JP2022514955A - ウィスコット・アルドリッチ症候群の造血幹細胞遺伝子治療 - Google Patents

ウィスコット・アルドリッチ症候群の造血幹細胞遺伝子治療 Download PDF

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Abstract

本開示は、少なくとも２つの核酸配列を含む発現ベクターであって、すなわち、抗ＨＰＲＴ ＲＮＡｉをコードする核酸配列、およびウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは自己不活性化レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質はウィスコット・アルドリッチ症候群と関連する病理を緩和するために使用される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その開示を参照によってその全体を本明細書に組み入れる、２０１８年１２月２３日に出願された米国仮出願第６２／７８４，５０８号の出願日の利点を主張する。
本開示は、一般に、遺伝子治療、特に、発現ベクターによって形質導入した造血幹細胞に関する。
ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）は、まれな、回帰感染、小型血小板、マイクロ血小板減少症、湿疹、ならびに自己免疫症状および腫瘍のリスクの増加によって特徴づけられるＸ連鎖原発性免疫不全（ＰＩＤ）障害である。ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳＰ）遺伝子における変異は、ウィスコット・アルドリッチ症候群の原因となる。ＷＡＳタンパク質をコードする遺伝子は、Ｘ染色体の短腕に位置し（ＸＰ１１．２２－１１．２３）、約９ｋｂであり、１２個のエキソンを含み、５０２個のアミノ酸をコードする。これまで、ミスセンス／ナンセンス、スプライシング、小さい欠失、小さい挿入、大きな欠失、および大きな挿入を含むＷＡＳＰ変異が、ウィスコット・アルドリッチ症候群の患者で同定された。
ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質は、造血系特異的細胞内シグナル伝達分子であり、プロリンリッチであり、造血細胞株においてのみ発現される。ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質は、全ての白血球で発現されることが見出されたアクチン細胞骨格の重要な調節因子であると考えられる。それは、接着、遊走、食作用、免疫シナプス形成、および受容体媒介細胞活性化方法（例えば、ＢおよびＴ細胞抗原受容体）のような、複数の細胞機能に必須である動的な細胞骨格の変化に関与すると考えられる。結果として、ウィスコット・アルドリッチ症候群患者において自然免疫と細胞の適応免疫の両方が影響されると考えられ、これらの患者を感染に非常に感受性にする。
一般に、タンパク質発現の不在をもたらすＷＡＳ遺伝子変異は、「古典的なウィスコット・アルドリッチ症候群」を生じる。ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質発現の低下は、Ｘ連鎖血小板減少症を生じる。機能獲得型変異を活性化するウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質はＸ連鎖好中球減少症を生じる。ＷＡＳ遺伝子産物内の変異により、広範な臨床疾患がある。ウィスコット・アルドリッチ症候群を有する１５４人の患者の一研究では、３０％のみが血小板減少症、小型血小板、湿疹、および免疫不全による古典的な徴候を示し；８４％が血小板減少症の臨床徴候および症状を示し、８０％が湿疹を示し、２０％が血液学的異常のみを示し、５％が感染の症状のみを示す（非特許文献１を参照）。自己免疫疾患は共通しており、患者の４０～７０％まで生じる。リンパ腫、白血病、および脊髄形成異常のようなリンパ細網の悪性腫瘍（１０～２０％）のリスクの著しい増加があるとも考えられる。フランスの１つの病院からのウィスコット・アルドリッチ症候群を有する５５人の患者の別の報告では、２０年にわたり、７０％の患者で自己免疫または炎症状態、最も一般的には自己免疫溶液性貧血が見出された。
ウィスコット・アルドリッチ症候群は、ほぼ４０年前に同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）によってこれまでに処置が成功した最初の疾患の１つであった（非特許文献２、非特許文献３）。ＷＡＳの処置のための遺伝子治療アプローチは、報告され続けており、例えば、非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７および非特許文献８を含む。
骨髄移植は、この疾患の効き目が証明された唯一の治療法であり、結果はＨＬＡ適合ドナー（２０％より少ない患者だけが入手できる）によるそれらの患者でまあまあ良い。造血幹細胞遺伝子治療（ＨＳＣ－ＧＴ）は、新しい、治療可能性のある、適合ドナーのいない患者のためのオプションを提供する。遺伝子治療は、同種ＨＳＣＴへのいくつかの可能な利点を提供する。それは全ての患者に理論的に利用可能であり、移植片拒絶のリスクを減らし、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）と関連するリスクを避けることができると考えられる。
Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ．１９９４年；１２５（６ Ｐｔ １）：８７６～８５頁 Ｇａｌｙ，Ｒｏｎｃａｒｏｌｏら ２００８年 Ｃａｎｄｏｔｔｉ ２０１８年 Ａｉｕｔｉら（２０１３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４１、１２３３１５１頁 Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ Ａｂｉｎａら（２０１５年）ＪＡＭＡ、３１３、１５５０～１５６３頁 Ｋｏｌｄｅｊら（２０１３年）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｖｏｌ２４、７７～８５頁 Ｗｉｅｌｇｏｓｚら（２０１５年）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ２、１４０６３頁 Ｓｉｎｇｈら（２０１７年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ．４ １～１６頁
ヒト幹細胞を改変する遺伝子治療戦略は、多くのヒト疾患の治療にかなり有望である。しかしながら、遺伝子治療に伴う問題の１つは、十分なレベルの生着を得ることである。遺伝子改変幹細胞の生着は、幹細胞を操作することによって増強されると考えられ、ここでは、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（「ＨＰＲＴ」）発現がノックダウンされ、それによりグアニン類似体代謝拮抗薬に対する耐性を与えることによって遺伝子改変細胞の選択を可能にする。
本開示の第１の態様では、発現ベクターであって、ＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列；およびウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（例えば、野生型ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質またはコドン最適化ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質）をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列を含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、発現ベクターはレンチウイルス発現ベクターである。いくつかの実施形態では、レンチウイルス発現ベクターはインテグレーション欠損レンチウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号３２を有するヘアピンループ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２６の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２６の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号３４および配列番号３５からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号３４および配列番号３５のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２１および配列番号２２からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２１および配列番号２２のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号３６の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号３６の配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の発現制御配列はＰｏｌＩＩＩプロモーターまたはＰｏｌＩＩプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ＰｏｌＩＩＩプロモーターは７ｓｋである。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは配列番号２８の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは配列番号２８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは配列番号２９の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸は、配列番号１、２、３、および４のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸は、配列番号１、２、３、および４のいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸は、配列番号１、２、３、および４のいずれか１つと少なくとも９９％同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸は、配列番号１、２、３、および４のいずれか１つを含む配列を含む。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸は、配列番号６７、６８、および６９のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸は、配列番号６７、６８、および６９のいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸は、配列番号６７、６８、および６９のいずれか１つと少なくとも９９％同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸は、配列番号６７、６８、および６９のいずれか１つを含む配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の発現制御配列はＭＮＤプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ＭＮＤプロモーターは、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を含む。いくつかの実施形態では、ＭＮＤプロモーターは、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２のいずれか１つと少なくとも９９％同一性を含む。
いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は配列番号５および６のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドをコードし；第１の核酸配列は配列番号１６またはその相補鎖と少なくとも９５％同一性を有する核酸分子をコードする。
いくつかの実施形態では、発現ベクターはインスレーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、インスレーターは、６５０ｃＨＳ４インスレーター、４００ｃＨＳ４インスレーター、および泡沫状ウイルスインスレーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するインスレーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０からなる群から選択される核酸配列を有するインスレーターをさらに含む。
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列の下流に位置する。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列と同じ方向に配向されている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は第１の方向に配向され、ここで、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列は第２の方向に配向され、第１の方向と第２の方向は反対である。
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列の上流に位置する。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列と同じ方向に配向されている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は第１の方向に配向され、ここで、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列は第２の方向に配向され、第１の方向と第２の方向は反対である。
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は第１の方向に配向され、ここで、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列は第２の方向に配向され、第１の方向と第２の方向は反対である。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列の下流に位置する。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列の上流に位置する。
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列と同じ方向に配向されている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列の下流に位置する。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列の上流に位置する。
本開示の第２の態様では、発現カセットであって、配列番号１５の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を含む発現カセットを提供する。いくつかの実施形態では、発現カセットは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９６％同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９９％同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは配列番号１５を含む。
本開示の第３の態様では、レンチウイルスベクターであって、配列番号１５の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む発現カセットを含み、６５０ｃＨＳ４インスレーター、４００ｃＨＳ４インスレーター、および泡沫状ウイルスインスレーターからなる群から選択されるインスレーターをさらに含むレンチウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、インスレーターは、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、インスレーターは、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０からなる群から選択される核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、第２の発現カセットをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、７ｓｋプロモーターおよびＨＰＲＴをノックダウンするＲＮＡｉをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは配列番号１４の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは配列番号１４の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む。
本開示の第４の態様では、宿主細胞であって、ＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列；およびウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列を含む発現ベクターによって形質導入された宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質は野生型ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質である。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質はコドン最適化ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質である。いくつかの実施形態では、発現ベクターはレンチウイルス発現ベクターである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は実質的にＨＰＲＴ欠損である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は薬学的に許容される担体と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は造血幹細胞である。
本開示の第５の態様では、宿主細胞であって、配列番号１５の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む発現カセットを含み、６５０ｃＨＳ４インスレーター、４００ｃＨＳ４インスレーター、および泡沫状ウイルスインスレーターからなる群から選択されるインスレーターをさらに含むレンチウイルスベクターによって形質導入された宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは第２の発現カセットをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は実質的にＨＰＲＴ欠損である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は薬学的に許容される担体と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は造血幹細胞である。
本開示の第６の態様では、宿主細胞であって、ＨＰＲＴ欠損であり、配列番号５および６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するペプチドを発現する宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、発現されたペプチドは配列番号５および６のいずれか１つと少なくとも９６％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現されたペプチドは配列番号５および６のいずれか１つと少なくとも９７％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現されたペプチドは配列番号５および６のいずれか１つと少なくとも９８％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現されたペプチドは配列番号５および６のいずれか１つと少なくとも９９％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現されたペプチドは配列番号５および６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は造血幹細胞である。
本開示の第７の態様では、ＨＰＲＴ欠損であり、配列番号５および６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するペプチドを発現する宿主細胞であって、ＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列；およびウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列を含む発現ベクターによって宿主細胞に形質導入することによって調製される宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、発現されたペプチドは配列番号５および６のいずれか１つと少なくとも９６％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現されたペプチドは配列番号５および６のいずれか１つと少なくとも９７％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現されたペプチドは配列番号５および６のいずれか１つと少なくとも９８％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現されたペプチドは配列番号５および６のいずれか１つと少なくとも９９％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現されたペプチドは配列番号５および６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の発現制御配列はＭＮＤプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するインスレーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３８、３９、および４０のいずれか１つを含む核酸配列を有するインスレーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は造血幹細胞である。
本開示の第８の態様では、医薬組成物であって、ＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列；およびウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列；ならびに薬学的に許容される担体を含む発現ベクターを含む医薬組成物を提供する。
本開示の第９の態様では、医薬組成物であって、ＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列；およびウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列；ならびに薬学的に許容される担体を含む発現ベクターによって形質導入された宿主細胞を含む医薬組成物を提供する。
本開示の第１０の態様では、形質導入された細胞を選択する方法であって、ＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列；およびウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列を含む発現ベクターによって細胞の集団に形質導入する工程；ならびにプリン類似体によって形質導入された細胞を選択することによって、形質導入された細胞の集団を濃縮する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、プリン類似体は、６－チオグアニン（「６ＴＧ」）および６－メルカプトプリンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、形質導入された細胞はＨＳＣである。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは同種ＨＳＣである。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは自家ＨＳＣである。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは兄弟適合ＨＳＣである。
本開示の第１１の態様では、治療有効量の形質導入された宿主細胞をその処置を必要とする患者に投与する工程を含む、ウィスコット・アルドリッチ症候群と関連する病理を緩和する方法であって、形質導入された宿主細胞は、ＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列；およびウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列を含む発現ベクターによって宿主細胞の集団に形質導入することによって調製される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群と関連する病理は、マイクロ血小板減少症、湿疹、自己免疫疾患、および回帰感染からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、回帰感染は回帰皮膚感染を含む。いくつかの実施形態では、回帰感染は、中耳炎、皮膚膿瘍、肺炎、腸炎、髄膜炎、敗血症、および尿路感染症からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、湿疹は治療抵抗性湿疹である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、溶血性貧血、血管炎、関節炎、好中球減少症、炎症性腸疾患、およびＩｇＡ腎症、ヘノッホ・シェーンライン様紫斑病、皮膚筋炎、再発性血管性浮腫、およびぶどう膜炎からなる群から選択される。
本開示の第１２の態様では、ポリヌクレオチドであって、配列番号１４の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する第１の核酸配列、および配列番号１５の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号１３を有する核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号４１を有する核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号３１を有する核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０からなる群から選択される核酸配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は第２の核酸配列の上流に位置する。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は第２の核酸配列と同じ配向を有する。いくつかの実施形態では、同じ配向はフォワード配向である。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は第２の核酸配列と異なる配向を有する。いくつかの実施形態では、異なる配向はリバース配向である。
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は第２の核酸配列の下流に位置する。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は第２の核酸配列と同じ配向を有する。いくつかの実施形態では、同じ配向はフォワード配向である。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は第２の核酸配列と異なる配向を含む。いくつかの実施形態では、異なる配向はリバース配向である。
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は第１の方向に配向され、ここで、第２の核酸配列は第２の方向に配向され、第１の方向と第２の方向は反対である。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は第２の核酸配列の下流に位置する。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は第２の核酸配列の上流に位置する。
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は第２の核酸配列と同じ方向に配向されている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は第２の核酸配列の下流に位置する。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は第２の核酸配列の上流に位置する。
本開示の第１３の態様では、ポリヌクレオチドであって、配列番号４２～５７のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号４２～５７のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号４２～５７のいずれか１つと少なくとも９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号４２～５７のいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号４２～５７のいずれか１つと少なくとも９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号４２～５７のいずれか１つと少なくとも９９％同一性を有する。
本開示の第１４の態様では、ポリヌクレオチドであって、配列番号４２～５７のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
本開示の第１５の態様では、発現ベクターであって、（ａ）ｐＴＬ２０ｃをコードする核酸配列；（ｂ）ＷＡＳＰ発現カセットをコードする核酸；および（ｃ）７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、発現ベクターはインスレーターをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＷＡＳＰ発現カセットは７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの上流に位置する。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの上流に位置するＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号４４、４５、４８、および４９のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの上流に位置するＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号４４、４５、４８、および４９のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの上流に位置するＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号５１、５３、５５、および５７のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの上流に位置するＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号５１、５３、５５、および５７のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＷＡＳＰ発現カセットは７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの下流に位置する。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの下流に位置するＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号４２、４３、４６、および４７のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの下流に位置するＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号４２、４３、４６、および４７のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの下流に位置するＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号５０、５２、５４、および５６のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの下流に位置するＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号５０、５２、５４、および５６のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットおよびＷＡＳＰ発現カセットは同じ方向に配向されている。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットおよびＷＡＳＰ発現カセットは反対方向に配向されている。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットはＷＡＳＰカセットに対してフォワード方向に配向されている。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットはＷＡＳＰ発現カセットに対してリバース方向に配向されている。
いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットに対して同じ方向に配向されているＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号４２、４４、４６、および４８のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットに対して同じ方向に配向されているＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号４２、４４、４６、および４８のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットに対して同じ方向に配向されているＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号５０、５１、５４、および５５のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットに対して同じ方向に配向されているＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号５０、５１、５４、および５５のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットに対して反対方向に配向されているＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号４３、４５、４７、および４９のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットに対して反対方向に配向されているＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号４３、４５、４７、および４９のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットに対して反対方向に配向されているＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号５２、５３、５６、および５７のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットに対して反対方向に配向されているＷＡＳＰ発現カセットを有する発現ベクターは、配列番号５２、５３、５６、および５７のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。
本開示の第１６の態様には、ポリヌクレオチドであって、配列番号５８と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドがある。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号５８と少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号５８と少なくとも９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号５８と少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号５８と少なくとも９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号５８と少なくとも９９％同一性を有する。
本開示の第１７の態様には、ポリヌクレオチドであって、配列番号５８を有するポリヌクレオチドがある。
本開示の第１８の態様には、ポリヌクレオチドであって、配列番号５９と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドがある。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号５９と少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号５９と少なくとも９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号５９と少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号５９と少なくとも９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号５９と少なくとも９９％同一性を有する。
本開示の第１９の態様には、ポリヌクレオチドであって、配列番号５９を有するポリヌクレオチドがある。
本開示の第２０の態様には、ポリヌクレオチドであって、配列番号６３および６５のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドがある。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号６３および６５のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号６３および６５のいずれか１つと少なくとも９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号６３および６５のいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号６３および６５のいずれか１つと少なくとも９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号６３および６５のいずれか１つと少なくとも９９％同一性を有する。
本開示の第２１の態様には、ポリヌクレオチドであって、配列番号６３および６５のいずれか１つを有するポリヌクレオチドがある。
本開示の第２２の態様には、ポリヌクレオチドであって、配列番号６４および６６のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドがある。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号６４および６６のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号６４および６６のいずれか１つと少なくとも９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号６４および６６のいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号６４および６６のいずれか１つと少なくとも９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号６４および６６のいずれか１つと少なくとも９９％同一性を有する。
