº WO/2017/219025 e WO/2017/219029, cujas íntegras encontram-se aqui incorporadas a título de referência. Em algumas modalidades, o kit pode incluir uma imunotoxina selecionada dentra exotoxina A de pseudomonas, deBouganin, toxina diftérica, uma amatoxina, tal como a-amanitina, saporina, maitansina, um maitansinoide, uma auristatina, uma antracíclina, uma caliqueamicina, irinotecan, SN-38, uma duo- carmicina, uma pirrolobenzodiazepina, um dímero de pirrolobenzodia- zepina, uma indolinobenzodiazepina, ou um dímero de indolinobenzo- diazepina, Ricina-A ou uma variante das mesmas. Em algumas moda- lidades, o kit pode incluir saporina.
Métodos de tratamento
[00163] Os métodos e as composições divulgados neste pedido são para modificar a expressão de uma proteína ou corrigir uma sequência gênica aberrante que codifica uma proteína expressa em uma doença genética, tal como uma doença de células falciformes ou uma talas- semia. Em algumas modalidades, o gene terapêutico apresentado nos vetores da presente invenção é usado para tratar deficiências imunes, doenças hereditárias, doenças do sangue (por exemplo, hemofilia, dis- túrbios de hemoglobina), doenças do armazenamento lisossômico, doenças neurológicas, distúrbios angiogêncios, ou câncer. Embora nenhuma referência específica possa ser feita ao tratamento genético de anemia de células falcifomes ou B-talassemia, a presente invenção não está limitada a métodos para tratar apenas aquelas doenças. As- sim sendo, em algumas modalidades, o método de tratamento de defi-
ciências imunes, doenças hereditárias, doenças do sange (por exem- plo, hemofíilia, distúrbios de hemoglobina), doenças do armazenamen- to lisossômico, doenças neurológicas, distúrbios angiogêncios, ou câncer compreende (i) transduzir HSCs incluindo, HSCs autólogas, HSCs alogênicas, HSCs compatíveis de parentes, etc. com um vetor compreendendo pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos, a saber, uma sequência de ácidos nucleicos codificando um agente para diminuir a expressão de HPRT, e uma sequência de ácidos nucleicos codificando um gene terapêutico, e (ii) administrar as HSCs transduzi- das a um indivíduo mamífero.
[00164] A título de exemplo, um vetor de expressão incluindo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um gene de gama-globina (tal como descrito neste pedido) pode ser administrado para corrigir geneticamente uma doença de células falciformes ou B-talassemia, ou reduzir sintomas das mesmas. Em algumas modalidades, uma popu- lação de células hospedeiras transduzidas com um vetor de expressão incluindo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um gene de gama-globina pode ser administrada para corrigir geneticamente uma doença de células falciformes ou B-talassemia, ou reduzir sintomas das mesmas. Acredita-se que a correção genética de HSCs com um vetor codificando o gene de gama globina resultaria em uma produção contínua (i.e., permanente) da HbF anti-falciforme, dessa forma preve- nindo ou mitigando a falciformação de células sanguíneas vermelhas por toda a vida do individuo. Acredita-se que este método seja vanta- joso em relação às terapias atualmente disponíveis, incluindo sua dis- ponibilidade para todos os pacientes, particularmente aqueles não têm um parente doador compatível, e o fato de que seria um tratamento único, resultando em correção permanente. Também se acredita que o método seja vantajosamente destituído de efeitos colaterais imunes, e caso surjam efeitos colaterais, os efeitos colaterais poderiam ser miti-
gados pela administração de MTX ou MPA, como observado neste pedido. Acredita-se ainda que uma terapia genética eficaz revoluciona- ria a maneira como SDC é tratada e melhoraria os desfechos de paci- entes com este distúrbio devastadr.
[00165] Como observado neste relatório, além do gene terapêutico, os vetores de expressão da presente invenção incluem um agente de- senhado para diminuir a expressão de HPRT (por exemplo, um SshRNA para HPRT para efetuar o derrubamento da expressão de HPRT), e assim oferecer uma estratégia de quimiosseleção in vivo que explora o papel essencial que o HPTR desempenha na metabolização de análo- gos de purina, por exemplo, 6TG, em agentes mielotóxicos. Como a deficiência em HPRT não prejudica o desenvolvimento ou a função das células hematopoiéticas, ela pode ser removida das células hema- topoiéticas usadas para transplante. Condicionamento e quimiossele- ção com um análogo de purina estão discutidos mais adiante neste relatório.
[00166] No contexto do tratamento da doença de células falciformes ou B-talassemia (ou redução dos sintomas da doença de células falci- formes ou B-talassemia), e com referência à FIG. 2, o tratamento de um indivíduo inclui: identificar um indivíduo com necessidade de trata- mento; transduzir HSCs (por exemplo, HSCs autólogas, HSCs alogê- nicas, HSCs compatíveis de parentes) com um vetor de expressão (por exemplo, um vetor lentiviral) da presente invenção (etapa 120); e transplante ou administração das HSCs transduzidas no indivíduo (etapa 140). Em algumas modalidades, o indivíduo com necessidade de tratamento é um indivíduo que sofre de SCD sintomática severa.
[00167] Em algumas modalidades, o método de tratamento de he- moglobinopatias compreende (i) transduzir HSCs com um vetor com- preendendo pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos, a sa- ber, uma sequência de ácidos nucleicos codificando um sShRNA para derrubar o gene de HPRT, e uma sequência de ácidos nucleicos codi- ficando um gene de gama globina, e (ii) administrar as HSCs transdu- zidas a um indivíduo mamífero. Em algumas modalidades, a sequên- cia de ácidos nucleicos codificando o ShRNA compreende a sequência de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o gene de gama globina compreende a sequên- cia de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, o método compre- ende ainda uma etapa de condicionamento mieloablativo antes da administração das HSCs transduzidas (por exemplo, usando um aná- logo de purina, quimioterapia, radioterapia, tratamento com uma ou mais imunotoxinas internalizantes ou conjugados de anticorpo-droga, ou qualquer combinações dos memos). Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de quimiosseleção in vivo utilizan- do um análogo de purina (por exemplo, 6TG) subsequente à adminis- tração das HSCs transduzidas. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de seleção negativa utilizando MTX ou MPA caso surjam efeitos colaterais (por exemplo, GVHD).
[00168] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um método de tratamento de hemoglobinopatias compreendendo ad- ministrar uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica a um indivíduo mamífero (por exemplo, um paciente humano), onde a composição farmacêutica inclui um vetor de expressão compreenden- do pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em um outro aspecto da presente des- crição encontra-se um método de tratamento de hemoglobinopatias compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma composi- ção farmacêutica a um indivíduo mamífero (por exemplo, um paciente humano), onde a composição farmacêutica inclui uma população de células hospedeiras transduzidas com um vetor de expressão compre- endendo pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos, e um veí-
culo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor de expressão lentiviral incluindo um primeiro ácido nucleico codificando um RNAi para derrubar o gene de HPRT; e um segundo ácido nucleico codificando um gene terapêutico (por exemplo, um gene de gama globina). Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos codificando o gene de gama globina com- preende a sequência de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, o método compreende ainda uma etapa de condicionamento mieloabla- tivo antes da administração das HSCs transduzidas. Em algumas mo- dalidades, o método compreende ainda a etapa de quimiosseleção in vivo utilizando 6TG subsequente à administração das HSCs transduzi- das. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de seleção negativa utilizando MTX ou MPA caso surjam efeitos cola- terais (por exemplo, GVHD).
[00169] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um método para tratar SCD sintomática severa, ou reduzir ou melhorar um ou mais sintomas de SCD sintomática severa, compreendendo (i) transduzir HSCs com um vetor compreendendo pelo menos duas se- quências de ácidos nucleicos, a saber uma sequência de ácidos nu- cleicos codificando um sShRNA para derrubar o gene de HPRT, e uma sequência de ácidos nucleicos codificando um gene de gama globina, e (ii) administrar as HSCs transduzidas a um indivíduo mamífero. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA compreende a sequência de SEQ ID NO: 30. Em algumas mo- dalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o gene de ga- ma globina compreende a sequência de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, o método compreende ainda uma etapa de condiciona- mento mieloablativo antes da administração das HSCs transduzidas (por exemplo, usando um análogo de purina, quimioterapia, radiotera- pia, tratamento com uma ou mais imunotoxinas internalizantes ou con-
jugados de anticorpo-droga, ou qualquer combinação dos mesmos). Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de quimiosseleção in vivo utilizando um análogo de purina (por exemplo, 6TG) subsequente à administração das HSCs transduzidas. Em algu- mas modalidades, o método compreende ainda a etapa de seleção negativa utilizando MTX ou MPA caso surjam efeitos colaterais (por exemplo, GVHD). Em algumas modalidades, o tratamento reduz ou melhora pelo menos um dentre síndrome torácica aguda, episódios de dor severa, priapismo recorrente, aloimunização de células vermelhas, e/ou eventos neurológicos.
[00170] Em algumas modalidades, a hemoglobina fetal pós- transplante excede pelo menos 20%; as células F constituem pelo me- nos 2/3 das células sanguíneas vermelhas circulantes, a hemoglobina fetal por células é responsável por pelo menos 1/3 da hemoglobina total nas células sanguíneas vermelhas falciformes; e pelo menos 20% das HSCs de genes modificados repopulam a medula óssea do indiví- duo. Em algumas modalidades, a hemoglobina fetal pós-transplante excede 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, ou mais. Em algumas moda- lidades, a hemoglobina fetal pós-transplante excede 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou mais. Em algumas modalidades, as células F constituem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou mais das células sanguíneas vermelhas circulantes. Em algumas modalidades, a hemoglobina fetal por células é responsável por pelo menos 1/3 da hemoglobina total nas células sanguíneas vermelhas falciformes. Em algumas modalidades, a hemoglobina fetal por células é responsável pelo por menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais da hemoglobina total nas células sanguíneas vermelhas falciformes. Em algumas modalidades, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou mais das HSCs de genes modificados repopulam a medula óssea do indivíduo.
[00171] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um método para tratar deficiências imunes, doenças hereditárias, do- enças do sange (por exemplo, hemofilia, distúrbios de hemoglobina), doenças do armazenamento lisossômico, doenças neurológicas, dis- túrbios angiogêncios, ou câncer compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um vetor a um indivíduo mamífero, o vetor com- preendendo pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos, a sa- ber, uma sequência de ácidos nucleicos codificando um RNAi para derrubar o gene de HPRT, e uma sequência de ácidos nucleicos codi- ficando um gene terapêutico.
Condicionamento e quimiosseleção com um análogo de purina
[00172] Em algumas modalidades, o método de tratamento com- preende as etapas adicionais de (i) condicionamento antes do trans- plante de HSCs; e/ou (ii) quimiosseleção in vivo. Uma ou ambas as etapas podem utilizar um análogo de purina, em algumas modalida- des, o análogo de purina é 6TG. Acredita-se que as HSCs contendo gene de gama-globina enxertadas com deficiência de atividade de HPRT sejam altamente resistentes aos efeitos citotóxicos do análogo introduzido. Com uma estratégia combinada de condicionamento e quimiosseleção, é possível obter uma enxertia alta e eficiente de HSCs contendo gene terapêutico deficiente em HPRT (por exemplo, gene de gama globina) com baixa toxicidade geral. Acredita-se que a expres- são resultante do gene terapêutico (por exemplo, gene de gama globi- na), combinada com a enxertia melhorada e a quimiosseleção de HSCs de genes modificados, pode resultar em produção suficiente de proteínas para corrigir deficiências imunes, doenças hereditárias, do- enças do sange (por exemplo, hemofilia, distúrbios de hemoglobina), doenças do armazenamento lisossômico, doenças neurológicas, dis- túrbios angiogêncios, ou câncer (e, no caso da produção da proteína gama-globina, formação de hemoglobina fetal suficiente para corrigir SCD e/ou beta talassemia).
