CN118103076A - 可用于疾病治疗的慢病毒载体 - Google Patents

可用于疾病治疗的慢病毒载体 Download PDF

Info

Publication number
CN118103076A
CN118103076A CN202280037491.XA CN202280037491A CN118103076A CN 118103076 A CN118103076 A CN 118103076A CN 202280037491 A CN202280037491 A CN 202280037491A CN 118103076 A CN118103076 A CN 118103076A
Authority
CN
China
Prior art keywords
insulator
seq
sequence
mutation
lentiviral vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280037491.XA
Other languages
English (en)
Inventor
陈超广
克里斯蒂安·蒙特勒色
弗洛里安·艾希曼
大卫·J·罗林斯
伊拉姆·法蒂玛·卡恩
埃丝特·于-婷·陈
哈里·马立克
淑·西·德拉万
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
American Jette Bellin Biological Products Co ltd
US Department of Health and Human Services
Seattle Childrens Hospital
Original Assignee
American Jette Bellin Biological Products Co ltd
US Department of Health and Human Services
Seattle Childrens Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by American Jette Bellin Biological Products Co ltd, US Department of Health and Human Services, Seattle Childrens Hospital filed Critical American Jette Bellin Biological Products Co ltd
Priority claimed from PCT/US2022/026409 external-priority patent/WO2022232191A1/en
Publication of CN118103076A publication Critical patent/CN118103076A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本公开内容一般性地涉及可用于疾病或病症治疗的慢病毒载体，所述疾病或病症例如威斯科特‑奥尔德里奇综合征(WAS)或镰状细胞病(SCD)。

Description

可用于疾病治疗的慢病毒载体
相关申请
本申请要求2021年4月26日提交的标题为“Lentiviral vectors useful for thetreatment of Wiskott Aldrich Syndrome”的美国临时申请No.63/179,993和2021年4月26日提交的标题为“Lentiviral vectors useful for the treatment of Sickle CellDisease”的美国临时申请No.63/180,001的优先权，其内容在此通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开内容一般性地涉及可用于疾病或病症治疗的慢病毒载体，所述疾病或病症例如威斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich Syndrome，WAS)或镰状细胞病(Sickle Cell Disease，SCD)。
背景技术
威斯科特-奥尔德里奇综合征(WAS)是一种罕见的X连锁原发性免疫缺陷(primaryimmunodeficiency，PID)疾病，其特征在于复发性感染、小血小板、微血小板减少症(microthrombocytopenia)、湿疹、以及自身免疫性表现和肿瘤的提高的风险。威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白(Wiskott-Aldrich Syndrome protein，WASP)基因的突变引起了威斯科特-奥尔德里奇综合征。编码WAS蛋白的基因位于X染色体的短臂(XP11.22至11.23)，并且为约9kb，包括12个外显子，并且编码502个氨基酸。迄今为止，已经在患有威斯科特-奥尔德里奇综合征的患者中鉴定了WASP突变，包括错义/无义、剪接、小缺失、小插入、总缺失和总插入。
威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白是造血系统特异性胞内信号转导分子，其富含脯氨酸，并且仅在造血细胞系中表达。威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白被认为是肌动蛋白细胞骨架的重要调节因子，发现其在所有白细胞中都表达。威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白被认为参与动态的细胞骨架变化，其对多种细胞功能是至关重要的，所述细胞功能例如黏附、迁移、吞噬作用、免疫突触形成和受体介导的细胞激活过程(例如B和T细胞抗原受体)。因此，先天性免疫和细胞适应性免疫二者都被认为在威斯科特-奥尔德里奇综合征患者中受到影响，使得这些患者对感染高度易感。
通常来说，引起蛋白质表达缺失的WAS基因突变会导致“典型的威斯科特-奥尔德里奇综合征”。降低的威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白表达导致X连锁血小板减少症。威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白激活功能获得突变，导致X连锁中性粒细胞减少症。根据WAS基因产物中的突变，临床疾病具有广泛的变异性。在一项154名患有威斯科特-奥尔德里奇综合征患者的研究中，仅30％的患者具有血小板减少症、小血小板、湿疹和免疫缺陷的典型表现；84％的患者具有血小板减少症的临床体征和症状，80％的患者具有湿疹，20％的患者仅有血液学异常，以及5％的患者仅有感染性表现(参见Sullivan(1994)，J Pediatr.，125(6Pt 1)：876-85)。自身免疫病是常见的，并且在高达40％至70％的患者中出现。还认为淋巴网状恶性病(10％至20％)的风险显著提高，所述淋巴网状恶性病例如淋巴瘤、白血病和脊髓发育不良(myelodysplasia)。另一项对来自法国一家医院的55名患有威斯科特-奥尔德里奇综合征患者的为期20年的研究发现70％的患者患有自身免疫性或炎性病症，最常见的是自身免疫性溶血性贫血。
威斯科特-奥尔德里奇综合征是近40年前通过同种异体的造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)成功治疗的第一批病症之一(Galy，Roncarolo et al.(2008)，Expert Opinion on Biological Therapy，Vol.8(2)：pp.181-190；Candotti(2018)，Journal of Clinical Immunology，33：pp.13-27)。用于WAS治疗的基因治疗方法继续被报道，包括，例如Aiuti et al.(2013)，Science，341，p.1233151；Hacein-Bey Abina，et al.(2015)，JAMA，313，pp.1550-1563；Koldej et al.(2013)，HumanGene Therapy Clinical Development，Vol 24，pp.77-85；Wielgosz et al.(2015)，Molecular Therapy：Methods&Clinical Development Vol 2，pp.14063和Singh et al.(2017)，Molecular Therapy：Methods&Clinical Development Vol.4pp.1-16。
认为骨髓移植仍然是这种疾病的唯一已证实的治疗方法，并且对于具有HLA匹配供体的那些患者结局尚可(仅适用于少于20％的患者)。造血干细胞基因治疗(hematopoietic stem cell gene therapy，HSC-GT)为缺少匹配供体的患者提供了新的、潜在的治疗性选择。与同种异体的HSCT相比，基因治疗提供了数个潜在的优势。理论上，其对所有患者都是可用的，并被认为降低移植物排斥反应的风险，并且可能避免与移植物抗宿主病(Graft versus Host Disease，GvHD)相关的风险。
虽然用于WAS治疗的使用整合病毒载体(例如慢病毒载体)的HSC-GT的临床试验已表明这种方法可以是治疗有效的，但在使用γ-逆转录病毒载体的临床试验中的患者由于整合事件而发生白血病(参见例如Braun et al.(2014)，Sci Transl Med.6(227)：227ra33)。这突出了开发具有改进的安全性特征的慢病毒载体的持续需要。
发明内容
慢病毒载体(以及实际上其他病毒载体)内的隐蔽剪接位点能够导致转基因RNA的可变剪接，导致潜在的非治疗性截短转录物和截短蛋白质的产生，以及慢病毒基因组RNA的可变剪接，导致截短病毒RNA和潜在的非活体病毒。此外，慢病毒载体内的隐蔽剪接位点能够导致来自载体基因组已整合至其中的基因的转录物的可变剪接。已知慢病毒载体可整合至其中的基因(例如HMGA2)的转录物的可变剪接能够产生具有克隆性生长优势的细胞，并且因此导致表达可变剪接转录物的那些细胞的扩增。这显示出至少部分是由于在这些截短或融合的转录物中的let-7结合位点中的一个或更多个的缺乏，所述位点存在于完整的HMGA2转录物中，并且通常被肿瘤抑制因子微RNA的let-7家族结合以负调节表达。虽然不认为HMGA2是致癌基因，并且由截短或融合的转录物结果的过表达导致的克隆性扩增通常被认为是良性的，但即使是由治疗性慢病毒载体的施用导致的良性细胞生长的耐受性也是低的，例如，当患者是儿科患者时，例如在WAS治疗的靶群体的情况下。对于其他遗传性疾病也是如此，尽早治疗患者以减轻疾病的影响以及从早期阶段提高生活质量是期望的，并且因此需要降低所有基因治疗中的可变剪接。
本公开内容至少部分基于cHS4来源的绝缘子(包括HS4-650绝缘子或HS4-400绝缘子)内的隐蔽剪接受体位点的鉴定，所述隐蔽剪接受体位点存在于可用于治疗包括威斯科特-奥尔德里奇综合征(WAS)或镰状细胞病(SCD)的疾病或病症的治疗性慢病毒载体中。这些隐蔽剪接受体位点位于HS4-650绝缘子和HS4-400绝缘子的反向互补序列中(即在负链或反向链上)。对于HS4-650绝缘子，第一隐蔽剪接受体位点被称为剪接受体位点1(spliceacceptor site 1，SA1)，并且其位于SEQ ID NO：2的核苷酸第385至386位(即剪接发生在核苷酸第385位和核苷酸第386位之间)，其中SEQ ID NO：2是SEQ ID NO：1中所示的未经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列。第二隐蔽剪接受体位点被称为剪接受体位点2(spliceacceptor site 2，SA2)，并且其位于SEQ ID NO：2的核苷酸第446至447位(即剪接发生在核苷酸第446位和核苷酸第447位之间)，以及第三隐蔽剪接受体位点被称为剪接受体位点3(splice acceptor site 3，SA3)，并且其位于SEQ ID NO：2的核苷酸第456至457位(即剪接发生在核苷酸第456位和核苷酸第457位之间)。对于HS4-400绝缘子，SA2位于SEQ ID NO：90的核苷酸第190位至第191位，其中SEQ ID NO：90是SEQ ID NO：89中所示的未经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列，并且SA3位于SEQ ID NO：90的核苷酸第200位至第201位。
含有来自鸡β-珠蛋白基因座的超敏位点4(cHS4)的1.2kb片段是具有屏障和增强子阻断功能的良好表征的绝缘子。因此，本文中提供了慢病毒载体，其包含经修饰的cHS4来源的绝缘子，例如经修饰的HS4-650或经修饰的HS4-400绝缘子。特别地，本文中提供了含有经修饰的HS4-650绝缘子的慢病毒载体(其中SA1、SA2和SA3中的一个或更多个是已失活的)，以及含有经修饰的HS4-400绝缘子的慢病毒载体(其中SA2和SA3中的一者或两者是已失活的)。因此，所得的慢病毒载体在引入到细胞(例如造血干细胞)中时可具有与其相关联的降低的可变剪接的风险。相对于“野生型”或未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子可以具有使SA1、SA2或SA3失活的突变。或者，所述经修饰的HS4-650绝缘子可以在慢病毒载体内，和/或相对于转基因(例如WAS转基因)以这样的方式定向，使得有效地使SA1、SA2和/或SA3失活，例如SA1、SA2和SA3不在病毒性RNA和/或转录物(例如WAS转录物)的正链或正向链上。类似地，相对于野生型或未经修饰的HS4-400绝缘子，所述经修饰的HS4-400绝缘子可以具有使SA2和SA3中的一者或两者失活的突变。或者，所述经修饰的HS4-400可以在慢病毒载体内和/或相对于转基因(例如珠蛋白转基因)以这样的方式定向，使得有效地使SA2和/或SA3失活，例如SA2和SA3不在病毒性RNA和/或转录物(例如珠蛋白转录物)的正链或正向链上。
因此，在一个方面中，提供了慢病毒载体，其包含：
第一启动子，其可操作连接至第一核酸序列，其中所述第一核酸序列编码威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白；和
经修饰的HS4-650绝缘子，其中：
当存在于所述载体中时，相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含已失活的剪接受体位点1(SA1)，并且其中：
SA1存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第385至386位，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的，其中SEQ ID NO：2是SEQ ID NO：1中所示的未经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列；和/或
SA1包含序列TTGCATCCAG^ACACCATCAA(SEQ ID NO：60)，其中^表示剪接位置。
在一些实施方案中，相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含使SA1失活的突变。在一个实例中，所述突变是第384位的A的突变(例如A至T的突变)和/或第385位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些具体实施方案中，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含SEQ ID NO：3、12、21、30、39和48中任一者所示的序列。
在一些实例中，相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子还包含使剪接受体位点2(SA2)失活的突变，其中SA2存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第446至447位，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。例如，所述突变可以是第445位的A的突变(例如A至T的突变)和/或第446位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些具体实施方案中，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含SEQ ID NO：4、13、22、31、40和49中任一者所示的序列。
在另一个实例中，相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子还包含使剪接受体位点3(SA3)失活的突变，其中SA3存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第456至457位，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的，例如所述突变是第455位的A的突变(例如A至T突变)和/或第456位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些具体实例中，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含SEQ ID NO：5、6、14、15、23、24、32、33、41、42、50和51中所示的序列。
在一些实施方案中，所述经修饰的HS4-650绝缘子处于与所述第一核酸序列相反的方向。在一些具体实施方案中，所述第一核酸在所述慢病毒载体内是处于正向的，而所述经修饰的HS4-650绝缘子在所述慢病毒载体内是处于反向的。
在一些替代实施方案中，所述经修饰的HS4-650绝缘子处于与所述第一核酸序列相同的方向，从而使SA1失活。在一些具体实例中，所述第一核酸和所述经修饰的HS4-650绝缘子在所述慢病毒载体内是处于正向的。
在另一个方面中，提供了慢病毒载体，其包含：
第一启动子，其可操作连接至第一核酸序列，所述第一核酸序列编码威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白；和
经修饰的HS4-650绝缘子，其中：
当存在于所述载体中时，相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含已失活的剪接受体位点2(SA2)，并且其中：
SA2存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第446至447位，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的，其中SEQ ID NO：2是SEQ ID NO：1中所示的未经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列；和/或
SA2包含序列ATCCCCCCAG^GTGTCTGCAG(SEQ ID NO：61)，其中^表示剪接位置。
在一些实施方案中，相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含使SA2失活的突变，例如是第445位的A的突变(例如A至T突变)和/或第446位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些实例中，所述经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：7、16、25、34、43和52中任一者所示的序列。
相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子还可包含使剪接受体位点1(SA1)失活的突变，其中SA1存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第385至386位的核苷酸，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些实例中，所述突变是第384位的A的突变(例如A至T突变)和/或第385位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些具体实施方案中，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含SEQ ID NO：4、13、22、31、40和49中任一者所示的序列。
相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子还可包含使剪接受体位点3(SA3)失活的突变，其中SA3存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第456至457位，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的，例如第455位的A的突变(例如A至T突变)和/或第456位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些实例中，所述经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：5、6、14、15、23、24、32、33、41、42、50和51中所示的序列。
在本方面的一些实施方案中，所述经修饰的HS4-650绝缘子处于与所述第一核酸序列相反的方向。在一个实例中，所述第一核酸在所述慢病毒载体内是处于正向的，而所述经修饰的HS4-650绝缘子在所述慢病毒载体内是处于反向的。
在本方面的另一些实施方案中，所述经修饰的HS4-650绝缘子处于与所述第一核酸序列相同的方向，从而使SA2失活。在一个实例中，所述第一核酸和所述经修饰的HS4-650绝缘子在所述慢病毒载体内是处于正向的。
在另一个方面中，提供了慢病毒载体，其包含：
第一启动子，其可操作连接至第一核酸序列，所述第一核酸序列编码威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白；和
经修饰的HS4-650绝缘子，其中：
当存在于所述载体中时，相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含已失活的剪接受体位点3(SA3)，并且其中：
SA3存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第456至457位，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的，其中SEQ ID NO：2是SEQ ID NO：1中所示的未经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列；和/或
SA3包含序列GTGTCTGCAG^GCTCAAAGAG(SEQ ID NO：62)，其中^表示剪接位置。
在一个实例中，相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含使SA3失活的突变。在一些实施方案中，所述突变是第455位的A的突变(例如A至T突变)和/或第456位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一个实例中，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含SEQ ID NO：9、18、27、36、45和54中任一者所示的序列。
相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子还可包含使剪接受体位点1(SA1)失活的突变，其中SA1存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第385至386位，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一个实例中，所述突变是第384位的A的突变(例如A至T突变)和/或第385位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些实施方案中，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含SEQ ID NO：14、23、32、41和50中任一者所示的序列。
相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子还可包含使剪接受体位点2(SA2)失活的突变，其中SA2存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第446至447位的核苷酸，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的，例如是第445位的A的突变(例如A至T突变)和/或第446位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些实例中，所述经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：6、8、15、17、24、26、33、35、42、44、51和53中所示的序列。
在本方面的一些具体实施方案中，所述经修饰的HS4-650绝缘子处于与所述第一核酸序列相反的方向。在一些实例中，所述第一核酸在所述慢病毒载体内是处于正向的，而所述经修饰的HS4-650绝缘子在所述慢病毒载体内是处于反向的。
在本方面的另一些实施方案中，所述经修饰的HS4-650绝缘子处于与所述第一核酸序列相同的方向，从而使SA3失活。在一些实例中，所述第一核酸和所述经修饰的HS4-650绝缘子在所述慢病毒载体内是处于正向的。
在上述方面的一些实施方案中，所述经修饰的HS4-650绝缘子处于所述第一核酸序列的下游。在另一些实施方案中，所述威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白包含SEQ ID NO：76中所示的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列。在一些具体实例中，所述第一核酸序列包含SEQ ID NO：73至75中任一者所示的序列或者与其具有至少90％序列同一性的序列。
所述慢病毒载体还可包含所述第一核酸序列与所述经修饰的HS4-650绝缘子之间的土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus，WHV)转录后调节元件(Posttranscriptional Regulatory Element，WPRE)，例如这样的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，其包含SEQ ID NO：77至78中任一者所示的核酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述慢病毒载体包含选自以下的序列：如SEQ ID NO：57的核苷酸第3098至6006位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；如SEQ ID NO：58的核苷酸第3098至6009位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；以及如SEQ ID NO：59的核苷酸第3098至6006位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实例中，所述第一启动子是MND启动子，例如包含SEQ ID NO：72中任一者所示的核酸序列或者与其具有至少90％序列同一性的序列的MND启动子。在一些具体实例中，所述载体包含选自以下的序列：如SEQ ID NO：57的核苷酸第2710至6006位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；如SEQ ID NO：58的核苷酸第2710至6009位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；以及如SEQ ID NO：59的核苷酸第2710至6006位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
所述慢病毒载体还可包含可操作连接至第二核酸序列的第二启动子，其中所述第二核酸序列编码抑制HPRT表达的核酸。在一些实例中，所述抑制HPRT表达的核酸是shRNA，例如包含SEQ ID NO：66中所示的发夹环序列的shRNA和/或者包含SEQ ID NO：67至68中任一者所示的核酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列的shRNA。在一些实例中，所述第二启动子包含Pol III启动子或Pol II启动子，例如包含7sk的启动子(例如包含SEQ IDNO：69至71中任一者所述的核酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列的启动子)。在一些实例中，所述第二启动子和经可操作连接的第二核酸序列处于所述第一启动子和经可操作连接的第一核酸的反向和上游。在一些实施方案中，所述载体包含选自以下的序列：如SEQ ID NO：57的核苷酸第2402至6006位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；如SEQ ID NO：58的核苷酸第2402至6009位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；以及如SEQ ID NO：59的核苷酸第2402至6006位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
所述慢病毒载体还可包含位于所述第一核酸和所述经修饰的HS4-650绝缘子下游的多腺苷酸化信号。
在一些实例中，所述载体是质粒。在另一些实例中，所述载体是病毒颗粒。
还提供了包含本公开内容的慢病毒载体的宿主细胞或用本公开内容的慢病毒载体转导的宿主细胞。在一些实例中，所述宿主细胞是造血干细胞(HSC)，例如同种异体的或自体的HSC。
还提供了用于治疗患有威斯科特-奥尔德里奇综合征的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用上述和本文中所述的宿主细胞。在一些具体实施方案中，所述方法包括向所述对象施用所述宿主细胞，并随后向所述对象施用嘌呤类似物(例如6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine，“6TG”)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine，“6MP”)或氮杂硫代嘌呤(azathiopurine，“AZA”)，以提高所述宿主细胞的植入。在另一些实施方案中，所述方法包括在施用所述宿主细胞之前用嘌呤类似物预处理所述对象。还提供了本公开内容的宿主细胞用于制备用于治疗威斯科特-奥尔德里奇综合征的药物的用途。
附图说明
仅通过非限制性示例的方式，参考以下附图在本文中描述本公开内容的一些实施方案。
图1是HS4-650绝缘子的反向互补序列的比对。
图2是pBRNGTR47的示意图。
图3是pBRNGTR47的示意图，示出了HS4-650绝缘子(650bp Ins)中的隐蔽剪接受体位点SA1、SA2和SA3。
图4是pBRNGTR84的示意图。
图5是pBRNGTR88的示意图。
图6是pBRNGTR92的示意图。
图7是pBRNGTR120的示意图。
图8示出了在第7天(实心条，左)和第14天(右)通过ddPCR评估的HMGA2外显子2至3/外显子4至5的转录物之比。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“3×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)；以及“mock”是指对照。
图9示出了从第7天(实心条)至第26天(斜线条)在培养物中的经编辑的细胞频率，显示了在KG1细胞中包含经修饰的绝缘子的构建体在培养物中的选择性细胞生长优势随着时间的降低或消除。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“2×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有两个校正的隐蔽剪接受体位点；“3×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)；以及“mock”或“MND-GFP”是指对照。
