KR20180015751A - 역배향 인간 유비퀴틴 c 프로모터를 함유하는 레트로바이러스 벡터들 - Google Patents

역배향 인간 유비퀴틴 c 프로모터를 함유하는 레트로바이러스 벡터들 Download PDF

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Abstract

특정 구체예에서 재조합 레트로바이러스 벡터가 제공되며, 상기 벡터는 삽입유전자에 작동가능하도록 연결된 인간 유비퀴틴 C (UBC) 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터와 상기 삽입유전자는 역배향으로 있고, 이로써 상기 프로모터로부터 상기 삽입유전자의 전사 배향은 상기 벡터의 5' 긴 말단 반복부 (LTR)로 배향되도록 한다.

Description

역배향 인간 유비퀴틴 C 프로모터를 함유하는 레트로바이러스 벡터들
관련 출원들에 대한 교차 -참조
본 출원은 2015년 7월 1일자로 제출된 USSN 62/187,678에 우선권 및 이익을 주장하며, 상기 미국 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참고자료에 편입된다.
정부 지원 서술
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)의 National Heart Lung and Blood Institute가 수여한 허가 번호 HL073104에 의해 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가지고 있다.
인간 세포 안으로의 유전자 전달은 선천성 효소 결핍 또는 혈액학적 악성종양과 같은 다양한 인간 질병의 유전적 변경(alterations)을 교정하거나, 또는 이를 예방하는 수단으로 연구되어 왔다. 온코레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터 및 아데노 관련 바이러스 벡터를 포함하는, 다양한 유전자 형질도입(transduction) 시스템이 개발되었다. 그러나, 벡터 시스템의 다양성에도 불구하고, 세포 형질도입 효율은 치료 효능으로 사용하기엔 여전히 턱없이 낮을 수 있다.
효과적인 벡터의 필요성은 잘 알고 있지만, 대다수의 표적 세포에서 삽입유전자(transgenes)를 높은 수준으로 발현시키는 것은 유전자 전달 기술에 있어서 상당한 도전이었다.
요약
다양한 구체예들에서, 역배향의 인간 유비퀴틴(ubiquitin) C 프로모터를 포함하는 레트로바이러스 벡터들 뿐만 아니라, 이러한 벡터들이 함유된 바이러스 입자들, 이러한 벡터들로 형질전환된 숙주 세포, 그리고 이러한 것들을 이용한 치료 방법들이 제공된다.
본 명세서에서 고려되는 다양한 구체예들은 다음중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있지만, 이에 한정할 필요는 없다:
구체예 1: 재조합 레트로바이러스 벡터, 전술한 벡터는 인간 유비퀴틴 C (UBC) 프로모터와 다중 클로닝 부위를 함유하며, 여기에서 전술한 벡터 안에서 전술한 UBC 프로모터는 역배향으로 있고, 따라서 전술한 프로모터로부터 전사 배향은 전술한 벡터의 5' 긴 말단 반복부 (LTR) 쪽으로 향하고, 전술한 다중 클로닝 부위에 삽입된 핵산을 전사한다.
구체예 2: 재조합 레트로바이러스 벡터, 전술한 벡터는 삽입유전자에 작동가능하게 연결된(operably linked) 인간 유비퀴틴 C (UBC) 프로모터를 함유하며, 여기에서 전술한 프로모터와 삽입유전자는 역배향으로 있고, 따라서, 전술한 프로모터로부터 전사 배향은 전술한 벡터의 5' 긴 말단 반복부 (LTR) 쪽으로 향한다.
구체예 3: 구체예 1-2중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 프로모터는 인간 유비퀴틴 C 유전자 UCSC 인간 게놈 서열 형태 hg19 마이너스 스트랜드에서 대략적으로 위치 125398318 내지 대략적으로 위치 125399530의 단편을 함유하거나 또는 이로 구성된다.
구체예 4: 구체예 1-3중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 프로모터 안에 있는 인트론은 레트로바이러스 패키징(packaging) 동안 상실되지 않는다.
구체예 5: 구체예 1-4중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 벡터는 역배향으로 있는 폴리아데닐화 신호를 함유한다.
구체예 6: 구체예 5에 따른 벡터, 여기에서 전술한 폴리아데닐화 신호 (polyA)는 전체 벡터 서열에 대하여, 상기 프로모터의 5'인, 상기 프로모터의 3'에 삽입된다.
구체예 7: 구체예 5-6중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열, 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, 토끼 β-글로빈 유전자 폴리아데닐화 신호, 인간 포진 바이러스 (HSV) 폴리아데닐화 신호, 티미딘 키나제 (TK) 유전자 폴리아데닐화 신호, 그리고 기존 게놈으로부터 유도된 또는 가상으로 기획되고, 합성된 다른 신호들로 구성된 군에서 선택된다.
구체예 8: 구체예 5-6중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열 또는 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호다.
구체예 9: 구체예 1-8중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 벡터는 비-역전진 배향의(non-reversed orientation) UBC 프로모터를 갖는 동일한 벡터와 비교하였을 때, 일시적으로 형질 감염되고(transfected), 안정적으로 형질도입된 세포주에서 적어도 약 2-배 증가된 발현을 제공한다.
구체예 10: 구체예 1-9중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 벡터는 비-역전진 배향의 UBC 프로모터를 갖는 동일한 벡터와 비교하였을 때, 형질도입된 일차 세포(primary cell)에서 적어도 약 4-배 증가된 발현을 제공한다.
구체예 11: 구체예 1-10중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 레트로바이러스 벡터는 HIV-1 렌티바이러스 벡터, HIV-2 렌티바이러스 벡터, 알파레트로바이러스 벡터, 말 감염성 빈혈증 바이러스 (EIAV) 렌티바이러스 벡터, MoMLV 벡터, X-MLV 벡터, P-MLV 벡터, A-MLV 벡터, GALV 벡터, HEV-W 벡터, SIV-1 벡터, FIV-1 벡터, 및 SERV-1-5 벡터로 구성된 군에서 선택된다.
구체예 12: 구체예 11에 따른 벡터, 여기에서 전술한 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터다.
구체예 13: 구체예 12에 따른 벡터, 여기에서 전술한 레트로바이러스 벡터는 HIV-1 기반의 렌티바이러스 벡터다.
구체예 14: 구체예 12-13중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 렌티바이러스 벡터는 TAT-독립적 그리고 자가-비활성화 (SIN) 렌티바이러스 벡터다.
구체예 15: 구체예 1-14중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 벡터는 양배향성(bidirectional) 벡터다.
구체예 16: 구체예 1-15중 임의의 하나에 따른 벡터, 3' LTR에서 절연체(insulator)를 더 포함한다.
구체예 17: 구체예 16의 벡터, 여기에서 전술한 절연체는 FB (FII/BEAD-A), 77 bp의 절연체 요소를 함유하며, 이것은 닭 β-글로빈 5' DnaseI-과민성 부위 4 (5' HS4)의 최소 CTCF 결합 부위 인헨서-차단 구성원들을 보유하고 있다.
구체예 18: 구체예 1-17중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 벡터는 ψ 영역 벡터 게놈 패키징 신호를 함유한다.
구체예 19: 구체예 1-18중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 벡터는 Rev 반응 요소 (RRE)를 함유한다.
구체예 20: 구체예 1-19중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 벡터는 중심 폴리퓨린 트랙(central polypurine tract)을 함유한다.
구체예 21: 구체예 1-20중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 벡터는 해독-후(post-translational) 조절 요소를 함유한다.
구체예 22: 구체예 21의 벡터, 여기에서 상기 해독후 조절 요소는 변형된 우드척(Woodchuck) 해독-후 조절 요소 (WPRE)다.
구체예 23: 구체예 1-22중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 벡터는 재조합을 통해 야생형 렌티바이러스를 재구성 할 수 없다.
구체예 24: 구체예 2-23중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 벡터는 전술한 UBC 프로모터에 작동가능하게 연결된 삽입유전자를 함유하며, 여기에서 전술한 삽입유전자는 SCID, 겸상 적혈구 질환, 리포좀 축적 질환, 낭포성 섬유증, 근이영양증, 페닐케톤뇨증, 파킨슨 병 및 혈우병으로 구성된 군에서 선택된 병리학의 치료를 위한 유전자 산물을 발현한다.
구체예 25: 구체예 2-15중 임의의 하나에 따른 벡터, 여기에서 전술한 벡터는 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 유전자 산물을 발현시킨다: 아데노신 탈아미노효소 (ADA), IL-2 수용체 감마 (IL-2Rγ), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 (PNP) 유전자, Janus 키나제-3 (JAK3), Artemis 유전자, 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈 유전자, Factor VIII, Factor IX, CFTR, 전장의 또는 짧아진 디스트로핀, ABCD1 유전자, TH, AADC, 및 GCH1, 아스파르틸글루코사미니다제, α-갈락토시다제 A, 팔미토일 단백질 티오에스테라제, 삼펩티딜 펩티다제, 리소좀성 막통과 단백질, 시스테인 전달체, 산 세라미다제, 산-α-L-퓨코시다제, 보호성 단백질/카텝신 A, 산 β-글루코시다제, 산 β-갈락토시다제, 이듀로네이트-2-술파타제, α-L-이듀로니다제, 갈락토세레브로시다제, 산α-만노시다제., 산 β-만노시다제, 아릴술파타제 B, 아릴술파타제 A, N-아세틸갈락토사민-6-술페이트, 산 β-갈락토시다제, N-아세틸글루코사민-1-포스포전달효소, 산 스핑고미엘리나제 (aSM), NPC-1, α-글루코시다제, β-헥소사미니다제 B, 헤파란 N-술파타제, α-N-아세틸글루코사미니다제, 아세틸-CoA:α-글루코사미니드, N-아세틸글루코사민-6-술페이트, α-N-아세틸갈락토사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니다제, α-뉴라미다제, β-글루코로니다제, β-헥소사미니다제 A, 산 리파제.
구체예 26: 구체예 24의 벡터, 여기에서 전술한 삽입유전자는 ADA-SCID 치료용 아데노신 탈아미노효소 (ADA)를 발현한다.
구체예 27: 구체예 24에 따른 벡터, 여기에서 전술한 삽입유전자는 X-SCID 치료용 IL-2 수용체 감마 (IL-2Rγ) 유전자/cDNA를 발현한다.
구체예 28: 구체예 24에 따른 벡터, 여기에서 전술한 삽입유전자는 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈 유전자를 발현한다.
구체예 29: 구체예 28에 따른 벡터, 여기에서 전술한 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈 유전자는 인간 β-글로빈 유전자 5' 프로모터와 인간 β-글로빈 3' 인헨서의 제어하에 엑손 및 인트론이 함유된 약 2.3 kb의 재조합 인간 β-글로빈 유전자를 함유한다.
구체예 30: 벡터 구체예 29에 따른 벡터, 여기에서 전술한 β-글로빈 유전자는 IVS2로부터 375 bp의 RsaI 결손을 갖는 β-글로빈 인트론 2, 그리고 HS2, HS3, 및 HS4를 비롯한 합성(composite) 인간 β-글로빈 좌(locus) 제어 영역을 함유한다.
구체예 31: 구체예 1-23중 임의의 하나에 따른 벡터를 함유하는 바이러스 입자.
구체예 32: 구체예 2-23중 임의의 하나에 따른 벡터가 형질도입된 숙주 세포.
구체예 33: 구체예 32에 따른 숙주 세포, 여기에서 상기 세포는 줄기 세포다.
구체예 34: 구체예 33에 따른 숙주 세포, 여기에서 전술한 세포는 골수로부터 유래된 줄기 세포다.
구체예 35: 구체예 33에 따른 숙주 세포, 여기에서 전술한 세포는 배아 또는 배아 조직으로부터 유래되지 않은 줄기 세포다.
구체예 36: 구체예 32에 따른 숙주 세포, 여기에서 상기 세포는 293T 세포다.
구체예 37: 구체예 32에 따른 숙주 세포, 여기에서, 상기 세포는 인간 조혈성 조상 세포(progenitor cell)다.
구체예 38: 구체예 37에 따른 숙주 세포, 여기에서 인간 조혈성 조상 세포는 CD34+ 세포다.
구체예 39: 구체예 37에 따른 숙주 세포, 여기에서 상기 인간 조혈성 조상 세포는 CD34+/CD38- 세포다.
구체예 40: 구체예 2-23중 임의의 하나에 따른 벡터로 형질감염된 줄기 세포 및/또는 조상 세포와 약학적으로 수용가능한 운반체를 함유하고, 아래 컬럼 A에서 나타낸 병리 치료용 조성물로써, 여기에서 전술한 벡터는 아래 컬럼 B에 나타낸 전술한 병리 치료를 위한 하나 또는 그 이상의 삽입유전자를 함유한다:
Figure pct00001
Figure pct00002
구체예 41: 구체예 40에 따른 조성물, 여기에서 전술한 조성물은 ADA-SCID의 치료용이며, 전술한 삽입유전자는 아데노신 탈아미노효소 (ADA)를 발현한다.
구체예 42: 구체예 40에 따른 조성물, 여기에서 전술한 조성물은 X-SCID 치료용이며, 전술한 삽입유전자는 IL-2 수용체 감마 (IL-2Rγ)를 발현한다.
구체예 43: 구체예 40에 따른 조성물, 여기에서 전술한 조성물은 겸상 적혈구 질환 치료용이며, 전술한 삽입유전자는 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈 유전자를 발현한다.
구체예 44: 구체예 43에 따른 조성물, 여기에서 전술한 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈 유전자는 인간 β-글로빈 유전자 5' 프로모터와 인간 β-글로빈 3' 인헨서의 제어하에 엑손 및 인트론이 함유된 약 2.3 kb의 재조합 인간 β-글로빈 유전자를 함유한다.
구체예 45: 구체예 44에 따른 조성물, 여기에서 전술한 β-글로빈 유전자는 IVS2로부터 375 bp의 RsaI 결손을 갖는 β-글로빈 인트론 2, 그리고 HS2, HS3, 및 HS4를 비롯한 합성 인간 β-글로빈 좌 제어 영역을 함유한다.
구체예 46: 구체예 40-45중 임의의 하나에 따른 조성물, 여기에서 전술한 숙주 세포는 CD34+ 세포다.
구체예 47: 구체예 46에 따른 조성물, 여기에서 전술한 숙주 세포는 CD34+/CD38- 세포다.
구체예 48: 구체예 2-23중 임의의 하나에 따른 벡터로 형질감염된 조상세포 또는 줄기 세포를 상기 대상에게 도입시키는 것을 포함하는, 아래 컬럼 A에 나타낸 병리에 대하여 대상을 치료하는 방법, 여기에서 전술한 벡터는 아래 컬럼 B에 나타낸 전술한 병리 치료를 위한 하나 또는 그 이상의 삽입유전자를 함유한다:
Figure pct00003
Figure pct00004
구체예 49: 구체예 48에 따른 방법, 여기에서 전술한 방법은 ADA-SCID 치료용이며, 전술한 삽입유전자는 아데노신 탈아미노효소 (ADA)를 발현한다.
구체예 50: 구체예 48에 따른 방법, 여기에서 전술한 방법은 X-SCID 치료용이며, 전술한 삽입유전자는 IL-2 수용체 감마 (IL-2Rγ)를 발현한다.
구체예 51: 구체예 48에 따른 방법, 여기에서 전술한 방법은 겸상 적혈구 질환 치료용이며, 전술한 삽입유전자는 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈 유전자를 발현한다.
구체예 52: 구체예 51에 따른 방법, 여기에서 전술한 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈 유전자는 인간 β-글로빈 유전자 5' 프로모터와 인간 β-글로빈 3' 인헨서의 제어하에 엑손 및 인트론이 함유된 약 2.3 kb의 재조합 인간 β-글로빈 유전자를 함유한다.
구체예 53: 구체예 52에 따른 방법, 여기에서 전술한 β-글로빈 유전자는 IVS2로부터 375 bp의 RsaI 결손을 갖는 β-글로빈 인트론 2, 그리고 HS2, HS3, 및 HS4를 비롯한 합성 인간 β-글로빈 좌 제어 영역을 함유한다.
구체예 54: 구체예 48-53중 임의의 하나에 따른 방법, 여기에서 전술한 도입은 전술한 대상의 줄기 세포 및/또는 조상 세포에 전술한 벡터를 형질도입하고; 그리고 이로부터 유도된 전술한 형질도입된 세포 또는 세포들을 전술한 대상에게 이식하고, 이때 전술한 세포 또는 이로부터 유도된 유도체들은 전술한 삽입유전자를 발현한다.
구체예 55: 구체예 48-54중 임의의 하나에 따른 방법, 여기에서, 상기 세포는 조상 세포다.
구체예 56: 구체예 48-54중 임의의 하나에 따른 방법, 여기에서 상기 세포는 줄기 세포다.
구체예 57: 구체예 48-56중 임의의 하나에 따른 방법, 여기에서 전술한 세포는 골수로부터 유도된다.
구체예 58: 구체예 48-57중 임의의 하나에 따른 방법, 여기에서 전술한 세포는 CD34+ 세포다.
구체예 59: 구체예 58에 따른 방법, 여기에서 전술한 세포는 CD34+/CD38- 세포다.
구체예 60: 구체예 48-59중 임의의 하나에 따른 방법, 여기에서 전술한 세포는 전술한 대상으로부터 유도된다.
구체예 61: 재조합 렌티바이러스로 개선된 형질도입을 제공하는 세포 집단, 전술한 세포 집단은 CD34+/CD38- 세포에 대해 농축된다.
구체예 62: 구체예 61의 세포 집단, 여기에서 전술한 CD34+/CD38- 세포는 혈액 또는 골수로부터 유도된다.
구체예 63: 구체예 61-62중 임의의 하나에 따른 집단, 여기에서 전술한 CD34+/CD38- 세포는 삽입유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡터로 형질감염된다.
구체예 64: 구체예 63에 따른 세포 집단, 여기에서 전술한 CD34+/CD38- 세포는 HIV-1 렌티바이러스 벡터, HIV-2 렌티바이러스 벡터, 알파레트로바이러스 벡터, 말 감염성 빈혈증 바이러스 (EIAV) 렌티바이러스 벡터, MoMLV 벡터, X-MLV 벡터, P-MLV 벡터, A-MLV 벡터, GALV 벡터, HEV-W 벡터, SIV-1 벡터, FIV-1 벡터, 및 SERV-1-5 벡터로 구성된 집단으로부터 선택된 레트로바이러스 벡터로 형질도입된다.
구체예 65: 구체예 63에 따른 세포 집단, 여기에서 전술한 CD34+/CD38- 세포에 렌티바이러스 벡터가 형질도입된다.
구체예 66: 구체예 65에 따른 세포 집단, 여기에서 전술한 CD34+/CD38- 세포에 TAT-독립적 그리고 자가-비활성화 (SIN) 렌티바이러스 벡터가 형질도입된다.
구체예 67: 구체예 63-66중 임의의 하나에 따른 세포 집단, 여기에서 전술한 삽입유전자는 표 1에 열거된 병리 치료용 삽입유전자다.
구체예 68: 구체예 63-66중 임의의 하나에 따른 세포 집단, 여기에서 전술한 삽입유전자는 ADA, IL-2γR, 또는 항겸상세포생성 유전자를 암호화한다.
구체예 69: 구체예 63에 따른 세포 집단, 여기에서 전술한 세포는 CCL-βAS3-FB LV로 형질감염된다.
구체예 70: 줄기 세포 또는 조상 세포의 형질도입을 개선시키는 방법으로, 이 방법은 CD34+/CD38-세포에 대해 농축된 줄기 세포 또는 조상 세포 집단의 전술한 형질도입을 제공하는 것을 포함한다.
정의
"재조합체(Recombinant)"는 단일 서열의 일부로서, 자연상태에서 함께 존재하지 않는 일부분, 또는 자연 발생 서열과 비교하여 재배열된 일부분을 포함하는 핵산 서열을 언급할 때, 당해 기술 분야에서 일관되게 사용된다. 재조합 핵산은 인간의 수작업이 수반되는 및/또는 사람의 손에 의해 생성된 핵산 (예컨대, 복제, 증폭, 전사 등의 하나 이상의 주기에 의해)으로부터 생성되는 과정에 의해 만들어진다. 재조합 바이러스는 재조합 핵산을 포함하는 바이러스다. 재조합 세포는 재조합 핵산을 포함하는 세포다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)" 또는 "재조합 LV)은 인간 개입 및 조작의 결과로서, LV 및 복수의 추가 단편으로부터 조립된 인위적으로 만들어진 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭한다.
"글로빈 핵산 분자(globin nucleic acid molecule)"는 글로빈 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 의미한다. 다양한 구체예들에서, 상기 글로빈 핵산 분자는 코딩 서열의 상류 및/또는 하류 조절 서열을 함유할 수 있다.
"글로빈 폴리펩티드(globin polypeptide)" 는 인간 알파, 베타 또는 감마 글로빈에 대하여 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단백질을 의미한다.
용어 "치료요법적 기능성 글로빈 유전자(therapeutic functional globin gene)"는 헤모글로빈병증 표현형을 나타내지 않는 글로빈으로 발현되는 뉴클레오시드로써, 결함성 글로빈 유전자를 가진 개체에게 치료 효과를 제공하는데 효과적인 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 기능성 글로빈 유전자는 치료될 포유 동물 개체에 적합한 야생형 글로빈을 코딩할 수 있거나, 또는 글로빈의 돌연변이 형태, 바람직하게는 우수한 산소 수송 특성 또는 항겸상세포생성 특성과 같은 우수한 특성을 제공하는 글로빈의 돌연변이 형태일 수 있다. 상기 기능성 글로빈 유전자는 엑손과 인트론 모두, 뿐만 아니라 글로빈 프로모터 및 스플라이스(splice) 공여체/수용체를 포함한다.
"유효량(an effective amount)"이란 치료되지 않은 환자와 비교하여, 질환의 증상을 개선시키거나 또는 제거하는 물질을 포함하는 필요한 제제 또는 조성물의 양을 의미한다. 질환의 치료요법적 처리를 위하여 본 명세서에서 기술된 방법을 실행하는데 이용되는 조성물(들)의 유효량은 투여 방식, 환자의 연령, 체중 그리고 전반적인 건강에 따라 변화된다. 궁극적으로, 주치의 또는 수의사는 적절한 양 및 용량 요법을 결정할 것이다. 이러한 양을 "유효"량이라고 한다.
도 1은 역배향 UBC 렌티바이러스 벡터 (pCCLc-roUBC) 전달 플라스미드 지도의 한 가지 구체예를 도식적으로 설명한다. 점선은 렌티바이러스 서열 밖의 플라스미드 기본 서열을 나타낸다.
도 2는 개선된 역배향 CCLc-roUBC-EmGFP 벡터와 비교하였을 때, 전진 배향(forward orientation) CCLc-UBC-EmGFP 벡터의 발현을 나타낸다.
도 3은 연구에 이용된 발현 벡터들을 도식적으로 나타낸다. 렌티바이러스 도표는 CCLc 벡터들에서 위치를 나타낸다. roUBC 및 roUBCs 벡터들은 적절하게 역배향으로 위치하는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 (나타내지 않음)와, 그 끝에 EmGFP 판독틀(reading frame)을 함유한다. pCafe 발현 플라스미드는 SV40 폴리아데닐화 신호의 동일한 상류 카세트를 함유한다.
도 4, 패널 A 및 B는 UBC 스플라이싱(splicing)의 유전적 분석을 보여준다. 패널 A: 프라이머 위치 및 예상된 산물 크기를 나타낸 PCR 전략. 패널 B: 대조 및 UBC 프로모터 변이체들을 품고 있는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 세포들의 gDNA로부터 PCR 산물의 전기영동분석.
도 5, 패널 A-C는 패키징 및 형질도입 동안 UBC 상실을 정량적으로 분석한 것을 나타낸다. 패널 A: 전체 프로바이러스 통합 (HEX-LV psi)으로 표준화된, UBC 인트론 복사체(FAM-UBC 인트론)를 정량화하기 위한 듀플렉스 ddPCR 전략. 패널 B: ddPCR의 대표적인 비가공 데이터(raw data), 이것은 양성 비말(droplets)과 음성 비말의 분리를 나타낸다. 패널 C: 대조와, UBC 프로모터 변이체들을 품고 있는 LV로 형질도입된 시료에서 전체 프로바이러스 복사체에 대한 UBC 인트론 복사체의 비율. 오류 막대는 ddPCR 포아송(Poisson) 통계를 기반으로, 95 % 신뢰 구간을 나타낸다.