本開示の第２３の態様には、ポリヌクレオチドであって、配列番号６４および６６のいずれか１つを有するポリヌクレオチドがある。
前処置とケモセレクション（例えばプリン類似体による）を組み合わせた戦略により、ＨＰＲＴ欠損、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質含有造血幹細胞の効率的および高い生着が達成されると考えられ、そのような高い生着は全体的に低い毒性で達成されると考えられる。ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質の系統特異的発現と組み合わせた、生着の増強および遺伝子改変ＨＳＣのケモセレクションは、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質を発現する細胞の十分な頻度をもたらし得ると考えられる。安全性測定のため、ＨＰＲＴ欠損細胞には、例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ）またはミコフェノール酸（ＭＰＡ）のようなジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を導入することにより負の選択を行って、プリンｄｅ ｎｏｖｏ合成経路の酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を阻害し、したがってＨＰＲＴ欠損細胞を死滅させることができる。ＨＰＲＴ欠損ＨＳＣは、プリン類似体（例えば６ＴＧ）のレジメンを使用してｉｎ ｖｉｖｏで選択され、生着を増強することができるとさらに考えられる。拡大した遺伝子改変ＨＳＣは、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質導入遺伝子を発現する赤血球へと分化できるとも考えられる。
ＭＮＤプロモーターの制御下でヒトＷＡＳＰ遺伝子をコードする核酸配列を含むベクターの線図について詳細に説明する図である。 本開示のいくつかの実施形態により、（ｉ）ＭＮＤプロモーターの制御下でヒトＷＡＳＰ遺伝子をコードする核酸配列と、（ｉｉ）７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットがｈＷＡＳＰ発現カセットの下流に位置される、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計されたｓｈＲＮＡをコードする核酸配列とを含むベクターの線図を詳細に説明する図である。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、野生型ヒトＷＡＳＰ遺伝子（例えば、配列番号６７）またはその変異体（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのサイレント突然変異を含むもの）（例えば、配列番号６８）である。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、コドン最適化される（例えば、配列番号６９）。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４８に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。 本開示のいくつかの実施形態により、（ｉ）ＭＮＤプロモーターの制御下でヒトＷＡＳＰ遺伝子をコードする核酸配列と、（ｉｉ）７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットがｈＷＡＳＰ発現カセットの下流に位置される、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計されたｓｈＲＮＡをコードする核酸配列とを含むベクターの線図を詳細に説明する図である。図１Ｂに示されるベクターと比較して、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットは、比較的、リバース方向に配向されている。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、野生型ヒトＷＡＳＰ遺伝子（例えば、配列番号６７）またはその変異体（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのサイレント突然変異を含むもの）（例えば、配列番号６８）である。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、コドン最適化される（例えば、配列番号６９）。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４５に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４９に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。 本開示のいくつかの実施形態により、（ｉ）ＭＮＤプロモーターの制御下でヒトＷＡＳＰ遺伝子をコードする核酸配列と、（ｉｉ）７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットがｈＷＡＳｐ発現カセットの上流に位置される、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計されたｓｈＲＮＡをコードする核酸配列とを含むベクターの線図を詳細に説明する図である。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、野生型ヒトＷＡＳＰ遺伝子（例えば、配列番号６７）またはその変異体（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのサイレント突然変異を含むもの）（例えば、配列番号６８）である。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、コドン最適化される（例えば、配列番号６９）。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。 本開示のいくつかの実施形態により、（ｉ）ＭＮＤプロモーターの制御下でヒトＷＡＳＰ遺伝子をコードする核酸配列と、（ｉｉ）７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットがｈＷＡＳｐ発現カセットの上流に位置される、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計されたｓｈＲＮＡをコードする核酸配列とを含むベクターの線図を詳細に説明する図である。図１Ｄに示されるベクターと比較して、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットは、比較的、リバース方向に配向されている。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、野生型ヒトＷＡＳＰ遺伝子（例えば、配列番号６７）またはその変異体（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのサイレント突然変異を含むもの）（例えば、配列番号６８）である。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、コドン最適化される（例えば、配列番号６９）。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４３に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４７に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。 本開示のいくつかの実施形態により、（ｉ）ＭＮＤプロモーターの制御下でヒトＷＡＳＰ遺伝子をコードする核酸配列と、（ｉｉ）７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットがｈＷＡＳＰ発現カセットの下流に位置される、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計されたｓｈＲＮＡをコードする核酸配列とを含むベクターの線図を詳細に説明する図である。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、野生型ヒトＷＡＳＰ遺伝子（例えば、配列番号６７）またはその変異体（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのサイレント突然変異を含むもの）（例えば、配列番号６８）である。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、コドン最適化される（例えば、配列番号６９）。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５５に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。 本開示のいくつかの実施形態により、（ｉ）ＭＮＤプロモーターの制御下でヒトＷＡＳＰ遺伝子をコードする核酸配列と、（ｉｉ）７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットがｈＷＡＳＰ発現カセットの下流に位置される、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計されたｓｈＲＮＡをコードする核酸配列とを含むベクターの線図を詳細に説明する図である。図１Ｆに示されるベクターと比較して、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットは、比較的、リバース方向に配向されている。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、野生型ヒトＷＡＳＰ遺伝子（例えば、配列番号６７）またはその変異体（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのサイレント突然変異を含むもの）（例えば、配列番号６８）である。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、コドン最適化される（例えば、配列番号６９）。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５３に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５７に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。 本開示のいくつかの実施形態により、（ｉ）ＭＮＤプロモーターの制御下でヒトＷＡＳＰ遺伝子をコードする核酸配列と、（ｉｉ）７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットがｈＷＡＳｐ発現カセットの上流に位置される、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計されたｓｈＲＮＡをコードする核酸配列とを含むベクターの線図を詳細に説明する図である。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、野生型ヒトＷＡＳＰ遺伝子（例えば、配列番号６７）またはその変異体（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのサイレント突然変異を含むもの）（例えば、配列番号６８）である。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、コドン最適化される（例えば、配列番号６９）。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５０に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。 本開示のいくつかの実施形態により、（ｉ）ＭＮＤプロモーターの制御下でヒトＷＡＳＰ遺伝子をコードする核酸配列と、（ｉｉ）７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットがｈＷＡＳｐ発現カセットの上流に位置される、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計されたｓｈＲＮＡをコードする核酸配列とを含むベクターの線図を詳細に説明する図である。図１Ｈに示されるベクターと比較して、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットは、比較的、リバース方向に配向されている。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、野生型ヒトＷＡＳＰ遺伝子（例えば、配列番号６７）またはその変異体（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのサイレント突然変異を含むもの）（例えば、配列番号６８）である。いくつかの実施形態では、ヒトＷＡＳＰ遺伝子は、コドン最適化される（例えば、配列番号６９）。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。 ｓｈ７３４の二次構造および理論的一次ＤＩＣＥＲ切断部位（矢印）を示す図である（配列番号２６も参照）。二次構造は、約－３０．９ｋｃａｌ／ｍｏｌのＭＦＥ値を有する。 ｓｈ６１６についての二次ＲＮＡ構造および最小自由エネルギー（ｄＧ）を示す図である（配列番号２３も参照）。 ｓｈ２１２についての二次ＲＮＡ構造および最小自由エネルギー（ｄＧ）を示す図である（配列番号２４も参照）。 ｓｈ７３４の改変バージョン（ｓｈ７３４．１）を示す図である（配列番号２５も参照）。二次構造は、約－３６．１６ｋｃａｌ／ｍｏｌのＭＦＥ値を有する。 人工ｍｉＲＮＡ７３４（１１１ｎｔ）の新規設計図を示す図である。（配列番号１９も参照）。 人工ｍｉＲＮＡ２１１（１１１ｎｔ）の新規設計図を示す図である（配列番号２０も参照）。 天然のｍｉＲＮＡ １６－２構造に由来する第３世代のｍｉＲＮＡスキャフォールドである、ｍｉＲＮＡ－３Ｇ骨格に包埋しているｓｈ７３４を示す図である（配列番号２２も参照）。 天然のｍｉＲＮＡ １６－２構造に由来する第３世代のｍｉＲＮＡスキャフォールドである、ｍｉＲＮＡ－３Ｇ骨格に包埋しているｓｈ２１１を示す図である（配列番号２１も参照）。 ヒト７ｓｋプロモーター突然変異を示す図である。ＴＡＴＡボックス（高く薄いボックス）と比べて７ｓｋプロモーターでのシス遠位配列エンハンサー（ＤＳＥ）および近位配列エンハンサー（ＰＳＥ）エレメント（長く広いボックス）中に導入された突然変異（矢印）および欠失が図解されている。突然変異は、Ｂｏｙｄ，Ｄ．Ｃ．、Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐ．Ｃ．、Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｎ．Ｊ．、Ｇｅｒｓｔｅｒ，Ｔ．＆Ｍｕｒｐｈｙ，Ｓ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ ｏｆ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｅｎｓｕｒｅｓ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ７ＳＫ Ｇｅｎｅ ｉｎ ｖｉｖｏ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５３、６７７～６９０頁（１９９５）によっても記載されており、前記文献の開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。 本開示のある特定の実施形態により、前処置およびケモセレクションの工程を含む、形質導入されたＨＳＣにて対象を治療する方法を示すフローチャートを詳細に説明する図である。 ＭＮＤプロモーター、ＷＡＳＰコドン最適化ｃＤＮＡ、ＷＰＲＥエレメント、および７ＳＫ／ＳｈＲＮＡを含む３ｋｂ断片を示す図である。断片は、最初に、異なる組合せにおいて異なるモジュールの迅速で容易なクローニングを可能にする任意のクローニングプラスミドベクターにおいて「構築する」ことができる。次いで、発現カセットは、ＭｌｕＩおよびＮｏｔＩ消化によって単離し、最終発現ベクターを生成するために、ｐＴ２０Ｌｃレンチウイルスベクターの独特なＭｌｕＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングすることができる。 モロニーマウス白血病（ＭｏＭｕＬＶ）長末端反復を示す図である。ＭＮＤプロモーターは、ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲに由来し得る。 ＨＰＲＴの相対的な発現レベルを示し、その時点でＨＰＲＴ欠損細胞をプリン類似体で選び出すカットオフをさらに示す図である。 ｐＴＬ２０ｃ－ＭＮＤ／ｈＷＡＳｗｔ－ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４およびｐＴＬ２０ｃ－ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４－ＭＮＤ／ｈＷＡＳｃｏベクター候補の場合のＷＡＳｐ＋細胞およびＷＡＳｐ発現の代表的結果を詳細に説明する図である（表１５を参照）。 表１５において詳細に説明した８つのベクター候補および対照のＷＡＳｐ＋発現の百分率のグラフを提供する図である。 表１５において詳細に説明した８つのベクター候補および対照の平均蛍光強度のグラフを提供する図である。 ４つの異なるベクター候補のＷＡＳｐ＋細胞対ベクターコピー数（ＶＣＮ）の百分率のグラフを提供する図である。 ４つの異なるベクター候補のベクターコピー数（ＶＣＮ）あたりのＭＦＩ（平均蛍光強度）におけるＷＡＳｐ発現のバリエーションを示す棒グラフを提供する図である。 ジャーカット細胞の６ＴＧの初期滴定を示すグラフを提供する図である。最適な６ＴＧ用量をさらに示す。 形質導入されたジャーカット細胞のケモセレクション後のベクターコピー数（ＶＣＮ）を示すグラフを提供する図である。 ＷＡＳｐノックアウトマウスの放射線照射およびその後のマウスＨＳＣの移植を図式的に示す図である。 ｐＴＬ２０ｃ＿ＳＫ７３４ｆｗｄ＿ＭＮＤ＿ＷＡＳ＿６５０（配列番号５０）のベクターマップを詳細に説明する図である。 ｐＴＬ２０ｃ＿ＭＮＤ＿ＷＡＳ＿ＳＫ７３４ｆｗｄ＿６５０（配列番号５１）のベクターマップを詳細に説明する図である。 ｐＴＬ２０ｃ＿ＳＫ７３４ｒｅｖ＿ＭＮＤ＿ＷＡＳ＿６５０（配列番号５２）のベクターマップを詳細に説明する図である。 ｐＴＬ２０ｃ＿ＭＮＤ＿ＷＡＳ＿ＳＫ７３４ｒｅｖ＿６５０（配列番号５３）のベクターマップを詳細に説明する図である。 ｐＴＬ２０ｃ＿ＳＫ７３４ｆｗｄ＿ＭＮＤ＿ｃｏＷＡＳ＿６５０（配列番号５４）のベクターマップを詳細に説明する図である。 ｐＴＬ２０ｃ＿ＭＮＤ＿ｃｏＷＡＳ＿ＳＫ７３４ｆｗｄ＿６５０（配列番号５５）のベクターマップを詳細に説明する図である。 ｐＴＬ２０ｃ＿ＳＫ７３４ｒｅｖ＿ＭＮＤ＿ｃｏＷＡＳ＿６５０（配列番号５６）のベクターマップを詳細に説明する図である。 ｐＴＬ２０ｃ＿ＭＮＤ＿ｃｏＷＡＳ＿ＳＫ７３４ｒｅｖ＿６５０（配列番号５７）のベクターマップを詳細に説明する図である。 レンチウイルスベクター候補による２９３Ｔ細胞の形質導入後に測定した相対力価レベルを示すグラフを提供する図である。 レンチウイルスベクター候補による２９３Ｔ細胞の形質導入後に測定した相対力価レベルを示すグラフを提供する図である。 レンチウイルスベクター候補による２９３Ｔ細胞の形質導入後に測定した相対力価レベルを示すグラフを提供する図である。
配列リスト
本明細書に添付の核酸およびアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に規定のように、ヌクレオチド塩基の標準的な文字省略、およびアミノ酸の３文字コードを使用して示される。配列リストは、参照により本明細書に組み入れる、２０１９年１２月１８日に作成された「Ｃａｌｉｍｍｕｎｅ－０７１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名の、３１１ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された。
定義
反対に明確に指示しない限り、１つより多くの工程または行為を含む本明細書で主張する任意の方法では、方法の工程または行為の順序は、方法の工程または行為が引用される順序に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に別段に指示しない限り、複数の参照を含む。同様に、単語「または（ｏｒ）」は、文脈が明確に別段に指示しない限り、「および（ａｎｄ）」を含むことを意図する。
明細書および特許請求の範囲において本明細書で使用する場合、１つまたはそれ以上の要素のリストを参照して、句「少なくとも１つ」は、要素のリストのいずれか１つまたはそれ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、特に要素のリスト内に列挙された各および全ての要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリストの要素のいずれかの組合せを除外しないと理解されるべきである。この定義は、要素が、場合により、句「少なくとも１つ」が指す要素のリスト内で特に同定された要素以外を、特に同定したそれらの要素に関連してもしなくても表し得ることも許容する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同等に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、Ｂが存在しない（および場合により、Ｂ以外の要素を含む）少なくとも１つ、場合により１つより多くのＡを含む、；別の実施形態では、Ａが存在しない（および場合により、Ａ以外の要素を含む）少なくとも１つ、場合により１つより多くのＢを含む、；さらに別の実施形態では、少なくとも１つ、場合により１つより多くのＡを含む、および少なくとも１つ、場合により１つより多くのＢを含む（および場合により、他の要素を含む）；等を指すことができる。
本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」等は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」等は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。特に、各用語は、「少なくとも以下」を意味する開かれた用語であると解釈されるものであり、さらなる特徴、制限、態様等を除外しないとも解釈される。したがって、例えば、「構成要素ａ、ｂ、およびｃを有するデバイス」は、少なくとも構成要素ａ、ｂ、およびｃを含むデバイスを意味する。同様に、句：「工程ａ、ｂ、およびｃを含む方法」は、方法が少なくとも工程ａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。さらに、工程および方法は特定の順序で本明細書に概説されるが、当業者は工程および方法の順序は変わり得ることを認識するであろう。
明細書および特許請求の範囲において本明細書で使用する場合、「または」は、上記の「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストにおいて項目を分ける場合、「または」もしくは「および／または」は、包括的である、すなわち少なくとも１つの包括であるが、いくつかの要素または要素のリストの１つより多く、ならびに、場合により、さらなるリストにない項目も含むと解釈されるべきである。「の１つのみ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」もしくは「の厳密に１つ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」のような反対に明確に指定した用語のみ、または特許請求の範囲で使用する場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、いくつかの要素または要素のリストの厳密に１つの要素の包括を指す。一般に、本明細書で使用する場合、用語「または」は、「いずれか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「の１つ（ｏｎｅ ｏｆ）」、「の１つのみ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」または「の厳密に１つ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」のような排他的な用語によって先行される場合、排他的な代替物（すなわち「１つまたはその他であるが両方ではない」）を示すとだけ解釈されるべきである。特許請求の範囲で使用する場合、「基本的に～からなる」は、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するべきである。
本明細書で使用する場合、用語「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」または「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は、組成物、製剤、または特定の薬剤を、本明細書に記載のものを含む、処置を必要とする対象（例えば、ヒト患者）に提供することを指す。
本明細書で使用する場合、用語「発現カセット」は、ＲＮＡ、および、いくつかの実施形態では、続いてタンパク質を発現することができるベクター内の１つまたはそれ以上の遺伝子配列を指す。発現カセットは、少なくとも１つのプロモーターおよび少なくとも１つの目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、少なくとも１つのプロモーター、少なくとも１つの目的の遺伝子、および発現のための分子（例えばＲＮＡｉ）をコードする少なくとも１つのさらなる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡへと転写され、必要な場合、タンパク質またはポリペプチドへと翻訳され、形質転換した細胞（例えば、形質導入した幹細胞）において活性に必要な適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画への標的化または細胞外区画への分泌によって生物活性のための適切な区画へと移行するような位置および順番となるようにベクター内において配向されている。いくつかの実施形態では、カセットは、ベクターへの挿入が容易になるように適合させたその３’端および５’端を有し、例えば、各端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。
本明細書で使用する場合、用語「機能性核酸」は、タンパク質をコードする転写物と直接相互作用することによってタンパク質の発現を減らす能力を有する分子を指す。ｓｉＲＮＡ分子、リボザイム、およびアンチセンス核酸は、例示的な機能性核酸を構成する。
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」は、生物機能と関連する任意のＤＮＡのセグメントを広く指す。遺伝子は、限定はされないが、コード配列、プロモーター領域、シス調節配列、調節タンパク質の特異的認識配列である非発現ＤＮＡセグメント、遺伝子発現に寄与する非発現ＤＮＡセグメント、所望のパラメーターを持つように設計されたＤＮＡセグメント、またはこれらの組合せを含む配列を包含する。
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子サイレンシング」は、下方調節、ノックダウン、分解、阻害、抑制、抑圧、防止、または遺伝子、転写物および／またはポリペプチド産物の発現の低下を記載することを意味する。遺伝子サイレンシングおよび干渉は、ｍＲＮＡ転写物のポリペプチドへの翻訳の防止も記載する。いくつかの実施形態では、翻訳は、ｍＲＮＡ転写物の分解またはｍＲＮＡ翻訳の遮断によって防止、阻害され、または低下する。
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子発現」は、それにより生物学的に活性なポリペプチドがＤＮＡ配列から産生される細胞のプロセスを指す。
本明細書で使用する場合、用語「造血細胞移植（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）」または「造血細胞移植（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」は、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯静脈血移植、または任意の他の多能性造血幹細胞の起源を指す。同様に、用語「幹細胞移植」または「移植」は、薬学的に許容される担体と接触している（例えば懸濁している）幹細胞を含む組成物を指す。カテーテルを通して、そのような組成物を対象に投与することができる。
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、本開示の方法を使用して改変される細胞を指す。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発現ベクターが発現される哺乳動物細胞である。好適な哺乳動物宿主細胞としては、限定はされないが、ヒト細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞（例えば、アカゲザル細胞）、ヒト前駆細胞または幹細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｄ１７細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ細胞、およびＣｆ２Ｔｈ細胞を含む。特定の実施形態では、本開示の発現ベクターを含む宿主細胞は、造血前駆細胞／幹細胞（例えば、ＣＤ３４陽性造血前駆細胞／幹細胞）、単球、マクロファージ、末梢血単核細胞、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、または樹状細胞のような造血細胞である。本開示の発現ベクターによって形質導入する造血細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、および／または単球／マクロファージ）は、同種、自家または適合した兄弟由来であり得る。造血細胞は、いくつかの実施形態では、ＣＤ３４陽性であり、患者の骨髄または末梢血から単離される。単離したＣＤ３４陽性造血細胞（および／または本明細書に記載の他の造血細胞）は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のように発現ベクターによって形質導入する。
本明細書で使用する場合、用語「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」は、限定はされないが、顆粒球、単球、赤血球、巨核球、リンパ球、樹状細胞を含む造血系の全ての細胞型へと分化することができる多能性細胞；および自己再生活性、すなわち親細胞の同一の（例えば自己再生の）特徴を有する少なくとも１つの娘細胞を分裂および生成する能力を指す。
本明細書で使用する場合、「ＨＰＲＴ」はＨＰＲＴ１遺伝子によってコードされるプリン代謝に関与する酵素である。ＨＰＲＴ１はＸ染色体に位置し、したがって男性に単一コピーで存在する。ＨＰＲＴ１は、Ｘ染色体に位置し、したがって男性では単一コピーで存在する。ＨＰＲＴ１は、５－ホスホリボシル１－ピロリン酸からプリンへと５－ホスホリボシル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｉｂｏｓｙｌ）基を転移することにより、ヒポキサンチンのイノシン一リン酸への変換、およびグアニンのグアノシン一リン酸への変換を触媒するトランスフェラーゼをコードする。酵素は、主に、新しいプリン合成での使用のため、分解したＤＮＡからのプリンの再利用に機能する（図３７も参照）。
本明細書で使用する場合、用語「レンチウイルス」は、分裂および非分裂細胞に感染することができるレトロウイルスの属を指す。レンチウイルスのいくつかの例としては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ １型、およびＨＩＶ ２型を含む）、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体；羊の脳炎（ビスナ）または肺炎（マエディ）を引き起こす、ビスナ・マエディ、ヤギの免疫不全、関節炎、および脳症を引き起こす、ヤギ関節炎脳炎ウイルス；ウマに自己免疫性溶血性貧血、および脳症を引き起こす、ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコに免疫不全を引き起こす、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシのリンパ節腫大、リンパ球増加症、および中枢神経系感染症を引き起こす可能性のある、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；ならびに類人霊長類に免疫不全および脳症を生き起こす、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「レンチウイルスベクター」は、レンチウイルス由来の核酸の任意の形態を示すために使用され、形質導入により細胞へと遺伝物質を移行するために使用される。用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡのようなレンチウイルスベクターの核酸、これらの核酸のカプセル化形態、およびウイルスベクター核酸がパッケージされたウイルス粒子を包含する。
本明細書で使用する場合、用語「ノックダウン（ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ）」または「ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）」は、遺伝子発現へのＲＮＡｉの効果に関して使用する場合、遺伝子発現のレベルが阻害され、実質的に同じ条件だがＲＮＡｉの非存在下で調べた場合に通常観察されるレベル以下まで低減されることを意味する。
本明細書で使用する場合、用語「ミニ細胞」は、二分裂の間に、ＤＮＡ分離を伴う細胞分裂の調整の障害によって生じる、無核形態の細菌細胞を指す。ミニ細胞は、特定の状況で、およびミニ細胞とは対照的に自然発生的に生成および放出される他の小胞とは異なり、特定の遺伝子再編成またはエピソーム遺伝子発現によらない。本開示のミニ細胞は、二分裂の間に、ＤＮＡ分離を伴う細胞分裂の調整の障害によって生じる、無核形態の大腸菌または他の細菌細胞である。原核生物の染色体複製は、中間細胞隔膜形成を含む、正常な二分裂と関連する。大腸菌では、例えば、ｍｉｎＣＤのようなｍｉｎ遺伝子の変異は、細胞分裂中に細胞極において隔膜形成の阻害を除去し、正常な娘細胞および無核ミニ細胞の産生をもたらし得る。ｄｅ Ｂｏｅｒら、１９９２年；Ｒａｓｋｉｎ＆ｄｅ Ｂｏｅｒ、１９９９年；Ｈｕ＆Ｌｕｔｋｅｎｈａｕｓ、１９９９年；Ｈａｒｒｙ、２００１年を参照。ミニ細胞は、特定の状況で、およびミニ細胞とは対照的に自然発生的に生成および放出される他の小胞とは異なり、特定の遺伝子再編成またはエピソーム遺伝子発現によらない。本開示を実施するため、ミニ細胞は無傷の細胞壁（「無傷のミニ細胞」）を持つことが望ましい。ｍｉｎオペロン変異に加えて、無核ミニ細胞は、隔膜形成に影響する他の遺伝子再編成または変異の範囲、例えば枯草菌のｄｉｖＩＶＢ１においても生成される。Ｒｅｅｖｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｔｔ、１９７５年；Ｌｅｖｉｎら、１９９２年を参照。ミニ細胞は、細胞分裂／染色体分離に関与するタンパク質の遺伝子発現のレベルの攪乱後にも形成される。例えば、ｍｉｎＥの過剰発現は、極分裂およびミニ細胞の産生をもたらす。同様に、染色体の無いミニ細胞は、染色体分離における欠損、例えば、枯草菌のｓｍｃ変異（Ｂｒｉｔｔｏｎら、１９９８年）、枯草菌のｓｐｏＯＪ欠失（Ｉｒｅｔｏｎら、１９９４年）、大腸菌のｍｕｋＢ変異（Ｈｉｒａｇａら、１９８９年）、および大腸菌のｐａｒＣ変異（Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｄ’Ａｒｉ、１９９２年）から生じ得る。遺伝子産物はトランスに供給される。高コピー数プラスミドから過剰発現される場合、例えば、ＣａｆＡは細胞分裂の割合を増加および／または複製後の染色体分配を阻害し（Ｏｋａｄａら、１９９４年）、連鎖する細胞および無核ミニ細胞の形成をもたらし得る（Ｗａｃｈｉら、１９８９年；Ｏｋａｄａら、１９９３年）。ミニ細胞は、グラム陽性またはグラム陰性起源の任意の細菌細胞から調製される。
本明細書で使用する場合、用語「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」は、典型的にはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとして公知の約７０ヌクレオチド折り返しＲＮＡ前駆体構造から除外される、２０～２２ヌクレオチドの低分子非コードＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡと標的の間の相補性の程度により、ｍｉＲＮＡは２つの方法の１つでそれらの標的を負に調節する。第１に、完全またはほぼ完全な相補性でタンパク質コードｍＲＮＡ配列と結合するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する。それらのｍＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の不完全な相補性部位に結合することによりそれらの調節効果を発揮するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路に使用されるものと類似の、またはおそらく同一であるＲＩＳＣ複合体により、標的遺伝子発現を転写後、明らかに翻訳のレベルで抑制する。翻訳制御と整合して、この機構を使用するｍｉＲＮＡはそれらの標的遺伝子のタンパク質レベルを低下させるが、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは最小限に影響されるだけである。ｍｉＲＮＡは、天然に存在するｍｉＲＮＡならびに任意のｍＲＮＡ配列を特異的に標的化できる人工的に設計されたｍｉＲＮＡの両方を包含する。例えば、一実施形態では、当業者は、ヒトｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－３０またはｍｉＲ－２１）転写一次産物として発現される短鎖ヘアピンＲＮＡ構築物を設計することができる。この設計は、ヘアピン構築物にＤｒｏｓｈａプロセシング部位を付加し、ノックダウン効率を大きく増加させることが示された（Ｐｕｓｃｈら、２００４年）。ヘアピンステムは、２２ｎｔのｄｓＲＮＡ（例えば、アンチセンスは所望の標的と完全な相補性を有する）およびヒトｍｉＲからの約１５～約１９ヌクレオチドのループからなる。ｍｉＲループおよびｍｉＲ３０隣接配列をヘアピンのいずれかまたは両側に付加することにより、マイクロＲＮＡ無しの従来のｓｈＲＮＡ設計と比較した場合、発現したヘアピンのＤｒｏｓｈａおよびＤＩＣＥＲプロセシングの１０倍より高い増加をもたらすと考えられる。ＤｒｏｓｈａおよびＤＩＣＥＲプロセシングの増加は、より多くのｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ産物および発現されたヘアピンのより高い能力へと変換される。
本明細書で使用する場合、用語「変異」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のような配列の、天然、標準またはそれぞれの配列の参照バージョン、すなわち非変異配列からの変化を指す。変異遺伝子は、変異遺伝子産物をもたらし得る。変異遺伝子産物は、非変異遺伝子産物と１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なる。いくつかの実施形態では、変異遺伝子産物をもたらす変異遺伝子は、相当する非変異ヌクレオチド配列と約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上の配列同一性を有し得る。