[00173] 6TG é um análogo de purina tendo atividades tanto anti- câncer quanto imunossupressoras. A tioguanina compete com a hi- poxantina e a guanina pela enzima hipoxantina-guanina fosforibosil- transferase (HGPRTase) e é ela própria convertida em ácido 6- tioguanílico (TGMP). Este nucleotídeo atinge concentrações intracelu- lares altas em doses terapêuticas. O TGMP interfere em vários pontos na síntese de nucleotídeos de guanina. Ele inibe a biossíntese de novo da purina pela inibição da pseudo-retroalimentação de glutamina-5- fosforibosilpirofosfatoamidotransferase - a primeira enzima exclusiva da via de novo para o ribonucleotídeo de purina. O TGMP também ini- be a conversão de ácido inosínico (IMP) em ácido xantílico (XMP) por competição pela enzima IMP desidrogenase. No passado, o TGMP foi considerado um inibidor significativo de ATP : GMP fosfotransferase (guanilato quinase), mas resutlados recentes mostraram que este não é o caso. O ácido tioguanílico é ainda convertido nos di- e trifosfatos, tioguanosina difosfato (TGDP) e tioguanosina trifosfato (TGTP) (assim como seus análogos 2'-desoxirribosílicos) pelas mesmas enzimas que metabolizam os nucleotídeos de guanina.
[00174] Como será observado pelos especialistas na técnica, com a inclusão de um agente desenhado para reduzir a expressão de HPRT, por exemplo, um agente RNAi para derrubar o HPRT, nos vetores da presente invenção, as HSCs transduzidas resultantes são deficientes em HPRT ou substancialmente deficientes em HPRT. Assim sendo, aquelas HSCs que expressam HPRT, i.e., células de HPRT do tipo selvagem, podem ser seletivamente depletadas pela administração de uma ou mais doses de 6TG. Em algumas modalidades, o 6TG pode ser administrado tanto para condicionamento mieloablativo de recepto- res de HPRT do tipo selvagem quanto para o processo de quimiosse-
leção in vivo de células doadoras. Logo, acredita-se que esta estraté- gia possibilita a seleção de células de genes modificados in vivo, i.e, a seleção de células de genes modificados contendo gama-globina in vivo.
[00175] Com relação à FIG. 2, em algumas modalidades, depois da coleta de HSCs de um doador (etapa 110), as HSCs são transduzidas com um vetor de acordo com a presente invenção (etapa 120). As HSCs resultantes são deficientes em HPRT e expressam o gene tera- pêutico, por exemplo, o gene de gama globina. Paralelamente, um pa- ciente que vai receber as HSCs é primeiro tratado com uma etapa de condicionamento mieloablativo (etapa 130). Depois do condicionamen- to, as HSCs transduzidas são transplantadas ou administradas ao pa- ciente (etapa 140). As HSCs contendo gene terapêutico (por exemplo, gene de gama globina) podem ser selecionadas para uso in vivo (eta- pa 150) usando 6TG, como discutivo neste pedido.
[00176] O condicionamento mieloablativo pode ser obtido por meio de radiação de condicionamento de dose elevada, quimioterapia, e/ou tratamento com um análogo de purina (por exemplo, 6TG). Em algu- mas modalidades, as HSCs são administradas entre cerca de 24 e cerca de 96 horas depois do tratamento com o esquema de condicio- namento. Em outras modalidades, o paciente é tratado com o enxerto de HSCs entre cerca de 24 e cerca de 72 horas depois do tratamento com o esquema de condicionamento. Em ainda outras modalidades, o paciente é tratado com o enxerto de HSCs entre cerca de 24 e cerca de 48 horas depois do tratamento com o esquema de condicionamen- to. Em algumas modalidades, o enxerto de HSCs compreende entre cerca de 2 x 10º células/kg a cerca de 15 x 10º células/kg (peso corpo- ral do paciente). Em algumas modalidades, o enxerto de HSCs com- preende um mínimo de 2 x 10º células/Kkg, com um alvo sendo mais de 6 x 106 células/kg. Em algumas modalidades, pelo menos 10% das células administradas são transduzidas com um vetor lentiviral descrito neste pedido. Em algumas modalidades, pelo menos 20% das células administradas são transduzidas com um vetor lentiviral descrito neste pedido. Em algumas modalidades, pelo menos 30% das células admi- nistradas são transduzidas com um vetor lentiviral descrito neste pedi- do. Em algumas modalidades, pelo menos 40% das células adminis- tradas são transduzidas com um vetor lentiviral descrito neste pedido. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células administradas são transduzidas com um vetor lentiviral descrito neste pedido.
[00177] Em algumas modalidades, as HSCs deficientes em HPRT e contendo gene terapêutico são selecionadas para uso in vivo em um esquema de baixa dose de 6TG, que se acredita ter efetios adversos mínimos nos tecidos extra-hematopoiéticos. Em algumas modalidades, uma dosagem de 6TG para quimiosseleção in vivo variando entre cer- ca de 0,2 mg/kg/dia e cerca de 0,6 mg/kg/dia é apresentada ao pacien- te depois da introdução das HSCs no paciente. Em algumas modali- dades, a dosagem varia entre cerca de 0,3 mg/kg/dia e cerca de 1 mg/kg/dia. Em algumas modalidades, a dosagem é de até cerca de 2 mg/kg/dia.
[00178] Em algumas modalidades, a quantidade de 6TG adminis- trada por dose baseia-se na determinação da atividade da enzima HPRT do paciente. Os especialistas na técnica vão perceber que aqueles que apresentam níveis mais altos de atividade da enzima HPRT podem receber doses com quantidades mais baixas de 6TG. Quanto mais alto o nível de HPRT, maior a conversão de 6TG em me- tabólitos tóxicos. Portanto, seria necessário administrar a dose mais dose para atingir o mesmo objetivo.
[00179] A medição de genótipos de TPMT e/ou da atividade da en- zima TPMT antes de estabelecer o condicionamento com 6TG pode identificar indivíduos com atividade baixa ou ausente da enzima TPMT.
Assim sendo, em outras modalidades, a quantidade de 6TG adminis- trada baseia-se nos níveis de tiopurina S-metiltransferase (TPMT) ou no genótipo da TPMT.
[00180] Em algumas modalidades, a dosagem de 6TG para quimi- osseleção in vivo é administrada ao paciente uma a três vezes por semana em um esquema com um ciclo selecionado do grupo que con- siste em: (i) uma vez por semana; (ii) em semanas intercaladas; (iii) uma semana de terapia seguida por duas, três ou quatro semanas sem terapia; (iv) duas semanas de terapia seguidas por uma, duas, três ou quatro semanas sem terapia; (v) três semanas de terapia se- guidas por uma, duas, três, quatro ou cinco semanas sem terapia; (vi) quatro semanas de terapia seguidas por uma, duas, três, quatro ou cinco semanas sem; (vii) cinco semanas de terapia seguidas por uma, duas, três, quatro ou cinco semanas sem terapia ; e (viii) uma vez por mês.
[00181] Em algumas modalidades, entre cerca de 3 e cerca de 10 dosagens de 6TG são administradas ao paciente por um período de administração variando de 1 semana a cerca de 4 semanas. Em algu- mas modalidades, 4 ou 5 dosagens de 6TG são administradas ao pa- ciente por um período de 14 dias. Seleção negativa com MTX ou MPA
[00182] Além disso, as células deficientes em HPRT podem ser ne- gativamente selecionadas usando metotrexato (MTX) para inibir a en- zima di-hidrofolato redutase (DHFR) na via sintética de novo da purina. Isto foi desenvolvido como um procedimento de segurança para elimi- nar as HSCs de genes modificados no caso de serem observados efei- tos adversos inesperados. Assim sendo, e com relação à FIG. 2, caso surjam efeitos colaterais adversos, o paciente deve ser tratado com MTX ou com ácido micofenólico (MPA) (etapa 160). Efeitos colaterais adversos incluem, por exemplo, contagens sanguíneas/expansão clo-
nal aberrantes indicando mutagênese insercional em um clone especí- fico de células ou ciclone de citocinas.
[00183] Acredita-se que MTX ou MPA inibam de forma competitiva a di-hidrofolato redutase (DHFR), uma enzima que participa na síntese de tetra-hidrofolato (THF). A DHFR catalisa a convrsão de di- hidrofolato em tetra-hidrofolato ativo. É necessário ácido fólico para a síntese de novo da nucleosídeo timidina, requerida para a síntese de DNA. Ainda, o folato é essencial para a biossíntese das bases purina e pirimidina, assim a síntese será inibida. MTX ou MPA inibem, portanto, a síntese de DNA, RNA, timidilatos, e proteínas. MTX ou MPA blo- queiam a via de novo inibindo o DHFR. Nas células HPRT-/-, não exis- tem vias de salvamento ou de novo funcionais, o que leva a não ocor- rer síntese da purina e, portanto, as células morrem. No entanto, as células do tipo selvagem de HPRT possuem uma via de salvamento funcional, ocorrendo síntese da purina e as células sobrevivem.
[00184] Dada a sensibilidade das HSCs modificadas produzidas de acordo com a presente invenção, MTX ou MPA podem ser usados pa- ra eliminar de forma seletiva as células deficientes em HPRT. Em al- gumas modalidades, o MTX ou MPA é administrado como uma dose única. Em algumas modalidades, são administradas múltiplas doses de MTX ou MPA.
[00185] Em algumas modalidades, uma quantidade de MTX admi- nistrada varia de cerca de 2 mg/m?/infusão a cerca de 100 mg/m?/in- fusão. Em algumas modalidades, uma quantidade de MTX administra- da varia de cerca de 2 mg/m?/infusão a cerca de 90 mg/m?/infusão. Em algumas modalidades, uma quantidade de MTX administrada varia de cerca de 2 mg/m?/infusão a cerca de 80 mg/m?/infusão. Em algumas modalidades, uma quantidade de MTX administrada varia de cerca de 2 mg/mº?/infusão a cerca de 70 mg/m?/infusão. Em algumas modalida- des, uma quantidade de MTX administrada varia de cerca de 2 mg/m?/
infusão a cerca de 60 mg/m?/infusão. Em algumas modalidades, uma quantidade de MTX administrada varia de cerca de 2 mg/m?/infusão a cerca de 50 mg/m?/infusão. Em algumas modalidades, uma quantida- de de MTX administrada varia de cerca de 2 mg/m?/infusão a cerca de 40 mg/m?infusão. Em algumas modalidades, uma quantidade de MTX administrada varia de cerca de 2 mg/m?/infusão a cerca de 30 mg/m?/ infusão. Em algumas modalidades, uma quantidade de MTX adminis- trada varia de cerca de 20 mg/m?/infusão a cerca de 20 mg/m?/ infu- são. Em algumas modalidades, uma quantidade de MTX administrada varia de cerca de 2 mg/m?/infusão a cerca de 10 mg/m?/infusão. Em algumas modalidades, uma quantidade de MTX administrada varia de cerca de 2 mg/m?/infusão a cerca de 8 mg/m?/infusão. Em outras mo- dalidades, uma quantidade de MTX administrada varia de cerca de 2,5 mg/mº?/infusão a cerca de 7,5 mg/m?/infusão. Em ainda outras modali- dades, a quantidade de MTX administrada é de cerca de 5 mg/m?/in- fusão. Em ainda outras modalidades, a quantidade de MTX adminis- trada é de cerca de 7,5 mg/m?/infusão.
[00186] Em algumas modalidades, são feitas entre 2 e 6 infusões, e as infusões podem compreender, cada uma, a mesma dosagem ou dosagens diferentes (por exemplo, dosagens escalonadas, dosagens decrescentes, etc.). Em algumas modalidades, as administrações po- dem ser feitas uma vez por semana, ou uma vez a cada dois meses.
[00187] Em algumas modalidades, o MPA é administrado em uma quantidade entre cerca de 500 mg e cerca de 1500 mg por dia. Em algumas modalidades, a dose de MPA é administrada em um bolo úni- co. Em algumas modalidades, a dose de MPA é fracionada em uma pluralidade de doses individuais totalizando entre cerca de 500 mg e cerca de 1500 mg por dia.