도 6, 패널 A-C은 UBC 프로모터 변이체들 유동 세포측정 발현 분석을 나타낸다. 패널 A: 발현 플라스미드로 형질감염 후 48h에 293T 세포의 기하 평균 형광 광도 (gMFI). 오류 막대는 세 가지 생물학적 레플리케이트(replicates)의 표준 편차를 나타낸다. UBC 대(versus) UBCs 비쌍체 t-테스트 P = 0.0122, roUBC 대 roUBCs P = 0.0134. 패널 B: UBC 프로모터 변이체들을 품고 있는 CCLc 렌티바이러스 벡터들로 형질도입 후 10일 시점에 K562 세포의 gMFI. 데이터는 여러 실험을 나타낸다. 패널 C: 형질감염후 48h에서의 293T 세포의 gMFI. 오류 막대는 세 가지 생물학적 레플리케이트(replicates)의 SD를 나타낸다. * 는 P < 0.05를 나타낸다. UBC 대 dEnh 비쌍체 t-테스트 P = 0.0267, UBCs 대 dEnh P = 0.0008.
도 7, 패널 A-E는 EEF1A1 분석을 나타낸다. 패널 A: EEF1A1 프로모터 변이체들을 품고 있는 렌티바이러스 벡터들의 도해. 패널 B: 형질도입 후 2주 이상에 걸쳐 안정적으로 형질도입된 K562 세포에서 EEF1A1 인트론에 걸쳐 증폭되는 PCR 산물의 겔 전기영동. 패널 C: (패널 B)에서 분석된 시료에서 프로바이러스 복사체에 대한 인트론 복사체 비율의 ddPCR 정량회. 패널 D: 유동 세포측정에 의해 측정되었을 때, 발현 플라스미드로 형질감염 후 48h 시점에서 형질감염된 293T 세포의 gMFI. 패널 C의 오차 막대는 95 % 신뢰 구간을 나타내며, 패널 D와 E 에서 세 가지 생물학적 레플리케이트의 SD를 나타낸다. * 는 P < 0.05를 나타낸다. 비쌍체 t-테스트 P = 0.0064. (E) 유동 세포측정에 의해 측정되었을 때, 형질도입 후 10일 시점에서 안정적으로 형질도입된 K562 세포의 gMFI.
도 8 패널 A-C 양배향성(bidirectional) 벡터 분석을 나타낸다. 패널 A: 벡터 도해. 패널 B: BD 및 roBD 벡터들에서 인트론 상실의 ddPCR 분석. 패널 C: 유동 세포측정에 의해 측정되었을 때, 형질도입 후 2주 시점에서 안정적으로 형질도입된 293T 세포의 gMFI. 오류 막대는 95 % 신뢰 구간을 나타낸다.
도 9는 바이러스 벡터 상청액과 형질도입된 K562 세포에서 스플라이싱된 벡터 정션(junctions)의 디지털 PCR 정량화를 도시한다.
도 10은 건강한 공여체의 동원된 말초 혈액로부터 농축된 형질도입된 인간 CD34+ HSPCs로부터 분화된 골수 세포에서 유동 세포측정로 측정하였을 때, EmGFP의 발현을 나타낸다. 대략적으로 10% 형질도입된 집단에서 형질도입 후 10일 시점에서 발현이 분석되었다. 양단(Twotailed) t-테스트 p-값 0.0013.
도 11은 형질도입 후, 10일 시점에서 형질도입된 CD34+ HSPCs에서 프로바이러스 형태 안에 UBC 인트론의 디지털 PCR 정량화를 나타낸다.
도 12는 pGL4.25-기반의 플라스미드에서 인트론 서열의 인헨서 활성을 루시퍼라제 분석을 나타낸다. 루시퍼라제 활성은 293T 세포의 형질감염 후, 48시점에 세포 용해물에서 측정되었다.
도 13, 패널 A-C는 바뀐(swapped) 인트론을 갖는 UBC 및 EEF1A1 렌티바이러스 벡터들의 발현 및 유전적 분석을 나타낸다. 패널 A: 형질도입 후 7일 시점에서 유동 세포측정에 의해 측정되었을 때, 표시된 프로모터가 함유된 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 K562 세포들의 발현 분석. 패널 B: 도 4, 패널 A에 도시된 프라어미를 이용한 유전적 분석. 우측에 있는 3개 라인에 중간 길이의 산물은 K562 게놈 DNA의 비-특이적 산물이며, 무시해야 한다. 패널 C: 도 7, 패널 A에 도시된 프라이머를 이용한 형질도입된 K562 세포의 유전적 분석.
도 14, 패널 A-B는 인간 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포의 단리 및 성장 특징을 나타낸다. 패널 A: CD34+/CD38+ 세포 (영역 P5) 및 CD34+/CD38- 세포 (영역 P3)을 특정하기 위하여 이용된 게이팅 전략을 보여주는 CD34-농축된 세포의 유동 세포측정. 패널 B: 제대혈에서 CD34+ 및 CD34+/CD38-. 세포로부터 세포 확장 세포는 장기 배양 배지에서 조사된(irradiated) MS5 기질 세포와 함께 배양되었다. 장기 배양의 각 배양 시점에서 0 일 시점에 도말된 세포 수에 대한 평균 배수 증가가 나타난다. 데이터는 시간 경과에 따른 세포 확장 ± SEM (n = 3, p<.0001)을 나타낸다. 약어: APC, 알로피코시아닌.
도 15, 패널 A-F는 CCL-βAS3-FB LV 벡터를 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포에 형질도입한 분석을 나타낸다. 패널 A: 형질도입된 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포에서 벡터 복사체 수 (VCN)±SEM(n=9, p=.02). 패널 B: 비-형질도입된 제대혈 (CB) CD34+ (NT-CD34+), 형질도입된 CD34+ (CD34+), 그리고 CD34+/CD38- 세포에 의해 형성된 조혈성 콜로니 유형 (n=80개 콜로니)의 분포. 패널 C: 도말된 NT-CD34+, CD34+, 및 CD34+/CD38- 세포가 시험관에서 조혈성 콜로니로 성장된 비율. 값은 평균 ± SD로 나타낸다. 패널 D: 형질도입된 CD34+ (좌측) 및 CD34+/CD38- (우측) CB 세포로부터 성장된 단일 CFU는 VCN에 대하여 ddPCR를 이용하여 분석되었다 (n=80 콜로니). 그래프는 디지털 PCR을 이용하여 벡터에 음성인 백분율(0 VC/세포) 또는 1-2, 3-4, 5-6, 또는 >6 VC/세포인 CFU의 백분율을 나타낸다. 패널 E: CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포에 대한 벡터 형질도입 용량-반응 (n=3, 6.6 x 106 TU/ml에서 p=.05, 2 x 107 TU/ml에서 p=.002). 패널 F: 장기 배양에서 시간에 따른 VCN (± SEM [n = 3]) (시간 경향 차이 p = .03, VCN 차이 p = .004, 선형 혼합 모델). 별표는 유의성을 나타낸다, *, p≤.05; **, p≤.01.
도 16, 패널 A-C는 CCL-MND-GFP LV 벡터로 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포의 형질도입 분석을 나타낸다. 패널 A: 용량 범위의 CCL-MND-GFP LV로 형질도입된 후, 배양 14일 차에 qPCR을 이용하여 분석한 평균 벡터 복사체 수 ± SEM의 비교. 패널 B: 형질도입된 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포의 상대적 GFP 발현을 보여주는 대표적인 막대그림. 패널 C: CCL-MND-GFP-형질도입된 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포에서 유동 세포측정에서 결정된 GFP1 세포의 백분율 (n = 6, p = .02). 약어: GFP, 녹색 형광 단백질.
도 17, 패널 A-B는 CCL-βAS3-FB LV 벡터로 형질도입된 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포의 적혈구 분화를 나타낸다. 패널 A: 형질도입 후 14일차 분화하는 동안 벡터 복사체 수 (VCN) ± SEM의 비교 (n = 3). 패널 B: 형질도입된 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포로부터 분화된 적혈구 세포에서 VCN 당 모든 β-글로빈 전사체의 HBBAS3 mRNA 발현 백분율(% AS3/VCN)(qRT-PCR을 이용한 분석)(n = 3).
도 18, 패널 A-E는 CCL-βAS3-FB LV 벡터에 의해 형질도입시 벡터 외피와 수용체의 역할을 나타낸다. 하기 상에서의 CD34+ 및 CD34+/CD38- 에 의한 LDL 수용체 발현: (패널 A) 새로 단리된 CD34+ 세포에서 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포에 의한 LDL 수용체 발현, (패널 B) 배양 48시간 시점에서 사이토킨에서 CD34+ 세포, (패널 C) 새로 단리된 CD34+/CD38- 세포, 그리고 (패널 D) 배양 48시간 시점에서 사이토킨에서 CD34+/CD38- 세포. 패널 E: RD114 모의유형화된(pseudotyped) CCL-βAS3-FB LV 벡터로 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포의 형질도입. 이 그래프는 배양 14일차에 qPCR에 의해 분석된 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포의 평균 벡터 복사체 수 ± SEM를 나타낸다(n = 3). 약어: LDL, 저밀도 지단백질.
도 19, 패널 A 및 B는 NOD의 접목(engraftment) 비교를 나타낸다. Cg-Prkd scidIl2rgtm1Wjil/SzJ (NSG) 마우스. 패널 A: 형질도입된, 이식된 세포 집단에 의해 NSG 마우스에서 인간 CD451 세포 접목에 기여. 비-형질도입된 인간 CB CD34+ 세포가 이식된 허위(Mock) 마우스; 대조 마우스는 형질도입된 CD34+ 세포가 이식; 모든 다른 마우스는 CD34+/CD38- (1%)와 CD34+/CD38+ 세포 (99%)의 조합이 이식되었다. 각 이식체에서 상기 세포 집단간에 형질도입 (CCLc-UBC-mStrawberry-FB, CCLc-UBC-mCitrine-FB, 및 CCLc-UBCmCerulean-FB LV)에 이용된 백터는 교번되었다. 인간 세포 접목 (%huCD451/%huCD4511muCD451 세포)을 가진 NSG 마우스로부터 수득된 BM은 유동 세포측정을 이용하여 벡터 발현 백분율에 대하여 더 분석되었다. (B): 생체내 마우스 이식에서 분석된 세포의 벡터 복사체 수 (VCN). 프라이머와 각 형광물질 리포터에 특이적인 프로브를 이용한 ddPCR을 이용하여 NSG 마우스 안으로 이식된 후 80-90일 시점에 수거된 BM으로부터 생체내 VCN이 분석되었다. 각 세포 집단에서 마우스당 생체내 VCN는 별도로 나타내었다.
도 20, 패널 A-C는 CCL-βAS3-FB LV 벡터로 형질도입된 CD34+ 및 CD34+/CD38-의 분석 및 장기 배양물의 30일 시점의 조혈성 가능성 분석을 나타낸다. 패널 A: 비-형질도입된 (NT)-CD34+ 세포 (n=37 콜로니), 형질도입된 CD34+ 세포 (n=29 콜로니) 및 CD34+/CD38- 세포 (n=81 콜로니)에 의해 형성된 조혈성 콜로니 유형의 분포. 패널 B: 도말된 NT-CD34+, 형질도입된 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포가 생체내 조혈성 콜로니로 성장된 백분율. 값은 평균 ± SD를 나타내고; 별표는 유의성을 나타낸다, ****p≤ 0.0001. 패널 C: ddPCR을 이용하여 분석하였을 때, 형질도입된 CD34+ 로부터 성장된 단일 CFU의 VCN 분포(n=22 콜로니). 그래프는 벡터에 음성인 백분율(0 VC/세포) 또는 1-2, 3-4, 5-6, 또는 >6 VC/세포인 CFU의 백분율을 나타낸다. 형질도입된 CD34+/CD38- 세포로부터 성장된 시험관 CFU에 대한 VCN 분포(n=43 콜로니).
도 21, 패널 A-C는 CCL-βAS3-FB LV 벡터로 형질도입된 CD34+ 및 CD34+/CD38-의 분석 및 장기 배양물의 60일 시점의 조혈성 가능성 분석을 나타낸다. 패널 A: 비-형질도입된 (NT)-CD34+ 세포 (n=5 콜로니), 형질도입된 CD34+ 세포 (n=3 콜로니) 및 CD34+/CD38- 세포 (n=22 콜로니)에 의해 형성된 조혈성 콜로니 유형의 분포. 패널 B: 도말된 NT-CD34+, 형질도입된 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포가 생체내 조혈성 콜로니로 성장된 백분율. 패널 C: ddPCR을 이용하여 분석하였을 때, 형질도입된 CD34+/CD38- 세포로부터 성장된 단일 CFU의 VCN 분포(n=18 콜로니). 그래프는 벡터에 음성인 백분율(0 VC/세포) 또는 1-2, 3-4, 5-6, 또는 >6 VC/세포인 CFU의 백분율을 나타낸다.
도 22, 패널 A-C는 CCL-βAS3-FB LV 벡터로 형질도입된 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포의 적혈구 분화를 나타낸다. (패널 A) 비분획된(unfractionated) CD34+ 세포 및 (패널 B) CD34+/CD38- 세포의 적혈구 배양물로부터 세포의 유동 세포측정 분석. 제핵(Enucleated) 적혈구는 DRAQ5 음성, 글리코포린 A (GpA) 양성 세포로 좌측 상위 사분역에 나타낸다. 패널 C: 적혈구 분화 종료시 제핵 RBC의 백분율.
도 23은 형질도입된, 이식된 세포 집단에 의해 NSG 마우스에서 전체 인간 접목에 기여를 나타낸다. 비-형질도입된 인간 CB CD34+ 세포가 이식된 허위(mock) 마우스; 대조 마우스는 형질도입된 CD34+ 세포가 이식; 모든 다른 마우스는 CD34+/CD38- (1%)와 CD34+/CD38+ 세포 (99%)의 조합이 이식되었다. 각 이식체에서 상기 세포 집단간에 형질도입 (CCLc-UBC-mStrawberry-FB, CCLc-UBC-mCitrine-FB, 및 CCLc-UBC-mCerulean-FB LV)에 이용된 백터는 교번되었다. 인간 세포 접목 (%huCD45+/%huCD45++muCD45+ 세포)을 가진 NSG 마우스로부터 수득된 BM은 유동 세포측정을 이용하여 벡터 발현 백분율에 대하여 더 분석되었다.
HIV-1-기반의 렌티바이러스 벡터 (LV)는 생물학적 실험 및 유전자 요법에서 유전적 변형에 가장 흔히 사용되는 도구중 하나다. 사용된 대부분의 LVs는 자가-비활성화된 것으로써, 이는 프로모터와 인헨서가 함유된 긴 말단 반복부 안에 영역이 제거되었다는 것을 의미한다(Zufferey 등 (1998) J. Virol., 72: 9873-9880). 이러한 벡터 안에 있는 삽입유전자를 발현시키기 위하여, 프로모터는 이 삽입유전자가 있는 벡터 페이로드 안에 위치되어야만 한다. 전형적으로, 단백질-코딩 유전자를 발현시키기 위하여, 이종(heterologous) RNA Pol II 바이러스 또는 세포의 프로모터가 이용될 것이며, 흔한 예로써 사이토메갈로바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스 및 비장 포커스-형성(focus-forming) 바이러스의 바이러스 프로모터, 그리고 인간 유전자, 이를 테면, 연장 인자 1 알파 (EEF1A1), 유비퀴틴 C (UBC) 및 포스포글리세레이트 키나제 (PGK1) (Schambach 등 (2006) Mol. Ther., 13, 391-400; Dull 등 (1998) J. Virol., 72: 8463-8471)와 같은 인간 유전자의 세포의 프로모터가 있다.
바이러스 생성 공정 동안, RNA Pol II는 전형적으로 생산자 세포 안으로 형질감염된 전달 플라스미드로부터 벡터 게놈을 전사한다. 사실상 모든 시스템은 HIV-1으로부터 Rev 단백질을 통합하는데, 이것은 HIV-1 게놈 안에 있는 Rev 반응 요소 (RRE)에 결합하고, 이 바이러스 게놈의 스플라이싱-독립적 핵 방출(export)을 중개한다. 그러나, RRE 서열의 LV 구조체에 통합에도 불구하고, 스플라이싱 사건이 전사체 안에 패키징 신호 (Psi)를 유지한다면, 패키징 동안 벡터 페이로드(payload) 안에 인트론은 상실될 수 있다. 비록 일부 발현, 이를 테면 EEF1A1의 인트론-함유 프로모터를 포함하는 카세트, 그리고 하이브리드 CAG 프로모터를 함유하는 것과 같은 일부 발현 카세트를 이용하여도, 렌티바이러스 패키징 동안 인트론 상실이 관찰되지 않았다 (Ramezani 등 (2000) Mol. Ther., 2: 458-469; Zaiss 등 (2002) J. Virol., 76: 7209-7219). 이러한 관찰로부터, 때로 렌티바이러스 유전자 전달은 인트론의 전달을 허용한다는 것이 추측되었다(Logan 등 (2002) Curr. Opin. Biotechnol., 13: 429-436).
상기 인간 UBC 프로모터에 함유된 인트론이 전달 플라스미드로부터 안정적으로 형질도입된 세포에서 프로바이러스 형태로 충실하게 전달되는 지 여부의 조사를 착수하였다. UBC 인트론이 강력한 인헨서 활성을 보유하는 것으로 보고 되었기 때문에, UBC 인트론의 손실은 도입 유전자 발현의 상당한 감소를 가져올 것이라고 가정했다(Bianchi 등 (2009) Gene, 448: 88-101). EEF1A1 인트론을 이용한 기존 발견과 대조적으로, UBC 인트론은 인트론-함유 플라스미드로부터 생산된 벡터로 형질도입된 세포에서 대다수의 프로바이러스 형태에서 상실된 것으로 밝혀졌다. UBC 인트론의 결핍은 세포주에서 일시적인 형질감염 및 안정적인 형질 도입 실험 모두에서 약 2-배의 발현 감소를 가져 왔고, 일차 세포에서의 형질 도입 실험에서는 4-배의 감소를 가져왔다. 이것은 대다수의 프로바이러스 형태가 인트론을 유지하는, EEF1A1 프로모터 실험과 현저하게 대조를 이뤘다. UBC 발현 카세트의 역전은 이러한 스플라이싱-매개된 인트론 상실을 방지하고, 일배향(uni-directional)- 및 양배향성(bidirectional)-LVs에서의 발현을 최대화시켰다. 특정 이론에 결부되지 않고, UBC와 EEF1A1 프로모터 간의 인트론 유지의 차이는 인트론 서열 자체보다는 프로모터 엑손 서열에 의해 유발된다고 보여진다.
상기 관점에서, 다양한 구체예에서, UBC 프로모터가 벡터에서 역배향으로 있는 인간 유비퀴틴 C (UBC) 프로모터를 포함하는 재조합 레트로바이러스 벡터가 제공되고, 이로써 프로모터로부터의 전사 배향은 이 벡터의 5' 긴 말단 반복부 (LTR)를 향하게 된다. 다양한 구체예들에서, 상기 벡터는 다중 클로닝 부위에 삽입된 유전자/cDNA가 역배향 UBC에 작동가능하도록 연결되고, 이로써, 이 프로모터에 의해 제어되는 유전자의 전사 배향은 전술한 벡터의 5' 긴 말단 반복부 (LTR)로 향하게 되도록 위치된, 다중 클로닝 부위를 포함한다.
비-제한적 설명을 위하여, 이러한 한 가지 바이러스 벡터는 도 1에서 예시된다. 렌티바이러스 벡터 "pCCLc-roUBC"를 만들기 위하여, 인간 유비퀴틴 C 유전자 (UCSC 인간 게놈 서열 형태 hg19, 위치 125398318 내지 위치 125399530의 스트랜드 없음)의 단편(fragment)은 표준 분자 클로닝 기술, 이를 테면, 제한 절단(restriction digestion) 및 결찰(ligation), 또는 합체(assembly) 기술 인-퓨젼(In-Fusion), Gibson 합체, 또는 서열- 및 결찰-독립적 클로닝 (SLIC)을 이용하여 pCCLc의 다중 클로닝 부위로 삽입되었다.
렌티바이러스 벡터의 전형적인 전사 배향인 pCCLc 벡터의 3'긴 말단 반복 (LTR)을 향하는 것과는 달리, UBC 프로모터로부터의 전사 배향은 pCCLc 벡터의 5 'LTR로 배향되도록 삽입 배향된다.
표적 세포의 렌티바이러스 형질도입시, 이 roUBC 벡터는 전사가 3'LTR을 향해 진행하도록 배향된 UBC 프로모터를 갖는 벡터보다 약 4-배 더 높은 수준으로 형질 전환 유전자를 발현한다. 이 값은 녹색 형광 단백질 삽입 유전자의 Emerald 변이체(EmGFP)를 인코딩하는 벡터로 형질도입된 인간 조혈 줄기 및 조상 세포에서 결정되었다(도 2).
이 프로모터 배향의 유용성은 pCCLc 렌티바이러스 벡터에 한정되지 않고, 다른 레트로바이러스 벡터에서도 유익한 것으로 여겨진다. 따라서 특정 구체예에서, 역배향 UBC 프로모터를 포함하는 다른 레트로바이러스 벡터들도 고려된다. 이러한 벡터들은 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: HIV-2 렌티바이러스 벡터, 알파레트로바이러스 벡터, 말 감염성 빈혈증 바이러스 (EIAV) 렌티바이러스 벡터, MoMLV 벡터, X-MLV 벡터, P-MLV 벡터, A-MLV 벡터, GALV 벡터, HEV-W 벡터, SIV-1 벡터, FIV-1 벡터, SERV-1-5 벡터, 및 이와 유사한 것들.
다양한 구체예들에서, 상기 벡터는 삽입유전자의 효율적인 폴리아데닐화를 가져오기 위하여, 프로모터 단편의 동일한(역) 배향 3'(전체 벡터 서열에 있어서 이 프로모터의 5')에 삽입된 폴리아데닐화 신호 (polyA)를 함유한다. 적합한 폴리아데닐화 신호는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 소 성장 호르몬 polyA, 인간 성장 호르몬 polyA, 토끼 β-글로빈 유전자 폴리아데닐화 신호, 인간 포진 바이러스 (HSV) 폴리아데닐화 신호, 티미딘 키나제 (TK) 유전자 폴리아데닐화 신호, 및 이와 유사한 것들.
UBC 프로모터의 역전은 이를 테면 US 특허 번호: 8,501,464 B2에서 설명된, 양배향성 벡터들로부터 발현을 향상시킨다는 것이 또한 발견되었다. 이것은 전진 배향 대응체, "BD" 와 비교하였을 때, 역전된 UBC 프로모터, "roBD"를 갖는 양배향성 벡터의 EGFP 증가된 발현으로 실증되었다(가령, 도 8, 패널 C 참고). 따라서, 특정 구체예에서, 역배향된 인간 UBC 유전자를 포함하는 양배향성 레트로바이러스 벡터들 (가령, 양배향성 렌티바이러스 벡터들)이 또한 고려된다.
다양한 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 벡터들을 포함하는 바이러스 입자들, 뿐만 아니라 본 명세서에서 기술된 벡터들로 형질도입된 숙주 세포(가령, 줄기 세포, 조상 세포, 등)이 또한 고려된다. 특정 구체예에서, 상기 숙주 세포는 CD34+ 조혈성 줄기 세포다. 실시예 2에서 기술된 바와 같이, 단리된 CD34+/CD38- 의 사용으로 상당히 적은 양의 벡터 사용이 가능하다는 것이 발견되었으며, HSC 유전자 요법을 위한 형질도입을 개선시키는 것으로 나타났다. 따라서 특정 구체예에서, 상기 숙주 세포는 CD34+/CD38- 세포이며, 그리고 특정 구체예에서 CD34+/CD38-세포가 농축된 세포 집단이 제공된다.
CD34+/CD38-세포의 용도를 역배향 UBC를 함유하는 벡터들로 형질도입시키는 것에 제한둘 필요는 없다. 특정 구체예에서, 이러한 세포는 기본적으로 임의의 레트로바이러스 벡터 (가령, 항-겸상세포생성 레트로바이러스 벡터, 이를 테면 PCT 공개 번호: WO2014043131 A1 (PCT/US2013/059073)에서 기술된 CCL-βAS3-FB LV)로 형질도입될 수 있다.
다양한 구체예들에서, 병리 치료용 조성물이 제공되는데, 이때 상기 조성물은 본 명세서에서 기술된 벡터로 형질감염된 줄기 세포 및/또는 조상 세포를 포함하고, 여기에서 상기 벡터는 이 병리 치료 (가령, 하기 표 1에 나타낸 것과 같은)를 위한 하나 또는 그 이상의 삽입유전자를 함유하며, 여기에서 상기 조성물은 추가적으로 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함한다.