图10示出了从第5天(实心条，左)至第26天(斜线条，右)在培养物中的经编辑的细胞频率，显示了在CD34+细胞中包含经修饰的绝缘子的构建体在培养物中的选择性细胞生长优势随着时间的降低或消除。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“3×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)；以及“mock”或“GFP”是指对照。
图11是用于富集HMGA2外显子1、2和3的定制诱饵的映射(mapping)的示意图。
图12示出了KG1细胞中HMGA2转录物和AAV融合转录物的表达水平。(A)与未经处理的细胞相比，表达HMGA2的转录物总量的测量。(B)在细胞中表达的融合转录物水平的测量，其相对于3×SA归一化。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“2×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有两个校正的隐蔽剪接受体位点；“3×SA”是指包含650bp cHS4绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)；以及“mock”或“fwd_LTRrev”是指对照。
图13示出了CD34+细胞中HMGA2转录物和AAV融合转录物的表达水平。(A)与未经处理的细胞相比，表达HMGA2的转录物总量的测量。(B)在细胞中表达的融合转录物水平的测量，其相对于3×SA归一化。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“3×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)；以及“mock”是指对照。
图14示出了在CD34+细胞中由HMGA2转录物测定所映射的外显子3-LVV剪接连接的百分比。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“3×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)；以及“mock”、“仅AAV”或“MND_GFP”是指对照。
图15示出了在CD34+细胞中由HMGA2转录物测定所映射的HMGA2外显子3至外显子4剪接连接的百分比。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“3×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)；以及“mock”、“仅AAV”或“MND_GFP”是指对照。
图16示出了在CD34+细胞中由HMGA2转录物测定所映射的LVV融合转录物与HMGA2同种型1之比。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“3×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)；以及“mock”、“仅AAV”或“MND_GFP”是指对照。
图17示出了在KG1细胞中由HMGA2转录物测定所映射的外显子3-LVV剪接连接的百分比。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“3×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)；以及“mock”、“仅AAV”或“MND_GFP”是指对照。
图18示出了在KG1细胞中由HMGA2转录物测定所映射的HMGA2外显子3至外显子4剪接连接的百分比。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“3×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)；以及“mock”、“仅AAV”或“MND_GFP”是指对照。
图19示出了在KG1细胞中由HMGA2转录物测定所映射的LVV融合转录物与HMGA2同种型1之比。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“3×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)；以及“mock”、“仅AAV”或“MND_GFP”是指对照。
图20示出了单细胞测定中仅LIM结构域2(LIM domain only 2，LMO2)激活测定的结果。在mScarlet+细胞中，相对于不包含绝缘子的对照构建体，相对于PPIA归一化的LMO2mRNA水平(％；y轴)。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“3×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)。“不含启动子”是指缺少启动子的对照构建体；“不含绝缘子”是指缺少绝缘子的对照构建体。
图21示出了批量细胞测定中LMO2激活测定的结果。(A)在批量细胞测定中，在mScarlet+细胞中，相对于不包含绝缘子的对照构建体，相对于PPIA归一化的LMO2 mRNA水平(％；y轴)。(B)从(A)中提取的扩展图，在mScarlet+细胞中，相对于不包含绝缘子的对照构建体，相对于PPIA归一化的LMO2 mRNA水平(％；y轴)。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“3×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)。“无绝缘子(No-Ins)”是指缺少绝缘子的对照构建体。注：表示来自三个独立重复的平均数据。
图22示出了(A)KG1和(B)CD34+细胞中包含经修饰的或未经修饰的绝缘子的示例性构建体中的AAV/HMGA2之比，其计算为AAV读数和HMGA2下游外显子读数之比。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“2×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有两个校正的隐蔽剪接受体位点；“3×SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)；“mock”是指对照；以及“(r1)”……“(r2)”……是指样品重复数目。
图23示出了用所选择的WAS LVV转导的鼠谱系阴性(Linneg)WAS KO细胞中WAS的表达。在感染复数(multiplicity of infection，MOI)为1和10(如所示)的情况下所转导的细胞中显示为MFI(y轴)的转基因表达。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“3SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)；“KO”是指未经转导的WAS KO细胞以及“WT”是指野生型细胞(Linneg细胞)，作为阴性和阳性对照。
图24示出了用所选择的WAS LVV转导的人U937 WAS KO细胞中WAS的表达。在MOI复数为1和10(如所示)的情况下所转导的细胞中显示为MFI(y轴)的转基因表达。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“3SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)；“KO”是指未经转导的WAS KO细胞以及“WT”是指野生型细胞(U937细胞)，作为阴性和阳性对照。
图25显示了在MOI为1、2、10和20(如所示)的情况下用所选择的WAS LVV转导的鼠Linneg WAS KO细胞中载体拷贝整合(vector copy integration，VCN)的剂量依赖性提高。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“3SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)；“KO”是指未经转导的WAS KO细胞以及“WT”是指野生型细胞(Linneg细胞)，作为阴性和阳性对照。
图26显示了在MOI为1、2、10和20(如所示)的情况下用所选择的WAS LVV转导的人U937 WAS KO细胞中VCN的剂量依赖性提高。“650”是指包含未经修饰的HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有未经修饰的剪接位点；“3SA”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子具有三个校正的隐蔽剪接受体位点；“fwd”是指包含HS4-650绝缘子的构建体，所述绝缘子相对于转基因是正向的(或相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体是反向的)。“KO”是指未经转染的WAS KO细胞以及“WT”是指野生型细胞(U937细胞)，作为阴性和阳性对照。
图27示出了pCalH10中的基因和元件的排列。(A)pCalH10的高层次概述示意图。(B)pCalH10的详细示意图。
图28示出了用产生自pCalH10的病毒体(virion)转导的HeLa细胞的Southern印迹分析结果。(A)示出在细胞中所观察到的片段尺寸的Southern印迹。(B)每个片段对群体贡献的量化。
图29是pCalH10的示意图，示出了剪接供体位点1(splice donor site 1，SD1)和剪接受体位点1(SA2)的位置以及在这些位点处的可变剪接之后所产生的融合。
图30是pCalH10的示意图，示出了剪接供体位点1(SD1)、剪接受体位点2(SA2)和剪接受体位点3(SA3)的位置。
具体实施方式
1.定义
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术性和科学性术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文中所述的类似的或等同的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和物质。出于本发明的目的，以下术语定义如下。
没有数量词修饰的名词在本文中用于指代一个/种或多于一个/种(即指代至少一个/种)语法对象。举例来说，“要素”意指一个/种要素或多于一个/种要素。
如本文中所用，“和/或”是指并且涵盖相关的所列出项目中的一个或更多个的任何和所有可能的组合，以及当以替代方案(或)解释时缺乏组合。
术语“活性剂”和“治疗剂”在本文中可互换使用，并且是指预防、降低或改善疾病或病症的至少一种症状的药剂。
术语“同时施用(administration concurrently)”或“同时施用(administeringconcurrently)”或“共同施用”等是指含有两种或更多种物质的单一组合物的施用，或将每种物质作为单独的组合物的施用和/或在足够短的时间内同期地或同时地或顺序地将每种物质通过单独的途径递送，其有效结果等同于当所有这样的物质作为单一组合物施用时所获得的结果。“同时地”意指物质在基本上相同的时间施用，并且需要在同一制剂中一起施用。“同期地”意指物质在时间上紧密地施用，例如，一种物质在另一种物质之前或之后约一分钟内至约一天内施用。任何同期性时间都是可用的。然而，通常情况下，当不同时施用时，物质将在约1分钟内至约8小时内施用，并且适当地在小于约1小时至约4小时内施用。当同期施用时，物质在对象的相同部位适当地施用。术语“相同部位”包括确切的位置，但可以在约0.5至约15厘米内，优选在约0.5至约5厘米内。本文中所用的术语“单独地”意指物质以一定间隔施用，例如以约一天至数周或数月的间隔施用。物质可以按任一顺序施用。本文中所用的术语“顺序地”意指物质是按顺序施用的，例如以一定间隔或以分钟、小时、天或周的间隔施用。如果合适的话，物质可以以规则的重复周期施用。
在本说明书通篇，除非上下文另有要求，否则词语“包含”及其变化形式将被理解为意味着包括所述步骤或要素或者步骤或要素的组，而不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素的组。因此，术语“包含”等的使用表明所列出的要素是必需的或强制性的，但其他要素是任选的，并且可存在也可不存在。“由……组成”意指包括并限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”表明所列出的要素是必需的或强制性的，并且不可存在其他要素。“基本上由……组成”意指包括在该短语之后所列出的任何要素，并限于不干扰或有助于在本公开内容中的所列出的要素所指定的活动或行动的其他要素。因此，短语“基本上由……组成”表明所列出的要素是必需的或强制性的，但其他要素是任选的，并且可存在也可不存在，这取决于其是否影响所列出的要素的活动或行动。
如本文中所用，“相应核苷酸”、“相应氨基酸残基”或“相应位置”是指存在于经比对的基因座的核苷酸、氨基酸或位置。相关的或变体多核苷酸或多肽的序列通过本领域技术人员已知的任何方法进行比对。这样的方法通常使匹配(例如，位置上的相同核苷酸或氨基酸)最大化，并且包括以下方法：例如使用人工比对和通过使用大量可用的比对程序(例如，BLASTN、BLASTP、ClustlW、ClustlW2、EMBOSS、LALIGN、Kalign等)以及本领域技术人员已知的其他方法。通过比对多核苷酸的序列，本领域技术人员能够鉴定相应核苷酸。例如，通过将SEQ ID NO：2中所示的HS4-650绝缘子与其他HS4-650绝缘子进行比对(例如，如图1所示)，本领域技术人员能够鉴定对应于SEQ ID NO：2中所示的绝缘子中的多个区域或核苷酸的其他绝缘子内的区域或核苷酸。例如，SEQ ID NO：2的第384位的A是SEQ ID NO：11的第375位的A的相应核苷酸，或与其对应。在另一个实例中，SEQ ID NO：2的核苷酸第385至386位的SA1位点对应于SEQ ID NO：20的核苷酸第375至376位的SA1位点。因此，相对于特定序列(例如HS4 650绝缘子序列)，当本文中提及核苷酸或位置时，应当理解，在合适的情况下，所述提及也是指另一个序列(例如另一个HS4 650绝缘子序列)中的相应核苷酸或位置。例如，提及HS4-650绝缘子中“核苷酸第385至386位的SA1，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的”是指在SEQ ID NO：2中所示的HS4-650绝缘子的第385至386位的SA1和其他HS4-650绝缘子中的SA1，其中所述SA1在对应于SEQ ID NO：2中所示的HS4-650绝缘子的第385至386位的位置。在另一个实例中，提及“第384位包含A的突变的HS4-650绝缘子，所述编号是相对于SEQID NO：2的”不仅涵盖SEQ ID NO：2中所示的HS4-650绝缘子，其在第384位具有A的突变，还涵盖在对应于SEQ ID NO：2的第384位的位置具有A的突变的其他HS4-650绝缘子。
在治疗疾病或病症的情况下，“有效量”意指一定量的药剂或组合物以单一剂量或作为系列的一部分向需要这样的治疗或预防的个体的施用，其对遭受该病症的症状的预防、控制这样的症状、和/或治疗该病症的现有症状是有效的。有效量将根据待治疗个体的年龄、健康和身体状况以及疾病的症状是否明显、待治疗个体的分类组、组合物的制剂、医疗状况的评估和其他相关因素而变化。最佳给药方案可以通过对对象体内药物积累的测量结果来计算。最佳剂量可根据个体对象中的相对效力而变化，并且通常可以基于在体外和体内动物模型中发现的有效的EC50值来估计。普通技术人员能够容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。该量预期将落入能够通过常规试验所确定的相对较宽的范围内。
本文中可互换使用的术语“对象”、“患者”和“个体”是指任何对象，特别是脊椎动物对象、并且甚至更特别地是哺乳动物对象(例如人)。在一些实施方案中，术语“对象”是指患有WAS的哺乳动物对象(例如人)。在另一些实施方案中，术语“对象”是指患有SCD的哺乳动物对象(例如人)。
如本文中所用，术语“表达盒”是指在载体内的一个或更多个遗传性序列，其能够表达RNA，并且在一些实施方案中，随后表达蛋白质。表达盒包含至少一个启动子和至少一个目的基因。在一些实施方案中，表达盒包括至少一个启动子、至少一个目的基因和至少一个编码用于表达的分子(例如转基因或RNAi)的另外的核酸序列。在一些实施方案中，表达盒在载体内是按定位和顺序定向的，使得盒中的核酸能够转录为RNA，并且在必要时翻译为蛋白质或多肽，经历转化细胞(例如经转导的干细胞)中的活性所需的合适的翻译后修饰，并通过靶向至合适的胞内区室或分泌至胞外区室而易位至针对生物活性的合适的区室。在一些实施方案中，盒具有适于随时插入载体中的3′和5′末端，例如，其在每个末端具有限制性内切核酸酶位点。
如本文中所用，术语“宿主细胞”是指使用本公开内容的方法待修饰的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，其中能够引入慢病毒载体。合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于人细胞、鼠细胞、非人灵长类细胞(例如恒河猴(rhesus monkey)细胞)、人祖细胞或干细胞、293细胞、HeLa细胞、D17细胞、MDCK细胞、BHK细胞和Cf2Th细胞。在某些实施方案中，包含本公开内容的表达载体的宿主细胞是造血细胞，例如造血祖细胞/干细胞(例如CD34阳性造血祖细胞/干细胞)、单核细胞、巨噬细胞、外周血单个核细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞或树突细胞。待用本公开内容的表达载体转导的造血细胞(例如CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和/或单核细胞/巨噬细胞)可以是同种异体的、自体的或来自匹配的同胞(sibling)。在一些实施方案中，造血细胞是CD34阳性的，并且可以分离自患者的骨髓或外周血。在一些实施方案中，已分离的CD34阳性造血细胞(和/或本文中所述的其他造血细胞)用如本文中所述的表达载体进行转导。
如本文中所用，术语“造血干细胞”或“HSC”是指这样的多能细胞，其能够分化为造血系统的所有细胞类型，包括但不限于粒细胞、单核细胞、红细胞、巨核细胞、淋巴细胞、树突细胞；以及具有自我更新活性，即分裂和产生至少一个具有与亲本细胞相同(例如，自我更新)特征的子细胞的能力。
如本文中所用，“HPRT”是参与嘌呤代谢的酶，其由HPRT1基因编码。HPRT1位于X染色体上，并且因此在雄性中以单拷贝存在。HPRT1编码转移酶，所述转移酶通过将5-磷酸核糖基从5-磷酸核糖基1-焦磷酸转移至嘌呤来催化次黄嘌呤转化为肌苷一磷酸以及催化鸟嘌呤转化为鸟苷一磷酸。该酶的功能主要是从降解的DNA中回收嘌呤用于更新的嘌呤合成。
如本文中所用，术语“慢病毒”是指能够感染分裂细胞和非分裂细胞的逆转录病毒属。慢病毒的数个实例包括HIV(人免疫缺陷病毒：包括HIV 1型和HIV 2型)、人获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病原体；梅迪-维斯纳(visna-maedi)，其引起绵羊脑炎(visna)或肺炎(maedi)，山羊(caprine)关节炎脑炎病毒，其引起山羊(goat)免疫缺陷、关节炎和脑病；马(equine)感染性贫血病毒，其引起马(horse)的脑病和自身免疫性溶血性贫血；猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiencyvirus，FIV)，其引起猫(cat)免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(bovine immune deficiencyvirus，BIV)，其引起牛的淋巴结病、淋巴细胞增多，以及可能的中枢神经系统感染；以及猿(simian)免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)，其引起亚人灵长类免疫缺陷和脑病。
如本文中所用，术语“慢病毒载体”用于表示来源于慢病毒并用于通过转导将遗传物质转移至细胞中的任何形式的核酸。该术语涵盖慢病毒载体核酸(例如DNA和RNA)，这些核酸的已封装的形式，以及病毒载体核酸已包装在其中的病毒颗粒。
如本文中所用，术语“突变的”是指序列(例如核苷酸或氨基酸序列)相对于相应序列(即非突变的序列)的天然、标准或参考版本的变化。
如本文中所用，术语“可操作连接”是指核酸表达控制序列(例如启动子、信号序列、增强子或转录因子结合位点的阵列)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中当合适的分子(例如转录激活蛋白)与表达控制序列结合时，表达控制序列影响对应于第二序列的核酸的转录和/或翻译。
如本文中所用，术语“启动子”是指与RNA聚合酶结合的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶启动并转录与启动子可操作连接的多核苷酸。在一些实施方案中，在哺乳动物细胞中操作的启动子包括位于转录启动位点上游约25至30个碱基的富含AT的区域和/或在转录开始上游存在的约70至约80个碱基的另一个序列，例如N可以是任何核苷酸的CNCAAT区域。
如本文中所用，术语“小发夹RNA”或“shRNA”是指包含反义区、环部分和有义区的RNA分子，其中有义区具有与反义区碱基配对以形成双链体茎的互补核苷酸。在转录后处理之后，小发夹RNA通过酶DICER所介导的切割事件转化为小干扰RNA，DICER酶是RNA酶III家族的成员。如本文中所用，短语“转录后处理”是指在转录之后发生的mRNA处理，并且其例如由酶DICER和/或Drosha介导。
如本文中所用，术语“转导(transduce)”或“转导(transduction)”是指使用病毒载体或逆转录病毒载体通过感染而不是通过转染对基因的递送。例如，由逆转录病毒载体(用作将核酸引入至细胞中的载体的经修饰的逆转录病毒)携带的抗HPRT基因能够通过感染和原病毒整合转导至细胞中。因此，“经转导的基因”是通过慢病毒或载体感染和原病毒整合引入至细胞中的基因。病毒载体(例如“转导载体”)将基因转导至“靶细胞”或宿主细胞中。
如本文中所用，术语“治疗”及其变化形式等是指在需要治疗的对象，即患有疾病或病症的对象中获得期望的药理学和/或生理学作用。“治疗”意指改善或预防疾病或病症的一种或更多种症状或影响(例如结果)。提及“治疗”及其变化形式不一定意味着逆转或预防疾病或病症的任何或所有症状或影响。例如，对象最终可遭受一种或更多种症状或影响，但与治疗之前相比，症状或影响的数目和/或严重程度降低和/或生活质量提高。
除非另有明确说明，否则本文中所描述的每个实施方案将在必要的修改后应用于每一个实施方案。
表1.序列简述
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
2.慢病毒载体
本公开内容提供了可用于基因治疗应用的慢病毒载体，例如用于治疗包括WAS或SCD的疾病或病症。在一个方面中，慢病毒载体包含可操作连接至转基因(即可操作连接至第一核酸序列，其中所述第一核酸序列编码蛋白质或多核苷酸，例如治疗性蛋白质或多核酸)的第一启动子和经修饰的HS4-650绝缘子。当经修饰的HS4-650绝缘子存在于载体中时，该绝缘子包含存在于未经修饰的HS4-650绝缘子中的一个或更多个隐蔽剪接受体位点的失活。在另一个方面中，慢病毒载体包含可操作连接至转基因(即可操作连接至第一核酸序列，其中所述第一核酸序列编码蛋白质或多核苷酸，例如治疗性蛋白质或多核酸)的第一启动子和经修饰的HS4-400绝缘子。当经修饰的HS4-400绝缘子存在于载体中时，该绝缘子包含存在于未经修饰的HS4-400绝缘子中的一个或更多个隐蔽剪接受体位点的失活。
因此，如本文中所述，当整合至细胞基因组中时，与包含未经修饰的HS4-650绝缘子或未经修饰的HS4-400绝缘子的慢病毒载体相比，本公开内容的慢病毒载体可以与降低的可变剪接相关(例如，以下中的降低的可变剪接：慢病毒载体所整合至细胞中的基因的转录物；慢病毒载体RNA；和/或由慢病毒载体编码的转基因的转录物)。在一些实例中，可变剪接的水平降低了至少或约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
出于本公开内容的目的，慢病毒载体是这样的载体，其包含核酸，所述核酸包含可来源于慢病毒的至少一个组分部分。该组分部分可参与载体感染细胞、表达基因或进行复制的生物学机制。因此，慢病毒载体包含核酸分子，例如质粒和病毒颗粒。
逆转录病毒基因组和慢病毒基因组的基本结构具有许多共同的特征，例如5′LTR和3′LTR，在其之间或内部有：使基因组能够被包装的包装信号，引物结合位点，使得能够整合至宿主细胞基因组中的整合位点，以及编码包装组分的gag、pol和env基因，所述包装组分是组装病毒颗粒所需的多肽。慢病毒具有另外的特征，例如rev和rev响应元件(revresponse element，RRE)序列，其使经整合的原病毒的RNA转录物能够有效地从经感染的靶细胞的细胞核输出至胞质。在原病毒中，病毒基因的两个末端的两侧是被称为长末端重复(long terminal repeat，LTR)的区域。LTR负责原病毒性整合和转录。LTR还作为增强子-启动子序列，并且能够控制病毒基因的表达。LTR本身是相同的序列，其可分为三个元件，称为“U3”、“R”和“U5”。U3来源于RNA的3′末端特有的序列，R来源于在RNA的两个末端处重复的序列，以及U5来源于RNA的5′末端特有的序列。这三个元件的尺寸在不同的病毒之间可以有相当大的变化。
在一个实施方案中，可以从载体中除去复制所必需的一个或更多个蛋白质编码区的至少一部分，这使得载体是复制缺陷性的。病毒基因组的部分也可以用核酸替代，以产生包含该核酸的载体，所述载体能够转导靶标非分裂性宿主细胞和/或将其基因组整合至宿主基因组中。在一个实施方案中，慢病毒载体是如美国专利申请序列No.12/138,993(通过引用并入本文)所述的非整合性载体。
慢病毒载体可以具有已经经过操作以除去非必需元件并保留必需元件的基因组，以提供所需的功能来感染、转导目的核苷酸序列并将其递送至靶宿主细胞(参见例如美国专利No.6,669,936，通过引用并入)。在一些实施方案中，基因组被限于充分的慢病毒遗传信息，以允许在包装组分存在的情况下将RNA基因组包装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中。靶细胞的感染可以包括逆转录和整合至靶细胞基因组中。在一些实施方案中，载体不能独立复制从而不能在最终靶细胞内产生感染性慢病毒颗粒。在一些实施方案中，慢病毒载体缺少功能性gag-pol和/或env基因和/或者复制所必需的其他基因。
在一些实例中，慢病毒载体是自失活载体。自失活载体可以通过删除3′LTR的U3区域中的增强子和启动子或转录增强子来构建。在一轮载体逆转录和整合之后，这些变化被复制至5′LTR和3′LTR二者中，从而产生转录失活的原病毒(Y Yu et al.(1986)，Proceedings Nat′l Acad.Sci.USA，83：3194-98；Dougherty and Temin et al.(1987)，Proceedings Nat′l Acad.Sci.USA，84：1197-01；Hawley(1987)，Proceedings Nat′lAcad.Sci.USA，84：2406-10；Yee et al.(1994)，Proceedings Nat′l Acad.Sci.USA，91：9564-68)。然而，这样的载体中LTR内部的任何启动子仍将是具有转录活性的。该策略已被用于消除病毒性LTR中的增强子和启动子对内置基因转录的影响。这样的影响包括提高转录(Jolly et al.(1983)，Nucleic Acids Research，11：1855-72)或对转录的抑制(Emerman and Temin(1984)，Cell，39：449-67)。该策略也可用于消除从3′LTR至基因组DNA中的下游转录(Herman&Coffin(1987)，Science，236：845-48)。
用于在宿主细胞/包装细胞内产生病毒基因组的质粒载体还将包含可操作连接至慢病毒基因组的转录调节控制序列，以指导该基因组在宿主细胞/包装细胞中的转录。这些调节序列可以是与经转录的慢病毒序列相关的天然序列，即5′U3区域，或者其可以是异源性的或经修饰的启动子，例如另一个病毒性启动子，例如CMV启动子或7tetO启动子/操作子。一些慢病毒基因组需要另外的序列用于有效的病毒产生。例如，在基于HIV的慢病毒载体的情况下，优选包括rev和RRE序列；然而，对rev和RRE的需求可以通过密码子优化来降低或消除(参见美国专利申请序列No.12/587,236，通过引用并入)。执行与rev/RRE系统相同功能的替代性序列也是已知的。例如，在梅森-辉瑞猴病毒(Mason Pfizer monkey virus)中发现了revIRRE系统的功能性类似物。这被称为组成型转运元件(constitutivetransport element，CTE)，并在基因组中包含RRE型序列，该序列被认为与经感染的细胞中的因子相互作用。细胞因子可以被认为是rev的类似物。因此，CTE可以用作reviRRE系统的替代物。已知或变得可用的任何其他功能性等价物可以与本公开内容的载体相关。例如，HTLV-1的Rex蛋白可以在功能上替代HIV-1的Rev蛋白。同样已知的是，Rev和Rex具有与IRE-BP相似的作用。
在一些实施方案中，表达载体包含来自慢病毒的5′和3′长末端重复(LTR)的序列。在一些实施方案中，载体包含来自慢病毒的5′LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的已失活的或自失活的3′LTR。在一些实施方案中，LTR序列是HIV LTR序列。
在一些实施方案中，本文中所预期的慢病毒载体可以是整合的或非整合的(也称为整合缺陷性慢病毒)。如本文中所用，术语“整合缺陷性慢病毒”或“IDLV”是指这样的慢病毒：所述慢病毒具有整合酶，其缺少将病毒基因组整合至宿主细胞基因组中的能力。在一些应用中，通过整合慢病毒载体的使用可以避免由整合慢病毒所诱导的潜在插入性诱变。整合缺陷性慢病毒载体通常通过对慢病毒整合酶基因进行突变或通过对LTR的连接序列进行修饰来产生(参见，例如Sarkis et al.(2008)，Curr.Gene.Ther.，6：430-437)。慢病毒整合酶由HIV-1 Pol区域进行编码，并且该区域不能被删除，因为其编码其他关键活性，包括逆转录、核输入和病毒颗粒组装。pol中改变整合酶蛋白的突变落入以下两类之一：选择性地仅影响整合酶活性的那些突变(I类)；或具有多效性作用的那些突变(II类)。整合酶蛋白的整个N和C端以及催化核心区域的突变产生影响多种功能的II类突变，所述功能包括颗粒形成和逆转录。I类突变将其影响限制于整合酶的催化活性、DNA结合、线性附加体处理和多聚化。最常见的I类突变位点是在整合酶的催化核心的三个残基，包括D64、D116、和E152。每个突变已表明有效地抑制整合，其整合频率比正常整合载体的整合频率低高达四个对数，同时保持NILV的转基因表达。另一种用于抑制整合的替代性方法是在整合酶DNA连接位点(LTR att位点)中分别在5′LTR和3′LTR末端的U3区域的12个碱基对区域内或U5区域的11个碱基对区域内引入突变。这些序列包含在整合酶介导的末端处理之后所暴露的保守性末端CA二核苷酸。在保守性CA/TG二核苷酸处的单突变或双突变导致整合频率的高达三至四个对数的降低；然而，其保留了有效病毒性转导的所有其他必要功能。
2.1转基因
转基因可以是编码治疗性表达产物(例如蛋白质或多核苷酸)的任何基因，所述治疗性表达产物能够校正靶细胞(例如HSC)中的缺陷。转基因可以包括基因组序列、cDNA序列和较小的经改造的基因区段，其表达或可以适于表达保持由转基因所编码的全长多肽的一些或全部治疗性功能的蛋白质、多肽、结构域、融合蛋白和突变体。