[00188] Em algumas modalidades, um análogo ou derivado de MTX ou MPA pode substituir o MTX ou MPA. Derivados de MTX estão des-
critos na Patente US Nº 5,958,928 e na Publicação PCT Nº WO/2007/098089, cujas íntegras encontram-se aqui incorporadas a título de referência. Terapia combinada
[00189] Acredita-se que a hidroxiureia, um agente mielossupressor, aumenta o nível de HbF e os níveis de hemoglobina nos pacientes. As atuais evidências sugerem que vários mecanismos potenciais de ação por hidroxiureia podem ser relevantes para pacientes com SCD, que juntos levam não apenas à indução de HbF, mas também a benefícios adicionais. Acredita-se que a hidroxiureia seja um inibidor potent da ribonucleotídeo redutase (RR) que reduz as poças de desoxinucleotí- deo trifosfato intracelular e agente como um agente específico para a fase S com inibição da síntese de DNA e eventual citotoxidade celular. A hidroxiureia inibe diretamente a subunidade M2 de RR, mas ocorre regeneração espontânea da enzima ativa quando a hidroxiureia é re- movida. Por este motivo, os feitos in vivo da hidroxiureia em RR são previsivelmente transitórios, resultando da rápida absorção, metabo- lismo, e excreção da hidroxiureia nos sistemas dos mamíferos. Prova- velmente com uma dose diária em SCD, a hidroxiureia cause supres- são citotóxica intermitente dos progenitores de eritroides e a sinaliza- ção de estresse as células, que afeta então a cinética e a fisiologia da eritropoiese e leva ao recrutamento de progenitores de eritroides com níveis aumentados de HbF. Um atributo notável da hidroxiureia é a ob- servação de que o tratamento apresenta múltiplas vantagens poten- ciais para pacientes com SCD. Além da indução de HbF, os efeitos citotóxicos da hidroxiureia também reduzem a produção medular de neutrófilos, reticulócitos e também reduzem o número de plaquetas que é um mediador importante da inflamação. Vantagens adicionais do tratamento com hidroxiureia incluem efeitos salutares nos eritrócitos circulantes.
[00190] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se uma terapia combinada pela qual a hidroxiureia é administrada antes, durante ou depois da administração ou transplante de HSCs transdu- zidas (descritas acima) no paciente com necessidade de tratamento. Em algumas modalidades, a hidroxiureia pode ser administrada depois da administração ou transplante de HSCs transduzidas, conforme ne- cessário, tal como durante uma crise de dor, no início de síndrome to- rácica aguda, no início de anemia severa ou sintomática (Hb < 7 g/dL), etc. Em algumas modalidades, a hidroxiureia é administrada em uma dose variando de cerca de 10 mg/kg/dia a cerca de 15 mg/kg/dia, e dada como uma única dose ao dia. Em algumas modalidades, a dose de hidroxiureia pode ser aumentada ou reduzida ao longo do tempo.
EXEMPLOS Exemplo 1 — Produção do vetor TL20c-rGbGY-7SK/sh734
[00191] O vetor pTL20c (SEQ ID NO: 47) (vide FIG. 40) contém o elemento de núcleo ampliado de 400 bp do isolador do sítio de hiper- sensibilidade 4 de galinha (cHS4) (SEQ ID NO: 49) inserido na 3LTR na orientação reversa do transcrito viral. O isolador de cHS4 contém atividade bloqueadora de melhoradores mediada pelo sítio de ligação de CTCF de núcleo e atividade de barreira mediada por sítios de liga- ção de VEZF1. Detalhes adicionais referentes ao vetor pTL20Oc, inclu- indo sua estrutura (SEQ ID NO: 48), métodos de produção de linha- gens celulares produtoras dos mesmos, ou o título viral resultante es- tão descritos na Publicação de Patente US Nº 2018/0112233, cuja ín- tegra encontra-se aqui incorporada a título de referência.
[00192] O isolador de cHS4 de 400 bp foi colocado na orientação reversa na LTR, e combinado com uma deleção de 46 bp que remo- veu a sequência nef residual, que se acredita reduzir a frequência de leitura completa da poliadenilação de uma LTR 3 lentiviral. Além disso, o sinal de poliadenilação da B-globina de coelho foi inserido a jusante da 3'LTR para fornecer um sinal de poliadenilação mais forte para o transcrito de vetor e reduzir a leitura completa transcritional.
[00193] O vetor lentiviral de SGbGY - o vetor lentiviral de gama glo- bina sSIN - sSGbGY (SEQ ID NO: 50) com transgene relevante e se- quências reguladoras estão ilustrados na FIG. 41. Os éxons 1,2,e 3 estão apresentados nas SEQ ID NOS; 41, 52, e 53, respectivamente. O vetor lentiviral de HIV tem um desenho auto-inativante (SIN). A regi- ão U3 da 5LTR (melhorador/promotor de HIV) foi substituído pelo me- lhorador/promotor de CMV. A região U3 da 3'LTR continha uma dele- ção de 400 bp do promotor melhorador, para tornar possível um dese- nho de SIN, de modo que não contivesse elementos transcricionais virais quando da integração em células hospedeiras. A jusante da 3'LTR, foi inserido um sinal de poli A do hormônio de crescimento bo- vino para melhorar a poliadenilação do vetor. Além da região de acon- dicionamento, o vetor carregava aproximadamente 350 bp de um gene gag, 540 bp de env, incluindo o aceptor de junção e o elemento de resposta rev, seguido por 150 bp do trato de polipurina central do gene pol a jusante da 5' LTR. O cassete de expressão de transgene consis- tia em 3,2Kb dos sítios hipersensíveis 2, 3 e 4, derivados por PCR a partir do genoma e um gene híbrido modificado de B-globina/y-globina. O gene híbrido de globina foi ainda modificado por PCR e mutagênese sitio-direcionada para trocar todos os códons por códons de y-globina.
[00194] O vetor pTL20c-sSGbGM (FIG. 42) foi construído por inser- ção do cassete de expressão do gene híbrido de B-globina/y-globina modificado com SGbGM (SEQ ID NO: 50) (FIG. 41) no vetor lentiviral pTL20Oc (FIG. 40) entre os sítios Mlul e Notl. A sequência do cassete de expressão do transgene consistia em 3,2 Kb dos sítios hipersensí- veis 2, 3, e 4 e um gene híbrido modificao de B-globina/y-globina. O promotor de B-globina e o gene híbrido modificao de B-globina/y- globina foram inseridos na orientação reversa no transcrito de RNA viral na estrutura SIN lentiviral.
[00195] O vetor TL20c-rGbGM-7SK/sh734 (FIG. 43) foi construído por inserção do cassete de expressão do RNA tipo grampo de cabelo curto (ShRNA734) (SEQ ID NO: 54) no vetor lentiviral pTL20c-sGbGY vector entre Hpal e Notl sites (vide FIG. 42). A do cassete de expres- são do RNA tipo grampo de cabelo curto (ShRNA734) incluía o promo- tor de RNA Pol Ill 7sk humano (SEQ ID NO: 32) e um RNA tipo gram- po de cabelo curto (ShRNA734) gene (SEQ ID NO: 30). Exemplo 2 — Testes pré-clínicos do vetor TL20c-rGbGM-7SK/ sh734 Panorama geral
[00196] O construto de vetor lentiviral terapêutico dual pTL20c- rGbGY-7SK/sh734 foi identificado por uma triagem funcional de células K562 que comparou o efeito da posição e da orientação dos transge- nes um em relação ao outro na expressão transgênica e na seleção in vitro de 6-TG. As células K562 transduzidas com pTL20c-rGbGY- 7SK/sh734 selecionadas em cultura com 6TG demonstraram estabili- dade de longo prazo e expressão do transgene da y*-globina normali- zada para VCN equivalente a células transduzidas com o vetor lentivi- ral GbGY parental ou CAL-H que não foram tratadas com 6TG. Estes achados indicaram que a expressão funcional do sh734 e do gene sGbGY corretivo induzido por diferentes promotores era mutualmente exclusiva e que a regulação do SGbGY era dependente da linhagem. Usando um modelo in vitro de diferenciação de eritroides humanos, mostra-se que HSCs CD34+ transduzidas com o vetor lentiviral CAL-H expressavam constitutivamente sh734 em culturas ampliadas em um nível suficiente para derrubar a expressão de HPRT e conferir sele- ções de células de genes modificados segundo determinado por um aumento no número médio de cópias do vetor (VCN) e na frequência de células transduzidas no dia 14. Quando culturas de 6TG seleciona-
do foram transferidas para condições de cultura de diferenciação de eritroides, o transgene Ay-globina foi expresso de forma específica pa- ra linhagem, comprovando assim o conceito de regulação sequencial e coordonada de expressão transgênica em HSPCs CD34+ humanas transduzidas. Os resultados descritos neste relatório descritivo dão suporte a um ensaio clínico para avaliar um protocolo de amplificação in vivo usando 6TG para aumentar o potencial de enxertia de longo prazo de HSCs CD34+ transduzidas com CAL-H necessárias para atingir níveis curativos de HbF total e percentagem de células F para a doença de células falciformes.
[00197] Os experimentos feitos até hoje com terapia genética autó- loga para talassemia e doença de células falciformes sugeriram que o nível de condicionamento sub-mieloablativo com doses de bulssulfano de 12 mg/kg pode ser insuficiente para atingir quimerismo adequado do doador para curar doenças, embora se estime que quimerismo mis- to com enxertia gênica de 30% de células de genes modificados possa ser curativo. Uma abordagem para lograr as eficiências de enxertia mais baixas é a aplicação de estratégias de amplificação in vivo. Como a eficiência de transdução de HSPCs CD34+ autólogas pode variar de 10% a 60% e uma população ainda menor dessas células são células- tronco HSC/MPP de repovoamento de longo prazo, na maioria dos ca- sos a dose de células-tronco transduzidas é inadequada ideal. A baixa eficiência é refletida no número de cópias do vetor (VCN) que é visto nas linhagens de céloulas hematopoiéticas depois da transfusão. Na maioria dos casos, o VON médio é significativamente menor que 1 por célula.
[00198] O objetivo da terapia genética é oferecer ao indivíduo com necessidade de tratamento uma correção ex vivo única de células fal- ciformes HSCs com seu transplante autólogo e lograr as consequên- cias imunológicas tais como rejeição do enxerto e doença do enxerto versus hospedeiro associada ao transplante alogênico. Materiais e Métodos Título infeccioso de HbF em células MEL.
[00199] Células MEL foram transduzidas por espinoculação com diluições seriadas de CAL-H e do vetor sh7/GFP a uma MOI de 1 a 10 e plaqueadas em diluição limitante.
[00200] Depois de 24-48 horas determinar a % células positivas pa- ra GFP
[00201] Expandir e induzir a diferenciação com 10 mM de hemina e 3 mM de HMBA por 3-4 dias.
[00202] Medir a diferenciação de eritroblastos por citometria de flu- xo e a viabilidade/apoptose por coloração com Anexina/7AAD.
[00203] Extrair RNA. Medir a expressão e o VCN de sh7 e -globina por RT- PCR.
[00204] Plotar o aumento proporcional de mMRNA de -globina e de MRNA/VCN de -globina nas células transduzidas versus células pseu- do-transduzidas.
[00205] Seleção de 6TG e estabilidade de longo prazo de céllulas K562 transduzidas com CAL-H. Ensaios para medir a eficiência de transdução, o VCN, a expressão de sh7 e de y-globina, a viabilidade e diferenciação
[00206] 1) Células K562 (1x10º em cada condição) são transduzi- das com 6 vetores diferentes em fatores de diluição 2 no dia 7.
[00207] 2) As células são novamente semeadas em placas de 6 po- ços com mais 4 mL de meio RPMI fresco no dia 3.
