CN112195195A - 慢病毒包装载体与包装方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体而言,涉及一种慢病毒包装载体与包装方法。该慢病毒包装载体,沿病毒基因组表达方向设置有位于上游的第一LTR和位于下游的第二LTR,所述第一LTR和所述第二LTR之间具有反向插入的基因表达盒;所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子、目的基因和多腺苷酸化信号;当有阻遏物存在时,所述阻遏型操作子阻遏所述目的基因的表达。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体而言,涉及一种慢病毒包装载体与包装方法。
背景技术
慢病毒载体(Lentivirus)是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体,是逆转录病毒的一种,基因组是RNA,其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达,具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒基因组进入细胞后,在细胞浆中反转录为DNA,形成DNA整合前复合体,进入细胞核后,DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA,回到细胞浆中,表达目的蛋白;或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定,并随细胞基因组的分裂而分裂。
目前慢病毒载体的研究都集中在感染能力、特异性、包装容量等方面,而对于包装的目的基因(gene of interest,GOI)对于病毒的影响关注很少,在实践中,有相当一部分目的基因由于自身表达会干扰慢病毒的包装过程,是无法获得有效的慢病毒颗粒。另一方面,在慢病毒载体中,因为病毒包装过程中会经过转录的过程,而circRNA等包含重要剪接位点的外源基因在包装过程中会有大比例的剪接发生,从而使最终的病毒颗粒中的外源基因序列发生缺失。目前也没有针对这种情况的有效解决方法。
发明内容
本发明涉及一种慢病毒包装载体,沿病毒基因组表达方向设置有位于上游的第一LTR和位于下游的第二LTR,所述第一LTR和所述第二LTR之间具有反向插入的基因表达盒;
所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子、目的基因和多腺苷酸化信号;
当有阻遏物存在时,所述阻遏型操作子阻遏所述目的基因的表达;
所述目的基因为需要精确终止表达的基因。
根据本发明的再一方面,本发明还涉及一种慢病毒包装载体系统,其能产生只有一次感染能力而无复制能力的HIV载体颗粒,并包含如上所述的慢病毒包装载体。
根据本发明的再一方面,本发明还涉及一种慢病毒的包装方法,所述方法将包含如上所述的慢病毒包装载体系统转入宿主细胞,并于所述阻遏物存在的前提下进行包装。
在慢病毒载体中是不能够出现正向PolyA信号,PolyA信号会使得病毒RNA的转录提前终止,进而严重的影响病毒的滴度。因此,慢病毒载体不适合用于表达需要精确终止表达的基因,例如Pol II启动子启动的长链非编码RNA,会因为不能及时终止而使LncRNA带上大段的载体序列(例如WPRE),从而影响LncRNA的生物学功能,再比如circRNA等包含重要剪接位点的外源基因构建到慢病毒载体中,会在病毒RNA生成过程中发生剪接而丢失外源基因申请人发现,反向表达框可以避免PolyA信号导致的病毒RNA的转录提前终止,可以使LncRNA有效终止,同时对于circRNA反向表达框也可以使其剪接位点不再发挥作用从而保证基因完整性,但由于反向表达框与病毒RNA的转录冲突的缘故(可能是由于反向表达框的启动子的转录过程与病毒RNA的转录冲突,或者是反向转录出来的RNA和正向转录出来的会形成双链RNA,从而影响病毒包装),因而也无法有效的实现需要精确终止表达的基因在慢病毒中的包装。
本发明创造性的将阻遏型操作子调控系统应用于反向PolyA慢病毒载体,可以实现反向表达框慢病毒病毒高效的包装。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1~图5依次为本发明一个实施例中pcDNA3.1-CymR、CMV-CuO、EF1a-CuO、SFH-CuO、CAG-CuO载体的质粒图谱;
图6为本发明一个实施例中CymR-CuO在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果;
图7为本发明一个实施例中CMV- TrpO 质粒图谱;
图8为本发明一个实施例中色氨酸操作子系统在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果;
图9为本发明一个实施例中EF1a- ToxO质粒图谱;
图10为本发明一个实施例中白喉毒素抑制子调控系统在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果;
图11为本发明一个实施例中SFH- LacO质粒图谱;
