JP2021534818A - 無血清培地におけるベクター産生 - Google Patents

無血清培地におけるベクター産生 Download PDF

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Abstract

本開示の一態様には、安定な産生細胞株の細胞の誘導に続いて約４０時間ごと〜約５６時間ごとにウイルス力価を回収する方法があり、ウイルス力価は無血清培地で少なくとも部分的に回収される。本開示の別の態様には、以下を含む、ベクター上清を回収する方法がある：安定な産生細胞株の細胞を生成すること；生成された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクター産生を誘導すること；およびウイルスベクターの最初の回収に続いて約４０〜約５６時間ごとに、無血清培地中で、誘導された生成された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクターを反復回収すること。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月２４日に出願された米国特許仮出願第６２／７２２，７８４号の出願日の恩恵を主張し、その開示は、参照によってその全体を本明細書に組み入れる。
本開示は、一般に、生物的製造法およびウイルス力価を回収する方法に関する。
インビトロ培養条件下で増殖する細胞株および初代細胞は、（ｉ）対数期における細胞複製を、および（ｉ）細胞がもはや分裂しなくなったら、すなわち、細胞が定常期にある場合に細胞維持を支持することができる特別な増殖および維持培地を必要とする。一般に使用される細胞培養培地は、ビタミン、アミノ酸、必須微量元素および糖を含有する豊塩溶液（ｒｉｃｈ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む。細胞の増殖および維持を支持するのに必要とされる成長ホルモン、酵素および生物学的に活性なタンパク質は、動物の血液由来の血清製品の形態で、補充物として培地に通常加えられる。動物の血液由来の血清製品の例は、ウシ胎仔血清、ニワトリ血清、ウマ血清およびブタ血清である。これらの血清は、赤血球および白血球が除去された、分画された血液に由来する。
動物血清は、細胞の増殖に必要とされる因子を含むだけでなく、培養容器の細胞支持面に接着するために、接着細胞として自然に成長する細胞に必要とされる因子も含む。したがって、接着細胞にとって、それらが増殖し、単層を形成することを可能にするのに十分な血清が培地に加えられることが重要である。
残念ながら、ウシ／ウシ胎仔血清、ならびに他の動物由来の血清は、ウイルスまたはプリオンタンパク質などの外来性病原体を含む可能性がある。これらの病原体が、細胞培養で産生されるワクチンまたは任意の他の医薬製品で治療されるまたはワクチン接種される動物／ヒトに伝染する可能性があるという、潜在的な危険性がある。これは、細胞培養産物が免疫無防備状態のヒトに投与される場合、特に関連する。細胞培養における動物血清の使用に関連する起こり得る危険性を考慮して、動物産物を使用しない製造方法が非常に望ましいことが明らかになってきている。
臨床試験を支持する規模での自己不活性化ベクター（「ＳＩＮ−ベクター」）の産生は、本分野内の重要な課題である。ガンマ−レトロウイルスベクターは一過的トランスフェクションまたは安定な産生細胞株の生成のいずれかによって産生することができるが、レンチウイルスは、複数の細胞傷害性アクセサリー遺伝子の発現を必要とし、これは、産生細胞の生成をより複雑にする（非特許文献１。その開示は、その内容全体を参照によって本明細書に組み入れる）。代わりに、一過的トランスフェクションがレンチウイルスの試験的産生の現在の技術であり、これは、安全性、費用、および再現性の観点から、非常に大規模な適用にとって実際的でない。実際に、この技術は費用がかかり、標準化すること、およびスケールアップすることが難しく、かつバッチ間の変動性および逆転写酵素の低いフィデリティーに悩まされる（非特許文献２。その開示は、その内容全体を参照によって本明細書に組み入れる）。
Ｇｒｅｅｎｅら、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４＋ Ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ Ｓｅｌｆ−Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ＳＣＩＤ−Ｘｌ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａｔ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃａｌｅ ｂｙ ａ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ、ＨＧＴＭ、２３、２９７〜３０８（２０１２年１０月） Ｓｔｏｒｎａｉｕｏｌｏら、ＲＤ２−ＭｏｌＰａｃｋ−Ｃｈｉｍ３，ａ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ｆｏｒ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−ＨＩＶ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、ＨＧＴＭ、２４：２２８〜２４０（２０１３年８月）
毎日の回収（例えば、２４時間ごとに回収する）を利用する産生プロトコールは、小規模で様々な試験ベクターを産生するために利用することができるが、毎日の回収および培地交換は非経済であることが多い。毎日の回収の代わりとして、本出願人は、「２日間の回収」プロトコールを開発し、ウイルスベクターは、ウイルスベクターの最初の回収に続いて約４０時間〜約５６時間ごとに無血清培地中で反復回収される。本出願人は、無血清培地を使用するそのような「２日間の回収」プロトコールは、より伝統的な毎日の回収とほぼ同じ量のウイルスベクターの生成を可能にし、同時に、より少ない培養培地しか必要としないという利点も提供することを予想外に発見した。無血清培地と比較して血清含有培地に関連する高い費用を考えれば、開示される「２日間の回収」手順とともに無血清培地を使用することが大規模な生物的製造に特に重要であると考えられる。さらに、無血清培地を使用する場合、回収されたウイルスベクターで治療される対象への、血清含有培地中に潜在的に存在する病原体の伝染の危険性は、最小化されるか、または排除される。これらの利点は、大規模な生物的製造の費用を減らし、安全性を高めるという、業界において未だ対処されていない要求を満たし、同時に高い量のウイルスベクター力価を得ることができる生物的製造方法を提供する。
本開示の第１の態様には、以下を含む、ベクター上清を回収する方法がある：安定な産生細胞株の細胞を生成すること；生成された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクター産生を誘導すること；およびウイルスベクターの最初の回収に続いて約４０〜約５６時間ごとに、無血清培地中で、誘導された生成された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクターを反復回収すること。いくつかの実施形態では、反復回収は、さらなる生成された安定な産生細胞株の細胞を導入することなく、誘導された生成された安定な産生細胞株の細胞に新鮮な無血清培地を加えることを含む。
いくつかの実施形態では、回収に使用される無血清培地は各反復回収後に交換される。いくつかの実施形態では、各個別の回収の間、さらなる無血清培地は生成された安定な産生細胞株の細胞に導入されない。いくつかの実施形態では、無血清培地は１つまたはそれ以上の増殖因子を含む。いくつかの実施形態では、無血清培地は１つまたはそれ以上の脂質を含む。いくつかの実施形態では、無血清培地は増殖因子と脂質の両方を含む。いくつかの実施形態では、脂質はコレステロール、リン脂質および脂肪酸を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの最初の回収は誘導後（すなわち、ウイルスベクター産生を誘導した後）約４０時間〜約５６時間の間に行われる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの最初の回収は誘導後４８時間未満に行われる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの反復回収は、約４４〜約５２時間ごとに行われる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの反復回収は、約４６〜約５０時間ごとに行われる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの反復回収は、約４８時間ごとに行われる。
いくつかの実施形態では、方法は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約４×１０６ＴＵ／ｍＬの間の範囲に及ぶウイルス力価の産生を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルス力価は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約２×１０６ＴＵ／ｍＬの間の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、ウイルス力価は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約１．５×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの反復回収は少なくとも２回行われる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの反復回収は少なくとも３回行われる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの反復回収は少なくとも４回行われる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの反復回収は少なくとも５回行われる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの反復回収は少なくとも１０回行われる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの反復回収は少なくとも２０回行われる。いくつかの実施形態では、反復回収は、約１０日〜約９０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる。いくつかの実施形態では、反復回収は、約２０日〜約７０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる。
いくつかの実施形態では、安定な産生細胞株の細胞はパッケージング細胞株の細胞に由来する。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞株の細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ−２細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞および２１１Ａ細胞からなる群から選択される細胞に由来する。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞株の細胞は、ＧＰＲ、ＧＰＲＧ、ＧＰＲＴ、ＧＰＲＧＴおよびＧＰＲＴ−Ｇ細胞株の細胞からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、安定な産生細胞株の細胞は、（ａ）１つまたはそれ以上の遺伝子を組換えプラスミドにクローニングすることによって、ベクターを合成すること；（ｂ）（ｉ）合成されたベクターから切除された発現カセットおよび（ｉｉ）抗生物質抵抗性カセットプラスミドから得られた発現カセットからコンカテマーアレイを形成すること；（ｃ）形成されたコンカテマーアレイをＧＰＲ、ＧＰＲＧ、ＧＰＲＴ、ＧＰＲＧＴまたはＧＰＲＴ−Ｇパッケージング細胞株の細胞にトランスフェクトすること；ならびに（ｄ）安定な産生細胞株の細胞を単離することによって生成される。いくつかの実施形態では、合成されたベクターはレンチウイルスベクター、例えば、自己不活性化レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、抗生物質抵抗性カセットプラスミドはブレオマイシン抗生物質抵抗性カセットである。いくつかの実施形態では、合成されたベクターから切除された発現カセットとブレオマイシン抗生物質抵抗性カセットから得られた発現カセットのモル比は、約５０：１〜約１：５０の間の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、モル比は約２５：１〜約１：２５の間の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、モル比は約１５：１〜約１：１５の間の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、モル比は約１０：１〜約１：１０の範囲に及ぶ。
いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、配列番号１のものに対して少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、配列番号１のものに対して少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、配列番号１のものに対して少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、配列番号２のものに対して少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、配列番号２のものに対して少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、配列番号２のものに対して少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、ＢｓｔＢＩ、ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩおよび／またはＣｌａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を有するマルチクローニングサイトを含む。いくつかの実施形態では、マルチクローニングサイトをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７のものに対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、マルチクローニングサイトをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７のものに対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、パッケージングシグナルをコードするヌクレオチド配列；セントラルポリプリントラクトをコードするヌクレオチド配列；Ｒｅｖ応答エレメントをコードするヌクレオチド配列；および自己不活性化ロングターミナルリピートをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターカセットに少なくとも２つのさらなる制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接しており、少なくとも２つのさらなる制限エンドヌクレアーゼ部位はｓｆｉＩおよびＢｓｕ３６Ｉから独立に選択される。
いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、（本明細書に挙げたそうした遺伝子のうちのいずれかを含めた）治療的遺伝子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療的遺伝子は、鎌状赤血球症を治すか、または鎌状赤血球症の１つの症状を少なくとも軽減する。いくつかの実施形態では、治療的遺伝子はガンマ−グロビン遺伝子である。いくつかの実施形態では、治療的遺伝子はウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質である。いくつかの実施形態では、治療的遺伝子はＣ１エステラーゼインヒビタータンパク質である。いくつかの実施形態では、治療的遺伝子はブルトンチロシンキナーゼである。いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（「ＨＰＲＴ」）をノックダウンするための核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、（ｉ）ＨＰＲＴをノックダウンするための第１の核酸配列、および（ｉｉ）（本明細書に挙げたまたは上で列挙した治療的遺伝子のうちのいずれかを含めた）治療的遺伝子をコードする第２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、（ｉ）ＨＰＲＴをノックダウンするための第１の核酸配列、および（ｉｉ）ガンマ−グロビン遺伝子をコードする第２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、（ｉ）ＨＰＲＴをノックダウンするための第１の核酸配列、および（ｉｉ）ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする第２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、ＣＣＲ５をノックダウンするための核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクター産生の誘導は血清含有培地中で行われる。いくつかの実施形態では、方法は、さらなる血清含有培地での誘導に続いて約１８時間〜約２８時間の間に血清含有培地を交換することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、さらなる血清含有培地での誘導に続いて約２４時間で血清含有培地を交換することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、無血清培地での誘導に続いて約１８時間〜約２８時間の間に血清含有培地を交換することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、無血清培地での誘導に続いて約２４時間で血清含有培地を交換することを含む。いくつかの実施形態では、無血清培地は、脂質および／または増殖因子を含むことができる。
本開示の第２の態様には、安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクターを産生する方法であって、（ａ）１つまたはそれ以上の核酸配列を組換えプラスミドに挿入することによって、ベクターを合成すること；（ｂ）合成されたベクターから切除された発現カセットから、および抗生物質抵抗性カセットプラスミドから得られたＤＮＡ断片からコンカテマーアレイを形成すること；（ｃ）ＧＰＲ、ＧＰＲＧ、ＧＰＲＴ、ＧＰＲＧＴ、ＧＰＲＴ−Ｇパッキング細胞株またはそれらの誘導体のうちの１つに形成されたコンカテマーアレイをトランスフェクトして、安定な産生細胞株の細胞を提供すること；（ｄ）安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクター産生を誘導すること；ならびに（ｅ）ウイルスベクターの最初の回収に続いて約４０時間〜約５６時間ごとに無血清培地中でウイルスベクターを反復回収することを含む方法がある。いくつかの実施形態では、最初の回収は、誘導後約４０時間〜約５６時間の間に行われる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、約４４時間〜約５２時間ごとに反復回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは約４８時間ごとに反復回収される。いくつかの実施形態では、無血清培地は１つまたはそれ以上の増殖因子を含む。いくつかの実施形態では、無血清培地は、１つまたはそれ以上の脂質を含む。いくつかの実施形態では、無血清培地は、増殖因子と脂質の両方、例えば、１つもしくはそれ以上の増殖因子および／または１つもしくはそれ以上の脂質を含む混合物を含む。いくつかの実施形態では、反復回収は、さらなる生成された安定な産生細胞株の細胞を導入することなく、誘導された生成された安定な産生細胞株の細胞に新鮮な無血清培地を加えることを含む。
いくつかの実施形態では、安定な産生細胞株はＧＰＲＧパッケージング細胞株に基づく。いくつかの実施形態では、安定な産生細胞株はＧＰＲＴパッケージング細胞株に基づく。いくつかの実施形態では、安定な産生細胞株はＧＰＲパッケージング細胞株に基づく。いくつかの実施形態では、合成されたベクターからのＤＮＡ断片と抗生物質抵抗性カセットからのＤＮＡ断片の比は、約２５：１〜約１：２５の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、抗生物質抵抗性カセットプラスミドはブレオマイシン抗生物質抵抗性カセットである。
いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、配列番号１のものに対して少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、配列番号１のものに対して少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、配列番号２のものに対して少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、配列番号２のものに対して少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクター産生の誘導は血清含有培地中で行われる。いくつかの実施形態では、方法は、さらなる血清含有培地での誘導に続いて約２４時間で血清含有培地を交換することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、無血清培地での誘導に続いて約２４時間で血清含有培地を交換することをさらに含む。いくつかの実施形態では、無血清培地は、脂質および／または増殖因子を含むことができる。いくつかの実施形態では、脂質はコレステロール、リン脂質および脂肪酸を含む。
いくつかの実施形態では、組換えプラスミド中に挿入される１つまたはそれ以上の核酸配列は治療的遺伝子である。適切な治療的遺伝子の例は本明細書に挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えプラスミド中に挿入される１つまたはそれ以上の核酸配列はガンマ−グロビン遺伝子である。いくつかの実施形態では、組換えプラスミド中に挿入される１つまたはそれ以上の核酸配列は、ＨＰＲＴをノックダウンするためのＲＮＡ干渉薬剤（「ＲＮＡｉ薬剤」）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ薬剤は、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはそれらのハイブリッドである。いくつかの実施形態では、組換えプラスミド中に挿入される１つまたはそれ以上の核酸配列は、ＣＣＲ５をノックダウンするためのＲＮＡｉを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約４×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲に及ぶウイルス力価の産生を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルス力価は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約２×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、ウイルス力価は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約１．５×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは少なくとも５回回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは少なくとも１０回回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは少なくとも２０回回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは少なくとも２０回回収される。いくつかの実施形態では、反復回収は、約１０日〜約９０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる。いくつかの実施形態では、反復回収は、約２０日〜約７０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる。
本開示の第３の態様には、以下を含む、安定な産生細胞株の細胞からベクター上清を回収する方法がある：安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクター産生を誘導すること；および無血清培地中で、ウイルスベクターの最初の回収に続いて約４０〜約５６時間の間ごとに、誘導された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクターを反復回収すること。いくつかの実施形態では、反復回収は、さらなる生成された安定な産生細胞株の細胞を導入することなく、誘導された生成された安定な産生細胞株の細胞に新鮮な無血清培地を加えることを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、誘導後約４０時間で最初に回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクターの最初の回収に続いて約４８時間ごとに反復回収される。いくつかの実施形態では、方法は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約４×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲に及ぶウイルス力価の産生を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは少なくとも５回回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは少なくとも１０回回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは少なくとも２０回回収される。いくつかの実施形態では、反復回収は、約１０日〜約９０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる。いくつかの実施形態では、反復回収は、約２０日〜約７０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる。
いくつかの実施形態では、無血清培地は１つまたはそれ以上の添加物を含む。いくつかの実施形態では、添加物は１つまたはそれ以上の増殖因子を含む。いくつかの実施形態では、添加物は１つまたはそれ以上の脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質はコレステロール、リン脂質および脂肪酸を含む。