특정 구체예에서, 병리 (가령, 삽입유전자의 도입에 의해 치료될 수 있는 병리 치료 방법이 고려된다. 특정 구체예에서 상기 방법은 이 병리에 걸리거나 또는 걸릴 위험에 처한 대상에게 본 명세서에서 기술된 벡터로 형질감염된 조상 또는 줄기 세포를 도입시키는 것을 포함하며, 여기에서 상기 벡터는 이 병리(가령, 하기 표 1에 나타낸) 치료용 하나 또는 그 이상의 삽입유전자를 함유한다.
하기에서 제시되는 논의는 SIN 렌티바이러스 벡터들에 관한 것이나, 본 명세서에서 제시된 다양한 요소, 구조체, 및 교시를 이용하여 역배향 UBC 프로모터가 함유된 다른 레트로바이러스 벡터들, 또는 역배향 UBC 프로모터를 포함하는 양배향성 프로모터가 용이하게 만들어질 수 있다.
TAT-독립적 및 자가 비활성화 렌티바이러스 벡터들.
상기에서 언급한 바와 같이, 역배향 UBC 프로모터는 기본적으로 임의의 레트로바이러스 벡터에 이용될 수 있음이 고려된다. 특정 구체예에서, 상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 (LV)이며, 특정 구체예에서 상기 렌티바이러스 벡터들 (LVs)은 TAT-독립적, 자가-비활성화 (SIN) 구성형태를 포함한다. 따라서, 다양한 구체예들에서, 야생형 LTR에 비교하여, 감소된 프로모터 활성을 갖는 LTR 영역을 본원에 기재된 LV에서 사용하는 것이 바람직하다. 생물안전성 특징을 제공하는 효과적으로 "자가-비활성화" (SIN) 구조체가 제공될 수 있다. SIN 벡터들은 형질도입된 세포에서 전장(full-length)의 벡터 RNA 생산이 크게 감소되거나 또는 완전히 폐지된 벡터다. 이 특징은 복제-가능(competent) 재조합체 (RCR)의 출현 위험을 최소화할 것이다. 더욱이, 벡터 통합 부위에 인접하여 위치한 세포 코딩 서열이 비정상적으로 발현될 위험을 감소시킨다.
더욱이, SIN 디자인은 삽입유전자의 발현을 촉진시키는 프로모터와 LTR 사이의 간섭 가능성을 줄인다. SIN LV는 종종 내부 프로모터의 완전한 활동을 허용할 수 있다.
SIN 디자인은 LV의 생물안전성을 향상시킨다. HIV LTR의 대부분은 U3 서열로 구성된다. 상기 U3 영역은 세포 활성화에 반응하여 감염된 세포에서 HIV 게놈의 기저 및 유도된 발현을 조절하는 인핸서 및 프로모터 요소를 포함한다. 이들 몇 가지 프로모터 요소는 바이러스 복제에 필수적이다. 인핸서 요소 중 일부는 바이러스 분리주(isolates)에서 상당히 보존되어 있으며, 바이러스성 발병에 중요한 병독성(virulence) 요소로 연루되어 있다. 상기 인헨서 요소는 바이러스의 상이한 세포 표적에서 복사 속도에 영향을 줄 수 있다.
바이러스 전사는 5' LTR의 U3 영역의 3' 단부에서 시작하기 때문에, 이들 서열은 바이러스성 mRNA의 일부가 아니며, 3' LTR으로부터의 복사체(copy)는 통합된 프로바이러스의 양쪽 LTR 의 생성을 위한 주형(template)으로써 작용한다. 만약 U3 영역의 3' 복사체가 레트로바이러스 벡터 구조체에서 변경되는 경우, 생산자 세포에서 온전한(intact) 5' LTR로부터 벡터 RNA는 여전히 만들어질 수 있지만, 표적 세포에서 재생될 수는 없다. 이러한 벡터의 형질도입은 후손 바이러스에서 양쪽 LTR의 비활성화를 초래한다. 따라서, 레트로바이러스는 자가-비활성화 (SIN)이며, 이들 벡터는 SIN 전달 벡터로 공지된다.
특정 구체예에서, 자가-비활성화(self-inactivation)는 이 벡터 DNA, 가령, 이 벡터 RNA를 만드는데 이용된 DNA의 3' LTR의 U3 영역에서 결손 도입을 통하여 취득된다. RT 동안, 이 결손(deletion)은 프로바이러스 DNA의 5' LTR로 전달된다. 전형적으로, LTR의 전사 활성을 크게 감소시키거나 또는 완전히 폐지시키기에 충분한 U3 서열을 제거하는 것이 바람직하며, 이로인하여 형질도입된 세포에서 전장의 벡터 RNA 생산은 상당히 감소되거나, 또는 폐기된다. 그러나, U3, R 및 U5 상에 전형적으로 퍼져있는 기능인 바이러스 RNA의 폴리아데닐화에 관여하는 LTR의 요소는 보유하는 것이 일반적으로 바람직하다. 따라서, 특정 구체예에서, 폴리아데닐화 결정군(determinants)은 남겨두면서, LTR로부터 전사적으로 중요한 모티프를 가능한 한 많이 제거하는 것이 바람직하다.
상기 SIN 디자인은 Zufferey 등 (1998) J Virol. 72(12): 9873-9880, 및 U.S. 특허 번호: 5,994,136에서 상세하게 기술되어 있다. 그러나, 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 3' LTR에서 결손 정도는 제한된다. 첫째, U3 영역의 5 '말단은 벡터 전달에서 통합에 필요한 또 다른 필수 기능을 제공한다 (말단 디뉴클레오티드+att 서열). 따라서, 말단 디뉴클레오티드 및 att 서열은 U3 서열의 5' 경계를 나타내는데, 이들은 결손될 수 있다. 또한, 일부 세밀하게 정의되지 않은(loosely defined) 영역은 R 영역에서 하류(downstream) 폴리아데닐화 부위의 활성에 영향을 미칠 수 있다. 3'LTR로부터의 U3 서열의 과도한 결손은 생산자 세포에서의 벡터의 역가(titer) 및 표적 세포에서의 삽입유전자 발현 모두에 불리한 결과를 갖는 벡터 전사체의 폴리아데닐화를 감소시킬 수 있다.
추가적인 SIN 디자인은 U.S. 특허 공개 번호: 2003/0039636에서 기술된다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 특정 구체예에서, LTRs로부터 제거된 렌티바이러스 서열은 비(non)-렌티바이러스 레트로바이러스의 필적가능한 서열로 대체되고, 이로 인하여 하이브리드 LTRs가 형성된다. 구체적으로, LTR 안의 렌티바이러스 R 영역은 비-렌티바이러스 레트로바이러스의 R 영역으로 전부 또는 부분적으로 대체될 수 있다. 특정 구체예에서, 바이러스 복제를 강화시키기 위하여 TAT 단백질과 상호작용하는 서열인, 렌티바이러스 TAR 서열은 R 영역으로부터 제거되는데, 바람직하게는 전부 제거된다. 그 다음, 이 TAR 서열은 비-렌티바이러스 레트로바이러스의 R 영역의 필적가능한 부분으로 대체되고, 이로 인하여 하이브리드 R 영역이 형성된다. LTRs은 추가적으로 변형되어, 렌티바이러스 U3 및 U5 영역의 전부 또는 일부가 제거되거나, 및/또는 비-렌티바이러스 서열로 대체될 수 있다.
따라서, 특정 구체예에서, SIN 구성형태는 TAR 서열 전부 또는 일부분이 결여된 하이브리드 렌티바이러스 R 영역을 포함하는 레트로바이러스 LTR를 제공하고, 이로 인하여 TAT에 의한 임의의 가능한 활성화는 없어지게 되고, 여기에서 TAR 서열 또는 이의 일부는 비-렌티바이러스 레트로바이러스의 R 영역의 필적가능한 영역으로 대체되고, 이로 인하여 하이브리드 R 영역이 형성된다. 특정 구체예에서, 상기 레트로바이러스 LTR은 하이브리드 R 영역을 포함하고, 여기에서 상기 하이브리드 R 영역은 TAR 서열이 결여된 HIV R 영역 (가령, US 2003/0039636에서 서열 번호: 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이로 구성된 부분), 그리고 HIV R 영역으로부터 결여된 TAR 서열에 필적가능한 MoMSV R 영역의 일부(가령, 2003/0039636에서 서열 번호: 9에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이로 구성된 부분)를 포함한다. 또다른 특정 구체예에서, 전체 하이브리드 R 영역은 2003/0039636에서 서열 번호: 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이로 구성된다.
R 영역이 유도될 수 있는 적합한 렌티바이러스는 예를 들면, HIV (HIV-1 및 HIV-2), EIV, SIV 및 FIV를 포함한다. 비-렌티바이러스 서열이 유도될 수 있는 적합한 레트로바이러스는 예를 들면, MoMSV, MoMLV, Friend, MSCV, RSV 및 스푸마바이러스(Spumaviruses)를 포함한다. 한 가지 예시적 구체예에서, 렌티바이러스는 HIV이며, 비-렌티바이러스 레트로바이러스는 MoMSV이다.
US 2003/0039636에서 설명된 또다른 구체예에서, 하이브리드 R 영역을 포함하는 LTR은 좌측 (5') LTR이며, 하이브리드 R 영역으로부터 상류 프로모터 서열을 더 포함한다. 선호되는 프로모터는 비-렌티바이러스 기원(in origin)이며, 예를 들면, 비-렌티바이러스 레트로바이러스의 U3 영역 (가령, MoMSV U3 영역)을 포함한다. 한 특정 구체예에서, U3 영역은 US 2003/0039636에 나타낸 서열번호 :12의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서, 좌측 (5') LTR은 하이브리드 R 영역의 하류 렌티바이러스 U5 영역을 더 포함한다. 한 구체예에서, 상기 U5 영역은 게놈 통합에 필수적인 HIV att 부위가 함유된 HIV U5 영역이다. 또다른 구체예에서, 상기 U5 영역은 US 2003/0039636에 나타낸 서열 번호: 13의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 여전히 또다른 구체예에서, 전체 좌측 (5') 하이브리드 LTR은 US 2003/0039636에 나타낸 서열 번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또다른 예시적인 구체예에서, 하이브리드 R 영역을 포함하는 LTR은 우측(3') LTR이고 하이브리드 R 영역의 상류 변형된 (가령, 절두된(truncated)) 렌티바이러스 U3 영역을 더 포함한다. 상기 변형된 렌티바이러스 U3 영역은 att 서열을 포함할 수 있지만, 프로모터 활성을 갖는 임의의 서열이 결여될 수 있고, 이로 인하여 상기 벡터는 염색체 통합 후, 바이러스 전사가 제 1 라운드 복제를 넘어서지 못하는 SIN이 된다. 특정 구체예에서, 하이브리드 R 영역의 상류 변형된 렌티바이러스 U3 영역은 렌티바이러스 (가령, HIV) U3 영역의 3'단부에서 최대 렌티바이러스 U3 att 부위까지, 그리고 이를 함유하도록 구성된다. 한 구체예에서, 상기 U3 영역은 US 2003/0039636에 나타낸 서열번호 :15의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서, 상기 우측 (3') LTR은 하이브리드 R 영역의 하류 폴리아데닐화 서열을 더 포함한다. 또다른 구체예에서, 상기 폴리아데닐화 서열은 US 2003/0039636에 나타낸 서열 번호: 16의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 전체 우측 (5') LTR은 US 2003/0039636에 나타낸 서열 번호: 2 또는 17의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
따라서, HIV 기반의 LV의 경우에서, 이러한 벡터는 벡터 역가의 유의적인 감소없이, LTR TATA 박스의 제거를 비롯하여, 상당한 U3 결손(가령, -418에서부터 -18까지의 결손)을 허용한다. 이러한 결손은 LTR의 전사능력이 약 90 % 또는 그 이하로 감소함으로써, LTR 영역은 실질적으로 전사적으로 불활성이 된다.
전달 벡터 구조체의 상류 LTR의 일부가 구성적으로 활성 프로모터 서열로 대체된다면, Tat의 트란스-작용 기능은 불필요하게 된다는 것이 또한 실증되었다 (가령, Dull 등 (1998) J Virol. 72(11): 8463-8471 참고. 더욱이, rev의 trans 발현으로 패키징 구조체로부터 단지 gag 및 pol을 함유하는 고-역가 HIV-유래된 벡터 스톡의 생산이 허용된다는 것을 보여준다. 이 디자인에 의해 패키징 기능의 발현이 오직 생산자 세포에서만 이용가능한 상보성 조건부가 되게 한다. 결과적으로 유전자 전달 시스템은 HIV-1의 9 개 유전자 중 3 개만을 보존하고, 형질도입 입자 생산을 위한 4 개의 별도 전사 단위에 의존한다.
실시예 1에서 설명된 한 구체예에서, 항-겸상세포생성 β-글로빈 (가령, βAS3)을 발현시키는 카세트가 pCCL LV 골격에 위치되며, 이 골격은 5' LTR에서 대체된 CMV 인헨서/프로모터를 갖는 SIN 벡터다.
CMV 프로모터는 전형적으로 높은 수준의 비-조직 특이적 발현을 제공한다는 것을 인지할 것이다. 유사한 구성적 활성을 갖는 다른 프로모터는 RSV 프로모터, 및 SV40 프로모터를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 포유류 프로모터, 이를 테면 베타-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 연장 인자 1α프로모터, 튜블린(tubulin) 프로모터, 등등이 또한 이용될 수 있다.
전술한 SIN 구성배열은 예시적인 것이며, 이에 제한되는 것은 아니다. 당업자에게는 다수의 SIN 구성형태들이 공지되어 있다. 상기에서 나타낸 바와 같이, 특정 구체예에서, LTR 전사는 약 95% 내지 약 99% 감소된다. 특정 구체예에서, LTR는 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95% 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 전사에서 비활성이다.
절연체 요소(Insulator element)
특정 구체예에서, 생물안정성을 더 강화시키기 위하여, 본 명세서에서 기술된 벡터들 안에 절연체들이 삽입된다. 절연체는 게놈 전체에 존재하는 DNA 서열 요소다. 그들은 염색질(chromatin)을 변형시키고, 영역 유전자 발현을 변경시키는 단백질에 결합한다. 본 명세서에 기술된 벡터 내의 절연체의 배치는 그중에서도 특히 다음을 비롯한 다양한 잠재적 이익을 제공한다: 1) 측면에 있는 염색체에 의한 발현의 위치적 효과 다양성으로부터 이 벡터를 차폐 (가령, 장벽 활성); 그리고 2) 상기 벡터에 의한 유전자 발현의 삽입에 의한 유전자 발현의 trans-활성화로부터 측면에 있는 염색체의 차폐 (인헨서 차단). 따라서, 절연체는 게놈 또는 유전적 맥락에 내장된 유전자 또는 전사 단위의 독립적인 기능을 보존하는 데 도움을 줄 수 있고, 이때 그렇지 않으면, 이들 발현은 이 게놈 또는 유전적 맥락 안에 있는 조절 신호에 의해 영향을 받을 수 있다 (가령, Burgess-Beusse 등 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 16433; 그리고 Zhan 등 (2001) Hum. Genet., 109: 471 참고). 현재의 문맥에서, 절연체는 통합 부위 효과로부터 렌티바이러스-발현된 서열을 보호하는데 기여할 수 있고, 게놈 DNA에 존재하는 cis-작용 요소에 의해 매개될 수 있는데, 이로써 전달된 서열의 조절해제된 발현을 유도할 수 있다. 다양한 구체예들에서, 세포 게놈에 통합되는 벡터 영역의 한쪽 또는 양쪽 LTR 또는 이 벡터 영역의 임의의 곳에 절연체 서열이 삽입된 LV가 제공된다.
처음으로, 그리고 가장 잘 특징 지워진 척추동물 염색질 절연체는 닭 β-글로빈 좌 제어 영역 내에 위치한다. DNase-I 과민성 부위-4 (cHS4)를 함유하는 이 요소는 닭 β-글로빈 좌의 5 '경계를 구성하는 것으로 보인다 (Prioleau 등 (1999) EMBO J. 18: 4035-4048). cHS4 요소를 함유하는 1.2kb의 단편은 세포주에서 글로빈 유전자 프로모터와 인핸서의 상호 작용을 차단하는 능력(Chung 등 (1993) Cell, 74: 505-514), 그리고 초파리(Drosophila )(Id.), 형질변환된 세포주 (Pikaart 등 (1998) Genes Dev. 12: 2852-2862), 그리고 이식유전자를 가진 포유류 (Wang 등 (1997) Nat. Biotechnol., 15: 239-243; Taboit-Dameron 등 (1999) Transgenic Res., 8: 223-235)에서 위치 효과로부터 발현 카세트를 보호하는 능력을 비롯하여, 전형적인 절연체 활성을 나타낸다. 이 활동의 대부분은 250-bp의 단편에 담겨 있다. 이 띠(stretch) 안에 인헨서-차단 분석에 연루된 아연 핑거 DNA 결합 단백질 CTCF(Bell 등 (1999) Cell, 98: 387-396)와 상호작용하는 49-bp의 cHS4 코어가 있다(Chung 등 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94: 575-580).
하나의 예시적인 그리고 적합한 절연체는 77 bp의 절연체 요소인 FB (FII/BEAD-A)인데, 여기에는 닭 β-글로빈 5' HS4 절연체의 최소 CTCF 결합 부위 인헨서-차단 구성원들, 그리고 Ramezani 등 (2008) Stem Cell 26: 3257-3266에서 기술된 상기 인간 T-세포 수용체 알파/델타 차단 요소 알파/델타 I (BEAD-I) 절연체의 상동성 영역을 함유한다. 상기 FB "합성" 절연체는 온전한 인헨서 차단 활성을 갖는다. 이 절연체는 예를 든 것이며, 이에 한정되지 않는다. 다른 적합한 절연체, 예를 들면, 전장의 닭 베타-글로빈 HS4 또는 이의 절연체 하위-단편들, 안키린(ankyrin) 유전자 절연체, 그리고 기타 합성 절연체 요소들을 비롯한, 절연체가 이용될 수 있다.
패키징 신호(Packaging signal).
다양한 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 벡터들은 패키징 신호를 더 포함한다. "패키징 신호(packaging signal)", "패키징 서열(packaging sequence)", 또는 "psi 서열"은 패키징 신호를 포함하고, 상기 패키징 신호를 레트로바이러스 입자로 핵산의 패키징을 지시하기에 충분한 임의의 핵산 서열이다. 이 용어는 자연 발생적 패키징 서열과 이의 조작된 변이체를 포함한다. 상이한 다수의 렌티바이러스의 패키징 신호는 당업계에 공지되어 있다.
Rev 반응 요소 (RRE).
특정 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 벡터들은 스플라이스안된 RNA의 핵 추출을 강화하기 위한 Rev 반응 요소 (RRE)를 포함한다. RREs는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예시적인 RREs는 이를 테면, HIV NL4-3 게놈에서 위치 7622-8459에 위치한 RRE (Genbank 수탁 번호 AF003887), 뿐만 아니라 다른 HIV 균주 또는 다른 레트로바이러스들의 RREs를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 이러한 서열들은 Genbank 또는 URL hiv-web.lanl.gov/content/index 데이터베이스로부터 바로 이용가능하다.
중심 폴리퓨린 트랙 (cPPT).
다양한 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 벡터들은 중심 폴리퓨린 트랙을 더 함유한다. 중심 DNA 플랩(flap)을 통하여 바이러스 cDNA의 핵 반입(import)을 실행함으로써 보고된 바에 따르면, 가령, 렌티바이러스 (가령, HIV-1) 벡터 구조체에 중심 폴리퓨린 트랙 (cPPT)이 함유된 단편을 삽입하면 형질도입 효과가 극적으로 강화되는 것으로 알려져 있다.
발현-촉진하는 해독후 조절 요소 (PRE)
특정 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 벡터들은 임의의 다양한 해독후 조절 요소들 (PREs)을 포함하는데, 전사체 안에 이들의 존재로 단백질 수준에서 이종 핵산 (가령, ADA, IL-2Rγ, βAS3, 및 이와 유사한 것들)의 발현이 증가된다. PREs는 특정 구체예에서, 가령, 보통(modest) 프로모터를 갖는 렌티바이러스 구조체가 연관된 경우에, 특이 유용할 수 있다.
한 가지 유형의 PRE는 발현 카세트 안에 위치된 인트론이며, 이것은 유전자 발현을 자극할 수 있다. 그러나, 인트론은 렌티바이러스의 삶 주기 동안에 스플라이스 아웃(spliced out)될 수 있다. 이러한 이유로, 만약 인트론들이 PRE로 이용된다면, 이들은 전형적으로 상기 벡터 게놈 전사체에 대하여 반대 배향으로 위치된다.
스플라이싱 사건에 의존하지 않는 해독후 조절 요소들은 바이러스 수명 주기 동안 제거되지 않는 이점을 갖는다. 일부 예들은 단순 포진 바이러스의 해독후 프로세싱 요소, B형 간염 바이러스 (HPRE)와 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 (WPRE)의 해독후 조절 요소이다. 이들중 WPRE는 HPRE에서 볼 수 없는 추가적인 시스-작용 요소를 함유하기 때문에, 전형적으로 선호된다. 이 조절 요소는 삽입유전자의 RNA 전사체 안에 포함되도록, 그러나 삽입 유전자 해독 단위의 정지 코돈 밖에 있도록 벡터 안에 일반적으로 위치한다.
WPRE는 U.S. 특허 번호: 6,136,597에서 특징화되고, 기술되어 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, WPRE는 핵으로부터 세포질로의 RNA의 효율적인 전달을 매개하는 RNA 추출 요소이다. 이것은 cis-작용 핵산 서열의 삽입에 의해 삽입유전자의 발현을 향상시켜, 이 요소와 삽입유전자는 단일 전사체 내에 함유되도록 한다. 센스 배향(sense orientation)으로 WPRE가 존재하면, 삽입유전자의 발현이 최대 7 배에서 10 배까지 증가되는 것으로 나타났다. 레트로바이러스 입자의 형성을 유도하는 일련의 사건 중에 인트론은 일반적으로 스플라이스되기 때문에, 레트로바이러스 벡터들은 완전한 인트론-함유 유전자 대신 cDNAs 형태로 서열을 전달한다. 인트론은 1 차 전사물과 스플라이싱 기전과의 상호 작용을 중재한다. 스플라이싱과 수송 기전 간의 커플링으로 인하여, 스플라이싱 기전에 의한 RNA의 프로세싱은 포질 배출을 촉진시키기 때문에, cDNA는 종종 비효율적으로 발현된다. 따라서, 벡터에 WPRE가 포함되면 삽입유전자의 발현이 향상된다.
형질도입된 숙주 세포 및 세포 형질도입 방법.
본 발명에서 기술된 재조합 벡터들과 생성된 바이러스는 핵산 서열 (가령, 항-겸상세포생성 β-글로빈, ADA, IL-2Rγ 유전자, 표 1에서 열거된 임의의 기타 표적/삽입유전자, 그리고 이와 유사한 것들을 암호화하는 핵산)을 포유류 세포로 전달할 수 있다. 세포로 전달하기 위하여, 본 발명의 벡터들은 적합한 패키징 세포주와 병용하여 이용되거나, 또는 본 발명의 벡터들을 패키징하고, 세포를 감염시킬 수 있는 복제 불능 비리온을 형성하는데 필수적인 레트로바이러스 유전자 (가령, gag 및 pol)을 함유하는 다른 벡터 플라스미드와 함께 시험관에서 세포 안으로 공동-형질감염될 수 있다.
전형적으로, 상기 벡터들은 형질감염을 통하여 상기 패키징 세포주 안으로 도입된다. 상기 패키징 세포주는 상기 벡터 게놈이 함유된 바이러스 입자들을 만든다. 형질감염 방법은 당업자들에게 잘 공지되어 있다. 패키징 벡터들과 패키징 세포주에 벡터를 전달하는 전달 벡터의 공동형질감염 후, 재조합 바이러스는 배양 배지로부터 회수되고, 당업자들이 이용하는 표준 방법을 이용하여 역가측정된다. 따라서, 상기 패키징 구조체는 우성 선택성 표지, 이를 테면 네오마이신, DHFR, 글루타민 합성효소와 일반적으로 함께, 인산칼슘 형질감염, 리포펙션(lipofection) 또는 전기천공(electroporation)에 의해 안간 세포주 안으로 도입되며, 이어서 적절한 약물 존재하에 선별되고, 클론이 단리된다. 특정 구체예에서, 상기 선택성 표지 유전자는 이 구조체의 패키징 유전자에 물리적으로 연계될 수 있다.