在一些具体实施方案中，转基因编码威斯科特-奥尔德里奇综合征(WAS)蛋白(WASP)。因此，在一些实施方案中，本公开内容的慢病毒载体包含第一核酸序列，其中所述第一核酸序列编码WASP。示例性WASP包括包含SEQ ID NO：76中所示的氨基酸序列的WASP，以及与SEQ ID NO：76中所示的WASP具有至少或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％序列同一性的WASP。在一些实施方案中，编码WASP的核酸序列包含与SEQ ID NO：73至75中任一者所示的核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％序列同一性的序列。在另一些实施方案中，转基因是珠蛋白转基因，例如γ-珠蛋白转基因。
在一些具体实施方案中，转基因编码珠蛋白转基因。因此，在一些实施方案中，本公开内容的慢病毒载体包含第一核酸序列，其中所述第一核酸序列编码珠蛋白转基因。示例性珠蛋白转基因包括包含SEQ ID NO：103中所示的氨基酸序列的珠蛋白转基因，以及与SEQ ID NO：103中所示的蛋白质具有至少或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％序列同一性的珠蛋白转基因。在一些实施方案中，编码珠蛋白蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO：101至102中任一者所示的核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％序列同一性的序列。
2.2 HS4-650绝缘子
本公开内容的一些慢病毒载体包含经修饰的HS4-650绝缘子，其相对于未经修饰的HS4-650绝缘子具有一个或更多个已失活的或已断裂的剪接受体位点。
绝缘子元件具有两种重要的活性：“增强子阻断活性”，其中绝缘子阻止增强子和启动子之间的相互作用，以及“屏障活性”，由此绝缘子通过染色质凝聚阻止转基因沉默。屏障活性能够有效地提高转基因表达，而增强子阻断活性能够阻止载体中的增强子在附近整合时作用于正常失活的癌基因启动子。
具有屏障和增强子阻断功能的最充分表征的绝缘子是1.2kb的片段，该片段含有来自鸡β-珠蛋白基因座的超敏位点4(cHS4)。虽然该绝缘子在提高转基因表达和降低不需要的启动子活性方面是有效的，但其已被表降低了病毒滴度，从而限制用于临床使用的大规模病毒产生。一种替代性形式，650bp的cHS4绝缘子，其包含HS4-核心(250bp)和HS4-Ext(400bp)，并被称为HS4-650(或cHS4-650)，其保留屏障和增强子阻断功能，但不以与1.2kb片段相同的方式影响病毒的产生(参见例如Arumugam et al.(2009)，PLoS ONE，4(9)：e6995；Wielgosz et al.(2015)，Molecular Therapy-Methods&Clinical Development，2，14063)。另一种替代性形式，400bp的cHS4绝缘子，其包含HS4-Ext(400bp)并被称为HS4-400(或cHS4 400)，也保留了屏障和增强子阻断功能，但不以与1.2kb片段相同的方式影响病毒的产生。
如本文中所确定的，cHS4来源的绝缘子，包括HS4-650和HS4-400绝缘子，当存在于病毒载体中时，可以包含隐蔽剪接受体位点。这些剪接受体位点在SEQ ID NO：1中所示的HS4-650绝缘子中被鉴定出(当该绝缘子反向存在于慢病毒载体中时)，由此剪接受体位点在载体的正链中。因此，剪接受体位点在SEQ ID NO：1的反向互补序列中。该反向互补序列如SEQ ID NO：2所示出。剪接受体位点包括剪接受体位点1(SA1)、剪接受体位点2(SA2)和剪接受体位点3(SA3)。表2示出了这些剪接位点在SEQ ID NO：2中所示的HS4-650绝缘子中的序列和位置。
表2.HS4-650绝缘子中的剪接位点
2.2.1 SA1
如表2所示，SA1存在于SEQ ID NO：2的第385至386位(即剪接发生在第385位的G和第386位的A之间)和其他反向互补HS4-650绝缘子序列的相应位置，包括SEQ ID NO：11、20、29、38和47中所示的位置(参见图1)。SA1也可以限定为包含序列TTGCATCCAG^ACACCATCAA(SEQ ID NO：60)，其中^表示剪接位置。
本公开内容的慢病毒载体包含经修饰的HS4-650绝缘子，当存在于慢病毒载体中时，所述绝缘子包含已失活的SA1(相对于当存在于该慢病毒载体中时未经修饰的HS4-650绝缘子)。因此，当存在于载体中时，经修饰的HS4-650绝缘子相对于未经修饰的HS4-650绝缘子包含修饰，其中所述修饰导致SA1的失活。因此，与包含未经修饰的HS4-650绝缘子的慢病毒载体中在第385至386位发生的剪接相比，当转导至细胞中时，包含经修饰的HS4-650绝缘子的慢病毒载体在第385至386位表现出降低的剪接，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些实例中，剪接降低至少或约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，修饰是或包含经修饰的HS4-650绝缘子的序列相对于未经修饰的HS4-650绝缘子的突变。在另一些实例中，修饰是经修饰的HS4-650绝缘子在载体中的方向相对于未经修饰的HS4-650绝缘子在载体中时的方向的变化。如将理解的，在修饰是绝缘子方向的改变的情况下，与未经修饰的HS4-650绝缘子相比，经修饰的HS4-650绝缘子的序列可以没有修饰。
未经修饰的HS4-650绝缘子包括当存在于慢病毒载体中时包含活性SA1的绝缘子，即在慢病毒载体内包含能够促进在SA1处的剪接的序列和方向。示例性未经修饰的HS4-650绝缘子包含SEQ ID NO：1、10、19、28、37和46中所示的序列(具有SEQ ID NO：2、11、20、29、38和47中所示的反向互补序列)和与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是SA1位点仍然存在，例如前提是HS4-650绝缘子的反向互补包含序列TTGCATCCAGACACCATCAA(SEQ ID NO：60))。在一些实例中，未经修饰的HS4-650绝缘子是在慢病毒载体中处于反向的绝缘子，使得SA1存在于正链上。在另一些实例中，与转基因相比，未经修饰的HS4-650绝缘子是处于反向的绝缘子，使得SA1存在于转基因转录物的正链上。
在一些具体实例中，相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，经修饰的HS4-650绝缘子含有突变(例如核苷酸缺失、插入或替代)，其中所述突变使存在于所述未经修饰的HS4-650绝缘子中的SA1失活(或与发生在未经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列的第385至386位的剪接相比降低所述经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列在第385至386位的剪接，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的)。突变可以是任何使SA1失活或使SA1断裂的突变。在一些实例中，突变是SA1序列中任何核苷酸的缺失或替换，或插入至SA1序列(例如序列TTGCATCCAGACACCATCAA(SEQ ID NO：60))的核苷酸。在一些具体实例中，突变是第384位的A、第385位的G、第386位的A和/或第387位的C的突变(例如缺失或替换)，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。例如，经修饰的HS4-650绝缘子可包含第384位的A至T、A至C或A至G突变，第385位的G至C、G至A或G至T突变，第386位的A至T、A至C或A至G突变、和/或第387位的C至G、C至T或C至A突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在另一些实例中，突变包含在第384、385或386位之后的核苷酸的插入。在一些实例中，经修饰的HS4-650绝缘子包含两种或更多种这样的突变。
在一个实例中，经修饰的HS4-650绝缘子在反向互补序列中(即互补链中)的第384位包含A至T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些具体实施方案中，经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：3、12、21、30、39和48中任一者所示的序列，或者与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是存在第384位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的)。
在一些实例中，本文中所述的具有使SA1失活的突变的经修饰的HS4-650绝缘子处于与转基因相反的方向(即，处于与第一核酸序列相反的方向)。在一些具体实例中，第一核酸在慢病毒载体内是处于正向的，而经修饰的HS4-650绝缘子在慢病毒载体内是处于反向的。
在另一个实例中，经修饰的HS4-650绝缘子在慢病毒载体中处于与未经修饰的HS4-650绝缘子在慢病毒载体中时的相反的方向，即相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，经修饰的HS4-650绝缘子是反向的，以使SA1失活。在一些具体实例中，经修饰的HS4-650绝缘子在载体中是处于正向的。因此，还提供了这样的慢病毒载体，所述慢病毒载体包含第一启动子，其可操作连接至第一核酸序列，其中所述第一核酸序列编码WASP；以及包含HS4-650绝缘子，其中所述HS4-650绝缘子在所述载体中是处于正向的。在一些实例中，第一核酸序列在载体中也是处于正向的。在一些实例中，HS4-650绝缘子包含SEQ ID NO：1、10、19、28、37和46中任一者所示的序列或者与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
2.2.2 SA2
SA2存在于SEQ ID NO：2的第446至447位(即剪接发生在第446位的G和第447位的G之间)和其他反向互补HS4-650绝缘子序列的相应位置，包括SEQ ID NO：11、20、29、38和47中所示的位置(参见图1)。SA2也可以限定为包含序列ATCCCCCCAG^GTGTCTGCAG(SEQ ID NO：61)，其中^表示剪接位置。
本公开内容的慢病毒载体包含经修饰的HS4-650绝缘子，当存在于慢病毒载体中时，所述绝缘子包含已失活的SA2(相对于当存在于该慢病毒载体中时的未经修饰的HS4-650绝缘子)。因此，当存在于载体中时，经修饰的HS4-650绝缘子相对于未经修饰的HS4-650绝缘子包含修饰，其中所述修饰导致SA2的失活。因此，与包含未经修饰的HS4-650绝缘子的慢病毒载体中在第446至447位发生的剪接相比，当转导至细胞中时，包含经修饰的HS4-650绝缘子的慢病毒载体在第446至447位表现出降低的剪接，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些实例中，剪接降低至少或约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，修饰是或包含经修饰的HS4-650绝缘子的序列相对于未经修饰的HS4-650绝缘子的突变。在另一些实例中，修饰是经修饰的HS4-650绝缘子在载体中的方向相对于未经修饰的HS4-650绝缘子在载体中时的方向的变化。如将理解的，在修饰是绝缘子方向的改变的情况下，与未经修饰的HS4-650绝缘子相比，经修饰的HS4-650绝缘子的序列可以没有修饰。
未经修饰的HS4-650绝缘子包括当存在于慢病毒载体中时包含活性SA2的绝缘子，即在慢病毒载体内包含能够促进在SA2处的剪接的序列和方向。示例性未经修饰的HS4-650绝缘子包含SEQ ID NO：1、10、19、28、37和46中所示的序列(具有SEQ ID NO：2、11、20、29、38和47中所示的反向互补序列)和与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是SA2位点仍然存在，例如前提是HS4-650绝缘子的反向互补包含序列ATCCCCCCAGGTGTCTGCAG(SEQ ID NO：61))。在一些实例中，未经修饰的HS4-650绝缘子是在慢病毒载体中处于反向的绝缘子，使得SA2存在于正链上。在另一些实例中，与转基因相比，未经修饰的HS4-650绝缘子是处于反向的绝缘子，使得SA2存在于转基因转录物的正链上。
在一些具体实例中，相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，经修饰的HS4-650绝缘子含有突变(例如核苷酸缺失、插入或替代)，其中所述突变使存在于所述未经修饰的HS4-650绝缘子中的SA2失活(或与发生在未经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列的第446至447位的剪接相比降低所述经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列在第446至447位的剪接，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的)。突变可以是任何使SA2失活或使SA2断裂的突变。在一些实例中，突变是SA2序列中任何核苷酸的缺失或替换，或插入至SA2序列(例如序列ATCCCCCCAGGTGTCTGCAG(SEQ ID NO：61))的核苷酸。在一些具体实例中，突变是第445位的A、第446位的G、第447位的G和/或第448位的T的突变(例如缺失或替换)，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。例如，经修饰的HS4-650绝缘子可包含第445位的A至T、A至C或A至G突变，第446位的G至C、G至A或G至T突变，第447位的G至C、G至T或G至A突变、和/或者第448位的T至A、T至C或T至G突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在另一些实例中，突变包含在第445、446或447位之后的核苷酸的插入。在一些实例中，经修饰的HS4-650绝缘子包含两种或更多种这样的突变。
在一个实例中，经修饰的HS4-650绝缘子在反向互补序列中的第445位包含A至T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些具体实施方案中，经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：7、16、25、34、43和52中任一者所示的序列，或者与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是存在第445位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的)。
在一些实例中，本文中所述的具有使SA2失活的突变的经修饰的HS4-650绝缘子处于与转基因相反的方向(即，处于与第一核酸序列相反的方向)。在一些具体实例中，第一核酸在慢病毒载体内是处于正向的，而经修饰的HS4-650绝缘子在慢病毒载体内是处于反向的。
在另一个实例中，经修饰的HS4-650绝缘子在慢病毒载体中处于与未经修饰的HS4-650绝缘子在慢病毒载体中时的相反的方向，即相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，经修饰的HS4-650绝缘子是反向的，以使SA2失活。在一些具体实例中，经修饰的HS4-650绝缘子在载体中是处于正向的。
2.2.3 SA3
SA3存在于SEQ ID NO：2的第456至457位(即剪接发生在第456位的G和第457位的G之间)和其他反向互补HS4-650绝缘子序列的相应位置，包括SEQ ID NO：11、20、29、38和47中所示的位置(参见图1)。SA3也可以限定为包含序列GTGTCTGCAG^GCTCAAAGAG(SEQ ID NO：62)，其中^表示剪接位置。
本公开内容的慢病毒载体包含经修饰的HS4-650绝缘子，当存在于慢病毒载体中时，所述绝缘子包含已失活的SA3(相对于当存在于该慢病毒载体中时的未经修饰的HS4-650绝缘子)。因此，当存在于载体中时，经修饰的HS4-650绝缘子相对于未经修饰的HS4-650绝缘子包含修饰，其中所述修饰导致SA3的失活。因此，与包含未经修饰的HS4-650绝缘子的慢病毒载体中在第456至457位发生的剪接相比，当转导至细胞中时，包含经修饰的HS4-650绝缘子的慢病毒载体在第456至457位表现出降低的剪接，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些实例中，剪接降低至少或约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，修饰是或包含经修饰的HS4-650绝缘子的序列相对于未经修饰的HS4-650绝缘子的突变。在另一些实例中，修饰是经修饰的HS4-650绝缘子在载体中的方向相对于未经修饰的HS4-650绝缘子在载体中时的方向的变化。如将理解的，在修饰是绝缘子方向的改变的情况下，与未经修饰的HS4-650绝缘子相比，经修饰的HS4-650绝缘子的序列可以没有修饰。
未经修饰的HS4-650绝缘子包括当存在于慢病毒载体中时包含活性SA3的绝缘子，即在慢病毒载体内包含能够促进在SA3处的剪接的序列和方向。示例性未经修饰的HS4-650绝缘子包含SEQ ID NO：1、10、19、28、37和46中所示的序列(具有SEQ ID NO：2、11、20、29、38和47中所示的反向互补序列)和与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是SA3位点仍然存在，例如前提是HS4-650绝缘子的反向互补包含序列GTGTCTGCAGGCTCAAAGAG(SEQ ID NO：62))。在一些实例中，未经修饰的HS4-650绝缘子是在慢病毒载体中处于反向的绝缘子，使得SA3存在于正链上。在另一些实例中，与转基因相比，未经修饰的HS4-650绝缘子是处于反向的绝缘子，使得SA3存在于转基因转录物的正链上。
在一些具体实例中，相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，经修饰的HS4-650绝缘子含有突变(例如核苷酸缺失、插入或替代)，其中所述突变使存在于所述未经修饰的HS4-650绝缘子中的SA3失活(或与发生在未经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列的第456至457位的剪接相比降低所述经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列在第456至457位的剪接，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的)。突变可以是任何使SA3失活或使SA3断裂的突变。在一些实例中，突变是SA3序列中任何核苷酸的缺失或替换，或插入至SA3序列(例如序列GTGTCTGCAGGCTCAAAGAG(SEQ ID NO：62))的核苷酸。在一些具体实例中，突变是第455位的A、第446位的G、第457位的G和/或第458位的C的突变(例如缺失或替换)，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。例如，经修饰的HS4-650绝缘子可包含第455位的A至T、A至C或A至G突变，第456位的G至C、G至A或G至T突变，第447位的G至C、G至T或G至A突变、和/或者第458位的C至A、C至G或C至T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在另一些实例中，突变包含在第455、456或457位之后的核苷酸的插入。在一些实例中，经修饰的HS4-650绝缘子包含两种或更多种这样的突变。
在一个实例中，经修饰的HS4-650绝缘子在反向互补序列中的第455位包含A至T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些具体实施方案中，经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：9、18、27、36、45和54中任一者所示的序列，或者与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是存在第455位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的)。
在一些实例中，本文中所述的具有使SA3失活的突变的经修饰的HS4-650绝缘子处于与转基因相反的方向(即，处于与第一核酸序列相反的方向)。在一些具体实例中，第一核酸在慢病毒载体内是处于正向的，而经修饰的HS4-650绝缘子在慢病毒载体内是处于反向的。
在另一个实例中，经修饰的HS4-650绝缘子在慢病毒载体中处于与未经修饰的HS4-650绝缘子在慢病毒载体中时的相反的方向，即相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，经修饰的HS4-650绝缘子是反向的，以使SA3失活。在一些具体实例中，经修饰的HS4-650绝缘子在载体中是处于正向的。
2.2.4组合突变
相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，经修饰的HS4-650绝缘子可以包含使SA1、SA2或SA3中的两个或更多个失活的两个或者突变。上述用于使SA1、SA2和/或SA3失活的任何突变都可以在经修饰的HS4-650绝缘子中组合。
在一个实例中，经修饰的HS4-650绝缘子包含使SA1失活的突变和使SA2失活的突变。例如，经修饰的HS4-650绝缘子可以包含在反向互补序列中第384位的A至T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的，并且包含在反向互补序列中第445位的A至T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些具体实施方案中，经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：4、13、22、31、40和49中任一者所示的序列，或者与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是存在第384位的T和第445位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的)。
在另一个实例中，经修饰的HS4-650绝缘子包含使SA1失活的突变和使SA3失活的突变。例如，经修饰的HS4-650绝缘子可以包含在反向互补序列中第384位的A至T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的，并且包含在反向互补序列中第455位的A至T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些具体实施方案中，经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：5、14、23、32、41和50中任一者所示的序列，或者与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是存在第384位的T和第455位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的)。
经修饰的HS4-650绝缘子还可包含使SA2失活的突变和使SA3失活的突变。例如，经修饰的HS4-650绝缘子可以包含在反向互补序列中第445位的A至T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的，并且包含在反向互补序列中第455位的A至T突变，所述编号是相对于SEQID NO：2的。在一些具体实施方案中，经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列包含SEQ IDNO：8、17、26、35、44和43中任一者所示的序列，或者与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是存在第445位的T和第455位的T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的)。
在另一个实例中，经修饰的HS4-650绝缘子包含使SA1失活的突变、使SA2失活的突变和使SA3失活的突变。例如，在一些实施方案中，经修饰的HS4-650绝缘子包含在反向互补序列中第384位的A至T突变、包含在反向互补序列中第445位的A至T突变和包含在反向互补序列中第455位的A至T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。在一些具体实施方案中，经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：6、15、24、33、42和51中任一者所示的序列，或者与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是存在第384位的T、第445位的T和第455位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的)。
2.3 HS4-400绝缘子
本公开内容的慢病毒载体可以包含HS4-400绝缘子。在一些具体实施方案中，相对于未经修饰的HS4-400绝缘子，HS4-400绝缘子是具有一个或更多个已失活的或已断裂的剪接受体位点的经修饰的HS4-400绝缘子。示例性HS4-400绝缘子是包含SEQ ID NO：89中所示的序列的绝缘子，或与其具有至少或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％、或99％序列同一性的绝缘子。
如本文中所确定的，当存在于病毒载体中时，HS4-400绝缘子可以包含隐蔽剪接受体位点。这些剪接受体位点在SEQ ID NO：89中所示的HS4-400绝缘子中被鉴定出(当该绝缘子反向存在于慢病毒载体中时)，由此剪接受体位点在载体的正链中。因此，剪接受体位点在SEQ ID NO：89的反向互补序列中。该反向互补序列如SEQ ID NO：90所示。剪接受体位点包括剪接受体位点2(SA2)和剪接受体位点3(SA3)。表3示出了这些剪接位点在SEQ ID NO：2中所示的HS4-400绝缘子序列中的序列和位置。
表3.HS4-400绝缘子中的剪接位点
2.3.1 SA2
SA2存在于SEQ ID NO：90的第190至191位(即剪接发生在第190位的G和第191位的G之间)和其他反向互补HS4-400绝缘子序列的相应位置。SA2也可以限定为包含序列ATCCCCCCAG^GTGTCTGCAG(SEQ ID NO：61)，其中^表示剪接位置，或包含HS4-400绝缘子的互补链的第181至200位的核苷酸序列，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的。
本公开内容的慢病毒载体包含经修饰的HS4-400绝缘子，当存在于慢病毒载体中时，所述绝缘子包含已失活的SA2(相对于当存在于该慢病毒载体中时的未经修饰的HS4-400绝缘子)。因此，当存在于载体中时，经修饰的HS4-400绝缘子相对于未经修饰的HS4-400绝缘子包含修饰，其中所述修饰导致SA2的失活。因此，与包含未经修饰的HS4-400绝缘子的慢病毒载体中在第190至191位发生的剪接相比，当转导至细胞中时，包含经修饰的HS4-400绝缘子的慢病毒载体在第190至191位表现出降低的剪接，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的。在一些实例中，剪接降低至少或约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，修饰是或包含经修饰的HS4-400绝缘子的序列相对于未经修饰的HS4-400绝缘子的突变。在另一些实例中，修饰是经修饰的HS4-400绝缘子在载体中的方向相对于未经修饰的HS4-400绝缘子在载体中时的方向的变化。如将理解的，在修饰是绝缘子方向的改变的情况下，与未经修饰的HS4-400绝缘子相比，经修饰的HS4-400绝缘子的序列可以没有修饰。
未经修饰的HS4-400绝缘子包括当存在于慢病毒载体中时包含活性SA2的绝缘子，即在慢病毒载体内包含能够促进在SA2处的剪接的序列和方向。示例性未经修饰的HS4-400绝缘子包括这样的绝缘子，其包含SEQ ID NO：89中所示的序列(具有SEQ ID NO：90中所示的反向互补序列)和与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是SA2位点仍然存在，例如前提是HS4-400绝缘子的反向互补包含序列ATCCCCCCAGGTGTCTGCAG(SEQ ID NO：61))。在一些实例中，未经修饰的HS4-400绝缘子是在慢病毒载体中处于反向的绝缘子，使得SA2存在于正链上。
在一些具体实例中，相对于未经修饰的HS4-400绝缘子，经修饰的HS4-400绝缘子含有突变(例如核苷酸缺失、插入或替代)，其中所述突变使存在于所述未经修饰的HS4-400绝缘子中的SA2失活(或与发生在未经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列的第190至191位的剪接相比降低所述经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列在第190至191位的剪接，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的)。突变可以是任何使SA2失活或使SA2断裂的突变。在一些实例中，突变是SA2序列中任何核苷酸的缺失或替换，或插入至SA2序列(例如序列ATCCCCCCAGGTGTCTGCAG(SEQ ID NO：61))的核苷酸。在一些具体实例中，突变是第189位的A、第190位的G、第191位的G和/或第192位的T的突变(例如缺失或替换)，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的。例如，经修饰的HS4-400绝缘子可包含第189位的A至T、A至C或A至G突变，第190位的G至C、G至A或G至T突变，第191位的G至C、G至T或G至A突变、和/或者第192位的T至A、T至C或T至G突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的。在另一些实例中，突变包含在第189、190或191位之后的核苷酸的插入。在一些实例中，经修饰的HS4-400绝缘子包含两种或更多种这样的突变。
在一个实例中，经修饰的HS4-400绝缘子在反向互补序列中的第189位包含A至T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的。在一些具体实施方案中，经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：93中所示的序列，或者与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是存在第189位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的)。
在一些实例中，本文中所述的具有使SA2失活的突变的经修饰的HS4-400绝缘子在慢病毒载体内是处于反向的。
在另一个实例中，经修饰的HS4-400绝缘子在慢病毒载体中处于与未经修饰的HS4-400绝缘子在慢病毒载体中时的相反的方向，即相对于未经修饰的HS4-400绝缘子，经修饰的HS4-400绝缘子是反向的，以使SA2失活。在一些具体实例中，经修饰的HS4-400绝缘子在载体中是处于正向的。因此，还提供了这样的慢病毒载体，所述慢病毒载体包含第一启动子，其可操作连接至第一核酸序列，其中所述第一核酸序列包含含有HBB内含子2的经修饰的γ-珠蛋白转基因；以及包含HS4-400绝缘子，其中所述HS4-400绝缘子在所述载体中是处于正向的。在一些实例中，第一核酸序列在载体中是处于反向的。在一些实例中，HS4-400绝缘子包含SEQ ID NO：90中所示的序列或者与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