本明細書で使用する場合、用語「ナノカプセル」は、１つまたはそれ以上の成分、例えば１つもしくはそれ以上のタンパク質および／または１つもしくはそれ以上の核酸をカプセル化するシェル、例えばポリマーシェルを有するナノ粒子を指す。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、約２００ナノメートル（ｎｍ）以下、例えば、約１～２００ｎｍの間、または約５～約２００ｎｍの間、または約１０～約１５０ｎｍの間、または１５～１００ｎｍ、または約１５～約１５０ｎｍの間、または約２０～約１２５ｎｍの間、または約５０～約１００ｎｍの間、または約５０～約７５ｎｍの間の平均直径を有する。他の実施形態では、ナノカプセルは、約１０ｎｍ～約２０ｎｍ、約２０ｎｍ～約２５ｎｍ、約２５ｎｍ～約３０ｎｍ、約３０ｎｍ～約３５ｎｍ、約３５ｎｍ～約４０ｎｍ、約４０ｎｍ～約４５ｎｍ、約４５ｎｍ～約５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約５５ｎｍ、約５５ｎｍ～約６０ｎｍ、約６０ｎｍ～約６５ｎｍ、約７０ｎｍ～約７５ｎｍ、約７５ｎｍ～約８０ｎｍ、約８０ｎｍ～約８５ｎｍ、約８５ｎｍ～約９０ｎｍ、約９０ｎｍ～約９５ｎｍ、約９５ｎｍ～約１００ｎｍ、または約１００ｎｍ～約１１０ｎｍの間の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、約１時間、または約２時間、または約３時間、または約４時間、または約５時間、または約６時間、または約１２時間、または約１日、または約２日、または約１週間、または約１か月で分解されるように設計される。いくつかの実施形態では、ナノカプセルの表面は、約１～約１５ミリボルト（ｍＶ）の間の電荷（例えば標準的なリン酸溶液中で測定される）を有し得る。他の実施形態では、ナノカプセルの表面は、約１～約１０ｍＶの間の荷電を有し得る。
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結した」は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、エンハンサーまたは転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列の間の機能性結合を指し、ここで、適切な分子（例えば、転写アクチベータータンパク質）が発現制御配列に結合すると、発現制御配列は第２の配列に相当する核酸の転写および／または翻訳に影響する。
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドを開始および転写する。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞で作動するプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５～３０ベース上流に位置するＡＴリッチ領域および／または転写の開始から約７０～約８０塩基上流に見出される別の配列、例えば、Ｎが任意のヌクレオチドであり得るＣＮＣＡＡＴ領域を含む。
本明細書で使用する場合、用語「レトロウイルス」は、宿主細胞ゲノムにインテグレートされるｃＤＮＡコピーへと、レトロウイルス逆転写酵素によって逆転写されるＲＮＡゲノムを有するウイルスを指す。レトロウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターを作製する方法は、当技術分野で公知である。簡潔に言うと、レトロウイルスベクターを構築するため、目的の遺伝子をコードする核酸は、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムへと挿入され、複製欠損であるウイルスを産生する。ビリオンを産生するため、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を持たないパッケージング細胞株が構築される（Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．３３：１５３～１５９頁、１９８３年）。レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と一緒にｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドがこの細胞株へと導入されると、パッケージング配列は組換えプラスミドのＲＮＡ転写物をウイルス粒子にパッケージングさせ、次いでそれらは培養培地へと分泌される。組換えレトロウイルスを含有する培地は、次いで回収され、場合により濃縮され、遺伝子移入に使用される。
本明細書で使用する場合、用語「ｓｉＲＮＡ」または「低分子干渉ＲＮＡ」は、約１０ヌクレオチド～数十ヌクレオチドから構成される短い二本鎖ＲＮＡを指し、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を誘導し、すなわち標的ｍＲＮＡの分解を誘導または標的ｍＲＮＡの切断により標的遺伝子の発現を阻害する。ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）は、多くの真核生物で保存された、遺伝子発現の転写後阻害の方法であり、標的遺伝子のｍＲＮＡに相同な配列を有するセンスＲＮＡおよびそれに対して相補性な配列を有するアンチセンスＲＮＡから構成される二本鎖ＲＮＡが細胞等に導入され、それにより標的遺伝子のｍＲＮＡの分解を選択的に誘導することができ、または標的遺伝子の発現を阻害することができる現象を指す。ＲＮＡｉは、細胞に存在する短い（すなわち約３０ヌクレオチドより短い）二本鎖ＲＮＡ分子によって誘導される（Ｆｉｒｅ Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：８０６～８１１頁、１９９８年）。ｓｉＲＮＡが細胞に導入されると、ｓｉＲＮＡの配列に相補性なヌクレオチド配列を有する標的遺伝子のｍＲＮＡの発現が阻害されるであろう。
本明細書で使用する場合、用語「低分子ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」は、アンチセンス領域、ループ部分およびセンス領域を含むＲＮＡ分子を指し、ここで、センス領域はアンチセンス領域と塩基対を形成して二重ステムを形成する相補性なヌクレオチドを有する。転写後プロセシングの後、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーである酵素ＤＩＣＥＲによって媒介される切断イベントにより、低分子ヘアピンＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡへと変換される。本明細書で使用する場合、句「転写後プロセシング」は、転写後に起こり、例えば酵素ＤＩＣＥＲおよび／またはＤｒｏｓｈａによって媒介されるｍＲＮＡプロセシングを指す。
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒト、マウスまたは霊長類のような哺乳動物を指す。典型的には、哺乳動物はヒト（ホモサピエンス）である。
本明細書で使用する場合、用語「治療遺伝子」は、疾患を処置または防止する目的のために対象に投与される遺伝子を指す。
本明細書で使用する場合、用語「形質導入する」または「形質導入」は、トランスフェクションよりも感染の手段によるウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用する遺伝子の送達を指す。例えば、レトロウイルスベクター（細胞への核酸の導入のためのベクターとして使用する改変レトロウイルス）によって運ばれる抗ＨＰＲＴ遺伝子は、感染およびプロウイルスのインテグレーションによって細胞へと形質導入される。したがって、「形質導入遺伝子」は、レトロウイルスまたはベクター感染およびプロウイルスインテグレーションによって細胞へと導入された遺伝子である。ウイルスベクター（例えば、「形質導入するベクター」）は、遺伝子を「標的細胞」または宿主細胞へと形質導入する。
本明細書で使用する場合、特定の条件に関して、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「処置する（ｔｒｅａｔ）」は、所望の薬理的および／または生理的効果を得ることを指す。効果は、疾患またはその症状の完全または部分的な防止の観点では予防であり、および／または疾患および／または疾患に起因する有害事象の部分的または完全な治癒の観点では治療であり得る。本明細書で使用する場合、「処置」は、対象、特にヒトにおける疾患または障害の任意の処置を包含し、：（ａ）疾患に罹りやすいがまだ疾患を有すると診断されていない対象において疾患または障害が生じるのを防止すること；（ｂ）疾患または障害を阻害すること、すなわちその発生を停止させること；および（ｃ）疾患または障害を軽減または緩和すること、すなわち疾患もしくは障害の回帰を引き起こすおよび／または１つまたはそれ以上の疾患もしくは障害の症状を軽減することを含む。「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患、障害または症状の非存在下でも、薬理学的な効果を提供するための薬剤の送達または治療の投与も包含し得る。用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、いくつかの実施形態で使用され、宿主における、好ましくは哺乳動物対象における、より好ましくはヒトにおける疾患または障害を軽減する本開示の化合物の投与を指す。したがって、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は：特に宿主が疾患に罹りやすいがまだ疾患を有すると診断されていない場合、宿主において障害が生じるのを防止すること；障害を阻害すること；および／または障害を緩和または後退させることを含み得る。本開示の方法が障害の防止を対象とする限り、用語「防止する」は、疾患状態が完全に阻止されることを必要としないことが理解される。むしろ、本明細書で使用する場合、用語防止するは、疾患の発症前に本開示の化合物の投与を行うことができるように、障害に感受性のある集団を同定する当業者の能力を指す。用語は、疾患状態が完全に避けられなければならないことを意味しない。
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、別の核酸分子の細胞への侵入、例えば移行、輸送等を媒介することができる核酸分子を指す。移行する核酸は、通常、ベクター核酸分子に連結される、例えばベクター核酸分子に挿入される。ベクターは、自立複製を導く配列を含んでよく、または宿主細胞ＤＮＡへのインテグレーションを可能にするのに十分な配列を含んでよい。当業者には明らかであるように、ウイルスベクターは、核酸に加えて、移行する核酸の侵入を媒介する様々なウイルス成分を含み得る。多くのベクターが当技術分野で公知であり、限定はされないが、線状ポリヌクレオチド、イオンまたは両親媒性化合物と関連するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスベクターを含む。ウイルスベクターの例としては、限定はされないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）等が挙げられる。
発現ベクター
いくつかの実施形態では、本開示は、発現のための少なくとも２つの核酸配列を含む発現ベクター（例えば、レンチウイルス発現ベクター）を提供する。いくつかの実施形態では、核酸配列は核酸分子（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、または細胞の細胞質に見出される別の分子）をコードする。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＨＰＲＴ遺伝子をノックダウンするまたはそうでなければＨＰＲＴ発現の低下をもたらすように設計した因子をコードする第１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターはウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸を含む。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは自己不活性化レンチウイルスベクターである。他の実施形態では、発現ベクターはレトロウイルスベクターである。レンチウイルスゲノムは、通常、５’長い末端反復配列（ＬＴＲ）、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、アクセサリー遺伝子（ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ）および３’ＬＴＲへと組織される。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と呼ばれる３つの領域へと分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含有する。Ｕ５領域は、ポリアデニル化シグナルを含有する。Ｒ（反復）領域は、Ｕ３領域とＵ５領域を分け、Ｒ領域の転写された配列は、ウイルスＲＮＡの５’端と３’端の両方に見られる。例えば、”ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ａｌａｎ Ｊ．Ｃａｎｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、（２０００年））；Ｏ Ｎａｒａｙａｎ ａｎｄ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ（１９８９年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７０：１６１７～１６３９頁；Ｆｉｅｌｄｓら（１９９０年）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ．；Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｈ，Ｂｌａｍｅｒ Ｕ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｍ，Ｇａｇｅ Ｆ Ｈ，Ｖｅｒｍａ Ｉ Ｍ．（１９９８年）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、Ｖｏｌ．７２（１０）：８１５０ ７、および米国特許第６，０１３，５１６号を参照。ＨＳＣに感染させるために使用されたレンチウイルスベクターの例は、以下の論文に記載され、その各々がその全体を参照により本明細書に組み入れる：Ｅｖａｎｓら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、Ｖｏｌ．１０：１４７９～１４８９頁、１９９９年；Ｃａｓｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９６：２９８８～２９９３頁、１９９９年；Ｕｃｈｉｄａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９５：１１９３９～１１９４４頁、１９９８年；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２８３：６８２～６８６頁、１９９９年；およびＳｕｔｔｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、Ｖｏｌ．７２：５７８１～５７８８頁、１９９８年。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは改変レンチウイルスであり、したがって、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができる。いくつかの実施形態では、改変レンチウイルスゲノムは、ウイルス複製に必要なレンチウイルスタンパク質の遺伝子を欠損し、したがって、標的細胞における複製のような望まない複製を防止する。いくつかの実施形態では、改変ゲノムの複製のために必要なタンパク質は、組換えレトロウイルスまたはレンチウイルスの産生の間に、パッケージング細胞株においてトランスに提供される。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、レンチウイルスの５’および３’長い末端反復配列（ＬＴＲ）からの配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルスの５’ＬＴＲからのＲおよびＵ５配列、ならびにレンチウイルスからの不活性化または自己不活性化３’ＬＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＬＴＲ配列はＨＩＶ ＬＴＲ配列である。
レンチウイルス発現ベクターのさらなる成分（ならびにそのようなベクターを合成および／または産生する方法）は、米国特許出願公開第２０１８／０１１２２２０号に開示され、その開示は、その全体を参照により本明細書に組み入れる。例えば、レンチウイルス発現ベクターは、中央ポリプリントラクト（例えば配列番号４１を有する）、ＷＰＲＥエレメント（例えば配列番号１３を有する）、およびＲｅｖ応答エレメント（例えば、配列番号３８を有する）の１つまたはそれ以上を含み得る。これらの追加のエレメントは、例えば図１Ａ～図１Ｅに示す。
いくつかの実施形態では、本明細書で検討したレンチウイルスベクターは、インテグレーションを生じるものであっても、インテグレーションを生じるものでなくてもよい（インテグレーション欠損レンチウイルスとも呼ばれる）。本明細書で使用する場合、用語「インテグレーション欠損レンチウイルス」または「ＩＤＬＶ」は、宿主細胞のゲノムへとウイルスゲノムをインテグレートする能力を欠損するインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。いくつかの出願では、インテグレーションを生じるレンチウイルスベクターの使用は、インテグレーションを生じるレンチウイルスによって誘導される挿入変異の可能性を避けることができる。インテグレーション欠損レンチウイルスベクターは、典型的には、レンチウイルスのインテグラーゼ遺伝子を変異することにより、またはＬＴＲの結合配列を改変することにより生成される（例えば、Ｓａｒｋｉｓら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．、６：４３０～４３７頁（２００８年）を参照）。レンチウイルスインテグラーゼは、ＨＩＶ－１ Ｐｏｌ領域によってコードされ、その領域は、逆転写、核内移行、およびウイルス粒子アセンブリを含む他の重要な活性をコードするので、欠失させることができない。インテグラーゼタンパク質を変更するｐｏｌにおける変異は、以下の２つのクラスの１つに分類される：インテグラーゼ活性にのみ選択的に影響するもの（クラスＩ）；または多面的な効果を有するもの（クラスＩＩ）。Ｎ末端およびＣ末端に渡る変異、ならびにインテグラーゼタンパク質の触媒コア領域は、粒子形成および逆転写を含む複数の機能に影響するクラスＩＩ変異を生成する。クラスＩ変異は、触媒活性、ＤＮＡ結合、線状エピソームプロセシングおよびインテグラーゼの多量体化へのそれらの影響を制限する。最も一般的なクラスＩ変異部位は、Ｄ６４、Ｄ１１６、およびＥ１５２を含む、インテグラーゼの触媒コアにおける三つ組の残基である。各変異は、ＮＩＬＶの導入遺伝子発現を維持しながら、通常の、インテグレーションを生じるベクターより最高４ｌｏｇ低いインテグレーションの頻度でインテグレーションを効果的に阻害することが示された。インテグレーションを阻害する別の代替方法は、それぞれ５’および３’ＬＴＲの末端で、Ｕ３領域の１２塩基対領域内またはＵ５領域の１１塩基対領域内のインテグラーゼＤＮＡ結合部位（ＬＴＲａｔｔ部位）に変異を導入することである。これらの配列は、インテグラーゼ媒介末端プロセシング後に曝露される保存された末端ＣＡジヌクレオチドを含む。保存されたＣＡ／ＴＧジヌクレオチドにおける単一または二重変異は、インテグレーション頻度の最大３～４ｌｏｇの減少をもたらす；しかしながら、効果的なウイルス形質導入のための全ての他の必要な機能を保持する。
いくつかの実施形態では、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。本明細書で使用する場合、用語「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター」は、ＡＡＶベクターゲノムを含有するＡＡＶウイルス粒子を意味する（それは、順に、本明細書で言及する第１および第２の発現カセットを含む）。全ての血清型のＡＡＶベクター、好ましくはＡＡＶ－１からＡＡＶ－９、より好ましくはＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、およびこれらの組合せを含むことを意味する。異なる血清型の組合せから生じるＡＡＶベクターは、ハイブリッドＡＡＶベクターと呼ばれる。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、およびＡＡＶ－６、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ－５ベクターである。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－２逆位末端配列（ＩＴＲ）を含むＡＡＶ－５ベクターである。また本開示によって検討するのは、天然に存在するウイルスタンパク質、例えば１つまたはそれ以上のキャプシドタンパク質のバリアントを含むＡＡＶベクターである。
ＨＰＲＴ遺伝子のノックダウンをもたらす成分
いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子をノックダウンするまたはそうでなければその発現の低下をもたらすように設計した因子をコードする核酸配列は、ＲＮＡ干渉因子（ＲＮＡｉ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ因子はｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはこれらのハイブリッドである。
ＲＮＡｉ
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列を含む。ＲＮＡ干渉は、複合の多段階な酵素方法、例えば配列特異的二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む方法によって、相同転写物の分解を誘発することによる遺伝子発現の転写後サイレンシングのアプローチである。ＲＮＡｉ経路の簡単なモデルは、２ステップに基づき、それぞれリボヌクレアーゼ酵素を含む。第１のステップでは、トリガーＲＮＡ（ｄｓＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ一次転写物のいずれか）は、ＲＮａｓｅＩＩ酵素ＤＩＣＥＲおよびＤｒｏｓｈａにより、短い、干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へとプロセシングされる。第２のステップでは、ｓｉＲＮＡは、エフェクター複合体ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へとロードされる。ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣアセンブリ中にほどかれ、一本鎖ＲＮＡがｍＲＮＡ標的とハイブリダイズする。遺伝子サイレンシングは、ＲＮａｓｅＨ酵素Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（Ｓｌｉｃｅｒ）による標的ｍＲＮＡの酵素分解の結果であると考えられる。ｓｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ二重鎖がミスマッチを含有する場合、ｍＲＮＡは切断されない。むしろ、遺伝子サイレンシングは翻訳阻害の結果である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ因子は、阻害またはサイレンシング核酸である。本明細書で使用する場合、「サイレンシング核酸」は、特定の配列と相互作用し、遺伝子発現を阻害することができる任意のポリヌクレオチドを指す。サイレンシング核酸の例としては、ＲＮＡ二重鎖（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのセンスおよび／またはアンチセンス配列をコードするＤＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡザイム、またはリボザイムが挙げられる。当業者は、遺伝子発現の阻害が、必ずしも特定の列挙した配列からの遺伝子発現である必要はなく、例えば特定の配列によって制御される配列からの遺伝子発現であり得ることを認識するであろう。
干渉ＲＮＡを構築する方法は、当技術分野で公知である。例えば、干渉ＲＮＡは、２つの別々のオリゴヌクレオチドからアセンブルされ、１つの鎖はセンス鎖であり、他の鎖はアンチセンス鎖であり、アンチセンスおよびセンス鎖は自己相補性である（すなわち、各鎖は他の鎖のヌクレオチド配列に相補性であるヌクレオチド配列を含む；例えばアンチセンス鎖およびセンス鎖が二重または二本鎖構造を形成する場合）；アンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその部分（すなわち、望まない遺伝子）のヌクレオチド配列に相補性であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列またはその部分に相当するヌクレオチド配列を含む。あるいは、干渉ＲＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドからアセンブルされ、自己相補性センスおよびアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって連結される。干渉ＲＮＡは、自己相補性センスおよびアンチセンス領域を有する、二重鎖、非対称の二重鎖、ヘアピン、または非対称のヘアピン二次構造によるポリヌクレオチドであり、アンチセンス領域は、別々の標的核酸分子またはその部分のヌクレオチド配列に相補性であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその部分に相当するヌクレオチド配列を有する。干渉ＲＮＡは、２つまたはそれ以上のループ構造ならびに自己相補性センスおよびアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであり、アンチセンス領域は標的核酸分子またはその部分のヌクレオチド配列に相補性であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその部分に相当するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドはｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかでプロセシングされ、ＲＮＡ干渉を媒介することができる活性なｓｉＲＮＡ分子を生成することができる。
いくつかの実施形態では、干渉ＲＮＡコード領域は、センス領域、アンチセンス領域およびループ領域を有する自己相補性ＲＮＡ分子をコードする。発現される場合、そのようなＲＮＡ分子は、望ましい「ヘアピン」構造を形成し、本明細書で「ｓｈＲＮＡ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ループ領域は通常約２～約１０ヌクレオチド長の間である（ほんの一例として、配列番号３２参照）。他の実施形態では、ループ領域は約６～約９ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、センス領域およびアンチセンス領域は約１５～約３０ヌクレオチド長の間である。転写後プロセシングの後、低分子ヘアピンＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーである酵素ＤＩＣＥＲによって媒介される切断イベントによってｓｉＲＮＡへと変換される。次いで、ｓｉＲＮＡは、それと相同性を共有する遺伝子の発現を阻害することができる。さらなる詳細は、それらの開示がその全体を本明細書に参照により組み入れる、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０～５５３頁、（２００２年）；Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、５００～５０５頁、（２００２年）；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：４９７～５００頁、（２００２年）；Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１６：９４８～９５８頁、（２００２年）；Ｐａｕｌ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０、５０５～５０８頁、（２００２年）；Ｓｕｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ、９９（６）、５５１５～５５２０頁、（２００２年）；およびＹｕら、Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ ９９：６０４７～６０５２頁、（２００２年）に記載される。
ｓｈＲＮＡ
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２６の配列と少なくとも８０％同一性を有する配列を有する（本明細書では「ｓｈ７３４」と呼ばれる）。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２６の配列と少なくとも８５％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２６の配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２６の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２６の核酸配列と少なくとも９６％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２６の核酸配列と少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２６の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２６の核酸配列と少なくとも９９％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２６の配列を有する（図１１も参照）。
いくつかの実施形態では、配列番号２６の核酸配列は、改変される。いくつかの実施形態では、改変は：（ｉ）ｈｓａ－ｍｉＲ－２２ループ配列（例えば、ＣＣＵＧＡＣＣＣＡ）（配列番号３３）の組み込み；（ｉｉ）２または３つのヌクレオチド（例えばＴＡ）を有するスペーサーのような５’～３’ヌクレオチドスペーサーの付加；（ｉｉｉ）１つまたはそれ以上のヌクレオチド（例えばＧ）の付加のような５’開始の改変；および／または（ｉｖ）２つのヌクレオチド５’および３’のステムおよびループへの付加（例えば５’Ａおよび３’Ｔ）。一般に、第１世代のｓｈＲＮＡは、低分子ＲＮＡの不均一な混合物へとプロセシングされ、前駆体転写物の蓄積がｉｎ ｖｉｖｏでの配列依存的および非依存的両方の非特異的オフターゲット効果を誘導することが示された。したがって、ＤＩＣＥＲプロセシングおよび特異性の現行の理解に基づき、ｓｈ７３４の構造およびＤＩＣＥＲプロセシング能力および有効性を最適化するであろう設計に設計規則が適用された（Ｇｕ，Ｓ．、Ｙ．Ｚｈａｎｇ、Ｌ．Ｊｉｎ、Ｙ．Ｈｕａｎｇ、Ｆ．Ｚｈａｎｇ、Ｍ．Ｃ．Ｂａｓｓｉｋ、Ｍ．Ｋａｍｐｍａｎｎ、ａｎｄ Ｍ．Ａ．Ｋａｙ．２０１４年．Ｗｅａｋ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｉｎ ｂｏｔｈ ｓｅｅｄ ａｎｄ ３’ｒｅｇｉｏｎｓ ｒｅｄｕｃｅ ＲＮＡｉ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｓｉ／ｓｈＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２：１２１６９～１２１７６頁も参照）。
いくつかの実施形態では、配列番号２６の核酸配列は、２つのヌクレオチド５’および３’（例えば、それぞれＧおよびＣ）をヘアピンループ（配列番号３２）に付加し、それによりガイド鎖を約１９ヌクレオチド長から約２１ヌクレオチド長に伸長し、ループをｈｓａ－ｍｉＲ－２２ループＣＣＵＧＡＣＣＣＡ（配列番号３３）と置き換えることによって改変し、配列番号２７のヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２７の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２７の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２７の核酸配列と少なくとも９６％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２７の核酸配列と少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２７の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２７の核酸配列と少なくとも９９％同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２７の配列を有する。配列番号２７によってコードされるｓｈＲＮＡは、配列番号２６と比較して、ＨＰＲＴの同様のノックダウンを達成すると考えられる。同様に、配列番号２７によってコードされるｓｈＲＮＡの発現によるＨＰＲＴのノックダウンを通してＨＰＲＴを欠損した細胞は、チオグアニン類似体（例えば、６ＴＧ）を使用する選択を可能にすると考えられる。
いくつかの実施形態では、ベクター内に存在するＲＮＡｉは、配列番号１６または配列番号１７のいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有する核酸分子のような核酸分子をコードする。他の実施形態では、ベクター内に存在するＲＮＡｉは、配列番号１６または配列番号１７のいずれか１つと少なくとも９７％配列同一性を有する核酸分子のような核酸分子をコードする。いくつかの実施形態では、ベクター内に存在するＲＮＡｉは、核酸分子、配列番号１６または配列番号１７を有する核酸分子のような核酸分子をコードする。いくつかの実施形態では、配列番号１６または配列番号１７を有する核酸分子は、宿主細胞の細胞質に見出される。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１６または配列番号１７から選択される少なくとも１つの核酸分子を含む宿主細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２３の配列と少なくとも８０％同一性を有する配列を有する（本明細書では「ｓｈＨＰＲＴ ６１６」と呼ばれる）。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２３の配列と少なくとも８５％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２３の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２３の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２３の核酸配列と少なくとも９６％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２３の核酸配列と少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２３の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２３の核酸配列と少なくとも９９％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２３の配列を有する（図３も参照）。
いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２４の核酸配列と少なくとも８０％同一性を有する配列を有する（本明細書では、「ｓｈＨＰＲＴ２１１」と呼ばれる）。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２４の配列と少なくとも８５％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２４の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２４の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２４の配列と少なくとも９６％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２４の配列と少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２４の配列と少なくとも９８％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２４の配列と少なくとも９９％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２４の配列を有する（図４も参照）。
いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２５の配列と少なくとも８０％同一性を有する配列を有する（本明細書では「ｓｈＨＰＲＴ７３４．１」と呼ばれる）。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２５の配列と少なくとも８５％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２５の配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２５の配列と少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２５の配列と少なくとも９６％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２５の配列と少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２５の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２５の核酸配列と少なくとも９９％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２５の配列を有する（図５も参照）。
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、それらの標的遺伝子の発現を転写後に調節する非コードＲＮＡの群である。これらの一本鎖分子は、細胞質でのそれらの翻訳を防ぐようにそれらの標的ｍＲＮＡの３’未翻訳領域（ＵＴＲ）に結合する他のタンパク質とｍｉＲＮＡ媒介サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）複合体を形成する。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡ配列は、マイクロＲＮＡ二次構造に埋め込まれる（「マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡ」）。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴを標的化するｓｈＲＮＡ核酸配列は、マイクロＲＮＡ二次構造に埋め込まれる。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、ＨＰＲＴ内のコード配列を標的化し、ＨＰＲＴ発現のノックダウンを達成し、これは付随する経路の飽和、および細胞毒性またはオフターゲット効果なくＨＰＲＴを標的化するｓｈＲＮＡの利用と等価であると考えられる。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、新規の人工マイクロＲＮＡ ｓｈＲＮＡである。そのような新規のマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡの産生は、その開示がその全体を参照により本明細書に組み入れる、Ｆａｎｇ，Ｗ．＆Ｂａｒｔｅｌ，Ｄａｖｉｄ Ｐ．Ｔｈｅ Ｍｅｎｕ ｏｆ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｔｈａｔ Ｄｅｆｉｎｅ Ｐｒｉｍａｒｙ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ Ｅｎａｂｌｅ Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｇｅｎｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６０、１３１～１４５頁に記載される。