いくつかの実施形態では、安定な産生細胞株の細胞は血清含有培地中で継代され；細胞は無血清培地中で培養される。いくつかの実施形態では、安定な産生細胞株の細胞は血清含有培地中で継代され；細胞は血清含有培地中で培養される。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは治療的遺伝子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療的遺伝子は、鎌状赤血球症を治すか、または鎌状赤血球症の１つの症状を少なくとも軽減する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはガンマ−グロビン遺伝子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはＨＰＲＴをノックダウンするための核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、（ｉ）ＨＰＲＴをノックダウンするための第１の核酸配列、および（ｉｉ）治療的遺伝子をコードする第２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはＣＣＲ５をノックダウンするための核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分をコードする核酸配列を含む。
本開示の第４の態様には、ＨＰＰＲＴをノックダウンするためのＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列を含むウイルスベクターを含む組成物があり、ウイルスベクターは：生成された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクター産生を誘導すること；およびウイルスベクターの最初の回収に続いて約４０〜約５６時間ごとに、誘導された生成された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクターを反復回収することによって産生される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの反復回収は、さらなる生成された安定な産生細胞株の細胞を導入することなく、誘導された生成された安定な産生細胞株の細胞に新鮮な培地を加えることを含む。いくつかの実施形態では、反復回収は無血清培地中で行われる。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは第２の核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、本明細書に挙げたもののうちのいずれかを含めた治療的遺伝子をコードする。いくつかの実施形態では、治療的遺伝子はガンマグロビン遺伝子である。いくつかの実施形態では、治療的遺伝子はウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質である。いくつかの実施形態では、治療的遺伝子はＣ１エステラーゼインヒビタータンパク質である。いくつかの実施形態では、治療的遺伝子はブルトンチロシンキナーゼである。いくつかの実施形態では、第２の核酸はヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＩＩ型のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートおよびｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分はＣａｓ９タンパク質およびＣａｓ１２タンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
本開示の第５の態様には、宿主細胞の形質導入における、本開示の第４の態様のウイルスベクターを含む組成物の使用がある。適切な宿主細胞としては、限定されないが、ヒト細胞、マウスの細胞、非ヒト霊長類細胞（例えば、アカゲザル細胞）、ヒト前駆細胞または幹細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｄ１７細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ細胞およびＣｆ２Ｔｈ細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、造血細胞、例えば、造血前駆細胞／幹細胞（例えば、ＣＤ３４陽性造血前駆細胞／幹細胞（ＨＰＳＣ））、単球、マクロファージ、末梢血単核球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球または樹状細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、形質導入後に、実質的にＨＰＲＴ欠乏性にされ、例えば、ＨＰＲＴ発現が５０％低減している。
本開示の第６の態様には、以下を含む、ウイルス力価を反復回収する方法がある：（ａ）安定な産生細胞株の細胞が血清含有培地中で継代される継代段階、（ｂ）安定な産生細胞株の細胞が第１の無血清培地中で処理される培養段階、および（ｃ）安定な産生細胞株の細胞が第２の無血清培地中で処理される産生段階。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、誘導された安定な産生細胞株の細胞から反復回収され、反復回収は無血清培地中で行われる。いくつかの実施形態では、反復回収は、ウイルスベクターの最初の回収に続いて約４０時間〜約５６時間ごとに行われる。いくつかの実施形態では、反復回収は、さらなる安定な産生細胞株の細胞を導入すること無しに、誘導された安定な産生細胞株の細胞に新鮮な無血清培地を加えることを含む。
いくつかの実施形態では、第１の無血清培地は１つまたはそれ以上の添加物を含む。いくつかの実施形態では、第２の無血清培地は１つまたはそれ以上の添加物を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の無血清培地は同じである。いくつかの実施形態では、第１および第２の無血清培地は異なり、例えば、それぞれ異なる添加物成分を含む。例えば、第１の無血清培地は１つのタイプの増殖因子を含むことができるが、第２の無血清培地は異なるタイプの増殖因子を含むことができる。同様に、第１の無血清培地は１つまたはそれ以上の増殖因子を含むことができるが、第２の無血清培地は１つまたはそれ以上の脂質を含む。いくつかの実施形態では、任意の無血清培地中の添加物の量は、培地の体積基準で、約０．０５％から約１０％の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、方法は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約４×１０６ＴＵ／ｍＬの間の範囲に及ぶ量のウイルス力価の回収を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは少なくとも５回回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは少なくとも１０回回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは少なくとも２０回回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは少なくとも２０回回収される。いくつかの実施形態では、反復回収は、約１０日〜約９０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる。いくつかの実施形態では、反復回収は、約２０日〜約７０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる。
いくつかの実施形態では、安定な産生細胞株の細胞は、（ａ）１つまたはそれ以上の遺伝子を組換えプラスミドにクローニングすることによって、ベクターを合成すること；（ｂ）（ｉ）合成されたベクターから切除された発現カセットおよび（ｉｉ）抗生物質抵抗性カセットプラスミドから得られた発現カセットからコンカテマーアレイを形成すること；（ｃ）ＧＰＲ、ＧＰＲＧ、ＧＰＲＴ、ＧＰＲＧＴまたはＧＰＲＴ−Ｇパッケージング細胞株のうちの１つに形成されたコンカテマーアレイをトランスフェクトすること、ならびに（ｄ）安定な産生細胞株を単離することによって生成される。
いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、治療的遺伝子をコードする核酸配列を含む。適切な治療的遺伝子の例は本明細書に挙げられる。いくつかの実施形態では、治療的遺伝子は、鎌状赤血球症を治すか、または鎌状赤血球症の１つの症状を少なくとも軽減する。いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、ガンマ−グロビン遺伝子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（「ＨＰＲＴ」）をノックダウンするための核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、（ｉ）ＨＰＲＴをノックダウンするための第１の核酸配列、および（ｉｉ）治療的遺伝子をコードする第２の核酸配列（例えば、ガンマ−グロビン遺伝子）を含む。いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、ＣＣＲ５をノックダウンするための核酸配列を含む。
本開示の第７の態様には、以下を含む、ベクター上清を回収する方法がある：ＧＰＲ、ＧＰＲＧ、ＧＰＲＴ、ＧＰＲＧＴもしくはＧＰＲＴ−Ｇパッキング細胞株またはそれらの誘導体のうちの１つに由来する安定な産生細胞株の細胞を生成すること；生成された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクター産生を誘導すること；およびさらなる生成された安定な産生細胞株の細胞を導入することなく、誘導された生成された安定な産生細胞株の細胞に新鮮な無血清培地を加えることを含む、ウイルスベクターの最初の回収に続いて約４０〜約５６時間ごとに、無血清培地中で、誘導された生成された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクターを反復回収すること。いくつかの実施形態では、無血清培地は１つまたはそれ以上の増殖因子を含む。いくつかの実施形態では、無血清培地は、１つまたはそれ以上の脂質を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの最初の回収は誘導後約４０時間〜約５６時間の間に行われる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの最初の回収は誘導後４８時間未満に行われる。いくつかの実施形態では、反復回収は少なくとも２回行われる。いくつかの実施形態では、反復回収は約４４〜約５２時間ごとに行われる。いくつかの実施形態では、反復回収は約４８時間ごとに行われる。
いくつかの実施形態では、無血清培地は各反復回収後に交換される。いくつかの実施形態では、方法は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約４×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲に及ぶウイルス力価の産生を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルス力価は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約２×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは少なくとも５回回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは少なくとも１０回回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは少なくとも２０回回収される。いくつかの実施形態では、反復回収は約１０日〜約９０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる。いくつかの実施形態では、反復回収は約２０日〜約７０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる。
確立された手順によるＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞での一過的トランスフェクション、またはＧＰＲＧベースの安定な産生細胞株の使用のいずれかによって、同じレンチウイルスベクターを反復して産生したことを図示する図である。ベクター含有培地（ＶＣＭ）を超遠心分離法によって１００×濃縮し、レンチウイルスの（ＬＶ）力価を遺伝子形質導入アッセイによって決定した。 安定な産生細胞株を生成する方法、および生成された安定な産生細胞株から産生されたレンチウイルスベクターを回収するための方法を図示するフローチャートである。 連続的な継代の３か月の期間にわたって、２つの異なる細胞株ＭＷＣＢについて産生細胞株の安定性の評価を図示する図である。一定の間隔で、テトラサイクリン（ＴＥＴ）除去によってレンチウイルスベクターを誘導し、遺伝子形質導入アッセイによって、レンチウイルスベクター力価についてＶＣＭを評価した。両方の細胞株は安定であり、３か月の期間（約９０日）にわたって、および約２５継代を超えて、１×１０６ＴＵ／ｍＬを超えてレンチウイルスベクターを産生することができた。 ＴＥＴの除去による誘導に続くレンチウイルスベクター産生のキネティクスを図示する図である。遺伝子形質導入アッセイによって、ＶＣＭ中のベクター力価を評価した。すべての場合で、ＧＰＲＧベースの安定な産生細胞株は、誘導に続いて少なくとも約５日間、約１×１０６ＴＵ／ｍＬを上回るレベル（未濃縮）でレンチウイルスベクター産生を維持することができた。 図５Ａおよび図５Ｂは、安定細胞株からのレンチウイルスベクター産生のキネティクスを図示する図である。（図５Ａ）ベクター産生の間、毎日（■）または２日ごと（□）培地を新鮮な培地と交換した。（図５Ｂ）回収した培地中のレンチウイルスベクターの総量を２９３Ｔ細胞で力価測定した。示されるデータは、平均値±ＳＤ（Ｎ＝２）である。ＴＵ、形質導入単位。 図６Ａは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を含まない培地中でＧＰＲＧおよび２９３Ｔ細胞を誘導したことを図示する図である。誘導された細胞を、抗ＶＳＶＧ抗体によって染色してＶＳＶＧ発現を検出し、フローサイトメトリーによって測定した。図６Ｂは、ＧＰＲＧパッケージング細胞株が長期培養後でさえレンチウイルスベクターを産生する能力を図示する図である。 図７Ａおよび図７Ｂは、異なる培養条件におけるレンチウイルス産生を図示する図である。（Ａ）血清含有培地で培養した／産生した。（Ｂ、左）血清含有培地で培養した／無血清培地で産生した；（Ｂ、右）無血清培地で培養した／産生した。Ｄ１０：５００ｍＬ ＤＭＥＭ／ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから入手可能）；５０ｍＬ ＦＢＳ（１０％ｗ／ｖ）；５ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン；ＳＦＭ：無血清培地。 新鮮な培地（ベクターなし）またはＬＶｓｈ５／Ｃ４６ベクターのいずれかとともにインキュベートした２９３ＴまたはＴＦ−１ａ細胞のＦＡＣＳ解析を示す図である。 感染細胞におけるレンチウイルスベクターコピー数の定量化を図示する図である。Ｃ４６のｑＰＣＲを使用して、２用量（ＭＯＩ＝１または０．３）での形質導入後に宿主ゲノムあたりのベクターコピー数を決定した。 ｇ宿主−ＣＣＲ５細胞にＬＶｓｈ５／Ｃ４６ベクターを形質導入したことを図示する図である。ＦＡＣＳによって、ＣＣＲ５発現レベルの低下が測定された。 ｐＵＣ５７−ＴＬ２０の模式図を示す図である。 本開示のいくつかの実施形態によるＨＩＶ−１ベースのレンチウイルストランスファーベクターを図示する図である。この特定のトランスファーベクターは、ＨＩＶ−１融合インヒビター（Ｃ４６）と組み合わせて、ＨＩＶ−１共受容体ＣＣＲ５のダウンレギュレーションのための低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする。 血清有りおよび無しの本明細書に開示される方法の使用からのレンチウイルスの誘導を図示する図である。無血清培地で培養した細胞は、１０％ＰＢＳで培養したものとほぼ同じ量のウイルスを産生した。本明細書で開示される方法を無血清培養環境に適合させることができることが考えられる。 ＤＮＡ断片を生成する方法を図示するフローチャートである。 コンカテマーアレイを合成する方法を図示するフローチャートである。 コンカテマーアレイをパッケージング細胞株に導入する方法を図示するフローチャートである。 トランスフェクトされたクローンを選択する方法を図示するフローチャートである。 単一コロニーの単離を行う方法を図示するフローチャートである。 ウイルス産生を評価する方法を図示するフローチャートである。 図２０Ａ、図２０Ｂおよび図２０Ｃは、一般に、ＴＬ２０−Ｃａｌ１−ｗｐｒｅおよびＴＬ２０−Ｕｎｃ−ＧＦＰベクターを合成するための産生細胞を説明する図である。図２０Ａは、新鮮な培地（左：ベクターなし）または最も強力な産生クローンから回収されたＴＬ２０−Ｃａｌ１−ＷＰＲＥ（右）のいずれかとともにインキュベートした２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析を図示する。図２０Ｂは、新鮮な培地（ダークグレーのバー：ベクターなし）または最も強力な産生クローンから回収されたＴＬ２０−ＵｂｃＧＦＰ（ライトグレーのバー）のいずれかとともにインキュベートした２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析を図示する。図２０Ｃは、ＴＬ２０−Ｃａｌ１−ＷＰＲＥ（左）またはＴＬ２０−ＵｂｃＧＦＰ（右）ベクターを作製するための独立の産生クローンからの上清の測定されたベクター力価の分布を図示する。ベクターを２９３Ｔ細胞で力価測定し、フローサイトメトリーによって解析した。ポリクローナル産生細胞を使用して調製したベクターについて達成された最高の力価（単一クローン選択の前）を破線で示す。凡例：Ｕｂｃ：ユビキチンＣプロモーター；ＧＦＰ：高感度緑色蛍光タンパク質。 図２０−１の続き。 産生細胞株が無血清培地中でウイルスを生成することができることを図示する図である。図２１Ａは、キネティック研究の間のＧＦＰウイルスの感染力価を図示する（誘導後７日目まで連続的に回収する）。 産生細胞株が無血清培地中でウイルスを生成することができることを図示する図である。図２１Ｂは、ＬＶｓｈ５／Ｃ４６ベクターの形質導入効率を図示する（誘導後３日目に回収する）。
配列表
本明細書で提供される核酸配列およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基に対する標準的な文字省略形、およびアミノ酸に対する３文字コードを使用して示される。配列表は、２０１６年５月９日に作成された５ＫＢの「２０１６−０５−０９＿Ｃａｌ−００１３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前のＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、これを、参照によって本明細書に組み入れる。
定義
本明細書で使用する場合、単数形の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈において別段示さない限り、複数の指示物を含む。同様に、単語「または」は、文脈において別段示さない限り、「および」を含むことが意図される。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、互換的に使用され、同じ意味を有する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」などは互換的に使用され、同じ意味を有する。特に、これらの用語のそれぞれは、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の一般的な米国特許法の定義と一致して定義され、したがって、「少なくとも以下の」を意味するオープン用語として解釈され、さらなる構成、制限、態様などを除外するものではないとも解釈される。したがって、例えば、「成分ａ、ｂおよびｃを有するデバイス」は、少なくとも成分ａ、ｂおよびｃを含むデバイスを意味する。同様に、フレーズ：「工程ａ、ｂおよびｃを伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）方法」は、方法が少なくとも工程ａ、ｂおよびｃを含むことを意味する。さらに、工程および方法は特定の順序で本明細書で概要が述べられる可能性があるが、工程および方法の順序付けは変動し得ることを当業者は認識するであろう。
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、「または」は、上記で定義された通り、「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈されるべきであり、すなわち、要素の数またはリストの少なくとも１つを含むだけでなく、１つより多くも含み、場合により、さらなる列挙されていない項目を含むと解釈されるべきである。「の１つのみ」もしくは「の正確に１つ」のようにそれとは反対に明示される用語のみ、または特許請求の範囲において使用される場合、「からなる」は、要素の数またはリストの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用する場合、用語「または」は、排他性の用語、例えば、「いずれか」、「の１つ」、「の１つのみ」または「の正確に１つ」が先行する場合、排他的な代替物（すなわち「一方または他方であるが、両方ではない」）を示すと解釈されるべきである。特許請求の範囲において使用される場合、「から本質的になる」は、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するべきである。
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、１つまたはそれ以上の要素のリストに関連するフレーズ「少なくとも１つ」は、要素のリスト中の要素のいずれか１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙されるありとあらゆる要素の少なくとも１つを必ずしも含むとは限らず、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを除外しないことを理解されるべきである。この定義は、フレーズ「少なくとも１つの」が言及する要素のリスト内に具体的に特定される要素以外に、具体的に特定されるそうした要素に関連しているか、または関連していないかに関係なく、要素が場合により存在し得ることも許可する。したがって、非限定例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同等に、「ＡもしくはＢの少なくとも１つ」、または同等に、「Ａおよび／もしくはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、Ｂは存在せず、１つより多いＡを場合により含めた、少なくとも１つのＡ（Ｂ以外の要素を場合により含む）；別の実施形態では、Ａは存在せず、１つより多いＢを場合により含めた、少なくとも１つのＢ（Ａ以外の要素を場合により含む）；さらに別の実施形態では、１つより多いＡを場合により含めた、少なくとも１つのＡ、および場合により１つより多いＢを含めた、少なくとも１つのＢ（他の要素を場合により含む）；などを指すことができる。
本明細書で使用する場合、用語「クローニング」は、核酸分子をプラスミド中にライゲーションし、宿主の増殖中の複製に適した宿主細胞にこれを移行させる方法を指す。
本明細書で使用する場合、用語「断片」はポリペプチドを指し、そのポリペプチドに特有のまたは特徴的である、所与のポリペプチドの任意の別々の部分と定義される。本明細書で使用する場合、本用語は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも一部を保持する、所与のポリペプチドの任意の別々の部分も指す。
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」は、任意のヌクレオチド配列、ＤＮＡまたはＲＮＡを指し、少なくともそのある部分は、細胞プロセスのある態様で機能する別々の最終産物、典型的には、限定されないがポリペプチドをコードする。本用語は、ポリペプチドまたは他の別々の最終産物をコードするコード配列を指すことを意味するだけでなく、基底レベルの発現をモジュレートする、コード配列の前または後の領域、および個々のコーディングセグメント（「エクソン」）間の介在配列（「イントロン」）を包含することもできる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列、終結配列、コザック配列、ＴＡＴＡボックスなど）および／または改変配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、タンパク質をコードするのではなく、むしろ機能的ＲＮＡ分子、例えば、ｔＲＮＡ、ＲＮＡｉ誘導剤などをコードする核酸への言及を含むことができる。
本明細書で使用する場合、用語「ＨＩＶ」は、ＨＩＶ−１だけでなく、ＨＩＶ−１の様々な系統（例えば、ＢａＬ系統またはＳＦ１６２系統）ならびにＨＩＶ−１の様々なサブタイプ（例えば、サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＪおよびＫ）も含む。
本明細書で使用する場合、用語「同一性」は、高分子分子間の、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間の、ならびに／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。２つの核酸配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって行うことができる（例えば、最適な整列化のために、第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的で、同一でない配列を無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較目的のために整列させる配列の長さは、参照配列の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または実質的に１００％の長さである。対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを次いで比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同じヌクレオチドで占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適な整列化のために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列が共に有する同一の位置の数の関数である。
本明細書で使用する場合、用語「レンチウイルス」は、分裂細胞および非分裂細胞に感染することができるレトロウイルスの属を指す。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体である、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶタイプ１およびＨＩＶタイプ２を含める）；ヒツジにおいて脳炎（ビスナ）または肺炎（マエディ）を引き起こす、ビスナ・マエディ、ヤギにおいて免疫不全、関節炎および脳症を引き起こす、ヤギ関節炎脳炎ウイルス；ウマにおいて自己免疫性溶血性貧血および脳症を引き起こす、ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコにおいて免疫不全を引き起こす、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシにおいてリンパ節腫脹、リンパ球増加症、およびおそらく中枢神経系感染症を引き起こす、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；ならびに人間に近い霊長類において免疫不全および脳症を引き起こす、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「レンチウイルスベクター」は、レンチウイルスに由来し、形質導入を介して遺伝物質を細胞中に移行させるために使用される核酸の任意の形態を示すために使用される。本用語は、レンチウイルスベクター核酸、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ、これらの核酸のカプセル化形態およびウイルスベクター核酸がパッケージングされたウイルス粒子を包含する。
