CN106190992A - 癌症靶向基因-溶瘤腺病毒的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种使用在细菌中进行同源重组取代在细胞中进行同源重组的方法步骤，以获得溶瘤病毒携带抗癌基因的质粒和病毒(即癌症的靶向基因‑病毒治疗，Cancer Targeting Gene‑Viro‑Therapy，CTGVT)。CTGVT乃将抗癌基因加入到溶瘤病毒(Oncolytic Virus,OV)构建而成，故亦即OV‑gene治疗。采用本发明方法构建一个CTGVT(OV‑gene)一般不到1个月即可完成，效率高，准确率高，解决了科学工作者的一个难题，使溶瘤病毒的构建工作进度可大大地加快而准确地完成。

Description

癌症靶向基因-溶瘤腺病毒的构建方法

技术领域

本发明涉及溶瘤腺病毒领域，具体地说，是关于一种癌症靶向基因-溶瘤腺病毒的构建方法。

背景技术

重组包括不同方法：1、利用限制性切酶将不同DNA切开，再用连接酶把不同DNA片段联接起来，称为DNA重组；2.、利用DNA片段两端DNA含有相同(或叫同源)DNA序列，进行同源重组，即利用DNA片段两端的DNA片段的顺序相同，将一个DNA片段替换到另一个DNA片段。

在当今癌症治疗领域中，由刘新垣院士创建了OV-gene治疗策略，即癌症的靶向基因-病毒治疗策略(Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy，CTGVT)，也就是说将抗癌基因加入到溶瘤病毒载体(Oncolytic Virus，OV)中。将癌症的溶瘤病毒治疗与癌症的基因治疗相结合的方法是治疗癌症的一个革命性的学说，可以达到全歼移植性肿瘤的作用，其中重点在于将非复制型病毒载体(Ad)更换成可复制型的溶瘤病毒载体(Oncolytic Virus，OV)。Ad无靶向性，无复制能力，故抗癌作用很弱，而OV能在癌细胞中复制数万倍，它所携带的抗癌基因也随之复制数万倍，故抗癌能力大增，其结果是OV-gene的抗癌效果远远超过OV或Ad-gene。用OV载体取代Ad载体，在癌症治疗中是非常重要的革命性改进。然而，过去构建一个癌症靶向基因-溶瘤病毒需在细胞中进行同源重组，要花时数月，且错误很多，野生型多，需空斑纯化，时间最长可达半年，甚至到最后还纯化不到所需溶瘤病毒，以失败告终，大大妨碍科学工作。

腺病毒在正常细胞和癌细胞中都能复制，不能针对癌细胞进行选择性复制。通过对腺病毒进行更换启动子、突变等修饰操作，获得溶瘤腺病毒，其能够特异性地在癌细胞中复制，而不对正常细胞产生影响。溶瘤腺病毒构建过程中最困难的一步，是包含有人工修饰的腺病毒片段的穿梭的小质粒与腺病毒大质粒进行同源重组的步骤，传统的这一步骤在细胞中进行，其效率低，花费时间长。由Quantum Biotechnology基因公司创造了AdEasy^TM方法，将这一同源重组的构建过程从细胞改到细菌(大肠杆菌BJ5183)中进行，因后者含重组酶很高，故效率高，成功率高，但AdEasy只能用于构建复制缺陷型腺病毒的同源重组用于基因治疗(Ad-gene)，目前仍未有高效的、能够应用于可复制的溶瘤腺病毒的同源重组的系统的相关报道。

发明内容

本发明提供了一种使用在细菌中进行同源重组取代在细胞中进行同源重组的方法，以获得溶瘤病毒携带抗癌基因的质粒和病毒(即癌症的靶向基因-病毒治疗，Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy，CTGVT)。CTGVT乃将抗癌基因加入到溶瘤病毒(Oncolytic Virus,OV)构建而成，故亦即OV-gene治疗。所述方法包括四个步骤。具体地说，第一步构建穿梭质粒(pSW-X)，第二步利用在细菌中进行同源重组，在AdEasy-1上加入E3区，构建大质粒pBHG581，第三步将pSW-X与大质粒pBGH581在BJ5183细菌中进行同源重组，获得pCTGVT(pOV-gene)，然后进一步用PacI线性化，在HEK293细胞中包装，获得所需溶瘤腺病毒。