图12为本发明一个实施例中乳糖操作子系统在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果;
图13为本发明一个实施例中TrpO元件相对于CMV的TATA Box的插入位置示意图;
图14为本发明一个实施例中TrpO元件不同插入位置对阻遏效率的影响;
图15为本发明一个实施例中CuO元件相对于CMV的TATA Box的插入位置示意图;
图16为本发明一个实施例中CuO元件不同插入位置对阻遏效率的影响;
图17~图19依次为本发明一个实施例中pSLenti-TK PolyA-mCherry-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE、pSLenti-TK PolyA-mCherry-CuO-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE、pSLenti-TK PolyA-mCherry-TrpO-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE载体的质粒图谱;
图20为本发明一个实施例中阻遏型操作子提高反向表达框的慢病毒载体的表达效率结果的荧光图;
图21为本发明一个实施例中阻遏型操作子提高反向表达框的慢病毒载体的滴度结果的统计图;
图22为本发明一个实施例中反向表达框的慢病毒载体不同PolyA信号序列对滴度影响结果的荧光图;
图23为本发明一个实施例中反向表达框的慢病毒载体不同PolyA信号序列对滴度影响结果的统计图;
图24为本发明一个实施例中pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS载体图谱;
图25为本发明一个实施例中pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV- hsa_circ_0008285载体图谱;
图26为本发明一个实施例中感染和转染293T的荧光图片;
图27为本发明一个实施例中hsa_circ_0008285表达情况的统计图;
图28为本发明一个实施例中反向表达框的慢病毒载体表达hsa_circ_0008285基因的结果图;
图29为本发明原理示意图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
因此,旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述,而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及一种慢病毒包装载体,沿病毒基因组表达方向设置有位于上游的第一LTR和位于下游的第二LTR,所述第一LTR和所述第二LTR之间具有反向插入的基因表达盒;
所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子、目的基因和多腺苷酸化信号;
当有阻遏物存在时,所述阻遏型操作子阻遏所述目的基因的表达;
所述目的基因为需要精确终止表达的基因。
在本发明中术语“载体(vector)”是指,可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体优选为质粒,但并不限于此。
在一些实施方式中,所述目的基因用于表达Pol II启动子表达的非编码RNA。
在一些实施方式中,所述目的基因用于表达snRNA、lncRNA、amiRNA或circ-RNA。
在一些实施方式中,所述多腺苷酸化信号为TK PolyA和/或SV40 PolyA V2。
在一些实施方式中,所述阻遏型操作子选自色氨酸操作子和/或Cumate-CuO可调控系统。
在一些实施方式中,所述阻遏型操作子具有一个或多个拷贝。
在一些实施方式中,所述氨酸操作子中的TrpO元件在所述基因表达盒的插入位置距离所述启动子的TATA BOX 小于等于18个核苷酸,例如17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个核苷酸。
在一些实施方式中,所述Cumate-CuO可调控系统中的CuO元件的插入位置距离所述启动子的TATA BOX 40~50个核苷酸,例如41、42、43、44、45、46、47、48、49个核苷酸。
上述阻遏型操作子元件和启动子的TATA BOX之间的距离是指该元件的5’端的第一个核苷酸(不含)到TATA BOX 3’端的第一个核苷酸(不含)的核苷酸个数。
需要说明的是,一般认为TATA BOX后8个核苷酸以内(含第8个核苷酸)都属于启动子核心区域。所以优选TrpO元件与启动子的TATA BOX之间的距离大于8个核苷酸,当该元件与该8个核苷酸有重叠序列时可以距离TATA BOX更近。
“启动子”为指导RNA聚合酶结合并由此启动RNA合成的DNA序列。本发明所使用的启动子允许在各种各样的细胞和组织类型中表达;或者可以为无细胞特异性启动子,或者可为“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子,其允许分别在种类受限的细胞和组织类型中表达。在具体实施方案中,可取的是使用细胞、细胞类型、细胞谱系或组织特异性表达控制序列,以实现所需多核苷酸序列的细胞类型特异性、细胞谱系特异性或组织特异性表达(例如,仅在细胞类型、细胞谱系或组织的子群中或在特定发育阶段表达编码多肽的核酸)。