적절한 패키징 세포에 의해 패키징 기능이 발현되도록 하는 안정한 세포주는 공지되어 있다 (패키징 세포를 설명하는 미국 특허 번호 5,686,279 참고). 일반적으로, 바이러스 입자들의 생성을 위하여, 렌티바이러스 Gag 및 Pol 유전자의 발현과 양립가능한 임의의 세포, 또는 이러한 발현을 지원하도록 조작될 수 있는 임의의 세포를 사용할 수 있다. 예를 들면, 생산자 세포, 이를 테면 293T 세포 및 HT1080 세포가 이용될 수 있다.
레트로바이러스 벡터 (가령, 렌티바이러스 벡터)가 통합된 패키징 세포는 생산자 세포를 만든다. 따라서, 생산자 세포는 관심대상의 치료요법적 유전자(가령, 항-겸상세포생성 β-글로빈, ADA, IL-2Rγ 유전자, 등)를 휴대하고 있는 패키지된 감염성 바이러스 입자들을 만들 수 있는 세포 또는 세포-계통이다. 이들 세포는 고정(anchorage) 의존성이 있을 수 있는데, 이는 유리 또는 플라스틱과 같은 표면에 부착될 때 이들 세포의 성장, 생존하거나 또는 기능이 최적으로 유지된다는 것을 의미한다. 벡터가 복제 능력이 있을 때, 렌티바이러스 벡터 패키징 세포주로 이용되는 고정 의존적 세포주의 일부 예는 HeLa 또는 293 세포 및 PERC.6 세포이다.
따라서, 특정 구체예에서, 본원에 기술된 렌티바이러스 벡터를 함유하는 비리온에 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포의 게놈으로 유전자를 전달하고, 이에 이 유전자를 통합시키는 방법이 제공된다. 상기 세포 (가령, 조직 또는 기관 형태의)는 생체외에서 비리온과 접촉될 수 있고 (가령, 감염되고), 그 다음 대상 (가령, 포유류, 동물 또는 인간)에게 전달되고, 여기에서 유전자 (가령, 항-겸상세포생성 β-글로빈, ADA, IL-2Rγ 유전자, 등)이 발현될 것이다. 다양한 구체예들에서, 상기 세포는 상기 대상에 자가조직 (가령, 대상으로부터 유래된)이거나, 또는 대상에 대하여 비-자가조직 (가령, 동종이계(allogeneic) 또는 이종성(xenogenic))일 수 있다. 더욱이, 본 명세서에서 기술된 벡터들은 분할 세포 및 비-분할 세포 모두에 전달될 수 있기 때문에, 상기 세포는 예를 들면, 골수 세포, 중간엽 줄기 세포 (가령, 지방 조직으로부터 수득된), 그리고 인간 및 동물 기원으로부터 유래된 기타 일차 세포를 비롯한 다양한 원천으로부터 유래될 수 있다. 대안으로, 비리온은 생체 내에서 대상 또는 대상의 국소 영역(가령, 골수)에 직접 투여될 수 있다.
물론, 상기에서 언급한 바와 같이, 본 명세서에서 기술된 벡터들은 골수, 말초 혈액 또는 제대혈로부터 수득된 인간 조혈성 조상 세포 또는 조혈성 줄기 세포의 형질도입, 뿐만 아니라 CD4+ T 세포, 말초 혈액 B 또는 T 림프구 세포, 및 이와 유사한 것들의 형질도입에 특히 유용하다. 특정 구체예에서, 특별히 선호되는 표적은 CD34+ 세포다. 특정 구체예에서, 상기 표적은 CD34+/CD38- 세포다.
유전자 요법.
특정 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 벡터들은 가령, 유전적 결함의 교정에 의해 및/또는 하나 또는 그 이상의 이종(heterologous) 유전자(들)의 발현에 의해 개선될 수 있는 병리를 치료하기 위하여, 대상으로 삽입유전자를 도입하는데 유용하다. 한 가지 예시적인, 그러나 이에 국한되지 않는 구체예에서, 상기 방법은 조혈성 줄기 세포가 포함된 인간 세포 집단에 관심대상의 삽입유전자(들)이 포함된 본 명세서에서 기술된 벡터를 이 벡터에 의해 상기 집단에서 인간 줄기 세포 또는 조상 세포의 형질도입을 초래하는 조건하에서 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 줄기 세포는 궁극적인 적용방법에 따라 생체 내 또는 시험 관내에서 형질도입될 수 있다. 인간 유전자 요법, 이를 테면 인간 줄기 세포의 유전자 요법의 맥락에서, 생체 내에서 줄기 세포 또는 전구 세포를 인간 대상으로 형질도입하거나, 또는 대안으로 시험관내에서 형질 도입한 후, 이어서 형질도입된 세포를 사람 대상으로 주입할 수 있다. 한 측면에서, 상기 인간 세포는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 인간, 가령, 인간 환자에서 떼어낸 후, 상기에서 언급한 바와 같이 형질도입될 수 있다. 그 다음 형질도입된 세포는 동일한 또는 상이한 인간에게 재도입되고, 여기에서 이 삽입유전자(들)의 발현으로 병리의 하나 또는 그 이상의 증상을 개선하거나, 효과적으로 이 병리를 치유하거나, 또는 이 병리 또는 이의 진행을 지연시킨다.
병리 및 유전자 요법의 표적.
본 명세서에서 기술된 벡터들은 유전자 요법 기술을 이용하여 치료될 수 있는 기본적으로 임의의 상태 치료에서 삽입 유전자의 전달에 유용하다. 이 벡터는 다수의 병리 치료를 위한 삽입유전자를 전달하는데 이용될 수 있다. 이점에 있어서, 상당한 수의 유전자 요법 임상 프로토콜이 승인되거나 또는 검토된다(가령, Misra (2013) J.A. P. I., 61: 127-133, 및 이와 유사한 것들을 참고).
특정 구체예에서 상기 벡터들은 병리 치료, 이를 테면 SCID, 겸상 적혈구 질환, 리포좀 축적 질환, 낭포성 섬유증, 근이영양증, 페닐케톤뇨증, 파킨슨 병, 또는 혈우병를 위한 삽입유전자를 함유한다. 본 명세서에서 기술된 벡터들을 이용하여 유전자 전달 (가령, 유전자 요법) 방법으로 치료될 수 있는 예시적인, 그러나 이에 한정되지 않는, 병리 목록과 연관된 "표적"의 목록이 표 1에 제시된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
한 가지 예시적 구체예에서, 아데노신 탈아미노효소 (ADA) 유전자/cDNA의 도입에 의해 ADA-SCID의 치료에 있어서 본 명세서에서 기술된 벡터들이 이용된다. 또다른 구체예에서, IL-2 수용체 감마 (IL-2γ) 유전자 도입에 의해 X-SCID의 치료에 있어서 본 명세서에서 기술된 벡터들이 이용된다. 특정 구체예에서, 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈 유전자 (가령, PCT 공개 번호: WO2014043131 A1 (PCT/US2013/059073)에서 설명된 바와 같이)의 도입에 의해 겸상 적혈구 질환 치료에 있어써 본 명세서에서 기술된 벡터들이 이용된다.
전술한 병리들과 표적들은 예시적인 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 제공된 교시를 이용하여, 본 명세서에서 기술된 벡터들은 임의의 다수의 유전자/cDNAs를 전달하는데 이용될 수 있다.
줄기 세포/조상 세포 유전자 요법.
다양한 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 벡터들은 골수, 말초 혈액 또는 제대혈로부터 수득된 인간 조혈성 조상 세포 또는 조혈성 줄기 세포 (HSCs)의 형질도입, 뿐만 아니라 CD4+ T 세포, 말초 혈액 B 또는 T 림프구 세포, 및 이와 유사한 것들의 형질도입에 특히 유용하다. 특정 구체예에서, 특별히 선호되는 표적은 CD34+ 세포다. 특정 구체예에서 선호되는 표적은 CD34+/CD38- 세포다.
세포, 예를 들면 CD34+ 세포, CD34+/CD38- 세포, 수지상 세포, 말초 혈액 세포 또는 종양 세포가 생체외 형질도입될 때, 상기 벡터 입자들은 1 내지 50 감염다중도(MOI) 크기의 분량을 이용하여 상기 세포와 항온처리되는데, 이때 상기 분량은 105 세포당 1 × 105 내지 50 × 105 바이러스 벡터의 형질도입 단위에 상응한다. 물론, 이 분량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 및 50의 MOI에 상응하는 벡터의 양을 포함한다. 전형적으로, 벡터의 양은 HeLa 형질도입 단위 (TU)로 표현될 수 있다.
PCT 공개 번호: WO2014043131 A1 (PCT/US2013/059073)의 실시예 1에서 나타낸 바와 같이, 획득된 유전자 전달에서 분량-관련된 증가(qPCR을 이용하여 측정된 평균 VC/세포)는 벡터 농도가 2 × 107 TU/ml 미만인 경우에만 발견되었다. 더 높은 농도의 벡터는 형질도입 효율을 증가시키지 않았고, 실제로, 형질도입 정도에서 부정적 효과 (데이터로 제시되지 않음)를 갖는다. 이와 같은 발견에 근거하여, CCL-βAS3-FB 벡터는 표준 농도 2 × 107 TU/ml (MOI = 40)에서 이용되었다.
특정 구체예에서, 세포-기반의 요법은 줄기 세포 및/또는 조혈성 전구물질을 제공하고, 관심대상의 삽입유전자 (가령, 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈을 암호화하는 바이러스로 이 세포를 형질도입시키고, 그리고 그 다음, 이를 필요로 하는 대상 (가령, 겸상적혈구 세포 돌연변이를 갖는 대상)으로 상기 형질변환된 세포를 도입시키는 것을 포함함다.
특정 구체예에서, 상기 방법은 대상으로부터 세포 집단, 가령, 줄기 세포를 단리하고, 임의선택적으로 조직 배양에서 이들 세포를 확장시키고, 그리고 렌티바이러스 벡터를 투여하고, 세포 안에 이들 벡터의 존재로 인하여 시험관에서 상기 세포 안에서 항-겸상세포생성 β-글로빈이 생성되는 것을 포함한다. 그 다음 상기 세포들은 이 대상으로 복귀시키고, 이때 예를 들면, 이들 세포는 항-겸상세포생성 β 글로빈을 만드는 적혈구 세포 집단을 제공할 수 있는데, 가령, PCT 공개 번호: WO2014043131 A1 (PCT/US2013/059073)의 도 16 참고.
본 발명의 일부 구체예에서, 세포 집단은 상기 대상의 것이 아닌 세포주의 세포, 또는 상기 대상이 아닌 개체로부터 유래된 세포 집단이 이용될 수 있다. 대상으로부터 줄기 세포, 면역계 세포, 등등을 단리하고, 이를 다시 이 대상으로 복귀시키는 방법들은 당분야에 잘 공지되어 있다. 이러한 방법들은 화학요법을 받는 환자에서 가령, 골수 이식, 말초 혈액 줄기 세포 이식, 등등에 이용된다.
줄기 세포들이 이용되는 경우, 이러한 줄기 세포는 골수 (BM), 제대혈 (CB) CB, 동원된 말초 혈액 줄기 세포 (mPBSC), 및 이와 유사한 것들을 비롯하여 다수의 원천으로부터 유래될 수 있음을 인지할 것이다. 특정 구체예에서, 유도된 다분화능 줄기 세포 (IPSCs)의 사용도 고려된다. 조혈성 줄기 세포 (HSCs)의 단리, 이러한 세포의 형질도입 그리고 이들을 포유류 대상에게 도입시키는 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있다.
벡터의 직접 도입.
특정 구체예에서, 상기 벡터의 직접 도입에 의해 대상의 직접적 치료도 고려된다. 상기 벡터 조성물은 비경구 (가령, 정맥내), 피부내, 피하, 경구 (가령, 흡입), 경피(국소), 경점막, 직장 및 질을 포함하나, 이에 국한되지 않는, 임의의 이용가능한 경로에 의해 전달되도록 제제화될 수 있다. 흔히 사용되는 전달 경로에는 흡입, 비경구 및 점막 경로가 포함된다.
다양한 구체예들에서, 약학 조성물은 약학적으로 수용가능한 운반체와 복합된 벡터를 함유할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 수용가능한 운반체(pharmaceutically acceptable carrier)" 용어는 약학적 투여와 양립가능한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장액 및 흡수 지연제 및 이와 유사한 것등을 포함한다. 보충 활성 화합물 또한 상기 조성물에 혼합될 수 있다.
일부 구체예에서, 활성 물질, 가령, 본 명세서에서 기술된 벡터 및/또는 이 벡터와 함께 투여될 다른 물질들은 임플란트 및 미세캡슐화된 전달계를 비롯한 방출 제어 제제와 같이, 신체로부터의 이 화합물이 신속하게 제거되지 않도록 보호하는 담체와 함께 제조된다. 생분해가능한, 생체적합성 폴리머, 이를 테면 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르, 및 폴리락트산이 이용될 수 있다. 상기 조성물의 제조 방법은 당업자들에게 자명할 것이다. 적합한 물질은 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 리포솜은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 번호 4,522,811에서 설명된 바와 같이, 이들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조 될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 특정 세포 유형, 또는 바이러스에 감염된 세포를 표적으로 한다. 예를 들면, 조성물은 세포 표면 표지, 가령, 감염된 세포의 표면 상에 발현되는 내인성 표지 또는 바이러스성 항원에 대한 단클론성 항체를 사용하여 표적화될 수 있다.
투여의 용이함 및 투여량(dosage)의 균일성을 위하여, 단위 투약형(dosage unit form)으로 조성물을 제형화하는 것이 유리하다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단위 투약형은 치료할 대상을 위한 일원화된 투약형으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 약학 담체와 연합하여, 원하는 치료 효과를 내도록 계산하여 미리 결정된 양의 벡터 (예를 들어, LV)를 포함한다.
단위 투여분량은 한번의 주사로 투여될 필요는 없으며, 설정된 기간 동안 연속 주입을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 기술된 상기 벡터(들)의 단위 투여분량은 세포주, 이를 테면 HeLa 또는 293에서 상기 벡터의 역가로 정의된 바와 같이, 벡터의 형질도입 단위(T.U.)로 편의상 기술될 수 있다. 특정 구체예에서, 단위 투여분량은 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 T.U.범위 및 이 보다 더 높은 범위가 될 수 있다.
약학 조성물은 다양한 간격에서, 그리고 요구되는 상이한 기간에 걸쳐 투여될 수 있는데, 가령, 약 1 내지 약 10 주; 약 2 내지 약 8 주; 약 3 내지 약 7 주; 약 4 주; 약 5 주; 약 6 주, 등등의 기간 동안 주당 1회 투여될 수 있다. 치료 조성물을 무기한으로 투여하는 것이 필요할 수 있다. 당업자는 질환 또는 장애의 심각성, 기존 치료, 대상의 전반적 건강 및/또는 연령, 및 기타 질환의 존재를 비롯하나, 이에 한정되지 않는 특정 인자들에 의해 환자를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여분량 및 횟수에 영향을 미칠 수 있음을 인식 할 것이다. 본 명세서에서 고려되는 벡터 (가령, LV)를 이용한 대상의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있고, 또는 대부분의 경우 일련의 치료를 포함할 수 있다.　
유전자 치료 벡터의 투여를 위한 예시적인 투여분량 및 적합한 투여분량을 결정하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 벡터의 적절한 투여분량은 특정 수령대상 및 투여 방식에 따라 더 달라질 수 있음을 이해한다. 임의의 특정 대상을 위한 적절한 투여 수준은 문제의 병리, 표적 조직, 연령, 체중, 대상의 일반 건강, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 투여 경로, 투여 경로, 배설 속도, 다른 투여된 치료제 및 이와 유사한 것을 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 벡터들은 예를 들면, 정맥 내 주사, 국소 투여 또는 정위(stereotactic) 주사에 의해 대상에게 전달될 수 있다(가령, Chen 등 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3054 참고). 특정 구체예에서, 벡터는 경구 또는 흡입을 통해 전달될 수 있고, 캡슐화되거나 또는 그렇지 않으면 분해로부터 보호되거나, 조직 또는 세포 등으로의 흡수를 증진시키기 위해 조작될 수 있다. 약학 제제는 허용가능한 희석제 안에 벡터를 함유할 수 있거나, 또는 벡터가 매립된 서방형 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 벡터는 본원에 기술된 바와 같은 레트로바이러스 벡터의 경우에서와 같이, 재조합 세포로부터 온전하게 생산될 수 있고, 약학 제제는 벡터를 생산하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 기술된 벡터를 포함하는 약학 조성물은 선택적으로 투여 지침과 함께, 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
전술한 조성물, 방법 및 용도는 예시적인 것이며, 이에 국한시키려는 의도는 없다. 본원에 제공된 교시를 사용하여 조성물; 방법 및 사용에 대한 에 대한 다른 변형은 당업자에게 용이하게 이용가능할 것이다.
실시예
다음의 실시예들은 예시를 위해 제공되지만, 청구된 발명으로 이에 한정되지 않는다.
실시예 1
스플라이싱-중재된 인트론 상실의 구제(rescue)로 인간 유비퀴틴 C 프로모터가 함유된 렌디바이러스 벡터에서 발현이 최대화된다
렌티바이러스 벡터들은 형질 전환 유전자를 발현하기 위해 거의 보편적으로 내부 프로모터를 사용한다. 가장 흔히 이용되는 프로모터 단편중에 하나는 인간 유비퀴틴 C (UBC) 유전자의 1.2-kb 서열로써, 여기에는 UBC의 프로모터, 일부 인헨서, 제1 엑손, 제1 인트론 그리고 제2 엑손의 작은 일부분이 포괄된다. 벡터 생산 동안 벡터 게놈의 전사 후, 스플라이싱이 일어날 수 있기 때문에, UBC 프로모터 단편 안에 있는 인트론이 표적 세포로 정확히 전달되는지를 조사하였다. 본 실시예에서 기술된 바와 같이, 유전적 분석에서 프로바이러스 형태의 80% 이상이 UBC 프로모터의 인토론이 결여된 것으로 드러났다. 렌티바이러스 패키징 동안, 상기 인간 연장 인자 1 알파 (EEF1A1) 프로모터 단편 인트론은 상실되지 않았고, UBC와 EEF1A1 프로모터 인트론 간의 이 차이는 프로모터 엑손 서열들에 의해 부여된 것이었다. UBC 프로모터 인트론 상실은 삽입유전자 발현을 4-배 감소시켰다. 발현 카세트를 반대 가닥으로 이동 시키면, 인트론 상실을 방지하고, 완전한 발현으로 복귀되었다. 이러한 발현의 증가는 대부분 인트론 내에서의 비-고전적 인헨서 활성으로부터 기인된 것이며, 다중 프로모터-근위 부위로 추정(putative) 인트론 인핸서 서열의 이동은 실제로 발현을 억제하였다. UBC 프로모터의 역전은 또한 인트론 상실을 방지하고, 양배향성 렌티바이러스 벡터들에서 완전한 발현으로 회복되었다.
재료 및 방법
플라스미드 구축
이들 연구에 사용된 모든 플라스미드 서열은 모든 목적을 위해 본 명세서에서 첨부된 서열 목록에 편입된다.
인간 유비퀴틴 C 프로모터는 FUGW (Lois 등 (2002) Science, 295: 868-872)로부터 증폭되고, T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 포스포릴화되고, 그리고 선형으로 된, 그리고 블런트화된(blunted) pCafe (발현용 카세트)에 결찰되어 pCafe-UBC가 만들어졌다. 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소 서열 (본 명세서에서 'PRE', Schambach 등에서는 'LPRE'로 지칭됨)은 중합효소 쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭되고, 그리고 In-Fusion (Clontech Laboratories, Mountain View, CA, USA, Cat. No. 639645)을 이용하여 KpnI으로 선형화된 pCafe-UBC 안으로 클론되었다. EGFP의 Emerald 변이체는 pRSET-EmGFP (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, Cat. No. V353-20)로부터 PCR 증폭되고, 그리고 In-Fusion을 이용하여 HpaI-선형화된 pCafe-UBC-PRE 안으로 클론되어, pCafe-UBC-EmGFP-PRE가 만들어졌다. pCafe-UBCs-EmGFP-PRE는 UBC 인트론 서열을 배제하도록 기획된 UBC 클로닝 프라이머를 이용하여, 유사한 방식으로 생성되었다.
역배향 (ro) 플라스미드, pCafe-roUBC-EmGFP-bGHpA 및 pCafe-roUBCs-EmGFP-bGHpA에 있는 발현 카세트 경우, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열은 pcDNA4/HisMax A(Life Technologies, Cat. No. V864-20)로부터 증폭되었고, 상기 삽입유전자 다음에 삽입되었다.
(i) UBC 인트론 재배치된, pCafe-iUBC-EmGFP-PRE, pCafe-roiUBC-EmGFP-PRE 및 pCafe-rofiUBC-EmGFP-PRE의 구조체의 경우, UBC 인트론 서열은 pCafe-UBC-PRE로부터 증폭되고, 그리고 In-Fusion을 이용하여 EcoRV-선형화된 pCafe-UBCs-EmGFP-PRE 안으로 클론되었다.
UBC 인헨서 결손된(dEnh) 구조체, pCafe-dEnhUBC-EmGFP-PRE의 경우, pCafe-UBC-EmGFP-PRE는 추정 인트론 인헨서 영역의 측면 중첩, 외배향(outward-facing) 프라이머를 이용하여 증폭되었고, 그리고 DpnI 처리 후, In-Fusion으로 다시 고리화되었다.
모든 pCCLc (Dull 등 (1998) J. Virol., 72: 8463-8471) LVs의 경우, 발현 카세트는 pCafe 플라스미드로부터 EcoRV/KpnI 절단에 의해 제거되었고, 그리고 EcoRV/KpnI-선형화된 pCCLc 안에 결찰되었다.
소 성장 호르몬 polyA (bGHpA) 및 양배향성 mCMV/UBC 프로모터 (Kamata 등 PLoS ONE, 5: e11834)의 PCR 앰플리콘, FUGW로부터 EGFP 및 WPRE, 그리고 In-Fusion 클로닝 키트 (Clontech, Mountain View, CA, USA)를 이용하여 pCCLc 골격과 중첩 상동성을 갖도록 기획된 EFS-단일-IDLV (Joglekar 등 (2013) Mol. Ther., 21: 1705-1717)의 mCherry의 합체에 의해 양배향성 (BD) 벡터가 구축되었다. 역전 bGHpA와 WPRE 사이에서 mCherry-양배향성 프로모터-EGFP 카세트를 역전시키기 위하여 BD의 제한 절단과, NEB Quick Ligase Kit (New England Biolabs, Ipswitch, MA, USA)에 의한 결찰에 의해 roBD 벡터가 구축되었다.
세포 배양
D10 배지는 50-ml 열-비활성화된 태아 송아지 혈청 (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA, USA, Cat. No. 900-208) 및 5.5-ml 100X L-글루타민:페니실린:스트렙토마이신 용액 (Gemini Bio-Products Cat. No. 400-110)을 L-글루타민이 없는 500-ml의 Dulbecco 변형된 Eagle 배지(Mediatech, Herndon, VA, USA, Cat. No. 15-013-CV)에 추가하여, 준비되었다. R10 배지는 상기 동일한 두 가지 구성요소들을 L-글루타민이 없는 500-ml의 RPMI 1640 배지(Mediatech Cat. No. 15-040)에 추가하여, 준비되었다. 293T 세포 (ATCC, Manassas, VA, USA, Cat. No. CRL-1268)는 D10 배지에서 유지되었고, K562 (ATCC Cat. No. CCL-243) 세포는 R10 배지에서 유지되었다.