本明細書で使用する場合、用語「マルチクローニングサイト」または「ＭＣＳ」は、クローニングベクタープラスミド中に核酸断片をクローニングする目的で制限部位を含むヌクレオチド配列を指す。ポリリンカーまたはポリクローニング部位とも称されるＭＣＳは、クローニング部位のクラスターであり、多くの制限酵素がその部位内で機能することができる。いくつかの実施形態のクローニング部位は、制限酵素がプラスミドを直鎖化または切断するように機能する既知の配列である。
本明細書で使用する場合、用語「産生細胞」は、レンチウイルスベクター粒子の産生に必要なすべての要素を含む細胞を指す。
本明細書で使用する場合、用語「パッケージング細胞」は、組換えウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルストランスファーベクタープラスミド中で欠けている、感染性組換えウイルスの産生に必要な要素を含む細胞を指す。典型的には、そのようなパッケージング細胞は、ウイルスの構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を発現することができる１つまたはそれ以上の発現カセットを含むが、パッケージングシグナルを含まない。パッケージング細胞株の細胞は典型的には哺乳動物細胞株であり、これは、ＲＮＡをパッケージングし、複製能があるヘルパーウイルスを産生する能力を欠くウイルス粒子を産生するのに必要なコード配列を含む。パッケージング機能が（例えば、トランスで）細胞株内に提供されると、パッケージング細胞株は組換えレトロウイルス（または、レンチウイルス）を産生し、それによって、「産生細胞株」になる。
本明細書で使用する場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ」または「制限酵素」は、同種の核酸分子の配列（例えば、ＤＮＡ）に結合し、配列内の正確な位置でそれを切断する触媒分子のクラスの１つのメンバーまたは複数のメンバーを指す。
本明細書で使用する場合、用語「レトロウイルス」は、宿主細胞ゲノム中に組み込まれるｃＤＮＡコピーにレトロウイルスの逆転写酵素によって逆転写されるＲＮＡゲノムを有するウイルスを指す。レトロウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターを作製する方法は当技術分野で既知である。手短に言えば、レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸をある特定のウイルス配列に置き換えてウイルスゲノム中に挿入して、複製欠損のウイルスを産生する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲおよびパッケージング成分がないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ、３３巻：１５３〜１５９、１９８３）。レトロウイルスのＬＴＲおよびパッケージング配列とともにｃＤＮＡを含む組換えプラスミドがこの細胞株中に導入されると、パッケージング配列によって、組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物がウイルス粒子中にパッケージングされることが可能になり、次いで、これが培養培地中に分泌される。次いで、組換えレトロウイルスを含む培地を収集し、場合により濃縮し、遺伝子導入に使用する。いくつかの実施形態では、用語「レトロウイルス」は、任意の既知のレトロウイルス（例えば、タイプｃレトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））を指す。本発明の「レトロウイルス」は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、ならびにレトロウイルスのレンチウイルスファミリー、例えば、ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ）、ならびにレトロウイルスの他のクラスも含む。
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ干渉薬剤」または「ＲＮＡｉ薬剤」は、阻害性核酸またはサイレンシング核酸である。本明細書で使用する場合、「サイレンシング核酸」は、特異的な配列と相互作用して、遺伝子発現を阻害することができる任意のポリヌクレオチドを指す。サイレンシング核酸の例としては、ＲＮＡ二本鎖（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡのセンスおよび／もしくはアンチセンス配列をコードするＤＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡザイムまたはリボザイムが挙げられる。遺伝子発現の阻害は、必ずしも特定の挙げられた配列からの遺伝子発現である必要はなく、例えば、その特定の配列によって制御される配列からの遺伝子発現であり得ることを当業者は認識するであろう。
本明細書で使用する場合、用語「播種」は、細胞またはベクターの培養産生のために細胞培養をバイオリアクターまたは別の容器に加える方法を指す。
本明細書で使用する場合、フレーズ「無血清培地（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ）」または「無血清培地（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）」は、血清を含まない培地、すなわち、動物またはヒト起源の血清を含まない細胞培養培地を指す。いくつかの実施形態では、無血清培地はタンパク質を含まず、加水分解産物または未知の組成の成分も含まない。適切な細胞培養培地は当業者に既知である。これらの培地は、場合により、塩、ビタミン、バッファー、エネルギー源、アミノ酸および他の物質を含むことができる。細胞の無血清培養に適した培地の例は、培地１９９（Ｍｏｒｇａｎ、ＭｏｒｔｏｎおよびＰａｒｋｅｒ；Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９５０、７３、１；特に１０ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）である。
本明細書で使用する場合、用語「ｓｈＲＮＡ」は、アンチセンス領域、ループ部分およびセンス領域を含むＲＮＡ分子であって、センス領域がアンチセンス領域と塩基対合して、二本鎖のステムを形成する相補的ヌクレオチドを有するＲＮＡ分子を指す。転写後に続く。
本明細書で使用する場合、用語「治療的遺伝子」は、疾患を治療または防止する目的で対象に投与することができる遺伝子を指す。「治療的遺伝子」の定義内には、「生物学的に機能上同等な」治療的遺伝子が包含される。当業者によって理解されるように、用語「治療的遺伝子」は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、およびタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、融合タンパク質を発現する、または発現するように適合させることができる、より小さな操作された遺伝子セグメント、および治療的遺伝子にコードされる完全長ポリペプチドの治療的機能のいくつかまたはすべてを維持する変異体を含む。したがって、治療的遺伝子のアミノ酸と同一であるまたは機能的に同等であるアミノ酸の約７０％の配列相同性〜約９９％の配列相同性、および例えば、約７０％〜約８０％、より好ましくは約８５％および約９０％；またはさらにより好ましくは約９５％〜約９９％の間などの、その中で導き出せる任意の範囲または量の配列相同性を有する配列は、ポリペプチドの生物活性が維持されることを条件として、生物学的に機能上同等な配列である。
本明細書で使用する場合、用語「形質導入する」または「形質導入」は、トランスフェクションによってではなく、感染による、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを使用する遺伝子の送達を指す。例えば、レトロウイルスベクター（細胞中への核酸の導入ためのベクターとして使用される改変レトロウイルス）によって運ばれる抗ＨＰＲＴ遺伝子は、感染およびプロウイルス組込みを介して細胞中に形質導入することができる。したがって、「形質導入される遺伝子」は、レンチウイルスまたはベクター感染およびプロウイルス組込みを介して細胞中に導入された遺伝子である。ウイルスベクター（例えば、「形質導入ベクター」）は、「標的細胞」または宿主細胞中に遺伝子を形質導入する。
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、別の核酸分子の細胞中への侵入、例えば、移行、輸送などを媒介することができる核酸分子を指す。移行した核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば挿入される。ベクターは、自律複製を指示する配列を含むことができ、または宿主細胞のＤＮＡ中への組込みを可能にするのに十分である配列を含むことができる。当業者に明らかであるように、ウイルスベクターは、移行した核酸の侵入を媒介する核酸に加えて、様々なウイルス成分を含むことができる。限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスベクターを含めて、多数のベクターが当技術分野で既知である。ウイルスベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含める）などが挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「ベクターコピー数」または「ＶＣＮ」は、細胞のゲノム中のベクターまたはその一部のコピーの数を指す。平均ＶＣＮは、細胞の集団から、または個々の細胞コロニーから決定することができる。ＶＣＮを決定するための例示的方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびフローサイトメトリーが挙げられる。
本明細書で使用する場合、本明細書で互換的に使用される用語「ウイルス力価」または「力価」は、感染個体からの体液（例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿）の試料中の感染性ウイルス粒子の数を指す。
レンチウイルスゲノムは、一般に、５’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、アクセサリー遺伝子（ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ）および３’ＬＴＲで構成されている。ウイルスのＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と呼ばれる３つの領域に分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーター要素を含む。Ｕ５領域はポリアデニル化シグナルを含む。Ｒ（反復）領域はＵ３領域とＵ５領域を分離し、Ｒ領域の転写される配列は、ウイルスＲＮＡの５’末端と３’末端の両方に出現する。例えば「ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ａｌａｎ Ｊ．Ｃａｎｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、（２０００））；Ｏ ＮａｒａｙａｎおよびＣｌｅｍｅｎｔｓ（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７０：１６１７〜１６３９；Ｆｉｅｌｄｓら（１９９０）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ．；Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｈ、Ｂｌａｍｅｒ Ｕ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｍ、Ｇａｇｅ Ｆ Ｈ、Ｖｅｒｍａ Ｉ Ｍ．（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、７２巻（１０）：８１５０ ７、ならびに米国特許第６，０１３，５１６号を参照されたい。
造血前駆細胞／幹細胞（ＨＰＳＣ）に感染させるために使用されてきたいくつかのものを含めて、レンチウイルスベクターは当技術分野で既知である。そのようなベクターは、例えば、参照によって本明細書に組み入れる以下の刊行物に見出すことができる：Ｅｖａｎｓら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０巻：１４７９〜１４８９、１９９９；Ｃａｓｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９６巻：２９８８〜２９９３、１９９９；Ｕｃｈｉｄａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９５巻：１１９３９〜１１９４４、１９９８；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８３巻：６８２〜６８６、１９９９；およびＳｕｔｔｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：５７８１〜５７８８、１９９８。一実施形態では、発現ベクターは改変レンチウイルスであり、それにより、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染させることができる。さらに、改変レンチウイルスゲノムは、好ましくは、ウイルス複製に必要とされるレンチウイルスタンパク質に対する遺伝子を欠き、したがって、望まれない複製、例えば、標的細胞における複製を防止する。改変ゲノムの複製に必要とされるタンパク質は、好ましくは、組換えレトロウイルス（または、特にレンチウイルス）の産生の間に、パッケージング細胞株においてトランスで提供される。一実施形態では、パッケージング細胞株は２９３Ｔ細胞株である。レンチウイルスベクターは、好ましくは、レンチウイルスの５’および３’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）からの配列を含む。一実施形態では、ウイルスコンストラクトは、レンチウイルスの５’ＬＴＲからのＲおよびＵ５配列ならびにレンチウイルス由来の不活性化または自己不活性化３’ＬＴＲを含む。ＬＴＲ配列は、任意の種または系統からのものを含めた任意のレンチウイルスからのＬＴＲ配列でもよい。例えば、ＬＴＲは、ＨＩＶ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）またはウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）からのＬＴＲ配列でもよい。好ましくは、ＬＴＲ配列はＨＩＶ ＬＴＲ配列である。
安定な産生細胞株の細胞を生成する方法
レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、分裂細胞および非分裂細胞の両方を安定して形質導入するためのそれらの効率および能力が理由で、遺伝子導入のための重要なツールである。その結果、研究者は、多種多様の臨床応用において遺伝子送達ビヒクルとして、それを使用している。それにもかかわらず、現行適正製造基準（ｃＧＭＰ）方法を使用する大規模な臨床的産生は、レンチウイルスベクターを使用するより多くの臨床試験が規制当局の承認を受ける場合に考慮されなければならない一連の課題を伴う。ｃＧＭＰ適合方法を設計する際に考慮すべき重要な事項の１つは、規制上の考慮すべき事項を、複数のｃＧＭＰ産生のために一貫性があるレンチウイルスを産生することができる製造方法に統合する必要があることである。臨床的に使用されているレンチウイルスベクターの大多数は、一過的トランスフェクションによって産生されている。しかし、一過的トランスフェクションベースの産生は、しばしば労働集約的であり、変動しやすい。このような理由で、いくつかの安定なパッケージング細胞株システムが最近開発された。レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターの生物的製造のためのこれらの細胞株の使用は、拡張性と一貫性の両方の理由で特に魅力的であるが、そのような株の開発は時間がかかり、これらの株のｃＧＭＰ使用ための規制経路はしっかりと確立されていない。
前述のことを考慮して、本開示は、自己不活性化レンチウイルスベクター（ＳＩＮ−ＬＶ）を含めたレトロウイルスベクターの臨床的産生のための方法を記載する。新規なレンチウイルストランスファーベクタープラスミドをパッケージング細胞株（例えば、ＧＰＲ、ＧＰＲＧ、ＧＰＲＴ、ＧＰＲＧＴもしくはＧＰＲＴ−Ｇまたはこれらに由来する誘導体もしくは類似体パッケージング細胞株）と共に使用して、自己不活性化レンチウイルスベクター（例えば、ＬＶｇＧｓｈ７；ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）の発現をノックダウンするように設計された成分を含むベクター；ＨＰＲＴ発現をノックダウンするように設計された第１の成分、および治療的遺伝子、例えばガンマ−グロビン遺伝子の発現のための第２の成分も含むベクター）を含めたレトロウイルスベクターの産生を可能にするために、安定な産生細胞株の細胞を生成することができると考えられる。本明細書に記載のある特定の実施形態および例は、ＨＩＶ−１融合インヒビター（すなわち、Ｃ４６）と組み合わせて、ＨＩＶ−１共受容体ＣＣＲ５のダウンレギュレーションのための低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする自己不活性化レンチウイルスベクターであるＬＶｓｈ５／Ｃ４６の産生に言及するが、本明細書に記載の方法は、任意の所望の、または依頼人が提供した遺伝子または配列を含む、任意のＳＩＮ−ＬＶ（例えば、ガンマ−グロビン遺伝子をコードする核酸配列、例えば、その開示を参照によってその全体を本明細書に組み入れる米国特許出願公開第２０１７／０１４５０７７号に開示されているそうした核酸配列を発現するように設計されたＳＩＮ−ＬＩＶ；またはウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする核酸配列を発現するように設計されたＳＩＮ−ＬＩＶ）を産生することができる安定な産生細胞株の細胞の生成に適していることを当業者は認識するであろう。
本出願人は、一過的トランスフェクションによって産生されたＳＩＮ−ＬＶと比較して、本明細書中に開示される方法は、（ｉ）同様の質および量のＳＩＮ−ＬＶを生成することができること；（ｉｉ）より良い効力を有し得るＳＩＮ−ＬＶを産生すること；および（ｉｉ）一過的トランスフェクションで見られるプレップ間の変動性を大きく低下させると同時に、収量を維持する方法を可能にすることを示した。
ｐＵＣ５７−ＴＬ２０ｃ
いくつかの実施形態では、本開示は、新規な多用途のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ベースの第３世代の自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルストランスファーベクタープラスミド（以降、「ｐＵＣ５７−ＴＬ２０」と称される）を提供する（図１１を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、内部プロモーターをそれ自体は含まない（したがって、これは「プロモーターレス」である）ベクター骨格（「ＴＬ２０ｃ」）を含むプラスミドを移行させる。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは１つのプロモーター、例えばテトラサイクリン抑制性プロモーターをベクター骨格の上流に含むプラスミドを移行させる（図１２を参照されたい）。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ベクター骨格のプロモーターレス設計は、使用者が決定したプロモーターからの目的の遺伝子の送達およびその後の発現を可能にするレンチウイルストランスファーベクタープラスミドの生成を可能にすると考えられる。
図１１は、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドの構成要素を図示する遺伝子地図を記載する。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは約６５００ヌクレオチド〜約６７５０ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは６６００ヌクレオチド〜約６７００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルストランスファーベクタープラスミドのベクター骨格は約３８５０ヌクレオチド〜約３９５０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルストランスファーベクタープラスミドのベクター骨格は約３９０１ヌクレオチドを含む。
図１１に示すように、プラスミドは、５’隣接ＨＩＶ ＬＴＲ、パッケージングシグナルまたはψ＋、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）および３’隣接ＨＩＶ ＬＴＲを含む。ＬＴＲ領域は、Ｕ３およびＵ５領域ならびにＲ領域をさらに含む。
本開示のある特定の実施形態によれば、トランスファープラスミドは自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲを含む。当該技術分野において既知であるように、レトロウイルスの生活環の間、３’ＬＴＲのＵ３領域が複製されて、逆転写およびウイルスのＤＮＡ合成の過程で、５’ＬＴＲの対応する領域を形成する。ＳＩＮ ＬＴＲの作出は、３’ＬＴＲのＵ３領域を（好ましくは、その一部の欠失、例えばＴＡＴＡ配列の除去によって）不活性化することによって、達成される。この変化は逆転写後に５’ＬＴＲに移行されるので、プロウイルスのＬＴＲの転写単位が排除され、これは、複製能があるウイルスによる動員を防止すると考えられている。さらなる安全性の増強は、５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターに置き換えて、ウイルス粒子の産生の間にウイルスゲノムの転写を駆動することによってもたらされる。
いくつかの実施形態では、パッケージングシグナルは、野生型ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ０１ ＨＸＢ２＿ＬＡＩ＿ＩＩＩＢ）の約３６１塩基対のＧａｇ配列および約４４８塩基対のＰｏｌ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｃＰＰＴは野生型ＨＩＶの約８５塩基対のＶｉｆ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＶポリプリントラクト（ｐＰｕ）は野生型ＨＩＶの約１０６塩基対のＮｅｆ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＲＥは、野生型ＨＩＶの約２６塩基対のＲｅｖ配列、約２５塩基対のｔａｔ配列および約７６９塩基対のＥｎｖ配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、クロマチンインスレーターおよび／またはベータ−グロブリンのポリアデニル化シグナルを含む。
いくつかの実施形態では、パッキングシグナルをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３の配列、または配列番号３のものに少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、パッキングシグナルをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３の配列、または配列番号３のものに少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、パッキングシグナルをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３の配列、または配列番号３のものに少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４の配列、または配列番号４のものに少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４の配列、または配列番号４のものに少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４の配列、または配列番号４のものに少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｒｅｖ応答エレメントをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５の配列、または配列番号５のものに少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｒｅｖ応答エレメントをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５の配列、または配列番号５のものに少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｒｅｖ応答エレメントをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５の配列、または配列番号５のものに少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、自己不活性化ロングターミナルリピートをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６の配列、または配列番号６のものに少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、自己不活性化ロングターミナルリピートをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６の配列、または配列番号６のものに少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、自己不活性化ロングターミナルリピートをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６の配列、または配列番号６のものに少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１０のものに対して少なくとも８５％の同一性を有する、ドキシサイクリン抑制性プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１０のものに対して少なくとも９０％の同一性を有する、ドキシサイクリン抑制性プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１０のものに対して少なくとも９５％の同一性を有する、ドキシサイクリン抑制性プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１１のものに対して少なくとも８５％の同一性を有する、ＨＩＶ ＬＴＲ Ｒ５領域をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１１のものに対して少なくとも９０％の同一性を有する、ＨＩＶ ＬＴＲ Ｒ５領域をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１１のものに対して少なくとも９５％の同一性を有する、ＨＩＶ ＬＴＲ Ｒ５領域をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１２のものに対して少なくとも８５％の同一性を有する、ＨＩＶ ＬＴＲ Ｕ５領域をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１２のものに対して少なくとも９０％の同一性を有する、ＨＩＶ ＬＴＲ Ｕ５領域をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１２のものに対して少なくとも９５％の同一性を有する、ＨＩＶ ＬＴＲ Ｕ５領域をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１３のものに対して少なくとも８５％の同一性を有する、クロマチンインスレーターをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１３のものに対して少なくとも９０％の同一性を有する、クロマチンインスレーターをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１３のものに対して少なくとも９５％の同一性を有する、クロマチンインスレーターをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１４のものに対して少なくとも８５％の同一性を有する、ベータ−グロビンのポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１４のものに対して少なくとも９０％の同一性を有する、ベータ−グロビンのポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１４のものに対して少なくとも９５％の同一性を有する、ベータ−グロビンのポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１５のものに対して少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１５のものに対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１５のものに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本開示は、様々な異なる制限酵素のためのＭＣＳを組み込んでいるレンチウイルストランスファーベクタープラスミドを提供する。本開示のある特定の実施形態によれば、ＭＣＳは、約２０〜４０ヌクレオチドを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプラスミドのＭＣＳは少なくとも２個の制限酵素切断部位を含む。他の実施形態では、本明細書に開示されるプラスミドのＭＣＳは少なくとも３個の制限酵素切断部位を含む。他の実施形態では、本明細書に開示されるプラスミドのＭＣＳは少なくとも４個の制限酵素切断部位を含む。さらに他の実施形態では、本明細書に開示されるプラスミドのＭＣＳは約２個〜約１０個の制限部位を含む。さらに別の実施形態では、本明細書に開示されるプラスミドのＭＣＳは約３個〜約８個の制限部位を含む。いくつかの実施形態では、ＭＣＳ内の制限部位は、ＢｓｔＢＩ、ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩ、ＣｌａＩ、ＡｐａＩ、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＨｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＰａｃＩ、ＮｓｉＩ、ＳｐｈＩ、Ｓｍａ／Ｘｍａ、ＡｃｃＩ、ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩまたはこれらの任意の誘導体または類似体から選択される。
