CN1796566A - 新型重组腺病毒载体骨架质粒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新型重组腺病毒载体骨架质粒及其用途，利用此载体构建用骨架质粒能够快速、高效率、简便地获得携带有外源基因的Ad5F35型重组腺病毒，并且明显提高病毒的产率。本发明通过下述技术方案实现：用编码Ad35纤突的基因序列替换pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架质粒上编码Ad5纤突的基因序列。本发明的主要用途是：快速、稳定、高产的包装出携带外源基因的Ad5F35型重组腺病毒载体，感染很难用传统病毒载体感染的恶性肿瘤细胞、人外周血细胞和造血干细胞等靶细胞，进而应用于基因治疗、基因功能性研究、反义治疗、疫苗开发领域。

Description

新型重组腺病毒载体骨架质粒及其用途

技术领域

本发明涉及新型重组腺病毒载体骨架质粒及其用途。

背景技术

腺病毒载体是目前运用最广的病毒载体之一，它被广泛用于基因治疗、基因功能性研究、反义治疗、疫苗开发等领域。目前普遍使用的腺病毒包装系统主要有两种：AdEasy系统和AdMax系统。其中，AdEasy系统由穿梭质粒、骨架质粒和原核细胞(BJ5183)组成，外源基因序列被构建入穿梭质粒后，通过与骨架质粒在原核细胞中完成病毒基因组重组来产生重组腺病毒。AdMax系统由含有loxP位点的穿梭质粒、骨架质粒和HEK-293细胞株组成，外源基因序列被构建入穿梭质粒后，通过与骨架质粒在HEK-293细胞中进行基因重组来产生重组腺病毒。

AdMax腺病毒系统是由腺病毒载体鼻祖Dr.Frank Graham在1999年创建的一套重组腺病毒构建系统，目前已被加拿大的Micobix公司开发成为一种腺病毒载体包装系统。AdMax系统进行重组腺病毒包装的基本原理是通过Cre-loxP或FLP-frt重组酶，使转染进HEK-293细胞的穿梭质粒和骨架质粒发生定点重组，产生重组腺病毒，这样得到的重组病毒是E1缺失的复制缺陷型腺病毒，病毒在不能够提供E1区的细胞中只能实现外源基因的表达而本身不具备增殖能力。AdMax系统的特点是通过重组酶在真核细胞内完成重组出毒，高效且稳定，可以说，它是目前最方便快捷的腺病毒包装系统之一。

与现在使用最普及的AdEasy系统相比，AdMax系统出毒更快，能够高效率、简便而快速地获得重组腺病毒，并且病毒的产率(yielding)明显提高。利用AdMax系统，只需要2～4周就能完成从质粒构建到重组出毒的全过程，成功率大于98％(其中95％的克隆含有目的基因)，因为重组出毒是在真核细胞内完成的，保持了对腺病毒的生存压力，因此有助于保持重组腺病毒基因组的完整性；而AdEasy系统的出毒成功率只有18-34％(Stratagene公司新版的AdEasy XL系统成功率在94％左右)，而且在原核细胞(BJ5183)中完成病毒基因组重组，理论上，失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，病毒遗传背景及活性可能会受到影响。

人类腺病毒家族有51个已知血清型，分为6个亚群：A组、B组、C组、D组、E组和F组。现今最常用的腺病毒载体是Ad5，即血清型为5的腺病毒，属于C亚群，AdEasy系统和AdMax系统包装出的也都是Ad5。腺病毒的纤突结(fiber knob)介导病毒与细胞的吸附，除了B组腺病毒以外，其它各组腺病毒都用CAR(coxsackievirus-adenovirus receptors)作为其主要吸附受体(attachment receptor)，而B组腺病毒则用另外一种细胞受体CD46作为吸附受体(Gaggar，A.，et al.，Nature Medicine.2003)。依据组织亲嗜性和与致病部位的相关性，B组腺病毒又进一步分为B1和B2亚组：B1亚组感染呼吸道，B2亚组感染肾和尿道。Ad11p，Ad14，Ad35为B2亚组腺病毒；Ad3，Ad16，Ad21，Ad50为B1亚组腺病毒。CD46是一种广泛表达的补体调节蛋白(complement regulatory protein)，这种蛋白几乎存在于所有的人类体细胞表面。近年来，B组腺病毒的衍生体作为颇具吸引力的基因治疗载体而受到关注，因为它们可以转导造血干细胞、树突状细胞(DC细胞)和恶性肿瘤细胞等靶细胞，而这些细胞往往不易被常用的腺病毒载体(如Ad5)感染(Shayakhmetov，D.，et al.，Journal of Virology.2000)。

