CN111733184B - 腺病毒包装方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种腺病毒包装方法。该方法包括将AdMax系统转入细胞：将带有包含编码目的基因产物的核苷酸序列的异源核酸的穿梭质粒与含有loxP位点的骨架质粒共转染能够提供腺病毒E1区的细胞，得到重组质粒；所述细胞还转染有Cas载体系统，所述Cas载体系统包含一种或多种载体，所述载体包含：第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码Cas核酸酶的核苷酸片段，所述第二调控元件可操作地连接至gRNA的核苷酸片段；所述gRNA靶向所述重组质粒上位于所述异源核酸两端的ITR末端区域，且所述Cas核酸酶切割所述ITR末端区域。本方法可以有效的将AdMax的出毒时间提前，并增强出毒的毒力。

Description

腺病毒包装方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种腺病毒包装方法。
背景技术
1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮。1977年，Frank Graham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。
应用重组腺病毒的优点有很多，例如：
1. 宿主范围广，对人致病性低
这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。
2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因
逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。
3. 能有效进行增殖，滴度高
这套腺病毒系统可产生1010到1011vp/ml，浓缩后可达1013 vp/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。
4. 无需辅助病毒，可容纳7.5 kb外源DNA
为提供克隆空间，此腺病毒缺失了E1和E3早期区。此外，此腺病毒可包装比正常病毒DNA稍大的DNA分子（105%）。这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达7.5kb。
5. 与人类基因同源
该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。
6. 不整合到染色体中，无插入致突变性
逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。
7. 能在悬浮培养液中扩增
293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细胞可在1L~20L的生物反应器中表达重组蛋白。
8. 能同时表达多个基因
这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。
目前腺病毒包装主要有两种包装方案，一种是较为传统的AdEasy，需要在大肠杆菌中重组，获得重组后的大载体，但操作繁琐，周期长。
另一种是AdMax方案，在体内利用Cre/loxp酶，将穿梭载体和大载体重组的方式，特点是操作方便，直接两个载体共转染HEK293即可，但是出毒周期较长，通常需等待发生在转染后10～12天以上出毒才能观察到空斑的形成。此外，不出毒的比例在AdMax中也高于AdEasy系统。
发明内容
本发明涉及腺病毒包装方法，包括将AdMax系统转入细胞：将带有包含编码目的基因产物的核苷酸序列的异源核酸的穿梭质粒与含有loxP位点的骨架质粒共转染能够提供腺病毒E1区的细胞，得到重组质粒；
所述细胞还转染有Cas载体系统，所述Cas载体系统包含一种或多种载体，所述载体包含：第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码Cas核酸酶的核苷酸片段，所述第二调控元件可操作地连接至编码gRNA的核苷酸片段；
所述gRNA包括a）与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段，以及b）与靶核酸结合的特异性核酸片段，所述特异性核酸片段包括SEQ ID NO：5和7；
所述gRNA靶向所述重组质粒上位于所述异源核酸两端的ITR末端区域，且所述Cas核酸酶切割所述ITR末端区域。
本发明还涉及如上所述腺病毒包装方法包装得到的腺病毒。
本发明还涉及如上所定义的Cas载体系统。
本发明还涉及一种组合产品，其包括如上所定义的AdMax载体系统以及如上所定义的Cas载体系统。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含如上所述的Cas载体系统或如上所述的组合产品。
本发明的有益效果为：
本发明所提供的腺病毒包装方法，在AdMax包装同时使用Cas载体系统对重组后的质粒进行切割修饰，可以有效的将AdMax的出毒时间提前2～3天，通常整体出毒的毒力也有明显增强，腺病毒滴度约是传统技术的2.63倍，并且该修饰不影响外源基因的正常表达。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中靶点的选取位置图；