组织特异性启动子的示例性实例包括但不限于:B29启动子(B细胞表达)、runt转录因子(CBFa2)启动子(干细胞特异性表达)、CD14启动子(单核细胞表达)、CD43启动子(白细胞和血小板表达)、CD45启动子(造血细胞表达)、CD68启动子(巨噬细胞表达)、CYP4503A4或ALB启动子(肝细胞表达)、肌间线蛋白启动子(肌肉细胞表达)、弹性蛋白酶I启动子(胰腺泡细胞表达)、内皮糖蛋白启动子(内皮细胞表达)、成纤维细胞特异性蛋白I启动子(FSPl)启动子(成纤维细胞表达)、纤连蛋白启动子(成纤维细胞表达)、fms-相关的酪氨酸激酶I(FLTl)启动子(内皮细胞表达)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(星形胶质细胞表达)、胰岛素启动子(胰腺细胞表达)、整合蛋白-α-2b(ITGA2B)启动子(巨核细胞)、胞内粘着分子2(ICAM-2)启动子(内皮细胞)、干扰素-β (IFN-β)启动子(造血细胞)、角蛋白5启动子(角化细胞表达)、肌红蛋白(MB)启动子(肌肉细胞表达)、成肌分化I (MYOD1)启动子(肌肉细胞表达)、肾病蛋白启动子(足细胞表达)、骨γ-羧基谷氨酸蛋白2(OG-2)启动子(成骨细胞表达)、3-酮酸CoA转移酶2B(Oxct2B)启动子(单倍体精细胞表达)、表面活化蛋白B(SP-B)启动子(肺细胞表达)、突触蛋白启动子(神经细胞表达)、Wiskott-Aldrich综合征蛋白(WASP)启动子(造血细胞表达)。
在一些实施方式中,所述启动子为无细胞特异性的启动子。示例性的无细胞特异性的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)极早期启动子,病毒性猿猴病毒40 (SV40)(例如,早期或晚期)、莫罗尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子,劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子,牛痘病毒的H5、P7.5和Pll启动子,延长因子l-α (EFla)启动子,早期生长应答I (EGRl)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、3_磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、真核生物翻译起始因子4 A 1 (EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5 (HSPA5)、热休克蛋白90kDa-β成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人R0SA26 基因座(Irions et al., (2007) Nature Biotechnology25, 1477-1482)、泛激素 C 启动子(UBC),磷酸甘油酸激酶-1 (PGK)启动子,巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子,以及β-肌动蛋白启动子。无细胞特异性的启动子能使得所述基因表达盒具有更好的通用性及表达效率。
在一些优选的实施方式中,所述启动子是强启动子。
在一些优选的实施方式中,所述启动子是CMV、EF1a、SFH、CAG、CBh、UBC、SFFV、SV40、RSV、mCMV、GAPDH、PGK、CASI、SMVP、GUSB (hGBp)或UCOE。
在一些实施方式中,所述慢病毒包装载体还包含报告基因、增强子、内部核糖体进入位点和终止子中的至少一种。
根据本发明的再一方面,本发明还涉及一种慢病毒包装载体系统,其能产生只有一次感染能力而无复制能力的HIV载体颗粒,包含如上所述的慢病毒包装载体。
在一些实施方式中,所述慢病毒包装载体系统为二质粒、三质粒或四质粒包装系统。
在一些实施方式中,所述HIV载体颗粒为HIV-1或HIV-2载体颗粒。
根据本发明的再一方面,本发明还涉及一种慢病毒的包装方法,所述方法将包含如上所述的慢病毒包装载体系统转入宿主细胞,并于所述阻遏物存在的前提下进行包装。
在一些实施方式中,所述宿主细胞为哺乳动物细胞或禽类动物细胞。
在一些实施方式中,所述宿主细胞还可以为鱼类细胞或两栖类动物细胞,例如公开号CN105018527A,公开日 2015.11.04的发明专利所示技术方案。
在一些实施方式中,所述宿主细胞为啮齿类动物细胞,例如大鼠、小鼠、仓鼠。
在一些实施方式中,所述宿主细胞为灵长类动物细胞,优选为人。
在一些实施方式中,所述宿主细胞为原代细胞,例如肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等。
在一些实施方式中,所述宿主细胞为细胞系;
常见的细胞系例如:
来源于人的细胞系:
293、IMR-90、W1-38、A549、A431、BHL-100、BeWo、Caco-2、Chang、HCT-15、HeLa、HEp-G2、HEp-2、HT-1080、HT-29、JEG-2、MCF7、KB、Saos-2、WI-38、WISH、WS1、HUVEC、EB-3、Raji、IM-9、Daudi、H9、HL-60、Jurkat、K-562、U937、KG-1;
来源于小鼠的细胞系:
McCoy、BALB/3T3、3T6、A9、AtT-20、Clone M-3、I-10、Y-1、WEHI-3b、ES-D3、F9;
来源于仓鼠的细胞系:
BHK-21、HaK、CHO-K1;
来源于大鼠的细胞系:
AR42J、BRL3A、Clone 9、H4--Ⅱ-E-C3、GH1、GH3、IEC-6、L2、XC、LLC-WRC 256、Jensen、Rat2(TK-)、PC12、L6;
来源于其他动物的细胞系:
D-17、BT、MARC-145、CV-1、COS-1、COS-3、COS-7、Vero、B95-8、CRFK。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1 慢病毒的包装和滴度检测
一、慢病毒包装
利用慢病毒载体进行病毒包装的方法,具体包括:
1、转染前一天,将293T细胞接种到培养皿中;转染前一小时取出细胞培养皿,弃去原有细胞培养基,加入Opti-MEM培养基,将细胞放回培养箱;制备转染试剂和质粒的复合物,包括以下步骤:
2、将待转染的病毒载体质粒(骨架质粒pCAG-gagpol、包膜蛋白质粒pHCMV-VSVG和穿梭质粒)溶于Opti-MEM培养基,轻轻混匀,静置后得到质粒稀释液;所述骨架质粒为pCAG-gagpol、pCAG-gagpol-CMV-CymR或pCAG-gagpol-CMV-TrpR;包膜蛋白质粒为pHCMV-VSVG、pHCMV-VSVG-CMV-CymR或pHCMV-VSVG-CMV- TrpR。
3、将转染试剂溶于Opti-MEM培养基,轻轻混匀,静置后得到转染试剂稀释液;将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中,边加边轻轻混匀后在室温放置15-25min,使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体;取出细胞培养皿,将准备好的DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养皿中,放回培养箱;
4、5-8小时后吸去培养基,用PBS溶液洗涤后加入新鲜完全培养基培养,其中色氨酸操作子组(pSLenti-TK PolyA-mCherry-TrpO-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE)需更换含有0.3mM色氨酸的完全培养基。
5、转染48小时后,第一次收毒,收集培养基至50ml离心管中,并给细胞更换新鲜的完全培养基。转染72小时后,第二次收毒,收集培养基至50ml离心管中,丢弃细胞。
6、将收集的培养上清,用离心机3500rpm,10min,室温离心后,上清倒入新的50ml离心管;用超速离心机30,000rpm,4℃离心2小时后,小心地弃去上清,离心管倒扣在灭菌过的吸水纸上,加入DPBS重悬沉淀,收集到1.5ml EP管中,-80℃冰箱保存。
二、慢病毒滴度检测
慢病毒滴度检测方法,具体包括:
采用Real time定量PCR法测定慢病毒滴度,具体步骤如下:
制备样品:按1×105细胞每孔接种293T细胞于24孔板;第二天加入病毒,12~20小时后更换新鲜培养基;感染后72小时拍照记录荧光,后收取细胞抽取基因组DNA并做定量PCR实验测定滴度。
Real-time PCR 在ABI7500仪器上完成。使用试剂SYBR Master Mixture来自TAKARA公司。
1.按下列比例配置反应体系:
SYBR premix ex taq:10 μl;
ROX:0.4μl;
上游引物(25μM):0.5μl;
下游引物(25μM):0.5μl;
Genomic DNA:2.0μl;
水6.6μl;
2.设定程序为两步法Real-Time定量。预变性95℃,15S,之后每一步变性95℃,5S,退火延伸60℃,34S,共进行40个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。
PCR程序为:
Cycle 1:(1×)
Step 1:95.0 ℃ for 00:15;
Cycle 2:(40×)
Step 1:95.0 ℃ for 00:05
Step 2:60.0 ℃ for 00:34;
启用数据收集和实时分析。
3.制作熔解曲线。PCR 结束后,在95℃变性1min。然后冷却至55℃,使DNA 双链充分结合。从55℃开始到95℃,每一步增加0.5℃,保持30S,同时读取吸光值。
制作溶解曲线程序为:
Cycle 3:(1×)
Step 1:95.0 ℃ for 01:00;
Cycle 4:(1×)
Step 1:55.0 ℃ for 01:00;
Cycle 5:(81×)
Step 1:55.0 ℃-95.0 ℃ for 00:30
循环2次后将设定点温度提高0.5 ℃。
实施例2 阻遏型操作子的选择
本发明共测试了4种转录调控系统:CymR-CuO、色氨酸操作子、白喉毒素抑制子调控系统、乳糖操作子。
一、首先通过在慢病毒载体上引入这四个系统的顺式作用元件,测试是否在真核系统中有抑制外源基因表达的效果。
1. CymR-CuO系统