近年来，由于基因治疗的需要，包括骨髓干细胞在内的的一系列人造血干细胞(Humanhematopoietic stemcells，HSCs)的转染越来越受到重视。而此类细胞表面通常都缺乏CAR，是一类很难用传统病毒载体，包括Ad5感染的细胞(Crooks，G.M.，and D.B.Kohn.，Blood.1993)。各个血清型的腺病毒间纤突结的核苷酸和氨基酸序列差别很大，通常认为正是这些差别导致了不同血清型的腺病毒所能识别受体的差异(Bailey，A.，et al.，Virology.1994)。因此，很多研究人员都在致力于带有其他血清型腺病毒纤突结的Ad5嵌合体的构建，并已取得了一定的突破。Ad5F35腺病毒载体是一种“改外壳”的腺病毒杂合载体，即在5型腺病毒外壳的基础上用35型腺病毒(Ad35)的纤突替代5型腺病毒的纤突。此重组病毒除了拥有35型腺病毒(Ad35)的纤突结外，其它外壳组成完全是5型腺病毒的外壳蛋白。有实验表明，带有绿色荧光蛋白(GFP)的Ad5F35感染CD34⁺细胞后，54％的细胞中表达了GFP；而用Ad5-GFP以同样条件进行的平行实验结果中，只有25％的CD34⁺细胞能够表达GFP(Shayakhmetov，D.，et al.，Journal ofVirology.2000)。瑞典Lund大学的研究人员已经利用AdEasy系统的骨架质粒为基础，对AdEasy系统进行改造，在骨架质粒中加入编码Ad35的纤突柄、Ad35纤突结的DNA序列，就能够实现利用AdEasy包装嵌合型腺病毒载体的目的(Fan，X.，et al.，Gene Therapy.2000；Nilsson，M.，etal.，2003.Unpublished manuscript)。在穿梭质粒中插入编码外源基因GFP的序列，就能够利用改造过的AdEasy系统包装出重组腺病毒Ad5F35-GFP，以Ad5-GFP为对照，转染CD34⁺造血细胞。同样条件下Ad5F35-GFP感染细胞数是Ad5-GFP的2～3倍；而被感染细胞中GFP的表达量则相差3～4倍(Nilsson M.，et al.，Molecular Therapy.2003)。

参考文献：

文献：

1.Gaggar，A.，Shayakhmetov，D.M.，and Lieber，A.CD46 is a cellular for group B adenoviruses.

Nature Medicine.2003；9(11)：1408-1412.

2.Shayakhmetov，D.，Papayannopoulou，T.，Stamatoyannopoulos，G.，and Lieber，L.Efficient Gene Transfer into Human CD34⁺Cells by a Retargeted Adenovirus Vector.

Journal of Virology.Mar.2000；74(6)：2567-2583.

3.Crooks，G.M.，and D.B.Kohn.

Growth factors increase amphotropic retrovirus binding to human CD34 bone marrow progenitorcells.

Blood.1993；82：3290-3297.

4.Bailey，A.，and V.Mautner.

Phylogenetic relationships among adeno-virus serotypes.

Virology.1994；205：438-452.

5.Fan，X.，Brun，A.，and Karlsson，S.

Adenoviral vector design for high-level transgene expression in primitive human hematopoieticprogenitors.

Gene Therapy.2000；7：2132-2138.

6.Nilsson，M.，et al.