벡터 생산
LV 상청액은 1 × 107 HEK293T 세포에 10-㎍의 pCMVΔR8.91 (Zufferey 등 (1997) Nat. Biotechnol., 15: 871-875), 10 ㎍ the 적절한 pCCLc 벡터 플라스미드 그리고 2-㎍의 pCAG-VSV-G (Hanawa 등 (2002) Mol. Ther., 5: 242-251)로 형질감염시켜, 만들었다. 형질감염 혼합물은 1.5-ml의 DPBS에 플라스미드와 66-㎕의 1-mg/ml 분지형(branched) PEI 용액 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, Cat. No. 408727-100ML)을 추가하고, 그 다음 몇 초간 볼텍싱(vortexing)함으로써, 준비되었다. 실온에서 5-10 분 동안 항온처리 후, 형질감염 믹스(mixes)는 10-cm 접시에 24h 앞서 도말된 293T 세포에 점적(dropwise) 추가되었다. ~16 h 후, 상기 배지는 50-U/ml의 페니실린, 50-㎍/ml의 스트렙토마이신, 2-mM의 L-글루타민 및 20-mM의 HEPES이 보충된 UltraCULTURE 배지 (Lonza, Basel, Switzerland, Cat. No. 12-725F)로 교환되었다. 바이러스 상청액은 이 배지 교환 후 24-48 h에 수거되었다.
roUBC 벡터들의 경우, 상기 벡터 게놈 RNA (Maetzig 등 (2010) Gene Ther., 17: 400-411)에 대한 안티센스 전사체 존재에 의해 초래되는 역가의 하락을 방지하기 위하여 5-㎍의 pcDNA3-NovB2가 포함되었다. 상기 증가된 플라스미드 DNA를 보상하기 위하여, 추가적으로 15-㎕의 1-㎍/ml PEI 용액은 추가되었다.
인간 CD34+ HSPCs의 형질도입을 위하여, Beckman Coulter SW-32Ti 로터에서 4℃, 90 분 동안 26,000 rpm으로 한외원심분리함으로써, 이 벡터는 ~150-배 농축되었다.
형질감염
293T 세포는 6-웰 플레이트 (Corning, Corning, NY, USA, Cat. No. 3516)안 D10 배지에 웰당 8 x 105 세포로 씨딩되었다. 24시간 후, 1.5-ml 마이크로원심분리 튜브 안에서 200-㎕의 Opti-MEM I 배지 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, Cat. No. 31985-062)에서 형질감염을 위하여 1.5 ㎍의 플라스미드가 준비되었다. 4.5 ㎕의 TransIT-293 형질감염 시약 (Mirus Bio, Madison, WI, USA, Cat. No. MIR 2700)이 추가되었고, 이 혼합물은 간단히 볼텍싱하고, 실온에서 5분간 항온처리 후, 상기 세포에 점적 추가되었다. 형질감염 후 48시간 시점에 간단한 트립신 처리에 세포는 수집되었고, BDLSR Fortessa 유동 세포측정기에서 녹색 형광 단백질 리포터 발현에 대하여 분석되었다.
형질도입
렌티바이러스 발현 분석을 위하여, K562 세포는 24-웰 플레이트에 웰당 50 000 세포로 도말되었고, 다양한 분량의 벡터로 처리하여, 10% 형질도입 또는 그 이하를 갖는 집단을 획득함으로써, 세포의 대부분이 오직 단일 통합만을 수용하도록 하였다. 세포는 1-2 주 동안 배양한 후, 유동 세포측정 분석에 앞서 비-통합된 벡터를 희석하여 버리고, 형광 단백질 수준이 항정 상태(steady state)에 도달하도록 하였다.
동원된 말초 혈액으로부터 일차 인간 CD34+ HSPCs에서 발현 분석을 위하여, 저온보존된 세포는 해동시켰고, 그리고 50-ng/ml의 인간 FLT-3 리간드, 50-ng/ml의 인간 줄기 세포 인자 또는 50ng/ml의 인간 트롬보포에틴 (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA)이 보충된 X-VIVO 15 배지 (Lonza) 에서 하룻밤 동안 사전-자극시켰다. 그 다음 바이러스 벡터는 동일한 배지의 대응 용적에 추가하여, 3 x 105 형질도입 단위/ml의 최종 벡터 농도를 수득하였다(K562 세포의 형질도입에 의해 측정될 때). 이 벡터 분량은 ~10% 형질도입을 산출하였다. 벡터 추가 후 24시간 시점에, 2 ml의 골수 분화 배지가 추가되었다. 이것은 20% FBS, 0.5% 소 혈청 알부민, 5-ng/ml의 인간 인터루킨-3, 10-ng/ml의 인간 인터루킨-6 및 25-ng/ml의 인간 줄기 세포 인자 (PeproTech)가 보충된 IMDM로 구성되었다.
스플라이싱의 PCR 분석
형질도입된 K562 세포의 게놈 DNA는 KAPA HiFi Hot Start 중합효소 및 프라이머 UBC 인트론 F (AAG TAG TCC CTT CTC GGC GAT, (서열 번호:1)), UBC 인트론 R (GGT CAG CTT GCC GTA GGT, (서열 번호:2)), EEF1A1 인트론 F (GTT CTT TTT CGC AAC GGG TTT G, (서열 번호:3)) 및 EEF1A1 인트론 R (TGT GGC CGT TTA CGT CGC, (서열 번호:4))를 이용하여 PCR을 통하여 분석되었다.
정량적 비말 디지털 PCR (ddPCR)은 프라이머 UBCint F (GGC GAG TGT GTT TTG TGA AGT TT, (서열 번호:5)) 및 EmGFP R (TAC GTC GCC GTC CAG CTC, (서열 번호:6)), 그리고 프로브 FAM-EmGFP (FAM-CAC CAC CCC GGT GAA CAG CTC CTC G, (서열 번호:7))를 이용하여 UBC 벡터-형질도입된 K562 세포의 게놈 DNA 분석에 의해 실행되었다. EEF1A1 벡터 분석의 경우, UBCint F 프라이머는 EEF1A1int F (TCT CAA GCC TCA GAC AGT GGT, (서열 번호:8))로 대체되었다.
UBC의 스플라이싱된 형태는 UBCint F를 대신하여, UBCs F (GCT GTG ATC GTC ACT TGA CA, (서열 번호:9))를 이용하여 정량화되었다. ddPCR은 100 ng의 주형 gDNA를 이용하여 제작자의 지침에 따라 실행되었다. 1 단위의 DraI 효소 (New England Biolabs)는 프로브로써 ddPCR Supermix가 함유된 ddPCR master mix(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 추가되었고, 그리고 37℃에서 1-2h 동안 PCR 반응 믹스에서 사전-절단이 실행된 후, 비말 생성 및 열 사이클링(thermal cycling)되었다.
벡터 상청액에서 벡터 게놈 분석을 위하여, PureLink RNA Mini Kit 액체 시료 과정(Life Technologies)을 이용하여 500 ㎕의 미가공(raw) 벡터 상청액으로부터 RNA가 정제되었다. iScript cDNA 합성 키트 (Bio-Rad)를 이용한 PCR에 앞서, 역 형질감염이 실행되었다.
루시퍼라제 분석
최소 TATA box 프로모터에 의해 구동된 최적화된 루시퍼라제 ORF를 함유하는 pGL4.25 벡터 (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 UBC 및 EEF1A1 인트론의 인헨서 활성에 대하여 분석하였다. CMV 프로모터로부터 프로모터 없는(promoterless) 인헨서 서열을 양성 대조로 삼았다. 모든 삽입체는 PCR 및 Gibson 합체를 통하여, EcoRV 및 KpnI로 선형화된 pGL4.25 안으로 클론되었다. 루시퍼라제 분석은 96 웰 조직 배양물-처리된 플레이트 상에 도말된 293T 세포에서 실행되었다. 웰당 5만개 세포가 D10 배지에 도말되었고, 18 h 후, 형질감염 믹스는 웰당 100-ng의 리포터 플라스미드와 0.3-㎕의 TransIT-293이 포함된, OPTI-MEM에서 준비되었다. 이중-루시퍼라제 리포터 분석 시스템(Promega)으로 형질감염 후 48h 시점에 시료가 준비되었고, 발광 판독은 Tecan Infinite M1000 PRO 플레이트 판독기(Tecan, Mannedorf, Switzerland)로 얻었다.
결과
UBC 인트론은 프로바이러스 형태에서 상실되며, 역(reversal) 발현 카세트는 상실을 방지한다 .
UBC 인트론 1이 패키징 동안 유지되는 지를 평가하기 위하여, UBC 프로모터의 다양한 변형으로 pCCLc LV DNA 구조체와 일시적 형질감염용으로 더 간단한 pCafe 발현 플라스미드 구조체를 만들었다 (도 3). 모든 구조체는 녹색 형광 단백질의 Emerald 변이체(EmGFP)를 보유하였으며, 이것은 유동 세포측정 (Tsien (1998) Annu. Rev. Biochem. 67: 509-544)을 통한 발현 분석이 가능하게 하였다. UBC 구조체는 인간 게놈에 존재하였기 때문에 완전한 UBC 프로모터 단편을 보유하였고, 한편 UBC 인트론 1의 완전한 결손이 되도록 더 짧은 UBCs 구조체가 기획되었고, 이것은 만약 패키징 동안 규정의(canonical) 스플라이싱이 발생된다면, 예상된 프로바이러스 형태가 될 것이다. 발현 카세트의 반대 스트랜드로의 이동이 상기 인트론의 스플라이싱-매개된 상실을 회피할 것인지를 테스트하기 위하여, 프로모터와 삽입유전자를 역으로 하고, 이 삽입 유전자 다음에 폴리아데닐화 신호를 끼워 넣음으로써, 역배향 (ro) 구조체 roUBC 및 roUBCs가 만들어졌다. 중요한 것은, pCCLc LVs의 페이로드가 RNA 중간 단계를 통과하는 동안 스플라이싱-매개된 상실에 민감해지고, pCafe 발현 플라스미드의 페이로드는 RNA 중간체를 보유하지 않고, 따라서 스플라이싱으로 인한 유전적 요소들을 잃지는 않을 것이다. 바이러스 벡터들이 293T 세포에서 만들어졌고, 프로바이러스 형태의 PCR-기반의 유전적 분석을 위하여 K562 세포를 형질도입시키는데 이용되었다 (도 4, 패널 A). 형질도입-후 2주 gDNA의 PCR 분석에서 많은 CCLc-UBCEmGFP-PRE 프로바이러스 형태는 UBCs 프로바이러스 형태의 분석에서 나타난 바와 같이, 인트론 상실과 일치되는 앰플리콘을 보유한 것으로 드러났다 (도 4, 패널 B, 라인 5 및 6). 상기 짧은 산물의 Sanger 서열화에서 예상된 규정 스플라이싱이 발생되었음이 확인되었다 (데이터 제시하지 않음). 대조적으로, roUBC 프로바이러스 형태는 절두된 PCR 산물을 산출하지 않았고, 이로써 역 발현 카세트는 충분히 인트론 상실을 방지한다는 것을 암시한다 (도 4, 패널 B, 라인 7). 상기 인트론-함유 주형과 인트론-결핍된 주형 간의 예상된 PCR 산물 크기의 유의적인 차이로 인하여, 상기 인트론-결핍된 주형 증폭으로의 실질적 편향이 있을 수 있으며, 그리고 이 결과로부터 인트론 상실 양이 과대평가될 수 있다. 따라서, 인트론 상실 빈도를 정량화하기 위하여, 듀플렉스 디지털 PCR 분석이 준비되었고, 이때 상기 인트론과 EmGFP 삽입유전자까지 연결되는 프라이머와 프로브 세트로부터의 신호는 LV 패키징 신호에 대한 프라이머 및 프로브 설정을 이용하여 표준화되었다 (도 5, 패널 A 및 B). 이 분석에서 UBC 벡터 형태의 단지 18%만이 UBC 인트론을 보유하였고 (도 5, 패널 C), 한편 roUBC 벡터 형태는 온전하게 상기 인트론을 보유한 것으로 나타났다.
형질도입 및 역전사 동안 사건이 인트론이 함유된 프로바이러스 형태의 비율에 영향을 주는 지를 평가하기 위하여, UBC 바이러스 상청액으로부터 RNA를 수거하였고, 스플라이싱된 UBC 인트론이 함유된 RNA 게놈 분획을 정량화하였다. 그 다음 이것을 동일한 상청액으로 형질도입된 K562 세포 안에 스플라이싱된 인트론이 함유된 벡터 프로바이러스 형태의 분획과 비교하였다. 이 값은 매우 일치하여, 상기 인트론은 벡터 입자에서 이미 상실되었으며, 따라서 패키징 세포에서도 제거되었음을 암시한다 (도 9).
인트론의 상실은 UBC 프로모터로부터 발현을 낮춘다
삽입유전자 발현에서 인트론 상실 효과를 평가하기 위하여, 온전한 UBC 프로모터 요소를 함유하는, 또는 상기 인트론이 제거된 절두된 UBCs 프로모터를 함유하는 pCafe 발현 플라스미드는 일시적으로 293T 세포 안으로 형질감염되었고, 그리고 형질감염-후 48h 시점에서 유동 세포측정을 통하여 분석되었다. UBC 프로모터는 UBCs 프로모터 보다 대략 ~2-배 더 유의적으로 더 높은 발현을 산출하였다 (도 6, 패널 A). roUBC와 roUBCs 구조체 간에도 유사한 2-배 차이가 관찰되었다. 이들 플라스미드는 세포 안으로 직접적으로 형질감염되었기 때문에, 인트론 상실이 불가능하였고, 테스트된 모든 UBC 프로모터 플라스미드는 상기 인트론을 함유하였다.
인트론의 존재가 인트론 상실이 불가능한 형질감염 실험에서 더 높은 발현을 부여한다는 것이 확립되었고, 그 다음 K562 세포의 형질도입 후, 2주차 LVs로 포장된 다양한 구조체로부터 발현을 검사하였다. 유전적 분석에서 UBC LV 형태의 대부분은 인트론이 결핍되었음이 드러났기 때문에, UBC 벡터는 UBCs 벡터와 유사하게 EmGFP 수준을 발현시킬 것으로 우리는 추론하였다. 또한, UBC 벡터로 형질도입된 집단에서 EmGFP-발현 세포의 형광은 UBCs 벡터로 형질도입된 집단의 것에 거의 대등하였다 (도 6, 패널 B). 대조적으로, roUBC 벡터는 유전자 분석과 일관되게 UBC 벡터보다 세포에서 ~2-배 더 높은 형광을 나타내었고, 이는 roUBC 벡터가 인트론을 함유한다는 것을 나타낸다.
우리는 또한 UBC 벡터와 비교하여 roUBC 벡터로부터 개선된 발현이 또한 렌티바이러스 유전자 요법과 관련된 일차 세포 유형에서도 관찰될 수 있는 지를 확인하기 위하여, 과립구-콜로니 자극 인자로 처리된 건강한 공여체의 말초 혈액으로부터 농축된 인간 CD34+ 조혈성 줄기 세포 및 조상 세포를 형질도입하였다. 골수 분화 조건에서 형질도입 후 10일 배양 후, roUBC 벡터로 형질도입된 세포는 UBC로 형질도입된 세포보다 4-배 더 높은 발현을 보여주었다 (도 10). 유전적 분석에서 UBC-형질도입된 세포에서 인트론 상실은 K562 세포에서 관찰된 것과 유사하였고, 상기 인트론은 roUBC-형질도입된 세포에서 완전히 유지되었음이 나타났다 (도 11).
발현에서 UBC 인트론의 긍정적 효과는 전통적인 인헨서 활성을 통한 것은 아니다
발현 카세트의 역전을 제외하고, 우리는 LV에서 UBC 프로모터 단편의 완전한 발현을 유지시키는 다른 방법을 모색하였다. 우선, 보고된 인트론 인헨서 서열을 이 프로모터의 바로 상류 부위로 이동시키면, 전장 UBC 프로모터 단편과 비교하여 등가의 발현을 유도할 수 있는지를 조사하였다 (Bianchi 등 (2009) Gene, 448: 88-101). 중요한 것은, 이 변이체는 상기 인트론 스플라이스 부위들이 결핍되어 있는데, 이것은 LVs에서 전달을 허용할 수 있다. 그러나, 생성된 iUBC 구조체는 UBCs보다 더 열악하였다 (도 6, 패널 C). roiUBC 및 rofiUBC가 만들어졌고, 프로모터에 대한 인헨서 서열의 배향이 중요한지를 평가하기 위하여 분석하였지만, 이들 프로모터 변이체들의 발현은 iUBC보다 좋은 것은 아니었다 (도 6, 패널 C). 최종적으로 dEnhUBC를 구축하였는데, 이때 추정 인헨서 서열은 결손되었지만, 스플라이싱 부위들은 유지되었다. 이 변이체는 UBCs보다 EmGFP를 약간 더 발현하였는데-그 이유는 아미도 스플라이싱으로부터 핵 추출이 개선되었기 때문일 것으로 추정하며-, 그러나, UBC보다는 유의적으로 적었다 (도 6, 패널 C). 이들 결과는 인트론 인헨서 활성은 인트론 안의 위치에 전적으로 의존적이었다는 것을 알아낸 UBC 프로모터 단편 인트론의 추적 연구와 일치된다 (Bianchi 등 (2013) PLoS ONE, 8: e65932). 인트론-매개된 강화(intron-mediated enhancement)라고 명명된 이와 같은 행태는 아직 충분히 이해되지 못하였다.
만약 UBC 인트론 서열이 전통적인 인헨서가 아니라면, 이종 최소 프로모터로부터 발현은 증가되지 않아야 한다고 추론하였다. 또한, 상기 인트론 서열이 최소 프로모터의 상류 루시퍼라제 리포터 플라스미드에 전배향 또는 역배향으로 존재하였을 때, CMV 인헨서 서열이 상류에 위치된 플라스미드와는 대조적으로, 루시퍼라제 발현이 배경이상으로 증가되는 것이 관찰되지 않았다(도 12). 사실, 이들 플라스미드로부터의 발현은 최소 프로모터만을 가진 플라스미드로부터의 발현보다 상당히 더 낮았고, 이는 전사 단위 외부에 위치될 때, UBC 인트론 서열이 억압되는 것과 일치한다. 이와 같은 억압 효과(repressive effect)는 인트론 서열이 UBCs 프로모터 형태의 상류에 위치할 때 볼 수 있는 발현 감소를 반영한다 (도 6, 패널 C). 흥미로운 것은, 전배향 또는 역배향의 EEF1A1 인트론 1 경우에도 마찬가지였다 (도 12).
EEF1A1 인트론은 프로바이러스 형태에서 유지되었고, 최대 발현을 지원한다
UBC 프로모터로부터 인트론 상실 관찰은 LVs에서 연장 인자 1 알파 (EEF1A1) 프로모터 단편과 완전히 대조적이었기 때문에, 일시적 형질감염용 발현 벡터를 만들었고, 그리고 EEF1A1 프로모터 단편과 EmGFP 리포터를 갖는 렌티바이러스를 생산하였다. 형질도입된 세포의 gDNA의 PCR 및 ddPCR 분석에서 거의 모든 벡터 형태는 프로모터 안에 인트론을 유지하는 것으로 나타났다 (도 7, 패널 B, 라인 5). 겔 전기영동 이미지의 극단적인 대비 조정은 인트론 상실시 예측되는 길이의 짧은 생성물을 간신히 검출할 수 있지만, 정량적ddPCR 분석은 인트론-결핍된 프로바이러스 형태의 이와 같은 작은 집단을 검출하지 못한다 (도 7, 패널 C). 이와 같은 관찰 및 기존 보고(2)와 일관되게, 일시적 형질감염 (도 7, 패널 D) 및 형질도입 (도 7, 패널 E) 실험에서 상기 인트론-함유 프로모터와 인트론-결핍된 프로모터 간의 발현에 있어서 ~2-배 차이가 관찰되었고, 이것은 EEF1A1 프로모터 요소의 인트론은 거의 모든 경우에 충실하게 전달된다는 것을 암시한다.
인트론 전달의 차이는 프로모터 엑손 서열에 의해 결정된다
우리는 UBC와 EEF1A1 프로모터 간에 인트론 잔류의 차이는 인트론 안에 스플라이싱 효과의 서열 결정군 또는 인트론 안에서 스플라이싱 역학(kinetics) 때문일 것으로 가정하였다. 이를 테스트하기 위하여, 한 프로모터에서 다른 프로모터로 인트론을 교환함으로써, UBC (EEF1A1int) 및 EEF1A1(UBCint) 벡터들이 만들어졌다. 놀랍게도, UBC (EEF1A1int) LV는 EEF1A1 인트론을 상실하였고, 인트론없는 UBCs 벡터와 유사한 수준으로 EmGFP를 발현시켰고, 한편 EEF1A1(UBCint)은 UBC 인트론을 유지하였고, 상기 인트론없는 EEF1A1s 벡터보다 상당히 더 많은 EmGFP를 발현시켰다는 것을 알아내었다 (도 13). 이 결과는 두 프로모터의 별개 엑손 서열이 렌티바이러스 생산 동안 상기 인트론이 유지되는 지를 결정하는 요인임을 암시한다.
발현 카세트 변형은 UBC 양배향성 벡터들의 발현을 최대화시킨다
끝으로, LVs에서 2개의 삽입유전자의 동조적(coordinated) 발현을 매개하는 UBC 프로모터-기반의 양배향성 벡터들로부터 발현 개선을 모색하였다 (Kamata 등 PLoS ONE, 5: e11834; Amendola 등 (2005) Nat. Biotechnol., 23: 108-116). 상기 벡터 디자인은 UBC 프로모터의 센스-스트랜드 배향을 필요로 하기 때문에, 프로바이러스 형태의 대부분이 UBC 인트론을 상실할 것이며, 이중의, 발산성(divergent) UBC와 최소 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터는 UBC-촉진된 삽입유전자와 함께 인트론 봉입으로 인하여 발현 증가가 될 것이라고 추론하였다 (도 8, 패널 A).
안정적으로 형질도입된 293T 세포의 유전적 분석에서, UBC 인트론은 BD 벡터들로부터 시간의 75%가 상실되었으며, 이때 UBC 프로모터는 상기 벡터의 센스 스트랜드 상에 있고, 반면 roBD 벡터들에서 거의 모든 프로바이러스 형태는 UBC 인트론을 보유하는 것으로 드러났다 (도 8, 패널 B). 이것은 안정적으로 형질도입된 세포에서 UBC 프로모터에 의해 구동된 EGFP 발현 증가로 이어졌다 (도 8, 패널 C). 놀랍게도, 상기 인트론은 전통적인 인헨서를 보유하지 않음을 암시하는 발현 데이터에 근거하여, roBD-형질도입된 세포에서 보유된 UBC 인트론에서 최소 CMV 프로모터에 의해 구동된 mCherry 발현 또한 증가되었다.
논의
렌티바이러스 유전자 전달은 최근 임상 유전자 요법 시도로 진출했고, 다수의 성공 사례가 있었으며, 임상적으로 유의적인 부작용 사건은 없었고, 조만간 임상으로 옮겨질 수 있는 많은 전-임상 연구에서 전망을 또한 나타내었다 (Cartier 등 (2009) Science, 326(5954): 818-823; Cavazzana-Calvo 등 (2010) Nature, 467: 318-322; Aiuti 등 (2013) Science, 341(6148): 1233151; Biffi 등 (2013) Science, 341(6148): 1233158; Romero 등 (2013) J. Clin. Invest. 123(8): 3317-3330; Carbonaro 등 (2014) Mol. Ther., 22: 607-622). 추가 장애에 대한 치료법이 개발됨에 따라, 삽입유전자 조절을 위한 다양한 게놈 단편을 지니는 새로운 벡터가 만들어질 것이다. 과거의 프로모터/삽입유전자 조합은 완전한 활성과 조절을 위해 인트론의 존재를 요구했으며, 일부 미래의 디자인도 마찬가지로 이들을 필요로 할 수 있다.
우리의 결과는 벡터 생산 및 형질도입 과정에서 인트론의 상실 가능성은 상이하다는 것을 암시한다. 상기 인간 UBC 프로모터 단편은 대부분의 프로바이러스 형태에서 이의 인트론을 상실하지만, 상기 인간 EEF1A1 프로모터 단편은 유사하게 영향을 받지는 않았다. UBC 인트론의 포함은 스플라이싱 기전의 처리를 회피하기 위하여 삽입유전자의 역전을 요구하지만, 그러나 스플라이스좀에 이론적으로 노출된다 하더라도, EEF1A1 인트론은 거의 모든 프로바이러스 형태에서 유지된다. 하이브리드 CAG 프로모터는 벡터 생산 및 형질도입을 통하여 또한 유지된다는 것이 기존 연구에서 보여주었다 (Ramezani 등 (2000) Mol. Ther., 2: 458-469). 인트론없는 형태의 EEF1A1 프로모터는 아데노신-탈아미노효소-결핍된 심각한 복합 면역결핍 (ADA-SCID) 및 X-연계된 SCID (SCID- X1)의 경우를 위한 임상 시험을 시작하였으며, 치료요법적 효과를 위한 충분한 삽입유전자 발현을 구동할 것이라고 전임상 연구에서 제시되었다. 우리 데이터에서 인트론 1이 함유된 온전한 EEF1A1 프로모터는 미래의 벡터 디자인에 필수적이거나 또는 유익한 증가에 해당되는 거의 2-배 더 높은 삽입유전자 발현을 유도하였다는 것을 보여주었다. 이 벡터로 형질도입된 거의 모든 프로바이러스 형태는 인트론을 상실하지 않았다는 것을 또한 알았다. 전반적으로, 이들 결과는 알려진 또는 알려지지 않은 인트론이 고도의 변이 벡터 형태를 갖는 형질 도입된 세포를 유도할 수 있기 때문에, 레트로바이러스 벡터의 완전한 유전적 특성화의 중요성을 설명한다. 규제 관점에서 제품 특성 분석이 중요한 유전자 치료 영역에서 이러한 변이가 수용될 가능성은 적다.