图2A为本发明一个实施例中L-ITR gRNA和R-ITR gRNA活性检测时对剪切产物对琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图2B为本发明一个实施例中L+R-ITR gRNA01和L+R-ITR gRNA02活性检测时对剪切产物对琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图3A为本发明一个实施例中所采用的pCLenti-U6-gRNA v2.0(L-ITR)-CMV-spCas9-P2A-Puro-WPRE的质粒图谱；
图3B为本发明一个实施例中所采用的pCLenti-U6-gRNA v2.0(R-ITR)-CMV-spCas9-P2A-Puro-WPRE的质粒图谱；
图3C为本发明一个实施例中所采用的pCLenti-U6-gRNA v2.0(L+R-ITR-01)-CMV-spCas9-P2A-Puro-WPRE的质粒图谱；
图4为本发明一个实施例中腺病毒出毒情况与普通包装组比较结果；
图5为本发明一个实施例中使用Western Blot方法检测异源蛋白的表达情况；
图6为本发明一个实施例中腺病毒滴度检测图片（图6A）和统计图（图6B）。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及腺病毒包装方法，包括将AdMax系统转入细胞：将带有包含编码目的基因产物的核苷酸序列的异源核酸的穿梭质粒与含有loxP位点的骨架质粒共转染能够提供腺病毒E1区的细胞，得到重组质粒；
所述细胞还转染有Cas载体系统，所述Cas载体系统包含一种或多种载体，所述载体包含：第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码Cas核酸酶的核苷酸片段，所述第二调控元件可操作地连接至编码gRNA的核苷酸片段；
所述gRNA包括a）与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段，以及b）与靶核酸结合的特异性核酸片段，所述特异性核酸片段包括SEQ ID NO：5和7；
所述gRNA靶向所述重组质粒上位于所述异源核酸两端的ITR末端区域，且所述Cas核酸酶切割所述ITR末端区域。
本发明发明人意外的发现，如果从AdMax系统ITR末端的特定区域切开重组质粒后，可以有效的将AdMax的出毒时间提前2～3天，并且整体出毒的毒力有明显增强。
如本领域技术人员所显而易见得知的，与SEQ ID NO：5和7所示核酸片段实质上相同的核酸片段也在本申请的保护范围内。“实质上相同的核酸片段”是指在严格条件下能够与SEQ ID NO：5和7所对应的靶序列杂交的核酸片段。这样的核酸片段可以相较于SEQ IDNO：5和7替换、增加或减少1、2、3或更多个核酸碱基或碱基类似物【例如4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、Q核苷等】，或者是部分碱基具有某些修饰（通常这种修饰对引导序列与靶核酸的杂交是无关紧要的），长度可以控制在18bp～35bp，优选为20 bp～24bp。本发明中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400 mM NaCl、40 mM PIPES（pH6.4）和1 mM EDTA的杂交液中于65℃杂交12h~16h，然后在65℃下用含0.1%SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15min~60min。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。
当所述组合物包含多种gRNA时，不同的gRNA可串联于同一种载体上，或分别位于不同载体上。
Cas核酸酶可与gRNA位于相同或不同载体上。
包含SEQ ID NO：5和7所示特异性核酸片段的gRNA可以分别位于两个所述第二调控元件上。
AdMax系统通常为两质粒系统，组成为穿梭质粒（例如pHBAd系列，包括包括过表达、干扰等类型）和骨架质粒（例如pBHGlox(delta)E1, 3Cre)。AdMax系统通过Cre-loxP重组酶系统，使共转染到细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和骨架质粒（腺病毒基因组质粒）在重组酶的作用下产生重组腺病毒，获得的病毒滴度更高。
术语“可操作地连接”指遗传元件的并列，其中所述元件呈允许其以预期方式操作的关系。例如，如果启动子帮助引发编码序列的转录，则启动子与编码区操作性连接。只要维持这种功能关系，在启动子和编码区域之间可能有插入残基。
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。
在一些优选的实施方式中，所述Cas载体系统包装于单个或多个慢病毒载体中。
在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点（IRES）和其他表达控制元件（例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等）。
在一些实施方式中，本发明所述载体、转录物中还可以包含筛选所用的基因（例如抗生素抗性基因）、用于生成荧光蛋白的核酸等片段。荧光蛋白可以选择绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或红色荧光蛋白。其中绿色荧光蛋白可以采用常见的GFP，也可以采用经过改造后的GFP基因，例如增强型GFP基因EGFP等。
在一些实施方式中，所述Cas核酸酶为Cas9核酸酶，例如spCas9（来自化脓链球菌的Cas9）或saCas9（来自金黄色葡萄球菌的Cas9）。
在一些实施方式中，其中编码所述Cas核酸酶的核苷酸片段经密码子优化以在真核细胞中表达。