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３４の核酸配列と少なくとも８０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３４の核酸配列と少なくとも８５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３４の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３４の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３４の核酸配列と少なくとも９６％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３４の核酸配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３４の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３４の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３４の核酸配列を有する（「ｍｉＲＮＡ７３４－Ｄｅｎｏｖｏ」）（図６も参照）。配列番号３４のＲＮＡ形態は配列番号１９に見出される。
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３５の核酸配列と少なくとも８０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３５の核酸配列と少なくとも８５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３５の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３５の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３５の核酸配列と少なくとも９６％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３５の核酸配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３５の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３５の核酸配列と少なくとも９９％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３５の核酸配列を有する（「ｍｉＲＮＡ２１１－Ｄｅｎｏｖｏ」）（図７も参照）。配列番号３５のＲＮＡ形態は、配列番号２０に見出される。
他の実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、第三世代ｍｉＲＮＡ足場改変ｍｉＲＮＡ１６－２である（以降「ｍｉＲＮＡ－３Ｇ」）（例えば、図８および図９を参照）。そのようなｍｉＲＮＡ－３Ｇ分子の合成は、その開示がその全体を参照により本明細書に組み入れる、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｃ．，Ｃｕｅｌｌａｒ，Ｔ．Ｌ．＆Ｈａｌｅｙ，Ｂ．“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｒｓｔ，ｓｅｃｏｎｄ，ａｎｄ ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｈａｉｒｐｉｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｖｅｃｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ＲＮＡｉ、”ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３、２５～３３頁（２０１６年）に記載される。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号２１の核酸配列と少なくとも８０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号２１の核酸配列と少なくとも８５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号２１の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３５の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３５の核酸配列と少なくとも９６％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３５の核酸配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３５の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号３５の核酸配列と少なくとも９９％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号２１の核酸配列を有する（「ｍｉＲＮＡ２１１－３Ｇ」）（図９も参照）。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号２２の核酸配列と少なくとも８０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号２２の核酸配列と少なくとも８５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号２２の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号２２の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号２２の核酸配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号２２の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号２２の核酸配列と少なくとも９９％同一性を有する核酸配列を有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号２２の核酸配列を有する（「ｍｉＲＮＡ７３４－３Ｇ」）（図８も参照）。
いくつかの実施形態では、ｓｈ７３４ｓｈＲＮＡは、１７ヌクレオチド塩基対ステムおよび４ヌクレオチドループを有するｍｉＲＮＡ－４５１（配列番号３６を参照）構造を模倣するように適合される（ｍｉＲ－４５１は薬物輸送タンパク質Ｐ糖タンパク質を調節する）。特に、この構造は、ＤＩＣＥＲによるプロセシングを必要としない。ｐｒｅ－４５１ ｍＲＮＡ構造は、Ａｇｏ２により、続いてポリ（Ａ）特異的リボヌクレアーゼ（ＰＡＲＮ）により切断され、成熟ｍｉＲＮＡ－４５１構造模倣体（配列番号３７を参照）を生成すると考えられる。Ａｇｏ－ｓｈＲＮＡは内在性ｍｉＲ－４５１の構造を模倣し、ＤＩＣＥＲ非依存性である利点を有し得る。これは、可変３’－５’エキソヌクレアーゼ活性による、パッセンジャーローディングのオフターゲット効果を制限すると考えられる（成熟２３～２６ｎｔ）（Ｈｅｒｒｅｒａ－Ｃａｒｒｉｌｌｏ，Ｅ．，ａｎｄ Ｂ．Ｂｅｒｋｈｏｕｔ．２０１７年．ＤＩＣＥＲ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘｅｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４５：１０３６９～１０３７９頁を参照）。単一ＲＮＡｉ活性ガイドのオフターゲット効果の効果的な減少、細胞性ＲＮＡｉ ＤＩＣＥＲ機構の飽和がないことを含む、ｓｈＲＮＡの代替のｄｉｃｅｒ非依存的プロセシングを利用する利点が存在するとも考えられ、より短いＲＮＡ二重鎖は生来のＲＩＧ－Ｉ応答を誘発しにくいようである。
ＲＮＡｉの代替物
ＲＮＡｉの組み込みの代替物として、いくつかの実施形態では、発現ベクターは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする核酸配列を含み得る。本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、タンパク質の転写または翻訳を干渉する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡを標的化し、その複製および／または転写を干渉する。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡの未成熟な一本鎖である前駆体ｍＲＮＡ）、およびｍＲＮＡを含むＲＮＡと特異的にハイブリダイズする。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡのタンパク質翻訳の部位への移行、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種を産生するＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡが関与するまたはＲＮＡによって促進される触媒活性に影響し得る。そのような干渉の全効果は、標的タンパク質発現を調節する、低下させる、または阻害することである。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、エキソンスキッピング因子またはエキソンスキッピング導入遺伝子をコードする核酸配列を組み込む。本明細書で使用する場合、句「エキソンスキッピング導入遺伝子」または「エキソンスキッピング因子」は、エキソンスキッピングを生成することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする任意の核酸を指す。「エキソンスキッピング」は、タンパク質産生の間にｐｒｅ－ｍＲＮＡレベルでスキップおよび除去されるエキソンを指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エキソン内のスプライス部位または調節エレメントと干渉し得ると考えられる。これは、遺伝子変異の存在にもかかわらず、トランケートした、部分的に機能性のタンパク質をもたらし得る。一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、変異特異的であってよく、ｐｒｅ－メッセンジャーＲＮＡの変異部位へと結合し、エキソンスキッピングを誘導することができる。
エキソンスキッピング導入遺伝子は、エキソンスキッピングを生じ得る因子をコードし、そのような因子はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エキソン内のスプライス部位または調節エレメントと干渉し、遺伝子変異の存在にもかかわらず、トランケートした、部分的に機能性のタンパク質をもたらし得る。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、変異特異的であってよく、ｐｒｅ－メッセンジャーＲＮＡの変異部位へと結合し、エキソンスキッピングを誘導することができる。エキソンスキッピングのためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは当技術分野で公知であり、一般に、ＡＯＮと呼ばれる。そのようなＡＯＮは、低分子核ＲＮＡ（「ｓｎＲＮＡ」）を含み、それは、核に限定され、スプライシングまたは他のＲＮＡプロセシング反応に関与する、低分子ＲＮＡ分子のクラスである。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例、それを設計する方法、および関連する産生方法が、例えば、その開示がその全体を参照によりそれぞれ本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２０１５０２２５７１８号、第２０１５０１５２４１５号、第２０１５０１４０６３９号、第２０１５００５７３３０号、第２０１５００４５４１５号、第２０１４０３５００７６号、第２０１４０３５００６７号、および第２０１４０３２９７６２号に開示される。
いくつかの実施形態では、本開示の発現ベクターは、ＨＰＲＴの発現中にエキソンスキッピングをもたらす、またはＨＰＲＴ重複変異（例えば、エキソン４における重複変異）をもたらすエキソンスキッピング因子をコードする核酸を含む（その開示がその全体を参照により本明細書に組み入れる、Ｂａｂａ Ｓら Ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＨＰＲＴ１ ｃａｕｓｉｎｇ ａ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｅｒｒｏｒ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１７年１月 ２；３６（１）：１～６頁を参照）。
いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴは、スプライソソームトランススプライシングによって、改変した変異配列で置き換えられ、したがってＨＰＲＴのノックダウンを促進することができる。いくつかの実施形態では、これは（１）標的ＲＮＡにおいてコード配列を置き換える変異コード領域、（２）５’または３’スプライス部位、および／または（３）結合ドメイン、すなわち標的ＨＰＲＴ ＲＮＡに相補性であるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を必要とする。いくつかの実施形態では、３つ全ての要素が必要である。
ＷＡＳＰ治療遺伝子
本明細書で記載する場合、本開示の発現ベクター（例えば、レンチウイルス発現ベクターまたはＡＡＶベクター）は、治療遺伝子（例えばＷＡＳＰ）をコードする第２の核酸配列も含んでよく、それにより治療遺伝子は標的細胞（例えば、ＨＳＣ）における欠損を正すことができる。当業者に理解されるように、用語「治療遺伝子」は、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、融合タンパク質、ならびに治療遺伝子によってコードされる全長ポリペプチドの治療機能のいくつかまたは全てを維持する変異体を発現する、または発現するように適合させたゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、およびより小さい操作された遺伝子断片を含む。「治療遺伝子」の定義内に包含されるのは、「生物学的に機能的な等価物」治療遺伝子である。したがって、約７０％配列相同性～約９９％配列相同性を有する配列ならびに治療遺伝子のアミノ酸と同一または機能的に等価なアミノ酸の、例えば、約７０％～約８０％、または約８５％および約９０％；または約９５％と約９９％の間のような、そこから誘導できる配列相同性の任意の範囲または量は、ポリペプチドの生物活性が維持されるならば、生物学的に機能的に等価物である配列である。
いくつかの実施形態では、本開示の発現ベクターは、野生型ＷＡＳＰをコードする核酸配列を含む。「野生型ＷＡＳＰをコードする核酸配列」により、ＷＡＳＰのヌクレオチド配列は（ｉ）その天然の、非変異形態であり得る（例えば配列番号６７を参照）；または（ｉｉ）１、２、３、または４個のサイレント変異を含むことによりその天然、非変異形態とは異なり得る（例えば配列番号６８を参照）ことを意味する。いくつかの実施形態では、野生型ＷＡＳＰをコードする核酸配列は、１つのサイレント変異を含み得る。他の実施形態では、野生型ＷＡＳＰをコードする核酸配列は２つのサイレント変異を含み得る。さらに他の実施形態では、野生型ＷＡＳＰをコードする核酸配列は３つのサイレント変異を含み得る。さらなる実施形態では、野生型ＷＡＳＰをコードする核酸配列は４つのサイレント変異を含み得る。他の実施形態では、本開示の発現ベクターは、コドン最適化ＷＡＳＰをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、野生型ＷＡＳＰとコドン最適化ＷＡＳＰをコードする核酸配列は異なるが、それらは両方とも同じタンパク質配列をコードする。いくつかの実施形態では、コドン最適化ＷＡＳＰをコードする核酸は、野生型ＷＡＳＰをコードする核酸と比較して、（ｉ）高い発現を提供し得る、（ｉｉ）比較的高い転写レベル、したがって比較的高いウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質レベルをもたらし得る；および／または（ｉｉｉ）他の利点を提供し得ると考えられる。いくつかの実施形態では、コドン最適化ＷＡＳＰの使用は、内在性ＷＡＳを超えた生じるタンパク質の発現の検出を可能にする。
いくつかの実施形態では、発現ベクターはウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列、すなわちＷＡＳＰをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１、２、３、または４のいずれか１つと少なくとも８０％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１、２、３、または４のいずれか１つと少なくとも８５％同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１、２、３、または４のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１、２、３、または４のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１、２、３、または４のいずれか１つと少なくとも９６％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１、２、３、または４のいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１、２、３、または４のいずれか１つと少なくとも９８％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１、２、３、または４のいずれか１つと少なくとも９９％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１、２、３、または４のいずれか１つを含む配列を有する。
いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号６７、６８、および６９のいずれか１つと少なくとも８０％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号６７、６８、および６９のいずれか１つと少なくとも８５％同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号６７、６８、および６９のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号６７、６８、および６９のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号６７、６８、および６９のいずれか１つと少なくとも９６％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号６７、６８、および６９のいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号６７、６８、および６９のいずれか１つと少なくとも９８％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号６７、６８、および６９のいずれか１つと少なくとも９９％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号６７、６８、および６９のいずれか１つを含む配列を有する。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含む。他の実施形態では、核酸配列は、配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも約８５％の同一性を有するアミノ酸をコードする。さらに他の実施形態では、核酸配列は、配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸をコードする。さらなる実施形態では、核酸配列は、配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸をコードする。さらなる実施形態では、核酸配列は、配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも約９６％の同一性を有するアミノ酸をコードする。よりさらなる実施形態では、核酸配列は、配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも約９７％の同一性を有するアミノ酸をコードする。よりさらなる実施形態では、核酸配列は、配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも約９８％の同一性を有するアミノ酸をコードする。よりさらなる実施形態では、核酸配列は、配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸をコードする。よりさらなる実施形態では、核酸配列は、配列番号５または６のいずれか１つを含むアミノ酸をコードする。
プロモーター
いくつかの実施形態では、異なるプロモーターは、本開示の発現ベクター内に組み込まれた核酸配列のそれぞれの発現を駆動するために使用される。例えば、ＲＮＡｉ（例えば抗ＨＰＲＴ ｓｈＲＮＡ）をコードする第１の核酸配列は第１のプロモーターから発現され、治療遺伝子（例えばＷＡＳ遺伝子）をコードする第２の核酸配列は第２のプロモーターから発現され、ここで、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは異なる。同様に、および別の例により、ＨＰＲＴを下方調節するマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は第１のプロモーターから発現され、治療遺伝子（例えばＷＡＳ遺伝子）をコードする第２の核酸配列は第２のプロモーターから発現され、ここで、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは異なる。
一部の実施形態では、プロモーターは、当業者に公知である構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターでもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターはＨＩＶ ＬＴＲの少なくとも一部（例えば、ＴＡＲ）を含む。
適切なプロモーターの例は、ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）、ポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）、またはポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターを含むがこれらに限定されない。「ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター」または「ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター」または「ポリメラーゼＩＩＩプロモーター」または「ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター」とは、細胞中その天然の状況において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩと会合するもしくは相互作用してその作動可能に連結した遺伝子を転写する任意の無脊椎動物プロモーター、脊椎動物プロモーター、もしくは哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、霊長類、サル、等のプロモーター、または選択された宿主細胞においてＲＮＡポリメラーゼＩＩＩと相互作用して作動可能に連結した核酸配列を転写する、天然であれ操作されたものであれ、その任意の変異体のことを意味する。本開示の発現ベクターでの使用に適したＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ヒトＵ６、マウスＵ６、およびヒトＨ１他を含むがこれらに限定されない。
ｐｏｌＩＩプロモーターの例として、限定はされないが、Ｅｆ１アルファ、ＣＭＶ、およびユビキチンが挙げられる。他の特異的ｐｏｌＩＩプロモーターは、限定はされないが、アンキリンプロモーター（Ｓａｂａｔｉｎｏ ＤＥら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｄ ＵＳＡ．（２４）：１３２９４～９頁（２０００年））、スペクトリンプロモーター（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ＰＧら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７４（１０）：６０６２～７３頁、（２０００年））、トランスフェリン受容体プロモーター（Ｍａｒｚｉａｌｉ Ｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２１（５２）：７９３３～４４頁、（２００２年））、ｂａｎｄ３／アニオントランスポータープロモーター（Ｆｒａｚａｒ ＴＦら、ＭｏＩ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１４）：４７５３～６３頁、（２００３年））、ｂａｎｄ ４．１プロモーター（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＰＲら、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１５５（２）：３２１～４４頁、（１９８４年））、ＢｃＩ－Ｘｌプロモーター（Ｔｉａｎ Ｃら、Ｂｌｏｏｄ １５；１０１（６）：２２３５～４２頁（２００３年））、ＥＫＬＦプロモーター（Ｘｕｅ Ｌら、Ｂｌｏｏｄ．１０３（１１）：４０７８～８３頁（２００４年））．Ｅｐｕｂ ２００４年 Ｆｅｂ ５）、ＡＤＤ２プロモーター（Ｙｅｎｅｒｅｌ ＭＮら、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．３３（７）：７５８～６６頁（２００５年））、ＤＹＲＫ３プロモーター（Ｚｈａｎｇ Ｄら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８５（１）：１１７～３０頁（２００５年））、ＳＯＣＳプロモーター（Ｓａｒｎａ ＭＫら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２（２１）：３２２１～３０頁（２００３年））、ＬＡＦプロモーター（Ｔｏ ＭＤら、ｂｉｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ｌ；１１５（４）：５６８～７４頁、（２００５年））、ＰＳＭＡプロモーター（Ｚｅｎｇ Ｈら、ＪＡｎｄｒｏｌ （２）：２１５～２１頁、（２００５年））、ＰＳＡプロモーター（Ｌｉ ＨＷら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３３４（４）：１２８７～９１頁、（２００５年））、Ｐｒｏｂａｓｉｎプロモーター（Ｚｈａｎｇ Ｊら、１４５（ｌ）：１３４～４８頁、（２００４年））．Ｅｐｕｂ ２００３年 Ｓｅｐ １８）、ＥＬＡＭ－Ｉプロモーター／Ｅ－セレクチン（Ｗａｌｔｏｎ Ｔら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８（３Ａ）：１３５７～６０頁、（１９９８年））、Ｓｙｎａｐｓｉｎプロモーター（Ｔｈｉｅｌ Ｇら、ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｄ ＵＳＡ．、８８（８）：３４３１～５頁（１９８８年））、ウィレブランド因子プロモーター（Ｊａｈｒｏｕｄｉ Ｎ、Ｌｙｎｃｈ ＤＣ．ＭｏＩ Ｃｅｌｌ－５ｚｏ／．１４（２）：９９９～１００８頁、（１９９４年））、ＦＬＴｌ（Ｎｉｃｋｌｉｎ ＳＡら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ３８（ｌ）：６５～７０頁、（２００１年））、Ｔａｕプロモーター（Ｓａｄｏｔ Ｅら、ＪＭｏＩ Ｂｉｏｌ．２５６（５）：８０５～１２頁、（１９９６年））、チロシナーゼプロモーター（Ｌｉｌｌｅｈａｍｍｅｒ Ｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００５年））、ｐａｎｄｅｒプロモーター（Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ ＢＲら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．（２００５年））、神経特異的エノラーゼプロモーター（Ｌｅｖｙ ＹＳら、ＪＭｏｌＮｅｕｒｏｓｃｉ．２１（２）：１２１～３２頁、（２００３年））、ｈＴＥＲＴプロモーター（Ｉｔｏ Ｈら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６（６）：６８５～９８頁、（２００５年））、ＨＲＥ応答エレメント（Ｃｈａｄｄｅｒｔｏｎ Ｎら、ＩｎｔＪＲａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ．６２（ｌ）：２Ｕ－２２、（２００５年））、ｌｃｋプロモーター（Ｚｈａｎｇ ＤＪら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４（１１）：６７２５～３１頁、（２００５年））、ＭＨＣＩＩプロモーター（Ｄｅ Ｇｅｅｓｔ ＢＲら、Ｂｌｏｏｄ．１０１（７）：２５５１～６頁、（２００３年）、Ｅｐｕｂ ２００２年 Ｎｏｖ ２１）、およびＣＤｌ Ｉｃプロモーター（Ｌｏｐｅｚ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｃら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７２（４６）：２９１２０～６頁（１９９７年））を含み、これらの開示はその全体を参照により本明細書に組み入れる。
いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計された薬剤の発現を駆動するプロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計された薬剤の発現を駆動するプロモーターは、７ｓｋプロモーター（例えば、７ＳＫヒト７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）である。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、アクセションＡＹ５７８６８５（ホモサピエンス細胞株ＨＥＫ－２９３ ７ＳＫ ＲＮＡプロモーター領域、完全配列、アクセションＡＹ５７８６８５）により提供される核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号２８の配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号２８の配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号２８の配列と少なくとも９６％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号２８の配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号２８の配列と少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号２８の配列と少なくとも９９％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号２８に示される核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、利用される７ｓｋプロモーターは、７ｓｋプロモーターと比べて少なくとも１つの突然変異および／または欠失をその核酸配列に含む。適切な７ｓｋプロモーター突然変異はＢｏｙｄ，Ｄ．Ｃ．、Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐ．Ｃ．、Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｎ．Ｊ．、Ｇｅｒｓｔｅｒ，Ｔ．＆Ｍｕｒｐｈｙ，Ｓ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ ｏｆ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｅｎｓｕｒｅｓ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ７ＳＫ Ｇｅｎｅ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５３、６７７～６９０頁（１９９５）に記載されており、前記文献の開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる（図１０も参照）。いくつかの実施形態では、ｓｈ７３４（配列番号２９を参照）を含む、プロモーター駆動トランス遺伝子の発現レベルを調節するため７ｓｋプロモーター中に機能的突然変異または欠失をシス調節エレメントで作成する。記載される突然変異を使用して、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターにより駆動されるｓｈ７３４発現レベル間の相関性を確立し、６ＴＧ療法の存在下で安定した選択を受ける機能性ならびに長期の安定性および安全性を導入する。７ｓｋプロモーター突然変異の位置は図１０に描かれている。
いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号２９の配列と少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号２９の配列と少なくとも９６％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号２９の配列と少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号２９の配列と少なくとも９８％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号２９の配列と少なくとも９９％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号２９に示される配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＷＡＳＰをコードする核酸配列の発現を駆動するプロモーターはＭＮＤプロモーターである。ＭＮＤプロモーターを含む発現カセットの例を、図１Ａ～図１Ｅに例示する。ＭＮＤプロモーターは、骨髄およびリンパ球系列、特にＷＡＳにおけるより良いおよびより一貫した発現を提供する。
ＭＮＤプロモーターは、合成ウイルスプロモーターである。ＭＮＤプロモーターは、「陰性対照領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換した骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー」と規定される。Ｈａｌｅｎｅら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ Ａｆｔｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ」、Ｂｌｏｏｄ １９９９年 ９４：３３４９～３３５７頁（その開示はその全体を参照により本明細書に組み入れる）を参照。その全体を参照により本明細書に組み入れられる、Ｃｈａｌｌｉｔａら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｉｓ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ ｏｆ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｌｅａｄ ｔｏ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｆｅｂ．１９９５年、７４８～７５５頁は、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）転写単位の改変を含有する一連のレトロウイルスベクターの構築物を記載する。そのような改変は、（ｉ）ＭｏＭｕＬＶエンハンサーのＭＰＳＶからのエンハンサーへの置換、（ｉｉ）ＮＣＲの欠失、（ｉｉｉ）ＭｏＭｕＬＶ ＰＢＳのｄ１５８７ｒｅｖ株のＰＢＳとの置換、および（ｉｖ）マウスＴｈｙ－１遺伝子の５９上流領域からクローニングされたジメチル化断片の挿入を含み得る。モロニーマウス白血病ウイルス転写単位への前述の改変の位置を示す概略図を図１３に示す。ＭｏＭｕＬＶ（モロニ－マウス白血病ウイルス）転写単位のその他の改変が記載された。当業者は、「ＭＮＤプロモーター」が、本開示の文脈では、ＷＡＳＰをコードする核酸配列の発現を駆動するのに好適なＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）転写単位の他の記載した改変またはバリアントを包含することを理解するであろう。例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許出願公開第２０１７／００５１３０８号は、本開示に適用され、ＷＡＳＰをコードする任意の核酸配列の発現を駆動することができるＭｏＭｕＬＶ（モロニ－マウス白血病ウイルス）転写単位の他の改変を記載する。
Ｃｈａｌｌｉｔａら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｉｓ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ ｏｆ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｌｅａｄ ｔｏ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｆｅｂ．１９９５年、７４８～７５５頁に記載のように、ＭＮＤプロモーターは改変したＭｏＭｕＬＶ長い末端反復配列由来であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＷＡＳＰ遺伝子の発現を駆動するために使用するＭＮＤプロモーターは、図１３に示すＭｏＭｕＬＶ長い末端反復配列と比較してトランケートされた、トランケートしたＭＮＤプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、トランケーションは図１３で同定した１つまたはそれ以上の領域の除去を含む。他の実施形態では、トランケーションは図１３で同定した１つまたはそれ以上の領域の部分の除去を含む。いくつかの実施形態では、ＷＡＳＰ遺伝子の発現を駆動するために使用するＭＮＤプロモーターは、ＭｏＭｕＬＶ長い末端反復配列のＵ３セクションを含む。他の実施形態では、ＷＡＳＰ遺伝子の発現を駆動するために使用するＭＮＤプロモーターは改変したＵ３領域を含み、ここでＵ３領域は陰性対照領域（ＮＣＲ）を欠如する。さらに他の実施形態では、ＷＡＳＰ遺伝子の発現を駆動するために使用するＭＮＤプロモーターは、ＰＢＳ領域、Ｒ領域、またはＭｏＭｕＬＶ長い末端反復配列のＵ５領域を含まないが、少なくともＵ３領域の部分を含む。さらなる実施形態では、ＷＡＳＰ遺伝子の発現を駆動するために使用するＭＮＤプロモーターは、改変したＵ３領域を含み、ここでＵ３領域は陰性対照領域（ＮＣＲ）を欠如し；ここでＭＮＤプロモーターはＰＢＳ領域、Ｒ領域、またはＭｏＭｕＬＶ長い末端反復配列のＵ５領域を含まない。よりさらなる実施形態では、ＷＡＳＰ遺伝子の発現を駆動するために使用するＭＮＤプロモーターは、ＭｏＭｕＬＶ長い末端反復配列のＰＢＳ領域を含まない。
いくつかの実施形態では、ＭＮＤプロモーターは配列番号７、８、９、１０、１１、または１２のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。他の実施形態では、ＭＮＤプロモーターは配列番号７、８、９、１０、１１、または１２のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。さらに他の実施形態では、ＭＮＤプロモーターは配列番号７、８、９、１０、１１、または１２のいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する。さらなる実施形態では、ＭＮＤプロモーターは配列番号７、８、９、１０、１１、または１２のいずれか１つと少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＭＮＤプロモーターは配列番号７、８、９、１０、１１、または１２のいずれか１つと少なくとも９９％同一性を有する核酸配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＭＮＤプロモーターは配列番号６，７、８、９、１０、１１、または１２のいずれか１つの核酸配列を含む。
いずれの特定の理論に拘束されることを望まないが、ＭＮＤプロモーターは、ＷＳ１．６プロモーターのような他のプロモーターと比較してＷＡＳＰのより効率的な発現を駆動し得ると考えられる。ＷＳ１．６プロモーター（内在性ＷＡＳプロモーターのセクション）はＭＮＤと比較して始原ヒト細胞において活性が低いと考えられる。ＷＳ１．６－ｈｕＷＡＳｐＬＶは、ｉｎ ｖｉｖｏでの限定されたＷＡＳＰ発現を媒介するとも考えられる。ＭＮＤ－ｈｕＷＡＳｐＬＶによって形質導入された幹細胞の移植が、持続した全ての造血系統におけるＷＡＳＰの内在性レベル、ＷＡＳＰ＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞およびＢ細胞の選択の向上、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生のレスキュー、および／または周辺帯（ＭＺ）Ｂ細胞の実質的な回復をもたらし得るとも考えられる。先の記載を考慮して、ＭＮＤは最も有効な結果を提供し得ると考えられる。
インスレーター
いくつかの実施形態では、本開示の発現ベクターはインスレーター、例えばクロマチンインスレーターを含む。いずれの特定の理論にも拘束されることを望まないが、クロマチンインスレーターエレメントは、ヘテロクロマチンの拡大および遺伝子のサイレンシングを防止し、クロマチン位置効果を減らし、エンハンサーブロッキング活性を有すると考えられる。これらの特性は、一貫した予測できる発現および無作為にインテグレートするベクターによる安全な導入遺伝子送達に望ましいと考えられる。クロマチン位置効果を克服することは治療効果に必要なコピー数を減らし、ベクターの遺伝子毒性のリスクを減らすことができるとも考えられる。研究は、インスレーターを有するベクター（ｉｎｓｕｌａｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ）が、造血幹細胞の分化した子孫におけるインテグレーション部位にかかわらず一貫した、予測できる発現を示し、約２～約４倍高い全体的な発現をもたらすことを示した。近年の証拠は、ｃＨＳ４インスレーターを有するレンチウイルスベクターが細胞性がん遺伝子の挿入による活性化のリスクを減らし得ることも示している。インスレーターを有するベクターの有益な効果にかかわらず、それらはレンチウイルスベクターの３’ＬＴＲにおける全長１．２ＫｂのｃＨＳ４インスレーターエレメントの挿入による力価の著しい減少ももたらす。３’ＬＴＲにおいて挿入を含有するガンマレトロウイルスベクターによるウイルス力価の低下または不安定な伝達の同様の報告がある。力価のこの減少は、特に比較的大きな発現カセットを持つベクターによる、臨床試験のためのベクター産生のスケールアップの事実上制限になると考えられる。これらの結果は、臨床的な遺伝子治療のためのベクター設計の重要な意味を持つと考えられる。チキン過敏性部位４（ｃＨＳ４）エレメント、プロトタイプのインスレーターの研究は、エンハンサーブロッキング活性を提供し、位置効果を減少させる、「コア」と呼ばれる、ｃＨＳ４のおよそ２５０ｂｐにおけるＣＴＣＦおよびＵＳＦ－１／２モチーフを同定した。しかしながら、コア単独ではウイルスベクターを効果的にインスレートしない。全長ｃＨＳ４は、優れたインスレート特性を有すると考えられるが、その大きなサイズはベクター力価をひどく損なう。
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターの力価は、全長クロマチンインスレーターの機能性部分を含有する１つまたはそれ以上の長さを減らしたクロマチンインスレーターを組み込むことにより増大される。いくつかの実施形態では、機能的な長さを減らしたクロマチンインスレーターはチキン過敏性部位４（ｃＨＳ４）エレメント由来である。いくつかの実施形態では、機能的な長さを減らしたインスレーターは、６５０塩基対またはそれ以下のｃＨＳ４由来インスレーターである。いくつかの実施形態では、インスレーターは６５０ｃＨＳ４、４００ｃＨＳ４、または泡沫状ウイルスインスレーターである。いくつかの実施形態では、機能性部分は全長クロマチンインスレーターの１つの型由来である。いくつかの実施形態では、長さを減らした機能的なインスレーターは、クロマチンインスレーターの２つまたはそれ以上の別々のバリアントの機能性部分を含む。いくつかの実施形態では、インスレーターは配列番号３８、３９、または４０のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。他の実施形態では、インスレーターは配列番号３８、３９、または４０のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。さらに他の実施形態では、インスレーターは配列番号３８、３９、または４０のいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する。さらなる実施形態では、インスレーターは配列番号３８、３９、または４０のいずれか１つの核酸配列を有する。他のインスレーターは、米国特許出願公開第２０１８／０１４２２５５号および第２００７／０１５４４５６号に記載され、その開示はその全体を参照により本明細書に組み入れる。
クロマチンインスレーターは２つのレベルの活性を提供すると考えられる。それらは、インテグレートした配列のエピジェネティックなサイレンシングを防止すると考えられる。ゲノムの一部のエピジェネティックなサイレンシングは、ＨＳＣの細胞系列への分化の間に生じるプロセスであると考えられる。例として、ＷＡＳＰは、形質導入されたＨＳＣにおいてよく発現される。しかしながら、いったんＨＳＣが分化した細胞を生じると、これらのサイレンシング事象により、より低いＷＡＳＰ発現が達成されると考えられる。インスレーターはインテグレーション部位の外側のプロモーター活性を防止するとも考えられる（エンハンサーブロッキング活性）。例えば、レンチウイルスが特定の遺伝子（「遺伝子Ｘ」）「に」、または特定の遺伝子（「遺伝子Ｘ」）「付近に」インテグレートする場合、ＭＮＤのようなプロモーターがＷＡＳＰおよびインテグレーション部位の周りに位置する「遺伝子Ｘ」に機能するのを防止する。
ベクターの産生
いくつかの実施形態では、発現のための特定のトランス遺伝子（配列番号１５）を有するもののような発現カセットを、レンチウイルス発現ベクターのような発現ベクター中に挿入して、発現のための少なくとも１つのトランス遺伝子を有するベクターを提供する。いくつかの実施形態では、レンチウイルス発現ベクターは、ｐＴＬ２０ｃ、ｐＴＬ２０ｄ、ＦＧ、ｐＲＲＬ、ｐＣＬ２０、ｐＬＫＯ．１ ｐｕｒｏ、ｐＬＫＯ．１、ｐＬＫＯ．３Ｇ、Ｔｅｔ－ｐＬＫＯ－ｐｕｒｏ、ｐＳｉｃｏ、ｐＬＪＭ１－ＥＧＦＰ、ＦＵＧＷ、ｐＬＶＴＨＭ、ｐＬＶＵＴ－ｔＴＲ－ＫＲＡＢ、ｐＬＬ３．７、ｐＬＢ、ｐＷＰＸＬ、ｐＷＰＩ、ＥＦ．ＣＭＶ．ＲＦＰ、ｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ Ｐｕｒｏ ＤＥＳＴ、ｐＬｅｎｔｉ－ｐｕｒｏ、ｐＬＯＶＥ、ｐＵＬＴＲＡ、ｐＬＪＭ１－ＥＧＦＰ、ｐＬＸ３０１、ｐＩｎｄｕｃｅｒ２０、ｐＨＩＶ－ＥＧＦＰ、Ｔｅｔ－ｐＬＫＯ－ｎｅｏ、ｐＬＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＣＷ５７．１、ｐＬｉｏｎＩＩ、ｐＳＬＩＫ－Ｈｙｇｒｏ、およびｐＩｎｄｕｃｅｒ１０－ｍｉｒ－ＲＵＰ－ＰｈｅＳからなる群から選択し得る。他の実施形態では、レンチウイルス発現ベクターは、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、ｌｅｎｔｉｇｌｏｂｉｎ ＨＰＶ５６９ベクター、ｌｅｎｔｉｇｌｏｂｉｎ ＢＢ３０５ベクター、ＢＧ－１ベクター、ＢＧＭ－１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ－ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３－ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３－４００ベクター、Ｇ９ベクター、およびＢＣＬ１１Ａ ｓｈｍｉｒベクターから選択し得る。いくつかの実施形態では、レンチウイルス発現ベクターは、ｐＴＬ２０ｃ、ｐＴＬ２０ｄ、ＦＧ、ｐＲＲＬおよびｐＣＬ２０からなる群から選択し得る。さらに他の実施形態では、レンチウイルス発現ベクターはｐＴＬ２０ｃである。
例えば、発現のためのトランス遺伝子（例えば、ＷＡＳトランス遺伝子）を有する発現カセットが、米国特許出願公開第２０１８／０１１２２３３号に記載される方法に従って、ｐＴＬ２０ｃベクター（配列番号１８）に挿入され得、前記特許文献の開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。この「中間体」は、図１Ａに示される。いくつかの実施形態では、ｐＴＬ２０ｃベクターは、配列番号３０の配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有するベクター骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｐＴＬ２０ｃベクターは、配列番号３０の配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有するベクター骨格を含む。
いくつかの実施形態では、発現ベクターへの発現カセットの挿入に続いて、第２の発現カセットが、発現のための第２のトランス遺伝子を有するベクターに挿入される。例えば、ＨＰＲＴをノックダウンするための核酸配列（例えば、配列番号１４）を含む発現カセットが、発現のための少なくとも１つのトランス遺伝子を有するベクターに挿入される。
他の実施形態では、発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結した発現のための第１のトランス遺伝子と、第２のプロモーターに作動可能に連結した発現のための少なくとも１つの第２のトランス遺伝子とを含み得る。例えば、発現ベクターへの挿入のための発現カセット、例えば、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴカセット（配列番号５８）または３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯカセット（配列番号５９）、は、発現のための第１のトランス遺伝子と、ＨＰＲＴをノックダウンするための第２の核酸配列（例えば、配列番号１４）とを含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、発現のための第１のトランス遺伝子と、第２の核酸配列７ｓｋ／ｓｈ７３４（例えば、配列番号１４）とを含む。いくつかの実施形態では、発現カセット、例えば、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴカセット（配列番号５８）または３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯカセット（配列番号５９）は、発現のためのＷＡＳトランス遺伝子と、第２の核酸配列７ｓｋ／ｓｈ７３４（例えば、配列番号１４）とを含む。いくつかの実施形態では、発現カセット、例えば、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴカセット（配列番号５８）または３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯカセット（配列番号５９）、は、プロモーターに作動可能に連結したＷＡＳトランス遺伝子と、プロモーターに作動可能に連結した、ＨＰＲＴをノックダウンするための第２の核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、発現カセット、例えば、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴカセット（配列番号５８）または３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯカセット（配列番号５９）、は、ＭＮＤプロモーターに作動可能に連結したＷＡＳトランス遺伝子と、７ｓｋ／ｓｈ７３４（例えば、配列番号１４）とを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のトランス遺伝子を含む発現カセットが、発現ベクターに挿入される。例えば、いくつかの実施形態では、第１および第２のトランス遺伝子を含む発現カセットは、一段階において発現ベクターに挿入される。
結果として得られるベクターの非限定的な例が、図１Ｂ～１Ｅに表される。図１Ｂ～１Ｅに示されるように、７ｓｋ発現カセット（例えば、配列番号１４を有する発現カセット）は、異なる位置（例えば、ＷＡＳＰ発現カセットに対して異なる位置）において発現ベクターに挿入される。さらに、７ｓｋ発現カセットは、異なる配向で発現ベクターに挿入される（例えば、図１Ｂと１Ｃの間および図１Ｄと１Ｅの間の７ｓｋプロモーターの配向を比較されたい）。ＷＡＳＰ発現カセットに対して７ｓｋ発現カセットの異なる位置および／または配向はｓｈ７３４の発現を増強し得ると考えられる。異なる構成のさらなる例は、以下において詳細に説明される。
Figure 2022514955000002
いくつかの実施形態では、ＷＡＳＰ発現カセットは、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットに対して上流に位置している。
いくつかの実施形態では、ＷＡＳＰ発現カセットは、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットに対して下流に位置している。
いくつかの実施形態では、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットおよびＷＡＳＰ発現カセットは、同じ方向に配向されている。
いくつかの実施形態では、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットおよびＷＡＳＰ発現カセットは、反対方向に配向されている。
いくつかの実施形態では、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットは、ＷＡＳＰカセットに対してフォワード方向に配向されている。
いくつかの実施形態では、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットは、ＷＡＳＰ発現カセットに対してリバース方向に配向されている。
いくつかの実施形態では、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットは、ＷＡＳＰカセットに対して上流に位置しておりフォワード方向に配向されている。
いくつかの実施形態では、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットは、ＷＡＳＰ発現カセットに対して上流に位置しておりリバース方向に配向されている。
いくつかの実施形態では、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットは、ＷＡＳＰカセットに対して下流に位置しておりフォワード方向に配向されている。
いくつかの実施形態では、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットは、ＷＡＳＰ発現カセットに対して下流に位置しておりリバース方向に配向されている。
いくつかの実施形態にでは、第１のトランス遺伝子発現カセットは、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットに対して上流に位置される。
いくつかの実施形態では、第１のトランス遺伝子発現カセットは、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットに対して下流に位置されている。
いくつかの実施形態では、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットおよび第１のトランス遺伝子発現カセットは、同じ方向に配向されている。
いくつかの実施形態では、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットおよび第１のトランス遺伝子発現カセットは、反対方向に配向されている。
いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットは、第１のトランス遺伝子発現カセットに対してフォワード方向に配向されている。
いくつかの実施形態では、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットは、第１のトランス遺伝子発現カセットに対して反対方向に配向されている。
いくつかの実施形態では、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットは、第１のトランス遺伝子発現カセットに対して上流に位置しておりフォワード方向に配向されている。
いくつかの実施形態では、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットは、第１のトランス遺伝子発現カセットに対して上流に位置しておりリバース方向に配向されている。
いくつかの実施形態では、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットは、第１のトランス遺伝子発現カセットに対して下流に位置しておりフォワード方向に配向されている。
いくつかの実施形態では、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットは、第１のトランス遺伝子発現カセットに対して下流に位置しておりリバース方向に配向されている。
さらなる他の実施形態では、発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結した発現のための第１のトランス遺伝子と、少なくとも１つの第２の核酸配列７ｓｋ／ｓｈ７３４（例えば、配列番号１４）とを含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結した発現のための第１のトランス遺伝子と、少なくとも２つの核酸配列７ｓｋ／ｓｈ７３４（例えば、配列番号１４）とを含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、発現のためのＷＡＳトランス遺伝子と、少なくとも２つの７ＳＫ／ｓｈ７３４核酸配列（例えば、配列番号１４）とを含む。
プロモーターに作動可能に連結した発現のための第１のトランス遺伝子と第２のプロモーターに作動可能に連結した発現のための少なくとも１つの第２のトランス遺伝子とを含む適切な発現カセットのさらなる例としては、以下が挙げられる。
７ＳＫ／ｓｈ７３４＿ＭＮＤ／ｈＷＡＳＷＴ＿ＷＰＲＥ＿７ＳＫ／ｓｈ７３４；
ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４＿ＭＮＤ＿ｈＷＡＳＣＯ＿ＷＰＲＥ＿ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４；
ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４＿ＭＮＤ／ｈＷＡＳＷＴ＿ＷＰＲＥ＿ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４；および
７ＳＫ／ｓｈ７３４＿ＭＮＤ／ｈＷＡＳＣＯ＿ＷＰＲＥ＿７ＳＫ／ｓｈ７３４．
いくつかの実施形態では、発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結した発現のための第１のトランス遺伝子と、ＨＰＲＴをノックダウンするための少なくとも２つの核酸配列（例えば、配列番号１４）とを含み得、例えば、以下のものが挙げられる。
７ＳＫ／ｓｈ７３４＿ＭＮＤ／ｈＷＡＳＷＴ＿ＷＰＲＥ＿７ＳＫ／ｓｈ７３４；
ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４＿ＭＮＤ＿ｈＷＡＳＣＯ＿ＷＰＲＥ＿ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４；
ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４＿ＭＮＤ／ｈＷＡＳＷＴ＿ＷＰＲＥ＿ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４；または
７ＳＫ／ｓｈ７３４＿ＭＮＤ／ｈＷＡＳＣＯ＿ＷＰＲＥ＿７ＳＫ／ｓｈ７３４
ＨＰＲＴをノックダウンするための少なくとも２つの核酸配列を含むこのタイプの発現カセットは、ＨＰＲＴをノックダウンするための２つの核酸配列のうちの１つの選択的除去によって、７ＳＫ／ｓｈ７３４発現カセットの異なる位置および／または配向における様々なコンストラクトへのさらなるアクセスを提供し得ることを当業者は理解するであろう。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、発現ベクターに挿入される。例えば、第１および第２のトランス遺伝子を含む発現カセット、例えば、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴカセット（配列番号５８）または３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯカセット（配列番号５９）、は、一段階において発現ベクターに挿入される。構成のさらなる例は、本明細書において実施例１および表１０で詳細に説明される。
プロモーターに作動可能に連結した発現のための第１のトランス遺伝子と第２にプロモーターに作動可能に連結した発現のための少なくとも１つの第２のトランス遺伝子とを含む、配列番号５８または配列番号５９において記載されるタイプの発現カセットは、発現ベクターへの挿入の前、発現ベクターへの挿入後、またはその組合せにおいて、さらに改変または誘導体化してもよいことは当業者によって理解されるであろう。例えば、プロモーターに作動可能に連結した発現のための第１のトランス遺伝子と第２にプロモーターに作動可能に連結した発現のための少なくとも１つの第２のトランス遺伝子とを含む発現カセットは、ｉ）１つまたはそれ以上の追加のトランス遺伝子または遺伝因子を加えるため、
ｉｉ）１つまたはそれ以上のトランス遺伝子または遺伝因子を除去するため、ｉｉｉ）トランス遺伝子または遺伝因子のうちの１つまたはそれ以上を１つまたはそれ以上の代替のトランス遺伝子または遺伝因子で置き換えるため、あるいはそれらの組合せのために、発現ベクターへの挿入の前に改変または誘導体化され得ることは想定される。
いくつかの実施形態では、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴカセット（配列番号５８）または３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯカセット（配列番号５９）は、上記において記載されるように、改変または誘導体化される。いくつかの実施形態では、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴカセットまたは３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯカセット（配列番号５８または５９）のＷＡＳトランス遺伝子は、ＷＡＳトランス遺伝子以外の発現のためのトランス遺伝子と、ＨＰＲＴをノックダウンするための第２の核酸配列（配列番号１４）とを含む発現ベクターへの挿入のための発現カセットを提供するために、発現のための代替のトランス遺伝子で置き換えることができる。さらなる他の実施形態では、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴカセットまたは３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯ（配列番号５８または５９）の２つの７ＳＫ／ｓｈ７３４核酸配列のうちの少なくとも１つは、７ＳＫ／ｓｈ７３４以外の発現のための代替のトランス遺伝子と、ＷＡＳトランス遺伝子とを含む発現ベクターへの挿入のための発現カセットを提供するために、発現のための代替のトランス遺伝子で置き換えてもよい。他の実施形態では、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴカセットまたは３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯ（配列番号５８または５９）の７ＳＫ／ｓｈ７３４核酸配列およびＷＡＳトランス遺伝子のそれぞれは、７ＳＫ／ｓｈ７３４以外の発現のための代替のトランス遺伝子と、ＷＡＳトランス遺伝子とを含む発現ベクターへの挿入のための発現カセットを提供するために、発現のための代替のトランス遺伝子で置き換えてもよい。詳細には、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴカセット（配列番号５８）または３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯカセット（配列番号５９）のようは発現カセットにおける、発現のための第１のトランス遺伝子および発現のための第２のトランス遺伝子は、それぞれが同じであってもまたは異なっていてもよい代替のトランス遺伝子で置き換えてもよい。したがって、第３のプロモーターに作動可能に連結した発現のための第３のトランス遺伝子と、第４のプロモーターに作動可能に連結した発現のための少なくとも１つの第４のトランス遺伝子とを含む、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴカセットまたは３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯカセット（配列番号５８または５９）に由来する発現カセットが提供される。
あるいは、プロモーターに作動可能に連結した発現のための第１のトランス遺伝子と第２のプロモーターに作動可能に連結した発現のための少なくとも１つの第２のトランス遺伝子とを含む発現カセットは、ｉ）１つまたはそれ以上の追加のトランス遺伝子または遺伝因子を加えるため、ｉｉ）１つまたはそれ以上のトランス遺伝子または遺伝因子を除去するため、ｉｉｉ）トランス遺伝子または遺伝因子のうちの１つまたはそれ以上を代替のトランス遺伝子または遺伝因子で置き換えるため、あるいはそれらの組合せのために、発現ベクターへの挿入の後にさらに改変または誘導体化されることは想定される。
いくつかの実施形態では、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴカセットまたは３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯカセットは、上記において記載されるように、例えば、配列番号６３、６４、６５、または６６によって記載されるタイプの中間体ベクターにおいて、発現ベクターへの挿入後に、改変または誘導体化される。いくつかの実施形態では、中間体ベクター配列番号６３、６４、６５、または６６のいずれか１つにおける、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴカセットの野生型ＷＡＳトランス遺伝子または３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯカセットのコドン最適化ＷＡＳトランス遺伝子は、ＷＡＳトランス遺伝子以外の発現のためのトランス遺伝子と、ＨＰＲＴをノックダウンするための第２の核酸配列（配列番号１４）とを含む発現ベクターを提供するために、発現のための代替のトランス遺伝子で置き換えてもよい。さらなる他の実施形態では、配列番号６３、６４、６５、または６６によって記載されるタイプの中間体ベクターにおける、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴカセットまたは３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯ（配列番号５８または５９）の２つの７ＳＫ／ｓｈ７３４核酸配列のうちの少なくとも１つは、７ＳＫ／ｓｈ７３４以外の発現のための代替のトランス遺伝子を含む発現ベクターを提供するために、発現のための代替のトランス遺伝子で置き換えてもよい。他の実施形態では、配列番号６３、６４、６５、または６６によって記載されるタイプの中間体ベクターにおける、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴまたは３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯカセットの７ＳＫ／ｓｈ７３４核酸配列およびＷＡＳトランス遺伝子のそれぞれは、７ＳＫ／ｓｈ７３４以外の発現のための代替のトランス遺伝子とＷＡＳトランス遺伝子とを含む発現ベクターを提供するために、発現のための代替のトランス遺伝子で置き換えてもよい。詳細には、配列番号６３、６４、６５、または６６によって記載されるタイプの中間体ベクターにおける、３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴまたは３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯカセットのような発現カセットにおける発現のための第１のトランス遺伝子および発現のための第２のトランス遺伝子は、それぞれが同じであってもまたは異なっていてもよい代替のトランス遺伝子に置き換えてもよい。したがって、第３のプロモーターに作動可能に連結した発現のための第３のトランス遺伝子と、第４のプロモーターに作動可能に連結した発現のための少なくとも１つの第４のトランス遺伝子とを含む、配列番号６３、６４、６５、または６６によって記載されるタイプの中間体ベクターに由来する発現ベクターが、提供される。
ポリヌクレオチド
本開示は、配列番号４２～５７のいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有するポリヌクレオチドも提供する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４２の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４２の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４２の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４２の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４２の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４２の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４２の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４３の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４３の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４３の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４３の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４３の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４３の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４３の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４４の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４４の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４４の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４４の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４４の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４４の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４４の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４５の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４５の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４５の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４５の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４５の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４５の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４５の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４６の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４６の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４６の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４６の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４６の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４６の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４６の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４７の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４７の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４７の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４７の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４７の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４７の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４７の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４８の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４８の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４８の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４８の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４８の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４８の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４８の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４９の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４９の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４９の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４９の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４９の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４９の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４９の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５０の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５０の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５０の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５０の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５０の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５０の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５０の核酸配列を含む（図１Ｆも参照）。いくつかの実施形態では、配列番号５０のポリヌクレオチドは、表２において識別される成分を含む。
Figure 2022514955000003
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５１の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５１の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５１の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５１の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５１の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５１の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５１の核酸配列を含む（図１Ｇも参照）。いくつかの実施形態では、配列番号５１のポリヌクレオチドは、表３において識別される成分を含む。
Figure 2022514955000004
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５２の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５２の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５２の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５２の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５２の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５２の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５２の核酸配列を含む（図１Ｈも参照）。いくつかの実施形態では、配列番号５２のポリヌクレオチドは、表４において識別される成分を含む。
Figure 2022514955000005
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５３の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５３の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５３の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５３の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５３の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５３の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５３の核酸配列を含む（図１Ｉも参照）。いくつかの実施形態では、配列番号５３のポリヌクレオチドは、表５において識別される成分を含む。
Figure 2022514955000006
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４の核酸配列を含む（図１Ｊも参照）。いくつかの実施形態では、配列番号５４のポリヌクレオチドは、表６において識別される成分を含む。
Figure 2022514955000007
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５５の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５５の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５５の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５５の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５５の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５５の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５５の核酸配列を含む（図１Ｋも参照）。いくつかの実施形態では、配列番号５５のポリヌクレオチドは、表７において識別される成分を含む。
Figure 2022514955000008
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５６の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５６の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５６の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５６の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５６の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５６の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５６の核酸配列を含む（図１Ｌも参照）。いくつかの実施形態では、配列番号５６のポリヌクレオチドは、表８において識別される成分を含む。
Figure 2022514955000009
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５７の配列と９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５７の配列と９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５７の配列と９６％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５７の配列と９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５７の配列と９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５７の配列と９９％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５７の核酸配列を含む（図１Ｍも参照）。いくつかの実施形態では、配列番号５７のポリヌクレオチドは、表９において識別される成分を含む。
Figure 2022514955000010
宿主細胞
本開示は、本開示の新規の発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。「宿主細胞」または「標的細胞」とは、本開示の方法および発現ベクターを使用して形質転換される細胞を意味する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発現ベクターを発現することができる哺乳動物細胞である。適切な哺乳動物宿主細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞（例えば、アカゲザル細胞）、ヒト前駆細胞または幹細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｄ１７細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ細胞、およびＣｆ２Ｔｈ細胞を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、本開示の発現ベクターを含む宿主細胞は、造血前駆細胞／幹細胞（例えば、ＣＤ３４陽性造血前駆細胞／幹細胞）、単球、マクロファージ、末梢血単核球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、または樹状細胞のような造血細胞である。
本開示の発現ベクターで形質導入される造血幹細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球および／または単球／マクロファージ）は、同種異系間の、自己の、または適合兄弟姉妹由来が可能である。ＨＳＣは、いくつかの実施形態では、ＣＤ３４陽性であり、患者の骨髄または末梢血から単離することができる。単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＣ（および／または本明細書に記載される他の造血細胞）は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現ベクターで形質導入される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞または形質導入された宿主細胞は薬学的に許容される担体と組み合わされる。いくつかの実施形態では、宿主細胞または形質導入された宿主細胞は、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（例えば、静脈内投与のための無菌非発熱性等張溶液；その場合、１リットルのＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａは、１４０ｍＥｑナトリウム、５ｍＥｑカリウム、３ｍＥｑマグネシウム、９８ｍＥｑ塩化物、２７ｍＥｑアセテート、および２３ｍＥｑグルコン酸のイオン濃度を有する）で製剤化される。他の実施形態では、宿主細胞または形質導入された宿主細胞は、約８％と約１０％の間のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む溶液である、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａの溶液で製剤化される。いくつかの実施形態では、約２×１０７個未満の宿主細胞／形質導入された宿主細胞が、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ ＡおよびＤＭＳＯを含む１ｍＬあたりの製剤に存在する。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本開示によるベクターを用いた形質導入後、実質的にＨＰＲＴ欠損される。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは、少なくとも５０％減少される。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは、少なくとも約５５％減少される。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは、少なくとも６０％減少される。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは、少なくとも６５％減少される。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは、少なくとも７０％減少される。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは、少なくとも７５％減少される。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは、少なくとも８０％減少される。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは、少なくとも８５％減少される。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは、少なくとも９０％減少される。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは、少なくとも９５％減少される。２０％またはそれよりも少ない残りのＨＰＲＴ遺伝子発現を有する細胞は、例えば、６ＴＧのようなプリン類似体に感受性であり、プリン類似体を用いたその選択を可能にすると考えられる（例えば、図１４参照）。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号１６または配列番号１７の少なくとも１つを含む核酸分子を含む。
いくつかの他の実施形態では、宿主細胞は、（ｉ）ＨＰＲＴをノックダウンするためのｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列と、（ｉｉ）ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列とを含む発現ベクターによって形質導入される。いくつかの実施形態では、形質導入された宿主細胞は、実質的にＨＰＲＴ欠損される。いくつかの実施形態では、形質導入された宿主細胞は、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質を発現する。
いくつかの実施形態では、宿主細胞の形質導入は、本開示の発現ベクターおよび形質導入効率を増やす１つまたはそれ以上の化合物に宿主細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで接触させることにより増やしてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、形質導入効率を増やす１つまたはそれ以上の化合物は、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物、すなわち、１つまたはそれ以上の化合物の非存在下でプロスタグランジンＥＰ受容体の下流の細胞シグナル伝達活性と比べて１つまたはそれ以上の化合物に接触させた細胞においてプロスタグランジンＥＰ受容体の下流の細胞シグナル伝達活性を増やす１つまたはそれ以上の化合物である。いくつかの実施形態では、形質導入効率を増やす１つまたはそれ以上の化合物は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、またはその類似体もしくは誘導体を含むがこれらに限定されない、プロスタグランジンＥＰ受容体リガンドである。他の実施形態では、形質導入効率を増やす１つまたはそれ以上の化合物は、レトロネクチン（組換えヒトフィブロネクチン断片の６３ｋＤ断片、Ｔａｋａｒａより入手可能）；Ｌｅｎｔｉｂｏｏｓｔ（膜シーリングポロクサマー、Ｓｉｒｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手可能）、硫酸プロタミン、シクロスポリンＨ、およびラパマイシンを含むがこれらに限定されない。
医薬組成物
本開示は、本明細書で開示される１つまたはそれ以上の発現ベクターおよび／または非ウイルス送達ビヒクル（例えば、ナノカプセル）を含む、医薬組成物を含む組成物も提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される発現ベクターおよび／または非ウイルス送達ビヒクルの少なくとも１つの有効量ならびに薬学的に許容される担体を含む。例えば、ある特定の実施形態では、医薬組成物は、有効量の発現ベクターおよび薬学的に許容される担体を含む。有効量は、当業者であれば、対象の身体サイズ、体重、年齢、健康、性別、民族性、およびウイルス力価のような要因に基づいて容易に決定することができる。
語句「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」とは、動物またはヒトに投与された場合、有害な、アレルギー性の、または他の都合の悪い反応を生じない分子実体および組成物のことである。例えば、発現ベクターは薬学的に許容される担体と一緒に製剤化される。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、溶剤、バッファー、溶液、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤ならびにヒトへの投与に適した医薬品のような医薬品を製剤化する際の使用に適した同類のものを含む。製薬担体と一緒の化合物の製剤化のための方法は、当技術分野では公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、（第１７版．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．１９８５年）；およびＧｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第１１版、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、２００５年）に記載されており；前記文献のそれぞれの開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される発現ベクター、ナノカプセル、または組成物のいずれでも、投与されたサイレンシング核酸が約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を達成するのを可能にするいかなる濃度で含んでもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約０．１重量％～約９９．９重量％までの量で発現ベクターを含んでもよい。任意の医薬組成物内での包含に適した薬学的に許容される担体は、水、緩衝水、例えば、通常生理食塩水のような生理食塩水またはハンクスもしくはアール平衡溶液のような平衡生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、等を含む。医薬組成物を、静脈内、筋肉内または皮下投与のような非経口投与用に製剤化してもよい。非経口投与用の医薬組成物は、薬学的に許容される無菌水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液または乳濁液ならびに無菌注射液または分散液への復元用の無菌粉末を含んでもよい。適切な水溶性および非水溶性担体、溶剤、希釈剤またはビヒクルの例は、水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、等のような）、カルボキシメチルセルロースおよびその混合物、植物油（オリーブオイルのような）、注射可能な有機エステル類（例えば、オレイン酸エチル）を含む。
医薬組成物は経口投与用に製剤化される。経口投与用の固体剤形は、例えば、錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル、および顆粒を含んでいてもよい。該固体剤形では、組成物は、クエン酸ナトリウムおよび／もしくはリン酸二カルシウムのような少なくとも１つの薬学的に許容される担体ならびに／またはデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸のような充填剤もしくは延長剤；カルボキシルメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシアのような結合剤；グリセリンのような保湿剤；寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ケイ酸塩、および炭酸ナトリウムのような崩壊剤；アセチルアルコール、グリセリンモノステアレートのような湿潤剤；カオリンおよびベントナイト粘土のような吸収剤（ａｂｓｏｒｂａｎｔｓ）；ならびに／またはタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングルコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物のような潤滑剤を含んでいてもよい。経口投与用の液体剤形は、例えば、薬学的に許容される乳濁液、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルを含んでいてもよい。液体剤は、水もしくは他の溶剤のような不活性希釈液、可溶化剤ならびに／またはエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、オイル（例えば、綿実油、トウモロコシ油、胚芽油、ひまし油、オリーブオイル、ゴマ油のような）、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルならびにそれらの混合物のような乳濁液を含んでいてもよい。
医薬組成物は、その送達を増強する浸透増強剤を含んでいてもよい。浸透増強剤は、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレイン酸、ジカプリン酸（ｄｉｃａｐｒａｔｅ）、レクリネート（ｒｅｃｌｉｎｅａｔｅ）、モノオレイン、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル１－モノカプレート、モノおよびジ－グリセリドのような脂肪酸ならびにそれらの生理的に許容される塩を含んでいてもよい。組成物は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチル酸塩、ホモバニリン酸塩）のようなキレート剤をさらに含んでいてもよい。
医薬組成物は、本明細書で開示される発現ベクターのいずれかをカプセル化形態で含んでもよい。例えば、発現ベクターは、ポリラクチド－ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（無水物）のような、１種またはそれ以上の生分解性ポリマーを含むナノカプセルのようなナノカプセルの中に封入される。いくつかの実施形態では、ベクターは、ポリマー性ナノカプセル内に封入される。他の実施形態では、ベクターは、生分解性および／または崩壊性のポリマー性ナノカプセル内に封入される。いくつかの実施形態では、ポリマー性ナノカプセルは、正に荷電された２種類の異なるモノマーと、少なくとも１種の中性のモノマーと、架橋剤とで構成される。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、少なくとも１つのターゲッティング部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、２つ～６つの間の標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は、抗体である。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＣＤ１１７、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３５、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ９６、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、およびＣＤ９マーカーのいずれか１つを標的にする。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ４９ａ－ｆ、ＣＤ５１、ＣＤ７３（ＳＨ３）、ＣＤ１０５（ＳＨ２）、ＣＤ１０６、ＣＤ１６６、およびＳｔｒｏ－１マーカーを含む、ヒト間葉系幹細胞ＣＤマーカーのいずれか１つを標的にする。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９０、およびＣＤ４９を含むヒト造血幹細胞ＣＤマーカーのいずれか１つを標的にする。
他の実施形態では、発現ベクターは、リポソーム中に封入してもよく、またはマイクロエマルジョン内に分散させてもよい。リポソームは、例えば、リポフェクチンまたはリポフェクタミンでもよい。別の例では、組成物は、無核細菌ミニ細胞中にまたはこの上に本明細書で開示される発現ベクターを含んでいてもよい（Ｇｉａｃａｌｏｎｅら、Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００６年、８（１０）：１６２４～３３頁）。本明細書で開示される発現ベクターはナノ粒子と組み合わせてもよい。
キット
いくつかの実施形態には、本明細書に記載される発現ベクターを含むキットまたは発現ベクターを含む組成物がある。キットは容器を含んでいてよく、容器は、発現ベクターまたは組成物を経口または非経口剤形で含むビンでもよく、それぞれの剤形は単位用量の発現ベクターを含む。キットは、本明細書に記載される方法に従った対象の処置を指示するラベルまたは同類のものを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、キットは追加の活性剤を含んでいてもよい。追加の活性剤を、ベクターまたはベクターを含む組成物を収納する容器から離れている容器に収納してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、プリン類似体（例えば、６ＴＧ）の１つまたはそれ以上の用量、ならびに、場合により、前処置および／またはケモセレクションのためにプリン類似体を投与するための説明書を含んでいてもよい（それらの工程は本明細書にさらに記載されている）。他の実施形態では、キットは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、ＭＴＸまたはＭＰＡ）の１つまたはそれ以上の用量と、場合により、本明細書に記載されるような負の選択のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を投薬するための取扱説明書とを含み得る。
治療方法
例として、ＷＡＳ遺伝子をコードする核酸配列を含む発現ベクターは、ウィスコット・アルドリッチ症候群を遺伝子学的に修正するため、またはウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する病理を軽減するために投与される。いくつかの実施形態では、ＷＡＳ遺伝子をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質導入された宿主細胞の集団は、ウィスコット・アルドリッチ症候群を修正するため、またはウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する病理を軽減するために投与される。この方法は、全ての患者、特に適合する同胞ドナーを有さない患者に対するその可用性により、現在利用可能な療法に勝っていると考えられる。さらに、この方法は、生涯にわたる修正を提供する一回治療として投与される可能性も有すると考えられる。また、方法は、有利なことに、いかなる免疫副作用もなく、副作用が生じた場合、副作用は、本明細書において述べられるようなジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、ＭＴＸまたはＭＰＡ）を投与することによって緩和することができるとも考えられる。さらに、効果的な遺伝子治療手法は、ウィスコット・アルドリッチ症候群を治療する方法を変革し、最終的に患者の転帰を向上させるであろうと考えられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のベクターまたは形質導入された宿主細胞による治療は、下記において概説されるようなウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する病理の１つまたはそれ以上を遺伝子学的に修正するかまたは軽減する。いくつかの実施形態では、患者に発現ベクターまたは形質導入された宿主細胞を投与することによって遺伝子学的に修正されるまたは軽減される病理としては、これらに限定されないが、微小血小板減少症（ｍｉｃｒｏｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、湿疹、自己免疫疾患、および回帰感染が挙げられる。湿疹皮疹は、従来的なＷＡＳを有する患者において一般的である。乳幼児において、湿疹は、顔または頭皮に生じ得るか、または「乳痂」に酷似し得る。それは、重度のおむつ皮膚炎の外観も有し得るか、または腕および足を含めて、より全般化し得る。年長の少年では、湿疹は、多くの場合、肘の前部または膝の裏側の周り、耳の裏側、または手首の周りの皮膚の皺に限定される。湿疹は、非常にかゆいため、患者は、多くの場合、眠っている間でさえ、出血するまで掻く。次いで、皮膚のバリアが破壊されたこれらの領域は、細菌が入り込む位置としての役割を果たし、皮膚および血流感染症を引き起こし得る。
血小板減少症（血小板の数の減少）は、ウィスコット・アルドリッチ症候群を有する患者の一般的な特徴であると考えられる。数が減少することに加えて、血小板それ自体が、小さく、ならびに機能不全となり、正常な血漿倍のサイズの半分未満となる。その結果、ウィスコット・アルドリッチ症候群を患う患者は、たとえ外傷がなくても、容易に出血し得る。いくつかの実施形態では、皮膚内への出血は、点状出血と呼ばれるピン先ほどのサイズの青みがかった赤斑を生じ得るか、または、それらは、より大きな打撲傷に似ている場合もある。
ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する免疫不全は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の両方の機能を著しく異常にすると考えられる。その結果、感染症は、ウィスコット・アルドリッチ症候群の従来的な形態において一般的であり、ならびに微生物の全てのクラスに関与し得る。いくつかの実施形態では、これらの感染症は、耳の感染症、副鼻腔感染、および肺炎のような上部および下部呼吸器感染症を含み得る。敗血症（血流感染または「血液中毒（ｂｌｏｏｄ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ）」）、髄膜炎、および重症のウイルス感染症のようなより重症の感染症は、それほど頻繁ではないが生じる場合がある。時折、従来的な形態のウィスコット・アルドリッチ症候群を患う患者は、かび（ニューモシスチス・ジロベシ（ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉ）カリニ（ｃａｒｉｎｉｉ））によって引き起こされる肺炎を発症し得る。いくつかの実施形態では、皮膚は、患者が自身の湿疹を掻いた領域においてブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のような細菌に感染するようになり得る。いくつかの実施形態では、伝染性軟属腫と呼ばれるウイルス性皮膚感染症も、ウィスコット・アルドリッチ症候群において一般的に見られる。感染を予防するワクチンは、多くの場合、ウィスコット・アルドリッチ症候群において効果がないと考えられるが、それは、患者が、ワクチンに対して正常な保護的抗体反応を示さないためである。
いくつかの実施形態では、回帰感染としては、これらに限定されないが、中耳炎、皮膚膿瘍、肺炎、腸炎、髄膜炎、敗血症、および尿路感染症が挙げられる。いくつかの実施形態では、回帰感染は、皮膚感染である。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群と診断された患者が経験する湿疹は、治療抵抗性湿疹として分類される。
例として、ウィスコット・アルドリッチ症候群を患う患者がしばしば経験する自己免疫疾患としては、溶血性貧血、血管炎、関節炎、好中球減少症、炎症性腸疾患、およびＩｇＡ腎症、ヘノッホ・シェーンライン様紫斑病、皮膚筋炎、再発性血管性浮腫、およびぶどう膜炎が挙げられる。いくつかの実施形態では、回帰感染は、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染のいずれかによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、本明細書において記載したベクターまたは形質導入された宿主細胞による治療は、下記において概説されるようなウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する複数の病理を遺伝子学的に修正するかまたは軽減する。
本明細書において述べられるように、治療遺伝子に加えて、本開示の発現ベクターは、ノックダウンするように設計された原因物質（例えば、ＨＰＲＴ発現のノックダウンを行うためにＨＰＲＴに対してｓｈＲＮＡ）を含み、したがって、プリン類似体、例えば、６ＴＧを骨髄毒剤へと代謝する際にＨＰＲＴが果たす本質的役割を利用する、インビボケモセレクション戦略を提供する。ＨＰＲＴ欠損は、造血細胞の発達または機能を損なわないため、移植のために使用される造血細胞から除去することができる。プリン類似体による前処置およびケモセレクションについて、本明細書においてさらに記載される。
ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する病理の治療または緩和との関連において、図１１を参照して、対象の治療は、その治療を必要とする対象を特定することと；本開示の発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）によってＨＳＣ（例えば、自己ＨＳＣ、同種異系ＨＳＣ、同胞交配ＨＳＣ）に形質導入すること（工程１２０）と；形質導入されたＨＳＣを対象に移植または投与すること（工程１４０）とを含む。いくつかの実施形態では、その治療を必要とする対象は、ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する病理を患う対象である。
いくつかの実施形態では、異常ヘモグロビン症を治療する方法は、（ｉ）少なくとも２つの核酸配列、すなわち、ＨＰＲＴ遺伝子をノックダウンするためのｓｈＲＮＡをコードする核酸配列と、ＷＡＳＰをコードする核酸配列とを含むベクターによってＨＳＣに形質導入することと、（ｉｉ）形質導入されたＨＳＣを哺乳動物対象（例えば、ヒト患者）に投与することとを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、形質導入されたＨＳＣの投与の前に、骨髄破壊的前処置の工程を含む（例えば、プリン類似体、化学療法、放射線療法、１つまたはそれ以上の内部移行免疫毒素または抗体－薬物コンジュゲートによる治療、あるいはそれらの任意の組合せを使用する）。いくつかの実施形態では、方法はさらに、形質導入されたＨＳＣの投与の後に、プリン類似体（例えば、６ＴＧ）を利用したｉｎ ｖｉｖｏケモセレクションの工程を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、万一副作用（例えば、ＧｖＨＤ）が起きた場合には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、ＭＴＸまたはＭＰＡ）を利用した負の選択の工程を含む。
本開示の別の態様では、ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する１つまたはそれ以上の病理を軽減する方法であって、医薬組成物の有効量を哺乳動物対象（例えば、ヒト患者）に投与することを含み、医薬組成物が、少なくとも２つの核酸配列と薬学的に許容される担体とを含む発現ベクターを含む、方法である。本開示の別の態様では、ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する病理を軽減する方法であって、医薬組成物の有効量を哺乳動物対象（例えば、ヒト患者）に投与することを含み、医薬組成物が、少なくとも２つの核酸配列と薬学的に許容される担体とを含む発現ベクターによって形質導入された宿主細胞の集団を含む、方法である。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＨＰＲＴ遺伝子をノックダウンするためのＲＮＡｉをコードする第１の核酸と；ＷＡＳＰをコードする第２の核酸とを含むレンチウイルス発現ベクターである。いくつかの実施形態では、方法はさらに、形質導入されたＨＳＣの投与の前の骨髄破壊的前処置の工程を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、形質導入されたＨＳＣの投与後の６ＴＧを利用したｉｎ ｖｉｖｏケモセレクションの工程を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、万一副作用（例えば、ＧｖＨＤ）起きた場合には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、ＭＴＸまたはＭＰＡ）を利用した負の選択の工程を含む。
プリン類似体による前処置およびケモセレクション
いくつかの実施形態では、治療の方法は、（ｉ）ＨＳＣ移植の前の前処置；および／または（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｖｏケモセレクション、の追加の工程を含む。一方または両方の工程は、プリン類似体を利用し得る。いくつかの実施形態では、プリン類似体は、６ＴＧである。ＨＰＲＴ活性における移植されたウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質を含有するＨＳＣ欠損は、導入されたプリン類似体の細胞傷害性効果に対して高耐性であると考えられる。前処置およびケモセレクションの組合せ戦略により、全体的に低い毒性のＨＰＲＴ欠損ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質含有ＨＳＣの効率的で高い生着を達成することができる。遺伝子改変ＨＳＣの増強された生着およびケモセレクションと組み合わされた、結果としてのウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質の発現は、結果として、ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する病理を軽減するのに十分なタンパク質産生をもたらすことができると考えられる。
６ＴＧは、抗がん性および免疫抑制活性の両方を有するプリン類似体である。チオグアニンは、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴａｓｅ）に対してヒポキサンチンおよびグアニンと競合し、それ自体、６－チオグアニル酸（ＴＧＭＰ）へと変換される。このヌクレオチドは、治療用量にて高い細胞内濃度に達する。ＴＧＭＰは、グアニンヌクレオチドの合成により、いくつかの点を遮断する。それは、グルタミン－５－ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ（プリンリボヌクレオチドのための新規の経路に対して独特な第１の酵素）の擬フィードバック阻害によって新規プリン生合成を阻害する。ＴＧＭＰは、酵素ＩＭＰデヒドロゲナーゼに対する競合によってキサンチル酸（ＸＭＰ）へのイノシン酸（ＩＭＰ）の変換も阻害する。かつて、ＴＧＭＰは、ＡＴＰ：ＧＭＰリン酸転移酵素（グアニル酸キナーゼ）の重要な阻害剤であると感じられていたが、最近の結果は、そうではないことを示した。チオグアニル酸はさらに、グアニンヌクレオチドを代謝する同じ酵素によって、ジホスフェートおよびトリホスフェート、チオグアノシン二リン酸（ＴＧＤＰ）およびチオグアノシン三リン酸（ＴＧＴＰ）（ならびに、それらの２’－デオキシリボシル類似体）へ変換される。
当業者であれば理解するであろうように、ＨＰＲＴ発現を減らすように設計された薬剤、例えば、ＨＰＲＴをノックダウンするためのＲＮＡｉ薬剤を本開示のベクターに含ませることを考慮して、結果として得られる形質導入されたＨＳＣは、ＨＰＲＴ欠損または実質的にＨＰＲＴ欠損である（例えば、２０％もしくはそれよりも少ない残りのＨＰＲＴ遺伝子発現を有するもの）。そのため、ＨＰＲＴを発現するこれらのＨＳＣ、すなわち、ＨＰＲＴ野生型細胞、は、６ＴＧの１つまたはそれ以上の用量を投与することによって選択的に枯渇される。いくつかの実施形態では、６ＴＧが、ＨＰＲＴ野生型タイプのレシピエントの骨髄破壊的前処置と、ドナー細胞のｉｎ ｖｉｖｏケモセレクション方法の両方のために投与される。したがって、この戦略は、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子改変細胞の選択、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏでのウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質含有遺伝子改変細胞の選択を可能にすると考えられる。
再び図１１を参照すると、いくつかの実施形態では、ドナーからのＨＳＣの収集（工程１１０）に続いて、ＨＳＣは、本開示によるベクターによって形質導入される（工程１２０）。結果として得られるＨＳＣは、ＨＰＲＴ欠損であり、ＷＡＳ遺伝子を発現する。並行して、ＨＳＣを受ける患者は、最初に、骨髄破壊的前処置工程で処理される（工程１３０）。前処置に続いて、形質導入されたＨＳＣが、患者に移植されるかまたは投与される（工程１４０）。次いで、本明細書において記載されるように、６ＴＧを使用してｉｎ ｖｉｖｏのために、ＨＳＣを含有するＷＡＳ遺伝子が選択される（工程１５０）。
骨髄破壊的前処置は、高用量前処置放射線照射、化学療法、および／またはプリン類似体（例えば、６ＴＧ）による処理を使用して達成され得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、前処置レジメンによる処理の後、約２４～約９６時間の間に投与される。他の実施形態では、患者は、前処置レジメンによる処理の後、約２４～約７２時間の間にＨＳＣ移植によって治療される。さらなる他の実施形態では、患者は、前処置レジメンによる処理の後、約２４～約４８時間の間にＨＳＣ移植によって治療される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ移植は、約２×１０６細胞／ｋｇ～約１５×１０６細胞／ｋｇ（患者の体重）の間を含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ移植は、６×１０６細胞／ｋｇ超の標的として、最低限の２×１０６細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与された細胞の少なくとも１０％が、本明細書に記載されるようなレンチウイルスベクターによって形質導入される。いくつかの実施形態では、投与された細胞の少なくとも２０％が、本明細書に記載されるようなレンチウイルスベクターによって形質導入される。いくつかの実施形態では、投与された細胞の少なくとも３０％が、本明細書に記載されるようなレンチウイルスベクターによって形質導入される。いくつかの実施形態では、投与された細胞の少なくとも４０％が、本明細書に記載されるようなレンチウイルスベクターによって形質導入される。いくつかの実施形態では、投与された細胞の少なくとも５０％が、本明細書に記載されるようなレンチウイルスベクターによって形質導入される。
いくつかの実施形態では、治療遺伝子を含むＨＰＲＴ欠損ＨＳＣは、過剰な造血組織に対して最小限の有害作用を有すると考えられる６ＴＨの低用量スケジュールを使用してｉｎ ｖｉｖｏのために選択される。いくつかの実施形態では、患者へのＨＳＢの導入後、約０．２ｍｇ／ｋｇ／日～約０．６ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の、ｉｎ ｖｉｖｏケモセレクションのための６ＴＧの投与量が患者に提供される。いくつかの実施形態では、投与量は、約０．３ｍｇ／ｋｇ／日～約１ｍｇ／ｋｇ／日の間の範囲である。いくつかの実施形態では、投与量は、最大約２ｍｇ／ｋｇ／日までである。
いくつかの実施形態では、用量あたりの投与される６ＴＧの量は、患者のＨＰＲＴ酵素活性の特定に基づく。より高いレベルのＨＰＲＴ酵素活性を示す場合には、より低い量の６ＴＧを有する用量を提供してもよいことを、当業者は理解するであろう。ＨＰＲＴのレベルが高い程、毒性代謝物への６ＴＧの変換も大きくなる。したがって、同じ目標を達成するために、より少ない用量を投与する必要があるであろう。
６ＴＧ前処置を行う前のＴＰＭＴ遺伝子型および／またはＴＰＭＴ酵素活性の測定は、ＴＰＭＴ酵素活性が低いかまたは欠く個体を識別し得る。そのため、他の実施形態では、投与される６ＴＧの量は、Ｓ－メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）レベルまたはＴＰＭＴ遺伝子型に基づく。
いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏケモセレクションのための６ＴＧの投与量が、（ｉ）毎週；（ｉｉ）隔週；（ｉｉｉ）：１週間の治療後に２週間、３週間、または４週間空ける；（ｉｖ）２週間の治療後に１週間、２週間、３週間、または４週間空ける；（ｖ）３週間の治療後に１週間、２週間、３週間、４週間、または５週間空ける；（ｖｉ）４週間の治療後に１週間、２週間、３週間、４週間、または５週間空ける；（ｖｉｉ）５週間の治療後に１週間、２週間、３週間、４週間、または５週間空ける；（ｖｉｉｉ）毎月、からなる群から選択されるサイクルのスケジュールにおいて１週間に１回～３回、患者に投与される。
いくつかの実施形態では、１週間～約４週間の投与期間にわたって、約３～約１０回の間の投与量の６ＴＧが患者に投与される。いくつかの実施形態では、１４日間にわたって、４または５回の投与量の６ＴＧが患者に投与される。
ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤による負の選択
さらに、プリン新規合成経路において酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を阻害するためにジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、ＭＴＸ）を使用することにより、ＨＰＲＴ欠損細胞を負の選択をすることができる。これは、予期しない有害作用が観察された場合に遺伝子改変ＨＳＣを排除するための安全な手順として開発された。そのため、図１１を参照すると、万一何か有害な副作用が起きた場合には、患者は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、ＭＴＸまたはＭＰＡ）で治療される（工程１６０）。有害な副作用としては、例えば、細胞の特定のクローンまたはサイトカイン急増において挿入変異を示す異常な血球数／クローン増殖が挙げられる。
ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、ＭＴＸまたはＭＰＡ）は、テトラヒドロ葉酸塩（ＴＨＦ）合成に参加する酵素であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を競合的に阻害すると考えられる。ＤＨＦＲは、テトラヒドロ葉酸を活性化するためにジヒドロ葉酸の変換を触媒する。葉酸は、ＤＮＡ合成に必要なヌクレオシドチミジンの新規合成に必要とされる。その上、葉酸塩はプリンおよびピリミジン塩基生合成にとって不可欠なので、合成は阻害されることになる。したがって、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、ＭＴＸまたはＭＰＡ）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、チミジル酸、およびタンパク質の合成を阻害する。ＭＴＸまたはＭＰＡは、ＤＨＦＲを阻害することによって新規の経路を遮断する。ＨＰＲＴ－／－細胞では、サルベージも新規の経路も機能的ではなく、プリン合成をもたらさず、したがって、細胞は死滅する。しかし、ＨＰＲＴ野生型細胞は、機能的なサルベージ経路を持ち、そのプリン合成が行われ、細胞は生存する。
本開示に従って産生された改変ＨＳＣの感度を考慮して、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、ＭＴＸまたはＭＰＡ）は、ＨＰＲＴ欠損細胞を選択的に排除するために使用される。いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、ＭＴＸまたはＭＰＡ）は、１回用量として投与される。いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の複数回用量が投与される。
いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／輸注～約１００ｍｇ／ｍ２／輸注の範囲である。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／輸注～約９０ｍｇ／ｍ２／輸注の範囲である。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／輸注～約８０ｍｇ／ｍ２／輸注の範囲である。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／輸注～約７０ｍｇ／ｍ２／輸注の範囲である。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／輸注～約６０ｍｇ／ｍ２／輸注の範囲である。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／輸注～約５０ｍｇ／ｍ２／輸注の範囲である。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／輸注～約４０ｍｇ／ｍ２／輸注の範囲である。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／輸注～約３０ｍｇ／ｍ２／輸注の範囲である。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／輸注～約２０ｍｇ／ｍ２／輸注の範囲である。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／輸注～約１０ｍｇ／ｍ２／輸注の範囲である。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／輸注～約８ｍｇ／ｍ２／輸注の範囲である。他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２．５ｍｇ／ｍ２／輸注～約７．５ｍｇ／ｍ２／輸注の範囲である。さらなる他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約５ｍｇ／ｍ２／輸注である。さらなる別の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約７．５ｍｇ／ｍ２／輸注である。
いくつかの実施形態では、２～６回の間の輸注が行われ、輸注はそれぞれが同じ投与量または異なる投与量（例えば、漸増投与量、徐々に漸減投与量など）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、投与は１週間単位で、または２か月単位で行ってもよい。
いくつかの実施形態では、ＭＰＡは、１日あたり約５００ｍｇ～約１５００ｍｇの間の量において投与される。いくつかの実施形態では、ＭＰＡの用量は、単回ボーラスにおいて投与される。いくつかの実施形態では、ＭＰＡの用量は、合計して１日あたり約５００ｍｇから約１５００ｍｇの間となる、複数の個別の用量に分割される。
いくつかの実施形態では、ＭＴＸまたはＭＰＡの類似体または誘導体をＭＴＸまたはＭＰＡの代わりに使用してもよい。ＭＴＸの誘導体は、米国特許出願第５，９５８，９２８号および国際公開第２００７／０９８０８９号に記載されており、前記特許文献の開示は、これにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。いくつかの実施形態では、リババリン（ｒｉｂａｖａｒｉｎ）（ＩＭＰＤＨ阻害剤）；ＶＸ－４９７（ＩＭＰＤＨ阻害剤）（Ｊａｉｎ Ｊ、ＶＸ－４９７：ａ ｎｏｖｅｌ、ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＩＭＰＤＨ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｇｅｎｔ、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２００１年５月；９０（５）：６２５～３７頁参照）；ロメテレキソール（ＤＤＡＴＨＦ、ＬＹ２４９５４３）（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）；チオフェン類似体（ＬＹ２５４１５５）（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）、フラン類似体（ＬＹ２２２３０６）（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）（Ｈａｂｅｃｋら、Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｇｌｕｔａｍａｔｅｄ Ａｎｔｉｆｏｌａｔｅｓ Ｅｘｈｉｂｉｔｓ Ｔｉｇｈｔ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｅ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５４、１０２１～２０２６頁、１９９４年２月参照）；ＤＡＣＴＨＦ（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）（Ｃｈｅｎｇら、Ｄｅｓｉｇｎ、ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ １０－ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ－ＤＤＡＣＴＨＦ、１０－ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ－５－ＤＡＣＴＨＦ、ａｎｄ １０－ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ－ＤＤＡＣＴＨＦ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅ ｎｏｖｏ ｐｕｒｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ；Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００５年５月１６日；１３（１０）：３５７７～８５頁参照）；ＡＧ２０３４（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）（Ｂｏｒｉｔｚｋｉら、ＡＧ２０３４：ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ．１９９６年；１４（３）：２９５～３０３頁参照）；ＬＹ３０９８８７（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）（（２Ｓ）－２－［［５－［２－［（６Ｒ）－２－アミノ－４－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロ－１Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－６－イル］エチル］チオフェン－２－カルボニル］アミノ］ペンタン二酸）；アルムタ（ＬＹ２３１５１４）（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）（Ｓｈｉｈら、ＬＹ２３１５１４、ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｎｔｉｆｏｌａｔｅ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｏｌａｔｅ－ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９７年３月１５日；５７（６）：１１１６～２３頁参照）；ｄｍＡＭＴ（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）、ＡＧ２００９（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）；フォロデシン（Ｉｍｍｕｃｉｌｌｉｎ Ｈ、ＢＣＸ－１７７７；ｔｒａｄｅ ｎａｍｅｓ Ｍｕｎｄｅｓｉｎｅ ａｎｄ Ｆｏｄｏｓｉｎｅ）（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ［ＰＮＰ］の阻害剤）（Ｋｉｃｓｋａら、Ｉｍｍｕｃｉｌｌｉｎ Ｈ、ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ－ｓｔａｔｅ ａｎａｌｏｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ、ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＰＮＡＳ ２００１年４月１０日．９８（８）４５９３～４５９８頁参照）；およびイムシリン－Ｇ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ［ＰＮＰ］の阻害剤）を含むがこれらに限定されない代替薬剤をＭＴＸまたはＭＰＡの代わりに使用してもよい。
併用療法
本開示の別の態様には、例えば、ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する病理を軽減するために、その治療を必要とする患者に形質導入されたＨＳＣ（上記にて記載した）の投与または移植の前、その間、その後に、抗細菌性、抗真菌性、および／または抗ウイルス性医薬品有効成分（当然のことながら、提示される特定の感染症に応じて）が投与される、併用療法がある。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群を患い、重度の血小板減少症を有する患者は、その治療を必要とする患者に形質導入されたＨＳＣ（上記にて記載した）の投与または移植の前、その間、その後に、高用量の静脈免疫グロブリン（２ｍｇ／ｋｇ／日）および／またはコルチコステロイド（２ｍｇ／ｋｇ／日）によって治療される。あるいは、健常ドナーからの幹細胞の同種移植が、本開示の発現ベクターまたは形質導入された幹細胞による治療の前または後に投与される。
中間体ベクターの産生－４００ｂｐインスレーターを含むｐＴＬ２０ｃベクター
Figure 2022514955000011
３．２ｋｂ ｈＷＡＳＷＴカセット（配列番号５８）をｐＴＬ２０ｃベクターのＢｓｔＢＩおよびＮｏｔＩ部位に挿入することによって、「Ｉｎｔ １」ベクター（表１０）を生成した。３．２ｋｂを合成し、（以下の順において）：１）フォワード方向における７ＳＫプロモーターおよびショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）７３４発現カセット（配列番号１４）と；２）ＭＮＤプロモーター、ｈＷＡＳＷＴ ｃＤＮＡ（配列番号１）、およびＷＰＲＥエレメント（配列番号１３）からなるＷＡＳ発現カセットと：３）フォワード方向における７ＳＫプロモーターおよびショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）７３４発現カセット（配列番号１４）とを含む。ＷＡＳＷＴ ｃＤＮＡは、２つの内部ＳｆｉＩ部位を除去するために２つのサイレント変異を含む。
３．２ｋｂ ｈＷＡＳＣＯカセット（配列番号５９）をｐＴＬ２０ｃベクターのＢｓｔＢＩおよびＮｏｔＩ部位に挿入することによって、「Ｉｎｔ ２」ベクター（表１０）を生成した。３．２ｋｂを合成し、（以下の順において）：１）リバース方向における７ＳＫプロモーターおよびショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）７３４発現カセット（配列番号１４）と；２）ＭＮＤプロモーター、ｈＷＡＳＣＯ ｃＤＮＡ（配列番号４）、およびＷＰＲＥエレメント（配列番号１３）からなるＷＡＳ発現カセットと：３）リバース方向における７ＳＫプロモーターおよびショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）７３４発現カセット（配列番号１４）とを含む。ｈＷＡＳＣＯ ｃＤＮＡをコドン最適化した。
ｈＷＡＳＷＴ ｃＤＮＡをｐＴＬ２０ｃ＿ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４＿ＭＮＤ＿ｈＷＡＳＣＯ＿ＷＰＲＥ＿ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４＿Ｉｎｓ４００ベクター（配列番号６４）のＡｓｃＩ／ＳｐｅＩ部位に挿入し、ｈＷＡＳＣＯ ｃＤＮＡと置き換えることによって、リバース方向の２つのｓｈＲＮＡ発現カセットを含む「Ｉｎｔ ３」ベクター（表１０）を生成した。
ｈＷＡＳＣＯ ｃＤＮＡをｐＴＬ２０ｃ＿７ＳＫ／ｓｈ７３４＿ＭＮＤ＿ｈＷＡＳＷＴ＿ＷＰＲＥ＿７ＳＫ／ｓｈ７３４＿Ｉｎｓ４００ベクター（配列番号６３）のＡｓｃＩ／ＳｐｅＩ部位に挿入し、ｈＷＡＳＷＴ ｃＤＮＡと置き換えることによって、フォワード方向の２つのｓｈＲＮＡ発現カセットを含む「Ｉｎｔ ４」ベクター（表１０）を生成した。
ベクターの産生－４００ｂｐインスレーターを含むｐＴＬ２０ｃベクター
鶏肉薬物アレルギー部位４インスレーター（ｃＨＳ４）の４００ｂｐ拡張コアエレメントを含むベクター候補を、表１１に詳しく説明されるように調製した。
Figure 2022514955000012
ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）７３４配列のうちの１つを除去することによって、中間体コンストラクト（表１０）から候補ベクターを調製した。
ＡｇｅＩ消化とその後の再連結（ｒｅ－ｌｉｇａｔｉｏｎ）により、「Ｉｎｔ １」ベクターから、ｈＷＡＳ発現カセットの下流に位置された第２の７ＳＫ／ｓｈ７３４ ｓｈＲＮＡ発現カセットを除去することによって、ｐＴＬ２０ｃ－７ＳＫ／ｓｈ７３４－ＭＮＤ／ｈＷＡＳＷＴベクター（配列番号４２）を作製した。
ＭｌｕＩ消化とその後の再連結により、「Ｉｎｔ １」ベクターから、ｈＷＡＳ発現カセットの上流に位置された第２の７ＳＫ／ｓｈ７３４ ｓｈＲＮＡ発現カセットを除去することによって、ｐＴＬ２０ｃ－ＭＮＤ／ｈＷＡＳＷＴ－７ＳＫ／ｓｈ７３４ベクター（配列番号４３）を作製した。
ＡｇｅＩ消化とその後の再連結により、「Ｉｎｔ ３」ベクターから、ｈＷＡＳ発現カセットの下流に位置された第２のｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４ ｓｈＲＮＡ発現カセットを除去することによって、ｐＴＬ２０ｃ－ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４－ＭＮＤ／ｈＷＡＳＷＴベクター（配列番号４４）を作製した。
ＭｌｕＩ消化とその後の再連結により、「Ｉｎｔ ３」ベクターから、ｈＷＡＳ発現カセットの上流に位置された第２のｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４ ｓｈＲＮＡ発現カセットを除去することによって、ｐＴＬ２０ｃ－ＭＮＤ／ｈＷＡＳｗｔ－ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４ベクター（配列番号４５）を作製した。
ＡｇｅＩ消化とその後の再連結により、「Ｉｎｔ ４」ベクターから、ｈＷＡＳ発現カセットの下流に位置された第２の７ＳＫ／ｓｈ７３４ ｓｈＲＮＡ発現カセットを除去することによって、ｐＴＬ２０ｃ－ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４－ＭＮＤ／ｈＷＡＳＣＯベクター（配列番号４６）を作製した。
ＭｌｕＩ消化とその後の再連結により、「Ｉｎｔ ４」ベクターから、ｈＷＡＳ発現カセットの上流に位置されたｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４ ｓｈＲＮＡ発現カセットを除去することによって、ｐＴＬ２０ｃ－ＭＮＤ／ｈＷＡＳＣＯ－ｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４ベクター（配列番号４７）を作製した。
ＡｇｅＩ消化とその後の再連結により、「Ｉｎｔ ２」ベクターから、ｈＷＡＳ発現カセットの下流に位置された第２のｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４ ｓｈＲＮＡ発現カセットを除去することによって、ｐＴＬ２０ｃ－７ＳＫ／ｓｈ７３４－ＭＮＤ／ｈＷＡＳＣＯベクター（配列番号４６）を作製した。
ＭｌｕＩ消化とその後の再連結により、「Ｉｎｔ ２」ベクターから、ｈＷＡＳ発現カセットの上流に位置された第２のｒ７ＳＫ／ｓｈ７３４ ｓｈＲＮＡ発現カセットを除去することによって、ｐＴＬ２０ｃ－ＭＮＤ／ｈＷＡＳＣＯ－７ＳＫ／ｓｈ７３４ベクター（配列番号４９）を作製した。
ベクターの産生－６５０ｂｐインスレーターを含むｐＴＬ２０ｃベクター
鶏肉薬物アレルギー部位４インスレーター（ｃＨＳ４）の６５０ｂｐ拡張コアエレメントを含む候補ベクターを、以下のプロトコルに従って調製した。
Figure 2022514955000013
方法
鶏肉薬物アレルギー部位４インスレーター（ｃＨＳ４）配列の６５０ｂｐ拡張コアエレメントを含むｐＴＬ２０ｃベクターコンストラクト（表１２：候補番号９～１６）を作製した。６５０ｂｐ ｃＨＳ４配列を、ウイルス転写産物に対してリバース方向において３’ＬＴＲに挿入した。これらのベクターを、先述のベクター表１１：候補番号１～８から４００ｂｐインスレーターを交換することによって調製した。
４００ｂｐ ｃＨＳ４インスレーター配列を除去するために、表１１の候補番号１～８に記載されるｐＴＬ２０ｃベクターコンストラクトを、ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩ制限酵素で消化し、消化されたベクター骨格をゲル精製した。
プラスミド１１、１２、１５、および１６（表１２）を、４つの断片のギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）によって構築した。ＮｏｔＩ／ＮｈｅＩ消化ベクター骨格に隣接して、各アセンブリ反応は、６５０ ｂｐ ｃＨＳ４配列のＰＣＲ産生および２つのＩＤＴ ｇＢｌｏｃｋｓ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ｇＢｌｏｃｋｓ）を含んだ。ｇＢｌｏｃｋｓは、ｐＴＬ２０ｃコンストラクトにおいてインスレーターに隣接する配列を再導入した。インスレーターとＮｈｅＩ部位との間の配列を、各ギブソンアセンブリ反応に共通して、ｇＢｌｏｃｋ１（配列番号６０）（表１３）を使用して再導入した。ＮｏｔＩ部位とインスレーターとの間の配列を、それぞれ、下流位置の７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの有無に応じて、ｇＢｌｏｃｋ２（配列番号６１）（表１２、候補番号１１および１５）またはｇＢｌｏｃｋ３（配列番号６２）（表１２、候補番号１２および１６）を使用して再導入した。
Figure 2022514955000014
プラスミド９、１０、１３、および１４（表１２）を、従来の制限クローニングを使用して構築した。隣接領域を含む６５０ｂｐ ｃＨＳ４配列を、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩによる１５（表１２）の制限消化とその後のゲル精製によって単離した。ＮｏｔＩ／ＮｈｅＩ消化ベクター骨格によるＤＮＡ断片のライゲーションによって、最終的なプラスミドを得た。
形質導入
材料
２９３Ｔ細胞およびＬＶ－ｈＷＡＳｐ／ｓｈ７ベクター
方法
ウェルあたり２９３Ｔ細胞を、ＬＶ－ｈＷＡＳｐ／ｓｈ７ベクターと共インキュベートした。
予備スクリーニングデータ形質導入およびＷＡＳｐ発現（平均蛍光強度）
ヒトウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（ｈＷＡＳｐ）の細胞内発現を、フローサイトメトリーによって検出した。
材料
ＢＤ ５Ａ５抗ｈＷＡＳｐ（ＢＤ）Ａｂｓを、一次抗体として使用した。検出を支援するために、一次抗体に結合する二次抗体としてＡＰＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）抗体を使用した。ＢＤ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ）、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ）、およびＦｃ受容体ブロッカー（Ｉｎｎｏｖｅｘ）も使用した（表１４を参照）。
９６プレートリーダーを備えるＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーターにおいてフローサイトメトリーを行った。
Figure 2022514955000015
方法
サンプル調製
形質導入の４日後、形質導入された細胞を分析した。培地を除去し、形質導入された細胞を５００μＬのＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを捨て、２００μｌの１ｘＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを加えた。
細胞が剥がれるまで、細胞を室温でインキュベートした。細胞を１ｍＬのＤ１０培地に再懸濁させ、１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移し、続いて食卓遠心分離機において１，２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。続いて、上清をピペットで除去した。
５００μＬのＰＢＳに再懸濁させることによって細胞を洗浄し、その後、食卓遠心分離機において１，２００ｒｐｍで３分間遠心分離処理した。続いて、上清をピペットで除去した。洗浄を繰り返し、その後、細胞を２００μＬの冷ＢＤ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁させ、９６ウェルプレート（Ｖ底ウェル）に移した（対照：染色の有無において）。
ＦＣブロッキング
１００μＬの冷ＢＤ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒを各ウェルに加えた。続いて、サンプルを２，０００（８００ｘｇ）で３分間遠心分離した。プレートを軽打することによって上清を素早く除去し、プレートにペーパータオルを適用することによって残液を除去した。１滴（約５０μＬ）のＦｃ受容体ブロックを加え、続いて、マルチチャンネルピペットを使用した撹拌によって細胞を再懸濁させた。
サンプルを、４℃または氷上で３０分間インキュベートした。続いて、各ウェルに２００μＬの冷ＢＤ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒを加えることによって洗浄し、その後、２，０００（８００ｘｇ）で３分間遠心分離した。プレートを軽打することによって再び上清を素早く除去し、プレートにペーパータオルを適用することによって残液を除去した。次いで、洗浄を繰り返した。
固定化／透過化処理
１００μＬのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液を各ウェルに加え、続いて、マルチチャンネルピペットを使用した撹拌によって細胞を再懸濁させた。サンプルを、４℃または氷上で３０分間インキュベートし、光を排除した。
一次抗体のためのマスターミックスを、上記において述べたように調製した。５ｍＬの１０ｘＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液＋４５ｍＬの水を含む１ｘＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液を調製し、４℃で保存した。サンプルを、冷１ｘＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液で繰り返し洗浄した。
抗体染色
細胞を、一次抗体を含む５０μＬの１ｘＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液に再懸濁させ、その後、光を排除しながら４℃で２０分間インキュベートした。サンプルを、２，０００ｒｐｍ（８００ｘｇ）で３分間、１ｘＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液によって繰り返し洗浄し、その後、二次抗体を含む５０μＬの１ｘＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液に再懸濁させた。続いて、サンプルを、光を排除しながら４℃で２０分間インキュベートし、その後、１ｘＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液によって繰り返し洗浄した。最後に、サンプルをＢＤ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、その後、分析のために２００μＬのＢＤ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁させた。
フローサイトメトリー
９６プレートリーダーが取り付けられたＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーターにおいてフローサイトメトリーを行った（図１５～１７を参照）。染色した２９３Ｔ細胞を、サイズ（ＳＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ａ）およびシングレット（ＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣ－Ａ）に対してゲートした。ＡＰＣ＋細胞の周りのゲートを図で表した。陰性対照ゲーティングは、（模擬、試験したウイルスを伴わない、ｈＷＡＳｐ染色）：０．５％以下であった。
表１５に述べられるように、候補３、４、５、および６を、さらなるスクリーニングへと進めた。
Figure 2022514955000016
感染力価－ベクターコピー対ＷＡＳｐ＋
（ｉ）Ｕ５ｐｓｉ／ｈｕＲＰＰ３０ ｄｄＰＣＲによる形質導入したヒト細胞における積算したレンチウイルスベクターコピー数（ＶＣＮ）の定量化
宿主細胞ゲノムあたりの積算したレンチウイルスベクターゲノムの数を特定するためにＶＣＮアッセイを使用した。
アッセイは、Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）技術を利用し、アッセイを、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒを備えるＢｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００ ｄｄＰＣＲシステムを使用して実施した。形質導入された細胞を、ゲノムＤＮＡ抽出のために収穫した。多重形式において細胞あたりの平均ベクターコピー数を特定するために、抽出したゲノムＤＮＡをｄｄＰＣＲ ＶＣＮアッセイによって分析した。
形質導入されたヒト細胞の場合、ｄｄＰＣＲ ＶＣＮアッセイは、レンチウイルスベクター標的（Ｕ５ｐｓｉ）およびヒト内因性参照配列（ｈｕＲＰＰ３０）の絶対濃度（コピー／μＬ）を測定した。ＶＣＮは、ｈｕＲＰＰ３０に対するＵ５ｐｓｉの比率から計算され、使用した細胞タイプにおけるｈｕＲＰＰ３０の既知のコピー数に対して正規化される（図１８も参照）。
Figure 2022514955000017
（ｉｉ）ベクターコピー数（ＶＣＮ）あたりのＭＦＩ（平均蛍光強度）におけるＷＡＳｐ発現のバリエーション
親対照ベクターの０．２～９のコピーと４つの候補ベクター（ｎ＝４）を含む形質導入された２９３Ｔ細胞でのベクターコピー数あたりのＭＦＩ（平均蛍光強度）におけるＷＡＳｐ発現のばらつきを図１９に示す。
（ｉｉｉ）感染力価－４００インスレーターを含むＬＶ候補
感染力価を測定するために、希釈したＶＣＮを用いて４００インスレーターを含むレンチウイルスベクター候補の共インキュベーションによって２９３Ｔ細胞に形質導入した。結果を図２３Ａおよび２３Ｂに示す。また、６５０インスレーターを含むレンチウイルスベクター候補で形質導入した細胞について、力価レベルも測定した（図２４を参照）。
６ＴＧ選択／耐性アッセイ
ｉ）滴定６ＴＧ投与ウィンドウ
６ＴＧの様々な濃度において（０．０１～１００μＭ）、ジャーカット細胞を９６ウェルプレートにおいてインキュベートした。２日後、細胞カウンターＴＣ２０を用いて細胞の生存率を測定した。ジャーカット細胞にとって最適な６ＴＧ用量は、約５μＭであると見積もった。後続のケモセレクション実験のために、２．５μＭの６ＴＧの名目上の濃度を選出した。結果を図２０Ａに示す。
ｉｉ）６ＴＧによる形質導入されたジャーカット細胞のケモセレクション
ＭＯＩ＝０．５および３週間の培養とその後の２．５μＭの６ＴＧによる２週間の処理において、代表的なベクター候補によってジャーカット細胞に形質導入した。５週目に、細胞を６ＴＧを伴わない新鮮な培地で洗浄し、続けて培養した。ｄｄＰＣＲアッセイによってＶＣＮを分析した（実施例６に記載されるように）。６つ全ての代表的候補は、６ＴＧの処理の下、ケモセレクションを実証した。結果を図２０Ｂに示す。
Ｉｎ ｖｉｖｏマウス実験
Ｉｎ ｖｉｖｏマウス実験 ｗ／ＮＳＧおよび／またはＷＡＳｐ－／－
ｉ）マウス実験のマウス
マウス
雄および雌のＷＡＳｐ－ＫＯマウス、ＣＤ４５．２＋、５～１０週齢をレシピエントとして使用し、ＣＤ４５．１＋ＷＡＳｐ－ＫＯをドナーとして、また逆において使用した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＣＤ４５．１＋、６～１０週齢を対照として使用した。ドナーは、好ましくは、雌がよい。
全てのマウスを、無菌状態において、飼育し、取り扱い、実験を行った。
細胞調製および移植
「Ｓｉｎｇｈら．（２０１７）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ － Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌｕｍｅ ４，ｐｐ．１～１６」に記載のプロトコルに従い、ドナーマウスを犠牲にし（動物倫理ガイドラインに従って）、系統ネガティブ細胞を、Ｌｉｎｅａｇｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎキットを使用して単離した（＞９５％純度にて）。ドナー細胞を幹細胞医因子（ＳＣＦ）およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）と共に播種し、２ヒットレンチウイルスベクター形質導入を実施した。形質導入後、ウイルスを除去するために細胞を洗浄し、再懸濁させた。
レシピエントマウスに、Ｘ線照射装置を使用して放射線照射した後、放射線照射の間に４時間の間隔を空けて４５０ｃＧｙ放射線照射を２回行った（例えば、図２１を参照）。２回目の放射線照射の後、マウスに、（上記に記載したように）調製した細胞をカニューレを使用して移植した。移植後の一定の時点において（すなわち、移植の３、６、９、１２、１６週間後）、レシピエントマウスの末梢血におけるドナー細胞移植を染色特異的マーカー（ＣＤ４５．１および／またはＣＤ４５．２）を使用して分析した。分析は、抗凝血物質としてヘパリンを使用した伏在静脈の穿刺による末梢血の抜き取りを含んだ。（赤血球を除去するために）血液を溶解させ、フローサイトメトリーを行った。ドナー細胞の移植および免疫細胞系統（骨髄およびリンパ）の移植を分析した。長期間の分析の場合、マウスは、移植後、２０週間から２２週間分析される。
ｉｉ）マウス実験のヒト
マウス
ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ＩＬ－２ｒｇ（ＮＳＧ）マウスを使用した。マウスを飼育し、ＮＳＧマウスにＸ線照射装置を使用して４５０ｃＧｙの照射量にて一回照射することを除いて、上記のマウス実験においてマウスに対して記載したように前処理した。
細胞調製および移植
Ｇ－ＣＳＦ動員末梢血誘導ＣＤ３４＋細胞を購入し、保存した（－１８０℃にて）。移植の３日前、適切な数のＣＤ３４＋細胞を解凍し、細胞の数を特定した。細胞を播種し、ヒトＳＣＦ、ＴＰＯ、およびＦＬＴ３Ｌで４８時間プレコンディショニングした。プレコンディショニング後、細胞にＬＶで１６時間形質導入した。形質導入後、ウイルスを除去するために細胞を洗浄し、再懸濁させた。カニューレを使用して尾静脈から静脈内（ｉ．ｖ．）において形質導入したＣＤ３４＋細胞をマウスに移植した。レシピエントマウスの末梢血中の移植されたヒト細胞を、一定の間隔において（移植後３、６、１０、１２、および１６週間にて）分析した。１６週目にマウスを犠牲にし、ヒト細胞移植を分析するために（多重系列分析を含む）、組織を採取した。長期間の分析の場合、マウスを、移植後、２０週間から２２週間分析される。
追加の実施形態
いくつかの実施形態には、（ｉ）ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（野生型またはコドン最適化のどちらか）をコードする遺伝子を造血幹細胞（「ＨＳＣ」）に導入する成分と、（ｉｉ）ＨＳＣにおけるＨＰＲＴの発現を減少させる成分とを含む組成物がある。いくつかの実施形態では、成分（例えば、核酸配列）を、レンチウイルス発現ベクター内に含ませる。いくつかの実施形態では、レンチウイルス発現ベクターを、ＨＳＣを標的にするのに適合されたもののようなナノカプセル内に組み入れる。いくつかの実施形態では、組成物は、ＭＮＤプロモーターの制御下で、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質の発現を実現するように設計されたレンチウイルスベクターを含む。
いくつかの実施形態には、（ｉ）ＲＮＡをコードする第１の核酸配列と；（ｉｉ）ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（例えば、野生型タンパク質またはコドン最適化タンパク質）をコードする第２の核酸配列とを含む発現ベクターがある。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列は、ＨＰＲＴを標的にするスモールヘアピンリボ核酸分子（「ｓｈＲＮＡ」）をコードする。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的にするｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２３～２７のうちのいずれか１つと少なくとも８０％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２３～２７のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２３～２７のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２３～２７のいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２３～２７のいずれか１つの配列を有する。
いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号１、２、３、および４のうちのいずれか１つと少なくとも８０％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号１、２、３、および４のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号１、２、３、および４のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号１、２、３、および４のうちのいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号１、２、３、および４のうちのいずれか１つを含む配列を有する。