Development of an adenoviral vector system with adenovirus serotype 35 tropism：efficient ransientgene transfer into primary malignant hemato-poietic cells.

2003.Unpublished manuscript.

7.Nilsson M.，Karlsson S.，and Fan X.L.

Functionally Distinct Subpopulations of Cord Blood CD34+Cells Are Transduced by AdenoviralVectors with Serotype 5 or 35 Tropism.

Molecular Therapy.2003；12；4C

发明内容

本发明提供了一种重组腺病毒载体骨架质粒pBHG-fiber5/35，利用这种骨架质粒，可以和AdMax系统含有loxP位点的穿梭质粒以及能够提供腺病毒E1区的细胞(HEK-293细胞、911细胞或者PERC6细胞)共同组成一种新型重组腺病毒载体包装系统。将外源基因克隆入含有loxP位点的穿梭质粒后，与本发明所述的腺病毒载体骨架质粒一起转染细胞，就能够包装出带有外源基因的Ad5F35，此重组Ad5F35是E1区缺失的复制缺陷型腺病毒，在不能够提供E1区的细胞中只能实现外源基因的表达而本身不具备增殖能力。在本发明所述之骨架质粒的PacI单一酶切位点处也可以插入外源基因，带有外源基因序列的pBHG-fiber5/35与含有loxP位点的穿梭质粒共转染能够提供腺病毒E1区的细胞，也可以包装出能够表达外源基因编码蛋白质的重组Ad5F35型腺病毒。与现有的AdEasy系统、AdMax系统等腺病毒包装系统中的骨架质粒相比，本发明所述的骨架质粒的优点在于：第一，本发明中所述的骨架质粒可以和AdMax系统中含有loxP位点的穿梭质粒及细胞组合使用，进行重组腺病毒的包装，从而使得已经将外源基因构建入原有AdMax系统穿梭质粒的用户不必重新进行复杂的质粒构建，就可以应用由本发明所述的骨架质粒所构成的重组腺病毒载体包装系统包装出新型的Ad5F35重组腺病毒；第二，本发明中所述的重组腺病毒载体骨架质粒所构成的包装系统具备AdMax系统出毒快、稳定性好、产率高的优点；第三，利用本发明中所述的骨架质粒，能够包装出带有外源基因的Ad5F35型重组腺病毒，此类重组腺病毒能够通过CD46来感染细胞，而CD46是一种广泛表达的补体调节蛋白，这种蛋白几乎存在于所有的人类体细胞表面，因此，利用本发明中所述骨架质粒所装出的Ad5F35型重组腺病毒与AdMax系统包装出的Ad5型重组腺病毒相比，所能够感染的细胞种类明显增加；第四，一些因为表面缺乏Ad5型腺病毒受体CAR而难以被现有AdEasy及AdMax系统包装出的重组腺病毒所感染的细胞，如树突状细胞(DC细胞)、恶性肿瘤细胞，及CD34⁺的人外周血细胞和造血干细胞等靶细胞，均能够被本发明中所述的重组腺病毒包装系统所包装出的Ad5F35型重组腺病毒感染，从而实现外源基因的转入。

本发明所述之骨架质粒，是以pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架质粒为材料，通过下述方法得到：用AdEasy5/35为模板扩增得到fiber5/35序列，即编码Ad35纤突柄及Ad35纤突结的基因序列，序列如序列表中SEQ ID No 2所示；用fiber5/35序列替换pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架质粒上编码Ad5纤突柄及纤突结的基因序列，如序列表中SEQ ID No 1所示序列，得到pBHG-fiber5/35。因此，在pBHG-fiber5/35质粒上，含有SV40AN位点和pIX基因，SV40AN位点和pIX基因之间含有Cre位点、HCMV IE立早启动字、氨苄青霉素抗性基因和loxP位点。pBHG-fiber5/35与pBHGlox(delta)E1，3Cre相比，编码腺病毒纤突柄及纤突结的基因发生了改变，而重组腺病毒包装所需的其他元件并没有发生变化。通过这种改造，使得pBHG-fiber5/35骨架质粒可以与带有loxP位点的穿梭质粒配合起来进行重组腺病毒的包装，而且包装出的带有外源基因的重组腺病毒不仅保留了AdMax系统出毒快、稳定性好、产率高等优点，而且感染细胞的范围更广、感染效率更高、外源基因表达量更多。

本发明所述之骨架质粒可以与具有loxP位点的穿梭质粒一起共转染细胞，在细胞内发生病毒基因组同源重组，产生能够表达外源基因的Ad5F35型重组腺病毒。

本发明所述之骨架质粒可以与具有loxP位点的穿梭质粒共转染细胞，在细胞内发生病毒基因组同源重组，产生携带组织或肿瘤特异启动元件的Ad5F35型重组腺病毒。

附图说明

图1.本发明公开的骨架质粒构建流程

(1)将AdMax系统中的骨架质粒pBHGlox(delta)E1，3Cre用SpeI和XbaI进行双酶切，保留酶切后得到的大片段；

(2)将双酶切得到的小片段即图1中的片段I克隆入pBluescript II KS，得到中间质粒I；

(3)用PacI和AflII双酶切中间质粒I，保留酶切得到的大片段；

(4)以AdEasy5/35为模板扩增得到两端带有PacI和AflII酶切位点的fiber5/35序列，即为图1中所示的片段II；

(5)将步骤(4)得到的fiber5/35序列即片段II连接入步骤(3)得到的大片段中，得到中间质粒II；

(6)将步骤(5)得到的中间质粒II用SpeI和XbaI进行双酶切，将得到的小片段与步骤(1)中保留的大片段连接，得到本发明中所述之骨架质粒pBHG-fiber5/35。与改造前的pBHGlox(delta)E1，3Cre质粒相比，在SpeI与XbaI两个酶切位点间，编码Ad5纤突柄及Ad5纤突结的基因序列(图3B所示)被编码Ad35纤突柄及Ad35纤突结的基因序列替换(图3A所示)，其他序列没有改变。

图2.Microbix公司AdMax系统pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架质粒结构示意图此质粒上含有SV40AN位点和pIX基因，SV40AN位点和pIX基因之间含有Cre位点、HCMVIE立早启动字、氨苄青霉素抗性基因和loxP位点，还具有如图2所示的多个限制性内切酶的位点。

图3.本发明公开的骨架质粒与pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架质粒相比，SpeI与XbaI两个酶切位点间序列的示意图

图A显示的是本发明公开的骨架质粒中SpeI与XbaI两个酶切位点间序列的示意图，在两个酶切位点间包含Ad5尾部序列、Ad35纤突柄序列、Ad35纤突结序列、polyA序列、E4基因序列；

图B显示的是AdMax系统中未经改造的pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架质粒，SpeI与XbaI两个酶切位点间序列的示意图，在两个酶切位点间，包含Ad5尾部序列、Ad5纤突柄序列、Ad5纤突结序列、polyA序列、E4基因序列

图4.本发明公开的骨架质粒与带有外源基因及loxP位点的穿梭质粒一起共转染细胞，在细胞内发生病毒基因组同源重组，产生能够表达外源基因的Ad5F35型重组腺病毒过程的示意图通过Cre-loxP重组酶，转染进HEK-293细胞的穿梭质粒和骨架质粒发生定点重组，7～10天后，产生带有外源基因序列的重组腺病毒

图5.带有编码GFP的外源基因序列及loxP位点的穿梭质粒与本发明所述的骨架质粒共转染HEK-293细胞后，产生能够表达外源基因GFP的Ad5F35重组腺病毒

图A是在相差显微镜下观察的结果，在图的中心部分可以看到一个明显的毒斑；图B是同一视野在荧光显微镜下观察的结果，可以看到毒斑及其周围细胞中有能够发出绿色荧光的GFP表达。

结果说明：用带有编码外源基因序列及loxP位点的穿梭质粒与本发明所述的骨架质粒，以及能够提供腺病毒E1区的细胞(本实施例中采用HEK-293细胞)所组成的新型重组腺病毒包装系统能够包装出表达外源基因的Ad5F35重组腺病毒。

图6.利用发明所述的系统包装出的Ad5F35-GFP与Ad5-GFP感染CD34⁺造血干细胞的效率比较结果

白色柱状图显示的是在MOI分别为20、100、500时用Ad5-GFP感染CD34⁺造血干细胞后能够表达GFP的细胞占总细胞量的百分比；黑色柱状图显示的是在MOI分别为20、100、500时用Ad5F35-GFP感染CD34⁺造血干细胞后能够表达GFP的细胞占总细胞量的百分比。^***表示在t检测中，p＜0.001。结果说明：与Ad5相比，Ad5F35能够携带外源基因高效感染CD34⁺造血干细胞，并实现外源基因在其中的表达。

图7.带有编码人血管内皮细胞生长因子VEGF的外源基因序列及loxP位点的穿梭质粒与本发明所述的骨架质粒共转染HEK-293细胞后，产生能够表达外源基因VEGF的Ad5F35重组腺病毒

结果可以看到，被病毒感染的细胞胀大、脱落、崩解，细胞间出现明显的毒斑。

图8.带有编码人血管内皮细胞生长因子VEGF的外源基因序列及loxP位点的穿梭质粒与本发明所述的骨架质粒共转染HEK-293细胞后，产生能够表达外源基因VEGF的Ad5F35重组腺病毒Ad5F35-VEGF，用此病毒感染CHO细胞，Western blot检测被病毒感染的实验组细胞及未被病毒感染的对照组细胞抽提液中VEGF表达情况

结果可以看出，被Ad5F35-VEGF感染的A59细胞与未被感染的细胞相比，VEGF的表达量明显增加。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的描述，但本发明的内容并不只限于下列实施例所述的范围。能够与含有loxP位点的穿梭质粒及本发明所述的pBHG-fiber5/35质粒构成重组腺病毒包装系统的细胞是能够提供腺病毒E1区的细胞，下述实施例以HEK-293细胞为例进行说明，其它允许细胞也可以使用。

实施例1：pBHG-fiber5/35质粒的构建过程

以图2所示的pBHGlox(delta)E1，3Cre质粒为材料，按照图1所示的过程，构建本发明所公开的骨架质粒，步骤如下：

(1)将AdMax系统中的骨架质粒pBHGlox(delta)E1，3Cre用SpeI和XbaI进行双酶切，保留酶切后得到的大片段；

(2)将双酶切得到的小片段即图1中的片段I克隆入pBluescript II KS，得到中间质粒I；

(3)用PacI和AflII双酶切中间质粒I，保留酶切得到的大片段；

(4)以AdEasy5/35为模板扩增得到两端带有PacI和AflII酶切位点的fiber5/35序列，即为图1中所示的片段II；

(5)将步骤(4)得到的fiber5/35序列即片段II连接入步骤(3)得到的大片段中，得到中间质粒II；

(6)将步骤(5)得到的中间质粒II用SpeI和XbaI进行双酶切，将得到的小片段与步骤(1)中保留的大片段连接，得到本发明中所述之骨架质粒pBHG-fiber5/35。与改造前的pBHGlox(delta)E1，3Cre质粒相比，在SpeI与XbaI两个酶切位点间，编码Ad5纤突柄及Ad5纤突结的基因序列(图3B所示)被编码Ad35纤突柄及Ad35纤突结的基因序列替换(图3A所示)，其他序列没有改变。

实施例2：利用本发明所述的重组腺病毒载体骨架质粒pBHG-fiber5/35包装出带有外源基因的重组腺病毒

下列操作均在无菌条件下进行，包装出毒的原理如图4所示：

1.将HEK-293细胞复苏：

1.1取冻存于液氮中的HEK-293细胞一支，迅速于35～42℃温水中融化；

1.2将细胞在室温，1000rpm下离心5分钟；

1.3弃掉上清，加入1mL含有10％FBS的DMEM，轻轻吹打重悬细胞；

1.4将重悬的细胞加入装有5mL含有10％FBS的DMEM的25cm²培养瓶中，在5％CO₂，37℃条件下培养过夜；

2.HEK-293细胞的转染

2.1细胞培养至汇合度达到80％时，在转染前2～6小时，给细胞换液，换上新鲜的含有10％FBS的DMEM；

2.2用携带有外源基因序列且含有loxP位点的穿梭质粒和本发明所述的骨架质粒共转染细胞；

2.34～11天后，细胞全部被感染、脱落并崩解，培养细胞的培养液中即含有携带有外源基因序列的Ad5F35型重组腺病毒。

实施例3：带有编码GFP的外源基因序列及loxP位点的穿梭质粒与本发明所述的骨架质粒共转染细胞后，包装出表达外源基因GFP的Ad5F35型重组腺病毒

1.将HEK-293细胞复苏：

1.1取冻存于液氮中的HEK-293细胞一支，迅速于35～42℃温水中融化；

1.2将细胞在室温，1000rpm下离心5分钟；

1.3弃掉上清，加入1mL含有10％FBS的DMEM，轻轻吹打重悬细胞；

1.4将重悬的细胞加入装有5mL含有10％FBS的DMEM的25cm²培养瓶中，在5％CO₂，37℃条件下培养过夜；

2.HEK-293细胞的转染

2.1细胞培养至汇合度达到80％时，在转染前2～6小时，给细胞换液，换上新鲜的含有10％FBS的DMEM；

2.2用携带有编码GFP基因序列且含有loxP位点的穿梭质粒和本发明所述的骨架质粒共转染细胞；

3.3～7天后，开始有重组腺病毒Ad5F35-GFP包装成功，在相差显微镜下观察可看到部分细胞发生聚集、细胞间出现毒斑(图5A)，在荧光显微镜下可观察到有Ad5F35-GFP包装的细胞产生绿色荧光(图5B)。

实施例4：利用实施例3所述的方法包装出的Ad5F35-GFP重组腺病毒感染CD34⁺造血干细胞

1.CD34⁺造血干细胞的分离和培养

1.1采集脐带血；

1.2用德国Miltenyi Biotech公司生产的CD34⁺起源细胞分离试剂盒分离CD34⁺造血干细胞；

1.3用流式细胞仪检测，分离得到的CD34⁺造血干细胞纯度达到95％以上；

1.4将分离得到的CD34⁺造血干细胞以2×10^5/孔的数量置于细胞培养用24孔板中，用美国BioWhittaker公司生产的X-vivo 15无血清培养基培养，培养基用量为每孔600微升；

1.5培养CD34⁺造血干细胞的培养基中还含有：1％的加拿大StemCellTechnologies公司产牛血清白蛋白、2mM的L-谷氨酰胺、100uM的β-巯基乙醇、100单位/mL的青霉素、100ug/mL的链霉素。

1.6在CD34⁺造血干细胞培养的生存期，上述培养基中加入人巨核细胞生长发育因子至50ng/mL、干细胞生长因子至100ng/mL、Flt3配基至50ng/mL；

1.7在CD34⁺造血干细胞培养的增殖期，上述培养基中加入人干细胞生长因子至100ng/mL。

2.Ad5F35-GFP重组腺病毒感染CD34⁺造血干细胞

2.1CD34⁺造血干细胞培养过夜后，用实施例3中所述的方法包装出的Ad5F35-GFP分别以MOI为20、100、500感染细胞，混合均匀，同时以同样的条件用Ad5-GFP感染细胞作为对照；

2.2三小时后，洗去未感染细胞的残留病毒，细胞换新鲜的培养基。

3.外源基因表达的检测及作图

3.1病毒感染细胞48小时后，用流式细胞仪检测实验细胞和对照细胞中GFP的表达量；

3.2以能够表达GFP的CD34⁺造血干细胞占细胞总量的百分比为纵坐标，对不同MOI条件下Ad5-GFP感染细胞与Ad5F35-GFP感染细胞的情况做柱状图，计算方差。结果如图6所示，与Ad5-GFP相比，Ad5F35-GFP能够更高效感染CD34⁺造血干细胞，并实现GFP在其中更大量的表达。

实施例5：带有编码人血管内皮细胞生长因子VEGF的外源基因序列及loxP位点的穿梭质粒与本发明所述的骨架质粒共转染细胞后，包装出表达外源基因VEGF的Ad5F35型重组腺病毒

1.将HEK-293细胞复苏：

1.1取冻存于液氮中的HEK-293细胞一支，迅速于35～42℃温水中融化；

1.2将细胞在室温，1000rpm下离心5分钟；

1.3弃掉上清，加入1mL含有10％FBS的DMEM，轻轻吹打重悬细胞；

1.4将重悬的细胞加入装有5mL含有10％FBS的DMEM的25cm²培养瓶中，在5％CO₂，37℃条件下培养过夜；

2.HEK-293细胞的转染

2.1细胞培养至汇合度达到80％时，在转染前2～6小时，给细胞换液，换上新鲜的含有10％FBS的DMEM；

2.2用携带有编码人VEGF基因序列且含有loxP位点的穿梭质粒和本发明所述的骨架质粒共转染细胞；

3.3～7天后，开始有重组腺病毒Ad5F35-VEGF包装成功，在相差显微镜下观察可看到部分细胞发生聚集、细胞间出现毒斑(图7)。

实施例6：带有编码人血管内皮细胞生长因子VEGF的外源基因序列的重组腺病毒Ad5F35-VEGF感染CHO细胞后，在细胞中表达VEGF

1.将CHO细胞复苏：

1.1取冻存于液氮中的CHO细胞一支，迅速于35～42℃温水中融化；

1.2将细胞在室温，1000rpm下离心5分钟；

1.3弃掉上清，加入1mL含有10％FBS的DMEM，轻轻吹打重悬细胞；

1.4将重悬的细胞加入装有5mL含有10％FBS的DMEM的25cm²培养瓶中，在5％CO₂，37℃条件下培养过夜；

2.CHO细胞的感染

细胞培养扩增至2×10⁸个细胞时，以MOI＝10的剂量加入Ad5F35-VEGF，感染12～16小时。

3.CHO细胞中表达VEGF的检测

3.1CHO细胞被感染24小时后，收集细胞，加入2×SDS-PAGE上样缓冲液，进行SDS-PAGE，同时以未被感染的细胞为对照组；

3.2对照组和实验组的样品同时以抗VEGF抗体进行Western blot检测；

3.3Western blot检测结果用ECL化学发光法显色。由图8结果可看出，Ad5F35-VEGF感染的细胞中VEGF的表达量大大多于对照组细胞。

                      序列表

<110>本元正阳基因技术股份有限公司

<120>新型重组腺病毒载体骨架质粒及其用途

<130>200412171

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2280

<212>DNA

<213>Human adenovirus type 5

<220>

<221>被替换的Ad5的序列

<222>(44)..(2181)

<223>

<400>1

gtctggtaaa gcaggccaaa gtcacctacg acagtaatac caccggacac cgccttagct     60

acaagttgcc aaccaagcgt cagaaattgg tggtcatggt gggagaaaag cccattacca    120

taactcagca ctcggtagaa accgaaggct gcattcactc accttgtcaa ggacctgagg    180

atctctgcac ccttattaag accctgtgcg gtctcaaaga tcttattccc tttaactaat    240

aaaaaaaaat aataaagcat cacttactta aaatcagtta gcaaatttct gtccagttta    300

ttcagcagca cctccttgcc ctcctcccag ctctggtatt gcagcttcct cctggctgca    360

aactttctcc acaatctaaa tggaatgtca gtttcctcct gttcctgtcc atccgcaccc    420

actatcttca tgttgttgca gatgaagcgc gcaagaccgt ctgaagatac cttcaacccc    480

gtgtatccat atgacacgga aaccggtcct ccaactgtgc cttttcttac tcctcccttt    540

gtatccccca atgggtttca agagagtccc cctggggtac tctctttgcg cctatccgaa    600

cctctagtta cctccaatgg catgcttgcg ctcaaaatgg gcaacggcct ctctctggac    660

gaggccggca accttacctc ccaaaatgta accactgtga gcccacctct caaaaaaacc    720

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ccgctaaccg tgcacgactc caaacttagc attgccaccc aaggacccct cacagtgtca    900

gaaggaaagc tagccctgca aacatcaggc cccctcacca ccaccgatag cagtaccctt    960

actatcactg cctcaccccc tctaactact gccactggta gcttgggcat tgacttgaaa    1020

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ttttcaattg cagaaaattt caagtcattt ttcattcagt agtatagccc caccaccaca    2280

<110>本元正阳基因技术股份有限公司

<120>新型重组腺病毒载体骨架质粒及其用途

<130>200412172

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>2

<211>1092

<212>DNA

<213>Human adenovirus type 35

<220>

<221>插入到骨架质粒中的Ad35序列

<222>(129)..(972)

<223>

<400>2

atgaccaaga gagtccggct cagtgactcc ttcaaccctg tctaccccta tgaagatgaa     60

agcacctccc aacacccctt tataaaccca gggtttattt ccccaaatgg cttcacacaa    120

agcccagacg gagttcttac tttaaaatgt ttaaccccac taacaaccac aggcggatct    180

ctacagctaa aagtgggagg gggacttaca gtggatgaca ctgatggtac cttacaagaa    240

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gtgaaccaaa tgttcacaca aaagacagca aacatccaat taagattata ttttgactct    600

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cccttcaaca ccactactag ggatagtgaa aactacattc atggaatatg ttactacatg    780

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ttttgcctcc accttcccat ttgacagaat acaccaatct ctccccacgc acagctttaa    1080

acatttggat cc                                                        1092

Claims (10)

1.新型重组腺病毒载体骨架质粒pBHG-fiber5/35。

2.根据权利要求1所述之骨架质粒，其特征在于，所述骨架质粒是以pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架质粒为材料改造而成的。

3.根据权利要求2所述之改造，其特征在于，所述改造是通过用编码Ad35纤突柄及Ad35纤突结的基因序列替换了pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架质粒上编码Ad5纤突柄及Ad5纤突结的基因序列所完成的。

4.根据权利要求1所述之骨架质粒，其特征在于，所述骨架质粒上的PacI酶切位点是外源基因插入的位点。

5.根据权利要求1所述之骨架质粒，其特征在于，所述骨架质粒上含有SV40 AN位点和pIX基因，SV40 AN位点和pIX基因之间含有Cre位点、HCMV IE立早启动子、氨苄青霉素抗性基因和loxP位点。

6.根据权利要求1所述之骨架质粒，其特征在于，所述骨架质粒可以与有loxP位点的穿梭质粒、能够提供腺病毒E1区的细胞组成新型重组腺病毒包装系统。

7.根据权利要求1所述之骨架质粒，其特征在于，所述骨架质粒可以与有loxP位点的穿梭质粒一起共转染细胞，在细胞内发生病毒基因组同源重组，产生能够表达外源基因的Ad5F35型重组腺病毒。

8.根据权利要求1所述之骨架质粒，其特征在于，所述骨架质粒与有loxP位点的穿梭质粒、能够提供腺病毒E1区的细胞组成的新型重组腺病毒包装系统，包装出的重组腺病毒是E1缺失的复制缺陷型腺病毒。

9.根据权利要求1所述之骨架质粒，其特征在于，所述骨架质粒与有loxP位点的穿梭质粒、能够提供腺病毒E1区的细胞组成的新型重组腺病毒包装系统，包装出的重组腺病毒上能够带有外源基因序列。

10.根据权利要求1所述之骨架质粒，其特征在于，所述骨架质粒的用途是用于新型重组腺病毒的包装。

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