在一些实施方式中，其中编码所述Cas核酸酶的核苷酸片段经密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。
在一些实施方式中，其中编码所述Cas核酸酶的核苷酸片段经密码子优化以在人细胞中表达。
在一些实施方式中，所述框架核酸片段为SEQ ID NO:6所示。
在一些实施方式中，所述Cas载体系统在所述AdMax系统转入细胞12h后转入。
在一些实施方式中，所述目的基因产物为干扰RNA或适配体。
干扰RNA可以选自例如siRNA或shRNA。
在一些实施方式中，所述目的基因产物为多肽。
术语“多肽”在本发明中可交换用于指任何长度的氨基酸聚合物。所述术语还涵盖已经修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、磷酸化或与标记组分结合。
在一些实施方式中，所述细胞为HEK-293细胞或其能够提供腺病毒E1区的衍生株。
在一些实施方式中，所述衍生株选自HEK-293A、HEK-293S、HEK-293SG、HEK-293SGGD、HEK-293T、HEK-293T/17 SF、HEK-293H、HEK-293E、HEK-293-6E、HEK-293F、HEK-293FT、HEK-293FTM、AAV-293以及GP2-293中的至少一种。
本发明还涉及如上所述腺病毒包装方法包装得到的腺病毒。
本发明还涉及如上所定义的Cas载体系统。
本发明还涉及一种组合产品，其包括如上所定义的AdMax载体系统以及如上所定义的Cas载体系统。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含如上所述的Cas载体系统或如上所述的组合产品。
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
除非另有说明，本发明采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。参见萨姆布鲁克( Sambrook )、弗里奇( Fritsch )和马尼亚蒂斯( Maniatis )，《分子克隆：实验室手册》( MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL )，第2次编辑( 1989 )；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY )( F .M .奥苏贝尔( F .M .Ausubel )等人编辑，( 1987 ))；《酶学方法》( METHODS IN ENZYMOLOGY )系列(学术出版公司)：《PCR2:实用方法》( PCR 2:A PRACTICAL APPROACH )( M .J .麦克弗森( M .J .MacPherson )、B.D .黑姆斯( B .D .Hames )和G .R .泰勒( G .R .Taylor )编辑( 1995 ))、哈洛(Harlow )和拉内( Lane )编辑( 1988 )《抗体：实验室手册》( ANTIBODIES, A LABORATORYMANUAL )，以及《动物细胞培养》( ANIMAL CELL CULTURE )(R .I .弗雷谢尼(R .I.Freshney )编辑(1987 ))。
实施例1 Cas载体系统的构建
1.gRNA靶点设计
本发明所选择的靶点位置如图1所示。
L-ITR gRNA: gtatattattgatgattattt（SEQ ID NO:1）；
R-ITR gRNA: gttgatgaatataccttattt（SEQ ID NO:2）；
L+R-ITR gRNA01: atcaataatataccttattt （SEQ ID NO:3）；
L+R-ITR gRNA02:attggcttcaatccaaaata（SEQ ID NO:4）。
2. gRNA活性测试实验
化学合成gRNA，序列如下所示：
L-ITR gRNA: GUAUAUUAUUGAUGAUUAUUU（SEQ ID NO:5）GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU（SEQ ID NO:6）；
R-ITR gRNA: GUUGAUGAAUAUACCUUAUUU（SEQ ID NO:7）GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU（SEQ ID NO:6）；
L+R-ITR gRNA01: AUCAAUAAUAUACCUUAUUU（SEQ ID NO:8）GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU（SEQ ID NO:6）；
L+R-ITR gRNA02: AUUGGCUUCAAUCCAAAAUA（SEQ ID NO:9）GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU（SEQ ID NO:6）。
扩增切割模板，L-ITR，L+R-ITR-01，L+R-ITR-02的PCR引物序列如下：
L-ITR-F AGGCCTGCAGACCGTAAACCTG（SEQ ID NO:10）；
L-ITR-R CTTTCCTTTCGCAGCGCCGCCTC（SEQ ID NO:11）；
R-ITR, L+R-ITR-01, L+R-ITR-02的PCR引物：
R-ITR-F TCATGTCTGGATCGTCTAGCATCG（SEQ ID NO:12）；
R-ITR-R TCGTGCACACAGCCCAGCTTGG（SEQ ID NO:13）。
模板质粒pBHGlox(delta)E1, 3Cre和pAdeno-MCMV-MCS-3FLAG；