いくつかの実施形態では、レンチウイルストランスファーベクタープラスミドのＭＣＳ領域は、所望の導入遺伝子カセットの容易なサブクローニングを行いやすくすると考えられている４つのユニークな制限酵素切断部位を保有する。いくつかの実施形態では、マルチクローニングサイトは、ＢｓｔＢＩ、ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩおよびＣｌａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。いくつかの実施形態では、マルチクローニングサイトをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７の配列、または配列番号７のものに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。それらの制限部位は任意の順序で配置することができる。
いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドはベクター骨格に隣接する１つまたはそれ以上のさらなる制限酵素切断部位を含む（図１１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドはベクター骨格に隣接する２つのさらなる制限酵素切断部位を含む。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、さらなる隣接する制限酵素切断部位は、方向性の（「ヘッドトゥーテールの」）コンカテマーアレイの生成を可能にするものであると考えられる。いくつかの実施形態では、制限酵素切断部位はＳｆｉｌおよびＢｓｕ３６Ｉから選択される。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の遺伝子を含むレンチウイルスベクターはプラスミドに由来する。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号１の配列のものに対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号１の配列のものに対して少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらに他の実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号１の配列のものに対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号１の配列のものに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号１の配列のものに対して少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号１の配列のものに対して少なくとも９７％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号１の配列のものに対して少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号１の配列のものに対して少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは配列番号１の配列を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号１に記載される配列と１００ヌクレオチド以下異なる配列を有する。
いくつかの実施形態では、レンチウイルストランスファーベクタープラスミドは、配列番号２のものに対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号２のものに対して少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらに他の実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号２のものに対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号２のものに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号２のものに対して少なくとも９６％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号２のものに対して少なくとも９７％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは配列番号２のものに対して、少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号２のものに対して少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドは、配列番号２に記載される配列と１００ヌクレオチド以下異なる配列を有する。
いくつかの実施形態では、レンチウイルストランスファーベクタープラスミドは、当業者に既知の方法に従って合成される。例えば、当業者に既知の従来の制限消化およびライゲーション技法を使用して、プラスミドを合成することができる。例えば、当業者に既知の標準的な消化およびライゲーション手順（例えば、その開示を参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい）を使用して、ＴＬ２０ｃベクター骨格を含むドナープラスミドをｐＵ５７Ｃレシピエントプラスミド（例えば、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔから市販されているものなど）にサブクローニングすることができる。
本開示は、レンチウイルスベクター、例えば、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計された成分を含むレンチウイルスベクターであるＬＶｇＧｓｈ７、またはＨＰＲＴをノックダウンするように設計された第１の成分および治療的遺伝子、例えばガンマグロビン遺伝子をコードする第２の成分を含むレンチウイルスベクター（例えば、その開示を参照によってその全体を本明細書に組み入れるＷＯ／２０１９／０１８３８３に開示されているベクターおよび核酸配列を参照されたい）を含めて、レトロウイルスベクターを産生する方法も含む。いくつかの実施形態では、方法は、遺伝子（本明細書に開示される遺伝子のうちのいずれかを含める）のｃＤＮＡを合成し、組換えプラスミド、例えばｐＵＣ５７−ＴＬ２０ｃの制限部位に合成したｃＤＮＡをクローニングすることを含む。当業者に既知の技法を使用して、任意の治療的遺伝子を適切なクローニング部位に挿入することができる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）によって遺伝子を増幅し、次いでこれを、所望のプロモーターまたは遺伝子発現制御要素（適切なプロモーターの例は、その開示を参照によってその全体を本明細書に組み入れるＷＯ／２０１９／０１８３８３内に開示されている）を含む組換えプラスミドにクローニングすることができる。
いくつかの実施形態では、および単に例として、方法は、細胞中へのＨＩＶ融合またはＨＩＶ複製を防止することができるタンパク質を発現する遺伝子のｃＤＮＡを合成し；次いで、本明細書で開示されるプラスミドの制限部位に合成したｃＤＮＡをクローニングすることを含む。
安定な産生細胞株の細胞の生成およびそれから産生されたレンチウイルスベクターの反復回収
本開示のいくつかの実施形態には、安定な産生細胞株の細胞を形成し、生成された安定な産生細胞株の細胞から産生されたレトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含める）を回収する方法がある。いくつかの実施形態では、生成された産生細胞株の細胞から産生されたレンチウイルスベクターは反復回収され、例えば、約４０〜約５６時間ごとに反復回収される。図２を参照すると、安定な産生細胞株の産生の第１工程は、第１および第２のプラスミドからＤＮＡ断片を生成すること（１０）を含み、プラスミドのうちの１つは抗生物質抵抗性カセットプラスミドである。例えば、ＤＮＡ断片は、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドおよび抗生物質抵抗性カセットプラスミドから生成することができる。ＤＮＡ断片の生成（１０）に続いて、次いで、ＤＮＡを使用してコンカテマーアレイを形成する（２０）。
その後に、トランスフェクションなどによってコンカテマーアレイを、次いで、パッキング細胞株（例えば、ＧＰＲ、ＧＰＲＧ、ＧＰＲＴ、ＧＰＲＧ、ＧＰＲＴ−Ｇまたはそれらの誘導体のパッケージング細胞株）に導入する（３０）。アレイの導入（３０）およびその後のトランスフェクションに続いて、クローンを選択し（４０）、単離して（５０）、安定な産生細胞株を生成する（６０）。次いで、レンチウイルスベクターを含むベクター上清を回収する、例えば、無血清培地中で約４０〜約５６時間ごとに反復回収することができる。
コンカテマーアレイの形成および精製
本明細書で互換的に使用される「コンカテマー」または「コンカテマーアレイ」は、直接的または間接的に直列に連結された同じＤＮＡ配列の複数のコピーを含む、長い連続的なＤＮＡ分子を指す。いくつかの実施形態では、コンカテマーアレイは、パッケージング細胞株の細胞のトランスフェクションで生成され、使用される。いくつかの実施形態では、コンカテマーアレイは、連結されたベクターゲノム発現カセットの大きなアレイであり、その中に抗生物質抵抗性カセットが散在している。
図１４を参照すると、コンカテマーアレイを形成するために、レンチウイルストランスファーベクタープラスミドからのＤＮＡ断片（工程１００）および抗生物質抵抗性カセットプラスミド（工程１１０）が生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片は、当業者に既知のプロトコールに従ってプラスミドのそれぞれを消化すること、次いで、消化された断片をライゲーションすることによって、調製することができる。いくつかの実施形態では、電気泳動およびアガロースゲルを利用して、所望のＤＮＡ断片を獲得する（工程１２０）。いくつかの実施形態では、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用してＤＮＡ断片の濃度を決定することができる（工程１３０）。ＤＮＡの断片をライゲーションするために様々なストラテジーが利用可能であり、その選択はＤＮＡ断片の末端の性質に依存し、その選択は当業者が容易に行うことができる。
いくつかの実施形態では、レンチウイルストランスファーベクタープラスミドはｐＵＣ５７−ＴＬ２０ｃに基づく。いくつかの実施形態では、抗生物質抵抗性カセットプラスミドはＰＧＫプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、抗生物質抵抗性カセットプラスミドは、レンチウイルストランスファーベクタープラスミドにおけるレンチウイルスカセットとのコンカテマー化ための隣接部位を含む。いくつかの実施形態では、抗生物質抵抗性カセットプラスミドはＰＧＫ−ｂｌｅ（ブレオマイシン抵抗性）である。いくつかの実施形態では、ＰＧＫ−ｂｌｅプラスミドは、配列番号９の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ＰＧＫ−ｂｌｅプラスミドは、配列番号９の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ＰＧＫ−ｂｌｅプラスミドは、配列番号９のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、コンカテマーアレイは、レンチウイルストランスファーベクタープラスミドおよびＰＧＫ−ｂｌｅプラスミドに由来する生成されたＤＮＡ断片のインビトロライゲーションを介して形成される。
図１５は、コンカテマーアレイの形成で使用される一般的な工程の概要を述べる。工程２００では、生成されたＤＮＡ断片を混合し、ライゲーション反応の断片の量を最大にして、所望の比を維持する（工程２１０）。いくつかの実施形態では、レンチウイルストランスファーベクタープラスミドＤＮＡの量対抗生物質抵抗性カセットプラスミドＤＮＡの量の比は約１００：１〜約１：１００の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、レンチウイルストランスファーベクタープラスミドＤＮＡの量対抗生物質抵抗性カセットプラスミドＤＮＡの量の比は約７５：１〜約１：７５の範囲に及ぶ。他の実施形態では、レンチウイルストランスファーベクタープラスミドＤＮＡの量対抗生物質抵抗性カセットプラスミドＤＮＡの量の比は約５０：１〜約１：５０の範囲に及ぶ。さらに他の実施形態では、レンチウイルストランスファーベクタープラスミドＤＮＡの量対抗生物質抵抗性カセットプラスミドＤＮＡの量の比は約２５：１〜約１：２５の範囲に及ぶ。さらなる実施形態では、レンチウイルストランスファーベクタープラスミドＤＮＡの量対抗生物質抵抗性カセットプラスミドＤＮＡの量の比は約１０：１〜約１：１０の範囲に及ぶ。
いくつかの実施形態では、コンカテマー反応混合物を室温で、例えば、約２０℃〜約２５℃の間の範囲に及ぶ温度で一晩インキュベートする（工程２２０）。その後に、各試料のＤＮＡ断片の濃度を、次いで、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）を使用して測定することができる（工程２３０）。
いくつかの実施形態では、方向性のコンカテマーアレイが、パッキング細胞株のトランスフェクションで形成され、使用される。いくつかの実施形態では、方向性アレイの形成は、レンチウイルスベクター骨格に隣接する、レンチウイルストランスファーベクタープラスミド内の１つまたはそれ以上の制限酵素部位を利用することによって、達成される。いくつかの実施形態では、制限消化はＴＬ２０ｃベクターカセットに隣接する制限酵素部位を利用し、ヘッドトゥーテールのライゲーションにのみ使用することができるヌクレオチド非パリンドロームオーバーハングの形成を可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法による方向性ライゲーションは、主にヘッドトゥーテールのＤＮＡ生成物を含むコンカテマーアレイの生成を可能にする。
いくつかの実施形態では、コンカテマーアレイは、本明細書の実施例３に記載される方法に従って形成される。当然ながら、実施例３で提供する手順は、異なる比の第１のプラスミド対第２のプラスミドを有するコンカテマーアレイの形成に、およびＬＶｓｈ５／Ｃ４６以外のトランスファープラスミド、例えば、ガンマ−グロビン遺伝子または目的の任意の他の遺伝子を発現するように設計されたトランスファープラスミドに適合し得ることを当業者は認識するであろう。
いくつかの実施形態では、コンカテマーアレイは、パッキング細胞株中へのトランスフェクションより前に、フェノール抽出およびエタノール沈殿によって精製される。この従来の技法は安価かつ有効であるが、しかし、この手順は時間がかかり、再現性のある収量をもたらさない可能性がある。この特定の方法を使用する場合、最終的な試料にフェノール／クロロホルムを持ち越す危険性があることも考えられる。さらに、この方法は、さらなる有害な化学物質を含み、かつ、有害廃棄物ガイドラインに従って慎重に処分されなければならない有毒な廃棄物を生成する可能性があると考えられる。
あるいは、他の実施形態では、ライゲーション後に新しく合成されたコンカテマーアレイを精製するために、シリカベースの方法が使用される。この方法は、高品質のトランスフェクショングレードのコンカテマーアレイを単離するための、単純で、信頼でき、迅速な、簡便な方法を提供すると考えられる。いくつかの実施形態では、コンカテマーアレイは、Ｑｉａｇｅｎから入手可能なＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラムを使用して、例えば、実施例６に記載される手順を使用して、精製される。
トランスフェクション／単一クローンの単離
コンカテマーアレイの精製後、次いで、アレイはパッケージング細胞株の細胞をトランスフェクトするために使用される。本明細書で使用する場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に導入するための当技術分野で認識される様々な技法を指すことが意図される。本明細書で提供される例から明らかなように、レンチウイルス粒子の産生に許容的な宿主細胞に生成されたコンカテマーアレイをトランスフェクトすると、細胞は産生細胞、すなわち、感染性レンチウイルス粒子を産生する細胞になる。
一般に、形成されたコンカテマーアレイまたは形成された方向性コンカテマーアレイは、従来のトランスフェクション技法を介して細胞中に導入することができる。例えば、図１６を参照すると、いくつかの実施形態では、トランスフェクションの約２０〜約２４時間前に細胞を回収し、播種し（工程３００）、次いで、合成されたコンカテマーアレイ（工程３１０）をこれにトランスフェクトする（工程３２０）。パッキング細胞株の細胞にトランスフェクトする手順は本明細書の実施例４で提供される。
形成されたコンカテマーまたは方向性コンカテマーアレイでのトランスフェクションに適した１つのパッケージング細胞株はＧＰＲパッケージング細胞株である。ＧＰＲ株は、ｇａｇｐｏｌおよびｒｅｖを含めた必要なウイルス成分を有する２９３Ｔ／１７細胞に由来するＨＩＶ−１ベースのパッケージング細胞株である（その開示を参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｔｈｒｏｍら、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ａ ＳＩＮ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ＳＣＩＤ−Ｘ１ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｃ ａｒｒａｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ １１３：５１０４〜５１１０を参照されたい）。
形成されたコンカテマーまたは方向性コンカテマーアレイでのトランスフェクションに適した別のパッケージング細胞株はＧＰＲＧパッケージング細胞株である。いくつかの実施形態では、ＧＰＲＧパッキング細胞株はｇａｇｐｏｌ、ｒｅｖおよびＶＳＶ−Ｇを含む。
形成されたコンカテマーまたは方向性コンカテマーアレイでのトランスフェクションに適したさらに別のパッケージング細胞株は、ＧＰＲＴパッケージング細胞株（ｇａｇｐｏｌ、ｒｅｖおよびｔａｔ）である。ＧＰＲＧおよびＧＰＲＴパッケージング細胞株およびこれらを形成する方法もＴｈｒｏｍらによって開示され、その開示を、再度参照によってその全体を本明細書に組み入れる。他の適切なパッケージング細胞株（例えば、ＧＰＲＴ−Ｇ）は、Ｗｉｅｌｇｏｓｚ ｅｔ ａｌ．「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２、Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１４０６３（２０１５）によって記載され、その開示を参照によってその全体を本明細書に組み入れる。
本明細書中に開示される方法を用いる使用に適した他のパッケージング細胞株も利用することができることを当業者は認識するであろう。いくつかの実施形態では、他のパッケージング細胞株は、ＧＰＲ、ＧＰＲＧ、ＧＰＲＴまたはＧＰＲＴ−Ｇパッケージング細胞株のうちのいずれかに由来し得る。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＧＰＲＴ−Ｇ細胞株はＣＤ３４＋細胞において形質導入効率がより高いと考えられている（Ｗｉｅｌｇｏｓｚを参照されたい）。本明細書で使用する場合、用語「に由来する」は、個々の細胞からクローン的に派生し、いくつかの選り抜きの特質、例えば、所与の力価で活性タンパク質を産生する能力、または特定の密度まで増殖する能力を有する細胞の集団を指す。
いくつかの実施形態では、パッケージング細胞株の細胞は２９３Ｔ細胞である。２９３Ｔ細胞（または、ＨＥＫ２９３Ｔ）は、ＳＶ４０ラージＴ抗原の変異体バージョンを発現する、ＨＥＫ ２９３細胞株に由来するヒト細胞株の細胞である。さらに他の適切なパッケージング細胞株の細胞は、米国特許公開第２００９／０１８７９９７号、ＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１２／１７０４３１号および米国特許第８，０３４，６２０号に記載されており、これらの開示を参照によってその全体を本明細書に記載する。ＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１２／１７０４３１号は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ ｉ、Ｐｓｉ−２細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞および２１１Ａ細胞から調製することができるパッケージング細胞を記載する。
図１７は、トランスフェクトされた細胞を選択する一般的な方法を図示する。いくつかの実施形態では、トランスフェクションから約７２時間後に、ＧＰＲＧ細胞を選択培地（ゼオシンおよびドキシサイクリン）で培養する（工程４００）。次いで、細胞巣（ｃｅｌｌ ｆｏｃｉ）が確認されるまで約３〜約４日ごとに選択培地（ゼオシンおよびドキシサイクリン）を細胞に供給する（工程４１０）。その後に、細胞株を拡大させ、評価する（工程４２０）。
いくつかの実施形態では、トランスフェクションに続いて、良好な製造潜在能力を有する単一細胞クローンを特定するために、単一巣の選択／スクリーニング方法が利用される。この方法によれば、いくつかの実施形態では、選択される細胞を１５０×２５ｍｍのディッシュにまばらに播種し、約２〜約３週間拡大させ、認識可能なコロニーを形成させる。次いで、単クローン性増殖のために、個々のコロニーを別のより小さな培養容器に移すことができる。この方法は費用対効果が大きく、頻繁に採用される技法であると考えられるが；単一巣選択技法の本質的な限界のために、良好な産生細胞株の高確率の単クローン性を達成することは困難である可能性がある。
図１８は単一コロニーの単離を図示する。工程５００では、フローサイトメトリーを利用して、単一細胞ソーティングを調製する。次いで、細胞を条件培養培地にプレーティングし（工程５１０）、拡大させる（工程５２０）。
他の実施形態では、高力価レンチウイルスベクターの安定な産生細胞株を生成するために、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用して単一クローンを単離する（例えば、図８を参照されたい）。細胞付着および生存率を高め、コロニー形成を促進するために、ソーティング方法の間に、条件培地、例えば、ゼオシン（５０μｇ／ｍＬ）およびドキシサイクリン（１ｎｇ／ｍＬ）を加えることもできる。条件増殖培地の使用およびＦＡＣＳシステムのハイスループット能力は、多数のクローンのスクリーニングを可能にすると考えられ、それにより、高力価レンチウイルスベクター産生クローンの発見の確率を高めると考えられる。
いくつかの実施形態では、良好な増殖速度およびウイルス産生能力を有するクローンが、約２０継代にわたって安定性について試験される。
ウイルスベクターを生成するための産生細胞株の誘導および「２日間の回収」
クローンの選択および選択されたクローンの拡大に続いて、選択されたクローンは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターを産生するように誘導される。いくつかの実施形態では、誘導は当業者に既知の手順に従って行うことができる。
図１９は誘導および評価の方法を図示する。工程６００では、ウイルスベクターを誘導し、次いで、細胞、例えば２９３Ｔ細胞のスピノキュレーションを行って、形質導入効率を決定する（工程６１０）。いくつかの実施形態では、上位３クローンをスクリーニングし（工程６２０）、拡大させる（工程６３０）。いくつかの実施形態では、次いで、クローンを（例えば液体窒素下で）保存する（工程６４０）。いくつかの実施形態では、次いで、保存細胞バンクを本明細書に記載のようにウイルス性上清の反復回収で利用することができる。