[00208] 3) Dois péletes de células (1x10º células cada) para análise de DNA e RNA para 13 amostras incluindo K562 de controle serão congelados no dia O (MY). O número de cópias de GbG e de sh734 são analisados.
[00209] 4) 2x10º células de controle K562, 6 amostras transduzidas em fator de diluição 32 e 6 amostras transduzidas em fator de diluição 1 são novamente semeadas em placas de 6 poços com mais 4 mL de meio RPMI com e sem 300 nM de 6-tioguanina, respectivamente. São feitas 2,5x108 células de 6 amostras transduzidas em fator de diluição 1 por misturação de células transduzidas e não transduzidas em uma proporção de 1:3. Dois péletes de células (1x10º células cada) para análise de DNA e RNA para essas 6 amostras serão congeladas. O meio é renovado a cada 3-4 dias. K562 transduzidas com TL20cw- 7SK/sh734-GFP (fator de diluição 256 e 8) serão incluídas como con- troles positivos.
[00210] 5) Dois péletes de células (1x10º células cada) para análise de DNA e RNA para 13 amostras incluindo K562 de controle serão congelados no dia 7/14/21 ou ainda 28(MY). O número de cópias de GbG e de sh734 é analisado. As amostras no dia 21/28 são opcionais se o número de cópias de todas as amostras for maior que 95% do valor esperado para o dia 14.
[00211] 6) No dia 14/21, semear 1x10º de células de 12 amostras sob seleção de 6-TG em placas de 12 poços com 1 m mL de RPMI sem 6-TG. Realizar ensaios de anexina V e 7-AAD 3 dias depois. Usar células tratadas com camptotecina e células transduzidas com TL20cw-7SK/sh734-GFP (fator de diluição 1) como controle positivo. Objetivo
[00212] Visto que níveis elevados de expressão de hemoglobina fetal eritroide-específica (gama-globina) podem ser curativos em SCD e beta-talassemia, avaliamos a eficiência da transferência de genes (VCN), a expressão gênica da globina, a diferenciação de eritroides, e a produção total de RBC Hba. A linhagem de células de leucemia eri- troide humana K562 foi usada como um modelo de diferenciação in vitro de eritroides para fornecer evidências de que (1) genes de y- globina transferidos foram expressos e regulados corretamente como consequência da diferenciação de eritroides (sem expessão no estado não-diferenciado versus expressão abundante depois de diferencia- ção); (2) o sh734 contra o HPRT não alterou significativamente a ex- pressão de y-globina; e (3) a expressão do sh734 contra o HPRT não foi significativamente influenciada pela diferenciação de eritroides (ex- pressão de alto nível no estado não diferenciado vs. expressão similar ou mais baixa depois da diferenciação).
[00213] Objetivos adicionais para funcionalidade de sh734/seleção 6TG:
[00214] Determinar se função equiparável de sh734 + y-globina;
[00215] Determinar se função equiparável de sh734 + diferenciação de eritroides;
[00216] Determinar seleção e estabilidade de longo prazo de célu- las transduzidas com sh734; e
[00217] Determinar se sh734 não afeta a viabilidade celular ou a estabilidade do vetor. Caracterização in vitro
[00218] Foi determinado que a estrutura de TL20c LV aumenta sig- nificativamente o título do vetor lentiviral SGbGY parental como ilustra- do nas FIGURAS 44A, 44B e 45. Títulos equiparáveis foram obtidos com o monovetor expressando sSGbGY e o vetor CAL-H terapêutico dual, sugerindo que a expressão de transgenes não afetou o título medido como uma percentagem de células HbF-positivas ou a hemo- globinização por células medida pelo MFI normalizado (dados não mostrados). O importante é que a inclusão da sequência isoladora de cHS4 de 400 bp na estrutura de TL20c não teve um efeito adverso no título do vírus.
[00219] Com relação à FIG. 44A, sobrenadante de vetor foi gerado por transfecção transitória mediada por CaPO, de células GPRG (vide Publicação de Patente US Nº 2018/0112233) e armazenado a -80ºC.
Todos os vetores foram titulados depois de 1 ciclo de congelamento e descongelamento. Título (TU/mL) = % de células HbF-positivas/100) x fator de diluição x número de células / Volume (mL). No geral, a estru- tura do vetor lentiviral TL20 melhorou significativamente a eficiência de transdução vetores lentivirais SIN pseudotipificados VSVg.
[00220] Com relação à FIG. 45, estoques de vetor foram produzidos por transfecção com CaPO;, de células GPRG e concentrados através de um sistema TFF 700 vezes. O título do vetor foi determinado em células MEL. A concentração de partículas vetoriais foi determinada por um ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA) específico para a proteína capsídica p24 de HIV-1. Os valores obtidos foram usa- dos para calcular a infectividade vetorial média (unidades de introdu- ção [TU] por ng p24). Comparativamente, o vetor TL20c-rGbGM- 7SK/sh734 apresentou infectividade vetorial superior em comparação com sGbGY, Expressão e regulação equivalentes do construto de y-globina sSGbGM" base comparado com o construto contendo sh734
[00221] Como os níveis de expressão de sh7 estavam correlacio- nados com a seleção 6TG na linhagem de células de leucemia eritroi- de K562 humana, estes modelos de células foram usados para apre- sentar evidências de que (1) genes de y-globina transferidos foram ex- pressos e regulados corretamente como consequência da diferencia- ção de eritroides (i.e., sem expessão no estado não diferenciado ver- sus expressão abundante depois de diferenciação); (2) o sh734 não alterou significativamente a expressão de y-globina; e (3) a expressão do sh734 contra o HPRT não foi significativamente influenciada pela diferenciação de eritroides (expressão de alto nível no estado não dife- renciado vs. expressão similar ou mais baixa depois da diferenciação). Como a célula K562 expressou constitutivamente globina fetal humana e não expressou f-globina, este foi considerado um sistema satisfató-
rio para validar a especificidade de iniciadores e sondas de transgenes de y-globina específicos.
[00222] Como ilustrado na FIG. 46, houve uma expressão equiva- lente de SGbGY entre o monovetor SGbGY (SSIN) o construto de vetor TL20c-rGbGM-7SK/sh734 terapêutico dual ora revelado. Células MEL foram transduzidas com cinco diluições dobradas (1:8-1:128) de LV VCM por 3 dias antes de tratamento das células com 10 uM de hemina e 3 mM de HMBA no protocolo de indução padrão. Células MEL não transduzidas e culturas não induzidas transduzidas paralelas serviram de controle negativo. O título viral infeccioso HbF foi determinado no dia 7 medindo-se a % de células Hu-HbF-positivas por citometria de fluxo. RNA foi extraído dos péletes de células e a expressão de 9- globina foi determinada por RT-PCR normalizada para expresão do gene zelador b2M. A expressão relativa de g-globina normalizada para o título viral infeccioso HbF (15-25%) foi plotada para cada vetor. Os valores plotados representam todas as réplicas biológicas de 3 expe- rimentos separados. Não houve diferença significativa na expressão de SGbGM entre as diferentes células transduzidas com LV. ANOVA unilateral, p = 0,137 e teste de comparações múltiplas de Tukey test p > 0,05.
[00223] Como mostrado na FIG. 47, houve um aumento de 12 ve- zes na expressão dos níveis de MRNA de y-globina nas células K562 transduzidas com TL20c-rGbGY comparado com um aumento de 7,9 vezes nas células transduzidas com TL20c-rGbGM-7SK/sh734. O tes- tetem p < 0,05 não foi significativo. Além disso, todos os controles de especificidade não apresentaram reatividade cruzada dos nossos ini- ciadores de y-globina transgene-específicos com Hb fetal endógeno.
[00224] Mais especificamente, células K562 foram transduzidas com TL20c GbGM ou CAL-H for e passadas por 39 dias. As células foram coletadas e cultivadas em meio contendo 10 uM de hemina e 3 mM de HMBA por 3-4 dias em um protocolo de indução de diferencia- ção de eritroides padrão. A expressão relativa de SGbGM foi medida por RT-PCR e normalizada para VON para comparar os tratamentos. Houve um aumento de 12 vezes na expressão dos níveis de MRNA de Ag- globina nas células K562 transduzidas com TL20crGbGM compa- rado a um aumento de 7,9 vezes nas células transduzidas com CAL-H (teste t, p < 0,05 não foi significativo). Não foi detectada expressão de GbGM nas células pseudotransduzidas não induzidas ou induzidas e não foi detectada expressão de GbGM nas células K562 transduzidas com o monovetor rsh7-GFP não induzido ou induzido. Ocorre pouca a nenhuma transativação do promotor de sh734 du- rante a diferenciação de eritroides
[00225] A requerente demonstrou que a expressão do transgene sh734 fica inalterada nas células K562 durante a diferenciação de eri- troides (vide FIG. 48). Mais especificamente, células K562 foram tran- duzidas com TL20c GPbGM ou CAL-H for e passadas por 39 dias. As células foram coletadas e cultivadas em meio contendo 10 uM de he- mina e 3 mM de HMBA por 3-4 dias em um protocolo de indução de diferenciação de eritroides padrão. A expressão de sh734 foi determi- nada por RT-PCR em relação ao RNU38B e normalizada para VCN para comparar os tratamentos. O teste t foi usado para determinar se as diferenças na expressão de sh7 entre os grupos atingiram signifi- cância. Não foram encontradas diferenças significativas em p <0,05. Culturas induzidas e não induzidas de sh7GFP de controle p=0,69, CAL-H, p = 0,226 e CAL-H não induzido vs rsh7-GFP, p=0,227. Não foi detectada expressão de sh734 no grupo de TL20c-rGbGM simulado e no de controle negativo. Triagem funcional de vetores TL20 SIN LV em células K562
[00226] O construto de vetor lentiviral terapêutico dual TL20c- rGbGM-7SK/sh734 foi identificado por meio de uma triagem funcional em células K562 que comparou o efeito da posição e da orientação do transgene um em relação ao outro na expressão transgênica e na se- leção de 6-TG in vitro. Outros vetores lentivirais transgênicos duaiss (vide, por exemplo, SEQ ID NOS: 5 a 22) foram construídos usando a estrutura de vetor lentiviral TL20c com o sh734 posicionado seja a montante ou a jusante do cassete GDGM e seja em sua orientação normal ou reversa. Os vetores lentivirais auto-inativantes TL20 com o isolador Ins-400 de cHS4 testados incluíram: TL20c-rGbGM-7SK/ sh734 (FIG. 11), TL20c-rGbGM-r7SK/sh734 (FIG. 13), TL20c-7SK/ sh734-rGbGM (Figura 7), e TL20c-r7SK/sh734-rGbGM (FIG. 9). Outros vetores testados incluíram TL20d-rGbGM-7SK/sh734 sem o isolador Ins-400 de cHS4 (Figura 21), um construto repórter sh7 de controle, TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP, e TL20c-rGbGM.
[00227] Células K562 foram transduzidas com sh734 por 21 dias antes do início do tratamento com 6TG por 14 dias (áreas sombrea- das). Com relação às FIGURAS 49A a 49G, o número de cópias do vetor (VCN) foi determinado a cada duas semanas a partir do DNA genômico por RUS qPCR multiplex e quantificação absoluta a partir de uma curva padrão usando sequências-alvo do vetor lentiviral (LTR R- U5 baseado em HIV-1) e sequências de referência da apolipoproteína B humana (ApoB). Cada ponto de dado representa a média + SD de três transduções separadas (réplicas biológicas em triplicata).
[00228] Células K562 transduzidas com o vetor lentiviral terapêutico dual TL20c-rGbGM-7SK/sh734 selecionadas em cultura de 6TG de- monstraram estabilidade de longo prazo e expressão do transgene de gama-globina normalizada para VON equivalente a células transduzi- das com o vetor parental GbGm LV ou a células transduzidas com CAL-H que não foram tratadas com 6TG. Estes achados indicam que a expressão funcional do sh734 e do gene de SGbGM corretivo induzi- do por promotores de Pol Ill e Pol Il separados, respectivamente, é mutuamente exclusiva e que a regulação de SGbGM é dependente da linhagem.