2.3.2 SA3
SA3存在于SEQ ID NO：90的第200至201位(即剪接发生在第200位的G和第201位的G之间)和其他反向互补HS4-400绝缘子序列的相应位置。SA3也可以限定为包含序列GTGTCTGCAG^GCTCAAAGAG(SEQ ID NO：62)，其中^表示剪接位置，或包含HS4-400绝缘子的互补链的第191至210位的核苷酸序列，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的。
本公开内容的慢病毒载体包含经修饰的HS4-400绝缘子，当存在于慢病毒载体中时，所述绝缘子包含已失活的SA3(相对于当存在于该慢病毒载体中时的未经修饰的HS4-400绝缘子)。因此，当存在于载体中时，经修饰的HS4-400绝缘子相对于未经修饰的HS4-400绝缘子包含修饰，其中所述修饰导致SA3的失活。因此，与包含未经修饰的HS4-400绝缘子的慢病毒载体中在第200至201位发生的剪接相比，当转导至细胞中时，包含经修饰的HS4-400绝缘子的慢病毒载体在第200至201位表现出降低的剪接，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的。在一些实例中，剪接降低至少或约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，修饰是或包含经修饰的HS4-400绝缘子的序列相对于未经修饰的HS4-400绝缘子的突变。在另一些实例中，修饰是经修饰的HS4-400绝缘子在载体中的方向相对于未经修饰的HS4-400绝缘子在载体中时的方向的变化。如将理解的，在修饰是绝缘子方向的改变的情况下，与未经修饰的HS4-400绝缘子相比，经修饰的HS4-400绝缘子的序列可以没有修饰。
未经修饰的HS4-400绝缘子包括当存在于慢病毒载体中时包含活性SA3的绝缘子，即在慢病毒载体内包含能够促进在SA3处的剪接的序列和方向。示例性未经修饰的HS4-400绝缘子包含这样的绝缘子，其包含SEQ ID NO：90中所示的序列(具有SEQ ID NO：89中所示的反向互补序列)和与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是SA3位点仍然存在，例如前提是HS4-400绝缘子的反向互补包含序列GTGTCTGCAGGCTCAAAGAG(SEQ ID NO：62))。在一些实例中，未经修饰的HS4-400绝缘子是在慢病毒载体中处于反向的绝缘子，使得SA3存在于正链上。
在一些具体实例中，相对于未经修饰的HS4-400绝缘子，经修饰的HS4-400绝缘子含有突变(例如核苷酸缺失、插入或替代)，其中所述突变使存在于所述未经修饰的HS4-400绝缘子中的SA3失活(或与发生在未经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列的第200至201位的剪接相比降低所述经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列在第200至201位的剪接，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的)。突变可以是任何使SA3失活或使SA3断裂的突变。在一些实例中，突变是SA3序列中任何核苷酸的缺失或替换，或插入至SA3序列(例如序列GTGTCTGCAGGCTCAAAGAG(SEQ ID NO：62))的核苷酸。在一些具体实例中，突变是第199位的A、第200位的G、第201位的G和/或第202位的C的突变(例如缺失或替换)，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的。例如，经修饰的HS4-400绝缘子可包含第199位的A至T、A至C或A至G突变，第200位的G至C、G至A或G至T突变，第201位的G至C、G至T或G至A突变、和/或者第202位的C至A、C至G或C至T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的。在另一些实例中，突变包含在第199、200或201位之后的核苷酸的插入。在一些实例中，经修饰的HS4-400绝缘子包含两种或更多种这样的突变。
在一个实例中，经修饰的HS4-400绝缘子在反向互补序列中的第199位包含A至T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的。在一些具体实施方案中，经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：95中任一者所示的序列，或者与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是存在第199位的A至T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的)。
在一些实例中，本文中所述的具有使SA3失活的突变的经修饰的HS4-400绝缘子在慢病毒载体内是处于反向的。
在另一个实例中，经修饰的HS4-400绝缘子在慢病毒载体中处于与未经修饰的HS4-400绝缘子在慢病毒载体中时的相反的方向，即相对于未经修饰的HS4-400绝缘子，经修饰的HS4-400绝缘子是反向的，以使SA3失活。在一些具体实例中，经修饰的HS4-400绝缘子在载体中是处于正向的。
2.3.3组合突变
相对于未经修饰的HS4-400绝缘子，经修饰的HS4-400绝缘子可以包含使SA2和SA3二者失活的两个或更多个突变。上述用于使SA2或SA3失活的任何突变都可以在经修饰的HS4-400绝缘子中组合。
在一个实例中，经修饰的HS4-400绝缘子包含在反向互补序列中第189位的A至T突变(即包含第189位的T)，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的，并且包含在反向互补序列中第199位的A至T突变(即包含第199位的T)，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的。在一些具体实施方案中，经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：94中所示的序列，或者与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是存在第189位的T和第199位的T突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：90的)。
2.4抑制HPRT基因表达的组分
在一些实施方案中，本公开内容的慢病毒载体包含编码抑制HPRT表达的物质的核酸序列。因此，在一些实例中，慢病毒载体包含可操作连接至第二核酸序列的第二启动子，其中第二核酸序列编码抑制HPRT表达的核酸。在一些实施方案中，RNAi物质是shRNA、微RNA或其杂交体。
2.4.1 RNAi
在一些实施方案中，表达载体包含编码RNAi的第二核酸序列。RNA干扰是通过复杂的多步骤酶促过程(例如涉及序列特异性双链小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的过程)通过触发同源性转录物的降解用于基因表达的转录后沉默的方法。RNAi途径的简化模型基于两个步骤，每个步骤都涉及核糖核酸酶。在第一步骤中，通过RNA酶II酶DICER和Drosha将触发RNA(dsRNA或miRNA初级转录物)加工成短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)。在第二步骤中，将siRNA装载至效应物复合物RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencing complex，RISC)中。siRNA在RISC组装期间解开，并且单链RNA与mRNA靶标杂交。基因沉默被认为是通过RNA酶H酶Argonaute(Slicer)对靶mRNA的核溶解降解的结果。如果siRNA/mRNA双链体包含错配，则mRNA不被切割。相反，基因沉默是翻译抑制的结果。
在一些实施方案中，RNAi物质是抑制性或沉默核酸。如本文中所用，“沉默核酸”是指能够与特定序列相互作用以抑制基因表达的任何多核苷酸。沉默核酸的一些实例包括RNA双链体(例如siRNA、shRNA)、锁核酸(locked nucleic acid，“LNA”)、反义RNA、编码siRNA或shRNA的有义和/或反义序列的DNA多核苷酸、DNA酶或核酶。本领域技术人员将理解，基因表达的抑制不一定是来自特定列举的序列的基因表达，并且可以是例如来自由该特定序列所控制的序列的基因表达。
用于构建干扰RNA的方法是本领域已知的。例如，干扰RNA可以由两个单独的寡核苷酸组装，其中一条链是有义链，并且另一条链是反义链，其中所述反义链和有义链是自互补的(即，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；例如其中所述反义链与有义链形成双链体或双链结构)；所述反义链包含与靶核酸分子或其一部分(即不期望的基因)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列并且所述有义链包含对应于靶核酸序列或其一部分的核苷酸序列。或者，干扰RNA可以由单个寡核苷酸组装，其中自身互补的有义区和反义区通过基于核酸的或基于非核酸的接头连接。干扰RNA可以是具有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸，具有自互补的有义区和反义区，其中所述反义区包含与单独的靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列并且所述有义区具有对应于靶核酸序列或其一部分的核苷酸序列。干扰RNA可以是具有两个或更多个环结构的环状单链多核苷酸和包含自互补有义区和反义区的茎，其中所述反义区包含与靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列并且所述有义区具有对应于靶核酸序列或其一部分的核苷酸序列，并且其中所述环状多核苷酸可以体内或体外处理以产生能够介导RNA干扰的活性siRNA分子。
在一些实施方案中，干扰RNA编码区编码具有有义区、反义区和环区的自互补RNA分子。当表达时，这样的RNA分子需要形成“发夹”结构，并且在本文中称为“shRNA”。在一些实施方案中，环区的长度通常在约2至约10个核苷酸之间。在另一些实施方案中，环区的长度为约6至约9个核苷酸。在一些实施方案中，有义区和反义区的长度为约15至约30个核苷酸。在转录后处理之后，小发夹RNA通过酶DICER所介导的切割事件转化为siRNA，酶DICER是RNA酶III家族的成员之一。然后siRNA能够抑制与其具有同源性的基因的表达。进一步的细节通过参见Brummelkamp et al.(2002)，Science，296：550-553；Lee et al.(2002)，Nature Biotechnol.，20，500-505；Miyagishi and Taira(2002)，Nature Biotechnol.，20：497-500；Paddison et al.(2002)，Genes&Dev.，16：948-958；Paul(2002)，NatureBiotechnol.，20，505-508；Sui(2002)，Proceedings Nat′l Acad.Sci.USA，99(6)，5515-5520；和Yu et al.(2002)，Proceedings Nat′l Acad.Sci.USA 99：6047-6052来描述，其公开内容在此通过引用以其整体并入本文。
2.4.2 shRNA
在一些实施方案中，第二核酸序列编码抑制HPRT的shRNA。在一个具体实施方案中，shRNA是sh734，例如包含SEQ ID NO：66中所示的序列的shRNA或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的shRNA。在另一个实施方案中，sh734包含多t终止序列，其可以是Pol III启动子(例如7SK)所需的。因此，在一些实施方案中，sh734包含SEQ ID NO：67中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，sh734包含单t终止序列，并且因此包含例如SEQ ID NO：68中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列。
2.4.3 微RNA
微RNA(microRNA，miR)是一组非编码RNA，其在转录后调节其靶基因的表达。这些单链分子被认为与其他蛋白质形成miRNA介导沉默复合物(miRNA-mediated silencingcomplex，miRISC)复合物，所述蛋白质与其靶mRNA的3′非翻译区(untranslated region，UTR)结合，以阻止其在胞质中的翻译。
在一些实施方案中，shRNA序列嵌入至微RNA二级结构(“基于微RNA的shRNA”)。在一些实施方案中，靶向HPRT的shRNA核酸序列嵌入至微RNA二级结构中。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA靶向HPRT内的编码序列以实现HPRT表达的敲低，其被认为与在没有伴随的途径饱和度和细胞毒性或脱靶作用下的靶向HPRT的shRNA的利用是等同的。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA是从头(de novo)人工微RNA shRNA。这样的基于微RNA的从头shRNA的产生通过Fang，W.&Bartel，David P.The Menu of Features that DefinePrimary MicroRNAs and Enable De Novo Design of MicroRNA Genes.Molecular Cell60，131-145所描述，其公开内容在此通过引用以其整体并入本文。
示例性miRNA在国际专利公开No.WO2020139796中提供。
2.4.4 RNAi的替代物
作为RNAi并入的替代物，在一些实施方案中，载体可以包括编码与信使RNA(messenger RNA，mRNA)中的位点结合的反义寡核苷酸的核酸序列。本公开内容的反义寡核苷酸与编码蛋白质的核酸特异性杂交，并干扰蛋白质的转录或翻译。在一些实施方案中，反义寡核苷酸靶向DNA并干扰其复制和/或转录。在另一些实施方案中，反义寡核苷酸与RNA特异性杂交，所述RNA包括前mRNA(即，前体mRNA，其为mRNA的未成熟单链)和mRNA。这样的反义寡核苷酸可以影响例如RNA向蛋白质翻译位点的易位、从RNA翻译蛋白质、RNA的剪接以产生一种或更多种mRNA物质，以及通过RNA可参与或促进的催化活性。这样的干扰的总体作用是调节、减少或抑制靶蛋白的表达。
2.5其他元件
可存在于本公开内容的慢病毒载体中的其他元件包括：例如启动子、操纵子、终止信号、多腺苷酸化信号等。本领域技术人员可容易地鉴定用于载体中存在的和由载体编码的核酸的正确加工、转录和/或翻译的合适元件。
在一个实例中，载体包含土拨鼠肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)。在一个具体实施方案中，WPRE在第一核酸序列的下游和经修饰的HS4-650绝缘子的上游(即，在第一核酸序列与经修饰的HS4-650绝缘子之间)。在一些实施方案中，WPRE是包含SEQ ID NO：77中所示的序列的WPRE mut6或包含SEQ ID NO：78中所示的序列的WPRE mut7，或者包含与SEQ ID NO：77或78中所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列。
在一些实例中，启动子是MND启动子，例如包含SEQ ID NO：72所示的序列，与SEQID NO：77或78中所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的启动子。在一个实施方案中，第一启动子是MND启动子并且其可操作地连接至包含转基因的第一核酸。
在一些实例中，启动子是7SK RNA启动子，例如SEQ ID NO：69至71中任一者所示的启动子，或包含与SEQ ID NO：69至71中所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的启动子。在一个实施方案中，第二启动子是7SK RNA启动子并且其可操作地连接至编码抑制HPRT表达的核酸的第二核酸。
在一些实例中，慢病毒载体包含7tetO启动子/操纵子，例如包含SEQ ID NO：79中所示的序列或者与SEQ ID NO：79中所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的启动子/操纵子。
在另一些实例中，慢病毒载体包含β-珠蛋白poly(A)信号，例如包含SEQ ID NO：80中所示的序列或者与SEQ ID NO：80中所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的信号。
2.6载体的产生
本公开内容的慢病毒载体可使用任何方法产生，并且这样的方法是本领域技术人员公知的。在一些实施方案中，第一启动子可操作地连接至编码治疗性蛋白质例如威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白的第一核酸序列；并且经修饰的HS4-650绝缘子(以及任选地本文中所述的任何其他表达盒或元件)被插入到作为质粒的慢病毒载体，例如选自以下的载体中：
pTL20c，pTL20d，FG，pRRL，pCL20，pLKO.1puro，pLKO.1，pLKO.3G，Tet-pLKO-puro，pSico，pLJM1-EGFP，FUGW，pLVTHM，pLVUT-tTR-KRAB，pLL3.7，pLB，pWPXL，pWPI，EF.CMV.RFP，pLentl CMV Puro DEST，pLenti-puro，pLOVE，pULTRA，pLJM1-EGFP，pLX301，pInducer20，pHIV-EGFP，Tet-pLKO-neo，pLV-mCherry，pCW57.1，pLionII，pSLIK-Hygro，和pInducer10-mir-RUP-PheS.
在另一些实施方案中，插入第一启动子、第一核酸序列和经修饰的HS4-650绝缘子的慢病毒载体选自AnkT9W载体、T9Ank2W载体、TNS9载体、lentiglobin HPV569载体、lentiglobin BB305载体、BG-1载体、BGM-1载体、GLOBE载体、G-GLOBE载体、V5载体、V5m3载体、V5m3-400载体、G9载体和BCL11A shmir载体。在一些具体实施方案中，慢病毒表达载体是pTL20c。
在一个实例中，根据美国专利公开No.20180112233和国际专利公开No.WO2020139796中所述的方法，具有可操作地连接至第一核酸序列的第一启动子和经修饰的HS4-650绝缘子的表达盒可插入到pTL20c载体中。
在一些实例中，根据美国专利公开No.20180112233和国际专利公开No.WO2020139796中所述的方法，具有可操作地连接至第一核酸序列的第一启动子和任选的经修饰的HS4-400绝缘子的表达盒可插入到pTL20c载体中。
慢病毒颗粒或病毒体(或重组慢病毒)可使用本领域公知的标准方法产生。在一个实例中，利用稳定生产者细胞系用于产生病毒，其中稳定生产者细胞系来源于GPR、GPRG、GPRT、GPRGT或GPRT-G包装细胞系之一。在一些实施方案中，稳定生产者细胞系来源于GPRT-G细胞系。在一些实施方案中，稳定生产者细胞系通过以下方式产生：(a)通过将编码抗HPRTshRNA和WASP的核酸序列克隆至重组质粒中来合成载体(即，合成的载体可以是本文中所述的编码抗HPRT shRNA和WASP载体中的任一种载体)；(b)由合成的载体产生DNA片段；(c)由以下形成串联阵列：(i)从合成载体产生的DNA片段，和(ii)来源于抗生素抗性盒质粒的DNA片段；(d)用形成的串联阵列转染包装细胞系之一；和(e)分离稳定生产者细胞系。美国专利公开No.20180112233中描述了形成稳定生产者细胞系的另外的方法。
2.7示例性载体
本公开内容的示例性慢病毒载体包括核酸载体(例如质粒)和慢病毒病毒体(或病毒颗粒)，所述载体包含5’LTR(包括7tetO启动子/操纵子、R和U5，例如图2至7中示意性示出的)，其下游(从5’至3’)是中央多嘌呤束(central polypurine tract，cPPT)、REV响应元件(REV response element，RRE)、7sk-sh734表达盒(其包含与编码sh734的核酸(例如编码sh734的核酸，其包含SEQ ID NO：66至68中任一者所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列)可操作连接的7sk启动子(例如，包含SEQ ID NO：69至72中任一者所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的启动子))、WASP表达盒(其包含与编码WASP的转基因(例如包含SEQ ID NO：73至75中任一者所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的转基因)可操作连接的MND启动子(例如，包含SEQ ID NO：72中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的启动子))、WPRE(例如包含SEQ ID NO：77或78中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的WPRE)，和3’LTR，其包括HS4-650绝缘子(例如SEQ ID NO：1、10、19、28、37和46中任一者或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列所示的未经修饰的HS4-650绝缘子，其中HS4-650绝缘子处于正向方向，或本文中所述的具有失活的SA1、SA2和/或SA3的经修饰的HS4-650绝缘子，其中经修饰的HS4-650绝缘子处于反向方向，例如包含互补链的绝缘子，所述互补链包含SEQ ID NO：3、12、21、30、39和48中任一者所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列，其中所述序列包含第384位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的；包含互补链的绝缘子，所述互补链包含SEQ ID NO：7、16、25、34、43和52中任一者所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列，其中所述序列包含第445位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的；包含互补链的绝缘子，所述互补链包含SEQ ID NO：9、18、27、36、45和54中任一者所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列，其中所述序列包含第445位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的；包含互补链的绝缘子，所述互补链包含SEQ ID NO：4、13、22、31、40和49中任一者所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列，其中所述序列包含第384位的T和第445位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的；包含互补链的绝缘子，所述互补链包含SEQ ID NO：5、14、23、32、41和50中任一者所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列，其中所述序列包含第384位的T和第445位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的；包含互补链的绝缘子，所述互补链包含SEQ ID NO：8、17、26、35、44和43中任一者所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列，其中所述序列包含第445位的T和第455位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的；或包含互补链的绝缘子，所述互补链包含SEQ ID NO：6、15、24、33、42和51中任一者所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列，其中所述序列包含第384位的T、第445位的T和第455位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的)、U3、R和β-珠蛋白poly(A)信号(例如，包含SEQID NO：31中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的信号)。在这些载体中，通常7sk-sh734表达盒处于反向方向，而WASP表达盒处于正向方向。
在一些实施方案中，慢病毒载体包含选自以下的序列：如SEQ ID NO：57的核苷酸第3098至6006位所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，其中所述序列包含SA1和SA2的失活，例如包含第384位的T和第445位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的；如SEQ ID NO：58的核苷酸第3098至6009位所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；以及如SEQ ID NO：59的核苷酸第3098至6006位所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，其中所述多核苷酸包含SA1、SA2和SA3的失活，其中所述序列包含SA1、SA2和SA3的失活，例如包含第384位的T、第445位的T和第455位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
在一些实施方案中，慢病毒载体包含选自以下的序列：如SEQ ID NO：57的核苷酸第2710至6006位所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，其中所述序列包含SA1和SA2的失活，例如包含第384位的T和第445位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的；如SEQ ID NO：58的核苷酸第2710至6009位所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；以及如SEQ ID NO：59的核苷酸第2710至6006位所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，其中所述序列包含SA1、SA2和SA3的失活，例如包含第384位的T、第445位的T和第455位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
在一些实施方案中，慢病毒载体包含选自以下的序列：如SEQ ID NO：57的核苷酸第2402至6006位所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，其中所述序列包含SA1和SA2的失活，例如包含第384位的T和第445位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的；如SEQ ID NO：58的核苷酸第2402至6009位所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；以及如SEQ ID NO：59的核苷酸第2402至6006位所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，其中所述多核苷酸包含SA1、SA2和SA3的失活，其中所述序列包含SA1、SA2和SA3的失活，例如包含第384位的T、第445位的T和第455位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
在一个实施方案中，本公开内容的慢病毒载体包含SEQ ID NO：57或82中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，其中所述序列包含SA1和SA2的失活，例如包含第384位的T和第445位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
在另一个实施方案中，本公开内容的慢病毒载体包含SEQ ID NO：58或83中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，本公开内容的慢病毒载体包含SEQ ID NO：59或84中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，其中所述序列包含SA1、SA2和SA3的失活，例如包含第384位的T、第445位的T和第455位的T，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
3.宿主细胞
本公开内容还提供了包含用本公开内容的慢病毒载体转化或转导的宿主细胞。“宿主细胞”或“靶细胞”意指待使用本公开内容的方法和载体转化或转导的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是可以在其中表达载体的哺乳动物细胞。合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于人细胞、鼠细胞、非人灵长类细胞(例如恒河猴细胞)、人祖细胞或干细胞、293细胞、HeLa细胞、D17细胞、MDCK细胞、BHK细胞和Cf2Th细胞。在某些实施方案中，包含本公开内容的表达载体的宿主细胞是造血细胞，例如造血祖细胞/干细胞(例如CD34阳性造血祖细胞/干细胞)、单核细胞、巨噬细胞、外周血单个核细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞或树突细胞。
待用本公开内容的载体转导的造血干细胞(例如CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和/或单核细胞/巨噬细胞)可以是同种异体的、自体的或来自匹配的同胞。在一些实施方案中，HSC是CD34阳性的并且可从患者的骨髓或外周血中分离。在一些实施方案中，分离的CD34阳性HSC(和/或本文中所述的其他造血细胞)用本文中所述的载体转导。
在一些实施方案中，宿主细胞或转导的宿主细胞与可药用载体组合。在一些实施方案中，宿主细胞或转导的宿主细胞用PLASMA-LYTE A(例如，用于静脉内施用的无菌、无热原等张溶液；其中一升PLASMA-LYTE A具有140mEq钠、5mEq钾、3mEq镁、98mEq氯化物、27mEq乙酸盐和23mEq葡萄糖酸盐的离子浓度)配制。在另一些实施方案中，宿主细胞或转导的宿主细胞被配制在PLASMA-LYTE A溶液中，所述溶液包含约8％至约10％的二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。在一些实施方案中，每mL包含PLASMA-LYTE A和DMSO的配制物存在少于约2×107个宿主细胞/转导的宿主细胞。