毎日の回収（例えば、約２４時間ごとの回収）を利用する産生プロトコールは小規模で様々な試験ベクターを産生するために利用することができるが、生物的製造を大規模に行う場合は、毎日の回収および培地交換は非経済である。この費用は、無血清培地よりも高価な血清含有培地を使用する場合に増幅される。毎日の回収の代わりとして、本明細書に記載のように、「２日間の回収」プロトコールを発明した。本出願人は、「２日間の回収」は、より伝統的な毎日の回収とほぼ同じ量のウイルスベクターの生成を可能にし、同時に、より少ない培養培地しか必要としないという利点も提供することを予想外に発見した。毎日の回収からのベクター力価収量と「２日間の回収」プロトコールによるベクター力価収量の比較を図５Ａおよび５Ｂに図示する。いくつかの実施形態では、「２日間の回収」手順は、従来の毎日の回収方法と比較して、少なくとも約３０％少ない培養培地を利用する。他の実施形態では、「２日間の回収」手順は、従来の毎日の回収方法と比較して、少なくとも約３５％少ない培養培地を利用する。他の実施形態では、「２日間の回収」手順は、従来の毎日の回収方法と比較して、少なくとも約４０％少ない培養培地を利用する。他の実施形態では、「２日間の回収」手順は、従来の毎日の回収方法と比較して、少なくとも約４５％少ない培養培地を利用する。さらに他の実施形態では、従来の毎日の回収方法と比較して、「２日間の回収」手順は、少なくとも約５０％少ない培養培地を利用する。さらに他の実施形態では、「２日間の回収」手順は、従来の毎日の回収方法と比較して、少なくとも約５５％少ない培養培地を利用する。
本出願人は、血清含有培地の使用と比較して、（培養および／または産生段階のいずれかまたは両方において）無血清培地中で反復回収する場合に、ウイルスベクター力価が低減する可能性があるが、特に、無血清培地の使用が、おそらく血清含有培地中に存在する病原体からの汚染の危険性を軽減または防止することを考慮する場合、ウイルスベクター力価の低減は有意ではないと考えられる（図２１Ａおよび２１Ｂを参照されたい）ことをさらに示した。さらに、本出願人は、血清含有培地から無血清培地への切り換えが行われる場合、「２日間の回収」プロトコールがウイルス力価の低減を軽減することを示した。実際に、本出願人は、細胞が、無血清培地における毎日の回収と比較して無血清培地における「２日間の回収」をより良く許容することを発見した。最後に、無血清培地を使用して生物的製造作業を行うことに関連する費用は、血清含有培地を使用して生物的製造作業を行う場合よりも、比較上はるかに少なく、それにより、無血清培地へ切り替える場合のウイルスベクター力価の任意の喪失は、認識される費用節約を考慮すれば、管理可能である（本明細書において、表ＡおよびＢを比較する）。
上記のように、本開示の方法は、ウイルスベクターの最初の回収に続いて約２日ごとにウイルスベクターが反復回収される「２日間の回収」プロトコールを利用する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの最初の回収は誘導後（すなわち、ウイルスベクター産生を誘導した後）約２４時間〜約５６時間の間に行われる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの最初の回収は誘導後（すなわち、ウイルスベクター産生を誘導した後）約３０時間〜約５６時間の間に行われる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの最初の回収は誘導後（すなわち、ウイルスベクター産生を誘導した後）約４０時間〜約５６時間の間に行われる。他の実施形態では、ウイルスベクターの最初の回収は誘導後約４２時間〜約５４時間の間に行われる。さらに他の実施形態では、ウイルスベクターの最初の回収は誘導後約４４時間〜約５２時間の間に行われる。さらなる実施形態では、ウイルスベクターの最初の回収は誘導後約４６時間〜約５０時間の間に行われる。さらなる実施形態では、ウイルスベクターの最初の回収は誘導後約４７時間〜約４９時間の間に行われる。さらに別の実施形態では、ウイルスベクターの最初の回収は誘導後約４８時間目で行われる。いくつかの実施形態では、最初の回収は、誘導後少なくとも３０時間目で行われる。いくつかの実施形態では、最初の回収は、誘導後少なくとも３５時間目で行われる。いくつかの実施形態では、最初の回収は、誘導後少なくとも４０時間目で行われる。いくつかの実施形態では、最初の回収は、誘導後少なくとも４５時間目で行われる。
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される「２日間の回収」プロトコールによる反復回収は、ウイルスベクターの最初の回収に続いて約４０時間〜約５６時間ごとにウイルスベクターを反復回収することを含む。他の実施形態では、最初の回収は、安定な産生細胞株の細胞の誘導後約４０〜約５６時間の間に行われ、次いで、その後約４２〜約５５時間ごとに回収が反復される。さらに他の実施形態では、最初の回収は、安定な産生細胞株の細胞の誘導後約４０〜約５６時間の間に行われ、次いで、その後約４４〜約５２時間ごとに回収が反復される。さらなる実施形態では、最初の回収は、安定な産生細胞株の細胞の誘導後約４０〜約５６時間の間に行われ、次いで、その後約４６〜約５０時間ごとに回収が反復される。さらに別の実施形態では、最初の回収は、安定な産生細胞株の細胞の誘導後約４０〜約５６時間の間に行われ、次いで、その後約４８時間ごとに回収が反復される。本出願人は、誘導に続いて約４８時間でウイルスベクターを回収することができること、および誘導後約７２時間で最大量のウイルス力価を得ることができることを発見した。本出願人は、反復ウイルス回収プロトコールはウイルスベクターの最終的な収量を増大させることもできることも発見した。
いくつかの実施形態では、最初の回収は、安定な産生細胞株の細胞の誘導後約４０〜約５６時間の間に行われ、次いで、その後少なくとも約４０時間ごとに回収が反復される。いくつかの実施形態では、最初の回収は、安定な産生細胞株の細胞の誘導後約４０〜約５６時間の間に行われ、次いで、その後少なくとも約４２時間ごとに回収が反復される。いくつかの実施形態では、最初の回収は、安定な産生細胞株の細胞の誘導後約４４〜約５６時間の間に行われ、次いで、その後少なくとも約４０時間ごとに回収が反復される。いくつかの実施形態では、最初の回収は、安定な産生細胞株の細胞の誘導後約４６〜約５６時間の間に行われ、次いで、その後少なくとも約４０時間ごとに回収が反復される。
いくつかの実施形態では、回収に使用される無血清培地は各反復回収後に交換される。いくつかの実施形態では、各個別の回収の間、さらなる無血清培地は生成された安定な産生細胞株の細胞に導入されない。いくつかの実施形態では、反復回収は、さらなる安定な産生細胞株の細胞を導入すること無しに、安定な産生細胞株の細胞に新鮮な培地を加えることを含む。
いくつかの実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約５×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲の生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。他の実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約４×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲の生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。さらに他の実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約３．５×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲の生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。さらなる実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約３×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲の生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。さらに別の実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約２．５×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲の生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。さらに他の実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約２×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲の生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。さらに他の実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約１．７×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲の生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。さらに別の実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約１．６×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲の生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。さらに他の実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約１．４×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲の生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。さらに他の実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約１．３×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲の生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。さらに別の実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約１．２×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲の生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。さらに別の実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約１．１×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲の生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。さらに別の実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約１×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲の生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。
いくつかの実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、少なくとも約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬの生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。いくつかの実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、少なくとも約１×１０６ＴＵ／ｍＬの生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。いくつかの実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、少なくとも約１．５×１０６ＴＵ／ｍＬの生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。いくつかの実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、少なくとも約２×１０６ＴＵ／ｍＬの生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。いくつかの実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、少なくとも約２．５×１０６ＴＵ／ｍＬの生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。いくつかの実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、少なくとも約３×１０６ＴＵ／ｍＬの生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。いくつかの実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、少なくとも約３．５×１０６ＴＵ／ｍＬの生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。いくつかの実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、少なくとも約４×１０６ＴＵ／ｍＬの生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。いくつかの実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、少なくとも約４．５×１０６ＴＵ／ｍＬの生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。いくつかの実施形態では、本開示による方法（無血清培地における「２日間の回収」）は、反復回収の各個別の回収の間、少なくとも約５×１０６ＴＵ／ｍＬの生存可能なウイルス力価を回収することを可能にする。
いくつかの実施形態では、産生段階は約５日〜約９０日間続く。いくつかの実施形態では、産生段階は約５日〜約８０日間続く。いくつかの実施形態では、約５日〜約７０日間産生段階は続く。いくつかの実施形態では、産生段階は約５日〜約６０日間続く。いくつかの実施形態では、産生段階は約５日〜約５０日間続く。いくつかの実施形態では、産生段階は約５日〜約４０日間続く。いくつかの実施形態では、産生段階は約５日〜約３０日間続く。いくつかの実施形態では、産生段階は約５日〜約２０日間続く。いくつかの実施形態では、産生段階は約１０日〜約９０日間続く。いくつかの実施形態では、産生段階は約１０日〜約６０日間続く。いくつかの実施形態では、産生段階は約１０日〜約４５日間続く。いくつかの実施形態では、産生段階は、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５または少なくとも約９０日間続く。いくつかの実施形態では、産生段階は、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５または約９０日続く。
いくつかの実施形態では、回収は少なくとも２回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも３回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも４回行われる。他の実施形態では、反復回収は少なくとも５回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも６回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも７回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも８回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも９回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも１０回行われる。いくつかの実施形態では、回収は１１回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも１２回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも１３回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも１４回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも１５回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも１６回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも１７回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも１８回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも１９回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも２０回行われる。他の実施形態では、回収は少なくとも２５回行われる。
本出願人は、無血清培地中で約２日ごとにウイルスベクターを反復回収することは、血清含有培地中を除いて同じ回収プロトコールを使用した場合に回収されたウイルスベクター力価の量と比較して、実質的に同じ量のウイルスベクター力価を回収することを可能にすることも発見した（例えば、表ＡおよびＢを参照されたい；図２１Ａおよび２１Ｂも参照されたい）。いくつかの実施形態では、（「２日間の回収」スケジュールに従って）無血清培地中で産生された感染性粒子の量は、（「２日間の回収」スケジュールに従って）血清含有培地中で産生された感染性粒子の全量の少なくとも約６５％以内である。いくつかの実施形態では、（「２日間の回収」スケジュールを使用して）無血清培地中で産生された感染性粒子の量は、（「２日間の回収」スケジュールを使用して）血清含有培地中で産生された感染性粒子の全量の少なくとも約７０％以内である。いくつかの実施形態では、（「２日間の回収」スケジュールを使用して）無血清培地中で産生された感染性粒子の量は、（「２日間の回収」スケジュールを使用して）血清含有培地中で産生された感染性粒子の全量の少なくとも約７５％以内である。いくつかの実施形態では、（「２日間の回収」スケジュールを使用して）無血清培地中で産生された感染性粒子の量は、（「２日間の回収」スケジュールを使用して）血清含有培地中で産生された感染性粒子の全量の少なくとも約８０％以内である。いくつかの実施形態では、（「２日間の回収」スケジュールを使用して）無血清培地中で産生された感染性粒子の量は、（「２日間の回収」スケジュールを使用して）血清含有培地中で産生された感染性粒子の全量の少なくとも約８５％以内である。いくつかの実施形態では、（「２日間の回収」スケジュールを使用して）無血清培地中で産生された感染性粒子の量は、（「２日間の回収」スケジュールを使用して）血清含有培地中で産生された感染性粒子の全量の少なくとも約９０％以内である。いくつかの実施形態では、（「２日間の回収」スケジュールを使用して）無血清培地中で産生された感染性粒子の量は、（「２日間の回収」スケジュールを使用して）血清含有培地中で産生された感染性粒子の全量の少なくとも約９５％以内である。
いくつかの実施形態では、各反復回収工程の終了の後に、回収されたウイルスベクターを濾過によって精製することができる。いくつかの実施形態では、回収されたベクターは、ウイルス力価、細胞ゲノムあたりのウイルスのコピーおよび／またはｐ２４濃度の１つまたはそれ以上を決定することによって特性評価される。
血清含有培地を使用する反復回収の例
第１の例示的方法
第１の例示的方法では、各工程で、すなわち、培養段階で、産生段階で、および細胞の継代の間で、血清を含む培地が利用される。いくつかの実施形態では、血清を含む培地はＤ１０血清含有培地である。いくつかの実施形態では、Ｄ１０血清含有培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および熱不活性化ウシ胎仔血清（１０％）（すなわち、使用前に既に熱不活性化されたウシ胎仔血清）を含む。
一実施形態には、本開示による２日間の回収を使用してウイルスベクターを生成する第１の方法があり、第１の方法は以下の工程を含む：
（１）産生株の培養ディッシュの古い培養培地を可能な限り完全に除去し、１×ＰＢＳで細胞を洗浄する。
（２）ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（１×）を培養ディッシュに加える（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）。
（３）約３７℃で約２分間インキュベーターに入れる。
（４）Ｄ１０培地（いかなる薬物も含まない）を加えることにより細胞を洗い流し、上下にピペッティングすることにより細胞クラスターを単一細胞に分離する（Ｄ１０培地：高グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補充物および１０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳおよび１％（ｗ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを有するダルベッコ改変イーグル培地）。
（５）約１２００ｒｐｍ（または、１２５×ｇ）で約５分間約４℃で細胞を遠心分離する。
（６）培地を吸引し、形成されたペレットを新鮮なＤ１０培地（薬物なし）中に穏やかに懸濁させる。
（７）培養ディッシュ中に約９５％コンフルエントで細胞を播種する（大まかに、４×１０６細胞／６０ｍｍ培養ディッシュにおいてプレーティングすることによる。ベクター誘導）。
（８）次いで、約２４時間後（誘導後１日目）に、新鮮な予熱したＤ１０培地を播種した細胞に補充することができる。
（９）最初の培地交換から約４８時間後（誘導後３日目）に初めてウイルスベクターを回収する。
（１０）新鮮な予熱した培地を培養ディッシュに加える。
（１１）２回目の培地交換から約４８時間後（誘導後５日目）に２回目のウイルスベクター回収を行う。
（１２）新鮮な予熱した培地を培養ディッシュに加える。
（１３）３回目の培地交換から約４８時間（誘導後７日目）に３回目のウイルスベクター回収を行う。
第２の例示的方法
第２の例示的方法では、各工程で、すなわち、細胞の継代の間で、培養段階で、および産生段階で、血清含有培地が利用される。いくつかの実施形態では、血清含有培地はＤ１０である。
（１）産生株の培養ディッシュの培地を可能な限り完全に除去し、１×ＰＢＳで細胞を洗浄する。
（２）１００ｍｍの培養ディッシュに対して３ｍＬを使用して、洗浄した細胞単層上に１×ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを穏やかにピペットで移す。
（３）フラスコを回転させて、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで単層を覆う。
（４）フラスコをインキュベーターに戻し、約２分間放置する。
（５）フラスコの側面を穏やかにたたいて、いかなる残存付着細胞も遊離させた。
（６）新鮮なＤ１０培地約２ｍＬ（抗生物質無し）中に細胞を再懸濁させ、１５ｍＬコニカル遠心チューブに移す。
（７）約１２００ｒｐｍ（または、１２５×ｇ）で約５分間細胞を遠心分離する。
（８）培地を吸引し、新鮮なＤ１０培養培地（抗生物質なし）約５ｍＬにペレットを穏やかに懸濁させる。
（９）ＴＣ１０（商標）自動細胞カウンターによって細胞数を決定する。
（１０）培養ディッシュにおいて約９５％コンフルエントを越える細胞を播種する（約４×１０６個の生細胞を６０ｍｍ培養ディッシュにプレーティングすることによる）。
（１１）新鮮な温めたＤ１０培地を播種した細胞に毎日（約２４時間ごとに）補充した。
本出願人は、ウイルスベクターは誘導後約４８時間で細胞から回収することができること、および最高のウイルス力価は誘導後７２時間で得ることができることを発見した。本出願人は、ウイルスベクターは誘導後約２日〜約４日まで回収することができることを再度予想外に発見した。
いくつかの実施形態では、回収されたベクターは濾過によって精製される。いくつかの実施形態では、回収されたベクターは、ウイルス力価、細胞ゲノムあたりのウイルスのコピーおよびｐ２４濃度を決定することによって特性評価される。
無血清培地を使用する反復回収の例
本開示は、無血清培地を使用して２日間の回収を行う方法も提供する。以下に記載の第３のおよび第４の実施形態で詳しく述べるように、培養段階または産生段階の少なくとも１つで無血清培地を利用することができる。
本出願人は、「２日間の回収」手順と無血清培地の使用を組み合わせることによって、最小限の力価の低減しかない、ウイルスベクターを反復回収する費用対効果が大きい方法を発見した。「２日間の回収」プロトコールとともに無血清培地を使用することは、血清含有培地の費用がかなり高い可能性がある大規模な生物的製造に特に重要であることが考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、回収は無血清培地中で少なくとも部分的に行われる。例えば、培養段階または産生段階の少なくとも１つが無血清培地を利用する。別の例として、培養段階と産生段階の両方が無血清培地を利用する。
Figure 2021534818
Figure 2021534818
第３の例示的方法
第３の例示的方法では、無血清培地がいくつかの工程で（例えば、培養と産生の両方の段階で）使用され、一方で、血清含有培地が他の工程で（例えば、細胞の継代の間）使用される。いくつかの実施形態では、血清含有培地はＤ１０血清含有培地であり；無血清培地はＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ（商標）培地（Ｌｏｎｚａから入手可能）である。いくつかの実施形態では、無血清培地は、１つまたはそれ以上の増殖因子および／または脂質、例えば、「脂質混合物補充物」（Ｓｉｇｍａ Ｌ５１４５から入手可能）を場合により含むことができる。ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ（商標）培地とＳｉｇｍａ Ｌ５１４５培地の両方は、ベクター産生の間細胞を安定化した。表ＡおよびＢ（上記）ならびに図２１Ａおよび２１Ｂに比較データを提供する。
したがって、本開示は、２日間の回収を使用してウイルスベクターを生成する第３の方法を提供し、第３の方法は以下の工程を含む：
（１）ウイルスベクター産生で使用する前に、（例えば、凍結から回復させるために）解凍後少なくとも４回細胞を継代する。
（２）所望の量まで細胞を培養する（一日おきに細胞を継代する）。
（３）産生株の培養ディッシュの培地を可能な限り完全に除去し、１×ＰＢＳで細胞を洗浄する。
（４）洗浄した細胞単層上に１×ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを穏やかにピペットで移す。
（５）フラスコを回転させて、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで単層を覆う。
（６）フラスコをインキュベーターに戻し、約２分間放置する。
（７）フラスコの側面を穏やかにたたいて、いかなる残存付着細胞も遊離させる。
（８）新鮮なＤ１０培地（抗生物質なし）中に細胞を再懸濁し、コニカル遠心チューブに移す。
（９）約１２００ｒｐｍで約５分間細胞を遠心分離する。
（１０）培地を吸引し、新鮮なＤ１０培養培地（抗生物質なし）中にペレットを穏やかに懸濁させる。
（１１）ＴＣ１０（商標）自動細胞カウンターを使用して細胞数を決定する。
（１２）培養ディッシュにおいて＞９５％コンフルエントの細胞をＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ（商標）無血清培地（抗生物質なし）中に直接播種する。
（１３）誘導後約２４時間で、古い培養培地を新鮮な予熱したＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ（商標）無血清培地と交換する。
（１４）誘導後約７２時間で、誘導された細胞からウイルスベクターを回収した。
第４の例示的方法