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列はＰｏｌ ＩＩＩプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ホモサピエンス細胞株ＨＥＫ－２９３ ７ｓｋ ＲＮＡプロモーターである（例えば、配列番号２８参照）。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、配列番号２８と比べてその核酸配列に単一の突然変異を含む７ｓｋプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、配列番号２８と比べてその核酸配列に複数の突然変異を含む７ｓｋプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、配列番号２８と比べてその核酸配列に欠失を含む７ｓｋプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、配列番号２８と比べてその核酸配列に突然変異と欠失の両方を含む７ｓｋプロモーターである。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号２８の配列と少なくとも９５％同一性を有するプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号２８の配列と少なくとも９７％同一性を有するプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号２８の配列と少なくとも９８％同一性を有するプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号２８の配列と少なくとも９９％同一性を有するプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号２８を有するプロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態には、（ｉ）ＨＰＲＴ遺伝子を標的にするマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードする核酸配列と；（ｉｉ）ＷＡＳＰをコードする核酸配列とを含むベクターがある。いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号１、２、３、および４のうちのいずれか１つを含む配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号１９、２０、２１、および２２のうちのいずれか１つと少なくとも８０％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号１９、２０、２１、および２２のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号１９、２０、２１、および２２のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号１９、２０、２１、および２２のうちのいずれか１つの配列を有する。
いくつかの実施形態には、（ａ）ＨＰＲＴを標的にするｓｈＲＮＡをコードする第１のタンパク質と；（ｂ）ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２のタンパク質とを含むポリヌクレオチド配列がある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列はさらに、（ｃ）ＨＰＲＴを標的にするｓｈＲＭＡをコードする配列の発現を駆動するための第１のプロモーターをコードする第３のタンパク質と；（ｄ）ＷＡＳＰをコードする配列の発現を駆動するための第２のプロモーターをコードする第４のタンパク質とを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列はさらに、（ｅ）中央ポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）エレメントをコードする第５のタンパク質と；（ｆ）Ｒｅｖ応答エレメント（配列番号３１）をコードする第６のタンパク質とを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列はさらに、ＷＰＲＥエレメント（例えば、配列番号４１を含むＷＰＲＥエレメント）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列はさらに、インスレーターを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターの安全性プロファイルを増強するため、および／またはトランスジェニック発現を向上させるために、１つまたはそれ以上のインスレーターが、ポリヌクレオチド配列に組み入れられる。いくつかの実施形態では、インスレーターは、クロマチンインスレーターである。いくつかの実施形態では、インスレーターは、配列番号３８、３９、および４０のいずれかを含む核酸配列を有する。
いくつかの実施形態には、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質トランス遺伝子と、ＨＰＲＴ発現を減らすように設計された薬剤（例えば、ＨＰＲＴのノックダウンのためのＲＮＡｉ）とを含む発現ベクターによって形質導入されたＨＳＣ（例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣｓ）がある。いくつかの実施形態では、形質導入されたＨＳＣは、例えば、ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する病理の治療のため、またはウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する病理を軽減するために、それを必要とする対象に投与される細胞治療製品を構成する。
いくつかの実施形態では、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列と、抗ＨＰＲＴ ｓｈＲＮＡをコードする核酸とを含む発現ベクターによって形質導入されたＨＳＣである。いくつかの実施形態では、抗ＨＰＲＴ ｓｈＲＮＡは、７ｓｋプロモーターによって駆動され、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸は、ＭＮＤプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、７ｓｋによって駆動される抗ＨＰＲＴ ｓｈＲＮＡは、上流または下流のいずれかにおいて、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質カセット（配列番号１５）に対してセンスまたはアンチセンス方向に配向される。いくつかの実施形態では、形質導入されたＨＳＣは、例えば、ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する病理を治療または軽減するために、（例えば、薬学的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物において）それを必要とする対象に投与される細胞治療製品を構成する。
いくつかの実施形態では、それを必要とする患者（例えば、ヒト患者）において、ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する病理を治療または軽減する方法であって、（ａ）レンチウイルス発現ベクターにてＨＳＣに形質導入することであって、レンチウイルス発現ベクターが、抗ＨＰＲＴ ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ内に組み込まれた抗ＨＰＲＴ ｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列；およびウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列を含む、ことと；（ｂ）患者内に形質導入されたＨＳＣを移植することとを含む方法である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、自家または異系である。
いくつかの実施形態では、患者は、形質導入されたＨＳＣ投与（６－チオグアニン（「６ＴＧ」）を含むプリン類似体によるような）の移植の前に、米国特許出願公開第２０１７／０３６０９５４号および同第２０１８／０１４７２９４号ならびにＰＣＴ国際公開第２０１７／２１９０２５号および同第２０１７／２１９０２９号に記載されるものなどのような、化学療法剤により；放射線照射により；抗体－薬物コンジュゲートにより、骨髄破壊的前処置によって予め処理され、前記特許文献のそれぞれの開示は参照によってその全体を本明細書に組み入れる。いくつかの実施形態では、移植（６ＴＧによるような）の後、形質導入されたＨＳＣがｉｎ ｖｉｖｏのために選択される。いくつかの実施形態では、形質導入されたＨＳＣの移植のいかなる副作用（例えば、移植片対宿主病）を寛解するために、メトトレキサートまたはミコフェノール酸が投与される。
いくつかの実施形態には、（ａ）（ｉ）ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列；および（ｉｉ）ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列を含む、発現ベクターのようなベクター、と；（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物がある。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、乳濁液として製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ミセル内で製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ポリマー内にカプセル化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、リポソーム内にカプセル化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ミニ細胞またはナノカプセル内にカプセル化される。
いくつかの実施形態には、ウイルス力価を生成するための安定な産生細胞株があり、この場合、安定な産生細胞株は、ＧＰＲ、ＧＰＲＧ、ＧＰＲＴ、ＧＰＲＧＴ、またはＧＰＲＴ－Ｇパッキング細胞株のうちの１つに由来する。いくつかの実施形態では、安定な産生細胞株は、ＧＰＲＴ－Ｇ細胞株に由来する。いくつかの実施形態では、安定な産生細胞株は、（ａ）抗ＨＰＲＴ ｓｈＲＮＡおよびＷＡＳＰをコードする核酸配列を組換えプラスミド中にクローニングすることによりベクターを合成すること（すなわち、合成されたベクターは、本明細書に記載されるベクターのうちのいずれか１つであり得る）と；（ｂ）合成されたベクターからＤＮＡ断片を生成することと；（ｃ）（ｉ）合成されたベクターから生成されたＤＮＡ断片；および（ｉｉ）抗生物質耐性カセットプラスミド由来のＤＮＡ断片からコンカテマーアレイを形成することと；（ｄ）パッキング細胞株のうちの１つに形成されたコンカテマーアレイをトランスフェクトすることと；（ｅ）安定な産生細胞株を単離することと、により生成される。安定な産生細胞株を形成する追加の方法は、２０１６年５月１２日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３１９５９号に開示されており、前記特許文献の開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。
本明細書において言及されるおよび／または出願データシートに収載される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物の全ては、参照によりその全体を本明細書に組み入れる。実施形態の態様は、必要な場合には、さらなる実施形態を提供するために種々の特許、出願および刊行物の概念を用いるように改変することができる。
本開示はいくつかの例示的実施形態を参照して記載されてきたが、本開示の原理の精神および範囲内に収まる数多くの他の改変および実施形態を当業者であれば考案することができることは理解されるべきである。より詳しくは、本開示の精神から逸脱することなく、前述の開示、図面、および添付の特許請求の範囲内で主題の組合せ配置の構成部品および／または配置において合理的な変動および改変が可能である。構成部品および／または配置における変動および改変に加えて、代替の使用も当業者には明らかである。

Claims (148)

  1. 発現ベクターであって、ＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列；およびウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列を含む前記発現ベクター。
  2. ｓｈＲＮＡは配列番号３２のヘアピンループ配列を含む、請求項１に記載の発現ベクター。
  3. ｓｈＲＮＡは配列番号２６の核酸配列を含む、請求項１に記載の発現ベクター。
  4. ｓｈＲＮＡは、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する、請求項１に記載の発現ベクター。
  5. ｓｈＲＮＡは、配列番号３４および配列番号３５からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する、請求項１に記載の発現ベクター。
  6. ｓｈＲＮＡは、配列番号２１および配列番号２２からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する、請求項１に記載の発現ベクター。
  7. ｓｈＲＮＡは配列番号３６のものと少なくとも９５％配列同一性を有する、請求項１に記載の発現ベクター。
  8. 第１の発現制御配列はｐｏｌＩＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩプロモーターを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  9. ｐｏｌＩＩＩプロモーターは７ｓｋを含む、請求項８に記載の発現ベクター。
  10. ７ｓｋプロモーターは配列番号２８の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する核酸配列を有する、請求項９に記載の発現ベクター。
  11. ７ｓｋプロモーターは配列番号２８の核酸配列を有する、請求項９に記載の発現ベクター。
  12. ７ｓｋプロモーターは配列番号２９の核酸配列を有する、請求項９に記載の発現ベクター。
  13. 第２の核酸配列は野生型ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする、請求項１～１２のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  14. 第２の核酸配列はコドン最適化ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする、請求項１～１３のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  15. ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸は、配列番号１、２、３、および４のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する配列を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  16. ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸は、配列番号１、２、３、および４のいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する配列を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  17. ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸は、配列番号１、２、３、および４のいずれか１つと少なくとも９９％同一性を有する配列を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  18. ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸は、配列番号１、２、３、および４のいずれか１つを含む配列を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  19. 第２の発現制御配列はＭＮＤプロモーターを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  20. ＭＮＤプロモーターは配列番号７、８、９、１０、１１、および１２のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１９に記載の発現ベクター。
  21. 第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列の下流に位置する、請求項１～２０のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  22. 第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列と同じ方向に配向されている、請求項２１に記載の発現ベクター。
  23. 第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は第１の方向に配向され、ここで、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列は第２の方向に配向され、第１の方向と第２の方向は反対である、請求項２１に記載の発現ベクター。
  24. 第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列の上流に位置する、請求項１～２０のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  25. 第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列と同じ方向に配向されている、請求項２４に記載の発現ベクター。
  26. 第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第１の方向に配向され、ここで、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列は第２の方向に配向され、第１の方向と第２の方向は反対である、請求項２４に記載の発現ベクター。
  27. 第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第１の方向に配向され、ここで、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列は第２の方向に配向され、第１の方向と第２の方向は反対である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  28. 第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列の下流に位置する、請求項２７に記載の発現ベクター。
  29. 第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列の上流に位置する、請求項２７に記載の発現ベクター。
  30. 第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列と同じ方向に配向されている、請求項１～２０のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  31. 第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列の下流に位置する、請求項３０に記載の発現ベクター。
  32. 第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列の上流に位置する、請求項３０に記載の発現ベクター。
  33. 第２の核酸配列は配列番号５および６のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードし；第１の核酸配列は配列番号１６またはその相補鎖と少なくとも９５％同一性を有する核酸分子をコードする、請求項１～１２のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  34. ６５０ｃＨＳ４インスレーター、４００ｃＨＳ４インスレーター、および泡沫状ウイルスインスレーターからなる群から選択されるインスレーターをさらに含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  35. 配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０からなる群から選択される核酸配列を有するインスレーターをさらに含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  36. レンチウイルス発現ベクターである、請求項１～３５のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  37. レンチウイルス発現ベクターはインテグレーション欠損レンチウイルスベクターである、請求項３６に記載の発現ベクター。
  38. 発現カセットであって、配列番号１５の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を含む、前記発現カセット。
  39. 核酸配列は、配列番号１５の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する、請求項３８に記載の発現カセット。
  40. レンチウイルス発現ベクターであって、請求項３８または３９に記載の発現カセットを含み、６５０ｃＨＳ４インスレーター、４００ｃＨＳ４インスレーター、および泡沫状ウイルスインスレーターからなる群から選択されるインスレーターをさらに含む前記レンチウイルス発現ベクター。
  41. インスレーターは、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０からなる群から選択される核酸配列を有する、請求項４０に記載のレンチウイルス発現ベクター。
  42. 宿主細胞であって、請求項１～３７のいずれか１項に記載の発現ベクターまたは請求項４０もしくは４１に記載のレンチウイルス発現ベクターによって形質導入された前記宿主細胞。
  43. 実質的にＨＰＲＴを欠損した、請求項４２に記載の宿主細胞。
  44. ウィスコット－アルドリッチ症候群タンパク質を発現する、請求項４２または４３に記載の宿主細胞。
  45. 薬学的に許容される担体と共に製剤化されている、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  46. 造血幹細胞である、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  47. 宿主細胞であって、実質的にＨＰＲＴを欠損し、配列番号５および６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを発現する前記宿主細胞。
  48. 造血幹細胞である、請求項４７に記載の宿主細胞。
  49. 実質的にＨＰＲＴを欠損し、配列番号５および６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を有するペプチドを発現する宿主細胞であって、ＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列；およびウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結した第２の発現制御配列を含む発現ベクターによってＨＳＣに形質導入することによって調製される前記宿主細胞。
  50. 第２の核酸は野生型ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする、請求項４９に記載の宿主細胞。
  51. 第２の核酸はコドン最適化ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする、請求項４９に記載の宿主細胞。
  52. 第２の発現制御配列はＭＮＤプロモーターである、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  53. 発現ベクターは、配列番号３８、３９、および４０のいずれか１つを含む核酸配列を有するインスレーターをさらに含む、請求項４９～５２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  54. 造血幹細胞である、請求項４９～５３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  55. 医薬組成物であって、請求項１～３７のいずれか１項に記載の発現ベクターまたは請求項４０もしくは４１に記載のレンチウイルス発現ベクター、および薬学的に許容される担体を含む前記医薬組成物。
  56. 医薬組成物であって、請求項４２～５４のいずれか１項に記載の宿主細胞を含む前記医薬組成物。
  57. 形質導入された細胞を選択する方法であって、
    請求項１～３７のいずれか１項に記載の発現ベクターまたは請求項４０もしくは４１に記載のレンチウイルス発現ベクターによって細胞の集団に形質導入する工程；および
    プリン類似体によって、形質導入された細胞を選択することによって、形質導入された細胞の集団を濃縮する工程
    を含む前記方法。
  58. プリン類似体は、６ＴＧおよび６－メルカプトプリンからなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
  59. 形質導入された細胞はＨＳＣである、請求項５７または５８に記載の方法。
  60. ＨＳＣは同種ＨＳＣである、請求項５７に記載の方法。
  61. ＨＳＣは自家ＨＳＣである、請求項５７に記載の方法。
  62. ＨＣＳは兄弟適合ＨＳＣである、請求項５７に記載の方法。
  63. ウィスコット・アルドリッチ症候群と関連する病理を緩和する方法であって、請求項４２～５４のいずれか１項に記載の治療有効量の宿主細胞をその処置を必要とする患者に投与する工程を含む前記方法。
  64. ウィスコット・アルドリッチ症候群と関連する病理は、マイクロ血小板減少症、湿疹、自己免疫疾患、および回帰感染からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
  65. 回帰感染は回帰皮膚感染を含む、請求項６３に記載の方法。
  66. 回帰感染は、中耳炎、皮膚膿瘍、肺炎、腸炎、髄膜炎、敗血症、および尿路感染症からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
  67. 湿疹は治療抵抗性湿疹である、請求項６４に記載の方法。
  68. 自己免疫疾患は、溶血性貧血、血管炎、関節炎、好中球減少症、炎症性腸疾患、およびＩｇＡ腎症、ヘノッホ・シェーンライン様紫斑病、皮膚筋炎、再発性血管性浮腫、およびぶどう膜炎からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
  69. ポリヌクレオチドであって、配列番号１４の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する第１の核酸配列、および配列番号１５の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する第２の核酸配列を含む前記ポリヌクレオチド。
  70. 配列番号１３を有する核酸配列をさらに含む、請求項６９に記載のポリヌクレオチド。
  71. 配列番号４１を有する核酸配列をさらに含む、請求項６９に記載のポリヌクレオチド。
  72. 配列番号３１を有する核酸配列をさらに含む、請求項６９に記載のポリヌクレオチド。
  73. 配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０からなる群から選択される核酸配列をさらに含む、請求項６９に記載のポリヌクレオチド。
  74. 第１の核酸配列は第２の核酸配列の上流に位置する、請求項６９～７３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  75. 第１の核酸配列は第２の核酸配列と同じ配向を含む、請求項７４に記載のポリヌクレオチド。
  76. 同じ配向はフォワード配向である、請求項７５に記載のポリヌクレオチド。
  77. 第１の核酸配列は第２の核酸配列と異なる方向を含む、請求項７５に記載のポリヌクレオチド。
  78. 異なる配向はリバース配向である、請求項７７に記載のポリヌクレオチド。
  79. 第１の核酸配列は第２の核酸配列の下流に位置する、請求項６９～７３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  80. 第１の核酸配列は第２の核酸配列と同じ配向を含む、請求項７９に記載のポリヌクレオチド。
  81. 同じ配向はフォワード配向である、請求項８０に記載のポリヌクレオチド。
  82. 第１の核酸配列は第２の核酸配列と異なる配向を含む、請求項７９に記載のポリヌクレオチド。
  83. 異なる配向はリバース配向である、請求項８２に記載のポリヌクレオチド。
  84. 第１の核酸配列は第１の方向に配向され、第２の核酸配列は第２の方向に配向され、第１の方向と第２の方向は反対である、請求項６９～７３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  85. 第１の核酸配列は第２の核酸配列の下流に位置する、請求項８４に記載のポリヌクレオチド。
  86. 第１の核酸配列は第２の核酸配列の上流に位置する、配列番号８４に記載のポリヌクレオチド。
  87. 第１の核酸配列は第２の核酸配列と同じ方向に配向されている、請求項６９～７３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  88. 第１の核酸配列は第２の核酸配列の下流に位置する、請求項８７に記載のポリヌクレオチド。
  89. 第１の核酸配列は第２の核酸配列の上流に位置する、請求項８７に記載のポリヌクレオチド。
  90. ポリヌクレオチドであって、配列番号４２～５７のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を含む前記ポリヌクレオチド。
  91. 核酸配列は配列番号４２～５７のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する、請求項９０に記載のポリヌクレオチド。
  92. 核酸配列は配列番号４２～５７のいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する、請求項９０に記載のポリヌクレオチド。
  93. 核酸配列は配列番号４２～５７のいずれか１つと少なくとも９８％同一性を有する、請求項９０に記載のポリヌクレオチド。
  94. 核酸配列は配列番号４２～５７のいずれか１つと少なくとも９９％同一性を有する、請求項９０に記載のポリヌクレオチド。
  95. ポリヌクレオチドであって、配列番号４２～５７のいずれか１つを有する前記ポリヌクレオチド。
  96. 発現ベクターであって、
    （ａ）ｐＴＬ２０ｃをコードする核酸配列；
    （ｂ）ＷＡＳＰ発現カセットをコードする核酸；および
    （ｃ）７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットをコードする核酸
    を含む前記発現ベクター。
  97. インスレーターをコードする核酸配列をさらに含む、請求項９６に記載の発現ベクター。
  98. ＷＡＳＰ発現カセットは７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの上流に位置する、請求項９６に記載の発現ベクター。
  99. 配列番号４４、４５、４８、および４９のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する、請求項９８に記載の発現ベクター。
  100. 配列番号４４、４５、４８、および４９のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する、請求項９８に記載の発現ベクター。
  101. 配列番号５１、５３、５５、および５７のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する、請求項９８に記載の発現ベクター。
  102. 配列番号５１、５３、５５、および５７のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する、請求項９８に記載の発現ベクター。
  103. ＷＡＳＰ発現カセットは７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの上流に位置し、ここで、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットはＷＡＳＰ発現カセットに対してリバース配向を含む、請求項９６に記載の発現ベクター。
  104. 配列番号４５、４９、５３、５７のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１０３に記載の発現ベクター。
  105. 配列番号４５、４９、５３、５７のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１０３に記載の発現ベクター。
  106. ＷＡＳＰ発現カセットは７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの上流に位置し、ここで、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットおよびＷＡＳＰ発現カセットは同じ方向に配向されている、請求項９６に記載の発現ベクター。
  107. 配列番号４４、４８、５１、５５のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１０６に記載の発現ベクター。
  108. 配列番号４４、４８、５１、５５のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１０６に記載の発現ベクター。
  109. ＷＡＳＰ発現カセットは７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの下流に位置する、請求項９６に記載の発現ベクター。
  110. 配列番号４２、４３、４６、および４７のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１０９に記載の発現ベクター。
  111. 配列番号４２、４３、４６、および４７のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１０９に記載の発現ベクター。
  112. 配列番号５０、５２、５４、および５６のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１０９に記載の発現ベクター。
  113. 配列番号５０、５２、５４、および５６のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１０９に記載の発現ベクター。
  114. ＷＡＳＰ発現カセットは７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの下流に位置し、ここで、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットはＷＡＳＰ発現カセットに対してリバース配向を含む、請求項９６に記載の発現ベクター。
  115. 配列番号４３、４７、５２、および５６のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１１４に記載の発現ベクター。
  116. 配列番号４３、４７、５２、および５６のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１１４に記載の発現ベクター。
  117. ＷＡＳＰ発現カセットは７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットの下流に位置し、ここで、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットとＷＡＳＰ発現カセットは同じ方向に配向されている、請求項９６に記載の発現ベクター。
  118. 配列番号４２、４６、５０、および５４のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１１７に記載の発現ベクター。
  119. 配列番号４２、４６、５０、および５４のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１１７に記載の発現ベクター。
  120. ウィスコット・アルドリッチ症候群の処置のための医薬組成物の調製のための請求項９６～１１９のいずれか１項に記載の発現ベクターの使用であって、該医薬組成物は宿主細胞および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、前記使用。
  121. ポリヌクレオチドであって、配列番号５８と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を含む前記ポリヌクレオチド。
  122. 核酸配列は配列番号５８と少なくとも９５％同一性を有する、請求項１２１に記載のポリヌクレオチド。
  123. 核酸配列は配列番号５８と少なくとも９６％同一性を有する、請求項１２１に記載のポリヌクレオチド。
  124. 核酸配列は配列番号５８と少なくとも９７％同一性を有する、請求項１２１に記載のポリヌクレオチド。
  125. 核酸配列は配列番号５８と少なくとも９８％同一性を有する、請求項１２１に記載のポリヌクレオチド。
  126. 核酸配列は配列番号５８と少なくとも９９％同一性を有する、請求項１２１に記載のポリヌクレオチド。
  127. ポリヌクレオチドであって、配列番号５８を有する前記ポリヌクレオチド。
  128. ポリヌクレオチドであって、配列番号５９と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を含む前記ポリヌクレオチド。
  129. 核酸配列は配列番号５９と少なくとも９５％同一性を有する、請求項１２８に記載のポリヌクレオチド。
  130. 核酸配列は配列番号５９と少なくとも９６％同一性を有する、請求項１２８に記載のポリヌクレオチド。
  131. 核酸配列は配列番号５９と少なくとも９７％同一性を有する、請求項１２８に記載のポリヌクレオチド。
  132. 核酸配列は配列番号５９と少なくとも９８％同一性を有する、請求項１２８に記載のポリヌクレオチド。
  133. 核酸配列は配列番号５９と少なくとも９９％同一性を有する、請求項１２８に記載のポリヌクレオチド。
  134. ポリヌクレオチドであって、配列番号５９を有する前記ポリヌクレオチド。
  135. ポリヌクレオチドであって、配列番号６３および６５のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を含む前記ポリヌクレオチド。
  136. 核酸配列は配列番号６３および６５のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する、請求項１３５に記載のポリヌクレオチド。
  137. 核酸配列は配列番号６３および６５のいずれか１つと少なくとも９６％同一性を有する、請求項１３５に記載のポリヌクレオチド。
  138. 核酸配列は配列番号６３および６５のいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する、請求項１３５に記載のポリヌクレオチド。
  139. 核酸配列は配列番号６３および６５のいずれか１つと少なくとも９８％同一性を有する、請求項１３５に記載のポリヌクレオチド。
  140. 核酸配列は配列番号６３および６５のいずれか１つと少なくとも９９％同一性を有する、請求項１３５に記載のポリヌクレオチド。
  141. ポリヌクレオチドであって、配列番号６３および６５のいずれか１つを有する前記ポリヌクレオチド。
  142. ポリヌクレオチドであって、配列番号６４および６６のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を含む前記ポリヌクレオチド。
  143. 核酸配列は配列番号６４および６６のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する、請求項１４２に記載のポリヌクレオチド。
  144. 核酸配列は配列番号６４および６６のいずれか１つと少なくとも９６％同一性を有する、請求項１４２に記載のポリヌクレオチド。
  145. 核酸配列は配列番号６４および６６のいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する、請求項１４２に記載のポリヌクレオチド。
  146. 核酸配列は配列番号６４および６６のいずれか１つと少なくとも９８％同一性を有する、請求項１４２に記載のポリヌクレオチド。
  147. 核酸配列は配列番号６４および６６のいずれか１つと少なくとも９９％同一性を有する、請求項１４２に記載のポリヌクレオチド。
  148. ポリヌクレオチドであって、配列番号６４および６６のいずれか１つを有する前記ポリヌクレオチド。
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