因此本发明的第一个目的在于提供一种癌症靶向基因-溶瘤腺病毒的构建方法。

本发明的第二个目的在于提供根据上述构建方法制备获得各种不同改进的癌症靶向基因-溶瘤腺病毒。

为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

根据本发明的第一个方面，一种癌症靶向基因-溶瘤腺病毒的构建方法，所述方法包括在细菌中进行同源重组取代在细胞中进行同源重组，以获得溶瘤腺病毒携带抗癌基因的质粒和病毒。

根据本发明，所述方法包括以下步骤：

(A)穿梭质粒pSW-X的构建：在pXC2中，将五型腺病毒基因组上的正常E1A或E1B改为能提高五型腺病毒癌症靶向性的mE1A或mE1B(m代表mustated E1A或E1B，包括在改造E1A或E1B或更换其启动子或在其中加基因)，用XhoI和MfeI酶切，然后与XhoI和MfeI切开的pShuttle相结合，构建获得pSW-X；

(B)腺病毒大质粒pBGH581的构建：将含腺病毒E3区的pBHGE3用HindIII酶切，然后与经SpeI或SrfI线性化的pAdEasy-1共转化到大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，获得腺病毒大质粒pBHG581；

(C)pOV-gene的构建：将步骤(A)中所述pSW-X用PmeI线性化后，与步骤(B)中所述pBHG581共转化到大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，获得pOV-gene。

(D)将步骤(C)中所述pOV-gene经PacI线性化，转染到HEK293细胞中包装，获得癌症靶向基因-溶瘤腺病毒。

根据本发明的第二个方面，根据上述构建方法制备获得的溶瘤腺病毒携带抗癌基因的质粒和病毒。

有益效果：

本发明主要是不同产品的构建方法，即构建带有抗癌基因、有靶向性又能复制的CTGVT或OV-gene，其中抗癌基因是现有的，主要就是要构建有靶向性、能复制的CTGVT(OV-gene)，关键点是将过去的在HEK293细胞同源重组改为在BJ5183细菌中进行同源重组，过去在细胞中进行同源重组，效率低，错误率高，完成一个OV-gene的构建需要几个月，而细菌BJ5183含很高的重组酶，故重组效率高，含野生型腺病毒少或无(野生型Ad必需除去)，采用本发明方法构建一个CTGVT(OV-gene)一般不到1个月即可完成，效率高，准确率高，解决了科学工作者的一个难题，使溶瘤病毒的构建工作进度可大大地加快而准确地完成。

附图说明

图1为本发明的实施例1的pSW-X质粒的构建示意图。

图2为本发明的实施例1的pBHG581通用型质粒的构建示意图。

图3为本发明的实施例1的OV-gene的构建示意图。

图4为本发明实施例2的构建示意图。

图5为本发明实施例3的构建示意图。

图6为本发明实施例3的构建示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1、

本发明的癌症靶向基因-溶瘤腺病毒的构建方法的原理说明如下：

步骤一、pSW-X穿梭质粒的构建

如图1所示，在pXC2(市售)中，根据已知的现有技术，将五型腺病毒基因组上的正常E1A或E1B改为能提高五型腺病毒癌症靶向性的mE1A或mE1B(m代表mustated E1A或E1B，即改造的E1A或E1B或替换其启动子，也包括在mE1A或mE1B中加上基因)，用XhoI和MfeI酶切，然后与XhoI和MfeI切开的pShuttle(购自Agilent Technologies公司，6586bp)相结合，构建获得pSW-X(约9512bp)。

步骤二、pBHG58通用型腺病毒大质粒的构建

如图2所示，将含腺病毒E3区的pBHGE3(37436bp)用HindIII酶切，然后与经SpeI或SrfI线性化的pAdEasy-1(购自Agilent Technologies公司，33442bp，只含小部分E3区)共转到大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，获得可通用的腺病毒大质粒pBHG581(即在pAdEasy中加入E3，即pAdEasy-E3)。在pBHGE3中含有很多HindⅢ，但只有HindⅢ两旁内有同源顺序者，才能与AdEasy-1上SpeI与SrfI两旁的DNA进行同源顺序重组。

步骤三、pOV-gene的构建

如图3所示，将步骤一中构建的pSW-X用PmeI线性化后，与步骤二中构建的通用型大质粒pBHG581共转化到大肠杆菌BJ5183中进行重组，获得pOV-gene，其带有pSW-X中的抗癌基因及靶向的溶瘤腺病毒。将pOV-gene经PacI线性化，切除Ori和Kana基因后，转染到HEK293细胞(购自美国ATCC)中包装，可获得各种CTGVT(OV)策略改造的腺病毒抗癌药物。

实施例2、溶瘤腺病毒Ad.RGD-hTERT-E1A(D24)-E1B(D55)-Gene的构建(即带RGD的CTGVT(OV-gene))。

2.1、背景介绍

5型腺病毒感染肿瘤细胞时通常是与细胞表面柯萨奇与腺病毒受体(CAR)结合(Bergelson，J.M.，Cunningham，J.A.，Droguett，G.，KurtJones，E.A.，Krithivas，A.，Hong，J.S.，Horwitz，M.S.，Crowell，R.L.，和Finberg，R.W.，1997，Isolation of a common receptor for coxsackie B viruses andadenoviruses 2and 5，Science 275，1320-1323)，再经由整合素结合到质膜上内化进入细胞(Wickham，T.J.，Mathias，P.，Cheresh，D.A.，和Nemerow，G.R.，1993，Integrins alpha v beta 3and alpha v beta 5promote adenovirusinternalization but not virus attachment，Cell 73，309-319)。

部分癌症干细胞表面CAR表达量显著降低，影响腺病毒感染效率，导致传统的癌症基因治疗策略的效果大为下降。利用pAdEasy-1质粒体系在细菌(大肠杆菌BJ5183)中重组的方法，能够便捷地获得外壳纤维蛋白(Fiber)区修饰后的溶瘤腺病毒，例如插入一段含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)基序的短肽编码序列，直接识别整合素并与之结合，从而增强其感染能力，提高其治疗效果。

本实施例的构建线路如图4所示。

2.2、在纤维蛋白区插入编码含有RGD基序短肽序列

pAdEasy-1经EcoRI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳并回收长度为9617bp的小片段。使用DNA连接酶令该小片段自连，转化大肠杆菌DH5α并以氨苄霉素筛选，获得含有纤维蛋白区域的新质粒，命名为pfiber。

设计引物在pfiber加上RGD，构建pfiber-RGD。引物如下：

RGD-正向-1：5’-GCTTGAGGTTAACCTAAGCACT-3’(SEQ ID NO：1)；

RGD-反向-1：5’-AGTTGTGTCGCAGAAGCAATCTCCAC-3’(SEQ IDNO：2)；

RGD-正向-2：5’-GGAAACAGGATGTGATTGTCGTGGAG-3’(SEQ IDNO：3)；

RGD-反向-2：5’-AAATGACTTGAAATTTTCTGCAAT-3’(SEQ ID NO：4)。

以pfiber小质粒为反应的模板，分别以上述两对引物进行PCR反应并电泳回收两种PCR产物。以这两种PCR产物混合作为模板，并以RGD-正向-1与RGD-反向-2为引物进行PCR反应并电泳回收产物，通过氨苄霉素筛选获得含有RGD基序短肽编码序列的新质粒，命名为pfiber-RGD。

2.3、pAdEasy-1-RGD质粒的构建

以SrfI和PacI酶切pAdEasy-1质粒，同时以EcoRI酶切pfiber-RGD质粒，电泳回收上述两种DNA片段，共转化入大肠杆菌BJ5183中，利用同源序列区域(SrfI与EcoRI之间片段，PacI与EcoRI之间片段为同源臂)重组，并以氨苄霉素筛选获得新质粒，命名为pAdEasy-1-RGD。

2.4、pAdEasy-RGD-hTERT-D24-D55-Gene质粒的构建

以质粒pAdEasy-1-RGD转化大肠杆菌BJ5183菌株，获得携带该质粒的BJ5183新菌株并使用氯化铷法将其制备为感受态细胞。

按本申请图1所述的方法，在市售获得的pShuttle上加hTERT-D24-D55-gene(即mE1A或mE1B，实为Ad-hTERT-E1A(D24)-E1B(D55)-Gene，其中，D24即缺失E1A的24bp，但D55则为缺失E1B的55KDagene)，构建pShuttle-hTERT-D24-D55-gene。

以PmeI酶切含有治疗基因表达框的穿梭质粒pSW-X(pShuttle-hTERT-D24-D55-Gene)，并用去磷酸酶处理后，转化上述含有pAdEasy-1-RGD质粒的BJ5183感受态细胞，以卡那霉素筛选鉴定从而获得质粒pAdEasy-RGD-hTERT-D24-D55-Gene。

以PacI酶切质粒pAdEasy-RGD-hTERT-D24-D55-Gene，去除原核表达元件Ori和Kana等并暴露反向末端重复序列(ITR)，使用脂质体转染试剂(Effectene)将该片段转染入人胚胎肾细胞HEK-293中产生重组溶瘤腺病毒颗粒Ad.RGD-hTERT-E1A(D24)-E1B(D55)-Gene。收集并扩增后，提取重组腺病毒DNA，进行PCR及测序分析，确定正确的病毒株，大量扩增后，使用氯化铯梯度离心纯化病毒，-80℃保存待用。