在一些实施方案中，在用根据本公开内容的载体转导之后，宿主细胞基本上是HPRT缺陷的。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少50％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少55％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少60％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少65％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少70％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少75％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少80％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少85％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少90％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少95％。认为具有20％或更少残余HPRT基因表达的细胞对嘌呤类似物(例如6TG)敏感，从而允许用嘌呤类似物对其进行选择。
在一些实施方案中，可通过使宿主细胞在体外、离体或体内与本公开内容的表达载体和提高转导效率的一种或更多种化合物接触来提高宿主细胞的转导。例如，在一些实施方案中，提高转导效率的一种或更多种化合物是刺激前列腺素EP受体信号传导途径的化合物，即与不存在该一种或更多种化合物的情况下前列腺素EP受体下游的细胞信号传导活性相比，提高与该一种或更多种化合物接触的细胞中的前列腺素EP受体下游的细胞信号传导活性的一种或更多种化合物。在一些实施方案中，提高转导效率的一种或更多种化合物是前列腺素EP受体配体，其包括但不限于前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)或者其类似物或衍生物。在另一些实施方案中，提高转导效率的一种或更多种化合物包括但不限于纤维连接蛋白(RetroNectin)(重组人纤连蛋白片段的63kD片段，可从Takara获得)；Lentiboost(膜密封泊洛沙姆，可从Sirion Biotech获得)、硫酸鱼精蛋白、环孢菌素H(Cyclosporin H)和雷帕霉素(Rapamycin)。
4.药物组合物
本公开内容还提供了组合物，包括药物组合物，其包含本文中公开的一种或更多种载体和/或非病毒递送载剂(例如纳米胶囊)。在一些实施方案中，药物组合物包含有效量的如本文中所述的至少一种载体和/或非病毒递送载剂以及可药用载体。例如，在某些实施方案中，药物组合物包含有效量的载体和可药用载体。本领域技术人员可以基于例如以下因素容易地确定有效量：身体尺寸、体重、年龄、健康状况、对象的性别、种族和病毒滴度。
短语“可药用的”或“药理学上可接受的”是指当施用于动物或人时不产生不良的、变应性的或其他不利的反应的分子实体和组合物。例如，可以用可药用载体来配制表达载体。如本文中所使用的，“可药用载体”包括溶剂、缓冲剂、溶液剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等，其可接受，以用于配制药物，例如适合施用于人的药物。用药物载体配制化合物的方法是本领域已知的，并且描述于例如Remington′sPharmaceutical Science，(17th ed.Mack Publishing Company，Easton，Pa.1985)；和Goodman&Gillman′s：The Pharmacological Basis of Therapeutics(11th Edition，McGraw-Hill Professional，2005)中；其各自的公开内容均通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，药物组合物可包含任何浓度的本文中公开的任一种载体、纳米胶囊剂或组合物，使得施用的沉默核酸达到约0.1mg/kg至约1mg/kg范围内的浓度。在一些实施方案中，药物组合物可包含按重量计约0.1％至约99.9％的量的表达载体。适合包含在任何药物组合物中的可药用载体包括水、缓冲水、盐溶液例如(例如生理盐水或平衡盐溶液(例如Hank或Earle平衡溶液))、甘氨酸、透明质酸等。药物组合物可被配制成用于肠胃外施用，例如静脉内、肌内或皮下施用。用于肠胃外施用的药物组合物可包含可药用无菌水性或非水性溶液剂、分散剂、悬浮剂或乳剂以及用于重构成无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、溶剂、稀释剂或载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素、及其混合物、植物油(例如橄榄油)、可注射有机酯(例如油酸乙酯)。
药物组合物可被配制成用于经口施用。用于经口施用的固体剂型可包括例如片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂。在这样的固体剂型中，组合物可包含至少一种可药用载体，例如柠檬酸钠和/或磷酸二钙；和/或填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；黏合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；保湿剂，例如甘油；崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、硅酸盐和碳酸钠；润湿剂，例如乙酰基醇、单硬脂酸甘油酯；吸收剂，例如高岭土和膨润土；和/或润滑剂例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠；及其混合物。用于经口施用的液体剂型可以包括例如可药用乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。液体剂量可包括惰性稀释剂例如水或其他溶剂、增溶剂和/或乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(例如如棉籽油、玉米油、胚芽油、蓖麻油、橄榄油、芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、及其混合物。
药物组合物可包含渗透增强剂以增强其递送。渗透增强剂可包括脂肪酸，例如油酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、reclineate、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、1-甘油单癸酸酯、甘油单酯和甘油二酯、及其生理学上可接受的盐。组合物还可包含螯合剂，例如如乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐、高香草酸盐)。
药物组合物可包含包封形式的本文中公开的任何载体。例如，载体可包封在纳米胶囊，例如包含一种或更多种可生物降解聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)的纳米胶囊内。在一些实施方案中，载体包封在聚合物纳米胶囊内。在另一些实施方案中，载体包封在可生物降解和/或可蚀解的(erodible)聚合物纳米胶囊内。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊包含两种不同的带正电荷的单体、至少一种中性单体和交联剂。在一些实施方案中，纳米胶囊还包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，纳米胶囊包含2至6个靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分是抗体。在一些实施方案中，靶向部分靶向CD117、CD10、CD34、CD38、CD45、CD123、CD127、CD135、CD44、CD47、CD96、CD2、CD4、CD3和CD9标志物中的任一种。在一些实施方案中，靶向部分靶向人间充质干细胞CD标志物，包括CD29、CD44、CD90、CD49a至f、CD51、CD73(SH3)、CD105(SH2)、CD106、CD166和Stro-1标志物中的任一种。在一些实施方案中，靶向部分靶向人造血干细胞CD标志物，包括CD34、CD38、CD45RA、CD90和CD49中的任一种。
5.治疗方法
举例来说，可施用本文中所述的包含编码WASP的核酸序列的慢病毒载体，以在遗传上校正威斯科特-奥尔德里奇综合征或减轻与威斯科特-奥尔德里奇综合征相关的病理状况。在一些实施方案中，施用用载体转导的宿主细胞群体以校正威斯科特-奥尔德里奇综合征或减轻与威斯科特-奥尔德里奇综合征相关的病理状况。由于该方法对于所有患者，特别是那些没有匹配的同胞供体的患者具有可用性，因此认为其优于目前可用的治疗。还认为，该方法还具有作为提供终生校正的一次性治疗施用的潜力。还认为该方法有利地没有任何免疫副作用，并且如果确实出现副作用，则可通过施用本文中所述的二氢叶酸还原酶抑制剂(例如MTX或MPA)来减轻副作用。还认为，有效的基因治疗方法将彻底改变治疗威斯科特-奥尔德里奇综合征的方式，最终改善患者的结局。
在一些实施方案中，用本文中所述的载体或转导的宿主细胞进行的治疗在遗传上校正或减轻了与威斯科特-奥尔德里奇综合征相关的一种或更多种病理状况，例如下文概述的那些。在一些实施方案中，可通过向患者施用表达载体或转导的宿主细胞以在遗传上校正或减轻的病理状况包括但不限于微血小板减少症、湿疹、自身免疫病和复发性感染。湿疹皮疹常见于患有典型WAS的患者。在婴儿中，湿疹可能出现在面部或头皮上，并且可类似于“乳痂”。其还可能出现严重的尿布疹，或更普遍的，涉及臂部和腿部。在年龄较大的男孩中，湿疹通常限于肘部前面或膝盖后面、耳朵后面或手腕周围的皮肤皱褶。由于湿疹非常地痒，患者经常挠自己直至出血(甚至在睡觉时也是如此)。皮肤屏障破坏的这些区域然后可成为细菌的进入点，可导致皮肤和血流感染。
认为血小板减少症(血小板数目降低)是威斯科特-奥尔德里奇综合征患者的常见特征之一。除了数目减少之外，血小板本身也是小且功能障碍的，小于正常血小板尺寸的一半。因此，患有威斯科特-奥尔德里奇综合征的患者即使没有受伤，也可能很容易出血。在一些实施方案中，出血到皮肤中可导致针头大小的蓝红色斑点，称为瘀点，或者其可能更大并且类似于瘀伤。
认为与威斯科特-奥尔德里奇综合征相关的免疫缺陷导致B淋巴细胞和T淋巴细胞二者的功能显著异常。因此，感染在经典形式的威斯科特-奥尔德里奇综合征中是常见的，并且可能涉及所有种类的微生物。在一些实施方案中，这些感染可包括上呼吸道感染和下呼吸道感染，例如耳部感染、鼻窦感染和肺炎。更严重的感染，例如脓毒症(血流感染或“血液中毒”)、脑膜炎和严重的病毒感染不太常见，但也可能发生。偶尔，患有经典形式的威斯科特-奥尔德里奇综合征的患者可能出现由真菌(耶氏卡氏肺孢子虫(pneumocystisjiroveci carinii))引起的肺炎。在一些实施方案中，在其中患者已经抓破其湿疹的区域中，皮肤可能被细菌(例如葡萄球菌(Staphylococcus))感染。在一些实施方案中，称为传染性软疣的病毒性皮肤感染也常见于威斯科特-奥尔德里奇综合征。认为，进行疫苗接种以预防感染在威斯科特-奥尔德里奇综合征中通常不起作用，因为患者不对疫苗产生正常的保护性抗体响应。
在一些实施方案中，复发性感染包括但不限于中耳炎、皮肤脓肿、肺炎、小肠结肠炎、脑膜炎、脓毒症和尿路感染。在一些实施方案中，复发性感染是皮肤感染。在一些实施方案中，将诊断患有威斯科特-奥尔德里奇综合征的患者经历的湿疹分类为治疗抗性湿疹。
举例来说，患有威斯科特-奥尔德里奇综合征的患者经常经历的自身免疫病包括溶血性贫血、血管炎、关节炎、中性粒细胞减少症、炎性肠病和IgA肾病、样紫癜、皮肌炎、复发性血管性水肿和葡萄膜炎。在一些实施方案中，复发性感染可由细菌、病毒或真菌感染中的任一种引起。在一些实施方案中，用本文中所述的载体或转导的宿主细胞进行治疗在遗传上校正或减轻了与威斯科特-奥尔德里奇综合征相关的多种病理状况，例如下文概述的那些。
如本文中所述，除了治疗性基因之外，本公开内容的表达载体还包含被设计用于抑制或敲低HPRT表达的物质(例如针对HPRT的shRNA)，并因此提供了体内化学选择策略，该策略利用了HPRT在将嘌呤类似物(例如6TG)代谢成骨髓毒性物质中所发挥的重要作用。由于HPRT缺陷不损害造血细胞的发育或功能，因此可将其从用于移植的造血细胞中去除。本文中还讨论了用嘌呤类似物进行的处理(conditioning)和化学选择。
在治疗威斯科特-奥尔德里奇综合征或减轻与威斯科特-奥尔德里奇综合征相关的病理状况的背景下，对对象的治疗包括：鉴定有此治疗需要的对象；用本公开内容的慢病毒载体转导HSC(例如白体HSC、同种异体HSC、同胞匹配的HSC)；以及将转导的HSC移植到或施用于对象中。在一些实施方案中，有此治疗需要的对象是患有与威斯科特-奥尔德里奇综合征相关的病理状况的对象。
在一些实施方案中，该方法还包括在施用转导的HSC之前进行清髓性处理的步骤(例如使用嘌呤类似物、化学治疗、放射治疗、用一种或更多种内化免疫毒素或抗体-药物缀合物进行的治疗、或者其任意组合)。在一些实施方案中，该方法还包括在施用转导的HSC之后利用嘌呤类似物(例如6TG)进行预处理或体内化学选择的步骤。在一些实施方案中，如果出现副作用(例如GvHD)，则该方法还包括利用二氢叶酸还原酶抑制剂(例如MTX或MPA)进行负选择的步骤。
5.1用嘌呤类似物进行处理和化学选择
在一些实施方案中，治疗方法包括以下另外的步骤：(i)在HSC移植之前进行处理；和/或(ii)体内化学选择。一个或两个步骤可利用嘌呤类似物。在一些实施方案中，嘌呤类似物选自6-硫鸟嘌呤(“6TG”)、6-巯基嘌呤(“6MP”)或氮杂硫代嘌呤(“AZA”)。认为移植的缺乏HPRT活性的含有威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白的HSC对引入的嘌呤类似物的细胞毒性作用具有高度抗性。用处理和化学选择的组合策略，可实现HPRT缺陷的、含有威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白且总体毒性较低的HSC的有效且高度的移植。认为威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白的最终表达，与基因经修饰的HSC的增强的植入和化学选择相组合，可导致足够的蛋白产生，以减轻与威斯科特-奥尔德里奇综合征相关的病理状况。
6TG是具有抗癌活性和免疫抑制活性二者的嘌呤类似物。硫鸟嘌呤与次黄嘌呤和鸟嘌呤竞争酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase，HGPRT酶)，并自身转化为6-硫代鸟苷酸(TGMP)。这种核苷酸在治疗剂量下达到高的胞内浓度。TGMP干扰鸟嘌呤核苷酸合成的数个点。其通过谷氨酰胺-5-磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(嘌呤核糖核苷酸从头途径特有的第一酶)的伪反馈抑制来抑制从头嘌呤生物合成。TGMP还通过竞争酶IMP脱氢酶来抑制肌苷酸(IMP)向黄苷酸(XMP)的转化。TGMP一度被认为是ATP：GMP磷酸转移酶(鸟苷酸激酶)的重要抑制剂，但最近的结果表明并非如此。硫代鸟苷酸通过代谢鸟嘌呤核苷酸的相同酶进一步转化为二磷酸和三磷酸、二磷酸硫鸟苷(thioguanosine diphosphate，TGDP)和三磷酸硫鸟苷(thioguanosinetriphosphate，TGTP)(以及它们的脱氧核糖基类似物)。
如本领域技术人员将理解的，鉴于在本公开内容的载体中包含被设计用于抑制HPRT表达的物质，例如，用于敲低HPRT的RNAi物质，所得转导的HSC是HPRT缺陷的或基本上HPRT缺陷的(例如如具有20％或更少的残余HPRT基因表达的那些)。因此，那些确实表达HPRT的HSC(即HPRT野生型细胞)可通过施用一个或更多个剂量的6TG来使其选择性地耗竭。在一些实施方案中，可施用6TG以用于HPRT野生型接受体的清髓性处理和供体细胞的体内化学选择过程二者。因此，认为该策略允许在体内选择基因经修饰的细胞，即允许在体内选择含有威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白的基因经修饰的细胞。
在一些实施方案中，在从供体收集HSC之后，用根据本公开内容的载体转导HSC。所得HSC是HPRT缺陷的并表达WAS基因。与此同时，待接受HSC的患者首先用清髓性处理步骤治疗。在处理之后，将转导的HSC移植至或施用于患者。然后可使用6TG在体内选择含有WAS基因的HSC，如本文中所讨论的。
清髓性处理可使用高剂量处理放射治疗、化学治疗和/或用嘌呤类似物(例如6TG)进行治疗来实现。在一些实施方案中，在用处理方案治疗之后约24至约96小时施用HSC。在另一些实施方案中，在用处理方案治疗之后约24至约72小时用HSC移植物(graft)治疗患者。在又一些实施方案中，在用处理方案治疗之后约24至约48小时用HSC移植物治疗患者。在一些实施方案中，HSC移植物包含约2×106个细胞/kg至约15×106个细胞/kg(患者的体重)。在一些实施方案中，HSC移植物包含最小2×106个细胞/kg，目标为大于6×106个细胞/kg。在一些实施方案中，所施用细胞的至少10％是用本文中所述的慢病毒载体转导的。在一些实施方案中，所施用细胞的至少20％是用本文中所述的慢病毒载体转导的。在一些实施方案中，所施用细胞的至少30％是用本文中所述的慢病毒载体转导的。在一些实施方案中，所施用细胞的至少40％是用本文中所述的慢病毒载体转导的。在一些实施方案中，所施用细胞的至少50％是用本文中所述的慢病毒载体转导的。
在一些实施方案中，使用嘌呤类似物(例如6TG，其被认为对造血外组织具有最小的副作用)的低剂量方案在体内选择含有转基因的HPRT缺陷的HSC。在一些实施方案中，在将HSC引入患者之后，向患者提供范围为约0.2mg/kg/天至约0.6mg/kg/天剂量的嘌呤类似物(例如6TG)，以用于体内化学选择。在一些实施方案中，剂量范围为约0.3mg/kg/天至约1mg/kg/天。在一些实施方案中，剂量为多至约2mg/kg/天。
在一些实施方案中，每次给药所施用的6TG的量基于患者的HPRT酶活性的测定。本领域普通技术人员将理解，可向表现出具有较高HPRT酶活性水平的那些提供具有较低量的嘌呤类似物(例如6TG)的剂量。HPRT的水平越高，嘌呤类似物(例如6TG)向毒性代谢物的转化越大。因此，达到相同目标需要施用的剂量越低。
在开始6TG处理之前测量TPMT基因型和/或TPMT酶活性可确定具有低TPMT酶活性或没有TPMT酶活性的个体。因此，在另一些实施方案中，施用的6TG的量基于硫嘌呤S-甲基转移酶(TPMT)水平或TPMT基因型。
在一些实施方案中，用于体内化学选择的嘌呤类似物(例如6TG)的剂量按照具有选自以下的周期的时间表每周一至三次施用于患者：(i)每周；(ii)每隔一周；(iii)治疗一周，然后休息两、三或四周；(iv)治疗两周，然后休息一、二、三或四周；(v)治疗三周，然后休息一、二、三、四或五周；(vi)治疗四周，然后休息一、二、三、四或五周；(vii)治疗五周，然后休息一、二、三、四或五周；以及(viii)每月。
在一些实施方案中，在1周至约4周的施用时期内向患者施用约3至约10剂量的嘌呤类似物(例如6TG)。在一些实施方案中，在14天的时期内向患者施用4或5个剂量的6TG。
5.2用二氢叶酸还原酶抑制剂进行负选择
另外，通过使用二氢叶酸还原酶抑制剂(例如MTX)抑制嘌呤从头合成途径中的酶二氢叶酸还原酶(DHFR)，可以负选择HPRT缺陷的细胞。其已被开发为安全程序，以在观察到意想不到的不良反应的情况下消除基因经修饰的HSC。因此，如果出现任何不良副作用，可以用二氢叶酸还原酶抑制剂(例如MTX或MPA)治疗患者。不良副作用包括，例如异常的血细胞计数/克隆扩增，其表明特定细胞克隆中的插入诱变或细胞因子风暴。
认为二氢叶酸还原酶抑制剂(例如MTX或MPA)竞争性抑制二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)，所述二氢叶酸还原酶是参与四氢叶酸(tetrahydrofolate，THF)合成的酶。DHFR催化二氢叶酸转化为活性四氢叶酸。叶酸是DNA合成所需的核苷胸苷的从头合成所必需的。此外，叶酸对于嘌呤和嘧啶碱的生物合成至关重要，因此合成将受到抑制。因此，二氢叶酸还原酶抑制剂(例如MTX或MPA)抑制DNA、RNA、胸苷酸和蛋白质的合成。MTX或MPA通过抑制DHFR来阻断从头途径。在HPRT-/-细胞中，没有功能性的挽救或从头途径，导致没有嘌呤合成，并因此导致细胞死亡。然而，HPRT野生型细胞具有功能性挽救途径，它们的嘌呤合成发生并且细胞存活。
鉴于根据本公开内容产生的经修饰的HSC的敏感性，二氢叶酸还原酶抑制剂(例如MTX或MPA)可用于选择性消除HPRT缺陷的细胞。在一些实施方案中，二氢叶酸还原酶抑制剂(例如MTX或MPA)作为单剂量施用。在一些实施方案中，施用多剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂。
在一些实施方案中，施用的MTX的量为约2mg/m2/次输注至约100mg/m2/次输注。在一些实施方案中，施用的MTX的量为约2mg/m2/次输注至约90mg/m2/次输注。在一些实施方案中，施用的MTX的量为约2mg/m2/次输注至约80mg/m2/次输注。在一些实施方案中，施用的MTX的量为约2mg/m2/次输注至约70mg/m2/次输注。在一些实施方案中，施用的MTX的量为约2mg/m2/次输注至约60mg/m2/次输注。在一些实施方案中，施用的MTX的量为约2mg/m2/次输注至约50mg/m2/次输注。在一些实施方案中，施用的MTX的量为约2mg/m2/次输注至约40mg/m2/次输注。在一些实施方案中，施用的MTX的量为约2mg/m2/次输注至约30mg/m2/次输注。在一些实施方案中，施用的MTX的量为约20mg/m2/次输注至约20mg/m2/次输注。在一些实施方案中，施用的MTX的量为约2mg/m2/次输注至约10mg/m2/次输注。在一些实施方案中，施用的MTX的量为约2mg/m2/次输注至约8mg/m2/次输注。在另一些实施方案中，施用的MTX的量为约2.5mg/m2/次输注至约7.5mg/m2/次输注。在又一些实施方案中，施用的MTX的量为约5mg/m2/次输注。在又一些实施方案中，施用的MTX的量为约7.5mg/m2/次输注。
在一些实施方案中，进行2至6次输注，并且每次输注可包含相同剂量或不同剂量(例如递增剂量、递减剂量等)。在一些实施方案中，可以每周一次或每两个月一次进行施用。
在一些实施方案中，MPA以每天约500mg至约1500mg的量给药。在一些实施方案中，MPA的剂量以单次推注施用。在一些实施方案中，将MPA的剂量分成多个单独的剂量，总计每天约500mg至约1500mg。
在一些实施方案中，MTX或MPA的类似物或衍生物可以替代MTX或MPA。MTX的衍生物描述于美国专利No.5,958,928和PCT公开No.WO/2007/098089中，其公开内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，可使用替代物质代替MTX或MPA，包括但不限于ribavarin(IMPDH抑制剂)；VX-497(IMPDH抑制剂)(参见Jain J，VX-497：a novel，selective IMPDHinhibitor and immunosuppressive agent，(2001)，J Pharm Sci.，90(5)：625-37)；洛美曲索(lometrexol)(DDATHF、LY249543)(GAR和/或AICAR抑制剂)；噻吩类似物(LY254155)(GAR和/或AICAR抑制剂)；呋喃类似物(LY222306)(GAR和/或AICAR抑制剂)(参见Habeck etal，A Novel Class of Monoglutamated Antifolates Exhibits Tight-bindingInhibition of Human Glycinamide Ribonucleotide Formyltransferase and PotentActivity against Solid Tumors，(1994)，Cancer Research，54，1021-2026)；DACTHF(GAR和/或AICAR抑制剂)(参见Cheng et.al.Design，synthesis，and biological evaluationof 10-methanesulfonyl-DDACTHF，10-methanesulfonyl-5-DACTHF，and 10-methylthio-DDACTHF as potent inhibitors of GAR Tfase and the de novo purine biosyntheticpathway，(2005)Bioorg Med Chem.，13(10)：3577-85)；AG2034(GAR和/或AICAR抑制剂)(参见Boritzki et.al.AG2034：a novel inhibitor of glycinamide ribonucleotideformyltransferase，(1996)，Invest New Drugs.，14(3)：295-303)；LY309887(GAR和/或AICAR抑制剂)((2S)-2-[[5-[2-[(6R)-2-氨基-4-氧代-5，6，7，8-四氢-1H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基]乙基]噻吩-2-羰基]氨基]戊二酸)；爱宁达(alimta)(LY231514)(GAR和/或AICAR抑制剂)(参见Shih et.al.LY231514，a pyrrolo[2，3-d]pyrimidine-basedantifolate that inhibits multiple folate-requiring enzymes，(1997)CancerResearch，57(6)：1116-23)；dmAMT(GAR和/或AICAR抑制剂)、AG2009(GAR和/或AICAR抑制剂)；呋咯地辛(forodesine)(Immucillin H，BCX-1777；商品名Mundesine和Fodosine)(嘌呤核苷磷酸化酶[purine nucleoside phosphorylase，PNP]抑制剂)(参见Kicska et.al.，Immucillin H，a powerful transition-state analog inhibitor of purinenucleoside phosphorylase，selectively inhibits human T lymphocytes，(2001)Proceedings Nat′l Acad.Sci.USA，98(8)4593-4598)；和immucillin-G(嘌呤核苷磷酸化酶[PNP]抑制剂)。
6.组合治疗
本公开内容的另一方面是组合治疗，其中在将转导的HSC(如上所述)施用于或移植到有此治疗(例如治疗威斯科特-奥尔德里奇综合征)需要的患者之前、期间或之后，施用抗细菌、抗真菌和/或抗病毒活性药物成分(当然，这取决于出现的特定感染)。在一些实施方案中，在将转导的HSC(如上所述)施用于或移植到有此治疗需要的患者之前、期间或之后，可用高剂量静脉内免疫珠蛋白(2gm/kg/天)和/或皮质类固醇(2mg/kg/天)治疗患有威斯科特-奥尔德里奇综合征和患有严重血小板减少症的患者。或者，可在用本公开内容的表达载体或转导的干细胞治疗之前或之后，施用来自健康供体的干细胞的同种异体移植。
7.可用于治疗镰状细胞病的慢病毒载体
β-血红蛋白病(包括β-地中海贫血和镰状细胞病(sickle-cell disease，SCD))是影响血红蛋白的功能或水平的常见遗传性病症的异质性组。SCD和重型β-地中海贫血是世界上最常见的单基因病症，每年约有400,000新生儿受到影响。通常在出生之后数个月，在从胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin，HbF)转变为成人β-珠蛋白(adult β-globin，HbA)期间出现临床表现，并且可能是严重的，具有严重的发病率和死亡率。同种异体骨髓移植是治愈性的，但限于那些具有合适匹配供体的患者。用患者自身细胞的自体基因治疗是有吸引力的治疗选择。
β-地中海贫血是特征为功能性血红蛋白水平降低的遗传性血液病症。β-地中海贫血是由血红蛋白亚基β(下文称为“HBB基因”)突变引起的，其被认为以常染色体隐性方式遗传。β-重型地中海贫血(临床上定义为输血依赖性)是由血红蛋白β链的合成降低或缺乏引起的。该疾病的严重程度取决于突变的性质，具有多种多样的结局，从严重贫血到临床无症状个体。
已经描述了通过影响广泛范围的过程，包括转录、mRNA剪接/加工、RNA稳定性、翻译和珠蛋白肽稳定性来影响β-珠蛋白水平的数百种不同的突变。认为低β-珠蛋白含量允许过量的α-珠蛋白链沉淀在红细胞前体中。还认为，α-珠蛋白聚集体引起细胞膜损伤并导致早期红细胞前体死亡。患者中存在的无效红细胞生成如果严重的话可能需要频繁输血。
镰状细胞贫血(sickle cell anemia，SCA)是由β-珠蛋白基因的外显子1中的单点突变引起的，导致突变的镰状形式的血红蛋白(血红蛋白S(hemoglobin S，HbS))中第6位的谷氨酸被缬氨酸替代。除了纯合血红蛋白S(“HbSS”)之外，还存在其他可导致SCD的基因型。虽然典型的SCA通常定义为纯合HbSS，但纯合血红蛋白C(“HbSC”)和HbS/β0是具有基本相同的疾病表现的常见基因型。HbS在脱氧时聚合，导致镰状样式的红细胞(red blood cell，“RBC”)，阻塞微脉管系统。SCD的临床特征在于不同程度的贫血和导致多器官损伤和过早死亡的阵发性血管闭塞性危象。除了镰状外，还存在过度溶血和慢性炎症状态。
SCD患者占美国每年住院治疗的约75,000人，导致估计每年支出4.75亿美元。在世界范围内，SCD在单基因病症的发病率方面仅次于地中海贫血，在非洲每年有超过200,000名患有这种疾病的儿童出生。目前可用于SCD的医学管理选择包括血管闭塞性危象的支持性管理、长期输血以避免或防止SCD的严重并发症(例如卒中或急性胸部综合征)的复发，以及用羟基脲诱导胎儿血红蛋白(HbF)。认为匹配的同种异体造血干细胞(hematopoieticstem cell，HSC)移植是治愈性的，但受匹配的相关供体的可用性的限制，并且具有潜在的严重并发症。在胎儿时期，γ-珠蛋白基因(产生HbF；α2γ2)是由β-珠蛋白基因座表达的主要基因，并且β-珠蛋白基因表达受到抑制。然而，在出生之后，胎儿γ-珠蛋白基因的表达降低至可忽略不计的水平，伴随着β-珠蛋白表达的提高。在成人时期，胎儿γ-珠蛋白转录物被高度沉默，即调节基因表达以阻止或降低γ-珠蛋白的表达。这种表达变化导致HbF降低，HbA(α2β2)相应提高。已知γ-珠蛋白具有抗镰状化特性并且，因此考虑添加该基因以用于基因治疗。
出于多种原因，血红蛋白病，尤其是SCD，是基因治疗的主要目标。它们的高患病率、显著的发病率和死亡率，以及由此产生的终生姑息医学护理的高成本，预示着治愈性治疗可以极大地改善患者的结局，并显著降低相关的医学成本。通过将治疗性β-珠蛋白基因离体慢病毒转移至自体CD34+造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC)中，已在人临床试验中评价了针对β-血红蛋白病的基因治疗。基于清髓性治疗的自体HSC移植已导致β-地中海贫血患者在基因治疗之后超过12个月不依赖于输血或输血量减少。
虽然使用病毒载体(例如慢病毒载体)用于治疗SCD和其他β-血红蛋白病的基因治疗的临床试验已经表明这种方法可能是治疗上有效的，但仍然需要开发具有改善的效力和改善的安全性特性谱的载体。
因此，在另一个方面中，本文中提供了含有其中SD1已失活的经修饰的珠蛋白转基因的慢病毒载体。应当理解，这样的珠蛋白转基因含有来源于β-珠蛋白的内含子2。在一些具体实施方案中，提供了含有其中SD1已失活的经修饰的γ-珠蛋白转基因的慢病毒载体。本文中还提供了含有其中SA2和SA3之一或二者已失活的经修饰的HS4-400绝缘子的慢病毒载体。还提供了不包含HS4-400绝缘子的载体。因此，当引入细胞例如造血干细胞时，本公开内容的慢病毒载体可与降低选择性剪接的风险相关。
本公开内容的这个方面至少部分基于治疗性慢病毒载体中存在的γ-珠蛋白转基因中的内含子2(其来源于β-珠蛋白)内的隐蔽剪接供体位点的鉴定。这个隐蔽剪接供体位点，称为SD1，位于γ-珠蛋白转基因内的β-珠蛋白内含子2中的载体的正链中。由于γ-珠蛋白转基因以反向方向存在于载体中，因此SD1位于γ-珠蛋白转基因的互补链中，即位于γ-珠蛋白转基因的反向互补序列中。SD1位于：SEQ ID NO：122的核苷酸第933至934位，其中SEQ ID NO：122是SEQ ID NO：121中所示的γ-珠蛋白转基因的反向互补序列，即剪接可发生在第933位的G与第934位的G之间；和SEQ ID NO：119的核苷酸第150至151位，其中SEQ IDNO：119是SEQ ID NO：118中所示的γ-珠蛋白转基因的反向互补序列，即剪接可发生在位第150位的G与第150位的G之间。当在β-珠蛋白内含子2的上下文中提及时，隐蔽剪接供体位点位于SEQ ID NO：88的核苷酸第20至21位，其中SEQ ID NO：88是SEQ ID NO：87中所示的β-珠蛋白内含子2的反向互补序列，即剪接可发生在SEQ ID NO：88的第20位的G与第21位的G之间。