PCR产物大小：750bp。
预测切割后大小：250bp +500 bp体外切割：
Figure 511754DEST_PATH_IMAGE001
37℃孵育10min，分别加PCR产物300ng及100ng，用DEPC水补足到20μL，37℃，反应1h。
用2%的普通琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图2A及图2B所示，实验结果证实L-ITR，R-ITR，L+R-ITR-01这四条gRNA有切割活性，L+R-ITR-02 gRNA未检测到明显的切割活性，不进行后续实验。
3. gRNA慢病毒载体构建
（1）合成spCas9 gRNA（验证有切割活性）序列的寡核酸链：
L-ITR gRNA:5’accgGtatattattgatgattattt 3’ 5’aaacaaataatcatcaataatataC3’；
R-ITR gRNA:5’ accgGttgatgaatataccttattt 3’ 5’aaacaaataaggtatattcatcaaC3’；
L+R-ITR gRNA01:5’ accgGatcaataatataccttattt 3’ 5’aaacaaataaggtatattattgatC3’；
（2）将上述引物对分别用退火buffer溶解成20uM的浓度，于95℃水浴锅中孵育5min，再开水浴锅盖子慢慢自然冷却至室温。
（3）用BsmB I酶切pCLenti-U6-gRNA v2.0-CMV-spCas9-P2A-Puro-WPRE，NEBuffer3，55°C中酶切4h，得到324bp和6.1kb的片段，回收6.1kb的载体。将退火产物与酶切回收的载体片段连接得到目的质粒。将连接后的质粒转化至感受态细胞Stbl3中，均匀涂至LB固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12h~16h，单个菌落即可出现。
（4）挑取单个菌落扩大培养并质粒小提。
（5）测序鉴定质粒构建成功，并命名为：
pCLenti-U6-gRNA v2.0(L-ITR)-CMV-spCas9-P2A-Puro-WPRE（图3A）；
pCLenti-U6-gRNA v2.0(R-ITR)-CMV-spCas9-P2A-Puro-WPRE（图3B）；
pCLenti-U6-gRNA v2.0(L+R-ITR-01)-CMV-spCas9-P2A-Puro-WPRE（图3C）。
实施例2 AdMax腺病毒包装
1. 质粒转染前一天选取状态良好的HEK 293细胞，消化后收集细胞，计数后使用完全培养基重悬细胞，制备成5×105个/mL的细胞悬液6孔板每个孔中加入2mL细胞悬液，摇匀，37℃、5% CO2培养箱培养。
2. 将要转染的目的质粒: pBHGlox(delta)E1, 3Cre和pAdeno-MCMV-GFP-3FLAG质粒(该质粒通过在pAdeno-MCMV-MCS-3FLAG载体MCS位点插入有GFP获得) 按顺序摆好，每个质粒对应的位置摆一个1.5mL EP管，并在管盖上标注好对应的质粒编号，每个1.5mL的EP管中加入250μL Opti-MEM培养基；依次加入6μg的pBHG和3μg pAdeno。再另取一个1.5mL的EP管，按照每个质粒240μL Opti-MEM+10μL LIPO2000转染试剂的量配制总的需求量，用移液枪吹打混匀；配好之后计时器计时5min；按照每个克隆号250μL的量，将配制的总的转染试剂加入到每个克隆号对应的EP管中；静置20min。
3. 质粒转染前1h将前一天铺好的6孔板从培养箱中拿出，吸引器连接1mL吸头吸去6孔板中的培养基，每孔加入1.5mL预热好的Opti-MEM培养基，然后放入5% CO2培养箱待转染。
4. 20min后，从培养箱中取出6孔板，根据EP管上的克隆号在每个孔上写上对应克隆号，将每个EP管中500μL的转染试剂缓慢加入每孔，避免细胞吹起。将6孔板放入5% CO2培养箱中。
5. Cas9-gRNA慢病毒感染组在质粒转染12h后，加入Cas9-gRNA病毒混合液(L-ITRgRNA+R-ITR gRNA组MOI按照5+5使用；L+R ITR gRNA01组也按照MOI 5使用)。
6. 加入Cas9-gRNA病毒4天开始，每天观察细胞出毒，鉴别空斑。
7. 出毒后，待细胞死亡50%收毒，准备好15mL离心管，写好对应的克隆号。用1mL移液器，吸取细胞上清液来回吹打皿底部细胞，让细胞完全脱落，然后将细胞与上清液全部收集到对应的15mL离心管中，拧紧管盖，直接放置液氮中3min直至完全冻住，然后放至37℃水浴锅中5min彻底融化（反复4次）。然后使用湘仪离心机4000rpm/10min离心。用0.22μm的滤器过滤病毒，分装到病毒管中，-80℃保存。
8. 腺病毒出毒情况及异源基因的表达情况。
腺病毒出毒情况如图4所示，其中以将未经过Cas载体系统处理过的AdMax包装的腺病毒作为普通包装组对照。包装7天后观察，各组异源基因（GFP）均表达正常，但对照组只有轻微的细胞病变迹象。L-ITR gRNA+R-ITR gRNA组已经形成明显的空斑聚集，而L+R ITRgRNA01组基本没有出毒，推测切割位置干扰了正常的腺病毒元件。L+R ITR gRNA02 因为未检测到活性，所以没有进行出毒比较。
为进一步验证Cas载体系统处理是否会影响异源基因的正常表达，申请人将L-ITRgRNA+R-ITR gRNA慢病毒感染组包装的腺病毒去感染了293T细胞，24h检测了表达情况，使用了GFP抗体检测，可以证实包装的病毒异源基因（GFP）可正常表达（图5）。
9. 腺病毒用免疫染色方法检测其滴度。