CymR -CuO系统是一类可调控的表达系统。其原理如下:
CymR蛋白在Cumate(枯酸)不存在的情况下,可以特异性的和CuO元件结合,从而抑制基因的转录。在Cumate存在的情况下,结合了Cumate的CymR将脱离CuO元件,从而使基因正常表达。
本发明构建了CMV-CuO、EF1a-CuO、SFH-CuO、CAG-CuO一系列启动子载体,证实了CuO元件配合CymR载体(pcDNA3.1-CymR)可以有效抑制基因的表达。其中pcDNA3.1-CymR的质粒图谱如图1所示,CMV-CuO、EF1a-CuO、SFH-CuO、CAG-CuO启动子载体的质粒图谱依次如图2~5所示。
将带有CuO原件的慢病毒载体分别与pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-CymR共转293T细胞,24小时后荧光拍照,可以看到,在CymR蛋白的作用下,CMV-CuO、EF1a-CuO、SFH-CuO、CAG-CuO启动子的表达效率均有明显的抑制(图6)。
2. 色氨酸操作子系统
在Trp repressor(TrpR)蛋白在色氨酸存在的情况下,可以特异性的和TrpO元件结合,从而抑制基因的转录。该系统在原核细胞中发现,长期以来用作基因调控的讲解示范,但是由于哺乳动物细胞培养中色氨酸是必须的,所以该系统并没有在真核细胞中得以应用。
本发明构建了CMV-TrpO、EF1a-TrpO、SFH-TrpO、CAG-TrpO等一系列启动子载体,证实了TrpO元件配合TrpR载体(pcDNA3.1-TrpR)在色氨酸的存在下可以有效抑制基因的表达。其中CMV- TrpO 质粒图谱如图7所示,EF1a-TrpO、SFH-TrpO、CAG-TrpO启动子载体的质粒图谱的设计方式可在图7的基础上参考图2~5,不再赘述。
带有TrpO原件的载体分别与pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1- TrpR共转293T细胞,同时添加0.3mM的色氨酸,24小时后荧光拍照,可以看到,在TrpR蛋白的作用下,CMV-TrpO、EF1a-TrpO、SFH-TrpO、CAG-TrpO启动子的表达效率均有明显的抑制(图8)。
3. 白喉毒素抑制子调控系统
白喉毒素抑制子DtxR蛋白可以特异性的和ToxO元件结合,从而抑制基因的转录。本发明构建了CMV-ToxO、EF1a-ToxO、SFH-ToxO、CAG-ToxO等一系列启动子载体,分别与pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-DtxR共转293T细胞并加入二价铁离子的情况下,没有发现目的基因受到明显的抑制作用(图10)。
其中EF1a- ToxO的质粒图谱如图9所示,CMV-ToxO、SFH-ToxO、CAG-ToxO启动子载体的质粒图谱的设计方式可在图9的基础上参考图2~5,不再赘述。
4. 乳糖操作子系统
乳糖操作子抑制蛋白LacI可以特异性的和LacO元件结合,从而抑制基因的转录。在IPTG存在的情况下则与之结合并发生构象变化,丧失结合能力,下游基因开始表达。乳糖操作子在原核细胞中广泛用于外源基因的诱导表达。
本发明构建了CMV-LacO、EF1a-LacO、SFH-LacO、CAG-LacO等一系列启动子载体,分别与pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-LacI共转293T细胞,没有发现目的基因受到明显的抑制作用(图12)。
其中SFH- LacO的质粒图谱如图11所示,CMV- LacO、EF1a- LacO、CAG- LacO启动子载体的质粒图谱的设计方式可在图11的基础上参考图2~5,不再赘述。
二、阻遏型操作子元件的插入位置优化
1. TrpO元件
TrpO元件相对于CMV的TATA Box距离不同,发明人设计了两个启动子,如图13所示,质粒配合pcDNA3.1-TrpR共同转染(加入0.1mM色氨酸),48小时后观察荧光,实验显示,距离TATA Box的位置不同,会产生不同的抑制效果(见图14),本发明后续均使用抑制效果更好的TrpO v2启动子序列。
2. CuO元件
CuO元件相对于CMV的TATA Box距离不同,设计了3个启动子,如图15所示,质粒配合pcDNA3.1-CymR共同转染,48小时后观察荧光,实验显示,CuO元件距离TATA Box的位置不同,会产生不同的抑制效果(见图16),本发明后续均使用抑制效果更好的CuO v1启动子序列。
实施例3 阻遏型操作子提高反向表达框的慢病毒载体的病毒滴度
如果慢病毒存在反向表达框,因为反向的表达框存在,病毒RNA很少被转录出来,这样病毒滴度非常低。
本实施例的分别构建pSLenti-TK PolyA-mCherry-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE(图17)、pSLenti-TK PolyA-mCherry-CuO-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE(图18)、pSLenti-TK PolyA-mCherry-TrpO-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE(图19)载体,使用CMV-CuO和CMV-TrpO启动子反向表达框,在慢病毒包装中使用CymR或者TrpR和色氨酸,配合抑制蛋白的表达,可以有效解决反向表达框出毒低的问题(实验结果的荧光图如图20所示,慢病毒滴度统计图如图21所示)。
这种表达构架很适合LncRNA,miRNA,circRNA等基因的过表达。
实施例4 反向表达框的慢病毒载体不同PolyA信号序列对滴度影响
根据我们实验结果,反向表达框慢病毒载体中,即使无反向PolyA的存在也能够很好的表达反向基因,推测在慢病毒载体cPPT序列下游的tttatt序列可能起到了PolyA信号的作用。但是反向表达框的目的就是能够更精确的控制转录,所以加入不影响滴度的反向PolyA,及时终止反向表达框的转录具有重要意义,利用CuO-cumate系统,我们在反向表达框慢病毒载体上放置了8种不同的PolyA信号,除了bGH PolyA和short bGH PolyA对慢病毒滴度有较大的影响,其余载体病毒滴度均优于或者与无PolyA的反向表达框慢病毒载体载体持平。其中 TK PolyA和SV40 PolyA V2表现最为出色,能够在反向表达框的慢病毒载体中提供更好的病毒滴度表现(实验结果的荧光图如图22所示,慢病毒滴度统计图如图23所示)。
实施例5 反向表达框的慢病毒载体表达hsa_circ_0008285基因
在病毒生产中我们发现hsa_circ_0008285基因构建到普通慢病毒载体中,得到的慢病毒颗粒检测不到hsa_circ_0008285基因的正常表达。具体的,发明人在pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS空载体(载体图谱如图24所示)的基础上构建了pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV- hsa_circ_0008285载体(载体图谱如图25所示),该载体正向插入hsa_circ_0008285基因,且不具有阻遏型操纵子。pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS空载体与pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV- hsa_circ_0008285载体分别包装慢病毒,包装完的慢病毒经滴度检测后,按照MOI(感染复数)为5分别感染293T细胞;同时pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS和pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV- hsa_circ_0008285质粒利用lipo2000分别转染293T细胞,分组方式为:空载体-病毒组(病毒空白对照组)、hsa_circ_0008285-病毒组(病毒表达组)、空载体-质粒组(质粒空白对照组)和hsa_circ_0008285-质粒组(质粒表达组);感染或者转染48h后,使用荧光显微镜拍荧光照片,荧光图片结果如图26所示,pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS和pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV- hsa_circ_0008285病毒感染和质粒转染组绿色荧光均表达正常。感染或者转染48h后,收集细胞,利用QPCR方法检测hsa_circ_0008285的表达情况,检测结果如图27所示,QPCR的结果显示,只有质粒表达组能检测到hsa_circ_0008285的表达,约为对照组的83倍;而pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV- hsa_circ_0008285病毒感染组未能检测到hsa_circ_0008285的表达。故我们发现hsa_circ_0008285基因构建到普通慢病毒载体中,得到的慢病毒颗粒检测不到hsa_circ_0008285基因的正常表达。
进一步的,本实施例使用CMV-CuO和CMV-TrpO启动子反向表达框,分别构建pSLenti-TK PolyA-hsa_circ_0008285 -CMV-PGK-Puro-WPRE、pSLenti-TK PolyA-hsa_circ_0008285-CuO-CMV-PGK-Puro-WPRE和pSLenti-TK PolyA-hsa_circ_0008285-TrpO-CMV-PGK-Puro-WPRE载体,在慢病毒包装中使用CymR或者TrpR和色氨酸,配合抑制蛋白的表达,包装完的慢病毒感染293T细胞后,利用qPCR检测hsa_circ_0008285基因的表达情况,结果显示,pSLenti-TK PolyA-hsa_circ_0008285-CuO-CMV-PGK-Puro-WPRE/CymR组和pSLenti-TK PolyA-hsa_circ_0008285-TrpO-CMV-PGK-Puro-WPRE/TrpR和色氨酸组hsa_circ_0008285基因的表达均明显高于对照组,证实我们的反向表达框的慢病毒载体可以有效解决hsa_circ_0008285基因过表达问题(实验结果见图28)。
从图中可知,pSLenti-TK PolyA-hsa_circ_0008285-CuO-CMV-PGK-Puro-WPRE和pSLenti-TK PolyA-hsa_circ_0008285-TrpO-CMV-PGK-Puro-WPRE载体在不含有CymR阻遏物和色氨酸时,表达效率几乎检测不到;不带有阻遏型操纵子,且具有反向插入表达盒的载体(pSLenti-TK PolyA-hsa_circ_0008285 -CMV-PGK-Puro-WPRE)仍然无法正常包装,说明反向插入的表达盒的表达会影响目的基因的的正常表达。然而,反向插入的表达盒PolyA-hsa_circ_0008285-CuO,且含有阻遏物的两组,均能够正常表达。这说明反向插入的表达盒配合阻遏型操纵子-阻遏物能够实现hsa_circ_0008285的表达。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (12)
1.慢病毒包装载体,其特征在于,沿病毒基因组表达方向设置有位于上游的第一LTR和位于下游的第二LTR,所述第一LTR和所述第二LTR之间具有反向插入的基因表达盒;
所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子、目的基因和多腺苷酸化信号;
当有阻遏物存在时,所述阻遏型操作子阻遏所述目的基因的表达;
所述目的基因为需要精确终止表达的基因。
2.根据权利要求1所述的慢病毒包装载体,其特征在于,所述目的基因用于表达Pol II启动子表达的非编码RNA。
3.根据权利要求2所述的慢病毒包装载体,其特征在于,所述非编码RNA选自snRNA、lncRNA、amiRNA或circ-RNA。
4.根据权利要求1所述的慢病毒包装载体,其特征在于,所述多腺苷酸化信号为TKPolyA和/或SV40 PolyA V2。
5.根据权利要求1~4任一项所述的慢病毒包装载体,其特征在于,所述阻遏型操作子选自色氨酸操作子和/或Cumate-CuO可调控系统。
6.根据权利要求5所述的慢病毒包装载体,其特征在于,所述氨酸操作子中的TrpO元件在所述基因表达盒的插入位置距离所述启动子的TATA BOX 小于等于18个核苷酸。
7.根据权利要求5所述的慢病毒包装载体,其特征在于,所述Cumate-CuO可调控系统中的CuO元件的插入位置距离所述启动子的TATA BOX 40~50个核苷酸。
8.根据权利要求1~4、6、7任一项所述的慢病毒包装载体,其特征在于,所述启动子为CMV、EF1a、SFH、CAG、CBh、UBC、SFFV、SV40、RSV、mCMV、GAPDH、PGK、CASI、SMVP、GUSB或UCOE。
9.根据权利要求1~4、6、7任一项所述的慢病毒包装载体,其特征在于,所述慢病毒包装载体还包含报告基因、增强子、内部核糖体进入位点和终止子中的至少一种。
10.慢病毒包装载体系统,所述包装载体系统能产生只有一次感染能力而无复制能力的HIV载体颗粒,其特征在于,包含权利要求1~9任一项所述的慢病毒包装载体。
11.根据权利要求10所述的包装载体系统,其特征在于,所述慢病毒包装载体系统为二质粒、三质粒或四质粒包装系统。
12.一种慢病毒的包装方法,其特征在于,将包含权利要求10或11所述的慢病毒包装载体系统转入宿主细胞,并于所述阻遏物存在的前提下进行包装。
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---|---|---|---|
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WO (1) | WO2022121862A1 (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113832191A (zh) * | 2021-11-26 | 2021-12-24 | 和元生物技术(上海)股份有限公司 | 慢病毒载体、系统及其应用 |
CN114107396A (zh) * | 2021-11-26 | 2022-03-01 | 和元智造(上海)基因技术有限公司 | 慢病毒载体、系统及其应用 |
WO2022121862A1 (zh) * | 2020-12-07 | 2022-06-16 | 和元生物技术(上海)股份有限公司 | 慢病毒包装载体及其包装方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006037215A1 (en) * | 2004-10-04 | 2006-04-13 | National Research Council Of Canada | Expression system, components thereof and methods of use |
CN106676135A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-05-17 | 中国人民解放军第三军医大学第附属医院 | Alb‑uPA‑teton慢病毒载体及其制备方法和应用 |
CN107557363A (zh) * | 2016-06-30 | 2018-01-09 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 可诱导型siRNA表达载体及其制备和应用 |
CN107949640A (zh) * | 2015-07-01 | 2018-04-20 | 加利福尼亚大学董事会 | 含有反向取向人泛素c启动子的逆转录病毒载体 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103255172A (zh) * | 2013-04-03 | 2013-08-21 | 傅开屏 | 一种诱导型shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用 |
CN107523588B (zh) * | 2017-08-18 | 2020-08-07 | 深圳大学 | 一种四环素慢病毒诱导表达载体及其建立方法和应用 |
CN112011574B (zh) * | 2020-10-28 | 2021-01-15 | 和元生物技术(上海)股份有限公司 | 一种慢病毒载体、构建方法及其应用 |
CN112195195A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-01-08 | 和元生物技术(上海)股份有限公司 | 慢病毒包装载体与包装方法 |
-
2020
- 2020-12-07 CN CN202011419453.XA patent/CN112195195A/zh active Pending
-
2021
- 2021-12-06 WO PCT/CN2021/135859 patent/WO2022121862A1/zh active Application Filing
- 2021-12-06 US US18/265,896 patent/US20240035044A1/en active Pending
- 2021-12-06 EP EP21902567.3A patent/EP4257695A1/en active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006037215A1 (en) * | 2004-10-04 | 2006-04-13 | National Research Council Of Canada | Expression system, components thereof and methods of use |
CN107949640A (zh) * | 2015-07-01 | 2018-04-20 | 加利福尼亚大学董事会 | 含有反向取向人泛素c启动子的逆转录病毒载体 |
CN107557363A (zh) * | 2016-06-30 | 2018-01-09 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 可诱导型siRNA表达载体及其制备和应用 |
CN106676135A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-05-17 | 中国人民解放军第三军医大学第附属医院 | Alb‑uPA‑teton慢病毒载体及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
TUULA KALLUNKI等: "How to Choose the Right Inducible Gene Expression System for Mammalian Studies?", 《CELLS》 * |
YING POI LIU等: "Titers of lentiviral vectors encoding shRNAs and miRNAs are reduced by different mechanisms that require distinct repair strategies", 《RNA》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022121862A1 (zh) * | 2020-12-07 | 2022-06-16 | 和元生物技术(上海)股份有限公司 | 慢病毒包装载体及其包装方法 |
CN113832191A (zh) * | 2021-11-26 | 2021-12-24 | 和元生物技术(上海)股份有限公司 | 慢病毒载体、系统及其应用 |
CN114107396A (zh) * | 2021-11-26 | 2022-03-01 | 和元智造(上海)基因技术有限公司 | 慢病毒载体、系统及其应用 |
CN113832191B (zh) * | 2021-11-26 | 2022-04-19 | 和元生物技术(上海)股份有限公司 | 慢病毒载体、系统及其应用 |
CN114107396B (zh) * | 2021-11-26 | 2024-02-02 | 和元智造(上海)基因技术有限公司 | 慢病毒载体、系统及其应用 |
Also Published As
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