因此，在一个方面中，提供了慢病毒载体，其包含：
第一启动子，其与第一核酸序列可操作地连接，其中第一核酸序列包含含有β-珠蛋白内含子2的经修饰的γ-珠蛋白转基因；其中：
经修饰的γ-珠蛋白转基因相对于未经修饰的γ-珠蛋白转基因包含突变，其中该突变使未经修饰的γ-珠蛋白转基因中存在的剪接供体位点1(SD1)失活，并且其中：
SD1存在于未经修饰的γ-珠蛋白转基因中，位于相对于SEQ ID NO：122编号为第933至934位的核苷酸处，其中SEQ ID NO：122是SEQ ID NO：121中所示的未经修饰的γ-珠蛋白转基因的反向互补序列；
SD1存在于未经修饰的γ-珠蛋白转基因中，位于相对于SEQ ID NO：119编号为第150至151位的核苷酸处，其中SEQ ID NO：119是SEQ ID NO：118中所示的未经修饰的γ-珠蛋白转基因的反向互补序列；和/或
SD1包含序列AAGATAAGAG^GTATGAACAT(SEQ ID NO：96)，其中^表示剪接位置。
在一些实施方案中，突变是相对于SEQ ID NO：122编号为第932位的A、第933位的G、第934位的G和/或第935位的T的突变。在一些具体实例中，突变是核苷酸替换，例如相对于SEQ ID NO：122编号为第934位的G至A突变。在一些实例中，经修饰的γ-珠蛋白转基因包含SEQ ID NO：91中所示的序列。
在一些实施方案中，慢病毒载体还包含经修饰的HS4-400绝缘子。
在一个实例中，当存在于载体中时，经修饰的HS4-400绝缘子相对于未经修饰的HS4-400绝缘子包含已失活的剪接受体位点2(SA2)，并且其中：SA2存在于未经修饰的HS4-400绝缘子中，位于相对于SEQ ID NO：90编号为第190至191位的核苷酸处，其中SEQ ID NO：90是SEQ ID NO：89中所示的未经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列；和/或SA2包含序列ATCCCCCCAG^GTGTCTGCAG(SEQ ID NO：61)，其中^表示剪接位置。在一些实例中，经修饰的HS4-400绝缘子相对于未经修饰的HS4-400绝缘子包含使SA2失活的突变，例如相对于SEQID NO：90编号为第189位的A(例如A至T突变)、第190位的G、第191位的G和/或第192位的T的突变。在一些实例中，经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：93中所示的序列。
在另一个实例中，当存在于慢病毒载体中时，经修饰的HS4-400绝缘子相对于未经修饰的HS4-400绝缘子包含使剪接受体位点3(SA3)失活的突变，其中：SA3存在于未经修饰的HS4-400绝缘子中，位于相对于SEQ ID NO：90编号为第200至201位的核苷酸处；和/或其中SA3包含序列GTGTCTGCAG^GCTCAAAGAG(SEQ ID NO：62)，其中^表示剪接位置。在一些实例中，突变是相对于SEQ ID NO：90编号为第199位的A(例如A至T突变)、第200位的G、第201位的G和/或第202位的C的突变。在一些具体实施方案中，经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：94至95中任一者中所示的序列。
在一些实例中，经修饰的HS4-400绝缘子在慢病毒载体内处于反向方向。在一个具体实施方案中，第一核酸处于反向方向并且经修饰的HS4-400绝缘子在慢病毒载体内处于反向方向。
在另一个实例中，经修饰的HS4-400在慢病毒载体内处于正向方向。
在另一个方面中，提供了慢病毒载体，其包含：
第一启动子第一启动子，其与第一核酸序列可操作地连接，其中第一核酸序列包含含有β-珠蛋白内含子2的经修饰的γ-珠蛋白转基因；和
经修饰的HS4-400绝缘子，其中：
当存在于载体中时，经修饰的HS4-400绝缘子相对于未经修饰的HS4-400绝缘子包含已失活的剪接受体位点2(SA2)，并且其中：
SA2存在于未经修饰的HS4-400绝缘子中，位于相对于SEQ ID NO：90编号为第190至191位的核苷酸处，其中SEQ ID NO：90是SEQ ID NO：89中所示的未经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列；和/或
SA2包含序列ATCCCCCCAG^GTGTCTGCAG(SEQ ID NO：61)，其中^表示剪接位置。
在一个实施方案中，经修饰的HS4-400绝缘子相对于未经修饰的HS4-400绝缘子包含使SA2失活的突变，例如相对于SEQ ID NO：90编号为第189位的A(例如，A至T突变)、第190位的G、第191位的G和/或第192位的T的突变。在一些具体实例中，经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：93中所示的序列。
在另一个实施方案中，经修饰的HS4-400绝缘子相对于未经修饰的HS4-400绝缘子还包含使剪接受体位点3(SA3)失活的突变，其中：SA3存在于未经修饰的HS4-400绝缘子中，位于相对于SEQ ID NO：90编号为第200至201位的核苷酸处；和/或其中SA3包含序列GTGTCTGCAG^GCTCAAAGAG(SEQ ID NO：62)，其中^表示剪接位置。在一些实例中，突变是相对于SEQ ID NO：90编号为第199位的A(例如，A至T突变)、第20位的G、第201位的G和/或第202位的C的突变。在一些具体实施方案中，经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列包含SEQID NO：94中所示的序列。
在该方面的一个实例中，经修饰的HS4-400绝缘子在慢病毒载体内处于反向方向。在另一个实例中，经修饰的HS4-400绝缘子在慢病毒载体内处于正向方向，从而使SA2失活。
在另一个方面中，提供了慢病毒载体，其包含：
第一启动子第一启动子，其与第一核酸序列可操作地连接，其中第一核酸序列包含含有β-珠蛋白内含子2的经修饰的γ-珠蛋白转基因；和
经修饰的HS4-400绝缘子，其中：
当存在于载体中时，经修饰的HS4-400绝缘子相对于未经修饰的HS4-400绝缘子包含已失活的剪接受体位点3(SA3)，并且其中：
SA3存在于未经修饰的HS4-400绝缘子中，位于相对于SEQ ID NO：90编号为第200至201位的核苷酸处，其中SEQ ID NO：90是SEQ ID NO：89中所示的未经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列；和/或
SA3包含序列GTGTCTGCAG^GCTCAAAGAG(SEQ ID NO：62)，其中^表示剪接位置。
在一个实施方案中，经修饰的HS4-400绝缘子相对于未经修饰的HS4-400绝缘子包含使SA3失活的突变，例如相对于SEQ ID NO：90编号为第199位的A(例如A至T突变)、第200位的G、第201位的G和/或第202位的C的突变。在一些实施方案中，经修饰的HS4-400绝缘子包含SEQ ID NO：95中所示的序列。
在一些实例中，经修饰的HS4-400绝缘子相对于未经修饰的HS4-400绝缘子还包含使剪接受体位点2(SA2)失活的突变，并且其中：SA2存在于未经修饰的HS4-400绝缘子中，位于相对于SEQ ID NO：90编号为第190至191位的核苷酸处，其中SEQ ID NO：90是SEQ ID NO：89中所示的未经修饰的HS4-400绝缘子的反向互补序列；和/或SA2包含序列ATCCCCCCAG^GTGTCTGCAG(SEQ ID NO：61)，其中^表示剪接位置。在一些实例中，突变是相对于SEQ IDNO：90编号为第189位的A(例如，A至T突变)、第190位的G、第191位的G和/或第192位的T的突变。在一些具体实施方案中，经修饰的HS4-400绝缘子包含SEQ ID NO：94中所示的序列。
在该方面的一些实例中，经修饰的HS4-400绝缘子在慢病毒载体内处于反向方向。在另一些实例中，经修饰的HS4-400绝缘子在慢病毒载体内处于正向方向，从而使SA3失活。
在一些实施方案中，未经修饰的γ-珠蛋白转基因包含SEQ ID NO：85中所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一个实例中，经修饰的γ-珠蛋白转基因编码γ-珠蛋白，所述γ-珠蛋白包含SEQ ID NO：103中所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实例中，转基因仅包含γ-珠蛋白编码序列(例如如SEQ ID NO：101或102中所示)。在一些具体实例中，γ-珠蛋白转基因包含外显子和内含子并且与其他非编码元件缔合。在一个实例中，γ-珠蛋白转基因包含γ-珠蛋白外显子1(或HBG外显子1，例如如SEQID NO：98中所示)、γ-珠蛋白外显子2(或HBG外显子2，例如如SEQ ID NO：99中所示)和γ-珠蛋白外显子3(或HBG外显子3，例如如SEQ ID NO：100中所示)。内含子可包含γ-珠蛋白内含子1(或HBG内含子1)和β-珠蛋白内含子2(HBB内含子2，例如截短的HBB内含子2，例如如SEQ ID NO：87中所示)。在一个具体实施方案中，转基因包含SEQ ID NO：118(即HBG外显子1、HBG内含子1、HBG外显子2、HBB截短的内含子2和HBG外显子3)或SEQ ID NO：121(即HBG外显子1、HBG内含子1、HBG外显子2、HBB截短的内含子2、HBG外显子3和3’UTR/polyA信号)中所示的序列。转基因可任选地与其他非编码元件例如β-珠蛋白基因座控制区(Locus controlregion，LCR)(例如如SEQ ID NO：105中所示)缔合。
如本文中确定的，当在慢病毒载体中时，含有β-珠蛋白内含子2的γ-珠蛋白转基因可具有隐蔽剪接供体位点(SD1)。当转基因以反向方向存在于慢病毒载体中时，在SEQ IDNO：118和121中所示的γ-珠蛋白转基因中鉴定了该剪接供体位点，其中SD1位于载体正链中的β-珠蛋白内含子2中。因此，SD1在SEQ ID NO：118和121的反向互补序列中。这些反向互补序列如SEQ ID NO：120和122所示。
SD1存在于SEQ ID NO：121的第933至934位(即剪接发生第933位的G与第934位的G之间)和SEQ ID NO：119的第150至151位(即剪接可发生第150位的G与第150位的G之间)以及含有β-珠蛋白内含子2的其他γ-珠蛋白转基因的相应位置。SD1还可被定义为包含序列AAGATAAGAG^GTATGAACAT(SEQ ID NO：96)，其中^表示剪接位置；或者包含含有β-珠蛋白内含子2的γ-珠蛋白转基因的互补链的相对于SEQ ID NO：121编号为第924至943位的核苷酸序列；或者包含含有β-珠蛋白内含子2的γ-珠蛋白转基因的互补链的相对于SEQ ID NO：119编号为第141至160位的核苷酸序列。当在β-珠蛋白内含子2的背景下考虑时，SD1存在于SEQ ID NO：88的第20至21位(即剪接发生在第20位的G与第21位的G之间)以及其他β-珠蛋白内含子的相应位置。因此，SD1也可被定义为包含β-珠蛋白内含子2互补链的相对于SEQID NO：88编号为第11至30位的核苷酸序列。
因此，在一些实施方案中，本公开内容的慢病毒载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一启动子，其中第一核酸序列包含含有β-珠蛋白内含子2的经修饰的γ-珠蛋白转基因；其中经修饰的γ-珠蛋白转基因相对于未经修饰的γ-珠蛋白转基因包含突变，其中该突变使SD1失活。当转导到细胞中时，与在具有包含未经修饰的γ-珠蛋白转基因的慢病毒载体的情况下在分别相对于SEQ ID NO：122或119编号为第924至943位或150至151位处发生的剪接相比，包含经修饰的γ-珠蛋白转基因的慢病毒载体在第924至943或150至151位处可表现出降低的剪接。在一些实例中，剪接降低至少或约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
未经修饰的γ-珠蛋白转基因包括当存在于慢病毒载体中时包含活性SD1的那些，即在慢病毒载体内包含可促进在SD1处的剪接的序列和方向。示例性的未经修饰的γ-珠蛋白转基因包括：编码γ-珠蛋白的那些和包含SEQ ID NO：118和121(分别具有SEQ ID NO：119和122中所示的反向互补序列)中所示的序列的那些以及与其具有至少或者约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是SD1位点仍然存在，例如前提是γ-珠蛋白转基因的反向互补包含序列AAGATAAGAGGTATGAACAT(SEQ ID NO：96))。
在一些具体实例中，经修饰的γ-珠蛋白转基因相对于未经修饰的γ-珠蛋白转基因包含突变(例如，核苷酸缺失、插入或替代)，其中该突变使存在于未经修饰的γ-珠蛋白转基因中的SD1失活(或与发生在未经修饰的γ-珠蛋白转基因的反向互补序列中的相对于SEQ ID NO：122编号为第924至943位的剪接相比，降低了经修饰的γ-珠蛋白转基因的反向互补序列的第924至943位的剪接)。突变可以是使SD1失活或破坏SD1的任何突变。在一些实例中，突变是SD1序列中任何核苷酸的缺失或替换，或者是SD1序列(例如序列AAGATAAGAGGTATGAACAT(SEQ ID NO：96))中的核苷酸插入。在一些具体实例中，突变是相对于SEQ ID NO：122编号为第932位的A、第933位的G、第934位的G和/或第935位的T的突变(例如缺失或替换)(例如，是相对于SEQ ID NO：119编号为第149位的A、第150位的G、第151位的G和/或第152位的T的突变)。例如，经修饰的γ-珠蛋白转基因可包含相对于SEQ ID NO：122编号为第932位的A至T、A至C或A至G突变，第933位的G至C、G至A或G至T突变，第934位的G至C、G至T或G至A突变，和/或者第935位的T至A、T至C或T至G突变(即相对于SEQ ID NO：119编号为第149位的A至T、A至C或A至G突变，第150位的G至C、G至A或G至T突变，第151位的G至C、G至T或G至A突变，和/或者第152位的T至A、T至C或T至G突变)。在另一些实例中，突变包含在相对于SEQ ID NO：122编号为第932、933和/或934位之后核苷酸的插入(即在相对于SEQ IDNO：119编号为第149、150和/或151位之后的核苷酸的插入。在一些实例中，经修饰的γ-珠蛋白转基因包含两个或更多个这样的突变。
在一个实例中，经修饰的γ-珠蛋白转基因在反向互补序列中在相对于SEQ IDNO：122编号为第934位处包含G至A突变(即，在相对于SEQ ID NO：122编号为第934位处包含A)。因此，在一些实例中，经修饰的γ-珠蛋白转基因在反向互补序列中在相对于SEQ IDNO：119编号为第151位处包含G至A突变(即，在相对于SEQ ID NO：119编号为第151位处包含A)。在一些具体实施方案中，γ-珠蛋白转基因的反向互补序列包含SEQ ID NO：123中所示的序列或者与其具有至少或者约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是在相对于SEQ ID NO：122编号为第934位处具有A)。在另一些实施方案中，γ-珠蛋白转基因的反向互补序列包含SEQ ID NO：120中所示的序列或者与其具有至少或者约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(前提是在相对于SEQ ID NO：119编号为第151位处具有A)。
在一些实例中，具有使SD1失活的突变的本文中所述的经修饰的γ-珠蛋白转基因在慢病毒载体内处于反向方向。
在另一些实施方案中，第一启动子是β-珠蛋白启动子，例如包含SEQ ID NO：115至117中任一者中所示的核酸序列的启动子，或者与SEQ ID NO：115至117中任一者具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的启动子。
在一个实施方案中，第一启动子是β-珠蛋白启动子并且与包含γ-珠蛋白转基因的第一核酸可操作地连接。
在一些实施方案中，慢病毒载体还包含与第二核酸序列可操作地连接的第二启动子，其中第二核酸序列编码抑制HPRT表达的核酸。在一些实例中，抑制HPRT表达的核酸是shRNA，例如包含SEQ ID NO：66中所示的发夹环序列的shRNA，和/或者包含SEQ ID NO：67至68中任一者中所示的核酸序列或包含与SEQ ID NO：67至68中任一者包含至少95％序列同一性的序列的shRNA。在一个实例中，第二启动子包含Pol III启动子或Pol II启动子，例如包含7sk的启动子(例如包含SEQ ID NO：69至71中任一者中所示的核酸序列或与SEQ IDNO：69至71中任一者具有至少95％序列同一性的序列的启动子)。在一个具体实施方案中，第二启动子和可操作地连接的第二核酸序列处于正向方向并且位于处于反向方向的第一启动子和可操作地连接的第一核酸的下游。
在一些实例中，慢病毒载体还在载体的3’LTR中包含多腺苷酸化信号。多腺苷酸化信号可以是例如兔β-珠蛋白多腺苷酸化信号，其包含SEQ ID NO：103中所示的核酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列。
在本公开内容的另一个方面中，提供了慢病毒载体，其包括核酸载体(例如质粒)和慢病毒病毒体(或病毒颗粒)，所述慢病毒载体包含：5’LTR(包括7tetO启动子/操纵子、R和U5，例如图27中示意性示出的)，其下游(从5’至3’)是中央多嘌呤束(cPPT)；REV响应元件(RRE)(例如包含SEQ ID NO：106中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的元件)；γ-珠蛋白表达盒，其包含与γ-珠蛋白转基因(例如本文中所述的具有已失活的SD1的经修饰的γ-珠蛋白转基因，例如包含含有SEQ ID NO：123中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的互补链的转基，其中所述序列包含相对于SEQ ID NO：122编号为第934位的A；或包含含有SEQ ID NO：120中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的互补链的转基因，其中所述序列包含相对于SEQ ID NO：119编号为第151位的A)可操作地连接的β-珠蛋白启动子(例如包含SEQ ID NO：11至117中任一者中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的启动子)；β-珠蛋白LCR(例如，包含SEQ ID NO：105中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的LCR)；7sk-sh734表达盒，其包含与编码sh734的核酸可操作地连接的7sk启动子，和3’LTR，其包含HS4-400绝缘子(例如本文中所述的具有已失活的SA2和/或SA3的经修饰的HS4-400绝缘子，例如包含含有SEQ ID NO：93中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的互补链的绝缘子，其中所述序列包含相对于SEQ ID NO：93编号为第189位的T；包含含有SEQ IDNO：95中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的互补链的绝缘子，其中所述序列包含相对于SEQ ID NO：95编号为第199位的T；或包含含有SEQ ID NO：94中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的互补链的绝缘子，其中所述序列包含相对于SEQ ID NO：94编号为第189位的T和第199位的T)；R和β-珠蛋白poly(A)信号(例如，包含SEQ ID NO：104中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列的信号)。在一些实例中，γ-珠蛋白表达盒是这样的一种表达盒，其中互补链包含SEQ ID NO：91中所示的序列或者包含与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列，其中所述序列包含相对于SEQ ID NO：86编号为第934位的A。在这些载体中，γ-珠蛋白表达盒通常处于反向方向，而7sk-sh734表达盒处于正向方向。
在一些实施方案中，慢病毒载体是质粒。在另一些实施方案中，慢病毒载体是病毒颗粒。
在一个实施方案中，载体是质粒并且包含SEQ ID NO：109中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列，前提是载体包含γ-珠蛋白表达盒的相对于SEQ ID NO：91编号为第934位的A)。
在另一个实施方案中，载体是质粒并且包含SEQ ID NO：110中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列，前提是载体包含HS4-400绝缘子的相对于SEQ ID NO：94编号为第189位的T和第199位的T。
在另一个实施方案中，载体是质粒并且包含SEQ ID NO：111中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列，前提是载体包含γ-珠蛋白表达盒的相对于SEQ ID NO：91编号为第934位的A，并且前提是载体包含HS4-400绝缘子的相对于SEQ ID NO：94编号为第189位的T和第199位的T。
在一个实施方案中，载体是质粒并且包含SEQ ID NO：112中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列，前提是载体包含γ-珠蛋白表达盒的相对于SEQ ID NO：91编号为第934位的A。
在另一个实施方案中，载体是质粒并且包含SEQ ID NO：113中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列，前提是载体包含HS4-400绝缘子的相对于SEQ ID NO：93编号为第189位的T。
在另一个实施方案中，载体是质粒并且包含SEQ ID NO：114中所示的序列或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％序列同一性的序列，前提是载体包含γ-珠蛋白表达盒的相对于SEQ ID NO：91编号为第934位的A，并且前提是载体包含HS4-400绝缘子的相对于SEQ ID NO：93编号为第189位的T。
还提供了宿主细胞，其包含本公开内容的慢病毒载体或用本公开内容的慢病毒载体转导。在一些实例中，宿主细胞是造血干细胞(HSC)(例如同种异体或自体HSC)。例如，宿主细胞是HPRT缺陷的。
在另一方面中，提供了治疗患有镰状细胞病或β-地中海贫血的对象的方法，其包括向对象施用上文和本文中所述的宿主细胞。在一个实施方案中，所述方法包括向对象施用宿主细胞，然后向对象施用嘌呤类似物(6-硫鸟嘌呤(“6TG”)、6-巯基嘌呤(“6MP”)或氮杂硫代嘌呤(“AZA”))以提高宿主细胞的植入。在一些实例中，所述方法还包括在施用宿主细胞之前用嘌呤类似物预处理对象。还提供了宿主细胞用于制备用于治疗镰状细胞病或β-地中海贫血的药物的用途。
认为，用编码γ珠蛋白基因的载体对HSC进行遗传校正将导致抗镰状化HbF的连续(即永久)产生，从而在对象的一生中预防或减轻RBC镰状化。认为，这种方法比目前可用的治疗具有优势，包括其可用于所有患者，特别是那些没有匹配的同胞供体的患者，而且事实上其将是一次性治疗，导致终生矫正。还认为该方法有利地没有任何免疫副作用。还认为，有效的基因治疗方法将彻底改变治疗SCD的方式，并改善患有这种破坏性疾病的患者的结局。
如本文中所述，除了γ-珠蛋白转基因之外，本公开内容的载体还可包含被设计用于抑制或敲低HPRT表达的物质(例如shRNA)，并因此提供了体内化学选择策略，该策略利用了HPRT在将嘌呤类似物(例如6TG)代谢成骨髓毒性物质中所发挥的重要作用。由于HPRT缺陷不损害造血细胞的发育或功能，因此可将其从用于移植的造血细胞中去除。本文中还讨论了用嘌呤类似物进行的处理和化学选择。
在治疗镰状细胞贫血或β-地中海贫血的情况下，对对象的治疗包括以下步骤：鉴定有此治疗需要的对象；用本公开内容的载体(例如慢病毒载体)(即包含突变的人γ-珠蛋白基因和针对HPRT的shRNA的载体)转染造血干细胞(HSC)(例如自体HSC)；以及将转染的HSC移植到对象中。
在一些实施方案中，治疗血红蛋白病的方法包括：(i)用包含至少两种核酸序列的载体转导HSC，所述核酸序列即编码HPRT基因的shRNA的核酸序列和编码γ珠蛋白基因的核酸序列，以及(ii)将转导的HSC施用于哺乳动物对象。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用转导的HSC之前进行清髓性处理的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用转导的HSC之后利用嘌呤类似物(例如6TG)进行体内化学选择的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括利用MTX或MTA进行负选择的步骤。
在一些实施方案中，移植后胎儿血红蛋白超过至少20％；F细胞构成循环红细胞的至少2/3；每个F细胞的胎儿血红蛋白占镰状红细胞中总血红蛋白的至少1/3；并且至少20％的基因经修饰的HSC重新填充(re-populate)对象的骨髓。在一些实施方案中，移植后胎儿血红蛋白超过25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。在一些实施方案中，移植后胎儿血红蛋白超过55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，F细胞构成循环红细胞的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，每个F细胞的胎儿血红蛋白占镰状红细胞中总血红蛋白的至少1/3。在一些实施方案中，每个F细胞的胎儿血红蛋白占镰状红细胞中总血红蛋白的至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的基因经修饰的HSC重新填充对象的骨髓。
本公开内容的另一方面是治疗免疫缺陷、遗传性疾病、血液疾病(例如血友病、血红蛋白病症)、溶酶体贮积症、神经系统疾病、血管生成障碍或癌症的治疗方法，其包括向哺乳动物对象施用有效量的载体，所述载体包含至少两种核酸序列，即编码HPRT基因的RNAi的核酸序列和编码治疗性基因的核酸序列。
本公开内容的另一方面是治疗血红蛋白病的方法，其包括向哺乳动物对象施用有效量的载体，所述载体包含至少两种核酸序列，即编码RNAi以敲除或以其他方式降低HPRT基因的表达的核酸序列，和编码γ珠蛋白基因的核酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括向患者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含(i)含有至少两种核酸序列的载体，所述至少两种核酸序列即编码HPRT基因的shRNA的核酸序列和编码γ珠蛋白基因的核酸序列，和(ii)可药用载体。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用转导的HSC之前进行清髓性处理的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用转导的HSC之后利用6TG进行体内化学选择的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括利用MTX进行负选择的步骤。
为了使本发明易于理解并付诸实践，现在将通过以下非限制性实施例来描述一些具体的优选实施方案。
实施例
实施例1
WAS LVV中隐蔽剪接位点的鉴定
评估含有WAS cDNA的慢病毒载体的隐蔽剪接位点。该慢病毒载体是质粒pBRNGTR47_pTL20c_SK734rev_MND_WAS_650(或pBRNGTR47)，其具有SEQ ID NO：55中所示的序列。从图1可看出，pBRNGTR47含有正向方向的第一表达盒，其包含在MND启动子控制下的WAS cDNA。WAS cDNA的下游是土拨鼠肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)，随后是HS4-650绝缘子(在反向方向)和β-珠蛋白polyA信号。第二表达盒位于第一表达构建体的上游并且在反向方向，包括在7sk启动子控制下的编码shRNA 734的核酸。慢病毒DNA(包括病毒基因和LTR元件)在7tetO启动子/操纵子的控制下(参见图1)。下表4中提供了载体内这些元件各自的位置和方向。
表4
使用生物信息学剪接位点预测分析(Netgene2)来鉴定pBRNGTR47中的潜在剪接位点。鉴定了载体正链上的HS4-650绝缘子的三个关键的剪接受体位点(剪接受体位点1(SA1)、剪接受体位点2(SA2)、剪接受体位点3(SA3)，置信水平为0.30至0.82(参见图2)。由于HS4-650绝缘子在pBRNGTR47中的反向方向中，剪接受体位点在HS4-650绝缘子的反向互补序列中。这三个位点被认为特别易于诱导异常转录。下表5示出了SA1、SA2和SA3的详细信息。
表5
位置：核苷酸位置编号是紧邻SEQ ID NO：55中剪接位点5’的G。
链：剪接位点所在的链；(+)＝正向 (-)＝反向
置信度评分：由NetGene软件提供的置信度值，其估计给定序列是真实剪接位点的概率(1＝最大值；对于剪接供体(splice donor，SD)，认为评分＞0.5是显著的；对于剪接受体(splice acceptor，SA)，认为评分＞0.2是显著的)。
^表示剪接位点
实施例2
具有已失活的剪接受体位点的载体的产生
产生了一系列经修饰的载体以使SA1、SA2和/或SA3失活。这些载体含有剪接受体位点突变，或HS4-650绝缘子的倒置，使得其以正向方向存在于载体内(类似于WAS cDNA)，从而将剪接受体位点序列置于反向链。对于在HS4-650绝缘子中含有使剪接受体位点失活的突变的那些载体，该突变是A至T突变，如下表6中所示。
表6
表7总结了产生的载体。一些载体(pBRNGTR83、pBRNGTR87、pBRNGTR91和pBRNGTR119)缺少第二表达盒(即p7sk-shRNA 734表达盒)。所有载体都包含WAS cDNA下游的WPRE，但序列不同，且当与野生型序列相比时，pBRNGTR47中的WPRE包括7个突变(WPREmut7)，并且当与野生型序列相比时，新产生的载体利用具有6个突变的WPRE(mut6)(在文献中也称为WPRE mut6)。所有新产生的载体还在绝缘子上游的U3序列中包含另外的2bp。其在pBRNGTR47中已缺失，但重新引入pBRNGTR83、pBRNGTR84、pBRNGTR87、pBRNGTR88、pBRNGTR91、pBRNGTR92、pBRNGTR119和pBRNGTR120中)。具有2个点突变以使SA1和SA2失活的载体包括pBRNGTR87和pBRNGTR88，并且具有3个点突变以使SA1、SA2和SA3失活的载体包括pBRNGTR119和pBRNGTR120。具有HS4-650绝缘子倒置以使剪接位点失活的载体包括pBRNGTR91和pBRNGTR92。
表7
/>
/>
下表8至11中提供了pBRNGTR84、pBRNGTR88、pBRNGTR92和pBRNGTR120内的多种元件的位置和方向，并在图3至6中示出。
表8 pBRNGTR84
元件 方向 起始(nt位置) 终止(nt位置)
7tetO启动子 正向 28 315
shRNA 734 反向 2402 2448
7SK启动子 反向 2449 2697
MND启动子 正向 2710 3056
WAS cDNA(野生型ORF) 正向 3098 4606
WPRE 正向 4615 5204
cHS4 Ins-650绝缘子 反向 5342 6006
兔β-珠蛋白多腺苷酸化信号 正向 6133 6581
表9：pBRNGTR88
/>