스플라이스 공여체 또는 수용체 부위를 표적으로 하는 안티센스 RNA는 일차 전사체의 스플라이싱을 방지한다고 보고되었다 (Morcos (2007) Biochem. Biophys. Res. Comm. 358:521-527). 따라서, 렌티바이러스 생산 동안 스플라이스 공여체 또는 스플라이스 수용체 부위에 50 nt 안티센스 서열을 발현시키는 U6-구동 플라스미드를 사용하여 UBC 벡터 게놈의 스플라이싱을 억제하는 시도를 하였다. 불행하게도, 이들 구조체는 단독으로, 또는 조합하여 사용했을 때, 형질 도입시 UBC 벡터로부터 더 높은 발현을 유도하지 못했다 (데이터는 나타내지 않음). 이 전략은 LV가 다른 인트론을 보유하도록 할 수도 있지만, 우리 실험에서 UBC 인트론에는 효과가 없었다. UBC 프로모터 인트론은 이전에 보고된 바와 같이 실제로 발현을 증가시키지만, 인트론 서열 내의 인핸서-유사 활성은 인트론 내부에 이의 배치에 의존적이라는 것을 알았다. 이것은 인트론 서열에 의해 함유된 조절 활성이 유사하게 이동할 수 없는 완전한 활성을 위하여 내인성 인트론을 갖는 삽입유전자를 통합하는 장래의 벡터 디자인에도 필적할 수 있으며, 이때 인트론 서열에 의해 함유된 조절 활성은 유사하게 이동성(mobile)이 아닐 수도 있다. UBC 인트론 서열이 전사 단위 내에 존재할 때 발현에 긍정적 인 효과를 갖지만, 그러나 프로모터의 상류에 위치할 때 부정적인 영향을 미치는 이유를 조사하기 위해 더 많은 연구가 필요하다. 이것은 유전자 요법 및 유전자 조작을 위하여 내인성 유전자 조절과 삽입유전자 조절에 중요한 영향을 미칠 것이다. 중요한 것은, 그러한 인트론은 임상 유전자 치료 임상 시험에서 부작용 및 준임상적 확장을 일으키는 방식으로 부근 프로모터를 아마도 활성화시키지 않기 때문에, 벡터 통합을 위한 상대적으로 안전한 페이로드다(Cavazzana-Calvo 등 (2010) Nature, 467: 318-322; Hacein-Bey Abina 등 (2003) Science, 302: 415-419; Hacein-Bey-Abina 등 (2008) J. Clin. Invest., 118: 3132-3142; Howe 등 (2008) J. Clin. Invest., 118: 3143-3150; Stein 등 (2010) Nat. Med., 16: 198-204).
UBC 인트론 및 EEF1A1 인트론 1은 기본적인(canonical) 스플라이스 공여체, 수용체 및 분기점 부위에 이들의 유착에 있어서 서열 수준에서 눈에 띄는 차이는 없고, 인트론이 교환된 벡터로부터 얻은 우리 데이터에서 인트론 상실의 서열 결정군은 상기 인트론 자체 내부에 있지 않고, UBC 프로모터와 EEF1A1 프로모터의 엑손 서열 안에 있음을 나타낸다. 스플라이싱을 변경시키는 벡터에 대한 잠재적인 변형이 코딩 서열인 대다수의 엑손에서 극적으로 제한되기 때문에, 이것이 일반적으로 사실이라면 애석한 일이다. 생물학적으로 말하자면, 인간 게놈의 엑손은 엑손 스플라이싱 인핸서 뿐만 아니라 엑손 스플라이싱 억제제/사일런서(silencers)를 포함하는 것으로 알려져 있기 때문에, 놀라운 것은 아니다. 이러한 서열은 인간 인트론의 스플라이싱 효율을 제어하며, 대부분은 준최적으로(suboptimally) 한정된다(Zheng (2004) J. Biomed. Sci., 11: 278-294).
이들 인트론 간의 상실 빈도의 차이는 이들이 스플라이싱되는 속도와 관련이 있으며, 이는 주로 엑손 염기 서열에 의해 결정될 수 있다고 우리는 생각한다. 앞으로의 실험은 이 두 유전적 요소의 스플라이싱 역학을 평가할 수 있으며, 이 속도는 인트론 전달과 반비례할 것으로 예측된다. 새로운 연구가 전사체 스플라이싱의 반응 속도와 염색질로부터의 방출을 조사했지만, 상이한 전사체로부터 관찰된 속도 범위의 서열 결정 인자는 여전히 이해되지 않고 있다.(Pandya-Jones 등 (2013) RNA, 19: 811-827). 스플라이싱 역학의 더 나은 이해는 삽입유전자의 발현 동안 효과적인 스플라이싱을 유지하면서, 벡터 입자들에서 인트론-함유 게놈 RNA를 얻는데 충분한 속도로 스플라이싱 속도를 감소시키도록 UBS 프로모터 단편의 변형을 지시하는 것을 수 있다.
실시예 2
인간 조혈성 줄기/조상 세포의 농축은 줄기 세포 유전자 요법을 위한 형질도입을 용이하게 한다.
겸상 적혈구 질환에 대한 자가 조혈성 줄기 세포 (HSC) 유전자 요법은 동종이계 이식과 관련된 주요 면역학적 합병증 없이, 이 질환을 치료할 수 있는 잠재력을 갖는다. 그러나, CD34-농축된 세포 집단을 이용한 b-글로빈 렌티바이러스 벡터들에 의한 형질도입 효과는 준최적이며, 임상 시험을 위하여 상당한 벡터 생산 배취(batches)가 필요할 수 있다. HSC에 대하여 더 농축된 세포 집단의 형질도입은 벡터 필요를 상당히 감소시킬 수 있고, 잠재적으로 형질도입 효과를 증가시킨다. 모든 CD34+ 세포의 ~1%-3%를 포함하는 CD34+/CD38- 세포는 형광-활성화된 세포 분류에 의해 건강한 제대혈 CD34+ 세포로부터 단리되었고, 항-겸상세포생성 형태의 베타글로빈 (CCL-βAS3-FB)을 발현시키는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 단리된 CD34+/CD38- 세포는 CD34+ 세포와 비교하여 연장된 기간의 장기간-배양 (LTC)에 걸쳐 후손을 생성할 수 있고, 대등한 수의 CD34+/CD38- 세포를 함유하는 벌크 CD34+ 조제물과 비교하여 형질도입을 위하여 최대 40-배 적은 벡터를 필요로 하였다. 단리된 CD34+/CD38- 세포의 형질도입은 14일차 정량적 PCR에 의해 측정하였을 때, CD34+ 세포에 필적하며, 벡터 요구가 감소되며, 그리고 CD34+/38- 세포로부터 시작된 LTC의 경우 시간의 경과에 따라 평균 벡터 복사/세포는 더 많이 유지되었다. 시험관 적혈구 분화 후, HBBAS3 mRNA 발현은 CD34+/CD38- 세포 또는 비분획된 CD34+ 세포에서 유래된 배양물에서 유사하였다. 생체내 연구에서 100-배 더 많은 CD34+/CD38+ 세포와 경쟁하여 이식된 경우, 형질도입된 CD34+/CD38- 세포의 대등한 접목(engraftment)을 보여주었다. 이 연구는 HSC 유전자 요법을 위한 벡터의 사용을 현저히 줄이고, 잠재적으로 형질 도입을 향상시키기 위하여, 인간 CD34+/CD38- 세포를 단리하는 것의 유익한 효과에 대한 증거를 제공한다.
개요
조혈성 줄기 세포-기반의 요법은 선천적 그리고 후천적 혈액 세포 질환을 치료할 수 있으며, 최근 임상에서 진전이 이루어지고 있다(Kohn 등 (2013) Biol. Blood Marrow Transplant. 19(suppl 1): S64-S69). 겸상 적혈구 질환 (SCD)은 심각한 급성 질환 및 진행성 기관 손상과 관련된 다중 질환으로써, 심각한 사망률 및 조기 사망으로 이어진다 (Platt 등 (1994) N. Engl. J. Med. 330: 1639-1644). 전 세계적으로 가장 흔한 유전 장애중 하나이며, 미국의 대략 9 만명이 앓고 있다. 현재 치료법은 주로 빈혈과 통증의 증상 치료법으로 구성된다. 히드록시우레아 (HU)는 태아 헤모글로빈 (HbF) 생성을 유도하여 낮은 산소 장력 조건에서 겸상 적혈구 헤모글로빈 (HbS)의 중합을 억제하는 또 다른 선택 치료이며; 그러나, HU는 다양한 이유로 인하여 널리 사용되지 않는다 (Green and Barral (2014) Pediatr. Res. 75: 196-204; Brandow 등 (2013) Am. J. Hematol. 85: 611-613). SCD의 유일한 치료법은 동종이계 조혈성 줄기 세포 이식 (HSCT)이다. 이것은 전형적으로 잘-매칭되는 기증자를 필요로 하며, 장기적 면역억제의 필요성을 동반할 수 있다, 형제 간 일치되는 줄기 세포를 제공받은 성인에서 효과적으로 감소된 강도에 대한 최근 보고가 있어 비록 전망이 있지만, 이식 거부 또는 이식편 대 숙주 질환의 가능성으로, 장기적인 면역 억제의 필요성이 동반될 수 있다(Hsieh 등 (2014) JAMA 312: 48-56).
자가 조혈성 줄기세포 (HSCs)를 이용한 유전자 요법은 동종이계 HSCT에서 나타날 수있는 주요 면역학적 합병증 없이, 잠재적으로 SCD 치료법으로 기대되고 있다(Chandrakasan 등 (2014) Hematol. Oncol. Clin. North Am. 28: 199-216). 마우스와 인간 조혈성 줄기/조상 세포 (HSPC)에 추가될 때 항겸상세포생성 βAS3-글로빈 유전자는 HbF와 유사한 활성을 보유하여, 적혈구 세포 (RBC) 겸상화를 억제하고, SCD 현시를 방지하는 것으로 나타났다 (Levasseur 등 (2003) Blood 102: 4312-4319; Levasseur 등 (2004) J. Biol. Chem. 279: 27518-27524; Romero 등 (2013) J. Clin. Invest. 123: 3317-3330). 그러나, 복잡하고, 상대적으로 큰 인간 β-글로빈 게놈 발현 카세트를 휴대하는 렌티바이러스 벡터들은 낮은 역가를 가지며; 인간 CD34+ HSPC의 형질도입은 겨우 중간수준의 효과가 있고, 상대적으로 상당한 양의 이용되는 벡터를 요구하며, 상대적으로 낮은 유전자 전달을 산출한다 (가령, 세포당 평균 벡터 복사체 수는 0.5-1.0). 농축안된 생산 배취는 ≤106 의 형질도입 단위(TU)의 역가를 산출하고, 임상 규모에서 형질도입을 실행하기 위하여 상당한 용적의 벡터를 필요로 한다. 이상적으로, 바이러스 벡터를 적게 사용하는 방법을 확인하면 높은 벡터 생산 비용을 피할 수 있고, 더 많은 환자를 치료할 수 있다(Logan 등 (2004) Hum. Gene Ther. 15: 976-988).
CD38은 다양한 성숙한 조혈 세포에서 발현되는 유형 II의 막 표면 당 단백질이다. 초기 HSPC 개체군에서 CD38 발현이 낮거나 또는 없고(Hao 등 (1995) Blood, 86: 3745-3753; Hao 등 (1995) Blood, 88: 3306-3313; Albeniz 등 (2012) Oncol . Lett. 3: 55-60) 그리고 원시적(primitive), 다분화능 인간 HSCs의 대부분은 CD34+/CD38- 분획 안에 포함된다(Notta 등 (2011) Science, 333: 218-221). CD34+/CD38- 세포는 단지 ~1%-3%의 CD34+ 세포를 포함하고, 따라서 비분획된 CD34+ 집단보다 HSPC에 대하여 50-100배 더 농축되어 있다. CD34+/CD38- 세포는 장기적 증식 능력과 비분획된 CD34+ 세포를 능가하는 혈액 생산 능력을 보유한다 (Hao 등 (1995) Blood, 86: 3745-3753; Hao 등 (1996) Blood, 88: 3306-3313). 이전 발표된 연구에서 일차 인간 BM CD34+ 세포를 CCL-βAS3-FB LV 벡터로 형질도입시키는 능력이 입증되었는데 (Romero 등 (2013) J. Clin. Invest. 123: 3317-3330) 상대적으로 높은 벡터 농도를 이용하여 중간 수준의 효과를 가졌다. CD34+/CD38- 세포를 단리함으로써, 표준 CD34+ 세포-농축된 분획을 초과하는 HSPC의 추가 정제하면, 체외에서 처리되는 표적 세포의 절대 수가 감소하게 될 것이고, 치료 대상 당 요구되는 훨씬 적은 벡터가 필요할 것으로 추정하였다.
여기에서, 우리는 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)를 이용하여 단리된 인간 제대혈 (CB) CD34+/CD38- 세포는 최대 40-배 적은 바이러스 벡터로 형질도입될 수 있고, 비분획된 CD34+ 세포 집단에서 볼 수 있는 것과 필적하거나 또는 더 높은 벡터 복사체 수 (VCN)를 얻을 수 있다는 것을 보여준다. 이 결과는 CD34+/CD38--농축된 HSPC를 사용하여 SCD의 유전자 요법에서 효능 증가를 위한 HSC의 형질 도입을 개선할 수 있음을 실증한다.
재료 및 방법
벡터들
CCL-βAS3-FB 및 CCL-MND-GFP의 구축은 설명되었다 (Romero 등 (2013) J. Clin. Invest. 123: 3317-3330). CCL-Ubiq-mCitrine-PRE-FB-2XUSE, CCL-UbiqmStrawberry-PRE-FB-2XUSE, 및 CCL-Ubiq-mCerulean-PRE-FB-2XUSE는 CCL 벡터 골격 (Zufferey 등 (1998) J. Virol. 72: 9873-9880), 인간 유비퀴틴 프로모터 (Lois 등 (2002) Science, 295: 868-872), Addgene (Cambridge, MA)에서 구입한 형광 유전자, 최적화된 전사-후 조절 요소 (PRE; (Zanta-Boussif 등 (2009) Gene Ther. 16: 605- 619; Schambach 등 (2006) Gene Ther. 13: 641-645)), 그리고 SV40 폴리아데닐화 인헨서 서열 USE의 2개 텐덤(tandem) 복사체(Schambach 등 (2007) Mol. Ther. 15: 1167-1173)를 이용하여 구축되었다. 렌티바이러스 벡터들은 기술된 바와 같이(Cooper 등 (2011) J. Virol. Meth. 177: 1-9), VSV-G 모의유형(pseudotype)으로 패키지되었고, 농축되었고, 역가측정되었다. CCL-βAS3-FB는 RD114/TR 플라스미드 (Sandrin 등 (2002) Blood 100: 823-832; Bell 등 (2010) Exp. Biol. Med. 234: 1269-1276; Rasko 등 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 2129-2134)를 이용하여 RD-114 모의유형과 함께 패키지 되었고, 그리고 기술된 바와 같이 역가 측정되었다 (Cooper 등 (2011) J. Virol. Meth. 177: 1-9). 농축된 RD114/TR 모의유형 조제물의 경우 2.7 x 107 TU/ml과 비교하였을 때, VSV-G 모의유형의 CCL-βAS3-FB의 상이한 조제물은 300-1,000X 농축 후 6 x 108-6 x 109 TU/ml 의 역가를 보유하였다.
시료 수집
탯줄 CB는 UCLA 메디컬 센터 (로스 앤젤레스)에서 질 분비물과 제왕 절개 후, 태반으로부터 항응고제인 시트르산-인산염-덱스트로오스가 포함된 멸균 수거 튜브로 배혈(drainage of blood)하고, 탯줄을 절단한 후 얻은 것이다. 모든 CB 표본은 캘리포니아 대학이 승인한 지침에 따라 얻었으며, IRB 검토에서 면제된 익명의 의료 폐기물로 간주되었다. 세포는 수집 48 시간 이내에 처리되었다. 단핵 세포 (MNCs)는 Ficoll Hypaque (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada) 밀도 원심 분리를 사용하여 CB로부터 단리되었다. 그 다음 면역자석 컬럼 분리(Immunomagnetic column separation)를 이용하여 4℃에서 30 분 동안 항-CD34 마이크로비드(Miltenyi Biotec, Inc., Bergisch Gladbach, Germany)와 함께 MNC를 배양함으로써, CD34+ 세포를 농축하였다. 상기 세포는 상기 면역자석 컬럼을 통과하고, CD34+ 세포가 수집되었다. CD34+ 세포는 동결 배지 (10% 디메틸 술폭시드 [Sigma Aldrich, St. Louis, MO], 90% FBS)가 포함된 저온 바이알에 넣고, 필요할 때까지 액화 질소에서 저온보존된다.
형광 항체 라벨링 및 CD34 + /CD38 - 세포 분류
CD34+ 세포를 해동하고, 세척하고, 형광-라벨된 항체와 함께 배양하기 위해 인산-완충 염수 (PBS) 75ml에 재현탁시켰다. 희석안된 피코에리트린 (PE) 콘쥬게이트된 항-CD38 (20 ml) 및 희석안된 알로피코시아닌 (APC) 콘쥬게이트된 항-CD34 (5 ml) (모든 항체는 BD Sciences, San Jose, CA의 것임)가 추가되었고, 상기 세포는 암 상태에서 4℃에서 30분간 배양되었다. 배양 후, 세포는 PBS에서 일회 세척되었다. FACS는 FACS Aria II (BD Biosciences)에서 실행되었다.
생존가능한 MNC 집단은 전방 산란 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 착색(Life Technologies, Grand Island, NY)에 의해 게이트화되었다(gated). 게이트화된(gated) 영역은 CD34+ 세포 집단 (도 14, 패널 A)을 특정하는데 이용되었다. P3을 이용하여 F1 CD34+/38- 세포 집단을 특정하였는데, 이 집단은 PE에 대하여 음성인 APC 양성 세포의 2.5%이었다. P5를 이용하여 APC에 양성이며, PE에 음성인 CD34+/CD38+ 세포를 특정하였다. 이러한 게이팅 전략(gating strategies)은 모든 분류 실험에 사용되었다.
렌티바이러스 벡터 형질도입
세포 분류(sorting) 후, CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포는 니트로넥틴 (20 mg/ml 니트로넥틴, Takara Shuzo, Co., Japan)으로 피복된 비조직 배양물 처리된 플레이트의 개별 웰에 밀리리터당 6.3 x 104-7.5 x 105 세포의 밀도로 배치되었다. 선자극(Prestimulation)은 1X L-글루타민/페니실린/스트렙토마이신 (L-Glut/Pen/Strep) (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA), 50 ng/ml의 인간 줄기 세포 인자 (hSCF) (StemGent, Cambridge, MA), 20 ng/ml의 인간 인터루킨-3 (hIL-3) (R&D Systems, Minneapolis, MN), 50 ng/ml의 인간 트롬보포에틴 (R&D Systems), 및 50 ng/ml의 인간 Flt-3 리간드 (Flt-3) (PeproTech, Rocky Hill, NJ))이 함유된 형질도입 배지 (무혈청 X-vivo 15 배지 (Lonza, Basel, Switzerland))에서 37℃, 5% CO2에서 18-24시간 동안 실행되었다. 선자극 후, 원하는 바이러스 벡터 (CCL-βAS3-FB, CCLMND-GFP, mStrawberry, mCerulean, mCitrine 또는 βAS3-FB-RD114)는 명시된 벡터 농도 (다른 언급이 없는 한, 전형적으로 2 x 107 TU/ml)에서 각 웰에 추가되었고, 다시 24시간 동안 37℃, 5% CO2 에서 배양되었다. 그 다음 상기 세포는 세척되었고, 5 ng/ml의 IL-3, 10 ng/ml의 IL-6, 및 25 ng/ml의 hSCF과 함께 기본 골수 배지 (Iscove의 변형된 Dulbecco 배지 (IMDM) (Life Technologies, Grand Island, NY), 1X L-Glut/Pen/Strep, 20% FBS, 0.52% 소 혈청 알부민 (BSA)) 골수 분화를 위하여 37℃, 5% CO2에서 조직 배양물 처리된 플레이트로 이동되었다. 필요에 따라, 14-일 기간에 걸쳐 새로운 배지를 첨가하였다. 배양물에서 14일 후, qPCR 또는 디지털 비말 PCR (ddPCR)을 이용하여 VCN이 결정되었으며 (Hindson 등 (2011) Anal. Chem. 15: 8604-8610) 그리고 형광 리포터 유전자 발현은 유동 세포측정을 이용하여 분석되었다.
장기 기질(Stromal) 배양 및 메틸셀룰로오스 배양물
계획된 CD34+ 세포 분류에 앞서 2일 전, MS5 뮤린 기질 세포 (Suzuki 등 (1991) Leukemia, 6: 452-458)를 해동하고, 10,000 cGy에서 조사하고(irradiated), 그 다음 96-웰 플레이트의 기질 배지 (IMDM [Life Technologies Grand Island, NY], FBS 10%, 2-멀캅토에탄올)에 도말하여(3 x 104 세포/웰), 장기 배양 (LTCs)을 위하여 미리-확립된 기질 층을 만들었다. 분류된(sorted) CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포는 LTC 배지 (10 ng/ml의 인터루킨-3 [IL-3], 50 U/ml의 IL-6, 및 50 ng/ml의 인간 줄기 세포 인자 (hSCF)와 함께, IMDM, 30% FBS, 10% BSA, 2-멀캅토에탄올, 106 mol/l의 히드로코르티손, 1X L-Glut/Pen/ Strep)에서 조사된 기질상에서 공동-배양되었다 (Hao 등 (1996) Blood, 88: 3306-3313: Breems 등 (1998) Blood, 91: 111-117; Koller 등 (1995) Blood, 86: 1784-1793; Bennaceur-Giscelli 등 (2001) Blood, 97: 435-441). 2 내지 4 주 간격으로, 비-흡착 세포 시료는 배양물로부터 제거하였다. 혈구계 (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)로 살아있는 세포를 계수하여 그들의 숫자를 결정되었고, 게놈 DNA는 qPCR을 위하여 하기에서 설명된 바와 같이, Purelink Genomic DNA Mini kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 추출되었다.
분화 및 mRNA 발현 분석
시험관 적혈구 분화 분석은 Douay and Giarratana (2009) Meth. Mol. Biol. 482: 127-140에 근거하여, Romero 등 (2013) J. Clin. Invest. 123: 3317-3330에 의해 변형된 프로토콜에 기초하였다. FACS 단리된 CD34+/CD38- 세포 및 비분획된 CD34+ 세포의 선자극 및 형질도입 후, 상기 세포는 적혈구 배양물로 전달되었다. VCN는 LV 프로바이러스에서 HIV-1 패키징 신호 서열 Psi의 qPCR을 이용하여 분석되었고, 그리고 상기 인간 세포의 보통염색체(autosomal) 유전자 syndecan 4 (SDC4)로 표준화시켜, Cooper 등 (2011) J. Virol. Meth. 177: 1-9에서 설명된 바와 같이, VCN을 산출하였다. HBβAS3 mRNA 발현은 Romero 등 (2013) J. Clin. Invest. 123: 3317-3330에서 이미 기술된 바와 같이 측정되었다.