[00229] Neste experimento, células K562 transduzidas com os veto- res lentivirais TL20c-rGbGM-r7SK/sh734, TL20c-7SK/sh734-rGbGM, e TL20c-r7SK/sh734-rGbGM foram apenas acompanhadas por duas semanas após o tratamento com 6TG. Curiosamente, todos os vetores construídos duais testados independentemente da posição ou orienta- ção dos transgenes apresentaram cinética de seleção similar durante o tratamento com 6TG sugerindo que as células transduzidas expres- saram constitutivamente um nível limítrofe de sh7 que aguentou o der- rubamento de HPRT possibilitando a seleção. Também observa-se um efeito dose-resposta com os vetores lentivirais auto-inativantes de transgene dual onde o VCN de culturas tratadas com 6TG está forte- mente correlacionado com a expressão de sh7 e a diluição do vírus usado para transduzir células K562 (dados não mostrados). Todos os vetores testados apresentaram níveis de expressão de gama-globina similares (em relação à expressão de GbGM /b2M) por indução e via- bilidade (< 0,5% de anexina V e células duplo positivas para 7-AAD) (dados não mostrados). O vetor TL20c-rGbGM-7SK/sh734 LV mos- trou-se mais eficiente na expressão de altos níveis de sh7, cinética ro- busta da seleção 6TG, e estabilidade. Estes achados foram consisten- tes com os resultados encontrados nos experimentos anteriores.
[00230] Com relação à FIG. 50, células K562 foram transduzidas com TL20c-rGbGM-7SK/sh734 or TL20c GbGY 21 dias antes do início do tratamento com 6TG. RNA foi isolado e gRT-PCRT foi realizada para determinar o número de cópias de sh734 em relação ao RNU38B e normalizadas para VCN (expressão relativa/VCN). Os níveis de ex- pressão relativa de sh734 e HPRT foram determinados a cada duas semanas após a transdução. O gráfico ilustra sh734 plotado no eixo Y e a percentagem de HPRT derrubada em relação às células pseudo-
transduzidas (HPRT/pseudotransduzidas x 100) e normalizadas para VCN plotado à direita no eixo Y.
[00231] Células K562 foram transduzidas com o construto repórter de monovetor sh7-GFP ou CAL-H por 21 dias antes do início de 6TG. RNA foi isolado, e gRT-PCR foi realizada para determinar o número de cópias de sh734 em relação ao RNU3S8B e normalizadas para VON (expressão relativa/VCN). As FIGURAS 51A e 51B ilustram a percen- tagem de derrubamento de HPRT em relação às células pseudotrans- duzidas (HPRT/ pseudotransduzidas x 100) normalizadas para VON está plotada à direita no eixo Y. No geral, as células K562 transduzi- das com o CAL-H ou com o construto repórter de monovetor sh7-GFP apresentaram níveis similares de expressão de sh734 e cinética de derrubamento de HPRT e seleção de 6TG. De fato, o tratamento com 6TG resultou em uma queda significativa dos níveis de HPRT (menos de 10% das células não tratadas) nas células expressando sh734. 14 dias depois da seleção, os níveis de HPRT ficaram indetectáveis nas culturas transduzidas. As células K562 selecionadas com 6TG conti- nuaram a crescer e expressar sh734 depois de 3 meses em cultura (dados não mostrados). Estes achados sugerem que uma vez estabe- lecida a resistência, as células transduzidas com sh734 persistem e há poucas evidências de silenciamento nas células K562. No dia 21, as células K562 tranduzidas com o construto repórter sh7-GFP eram 35 % GFP+ e aumentaram para 88% de células GFP + no dia 42 depois do tratamento com 6TG. Com relação à FIG. 49H, os vetores TL20c- rGbGM-7SK/sh734 LV e TL20d-rGbGM-7SK/sh734 LV mostraram se- leção rápida durante as 2 semanas de tratamento com 6TG (d35) em comparação com os osutros construtos testados.
[00232] Células CD34+ foram descongeladas e pré-estimuladas por cultura noturna de 2x10º células em 0,1 mL de meio SFEM |l suple- mentado com SCF/Flit-3/TPO/IL-3. As células pré-estimuladas foram infectadas com o vetor Cal-H a uma MOI = 20 com espinoculação (2500 rpm e 1,5 hora) na presença de polybrene (6 ug/ml). As células foram retiradas da centrífuga e colocadas novamente na incubadora por 4 horas antes da troca pelo meio SFEM suplementado com StemSpan'" CD34+ Expansion Supplement (100X) e UM171(67nM)/ SR1(750nM). As células foram incubadas a 37ºC e 5% CO?2 por 4 dias. A partir do dia 4, 10 mM de solução de estoque de 6-TG foram adicio- nados às células CD34+ até atingir uma concentração final de 200 nM. Meio de cultura fresco estendido com ou sem 6TG foi reposto a cada 3-4 dias (vide FIG. 52A). No dia 14, foi realizado um ensaio VON com as células transduzidas com Cal-H cultivadas na presença de 6-TG ou na ausência de 6-TG. No dia 15, as células CD34+ foram lavadas e semeadas em meio de expansão de eritroides como o meio SFEM |l suplementado com suplemento de expansão de eritroides. Meio de expansão de eritroides fresco foi adicionado no dia 2 e 4. A partir do dia 21, o meio com eritroides (meio SFEM Il suplementado com 10U/mL de EPO foi adicionado a cada 3 dias. No dia 28, um ensaio de fluxo mostrou que 60-80% das células não transduzidas e transduzi- das eram CD235a+ (vide FIG. 52B) e a coloração intracelular de HbF mostrou que 34,3% das células transduzidas com Cal-H sob seleção de 6-TG eram HbF+ comparados com 15,8% na ausência de 6-TG (vi- de FIG. 52C).
[00233] Este experimento oferece comprovação do conceito para a regulação funcional da expressão transgênica de CAL-H em CD34+HSPC primitivas. A regulação funcional da expressão de sh7 e GbGm em CD34+HSPC modificadas com CALH é mostrada por um aumento no VCN médio depois da seleção de 6TG e um aumento de mais 2 vezes na % de células HbF depois da diferenciação e matura- ção de eritroides in vitro. Conclusão
[00234] O construto de LV terapêutico dual TL20c-rGbGM-7SK/ sh734 foi identificado por meio de uma triagem funcional nas células K562 que comparou o efeito da posição e da orientação dos transge- nes um em relação ao outro na expressão transgênica, na estabilidade e na função de longo prazo e na seleção de 6-TG in vitro.
O título in- feccioso de HbF e a expressão do cassete sSGbGY melhoraram quando foi inserido na estrutura de TL20c LV o isolador de cHS4 de 400bp na orientação reversa.
Foi observado um alto nível de expressão de sh734 e expressão gênica direcionada para a linhagem de eritroides na expressão do vetor TL20c-rGbGM-7SK/sh734 terapêutico dual su- gerindo expressão mutuamente exclusiva de transgenes e interações mínimas entre os elementos reguladores do gene de globina e o pro- motor de Pol Ill.
Além disso, as culturas de K562 transduzidas com TL20c-rGbGM-7SK/sh734 selecionadas com 6TG continuaram a ex- pressar sh734 e manter a função por mais 3 meses e poderiam ser induzidas a diferenciar células de eritroides e suprarregular a expres- são do transgene de gama-globina em cerca de 8 vezes.
Como o si- lenciamento e a variabilidade de transgene são altamente dependen- tes da estrutura do vetor e do tipo de célula, foi conduzida uma investi- gação sobre se o TL20c-rGbGM-7SK/sh734 funcionaria tão bem no modelo de CD34+HSPC como aconteceu no modelo de células K562. HSCs CD34+ foram transduzidas com o vetor lentiviral TL20c-rGbGM- 7SK/sh734 e em seguida as células foram cultivadas em meio suple- mentado como UM171 e SR1 para preservar as HSCs mais primitivas contra diferenciação em culturas extendidas tratadas com 6TG.
Depois de 2 semanas, as culturas de CD34 HSC com 6TG selecionada foram transferidas para um meio de diferenciação de eritroides por mais 2 semanas e a percentagem de células HbF-positivas foi medida por ci- tometria de fluxo.
As culturas com 6TG selecionada apresentaram um aumento de 2 vezes nas células HbF-positivas, sugerindo que as
HSCs primitivas transduzidas com o vetor lentiviral TL20c-rGbGM- 7SK/sh734 poderiam sofrer seleção in vitro e expressar a gama- globina em um controle específico para linhagem. Exemplo 3 — Desenho do sShRNA polimerase |l (Pol-I/)-dependente para derrubamento do HPRT e suas aplicações para seleção de 6-
TG
[00235] Já se sabe que alguns RNAs tipo grampo de cabelo curtos polimerase Ill-dependentes apresentam problemas de superexpressão e podem induzir citotoxicidade aguda. Alguns promotores de pol Ill, por exemplo, o U6, pode levar a uma expressão muito mais alta de RNAs tipo grampo de cabelo curtos (vide Mol Ther. 2006 Oct;14(4):494-504, que sugere o uso de um ShRNA induzido por um promotor de pol |l para resolver qualquer problema de toxicidade), cuja íntegra encontra- se aqui incorporada a título de referência. Esta é uma preocupação importante quando se considera o uso de interferência de RNA (RNAi) comod uma potencial abordagem terapêutica, sobretudo em terapia genética com células-tronco. Aqui, polimerase Il foi usado como pro- motor alternativo para expressar micro-RNA para efetuar o derruba- mento da expressão de HPRT. Foi utiizada uma abordagem de edi- ção de genes CRISPR/Cas9, e um Cas9 com um único RNA guia (Cas9 RNP) direcionado para CCR5, junto com doador de oligonucleo- tídeos de DNA de filamento simples (ssODN) codificando um shRNA induzido por HPRT Pol Il, foi usado para possibilitar a substituição efi- ciente do locos CCR5 por um HPRT miRNA funcional. A capacidade de repor ShnHPRT induzido por Pol |l em uma região CCR5 para derru- bar o HPRT e selecionar a linhagem celular com um gene de expres- são de miroRNA tipo grampo de cabelo sob 6TG foi demonstrada. Pa- ra reposição de sh211 e sh734, não se observou a citotoxidade óbvia em células K562.
[00236] Foram desenhados dois tipos de ShRNAs baseados em mi-
Cro-RNA para derrubamento do HPRT (Tabela 1). Um tipo é um dese- nho de novo de micro-RNA shRNA artificial (vide Fang, W. & Bartel, David P. The Menu of Features that Define Primary MicroRNAs and Enable De Novo Design of MicroRNA Genes. Molecular Cell 60, 131- 145). Foram empregados dois candidatos para este desenho, incluindo mMIRNA734 (111nt) (SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 67) e miR- NA211(111nt) (SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 68). Um outro tipo de ShRNA baseado em micro-RNA foi baseado em um miRNA 16-2 de cadafalso de miRNA modificado de terceira geração (mMiRNA-3G) (vide Watanabe, C., Cuellar, T.L. & Haley, B. Quantitative evaluation of first, second, and third generation hairpin systems reveals the limit of mam- malian vector-based RNAi. RNA Biology 13, 25-33 (2016)). Foram em- pregados dois outros candidatos, incluindo sh734 e sh211, cada um deles embutido em um miRNA 3-G (165nt) (SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 25, respectivamente).
[00237] Para demonstrar suas funções biológicas, cada um dos ShRNAs tendo a SEQ ID NOS: 23, 24, 25, e 26 foi combinado (cada um individualmente) com promotores de pol |l, a saber, com EF1a (SEQ ID NO: 64) e com SV40 poliA (SEQ ID NO: 65), e os cassetes de DNA correspondentes foram sintetizados para dar as SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, e SEQ ID NO:39 apresentadas na Tabela 2 (vide também FIG. 24). Células K562 foram transitoriamente transfectadas com nanocápsulas incorporando cada um dos cassetes de sSshRNA DNA mencionados acima e incorporados naquelas células sob a seleção 6-TG. As células transfectadas com sShRNA apresenta- ram resistência à seleção 6-TG segundo demonstrado pelo menos nas FIGURAS 25A e 25B. Acredita-se que as células transfectadas com todos os cassetes de ShRNA DNA tenham um número de células so- breviventes mais alto que o grupo de controle em tratamento com 6- TG.
[00238] Para investigar a estabilidade de longo prazo dos sShRNAs, também foram usadas tecnologias CRIPSR para repor cassetes ex- pressando shRNA na região CCR5 derrubar o HPRT (vide FIG. 26) e selecionamos a linhagem celular com um gene de expressão de mi- roRNA tipo grampo de cabelo sob 6-TG (vide também Tabela 3, SEQ ID NO:S 40, 41, e 42; e também SEQ ID NOS: 62 e 63). Depois de três semanas de seleção de 6-TG, coloração de HPRT mostrou que as células K562 com sh211-3G induzido por knock-iof Pol-ll apresenta- vam níveis significativamente mais baixos de HPRT (12%) em compa- ração com aquele do controle (i.e., células não-tranduzidas) (99%) (FIGURAS 27A, 27B, e 27C). Tabela 1: ShRNAs baseados em micro-RNA induzido por Pol Il pa- ra derrubamento de HPRT. Nome Comprimento SEQID Sequência (nt) NO: MIRNA734- 111 23 Accegtacatatttttgtgtagetetagettatage Denovo caagggcatatcecttgtgttttttttgaaggatato ceccttgactataaactagegetacactttttegtet tat MIRNA211- 11 24 Acccegtacatatttttgtgtagctetagttataaat Denovo caaggtcataaccttgtgttttttttagaaggttat gaccttgatttataactagegetacactttttegt cttgt MIRNA734-3G 166 26 CCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACT
GACATACGCGTATCCGTCTTATAGTCAAGGGCATAT CCTGTAGTGAAATATATATTAAACAAGGATATGCC CTTGACTATAATACGGTAACGCGGAATTCGCAACTA
TTTTATCAATTTTTTGCGTCGAC MIRNA211-3G 166 25 CCEGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACT
GACATACGCGTATCCGTCTTTTAAATCAAGGTCATA ACCGTAGTGAAATATATATTAAACAGGTTATGACCT TGATTTAAAATACGGTAACGCGGAATTCGCAACTAT TTTATCAATTTTTTGCGTCGAC
Tabela 2: Sequências de ShRNAs baseados em micro-RNA indu- zido por EF1a para derrubamento de HPRT.
rm E mento 1D NO: nt) EFT1a-miRNA734- 483 36 ggatatcggcteeggtgccegteagtgggcagagegeaca- Denovo-SV40 poliA tegeccacagteceegagaagttgggagggaggggteggeaa- ttgaaccggtgcctagagaaggtggegegaggtaaactag- gaaagtgatgtegtgtactggetecgectttttecegagag- tgggggagaacegtatataagtgcagtagtegecegtgaaca- ttettttegeaacgggtttgcegecagaacacaggatgac- cegtacatatttttgtgtagetetagttataaatcaaggt- cataaccttgtagttttttttgaaggttatgaccttgattta- taactagegetacactttttegtettgttagaacttattta- ttgcagcttataatggttacaaataaagcaatageatca- caaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattetag- ttgtggtttgtccaaacteatceaatagtatettateatet EF1a-miRNA2Z11- 483 37 ggatatcggeteeggtgccegteagtgggcagagegeaca- Denovo-SV40 tegeceacagteceegagaagttggggggagggateggcaa= poliA ttgaaccggtgcctagagaaggtggegeggggtaaactag- gaaagtgatgtegtagtactagetecgectttttecegagga- tgggggagaacegtatataagtgcagtagtegecegtgaaca= ttettttegcaacgggtttgcegecagaacacaggatgac- cegtacatatttttgtgtagctetagtttatagtcaaggo- catatccttgtgttttttttgaaggatatgccettgacta- taaactagegetacactttttegtettgttagaacttatt- tattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatca- caaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctag- ttgtggtttgtccaaacteateaatgtatettateatet EFT1a-miRNA734- 537 38 ggatatcggeteeggtagceegteagtaggcagagegeaca- 3G-SV40 poliA tegeccacagteceegagaagttggagggaggggteggcaa- ttgaaccggtgcctagagaaggtagegeggaggtaaactgg- gaaagtgatgtegtatactagetecegectttttecegaggg- tgggggagaacegtatataagtgcagtagtegeegtgaaca- ttcttttegeaacgggtttagcegecagaacacaggataceg- gatcaacgccetaggtttatgtttggatgaactgacataca- ecgtatcegtettatagteaagggcatatecagtagtgaaa- tatatattaaactggatatgcccttgactataatacag- taacgcggaattegceaactattttatcaattttttgca- tegactagaacttgtttattgcagcttataatagttacaaa- taaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaag- catttttttcactgcattctagttgtagtttgtccaaact- catcaatgtatcttatcatect EF1a-miRNA211- 537 39 ggatatcggeteeggtgceegteagtaggcagagegeaca- 3G-SV40 poliA tegeccacagteceegagaagttagggggaggggteggecaa- ttgaaccggtgcctagagaaggtggegegaggtaaactag- gaaagtgatgtegtgatactagetecegectttttecegaggg- tgggggagaaccgtatataagtgcagtagtegecegtgaaca- ttettttegcaacgggtttgeegecagaacacaggecggat- caacgccetaggtttatgtttggatgaactgacatacgcg- tatcegtetataaatcaaggtcataacctagtagtgaaata- tatattaaacaaggttatgaccttgatttattacggtaaca- cggaattegeaactattttatcaattttttgegtegaceca- gatcaacgccetaggtttatgtttaggatgaactgacatacg- ecgtatcegtetataaateaaggtcataacetgtagtgaaa- tatatattaaacaaggttatgaccttgatttattacag- taacgcggaattegeaactattttatcaattttttacg- tegacaacttgtttattgcagettataatagttacaaa- taaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaag- catttttttcactgcattetagttagtagtttgtecaaact- catcaatgtatcttatcatct
Tabela 3: de ShRNAs baseados em micro-RNA induzido por EF1a com braço de homologia para reposição na região CCR5. mento (nt) NO:
Braço — Esquerdo | 809 40 gettettetetagaatettetteateatectectgacaa-
150-EF1a- tegataggtacetggetgtegtecatgctatatttagctt-
MIRNA734- taaaagccaggacggtcacetttggggtggtgacaagto-
Dencvo-SV40 tgatcacttgggtagtagetgtatttgegteteaagetttt-
aco Diaão 160 cgaageggcegeggatateggetecggtgecegteagtggg- cagagegcacategeceacagteceegagaagttagaggga- ggggteggeaattgaaceggtgectagagaaggtageg- cggggtaaactagggaaagtgatategtgtactagetecg- cetttttecegagggtgggggagaacegtatataagtgcag- tagtegeegtgaacgttettttegeaacgggtttgeegeca- gaacacaggatgaccegtacatatttttgtgtagctetagt- tataaatcaaggtcataaccttgtagttttttttgaagatta- tgaccttgatttataactagegetacactttttegtettat- tagaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaag- caatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcac- tgcattetagttatagtttgtecaaacteateaatgtatet- tatcatctacgegtecaggaateatetttaccagatet- caaaaagaaggtetteattacacetagcageteteatttteca- tacagtcagtatcaattctaggaagaatttccagacattaaa- gatagtcatcttggggetagtectgeegetgettgteatagãe
MIRNA211- 809 41 gettettetetagaatettetteateatectectgacaa-
Denovo tegataggtacetggetgtegtecatgetatgtttgott- taaaagccaggacggteacetttagggtagtgacaagty- tgatcacttgggtggtggetgtatttgcgteteaagetttt- cgaageggcegeggatateggetecggtgceegteagtagg- cagagegeacategeceacagteceegagaagttgggggga- ggggteggcaattgaaceggtgectagagaaggtageg- cggggtaaactagggaaagtgatgtegtgtactagetecg- cetttttecegagggtgggggagaacegtatataagtgcag- tagtcgeegtgaacgttettttegeaacgggtttgcegeca- gaacacaggatgaccegtacatatttttgtgtagetetagtt- tatagtcaagggcatatecttgtgttttttttgaaggatata- ccettgactataaactagegetacactttttegtettat- tagaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaag- caatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcac- tgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatet- tatcatctacgegtecaggaateatetttaccagatet- caaaaagaaggtetteattacacetgcageteteatttteca- tacagtcagtatcaattctggaagaatttccagacattaaa- gatagtcatcttaggggetagtectgcegetgettgteatagte
MIRNA734-3G 863 42 gettettetetagaatettetteateatectectgacaa- tegataggtacetggetgtegtecatgctatatttgett- taaaagccaggacggtcacctttggggtggtgacaagta- tgatcacttgggtggtggetgtatttgegteteaagetttt- cgaageggecgeggatateggetecggtgecegteagtaga- cagagegeacategeceacagteceegagaagttaggaggga- ggggteggcaattgaaceggtgectagagaaggtageg- cggggtaaactagggaaagtgatategtgtactagetecg- cetttttecegagggtgggggagaacegtatataagtgcag- tagtegeegtgaacgttettttegeaacgggtttgeegeca- gaacacaggatgceggatcaacgecetaggatttatgtttaga- tgaactgacatacgcgtatcegtettatagtcaagggcata- tcecagtagtgaaatatatattaaactggatatagccettgac- tataatacggtaacgcggaattegeaactattttatcaa- ttttttgegtegactagaacttgtttattgcagcttataa- tggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaa- taaagcatttttttcactagcattetagttatagttta- tecaaactcatcaatgtatettatcatetacgegtecaggaa- tcatctttaccagatctcaaaaagaaggtetteattacac-
Cctgcageteteattttecatacagteagtateaattetaga- agaatttccagacattaaagatagtcatcttggggetag- tectgcegetgettateatagte MIRNA211-3G 863 43 gettettetetagaatettetteateatectectgacaa- tegataggtacetggetgtegtecatgetatgtttgott- taaaagccaggacggtcacetttggggtggtgacaagto- tgatcacttgggtggtggetgtatttgcgteteaagetttt- cgaageggecegeggatateggetecgagtgceegteagtagg- cagagegeacategeceacagteceegagaagttgggggga- ggggteggcaattgaacceggtgectagagaaggtggeg- cggggtaaactagggaaagtgatgtegtgtactagetecg- cetttttecegagggtgggggagaacegtatataagtgcag- tagtegcegtgaacgttettttegeaacgggtttgcegeca- gaacacaggccggatcaacgecetaggtttatatttaga- tgaactgacatacgegtatcegtetataaatcaaggtca- taacctgtagtgaaatatatattaaacaaggttatgac- cttgatttattacggtaacgcggaattcgeaactattttat- caattttttgegtegaceeggateaacgecetaggtttato- tttggatgaactgacatacgegtateegtetataaatcaagao- tcataacctgtagtgaaatatatattaaacaaggttatgac- cttgatttattacggtaacgcggaattegeaactattttat- caattttttgegtegacaacttgtttattgcagettataa- tggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaa- taaagcatttttttcactgcattctagttatggttto- tccaaactcatcaatgtatettateatetacgegtecaggaa- tcatctttaccagateteaaaaagaaggtetteattacac- ctgcagcteteattttecatacagtcagtatcaattetagga- agaatttccagacattaaagatagtcatcttggggetag- tecctagcegetgettateatagte Exemplo 4 — Condicionamento antes do transplante de células- tronco hematopoiéticas
[00239] O transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSCT) é amplamente usado para tratar malignidades hematológicas e também oferece terapia curativa para pacientes com hemoglobinopatias, imu- nodeficiências congênitas, e outras condições, incluindo doenças in- fecciosas tais como HIV/AIDS. Entretanto, a capacidade das HSCT de curar esta ampla gama de doenças não malignas é drasticamente su- butilizada. Os obstáculos para o uso de HSCT alogênicas nestas di- versas condições referem-se principalmente à frequência de doença do enxerto versus hospedeiro com risco de vida (GVHD), de complica- ções agudas que resultam dos efeitos citotóxicos do condicionamento, tais como mucosite e infecções, e de complicações irreversíveis a lon- go prazo que surgem dos efeitos genotóxicos do condicionamento, tal como infertilidade. HSCT autólogas usando células geneticamente cor- rigidas evitariam o risco de GVHD, mas a genotoxicidade do condicio-
namento continua sendo uma barreira significativa para o desenvolvi- mento desta abordagem.
