CN114107396B - 慢病毒载体、系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种慢病毒载体，具有截短的顺式作用元件，以SEQ ID NO:1所示的顺式作用元件为基准，所述截短的顺式作用元件具有在如下位置处的缺失：第541位至第690位中的任意一个或多个碱基。本发明还公开了基于该慢病毒载体的慢病毒载体系统、宿主细胞、应用及转染方法。

Description

慢病毒载体、系统及其应用
技术领域
本发明涉及生物医疗技术领域，具体涉及一种慢病毒载体、系统及其应用。
背景技术
慢病毒载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的病毒载体。慢病毒载体可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，此外区别于来自小鼠白血病病毒的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达；同时与逆转录病毒可能因为整合而引起肿瘤不同，目前的多方面临床研究证实了慢病毒载体的安全性，因此慢病毒载体具有广阔的发展前景。
慢病毒属于逆转录病毒科，但其基因组结构复杂，除gag、pol和env这3个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外，还包括4个辅助基因，vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。HIV-1是慢病毒中最具特征性的病毒，第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。慢病毒载体的构建原理就是将HIV-1基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的HIV-1顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV)的可能性，第三代载体将包装成分的5’LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子获得RSV启动子，3’LTR进行缺失突变,并添加SV 40polyA位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上，即一个表达gag和pol、另一个表达env。根据这个原理构建了三质粒表达系统。三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和穿梭质粒。其中包装质粒在CMV启动子的控制下，表达HIV-1复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)，应用VSV-G包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；穿梭质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留了RRE，cPPT/CTS等序列(见图1)，并在其中插入目的基因(GOI,gene of interest)。
无论哪一种慢病毒载体，都必须保留5’端R，U5，包装信号(PSI),RRE和cPPT/CTS等顺式作用元件，这些元件是慢病毒基因组包装进病毒颗粒所必需的。目前这部分序列在通用的慢病毒载体上长度约为1720bp,其中包括了5’端LTR(R+U5区)序列199bp，PSI序列491bp，RRE序列858bp，cPPT/CTS序列147bp，其它用于连接的序列(主要是酶切位点)25bp。
慢病毒载体包装出毒的效率是和插入的外源基因长度负相关的，插入的序列越长，得到的慢病毒滴度就越低。例如在科研中最常使用的spCas9就属于大基因，其长度在4.2kb以上，对于这类基因使用慢病毒载体就受到了慢病毒载体容量的限制，融合EGFP荧光等标记以后长度进一步加长，更是严重影响了病毒出毒效率。为此，增加慢病毒载体的容量意义重大。
发明内容
基于此，有必要针对慢病毒载体容量小的问题，提供一种慢病毒载体、系统及其应用。
本发明的第一目的在于提供一种慢病毒载体，具有截短的顺式作用元件，以SEQID NO:1所示的顺式作用元件为基准，所述截短的顺式作用元件具有在如下位置处的缺失：
第541位至第690位中的任意一个或多个碱基。
在其中一些实施例中，还具有如下一种或多种位置处的缺失：
1)第699位至第745位中的任意一个或多个碱基；
2)第1144位至第1331位中的任意一个或多个碱基；
3)第1486位至第1559位中的任意一个或多个碱基。
可选的，缺失的碱基为连续排列的碱基或者不连续排列的碱基。
可选的，缺失第541位至第690位中的全部序列。
可选的，1)中缺失第699位至第745位中的全部序列。
可选的，2)中缺失第1144位至第1331位中的全部序列。