면역-결핍된 마우스에서 형질도입된 인간 CB CD34 + /CD38 - 세포의 이식
건강한 공여체 CB로부터 비분획된 CD34+, CD34+/CD38+, 및 CD34+/CD38- 세포는 상이한 형광 표지 유전자를 보유한 렌티바이러스 벡터로 2 3x 107 TU/ml (MOI 5-140)에서 별도 형질도입되었다. 허위(mock) 형질도입된 (5 x 105) 세포와 대조 비분획된 형질도입된 CD34+ (5 x 105) 세포는 6-10 주령, 면역-결핍된 NOD.Cg-Prkd scidIl2rgtm1Wjil/SzJ (NSG) 마우스 (Jackson Laboratory, Sacramento, CA)에게 전신 250 cGy 조사(irradiation) 후, 꼬리 정맥 주사를 통하여 개별적으로 이식되었다. CD34+/CD38-와 CD34+/CD38+ 세포는 1:99 비율로 혼합되었고, 2 x 103 CD34+/CD38- 세포와 2 x 105 CD34+/CD38+ 세포는 6-10 주령의 NSG 마우스에게 조사 후, 꼬리 정맥 주사를 통하여 공동-이식되었다.
8-12 주 후, 상기 마우스는 안락사시키고, BM은 Horizon V450-콘쥬게이트된 항-뮤린 CD45 (BD Biosciences)에 대하여 APC-콘쥬게이트된 항-인간 CD45를 이용하여 유동 세포측정을 통하여 인간 세포의 접목(engraftment)에 대하여 분석되었다. 항체 배양 후, RBCs는 BD FACS-용해 용액(BD Biosciences)을 사용하여 용해시켰다. 접목된 인간 세포의 백분율은 %huCD45+/%huCD45+ + %muCD45+ 세포)로 정의되었다. huCD45+ 세포중에서 mCitrine, mStrawberry, 및 mCerulean의 발현은 유동 세포측정을 통하여 분석되었다.
평균 VC/인간 세포는 ddPCR을 이용하여 인간 세포의 양성 접목을 갖는 뮤린 BM 시료에서 측정되었다 (표 4). 1X ddPCR Master Mix (Bio-Rad, Hercules, CA), 모든 벡터를 탐지하기 위하여 HIV-1 Psi 영역에 특이적인, 또는 각 형광 리포터 유전자에 특이적인 프라이머와 프로브 (프라이머와 프로브는 각각 400 nM 및 100 nM), DraI (40 U; New England Biolabs, Ipswich, MA), 그리고 1.1 ml (cfu의 경우 4 ml)의 게놈 DNA 시료를 포함하는 22 ml 용적으로 구성된 반응 혼합물이 준비되었다. Hindson 등 (2011) Anal. Chem. 15: 8604-8610에서 설명된 바와 같이, 비말(droplet) 생성을 실시하였다. 열 사이클링 조건은 95℃ 10 분, 94 ℃ 30 초 및 60 ℃ 1 분 (55 주기), 98 ℃ 10 분 (1 주기), 그리고 12℃ 유지(hold) (표 3)로 구성되었다. 이 유전자의 특이적 증폭 부분을 보통염색체 인간 유전자 SDC4 유전자에 대한 프라이머를 사용하여, NSG 마우스로부터 수집된 골수에 존재하는 인간 세포의 백분율에 대해 표준화하여, 시료 내의 뮤린 세포의 존재를 조정하였다. 실험에 참여한 모든 동물은 UCLA 동물 실험위원회 (The UCLA Animal Research Committee)의 실험실 의학 부서 (Laboratory Medicine Division)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 관리되고 처리되었다.
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저밀도 지단백질 수용체 발현 분석
세포는 수거되었고, 형광 항체 착색 및 세포 분류 단락에서 이미 설명된 바와 같이, 분류되었다. CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포는 37℃, 5% CO2에서 니트로넥틴 (20 mg/ml 니트로넥틴, Takara Shuzo, Co., Japan)으로 피복된 비-조직 배양물 처리된 플레이트의 개별 웰 안의 형질도입 배지에 도말되었다. 배양 24시간 및 48시간 시점에서, 배양 전 세포(0 시간 시점)과 비교하여, 저밀도 지단백질 (LDL) 수용체 발현 분석을 위하여 유동 세포측정을 이용하여 상기 세포는 수거되었다. 상기 세포를 세척하고, 형광-라벨된 항체, 10 ml의 희석안된 APC 콘쥬게이트된 항-인간 LDL 수용체 (R&D System, Minneapolis, MN)와 함께, 배양을 위하여 90 ml의 PBS에 재현탁되었다. 상기 세포는 암 상태에서 30 분 동안 4℃에서 배양되었다. 배양 후, 세포를 PBS에서 한 번 세척한 후, 분석용 LSR Fortessa와 함께 분석하였다. APC-양성 세포는 LDL 수용체의 발현에 대하여 양성으로 간주되었다.
통계학적 분석
실험 조건에 의한 평균 및 SEs와 같은 연속 결과 변수가 도면에 제시되어있다. 쌍방향 비교는 일원(one-way) 또는 이원(two-way) ANOVA 틀 내에서 비쌍체 t-테스트에 의해 수행되었다. 윌콕슨 검정(Wilcoxon rank sum test)에 의한 두 그룹 비교는 정상의 가정이 충족되지 않을 때 수행되었다. 혼합 된 선형 모델을 사용하여 시간 경과에 따라 두 그룹을 비교했다. 유의적 임계치로 .05의 p-값이 사용되었다.
결과
FACS를 이용한 CB CD34 + /CD38 - 세포 단리
면역자석 컬럼을 이용하여 CD34+ 세포에 대하여 건강한 공여체 CB를 농축하였다. 비분획된 CD34+ 세포의 일부분을 유동 세포측정을 사용하여 분류함으로써 CD38 발현에 대하여 최저 2.5%를 갖는 세포로 기능적으로 정의되는 CD34+/CD38- 세포를 단리하였다(도 14, 패널 A). CB 단위로부터 단리된 2.2-6.8 x 106 CD34+ 세포에서 출발하여, 6 x 103- 6 x 104 (평균 = 2.5 x 104) CD34+/CD38- 세포가 단리되었으며, 이는 이론적 산출의 36%-99% 범위를 나타낸다 (n = 11).
장기 배양에 들어갈 때, 비분획된 CD34+ 세포는 1개월에 걸쳐 ~10-배 확장되고, 그 다음 수는 감소된다(도 1B). CD34+/CD38- 세포로 시작된 LTCs는 더 많이 확장되었고 (~100-배), 3개월 이상 안정적인 세포 수를 유지하였으며(도 14, 패널 B), 이는 벌크 CD34+ 세포와 비교하였을 때 더 원시적 CD34+/CD38- 집단의 더 큰 생성 능력을 입증한다.
CB CD34 + 대 CD34 + /CD38 - 세포의 형질도입 평가
건강한 공여체 (n511)의 CB로부터 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포에 CCL-βAS3-FB 렌티바이러스 벡터의 형질도입을 비교하였다. 동일한 용적 안에 대등한 수의 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포를 이용하거나, 또는 상이한 세포 수가 형질도입된 경우, 배양물의 전제 용적을 조정함으로써, 이 실험에서 두 가지 세포 유형에 있어서 세포 밀도 및 벡터 농도, 그리고 그 다음 감염 다중성(MOI)은 일정하여 유지되었다. 콜로니-형성 능력과 VCN을 비교하기 위하여, 형질도입된 세포는 시험관 골수 분화 조건에서 2주의 단기로 배양되거나, 메틸셀룰로오스 콜로니 형성 단위 (CFU) 분석 (14 일)에서 성장되거나, 또는 장기 골수 배양물 (90 일)에 성장되었다.
세포로부터 단리된 게놈 DNA는 평균 벡터 복사체 수/세포 (VCN)를 결정하기 위하여 14일차에 상기 벡터의 HIV-1 psi 영역에 대한 정량(qPCR)을 이용하여 분석되었다. 각 시료에서, CD34+/CD38- 세포의 형질도입은 CD34+ 세포의 형질도입과 대등하거나 또는 더 크다 (표 2). 형질도입된 CD34+/CD38- 세포로부터 생성된 세포는 형질도입된 CD34+ 배양물 (n = 11, p = .02)의 1.25 ± 0.28과 비교하였을 때, 상당히 더 높은 2.43 ± 0.41의 VCN을 보유하였다 (도 15, 패널 A).
CD34+ 세포 및 CD34+/ CD38- 세포에 의해 형성된 콜로니 유형은 상이하지 않았다 (도 15, 패널 B). 비-형질도입된 CD34+ (NT-CD34+)는 25.7%, 형질도입된 CD34+는 24.3%, 그리고 메틸셀룰로오스에 도말된 형질도입된 CD34+/38- 세포는 22.3%의 콜로니가 형성되었다 (도 15, 패널 C). CCL-βAS3-FB 벡터 서열을 탐지하고 정량화하기 위하여 개별 CFU의 qPCR에서 CD34+/CD38- 세포 (73.8%, 평균 VCN = 2.12)로부터 형질도입된 콜로니-형성 조상의 비율은 CB CD34+ 세포 (56.2%, 평균 VCN = 1.75) (각 n = 80 콜로니)와 비교하여 더 높다는 것이 실증되었다 (도 15, 패널 D) (p = .52). CD34+/38- 세포에서 형성된 CFU는 비분획된 CD34+ 세포로부터 형성된 것 (36.2%)과 비교하였을 때, 1-2 VC/세포를 갖는 콜로니 비율이 훨씬 높게(47.5%) 나타났다 (도 15, 패널 D).
2 x 106 내지 2 x 107 TU/ml의 형질도입 동안 다양한 벡터 농도를 이용하여, 인간 CB CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포를 형질도입시키기 위한 CCL-βAS3-FB 벡터의 상대적 능력을 검사하기 위하여 벡터 분량-반응 실험이 실행되었다. 이들 두 세포 집단 모두에서 벡터 농도를 증가시킬 때, 14일 시점에서 유전자 전달에서 분량-관련 증가 (qPCR에 의해 측정된 VCN)를 볼 수 있었다(도 15, 패널 E). 그러나, 테스트된 모든 벡터 농도에서 VCN 결과는 CD34+ 세포보다 CD34+/CD38- 세포 (6.6 x 106 TU/ ml에서 p = .05, 2 x 107 TU/ml에서 p = .002 )에서 더 높았고; 따라서 상당히 더 낮은 농도의 바이러스 벡터 (2 x 106 TU/ml)를 CD34+/CD38- 세포를 형질도입하는데 이용할 수 있으며, 그리고 더 높은 벡터 농도 (2 x 107 TU/ml)의 CD34+ 세포에서 수득된 형질도입 수준에 여전히 대등하다 (도 15, 패널 E).
형질도입된 CB CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포 (n = 3)는 MS5 기질 세포 상에서 LTC로 90일 동안 성장되었고, 그리고 VCN을 위하여 몇 군데 시점에서 세포 시료가 분석되었다 (도 15, 패널 F). 각 시점에서, 비분획된 CD34+ 집단의 배양물과 비교하였을 때(0.3-0.6) (p = 0.0004), CD34+/CD38- 세포의 배양물에서 VCN이 더 높았고 (1.6-2.3), 이는 통계학적으로 유의적인 시간 경향 차이가 있다(p =.03).
CD34+/CD38- 세포에서 시작된 LTCs는 CD34+ 세포에서 시작된 배양물과 비교하였을 때, 점점 더 증가되는 더 높은 콜로니-형성 세포를 보유하였다. LTC 30일 시점에서, NT CD34+ 세포 배양물내 세포의 0.05%, 형질도입된 CD34+의 0.04% 그리고 메틸셀룰로오스에 도말된 형질도입된 CD34+/38- 세포의 0.13% (p < 0.0001)는 콜로니를 만들었다 (도 20). LTC 60일 시점에서, NT CD34+ 세포로부터 유래된 세로의 0.0017%, 형질도입된 CD34+의 0.0025%, 그리고 메틸셀룰로오스에 형질도입된 CD34+/CD38- 세포의 0.0067%가 콜로니를 만들었다(도 21).
CD34+ 세포로 시작된 것보다 CD34+/CD38- 세포로부터 시작된 배양물에서 더 높은 비율의 형질도입된 콜로니-형성 조상이 또한 존재하였다. ddPCR을 이용하여 LTC 30일 시점에서 분석하였을 때, CD34+/CD38- 세포로부터 형성된 83.7% (평균 VCN52.3)는 비분획된 CD34+ (도 20)의 배양물로부터 유래된 개별 CFU의 77.3% (평균 VCN = 2.2)와 비교하였을 때, CCL-βAS3-FB 벡터에 양성이었다. 60일 시점에서, 비분획된 CD34+ 세포는 단지 3개의 콜로니를 만들었는데, 이중 하나의 VCN은 0.5이었고, 다른 2개는 VCN이 0이었다. CD34+/CD38- 세포에서 22개의 CFU가 형성되었는데, 16 (88.8%)개가 CCL-βAS3-FB 벡터에 양성이었다 (평균 VCN = 1.52) (도 21).
CCL-βAS3-FB 벡터이외의 벡터로 CD34+/CD38- 세포의 더 높은 형질도입이 발생할 수 있는 지를 확인하기 위하여, 고역가 녹색 형광 단백질 (GFP)-발현하는 LV 벡터 (CCL-MND-GFP)에 의한 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포의 형질도입 효과가 이들 분량 반응 실험에서 평가되었다. 이들 두 세포 집단은 2 x 106, 6.6 x 106, 및 2 x 107 TU/ ml (각각 차례로 MOI = 4, 40, 및 400)의 농도의 CCL-MND-GFP LV 벡터로 동일한 세포 농도에서 형질도입되었다. 다시, 이들 두 세포 집단 모두에서 벡터 농도를 증가시킬 때, 14일 시점에서 유전자 전달에서 분량-관련 증가 (ddPCR에 의해 측정된 VCN)를 볼 수 있었다(도 16, 패널 A). 6.6 x 106 및 2 x 107 TU/ml의 벡터 농도에서, CD34+ 세포보다는 CD34+/CD38- 세포에서 결과 VCN이 더 높았다(6.6 x 106 TU/ml에서 CD34+ 평균 VCN = 2.25 ± 0.15 vs. 1.36 ± 0.05; 그리고 2 x 107 TU/ml에서 4.32 ± 0.6 vs. 3.37 ± 0.07, p = .02). 14일 시점에서, 유동 세포측정을 이용하여 GFP 발현 세포의 백분율이 결정되었고 (도 16, 패널 B), 그리고 CD34+/CD38- 세포의 경우 45%-97%와 비교하였을 때, CD34+ 세포에서 45% 내지 81% 범위였고(도 16, 패널 C), 이는 통계학적으로 상이하지 않았다, p = 0.29.
CB CD34 + /CD38 - 세포의 시험관내 적혈구 분화
CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포의 형질도입 후, CCL-βAS3-FB 벡터에 의한 βAS3-글로빈 발현을 비교하기 위하여, β-글로빈 유전자 카세트에 의한 발현을 뒷받침하는 성숙 RBCs를 만들기 위하여, 형질도입된 세포를 시험관내 적혈구 분화 모델 (Douay and Giarratana (2009) Meth. Mol. Biol. 482: 127-140)에 넣었다. 상기 벡터로부터 HBβAS3 전사체와 전체 b-글로빈-유사 전사체 (내생성 HBB 및 HBβAS3)를 모두 특이적으로 정량화하기 위하여, 벡터 발현을 정량적 역 전사효소 중합효소 쇄 반응(qRT-PCR) 으로 측정하였다. 건강한 CB 공여체로부터 얻은 CD34+/CD38- 및 CD34+ 세포에 CCL-βAS3-FB LV 벡터를 형질도입시키고, 대조 시료로는 허위 형질도입된 것을 사용하였다. 24 시간 후, 상기 세포는 27일 동안 적혈구 세포로 분화되었다. 상기 분화 종료 시점(27일 차)에서 적혈구 막 당단백질 GpA에 대한 항체와 DNA 라벨링 형광 염료, DRAQ5로 이중 착색을 통하여 제핵 RBCs가 확인되었다. 제핵 RBCs는 GpA+/DRAQ5- 으로 특정되었다(도 22). 최종 세포 수, 분화 표지, 그리고 제핵(enucleation) 백분율은 두 세포 집단 간에 유사하였는데, 비분획된 CD34+ 세포로부터 제핵 적혈구는 52.6% ± 1.06%이며, 그리고 CD34+/CD38- 세포의 경우 52.7% ± 1.08% 범위였다 (p = .87).
CD34+ 세포의 후손과 비교하였을 때, CD34+/CD38- 세포의 적혈구 후손에 더 높은 VCN이 존재하였다. 배양 2주 시점에, CD34+/ CD38- 세포의 배양물은 CD34+ 세포의 평균 VCN 1.84 ± 0.44와 비교하여, 평균 VCN 3.08 ± 0.71을 보유하였다 (n = 3, p = .26) (도 17, 패널 A).
CCL-βAS3-FB LV로 형질도입되고, 적혈구 분화 배양물 분석 14일 차에 수거된 세포는 qRT-PCR를 이용하여 이들의 HBβAS3 mRNA 발현이 평가되었고, 그리고 내생성 성인 HBB mRNA의 발현과 비교하였다. 모든 배양물에서 발현 수준은 유사하였다; HBβAS3 mRNA 수준은 CB CD34+ 세포 배양물의 45.4% ± 16.7%와 비교하였을 때, CB CD34+/38- 세포의 배양물 내 적혈구 세포에서 전체 HBB-유사 mRNA는 55.2% ± 18.1%이며 (p = 0.59) (도 17, 패널 B), 이것은 건강한 그리고 SCD 골수 CD34+ 세포에서 CCL-βAS3-FB LV를 이용한 기존 연구에서 보고된 양과 유사한 것이다 (Romero 등 (2013) J. Clin. Invest. 123: 3317-3330).
선자극 및 형질도입 후 LDL 수용체 발현 평가
VSV-G-모의유형 벡터들에 대한 최근에 확인된 세포 수용체 (Finkelstein 등 (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110: 7306-7311), 인간 LDL 수용체의 차이가 CD34+ 세포와 비교하였을 때, CD34+/CD38- 세포의 더 효과적인 형질도입에 역할을 하는지를 평가하였다. APC 항-인간 LDL 수용체 항체로 착색되고, 그 다음 다시 다중 사이토킨이 있는 형질도입 배지에서 24시간과 48시간 후 (시점은 차례로 선자극 및 형질도입의 종료에 상응함) 새로운 CB CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포에서 LDL 수용체 발현을 분석하기 위하여 유동 세포측정을 이용하였다.
새로운 CD34+ 세포는 새로운 CD34+/CD38- 세포의 4.8%와 비교하여 LDL 수용체를 발현하였다(7.9%) (도 18, 패널 A, D). 24 시간 시점에서, CD34+/CD38- 세포의 74.6%와 비교하였을 때, LDL 수용체를 발현하는 CD34+ 세포는 ~91%이었다 (도 18, 패널 B, 18, 패널 E). 48 시간 시점에서, CD34+ 세포의 99%, 그리고 CD34+/CD38- 세포의 90%에서 LDL 수용체가 발현되었다 (도 18, 패널 C, F). LDL 수용체의 기하 평균 형광 광도는 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포에서 유사하였다 (차례로 1.6 x 103-3 x 103 및 1.5 x 103-3.5 x 103). 새로운 CD34+ 및 CD34+/CD38- 세포는 LDL 수용체를 발현하는 백분율이 유사하게 낮았고, 그것은 선자극 및 형질도입에 사용된 조건 하에서 배양에 의해 이들 세포에서 동등하게 유도되었다. 따라서, LDL 수용체 발현의 차이가 CD34+/CD38- 세포의 더 나은 형질도입의 이유는 아니었다.
RD114 레트로바이러스 외피 모의유형화된 LV
CD34+/CD38- 세포의 개선된 형질도입이 VSV-G 외피(envelope)와 특이적으로 관련되어 있는 지를 확인하기 위하여, RD114 레트로바이러스 외피 (Sandrin 등 (2002) Blood 100: 823-832; Bell 등 (2010) Exp. Biol. Med. 234: 1269-1276)를 이용하여, 대체적 모의유형(pseudotype)을 갖는 CCL-βAS3-FB LV 배취(batch)를 만들었다. RD114-모의유형화된 CCL-βAS3-FB LV 벡터로 형질도입되고, 그 다음 14일간 배양된 CD34+/CD38- 세포는 동일한 조건에서 형질도입되고, 분석된 CD34+ 세포와 비교하였을 때, 더 높은 평균 VCN (0.86 ± 0.46)을 보유하였다 (0.006 ± 0.05, n = 3) (도 18, 패널 G). 따라서, CD34+/CD38- 세포의 더 높은 형질도입이 VSVG 모의유형에 특이적인 것은 아니다.
생체내 CD34 + /CD38 - 세포의 접목 가능성 평가
기존 연구는 FACS에 의해 단리된 D34+/CD38- 세포의 형질도입을 비분획된 CD34+ 세포와 비교하였다. 후속 연구를 위하여, 우리는 CD34+/CD38- 세포와 CD34+/ CD38+ 세포의 형질도입 및 접목 가능성을 비교하였는데, 이들 두 세포는 동일한 비분획된 CD34+집단으로부터 FACS에 의해 단리되었다. 각 집단은 상이한 형광 리포터 유전자 (CCLc-UBC-mCitrine-PRE-FB-2XUSE LV, CCLc-UBC-mCerulean-PRE-FB-2XUSE LV, 및 CCLc-UBC-mStrawberry-PRE-FB-2XUSE LV 벡터들)를 휴대하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 이 결과들이 상기 벡터에 의해 영향을 받지 않음을 확인하기 위하여, 각 세포 분획을 형질도입시키는데 이용된 벡터는 각 연구에서 대체되었다 (n = 3). 형질도입된 CD34+, CD34+/CD38+, 그리고 CD34+/CD38- 세포는 이들의 적절한 생리학적 비율 (99% CD34+/CD38+ 세포 + 1% CD34+/CD38- 세포; 또는 100% CD34+ 세포)에서 NSG 마우스로 이종이식되었다(xenotransplant). 형질 도입 조건은 시험관내 분석에 사용된 것과 동일하였으며, 세포는 형질 도입 24 시간 후 바로 이식하였다. 각 마우스는 (a) NT CD34+ 세포 (허위), (b) 형질도입된 CD34+ 세포 (대조), 또는 (c) 형질도입된 CD34+/CD38+ 및 형질도입된 CD34+/CD38- 세포의 조합 (테스트)로 구성된 총 세포 분량 5 x 105의 세포를 제공받았으며, 이때 각 세포는 "충전제(fillers)"로 조사된 (10,000 cGy) CD34- 세포와 혼합되었다(표 5). 상기 마우스는 이식 한 후 80-90 일 시점에 안락사시키고, 골수를 채취하여 유동 세포 측정에 의한 인간 세포의 접목을 분석하고 그리고 접목된 세포의 VCN을 측정하였다. 접목 백분율은 전체 CD45+ 집단 (뮤린 CD45+ + 인간 CD45+)에서 인간 CD45+ 세포의 백분율로 정의되었다. 인간 접목된 마우스의 BM은 이용된 형광 표지 및 ddPCR에 근거하여, 인간 접목된 세포 안에 존재하는 상이하게 형질도입된 세포 분획 백분율을 확인하기 위하여 유동 세포측정으로 추가 분석되었다.
각 6마리 마우스로 구성된, 총 18마리의 이식 마우스 (5마리는 허위 [NT CD34+ 세포], 4 마리는 대조군 [형질도입된 CD34+ 세포], 9마리는 테스트 마우스 [형질도입된 CD34+/38+ 와 형질도입된 CD34+/38- 세포의 혼합물])에서 3가지 생체내 마우스 이식이 실행되었다 (표 5). 형질도입된 세포의 일부는 시험관에서 2 주 동안 성장되었고, VCN을 위하여 분석되었다 (표 4). ddPCR 프라이머와 프로브는 각 형광 표지 유전자들을 특이적으로 탐지하도록 기획되었다 (표 3). 모든 벡터들을 측정하기 위하여 HIV-1 Psi 영역 프라이머를 이용하여 시험관 배양 2주 후에 분석된 형질도입된 세포의 시료에서 형질도입에 이용된 벡터(mCitrine, mStrawberry, mCerulean) 와 무관하게, 비분획된 CD34+ 세포 (VCN = 2.19 ± 0.47) 또는 CD34+/ CD38+ 세포 (VCN = 1.66 ± 0.36)보다 더 높은 VCN (6.89 ± 0.75)을 보유하였다(표 4). 18마리의 전체 마우스 중에서, 14마리는 BM 수거 시점에서 성공적으로 접목된 인간 CD45+ 세포를 보유하였다 (도 23). 접목된 마우스중에서, 마우스 번호 1, 6, 및 7은 오직 허위-형질도입된 인간 CD34+ 세포만을 제공받았다. 대조 마우스 번호 8, 9, 12는 단일 벡터로 형질도입된 CD34+ 세포를 제공받았다. 마우스 번호 2, 3, 4, 5, 10, 11, 13, 및 14는 상이한 벡터들로 형질도입된 CD34+/CD38- 및 CD34+/CD38+ 세포 (1:99 세포 비율)의 테스트 혼합물을 제공받았다. 전반적으로, 비분획된 CD34+ 세포와 비교하여 CD34+/CD38- 세포에서 접목이 더 잘 되는 경향이 있었다 (p = .06).