第４の例示的方法では、無血清培地が産生段階で使用され；一方で、血清含有培地が培養段階および細胞の継代の間の両方で使用される。いくつかの実施形態では、血清を含む培地はＤ１０血清含有培地であり；無血清培地はＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ（商標）培地（Ｌｏｎｚａから入手可能）（場合により添加増殖因子、例えば、ＥＸ−ＣＹＴＥ（登録商標）を含む）である。ＥＸ−ＣＹＴＥ（登録商標）補充物は、様々な哺乳動物細胞において細胞増殖およびタンパク質産生を増強することが証明されている代謝因子のバランスの取れたプロファイルを提供する、コレステロール、リポタンパク質および脂肪酸の水溶性濃縮物である。いくつかの実施形態では、約１％のｖ／ｖのＥＸ−ＣＹＴＥを培養培地に加えた。産生段階で無血清培地を使用する場合、細胞は、適合手順を介して進行する必要がなかったことが考えられる。これに対して、無血清培地を培養段階で使用した場合、細胞は、無血清培地の使用へ適合するのにいくらかの時間を必要としたことが考えられる。
別の実施形態には、本開示に従って２日間の回収手順を使用してウイルスベクターを生成する第４の方法があり、第４の方法は以下の工程を含む：
（１）ウイルスベクター産生で使用する前に、解凍後少なくとも約４回細胞を継代する。
（２）（対数期増殖を維持するために）ベクター誘導の少なくとも２日前に細胞を毎日継代する。
（３）産生株の培養ディッシュの培地を可能な限り完全に除去し、１×ＰＢＳで細胞を洗浄する。
（４）洗浄した細胞単層上に１×ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを穏やかにピペットで移す。
（５）フラスコを回転させて、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで単層を覆う。
（６）フラスコをインキュベーターに戻し、約２分間放置する。
（７）フラスコの側面を穏やかにたたいて、いかなる残存付着細胞も遊離させた。
（８）新鮮なＤ１０培地（抗生物質なし）中に細胞を再懸濁し、コニカル遠心チューブに移す。
（９）約１２００ｒｐｍ（または、１２５×ｇ）で約５分間細胞を遠心分離する。
（１０）培地を吸引し、新鮮なＤ１０培養培地（抗生物質なし）中にペレットを穏やかに懸濁させる。
（１１）ＴＣ１０（商標）自動細胞カウンターによって細胞数を決定する。
（１２）培養ディッシュにおいて＞９５％コンフルエントの細胞を新鮮なＤ１０培養培地（抗生物質なし）中に播種する。
（１３）誘導後約２４時間で、Ｄ１０培養培地を新鮮な予熱したＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ（商標）無血清培地と交換する。
（１４）誘導後約７２、約１２０および約１６８時間で、誘導された細胞からウイルスベクターを回収した。
一過的トランスフェクションで産生された自己不活性化レンチウイルスベクターと開示される安定細胞株方法によって産生されたベクターの詳細な比較
本明細書に記載の方法を使用して、ＨＩＶ−１融合インヒビター、Ｃ４６と組み合わせて、ＨＩＶ−１共受容体ＣＣＲ５のダウンレギュレーションのための低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする自己不活性化レンチウイルスベクター（ＳＩＮ−ＬＶ）である、ＬＶｓｈ５／Ｃ４６の産生のための安定細胞株を生成した。一過的トランスフェクションによって産生されたこのレンチウイルスベクターは、現在、ＨＩＶ感染個体における臨床試験で評価されている。ここでは、ＬＶｓｈ５／Ｃ４６および他のＳＩＮ−ＬＶの臨床的製造へのこのシステムの適用を支持するために、一過的トランスフェクションによって産生されたＬＶｓｈ５／Ｃ４６と本明細書に記載の方法を使用して産生されたＬＶｓｈ５／Ｃ４６の比較解析を行った。
本明細書に記載の方法を他の自己不活性化レンチウイルスベクターの産生に拡張することができることを当業者は認識するであろう。例えば、ＳＩＮ−ＬＶは、（ｉ）ＨＰＲＴ遺伝子を標的にする、ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはエクソンスキッピング剤；および（ｉｉ）第２の治療的遺伝子をコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の治療的遺伝子をコードする核酸は、鎌状赤血球症またはβ−サラセミアを遺伝的に治すことができるもの；またはそれらの症状（重度鎌状赤血球症の症状を含める）を低減することができるものである。他の実施形態では、治療的遺伝子をコードする核酸は、免疫不全、遺伝性疾患、血液疾患（例えば、血友病、ヘモグロビン障害）、神経学的疾患および／またはリソソーム蓄積症遺伝的に治すことができるもの；またはそれらの症状を低減することができるものである。いくつかの実施形態では、治療的遺伝子はガンマグロビン遺伝子である。いくつかの実施形態では、ガンマグロビン遺伝子をコードする第２の核酸配列はアルファ−グロビン鎖に競合的利点を与え、四量体ＨｂＦ対ＨｂＳの形成を歪める点変異を含むハイブリッドガンマグロビン遺伝子である。
レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、４プラスミドシステム（１つはトランスファーベクター、２つはパッケージングベクター、１つはエンベロープベクター）を使用して、２９３Ｔ細胞におけるリン酸カルシウムトランスフェクションによって産生した。ウイルス含有培地（ＶＣＭ）をトランスフェクション後４８時間で回収し、２０％ショ糖クッションを介する超遠心分離法によって濃縮した。
細胞株生成のために、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を含まない培地中で産生細胞株の細胞を誘導し、約７２時間でＶＣＭを回収し、超遠心分離法によって同様に濃縮した。表１および図８および９を参照すると、粒子力価に基づいて、ならびに２９３ＴおよびＴＦ−１ａ Ｔ細胞株に対する遺伝子形質導入効力についての３つの独立のアッセイを使用して、各方法によって産生されたレンチウイルスベクターが比較された。これらは、細胞表面のＣ４６発現およびＣＣＲ５発現のｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウンのためのＦＡＣＳアッセイ、ならびに宿主細胞ゲノムあたりのベクターコピー数（ＶＣＮ）のためのｑＰＣＲアッセイを含んでいた。すべてのアッセイについて、ベクター希釈の範囲にわたって力価を決定して、直線関係を定義した。ｑＰＣＲアッセイは、形質導入された細胞から抽出されたゲノムＤＮＡを利用し、Ｃ４６導入遺伝子および内在性β−グロビン遺伝子の配列を検出する。したがって、Ｃ４６のＶＣＮを細胞ゲノムに対して正規化することができる。
Figure 2021534818
一過的トランスフェクション方法と比較して、より高濃度のｐ２４が、産生細胞株によって生成されたＶＣＭ中に観察された。しかし、２つの異なるシステムを使用して産生されたＬＶｓｈ５／Ｃ４６の収量および効力は同様であった。等量のＶＣＭを使用して、ＦＡＣＳによって、ベクターをＣ４６力価について最初に評価した。Ｃ４６力価を正規化し、ｑＰＣＲアッセイを使用して、またはＣＣＲ５の機能的ノックダウンを介して遺伝子形質導入についてベクター調製物を評価した場合に、一過的トランスフェクションによって産生されたベクターは中程度に力価が増大したが、安定な産生細胞株によって産生されたベクターは、より大きな効力を示した（表２を参照されたい）。ＣＣＲ５発現のダウンレギュレーションおよびゲノムのＣ４６導入遺伝子（ＶＣＮ）は、本明細書に開示される方法で産生されたＬＶｓｈ５／Ｃ４６で処理した標的細胞において、一過的トランスフェクションによって産生されたベクターで処理したものよりもそれぞれ有意に高かった（表３および図１０を参照されたい）。
Figure 2021534818
Figure 2021534818
３つの独立のアッセイに基づくと、本明細書に記載の方法は、一過的トランスフェクション方法と比較して同様の質および量のＳＩＮ−ＬＶを生成することができる、安定なレンチウイルスベクター産生システムを提供することが示された。より高いＣＣＲ５ダウンレギュレーション効能および形質導入された細胞におけるＣ４６のＶＣＮ（Ｃ４６力価に正規化）によって、産生細胞によって産生されたＬＶｓｈ５／Ｃ４６は、従来の４プラスミドの一過的トランスフェクション方法を使用して生成されたベクターのものよりも良い効力を有することが示された。冗長な一過的トランスフェクション工程を除去することによって、いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ヒトで使用するための臨床グレードの材料の製造についてのｃＧＭＰ条件にこの産生システムを容易に適合させることができることが考えられる。
ＨＩＶ遺伝子療法のためのレンチウイルスベクターの生物的産生のためのＧＰＲＧベースの産生細胞株の開発および特性評価
ＧＰＲＧ細胞株システムは、自己不活性化レンチウイルスベクター（ＳＩＮ−ＬＶ）の臨床的産生のために以前に確立された。ここでは、ＬＶｓｈ５／Ｃ４６の産生のための、ＧＰＲＧに基づく産生細胞株を開発した（ＬＶｓｈ５／Ｃ４６はＨＩＶ感染個体の治療ためにクリニックで現在評価されているＳＩＮ−ＬＶである）。このベクターは、２つのウイルス侵入インヒビター；ＨＩＶ共受容体ＣＣＲ５に対する低分子ヘアピン型ＲＮＡであるｓｈ５、およびウイルス融合インヒビターであるＣ４６をコードする。さらに、ＬＶｓｈ５／Ｃ４６の生物的産生のためのＧＰＲＧシステムの規制当局への提出書類（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆｉｌｌｉｎｇ）および臨床応用に必要とされる、ＧＰＲＧパッケージング細胞株、ＧＲＰＧ−ベースのＬＶｓｈ５／Ｃ４６産生細胞株およびテトラサイクリン誘導後のＬＶｓｈ５／Ｃ４６産生の安定性を本実験によって決定した。
ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）およびピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）を含むＤ１０培地でＧＰＲＧ細胞を培養した。ＬＶｓｈ５／Ｃ４６産生細胞を生成するために、トランスファープラスミドＴＬ２０−ＬＶｓｈ５／Ｃ４６およびゼオシン抵抗性プラスミドをコンカテマーアレイとしてＧＰＲＧ細胞にトランスフェクトした。個々のクローンをＬＶｓｈ５／Ｃ４６ベクターを産生する能力について評価し、Ｄｏｘ、Ｐｕｒｏおよびゼオシンを含むＤ１０培地中で維持した。レンチウイルス（ＬＶ）産生についての親ＧＰＲＧ細胞株の安定性を評価するために、３か月の期間にわたって１０継代ごとに（５０＋の全継代）、トランスファーベクターをＧＰＲＧ細胞にトランスフェクトした（図３Ａおよび３Ｂを参照されたい）。ウイルス含有培地（ＶＣＭ）をトランスフェクション後４８時間で回収し、相補的遺伝子形質導入アッセイによってベクター力価を評価した。安定な産生細胞クローンからのＬＶ産生の安定性を評価するために、Ｄｏｘを含まないＤ１０培地中で細胞を誘導した。誘導後７２時間でＶＣＭを回収し、ベクター希釈の範囲にわたって力価を同様に評価した。長期継代後の誘導後のＶＳＶ−Ｇの発現安定性を解析するために、Ｄｏｘの使用中止によってＧＰＲＧ細胞を誘導し、次いで、ビオチンコンジュゲート抗ＶＳＶ−Ｇ抗体を使用して染色し、続いて、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで二次染色を行った。
ＧＰＲＧ細胞は、ＶＳＶ−Ｇの厳密なテトラサイクリン調節性発現を示した。このパッケージング細胞株は、ＬＶトランスファーベクターでのトランスフェクション後に最大で１０７ＬＶ形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬをもたらすことができ、連続的な培養において５０継代より多くにわたって高レベルのＬＶ産生を維持した（図６Ａおよび６Ｂを参照されたい）。コンカテマーアレイトランスフェクションを利用することによって、ＬＶｓｈ５Ｃ４６の産生のための、ＧＰＲＧに基づく産生細胞株の効率的な構築が示された。この細胞株は、１０６ＴＵ／ｍＬを上回る力価を一貫してもたらした。力価のさらなる増大は、二次産生細胞株の再クローニングおよび選択によって達成することができる。力価は誘導後２〜５日でピークに達した。確立された安定な産生細胞株は、２５継代を超える連続的な培養の間、１０６ＴＵ／ｍＬを超える力価でのＬＶｓｈ５／Ｃ４６産生を維持することが示された。
ＧＰＲＧ細胞株は、Ｄｏｘの除去の際に細胞表面でＶＳＶ−Ｇを効率的に発現した。これらの細胞株は、トランスファーベクタープラスミドのトランスフェクション後に高いＬＶ力価をもたらすことができることも考えられる。さらに、この細胞株は、ＳＩＮ−ＬＶに対する高力価産生細胞株の誘導を可能にした。産生細胞株は、長期培養の間、安定なベクター産生を示し、この細胞株について無血清および懸濁培養システムにベクター産生を適合させる能力の評価を探究した（図７Ａおよび７Ｂを参照されたい）。
コンカテマーアレイの生成プロトコール
工程１
脱イオン水４９０ｍＬを５０×ＴＡＥ１０ｍＬ（（Ｔｒｉｓ−アセテート−ＥＤＴＡ）バッファー）と混合することによって、１×ＴＡＥランニングバッファー５００ｍＬを調製する。
アガロース１ｇおよび１×ＴＡＥバッファー１００ｍＬ（５０×ＴＡＥ ２ｍＬにオートクレーブした水９８ｍＬを加える）をビーカーに加え、固体粒子または泡がなくなるまで（約２．５分）、この混合物を電子レンジで加熱することによって、１％アガロースゲルを作製する。
混合物を３分間冷却させる。
ＧｅｌＲｅｄ（商標）１０μＬをアガロースゲル混合物に加え、撹拌する（Ｂｉｏｔｉｕｍから入手可能）。
ゲルキャスターおよびゲルコームを組み立てる。混合物をゲルモールドに注ぎ、これを３０分間過冷却させる（容量：大コームに対して６０μＬ）。
ゲルが冷却したら、ゲルが完全に沈むまでボックスを１×ＴＡＥバッファーで満たす。
ＤＮＡを線状にするために、室温で消化反応混合物を調製する。
ベクタープラスミド２５μｇを制限酵素ＳｆｉＩで消化する。別の反応では、抵抗性カセットプラスミドＰＧＫ−ｂｌｅをＰｆｌＭＩで消化する（１０μｇは十分過ぎるほどである）。
Figure 2021534818
穏やかに混合し、加熱して３７℃で１５分間インキュベートする。
ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ １ｋｂ ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー混合物１０μＬ（ＤＮＡラダー２μＬ＋ヌクレアーゼフリー水８μＬ）および試料混合物５０μＬを利用可能なスロットに加える。
電気泳動装置の電源を入れ、電圧１５０Ｖで１時間流す。
ゲルを「ＵＶＰ ＰｈｏｔｏＤｏｃ−Ｉｔ」イメージングシステムに移し、結果の画像を得る。
Ｅｙｅ−Ｆｉウェブサイトからゲルの写真をダウンロードする。
ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計を使用して、各試料のＤＮＡ濃度を決定する。
工程２
アガロースゲルからＤＮＡバンドを切り出す。
１容量のゲルに３容量のバッファーＱＧを加える（一般に、ＱＧ ５００μＬを加える）。
ゲルスライスが完全に溶解した後、５０℃で１０分間インキュベートする。
ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに試料をアプライし、これを１７，９００ｒｐｍで１分間遠心分離する（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）。
フロースルーを捨て、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを同じ収集チューブに戻す。
バッファーＱＧ ０．５ｍＬをＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに加え、１分間遠心分離する。
バッファーＰＥ ０．７５ｍＬをＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに加え、１分間遠心分離する。
フロースルーを捨て、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを１７，９００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離する。
ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを清潔な１．５ｍＬ微量遠心チューブに入れる。
ＤＮＡを溶出するために、ＱＩＡｑｕｉｃｋメンブレンの中央にバッファーＥＢ ３５μＬを加え、カラムを１７，９００ｒｐｍで１分間遠心分離する（バッファーＥＢは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｃｌ、ｐＨ８．５である）。
ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計を使用してＤＮＡ断片の濃度を測定する（ブランク測定のために、ＥＢバッファーを使用する）。
工程３
氷上で、１．７ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心チューブ中にライゲーション反応をセットアップする。
予め作成されたスプレッドシート（Ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｃ Ｌｉｇａｔｉｏｎｓ．ｘｌｓｘ）を使用して、ベクター対ＰＧＫ−ｂｌｅの約２５：１のモル比を作るように混合する必要がある各断片の量を計算する。
ライゲーション反応の断片の量を最大にし、所望のモル比を維持する。
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファーは、解凍し、室温で再懸濁するべきである（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファーは以下の成分を含む：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）。
ライゲーション反応物をピペットで移す。上記の例では、１０×ライゲーションバッファー１０μＬ（ＮＥＢ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎキット）およびリガーゼ酵素０．５μＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから入手可能）を加えることによって、ＤＮＡ混合物９０μＬを利用した。
室温で以下のものを含む以下の反応混合物を調製する：
Figure 2021534818
上下にピペッティングすることによって、穏やかに混合する。
室温で一晩インキュベートする。
工程４
ＧＰＲＧ細胞へのトランスフェクションより前に、シリカベースのメンブレン（ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅキット）によって、コンカテマーアレイを回収し、精製した。
２ｍＬ収集チューブ中に入れたＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラムにコンカテマーアレイ混合物をピペットで移す。
８０００×ｇで１分間遠心分離する。フロースルーおよび収集チューブを捨てる。
ＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラムを（提供された）新しい２ｍＬ収集チューブ（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）に入れる。
バッファーＡＷ１ ５００μＬを加え、８０００×ｇで１分間遠心分離する。
フロースルーおよび収集チューブを捨てる。
ＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラムを（提供された）新しい２ｍＬ収集チューブに入れる。
バッファーＡＷ２ ５００μＬを加え、２０，０００×ｇで３分間遠心分離して、ＤＮｅａｓｙメンブレンを乾燥させる。
フロースルーおよび収集チューブを捨てる。
清潔な１．７ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心チューブにＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラムを入れる。
バッファーＡＥ ２００μＬをＤＮｅａｓｙメンブレン上に直接加える。
室温で４分間インキュベートする。
８０００×ｇで１分間遠心分離して、ＤＮＡ混合物を溶出する。
溶出を１回反復する。
ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ分光光度計によってコンカテマーＤＮＡ濃度を測定する。
コンカテマーアレイを使用して産生細胞株を生成するためのプロトコール
ウイルスベクター産生で使用する前に、解凍後少なくとも４回細胞を継代する。
ベクター誘導の前に、トリパンブルー方法を使用して、細胞が健常であること、および９５％より多くが生存可能であることを確実にする（トリパンブルーは、生存可能な細胞をカウントするために、色素排除手順で一般に使用される。この方法は、生（生存可能な）細胞はある特定の色素を取り込まないが、死（生存不可能な）細胞は色素を取り込むという原理に基づく。染色は、細胞形態の可視化を容易にする）。
所望の量のＧＰＲＧ細胞を培養する。
細胞を播種する前に、少なくとも２回の毎日の継代で細胞を継代培養する。
初日に、ＧＰＲＧ細胞株の培養ディッシュの培地を除去し、１×ＰＢＳで細胞を洗浄する。
Ｔ７５フラスコについて３ｍｌまたはＴ２５フラスコについて１ｍＬを使用して、洗浄した細胞単層上に１×ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを穏やかにピペットで移す。
フラスコを回転させて、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで単層を覆う。
フラスコをインキュベーターに戻し、２分間放置する。
フラスコの側面を穏やかにたたいて、いかなる残存付着細胞も遊離させた。
新鮮なＤ１０培地２ｍＬに細胞を再懸濁させ、１５ｍＬコニカル遠心チューブに移す。
１２００ｒｐｍで５分間細胞を遠心分離する。
培地を吸引し、ドキシサイクリン（１ｎｇ／ｍＬ）を含む新鮮なＤ１０培養培地５ｍＬにペレットを穏やかに懸濁させる。
ＴＣ１０（商標）自動細胞カウンターによって細胞数を決定する。
トランスフェクションの２０〜２４時間前に、培養ディッシュにおいて、８０％コンフルエントで細胞を播種する（ドキシサイクリンを含む６０ｍｍ培養ディッシュに３．２×１０６生細胞をプレーティングすることによる）。
コンカテマーアレイ形成物を調製する（例えば、実施例３を参照されたい）。
２日目に、トランスフェクションより前に、ＣａｌＰｈｏｓ（商標）哺乳類トランスフェクションキットを室温にする（ＣｌｏｎＴｅｃｈから入手可能）。
コンカテマーＤＮＡを精製し、濃度を測定する（コンカテマーアレイは本明細書に記載の方法に従って精製することができる）。
トランスフェクションプラスミドＤＮＡを調製する（４ｍＬ、６０ｍｍ培養ディッシュ）。
各トランスフェクションについて、溶液Ａおよび溶液Ｂを別々の１５ｍＬコニカル遠心チューブに調製する。
ピペットを使用して溶液Ｂ（２×ＨＢＳ）を泡立たせ、溶液Ａ（ＤＮＡ混合物）を一滴ずつ加える。
トランスフェクション溶液を室温で１５分間インキュベートする。
トランスフェクション溶液を培養ディッシュに穏やかに加える。
プレートを穏やかに前後に動かして、トランスフェクション溶液を均等に分布させる。
ＣＯ２インキュベーター中でプレートを３７℃で４時間インキュベートする。
６０ｍｍ培養ディッシュあたり新鮮なＤ１０培地５ｍＬを３７℃のＣＯ２インキュベーター中で温める。
４時間後、予熱したＤ１０ １ｍＬで洗浄し、予熱した新鮮なＤ１０培地４ｍＬと交換する。
５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターでインキュベートする。
コンカテマーのトランスフェクションから４８時間後に、トランスフェクトされたＧＰＲＧ細胞を回収する（細胞の継代培養を行う）。
ゼオシン（５０μｇ／ｍＬ）およびドキシサイクリン（１ｎｇ／ｍＬ）を含む新鮮なＤ１０培地を有するＴ１５０フラスコまたは３０ｍＬの１５０ｍｍ培養ディッシュに細胞を再プレーティングする。
細胞巣が確認されるまで（通常、１〜２週以内に観察される）、ドキシサイクリン（１ｎｇ／ｍＬ）を含む選択培地（ゼオシン、５０μｇ／ｍＬ）を３〜４日ごとに細胞に供給する。
ＧＰＲＧパッケージング細胞株を生成するために使用される細胞株および配列の説明
ＨＥＫ−２９３Ｔ／１７はＨＥＫ−２９３Ｔのサブクローンである。これらの細胞はＳＶ−４０Ｔ抗原を安定して発現し、特にその高いトランスフェクト能力のために特定のクローンを選択した。ＨＥＫ−２９３Ｔ／１７に基づくマスター細胞バンクを生成した（ＨＥＫ−２９３Ｔ／１７ＭＣＢ）。
ＳＦＧ−ＩＣ−ＨＩＶｇｐ−Ｐｐａｃ２は、ピューロマイシン抵抗性を有する、ＣＭＶプロモーターの制御化でコドン最適化ＨＩＶ ｇａｇｐｏｌを発現するガンマレトロウイルスベクターである。このベクターを作製するために使用されたプラスミド（ｐＳＦＧ−ＩＣ−ＨＩＶｇｐ−Ｐｐａｃ２）は以下の成分を使用して構築された：
（１）ｐＳＦＧ ｔｃＬｕｃ ＥＣＴ３は、レトロウイルスベクター骨格プラスミド（ＳＦＧ）の誘導体であり、テトラサイクリン調節性プロモーターシステムを使用して調節された遺伝子発現に適合されている（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｄ．、Ｐａｔｒｉｑｕｉｎ，Ｅ．、Ｆｅｎｇ，Ｓ．、＆ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３、４６６〜４７６（１９９７））；
（２）ＣＭＶエンハンサー／プロモーター駆動性コドン最適化ＨＩＶ ＮＬ４−３ ｇａｇｐｏｌ遺伝子；
（３）ｐＭＳＣＶｐａｃに由来するＰＧＫプロモーター駆動性ピューロマイシン抵抗性遺伝子（Ｈａｗｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．、Ｌｉｅｕ，Ｆ．Ｈ．、Ｆｏｎｇ，Ａ．Ｚ．、＆ Ｈａｗｌｅｙ，Ｔ．Ｓ．Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｕｓｅ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１、１３６〜１３８（１９９４））。
ＳＦＧ−ＩＣ−ＨＩＶｇｐ−Ｐｐａｃ２レトロウイルスベクターによるＨＥＫ−２９３Ｔ／１７ ＭＣＢの感染は、ＧＰ細胞株を生成した。
ＳＦＧ−ｔｃ−ｒｅｖｃｏは、テトラサイクリン応答性プロモーターの制御化でコドン最適化ＨＩＶ ｒｅｖを発現するガンマレトロウイルスベクターである。このベクター（ｐＳＦＧ−ｔｃ−ｒｅｖｃｏ）を生成するために使用されたプラスミドは、以下の成分を使用して構築された：
（１）上記のＮＬ４−３系統配列に基づくＨＩＶ ｒｅｖ 遺伝子、および
（２）ｐＳＦＧ ｔｃＬｕｃ ＥＣＴ３（上記）。
ＳＦＧ−ｔＴＡは、レトロウイルスＬＴＲの制御化でキメラの転写トランス活性化因子を発現するガンマレトロウイルスベクターである（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｄ．、Ｐａｔｒｉｑｕｉｎ，Ｅ．、Ｆｅｎｇ，Ｓ．およびＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３、４６６〜４７６（１９９７））。これは、ＳＦＧレトロウイルスベクターに基づき、プラスミドｐＵＨＤ１５−１からのＴｅｔプロモーター要素を組み込む（Ｇｏｓｓｅｎ ＭおよびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）ＰＮＡＳ ８９ １２：５５４７〜５５５１）。
ＳＦＧ−ｔｃ−ｒｅｖｃｏおよびＳＦＧ−ｔＴＡによるＧＰ細胞株の感染はＧＰＲ細胞株を生成した。
ＳＦＧ−ｔｃ−ＶＳＶＧは、テトラサイクリン調節性プロモーターの制御化でＶＳＶ糖タンパク質Ｇを発現するガンマレトロウイルスベクターである。このベクター（ｐＳＦＧ−ｔｃ−ＶＳＶＧ）を作製するために使用したプラスミドは、他のベクターと同じｐＳＦＧｔｃＬｕｃＥＣＴ３骨格、およびＶＳＶＧエンベロープタンパク質の供給源としてのプラスミドｐＭＤ．Ｇを使用して生成された（Ｏｒｙ，Ｄ．Ｓ．、Ｎｅｕｇｅｂｏｒｅｎ，Ｂ．Ａ．およびＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ． Ａ ｓｔａｂｌｅ ｈｕｍａｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ／ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｇ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３、１１４００〜１１４０６（１９９６）、ならびにＲｏｓｅ，Ｊ．Ｋ． ＆ Ｇａｌｌｉｏｎｅ，Ｃ．（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３９、５１９〜５２８を参照されたい）。
ＳＦＧ−ｔｃ−ＶＳＶＧによるＧＰＲ細胞株の感染はＧＰＲＧ細胞株を生成した。
ＧＰＲＳ細胞株を生成するためのＲｅｔｒｏ−ＳＶＧｍｕによるＧＰＲ細胞株の感染は、Ｌｅｅ，Ｃｈｉ−Ｌｉｎら「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｍａｋｅ Ｈｉｇｈ−Ｔｉｔｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０９．６（２０１２）：１５５１〜１５６０．ＰＭＣ．Ｗｅｂ．１４ ２０１６年４月によって記載されている。
コンカテマーアレイの精製
ＧＰＲＧ細胞へのトランスフェクションより前に、シリカベースのメンブレン（ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅキット）によって、コンカテマーを回収し、精製した。
２ｍＬ収集チューブ中に入れたＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラムにコンカテマーアレイ混合物をピペットで移す。
６０００×ｇで１分間遠心分離する。フロースルーおよび収集チューブを捨てる。
ＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラムを（提供された）新しい２ｍＬ収集チューブに入れる。
バッファーＡＷ１ ５００μＬを加え、６０００×ｇで１分間遠心分離する。
フロースルーおよび収集チューブを捨てる。
ＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラムを（提供された）新しい２ｍＬ収集チューブに入れる。
バッファーＡＷ２ ５００μＬを加え、２０，０００×ｇで３分間遠心分離して、ＤＮｅａｓｙメンブレンを乾燥させる。
フロースルーおよび収集チューブを捨てる。
清潔な１．７ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心チューブにＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラムを入れる。
バッファーＡＥ ２００μＬをＤＮｅａｓｙメンブレン上に直接加える。
室温で４分間インキュベートする。
６０００×ｇで１分間遠心分離して、ＤＮＡ混合物を溶出する。
溶出を１回反復する（新しい溶出バッファーを加える）。
ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ分光光度計によってコンカテマーＤＮＡ濃度を測定する。
ＴＬ２０−ＵｂｃＧＦＰ ＆ Ｃａｌ１−ＷＰＲＥ産生細胞株
以下の表４は、本明細書に記載の方法に従って合成された２つの安定な産生細胞株の細胞を要約する。ＴＬ２０−Ｃａｌ１−ｗｐｒｅおよびＴＬ２０−Ｕｎｃ−ＧＦＰベクターに関するデータを図２０Ａ、２０Ｂおよび２０Ｃにさらに図示する。
Figure 2021534818
他の治療的遺伝子
いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、以下に挙げる治療的遺伝子のうちのいずれかを含むことができる。例えば、以下に挙げる遺伝子のうちのいずれかをコードする核酸を本明細書に記載の組換えプラスミドに挿入することができる。いくつかの実施形態では、治療的遺伝子は単一遺伝子の障害を治す。いくつかの実施形態では、治療的遺伝子は、免疫不全、遺伝性疾患、血液疾患（例えば、血友病、ヘモグロビン障害）、リソソーム蓄積症、神経学的疾患、血管新生障害またはがんを治療するために使用される。
いくつかの実施形態では、治療的遺伝子は、アデノシンデアミナーゼ酵素をコードする遺伝子、アルファ−１−抗トリプシンをコードする遺伝子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子をコードする遺伝子、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子、凝固因子（例えば、ヒト第ＩＸ因子）をコードする遺伝子、リポタンパク質リパーゼ遺伝子をコードする遺伝子、ドーパミン合成に必要とされる酵素をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）をコードする遺伝子、インターロイキン−２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ−２ＲＧ）をコードする遺伝子、Ｇｐ９１ｐｈｏｘをコードする遺伝子、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質をコードする遺伝子、グロビンタンパク質をコードする遺伝子、変異グロビンタンパク質（例えば、抗鎌状赤血球化特性を有するもの）をコードする遺伝子、変異ベータ−グロビンをコードする遺伝子、ガンマ−グロビンをコードする遺伝子、抗ＣＤ１９抗体をコードする遺伝子などである。他の実施形態では、治療的遺伝子は、グロビン遺伝子、スフィンゴミエリナーゼ遺伝子、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ遺伝子、ハンチンチン遺伝子、ニューロフィブロミン１遺伝子、ＭＬＨ１遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、ＭＳＨ６遺伝子、ＰＭＳ２遺伝子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子遺伝子、ヘキソサミニダーゼＡ遺伝子、ジストロフィン遺伝子、ＦＭＲｌ遺伝子、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子および低密度リポタンパク質遺伝子からなる群から選択される。
治療的遺伝子のクラスの例としては、限定されないが、腫瘍抑制遺伝子、アポトーシスを誘導または防止する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、抗体をコードする遺伝子、ホルモンをコードする遺伝子、受容体をコードする遺伝子、およびサイトカイン、ケモカインまたは血管新生因子をコードする遺伝子が挙げられる。治療的遺伝子の特定例としては、限定されないが、Ｒｂ、ＣＦＴＲ、ｐｌ６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ｐ７３、Ｃ−ＣＡＭ、ＡＰＣ、ＣＴＳ−Ｉ、ｚａｃｌ、ｓｃＦＶ、ｒａｓ、ＤＣＣ、ＮＦ−Ｉ、ＮＦ−２、ＷＴ−Ｉ、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＢＲＣＡｌ、ＶＨＬ、ＭＭＡＣｌ、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ＢＲＣＡ２、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−ＩＯ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、チミジンキナーゼ、ｍｄａ７、ＦＵＳｌ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、ＡＤＰ、ｐ５３、ＡＢＬＩ、ＢＬＣｌ、ＢＬＣ６、ＣＢＦＡｌ、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳｌ、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬｌ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭｌ、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬＩ、ＴＣＬ３、ＹＥＳ、ＭＡＤＨ４、ＲＢｌ、ＴＰ５３、ＷＴｌ、ＴＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＴＶ、ＡｐｏＥ、ＲａｐｌＡ、シトシンデアミナーゼ、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、ＢＲＣＡ２、ｚａｃｌ、ＡＴＭ、ＨＩＣ−Ｉ、ＤＰＣ−４、ＦＨＩＴ、ＰＴＥＮ、ＩＮＧｌ、ＮＯＥＹｌ、ＮＯＥＹ２、ＯＶＣＡｌ、ＭＡＤＲ２、５３ＢＰ２、ＩＲＦ−Ｉ、ｚａｃｌ、ＤＢＣＣＲ−Ｉ、ｒｋｓ−３、ＣＯＸ−Ｉ、ＴＦＰＩ、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｉｎｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、ＥｌＡ、ｐ３００、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−Ｉ、ＧＤＡＩＦ、ＭＣＣ、４１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはＯＸ４０が挙げられる。
治療的遺伝子の他の例は腫瘍抑制遺伝子であり、限定されないが、ＦＵＳｌ、遺伝子２６（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、ＰＬ６、ＬＵＣＡ−Ｉ（ＨＹＡＬｌ）、ＬＵＣＡ−２（ＨＹＡＬ２）、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦｌ）、１０１Ｆ６、遺伝子２１（ＮＰＲＬ２）、ＳＥＭ Ａ３、ＮＦｌ、ＮＦ２、およびｐ５３が挙げられる。
治療的遺伝子のさらに他の例は酵素をコードする遺伝子であり、限定されないが、ＡＣＰデサチュラーゼ、ＡＣＰヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホリラーゼ、ＰＤＥ８Ａ（ｃａｍｐホスホジエステラーゼ）、ＡＴＰａｓｅ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、エステラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ヒアルロンシンテターゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコース酸化酵素、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リアーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ、プルラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼまたはキシラナーゼが挙げられる。治療的遺伝子のさらなる例としては、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、低密度リポタンパク質受容体、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオニンベータシンテターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータグルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、メンケス病銅輸送ＡＴＰａｓｅ、ウィルソン病銅輸送ＡＴＰａｓｅ、シトシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＳＶチミジンキナーゼまたはヒトチミジンキナーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
治療的遺伝子のさらなる例としては、ホルモンをコードする遺伝子が挙げられ、限定されないが、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、レプチン、副腎皮質刺激ホルモン、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンＩＩ、アルファ−エンドルフィン、ベータ−メラニン細胞刺激ホルモン、コレシストキニン、エンドセリンＩ、ガラニン、胃抑制ペプチド、グルカゴン、インスリン、リポトロピン、ニューロフィジン、ソマトスタチン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、ベータ−カルシトニン遺伝子関連ペプチド、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症因子、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、グルカゴン様ペプチド、パンクレアスタチン、膵臓ペプチド、ペプチドＹＹ、ＰＨＭ、セクレチン、血管作用性小腸ペプチド、オキシトシン、バソプレシン、バソトシン、エンケファリンアミド、メトルフィンアミド（ｍｅｔｏｒｐｈｉｎａｍｉｄｅ）、アルファメラニン細胞刺激ホルモン、心房性ナトリウム利尿因子、アミリン、アミロイドＰ成分、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出因子、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経ペプチドＹ、サブスタンスＫ、サブスタンスＰまたは甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンが挙げられる。
さらに他の治療的遺伝子は、以下に記載のそうした遺伝子を含む発現に組み込むことができる。
アデノシンデアミナーゼ−重症複合免疫不全（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）欠乏症は、免疫系を破壊する有毒な代謝物の蓄積をもたらし、「バブル・ボーイ」疾患と称されることが多い、重症複合免疫不全（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）を引き起こす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターの第２の核酸は、ヒトＡＤＡ ｃＤＮＡ配列をコードする。
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ−Ｘ１）疾患はＳＣＩＤの最も一般的な形態であり、世界的に報告されたＳＣＩＤ症例の４０〜５０％を占める。ＩＬ２ＲＧ遺伝子の変異は、リンパ球の発生および機能できわめて重要な役割を果たす、インターロイキン（ＩＬ）−２、４、７、９、１５および２１受容体複合体を含めた多くのサイトカイン受容体に共通のサブユニットである、共通ガンマ鎖（γｃ）の不完全な発現に対するリード役である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターの第２の核酸は、ヒトγｃ ｃＤＮＡ配列をコードする。
慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）は、食細胞由来のＮＡＤＰＨオキシダーゼのサブユニット（ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘまたはｐ６７ｐｈｏｘ）の欠損によって引き起こされる。ｇｐ９１ｐｈｏｘサブユニットをコードするＣＹＢＢ遺伝子の変異は、患者のおよそ７０％を占めるＸ連鎖型のＣＧＤに関与する。Ｘ連鎖ＣＧＤは好中球、好酸球、単球およびマクロファージによるスーパーオキシドアニオンおよび他の活性酸素中間体の生成が損なわれるために、重度の命に関わる細菌および真菌感染を特徴とする。疾患の別の態様は、主に、炎症誘発性サイトカインの生成の増大、炎症細胞のアポトーシスの遅延、および活性化された好中球による抗炎症性メディエーターの不十分な分泌によって引き起こされる、腸または肺などの器官に影響を及ぼす無菌の慢性肉芽腫性炎である。転帰不良は、侵襲性真菌感染、肝膿瘍および慢性肉芽腫性炎の病歴に関連する。利用可能な治療ストラテジーとしては、抗生物質長期予防法（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｌｏｎｇ−ｌｉｆｅ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）、ＩＦＮ−γ投与およびＨＣＴが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターの第２の核酸は、ヒトサブユニットｃＤＮＡ配列をコードする。
異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）ＭＬＤは、酵素欠損ならびに中枢神経系および末梢神経系の神経細胞およびグリア細胞中の未分解基質セレブロシド３−サルフェート（サルファタイド）の蓄積をもたらす、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子の変異によって引き起こされるまれな常染色体劣性リソソーム蓄積症である。サルファタイドのこの蓄積は、進行性の脱髄および神経変性につながる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターの第２の核酸は、ヒトＡＲＳＡ ｃＤＮＡ配列をコードする。
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ−Ｉ）またはハーラー症候群は、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ酵素（ＩＤＵＡ）の欠損によって引き起こされるリソソーム性蓄積症である。この疾患は、器官の腫大および損傷、尿中への異常な量のＧＡＧの排出、ならびに特に結合組織に影響を及ぼすＧＡＧ代謝回転の混乱を伴う、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の不適切な蓄積を特徴とする。臨床症状としては、骨格異常、肝脾腫、精神遅滞、ならびに循環器および呼吸器の機能障害が挙げられる。ＩＤＵＡ欠損症は幅広い表現型提示をもたらす可能性があり、ＭＰＳ Ｉ Ｈｕｒｌｅｒ（ＭＰＳ ＩＨ）は、このスペクトル内で最も重度の疾患変異型に相当し、複数の器官および中枢神経系に関係する慢性、進行性および身体障害性の疾患経過を特徴とする。この疾患は、治療されない場合幼児期において致死的であり、死亡は、心臓呼吸性不全のために、生後１０年以内に通常起こる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターの第２の核酸は、アルファ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）のヒトｃＤＮＡをコードする。
ゴーシェ病はリソソーム蓄積症の最も一般的なものである。これは、スフィンゴ糖脂質の分解に必要とされるグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）酵素の欠損によって引き起こされる常染色体劣性のリソソーム蓄積症である。臨床症状としては、肝脾腫、血小板減少、骨疾患および出血素因が挙げられ、頻繁に血液学者に紹介される。遺伝子療法は、酵素補充療法の患者および適切な骨髄ドナーを欠く患者に対する治療的代替法に相当する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターの第２の核酸は、ＧＢＡ遺伝子のヒトｃＤＮＡをコードする。
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、リソソームの機能障害を特徴とするまれな遺伝性代謝障害である。ＬＳＤはおよそ７０の遺伝的に異なる疾患を包含し、１：５０００出生数の集合的発生率を有する。例としては、ファブリー病（アルファ−ガラクトシダーゼＡ欠損）、ポンペ病（α−グルコシダーゼ［ＧＡＡ］欠損）、ハンター症候群（イズロネート−２−スルファターゼ［Ｉ２Ｓ］欠損）、サンフィリポ症候群（グリコサミノグリカンヘパラン硫酸の分解に必要とされる酵素のうちの１つの欠損）およびクラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ欠損）が挙げられる。同様に、遺伝性代謝障害は、代謝障害の１つの原因であり、欠損した遺伝子が酵素欠損を引き起こす場合に生じる。本開示の発現ベクターは、上記で特定された状態のいずれかの治療での使用に適する遺伝子をコードする第２の核酸配列を組み込むために適合させることができると考えられる。
ピルビン酸キナーゼ欠損（ＰＫＤ）は、不定の総体症状の溶血性貧血につながり、新生児期の間致死的であり得る、ＰＫＬＲ遺伝子の変異によって引き起こされる一遺伝子性代謝疾患である。ＰＫＤ劣性遺伝形質および同種骨髄移植によるその治癒的治療は、遺伝子療法アプローチを開発するための理想的なシナリオを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターの第２の核酸はヒトＰＫＬＲ ｃＤＮＡをコードする。
副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）は、副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤＰ）の欠損およびその後の極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の蓄積をもたらすＡＢＣＤ１遺伝子の変異によって引き起こされる、まれなＸ連鎖代謝障害である。ＶＬＣＦＡ蓄積は、血漿およびすべての組織型で生じるが、副腎皮質ならびに脳および脊髄の白質に主として影響を及ぼし、様々な臨床転帰につながる。ＡＬＤの最も重度の形態、すなわち、大脳ＡＬＤ（ＣＡＬＤ）として知られる炎症性の大脳表現型は、思考および筋肉制御に関与する脳の神経細胞の保護鞘であるミエリンの進行性の破壊を伴う。ＣＡＬＤの症状は、通常、早期幼児期で生じ、治療されない場合急速に進行し、大抵の患者において、神経機能の重度の喪失および最終的な死亡につながる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターの第２の核酸は、ヒト副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤＰ）をコードする。
ファンコニ貧血（ＦＡ）は遺伝性の骨髄不全症候群である。少なくとも１６個のＤＮＡ修復遺伝子のうちの１の欠損は、形成不全ならびに悪性病変、特にＡＭＬおよびＭＤＳの危険性の増大につながる。さらに、腺腫、腺癌および扁平上皮癌の危険性が高まる。大抵の患者はまた、身長が低く、様々な形態学的異常があり、発達障害を発生する。支持的な治療としては、血液製剤の定期的な輸液およびＦＡ患者の随伴性内分泌疾患の理由から成長ホルモン補充（ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）が挙げられる。ドナー適合状況でのＨＳＣＴは唯一の治癒的選択肢あり、したがって、遺伝子療法の魅力的な選択肢である。影響を受ける遺伝子における異種性にもかかわらず、患者の６０％より多くがＦＡＮＣＡ遺伝子に変異を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターの第２の核酸は、ヒトＦＡＮＣＡ ｃＤＮＡをコードする。
いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、Ｃ１エステラーゼインヒビタータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。Ｃ１エステラーゼインヒビタータンパク質は、米国特許第１０，２１４，７３１号および米国特許公開第２０１８／０３３４４９３号に記載されており、これらの開示を、参照によってその全体を本明細書に組み入れる。
いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）を治療するためのブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）をコードするヌクレオチド配列を含む。ＢＴＫは、ヒトにおいてＢＴＫ遺伝子にコードされる酵素である。ＢＴＫは、Ｂ細胞の発生で重要な役割を果たすキナーゼである。例えば、ＢＴＫは、Ｂ細胞の成熟および高親和性ＩｇＥ受容体を介する肥満細胞の活性化で重要な役割を果たす。ＢＴＫ遺伝子の変異は、原発性免疫不全疾患のＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（ブルトン型無ガンマグロブリン血症）に関与する。ＸＬＡの患者は骨髄中に正常なプレＢ細胞集団を有するが、これらの細胞は成熟せず、循環に入らない。いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、ＢＴＫ発現を回復させるヌクレオチド配列を含む。適切なベクターはＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１８／１９５２９７号に記載されており、その開示を参照によってその全体を本明細書に組み入れる。
いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、原発性免疫不全を治すための遺伝子または成分をコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含む（その開示を参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｆａｒｉｎｅｌｌｉ Ｇ．ら（２０１４）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ．Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．３７：５２５〜３３を参照されたい。）。
いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、開示をそれぞれ参照によってその全体を本明細書に組み入れる、ＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１８／０３４５２３号、第ＷＯ／２０１７／１５６４８４号、第ＷＯ／２０１７／１０６５２８号および第ＷＯ／２０１５／０８９０４６号または米国特許公開第ＵＳ／２０１９／０１６９５９７号に記載されているものを含めた、ホーミングエンドヌクレアーゼ（例えば、ｌ−Ｓｃｅｌ、ｌ−Ｃｅｕｌ、Ｆｌ−Ｐｓｐｌ、Ｆｌ−Ｓｃｅ、ｌ−ＳｃｅＴＶ、Ｉ−Ｃｓｍｌ、ｌ−Ｐａｎｌ、ｌ−Ｓｃｅｌｌ、ｌ−Ｐｐｏｌ、ｌ−Ｓｃｅｌｌｌ、ｌ−Ｃｒｅｌ、ｌ−Ｔｅｖｌおよびｌ−Ｔｅｖｌｌ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＩＩ型のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、またはｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、少なくともエンドヌクレアーゼ活性を示すことができる酵素をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分、例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質としては、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９オルソログにコードされるＣａｓ９様タンパク質、Ｃａｓ９様合成タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃｐｆ１オルソログにコードされるタンパク質、Ｃｐｆ１様合成タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなど）ならびにこれらの変異型および改変型が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質としては、例えば、原核生物供給源、例えば、細菌および古細菌を含めた様々な生物学的供給源のうちのいずれかからのＣａｓ９ポリペプチドが挙げられる。細菌のＣａｓ９としては、放線菌門（例えば、アクチノミセス・ネスルンディ）のＣａｓ９、アクウィフェクス門のＣａｓ９、バクテロイデス門のＣａｓ９、クラミジアのＣａｓ９、緑色非硫黄細菌門のＣａｓ９、シアノバクテリアのＣａｓ９、エルシミクロビウム門のＣａｓ９、フィブロバクター門のＣａｓ９、ファーミキューテス門のＣａｓ９（例えば、化膿性連鎖球菌のＣａｓ９、ストレプトコッカス・サーモフィルスのＣａｓ９、リステリア・イノキュアのＣａｓ９、ストレプトコッカス・アガラクチアのＣａｓ９、ストレプトコッカス・ミュータンスのＣａｓ９、およびエンテロコッカス・フェシウムのＣａｓ９）、フソバクテリウム門のＣａｓ９、プロテオバクテリア（例えば、髄膜炎菌、カンピロバクター・ジェジュニおよびラリ）のＣａｓ９、スピロヘータ（例えば、トレポネーマ・デンティコラ）のＣａｓ９などが挙げられる。古細菌のＣａｓ９としては、ユリアーキオータ門のＣａｓ９（例えば、メタノコッカス・マリパルディスのＣａｓ９）などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、合成されたベクターは、哺乳類βグロビン遺伝子（ＨＢＢ）、ガンマグロビン遺伝子（ＨＢＧ１）、Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子、クルッペル様因子１（ＫＬＦ１）遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）遺伝子、アルブミン遺伝子およびロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。