实施例3、构建OV5/11-gene(OV5/11表示由腺病毒5/11嵌合型鞭毛5/11型构成的溶瘤病毒)。

3.1、背景介绍

目标：将溶瘤腺病毒的鞭毛由5型改为5/11嵌合型。

说明：5型腺病毒(Ad5)的受体为CAR，在肿瘤细胞中CAR受体含量较少，但Ad11的受体CD46含量较多，而决定腺病毒的靶向性为其鞭毛，故将Ad5的鞭毛改为Ad11型的融合鞭毛Ad5/11，就可大大提高其在肿瘤中的靶向性和抗癌效率。

本实施例的构建线路如图5和图6所示。

3.2、Onco^Ad(5/11)-gene的构建

3.2.1、嵌合型fiber5/11的构建：

pAdEasy-1经EcoRI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳并回收长度为9617bp的小片段，使用Ligation High连接酶使小片段自连，转化到大肠杆菌感受态Trans-T并以氨苄霉素进行筛选，获得含有5型腺病毒鞭毛区的新质粒，命名为pfiber。采用常规的overlapPCR将fiber5的杆状区域shaft区和顶端球状蛋白区域knob区(133bp-1746bp)替换为fiber11型序列(133bp-975bp)。构建基座区为5型而其鞭毛区域为11型的嵌合型fiber5/11，构建好的质粒命名为pfiber5/11(图5)。

3.2.2、pAdEasy-fiber5/11质粒的构建：

用SrfI和PacI酶切pAdEasy-1质粒，同时用EcoR1酶切pfiber5/11质粒，电泳回收上述两种DNA片段，共转化到大肠杆菌BJ5183中，利用同源序列区域(Srfl与EcoRI之间的片段为同源左臂，PacI与EcoRI之间的片段为同源右臂)进行同源重组，并以氨苄霉素筛选获得含有5/11嵌合型fiber的pAdEasy，命名为pAdEasy-fiber5/11(图5)。

3.2.3、pOV5/11-gene的构建即pAdEasy-fiber5/11与pSW-X的结合：

用RbCl法制备含有pAdEasy-fiber5/11的感受态，然后再转化用PmeI酶切线性化的pSW-X，在BJ5183中重组，以卡那霉素进行筛选鉴定从而获得质粒pAdEasy-fiber5/11-mE1A-mE1B-gene即pOV5/11-gene(图6)。

3.2.4、OV5/11-gene病毒的构建：

以PacI酶切质粒pAdEasy-fiber5/11-mE1A-mE1B-gene，去除原核表达原件Ori和Kana等并暴露反向末端重复序列ITR，使用Effectene转染试剂将该线性化的质粒片段转入HEK-293中产生重组溶瘤腺病毒颗粒Ad5F/11.mE1A-mE1B-gene。收集并扩增后，提取重组腺病毒基因组，进行PCR鉴定和测序分析，确定正确的病毒株，大量扩增后使用氯化铯梯度离心纯化病毒，-80℃保存待用。

Claims (3)

1.一种癌症靶向基因-溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，所述方法包括在细菌中进行同源重组取代在细胞中进行同源重组，以获得溶瘤腺病毒携带抗癌基因的质粒和病毒。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(A)穿梭质粒pSW-X的构建：在pXC2中，将五型腺病毒基因组上的正常E1A或E1B改为能提高五型腺病毒癌症靶向性的mE1A或mE1B同时还带有基因，用XhoI和MfeI酶切，然后与XhoI和MfeI切开的pShuttle质粒相结合，构建pSW-X；

(B)腺病毒大质粒pBGH581的构建：将含腺病毒E3区的pBHGE3用HindIII酶切，然后与经SpeI或SrfI线性化的pAdEasy-1共转化到大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，获得腺病毒大质粒pBHG581；

(C)pOV-gene的构建：将步骤(A)中所述pSW-X用PmeI线性化后，与步骤(B)中所述pBHG581共转化到大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，获得pOV-gene。

(D)将步骤(C)中所述pOV-gene经PacI线性化，转染到HEK293细胞中包装，获得癌症靶向基因-溶瘤腺病毒。

3.如权利要求1-2中任一项所述的构建方法制备获得的溶瘤腺病毒携带抗癌基因的质粒和病毒。