Figure pct00008
8마리 접목된 테스트 마우스의 경우, 6마리 마우스(번호 2, 3, 4, 5, 11, 및 14)는 상기 벡터-라벨된 CD34+/CD38- 세포의 접목이 더 높았고, 1 마리 마우스 (#10)에서는 CD34+/ CD38+ 와 CD34+/CD38- 세포는 대등한 접목을, 그리고 1 마리 마우스 (#13)에서는 CD34+/CD38+ 접목이 더 높았다 (도 19, 패널 A, 도 23). 이식된 벌크 CD34+ 세포 또는 분획된 CD34+/CD38- 및 CD34+/CD38- 세포에 의한 전반적인 유전자 표지 수준은 상이하지 않았고 (표 6), 따라서, 형질도입된 CD34+/CD38- 세포는 비분획된 CD34+ 또는 CD34+/CD38+ 세포보다 대략적으로 100-배 더 강력하게 접목되었다.
Figure pct00009
단일 벡터로 형질도입된 벌크 CD34+ 세포가 이식된 2마리 마우스의 VCN은 12 및 6이며, HIV-1 Psi 영역 프라이머를 이용하여, 또는 형광 표지-특이적 프라이머를 이용하여 유사한 값이 측정되었다. CD34+/CD38+ 및 CD34+/CD38- 세포의 혼합물이 이식된 마우스에서 2개 벡터들을 표지하는 유전자는 유사한 수준 (차례로 3.60 ± 0.26 및 2.17 ± 0.15)을 나타내었고, 각 마우스에서 2개의 개별 벡터에 대한 VCN의 합은 Psi 영역 프라이머를 이용하여 측정된 전체 VCN에 유사하였다 (도 19, 패널 B).
논의.
줄기 세포 유전자 요법은 SCD을 비롯한 다중 질환 치료용 임상으로 진출되고 있다. SCD에 유익하기 위해서, 형질도입은 이 질환의 병태생리를 변경하는데 효과적이어야 하는데, 충분한 βAS3-글로빈이 발현되도록 충분한 수의 형질도입된 HSC를 가져야 한다. 임상 규모의 HSC 형질도입은 이를 테면 삽입된 βAS3-글로빈 유전자를 운반하는 크고, 복합적인 유전자 카세트는 더욱 어려운 도전적인 과정이 될 수 있다. CCL-βAS3-FB LV 벡터를 인간 CD34+ HSPC에 형질도입하는 것은 실증되었지만(Romero 등 (2013) J. Clin. Invest. 123: 3317-3330), 이 바이러스 벡터의 준최적 비농축된 역가로 인하여, SCD의 RBC 질환 현시를 교정하기 위하여 접목 HSC에 유전자 전달 수준을 달성하기 위하여 상당한 용적의 바이러스 벡터가 요구된다. 이러한 이유들로 인하여, 효과적인 접목 능력을 가지고, 필적하는 유전자 형질도입 효과를 얻기 위하여 적은 양의 바이러스 벡터를 사용하여 형질도입될 수 있는 대체 세포 집단이 매력적이다. 현재까지 몇 가지 연구에서 CD34+/CD38- 세포는 LV 벡터들로 형질도입될 수 있는데, 그 이유는 이들 벡터가 c-레트로바이러스와 달리, 활발하게 분화되지 않는 세포를 형질도입시킬 수 있기 때문이다 (Case 등 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 2988-2993; Geronimi 등 (2003) Stem Cells, 21: 472-480; Guenechea 등 (2000) Mol. Ther. 1: 566-573). 그러나, 유전자 요법을 위하여 형질도입되고, 접목되는 CD34+/CD38- 세포의 능력은 임상-등급 시약 및 대규모 GMP 세포 분류로 인하여 분석되지 않았다.
형질도입에 더 적은 양의 바이러스를 이용하면서, SCD에 대한 유전자 요법으로 이들 세포의 잠재적 적합성을 평가하기 위하여, 인간 CB CD34+/CD38- 세포를 연구하였다. 우리 연구는 CB로부터 단리된 CD34+/CD38- 세포는 렌티바이러스 벡터를 형질도입하기 쉽고, CD34+ 세포와 비교하여 필적되는 또는 더 높은 유전자 전달을 획득하는데 상당히 더 적은 양의 바이러스 벡터를 필요로 한다는 것을 보여주었다. 중요한 것은, 콜로니-형성 조상의 클론 분석에서 벌크 CD34+ 표적과 비교하였을 때, CD34+/CD38- 집단을 표적으로 하면, 일정한 분획을 형질도입하기보다는 더 많은 벡터 복사체수를 가지고, 형질도입 백분율이 더 높은 것으로 나타났다. 이상적으로, 임상적 적용은 효능을 더 높이기 위하여 유사하게 더 높은 백분율의 형질전환된 HSC를 유도해야 할 것이고, 그리고 안정성을 더 높이기 위하여 형질도입된 세포당 VCN를 제한해야 할 것이다.
흥미로운 것은, NSG 마우스에서 생체내 이식 연구에서 CD34+/CD38- 세포는 대응하는 CD34+/CD38- 세포보다 접목이 대략 100-배 더 강력하였으며, 기본적으로 대등한 접목 결과(engraftment contributions)를 가진다. CD34+/CD38+ 및 CD34+/CD38- 세포로부터 유래된 세포를 이들의 형광 표지에 근거하여 걸러내기 위하여 접목된 NSG 마우스의 골수로부터 충분한 인간 세포를 획득하지 못하였고, CD34+/CD38- 세포의 접목된 후손에서 벡터 복사체 수가 더 많은 지를 결정하기 위하여, 시험관에서 볼 수 있는 것과 같이, 직접적으로 세포당 절대적 VCNs를 측정할 수 없을 것이다. 오히려, CD34+/CD38- 세포 또는 CD34+/CD38+ 세포를 표지하는데 이용되는 특이적 형광 리포터 유전자를 정량화하기 위하여 접목된 NSG 마우스로부터 전체 골수 세포로 ddPCR을 실행하였고, 상기 인간 골수 세포 함량에 대하여 표준화하였고, 그리고 이식된 99% CD34+/CD38- 에서와 마찬가지로, 1% CD34+/CD38- 세포에 의한 조혈에 유사한 공헌을 보여주었다. 그러나, 골수에서 CD34+/CD38- 세포를 표지하는데 이용된 상기 벡터의 더 높은 평균 VCN의 결여는 높은 VCN이 형질도입된 HSC에 세포독성이 되며, 그리고 접목에 대한 기여가 감소될 수 있음을 보여주는 것일 가능성이 있다.
전반적으로, 본 명세서에서 보여준 SCD 유전자 요법에 대한 특정 장점에 부가하여, 이러한 발견으로 HSC를 이용한 유전자 요법에 대한 임의의 접근방식에 적용할 수 있을 것이다. 유전자 요법에서 CD34+/CD38- 세포를 이용하면, 이종-이식 연구에서 우리가 관찰한 사실에 근거하여 볼 때, 표적 세포를 형질도입하기 위하여 더 적은 양의 벡터를 사용하면서도, 여전히 적절한 접목을 얻을 수 있을 것이다. 이러한 발견은 CD34+/CD38- 세포의 우수한 접목 능력을 실증하는 다른 연구들과 일치한다 (Case 등 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 2988-2993; Geronimi 등 (2003) Stem Cells, 21: 472-480; Guenechea 등 (2000) Mol. Ther. 1: 566-573; Haas 등 (2000) Mol. Ther. 2: 71-80).
최근의 공개 문헌은 모의유형 렌티바이러스 벡터에 가장 흔히 이용되는 수포구 식염 바이러스 (VSV)에 대한 주요 수용체로써 LDL 수용체를 기술하고 있다 (Finkelstein 등 (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110: 7306-7311). LDL 수용체 발현이 CD34+/CD38- 세포에서 더 높았다면, 상기 세포에 결합하여, 이 세포 안으로 취입되고, 종국에는 게놈 안에 통합되어, 더 높은 VCN을 보여줄 가능성이 있는 더 많은 벡터의 가능성이 있다. 비분획된 CD34+ 와 CD34+/CD38- 세포 집단에서 LDL 수용체의 발현을 분석할 때, 사이토킨으로 자극 후, 형질도입을 위한 시간에 상응하는 48시간 후 휴지상태에(at rest) 그리고 상대적으로 대등한 발현 유도에서 LDL 수용체를 발현하는 세포는 거의 없었다. 따라서, VSV-G 모의유형화된 벡터에 대한 수용체의 더 많은 발현은 CD34+/CD38- 세포의 증가된 형질도입 기전일 것 같지는 않다.
RD-114 레트로바이러스 외피 단백질로 모의유형화된 CCL-βAS3-FB LV 벡터로 이들 두 세포 집단에 형질도입될 때, CD34+ 세포와 비교하여, CD34+/CD38- 세포의 형질도입이 더 높았다. 이러한 결과는 상이한 외피 단백질의 사용에도 불구하고, CD34+/CD38- 세포의 형질도입에 대한 민감성 증가가 관찰된 것을 보강한다 (Sandrin 등 (2002) Blood 100: 823-832; Bell 등 (2010) Exp. Biol. Med. 234: 1269-1276; Rasko 등 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 2129-2134).
본 명세서에 기술된 실시예 및 구체예들은 단지 설명을 목적으로 한 것이며, 이에 대한 다양한 수정 또는 변경이 당업자에게 암시될 수 있으며, 이런 것들은 본원의 사상 및 범위 그리고 첨부된 청구범위 내에 포함될 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원의 참고자료에 편입된다.

Claims (70)

  1. 재조합 레트로바이러스 벡터로서,
    상기 벡터는 인간 유비퀴틴 C (UBC) 프로모터와 다중 클로닝 부위를 함유하며, 상기 벡터 안에서 상기 UBC 프로모터는 역 배향으로 있고, 이로써 상기 프로모터로부터의 전사 배향은 상기 벡터의 5' 긴 말단 반복부 (LTR) 쪽으로 향하고, 상기 다중 클로닝 부위에 삽입된 핵산을 전사하도록 하는, 재조합 레트로바이러스 벡터.
  2. 재조합 레트로바이러스 벡터로서,
    상기 벡터는 삽입유전자에 작동가능하게 연결된 인간 유비퀴틴 C (UBC) 프로모터를 포함하며, 상기 프로모터와 상기 삽입유전자는 역 배향으로 있고, 이로써 상기 프로모터로부터의 상기 삽입유전자의 전사 배향은 상기 벡터의 5' 긴 말단 반복부 (LTR) 쪽으로 향하도록 하는, 재조합 레트로바이러스 벡터.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 인간 유비퀴틴 C 유전자 UCSC 인간 게놈 서열 형태 hg19 마이너스 스트랜드 유래의, 대략적으로 위치 125398318 내지 대략적으로 위치 125399530의 단편을 함유하거나 또는 이로 구성된, 벡터.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터 안에 있는 인트론은 레트로바이러스 패키징 동안 상실되지 않는, 벡터.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 역배향으로 있는 폴리아데닐화 신호를 함유하는, 벡터.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호 (polyA)는, 전체 벡터 서열에 대하여, 상기 프로모터의 5'인, 상기 프로모터의 3'에 삽입되는, 벡터.
  7. 청구항 5 또는 청구항 6에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열, 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, 토끼 β-글로빈 유전자 폴리아데닐화 신호, 인간 포진 바이러스 (HSV) 폴리아데닐화 신호, 티미딘 키나제 (TK) 유전자 폴리아데닐화 신호, 그리고 기존 게놈으로부터 유도된 또는 가상으로 기획되고, 합성된 다른 신호들로 구성된 군에서 선택된, 벡터.
  8. 청구항 5 또는 청구항 6에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열 또는 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, 벡터.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 비-역전진 배향의(non-reversed orientation) UBC 프로모터를 갖는 동일한 벡터와 비교하였을 때, 일시적으로 형질 감염되고(transfected), 안정적으로 형질도입된 세포주에서 적어도 약 2-배 증가된 발현을 제공하는, 벡터.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 비-역전진 배향의 UBC 프로모터를 갖는 동일한 벡터와 비교하였을 때, 형질도입된 일차 세포(primary cells)에서 적어도 약 4-배 증가된 발현을 제공하는, 벡터.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터는 HIV-1 렌티바이러스 벡터, HIV-2 렌티바이러스 벡터, 알파레트로바이러스 벡터, 말 감염성 빈혈증 바이러스 (EIAV) 렌티바이러스 벡터, MoMLV 벡터, X-MLV 벡터, P-MLV 벡터, A-MLV 벡터, GALV 벡터, HEV-W 벡터, SIV-1 벡터, FIV-1 벡터, 및 SERV-1-5 벡터로 구성된 군에서 선택되는, 벡터.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터는 HIV-1 기반의 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  14. 청구항 12 또는 청구항 13에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 TAT-독립적이며, 그리고 자가-비활성화(SIN)의, 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 양배향성 벡터인, 벡터.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 3' LTR에서 절연체를 더 포함하는, 벡터.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 절연체는 FB (FII/BEAD-A), 77 bp의 절연체 요소를 포함하며, 이는 닭 β-글로빈 5' DnaseI-과민성 부위 4 (5' HS4)의 최소 CTCF 결합 부위 인헨서-차단 구성원들을 함유하는, 벡터.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 ψ 영역 벡터 게놈 패키징 신호를 포함하는, 벡터.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 Rev 반응 요소 (RRE)를 포함하는, 벡터.
  20. 청구항 1 내지 19중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 중심 폴리퓨린 트랙(central polypurine tract)을 포함하는, 벡터.
  21. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 해독-후 조절 요소를 포함하는, 벡터.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 해독후 조절 요소는 변형된 우드척(Woodchuck) 해독-후 조절 요소 (WPRE)인, 벡터.
  23. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 재조합을 통해 야생형 렌티바이러스를 재구성 할 수 없는, 벡터.
  24. 청구항 2 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 상기 UBC 프로모터에 작동가능하게 연결된 삽입유전자를 포함하며, 상기 삽입유전자는 SCID, 겸상 적혈구 질환, 리포좀 축적 질환, 낭포성 섬유증, 근이영양증, 페닐케톤뇨증, 파킨슨 병 및 혈우병으로 구성된 군에서 선택된 병리의 치료를 위한 유전자 산물을 발현하는, 벡터.
  25. 청구항 2 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 유전자 산물을 발현하는, 벡터: 아데노신 탈아미노효소 (ADA), IL-2 수용체 감마 (IL-2Rγ), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 (PNP) 유전자, Janus 키나제-3 (JAK3), Artemis 유전자, 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈 유전자, Factor VIII, Factor IX, CFTR, 전장의 또는 짧아진 디스트로핀, ABCD1 유전자, TH, AADC, 및 GCH1, 아스파르틸글루코사미니다제, α-갈락토시다제 A, 팔미토일 단백질 티오에스테라제, 삼펩티딜 펩티다제, 리소좀성 막통과 단백질, 시스테인 전달체, 산 세라미다제, 산-α-L-퓨코시다제, 보호성 단백질/카텝신 A, 산 β-글루코시다제, 산 β-갈락토시다제, 이듀로네이트-2-술파타제, α-L-이듀로니다제, 갈락토세레브로시다제, 산 α-만노시다제, 산 β-만노시다제, 아릴술파타제 B, 아릴술파타제 A, N-아세틸갈락토사민-6-술페이트, 산 β-갈락토시다제, N-아세틸글루코사민-1 -포스포전달효소, 산 스핑고미엘리나제 (aSM), NPC-1, α-글루코시다제, β-헥소사미니다제 B, 헤파란 N-술파타제, α-N-아세틸글루코사미니다제, 아세틸-CoA:α-글루코사미니드, N-아세틸글루코사민-6-술페이트, α-N-아세틸갈락토사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니다제, α-뉴라미다제, β-글루코로니다제, β-헥소사미니다제 A, 산 리파제.
  26. 청구항 24에 있어서, 상기 삽입유전자는 ADA-SCID 치료용 아데노신 탈아미노효소 (ADA)를 발현하는, 벡터.
  27. 청구항 24에 있어서, 상기 삽입유전자는 X-SCID 치료용 IL-2 수용체 감마 (IL-2Rγ) 유전자/cDNA를 발현하는, 벡터.
  28. 청구항 24에 있어서, 상기 삽입유전자는 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈 유전자를 발현하는, 벡터.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈 유전자는 상기 인간 β-글로빈 유전자 5' 프로모터와 상기 인간 β-글로빈 3' 인헨서의 제어하에 엑손 및 인트론이 함유된 약 2.3 kb의 재조합 인간 β-글로빈 유전자를 포함하는, 벡터.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 β-글로빈 유전자는 IVS2로부터 375 bp의 RsaI 결손을 갖는 β-글로빈 인트론 2, 및 HS2, HS3, 및 HS4를 포함하는 합성(composite) 인간 β-글로빈 좌(locus) 제어 영역을 포함하는, 벡터.
  31. 청구항 1 내지 23 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 바이러스 입자.
  32. 청구항 2 내지 23 중 어느 한 항에 따른 벡터로 형질도입된 숙주 세포.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포인, 숙주 세포.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 세포는 골수로부터 유래된 줄기 세포인, 숙주 세포.
  35. 청구항 33에 있어서, 상기 세포는 배아 또는 배아 조직으로부터 유래되지 않은 줄기 세포인, 숙주 세포.
  36. 청구항 32에 있어서, 상기 세포는 293T 세포인, 숙주 세포.
  37. 청구항 32에 있어서, 상기 세포는 인간 조혈성 조상 세포인, 숙주 세포.
  38. 청구항 37에 있어서, 상기 인간 조혈성 조상 세포는 CD34+ 세포인, 숙주 세포.
  39. 청구항 37에 있어서, 상기 인간 조혈성 조상 세포는 CD34+/CD38- 세포인, 숙주 세포.
  40. 청구항 2 내지 23 중 어느 한 항에 따른 벡터로 형질감염된 줄기 세포 및/또는 조상 세포와 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하고, 하기 컬럼 A에서 나타낸 병리 치료용 조성물로써,
    상기 벡터는 하기 컬럼 B에 나타낸 상기 병리 치료를 위한 하나 또는 그 이상의 삽입유전자를 함유하는, 조성물:
    Figure pct00010

    Figure pct00011
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 조성물은 ADA-SCID의 치료용이며, 그리고 상기 삽입유전자는 아데노신 탈아미노효소 (ADA)를 발현하는, 조성물.
  42. 청구항 40에 있어서, 상기 조성물은 X-SCID 치료용이며, 그리고 상기 삽입유전자는 IL-2 수용체 감마 (IL-2Rγ)를 발현하는, 조성물.
  43. 청구항 40에 있어서, 상기 조성물은 겸상 적혈구 질환 치료용이며, 그리고 상기 삽입유전자는 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈 유전자를 발현하는, 조성물.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈 유전자는 상기 인간 β-글로빈 유전자 5' 프로모터와 상기 인간 β-글로빈 3' 인헨서의 제어하에 엑손 및 인트론을 포함하는, 약 2.3 kb의 재조합 인간 β-글로빈 유전자를 포함하는, 조성물.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 β-글로빈 유전자는 IVS2로부터 375 bp RsaI 결손을 갖는 β-글로빈 인트론 2, 및 HS2, HS3, 및 HS4를 포함하는 합성 인간 β-글로빈 좌 제어 영역을 포함하는, 조성물.
  46. 청구항 40 내지 45중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 CD34+ 세포인, 조성물.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 숙주 세포는 CD34+/CD38- 세포인, 조성물.
  48. 하기 컬럼 A에 나타낸 병리에 대하여 대상을 치료하는 방법으로서,
    청구항 2 내지 23 중 어느 한 항에 따른 벡터로 형질감염된 상기 본 조상세포 또는 줄기 세포를 상기 대상에게 도입시키는 단계를 포함하되,
    상기 벡터는 하기 컬럼 B에 나타낸 상기 병리 치료를 위한 하나 또는 그 이상의 삽입유전자를 포함하는, 방법:
    Figure pct00012

    Figure pct00013
  49. 청구항 48에 있어서, 상기 방법은 ADA-SCID의 치료용이며, 그리고 상기 삽입유전자는 아데노신 탈아미노효소 (ADA)를 발현하는, 방법.
  50. 청구항 48에 있어서, 상기 방법은 X-SCID 치료용이며, 그리고 상기 삽입유전자는 IL-2 수용체 감마 (IL-2Rγ)를 발현하는, 방법.
  51. 청구항 48에 있어서, 상기 방법은 겸상 적혈구 질환 치료용이며, 그리고 상기 삽입유전자는 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈 유전자를 발현하는, 방법.
  52. 청구항 51에 있어서, 상기 항-겸상세포생성 인간 β-글로빈 유전자는 상기 인간 β-글로빈 유전자 5' 프로모터와 상기 인간 β-글로빈 3' 인헨서의 제어하에 엑손 및 인트론을 포함하는 약 2.3 kb의 재조합 인간 β-글로빈 유전자를 포함하는, 방법.
  53. 청구항 52에 있어서, 상기 β-글로빈 유전자는 IVS2로부터 375 bp RsaI 결손을 갖는 β-글로빈 인트론 2, 및 HS2, HS3, 및 HS4을 포함하는 합성 인간 β-글로빈 좌 제어 영역을 포함하는, 방법.
  54. 청구항 48 내지 53중 어느 한 항에 있어서,
    상기 도입은
    상기 대상으로부터의 줄기 세포 및/또는 조상 세포를 상기 벡터로 형질도입시키는 것; 및
    상기 형질도입된 세포 또는 이로부터 유래된 세포를 상기 대상에게 이식하는 것으로서, 상기 세포 또는 이로부터 유래된 유도체가 상기 삽입유전자를 발현하는, 상기 이식
    을 포함하는, 방법.
  55. 청구항 48 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 조상 세포인, 방법.
  56. 청구항 48 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포인, 방법.
  57. 청구항 48 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 골수로부터 유래된, 방법.
  58. 청구항 48 내지 57 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 CD34+ 세포인, 방법.
  59. 청구항 58에 있어서, 상기 세포는 CD34+/CD38- 세포인, 방법.
  60. 청구항 48 내지 59 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 상기 대상으로부터 유래된, 방법.
  61. 재조합 렌티바이러스로 개선된 형질도입을 제공하는 세포 집단으로서,
    상기 세포 집단은 CD34+/CD38- 세포에 대해 농축된, 세포 집단.
  62. 청구항 61에 있어서, 상기 CD34+/CD38- 세포는 혈액 또는 골수로부터 유도된, 세포 집단.
  63. 청구항 61 또는 청구항 62에 있어서, 상기 CD34+/CD38- 세포는 삽입유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡터로 형질감염된, 세포집단.
  64. 청구항 63에 있어서, 상기 CD34+/CD38- 세포는 HIV-1 렌티바이러스 벡터, HIV-2 렌티바이러스 벡터, 알파레트로바이러스 벡터, 말 감염성 빈혈증 바이러스 (EIAV) 렌티바이러스 벡터, MoMLV 벡터, X-MLV 벡터, P-MLV 벡터, A-MLV 벡터, GALV 벡터, HEV-W 벡터, SIV-1 벡터, FIV-1 벡터, 및 SERV-1-5 벡터로 구성된 집단으로부터 선택된 레트로바이러스 벡터로 형질도입되는, 세포 집단.
  65. 청구항 63에 있어서, 상기 CD34+/CD38- 세포는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된, 세포 집단.
  66. 청구항 65에 있어서, 상기 CD34+/CD38- 세포는 TAT-독립적인, 그리고 자가-비활성화(SIN)의, 렌티바이러스 벡터로 형질도입된, 세포 집단.
  67. 청구항 63 내지 66 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삽입유전자는 표 1에 열거된 병리 치료용 삽입유전자인, 세포 집단.
  68. 청구항 63 내지 66 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삽입유전자는 ADA, IL-2γR, 또는 항겸상세포생성 유전자를 암호화하는, 세포 집단.
  69. 청구항 63에 있어서, 상기 세포는 CCL-βAS3-FB LV로 형질감염된, 세포 집단.
  70. 줄기 세포 또는 조상 세포의 형질도입을 개선시키는 방법으로서,
    CD34+/CD38-세포에 대해 농축된 줄기 세포 또는 조상 세포 집단의 상기 형질도입을 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
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