可选的，3)中缺失第1486位至第1559位中的全部序列。
在其中一些实施例中，所述截短的顺式作用元件序列如SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12所示。
可选的，所述截短的顺式作用元件的3’端连接有目的基因片段。
在其中一些实施例中，所述目的基因片段的长度范围为4500bp～7700bp。
在其中一些实施例中，所述目的基因片段选自spCas9、dSpCas9、AsCpf1及LbCpf1中的至少一种。
本发明的第二目的在于提供一种慢病毒载体系统，其包含包装成分和所述的慢病毒载体。
可选的，所述慢病毒载体系统为二质粒、三质粒或四质粒系统。
本发明的第三目的在于提供一种所述的慢病毒载体系统包装得到的慢病毒颗粒。
本发明的第四目的在于提供一种所述的慢病毒载体系统在制备用于基因治疗的药物中的应用。
本发明的第五目的在于提供一种宿主细胞，其被所述的慢病毒载体系统感染和转导。
本发明的第六目的在于提供一种慢病毒转染方法，将包含所述的慢病毒载体系统转入宿主细胞。
本发明对慢病毒载体的特异性顺式元件序列进行截短，筛选到能够有效承载长序列的新型慢病毒载体，相对于野生型慢病毒载体，截短的慢病毒载体的出毒效率影响较小，但是扩展容量增大，同时对病毒进行包装后，感染能力增大。
附图说明
图1为传统慢病毒载体穿梭质粒结构示意图；
图2为本发明一实施例的pSLenti-CMV-EGFP-P2A-Luciferase-PGK-Puro-WPRE表达框；
图3为本发明一实施例的慢病毒载体截短体构建示意图；
图4为本发明一实施例的截短体病毒包装上清感染293T细胞荧光照片；
图5为本发明一实施例的截短体相对WT的Luciferase比值结果；
图6为本发明一实施例的D12截短体与WT病毒相同MOI(MOI＝10)感染293T荧光照片；
图7为本发明一实施例的D12截短体与WT病毒相同MOI(MOI＝10)感染293T的Luciferase比值；
图8A为本发明一实施例的WT-spCas9-P2A-EGFP慢病毒载体图谱；
图8B为本发明一实施例的D12-spCas9-P2A-EGFP慢病毒载体图谱；
图9为本发明一实施例的WT-spCas9-P2A-EGFP和D12-spCas9-P2A-EGFP在相同MOI(MOI＝10)感染293T荧光照片；
图10为本发明一实施例的WT-spCas9-P2A-EGFP和D12-spCas9-P2A-EGFP表达量灰度分析；
图11A为本发明一实施例的pSLenti-CMV-SDK2-3xFlag-WPRE表达载体；
图11B为本发明一实施例的pSLenti-D12-CMV-SDK2-3xFlag-WPRE表达载体；
图12为本发明一实施例的pSLenti-CMV-SDK2-3xFlag-WPRE和pSLenti-D12-CMV-SDK2-3xFlag-WPRE过表达检测图；
图13为本发明一实施例的D08截短体与WT病毒相同MOI(MOI＝10)感染293T荧光照片；
图14为本发明一实施例的D08截短体与WT病毒相同MOI(MOI＝10)感染293T的Luciferase比值；
图15A为本发明一实施例的WT-spCas9-P2A-EGFP慢病毒载体图谱；
图15B为本发明一实施例的D08-spCas9-P2A-EGFP慢病毒载体图谱；
图16为本发明一实施例的WT-spCas9-P2A-EGFP和D08-spCas9-P2A-EGFP在相同MOI(MOI＝10)感染293T荧光照片；
图17为本发明一实施例的WT-spCas9-P2A-EGFP和D08-spCas9-P2A-EGFP表达量灰度分析；
图18A为本发明一实施例的pSLenti-CMV-SDK2-3xFlag-WPRE表达载体；
图18B为本发明一实施例的pSLenti-D08-CMV-SDK2-3xFlag-WPRE表达载体；
图19为本发明一实施例的pSLenti-CMV-SDK2-3xFlag-WPRE和pSLenti-D08-CMV-SDK2-3xFlag-WP RE过表达检测图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
第一方面，本发明对包括5’端至3’端顺次连接的启动子区、R region、U5、PSI、RRE和cPPT/CTS组成的顺式作用元件序列进行截短，筛选得到不影响原始慢病毒载体的出毒效率和感染表达能力的截短体，使得慢病毒载体的可插入目的基因片段长度得到扩展。
“启动子”为指导RNA聚合酶结合并由此启动RNA合成的DNA序列。本发明所使用的启动子允许在各种各样的细胞和组织类型中表达；或者可以为无细胞特异性启动子，或者可为“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子，其允许分别在种类受限的细胞和组织类型中表达。在具体实施方案中，可取的是使用细胞、细胞类型、细胞谱系或组织特异性表达控制序列，以实现所需多核苷酸序列的细胞类型特异性、细胞谱系特异性或组织特异性表达(例如，仅在细胞类型、细胞谱系或组织的子群中或在特定发育阶段表达编码多肽的核酸)。
组织特异性启动子的示例性实例包括但不限于：B29启动子(B细胞表达)、runt转录因子(CBFa2)启动子(干细胞特异性表达)、CD14启动子(单核细胞表达)、CD43启动子(白细胞和血小板表达)、CD45启动子(造血细胞表达)、CD68启动子(巨噬细胞表达)、CYP4503A4或ALB启动子(肝细胞表达)、肌间线蛋白启动子(肌肉细胞表达)、弹性蛋白酶I启动子(胰腺泡细胞表达)、内皮糖蛋白启动子(内皮细胞表达)、成纤维细胞特异性蛋白I启动子(FSPl)启动子(成纤维细胞表达)、纤连蛋白启动子(成纤维细胞表达)、fms-相关的酪氨酸激酶I(FLTl)启动子(内皮细胞表达)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(星形胶质细胞表达)、胰岛素启动子(胰腺细胞表达)、整合蛋白-α-2b(ITGA2B)启动子(巨核细胞)、胞内粘着分子2(ICAM-2)启动子(内皮细胞)、干扰素-β(IFN-β)启动子(造血细胞)、角蛋白5启动子(角化细胞表达)、肌红蛋白(MB)启动子(肌肉细胞表达)、成肌分化I(MYOD1)启动子(肌肉细胞表达)、肾病蛋白启动子(足细胞表达)、骨γ-羧基谷氨酸蛋白2(OG-2)启动子(成骨细胞表达)、3-酮酸CoA转移酶2B(Oxct2B)启动子(单倍体精细胞表达)、表面活化蛋白B(SP-B)启动子(肺细胞表达)、突触蛋白启动子(神经细胞表达)、Wiskott-Aldrich综合征蛋白(WASP)启动子(造血细胞表达)。
在一些实施方式中，所述启动子为无细胞特异性的启动子。示例性的无细胞特异性的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)极早期启动子，病毒性猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、莫罗尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子，劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子，牛痘病毒的H5、P7.5和Pll启动子，延长因子l-α(EFla)启动子，早期生长应答I(EGRl)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、3_磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、真核生物翻译起始因子4A 1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDa-β成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人R0SA26基因座(Irions et al.,(2007)Nature Biotechnology25,1477-1482)、泛激素C启动子(UBC)，磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子，巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子，以及β-肌动蛋白启动子。
在一些优选的实施方式中，所述启动子是强启动子。
在一些优选的实施方式中，所述启动子是CMV、EF1a、SFH、CAG、CBh、UBC、SFFV、SV40、RSV、mCMV、GAPDH、PGK、CASI、SMVP、GUSB(hGBp)或UCOE。
在本发明的实施例中，以SEQ ID NO:1所示的顺式作用元件为基准进行截短，即，所述截短的顺式作用元件为在SEQ ID NO:1所示的顺式作用元件中所标示的位置具有所述缺失的核酸片段。以PSI和RRE为截短对象，选择14种截短体进行研究和检测。SEQ ID NO:1所示的顺式作用元件的组成为：R region(1-96)-U5(97-181)-PSI(182-690)-linker(691-698)-RRE(699-1559)-linker(1560-1573)-cPPT/CTS(1574-1720)。
本发明实施例提供一种慢病毒载体，具有截短的顺式作用元件，以SEQ ID NO:1所示的顺式作用元件为基准，所述截短的顺式作用元件具有在如下位置处的缺失：
第541位至第690位中的任意一个或多个碱基。
在一些实施方式中，还具有如下一种或多种位置处的缺失：
1)第699位至第745位中的任意一个或多个碱基；
2)第1144位至第1331位中的任意一个或多个碱基；
3)第1486位至第1559位中的任意一个或多个碱基。
可选的，缺失的碱基为连续排列的碱基或者不连续排列的碱基。
可选的，所述截短的顺式作用元件中缺失第360位至第509位中的全部序列。
可选的，1)中缺失第699位至第745位中的全部序列。
可选的，2)中缺失第1144位至第1331位中的全部序列。
可选的，3)中缺失第1486位至第1559位中的全部序列。
在一些实施方式中，所述截短的顺式作用元件序列如SEQ ID NO:10(D10)、SEQ IDNO:11(D11)或SEQ ID NO:12(D12)所示。
可选的，所述cPPT/CTS的3’端，即所述截短的顺式作用元件的3’端连接有目的基因片段。
在一些实施方式中，所述目的基因片段的长度范围为4500bp～7700bp。
在一些实施方式中，所述目的基因片段选自spCas9、dSpCas9、AsCpf1及LbCpf1中的至少一种。
第二方面，本发明实施例提供一种慢病毒载体系统，其包含包装成分和所述的慢病毒载体。
可选的，所述慢病毒载体系统为二质粒、三质粒或四质粒系统。
第三方面，本发明实施例提供一种所述的慢病毒载体系统包装得到的慢病毒颗粒。
第四方面，本发明实施例提供一种所述的慢病毒载体系统在制备用于基因治疗的药物中的应用。
第五方面，本发明实施例提供一种宿主细胞，其被所述的慢病毒载体系统感染和转导。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞或禽类动物细胞。
在一些实施方式中，所述宿主细胞还可以为鱼类细胞或两栖类动物细胞。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为啮齿类动物细胞，例如大鼠、小鼠、仓鼠。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为灵长类动物细胞，优选为人。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为原代细胞，例如肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为细胞系；
常见的细胞系例如：
来源于人的细胞系：
293T、IMR-90、W1-38、A549、A431、BHL-100、BeWo、Caco-2、Chang、HCT-15、HeLa、HEp-G2、HEp-2、HT-1080、HT-29、JEG-2、MCF7、KB、Saos-2、WI-38、WISH、WS1、HUVEC、EB-3、Raji、IM-9、Daudi、H9、HL-60、Jurkat、K-562、U937、KG-1；
来源于小鼠的细胞系：
McCoy、BALB/3T3、3T6、A9、AtT-20、Clone M-3、I-10、Y-1、WEHI-3b、ES-D3、F9；
来源于仓鼠的细胞系：
BHK-21、HaK、CHO-K1；
来源于大鼠的细胞系：
AR42J、BRL3A、Clone 9、H4--Ⅱ-E-C3、GH1、GH3、IEC-6、L2、XC、LLC-WRC 256、Jensen、Rat2(TK-)、PC12、L6；
来源于其他动物的细胞系：
D-17、BT、MARC-145、CV-1、COS-1、COS-3、COS-7、Vero、B95-8、CRFK。
第六方面，本发明实施例提供一种慢病毒转染方法，将包含所述的慢病毒载体系统转入宿主细胞。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
以下为具体实施例。
实施例1.截短体构建及出毒比较
以pSLenti-CMV-EGFP-P2A-Luciferase-PGK-Puro-WPRE病毒载体为基础进行截短体改造。pSLenti-CMV-EGFP-P2A-Luciferase-PGK-Puro-WPRE野生型病毒载体表达框如图2所示。对该野生型病毒载体的SEQ ID NO:5野生型顺式作用元件序列段为基准进行所述截短行为，共构建了14种顺式作用元件序列截短体，命名为D01-D14，其中D01、D03-D14的截短体构建示意图如图3所示。通过对这些截短体出毒及感染能力的测试，获得容量扩大的截短体。D01、D03-D14的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO:2～14所示。
病毒感染及luciferase检测：
通过相同条件进行病毒包装后，取上清100ul感染293T，72hr拍摄荧光照片。结果如图4。
同时检测细胞样品luciferase。结果见图5。
通过图4～5结果可以发现，截短体D01、D03～D06、D08、D10～D12仍然保持高的出毒效率。D01、D03～D06虽然截短的长度不大，但也相对于野生型缩短了载体本身的长度。D08相对于野生型其载体自身长度缩短309bp的情况下出毒效率几乎没有明显影响(>91％)。D12在能截短的最大范围内(459bp)仍保持着相对较高的出毒效率(>72％)。截短体D07在RRE上的截取超出了第1144位至第1331位的范围，截短体D09在RRE上的截取超出了第1486位至第1559位的范围，进一步的截短体D13(第491位至第690位)和D14(第200位至第249位)在PSI上的截取超出了D12的范围，结果发现都严重影响了出毒效率。
实施例2.
为了验证D12病毒颗粒的感染及表达能力，进行相同的感染复数(MOI)的感染实验。如图6所示,相同的MOI感染293T 72小时以后，D12截短体相对野生型(WT)具有更高的感染能力。
如图7所示，截短体D12在相同的感染复数的条件下，基因的表达能力相对野生型有2倍左右的提升。
实施例3.spCas9-P2A-EGFP基因的表达
为了验证D12截短体对超大基因的承载能力，构建了野生型和截短体的spCas9过表达载体。pSLenti-U6-gRNA v2.0-CMV-spCas9-P2A-EGFP-WPRE(WT-spCas9-P2A-EGFP)和pSLenti-D12-U6-gRNA v2.0-CMV-spCas9-P2A-EGFP-WPRE(D12-spCas9-P2A-EGFP)。在这两个载体中U6-gRNA-CMV-spCas9-P2A-EGFP-WPRE长度共计6.6kb。其慢病毒载体图谱分别如图8A和图8B所示。
相同条件下进行慢病毒包装，重悬到相同体积PBS中，D12-spCas-P2A-EGFP(2.3*10^8TU/ml)滴度约为WT-spCas9-P2A-EGFP滴度(7.2*10^7TU/ml)的3倍以上。
相同MOI下感染293T荧光照片如图9所示。
根据灰度分析，D12-spCas9-P2A-EGFP表达量约为WT-spCas9-P2A-EGFP表达量的5倍以上，如图10所示。
实施例4. 6.5kb编码蛋白基因过表达
为了进一步验证截短体D12对其它大基因的承载能力，选择人的SDK2基因(NM_001144952)，长度6519bp，C端融合3xFlag标签以后长度为6594bp,在WT慢病毒载体(pSLenti-CMV-SDK2-3xFlag-WPRE)上进行包装，由于超载严重，纯化后的病毒滴度无法达到7次方。将SDK2基因构建到D12截短体获得pSLenti-D12-CMV-SDK2-3xFlag-WPRE(图11A和图11B)，慢病毒包装获得1.2*10^8TU/ml滴度，经过Western Blot，使用Flag抗体检测到SDK2-3xFlag的表达(图12)。从以上数据可以判断D12截短体对大基因有一定的承载能力，相同条件下病毒出毒量增加，并能检测到目的基因表达。
实施例5.
为了验证D08病毒颗粒的感染及表达能力,进行相同的感染复数(MOI)的感染实验。如图13所示，相同的MOI感染293T 72小时以后，D08截短体相对WT具有更高的感染能力。
如图14所示，截短体D08在相同的感染复数的条件下，基因的表达能力相对野生型有1.3倍左右的提升。
实施例6.spCas9-P2A-EGFP基因的表达
为了验证D08截短体对超大基因的承载能力，构建野生型和截短体的spCas9过表达载体。pSLenti-U6-gRNA v2.0-CMV-spCas9-P2A-EGFP-WPRE(WT-spCas9-P2A-EGFP)和pSLenti-D08-U6-gRNA v2.0-CMV-spCas9-P2A-EGFP-WPRE(D08-spCas9-P2A-EGFP)。在这两个载体中U6-gRNA-CMV-spCas9-P2A-EGFP-WPRE长度共计6.6kb。其慢病毒载体图谱分别如图15A和图15B所示。
相同条件下进行慢病毒包装，重悬到相同体积PBS中，D08-spCas-P2A-EGFP(1.2*10^8TU/ml)滴度约为WT-spCas9-P2A-EGFP滴度(7.2*10^7TU/ml)的3倍以上。
相同MOI下感染293T荧光照片，如图16所示。
根据灰度分析，D08-spCas9-P2A-EGFP表达量约为WT-spCas9-P2A-EGFP表达量的2.5倍以上，如图17所示。
实施例7. 6.5kb编码蛋白基因过表达
为了进一步验证截短体D08对其它大基因的承载能力，选择人的SDK2基因(NM_001144952)，长度6519bp，C端融合3xFlag标签以后长度为6594bp，在WT慢病毒载体(pSLenti-CMV-SDK2-3xFlag-WPRE)上进行包装，由于超载严重，纯化后的病毒滴度无法达到7次方。将SDK2基因构建到D08截短体获得pSLenti-D08-CMV-SDK2-3xFlag-WPRE(图18A和图18B)。慢病毒包装获得1.5*10^8TU/ml滴度，经过Western Blot，使用Flag抗体检测到SDK2-3xFlag的表达(图19)。从以上数据可以判断D08截短体对大基因有一定的承载能力，相同条件下病毒出毒量增加，并能检测到目的基因表达。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 和元智造（上海）基因技术有限公司
<120> 慢病毒载体、系统及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 60
tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 120
gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 180
gtggcgcccg aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag 240
gactcggctt gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc 300
aaaaattttg actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa 360
gcgggggaga attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa 420
atataaatta aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc 480
tggcctgtta gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct 540
tcagacagga tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt 600