腺病毒滴度检测情况如图6A所示，三次包装的滴度统计结果如图6B所示，其中以将未经过Cas载体系统处理过的AdMax包装的腺病毒作为普通包装组对照。滴度结果显示，L-ITR gRNA+R-ITR gRNA组腺病毒滴度相对于对照组腺病毒滴度平均高了2.63倍。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 和元生物技术（上海）股份有限公司
<120> 腺病毒包装方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
gtatattatt gatgattatt t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
gttgatgaat ataccttatt t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
atcaataata taccttattt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
attggcttca atccaaaata 20
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial sequence
<400> 5
guauauuauu gaugauuauu u 21
<210> 6
<211> 80
<212> RNA
<213> artificial sequence
<400> 6
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial sequence
<400> 7
guugaugaau auaccuuauu u 21
<210> 8
<211> 20
<212> RNA
<213> artificial sequence
<400> 8
aucaauaaua uaccuuauuu 20
<210> 9
<211> 20
<212> RNA
<213> artificial sequence
<400> 9
auuggcuuca auccaaaaua 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 10
aggcctgcag accgtaaacc tg 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 11
ctttcctttc gcagcgccgc ctc 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 12
tcatgtctgg atcgtctagc atcg 24
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 13
tcgtgcacac agcccagctt gg 22

Claims (13)

1.腺病毒包装方法，包括将AdMax系统转入细胞：将带有包含编码目的基因产物的核苷酸序列的异源核酸的穿梭质粒与含有loxP位点的骨架质粒共转染能够提供腺病毒E1区的细胞，得到重组质粒，其特征在于：
所述细胞还转染有Cas载体系统，所述Cas载体系统包含一种或多种载体，所述载体包含：第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码Cas核酸酶的核苷酸片段，所述第二调控元件可操作地连接至编码gRNA的核苷酸片段；
所述gRNA包括a）与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段，以及b）与靶核酸结合的特异性核酸片段，所述特异性核酸片段包括SEQ ID NO：5和7；
所述gRNA靶向所述重组质粒上位于所述异源核酸两端的ITR末端区域，且所述Cas核酸酶切割所述ITR末端区域。
2.根据权利要求1所述的腺病毒包装方法，其特征在于，所述Cas核酸酶为Cas9核酸酶。
3.根据权利要求2所述的腺病毒包装方法，其特征在于，所述框架核酸片段为SEQ IDNO:6所示。
4.根据权利要求1所述的腺病毒包装方法，其特征在于，所述Cas载体系统包装于单个或多个慢病毒载体中。
5.根据权利要求1所述的腺病毒包装方法，其特征在于，所述Cas载体系统在所述AdMax系统转入细胞12h后转入。
6.根据权利要求1～5任一项所述的腺病毒包装方法，其特征在于，所述目的基因产物为干扰RNA或适配体。
7.根据权利要求1～5任一项所述的腺病毒包装方法，其特征在于，所述目的基因产物为多肽。
8.根据权利要求1～5任一项所述的腺病毒包装方法，其特征在于，所述细胞为HEK-293细胞或其能够提供腺病毒E1区的衍生株。
9.根据权利要求8所述的腺病毒包装方法，其特征在于，所述衍生株选自HEK-293A、HEK-293S、HEK-293SG、HEK-293SGGD、HEK-293T、HEK-293T/17 SF、HEK-293H、HEK-293E、HEK-293-6E、HEK-293F、HEK-293FT、HEK-293FTM、AAV-293以及GP2-293中的至少一种。
10.权利要求1～9任一项所述腺病毒包装方法包装得到的腺病毒。
11.权利要求1～9任一项中所定义的Cas载体系统。
12.一种组合产品，其特征在于，包括权利要求1～9任一项中所定义的AdMax载体系统以及Cas载体系统。
13.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求11所述的Cas载体系统或权利要求12所述的组合产品。
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