[00240] Uma seara promissora para melhorar a segurança do con- dicionamento é o uso de drogas, tais como anticorpos, que sejam visa das especificamente para as HSCs e outras células hematopoiéticas no nicho da medula óssea e que, acredita-se, poupem as células não ematopoiéticas. Determinadas imunotoxinas internalizadoras (também conhecidas como conjugados de anticorpo-droga ou ADCs) visa das para o receptor de CD45 restrito a células hematopoiéticas ou o CD117 mais específico para HSC (c-Kit) podem ser usadas com esta finalidade (vide, por exemplo, Publicações de Patente US Nº 2017/0360954 e 2018/014/294; e Publicaõões PCT Nº WO/2017/219025 e WO/2017/219029, cujas íntegras estão aqui incor- poradas a título de referência). Em algumas modalidades, a imunoto- xina é selecionada dentre exotoxina A de pseudomonas, deBouganin, toxina diftérica, uma amatoxina, tal como a-amanitina, saporina, mai- tansina, um maitansinoide, uma auristatina, uma antraciclina, uma ca- liqueamicina, irinotecano, SN-38, uma duocarmicina, uma pirroloben- zodiazepina, um dímero de pirrolobenzodiazepina, uma indolinoben- zodiazepina, ou um dímero de indolinobenzodiazepina, Ricina-A ou uma variante da mesma. Em algumas modalidades, a imunotoxina é saporina, uma proteína catalítica inativadora do ribossoma N-glico- sidase que interrompe a síntese de proteínas. Ao contrário de outros da família das ricinas, acredita-se que ela não possua um domínio ge- ral de entrada de células e seja não-tóxica, a menos que conjugada a um anticorpo visa do ou a um ligando capaz de internalização mediada por receptor.
[00241] Em testes pré-clínicos, uma única dose da imunotoxina, CDA45-SAP (saporina conjugada a um anticorpo visa do para CD45), possibilitou a enxertia eficiente (>90%) de células doadoras e a com-
pleta correção de um modelo de camundongo com anemia de células falciformes. Ao contrário da radiação, a CD45-SAP evitou completa- mente neutropenia e anemia, poupou a medula óssea e os nichos tí- micos, possibilitando uma rápida recuperação de células T e B, pre- servou a imunidade antifúngica, e teve toxicidade geral mínima. Ca- mundongos NSG humanizados tratados com uma única dose de CD117-SAP apresentaram mais de 90% de depleção de HSPCs na medula óssea depois de uma única administração do ADC. Estes mé- todos de condicionamento não genotóxicos podem oferecer uma alter- nativa atraente para os atuais esquemas de condicionamento para HSCT no tratamento de doenças não malignas do sangue. A seguran- ça aumentada desses agentes de condicionamento visa dos pode am- pliar o uso de transplante de medula óssea curativo em pacientes que não conseguem tolerar os atuais métodos de condicionamento e em pacientes nos quais se acredita que transplante de medula óssea seja bastante arriscado.
[00242] No contexto da presente invenção, os pacientes são condi- cionados para junção das células-tronco existentes na medula óssea e das células doentes, e para prevenção de rejeição das células-tronco que entram. Este processo utiliza atualmente agentes tóxicos original- mente desenvolvidos para tratar câncer, e procedimentos tais como radiação que eliminam células de forma inespecífica. Para combater este procedimento agressivo, as Requerentes desenvolveram um pro- cedimento por meio do qual os pacientes são tratados com uma com- binação condicionamento de intensidade reduzida (por exemplo, bu- sulfano ou melfalano — ambos agentes alquilantes anticâncer inespecí- ficos) seguido por seleção pós-infusão de células com genes modifica- dos, com o objetivo de apresentar HSCT como procedimento ambula- torial, com eventos adversos relacionados ao condicionamento drasti- camente reduzidos. Ainda assim, é necessário algum nível de quimio-
terapia inespecífica para fazer espaço na medula óssea para a popu- lação de células com genes modificados.
[00243] Como uma alternativa para o condicionamento de intensi- dade reduzida pelo uso de busulfano ou melfalano, conjugados de an- ticorpo-droga (descritos acima) podem ser usados como um método de condicionamento alternativo, possibilitando o condicionamento não genotóxico da medula óssea nos pacientes antes de receberem tera- pia genética de acordo com os métodos descritos neste pedido. Espe- cificamente, pacientes com a doença de células falciformes ou B- talassemia recebem a infusão de um SAP anti-CD45 ou de um SAP anti-CD117/c-kit (ou uma combinação dos dois anticorpos) para "fazer espaço" na medula óssea, seguida pela infusão de uma HSC modifi- cada de acordo com os métodos descritos neste pedido. A administra- ção de 6TG após a infusão pode aumentar o quimerismo das células com genes modificados para corrigir a doença. Acredita-se que isto poderia ser feito potencialmente com toxicidade geral mínima ou even- tos adversos mínimos para o paciente.
MODALIDADES ADICIONAIS
[00244] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um vetor compreendendo (i) uma sequência de ácidos nucleicos codi- ficando um sShRNA visa do para um gene de HPRT; e (ii) uma sequên- cia de ácidos nucleicos codificando um gene terapêutico. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o SRRNA visa do para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30. Em algumas moda- lidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA visa do para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA visa do para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identi-
dade com aquela de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA visa do para o gene de HPRT tem uma sequência de SEQ ID NO: 30. Em algumas modali- dades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o gene terapêutico tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o gene terapêutico tem uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o gene terapêutico tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identi- dade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos codificando o gene terapêutico tem a se- quência de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA visa do para o gene de HPRT é operacionalmente ligada a um promotor de Pol Ill. Em algumas moda- lidades, o promotor de Pol Ill é 7sk, ou um promotor 7sk tendo pelo menos uma mutação ou deleção. Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos codificando o gene terapêutico é operaci- onalmente ligada a um promotor de pol Il. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o gene terapêutico é ope- racionalmente ligada a um promotor de beta globina. Em algumas mo- dalidades, o vetor compreende ainda uma sequência de controle de expressão tendo uma repetição terminal 5' comprida a montante do ácido nucleico codificando o ShRNA visa do para o gene de HPRT, e uma repetição terminal 3' longa a jusante do ácido nucleico codificando o gene de gama-globina.
[00245] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um vetor compreendendo uma primeira sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90%
de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalida- des, o vetor é um vetor lentiviral.
[00246] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um vetor compreendendo uma primeira sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalida- des, o vetor é um vetor lentiviral.
[00247] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um vetor compreendendo uma primeira sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 96% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 96% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalida- des, o vetor é um vetor lentiviral.
[00248] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um vetor compreendendo uma primeira sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 97% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 97% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalida- des, o vetor é um vetor lentiviral.
[00249] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um vetor compreendendo uma primeira sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalida- des, o vetor é um vetor lentiviral.
[00250] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um vetor compreendendo uma primeira sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 99% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 99%
de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalida- des, o vetor é um vetor lentiviral.
[00251] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um vetor compreendendo uma primeira sequência de ácidos nucleicos tendo a SEQ ID NO: 30, e uma segunda sequência de ácidos nuclei- cos tendo a SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor lentiviral.
[00252] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se uma composição compreendendo um vetor compreendendo (i) uma sequência de ácidos nucleicos codificando um sShRNA visa do para um gene de HPRT; e (ii) uma sequência de ácidos nucleicos codificando um gene terapêutico. Em algumas modalidades, a composição com- preende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o SRRNA visa do para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30. Em algumas moda- lidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA visa do para o gene de HPRT tem uma sequência de SEQ ID NO: 30. Em al- gumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o gene terapêutico tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identi- dade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos codificando o gene terapêutico tem uma sequência de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA visa do para o gene de HPRT é operacionalmente ligada a um promotor de Pol Ill. Em algu- mas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o gene terapêutico é operacionalmente ligada a um promotor de beta globina. Em algumas modalidades, a composição é formulada como an emul- sion. Em algumas modalidades, a composição é formulada dentro de micelas. Em algumas modalidades, a composição é encapsulada em um polímero. Em algumas modalidades, as composições são encap- suladas em lipossomas. Em algumas modalidades, as composições são encapsuladas em micelas ou nanocápsulas.
[00253] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se uma célula compreendendo um vetor compreendendo (i) uma sequên- cia de ácidos nucleicos codificando um ShRNA visa do para um gene de HPRT; e (ii) uma sequência de ácidos nucleicos codificando um gene terapêutico. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA visa do para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA visa do para o gene de HPRT tem uma sequên- cia de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, a sequência de áci- dos nucleicos codificando o gene terapêutico tem uma sequência ten- do pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o gene terapêutico tem uma sequência de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o SRRNA visa do para o gene de HPRT é operacionalmente ligada a um promo- tor de Pol Ill. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nuclei- cos codificando o gene terapêutico é operacionalmente ligada a um promotor de beta globina.
[00254] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se uma célula transduzida por um vetor compreendendo (i) uma sequên- cia de ácidos nucleicos codificando um sShRNA visa do para um gene de HPRT; e (ii) uma sequência de ácidos nucleicos codificando um gene terapêutico. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA visa do para o gene de HPRT tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o ShRNA visa do para o gene de HPRT tem uma sequên- cia de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, a sequência de áci- dos nucleicos codificando o gene terapêutico tem uma sequência ten- do pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o gene terapêutico tem uma sequência de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o SRRNA visa do para o gene de HPRT é operacionalmente ligada a um promo- tor de Pol Ill. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nuclei- cos codificando o gene terapêutico é operacionalmente ligada a um promotor de beta globina. Em algumas modalidades, a célula é uma HSC.
[00255] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 5.
[00256] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um plasmídio recombinante compreendendo entre cerca de 11200 nu- cleotídeos e cerca de 12300 nucleotídeos, e onde o plasmídio com- preende uma primeira sequência de ácidos nucleicos tendo pelo me- nos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, o plasmídio compreende entre cerca de 11600 nucleotídeos e cerca de 12200 nu- cleotídeos. Em algumas modalidades, o plasmídio compreende entre cerca de 11600 nucleotídeos e cerca de 11700 nucleotídeos. Em al- gumas modalidades, o plasmídio compreende entre cerca de 12000 nucleotídeos e cerca de 12100 nucleotídeos.
[00257] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um vetor lentiviral compreendendo (a) uma estrutura lentiviral compre- endendo sequências lentivirais essenciais para integração no genoma de uma célula-alvo; (b) uma primeira sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 30; (c) uma segunda sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 55; (d) um primeiro elemento de controle de expressão que regula a expressão do primei- ro ácido nucleico; e (e) um segundo elemento de controle de expres- são que regula a expressão do segundo ácido nucleico.
[00258] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um vetor de expressão lentiviral compreendendo uma primeira se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 23 - 31, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos tendo a SEQ ID NO: 55.
[00259] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um sh734 shRNA modificado tendo pelo menos um dentre: (i) uma in- corporação de uma sequência de alça de hsa-miR-22; (ii) uma adição de um espaçador 3' — 5'; (iii) uma modificação no início 5'; e/ou (iv) uma adição de dois nucleotídeos 5' e 3' ao tronco e à alça.