表10.pBRNGTR92
元件 方向 起始(nt位置) 终止(nt位置)
7tetO启动子 正向 28 315
shRNA 734 反向 2402 2448
7SK启动子 反向 2449 2697
MND启动子 正向 2710 3056
WAS cDNA(野生型ORF) 正向 3098 4606
WPRE 正向 4615 5204
cHS4 Ins-650绝缘子 正向 5345 6009
兔β-珠蛋白多腺苷酸化信号 正向 6133 6581
表11.pBRNGTR120
实施例3
用HMGA2融合转录物测定评估异常剪接
已经开发了新的基于HDR的基因编辑测定以直接评估在HMGA2基因的内含子3内整合之后在HMG2A基因座内的LV载体融合转录物。使用这种方法是因为已在LV试验中鉴定出LV整合贯穿该内含子(De Ravin et al.(2016)，Science Translational Medicine，Vol.8，pp.335ra57)。
简言之，设计了靶向HMGA2内含子3内多个位点的sgRNA，其在细胞系中表现出高效切割(NHEJ率70％至90％)。设计并产生了一系列具有0.6kb同源臂的AAV同源定向修复(homology directed repair，HDR)供体。每个供体含有来源于含有绝缘子元件(包含经修饰的绝缘子)的LVV LTR的同源臂侧翼序列。设计AAV供体以用于与sgRNA共递送。
在重组AAV载体原种产生之后，通过核转染将AAV供体和sgRNA(作为RNP递送)引入到KG-1细胞系或引入到原代人CD34+细胞中。除了LTR/绝缘子供体构建体之外，还产生了对照AAV HDR供体，其含有被设计用于引入MND.GFP.多腺苷酸化盒的相同同源臂。该对照提供了通过流式细胞术获取目标整合率的快速方法。使用该对照构建体，在KG-1细胞中观察到约40％的HDR率。在共递送RNP和AAV LTR供体之后，在编辑后＞1周，在从编辑的细胞中分离的基因组DNA和RNA中测量HDR率和融合转录物。
在KG-1细胞中进行的初步实验表明，在AAV供体下有效靶向，且平均HDR率为31％(范围23％至37％)。在用cHS4元件编辑的细胞中检测到利用SA位点的融合转录物。融合构建体的序列通过DNA测序得到确认，并与最高评分SA位点的预测用途相匹配。
最初的研究表明，SA1和SA2二者的修饰均会使这些位点处的剪接失活或消除这些位点处的剪接。然而，观察到由这些构建体中未经修饰的SA3处的剪接产生的融合转录物。用包含倒置HS4-650绝缘子(即相对于WAS转基因处于正向方向)的构建体未检测到融合转录物，表明使方向反转消除了剪接位点。评估了包含SA1、SA2和SA3处的突变的组合的构建体。
通过ddPCR评估HMGA2外显子2-3/外显子4-5的转录物之比，表明当与包含具有未经修饰的剪接位点的未经修饰的650bp绝缘子的构建体(“650”)相比时，来自包含经修饰的绝缘子的构建体(“3×SA”和“fwd”)的异常剪接的融合转录物减少；参见图8。
此外，培养物中编辑的细胞频率随时间的评估表明，与针对包含具有未经修饰的剪接位点的未经修饰的650bp绝缘子的构建体(“650”)观察到的优势相比，HMGA2融合转录物(即在包含经修饰的绝缘子“fwd”和“3×SA”的构建体)的减少与选择性细胞生长优势的降低或消除相关。图9中示出了来自KG1细胞的结果并且图10中示出了来自CD34+细胞的结果。
实施例4
用于评估异常剪接的富集RNA-SEQ方法
对样品中的总RNA进行测序(RNA-Seq)是用于直接评估样品中的基因表达信号的有用的下一代测序技术。然而，RNA-Seq样品通常高度复杂，并且通常需要深度测序来完全解析相对罕见的目的转录物的信号。RNA-Seq杂交捕获试剂盒可用于在RNA-Seq之前从复杂样品富集靶标。为此，设计了靶向HMGA2以富集HMGA2 mRNA转录物的定制RNA诱饵。
认识到HMGA2有五种已知的转录物变体，每种变体均导致不同蛋白质同种型的表达。所有同种型的共同点是外显子1、2和3。用靶向HMGA2外显子1、2和3的诱饵设计HMGA2靶标富集试剂盒。还设计了针对三个看家基因(B2M、PPIA、GAPDH)的诱饵作为用于归一化的对照(图11)。以下方案用于从复杂的RNA Seq样品富集含有HMGA2外显子1至3的mRNA，使得能够通过对与下游慢病毒序列相比的下游HMGA2外显子的丰度进行测序和定量来评估异常剪接事件。
a)杂交——首先将条码化的NGS cDNA文库通过加热变性，并在数个小时的过程中使其与互补生物素化的RNA诱饵的复杂混合物杂交。使用接头(adapter)特异性阻断寡核苷酸来防止文库分子在常见接头位点处随机退火。
b)清洗——在杂交完成之后，每个诱饵上存在的生物素与链霉亲和素包被的磁珠结合。清洗步骤有助于去除脱靶或杂交不佳的文库分子。
c)扩增——通过加热使与其互补诱饵结合的剩余文库分子变性，并使用通用文库引物进行扩增。对这个“富集”的文库进行测序和评估。
对来自KG1细胞(用AAV供体和RNP编辑之后35天)和CD34+细胞(用AAV供体和RNP编辑之后13天)的每一个样品进行了评估。提取映射到人基因组或任何AAV构建体的所有读数。对映射到i)PPIA、ii)GAPDH、iii)B2M、iv)HMGA2或AAV(组合)的读数进行计数。将映射到HMGA2或AAV的读数进一步分为映射到以下的读数：i)AAV插入位点上游的HMGA2；ii)AAV插入位点下游的HMGA2；和iii)AAV序列。
可使用AAV读数与HMGA2下游读数之比作为对包含经修饰的绝缘子序列的LVV的剪接活性的量度。计算AAV融合转录物的表达水平，并相对于上述选定的看家基因(对照)进行归一化。计算HMGA2上游读数并相对于看家基因进行归一化，以评估总的HMGA2表达转录物。
在KG1细胞中，在包含3×SA 650bp校正绝缘子的构建体中观察到AAV/HMGA2之比降低5.5倍，计算为AAV读数与HMGA2下游外显子读数之比(图22A)。在CD34+细胞中，在包含3×SA 650bp校正绝缘子的构建体中观察到AAV/HMGA2之比降低3.6倍(图22B)。在包含相对于转基因处于正向方向(相对于包含原始未经修饰的绝缘子的对照构建体的反向方向)的HS4-650绝缘子的构建体中观察到AAV/HMGA2之比的类似降低(图22A和22B；“fwd”)。
图12和图13分别示出了KG1和CD34+细胞中HMGA2转录物和AAV融合转录物的表达水平。具体地，图12A和13A示出了与未处理细胞相比的总HMGA2表达转录物的水平。图12B和13B示出了细胞中表达的相对于3×SA经修饰的绝缘子构建体归一化的融合转录物的水平。“650”是指包含具有未修饰剪接位点的未修饰HS4-650绝缘子的构建体；“2xSA”是指包含具有两个校正的隐蔽剪接受体位点的HS4-650绝缘子的构建体；“3×SA”是指包含具有三个校正的隐蔽剪接受体位点的HS4-650绝缘子的构建体；“fwd”是指包含相对于转基因处于正向方向(或相对于包含原始未修饰绝缘子的对照构建体的反向方向)的HS4-650绝缘子的构建体；并且“mock”或“fwd_LTRrev”是指对照。在KG1细胞和CD34+细胞二者中，与包含未经修饰的绝缘子的构建体(“650”)相比，包含经修饰的绝缘子的构建体(“3×SA”和“fwd”)表现出降低的AAV融合转录物的表达水平。
为了量化HMGA2外显子3与外显子4(主要同种型)或LVV序列(AAV插入)之间检测到的剪接事件，提取包含HMGA2外显子3序列的读数，并对与下游下一个外显子的连接进行量化。针对CD34+(图14至图16)和KG1细胞(图17至图19)二者进行该分析。在两种细胞类型中，与包含具有未修饰剪接位点的未修饰HS4-650绝缘子的构建体相比，在包含修饰绝缘子的两种构建体中HMGA2外显子3-LVV剪接的百分比均降低(图14和图17)。
实施例5
绝缘子活性的评估
为了评估经修饰的HS4-650绝缘子的增强子阻断活性，可使用仅LIM结构域二(LIMdomain only two，LMO2)激活测定来验证经修饰的绝缘子的功能。Ryu et al.，2008，Blood，Vol.111，pp.1866和Goodman et al.2018，Journal of Virology，Vol.92pp.e01639-17中已经描述了类似的测定。
简言之，使用在LMO2基因的启动子或第一内含子内具有靶向整合的原病毒的Jurkat细胞系来评估载体构建体(Ryu et al.，2008；Zhou et al.，2010)。当经修饰的绝缘子序列保留其绝缘子增强子阻断功能时，观察到与未经修饰的绝缘子序列相似的LMO2表达，对应于与未绝缘的原病毒相比LMO2表达的明显降低。当绝缘子功能因绝缘子序列修饰而降低或破坏时，观察到LMO2表达高于未修饰绝缘子序列的表达。
使用RT-qPCR作为对LMO2表达的测量，并因此测量示例性绝缘子的增强子阻断活性。具有驱动mScarlet-I报道转基因并在LTR中包含不同绝缘子序列的MND启动子的LVV原病毒构建体用于该测定。具有驱动mScarlet-I报告转基因但缺乏绝缘子的MND启动子的MoMLV原病毒和LVV原病毒构建体用作LMO2激活的阳性对照。不具有启动子或具有EF1α启动子的前病毒构建体用作LMO2激活的阴性对照。单克隆测定(图20)和批量细胞测定(图21A和图21B)二者均已完成。包含经修饰的绝缘子的示例性构建体(“fwd”和“3×SA”)相对于具有未经修饰的剪接位点的未经修饰的HS4-650绝缘子(“650”)表现出相当的LMO2表达，表明经修饰的绝缘子保留了期望的绝缘子增强子阻断功能。阳性和阴性对照包括缺乏启动子的构建体(“不含启动子”)和缺乏绝缘子的构建体(“不含绝缘子”或“无Ins”)。
实施例6
体外永生化测定(IVIM测定)
体外永生化测定(in vitro immortalization assay，IVIM测定)用于评估在用慢病毒载体进行基因治疗之后载体介导的遗传毒性事件。IVIM是使用简单的细胞培养模型来量化造血细胞转化的风险的快速诱变测定。IVIM测定可基于转导的细胞的初始数目和在有限稀释之后表现出稳健的重新接种的突变体的克隆特征，使得能够量化遗传毒性突变体的发生率。它还能够表征转化常见插入位点(common insertion site，CIS)。
已经描述了IVIM测定(Modlich et al.(2006)，Blood，Vol.108pp.2545；和Modlich et al.(2009)，Molecular Therapy，Vol.17pp.1919-1928)。简言之，从完整骨髓中分离出谱系阴性(Lin-)骨髓细胞。通过旋转孵育(Spinoculation)(纤维连接蛋白包被的悬浮培养皿)用LVV载体转导预刺激的Lin-骨髓细胞。在两轮转导之后，并且收获细胞以用于流式细胞术(flow cytometry，FACS)并将DNA样品用于实时PCR分析(拷贝数)。
在转导之后，将细胞作为大规模培养物扩增大约两周。在大量规模培养物扩增之后，将细胞接种到96孔板中，大约两周之后，对阳性孔进行计数，并计算重新接种细胞的频率。可扩增选择的克隆用于进一步表征。
实施例7
转导和WASP表达
在以下两种不同的细胞类型中评估了来自示例性慢病毒载体构建体的WAS表达：鼠谱系阴性(lineage negative，Linneg)细胞和(人)U937细胞。两种细胞类型中的WAS KO和WT细胞均用作阳性对照用于测定。
鼠Linneg细胞：通过使用直接谱系细胞去除试剂盒(Miltenyi)对来自WAS KO小鼠骨髓的谱系阴性细胞进行磁性标记。在谱系耗竭之后，将每种转导条件下的200.000个Linneg WASp KO细胞与含有转导增强子(TE；1×LentiBoost和10μM dmPGE2)的150μL培养基在96孔中混合，并在37℃和5％CO2下孵育1小时。将不同的WASP LV以MOI为1和10添加至细胞，最终体积为每孔200μL，并在37℃和5％CO2下孵育12至16小时。每次转导均在一式三份的孔中进行。在规定的孵育时间之后，用培养基洗涤细胞以去除病毒上清液并培养7天(在24孔板中)。
U937细胞：U937是已知表达高水平的WASP的前单核、人髓性白血病细胞系。对于WASP LV表征，使用U937WASP KO细胞(克隆19B)。WAS KO克隆是通过CRISPR/Cas9靶向WASP基因基因座的外显子7产生的。与鼠Linneg细胞一样，WAS KO U937细胞用多种WAS LV转导，并在37℃和5％CO2下孵育12至16小时。用于U937细胞的MOI为：0.5、1和10。与鼠Linneg细胞一样，每次转导一式三份进行，并且在转导之后将细胞(在24孔板中)培养21天。
对于Linneg细胞在转导之后7天分析WAS蛋白表达并且对于U937细胞在转导后21天分析WAS蛋白表达。简言之，收获细胞并透化以允许胞内WAS蛋白的染色。用标记WAS抗体(5A5，BD Biosciences，内部标记)的Alexa-Fluor 647对WAS蛋白进行染色。未转导的WASKO细胞和WT细胞(Linneg和U937细胞)分别用作阴性对照和阳性对照，并且WAS表达表示为中值荧光强度(Median Fluorescent Intensity，MFI)。在Linneg细胞中，在所有LVV(包括具有经修饰的绝缘子的那些)中观察到相当的WASP表达。在U937细胞中，WASP表达超过WT对照(WT：KO为1至2和1至3)。这表明为解决异常剪接而对绝缘子进行修饰没有降低或阻碍转基因表达(对于Linneg细胞参见图23并且对于参见U937细胞参见图25)。
除了WAS蛋白表达之外，从细胞中提取总DNA，并通过q-PCR分析载体拷贝数(number of vector copy，VCN)整合，并表示为VCN/细胞。在两种细胞类型中均观察到VCN的剂量依赖性提高(对于Linneg细胞参见图24并且对于U937细胞参见图26)。
实施例8
用经LVV修饰细胞进行的WAS KO小鼠的移植
在WAS KO小鼠模型中评估体内WAS挽救。在这种程度上，将WAS KO鼠Linneg细胞用与实施例6中所述的相同方案用具有校正绝缘子的示例性WAS LVV进行修饰。在LV修饰之后，洗涤细胞并将其移植到预处理的(致死辐照)WAS KO小鼠(约2×106个细胞/小鼠±20％)中。来自供体小鼠和接受体小鼠的细胞可基于CD45.1或CD45.2同源等位基因进行区分。WT与WAS KO以及WAS KO与WAS KO组分别用作阳性对照和阴性对照。定期从小鼠抽取外周血，以监测多种免疫细胞谱系的植入和发育以及相应细胞类型中的WASP表达。为了评估WASP挽救的功能，分析来自移植小鼠(处死之后)脾的T细胞响应于刺激的功能。
实施例9
SCD LVV中隐蔽剪接位点的鉴定
评估含有人γ-珠蛋白转基因的慢病毒载体的隐蔽剪接位点。该慢病毒载体是具有SEQ ID NO：109中所示序列的质粒pCalH10_TL20c_rGbGM_7SKsh734(“pCalH10”)。如可从图27中看出的，pCalH10含有人γ-珠蛋白G16D表达盒，该表达盒含有人γ-珠蛋白(humanγ-globin，HBG)外显子(具有G16D点突变)、β-珠蛋白(HBB)非编码序列、β-珠蛋白启动子、和由超敏位点(HS2、HS3和HS4元件)组成的3.2kbβ-珠蛋白基因座控制区(LCR)，以与病毒主链中的病毒RNA转录物相反的方向克隆。β-珠蛋白非编码区包含截短的HBB内含子2。第二表达盒位于人γ-珠蛋白G16D表达盒的下游并且处于正向方向，包括与编码shRNA 734(sh734)的核酸可操作地连接的7sk启动子。LTR中的下游是处于反向方向的HS4-400绝缘子。慢病毒DNA的转录由7tetO启动子/操纵子驱动(参见图27)。
使用生物信息学剪接位点预测分析(Netgene2)来鉴定pCalH10中的潜在剪接位点。这揭示了大约一百个潜在剪接位点，表明可能存在与该载体相关的异常剪接。
然后分析pCalH10载体插入物的稳定性。简言之，用由pCalH10产生的病毒体转导HeLa细胞，并因此含有与上述和图27中所示相同的插入物。在6天之后提取细胞DNA，并对DNA进行限制性酶消化和Southern印迹分析，并与未转导的HeLa细胞(阴性对照)和pCalH10(阳性对照)进行比较。对测试样品使用AflIII和NotI限制性酶以释放大约6.7kb的载体插入序列，并使用MfeI和XbaI以从pCalH10产生探针片段。如图28中所示，观察到大约7kb的片段为主要物质(87.5％)，大约4kb和2.5kb的片段为次要物质(分别为3％和9.5％)。
还对从转导的细胞获得的DNA进行了下一代测序，以鉴定有助于产生截短的2.5kb片段(构成群体的9.5％)的供体和接受体位点。已确定剪接供体位点是载体正链中的剪接供体位点(SD1)，位于γ-珠蛋白转基因内截短的β-珠蛋白内含子2中。由于γ-珠蛋白转基因以反向方向存在于载体中，因此SD1位于γ-珠蛋白转基因的互补链中，即位于γ-珠蛋白转基因的反向互补序列中。剪接受体位点(SA2)位于HS4-400绝缘子中的载体的正链上。由于HS4-400绝缘子在pCalH10中处于反向方向，因此SA2位于HS4-400绝缘子的互补链上(即位于其的反向互补序列中)。这些位点处的异常剪接导致产生截短的慢病毒片段，其中缺失了γ-珠蛋白表达构建体、β-珠蛋白LCR和7sk-sh734表达构建体的一部分(图29)。下表12示出了SD1和SA2以及认为值得关注的另一个剪接受体位点SA3(参见图30)的详细信息。
表12
位置：核苷酸位置编号是剪接位点序列中的第一个核苷酸，因为它涉及SEQ IDNO：107。
链：剪接位点所在的链；(+)＝正向 (-)＝反向
置信度评分：由NetGene软件提供的置信度值，其估计给定序列是真实剪接位点的概率(1＝最大值；对于剪接供体(SD)，认为评分＞0.5是显著的；对于剪接受体(SA)，认为评分＞0.2是显著的)。
^表示剪接位点
实施例10
具有已失活的剪接位点的载体的产生
产生了一系列经修饰的载体以使SD1、SA2和/或SA3失活。这些载体中的大多数基于pCalH10，并且在一个或更多个剪接位点的序列中含有突变，从而使其失活。对于在γ-珠蛋白转基因中含有使SD1失活的突变的那些载体，进行G至A的突变，并且对于在HS4-400绝缘子中含有使SA2和/或SA3失活的突变的那些载体，该突变是A至T突变，如下表13中所示。在两个载体中，HS4-400绝缘子简单地缺失。表14总结了产生的载体。
表13
表14
/>
实施例11
绝缘子活性的评估
为了评估经修饰的HS4-400绝缘子的活性，可使用仅LIM结构域二(LMO2)激活测定来验证经修饰的绝缘子的功能。Ryu et al(2008)，Blood，Vol.111，pp.1866和Goodman etal(2018)，Journal of Virology，Vol.92pp.e01639-17中已经描述了类似的测定。
简言之，使用在LMO2基因的启动子或第一内含子内具有靶向整合位点的Jurkat细胞系来评估载体构建体(Ryu et al.，2008；Zhou et al.，2010，Blood，Vol.116(6)，pp.900-908)。当经修饰的绝缘子序列保留其绝缘子功能时，观察到LMO2表达的降低。当绝缘子功能因绝缘子序列的修饰而降低或破坏时，观察到LMO2表达的降低很少或没有观察到LMO2表达的降低。
实施例12
体外永生化测定(IVIM测定)
体外永生化测定(IVIM测定)可用于评估在用慢病毒载体进行基因治疗之后载体介导的遗传毒性事件。IVIM是使用简单的细胞培养模型来量化造血细胞转化的风险的快速诱变测定。IVIM测定可基于转导的细胞的初始数目和在有限稀释之后表现出稳健的重新接种的突变体的克隆特征，使得能够量化遗传毒性突变体的发生率。它还能够表征转化常见插入位点(CIS)。
已经描述了IVIM测定(Modlich et al.(2006)，Blood，Vol.108pp.2545；和Modlich et al.(2009)，Molecular Therapy，Vol.17pp.1919-1928)。简言之，从完整骨髓中分离出谱系阴性(Lin-)骨髓细胞。通过旋转孵育(纤维连接蛋白包被的悬浮培养皿)用LVV载体转导预刺激的Lin-骨髓细胞。在两轮转导之后，并且收获细胞以用于流式细胞术(FACS)并将DNA样品用于实时PCR分析(拷贝数)。
在转导之后，将细胞作为大规模培养物扩增大约两周。在大规模培养物扩增之后，将细胞接种到96孔板中，大约两周之后，对阳性孔进行计数，并计算重新接种细胞的频率。可扩增选择的克隆用于进一步表征。
序列
未经修饰的HS4-650绝缘子(SEQ ID NO：1)
未经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补(r-c)(SEQ ID NO：2)
经修饰的HS4-650绝缘子(r-c)-在SA1处的A至T突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：3)
经修饰的HS4-650绝缘子(r-c)-在SA1和SA2处的A至T突变(突变加粗并加下划线) (SEQ ID NO：4)
经修饰的HS4-650绝缘子(r-c)-在SA1和SA3处的A至T突变(突变加粗并加下划线) (SEQ ID NO：5)
经修饰的HS4-650绝缘子(r-c)-在SA1、SA2和SA3处的A至T突变(突变加粗并加下 划线)(SEQ ID NO：6)
经修饰的HS4-650绝缘子(r-c)-在SA2处的A至T突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：7)
经修饰的HS4-650绝缘子(r-c)-在SA2和SA3处的A至T突变(突变加粗并加下划线) (SEQ ID NO：8)
/>
经修饰的HS4-650绝缘子(r-c)-在SA3处的A至T突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：9)
未经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.JN000001)(SEQ ID NO：10)
反向互补(r-c)未经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.JN000001)(SEQ ID NO：11)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.JN000001)(r-c)-在SA1处的A至T突变 (突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：12)
/>
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.JN000001)(r-c)-在SA1和SA2处的A至T 突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：13)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.JN000001)(r-c)-在SA1和SA3处的A至T 突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：14)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.JN000001)(r-c)-在SA1、SA2和SA3处的 A至T突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：15)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.JN000001)(r-c)-在SA2处的A至T突变 (突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：16)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.JN000001)(r-c)-在SA2和SA3处的A至T 突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：17)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.JN000001)(r-c)-在SA3处的A至T突变 (突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：18)
未经修饰的HS4-650绝缘子(US2016003218)(SEQ ID NO：19)
未经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补(US2016003218)(SEQ ID NO：20)
经修饰的HS4-650绝缘子(US2016003218)(r-c)-在SA1处的A至T突变(突变加粗并 加下划线)(SEQ ID NO：21)
经修饰的HS4-650绝缘子(US2016003218)(r-c)-在SA1和SA2处的A至T突变(突变 加粗并加下划线)(SEQ ID NO：22)
经修饰的HS4-650绝缘子(US2016003218)(r-c)-在SA1和SA3处的A至T突变(突变 加粗并加下划线)(SEQ ID NO：23)
经修饰的HS4-650绝缘子(US2016003218)(r-c)-在SA1、SA2和SA3处的A至T突变 (突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：24)
经修饰的HS4-650绝缘子(US2016003218)(r-c)-在SA2处的A至T突变(突变加粗并 加下划线)(SEQ ID NO：25)
经修饰的HS4-650绝缘子(US2016003218)(r-c)-在SA2和SA3处的A至T突变(突变 加粗并加下划线)(SEQ ID NO：26)
经修饰的HS4-650绝缘子(US2016003218)(r-c)-在SA3处的A至T突变(突变加粗并 加下划线)(SEQ ID NO：27)
未经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044710.1)(SEQ ID NO：28)
未经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补(Genbank登录No.MN044710.1)(SEQ ID NO：29)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044710.1)(r-c)-在SA1处的A至T突 变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：30)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044710.1)(r-c)-在SA1和SA2处的A 至T突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：31)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044710.1)(r-c)-在SA1和SA3处的A 至T突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：32)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044710.1)(r-c)-在SA1、SA2和SA3处 的A至T突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：33)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044710.1)(r-c)-在SA2处的A至T突 变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：34)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044710.1)(r-c)-在SA2和SA3处的A 至T突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：35)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044710.1)(r-c)-在SA3处的A至T突 变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：36)
未经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044709)(SEQ ID NO：37)
未经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补(Genbank登录No.MN044709)(SEQ ID NO： 38)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044709)(r-c)-在SA1处的A至T突变 (突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：39)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044709)(r-c)-在SA1和SA2处的A至T 突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：40)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044709)(r-c)-在SA1和SA3处的A至T 突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：41)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044709)(r-c)-在SA1、SA2和SA3处的 A至T突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：42)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044709)(r-c)-在SA2处的A至T突变 (突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：43)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044709)(r-c)-在SA2和SA3处的A至T 突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：44)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.MN044709)(r-c)-在SA3处的A至T突变 (突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：45)
未经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.KF569217)(SEQ ID NO：46)
未经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补(Genbank登录No.KF569217)(SEQ ID NO： 47)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.KF569217)(r-c)-在SA1处的A至T突变 (突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：48)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.KF569217)(r-c)-在SA1和SA2处的A至T 突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：49)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.KF569217)(r-c)-在SA1和SA3处的A至T 突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：50)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.KF569217)(r-c)-在SA1、SA2和SA3处的 A至T突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：51)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.KF569217)(r-c)-在SA2处的A至T突变 (突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：52)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.KF569217)(r-c)-在SA2和SA3处的A至T 突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：53)