本明細書で言及するすべての刊行物は、参照によってその全体を本明細書に組み入れる。広く記載されている本開示の趣旨または範囲を逸脱することなく、特定の実施形態に示すように、本開示に対して多数の変形および／または修正を行うことができることが当業者に理解されよう。したがって、本実施形態は、すべての点で例示的であり、限定的でないと見なされるべきである。
特定の実施形態に関連して本明細書の開示を記載してきたが、これらの実施形態は、本開示の原理および適用の単に例示であることを理解されたい。したがって、例示的実施形態に対して多数の修正を行うことができること、および添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨および範囲を逸脱することなく、他の構成を考案することができることを理解されたい。

Claims (112)

  1. ベクター上清を回収する方法であって：安定な産生細胞株の細胞を生成すること；生成された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクター産生を誘導すること；およびウイルスベクターの最初の回収に続いて約４０〜約５６時間ごとに、無血清培地中で、誘導された生成された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクターを反復回収することを含む、前記方法。
  2. 無血清培地は１つまたはそれ以上の増殖因子を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 無血清培地は１つまたはそれ以上の脂質を含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
  4. ウイルスベクターの最初の回収は、ウイルスベクター産生を誘導した後約４０時間〜約５６時間の間に行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. ウイルスベクターの最初の回収は、ウイルスベクター産生を誘導した後４８時間未満に行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. ウイルスベクターの反復回収は、約４４〜約５２時間ごとに行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. ウイルスベクターの反復回収は、約４８時間ごとに行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 無血清培地は各反復回収後に交換される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約４×１０６ＴＵ／ｍＬの間の範囲に及ぶウイルス力価の産生を提供する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約２×１０６ＴＵ／ｍＬの間の範囲に及ぶウイルス力価の産生を提供する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約１．５×１０６ＴＵ／ｍＬの間の範囲に及ぶウイルス力価の産生を提供する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. ウイルスベクターは少なくとも５回回収される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. ウイルスベクターは少なくとも１０回回収される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. ウイルスベクターは少なくとも２０回回収される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 反復回収は約１０日〜約９０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 反復回収は約２０日〜約７０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 安定な産生細胞株の細胞はパッケージング細胞株の細胞に由来する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. パッケージング細胞株の細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ−２細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞および２１１Ａ細胞からなる群から選択される細胞に由来する、請求項１７に記載の方法。
  19. パッケージング細胞株の細胞は、ＧＰＲ、ＧＰＲＧ、ＧＰＲＴ、ＧＰＲＧＴおよびＧＰＲＴ−Ｇ細胞株の細胞からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  20. 反復回収は、さらなる生成された安定な産生細胞株の細胞を導入することなく、誘導された生成された安定な産生細胞株の細胞に新鮮な無血清培地を加えることを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 安定な産生細胞株の細胞は、（ａ）１つまたはそれ以上の遺伝子を組換えプラスミドにクローニングすることによって、ベクターを合成すること；（ｂ）（ｉ）合成されたベクターから切除された発現カセットおよび（ｉｉ）抗生物質抵抗性カセットプラスミドから得られた発現カセットからコンカテマーアレイを形成すること；（ｃ）ＧＰＲ、ＧＰＲＧ、ＧＰＲＴ、ＧＰＲＧＴおよびＧＰＲＴ−Ｇからなる群から選択されるパッキング細胞株の細胞に形成されたコンカテマーアレイをトランスフェクトすること；ならびに（ｄ）安定な産生細胞株の細胞を単離することによって生成される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 抗生物質抵抗性カセットプラスミドはブレオマイシン抗生物質抵抗性カセットである、請求項２１に記載の方法。
  23. 合成されたベクターから切除された発現カセットと抗生物質抵抗性カセットプラスミドから得られた発現カセットのモル比が約５０：１〜約１：５０の範囲に及ぶ、請求項２１に記載の方法。
  24. モル比は約２５：１〜約１：２５の範囲に及ぶ、請求項２３に記載の方法。
  25. モル比は約１５：１〜約１：１５の範囲に及ぶ、請求項２３に記載の方法。
  26. 組換えプラスミドは、配列番号１のものに対して少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の方法。
  27. 組換えプラスミドは、配列番号２のものに対して少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の方法。
  28. 組換えプラスミドは、ＢｓｔＢＩ、ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩおよびＣｌａＩからなる群から選択される制限エンドヌクレアーゼ部位を有するマルチクローニングサイトを含む、請求項２１に記載の方法。
  29. マルチクローニングサイトをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７のものに対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する、請求項２８に記載の方法。
  30. 組換えプラスミドは、パッケージングシグナルをコードするヌクレオチド配列；セントラルポリプリントラクトをコードするヌクレオチド配列；Ｒｅｖ応答エレメントをコードするヌクレオチド配列；および自己不活性化ロングターミナルリピートをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の方法。
  31. 組換えプラスミドは、配列番号２のものに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するベクターカセットを含む、請求項３０に記載の方法。
  32. ベクターカセットに少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接しており、該少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼ部位は、ｓｆｉＩおよびＢｓｕ３６Ｉからなる群から独立に選択される、請求項３１に記載の方法。
  33. 合成されたベクターは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（「ＨＰＲＴ」）をノックダウンするためのｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
  34. 合成されたベクターは、治療的遺伝子をコードする核酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
  35. 治療的遺伝子は、ガンマ−グロビン遺伝子、Ｃ１エステラーゼインヒビタータンパク質、ブルトンチロシンキナーゼおよびウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. ウイルスベクター産生の誘導は血清含有培地中で行われる、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. さらなる血清含有培地による誘導から約２４時間後に血清含有培地を交換することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 無血清培地による誘導から約２４時間後に血清含有培地を交換することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
  39. 安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクターを産生する方法であって、（ａ）１つまたはそれ以上の核酸配列を組換えプラスミドに挿入することによって、ウイルスベクターを合成すること；（ｂ）合成されたウイルスベクターから切除された発現カセットから、および抗生物質抵抗性カセットプラスミドから得られたＤＮＡ断片からコンカテマーアレイを形成すること；（ｃ）ＧＰＲ、ＧＰＲＧ、ＧＰＲＴ、ＧＰＲＧＴ、ＧＰＲＴ−Ｇパッキング細胞株またはそれらの誘導体のうちの１つに形成されたコンカテマーアレイをトランスフェクトして、安定な産生細胞株の細胞を提供すること；（ｄ）安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクター産生を誘導すること；ならびに（ｅ）ウイルスベクターの最初の回収に続いて約４０時間〜約５６時間ごとに無血清培地中でウイルスベクターを反復回収することを含む、前記方法。
  40. ウイルスベクターの最初の回収は誘導後約４０時間〜約５６時間の間に行われる、請求項３９に記載の方法。
  41. ウイルスベクターは約４８時間ごとに反復回収される、請求項３９〜４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 無血清培地は１つまたはそれ以上の増殖因子を含む、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 無血清培地は１つまたはそれ以上の脂質を含む、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 組換えプラスミドは、配列番号１のものに対して少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３９〜４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 組換えプラスミドは、配列番号２のものに対して少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. トランスフェクトされるパッケージング細胞株がＧＰＲＧである、請求項３９〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. トランスフェクトされるパッケージング細胞株がＧＰＲＴである、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. トランスフェクトされるパッケージング細胞株がＧＰＲである、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 抗生物質抵抗性カセットプラスミドはブレオマイシン抗生物質抵抗性カセットであり；合成されたベクターからのＤＮＡ断片とブレオマイシン抗生物質抵抗性カセットからのＤＮＡ断片の比は約２５：１〜約１：２５の範囲に及ぶ、請求項３９〜４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. ウイルスベクター産生の誘導は血清含有培地中で行われる、請求項３９〜４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. さらなる血清含有培地での誘導に続いて約２４時間で血清含有培地を交換することをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 無血清培地での誘導に続いて約２４時間で血清含有培地を交換することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 無血清培地は１つもしくはそれ以上の脂質および／または１つもしくはそれ以上の増殖因子をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 組換えプラスミドに挿入される１つまたはそれ以上の核酸配列は治療的遺伝子をコードする、請求項３９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約４×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲に及ぶウイルス力価の産生を提供する、請求項３９〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約２×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲に及ぶウイルス力価の産生を提供する、請求項３９〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  57. 反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約１．５×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲に及ぶウイルス力価の産生を提供する、請求項３９〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  58. ウイルスベクターは少なくとも５回回収される、請求項３９〜５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. ウイルスベクターは少なくとも１０回回収される、請求項３９〜５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. ウイルスベクターは少なくとも２０回回収される、請求項３９〜５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 反復回収は約１０日〜約９０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる、請求項３９〜６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 反復回収は約２０日〜約７０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる、請求項３９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 安定な産生細胞株の細胞からベクター上清を回収する方法であって：安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクター産生を誘導すること；およびウイルスベクターの最初の回収に続いて約４０〜約５６時間ごとに、無血清培地中で、誘導された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクターを反復回収することを含む、前記方法。
  64. 反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約４×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲に及ぶウイルス力価の産生を提供する、請求項６３に記載の方法。
  65. ウイルス力価は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約２×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲に及ぶ、請求項６４に記載の方法。
  66. ウイルス力価は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約１．５×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲に及ぶ、請求項６４に記載の方法。
  67. ウイルスベクターは少なくとも５回回収される、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の方法。
  68. ウイルスベクターは少なくとも１０回回収される、請求項６３〜６７のいずれか１項に記載の方法。
  69. ウイルスベクターは少なくとも２０回回収される、請求項６３〜６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. 反復回収は約１０日〜約９０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる、請求項６３〜６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 反復回収は約２０日〜約７０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる、請求項６３〜７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 安定な産生細胞株の細胞は血清含有培地中で継代され；細胞は無血清培地中で培養される、請求項６３〜７１のいずれか１項に記載の方法。
  73. 安定な産生細胞株の細胞は血清含有培地中で継代され；細胞は血清含有培地中で培養される、請求項６３〜７２のいずれか１項に記載の方法。
  74. ウイルスベクターの最初の回収は誘導後少なくとも約４０時間で行われる、請求項６３〜７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. ウイルスベクターは約４８時間ごとに反復回収される、請求項６３〜７４のいずれか１項に記載の方法。
  76. 無血清培地は１つまたはそれ以上の添加物を含む、請求項６３〜７５のいずれか１項に記載の方法。
  77. ウイルスベクターは治療的遺伝子をコードする核酸配列を含む、請求項６３〜７６のいずれか１項に記載の方法。
  78. 治療的遺伝子は、鎌状赤血球症を治すか、または鎌状赤血球症の１つの症状を少なくとも軽減する、請求項７７に記載の方法。
  79. 治療的遺伝子は、ガンマ−グロビン遺伝子、Ｃ１エステラーゼインヒビタータンパク質、ブルトンチロシンキナーゼおよびウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質からなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
  80. ウイルスベクターはＨＰＲＴまたはＣＣＲ５をノックダウンするためのＲＮＡｉをコードする核酸配列を含む、請求項６３〜７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. ウイルスベクターは（ｉ）ＨＰＲＴをノックダウンするためのＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列、および（ｉｉ）治療的遺伝子をコードする第２の核酸配列を含む、請求項６３〜８０のいずれか１項に記載の方法。
  82. ベクター上清を回収する方法であって：ＧＰＲ、ＧＰＲＧ、ＧＰＲＴ、ＧＰＲＧＴもしくはＧＰＲＴ−Ｇパッキング細胞株またはそれらの誘導体のうちの１つに由来する安定な産生細胞株の細胞を生成すること；生成された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクター産生を誘導すること；およびさらなる生成された安定な産生細胞株の細胞を導入することなく、誘導された生成された安定な産生細胞株の細胞に新鮮な無血清培地を加えることを含む、ウイルスベクターの最初の回収に続いて約４０〜約５６時間ごとに、無血清培地中で、誘導された生成された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクターを反復回収することを含む、前記方法。
  83. 無血清培地は１つまたはそれ以上の増殖因子を含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 無血清培地は１つまたはそれ以上の脂質を含む、請求項８２または８３のいずれか１項に記載の方法。
  85. ウイルスベクターの最初の回収は誘導後約４０時間〜約５６時間の間に行われる、請求項８２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
  86. ウイルスベクターの最初の回収は誘導後４８時間未満に行われる、請求項８２〜８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. 反復回収は少なくとも２回行われる、請求項８２〜８６のいずれか１項に記載の方法。
  88. 反復回収は約４４〜約５２時間ごとに行われる、請求項８２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
  89. 反復回収は約４８時間ごとに行われる、請求項８２〜８８のいずれか１項に記載の方法。
  90. 無血清培地は各反復回収後に交換される、請求項８２〜８９のいずれか１項に記載の方法。
  91. 反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約４×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲に及ぶウイルス力価の産生を提供する、請求項８２〜９０のいずれか１項に記載の方法。
  92. ウイルス力価は、反復回収の各個別の回収の間、約０．５×１０６ＴＵ／ｍＬ〜約２×１０６ＴＵ／ｍＬの範囲に及ぶ、請求項９１に記載の方法。
  93. ウイルスベクターは少なくとも５回回収される、請求項８２〜９２のいずれか１項に記載の方法。
  94. ウイルスベクターは少なくとも１０回回収される、請求項８２〜９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. ウイルスベクターは少なくとも２０回回収される、請求項８２〜９４のいずれか１項に記載の方法。
  96. 反復回収は約１０日〜約９０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる、請求項８２〜９５のいずれか１項に記載の方法。
  97. 反復回収は約２０日〜約７０日の間の範囲に及ぶ期間にわたって行われる、請求項８２〜９６のいずれか１項に記載の方法。
  98. ＨＰＰＲＴをノックダウンするためのＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列を有するウイルスベクターを含む組成物であって、該ウイルスベクターは：生成された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクター産生を誘導すること；およびウイルスベクターの最初の回収に続いて約４０〜約５６時間ごとに、誘導された生成された安定な産生細胞株の細胞からウイルスベクターを反復回収することによって産生される、前記組成物。
  99. ウイルスベクターの反復回収は、さらなる生成された安定な産生細胞株の細胞を導入することなく、誘導された生成された安定な産生細胞株の細胞に新鮮な培地を加えることを含む、請求項９８に記載の組成物。
  100. 反復回収は無血清培地中で行われる、請求項９８に記載の組成物。
  101. ウイルスベクターは第２の核酸配列をさらに含む、請求項９８に記載の組成物。
  102. 第２の核酸配列は治療的遺伝子をコードする、請求項１０１に記載の組成物。
  103. 治療的遺伝子はガンマ−グロビン遺伝子である、請求項１０２に記載の組成物。
  104. 治療的遺伝子はＣ１エステラーゼインヒビタータンパク質である、請求項１０２に記載の組成物。
  105. 治療的遺伝子はブルトンチロシンキナーゼである、請求項１０２に記載の組成物。
  106. 治療的遺伝子はウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質である、請求項１０２に記載の組成物。
  107. 第２の核酸はヌクレアーゼをコードする、請求項１０１に記載の組成物。
  108. ヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＩＩ型のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートおよびｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１０７に記載の組成物。
  109. 第２の核酸配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分をコードする、請求項１０１に記載の組成物。
  110. ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分はＣａｓ９タンパク質およびＣａｓ１２タンパク質からなる群から選択される、請求項１０９に記載の組成物。
  111. 宿主細胞の形質導入における、請求項９８〜１１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  112. 宿主細胞は造血細胞である、請求項１１１の使用。
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