gcatcaaagg atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca 660
aaacaaaagt aagaccaccg cacagcaagc ggccggccgc tgatcttcag acctggagga 720
ggagatatga gggacaattg gagaagtgaa ttatataaat ataaagtagt aaaaattgaa 780
ccattaggag tagcacccac caaggcaaag agaagagtgg tgcagagaga aaaaagagca 840
gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc ttgggagcag caggaagcac tatgggcgca 900
gcgtcaatga cgctgacggt acaggccaga caattattgt ctggtatagt gcagcagcag 960
aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa cagcatctgt tgcaactcac agtctggggc 1020
atcaagcagc tccaggcaag aatcctggct gtggaaagat acctaaagga tcaacagctc 1080
ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc atttgcacca ctgctgtgcc ttggaatgct 1140
agttggagta ataaatctct ggaacagatt tggaatcaca cgacctggat ggagtgggac 1200
agagaaatta acaattacac aagcttaata cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag 1260
caagaaaaga atgaacaaga attattggaa ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg 1320
tttaacataa caaattggct gtggtatata aaattattca taatgatagt aggaggcttg 1380
gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt tctatagtga atagagttag gcagggatat 1440
tcaccattat cgtttcagac ccacctccca accccgaggg gacccgacag gcccgaagga 1500
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cgacggtatc gcctttaaaa gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat 1620
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<210> 2
<211> 1646
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 7
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<210> 8
<211> 1411
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 180
gtggcgcccg aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag 240
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gcgggggaga attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa 420
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Claims (11)

1. 慢病毒载体，其特征在于，包括顺式作用元件、异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因；其中，所述慢病毒载体中除目的基因以外的成分以pSLenti-CMV-EGFP-P2A-Luciferase-PGK-Puro-WPRE病毒载体中的相应成分为基础，将其中的SEQID NO:1所示的顺式作用元件替换为截短的顺式作用元件；所述截短的顺式作用元件的序列如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示。
2.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述截短的顺式作用元件的3’端连接有目的基因片段。
3.根据权利要求2所述的慢病毒载体，其特征在于，所述目的基因片段的长度范围为4500bp~7700bp。
4.根据权利要求3所述的慢病毒载体，其特征在于，所述目的基因片段选自spCas9、dSpCas9、AsCpf1及LbCpf1中的至少一种。
5. 根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体以pSLenti-CMV-EGFP-P2A-Luciferase-PGK-Puro-WPRE病毒载体为基础，将其中的SEQ ID NO:1所示的顺式作用元件替换为所述截短的顺式作用元件。
6.慢病毒载体系统，其包含包装成分和权利要求1~5任一项所述的慢病毒载体。
7.根据权利要求6所述的慢病毒载体系统，其特征在于，所述慢病毒载体系统为二质粒、三质粒或四质粒系统。
8.权利要求6或7所述的慢病毒载体系统包装得到的慢病毒颗粒。
9.权利要求6或7所述的慢病毒载体系统在制备用于基因治疗的药物中的应用。
10.一种宿主细胞，其被权利要求6或7所述的慢病毒载体系统感染和转导。
11.一种慢病毒转染方法，其将包含权利要求6或7所述的慢病毒载体系统转入宿主细胞。
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