经修饰的HS4-650绝缘子(Genbank登录No.KF569217)(r-c)-在SA3处的A至T突变 (突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：54)
pBRNGTR47 pTL20c SK734rev MND WAS 650(SEQ ID NO：55)
/>
/>
pBRNGTR84 pTL20c SK734rev MND WAS 650(SEQ ID NO：56)
/>
/>
pBRNGTR88 pTL20c SK734rev MND WAS 650 SAmut(SEQ ID NO：57)
/>
/>
pBRNGTR92 pTL20c SK734rev MND WAS 650fwd(SEQ ID NO：58)
/>
/>
pBRNGTR120 pTL20c SK734rev MND WAS 650 3xSAmut(SEQ ID NO：59)
/>
/>
SA1序列(SEQ ID NO：60)
SA2序列(SEQ ID NO：61)
SA3序列(SEQ ID NO：62)
已失活的SA1序列(SEQ ID NO：63)
已失活的SA2序列(SEQ ID NO：64)
已失活的SA3序列(SEQ ID NO：65)
sh734(SEQ ID NO：66)
具有多t终止序列的sh734(SEQ ID NO：67)
shRNA734单t终止序列(SEQ ID NO：68)
7SK RNA启动子(SEQ ID NO：69)
7SK RNA启动子(SEQ ID NO：70)
7SK RNA启动子(SEQ ID NO：71)
MND启动子(SEQ ID NO：72)
WASWT cDNA(野生型ORF)(SEQ ID NO：73)
WASWT cDNA(Genbank登录no.AB590224.1)(SEQ ID NO：74)
WASWT cDNA-密码子优化(SEQ ID NO：75)
WASP(SEQ ID NO：76)
WPRE mut6(SEQ ID NO：77)
WPRE mut7(SEQ ID NO：78)
7tet操纵子(SEQ ID NO：79)
β-珠蛋白poly(A)信号(SEQ ID NO：80)
pBRNGTR83 pTL20c MND WAS 650(SEQ ID NO：81)
/>
pBRNGTR87 pTL20c MND WAS 650 SAmut(SEQ ID NO：82)
/>
pBRNGTR91 pTL20c MND WAS 650fwd(SEQ ID NO：83)
/>
pBRNGTR119 pTL20c MND WAS 650 3xSAmut(SEQ ID NO：84)
/>
未经修饰的γ-珠蛋白表达盒(外显子大写)(SEQ ID NO：85)
未经修饰的γ-珠蛋白表达盒-反向互补(外显子大写)(SEQ ID NO：86)
未经修饰的截短的HBB内含子3(SEQ ID NO：87)
/>
未经修饰的截短的HBB内含子3-反向互补(SEQ ID NO：88)
未经修饰的HS4-400(SEQ ID NO：89)
未经修饰的HS4-400-反向互补(SEQ ID NO：90)
经修饰的γ-珠蛋白转基因-反向互补(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：91)
经修饰的截短的HBB内含子3-反向互补(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：92)
经修饰的HS4-400-反向互补-在SA2处的A至T突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：93)
/>
经修饰的HS4-400-反向互补-在SA2和SA3处的A至T突变(突变加粗并加下划线) (SEQ ID NO：94)
经修饰的HS4-400-反向互补-在SA3处的A至T突变(突变加粗并加下划线)(SEQ ID NO：95)
剪接供体位点1(SD1)(SEQ ID NO：96)
已失活的SD1(突变加下划线)(SEQ ID NO：97)
γ-珠蛋白外显子1(SEQ ID NO：98)
γ-珠蛋白外显子2(SEQ ID NO：99)
γ-珠蛋白外显子3(SEQ ID NO：100)
γ-珠蛋白编码序列(SEQ ID NO：101)
γ-珠蛋白编码序列(SEQ ID NO：102)
γ-珠蛋白G16D(GbGMG16D)蛋白(SEQ ID NO：103)
β-珠蛋白poly(A)信号(SEQ ID NO：104)
β-珠蛋白基因座控制区(LCR)(SEQ ID NO：105)
REV响应元件(RRE)(SEQ ID NO：106)
pCalH10 TL20c rGbGM 7SKsh734(SEQ ID NO：107)
/>
/>
pCalH20 TL20d rGbGM 7SKsh734(SEQ ID NO：108)
/>
/>
/>
pCalH21 TL20d rGbGM G3320A 7SKsh734(SEQ ID NO：109)
/>
/>
/>
pCalH32 TL20c rGbGM 7SKsh734 400 2AT(SEQ ID NO：110)
/>
/>
pCalH13 TL20c rGbGM G3320A 7SKsh734 400 2AT(SEQ ID NO：111)
/>
/>
pCalH11 TL20c rGbGM G3320A 7SKsh734(SEQ ID NO：112)
/>
/>
/>
pCalH31 TL20c rGbGM 7SKsh734 400 1AT(SEQ ID NO：113)
/>
/>
/>
pCalH12 TL20c rGbGM G3320A 7SKsh734 400 1AT(SEQ ID NO：114)
/>
/>
/>
β-珠蛋白启动子(SEQ ID NO：115)
β-珠蛋白启动子(SEQ ID NO：116)
β-珠蛋白启动子(SEQ ID NO：117)
未经修饰的γ-珠蛋白转基因(SEQ ID NO：118)
未经修饰的γ-珠蛋白转基因-反向互补(外显子大写)(SEQ ID NO：119)
未经修饰的γ-珠蛋白转基因-反向互补-在SD1处的G至A突变(突变加粗并加下划 线)(SEQ ID NO：120)
未经修饰的γ-珠蛋白转基因+polyA信号(SEQ ID NO：121)
未经修饰的γ-珠蛋白转基因+polyA信号-反向互补(SEQ ID NO：122)
未经修饰的γ-珠蛋白转基因+polyA信号-反向互补-在SD1处的G至A突变(突变加 粗并加下划线)(SEQ ID NO：123)
本文中引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此均通过引用整体并入本文。
本文中对任何参考文献的引用不应解释为承认这样的参考文献可作为本申请的“现有技术”使用。
本说明书通篇的目的是描述本发明的优选实施方案，而不将本发明限于任一个实施方案或具体的特征集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开内容，可在不脱离本发明的范围的情况下对示例的具体实施方案进行多种修改和改变。所有这样的修改和改变旨在包括在所附权利要求的范围内。

Claims (87)

1.慢病毒载体，其包含：
第一启动子，其可操作连接至第一核酸序列，其中所述第一核酸序列编码威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白；和
经修饰的HS4-650绝缘子，其中：
当存在于所述载体中时，相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含已失活的剪接受体位点1(SA1)，并且其中：
SA1存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第385至386位，所述编号是相对于SEQID NO：2的，其中SEQ ID NO：2是SEQ ID NO：1中所示的未经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列；和/或
SA1包含序列TTGCATCCAG^ACACCATCAA(SEQ ID NO：60)，其中^表示剪接位置。
2.权利要求1所述的慢病毒载体，其中相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含使SA1失活的突变。
3.权利要求2所述的慢病毒载体，其中所述突变是第384位的A的突变和/或第385位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
4.权利要求3所述的慢病毒载体，其中所述第384位的A的突变是A至T突变。
5.权利要求1至4中任一项所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子包含SEQ ID NO：3、12、21、30、39和48中任一者所示的序列。
6.权利要求2至5中任一项所述的慢病毒载体，其中相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含使剪接受体位点2(SA2)失活的突变，其中SA2存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第446至447位，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
7.权利要求6所述的慢病毒载体，其中所述突变是第445位的A的突变和/或第446位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
8.权利要求7所述的慢病毒载体，其中所述第445位的A的突变是A至T突变。
9.权利要求6至8中任一项所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：4、13、22、31、40和49中任一者所示的序列。
10.权利要求2至9中任一项所述的慢病毒载体，其中相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含使剪接受体位点3(SA3)失活的突变，其中SA3存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第456至457位，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
11.权利要求10所述的慢病毒载体，其中所述突变是第455位的A的突变和/或第456位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
12.权利要求11所述的慢病毒载体，其中所述第455位的A的突变是A至T突变。
13.权利要求10至12中任一项所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：5、6、14、15、23、24、32、33、41、42、50和51中所示的序列。
14.权利要求1至13中任一项所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子处于与所述第一核酸序列相反的方向。
15.权利要求1至14中任一项所述的慢病毒载体，其中所述第一核酸在所述慢病毒载体内是处于正向的，而所述经修饰的HS4-650绝缘子在所述慢病毒载体内是处于反向的。
16.权利要求1所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子处于与所述第一核酸序列相同的方向，从而使SA1失活。
17.权利要求16所述的慢病毒载体，其中所述第一核酸和所述经修饰的HS4-650绝缘子在所述慢病毒载体内是处于正向的。
18.慢病毒载体，其包含：
第一启动子，其可操作连接至第一核酸序列，所述第一核酸序列编码威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白；和
经修饰的HS4-650绝缘子，其中：
当存在于所述载体中时，相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含已失活的剪接受体位点2(SA2)，并且其中：
SA2存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第446至447位，所述编号是相对于SEQID NO：2的，其中SEQ ID NO：2是SEQ ID NO：1中所示的未经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列；和/或
SA2包含序列ATCCCCCCAG^GTGTCTGCAG(SEQ ID NO：61)，其中^表示剪接位置。
19.权利要求18所述的慢病毒载体，其中相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含使SA2失活的突变。
20.权利要求19所述的慢病毒载体，其中所述突变是第445位的A的突变和/或第446位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
21.权利要求20所述的慢病毒载体，其中所述第445位的A的突变是A至T突变。
22.权利要求18至21中任一项所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：7、16、25、34、43和52中任一者所示的序列。
23.权利要求19至22中任一项所述的慢病毒载体，其中相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含使剪接受体位点1(SA1)失活的突变，其中SA1存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第385至386位的核苷酸，所述编号是相对于SEQ IDNO：2的。
24.权利要求25所述的慢病毒载体，其中所述突变是第384位的A的突变和/或第385位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
25.权利要求27所述的慢病毒载体，其中所述第384位的A的突变是A至T突变。
26.权利要求23至25中任一项所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子包含SEQ ID NO：4、13、22、31、40和49中任一者所示的序列。
27.权利要求19至26中任一项所述的慢病毒载体，其中相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含使剪接受体位点3(SA3)失活的突变，其中SA3存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第456至457位，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
28.权利要求27所述的慢病毒载体，其中所述突变是第455位的A的突变和/或第456位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
29.权利要求28所述的慢病毒载体，其中所述第455位的A的突变是A至T突变。
30.权利要求27至29中任一项所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：5、6、14、15、23、24、32、33、41、42、50和51中所示的序列。
31.权利要求18至30中任一项所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子处于与所述第一核酸序列相反的方向。
32.权利要求18至31中任一项所述的慢病毒载体，其中所述第一核酸在所述慢病毒载体内是处于正向的，而所述经修饰的HS4-650绝缘子在所述慢病毒载体内是处于反向的。
33.权利要求18所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子处于与所述第一核酸序列相同的方向，从而使SA2失活。
34.权利要求33所述的慢病毒载体，其中所述第一核酸和所述经修饰的HS4-650绝缘子在所述慢病毒载体内是处于正向的。
35.慢病毒载体，其包含：
第一启动子，其可操作连接至第一核酸序列，所述第一核酸序列编码威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白；和
经修饰的HS4-650绝缘子，其中：
当存在于所述载体中时，相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含已失活的剪接受体位点3(SA3)，并且其中：
SA3存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第456至457位，所述编号是相对于SEQID NO：2的，其中SEQ ID NO：2是SEQ ID NO：1中所示的未经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列；和/或
SA3包含序列GTGTCTGCAG^GCTCAAAGAG(SEQ ID NO：62)，其中^表示剪接位置。
36.权利要求35所述的慢病毒载体，其中相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含使SA3失活的突变。
37.权利要求36所述的慢病毒载体，其中所述突变是第455位的A的突变和/或第456位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
38.权利要求37所述的慢病毒载体，其中所述第455位的A的突变是A至T突变。
39.权利要求35至38中任一项所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子包含SEQ ID NO：9、18、27、36、45和54中任一者所示的序列。
40.权利要求36至39中任一项所述的慢病毒载体，其中相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含使剪接受体位点1(SA1)失活的突变，其中SA1存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第385至386位，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
41.权利要求40所述的慢病毒载体，其中所述突变是第384位的A的突变和/或第385位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
42.权利要求41所述的慢病毒载体，其中所述第384位的A的突变是A至T突变。
43.权利要求40至42中任一项所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子包含SEQ ID NO：14、23、32、41和50中任一者所示的序列。
44.权利要求36至43中任一项所述的慢病毒载体，其中相对于未经修饰的HS4-650绝缘子，所述经修饰的HS4-650绝缘子包含使剪接受体位点2(SA2)失活的突变，其中SA2存在于未经修饰的HS4-650绝缘子的核苷酸第446至447位的核苷酸，所述编号是相对于SEQ IDNO：2的。
45.权利要求44所述的慢病毒载体，其中所述突变是第445位的A的突变和/或第446位的G的突变，所述编号是相对于SEQ ID NO：2的。
46.权利要求45所述的慢病毒载体，其中所述第445位的A的突变是A至T突变。
47.权利要求44至46中任一项所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子的反向互补序列包含SEQ ID NO：6、8、15、17、24、26、33、35、42、44、51和53中所示的序列。
48.权利要求35至47中任一项所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子处于与所述第一核酸序列相反的方向。
49.权利要求35至47中任一项所述的慢病毒载体，其中所述第一核酸在所述慢病毒载体内是处于正向的，而所述经修饰的HS4-650绝缘子在所述慢病毒载体内是处于反向的。
50.权利要求49所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子处于与所述第一核酸序列相同的方向，从而使SA3失活。
51.权利要求50所述的慢病毒载体，其中所述第一核酸和所述经修饰的HS4-650绝缘子在所述慢病毒载体内是处于正向的。
52.权利要求1至51中任一项所述的慢病毒载体，其中所述经修饰的HS4-650绝缘子处于所述第一核酸序列的下游。
53.权利要求1至52中任一项所述的慢病毒载体，其中所述威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白包含SEQ ID NO：76中所示的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列。
54.权利要求1至53中任一项所述的慢病毒载体，其中所述第一核酸序列包含SEQ IDNO：73至75中任一者所示的序列或与其具有至少95％序列同一性的序列。
55.权利要求1至54中任一项所述的慢病毒载体，其还包含所述第一核酸序列与所述经修饰的HS4-650绝缘子之间的土拨鼠肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)。
56.权利要求55所述的慢病毒载体，其中所述WPRE包含SEQ ID NO：77至78中任一者所示的核酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列。
57.权利要求55或56所述的慢病毒载体，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO：57的核苷酸第3098至6006位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；SEQ ID NO：58的核苷酸第3098至6009位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；以及SEQ ID NO：59的核苷酸第3098至6006位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
58.权利要求1至57中任一项所述的慢病毒载体，其中所述第一启动子是MND启动子。
59.权利要求58所述的慢病毒载体，其中所述MND启动子包含SEQ ID NO：72中任一者所示的核酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列。
60.权利要求58或59所述的慢病毒载体，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO：57的核苷酸第2710至6006位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；SEQ ID NO：58的核苷酸第2710至6009位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；以及SEQ ID NO：59的核苷酸第2710至6006位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
61.权利要求1至60中任一项所述的慢病毒载体，其还包含可操作连接至第二核酸序列的第二启动子，其中所述第二核酸序列编码抑制HPRT表达的核酸。
62.权利要求61所述的慢病毒载体，其中所述抑制HPRT表达的核酸是shRNA。
63.权利要求62所述的慢病毒载体，其中所述shRNA包含SEQ ID NO：66中所示的发夹环序列。
64.权利要求62所述的慢病毒载体，其中所述shRNA包含SEQ ID NO：67至68中任一者所示的核酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列。
65.权利要求61至64中任一项所述的慢病毒载体，其中所述第二启动子包含Pol III启动子或Pol II启动子。
66.权利要求65所述的慢病毒载体，其中所述Pol III启动子包含7sk。
67.权利要求66所述的慢病毒载体，其中所述7sk启动子包含SEQ ID NO：69至71中任一项所述的核酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列。
68.权利要求61至67中任一项所述的慢病毒载体，其中所述第二启动子和经可操作连接的第二核酸序列处于所述第一启动子和经可操作连接的第一核酸的反向和上游。
69.权利要求68所述的慢病毒载体，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO：57的核苷酸第2402至6006位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；SEQ ID NO：58的核苷酸第2402至6009位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；以及SEQ ID NO：59的核苷酸第2402至6006位所示的序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
70.权利要求1至60中任一项所述的慢病毒载体，其还包含位于所述第一核酸和所述经修饰的HS4-650绝缘子下游的多腺苷酸化信号。
71.权利要求1至70中任一项所述的慢病毒载体，其为质粒。
72.权利要求1至70中任一项所述的慢病毒载体，其为病毒颗粒。
73.权利要求61至70中任一项所述的慢病毒载体，其为病毒颗粒。
74.宿主细胞，其包含权利要求1至73中任一项所述的慢病毒载体。
75.宿主细胞，其用权利要求71或72所述的慢病毒载体转导。
76.权利要求74或75所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是造血干细胞(HSC)。
77.权利要求76所述的宿主细胞，其中所述HSC是同种异体的或自体的。
78.宿主细胞，其包含权利要求61至70中任一项所述的慢病毒载体。
79.宿主细胞，其用权利要求73所述的慢病毒载体转导。
80.权利要求79所述的宿主细胞，其是HPRT缺陷的。
81.权利要求78至80中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是造血干细胞(HSC)。
82.权利要求81所述的宿主细胞，其中所述HSC是同种异体的或自体的。
83.治疗患有威斯科特-奥尔德里奇综合征的对象的方法，其包括向所述对象施用权利要求73至79中任一项所述的宿主细胞。
84.治疗患有威斯科特-奥尔德里奇综合征的对象的方法，其包括：
向所述对象施用权利要求79至82中任一项所述的宿主细胞；和
向所述对象施用嘌呤类似物以提高所述宿主细胞的植入。
85.权利要求84所述的方法，其中所述嘌呤类似物选自6-硫代鸟嘌呤(“6TG”)、6-巯基嘌呤(“6MP”)或氮杂硫代嘌呤(“AZA”)。
86.权利要求84或85所述的方法，其还包括在施用所述宿主细胞之前用嘌呤类似物预处理所述对象。
87.权利要求74至82中任一项所述的宿主细胞用于制备用于治疗威斯科特-奥尔德里奇综合征的药物的用途。
CN202280037491.XA 2021-04-26 2022-04-26 可用于疾病治疗的慢病毒载体 Pending CN118103076A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163180001P 2021-04-26 2021-04-26
US63/179,993 2021-04-26
US63/180,001 2021-04-26
PCT/US2022/026409 WO2022232191A1 (en) 2021-04-26 2022-04-26 Lentiviral vectors useful for the treatment of disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118103076A true CN118103076A (zh) 2024-05-28

Family

ID=91165610

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280037491.XA Pending CN118103076A (zh) 2021-04-26 2022-04-26 可用于疾病治疗的慢病毒载体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118103076A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11739329B2 (en) Compositions and methods to treating hemoglobinopathies
US10876118B2 (en) Method for expression of small antiviral RNA molecules with reduced cytotoxicity within a cell
Ringpis et al. Engineering HIV-1-resistant T-cells from short-hairpin RNA-expressing hematopoietic stem/progenitor cells in humanized BLT mice
Pernet et al. Stem cell-based therapies for HIV/AIDS
US20210316013A1 (en) Haematopoietic stem cell-gene therapy for wiskott-aldrich syndrome
EP3655534A1 (en) Compositions and methods for treating beta-hemoglobinopathies
AU2017221456B2 (en) Short hairpin RNA (shRNA734) and use of same to positively select and eliminate genetically modified cells
US20210340563A1 (en) Donor t-cells with kill switch
CN118103076A (zh) 可用于疾病治疗的慢病毒载体
JP2024519524A (ja) 疾患の処置のために有用なレンチウイルスベクター
US20230355674A1 (en) Donor t-cells with kill switch
US20230405116A1 (en) Vectors, systems and methods for eukaryotic gene editing
Doi A novel lentiviral vector model to investigate the mechanism of insertional mutagenesis by aberrant splicing
Browning Development of a clinically relevant insulated foamy viral vector for hematopoietic stem cell gene therapy
Ringpis et al. Engineering HIV-1-Resistant T-Cells from Short-Hairpin RNA-Expressing

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination