CN110272917B - 一套快速准确的三质粒溶瘤腺病毒重组包装系统Ad5MixPlus及其应用 - Google Patents

一套快速准确的三质粒溶瘤腺病毒重组包装系统Ad5MixPlus及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一套快速准确的三质粒溶瘤腺病毒重组包装系统Ad5MixPlus及其应用。所述系统由3个腺病毒重组质粒组成，其核心技术就是巧妙地在第一个5型腺病毒右臂骨架质粒大载体上装载两套不同的位点重组序列，再由两个小的穿梭质粒分别提供右臂改造的Hexon/E3/Fiber序列和左臂肿瘤特异性启动子控制的E1a表达框，避开了对腺病毒骨架大载体改造的困难和障碍。经过两轮位点特异性重组，准确快速地包装出理想的溶瘤腺病毒。本发明将病毒重组包装过程简单化、快速化，解决了腺病毒骨架大载体改造的挑战性难题，能快速重组并筛选到需要的溶瘤腺病毒，非常适合产业化需要，所包装的溶瘤腺病毒具备显著的抗肿瘤活性。

Description

一套快速准确的三质粒溶瘤腺病毒重组包装系统Ad5MixPlus 及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，涉及一套快速准确的三质粒溶瘤腺病毒重组包装系统Ad5MixPlus及其应用。
背景技术
恶性肿瘤已成为影响全人类生命的一大类疾病。2000年全球新发肿瘤病例约1000万人，死亡620万人，到2018年全球新发肿瘤病例已增至1810万，死亡达960万人(CA CancerJ Clin.2018 Nov；68:394-424)。我国2000年肿瘤发病人数约180-200万人，死亡140-150万人，而到2014年新增病例数占380.4万人，死亡占229.6万人，肿瘤已占死因的首位(Chin JCancer Res.2018 Feb；30:1-12)。目前对恶性肿瘤的治疗除了常规的手术、放疗、化疗治疗手段以外，近几年发展起来的肿瘤免疫治疗有了突飞猛进的发展，特别是免疫检查点治疗如PD-1/PD-L1抗体和免疫细胞治疗如CAR-T，成为继放疗、化疗、手术治疗之后综合治疗中不可或缺的一部分。以CAR-T细胞、PD-1/PD-L1抗体为代表的免疫疗法已在临床应用，展示出强大疗效和巨大市场价值(Nat Biotechnol.2018 Oct；36:847-856；Cell.2018 Oct 4；175:313-326)。2017年8月，诺华公司治疗B细胞急性淋巴白血病的CAR-T产品Kymriah被FDA批准上市，定价47.5万美元。2个月后，FDA又批准Kite公司治疗大B细胞淋巴瘤的CAR-T药物Yescarta上市，定价37.3万美元。近来科学家又发现，多种能够作为CAR-T细胞、PD-1/PD-L1抗体免疫疗法增效剂的溶瘤病毒产品，不仅能增强放化疗作用，同样能提高抗体、免疫细胞治疗效果。同时，这些溶瘤病毒感染的肿瘤细胞能释放大量细胞因子，裂解的肿瘤细胞释放大量肿瘤相关抗原，兼有免疫激活作用，因此与CAR-T细胞、PD-1/PD-L1抗体联合，有利于免疫治疗效果的放大，溶瘤病毒产品应用范围也得以拓宽。
溶瘤病毒(oncolytic virus,OV)是经过人工基因改造的一类病毒，能够特异性地在肿瘤细胞中大量复制，而不影响正常细胞，大量复制的病毒溶解破坏肿瘤细胞，释放出病毒粒子继续感染破坏更多的肿瘤细胞。以溶瘤病毒作为载体携带抗癌基因，随着病毒的复制及扩散，其所携带的抗癌基因拷贝数随之增加，基因蛋白产物表达量增加，抗癌效果与溶瘤效应协同，进一步增强抗癌疗效。相比于CAR-T细胞治疗，溶瘤病毒适应症更广；相比于单抗药物，溶瘤病毒价格更低廉。溶瘤病毒介导的基因治疗对肿瘤细胞杀伤效率高、靶向性好、安全性高、副作用小和成本低廉，使其成为继三大常规治疗方法(手术、放疗和化疗)和免疫细胞治疗之后的又一重要的新兴肿瘤治疗模式，有望成为肿瘤综合治疗协同提高疗效的重要辅助手段。2017年9月医学顶级期刊《Cell》报道一项重大突破，来自美国、瑞士、西班牙和澳大利亚的研究人员，在一项针对21名黑色素瘤患者的Ib期临床试验中，研究了溶瘤病毒疗法与PD-1单抗免疫治疗联合的疗效，结果提示溶瘤病毒能有效改善免疫疗法的疗效，总体反应率高达62％，联合治疗明显比单独治疗表现得更好，提示溶瘤病毒作为肿瘤综合治疗的方法之一，具有非常美好的前景(Cell.2017 Sep 7；170:1109-1119.e10)。而溶瘤病毒的里程碑事件是2015年Amgen公司的溶瘤病毒Talimogene laherparepvec(T-Vec)被美国和欧盟批准上市，T-Vec表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，通过直接注射入肿瘤，在肿瘤细胞中复制直至引起细胞裂解(溶瘤作用)，同时在肿瘤组织局部释放GM-CSF，激活系统性免疫反应。T-Vec通过引发肿瘤细胞溶解和激发全身抗肿瘤免疫反应两种重要且协同的方式发挥作用(Lancet Oncol.2016 Nov；17:1485-1486)。仅针对黑色素患者的治疗市场，汤森路透预计到2020年T-Vec销售额为3.88亿美元/年。
OV一直是抗肿瘤药研发热点，也是资本市场和制药集团关注热点。2018年初，默沙东公司和Viralytics公司宣布，默沙东以3.94亿美元价格收购Viralytics，相当于Viralytics股票一个月成交量加权平均价格的160％溢价，默沙东获得Viralytics研发的溶瘤病毒免疫疗法(CVA21)的全部权利。/>是基于Viralytics专有的溶瘤病毒(Coxsackievirus Type A21)制剂，已被证明可优先感染并杀死癌细胞。CAVATAK目前正处于多个I期和II期临床试验，作为肿瘤内静脉注射剂，考虑到默沙东正在进行的PD-1药物/>的试验，CAVATAK下一步或与其PD-1药物/>联合使用，用于黑色素瘤、前列腺癌、肺癌和膀胱癌的治疗。2011年生物技术巨头安进公司以4.25亿美元收购BioVex公司研发的OV药物T-Vec，2015年FDA批准T-Vec上市，同年12月取得欧盟CHMP许可，成为OV治疗肿瘤里程碑。目前，T-Vec已在美国、欧洲和澳大利亚广泛用于复发黑色素瘤治疗，平均成本65000美元，汤森路透预计到2020年T-Vec销售额为3.88亿美元/年。进入ΙIΙ期临床的OV产品还有Oncolytics公司治疗头颈部肿瘤的Reolysin、ColdGenesys公司治疗膀胱癌的CG0070、Advantagene公司治疗前列腺癌的Prost AtakTM、Jennerex公司治疗肝癌的PexaVec。OV是一个广谱抗肿瘤药，目前进入临床试验的OV治疗的肿瘤包括黑色素瘤、头颈部癌、前列腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、肝癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、卵巢癌等，其中，前六种肿瘤将是最近几年的主要市场。据北京欧立信信息咨询有限公司预测，针对头颈部肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、胶质细胞瘤和肝癌即将上市的OV产品，分别有11.7、71.5、29.25、22.75和48.64亿美元的年销售额。OV更大的应用价值是与放化疗联合，Oncolytics公司的Reolysin与紫杉醇/卡铂联合治疗晚期头颈部癌，应答率为42％，而单用化疗仅为3-10％。因此，考虑OV可以和其他药物联合应用，其市场空间更加巨大。
我国在OV领域也取得不少成绩，国家科技部新药创制重大专项连续将OV研发立为支持项目，2005年CFDA抢先批准上海三维生物技术有限公司研发的溶瘤腺病毒“H101”(商品名：安柯瑞)一类新药许可，成为全球第一个上市的OV药物。
OV是为解决基因治疗中抗癌基因表达量低及载体不能靶向肿瘤细胞等缺点而开始研发的。以溶瘤病毒为载体介导肿瘤的基因治疗，则能够靶向肿瘤细胞，产生溶瘤效应，并与基因治疗产生协同抗癌效应，具有明显的应用价值。理论上，很多种类的病毒都可以被改造成溶瘤病毒，如T-Vec由单纯疱疹病毒改造而来，ProstAtak和G0070是腺病毒，Reolysin是呼肠孤病毒，JX-594是牛痘病毒。腺病毒是研究最广泛深入的类型，形成溶瘤病毒的品种也最多。腺病毒种类多，结构复杂，目前已发现有100余个血清型，其基因组为线状双链DNA分子，大约35～36kb。与其他类型的病毒相比，腺病毒的优点有：几乎能感染所有类型的细胞，能在宿主细胞中有效进行增殖；病毒基因组不整合到宿主细胞染色体中，无插入致突变性；滴度高，易于制备和纯化等，最适宜开发安全的OV产品。但腺病毒作为溶瘤病毒，也存在一些缺点：如自身免疫原性强、特异性差和静脉注射易在肝脏富集等，因此需要对其进行进一步改造。这些复杂性特点正好成为我们进行靶向性和有效性改造的最佳机会，更有利于通过全方位的改造研发出多机制协同抗癌的高效溶瘤腺病毒(OAV)产品，并能根据肿瘤类型特征设计构建个性化的OAV。对腺病毒的改造主要集中于提高靶向肿瘤细胞的特异性、感染细胞的转染率、装载的抗癌基因的表达量、以及避免机体免疫系统对病毒的清除(Mol Cancer Ther.2016 Jul；15:1436-51)。
OAV构建以致病力最弱的人类腺病毒C亚属中的5型(Ad5)为基础，主要分为基因组左臂E1区的改造和右臂外壳蛋白、纤毛蛋白、E3区的改造。
1.腺病毒基因组左臂功能区改造
构建OAV，需要保留E1a蛋白表达并使其受肿瘤特异性启动子调控，实现肿瘤特异性复制。E1a有3个功能区，即CR1、CR2、CR3，CR1区通过与转录调节因子P300/CBP结合能抑制Her-2/neu基因的表达，CR2区与Rb蛋白家族结合，CR3区是转录活化区。因此E1a蛋白具有抗肿瘤作用，既可以抑制Her-2/neu基因的转录、阻断NF-κB的活性、提高p53的表达，又可以抑制Ⅳ型胶原酶、纤溶酶原激活剂等蛋白酶基因表达；E1a还能引起非特异性免疫反应，提高CTL细胞、NK细胞、巨噬细胞的杀伤效应等多种途径，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤侵袭转移，提高肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性。对E1a的CR2区引入缺失突变，使其不能结合Rb蛋白，保证去磷酸化的Rb蛋白与转录因子E2F形成复合物，阻断E2F的转录活性，可以增强抗癌活性。改造E1a实现其抗癌活性、阐明其功能作用的分子机制和信号通路，还有很多问题需要深入研究，特别是OAV感染癌细胞释放大量细胞因子，裂解癌细胞释放大量肿瘤相关抗原，发挥进一步的免疫激活作用，因此OAV最大的应用价值是与免疫治疗的联合应用。
Elb转录单元编码Elb-55kDa和Elb-19kDa。Elb-55kDa是腺病毒在正常细胞增殖复制必需的而在肿瘤细胞中不必需的蛋白，Elb-55kDa编码基因的选择性缺失可以使腺病毒在肿瘤细胞内保持增殖复制的能力，而在正常细胞中失去复制能力。Elb-55kDa蛋白能够灭活并降解P53蛋白，Elb-55kDa缺失有利于细胞保持P53的抗肿瘤活性，同时提高病毒载体的靶向性。Elb-19kDa基因与凋亡抑制基因Bcl-2同源，Elb-19kDa蛋白能够结合Bax或/和Bak启动下游的凋亡抑制程序，保护感染的细胞免受TNF-α介导的杀伤作用，Elb-19kDa缺失，因而该病毒突变体在肿瘤细胞内增殖的特异性得以提高，而在正常细胞内的增殖活性被削弱。Elb-19kDa缺失能够促进癌细胞凋亡通路的恢复，且有利于病毒在正常细胞内的快速清除以及在肿瘤细胞内的快速释放和播散，使OAV特异性更好，效能更强。但Elb-55kDa和Elb-19kDa双缺失是否影响OAV增殖力、通过对两者的改造能否产生免疫增强作用，需要进一步研究。
2.腺病毒基因组右臂功能区改造
腺病毒基因组右臂E3转录单位有9个开放读框，编码蛋白保护感染细胞免受宿主免疫反应的杀伤，E3-gpl9k可减弱CTL介导的感染细胞杀伤效应；RID可阻断“死亡”配体包括TNF、Fas配体和TRAIL，介导的细胞凋亡；RID还可抑制IL-1和TNF介导的细胞存活所必须的NF-κB的激活；E3-6.7k除了使TRAIL受体下调之外还可单独抑制外部和内部信号通路诱导的细胞凋亡；E3-14.7k是TNF介导细胞凋亡的广泛抑制剂，也可结合并抑制Caspases-8从而阻止Fas信号通路启动的细胞凋亡；E3-14.7k与受感染的细胞内FIP蛋白(for 14.7K-interacting protein，FIP-1、-2、-3)作用，可使E3-14.7k蛋白在细胞凋亡和存活、炎症反应、维持膜稳定、核浆转运等信号转导通路中处于重要地位，这一多功能的E3蛋白的分子机制仍需深入研究。腺病毒死亡蛋白(ADP)可促进溶解细胞、病毒释放，然而分子机制不明。由此可见，在OAV构建过程中删除E3区，既可以扩大载体容量，又能够促进受感染的癌细胞的凋亡。但E3缺失也解除了病毒对机体的免疫抵抗，病毒可被快速清除。因此有必要加强对E3区编码蛋白的认识，在OAV构建中避免盲目删除全部E3区，可能更有利于目的基因的长期表达。
人类腺病毒家族有52个血清型，分6个亚属(A至F)。除了B组以外，各组腺病毒都用Coxsackievirus-adenovirus receptor(CAR)作为其主要吸附受体，对缺乏CAR的造血细胞、造血干细胞、树突状细胞、部分肿瘤细胞尤其是肿瘤干细胞等感染效率很低。B组腺病毒(Ad3、Ad11b、Ad14、Ad16、Ad21、Ad35、Ad50)则主要识别一种广泛表达的补体调节蛋白CD46。采用B组腺病毒的纤毛蛋白(fiber knob)替代Ad5纤毛蛋白，构建嵌合病毒，则有利于提高病毒对肿瘤细胞转导效率，特别是感染肿瘤干细胞的能力，有可能更彻底地根除肿瘤复发的根源。
Ad5在自然界存在较广，大多数人已被感染并产生了中和抗体，能够拦截病毒。况且Ad5具有嗜肝细胞性，能够被肝细胞吸附。腺病毒外壳蛋白Hexon的高变区(HVR)因位置暴露于腺病毒表面，是导致不同血清型腺病毒之间对肝脏感染能力和免疫原性差异的关键部位。将Ad5的Hexon分子内7个HVR选择性地与稀有血清型如D亚群(Ad37、Ad43)、B亚群(Ad48)病毒的Hexon相应区域进行嵌合，是帮助Ad5逃避预存免疫和肝脏摄取的有效方法。然而，Hexon作为腺病毒的主要结构蛋白，对其进行改造往往会导致腺病毒载体结构不稳定，从而无法有效地包装病毒，因此这是一项很具有挑战性的研究。
3.腺病毒重组包装技术
目前包装腺病毒采用的最多的系统是Microbix Biosystems公司包装技术，以腺病毒左臂质粒pDC系列(如pDC315、pDC316、pDC312等)和完全删除E1/E3区的左臂骨架质粒(pBHGloxdelE13cre)进行重组，这个技术市场上用了近20年，而且现在一直还在用，产生的病毒都是缺少全部E3区的。实现E1a肿瘤特异性增殖以及外源抗癌基因表达都要靠pDC质粒携带，重组到腺病毒E1区。这样一来，左臂插入片段大小受限，而且E1a的启动子和抗癌基因启动子都在E1区，相距太近，互相干扰，表达效率都有下降。我们前期尝试用绝缘子序列隔开，虽有改善，但效果不明显。曾有人尝试将外源抗癌基因插入到E3区，外源基因表达效率较理想，但右臂质粒较大，以pBHGloxdelE13cre为例大小为34.707kb，做一次大载体的改造难度较大，成功率也不高，往往需要反复尝试很多次才能筛选到正确的载体。
对于构建新型的OAV来说，为了提高OAV靶向肿瘤细胞的特异性、感染细胞的转染率、装载的抗癌基因的表达量、以及避免机体免疫系统对病毒的清除，需要对右臂骨架质粒进行较大范围改造，不但要在不同的血清型腺病毒之间筛选能增强腺病毒感染效率的Fiber分子、筛选能使病毒逃避机体免疫拦截和肝脏摄取的Hexon分子、以及筛选不同机制不同功能的多种外源基因插入E3区，每一个分子的筛选和改造都要重构一次右臂骨架大载体，且从Hexon、E3区到Fiber，基因组跨度达14kb，工作量大，难度高，费时耗力。如2013年博士论文“靶向胃癌相关成纤维细胞的纤毛蛋白修饰、六联体嵌合型溶瘤腺病毒载体的实验研究”，以嵌合型六联体基因替换原有的六联体基因，得到含有高变区的嵌合型六联体的腺病毒骨架质粒载体，即存在上述技术问题。为了解决OAV构建包装的技术难题，我们研发出一套快速准确的三质粒溶瘤腺病毒重组系统Ad5MixPlus，并在实际应用中得到证实，能够省时省力、准确快速地包装重组出理想的OAV新产品。
发明内容
实现腺病毒靶向肿瘤细胞增殖并产生溶瘤作用，以及介导抗癌基因高效表达，需要对腺病毒进行大范围的改造，几乎涉及到整个基因组，主要是提高靶向肿瘤细胞的特异性、感染细胞的转染率、装载的抗癌基因的表达量、以及避免机体免疫系统对病毒的清除。以往的OAV改造及重组，多集中于腺病毒基因组左臂E1功能区，外源抗癌基因也插入在E1区，E1a的肿瘤特异性启动子和抗癌基因启动子都在E1区，相距太近，互相干扰，表达效率都有下降。如果要想进一步优化并提高OAV的感染细胞的转染率、装载的抗癌基因的表达量、以及避免机体免疫系统对病毒的清除，则需要在不同血清型腺病毒之间筛选并建立Fiber嵌合和Hexon嵌合的杂合OAV，并根据肿瘤类型以及治疗需要优选多种抗癌基因装载到OAV的E3区，则要对腺病毒右臂骨架质粒的结构蛋白包括Hexon、Fiber、E3区等进行大范围多层次改造。但右臂质粒较大，以最常用的Microbix Biosystems公司的右臂骨架质粒pBHGloxdelE13cre为例大小为34.707kb，每一次改变每一个蛋白分子都要进行一次大载体构建。由于大载体改造难度较大，出错率极高，筛选难度大，因此费时费力费钱，往往需要反复尝试很多次才能筛选到正确的载体。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种快速准确的三质粒溶瘤腺病毒重组包装系统，其包含以下3个腺病毒重组质粒：
a)腺病毒右臂骨架质粒：所述腺病毒右臂骨架质粒上装载两套不同的位点重组序列，一套attL/attR在Fiber/Hexon/E3区，一套Cre/loxP在E1区；E3区还插入了DB3.1大肠杆菌菌株及感受态ccdB致死基因；
b)腺病毒右臂穿梭质粒：所述腺病毒右臂穿梭质粒含有已改建好的嵌合型Hexon序列和嵌合型Fiber序列，中间E3区预置外源基因多克隆位点，Hexon/E3/Fiber序列两端含有attL1/attL2重组位点；
c)腺病毒左臂穿梭质粒：所述腺病毒左臂穿梭质粒在其多克隆位点插入肿瘤特异性启动子控制的腺病毒早期增殖基因和loxP重组位点；
其中，所述腺病毒右臂穿梭质粒通过Hexon/E3/Fiber序列两端的attL1/attL2与所述腺病毒右臂骨架质粒发生第一轮attL/attR位点特异性重组，所述腺病毒右臂穿梭质粒中attL1/attL2间的序列置换所述腺病毒右臂骨架质粒中attR1/attR2间的序列；所述腺病毒左臂穿梭质粒与所述腺病毒右臂骨架质粒发生第二轮Cre/loxP位点特异性重组，所述腺病毒左臂穿梭质粒中的肿瘤特异性启动子控制的E1a表达框插入到所述腺病毒右臂骨架质粒缺失的E1区；经过两轮位点特异性重组，包装出所需要的溶瘤腺病毒。
作为本发明的一个优选例，所述嵌合型Hexon序列为Ad5与Ad48、Ad9、Ad37、Ad43及其它任一血清型腺病毒Hexon及其突变序列的嵌合。
作为本发明的另一优选例，所述嵌合型Hexon序列如SEQ ID NO:5所示。
作为本发明的另一优选例，所述嵌合型Fiber序列为Ad5与Ad11b、Ad3、Ad14、Ad16、Ad21、Ad35、Ad50、Ad55及其它任一血清型腺病毒Fiber及其突变序列的嵌合。
作为本发明的另一优选例，所述嵌合型Fiber序列如SEQ ID NO:6所示。
作为本发明的另一优选例，所述肿瘤特异性启动子选自：(a)癌胚抗原启动子、增强子及其突变体序列；(b)甲胎蛋白启动子、增强子及其突变体序列；(c)人表皮生长因子受体家族(EGFRs)的受体酪氨酸激酶(包括EGFR、Her-2、Her-3和Her-4)启动子、增强子及其突变体序列；(d)乳腺癌相关抗原DF3/MUC1启动子、增强子及其突变体序列；(e)血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR的启动子、增强子及其突变体序列；(f)L-plastin启动子、增强子及其突变体序列；(g)凋亡抑制蛋白家族(IAP)成员的启动子、增强子及其突变体序列；(h)前列腺素特异性抗原的启动子、增强子及其突变体序列；(i)缺氧诱导因子-1(HIF-1)调控的缺氧反应元件保守序列；(j)转录因子E2F启动子、增强子及其突变体序列；(k)hTERT启动子、增强子及其突变体序列。
作为本发明的另一优选例，所述肿瘤特异性启动子的序列如SEQ ID NO:7所示。
作为本发明的另一优选例，所述腺病毒早期增殖基因包括E1a和E1b，其中E1a选自E1a野生序列及其突变序列，所述E1b选自Elb-55kDa、Elb-19kDa及其突变序列。
作为本发明的另一优选例，所述E1a表达框的序列如SEQ ID NO:8所示。
作为本发明的另一优选例，所述腺病毒右臂骨架质粒的序列如SEQ ID NO:1所示，所述腺病毒右臂穿梭质粒的序列如SEQ ID NO:2所示，所述腺病毒左臂穿梭质粒的序列如SEQ ID NO:3所示。
作为本发明的另一优选例，所述溶瘤腺病毒的序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供了所述的三质粒溶瘤腺病毒重组包装系统在制备溶瘤腺病毒或抗肿瘤药物中的应用。
作为本发明的一个优选例，所述肿瘤选自消化系统肿瘤如食道癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌、胸膜瘤；血液系统肿瘤如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、外阴癌、睾丸癌、前列腺癌、阴茎癌；神经系统肿瘤如胶质瘤、神经母细胞瘤、脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌、舌癌、喉癌、鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌、膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、甲状腺癌。
本发明优点在于：
本发明提供了一套快速准确的三质粒溶瘤腺病毒重组包装系统Ad5MixPlus及其应用。该系统由3个腺病毒重组质粒组成，其核心技术就是巧妙地在第一个5型腺病毒右臂骨架质粒pAd5MixPlus上装载两套不同的位点重组序列，一套attL/attR在Fiber/Hexon/E3区，一套Cre/loxP在E1区。第二个腺病毒右臂穿梭质粒pAdH548F511LR含有Fiber/Hexon/E3改造序列，E3区还预置外源基因多克隆插入位点，该质粒将通过Hexon/E3/Fiber序列两端的attL1/attL2与腺病毒右臂骨架质粒pAd5MixPlus在细菌内发生第一轮attL/attR位点特异性重组，pAdH548F511LR中attL1/attL2间的序列置换pAd5MixPlus中attR1/attR2间的序列，由pAd5MixPlus中E3区的ccdB基因进行精准筛选；第三个腺病毒左臂穿梭质粒pAdSVPcreLoxP含有肿瘤特异性启动子控制的E1a表达框和loxP重组位点，该质粒将与pAd5MixPlus在真核细胞内发生第二轮Cre/loxP位点特异性重组，pAdSVPcreLoxP中肿瘤特异性启动子控制的E1a表达框插入到pAd5MixPlus缺失的E1区。经过两轮位点特异性重组，准确快速地包装出理想的溶瘤腺病毒。该系统所有序列改造均在两个小的穿梭质粒上进行，病毒肿瘤特异性增殖的E1区改造在左臂穿梭质粒上进行，病毒Hexon、Fiber、E3区蛋白结构改造以及E3区插入外源基因均在右臂穿梭质粒上进行，避开了对腺病毒骨架大载体改造的困难和障碍。根据实际需要，外源基因可以装在到任意一个穿梭质粒，分别插入到溶瘤腺病毒的E1区和E3区。因此，我们最新一代Ad5MixPlus重组系统，将病毒重组包装过程简单化、快速化、准确化，解决了腺病毒骨架大载体改造的挑战性难题，能快速重组并筛选到我们需要的溶瘤腺病毒，非常适合产业化需要。
进一步的实验表明，本发明所包装的溶瘤腺病毒在肿瘤中特异性增殖活性很强，对肿瘤细胞的杀伤活性很强，能明显抑制肿瘤体积的增加。
附图说明
图1.腺病毒右臂骨架质粒pAd5MixPlus结构图。
图2.腺病毒右臂穿梭质粒pAdH548F511LR结构图。
图3.腺病毒左臂穿梭质粒pAdSVPcreLoxP结构图。
图4.Ad5MixPlus系统重组包装溶瘤腺病毒AdSVPH548F511流程图。
图5.溶瘤腺病毒AdSVPH548F511结构图。
图6.TCID50法检测溶瘤腺病毒AdSVPH548F511的增殖活性。
图7.溶瘤腺病毒AdSVPH548F511对肿瘤细胞的杀伤活性，(A)MTT法，(B)RTCA法。
图8.溶瘤腺病毒AdSVPH548F511对肾癌移植瘤的抑制作用。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1本发明的一套快速准确的三质粒溶瘤腺病毒重组包装系统Ad5MixPlus
本发明所述的一套快速准确的三质粒溶瘤腺病毒重组系统Ad5MixPlus，由3个腺病毒重组质粒组成。这3个腺病毒重组质粒分别是Ad5MixPlus系统右臂骨架质粒、Ad5MixPlus系统右臂穿梭质粒和Ad5MixPlus系统左臂穿梭质粒。现介绍这3个腺病毒重组质粒及Ad5MixPlus的重组包装，具体如下：
1.Ad5MixPlus系统右臂骨架质粒
在第一个5型腺病毒右臂骨架质粒pAd5MixPlus上装载两套不同的位点重组序列，一套attL/attR在Fiber/Hexon/E3区，一套Cre/loxP在E1区(图1)。E3区还插入了DB3.1大肠杆菌菌株及感受态ccdB致死基因，用于筛选重组成功的病毒克隆，重组成功的载体，失去了attR1和attR2位点间的ccdB基因，感受态细菌存活下来，出现克隆生长；重组不成功的载体，在其原有的ccdB基因产物作用下，细菌死亡。
腺病毒右臂骨架质粒pAd5MixPlus的全长序列为：SEQ ID NO:1。
2.Ad5MixPlus系统右臂穿梭质粒
第二个腺病毒右臂穿梭质粒pAdH548F511LR含有已改建好的Ad5H48嵌合型Hexon序列和Ad5F11b嵌合型Fiber序列，中间E3区预置外源基因多克隆位点，Hexon/E3/Fiber序列两端含有attL1/attL2重组位点(图2)。
腺病毒右臂穿梭质粒pAdH548F511LR的全长序列为：SEQ ID NO:2。
3.Ad5MixPlus系统左臂穿梭质粒
第三个腺病毒左臂穿梭质粒pAdSVPcreLoxP在其多克隆位点插入肿瘤特异性Survivin启动子控制的E1a表达框和loxP重组位点(图3)。
腺病毒左臂穿梭质粒pAdSVPcreLoxP的全长序列为：SEQ ID NO:3。
4.Ad5MixPlus系统重组包装程序
第二个腺病毒右臂穿梭质粒pAdH548F511LR通过Hexon/E3/Fiber序列两端的attL1/attL2与腺病毒右臂骨架质粒pAd5MixPlus在DB3.1大肠杆菌感受态细菌内发生第一轮attL/attR位点特异性重组，pAdH548F511LR中attL1/attL2间的序列置换pAd5MixPlus中attR1/attR2间的序列；第三个腺病毒左臂穿梭质粒pAdSVPcreLoxP与pAd5MixPlus在真核细胞内发生第二轮Cre/loxP位点特异性重组，pAdSVPcreLoxP中的肿瘤特异性启动子控制的E1a表达框插入到pAd5MixPlus缺失的E1区。经过两轮位点特异性重组，准确快速地包装出理想的溶瘤腺病毒AdSVPH548F511。Ad5MixPlus系统重组包装程序如图4所示，溶瘤腺病毒AdSVPH548F511如图5所示。
本发明所述的溶瘤腺病毒AdSVPH548F511，其完整序列为：SEQ ID NO:4。
需要说明的是：
1.嵌合型Hexon序列改造
第二个腺病毒右臂穿梭质粒pAdH548F511LR含有已改建好的Ad5H48嵌合型六邻体(Hexon)编码序列。Hexon高变区(HVR)因位置暴露于腺病毒表面，是导致不同血清型的腺病毒之间对肝脏感染能力和免疫原性差异的关键部位。利用基因工程改造腺病毒载体，将Ad5表面Hexon的7个HVR选择性地与稀有血清型病毒Hexon的相应区域嵌合，是帮助腺病毒逃避预存免疫、避免肝脏吸附的有效方法。本发明所述Ad5H48嵌合型Hexon，由D亚群48型腺病毒的HVR替换Ad5的相应序列，Ad48在人群中普遍缺乏中和抗体、且肝脏亲嗜性弱。因此，用Ad48的HVR替换Ad5的相应部分，构建Ad5和Ad48嵌合型Hexon的腺病毒，能够避免中和抗体拦截和肝脏摄取，提高病毒存活能力。本发明所述嵌合型Hexon，还包括Ad5与Ad9、Ad37、Ad43等其他任何血清型腺病毒Hexon及其突变序列的嵌合。
Ad5H48嵌合型Hexon完整序列如下：SEQ ID NO:5。
2.嵌合型Fiber序列改造
第二个腺病毒右臂穿梭质粒pAdH548F511LR含有已改建好的Ad5F11b嵌合型Fiber编码序列。人类腺病毒家族有51个已知血清型，分为6个亚属(A至F)。除了B组以外，各组腺病毒都用CAR作为其主要吸附受体(Ad5属于C组)。B组腺病毒又进一步分为B1和B2亚组，Ad11b、Ad14、Ad35为B2组腺病毒；Ad3、Ad16、Ad21、Ad50为B1组腺病毒。近年来，B组腺病毒的衍生体作为颇具吸引力的基因治疗载体而受到关注，因为它们可以转导造血细胞、造血干细胞、树突状细胞(DC细胞)和恶性肿瘤细胞等靶细胞，而这些细胞往往不易被常用的腺病毒载体(如Ad5)感染。与许多腺病毒是通过CAR受体来感染细胞不同的是，B组腺病毒用CD46作为吸附受体。CD46是一种广泛表达的补体调节蛋白，这种蛋白几乎在所有的人类体细胞表面都存在。Ad5F11b嵌合型Fiber，即用Ad11b的纤突结(fiber knob)替代5型腺病毒的fiber相应序列，因而使该嵌合病毒对造血细胞、干细胞、肿瘤细胞具有高转导特点。本发明所述嵌合型Fiber，还包括Ad5与Ad3、Ad14、Ad16、Ad21、Ad35、Ad50、Ad55等其他任何血清型腺病毒Fiber及其突变序列的嵌合。
Ad5F11b嵌合型Fiber完整序列如下：SEQ ID NO:6。
3.肿瘤特异性启动子
第三个腺病毒左臂穿梭质粒pAdSVPcreLoxP在其多克隆位点插入肿瘤特异性Survivin启动子控制的E1a表达框。Survivin启动子因其特异性高、肿瘤谱广而受到更多关注。Survivin在正常组织中几乎不表达，而在恶性肿瘤中的表达具有高度选择性，在大多数肿瘤如肺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌中都呈高表达，并且与肿瘤的复发转移以及患者的预后不佳密切相关，使其成为肿瘤基因治疗广谱的分子靶标。Survivin启动子调控的溶瘤腺病毒能够靶向癌细胞增殖复制并裂解癌细胞，同时介导抗肿瘤目的基因高效表达。因此，以Survivin启动子调控的溶瘤腺病毒，有望实现针对大多数人体肿瘤的广谱而安全的抗癌效应。本发明所述的肿瘤特异性启动子，除Survivin启动子以外，还包括：(a)癌胚抗原启动子、增强子及其突变体序列；(b)甲胎蛋白启动子、增强子及其突变体序列；(c)人表皮生长因子受体家族(EGFRs)的受体酪氨酸激酶(包括EGFR、Her-2、Her-3和Her-4)启动子、增强子及其突变体序列；(d)乳腺癌相关抗原DF3/MUC1启动子、增强子及其突变体序列；(e)血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR的启动子、增强子及其突变体序列；(f)L-plastin启动子、增强子及其突变体序列；(g)凋亡抑制蛋白家族(IAP)成员的启动子、增强子及其突变体序列；(h)前列腺素特异性抗原的启动子、增强子及其突变体序列；(i)缺氧诱导因子-1(HIF-1)调控的缺氧反应元件保守序列；(j)转录因子E2F启动子、增强子及其突变体序列；(k)hTERT启动子、增强子及其突变体序列。
本发明所述的肿瘤特异性Survivin启动子，其编码序列如下：SEQ ID NO:7。
4.腺病毒早期增殖基因E1a的调控
第三个腺病毒左臂穿梭质粒pAdSVPcreLoxP在其多克隆位点插入肿瘤特异性Survivin启动子控制的E1a表达框。将腺病毒早期增殖基因E1a置于肿瘤特异性启动子调控下，实现病毒的肿瘤特异性复制及溶瘤作用。本发明所述腺病毒早期增殖基因，除E1a野生序列以外，还包括对E1a进行的突变改造，以及Elb-55kDa、Elb-19kDa及其突变序列。
本发明所述的肿瘤特异性启动子控制的E1a表达框，其E1a编码序列如下：SEQ IDNO:8。
实施例2溶瘤腺病毒AdSVPH548F511的特异性增殖活性
收集对数生长期的肝癌细胞(HCCLM3、HepG2、Huh-7、MHCC97H、MHCC97L)和正常肝细胞(WRL-68)以及正常成纤维细胞(BJ)，计数，铺96孔板，1×104/孔，细胞贴壁后，换用无血清培养液；以MOI＝1加入溶瘤腺病毒AdSVPH548F511。病毒感染2h后调节至5％血清培养液(此时作为感染起始时间0h)，继续培养48h、96h，分别在这三个时间段收集细胞，TCID50方法检测病毒滴度。结果显示：AdSVPH548F511在肝癌中特异性增殖复制的能力非常强，48h时增殖倍数均在10000倍以上，最高达50000倍以上；96h后可达100000至800000倍以上。而AdSVPH548F51在正常细胞中WRL-68、BJ中有轻度增殖，96h时最高仅200倍以下(图6)。
实施例3溶瘤腺病毒AdSVPH548F511对肿瘤细胞的杀伤活性
收集对数生长期的肝癌细胞(HepG2、MHCC97H)和正常肝细胞(L02)以及正常成纤维细胞(BJ)，计数，铺96孔板，1×104/孔，细胞贴壁后，换用无血清培养液。通过四唑盐比色实验(MTT)检测病毒AdSVPH548F511对细胞存活率的影响。Cell Proliferation Kit I(MTT)购于Roche Diagnostics GmbH。按梯度MOI加入病毒，对应于每个病毒设8个复孔，孵箱内培养2h；换血清培养液100μl/孔，培养48h后，弃培养液，加入0.1mol/L PBS溶液100μl/孔，再加MTT labeling reagent 10μl/孔至终浓度0.5mg/ml，置孵箱内4h；加Solubilization solution(10％SDS in 0.01mol/L HCl)100μl/孔，置孵箱内过夜；采用Model 550Microplate Reader(BIO-RAD)测定570nm波长光吸收值，校正波长为655nm；绘制生存曲线，计算IC50值。结果显示：AdSVPH548F511对HepG2和MHCC97H杀伤活性很强，IC50值分别为35.16和212.4；AdSVPH548F511对正常BJ细胞无明显影响，IC50值为20035。可见溶瘤腺病毒AdSVPH548F511具有特异性杀伤破坏癌细胞的能力(图7中A)。
我们同时以实时无标记动态细胞分析技术(Real Time Cellular Analysis，RTCA)对AdSVPH548F511的细胞杀伤活性进行实时、动态、定量检测。向E-Plate检测板中加入培养基并测定背景阻抗值；收集对数生长期的肝癌细胞(HepG2)和正常肝细胞(L02)，计数，加入到E-Plate检测板中，室温超净台内放置30min；以无血清培养液稀释病毒并按MOI＝5、10、20的梯度加入病毒；将加入细胞的E-Plate检测板放入预先放入培养箱中的检测台上，进行实时动态的细胞增殖检测，绘制细胞实时动态生长曲线。结果发现，AdSVPH548F511对肝癌HepG2细胞的杀伤破坏活性，随病毒MOI的增加以及作用时间延长而增强，而AdSVPH548F511对正常肝细胞L02杀伤活性不明显，高强度感染病毒对L02细胞有一定抑制作用(图7中B)。
实施例4溶瘤腺病毒AdSVPH548F511抗肿瘤活性的动物模型实验
健康纯种BALB/c裸鼠8只，6-8周龄，雄性，中科院上海实验动物中心提供，清洁级动物实验室饲养；取对数生长期的肾癌OSRC-2细胞，用PBS液调整细胞数至1×107/ml，消毒裸鼠侧腹部近腋下皮肤，取100μl细胞悬液注射于皮下，恒温、通风、无菌条件下饲养；每日定时观察瘤体生长情况，接种区皮下出现米粒大小肿瘤，即为种植成功。随机分为两组(病毒组AdSVP n＝5、对照组PBS n＝3)，编号、游标卡尺测量瘤体大小。开始治疗，以2×108pfu/100μl的病毒AdSVPH548F511直接瘤内多点注射，隔日一次，共5次，对照组以PBS代替病毒注射，100μl×5次；定时测量瘤体大小，以“a×b2×0.5”公式计算瘤体体积(a:最大径，b:最小径)，绘制移植瘤生长曲线(图8)。结果显示，AdSVPH548F511能明显抑制肾癌OSRC-2移植瘤的生长。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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<110> 苏, 英晗
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ttattttgga ttgaagccaa tatgataatg agggggtgga gtttgtgacg tggcgcgggg 60
cgtgggaacg gggcgggtga cgtagtagtg tggcggaagt gtgatgttgc aagtgtggcg 120
gaacacatgt aagcgacgga tgtggcaaaa gtgacgtttt tggtgtgcgc cggatccaca 180
ggacgggtgt ggtcgccatg atcgcgtagt cgatagtggc tccaagtagc gaagcgagca 240
ggactgggcg gcggccaaag cggtcggaca gtgctccgag aacgggtgcg catagaaatt 300
gcatcaacgc atatagcgct agcagcacgc catagtgact ggcgatgctg tcggaatgga 360
cgatatcccg caagaggccc ggcagtaccg gcataaccaa gcctatgcct acagcatcca 420
gggtgacggt gccgaggatg acgatgagcg cattgttaga tttcatacac ggtgcctgac 480
tgcgttagca atttaactgt gataaactac cgcattaaag cttatcgttc gaaatttggg 540
ggatcttcga tgctagacga tccagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc 600
acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta 660
tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttgctcgaa gtcgacgatc cgaacaaacg 720
ncccaacacc cgtgcgtttt attctgtctt tttattgccg atcccctcag aagaactcgt 780
caagaaggcg atagaaggcg atgcgctgcg aatcgggagc ggcgataccg taaagcacga 840
ggaagcggnc agcccattcg ccgccatgtt tttnagcaat atcacgggta gccaacgcta 900
tgtcctgata gcggtccgcc acacccagcc tcgacaattc caaccttacc caagagttcg 960
ccaaactcag acatcacttt agcaaaaccg cgccgtgctt cttcctcggt ggcattcatc 1020
acgaaatgtt cagcactacg catacttttg gacaggaaac gcaacggata ttgagtcaat 1080
atcaggcatt ctatcgctca gctttacagt gacaatgncg gctggcgact gaatattagt 1140
gcttacagac agcactacat attttccgtc gatgttgaaa tcctttctca tatgtcncca 1200
taaatatcaa ataattatag caatcattta cgcgttaatg gctaatcgcc atcttccagc 1260
aggcgcacca ttgcccctgt ttcactatcc aggttacgga tatagttcat gacaatattt 1320
acattggtcc agccaccagc ttgcatgatc tccggtattg aaactccagc gcgggccata 1380
tctcgcgcgg ctccgacacg ggcactgtgt ccagaccagg ccaggtatct ctgaccagag 1440
tcatccttag cgccgtaaat caatcgatga gttgcttcaa aaatcccttc cagggcgcga 1500
gttgatagct ggctggtggc agatggcgcg gcaacaccat tttttctgac ccggcaaaac 1560
aggtagttat tcggatcatc agctacacca gagacggaaa tccatcgctc gaccagttta 1620
gttaccccca ggctaagtgc cttctctaca cctgcggtgc taaccagcgt tttcgttctg 1680
ccaatatgga ttaacattct cccaccgtca gtacgtgaga tatctttaac cctgatcctg 1740
gcaatttcgg ctatacgtaa cagggtgtta taagcaatcc ccagaaatgc cagattacgt 1800
atatcctggc agcgatcgct attttccatg agtgaacgaa cctggtcgaa atcagtgcgt 1860
tcgaacgcta gagcctgttt tgcacgttca ccggcatcaa cgttttcttt tcggatccgc 1920
cgcataacca gtgaaacagc attgctgtca cttggtcgtg gcagcccgga ccgacgatga 1980
agcatgttta gctggcccaa atgttgctgg atagttttta ctgccagacc gcgcgcctga 2040
agatatagaa gataatcgcg aacatcttca ggttctgcgg gaaaccattt ccggttattc 2100
aacttgcacc atgccgccca cgaccggcaa acggacagaa gcattttcca ggtatgctca 2160
gaaaacgcct ggcgatccct gaacatgtcc atcaggttct tgcgaacctc atcactcgtt 2220
gcatcgaccg gtaatgcagg caaattttgg tgtncggtca gtaaattgga caccttcctc 2280
ttcttcttgg gcatggtcga gtctagactc gagggatcct cgactcgaag actgatcccc 2340
aggctggatc ggtcccggtg tcttctatgg aggtcaaaac agcgtggatg gcgtctccag 2400
gcgatctgac ggttcactaa acgagctctg cttatataga cctcccaccg tacacgccta 2460
ccgcccattt gcgtcaatgg ggcggagttg ttacgacatt ttggaaagtc ccgttgattt 2520
tggtgccaaa acaaactccc attgacgtca atggggtgga gacttggaaa tccccgtgag 2580
tcaaaccgct atccacgccc attgatgtac tgccaaaacc gcatcaccat ggtaatagcg 2640
atgactaata cgtagatgta ctgccaagta ggaaagtccc ataaggtcat gtactgggca 2700
taatgccagg gaattagatc cactagacga tgataagctg tcaaacatga gaattcttga 2760
agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt 2820
tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 2880
ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 2940
taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt 3000
tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat 3060
gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag 3120
atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg 3180
ctatgtggcg cggtattatc ccgtgttgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata 3240
cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat 3300
ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc 3360
aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg 3420
ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac 3480
gacgagcgtg acaccacgat gcctgcagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact 3540
ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa 3600
gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct 3660
ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc 3720
tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga 3780
cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac 3840
tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag 3900
atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg 3960
tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc 4020
tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag 4080
ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc 4140
cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac 4200
ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc 4260
gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt 4320
tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt 4380
gagcattgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc 4440
ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt 4500
tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca 4560
ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt 4620
tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt 4680
attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag 4740
tcagtgagcg aggaagcgga agagcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc 4800
ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta 4860
agccagtaat cgaattcaag cttgtcgact cgaagatcca ataacttcgt atagcataca 4920
ttatacgaag ttataagtac tgaattcgga tctgggcgtg gttaagggtg ggaaagaata 4980
tataaggtgg gggtcttatg tagttttgta tctgttttgc agcagccgcc gccgccatga 5040
gcaccaactc gtttgatgga agcattgtga gctcatattt gacaacgcgc atgcccccat 5100
gggccggggt gcgtcagaat gtgatgggct ccagcattga tggtcgcccc gtcctgcccg 5160
caaactctac taccttgacc tacgagaccg tgtctggaac gccgttggag actgcagcct 5220
ccgccgccgc ttcagccgct gcagccaccg cccgcgggat tgtgactgac tttgctttcc 5280
tgagcccgct tgcaagcagt gcagcttccc gttcatccgc ccgcgatgac aagttgacgg 5340
ctcttttggc acaattggat tctttgaccc gggaacttaa tgtcgtttct cagcagctgt 5400
tggatctgcg ccagcaggtt tctgccctga aggcttcctc ccctcccaat gcggtttaaa 5460
acataaataa aaaaccagac tctgtttgga tttggatcaa gcaagtgtct tgctgtcttt 5520
atttaggggt tttgcgcgcg cggtaggccc gggaccagcg gtctcggtcg ttgagggtcc 5580
tgtgtatttt ttccaggacg tggtaaaggt gactctggat gttcagatac atgggcataa 5640
gcccgtctct ggggtggagg tagcaccact gcagagcttc atgctgcggg gtggtgttgt 5700
agatgatcca gtcgtagcag gagcgctggg cgtggtgcct aaaaatgtct ttcagtagca 5760
agctgattgc caggggcagg cccttggtgt aagtgtttac aaagcggtta agctgggatg 5820
ggtgcatacg tggggatatg agatgcatct tggactgtat ttttaggttg gctatgttcc 5880
cagccatatc cctccgggga ttcatgttgt gcagaaccac cagcacagtg tatccggtgc 5940
acttgggaaa tttgtcatgt agcttagaag gaaatgcgtg gaagaacttg gagacgccct 6000
tgtgacctcc aagattttcc atgcattcgt ccataatgat ggcaatgggc ccacgggcgg 6060
cggcctgggc gaagatattt ctgggatcac taacgtcata gttgtgttcc aggatgagat 6120
cgtcataggc catttttaca aagcgcgggc ggagggtgcc agactgcggt ataatggttc 6180
catccggccc aggggcgtag ttaccctcac agatttgcat ttcccacgct ttgagttcag 6240
atggggggat catgtctacc tgcggggcga tgaagaaaac ggtttccggg gtaggggaga 6300
tcagctggga agaaagcagg ttcctgagca gctgcgactt accgcagccg gtgggcccgt 6360
aaatcacacc tattaccggg tgcaactggt agttaagaga gctgcagctg ccgtcatccc 6420
tgagcagggg ggccacttcg ttaagcatgt ccctgactcg catgttttcc ctgaccaaat 6480
ccgccagaag gcgctcgccg cccagcgata gcagttcttg caaggaagca aagtttttca 6540
acggtttgag accgtccgcc gtaggcatgc ttttgagcgt ttgaccaagc agttccaggc 6600
ggtcccacag ctcggtcacc tgctctacgg catctcgatc cagcatatct cctcgtttcg 6660
cgggttgggg cggctttcgc tgtacggcag tagtcggtgc tcgtccagac gggccagggt 6720
catgtctttc cacgggcgca gggtcctcgt cagcgtagtc tgggtcacgg tgaaggggtg 6780
cgctccgggc tgcgcgctgg ccagggtgcg cttgaggctg gtcctgctgg tgctgaagcg 6840
ctgccggtct tcgccctgcg cgtcggccag gtagcatttg accatggtgt catagtccag 6900
cccctccgcg gcgtggccct tggcgcgcag cttgcccttg gaggaggcgc cgcacgaggg 6960
gcagtgcaga cttttgaggg cgtagagctt gggcgcgaga aataccgatt ccggggagta 7020
ggcatccgcg ccgcaggccc cgcagacggt ctcgcattcc acgagccagg tgagctctgg 7080
ccgttcgggg tcaaaaacca ggtttccccc atgctttttg atgcgtttct tacctctggt 7140
ttccatgagc cggtgtccac gctcggtgac gaaaaggctg tccgtgtccc cgtatacaga 7200
cttgagaggc ctgtcctcga gcggtgttcc gcggtcctcc tcgtatagaa actcggacca 7260
ctctgagaca aaggctcgcg tccaggccag cacgaaggag gctaagtggg aggggtagcg 7320
gtcgttgtcc actagggggt ccactcgctc cagggtgtga agacacatgt cgccctcttc 7380
ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgaccgggtg ttcctgaagg 7440
ggggctataa aagggggtgg gggcgcgttc gtcctcactc tcttccgcat cgctgtctgc 7500
gagggccagc tgttggggtg agtactccct ctgaaaagcg ggcatgactt ctgcgctaag 7560
attgtcagtt tccaaaaacg aggaggattt gatattcacc tggcccgcgg tgatgccttt 7620
gagggtggcc gcatccatct ggtcagaaaa gacaatcttt ttgttgtcaa gcttggtggc 7680
aaacgacccg tagagggcgt tggacagcaa cttggcgatg gagcgcaggg tttggttttt 7740
gtcgcgatcg gcgcgctcct tggccgcgat gtttagctgc acgtattcgc gcgcaacgca 7800
ccgccattcg ggaaagacgg tggtgcgctc gtcgggcacc aggtgcacgc gccaaccgcg 7860
gttgtgcagg gtgacaaggt caacgctggt ggctacctct ccgcgtaggc gctcgttggt 7920
ccagcagagg cggccgccct tgcgcgagca gaatggcggt agggggtcta gctgcgtctc 7980
gtccgggggg tctgcgtcca cggtaaagac cccgggcagc aggcgcgcgt cgaagtagtc 8040
tatcttgcat ccttgcaagt ctagcgcctg ctgccatgcg cgggcggcaa gcgcgcgctc 8100
gtatgggttg agtgggggac cccatggcat ggggtgggtg agcgcggagg cgtacatgcc 8160
gcaaatgtcg taaacgtaga ggggctctct gagtattcca agatatgtag ggtagcatct 8220
tccaccgcgg atgctggcgc gcacgtaatc gtatagttcg tgcgagggag cgaggaggtc 8280
gggaccgagg ttgctacggg cgggctgctc tgctcggaag actatctgcc tgaagatggc 8340
atgtgagttg gatgatatgg ttggacgctg gaagacgttg aagctggcgt ctgtgagacc 8400
taccgcgtca cgcacgaagg aggcgtagga gtcgcgcagc ttgttgacca gctcggcggt 8460
gacctgcacg tctagggcgc agtagtccag ggtttccttg atgatgtcat acttatcctg 8520
tccctttttt ttccacagct cgcggttgag gacaaactct tcgcggtctt tccagtactc 8580
ttggatcgga aacccgtcgg cctccgaacg gtaagagcct agcatgtaga actggttgac 8640
ggcctggtag gcgcagcatc ccttttctac gggtagcgcg tatgcctgcg cggccttccg 8700
gagcgaggtg tgggtgagcg caaaggtgtc cctgaccatg actttgaggt actggtattt 8760
gaagtcagtg tcgtcgcatc cgccctgctc ccagagcaaa aagtccgtgc gctttttgga 8820
acgcggattt ggcagggcga aggtgacatc gttgaagagt atctttcccg cgcgaggcat 8880
aaagttgcgt gtgatgcgga agggtcccgg cacctcggaa cggttgttaa ttacctgggc 8940
ggcgagcacg atctcgtcaa agccgttgat gttgtggccc acaatgtaaa gttccaagaa 9000
gcgcgggatg cccttgatgg aaggcaattt tttaagttcc tcgtaggtga gctcttcagg 9060
ggagctgagc ccgtgctctg aaagggccca gtctgcaaga tgagggttgg aagcgacgaa 9120
tgagctccac aggtcacggg ccattagcat ttgcaggtgg tcgcgaaagg tcctaaactg 9180
gcgacctatg gccatttttt ctggggtgat gcagtagaag gtaagcgggt cttgttccca 9240
gcggtcccat ccaaggttcg cggctaggtc tcgcgcggca gtcactagag gctcatctcc 9300
gccgaacttc atgaccagca tgaagggcac gagctgcttc ccaaaggccc ccatccaagt 9360
ataggtctct acatcgtagg tgacaaagag acgctcggtg cgaggatgcg agccgatcgg 9420
gaagaactgg atctcccgcc accaattgga ggagtggcta ttgatgtggt gaaagtagaa 9480
gtccctgcga cgggccgaac actcgtgctg gcttttgtaa aaacgtgcgc agtactggca 9540
gcggtgcacg ggctgtacat cctgcacgag gttgacctga cgaccgcgca caaggaagca 9600
gagtgggaat ttgagcccct cgcctggcgg gtttggctgg tggtcttcta cttcggctgc 9660
ttgtccttga ccgtctggct gctcgagggg agttacggtg gatcggacca ccacgccgcg 9720
cgagcccaaa gtccagatgt ccgcgcgcgg cggtcggagc ttgatgacaa catcgcgcag 9780
atgggagctg tccatggtct ggagctcccg cggcgtcagg tcaggcggga gctcctgcag 9840
gtttacctcg catagacggg tcagggcgcg ggctagatcc aggtgatacc taatttccag 9900
gggctggttg gtggcggcgt cgatggcttg caagaggccg catccccgcg gcgcgactac 9960
ggtaccgcgc ggcgggcggt gggccgcggg ggtgtccttg gatgatgcat ctaaaagcgg 10020
tgacgcgggc gagcccccgg aggtaggggg ggctccggac ccgccgggag agggggcagg 10080
ggcacgtcgg cgccgcgcgc gggcaggagc tggtgctgcg cgcgtaggtt gctggcgaac 10140
gcgacgacgc ggcggttgat ctcctgaatc tggcgcctct gcgtgaagac gacgggcccg 10200
gtgagcttga gcctgaaaga gagttcgaca gaatcaattt cggtgtcgtt gacggcggcc 10260
tggcgcaaaa tctcctgcac gtctcctgag ttgtcttgat aggcgatctc ggccatgaac 10320
tgctcgatct cttcctcctg gagatctccg cgtccggctc gctccacggt ggcggcgagg 10380
tcgttggaaa tgcgggccat gagctgcgag aaggcgttga ggcctccctc gttccagacg 10440
cggctgtaga ccacgccccc ttcggcatcg cgggcgcgca tgaccacctg cgcgagattg 10500
agctccacgt gccgggcgaa gacggcgtag tttcgcaggc gctgaaagag gtagttgagg 10560
gtggtggcgg tgtgttctgc cacgaagaag tacataaccc agcgtcgcaa cgtggattcg 10620
ttgatatccc ccaaggcctc aaggcgctcc atggcctcgt agaagtccac ggcgaagttg 10680
aaaaactggg agttgcgcgc cgacacggtt aactcctcct ccagaagacg gatgagctcg 10740
gcgacagtgt cgcgcacctc gcgctcaaag gctacagggg cctcttcttc ttcttcaatc 10800
tcctcttcca taagggcctc cccttcttct tcttctggcg gcggtggggg aggggggaca 10860
cggcggcgac gacggcgcac cgggaggcgg tcgacaaagc gctcgatcat ctccccgcgg 10920
cgacggcgca tggtctcggt gacggcgcgg ccgttctcgc gggggcgcag ttggaagacg 10980
ccgcccgtca tgtcccggtt atgggttggc ggggggctgc catgcggcag ggatacggcg 11040
ctaacgatgc atctcaacaa ttgttgtgta ggtactccgc cgccgaggga cctgagcgag 11100
tccgcatcga ccggatcgga aaacctctcg agaaaggcgt ctaaccagtc acagtcgcaa 11160
ggtaggctga gcaccgtggc gggcggcagc gggcggcggt cggggttgtt tctggcggag 11220
gtgctgctga tgatgtaatt aaagtaggcg gtcttgagac ggcggatggt cgacagaagc 11280
accatgtcct tgggtccggc ctgctgaatg cgcaggcggt cggccatgcc ccaggcttcg 11340
ttttgacatc ggcgcaggtc tttgtagtag tcttgcatga gcctttctac cggcacttct 11400
tcttctcctt cctcttgtcc tgcatctctt gcatctatcg ctgcggcggc ggcggagttt 11460
ggccgtaggt ggcgccctct tcctcccatg cgtgtgaccc cgaagcccct catcggctga 11520
agcagggcta ggtcggcgac aacgcgctcg gctaatatgg cctgctgcac ctgcgtgagg 11580
gtagactgga agtcatccat gtccacaaag cggtggtatg cgcccgtgtt gatggtgtaa 11640
gtgcagttgg ccataacgga ccagttaacg gtctggtgac ccggctgcga gagctcggtg 11700
tacctgagac gcgagtaagc cctcgagtca aatacgtagt cgttgcaagt ccgcaccagg 11760
tactggtatc ccaccaaaaa gtgcggcggc ggctggcggt agaggggcca gcgtagggtg 11820
gccggggctc cgggggcgag atcttccaac ataaggcgat gatatccgta gatgtacctg 11880
gacatccagg tgatgccggc ggcggtggtg gaggcgcgcg gaaagtcgcg gacgcggttc 11940
cagatgttgc gcagcggcaa aaagtgctcc atggtcggga cgctctggcc ggtcaggcgc 12000
gcgcaatcgt tgacgctcta ccgtgcaaaa ggagagcctg taagcgggca ctcttccgtg 12060
gtctggtgga taaattcgca agggtatcat ggcggacgac cggggttcga gccccgtatc 12120
cggccgtccg ccgtgatcca tgcggttacc gcccgcgtgt cgaacccagg tgtgcgacgt 12180
cagacaacgg gggagtgctc cttttggctt ccttccaggc gcggcggctg ctgcgctagc 12240
ttttttggcc actggccgcg cgcagcgtaa gcggttaggc tggaaagcga aagcattaag 12300
tggctcgctc cctgtagccg gagggttatt ttccaagggt tgagtcgcgg gacccccggt 12360
tcgagtctcg gaccggccgg actgcggcga acgggggttt gcctccccgt catgcaagac 12420
cccgcttgca aattcctccg gaaacaggga cgagcccctt ttttgctttt cccagatgca 12480
tccggtgctg cggcagatgc gcccccctcc tcagcagcgg caagagcaag agcagcggca 12540
gacatgcagg gcaccctccc ctcctcctac cgcgtcagga ggggcgacat ccgcggttga 12600
cgcggcagca gatggtgatt acgaaccccc gcggcgccgg gcccggcact acctggactt 12660
ggaggagggc gagggcctgg cgcggctagg agcgccctct cctgagcggt acccaagggt 12720
gcagctgaag cgtgatacgc gtgaggcgta cgtgccgcgg cagaacctgt ttcgcgaccg 12780
cgagggagag gagcccgagg agatgcggga tcgaaagttc cacgcagggc gcgagctgcg 12840
gcatggcctg aatcgcgagc ggttgctgcg cgaggaggac tttgagcccg acgcgcgaac 12900
cgggattagt cccgcgcgcg cacacgtggc ggccgccgac ctggtaaccg catacgagca 12960
gacggtgaac caggagatta actttcaaaa aagctttaac aaccacgtgc gtacgcttgt 13020
ggcgcgcgag gaggtggcta taggactgat gcatctgtgg gactttgtaa gcgcgctgga 13080
gcaaaaccca aatagcaagc cgctcatggc gcagctgttc cttatagtgc agcacagcag 13140
ggacaacgag gcattcaggg atgcgctgct aaacatagta gagcccgagg gccgctggct 13200
gctcgatttg ataaacatcc tgcagagcat agtggtgcag gagcgcagct tgagcctggc 13260
tgacaaggtg gccgccatca actattccat gcttagcctg ggcaagtttt acgcccgcaa 13320
gatataccat accccttacg ttcccataga caaggaggta aagatcgagg ggttctacat 13380
gcgcatggcg ctgaaggtgc ttaccttgag cgacgacctg ggcgtttatc gcaacgagcg 13440
catccacaag gccgtgagcg tgagccggcg gcgcgagctc agcgaccgcg agctgatgca 13500
cagcctgcaa agggccctgg ctggcacggg cagcggcgat agagaggccg agtcctactt 13560
tgacgcgggc gctgacctgc gctgggcccc aagccgacgc gccctggagg cagctggggc 13620
cggacctggg ctggcggtgg cacccgcgcg cgctggcaac gtcggcggcg tggaggaata 13680
tgacgaggac gatgagtacg agccagagga cggcgagtac taagcggtga tgtttctgat 13740
cagatgatgc aagacgcaac ggacccggcg gtgcgggcgg cgctgcagag ccagccgtcc 13800
ggccttaact ccacggacga ctggcgccag gtcatggacc gcatcatgtc gctgactgcg 13860
cgcaatcctg acgcgttccg gcagcagccg caggccaacc ggctctccgc aattctggaa 13920
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atttgtacct gaggactacc acgcccacga gattaggttc tacgaagacc aatcccgccc 27540
gccaaatgcg gagcttaccg cctgcgtcat tacccagggc cacattcttg gccaattgca 27600
agccatcaac aaagcccgcc aagagtttct gctacgaaag ggacgggggg tttacttgga 27660
cccccagtcc ggcgaggagc tcaacccaat ccccccgccg ccgcagccct atcagcagca 27720
gccgcgggcc cttgcttccc aggatggcac ccaaaaagaa gctgcagctg ccgccgccac 27780
ccacggacga ggaggaatac tgggacagtc aggcagagga ggttttggac gaggaggagg 27840
aggacatgat ggaagactgg gagagcctag acgaggaagc ttccgaggtc gaagaggtgt 27900
cagacgaaac accgtcaccc tcggtcgcat tcccctcgcc ggcgccccag aaatcggcaa 27960
ccggttccag catggctaca acctccgctc ctcaggcgcc gccggcactg cccgttcgcc 28020
gacccaaccg tagatgggac accactggaa ccagggccgg taagtccaag cagccgccgc 28080
cgttagccca agagcaacaa cagcgccaag gctaccgctc atggcgcggg cacaagaacg 28140
ccatagttgc ttgcttgcaa gactgtgggg gcaacatctc cttcgcccgc cgctttcttc 28200
tctaccatca cggcgtggcc ttcccccgta acatcctgca ttactaccgt catctctaca 28260
gcccatactg caccggcggc agcggcagcg gcagcaacag cagcggccac acagaagcaa 28320
aggcgaccgg atagcaagac tctgacaaag cccaagaaat ccacagcggc ggcagcagca 28380
ggaggaggag cgctgcgtct ggcgcccaac gaacccgtat cgacccgcga gcttagaaac 28440
aggatttttc ccactctgta tgctatattt caacagagca ggggccaaga acaagagctg 28500
aaaataaaaa acaggtctct gcgatccctc acccgcagct gcctgtatca caaaagcgaa 28560
gatcagcttc ggcgcacgct ggaagacgcg gaggctctct tcagtaaata ctgcgcgctg 28620
actcttaagg actagtttcg cgccctttct caaatttaag cgcgaaaact acgtcatctc 28680
cagcggccac acccggcgcc agcacctgtc gtcagcgcca ttatgagcaa ggaaattccc 28740
acgccctaca tgtggagtta ccagccacaa atgggacttg cggctggagc tgcccaagac 28800
tactcaaccc gaataaacta catgagcgcg ggaccccaca tgatatcccg ggtcaacgga 28860
atccgcgccc accgaaaccg aattctcttg gaacaggcgg ctattaccac cacacctcgt 28920
aataacctta atccccgtag ttggcccgct gccctggtgt accaggaaag tcccgctccc 28980
accactgtgg tacttcccag agacgcccag gccgaagttc agatgactaa ctcaggggcg 29040
cagcttgcgg gcggctttcg tcacagggtg cggtcgcccg ggcagggtat aactcacctg 29100
acaatcagag ggcgaggtat tcagctcaac gacgagtcgg tgagctcctc gcttggtctc 29160
cgtccggacg ggacatttca gatcggcggc gccggccgtc cttcattcac gcctcgtcag 29220
gcaatcctaa ctctgcagac ctcgtcctct gagccgcgct ctggaggcat tggaactctg 29280
caatttattg aggagtttgt gccatcggtc tactttaacc ccttctcggg acctcccggc 29340
cactatccgg atcaatttat tcctaacttt gacgcggtaa aggactcggc ggacggctac 29400
gactgaatgt taagtggaga ggcagagcaa ctgcgcctga aacacctggt ccactgtcgc 29460
cgccacaagt gctttgcccg cgactccggt gagttttgct actttgaatt gcccgaggat 29520
catatcgagg gcccggcgca cggcgtccgg cttaccgccc agggagagct tgcccgtagc 29580
ctgattcggg agtttaccca gcgccccctg ctagttgagc gggacagggg accctgtgtt 29640
ctcactgtga tttgcaactg tcctaacctt ggattacatc aagatcctct agttaattaa 29700
gaatatatac tgatatgtat acccgaagta tgtcaaaaag aggtgtgcta tgaagcagcg 29760
tattacagtg acagttgaca gcgacagcta tcagttgctc aaggcatata tgatgtcaat 29820
atctccggtc tggtaagcac aaccatgcag aatgaagccc gtcgtctgcg tgccgaacgc 29880
tggaaagcgg aaaatcagga agggatggct gaggtcgccc ggtttattga aatgaacggc 29940
tcttttgctg acgagaacag ggactggtga aatgcagttt aaggtttaca cctataaaag 30000
agagagccgt tatcgtctgt ttgtggatgt acagagtgat attattgaca cgcccgggcg 30060
acggatggtg atccccctgg ccagtgcacg tctgctgtca gataaagtct cccgtgaact 30120
ttacccggtg gtgcatatcg gggatgaaag ctggcgcatg atgaccaccg atatggccag 30180
tgtgccggtc tccgttatcg gggaagaagt ggctgatctc agccaccgcg aaaatgacat 30240
caaaaacgcc attaacctga tgttctgggg aatataaatg tcaggctccc ttatacacag 30300
ccagtctaga gtacccgggg atcttattcc ctttaactaa taaaaaaaaa taataaagca 30360
tcacttactt aaaatcagtt agcaaatttc tgtccagttt attcagcagc acctccttgc 30420
cctcctccca gctctggtat tgcagcttcc tcctggctgc aaactttctc cacaatctaa 30480
atggaatgtc agtttcctcc tgttcctgtc catccgcacc cactatcttc atgttgttgc 30540
agatgaagcg cgcaagaccg tctgaagata ccttcaaccc cgtgtatcca tatgacacgg 30600
aaaccggtcc tccaactgtg ccttttctta ctcctccctt tgtatccccc aatgggtttc 30660
aagagagtcc ccctggggta ctctctttgc gcctatccga acctctagtt acctccaatg 30720
gcatgcttgc gctcaaaatg ggcaacggcc tctctctgga cgaggccggc aaccttacct 30780
cccaaaatgt aaccactgtg agcccacctc tcaaaaaaac caagtcaaac ataaacctgg 30840
aaatatctgc acccctcaca gttacctcag aagccctaac tgtggctgcc gccgcacctc 30900
taatggtcgc gggcaacaca ctcaccatgc aatcacaggc cccgctaacc gtgcacgact 30960
ccaaacttag cattgccacc caaggacccc tcacagtgtc agaaggaaag ctagccctgc 31020
aaacatcagg ccccctcacc accaccgata gcagtaccct tactatcact gcctcacccc 31080
ctctaactac tgccactggt agcttgggca ttgacttgaa agagcccatt tatacacaaa 31140
atggaaaact aggactaaag tacggggctc ctttgcatgt aacagacgac ctaaacactt 31200
tgaccgtagc aactggtcca ggtgtgacta ttaataatac ttccttgcaa actaaagtta 31260
ctggagcctt gggttttgat tcacaaggca atatgcaact taatgtagca ggaggactaa 31320
ggattgattc tcaaaacaga cgccttatac ttgatgttag ttatccgttt gatgctcaaa 31380
accaactaaa tctaagacta ggacagggcc ctctttttat aaactcagcc cacaacttgg 31440
atattaacta caacaaaggc ctttacttgt ttacagcttc aaacaattcc aaaaagcttg 31500
aggttaacct aagcactgcc aaggggttga tgtttgacgc tacagccata gccattaatg 31560
caggagatgg gcttgaattt ggttcaccta atgcaccaaa cacaaatccc ctcaaaacaa 31620
aaattggcca tggcctagaa tttgattcaa acaaggctat ggttcctaaa ctaggaactg 31680
gccttagttt tgacagcaca ggtgccatta cagtaggaaa caaaaataat gataagctaa 31740
ctttgtggac cacaccagct ccatctccta actgtagact aaatgcagag aaagatgcta 31800
aactcacttt ggtcttaaca aaatgtggca gtcaaatact tgctacagtt tcagttttgg 31860
ctgttaaagg cagtttggct ccaatatctg gaacagttca aagtgctcat cttattataa 31920
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acctatcagc ttatccaaaa tctcacggta aaactgccaa aagtaacatt gtcagtcaag 32100
tttacttaaa cggagacaaa actaaacctg taacactaac cattacacta aacggtacac 32160
aggaaacagg agacacaact ccaagtgcat actctatgtc attttcatgg gactggtctg 32220
gccacaacta cattaatgaa atatttgcca catcctctta cactttttca tacattgccc 32280
aagaataaag aatcgtttgt gttatgtttc aacgtgttta tttttcaatt gcagaaaatt 32340
tcaagtcatt tttcattcag tagtatagcc ccaccaccat agtgactgga tatgttgtgt 32400
tttacagtat tatgtagtct gttttttatg caaaatctaa tttaatatat tgatatttat 32460
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ccgtacctta atcaaactca cagaacccta gtattcaacc tgccacctcc ctcccaacac 32580
acagagtaca cagtcctttc tccccggctg gccttaaaaa gcatcatatc atgggtaaca 32640
gacatattct taggtgttat attccacacg gtttcctgtc gagccaaacg ctcatcagtg 32700
atattaataa actccccggg cagctcactt aagttcatgt cgctgtccag ctgctgagcc 32760
acaggctgct gtccaacttg cggttgctta acgggcggcg aaggagaagt ccacgcctac 32820
atgggggtag agtcataatc gtgcatcagg atagggcggt ggtgctgcag cagcgcgcga 32880
ataaactgct gccgccgccg ctccgtcctg caggaataca acatggcagt ggtctcctca 32940
gcgatgattc gcaccgcccg cagcataagg cgccttgtcc tccgggcaca gcagcgcacc 33000
ctgatctcac ttaaatcagc acagtaactg cagcacagca ccacaatatt gttcaaaatc 33060
ccacagtgca aggcgctgta tccaaagctc atggcgggga ccacagaacc cacgtggcca 33120
tcataccaca agcgcaggta gattaagtgg cgacccctca taaacacgct ggacataaac 33180
attacctctt ttggcatgtt gtaattcacc acctcccggt accatataaa cctctgatta 33240
aacatggcgc catccaccac catcctaaac cagctggcca aaacctgccc gccggctata 33300
cactgcaggg aaccgggact ggaacaatga cagtggagag cccaggactc gtaaccatgg 33360
atcatcatgc tcgtcatgat atcaatgttg gcacaacaca ggcacacgtg catacacttc 33420
ctcaggatta caagctcctc ccgcgttaga accatatccc agggaacaac ccattcctga 33480
atcagcgtaa atcccacact gcagggaaga cctcgcacgt aactcacgtt gtgcattgtc 33540
aaagtgttac attcgggcag cagcggatga tcctccagta tggtagcgcg ggtttctgtc 33600
tcaaaaggag gtagacgatc cctactgtac ggagtgcgcc gagacaaccg agatcgtgtt 33660
ggtcgtagtg tcatgccaaa tggaacgccg gacgtagtca tatttcctga agcaaaacca 33720
ggtgcgggcg tgacaaacag atctgcgtct ccggtctcgc cgcttagatc gctctgtgta 33780
gtagttgtag tatatccact ctctcaaagc atccaggcgc cccctggctt cgggttctat 33840
gtaaactcct tcatgcgccg ctgccctgat aacatccacc accgcagaat aagccacacc 33900
cagccaacct acacattcgt tctgcgagtc acacacggga ggagcgggaa gagctggaag 33960
aaccatgttt ttttttttat tccaaaagat tatccaaaac ctcaaaatga agatctatta 34020
agtgaacgcg ctcccctccg gtggcgtggt caaactctac agccaaagaa cagataatgg 34080
catttgtaag atgttgcaca atggcttcca aaaggcaaac ggccctcacg tccaagtgga 34140
cgtaaaggct aaacccttca gggtgaatct cctctataaa cattccagca ccttcaacca 34200
tgcccaaata attctcatct cgccaccttc tcaatatatc tctaagcaaa tcccgaatat 34260
taagtccggc cattgtaaaa atctgctcca gagcgccctc caccttcagc ctcaagcagc 34320
gaatcatgat tgcaaaaatt caggttcctc acagacctgt ataagattca aaagcggaac 34380
attaacaaaa ataccgcgat cccgtaggtc ccttcgcagg gccagctgaa cataatcgtg 34440
caggtctgca cggaccagcg cggccacttc cccgccagga accttgacaa aagaacccac 34500
actgattatg acacgcatac tcggagctat gctaaccagc gtagccccga tgtaagcttt 34560
gttgcatggg cggcgatata aaatgcaagg tgctgctcaa aaaatcaggc aaagcctcgc 34620
gcaaaaaaga aagcacatcg tagtcatgct catgcagata aaggcaggta agctccggaa 34680
ccaccacaga aaaagacacc atttttctct caaacatgtc tgcgggtttc tgcataaaca 34740
caaaataaaa taacaaaaaa acatttaaac attagaagcc tgtcttacaa caggaaaaac 34800
aacccttata agcataagac ggactacggc catgccggcg tgaccgtaaa aaaactggtc 34860
accgtgatta aaaagcacca ccgacagctc ctcggtcatg tccggagtca taatgtaaga 34920
ctcggtaaac acatcaggtt gattcatcgg tcagtgctaa aaagcgaccg aaatagcccg 34980
ggggaataca tacccgcagg cgtagagaca acattacagc ccccatagga ggtataacaa 35040
aattaatagg agagaaaaac acataaacac ctgaaaaacc ctcctgccta ggcaaaatag 35100
caccctcccg ctccagaaca acatacagcg cttcacagcg gcagcctaac agtcagcctt 35160
accagtaaaa aagaaaacct attaaaaaaa caccactcga cacggcacca gctcaatcag 35220
tcacagtgta aaaaagggcc aagtgcagag cgagtatata taggactaaa aaatgacgta 35280
acggttaaag tccacaaaaa acacccagaa aaccgcacgc gaacctacgc ccagaaacga 35340
aagccaaaaa acccacaact tcctcaaatc gtcacttccg ttttcccacg ttacgtaact 35400
tcccatttta agaaaactac aattcccaac acatacaagt tactccgccc taaaacctac 35460
gtcacccgcc ccgttcccac gccccgcgcc acgtcacaaa ctccaccccc tcattatcat 35520
attggcttca atccaaaata aggtatatta ttgatgat 35558
<210> 2
<211> 13611
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgctagca tggatctcgg 60
ggacgtctaa ctactaagcg agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct 120
cagtcggaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt 180
aggacaaatc cgccgggagc ggatttgaac gttgtgaagc aacggcccgg agggtggcgg 240
gcaggacgcc cgccataaac tgccaggcat caaactaagc agaaggccat cctgacggat 300
ggcctttttg cgtttctaca aactcttcct gttagttagt tacttaagct cgggccccaa 360
ataatgattt tattttgact gatagtgacc tgttcgttgc aacaaattga taagcaatgc 420
ttttttataa tgccaacttt gtacaaaaaa gcaggcttcg aaggagatag aaccaattct 480
ctaaggaaat acttaaccat ggctctagac cgccgcgcgg ccgctttcca agatggctac 540
cccttcgatg atgccgcagt ggtcttacat gcacatctcg ggccaggacg cctcggagta 600
cctgagcccc gggctggtgc agtttgcccg cgccaccgag acgtacttca gcctgaataa 660
caagtttaga aaccccacgg tggcgcctac gcacgacgtg accacagacc ggtcccagcg 720
tttgacgctg cggttcatcc ctgtggaccg tgaggatact gcgtactcgt acaaggcgcg 780
gttcacccta gctgtgggtg ataaccgtgt gctggacatg gcttccacgt actttgacat 840
ccgcggcgtg ctggacaggg gccctacttt taagccctac tctggcactg cctacaacgc 900
cctggctccc aagggtgccc caaatccttg cgaatgggaa gagaaaaaga atggaggagg 960
aagcgatgct aatcaaatgc aaactcacgt atttgggcag gcgccttatt ctggtataaa 1020
tattacaaag gagggtattc aaataggtat tgatgcaacc aaagaggaag ataatggaaa 1080
ggaaatatat gccgataaaa catttcaacc tgaacctcaa ataggagaat ctcagtggca 1140
ggatagtgat aattactatg gagggagagt ccttaaaaag actaccccaa tgaaaccatg 1200
ttacggttca tatgcaaaac ccacaaatga aaatggaggg caagctaaat tcaaaacacc 1260
tgaaaaagaa ggtgaagaac ccaaagaaag tcaagtggaa atgcaatttt tcgatattcc 1320
cagtactggc acaggtggta atggaacaaa tgttaatttc aaacctaaag tggtattgta 1380
cagtgaagat gtagatatag aaaccccaga cactcatatt tcttacatgc ccggcaagga 1440
agatgcaagt tcacgagaac taatgggcca acaatctatg cccaacaggc ctaattacat 1500
tgcttttagg gacaatttta ttggtctaat gtattacaac agcacgggta atatgggtgt 1560
tctggcgggc caagcatcgc agttgaatgc tgttgtagat ttgcaagaca gaaacacaga 1620
gctttcatac cagcttttgc ttgattccat tggtgataga accaggtact tttctatgtg 1680
gaatcaggct gttgacagct atgatccaga tgttagaatt attgaaaatc atggaactga 1740
agatgaactt ccaaattact gctttccact ggatggcgct ggaactaacg cagtgtacca 1800
aggtgtaaaa gttaaaacta ctaacaatac agaatgggaa aaagacactg cagtatctga 1860
acacaatcag ataagagttg gaaataattt tgccatggaa atcaatctaa atgccaacct 1920
gtggagaaat ttcctgtact ccaacatagc gctgtatttg cccgacaagc taaagtacag 1980
tccttccaac gtaaaaattt ctgataaccc aaacacctac gactacatga acaagcgagt 2040
ggtggctccc gggttagtgg actgctacat taaccttgga gcacgctggt cccttgacta 2100
tatggacaac gtcaacccat ttaaccacca ccgcaatgct ggcctgcgct accgctcaat 2160
gttgctgggc aatggtcgct atgtgccctt ccacatccag gtgcctcaga agttctttgc 2220
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cccatcactg ggctcgggct acgaccctta ttacacctac tctggctcta taccctacct 2640
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tccgcttata ggcaagaccg cagttgacag cattacccag aaaaagtttc tttgcgatcg 3120
caccctttgg cgcatcccat tctccagtaa ctttatgtcc atgggcgcac tcacagacct 3180
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acggccggtc gcgagactgg gggcgtacac tggatggcct ttgcctggaa cccgcactca 3600
aaaacatgct acctctttga gccctttggc ttttctgacc agcgactcaa gcaggtttac 3660
cagtttgagt acgagtcact cctgcgccgt agcgccattg cttcttcccc cgaccgctgt 3720
ataacgctgg aaaagtccac ccaaagcgta caggggccca actcggccgc ctgtggacta 3780
ttctgctgca tgtttctcca cgcctttgcc aactggcccc aaactcccat ggatcacaac 3840
cccaccatga accttattac cggggtaccc aactccatgc tcaacagtcc ccaggtacag 3900
cccaccctgc gtcgcaacca ggaacagctc tacagcttcc tggagcgcca ctcgccctac 3960
ttccgcagcc acagtgcgca gattaggagc gccacttctt tttgtcactt gaaaaacatg 4020
taaaaataat gtactagaga cactttcaat aaaggcaaat gcttttattt gtacactctc 4080
gggtgattat ttacccccac ccttgccgtc tgcgccgttt aaaaatcaaa ggggttctgc 4140
cgcgcatcgc tatgcgccac tggcagggac acgttgcgat actggtgttt agtgctccac 4200
ttaaactcag gcacaaccat ccgcggcagc tcggtgaagt tttcactcca caggctgcgc 4260
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ccgccctgcg cgcgcgagtt gcgatacaca gggttgcagc actggaacac tatcagcgcc 4380
gggtggtgca cgctggccag cacgctcttg tcggagatca gatccgcgtc caggtcctcc 4440
gcgttgctca gggcgaacgg agtcaacttt ggtagctgcc ttcccaaaaa gggcgcgtgc 4500
ccaggctttg agttgcactc gcaccgtagt ggcatcaaaa ggtgaccgtg cccggtctgg 4560
gcgttaggat acagcgcctg cataaaagcc ttgatctgct taaaagccac ctgagccttt 4620
gcgccttcag agaagaacat gccgcaagac ttgccggaaa actgattggc cggacaggcc 4680
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cggttcttca cgatcttggc cttgctagac tgctccttca gcgcgcgctg cccgttttcg 4800
ctcgtcacat ccatttcaat cacgtgctcc ttatttatca taatgcttcc gtgtagacac 4860
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atcgtcacaa aggtcttgtt gctggtgaag gtcagctgca acccgcggtg ctcctcgttc 5040
agccaggtct tgcatacggc cgccagagct tccacttggt caggcagtag tttgaagttc 5100
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ttgctgaaac ccaccatttg tagcgccaca tcttctcttt cttcctcgct gtccacgatt 5400
acctctggtg atggcgggcg ctcgggcttg ggagaagggc gcttcttttt cttcttgggc 5460
gcaatggcca aatccgccgc cgaggtcgat ggccgcgggc tgggtgtgcg cggcaccagc 5520
gcgtcttgtg atgagtcttc ctcgtcctcg gactcgatac gccgcctcat ccgctttttt 5580
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ggacgtcgcg ccgcaccgcg tccgcgctcg ggggtggttt cgcgctgctc ctcttcccga 5700
ctggccattt ccttctccta taggcagaaa aagatcatgg agtcagtcga gaagaaggac 5760
agcctaaccg ccccctctga gttcgccacc accgcctcca ccgatgccgc caacgcgcct 5820
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<223> n is a, c, g, or t
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caacgatgta ctcgccggga cagcgatgtc tgctgcactc catccctccc ctgttcattt 720
gtccttcatg cccgtctgga gtagatgctt tttgcagagg tggcaccctg taaagctctc 780
ctgtctgact tttttttttt ttttagactg agttttgctc ttgttgccta ggctggagtg 840
caatggcaca atctcagctc actgcaccct ctgcctcccg ggttcaagcg attctcctgc 900
ctcagcctcc cgagtagttg ggattacagg catgcaccac cacgcccagc taatttttgt 960
atttttagta gagacaaggt ttcaccgtga tggccaggct ggtcttgaac tccaggactc 1020
aagtgatgct cctgcctagg cctctcaaag tgttgggatt acaggcgtga gccactgcac 1080
ccggcctgca cgcgttcttt gaaagcagtc gagggggcgc taggtgtggg cagggacgag 1140
ctggcgcggc gtcgctgggt gcaccgcgac cacgggcaga gccacgcggc gggaggacta 1200
caactcccgg cacaccccgc gccgccccgc ctctactccc agaaggccgc ggggggtgga 1260
ccgcctaaga gggcgtgcgc tcccgacatg ccccgcggcg cgccattaac cgccagattt 1320
gaatcgcggc gaggatccac tagtgattta aatctcgaga attcggtacc gctagccatg 1380
gacgcgttaa ccggtgatat cgatagatct caccatgaga catattatct gccacggagg 1440
tgttattacc gaagaaatgg ccgccagtct tttggaccag ctgatcgaag aggtactggc 1500
tgataatctt ccacctccta gccattttga accacctacc cttcacgaac tgtatgattt 1560
agacgtgacg gcccccgaag atcccaacga ggaggcggtt tcgcagattt ttcccgactc 1620
tgtaatgttg gcggtgcagg aagggattga cttactcact tttccgccgg cgcccggttc 1680
tccggagccg cctcaccttt cccggcagcc cgagcagccg gagcagagag ccttgggtcc 1740
ggtttctatg ccaaaccttg taccggaggt gatcgatctt acctgccacg aggctggctt 1800
tccacccagt gacgacgagg atgaagaggg tgaggagttt gtgttagatt atgtggagca 1860
ccccgggcac ggttgcaggt cttgtcatta tcaccggagg aatacggggg acccagatat 1920
tatgtgttcg ctttgctata tgaggacctg tggcatgttt gtctacagta agtgaaaatt 1980
atgggcagtg ggtgatagag tggtgggttt ggtgtggtaa tttttttttt aatttttaca 2040
gttttgtggt ttaaagaatt ttgtattgtg atttttttaa aaggtcctgt gtctgaacct 2100
gagcctgagc ccgagccaga accggagcct gcaagaccta cccgccgtcc taaaatggcg 2160
cctgctatcc tgagacgccc gacatcacct gtgtctagag aatgcaatag tagtacggat 2220
agctgtgact ccggtccttc taacacacct cctgagatac acccggtggt cccgctgtgc 2280
cccattaaac cagttgccgt gagagttggt gggcgtcgcc aggctgtgga atgtatcgag 2340
gacttgctta acgagcctgg gcaacctttg gacttgagct gtaaacgccc caggccataa 2400
gtcgacgcgg ccgcaagctt ctagagttcg agcaacttgt ttattgcagc ttataatggt 2460
tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct 2520
agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggatcgt ctagcatcga 2580
agatccaata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta taagtactga attcggatct 2640
gggcgtggtt aagggtggga aagaatatat aaggtggggg tcttatgtag ttttgtatct 2700
gttttgcagc agccgccgcc gccatgagca ccaactcgtt tgatggaagc attgtgagct 2760
catatttgac aacgcgcatg cccccatggg ccggggtgcg tcagaatgtg atgggctcca 2820
gcattgatgg tcgccccgtc ctgcccgcaa actctactac cttgacctac gagaccgtgt 2880
ctggaacgcc gttggagact gcagcctccg ccgccgcttc agccgctgca gccaccgccc 2940
gcgggattgt gactgacttt gctttcctga gcccgcttgc aagcagtgca gcttcccgtt 3000
catccgcccg cgatgacaag ttgacggctc ttttggcaca attggattct ttgacccggg 3060
aacttaatgt cgtttctcag cagctgttgg atctgcgcca gcaggtttct gccctgaagg 3120
cttcctcccc tcccaatgcg gtttaaaaca taaataaaaa accagactct gtttggattt 3180
ggatcaagca agtgtcttgc tgtctttatt taggggtttt gcgcgcgcgg taggcccggg 3240
accagcggtc tcggtcgttg agggtcctgt gtattttttc caggacgtgg taaaggtgac 3300
tctggatgtt cagatacatg ggcataagcc cgtctctggg gtggaggtag caccactgca 3360
gagcttcatg ctgcggggtg gtgttgtaga tgatccagtc gtagcaggag cgctgggcgt 3420
ggtgcctaaa aatgtctttc agtagcaagc tgattgccag gggcaggccc ttggtgtaag 3480
tgtttacaaa gcggttaagc tgggatgggt gcatacgtgg ggatatgaga tgcatcttgg 3540
actgtatttt taggttggct atgttcccag ccatatccct ccggggattc atgttgtgca 3600
gaaccaccag cacagtgtat ccggtgcact tgggaaattt gtcatgtagc ttagaaggaa 3660
atgcgtggaa gaacttggag acgcccttgt gacctccaag attttccatg cattcgtcca 3720
taatgatggc aatgggccca cgggcggcgg cctgggcgaa gatatttctg ggatcactaa 3780
cgtcatagtt gtgttccagg atgagatcgt cataggccat ttttacaaag cgcgggcgga 3840
gggtgccaga ctgcggtata atggttccat ccggcccagg ggcgtagtta ccctcacaga 3900
tttgcatttc ccacgctttg agttcagatg gggggatcat gtctacctgc ggggcgatga 3960
agaaaacggt ttccggggta ggggagatca gctgggaaga aagcaggttc ctgagcagct 4020
gcgacttacc gcagccggtg ggcccgtaaa tcacacctat taccgggtgc aactggtagt 4080
taagagagct gcagctgccg tcatccctga gcaggggggc cacttcgtta agcatgtccc 4140
tgactcgcat gttttccctg accaaatccg ccagaaggcg ctcgccgccc agcgatagca 4200
gttcttgcaa ggaagcaaag tttttcaacg gtttgagacc gtccgccgta ggcatgcttt 4260
tgagcgtttg accaagcagt tccaggcggt cccacagctc ggtcacctgc tctacggcat 4320
ctcgatccag catatctcct cgtttcgcgg gttggggcgg ctttcgctgt acggcagtag 4380
tcggtgctcg tccagacggg ccagggtcat gtctttccac gggcgcaggg tcctcgtcag 4440
cgtagtctgg gtcacggtga aggggtgcgc tccgggctgc gcgctggcca gggtgcgctt 4500
gaggctggtc ctgctggtgc tgaagcgctg ccggtcttcg ccctgcgcgt cggccaggta 4560
gcatttgacc atggtgtcat agtccagccc ctccgcggcg tggcccttgg cgcgcagctt 4620
gcccttggag gaggcgccgc acgaggggca gtgcagactt ttgagggcgt agagcttggg 4680
cgcgagaaat accgattccg gggagtaggc atccgcgccg caggccccgc agacggtctc 4740
gcattccacg agccaggtga gctctggccg ttcggggtca aaaaccaggt ttcccccatg 4800
ctttttgatg cgtttcttac ctctggtttc catgagccgg tgtccacgct cggtgacgaa 4860
aaggctgtcc gtgtccccgt atacagactt gagaggcctg tcctcgagcg gtgttccgcg 4920
gtcctcctcg tatagaaact cggaccactc tgagacaaag gctcgcgtcc aggccagcac 4980
gaaggaggct aagtgggagg ggtagcggtc gttgtccact agggggtcca ctcgctccag 5040
ggtgtgaaga cacatgtcgc cctcttcggc atcaaggaag gtgattggtt tgtaggtgta 5100
ggccacgtga ccgggtgttc ctgaaggggg gctataaaag ggggtggggg cgcgttcgtc 5160
ctcactctct tccgcatcgc tgtctgcgag ggccagctgt tggggtgagt actccctctg 5220
aaaagcgggc atgacttctg cgctaagatt gtcagtttcc aaaaacgagg aggatttgat 5280
attcacctgg cccgcggtga tgcctttgag ggtggccgca tccatctggt cagaaaagac 5340
aatctttttg ttgtcaagct tggtggcaaa cgacccgtag agggcgttgg acagcaactt 5400
ggcgatggag cgcagggttt ggtttttgtc gcgatcggcg cgctccttgg ccgcgatgtt 5460
tagctgcacg tattcgcgcg caacgcaccg ccattcggga aagacggtgg tgcgctcgtc 5520
gggcaccagg tgcacgcgcc aaccgcggtt gtgcagggtg acaaggtcaa cgctggtggc 5580
tacctctccg cgtaggcgct cgttggtcca gcagaggcgg ccgcccttgc gcgagcagaa 5640
tggcggtagg gggtctagct gcgtctcgtc cggggggtct gcgtccacgg taaagacccc 5700
gggcagcagg cgcgcgtcga agtagtctat cttgcatcct tgcaagtcta gcgcctgctg 5760
ccatgcgcgg gcggcaagcg cgcgctcgta tgggttgagt gggggacccc atggcatggg 5820
gtgggtgagc gcggaggcgt acatgccgca aatgtcgtaa acgtagaggg gctctctgag 5880
tattccaaga tatgtagggt agcatcttcc accgcggatg ctggcgcgca cgtaatcgta 5940
tagttcgtgc gagggagcga ggaggtcggg accgaggttg ctacgggcgg gctgctctgc 6000
tcggaagact atctgcctga agatggcatg tgagttggat gatatggttg gacgctggaa 6060
gacgttgaag ctggcgtctg tgagacctac cgcgtcacgc acgaaggagg cgtaggagtc 6120
gcgcagcttg ttgaccagct cggcggtgac ctgcacgtct agggcgcagt agtccagggt 6180
ttccttgatg atgtcatact tatcctgtcc cttttttttc cacagctcgc ggttgaggac 6240
aaactcttcg cggtctttcc agtactcttg gatcggaaac ccgtcggcct ccgaacggta 6300
agagcctagc atgtagaact ggttgacggc ctggtaggcg cagcatccct tttctacggg 6360
tagcgcgtat gcctgcgcgg ccttccggag cgaggtgtgg gtgagcgcaa aggtgtccct 6420
gaccatgact ttgaggtact ggtatttgaa gtcagtgtcg tcgcatccgc cctgctccca 6480
gagcaaaaag tccgtgcgct ttttggaacg cggatttggc agggcgaagg tgacatcgtt 6540
gaagagtatc tttcccgcgc gaggcataaa gttgcgtgtg atgcggaagg gtcccggcac 6600
ctcggaacgg ttgttaatta cctgggcggc gagcacgatc tcgtcaaagc cgttgatgtt 6660
gtggcccaca atgtaaagtt ccaagaagcg cgggatgccc ttgatggaag gcaatttttt 6720
aagttcctcg taggtgagct cttcagggga gctgagcccg tgctctgaaa gggcccagtc 6780
tgcaagatga gggttggaag cgacgaatga gctccacagg tcacgggcca ttagcatttg 6840
caggtggtcg cgaaaggtcc taaactggcg acctatggcc attttttctg gggtgatgca 6900
gtagaaggta agcgggtctt gttcccagcg gtcccatcca aggttcgcgg ctaggtctcg 6960
cgcggcagtc actagaggct catctccgcc gaacttcatg accagcatga agggcacgag 7020
ctgcttccca aaggccccca tccaagtata ggtctctaca tcgtaggtga caaagagacg 7080
ctcggtgcga ggatgcgagc cgatcgggaa gaactggatc tcccgccacc aattggagga 7140
gtggctattg atgtggtgaa agtagaagtc cctgcgacgg gccgaacact cgtgctggct 7200
tttgtaaaaa cgtgcgcagt actggcagcg gtgcacgggc tgtacatcct gcacgaggtt 7260
gacctgacga ccgcgcacaa ggaagcagag tgggaatttg agcccctcgc ctggcgggtt 7320
tggctggtgg tcttctactt cggctgcttg tccttgaccg tctggctgct cgaggggagt 7380
tacggtggat cggaccacca cgccgcgcga gcccaaagtc cagatgtccg cgcgcggcgg 7440
tcggagcttg atgacaacat cgcgcagatg ggagctgtcc atggtctgga gctcccgcgg 7500
cgtcaggtca ggcgggagct cctgcaggtt tacctcgcat agacgggtca gggcgcgggc 7560
tagatccagg tgatacctaa tttccagggg ctggttggtg gcggcgtcga tggcttgcaa 7620
gaggccgcat ccccgcggcg cgactacggt accgcgcggc gggcggtggg ccgcgggggt 7680
gtccttggat gatgcatcta aaagcggtga cgcgggcgag cccccggagg tagggggggc 7740
tccggacccg ccgggagagg gggcaggggc acgtcggcgc cgcgcgcggg caggagctgg 7800
tgctgcgcgc gtaggttgct ggcgaacgcg acgacgcggc ggttgatctc ctgaatctgg 7860
cgcctctgcg tgaagacgac gggcccggtg agcttgagcc tgaaagagag ttcgacagaa 7920
tcaatttcgg tgtcgttgac ggcggcctgg cgcaaaatct cctgcacgtc tcctgagttg 7980
tcttgatagg cgatctcggc catgaactgc tcgatctctt cctcctggag atctccgcgt 8040
ccggctcgct ccacggtggc ggcgaggtcg ttggaaatgc gggccatgag ctgcgagaag 8100
gcgttgaggc ctccctcgtt ccagacgcgg ctgtagacca cgcccccttc ggcatcgcgg 8160
gcgcgcatga ccacctgcgc gagattgagc tccacgtgcc gggcgaagac ggcgtagttt 8220
cgcaggcgct gaaagaggta gttgagggtg gtggcggtgt gttctgccac gaagaagtac 8280
ataacccagc gtcgcaacgt ggattcgttg atatccccca aggcctcaag gcgctccatg 8340
gcctcgtaga agtccacggc gaagttgaaa aactgggagt tgcgcgccga cacggttaac 8400
tcctcctcca gaagacggat gagctcggcg acagtgtcgc gcacctcgcg ctcaaaggct 8460
acaggggcct cttcttcttc ttcaatctcc tcttccataa gggcctcccc ttcttcttct 8520
tctggcggcg gtgggggagg ggggacacgg cggcgacgac ggcgcaccgg gaggcggtcg 8580
acaaagcgct cgatcatctc cccgcggcga cggcgcatgg tctcggtgac ggcgcggccg 8640
ttctcgcggg ggcgcagttg gaagacgccg cccgtcatgt cccggttatg ggttggcggg 8700
gggctgccat gcggcaggga tacggcgcta acgatgcatc tcaacaattg ttgtgtaggt 8760
actccgccgc cgagggacct gagcgagtcc gcatcgaccg gatcggaaaa cctctcgaga 8820
aaggcgtcta accagtcaca gtcgcaaggt aggctgagca ccgtggcggg cggcagcggg 8880
cggcggtcgg ggttgtttct ggcggaggtg ctgctgatga tgtaattaaa gtaggcggtc 8940
ttgagacggc ggatggtcga cagaagcacc atgtccttgg gtccggcctg ctgaatgcgc 9000
aggcggtcgg ccatgcccca ggcttcgttt tgacatcggc gcaggtcttt gtagtagtct 9060
tgcatgagcc tttctaccgg cacttcttct tctccttcct cttgtcctgc atctcttgca 9120
tctatcgctg cggcggcggc ggagtttggc cgtaggtggc gccctcttcc tcccatgcgt 9180
gtgaccccga agcccctcat cggctgaagc agggctaggt cggcgacaac gcgctcggct 9240
aatatggcct gctgcacctg cgtgagggta gactggaagt catccatgtc cacaaagcgg 9300
tggtatgcgc ccgtgttgat ggtgtaagtg cagttggcca taacggacca gttaacggtc 9360
tggtgacccg gctgcgagag ctcggtgtac ctgagacgcg agtaagccct cgagtcaaat 9420
acgtagtcgt tgcaagtccg caccaggtac tggtatccca ccaaaaagtg cggcggcggc 9480
tggcggtaga ggggccagcg tagggtggcc ggggctccgg gggcgagatc ttccaacata 9540
aggcgatgat atccgtagat gtacctggac atccaggtga tgccggcggc ggtggtggag 9600
gcgcgcggaa agtcgcggac gcggttccag atgttgcgca gcggcaaaaa gtgctccatg 9660
gtcgggacgc tctggccggt caggcgcgcg caatcgttga cgctctaccg tgcaaaagga 9720
gagcctgtaa gcgggcactc ttccgtggtc tggtggataa attcgcaagg gtatcatggc 9780
ggacgaccgg ggttcgagcc ccgtatccgg ccgtccgccg tgatccatgc ggttaccgcc 9840
cgcgtgtcga acccaggtgt gcgacgtcag acaacggggg agtgctcctt ttggcttcct 9900
tccaggcgcg gcggctgctg cgctagcttt tttggccact ggccgcgcgc agcgtaagcg 9960
gttaggctgg aaagcgaaag cattaagtgg ctcgctccct gtagccggag ggttattttc 10020
caagggttga gtcgcgggac ccccggttcg agtctcggac cggccggact gcggcgaacg 10080
ggggtttgcc tccccgtcat gcaagacccc gcttgcaaat tcctccggaa acagggacga 10140
gccccttttt tgcttttccc agatgcatcc ggtgctgcgg cagatgcgcc cccctcctca 10200
gcagcggcaa gagcaagagc agcggcagac atgcagggca ccctcccctc ctcctaccgc 10260
gtcaggaggg gcgacatccg cggttgacgc ggcagcagat ggtgattacg aacccccgcg 10320
gcgccgggcc cggcactacc tggacttgga ggagggcgag ggcctggcgc ggctaggagc 10380
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gccgcggcag aacctgtttc gcgaccgcga gggagaggag cccgaggaga tgcgggatcg 10500
aaagttccac gcagggcgcg agctgcggca tggcctgaat cgcgagcggt tgctgcgcga 10560
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cgccgacctg gtaaccgcat acgagcagac ggtgaaccag gagattaact ttcaaaaaag 10680
ctttaacaac cacgtgcgta cgcttgtggc gcgcgaggag gtggctatag gactgatgca 10740
tctgtgggac tttgtaagcg cgctggagca aaacccaaat agcaagccgc tcatggcgca 10800
gctgttcctt atagtgcagc acagcaggga caacgaggca ttcagggatg cgctgctaaa 10860
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ggtgcaggag cgcagcttga gcctggctga caaggtggcc gccatcaact attccatgct 10980
tagcctgggc aagttttacg cccgcaagat ataccatacc ccttacgttc ccatagacaa 11040
ggaggtaaag atcgaggggt tctacatgcg catggcgctg aaggtgctta ccttgagcga 11100
cgacctgggc gtttatcgca acgagcgcat ccacaaggcc gtgagcgtga gccggcggcg 11160
cgagctcagc gaccgcgagc tgatgcacag cctgcaaagg gccctggctg gcacgggcag 11220
cggcgataga gaggccgagt cctactttga cgcgggcgct gacctgcgct gggccccaag 11280
ccgacgcgcc ctggaggcag ctggggccgg acctgggctg gcggtggcac ccgcgcgcgc 11340
tggcaacgtc ggcggcgtgg aggaatatga cgaggacgat gagtacgagc cagaggacgg 11400
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cagaccaacc tggaccggct ggtgggggat gtgcgcgagg ccgtggcgca gcgtgagcgc 11820
gcgcagcagc agggcaacct gggctccatg gttgcactaa acgccttcct gagtacacag 11880
cccgccaacg tgccgcgggg acaggaggac tacaccaact ttgtgagcgc actgcggcta 11940
atggtgactg agacaccgca aagtgaggtg taccagtctg ggccagacta ttttttccag 12000
accagtagac aaggcctgca gaccgtaaac ctgagccagg ctttcaaaaa cttgcagggg 12060
ctgtgggggg tgcgggctcc cacaggcgac cgcgcgaccg tgtctagctt gctgacgccc 12120
aactcgcgcc tgttgctgct gctaatagcg cccttcacgg acagtggcag cgtgtcccgg 12180
gacacatacc taggtcactt gctgacactg taccgcgagg ccataggtca ggcgcatgtg 12240
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cttaacctga tgcgcgacgg ggtaacgccc agcgtggcgc tggacatgac cgcgcgcaac 12480
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ctctgggacg acatagacga cagcgtgttt tccccgcaac cgcagaccct gctagagttg 12720
caacagcgcg agcaggcaga ggcggcgctg cgaaaggaaa gcttccgcag gccaagcagc 12780
ttgtccgatc taggcgctgc ggccccgcgg tcagatgcta gtagcccatt tccaagcttg 12840
atagggtctc ttaccagcac tcgcaccacc cgcccgcgcc tgctgggcga ggaggagtac 12900
ctaaacaact cgctgctgca gccgcagcgc gaaaaaaacc tgcctccggc atttcccaac 12960
aacgggatag agagcctagt ggacaagatg agtagatgga agacgtacgc gcaggagcac 13020
agggacgtgc caggcccgcg cccgcccacc cgtcgtcaaa ggcacgaccg tcagcggggt 13080
ctggtgtggg aggacgatga ctcggcagac gacagcagcg tcctggattt gggagggagt 13140
ggcaacccgt ttgcgcacct tcgccccagg ctggggagaa tgttttaaaa aaaaaaaagc 13200
atgatgcaaa ataaaaaact caccaaggcc atggcaccga gcgttggttt tcttgtattc 13260
cccttagtat gcggcgcgcg gcgatgtatg aggaaggtcc tcctccctcc tacgagagtg 13320
tggtgagcgc ggcgccagtg gcggcggcgc tgggttctcc cttcgatgct cccctggacc 13380
cgccgtttgt gcctccgcgg tacctgcggc ctaccggggg gagaaacagc atccgttact 13440
ctgagttggc acccctattc gacaccaccc gtgtgtacct ggtggacaac aagtcaacgg 13500
atgtggcatc cctgaactac cagaacgacc acagcaactt tctgaccacg gtcattcaaa 13560
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ccatgaccat agaccttatg aacaacgcga tcgtggagca ctacttgaaa gtgggcagac 13860
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tgttgggcat ccgcaagcgg caacccttcc aggagggctt taggatcacc tacgatgatc 14100
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atgacaccga acagggcggg ggtggcgcag gcggcagcaa cagcagtggc agcggcgcgg 14220
aagagaactc caacgcggca gccgcggcaa tgcagccggt ggaggacatg aacgatcatg 14280
ccattcgcgg cgacaccttt gccacacggg ctgaggagaa gcgcgctgag gccgaagcag 14340
cggccgaagc tgccgccccc gctgcgcaac ccgaggtcga gaagcctcag aagaaaccgg 14400
tgatcaaacc cctgacagag gacagcaaga aacgcagtta caacctaata agcaatgaca 14460
gcaccttcac ccagtaccgc agctggtacc ttgcatacaa ctacggcgac cctcagaccg 14520
gaatccgctc atggaccctg ctttgcactc ctgacgtaac ctgcggctcg gagcaggtct 14580
actggtcgtt gccagacatg atgcaagacc ccgtgacctt ccgctccacg cgccagatca 14640
gcaactttcc ggtggtgggc gccgagctgt tgcccgtgca ctccaagagc ttctacaacg 14700
accaggccgt ctactcccaa ctcatccgcc agtttacctc tctgacccac gtgttcaatc 14760
gctttcccga gaaccagatt ttggcgcgcc cgccagcccc caccatcacc accgtcagtg 14820
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cggccattag tgctatgact cagggtcgca ggggcaacgt gtattgggtg cgcgactcgg 15540
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taactatttt gtagaatgga agacatcaac tttgcgtctc tggccccgcg acacggctcg 17160
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cacacacccg taacgctgga cctgcctccc cccgccgaca cccagcagaa acctgtgctg 17700
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tcgtatgtgt gtcatgtatg cgtccatgtc gccgccagag gagctgctga caagtttgta 17940
caaaaaagca ggcttcgaag gagatagaac caattctcta aggaaatact taaccatggc 18000
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ttgcccagtg taacatgacc aaagactggt tcctggtaca aatgctagct aactacaaca 20340
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ccagtaactt tatgtccatg ggcgcactca cagacctggg ccaaaacctt ctctacgcca 20700
actccgccca cgcgctagac atgacttttg aggtggatcc catggacgag cccacccttc 20760
tttatgtttt gtttgaagtc tttgacgtgg tccgtgtgca ccggccgcac cgcggcgtca 20820
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cgtagaacgc agatcgaatt actagtcagg gaattcggta ccgctagcca tggacgcgtt 27900
aaccggtgat atcgatagat ctcatatgga tccagcttgt cgacttcgag caacttgttt 27960
attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca 28020
tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc 28080
tggatcgtct agcatcgaag atcctagcaa atttctgtcc agtttattca gcagcacctc 28140
cttgccctcc tcccagctct ggtattgcag cttcctcctg gctgcaaact ttctccacaa 28200
tctaaatgga atgtcagttt cctcctgttc ctgtccatcc gcacccacta tcttcatgtt 28260
gtgcaccatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgt atccatatga 28320
cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactcct ccctttgtat cccccaatgg 28380
gtttcaagag agtccccctg gagttcttac tttaaaatgt ttaaccccac taacaaccac 28440
aggcggatct ctacagctaa aagtgggagg gggacttaca gtggatgaca ccaacggttt 28500
tttgaaagaa aacataagtg ccaccacacc actcgttaag actggtcact ctataggttt 28560
accactagga gccggattgg gaacgaatga aaataaactt tgtatcaaat taggacaagg 28620
acttacattc aattcaaaca acatttgcat tgatgacaat attaacacct tatggacagg 28680
agtcaacccc accgaagcca actgtcaaat catgaactcc agtgaatcta atgattgcaa 28740
attaattcta acactagtta aaactggagc actagtcact gcatttgttt atgttatagg 28800
agtatctaac aattttaata tgctaactac acacagaaat ataaatttta ctgcagagct 28860
gtttttcgat tctaactggt aatttaacta actagactct catcccctca aaactccact 28920
taatcataaa tcaggacaaa acatggctac tggtgccatt actaatgcta aaggtttcat 28980
gcccagcacg actgcctatc ctttcaatga taattctaga gaaaaagaaa actacattta 29040
cggaacttgt tactacacag ctagtgatcg cactgctttt cccattgaca tatctgtcat 29100
gcttaaccga agagcaataa atgacgagac atcatattgt attcgtataa cttggtcctg 29160
gaacacagga gatgccccag aggtgcaaac ctctgctaca accctagtca cctccccatt 29220
taccttttac tacatcagag aagacgacta aagaatcgtt tgtgttatgt ttcaacgtgt 29280
ttatttttca attgcagaaa atttcaagtc atttttcatt cagtagtata ctctagaccc 29340
agctttcttg tacaaagtgg tcatagctta tacagatcac cgtaccttaa tcaaactcac 29400
agaaccctag tattcaacct gccacctccc tcccaacaca cagagtacac agtcctttct 29460
ccccggctgg ccttaaaaag catcatatca tgggtaacag acatattctt aggtgttata 29520
ttccacacgg tttcctgtcg agccaaacgc tcatcagtga tattaataaa ctccccgggc 29580
agctcactta agttcatgtc gctgtccagc tgctgagcca caggctgctg tccaacttgc 29640
ggttgcttaa cgggcggcga aggagaagtc cacgcctaca tgggggtaga gtcataatcg 29700
tgcatcagga tagggcggtg gtgctgcagc agcgcgcgaa taaactgctg ccgccgccgc 29760
tccgtcctgc aggaatacaa catggcagtg gtctcctcag cgatgattcg caccgcccgc 29820
agcataaggc gccttgtcct ccgggcacag cagcgcaccc tgatctcact taaatcagca 29880
cagtaactgc agcacagcac cacaatattg ttcaaaatcc cacagtgcaa ggcgctgtat 29940
ccaaagctca tggcggggac cacagaaccc acgtggccat cataccacaa gcgcaggtag 30000
attaagtggc gacccctcat aaacacgctg gacataaaca ttacctcttt tggcatgttg 30060
taattcacca cctcccggta ccatataaac ctctgattaa acatggcgcc atccaccacc 30120
atcctaaacc agctggccaa aacctgcccg ccggctatac actgcaggga accgggactg 30180
gaacaatgac agtggagagc ccaggactcg taaccatgga tcatcatgct cgtcatgata 30240
tcaatgttgg cacaacacag gcacacgtgc atacacttcc tcaggattac aagctcctcc 30300
cgcgttagaa ccatatccca gggaacaacc cattcctgaa tcagcgtaaa tcccacactg 30360
cagggaagac ctcgcacgta actcacgttg tgcattgtca aagtgttaca ttcgggcagc 30420
agcggatgat cctccagtat ggtagcgcgg gtttctgtct caaaaggagg tagacgatcc 30480
ctactgtacg gagtgcgccg agacaaccga gatcgtgttg gtcgtagtgt catgccaaat 30540
ggaacgccgg acgtagtcat atttcctgaa gcaaaaccag gtgcgggcgt gacaaacaga 30600
tctgcgtctc cggtctcgcc gcttagatcg ctctgtgtag tagttgtagt atatccactc 30660
tctcaaagca tccaggcgcc ccctggcttc gggttctatg taaactcctt catgcgccgc 30720
tgccctgata acatccacca ccgcagaata agccacaccc agccaaccta cacattcgtt 30780
ctgcgagtca cacacgggag gagcgggaag agctggaaga accatgtttt tttttttatt 30840
ccaaaagatt atccaaaacc tcaaaatgaa gatctattaa gtgaacgcgc tcccctccgg 30900
tggcgtggtc aaactctaca gccaaagaac agataatggc atttgtaaga tgttgcacaa 30960
tggcttccaa aaggcaaacg gccctcacgt ccaagtggac gtaaaggcta aacccttcag 31020
ggtgaatctc ctctataaac attccagcac cttcaaccat gcccaaataa ttctcatctc 31080
gccaccttct caatatatct ctaagcaaat cccgaatatt aagtccggcc attgtaaaaa 31140
tctgctccag agcgccctcc accttcagcc tcaagcagcg aatcatgatt gcaaaaattc 31200
aggttcctca cagacctgta taagattcaa aagcggaaca ttaacaaaaa taccgcgatc 31260
ccgtaggtcc cttcgcaggg ccagctgaac ataatcgtgc aggtctgcac ggaccagcgc 31320
ggccacttcc ccgccaggaa ccttgacaaa agaacccaca ctgattatga cacgcatact 31380
cggagctatg ctaaccagcg tagccccgat gtaagctttg ttgcatgggc ggcgatataa 31440
aatgcaaggt gctgctcaaa aaatcaggca aagcctcgcg caaaaaagaa agcacatcgt 31500
agtcatgctc atgcagataa aggcaggtaa gctccggaac caccacagaa aaagacacca 31560
tttttctctc aaacatgtct gcgggtttct gcataaacac aaaataaaat aacaaaaaaa 31620
catttaaaca ttagaagcct gtcttacaac aggaaaaaca acccttataa gcataagacg 31680
gactacggcc atgccggcgt gaccgtaaaa aaactggtca ccgtgattaa aaagcaccac 31740
cgacagctcc tcggtcatgt ccggagtcat aatgtaagac tcggtaaaca catcaggttg 31800
attcatcggt cagtgctaaa aagcgaccga aatagcccgg gggaatacat acccgcaggc 31860
gtagagacaa cattacagcc cccataggag gtataacaaa attaatagga gagaaaaaca 31920
cataaacacc tgaaaaaccc tcctgcctag gcaaaatagc accctcccgc tccagaacaa 31980
catacagcgc ttcacagcgg cagcctaaca gtcagcctta ccagtaaaaa agaaaaccta 32040
ttaaaaaaac accactcgac acggcaccag ctcaatcagt cacagtgtaa aaaagggcca 32100
agtgcagagc gagtatatat aggactaaaa aatgacgtaa cggttaaagt ccacaaaaaa 32160
cacccagaaa accgcacgcg aacctacgcc cagaaacgaa agccaaaaaa cccacaactt 32220
cctcaaatcg tcacttccgt tttcccacgt tacgtaactt cccattttaa gaaaactaca 32280
attcccaaca catacaagtt actccgccct aaaacctacg tcacccgccc cgttcccacg 32340
ccccgcgcca cgtcacaaac tccaccccct cattatcata ttggcttcaa tccaaaataa 32400
ggtatattat tgatgat 32417
<210> 5
<211> 2844
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggctaccc cttcgatgat gccgcagtgg tcttacatgc acatctcggg ccaggacgcc 60
tcggagtacc tgagccccgg gctggtgcag tttgcccgcg ccaccgagac gtacttcagc 120
ctgaataaca agtttagaaa ccccacggtg gcgcctacgc acgacgtgac cacagaccgg 180
tcccagcgtt tgacgctgcg gttcatccct gtggaccgtg aggatactgc gtactcgtac 240
aaggcgcggt tcaccctagc tgtgggtgat aaccgtgtgc tggacatggc ttccacgtac 300
tttgacatcc gcggcgtgct ggacaggggc cctactttta agccctactc tggcactgcc 360
tacaacgccc tggctcccaa gggtgcccca aatccttgcg aatgggaaga gaaaaagaat 420
ggaggaggaa gcgatgctaa tcaaatgcaa actcacgtat ttgggcaggc gccttattct 480
ggtataaata ttacaaagga gggtattcaa ataggtattg atgcaaccaa agaggaagat 540
aatggaaagg aaatatatgc cgataaaaca tttcaacctg aacctcaaat aggagaatct 600
cagtggcagg atagtgataa ttactatgga gggagagtcc ttaaaaagac taccccaatg 660
aaaccatgtt acggttcata tgcaaaaccc acaaatgaaa atggagggca agctaaattc 720
aaaacacctg aaaaagaagg tgaagaaccc aaagaaagtc aagtggaaat gcaatttttc 780
gatattccca gtactggcac aggtggtaat ggaacaaatg ttaatttcaa acctaaagtg 840
gtattgtaca gtgaagatgt agatatagaa accccagaca ctcatatttc ttacatgccc 900
ggcaaggaag atgcaagttc acgagaacta atgggccaac aatctatgcc caacaggcct 960
aattacattg cttttaggga caattttatt ggtctaatgt attacaacag cacgggtaat 1020
atgggtgttc tggcgggcca agcatcgcag ttgaatgctg ttgtagattt gcaagacaga 1080
aacacagagc tttcatacca gcttttgctt gattccattg gtgatagaac caggtacttt 1140
tctatgtgga atcaggctgt tgacagctat gatccagatg ttagaattat tgaaaatcat 1200
ggaactgaag atgaacttcc aaattactgc tttccactgg atggcgctgg aactaacgca 1260
gtgtaccaag gtgtaaaagt taaaactact aacaatacag aatgggaaaa agacactgca 1320
gtatctgaac acaatcagat aagagttgga aataattttg ccatggaaat caatctaaat 1380
gccaacctgt ggagaaattt cctgtactcc aacatagcgc tgtatttgcc cgacaagcta 1440
aagtacagtc cttccaacgt aaaaatttct gataacccaa acacctacga ctacatgaac 1500
aagcgagtgg tggctcccgg gttagtggac tgctacatta accttggagc acgctggtcc 1560
cttgactata tggacaacgt caacccattt aaccaccacc gcaatgctgg cctgcgctac 1620
cgctcaatgt tgctgggcaa tggtcgctat gtgcccttcc acatccaggt gcctcagaag 1680
ttctttgcca ttaaaaacct ccttctcctg ccgggctcat acacctacga gtggaacttc 1740
aggaaggatg ttaacatggt tctgcagagc tccctaggaa atgacctaag ggttgacgga 1800
gccagcatta agtttgatag catttgcctt tacgccacct tcttccccat ggcccacaac 1860
accgcctcca cgcttgaggc catgcttaga aacgacacca acgaccagtc ctttaacgac 1920
tatctctccg ccgccaacat gctctaccct atacccgcca acgctaccaa cgtgcccata 1980
tccatcccct cccgcaactg ggcggctttc cgcggctggg ccttcacgcg ccttaagact 2040
aaggaaaccc catcactggg ctcgggctac gacccttatt acacctactc tggctctata 2100
ccctacctag atggaacctt ttacctcaac cacaccttta agaaggtggc cattaccttt 2160
gactcttctg tcagctggcc tggcaatgac cgcctgctta cccccaacga gtttgaaatt 2220
aagcgctcag ttgacgggga gggttacaac gttgcccagt gtaacatgac caaagactgg 2280
ttcctggtac aaatgctagc taactacaac attggctacc agggcttcta tatcccagag 2340
agctacaagg accgcatgta ctccttcttt agaaacttcc agcccatgag ccgtcaggtg 2400
gtggatgata ctaaatacaa ggactaccaa caggtgggca tcctacacca acacaacaac 2460
tctggatttg ttggctacct tgcccccacc atgcgcgaag gacaggccta ccctgctaac 2520
ttcccctatc cgcttatagg caagaccgca gttgacagca ttacccagaa aaagtttctt 2580
tgcgatcgca ccctttggcg catcccattc tccagtaact ttatgtccat gggcgcactc 2640
acagacctgg gccaaaacct tctctacgcc aactccgccc acgcgctaga catgactttt 2700
gaggtggatc ccatggacga gcccaccctt ctttatgttt tgtttgaagt ctttgacgtg 2760
gtccgtgtgc accggccgca ccgcggcgtc atcgaaaccg tgtacctgcg cacgcccttc 2820
tcggccggca acgccacaac ataa 2844
<210> 6
<211> 984
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccata tgacacggaa 60
accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg tatcccccaa tgggtttcaa 120
gagagtcccc ctggagttct tactttaaaa tgtttaaccc cactaacaac cacaggcgga 180
tctctacagc taaaagtggg agggggactt acagtggatg acaccaacgg ttttttgaaa 240
gaaaacataa gtgccaccac accactcgtt aagactggtc actctatagg tttaccacta 300
ggagccggat tgggaacgaa tgaaaataaa ctttgtatca aattaggaca aggacttaca 360
ttcaattcaa acaacatttg cattgatgac aatattaaca ccttatggac aggagtcaac 420
cccaccgaag ccaactgtca aatcatgaac tccagtgaat ctaatgattg caaattaatt 480
ctaacactag ttaaaactgg agcactagtc actgcatttg tttatgttat aggagtatct 540
aacaatttta atatgctaac tacacacaga aatataaatt ttactgcaga gctgtttttc 600
gattctaact ggtaatttaa ctaactagac tctcatcccc tcaaaactcc acttaatcat 660
aaatcaggac aaaacatggc tactggtgcc attactaatg ctaaaggttt catgcccagc 720
acgactgcct atcctttcaa tgataattct agagaaaaag aaaactacat ttacggaact 780
tgttactaca cagctagtga tcgcactgct tttcccattg acatatctgt catgcttaac 840
cgaagagcaa taaatgacga gacatcatat tgtattcgta taacttggtc ctggaacaca 900
ggagatgccc cagaggtgca aacctctgct acaaccctag tcacctcccc atttaccttt 960
tactacatca gagaagacga ctaa 984
<210> 7
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
taataggctg caggacttac tgttggtggg acgccctgct ttgcgaaggg aaaggaggag 60
tttgccctga gcacaggccc ccaccctcca ctgggctttc cccagctccc ttgtcttctt 120
atcacggtag tggcccagtc cctggcccct gactccagaa ggtggccctc ctggaaaccc 180
aggtcgtgca gtcaacgatg tactcgccgg gacagcgatg tctgctgcac tccatccctc 240
ccctgttcat ttgtccttca tgcccgtctg gagtagatgc tttttgcaga ggtggcaccc 300
tgtaaagctc tcctgtctga cttttttttt ttttttagac tgagttttgc tcttgttgcc 360
taggctggag tgcaatggca caatctcagc tcactgcacc ctctgcctcc cgggttcaag 420
cgattctcct gcctcagcct cccgagtagt tgggattaca ggcatgcacc accacgccca 480
gctaattttt gtatttttag tagagacaag gtttcaccgt gatggccagg ctggtcttga 540
actccaggac tcaagtgatg ctcctgccta ggcctctcaa agtgttggga ttacaggcgt 600
gagccactgc acccggcctg cacgcgttct ttgaaagcag tcgagggggc gctaggtgtg 660
ggcagggacg agctggcgcg gcgtcgctgg gtgcaccgcg accacgggca gagccacgcg 720
gcgggaggac tacaactccc ggcacacccc gcgccgcccc gcctctactc ccagaaggcc 780
gcggggggtg gaccgcctaa gagggcgtgc gctcccgaca tgccccgcgg cgcgccatta 840
accgccagat ttgaatcgcg g 861
<210> 8
<211> 986
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgagacata ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg 60
gaccagctga tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca 120
cctacccttc acgaactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag 180
gcggtttcgc agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta 240
ctcacttttc cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag 300
cagccggagc agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc 360
gatcttacct gccacgaggc tggctttcca cccagtgacg acgaggatga agagggtgag 420
gagtttgtgt tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattatcac 480
cggaggaata cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc 540
atgtttgtct acagtaagtg aaaattatgg gcagtgggtg atagagtggt gggtttggtg 600
tggtaatttt ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt attgtgattt 660
ttttaaaagg tcctgtgtct gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg gagcctgcaa 720
gacctacccg ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt 780
ctagagaatg caatagtagt acggatagct gtgactccgg tccttctaac acacctcctg 840
agatacaccc ggtggtcccg ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc 900
gtcgccaggc tgtggaatgt atcgaggact tgcttaacga gcctgggcaa cctttggact 960
tgagctgtaa acgccccagg ccataa 986

Claims (3)

1.一种快速准确的三质粒溶瘤腺病毒重组包装系统，其特征在于，其包含以下3个腺病毒重组质粒：
a)腺病毒右臂骨架质粒：所述腺病毒右臂骨架质粒上装载两套不同的位点重组序列，一套attL/attR在Fiber/Hexon/E3区，一套Cre/loxP在E1区，其全长序列见SEQ ID NO:1；E3区还插入了DB3.1大肠杆菌菌株及感受态ccdB致死基因；
b)腺病毒右臂穿梭质粒：所述腺病毒右臂穿梭质粒含有已改建好的嵌合型Hexon序列和嵌合型Fiber序列，中间E3区预置外源基因多克隆位点，Hexon/E3/Fiber序列两端含有attL1/attL2重组位点；所述嵌合型Hexon序列如SEQ ID NO:5所示；所述嵌合型Fiber序列如SEQ ID NO:6所示；
c)腺病毒左臂穿梭质粒：所述腺病毒左臂穿梭质粒在其多克隆位点插入肿瘤特异性启动子控制的腺病毒早期增殖基因和loxP重组位点；
其中，所述腺病毒右臂穿梭质粒通过Hexon/E3/Fiber序列两端的attL1/attL2与所述腺病毒右臂骨架质粒发生第一轮attL/attR位点特异性重组，所述腺病毒右臂穿梭质粒中attL1/attL2间的序列置换所述腺病毒右臂骨架质粒中attR1/attR2间的序列；所述腺病毒左臂穿梭质粒与所述腺病毒右臂骨架质粒发生第二轮Cre/loxP位点特异性重组，所述腺病毒左臂穿梭质粒中的肿瘤特异性启动子控制的E1a表达框插入到所述腺病毒右臂骨架质粒缺失的E1区；经过两轮位点特异性重组，包装出所需要的溶瘤腺病毒。
2.根据权利要求1所述的三质粒溶瘤腺病毒重组包装系统，其特征在于，所述肿瘤特异性启动子的序列如SEQ ID NO:7所示。
3.根据权利要求1所述的三质粒溶瘤腺病毒重组包装系统，其特征在于，所述E1a表达框的序列如SEQ ID NO:8所示。
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