[00260] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um método de codistribuição em uma célula tanto de um gene tera- pêutico quanto de um RNA interferente, o RNA interferente visa do o HPRT. Em algumas modalidades, o gene terapêutico codifica um gene para tratar deficiências imunes, doenças hereditárias, doenças do sangue (por exemplo, hemofilia, distúrbios de hemoglobina), doenças do armazenamento lisossômico, doenças neurológicas, distúrbios an- giogênicos, ou câncer.
[00261] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se um vetor compreendendo uma primeira sequência de controle de ex- pressão operacionalmente ligada a uma primeira sequência de ácidos nucleicos, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um RNAi para nocautear o HPRT; e uma segunda sequência de controle de expressão operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácidos nucleicos, a segunda sequência de ácidos nucleicos codifican- do um gene de gama-globina.
Em algumas modalidades, o RNAi é um ShRNA.
Em algumas modalidades, o ShRNA compreende uma se- quência de alça tipo grampo de cabelo de SEQ ID NO: 35. Em algu- mas modalidades, shRNA tem pelo menos 95% de identidade de se- quência com aquela de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, o ShRNA tem a sequência de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalida- des, o ShRNA tem pelo menos 95% de identidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, e SEQ ID NO: 29. Em algumas modalidades, o ShRNA tem pelo menos 95% de identidade de se- quência com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 68. Em algumas moda- lidades, o ShRNA tem pelo menos 95% de identidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27. Em algumas modalida- des, o ShRNA tem pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 59. Em algumas modalidades, a primeira se- quência de controle de expressão é um promotor de Pol Ill.
Em algu- mas modalidades, o promotor de Pol Ill é 7sk.
Em algumas modalida- des, o promotor 7Sk tem pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, o promotor 7sk tem a sequência de SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, o promotor 7sk tem a sequência de SEQ ID NO: 33. Em algumas moda- lidades, o segundo ácido nucleico codificando o gene de gama-globina tem pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, o segundo ácido nucleico codifi- cando o gene de gama-globina tem a SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, a segunda sequência de controle de expressão é um promotor de pol Il. Em algumas modalidades, o promotor de pol || é um promotor de beta-globina. Em algumas modalidades, o promotor de beta-globina tem pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 66. Em algumas modalidades, o primeiro ácido nucleico codifica uma molécula de ácido nucleico tendo a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o segundo ácido nucleico codifica uma molécula de ácido nucleico tendo a SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o segundo ácido nucleico codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor lentiviral auto-inativante. Em algumas modalidades, o vetor tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5 a 22. Em algumas modalidades, o vetor codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; e codifica uma molécula de ácido nucleico tendo a SEQ ID NO: 1 ou a SEQ ID NO: 2.
[00262] Em um outro aspecto da presente descrição encontra-se uma célula hospedeira isolada que inclui o vetor mencionado acima.
[00263] Todas as patentes US, publicações de pedido de patente US, pedidos de patente US, patentes estrangeiras, pedidos de patente estrangeiros e publicações não patentárias mencionadas neste relató- rio descritivo e/ou relacionados na Folha de Dados do Pedido estão aqui incorporadas em sua íntegra a título de referência. Os aspectos das modalidades podem ser modificados, se necessário, para empre- gar conceitos das várias patentes, pedidos e publicações para oferecer ainda outras modalidades.
[00264] Embora a presente invenção tenha sido descrita com refe- rência a inúmeras modalidades ilustrativas, deve ficar entendido que numerosas outras modificações e modificações que estejam dentro do espírito e escopo dos princípios desta invenção podem ser vislumbra- das pelos especialistas na técnica. Mais particularmente, são possíveis variações e modificações aceitáveis nas partes componentes e/ou nos arranjos do arranjo combinado em questão que estejam dentro do es- copo da divulgação acima, dos desenhos, e das reivindicações em anexo sem se afastar do espírito da invenção.
Além das variações e modificações nas partes componentes e/ou nos arranjos, usos alterna- tivos também serão evidentes para os especialistas na técnica.

Claims (1)

  1. UT
    REIVINDICAÇÕES
    1. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender uma pri- meira sequência de controle de expressão operacionalmente ligada a uma primeira sequência de ácidos nucleicos, a primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um RNAi para nocautear o HPRT; e uma segunda sequência de controle de expressão operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácidos nucleicos, a segunda sequência de ácidos nucleicos codificando um gene de gama-globina.
    2. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe- lo fato de que o RNAi é um shRNA.
    3. Vetor de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pe- lo fato de que o ShRNA compreende uma sequência de alça tipo grampo de cabelo de SEQ ID NO: 35.
    4. Vetor de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pe- lo fato de que o ShRNA tem pelo menos 95% de identidade de se- quência com aquela de SEQ ID NO: 30.
    5. Vetor de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pe- lo fato de que o ShRNA tem a sequência de SEQ ID NO: 30.
    6. Vetor de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pe- lo fato de que o ShRNA tem pelo menos 95% de identidade de se- quência com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, e SEQ ID NO: 29.
    7. Vetor de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pe- lo fato de que o ShRNA tem pelo menos 95% de identidade de se- quência com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 68.
    8. Vetor de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pe- lo fato de que o ShRNA tem pelo menos 95% de identidade de se- quência com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27.
    9. Vetor de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pe- lo fato de que o ShRNA tem pelo menos 95% de identidade de se- quência com aquela de SEQ ID NO: 59.
    10. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência de controle de expressão é um promotor de Pol Ill.
    11. Vetor de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o promotor de Pol Ill é 7sk.
    12. Vetor de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o promotor de 7sk tem pelo menos 95% de identidade de sequência com aquela de SEQ ID NO: 32.
    13. Vetor de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o promotor de 7sk tem a sequência de SEQ ID NO:
    32.
    14. Vetor de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o promotor de 7sk tem a sequência de SEQ ID NO:
    33.
    15. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o segundo ácido nucleico codificando o gene de gama-globina tem pelo menos 95% de identida- de de sequência com aquela de SEQ ID NO: 55.
    16. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o segundo ácido nucleico codificando o gene de gama-globina tem a SEQ ID NO: 55.
    17. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a segunda sequência de controle de expressão é um promotor de pol Il.
    18. Vetor de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o promotor de pol Il é um promotor de beta-globina.
    19. Vetor de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o promotor de beta-globina tem pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 66.
    20. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o primeiro ácido nucleico codifica uma molécula de ácido nucleico tendo a SEQ ID NO: 1 ou a SEQ ID NO: 2.
    21. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o segundo ácido nucleico codifica uma molécula de ácido nucleico tendo a SEQ ID NO: 3.
    22. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o segundo ácido nucleico codifica um polipeptídio tendo pelo menos 95% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 4.
    23. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor lentivi- ral de auto-inativação.
    24. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de compreender ainda um isola- dor de cSH4.
    25. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ter pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer das SEQ ID NOS: 5 a 22.
    26. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a segunda sequência de ácidos nucleicos codifica um polipeptídio tendo pelo menos 98% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 4; e a primeira sequência de ácidos nucleicos codifica uma mo- lécula de ácido nucleico tendo pelo menos 98% de identidade com aquela de SEQ ID NO: 1 ou seu complemento.
    27. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender o vetor como definido em qualquer uma das reivindica-
    ções | a 26 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
    28. Célula isolada, caracterizada pelo fato de compreender o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26.
    29. Célula hospedeira transduzida com o vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de ser substancialmente deficiente em HPRT.
    30. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de expressar o gene de gama-globina.
    31. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de ser formulada com um veículo farmaceuti- camente aceitável.
    32. Célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de ser para uso no tra- tamento da doença de células falciformes ou para reduzir os sintomas da doença de células falciformes.
    33. Método de seleção de células transduzidas, caracteri- zado pelo fato de compreender: transduzir uma população de células com o vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26; e enriquecer a população de células transduzidas selecionando as célu- las transduzidas com um análogo de puridina.
    34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que o análogo de purina é selecionado do grupo que consiste em 6TG e 6-mercaptopurina.
    35. Método de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que as células transduzidas são HSCs.
    36. Método de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que as HSCs são HSCs alogênicas.
    37. Método de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que as HSCs são HSCs autólogas.
    38. Método de acordo com a reivindicação 33, caracteriza-
    do pelo fato de que as HSCs são HSCs aparentadas.
    39. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de ser prepa- rada por transdução de uma célula-tronco hematopoiética com um ve- tor de expressão lentiviral, sendo que o vetor de expressão lentiviral compreende uma primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um shRNA anti-HPRT, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos codificando um gene de gama-globina.
    40. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que o vetor de expressão lentiviral tem uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com qualquer um das SEQ ID NOS: 5 a 22.
    41. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender a célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 39 e 40 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
    42. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compre- ender: (i) uma molécula de ácido nucleico tendo a SEQ ID NO: 1 ou a SEQ ID NO: 2; e (ii) uma molécula de ácido nucleico tendo a SEQ ID NO: 3.
    43. Método para tratar a doença de células falciformes, ca- racterizado pelo fato de compreender administrar as células hospedei- ras como definidas em qualquer uma das reivindicações 29, 30, 39, e 40 a um paciente com necessidade de tratamento da mesma.
    44. Método para reduzir os sintomas da doença de células falciformes, caracterizado pelo fato de compreender administrar as cé- lulas hospedeiras como definidas em qualquer uma das reivindicações 29, 30, 39, e 40 a um paciente com necessidade de tratamento da mesma.
    45. Método para reduzir os sintomas da doença de células falciformes severa, caracterizado pelo fato de compreender administrar as células hospedeiras como definida em qualquer uma das reivindi-
    cações 29, 30, 39, e 40 a um paciente com necessidade de tratamento da mesma.
    46. Método para tratar uma hemoglobinopatia, caracteriza- do pelo fato de compreender administrar as células hospedeiras como definidas em qualquer uma das reivindicações 29, 30, 39, e 40 a um paciente com necessidade de tratamento da mesma.
    47. Método para tratar beta-talassemia, caracterizado pelo fato de compreender administrar as células hospedeiras como defini- das em qualquer uma das reivindicações 29, 30, 39, e 40 a um pacien- te com necessidade de tratamento da mesma.
    48. Método para tratar a doença de células falciformes ou de redução de pelo menos um sintoma da doença de células falcifor- mes em um paciente humano, caracterizado pelo fato de compreender: (a) transduzir células hematopoiéticas com um vetor de expressão len- tiviral, onde o vetor de expressão lentiviral compreende uma primeira sequência de ácidos nucleicos codificando um sShRNA anti-HPRT, e uma segunda sequência de ácidos nucleicos codificando um gene de gama-globina; e (b) introduzir as células hematopoiéticas transduzidas no paciente humano.
    49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracteriza- do pelo fato de compreender ainda condicionar o paciente antes de introduzir as células hematopoiéticas transduzidas, onde o condicio- namento compreende administrar quimioterapia, radioterapia, ou tra- tamento com um ou mais conjugados de anticorpo-droga.
    50. Método de acordo com a reivindicação 48, caracteriza- do pelo fato de que o tratamento compreende ainda administrar uma ou mais doses de hidroxiureia depois do transplante.
    51. Método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal, caracterizado pelo fato de compreender administrar as células hospe- deiras como definidas em qualquer uma das reivindicações 29, 30, 39,
    e 40 a um paciente com necessidade de tratamento do mesmo.
    52. Célula hospedeira que é deficiente em HPRT e que ex- pressa um polipeptídio tendo a SEQ ID NO: 4, caracterizada pelo fato de ser preparada por transdução de uma HSC com o vetor como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26.
    53. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compre- ender: (i) pelo menos uma molécula de ácido nucleico tendo a SEQ ID NO: 3 ou um polipeptídio tendo a SEQ ID NO: 4; e (ii) pelo menos uma molécula de ácido nucleico tendo a SEQ ID NO: 1 ou uma molécula de ácido nucleico tendo a SEQ ID NO: 2.
    54. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 53, caracterizada pelo fato de ser preparada por contato de uma HSC com o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26.
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